Ассоциация генов цитокинов IL-10, IL-4, TNF и стадии фиброза у больных ХГС

УДК [616.36-002.12:578.891]-092

Е.Н. УСЫЧЕНКО

Одесский национальный медицинский университет, кафедра инфекционных болезней

АССОЦИАЦИЯ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ IL-10, IL-4, TNF И СТАДИИ ФИБРОЗА У БОЛЬНЫХ ХГС

Целью данного исследования являлось изучение трех полиморфизмов генов IL-10 (G1082A), IL-4 (C589T) и TNF а (G308A) у больных хроническим гепатитом С (ХГС) и здоровых лиц, принадлежащих к этнически однородной группе жителей Одесского региона, а также выявление возможной взаимосвязи определенных генотипов и степени фиброза печени. Полиморфизм изучался при помощи амплификации соответствующих участков генома методом ПЦР. Структура использованных праймеров и параметры температурных циклов, описанные в литературе и геномной базе данных. Оценка морфологических изменений в печени (степень активности и выраженность фибротических изменений) определяли по шкале METAVIR с использованием неинвазивного метода Fibrotest. Была выявлена ассоциация определенного генотипа IL-4 (C589T) и степени фиброза печени. Ключевые слова: хронический гепатит С, полиморфизм генов, фиброз печени

Введение. Вирусный гепатит С продолжает оставаться важной медико-социальной проблемой здравоохранения во всем мире. Это связано с широкой его распространенностью, недостаточной эффективностью современных схем лечения ХГС, отсутствием специфической профилактики, высокой частотой неблагоприятных исходов (цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома).

Особую актуальность представляет поиск маркеров прогрессирования ХГС с дальнейшим формированием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (1, 2, 3). В настоящее время четкого представления о причинах различной скорости формирования фиброза печени у больных ХГС не имеется. Вероятно, на формирование этого процесса в печени оказывают влияние не только генетические факторы вируса гепатита С, но и особенности генотипа больного (4, 5). Однако, данные об исследованиях генетических детерминант прогрессирования ХГС нередко противоречивы и во многом зависят от принадлежности больных к определенной этнической группе. Установлено, что фиброз печени развивается в результате чрезмерного накопления внеклеточных матриксных протеинов. При гепатите наиболее активными продуцентами коллагена являются активированные звездчатые клетки, портальные фибробласты и миофибробласты из костного мозга. Известно, что цитокины не только участвуют в формировании иммунного ответа, но и модулируют активность ферментов, участвующих в процессе преобразования коллагена в печени (6, 7).

Функционирование цитокиновой системы определяется рядом факторов, в том числе и генетическими. Молекулярной основой наследственных факторов является полиморфизм одиночных нуклеотидов в генах различных цитокинов и их рецепторов, который может быть локализован в кодирующей, либо промоторной части гена. При этом полиморфизм одиночных нуклеотидов в регуляторной части гена может оказывать влияние на уровень его экспрессии, что приводит к изменению количества его продукта - белка (8, 9).

Роль полиморфизма гена 1Ь-10 в развитии фиброза печени изучена недостаточно. В исследованиях ряда авторов установлено влияние генов 1Ь-10 и ЮТа на особенности течения ХГС, определяемых степенью фиброза (6, 10, 11, 12). На сегодняшний день актуальным является не только изучение полиморфизма различных генов цитокинов, но и анализ межгенных взаимодействий у больных ХГС и их

влияние на течение гепатита и формирование фиброза печени.

Цель исследования - оценка ассоциации полиморфизма маркеров генов 1Ь-4(С589Т), 1Ь-10(а1082А), ТОТа (С308А) у больных хроническим гепатитом С со степенью фиброза печени.

Материалы и методы. Обследовано 100 больных ХГС в возрасте от 18 до 62 лет, при этом средний возраст составил 42±3,08 года. Все обследованные больные находились на диспансерном наблюдении в гепатологическом центре Одесской городской клинической инфекционной больницы. Пациенты являются жителями Одесского региона, среди больных преобладали женщины (56%). Давность заболевания составила не более 10 лет.

Контрольная группа составлена из 30 практически здоровых лиц, средний возраст которых 32±1,05 года. Количество женщин и мужчин было одинаковым (по 15 человек).

Верификация диагноза ХГС включала: биохимические тесты (повышение активности АсАТ и АлАТ, концентрация билирубина и преобладание его прямой фракции), (Fibrotest или Fibromax) и серологические маркеры (ИСУ-^М, качественное и количественное определение и иРНК ИСУ методом ПЦР, генотипирование вируса)). Оценка морфологических изменений в печени (степень активности и выраженность фибротических изменений) определяли по шкале METAVIR с использованием неинвазивного метода Fibrotest. Оценка степени фиброза определялась по уровню таких показателей как альфа2макроглобулин, гаптоглобин, аполипопротеин А1, общий билирубин, ГГТ, АлАт и АсАт.

Для оценки ассоциации степени изменений печеночной ткани и аллельного полиморфизма генов все больные были разделены на три группы: с отсутствующим или минимальным фиброзом ^0- F1) - 46%, умеренным фиброзом ^2) - 31% и с выраженным фиброзом ^3) - 23%. Молекулярно-генетические исследования включали определение полиморфных вариантов генов 1Ь-4(С589Т), 1Ь-10(С1082А), ТОТа (С308А). Выделение ДНК проводилось при помощи набора «ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь» (НПФ «Литех», РФ). Полиморфизм изучался при помощи амплификации соответствующих участков генома методом ПЦР. Структура использованных праймеров и параметры температурных циклов, описанные в литературе и геномной базе данных. Исследования проводились на базе Немецкого диагностического центра им. Св. Павла (г. Одесса).

Таблица 1 - Характеристики исследованных полиморфизмов

Ген полиморфизм название праймера нуклеотидная последовательность

IL-4 C589T rs2243250 5'-TAAACTTGGGAGAACATGGT-3'

IL-10 G1082A rs1800896 5'-CCT ATC CCT ACT TCC CCT-3'

TNF а G308A rs1800620 5'-AGG CAA TAG GTT TTG AGG GC-3'

Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли с помощью критерия х2 Пирсона. Частоты аллелей и генотипов в группах сравнивали с применением критерия х2 Пирсона с поправкой Йетса на

непрерывность при числе степеней свободы равном 1. Взаимосвязь фибротических изменений в печеночной ткани и аллельного полиморфизма исследуемых генотипов

оценивали при помощи коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты исследования. Учитывая, что иммунные механизмы играют значительную роль в патогенезе хронического вирусного гепатита, регуляция которых определяется балансом цитокинов, представляется важным оценить частоту встречаемости аллельных вариантов генов

цитокинов среди здоровых лиц и больных ХГС в этнически однородной группе Одесского региона.

При исследовании аллельного полиморфизма IL-10 (G1082A), IL-4 (C589T) и TNF а (G308A) выявлены существенные различия в контрольной и исследуемой группе больных (таблица 2).

Таблица 2 - Распределение частот генотипов у больных ХГС и здоровых лиц.

генотип /аллель контрольная группа (n=30) частота (%) больные ХГС (n=100) частота (%) X2 уровень значимости

IL-10

GG 14 48 19 19 9,33 р<0,05

GA 8 26 53 53 6,44 р<0,05

AA 8 26 28 28 0,02 р>0,05

IL-4

СС 26 88 66 66 4,77 р<0,05

ТС 2 6 30 30 6,78 р<0,01

ТТ 2 6 4 4 0,32 р>0,05

TNF а

GG 27 91 19 19 50,88 р<0,05

GA 2 6 77 77 47,88 р<0,05

AA 1 3 4 4 0,028 р>0,05

При изучении аллельного полиморфизма в контрольной группе выявлено преобладание гомозиготного типа: частота генотипа GG IL-10 (1082G/A) составила 48%, генотипа СС IL-4 (С589Т) - 88% и генотипа GG TNF а (G308A) 91%. При исследовании полиморфизма IL-10 (1082G/A) установлено преобладание гетерозиготной аллели (комбинация GA у 53% больных). У больных ХГС отмечалось доминирование гомозиготной аллели IL-4 (С589Т) -комбинация СС у 66% больных. Также отмечалось

преобладание гетерозиготной аллели у больных ХГС (77%) при изучении полиморфизма TNF а (G308A). Разница частоты встречаемости генотипа GG и GA IL-10 (1082G/A), СС и ТС IL-4 (С589Т) и GG и GA TNF а (G308A) в исследуемой и контрольной группе достоверна (р>0,05). При исследовании трех полиморфизмов генов IL-10 (G1082A), IL-4 (C589T) и TNF а (G308A) установлена определенная взаимосвязь изученных полиморфизмов и степени фиброза печени (таблица 3).

Таблица 3 - Распределение частот генотипов у больных ХГС и здоровых лиц. В зависимости от степени фиброза.

генотип /аллель больные ХГС всего F0-F1 F2 F3

IL-10

GG 19 8 9 2

GA 53 23 14 16

AA 28 15 8 5

IL-4

СС 67 43 16 8

СТ 29 3 13 13

ТТ 4 - 2 2

TNF а

GG 19 16 1 2

GA 77 30 29 18

AA 4 - 1 3

Среди жителей Одесского региона гомозиготные носители GG IL-10 (G1082A) реже (19%), чем гомозиготные носители генотипа АА (28%) и гетерозиготные носители GA (53%). Следует отметить, что у гомозиготных носителей GG IL-10 (G1082A) отмечалась меньшая выраженность фибротических изменений в печени. Это позволяет предположить, что генотип GG IL-10 (G1082A) как протективный, а гетерозиготный GA IL-10 (G1082A) - как профибротический.

При изучении аллельного полиморфизма IL-4 (C589T) не отмечено достоверной разницы его взаимосвязи с выявленными изменениями в печеночной ткани. В исследуемой группе больных ХГС доминировали гетерозиготные носители GA TNF а (G308A) (77%) c различной степенью фиброза. В группе гомозиготных носителей GG отмечалось преобладание фиброза F0-F1 степени, а в группе гомозиготных носителей АА - со степенью фиброза F3. Обсуждение и заключение

Установлена ассоциация полиморфных маркеров гена IL-10 (G1082A), IL-4 (C589T) и TNF а (G308A), которые расположены в промоторных областях, со степенью фиброза печени у больных ХГС. При исследовании коэффициента

ранговой корреляции Спирмена установлена умеренная связь (г=0,532) между степенью фибротических изменений в печени и аллельным полиморфизмом 1Ь-4 (С589Т). У больных с генотипом СС были выявлены минимальные фибротические изменения (Р0-Р1), у больных с гетерозиготным вариантом генотипа (СТ) и мутантным гомозиготным (ТТ) отмечались значительные признаки фиброза печени (Р2- Р3).

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить роль 1Ь-4(С589Т), 1Ь-10(С1082А), ТОТа (С308А) в патогенезе поражения печени при хроническом гепатите С. Определение генетического профиля у таких пациентов может быть дополнительным фактором для прогнозирования течения и исхода заболевания. Выводы.

1. Выявлены различия по частотам аллелей гена 1Ь-4(С589Т), 1Ь-10(С1082А), ТОТа (С308А) между больными хроническим гепатитом С и здоровыми лицами в этнически однородной группе жителей Одесского региона.

2. Установлена ассоциация полиморфных маркеров гена 1Ь-4(С589Т) со степенью фиброза печени у больных ХГС: при исследовании коэффициента ранговой корреляции Спирмена установлена умеренная связь (г=0,532) между

www^kaznmu.kz В G L I НИК ^/iw-ots

степенью фибротических изменений в печени и аллельным полиморфизмом IL-4 (C589T).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Косаговская И.И. Медико-социальные аспекты вирусных гепатитов с парентеральным механизмом передачи / И.И. Косаговская, Е.В. Волчкова // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2013. - № 1. - С. 28-39.

2 Полиморфизм гена ИЛ-28В как предиктор ответа на противовирусную терапию хронического гепатита С / Т.В. Симакова, И.В. Гармаш, О.С. Аришева, Н.В. Манухина [и др.] // Клиническая фармакология и терапия. - 2012. - №21. - С. 1-6.

3 Ивашкин В.Т. Иммунная система и повреждения печени при хроническим гепатитах В и С / В.Т. Ивашкин // РЖГГК. - 2009. -№6. - С. 4-10.

4 Кучерявый Ю.А. Хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома - звенья одной цепи / Ю.А. Кучерявый, Н.Ю. Стукова, М.Л. Ахтаева // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2012. - № 5. - 130 с.

5 Полиморфизм генов - модификаторов иммунного ответа при заболеваниях печение различной этиологии / И.А. Гончарова, Гамаль Абд Ель Азиз Наср, Е.В. Белобородова [и др.] // Медицинская генетика. - 2010. - № 12. - С. 20-24.

6 Анализ влияния генетических факторов вируса гепатита С и полиморфизма генов инфицированных людей на развитие фиброза печени / Николаева Л.И., Колотвин А.В., Самоходская Л.М. [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2012. -№ 5. - С. 7-13.

7 Ивашкин В.Т. Фиброз печени / В.Т. Ивашкин, Ч.С. Павлов.— М.: ГЭОТАР Медиа, 2011. - 168 с.

8 Полиморфизм одиночных нуклеотидов в генах цитокинов и их рецепторов: биологический эффект и методы идентификации / Д.Д. Абрамов, И.А. Кофнади, К.В. Уткин [и др.] // Иммунология. - 2011. - № 5. - С. 275-278.

9 Genome-wide association study identifies variants associated with progression of liver fibrosis from HCV infection / Patin E., Kutalik Z., Guergnon J. [et al.l // Gastroenterology. - 2012. - Vol.143. - P. 1244-1252.

10 Analysis of interleukin-10 gene polymorphisms and hepatitis C susceptibility in Pakistan / Muhammad Sohail Afzal, Sadia Tahir, Amna Salman [et al.] // J.Infect.Dev.Ctries - 2011. - Vol.5(6). - P. 473-479.

11 Tumor necrosis factor-alpha promoter gene polymorphism affects the occurrence of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis В / Danbi Lee, Y.-H. Chung, J.A. Kim [et al.] // Journal of Hepatology. - 2010. - P. 223.

12 Monika Rau Host Genetic Variants in the Pathogenesis of Hepatitis C / Monika Rau, Katharina Baur, Andreas Geier // Viruses. - 2012. № 4. - P. 3281-3302.

E.N. USYCHENKO

Odessa National Medical University, Department of Infectious Diseases

THE ASSOCIATION OF CYTOKINE GENES OF IL-10, IL-4, TNF AND FIBROSIS IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C

Resume: The aim of this study was to evaluate three gene polymorphisms of IL-10 (G1082A), IL-4 (C589T) and TNF a (G308A) in patients with chronic hepatitis C (CHC) and healthy individuals belonging to ethnically homogeneous group of residents of the Odessa region, and identify a possible relationship of genotypes and the degree of liver fibrosis. The polymorphism of the amplification was investigated using respective portions of the genome by PCR. The structure of the primers used and the parameters of temperature cycles described in the literature and genomic database. Assessment of morphologic changes in the liver (the degree of activity and severity of fibrotic alterations) METAVIR scale determined by using noninvasive Fibrotest. We found a specific association of genotype IL-4 (C589T) and the degree of liver fibrosis.

Keywords: chronic hepatitis C, gene polymorphism, liver fibrosis

Е.Н. УСЫЧЕНКО

Одесса улттыцмедициналъщуниверситетi, Жущалы аурулар кафедрасы

IL-10, IL-4, TNF ЦИТОКИНДЕР ТЕКТЕР1 КАУЫМДАСТЬИЫ ЖЭНЕ ССГ АУРУЫМЕН АУЫРАТЫНДАРДЫН, ФИБРОС ДЭРЕЖЕС1

tywh: Осы зерттеудщ ма;саты созылмалы С гепатит (ХГС) ауруымен ауыратындардыц жэне Одесса ощршщ этникалы; бiртектi тургындар тобына жататын дет су адамдардыц уш полиморфизм IL-10 (G1082A), IL-4 (C589T) и TNF а (G308A) тектерш зерттеу, сондай-а; белгш генотектер мен бауыр фиброзы дэрежесшщ ы;тимал озара байланысын аны;тау болып табылады. Полиморфизм ПЦР тэсШмен геноманыц сэйкес учаскелершщ амплификация комепмен мецгершдъ Эдебиетте жэне геномды мэлiметтер базасында корсетшген ;олданылган праймерлер мен температуралы; циклдардыц параметрлершщ кдаылымы. Бауырдагы морфологиялы; взгерiстердi багалауды (белсендтк дэрежей жэне фибротикалы; взгерктердщ ай;ындылыгы) Fibrotest инвазивды емес тэсiлдi ;олданумен METAVIR шкаласы бойынша аны;тады. Белпленген IL-4 (C589T) генотеп жэне бауыр фиброзы дэрежесшщ ;ауымдастыгы аныщталган болатын.

TYWH4i сездер: созылмалы С гепатиту тектердщ полиморфизму бауыр фиброзы