Изотопные данные показывают: углеродный метаболизм в фотосинтезирующей клетке - колебательный процесс

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ

Известия ТСХА, выпуск 1, 2009 год

УДК 581./32:577.124

ИЗОТОПНЫЕ ДАННЫЕ ПОКАЗЫВАЮТ: УГЛЕРОДНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ В ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ КЛЕТКЕ — КОЛЕБАТЕЛЬНЫЙ ПРОЦЕСС

А.А. ИВЛЕВ

Предлагаемая оецилляционная концепция рассматривает фотосиитез как колебательный процесс, состоящий из фазы ассимиляции С02 и фазы фотодыхания, во время которых меняется движение потока углеродных субстратов в цикле Кальвина. Смена режимов функционирования цикла происходит благодаря двойственной способности ключевого фермента фотосинтеза — Рубиско работать как карбоксилаза и как оксигеназа в зависимости от периодически меняющегося в клетке отношения концентраций С02/02. Концепция обосновывается большим фактическим материалом, в основном связанным с фракционированием изотопов углерода в клетке. Данный материал включает факты, свидетельствующие о существовании в клетке двух изотопноразличающихся потоков углеродных субстратов, подтверждающие связь внутримолекулярной изотопной неоднородности в глюкозе крахмала запасающих органов растений с фотодыхательной фазой работы цикла Кальвина, данные по динамике изотопного состава углерода С02 при темновом дыхании, а также факты, не связанные с изотопными эффектами.

Ключевые слова: гипотеза о фотосинтетических осцилляциях.

Анализ литературы по фотосинтезу показывает, что практически все исследователи, занимающиеся изучением углеродного метаболизма, считают, что фотосинтез - стационарный процесс, в котором все реакции на свету протекают непрерывно, одновременно и в стационарном режиме. С этих позиций делаются попытки его описать [29, 43, 44]. В настоящей работе, опираясь на изотопные данные по углероду (13С/12С), мы попытаемся аргументировать другое утверждение: фотосинтез - это колебательный процесс, состоящий в чередовании процессов ассимиляции С02 и фотодыхания, что соответствует смене направления движения потоков углеродных субстратов в цикле Кальвина с синтеза глюкозо-

б-фосфата (Г6Ф) из С02 в фазу ассимиляции на окисление образовавшегося Г6Ф до С02 в фазу фотодыхания. Регулятором переключений является ключевой фермент фотосинтеза Рубиско (рибулозобисфосфаткарбоксилаза / оксигеназа), способный функционировать как карбоксилаза и как оксигеназа в зависимости от периодически меняющегося в клетке отношения концентраций С02/02 [34].

Первым шагом в направлении доказательства колебательной природы фотосинтеза явился открытый нами в 1993 г. изотопный эффект фото дыхания со знаком, противоположным знаку изотопного эффекта фотосинтетичес-кой ассимиляции [8]. До этого считалось, что фотосинтез сопровождается

только изотопным эффектом ассимиляции С02, который приводит к обогащению ассимилированного углерода (биомассы) изотопом 12С относительно С02 атмосферы. Этот феномен был назван изотопной дискриминацией 13С. Мы обратили внимание на некоторые факты, которые не укладывались в эту гипотезу и считались артефактами. Это накопление 13С в первичных ассими-лятах [23], преимущественное поглощение 13С, а не 12С в опытах по газообмену [3]. Обычно упомянутые факты отмечались, когда вместо С02 воздуха использовался С02, обогащенный «тяжелым» изотопом 13С. При постепенном увеличении в питающем С02 содержания «тяжелого» изотопа отмечалась инверсия знака изотопного эффекта. В биомассе накапливался изотоп 13С [5]. Сопоставив эти и другие факты, связанные с влиянием на изотопную дискриминацию таких внешних факторов, как соленость, влагодоступность, интенсивность освещения, отношение С02/02 в среде, мы пришли к выводу, что, вероятно, существует другой, неизвестный в то время, изотопный эффект, который, скорее всего, связан с фотодыханием и имеет знак противоположный знаку эффекта ассимиляции. Его не обнаруживали, поскольку он маскировался большим по величине изотопным эффектом ассимиляции С02. Проанализировав гликолатный путь фотодыхания, мы пришли к выводу, что узлом фракционирования изотопов углерода, по-видимому, является реакция ферментативного де-карбоксилирования глицина — одна из ключевых реакций фотодыхания [34]. Сделав такое предположение, мы вместе с проф. А.У. Игамбердиевым и его сотрудниками стали исследовать эту реакцию in vitro и, действительно, обнаружили в ней фракционирование изотопов углерода, но эффекты были обоих знаков [3, 12]. Доказать, что in vivo возникает эффект со знаком, противоположным знаку эффекта ассимиляции удалось после того как совмест-

но с зарубежными исследователями мы изучили фотодыхание у дикого вида ячменя и ячменя-мутанта с редуцированной глициндегидрогеназной функцией [30]. Для этого методами генной инженерии в пластиды растения был внедрен модифицированный ферментный комплекс. Предсказанное обогащение биомассы мутантного растения легким изотопом 12С по сравнению с диким видом подтвердилось (табл. 1) Это означало, что in vivo при фотодыхании возникает эффект, сопровождаемый утяжелением биомассы, и местом его возникновения является реакция декарбоксилирования глицина.

Таблица 1

Изотопный состав углерода листа ячменя дикого вида и ГДГ-мутанта [29]

Растение Воз- раст, нед. 513С%о

Ячмень, дикий вид 1 -39,0±0,7

6 -31,3+0,6

Ячмень, ГДГ-мутант 1 —45,5±0,6

6 -37,5±0,3

Примечание. Принято изотопный состав углерода образцов выражать в единицах б, представляющих нормированную разность отношений изотопных концентраций 13С/12С в образце и стан-

(^С) _

\ 12р /обр \12р/станд . _о

дарте 613С = ------тт-----------10 • В каче-

/^С\

\ 12 0 /станд

стве стандарта используется изотопный состав углерода карбоната кальция из белемнита, в котором отношение 13С/12С равно 1123 • 10-5.

Здесь и далее величины 613С%о даны в %о относительно стандарта РДВ.

Точно такие же опыты были повторены на арабидопсисе и картофеле. Получены аналогичные результаты [31].

Каким же образом представление о двух изотопных эффектах с противоположными знаками, сопровождающих фотосинтез, приводит к выводу о колебательном характере самого процесса? Чтобы ответить на этот вопрос, рассмотрим, каким образом в клетке

происходит периодическое изменение концентраций С02/02, переключающее Рубиско с карбоксилазной функции на оксигеназную и обратно.

Вероятный механизм переключений [33] основан на следующем допущении. Скорость ферментативных реакций карбоксилирования РиБФ и декарбок-силирования глицина существенно больше скорости диффузии С02 в клетку и из нее. В пользу этого говорит низкая энергия активации, экспериментально обнаруженная при изучении проводимости по С02 клеток мезофилла (10,2-12,5 кдж\моль при 15-25°С) [21].

Тогда в некоторый момент времени (т. 1 на рис. 1), соответствующий карбоксилазной фазе функционирования РБФК/О, когда концентрация С02 в клетке равна концентрации С02 в среде, углекислый газ поступает в клетку благодаря градиенту концентраций в среде и у мест карбоксилирования, создаваемому фиксацией углекислого газа на ферменте. Так как скорость

карбоксилирования РиБФ на ферменте выше скорости диффузии, концентрация С02, а точнее отношение концентраций С02/02 (концентрацию 02 в клетке мы принимаем постоянной) падает вплоть до некоторого критического уровня (т. 2 на рис. 1), соответствующего переключению Рубиско на оксигеназную функцию. На участке 1~2 диффузия С02 увеличивает его концентрацию в клетке, а карбокси-лирование уменьшает, т.е. их влияние противоположно (показано стрелками на рис.1). Чтобы избежать потерь на бесполезную рециркуляцию субстрата, переключения в клетке должны происходить триггерно (резко).

После переключения на оксигеназную функцию Рубиско концентрация С02 в клетке начинает возрастать, только на этот раз скорость диффузии С02 оказывается меньше скорости глициндекарбоксилазной реакции. Благодаря этому концентрация С02 в клетке возрастает, достигает уровня содержания в среде (т. 3 на рис. 1), а затем

Верхний уроиемь СО^ еклк>ча»<шшй карАоксняйзнум функцию РБФКД)

СО*, 11 Уровень С02 в аяиасферр ч 1/

У X А Выбрей; СОз ?]\ |

Р \ I го клетки I \ /

о \ / ^-----Г—'—\ : >

8 \ Н /И ! -И Гн ' \ ! /

ь \ / ! (Кар и оксила^^ал 8 /

\ / | I..../

Нижн**ц уровень СО2, вкпючающир окенген^знук» функцНс Р^ФКЮ

^Юксигеназная фаза?

Г й птП IV !

Полньш цикл

Рис. 1. Схема предполагаемого механизма переключения РБФК/О с карбоксилазной функции на оксигеназную и обратно

превосходит его. На этом временном участке, соответствующем отрезку 2-3 кривой изменения концентраций, гли-циндекарбоксилазная реакция и диффузия действуют в одном направлении, увеличивая концентрацию С02 в клетке. На временном отрезке 3-4 концентрация С02 возрастает до тех пор, пока не достигнет верхнего критического значения, соответствующего переключению фермента на карбоксилаз-ную функцию (т. 4 на рис. 1). При этом влияние диффузии и реакции декар-боксилирования глицина на концентрацию С02 в клетке будет противоположным. Диффузия будет приводить к выбросу углекислого газа в среду, т.е. к понижению его концентрации внутри клетки, а реакция - наоборот. После переключения фермента на кар-боксилазную функцию (отрезок 4~Г) влияние диффузии и реакции карбо-ксилирования вновь становится однонаправленным в сторону снижения концентрации С02 в клетке. Это будет продолжаться вплоть до момента, пока концентрация в клетке не сравняется с концентрацией С02 в среде (т. Г на рис. 1). Далее все процессы повторяются. Из механизма следует, что собственно фотодыхание, под которым понимается удаление С02 из клетки в среду, захватывает только часть ок-сигеназной фазы (кривая 3-4) и часть карбоксилазной фазы (кривая 4-1'), когда концентрация С02 в клетке выше, чем в среде. В рассмотренном механизме точки пороговых значений отношений С02/02 2 и 4, при которых происходит срабатывание фермента со сменой функции, играют особую роль. По существу, они определяют продолжительность фаз ассимиляции и фотодыхания и вклад последних в метаболизм фотосинтеза. Пороговые значения С02/02 зависят от ряда факторов, в т.ч. внешних, и связаны с адаптационной способностью организма.

В карбоксилазную фазу работы Ру-биско цикл Кальвина работает на кар-боксилирование, как показано на ри-

сунке 2. Так как при этом происходит фракционирование изотопов углерода при карбоксилировании РиБФ, то образующийся в эту фазу Г6Ф оказывается обогащенным 12С относительно С02 среды на величину изотопной дискриминации. Более того, благодаря рандомизации атомов в транскетолазных и трансальдолазных реакциях, атомы углерода в Г6Ф и в других ассимиля-тах, образующихся в эту фазу, оказываются приблизительно одного и того же изотопного состава. Часть Г6Ф, образующегося в карбоксилазную фазу, запасается в резервных углеводных фондах в виде полисахаридов, которые используются клеткой в темновой период для синтеза определенных метаболитов. Изотопный состав последних и распределение изотопов углерода будет определяться соответствующими характеристиками Г6Ф.

После переключения Рубиско на оксигеназную функцию оставшийся в фонде Г6Ф в виде лабильных углеводов устремляется в гликолатную цепь фотодыхания, где происходит синтез продуктов фотодыхания (оксалатов, гликолевой кислоты, ряда аминокислот серина, глицина, пролина) (рис. 3). Часть Г6Ф запасается в виде сахарозы, из которой в темновой период происходит синтез органических кислот. Поскольку в гликолатной цепи фотодыхания происходит фракционирование изотопов углерода в глициндекар-боксилазной реакции, в фонде Г6Ф, питающем фотодыхательную петлю, накапливается «тяжелый» изотоп 13С. Причем, чем интенсивнее фотодыхание (чем большее число оборотов совершает углеродный поток в фотоды-хательной петле), тем сильнее аккумулируется в фонде Г6Ф изотоп 13С. В силу кинетической природы изотопного эффекта декарбоксилирования глицина (изотопный эффект проявляется лишь по местам деструкции углеродных связей) изотопное распределение Г6Ф в оксигеназную фазу становится неоднородным, порождая «тяжелый»

‘СКгО©

ноос-сон

сн2о

7'С=0

СН2ОН

БИАР

СН20

Х5Р

Рис. 2. Схема работы цикла Кальвина в карбоксилазную фазу функционирования Рубиско

изотопный состав и неравномерное изотопное распределение в тех метаболитах, синтез которых связан с фондом Г6Ф в эту фазу. Такова последовательность метаболических событий, вытекающая из представлений о колебательном характере фотосинтеза и возникающем при этом сопряжении изотопных эффектов.

Факты и теоретические основания, говорящие в пользу гипотезы об осцилляциях

Как же аргументировать описанную последовательность событий?

1. Прежде всего, она предполагает существование «легкого» и «тяжелого» потоков метаболитов, источником углерода для которых является Г6Ф, накапливаемый в карбоксилазную и окси-

геназную фазы соответственно. Действительно, как видно из таблиц 2—4, к «легкому» потоку относятся метаболиты, синтез которых связан с гликолити-ческой цепью (большинство аминокислот, липидов), к «тяжелому» потоку — метаболиты фотодыхания (лабильные сахара, оксалаты, пролин) и органические кислоты. Это имеет место независимо от типа фотосинтезирующего организма.

На рисунке 4 представлены некоторые растительные глюкозилонаты. Это сложные молекулы, в синтезе которых принимают участие оба потока. В амигдалине и глюкозиналбине углеводные фрагменты значительно «тяжелее» агликоновых частей [42]. В холи-новом эфире синаповой кислоты холи-новый спирт синтезируется с участи-

<'Т’Н20 8 НСОН -

соон

РСА

<^Н20

сн2о

5 НеОН

СН2ОН ,1 2 _'е=0_ _

ноен

НСОН I

|_ А-НгР.!

87Р

САЪУШ

сн2он 2 НОСН

неон

ен2о

ЫиЕР

2 НОСН НСОН

ен2о

Х5Р

V

6С5

ен2о

Х5Р

!ун2о

6 неон — соон

Р1ю5рЬост1усега1е

ен2о©

вбр

СЬУСОЬАТЕ СНАШ

6 •&онтау“и“

8С1

1С,

ДНз

зс, Л

бнегш2 С11пе

СООН

5>Н2ОН (Ф^орв ЗНСГШ2 Х^-Э*С02

9 С

$Сп

6 С о

Рис. 3. Схема работы цикла Кальвина в оксигеназную фазу функционирования Рубиско

ем серина [6], углеродный скелет которого также значительно «тяжелее» остальной части молекулы. Обогащен-ность изотопом 13С во всех случаях объясняется синтезом из углеводов, накапливаемых в оксигеназную фазу.

2. Другим аргументом в пользу ос-цилляционной концепции стало обнаружение специфической изотопной

неоднородности в углеродном скелете ГбФ, синтезированного в оксигеназную фазу. Она, как было сказано выше, обусловлена кинетической природой изотопного эффекта, сопровождающего декарбоксилирование глицина. Чтобы представить, каким должно быть распределение изотопов углерода в ГбФ, следует иметь в виду, что в гли-

Таблица 2

Распределение 13С (613С%о в РОВ единицах) в биомассе и биохимических фракциях морской водоросли С1юге11а БИдта^рИога, выращенной в условиях различной солености.

613С питающей С02-21%о[11,17].

Концентрация NaCI

Параметр в среде, тМ

0 425 595

Сухая биомасса, %о -61,6 -59,0 -64,5

Липиды, %о -66,0 -65,0 -63,8

Белки, %о -42,1 -40,9 -47,3

Лабильные сахара, %о -30,0 — -30,5

Пролин, %о -29,0 — -31,5

колатный цикл поступает ГбФ, накопленный в карбоксилазную фазу и имеющий практически равномерное распределение изотопов углерода в скелете.

На первом витке гликолатного цикла до начала декарбоксилирования у глицина сохраняется равномерное распределение изотопов, унаследованное от исходного ГбФ. Однако после превращения в митохондрии двух молекул глицина в серин и отщепления С02 в образующемся серине распределение изотопов углерода становится неравномерным. Поскольку далее серин ис-

Таблица 3

Изотопный состав углерода биохимических фракций, выделенных из листьев Clusia minor, выросших при различных внешних условиях [27]. Пробы отобраны на рассвете и на закате

Мокрый сезон Сухой сезон

Фракция «экспониров» ЛИСТ «затененный» лист «экспониров» лист «затененный» лист

рассвет рассвет закат закат

Общий углерод -25,7 -30,3 -24,6 -29,1

Липиды и пигменты -28,7 -32,2 -27,7 -30,8

Аминокислоты -31,7 -32,6 -31,3 -32,7

Растворимые сахара -21,2 -29,2 -17,9 -21,9

Органические кислоты -22,3 -27,7 -21,1 -24,5

Таблица 4

Изотопный состав углерода листа и оксалата некоторых С3

оксалатнакапливающих растений [37, 38]

Вид растения Тип ассимиляции Лист Оксалаты Ссылка

Spinaceae oleracea С3 -27,5 -11,9 37

Spinaceae oleracea С3 -25,7 -19,9 38

Pelagronium С3 -31,0 -12,4 37

Mereurialis perennis С3 -27,9 -13,7 37

Echinomastus intertextus САМ -13,4 -7,3 38

Echinomastus horizonthalomus САМ -13,0 -7,8 38

Escobaria ruberoulosa САМ -12,3 -8,3 38

Opuntia euglemannii САМ -13,3 -8,5 38

Opuntia imbricata САМ -14,1 -8,7 38

пользуется при синтезе ГбФ, последний также приобретает изотопную неоднородность. Для того чтобы оценить изотопную неоднородность сери-на, рассмотрим фракционирование изотопов, которое происходит в глицин-

дегидрогеназном комплексе (рис. 5). При декарбоксилировании глицина в силу кинетического изотопного эффекта деструкции С - С связи в углеродных атомах недеструктированного глицина накапливается изотоп 13С (на рис. 5 ато-

-28.1 -22.9

N=0—Н,С—0| — гентобиоза

амнгдалин из семян горького миндаля

(ДОото,

отодыхание)

^N-080,

ОН глюкозиналбин

из листьев белой горчицы

Н С=СН- С= О ^фТтоСд& От СН—СН^-МСН3)3

Н3ССГ

2 ’-'*21 -26.0 I

ОН

холиновый эфир синаповой кислоты

Рис. 4. Изотопное распределение углерода в некоторых растительных глюкозилонатах. Цифры рядом с молекулами обозначают величины 613С изученных частей.

Данные из работы [20]

Н2С1Ш2

н2егш2

°соон

Глицин

соон е-сн2 -

СООН Гшпдшдегидрогеназный

ТГФК

—^ТГФК-*СН2

со.

сно

*1

неон

*1

носн

неон

неон

вён2о

ГбФ

^Н20

неон

еоон

ФГК

\/

сн2он

ксж?

*1 2 „ соон

Серии

V

<-

Рис. 5. Схема реакций, происходящих в глициндегидрогеназном комплексе, поясняющая возникновение изотопной неоднородности в Г6Ф в оксигеназную фазу работы Рубиско.

Пояснения в тексте

мы обозначены звездочкой), а в образующемся С02 и в метиленовой группе, которая связывается с переносчиком одноуглеродных фрагментов тет-рагидрофолиевой кислотой

накапливается 12С (на рис. 5 помечены залитыми кружочками). ТГФК переносит метиленовый атом и присоединяет его к молекуле недеструктированного глицина, который превращается в се-

рин [36]. Таким образом, у серина карбоксильный и смежный с ним атом углерода оказываются обогащенными «тяжелым» изотопом, а концевой ме-токсильный атом — «легким».

При синтезе Г6Ф из серина его скелет формируется таким образом, что «тяжелый» карбоксильный атом серина оказывается в положениях С-3 и С-4 атомов Г6Ф. Атомы в положениях С-2 и С-5 в результате перемешивания оказываются несколько «легче», чем С-3 и С-4, но «тяжелее» общего углерода Г6Ф, а атомы в положении С-1 и С-6 ГбФ оказываются «легче», чем углерод исходного субстрата. Расчет численного примера [6], представленный в таблице 5, показывает, что

на втором и последующих оборотах цикла эта неравномерность сохраняется и усиливается. Чем больше интенсивность фотодыхания, т.е. чем больше оборотов делает углеродный поток в фотодыхательной петле, тем «тяжелее» становится углерод Г6Ф, и тем сильнее изотопные различия атомов, составляющих его скелет (см. табл. 5).

Анализ имеющегося в литературе материала по изучению изотопного распределения углерода в углеводной фракции растений выявил, что распределение, сходное с вышеописанным, имеет глюкоза, выделенная из крахмала их запасающих органов (табл. 6). Следовательно, есть основания считать, что крахмал запасающих орга-

Таблица 5

Результаты расчёта распределения изотопов углерода Г6Ф, остающегося в фотодыхательном фонде по мере его исчерпания за п оборотов цикла Кальвина

Номер атома Число оборотов, п

10 20 30 40 50 60 70 80 90

1 -20,3 -20,7 -21,1 -21,4 -21,9 -22,4 -23,0 -23,7 -24,6

2 -19,7 -19,4 -19,1 -18,7 -18,3 -17,8 -17,2 -16,4 -15,2

3 -19,5 -18,8 -18,1 -17,3 -16,4 -15,2 -13,8 -11,9 -8,8

4 -19,5 -18,8 -18,1 -17,3 -16,4 -15,2 -13,8 -11,9 -8,8

5 -19,7 -19,4 -19,1 -18,7 -18,3 -17,8 -17,2 -16,4 -15,2

6 -20,0 -20,7 -21,1 -21,4 -21,9 -22,4 -23,0 -23,0 -24,6

Примечание. Расчёт проводился с учётом величины кинетического изотопного эффекта декарбоксилирования глицина, равной о, = '2к/**к = 1,020. Изотопной состав углеродных атомов Г6Ф, поступающего в цикл после карбоксилазной фазы, принят равным -20%о [6].

Таблица 6

Распределение изотопов углерода в глюкозе крахмала запасающих органов

ряда растений [4, 13, 39]

Объект 613C глюкозы > о и С| - 613СГЛюкозы, і- номер атома

ОСН(1) - НС(2)ОН - ОНС(з)Н - НС(4)ОН - X О о X С(6)Н2ОН

с. с2 С3 с4 с5 с6

Beta vulgaris, клубень -25,2 -1,6 -0,4 +2,1 +6,3 -1,7 -5,1

Zea mays, семена -10,8 -1,7 -0,1 + 1,1 +3,6 -0,2 -3,6

Zea mays, семена -12,5 -3,1 +1,9 -1,9

Triticum aestivum, семена -23,1 -7,1 +3,5* -7,1

Solanum tuberosum, клубень -24,9 -9,1 +4,5* -9,1

Oryza sativa, семена -26,1 -6,9 +3,5 -6,9

Pisum sativum, семена -24,9 -4,1 +2,1* -4,1

Примечание. Изотопные сдвиги углеродных атомов Д13С (%о) приведены относительно общего углерода глюкозы.

Величины б13С атомов С-3 и С-4 рассчитывались по данным [24] из предположения, что изотопный состав углерода остальных атомов равен изотопному составу атомов С-1

Ъно

2!

нс-он

з1

но-с

41

нс-он

нс-он

б!

СН2ОН

Рис. 6. Схема, иллюстрирующая унаследованность углеродных атомов глюкозы продуктами ее деструкции при ферментации

нов растений синтезируется с участием Г6Ф, образующегося в фазу фотодыхания.

С этим согласуется и изотопное распределение, полученное при анализе продуктов деструкции глюкозы при ее ферментации [28]. Как видно из рисунка 6, образующийся при ферментации С02 наследует атомы С-3 и С-4 глюкозы, а этиловый спирт — атомы С-1, С-2, С-5 и С-6 соответственно. Собранный углекислый газ оказался заметно «тяжелее» общего углерода молекулы, а углерод этанола, напротив, «легче». Другими словами, все исследователи получили согласующиеся между собой результаты.

Следовательно, можно сделать вывод, что в глюкозе крахмала запасающих органов растений изотопное распределение соответствует предсказываемому для глюкозы, синтезируемой в оксигеназную фазу, а значит, является аргументом в пользу существования осцилляций.

В пользу этого говорит и то, что запасающие органы растений формируются на поздних этапах онтогенеза, когда растения проявляют многочисленные признаки того, что в это время фотодыхание значительно усиливается. Действительно, на этапах цветения, созревания и плодоношения

происходит накопление в старых листьях окисленных продуктов гликолат-ного цикла, увеличивается концентрация перекиси водорода, усиливается активность пероксидазы [15, 16]. На усиление фотодыхания указывает и наблюдаемое в эти периоды изотопное утяжеление биомассы растений [35], и ряд других признаков [32, 41].

Возможный вклад в образование глюкозы крахмала запасающих органов глюкозы, синтезированной в кар-боксилазной фазе, не может исказить вышеописанное изотопное распределение, поскольку глюкоза, синтезируемая в карбоксилазной фазе, должна иметь приблизительно равномерное изотопное распределение. Сказанное не только свидетельствует в пользу осцилляций, но также позволяет сделать вывод о значительной биосинтетической роли фотодыхания, особенно проявляющегося на стадии формирования запасающих органов.

3. Другое свидетельство существования фотодыхательной глюкозы, а значит и двух фаз колебательного режима у цикла Кальвина, дает сопоставление внутримолекулярных изотопных распределений глюкозы крахмала запасающих органов у С3 и ^-растений. Хобби и Вернер [28], изучив такие распределения и усреднив их, установили, что у глюкозы крахмала из С3-растений изотопная неоднородность выражена гораздо резче. Результаты их исследования представлены в таблице 7, из которой видно, что в С4-растениях глюкоза крахмала имеет принципиально такое же распределение, как и глюкоза крахмала у С3-рас-тений, только внутримолекулярная изотопная неоднородность у нее гораздо менее выражена. Эта особенность согласуется с тем известным фактом, что С3-растения отличаются от С4-рас-тений гораздо более интенсивным фотодыханием. Выше отмечалось, что чем интенсивней фотодыхание, тем сильнее выражено изотопное утяжеление глюкозы и тем больше прояв-

ы

сн2он

3со2

со2

5сн2он

6сн3

Таблица 7

Сопоставление усредненных изотопных распределений в глюкозе крахмала из запасающих органов у С3 и С4-растений [28]

Номер атома Д(Сз) Д(С4) 0 1 о <

С-1 -1,3 +0,9 -2,2

С-2 -0,9 -0,1 -0,8

С-3 +1,9 -0,7 +2,6

С-4 +6,3 +5,2 +1,1

С-5 -1,1 -0,1 -1,0

С-6 -4,9 -4,8 -0,1

Примечание. Деструкция глюкозы проводилась путем ферментации. Цифры в столбцах представляют разность изотопного состава общего углерода глюкозы и изотопного состава углерода в ьм положении вС3 и С4-растениях (А, = = б13С,-С,0,а|). В последнем столбце приведены разности между изотопным составом углерода в каждом положении у С3 и С4-растений

ляется ее изотопная неоднородность, что подтверждается данными таблицы 7.

4. Информация, полученная при изучении темнового дыхания у С3-ра-стений, также свидетельствует в пользу фотосинтетических осцилляций. Группа ученых из нескольких стран, используя новейший настраиваемый диодный лазерный спектрометр, позволяющий одновременно определять интенсивность темнового дыхания и изотопный состав выдыхаемого С02, исследовала темновое дыхание Ricinus communis L. в опытах по газообмену в котролируемых условиях [26]. Результаты приведены в таблице 8.

Было обнаружено (см. табл. 8), что в первые 15 мин после выключения света наблюдается интенсивное дыхание

Таблица 8

Временная динамика величины б13С С02, выдыхаемого листьями Ricinus communis L. в темноте в газобменной камере, совмещенной с настраиваемым диодным лазерным

спектрометром [26]*

Время после выключения света

Д - 813Сс02 — 8МСсубстрат

Предполагаемый субстрат для темнового дыхания

10-15 мин от начала темново- * До+11%0

го периода

30-60 мин от начала темново- От +3 до +7%о го периода

2-5 ч после начала темнового До +4,5%о

периода

24 ч после начала темнового —1,1 %о

периода

48 ч после начала темнового -1,6%о

периода

* Условия эксперимента: обильное увлажнение; не

экспонирование светом высокой интенсивности.

Сахара из флоэмного сока

Сахара из флоэмного сока

Сахара из флоэмного сока

Сахара из флоэмного сока + вклад продуктов деструкции липидов Сахара из флоэмного сока + вклад продуктов деструкции липидов

менее чем за 20 мин до выключения света

и С02 по изотопному составу углерода значительно тяжелее предполагаемого субстрата — сахаров из флоэмного сока растений. Более того, оказалось, что если перед выключением осветить растение светом высокой интенсивности, изотопное утяжеление еще более усиливается. В последующий час интенсивность дыхания и изотопное утяжеление снижаются. При пролон-

гации темнового периода более чем на 24 ч и после 48 ч изотопный состав углерода С02 становится обогащенным изотопом 12С относительно исходного субстрата. Авторы не смогли объяснить эту динамику и источник столь «тяжелых» субстратов.

Объяснение дает осцилляционная гипотеза. Как было сказано, после переключения Рубиско на оксигеназную

функцию лабильные сахара не только питают фотодыхательную цепь, но одновременно поступают во флоэму. Поэтому сахара флоэмного сока не только обогащены изотопом 13С, но их гексозные звенья имеют неравномерное распределение изотопов углерода, в котором атомы С-3 и С-4 утяжелены сильнее других. Освещение светом высокой интенсивности перед его выключением должно приводить к усилению фотодыхания, поскольку интенсивность освещения является одним из факторов, стимулирующих фотодыхание [2]. Это, в свою очередь, еще больше усиливает обогащение сахаров флоэмного сока изотопом 13С, а в гексозах сахаров увеличивается внутримолекулярная изотопная неоднородность.

При выключении света сначала начинают разрушаться накопленные лабильные сахара, превращаясь в органические кислоты. На это указывают данные Борланд и др. [27], обнаруживших четкую связь между сахарами, накопленными в световой период, и синтезом органических кислот — в тем-новой. Одновременно прослеживается тесная корреляция и по изотопному составу сахаров и органических кислот. Авторы [26] также высказали предположение, что интенсивное дыхание, которое начинается сразу после выключения света, связано с синтезом органических кислот. Если это так, то становится понятным причина очень тяжелого изотопного состава С02, обусловленного этим синтезом. При деструкции сахаров атомы С-3 и С-4 гексоз отщепляются и фиксируются в виде С02 темнового дыхания, а двухуглеродные фрагменты используются на синтез углеродного скелета ди- и трикарбоновых кислот. Изотопный состав С02, выдыхаемого в первые 15 мин после выключения света по величине обогащенности изотопом 13С, как раз соответствует обогащению атомов С-3 и С-4 Г6Ф (см. табл. 5).

Облегчение изотопного состава С02 при пролонгировании темнового пери-

ода (см. табл. 7) связано уже не фотосинтезом, а с колебаниями в гликоли-тической цепи, период колебании которых составляет приблизительно 24 ч [24]. При этом в отсутствие поступления глюкозы из цикла Кальвина (цикл в темноте не работает), основную роль начинает играть ресинтез глюкозы за счет продуктов распада липидов и белков [36]. Поскольку последние в целом обогащены изотопом 12С, это и является причиной обогащения легким изотопом С02 при пролонгировании темноты.

5. Еще один аргумент в пользу фо-тосинтетических осцилляций дает рассмотрение связи изотопного состава кислорода, образующегося при фотосинтезе, с ассимиляцией С02. Еще в 1941 г. Виноградов и Тейс [1], используя меченую воду Н2018, выяснили, что кислород, выделяемый при фотосинтезе, происходит из воды.

пС02 + п н2018 (СН20)п + 0218

Однако долгое время оставалась загадкой обогащенность выделяющегося 02 «тяжелым» кислородом по сравнению с кислородом воды. В последующих опытах [2, 19, 20] было показано, что утяжеление 1802 возникает вследствие светоиндуцированного поглощения кислорода при ассимиляции. Оно, как выяснили авторы, является следствием фотодыхания и релеевского исчерпывания изотопа 160 (преимущественного поглощения 1602 при дыхании на свету), сопровождающих этот процесс. В подтверждение своего вывода авторы приводят экспериментально изученную связь обогащенности выдыхаемого на свету кислорода изотопом 180 с интенсивностью дыхания на свету, с содержанием в среде ассимилируемого углерода С02 (или бикарбонат иона) и с интенсивностью освещения, т.е. с факторами, влияющими на интенсивность фотодыхания [20]. Наблюдаемая у разных фотосинтезирующих организмов связь обогащенности кислорода 180 с факторами, влияю-

щими на интенсивность фотодыхания (интенсивность света, концентрация питающей С02) [19], обусловлена разной интенсивностью фотодыхания (разной степенью исчерпывания образовавшейся порции кислорода), определяемой вышеупомянутыми факторами. Но исчерпывание кислорода возможно лишь в том случае, если кислород при фотосинтезе образуется в виде отдельных порций. При этом порция кислорода образуется, если в процесс фотосинтеза С02 вовлекается в виде отдельных порций. Еще в 1989 г., анализируя изотопные эффекты углерода при фотосинтетической ассимиляции С02, мы высказали гипотезу [9], что С02 поступает в клетку не сплошным потоком, а дискретно. Сейчас природа дискретности стала понятной: она связана с периодическими переключениями Рубиско с карбоксилаз-ной функции на оксигеназную и обратно и с чередованием процессов ассимиляции и фотодыхания. Это и находит свое подтверждение в изотопных эффектах по кислороду.

6. Осцилляционная гипотеза подтверждается не только изотопными данными. Явление постиллюминацион-ного всплеска С02 (post illumination burst, PIB) [25], возникающего сразу после выключения света, свидетельствует, что ассимиляция С02 и процесс фотодыхания разнесены во вре-

мени [13], а это согласуется с колебаниями. О том же свидетельствует появление двух пиков на кривой замедленной люминесценции хлорофилла. Первый пик соответствует влиянию на фотосистему II цикла Кальвина, работающего в режиме карбоксилирова-ния, второй его влиянию, когда он работает в режиме оксигенирования [43]. Пики разнесены во времени на 1.6 с.

В работе [40] обнаружены периодические колебания концентрации С02 в межклеточном пространстве листа при концентрациях С02, близких к точке компенсации, т.е. тогда, когда фотодыхание проявляется сильнее всего. Авторы склонны считать эти колебания проявлением переключений Рубиско, о которых шла речь.

Заключение

Таким образом, рассмотренный фактический материал подводит серьезную основу под осцилляционную концепцию фотосинтеза. Последняя позволяет совершенно по-новому рассматривать фундаментальные вопросы организации и регуляции фотосинтеза и открывает новые возможности в интерпретации фактического материала. Несомненно, что при ее использовании появятся и новые возможности в решении прикладных вопросов — повышения продуктивности с.-х. культур, выведения сортов, устойчивых к неблагоприятным внешним факторам.

Библиографический список

Виноградов А.П., Тейс Р.В. Изотопный состав кислорода разного происхождения // Доклады АН СССР, 1960. Т. 33. N 9.

Виноградов А.П., Кутюрин В.М., Улубекова М.В., Задорожный П.К. Изотопный состав кислорода фотосинтеза и дыхание // Доклады АН СССР, 1960. Т.134. № 6.

Вознесенский В.Л., Глаголева Т.А., Зубкова Е.А., Мамушина Н.С., Филипова «77.А., Чулановская М.В. Метаболизм 14С при длительном выращивании хлореллы в присутствии ИС02 // Физиология растений, 1982. Т. 29. С. 564-571.

Галимов Э.М., Кодина JI.А./Генералова В.Н., Богачева М.В. The 8th International Congress on Organic Geochemistry. Moscow, // Thesis dokl., 1977. Vol.2.

Иванов M.B., Зякун A.M., Гоготова Е.И., Бондарь B.A. Разделение изотопов углерода фотосинтезирующими бактериями, растущими на бикарбонате, обогащенном изотопом 13С // Доклады АН СССР, 1978. Т. 242. С. 1417-420.

Ивлев А.А. Изотопный эффект в глициндегидрогеназной реакции — причина внутримолекулярной изотопной неоднородности углерода глюкозы крахмала, синтезируемого при фотодыхании // Биофизика, 2005. Т.50. №6. С.1079-1086.

Ивлев А.А. Вклад фотодыхания в изменения изотопноуглеродных характеристик растений при воздействии стрессовых факторов // Физиология растений, 2004. Т. 49. N 2. С. 303-313.

Ивлев А.А. О потоках «лёгкого» и «тяжёлого» углерода при сопряжении фотосинтеза и фотодыхания // Физиология растений, 1993. Т.40. С.872-880.

Ивлев А.А. О дискретности процесса ассимиляции С02 на свету С3-растениями // Биофизика, 1989. Т.34. Вып.5. С.887-891.

Ивлев А.А. О природе изотопных эффектов углерода в живой клетке // Биофизика, 1985. Т. 30. Вып. 3. С. 506-515.

Ивлев А.А., Калинкина Л.Г. Экспериментальные свидетельства существования изотопного эффекта фотодыхания // Физиология растений, 2001. Т. 48. С. 467-480.

Ивлев А.А., Игамбердиев А.У. Трелкелд Ч., Быкова Н.В. Изотопные эффекты углерода в глициндекарбоксилазной реакции in vitro на митохондриях из гороха и шпината // Физиология растений, 1999. Т. 46. №5. С. 748-756.

Ивлев А. А., Лапин А.В., Бризанова Л.Я. Распределение изотопов углерода (12С/13С) в глюкозе крахмала кукурузы // Физиология растений, 1987. Т.34. Вып. 3. С. 493-498.

Игамбердиев А.У. Пероксисомальное окисление в растениях // Физиология растений, 1991. Т. 38. С. 774-786.

Игамбердиев А.У. Роль микротелец в организации метаболических путей растений // Успехи современной биологии, 1990. Т.109.С. 65-76.

Калинкина Л.Г., Уделънова Т.М. Влияние фотодыхания на фракционирование стабильных изотопов углерода у морской хлореллы // Физиология растений, 1990.Т.37.С. 96-104.

Кукушкин А.К., Солдатова Е.А. Влияние фотодыхания на индукцию замедленной миллисекундной люминесценции хлорофилла фотосистемы II высших растений: теоретической исследование // Биофизика, 1996. Т. 41. С. 440-444.

Кутюрин В.М. Водное происхождение кислорода фотосинтеза и изменчивость изотопного состава кислорода, выделяемого растениями / Очерки современной геохимии и аналитической химии. М.: Наука, 1972. С.508-513.

Кутюрин В.М., Назаров Н.М., Семенюк К.Г. О кислородном обмене между водой хлоропластов и комплексом, выделяющим кислород фотосинтеза // Докл. АН СССР, 1966. Т.171. N 1.

Лайск А. X. Кинетика фотосинтеза и фотодыхания у С-3 растений. М.: Наука, 1977.

Ленинджер А. Биохимия М.: Мир. 1974.

Санадзе Г.А., Блэк Л.Л., Тевзадзе И.Т., Тархнишвили Г.М. Изменение отношения 13С02/12С02 при фотосинтезе растениями С3 и С4 // Физиология растений, 1978. Т.25. С. 171-172.

Селъков Е.Е. Временная организация энергетического метаболизма и клеточные часы // Регуляция энергетического обмена и физиологическое состояние организма / Под ред. М.Н.Кондрашовой. М.: Наука, 1978. С.15-32.

Atkin O.K., Gardstrom P., Day D.A. Photosynthesis, carbohydrate metabolism and respiration in leaves of higher plants // In:Leegood R.C., Dharkey T.D., von Caemmerer S., eds. / Advances in photosynthesis. Photosynthesis: physiology and metabolism. V. 9 Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2000. P. 153-175.

Barbour M.M., McDowwell N.G., Tcherkez G. Bickford Ch.P., Hanson D. A new measurement technique reveals rapid post illumination changes in the carbon isotope composition of leaf-respired C02 // Plant Cell and Environment, 2007. V.30. P. 469-482.

Borland A.M., Griffiths H., Broadmeadow M.S., Fordham M.C., Maxwell C.. Carbon Isotope Composition of Biochemical Fractions and the Regulation of Carbon Balance in Leaves of the C3-Crassulenean Acid Metabolism Intermediate Clusia minor L. Growing in Trinidad // Plant Physiol, 1994. V.105: P.493-501.

Hobbie E.A., Werner R.A. Intramolecular, compound-specific, and bulk carbon isotope patterns in C3 and C4 plants: a review and synthesis // New Phytologist, 2004. V. 161. P. 371-385.

Farquhar G.D., O’Leary M.H., Berry J.A. On the relationship between carbon isotope discrimination and intercellular carbon dioxide concentration in leaves // Aust. J. Plant Physiol., 1982. V.9. P.121-137.

Igamberdiev A.U., Ivlev A.A., Bykova N.V., Threlkeld Ch., Lea P.J., Gardestrom P. Decarboxylation of glycine contributes to carbon isotope fractionation in photosythetic organisms // Photosynthesis Research, 2001 V.67. P.177-184.

Igamberdiev A.U. Mikkelsen T.N., Ambus P., Bauwe H., Lea P.J., Gardestrom P. Photorespiration contributes to stomatal regulation and carbon isotope fractionation :

a study with barley, potato and Arabidopsis plants deficient in glycine decarboxylase // Photosynthesis Research, 2004. V.81. P.139-152.

Ivlev A.A., Igamberdiev A.Y., Bykova N.V. Fractionation of carbon (13C/12C) isotopes in glycine decarboxylase reaction // FEBS Letters, 1996. V.386. P.174-176.

Ivlev A.A., Igamberdiev A.Y., Bykova N.V. Fractionation of carbon (13C/12C) isotopes in glycine decarboxylase reaction // FEBS Letters, 1996. V.386. P.174-176.

Ивлев А.А., Пичужкин В.И. Князев Д.А. Изменения изотопного состава углерода органов пшениц в онтогенезе и их возможная связь с фотодыханием растений // Физиология растений, 2001. Т.46. №4. С. 517-526.

Ivlev A.A., Igamberdiev A.Y., Dubinsky A.Yu. Isotopic composition of carbon metabolites and metabolic oscillations in the course of photosynthesis // Biophysics, 2004. V.49. Suppl. 1. P. 3-16.

Laing W.A., Orgen W.L., Hageman R.H. Regulation of soybean net photosynthetic C02 fixation by interaction of C02, 02 and ribulose-l,5-biphosphate carboxylase // Plant Physiology, 1974. V.54. P.678-685.

Lerman J.C., Deleens E., A.Nato,A. Moyse Variations in the Carbon isotope Composition of a Plant with Crassulecean Acid Metabolism// Plant Physiology, 1974. V. 53. P. 5811-584.

Oliver D.J., Neuberger H., Bourguignon J., Douce L. // Glycine metabolism by plant mitochondria // Physiol. Plant, 1990. V.80. P.487-491.

Raven J.A., Griffiths H., Glidewell S.М., Preston T. The mechanism oxalate biosynthesis in higher plants: investigations with the stable isotopes oxygen-18 and carbon-13// Proc.R.Soc. (London). Ser.B., 1982. V. 216. P. 87—101.

Rivera E.R., Smith B.N. Crystal morphology and 13Carbon/12Carbon composition of solid oxalate in Cacti// Plant Physiol, 1979. V.64. P. 966-970.

Rofimann F., Butzenlechner М., Schmidt H.-L. Evidence for nonstatistical carbon isotope distribution in natural glucose // Plant Physiology, 1991.V. 96. P. 609-614.

Roussel M.R., Ivlev A.A., Igamberdiev A.Y. Oscillations of the internal C02 concentration in tobacco leaves transferred to low C02 // J. Plant Physiol, 2007. V. 164. P. 1188-1196.

Saranga Y., Flash I., Patersson A.H.,Yakir D. Carbon isotope ratio in cotton varies with growth stage and plant organ // Plant Science, 1999. V. 142. P. 47-56.

Schmidt H.-L., Kexel H., Butzenlechner М., Schwarz S., Gleixner G., Thimet S., Werner R.A. and Gensler M. 2. Non-statistical isotope distribution in natural compounds: mirror of their biosynthesis and key for their origin assignment// Stable Isotopes in the Biosphere /eds.:Wada E., Yoneyama Т., Minagawa М., Ando T. and Fry B.D. Kyoto : Kyoto University Press, 1995. P.17-35.

Tcherkez G., Farquhar G., Badek F., Ghashghaie J. Theoretical considerations about carbon isotope distribution in glucose of C3 plants // Funct. Plant Biology, 2004. V. 31. P. 857-877.

Vogel J.C. Variability of Carbon Isotope Fractionation during Photosynthesis// Stable isotopes and plant carbon — water relations / Eds Ehleringer J.R., Hall A.E., Farquhar G.D. San Diego — Boston, 1993. P.29-46.

Рецензент — д. б. н. И.Г. Тараканов

SUMMARY

The oscillation concept assuming that photosynthetic oscillations appear to be a result of periodic changes of Calvin cycle regimes from C02 assimilation to photorespiration is suggested. The oscillations occur due to switching of the key photosynthetic enzyme Rubisco from carboxylase function to oxygenase with simultaneous change in carbon substrate flux directions in the Calvin cycle. The factual argumentation of the theory is considered. It is based on carbon isotope fractionation data that comprise the existence of two isotopically different carbon fluxes in a cell, the heterogeneous carbon isotope distribution in glucose from starch of storage organs that was proved for glucose formed in photorespiration phase, carbon isotope ratio dynamics of C02 expired in the dark, etc. Some non-isotopic data confirm this concept as well.