НОВОЕ АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
NEW ACTIVE SUBSTANCE FOR REGENERATIVE PROCESS AND USE THEREOF

Объектом изобретения является по существу новое применение соединения, которое представляет собой сополимер соли 2-метил-2-[(1-оксо-2-пропенил)амино]-1-пропансульфоновой кислоты и 2-гидроксиэтилпропеноатного эфира.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению этого соединения в качестве агента для стимуляции и/или ускорения пролиферации и/или дифференциации фибробластов, в частности для изготовления композиции, предназначенной для стимуляции заживления или альтернативно для изготовления композиции, предназначенной для применения ex vivo для создания клеток для трансплантатов кожи.
Изобретение также относится к повязке для лечения ран, содержащей данное соединение, отдельно или в комбинации с другими активными веществами.
Известно, что открытые раны, которые включают ожоги, язвы, невропатические язвы, венозные или артериальные язвы, диабетические язвы, пролежни, буллезные поражения, экссудативные раны, поверхностные кожно-эпидермальные повреждения, которые могут быть хроническими или острыми, составляют подавляющее большинство ран.
Одной из первоочередных целей при лечении раны, независимо от ее природы или происхождения, является закрытие этой раны.
Кроме того, известно, что заживление раны представляет собой естественное биологические явление, где человеческие и животные ткани способны к репарации локализованных повреждений посредством процессов репарации и регенерации, которые специфичны для него.
В целом заживление раны происходит в три фазы: фаза очищения, фаза грануляции и фаза эпителизации, где каждая из этих трех фаз характеризуется специфичными клеточными активностями, которые вызывают прогрессирование процесса репарации в соответствии с точными хронологическими последовательностями.
Фаза очищения характеризуется появлением ранних воспалительных явлений. Сразу после травмы начинаются секреции, имеющие происхождение из кровеносных и лимфатических сосудов. Свертывание крови индуцировано активацией тромбокиназы, которая высвобождается при сопутствующем образовании фибрина. Примерно через 10 минут начинается экссудация, которая должна обеспечить защиту против инфекции и очищение раны. Примерно 4 суток спустя повреждение вступает в пролиферативную фазу. Организм начинает восполнять потерю вещества новой тканью. Для этой цели фибробласты первоначально продуцируют мукополисахариды, которые служат в качестве матрикса для развития коллагеновых волокон соединительной ткани. Между 6-ми и 10-ми сутками, в среднем, начинается фаза дифференциации. Начинается созревание коллагеновых волокон. Рана сокращается под влиянием особых клеток, миофибробластов. Грануляционная ткань постепенно становится истощенной водой и содержит все меньше сосудов, таким образом становясь прочнее. Затем она преобразуется в рубцовые ткани, которые, в свою очередь, стимулируют стягивание рубца.
Именно в ходе второй фазы заживления, известной как фаза грануляции, фибробласты играют важную роль. Фаза грануляции длится примерно 3 недели, и во время нормального процесса заживления также имеет место фаза эпителизации. Фибробласты размножаются в ране, также как и клетки-предшественники кератиноцитов из краев раны, из волосяных фолликулов и из потовых желез. После 3 суток фибробласты продуцируют коллаген, волокна которого ориентируются в соответствии с силами, действию которых они подвергаются. Их пролиферация управляется рядом определенных факторов. Как общее правило, эта пролиферация прерывается, когда грануляционная ткань восполнила потерю вещества и когда пролиферация фибробластов достигла уровня краев.
Фибробласт является одним из основных агентов в процессе заживления. Действительно, около 6-х суток более чем половина фибробластов, присутствующих в ране, преобразуется в миофибробласты. Эти клетки характеризуются присутствием в их цитоплазме сократительных миофибрилл, которые вызывают сокращение раны и, следовательно, уменьшение площади поверхности раны и ускорение ее закрытия.
Эти клетки, следовательно, играют незаменимую роль в сокращении раны, которое является основным феноменом спонтанного закрытия в полостной ране. Более чем 40% миофибробластов (содержащих сократительный белок, гладкомышечный актин альфа) присутствуют в грануляционной ткани. Когда рана заживает, эти клетки погибают, хотя сигнал, запускающий их исчезновение, не полностью понятен.
Фибробласт также является ключевой клеткой пролиферативной фазы. Фибробласт секретирует коллаген типа III, а затем последовательно коллаген типа I и гепарана сульфат, которые являются фундаментальными составляющими кожного внеклеточного матрикса, но также гиалуроновую кислоту, хондроитина сульфат, фибронектин и коллагеназу, приводя посредством этого в результате к закрытию раны.
Процесс заживления, даже для небольших ран или отверстий, может длиться в течение нескольких часов, нескольких суток или нескольких недель или даже более при некоторых обстоятельствах, как, например, в случае изъязвления, где рана может сохраняться в течение значительно более длительных периодов, то есть месяцев или лет.
Во время этого периода заживления, длится ли он кратковременно или длительное время, рана может быть подвержена инвазиям любого типа (патогенных организмов или чужеродных веществ) до тех пор, пока регенерация новой ткани полностью не закроет отверстие.
С целью предупреждения какой-либо инфекции рану обычно обрабатывают с целью удаления какого-либо загрязняющего вещества (пыли, обломков и т.д.), способного к внедрению патогенного вещества в участок поврежденной области. Последовательно проводят удаление омертвевших тканей в данной области и дезинфекцию. В некоторых случаях вводят определенное число швов с целью облегчения закрытия раны. Как только эти стадии проведены, рану поддерживают в окружающей среде, благоприятной для заживления. Для этого применяют различные типы повязок, чтобы предотвратить внедрение патогенов и/или их пролиферацию.
Следовательно, при лечении раны важно стимулировать явление закрытия раны с целью предотвращения, например, инвазии раны микроорганизмами или чужеродными веществами и, следовательно, инфекции раны. В результате необходимо иметь средства для индукции или стимуляции процесса заживления раны.
С целью индукции или ускорения заживления раны можно вводить некоторое число активных агентов. Эти активные агенты могут действовать на различных уровнях и при различных фазах заживления. Они различаются в соответствии со стадией и типом раны, подлежащей лечению. Эти активные агенты могут, например, представлять собой факторы роста фибробластов и/или кератиноцитов (такие как основной фактор роста фибробластов) или псевдофакторы роста (такие как маннозо-6-фосфат), гликозаминогликаны (такие как гиалуроновая кислота, коллаген и т.д.), гормоны (такие как эстрадиол, дегидроэпиандростерон и т.д.), полисахариды (такие как декстран) и т.д.
Было обнаружено, совершенно неожиданно и удивительно, что также возможно стимулировать и/или ускорить пролиферацию и/или дифференциацию фибробластов и, следовательно, стимулировать заживление с помощью соединения, которое представляет собой сополимер соли 2-метил-2-[(1-оксо-2-пропенил)амино]-1-пропансульфоновой кислоты и 2-гидроксиэтилпропеноатного эфира.
Предпочтительно вышеупомянутая соль 2-метил-2-[(1-оксо-2-пропенил)амино]-1-пропансульфоновой кислоты представляет собой натриевую соль.
Данный сополимер представляет собой продукт, который сам по себе известен, в частности, в области косметики благодаря его эмульгирующим/стабилизирующим свойствам и его хорошей загущающей способности.

Такой продукт, например, продается фирмой SEPPIC под торговым названием Sepinov ЕМТ 10.
Таким образом, в соответствии с первым аспектом, объектом настоящего изобретения является применение сополимера соли 2-метил-2-[(1-оксо-2-пропенил)амино]-1-пропансульфоновой кислоты и 2-гидроксиэтилпропеноатного эфира для изготовления композиции, предназначенной для стимуляции и/или ускорения пролиферации фибробластов in vivo или ex vivo, и, в частности, для изготовления композиции, предназначенной для стимуляции заживления.
Вышеупомянутый сополимер можно применять in vivo или ех vivo.
В качестве примера применения ех vivo можно упомянуть применение данного соединения для приготовления культуральной среды для стимуляции пролиферации фибробластов. Оказывается, что данное применение полезно для аутологичных трансплантатов кожного или кожно-эпидермального пласта. Это связано с тем, что при данном типе трансплантата методики культивирования клеток используют с целью получения достаточной площади поверхности кожи из небольшого образца, взятого от самого пациента или пациентки. Применение сополимера согласно настоящему изобретению дает возможность ускорить пролиферацию фибробластов и, следовательно, оказывается, что оно полезно при данном типе лечения.
В контексте его применения in vivo вышеупомянутый сополимер можно применять для изготовления композиции, которая даст возможность его непосредственного нанесения на рану и окружающую область, либо еще на слизистую оболочку, предпочтительно путем местного нанесения. Предпочтительно данный сополимер включают в повязку.
Как правило, вышеупомянутый сополимер можно применять отдельно или в комбинации с другими активными веществами, которые дают возможность индуцировать или ускорить заживление, либо которые могут играть благоприятную роль при лечении раны, такие как, например, противомикробные агенты или болеутоляющие средства. Такая комбинация активных агентов обеспечивает комбинированное консервативное лечение раны. Среди активных веществ, которые можно применять в контексте изобретения, можно упомянуть, в качестве примеров, бактерицидные или бактериостатические агенты (хлорамин, хлоргексидин, соли серебра, соли цинка, метронидазол, неомицин и т.д.), агенты для стимуляции заживления (гормоны, пептиды и т.д.), ферменты для стимуляции очищения раны (пепсин, трипсин и т.д.), ингибиторы протеаз или металлопротеиназ, болеутоляющие средства или местные анестетики (лидокаин, цинхокаин) или нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (ибупрофен, кетопрофен, фенопрофен, диклофенак).
Предпочтительно вышеупомянутый сополимер следует применять в комбинации с сульфатированным сахаридом, либо с солью или комплексом сульфатированного сахарида. Этот сульфатированный сахарид может, например, представлять собой октасульфат сахарозы в форме комплекса или соли с металлом, таким как Na, K, Ca, Мg, Ba, Al, Zn, Сu, Zr, Ti, Mn или Os, либо с органическим основанием, таким как аминокислота. В частности, предпочтительные результаты получены, когда вышеупомянутый сополимер применяют в комбинации с калия октасульфатом сахарозы, который представляет собой активный ингредиент, известный по его действию в процессе заживления.
Исследования пролиферации in vitro неожиданно дали возможность показать, что сополимер соли 2-метил-2-[(1-оксо-2-пропенил)амино]-1-пропансульфоновой кислоты и 2-гидроксиэтилпропеноатного эфира проявляет активность на пролиферацию фибробластов при очень низкой дозе. Конкретно, такую активность наблюдают, когда сополимер присутствует в культуральной среде при концентрации 0,00064 мг/мл.
Также показано, что, особенно предпочтительно, вышеупомянутый сополимер также проявляет активность в течение нескольких суток. Тесты, проведенные in vivo, дали возможность обнаружить активность на пролиферацию фибробластов через 72 часа после включения указанного сополимера в культуральную среду. Особенно предпочтительно, когда сополимер включают в повязку. Конкретно, одну и ту же повязку можно применять в течение нескольких суток, причем в то же время она остается активной без необходимости в ее замене.
Как правило, сополимер, применяемый в контексте настоящего изобретения, может быть включен в любой тип композиции, такой как, в частности раствор, крем, гель, масса (густая смесь), в частности эластомерная масса, или повязка. Сополимер может быть включен в компресс. Термин "компресс" как означающий любой тип абсорбирующего материала, обычно применяемого в повязках, такого как, например, текстильные материалы, которые могут представлять собой абсорбирующие нетканые материалы (например, на основе вискозы), возможно комбинированные с не абсорбирующими неткаными материалами (такими как полиэфирные волокна). Он может также включать сверхабсорбирующие волокна (такие как Lanseal Fibres, имеющиеся в продаже от фирмы Toyobo со, Ltd) или полиуретановые пенки.
В частности, данный сополимер может присутствовать в массе, составляющей повязку, либо на отдельном слое повязки, либо альтернативно в покрытии, покрывающем поверхность повязки, предназначенном для приведения в контакт с раной с целью ее лечения.

В термин "повязка" здесь подразумевают включать любой тип известных повязок, и предпочтительно пограничные повязки. Такие повязки имеются в продаже, например, под торговыми названиями Tulle Gras (Solvay Pharma), Physiotulle (Coloplast) или еще Urgotul (Laboratoires Urgo) и описаны в патенте EP 1143895.
Эти пограничные повязки, как правило, находятся в форме сита или сетки, покрытой массой, обычно эластомерной массой. Они могут также состоять из массы без ткани или сетки, имеющей форму пласта, который может иметь или не иметь сквозные отверстия в зависимости от типа раны, на которую накладывают повязку (пласт, который имеет сквозные отверстия, предпочтительно используют на экссудативной ране, когда масса не обладает или обладает слабой абсорбирующей способностью, отверстия, таким образом, дают возможность эвакуации экссудата из раны).

Настоящее изобретение также находит применение для изготовления повязок, основанных на гидрогелях и на гидроколлоидах, в которые включают вышеупомянутый сополимер. Известные повязки на основе гидроколлоидов имеются в продаже, например, под названиями Algoplaque (Laboratoires Urgo), Duoderm (Convatec) и Comfeel (Coloplast). Такие повязки описаны в приведенных ниже патентных заявках: FR 2392076, FR 2495473 и WO 98/10801 и EP 264299.
Сополимер, применяемый в контексте настоящего изобретения, можно включать в абсорбирующий элемент, такой как компресс или пенка, например, путем депонирования его на поверхности, предназначенной для приведения в контакт с раной, как описано в патентной заявке WO 2006/007844.

Настоящее изобретение также находит применение для изготовления пограничных повязок в комплексе с абсорбирующим слоем, таким как пенка или компресс, или гидроколлоида в комплексе с абсорбирующей пенкой. Такие повязки известны и имеются в продаже, например, под торговыми названиями UrgotulDuo и Cellosorb (Laboratoires Urgo). В таких повязках вышеупомянутый сополимер может быть включен в массу и/или в абсорбирующий слой.
Пограничные повязки, предпочтительно применяемые в контексте настоящего изобретения, состоят из эластомерной массы, то есть состоящей из одного или более чем одного эластомера, выбранного из блоксополимеров стирола-олефина-стерола, и одного или более чем одного соединения, выбранного из пластификаторов, адгезивных смол и при необходимости антиоксидантов.
Такие эластомерные массы хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в книге "Advances in Pressure Sensitive Adhesive Technology", изданной Donatas Satas в апреле 1995 в главе 7 "Wound dressings", с.158-171.
Когда он включен в повязку, такую как пограничная повязка, вышеупомянутый сополимер можно применять при концентрации от 1% до 5 мас.% относительно массы эластомерной массы. Показано, что такая концентрация достаточна для активации пролиферации фибробластов и, следовательно, для стимуляции заживления.
Как правило, вышеупомянутый сополимер должен присутствовать в повязке в количестве, которое может составлять между 0,1% и 20 мас.% относительно массы, в которую он включен, и предпочтительно между 1% и 5 мас.%.
Согласно второму аспекту целью настоящего изобретения является покрытие повязок, описанных выше, которое включает сополимер соли 2-метил-2-[(1-оксо-2-пропенил)амино]-1-пропансульфоновой кислоты и 2-гидроксиэтилпропеноатного эфира.
В целях демонстрации активности вышеупомянутого сополимера на фибробластах было проведено исследование in vitro, используя два типа экспериментов:
1. Сополимер, один или в комбинации с активным веществом (в настоящем случае калия сахарозы октасульфатом) добавляли непосредственно в культуральную среду фибробластов при различных концентрациях.
В данном случае различные разведения сополимера, одного или в комбинации с калия сахарозы октасульфатом, таким образом, готовили и добавляли в культуральную среду.
Разведения сополимера Sepinov EMT 10 при 0,011 мг/мл и калия сахарозы октасульфата при 0,00064 мг/мл, таким образом, тестировали в культуральной среде, содержащей фибробласты.
2. Сополимер, один или в комбинации с активным веществом (в настоящем случае калия сахарозы октасульфатом) включали в матрицу пограничной повязки, а затем повязку накладывали на культуральные лунки, содержащие фибробласты.
В данном случае различные пограничные повязки, содержащие сополимер при различных концентрациях, в комбинации или не в комбинации с калия сахарозы октасульфатом, были изготовлены в соответствии со способом, описанным ниже. Пограничная повязка, не содержащая ни один из этих двух активных агентов, также была изготовлена и протестирована для сравнения.
Способ изготовления тестируемых повязок
a. Получение эластомерных масс
Различные эластомерные массы (примеры 1-5) готовили с использованием приведенных ниже компонентов в массовых долях, указанных в таблице 1:
- Эластомер: блоксополимер поли(стирол-этилен-бутилен-стирол) (сокращенно СЭБС); Kraton G 1654 и G 1651, имеющийся в продаже от фирмы Kraton;
- Пластификатор: минеральное масло: Ondina 917, имеющееся в продаже от фирмы Shell;
- Антиоксидант: Irganox 1010, имеющийся в продаже от фирмы Ciba Specialty Chemicals;
- Жировое вещество: вазелиновое масло: вазелиновое масло Codex A, имеющееся в продаже от фирмы Aiglon;
- Гидроколлоид: натрийкарбоксиметилцеллюлоза: CMC Blanose 7H4XF, имеющийся в продаже от фирмы Hercules;
- Дополнительное активное вещество: калия сахарозы октасульфат: имеющийся в продаже от фирмы Euticals;
- Сополимер соли 2-метил-2-[(1-оксо-2-пропенил)амино]-1-пропансульфоновой кислоты и 2-гидроксиэтилового эфира пропеновой кислоты: Sepinov EMT 10, имеющийся в продаже от фирмы SEPPIC.
Массу на основе эластомера готовили путем смешивания в Z-лопастном смесителе при заданном значении температуры 155°C:
1. Трехблочные эластомеры стирол-этиленбутилен-стирол смешивают с половиной минерального масла и с антиоксидантом.
2. Через 30 минут к смеси добавляют вазелиновое масло.
3. Через 40 минут добавляют остальное минеральное масло.
4. Через 55 минут к смеси добавляют натрийкарбоксиметилцеллюлозу, где пригодно, активный агент (агенты).
Смеситель опорожняют через 70 минут.
б. Изготовление повязок
Пограничные повязки, состоящие из сита, покрытого эластомерной массой, готовили, используя вышеупомянутые эластомерные массы.
2
Более конкретно, здесь использовали сито, образованное из нитей термореактивного маркизета, изготовленного из полиэфира (полиэтилентерефталата) 33 децитекс в направлениях основы и утка, имеющее квадратные ячейки сита с отверстием примерно от 0,8 до 1 мм (меш 555, имеется в продаже от фирмы MDB Texinov).
Это сито покрывали слоем расплавленной эластомерной массы при 135-145°C, а затем избыток удаляли путем пропускания между двумя фиксированными роллерами, имеющими щель между ними 200 мкм. Полученную таким образом полосу отрезали, а затем образовывали комплекс с защитной полиэфирной пленкой, имеющей толщину 23 мкм, на каждой из ее сторон, образуя, таким образом, индивидуальные повязки, упакованные в непроницаемые защитные пакеты, и стерилизовали при β-излучении при 25 кГр.
Таблица 1
Компоненты
Пример 1
Пример 2
Пример 3
Пример 4
Пример 5
Минеральное масло (Ondina 917)
75
74
70
62,38
69,9
С-ЭБ-С (Kraton G 1651)
4,9
4,9
4,9
С-ЭБ-С (Kraton G 1654
6
6
Антиоксидант (Irganox 1010)
0,1
0,1
0,1
0,12
0,1
Вазелиновое масло
5
5
5
5
5
(вазелиновое масло Codex А)
Карбоксиметилцеллюлоза
15
15
15
14
14
(CMC Blanose 7H4XF)
Sepinov EMT 10
1
5
5
5
Калия сахарозы октасульфат
7,5
Эффект сополимера соли 2-метил-2-[(1-оксо-2-пропенил)амино]-1-пропансульфоновой кислоты и 2-гидроксиэтилпропеноатного эфира на пролиферацию фибробластов определяли в соответствии с приведенным ниже протоколом.
Демонстрация активности вышеупомянутого сополимера на пролиферацию фибробластов
Используемые клетки:
Тип: пул нормальных фибробластов кожи человека (NHDF) R9PF2
2
Культура: 37°C, 5% CO
Культуральная среда:
DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла, Invitrogen 21969035)
2 мМ L-глутамин (Invitrogen 25030024)
50 ед/мл пенициллин (Invitrogen 15070063)
10% фетальная сыворотка теленка (об/об, Invitrogen 10270098).
Тестируемые продукты:
Тестировали повязки, имеющие размер лунок, изготовленные, как описано ранее, используя эластомерные массы примеров 1-5, а также разведения сополимера Sepinov EMT 10 до 0,011 мг/мл и калия сахарозы октасульфата до 0,00064 мг/мл.
Эффекты на пролиферацию:
Фибробласты высевали в 12-луночные планшеты при низкой плотности (60% конфлюентности), а затем клетки обрабатывали разведениями, либо кусочки повязок наносили на эти планшеты и удерживали на месте с помощью пробки (называли "тест"). Контроль без повязки, без разведения, но с пробкой (называли "контроль").
3
Затем клетки инкубировали в течение 24 часов, 48 часов и 72 часов. Для каждого периода инкубации добавляли тритированный тимидин ([метил-H]-тимидин, Amersham TRK 686, конечная концентрация 2,5 мКи/мл) в течение последних 24 инкубаций, а затем ДНК клеток из клеточных слоев экстрагировали и очищали, и радиоактивность, включенную в ДНК, считали, используя сцинтилляционный счетчик.
Полученные результаты выражены в импульсах в минуту (срm), затем в виде процента относительно контроля в соответствии с приведенной ниже формулой:
контроль
тест
контроль
%=(cpm/cpm)×100
в которой:
тест
cpm: число импульсов в минуту, полученное для теста
контроль
cpm: число импульсов в минуту, полученное для контроля
Все эксперименты проводили в трех повторах.
Полученные результаты приведены ниже в таблицах 2-4.
Таблица 2
Результаты исследования пролиферации NHDF после включения тритированного тимидина через 24 часа
Обработка
% контроль
Контроль
100
Повязка в соответствии с примером 1
130
Повязка в соответствии с примером 2
196
Таблица 3
Результаты исследования пролиферации NHDF после включения тритированного тимидина через 48 часов
Обработка
% контроль
Контроль
100
Повязка в соответствии с примером 1
181
Повязка в соответствии с примером 2
260
Повязка в соответствии с примером 3
506
Повязка в соответствии с примером 4
456
Повязка в соответствии с примером 5
243
Калия сахарозы октасульфат при 0,011 мг/мл
106
Sepinov EMT 10 при 0,00064 мг/мл
125
Калия сахарозы октасульфат при 0,011 мг/мл и Sepinov EMT 10 при 0,00064 мг/мл
152
Таблица 4
Результаты исследования пролиферации NHDF после включения тритированного тимидина через 72 часа
Обработка
% контрол<sub>ь</sub>
Контроль
100
Повязка в соответствии с примером 1
150
Повязка в соответствии с примером 2
120
Повязка в соответствии с примером 3
493
Повязка в соответствии с примером 4
292
Sepinov EMT 10 при 0,00064 мг/мл
147
Таким образом, данные эксперименты in vitro дали возможность продемонстрировать роль сополимера Sepinov EMT 10 при пролиферации фибробластов, а также комбинированную активность данного сополимера и калия сахарозы октасульфата на тех же клетках.
Полученный эффект особенно благоприятен, когда сополимер Sepinov EMT 10 включают в эластомерную массу в концентрации 5% от общей массы, где этот эффект имеет место после 48 ч и 72 ч контакта с клеточной культуральной средой.
Сополимер, используемый отдельно при разведении в клеточной культуральной среде при очень низкой концентрации (0,00064 мг/мл), также значительно стимулировал пролиферацию фибробластов.
Также было возможно наблюдать, что удивительно, что когда сополимер Sepinov EMT 10 используют в комбинации с калия сахарозы октасульфатом, имеет место синергический эффект на пролиферацию фибробластов. Данную синергию наблюдали, в частности, когда калия сахарозы октасульфат добавляют в культуральную среду при концентрации 0,011 мг/мл, а сополимер Sepinov EMT 10 при концентрации 0,00064 мг/мл.
Сополимер, применяемый в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, особенно предпочтителен для лечения ран и, в частности, для стимуляции заживления, особенно при его включении в повязку.