ПОРИСТЫЕ МИКРОСФЕРЫ НА ОСНОВЕ БИОФОСФАТОВ КАЛЬЦИЯ И МАГНИЯ С РЕГУЛИРУЕМЫМ РАЗМЕРОМ ЧАСТИЦ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ
POROUS MICROSPHERES OF CALCIUM AND MAGNESIUM BIOPHOSPHATE WITH ADJUSTED PARTICLE SIZE FOR BONE TISSUE REGENERATION

Изобретение относится к области биофосфатных керамических материалов для медицины, а именно для травматологии, ортопедии, реконструктивно-восстановительной хирургии, косметологии, стоматологии и к системе доставки лекарственных препаратов.
3
4
2
5
4
3
Фосфаты кальция являются главными составляющими элементами кости и широко используются в качестве материалов для регенерации костной ткани и изготовления прочных костных имплантантов, применяемых в ортопедии, челюстно-лицевой хирургии и др. К наиболее применяемым в медицине фосфатам кальция относятся трикальцийфосфат - Са(PO) (TCP) и гидроксиапатит - Са(PO)ОН (ГА) или бифазные материалы основанные на системе ТКФ-ГА. Биологические и механические свойства кальцийфосфатной керамики, определяются фазовым составом и структурой, которые в основном зависят от температуры обжига и размера исходных частиц порошка керамики. Одним из методов повышения механических характеристик и снижения температуры спекания керамики является применение керамических ультрадисперсных порошков с размером частиц менее 1 мкм.
В работе (A. Tampieri, G. Celotti, F. Szontagh and Landi «Sistering and characterization of HA and TCP bioceramics with control of their strebght and phase purity». J. of Materials in Medicine 8 (1997 29-37) были получены кальцийфосфатные материалы на основе ТКФ и ГА из порошков со средним размером кристаллов 0,5 мкм. Полученные материалы характеризовались мелкокристаллической структурой со средним размером кристаллов 1-2 мкм, пористостью менее 7%. Недостатком данного материала являлась высокая температура обжига 1220-1300°С. Кроме того, при температуре выше 1250°С наблюдается снижение прочности и частичное разложение ГА с образование токсичного оксида кальция.
Известны также кальцийфосфатные материалы на основе системы трикальцийфосфат-гидроксиапатит (S. Raynaud, E. Champion, D. Bemache-Assollant «Calcium phosphate appatites with variable Ca/P atomic ratio 2. Calcination and sistering», Biomaterials 23 (2002) 1073-1080), получаемые в результате спекания нанокристаллических порошков при температуре 1100-1150°С. В данной работе снизить температуру спекания удалось за счет использования нанокристаллических порошков и применения метода горячего прессования. В результате были получены бифазные метериалы системы ТКФ-ГА, которые характеризовались мелкодисперсной структурой со средним кристаллом 200 нм. Недостатком данной керамики является высокая температура обжига и применение метода горячего прессования, что приводит к значительному удорожанию готовой продукции.
Из RU 2359708, 27.06.2009 известен другой кальцийфосфатный керамический материал, предназначенный для изготовления костных имплантантов и/или замещения дефектов при различных костных патологиях.
Материал состоит из трикальцийфосфат-гидроксиапатитовой керамики с добавками карбоната калия, и/или карбоната лития, или карбоната кальция при следующем соотношении компонентов в керамике, мас.%:
гидроксиапатит и/или трикальцийфосфат
- 80-99,5
одна из вышеуказанных добавок
- 0,5-20,0
Известный керамический материал имеет размер частиц не более 100 нм и пористость (открытую) менее 4% после обжига до 700°С.
Материал не обладает необходимыми остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами.
Известно, что фосфат магния входит в состав костной ткани. Магний выступает в роли регулятора клеточного роста, необходим на всех этапах синтеза белковых молекул. Магний - незаменимый элемент триады Са, Р, Mg, обмен которых тесно взаимосвязан. Он принимает участие в обмене фосфора, энергетическом обмене, синтезе АПФ, обмене углеводов, регулирует гликолиз, участвует в построении костной ткани, обеспечивает функциональную способность нервной и мышечной тканей.
Подобно кальцию он принимает участие во многих процессах обмена веществ. Ферменты, в состав активного каталитического центра которых входит ион магния, играет важную роль в обеспечении организма энергией, транспорте различных веществ через клеточные мембраны, синтезе белков и нуклеиновых кислот. Магний играет важную роль в процессах остеогенеза, может непосредственно влиять на функцию костных клеток.
Из RU 2292868, 10.02.2007 известен материал для заполнения костных челюстно-лицевых и стоматологических дефектов. Материал выполнен на основе реакционно-твердеющей смеси порошков, содержит гидроксиапатит и трикальций фосфат, в качестве затворяющей жидкости использован раствор фосфата магния и фосфата натрия в фосфорной кислоте при определенном количественном содержании их в затворяющей жидкости, при этом количество затворяющей жидкости к количеству реакционно-твердеющей смеси составляет 0,25-0,65. Недорогие исходные компоненты и высокая прочность позволяют широко использовать данный материал для корреляции фрагментов альвеолярного отростка, закрытия полостей в костных тканях и лечения различных трещин травматического генеза.
Известный материал имеет ограниченное использование и также не обеспечивает всего необходимого комплекса свойств, а именно необходимой биосовместимостью, биодеградацией, необходимыми остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами.
Он может быть выбран в качестве наиболее близкого аналога по числу общих сходных признаков.
Технической задачей данного изобретения является получение материала в виде микросфер-гранул на основе биофосфатов кальция и магния с регулируемым размером частиц, обладающих биосовместимостью биодеградацией, остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами, способными полностью замещаться костной тканью.
Поставленная техническая задача и достигаемый технический результат достигается пористыми гранулами-микросферами с регулируемым размером частиц для регенерации костной ткани и характеризующиеся тем, что имеют размер в диапазоне 1-1000 мкм, сквозные поры размером с 1-100 мкм и общую пористость 40-75%, гранулированные методом электроспининга, термообработанные и полученные из смеси, содержащей порошок ортофосфата магния и порошок биологического гидроксиапатита из деминерализованных костей крупного рогатого скота при соотношении 0,5-1,0, а также 1-3%-ный раствор в дистиллированной воде альгината натрия для получения пластичной массы, при соотношении порошка, жидкой фазы и отвердителя, насыщенного раствора хлорида кальция, как 0,5-1,5:2-5:5-20 соответственно.
Согласно уровню техники установлено, что взаимодействие кальция и магния будет оптимальным при соотношении в организме 1:0,5-0,7 соответственно. В противном случае кальций будет мешать всасыванию магния. Поэтому мы выбрали соотношение порошка ортофосфата магния и биологического гидроксиапатита 0,5-1,0. Эти соотношения являются оптимальными. Ниже этих значений полученная смесь из ортофосфата магния, гидроксиапатита при добавлении раствора альгината натрия становится очень жидкой и время ее истечения из иглы при приложенном напряжении настолько быстро, что гранулы не успевают формироваться. Выше этих значений полученная смесь настолько вязкая, что ее невозможно продавить через иглу.
Термообработку гранул проводят в течение 60 мин. при температуре 850°С. Использование метода электроспиннинга для получения гранул позволяет изготавливать очень мелкие частицы биофосфатов, меняя приложенное напряжение.
Электроспиннинг на настоящий момент можно назвать самым передовым и быстрым способом получения гранул. Электроспиннинг представляет собой распыление жидкости и образование гранул из вязкой среды под действием электрического поля. Процесс довольно прост и не требует применения высоких температур, что делает его чрезвычайно привлекательным. Суть метода состоит в следующем:
К капле вязкого раствора прикладывается высокое напряжение порядка 15-20 кВ, в этом случае жидкость приобретает заряд, силы электростатического отталкивания между молекулами начинают противодействовать силам поверхностного натяжения, и капля вытягивается. В данном случае подобрано определенное соотношение альгината натрия и биофосфатов на основе кальция и магния, а также и напряжение, чтобы происходило электрораспыление жидкости. В зависимости от приложенного напряжения возможно получение гранул разного размера. При напряжении менее 15 кВ получаются гранулы более 1 мкм, а увеличение напряжения более 20 кВ нецелесообразно с точки зрения безопасности и экономичности. Капли распыляются в ванну с отвердителем, содержащим насыщенный раствор хлорида кальция. Полученные гранулы прокаливаются в течение 60 мин. при температуре 850°С и просеиваются через сита для получения фракций с определенным размером гранул.
Установка для электроспиннинга состоит из насадки (это игла от шприца), соединенная с источником высокого напряжения, насоса и заземленного коллектора. В шприц помещается жидкость: раствор альгината натрия и биофосфатов на основе кальция и магния; затем жидкость с помощью насоса выдавливается со скоростью 1 капля в секунду на кончик иглы.
Порошок используемого в изобретении биологического гидроксиапатита получают следующим образом. Сначала получают биологический гидроксиапатит из костей крупного рогатого скота путем деминерализации костной ткани в 1 М растворе соляной кислоты с последующим осаждением гидроксиапатита осадителем, например 5 М раствором гидроксида натрия, фильтрование, термическую обработку, при температуре 830°С.
Полученный гидроксиапатит измельчают до получения частиц порошка размером не более 40 мкм. Данный способ позволяет получать мелкодисперсный порошок гидроксиапатита с микроэлементным составом, максимально приближенным к составу костной ткани человека. Для повышения остеогенных свойств материала в их состав вводят ортофосфат магния.
Порошок ортофосфатного магния готовится смешиванием оксида магния и 70% ортофосфорной кислоты в соотношении 1:1,18. Полученный ортофосфат магния измельчался в шаровой мельнице и просеивался через сита с размером ячеек не более 40 мкм. Приготовленный таким способом ортофосфат магния придает гранулам пластичные свойства.
2
Экспериментально установлено, что получение частиц с размером более 40 мкм не позволяет вводить их через инсулиновый шприц под кожу или в мелкие костные дефекты. Кроме того, частицы с размерами не более 40 мкм, как известно из уровня техники, обладают высокой удельной поверхностью порядка 80 м/г, что являются одним из ключевых факторов их биоактивности.
Ниже представлен конкретный пример получения пористых микросфер-гранул биофосфатов кальция и магния с регулируемым размером частиц для регенерации костной ткани по изобретению. Данный пример иллюстрирует изобретение, но не ограничивает его.
Пример 1.
Полученные фракции порошков ортофосфата магния и биологического гидроксиапатита смешиваются в соотношении 0,5-1,0 и перемешиваются в шаровой мельнице в течение 30 минут. Затем готовят пластичную массу, содержащую 1-3% раствора альгината натрия, растворенного в дистиллированной воде и смесь ортофосфата магния и биологического гидроксиапатита, гранулы формируются с помощью метода электроспиннинга. В качестве отвердителя используется насыщенный раствор хлорида кальция. Соотношения компонентов следующие: смесь порошков ортофосфата магния и биологического гидроксиапатита 0,5: раствор альгината натрия 2; раствор хлорида кальция 5.
Пример 2.
Полученные фракции порошков ортофосфата магния и биологического гидроксиапатита смешиваются в соотношении 0,5-1,0 и перемешиваются в шаровой мельнице в течение 30 минут. Затем готовят пластичную массу, содержащую 1-3% раствора альгината натрия, растворенного в дистиллированной воде и смесь порошков ортофосфата магния и биологического гидроксиапатита, гранулы формируются с помощью метода электроспиннинга. В качестве отвердителя используется насыщенный раствор хлорида кальция. Соотношения компонентов следующие: смесь порошков биофосфатов кальция и магния 1,5: раствор альгината натрия 5: раствор хлорида кальция 20.
Итак, используемый метод электроспиннинга, а именно, метод электрораспыления жидкости при напряжении порядка 15-20 кВ с последующим их улавливанием в ванне с отвердителем хлоридом кальция и термической обработкой гранул при температуре 830°С.
Измельчение полученных порошков проводят в шаровой мельнице в течение 30 минут с получением частиц размером не более 40 мкм. Такой размер частиц порошка оптимален для последующего процесса получения микросфер.
Термообработку гранул проводят в течение 60 минут. Микросферы содержат сквозные поры размером 1-100 мкм, общая пористость 40-75%.
Используемая температура термообработки достаточна для полного удаления органической составляющей и полной кристаллизации аморфных форм кальцийфосфатных соединений и, кроме того, необходима и достаточна и для формирования порового пространства в микросферах.
Выбранное соотношение компонентов (между фосфатом кальция и фосфатом магния и другими компонентами) необходимо для оптимального истечения жидкости через иглу, а также получения биофосфатных микросфер, содержащих сквозные поры определенного размера.
Сформированное поровое пространство в микросферах обеспечивает прорастание тканей вглубь порового пространства.
На основании многочисленных исследовании по применению в медицине керамических материалов установлено, что биофосфаты относятся к классу биоактивных материалов с поверхностно-активными свойствами и высокой биосовместимостью. Наиболее удобной формой для применения в медицине являются микросферы. Так, например, в косметологии при введении материала (поскольку введение проводится инсулиновым шприцом, то микросферы должны иметь размер не более 30-35 мкм) в дерму микросферы биофосфатов стимулируют фибробласты и запускается процесс неоколлагенеза. В случае введения микросфер под надкостницу, частицы биофосфатов стимулируют остеобласты и запускается процесс остеосинтеза.
Производство гранул из синтезированного гидроксиапатита в настоящее время достаточно хорошо освоено в широких масштабах. Получение гранул из биофосфатов кальция и магния естественного происхождения предполагает повысить биосовместимость и остеогенные свойства.
Для изучения свойств биосовместимости, биодеградации, а также способности к остеоиндукции и остеокондукции материала были проведены исследования на 20 крысах женского пола породы «Wistar» в возрасте 3-х месяцев. В целях выявления системных реакций организма на материал был проведен комплекс лабораторных исследований, в том числе определены необходимые биологические показатели, были выполнены рентгенологические исследования РКТ и также готовились и изучались гистологические препараты окружающих материал тканей. В ходе исследования было убедительно доказано, что материал обладает хорошо выраженными биосовместимыми, биодеградируемыми свойствами. Кроме того, материал проявил высокую остеоиндуктивную и остеокондуктивную способность, что подтверждено рентгенологическими, гистологическими и биохимическими методами исследования.
Кроме того, наблюдалась более высокая концентрация кальция в сыворотке крови, в сравнении с контрольной группой животных, что является важнейшим предиктором успешного остеогенеза.