Разработка новой химерной белковой конструкции для гидролиза бета-галактозидов

Разработка новой химерной белковой конструкции для гидролиза бета-галактозидов

Д. В. ГРИШИН

Московский государственный университет инженерной экологии Федерального агентства по образованию РФ, Москва

Design of a Novel Chimeric Protein Construction for Hydrolysis of Beta-Galactosides

D. V. GRISHIN

Moscow State University of Engineering Ecology, Moscow

Известно, что недостаточность фермента в-га-лактозидазы (лактазы), расщепляющей лактозу молока имеет особое значение в раннем детстве, так как дисахарид лактоза, содержащийся в молоке, является основным источником галактозы, которая в свою очередь участвует в синтезе галактоцеребро-зидов, необходимых для нормального развития ЦНС и сетчатки глаза, вследствие чего уменьшение количества лактозы и производных её гидролиза нежелательно, особенно в детском возрасте. Между тем 15—20% населения Земли стабильно подвержено синдрому мальабсорбции (СМА), который выражается, в частности, в лактозонепереносимости и сопряженных с этим явлением последствиях [1].

Наиболее радикальным и эффективным способом лечения СМА, является приём ферментных препаратов, расщепляющих лактозу, которые назначаются вместе с молоком и молочными продуктами (мезофильная в-галактозидаза), однако, в таком случае, наблюдается инактивация фермента и его выведение, вследствие физиологической перистальтики желудочно-кишечного тракта. Принципиально новым подходом к получению препаратов в-галактозидаз с улучшенными характеристиками является внедрение методов генной инженерии. С использованием этих методов возможно создание в-галактозидаз, обладающих повышенной термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с биологически совместимыми субстратами (декст-ран), что значительно облегчало бы процесс очистки фермента. Создание подобных ферментных препаратов становится возможным при использовании штаммов бактерий, трансформированных плазмидной ДНК, несущей ген в-галактозидазы с улучшенными свойствами. В настоящее время описан и получен рекомбинантный белок, обладающий активностью термостабильной в-галактозидазы [2]. А также получен штамм Е.соїі, экспрессирующий данный белок, однако данный

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. Редакция журнала «Антибиотики и химиотерапия»

фермент может быть иммобилизован только химическими методами, что способно привести к его значительной инактивации.

В настоящее время во Всемирном генетическом банке аннотированы последовательности декстрансвязывающих доменов, которые в виде индивидуальных белков способны к высокоаффинному связыванию с соответствующими субстратами (Кд =10-9) [3, 4].

Распространённая на сегодняшний день концепция разработки слитных генно-инженерных конструкций [5], позволила нам предложить стратегию получения химерного белка, обладающего одновременно двумя важными свойствами: лактазной активностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с декстраном.

Целью данной работы явилось создание рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей экспрессию белка ДСД-сп-^-ГАЛ, содержащего термостабильную бета-галактозидазу из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter ethanolicus (в-ГАЛ) и декстрансвязывающий домен из Leuconostoc mesenteroides (ДСД) в клетках E.coli. Кроме того, целью настоящей работы явилось получение штамма-продуцента E.coli, а также изучение физических свойств и ферментативной активности белка ДСД-сп-в-ГАЛ в лизатах клеток.

Материал и методы

Бактериальные штаммы и питательные среды, составы буферов, плазмидные векторы, олигонуклеотиды, используемые в работе. Штамм DH5a: E.coli [F"^80dlacZAM15A

Жидкая культура: LB + налидиксовая кислота (50 мг/мл).

Штамм М15: E.coli K12 [nals strs rif lac- ara- gal- mtl- F'-recA+, uvr+ lon+, pREP4 — kanamycin resistance 25 мг/мл]. Источник штамма: Qiagen (США). Чашка: LB + канамицин (25 мг/мл). Жидкая культура: среда LB + канамицин (25 мг/мл), pREP4 — экспрессия lac-репрессора.

Питательная среда LB (Luria Broth): 10 г/л пептон; 5 г/л дрожжевой экстракт; 10 г/л NaCl; pH 7,2, среда LB с ампициллином: LB-Medium + 100 мг/мл ампициллина. Среда LB для

-е-

e

селекции: LB-Medium + 100 мг/мл ампициллин + 40 мг/мл X-Gal + 0,2 мМ IPTG + 2,5 % агар.

Коммерческие плазмидные векторы: плазмида pQE-6 QIAGEN (США).

Используемые буферные системы: 50 х TAE (2,0 М трис-HCl; 50 мМ EDTA; 1,0 М уксусная кислота (ледяная), pH 8,8); 5 х DNA-буфер (250 мМ трис-HCl; 0,2 % Bromphenolblau; 40 % глицерол, pH 7,5); TBS (трис буфер Saline)); 5 х SDSPAGE-буфер (250 мМ трис-HCl; 10 мМ EDTA; 5 % (w/v) SDS; 0,005 % /3-меркаптоэтанол; pH 6,8); буфер (10 мМ трис-HCl, pH7,4—9,0; KCl 50 мМ; EDTA 1 мМ; 0,5% (v/v) твин 20; 0,2% (v/v) Тритон X100).

Олигонуклеотиды были синтезированы твёрдофазным амидофосфитным методом с помощью синтезатора АСМ-100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12% ПААГ (ЗАО «СИНТОЛ»; ЗАО «Евроген»).

Результаты исследования

Получение и клонирование гена ДСД из Leuco-nostoc mesenteroides. Копия гена декстрансвязываю-щего домена (ДСД) была получена благодаря ПЦР, с помощью прямого и обратного праймеров (сайты рестриктаз подчёркнуты), фланкирующих генную последовательность ДСД, при этом в качестве ДНК матрицы использовалась хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides.

Праймеры:

GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCAATCAGTATTAT NcoI BamHI

CAATTAGCAGATGGTAAA

RevGBD AGACTAAGATCT GGCTGACACAGCATTTCCATT BglII

ATTATCAAA

ПЦР проводили на приборе Терцик (ДНК

— технология, Россия). Реакцию проводят в 25 мкл реакционной смеси, которая содержала 2,5 мкл Taq pol PCR buffer 10х (СибЭнзим), дНТФ в конечной концентрации 400 мкМ, 4х10-7 М каждого праймера, 1 мкл Taq полимеразы (СибЭнзим) 5 ед. активности на реакционный объём, в качестве ДНК матрицы использовалась хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides. На реакционную смесь наслаивали 40 мкл вазелинового масла.

Параметры амплификации заключались в тридцатициклическом чередовании раундов денатурации, отжига праймеров и элонгации дочерних цепей [5]:

95°С — 5 мин; (94°С — 5 с, 60°С — 30 с, 72°С — 40 с) х 30; 72°С — 5 мин; 10°С — хранение. Режим программирования амплификации — точный.

Продукт амплификации размером 416 п. н. обрабатывали хлороформом, переосаждали этанолом и ресуспендировали в буфере трис-HCl 0,05 мМ, pH 7,5. Для дальнейшего клонирования ПЦР -продукт встраивался в коммерческий вектор pQE6 (Quageen, США), методом лигирования полученных рестрикционных

фрагментов по сайтам рестрикции NcoI, BglII/BamHI. Лигирование проводилось посредством ДНК-лигазы фага Т4 при 4°С в соответствующем буфере, в течение 24 часов. Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli М15, которые затем отбирали на агари-зованной среде LB с антибиотиками (ампициллин, канамицин). Затем плазмидная ДНК (pQEDBD) выделялась методом щелочного лизиса [6], проверялась методом рестрикционного анализа и секвенирования на автоматическом секвенаторе.

Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце. Создание гена ДСД-(01у-8ег)5, кодирующего белок ДСД и гли-цин-сериновый спейсер (G1y-Ser)5, необходимый в дальнейшем для пространственного разделения различных функциональных доменов, осуществлялось в два этапа методом «праймеро-посредованной прогулки», при этом происходило постепенное наращивание С-концевой спей-серной последовательности для чего были спланированы следующие праймеры.

GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCAATCAGTATTATCA NcoI BamHI

ATTAGCAGATGGTAAA

RevDBD-1: 5'-GGAGCCAGAACCCGGGGATCTTGCTGACAC-3'

RevDBD-2: 5'-AACTAAGCTTAGATCTGGCGCCAGAACCGGAAC HindIII BglII CAGAGCCGGAGCCAGAACC-3'

На первом этапе «праймер-опосредованной прогулки» использовались праймеры GBD11F и RevDBD-1, на втором — GBD11F и RevDBD-2, при этом, последний из праймеров спланирован внахлёст с RevDBD-1. Как видно для дальнейшего клонирования ПЦР фрагмента ДСД-(G1y-Ser)5 в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA) в праймерах были спланированы сайты эндонуклеаз рестрикции NcoI, BamHI, BglII и HindIII (отмечены на праймерах подчёркиванием). В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали плазмидную ДНК, полученную на предыдущем этапе pQEDBD. Амплификация проводилась в автоматическом режиме на приборе Терцик (Россия) при следующих условиях:

95°С — 5 мин; (94°С — 10 с, 60°С — 30 с, 72°С — 40 с) х 30; 72°С — 5 мин; 10°С — хранение. Режим программирования амплификации — точный.

Далее, по сайтам рестрикции NcoI и HindIII скорректированный ген ДСД, обладающий С-концевым спейсером был интегрирован в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, США), при этом была получена экспрессион-ная плазмида pQEDBDsp.

О

Є

Рис. 1. Общая схема организации химерных генноинженерных конструкций.

Р - промотор; Бй - сайт Шайна-Дальгарно; КСД, в-Гал -последовательности ДНК, кодирующие карбогидратсвя-зывающий домен и в-галактозидазу соответственно; Т -терминирующий кодон.

Рис. 2. Электрофорез длины рестрикционных фрагментов в 1% агарозном геле.

1) Маркер мол. массы (фаг лямбда EcoRI/HindIII);

2) pGD-10 (EcoRI/BglII, рестрикц. фрагменты 2706/2405 п. н.);

3) pGD-10, не рестрицированная;

4) pQELacZTm, (EcoRI/BglII, рестрикц. фрагменты 2405/ 2286 п. н.);

5) pQELacZTm, не рестрицированная;

6) Маркер мол. массы (фаг лямбда EcoRI/HindIII).

Получение экспрессионной плазмиды pGD-10 с геном химерного белка ДCД-cп-^8-ГAЛ.

Плазмидная конструкция pGD-10 с геном химерного белка ДCД-сп-в-ГAЛ (рис. 1) была собрана посредством лигирования ранее полученных экспрессионных плазмид pQEDBDsp (c геном ДОД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на C-конце) и pQELacZTm (pR624) (c геном термостабильной бета-галактозидазы из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter ethanoli-cus, любезно предоставлена к. х. н. Cергиенкo

О. В .) по рестрикционным сайтам BglII/BglI и BamHI/BglI соответственно.

Tрaнсфoрмaцию и молекулярное субклонирование в E.coli DH5a проводили по стандартным методикам [6]. Выделение плазмидной ДНК осуществляли посредством метода щелочного лизиса. Доказательство введения рекомбинантных ДНК в бактерии осуществлялось на

Рис. 3. Электрофорез ПЦР продуктов в 1% агарозном геле.

1) ПЦР продукт гена белка ДСД-сп-в-ГАЛ, проба № 1 (2683 п. н.);

2) Отрицательный контроль (pQE6, Taq полимераза);

3) ПЦР продукт гена белка ДСД-сп-в-ГАЛ, проба № 2 (2683 п. н.);

4) Отрицательный контроль (pQE6, Taq полимераза);

5) ПЦР продукт гена белка ДСД-сп-в-ГАЛ, проба № 3 (2683 п. н.);

6) Отрицательный контроль (pQE6, Taq полимераза);

7) Маркер мол. массы (фаг лямбда EcoRI/HindIII).

основе анализа выделенных плазмид с помощью рестрикционного скрининга, при этом наблюдался сдвиг полос на ожидаемую величину относительно контроля (трек 4) (рис. 2). Идентичность клонированного в составе вектора pGD-10 гена ДСД-сп-в-ГАЛ (размер гена 2683 п. н.) была подтверждена с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР), посредством прямого (GBD11F) и обратного праймеров (Revgal), фланкирующих целевую генную последовательность:

GBD11F 5'-CCACCGCCATGGATGGGATCCAATCAGTATT ATCAATTAGCAGATGGTAAA-3'

Revgal: 5'- GAGAAGACGAAAGGGCCTATAACGCCTATTTT TATAGGTTAAAATG-3'

Параметры амплификации:

95°С - 5 мин; (94°С - 20 с, 60°С - 30 с, 72°С

— 2,5 мин) х 30; 72°С — 5 мин; 10°С — хранение. Режим программирования амплификации — точный. Продукты амплификации детектировались в 1% агарозном геле (рис. 3).

В итоге была проклонирована, а также методами ПЦР и анализа длины рестрикционных фрагментов секвенирована нуклеотидная последовательность гена белка ДСД-сп-в-ГАЛ.

Получение бактериального штамма — продуцента, обеспечивающего экспрессию белковой конструкции ДСД-сп-8-ГАЛ в цитоплазме клеток E.coli. Данный этап работы заключался в трансформации клеток E.coli DH5a полученной плазмидной ДНК pGD-10. Выбранный по результа-

Є

Рис. 4. Электрофорез в 10% ПААГ в присутствии SDS.

1) Штамм 0Н5а - до индукции,

2) Штамм 0Н5а [рв010] - до индукции,

3) Штамм 0Н5а - индукция,

4) Штамм 0Н5а [рв010] - индукция,

5) Штамм 0Н5а до индукции; термолиз (75°С),

6) Штамм 0И5а [рв010] - до индукции; термолиз (75°С),

7) Штамм 0И5а [рв010] - индукция; термолиз (75°С),

8) Штамм 0И5а - индукция; термолиз (75°С),

9) Маркер мол. массы (Taq полимераза, 94,5кДа).

там секвенирования продуцент Е.еоН БИ5а [р0Б-10] выращивали на агаризованной среде ЬБ, содержащей антибиотики ампициллин и налидиксовую кислоту для селекции; синтез белка индуцировали добавлением изопропил-в-Б-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в конечной концентрации 0,3 мМ, при достижении оптической плотности 0Б=0,9. Время индукции составляло 4,0 ч. Клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции, термолизу (75°С), после чего клеточный дебрис осаждали центрифугированием и собирали супернатант (растворимая фракция белка). Уровень экспрессии целевого белка с молекулярной массой 102,3 кДа составлял порядка 15% от общего клеточного белка, что продемонстрировано на электрофорезе в 10% полиакриламидном геле относительно соответствующих контролей (рис. 4), в присутствии додецил-сульфата натрия (БОБ). При этом, параллельно, посредством термолиза была доказана растворимость полученного белка (присутствие в супернатанте) и его термостабильность, что принципиально важно в тех случаях, когда необходимо избавиться от фоновой активности мезофильной бета-галактозидазы.

Изучение бета-галактозидазной активности целевого белка в клеточных лизатах. Для изучения бета-галактозидазной активности химерной белковой конструкции ДСД-сп-в-ГАЛ в лизатах БИ5а (1ае7-), клетки с экспрессионной плазмидой р0Б-10 выращивали в 4 мл среды ЬБ до достижения оптической плотности 0,4—0,9

при 1=600 нм, затем пробу индуцировали добавлением 4 мкл 0,3М ИПТГ, при этом время индукции составило 4 ч. Затем, отбирали 500 мкл индуцированной культуры, осаждали 10 мин при 6000 об/мин и ресуспендировали в 500 мкл рабочего буфера, содержащего 50 мМ трис-ИС1; 10мМ СаС12, 10тМ МпС12; 0,1 мМ в-меркапто-этанола при рИ=7,4. После этого пробу лизи-ровали ультразвуком, либо чередованием замораживания и оттаивания проб при -20°С, после чего избавлялись от клеточного дебриса центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин.

Далее в супернатанте лизатов клеток определяли собственно бета-галактозидазная активность белка ДСД-сп-в-ГАЛ по способности гидролизовать хромогенный аналог лактозы — ОНФГ (орто-нитро-фенил-в-Б-галактопира-нозид) с образованием галактозы и окрашенного в желтый цвет соединения 2-нитрофенола. С этой целью к 0,1 мл осветлённого лизата добавляли 0,7 мл рабочего буфера и 0,2 мл ОНФГ (4 мг/мл), после чего реакционную смесь инкубировали 10—15 мин при оптимальной для белков подобного класса температуре 65°С. Останавливалась реакция добавлением раствора 1М карбоната натрия.

За единицу активности принимали количество 2-нитрофенола, образующегося за 1 мин. Концентрацию 2-нитрофенола рассчитывали спектрофотометрически при 1=420 нм. Расчёты производились по модифицированной формуле Миллера (1):

(1) а = Б420 / т и Б

*600)

где: а — активность фермента (ед/мкл), Б420 — измеренное значение плотности для реакционной смеси, Б600 — оптическая плотность клеточной суспензии перед определением, т — время реакции, мин, и — объём культуры, взятой для определения, мл [7].

В ходе расчётов было определено, что ферментативная активность нашего белка в лизатах клеток составила порядка 5 ед/мкл при 65°С и рН 7,4.

Выводы

1. Проведено планирование и в составе экспрессионной плазмиды р0В10 клонирование гена химерного белка ДСД-сп-в-ГАЛ.

2. Определена термостабильность и растворимость рекомбинантного белка ДСД-сп-в-ГАЛ в лизатах клеток Е.соїі ВИ5а.

3. Продемонстрирована ферментативная бета-галактозидазная активность целевого белка в лизатах клеток Е.соїі ВИ5а.

e

ЛИТЕРАТУРА 4 Hashimoto M., Ikegami T., Seino Sh. et al. Department of Biosystem

Science, Kyoto, Japan, J Bacteriology 2000; 11: 3045—3054.

1. Ладодо К. С. Руководство по лечебному питанию детей, М.: 2000; 5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология (принци-

384. пы и применение). М.: 2002; 158—330.

2. United States Patent. Pub№.: UniProt №Y08557, Pub.Date: 6. Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование: учебник. М.:

December 15, 1998. 1984; 450.

3. Morisaki H, Igarashi T, Yamamoto A., Goto N. Department of Oral 7. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике / Под редак-

Мюге^юк^, Showa University School of Dentistry, Shinagawa-ku, цией Алиханяна С. И. М.: 1976; 324—327.

Tokyo, Japan, Letters in Applied МюгоЬю^у 2002; 35: 223—227.