СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ И ИЗОЛЯТОВ БАКТЕРИИ Pasteurella multocida СЕРОГРУППЫ А У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR IDENTIFICATION OF STRAINS AND ISOLATES OF BACTERIA Pasteurella multocida OF SEROGROUP A IN CATTLE AND METHOD OF THEIR APPLICATION

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано для диагностики пастереллеза сельскохозяйственных животных.
Pasteurella multocida - условно-патогенная грамотрицательная бактерия, являющаяся комменсальным обитателем поверхности слизистых оболочек верхних дыхательных путей животных и птиц, способная, при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды и/или вирусной инфекции, преодолевать защитные механизмы организма и вызывать тяжелые поражения легких.
На основании строения капсульного антигена все штаммы бактерии делятся на 5 серогрупп. Штаммы серогруппы А вызывают пневмонии у крупного рогатого скота, овец, а также пастереллез птиц и кроликов. Для штаммов этой серогруппы характерно наличие гиалуроновой кислоты в составе капсулы (Carter, G.R. Recommendations for a standard system of designating serotypes of Pasteurella multocida / G.R. Carter, M.M. Chengappa // American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 1981. P.37-42).
До настоящего времени основным способом типирования штаммов и изолятов Р. multocida серогруппы А в нашей стране является тест на выявление гиалуроновой кислоты в капсуле бактерии. Для этого изучаемую 18-часовую бульонную культуру Р. multocida высевают штрихом на чашку Петри с 1,5% агаром Хоттингера. Затем перпендикулярно ей высевают штрихом суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus, синтезирующую гиалорунидазу. Обе культуры должны пересекаться. Чашки с посевами инкубируют при 37°С в течение 18-24 часов. Штаммы Pasteurella multocida, образующие вблизи (до 5 мм) от линии роста S. aureus более мелкие колонии, чем на удалении от этой линии, считают синтезирующими гиалуроновую кислоту и относят к серогруппе А. Размер колоний штаммов и изолятов других серогрупп не изменяется (Методические указания по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц. Утверждены Главным управлением ветеринарии министерства сельского хозяйства РФ №22-7/82 от 20.08.1992 г.).
К недостаткам данного способа относятся необходимость получения чистой культуры Р. multocida и поддержания культуры S. aureus. Кроме этого, в процессе культивирования Р. multocida на питательных средах могут возникать спонтанные мутации, приводящие к появлению безкапсульных вариантов бактерии, что приводит к невозможности их типирования по данному способу.
Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ, основанный на выявлении фрагмента генов hyaC-hyaD, отвечающих за синтез гиалуроновой кислоты у сероварианта А Р. multocida в полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий, синтез 2 пар специфических олигонуклеотидных праймеров: RGPMA5 5′aatgtttgcgatagtccgttaga3′ и RGPMA6 5′atttggcgccatatcacagtc3′, RGPMANP1 5′gaagtcggcggaaacta3′ и RGPMANP2 5′agtcttttctttcgctttctg3′, амплификацию ДНК возбудителя в два раунда, специфическую идентификацию продукта ПЦР размером 374 п.н. с помощью электрофореза в 2% агарозном геле (Gautam R. Specific identification of Pasteurella multocida serogroup-A isolates by PCR assay / R. Gautam, A.A. Kumar, V.P. Singh, Vijendra P. Singh, Т.К. Dutta, S.B. Shiva-chandra // Res.in Vet. Science. - 2004. - Vol.76. - P.179-185).
4
К недостаткам данного способа можно отнести то, что он разработан для идентификации штаммов и изолятов Pasteurella multocida серогруппы А в пробах патологического материала, полученного от больных птиц, требует проведения ПЦР в два раунда, а в результате реакции синтезируется фрагмент размером 374 п.н. Чувствительность способа составляет 1,2×10 бактериальных клеток на пробу.
Задачей изобретения является разработка синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А у крупного рогатого скота и способа их применения.
Поставленная задача решается тем, что подобрана и синтезирована пара синтетических олигонуклеотидных праймеров для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А у крупного рогатого скота, согласно изобретению имеют нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO:1 - 5′ tgaaaggggcatcacaaggt 3′, SEQ ID NO:2 - 5′ cccaaggcatataagtcagggt 3′.
Задача решается также тем, что в способе идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А у крупного рогатого скота, включающем выделение ДНК из проб биоматериала или бактериальных культур и проведение ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами, согласно изобретению используют пару олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO:1 - 5′ tgaaaggggcatcacaaggt 3′, SEQ ID NO:2 - 5′ cccaaggcatataagtcagggt 3′, ПЦР проводят в 1 раунд, при получении фрагмента, соответствующего размеру 218 п.н., диагностируют штаммы и изоляты бактерии Pasteurella multocida серогруппы А.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами
Пример 1. Получение синтетических олигонуклеотидных праймеров.
Поиск новых синтетических олигонуклеотидных праймеров осуществляют на основе анализа полного генома штамма Pasteurella multocida «36950», представленного в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/GenBankSearch.html), при помощи пакета программного обеспечения «Lasergen». Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестируют на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе «Vector NTI Suite» с последовательностями геномов штаммов других серогрупп Р. multocida, представителей семейства Pasteurellaceae и Enterobacteriaceae, представленных в базе данных GenBank.
Окончательный выбор праймеров основывают на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и ДНК различных штаммов Pasteurella multocida серогруппы А, высокая температура отжига (GC- метод), большая длина консенсусов, отсутствие гетеродуплексов.
Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U. Концентрацию синтетических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрометрическим методом.
Таким образом, были выбраны синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома Pasteurella multocida участка гена hyaD, отвечающего за синтез гиалуронсинтетазы:
SEQ ID NO:1 - 5′ tgaaaggggcatcacaaggt 3′,
SEQ ID NO:2 - 5′ cccaaggcatataagtcagggt 3′.
Пример 2. Способ выявления бактерии Pasteurella multocida серогруппы А с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в пробах патологического материала и культурах бактерий
Способ осуществляется в несколько этапов.
Этап 1. Подготовка проб патологического материала и бактериальных культур для исследования
Для исследования от павших или вынужденно убитых животных с признаками бронхопневмонии отбирают пробы внутренних органов (легких на границе нормального и измененного участка, бронхиальных и средостенных лимфатических узлов) не позднее 3-5 часов после гибели животного.
2
Из полученных проб делают посев методом отпечатков на мясопептонный агар с добавлением 5% дефибрированной крови барана (кровяной мясопептонный агар). Инкубируют в термостате при температуре 37°С в атмосфере 5% СО.
Через 24±2 часа инкубации просматривают чашки Петри с агаром на наличие типичных для пастерелл колоний (прозрачных, диаметром до 3 мм, округлых с ровными краями, слизистой консистенции, серого цвета). Их этих колоний делают мазки на стекле и окрашивают их по Грамму для предварительного типирования. При обнаружении в мазке грамотрицательных кокобактерий, окрашенных биполярно, колонию отбирают для исследования в ПЦР.
9
Для этого отдельные колонии, не смешивая, снимают с поверхности агара, переносят в отдельные стерильные стеклянные пробирки, содержащие 200 мкл стерильной дистиллированной воды, перемешивают на вортексе. Взвесь бактерий разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 10КОЕ/мл.
Пробы органов животных помещают в фарфоровые ступки, растирают с песком и разводят физиологическим раствором в соотношении 1/5-1/10, затем центрифугируют и надосадочную жидкость используют для выделения ДНК.
9
Взвесь бактерий в концентрации 10 КОЕ/мл используют для выделения ДНК без подготовки.
Этап 3. Выделение ДНК из проб биоматериала или взвеси бактерий. Выделение ДНК проводят любым доступным способом, включающим лизис клеток, депротеинизацию лизата, осаждением ДНК из раствора, отмывку спиртами, высушивание и растворение ДНК в буферном растворе.
Этап 4. Амплификация участка ДНК Pasteurella multocida, кодирующего участок гена hyaD.
2
Полимеразная цепная реакция. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl, 25 тМ KCl, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, no 0,2 мкг каждого праймера, 1.25 е.а. Taq-ДНК-полимеразы, 5 мкл выделенной ДНК.
Температурный режим проведения ПЦР: 95°С - 5 мин - 1 цикл; 95°С - 10 сек, 55°С - 15 сек, 72°С - 20 сек - 35 циклов; 72°С - 5 мин.
Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР.
Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере (рН 8,0) по стандартной методике.
Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».
Используют маркер молекулярного веса 100 bp. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 218 нуклеотидную пару.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно выявлять штаммы и изоляты бактерий вида Pasteurella multocida серогруппы А в пробах патологического материала от больных животных и бактериальных культурах.
Пример 3. Определение чувствительности, специфичности и эффективности ПЦР по заявленному способу и по способу, взятому за прототип
11
1
3
Для определения чувствительности метода по заявленному способу в сравнении с прототипом суточную культуру контрольного штамма Pasteurella multocida «W13Ф», выращенную на мясопептонном агаре с добавлением 5% дефибрированной крови барана, переносят в бактериологическую пробирку, содержащую 1000 мкл стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора, разводят до концентрации 10 КОЕ/мл, титруют методом 10-кратных разведении до разведения 10 КОЕ/мл, каждое разведение подвергают исследованию в ПЦР. Чувствительность разработанной ПЦР составляет 10 КОЕ/мл.
Результаты опытов по сравнению чувствительности реакции представлены в таблице 1.
Таблица 1
Концентрация Pasteurella multocida серогруппы А в пробе, КОЕ/мл
Результаты ПЦР по заявленному способу
Результаты ПЦР по способу, взятому за прототип
10<sup>7</sup>
+
+
10<sup>6</sup>
+
+
10<sup>5</sup>
+
+
10<sup>4</sup>
+
+
10<sup>3</sup>
+
-
10<sup>2</sup>
-
-
Результаты опытов по сравнению специфичности реакции представлены в таблице 2.
Таблица 2
Бактерии
Результаты ПЦР по заявленному способу
Результаты ПЦР по способу, взятому за прототип
Pasteurella multocida серогруппа А (штамм «W130»)
+
+
Pasteurella multocida серогруппа D (штамм Т80)
-
-
Pasteurella multocida серогруппа В (штамм 681)
-
-
Salmonella typhimurium
-
-
E. coli
-
-
Примечание: «+» - положительный результат;
«-» - отрицательный результат.
Результаты опытов по сравнению эффективности реакции при исследовании патологического материала, полученного от больных телят, и культур бактерий, выделенных на искусственных питательных средах из органов телят, представлены в таблице 3.
Таблица 3
№ п/п
Исследованные пробы
Количество
Количество положительных  проб по заявленному способу / % от исследованных
Количество положительных проб по способу, взятому за прототип / % от исследованных
1
Легкое
30
30/100
25/83
2
Бронхиальные лимфатические узлы
30
30/100
20/67
3
Средостенные лимфатические узлы
30
30/100
22/73
4
Культура бактерий, выделенная из органов телят
30/100
30/100
30/100
3
4
Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью (10 КОЕ/мл), специфичностью и эффективностью при выявлении участка гена hyaD бактерии Pasteurella multocida серогруппы А в пробах патологического материала, полученного от больных телят, культурах бактерий, выделенных на искусственных питательных средах. Способ, принятый за прототип, обладает более низкой чувствительностью (10 КОЕ/мл) и на 17-33% менее эффективен при исследовании проб легких, бронхиальных и средостенных лимфоузлов от больных животных.
Пример 4. Сравнение эффективности типирования Pasteurella multocida серогруппы А по заявленному способу и по способу, взятому за аналог
Преимущества разработанного способа представлены в таблицах 4 и 5.
Таблица 4
Штаммы и изоляты Pasteurella multocida
Результаты типирования Pasteurella multocida серогруппы А по заявленному способу
Результаты типирования Pasteurella multocida серогруппы А по способу, взятому за аналог
Штамм W130 (серогруппа А)
+
+
Штамм Т80 (серогруппа В)
-
-
Штамм 681 (серогруппа D)
-
-
Изолят Б37
+
+
Изолят АГМ
+
+
Изолят СР
+
+
Изолят Эвика/2012
+
-
Изолят Ир
+
-
Примечание: «+» - положительный результат;
«-» - отрицательный результат.
Таблица 5
Вирус (штамм, изолят)
Типирование Pasteurella multocida серогруппы А по заявленному способу
Типирование Pasteurella multocida серогруппы А по способу, взятому за аналог
Время исследования одной пробы биоматериала
4 часа
10 суток
Себестоимость исследования одной пробы (руб.):
Трудозатраты (чел.).
2
3
Оплата труда сотрудников
500
2750
Стоимость реактивов и питательных сред
60
120
Прочие расходы
200
500
Необходимость получения чистой культуры
Необязательно
Обязательно
Таким образом, заявляемый способ обеспечивают достижение цели изобретения: выявляется участок гена hyaD, отвечающего за синтез гиалуронсинтетазы Pasteurella multocida, непосредственно в пробах легких, бронхиальных и средостенных лимфоузлов и культурах бактерий. Он позволяет сократить сроки проведения исследований до четырех часов, снизить себестоимость диагностики в 4,5 раза, трудозатраты в 1,5 раза, исключить необходимость выделения чистой культуры.