СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕТЕРОМУЛЬТИМЕРНЫХ МОДИФИЦИРОВАННЫХ УБИКВИТИНОВЫХ БЕЛКОВ СО СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬСЯ С ЛИГАНДАМИ

1. Способ идентификации гетеромультимерного модифицированного убиквитина со способностью связываться с лигандом, включающий следующие этапы:
a) предоставление популяции гетеромультимерного модифицированного убиквитина, происходящего от мономерных модифицированных убиквитиновых белков, включающих два или больше мономеров убиквитина, связанных между собой по схеме голова к хвосту, в которой по меньшей мере один из упомянутых мономеров упомянутого гетеромультимерного белка модифицирован по-разному по меньшей мере путем замещений поверхностно открытых аминокислот по меньшей мере в трех аминокислотах, расположенных в положениях 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 и 68 SEQ ID NO:1, причем упомянутый модифицированный мономерный белок имеет идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% с немодифицированным убиквитиновым белком;
b) предоставление потенциального лиганда для упомянутой популяции по-разному модифицированных белков;
c) контакт упомянутой популяции по-разному модифицированных белков с упомянутым лигандом;
-7
-12
d) идентификация гетеромультимерного модифицированного белка процессом скрининга, причем упомянутый модифицированный гетеромультимерный белок связывается с упомянутым лигандом со специфическим сродством связывания Kd в диапазоне 10-10 М и проявляет одновалентную связывающую активность в отношении упомянутого лиганда; и, по выбору,
e) изоляция упомянутого гетеромультимерного модифицированного убиквитина с упомянутым сродством связывания.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутым гетеромультимерным белком является гетеродимерный или гетеротримерный белок.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутый модифицированный мономерный белок включает одну или несколько вставок вместе от 1 до 10 аминокислот и/или одно или несколько изъятий вместе от 1 до 7 аминокислот, кроме того, по выбору, отличающийся тем, что упомянутый модифицированный мономерный убиквитиновый белок включает по меньшей мере 6 и максимум 14 замещений аминокислот, и отличающийся тем, что упомянутый модифицированный гетеродимерный убиквитиновый белок включает вместе по меньшей мере 12 и максимум 28 замещений, и/или включает вместе по меньшей мере 1 и максимум 20 вставок, и/или по меньшей мере 1 и максимум 14 изъятий.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутый модифицированный мономерный белок включает одну или несколько вставок вместе от 1 до 10 аминокислот и/или одно или несколько изъятий вместе от 1 до 7 аминокислот, кроме того, по выбору, отличающийся тем, что упомянутый модифицированный мономерный убиквитиновый белок включает по меньшей мере 6 и максимум 14 замещений аминокислот, и отличающийся тем, что упомянутый модифицированный гетеродимерный убиквитиновый белок включает вместе по меньшей мере 12 и максимум 28 замещений, и/или включает вместе по меньшей мере 1 и максимум 20 вставок, и/или по меньшей мере 1 и максимум 14 изъятий.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что упомянутый модифицированный мономерный убиквитиновый белок получают путем генетической инженерии ДНК, отвечающей за получение убиквитина, и экспрессии упомянутого белка в прокариотических или эукариотических организмах или in vitro.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что упомянутый мультимерный белок получают способом выбора in vitro, которым предпочтительно является дисплейный способ, по выбору фаговый дисплей, рибосомный дисплей, фаговый дисплей ТАТ, дрожжевой дисплей, бактериальный дисплей, дисплей поверхности клетки или способ дисплея мРНК.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутым лигандом является антиген или гаптен.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что дальнейшие 1-7 дополнительных аминокислот замещают по меньшей мере в одном из мономерных убиквитиновых белков, которые, по выбору, выбирают из одной или нескольких аминокислот в положениях 36, 44, 70, 71, и, по выбору, дополнительно 62, 63, и 64, или 72 и 73, или 8 SEQ ID NO:1.
-7
-12
9. Способ п.1, отличающийся тем, что упомянутую популяцию гетеромультимерных составных белков убиквитина получают путем генетического слияния двух ДНК-библиотек, каждая из которых отвечает за получение по-разному модифицированных мономерных белков, трансляции этой ДНК в гетеромультимерные составные белки, дисплей упомянутых белков и скрининг дисплейных белков на присутствие модифицированных гетеромультимерных убиквитиновых белков, включающих мономерные убиквитиновые белки, соединенные между собой по схеме голова к хвосту, и отличающийся тем, что упомянутые модифицированные гетеромультимерные убиквитиновые белки связываются с упомянутым лигандом со специфическим сродством связывания Kd в диапазоне 10-10 М и проявляют одновалентным связывающую активность в отношении упомянутого лиганда или отличающийся тем, что упомянутую популяцию гетеромультимерных составных белков убиквитина получают химическим синтезом белков.
10. ДНК-библиотека, содержащая ДНК, отвечающую за получение популяции гетеромультимерных убиквитиновых составных белков, происходящих из мономерных убиквитинов, причем каждый мультимерный белок включает два или больше модифицированных мономеров убиквитина, соединенных между собой по схеме голова к хвосту, отличающаяся тем, что по меньшей мере два из каждого из упомянутых мономеров упомянутого мультимерного белка по-разному модифицированы по меньшей мере путем замещений поверхностно открытых аминокислот по меньшей мере в трех аминокислотах, расположенных в положениях 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 и 68 SEQ ID NO:1, причем упомянутый модифицированный мономерный белок имеет идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% с немодифицированным белком.
11. Библиотека белков, полученная путем экспрессии ДНК-библиотеки по п.10.
12. Прокариотическая или эукариотическая клетка или популяция фагов, содержащая ДНК-библиотеку или библиотеку белков по п.10 или 11.
13. Полинуклеотид, отвечающий за получение составного белка из упомянутой библиотеки белков по п.11.
14. Вектор, включающий полинуклеотид по п.13.