СПОСОБЫ МУТАГЕНЕЗА

1. Способ продуцирования в эукариотической клетке мишень-специфической молекулы РНК, способной направлять ДНК нуклеазу на геномную мишень, содержащий введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты в эукариотическую клетку, причем рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит первую область нуклеиновой кислоты, кодирующую акцепторный сайт сплайсинга, находящийся выше второй области нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК сегмент, способный взаимодействовать с РНК-управляемой ДНК-нуклеазой.
2. Способ продуцирования в эукариотической клетке мишень-специфической молекулы РНК, способной направлять ДНК-нуклеазу на геномную мишень, содержащий внедрение рекомбинантной нуклеиновой кислоты в геномный локус эукариотической клетки, причем рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит первую область нуклеиновой кислоты, кодирующую акцепторный сайт сплайсинга, находящийся выше второй области нуклеиновой кислоты, кодирующей сегмент РНК, способный взаимодействовать с РНК-управляемой ДНК-нуклеазой.
3. Способ инициирования РНК-управляемого расщепления геномной ДНК в клетке, содержащий продуцирование в эукариотической клетке РНК молекулы, которая содержит первый РНК сегмент, сплайсированный со вторым РНК сегментом, причем первый РНК сегмент содержит экзонную последовательность, транскрибированную из геномного локуса, и второй РНК сегмент содержит РНК сегмент, способный взаимодействовать с РНК-управляемой ДНК-нуклеазой, и
экспрессирование в эукариотической клетке РНК-управляемой ДНК-нуклеазы.
4. Способ по п.1 или 2, в котором рекомбинантная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК молекулу.
5. Способ по п.1 или 2, в котором рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит терминальные последовательности транспозонов.
6. Способ по п.5, в котором терминальные последовательности транспозонов содержат инвертированные терминальные повторяющиеся последовательности (ИТП).
7. Способ по п.5 или 6, в котором терминальные последовательности транспозонов содержат прямые терминальные повторяющиеся последовательности.
8. Способ по п.7, в той части, в которой он зависит от п.6, в котором прямые терминальные повторяющиеся последовательности фланкируют ИТП.
9. Способ по п.5, в котором терминальные последовательности транспозона содержат 5' терминальную CCY и 3' терминальную GGG.
10. Способ по п.9, в котором терминальные последовательности транспозона содержат 5' терминальную CCC и 3' терминальную GGG.
11. Способ по п.5, в котором терминальные последовательности транспозона нацеливают инсерционные сайты ТТАА.
12. Способ по п.5, в котором терминальные последовательности транспозона содержат PiggyBac транспозон-специфические инвертированные терминальные повторяющиеся последовательности (ИТП).
13. Способ по п.5, в котором терминальные последовательности транспозона содержат Tagalong транспозон-специфические инвертированные терминальные повторяющиеся последовательности (ИТП).
14. Способ по п.1 или 2, в котором рекомбинантная нуклеиновая кислота дополнительно содержит третью область нуклеиновой кислоты, кодирующую маркер отбора или скрининга.
15. Способ по п.14, в котором маркер отбора или скрининга представляет собой устойчивый к антибиотику белок или флуоресцентный или биолюминисцентный белок.
1
2
3
16. Способ по п.1 или 2, в котором акцепторный сайт сплайсинга содержит последовательность, представленную как 5'-XXX-3', в которой:
1
X представляет собой A,
2
Х представляет собой G или C; и
3
2
3
X представляет собой A, G, C или U, где 3' точка сплайсинга находится между X и X.
2
17. Способ по п.16, в котором Х представляет собой G.
3
18. Способ по п.16 или 17, в котором Х представляет собой A, G или C.
1
2
3
4
5
19. Способ по п.1 или 2, в котором акцепторный сайт сплайсинга содержит последовательность, представленную как 5'-XXXXX-3', в которой:
1
X представляет собой A, C или U,
2
X представляет собой A,
3
X представляет собой G,
4
Х представляет собой A, G или C; и
5
3
4
X представляет собой A, U или C, где 3' точка сплайсинга находится между X и X.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
20. Способ по п.1 или 2, в котором акцепторный сайт сплайсинга содержит последовательность, представленную как 5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3' (SEQ ID NO: 18), в которой:
1
3
5
7
9
12
15
16
17
X, X, X, X, X, X, X, X и X каждый независимо выбирают из A, G, C и U,
2
X представляет собой C или G,
4
X представляет собой U,
6
8
10
11
13
14
X, X, X, X, X, X каждый независимо выбирают из G, C и U,
18
X представляет собой A, C или U,
19
X представляет собой A,
20
X представляет собой G,
21
Х представляет собой A, C или G; и
22
20
21
X представляет собой A, U или C, где 3' точка сплайсинга находится между X и X.
21. Способ по п.1 или 2, в котором взаимодействующий с нуклеазой сегмент содержит по меньшей мере один участок стебля, который взаимодействует с РНК-управляемой ДНК-нуклеазой.
22. Способ по п.21, в котором взимодействующий с нуклеазой сегмент содержит первый и второй участки стебля, которые разделены некомплементарными РНК нуклеотидами.
23. Способ по п.21 или 22, в котором первый участок стебля содержит нить, имеющую нуклеотидную последовательность, представленную как 5ʹ-GUUGUAGC-3ʹ.
24. Способ по любому из пп.21-23, в котором второй участок стебля содержит нуклеотидную последовательность, представленную как 5ʹ-UUCUC-3ʹ.
25. Способ по любому из пп.21-24, в котором комплементарные пары оснований двух нитей второго участка стебля ковалентно связаны через петлевую структуру.
26. Способ по п.1 или 2, в котором взаимодействующий с нуклеазой сегмент содержит последовательность, представленную как 5ʹ-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU-3ʹ(SEQ ID NO: 1).
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего.
28. Способ по любому из пп.1-26, в котором эукариотическая клетка представляет собой растительную клетку.
29. Способ по п. 27, в котором клетка млекопитающего представляет собой человеческую клетку.
30. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором рекомбинантная нуклеиновая кислота кодирует РНК-управляемую ДНК-нуклеазу.
31. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-управляемая ДНК-нуклеаза представляет собой CRISPR-ассоциированную (Cas) нуклеазу.
32. Способ по п.31, в котором Cas нуклеаза представляет собой Cas нуклеазу II типа.
33. Способ по п.32, в котором Cas нуклеаза представляет собой Cas9 нуклеазу.
Neisseria meningitides
34. Способ по п.33, в котором Cas9 нуклеаза представляет собой  Cas9 нуклеазу (NmCas9).
Streptococcus thermophiles
35. Способ по п.34, в котором Cas9 нуклеаза представляет собой  Cas9 нуклеазу.
36. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-управляемая ДНК-нуклеаза обеспечивает однонитевые разрывы в ДНК.
37. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором РНК-управляемая ДНК-нуклеаза обеспечивает двунитевые разрывы в ДНК.
38. Способ по п.3, в котором РНК-управляемая ДНК-нуклеаза экспрессируется в условиях, которые способствуют i) взаимодействию между РНК-управляемой ДНК-нуклеазой и вторым РНК сегментом молекулы РНК, и ii) расщеплению ДНК в одном или более геномных локусах, кодирующих экзонную последовательность.
39. Способ по п.38, в котором один или более геномных локусов представляют собой два или более аллелей, кодирующих экзонную последовательность.
40. Способ по п.39, в котором два или более аллелей представляют собой аллели в клетке млекопитающего.
41. Способ по любому из пп. 38-40, в котором расщепление ДНК происходит в пределах 5 пар оснований выше от донорного сайта сплайсинга экзонной последовательности.
42. Способ продуцирования в эукариотической клетке мишень-специфической молекулы нуклеиновой кислоты которая направляет ДНК-модифицирующий фермент, содержащий введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты в эукариотическую клетку, причем рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит первую область нуклеиновой кислоты, кодирующую акцепторный сайт сплайсинга, находящийся выше второй области нуклеиновой кислоты, кодирующей сегмент РНК, способный взаимодействовать с ДНК-модифицирующим ферментом.
43. Способ по п.42, в котором ДНК-модифицирующий фермент представляет собой РНК-управляемую ДНК-нуклеазу.
44. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эукариотическая клетка представляет собой стволовую клетку.
45. Нуклеиновая кислота, содержащая первую область нуклеиновой кислоты, кодирующую акцепторный сайт сплайсинга, находящийся выше второй области нуклеиновой кислоты, кодирующей сегмент РНК, способный взаимодействовать с ДНК-модифицирующим ферментом.
46. Нуклеиновая кислота по п.45, в которой ДНК-модифицирующий фермент представляет собой РНК-управляемую ДНК-нуклеазу.