Способ производства функционального кормового продукта для сельскохозяйственных животных
METHOD FOR THE PRODUCTION OF A FUNCTIONAL FEED PRODUCT FOR FARM ANIMALS

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве кормовых белковых продуктов с использованием микробиологического синтеза, обладающих широким спектром функционального действия для сельскохозяйственных животных, связанным с составом продукта. Использование молочной сыворотки, или сухой молочной сыворотки в качестве компонента питательной среды позволяет отнести изобретение к молочной промышленности. Использование ультразвукового гидролизата опилок в качестве основного источника углеводов позволяет отнести изобретение к переработке древесины, конкретно к гидролизной промышленности, а именно к экологическому способу получения гидролизатов из древесины для последующего биосинтеза кормового белка.
Наукой и практикой установлено, что перевариваемость растительных протеинов у сельскохозяйственных животных не превышает 80%, а коэффициент использования его при получении молока составляет не более 30%. При этом у жвачных животных потребность в протеине на 20-30% удовлетворяется за счёт белка микроорганизмов рубца, а на 70-80% протеин должен поступать с кормом. Белок основных растительных кормов беден незаменимыми аминокислотами: лизин, метионин и триптофан [1]. На долю кормов приходится более половины всех затрат на производство животноводческой продукции. От научного обоснования и внедрения новых разработок в кормопроизводстве во многом будут зависеть эффективность функционирования отрасли животноводства, уровень конкурентоспособности готовой продукции отечественных производителей на внутреннем и мировом рынках и, в конечном итоге, качество жизни россиян [2].
В рационах сельскохозяйственных животных в качестве дополнительного источника полноценного белка широко применяют кормовые дрожжи. В кормовых дрожжах содержится 3,0-3,5 г лизина; метионина – до 1,7%, триптофана до 1,3%. В большинстве опытов добавка их (в количестве до 25% от потребности в протеине) в рационы, содержащие только протеины растительного происхождения, значительно повышает продуктивность животных: возрастает прирост мяса, молока, шерсти, у птиц – яйценосность.
Кормовые дрожжи представляют собой, своего рода, природный премикс, состоящий из комплекса незаменимых аминокислот, витаминов и наиболее ценных биоэлементов. Многочисленные практические исследования доказывают, что по зоотехнической эффективности кормовые дрожжи превосходят мясокостную муку и мало уступают рыбной муке, даже при высоком её качестве [1]. При этом ферменты кормовых дрожжей по протеазной активности пепсина в 2 раза выше, чем мясокостной муки, в 2,8 раза выше, чем рыбной муки, в 5-10 раз выше, чем подсолнечного жмыха, ячменя и гороха. Протеазная активность по трипсину ещё более выгодно отличает дрожжи от других кормов животного и растительного происхождения. В тоже время дрожжи активизируют трипсин желудочно-кишечного тракта животных. Благодаря этим биологическим особенностям дрожжи оказывают положительное влияние на рост, развитие и продуктивность животных. Дефицит кормового белка в мире оценивается примерно в 30 млн. т/год, а в России – в 2,3 млн т/год. При этом прослеживается тесная связь между пищевой промышленностью, биомедициной и кормопроизводством, так как эффективная конверсия белков корма в организме продуктивных сельскохозяйственных животных обеспечивает в итоге необходимый уровень метаболизма человека как основного потребителя конечной продукции, получаемой от данных животных [3].
Источниками сырья для получения биосинтетического кормового белка служат как растительная масса [4], так и углеводороды нефти и газа [5]. Наибольший практический интерес в настоящее время представляют растительные источники сырья, т.к., во-первых, в отличие от углеводородов нефти и газа они постоянно возобновляются путём фотосинтеза, во-вторых, менталитет граждан страны в настоящее время в большинстве случаев не допускает решение всех вопросов кормовой базы с помощью продуктов нефтехимии.
Несмотря на то, что переработка всего 2% от объема ежегодно добываемой нефти позволяет произвести до 25 млн т белка, чего достаточно для питания 2 млрд. человек в течение года, получающее развитие, так называемое экологичное, или органическое животноводство пока включает кормовые продукты, полученные с использованием микробной ферментации растительного сырья, а не продуктов нефтепереработки. Объемы производства органической сельскохозяйственной продукции в мире с каждым годом растут. Органическое сельское хозяйство стало мировым трендом, оно практикуется более чем в 160 странах Тотальная химизация сельскохозяйственного производства и другие антропогенные факторы привели к тому, что система экологического животноводства не может быть обеспечена без применения функциональных пищевых добавок в рационе животных [4].
Первые попытки организовать промышленное производство дрожжей для кормовых целей предпринимались ещё в начале XIX в. Существенный вклад в развитие науки о кормлении животных внесли русские ученые Н. П. Чирвинский, Е. А. Богданов, М. Ф. Иванов, Е. Ф. Лис- кун, И. С. Попов и другие.  И.С. Попов указывал, что сухие кормовые дрожжи служат хорошим источником белка, витаминов, ферментов (протеаз, нуклеаз и др.).
В 1877 г. в России впервые осуществили гидролиз древесных опилок с применением 1%-ного раствора серной кислоты, а продукты гидролиза (сахаристые вещества) использовали для дрожжевого брожения и получения спирта. Гидролизные производства, выпускающие кормовые дрожжи за пущены в 1943-1944 гг. на Саратовском и Хорском заводах. 1950-1980-е гг. В середине 1980-х гг. все гидролизные заводы вошли в состав Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР. Многие из них кооперировались с лесопильно-деревообрабатывающими, целлюлозно-бумажными и сельскохозяйственными предприятиями, что обеспечивало бесперебойную поставку сырья. В те годы в СССР насчитывалось около 40 гидролизных заводов, размещенных в различных регионах страны, включая Белоруссию, Казахстан, Молдавию, Грузию, Узбекистан. На территории Российской Федерации заводы действовали в центральных и северо-западных районах, в Поволжье, на Урале, в Сибири и на Дальнем Востоке. Они производили более 1 млн т кормовых дрожжей [6].
Одним из способов глубокой переработки древесного сырья являются гидролитические технологии, в результате которых образуются гидролизаты древесины, содержащие растворимые фракции гексозанов, пентозанов, лигнина, эфирных масел и минеральных примесей. Сернокислотный гидролиз как древесного сырья получил преимущество, известен гидролиз с помощью растворов соляной, уксусной и азотной кислот, так и щелочной гидролиз с применением растворов гидросульфита натрия, гидроксида натрия и гидролиз в слабокислой среде после щелочной обработки, а также предобработки с использованием ионной жидкостью, перекиси водорода Катализаторами процесса могут выступать ферменты [7, 8, 9].
Для здоровья нормальной микробиоты животного важное значение имеют также молочнокислые микроорганизмы и пропионовокислые бактерии. Современное развитие кормопроизводства базируется на внедрении ресурсосберегающих эффективных биотехнологиях белковых кормовых дрожжей на основе вторичных ресурсов производства с использованием селекционированных консорциумов молочнокислых и пропионовокислых бактерий [2, 10, 11].
Кормовые добавки могут содержать не только 45-47% протеина, но и комплекс биологически активных веществ, витаминов, аминокислот, иногда живые культуры бактерий [2]. Показано, что пропиовит, созданный на основе пропионовокислых бактерий усиливает рост и повышает продуктивность птицы, поросят, телят, на 2 - 12 %, облегчает и ускоряет адаптацию животных к различным стресс-факторам. Он эффективен для профилактики желудочно-кишечных заболеваний и при нарушениях минерального обмена. Препараты на основе ацидофильной палочки положительно влияют на яйценоскость, качество яиц и микрофлору пищеварительного тракта птицы. Лиофилизированной культурой ацидофильной палочки является препарат биобактон. Использование биобактона увеличивает сохранность поросят-гипотрофиков, на 3-11 %, скорость роста, на 5-7 %, нормализует основные показатели периферической крови, способствует снижению затрат на приобретение кормов. Применение культуры молочнокислого стрептококка повышает устойчивость поросят к кишечным болезням и др. Имеются исследования по эффективному применению других видов пробиотиков в животноводстве. Многие авторы считают перспективным обогащение кишечной микрофлоры   животных   не   одной   культурой, а   целым   рядом специально подобранных штаммов, иными словами использование комплексных пробиотиков [12].
3
Кормовая база сельхозпредприятий должна создаваться на внутренних ресурсах хозяйств, иметь необходимые резервы и одновременно включать наиболее дешевые источники питательных веществ. Только при этих условиях может быть обеспечена растущая продуктивность животных, высокое качество продукции и последовательное снижение ее себестоимости. Древесное сырье характеризуется быстрой и непрерывной возобновляемостью, что является одним из важнейших его преимуществ перед большинством других сырьевых источников. Средний естественный его прирост оценивается 1,4 м древесины на 1 га лесной площади [13].
Ещё одним высокоценным сырьём для биотехнологии получения кормового продукта для сельскохозяйственных животных является молочная сыворотка, в том числе сухая молочная сыворотка [14]. Известно, что загрязняющая способность 1 тонны сыворотки превышает аналогичный показатель для бытовых сточных вод более чем в 500 раз, что является чрезвычайно опасным для водоемов. Показатель недоиспользования молочной сыворотки колеблется в различных регионах, составляя примерно 25%, при этом недоиспользованными остаются около 250 ценных соединений, в том числе азотистые соединения, молочный жир, минеральные вещества, лактоза, витамины, ферменты, органические кислоты [17].
Наличие в молочной сыворотке легкоусвояемых многими видами микроорганизмов источников углеродного питания, а также различных ростовых факторов выдвигает ее в ряд наиболее ценных питательных сред для получения продуктов микробного синтеза. Способность к ассимиляции лактозы имеется примерно у 20% всех известных видов дрожжей [15].
При невозможности быстрой переработки молочной сыворотки, являющейся скоропортящимся продуктом, можно использовать сгущённую или сухую молочную сыворотку. В сгущённой сыворотке с высокой концентрацией сухих веществ, как правило, отсутствуют условия для развития большинства групп микроорганизмов. Кроме того, сгущенная сыворотка более транспортабельна и не требует больших емкостей для хранения. Другой продукт данного вида - сыворотка гидролизованная сгущенная. Еще менее благоприятны условия для развития микрофлоры в сухой сыворотке, которая может храниться при положительных температурах достаточно длительное время, а использование вакуумной упаковки этот срок увеличивает в 4-5 раз. Сухая молочная сыворотка представляет собой биологически полноценный продукт, который после восстановления может с успехом применяться в качестве питательной среды в процессе микробного синтеза [16].
При дополнительном обогащении среды недостающими сельскохозяйственным животным биоэлементами можно направлено повышать их содержание в функциональном кормовом продукте.
Всего известно 60 родов и около 450 видов дрожжей. Некоторые нашли промышленное применение как источник белковых и других биологически активных веществ. Основные представители вида Saccharomyces cerevisiae применяются в производстве этанола. В активной форме дрожжи Saccharomyces используются в хлебопекарной промышленности, в инактивированной форме – как источник белка, витаминов и др [17]. Хорошие результаты по усвоению углеводов и накоплению белка показали Saccharomyces сегevisiae различных рас, штаммы Rhodosporidium diobovatum, Torulopsis, Rhodosporidium diobovatum, Нansenula species, Debaryomyces hansenii, Guehomyces pullulans, Candida albicans и др. [16, 17, 18].
Активный катаболизм лактозы особенно характерен для дрожжей из рода Kluyveromyces, Debaryomyces hansenii и др. Переработка молочной сыворотки дрожжевыми культурами с целью получения кормового белка является перспективным путём решения проблемы её утилизации. Также изветно, что для максимального накопления биомассы на молочной сыворотке необходимо обогащать её, как минимум, азотом, фосфором, калием и серой, например сульфатом аммония и дигидрофосфатом калия в количестве 3,5 и 1 г/л, соответственно [19]. Дрожжи накапливают в своём составе моно и дисахариды (олигосахариды). Олигосахариды – это неотъемлемая часть дрожжевой стенки. Поэтому наличие таких сахаридов полезно для пищеварения у животных и птицы с точки зрения сорбции микотоксинов. Это означает, что олигосахариды дрожжей не следует считать отрицательным их свойством. Органические кислоты также являются стимуляторами желудочного пищеварения, способствующие росту переваримости протеина рациона животных и птицы. Эти кислоты стимулируют аппетит, и рост полезной микрофлоры в кишечнике.
Часто ценность кормовых дрожжей определяют не только уровнем протеина и аминокислот в их составе, но и концентрацией витаминов, ценным источником которых эти продукты действительно являются. Особую ценность представляют витамины группы В, накапливаемые дрожжевыми клетками в процессе своего синтеза. Поскольку витамины – есть активные участки ферментов синтеза дрожжевой клетки, накопление их концентрации происходит пропорционально росту дрожжевых клеток. Кутикула – оболочка дрожжей надёжно защищает витамины от деструкции в процессе сушки кормового продукта, она же защищает эти вещества от окисления при хранении дрожжей [20].
Однако, на развитие дрожжей и эффективность накопления белка влияет не только подбор вида, штамма, расы дрожжей, но состав субстрата. При использовании к лактозе или её гидролизату в молочной сыворотке дополнительного углеводного источника из древесных гидролизатов, содержащих гексозные сахара, интенсивность биосинтеза белка увеличивается [16].
Углеводы древесины представлены в основном полисахаридами, составляющими около 70 % вещества древесины (целлюлоза, гемицеллюлозы, крахмал, водорастворимые полисахариды), а также низкомолекулярными сахарами соков и развивающихся тканей. Целлюлоза и гемицеллюлозы растворяются в концентрированных кислотах, а лигнины – в концентрированных щелочах.
Хвойные породы отличаются от лиственного значительно меньшего содержания пентозанов, их количество в древесине лиственных пород почти в 2 раза больше, но хвойные породы содержат в своем составе большее количество лигнина, чем в лиственных. Смоляные кислоты также присутствуют главным образом в древесине хвойных пород, и они большей частью экстрагируются горячей водой [27]. До недавнего времени идеального процесса для получения микробного белка на целлюлозных субстратах не было. Общим недостатком процессов данного типа являлась напряжённая экология (предобработка субстрата, сточные воды, пылегазовые выбросы, сложность очистки получаемого микробного белка от химических реагентов) [17].
В последние годы для уменьшения химической напряженности процесса гидролиза древесных отходов нашла применение кавитационная обработка с помощью низкочастотной ультразвуковой ячейки.
Известна ультразвуковая технология получения белковых кормов, которая включает ингредиент корма измельчают и диспергируют в воде. Добавляют минеральное сырье, премиксы, микроэлементы, витамины и кальцийсодержащее сырье. Дезинтегрируют посредством циклического перекачивания полученной смеси по замкнутому контуру в режиме кавитации при температуре 30-100°С. Получают дисперсионную среду посредством механо-гидроударно-кавитационно-диссипационной переработки. Смесь пастеризуют и доводят за 20-120 циклов до гомогенного состояния с заданной крупностью частиц от 1 мкм до 3 мм. Изобретение позволяет упростить получение биологически полноценной кормовой смеси и улучшить ее усвоение для крупного рогатого скота, свиней, птицы и рыбы [21]. Основным недостатком этого способа являются механическое составление питательной смеси, в которую закладываются только готовые ингредиенты и не используется биотехнологический потенциал кормовых дрожжей.
В следующем изобретении, относящемся к получению кормового пробиотического препарата для сельскохозяйственных животных [22] предусматривается подготовка фитоносителя путем смешивания содержащего клетчатку растительного сырья, водопроводной воды, автолизата пекарских дрожжей, калия фосфорнокислого двузамещенного, магния сернокислого и мелассы в заданном соотношении компонентов. Полученный фитоноситель стерилизуют и вносят жидкую культуру Cellulomonas flavigena и выдерживают при заданных параметрах. Затем последовательно вносят жидкие культуры Bacillus subtilis и Lactococcus lactis subsp. lactis в равных количествах. Полученную смесь перемешивают, выдерживают при заданных параметрах процесса и высушивают до остаточной влажности 8-10%. При этом в качестве содержащего клетчатку растительного сырья используют измельченную солому, подсолнечный или соевый шрот, а жидкие культуры пробиотических штаммов Cellulomonas flavigena, Bacillus subtilis и Lactococcus lactis subsp. lactis  получают путем выращивания их на питательных средах, предназначенных для каждого штамма смеси в отдельности. Изобретение позволяет повысить биологическую активность препарата, повысить перевариваемость кормов [22]. Недостатками способа являются сложность получения препарата, отсутствие существенной питательной ценности, позволяющей корректировать рацион животных в случае нарушения его сбалансированности.
В других исследованиях [23] при использовании ферментно-щелочной экстракции с предварительным применением метода взрывного автогидролиза делигнифицированных образцов целлюлозы, увеличение реакционной способности субстратов после озвучивания составило 52 и 65%, однако изыскания проводились для получения гидролизных сахаров с целью получения биотоплива.
В способе, включающим квитационную обработку для получения кормовой смеси, содержащий приготовление взвеси в роторном измельчителе-диспергаторе из шрота или жмыха и барды при температуре 70-90°C, из которой сепарируют фугат, обогащенный отходами зернового производства в смесителе, отличается тем, что в барду дополнительно вводят измельченные бобовые и совместно с зерновыми диспергируют в роторном измельчителе-диспергаторе, оснащенном кавитатором, в течение 7-10 минут, а после центрифугирования полученную взвесь выдерживают в течение суток в присутствии целлюлазы для расщепления клетчатки до глюкозы или дисахарида в емкости, снабженной барботером, после чего в смеситель вводят измельченные отруби и/или дробину пивную и затем из приготовленной взвеси удаляют избыточную влагу, причем сушку проводят до содержания влаги в готовом продукте не выше 9 мас. % [24]. Способ не предусматривает использование молочной сыворотки и микробной биотехнологии.
Уровень области техники и технологии с использованием молочной сыворотки не характеризует отраслевая технологическая инструкция РД-01.000.23-К.03-89 «Корма и смеси на основе послеспиртовой барды с улучшающими добавками», как в выше представленном [24] способе, по технической сущности и числу совпадающих признаков выбрана в качестве наиболее близкого аналога выбран  Способ производства функционального кормового продукта для сельскохозяйственных животных [25].
7
В прототипе  [25] предусматривают  способ переработки молочной сыворотки, включающий дополнительное введение в нее питательных веществ, пастеризацию сыворотки, ферментацию молочной сыворотки культурами бактерий, одна из которых относится к пропионовым бактериям, при этом в процессе культивирования проводят аэрацию молочной сыворотки, молочную сыворотку обрабатывают культурами Lactobacillus casei и Propionibacterium freudenreichii, консорциумом мезофильных кормовых дрожжей, соотношение культур дрожжей к Lactobacillus casei поддерживают от 1,0 до 5,0, культивирование проводят до концентрации клеток не менее 10 КОЕ в 1 мл Lactobacillus casei, Propionibacterium freudenreichii и дрожжей, затем отделяют белковый концентрат, представляющий собой функциональный кормовой продукт для сельскохозяйственных животных, отстаиванием с последующей контаминацией пермеата, фильтрованием или сепарированием на сепараторе-творогоотделителе.
Готовый ФКП получают в виде концентрата с массовой долей 47-50% или сухого порошка с массовой долей сухих веществ 9-10%, полученного сублимационной сушкой, при которой сохраняются живые клетки пробиотических культур рас дрожжей и штаммов Propionibacterium и Lactobacillus.
Существенными недостатками прототипа являются: многоступенчатость, необходимость использования биополимеров гидроколлоидов хитозана и пектина,  сложность технологического процесса, параметрические показатели которого (рН, концентрацию культур) в условиях естественного колебания химического состава исходного сырья сложно осуществить, а именно то, что молочную сыворотку последовательно обрабатывают культурами Lactobacillus casei и Propionibacterium freudenreichii, причем обработку второй культурой проводят при снижении величины рН молочной сыворотки от первоначального значения по меньшей мере на 0,8 единиц, в момент засева второй культурой соотношение культур поддерживают от 0,4 до 5,0, а суммарную концентрацию культур выбирают от 1 до 5 г/л среды; существенным недостатком также является то, что недостаточное для развития дрожжей содержание углеводов в молочной  сыворотке (примерно 5% лактозы, в том числе частично гидролизованной на глюкозу и галактозу) сдерживает развитие накопление белковой массы.
На развитие дрожжей и ход брожения прежде всего влияют следующие факторы: концентрация сахара, температура, кислотность среды и наличие микроэлементов, доступ кислорода. Культурные дрожжи относятся к ацидофилам, то есть развиваются в кислой среде, оптимальное значение рН для дрожжей 4,5–5,0. В аэробных условиях они активно растут и размножаются, а в анаэробных осуществляют спиртовое брожение, для накопления белка необходимо избегать анаэробных условий. Чтобы избежать замедления роста повысить выход продукта, в питательной среде обеспечивают концентрацию сахаров 10-15% [26].
Целью изобретения является получение за один технологический цикл экологичного эффективного мультифункционального кормового продукта для сельскохозяйственных животных с использованием ультразвукового экстракта сахаристых веществ древесных опилок для выращивания белковых кормовых дрожжей на питательной среде с молочной сывороткой.
Для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата в молочную сыворотку, или восстановленную сгущённую сыворотку или восстановленную сухую молочную сыворотку дополнительно вводят питательные вещества, включающие углеводы, представляющие собой сахаристые вещества, полученные низкочастотной ультразвуковой кавитацией из древесных опилок, осуществляют ферментацию молочной сыворотки культурами пробиотических бактерий, при этом в процессе культивирования проводят аэрацию молочной сыворотки,  затем отделяют белковый концентрат, представляющий собой функциональный кормовой продукт для сельскохозяйственных животных, отстаиванием с последующей контаминацией пермеата, фильтрованием, сепарированием, или не отделяют белковый концентрат от части несброженных углеводов, в составе которых присутствует микроцеллюлоза и получают функциональный кормовой продукт для сельскохозяйственных животных.
При этом технология получения сахаристых веществ из опилок совмещена с технологией ферментации молочной сыворотки и заключается в заявляемом способе производства функционального кормового продукта для сельскохозяйственных животных в следующем:
+
7
В молочную сыворотку с содержанием (5,50,5) % сухих веществ (или восстановленную из сухой или концентрированной молочной сыворотки до этого содержания сухих веществ) добавляют биоэлементы азот, калий, фосфор и серу, при необходимости обогащения готового продукта дополнительно другими биоэлементами, выбранными из меди, железа, марганца, магния, цинка, кобальта, йода, селена и подготовленное древесно-стружечное сырьё, измельчённое до размера не более 3 мм, в соотношении молочная сыворотка с компонентами: древесные опилки - 10:1 по массе. Далее проводят пастеризацию сыворотки с компонентами, включая древесные опилки при (75±1)°С в течение 2 мин и её охлаждение до (33±1)°С, внесение культур  пробиотических штаммов молочнокислых культур, по меньшей мере рода Lactobacillus и Propionibacterium и, культивирование при  (33±1)°С до достижения рН 4,0-4,6, в процессе этой ферментации одновременно происходит набухание опилок, при истечении которого проводят низкочастотную квитанционную обработку смеси (далее смесь после кавитационной обработки - субстрат), последующее внесение в субстрат культур кормовых дрожжей и ферментацию при  (33±1)°С, культивирование при указанной температуре в течение 24-48 часов с аэрацией, до достижения биомассы культур не менее 10 КОЕ/мл;  охлаждение белково-дрожжевой биомассы до 10°C, отстаивание с последующей контаминацией пермеата, фильтрация или сепарирование на сепараторе-творогоотделителе до массовой доли сухих веществ 47-50%, или без отделения пермеата, с последующей сушкой ферментированного субстрата на лиофильной, распылительной или вальцовой сушилке для получения сухого продукта.
Готовый ФКП получают в виде концентрата с массовой долей 47-50% или сухого порошка с массовой долей сухих веществ 8-10%, полученного сублимационной сушкой, при которой сохраняются живые клетки пробиотических культур рас дрожжей и штаммов Propionibacterium и Lactobacillus, или сушкой, выбранной из распылительной и вальцовой, при которых не сохраняются живые клетки пробиотиков, но при использовании пробиотических культур со свойствами метабиотика – сохраняются метаболиты, оказывающие благоприятное воздействие на здоровье животных, в частности, обладающие антибактериальным свойством, что является безопасной альтернативой кормовых антибиотиков в экологическом животноводстве [27].
При непрерывном промышленном культивировании или периодическом процессе с подпиткой субстратом, обеспечивающую стационарную фазу роста пробиотических культур.
Сравнение предлагаемого изобретения с другими известными из уровня техники техническими решениями позволило установить следующие отличия, относящиеся к техническому решению:
- предлагаемый способ позволяет сократить древесные отходы и недоиспользованную молочную сыворотку, из которых получают за один технологический цикл мультифункциональный кормовой продукт для сельскохозяйственных животных: ультразвуковой экстракт сахаристых веществ для выращивания белковых кормовых дрожжей, белковый кормовой продукт, биоэлементы и комплекс других биологически активных веществ, переходящих из исходного сырья и образующихся в процессе ферментации при культивировании пробиотических клеток in vitro, живые пробиотические культуры и/или продукты метаболизма этих культур;
- продукты гидролиза древесины чрезвычайно разнообразны, среди них выделено более 200 индивидуальных соединений, образующихся в результате деструкции отдельных компонентов древесины,  при гидролизе некоторых видов древесины образуются вещества, которые могут тормозить развитие дрожжей и других пробиотических культур, поэтому нами дополнительно были проведены исследования по содержанию сахаристых веществ в ультразвуковых экстрактах различных видов древесины и оценка  токсичности примесей в них биотехнологическим методом; древесина берёзы и ели показали наилучшие показатели не токсичности для инфузорий и микроорганизмов;
- в составе ели, в отличие от берёзы до 30,1 экстрактивных веществ [27], которые могут давать привкус горечи, однако большинство из них относится к экстрагируемым горячей водой, поэтому подготовка древесины ели требует не только её измельчения, но и экстракцию горьких соединений, которые могут быть токсичны для некоторых пробиотических культур;
- молочная сыворотка обладает высокой пищевой ценностью и содержит помимо сывороточных белков, молочный жир и ряд биоэлементов, в среднем, мг: кальция – 103, магния – 10, фосфора – 78, калия – 143, натрия – 48, цинка – 0,4, селена – 1,8, древесина также, помимо высокой углеводной составляющей содержит, с некоторым колебанием, до 1% биоэлементов, что при может обеспечить по биоэлементам полноценность питательной среды для культур, применяемых при её ферментации, за исключением азота, калия фосфора,  иногда серы, дозы внесения которых понижаются по сравнению со средой, не содержащей молочную сыворотку, или кавитационный гидролизат древесных опилок;
- использование в качестве сырья одновременно: молочной сыворотки, и древесных опилок, суммарно содержащих в среднем необходимый минимум питательных веществ для развития используемых пробиотических культур, позволяет сократить количество добавляемых биоэлементов качественно и количественно, использовать в минимальном варианте для обогащения субстрата только источники азота, калия и фосфора; в максимальном варианте, дополнительно те биоэлементы, недостаток которых установлен у животных, для которых предназначен функциональный кормовой продукт;
- из патентной и научно-технической литературы не известен способ производства без химических реагентов экстракта сахаристых фракций древесных отходов, получаемый из опилок ели и березы с помощью низкочастотного ультразвукового реактора, который обеспечивает глубокое проникновение растворителя в структуру древесных частиц и за счет кавитационных эффектов вызывает увеличение скорости гидролиза компонентов древесины, полученные при этом сахаристые фракции из древесных отходов используется для приготовления субстрата на основе молочной сыворотки, или восстановленного варианта молочной сыворотки для последующей ферментации субстрата культурами кормовых дрожжей;
- в странах Евросоюза фермерским хозяйствам, которые занимаются животноводством, запретили использовать антибиотики в профилактических целях, что следует из обновленного Регламента ЕС «О ветеринарных лекарственных средствах», который вступил в силу 28 января 2022 года, однако пробиотические культуры с антибктериальными и метабиотическим свойствами, длительно применяемые в пищевых биотехнологиях, безопасны и могут использоваться при производстве продукция органического животноводства [28].  Пробиотики и пребиотики используются в современном животноводстве и птицеводстве для стабилизации кишечной микрофлоры у моногастричных животных и рубцовой среды у жвачных животных. Особенно после запрета использования антибиотиков в качестве стимуляторов роста в Европейском Союзе применение про- и пребиотиков в кормлении животных становится всё более важным. Препараты, в состав которых входит микрокристаллическая целлюлоза, гемицеллюлоза, лигнин, по совокупности относящиеся к нерастворимой клетчатке, относят к группе растительных лекарственных средств с пребиотическим свойствами.
+
2
7
Способ переработки молочной сыворотки осуществляющий предложенное техническое решение составляет дополнительное введение в молочную сыворотку или восстановленную молочную сыворотку питательных веществ и внесение подготовленных древесных опилок в соотношении опилки:сыворотка - 1:10, перемешивание, пастеризацию, а после пастеризации сыворотки с внесёнными опилками и питательными веществами её охлаждают до температуры (331) °C, вносят культуры  Lactobacillus и Propionibacterium, проводят ферментацию до снижения рН 4,0-4,6, затем проводят её ультразвуковую кавитацию при установке выходной мощности генератора, соответствующей интенсивности ультразвука, равной 2.4 Вт/см,  далее вносят культуры кормовых дрожжей и продолжают культивирование с аэрацией,     культивирование проводят до концентрации клеток не менее 10 КОЕ в 1 мл Lactobacillus, Propionibacterium и дрожжей, готовый белковый продукт получают в виде концентрата или сухого порошка. При использовании способа сушки, не обеспечивающего выживания эффективного количества живых пробиотических культур, в частности распылительной, или вальцовой сушке, для получения продукта, обладающего метабиотическими свойствами используют не менее одного штамма с известными метабиотическими признаками [29, 30, 31].
Для достижения указанного технического результата осуществляется последовательно:
- приемка молочной сыворотки с массовой долей сухих веществ 5,0-5,5% (творожной, подсырной, казеиновой) в соответствии с ГОСТ Р 53492-2009, или восстановление сгущёной/сухой сыворотки (ГОСТ 33958-2016 Сыворотка молочная сухая. Технические условия) до аналогичной массы сухих веществ, которая направляется в ферментеры с функциями стерилизации, охлаждения и аэрации;
- добавление в ферментёр биоэлементов, подготовленных измельчённых опилок ели или березы, перемешивание и пастеризация молочной сыворотки при (75±1)°С в течение 2 мин;
+
- охлаждение до (331)°С, добавление пробиотических культур, включающих по меньшей мере Lactobacillus, Propionibacterium и культивирование их до рН 4,0-4,6;
2
- далее подвергают смесь опилок с сывороткой и пробиотическим культурами ультразвуковой кавитации при установке выходной мощности генератора, соответствующей интенсивности УЗ, равной 2.4 Вт/см, охлаждение до (33±1)°C;
- добавление культуры кормовых дрожжей и проводят ферментацию при (33±1)°C, при этом в процессе культивирования культур проводят аэрацию;
7
- культивирование при указанной температуре в течение 36-48 часов с аэрацией, до достижения биомассы культур не менее 10 КОЕ/мл;
- охлаждение биомассы до 10°C;
- возможно как отстаивание с контаминацией пермеата верхней части, фильтрацией или сепарированием на сепараторе-творогоотделителе до массовой доли сухих веществ 47-50%, так и использование полученной биомассы без разделения для последующей сушки.
Готовый ФКП получают в виде концентрата с массовой долей 47-50% или сухого порошка с массовой долей сухих веществ 9-10%, полученного сублимационной сушкой, при которой сохраняются живые клетки пробиотических культур, вальцовой или распылительной сушкой, в этом случае используют культуры с метабиотическим свойствами.
Пробиотические культуры, которые получают путем выращивания их на питательных средах, предназначенных для каждого штамма смеси в отдельности, или активизированные, бактериальные концентраты, содержащие эти культуры, в соответствии с рекомендациями производителя.
При выборе пробиотических культур рас дрожжей и штаммов Propionibacterium и Lactobacillus руководствуются данными исследований:
- их пробиотического потенциала на различных уровнях:  специфического антагонизма по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре;
неспецифического антагонизма по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре;  клеточного и гуморального иммунитета, а также биосовместимости в условиях in vitro пробиотических микроорганизмов с индигенными штаммами нормобиоты конкретных животных, для которых продукт предназначен и др. [26];
- улучшения контролируемых показателей нормализации обмена веществ, кислотно-щелочного равновесия, и др. показателей здоровья и развития животных [27];
- обеспечение низкой концентрации в продукте пуриновых и пиримидиновых остатков нуклеиновых кислот;
-  количество скармливаемого продукта устанавливается таким образом, чтобы его введение в рацион служило профилактической мерой по обеспечению здоровья животных;
- метабиотических свойств используемых штаммов, что позволяет в функциональных кормовых продуктах одновременно увеличивать срок хранения продукта, и обеспечивать пробиотические свойства за счёт метаболитов, т.к. бактерицидная активность таких штаммов до  40 % выше  у лизатов, чем у живых культур [28,29,30];
- необходимого и безопасного для данного вида животных содержания в готовом продукте полисахаридов (целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина), а так же полифенольного вещества – лигнина, определяемых современной   детергентной аналитической системой [32, 33, 34].
Производство кормового продукта по данному способу осуществляется в условиях как мелких, так и крупных цехов по переработке сыворотки биотехнологических производств, а также возможно непосредственно в животноводческих хозяйствах.
Пример 1. Концентрированный мультифункциональный кормовой продукт, производимый непосредственно в мелких и средних животноводческих хозяйствах при установленном недостатке у животных биоэлемента марганец.
2
Ферментёры периодического действия заполняют на 1/3-1/2 часть молочной сывороткой, добавляют (по массе) 0,5% карбамида, 0,1% гидроортофосфата калия, 0,04% диоксида марганца, 10% измельченных до состояния муки опилок, например, после ленточного шлифовального станка; производится перемешивание, пастеризация при (75±1)°С в течение 2 мин;  охлаждение до (33+1)°С; добавление пробиотических культур, ферментирование до рН 4,0-4,6, озвучивание смеси опилок с сывороткой и пробиотическим культурами ультразвуком при установке выходной мощности генератора, соответствующей интенсивности УЗ, равной 2.4 Вт/см;  охлаждение до (30±1)°C добавление культуры кормовых дрожжей и проводят ферментацию при (30±1)°C, при этом в процессе культивирования культур проводят аэрацию;
7
культивирование при указанной температуре в течение 36-48 часов с аэрацией, до достижения биомассы культур не менее 10 КОЕ/мл, отстаивание с последующей контаминацией пермеата, фильтрация и охлаждение биомассы до 10°C.
В полученный белковый концентрат может быть добавлен консервант (в частности, цитрат натрия) с последующей расфасовкой в герметичную тару, либо концентрат подвергается сушке любым способом, обеспечивающим заявляемую функциональность продукта.
2
В приведённом примере в качестве пробиотических культур использовали Lactobacillus acidophilus 22w, вязкую в составе активированного бактериального препарата БК-Углич-АВ и бактериальный концентрат пропионовокислых бактерии, БК-Углич-ПРО и препарат активных сухих дрожжей верхового брожения Saccharomyces cerevisiae. Перед использованием концентраты растворяли в стерильной воде, нагретой до 30– 40°С, из расчета 1 пакет (1 ЕА) на 50-100 мл жидкости и выдерживали в течение 25-30 мин для набухания.
Состав продукта белковый концентрат по примеру 1:
- ЖБУ:  белок по Бернштейну (в пересчете на абсолютно сухое вещество), не менее 32%;  сырая клетчатка - 1,3-2,7%;   сырой жир - 2,7-3,3 %;
- пищевые волокна - 2,9 г/кг.
Мультифункциональность кормового продукта, полученного по способу 1 включает в себя по меньшей мере: высокое содержание протеина, пребиотик в виде нерастворимой клетчатки (целлюлозу, гемицеллюлозу, лигнин) и олигосахаридов, марганец, живые пробиотические культуры.
2
Штамм Lactobacillus acidophilus 22w известен высоким уровнем антибактериальной активности против Staphylococcus aureus, Micrococcus flavus, Proteus vulgari, Aspergillus niger и др,, подавляя рост патогенных бактерий и микромицетов [30].
Марганец необходим для нормального воспроизводства самцов, так и самок и является кофактором для ряда ферментов, регулирующих обмен веществ углеводов.
Пример 2. Сухой мультифункциональный кормовой продукт для восполнения дефицита белка, цинка, кобальта, иода и селена, при отсутствии гипоэлементоза железа производимый в специализированной цехе биотехнологического производства.
1
2
3
4
6
с
12
Кормовые дрожжи стабильного состава и качества получаются тогда, когда технологический процесс не прерывается, а объём производства превышает 40-50 т готового продукта в смену [20].  На крупных заводах с установленным надлежащим контролем за технологическим процессом и качеством готового продукта, с минимальными колебаниями эффективности пробиотиков, дрожжей от партии к партии, возможно соблюдение стандарта по обеспечению в готовом  мультифункциональном кормовом продукте содержания ЖБУ, аминокислот, ряда витаминов (тиамина В, рибофлавина В, пантотеновой кислоты В, холина В, пиридоксина В, никотиновой кислоты, биотина Н, фолиевой кислоты В,  цианкобаламина В, токоферола Е), биоэлементов (кальция, фосфора, натрия, калия, магния, хлора, железа, цинка, меди, марганца, кобальта, йода, селена) и др.
Процесс производства начинают с подготовки сырья.
2
Измельчённые опилки ели заливают горячей водой с температурой (95±1)°С в соотношении опилки: вода 1:10,  выдерживают 2-3 часа для набухания при температуре не ниже 40 °C, затем подвергают смесь опилок с водой ультразвуковой кавитации при установке выходной мощности генератора, соответствующей интенсивности ультразвука, равной 2.4 Вт/см  выдерживают подвергнутую кавитации смесь опилок с водой 2-3 часа для завершения экстракции, отфильтровывают и считают отмытые от экстрактивных веществ опилки подготовленными для  последующей стадии производства. Чем мельче измельчены опилки, тем меньше выдержка нужна для их набухания и экстракции смолистых веществ из них.
Ферментёры непрерывного действия заполняют на 1/2-2/3 части сывороткой сгущённой подсырной или сывороткой молочной сухой восстановленной до 5,0-5,5% сухих веществ, добавляют минеральные компоненты, которые могут корректироваться в качественном и количественном отношении в зависимости от установленной потребности животных, для которых продукт предназначен, в частности (г/л), табл 1:
Таблица 1.
<b>Минеральный компонент</b>
<b>Содержание биоэлемента, %</b>
<b>Добавление</b><b>в сыворотку</b>
Сульфат аммония
21% азота; 24% серы
3,2 г/л
Гидрофосфат калия
17% фосфора; 44% калия
2,0 г/л
Сульфат цинка
40% цинка; 19% серы
786 мг/л
Сульфат меди (II) пятиводный
25% меди; 12% серы
177,60 мг/л
Иодид калия
23% йода, 21% калия
16,52 мг/л
Сульфат кобальта (III)восемнадцативодный
16% кобальта; 12% серы
24,37 мг/л
Селенит натрия
45% селена
3,33 мг/л
Дополнительное введение в молочную сыворотку питательных веществ включает внесение подготовленных древесных опилок в соотношении опилки:сыворотка - 1:10, перемешивание.
Далее сыворотку пастеризуют при (75+1)°C в течение 2 мин; охлаждается до (33+1)°C, вносят культуры  пробиотических молочнокислых и пропионовокислых бактерий:
1) БИФИЛАКТ-ПЛЮС, содержащий Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis subsp. Diacetilactis, Streptococcus thermophilus (вязкий), Bifidobacterium bifidum и/или B. longum, и/или B. Adolescentis;
2)  БК-Углич-ПРО, содержащий Propionibacterium freudenreichii
2
и проводят ферментацию до снижения рН 4,0-4,6, затем ультразвуковую кавитацию при установке выходной мощности генератора, соответствующей интенсивности ультразвука, равной 2.4 Вт/см, охлаждение до (30+1)°C далее в субстрат вносят культуры кормовых дрожжей.
Дальнейшее культивирование проводят в течение 36-48 ч при интенсивной аэрации, поддерживая уровень растворенного кислорода не менее 10% от насыщения. При непрерывном промышленном культивировании, обеспечивают стационарную фазу роста пробиотических культур добавлением субстрата. Затем биомассу охлаждают, подвергают лиофильной сушке.
Мультифункциональность кормового продукта, полученного по способу 2 включает в себя по меньшей мере: высокое содержание протеина, живые пробиотические культуры и гарантированное обеспечение биоэлементами в функциональной дозе не менее 15% от установленной средней суточной нормы (расчёт произведён при скармливании 100 г сухого продукта  с массовой долей сухих веществ 90%  для потребности в питательных веществах для молочных коров с удоем до 8000 кг молока (содержан. жира в молоке 3,8-4,0%, белка 3,2%, жив. масса 600 кг, 5 месяц лактации)  [35], таб. 2.
Таблица 2. Биоэлементный состав обогащенного функционального продукта для КРС
Микронутриент
Норма
Содержание в 100 г лиофилизированногокомового продукта
Среднее обеспечениеот суточной нормы
Калий
24%
Фосфор
16%
Сера
24%
Цинк
1429 мг
314,4 мг
22%
Медь
222 мг
44,4 мг
20%
Йод
20 мг
3,8 мг
19%
Кобальт
17,8 мг
3,9 мг
21%
Селен
6,3 мг
1,5 мг
24%
Источники информации:
1. Калюнянц К.А.,  Ездаков Н.В., Пивняк И.Г. Применение продуктов микробиологического синтеза в животноводстве / К.А.Калунянц, М.: Колосс. 1980.  – 228 с.
2. Волкова Г.С., Римарева Л.В., Арифуллина Л.Р. и др. Биоконверсия вторичного сырья спиртового производства в белковые кормовые добавки / Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов. М.:  Государственное научное учреждение ВНИИ пищевой биотехнологии РАСХН. 2016. С. 275-282.
3. Гришин Д.В., Подобед О.В., Гладилина Ю.А. и др. Биоактивные белки и пептиды: современное состояние и новые тенденции практического применения в пищевой промышленности и кормопроизводстве // Вопросы питания. 2017. Т. 86. № 3
4. Рыбная мука должна соответствовать госту российский аграрный портал  https://agroportal-ziz.ru/articles/rybnaya-muka-dolzhna-sootvetstvovat-gostu
5. Донник И.М., Воронин Б.А. Производство продукции органического животноводства в Российской Федерации  // АВУ. 2016. №5 (147). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/proizvodstvo-produktsii-organicheskogo-zhivotnovodstva-v-rossiyskoy-federatsii-normativno-pravovoe-
6. Несмеянов А., Беликов В. Пища будущего. https://sheba.spb.ru. М.: Издательство: педагогика. 1985.
7. Суходолов А. П., Хаматаев В. А. Развитие Отечественной гидролизной промышленности // Известия БГУ. 2009. №3. URL: https://cyberleninka.ru /article/n/razvitie-otechestvennoy-gidroliznoy-promyshlennosti.
8. Голышкин, А. В. Сравнение различных видов химических предобработок соломы пшеницы и опилок бука // Молодой ученый. — 2016. — № 27 (131). — С. 14-18. — URL: https://moluch.ru/archive/131/36607/
9. Привалова Елена Андреевна, Фомина Елена Сергеевна, Евстафьев Сергей Николаевич Влияние компонентного состава соломы на скорость ферментативного гидролиза целлюлозы // Вестник ИрГТУ. 2010. №7 (47). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vliyanie-komponentnogo-sostava-solomy-na-skorost-fermentativnogo-gidroliza-tsellyulozy (дата обращения: 27.01.2022).
10. Зелтиня М, Лейте М, Апине А., Швинка Ю.  и др. Получение кормового белкового препарата из соломы и других малоценных отходов сельского и лесного хозяйства // Biotechnology & BioE. №5, 1991. С. 4-5.
11. Ефимова, Л.В.  Эффективные микроорганизмы в кормлении крупного рогатого скота и свиней /Л.В. Ефимова, Т.А. Удалова; Красноярский НИИЖ Россельхозакадемии. – Красноярск. 2011.
12. Биотехнология кормов: учебное пособие для обучающихся направлений подготовки 35.03.03 Агрохимия и агропочвоведение, 35.03.07 Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции, 35.03.04 Агрономия. ФГБОУ ВПО Приморская ГСХА / ФГБОУ ВПО ПГСХА; сост. Е.П. Иванова, О.М. Скалозуб. - Уссурийск, 2015. – 92с.
13. Тарасов С. М., Кононов Г.Н. Комплексная химическая переработка  древесины. Технология лесохимических и гидролизных производств. Учебно-методическое пособие для студентов направления подготовки 18.03.01, 18.04.01. – М.: ФГБОУ ВО МГУЛ, 2016. –  122 с.
14. Соколенко Г.Г., Пономарева И.Н., Елизарова Т.И., Есаулова Л.А. Биотехнология дрожжесывороточного продукта // Вестник ОрелГАУ. 2016. №5. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/biotehnologiya-drozhzhesyvorotochnogo-produkta
15. Зипаев Д. В., Зимичев А. В. Молочная сыворотка - ценное сырье для вторичной переработки // Известия вузов. Пищевая технология. 2007. №2. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/molochnaya-syvorotka-tsennoe-syrie-dlya-vtorichnoy-pererabotki
16. Ле Ань Туана «Применение психротолерантных дрожжей для биоконверсии вторичных ресурсов переработки растительного сырья. Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук. — Казань, КНИТУ, 2016. - 167 с.
17.  Ручай, Н. С. Экологическая биотехнология : учебное пособие для студентов специальности "Биоэкология" вузов / Н. С. Ручай, Р. М. Маркевич. - Минск : БГТУ, 2006.  311 с.
18. Туршатов М. В., Кононенко В. В., Леденев В.П., Кривченко В. А., и др. Технологические основы получения белковых кормопродуктов при переработке крахмалсодержащего сырья в биотехнологическую и химическую продукцию // Хранение и переработка сельхозсырья. 2018. №2.
19. Ильющенко А.Ф., Якимович Н.И., Якимович И.В. и др. Получение кормового белка путём переработки молочной сыворотки дрожжевыми культурами. Современные проблемы освоения новой техники, технологий, организации технического сервиса. С. 296-272. https://rep.bsatu.by/handle/doc/4748
20. Подобед Л.И Кормовые дрожжи – сравнительные характеристики питательной и биологической ценности. 2007. http://podobed.org/kormovye_drozhzhi_-_sravnitelnye_harakteristiki_pitatelnoy_i_biologicheskoy_tsennosti.html
21. Сеничев, В. П. (2015) Эффективность ультразвукового воздействия в процессе экстрагирования редуцирующих сахаров в измельченной древесине / В. П. Сеничев, Л. М. Воропай, Ю. Р. Осипов // AKTUÁLNÍ VYMOŽENOSTI VĚDY- 2015: мateriály 11 mezinárodní vědecko-praktická konference, Praha-2015. – Praha, 2015.
22. Пат. 2447674 РФ (2010), МПК51 С23К 1/00. Способ получения биологически полной кормовой смеси / Сидоров А.В.,К овалев А.В., Мошкутело И.И.; заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «Ковикорм» № 2010135931/10; заяв. 31.08.2010; опубл. 20.04.2012. – Б.и. – 2012 № 11.
23. Влияние ультразвуковой кавитации на реакционную способность лигноцеллюлозных субстратов при биоконверсии растительной биомассы
Донцов  А. Г., Карманов А. П.,  Кочева Л.  С., и др. Бутлеровские сообщения. 2014. Т.39. №9. С. 52-57.
24. Способ приготовления белковых кормовых смесей № охранного документа РИД 0002615814 11.04.2017. Ковалёв А.В., Сидоров А.В. ООО "Кавикорм Инжиниринг"
25. Способ производства функционального кормового продукта для сельскохозяйственных животных Патент на изобретение RU 2652155 C1, 25.04.2018.
26. Сучкова Е.П., Уваров Р.А., Основы биотехнологии– СПб: Университет ИТМО, 2021. – 83 с.
27. Тарасов С. М., Кононов Г.Н. Комплексная химическая переработка             древесины.   Технология лесохимических и гидролизных производств.   – М.: ФГБОУ ВО МГУЛ, 2016. 122 с.
28. ГОСТ 33980-2016 Межгосударственный стандарт. Продукция органического производства.
29. Polyanskaya I, Stoyanova L, Popova V. Сoncept of metabiotics in fermented dairy products  // JHED December Volume, December 2021.
30. Polyanskaya I, Shigina Е, Popova V. Metabiotics in fermented milk product // JHED December Volume, December 2021.
31. Стоянова Л.Г., Дбар С.Д., Полянская И.С. метабиотические свойства штаммов lactobacillus acidophilus, входящих в комплексные закваски для производства пробиотических молочных продуктов //  Биотехнология. 2022.
32. МУ 13-7-2/2156. Методические указания по ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов.
33. ГОСТ 31674-2012. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности
34. Основы питания и кормления сельскохозяйственных животных: учебно-практическое пособие/В.Г. Рядчиков – Краснодар: КубГАУ, 2012. - 328 с.
35. Головин А.В. Влияние углеводно-протеинового отношения в рационах на продуктивность и обмен веществ высокопродуктивных коров. Вологда: СЗНИИМЛПХ, 2020.