Роль адаптивных гормонов в регуляции содержания катионных белков в неитрофилах периферической крови

УДК 577.171.55:612.112.91 Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011

диабета 2-го типа больше, тем меньше ширина диапазона сердечно-дыхательного синхронизма, больше длительность развития синхронизации на минимальной границе диапазона, меньше индекс регуляторноадаптивного статуса. При уменьшении степени тяжести сахарного диабета 2-го типа значения параметров сердечно-дыхательного синхронизма приближаются к параметрам здоровых лиц (табл. 3).

Параметры сердечно-дыхательного синхронизма могут служить дополнительным критерием при определении степени тяжести у больных сахарным диабетом 2-го типа.

О состоянии компенсации наряду с улучшением клинической картины у пациентов свидетельствует динамика уровня глюкозы крови. Как показали исследования существует связь между уровнем глюкозы и параметрами сердечно-дыхательного синхронизма. Так, у больных между уровнем глюкозы крови и шириной диапазона сердечно-дыхательного синхронизма прослеживается обратная сильная корреляционная связь (коэффициент корреляции 0,99).

Таким образом, отражая функциональное состояние организма больного, параметры сердечно-дыхательного синхронизма могут использоваться в качестве

метода оценки эффективности проводимого лечения у больных сахарным диабетом 2-го типа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аметов А. С., Мельник А. В. Управление сахарным диабетом: роль постпрандиальной гипергликемии и возможности её коррекции// Русский медицинский журнал. - 2007. - Т. 15. № 27. - С. 2053-2058.

2. Дедов И. И., Шестакова М. В. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом. - М., 2007. - 127 с.

3. Покровский В. М. Сердечно-дыхательный синхронизм: выявление у человека, зависимость от свойств нервной системы и функциональных состояний организма / В. М. Покровский, В. Г. Абушкевич, Е. Г. Потягайло, А. Г. Похотько // Успехи физиологич. наук. - 2003. - Т. 34. № 3. - С. 68-77.

4. Покровский В. М., Пономарев В. В., Артюшков В. В., Фомина Е. В., Гриценко С. Ф., Полищук С. В. Система для определения сердечно-дыхательного синхронизма у человека. - Патент № 86860 от 20 сентября 2009 года.

5. Покровский В. М. Сердечно-дыхательный синхронизм в оценке регуляторно-адаптивных возможностей организма. - Краснодар, 2010. - 243 с.

Поступила 14.12.2010

Л. В. ВОХМИНЦЕВА, Н. Н. МАЯНСКАЯ

РОЛЬ АДАПТИВНЫХ ГОРМОНОВ В РЕГУЛЯЦИИ СОДЕРЖАНИЯ КАТИОННЫХ БЕЛКОВ

*+ _ ______________ _ *+

В НЕИТРОФИЛАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОМ КРОВИ

Кафедра биологической химии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава»,

Россия, 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52, тел. (383) 2266541.

E-mail: vokhmintseva@yandex.ru

Влияние адаптивных гормонов на содержание катионных белков в нейтрофилах крыс оценивали в различных моделях напряженности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси. Введение адреналина (0,6^10-6 М/100 г за 1 ч до декапитации) и гидрокортизона (0,3^10_э М/100 г в течение 3 дней) вызывало увеличение содержания катионных белков в нейтрофилах. Наибольшее повышение уровня катионных белков в нейтрофилах наблюдали при введении 0,3^10-э М/100 г гидрокортизона и 0,6^10-6 М/100 г адреналина в течение 6 дней через неделю после введения аллоксана в дозе 120 мкг/100 г массы тела. Добавление адреналина или гидрокортизона к нейтрофилам крови in vitro также вызывало увеличение содержания катионных белков в нейтрофилах.

Ключевые слова: нейтрофилы, катионные белки, адреналин, гидрокортизон.

L. V. VOKHMINTSEVA, N. N. MAYANSKAYA

THE ROLE OF ADAPTIVE HORMONES IN REGULATION OF CATIONIC PROTEINS LEVEL IN

PERIPHERAL BLOOD NEUTROPHILS

Department of biochemistry, SEIHPE Novosibirsk state medical university of Roszdrav,

Russia, 630091, Novosibirsk, Krasnyj avenue, 52, tel. (383) 2266541. E-mail: vokhmintseva@yandex.ru

The influence of adaptive hormones on neutrophils cationic proteins level was evaluated in rodent models of tension of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Epinephrine (0,6^10-6 M/100 g 1 hour before decapitaton) and hydrocortisone (0,3^10-9 M/100 g during 3 day) administration induced increased cationic proteins level in peripheral neutrophils. Hormonal administration (0,3^10-9 M/100 g hydrocortisone and 0,6^10-6 M/100 g epinephrine during 3 day after 7 days 120 mg/kg of alloxan) caused highest elevation neutrophils cationic proteins levels. Incubation of blood donors with epinephrine or hydrocortisone in vitro during 30 min has also increased the level of cationic proteins in neutrophils.

Key words: neutrophils, cationic proteins, epinephrine, hydrocortisone.

Полиморфно-ядерные нейтрофильные гранулоциты составляют 50-60% лейкоцитов крови и представляют собой дифференцированные клетки, богатые цитоплазматическими гранулами, содержимое которых выполняет чрезвычайно разнообразные функции в иммунитете. За счет слияния специфических и азурофильных гранул, содержащих в основном антимикробные полипептиды (дефенсины, гликозидазы, катепсины, миелоперокси-дазы, белок, увеличивающий проницаемость мембран) с фагосомами, обеспечивается эффективный киллинг микроорганизмов [4]. Содержимое желатиназных гранул (металлопротеиназа-9, аргиназа, Р2-интегрин) и секреторных гранул (азуроцидин, протеиназа-3) необходимо для трансэндотелиальной миграции нейтро-филов [4]. Белки специфических (1-1_37) и азурофильных гранул (азуроцидин, катепсин G, нейтрофильные пептиды человека 1-3) индуцируют адгезию и эмиграцию моноцитов в очаг воспаления [11]. Протеазы азурофильных гранул (эластаза и катепсин G) участвуют в генерации физиологически активных пептидов [8].

Активация иммунных клеток, таких как нейтрофилы, оркестрируется различными регуляторными путями, поскольку иммунная система не является автономной и находится под влиянием множества медиаторов, секре-тируемых эндокринной и нервной системами, также как и продуктов других клеток иммунной системы. К таким регуляторам относятся гормоны гипоталамо-гипофи-зарно-адреналовой оси, продукция которых повышается при травме, инфекциях, эмоциональном стрессе. В литературе представлены данные о влиянии катехоламинов и глюкокортикоидов на синтез цитокинов, фагоцитоз, хемотаксис нейтрофилов, продукцию супероксида кислорода, высвобождение лизоцима [6, 2, 12]. Целью данного исследования явилось изучение влияния адреналина и гидрокортизона на содержание катионных белков в ней-трофилах периферической крови.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на крысах Wistar массой 200-220 г (ЦНИЛ Новосибирского государственного медицинского университета). Содержание, питание, уход за крысами и выведение их из эксперимента осуществляли в

соответствии с Приказом МЗ СССР № 742 от 13.11.84 г. «Об утверждении Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Гормоны вводили в дозах, характерных для состояния напряженности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси. Первой группе животных адреналин вводили в дозе 0,6^10'6 М/100 г массы тела за 1 час до выведения крыс из эксперимента. Второй группе животных вводили суспензию гидрокортизона ежедневно в течение трех дней в дозе 0,3*10_э М/100 г. Поскольку стресс характеризуется развитием инсулиновой резистентности, животным третьей группы гормональный дисбаланс моделировали введением гидрокортизона (0,3^10'э М/100 г) совместно с адреналином (0,6И0_6 М/100 г) в течение 6 дней через неделю после введения аллоксана (120 мкг/100 г). Ин-тактные животные составили группу контроля. Влияние адреналина и гидрокортизона на содержание катионных белков в нейтрофилах было также оценено в экспериментах in vitro. К 50 мкл гепаринизированной крови доноров добавляли 20 мкл 0,001%-ного раствора адреналина или 20 мкл 0,5%-ной суспензии гидрокортизона и инкубировали в течение 30 мин при 37° С.

Содержание катионных белков в нейтрофилах периферической крови оценивали с помощью метода выявления содержания катионных белков, основанного на применении красителя прочного зелёного [1]. Средний цитохимический коэффициент содержания катионных белков рассчитывали по формуле: СЦК= (0а + 0,5б + 1в + 1,5г + 2д + 2,5е + 3ж)/100, где цифрами 0-3 обозначена степень интенсивности окрашивания, а буквами (а - ж) -количество однотипных клеток с определённой степенью окрашиваемости цитоплазмы. Распределение нейтро-филов по интенсивности окрашивания рассчитывали по процентному соотношению низкоактивных клеток (НАК) со степенью интенсивности окрашивания 0-0,5, среднеактивных клеток (САК) со степенью интенсивности окрашивания 1,0—1,5 и высокоактивных клеток (ВАК) со степенью интенсивности окрашивания 2-3.

Описательную статистику проводили с использованием следующих показателей: среднее арифметическое значение (М), стандартная ошибка (m). Соответствие нормальному распределению оценивали

Таблица 1

Влияние гормонов на содержание катионных белков нейтрофилов крыс с гормональными моделями стресса и их распределение по интенсивности окрашивания прочным зеленым

Условия эксперимента Средний цитохимический коэффициент Процентное содержание нейтрофилов, различающихся по интенсивности окрашивания прочным зелёным, %

НАК САК ВАК

Интактные (п=11) 0,7±0,04 53,4±3,7 44,6±3,7 2,1±0,8

Адреналин (п=9) 0,98±0,08* 32,9±4,5* 63,1±4,5* 4,0±0,8

Гидрокортизон (п=12) 1,2±0,02* 22,4±2,1* 65,3±2,0* 12,0±2,0*

Аллоксан + адреналин + гидрокортизон (п=9) 1,6±0,04* 12,9±2,0* 52,5±0,7 35,8±1,8*

Примечание: НАК - низкоактивные клетки,

САК - среднеактивные клетки,

ВАК - высокоактивные клетки;

* - р<0,05 по сравнению с показателями контрольной группы.

Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011

Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011

Таблица 2

Влияние гормонов на содержание катионных белков нейтрофилов доноров и их распределение по интенсивности окрашивания прочным зеленым

Условия эксперимента Средний цитохимический коэффициент Процентное содержание нейтрофилов, различающихся по интенсивности окрашивания прочным зелёным, %

НАК САК ВАК

Без добавок (n=7) 1,15 ± 0,06 28,1±3,1 59,3±2,6 14,0±3,3

Адреналин (n=6) 1,4 ± 0,03 * 18,0±2,4 * 49,0±7,5 26,3±1,4 *

Гидрокортизон (n=6) 1,6 ± 0,02 * 6,5±1,4 * 54,2±3,7 31,3±5,9 *

Примечание: НАК - низкоактивные клетки,

САК - среднеактивные клетки,

ВАК - высокоактивные клетки;

* - р<0,05 по сравнению с результатами после инкубации крови без добавок.

по критерию Шапиро - Уилка. Определение достоверности различий сравниваемых параметров между разными выборками проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты исследования

Исследование содержания катионных белков в ней-трофилах крыс с разными моделями напряженности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси показало их достоверное увеличение (табл.1). Введение адреналина сопровождалось повышением СЦК на 40% (p<0,05). Изменение показателя произошло за счет перераспределения нейтрофилов по интенсивности окрашивания, а именно увеличения доли среднеактивных клеток и снижения низкоактивных клеток (табл. 1). Введение гидрокортизона в течение трех дней характеризовалось большим увеличением среднего цитохимического коэффициента по сравнению с первой группой (введение адреналина) -СЦК в 1,7 раза (p<0,05) превышал таковой показатель в контроле. В этом случае перераспределение нейтрофи-лов по интенсивности окрашивания прочным зеленым касалось не только САК и НАК, но и высокоактивных клеток, относительное содержание которых возросло в 5,7 раза (p<0,05). Наиболее значительные изменения в уровне среднего цитохимического коэффициента и распределения клеток по интенсивности окрашивания прочным зеленым наблюдали в третьей группе, в которой введение адреналина и гидрокортизона было длительным на фоне инсулиновой резистентности, предварительно вызванной введением аллоксана. СЦК был более чем вдвое выше (p<0,05) среднего цитохимического коэффициента контрольной группы и составил 1,6±0,04 (р<0,05) за счёт значительного увеличения доли ВАК (в 17 раз, р<0,05) при снижении содержания НАК (в 4 раза, р<0,05).

Кроме изучения влияния адаптивных гормонов на содержание катионных белков в нейтрофилах крыс с экспериментальными моделями напряженности гипо-таламо-гипофизарно-адреналовой оси были проведены эксперименты по изучению влияния адреналина и гидрокортизона на содержание катионных белков в экспериментах in vitro (табл. 2). Добавление к крови доноров адреналина сопровождалось повышением СЦК на 25% (р<0,05) по сравнению с контролем. Перераспределение нейтрофилов по интенсивности окрашивания прочным зеленым при добавлении адреналина соответствовало таковому в экспериментальной моде-

ли и характеризовалось уменьшением доли НАК и повышением относительного содержания ВАК. Добавление гидрокортизона в среду инкубации крови доноров привело к повышению СЦК на 39%. В этом случае относительное содержание ВАК увеличилось в 2,2 раза (р<0,05), а НАК понизилось в 4,3 раза (р<0,05).

Результаты, полученные в экспериментах in vitro (повышение среднего цитохимического коэффициента и перераспределения нейтрофилов по интенсивности окрашивания прочным зеленым под влиянием адаптивных гормонов), имели сходную динамику с изменениями показателей в экспериментах in vivo на крысах с разными моделями напряженности гипоталамо-гипо-физарно-адреналовой оси.

Обсуждение

Взаимосвязь между нервной системой, гипоталамо-гипофизарно-адреналовой осью и компонентами врожденной и адаптивной иммунных систем играет ключевую роль в регуляции воспаления и иммунитета. Глюкокор-тикоиды в основном проявляют иммуносупрессивное действие, которое заключается в выключении множества провоспалительных генов, кодирующих цитокины (интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-6, ТНФ-а и др.), хемокины (интерлейкин-8, RANTES, MIP-1a, MCP-1 и др.), молекулы адгезии (ICAM-1, VCAM-1, E-селектин), воспалительные ферменты (индуци-бельные NO-синтетаза и циклооксигеназа-2), провос-палительные рецепторы (NK1 и NK2 тахикининовые рецепторы, рецептор B2 брадикинина) [3, 5]. Катехоламины также ингибируют продукцию интерлейкин-12, ТНФ-а, и интерферона-у [5]. Дополнительный эффект гормоны оказывают на синтез антивоспалительных белков, активируя экспрессию аннексина-1, ингибитора фосфолипазы A2 (CC10), в2-адренергического рецептора, IkB-a, интерлейкина-10, антагониста рецептора интерлейкина-1, ингибитора секреторной лей-копротеазы [3]. Катехоламины повышают продукцию интерлейкина-10, интерлейкина-4, трансформирующего фактора роста-Р [5]. Активация гипоталамо-ги-пофизарно-адреналовой оси во время иммунного или воспалительного ответа вызывает переход от провос-палительного цитокинового паттерна с повышением интерлейкина-1 и ТНФ-a до антивоспалительного цитокинового паттерна с повышением интерлейкина-10 и интерлейкина-4, тем самым защищая организм от развития синдрома системного воспалительного ответа

[5, 7]. Глюкокортикоиды значительно повреждают фагоцитарную и хемотаксическую активность нейтрофи-лов, способность к дыхательному взрыву и секреции лизоцима в ответ на стимуляцию [12]. Катехоламины также проявляют ингибирующее влияние на фагоцитоз, дегрануляцию, хемотаксис, продукцию супероксида кислорода нейтрофилами [6].

Изменение содержания катионных белков в нейтро-филах периферической крови в моделях напряженности гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси имеет несколько возможных объяснений. Повышение доли нейтрофилов с более высоким содержанием гранул, интенсивно окрашенных прочным зелёным, возможно, обусловлено увеличением количества клеток миело-идного ряда, резистентных к глюкокортикоид-индуци-руемому апоптозу, а также повышением содержания зрелых нейтрофилов в костном мозге [13]. Системные эффекты ЦНС также включают повышенное рекрутирование полиморфно-ядерных лейкоцитов в кровь [9]. Свой вклад в увеличение содержания катионных белков в нейтрофилах вносит также снижение апоптоза под влиянием глюкокортикоидов [10] и адреналина [2]. Повышение уровня катионных белков в нейтрофи-лах при добавлении адреналина или гидрокортизона в экспериментах in vitro, возможно, обусловлено снижением дегрануляции клеток под влиянием гормонов. Изменение содержания катионных белков в течение незначительного времени инкубации предполагает негеномные эффекты гормонов на процесс дегрануляции нейтрофилов, которые описаны в случае активации NO-синтетазы и ингибировании циклооксигеназы 2 под влиянием глюкокортикоидов [3]. Снижение дегрануляции нейтрофилов в кровяном русле и высвобождения в циркуляцию избыточного количества протеаз (эла-стаза, катепсины, коллагеназа, желатиназа), возможно, также имеет целью предотвращение системного воспаления, поскольку протеолитические ферменты азурофильных и специфических гранул способны активировать каскадные протеолитические системы -комплемента, свертывания, калликреин-кининовую, ренин-ангиотензиновую и привести к неблагоприятным последствиям для организма.

Таким образом, результаты исследований показали, что моделирование напряженности гипоталамо-гипофи-зарно-адреналовой оси у крыс приводит к повышению содержания катионных белков в нейтрофилах периферической крови, возможно, за счет снижения дегрануляции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Пигаревский В. Е., ред. Клиническая морфология нейтро-фильных гранулоцитов. - Ленинград, 1988. - 142 с.

2. Фролов В. А, Моисеева Е. Г., Пасечник А. В. Патофизиологические аспекты модулирования функциональных свойств нейтрофилов периферической крови человека // Бюл. экспер. биол. мед. - 2008. - Т. 141. № 6. - С. 622-624.

3. Barnes P. J. Corticosteroid effects on cell signaling // Eur. respir. j. - 2006. - Vol. 27. - P. 413-426.

4. BorregaardN., Cowland J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte // Blood. - 1997. - Vol. 89. № 10. -P. 3503-3521.

5. Elenkov I. J., Chrousos G. P. Stress system-organization, physiology and immunoregulation // Neuroimmunomodulation. - 2006. -Vol. 13. № 5-6. - P. 257-267.

6. Elenkov I. J., Wilder R. L., Chrousos G. P., Vizi E. S. The sympathetic nerve-an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system // Pharmacol. rev. - 2000. - Vol. 52. № 4. - P. 595-638.

7. Eskandari F., Webster J. I., Sternberg E. M. Neural immune pathways and their connection to inflammatory diseases // Arthritis res. ther. - 2003. - Vol. 5. № 6. - P. 251-265.

8. Pham C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation // Nat. rev. immunol. - 2006. - Vol. 6. № 7. -P. 541-550.

9. Pruenster M., Mudde L., Bombosi P., Dimitrova S., Zsak M., Middleton J., Richmond A, Graham G. J., Segerer S., Nibbs R. J., Rot A. The Duffy antigen receptor for chemokines transports chemokines and supports their promigratory activity // Nat. immunol. -2009. - Vol. 10. - P. 101-108.

10. Saffar A. S., Dragon S., Ezzati P., Shan L., Gounni A. S. Phosphatidylinositol 3-kinase and p38 mitogen-activated protein kinase regulate induction of Mcl-1 and survival in glucocorticoid-treated human neutrophils // J. alergy clin. immun. - 2008. - Vol. 121. № 2. - P. 492-498.

11. Soehnlein O., Weber C., Lindbom L. Neutrophil granule proteins tune monocytic cell function // Trends immunol. - 2009. -Vol. 30. № 11. - P. 538-546.

12. TaitA. S., Butts C. L., SternbergE. M. The role of glucocorticoids and progestins in inflammatory, autoimmune, and infectious disease // J. leukoc. biol. - 2008. - Vol. 84. № 4. - P. 924-931.

13. Trottier M. D., Newsted M. M, King L. E., Fraker P. J. Natural glucocorticoids induce expansion of all developmental stages of murine bone marrow granulocytes without inhibiting function // PNAS. - 2008. -Vol. 105. № 6. - P. 2028-2033.

Поступила 10.01.2011

С. П. ВЧЕРАШНЮК, А. X. КАДЕ

ДИНАМИКА УРОВНЯ НЕКОТОРЫХ ГОРМОНОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ТЭС-ТЕРАПИИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ГЕСТОЗА

Кафедра общей и клинической патофизиологии Кубанского государственного медицинского университета,

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. 8 918 4991853

При использовании ТЭС-терапии в комплексном лечении гестоза снижается повышенный уровень адреналина, норадре-налина, ангиотензина II. Сеансы ТЭС-терапии ограничивают чрезмерный рост адренокортикотропного гормона, повышают сниженный при гестозе уровень кортизола. ТЭС-терапия не влияет на уровень пролактина, который находится в пределах нормальных значений.

Ключевые слова: гестоз, ТЭС-терапия, адреналин, кортизол, пролактин.

Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011 УДК 618.3 - 008.6-039.12-085.847:612.11.018