СПОСОБЫ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ ИССЛЕДУЕМОЙ ОБЛАСТИ ГЕНОМА

1. Способ определения последовательности исследуемой области генома, содержащей последовательность нуклеотида-мишени, который включает фрагментацию перекрестно-сшитой ДНК, лигирование фрагментированной перекрестно-сшитой ДНК, реверсию перекрестного сшивания, определение по меньшей мере части последовательностей лигированных фрагментов ДНК, включающих последовательность нуклеотида-мишени, и использование определенных последовательностей для создания последовательности исследуемой области генома.
2. Способ определения последовательности исследуемой области генома, содержащей последовательность нуклеотида-мишени, который включает стадии:
a) получение образца перекрестно-сшитой ДНК;
b) фрагментацию перекрестно-сшитой ДНК;
c) лигирование фрагментированной перекрестно-сшитой ДНК;
d) реверсию перекрестного сшивания;
e) необязательно фрагментацию ДНК, полученной на стадии d), предпочтительно при помощи рестрикционного фермента;
f) необязательно лигирование фрагментированной ДНК, полученной на стадии d) или е), по меньшей мере с одним адаптером;
g) необязательно и предпочтительно амплификацию лигированных фрагментов ДНК, полученных на стадии d) или е), содержащих последовательность нуклеотида-мишени, с использованием по меньшей мере одного праймера, гибридизирующего с последовательностью нуклеотида-мишени, или амплификацию лигированных фрагментов ДНК, полученных на стадии f), с использованием по меньшей мере одного праймера, гибридизирующего с последовательностью нуклеотида-мишени, и по меньшей мере одного праймера, гибридизирующего по меньшей мере с одним адаптером;
h) определение по меньшей мере части последовательности (амплифицированных) лигированных фрагментов ДНК, полученных на стадии d), е), f) или g), содержащих последовательность нуклеотида-мишени, предпочтительно при помощи высокопроизводительного секвенирования;
i) создание совокупности смежных фрагментов исследуемой области генома из определенных последовательностей.
3. Способ определения последовательности исследуемой области генома по п.2, в котором исследуемая область генома включает одну или более последовательностей нуклеотидов-мишеней и на стадии амплификации (g) использован праймер, гибридизирующий с последовательностью нуклеотида-мишени, и один или более праймеров для одного или нескольких соответствующих дополнительных нуклеотидов-мишеней, где с помощью указанных праймеров амплифицируют лигированные фрагменты ДНК или кольцевую ДНК.
4. Способ по п.2, в котором стадия фрагментации b) включает обработку ультразвуком и последующую ферментативную репарацию концов ДНК.
5. Способ по п.2, в котором стадия фрагментации b) включает фрагментацию рестрикционным ферментом.
6. Способ по п.4, в котором стадию лигирования с) выполняют в присутствии адаптера, лигируя адапторные последовательности между фрагментами.
7. Способ по п.5, в котором на стадии b) производят обработку множества частей образцов, используя для каждой части образца рестрикционные ферменты с другими сайтами узнавания.
8. Способ по п.7, в котором на стадии фрагментации е) используют рестрикционный фермент с более длинной последовательностью сайта узнавания по сравнению с последовательностью сайта узнавания рестрикционного фермента, использованного на стадии b).
9. Способ по п.2, в котором определяют последовательности множества исследуемых областей генома.
10. Способ по п.2, в котором по меньшей мере одна из олигонуклеотидных праймеров, используемых на стадии g), содержит идентификатор.
11. Способ по п.2, в котором до или после стадии амплификации g) выполняют стадию выбора размера молекул, где предпочтительно стадию выбора размера молекул выполняют при помощи экстракционной хроматографии, гель-электрофореза или центрифугирования в градиенты плотности, и/или где предпочтительно выбирают ДНК размером 20-20000 пар оснований, предпочтительно 50-10000 пар оснований, наиболее предпочтительно 100-3000 пар оснований.
12. Способ по п.2, в котором если плоидность клетки исследуемой области генома больше 1, то на стадии i) создают совокупность смежных фрагментов для каждой плоидности.
13. Способ по п.2, в котором стадия i) создания совокупности смежных фрагментов включает стадии:
1) идентификацию фрагментов, полученных на стадии b);
2) отнесение указанных фрагментов к конкретной области генома;
3) создание совокупности смежных фрагментов для исследуемой области генома.
14. Способ по п.13, в котором стадия 2) отнесения фрагментов к конкретной области генома включает идентификацию разных лигированных продуктов, полученных на стадии f), и связывание разных лигированных продуктов с идентифицированными фрагментами.
15. Способ по п.2, в котором наличие или отсутствие метилированных нуклеотидов определяют во фрагментах ДНК, лигированных фрагментах ДНК и/или исследуемых областях генома.
16. Способ определения последовательности исследуемой области генома, содержащей последовательность нуклеотида-мишени, который включает стадии:
a) получение образца перекрестно-сшитой ДНК;
b) фрагментацию перекрестно-сшитой ДНК;
c) лигирование фрагментированной перекрестно-сшитой ДНК;
d) реверсию перекрестного сшивания;
e) необязательно фрагментацию ДНК, полученной на стадии d), предпочтительно при помощи рестрикционного фермента;
f) образование кольцевой ДНК, полученной на стадии d) или е);
g) необязательно и предпочтительно амплификацию кольцевой ДНК, содержащей последовательность нуклеотида-мишени, предпочтительно с использованием по меньшей мере одного праймера, гибридизирующегося с последовательностью нуклеотида-мишени;
h) определение по меньшей мере части последовательности (амплифицированных) лигированных фрагментов ДНК, содержащих нуклеотид-мишень, при помощи высокопроизводительного секвенирования;
i) создание совокупности смежных фрагментов исследуемой области генома из определенных последовательностей.
17. Способ идентификации наличия или отсутствия генетической мутации, который включает стадии a)-i) по п.2, выполняемые для создания совокупности смежных фрагментов для множества образцов, и дополнительные стадии:
j) выравнивание совокупностей смежных фрагментов множества образцов;
k) идентификацию наличия или отсутствия генетической мутации в исследуемой области генома из множества образцов.
18. Способ идентификации наличия или отсутствия генетической мутации, который включает стадии a)-i) по п.2 и дополнительные стадии:
j) выравнивание совокупности смежных фрагментов с эталонной последовательностью;
k) идентификацию наличия или отсутствия генетической мутации в исследуемой области генома.
19. Способ идентификации наличия или отсутствия генетической мутации, который включает стадии а)-h) по п.2 и дополнительные стадии:
i) выравнивание определенных последовательностей (амплифицированных) лигированных фрагментов ДНК с эталонной последовательностью;
j) идентификацию наличия или отсутствия генетической мутации в определенных последовательностях.
20. Способ идентификации наличия или отсутствия генетической мутации, который включает стадии a)-h) по п.2, где выполняется определение последовательностей (амплифицированых) лигированных фрагментов ДНК множества образцов, и дополнительные стадии:
i) выравнивание определенных последовательностей (амплифицированных) лигированных фрагментов ДНК множества образцов;
j) идентификацию наличия или отсутствия генетической мутации в определенных последовательностях.
21. Способ определения соотношения фрагментов, содержащих генетическую мутацию, в популяции клеток, в отношении которых подозревается, что они являются гетерологичными, который включает стадии а)-h) по п.2 и дополнительные стадии:
i) идентификацию фрагментов, полученных на стадии b);
j) идентификацию наличия или отсутствия генетической мутации в указанных фрагментах;
k) определение числа фрагментов, содержащих генетическую мутацию;
l) определение числа фрагментов, не содержащих генетическую мутацию;
m) вычисление соотношения фрагментов, содержащих генетическую мутацию.
22. Способ по п.21, в котором наличие или отсутствие генетической мутации, определяемое на стадии j), идентифицируют, выполняя выравнивание с эталонной последовательностью и/или сравнивая последовательности фрагментов множества образцов.
23. Способ по п.22, в котором генетическая мутация представляет собой SNP, делецию, инсерцию, инверсию и/или транслокацию.
24. Способ по п.23, в котором делецию и/или инсерцию идентифицируют, сравнивая число фрагментов и/или лигированных продуктов из образца, содержащего делецию и/или инсерцию, с эталонным образцом, либо на основании наличия точечных разрывов хромосомы в анализируемых фрагментах.
25. Способ определения соотношения лигированных продуктов, содержащих фрагмент с генетической мутацией, в популяции клеток, в отношении которых подозревается, что они являются гетерологичными, который включает стадии a)-h) по п.2 и дополнительные стадии:
i) идентификацию фрагментов, полученных на стадии b);
j) идентификацию наличия или отсутствия генетической мутации в указанных фрагментах;
k) идентификацию лигированных фрагментов ДНК, содержащих фрагменты с генетической мутацией или без указанной мутации;
l) определение числа лигированных фрагментов ДНК, содержащих фрагменты с генетической мутацией;
m) определение числа лигированных продуктов, содержащих фрагменты без генетической мутации;
n) вычисление соотношения лигированных продуктов, содержащих генетическую мутацию.