ОДНОРАЗОВЫЙ КАРТРИДЖ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ АМПЛИФИКАЦИИ (ВАРИАНТЫ)
DISPOSABLE CARTRIDGE FOR ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS AND THEIR SUBSEQUENT AMPLIFICATION (OPRIONS)

Изобретение относится к устройствам для лабораторного анализа в биохимии и может быть использовано для выделения из образца биоматериала нуклеиновых кислот проведения их амплификации внутри одноразового картриджа).
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Из уровня техники картриджи для биохимического анализа известен, в частности, картридж для пробоподготовки для использования с устройством для пробоподготовки (см. US10857538B2, опубл. 09.12.2020) (2). Картридж включает в себя корпус, определяющий множество отдельных сегментов-резервуаров, по меньшей мере, один из указанных сегментов содержит фиксированную секцию компонента пипетки; и подвижную головку, содержащую наконечник пипетки, при этом головка конфигурируется с возможностью перемещения между положением, в котором наконечник пипетки находится в герметичном зацеплении с фиксированной частью компонента пипетки, и положением, в котором наконечник пипетки расположен рядом с другой из упомянутых множественных сегментов. С помощью настоящего изобретения можно получить одноразовый картридж для пробоподготовки и соответствующий аналитический считыватель очень экономичным и простым способом, при этом обеспечивая высокое качество подготовки проб для анализа.
Устройство (2) имеет ряд недостатков, такие как, наличие поворотной головки, с функционалом пипетки, поскольку для корректной работы этого узла необходимо наличие дополнительной оси в аналитическом считывателе, который обеспечивает движение пипетки вверх-вниз. Кроме этого, для обеспечения герметичности зацепления поворотной головки со стыковочной частью сегментов-резервуаров, движение поворотной головки верх-вниз должно быть очень точным, поскольку отклонение от вертикальной оси приведет к нарушению герметизации соединения пипетка-резервуар, что приведет либо к недобору жидкости в пипетку при ее наполнении, либо к вытеканию набранной жидкости за пределы резервуара при опорожнении пипетки. В обоих случаях это приведет к искажению пропорций смешивающихся жидкостей и к ложному результату.
Из уровня техники также известна система молекулярной диагностики (см. US10562030B2, опубл. 18.02.2020) (3). Здесь представлены улучшенные узлы и способы управления для использования в диагностической аналитической системе, адаптированной для приема картриджа для анализа. Такие подузлы включают в себя: бесщеточный двигатель постоянного тока, механизм открывания / закрывания дверцы и механизм загрузки картриджа, узел механизма привода шприца и клапана, звуковой сигнал, устройство контроля температуры и устройство оптического обнаружения / возбуждения. Такие системы могут дополнительно включать в себя блок связи, сконфигурированный для беспроводной связи с мобильным устройством пользователя, чтобы принимать пользовательский ввод, относящийся к функциональности системы в отношении принятого в ней картриджа для анализа, и передачи результатов диагностики, относящихся к картриджу для анализа. на мобильное устройство.
Устройство-аналог (3) более эффективно, чем аналог (2), однако, в предложенном нами варианте выделение нуклеиновых кислот происходит с использованием магнитных частиц (магнитной силики), что является большим преимуществом по сравнению с выделением на мембране, используемым в данном патенте. Эффективность выделения на мембране ниже, что приводит к снижению чувствительности. Кроме того, по требованиям безопасности, использование данного картриджа вне специализированных лабораторий запрещено, т.к. после открытия крышки картридж становится негерметичным и есть риск протечки находящихся внутри реагентов.
Наиболее близким аналогом заявленного устройства, по мнению заявителя, является система для подготовки и анализа образца биологического материала, (см. US10093965B2, опубл. 2018-10-09) (4), включающая картридж, имеющий первый корпус, определяющий проточную камеру, второй корпус, определяющий центральное пространство, в котором, по меньшей мере, частично расположен первый корпус.Первый корпус может вращаться относительно второго корпуса, а второй корпус определяет множество разнесенных по окружности камер, одна из камер имеет вход для приема пробы, по меньшей мере, одна из камер, содержащая жидкий реагент, и по меньшей мере одна камер, содержащих модуль анализа, причем каждая камера второго корпуса имеет отверстие в центральное пространство. Первый корпус имеет одно или несколько отверстий в центральном пространстве, так что отверстия могут выборочно совмещаться с одним из отверстий в камерах второго корпуса за счет относительного вращения первого корпуса и вторых корпусов.
Предложенный наиболее близкий аналог наиболее близко подходит к решению проблем, решаемых заявленным изобретением, однако, по мнению заявителя проблема решается не самым эффективным способом, поскольку в данном случае намного сложнее обеспечить герметизацию соединения между корпусами: пятно контакта, которое надо герметизировать, большое. Это приводит к увеличению величины усилия прижатия, необходимого для плотного прилегания деталей, что, в свою очередь, приводит к увеличению величины крутящего момента привода, который проворачивает первый корпус.ПЦР чип в данном картридже имеет очень большой объем, что сильно увеличивает расход реагентов. Кроме того производитель не уточняет способ хранения лиофилизированных ПЦР реагентов, так как при контакте с воздухом срок их хранения сильно снижается и требуется применение дополнительных гидрофильных сорбентов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, существует необходимость устранить, по меньшей мере, часть упомянутых выше недостатков. В частности, существует потребность в устройстве, позволяющем производить выделение нуклеиновых кислот их последующую амплификацию в полностью автоматическом режиме.
Данное изобретение направлено на решение технической проблемы, связанной созданием картриджа позволяющего полностью автоматизировать процесс выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации.
Техническим результатом изобретения является создание устройства для автоматизации выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации с использованием одноразового картриджа.
Заявленный технический результат достигается с помощью одноразового картриджа для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации, содержащего основание с резервуарами; крышку с капиллярами для движения жидкости и отверстиями для движения воздуха, сверху герметично запаянную пленкой или фольгой и в сборе с резервуарами образующую герметичную емкость, в которой размещены компоненты для выделения ДНК или РНК из анализируемой пробы или лиофилизированные реагенты тест-системы для проведения амплификации, резервуары расположены на основании радиально, на одном расстоянии от геометрического центра окружности с капиллярами и отверстиями для движения воздуха, и загрузочным каналом ячейки для проведения амплификации; поворотный дозатор.
Одноразовый картридж характеризуется тем, что поворотный дозатор выполнен в виде поворотного клапана-золотника, содержащего поворотное основание с первым каналом внутри, начало которого расположено на одном радиусе с капиллярами резервуаров и ячейки, а конец - в буферной емкости золотника, которая выполнена в виде цилиндра на оси золотника, второй канал в основании золотника располагается на одном радиусе с отверстиями для воздуха, при повороте клапана-золотника каналы золотника точно совмещаются с капилляром и отверстием для воздуха в одном резервуаре, а первый канал в его основании совмещается с капилляром в резервуаре картриджа или с загрузочным каналом ячейки для проведения амплификации, создавая при этом герметичное соединение резервуар-цилиндр или ячейка-цилиндр, внутри цилиндра золотника располагается поршень, который обеспечивает при возвратно-поступательном движении внутри цилиндра избыточное или отрицательное давление, которое перемещает жидкость
В частном случае выполнения буферная емкость золотника содержит коннектор для подсоединения отдельного шприцевого насоса, а избыточное или отрицательное давление для перекачивания жидкости создается этим насосом.
В частном случае выполнения буферная емкость золотника представляет собой емкость произвольной формы внутри поворотного основания золотника, на дне этой емкости расположено отверстие, которое при повороте золотника совпадает с капилляром для жидкости резервуара или с загрузочным каналом ячейки для проведения амплификации.
В частном случае выполнения на поворотном основании золотника имеется только один канал, начало которого расположено на одном радиусе с капиллярами резервуаров и ячейки, а конец - в буферной емкости золотника, при этом каждый резервуар в основании картриджа имеет свой отдельный канал для воздуха, заглушенный фильтром для предотвращения выхода патогена за пределы картриджа.
В частном случае выполнения ячейка для проведения амплификации выполнена из прозрачного полимера и инертного к компонентам ПЦР или изотермальной амплификации имеет две впадины для креплении на основании с резервуарами с помощью защелок и микрофлюидные каналы заправки жидкостью с поворотного клапана - золотника. В центре ячейки предусмортрена полость, в которой происходит детекция ПЦР или изотермальной петлевой амплификации.
В частном случае выполнения ячейка для проведения амплификации имеет отверстия для крепления на основании с резервуарами с помощью саморезов.
В частном случае выполнения ячейка для проведения амплификации выполнена из прозрачного полимера, имеющего температуру стеклования выше 98°С.
В частном случае выполнения ячейка для проведения амплификации выполнена из материала, выбранного из группы: поликарбонат, полиметилметакрилат, полипропилен.
В частном случае выполнения на одну сторону ячейки для проведения амплификации наклеена специальная прозрачная тонкая пленка, которая выдерживает нагревание выше 98°С и инертная к биохимическим агентам.В частном случае выполнения на обе стороны ячейки для проведения амплификации наклеена специальная прозрачная тонкая пленка, которая выдерживает нагревание выше 98°С и инертная к биохимическим агентам.
В частном случае выполнения резервуары основания выполнены пирамидальной формы.
Технический результат также достигается с помощью другого варианта одноразового картриджа для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации, содержащего основание с резервуарами; крышку с капиллярами для движения жидкости и отверстием для движения воздуха, сверху герметично запаянную пленкой или фольгой, и в сборе с резервуарами образующую герметичную емкость, в которой размещены компоненты для выделения ДНК или РНК из анализируемой пробы или лиофилизированные реагенты тест-системы для проведения амплификации, резервуары расположены на основании радиально, на одном расстоянии от геометрического центра окружности с капиллярами и отверстиями для движения воздуха и с загрузочным каналом ячейки для проведения амплификации; поворотный дозатор.
Одноразовый картридж характеризуется тем, что поворотный дозатор выполнен в виде поворотного клапана-золотника, имеющего две полости: нижнюю для воздуха, в которой может перемещаться поршень и верхнюю для жидкости, которая соединяется с буферной емкостью произвольной формы, расположенной сверху, на боковой части золотника на одной линии, друг под другом, выполнены два отверстия: в верхней и нижней частях полостей для воздуха и жидкости, соответственно, и содержащего прокладку, которая служит седлом клапана с канавками, размещенную между двумя плоскими шайбами, нижняя шайба имеет два отверстия, соосные капилляру и вентиляционному отверстию в резервуаре, прокладка с канавками, зажатая между двух шайб, образует каналы: нижний для воздуха совмещен с вентиляционным отверстием в емкости и нижней полостью золотника, а верхний канал для жидкости через отверстие в прокладке соединяет верхнюю полость золотника с капилляром в резервуаре, внутри цилиндра золотника располагается поршень, который обеспечивает при возвратно-поступательном движении внутри цилиндра избыточное или отрицательное давление, которое перемещает жидкость.
В частном случае выполнения поворотный золотник имеет коннектор для подсоединения отдельного шприцевого насоса.
В частном случае выполнения ячейка для проведения амплификации выполнена из прозрачного полимера и инертного к компонентам ПЦР или изотермальной амплификации, имеет два выступа и микрофлюидные каналы по обеим сторонам для фиксации ячейки к основанию с резервуарами с отверстиями для фиксации ячейки к основанию с резервуарами, а также для заправки жидкостью образовавшихся микрофлюидных каналов с поворотного клапана - золотника.
В частном случае выполнения ячейка для проведения амплификации выполнена из прозрачного полимера, имеющего температуру стеклования выше 98°С.
В частном случае выполнения ячейка для проведения амплификации выполнена из материала, выбранного из группы: поликарбонат, полиметилметакрилат, полипропилен.
В частном случае выполнения на обе стороны ячейки для проведения амплификации наклеена специальная прозрачная тонкая пленка, которая выдерживает нагревание выше 98°С и инертная к биохимическим агентам.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых:
Фиг. 1 - модель одноразового картриджа в сборе;
Фиг. 2 - модель строения картриджа, выполненного по первому варианту выполнения с поршнем в верхнем положении;
Фиг. 3 - модель строения картриджа, выполненного по первому варианту выполнения с поршнем в нижнем положении;
Фиг. 4 - модель строения картриджа, выполненного по второму варианту;
Фиг. 5 - прокладка с канавками (общий вид);
Фиг. 6 - прокладка с канавками (разрез);
Фиг. 7 - нижняя щайба;
Фиг. 8 - верхняя щайба;
Фиг. 9 - золотник, выполненный по второму варианту;
Фиг. 10 - макет ячейки для проведения амплификации первый вариант;
Фиг. 11 - макет ячейки для проведения амплификации второй вариант.
На фиг.1-11 позиции обозначают следующее:
1- основание с резервуарами;
2- крышка;
3- капилляр;
4- цилиндр поворотного золотника-клапана первого варианта;
5- поворотное основание золотника-клапана
6- фильтр;
7- поршень;.
8- резервуар;
9- поворотный клапан-золотник второго варианта;
10- шлиц для поворота золотника;
11- канал для жидкости;
12- канал для воздуха;
13- буферная емкость;
14- прокладка из эластичного материала;
15- прокладка с канавками
16- верхняя шайба;
17- нижняя шайба;
18- отверстие в золотнике для воздуха;
19- отверстие в золотнике для жидкости;
20- ячейка для проведения амплификации;
21- загрузочный канал ячейки для проведения амплификации;
22-  верхняя полость для жидкости;
23- нижняя полость для воздуха;
24- коннектор.
Эти чертежи не охватывают и, кроме того, не ограничивают весь объем вариантов реализации данного технического решения, а представляют собой только иллюстративный материал частного случая его реализации.
ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение описывает одноразовый картридж для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации (фиг.1).
Одноразовый картридж, состоит из следующих функциональных узлов: основание с резервуарами (1), крышка (2) с капиллярами (3) поворотный дозатор (4) и ячейка для проведения амплификации (20).
Основание с резервуарами представляет собой основание с расположенными в нем отдельными резервуарами (8) (блистерами) пирамидальной формы, внутрь которых помещены компоненты полного набора реагентов для выделения ДНК или РНК из анализируемой пробы или лиофилизированные реагенты тест-системы для проведения амплификации (Фиг. 2, 3, 4).
При установке картриджа в амплификатор один из его резервуаров оказывается внутри нагреваемой ячейки прибора, и в этом резервуаре происходит термостатирование реагентов. К другому резервуару механическим приводом снизу подводятся магниты, которые удерживают магнитные частицы на стенках резервуара
Каждый резервуар имеет индивидуальную крышку с капилляром и отверстием. Крышка может быть выполнена в виде общей детали или в виде одной детали на несколько резервуаров (Фиг. 2, 3, 4.).
Каждый капилляр (3) достает до дна резервуара и служит для максимально полного забора жидкости (реагентов) из резервуара или, наоборот, для его заполнения жидкостью. Отверстие в крышке служит для выравнивания давления в резервуаре. Сверху крышка герметично запаивается фольгированной пленкой. Резервуар с крышкой в сборе представляют собой емкость, в которой хранятся компоненты для выделения ДНК или РНК из анализируемой пробы лиофилизированные реагенты тест-системы для проведения амплификации.
При этом, хранение и разбавление лиофилизированных реагентов тест-системы происходит внутри отдельной емкости, имеющей сходное устройство, как и все остальные.
Перемещение жидкостей между резервуарами, а также перемешивание жидкостей осуществляется специальной поворотным золотником-клапаном (4), расположенным в центре картриджа. Резервуары узла выделения при этом размещены на равном удалении от поворотного дозатора, который может вращаться вокруг своей оси для соединения с выбранным капилляром резервуара (блистера).
В качестве дозатора было разработано два альтернативных подхода с применением поворотного клапана (золотника).
В первом варианте, в качестве седла клапана выступает крышка капиллярами (2) и уплотнением (14). Золотник представляет собой поршень (4) с каналом, который при повороте совмещается с капилляром, образуя при этом герметичное соединение резервуар - цилиндр (11). Второе отверстие в золотнике совмещается со вторым отверстием в крышке и служит для выравнивания давления внутри резервуара (12). Для предотвращения утечки патогена, это отверстие заглушено фильтром (6) (Фиг. 2).
При движении плунжера вниз, жидкость через капилляр поступает в цилиндр золотника (Фиг. 3). Затем происходит поворот и совмещение канала золотника с другим резервуаром, который заполняется жидкостью при движении цилиндра золотника вверх.
В качестве замены плунжера и поршня внутри поворотного клапана можно использовать отдельный шприцевой насос.В этом случае упрощается конструкция поворотного клапана, но добавляется дополнительный модуль в Амплификатор (шприцевой насос), а также возникает необходимость в герметизации соединения шприцевого насоса с поворотным клапаном.
Во втором варианте выполнения клапана (Фиг 4,9), клапаном является сам золотник, а седлом - прокладка с канавками (Фиг 5,6), которые, после прижатия этой прокладки к плоским шайбам, образуют каналы. При этом нижняя шайба (Фиг. 7) имеет два ряда отверстий, соосных капилляру и вентиляционному отверстию в резервуаре. А верхняя шайба (Фиг. 8) дополнительных отверстий не имеет. Прокладка с канавками, зажатая между двух шайб, образует каналы: нижний (12) (для воздуха) совмещен с вентиляционным отверстием в емкости и нижней полостью золотника. Верхний канал (11) (для жидкости) через, отверстие в прокладке, соединяет верхнюю полость золотника с капилляром в резервуаре (см. Фиг. 4,9).
Сам поворотный золотник имеет две полости: нижняя для воздуха (23), в которой может перемещаться поршень, или коннектор (24) для подсоединения отдельного шприцевого насоса. И верхнюю полость для жидкости (22), которая соединяется с буферной емкостью (13) расположенной сверху. Сбоку на золотнике на одной линии, друг под другом, сделаны отверстия в верхней и нижней частях полостей для воздуха и жидкости, соответственно (см. Фиг. 4). Как вариант, поворотный золотник и буферная емкость могут быть выполнены в виде одной детали.
Принцип работы: при заборе жидкости из определенной емкости, поворотный золотник проворачивается на нужный угол, чтобы отверстия на золотнике совпали с соответствующими каналами в прокладке. Затем шприцевой насос или поршень нагнетает воздух в резервуар через нижний канал и передавливает жидкость через верхний канал в буферную емкость. Затем насос прекращает работу, золотник поворачивается на нужный угол и отверстия в золотнике становятся напротив соответствующих каналов другой емкости. После этого, насос или поршень начинает отбор воздуха, и жидкость поступает по каналу и через капилляр в нужный резервуар.
Ячейка для проведения амплификации представляет собой деталь из прозрачного полимера, имеющего температуру стеклования выше 98°С и инертного к компонентам ПЦР или изотермальной амплификации (биохимическим агентам): поликарбоната, полиметилметакрилата, полипропилена и т.п.(Фиг. 10).
Деталь имеет две впадины для креплении на основании с резервуарами с помощью защелок и микрофлюидные каналы заправки жидкостью с поворотного клапана - золотника.В центре ячейки предусмортрена полость, в котрой происходит детекция ПЦР или изотермальной амплификации.
В еще одном исполнении ячейка для проведения амплификации имеет отверстия для крепления на основании с резервуарами с помощью саморезов (фиг.11).
На деталь наклеена специальная прозрачная тонкая пленка, которая выдерживает нагревание выше 98°С и инертная к биохимическим агентам. Микрофлюидные каналы служат заправки жидкостью с помощью поворотного клапана (золотника)
Микрофлюидные каналы имеют три полость, в которой проходит ПЦР или петлевая изотермическая амплификация.
ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Предложенные устройства предназначены для ряда применений, включающих применение одноразового картриджа для выделения нуклеиновых кислот и их последующей амплификации в медицине и биотехнологической промышленности.