СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА
METHOD FOR PREDICTION OF CLINICAL COURSE AND TREATMENT EFFICACY OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения и эффективности проводимой терапии у больных сахарным диабетом 2 типа.
Сахарный диабет 2 типа (СД2) - самое распространенное эндокринное заболевание, которое представляет собой одну из острейших медико-социальных проблем, так как ведет к ранней инвалидизации и повышению смертности среди населения вследствие развития различных осложнений. Сахарный диабет 2-го типа (инсулин-независимый диабет) - метаболическое заболевание, характеризующееся хронической гипергликемией, развивающейся в результате нарушения секреции инсулина или механизмов его взаимодействия с клетками тканей [Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.В. Эндокринология: учебник для мед. вузов/ Под ред. акад. РАМН И.И. Дедова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 430 с.; Joseph NA., Greenberg AS. Adipocytocines and insulin resistance. // J Clin Endocrinol. Metab. 2004. - №89(2). - P.447-460].
Очень важное значение для качества жизни пациентов имеет течение заболевания и эффективность от проводимой терапии.
Как свидетельствуют результаты ряда исследований, значимую роль в патогенезе сахарного диабета 2-го типа и его осложнений играют провоспалительные цитокины, такие как ФНО и его рецепторы [Рыдловская А.В., Симбирцев А.С. «Функциональный полиморфизм гена TNFα и патология». Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, №3. С.4-10].
Ген Ltα, который в литературе упоминается как лимфотоксин α или TNFβ, представляет собой гликопротеид массой около 33 кДа, который продуцируется стимулированными митогенами T-лимфоцитами и лейкоцитами, а также секретируется фибробластами, астроцитами, миеломными клетками, эпителио- и эндотелиоцитами. Ген Ltα находится на шестой хромосоме (6р21.3), содержит 4 экзона и расположен на близком расстоянии от гена TNFα. Ltα не имеет трансмембранного домена, но может удерживаться на мембране за счет образования комплекса с трансмембранным белком рЗЗ (лимфотоксин бета) [S.P. Weisberg, D. McCann, М. Desai [et al.]. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue [Text] // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol.112, №12. - P.1796-1808].
Ген Ltα обладает рядом подобных TNFα биологических активностей, включая способность вызывать геморрагический некроз опухолей. Лимфотоксины занимают особое место в семействе фактора некроза опухолей. Подобно растворимой форме TNF, не имеющий трансмембранного домена, Ltα играет важную роль в клеточном иммунном ответе, воспалительных реакциях [Suriano, А.N. Sanford, N. Kim [et al.] // Mol. Cell. Biol. - 2005. - Vol.25, №20. - P.9073-9081], а также, возможно, в синдроме септического шока. Было обнаружено, что Ltα способен привлекать нейтрофилы в очаг респираторного воспаления, индуцировать фагоцитоз и обладает способностью индуцировать защиту от микроорганизмов, таких как Plasmodium falciparum, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis. Генетические полиморфизмы Ltα у человека ассоциированы с некоторыми инфекционными заболеваниями, ревматической, аллергической и эндокринной патологией, хроническим лимфолейкозом, генитальным эндометриозом, хроническим калькулезным холециститом, миомой матки, хроническим гломерулонефритом [V. Boraska, N.W Rayner, С.J. Groves [et al.]. Large-scale association analysis of TNF/LTA gene region polymorphisms in type 2 diabetes [Text] // BMC Medical Genetics. - 2010. - Vol.11, №1. - P. 69-70].
В настоящее время показано, что провоспалительную роль Ltα можно объяснить тем, что он вызывает активацию некоторых хемокинов (RANTES, IP-10, МСР-1, BLC, SLC, ELC) и молекул клеточной адгезии (VCAM, ICAM, E-selectin, MAdCAM-1) в эндотелиальных клетках. Ltα связывается с теми же рецепторами, что и TNFα, однако способность активировать рецепторы у Ltα менее выражена, зачастую он проявляет лишь частичную агонистическую активность. Ltα является хемоаттрактантом для нейтрофилов, стимулирует в них образование пероксид-ионов, усиливает фагоцитоз и адгезию к эндотелию, стимулирует активность фибробластов, играет роль в процессе заживления ран, а также провоцирует выработку стресс-гормонов, влияет на метаболизм глюкозы, влияет на липидный метаболизм, коагуляцию (Кетлинский, С.А. Цитокины [Текст]: [моногр.] / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев. - СПб.: Фолиант, 2008. - 549 с.: ил., табл.
Известен способ прогнозирования микрососудистых осложнений - диабетической нефропатии - путем определения прогностических факторов риска, отличающийся тем, что исследуют исходные значения соотношения систолодиастолических скоростей (Vmax/Vmin) в дуговых почечных артериях, гликозилированного гемоглобина (HbAlC) в %, диастолического артериального давления (АДд) в мм рт.ст., триглицеридов (ТГ) сыворотки крови в ммоль/л, решают дискриминантное уравнение:
Д=-207,116·Vmax/Vmin-28,659·HbA1C-3,068·АДд-20,079·ТГ,
и при величине Д меньше 844,07 прогнозируют развитие диабетической нефропатии в течение года (пат. РФ №2200328, МКИ 7 G01N 33/72, 33/92).
Известен способ прогнозирования течения сахарного диабета 1 типа (пат. РФ №2320272, кл. A61B 10/00), заключающийся в том, что устанавливают прогностические факторы риска: возраст, уровень антиокислительной активности, содержание общих липидов, концентрацию диеновых конъюгатов, далее прогностические значения факторов определяют по формулам и прогнозируют развитие микрососудистых осложнений, соответствующих длительности заболевания.
К недостаткам указанных способов следует отнести невысокую точность прогноза и ограниченную возможность использования для прогноза только у пациентов с СД 1 типа, в то время как возможность прогнозирования течения СД 2 типа и эффективность от проводимой терапии не оценивается.
Известен патент РФ №2461356, опубл. 20.09.2012, «Способ прогнозирования течения сахарного диабета», в котором в качестве факторов риска используют различные признаки, например умение свернуть язык в трубочку, миопия, и др., и при наличии у пациента с сахарным диабетом 1 типа 5-ти и более признаков прогнозируют высокий риск развития диабетической нефропатии и артериальной гипертонии, при наличии у пациента с сахарным диабетом 2 типа 5-ти и более признаков прогнозируют высокий риск развития ишемической болезни сердца, а при наличии 4-х и менее признаков у пациентов с сахарным диабетом 1 и 2 типов прогнозируют минимальный риск неблагоприятного течения сахарного диабета. Недостаток заключается в том, что он рассматривает лишь наличие пороков развития у пациентов с сахарным диабетом 1-го и 2-го типов и наличие определенных навыков, но не учитывает влияние генетических маркеров на эффективность проводимой терапии больных сахарным диабетом 2 типа.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения выбран способ прогнозирования тяжести ИЗСД у детей в зависимости от спектра антигенов системы HLA, определяемого в дебюте заболевания (I. Rjasanowski et al., Exp. Clin. Endocrinol. Vol.89, N 2, 1987. PP.216-224), заключающийся в заборе крови у детей, заболевших ИЗСД, анализе крови для определения состава антигенов системы HLA, прогнозе более тяжелого течения СД при определении генотипа HLA-B 8, DR 3. Недостатком прототипа является ограниченность его применения, т.к. он предназначен только для прогнозирования тяжести СД у детей с инсулинозависимостью и не может быть использован для прогнозирования течения и эффективности проводимой терапии у больных сахарным диабетом 2 типа.
Задачей настоящего исследования является создание способа прогнозирования течения и эффективности проводимой терапии у больных сахарным диабетом 2 типа по данным генетического полиморфизма лимфотоксина α (+250A/G Ltα).
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки течения заболевания и эффективности проводимой терапии у индивидуумов русской национальности, страдающих сахарным диабетом 2-го типа.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования течения и эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа у индивидуумов русской национальности, включающий: забор и анализ крови, выделение ДНК из периферической венозной крови; анализ полиморфизма гена лимфотоксина альфа (+250A/G Ltα); прогноз благоприятного течения заболевания и положительного эффекта от проводимой терапии таблетированными сахароснижающими препаратами у больных сахарным диабетом 2-го типа в случае выявления полиморфного варианта +250GG Ltα.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза течения и эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа по наличию генотипа +250GG Ltα гена лимфотоксина альфа (+250A/G Ltα) у индивидуумов русской национальности.
Способ осуществляют следующим образом
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных сахарным диабетом 2-го типа в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон X-100, 5 мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об./мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).
2
Анализ полиморфизма гена Ltα в 1 интроне проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 2,5 мМ MgCl, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°C) выполняли 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 50°C; денатурация - 15 сек при 95°C.
Таблица 1
Ген
Полиморфизм и его локализация в гене
Структура праймеров
Литература
Ltα
+250A/G (1 интрон)
F: 5'-CAG TCTCATTGTCTCTGTCACACATT-3'
(Mirjam М. de Jong et al., 2003)
R: 5'-ACAGAGAGAGACAGG AAGGGAACA-3'
5'-FAM:CCATGGTTCCTCTC-RTQ1-3'
5'-ROX:CTGCCATGATTCC-BHQ2-3'
Изобретение характеризуется следующими графическими материалами.

На фиг.1 представлена дискриминация аллелей по локусу +250A/G Ltα (где ● - гомозиготы +250GG,  - гомозиготы +250АА,  - гетерозиготы +250AG,  - отрицательный контроль), которая осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU, где RFU - это уровень относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM - аллелю G.
Две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси x) относительно RFU для другого флуорофора (на оси у) на диаграмме дискриминации аллелей.
- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси у).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля А отложены по оси x).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).
На фиг.2 иллюстрируется уровень гликемии у больных СД2 в зависимости от генотипов локуса +250A/G Ltα.
На фиг.3 иллюстрируется уровень гликированного гемоглобина у больных СД2 в зависимости от генотипов локуса +250A/G Ltα.
На Фиг.4. представлена частота генотипа +250GG Ltα среди больных СД2, получающих пероральные сахароснижающие препараты в зависимости от эффективности лечения.
2
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с течением заболевания у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) [Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] / О.Ю. Реброва. - М.: Медиасфера, 2006. - 305 с.; Боровиков, В. Statistical: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов)].
Возможность использования предложенного способа для оценки течения и эффективности терапии сахарного диабета 2-го типа подтверждает анализ результатов наблюдений 236 больных сахарным диабетом и 308 человек популяционного контроля. В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой, не страдающие заболеваниями эндокринной системы. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. В группу популяционного контроля включались индивидуумы без заболеваний эндокринной системы. В рассматриваемой выборке у 209 пациентов (88,56%) сахарный диабет был декомпенсирован, и лишь у 27 больных (11,44%) наблюдалась компенсация СД2 на момент исследования.
В исследуемой группе из 236 человек ангиопатия нижних конечностей встречалась у 130 пациентов (55,08%), полинейропатия нижних конечностей - у 230 пациентов (97,45%), синдром диабетической стопы - у 49 пациентов (20,76%), диабетическая нефропатия - у 144 пациентов (61,01%), ретинопатия - у 171 пациента (72,45%).
Было изучено наличие инсулинопотребности у больных сахарным диабетом 2 типа. На момент исследования установлена инсулинопотребность у 169 пациентов (71,61%), отсутствие инсулинопотребности установлено у 67 пациентов (28,39%).
Для проведения анализа эффективности терапии СД2 пациентов по виду предварительно полученного лечения распределили следующим образом: таблетированная терапия - 72 пациента (30,52%), инсулинотерапия - у 64 пациентов (27,11%), комбинированная терапия - у 100 пациентов (42,37%). Положительный эффект от проводимой терапии был выявлен у 71 пациента (30,08%), отсутствие эффекта наблюдалось у 165 пациентов (69,92%).
2
2
2
2
2
2
2
cor
cor
cor
cor
cor
cor
cor
Установлено, что у больных СД2 без ангиопатии нижних конечностей концентрация генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 16,04% и в 3 раза превышает аналогичный показатель как контрольной группы (4,57%, χ=13,34, р=0,0009, с учетом поправки Бонферрони, минимизирующей вероятность ложноположительных результатов (ошибки 1-го рода), p=0,0027, OR=3,99, 95% CI 1,79-8,79), так и пациентов с ангиопатией нижних конечностей (5,38%, χ=6,14, p=0,01, p=0,03, OR=3,36, 95% CI 1,25-9,36). Получено, что у больных СД2 без нефропатии концентрация генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 17,39% и в 3 раза превышает аналогичный показатель как контрольной группы (4,57%, х2=14,96, р=0,0007, p=0,0021, OR=4,41, 95% CI 1,93-10,05) так и пациентов с нефропатией (5,56%, χ=7,36, p=0,01, p=0,03). Установлено, что у больных СД2 без ретинопатии концентрация генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 15,38% и в 4 раза превышает аналогичный показатель контрольной группы (4,57%, χ=8,69, p=0,01, p=0,03, OR=3,80, 95% CI 1,48-9,69). Среди пациентов с ретинопатией частота этого маркера составила 8,29% (χ=2,01, р=0,16). Полученные результаты свидетельствуют о том, что у больных СД2 без синдрома диабетической стопы концентрация генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 12,90% и существенно превышает аналогичные показатели как контрольной группы (4,57%, χ=10,19, p=0,01, p=0,03, OR=3,10, 95% CI 1,49-6,51), так и пациентов с синдромом диабетической стопы (0%, χ=5,71, p=0,017, p=0,051).
Как видно на фигурах 2 и 3, генетический вариант +250GG Ltα маркирует низкий уровень гликемии и гликированного гемоглобина (медиана - 8,50 ммоль/л, интерквартильный размах - 6,05-11,25 ммоль/л, p=0,01 и медиана - 6,91%, интерквартильный размах - 6,16-8,70%, р=0,001, соответственно) по сравнению с пациентами с генетическими вариантами +250AG и +250АА Ltα (медиана - 10,50 ммоль/л, нижний квартиль - 8,20 ммоль/л, верхний квартиль - 12,60 ммоль/л и медиана - 8,80%, нижний квартиль - 7,40%, верхний квартиль - 10,30%, соответственно).
2
2
cor
cor
Анализ концентраций генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в группах больных СД2 в зависимости от эффективности терапии и в контрольной группе выявил различия в частотах генетических вариантов по локусу +250A/G Ltα: у больных СД2 с положительным эффектом от проводимой терапии распространенность генотипа +250GG лимфотоксина α составляет 18,31% и в 3-4 раза превышает аналогичный показатель как контрольной группы (4,57%, χ=14,42, p=0,0008, с учетом поправки Бонферрони, минимизирующей вероятность ложноположительных результатов, p=0,0024, OR=4,69, 95% CI 1,95-11,26), так и пациентов без эффекта от терапии (6,67%, χ=6,15, p=0,01,p=0,03).
2
2
cor
Детальный анализ связей генетических полиморфизмов цитокинов с эффективностью лечения в группах пациентов с СД2, получавших различную терапию (пероральные сахароснижающие препараты, инсулинотерапию и комбинированную терапию - в виде таблетированных сахароснижающих препаратов и инсулина), выявил значимые ассоциации генетических вариантов по локусу +250A/G Ltα с эффективностью терапии у больных, получавших пероральные сахароснижающие препараты. Как представлено на фиг.4, в группе пациентов с положительным эффектом от терапии сахароснижающими препаратами (n=48) частота генотипа +250GG Ltα составила 20,84%, тогда как среди больных с отрицательным эффектом от этой терапии (n=24) данный показатель равнялся - 0,00% (χ=4,20, p=0,04,), а в контрольной группе он был равен 4,57% (χ=14,95, р=0,0007, p=0,0021, OR=5,51, 95% CI 2,10-14,37).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что маркером благоприятного течения заболевания и положительного эффекта от проводимой терапии, в том числе пероральными сахароснижающими препаратами, у индивидуумов русской национальности, больных сахарным диабетом 2 типа, является полиморфный вариант +250GG Ltα, что может быть использовано в эндокринологических стационарах при обследовании пациентов с сахарным диабетом 2 типа для формирования групп с пониженным риском тяжелого течения заболевания и развития осложнений, с положительным эффектом от проводимой терапии сахароснижающими препаратами, с целью оптимизации дальнейшей тактики ведения данных пациентов (осмотр офтальмолога 1 раз в год, невролога 1 раз в год, анализ мочи на микроальбуминурию 2 раза в год, гликированный гемоглобин 1 раз в 3 месяца, самостоятельный осмотр ног, курс сосудистой и метаболической терапии 1 раз в год, что в два раза реже по сравнению с пациентами из повышенной группы риска) и назначения этим пациентам лечения пероральными сахароснижающими препаратами.