НАБОР ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, НАБОР ЗОНДОВ И НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НОВОГО ТИПА КОРОНАВИРУСА COVID-19 И СПОСОБ ЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ
SET OF PRIMERS FOR DETECTING NUCLEIC ACIDS, A SET OF PROBES AND A SET FOR DETECTING A NEW TYPE OF COVID-19 CORONAVIRUS AND A METHOD FOR DETECTING IT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001]
Настоящее изобретение относится к области техники выявления вируса и, в частности, к набору праймеров (реагентов) для обнаружения нуклеиновых кислот, набору зондов, набору для выявления нового типа коронавируса COVID-19 и к способу его выявления.
ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002]
Новый тип коронавируса относится к роду β-коронавирусов, при этом он включает оболочки, частицы округлой или овальной, зачастую плеоморфной формы диаметром 60-140 нм, и его геномная последовательность представляет собой одноцепочечную РНК (29903bp), а его генетические характеристики безусловно отличаются от характеристик SARSr-CoV и MERSr-CoV. Результаты последних исследований продемонстрировали, что степень гомологии с SARS-подобным коронавирусом, который заражает летучих мышей (bat-SL-CoVZC45) составляет более 85%. На основе последних эпидемиологических исследований было установлено, что инкубационный период заболевания составляет 1-14 дней, в большинстве случаев 3-7 дней, сопровождаемый повышенной температурой, слабостью и сухим кашлем в качестве основных симптомов его проявления. У некоторых пациентов может отмечаться заложенность носа, боль в горле, диарея и т.д. У тяжёлых пациентов зачастую развивается одышка и (или) гипоксемия через одну неделю после проявления болезни. В тяжелых случаях проявление указанных симптомов сопровождается развитием острого респираторного дистресс-синдрома, септического шока, трудно устранимого метаболического ацидоза, нарушением свертываемости крови и т.д.
[0003]
Новый тип коронавируса (COVID-19) вызывает острое респираторное инфекционное заболевание, при этом заболевание было отнесено к инфекционным заболеваниям Класса B, предусмотренным в «Законе Китайской Народной Республики о профилактике и борьбе с инфекционными заболеваниями», и лечение данного заболевания относится к инфекционным заболеваниям Класса B. Во всем мире складывается тяжелая ситуация, характеризующаяся прогрессированием пневмонии, вызываемой новым типом коронавируса, число подтвержденных и предполагаемых случаев заболевания постоянно растет, огромная нагрузка ложится на лечебно-диагностические учреждения, при этом новый тип коронавируса может представлять угрозу заражения в течение продолжительного периода времени. В этой связи разработка высокочувствительной системы для выявления нового типа коронавируса способствует принятию мер профилактики и контроля заболевания, вызываемого новым типом коронавируса, эффективной охраны здоровья и обеспечения безопасности людей, а также содействует общей экономической и социальной стабильности.
[0004]
С начала 2020 года также публиковались материалы, содержащие информацию о наборах праймеров для выявления нового типа коронавируса (COVID-19). Например, в заявке № CN111057797A, поданной 19 января 2020 г. и опубликованной 24 апреля 2020 г., были раскрыты праймеры и зонды, наборы и способы количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени для выявления нового типа коронавируса 2019-nCoV; например, в заявке № CN111118228A, поданной 31 марта 2020 г. и опубликованной 8 мая 2020 г., раскрывался набор для обнаружения нуклеиновой кислоты нового типа коронавируса COVID-19 и способ его применения, а также были
2
опубликованы аналогичные заявки. Тем не менее, с точки зрения применения в клинической практике степень точности является низкой, и существует вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005]
Цель настоящего изобретения заключается, по меньшей мере, в разрешении проблем предшествующего уровня техники, связанных с необходимостью повышения точности обнаружения и снижения вероятности получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов.
[0006]
В той связи первая цель настоящего изобретения заключается в создании набора праймеров для обнаружения нуклеиновых кислот нового типа коронавируса COVID-19, содержащего две пары специфических праймеров, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности:
[0007]
пара специфических праймеров для фрагмента гена ORF1ab вируса:
[0008]
ORF1ab-F: как показано в SEQ ID NO: 1,
[0009] 5′-TTTAGTTCCCTTCCATCATATGCA-3′;
[0010]
ORF1ab-R: как показано в SEQ ID NO: 2;
[0011] 5′-ATTCAGATTTAGCCACATTCAAAGA-3′;
[0012]
пара специфических праймеров для сегмента гена N вируса:
[0013]
N-F: как показано в SEQ ID NO: 3,
[0014] 5′-ATTGCACAATTTGCCCCCAG-3′;
[0015]
N-R: как показано в SEQ ID NO: 4.
[0016] 5′-CATCCAATTTGATGGCACCTG-3′.
[0017]
Набор праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, предлагаемый настоящим изобретением, обладает, по меньшей мере, нижеприведенными преимуществами.
[0018]
Две пары специфических праймеров соответственно нацелены на высококонсервативную область гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. Обнаружение фрагментов гена ORF1ab и гена N может помочь в диагностировании инфекции, вызванной новым типом коронавируса. При этом путем оптимизации последовательности праймеров может быть повышена чувствительность выявления нового типа коронавируса, а также может быть предотвращена вероятность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов. В соответствии со стандартной кривой могут быть обнаружены положительные пробы с минимальной концентрацией 15 копий/мл.
[0019]
Вторая цель настоящего изобретения заключается в создании набора зондов, используемых в комбинации с набором праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, включающего следующие зонды:
[0020]
зонд для фрагмента гена ORF1ab вируса:
[0021]
ORF1ab-P: как показано в SEQ ID NO: 5,
[0022] 5′-TTTTGCTACTGCTCAAGAAGCTTATGAGC-3′;
[0023]
зонд для фрагментов гена N вируса:
[0024]
N-P: как показано в SEQ ID NO: 6,
[0025] 5′-TTCTTCGGAATGTCGCGCATTG-3′.
[0026]
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения каждый 5’-конец зонда мечен флуоресцентной репортерной группой, и каждый 3’-конец зонда мечен флуоресцентной тушащей группой.
[0027]
В процессе амплификации в ПЦР, если зонд является интактным, ввиду того, что флуоресцентная тушащая группа расположена в
непосредственной близости от флуоресцентной репортерной группы, флуоресценция, излучаемая флуоресцентным репортерным геном, поглощается тушащей группой, в результате чего флуоресцентный сигнал не излучается. При удлинении праймера зонд, связанный с матрицей, обрезается ферментом Taq (5'→3' экзонуклеазная активность), флуоресцентная репортерная группа отделяется от флуоресцентной тушащей группы, в результате чего генерируется флуоресцентный сигнал. Прибор для проведения количественной ПЦР с флуоресцентной детекцией автоматически вычерчивает кривую амплификации в реальном времени на основе детектированного флуоресцентного сигнала, с целью выявления нового типа коронавируса на уровне нуклеиновых кислот. Результаты теста могут быть качественными или количественными, и качественное выявление нового типа коронавируса может быть осуществлено путем непосредственного определения наличия или отсутствия соответствующей кривой амплификации. Соответствующая стандартная кривая может быть вычерчена в соответствии с значением порогового цикла различных стандартных градиентов концентрация, в то время как количественные результаты могут быть получены путем вычисления значения порогового цикла пробы. Кроме того, основываясь на общем понимании в данной области техники, флуоресцентные репортерные группы различных зондов могут различаться таким образом, чтобы амплификация различных фрагментов генов в одной реакционной пробирке обеспечивала генерирование флуоресцентных сигналов различных диапазонов длин волн для упрощения процесса выявления нового типа коронавируса.
[0028]
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 5’-конец зонда для фрагмента гена ORF1ab-P вируса мечен флуоресцентной репортерной группой FAM, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой BHQ1; 5’-конец зонда для фрагмента гена NP мечен флуоресцентной репортерной группой HEX, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой BHQ1.
[0029]
Третья цель настоящего изобретения заключается в создании набора для выявления нового типа коронавируса COVID-19, при этом набор для выявления нового типа коронавируса включает вышеупомянутый набор праймеров и вышеупомянутый набор зондов.
[0030]
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса дополнительно включает пару праймеров внутреннего стандарта и зонд внутреннего стандарта;
[0031]
из них, нуклеотидная последовательность пары праймеров внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
[0032]
RNP-F: как показано в SEQ ID NO: 7,
[0033] 5′- AGATTTGGACCTGCGAGCG-3′;
[0034]
RNP-R: как показано в SEQ ID NO: 8,
[0035] 5′-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3′;
[0036]
нуклеотидная последовательность зонда внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
[0037]
RNP-P: как показано в SEQ ID NO: 9,
[0038] 5′-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3′.
[0039]
Внутренним стандартом, используемым в наборе, является рибонуклеотид человека P (РНаза P, рибонуклеопротеин (RNP)). Внутренний стандарт используют для определения того, получена ли ткань подходящего пациента или проба секреции. Весь экспериментальный процесс сбора, транспортировки и экстракции тестируемых проб находится
под полным контролем во избежание получения ложноотрицательных результатов теста.
[0040]
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 5’-конец RNP-P мечен флуоресцентной репортерной группой, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой.
[0041]
Флуоресцентная репортерная группа зонда внутреннего стандарта также может быть группой, отличающейся от флуоресцентной репортерной группы вышеупомянутого зонда выявления нового типа коронавируса, например, TEXAS RED, и BHQ2 выбран для флуоресцентной тушащей группы. Таким образом, обеспечивается детектирование флуоресценции в канале (красителе) TEXAS RED/ROX.
[0042]
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемый настоящим изобретением, дополнительно включает смесь фермента ОT-ПЦР и буфера для ОТ-ПЦР.
[0043]
В предпочтительном варианте осуществления набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемый настоящим изобретением, дополнительно включает пробу положительного контроля и пробу отрицательного контроля. Проба положительного контроля способна полностью амплифицировать фрагмент гена-мишени, соответствующий праймеру, в процессе амплификация, такой как стандартный штамм инактивированного вируса, плазмиды, содержащие соответствующей фрагмент гена-мишени (фрагмент гена ORFlab, фрагмент гена N, фрагмент гена RNP) и т.д. Проба отрицательного контроля представляет собой воду, используемую для растворения матричной РНК, например, воду, обработанную диэтилпилокарбонатом.
[0044]
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемого настоящим изобретением, дополнительно включает реагент для экстракции нуклеиновых кислот. Экстракция вирусных нуклеиновых кислот в пробе осуществляется с помощью соответствующего реагента для экстракции нуклеиновых кислот с целью обеспечения проведения последующих процессов амплификации и обнаружения.
[0045]
Четвертая цель настоящего изобретения заключается в создании способа выявления нового типа коронавируса с использованием вышеупомянутого набора для выявления указанного вируса.
[0046]
Способ выявления нового типа коронавируса включает следующие этапы:
[0047]
выделение тотальной РНК из тестируемых проб;
[0048]
использование тестируемых проб тотальной РНК в качестве матрицы; использование вышеупомянутого набора праймеров для амплификации и для выявления набора зондов в ПЦР после обратной транскрипции;
[0049]
проведение анализа продуктов амплификации и определение того, содержат ли тестируемые пробы новый тип коронавируса в зависимости от появления кривой амплификации.
[0050]
В соответствии со способом выявления нового типа коронавируса в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения программа реакции амплификации в ПЦР составляет 50°С, 5 мин; 95°С, 10 сек; 95°С, 5 сек; 60°С, 30 сек; с 40 циклами.
[0051]
Способ ОТ-ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией занимает только 1 час и 10 минут, начиная от экстракции нуклеиновых кислот до завершения выявления нового типа коронавируса. Способ является легким в использовании, характеризуется высокой
чувствительностью и представляет собой оперативный и эффективный лабораторный способ выявления нового типа коронавируса для диагностики инфекционного заболевания.
[0052]
Две пары специфических праймеров соответственно нацелены на высококонсервативную область гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. Выявление фрагментов гена ORF1ab и гена N позволяет диагностировать инфекцию, вызываемую новым типом коронавируса. При этом путем оптимизации последовательности праймеров может быть повышена чувствительность обнаружения нового типа коронавируса, снижена вероятность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов и вероятность необнаружения нового типа коронавируса.
[0053]
Вышеупомянутые способы выявления нового типа коронавируса с использованием вышеупомянутых наборов могут найти применение для дополнительной диагностики нового типа коронавируса, в результате чего может быть обеспечено оперативное получение информации о вспышках эпидемии, вызываемой новым типом коронавируса, и оказано надежное техническое содействие, направленное на проведение профилактических мер и мер по борьбе с эпидемией, вызываемой новым типом коронавируса. Этот фактор имеет первостепенное значение для предотвращения будущих вспышек заболевания, вызываемых неизвестными новыми типами коронавируса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0054]
На Фиг. 1 проиллюстрированы результаты амплификации с использованием набора мультиплексного ПЦР-анализа (Multiplex PCR Kit) для выявления нового типа коронавируса в соответствии с примером настоящего изобретения.
[0055]
На Фиг. 2 проиллюстрирована стандартная кривая и кривая амплификации одной и той же пробы при различных концентрациях разведения. На Фиг. 2-1 представлена стандартная кривая, основанная на кривой амплификации Фиг. 2-2, при этом концентрация положительных плазмид составляет 4 мкг\мл, и соответствующее количество копий составляет 1* 1010 копий/мл, C1~C7 соответствует 1*102~8 копий/мл после многократного разведения; взяв значение порогового цикла (Ct)<40 в качестве отрицательного критерия, предел выявления нового типа коронавируса с использованием разработанного набора составляет 15 копий/мл.
[0056]
На Фиг. 3 проиллюстрировано, что для экстракции РНК использовали исходный раствор положительной пробы D с применение соответственно разработанных наборов, набора A (Фиг. 3-1), набора B (Фиг. 3-2) и набора C (Фиг. 3-3), произвольно выбранных на рынке. Условия амплификации соответственно амплифицировали согласно инструкциям к наборам A, B и C. Пробу D протестировали как положительную для всех наборов. Значение порогового цикла набора настоящего изобретения ниже по сравнению с произвольно выбранными наборами, и при этом его чувствительность выше.
[0057]
На Фиг. 4-1 проиллюстрировано, что исходный раствор положительной пробы D разводили 8 раз для экстрагирования РНК в качестве матрицы и использовали разработанный набор и набор A, произвольно выбранный на рынке. Реакционная система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору A; разработанный набор отличался максимальным значением порогового цикла чувствительности (Ct), составлявшим 36,2, что рассматривалось как положительная проба.
Значение порогового цикла набора A достигало 38,3, и это определялось как сомнительная проба в соответствии с инструкциями к набору.
[0058]
На Фиг. 4-2 проиллюстрировано, что положительную пробу D разбавляли для экстрагирования РНК в качестве матрицы, и соответственно использовали разработанный набор (набор настоящего изобретения) и набор B, произвольно выбранный на рынке (Фиг. 4-2). Система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору B, максимальное значение порогового цикла чувствительности разработанного набора составляло 36,4, что рассматривалось как положительная проба. Значение порогового цикла набора B превысило 40, и это определялось как отрицательная проба в соответствии с инструкциями к набору, что приводило к ложноотрицательным результатам.
[0059]
На Фиг. 4-3 проиллюстрировано, что исходный раствор положительной пробы D разводили 8 раз для экстрагирования РНК в качестве матрицы. Соответственно использовали разработанный набор и набор C, произвольно выбранный на рынке (Фиг. 4-3). Система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору C. Максимальное значение пороговое цикла чувствительности разработанного набора составляло 38,2, и это определялось как сомнительная проба. Значение порогового цикла чувствительности набора C превысило 40, и это определялось как отрицательная проба в соответствии с инструкциями к набору, что приводило к ложноотрицательным результатам.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0060]
Ниже приведено ясное и полное описание идеи настоящего изобретения и достигаемые технические эффекты со ссылкой на варианты осуществления для полного понимания целей, характерных особенностей и эффектов настоящего изобретения. Безусловно, описанные варианты осуществления настоящего изобретения являются лишь частью вариантов осуществления настоящего изобретения, а не всеми из них. Исходя из вариантов осуществления настоящего изобретения, другие варианты осуществления настоящего изобретения, созданные специалистами в данной области техники без осуществления изобретательской деятельности, относятся к объему правовой охраны настоящего изобретения.
[0061]
Пример 1
[0062]
В примере предлагается набор праймеров и зондов для выявления нового типа коронавируса. На основе технологии TaqMan с использованием флуоресцентных зондов, соответствующие специфические праймеры для выявления нового типа коронавируса и зонды Taqman могут быть разработаны на основе высококонсервативных областей гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. При этом, при использовании РНП человека в качестве внутреннего стандарта могут быть разработаны соответствующие пары праймеров и зонды внутреннего стандарта. Детальная информация приведена в Таблице 1 ниже:
[0063]
Таблица 1: Информация о праймерах и зондах
Наименование последовательности
Последовательность
ORF1ab-F
5′-TTTAGTTCCCTTCCATCATATGCA-3′
ORF1ab-R
5′-ATTCAGATTTAGCCACATTCAAAGA-3′
ORF1ab-P
5′FAM-TTTTGCTACTGCTCAAGAAGCTTATGAGC-3′BHQ1
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ХУЧЖОУ СЕНТРAЛ ХОСПИТЕЛ
ХУЧЖОУ СЕНТЕР ФОР ДИЗИЗ КОНТРОЛ ЭНД ПРИВЕНШН
<120>   НАБОР ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ,
НАБОР ЗОНДОВ И НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НОВОГО ТИПА КОРОНАВИРУСА COVID-19
И СПОСОБ ЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ
<141>  2020-12-02
<160>  9
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(24)
<223>  ORF1ab-F
<400>  1
tttagttccc ttccatcata tgca                                               24
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(25)
<223>  ORF1ab-R
<400>  2
attcagattt agccacattc aaaga                                              25
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(20)
<223>  N-F
<400>  3
attgcacaat ttgcccccag                                                    20
<210>  4
<211>  21
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(21)
<223>  N-R
<400>  4
catccaattt gatggcacct g                                                  21
<210>  5
<211>  29
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(29)
<223>  ORF1ab-P
<400>  5
ttttgctact gctcaagaag cttatgagc                                          29
<210>  6
<211>  22
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(22)
<223>  N-P
<400>  6
ttcttcggaa tgtcgcgcat tg                                                 22
<210>  7
<211>  19
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(19)
<223>  RNP-F
<400>  7
agatttggac ctgcgagcg                                                     19
<210>  8
<211>  20
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(20)
<223>  RNP-R
<400>  8
gagcggctgt ctccacaagt                                                    20
<210>  9
<211>  23
<212>  DNA
<213>  искусственная последовательность
<220>
<222>  (1)..(23)
<223>  RNP-P
<400>  9
ttctgacctg aaggctctgc gcg                                                23
<---