Макулярная дегенерация сетчатки в эксперименте

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯ

УДК 617.736

© М.М. Бикбов, Р.Р. Файзрахманов, А.Л. Ярмухаметова, Р.М. Бикбулатов, 2012

М.М. Бикбов, Р.Р. Файзрахманов, А.Л. Ярмухаметова, Р.М. Бикбулатов МАКУЛЯРНАЯ ДЕГЕНЕРАЦИЯ СЕТЧАТКИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней АНРБ», г. Уфа

Изучена репаративная активность пигментного эпителия сетчатки кроликов на фоне применения пептидных биорегуляторов (ретиналамин, кортексин). Установлено, что применение пептидных регуляторов в послеоперационном периоде способствует ускорению репаративной регенерации пигментного эпителия за счет миграции уплощенных пигментных клеток в очаг повреждения, внутриклеточного накопления гранул меланина, восстановления формы клеток и уменьшения воспалительной реакции собственно сосудистой оболочки.

Ключевые слова: пигментный эпителий сетчатки, пептидные биорегуляторы, ретиналамин, кортексин.

М.М. Bikbov, R.R. Faizrakhmanov, A.L. Yarmukhametova, R.M. Bikbulatov RETINAL MACULAR DEGENERATION IN EXPERIMENTAL STUDY

The purpose of the study was to research the reparative activity of retinal pigment epithelium in rabbits as mediated by peptide bioregulators (retinalamin, kortexin) in rabbits. Peptide bioregulators have been determined to contribute to the reparative regeneration of pigment epithelium in the postoperative period due to migration of pigment cells to the lesion, intracellular accumulation of melanin granules, and a decrease in inflammation level of the vascular membrane.

Key words: retinal pigment epithelium, peptide bioregulators, retinalamin, kortexin.

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является основной причиной потери центрального зрения у лиц старше 55 лет в экономически развитых странах [8,9]. Тяжесть заболевания обусловлена центральной локализацией процесса, двусторонним характером поражения и хроническим прогрессирующим течением [1]. В России, по разным данным, ВМД подвержены от 14 до 46% населения в возрасте старше 65 лет [2]. В основе патологического процесса лежит повреждение пигментного эпителия сетчатки.

В связи с этим является актуальным вопрос поиска препаратов, обладающих способностью стимулировать репаративные процессы в сетчатке. Установлено, что такими свойствами обладают биорегуляторные пептиды (ретиналамин, кортексин). Данные препараты представляют собой комплекс пептидов с молекулярной массой 1000- 10000 Да, выделенных из коры головного мозга телят и свиней. Низкая молекулярная масса препаратов позволяет свободно проникать через гематоэнце-фалический и гематоофтальмический барьеры

[3].

Установлено, что ретиналамин при экспериментальном лазерном и токсическом повреждении сетчатки, вызванном действием монойодуксусной кислоты, по данным офтальмоскопии в 2,2 - 2,5 раза ускоряет покрытие дефекта сетчатки клетками пигментного эпителия, по данным электроретинографии

уменьшает дальнейшее развитие патологического процесса и степень угнетения функционального состояния сетчатки [4]. При добавлении препарата ретиналамин к первичной культуре клеток пигментного эпителия и сетчатки выявлена митогенная активность этих клеток [5]. Также выявлено, что пептидные биорегуляторы способны воздействовать как на дифференцированные клетки взрослого организма, запуская их пролиферацию и поддерживая при этом тканевую специфичность, так и на полипотентные эмбриональные клетки, индуцируя тканеспецифичную дифферен-цировку [6,7]. Однако до сих пор гистологически не установлен характер репаративной активности пигментного эпителия сетчатки in vivo на фоне применения биорегуляторных пептидов.

Цель работы. Изучить характер репара-тивной активности пигментного эпителия сетчатки кроликов на фоне сочетанного применения пептидных биорегуляторов ретина-ламина и кортексина в эксперименте.

Материал и методы

Экспериментальный раздел исследования проводился в условиях вивария У фимско-го НИИ глазных болезней.

Эксперимент был произведен на 9 половозрелых кроликах мужского пола породы шиншилла. Масса животных составляла 27003200 г. Кролики были разделены на 2 группы: 3 кролика (6 глаз) составили группу контроля,

S4

кроликам этой группы выполнялось хирургическое вмешательство без проведения дальнейшего лечения, 6 кроликов (12 глаз) составили опытную группу, в которой животным после операции проводились лечебные мероприятия препаратами ретиналамин и кортек-син. Хирургическое вмешательство проводилось в стерильных условиях под операционным микроскопом. Операцию выполняли по стандартной методике под местной анестезией и общим наркозом. Животных вводили в наркоз путем внутримышечной инъекции 100 мг/кг раствора «Золетил 100» (Франция).

Выполнялся прокол иглой 20 G в 4 мм от лимба через плоскую часть цилиарного тела (рис. 1), проводился массаж центральной области сетчатки иглой с силиконовым наконечником 20 G до дисперсии пигментного эпителия. Размер повреждения составил 1 диаметр диска зрительного нерва (ДЗН) (рис.2).

Ph^ i. Прокол иглой 2GG в 4 мм от лимба

Pto. 2. Дисперсия пигментного эпителия макулярной области

Каких-либо изменений преломляющих сред глаз экспериментальных животных до операции выявлено не было. Все операции прошли без осложнений.

После хирургического вмешательства всем кроликам под конъюнктиву вводили раствор гентамицина и дексаметазона (3 мг/кг и 0,2 мг/кг массы тела соответственно). В по-

следующие 7 дней в конъюнктивальную полость закапывали раствор левомицетина 0,25% 4р/д и дексаметазона 0,1% по убывающей схеме: 4р/д - 3 дня, 3р/д - 2 дня, 2р/д - 1 день, 1р/д - 1 день. На следующий день после операции в опытной группе проводилось лечение препаратами ретиналамин и кортексин. Ретиналамин вводился парабульбарно, кортексин - внутримышечно. Дозировка препаратов рассчитывалась соответственно весу кролика: ретиналамин - 0,25 мг/кг веса, кортексин - 0,5 мг/кг веса. Курс лечения составил 10 дней. В контрольной группе животным осуществлялось парабульбарное и внутримышечное введение физиологического раствора в течение 10 дней. Для гистологической оценки характера репаративной регенерации пигментного эпителия сетчатки кролики выводились из эксперимента на 15-, 30-, 90-е сутки после проведенного вмешательства. Животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения кролика в наркоз (согласно приказу Минвуза СССР №724 от 13.11.1984).

Для исследования с помощью световой микроскопии глаза энуклиировали и фиксировали в забуференном по Лилли 10% растворе формалина, затем рассекали во фронтальной плоскости. Выделяли центральную область сетчатки размером 5 х 5 мм и фиксировали в 10% растворе формалина в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Препараты промывались в течение 30 минут и обезвоживались в спиртах восходящей концентрации до 96,6° в течение 12 часов, уплотнялись в хлороформе 30 минут и растворе хлороформа с парафином в соотношении 50:50 в течение часа. Окраску гистологических срезов осуществляли гематоксилином и эозином. Светооптическое исследование проводили с использованием микроскопа «Axio-Star» фирмы Carl Zeiss (Германия), используя увеличение 10х40.

Результаты и обсуждение

В норме центральная область сетчатки глаз кролика не имеет фовеа и макулы. Офтальмоскопически визуализируется разреженная сетчатка, сосудистые аркады уходят на периферию и при офтальмоскопии центральной области не визуализируются. Диск зрительного нерва представлен миелиновыми волокнами. Сетчатка кролика состоит из 10 четко дифференцированных слоев. Пигментные клетки призматической формы тесно связаны с базальной мембраной, фоторецепторами, плотно контактируют между собой. Внутриклеточный меланин имеет крупногрануляр-

ную структуру.

Через день после травмы на гистологических срезах препаратов визуализируется дефект пигментного эпителия, вогнутость наружного ядерного слоя и наружной пограничной мембраны. Клетки пигментного эпителия находятся в различной степени дегрануляции, часть клеток содержит единичные гранулы меланина. По краям дефекта видны свободные гранулы пигмента. Сами клетки сильно уплощены. Наблюдается полнокровие хориокапилляров, прилежащих к базальной мембране (рис. 3).

Рис. 3. Полнокровие хориокапилярного слоя сетчатки глаз кроликов. Окраска гематоксилином и эозином.

Увеличение 10x40

На 15-е сутки эксперимента у животных обеих групп в зоне произведенного вмешательства пигментный слой сетчатки истончен, пигментные клетки сильно уплощены. В контрольной группе животных деструктивно измененная зона пигментного эпителия сохраняется, клетки пигментного эпителия дегра-нулированы. В зоне отсутствия пигментного эпителия базальная мембрана утолщена и кровеносные капилляры, прилегающие к базальной пластинке, характеризуются полнокровием или даже гиперемией. Тогда как в опытной группе животных линия пигментного эпителия прослеживается более четко, дефекты слоя пигментного эпителия закрыты. Пигментные клетки тесно прилежат к базальной мембране, а также образуют плотные контакты между собой. В цитоплазме клеток выявлено восстановление гранул меланина, что может быть признаком неполной дегрануляции клеток вследствие цитопротекторного действия препаратов или начавшегося синтеза меланина.

У экспериментальных животных через 30 дней после хирургического вмешательства пигментные клетки, расположенные на ба-

зальной мембране, плотно прилежат друг к другу. Все клетки тесно связаны с базальной мембраной. В контрольной группе отмечаются уплощенные клетки пигментного эпителия с небольшим количеством меланина в цитоплазме. В опытной группе многие клетки имеют кубическую форму, цитоплазма клеток содержит гранулы меланина различной интенсивности. У одних клеток гранулы пылевидной формы, тогда как у рядом расположенных клеток с большим количеством меланина в цитоплазме он имеет крупногранулярную структуру. Таким образом, на 30-е сутки опыта при лечении животных отмечается постепенное восстановление пигментного эпителия сетчатой оболочки глазного яблока, которое происходит за счет смещения клеток из области окружающей зону травмы.

Через три месяца после проведенного эксперимента пигментный эпителий сетчатой оболочки равномерно распределен в зоне травмы. В контрольной группе клетки имеют кубическую форму, некоторые клетки содержат малое количество меланина. В опытной группе клетки имеют призматическую форму, плотно контактируют между собой. Меланин имеет крупногранулярную структуру и располагается равномерно в цитоплазме клетки (рис. 4).

Рис. 4. Равномерное распределение меланина в пигментном эпителии сетчатки кроликов. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 10x40

Выводы

В эксперименте пептидные биорегуляторы способствуют ускорению репаративной регенерации пигментного эпителия за счет миграции уплощенных клеток пигментного эпителия в очаг повреждения, накопления гранул меланина и уменьшения воспалительной реакции собственно сосудистой оболочки.

Сведения об авторах статьи:

Бикбов Мухаррам Мухтарамович. - д.м.н., профессор, директор ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней АН PБ», г. Уфа. Адрес: 45GG77, Poссия, Peспyбликa Башкортостан, г. Уфа, ул. Пушкина, 9G. Телефон 8(347) 2723775.

Файзрахманов Ринат Рустамович - к.м.н., с.н.с., зав. отделением витреоретинальной и лазерной хирургии ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней АН PБ», г. Уфа. Адрес: 45GG77, г.Уфа, ул. Пушкина, 9G. E-mail: Rinatrf@gmail.com

Ярмухаметова Алия Линаровна - м.н.с. отделения витреоретинальной и лазерной хирургии ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней АН РБ», г. Уфа. Адрес: 450077, г.Уфа, ул. Пушкина, 90. E-mail: Vitreoretinal@yandex.ru

Бикбулатов Рустэм Маратович - офтальмолог IV микрохирургического отделения ГБУ «Уфимский НИИ глазных болезней АН РБ», г. Уфа. Адрес: 450077, г.Уфа, ул. Пушкина, 90. Телефон 8(347) 555717. E-mail: Vitreoretinal@yandex.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Либман, Е.С. Эпидемиологические характеристики инвалидности вследствие основных форм макулопатий / Е.С. Либман, Р.А. Толмачев, Е.В. Шахова // Тезисы докл. II. Всерос. семинара - Макула, 2006. - Ростов- на-Дону, 2006. - С.15-21.

2. Лысенко В.С. Макулярная дегенерация, связанная с возрастом / В.С. Лысенко [и др.] // Наследственные и врожденные заболевания сетчатки и зрительного нерва/ под ред. А.М. Шамшиновой. - М.: Медицина, 2001. - С. 229-256.

3. Справочник ВИДАЛЬ. Лекарственные препараты в России. - М.: АстраФармСервис, 2011. - 1728 с.

4. Хавинсон, В.Н. Индукционная активность пептидов сетчатки / В.Н. Хавинсон, В.В. Малинин, С.В. Трофимова, В.Н. Земчихина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2002. - Т.134, № 11. - С.560-563.

5. Шабалов Н.П. Кортексин в нейропедиатрии: методические рекомендации / Н.П. Шабалов, Т.Н. Платонова, А.П. Скоромец. -СПб., 2006. - 64 с.

6. Шмаков, А.Н. Критические состояния новорожденных (технология дистанционного консультирования и эвакуации) / А.Н. Шмаков, В.Н. Кохно. - Новосибирск, 2007. - 168 с.

7. Friedman D.S. The Eye Diseases Prevalence Research Group. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States / D.S. Friedman, G.O'Colman, B. Munoz, S.C.Tomany, C. McCarty, P.T. de Jong // Arch. Ophthalmol. - 2004. -Vol. 122, N° 4. - P. 564-572.

8. Klein R. Age-related maculopathy in a multiracial United States population / R. Klein, B.E. Klein, S.C. Jenson // the National Health and Nutrition Examination Survey III. Ophthalmology. - 1999. - Vol. 106. -P. 1056-1065.

УДК 615.014.425: [637.143.6:636.1]

© А.Г.Валиев, 2012

А.Г. Валиев

ПУТИ ПОВЫШЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУХОГО КОБЫЛЬЕГО МОЛОКА

ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Уфа

Цель работы: сравнение антиокислительной активности сухого кобыльего молока, высушенного с добавлением антиоксидантов (кверцетина или бисалкофена), с последующим хранением в течение 6-ти месяцев. Исследование проводили поквартально. Для суждения о пероксидации липидов (ПОЛ) и антиокислительной активности наряду с определением общей окисленности липидов был использован хемилюминесцентный анализ. При хранении сухого кобыльего молока происходит активация ПОЛ, что является следствием снижения антиокислительной активности сухого молока. Повышение ПОЛ приводило к порче продукта при его хранении более 3-х месяцев. Внесение перед сушкой кверцетина (витамина Р) достоверно снижало скорость развития ПОЛ. Добавление бисалкофена - димера ионола - более эффективно ингибировало ПОЛ молока. Полученные результаты позволяют заключить, что под влиянием кверцетина и бисалкофена повышается ан-тиокислительная активность продукта, при которой увеличивается срок хранения сухого кобыльего молока сублимационной сушки при комнатной температуре с 3-х до 6-ти месяцев.

Ключевые слова: антиоксиданты, кверцетин, бисалкофен, пероксидация липидов, кобылье молоко.

A.G. Valiyev

METHODS OF DRIED MARE’S MILK ANTIOXIDANT ACTIVITY ENHANCEMENT

The aim of the research: to assess the antioxidant activity of dried mare’s milk, desiccated with an antioxidant (quercetin or bisalkofen) and further stored within 6 months. The research was conducted quarterly. A chemiluminescence analysis was conducted for lipid peroxidation (LPO) and antioxidant activity evaluation, along with determination of total lipid oxidation. LPO activation in the powdered mare’s milk was observed as a storage factor which is consequent to a decrease in its antioxidant activity. An increase in the lipid peroxidation resulted in the product spoiling with the storage period exceeding three months. Introduction of quercetin (vitamin P) before the drying process significantly inhibited LPO development rate. Introduction of bisalkofen - a dimeric ionol - more effectively inhibited LPO of the milk. Based on the obtained results, we may conclude that application of quercetin and bisalkofen increases the product antioxidant activity and enables to extend the expiry date of powdered mare’s milk at 18-200C for 3-6 months.

Key words: antioxidants, quercetin, bisalkofen, lipid peroxidation, mare's milk.

Оптимальный рост и развитие ребёнка, лергенными свойствами [5]. а также высокая устойчивость его организма к Кобылье молоко по своему составу и

действию неблагоприятных факторов внеш- свойствам стоит ближе к женскому. Оно луч-

ней среды обеспечиваются благодаря грудно- ше соответствует физиологическим потребному вскармливанию. Женское молоко является стям ребёнка и является гипоаллергенным.

уникальным по своему составу. Часто в силу Жирно-кислотный состав липидов кобыльего

сложившихся обстоятельств приходится кор- молока, аналогичный женскому, характеризу-

мить детей заменителями - адаптированными ется большой долей высших полиненасыщен-

молочными смесями. Недостатком последних ных жирных кислот (ПНЖК) семейств ю-3 и

является то, что они обычно готовятся на ос- ю-6 [2]. Представители обоих семейств нена-

нове коровьего молока, которое обладает ал- сыщенных жирных кислот играют важную