СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОНЦЕНТРАТА ИЗ КОНСЕРВИРОВАННЫХ ПАНТОВ
METHOD FOR PREPARING BIOLOGICALLY ACTIVE CONCENTRATE OF PRESERVED ANTLERS

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, точнее к технологии переработки пантов для получения биологически активного концентрата в виде порошка.
Известен способ получения биологически активного концентрата из сырых пантов оленей, включающий измельчение (размороженных и посушенных при комнатной температуре) пантов до частиц размером 100 мкм, смешивание измельченных пантов с водой при соотношении 1:5, гомогенизацию смеси и экстракцию в течение 4 часов при температуре 90-93°C с последующим ферментативным гидролизом при температуре 38-40°C и pH 4,5 в присутствии папаина активностью 30 тыс. ЕД из расчета 1-2% от веса пантов в течение 5 часов. После окончания гидролиза гидролизат центрифугируют, фильтруют и сушат при температуре 45-50°C и вакууме 0,9 атм (см. патент RU №2386444, МПК A61K 35/32).
Однако разработанный способ относится к переработке сырых пантов, обладающих изначально большим (по сравнению с консервированными пантами) количеством влаги. Кроме того, высокотемпературная экстракция в начале процесса может вызвать необратимую денатурацию белков и аминокислот.
Известен способ получения биологически активного концентрата из пантов оленей, включающий ферментативный гидролиз пантов со степенью размола не более 100 мкм в присутствии воды и гомогената поджелудочной железы животного из расчета 100 г железы на 1 кг пантовой муки с последующей водной экстракцией гидролизата (смеси жидкой фракции и железы) и его центрифугированием и фильтрацией. В качестве фермента берут поджелудочную железу пантовых оленей при разведении пантовая мука: вода 1:1,5 и времени ферментации 3-4 часа при температуре не более 50°C, а экстракцию гидролизата проводят при весовом соотношении гидролизат:вода 1:1,5 в течение 3 часов и после центрифугирования и фильтрации производят сушку при температуре не выше 50°C и давлении 0,9 атм (см. патент RU 2386443, МПК A61K 35/32) (прототип).
Однако использование в качестве фермента поджелудочной железы пантовых оленей ограничено в связи с отсутствием в настоящее время промышленного выпуска данного ферментативного комплекса. Срок же хранения свежей поджелудочной железы достаточно ограничен, а высокотемпературная экстракция гидролизата (смеси жидкой фракции и жмыха) вызывает разрушение вновь образованных полезных веществ. Следует отметить также, что выход готового концентрата по обоим известным способам не превышает 12,5-13,0% (см. статью: В.Г.Луницын, В.А. Челах Способ получения пантовых концентратов, их биохимический состав // Мат. междун. науч.-практич. конф., Алтайский ГАУ. Барнаул. - 2009. - Т.3. - С.131-134).
Необходима разработка способа получения биологически активного концентрата из консервированных пантов, обеспечивающего максимально возможное извлечение биологически активных веществ из консервированных пантов с высоким выходом готового продукта.
Указанный технический результат достигается тем, что способ получения биологически активного концентрата из консервированных пантов характеризуется тем, что панты измельчают до частиц 100 мкм и подвергают ферментативному гидролизу с последующей экстракцией. При этом ферментативный гидролиз осуществляют в две стадии, на первой стадии в присутствии фермента пепсина из расчета 2% от веса пантов при соотношении панты:вода 1:3 в течение 4 часов и температуре 40°C с последующим центрифугированием и фильтрацией гидролизата. На второй стадии проводят ферментативный гидролиз жмыха, полученного после первой стадии ферментации в присутствии фермента папаина активностью 30 тыс. ЕД из расчета 2% от первоначального веса пантов при соотношении жмых:вода 1:1,5 в течение 4 часов при температуре 40°C, при этом экстракции подвергается жмых полученный после центрифугирования и фильтрации гидролизата после второй стадии ферментации при соотношении жмых:вода 1:5 в течение 3 часов и температуре 95-98°C. Сушку всех фильтратов проводят при температуре не выше 50°C и вакууме 0,9 атм. После каждого смешивания размолотых пантов и жмыхов с водой проводят гомогенизацию смеси, а в процессе ферментирования - перемешивание.
Сущность заявленного способа заключается в том, что оптимизация способа получения биологически активного концентрата осуществляется путем интенсификации процесса ферментативного гидролиза, основанного на использовании двух ферментов (пепсина и папаина) последовательно один за другим, воздействующих на измельченные панты, при этом доказана первоочередность воздействия пепсином, а высокотемпературной экстракции подвергается только жмых (твердая фракция после центрифугирования и фильтрации).
Для выявления оптимальных параметров технологического процесса получения биологически активного концентрата был проведен ряд экспериментальных опытов. Первые два опыта были направлены на выявление оптимальных параметров проведения процесса ферментации консервированных размолотых до частиц размером 100 мкм пантов с использованием в качестве фермента пепсина (1 опыт) при pH -2 и папаина (2 опыт) при pH 4,5. После ферментации отцентрифугированные жмыхи подвергались экстракции при идентичных, для обоих опытов, параметрах процесса экстракции, а именно при соотношении жмых: вода 1:5, в течение 3 часов при температуре 95-98°C с последующей сушкой гидролизата и экстракта (после центрифугирования и фильтрации) при температуре не выше 50°C и вакууме 0,9 атм. После каждого смешивания пантов и жмыхов проводили гомогенизацию смеси, а в процессе ферментирования - перемешивание.
В таблице 1 приведены результаты первого опыта, а именно выход концентрата и его биологическая активность при соотношении панты:вода 1:1,5; 1:3; 1:4,5, времени ферментации 3, 4, 5 часов и содержании пепсина 1,5, 2,0, 2,5% от количества размолотых пантов. Процесс ферментации проводили при 40°C.
Таблица 1
Выход концентрата и биологическая активность, %
№ опыта
Фермент
Количество фермента, %
Выход концентрата, % и его биологическая активность, % при соотношении панты: вода и времени ферментации, час
1: 1,5
1:3,0
1:4,5
3
4
5
3
4
5
3
4
5
1,5
<img file="00000001.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000002.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000003.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000004.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000005.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000006.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000007.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000008.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000009.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
1
пепсин
2,0
<img file="00000010.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000011.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000012.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000013.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000014.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000015.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000016.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000017.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000018.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
2,5
<img file="00000019.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000020.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000021.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000022.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000023.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000024.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000025.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000026.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000027.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примечание: числитель - выход концентрата, %; знаменатель - биологическая активность, %
Как видно из таблицы 1, максимальный выход и биологическая активность готового концентрата наблюдались при следующих технологических параметрах процесса: количество пепсина - 2% от веса пантов, при соотношении консервированные панты:вода 1:3 и длительности процесса ферментации 4 часа с последующей (после центрифугирования и фильтрации) экстракцией жмыха при соотношении жмых:вода 1:5 в течение 3 часов при температуре 95-98°C и сушке фильтратов при температуре не выше 50°C и вакууме 0,9 атм.
В таблице 2 приведены аналогичные результаты второго опыта, где в качестве фермента был использован папаин, а в связи со спецификой его свойств и согласно предварительным исследованиям время ферментации составило 4, 5 и 6 часов.
Таблица 2
Выход концентрата и биологическая активность, %
№ опыта
Фермент
Количество фермента, %
Выход концентрата, % и его биологическая активность, % при соотношении панты: вода и времени ферментации, час
1:1,5
1:3,0
1:4,5
4
5
6
4
5
6
4
5
6
1,5
<img file="00000028.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000029.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000030.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000031.tif" he="12" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000032.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000033.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000034.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000035.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000036.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
1
папаин
2,0
<img file="00000037.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000038.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000039.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000040.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000041.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000042.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000043.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000044.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000045.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
2,5
<img file="00000046.tif" he="13" wi="9" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000047.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000048.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000049.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000050.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000051.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000052.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000053.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000054.tif" he="13" wi="10" img-content="undefined" img-format="tif" />
Примечание: числитель - выход концентрата, %; знаменатель - биологическая активность, %
Оптимальными технологическими параметрами процесса, как видно по результатам таблицы 2, при использовании в качестве фермента папаина являются: количество папаина - 2%, соотношение панты:вода 1:1,5 и время процесса ферментации 6 часов.
Пепсин - протеолитический фермент класса гидролаз, который расщепляет центральные пептидные связи в молекулах белков и пептидов с образованием более простых пептидов и свободных аминокислот, таких как тирозин и фенилаланин, однако в отличие от других протеолитических ферментов строгой специфичностью не обладает. Действие пепсина осуществляется в среде с рН 1-2.
Папаин - способен гидролизовать практически любые пептидные связи и расщеплять белки глубже, чем протеазы животного происхождения, за исключением связей, образованных остатками пролина. При этом в своем составе содержит 212 аминокислотных остатков, тем самым заведомо обогащая готовый продукт. Действие папаина осуществляется в среде с pH 4,5.
Третий и четвертый опыты были направлены на выявление возможности проведения ферментативного гидролиза двумя видами ферментов для интенсификации процесса, а также на выявление оптимальной последовательности ввода ферментов в процесс.
В таблице 3 приведены опытные (опыт 3) данные процесса получения биологически активного концентрата, при получении которого на размолотые консервированные панты воздействовали сначала пепсином при оптимальных параметрах технологического процесса (согласно данным первого опыта), а далее, после центрифугирования и фильтрации гидролизата, жмых подвергался воздействию папаина (в технологическом режиме второго опыта).
Таблица 3
Выход концентрата и биологическая активность, %
№ опыта
фермент
Количество фермента, %
Соотношение панты:вода
Время фермента, час
Выходконцентра та, %
Биологическая активность, %
3
пепсин
2,0
1:3
4
-
-
2,0
1:1,5
4
43,5
38,4
папаин
2,0
1:1,5
5
40,9
35,6
2,0
1:1,5
6
39,1
34,1
Как видно из таблицы 3, оптимальный результат по выходу концентрата и его биологической активности при использовании двух ферментов (при первоочередности ввода в процесс пепсина) составил 43,5% - выход концентрата и 38,4% - биологическая активность. Оптимальный режим при этом характеризуется следующими параметрами: на первом этапе - воздействие пепсином в дозе 2% от веса размолотых пантов при соотношении панты:вода 1:3 в течение 4 часов при температуре 40°C, на втором этапе - воздействие на жмых отцентрифугированный и отфильтрованный из гидролизата после первого этапа папаином в соотношении жмых:вода 1:1,5 в течение 4 часов при температуре 40°C. Экстракции подвергался жмых после второго этапа по ранее описанному технологическому режиму.
Время ферментации папаином (при оптимальном результате) сокращалось на 2 часа по сравнению со вторым опытом, скорее всего из-за предварительного воздействия на панты и пепсином, активно расщепляющим практически все пептидные связи.
Аналогичный опыт, с той лишь разницей, что в качестве первого фермента вводимого в процесс использован папаин, отражен в таблице 4.
Таблица 4
Выход концентрата и биологическая активность, %
№ опыта
фермент
Количество фермента, %
Соотношение панты:вода
Время фермента, час
Выход концентрата, %
Биологическая активность, %
4
папаин
2,0
1:3
6
-
-
пепсин
2,0
1:1,5
3
35,4
30,5
2,0
1:1,5
4
32,6
28,8
2,0
1:1,5
5
32,0
28,0
По результатам четвертого опыта, где выход концентрата и его биологическая активность были значительно ниже, чем в третьем опыте, следует, что оптимальной последовательностью ввода ферментов при совместном ферментативном гидролизе является: на первой стадии ферментации - пепсин, на второй - папаин.
Исходя из четырех опытов следует отметить, что оптимальным режимом получения биологически активного концентрата является воздействие на первой стадии на размолотые панты ферментом пепсином в количестве 2% от веса пантов при разведении (соотношении) панты:вода 1:3 при времени ферментации 4 часа и после центрифугирования и фильтрации гидролизата воздействие на жмых пепсином (2 стадия) в количестве 2% от первоначального веса пантов при разведении (соотношении) жмых:вода 1:1,5 в течение 4 часов при последующей экстракции отцентрифугированного и отфильтрованного (после окончания второй стадии ферментации) жмыха при соотношении жмых:вода 1:5 в течение 3 часов при температуре 95-98°C и сушкой сборных фильтратов при температуре не выше 50°C и вакууме 0,9 атм, таблица 5.
Пример. Один килограмм консервированных пантов измельчали на костедробилке, а затем на мельнице до частиц размером 100 мкм. Далее к 1 кг пантовой муки добавили 3 л дистиллированной воды (соотношение 1:3) и 20 г пепсина и гомогенизировали смесь в течение 5 минут, ферментацию проводили при температуре 40°C в течение 4 часов после гомогенизации и постоянном, каждые 30 минут, перемешивании, по окончании процесса гидролизат подвергали центрифугированию и фильтрованию. В полученный жмых, смешанный с водой в соотношении 1: 1,5, вносили 20 г папаина активностью 30 тыс. ЕД и ферментировали при температуре 40°C в течение 4 часов при постоянном, каждые 30 минут, перемешивании, далее гидролизат центрифугировали и фильтровали. К полученному жмыху добавляли воду в соотношении 1: 5 и экстрагировали смесь в течение 3 часов при температуре 95-98°C с последующими центрифугированием и фильтрацией. Сушку всех полученных фильтратов проводили в вакуумной сушилке при температуре не выше 50°C и давлении 0,9 атм до влажности 4-5%. Концентрат упаковывали в герметичную вакуумную упаковку.
Таким образом, технологические приемы заявленного способа получения концентрата из консервированных пантов обеспечивают высокий 43,5% выход концентрата (при его высокой биологической активности - 38,4%), что выше на 30,8%, чем по известным технологиям.