SLIT-ROBO СИГНАЛИНГ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПОЧЕК
SLIT-ROBO SIGNALLING FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF KIDNEY DISEASE

Ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 USC §119 предварительной заявки на выдачу патента США 61/583379, поданной 5 января 2012 г., полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Область техники настоящего изобретения относится к способам лечения хронического заболевания почек и протеинурии и диагностики хронического заболевания почек и мониторинга эффектов лечения на прогрессирование хронического заболевания почек и протеинурии.
Правительственная поддержка
Настоящее изобретение было выполнено при правительственной поддержке согласно договору № DK078226, предоставленному Национальным Институтом Здоровья. Правительство обладает определенными правами на настоящее изобретение.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение предоставляет новые способы лечения хронического заболевания почек и протеинурии, а также диагностики хронического заболевания почек, и мониторинга эффектов лечения на прогрессирование хронического заболевания почек и протеинурии, основанные, в частности, на открытии исследователями новой и неожиданной роли сигнального пути SLIT-ROBO в регуляции F-актинового цитоскелета и структуры ножек подоцитов в почке.
Соответственно, согласно некоторым аспектам настоящей заявки предусмотрены способы лечения хронического заболевания почек у нуждающегося в этом субъекта, способы, предусматривающие введение субъекту, характеризующемуся наличием или риском развития хронического заболевания почек, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей ингибитор ROBO2.
Также согласно некоторым аспектам настоящей заявки предусмотрен способ для уменьшения протеинурии у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающий введение субъекту, характеризующемуся наличием или риском развития протеинурии терапевтически эффективного количества композиции, содержащей ингибитор ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов ингибитор ROBO2 представляет собой специфическое к ROBO2 блокирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфическую к ROBO2 антисмысловую молекулу, специфическую к ROBO2 короткую интерферирующую РНК (siPHK), небольшую молекулу-ингибитор ROBO2, ингибирующий ROBO2 полипептид или структурный аналог ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов ингибитор ROBO2 блокирует или уменьшает связывание ROBO2 с SLIT, С Nck или с обоими.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов ингибитор ROBO2 специфичен к SLIT-связывающему домену Ig1, SLIT-связывающим доменам Ig1 и Ig2, внутриклеточному Nck-связывающему домену или любой их комбинации.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов ингибирующий ROBO2 полипептид представляет собой доминантно-негативный слитый белок ROBO2, полипептид, содержащий внеклеточный домен ROBO2 без внутриклеточного домена, или полипептид, содержащий внутриклеточный домен ROBO2 без внеклеточного домена.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов субъект, характеризующийся наличием или риском развития хронического заболевания почек, имеет диабетическую нефропатию или высокое кровяное давление.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов способ дополнительно предусматривает введение субъекту дополнительного терапевтического средства.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов дополнительное терапевтическое средство представляет собой ангиотензин-превращающий фермент (angiotensin-converting enzyme - АСЕ) или блокатор рецепторов ангиотензина II (angiotensin II receptor blocker - ARB).
Также в настоящей заявке согласно некоторым аспектам предусмотрены способы, предусматривающие:
а. анализ биологического исследуемого образца от субъекта для определения уровня экспрессии полипептида ROBO2 или РНК, кодирующей полипептид ROBO2;
b. определение, выше ли уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК в биологическом исследуемом образце, чем эталонный пороговый уровень; и
c. диагностику субъекта как нуждающегося в лечении или терапии хронического заболевания почек.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов анализ уровня экспрессии полипептида ROBO2 выполняется с использованием специфического к полипептиду ROBO2 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов анализ уровня экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК выполняется с использованием ПЦР или гибридизационного анализа.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов исследуемый биологический образец представляет собой биопсию почки, мочу, кровь, сыворотку или осажденные из образца мочи клетки.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК по меньшей мере на 20% выше эталонного порогового уровня.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК по меньшей мере на два стандартных отклонения выше эталонного порогового уровня.
Также в настоящей заявке согласно некоторым аспектам предусмотрены способы анализа, предусматривающие:
a. контактирование выделенного из субъекта биологического исследуемого образца с реагентом, который обнаруживает полипептид ROBO2 или кодирующую полипептид ROBO2 РНК; и
b. измерение содержания полипептида ROBO2 или кодирующей полипептид ROBO2 РНК, где повышенное содержание указанного полипептида ROBO2 или указанной кодирующей полипептид ROBO2 РНК, по отношению к нормальному биологическому образцу, определяет субъекта, характеризующегося наличием хронического заболевания почек и/или прогрессирования хронического заболевания почек или протеинурии.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов анализа и всех подобных описанных в настоящей заявке способов определение уровня экспрессии полипептида ROBO2 выполняется с использованием специфического к полипептиду ROBO2 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов анализа и всех подобных описанных в настоящей заявке способов определение уровня экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК выполняется с использованием ПЦР или гибридизационного способа.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов анализа и всех подобных описанных в настоящей заявке способов исследуемый биологический образец представляет собой биопсию почки, мочу, кровь, сыворотку или осажденные из образца мочи клетки.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов анализа и всех подобных описанных в настоящей заявке способов уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК по меньшей мере на 20% выше эталонного порогового уровня.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов анализа и всех подобных описанных в настоящей заявке способов уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК по меньшей мере на два стандартных отклонения выше эталонного порогового уровня.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов анализа и всех подобных описанных в настоящей заявке способов субъекту был поставлен диагноз диабет или высокое кровяное давление.
Согласно некоторым аспектам в настоящей заявке предусмотрены системы для определения того, характеризуется ли субъект риском развития хронического заболевания почек или протеинурии или характеризуется наличием хронического заболевания почек, предусматривающая:
a. модуль измерения, способный к определению уровня экспрессии полипептида ROBO2 или уровня экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК в полученном от субъекта биологическом образце;
b. модуль сравнения, способный к получению указанного уровня экспрессии полипептида ROBO2 или уровня экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК измерительным модулем и осуществлению по меньшей мере одного способа для определения того, выше ли уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК, чем предопределенный эталонный уровень или соотношение, и к предоставлению извлеченного содержимого; и
с. модуль отображения для отображения содержания, основанного на выходных данных от указанного модуля сравнения, причем содержание содержит сигнал, указывающий, что уровень экспрессии или соотношение полипептида ROBO2 или РНК больше, чем предопределенный эталонный уровень или соотношение, или сигнал, указывающий, что уровень экспрессии или соотношение ROBO2 не больше, чем эталонный уровень или предопределенное соотношение.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих систем и всех подобных описанных в настоящей заявке систем содержание, отображаемое на указанном модуле отображения, дополнительно содержит сигнал, указывающий субъекта, которому рекомендуется получать определенную схему лечения.
Согласно некоторым аспектам в настоящей заявке предусмотрены системы для определения того, характеризуется ли субъект риском развития хронического заболевания почек или протеинурии или характеризуется наличием хронического заболевание почек, предусматривающая:
a. модуль определения, способный к получению по меньшей мере одного полученного от субъекта исследуемого образца и осуществлению по меньшей мере одного способа на указанном по меньшей мере одном исследуемом образце для определения наличия или отсутствия одного из следующих условий:
i. соотношение экспрессии ROBO2 больше предопределенного соотношения,
или
ii. уровень экспрессии ROBO2 больше предопределенного уровня
b. устройство хранения, способное к накоплению выходных данных от указанного модуля определения; и
c. модуль отображения для отображения содержания, основанного на выходных данных из указанного модуля определения, причем содержание содержит сигнал, указывающий, что соотношение экспрессии ROBO2 больше, чем предопределенное соотношение, или содержание ROBO2 больше, чем предопределенное содержание, или сигнал, указывающий, что соотношение экспрессии ROBO2 не больше, чем предопределенное соотношение, или не больше, чем предопределенное содержание.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих систем и всех подобных описанных в настоящей заявке систем содержание, отображаемое на указанном модуле отображения, дополнительно содержит сигнал, указывающий субъекта, которому рекомендуется получать определенную схему лечения.
Также в настоящей заявке согласно некоторым аспектам предусматриваются способы лечения субъекта-человека с риском хронического заболевания почек или протеинурии, предусматривающий введение лечения или терапии для предупреждения возникновения хронического заболевания почек или протеинурии субъекту-человеку, у которого определенное содержание белка ROBO2 выше эталонного порогового содержания.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов содержание белка ROBO2 по меньшей мере на 20% выше эталонного содержания.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов содержание белка ROBO2 по меньшей мере на два стандартных отклонения выше эталонного содержания.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов лечение или терапия для предупреждения возникновения хронического заболевания почек или протеинурии содержит ингибитор ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов ингибитор ROBO2 представляет собой специфическое к ROBO2 блокирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфическую к ROBO2 антисмысловую молекулу, специфическую к ROBO2 короткую интерферирующую РНК (siPHK), небольшую молекулу-ингибитор ROBO2, ингибирущий ROBO2 полипептид или структурный аналог ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов ингибитор ROBO2 блокирует или уменьшает связывание ROBO2 с SLIT, с Nck или с обоими.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов ингибитор ROBO2 характеризуется специфичностью к связывающему домену SLIT Ig1, связывающим доменам SLIT Ig1 и Ig2, внутриклеточному связывающему домену Nck или любой их комбинации.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов ингибирующий ROBO2 полипептид представляет собой доминантно-негативный слитый белок ROBO2, полипептид, содержащий внеклеточный домен ROBO2 без внутриклеточного домена, или полипептид, содержащий внутриклеточный домен ROBO2 без внеклеточного домена.
Также в настоящей заявке согласно некоторым аспектам предусмотрены ингибиторы ROBO2 для применения в лечении хронического заболевания почек и ингибитор ROBO2 для применения в лечении протеинурии.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих применений и всех подобных описанных в настоящей заявке применений ингибитор ROBO2 представляет собой специфическое к ROBO2 блокирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфическую к ROBO2 антисмысловую молекулу, специфическую к ROBO2 короткую интерферирующую РНК (siPHK), небольшую молекулу-ингибитор ROBO2, ингибирующий ROBO2 полипептид или структурный аналог ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих применений и всех подобных описанных в настоящей заявке применений ингибитор ROBO2 блокирует или уменьшает связывание ROBO2 с SLIT, с Nck или с обоими.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих применений и всех подобных описанных в настоящей заявке применений ингибитор ROBO2 специфичен к SLIT-связывающему домену Ig1, SLIT-связывающим доменам Ig1 и Ig2, внутриклеточному Nck-связывающему домену или любой их комбинации.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих применений и всех подобных описанных в настоящей заявке применений ингибирующий ROBO2 полипептид представляет собой доминантно-негативный слитый белок ROBO2, полипептид, содержащий внеклеточный домен ROBO2 без внутриклеточного домена, или полипептид, содержащий внутриклеточный домен ROBO2 без внеклеточного домена.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих применений и всех подобных описанных в настоящей заявке применений хроническое заболевание почек или протеинурия обусловлена диабетической нефропатией или высоким кровяным давлением.
Согласно некоторым вариантам осуществления любого из этих аспектов и всех подобных описанных в настоящей заявке аспектов ROBO2 относится к ROBO2 человека, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, кодируемую последовательностью мРНК SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам любого из этих аспектов и всех подобных описанных в настоящей заявке аспектов ROBO2 относится к ROBO2 человека, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, кодируемую последовательностью мРНК SEQ ID NO: 4.
Определения
Для удобства некоторые термины, используемые в настоящей заявке в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения собраны в настоящем разделе. Если не указано иное или не явно из контекста, следующие термины и фразы включают в себя приведенные ниже значения. Если ясно не указано иное или не очевидно из контекста, приведенные ниже термины и фразы не исключают то значение, которое термин или фраза приобрела в области техники, к которой она относится. Определения предоставляются для помощи в описании определенных вариантов осуществления и не предназначены для ограничения заявленного изобретения, поскольку объем изобретения ограничен только формулой изобретения. Если не определено иначе, все используемые в настоящей заявке технические и научные термины характеризуются тем же значением, что и обычно понимаемое специалистами в настоящей области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Используемый в настоящей заявке термин "содержащий" или "содержит" применяется по отношению к композициям, способам и соответствующему их компоненту(ам), которые существенны для изобретения, все еще открытого для включения неуказанных элементов, как значимых так и нет.
Используемый в настоящей заявке термин "состоящий по существу из" относится к тем элементам, которые необходимы для данного варианта осуществления. Термин допускает наличие дополнительных элементов, которые существенно не влияют на основные и новые или функциональную характеристику(и) этого варианта осуществления настоящего изобретения.
Термин "состоящий из" относится к описанным в настоящей заявке композициям, способам и соответствующим их компонентам, которые исключают любой элемент, не перечисленный в этом описании варианта осуществления.
Используемые в настоящей заявке и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Так, например, ссылки на "способ" включают в себя один или несколько способов и/или стадий описанного в настоящей заявке типа и/или те, которые станут очевидными для специалистов в настоящей области техники после прочтения настоящего раскрытия и так далее.
За исключением рабочих примеров или где не указано иное, все используемые в настоящей заявке числа, выражающие количества ингредиентов или условий реакции, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "приблизительно". Используемый в отношении процентов термин "приблизительно" может означать ±10%, ±5% или ±1%.
th
Если в настоящей заявке не определено иное, используемые в связи с настоящей заявкой научные и технические термины следует характеризовать значениями, которые обычно понятны специалисту в настоящей области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными в настоящей заявке конкретной методологией, протоколами и реагентами и т.д., и как таковые они могут варьировать. Используемая в настоящей заявке терминология предназначена только для целей описания определенных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения. Определения общих терминов в области иммунологии и молекулярной биологии можно найти в The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18 Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006. Определения общих терминов области молекулярной биологии находятся в Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); или Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol. 152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) and Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Следует понимать, что нижеследующее подробное описание и последующие примеры являются только иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Различные изменения и модификации раскрытых вариантов осуществления, которые будут очевидны специалистам в настоящей области техники, могут быть сделаны без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Дополнительно, все патенты, заявки на патенты и определенные публикации специально включены в настоящий документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, описанных в таких публикациях методологий, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Эти публикации приведены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в этой связи не должно быть истолковано как признание того, что изобретатели не озаглавили задним числом такое раскрытие в силу предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все заявления относительно даты или сообщения относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не представляют собой какое-либо подтверждение правильности дат или содержания этих документов.
Краткое описание графических материалов
На фигурах 1A-1R показано, что Robo2 экспрессируется и локализуется на базальной клеточной поверхности подоцитов. Все иммунные окрашивания на (фиг. 1А-1Q) выполняют на мышах в Ε16,5 дней при 600Х увеличении (смотрите фигуры 5А-5М для иммунных окрашиваний клубочков взрослой мыши), (фиг. 1А-1С) Robo2 колокализуется с белком нефрином щелевой диафрагмы подоцитов. (фиг. ID-IF) Robo2 колокализуется с белком подоцином щелевой диафрагмы подоцитов. (фиг. 1G-1I) Robo2 колокализуется с адапторным белком Nck в клубочках, (фиг. 1J-1L) Robo2 экспрессируется на базальной поверхности подоцитов, прилегающей к белку нидогену базальной мембраны клубочков, (фиг. 1М-1O) Robo2 не колокализуется с белком-маркером клубочкового клеточного эндотелия Pecaml. (фиг. 1Р) Увеличенная область, обведенная в (фиг. 1L), показывает, что Robo2 экспрессируется преимущественно на базальной клеточной поверхности (стрелка) подоцитов (р), прилегающих к маркеру базальной мембраны клубочков нидогену. Robo2 слабо экспрессируется на апикальных и латеральных клеточных поверхностях (острие стрелок) подоцитов. (фиг. 1Q) Robo2 экспрессируется преимущественно на базальной клеточной поверхности (стрелки) подоцитов (р) и слабо экспрессируется на апикальных или латеральных клеточных поверхностях (острие стрелок), (фиг. 1R) Электронная микроскопия с иммунологическим окрашиванием золотом показывает локализацию золотых частиц (стрелки), конъюгированных с антителом к Robo2 в ножке (FP) подоцита у 3-недельной мыши. GBM, базальная мембрана клубочков. Увеличение: 50000Х. Смотрите также фигуры 5А-5М.
На фигурах 2A-2J показано, что Robo2 взаимодействует с адапторным белком Nck и образует комплекс с нефрином. (фиг. 2А) Дрожжевые двугибридные анализы показывают положительное взаимодействие между внутриклеточным доменом Robo2 (Robo2-ICD) и Nck1. Репортер LacZ (X-gal): +++, дрожжи потемнели; ++, светлые; -, белые в течение 24 часов. Репортер лейцин (-Leu): +, дрожжи росли; -, дрожжи не росли. СС, цитоплазматическая консервативная область. Цифры указывают положения остатков в полноразмерном белке, (фиг. 2В) Дрожжевые двугибридные анализы показывают, что первые два SH3-домена Nck1 необходимы для его взаимодействия с Robo2-ICD. (фиг. 2С) Дрожжевые двугибридные анализы показывают потенциальные связывающие домены, которые опосредуют взаимодействие Robo2 и Nck1. Последовательность представляет собой потенциальную связывающую область в Robo2 для Nck1. Выделены богатые пролином области, (фиг. 2D) Копреципитация Robo2 и Nck. Клеточные лизаты в полосе 5 собраны из трансфектированных клеток His-myc-Robo2 (использованы в полосах 1 и 2); Клеточные лизаты в полосе 6 собраны из трансфектированных клеток His-myc-Robo2-ANBD (использованы в полосах 3 и 4). (фиг. 2Е) Копреципитация Robo2, Nck и нефрина. (фиг. 2F) Аналогичная копреципитация, как (фиг. 2Е), за исключением того, что His-myc-нефрин осаждали вместо His-Myc-Robo2. (фиг. 2G) Коиммунопреципитация эндогенных Robo2, Nck и нефрина почек, (фиг. 2Н) Аналогичный анализ как (фиг. 2G), за исключением того, что осадки готовят с использованием антитела к нефрину мыши. (I) Slit2 усиливает образование комплекса Robo2-Nck-нефрин. His-Myc-Robo2, нефрин и Fyn экспрессируются в клетках HEK, которые стимулируют кондиционированной Slit2 средой (полосы 1, 3) или контрольной кондиционированной средой (полоса 2, 4). (фиг. 2J) Количественная оценка интенсивности (фиг. 2I). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM; n=7, *р<0,05, **р<0,01, по сравнению с контролем, парный t-критерий Стьюдента. Смотрите также фигуры 6A-6F.
-/-
+/-
+/+
На фигурах 3A-3G показано, что передача сигналов Slit2-Robo2 ингибирует опосредованную нефрином полимеризацию актина. (фиг. 3А) CD16/7-NCD коэкспрессируется с Robo2 в клетках HEK, на которые воздействуют антителом к CD16 и конъюгированным с родамином антителом к IgG в присутствии кондиционированной Slit2 среды (Slit) или контрольной кондиционированной среды (CTL). Затем клетки фиксировали и окрашивали конъюгированным с FITC фаллоидином для выявления F-актина. Шкала, 5 мкм. NCD: цитоплазматический домен нефрина. (фиг. 3В) Аналогичный анализ как (фиг. 3А), за исключением того, что CD16/7-NCD заменяется на CD16/7-HA и используется в качестве контрольного анализа, (фиг. 3С) Количественно определяют процент клеток с хвостами F-актина от общего числа клеток с кластерами CD16/7 в каждой группе. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, *р<0,01, п=5. (Фиг. 3D) CD16/7-NCD в (фиг. 3А) иммунопреципитировали с помощью антитела к CD16 после стимуляции кондиционированной Slit2 средой (полосы 1 и 3) или контрольной кондиционированной средой (полосы 2 и 4). Показано снижение F-актина в полосе 1. CD16/7-HA используют в качестве отрицательного контроля, (фиг. 3Е) Количественная оценка интенсивности (фиг. 3D). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM; n=4, *р<0,05, по сравнению с контролем, парный t-критерий Стьюдента. (фиг. 3F) Иммунопреципитация нефрина из почек Robo2 нокаутных гомозиготных (Robo2), гетерозиготных (Robo2) и дикого типа (Robo2) мышей с использованием антитела к нефрину. Показано увеличение F-актина в полосе 3. (фиг. 3G) Количественная оценка интенсивности (фиг. 3F). Данные представлены в виде среднего значени ± SEM; n=4, *р<0,05, по сравнению с диким типом и гетерозиготой, дисперсионный анализ. Смотрите также фигуры 7А-7С.
del5/flox
Nphs2-Cre+
del5/flox
Nphs2-cre+
del5/flox
Nphs2-Cre+
-/-
-/-
-/-
-/-
На фиг. 4A-4W показаны структурные фенотипы подоцитов у Robo2 гомозиготных нулевых, Robo2 подоцит-специфических нокаутных по и Robo2 и Nphsl двойных нокаутных мышей, (фиг. 4А и 4В) На репрезентативных изображениях почек новорожденных показаны тела подоцитов (острие стрелок) и капсула Боумена (стрелки) у мышей дикого типа (фиг. 4А) и Robo2 гомозиготных нулевых мышей (фиг. 4В). (фиг. 4С и 4D) На изображениях с большим увеличением (фиг. 4А и 4В) показаны ножки подоцитов (стрелки) в почке новорожденных. Шкала, 1 мкм. (фиг. 4Е и 4F) На репрезентативных изображениях 3-недельных почек при низком увеличении показано тело клетки подоцита (стрелки) у Robo2 гомозиготной нулевой мыши (фиг. 4F), по сравнению с контролем того же возраста (фиг. 4Е). (фиг. 4G и 4Н) На изображении с большим увеличением (фиг. 4Е и 4F) показаны дезорганизованные более короткие извилистые ножки (стрелка) у 3-недельной Robo2 гомозиготной нулевой мыши (фиг. 4Н), по сравнению с хорошо упорядоченными переплетающимися подобно застежке «молнии» ножками в контроле того же возраста (фиг. 4G). Шкала: 2 мкм. (фиг. 4I и 4J) На репрезетнативном изображении, полученном с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, (увеличение 5000х) изображено фокально-сегментарное сглаживание ножек подоцитов (стрелка на фиг. 4J) у Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей возрастом 1 месяц и нормальный фенотип в контроле (фиг. 4I). Сокращения: ge: клубочковый капилляр; us: мочевое пространство, (фиг. 4K и 4L) На изображении, полученном с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, с большим увеличением (40000х) показаны более широкие ножки подоцитов (стрелка на фиг. 4L) у Robo2 подоцит-специфических мутантных мышей возрастом 2 месяца, по сравнению с контрольными особями (фиг. 4K). Сокращения: fp, ножка подоцита; GBM, базальная мембрана клубочков, (фиг. 4M) Количественная оценка ширины ножек подоцитов у месячных Robo2; Tg подоцит-специфических нокаутных мышей (Robo2 KО) и у контролен дикого типа из одного помета (WT). Данные представлены как среднее значение ± SEM, n=333, *р<0,01. (фиг. 4N) Анализ ELISA разовой порции мочи показывает повышенный коэффициент альбумин/креатинин у взрослых мышей Robo2;  (KO), по сравнению с контролями дикого типа (WT). Данные представлены как среднее значение ± SEM, n=20, *р<0,01. (фиг. 4O) Анализ с помощью вестерн-блоттинга показывает наличие альбумина в моче; 1 мкл мочи наносили на каждую лунку, 0,2 мкг альбумина использовали в качестве положительного контроля. WT, три особи дикого типа из одного помета; Robo2 KO, три отдельные Robo2;  мыши. (фиг. 4P и 4Q) На репрезентативном изображении, полученном с помощью сканирующей электронной микроскопии, показаны нарушенные переплетающиеся ножки подоцитов, которые напоминают дезорганизованные клеточные выступы (стрелки) в почке Nphsl одинарной гомозиготной новорожденной мыши. Шкала: 1 мкм. (фиг. 4R и 4S) В клубочках NphsrRobo2 двойных гомозиготных новорожденных мышей проявляются восстановленные переплетающиеся ножки (стрелки), что указывает на уменьшение нефрин-нулевого фенотипа с помощью нокаутирования Robo2. (фиг. 4Т и 4U) В клубочках Robo2 одинарных гомозиготные новорожденных мышей показаны нерегулярные и более широкие ножки, но обширное переплетающееся формирование структурирования (стрелки), (фиг. 4V и 4W), Клубочки от новорожденных мышей дикого типа с нормальным регулярным переплетающимся структурированием ножек (стрелки). Смотрите также фигуры 8A-8Z и таблицы 1-4.
На фигурах 5А-5М показано, что Robo2 экспрессируется в развивающихся и взрослых клубочках, (фиг. 5А и 5В) Анализ гибридизации in situ показывает, что транскрипты Robo2 экспрессируются в развивающихся клубочках (стрелки) в E16,5. Увеличение: 60Х (фиг. 5А) и 200Х (фиг. 5В). (фиг. 5C-5F) Иммуногистохимические (IHC) исследования показывают, что Robo2 экспрессируется во время развития клубочков с Е14,5 до Е17,5. Увеличение: 600Х. (фиг. 5G) IHC показывает, что Robo2 специфически экспрессируется в клубочках взрослой мыши в возрасте 5 недель (фиг. 5G). DAPI помечает клеточные ядра в почках. Увеличение: 400Х. (фиг. 5Н) IHC колокализационные окрашивания 5-недельных почек показывают, что Robo2 коэкспрессируется в клубочке подоцитов с маркером WTL. Увеличение: 600Х. (фиг. 5I-5K) Robo2 и WT1 коэкспрессируются в клубочках мыши в Е16,5. Увеличение: 600Х. (фиг. 5L и 5М) IHC колокализационные окрашивания 5-недельных почек показывают, что Robo2 коэкспрессируется в клубочке с мезангиальным клеточным маркером Pdgfrb (фиг. 5L) и эндотелиальным клеточным маркером Pecaml (фиг. 5М). Увеличение: 600Х.
На фигурах 6A-6F' показано, что Robo2 взаимодействует с Nck и образует комплекс с нефрином, который усиливается стимуляцией Slit2. (фиг. 6А) Коиммунопреципитация Robo2 и нефрина с эндогенным Nck. Robo2, нефрин и Fyn экспрессируются в клетках HEK и стимулируются Slit2. Эндогенный Nck иммунопреципитируется антителом к Nck. IgG мыши используют в качестве контроля. Образование комплекса с нефрином усиливается экспрессией Slit2 и Fyn. (фиг. 6В и 6С) Slit2 экспрессируется в клубочках новорожденной мыши путем иммунопероксидазного окрашивания (фиг. 6В) и коэкспрессируется в клубочке с маркером подоцитов синаптоподином (фиг. 6С). Увеличение: 600Х. (фиг. 6D и 6D') CD16/7-NCD коэкспрессируют с Robo2 в клетках HEK в присутствии Slit2, обрабатывают антителом к CD16 и конъюгированным с родамином антителом к IgG, затем фиксируют и окрашивают антителом к Robo2. Кластеры CD16/7-NCD колокализуются с Robo2 (фиг. 6D), но в контрольных кластерах CD16/7-HA колокализация не наблюдается (фиг. 6D'). Шкала: 5 мкм. NCD: цитоплазматический домен нефрина. (фиг. 6Е и 6Е') Удаление Nck-связывающего домена (NBD) в Robo2 ухудшает его колокализацию с CD16/7-NCD в присутствии Slit2. Кластеры CD16/7-NCD колокализуются с Robo2 (фиг. 6Е), но колокализация не наблюдается в кластерах Robo2-ANBD (фиг. 6Е'). Шкала: 5 мкм. (фиг. 6F и 6F') Стимуляция Slit2 усиливает колокализацию CD16/7-NCD и Robo2 в клетках HEK. Кластеры CD16/7-NCD колокализуются с Robo2 в присутствии Slit2 (фиг. 6F), но не с контрольной кондиционированной средой (фиг. 6F'). Шкала: 5 мкм.
-5
-5
На фигурах 7А-7С показано, что удаление Nck-связывающего домена в Robo2 негативно сказывается на ингибировании Slit2-Robo2 индуцированной нефрином полимеризации актина, (фиг. 7A) CD16/7-NCD и Robo2 коэкспрессировали в клетках HEK, кластеризовали с антителом к CD16 и конъюгированным с родамином антителом к IgG в присутствии кондиционированной Slit2 среды (Slit2) или контрольной кондиционированной среды (CTL). Затем клетки фиксировали и окрашивали конъюгированным с FITC фаллоидином для выявления волокон F-актина. Кластеры CD16/7-NCD и волокна F-актина изучали с помощью конфокальной микроскопии. Шкала, 5 мкм. NCD, цитоплазматический домен нефрина. (фиг. 7В) CD16/7-NCD и Robo2-ANBD коэкспрессировали в клетках HEK. Шкала, 5 мкм. NBD, Nck-связывающий домен, (фиг. 7С) Количественно определяли процент клеток с хвостами F-актина от общего числа клеток с кластерами CD16/7-NCD в каждой группе. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, *р=1,436×10, **р=6,32×10, n=5, дисперсионный анализ (ANOVA).
del5/del5
del5/del5
del5/flox
+
flox/+
del5/flox
Nphs2-Cre+
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
+/-
-/-
На фигурах 8A-8Z показан фенотип клубочков у Robo2 гомозиготных нулевых, Robo2 подоцит-специфических нокаутных и Robo2 и Nphsl двойных нокаутных мышей и предложенная модель передачи сигналов Robo2-нефрин. (фиг. 8A-8F) Анализ трансмиссионной электронной микроскопии ультраструктуры клубочков почки новорожденных (NB) Robo2 мутантных мышей, (фиг. 8А, 8С, 8Е) Ультраструктура клубочков новорожденной гетерозиготной Robo2 контрольной мыши при низком (фиг. 8А, 2200Х), среднем (фиг. 8С, 15500Х) и сильном (фиг. 8Е, 52000Х) увеличениях, (фиг. 8В, 8D, 8F) Ультраструктура клубочков новорожденной гомозиготной Robo2 (-/-) (т.е. Robo2) мутантной мыши при низком (фиг. 8В), среднем (фиг. 8D) и сильном (фиг. 8F) увеличениях. Стрелки указывают на фокальное сглаживание ножек. Сокращения: ge: клубочковый капилляр; us: мочевое пространство; GBM: базальная мембрана клубочков, (фиг. 8G-8N) Аномальные структурирования ножек подоцитов у Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей, (фиг. 8G-8J) Полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии репрезентативные изображения клубочков от месячных Robo2; Nphs2-Cre подоцит-специфических нокаутных мышей и контрольных мышей Robo2 того же возраста. Были обнаружены умеренные нарушения переплетающихся ножек подоцитов у месячной Robo2 подоцит-специфической нокаутной мыши (фиг. 8K и 8N). У семимесячных Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей развивались заметно неравномерные ножки (фиг. 8L и 8N). Шкала: 10 мкм (фиг. 8G, 8Н, 8K, 8L при 2000х увеличении) и 2 мкм (фиг. 8I, 8J, 8М, 8N при 13000х увеличении), (фиг. 8O-8Т) Морфология клубочков у Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей, (фиг. 8O-8R) Окрашивание реактивом Шиффа (PAS) показало расширение мезангиального матрикса в клубочках 2-месячных и 6-месячных Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей (фиг. 8Р, 8R), по сравнению с контрольными особями того же возраста (фиг. 8O, 8Q). (фиг. 8S) Количественный анализ клубочков показывает расширение мезангиального матрикса у 12-месячных Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей (MU), по сравнению с контрольными особями дикого типа (WT) того же возраста. Данные представлены как среднее значение ± SEM, n=5, *р<0,01. (Т) Robo2 подоцит-специфический нокаут не влияет на количество подоцитов. Клетки подоцитов определяли с использованием окрашивания WT-1. Количество подоцитов на поперечном сечении клубочков подсчитывали у четырех годовалых подоцит-специфических нокаутных мышей (MU) Robo2; Tg, в сравнении с четырьмя мышами дикого типа (WT) того же возраста. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, р=0,645, t-критерий; мутанты: n=165 клубочков; контроль: n=166 клубочков, (фиг. 8U-8Y) Фенотип клубочков у Robo2 и Nphsl двойных нокаутных мышей, (фиг. 8U) Окрашивание Н&Е показывает клубочки с характерными дилатациями пространства Боумена (звездочки) у Nphsl одинарной гомозиготной новорожденной мыши, 400х. (фиг. 8V) В клубочках от Robo2 одинарной гомозиготной новорожденной мыши отсутствует дилатация пространства Боумена; 400х. (фиг. 8W) Нормальные по внешнему виду клубочки без значительных дилатаций пространства Боумена (стрелки) показаны у Robo2; Nphsrl двойных гомозиготных новорожденных мышей, указывая на уменьшение клубочкового фенотипа Nphsl; 400х. (фиг. 8Х) Окрашивание Н&Е нормальной почки и клубочков контрольной новорожденной мыши дикого типа того же возраста; 400х. (фиг. 8Y) Количественная оценка клубочков с дилатационным пространством Боумена у новорожденных мышей показывает значительное снижение клубочков с характерным дилатационным фенотипом пространства Боумена у Robo2; Nphsl двойных гомозиготных, по сравнению с одинарными гомозиготными (Robo2; Nphsl). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, *р<0,01. (фиг. 8Z) Модель ингибирующих эффектов передачи сигналов Slit2-Robo2 на нефрин для влияния на структуру ножек подоцитов: В физиологических условиях (например, во время развития ножек) домены тирозина фосфорилированного внутриклеточного нефрина (YDxV-p) привлекают Nck благодаря своему взаимодействию с SH2-доменом. Nck в свою очередь привлекает регуляторы цитоскелета через свои SH3-домены для способствования полимеризации актина. Slit2 связывается с Robo2 для усиления взаимодействия внутриклеточного домена Robo2 с SH3-доменами Nck, что предотвратило бы связывание Nck с регуляторами цитоскелета и привело бы к торможению индуцированной нефрином полимеризации актина. Для нормальной структуры ножек в процессе развития подоцита поддерживается сбалансированная полимеризация актина. При отсутствии передачи сигналов Slit2-Robo2 (например, когда Robo2 нокаутируют) ингибирующие эффекты Robo2 на индуцированную нефрином полимеризацию теряются. SH3-домены в Nck способны взаимодействовать с нижележащими регуляторами цитоскелета для увеличения полимеризации актина, что может объяснить измененную структуру ножек подоцитов у Robo2 мутантных мышей. Сокращения: Ig: домен иммуноглобулина; FN3: домен фибронектина типа 3; SH2: гомологичный Src домен 2; SH3: гомологичный Src домен 3; СС0, CC1, СС2, СС3: цитоплазматическая консервативная область 0, 1, 2, 3.
Подробное описание настоящего изобретения
Ранее было показано, что Robo2 представляет собой поверхностный клеточный для отталкивающего наведения сигнала Slit и вовлечен в аксональное наведение и миграцию нейронов в нервной системе. Нефрин представляет собой белок щелевой диафрагмы подоцитов, который функционирует в фильтрационном барьере клубочков почек. В настоящей заявке мы демонстрируем, что Robo2 экспрессируется на базальной поверхности таких подоцитов, как подоциты мыши, и колокализуется с нефрином. Биохимические исследования показывают, что Robo2 образует комплекс с нефрином в почках через адапторный белок Nck. В отличие от нефрина, который способствует полимеризации актина, в настоящей заявке мы показываем, что передача сигналов Slit2-Robo2 ингибирует индуцированную нефрином полимеризацию актина. Например, количество ассоциированного с нефрином F-актина увеличивается у нокаутных по Robo2 мышей, которые развивают измененную структуру ножек подоцитов и микроальбуминурию. Генетические исследования взаимодействия дополнительно показывают, что потеря Robo2 частично снимает ненормальный фенотип подоцитов у нефрин нулевых мышей. Представленные в настоящей заявке результаты показывают, что передача сигналов Robo2 действует на нефрин как отрицательный регулятор, влияя на архитектуру ножек подоцитов.
Кроме того, было показано, что пациент, характеризующийся наличием пузырно-мочеточникового рефлюкса (ПМР), содержит транслокацию хромосомы, что нарушает ген ROBO2 и производит доминантно-негативные слитые белки ROBO2, которые прекращают сигнальный путь SLIT2-ROBO2. Как правило, ПМР представляет собой заболевание, характеризующееся ретроградным потоком мочи из мочевого пузыря в мочеточники и почку, и ПМР пациенты могут быть с рефлюкс-нефропатией, состоянием, которое проявляется тяжелой протеинурией. Было показано, что доминантно-негативные слитые белки ROBO2, производимые пациентами с ПМР, блокируют сигнальный путь SLIT2-ROBO2 и защищают пациента от рефлюкс-нефропатии и протеинурии, подтверждая тем самым и дополнительно поддерживая результаты исследователей на животных моделях в терапевтической ценности направленного воздействия на сигнальный путь SLIT2-ROBO2 для лечения хронического заболевания почек.
В нормальной почке трехслойная стенка клубочковых капилляров, состоящая из фенестрированных эндотелиальных клеток, базальной мембраны и подоцитов, ограничивает проницаемость для белков плазмы. Подоциты представляют собой специализированные эпителиальные клетки, простирающие первичные и вторичные отростки, которые покрывают внешнюю поверхность клубочковой базальной мембраны. Богатые актином переплетающиеся вторичные отростки, или ножки, из соседних подоцитов создают фильтрационные щели, соединенные мостиком с полу-пористой щелевой диафрагмой, которая образует окончательный барьер для проникновения белков. В то время как генетические мутации таких белков щелевых диафрагм подоцитов, как нефрин и другие, связаны с наследственными формами протеинурического заболевания почек (Tryggvason et al., 2006), стало очевидно, что белки, входящие в состав и ассоциированные с щелевой диафрагмой, представляют собой больше, чем простой структурный барьер. Эти белки образуют сбалансированную сигнальную сеть, которая может влиять на структуру и функцию ножек подоцитов через взаимодействие с F-актиновым цитоскелетом (Faul et al., 2007; Jones et al., 2006; Verma et al., 2006).
Белки семейства Roundabout (Robo), Robo1, Robo2, Robo3 и Robo4 представляют собой рецепторы клеточной поверхности для секретированного лиганда Slit (Dickson and Gilestro, 2006). Slitl, Slit2 и Slit3 первоначально были обнаружены как отталкивающие наведение сигналы для аксонального наведения и миграции нейронов во время развития нервной системы (Guan and Rao, 2003). Трансмембранный белок Robo содержит пять мотивов Ig и три повтора фибронектина типа III (FNIII) в своем внеклеточном домене (Dickson and Gilestro, 2006). Хотя оба мотива 1 и 2 иммуноглобулина (Ig) взаимодействуют с Slit, первый мотив Ig1 в Robo представляет собой основной сайт связывания для Slit (Dickson and Gilestro, 2006). Внутриклеточный домен Robo содержит четыре цитоплазматические консервативные (СС) последовательности, названные CC0, CC1, СС2 и СС3 (Bashaw et al., 2000; Kidd et al., 1998; Morlot et al., 2007; Zallen et al., 1998). CC0 и CC1 содержат тирозин, в то время как СС2 и СС3 представляют собой богатые пролином тяжи. Отталкивательная активность передачи сигналов Slit-Robo ингибирует полимеризацию актина (Guan and Rao, 2003) или индуцирует деполимеризацию F-актина (Piper et al., 2006).
Передача сигналов Slit-Robo также играет решающую роль в ранней индукции почек и роста зачатка мочеточника. Мутантные мыши, которые не содержат Slit2 или Robo2, развивают добавочные зачатки мочеточника, которые приводят к широкому спектру фенотипов мочевыводящих путей, включая удвоенные почки, аномальные мочеточниково-пузырные соустья и гидронефроз (Grieshammer et al., 2004; Lu et al. 2007). Разрушение ROBO2 y людей вызывает врожденные аномалии почек и мочевыводящих путей (CAKUT), и точечные мутации ROBO2 были выявлены у пациентов с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (ПМР) (Lu et al., 2007). Наше недавнее исследование показывает, что Robo2 имеет решающее значение для формирования нормального устья мочеточника и для поддержания эффективного антирефлюксного механизма (Wang et al., 2011).
В настоящей заявке мы показываем, что Robo2 представляет собой новый белок подоцитов, экспрессируемый на базальной поверхности клубочков подоцитов в почках и колокализованный с нефрином и подоцином. Robo2 взаимодействует непосредственно с SH3-доменами адапторного белка Nck и образует комплекс с нефрином. В то время как Robo2 нокаутные мыши развивают измененные ножки подоцитов, потеря Robo2 уменьшает структурные аномалии ножек, которые видны у нефрин нулевых мышей. Описанные в настоящей заявке эти результаты показывают, что передача сигналов Robo2 действует на передачу сигналов нефрином как отрицательный регулятор, влияя на архитектуру ножек подоцитов. Кроме того, как показано в настоящем документе, было обнаружено, что доминантно-негативные слитые белки ROBO2, производимые пациентом, блокируют сигнальный путь SLIT2-ROBO2 и защищают пациента от рефлюкс-нефропатии и протеинурии, подтверждая тем самым и дополнительно поддерживая результаты, описанные в настоящей заявке на животных моделях, в терапевтической ценности направленного воздействия на сигнальный путь SLIT2-ROBO2 для лечения хронического заболевания почек.
Таким образом, согласно некоторым аспектам в настоящей заявке предусмотрены способы лечения хронического заболевания почек у нуждающегося в этом субъекта, способ, предусматривающий введение субъекту, характеризующемуся наличием или риском развития хронического заболевания почек, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей ингибитор сигнального пути SLIT2-ROBO2.
Также в настоящей заявке предусмотрены согласно некоторым аспектам способы лечения протеинурии у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающие введение субъекту, характеризующемуся наличием или риском развития протеинурии, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей ингибитор сигнального пути SLIT2-ROBO2.
Согласно другим аспектам в настоящей заявке предусмотрены способы для профилактики заболеваний почек или способствование профилактике заболеваний почек у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающие введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей ингибитор сигнального пути SLIT2-ROBO2, чтобы предупредить или способствовать профилактике заболевания почек у субъекта.
Также в настоящей заявке предусмотрены согласно некоторым аспектам способы смягчения последствий заболевания почек, снижения тяжести заболевания почек, снижения вероятности развития заболевания почек и/или замедления прогрессирования заболевания почек у нуждающегося в этом субъекта.
Используемый в настоящей заявке "ROBO2" относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность:
(изоформа ROBO2a гомолога 2 (roundabout homolog) Homo sapiens; SEQ ID NO: 1), как описано, например, NP_001122401,1 и кодируется NM_001128929,2 (SEQ ID NO: 2); или
(изоформа ROBO2b гомолога 2 (roundabout homolog) Homo sapiens; SEQ ID NO: 3), как описано, например, NP_002933.1 и кодируется NM_002942.4 (SEQ ID NO: 4) вместе с любыми встречающимися в природе его аллелями, вариантами сплайсинга и преобразованными формами. Как правило, ROBO2 относится к ROBO2 человека. Ген ROBO2 консервативен у шимпанзе, макаки-резуса, собаки, коровы, мыши, крысы, цыпленка, данио, плодовой мухи, комара и C.elegans. Специфические остатки ROBO2 могут упоминаться как, например, "Robo2 (30)."
Специфические домены ROBO2 можно также отнести к такой номенклатуре. N-концевой или "внеклеточный домен ROBO2", содержащий пять мотивов иммуноглобулина и три повтора фибронектина типа III (FNIII), может быть отнесен к ROBO2 (46-848) в SEQ ID NO: 1 или ROBO2 (30-832) в SEQ ID NO: 3, например. Мотивы 1 и 2 иммуноглобулина (Ig), которые взаимодействуют с Slit2, или " SLIT-связывающий домен Ig" могут упоминаться как ROBO2 (46-145) и ROBO2 (151-237), соответственно, SEQ ID NO: 1, и Robo2 (30-129) и ROBO2 (135-221), соответственно, SEQ ID NO: 3. Аналогичным образом, "внутриклеточный домен", содержащий "внутриклеточный Nck-связывающий домен", который содержит описанные в настоящей заявке четыре внутриклеточные богатые пролином мотива, могут относиться к ROBO2 (881-1378) в SEQ ID NO: 3.
Используемые в настоящей заявке термины "ингибитор ROBO2", "антагонист ROBO2", "средство-ингибитор ROBO2" и "средство-антагонист ROBO2" относятся к молекуле или средству, которое существенно блокирует, ингибирует, снижает или препятствует биологической активности ROBO2 (ROBO2 млекопитающих, таких как человек) in vitro, in situ и/или in vivo, в том числе активности на последующих стадиях, опосредованных передачей сигналов ROBO2, таких как, например, взаимодействие ROBO2 с адапторным белком Nck и/или образованием комплекса с нефрином, опосредованное Slit2-ROBO-2 ингибирование опосредованной нефрином полимеризации актина и/или выявление клеточного ответа на ROBO2. Используемый в настоящей заявке термин "средство" в отношении ингибитора ROBO2 означает любое соединение или вещество, такое как, без ограничения, небольшая молекула, нуклеиновая кислота, полипептид, пептид, лекарственное средство, ион и т.п. "Средством" может быть любое химическое вещество, частица или фрагмент, в том числе, без ограничения, синтетические и встречающиеся в природе белковые и небелковые частицы. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке аспектов средство представляет собой нуклеиновую кислоту, аналог нуклеиновой кислоты, белок, антитело, пептид, аптамер, олигомер нуклеиновых кислот, аминокислоту или углевод, и включает в себя без ограничения белки, олигонуклеотиды, рибозимы, ДНК-ферменты, гликопротеины, антисмысловые РНК, siPHK, липопротеины, аптамеры и их модификации и комбинации и т.д. Описанные в настоящей заявке соединения для применения в терапевтических композициях и способах могут быть известны, как характеризующиеся требуемой активностью и/или свойством, или могут быть выбраны из библиотеки различных соединений с использованием известных специалистам в настоящей области техники способов скрининга.
Иллюстративные ингибиторы ROBO2, рассматриваемые для применения в различных описанных в настоящей заявке аспектах и вариантах осуществления, включают без ограничения антитела к ROBO2 или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с ROBO2; антисмысловые молекулы, направленные на нуклеиновую кислоту, кодирующую ROBO2 (например, ROBO2a или ROBO2b, или обе); молекулы короткой интерферирующей РНК ("siPHK"), направленные на нуклеиновую кислоту, кодирующую ROBO2 (например, ROBO2a или ROBO2b, или обе); аптамеры РНК или ДНК, которые связываются с ROBO2 и ингибируют/снижают/блокируют опосредованную ROBO2 передачу сигналов; структурные аналоги ROBO2 и растворимые белки ROBO2, ингибиторные полипептиды, например, доминантно-негативные полипептиды или их слитые полипептиды. Согласно некоторым вариантам осуществления этих аспектов и всех подобных описанных в настоящей заявке аспектов ингибитор ROBO2 (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается (физически взаимодействует с) с ROBO2, воздействует на нижележащую передачу сигналов ROBO2 и/или ингибирует (уменьшает) синтез ROBO2, продуцирование или высвобождение. Согласно некоторым вариантам осуществления этих аспектов и всех подобных описанных в настоящей заявке аспектов ингибитор ROBO2 связывает и предотвращает его связывание с таким белком-лигандом SLIT, как SLIT2. Согласно некоторым вариантам осуществления этих аспектов и всех подобных описанных в настоящей заявке аспектов ингибитор ROBO2 специфически уменьшает или устраняет экспрессию (т.е. транскрипцию или трансляцию) одной или нескольких изоформ ROBO2.
Используемый в настоящей заявке ингибитор или антагонист ROBO2 обладает способностью снижать активность и/или экспрессию ROBO2 в клетке (например, подоцитах) по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или более, по отношению к активности или уровню экспрессии в отсутствие ингибитора ROBO2.
Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор ROBO2 ингибирует опосредованную ROBO2 сигнальную трансдукцию. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор ROBO2 воздействует на взаимодействие ROBO2 с адапторным белком Nck и/или образование комплекса с нефрином, опосредованное SLIT2-ROBO-2 ингибирование опосредованной нефрином полимеризации актина и/или выявление клеточного ответа на ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов сайты связывания таких ингибиторов ROBO2, как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, направлены против сайта взаимодействия лиганда с ROBO2, например сайта взаимодействия с лигандом SLIT2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов сайты связывания таких ингибиторов ROBO2, как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, направлены против сайта взаимодействия адаптора ROBO2, такого как сайт взаимодействия с Nck или внутриклеточный NCK-связывающий домен, содержащий четыре внутриклеточные богатые пролином мотива в ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов сайты связывания ингибиторов ROBO2 направлены против сайта на мишени в непосредственной близости от сайта взаимодействия лиганда, для того чтобы обеспечить стерическое затруднение для взаимодействия рецептора (например, ROBO2) с его лигандом (например, SLIT2). Связываясь с сайтом взаимодействия лиганда ROBO2, описанный в настоящей заявке ингибитор ROBO2 может уменьшать или ингибировать активность или экспрессию ROBO2 и последствия нижележащей передачи сигналов ROBO2 (например, взаимодействие ROBO2 с адапторным белком Nck и/или образование комплекса с нефрином, опосредованное Slit2-ROBO-2 ингибирование опосредованной нефрином полимеризации актина и/или выявление клеточного ответа на ROBO2). Например, согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов сайты связывания ингибиторов ROBO2 блокируют или воздействуют по меньшей мере на Ig1, а предпочтительно как на Ig1, так и на Ig2 сайты, на ROBO2, т.е. ROBO2 (46-145) и ROBO2 (151-237), соответственно в SEQ ID NO: 1, и ROBO2 (30-129) и ROBO2 (135-221), соответственно в SEQ ID NO: 3, например. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов сайты связывания ингибиторов ROBO2 блокируют или воздействуют на внутриклеточный домен ROBO2, содержащий внутриклеточный Nck-связывающий домен, т.е. ROBO2 (881-1378) в SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов сайты связывания ингибиторов ROBO2 блокируют или воздействуют на внутриклеточный Nck-связывающий домен ROBO2, содержащий четыре внутриклеточные богатые пролином мотива ROBO2. Это может быть достигнуто различными хорошо известными в настоящей области техники средствами, такими как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, РНК-ингибиторами и т.д., и как описано в настоящей заявке.
Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор ROBO2 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который селективно связывается или физически взаимодействует с ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор ROBO2 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с ROBO2 и ингибирует и/или блокирует, и/или предотвращает взаимодействие с Nck и/или образование комплекса с нефрином. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается со SLIT-связывающим доменом Ig в ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается со SLIT-связывающим доменом Ig1 в ROBO2 или SLIT- связывающим доменом как Ig1, так и Ig2 в ROBO2, т.е. ROBO2 (46-145) и ROBO2 (151-237), соответственно, в SEQ ID NO: 1, и ROBO2 (30-129) и ROBO2 (135-221), соответственно, в SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает или блокирует внутриклеточный домен ROBO2, т.е. ROBO2 (881-1378) в SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает или блокирует внутриклеточный Nck-связывающий домен, содержащий четыре внутриклеточные богатые пролином мотива ROBO2.
Антитела, специфические к или селективно связывающие ROBO2, подходящие для применения в описанных в настоящей заявке композициях и для осуществления способов, представляют собой предпочтительно моноклональные и могут включать в себя без ограничения человеческие, гуманизированные или химерные антитела, содержащие одноцепочечные антитела, Fab фрагменты, F(ab') фрагменты, фрагменты, продуцируемые библиотекой экспрессии Fab и/или связывающие фрагменты любых из вышеперечисленных. Антитела также относятся к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина, т.е. молекулам, которые содержат антиген или связывающиеся с мишенью сайты, или "антигенсвязывающие фрагменты". Описанные в настоящей заявке молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекул иммуноглобулинов, как понятно специалистам в настоящей области техники.
Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов описанный в настоящей заявке ингибитор ROBO2 представляет собой моноклональное антитело к ROBO2 или его антигенсвязывающий фрагмент.
L
L
H
H
H
H
H
H
H
H
L
H
H
L
2
H
L
H
H
H
H
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов описанный в настоящей заявке ингибитор ROBO2 представляет собой фрагмент антитела ROBO2 или его антигенсвязывающий фрагмент. Используемые в настоящей заявке термины "фрагмент антитела", "антигенсвязывающий фрагмент" и "производное антитела" относятся к фрагменту белка, который содержит только часть интактного антитела, как правило, включающий в себя антигенсвязывающий сайт интактного антитела и, таким образом, сохраняющий способность связывать антиген. Примеры фрагментов антитела, охватываемые терминами фрагмента антитела или антигенсвязывающего фрагмента, включают в себя: (i) Fab фрагмент, содержащий домены V, C, V и C1; (ii) Fab'-фрагмент, который представляет собой фрагмент Fab, содержащий один или несколько остатков цистеина на С-конце домена C1; (iii) Fd фрагмент, содержащий домены V и C1; (iv) Fd'-фрагмент, содержащий домены V и C1 и один или несколько остатков цистеина на С-конце домена C1; (v) Fv фрагмент, содержащий домены V и V одного плеча антитела; (vi) dAb фрагмент (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), который состоит из домена V или домена V; (vii), выделенные области CDR; (viii) F(ab')-фрагменты, бивалентный фрагмент, включающий в себя два Fab'-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ix) молекулы одноцепочечного антитела (например, одноцепочечный Fv; scFv) (Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) и Huston et al., PNAS (USA) 85: 5879-5883 (1988)); (x) "диатела" с двумя антигенсвязывающими сайтами, содержащими вариабельный домен тяжелой цепи (V), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V) в той же полипептидной цепи (смотрите, например, Европейский патент 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)); (xi) "линейные антитела", содержащие пару тандемных сегментов Fd (V-C1-V-C1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995) и патент США №5641870) и модифицированные версии любого из вышеперечисленных (например, модифицированные с помощью ковалентного присоединения полиалкиленгликоля (например, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полибутиленгликоля) или другого подходящего полимера).
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор или антагонист ROBO2 представляет собой производное химерное антитело антитела-антагониста ROBO2 или его антигенсвязывающего фрагмента.
Описанные в настоящей заявке антитела ингибиторы или антагонисты ROBO2 и их антигенсвязывающие фрагменты также могут быть согласно некоторым вариантам осуществления производными гуманизированных антител.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящей заявке антитела ингибиторы или антагонисты ROBO2 и их антигенсвязывающие фрагменты включают в себя производные, которые модифицированы, т.е. путем ковалентного присоединения молекулы любого типа к антителу, при условии, что ковалентное присоединение не препятствует связыванию антитела с антигеном-мишенью, например, ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов применяются полностью человеческие антитела, которые особенно желательны для терапевтического лечения пациентов-людей.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор ROBO2 содержит по меньшей мере одну антисмысловую молекулу, способную блокировать или уменьшать экспрессию определенной функциональной ROBO2 путем нацеливания нуклеиновых кислот, кодирующих ROBO2, например, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, или обе, или их соответствующие домены. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов по меньшей мере одна антисмысловая молекула нацеливает нуклеиновые кислоты, кодирующие SLIT-связывающий домен Ig в ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов по меньшей мере одна антисмысловая молекула нацеливает нуклеиновые кислоты, кодирующие SLIT-связывающий домен Ig1 в ROBO2 или SLIT-связывающий домен как Ig1, так и Ig2 в ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов по меньшей мере одна антисмысловая молекула нацеливает нуклеиновые кислоты, кодирующие внутриклеточный домен ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов по меньшей мере одна антисмысловая молекула нацеливает нуклеиновые кислоты, кодирующие внутриклеточный Nck-связывающий домен, содержащий четыре внутриклеточные богатые пролином мотива ROBO2. Специалистам в настоящей области техники известны способы для подготовки антисмысловых олигонуклеотидных молекул, которые будут специфически связываться с мРНК ROBO2 без перекрестной реакции с другими полинуклеотидами. Иллюстративные сайты нацеливания включают в себя без ограничения инициирующий кодон, 5' регуляторные области, включая в себя промотеры или энхансеры, кодирующую последовательность, включая в себя любые консервативные консенсусные регионы, и 3' нетранслируемую область. Согласно некоторым вариантам осуществления этих аспектов и всех подобных описанных в настоящей заявке аспектов антисмысловые олигонуклеотиды составляют от приблизительно 10 до приблизительно 100 нуклеотидов в длину, от приблизительно 15 до приблизительно 50 нуклеотидов в длину, от приблизительно 18 до приблизительно 25 нуклеотидов в длину или более. Согласно определенным вариантам осуществления антисмысловые олигонуклеотиды дополнительно содержат такие химические модификации для увеличения резистентности нуклеазы и т.п., как, например, фосфоротиоатные связи и модификации 2'-О-сахара, известные специалистам в настоящей области техники.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор ROBO2 содержит по меньшей мере одну молекулу короткой интерферирующей РНК (siPHK), способную блокировать или уменьшать экспрессию функционального ROBO2 путем нацеливания нуклеиновых кислот, кодирующих или обе изоформы ROBO2, например, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, или соответствующие их домены. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов по меньшей мере одна молекула siPHK нацеливает нуклеиновые кислоты, кодирующие SLIT-связывающий домен Ig в ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов по меньшей мере одна молекула siPHK нацеливает нуклеиновые кислоты, кодирующие SLIT-связывающий домен Ig1 в ROBO2 или SLIT-связывающий домен как Ig1, так и Ig2 в ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов по меньшей мере одна молекула siPHK нацеливает нуклеиновые кислоты, кодирующие внутриклеточный домен ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов по меньшей мере одна молекула siPHK нацеливает нуклеиновые кислоты, кодирующие внутриклеточный Nck-связывающий домен, содержащий четыре внутриклеточные богатые пролином мотива ROBO2. Не вызывает затруднений подготовить молекулы siPHK, которые будут специфически нацеливать мРНК ROBO2 без перекрестной реакции с другими полинуклеотидами. Молекулы siPHK для применения в описанных в настоящей заявке композициях и способах могут быть произведены такими известными в настоящей области техники способами, как типичный твердофазный синтез олигонуклеотидов, и часто будут включать в себя химические модификации для увеличения времени полужизни и/или эффективности siPHK, и/или для обеспечения более надежной доставки состава. Кроме того, молекулы siPHK доставляются с использованием вектора, кодирующего экспрессионную кассету для внутриклеточной транскрипции siPHK.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор ROBO2 представляет собой аптамер РНК или ДНК, который связывается с одной или несколькими изоформами ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор или антагонист ROBO2 представляет собой аптамер РНК или ДНК, который связывает или физически взаимодействует с ROBO2 и блокирует взаимодействие между ROBO2 и лигандом или адапторной молекулой, например, SLIT2 или Nck, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор или антагонист ROBO-2 представляет собой аптамер РНК или ДНК, который связывается или физически взаимодействует с ROBO2, а также снижает, препятствует или блокирует последующие стадии сигнального пути ROBO2, такие как опосредованное SLIT2-ROBO-2 ингибирование опосредованной нефрином полимеризации актина и/или выявление клеточного ответа на ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов аптамер РНК или ДНК связывается или физически взаимодействует со SLIT-связывающим доменом Ig в ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов аптамер РНК или ДНК связывается или физически взаимодействует со SLIT-связывающим доменом Ig в ROBO2 или SLIT-связывающим доменом как Ig1, так и Ig2 в ROBO2, т.е. ROBO2 (46-145) и ROBO2 (151-237), соответственно, в SEQ ID NO: 1, и ROBO2 (30-129) и ROBO2 (135-221), соответственно, в SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов аптамер РНК или ДНК связывается или физически взаимодействует с внутриклеточным доменом ROBO2, т.е. ROBO2 (881-1378) в SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов аптамер РНК или ДНК связывается или физически взаимодействует с или блокирует нутриклеточный Nck-связывающий домен, содержащий четыре внутриклеточные богатые пролином мотива ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор ROBO2 представляет собой низкомолекулярное соединение или средство, которое нацеливает или связывается с ROBO2, включая в себя без ограничения малые пептиды или пептидо-подобные молекулы, растворимые пептиды и синтетические непептидильные органические или неорганические соединения. Используемый в настоящей заявке термин "малая молекула" относится к химическому средству, которое может включать в себя без ограничения пептид, пептидомиметик, аминокислоту, аналог аминокислоты, полинуклеотид, аналог полинуклеотида, аптамер, нуклеотид, аналог нуклеотида, органическое или неорганическое соединение (например, включая в себя гетероорганические и металлоорганические соединения), характеризующиеся молекулярной массой менее чем приблизительно 10000 грамм на моль, органические или неорганические соединения, характеризующиеся молекулярной массой менее чем приблизительно 5000 грамм на моль, органические или неорганические соединения, характеризующиеся молекулярной массой менее чем приблизительно 1000 грамм на моль, органические или неорганические соединения, характеризующиеся молекулярной массой менее чем приблизительно 500 грамм на моль, а также соли, сложные эфиры и другие фармацевтически приемлемые формы таких соединений. Иллюстративные сайты связывания малых молекул включают без ограничения часть ROBO2, которая связывается с SLIT2 или с адаптером Nck, т.е. SLIT-связывающий домен Ig1 в ROBO2 или SLIT-связывающие домены, как Ig1, так и Ig2 в ROBO2, внутриклеточный домен ROBO2 или внутриклеточный Nck-связывающий домен, содержащий четыре внутриклеточные богатые пролином мотива ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор или антагонист ROBO2 содержит малую молекулу, которая связывается с ROBO2 и ингибирует биологическую активность ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор или антагонист ROBO2 содержит по меньшей мере один структурный аналог ROBO2, такой как доминантно-негативный полипептид ROBO2. Используемый в настоящей заявке термин структурные аналоги ROBO2 относится к соединениям, которые характеризуются сходной трехмерной структурой как часть ROBO2 и которые связываются с SLIT2 и/или Nck в физиологических условиях in vitro или in vivo, причем связывание по меньшей мере частично ингибирует биологическую активность ROBO2, такую как опосредованное SLIT2-ROBO2 ингибирование опосредованной нефрином полимеризации актина и/или выявление клеточного ответа на ROBO2. Подходящие структурные аналоги ROBO2 могут быть разработаны и синтезированы с помощью молекулярного моделирования связывания ROBO2-SLIT2, например. Структурными аналогами ROBO2 могут быть мономеры, димеры или мультимеры более высокого порядка в любой требуемой комбинации одних и тех же или различных структур для получения улучшенных аффинностей и биологических эффектов.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибитор или антагонист ROBO2 содержит по меньшей мере один растворимый рецептор ROBO2 или его слитый полипептид, такой как, например, ингибирующий ROBO2 полипептид. Согласно некоторым таким вариантам осуществления ингибирующий ROBO2 полипептид представляет собой доминантно-негативный слитый белок ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке композиций и способов ингибирующий ROBO2 полипептид содержит внеклеточный домен ROBO2, например, SLIT-связывающий домен Ig1 в ROBO2 или SLIT-связывающие домены, как Ig1, так и Ig2 в ROBO2 без внутриклеточных доменов ROBO2.
Ингибиторы или антагонисты ROBO2 для применения в описанных в настоящей заявке композициях и способах могут быть идентифицированы или охарактеризованы с использованием известных в настоящей области техники способов, например, анализов белок-белковых связываний, анализов биохимического скрининга, иммунологических и клеточных анализов, которые хорошо известны в настоящей области техники, включая в себя без ограничения те, которые описаны в настоящей заявке в разделе Примеры.
Например, чтобы определить молекулу, которая ингибирует взаимодействие между ROBO2 и его лигандом, например, SLIT2, можно применить анализы связывания. Например, ROBO2 или SLIT иммобилизуют на планшете для микротитрования путем ковалентного или нековалентного прикрепления. Анализ проводят путем добавления неиммобилизованного компонента (лиганда или рецептора), который может быть помечен детектируемой меткой, к иммобилизованному компоненту при наличии или отсутствии исследуемого средства. Когда реакция завершена, непрореагировавшие компоненты удаляют и обнаруживают связывающие комплексы. Если образование связывающих комплексов ингибируется при наличии исследуемого средства, оно может считаться кандидатом в антагонисты, который ингибирует связывание между ROBO2 и SLIT2, например. Основанные на клетках или мембранах анализы также могут быть применены для идентификации ингибиторов ROBO2. Согласно другим вариантам осуществления путем обнаружения и/или измерения уровней генной экспрессии ROBO2 могут быть исследованы молекулы ингибитора ROBO2, которые ингибируют генную экспрессию ROBO2. Генная экспрессия ROBO2 может быть обнаружена и/или измерена с помощью различных способов, таких как ПЦР в реальном времени, иммуноферментный анализ ("ELISA"), нозерн-блоттинг или проточная цитометрия, и они известны специалистам в настоящей области техники.
Так идентифицированные ингибиторы ROBO2 могут быть дополнительно исследованы с использованием in vivo таких животных моделей хронического заболевания почек, как модели интерстициальных и клубочковых повреждений (например, животные модели волчаночного нефрита, включая в себя мышей линии NZB, (NZB x NZW) гибридных F1 (названных NZB/W) и конгенных их производных, линии MRL/lpr и BXSB), животных моделей старения (например, старые крысы линии Sprague Dawley и старые мыши C57BL/6); крыс со спонтанной гипертензией (SHR); крыс линии Buffalo/mna, которые представляют собой модель идиопатического нефротического синдрома человека; крыс Munich Wistar Frömter (MWF), которые представляют собой генетическую модель, относящуюся к врожденному дефициту количества нефронов, будучи предрасположенными к развитию гипертензии и чувствительности к соли в зрелом возрасте; модели первичного подоцит-специфического генетического фокально-сегментарного гломерулосклероза; трансгенные мышиные модели ВИЧ-ассоциированной нефропатии (HIVAN); животные модели синдрома Альпорта, которые содержат мутации цепей α3, α4 или α5 коллагена IV типа (COL4A3, COL4A4 и COL4A5); иммунно-индуцированные модели, такие как модель Thy-1 нефрита, которая представляет собой экспериментальную крысиную модель мезангиопролиферативного гломерулонефрита (MsPGN), модели гломерулонефрита с образованием антител к базальной мембране (GBM) и модели индуцированного отсутствия иммунитета.
D
D
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-5
Используемый в настоящей заявке в отношении ингибитора ROBO2, "селективно связывается" или "специфически связывается", или "специфичный для" относится к способности описанного в настоящей заявке ингибитора ROBO2, такого как, например, антитела антагониста ROBO2 или его антигенсвязывающего фрагмента ROBO2, связываться с мишенью, т.е. ROBO2 с K 10 M (10000 нМ) или менее, например, 10 M или менее, 10 M или менее, 10 M или менее, 10 M или менее, 10 M или менее, 10 M или менее или 10 M или менее. Например, если описанный в настоящей заявке ингибитор/антагонист ROBO2 связывается с ROBO2 с K 10 M или ниже, но не с родственной молекулой, такой как, например, другие представители семейства ROBO, то говорят, что средство специфически связывается с ROBO2. Специфическое связывание может зависеть от, например, аффинности и авидности, например, антитела ингибитора/антагониста ROBO2 или его антигенсвязывающего фрагмента и концентрации полипептидного средства. Специалист в настоящей области техники может определить подходящие условия, при которых описанные в настоящей заявке полипептидные средства селективно связываются с мишенями с использованием любых подходящих способов, таких как титрование полипептидного средства в подходящем анализе клеточного связывания.
В отношении способов лечения хронического заболевания почек путем ингибирования активности ROBO2 термин «хроническое заболевание почек», или ХБП относится к заболеваниям почек, которые медленно и постепенно ухудшаются с течением времени в связи с прогрессирующей потерей нефронов и последующей потерей функции почек. На ранних стадиях может не быть никаких симптомов. Потеря функции, как правило, может произойти через несколько месяцев или лет. Это может происходить так медленно, что симптомы не проявляются до тех пор, пока функция почек не будет составлять меньше одной десятой от нормальной. Заключительная стадия хронического заболеваниая почек называется терминальной стадией почечной недостаточности (ХПН). На данном этапе почки больше не в состоянии удалять в достаточной мере продукты распада и излишки жидкости из организма. Пациент нуждается в диализе или трансплантации почки. Диабет, который приводит к диабетической нефропатии, и высокое кровяное давление представляют собой две наиболее распространенные причины хронического заболевания почек в большинстве случаев. Другие заболевания и состояния, которые могут повредить почки и привести к хроническому заболеванию почек, включают в себя: аутоиммунные заболевания (такие как системная красная волчанка и склеродермия); врожденные дефекты почек (такие как поликистоз почек); определенные токсичные химические вещества; гломерулонефрит; повреждение или травма; камни в почках и инфекция; проблемы с артериями, ведущими к или от почки; некоторые обезболивающие и другие лекарственные препараты (например, лекарства от рака); рефлюкс-нефропатия (при котором почки повреждены обратным потоком мочи в почки) и т.д. Используемая в настоящей заявке «протеинурия» относится к наличию избытка сывороточных белков в моче. Согласно некоторым вариантам осуществления протеинурия может свидетельствовать о заболевании почек, но сама по себе не является информативной.
Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления этих аспектов и всех подобных описанных в настоящей заявке аспектов субъект, характеризующийся наличием или риском развития хронического заболевания почек, имеет диабетическую нефропатию.
Под терминами "уменьшать" или "ингибировать" с точки зрения описанных в настоящей заявке способов лечения хронического заболевания почек и протеинурии подразумевается способность вызывать общее снижение данного параметра или симптома хронического заболевания почек предпочтительно на 20% или более, 30% или более, 40% или более, 45% или более, более предпочтительно на 50% или более, 55% или более, 60% или более, 65% или более, 70% или более и наиболее предпочтительно на 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более или 95% или более. Уменьшение или ингибирование может относиться, например, к симптомам нарушения, подлежащего лечению, например, высокому кровяному давлению, белку в моче и т.д.
Высокое кровяное давление почти всегда присутствует на всех стадиях хронического заболевания почек. Исследование нервной системы может показать признаки повреждения нерва. Медицинский работник при прослушивании с помощью стетоскопа может услышать ненормальные звуки сердца или легких. Ранние симптомы хронического заболевания почек представляют собой также симптомы других заболеваний. Эти симптомы могут быть единственными признаками заболевания почек, пока состояние не станет более запущенным. Симптомы хронического заболевания почек могут включать в себя: потерю аппетита; общее плохое самочувствие и усталость; головные боли; чесотку (зуд) и сухость кожи; тошноту; потерю веса, без попыток похудеть и т.д. Другие симптомы, которые могут развиваться, особенно когда функция почек ухудшилась, включают в себя: аномально темную или светлую кожу; боль в костях; симптомы заболевания головного мозга и нервной системы; сонливость и спутанность сознания; проблемы с концентрацией или мышлением; онемение в руках, ногах или других областях; подергивание мышц или судороги; запах изо рта; легкие кровоподтеки, кровотечение или кровь в стуле; чрезмерную жажду; частую икоту; низкий уровень сексуального интереса и импотенцию; прекращение менструаций (аменорею); одышку; такие проблемы со сном, как бессонницу, синдром беспокойных ног и синдром обструктивного апноэ сна; отеки ног и рук (водянку); рвоту, как правило, по утрам.
Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке способов эффективное количество композиции, содержащей описанный в настоящей заявке ингибитор ROBO2, вводят субъекту для облегчения симптомов хронического заболевания почек. Используемое в настоящей заявке "облегчение симптома хронического заболевания почек" представляет собой улучшение любого состояния или симптома, связанного с хроническим заболеванием почек. Кроме того, облегчение симптома хронического заболевания почек может включать в себя уменьшение одного или нескольких симптомов хронического заболевания почек у пациента относительно нелеченого контрольного субъекта, страдающего от хронического заболевания почек, или относительно этого пациента до начала лечения. По сравнению с эквивалентным нелеченым контролем или пациентом до начала лечения с ингибитором ROBO2 такое уменьшение или степени предупреждения составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или более, как измерено любым стандартным способом. Желательно, чтобы хроническое заболевание почек значительно снижалось или не обнаруживалось любым стандартным способом, известным в настоящей области техники, и в этом случае хроническое заболевание почек, рассматривается как вылеченное. Пациент, который получает лечение от хронического заболевания почек, представляет собой того, кому врач поставил диагноз как характеризующемуся таким состоянием. Диагноз может быть поставлен любыми подходящими способами, известными специалисту в настоящей области техники. Диагностика и мониторинг могут включать в себя, например, определение содержания таких специфических белков или молекул в моче, крови или образце сыворотки, как, например, альбумин, кальций, холестерин, общий анализ крови (СВС), электролиты, магний, фосфор, калий, натрий или любое их сочетание; анализы для выявления, например, клиренса креатинина; содержания креатинина; АМК (азот мочевины крови); путем применения таких специфических техник или процедур, как КТ брюшной полости, МРТ брюшной полости, УЗИ брюшной полости, биопсия почек, сканирование почек, УЗИ почек; путем обнаружения изменений в результатах анализов или исследований для эритропоэтина, ПТГ; теста на плотность костной ткани или витамина D; или любое сочетание таких способов и анализов выявления.
Используемые в отношении любого из описанных в настоящей заявке способов термины "субъект" и "индивидуум" применяются в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к животному, например, человеку, получателю описанных в настоящей заявке ингибиторов ROBO2. Для лечения болезненных состояний, которые характеризуются специфичностью для конкретного животного, такого как субъект-человек, термин "субъект" относится к такому конкретному животному. Термины "не относящиеся к человеку животные" и "не относящиеся к человеку млекопитающие" используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и включают в себя таких млекопитающих, как крысы, мыши, кролики, овцы, кошки, собаки, коровы, свиньи и нечеловекообразные приматы. Термин "субъект" также охватывает любое позвоночное, включая в себя без ограничения млекопитающих, рептилий, амфибий и рыб. Тем не менее, предпочтительно, субъект представляет собой такое млекопитающее, как человек, или таких других млекопитающих, как домашние млекопитающие, например собака, кошка, лошадь и тому подобное.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов способ дополнительно содержит введение субъекту дополнительного терапевтического средства в дополнение к ингибитору ROBO2. Такое дополнительное терапевтическое средство может вводиться совместно с ингибитором ROBO2. Используемая в настоящей заявке фраза «совместное введение" или "вводить совместно" означает введение описанного в настоящей заявке ингибитора ROBO2 и другого соединения, например, терапевтического средства, отдельно, одновременно и/или последовательно в течение определенного периода времени, который определяется квалифицированным медработником.
Согласно некоторым таким вариантам осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ), блокатор рецепторов ангиотензина II (БРА) или антагонист минералокортикоидных рецепторов (MR).
Описанные в настоящей заявке ингибиторы АСЕ для применения с ингибиторами ROBO2 включают в себя без ограничения беназеприл (представлен на рынке США как LOTENSIN™), каптоприл (представлен на рынке США как CAPOTEN™), эналаприл/эналаприлат (представлен на рынке США как VASOTEC™ для приема внутрь и инъекционный), фозиноприл (представлен на рынке США как МОНОПРИЛ™), лизиноприл (представлен на рынке США как ZESTRIL™ и ПРИНИВИЛ™), моэксиприл (представлен на рынке США как UNIVASC™), периндоприл (представлен на рынке США как ACEON™), хинаприл (представлен на рынке США как ACCUPRIL™), рамиприл (представлен на рынке США как ALTACE™) и трандолаприл (представлен на рынке США как MAVIK™). ARB для использования с описанными в настоящей заявке ингибиторами ROBO2 включают в себя кандесартан (представлен на рынке США как ATACAND™), ирбесартана (представлен на рынке США как AVAPRO™), олмесартан (представлен на рынке США как BENICAR™), лозартан (представлен на рынке США как COZAAR™), валсартан (представлен на рынке США как DIOVAN™), телмисартан (представлен на рынке США как MICARDIS™) и эпросартан (представлен на рынке США как ТЕВЕТЕН™).
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов и всех подобных описанных в настоящей заявке способов способ дополнительно содержит введение субъекту эффективного количества мочегонного средства в дополнение к ингибитору ROBO2. Мочегонные средства включают в себя без ограничения торсемид (представлен на рынке США как DEMADEX™), фуросемид (представлен на рынке США как LASIX™), буметанид (представлен на рынке США как BUMEX™), этакриновая кислота (представлен на рынке США как EDECRTN™), торсемид (представлен на рынке США как Demadex™), амилорид (представлен на рынке США как MIDAMOP™), ацеталозамид (представлен на рынке США как DIAMOX™), памабром (представлен на рынке США как AQUA-BAN™), маннитол (представлен на рынке США как ARIDOL™ или OSMITROL™), триамтерен (представлен на рынке США как DYRENIUM™), спиронолактон (представлен на рынке США как ALDACTONE™), амилорид (представлен на рынке США как MIDAMOR™), индапамид (представлен на рынке США как LOZOL™), гидрохлоротиазид (представлен на рынке США как HYDRODIURIL™), метолазон (представлен на рынке США как ZAROXOLYN™ или MYKROX™), метилхлортиазид (представлен на рынке США как AQUATENSEN™ или ENDURON™), гидрохлортиазид (представлен на рынке США как AQUAZIDE Н™ или ESIDRIX™, или MICROZIDE™), хлортиазид (представлен на рынке США как DIURIL™), бендрофлуметиазид (представлен на рынке США как NATURETIN™), политиазид (представлен на рынке США как RENESE™), гидрофлуметиазид (представлен на рынке США как SALURON™) и хлорталидон (представлен на рынке США как THALITONE™). Для получения полного списка также смотрите, например, Physician's Desk Reference, 2012 Edition, PDR Network (2011).
Используемые в настоящей заявке в отношении любой из композиций и способов, содержащих описанные в настоящей заявке ингибиторы ROBO-2 или включающую их комбинированную терапию, термины "лечить", "лечение", "проводить лечение" или "улучшение состояния" относятся к терапевтическим воздействиям, причем цель заключается в том, чтобы обратить вспять, облегчить, улучшить, ингибировать, замедлить или остановить прогрессирование или тяжесть состояния, связанного с заболеванием или нарушением. Термин "проводить лечение" включает в себя уменьшение или облегчение по меньшей мере одного неблагоприятного эффекта или симптома состояния, заболевания или нарушения, связанного с хроническим заболеванием почек, такого как, без ограничения, диабетической нефропатии. Лечение, как правило, "эффективно", если один или несколько симптомов или клинических маркеров уменьшаются. Кроме того, лечение "эффективно", если прогрессирование заболевания уменьшается или прекращается. То есть, "лечение" включает в себя не только улучшение симптомов или маркеров, но также прекращение по меньшей мере медленного прогрессирования или ухудшения симптомов, которое можно было бы ожидать в отсутствие лечения. Эффективные или желаемые клинические результаты включают в себя без ограничения облегчение одного или более симптома(ов), уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е. без ухудшения) состояние заболевания, задержка или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (как частичную, так и полную), как поддающуюся обнаружению, так и недиагностированную. Термин "лечение" заболевания также включает в себя оказание помощи при симптомах или побочных эффектах заболевания (включая в себя паллиативное лечение).
Используемый в настоящей заявке термин «эффективное количество» относится к количеству описанного в настоящей заявке ингибитора ROBO-2, необходимого для облегчения по меньшей мере одного или нескольких симптомов подвергаемого лечению заболевания или нарушения и относится к достаточному количеству фармакологической композиции для обеспечения требуемого эффекта. Термин "терапевтически эффективное количество" поэтому относится к количеству описанного в настоящей заявке ингибитора ROBO-2 с использованием описанных в настоящей заявке способов, которое достаточно для обеспечения определенного эффекта при введении типичному субъекту. Используемое в настоящей заявке эффективное количество также будет включать в себя количество, достаточное для того, чтобы задержать развитие симптома заболевания, изменить ход симптома заболевания (например, без ограничения, замедлить прогрессирование симптома заболевания) или обратить симптом заболевания. Таким образом, не возможно точно определить "эффективное количество". Тем не менее для любого данного случая соответствующее "эффективное количество" может быть определено специалистом в настоящей области техники с использованием только рутинного экспериментирования.
50
50
50
50
50
Эффективные количества, токсичность и терапевтическая эффективность может быть определена с использованием стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, для определения LD (дозы, летальной для 50% популяции) и ED (дозы, терапевтически эффективной у 50% популяции). Дозировка может варьировать в зависимости от используемой лекарственной формы и способа введения. Соотношение дозы между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено как отношение LD/ED. Предпочтительны композиции и способы, которые проявляют высокие терапевтические индексы. Терапевтически эффективная доза может быть оценена первоначально из анализов клеточных культуры. Кроме того, доза может быть составлена на животных моделях для достижения диапазона циркулирующих в плазме концентраций, который включает в себя IC (т.е. концентрацию описанного в настоящей заявке ингибитора ROBO2, который достигает половину максимального ингибирования измеряемой функции или активности) в качестве определяемой в культуре клеток или в соответствующей животной модели. Содержание в плазме может быть измерено, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Эффекты какой-либо конкретной дозировки можно контролировать с помощью подходящего биоанализа. Дозировка может быть определена лечащим врачом и отрегулирована, если необходимо, для удовлетворения требованиям наблюдаемых эффектов лечения. В зависимости от типа и тяжести хронического заболевания почек, приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг) описанного в настоящей заявке ингибитора ROBO2 представляет собой начальный диапазон доз для введения субъекту, как, например, с помощью одного или нескольких отдельных введений, так и путем непрерывной инфузии.
Способы введения
Описанные в настоящей заявке ингибиторы ROBO2 или включающая их комбинированная терапия может быть введена нуждающемуся в них субъекту любым подходящим способом, который приводит к эффективному лечению субъекта. Используемые в настоящей заявке термины "введение" и "внесение" используются взаимозаменяемо и относятся к помещению ингибитора ROBO-2 в субъект способом или путем, который приводит по меньшей мере к частичной локализации таких средств в требуемом месте, таким образом, чтобы производить требуемый эффект(ы).
Согласно некоторым вариантам осуществления ингибитор ROBO2 вводят субъекту, характеризующемуся хроническим заболеванием почек, любым способом введения, который доставляет средство системно или до требуемой поверхности или мишени, и может включать в себя без ограничения инъекцию, инфузию, инсталляцию и ингаляционное введение. В тех случаях, когда полипептидные средства могут быть защищены от инактивации в кишечнике, также рассматриваются пероральные формы введения. "Инъекция" включает в себя без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интракапсулярную, внутриорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, интрацереброспинальную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Согласно некоторым вариантам осуществления ингибиторы ROBO-2 для применения в описанных в настоящей заявке способах вводят путем внутривенной инфузии или инъекции.
Используемые в настоящей заявке фразы "парентеральное введение" и "введенное парентерально" относятся к способам введения, отличным от энтерального и местного введения, как правило, в виде инъекций. Используемые в настоящей заявке фразы "системное введение", "введенное системно", "периферическое введение" и "введенное периферически" относятся к введению ингибитора ROBO-2, отличному от непосредственного введения в сайт-мишень, ткань или орган, такого как локализация опухоли, такому, что он входит в кровеносную систему субъекта и, таким образом, подлежит метаболизму и другим подобным процессам.
Для клинического применения описанных в настоящей заявке способов введение описанных в настоящей заявке ингибиторов ROBO-2 может включать в себя состав в фармацевтических композициях или фармацевтические составы для парентерального введения, например, внутривенного; мукозального, например, интраназального; окулярного или другого способа введения. Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящей заявке ингибиторы ROBO-2 могут быть введены вместе с любым фармацевтически приемлемым соединением-носителем, материалом или композицией, которое приводит к эффективному лечению субъекта. Таким образом, фармацевтический состав для применения в описанных в настоящей заявке способах может содержать описанный в настоящей заявке ингибитор ROBO-2 в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми ингредиентами.
Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к таким соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые, в рамках здравого медицинского представления, пригодны для применения в контакте с тканями человека и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соразмерно с разумным соотношением польза/риск. Используемая в настоящей заявке фраза "фармацевтически приемлемый носитель" означает такой фармацевтически приемлемый материал, композицию или наполнитель, как жидкий или твердый заполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель, среда, инкапсулирующий материал, вспомогательное средство (например, смазочный материал, тальк, магний, кальций или стеарат цинка, или стеариновая кислота) или растворимый инкапсулирующий материал, участвующий в поддержании стабильности, растворимости или активности ингибитора ROBO-2. Каждый носитель должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не приносить вред пациенту. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают в себя: (1) такие сахара, как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) такие крахмалы, как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и такие ее производные, как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) такие эксципиенты, как масло какао и воски для суппозиториев; (8) такие масла, как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (9) такие гликоли, как пропиленгликоль; (10) такие полиолы, как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль (PEG); (11) такие сложные эфиры, как этилолеат и этиллаурат; (12) агар; (13) такие буферные агенты, как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (14) альгиновую кислоту; (15) апирогенную воду; (16) изотонический физиологический раствор; (17) раствор Рингера; (19) рН буферные растворы; (20) сложные полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды; (21) такие объемообразующие средства, как полипептиды и аминокислоты (22) такие сывороточные компоненты, как сывороточный альбумин, ЛВП и ЛНП; (23) такие С2-С12 спирты, как этанол и (24) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах. Смазывающие средства, покрывающие средства, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в составе. Такие термины, как "вспомогательное вещество", "носитель", "фармацевтически приемлемый носитель" или тому подобные используются в настоящей заявке взаимозаменяемо.
Описанные в настоящей заявке ингибиторы ROBO-2 могут быть специально составлены для введения соединения в организм пациента в твердой, жидкой или гелевой форме, включая в себя адаптированные для следующих целей: (1) парентерального введения, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции, как, например, стерильный раствор или суспензия, или препарат с замедленным высвобождением; (2) местного применения, например, в виде крема, мази, или пластыря с контролируемым высвобождением или наносимого на кожу спрея; (3) интравагинального или ректального введения, например, в виде пессария, крема или пены; (4) окулярного; (5) трансдермального; (6) трансмукозального или (7) интраназального введения. Кроме того, ингибитор ROBO-2 может быть имплантирован в тело пациента или инъецирован с помощью системы доставки лекарственных средств. Смотрите, например, Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981); U.S. Pat. No. 3,773,919; and U.S. Pat. No. 35 3,270,960.
Дополнительные варианты осуществлений составов и способов введения композиций, содержащих описанные в настоящей заявке ингибиторы ROBO-2, которые могут быть использованы в описанных в настоящей заявке способах, описаны ниже.
Парентеральные лекарственные формы. Парентеральные лекарственные формы ингибиторов ROBO-2 можно также вводить субъекту с хроническим состоянием почек различными способами, включая в себя без ограничения подкожный, внутривенный (включая в себя болюсную инъекцию), внутримышечный и внутриартериальный. Поскольку введение парентеральных лекарственных форм, как правило, обходит естественные защиты пациента против загрязнений, парентеральные лекарственные формы предпочтительно характеризуются стерильностью или могут быть стерилизованы перед введением пациенту. Примеры парентеральных лекарственных форм включают в себя без ограничения готовые для инъекций растворы, сухие продукты, готовые к растворению или суспендированию в фармацевтически приемлемом наполнителе для инъекций, готовые для инъекций суспензии с контролируемым высвобождением парентеральных лекарственных форм и эмульсии.
Подходящие наполнители, которые могут быть использованы для обеспечения парентеральных лекарственных форм раскрытия, хорошо известны специалистам в настоящей области техники. Примеры включают в себя без ограничения: стерильную воду; воду для инъекций USP; солевой раствор; раствор глюкозы; такие водные наполнители, как без ограничения физиологический раствор для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, декстрозу и физиологический раствор для инъекций и раствор Рингера с лактатом для инъекций; такие смешиваемые с водой наполнители, как, без ограничения, этиловый спирт, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль; и такие неводные наполнители, как, без ограничения, кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, кунжутное масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат.
Согласно некоторым вариантам осуществления содержащие эффективное количество ингибитора ROBO2 композиции составлены так, чтобы быть пригодными для перорального введения, например, в виде таких дискретных лекарственных форм, как, без ограничения, таблетки (включая в себя без ограничения с насечками или с покрытием), пилюли, каплеты, капсулы, жевательные таблетки, пакетики с порошком, крахмальные облатки, пастилки, облатки, аэрозоли или такие жидкости, как, без ограничения, сиропы, эликсиры, растворы или суспензии в водной жидкости, неводной жидкости, эмульсии масло-в-воде или эмульсии вода-в-масле. Такие композиции содержат определенное количество фармацевтически приемлемой соли раскрытых соединений и могут быть приготовлены с помощью способов фармации, хорошо известных специалистам в настоящей области техники. Смотрите в общем, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton, Pa. (1990).
Благодаря легкости введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные твердые пероральные дозированные формы, в том случае, когда используются твердые фармацевтические вспомогательные вещества. При необходимости таблетки могут быть покрыты с помощью стандартных водных или неводных техник. Эти лекарственные формы могут быть приготовлены любым из способов фармации. Как правило, фармацевтические композиции и лекарственные формы получают путем равномерного и тщательного смешивания активного ингредиента(ов) с жидкими носителями, мелко измельченными твердыми носителями или обоими, а затем, если необходимо, формованием продукта желаемой формы. Согласно некоторым вариантам осуществления пероральные лекарственные формы не применяются для антибиотического средства.
Типичные пероральные лекарственные формы композиций, содержащих эффективное количество ингибитора ROBO2, получают путем комбинирования фармацевтически приемлемой соли ингибитора ROBO2 в однородной смеси по меньшей мере с одним вспомогательным веществом в соответствии с обычными техниками фармацевтических композиций. Вспомогательные вещества могут принимать широкое разнообразие форм в зависимости от формы композиции, требуемой для введения. Например, вспомогательные вещества, пригодные для использования в жидкой пероральной или аэрозольной лекарственных формах включают в себя без ограничения воду, гликоли, масла, спирты, вкусовые добавки, консерванты и красители. Примеры вспомогательных веществ, пригодных для использования в твердых пероральных лекарственных формах (например, порошки, таблетки, капсулы, каплеты) включают в себя без ограничения крахмалы, сахара, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связующие вещества и разрыхлителями.
Связующие вещества, пригодные для использования в описанных в настоящей заявке фармацевтических составах, включают в себя без ограничения кукурузный крахмал, картофельный крахмал или другие крахмалы, желатин, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, альгинат натрия, альгиновую кислоту, другие альгинаты, порошкообразный трагакант, гуаровую камедь, целлюлозу и ее производные (например, этилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, кальций карбоксиметилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу), поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, предварительно желатинированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу (например, №220829062910), микрокристаллическую целлюлозу и их смеси.
Примеры заполнителей, пригодных для использования в описанных в настоящей заявке фармацевтических составах, включают в себя без ограничения тальк, карбонат кальция (например, гранулы или порошок), микрокристаллическую целлюлозу, порошкообразную целлюлозу, декстраты, каолин, маннит, кремниевую кислоту, сорбит, крахмал, предварительно желатинированный крахмал и их смеси. Связующее вещество или заполнитель в описанных в настоящей заявке фармацевтических композициях, как правило, присутствует в количестве от приблизительно 50 до приблизительно 99 массовых процентов фармацевтической композиции.
Разрыхлители используются в описанных в настоящей заявке пероральных фармацевтических составах для получения таблеток, которые распадаются при контакте с водной средой. Должно быть использовано достаточное количество разрыхлителя, которого не должно быть ни слишком мало, ни слишком много, чтобы отрицательно влиять на высвобождение активного ингредиента(ов), для образования твердых пероральных лекарственных форм описанных в настоящей заявке ингибиторов ROBO2.
Количество разрыхлителя варьирует в зависимости от типа состава и очевидно специалистам в настоящей области техники. Разрыхлители, которые могут быть использованы для образования пероральных фармацевтических составов, включают в себя без ограничения агар, альгиновую кислоту, карбонат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, натриевую соль кроскармеллозы, кросповидон, калия полакрилин, натрия крахмала гликолят, картофельный крахмал или крахмал из тапиоки, другие крахмалы, предварительно желатинизированный крахмал, глины, другие альгины, другие целлюлозы, камеди и их смеси.
Смазывающие вещества, которые могут быть использованы для образования пероральных фармацевтических составов описанных в настоящей заявке ингибиторов ROBO2, включают в себя без ограничения стеарат кальция, стеарат магния, минеральное масло, легкое минеральное масло, глицерин, сорбит, маннит, полиэтиленгликоль, другие гликоли, стеариновую кислоту, лаурилсульфат натрия, тальк, гидрированное растительное масло (например, арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло), стеарат цинка, этилолеат, этиллауреат, агар и их смеси. Дополнительные смазывающие вещества включают в себя, например, силоидный силикагель (AEROSIL 200, выпускаемый W. R. Grace Co. of Baltimore, Md.), коагулированный аэрозоль синтетического диоксида кремния (продаваемый фирмой Degussa Co. of Piano, Тех.), CAB-O-SIL (продукт пирогенного диоксида кремния, продаваемый Cabot Co. of Boston, Mass.) и их смеси. Если смазочные вещества вообще используются, то обычно их количество составляет менее чем приблизительно 1 массовый процент фармацевтических композиций или лекарственных форм, в которые они включены.
Согласно другим вариантам осуществления предусмотрены не содержащие лактозу фармацевтические составы и лекарственные формы, причем такие композиции преимущественно содержат мало, если вообще содержат, лактозы или других моно- или дисахаридов. Используемый в настоящей заявке термин "не содержащий лактозу" означает, что количество присутствующей лактозы, если таковое имеется, недостаточно для существенного увеличения скорости деградации активного ингредиента. Не содержащие лактозу композиции согласно раскрытию могут содержать вспомогательные вещества, которые хорошо известны в настоящей области техники и перечислены в USP (XXI)/NF (XVI), который включен в настоящий документ посредством ссылки.
nd
Пероральные составы ингибиторов ROBO2 дополнительно охватывают, согласно некоторых вариантам осуществления, безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие описанные в настоящей заявке ингибиторы ROBO2 в качестве активных ингредиентов, поскольку вода может способствовать деградации некоторых соединений. Например, добавление воды (например, 5%) широко распространено в фармацевтической области как средство имитации длительного хранения для определения таких характеристик, как срок годности или стабильность составов с течением времени. Смотрите, например, Jens Т. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 379-80 (2 ed., Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995). Описанные в настоящей заявке безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы могут быть получены с использованием безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги в условиях низкой влажности. Фармацевтические композиции и лекарственные формы, которые содержат лактозу и по меньшей мере один активный ингредиент, который содержит первичный или вторичный амин, должны быть преимущественно безводными, если ожидается существенный контакт с водой и/или влажностью в процессе производства, упаковки и/или хранения. Безводные композиции преимущественно упаковывают с использованием материалов, предотвращающих взаимодействие с водой, так чтобы они могли быть включены в соответствующие рецептурных наборы. Примеры подходящей упаковки включают в себя без ограничения герметичную фольгу, пластмассы, контейнеры с однократными дозами (например, флаконы) с или без десиккантов, блистерные упаковки, а также контурные упаковки.
Аэрозольные составы. Ингибитор ROBO-2 может быть упакован в герметичный аэрозольный контейнер вместе с подходящими распыляющим веществом, например, такими углеводородными пропеллентами, как пропан, бутан или изобутан с обычными адъювантами. Ингибитор ROBO-2 можно также вводить в такой несжатой форме, как в небулайзере или пульверизаторе. Ингибитор ROBO-2 можно также вводить непосредственно в дыхательные пути в виде сухого порошка, например, путем применения ингалятора.
Подходящие порошковые композиции включают в себя, в качестве иллюстрации, порошкообразные препараты ингибитора ROBO-2, тщательно перемешанные с лактозой или другими инертными порошками, приемлемыми для внутрибронхиального введения. Порошковые композиции могут быть введены через аэрозольный распылитель или заключены в ломкой капсуле, которая может быть вставлена пациентом в устройство, которое прокалывает капсулу и выдувает порошок в устойчивый поток, пригодный для ингаляции. Композиции могут включать в себя пропелленты, поверхностно-активные вещества и сорастворители и могут быть помещены в обычные аэрозольные баллоны, которые закрыты с помощью соответствующего дозирующего клапана.
Аэрозоли для доставки в дыхательные пути известны в настоящей области техники. Смотрите, например, Adjei, A. and Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. and Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract," in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6: 273-313 (1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)) и имеют потенциал для системной доставки пептидов и белков, а также (Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8: 179-196 (1992)); Timsina et al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); and Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4: 26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. and Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. and R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, and Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. Α., Drag Delivery, 2: 10 1-20 1995); Patton, J. and Platz, R., Adv. Drag Del. Rev., 8: 179-196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28: 15 79-85 (1994); Damms, B. and Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995); and Kobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996), содержания которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
nd
Описанные в настоящей заявке составы ингибиторов ROBO-2 дополнительно охватывают безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие описанные соединения в качестве активных ингредиентов, поскольку вода может способствовать деградации некоторых соединений. Например, добавление воды (например, 5%) широко распространено в фармацевтической области как средство имитации длительного хранения для определения таких характеристик, как срок годности или стабильность составов с течением времени. Смотрите, например, Jens T. Carstensen, Drag Stability: Principles & Practice, 379-80 (2ed., Marcel Dekker, NY, N.Y.: 1995). Безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы согласно раскрытию могут быть получены с использованием безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги в условиях низкой влажности. Фармацевтические композиции и лекарственные формы, которые содержат лактозу и по меньшей мере один активный ингредиент, который содержит первичный или вторичный амин, должны быть преимущественно безводными, если ожидается существенный контакт с водой и/или влажностью в процессе производства, упаковки и/или хранения. Безводные композиции преимущественно упаковывают с использованием материалов, предотвращающих взаимодействие с водой, так чтобы они могли быть включены в соответствующие рецептурных наборы. Примеры подходящей упаковки включают в себя без ограничения герметичную фольгу, пластмассы, контейнеры с однократными дозами (например, флаконы) с или без десиккантов, блистерные упаковки, а также контурные упаковки.
Лекарственные формы с контролируемым и отсроченным высвобождением. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке аспектов ингибитор ROBO-2 может быть введен субъекту с помощью контролируемого или отсроченного высвобождения. В идеале, применения оптимально разработанного препарата с контролируемым высвобождением в лечении характеризуется минимумом лекарственного вещества, используемого для лечения или контроля состояния, в минимальном временном промежутке. Преимущества составов с контролируемым высвобождением включают в себя: 1) расширенную активность лекарственного средства; 2) уменьшенную кратность приема; 3) увеличенную приверженность лечению пациентами; 4) использование меньше лекарственных средств в целом; 5) снижение локальных или системных побочных эффектов; 6) минимизацию накопления лекарственных средств; 7) уменьшение колебаний содержания в крови; 8) улучшение эффективности лечения; 9) уменьшение потенцирования или потери активности лекарственного средства и 10) улучшение в скорости контроля заболеваний или состояний. (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)). Составы с контролируемым высвобождением могут быть использованы для контроля начала действия соединения формулы (I), продолжительности действия, содержания в плазме в пределах терапевтического окна и пикового содержания в крови. В частности, лекарственные формы или составы с контролируемым или отсроченным высвобождением могут быть использованы для уверенности в том, что максимальная эффективность соединения формулы (I) достигается при минимизации потенциальных побочных эффектов и угрозы безопасности, которые могут происходить как из-за уменьшения дозировки лекарственного средства (т.е. снижения ниже минимальных терапевтических уровней), так и из-за превышения уровня токсичности для лекарственного средства.
Множество известных лекарственных форм, составов и устройств с контролируемым или отсроченным высвобождением могут быть адаптированы для применения с описанными в настоящей заявке ингибиторами ROBO-2. Примеры включают в себя без ограничения те, которые описаны в патентах США No: 3845770; 3916899; 3536809; 3598123; 4008719; 5674.533; 5059595; 5591, 767; 5120548; 5073543; 5639476; 5354556; 5733566 и 6365185 В1, каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Эти лекарственные формы могут быть использованы для обеспечить медленного или контролируемого высвобождение одного или нескольких активных ингредиентов с использованием, например, гидроксипропилметилцеллюлозы, других полимерных матриц, гелей, проницаемых мембран, осмотических систем (таких как OROS (Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA)), многослойных покрытий, микрочастиц, липосом, микросфер или их комбинаций, чтобы обеспечить необходимый профиль высвобождения в различных пропорциях. Кроме того, могут быть использованы ионообменные материалы для получения иммобилизованных, адсорбированных солевых форм раскрытых соединений и таким образом осуществить контролируемую доставку лекарственного средства. Примеры специфических анионообменников включают в себя без ограничения DUOLITE А568 и DUOLITE АР143 (Rohm & Haas, Spring House, PA USA).
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке способов ингибитор ROBO-2 для применения в описанных в настоящей заявке способах вводят субъекту с замедленным высвобождением или импульсно. Пульс-терапия не представляет собой форму прерывистого введения такого же количества композиции в динамике, но заключает в себе введение той же дозы композиции со сниженной частотой или введение сниженных доз. Замедленное высвобождение или импульсные введения особенно предпочтительны, когда нарушение у субъекта происходит в течение длительного времени, например, когда субъект характеризуется наличием хронического заболевания почек. Каждая импульсная доза может быть уменьшена, а общее количество описанного в настоящей заявке ингибитора ROBO-2, вводимого за курс лечения субъекту или пациенту, сведено к минимуму.
Интервал между импульсами, при необходимости, может быть определен специалистом с обычной квалификацией в настоящей области техники. Часто интервал между импульсами может быть вычислен путем введения еще одной дозы композиции, когда композиция или активный компонент композиции больше не обнаруживается у субъекта до доставки следующего импульса. Интервалы также могут быть рассчитаны из времени полужизни композиции in vivo. Интервалы могут быть рассчитаны как большее, чем время полужизни in vivo или в 2, 3, 4, 5 и даже 10 раз большее время полужизни композиции. Различные способы и аппаратура для импульсных композиций путем инфузии или другие формы доставки пациенту раскрыты в патентах США №4747825; 4723958; 4948592; 4965251 и 5403590.
Согласно некоторым вариантам осуществления могут быть получены препараты с замедленным высвобождением, содержащие ингибитор ROBO-2. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают в себя полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие ингибитор, в котором матрицы находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают в себя полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамат, недеградируемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOT (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-оксимасляную кислоту.
Составы, содержащие используемые для введения in vivo ингибиторы ROBO-2, преимущественно стерильные. Это легко достигается путем фильтрации через, например, стерильные фильтрационные мембраны и другими способами, известными специалистам в настоящей области техники.
Также в настоящей заявке предусмотрены согласно некоторым аспектам анализы, способы и системы для определения того, характеризуется ли индивидуум наличием хронического заболевания почек или предрасположенности к хроническому заболеванию почек или протеинурии на основе профилей экспрессии или информации о последовательности ROBO2 в качестве индикативного биомаркера хронического заболевания почек или предрасположенности к хроническому заболеванию почек или протеинурии. Как показано в настоящей заявке ROBO2 применим в качестве биомаркера для идентификации субъекта, характеризующегося наличием хронического заболевания почек или высоким риском развития хронического заболевания почек или протеинурии, или для мониторинга влияния лечения на прогрессирование хронического заболевания почек или протеинурии.
Используемый в настоящей заявке "биомаркер" относится к органической биомолекуле, которая дифференциально присутствует в образце, взятом у субъекта одного фенотипического статуса (например, с заболеванием), по сравнению с другим фенотипическим статусом (например, без заболевания). Биомаркер дифференциально присутствует между различными фенотипическими статусами, если среднее значение или медиана уровня экспрессии биомаркера в различных группах рассчитывается статистически значимыми. Общие тесты для статистической значимости включают в себя, среди прочего, t-критерий, дисперсионный анализ, Крускала-Уоллиса, Уилкоксона, Манна-Уитни и отношение шансов. Биомаркеры, отдельно или в комбинации, обеспечивают меры относительного риска принадлежности субъекта одному фенотипическому статуса или иному. Как таковые, они применимы в качестве маркеров для заболевания (диагностики), терапевтической эффективности лекарственного средства (тераностики) и токсичности лекарственного средства.
Экспрессия ROBO2 для применения в описанных в настоящей заявке анализах может быть обнаружена любым подходящим способом, включая в себя обнаружение или содержание белка или обнаружение уровней экспрессии мРНК. Полипептид ROBO2 может быть обнаружен в любой форме, которая может быть найдена в полученном от субъекта биологическом образце, и в любой форме, которая может возникнуть в результате манипуляции с биологической пробой (например, в результате обработки образцов). Модифицированные формы ROBO2 могут включать модифицированные белки, которые представляют собой продукты аллельных вариантов, вариантов сплайсинга, посттрансляционной модификации (например, гликозилирования, протеолитического расщепления (например, фрагменты исходного белка), гликозилирования, фосфорилирования, липидизации, окисления, метилирования, цистеинилирования, сульфирования, ацетилирования и тому подобное), олигомеризации, де-олигомеризации (в отдельные мономеры из мультимерной формы белка), денатурации и тому подобное.
Описанные в настоящей заявке способы анализа могут быть разработаны для выявления всех форм или конкретной формы ROBO2. Где необходимо, различие между различными формами ROBO2, например, различными изоформами, может быть достигнуто путем использования способов обнаружения, зависящих от физических характеристик, которые отличаются между формами, например, различной молекулярной массы, различного молекулярного размера, наличия/отсутствия различных эпитопов и тому подобное.
Соответственно, в настоящей заявке предусмотрены согласно некоторым аспектам анализы для диагностики субъекта с хроническим заболеванием почек или с риском хронического заболевания почек или протеинурии, анализ, предусматривающий: измерение содержания белка или нуклеиновой кислоты ROBO2 в полученном от субъекта биологическом образце, причем, если содержание ROBO2 в биологическом образце от субъекта находится на том же уровне или выше (например, более, чем на статистически значимое количество) порогового эталонного содержания ROBO2, субъект вероятно характеризуется риском развития хронического заболевания почек или протеинурии или характеризуется наличием хронического заболевания почек. Например, увеличение содержания ROBO2 более чем приблизительно на 10%, или более чем приблизительно на 20%, или более чем приблизительно на 30%, или более чем приблизительно на 40%, или более чем приблизительно на 50%, или более чем приблизительно на 60%, или более, по сравнению с эталонным пороговым содержанием ROBO2. Согласно некоторым вариантам осуществления увеличение содержания ROBO2 по меньшей мере на одно стандартное отклонение больше или по меньшей мере на два стандартных отклонения или более больше, чем медиана или среднее значение эталонного порогового содержания ROBO2. Такая медиана или среднее значение эталонных уровней ROBO2 может быть получена, например, из пяти или более образцов, полученных от субъектов без хронических заболеваний почек или протеинурии, или из пяти или более образцов, полученных от того же субъекта в различные временные точки.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих способов анализа измеряемое в биологическом образце количество ROBO2 сравнивают с эталонным пороговым уровнем или эталонным биологическим образцом, таким как биологический образец, полученный от нормального контроля того же возраста (например, субъекта того же возраста, характеризующегося отсутствием риска развития хронического заболевания почек или протеинурии), или здорового субъекта, например, здорового человека.
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящей заявке анализы, системы и наборы могут быть также применимы для мониторинга курса лечения, вводимого субъекту. Например, можно измерить содержание ROBO2 в биологическом образце у субъекта в первой временной точке (например, t1) и сравнить с эталонным пороговым содержанием биомаркера ROBO2, и если измеренное содержание ROBO2 такое же или выше, чем эталонное пороговое содержание, субъекту можно вводить соответствующее терапевтическое лечение или режим, чтобы задержать или уменьшить риск возникновения хронического заболевания почек или протеинурии, например, увеличить физическую нагрузку, уменьшить сердечное давление, отрегулировать диету и т.д., как раскрыто в способах настоящего документа, а затем содержание панели белка-биомаркера ROBO2 может быть измерено во второй (например, t2) и последующие временные точки (например, t3, t4, t5, t5… и т.д.), и по сравнению с содержанием ROBO2 в одной или нескольких временных точках (например, в t1 или любой последующей временной точке) или с эталонным пороговым содержанием ROBO2, чтобы определить, эффективно ли терапевтическое лечение или медицинское лечение, или режим для уменьшения риска, задержания или уменьшения возникновения хронического заболевания почек или протеинурии. Согласно некоторым таким вариантам осуществления раскрытые в настоящей заявке анализы, системы и наборы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения у симптоматического субъекта (например, субъекта с хроническим заболеванием почек или протеинурией), где эффективное лечение может быть уменьшением ROBO2 у субъекта, или, альтернативно, раскрытые в настоящей заявке анализы, системы и наборы могут быть использованы для мониторинга эффекта профилактического лечения у бессимптомного субъекта (например, для предотвращения возникающего у субъекта хронического заболевания почек или протеинурии), например, где субъект был определен к группе риска развития хронического заболевания почек или протеинурии в соответствии с описанными в настоящей заявке способами или другими, известными в настоящей области техники, или из-за наследственных причин, например.
Используемый в настоящей заявке термин "образец", как правило, относится к любому материалу, содержащему нуклеиновую кислоту, или ДНК, или РНК, или аминокислоты. Как правило, такой материал будет в виде образца крови, образца кала, образца ткани, клеток, бактерий, гистологического среза или буккального мазка. Образцы могут быть подготовлены, например, образцы могут быть свежими, фиксированными, замороженными или залитыми в парафине. Используемый в настоящей заявке термин "биологический образец" относится к клетке или популяции клеток, или количеству ткани или жидкости от субъекта. Чаще всего образец был удален из субъекта, но термин "биологический образец" может также относиться к клеткам или тканям, проанализированным in vivo, т.е. без удаления из субъекта. Часто "биологический образец" будет содержать клетки от животного, но этот термин может также относиться к неклеточному биологическому материалу, например неклеточным фракциям крови, слюне, моче или тем, которые могут быть использованы для измерения уровня экспрессии генов. Биологические образцы включают в себя без ограничения биопсии тканей, царапины, цельную кровь, плазму, сыворотку, мочу, слюну, культуры клеток или спинномозговой жидкости. Биологические образцы также включают в себя биопсию тканей, клеточную культуру. Биологический образец или образец ткани может относиться к образцу ткани или жидкости, выделенной от индивидуума, включая без ограничения, например, мочу, кровь, плазму, сыворотку, биопсию почки, стул, мокроту, спинномозговую жидкость, плевральную жидкость, аспираты из сосков, лимфу, внешние срезы кожи, дыхательных, кишечных и мочеполовых трактов, слезы, слюну, молоко, клетки (включая без ограничения клетки крови), опухоли, органы, а также образцы составляющей клеточных культур in vitro. Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых получают образец мочи, образец мочи центрифугируют для осаждения любых почечных клеток, на которых могут быть выполнены описанные в настоящей заявке анализы и способы. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой биопсию почки, такую как толстоигольную биопсию почки или ее части, например, образец подоцитов. Кроме того, используются тонкоигольные аспирационные образцы.
Согласно некоторым вариантам осуществления биологические образцы могут быть подготовлены, например, образцы могут быть свежими, фиксированными, замороженными или залитыми в парафине. Образец может быть получен путем забора образца клеток у субъекта, а также может быть получен с использованием ранее выделенных клеток (например, выделенных другим лицом) либо путем выполнения описанных в настоящей заявке способов in vivo.
Используемый в настоящей заявке термин "экспрессия" относится взаимозаменяемо к экспрессии полипептида или белка или экспрессии полинуклеотида или экспрессии гена. Экспрессия также относится к экспрессии претрансляционно модифицированных и посттрансляционно модифицированных белков, а также экспрессии молекул пре-мРНК, подвергнутых альтернативному сплайсингу, и зрелых молекул мРНК. Экспрессия полинуклеотида может быть определена, например, путем измерения продукции молекул РНК-транскрипта, например, содержания транскриптов матричной РНК (мРНК). Экспрессия белка или полипептида может быть определена, например, с помощью иммуноферментного анализа с использованием антитела (антител), которое связывается с полипептидом. Применяемый к полинуклеотидам термин "кодирует" относится к полинуклеотиду, который, как говорят, "кодирует" полипептид или белок, если в его нативном состоянии или когда манипулируют способами, хорошо известными специалистам в настоящей области техники, он может быть транскрибирован для получения РНК, которая может быть транслирована в аминокислотную последовательность для произведения полипептида и/или его фрагмента. Антисмысловая цепь комплементарна такой нуклеиновой кислоте и из нее может быть получена кодирующая последовательность. Термин "эндогенно экспрессированный" или "эндогенная экспрессия" относится к экспрессии генного продукта при нормальных уровнях и при нормальном регулировании для этого типа клеток.
Способы обнаружения, которые можно использовать с описанными в настоящей заявке анализами, способами и системами, для измерения содержания белка или нуклеиновой кислоты ROBO2 в образце или биологическом образце включают в себя оптические способы, электрохимические способы (техники вольтамперометрии и амперометрии), атомносиловой микроскопии и радиочастотные, например, многополярную резонансную спектроскопию. Оптические способы включают в себя микроскопию, как конфокальную, так и неконфокальную, обнаружение флуоресценции, люминесценции, хемилюминесценции, абсорбции, отражения, пропускания и показатель двулучепреломления или преломления (например, поверхностный плазмонный резонанс, эллипсометрию, способ резонансного зеркала, способ с волновым решеточным светоделителем или интерферометрию).
Согласно тем вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем, в которых содержание белка ROBO2 определяют, как, например, содержание белка SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, можно применять любой протеомный подход, широко известный специалистам с обычной квалификацией в настоящей области техники, для измерения содержания белков-биомаркеров в биологическом образце. Измерение может быть либо количественным, либо качественным при условии, что измерение способно определить или указать характеризуется ли содержание белка ROBO2 в биологическом образце таким же значением, или выше, или ниже эталонного порогового значения для белка ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления измеренное содержание белка ROBO2 может быть первичным измерением содержания белка ROBO2 (измеряющим количество самого белка ROBO2, например, путем определения количества молекул белка ROBO2 в образце) или согласно некоторым вариантам осуществления это может быть вторичным измерением белка ROBO2 (измерение, из которого количество белка ROBO2 может быть, но не обязательно, выведено, как мера функциональной активности или мера такой нуклеиновой кислоты, как кодирующая белок ROBO2 мРНК). Качественные данные также могут быть выведены или получены из первичных измерений.
D
D
d
50
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов и способов содержание белка ROBO2 может быть измерено с использованием технологии измерения на основе аффинности. Термин "аффинность" по отношению к антителу хорошо известен в настоящей области техники и означает степень или силу связывания антитела с таким партнером по связыванию, как описанный в настоящей заявке биомаркер (или его эпитоп). Аффинность может быть измерена и/или выражена несколькими известными в настоящей области техники способами, включая в себя без ограничения равновесную константу диссоциации (K или Kd), кажущуюся равновесную константу диссоциации (K или K) и IC (количество, неоходимое для осуществления 50%-ного ингибирования в конкурентном анализе, используется в настоящей заявке взаимозаменяемо с «I50»). Понятно, что для целей настоящего изобретения, аффинность представляет собой среднюю аффинность для данной популяции антител, которые связываются с эпитопом.
Основанные на аффинности измерения используют молекулу, которая специфически связывается с измеряемым белком-биомаркером ("аффинность реагента", такого как антитело или аптамер), хотя также могут быть использованы другие технологам, такие как основанные на спектроскопии технологии (например, время-пролетная ионизация лазерной десорбцией с использованием матрицы, спектроскопия MALDI-TOF) или анализы, измеряющие биологическую активность (например, анализы, измеряющие митогенность факторов роста). Основанные на аффинности технологии для применения с описанными в настоящей заявке анализами и способами могут включать в себя основанные на антителах анализы (иммунологические) и использующие аптамеры анализы (молекулы нуклеиновых кислот, которые специфически связываются с другими молекулами), такие как ELONA. Кроме того, также рассматриваются анализы с использованием как антител, и аптамеров (например, «сэндвич» формат анализа с использованием антитела для захвата и аптамера для обнаружения). Также в настоящей области техники известно широкое разнообразие основанных на аффинности анализов.
Основанные на аффинности анализы, как правило, используют по меньшей мере один эпитоп, полученный из белка-биомаркера, т.е. ROBO2, и многие форматы основанных на аффинности анализов используют более одного эпитопа (например, два или более эпитопов участвуют в «сэндвич» формате анализов, по меньшей мере один эпитоп используется для захвата белка-биомаркера и по меньшей мере один другой эпитоп используется для обнаружения маркера).
Основанные на аффинности анализы могут быть в форматах конкуренции или прямой реакции, использовать форматы «сэндвич»-типа и могут дополнительно быть гетерогенными (например, использовать твердые подложки) или гомогенными (например, проходить в одной фазе), и/или использовать иммунопреципитацию. Многие анализы включают в себя применение меченых аффинных реагентов (например, антитело, полипептид или аптамер); метки могут быть, например, ферментными, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными или окрашенными молекулами. Известны также анализы, которые усиливают сигналы от зонда; примеры которых представляют собой анализы, которые используют биотин и авидин и меченые ферментом и опосредованные иммунологические анализы, такие как ELISA и ELONA анализы. Например, концентрации биомаркеров из образцов биологической жидкости могут быть измерены с использованием анализа LUMINEX или ELISA. Любой из биомаркеров или реагентов, специфичных для биомаркера, может быть прикреплен к поверхности, и содержание может быть измерено прямо или косвенно.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 может быть измерено с использованием технологии иммуноанализа основанных на аффинности измерений.
Технологии иммуноанализа могут включать в себя любую технологию иммуноанализа, которая может количественно или качественно измерить содержание белка ROBO2 в биологическом образце. Подходящие технологии иммуноанализа включают в себя без ограничения радиоиммуноанализ, ELISA (энзимсвязанный иммуносорбентный анализ), иммуноанализы типа «сэндвич», иммунорадиометрические анализы, иммунодиффузионные анализы, иммуноанализы in situ (с использованием коллоидного золота, фермента или радиоизотопных меток, например), вестерн-блоттинг, иммуннопреципитацию, иммунофлуоресцентные анализы, иммуноэлектрофорез, флуороиммунное измерение (FIA), иммунорадиометрический анализ (IRMA), иммуноферментный анализ (IEMA), иммунолюминесцентный анализ и иммунофлуоресценцию (Madersbacher S, Berger P. Antibodies and immunoassays. Methods 2000; 21: 41-50), хемилюминесцентный анализ, иммуно-ПЦР и вестерн-блот анализ. Кроме того, основанные на аптамерах анализы, которые могут количественно или качественно измерять содержание биомаркера в биологическом образце могут быть использованы в описанных в настоящей заявке анализах, способах и системах. Как правило, аптамеры могут быть заменены на антитела почти во всех форматах иммуноанализа, хотя с аптамерами возможны дополнительные форматы анализа (например, амплификация связанных аптамеров с использованием такой технологии амплификации нуклеиновых кислот, как ПЦР (патент США №4683202) или изотермическая амплификация с составными праймерами (патент США №6251639 и 6692918).
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем, в которых содержание белка ROBO2 измеряется с использованием технологии иммуноанализа основанных на аффинности измерений, иммуноанализ выполняется путем измерения степени взаимодействия белка/антитела взаимодействия биомаркера/антитело. Можно использовать любой известный способ иммуноферментного анализа.
Согласно некоторым вариантам осуществления, связывающий партнер, например, антитело или лиганд, связывающийся с белком ROBO2 в анализе связывания, предпочтительно представляет собой специфически меченый свзывающий партнер, но не обязательно антитело. Связывающий партнер, как правило, меченый сам по себе, но альтернативно он может быть обнаружен с помощью вторичной реакции, в которой генерируется сигнал, например, от другого меченого вещества.
Таким образом, антитело, которое специфически связывается с белком ROBO2, может быть использовано в описанных в настоящей заявке анализах, способах и системах для определения наличия и/или количества белка ROBO2 в биологическом образце, который может быть использован для обнаружения увеличенной или сниженной концентрации присутствующего в диагностическом образце белка ROBO2. Такие антитела можно индуцировать с помощью любого из способов, хорошо известных в области иммунодиагностики. Антитела могут быть антителами к белку ROBO2 к любому биологически релевантному состоянию белка. Так, например, они могут быть индуцированы против негликозилированной формы белка ROBO2, которая существует в организме в гликозилированного форме, или против пептида, несущего соответствующий эпитоп белка ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих анализов, способов и систем может быть использована форма усиленного анализа, в которой производится усиленный "сигнал" из относительно низкого содержания обнаруживаемого белка. Одна определенная форма усиленного иммуноанализа усиливается хемилюминесцентным анализом. Например, антитело метят пероксидазой хрена, которая участвует в хемилюминесцентной реакции с люминолом, пероксидным субстратом и соединением, которое усиливает интенсивность и продолжительность излучаемого света, обычно 4-йодфенолом или 4-гидроксикоричной кислотой.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих анализов, способов и систем усиленный иммуноанализ может быть использован вместе с иммуно-ПЦР. В этой технике антитело ковалентно связано с произвольной молекулой ДНК, содержащей ПЦР-праймеры, где ДНК с прикрепленным к нему антителом амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции. Смотрите Е. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529(1995).
Соответственно, согласно всем вариантам описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 может быть определено с использованием связывающего белок средства, также могут быть использованы отнесенные в настоящей заявке к "связывающей белок частице" или "аффинному реагенту", в частности, антитела. Например, аффинные реагенты, в частности, антитела, такие как антитела к биомаркеру, могут быть использованы в иммуноанализе, в частности, в ELISA (энзимсвязанном иммуносорбентном анализе). Согласно вариантам осуществления, где содержание белка биомаркера может быть измерено в биологическом образце с использованием общеизвестных в настоящей области техники способов, и включая, например, без ограничения специфическое к изоформе химическое или ферментативное расщепление белков, иммуноблоттинг, иммуногистохимические анализы, ELISA и масс-спектрометрию.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием "Энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA)". ELISA представляет собой технику для обнаружения и измерения концентрации антигена с использованием меченой (например, связанной с ферментом) формы антитела. Существуют различные формы ELISA, которые хорошо известны специалистам в настоящей области техники. Стандартные техники, известные в настоящей области для ELISA, описаны в "Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell et al., "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964; and Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22: 895-904.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием сэндвич-анализа ELISA. В "сэндвич ELISA" антитело (например, к ферменту) связано с твердой фазой (т.е. микротитрационным планшетом) и подвергается действию содержащему антиген (например, фермент) биологическому образцу. Твердую фазу затем отмывают для удаления несвязанного антигена. Меченое антитело (например, связанное с ферментом) затем связывается с нагруженным антигеном (если он присутствует), образуя сэндвич антитело-антиген-антитело. Соответственно, с использованием этого способа первое антитело к белку ROBO2 связывают с твердой фазой, такой как лунка пластмассового планшета для микротитрования, и инкубируют с образцом и с меченым вторичным антителом, специфичным к анализируемому белку ROBO2. Примеры ферментов, которые могут быть связаны с антителом, содержат щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена, люциферазу, уреазу и В-галактозидазу. Связанное с ферментом антитело реагирует с субстратом для получения окрашенного продукта реакции, который может быть измерен.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием анализа с иммобилизованными антителами или конкурентного ELISA. В "конкурентном ELISA" антитело инкубируют с образцом, содержащим антиген (т.е. фермент). Смесь антиген-антитело затем приводят в контакт с твердой фазой (например микротитрационным планшетом), которая покрыта антигеном (т.е. ферментом). Чем больше антигена присутствует в образце, тем меньше свободного антитела, которое будут доступно для связывания с твердой фазой. Меченное (например, связанное с ферментом) вторичное антитело затем добавляют к твердой фазе, чтобы определить количество первичного антитела, связанного с твердой фазой. Соответственно, согласно некоторым таким вариантам осуществления исследуемому биологическому образцу дают связаться с твердой фазой, и может быть добавлено и оставлено для связывания антитело к белку ROBO2 (например, антитела, которые специфически связываются с белком ROBO2). После отмывания несвязанного материала, определяют количество антитела, связанного с твердой фазой, с использованием меченого второго антитела к первому.
Согласно некоторым вариантам осуществления этих анализов, способов и систем метка предпочтительно представляет собой фермент. Субстрат для фермента может быть, например, окрашивающий, флуоресцентный или хемилюминесцентный.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием иммуногистохимии. В "иммуногистохимическом анализе" срез ткани исследуют на специфические белки, подвергая воздействию ткани антителами, которые специфические для анализируемого белка. Антитела затем визуализируют с помощью любого из ряда способов, чтобы определить наличие и количество присутствующего белка. Примеры способов, используемых для визуализации антител, например, включают в себя способы с ферментами, связанные с антителами (например, люциферазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена или бета-галактозидазу) или химические способы (например, DAB/субстрат хромоген). Затем образец анализируют микроскопически, наиболее предпочтительно с помощью световой микроскопии образца, окрашенного красителем, который определяется в видимой области спектра, с использованием любого из множества таких способов окрашивания и реагентов, известных специалистам в настоящей области техники.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием радиоиммуноанализа. Радиоиммуноанализ представляет собой технику для обнаружения и измерения концентрации антигена, т.е. ROBO2, с использованием меченой (например, радиоактивно или флуоресцентно меченой) формы антигена. Примеры радиоактивных меток для антигенов включают в себя 3Н, 14С и 125I. Концентрацию ROBO2 в биологическом образце измеряют с использованием конкурирования ROBO2 в биологическом образце с меченым (например, радиоактивно) ROBO2 для связывания с антителом с ROBO2. Для обеспечения конкурентного связывания между меченым ROBO2 и немеченым ROBO2, меченый ROBO2 присутствует в концентрации, достаточной для насыщения связывающих сайтов антитела. Чем выше концентрация ROBO2 в образце, тем ниже концентрация меченого ROBO2, который будет связываться с антителом.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием иммунорадиометрического анализа (IRMA). IRMA представляет собой иммунологический анализ, в котором реагент-антитело радиоактивно меченый. IRMA требует производства поливалентного конъюгата антигена с использованием таких техник, как конъюгация с белком, например, сывороточным альбумином кролика (RSA). Поливалентный конъюгат антигена должен содержать как минимум 2 остатка антигена на молекулу, и остатки антигенов должны быть на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы позволять связывание по меньшей мере двух антител с антигеном. Например, в IRMA поливалентный конъюгат антигена может быть присоединен к твердой поверхности, например, пластиковой сфере. Немеченый антиген "образца" и радиоактивно меченое антитело к антигену добавляют в пробирку, содержащую покрытую поливалентным конъюгатом антигена сферу. Антиген в образце конкурирует с поливалентным конъюгатом антигена за антигенсвязывающий сайт антитела. После соответствующего инкубационного периода несвязанные реагенты удаляются отмыванием, и определяется количество радиоактивности на твердой фазе. Количество связанного радиоактивного антитела обратно пропорционально концентрации антигена в образце.
Могут быть использованы другие техники для обнаружения содержания белка ROBO2 в биологическом образце и могут быть выполнены в соответствии с предпочтениями практикующего и на основе настоящего раскрытия и типа биологического образца (т.е. плазма, моча образец ткани и т.д.). Один из таких способов представляет собой Вестерн-блоттинг (Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 4350 (1979)), в котором соответствующим образом обработанный образец проходит SDS-PAGE-электрофорез перед помещением на твердую подложку, такую как нитроцеллюлозный фильтр. Меченые детектируемой меткой антитела к ROBO2 или связывающие белок молекулы могут быть использованы для оценки содержания белка ROBO2, где интенсивность сигнала от детектируемой метки соответствует количеству белка ROBO2. Содержание присутствующего белка ROBO2 также может быть количественно определено, например, путем денситометрии.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием такой масс-спектрометрии, как MALDI/TOF (время-пролетная), SELDI/TOF, жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (LC-MS), газовая хроматография с масс-спектрометрией (GC-MS), высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (HPLC-MS), капиллярный электрофорез с масс-спектрометрией, ядерно-магнитная резонансная спектрометрия или тандемная масс-спектрометрия (например, MS/MS, MS/MS/MS, ESI-MS/MS и т.д.). Смотрите, например, заявки на патент США №: 20030199001, 20030134304, 20030077616, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Согласно некоторым таким вариантам осуществления эти методологии могут быть комбинированы с машинами, компьютерными системами и средой для производства автоматизированной системы для определения содержания белка ROBO2 в биологическом образце и анализа для получения печатного отчета, который идентифицирует, например, содержание белка ROBO2 в биологическом образце. В некоторых случаях измерение содержания ROBO2 делается на расстоянии от модулей определения и сравнения.
Способы масс-спектрометрии хорошо известны в настоящей области техники и были использованы для количественной оценки и/или идентификации таких биомолекул, как протеины (смотрите, например, Li et al. (2000) Tibtech 18: 151-160; Rowley et al. (2000) Methods 20: 383-397; and Kuster and Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400). Кроме того, были разработаны масс-спектрометрические техники, которые позволяют по меньшей мере, частичное секвенирование de novo выделенных белков. Chait et al., Science 262: 89-92 (1993); Keough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 7131-6 (1999); reviewed in Bergman, EXS 88: 133-44 (2000).
Согласно некоторым вариантам осуществления применяется газофазный ионспектрофотометр. Согласно другим вариантам осуществления для анализа образца применяется масс-спектрометрия с лазерной дезорбцией/ионизацией. Современная масс-спектрометрия с лазерной дезорбцией/ионизацией ("LDI-MS") может быть осуществлена в двух основных вариантах: матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация ("MALDI") масс-спектрометрия и усиленная поверхностью лазерная десорбция/ионизация ("SELDI»). В MALDI аналит смешивают с раствором, содержащим матрицу, и каплю жидкости помещают на поверхность подложки. Раствор матрицы затем совместно кристаллизуется с биологическими молекулами. Подложку помещают в масс-спектрометр. Лазерная энергия направляется к поверхности подложки, где она десорбируется и ионизирует биологические молекулы без их существенной фрагментации. Смотрите, например, патент США №5118937 (Hillenkamp et al.) и патент США №5045694 (Beavis & Chait), которые включены в настоящий документе посредством ссылки.
В SELDI поверхность подложки модифицирована таким образом, что она представляет собой активного участника в процессе десорбции. В одном варианте поверхность образует производное с адсорбентом и/или захватывающими реагентами, которые селективно связывают интересующий белок. В другом варианте поверхность получает энергию абсорбированных молекул, которые не десорбируют при ударе лазера. В другом варианте поверхность образует производное с молекулами, которые связывают представляющий интерес белок и которые содержат фотолитическую связь, которая расщепляется при применении лазера. В каждом из этих способов дериватизирующее средство обычно локализуется в специфическом месте на поверхности подложки, где наносится образец. Смотрите, например, патент США №5719060 и WO 98/59361, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Эти два способа могут комбинироваться, например, с использованием аффинной поверхности SELDI для захвата анализируемого вещества и добавлением содержащей жидкость матрицы к захваченному аналиту, чтобы предоставить поглощающий энергию материал.
rd
th
Для дополнительной информации относительно масс-спектрометров, смотрите, например, Principles of Instrumental Analysis, 3 edition., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985; and Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4 ed. Vol. 15 (John Wiley & Sons, New York 1995), pp. 1071-1094.
Обнаружение содержания белка ROBO2, как правило, зависит от обнаружения интенсивности сигнала. Это, в свою очередь, может отражать количество и характер полипептида, связанного с подложкой. Например, согласно некоторым вариантам осуществления уровень сигнала пика оценивают по спектру первого образца и второй образец можно сравнить (например, визуально, с помощью компьютерного анализа и т.д.) для определения относительных количеств определенных биомолекул. Такое программное обеспечение, как программа Biomarker Wizard (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.) может быть использовано для оказания помощи в анализе масс-спектров. Масс-спектрометры и их техники хорошо известны специалистам в настоящей области техники.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием техник гель-электрофореза, в частности SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), особенно двухмерного PAGE (2D-PAGE), предпочтительно двухмерного SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE). Согласно конкретному примеру анализ основан на 2D-PAGE, в частности, с использованием иммобилизованных градиентов рН (IPG) с предпочтительным диапазоном рН 4-9.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измерено с использованием техник гель-электрофореза, в частности, упомянутых выше техник в сочетании с другими способами разделения белков, в частности способами, известными специалистам в настоящей области техники, в частности, хроматографией и/или гель-фильтрацией.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измерено с использованием резонансных техник, в частности, поверхности плазменного резонанса.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем содержание белка ROBO2 измеряют с использованием белкового биочипа. Биочип, как правило, содержит твердый субстрат, характеризующийся по существу плоской поверхностью, на которую прикрепляется захватывающий реагент (например, адсорбент или аффинный реагент). Часто, поверхность биочипа содержит множество адресуемых ячеек, содержащих прикрепленный захватывающий реагент. Биочип может также включать в себя прикрепленный захватывающий реагент, который служит в качестве контроля. Белковые биочипы представляют собой биочипы, предназначенные для захвата полипептидов. Многие белковые биочипы описаны в настоящей области техники. К ним относятся, например, белковые биочипы, произведенные Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, Calif.), Zyomyx (Hayward, Calif.), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), Biacore (Uppsala, Sweden) и Procognia (Berkshire, UK). Примеры таких белковых биочипов описаны в следующих патентах или опубликованных патентных заявках: патенте США №6225047 (Hutchens &Yip); патенте США №6537749 (Kuimelis and Wagner); патенте США №6329209 (Wagner et al.); международной публикации РСТ № WO 00156934 (Englert et al.); международной публикации РСТ № WO 031048768 (Boutell et al.) и патенте США №5242828 (Bergstrom et al.).
Эталонные пороговые уровни или значения содержания белка ROBO2, используемые для сравнения с содержанием белка ROBO2 у субъекта, могут варьировать в зависимости от описанного в настоящей заявке практикуемого аспекта или варианта осуществления, как будет понятно в настоящем описании и ниже. Эталонное пороговое значение может быть основано на индивидуальном значении образца, таком как, например, значение, полученное из биологического образца от исследуемого субъекта, но в более ранний момент времени (например, в первую временную точку (t1), например, измеренное первое содержание биомаркера или во вторую временную точку (t2), например). Эталонное пороговое значение может также быть основано на пуле образцов, например, значении(ях), полученном из образцов от пула исследуемых субъектов. Например, в некоторых вариантах осуществления эталонные пороговые значения для белка ROBO2 основаны на измеренной величине 50% (например, медиане) белка ROBO2, измеренного у субъектов с хроническим заболеванием почек или протеинурией. Например, субъекты в верхних 50% (например, на уровне или выше уровня медианы) для белка ROBO2 могут быть выбраны, как характеризующиеся риском развития хронического заболевания почек или протеинурии. Эталонное значение(я) может также быть основано на пуле образцов, включающих в себя или исключающих исследуемый образец(ы). Эталонное значение может быть основано на большом количестве образцов, таком, как от популяции здоровых субъектов хронологической группы соответствующего возраста или от субъектов, которые не характеризуются наличием или у которых нет риска развития хронического заболевания почек или протеинурии. Согласно некоторым вариантам осуществления эталонное значение может быть по меньшей мере на одно, более типично по меньшей мере на два стандартных отклонения выше среднего значения или медианы любых этих анализов или предопределенного среднего значения или медианы.
Для оценки риска субъекта, у которого вероятно будет наблюдаться или имеется хроническое заболевание почек или протеинурия с помощью описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем "эталонное пороговое значение" представляет собой, как правило, предопределенный эталонный пороговый уровень, например, медиану белка ROBO2 в моче, сыворотке или крови, полученную в популяции здоровых людей, которые находятся в хронологической возрастной группе, согласованной с хронологическим возрастом исследуемого субъекта. Как отмечалось ранее, в некоторых ситуациях эталонные образцы могут быть также соответствующего пола и/или соответствовать на основе этнической группы. Согласно некоторым вариантам осуществления эталонное пороговое значение для белка ROBO2 представляет собой медианное содержание этого биомаркера в типе биологического образца, например, моче, крови, сыворотке, в панели субъектов той же этнической группы, например, кавказской, афроамериканской, испанской, азиатской и азиатско-индийской, пакистанской, ближнего востока и/или тихоокеанских островов.
Для оценки риска субъекта, у которого вероятно будет наблюдаться или имеется хроническое заболевание почек или протеинурия с помощью описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем эталонное пороговое значение для белка ROBO2 может быть предопределенным уровнем, например, средним или медианным содержанием, полученным в популяции здоровых субъектов, которые находятся в хронологической возрастной группе, согласованной с хронологическим возрастом исследуемого субъекта. Альтернативно, эталонное пороговое содержание для белка ROBO2 может быть историческим эталонным содержанием для конкретного субъекта, который был получен из образца, полученного от того же субъекта, но в более ранний момент времени и/или когда у субъекта не было риска развития хронического заболевания почек или протеинурии. В некоторых случаях эталонное пороговое содержание для белка ROBO2 может быть историческим эталонным содержанием белка ROBO2 для определенной группы субъектов, все из которой характеризовались наличием хронического заболевания почек или протеинурии из-за, например, диабета.
Согласно некоторым вариантам осуществления здоровых субъектов выбирают в качестве контрольных субъектов. Согласно некоторым вариантам осуществления контроли представляют собой контроли того же возраста. Здоровый субъект может быть использован для получения эталонного порогового содержания белка ROBO2, например, в моче или образце сыворотки. Используемый в настоящей заявке "здоровый" субъект или образец от "здорового" субъекта или индивидуума характеризуется тем же значением, что и обычно понимаемое специалистами в настоящей области техники. Например, можно использовать описанные в настоящей заявке способы, широко известные для оценки функции почек, чтобы выбрать контрольных субъектов в качестве здоровых субъектов для диагностики и лечения описанных в настоящей заявке способов. Согласно некоторым вариантам осуществления здоровые субъекты без признаков или симптомов предполагаемого хронического заболевания почек могут быть привлечены в качестве здоровых контрольных субъектов. Субъекты оцениваются на основе обширных оценок, состоящих из истории болезни, семейного анамнеза, физических и почечных врачебных исследований, лабораторных тестов. Примеры анализов хронического заболевания почек и/или протеинурии включают в себя без ограничения определение содержания таких специфических белков или молекул в моче, крови или образце сыворотки, как, например, альбумин, кальций, холестерин, клинический анализ крови (СВС), электролиты, магний, фосфор, калий, натрий или любое их сочетание; анализы для выявления, например, клиренса креатинина; содержания креатинина; АМК (азота мочевины крови); использование таких специфических техник или процедур, как КТ брюшной полости, МРТ брюшной полости, УЗИ брюшной полости, биопсия почек, сканирования почек, УЗИ почек; обнаружение изменений в результатах анализов или тестов на эритропоэтин, ПТГ; исследования плотности костной ткани, или витамина D; или любое сочетание таких способов и анализов обнаружения.
Соответствующая возрастная популяция (в которой могут быть получены эталонные значения) в идеале того же хронологического возраста, что и исследуемый субъект или индивидуум, но также приемлемо примерное соответствие возраста популяции. Примерное соответствие возраста популяции может быть в пределах 1, 2, 3,4 или 5 лет хронологического возраста исследуемого индивидуума, или могут быть группы разных хронологических возрастов, которые охватывают хронологический возраст исследуемого индивидуума.
Субъект, которого сравнивают с его "соответствующей хронологической возрастной группой" представляет собой, как правило, отношение к сравниваемому субъекту с хронологическим соответствующим возрастом в диапазоне от 5 до 20 лет. Примерное соответствие возраста популяции может быть с шагом 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 15, или 20 лет (например, группа " с шагом 5 лет", которая может служить источником для эталонных значений для 62-летнего субъекта, может включать индивидуумов в возрасте 58-62 года, индивидуумов в возрасте 59-63 года, индивидуумов в возрасте 60-64 года, индивидуумов в возрасте 61-65 лет или индивидуумов в возрасте 62-66 года). В более широком определении, где есть большие промежутки между различными хронологическими возрастными группами, например, когда есть несколько различных хронологических возрастных групп, доступных для эталонных значений, а промежутки между различными хронологическими возрастными группами превышают описанный в настоящей заявке шаг в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 15, или 20 лет, то "соответствующая хронологическая возрастная группа" может относиться к возрастной группе, которая находится в более близком соответствии к хронологическому возрасту субъекта (например, когда эталонные значения доступны для более старшей возрастной группы (например, 80-90 лет) и более младшей возрастной группы (например, 20-30 лет), соответствующая хронологическая возрастная группа для 51-летнего индивидуума может использовать группу младшего возраста (20-30 лет), которая находится ближе к биологическому возрасту испытуемого субъекта в качестве эталонного уровня.
Другие факторы, которые необходимо учитывать при выборе контрольных субъектов включают в себя без ограничения вид, пол, этническое происхождение и так далее. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления эталонный уровень может быть предопределенным эталонным уровнем, например, как средний или медианный уровни, полученные в популяции здоровых контрольных субъектов соответствующего испытуемому субъекту пола. Согласно некоторым вариантам осуществления эталонный уровень может быть предопределенным эталонным уровнем, например, как средний или медианный уровни, полученные в популяции здоровых контрольных субъектов соответствующей испытуемому субъекту этнической группы (например, кавказской, афроамериканской, испанской, азиатской и азиатско-индийской, пакистанской, ближнего востока и/или тихоокеанских островов). Согласно другим вариантам осуществления как хронологический возраст, так и пол популяции здоровых субъектов совпадают с хронологическим возрастом и полом исследуемого субъекта, соответственно. Согласно другим вариантам осуществления как хронологический возраст, так и этническая принадлежность популяции здоровых субъектов совпадают с хронологическим возрастом и этнической принадлежностью исследуемого субъекта, соответственно. Согласно другим вариантам осуществления хронологический возраст, пол и этническая принадлежность популяции здоровых контрольных субъектов соответствуют хронологическому возрасту, полу и этнической принадлежности исследуемого субъекта, соответственно.
Процесс сравнения содержания белка ROBO2 в биологическом образце от субъекта и эталонного порогового содержания белка ROBO2 может быть осуществлен любым удобным соответствующим способом, известным специалисту в настоящей области техники. Как правило, значения содержания белка ROBO2, определяемые с использованием описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем, могут быть количественными значениями (например, количественные значения концентрации, такие как миллиграммы белка ROBO2 на литр (например, мг/л) образца или абсолютного количества). Альтернативно, значения содержания белка ROBO2 могут быть качественными в зависимости от техник измерений и, следовательно, способ сравнения значения от субъекта и эталонного значения может изменяться в зависимости от используемой технологии измерения. Например, сравнение может быть сделано путем проверки цифровых данных, путем проверки представления данных (например, проверки таких графических представлений, как гистограммы или линейные графики) и с использованием стандартных отклонений, например, по меньшей мере одного или по меньшей мере двух стандартных отклонений. В одном примере, когда для измерения содержания белка ROBO2 используется качественный анализ, содержание можно сравнить визуально путем сравнения интенсивности окрашенного продукта реакции или путем сравнения данных от денситометрических или спектрометрических измерений окрашенного продукта реакции (например, сравнения числовых данных или графических данных, таких как гистограммы, полученные с помощью измерительного прибора).
Описанное в настоящей заявке содержание белка ROBO2 может быть измерено количественно (абсолютные значения) или качественно (относительные значения). Согласно некоторым вариантам осуществления количественные значения содержания белка ROBO2 в биологических образцах могут указывать на заданный уровень (или степень) риска развития хронического заболевания почек или протеинурии.
Согласно некоторым вариантам осуществления сравнение выполняется для определения величины различия между значениями от субъекта и эталонными значениями (например, сравнивая "кратность" или разницу в процентах между измеренным содержанием полученного от субъекта белка ROBO2 и эталонным пороговым значением белка ROBO2). Кратность различия может быть определена путем измерения абсолютной концентрации содержания белка ROBO2 и сравнения абсолютного значения с эталонным пороговым содержанием белка ROBO2, или кратность различия может быть измерена в виде относительной разности между эталонным значением и значением образца, где никакое значение не представляет собой меру абсолютной концентрации, и/или где оба значения измерены одновременно. Например, анализ ELISA измеряет абсолютное содержание или концентрацию белка, из которого кратность изменения определяется в сравнении с абсолютной концентрацией того же эталонного протеина. В качестве другого примера, микромножество антител измеряет относительную концентрацию, из которой определяется кратность изменения. Соответственно, величина разности между измеренным значением и эталонным значением, которая предполагает или указывает на конкретный диагноз, будет зависеть от практикуемого способа.
Как будет очевидно специалистам в настоящей области техники, когда повторные измерения проводятся для измерения содержания белка ROBO2, измеренные значения от субъектов можно сравнить с эталонным пороговым содержанием белка ROBO2 и учитывать при повторных измерениях. Повторные измерения могут быть учтены с использованием либо среднего значения, либо медианы измеренных значений.
Согласно некоторым вариантам осуществления процесс сравнения может быть мануальным или может, предпочтительно, быть автоматизирован. Например, устройство анализа (например, люминометр для измерения хемилюминесцентных сигналов) может включать в себя схему и программное обеспечение, позволяющее ему сравнивать значение от субъекта с эталонным значением белка ROBO2. Альтернативно, отдельное устройство (например, цифровой компьютер) может быть использовано для сравнения измеренного содержания белка ROBO2 у субъекта(ов) и эталонных пороговых значений для белка ROBO2. Автоматизированные устройства для сравнения могут включать в себя сохраненные эталонные значения для белка ROBO2 или могут сравнивать измеренное содержание белка ROBO2 от субъекта(ов) с эталонными пороговыми уровнями для белка ROBO2, которые происходят от одновременно измеряемых эталонных образцов.
Согласно некоторым вариантам осуществления исследуемый на содержание белка ROBO2 субъект определяется в одну из двух или более групп (статусов) на основе описанных в настоящей заявке результатов анализов, способов и систем. Описанные в настоящей заявке диагностические анализы, способы и системы могут быть использованы для классификации между рядом различных состояниях.
Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления определение того, характеризуется ли субъект высоким риском развития хронического заболевания почек или протеинурии (статус: низкий риск против высокого риска), осуществляется с использованием описанных в настоящей заявке диагностических анализов, способов и систем. Идентифицируют количества или образцы биомаркеров белка ROBO2, определяемых как характеристика различных состояний риска, например, высокого, среднего или низкого. Риск развития хронического заболевания почек или протеинурии определяют путем измерения белка ROBO2 отдельно или в сочетании с другими известными биомаркерами, а затем либо предоставляя их алгоритму классификации, либо сравнивая их с эталонным количеством (например, граничным значением раскрытого в настоящей заявке эталонного количества), который связан с конкретным уровнем риска.
Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящей заявке предусмотрены диагностические анализы, способы и системы для определения тяжести или стадии, или риска наличия хронического заболевания почек или протеинурии у субъекта. Каждая стадия хронического заболевания почек, например, характеризуется наличием характерного количества белка ROBO2 или относительных количеств белка ROBO2. Стадия заболевания определяется путем измерения белка ROBO2 отдельно или в сочетании с другими биомаркерами, а затем либо предоставляя их алгоритму классификации, либо сравнивая их с эталонным количеством и/или образцом биомаркеров, связанных с конкретной стадией, например, как скоро у субъекта будет вероятно развиваться хроническое заболевание почек или протеинурия. Например, можно классифицировать между тем, что у субъекта вероятно будет хроническое заболевание почек или протеинурия в течение года (например, плохой прогноз) или у субъекта вероятно будет хроническое заболевание почек или протеинурия в ближайшие 5 лет.
Дополнительные варианты осуществления диагностических анализов, способов и систем относятся к передаче результатов или диагнозов, или того и другого лаборантам, врачам или пациентам, например. Согласно определенным вариантам осуществления компьютеры используются для передачи результатов анализа или диагнозов, или того и другого заинтересованным сторонам, например, врачам и их пациентам. Согласно некоторым вариантам осуществления анализы выполняются или результаты анализа анализируются в стране или юрисдикции, которая отличается от той страны или юрисдикции, в которой передают результаты или диагнозы, например. Согласно некоторым вариантам осуществления риск развития хронического заболевания почек или протеинурии на основе содержания белка ROBO2 в биологическом образце пациента доводится до сведения пациента после того, как получено содержание или прогноз. Прогноз или диагноз может быть доведен до сведения пациента его лечащим врачом. Альтернативно, прогноз или диагноз может быть доведен до сведения пациента по электронной почте или по телефону. Для передачи прогноза или диагноза по электронной почте или по телефону, или через Интернет может быть использован компьютер с использованием безопасного входа пациента в систему. Согласно некоторым вариантам осуществления сообщение, содержащее результаты прогноза или диагностического теста могут быть получены и автоматически доставлены пациенту с использованием комбинации компьютерного аппаратного оборудования и программного обеспечения, которые будут известны специалистам в области телекоммуникаций. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящей заявке анализов, способов и систем все или некоторые из стадий способа, включая в себя анализ образцов, диагностирование заболеваний и передачу результатов анализа или диагнозов, может быть осуществлено в различных (например, чужих) юрисдикциях.
Согласно некоторым вариантам осуществления диагностических анализов, способов и систем квалификации или оценки риска описанного в настоящей заявке хронического заболевания почек или протеинурии анализы, способы или системы дополнительно содержат контролирование лечения пациента, основанное на определении риска развития хронического заболевания почек или протеинурии. Такое контролирование включает в себя действия врача или клинициста в определении риска развития хронического заболевания почек или протеинурии у пациента. Например, если врач ставит пациенту диагноз риска развития хронического заболевания почек или протеинурии, то может следовать определенный режим лечения. Подходящий режим лечения может включать в себя без ограничения контролируемую программу упражнений; контроль артериального давления, потребления сахара и/или уровня липидов и лекарственную терапию. Согласно некоторым вариантам осуществления диагноз риска развития хронического заболевания почек или протеинурии может сопровождаться дополнительным тестированием для определения, страдает ли пациент от хронического заболевания почек или от связанных заболеваний. Кроме того, если диагностический тест дает неубедительный результат относительно риска основного статуса неблагоприятного события, могут быть востребованы дополнительные исследования. Согласно некоторым вариантам осуществления диагностических анализов, способов и систем квалификации или оценки риска описанного в настоящей заявке хронического заболевания почек или протеинурии, если врач ставит пациенту диагноз, что он не подвержен риску развития хронического заболевания почек или протеинурии, то никакое лечение не предоставляется.
Способы анализа и описанные в настоящей заявке способы обнаружения ROBO2 могут быть автоматизированы с использованием робототехники и компьютерных управляемых систем. Такой биологический образец, как моча, плазма или образец крови, могут быть введены в такую систему, как микроструйное устройство, полностью управляемое автоматической станцией от помещения образца до выхода результата.
Соответственно, также в настоящей заявке предусмотрены согласно некоторым аспектам системы (и машиночитаемые носители для установки компьютерных систем) для выполнения способа определения того, характеризуется ли индивидуум наличием хронического заболевания почек или протеинурии или предрасположен к хроническому заболеванию почек или протеинурии на основе профилей экспрессии или информации о последовательности.
Согласно некоторым аспектам в настоящей заявке предусмотрены системы для оценки, характеризуется ли субъект наличием или повышенным риском развития хронического заболевания почек или протеинурии, системы, содержащие: (а) модуль определения, выполненный с возможностью приема по меньшей мере одного биологического образца и выполнения по меньшей мере одного анализа указанного биологического образца для измерения содержания ROBO2 в биологическом образце или определения соотношения экспрессии ROBO2 по отношению к предопределенному или пороговому эталонному уровню и для вывода указанного измеренного уровня или соотношения экспрессии; (b) устройство хранения, способное к хранению информации выходных данных от модуля определения; (с) модуль сравнения, выполненный для получения входных данных из устройства хранения и сравнения данных, сохраненных на устройстве хранения, по меньшей мере с одним эталонным пороговым содержанием ROBO2, причем, если измеренное содержание белка ROBO2 по меньшей мере такое же или выше, чем эталонное пороговое содержание, модуль сравнения предоставляет информацию на модуль вывода о том, что биологический образец связан с субъектом, который отклоняется от эталонного порогового содержания биомаркера и (d) модуль вывода для отображения информации для пользователя.
Согласно всем аспектам изобретения способы определения содержания белка ROBO2 могут быть выполнены с использованием автоматизированной машины или системы. Такие машины и системы создают отчет, например, в виде отображение отчета на видимом экране или печатный отчет, который указывает содержание белка ROBO2 и/или сообщает об увеличении содержания или таком же, как эталонное порогового содержание белка ROBO2, и/или о том, что пациент, от которого был получен образец, характеризуется риском развития хронического заболевания почек или протеинурии.
Соответственно, описанные в настоящей заявке некоторые варианты осуществления также предусматривают для машин, компьютерных систем и машиночитаемых носителей среду для выполнения стадий (i) определения содержания белка ROBO2 и (ii) обозначения или отчета, характеризуется ли субъект риском развития хронического заболевания почек или протеинурии.
Варианты осуществления этих аспектов описаны через функциональные модули, которые определяются выполняемыми компьютерными командами, записанными на считываемых компьютером носителях, и которые вызывают выполнение компьютером этапов осуществляемого способа. Модули были разделены по функции для ясности. Тем не менее, следует понимать, что модули не должны соответствовать дискретным блокам кода, и описанные функции могут быть выполнены посредством выполнения различных частей кода, хранящихся на различных средах и выполненных в разное время. Кроме того, следует понимать, что модули могут выполнять другие функции, таким образом, модули не ограничиваются наличием определенных функций или набора функций.
Машиночитаемый носитель может представлять собой любой доступный материальный носитель данных, к которому можно обращаться с помощью компьютера. Машиночитаемый носитель включают в себя энергозависимые и энергонезависимые, съемные и несъемные материальные носители данных, выполненные любым способом или технологией для хранения информации, такой как считываемые компьютером инструкции, структуры данных, программные модули или другие данные. Считываемый компьютером носитель включает в себя без ограничения RAM (оперативное запоминающее устройство), ROM (постоянное запоминающее устройство), EPROM (стираемое программируемое постоянное запоминающее устройство), EEPROM (электрически-стираемое программируемое постоянное запоминающее устройство), флэш-память или память другой технологии, CD-ROM (компакт-диск только для чтения), DVD (цифровой универсальный диск) или другие оптические носители данных, магнитные кассеты, магнитную ленту, запоминающее устройство на магнитном диске или другие магнитные носители, другие типы энергозависимой и энергонезависимой памяти и любой другой материальный носитель, который может использоваться для хранения требуемой информации и к которому может обращаться компьютер, в том числе и любая подходящая комбинация вышеперечисленного.
Машиночитаемые данные, размещенные на одном или нескольких машиночитаемых носителях или машиночитаемом носителе, могут определить инструкции, например, в рамках одной или нескольких программ, которые, в результате выполнения на компьютере, инструктируют компьютер для выполнения одной или нескольких описанных в настоящей заявке функций (например, по отношению к системе или читаемому компьютером носителю) и/или различных вариантов осуществления, вариаций и их комбинаций. Такие инструкции могут быть написаны на любом из множества языков программирования, например, Java, J#, Visual Basic, С, C#, С++, Fortran, Pascal., Eiffel, Basic, языке ассемблера COBOL и тому подобных или любом из разнообразия их комбинаций. Машиночитаемые носители, на которых размещены такие инструкции, могут находиться на одном или нескольких компонентах или системы, или описанного в настоящей заявке машиночитаемого носителя, могут быть распределены среди одного или нескольких таких компонентов и могут быть переходным между ними.
nd
Машиночитаемые носители могут быть переносными, так чтобы инструкции, сохраненные на них, могли быть загружены на любой компьютерный ресурс для реализации аспектов настоящего изобретения, обсуждаемых в настоящем документе. Кроме того, следует иметь в виду, что инструкции, хранящиеся на описанных выше машиночитаемых носителях или машиночитаемом носителе не ограничены инструкциями, воплощенными в рамках прикладной программы, работающей на хост-компьютере. Скорее, инструкции могут быть выполнены в виде любого типа компьютерного кода (например, программного обеспечения или микрокода), который может использоваться для программирования компьютера для реализации аспектов настоящего изобретения. Исполнимые компьютером команды можно записать на подходящем языке компьютера или комбинации нескольких языках. Основные способы вычислительной биологии известны специалистам с обычной квалификацией в настоящей области техники и описаны, например, в Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000) и Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2 ed., 2001).
Функциональные модули определенных вариантов осуществления описанных в настоящей заявке аспектов включают в себя модуль определения, модуль хранения, модуль сравнения и модуль отображения. Функциональные модули могут быть выполнены на одном или множестве компьютеров, или с помощью одной или множества компьютерных сетей или компьютерных систем.
Согласно некоторым аспектам в настоящей заявке предусмотрены компьютерные системы, которые можно использовать для определения того, характеризуется ли субъект возможным наличием или риском развития хронического заболевания почек или протеинурии. Согласно некоторым вариантам осуществления компьютерная система подключена к модулю определения и выполнена с возможностью получать выходные данные из модуля определения в отношении биологического образца, где модуль определения выполнен с возможностью обнаруживать содержание белка ROBO2 в биологическом образце, полученном от субъекта; и где компьютерная система содержит: (а) устройство хранения, способное к хранению выходных данных из модуля определения, а также эталонных данных; где устройство хранения подключено к (b) модулю сравнения, который согласно некоторым вариантам осуществления выполнен с возможностью сравнивать выходные данные, сохраненные на устройстве хранения, с хранимыми эталонными данными, и в альтернативных вариантах осуществления выполнен с возможностью сравнивать выходные данные с самими собой, где модуль сравнения производит отчетные данные и подключен к (с) модулю отображения для отображения страницы извлеченного содержимого (т.е. отчетных данных из модуля сравнения) для пользователя на клиентском компьютере, при этом извлеченное содержимое может указать содержание ROBO2 и/или вероятность субъекта подвергнуться хроническому заболеванию почек или протеинурии в будущем.
Согласно некоторым вариантам осуществления модуль определения содержит исполняемые компьютером команды по обеспечению данных экспрессии, информации о последовательности, информации, связанной с информацией о последовательности в машиночитаемой форме. Используемая в настоящей заявке "информация о последовательности" относится к любой нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности, включая в себя без ограничения полноразмерные нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности, частичные нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности или мутированные последовательности. Кроме того, информация "связанная с" информацией о последовательности включает в себя обнаружение наличия или отсутствия последовательности (например, обнаружение мутации или делеции), определение концентрации последовательности в образце (например, уровни экспрессии аминокислотной последовательности или уровни экспрессии нуклеотидов (РНК или ДНК)) и тому подобное. Термин "информация о последовательности" предназначен для включения наличия или отсутствия посттрансляционных модификаций (например, фосфорилирования, гликозилирования, сумоилирования, фарнезилирования и других).
В качестве примера модули определения для определения последовательности ROBO2 или информации об экспрессии нуклеиновой кислоты могут включать в себя известные системы для автоматического анализа последовательностей, включая в себя без ограничения флуоресцентные сканеры Hitachi FMBIO и Hitachi FMBIO II (производства Hitachi Genetic Systems, Alameda, California); полностью автоматизированные системы генетического анализа 96-капиллярного электрофореза SPECTRUMEDIX SCE 9610 (производства SpectruMedix LLC, State College, Pennsylvania); секвенатор ДНК ABI PRISM 377, секвенатор ДНК ABI 373, генетический анализатор ABI PRISM 310, генетический анализаторАВ1 PRISM 3100 и ДНК анализатор ABI PRISM 3700 (производства Applied Biosystems, Foster City, California); флуоресцентные сканеры Molecular Dynamics FLUORIMAGER™ 575, SI и флуоресцентные сканеры Molecular Dynamics FLUORIMAGER™ 595 (производства Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, England); систему секвенирования ДНК GENOMYXSC™ (производства Genomyx Corporation (Foster City, California) и ДНК секвенатор PHARMACIA ALF™ и Pharmacia ALFEXPRESS™ (производства Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, England).
Согласно некоторым вариантам осуществления для определения последовательности или белковой информации модули определение включают в себя системы для анализа белков и ДНК. Например, системы масс-спектрометрии, включающие в себя систему время-пролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI-TOF); системы профилирования массива SELDI-TOF-MS ProteinChip, например машины с программным обеспечением CIPHERGEN PROTEIN BIOLOGY SYSTEM II™; системы для анализа данных экспрессии генов (смотрите, например США 2003/0194711); системы для основанных на массиве анализах экспрессии, например системы массива HT и картриджные системы массива производства Affymetrix (Santa Clara, СА 95051) AutoLoader, инструментальную систему COMPLETE GENECHIP, Fluidics Station 450, Hybridization Oven 645, QC Toolbox Software Kit, Scanner 3000 7G, Scanner 3000 7G плюс систему нацеленного генотипирования, полногеномную систему ассоциаций Scanner 3000 7G, инструмент GENETITAN™, GeneChip Array Station, массив HT; автоматизированную систему ELISA (например DSX или DS2 форма Dynax, Chantilly, VA или the ENEASYSTEM III, TRITURUS, THE MAGO Plus); денситометры (например, X-Rite-508-Spectro Densitometer, денситометр The HYRYS™ 2); автоматизированные флуоресцентные системы гибридизации in situ (смотрите, например, патент Соединенных Штатов 6136540); 2D системы гель визуализации в сочетании с программным обеспечением 2D изображений; планшет-ридеры; клеточный сортер с возбуждением флуоресценции (FACS) (например, проточный цитометр FACSVantage SE, Becton Dickinson); анализаторы радиоактивных изотопов (например, сцинтилляционные счетчики) или их комбинации.
Согласно некоторым вариантам осуществления этого аспекта и всех других аспектов настоящего изобретения может быть использовано различное программное обеспечение и форматы для хранения информации о содержании белка биомаркера на устройстве хранения. Любое количество форматов структурирования процессора для обработки данных (например, текстовый файл или база данных) можно использовать для получения или создания носителя, содержащего записанную на нем информацию о последовательности или информацию об уровне экспрессии.
Информация об экспрессии ROBO2 или информация, связанная с информацией об экспрессии ROBO2, определенная в модуле определения, может быть прочитана на устройстве хранения. Используемое в настоящей заявке "устройство хранения" предназначено для включения любого подходящего вычислительного или обрабатывающего устройства или другого устройства, выполненного или приспособленного для хранения данных или информации. Примеры электронного устройства, пригодного для использования в настоящем изобретении, включают в себя автономное вычислительное устройство, информационно-телекоммуникационные сети, в том числе локальные сети (LAN), глобальные сети (WAN), системы облачного хранения, интернет, интранет, экстранет и локальные и распределенные вычислительные системы. Устройства хранения также включают в себя без ограничения: магнитные запоминающие носители, такие как дискеты, носители информации на жестком диске, магнитную ленту, такие оптические носители, как CD-ROM, DVD, такие электронные носители, как RAM, ROM, EPROM, EEPROM и т.п., системы облачного хранения данных, общие жесткие диски и такие гибриды этих категорий, как средства магнитного/оптического хранения информации. Устройство хранения приспособлено или настроено на записывание на него информации о последовательности или информации об уровне экспрессии. Такая информация может быть предоставлена в цифровой форме, что может передаваться и читаться в электронном виде, например, через Интернет, через облачную систему, на дискете, через USB (универсальная последовательная шина) или через любой другой подходящей способ общения.
Используемая в настоящей заявке "информация об уровне экспрессии" относится к любой информации об уровне экспрессии нуклеотидов и/или аминокислот, включая без ограничения полноразмерные последовательности нуклеотидов и/или аминокислот, частичные последовательности нуклеотидов и/или аминокислот или мутированные последовательности. Кроме того, информация "связанная с" информацией об уровне экспрессии включает в себя обнаружение наличия или отсутствия последовательности (например, наличие или отсутствие аминокислотной последовательности, нуклеотидной последовательности или посттрансляционной модификации), определение концентрации последовательностей в образце (например, содержание аминокислотных последовательностей или уровни экспрессии нуклеотидов (РНК или ДНК), или уровень посттрансляционной модификации) и тому подобное.
Использумый в настоящей заявке термин «хранится» относится к способу кодирования информации на устройстве хранения. Специалисты в настоящей области техники могут легко выбирать любой из известных в настоящее время способов записи информации на известные носители для получения продуктов, содержащих информацию о последовательности или информацию об уровне экспрессии.
Может быть использовано разнообразие программного обеспечения и форматов для хранения информации о последовательности или информации об уровне экспрессии на устройстве хранения. Любое количество форматов структурирования процессора для обработки данных (например, текстовый файл или база данных) можно использовать для получения или создания носителя, содержащего записанную на нем информацию о последовательности или информацию об уровне экспрессии.
Предоставляя информацию о последовательности или информацию об уровне экспрессии в машиночитаемом виде, можно использовать информацию о последовательности или информацию об уровне экспрессии в читаемом виде в модуле сравнения для сравнения специфической последовательности или профиля экспрессии с эталонными данными в устройстве хранения. Например, поисковые программы могут быть использованы для идентификации фрагментов или областей последовательностей, которые соответствуют определенной последовательности (эталонным данным, например, информация о последовательности, полученной из контрольного образца) или прямое сравнение определенного уровня экспрессии можно сравнить с эталонными данными об уровне экспрессии (например, информация об уровне экспрессии, полученная от контрольного образца). Сравнение, сделанное в машиночитаемом виде, обеспечивает машиночитаемый результат сравнения, который может быть обработан различными способами. Содержимое на основе результата сравнения может быть получено из модуля сравнения, чтобы указать на конкретное заболевание или нарушение, например, хроническое заболевание почек или протеинурию.
Согласно некоторым вариантам осуществления эталонные данные, сохраненные в устройстве хранения, чтобы быть считаными с помощью модуля сравнения, представляют собой информационные данные о последовательности или экспрессии ROBO2, полученные от контрольного биологического образца того же типа, что и исследуемый биологический образец. Альтернативно, эталонные данные представляют собой базу данных, например, часть последовательностей всего генома организма или семейства белков последовательностей, или профиль уровня экспрессии (РНК, белка или пептида). Согласно некоторым вариантам осуществления эталонные данные представляют собой информацию о последовательности или профили уровня экспрессии, которые указывают на конкретное заболевание или нарушение, такое как хроническое заболевание почек или протеинурия.
Согласно некоторым вариантам осуществления эталонные данные записаны в электронном или цифровом виде и аннотированы из баз данных, включая в себя без ограничения базы данных белков и ДНК GenBank (NCBI), такие как genome, EST, SNPS, Traces, Celara, Ventor Reads, Watson reads, HGTS и тому подобное; базы данных Швейцарского института биоинформатики, такие как ENZYME, PROSITE, SWISS-2DPAGE, Swiss-Prot и базы данных TrEMBL; программный пакет Melanie или сервер WWW ExPASy и тому подобное; SWISS-MODEL, Swiss-Shop и другие сетевые вычислительные средства; база данных Comprehensive Microbial Resource (доступна из Института геномных исследований). Полученная информация может храниться в реляционной базе данных, которая может быть использована для определения гомологий между эталонными данными или генами, или белками внутри и между геномами.
Предоставляя содержание ROBO2 в машиночитаемой форме в модуле сравнения, оно может быть использовано для сравнения с эталонными пороговыми уровнями ROBO2 внутри устройства хранения. Сравнение, сделанное в машиночитаемом виде, обеспечивает машиночитаемое содержание, которое может быть обработано различными способами.
"Модуль сравнения" может использовать различное доступное программное обеспечение и форматы для сравнения, работающий со сравнением последовательности ROBO2 или информацией об уровне экспрессии, определенными в модуле определения, с эталонными данными о последовательности ROBO2 или уровне экспрессии. Согласно некоторым вариантам осуществления модуль сравнения настраивают на использование технологии распознавания образцов для сравнения данных о последовательности ROBO2 или уровне экспрессии от одного или нескольких входных данных с одним или несколькими образцами эталонных данных. Модуль сравнения может быть настроен с использованием существующего коммерчески доступного или свободно доступного программного обеспечения для сравнения образцов, и может быть оптимизирован для конкретных проводимых данных сравнений. Модуль сравнения обеспечивает машиночитаемую информацию, относящуюся к информации о последовательности, которая может включать в себя, например, обнаружение наличия или отсутствия последовательности (например, обнаружение мутации или делеции (белка или ДНК), информации о различных аллелях, обнаружение посттрансляционной модификации или пропуск или повторение последовательностей); определение концентрации последовательности в образце (например, уровни экспрессии аминокислотной последовательности/белка или уровни экспрессии нуклеотидов (РНК или ДНК), или уровни посттрансляционной модификации) или определение профиля экспрессии.
Согласно некоторым вариантам осуществления модуль сравнения позволяет сравнивать содержание ROBO2 из выходных данных модуля определения с данными эталонного порогового содержания для каждого ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления модуль сравнения осуществляет сравнения со спектрами масс-спектрометрии, например сравнения информации о последовательности пептидных фрагментов можно проводить с использованием спектров, обработанных в MATLB со сценарием под названием "Qcealign" (смотрите, например, WO 2007/022248, включенный в настоящий документ посредством ссылки) и "Qpeaks" (Spectrum Square Associates, Ithaca, NY) или программного обеспечения Ciphergen Peaks 2.1™. Обработанные спектры могут быть выравнены с использованием алгоритмов выравнивания, которые выравнивают данные образца с контрольными данными с использованием алгоритма минимальной энтропии, взяв базовый вариант откорректированных данных (смотрите, например, публикацию ВОИС WO 2007/022248, включенную в настоящий документ посредством ссылки). Результат сравнения может быть дополнительно обработан путем расчета коэффициентов. Можно различить профили экспрессии белка.
Может быть использовано любое доступное программное обеспечение сравнения, включая в себя без ограничения Ciphergen Express (СЕ) и пакет Biomarker Patterns Software (BPS), Ciphergen Biosystems, Inc, CA, USA. Сравнительный анализ может быть выполнен с программным обеспечением системы белкового чипа (например, The Proteinchip suite для Bio-Rad Laboratories).
Модуль сравнения или любой другой описанный в настоящей заявке модуль может включать в себя операционную систему (например, UNIX), на которой работает реляционная система управления базами данных, приложение World Wide Web и сервер World Wide Web. Приложение World Wide Web включает в себя исполнимый код, необходимый для генерации инструкций языковых баз данных (например, инструкции Structured Query Language (SQL)). Как правило, исполнимые файлы будут включать в себя встроенные инструкции SQL. Кроме того, приложение World Wide Web может включать в себя конфигурационный файл, который содержит указатели и адреса на различные объекты программного обеспечения, которые содержат сервер, а также различные внешние и внутренние базы данных, которые должны быть доступны для запросов пользователей. Файл конфигурации также направляет запросы о ресурсах сервера на соответствующее аппаратное оборудование и при необходимости должен распределять сервер по двум или более отдельным компьютерам. Согласно некоторым вариантам осуществления сервер World Wide Web поддерживает протокол TCP/IP. Локальные сети, такие как эта, иногда относятся к "Интранету". Преимущество таких интранетов заключается в том, что они позволяют легко связываться с базами данных общего пользования, находящихся на World Wide Web (например, GenBank или сайт World Wide Web Swiss Pro). Таким образом, согласно некоторым предпочтительным вариантам осуществления пользователи могут напрямую обращаться к данным (через гипертекстовые ссылки, например), находящимся в базах данных Интернет с использованием интерфейса HTML, предусмотренного браузерами и веб-серверами.
Согласно некоторым вариантам осуществления модуль сравнения сравнивает профили экспрессии генов. Например, обнаружение профилей экспрессии генов можно определить с использованием программного обеспечения Affymetrix Microarray Suite версии 5,0 (MAS 5,0) (доступного от Affymetrix, Santa Clara, California) для анализа относительной представленности гена или генов на основе интенсивности сигнала от наборов зондов, и файлы данных MAS 5,0 могут быть переданы в базу данных и проанализированы с Microsoft Excel и программным обеспечением GeneSpring 6,0 (доступен от Agilent Technologies, Santa Clara, California). Алгоритм обнаружения программного обеспечения MAS 5,0 может быть использован для получения всестороннего обзора того, сколько транскриптов обнаружено в данных образцах, и позволяет сравнительный анализ 2 или более наборов данных микрочипов.
Согласно некоторым вариантам осуществления модуль сравнения сравнивает профили экспрессии белков. Может быть использовано любое доступное программное обеспечение сравнения, включая в себя без ограничения Ciphergen Express (СЕ) и пакет Biomarker Patterns Software (BPS) (доступный от Ciphergen Biosystems, Inc., Freemont, California). Сравнительный анализ можно сделать с программным обеспечением системы белкового чипа (например, Proteinchip Suite (доступного от Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Алгоритмы для определения профилей экспрессии могут включать в себя использование таких алгоритмов оптимизации, как алгоритм средней дисперсии (например, алгоритм JMP Genomics, доступный от JMP Software Сагу, North Carolina).
Модуль сравнения обеспечивает машиночитаемый результат сравнения, который может быть обработан в машиночитаемой форме согласно заранее определенным критериям или критериям, определенным пользователем, чтобы обеспечить содержание, основанное частично на результате сравнения, которое может быть сохранено и выведено по требованию пользователя с использованием модуля отображения. Модуль отображения способен отображать содержание, основанное частично на результате сравнения для пользователя, причем содержание представляет собой сигнал, указывающий на хроническое заболевание почек или протеинурию. Такой сигнал, может быть, например, отображением содержимого, свидетельствующего о наличии или отсутствии хронического заболевания почек или протеинурии, на мониторе компьютера, на печатаемой странице содержимого, свидетельствующего о наличии или отсутствии хронического заболевания почек или протеинурии, на принтере, или световое или звуковое свидетельство наличия или отсутствия хронического заболевания почек или протеинурии.
Основанное на результате сравнения содержание может включать в себя профиль экспрессии одного или нескольких белков или профиль экспрессии одного или нескольких генов. Согласно некоторым вариантам осуществления основанное на результате сравнения содержание представляет собой лишь сигнал, указывающий на наличие или отсутствие хронического заболевания почек или протеинурии, на основе содержания белка ROBO2.
Согласно некоторым вариантам осуществления основанное на результате сравнения содержание отображается на мониторе компьютера. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения основанное на результате сравнения содержание отображается через печатные носители. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения основанное на результате сравнения содержание отображается в виде индикаторного света или звука. Модуль отображения может быть любым подходящим устройством, способным к приему от компьютера и отображению машиночитаемой информации пользователю. Примеры включают в себя без ограничения, например, компьютеры общего назначения, такие как основанные на процессоре типа Intel Pentium, компьютер Apple и планшетные устройства, Motorola PowerPC, Sun UltraSPARC, процессоры Hewlett-Packard PA-RISC, любой из множества процессоров, доступных от компании Advanced Micro Devices (AMD) of Sunnyvale, California, или любой другой тип процессора, устройства визуального отображения, такие как планшетные устройства, мобильные устройства смартфоны, плоские дисплеи, электронно-лучевые трубки и т.п., а также компьютерные принтеры различных типов.
Согласно некоторым вариантам осуществления World Wide Web-браузер используется для обеспечения пользовательского интерфейса для отображения основанного на результате сравнения содержания. Следует понимать, что другие модули согласно изобретению могут быть адаптированы для наличия интерфейса веб-браузера. Через веб-браузер пользователь может составить запросы для получения данных из модуля сравнения. Таким образом, пользователь, как правило, будет указывать и нажимать на элементы пользовательского интерфейса, такие как кнопки, выпадающие меню, полосы прокрутки и т.п., используемые обычно в графических пользовательских интерфейсах. Таким образом сформулированные запросы с веб-браузера пользователя передаются на веб-приложение, которое форматирует их для обеспечения запроса, который может быть использован для извлечения соответствующей информации, связанной с информацией о последовательности, например, отображение указания на наличие или отсутствие мутации или делеции (ДНК или белка); отображение уровней экспрессии аминокислотной последовательности (белок); отображение уровней экспрессии нуклеотидов (РНК или ДНК); отображение экспрессии, SNP или мутации профилей или гаплотипов или отображение информации на их основе. Согласно одному варианту осуществления также отображается информация о последовательности данных эталонного образца.
Согласно некоторым вариантам осуществления модуль отображения отображает результат сравнения и то, свидетельствует ли результат сравнения о заболевании, например, свидетельствует ли профиль экспрессии ROBO2 о хроническом заболевании почек или протеинурии.
Согласно некоторым вариантам осуществления основанное на результате сравнения отображаемое содержание представляет собой сигнал (например, положительный или отрицательный сигнал), свидетельствующий о наличии или отсутствии хронического заболевания почек или протеинурии, при этом может быть отображено только положительное или отрицательное указание.
Таким образом, в настоящей заявке предусмотрены системы (и машиночитаемый носитель для установки компьютерных систем) для выполнения анализов и способов определения наличия у индивидуума хронического заболевания почек или протеинурия или предрасположенности к хроническому заболеванию почек или протеинурии на основе профилей экспрессии или информации о последовательности.
Системы и машиночитаемый носитель представляют собой всего лишь иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения для проведения анализов и способов определения наличия у индивидуума специфического заболевания или нарушения или предрасположенности к специфическому заболеванию или нарушению на основе профилей экспрессии или информации о последовательности, и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Возможны вариации систем и машиночитаемого носителя и они предназначены, чтобы подпадать под объем настоящего изобретения.
Модули системы или используемые в машиночитаемом носителе могут предполагать многочисленные конфигурации. Например, функция может быть обеспечена на единственной машиной или распределена на несколько машин.
Robo2 представляет собой белок подоцитов, локализованный на базальной клеточной поверхности подоцитов мышей
В процессе развития почек мРНК Robo2 экспрессируется в метанефрической мезенхиме, окружающей ветвящийся зачаток мочеточника, а затем в проксимальном конце S-образного тела (Piper et al., 2000), расположении первичных подоцитов. Чтобы исследовать, вовлечен ли Robo2 также в процесс созревания подоцитов в дополнение к его роли в индукции ранней почки, мы провели гибридизацию in situ и обнаружили, что мРНК Robo2 экспрессировалась на стадии капиллярной петли развития клубочков эмбрионов мыши на эмбриональный день 16,5 (E16,5) (фиг. 5А и 5В). Белок Robo2 становился обнаруживаемым по иммунофлюоресценцентному окрашиванию в развивающемся клубочке приблизительно в Ε14,5 и достигал пика экспрессии в E16,5 (фиг. 5С-5Е). Хотя экспрессия уменьшалась в процессе развития после Е17,5 (фиг. 5F), специфическая экспрессия Robo2 поддерживалась в клубочках после рождения и обнаруживалась у взрослых мышей в возрасте 5 недель (фиг. 5G, 5Н, 5L-5M).
Для определения клеточной локализации Robo2 в развивающемся клубочке мы провели иммуногистохимию с двойным мечением со специфическими маркерами клубочкового типа клеток. Мы обнаружили, что белок Robo2 колокализуется с нефрином (фиг. 1А-1С) и подоцином (фиг. 1D-1F), двумя ассоциированными со щелевой диафрагмой белками подоцита. Robo2 также коэкспрессировался в клубочках с взаимодействующим с нефрином адапторным белком Nck (фиг. 1G, 1I) и с WT1, составной частью ядер подоцитов (фиг. 5Н-5К). Двойное мечение с антителами к нидогену, маркеру базальной мембраны (фиг. 1J-1L и 1Р) и Pecaml, маркером клеточного эндотелия (фиг. 1М-10, 5М) показало, что Robo2 был локализован вблизи внешней поверхности клубочковой базальной мембраны и отсутствовал в эндотелиальных клетках.
Конфокальная микроскопия с высоким разрешением дополнительно показала, что субклеточный Robo2 был наиболее распространен на базальной поверхности подоцитов (фиг. 1Q). Электронная микроскопия с иммунологическим окрашиванием золотом постнатальных мышиных почек с антителами к цитоплазматическому домену установила, что Robo2 был локализован в ножках подоцитов, близких к цитоплазматической стороне щелевой диафрагмы (фиг. 1R). Эти результаты показывают, что Robo2 представляет собой белок подоцитов и его базальная внутриклеточная локализация в ножках указывает на то, что он играет роль в регуляции структуры ножек подоцитов.
Внутриклеточный домен Robo2 непосредственно взаимодействует с SH3-доменами адапторного белка Nck
Участие внеклеточный домена нефрина приводит к фосфорилированию тирозина его внутриклеточного домена с помощью Src-киназ и привлечению SH2-домена адапторного белка Nck, который в свою очередь вызывает полимеризацию актина (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Nck несет один SH2-домен на С-конце и три SH3-домена возле N-конца. Полимеризация актина опосредуется SH3-доменами Nck (Rivera et al., 2004), которые могут привлекать различные регуляторы цитоскелета, включая в себя N-WASP и Рак (Jones et al., 2006). Предьщущие исследования показали, что SH3 домены гомолога Nck дрозофилы Dreadlock (Dock) также непосредственно взаимодействуют с внутриклеточным доменом Robo для ингибирования полимеризации актина (Fan et al., 2003; Yang and Bashaw, 2006).
Мы исследовали, может ли Nck млекопитающих также напрямую взаимодействовать с Robo2 в подоците для регулирования F-актинового цитоскелета. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали дрожжевой двугибридный анализ для изучения, взаимодействует ли Robo2 с Nck. Поскольку две Nck млекопитающих (т.е. Nck1, Nck2) характеризуются схожей структурой и функцией в развитии почек (Jones et al., 2006), в этом исследовании мы использовали Nck1 и наблюдали, что внутриклеточный домен Robo2 непосредственно взаимодействует с Nck1 (фиг. 2А-2С). Картирование сайта связывания Nck1 в Robo2 показало, что последовательность от аминокислоты 1085 до 1301, которая содержит 4 богатые пролином мотива, характеризуется решающим значением для взаимодействия (фиг. 2А и 2С). Отсутствие этой богатой пролином области предотвращало его взаимодействие с Nck1 (фиг. 2А). Картирование сайта связывания Robo2 в Nck1 показало, что первые два SH3-домена необходимы для его взаимодействия с Robo2, потому что удаление одного или обоих из них отменяет взаимодействие (фиг. 2В). Таким образом, взаимодействие Robo2 и Nck1 было опосредовано двумя хорошо изученными белковыми доменами, SH3-доменами и богатыми пролином мотивами (фиг. 2С). CD2AP, другой адапторный белок подоцитов, также несет три SFB-домена на своем N-конце (Shih et al., 2001), но мы не обнаружили никакого взаимодействия между CD2AP и Robo2 ни дрожжевым двугибридным анализом, ни анализом копреципитации. Эти наблюдения показывают, что связывание между Robo2 и Nck1 в подоците представляет собой специфическое взаимодействие.
Полноразмерный Robo2 образует комплекс с нефрином через Nck. Мы подтвердили взаимодействие между Robo2 и Nck по анализам осаждения и копреципитации. His- и myc-меченый полноразмерный Robo2 человека (His-myc-Robo2) или his-и myc-меченый Robo2 человека с делецией связывающего Nck1 домена (His-myc-Robo2-ANBD) были экспрессированы в клетках HEK. Трансфектированные клетки HEK стимулировали кондиционированной Slit2 средой (полученной из стабильно трансфектированных Slit2 клеток), чтобы активировать Robo2 и увеличить связывание Nck (Fan et al., 2003). Nck осаждался с His-myc-Robo2 из клеточных лизатов HEK с использованием гранул Ni-NTA, но не с His-myc-Robo2-ANBD (фиг. 2D). Поскольку SH2-домен в Nck взаимодействует с фосфотирозинами в цитоплазматическом домене нефрина (NCD) (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006), мы проверили, образует ли Robo2 комплекс с нефрином через Nck с использованием анализа копреципитации. Чтобы установить доказательство правила, мы коэкспрессировали Robo2 и нефрин в клетках HEK с Fyn-киназой для увеличения фосфорилирования нефрина (Verma et al., 2006). Осаждение His-myc-Robo2 из клеточных лизатов HEK с использованием гранул Ni-NTA, копреципитированное с Nck и нефрином при экспрессии Fyn (фиг. 2Е). В обратном порядке, осаждение His-Мус-нефрина, копреципитированное с Nck и Robo2 при экспрессии Fyn-киназы (фиг. 2F). Кроме того, осадки, полученные с антителом к Nck, содержали как Robo2, так и нефрин при сверхэкспрессии Fyn (фиг. 6А). Эти данные показывают, что нефрин, Nck и Robo2 образуют комплекс in vitro. Для подтверждения этого in vivo мы иммунопреципитировали Robo2 из лизатов почек новорожденных мышей и обнаружили, что Nck и нефрин копреципитировали (фиг. 2G). И наоборот, осадки, полученные с антителом к нефрину, также содержали Nck и Robo2 (фиг. 2Н). Поскольку нефрин однозначно экспрессируется в подоцитах, a Nck и Robo2 также локализованы в этих клетках в почках, эти результаты показывают, что нефрин, Nck и Robo2 способны образовывать комплекс в подоцитах.
Для определения роли Slit2 в образовании белкового комплекса Robo2-Nck-нефрин, His-myc-Robo2, нефрин и Fyn коэкспрессировали в клетках HEK, которые стимулировали кондиционированной Slit2 средой или контрольной кондиционированной средой без Slit2 до копреципитации (фиг. 2I). Мы наблюдали, что стимуляция Slit2 увеличивала связывание Robo2 с Nck и образование комплекса с нефрином. Как соотношение Nck1 к Robo2, так и нефрина к Robo2 были увеличены после стимуляции Slit2 (фиг. 2J). В соответствии с этим обнаружением, мы наблюдали, что Slit2 сильно экспрессировался в клубочках новорожденных мышей (фиг. 6В, 6С).
Передача сигналов Slit2-Robo2 ингибирует индуцированную нефрином полимеризацию актина
Поскольку Slit связывается с Robo для привлечения Dock и srGAP для ингибирования полимеризации актина (Fan et al., 2003), мы хотели исследовать, набирает ли Robo2 Nck для ингибирования полимеризации актина в клетках млекопитающих, выполняя противоположную нефрину роль, который способствует полимеризации актина. Для решения этого вопроса, мы изучали полимеризацию актина, анализируя хвосты F-актина в клетках, экспрессирующих описанный выше химерный белок CD16/7-NCD (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Эта модель использует внеклеточные и трансмембранные домены Fc-рецептора иммуноглобулина человека CD16 и CD7, слитые с цитоплазматическим доменом нефрина (NCD). CD16/7-HA, в котором NCD был заменен на маркер НА, использовали в качестве отрицательного контроля. Эти химерные белки коэкспрессировали с Robo2 в клетках HEK и кластеризовали путем обработки с антителом к CD16 и вторичным антителом, конъюгированным с родамином. Сначала мы исследовали, может ли кластеризация цитоплазматического домена нефрина привлекать Robo2. Мы наблюдали, что задействование CD16/7-NCD привносило Robo2 в кластеры, поскольку большинство Robo2 колокализовалось с кластерами CD16/7-NCD (фиг. 6D-6F). Однако никакой колокализации не наблюдалось у Robo2 ни с контролем CD16/7-HA (фиг. 6D'), ни с конструктом Robo2-ANBD (фиг. 6Е'), в котором был удален связывающий домен Robo2 Nck (NBD). Интересно, что в отсутствие Slit2 колокализация CD16/7-NCD и Robo2 была значительно снижена (фиг. 6F'). Эти данные обеспечивают дополнительное доказательство того, что цитоплазматический домен нефрина способен образовывать комплекс с внутриклеточным доменом Robo2 в присутствии Slit2 и обосновывает модель для определения, влияет ли образование комплекса Robo2-Nck-нефрин на полимеризацию актина.
Клетки HEK, экспрессирующие CD16/7-NCD и Robo2, стимулировали Slit2 или контрольной кондиционированной средой без Slit2, одновременно с кластеризацией с помощью антитела к CD16. Полимеризацию актина оценивали по количеству клеток HEK с видимыми хвостами F-актина (Rivera et al., 2004). Мы наблюдали, что 80% из кластеризованных клеток CD16/7-NCD образовывали хвосты F-актина, которые можно было выявить окрашиванием фаллоидином, как сообщалось ранее (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). После стимуляции Slit2, однако, число клеток с хвостами F-актина был значительно снижено до приблизительно 40% (фиг. 3А и 3С). Только у нескольких клеток наблюдали наличие более коротких хвостов F-актина, когда контрольные белки CD16/7-HA были кластеризованы (фиг. 3В и 3С). Для дальнейшего исследования того, требуется ли Nck для этого ингибирования полимеризации актина, мы повторили этот анализ с использованием Robo2 без связывающего Nck домена (Robo2-ANBD), чтобы определить, будет ли блокирование связывания Nck с Robo2 предотвращать ингибирование Slit2-Robo2 индуцированную нефрином полимеризацию актина. CD16/7-NCD коэкспрессировали либо с полноразмерным Robo2 (фиг. 7А), либо с Robo2-ANBD (фиг. 7В) в клетках HEK. Мы наблюдали, что удаление связывающего Nck домена в Robo2 значительно нарушало ингибирование Slit2-Robo2 индуцированной нефрином полимеризации актина (фиг. 7С).
Предыдущее исследование показало, что нефрин связан с F-актиновым цитоскелетом (Yuan et al., 2002). Чтобы определить, может ли передача сигналов Slit2-Robo2 ингибировать F-актин, связанный с нефрином, мы иммунопреципитировали CD16/7-NCD и CD16/7-HA с антителом к CD16 и оценили количество F-актина в осадках по Вестерн-блоттингу. Мы наблюдали, что обилие F-актина, связанного с нефрином, было значительно снижено при стимуляции Slit2 (фиг. 3D и 3Е). С другой стороны, анализы иммунопреципитации in vivo показали, что F-актин, связанный с нефрином, иммунопреципитированным с антителом к нефрину из почек Robo2 нулевых новорожденных мышей, был значительно увеличен, по сравнению с таковым из почек мышей дикого типа или почек Robo2 гетерозиготных мышей (фиг. 3F и 3G). Взятые вместе, эти результаты показывают, что передача сигналов Slit2-Robo2 ингибирует индуцированную нефрином полимеризацию актина.
Потеря Robo2 в подоцитах вызывает измененную структуру ножек у мышей
del5
del5/+
del5/del5
del5/del5
del5/del5
Нами и другими исследователями ранее было показано, что почти все Robo2 гомозиготные нулевые мыши в смешанном генетическом фоне умирают вскоре после рождения из-за тяжелого фенотипа CAKUT (Grieshammer et al., 2004; Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). После разведения мышей с мутантным аллелем Robo2 на протяжении пяти поколений в генетическом фоне C57BL/6, спаривание гетерозиготных Robo2 родителей показало три Robo2 гомозиготные нулевые мыши, которые прожили до 3 недель (среди общего количества 160 мышей, проанализированного при отъеме). Чтобы определить, был ли Robo2 необходим для формирования ножек подоцитов в процессе развития, мы рассмотрели ультраструктуру клубочков у Robo2 нулевых мышей при рождении и в 3-недельном возрасте. Хотя тело подоцитов, ножки и щелевая диафрагма были сформированы при рождении, трансмиссонная электронная микроскопия показала фокальное сглаживание ножек у новорожденных Robo2 гомозиготных нулевых мышей (фиг. 8A-8F). С помощью сканирующей электронной микроскопии мы наблюдали дезорганизованные переплетающиеся ножки у Robo2 гомозиготных нулевых мышей при рождении и в 3-недельном возрасте (фиг. 4А-4Н). Эти данные показывают, что Robo2 необходим для нормального структурирования ножек подоцитов во время развития почек.
flox/flox
del5/+
Nphs2-Cre/+
del5/flox
Nphs2-Cre/+
Для изучения роли Robo2 в поддержании структуры ножек в зрелых клубочках, мы получили подоцит-специфических Robo2 нокаутных мышей путем скрещивания условных Robo2 мышей с Robo2; Tg гетерозиготными мышами, несущими трансген podocin-Cre. Двадцать подоцит-специфичных Robo2 мутантных мышей с генотипом Robo2; Tgи 20 контрольных однопометных мышей были проанализированы до возраста один год. Подоцит-специфические Robo2 нокаутные мыши были жизнеспособны и фертильны. Тем не менее у них были показаны необычно широкие ножки подоцитов и фокально-сегментарное сглаживание ножек подоцитов в возрасте один месяц (фиг. 4I-4M). В возрасте 6 недель мутантные мыши развивали значительную микроальбуминурию, которая была выявлена как анализом ELISA, так и Вестерн-блоттингом (фиг. 4N и 4O). Кроме того, сканирующая электронная микроскопия показала дефекты структурирования ножек у Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей. Вместо упорядоченных переплетающихся подобно застежке «молнии» вторичных ножек у мышей дикого типа, у Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей проявлялось неупорядоченное и дезорганизованное переплетающееся структурирование ножек в возрасте один месяц (фиг. 8G-8J). Эти дефекты становились более очевидными с течением времени. В семь месяцев у Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей наблюдались очевидно дезорганизованные, более короткие и извилистые ножки (фиг. 8К-8N), которые были похожи на фенотип трехнедельных Robo2 нулевых мышей. Хотя Robo2 подоцит-специфические нокаутные мыши демонстрируют нормальное количество подоцитов, было значительно увеличено расширение матрикса в клубочках (фиг. 8O-8Т, таблицы 1 и 2). Эти морфологические изменения показывают, что Robo2 играет роль в регулировании и поддержании структуры ножек подоцитов клубочков.
Потеря Robo2 уменьшает структурный дефект подоцитов у нефрин нулевых мышей
-/-
-/-
flox/flox
Nphs2-Cre/+
-/-
-/-
-/-
-/-
flox/flox
Nphs2-Cre/+
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
Нефрин гомозиготные мыши развивают характерный фенотип с дилатацией пространства Боумена, аномально широкими ножками, отсутствием щелевой диафрагмы клубочков и значительную протеинурию (Done et al., 2008; Hamano et al., 2002). Поскольку Robo2 образовывал комплекс с нефрином и передача сигналов Slit2-Robo2 ингибировала индуцированную нефрином полимеризацию актина, нам стало интересно, будет ли потеря Robo2 модифицировать фенотип подоцитов у нефрин нулевых мышей. Чтобы проверить эту гипотезу о возможном генетическом взаимодействии между Robo2 и нефрином, мы произвели как зародышевую линию Robo2; Nphsl, так и подоцит-специфических Robo2; Tg; Nphsl двойных Robo2-нефрин нокаутных мышей. Подобно Nphsl одинарным гомозиготным, как Robo2; Nphsl (4/4, 100%), так и Robo2; Tg; Nphsl (3/3, 100%) двойные нокаутные мыши умерли в течение 10 часов после рождения. Гистологический анализ, однако, выявил, что морфология клубочков у Robo2; Nphsl двойных гомозиготных мышей проявляла относительно нормальный фенотип, по сравнению с фенотипом у Nphsl одинарных нефрин гомозиготных мышей, у которых была дилатация пространства Боумена (фиг. 8U-8X). Число клубочков с дилатацией пространства Боумена было значительно снижено у Robo2; Nphsl двойных гомозиготныхе мышей (2/55, 3,6%), по сравнению с нефрин одинарными нулевыми мышами (31/122, 25,4%) (фиг. 8Y и таблица 3). Кроме того, анализ ультраструктуры клубочков с помощью сканирующего электронного микроскопа показал, что переплетающаяся структура ножек подоцитов наблюдалась только в 1 (6,67%) из 15 клубочков от одинарных гомозиготных по нефрину мышей (фиг. 4P и 4Q), по сравнению со 100% у Robo2 одинарных гомозигот (фиг. 4Т и 4U) и контрольными особями дикого типа (фиг. 4В и 4W). Примечательно, переплетающееся структурирование ножек подоцитов было восстановлено в 12 (75%) из 16 клубочков в почках у Robo2; Nphsl двойных гомозиготных новорожденных мышей (фиг. 4R и 4S, таблица 4), указывая на то, что сопутствующая потеря Robo2 и нефрина ослабить структурный фенотип ножек подоцитов у этих мышей. Эти данные показывают, что описанные выше физические взаимодействия Robo2-Nck-нефрина оказывают существенное влияние на морфологию ножек подоцитов in vivo, когда уровни экспрессии Robo2 и нефрина генетически изменены.
Подоциты проявляют значительную степень пластичности. В процессе развития они дифференцируются от простых кубических эпителиальных клеток до сложных осуществляющих процессы клеток, которые мы признаем, как зрелые подоциты (Reeves et al., 1978). Эта пластичность сохраняется после созревания. Наиболее наглядно это видно при обратимом сглаживании ножек после экспериментальной нейтрализации поверхностного заряда с протаминсульфатом и восстановлении с гепарином (Seiler et al., 1975), а также во время рецидива и ремиссии протеинурии у детей с заболеванием с минимальными изменениями (Nachman et al., 2008). Более тонкие изменения в ножках, вероятно, происходят при физиологических условиях в ответ на положительные и отрицательные сигналы в виде гемодинамических, гормональных или паракринных раздражителей. Учитывая обилие F-актина в ножках, вполне вероятно, без желания быть связанными или ограничиваться теорией, что такие стимулы вызывают те тонкие изменения в ответ на положительные и отрицательные сигналы, трансдуцированные к F-актиновому цитоскелету. Слишком много и несбалансированные позитивные сигналы могут привести к фенотипу заболевания. Действительно, хотя физиологический лиганд до сих пор не определен, ясно, что кластеризация и фосфорилирование нефрина вызывает полимеризацию актина путем привлечения Nck, механизм, который может быть вовлечен в протеинурию, индуцированную у крыс с помощью нефритогенного моноклонального антитела к внеклеточному домену нефрина (Topham et al., 1999), и в случаях врожденного нефротического синдрома, при котором развиваются аллоантитела к нефрину после трансплантации почек (Patrakka et al., 2002).
Описанные в настоящей заявке наши исследования показывают другой уровень отрицательной регуляции полимеризации актина подоцитов, в котором Robo2, когда он связан с Slit, ингибирует индуцированную нефрином полимеризацию актина. Мы предполагаем, не желая быть связанными или ограничиваться теорией, что передача сигналов Slit-Robo2 может ингибировать индуцированную нефрином полимеризацию актина для поддержания нормальной структуры ножек подоцитов следующим образом: В физиологических условиях (например, во время развития ножек), участие нефрина приводит к фосфорилированию внутриклеточного Yl191/1208/1232, с которым связывается SH2-домен Nck (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). Nck, в свою очередь, привлекает такие регуляторы цитоскелета, как N-WASP через свои SH3-домены, содействуя полимеризации актина для расширения или распространения ножек подоцитов (фиг. 8Z). Локальная секреция и связывание Slit увеличивает взаимодействие Robo2 с Nck через его богатую пролином область и первые два SH3-домена Nck. Отделение первых двух SH3-доменов Nck с помощью Robo2 будет ингибировать опосредованную нефрин-Nck полимеризацию актина и уменьшать связанный с нефрином F-актин для поддержания динамичного и сбалансированного F-актинового цитоскелета и нормальную структуру ножек подоцитов (фиг. 8Z). Кроме прямого ингибирования индуцированной нефрином полимеризации актина через Nck, передача сигналов Slit-Robo2 может инактивировать полимеризацию актина через другие пути, например, привлечение Ena, Abl, srGAP для отрицательной регуляции F-актинового цитоскелета, как сообщалось ранее (Bashaw et al., 2000; Wong et al., 2001). При отсутствии передачи сигналов Slit2-Robo2 (например, когда Robo2 нокаутируют) ингибирующие эффекты Robo2 на индуцированную нефрином полимеризацию теряются. SH3-домены Nck способны взаимодействовать с нижележащими регуляторами цитоскелета для увеличения полимеризации актина (фиг. 8Z), что может объяснить измененную структуру ножек подоцитов, определенную у мутантных по Robo2 мышей. Описанные в настоящей заявке наши результаты, таким образом, поддерживают механизм, посредством которого передача сигналов Slit-Robo может регулировать пластичность подоцитов путем отрицательно регулирования F-актинового цитоскелета, что схоже с ролью передачи сигналов Slit-Robo в аксональном наведении (Guan and Rao, 2003). Обнаружение патологически повышенного расширения матрикса в клубочках мутантной по Robo2 мыши, вероятно, представляет собой вторичную реакцию.
Хотя, из описанных в настоящей заявке наших исследований понятно, что Robo2 локализуется на базальной поверхности подоцитов и образует комплекс с другими установленными белками щелевой диафрагмы ножек через его внутриклеточный домен, остается неясным, представляет ли он на самом деле часть щелевой диафрагмы. Интересно, что внеклеточный домен Robo2 напоминает таковой нефрина, который содержит восемь подобных иммуноглобулину (Ig) мотивов и один домен фибронектина, в то время как Robo2 содержит пять Ig-подобных мотивов и три домена фибронектина (фиг. 8Z) (Tryggvason et al., 2006). Мы изучили взаимодействие между внутриклеточным доменом Robo2 и цитоплазматическим доменом нефрина в дрожжевом двугибридном анализе. Наши данные биохимии (фиг. 2Е и 2F) также не подтверждают прямое взаимодействие между этими двумя рецепторами in vitro. Тем не менее, возможно, что внеклеточный домен Robo2 может ассоциировать с внеклеточным доменом нефрина in vivo на клеточных мембранах соседних ножек через транс-взаимодействие в щелевой диафрагме.
Мы обнаружили, что Robo2 гомозиготные нулевые и подоцит-специфические нокаутные мыши развивали измененное структурирование переплетающихся ножек, фенотип, который отличается от такового у нефрин нулевых мышей (Hamano et al., 2002; Done, 2008). Это не удивительно, так как нефрин и Robo2 играют противоположные роли в регуляции F-актинового цитоскелета подоцитов. В то время как передача сигналов нефрином индуцирует локализованную полимеризацию актина, передача сигналов Slit2-Robo2 действует как отрицательный регулятор на полимеризации актина для поддержания пластичности и динамики ножек подоцитов. Стоит отметить, что аналогичный дефект организации ножек наблюдается у мышей, у которых нокаутирован актин-деполимеризующий фактор кофилин-1, другой отрицательный регулятор F-актинового цитоскелета в подоцитах (Garg et al., 2010). Это указывает на то, что отсутствие либо такого способствующего полимеризации актина фактора, как передача сигналов нефрином, либо такого фактора ингибирования, как передача сигналов Robo2, будет влиять на нормальную структуру подоцитов. Таким образом, баланс между положительными и отрицательными регуляторами F-актинового цитоскелета в подоцитах важен для поддержания нормальной структуры ножек. Восстановление этого баланса путем нокаутирования как положительных (нефрин), так и отрицательных (Robo2) сигналов может объяснить восстановление переплетающихся ножек подоцитов и умеренный клубочковый фенотип у Robo2-нефрин двойных нокаутных мышей. Описанные в настоящей заявке наши исследования демонстрируют двойную роль нефрина: с одной стороны - в качестве важнейшего компонента щелевой диафрагмы для контроля клубочковой селективной проницаемости (Tryggvason et al., 2006), с другой стороны - в качестве регулятора морфологии ножек через его взаимодействия с цитоскелетом (Jones et al., 2006; Verma et al., 2006). В то время как передача сигналов Robo2 явно противостоит положительным сигнальным эффектам нефрина на ножки, еще предстоит определить, влияет ли он также и на целостность щелевой диафрагмы.
Соответственно, как описано в настоящем документе, мы определили Robo2 в качестве нового компонента межклеточного соединения подоцитов в почках. Мы продемонстрировали взаимодействие между Robo2 и нефрином с использованием биохимических, функциональных и генетических техник и показали, что передача сигналов Slit2-Robo2 ингибирует индуцированную нефрином динамику актина. Наши результаты показывают, что передача сигналов Robo2 действует как отрицательный регулятор на нефрин для модулирования архитектуры ножек подоцитов. Это исследование расширяет наше понимание роли передачи сигналов Slit-Robo и идентифицирует новый механизм взаимовлияния, с помощью которого управление стимулятором рецептора Robo может повлиять на динамику F-актинового цитоскелета.
Если не оговорено иное, используемые в отношении настоящей заявки научные и технические термины характеризуются теми же значениями, которые обычно понятны специалисту в настоящей области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными в настоящей заявке конкретной методологией, протоколами и реагентами и т.д., и как таковые они могут варьировать. Используемая в настоящей заявке терминология предназначена только для целей описания определенных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения. Определения общих терминов в области иммунологии и молекулярной биологии можно найти в The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006.Определения общих терминов в области молекулярной биологии находятся в Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones & Bartlett Publishing, 2007 (ISBN-13: 9780763740634); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); or Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol. 152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.) and Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, et al., ed. John Wiley and Sons, Inc.), которые все полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Используемый в настоящей заявке термин "содержащий" означает, что другие элементы также могут присутствовать в дополнение к определенным представленным элементам. Использование "содержащий" означает включение, а не ограничение.
Используемый в настоящей заявке термин "состоящий по существу из" относится к тем элементам, необходимым для настоящего варианта осуществления. Термин позволяет наличие дополнительных элементов, которые существенно не влияют на основные и новые или функциональную характеристику(и) этого варианта осуществления настоящего изобретения.
Термин "состоящий из" относится к описанным в настоящей заявке композициям, способам и соответствующим их компонентам, которые исключают любой элемент, не перечисленный в этом описании варианта осуществления.
Кроме того, если иное не предусмотрено контекстом, термины в единственном числе включают множественное число и термины во множественном включают единственное число. Используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Так, например, ссылки на "способ" включают в себя один или несколько способов и/или стадий описанного в настоящей заявке типа, и/или те, которые станут очевидными для специалистов в настоящей области техники после прочтения этого раскрытия и так далее.
За исключением рабочих примеров или где не указано иное, все используемые в настоящей заявке числа, выражающие количества ингредиентов или условий реакции следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "приблизительно". Используемый в отношении процентов термин "приблизительно" может означать ± 1%.
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными в настоящей заявке конкретной методологией, протоколами и реагентами и т.д., и как таковые они могут варьировать. Используемая в настоящей заявке терминология предназначена только для целей описания определенных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.
Все идентифицированные патенты и другие публикации специально включены в настоящий документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, описанных в таких публикациях методологий, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Эти публикации приведены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в этой связи не должно быть истолковано как признание того, что изобретатели не озаглавили задним числом такое раскрытие в силу предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все заявления относительно даты или сообщения относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не представляют собой какое-либо подтверждение правильности дат или содержания этих документов.
Варианты осуществления различных описанных в настоящей заявке аспектов можно проиллюстрировать следующими пронумерованными параграфами
2. Способ лечения хронического заболевания почек у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающий введении субъекту, характеризующемуся наличием или риском развития хронического заболевания почек, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей ингибитор ROBO2.
3. Способ уменьшения протеинурии у нуждающегося в этом субъекта, предусматривающий введении субъекту, характеризующемуся наличием или риском развития протинурии, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей ингибитор ROBO2.
4. Способ по любому из параграфов 1 или 2, при котором ингибитор ROBO2 представляет собой специфическое к ROBO2 блокирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфическую к ROBO2 антисмысловую молекулу, специфическую к ROBO2 короткую интерферирующую РНК (siPHK), небольшой молекулу-ингибитор ROBO2, ингибирующий ROBO2 полипептид или структурный аналог ROBO2.
5. Способ по любому одному из параграфов 1-3, при котором ингибитор ROBO2 блокирует или уменьшает связывание ROBO2 с SLIT, С Nck или с обоими.
6. Способ по любому одному из параграфов 1-4, при котором ингибитор ROBO2 специфичен к SLIT-связывающему домену Ig1, SLIT-связывающим доменам Ig1 и Ig2, внутриклеточному Nck-связывающему домену или любой их комбинации.
7. Способ по параграфу 3, при котором ингибирующий ROBO2полипептид представляет собой доминантно-негативный слитый белок ROBO2, полипептид, содержащий внеклеточный домен ROBO2 без внутриклеточного домена, или полипептид, содержащий внутриклеточный домен ROBO2 без внеклеточного домена.
8. Способ по любому одному из параграфов 1-6, при котором субъект, характеризующийся наличием или риском развития хронического заболевания почек, имеет диабетическую нефропатию или высокое кровяное давление.
9. Способ по любому из параграфов 1-7, дополнительно предусматривающий введение субъекту дополнительного терапевтического средства.
10. Способ по параграфу 8, при котором дополнительное терапевтическое средство представляет собой ангиотензин-превращающий фермент (АСЕ) или блокатор рецепторов ангиотензина II (БРА).
11. Способ, предусматривающий:
a. анализ биологического исследуемого образца от субъекта для определения уровня экспрессии полипептида ROBO2 или РНК, кодирующей полипептид ROBO2;
b. определение, выше ли уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК в биологическом исследуемом образце, чем эталонный пороговый уровень; и
c. диагностику субъекта как нуждающегося в лечении или терапии хронического заболевания почек.
12. Способ по параграфу 10, при котором анализ уровня экспрессии полипептида ROBO2 выполняется с использованием специфичного к полипептиду ROBO2 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
13. Способ по параграфу 10, при котором анализ уровня экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК выполняется с помощью ПНР или гибридизационного анализа.
14. Способ по любому одному из параграфов 10-12, при котором биологический исследуемый образец представляет собой биопсию почки, мочу, кровь, образец сыворотки или осажденные из образца мочи клетки.
15. Способ по любому одному из параграфов 10-13, при котором уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК по меньшей мере на 20% выше эталонного порогового уровня.
16. Способ по любому одному из параграфов 10-13, при котором уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК по меньшей мере на два стандартных отклонения выше эталонного порогового уровня.
17. Способ анализа, предусматривающий:
a. контактирование выделенного из субъекта биологического исследуемого образца с реагентом, который обнаруживает полипептид ROBO2 или кодирующую полипептид ROBO2 РНК; и
b. измерение содержания полипептида ROBO2 или кодирующей полипептид ROBO2 РНК, где повышенное содержание указанного полипептида ROBO2 или указанной кодирующей полипептид ROBO2 РНК, по отношению к нормальному биологическому образцу, определяет субъекта, характеризующегося наличием хронического заболевания почек и/или прогрессирования хронического заболевания почек или протеинурии.
18. Способ анализа по параграфу 16, при котором определение уровня экспрессии полипептида ROBO2 выполняется с использованием специфического к полипептиду ROBO2 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
19. Способ анализа по параграфу 16, при котором определение уровня экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК выполняется с использованием ПНР или гибридизационного анализа.
20. Способ анализа по любому из параграфов 16-18, при котором биологический исследуемый образец представляет собой биопсию почки, мочу, кровь, образец сыворотки или осажденные из образца мочи клетки.
21. Способ анализа по любому из параграфов 16-19, при котором уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК по меньшей мере на 20% выше эталонного порогового уровня.
22. Способ анализа по любому из параграфов 16-19, при котором уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК по меньшей мере на два стандартных отклонения выше эталонного порогового уровня.
23. Способ анализа по любому из параграфов 16-21, при котором субъекту был поставлен диагноз диабет или высокое кровяное давление.
24. Система для определения того, характеризуется ли субъект риском развития хронического заболевания почек или протеинурии или характеризуется наличием хронического заболевания почек, предусматривающая:
a. модуль измерения, способный к определению уровня экспрессии полипептида ROBO2 или уровня экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК в полученном от субъекта биологическом образце;
b. модуль сравнения, способный к получению указанного уровня экспрессии полипептида ROBO2 или уровня экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК измерительным модулем и осуществлению по меньшей мере одного анализа для определения того, выше ли уровень экспрессии полипептида ROBO2 или уровень экспрессии кодирующей полипептид ROBO2 РНК, чем предопределенный эталонный уровень или соотношение, и к предоставлению извлеченного содержимого; и
c. модуль отображения для отображения содержания, основанного на выходных данных от указанного модуля сравнения, причем содержание содержит сигнал, указывающий, что уровень экспрессии или соотношение полипептида ROBO2 или РНК больше, чем предопределенный эталонный уровень или соотношение, или сигнал, указывающий, что уровень экспрессии или соотношение ROBO2 не больше, чем эталонный уровень или предопределенное соотношение.
25. Система по параграфу 23, при которой содержание, отображаемое на указанном модуле отображения, дополнительно содержит сигнал, указывающий субъекта, которому рекомендуется получать определенную схему лечения.
26. Система для определения того, характеризуется ли субъект риском развития хронического заболевания почек или протеинурии или характеризуется наличием хронического заболевание почек, предусматривающая:
а. модуль определения, способный к получению по меньшей мере одного полученного от субъекта исследуемого образца и осуществлению по меньшей мере одного анализа на указанном по меньшей мере одном исследуемом образце для определения наличия или отсутствия одного из следующих условий:
i. соотношение экспрессии ROBO2 больше предопределенного соотношения, или
ii. уровень экспрессии ROBO2 больше предопределенного уровня
b. устройство хранения, способное к накоплению выходных данных от указанного модуля определения; и
c. модуль отображения для отображения содержания, основанного на выходных данных из указанного модуля определения, причем содержание содержит сигнал, указывающий, что соотношение экспрессии ROBO2 больше, чем предопределенное соотношение, или содержание ROBO2 больше, чем предопределенное содержание, или сигнал, указывающий, что соотношение экспрессии ROBO2 не больше, чем предопределенное соотношение, или не больше, чем предопределенное содержание.
27. Система по параграфу 25, при которой содержание, отображаемое на указанном модуле отображения, дополнительно содержит сигнал, указывающий субъекта, которому рекомендуется получать определенную схему лечения.
28. Способ лечения субъекта-человека с риском хронического заболевания почек или протеинурии, предусматривающий введение лечения или терапии для предупреждения возникновения хронического заболевания почек или протеинурии субъекту-человеку, у которого определенное содержание белка ROBO2 выше эталонного порогового содержания.
29. Способ по параграфу 27, при котором содержание белка ROBO2 по меньшей мере на 20% выше эталонного содержания.
30. Способ по параграфу 27, при котором уровень содержание белка ROBO2 по меньшей мере на два стандартных отклонения выше эталонного содержания.
31. Способ по любому из параграфов 27-29, при котором лечение или терапия для предупреждения возникновения хронического заболевания почек или протеинурии содержит ингибитор ROBO2.
32. Способ по параграфу 30, при котором ингибитор ROBO2 представляет собой специфическое к ROBO2 блокирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфическую к ROBO2 антисмысловую молекулу, специфическую к ROBO2 короткую интерферирующую РНК (siPHK), небольшой молекулу-ингибитор ROBO2, ингибирующий ROBO2 полипептид или структурный аналог ROBO2.
33. Способ по любому одному из параграфов 30-31, при котором ингибитор ROBO2 блокирует или уменьшает связывание ROBO2 с SLIT, С Nck или с обоими.
34. Способ по любому одному из параграфов 30-32, при котором ингибитор ROBO2 специфичен к SLIT-связывающему домену Ig1, SLIT-связывающим доменам Ig1 и Ig2, внутриклеточному Nck-связывающему домену или любой их комбинации.
35. Способ по параграфу 31, при котором ингибирующий RОВO2 полипептид представляет собой доминантно-негативный слитый белок ROBO2, полипептид, содержащий внеклеточный домен ROBO2 без внутриклеточного домена, или полипептид, содержащий внутриклеточный домен ROBO2 без внеклеточного домена.
36. Ингибитор ROBO2 для применения в лечении хронического заболевания почек.
37. Ингибитор ROBO2 для применения в лечении протеинурии.
38. Применение по любому из параграфов 35 или 36, при котором ингибитор ROBO2 представляет собой специфическое к ROBO2 блокирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфическую к ROBO2 антисмысловую молекулу, специфическую к ROBO2 короткую интерферирующую РНК (siPHK), небольшой молекулу-ингибитор ROBO2, ингибирующий ROBO2 полипептид или структурный аналог ROBO2.
39. Применение по любому из параграфов 35-37, при котором ингибитор ROBO2 блокирует или уменьшает связывание ROBO2 с SLIT, С Nck или с обоими.
40. Применение по любому из параграфов 35-38, при котором ингибитор ROBO2 специфичен к SLiT-связывающему домену Ig1, SLIT-связывающим доменам Ig1 и Ig2, внутриклеточному Nck-связывающему домену или любой их комбинации.
41. Применение по параграфу 37, при котором ингибирующий ROBO2полипептид представляет собой доминантно-негативный слитый белок ROBO2, полипептид, содержащий внеклеточный домен ROBO2 без внутриклеточного домена, или полипептид, содержащий внутриклеточный домен ROBO2 без внеклеточного домена.
42. Применение по любому из параграфов 35-40, при котором хроническое заболевание почек или протеинурия вызваны диабетической нефропатией или высоким кровяным давлением.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие.
ПРИМЕРЫ
Гибридизация in situ, иммуногистохимия и электронная микроскопии с иммунологическим окрашиванием золотом
Анализ гибридизации in situ выполняли с меченными дигоксигенином рибопробами Robo2, как описано ранее (Grieshammer et al., 2004). Иммуногистохимию проводили на тканях эмбриональных почек мыши, фиксированных в 4% параформальдегиде, и на тканях взрослых почек мыши, фиксированных в метаноле. Для электронной микроскопии с иммунологическим окрашиванием золотом почки мыши дикого типа иссекали и фиксировали в параформальдегид-лизин- периодате (PLP). Ультратонкие срезы почки мыши подготавливали и инкубировали с козьим антителом к Robo2 (DAKO Corporation) и вторичным антителом, соединенным с 10 нм коллоидного золота (Ted Pella).
Дрожжевой двугибридный анализ, анализы копреципитации и полимеризации актина
Для характеристики взаимодействия Robo2 и Nck1 использовали дрожжевую двугибридную систему DUPLEX-A™ (OriGene Tech) в соответствии с инструкциями изготовителя. Клеточную культуру, копреципитацию His-меченого белка и иммунопреципитацию проводили, как сообщалось ранее (Fan et al., 2003). Для эндогенной иммунопреципитации использовали почки новорожденных мышей. Опосредованное антителом CD16 сшивание CD16/7 слитых белков и анализ полимеризации актина проводили, как описано ранее (Jones et al., 2006; Rivera et al., 2004; Verma et al., 2006).
Исследование нокаутных мышей, трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия и анализ клубочков почек
flox
del5
2-
2+
+/-
+/-
Протоколы мышей были одобрены комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC) в медицинского центре Бостонского университета (#14388). Получение и генотипирование условного аллеля Robo2, мутантного аллеля зародышевой линии Robo2 (также взаимозаменяемо называемого в настоящей заявке Robo) и аллеля дикого типа Robo было описано ранее (Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). Для получения Robo2-нефрин двойных нокаутных мышей, Robo2 мышей скрестили с Nphsl мышами, которые были получены ранее (Hamano et al., 2002). Для трансмиссионной электронной микроскопии почки фиксировали, инкубировали в глутаровом альдегиде с концентрацией 2% в какодилате натрия с концентрацией 0,15 М, обезвоживали в переменном этаноле, заливали в Epon, делали срезы и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Ультратонкие срезы почек исследовали с использованием электронного микроскопа JEM-1011. Для сканирующей электронной микроскопии почки подготавливали в соответствии со стандартным протоколом. Для исследований патологий почек почки фиксировали в параформальдегиде с концентрацией 4%, заключали в парафин, делали срезы и окрашивали с использованием стандартного реактива Шиффа (PAS) или эозина и гематоксилина (Н&Е). Для количественного определения числа подоцитов использовали WT1 в качестве маркера ядер подоцитов, и иммунопероксидазное окрашивание проводили на срезах почек в соответствии со стандартным протоколом. Подсчитывали WT1-положительные ядра подоцитов в каждом клубочковом сечении. Для анализа протеинурии разовые образцы мочи от 6-недельных мышей исследовали с использованием количественного набора ELISA на альбуминурию мышей (Exocell) в соответствии с инструкцией изготовителя и тест-полосок для мочи (Multistix, Bayer, IN) в качестве способа скрининга. Гибридизация in situ и иммуногистохимия
Анализ гибридизации in situ выполняли с мечеными дигоксигенином рибопробами Robo2, как описано ранее (Grieshammer et al., 2004). кДНК Robo2 линеаризовали с Notl, и зонды получали с использованием набора для мечения и детектирования ДНК (Roche Applied Science). Гибридизацию проводили на фиксированых в параформальдегиде с концентрацией 4% заключенных в ОСТ замороженных срезах мышиных эмбриональных почек. Иммуногистохимию проводили на тканях эмбриональных почек мыши, фиксированных в параформальдегиде с концентрацией 4% с последующей криозащитой сахарозы в концентрации 30% (Mugford et al., 2008), и на тканях взрослых почек мыши, фиксированых в метаноле. Почки мыши, заключенные в соединение ОСТ замороживали и делали срезы с использованием Cryostat по 8-10 мкм. Срезы окрашивали первичными антителами с последующими соответствующими конъюгированными с FITC или Су3 вторичными антителами. Первичные антитела, используемые в настоящем исследовании, включают следующие к ROBO2 (R&D System, Abnova, Santa Cruz Biotechnology), нефрину (синтезированные на заказ) (Topham et al., 1999), Nck (Upstate/Millipore), подоцину (Sigma), нидогену (Santa Cruz Biotechnology), Pecaml (BD Biosciences), WT1 (Santa Cruz Biotechnology), Slit2 (Santa Cruz Biotechnology), PDGFR beta (Cell Signaling), синаптоподину (Santa Cruz Biotechnology). Изображения получали с использованием многоточечного лазерного сканирующего конфокального микроскопа с вращающимся диском Perkin Elmer LCI UltraView и конфокального лазерного сканирующего микроскопа с 60х иммерсионным объективом Zeiss LSM 510.
Электронная микроскопия с иммунологическим окрашиванием золотом Почки мышей дикого типа иссекали и фиксировали в параформальдегид-лизин-периодате (PLP) при 4°С в течение ночи. Ткань отмывали в 1xPBS и обезвоживали в переменном этаноле и заключали в смолу LR White (Electron Microscopy Sciences). Получали ультратонкие срезы почки мыши и переносили на покрытые формваром золотые сетки, и блокировали бычьим сывороточным альбумином в концентрации 1% и 5% нормальной козьей сывороткой в 1xPBS. Затем срезы инкубировали с козьим антителом к Robo2 с разведением 1:50 в DAKO (DAKO Corporation) при 4°С в течение ночи. В качестве контроля использовали неиммунную сыворотку. После трех отмывок в 1xPBS срезы инкубировали с вторичным антителом IgG, соединенным с коллоидным золотом размером 10 нм (Ted Pella) в течение 2 часов при комнатной температуре. Наконец, срезы пост-фиксировали в 1% глутаровом альдегиде и контрастировали с уранил-ацетатом. Срезы исследовали на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Tokyo, Japan) при 80 кВ, и изображения получали с помощью цифровой системы визуализации АМТ (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA.) и импортировали в Adobe Photoshop. Субклеточную локализацию окрашенных с помощью частиц золота Robo2 в клубочках узнавали на цифровых электронных микрофотографиях в сравнении с контрольными микрофотографиями, окрашенными без иммунной сыворотки.
Дрожжевой двугибридный анализ
Для характеристики взаимодействия Robo2 и Nck1 использовали дрожжевую двугибридную систему DUPLEX-Α™ (OriGene Tech, Rockville, MD) кДНК, кодирующие внутриклеточный домен Robo2 человека, и ее усеченные формы, клонировали в вектор pJG4-5 в сайтах EcoRVXhol, сливая их с доменом активации транскрипции В42. кДНК человеческого Nck1 и ее усеченные формы клонировали в вектор pEG202 в EcoRVXhol, чтобы слить их в ДНК-связывающий домен LexA. Ген LacZ в конструкте pSH18-34 и ген LEU2 в геноме дрожжей штамма EGY48 использовали в качестве репортерных генов. Конструкты PEG202, pSH 18-34 и pJG4-5 котрансформировали в клетки EGY48 дрожжей. Взаимодействие считали положительным, если дрожжевые клетки становились синими в присутствии X-gal и росли в отсутствие лейцина.
Культура клеток, ДНК конструкты, трансфекция, копреципитация и анализ вестерн-блот
2
4
2
4
3
4
Клетки HEK (293Т) трансфектировали при 60% конфлюентности с использованием трансфекции с фосфатом кальция. Чтобы получить С-концевые his- и шус-меченые слитые белки, полноразмерный нефрин и Robo2 человека клонировали в вектор pSecTag В (Invitrogen) в сайты рестрикции Hind UUEcoRl и EcoRl/Xhol, соответственно. Robo2-ANBD получали путем удаления Nck-связывающего домена (фиг. 2С) с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Strategene) в соответствии с инструкциями изготовителя. Немеченные Robo2 и Nck1 клонировали в вектор PCS2 (Addgene) в сайтах EcoRl/Xhol, нефрин в сайтах HindIII/EcoRl. О Fyn и тус-меченых конструктах Slit2 человека сообщалось ранее (Li et al., 2008; Wong et al., 2001). O CD16/7-NCD и CD16/7-HA конструктак также сообщалось ранее (Verma et al., 2006). Для обнаружения взаимодействия Robo2 и Nck1, С-концевые His- и myc-меченые Robo2 и Robo2-ANBD человека экспрессировали в клетках HEK. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки лизировали в буфере для лизиса (50 мМ NaHP0, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0,5% ТХ100, 1х ингибитор протеазы [рН 8,0]). Клеточные лизаты центрифугировали в течение 10 мин при 4°С; супернатанты инкубировали со смолой Ni-NTA (Qiagen) при 4°С в течение 2 часов, чтобы преципитировать His-Robo2, в качестве контроля использован NTA смолу без Ni. Смолу отмывали три раза отмывочным буфером (50 мМ NaHP0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5% ТХ100 [рН 8,0]) и нагревали при 95°С в течение 10 мин. Преципитаты разделяли в SDS-PAGE гелях и блоттировали с кроличьими антителами к туе, кроличьими моноклональными антителами к Nck1 (Cell Signaling) в разведении 1:1000. Для изучения тройного взаимодействия между Robo2, Nck1 и нефрином His-myc-Robo2 или His-myc-Robo2-ANBD коэкспрессировали в клетки HEK с нефрином человека и Fyn человека. His-Myc-Robo2 преципитировали с гранулами Ni-NTA, как описано выше. Для подтверждения тройного взаимодействия His-myc-нефрин коэкспрессировали с Robo2 и Fyn в клетках HEK, и His-myc-нефрин осаждали с помощью гранул Ni-NTA. Преципитаты блоттировали с кроличьими поликлональными антителами к туе, кроличьими моноклональными антителами к Nck1, кроличьими поликлональными антителами к нефрину, мышиными моноклональными антителами к Robo2 (R&D Systems) и кроличьими поликлональными антителами к Fyn (Santa Cruz Biotechnology) в разведении 1:1000. Для коиммунопреципитации эндогенных белков почки от новорожденных мышей гомогенизировали в буфере RIPA (50 мМ Трис [рН 7,4], 150 мМ NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 1 мМ NaV0, 1 мМ NaF, 1х ингибитор протеазы) на льду. Образцы центрифугировали в течение 10 мин при 4°С и супернатант инкубировали с 1 мкг мышиных моноклональных антител к Robo2 (R&D Systems) в течение 1 часа при 4°С. В качестве контроля использовали контрольные козьи IgG (Santa Cruz Biotechnology). Образцы затем смешивали с 30 мкл суспензии белка A/G плюс шарики агарозы (Santa Cruz Biotechnology) и дополнительно инкубировали в течение 12 часов при 4°С. Гранулы затем отмывали три раза в буфере RIPA, и белки элюировали в 1х буфере для внесения белков при нагревании при 95°С в течение 10 мин. Преципитаты разделяли в SDS-PAGE гелях и блоттировали с мышиными антителами к Robo2, кроличьими антителами к нефрину и кроличьими антителами к Nck1, как описано выше. Актин блоттировали мышиным антителом к бета-актину от Sigma. Интенсивность полос измеряли с помощью ImageJ. Для обнаружения протеинурии собирали разовые дозы мочи мышей и разбавляли 1х буфером для внесения белка при разведении 1:100. Белки мочи затем разделяли в SDS-PAGE гелях, и очищенный альбумин использовали в качестве контроля (MP Biomedicals). Гели блоттировали с кроличьим поликлональным антителом к альбумину (MP Biomedicals).
Сшивание CD16/7-NCD и анализ полимеризации актина
Опосредованное антителом CD16 сшивание слитых белков CD16/7 было описано ранее (Jones et al., 2006; Rivera et al., 2004; Verma et al., 2006). Вкратце, CD16/7-NCD или CD16/7-HA коэкспрессировали в клетках HEK с Robo2. Через 24 часа клетки переносили и высевали на покрытые полилизином покровные стекла еще на 24 часа. Затем клетки инкубировали с мышиными моноклональными антителами к CD16 (Beckman Coulter) в концентрации 1 мкг/мл в течение 30 мин при 37°С, отмывали один раз DMEM, инкубировали с конъюгированным с родамином вторичным антителом (Thermo Scientific), разведенного в кондиционированной Slit2 среде (Wong et al., 2001) или контрольной кондиционированной среде, в течение 30 мин и фиксировали в 4% параформальдегиде в lx PBS. F-актин окрашивали с использованием конъюгированного с FITC фаллоидина (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Вновь образованные F-актиновые пучки концентрируются возле кластеризованного нефрина (CD16/7-NCD) и выглядят под флуоресцентным микроскопом как хвосты комет (т.е. актиновые хвосты в основном тексте). В этом эксперименте мы только анализировали F-актиновые пучки, образованные кластеризацией CD16/7-NCD и прикрепленные к кластерам. Подсчитывали клетки с F-актиновыми хвостами и сравнивали с общим количеством трансфектированных клеток CD16/7-NCD. Формула количественной оценки представляет собой: Процент % = (количество трансфектированных клеток с F-актиновыми хвостами / общее число трансфектированных клеток) × 100 Изображения были получены с использованием конфокального микроскопа LSM510 с 60х масляно-иммерсионным объективом.
Получение и характеристика Robo2 подоцит-специфических нокаутных мышей и КоЬо2-нефрин двойных нокаутных мышей
flox
del5
-
+
del5/flox
Nphs2-Cre/+
del5
flox
flox
del5
del5/flox
Nphs2-Cre/+
del5
flox
Nphs2-Cre
flox/+
del5
Nphs2-Cre
+/-
+/-
+/-
+/-
-/-
-/-
-/-
-/-
+/+
+/+
Получение и генотипирование условного аллеля Robo2, мутантного аллеля зародышевой линии Robo2 (также взаимозаменяемо называемого в настоящей заявке Robo2) и аллеля дикого типа Robo2 было описано ранее (Lu et al., 2007; Wang et al., 2011). Следовали стандартной схеме размножения для получения Robo2 подоцит-специфических Robo2; Tg нокаутных мышей, которые несут один аллель Robo2 и один аллель Robo2. В этом соединенном мутанте подоцит-специфическая рекомбиназа Cre под воздействием промотера подоцина удаляет только аллель Robo2 для облегчения пенетрантности фенотипа, потому что другой аллель, Robo2, был удален повсеместно из экспрессии зародышевой линии. Аутентичность Robo2; Tg мышей определяли по хвосту генотипирования ДНК на наличие аллелей Robo2 и Robo2, а также трансгена Tg. Помет F2 Robo2 мышей без аллеля Robo2 и трансгена Tg использовали в качестве контроля. Для получения Robo2-нефрин двойных нокаутных мышей Robo2 гетерозиготных мышей скрещивали с Nphsl гетерозиготными мышами, которые были получены ранее (Hamano et al., 2002). После получения Robo2; Nphsl двойных гетерозиготных мышей проводили скрещивание двойных гетерозиготных мышей для получения Robo2; Nphsl двойных гомозиготных мышей, а также Nphsl одинарных гомозиготных, Robo2 одинарных гомозиготных и Robo2; Nphsl контролей дикого типа. Протоколы мышей были одобрены Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC) в Медицинском центре Бостонского университета (#14388).
Трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия
Для трансмиссионной электронной микроскопии почки иссекали у Robo2 гомозиготных нулевых мышей и подоцит-специфических нокаутных мышей, фиксировали в PLP при 4°С в течение ночи, а затем инкубировали в 2% глутаральдегиде в 0,15 M какодилате натрия в течение 6 часов. После отмывания в 1xPBS, фиксированные почки обезвоживали в переменном этаноле, заливали в Epon, делали срезы и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Ультратонкие срезы почек подготавливали и исследовали с использованием электронного микроскопа JEM-1011. Однопометных особей дикого типа использовали в качестве контроля. Для сканирующей электронной микроскопии образцы почек от Robo2 гомозиготных нулевых мышей, подоцит-специфических нокаутных мыши, нефрин гомозиготных нулевых мышей и Robo2-нефрин двойных гомозиготных мышей подготавливали согласно протоколу, описанному ранее (Friedman and Ellisman, 1981) с незначительными изменениями. Вкратце, почки перфузировали с 2,5% глутаральдегидом и 2% раствором параформальдегида в 0,1 M какодилатном буфере (фиксатор Карновского, Electron Microscopy Sciences), а затем фиксировали в фиксаторе Карновского в течение 24 часов с последующей вторичной фиксацией в 2% растворе осмия (Electron Microscopy Sciences). Образцы почек криофракционировали, обезвоживали и сушили с использованием гексаметилдисилазана (Electron Microscopy Sciences). Образцы почек исследовали с использованием сканирующих электронных микроскопов Amray 1000А и Jeol 6340F. Для получения репрезентативных изображений от каждого животного исследовали по три клубочка.
Исследования патологий почек мышей, количественная оценка количества подоцитов и анализ на протеинурию
del5/flox
Nphs2-Cre+
Для исследований патологий почек почки иссекали и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи, а затем обрабатывали переменными сериями этанола для заключения в парафин. Из парафиновых блоков почек делали срезы 4 мкм с использованием микротома МТ-920 (MICROM) и окрашивали с использованием стандартного реактива Шиффа (PAS) или эозина гематоксилина (Н&Е). Исследовали клубочки и оценивали расширение матрикса, сегментарный гломерулосклероз и дилатации пространства Боумена с использованием светового микроскопа Olympus ВНТ, оснащенного системой цифровой камеры SPOT. Для количественного определения числа подоцитов использовали WT1 в качестве ядерного маркера подоцитов, и иммунопероксидазное окрашивание проводили на срезах почек согласно протоколу, описанному ранее (Sanden et al., 2003). Вкратце, из заключенных в парафин секций почек от 4 годовалых Robo2; Tg подоцит-специфических нокаутных мышей и 4 контрольных мышей дикого типа соответствующего возраста делали срезы по 4 мкм и окрашивали антителом WT1 (Santa Cruz Biotechnology) после микроволнового демаскирования антигена. Для обнаружения сигнала WT1 использовали биотинилированные вторичные антитела и набор Vectastain ABC (Vector Laboratories). Подсчитывали положительные по WT1 ядра подоцитов в каждом клубочковом сечении во всех 165 клубочках от четырех мутантных мышей и 166 клубочках от четырех контрольных мышей. Для анализа на протеинурию образцы разовых порций мочи от 6 недельных мышей исследовали с использованием чувствительного количественного набора ELISA на мышиную альбуминурию (Exocell) в соответствии с инструкцией изготовителя и анализа мочи тестовыми полосками (Multistix от Bayer, IN) в качестве способа скрининга. Альбумин мочи нормализовали с креатинином для обеспечения соотношение альбумин/креатинин. Креатинин в моче определяли с использованием набора для обнаружения креатинина (Sigma) в соответствии с инструкцией изготовителя. Альбумин мочи также исследовали на 12% SDS-PAGE и блоттировали с антителом к альбумину (MP Biomedicals). Анализировали данные от мутантных и контрольных особей с использованием однофакторного дисперсионного анализа, t-критерия Стьюдента и критерия хи-квадрат.