СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГРУПП ИЗОФОРМ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА HNF4α В ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНЫХ КАРЦИНОМАХ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR TYPING TISSUE-SPECIFIC TRANSCRIPTION FACTOR HNF4α ISOFORMS IN HUMAN HEPATOCELLULAR CARCINOMAS

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и касается способа выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора Hepatocyte Nuclear Factor (HNF) 4α в гепатоцеллюлярных карциномах человека.
Транскрипционный фактор HNF4α - один из центральных регуляторов дифференцировки клеток печени, почек, кишечника и поджелудочной железы [Sladek F.M., Seidel S.D. Hepatocyte nuclear factor 4a. In "Nuclear Receptors and Genetic Diseases" (Burris, T.P., and McCabe, E., Eds.), 2001, pp.309-361. Academic Press, London]. Описано существование двух промоторов гена HNF4α, P1 и Р2, определяющих транскрипцию двух групп его изоформ - HNF4αP1 и HNF4αP2, соответственно, с разными спектрами тканевой экспрессии, активационными свойствами и спектром регулируемых генов [Torres-Padilla М.Е., Sladek F.M., Weiss M.C. Developmentally regulated N-terminal variants of the nuclear receptor hepatocyte nuclear factor 4alpha mediate multiple interactions through coactivator and corepressor-histone deacetylase complexes. J Biol. Chem. 2002, 277(47): 44677-44687]. Промотор P1 активен в гепатоцитах взрослой печени, активность промотора Р2 выявляется в клетках желчных протоков, эмбриональных клетках печени и трансформированных гепатоцитах [Tanaka Т., Jiang S., Hotta H., Takano K., Iwanari H., Sumi K., Daigo K., Ohashi R., Sugai M., Ikegame С., Umezu H., Hirayama Y., Midorikawa Y., Hippo Y., Watanabe A., Uchiyama Y., Hasegawa G., Reid P.C., Aburatani H., Hamakubo Т., Sakai J., Naito M., Kodama T. Dysregulated expression of P1 and Р2 promoter-driven hepatocyte nuclear factor-4α in the pathogenesis of human cancer. J. Path. 2006, 208(5): 662-672]. Большинство исследований по сопоставлению уровней синтеза изоформ HNF4α в нормальных и опухолевых клетках, проводимых с помощью различных способов, не позволяют определять изменения соотношения изоформ.
Прототипом заявляемого способа является способ выявления HNF4α с помощью иммуногистохимического окрашивания опухолевой ткани моноклональными антителами, специфичными к двум группам изоформ HNF4αP1 и HNF4αP2, с использованием стрептавидин-биотиновой системы детекции [Tanaka Т., Jiang S., Hotta H., Takano K., Iwanari H., Sumi K., Daigo K., Ohashi R., Sugai M., Ikegame С., Umezu H., Hirayama Y., Midorikawa Y., Hippo Y., Watanabe A., Uchiyama Y., Hasegawa G., Reid P.C., Aburatani H., Hamakubo T., Sakai J., Naito M., Kodama T. Dysregulated expression of P1 and Р2 promoter-driven hepatocyte nuclear factor-4α in the pathogenesis of human cancer. J. Path., 2006, 208(5): 662-672]. Моноклональные антитела окрашивали изоформы транскрипционного фактора HNF4α в ядрах гепатоцитов. Данный способ позволил исследовать тканевую специфичность экспрессии двух групп изоформ в нормальных тканях человека, а также продемонстрировать активацию экспрессии изоформ HNF4αP2 в нескольких образцах ткани гепатоцеллюлярных карцином человека.
Недостатками прототипа являются: 1) стрептавидин-биотиновая система, использованная в данном способе, не обладает достаточным уровнем чувствительности в тканях печени, т.к. биотин содержится в больших количествах в клетках печени, что приводит к неспецифическому связыванию вторичных антител с эндогенным биотином и появлению высокого уровня фоновой окраски, делая недостоверными исследования антигенов в тканях печени, 2) способ иммуногистохимического окрашивания в прототипе является трудоемким. Эти недостатки делают невозможным сопоставить уровень синтеза групп изоформ фактора HNF4α в нормальных и опухолевых клетках гепатокарцином человека с высокой точностью.
Задачей изобретения является разработка нового специфичного способа выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора HNF4α в гепатоцеллюлярных карциномах человека с использованием высокочувствительной полимерной пероксидазной системы.
Заявляемый способ, включающий несколько этапов, осуществляется следующим образом.
1. Подготовка образцов ткани к иммуногистохимическому окрашиванию.
Для дифференциального анализа экспрессии групп изоформ HNF4αP1 и HNF4α Р2 в гепатоцеллюлярных карциномах человека используют парафиновые блоки образцов гепатоцеллюлярной карциномы человека и неопухолевой ткани печени тех же пациентов. Образцы тканей гепатоцеллюлярной карциномы человека заливают в парафин, предварительно проведя обезвоживание тканей в батарее спиртов с восходящей концентрацией, проводят через промежуточный растворитель (ортоксилол) и пропитывают парафином при температуре 55-56°C, затем быстро охлаждают. Полученные парафиновые блоки нарезают на санном микротоме. Полученные образцы ткани печени толщиной в 5 мкм приклеивают на полилизиновые стекла (Menzel Glasses, Германия).
Затем проводят депарафинизацию образцов ткани гепатоцеллюлярной карциномы: помещают их в ксилол на 5 минут дважды, затем в этиловый спирт 96% и отмывают в дистиллированной воде в течение 5 минут дважды.
Далее для восстановления антигенов проводят их демаскировку в водяной бане при температуре 95°C в цитратном буфере с рН 6.0 (Dako; Дания), затем охлаждают при комнатной температуре в течение 25 минут, промывают дистиллированной водой дважды в течение 5 минут.
Затем проводят инактивацию эндогенной пероксидазы в коммерческом растворе 3% перекиси водорода (Peroxidase-Blocking Solution (Dako, Дания)) в течение 20 минут, после этого промывают в дистиллированной воде дважды в течение 5 минут.
2. Иммуногистохимическое определение уровней синтеза групп изоформ HNF4α P1 и HNF4αP2.
Иммуногистохимическое исследование уровня синтеза и локализации групп изоформ HNF4αP1 и HNF4αP2 проводят на серийных образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека для каждой изоформы отдельно.
Для получения иммуногистохимически окрашенных препаратов в качестве первичных антител используют моноклональные антитела мыши к HNF4αP2 (Н6939; R&D systems, США) или HNF4αP1 (К9218; R&D systems, США) человека в разведении 1,5 мкг/мл и 3 мкг/мл, соответственно. Антитела разводят на коммерческом буфере Antibody Diluent with Background Reducing Components (Dako, Дания). В качестве вторичных антител используют двухступенчатую пероксидазную систему детекции BioGenex (США).
На образец ткани гепатоцеллюлярной карциномы наносят предварительно разведенные антитела и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем его промывают в растворе Tris-HCl (50 мМ, рН 7-7.2) дважды в течение 5 минут. Образцы ткани гепатоцеллюлярной карциномы инкубируют со вторичными антителами Super enchancer (BioGenex, США) в течение 20 минут, после чего промывают раствором Tris-HCl дважды по 5 минут и инкубируют с полимерной пероксидазой хрена (HRP полимер) SS Label (BioGenex, США) в течение 30 минут. После инкубации с полимерной пероксидазой их промывают раствором Tris-HCl дважды в течение 5 минут, окрашивают 5-5′-диаминобензидином (ДАБ) (BioGenex, США) в течение 3-5 минут, промывают в дистиллированной воде дважды по 5 минут.
Образцы ткани гепатоцеллюлярной карциномы докрашивают в растворе гематоксилина Майера (Dako, Дания) в разведении 1:4 на дистиллированной воде в течение 1 минуты, затем отмывают сначала в проточной водопроводной воде, а потом в дистиллированной воде в течение 1 минуты. Далее их заключают в специальный состав Glycergel Mounting Medium (Dako, Дания) и накрывают покровным стеклом.
3. Оценка уровня синтеза двух групп изоформ HNF4α на образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы после иммуногистохимического окрашивания.
При анализе образцов ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека, окрашенных антителами на HNF4αP1 или HNF4αP2 группы изоформ, исследуют весь образец ткани за исключением краевых зон при увеличении 200×. При учете результатов иммуногистохимического окрашивания учитывают процент окрашенных опухолевых клеток антителами к каждой из групп изоформ, а также интенсивность окрашивания и внутриклеточную локализацию исследуемого белка. Интенсивность окрашивания опухолевых клеток оценивают по системе: «+» - слабое окрашивание, «++» - средняя интенсивность окрашивания, «+++» - сильное окрашивание. Негативно окрашенными считают срезы гепатокарцином, в которых доля окрашенных ядер опухолевых клеток составляет менее 10%; срезы гепатокарцином, в которых доля окрашенных ядер опухолевых клеток составляет 10-50%, квалифицируют как умеренно окрашенные; срезы гепатокарцином, в которых доля окрашенных ядер опухолевых клеток составляет 50-100%, - как интенсивно окрашенные. При наличии на образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы участка неопухолевой ткани дополнительно проводят учет перечисленных параметров для нетрансформированных гепатоцитов. При окраске антителами к группе изоформ HNF4αP1 положительным контролем служит окраска ядер гепатоцитов, составляющих окружающую опухоль ткань на том же образце ткани гепатоцеллюлярной карциномы, для группы изоформ HNF4αP2 положительным контролем служит окраска антителами ядер холангиоцитов.
Изобретение иллюстрировано фиг.1-4(А-Б), на которых изображены образцы ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека, окрашенные антителами к группам изоформ HNF4αP1 и HNF4αP2. На фиг.1А-1Б представлены образцы ткани, на которых выявлено окрашивание ядер опухолевых клеток антителами к изоформам группы HNF4αP1 и HNF4αP2. На фиг.2А-2Б представлены образцы ткани, на которых выявлено окрашивание ядер опухолевых клеток только антителами к изоформам группы HNF4αP2. На фиг.3А-3Б представлены образцы ткани, на которых выявлено окрашивание ядер опухолевых клеток только антителами к изоформам группы HNF4αP1. На фиг.4А-4Б представлены образцы ткани, на которых не выявлено окрашивания ядер опухолевых клеток ни к одной из групп изоформ HNF4α. Стрелками под номером 1 указаны ядра опухолевых клеток на образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека, окрашенные антителами к группам изоформ HNF4αP1 или HNF4αP2 в коричневый цвет. Стрелками под номером 2 указаны ядра опухолевых клеток, окрашенные в синий цвет гепатоксилином Майера, в которых отсутствует окрашивание ядер опухолевых клеток антителами к изоформам HNF4α.
Таким образом, при применении заявляемого способа показано, что на ранних стадиях гепатоканцерогенеза в дифференцированных опухолях активируется экспрессия нехарактерных для нормальной печени изоформ HNF4αP2, на более поздних стадиях опухолевой прогрессии в гепатоцеллюлярных карциномах последовательно подавляется экспрессия всех изоформ HNF4α.
Технический результат изобретения заключается в том, что заявляемый способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет с высокой точностью оценивать интенсивность окрашивания ядер опухолевых клеток и локализацию двух дифференциально экспрессирующихся групп изоформ HNF4α на образцах ткани гепатоцеллюлярной карциномы человека, а также оценить степень дифференцировки опухолевых клеток и их злокачественности по уровню экспрессии групп изоформ HNF4α, сократить время исследования до 4 часов.