СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ
METHOD FOR TUMOUR PROCESS PREDICTION IN BRAIN

Изобретение относится к медицине, а именно онкологии, патоморфологии, и может найти применение при оценке степени пролиферации клеток с целью прогнозирования течения заболевания.
Злокачественные опухоли головного мозга остаются одной из самых сложных проблем в современной онкологии. Первичные опухоли головного мозга составляют около 2% от всех выявленных случаев злокачественных новообразований. В детской онкологии они занимают второе место после лейкозов и являются наиболее распространенной формой опухолевого заболевания. По данным национального института рака США, абсолютное количество новых случаев заболевания увеличилось с 16500 в 2005 году до 23130 в 2013 году, из них опухоли глиального ряда - глиомы составляют около 80% всех злокачественных опухолей центральной нервной системы (ЦНС), из них около 40% составляют глиобластомы. По данным МНИОИ им. П.А. Герцена, в России ежегодный прирост заболеваемости опухолями головного мозга составляет 4,2%.
На настоящий момент нет сомнения в том, что применение клинических характеристик нейроонкологического заболевания в виде распространенности процесса, гистологического строения опухоли, молекулярного профиля поверхностных антигенов является недостаточным для предсказания прогноза течения заболевания и возможной эффективности назначенной терапии. Прогресс в понимании молекулярной биологии клетки, механизмах контроля клеточного деления и апоптоза, путей передачи сигнала от рецепторов в ядро привели к сознанию новых схем индивидуализации в терапии.
При современном подходе к выбору индивидуальной программы лечения больных злокачественными глиомами и прогнозирования течения заболевания наиболее перспективным является исследование молекулярно-биологических маркеров опухолевой ткани.
Пролиферативная активность является одной из основных морфологических характеристик прогрессирования и позволяет спрогнозировать эффективность лечения, развитие рецидивов, а также метастазирование по центральной нервной системе.
Одним из фундаментальных процессов в биологии является клеточный цикл - период существования клетки от момента ее образования путем деления материнской клетки до собственного деления или гибели. Все клетки организма, за исключением половых, имеют диплоидный набор хромосом и делению клеток предшествует их репликация.
Прохождение всего клеточного цикла следует по упорядоченной схеме, гарантирующей, что репликация ДНК происходит только один раз в ходе клеточного цикла и предшествует расщеплению хромосом, которое, в свою очередь, предшествует цитокинезу. На протяжении всего клеточного цикла встроенные механизмы в виде контрольных точек гарантируют полную и правильную передачу генетической информации дочерним клеткам. Обнаружение невосстановимых генетических повреждений на этих контрольных точках приводит к активации апоптоза или запрограммированной гибели клеток. Клетки, не имеющие эффективных контрольных точек, отражают геномную нестабильность, дефектную репликацию ДНК или аномальное разделение.
Количественная оценка содержания ДНК в клетке определяется методом проточной цитометрии, которая является широко известной и применяется как в онкологии, так и в фундаментальных биологических исследованиях. Вследствие протекающих жизненных процессов в клетке содержание ДНК в норме не является постоянным и зависит от фазы клеточного цикла клетки.
При патологии количество ДНК в неделящейся клетке может быть как нормальным - диплоидным, так иметь девиантные изменения - анеуплоидию в виде уменьшения - гипоплоидии или в сторону увеличения - гиперплоидии. Кратное увеличение количества ДНК гиперплоидия в виде триплоидии и тетраплоидии наиболее часто характерна при опухолевом росте. При регистрации количества ДНК учитывается не только плоидность, но и ее количество в делящихся клетках. Это обусловлено тем, что при патологии вероятнее всего присутствие в одном исследовании популяций нормальных - диплоидных и патологических анеуплоидных клеток.
Известно, что с помощью проточной-ДНК цитометрии с высокой степенью достоверности можно определить плоидность опухоли и оценить ее клеточную структуру и распределение ее по фазам клеточного цикла. Диплоидные (с нормальным содержанием ДНК) солидные опухоли отличаются более благоприятным прогнозом, чем анеуплоидные (с более высоким содержанием ДНК). Опухоли с высоким содержанием клеток в фазе синтеза клеточного цикла, как правило, характеризуются быстрым ростом и высокой метастатической активностью.
Известен метод проточной ДНК цитометрии, описанный при раках различных локализаций [Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - №2. - С.89-91., Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 2006. - Т. 17, №1. - С. 29-36.], он позволяет определить плоидность патологических клеток, оценить их количество, отдельно посчитать анеуплоидные клетки в опухоли и распределить их по фазам клеточного цикла с определением индекса пролиферации. Данный метод проточной ДНК цитометрии разработан для исследования асцитной жидкости при опухоли яичников и не пригоден для исследования биоптата головного мозга у больных с опухолями ЦНС.
В качестве прототипа нами взята работа, опубликованная в J. Neurooncol. - 2005. - Т. 71. - №2. - Р. 85-89, в которой был проведен количественный анализ ДНК из биоптата глиальных опухолей. Оценивалась плоидность клеток биоптата у 64 больных с подтвержденным диагнозом - астроцитарная опухоль и была установлена прямая корреляция со степенью анаплазии. В данной работе не было получено достоверных корреляционных зависимостей выживаемости больных и плоидности клеток биоптата глиальных опухолей. На наш взгляд, это вызвано тем, что для исследования использовался весь парафиновый блок, содержащий в себе не только опухолевую, но и соединительную ткань, участки кровеносных сосудов и зоны некроза, что в свою очередь дает диагностический "шум" и меняет статистические показатели, не позволяя сделать точное заключение о прогнозе течения заболевания.
Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности прогнозирования течения опухолевого процесса в головном мозге за счет использования в способе ДНК цитометрии прецизионно выделенной опухоли из парафинового блока.
Этот результат достигается тем, что в известном способе прогнозирования течения опухолевого процесса в головном мозге с получением парафинового блока из биоптата опухоли, согласно изобретению полученный парафиновый блок микротомируют, полученный срез окрашивают, сканируют и сопоставляют его с парафиновым блоком, из которого затем выделяют опухолевую ткань, после чего ее депарафинизируют, гидротируют, ферментативно разрушают в ней оболочку клеток до получения суспензии клеточных ядер, суспензию окрашивают флюорестентным красителем и проводят ДНК цитометрию и, если количество анеуплоидных клеточных ядер в полученной суспензии меньше или равно 21%, прогнозируют благоприятное течение опухолевого процесса, выше 21%  - неблагоприятное.
Микротомирование парафинового блока, окрашивание его и сканирование полученного гистологического среза позволяет проанализировать его, выявить зону опухоли и выделить ее без участков некроза, сосудов и соединительнотканных компонентов («панч»).
Депарафинизация «панча», его гидратация и ферментативное удаление из него клеточных оболочек позволяет получить суспензию из клеточных ядер опухоли, а последующее окрашивание флюорестентным красителем обеспечивает возможность проведения ДНК цитометрии с оценкой распределения ядер по клеточному циклу.
Наш вывод о благоприятном или неблагоприятном течениях опухолевого процесса по данным ДНК цитометрии суспензии клеточных ядер сделан нами на основе предварительно проведенного анализа результатов ДНК цитометрии суспензии клеточных ядер у 30 больных с прослеженной фактической выживаемостью. На основе проведения статистического анализа анеуплоидии было выявлено, что показатель содержания анеуплоидных клеточных ядер в 21% и меньше соответствовал благоприятному течению опухолевого процесса, а выше 21% - неблагоприятному.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого способа приводим алгоритм выполняемых действий.
У пациента проводят забор опухолевого материала с последующим изготовлением из него парафинового блока, который микротомируют и полученный срез окрашивают гемотоксилином-эозином. Окрашенный срез сканируют (Фиг. 1), выявляют зоны опухоли без участков некроза, сосудов и соединительнотканных компонентов (1). Сопоставляют полученное изображение с парафиновым блоком (Фиг. 2) с выделением зоны интереса - «панча». «Панч» депарафинизируют, гидротируют, клеточные оболочки в нем разрушают трипсином до получения суспензии клеточных ядер, которую окрашивают пропидий иодидом и проводят ДНК цитометрию. При содержании в суспензии анеуплоидных ядер в количестве 21% и менее прогнозируют благоприятное течение опухолевого процесса, а более 21% - неблагоприятное.
Сущность способа поясняется клиническим примером.
Пример 1
Больной Б., 60 лет, история болезни №1858/13. Поступил в клинику РНЦРХТ 20.05.2013 года с диагнозом: Глиобластома правой теменно-височной области, состояние после костно-пластической трепанации черепа от 25.03.2013.
Из анамнеза: заболел в марте 2013 года, когда возникли и стали нарастать головные боли гипертензионного характера. По МРТ от 25.03.2013 было выявлено объемное образование правой теменно-височной области. Был госпитализирован в НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе, 25.03.2013 выполнена костно-пластической трепанации черепа, субтотальное удаление опухоли. Затем из полученного биопсийного материала был изготовлен парафиновый блок для гистологического исследования и больной направлен в ФГБУ РНЦРХТ для диагностики и лечения.
При поступлении: был подтвержден ранее установленный диагноз.
Полученный парафиновый блок был микротомирован, после чего срез окрасили гемотоксилином-эозином. Полученный таким образом из опухоли микропрепарат отсканировали и выявили зону опухоли без участков некроза, сосудов и соединительнотканных компонентов. Затем сопоставили полученное изображение и парафиновый блок с последующим выделением «панча». «Панч» депарафинизировали, гидротировали, с помощи фермента трипсина произвели удаление клеточных оболочек. Полученные в виде суспензии клеточные ядра окрасили пропидий иодидом и провели ДНК цитометрию. По ДНК цитометрии была выявлена группа анеуплоидных ядер - 30%, что соответствует неблагоприятному прогнозу. В связи с этим больной подлежит немедленному химиолучевому лечению.
23.05.2013 была начата комбинированная лучевая терапия (изоэффективная суммарная доза излучения 60 Гр) с одновременной химиотерапией препаратами нитрозомочевины (Картмустин 150 мг, Винкристин 3 мг). Лечение перенес удовлетворительно.
14.06.2013 выписан в удовлетворительном состоянии под наблюдение районного онколога с явкой в ФГБУ РНЦРХТ через 1 месяц на контрольное обследование.
15.07.2013 больной госпитализирован на поддерживающий курс химиотерапию. Состояние средней степени тяжести. Проведен курс (2 дня) химиотерапии (Картмустин 200 мг, Винкристин 1 мг).
18.07.2013 больной был выписан. Состояние его оставалось стабильным.
21.08.2013 родственники сообщили, что больной скончался. Фактическая выживаемость со дня операционного вмешательства составила - 149 дней.
Пример 2
Больной Б., 66 лет, история болезни №2997/13. Поступил в клинику РНЦРХТ 16.09.2013 года с диагнозом: Глиобластома левой височной области, состояние после косто-пластической трепанации черепа от 28.08.2013.
Из анамнеза: заболел остро, когда на фоне общего благополучия возникла моторная афазия, с подозрением на инсульт был госпитализирован. По MPT от 18.08.2013 выявлено объемное образование левой височной доли с геморрагическим пропитыванием.
28.08.2013 была выполнена операция - костно-пластическая трепанация черепа субтотальное удаление опухоли. Затем из полученного биопсийного материала был изготовлен парафиновый блок для гистологического исследования.
Больной направлен в ФГБУ РНЦРХТ для специфического лечения.
При поступлении: был подтвержден ранее установленный диагноз. Полученный парафиновый блок был микротомирован, после чего срез окрасили гемотоксилином-эозином. Полученный таким образом из опухоли микропрепарат отсканировали и выявили зону опухоли без участков некроза, сосудов и соединительнотканных компонентов. Затем сопоставили полученное изображение и парафиновый блок с последующим выделением «панча». «Панч» депарафинизировали, гидротировали, с помощию фермента трипсина произвели удаление клеточных оболочек. Полученные в виде суспензии клеточные ядра окрасили пропидий иодидом и провели ДНК цитометрию. По ДНК цитометрии была выявлена группа анеуплоидных ядер - 17%, что соответствовала благоприятному прогнозу.
25.09.2013 в радиотерапевтическом отделении №4 ФГБУ РНЦРХТ проведена комбинированная лучевая терапия (изоэффективная суммарная доза излучения 60 Гр) с одновременной химиотерапией препаратами нитрозомочевины (Картмустин 150 мг, Винкристин 3 мг).
17.10.2013 больной выписан в удовлетворительном состоянии под наблюдение районного онколога с явкой в ФГБУ РНЦРХТ через 1 месяц на контрольное обследование.
Последующие адъювантные курсы химиотерапии (Картмустин 200 мг, Винкристин 1 мг) проводились с интервалом 1 месяц. Больной после трех курсов химиотерапии находился в удовлетворительном состоянии.
С 2014 года отмечалось общее ухудшение состояния в виде нарастания общей мозговой симптоматики. Пациент отказался от поддерживающих курсов химиотерапии.
12.07.2014 больной скончался. Фактическая выживаемость со дня операционного вмешательства составила - 474 дней.
К настоящему времени предлагаемым способом проведено прогнозирование у 20 прооперированных больных с глиобластомами головного мозга. Все больных проходили курс комбинированной химиолучевой терапии в радиологическом отделении №4 ФГБУ РНЦРХТ. У 15 больных прогноз был неблагоприятный - продолжительность жизни составила от 112 до 197 дней. У 5 больных прогноз был благоприятный - продолжительность жизни составила от 332 до 645 дней.
Предлагаемый способ впервые на основе предлагаемого прогнозирования позволяет оптимизировать тактику химиолучевого лечения.
Способ разработан в радиологическом отделении №4 ФГБУ РНЦРХТ и прошел клиническую апробацию у 20 больных с положительным результатом.