Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к филовирусам: Ebolavirus и/или Marburgvirus, способ использования иммунобиологического средства
IMMUNOBIOLOGICAL AGENT FOR INDUCTION OF IMMUNE RESPONSE TO FILOVIRUSES: EBOLAVIRUS AND/OR MARBURGVIRUS, METHOD OF USING IMMUNOBIOLOGICAL AGENT

Область техники
Изобретение относится к иммунологии и вирусологии и может быть использовано для создания специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных вирусом Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Marburg virus (MARV).
Предшествующий уровень техники
Filoviridae – это семейство РНК-содержащих вирусов, которое по современной классификации включает 6 родов: Cuevavirus, Dianlovirus, Ebolavirus, Marburgvirus, Striavirus, Thamnovirus (https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/negative-sense-rna-viruses/mononegavirales/w/filoviridae). Из них патогенными для человека считаются 2 рода: Marburgvirus и Ebolavirus.
Род Marburgvirus включает два вида: Marburg virus (MARV) и Ravn virus (RAVV). Впервые Marburg virus был выделен в 1967 году, во время вспышки геморрагической лихорадки у работников завода по производству вакцины от полиомиелита, которые контактировали с тканями гриветов. Вспышки были зафиксированы в трех городах: г.Марбурге, г.Франкфурте и г.Белграде. В общей сложности заразился 31 человек, 7 из которых погибли. Впоследствии вспышки болезни и отдельные случаи заболевания регистрировались в Анголе, Демократической Республике Конго, Кении, Уганде и Южной Африке. Ravn virus был впервые описан в 1987 году и назван в честь датского пациента, от которого он был выделен. Оба вида Marburgvirus вызывают марбургскую геморрагическую лихорадку, которая является тяжелым заболеванием с высокой смертностью, которая в некоторых вспышках доходила до 90%. Начальные симптомы заболевания включают высокую температуру, головную боль, озноб, тошноту, рвоту, диарею, фарингит, макулопапулезную сыпь, боль в животе, конъюнктивит. В дальнейшем развивается одышка, отек, инъекция конъюнктивы, вирусная экзантема и нарастают неврологические симптомы: спутанность сознания, делирий, апатию, агрессию, энцефалит. Геморрагические симптомы появляются в конечной стадии заболевания и включают кровавый стул, экхимозы, подтекание крови из мест венепункции, слизистые и висцеральные кровотечения. Гибель больных может наступить от отека легких или мозга, гиповолемического шока, ДВС-синдрома, острой почечной недостаточности. С момента начала наблюдения было зафиксировано 466 случаев заболевания, погибло 373 человека. (https://www.cdc.gov/vhf/marburg/outbreaks/chronology.html)
Род Ebolavirus включает 6 видов: Ebola virus (EBOV), Reston virus (RESTV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Taï Forest virus (TAFV), Bombali virus (BOMV). Три из них являются высокопатогенными для человека (Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus) и вызывают геморрагическую лихорадку Эбола. Это тяжелое заболевание, с острой манифестацией, без продромальных явлений. Первые симптомы включают лихорадку, головную боль, катаральные явления, миалгии. Позднее появляется неукротимая рвота, диарея, боли в животе, могут наблюдаться колющие боли в области грудной клетки, развивается обезвоживание организма, у 50% заболевших появляется геморрагическая сыпь, геморрагии в виде кожных кровоизлияний, наружных и внутренних кровотечений. С момента начала наблюдения было зафиксировано более 31 тысячи случаев заболевания, погибло более 12 тысяч человек. Самая крупная эпидемия была связанна с вирусом EBOV и произошла в 2014-2016 гг. Она затронула 5 стран Западной и Центральной Африки и унесла жизни более одиннадцати тысяч человек. SUDV стал причиной нескольких вспышек в Уганде и Южном Судане (412 погибших). BDBV, обнаруженный в 2007 году, был связан с двумя вспышками: в Демократической Республике Конго и в Уганде, и унес жизни 50 человек (https://www.cdc.gov/vhf/ebola/history/distribution-map.html).
Марбургская геморрагическая лихорадка и геморрагическая лихорадка Эбола – это зоонозные инфекции. В настоящее время считается, что естественным резервуаром филовирусов являются рукокрылые (Rousettus aegyptiacus, Mops condylurus, Chaerephon pumilus и др.), которые широко распространены в природе. Развитие сельского хозяйства приводит к тому, что человек все теснее контактирует с дикой природой, а, следовательно, в будущем можно ожидать новых эпидемий связанных с филовирусами.
В настоящее время нет разрешенных к применению профилактических препаратов против марбургской геморрагической лихорадки и ограниченное число вакцин против геморрагической лихорадки Эбола.
Известно решение согласно патенту WO 2011130627 А2, в котором для индукции иммунного ответа к филовирусам (вирус Эбола, вирус Марбург) предполагается использование аденовирусов шимпанзе, которые содержат гены различных белков данных вирусов, в том числе белок GP вируса Эбола.
Существует решение по патенту СА 2821289 А1, согласно которому для индукции иммунного ответа против филовирусов используют рекомбинантный аденовирусный вектор на основе аденовирусов 26 и 35 серотипа, которые экспрессируют антигены филовирусов.
Известно решение согласно патенту US 20100047282 А1, где в качестве вакцины против геморрагической лихорадки Эбола используют рекомбинантный аденовирус, содержащий ген гликопротеина вируса Эбола (GP).
Известно решение согласно патенту СА 2493142 С, в котором для стимуляции иммунного ответа к вирусу Эбола используют рекомбинантный вирус везикулярного стоматита (VSV), содержащий ген гликопротеина, выбранный из группы, состоящей из гликопротеина вируса лихорадки Ласса, гликопротеина вируса Марбург и гликопротеина вируса Эбола, вставленный в вирусный геном так, что данная последовательность заменила исходный ген гликопротеина VSV. Недостатком данного решения является то, что при повторной вакцинации антитела к векторной части могут снижать эффективность вакцинации.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке нового иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против филовирусов на основе различных типов рекомбинантных вирусов.
Раскрытие изобретения
Технической задачей заявленного изобретения является расширение арсенала иммунобиологических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против филовирусов: рода Ebolavirus: Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), и/или филовирусов рода Marburgvirus: Marburg virus (MARV).
Технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа, содержащего экспрессионную кассету SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, или SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8.
Кроме того, технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, или SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8.
А также, технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего нуклеиновую кислоту, соответствующую кДНК SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12, или SEQ ID NO:13, или SEQ ID NO:14, или SEQ ID NO:15, или SEQ ID NO:16.
Кроме того, был разработан способ использования иммунобиологического средства, заключающийся в его введении в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета против вируса Эбола и/или вируса Марбург.
Также был разработан способ использования, который предусматривает последовательное введение в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств с интервалом более чем в 1 неделю.
Другой вариант использования предусматривает одновременное введение в организм млекопитающих нескольких иммунобиологических средств.
При этом разработанные варианты иммунобиологического средства могут вводиться интраназально и/или подкожно и/или внутримышечно.
Также был разработан вариант способа использования, заключающийся во введении в организм млекопитающих композиции, содержащей любое количество иммунобиологических средств. При этом композиция может вводиться многократно с интервалом более 1 недели.
Реализация изобретения
Гликопротеин (GP) – единственный белок, расположенный на поверхности вириона филовирусов. Он необходим для прикрепления вирусной частицы к клетке и последующей интернализации. Было показано, что GP является мишенью для вируснейтрализующих антител, а титры антител к GP коррелируют с защитой от заболевания. Все это делает его одним из самых перспективных вакцинных антигенов.
Гликопротеин филовируса (GP) синтезируется в виде предшественника GP0, который расщепляется фурином на GP1 и GP2. GP1 содержит рецептор-связывающий домен, гликановый кэп и сильно гликозилированный муцинподобный домен. GP2 включает трансмембранный домен, гибридный пептид и гептадные повторы, необходимые для слияния вируса с клеточной мембраной. GP1 и GP2 соединяются дисульфидной связью и образуют гетеродимер. Затем гетеродимеры GP1/GP2 собираются в тример, образующий шипы на поверхности вириона.
При этом муцинподобный домен характеризуется высокой вариабельностью. Для того, чтобы в результате вакцинации получить антитела к более консервативным эпитопам, из гена гликопротеина филовирусов удалили последовательность, кодирующую муцинподобный домен (GPΔmuc).
На основе генов GP филовирусов (Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Marburg virus (MARV)) и их модификаций было предложено несколько вариантов экспрессионных кассет для аденовирусных векторов:
1) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1, которая содержит:
-  CMV промотор,
- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
2) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2, которая содержит:
-  CMV промотор,
- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
3) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3, которая содержит:
-  CMV промотор,
- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
4) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4, которая содержит:
-  CMV промотор,
- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
5) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:5, которая содержит:
-  CMV промотор,
- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
6) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:6, которая содержит:
-  CMV промотор,
- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
7) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:7, которая содержит:
-  CMV промотор,
- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
8) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:8, которая содержит:
-  CMV промотор,
- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
Кроме того, было предложено несколько вариантов дискретных транскрипционных единиц для рекомбинантного вируса везикулярного стоматита:
1) Транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:9), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
2) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:10), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
3) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:11), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
4) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:12), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
5) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:13), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
6) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:14), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
7) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:15), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
8) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:16), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
В качестве экспрессионных векторов были выбраны рекомбинантные аденовирусы человека 5-го и 26-го серотипов и вектор на основе вируса везикулярного стоматита, которые способны индуцировать устойчивый Т-клеточный и гуморальный ответ, а также показывают высокие профили безопасности.
Таким образом были разработаны варианты иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к филовирусам, который обеспечивают индукцию иммунного ответа к эпидемиологически значимым видам филовирусов.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1.
Разработка дизайна экспрессионных кассет.
На первом этапе работы производили выбор последовательности гена GP для каждого филовируса (Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus, Marburg virus) отдельно. Для анализа использовали последовательности, опубликованные в открытых базах данных. На основании нуклеотидной последовательности получали аминокислотную последовательность. Далее подсчитывали вариабельность аминокислот в каждой позиции и определяли консенсусную (консервативную) аминокислотную последовательность, которую затем сравнивали с полными последовательностями GP данного филовируса. По результатам проведенного исследования было определено, что самая близкая к консенсусной аминокислотная последовательность для Ebola virus (EBOV) -  ID AIG 95977, для Bundibugyo virus (BDBV) - ID AGL73460, для Sudan virus (SUDV) - ID AGB56678, для Marburg virus (MARV) - ID AFV31307. Далее из аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность GP-EBOV, GP-BDBV, GP-SUDV, GP-MARV. Затем были разработаны модификации гена GP с удаленной последовательностью, кодирующей муцинподобный домен: GPΔmuc-EBOV, GPΔmuc-BDBV, GPΔmuc-SUDV, GPΔmuc-MARV.
Таким образом был разработан дизайн экспрессионных кассет для аденовирусных рекомбинантных векторов:
1) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1, которая содержит:
-  CMV промотор,
- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
2) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2, которая содержит:
-  CMV промотор,
- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
3) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3, которая содержит:
-  CMV промотор,
- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
4) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4, которая содержит:
-  CMV промотор,
- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
5) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:5, которая содержит:
-  CMV промотор,
- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
6) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:6, которая содержит:
-  CMV промотор,
- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
7) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:7, которая содержит:
-  CMV промотор,
- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
8) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:8, которая содержит:
-  CMV промотор,
- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,
- сигнал полиаденилирования вируса SV40.
Кроме того, было предложено несколько вариантов дискретных транскрипционных единиц для рекомбинантного вируса везикулярного стоматита:
1) Транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:9), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
2) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:10), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
3) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:11), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
4) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:12), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
5) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:13), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
6) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:14), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
7) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:15), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
8) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:16), которая содержит:
-  сайт инициации транскрипции,
- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,
- сигнал для терминации и полиаденилирования.
Синтез генов осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Пример 2.
Способ получения иммунобиологического средства на основе аденовируса человека 26 серотипа.
На первом этапе с помощью методов генной инженерии были получены плазмиды pAd26-Ends-GP-EBOV, pAd26-Ends-GPΔmuc-EBOV, pAd26-Ends-GP-BDBV, pAd26-Ends-GPΔmuc-BDBV, pAd26-Ends-GP-SUDV, pAd26-Ends-GPΔmuc-SUDV, pAd26-Ends-GP-MARV, pAd26-Ends-GPΔmuc-MARV, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. После этого, полученные конструкции линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too, который содержит геном аденовируса человека 26-го серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа (на месте ORF6 аденовируса человека 26 серотипа) и с делецией E1 и Е3-областей. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-too-GP-EBOV, pAd26-too-GPΔmuc-EBOV, pAd26-too-GP-BDBV, pAd26-too-GPΔmuc- BDBV, pAd26-too-GP-SUDV, pAd26-too-GPΔmuc-SUDV, pAd26-too-GP-MARV, pAd26-too-GPΔmuc-MARV, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа (на месте ORF6 аденовируса человека 26 серотипа) и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно.
Далее, полученные плазмиды гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 26 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO:1 (Ad26-GP-EBOV), или SEQ ID NO:2 (Ad26-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:3 (Ad26-GP-BDBV), или SEQ ID NO:4 (Ad26-GPΔmuc-BDBV), или SEQ ID NO:5 (Ad26-GP-SUDV), или SEQ ID NO:6 (Ad26-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:7 (Ad26-GP-MARV), или SEQ ID NO:8 (Ad26-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис (0,1831-0,3432масс. %), хлорид натрия (0,3313-0,6212 масс. %), сахароза (3,7821-7,0915 масс. %), магния хлорида гексагидрат (0,0154-0,0289 масс. %),  ЭДТА (0,0029-0,0054 масс. %), полисорбат-80 (0,0378-0,0709 масс. %), этанол 95% (0,0004-0,0007 масс. %), вода остальное.
Пример 3.
Способ получения иммунобиологического средства на основе аденовируса человека 5 серотипа.
На первом этапе, с помощью методов генной инженерии были получены плазмиды pAd5-Ends-GP-EBOV, pAd5-Ends-GPΔmuc-EBOV, pAd5-Ends-GP-BDBV, pAd5-Ends-GPΔmuc-BDBV, pAd5-Ends-GP-SUDV, pAd5-Ends-GPΔmuc-SUDV, pAd5-Ends-GP-MARV, pAd5-Ends-GPΔmuc-MARV, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа.
Далее полученные конструкции лианеризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологи, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too, который содержит геном аденовируса человека 5-го серотипа с делецией E1 и Е3 областей генома. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-GP-EBOV, pAd5-too-GPΔmuc-EBOV, pAd5-too-GP-BDBV, pAd5-too-GPΔmuc-BDBV, pAd5-too-GP-SUDV, pAd5-too-GPΔmuc-SUDV, pAd5-too-GP-MARV, pAd5-too-GPΔmuc-MARV, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с делецей Е1 и Е3 областей и экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно.
На четвертом этапе, данные плазмиды гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. Полученный материал был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 2 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO:1 (Ad5-GP-EBOV), или SEQ ID NO:2 (Ad5-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:3 (Ad5-GP-BDBV), или SEQ ID NO:4 (Ad5-GPΔmuc-BDBV),  или SEQ ID NO:5 (Ad5-GP-SUDV), или SEQ ID NO:6 (Ad5-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:7 (Ad5-GP-MARV), или SEQ ID NO:8 (Ad5-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис (0,1831-0,3432масс. %), хлорид натрия (0,3313-0,6212 масс. %), сахароза (3,7821-7,0915 масс. %), магния хлорида гексагидрат (0,0154-0,0289 масс. %),  ЭДТА (0,0029-0,0054 масс. %), полисорбат-80 (0,0378-0,0709 масс. %), этанол 95% (0,0004-0,0007 масс. %), вода остальное.
Пример 4.
Для получения рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была использована плазмида pVSV-deltaG, представляющая собой кДНК, комплементарную геномной РНК вируса везикулярного стоматита с удаленным геном гликопротеина. Методами генной инженерии из данной плазмиды было получено 8 генетических конструкций: pVSV-deltaG-GP-EBOV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-EBOV, pVSV-deltaG-GP-SUDV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-SUDV, pVSV-deltaG-GP-BDBV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-BDBV, pVSV-deltaG-GP-MARV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-MARV,  содержащие SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, соответственно.
Для получения препаратов рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была проведена трансфекция клеток BHK21 плазмидами, несущими: ен ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7; гены - N (нуклеокапсид), Р (фосфопротеин), L (большая субъединица полимеразы) белков VSV; и векторной плазмидой, выбранной из pVSV-deltaG-GP-EBOV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-EBOV, pVSV-deltaG-GP-SUDV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-SUDV, pVSV-deltaG-GP-BDBV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-BDBV, pVSV-deltaG-GP-MARV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-MARV. Трансфекцию проводили с помощью реагента Lipofectamine-2000 (Life Technologies) согласно инструкции производителя. Таким образом, было получено 8 препаратов рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.
Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 3 представляет собой рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий последовательность, соответствующую кДНК SEQ ID NO:9 (VSV-GP-EBOV), или SEQ ID NO:10 (VSV-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:11 (VSV-GP-BDBV), или SEQ ID NO:12 (VSV-GPΔmuc-BDBV), или SEQ ID NO:13 (VSV-GP-SUDV), или SEQ ID NO:14 (VSV-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:15 (VSV-GP-MARV), или SEQ ID NO:16 (VSV-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис(гидроксиметил)аминометан - 0,4-0,7 мг, ЭДТА динатриевая соль - 0,1-0,2 мг, сахароза – 30-70 мг, вода для инъекций до 0,5 мл.
Пример 5.
Проверка безопасности разработанных вариантов иммунобиологического средства.
Целью данного эксперимента являлась проверка токсичности разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при и внутримышечном введении.
В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.
8
Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 10в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.
В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы   средства:
9
10в.ч. – увеличенная эффективная доза (ЭД) для мышей в 20 раз;
10
10в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;
11
10в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;
Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:
9
1) Ad26-GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
2) Ad26-GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
3) Ad26-GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
4) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
5) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
6) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
7) Ad26-GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
8) Ad26-GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
9) Ad26-GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
10) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
11) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
12) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
13) Ad26-GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
14) Ad26-GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
15) Ad26-GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
16) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
17) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
18) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
19) Ad26-GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
20) Ad26-GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
21) Ad26-GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
22) Ad26-GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
23) Ad26-GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
24) Ad26-GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
25)  Ad5-GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
26) Ad5-GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
27) Ad5-GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
28) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
29) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
30) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
31) Ad5-GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
32) Ad5-GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
33) Ad5-GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
34) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
35) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
36) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
37) Ad5-GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
38) Ad5-GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
39) Ad5-GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
40) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
41) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
42) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
43) Ad5-GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
44) Ad5-GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
45) Ad5-GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
46) Ad5-GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
47) Ad5-GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
48) Ad5-GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
49) VSV-GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
50) VSV -GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
51) VSV -GP-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
52) VSV -GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
53) VSV -GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
54) VSV -GPΔmuc-EBOV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
55) VSV -GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
56) VSV -GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
57) VSV -GP-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
58) VSV -GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
59) VSV -GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
60) VSV -GPΔmuc-BDBV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
61) VSV -GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
62) VSV -GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
63) VSV -GP-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
64) VSV -GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
65) VSV -GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
66) VSV -GPΔmuc-SUDV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
67) VSV -GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
68) VSV -GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
69) VSV -GP-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
9
70) VSV -GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
10
71) VSV -GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
11
72) VSV -GPΔmuc-MARV,10в.ч./мышь, 20 мышей;
73) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Cтатистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Таким образом, в ходе проведенной работы определяли безопасность разработанных средств путем оценки острой токсичности. Исходя из полученных данных можно заключить, что все разработанные иммунобиологические средства безопасны.
Пример 6.
Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Ebola virus или его производные.
Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.
10
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Ebola virus или буферный раствор.
Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-GP-EBOV;
2) Ad26-GPΔmuc-EBOV;
3) Ad26-null;
4) Ad5-GP-EBOV;
5) Ad5-GPΔmuc-EBOV;
6) Ad5-null;
7) VSV-GP-EBOV;
8) VSV-GPΔmuc-EBOV;
9) VSV-null;
10)  Буферный раствор.
Оценка титра антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.
o
Для иммуноферментного анализа антиген (GP Ebola virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 С в течение ночи.
2
4
2
4
o
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г NaHPO, 0,24 г KHPO, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
o
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 1.
Таблица 1. Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 1
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV
220,8
2
Ad26-GPΔmuc-EBOV
243,8
3
Ad26-null
0
4
Ad5-GP-EBOV
7801,7
5
Ad5-GPΔmuc-EBOV
8613,8
6
Ad5-null
0
7
VSV-GP-EBOV
7066,2
8
VSV-GPΔmuc-EBOV
8613,8
9
VSV-null
0
10
Буферный раствор
0
Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Ebola virus.
Пример 7.
Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Bundibugyo virus или его производные.
Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.
10
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Bundibugyo virus или буферный раствор.
Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-GP-BDBV;
2) Ad26-GPΔmuc- BDBV;
3) Ad26-null;
4) Ad5-GP- BDBV;
5) Ad5-GPΔmuc- BDBV;
6) Ad5-null;
7) Буферный раствор.
Оценка титра антител к GP Bundibugyo virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.
o
Для иммуноферментного анализа антиген (GP Bundibugyo virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 С в течение ночи.
2
4
2
4
o
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г NaHPO, 0,24 г KHPO, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
o
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
Таблица 2. Титр антител к GP Bundibugyo virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 2
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-BDBV
220,8
2
Ad26-GPΔmuc- BDBV
441,6
3
Ad26-null
0
4
Ad5-GP- BDBV
2898,3
5
Ad5-GPΔmuc- BDBV
1076,7
6
Ad5-null
0
7
Буферный раствор
0
Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Bundibugyo virus.
Пример 8.
Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Sudan virus или его производные.
Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.
10
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Sudan virus или буферный раствор.
Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-GP-SUDV;
2) Ad26-GPΔmuc- SUDV;
3) Ad26-null;
4) Ad5-GP- SUDV;
5) Ad5-GPΔmuc- SUDV;
6) Ad5-null;
7) VSV-GP- SUDV;
8) VSV-GPΔmuc- SUDV;
9) VSV-null;
10) Буферный раствор.
Оценка титра антител к GP Sudan virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.
o
Для иммуноферментного анализа антиген (GP Sudan virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 С в течение ночи.
2
4
2
4
o
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г NaHPO, 0,24 г KHPO, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
o
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Титр антител к GP Sudan virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 3
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP- SUDV
220,8
2
Ad26-GPΔmuc- SUDV
181,1
3
Ad26-null
0
4
Ad5-GP- SUDV
34455,0
5
Ad5-GPΔmuc- SUDV
4306,9
6
Ad5-null
0
7
VSV-GP- SUDV
883,3
8
VSV-GPΔmuc- SUDV
800,0
9
VSV-null
0
10
Буферный раствор
0
Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Sudan virus.
Пример 9.
Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Marburg virus или его производные.
Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.
10
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Marburg virus или буферный раствор.
Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-GP-MARV;
2) Ad26-GPΔmuc- MARV;
3) Ad26-null;
4) Ad5-GP- MARV;
5) Ad5-GPΔmuc- MARV;
6) Ad5-null;
7) VSV-GP- MARV;
8) VSV-GPΔmuc- MARV;
9) VSV-null;
10) Буферный раствор.
Оценка титра антител к GP Marburg virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.
o
Для иммуноферментного анализа антиген (GP Marburg virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 С в течение ночи.
2
4
2
4
o
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г NaHPO, 0,24 г KHPO, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
o
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 4.
Таблица 4. Титр антител к GP Marburg virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 4
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP- MARV
243,8
2
Ad26-GPΔmuc- MARV
243,8
3
Ad26-null
0
4
Ad5-GP- MARV
975,2
5
Ad5-GPΔmuc- MARV
2377,6
6
Ad5-null
0
7
VSV-GP- MARV
656,3
8
VSV-GPΔmuc- MARV
883,3
9
VSV-null
0
10
Буферный раствор
0
Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Marburg virus.
Пример 10.
Проверка эффективности разработанных иммунобиологических средств, путем оценки их способности индуцировать вируснейтрализующие антитела к филовирусам в организме млекопитающих.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно двукратно с интервалом 21 день вводили смесь из различных вариантов иммунобиологических средств.
Были сформированы следующие группы животных:
1) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
2) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
3) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
4) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
5) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
6) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
7) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
8) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
9) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
10) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;
11) VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
12) VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
13) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc –SUDV, VSV- GPΔmuc -MARV;
14)  Буферный раствор/ Буферный раствор.
Через 21 день после последней иммунизации у животных отбирали кровь и далее выделяли сыворотку крови.
5
2
Для проведения реакции вирус-нейтрализации использовали клеточную линию VeroE6 (клетки почки африканской зеленой мартышки). Клетки сеяли на 12-луночные планшеты в концентрации 5*10клеток на лунку за 24 часа до проведения реакции. Клетки инкубировали в СО-инкубаторе при t = 37ºC и 100% влажности.
2
Доза псевдотипированного вируса везикулярного стоматита бралась в расчете 100 БОЕ/лунку. Титр препарата псевдотипированного вируса везикулярного стоматита был заранее измерен в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 1 мл суспензии. С помощью 10-ти кратных разведений был приготовлен раствор псевдотипированного вируса везикулярного стоматита с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл. Вирус разводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, 10 % сахарозу. Приготовленный раствор вируса был разаликвочен и хранился при -70°С. Исследуемые инактивированные сыворотки до добавления вирусных частиц разводили в фосфатно-солевом буфере. Первое разведение составляло 1:20, общий объем в каждом разведении – 100 мкл. Далее к каждому разведению вносили одинаковое число вирусных частиц псевдотипированного вируса везикулярного стоматита в объеме 100 мкл. Для образования комплекса АГ+АТ, смесь вирусных частиц и сыворотки инкубировали при t = 37ºC  в течение 60 мин и затем вносили в объеме 200 мкл на лунку к клеткам VeroE6 в 12-луночный планшет. Каждое разведение ставилось в трехкратном повторе. В качестве контрольного вируса использовали разведения псевдотипированного вируса с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл без добавления сыворотки. Клетки инкубировали при t = 37ºC  в течение 2-3 часов. После инкубации среду с комплексом АГ+АТ удаляли из лунок, затем вносили 3 мл покрытия, содержащего 0,4 % агарозу разведенную в ростовой среде DMEM c 5% эмбриональной телячьей сыворотки, и оставляли на 48-96 часов в инкубаторе с 5% CO при t = 37ºC  и 100% влажности.
Результаты учитывали через 48-96 часов. Проводили подсчет вирусных бляшек в каждом разведении. За титр вирус-нейтрализующих антител принимали максимальное разведение сыворотки, дающее снижения вирусных бляшек более чем на 50% по сравнению с контрольным вирусом.
Результаты эксперимента представлены в таблицах 5,6,7,8.
Таблица 5. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-EBOV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 5
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
139,3
2
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV
367,6
3
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV
367,6
4
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
422,2
5
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
367,6
6
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
367,6
7
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV
422,2
8
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
640,0
9
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
640,0
10
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;
320,0
11
VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
367,6
12
VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
485,0
13
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV;
557,2
14
Буферный раствор/ Буферный раствор
0
Таблица 6. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-BDBV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 6
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
139,3
2
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV
367,6
3
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV
367,6
4
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
422,2
5
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
367,6
6
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
367,6
7
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV
422,2
8
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
640,0
9
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
640,0
10
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;
320,0
11
VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
422,2
12
VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
557,2
13
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV;
557,2
14
Буферный раствор/ Буферный раствор
0
Таблица 7. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-SUDV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 7
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
160,0
2
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV
320,0
3
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV
367,6
4
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
367,6
5
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
320,0
6
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
320,0
7
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV
422,2
8
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
557,2
9
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
640,0
10
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;
278,6
11
VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
320,0
12
VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
557,2
13
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV;
557,2
14
Буферный раствор/ Буферный раствор
0
Таблица 8. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-MARV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 8
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
139,3
2
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV
422,2
3
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV
367,6
4
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
557,2
5
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
367,6
6
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
422,2
7
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV-GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV
422,2
8
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
735,2
9
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
640,0
10
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;
485,0
11
VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
422,2
12
VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
640,0
13
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV;
640,0
14
Буферный раствор/ Буферный раствор
0
Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что иммунизация млекопитающих разработанными иммунобиологическими средствами приводит к образованию вируснейтрализующих антител к филовирусам.
Пример 11.
Способ использования иммунобиологических средств, путем введения в организм млекопитающих композиции, состоящей из разработанных средств, для индукции иммунного ответа к филовирусам.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно двукратно с интервалом 21 день вводили смесь из различных вариантов иммунобиологических средств.
Были сформированы следующие группы животных:
1) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
2) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
3) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
4) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
5) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
6) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
7) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
8) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
9) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
10) Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
11) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
12) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
13) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
14) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
15) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
16) Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/
Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
17) Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/
Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
18) Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/
VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
19) VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /
Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
20) VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /
Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
21) Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/
VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
22) Буферный раствор/ Буферный раствор.
Через 21 день после последней иммунизации у животных отбирали кровь и далее выделяли сыворотку крови.
5
2
Для проведения реакции вирус-нейтрализации использовали клеточную линию VeroE6 (клетки почки африканской зеленой мартышки). Клетки сеяли на 12-луночные планшеты в концентрации 5*10клеток на лунку за 24 часа до проведения реакции. Клетки инкубировали в СО-инкубаторе при t = 37ºC и 100% влажности.
2
Доза псевдотипированного вируса везикулярного стоматита бралась в расчете 100 БОЕ/лунку. Титр препарата псевдотипированного вируса везикулярного стоматита был заранее измерен в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 1 мл суспензии. С помощью 10-ти кратных разведений был приготовлен раствор псевдотипированного вируса везикулярного стоматита с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл. Вирус разводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, 10 % сахарозу. Приготовленный раствор вируса был разаликвочен и хранился при -70°С. Исследуемые инактивированные сыворотки до добавления вирусных частиц разводили в фосфатно-солевом буфере. Первое разведение составляло 1:20, общий объем в каждом разведении – 100 мкл. Далее к каждому разведению вносили одинаковое число вирусных частиц псевдотипированного вируса везикулярного стоматита в объеме 100 мкл. Для образования комплекса АГ+АТ, смесь вирусных частиц и сыворотки инкубировали при t = 37ºC  в течение 60 мин и затем вносили в объеме 200 мкл на лунку к клеткам VeroE6 в 12-луночный планшет. Каждое разведение ставилось в трехкратном повторе. В качестве контрольного вируса использовали разведения псевдотипированного вируса с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл без добавления сыворотки. Клетки инкубировали при t = 37ºC  в течение 2-3 часов. После инкубации среду с комплексом АГ+АТ удаляли из лунок, затем вносили 3 мл покрытия, содержащего 0,4 % агарозу разведенную в ростовой среде DMEM c 5% эмбриональной телячьей сыворотки, и оставляли на 48-96 часов в инкубаторе с 5% CO при t = 37ºC  и 100% влажности.
Результаты учитывали через 48-96 часов. Проводили подсчет вирусных бляшек в каждом разведении. За титр вирус-нейтрализующих антител принимали максимальное разведение сыворотки, дающее снижения вирусных бляшек более чем на 50% по сравнению с контрольным вирусом.
Результаты эксперимента представлены в таблицах 9, 10,11,12.
Таблица 9. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-EBOV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 9
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
121,3
2
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV
320,0
3
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV
367,6
4
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
367,6
5
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
320,0
6
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
320,0
7
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV
367,6
8
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
640,0
9
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
557,2
10
Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
278,6
11
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
278,6
12
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
320,0
13
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
320,0
14
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
557,2
15
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
557,2
16
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
367,6
17
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
278,6
18
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
320,0
19
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
320,0
20
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
557,2
21
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
485,0
22
Буферный раствор/ Буферный раствор
0
Таблица 10. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-BDBV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 10
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
52,8
2
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV
121,3
3
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV
139,3
4
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
139,3
5
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
105,6
6
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
160,0
7
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV
121,3
8
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
160,0
9
Ad5-GP-EBOV,  Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
139,3
10
Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
121,3
11
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
91,9
12
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
121,3
13
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
91,9
14
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
139,3
15
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
121,3
16
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
105,6
17
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
91,9
18
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
139,3
19
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
91,9
20
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
121,3
21
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
121,3
22
Буферный раствор/ Буферный раствор
0
Таблица 11. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-SUDV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 11
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
139,3
2
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV
367,6
3
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV
320,0
4
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
367,6
5
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
367,6
6
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
367,6
7
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV
422,2
8
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
485,0
9
Ad5-GP-EBOV,  Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
557,2
10
Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
320,0
11
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
320,0
12
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
367,6
13
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
422,2
14
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
422,2
15
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
422,2
16
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
320,0
17
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
367,6
18
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
320,0
19
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
367,6
20
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
422,2
21
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
485,0
22
Буферный раствор/ Буферный раствор
0
Таблица 12. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-MARV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 12
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
160,0
2
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV
367,6
3
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV
422,2
4
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
557,2
5
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;
367,6
6
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
422,2
7
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV
422,2
8
VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;
735,2
9
Ad5-GP-EBOV,  Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;
557,2
10
Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
485,0
11
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
278,6
12
Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
367,6
13
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;
367,6
14
VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;
640,0
15
Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;
485,0
16
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
557,2
17
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
320,0
18
Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
367,6
19
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;
367,6
20
VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;
640,0
21
Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;
367,6
22
Буферный раствор/ Буферный раствор
0
Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что иммунизация млекопитающих композицией из трех разработанных иммунобиологических средств, содержащих ген гликопротеина Ebola virus, Sudan virus, Marburg virus приводит к образованию вируснейтрализующих антител против 4 видов филовирусов: Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus, Marburg virus.
Специалисту среднего уровня очевидно, что антитела, образующиеся после введения разработанных иммунобиологических средств, могут также связываться с гликопротеином близкородственных видов филовирусов.
Пример 12.
Оценка иммуногенности разработанных иммунобиологических средств в зависимости от пути их введения в организм млекопитающих.
Целью данного эксперимента являлась оценка эффективности иммунизации млекопитающих вариантами разработанного иммунобиологического средства путем их интраназального, внутримышечного или подкожного введения. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции антител класса IgG специфичных к GP Ebola virus в сыворотке крови.
10
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно, подкожно или интраназально вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10вирусных частиц/мышь.
Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-GP-EBOV интраназально;
2) Ad26-GP-EBOV внутримышечно;
3) Ad26-GP-EBOV подкожно;
4) Ad5-GP-EBOV интраназально;
5) Ad5-GP-EBOV внутримышечно;
6) Ad5-GP-EBOV подкожно;
7) VSV-GP-EBOV интраназально;
8) VSV-GP-EBOV внутримышечно;
9) VSV-GP-EBOV подкожно;
10) Буферный раствор.
Оценка титра антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.
o
Для иммуноферментного анализа антиген (GP Ebola virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 С в течение ночи.
2
4
2
4
o
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г NaHPO, 0,24 г KHPO, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
o
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 13.
Таблица 13. Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 13
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV интраназально;
67,3
2
Ad26-GP-EBOV внутримышечно;
220,8
3
Ad26-GP-EBOV подкожно;
181,1
4
Ad5-GP-EBOV интраназально;
5250,1
5
Ad5-GP-EBOV внутримышечно;
8613,8
6
Ad5-GP-EBOV подкожно;
7066,2
7
VSV-GP-EBOV интраназально;
3533,1
8
VSV-GP-EBOV внутримышечно;
7801,7
9
VSV-GP-EBOV подкожно;
6400,0
10
Буферный раствор.
0
Как видно из представленных результатов, все пути введения разработанных иммунобиологических средств в организм млекопитающих приводят к развитию гуморального иммунного ответа. При этом наиболее высокие титры антител наблюдаются при внутримышечном и подкожном введении.
Пример 13.
Оценка иммуногенности разработанных иммунобиологических средств при последовательной и одновременной иммунизации.
Целью данного эксперимента являлась оценка эффективности иммунизации млекопитающих вариантами разработанного иммунобиологического средства при различных схемах введения средств. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции антител класса IgG специфичных к GP Ebola virus в сыворотке крови.
10
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10вирусных частиц/мышь.
Таким образом, были получены следующие группы животных:
1) Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,
2) Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,
3) Ad5-GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,
4) Ad26-GP-EBOV, VSV-GP-EBOV одновременно,
5) Ad26-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,
6) VSV -GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,
7) VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,
8) VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,
9) Ad5-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,
10) Буферный раствор.
Оценка титра антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.
o
Для иммуноферментного анализа антиген (GP Ebola virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 С в течение ночи.
2
4
2
4
o
На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г NaHPO, 0,24 г KHPO, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.
Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.
o
Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37С на протяжении часа.
Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.
Результаты эксперимента представлены в таблице 14.
Таблица 14.
Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).
Таблица 14
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,
8613,8
2
Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,
46373,1
3
Ad5-GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,
34455,0
4
Ad26-GP-EBOV, VSV-GP-EBOV одновременно,
10500,3
5
Ad26-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,
42001,2
6
VSV -GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,
38041,5
7
VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,
11593,3
8
VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,
51200,0
9
Ad5-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,
42001,2
10
Буферный раствор.
0
Как видно из представленных результатов, как одновременное, так и последовательное введение иммунобиологических средств в организм млекопитающих приводят к развитию гуморального иммунного ответа. При этом наиболее высокие титры антител наблюдаются при последовательном введении иммунобиологических средств.
Приведенные примеры подтверждают выполнение технической задачи, а именно: «расширение арсенала иммунобиологических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против филовирусов: рода Ebolavirus: Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), и/или филовирусов рода Marburgvirus: Marburg virus (MARV).
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают промышленную применимость изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный
исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного
академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации
<120> Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным
для человека филовирусам, способ использования иммунобиологического средства
<160> 16
<170> BISSAP1.3.6
<210> 1
<211> 2914
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
последовательность GP Ebola virus  и сигнал полиаденилирования
<400> 1
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat     120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga     180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc     240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt     300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat     360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag     420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc     480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga     540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctgaattcac     600
catgggtgtt acaggaatat tgcagttacc tcgtgatcga ttcaagagga catcattctt     660
tctttgggta attatccttt tccaaagaac attttccatc ccgcttggag ttatccacaa     720
tagtacatta caggttagtg atgtcgacaa actagtttgt cgtgacaaac tgtcatccac     780
aaatcaattg agatcagttg gactgaatct cgaggggaat ggagtggcaa ctgacgtgcc     840
atctgtgact aaaagatggg gcttcaggtc cggtgtccca ccaaaggtgg tcaattatga     900
agctggtgaa tgggctgaaa actgctacaa tcttgaaatc aaaaaacctg acgggagtga     960
gtgtctacca gcagcgccag acgggattcg gggcttcccc cggtgccggt atgtgcacaa    1020
agtatcagga acgggaccat gtgccggaga ctttgccttc cacaaagagg gtgctttctt    1080
cctgtatgat cgacttgctt ccacagttat ctaccgagga acgactttcg ctgaaggtgt    1140
cgttgcattt ctgatactgc cccaagctaa gaaggacttc ttcagctcac accccttgag    1200
agagccggtc aatgcaacgg aggacccgtc gagtggctat tattctacca caattagata    1260
tcaggctacc ggttttggaa ctaatgagac agagtacttg ttcgaggttg acaatttgac    1320
ctacgtccaa cttgaatcaa gattcacacc acagtttctg ctccagctga atgagacaat    1380
atatgcaagt gggaagagga gcaacaccac gggaaaacta atttggaagg tcaaccccga    1440
aattgataca acaatcgggg agtgggcctt ctgggaaact aaaaaaaacc tcactagaaa    1500
aattcgcagt gaagagttgt ctttcacagc tgtatcaaac ggacccaaaa acatcagtgg    1560
tcagagtccg gcgcgaactt cttccgaccc agagaccaac acaacaaatg aagaccacaa    1620
aatcatggct tcagaaaatt cctctgcaat ggttcaagtg cacagtcaag gaaggaaagc    1680
tgcagtgtcg catctgacaa cccttgccac aatctccacg agtcctcaac ctcccacaac    1740
caaaacaggt ccggacaaca gcacccataa tacacccgtg tataaacttg acatctctga    1800
ggcaactcaa gttggacaac atcaccgtag agcagacaac gacagcacag cctccgacac    1860
tccccccgcc acgaccgcag ccggaccctt aaaagcagag aacaccaaca cgagtaagag    1920
cgctgactcc ctggacctcg ccaccacgac aagcccccaa aactacagcg agactgctgg    1980
caacaacaac actcatcacc aagataccgg agaagagagt gccagcagcg ggaagctagg    2040
cttaattacc aatactattg ctggagtagc aggactgatc acaggcggga gaaggactcg    2100
aagagaagta attgtcaatg ctcaacccaa atgcaacccc aatttacatt actggactac    2160
tcaggatgaa ggtgctgcaa tcggattggc ctggatacca tatttcgggc cagcagccga    2220
aggaatttac acagaggggc taatgcacaa ccaagatggt ttaatctgtg ggttgaggca    2280
gctggccaac gaaacgactc aagctctcca actgttcctg agagccacaa ctgagctgcg    2340
aaccttttca atcctcaacc gtaaggcaat tgacttcctg ctgcagcgat ggggtggcac    2400
atgccacatt ttgggaccgg actgctgtat cgaaccacat gattggacca agaacataac    2460
agacaaaatt gatcagatta ttcatgattt tgttgataaa acccttccgg accaggggga    2520
caatgacaat tggtggacag gatggagaca atggataccg gcaggtattg gagttacagg    2580
tgttataatt gcagttatcg ctttattctg tatatgcaaa tttgtctttt gataaggaat    2640
tcaagcttct agataagata tccgatccac cggatctaga taactgatca taatcagcca    2700
taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct    2760
gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta    2820
caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag    2880
ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaa                                2914
<210> 2
<211> 2320
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
последовательность GPEbolavirus, модифицированная путем удаления области,
кодирующей муцинподобный домен,  и сигнал полиаденилирования
<400> 2
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat     120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga     180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc     240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt     300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat     360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag     420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc     480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga     540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctacgcgtat     600
gggtgttaca ggaatattgc agttacctcg tgatcgattc aagaggacat cattctttct     660
ttgggtaatt atccttttcc aaagaacatt ttccatcccg cttggagtta tccacaatag     720
tacattacag gttagtgatg tcgacaaact agtttgtcgt gacaaactct catccacaaa     780
tcaattgaga tcagttggac tgaatctcga ggggaatgga gtggcaactg acgtgccatc     840
tgtgactaaa agatggggct tcaggtccgg tgtcccacca aaggtggtca attatgaagc     900
tggtgaatgg gctgaaaact gctacaatct tgaaatcaaa aaacctgacg ggagtgagtg     960
tctaccagca gcgccagacg ggattcgggg cttcccccgg tgccggtatg tgcacaaagt    1020
atcaggaacg ggaccatgtg ccggagactt tgccttccac aaagagggtg ctttcttcct    1080
gtatgatcga cttgcttcca cagttatcta ccgaggaacg actttcgctg aaggtgtcgt    1140
tgcatttctg atactgcccc aagctaagaa ggacttcttc agctcacacc ccttgagaga    1200
gccggtcaat gcaacggagg acccgtcgag tggctattat tctaccacaa ttagatatca    1260
ggctaccggt tttggaacta atgagacaga gtacttgttc gaggttgaca atttgaccta    1320
cgtccaactt gaatcaagat tcacaccaca gtttctgctc cagctgaatg agacaatata    1380
tgcaagtggg aagaggagca acaccacggg aaaactaatt tggaaggtca accccgaaat    1440
tgatacaaca atcggggagt gggccttctg ggaaactaaa aaaaacctca ctagaaaaat    1500
tcgcagtgaa gagttgtctt tcacagctgt atcaaacaga aggactcgaa gagaagtaat    1560
tgtcaatgct caacccaaat gcaaccccaa tttacattac tggactactc aggatgaagg    1620
tgctgcaatc ggattggcct ggataccata tttcgggcca gcagccgaag gaatttacat    1680
agaggggcta atgcacaacc aagatggttt aatctgtggg ttgaggcagc tggccaacga    1740
aacgactcaa gctctccaac tgttcctgag agccacaact gagctgcgaa ccttttcaat    1800
cctcaaccgt aaggcaattg acttcctgct gcagcgatgg ggtggcacat gccacatttt    1860
gggaccggac tgctgtatcg aaccacatga ttggaccaag aacataacag acaaaattga    1920
tcagattatt catgattttg ttgataaaac ccttccggac cagggggaca atgacaattg    1980
gtggacagga tggagacaat ggataccggc aggtattgga gttacaggtg ttataattgc    2040
agttatcgct ttattctgta tatgcaaatt tgtcttttga gctagataac tgatcataat    2100
cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct    2160
gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa    2220
tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca    2280
ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa                          2320
<210> 3
<211> 2903
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
последовательность GPBundibugyovirus  и сигнал полиаденилирования
<400> 3
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat     120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga     180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc     240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt     300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat     360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag     420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc     480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga     540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt     600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatggaggg tcttagccta ctccaattgc     660
ccagagataa atttcgaaaa agctctttct ttgtttgggt catcatctta tttcaaaagg     720
ccttttccat gcctttgggt gttgtgacca acagcacttt agaagtaaca gagattgacc     780
agctagtctg caaggatcat cttgcatcca ctgaccagct gaaatcagtt ggtctcaacc     840
tcgaggggag cggagtatct actgacatcc catctgcgac aaagcgttgg ggcttcaggt     900
ctggtgtgcc tcccaaagtg gtcagctatg aagcaggaga atgggctgaa aattgctaca     960
atcttgaaat aaagaagccg gacgggagcg aatgcttacc cccaccgccg gatggtgtca    1020
gaggctttcc aaggtgccgc tatgttcaca aagcccaagg aaccgggccc tgcccgggtg    1080
actatgcctt tcacaaggat ggagctttct tcctctatga caggctggct tcaactgtaa    1140
tttacagagg agtcaatttt gctgaggggg taattgcctt cttgatattg gctaaaccaa    1200
aggaaacgtt ccttcaatca ccccccattc gagaggcagt aaactacact gagaatacat    1260
caagttacta tgccacatcc tacttggagt acgaaatcga aaattttggt gctcaacact    1320
ccacgaccct tttcaaaatt aacaacaata cttttgttct tctggacagg ccccacacgc    1380
ctcagttcct tttccagctg aatgatacca ttcaccttca ccaacagttg agcaacacaa    1440
ctgggaaact aatttggaca ctagatgcta atatcaatgc tgatattggt gaatgggctt    1500
tttgggaaaa taaaaaaaat ctctccgaac aactacgtgg agaagagctg tctttcgaaa    1560
ctttatcgct caacgagaca gaagacgatg atgcgacatc gtcgagaact acaaagggaa    1620
gaatctccga ccgagccacc aggaagtatt cggacctggt tccaaaggat tcccctggga    1680
tggtttcatt gcacgtacca gaaggggaaa caacattgcc gtctcagaat tcgacagaag    1740
gacgaagagt agatgtgaat actcaggaaa ctatcacaga gacaactgca acaatcatag    1800
gcactaacgg taacaacatg cagatcagca ccatcgggac aggactgagc tccagccaaa    1860
tcctgagttc ctcaccgacc atggcaccaa gccctgagac tcagacctcc acaacctaca    1920
caccaaaact accagtgatg accaccgagg aaccaacaac accaccgaga aactctcctg    1980
gctcaacaac agaagcaccc actctcacca ccccagagaa tataacaaca gcggtgaaaa    2040
ctgttttgcc acaagagtcc acaagcaacg gtctaataac ttcaacagta acaggtattc    2100
ttgggagcct tggacttcga aaacgcagca gaagacaagt taacaccagg gccacgggta    2160
aatgcaatcc caacttacac tactggactg cacaagaaca acataatgct gctgggattg    2220
cctggatccc gtactttgga ccgggtgcag aaggcatata cactgaaggc cttatgcaca    2280
accaaaatgc cttagtctgt ggactcagac aacttgcaaa tgaaaccact caagctctgc    2340
agcttttctt aagggccacg acggagctgc ggacatatac catactcaat aggaaggcca    2400
tagatttcct tctgcgacga tggggcggga catgtaggat cctgggacca gattgttgca    2460
ttgagccaca tgattggacc aaaaacatca ctgataaaat caaccaaatc atccatgatt    2520
tcatcgacaa ccctttaccc aatcaggata atgatgataa ttggtggacg ggctggagac    2580
agtggatccc tgcaggaata ggcattactg gaattattat tgcaatcatt gctcttcttt    2640
gcgtctgcaa gctgctttgt tgagctagat aactgatcat aatcagccat accacatttg    2700
tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa    2760
tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca    2820
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt    2880
ccaaactcat caatgtatct taa                                            2903
<210> 4
<211> 2357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
последовательность GPBundibugyovirus, модифицированная путем удаления
области, кодирующей муцинподобный домен,  и сигнал полиаденилирования
<400> 4
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat     120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga     180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc     240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt     300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat     360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag     420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc     480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga     540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt     600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatggaggg tcttagccta ctccaattgc     660
ccagagataa atttcgaaaa agctctttct ttgtttgggt catcatctta tttcaaaagg     720
ccttttccat gcctttgggt gttgtgacca acagcacttt agaagtaaca gagattgacc     780
agctagtctg caaggatcat cttgcatcca ctgaccagct gaaatcagtt ggtctcaacc     840
tcgaggggag cggagtatct actgacatcc catctgcgac aaagcgttgg ggcttcaggt     900
ctggtgtgcc tcccaaagtg gtcagctatg aagcaggaga atgggctgaa aattgctaca     960
atcttgaaat aaagaagccg gacgggagcg aatgcttacc cccaccgccg gatggtgtca    1020
gaggctttcc aaggtgccgc tatgttcaca aagcccaagg aaccgggccc tgcccgggtg    1080
actatgcctt tcacaaggat ggagctttct tcctctatga caggctggct tcaactgtaa    1140
tttacagagg agtcaatttt gctgaggggg taattgcctt cttgatattg gctaaaccaa    1200
aggaaacgtt ccttcaatca ccccccattc gagaggcagt aaactacact gagaatacat    1260
caagttacta tgccacatcc tacttggagt acgaaatcga aaattttggt gctcaacact    1320
ccacgaccct tttcaaaatt aacaacaata cttttgttct tctggacagg ccccacacgc    1380
ctcagttcct tttccagctg aatgatacca ttcaccttca ccaacagttg agcaacacaa    1440
ctgggaaact aatttggaca ctagatgcta atatcaatgc tgatattggt gaatgggctt    1500
tttgggaaaa taaaaaaaat ctctccgaac aactacgtgg agaagagctg tctttcgaaa    1560
ctttatcgct caacaaacgc agcagaagac aagttaacac cagggccacg ggtaaatgca    1620
atcccaactt acactactgg actgcacaag aacaacataa tgctgctggg attgcctgga    1680
tcccgtactt tggaccgggt gcagaaggca tatacactga aggccttatg cacaaccaaa    1740
atgccttagt ctgtggactc agacaacttg caaatgaaac cactcaagct ctgcagcttt    1800
tcttaagggc cacgacggag ctgcggacat ataccatact caataggaag gccatagatt    1860
tccttctgcg acgatggggc gggacatgta ggatcctggg accagattgt tgcattgagc    1920
cacatgattg gaccaaaaac atcactgata aaatcaacca aatcatccat gatttcatcg    1980
acaacccttt acccaatcag gataatgatg ataattggtg gacgggctgg agacagtgga    2040
tccctgcagg aataggcatt actggaatta ttattgcaat cattgctctt ctttgcgtct    2100
gcaagctgct ttgttgagct agataactga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg    2160
ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg    2220
caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca    2280
tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac    2340
tcatcaatgt atcttaa                                                   2357
<210> 5
<211> 2909
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
последовательность GPSudanvirus  и сигнал полиаденилирования
<400> 5
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat     120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga     180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc     240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt     300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat     360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag     420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc     480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga     540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt     600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatggttac atcaggaatt ctacaattgc     660
cccgtgaacg cttcaggaaa acatcatttt ttgtttgggt aataatccta ttccataagg     720
ttttccctat cccattgggc gtagttcaca acaacactct ccaggtaagt gatatagata     780
aattggtgtg ccgggataaa ctttcctcca caagtcaact gaaatcggtc gggcttaacc     840
tagaaggtaa tggagttgcc acagatgtac caacagcaac gaagagatgg ggattccgag     900
ccggtgttcc acccaaagtg gtgaactacg aggctgggga gtgggctgaa aactgctaca     960
acctggacat caagaaagca gatggtagcg aatgcctacc tgaagcccct gagggtgtaa    1020
gaggcttccc tcgctgccgt tatgtgcaca aggtttctgg aacagggccg tgtcctgaag    1080
gtttcgcttt ccacaaagaa ggcgctttct tcctgtatga tcgactggca tcaacaatca    1140
tctatcgaag caccacgttt tcagaaggtg ttgtggcttt cttgatcctc cccaagacta    1200
aaaaggactt tttccaatca ccaccactac atgaaccggc caatatgaca acagacccat    1260
ccagctacta ccacacagtc acacttaatt atgtggctga caattttggg accaatatga    1320
ctaactttct gtttcaagtg gatcatctaa cttatgtgca acttgaacca agattcacac    1380
cacaatttct tgtccaactc aatgagacca tttatactaa tgggcgtcgc agcaacacca    1440
caggaacact aatttggaaa gtaaatccta ctgttgacac cggcgtaggt gaatgggcct    1500
tctgggaaaa taaaaaaaac ttcacaaaaa ccctttcaag tgaagagctg tctgtcatac    1560
ttgtaccaag agcccaggat ccaggcagca accagaagac gaaggtcact cccaccagct    1620
tcgccaacaa ccaaacctcc aagaaccacg aagacttggt tccaaaggat cccgcttcag    1680
tcgttcaagt gcgagacctc cagagggaaa acacagtgcc gacctcaccc ttgaacacag    1740
tccccacaac tctgatcccc gacacaatgg aagagcaaac caccagccac tacgaactac    1800
caaacatttc cggaaaccat caagagagga acaacaccgc acaccccgaa actctcgcca    1860
acaatcctcc agacaacaca accccttcga caccacctca agacggtgag cggacaagtt    1920
cccacacaac accctccccc cgcccagtcc caaccagcac aatccatccc accacacgag    1980
agactcaaat tcccaccaca atgataacaa gccatgatac tgacagtaat cgacccaacc    2040
caattgacat cagcgagtct acagagccag gactactcac caacaccata agaggggttg    2100
caaatttgct gacaggttca agaagaaccc ggagggaaat caccttgaga acacaagcca    2160
aatgtaatcc gaacctacac tattggacaa cccaagatga aggggctgcc attggtctag    2220
cctggatacc ttacttcggg cccgcagcag agggaattta tacggaagga ataatgcaca    2280
atcaaaatgg gctaatttgc gggttgaggc aactagcaaa tgagacgact caagccctac    2340
agttattctt gcgtgctacc acggaattgc gcactttctc catattgaat cgaaaagcca    2400
tcgacttctt acttcaaaga tggggaggaa cgtgccacat cttaggccca gattgctgta    2460
ttgagcccca tgattggact aagaacatta ctgacaagat agatcaaatc attcatgatt    2520
tcattgataa acctctacca gatcagacag ataatgacaa ttggtggaca gggtggaggc    2580
aatgggttcc tgctgggatt gggatcacgg gggtaataat cgcagttata gcactgctgt    2640
gtatttgcaa atttctactc taagctagct ctagataact gatcataatc agccatacca    2700
catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac    2760
ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat    2820
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg    2880
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttaa                                      2909
<210> 6
<211> 2360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
последовательность GPSudanvirus, модифицированная путем удаления области,
кодирующей муцинподобный домен,  и сигнал полиаденилирования
<400> 6
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat     120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga     180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc     240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt     300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat     360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag     420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc     480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga     540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt     600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatggttac atcaggaatt ctacaattgc     660
cccgtgaacg cttcaggaaa acatcatttt ttgtttgggt aataatccta ttccataagg     720
ttttccctat cccattgggc gtagttcaca acaacactct ccaggtaagt gatatagata     780
aattggtgtg ccgggataaa ctttcctcca caagtcaact gaaatcggtc gggcttaacc     840
tagaaggtaa tggagttgcc acagatgtac caacagcaac gaagagatgg ggattccgag     900
ccggtgttcc acccaaagtg gtgaactacg aggctgggga gtgggctgaa aactgctaca     960
acctggacat caagaaagca gatggtagcg aatgcctacc tgaagcccct gagggtgtaa    1020
gaggcttccc tcgctgccgt tatgtgcaca aggtttctgg aacagggccg tgtcctgaag    1080
gtttcgcttt ccacaaagaa ggcgctttct tcctgtatga tcgactggca tcaacaatca    1140
tctatcgaag caccacgttt tcagaaggtg ttgtggcttt cttgatcctc cccaagacta    1200
aaaaggactt tttccaatca ccaccactac atgaaccggc caatatgaca acagacccat    1260
ccagctacta ccacacagtc acacttaatt atgtggctga caattttggg accaatatga    1320
ctaactttct gtttcaagtg gatcatctaa cttatgtgca acttgaacca agattcacac    1380
cacaatttct tgtccaactc aatgagacca tttatactaa tgggcgtcgc agcaacacca    1440
caggaacact aatttggaaa gtaaatccta ctgttgacac cggcgtaggt gaatgggcct    1500
tctgggaaaa taaaaaaaac ttcacaaaaa ccctttcaag tgaagagctg tctgtcatac    1560
ttgtaccaag aagaagaacc cggagggaaa tcaccttgag aacacaagcc aaatgtaatc    1620
cgaacctaca ctattggaca acccaagatg aaggggctgc cattggtcta gcctggatac    1680
cttacttcgg gcccgcagca gagggaattt atacggaagg aataatgcac aatcaaaatg    1740
ggctaatttg cgggttgagg caactagcaa atgagacgac tcaagcccta cagttattct    1800
tgcgtgctac cacggaattg cgcactttct ccatattgaa tcgaaaagcc atcgacttct    1860
tacttcaaag atggggagga acgtgccaca tcttaggccc agattgctgt attgagcccc    1920
atgattggac taagaacatt actgacaaga tagatcaaat cattcatgat ttcattgata    1980
aacctctacc agatcagaca gataatgaca attggtggac agggtggagg caatgggttc    2040
ctgctgggat tgggatcacg ggggtaataa tcgcagttat agcactgctg tgtatttgca    2100
aatttctact ctaagctagc tctagataac tgatcataat cagccatacc acatttgtag    2160
aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga    2220
atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata    2280
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca    2340
aactcatcaa tgtatcttaa                                                2360
<210> 7
<211> 2924
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
последовательность GPMarburgvirus  и сигнал полиаденилирования
<400> 7
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat     120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga     180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc     240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt     300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat     360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag     420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc     480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga     540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt     600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatgtggac tacatgcttc tttatcagtc     660
tcatcttaat ccaagggata aaaactctcc ctattttgga gatagccagt aacgatcaac     720
cccaaaatgt ggattcggta tgctccggaa ctctccagaa aactgaagac gtccatctga     780
tgggatttac actgagcggt cagaaagttg ctgattcccc tttggaggca tccaagcgat     840
gggctttcag gacaggtgta cctcctaaga atgttgagta tacggaaggg gaggaagcca     900
aaacatgcta caatataagt gtaacggatc cctctggaaa atccttgctg ttagatcctc     960
ccaccaacgt ccgagactat cctaaatgca agactatcca tcacattcaa ggtcaaaacc    1020
ctcatgcgca ggggattgcc ctccatttgt ggggagcatt tttcctatat gatcgcattg    1080
cctccacaac aatgtaccga ggcaaagtct tcactgaagg gaacatagca gccatgattg    1140
tcaataagac agtgcacaaa atgattttct cgcgtcaagg acaagggtat cgtcacatga    1200
atctgacttc tactaacaag tattggacaa gtagcaacgg aacgcaaaca aatgacactg    1260
gatgtttcgg tactcttcaa gaatacaatt ctacgaagaa ccaaacatgt gctccgtcta    1320
aaacaccccc accaccgccc acagcccatc cggagatcaa acccacaagc accccaaccg    1380
atgccactag actcaacacc acaaacccaa acagtgatga tgaggatctc acaacatccg    1440
gctcggggtc tggggaacag gaaccctata cgacttctga tgcggtcact aagcaagggc    1500
tttcatcaac aatgccaccc actccctcac cgcaaccagg cacgccacag cagggaggaa    1560
acaacacaaa ccactcccag gacgctgcaa ctgaacttga caacaccaat acaactgcac    1620
aacctcccat gccttcccac aacacgacca caatctcgac caacaacacg tccaaacaca    1680
acctcagcac cctctccgaa ccaccacaaa acaccaccaa tcccaacaca caaagcatgg    1740
ccactgaaaa tgagaaaacc agtgcccctc cgaaaacaac cctgcctcca acagaaagtc    1800
ctaccacaga aaagagcacc aacaatacaa aaagccccac cacaatggaa ccaaatacaa    1860
caaatggaca tttcactagt ccctcctcca cctccaactc gactactcaa catcttatct    1920
acttcaggag gaaacgaagt atcctctgga gggaaggcga tatgttccct ttcctagatg    1980
ggttaataaa tgctccaatt gattttgatc cagttccaaa tacaaagaca atctttgatg    2040
aatcttctag ttctggtgct tcagccgagg aagatcaaca tgcatcctcc aatatcagct    2100
tgactttatc ttatcttcct catacaagtg aaaacactgc ctactctgga gagaatgaaa    2160
atgattgtga tgcagagcta agaatttgga gcgttcagga ggacgacctg gcagcagggc    2220
tcagttggat accattcttc ggccctggaa tcgaaggact ttataccgct ggtttaatca    2280
agaaccaaaa caatttggtc tgcaggttga ggcgtctagc caatcaaact gcaaaatctt    2340
tggaactctt actaagggtc acaaccgagg aaagaacatt ttccttgatc aatagacatg    2400
ctattgactt tctactcaca aggtggggag gaacatgcaa agtgcttgga cctgattgtt    2460
gcataggaat agaggacttg tccagaaata tttcagaaca gattgaccaa atcaagaagg    2520
acgaacaaaa agaggggact ggttggggtc tgggtggtaa gtggtggaca tccgactggg    2580
gtgttcttac taacttgggc atcttgctac tattgtccat agctgtcttg attgctctat    2640
cctgtatttg tcgtatcttc actaaatata ttggataggc tagctctaga taactgatca    2700
taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc    2760
ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt    2820
ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac    2880
tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaa                     2924
<210> 8
<211> 2351
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
последовательность GPMarburgvirus, модифицированная путем удаления области,
кодирующей муцинподобный домен,  и сигнал полиаденилирования
<400> 8
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata      60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat     120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga     180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc     240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt     300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat     360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag     420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc     480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga     540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt     600
cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatgtggac tacatgcttc tttatcagtc     660
tcatcttaat ccaagggata aaaactctcc ctattttgga gatagccagt aacgatcaac     720
cccaaaatgt ggattcggta tgctccggaa ctctccagaa aactgaagac gtccatctga     780
tgggatttac actgagcggt cagaaagttg ctgattcccc tttggaggca tccaagcgat     840
gggctttcag gacaggtgta cctcctaaga atgttgagta tacggaaggg gaggaagcca     900
aaacatgcta caatataagt gtaacggatc cctctggaaa atccttgctg ttagatcctc     960
ccaccaacgt ccgagactat cctaaatgca agactatcca tcacattcaa ggtcaaaacc    1020
ctcatgcgca ggggattgcc ctccatttgt ggggagcatt tttcctatat gatcgcattg    1080
cctccacaac aatgtaccga ggcaaagtct tcactgaagg gaacatagca gccatgattg    1140
tcaataagac agtgcacaaa atgattttct cgcgtcaagg acaagggtat cgtcacatga    1200
atctgacttc tactaacaag tattggacaa gtagcaacgg aacgcaaaca aatgacactg    1260
gatgtttcgg tactcttcaa gaatacaatt ctacgaagaa ccaaacatgt gctccgtcta    1320
aaacaccccc accaccgccc acagctcatc cgaggaggaa acgaagtatc ctctggaggg    1380
aaggcgatat gttccctttc ctagatgggt taataaatgc tccaattgat tttgatccag    1440
ttccaaatac aaagacaatc tttgatgaat cttctagttc tggtgcttca gccgaggaag    1500
atcaacatgc atcctccaat atcagcttga ctttatctta tcttcctcat acaagtgaaa    1560
acactgccta ctctggagag aatgaaaatg attgtgatgc agagctaaga atttggagcg    1620
ttcaggagga cgacctggca gcagggctca gttggatacc attcttcggc cctggaatcg    1680
aaggacttta taccgctggt ttaatcaaga accaaaacaa tttggtctgc aggttgaggc    1740
gtctagccaa tcaaactgca aaatctttgg aactcttact aagggtcaca accgaggaaa    1800
gaacattttc cttgatcaat agacatgcta ttgactttct actcacaagg tggggaggaa    1860
catgcaaagt gcttggacct gattgttgca taggaataga ggacttgtcc agaaatattt    1920
cagaacagat tgaccaaatc aagaaggacg aacaaaaaga ggggactggt tggggtctgg    1980
gtggtaagtg gtggacatcc gactggggtg ttcttactaa cttgggcatc ttgctactat    2040
tgtccatagc tgtcttgatt gctctatcct gtatttgtcg tatcttcact aaatatattg    2100
gataggctag ctctagataa ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac    2160
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg    2220
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa    2280
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca    2340
atgtatcttaa                                                         2351
<210> 9
<211> 2147
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации
транскрипции, последовательность GPEbolavirus  и сигнал для терминации и
полиаденилирования
<400> 9
aacagagatcgatctgtttacgcgaattcaccatgggtgttacaggaatattgcagttac      60
ctcgtgatcgattcaagaggacatcattctttctttgggtaattatccttttccaaagaa     120
cattttccat cccgcttgga gttatccaca atagtacatt acaggttagt gatgtcgaca     180
aactagtttg tcgtgacaaa ctgtcatcca caaatcaatt gagatcagtt ggactgaatc     240
tcgaggggaa tggagtggca actgacgtgc catctgtgac taaaagatgg ggcttcaggt     300
ccggtgtccc accaaaggtg gtcaattatg aagctggtga atgggctgaa aactgctaca     360
atcttgaaat caaaaaacct gacgggagtg agtgtctacc agcagcgcca gacgggattc     420
ggggcttccc ccggtgccgg tatgtgcaca aagtatcagg aacgggacca tgtgccggag     480
actttgcctt ccacaaagag ggtgctttct tcctgtatga tcgacttgct tccacagtta     540
tctaccgagg aacgactttc gctgaaggtg tcgttgcatt tctgatactg ccccaagcta     600
agaaggactt cttcagctca caccccttga gagagccggt caatgcaacg gaggacccgt     660
cgagtggcta ttattctacc acaattagat atcaggctac cggttttgga actaatgaga     720
cagagtactt gttcgaggtt gacaatttga cctacgtcca acttgaatca agattcacac     780
cacagtttct gctccagctg aatgagacaa tatatgcaag tgggaagagg agcaacacca     840
cgggaaaact aatttggaag gtcaaccccg aaattgatac aacaatcggg gagtgggcct     900
tctgggaaac taaaaaaaac ctcactagaa aaattcgcag tgaagagttg tctttcacag     960
ctgtatcaaa cggacccaaa aacatcagtg gtcagagtcc ggcgcgaact tcttccgacc    1020
cagagaccaa cacaacaaat gaagaccaca aaatcatggc ttcagaaaat tcctctgcaa    1080
tggttcaagt gcacagtcaa ggaaggaaag ctgcagtgtc gcatctgaca acccttgcca    1140
caatctccac gagtcctcaa cctcccacaa ccaaaacagg tccggacaac agcacccata    1200
atacacccgt gtataaactt gacatctctg aggcaactca agttggacaa catcaccgta    1260
gagcagacaa cgacagcaca gcctccgaca ctccccccgc cacgaccgca gccggaccct    1320
taaaagcaga gaacaccaac acgagtaaga gcgctgactc cctggacctc gccaccacga    1380
caagccccca aaactacagc gagactgctg gcaacaacaa cactcatcac caagataccg    1440
gagaagagag tgccagcagc gggaagctag gcttaattac caatactatt gctggagtag    1500
caggactgat cacaggcggg agaaggactc gaagagaagt aattgtcaat gctcaaccca    1560
aatgcaaccc caatttacat tactggacta ctcaggatga aggtgctgca atcggattgg    1620
cctggatacc atatttcggg ccagcagccg aaggaattta cacagagggg ctaatgcaca    1680
accaagatgg tttaatctgt gggttgaggc agctggccaa cgaaacgact caagctctcc    1740
aactgttcct gagagccaca actgagctgc gaaccttttc aatcctcaac cgtaaggcaa    1800
ttgacttcct gctgcagcga tggggtggca catgccacat tttgggaccg gactgctgta    1860
tcgaaccaca tgattggacc aagaacataa cagacaaaat tgatcagatt attcatgatt    1920
ttgttgataa aacccttccg gaccaggggg acaatgacaa ttggtggaca ggatggagac    1980
aatggatacc ggcaggtatt ggagttacag gtgttataat tgcagttatc gctttattct    2040
gtatatgcaa atttgtcttt tgataaggaa ttctagctgt ttaggcgata tccatgctca    2100
aagaggcctc aattatattt gagtttttaa tttttatgaa aaaaact                  2147
<210> 10
<211> 1583
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации
транскрипции, последовательность GPEbolavirus, модифицированная путем
удаления области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал для терминации и
полиаденилирования
<400> 10
aacagagatcgatctgtttacgcgtatgggtgttacaggaatattgcagttacctcgtga      60
tcgattcaagaggacatcattctttctttgggtaattatccttttccaaagaacattttc     120
catcccgcttggagttatccacaatagtacattacaggttagtgatgtcgacaaactagt     180
ttgtcgtgacaaactctcatccacaaatcaattgagatcagttggactgaatctcgaggg     240
gaatggagtggcaactgacgtgccatctgtgactaaaagatggggcttcaggtccggtgt     300
cccaccaaaggtggtcaattatgaagctggtgaatgggctgaaaactgctacaatcttga     360
aatcaaaaaacctgacgggagtgagtgtctaccagcagcgccagacgggattcggggctt     420
cccccggtgccggtatgtgcacaaagtatcaggaacgggaccatgtgccggagactttgc     480
cttccacaaagagggtgctttcttcctgtatgatcgacttgcttccacagttatctaccg     540
aggaacgactttcgctgaaggtgtcgttgcatttctgatactgccccaagctaagaagga     600
cttcttcagctcacaccccttgagagagccggtcaatgcaacggaggacccgtcgagtgg     660
ctattattct accacaatta gatatcaggc taccggtttt ggaactaatg agacagagta     720
cttgttcgag gttgacaatt tgacctacgt ccaacttgaa tcaagattca caccacagtt     780
tctgctccag ctgaatgaga caatatatgc aagtgggaag aggagcaaca ccacgggaaa     840
actaatttgg aaggtcaacc ccgaaattga tacaacaatc ggggagtggg ccttctggga     900
aactaaaaaa aacctcacta gaaaaattcg cagtgaagag ttgtctttca cagctgtatc     960
aaacagaagg actcgaagag aagtaattgt caatgctcaa cccaaatgca accccaattt    1020
acattactgg actactcagg atgaaggtgc tgcaatcgga ttggcctgga taccatattt    1080
cgggccagca gccgaaggaa tttacataga ggggctaatg cacaaccaag atggtttaat    1140
ctgtgggttg aggcagctgg ccaacgaaac gactcaagct ctccaactgt tcctgagagc    1200
cacaactgag ctgcgaacct tttcaatcct caaccgtaag gcaattgact tcctgctgca    1260
gcgatggggt ggcacatgcc acattttggg accggactgc tgtatcgaac cacatgattg    1320
gaccaagaac ataacagaca aaattgatca gattattcat gattttgttg ataaaaccct    1380
tccggaccag ggggacaatg acaattggtg gacaggatgg agacaatgga taccggcagg    1440
tattggagtt acaggtgtta taattgcagt tatcgcttta ttctgtatat gcaaatttgt    1500
cttttgagct agctgtttag gcgatatcca tgctcaaaga ggcctcaatt atatttgagt    1560
ttttaatttt tatgaaaaaa act                                            1583
<210> 11
<211> 2132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации
транскрипции, последовательность GPBundibugyovirus  и сигнал для терминации и
полиаденилирования
<400> 11
aacagagatcgatctgtttacgcgtatggagggtcttagcctactccaattgcccagaga      60
taaatttcgaaaaagctctttctttgtttgggtcatcatcttatttcaaaaggccttttc     120
catgcctttgggtgttgtgaccaacagcactttagaagtaacagagattgaccagctagt     180
ctgcaaggatcatcttgcatccactgaccagctgaaatcagttggtctcaacctcgaggg     240
gagcggagtatctactgacatcccatctgcgacaaagcgttggggcttcaggtctggtgt     300
gcctcccaaagtggtcagctatgaagcaggagaatgggctgaaaattgctacaatcttga     360
aataaagaagccggacgggagcgaatgcttacccccaccgccggatggtgtcagaggctt     420
tccaaggtgccgctatgttcacaaagcccaaggaaccgggccctgcccgggtgactatgc     480
ctttcacaaggatggagctttcttcctctatgacaggctggcttcaactgtaatttacag     540
aggagtcaattttgctgagggggtaattgccttcttgatattggctaaaccaaaggaaac     600
gttccttcaatcaccccccattcgagaggcagtaaactacactgagaatacatcaagtta     660
ctatgccacatcctacttggagtacgaaatcgaaaattttggtgctcaacactccacgac     720
ccttttcaaaattaacaacaatacttttgttcttctggacaggccccacacgcctcagtt     780
ccttttccagctgaatgataccattcaccttcaccaacagttgagcaacacaactgggaa     840
actaatttggacactagatgctaatatcaatgctgatattggtgaatgggctttttggga     900
aaataaaaaaaatctctccgaacaactacgtggagaagagctgtctttcgaaactttatc     960
gctcaacgagacagaagacgatgatgcgacatcgtcgagaactacaaagggaagaatctc    1020
cgaccgagccaccaggaagtattcggacctggttccaaaggattcccctgggatggtttc    1080
attgcacgtaccagaaggggaaacaacattgccgtctcagaattcgacagaaggacgaag    1140
agtagatgtgaatactcaggaaactatcacagagacaactgcaacaatcataggcactaa    1200
cggtaacaacatgcagatcagcaccatcgggacaggactgagctccagccaaatcctgag    1260
ttcctcaccgaccatggcaccaagccctgagactcagacctccacaacctacacaccaaa    1320
actaccagtgatgaccaccgaggaaccaacaacaccaccgagaaactctcctggctcaac    1380
aacagaagcacccactctcaccaccccagagaatataacaacagcggtgaaaactgtttt    1440
gccacaagagtccacaagcaacggtctaataacttcaacagtaacaggtattcttgggag    1500
ccttggacttcgaaaacgcagcagaagacaagttaacaccagggccacgggtaaatgcaa    1560
tcccaacttacactactggactgcacaagaacaacataatgctgctgggattgcctggat    1620
cccgtactttggaccgggtgcagaaggcatatacactgaaggccttatgcacaaccaaaa    1680
tgccttagtctgtggactcagacaacttgcaaatgaaaccactcaagctctgcagctttt    1740
cttaagggccacgacggagctgcggacatataccatactcaataggaaggccatagattt    1800
ccttctgcgacgatggggcgggacatgtaggatcctgggaccagattgttgcattgagcc    1860
acatgattggaccaaaaacatcactgataaaatcaaccaaatcatccatgatttcatcga    1920
caaccctttacccaatcaggataatgatgataattggtggacgggctggagacagtggat    1980
ccctgcaggaataggcattactggaattattattgcaatcattgctcttctttgcgtctg    2040
caagctgctttgttgagctagctgtttaggcgatatccatgctcaaagaggcctcaatta    2100
tatttgagtt tttaattttt atgaaaaaaa ct                             2132
<210> 12
<211> 1586
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации
транскрипции, последовательность GPBundibugyovirus, модифицированная путем
удаления области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал для терминации и
полиаденилирования
<400> 12
aacagagatcgatctgtttacgcgtatggagggtcttagcctactccaattgcccagaga      60
taaatttcgaaaaagctctttctttgtttgggtcatcatcttatttcaaaaggccttttc     120
catgcctttgggtgttgtgaccaacagcactttagaagtaacagagattgaccagctagt     180
ctgcaaggatcatcttgcatccactgaccagctgaaatcagttggtctcaacctcgaggg     240
gagcggagtatctactgacatcccatctgcgacaaagcgttggggcttcaggtctggtgt     300
gcctcccaaagtggtcagctatgaagcaggagaatgggctgaaaattgctacaatcttga     360
aataaagaagccggacgggagcgaatgcttacccccaccgccggatggtgtcagaggctt     420
tccaaggtgccgctatgttcacaaagcccaaggaaccgggccctgcccgggtgactatgc     480
ctttcacaaggatggagctttcttcctctatgacaggctggcttcaactgtaatttacag     540
aggagtcaattttgctgagggggtaattgccttcttgatattggctaaaccaaaggaaac     600
gttccttcaatcaccccccattcgagaggcagtaaactacactgagaatacatcaagtta     660
ctatgccacatcctacttggagtacgaaatcgaaaattttggtgctcaacactccacgac     720
ccttttcaaaattaacaacaatacttttgttcttctggacaggccccacacgcctcagtt     780
ccttttccagctgaatgataccattcaccttcaccaacagttgagcaacacaactgggaa     840
actaatttggacactagatgctaatatcaatgctgatattggtgaatgggctttttggga     900
aaataaaaaaaatctctccgaacaactacgtggagaagagctgtctttcgaaactttatc     960
gctcaacaaacgcagcagaagacaagttaacaccagggccacgggtaaatgcaatcccaa    1020
cttacactactggactgcacaagaacaacataatgctgctgggattgcctggatcccgta    1080
ctttggaccgggtgcagaaggcatatacactgaaggccttatgcacaaccaaaatgcctt    1140
agtctgtggactcagacaacttgcaaatgaaaccactcaagctctgcagcttttcttaag    1200
ggccacgacggagctgcggacatataccatactcaataggaaggccatagatttccttct    1260
gcgacgatggggcgggacatgtaggatcctgggaccagattgttgcattgagccacatga    1320
ttggaccaaaaacatcactgataaaatcaaccaaatcatccatgatttcatcgacaaccc    1380
tttacccaatcaggataatgatgataattggtggacgggctggagacagtggatccctgc    1440
aggaataggcattactggaattattattgcaatcattgctcttctttgcgtctgcaagct    1500
gctttgttgagctagctgtttaggcgatatccatgctcaaagaggcctcaattatatttg    1560
agtttttaat ttttatgaaa aaaact                                    1586
<210> 13
<211> 2131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации
транскрипции, последовательность GPSudanvirus  и сигнал для терминации и
полиаденилирования
<400> 13
aacagagatcgatctgtttacgcgtatggttacatcaggaattctacaattgccccgtga      60
acgcttcaggaaaacatcattttttgtttgggtaataatcctattccataaggttttccc     120
tatcccattgggcgtagttcacaacaacactctccaggtaagtgatatagataaattggt     180
gtgccgggataaactttcctccacaagtcaactgaaatcggtcgggcttaacctagaagg     240
taatggagttgccacagatgtaccaacagcaacgaagagatggggattccgagccggtgt     300
tccacccaaagtggtgaactacgaggctggggagtgggctgaaaactgctacaacctgga     360
catcaagaaagcagatggtagcgaatgcctacctgaagcccctgagggtgtaagaggctt     420
ccctcgctgccgttatgtgcacaaggtttctggaacagggccgtgtcctgaaggtttcgc     480
tttccacaaagaaggcgctttcttcctgtatgatcgactggcatcaacaatcatctatcg     540
aagcaccacgttttcagaaggtgttgtggctttcttgatcctccccaagactaaaaagga     600
ctttttccaatcaccaccactacatgaaccggccaatatgacaacagacccatccagcta     660
ctaccacacagtcacacttaattatgtggctgacaattttgggaccaatatgactaactt     720
tctgtttcaagtggatcatctaacttatgtgcaacttgaaccaagattcacaccacaatt     780
tcttgtccaactcaatgagaccatttatactaatgggcgtcgcagcaacaccacaggaac     840
actaatttggaaagtaaatcctactgttgacaccggcgtaggtgaatgggccttctggga     900
aaataaaaaaaacttcacaaaaaccctttcaagtgaagagctgtctgtcatacttgtacc     960
aagagcccaggatccaggcagcaaccagaagacgaaggtcactcccaccagcttcgccaa    1020
caaccaaacctccaagaaccacgaagacttggttccaaaggatcccgcttcagtcgttca    1080
agtgcgagacctccagagggaaaacacagtgccgacctcacccttgaacacagtccccac    1140
aactctgatccccgacacaatggaagagcaaaccaccagccactacgaactaccaaacat    1200
ttccggaaaccatcaagagaggaacaacaccgcacaccccgaaactctcgccaacaatcc    1260
tccagacaacacaaccccttcgacaccacctcaagacggtgagcggacaagttcccacac    1320
aacaccctccccccgcccagtcccaaccagcacaatccatcccaccacacgagagactca    1380
aattcccaccacaatgataacaagccatgatactgacagtaatcgacccaacccaattga    1440
catcagcgagtctacagagccaggactactcaccaacaccataagaggggttgcaaattt    1500
gctgacaggttcaagaagaacccggagggaaatcaccttgagaacacaagccaaatgtaa    1560
tccgaacctacactattggacaacccaagatgaaggggctgccattggtctagcctggat    1620
accttacttcgggcccgcagcagagggaatttatacggaaggaataatgcacaatcaaaa    1680
tgggctaatttgcgggttgaggcaactagcaaatgagacgactcaagccctacagttatt    1740
cttgcgtgctaccacggaattgcgcactttctccatattgaatcgaaaagccatcgactt    1800
cttacttcaaagatggggaggaacgtgccacatcttaggcccagattgctgtattgagcc    1860
ccatgattggactaagaacattactgacaagatagatcaaatcattcatgatttcattga    1920
taaacctctaccagatcagacagataatgacaattggtggacagggtggaggcaatgggt    1980
tcctgctgggattgggatcacgggggtaataatcgcagttatagcactgctgtgtatttg    2040
caaatttctactctagctagctgtttaggcgatatccatgctcaaagaggcctcaattat    2100
atttgagttt ttaattttta tgaaaaaaac t                              2131
<210> 14
<211> 1582
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации
транскрипции, последовательность GPSudanvirus, модифицированная путем
удаления области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал для терминации и
полиаденилирования
<400> 14
aacagagatcgatctgtttacgcgtatggttacatcaggaattctacaattgccccgtga      60
acgcttcaggaaaacatcattttttgtttgggtaataatcctattccataaggttttccc     120
tatcccattgggcgtagttcacaacaacactctccaggtaagtgatatagataaattggt     180
gtgccgggataaactttcctccacaagtcaactgaaatcggtcgggcttaacctagaagg     240
taatggagttgccacagatgtaccaacagcaacgaagagatggggattccgagccggtgt     300
tccacccaaagtggtgaactacgaggctggggagtgggctgaaaactgctacaacctgga     360
catcaagaaagcagatggtagcgaatgcctacctgaagcccctgagggtgtaagaggctt     420
ccctcgctgccgttatgtgcacaaggtttctggaacagggccgtgtcctgaaggtttcgc     480
tttccacaaagaaggcgctttcttcctgtatgatcgactggcatcaacaatcatctatcg     540
aagcaccacgttttcagaaggtgttgtggctttcttgatcctccccaagactaaaaagga     600
ctttttccaatcaccaccactacatgaaccggccaatatgacaacagacccatccagcta     660
ctaccacacagtcacacttaattatgtggctgacaattttgggaccaatatgactaactt     720
tctgtttcaagtggatcatctaacttatgtgcaacttgaaccaagattcacaccacaatt     780
tcttgtccaactcaatgagaccatttatactaatgggcgtcgcagcaacaccacaggaac     840
actaatttggaaagtaaatcctactgttgacaccggcgtaggtgaatgggccttctggga     900
aaataaaaaaaacttcacaaaaaccctttcaagtgaagagctgtctgtcatacttgtacc     960
aagaagaagaacccggagggaaatcaccttgagaacacaagccaaatgtaatccgaacct    1020
acactattggacaacccaagatgaaggggctgccattggtctagcctggataccttactt    1080
cgggcccgcagcagagggaatttatacggaaggaataatgcacaatcaaaatgggctaat    1140
ttgcgggttgaggcaactagcaaatgagacgactcaagccctacagttattcttgcgtgc    1200
taccacggaattgcgcactttctccatattgaatcgaaaagccatcgacttcttacttca    1260
aagatggggaggaacgtgccacatcttaggcccagattgctgtattgagccccatgattg    1320
gactaagaac attactgaca agatagatca aatcattcat gatttcattg ataaacctct    1380
accagatcag acagataatg acaattggtg gacagggtgg aggcaatggg ttcctgctgg    1440
gattgggatc acgggggtaa taatcgcagt tatagcactg ctgtgtattt gcaaatttct    1500
actctagcta gctgtttagg cgatatccat gctcaaagag gcctcaatta tatttgagtt    1560
tttaattttt atgaaaaaaa ct                                             1582
<210> 15
<211> 2147
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации
транскрипции, последовательность GPMarburgvirus  и сигнал для терминации и
полиаденилирования
<400> 15
aacagagatcgatctgtttacgcgtatgtggactacatgcttctttatcagtctcatctt      60
aatccaagggataaaaactctccctattttggagatagccagtaacgatcaaccccaaaa     120
tgtggattcggtatgctccggaactctccagaaaactgaagacgtccatctgatgggatt     180
tacactgagcggtcagaaagttgctgattcccctttggaggcatccaagcgatgggcttt     240
caggacaggtgtacctcctaagaatgttgagtatacggaaggggaggaagccaaaacatg     300
ctacaatataagtgtaacggatccctctggaaaatccttgctgttagatcctcccaccaa     360
cgtccgagactatcctaaatgcaagactatccatcacattcaaggtcaaaaccctcatgc     420
gcaggggattgccctccatttgtggggagcatttttcctatatgatcgcattgcctccac     480
aacaatgtaccgaggcaaagtcttcactgaagggaacatagcagccatgattgtcaataa     540
gacagtgcacaaaatgattttctcgcgtcaaggacaagggtatcgtcacatgaatctgac     600
ttctactaacaagtattggacaagtagcaacggaacgcaaacaaatgacactggatgttt     660
cggtactcttcaagaatacaattctacgaagaaccaaacatgtgctccgtctaaaacacc     720
cccaccaccgcccacagcccatccggagatcaaacccacaagcaccccaaccgatgccac     780
tagactcaacaccacaaacccaaacagtgatgatgaggatctcacaacatccggctcggg     840
gtctggggaacaggaaccctatacgacttctgatgcggtcactaagcaagggctttcatc     900
aacaatgccacccactccctcaccgcaaccaggcacgccacagcagggaggaaacaacac     960
aaaccactcccaggacgctgcaactgaacttgacaacaccaatacaactgcacaacctcc    1020
catgccttcccacaacacgaccacaatctcgaccaacaacacgtccaaacacaacctcag    1080
caccctctccgaaccaccacaaaacaccaccaatcccaacacacaaagcatggccactga    1140
aaatgagaaaaccagtgcccctccgaaaacaaccctgcctccaacagaaagtcctaccac    1200
agaaaagagcaccaacaatacaaaaagccccaccacaatggaaccaaatacaacaaatgg    1260
acatttcact agtccctcct ccacctccaa ctcgactact caacatctta tctacttcag    1320
gaggaaacga agtatcctct ggagggaagg cgatatgttc cctttcctag atgggttaat    1380
aaatgctcca attgattttg atccagttcc aaatacaaag acaatctttg atgaatcttc    1440
tagttctggt gcttcagccg aggaagatca acatgcatcc tccaatatca gcttgacttt    1500
atcttatctt cctcatacaa gtgaaaacac tgcctactct ggagagaatg aaaatgattg    1560
tgatgcagag ctaagaattt ggagcgttca ggaggacgac ctggcagcag ggctcagttg    1620
gataccattc ttcggccctg gaatcgaagg actttatacc gctggtttaa tcaagaacca    1680
aaacaatttg gtctgcaggt tgaggcgtct agccaatcaa actgcaaaat ctttggaact    1740
cttactaagg gtcacaaccg aggaaagaac attttccttg atcaatagac atgctattga    1800
ctttctactc acaaggtggg gaggaacatg caaagtgctt ggacctgatt gttgcatagg    1860
aatagaggac ttgtccagaa atatttcaga acagattgac caaatcaaga aggacgaaca    1920
aaaagagggg actggttggg gtctgggtgg taagtggtgg acatccgact ggggtgttct    1980
tactaacttg ggcatcttgc tactattgtc catagctgtc ttgattgctc tatcctgtat    2040
ttgtcgtatc ttcactaaat atattggata ggctagctgt ttaggcgata tccatgctca    2100
aagaggcctc aattatattt gagtttttaa tttttatgaa aaaaact                  2147
<210> 16
<211> 1574
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации
транскрипции, последовательность GPMarburgvirus, модифицированная путем
удаления области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал для терминации и
полиаденилирования
<400> 16
aacagagatcgatctgtttacgcgtatgtggactacatgcttctttatcagtctcatctt      60
aatccaagggataaaaactctccctattttggagatagccagtaacgatcaaccccaaaa     120
tgtggattcggtatgctccggaactctccagaaaactgaagacgtccatctgatgggatt     180
tacactgagcggtcagaaagttgctgattcccctttggaggcatccaagcgatgggcttt     240
caggacaggtgtacctcctaagaatgttgagtatacggaaggggaggaagccaaaacatg     300
ctacaatataagtgtaacggatccctctggaaaatccttgctgttagatcctcccaccaa     360
cgtccgagactatcctaaatgcaagactatccatcacattcaaggtcaaaaccctcatgc     420
gcaggggattgccctccatttgtggggagcatttttcctatatgatcgcattgcctccac     480
aacaatgtaccgaggcaaagtcttcactgaagggaacatagcagccatgattgtcaataa     540
gacagtgcacaaaatgattttctcgcgtcaaggacaagggtatcgtcacatgaatctgac     600
ttctactaacaagtattggacaagtagcaacggaacgcaaacaaatgacactggatgttt     660
cggtactcttcaagaatacaattctacgaagaaccaaacatgtgctccgtctaaaacacc     720
cccaccaccgcccacagctcatccgaggaggaaacgaagtatcctctggagggaaggcga     780
tatgttccctttcctagatgggttaataaatgctccaattgattttgatccagttccaaa     840
tacaaagacaatctttgatgaatcttctagttctggtgcttcagccgaggaagatcaaca     900
tgcatcctccaatatcagcttgactttatcttatcttcctcatacaagtgaaaacactgc     960
ctactctggagagaatgaaaatgattgtgatgcagagctaagaatttggagcgttcagga    1020
ggacgacctggcagcagggctcagttggataccattcttcggccctggaatcgaaggact    1080
ttataccgctggtttaatcaagaaccaaaacaatttggtctgcaggttgaggcgtctagc    1140
caatcaaactgcaaaatctttggaactcttactaagggtcacaaccgaggaaagaacatt    1200
ttccttgatcaatagacatgctattgactttctactcacaaggtggggaggaacatgcaa    1260
agtgcttggacctgattgttgcataggaatagaggacttgtccagaaatatttcagaaca    1320
gattgaccaaatcaagaaggacgaacaaaaagaggggactggttggggtctgggtggtaa    1380
gtggtggacatccgactggggtgttcttactaacttgggcatcttgctactattgtccat    1440
agctgtcttgattgctctatcctgtatttgtcgtatcttcactaaatatattggataggc    1500
tagctgtttaggcgatatccatgctcaaagaggcctcaattatatttgagtttttaattt    1560
ttatgaaaaa aact                                                 1574
<---