Влияние растительных средств «Нефрофит» и «Гепатон» на процессы апоптоза у белых крыс

УДК 615.32.-092: 616 61

Влияние растительных средств «Нефрофит» и «Гепатон» на процессы апоптоза у белых крыс

С.В. Лемза, А.Г. Мондодоев, С.М. Николаев

Исследовали влияние комплексных растительных средств «Нефрофит» и «Гепатон» на интенсивность апоптотического процесса у белых крыс при ишемических повреждениях почек и токсических поражениях печени. Установлено ингибирующее действие «Нефрофита» и отсутствие этого действия у «Гепатона» на активность каспазы-3, биохимического маркера выраженности апоптоза в изученных моделях.

Effect of multicomponent plant drugs «Nephrophyte» and «Hepaton» on apoptotic process of white rats

S.V. Lemza, A.G. Mondodoev, S.M. Nikolaev

Effect of multicomponent plant drugs «Nephrophyte» and «Hepaton» on apoptotic process in ischemic renal injuries and toxic damage to liver in white rats has been studied. Inhibitory effect of «Nephrophyte» and its absence for «Hepaton» on caspase-3 activity has been shown.

В настоящее время установлено, что различные эндогенные и экзогенные повреждающие факторы приводят к развитию окислительного стресса, характеризующегося повышенным образованием активных форм кислорода. Активация процессов свободноради-кального окисления является инициирующим и/или поддерживающим фактором многих патологических состояний организма. Одним из ответов клетки на стресс является более ранний запуск процессов апоптоза - программируемой гибели клетки. Клетки, находящиеся в состоянии апоптоза, теряют функциональную состоятельность, что оказывает влияние на функции органа в целом [10]. Анализ особенностей патогенеза некоторых состояний, таких как острая почечная недостаточность ишемической, токсической и септической природы или токсическое поражение клеток печени, показывает, что они связаны с индукцией апоптотического процесса [4,П].

Это очень важное наблюдение, поскольку в отличие от некроза апоптоз поддается регулированию на определенных его стадиях. В настоящее время отмечается заметный переход от описания явления программированной клеточной смерти к подробному изучению ее механизмов и способов управления этими механизмами [3,6,7,9,10]. Таким образом, выяснение роли апоптоза в развитии патологических процессов и поиск новых средств, особенно средств природного происхождения, способных оказывать регулирующее действие на процессы индуцированного апоптоза, является актуальной проблемой биологии и медицины.

Цель настоящей работы - изучить влияние комплексных растительных средств «Нефрофит» и «Гепатон» на процессы индуцированного апоптоза на основе анализа активности каспазы-3, одного из ключевых ферментов наилучшим образом коррелирующего с апоптотическим фенотипом при ишемических повреждениях почек и токсических повреждениях печени белых крыс линии Wistar

Опыты проведены на белых крысах (как самцах, так и на самках) линии Wistar массой 180-200 г. Апоптоз индуцировали ишемией / реперфузией почек по методу [5] После 40-минутной окклюзии почечной артерии кровоток восстанавливали снятием зажимов. Продолжительность реперфузии составляла 1, 4, 8 и 16 часов. Активность каспазы-3 определяли в гомогенате коркового слоя почек колориметрическим методом согласно рекомендациям к набору реактивов (Caspase-3 Assay Kit, Sigma) в трех группах животных: в ложнооперированной, в группе с индуцированным апоптозом (контроль) и в группе животных на фоне введения «Нефрофита» (опыт). В каждой группе было по 7 крыс. Водный раствор фи-тосредства вводили животным внутрижелу-дочно в экспериментально-терапевтической дозе 150 мг/кг в объеме 10 мл/'кг за 16 часов и за 1 час до ишемии. Комплексное растительное средство «Нефрофит» представляет собой смесь из экстрактов листьев толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva ursi L ), листьев ортосифона тычиночного (Orthosiphon stamineus Benth.) и травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.) в соотно-

С.В. Лемза, А.Г. Мондодоев, СМ. Николаев. Влияние растительных средств «Нефрофит» и «Гепатон» на процессы апоптоза у белых крыс_

шении 4:4:2. Токсическое повреждение печени вызывали однократным внутрижелу-дочным введением 50%-ного масляного раствора четыреххлористого углерода (ССЦ) в дозе 1,25 мл/кг. Животным опытной группы «Гепатон» вводили внутрижелудочно в экспериментально-терапевтической дозе 50 мг/кг в объеме 10мл/кг за 16 часов и за 1 час до введения раствора тетрахлорметана. Крысы контрольной группы получали экви-объемное количество дистиллированной воды. Активность каспазы-3 определяли вышеуказанным методом в гомогенате печени через 1, 4, 12 и 24 часа после введения че-тыреххлористого углерода.

«Гепатон» представляет собой фитосбор из цветков ромашки аптечной (Matricaria recutita L.) - 1 часть, листьев мяты перечной (Mentha piperita L.) - 1 часть, плодов шиповника (Rosa sp.) — 3 части, плодов боярышника (Crataegus sp.) - 2 части, травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) - 1 часть, корней солодки уральской (Giycyrrhiza uralensis Fisch.) - 1 часть, корневищ и корней девясила высокого (Inula heiemum L.) - 1 часть. Эти средства были выбраны в качестве возможных ингибиторов активности каспазы-

ранее установлено, обладают выраженными нефропротекторным и гепатопротекторным свойствами, а также обладают выраженной антиоксидантной активностью [2].

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием и - критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при Р < 0,05.

Как видно из таблицы 1, активность каспазы-3 в контрольной группе животных с индуцированным апоптозом в почках увеличивалась по сравнению с интактными крысами в 3 раза после часовой реперфузии, 7,3 раза после 4-часовой и более чем в 15 раз через 8 и 16 часов реперфузии. В опытной группе животных под влиянием «Нефрофита» происходило снижение активности каспазы-3, сравнимое с действием специфического ингибитора этого фермента Ас-ВЕУБ-СНО. Через 1 час репер-фузии почек активность фермента у крыс опытной группы снижалась на 53%, через 4 на 42%, через 8 - на 41% и через 16 часов на 20% по сравнению с контролем Уменьшение ингибирующего влияния «Нефрофита» на активность указанного фермента, вероятно, объясняется его биотрансформацией и/или элиминацией из организма животных.

Активность каспазы-3 при ишемических повреждениях почек в различных группах животных

Таблица 1

Условия эксперимента Активность каспазы-3 пмоль/мин/мг белка

1 час 4 часа 8 часов 16 часов

Ложнооперированная группа (п=7) 2,40±0,13

Контрольная группа (п=7) 7,19±1,04 14,77±1,18 36,60±3,05 36,20±2,46

Контрольная группа + Ас-ОЕУО-СНО (п-7) 4,36±0,34 5,030±1,31 14,00±1,56 19,60±2,83

Опытная группа + «Нефрофит» (п=7) 3,36±0,23* 8,56±1,75* 21,50±1,10* 29,10±2,21

Примечание: здесь и далее *- различия в группах контроль - опыт достоверны при Р<0,05.

3 на том основании, что они, как было нами

Таким образом, установлено ингиби-рующее влияние комплексного растительного средства «Нефрофит» на активность каспазы-3. Снижение активности данного протеолити-ческого фермента коррелировало с улучшением показателей функционального состояния почек. Витральными методиками ранее было показано, что под влиянием нефропро-текторного средства увеличивается активность пируваткиназы более чем в 2 раза и снижается активность К' и в основном Кта+-АТФаз, что способствовало сохранению энергетического баланса клеток нефронов при

ишемии / реперфузии почек. Содержащиеся в «Нефрофите» флавоноиды и тритерпеноиды [1] могут регулировать транскрипционную активность генов, кодирующих супероксид-дисмутазу, глутатион пероксидазу, глутатион синтазу и другие белки, повышающие анти-оксидантный статус клетки и снижающие количество повреждений в ДНК, что приводит к повышению жизнестойкости клеток [3].

Данные по влиянию «Гепатона» на активность каспазы-3 в гепатоцитах при остром токсическом повреждении печени ССЦ представлены в таблице 2.

Влияние «Гепатона»» на активность каспазы-3 в клетках печени белых крыс при остром токсическом тетрахлорметоновом гепатите у крыс

Таблица 2

Условия эксперимента Активность каспазы -3, нмоль/ мин/мг белка

1 час 4 часа 12 часов 24 часа

Интактная группа (п=7) 16,68 ±3,56

Контрольная группа (ССЫ) (п=7) 15,23 ± 1,27 28,69±4,15 38,42±1,39 38,98 ±3,03

Контрольная группа +Ас-ОЕУВ-СНО (л-7) 8,94 ± 1,53* 22,19±5,41 21,60±3,91* 23,65 ± 1,46*

Опытная группа+ «Гепатон» (п--7) 7,24 ± 1,59* 29,51±3,76 39,874=3,53 33,75 ±2,40

Из таблицы 2 следует, что через 1 час после введения раствора тетрахлорметана активность фермента статистически не отличается от данных у животных интактной группы (15.23 ± 1.27 и 16.68 ±3.56 соответственно), максимальная активность каспазы-3 в клетках печени наблюдали через 12 и 24 часа после введения четыреххлористого углерода животным, что объясняется динамикой накопления СС14 в печени. Введение крысам «Гепатона», обладающего гепатопротекторной и антиок-сидантной активностью, не оказывало инги-бирующего действия на активность каспазы-

3. хотя под его влиянием наблюдали улучшение показателей функционального состояния печени у животных опытной группы, а также снижение показателей уровня окислительного стресса. Ранее было установлено, что «Гепа-тон» не влияет на активность пируваткиназы и таким образом в отличие от «Нефрофита» не содействует восполнению дефицита энер-

Литература

1. Маркарян А А. Феноловый состав сухого вещества «Нефрофит» / А.А. Маркарян, А.А. Абрамов // Вести. Моек, ун-та. Сер. 2. Химия. 2003. Т. 44. № 5. С 356-360.

2. Маркарян А.А. / Аминокислотный состав нового растительного препарата «Нефрофит» и его роль в коррекции острой сублимации почечной недостаточности / А.А. Маркарян, Р.Н. Аляутдин, А.Г. Мондодоев // Бюл. эксперимент, биол. и медицины. 2004. Т. 137. №2. С. 190-194.

3 De Feudis F.V., Papadopoulos V., Drieu K. Ginkgo biloba extracts and cancer: a research area in îts mfancy // Fundamental and Clin. Pharmacol. 2003. V. 17 P. 405-417.

4. Dhamidharka V.R., Nedeau K., Cannon C.L. et al. // Am. J. Kidney Dis. 1998. V. 31. P. 710-712.

5. Kaushal G.P., Singh A.B., Shah S. V. // Am. J. Physiol. 1998. V. 274. №3. P. F581-F595.

6. Kinloch R.A., Treheme J.M., Fumess L. M. et al. // TiPS. 1999. V. 20. P. 35-42.

7 Kulvinder S S., Walker N I. // Mol. and Cellular Bio-chem. // 1998. V. 178. P. 9-25.

8 Lieberthal W., Menza S A., Levme J //Am. J. Physiol

1998. V. 274. P. F315-F327.

гии, который является одной из причин вступления клетки в апоптоз [8].

Таким образом, на основании полученных результатов можно утверждать, что наличие одних только антиоксидантных свойств недостаточно для снижения уровня индуцированного апоптоза. Необходимо также, чтобы испытуемые средства обладали способностью восстанавливать нарушенный энергетический баланс клетки, так как скорость и глубина апоптотического процесса зависит от степени истощения запасов АТФ [8]. Хотя следует заметить, что при тетрахлорметановом повреждении печени главным образом идет некроз гепато-цитов и их частичный апоптоз с последующим вторичным некрозом, при котором также отмечается резкое повышение активности каспазы-3 [12]. Видимо, поэтому мы не обнаружили ингибирующего действия «Гепатона» на активность фермента.

9. Ortiz A., Justo Р., Sanz A. et al. // Biochem. Pharmacol. 2003. V. 66. P. 1589-1594.

10. Rana A., Salhyanarayana P., Lieberthal W. // Apoptosis 2000. V. 6. № 1/2. P. 83-102.

11. Schumer M., Colombel M.C., Sawchuk T. S ct al // Am. J. Pathol. 1992. V. 140. P. 831-838.

12. Sun F., Hamagawa E., Tsutsui C., et al. // Biochimca et Biophysica Acta. 2001. V. 1535. P. 186-191.

1. Markaryan A.A., Abramov A. A. Phenolic composition

of the dry extract "Nephrophyte" //Bull. Moscow State Univ. - 2003. V. 44. - № 5. - P. 356-360.

2. Markaryan A.A., Alyautdin R.N, Mondodoev A.G. Aminacid composition of the new complex plant preparation "Nephrophyte" and its possible role in the correction of acute sublimate renal failure in rats // Bull. Exper. Biol and Med. 2004. - V. 137. - № 2. - P. 190194.

3. De Feudis F.V., Papadopoulos V., Drieu K. Ginkgo

biloba extracts and cancer: a research area in its infancy // Fundamental and Clin. Pharmacol. - 2003. - V. 17. P. 405-417.

4. Dhamidharka V. R., Nadeau K., Cannon C. L., et al.

Ciprofloxicin overdose: acute renal failure with prominent apoptotic changes. // Am. J. Kidney Dis. 1998, Vol. 31, P. 710-712.

К.С. Лотиакова, И.О. Убашеее, Е.А. Абгалдаева и др. Влияние растительного лекарственного средства «Неф-рофит» при экспериментальной канамициновой нефропатии

5. Kaushal G.P., Singh A.R., Shah S.V. Identification of

gene family of caspases in rat kidney and altered expression in ischemia-reperfusion injury. // Am. J. Physiol 1998. Vol. 274. P. F581-F595.

6. Kinloch R. A., Treheme J. M., Furness L. M. et al. The Pharmacology of Apoptosis. //TiPS. 1999. V. 20. P. 3542.

7. Kulvinder S. S., Walker N. J. Biochemical and molecular mechanism regulating apoptosis. // Mol. and Cellular Biochem. 1998. V. 178. P. 9-25.

8. Lieberthal W., Menza S.A., Levine J. Graded ATP depletion can cause necrosis or apoptosis of cultured mouse proximal tubular cells. // Am. J. Physiol. 1998. V. 274. P. F315-F327.

9. Ortiz A., Justo P., Sanz A., et al. Targeting apoptosis in acute tubular injury. // Biochem. Pharmacol. - 2003. -Vol. 66. -P. 1589-1594.

10. Rana, A., Sathyanarayana, P., Lieberthal, W., 2001. Role of apoptosis of renal tubular cells in acute renal failure: Therapeutic implications. Apoptosis 6, 83-102.

11. Schumer, M., Colombel, M. C\, Sawchuk, T. S. Morphologic, biochemical, and molecular evidence of apop-tosis during the reperfusion phase after brief periods of renal ischemia. // Am. J. Pathol. 1992. V. 140. P. 831838.

12. Sun F., Hamagawa E ., Tsutsui C., Ono Y., Ogiri Y., Kojo S. Evaluation of Oxidative Stress during Apoptosis and Necrosis Caused by Carbon Tetrachloride in Rat Liver. // Biochemica et Biophysica Acta. 2001. V. 1535. P. 186-191.

Пемза Сергей Васильевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, Улан-Удэ.

Мондодоев Александр Гаврилович - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Института общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, Улан-Удэ.

Николаев Сергей Матвеевич - доктор медицинских наук, профессор медицинского факультета Бурятского государственного университета, заведующий отделом биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук, заслуженный деятель науки РФ, Улан-Удэ.

УДК 615.2

Влияние растительного лекарственного средства «Нефрофит» при экспериментальной канамициновой нефропатии К С. Лоншакова, И О. Убашеев, Е.А. Абгалдаева, А.Г. Мондодоев, ЯГ Разуваева, С.В. Лемза

Установлено, что чНефрофит» обладает выраженным нефропротекторпым действием при экспериментальной канамициновой нефропатии.

The action of phytogenic medication "Nephrophyte" on experimental nephropaty caused by kanamycin

K.S. Lonshakova, I.O. Ubasheev, E A. Abgaldaeva, A.G. Mondodoev, Ya.G. Razuvaeva, S.V. Lemza

The evaluation of morphofunctional .state of white rats kidneys during pharmacological nephropathy activated by kanamycin ingestion has been given in presence of pharmacotherapy with natural medication ''Nephrophyte''. The nephroprotective action of "Nephrophyte " was displayed.

Канамицин относится к антибиотикам аминогликозидной группы (Машковский, 2004), препараты которой были основными в течение последних десятилетий в лечении серьезных инфекций, вызываемых грамотри-цательными бактериями. В настоящее время доказана их эффективность, и в то же время неоспоримой является их токсичность (Ста-нева-Стойчева, Стойчев, 1984; Харкевич, 1999).

По мнению некоторых авторов, в патогенезе поражения почек аминогликозидами существенную роль играет экскреция антибиотиков клубочками и их реабсорбция в проксимальных канальцах (Гольдберг, 1969), а

также в петлях Генле и дистальных канальцах (РаБШпга-Мтог, 1982). Было выявлено, что аминогликозиды, находясь в ионизированной форме, связываются с рецепторами на клетках почечных канальцев с дальнейшим проникновением в клетку, предположительно путем эндоцитоза (МоезйшЬ е! а1., 1995). Внутриклеточный транспорт, накопление в лизосомах, взаимодействие препаратов аминогликозид-ной группы с субклеточными структурами определяют дальнейшее развитие нефроток-сичности и приводят к нарушению синтеза белков и некрозу клетки (Умнова, 1981; Лукьянова, 2002). При проведении клинико-мор-фологических исследований авторами выяв-