СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ В ВОДЕ
METHOD FOR DETECTION OF ENTEROVIRUSES IN WATER

Изобретение относится к области медицины, эпидемиологического надзора и вирусологии, и может быть использовано для выявления кишечных вирусов в водопроводной воде, в воде открытых водоемов, пресной и морской, в воде из подземных источников, в питьевой бутилированной воде, в воде плавательных бассейнов и в сточной воде.
Уровень техники.
В настоящее время для выявления кишечных вирусов в воде в Российской Федерации известны различные способы, каждый из которых применяется для определенного типа или объема воды. Это способ с использованием фильтрующих мембран, с использованием ионообменных смол, двухэтапный способ (сорбция на ионообменной смоле и осаждение с помощью сульфата аммония), способ двухфазного разделения, способ с помощью флизелиновых пакетов с макропористьм стеклом и с использованием набора для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды с помощью ловушечного устройства [Методические указания №4.2.2029-05 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов»].
Известны также способы, предложенные зарубежными авторами. Это концентрирование вирусов на мембранах с лигандами [патент США US 20080014625], на отрицательно заряженных мембранах [Katayama H., Shimasaki A., Ohgaki S. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and Norwalk virus from coastal seawater. Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 1033-1039].
2
2
3
Наиболее близким к заявленному способу является способ выявления кишечных вирусов, включающий концентрирование вирусов с помощью флизелиновых пакетов с макропористым стеклом [Конторович В.Б., Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Ширман Г.А., Казанцева В.А. Метод концентрирования вирусов в водных объектах окружающей среды. Вопр. вирусол., 1996, 1: 40-42]. В указанном способе время концентрирования вирусов из воды поверхностных водоемов и сточной воды составляет 3-7 суток. Для повышения сорбционных свойств макропористого стекла, представляющего собой белый порошок, его обрабатывают следующим образом: один объем стекла заливают в колбе одним объемом смеси (1:1) 3% раствора HO и 6М раствора соляной кислоты и кипятят в вытяжном шкафу в течение 1 ч без пробки, соблюдая меры предосторожности. Отмывают большим количеством дистиллированной воды до нейтрального значения рН и высушивают при 100°С. В пакет из флизелина размером 5×7 см помещают 3,0 см подготовленного сорбента. Пакет с сорбентом закрепляют с помощью лески за неподвижный предмет так, чтобы он оказался в токе воды. После экспозиции в течение 3-7 суток пакет вынимают, помещают в отдельный новый полиэтиленовый мешочек или стерильный флакон и доставляют в лабораторию в сумке-холодильнике в максимально короткий срок (не более 6 ч). Каждую пробу маркируют с указанием точки отбора, датой установки и времени экспозиции пакета. До обработки пробы можно хранить не более суток при 4°С. Пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной емкости и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают край пакета, вымывают стекло дистиллированной водой (5 мл) с помощью пипетки в эту же чашку Петри и переносят пипеткой или через воронку в колонку объемом 5-10 мл. Вирусы элюируют ступенчато тремя растворами по 3 мл каждый, собирая фракции в отдельные пенициллиновые флаконы. Исследованию подвергают каждую фракцию в отдельности (всего 3 фракции). В качестве элюирующих растворов используют: 1) 0,05 М трис-HCl рН 9,1; 2) 0,05 М трис-HCl рН 9,1 и 0,5 М NaCl; 3) 3% мясной экстракт на 0,05 М трис-HCl рН 9,1. Для выявления вирусов в элюате выбирают культуральные, иммунохимические или молекулярные методы.
Недостатками вышеописанного способа являются его длительность, большое количество и объем фракций элюата, маленькая площадь контакта сорбента с объемом воды.
Задача настоящего изобретения, на решение которой направлен технический результат, заключается в сокращении продолжительности заявленного способа и в его упрощении. Кроме того, обеспечивается высокая степень концентрирования вирусов, уменьшается объем элюирующего раствора и, как следствие, повышается выход вируса в элюате за счет использования в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния с аминопропильными группами.
Для достижения указанного технического результата в способе выявления кишечных вирусов, включающем концентрирование вирусов из образцов воды на сорбенте, элюцию кишечных вирусов с сорбента с их последующим выявлением иммунохимическими, культуральными или молекулярными методами, отличающегося тем, что концентрирование кишечных вирусов осуществляют путем внесения в исследуемый образец воды сорбента на основе магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния с аминопропильными группами, в соотношении 1:1000-3000 от объема образца воды, инкубации при постоянном перемешивании в течение 1-2 часов, сбора сорбента с использованием магнита, удаления супернатанта и получения комплекса сорбента с кишечными вирусами, причем элюцию кишечных вирусов осуществляют раствором 0,5M NaCl и 0,05М Трис (рН=10,5).
Признаками, отличающими настоящее изобретение от аналогов, являются:
- время инкубации сорбента MagSi+ с образцом - 1-2 часа;
- сорбент MagSi+ представлен суспензией, что увеличивает вероятность адсорбции вирусов за счет равномерного распределения сорбента по всему объему воды;
- магнитные свойства MagSi+ позволяют собирать сорбент с помощью магнита во флаконах или проточных системах;
- положительный заряд MagSi+ в воде позволяет адсорбировать вирусы не только за счет гидрофобных взаимодействий, но и за счет ионных;
- элюция вирусов с сорбента проводится небольшим объемом элюирующего раствора, что увеличивает концентрацию вирусов в элюате;
- состав и значение рН элюирующего раствора.
Раскрытие изобретения.
Способ выявления кишечных вирусов в воде заключается в их концентрировании из воды на магнитных микрочастицах, покрытых полимером диоксида кремния с аминопропильными группами, снятии вирионов с сорбента с использованием специального буфера для элюции и последующим выявлением кишечных вирусов в элюате с использованием молекулярных, иммунохимических или культуральных методов.
3
Сорбент MagSi+ получали согласно методике, описанной в патенте США US 20030148101 А1 с некоторыми изменениями. Покрытие магнетита проводилось в два этапа, где первый этап был идентичен описанному в патенте (полимеризация тетраэтоксисилана на поверхности частиц магнетита при значении рН 4,6 и температуре 90°С), а на втором этапе раствор тетраэтоксисилана был заменен 3-аминопропилтриметоксисиланом в той же концентрации. В результате реакции на поверхности магнетита образуются слои полимера диоксида кремния с аминопропильными группами, которые при рН ниже 7,0 имеют положительный заряд. Сорбент представляет собой частицы темно-бурого цвета размером 2-10 мкм, не склонные к образованию агрегатов, что обусловливается одноименным положительным зарядом частиц. Емкость сорбента MagSi+, оцененная по модельному белку БСА (бычий сывороточный альбумин), составляет 15-20 мг белка на 1 см сорбента. В модельных экспериментах по концентрированию вирусов из 1 л водопроводной воды эффективность концентрирования аденовирусов составила 76%, энтеровирусов - 81% и вируса гепатита А - 88%.
Принцип адсорбции вирусов на сорбенте MagSi+ основан на двух типах взаимодействий: (1) гидрофобные взаимодействия капсидных белков вирусов с полисилоксановыми связями полимера диоксида кремния; (2) электростатические взаимодействия аминогрупп сорбента, которые в водных условиях (при рН ниже 7,0) имеют положительный заряд, с вирионами, отрицательно заряженными при значениях рН выше 5,0. Кроме того, одноименный положительный заряд частиц MagSi+ обеспечивает распределение сорбента по всему объему воды, увеличивая тем самым вероятность контакта вирионов с частицами сорбента и ускоряя процесс сорбции. Таким образом, для обеспечения эффективного концентрирования вирусов за счет электростатических взаимодействий необходимо, чтобы значения рН воды находились в диапазоне 5,0-7,0. Данный диапазон рН соответствует средним значениям рН воды.
Способ включает в себя следующие этапы.
1. Внесение сорбента в пробу воды. Суспензия сорбента MagSi+ в объеме 1 мл (1:1 по объему сорбент MagSi+ и 50 мМ раствор NaCl) добавляется к 1 л исследуемой воды.
2. Инкубация при постоянном перемешивании в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Перемешивание осуществляется с помощью шейкера или верхнеприводной мешалки, при этом весь сорбент должен находиться во взвешенном состоянии.
3. Сбор сорбента MagSi+ с использованием магнита во флаконах, либо на специальных установках для проточного концентрирования магнитных микрочастиц. Удаление супернатанта, получение комплекса вирус + сорбент.
4. Элюция вирусов осуществляется раствором следующего состава - 0,5М NaCl, 0,05М Трис, рН=10,5, из расчета на 1 мл взвеси сорбента MagSi+ добавляется 1 мл элюирующего раствора.
5. Индикация и идентификация вирусов с использованием иммунохимических, культуральных или молекулярных методов. Для выявления ротавирусов А и вируса гепатита А применяется выявление вирусных антигенов методом иммуноферментного анализа. Культуральные методы, в частности реакцию нейтрализации, используют для выявления и типирования энтеровирусов (ECHO, Коксаки А и В, Полиовирусы и Энтеровирусы 68-71) и аденовирусов. Молекулярные методы, такие как обратная транскрипция с последующей ПЦР или ПЦР в режиме «реального времени», можно использовать для выявления всех известных кишечных вирусов [Svraka S et al. 2009, G. Shay Fout et al. 2003; Методические указания №4.2.2029-05].
Осуществление изобретения.
Пример 1.
Осуществляют концентрирование кишечных вирусов из проб сточной воды. К 1 л предварительно осветленной сточной воды добавляют 1 мл суспензии сорбента MagSi+. Инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере или с использованием верхнеприводной мешалки в течение 1 ч. После экспозиции собирают сорбент с помощью редкоземельного магнита, переносят суспензию в 15-мл стерильную полипропиленовую пробирку. Удаляют супернатант, удерживая магнитом сорбент с адсорбированными вирусами на внутренней стенке пробирки, и проводят элюцию вирусов 1 мл раствора следующего состава - 0,5М NaCl, 0,05M Трис, рН=10,5. Интенсивно встряхивают пробирку на вортексе в течение 15 минут, при этом весь сорбент должен находиться во взвешенном состоянии. Осаждают сорбент центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут или с помощью магнита. Супернатант переносят в две 1,5-2,0-мл полипропиленовые пробирки с завинчивающейся крышкой. Индикацию и идентификацию вирусов или их структурных элементов (вирусных белков или нуклеиновых кислот) проводят с использованием иммунохимических, культуральных или молекулярных методов (различные модификации ПЦР).
Пример 2.
Осуществляют концентрирование кишечных вирусов из водопроводной (питьевой) воды. К 10 л водопроводной (питьевой) воды добавляют 3 мл суспензии сорбента MagSi+. Инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере или с использованием верхнеприводной мешалки 2 ч. После экспозиции в воду добавляют 100 мл раствора 5М NaCl и инкубируют при перемешивании еще 30 минут. Собирают сорбент с помощью редкоземельного магнита, переносят суспензию в 15-мл стерильную полипропиленовую пробирку. Удерживая сорбент магнитом, удаляют супернатант и проводят элюцию кишечных вирусов в 3 мл раствора следующего состава - 0,5М NaCl, 0,05М Трис, рН=10,5. Интенсивно встряхивают пробирку на вортексе в течение 15 минут, при этом весь сорбент должен находиться во взвешенном состоянии. Осаждают сорбент центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут или с помощью магнита. Супернатант по 1,5 мл переносят в две 1,5-2,0-мл полипропиленовые пробирки с завинчивающимися крышками. Индикацию и идентификацию кишечных вирусов или их структурных элементов (вирусных белков или нуклеиновых кислот) проводят с использованием иммунохимических, культуральных или молекулярных методов (различные модифиации ПЦР).