ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МОНО- И ДИ-ПЭГ IL-10
PREPARING AND USING MONO- AND DI-PEGYLATED IL-10

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям монопегилированного (ПЭГ) и ди-ПЭГ-IL-10 и способам их применения.
Уровень техники изобретения
Цитокин интерлейкин-10 (IL-10) является димером, который становится биологически неактивным при разрушении нековалентных взаимодействий, соединяющих его две мономерные субъединицы. IL-10 был впервые идентифицирован как продукт T-клеток-хелперов второго типа, и позднее было показано, что он продуцируется другими типами клеток, включая B-клетки и макрофаги. Он также ингибирует синтез некоторых цитокинов, продуцируемых T-клетками-хелперами первого типа, таких как γ-интерферон, IL-2 и фактор некроза опухолей-α (TNF-α, ФНО-α). Способность IL-10 ингибировать модуляторы клеточно-опосредованного иммунного ответа и подавлять обусловленный антигенпрезентирующими клетками T-клеточный ответ свидетельствует о том, что IL-10 обладает иммуносупрессивными свойствами. Этот цитокин также ингибирует синтез моноцитами/макрофагами других цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, ГМКСФ), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF, ГКСФ) и ФНО-α. Благодаря своей плейотропной активности IL-10 изучается с точки зрения многочисленных клинических применений, таких как лечение воспалительных состояний, бактериального сепсиса, индуцируемого энтеротоксином летального шока и аутоиммунных заболеваний, например ревматоидного артрита, отторжения аллотрансплантата и диабета.
Cellular and Molecular Immunology
Cytokine Reference
New Engl. J. Med.
New Engl. J. Med.
Рак и опухоли можно контролировать или полностью устранять при помощи иммунной системы. Иммунная система включает несколько типов лимфоидных и миелоидных клеток, например моноциты, макрофаги, дендритные клетки (ДК), эозинофилы, T-клетки, B-клетки и нейтрофилы. Эти лимфоидные и миелоидные клетки продуцируют секретируемые сигнальные белки, известные как цитокины. Цитокины включают, например, интерлейкин-10 (IL-10), интерферон-гамма (TNFγ, ИФНγ), IL-2 и IL-23. Иммунный ответ включает воспаление, т.е. накопление иммунных клеток во всем организме или в отдельном месте тела. В ответ на инфекционный агент или инородное вещество иммунные клетки выделяют цитокины, которые, в свою очередь, регулируют пролиферацию, развитие, дифференциацию или миграцию иммунных клеток. Избыточный иммунный ответ может иметь патологические последствия, такие как аутоиммунные заболевания, в то время как ослабленный иммунный ответ может приводить к онкологическим заболеваниям. Противоопухолевый ответ иммунной системы включает врожденный иммунитет, например, опосредованный макрофагами, природными клетками-киллерами и нейтрофилами, и приобретенный иммунитет, например, опосредованный антигенпрезентирующими клетками (АПК), T-клетками и B-клетками (см., например, Abbas, et al. (eds.) (2000) , W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppenheim and Feldmann (eds.) (2001) , Academic Press, San Diego, CA; von Andrian and Mackay (2000)  343: 1020-1034; Davidson and Diamond (2001)  345: 340-350).
J. Exp. Med.
J. Immunol.
J. Exp. Med.
Способы регулирования иммунного ответа использовались в терапии рака, например меланомы. Эти способы включают лечение или цитокинами, такими как IL-2, IL-10, IL-12, фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа), ИФНγ (IFNγ), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (ГМКСФ) и трансформирующий фактор роста (TGF, ТФР), или антагонистами цитокинов (например, антителами). Интерлейкин-10 был впервые описан как фактор, ингибирующий синтез цитокинов (CSIF, ФИСЦ; см., например, Fiorentino, et al. (1989)  170: 2081-2095). IL-10 является плейотропным цитокином, продуцируемым T-клетками, B-клетками, моноцитами, который может функционировать как в качестве иммунодепрессанта, так и в качестве иммуностимулятора (см., например, Groux, et al. (1998)  160: 3188-3193; и Hagenbaugh, et al. (1997)  185: 2101-2110).
J. Exp. Med.
J. Natl. Cancer Inst.
J. Clin. Oncol.
Животные модели наводят на мысль о том, что IL-10 может индуцировать активацию природных клеток-киллеров и облегчать деструкцию клеток-мишеней дозозависимым образом (см., например, Zheng, et al. (1996)  184: 579-584; Kundu, et al. (1996)  88: 536-541). Дальнейшие исследования показали, что присутствие IL-10 в опухолевом микроокружении коррелирует с лучшей выживаемостью больных (см., например, Lu, et al. (2004)  22: 4575-4583).
По причине своего относительно короткого времени полужизни IL-10 соединялся с различными агентами, включая полиэтиленгликоль. Другие цитокины также подвергались пегилированию, как правило, путем монопегилирования, например молекулы ПЭГ присоединялись к одному остатку белка цитокина. К сожалению, монопегилирование одной субъединицы IL-10 приводит к образованию неоднородной смеси из монопегилированных, дипегилированных и непегилированных молекул IL-10, что вызвано перестановками субъединиц. Если реакции пегилирования позволяют дойти до конца, то это также приводит к получению неспецифичных и мультипегилированных целевых белков, что снижает биологическую активность этих белков. Таким образом, существует потребность в более эффективном получении правильно пегилированного IL-10 с более высоким выходом продукта. Настоящее изобретения удовлетворяет эту потребность путем предложения способов получения смеси моно- и дипегилированного IL-10.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показана кинетика реакции получения моно- и ди-ПЭГ-IL-10.
На фиг.2 показана эффективность действия различных моно- и ди-ПЭГ-IL-10 (мышиных) прототипов на имплантированную плоскоклеточную карциному PDV6.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на открытии, что в результате контролируемой реакции образуется смесь избирательно пегилированного моно- и ди-ПЭГ-IL-10, что в свою очередь повышает выход конечного продукта, имеющего сопоставимую эффективность с другими типами ПЭГ-IL-10.
Настоящее изобретение относится к способу получения смеси моно- и дипегилированного IL-10, где по меньшей мере одна молекула ПЭГ ковалентно присоединена к по меньшей мере одному аминокислотному остатку по меньшей мере одной субъединицы IL-10, включающему a) осуществление реакции белка IL-10 в концентрации от 1 мг/мл до 12 мг/мл с активированным ПЭГ-линкером, так чтобы отношение IL-10 к ПЭГ-линкеру составляло от 1:1 до 1:7,7, в присутствии от 0,75 мМ до 35 мМ восстанавливающего агента, при значении pH от примерно 5,0 до 7,4 и температуре от 5°С до 30°С в течение 12-15 часов; и b) очистку смеси моно- и дипегилированного IL-10. В некоторых вариантах осуществления изобретения ПЭГ-линкер выбран из группы, состоящей из ПЭГ-сукцинимидилкарбоната, ПЭГ-бутиральдегида, ПЭГ-пентальдегида, ПЭГ-амидопропиональдегида, ПЭГ-уретанопропиональдегида и ПЭГ-пропилальдегида, ПЭГ-линкер имеет массу от 5000 дальтон до 12000 дальтон, или восстанавливающий агент выбран из группы, состоящей из боргидрида, цианоборгидрида натрия, аминоборана и пиколин-борана. В еще одном варианте осуществления изобретения смесь моно- и ди-ПЭГ очищают при помощи хроматографии, выбранной из группы, состоящей из катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии и хроматографии с гидрофобным взаимодействием. Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей моно- и ди-ПЭГ-IL-10, полученный этим способом осуществления реакции, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение относится к способу получения смеси моно- и дипегилированного IL-10, где по меньшей мере одна молекула ПЭГ ковалентно присоединена к по меньшей мере одному аминокислотному остатку по меньшей мере одной субъединицы IL-10, включающему a) осуществление реакции белка IL-10 в концентрации 7,5 мг/мл с активированным ПЭГ-линкером, так чтобы отношение IL-10 к ПЭГ-линкеру составляло 1:3,5, в присутствии 25 мM восстанавливающего агента, при значении pH 6,3 и температуре 15°С в течение 15 часов; и b) очистку смеси моно- и дипегилированного IL-10. В некоторых вариантах осуществления изобретения ПЭГ-линкер выбран из группы, состоящей из ПЭГ-сукцинимидилкарбоната, ПЭГ-бутиральдегида, ПЭГ-пентальдегида, ПЭГ-амидопропиональдегида, ПЭГ-уретанопропиональдегида и ПЭГ-пропилальдегида. Молекулярная масса ПЭГ, составляющего ПЭГ-линкер, составляет от 5000 дальтон до 12000 дальтон, восстанавливающий агент выбран из группы, состоящей из боргидрида, цианоборгидрида натрия, аминоборана и пиколинборана, или смесь моно- и ди-ПЭГ очищают при помощи хроматографии, выбранной из группы, состоящей из катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии и хроматографии с гидрофобным взаимодействием. Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей моно- и ди-ПЭГ-IL-10, полученный этим способом осуществления реакции, и фармацевтически приемлемый носитель.
Подробное описание изобретения
Используемые в настоящем изобретении, включая прилагаемую формулу изобретения, формы единственного числа слов включают их соответствующие формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Все цитируемые в настоящем описании библиографические источники включены в него путем ссылки в такой же степени, как если бы для каждой отдельной публикации, патентной заявки или патента было специально и отдельно указано, что они включены в настоящее описание путем ссылки.
I. Определения терминов
Термины «активация», «стимуляция» и «обработка», когда они применяются по отношению к клеткам или рецепторам, могут иметь одинаковое значение, например активация, стимуляция или обработка клетки или рецептора лигандом, если иное не следует из контекста или не является очевидным. Термин «лиганд» включает природные и синтетические лиганды, например цитокины, варианты, аналоги, мутеины цитокинов и связывающие композиции, полученные из антител. Термин «лиганд» также включает низкомолекулярные соединения, например пептиды-миметики цитокинов и пептиды-миметики антител. Термин «активация» может относиться к активации клеток, регулируемой внутренними механизмами, а также внешними факторами и факторами окружающей среды. Термин «ответ», например, клетки, ткани, органа или организма включает изменение биохимических или физиологических характеристик, например концентрации, плотности, адгезии или миграции внутри биологического компартмента, скорости экспрессии генов или стадии дифференциации, где это изменение связано с активацией, стимуляцией или обработкой или с внутренними механизмами, такими как генетическое программирование.
Термин «активность» может описывать или относиться к связыванию молекулы с лигандом или рецептором, к каталитической активности; к способности стимулировать экспрессию генов или сигнальную систему клетки, дифференциацию или созревание; к антигенной активности, к регуляции активности других молекул и тому подобному. Термин «активность» молекулы может также относиться к активности по изменению или поддержанию взаимодействий между клетками, например адгезии, или активности по поддержанию клеточных структур, например клеточных мембран или цитоскелета. Термин «активность» может также означать удельную активность, например [каталитическая активность]/[мг белка] или [иммунологическая активность]/[мг белка], концентрацию в биологическом компартменте или тому подобное. Термин «пролиферативная активность» относится к активности, которая стимулирует, является необходимой для или непосредственно связана с, например, нормальным делением клеток, раком, опухолями, дисплазией, преобразованием клеток, метастазированием и ангиогенезом.
in vitro
ex vivo
Термины «введение» и «лечение», когда они применяются по отношению к животному, человеку, подопытному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относятся к контакту экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического агента, соединения или композиции с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Термины «введение» и «лечение» могут относиться, например, к терапевтическим, плацебо, фармакокинетическим, диагностическим, научно-исследовательским и экспериментальным способам. Термин «обработка клетки» включает контакт реагента с клеткой, а также контакт реагента с жидкостью, где жидкость находится в контакте с клеткой. Термины «введение» и «обработка» также означают  и  обработку, например, клетки реагентом, диагностическим средством, связывающей композицией или другой клеткой. Термин «лечение», когда он применяется по отношению к человеку, животному или подопытному субъекту, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к научно-исследовательскому и диагностическому применениям. Термин «лечение», когда он применяется по отношению к человеку, животному или подопытному субъекту, клетке, ткани или органу, включает контакт ПЭГ-IL-10 с человеческим или животным субъектом, клеткой, тканью, физиологическим компартментом или физиологической жидкостью. Термин «обработка клетки» также включает ситуации, когда ПЭГ-IL-10 контактирует с рецептором IL-10 (гетеродимером IL-10R1 и IL-10R2), например, в жидкой фазе или коллоидной фазе, а также ситуации, когда агонист или антагонист IL-10 контактирует с жидкостью, например, когда жидкость находится в контакте с клеткой или рецептором, но когда не было показано, что агонист или антагонист непосредственно контактирует с клеткой или рецептором.
et al.
J. Am. Coll. Surg.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Nature Reviews Cancer
et al.
Drug Discovery Today
et al.
J. Chemother.
et al.
Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care
Термином «кахексия» обозначается синдром истощения, включающий потерю мышечной (мышечная атрофия) и жировой массы, происходящую в результате нарушений в метаболизме. Кахексия имеет место при различных формах рака («раковая кахексия»), хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), запущенных формах органной недостаточности и СПИД. Раковая кахексия характеризуется, например, выраженной потерей веса, анорексией, астенией и анемией. Анорексия является расстройством, происходящим в результате отсутствия мотивации принимать пищу, например, отвращения к пище (см., например, MacDonald,  (2003)  197: 143-161; Rubin (2003)  100: 5384-5389; Tisdale (2002)  2: 862-871; Argiles,  (2003)  8: 838-844; Lelli,  (2003)  15: 220-225; Argiles,  (2003)  6: 401-406).
Термин «консервативно модифицированные варианты ПЭГ-IL-10» применяется по отношению как к аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям. В случае конкретных последовательностей нуклеиновых кислот термин «консервативно модифицированные варианты» относится к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности или, когда нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к по существу идентичным последовательностям нуклеиновых кислот. Вследствие вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот может кодировать любой конкретный белок.
et al.
J. Mol. Biol.
Что касается аминокислотных последовательностей, то специалисту в данной области техники известно, что отдельная замена в нуклеотидной, пептидной, полипептидной или белковой последовательности, которая заменяет аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности консервативной аминокислотой, представляет собой «консервативно модифицированный вариант». Таблица консервативных замен, обеспечивающих получение функционально аналогичных аминокислот, хорошо известна в данной области техники. Примером консервативной замены является замена аминокислоты в одной из следующих групп на другую аминокислоту из той же группы (патент США № 5767063, выданный Lee, ; Kyte and Doolittle (1982)  157: 105-132):
(1) гидрофобные: Ile, Val, Leu, Phe, Cys или Met;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe;
(7) малые аминокислоты: Gly, Ala, Ser.
et al.
et al.
A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice
Good Laboratory and Good Clinical Practice
Термин «эффективное количество» включает количество, достаточное для ослабления или предупреждения симптома или признака заболевания. Термин «эффективное количество» также означает количество, достаточное для того, чтобы сделать возможным или облегчить диагностику. Эффективное количество для конкретного пациента или животного может меняться в зависимости от таких факторов, как заболевание, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, способ и доза введения и тяжесть побочных эффектов (см., например, патент США № 5888530, выданный Netti, ). Эффективным количеством может быть максимальная доза или схема дозировки, которые позволяют избежать значительных побочных или токсических эффектов. Эффект заключается в улучшении диагностического показателя или параметра по меньшей мере на 5%, обычно по меньшей мере на 10%, более обычно по меньшей мере на 20%, чаще всего по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 60%, оптимально по меньшей мере на 70%, более оптимально по меньшей мере на 80% и наиболее оптимально по меньшей мере на 90%, где 100% определяются как диагностический параметр, характерный для нормального субъекта (см., например, Maynard,  (1996) , Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) , Urch Publ., London, UK). Эффективным количеством ПЭГ-IL-10 будет количество, достаточное для уменьшения объема опухоли, подавления роста опухоли, предотвращения метастазирования или увеличения инфильтрации CD8+ T-клеток в область локализации опухоли.
Термин «экзогенный» относится к веществам, которые вырабатываются вне организма, клетки или тела человека, в зависимости от контекста. Термин «эндогенный» относится к веществам, которые вырабатываются в клетке, организме или теле человека, в зависимости от контекста.
Термин «иммунное заболевание» или «иммунное расстройство» включает, например, патологическое воспаление, воспалительное заболевание, аутоиммунное расстройство или заболевание. Термин «иммунное заболевание» также относится к инфекциям, хроническим инфекциям и пролиферативным заболеваниям, таким как рак, опухоли и ангиогенез, включая инфекции, опухоли и рак, которые выдерживают воздействие со стороны иммунной системы. Термин «раковое заболевание» включает, например, рак, раковые клетки, опухоли, ангиогенез и предраковые состояния, такие как дисплазия.
Термины «ингибиторы» и «антагонисты» или «активаторы» и агонисты» относятся к ингибирующим или активирующим молекулам, соответственно, например, для активации, например, лиганда, рецептора, кофактора, гена, клетки, ткани или органа. Модулятором, например, гена, рецептора, лиганда или клетки является молекула, которая изменяет активность гена, рецептора, лиганда или клетки, где активность может быть активирована, ингибирована или изменена по своим регуляторным свойствам. Модулятор может действовать сам по себе или он может использовать кофактор, например белок, ион металла или низкомолекулярное соединение. Ингибиторы представляют собой химические соединения, которые уменьшают, блокируют, предотвращают, задерживают активацию, инактивируют, понижают чувствительность или подавляюще регулируют, например, ген, белок, лиганд, рецептор или клетку. Активаторы представляют собой химические соединения, которые увеличивают, активируют, облегчают, усиливают активацию, повышают чувствительность или стимулирующе регулируют, например, ген, белок, лиганд, рецептор или клетку. Ингибитор может быть также определен как композиция, которая уменьшает, блокирует или инактивирует конститутивную активность. Агонистом является химическое соединение, которое, взаимодействуя с мишенью, вызывает или стимулирует увеличение активации этой мишени. Антагонистом является химическое соединение, которое препятствует действию агониста. Антагонист предотвращает, уменьшает, ингибирует или нейтрализует активность агониста. Антагонист может также предотвращать, ингибировать или уменьшать конститутивную активность мишени, например целевого рецептора, даже тогда, когда агонист не выявлен.
Для изучения степени ингибирования, например, образцы или наборы для исследований, содержащие данный, например, белок, ген, клетку или организм, обрабатывают потенциальным активатором или ингибитором и сравнивают с контрольными образцами без ингибитора. Контрольным, т.е. не обработанным антагонистом, образцам присваивают значение относительной активности, равное 100%. Ингибирование достигается, когда значение активности относительно контроля составляет примерно 90% или менее, типично 85% или менее, более типично 80% или менее, наиболее типично 75% или менее, характерно 70% или менее, более характерно 65% или менее, наиболее характерно 60% или менее, типично 55% или менее, обычно 50% или менее, более обычно 45% или менее, наиболее обычно 40% или менее, предпочтительно 35% или менее, более предпочтительно 30% или менее, еще более предпочтительно 25% или менее и наиболее предпочтительно менее 25%. Активация достигается, когда значение активности относительно контроля составляет примерно 110%, характерно по меньшей мере 120%, более характерно по меньшей мере 140%, более характерно по меньшей мере 160%, часто по меньшей мере 180%, более часто по меньшей мере в 2 раза, наиболее часто по меньшей мере в 2,5 раза, обычно по меньшей мере в 5 раз, более обычно по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 20 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 40 раз и наиболее предпочтительно более чем в 40 раз больше.
Ann. Clin. Lab. Sci.
Nature Rev. Cancer
et al.
Curr. Drug Targets
Med. Clin. North Am.
Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.
et al.
Glia
Brain Pathol.
Конечные результаты активации и ингибирования можно отслеживать, как указано ниже. Активацию, ингибирование и ответ на лечение, например, клетки, физиологической жидкости, ткани, органа и животного или человека можно изучать через конечный результат. Конечный результат может включать заранее определенную величину или процент, например, признаков воспаления, онкогенности или клеточной дегрануляции или секреции, такой как высвобождение цитокинов, токсичного кислорода или протеаз. Конечный результат может включать, например, заранее определенную величину ионного потока или ионного транспорта; миграции клеток; адгезии клеток; пролиферации клеток; потенциала метастазирования; дифференциации клеток и изменения в фенотипе, например изменения в экспрессии генов, связанных с воспалением, апоптозом, трансформацией, клеточным циклом или метастазированием (см., например, Knight (2000)  30: 145-158; Hood and Cheresh (2002)  2: 91-100; Timme,  (2003)  4: 251-261; Robbins and Itzkowitz (2002)  86: 1467-1495; Grady and Markowitz (2002)  3: 101-128; Bauer,  (2001)  36: 235-243; Stanimirovic and Satoh (2000)  10: 113-126).
Конечный результат ингибирования обычно составляет 75% от контроля или менее, предпочтительно 50% от контроля или менее, более предпочтительно 25% от контроля или менее и наиболее предпочтительно 10% от контроля или менее. Как правило, конечный результат активации составляет по меньшей мере 150% от контроля, предпочтительно по меньшей мере в два раза больше контроля, более предпочтительно по меньшей мере в четыре раза больше контроля и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 раз больше контроля.
32
33
35
14
3
125
Chem. Biol.
«Помеченная» композиция детектируется или прямо, или опосредованно при помощи спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, изотопных и химических способов. Например, подходящие метки включают стабильные изотопы P, P, S, C, H, I, флуоресцентные красители, электроноплотные реагенты, субстраты, эпитопные метки или ферменты, например, такие, которые используются в иммуноферментном или флуоресцентном анализе (см., например, Rozinov and Nolan (1998)  5: 713-728).
Термин «лиганд» относится, например, к низкомолекулярному соединению, пептиду, полипептиду и мембраноассоциированной или мембраносвязанной молекуле или их комплексу, которые могут действовать как агонист или антагонист рецептора. Термин «лиганд» также включает агент, который не является агонистом или антагонистом, но который может связываться с рецептором, не оказывая по существу влияния на его биологические свойства, например на проведение сигнала или адгезию. Кроме того, термин «лиганд» включает мембраносвязанный лиганд, который был преобразован, например, химическим или рекомбинантным способом в растворимую форму этого мембраносвязанного лиганда. Как правило, когда лиганд связан с мембраной первой клетки, рецептор обычно находится на второй клетке. Вторая клетка может обладать той же идентичностью, что и первая или отличаться от нее. Лиганд или рецептор могут быть полностью внутриклеточными, т.е. они могут находиться в цитозоле, ядре или каком-либо другом внутриклеточном компартменте. Лиганд или рецептор могут менять свое местоположение, например, с внутриклеточного компартмента на наружную поверхность цитоплазматической мембраны. Комплекс лиганда и рецептора называется «лиганд-рецепторный комплекс». Когда лиганд и рецептор вовлечены в сигнальный путь, положение лиганда в этом сигнальном пути находится до положения рецептора.
et al.
Biochem. Biophys. Res. Commun.
J. Biotechnol.
Nat. Biotechnol.
et al.
Curr. Med. Chem.
et al.
Curr. Pharm. Des.
et al.
Nat. Struct. Biol.
Biochem. J.
et al.
Низкомолекулярные соединения предназначены для лечения физиологических состояний и нарушений при опухолях и раке. «Низкомолекулярные соединения» определяются как соединения, молекулярный вес которых составляет менее 10 кДа, обычно менее 2 кДа и предпочтительно менее 1 кДа. К числу низкомолекулярных соединений относятся, без ограничений, неорганические молекулы, органические молекулы, содержащие неорганический компонент, молекулы, включающие радиоактивный атом, синтетические молекулы, пептиды-миметики и антитела-миметики. Как лекарственные средства низкомолекулярные соединения могут легче проникать в клетку, менее подвержены деградации и менее склонны вызывать иммунный ответ по сравнению с высокомолекулярными соединениями. Низкомолекулярные соединения, такие как пептиды-миметики антител и цитокинов, а также низкомолекулярные токсины, описаны в литературе (см., например, Casset,  (2003)  307: 198-205; Muyldermans (2001)  74: 277-302; Li (2000)  18: 1251-1256; Apostolopoulos,  (2002)  9: 411-420; Monfardini,  (2002)  8: 2185-2199; Domingues,  (1999)  6: 652-656; Sato and Sone (2003)  371: 603-608; патент США № 6326482, выданный Stewart, ).
TM
Термин «химиотерапевтический агент» относится к химическому соединению, пригодному для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CITOXAN); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренальные средства, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например паклитаксел (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) и доцетаксел (Taxotere; Rhone-Poulene Porer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин C; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода (Xeloda Roche, Switzerland); ибандронат; CPT11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевую кислоту; эсперамицины; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше веществ. Также в данное определение включены антигормональные агенты, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Fareston); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и госерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше веществ.
9
et al.
Analyt. Biochem.
Термин «специфичное» или «избирательное» связывание, по отношению к лиганд/рецептор, антитело/антиген или другой связывающейся паре, означает реакцию связывания, которая определяется наличием белка в разнородной совокупности белков и других биологических соединений. Таким образом, в определенных условиях конкретный лиганд связывается с конкретным рецептором и не связывается в значительных количествах с другими белками, присутствующими в образце. Антитело или связывающая композиция, полученная из антигенсвязывающего сайта антитела, рассматриваемого способа, связывается со своим антигеном или его вариантом или мутеином с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше, предпочтительно по меньшей мере в десять раз больше, более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз больше и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 100 раз больше, чем аффинность любого другого антитела или связывающей композиции, полученной из него. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело обладает аффинностью большей, чем примерно 10 литров на моль, определенной, например, с помощью метода Скэтчарда (Munsen,  (1980)  107: 220-239).Термин «интерлейкин-10» или «IL-10», используемый в настоящем изобретении, независимо от того, конъюгирован ли он с полиэтиленгликолем или находится в неконъюгированной форме, относится к белку, содержащему две субъединицы, нековалентно соединенные в гомодимер. Используемый в настоящем изобретении термин «интерлейкин-10» или «IL-10», если не указано иное, может относиться к человеческому или мышиному IL-10 (номера доступа в Genbank NP_000563; M37897; или патент США № 6217857), которые также обозначаются как «чIL-10» или «мIL-10».
Термин «пегилированный IL-10» или «ПЭГ-IL-10» относится к молекуле IL-10, имеющей одну или несколько молекул полиэтиленгликоля, ковалентно присоединенных к одному или нескольким аминокислотным остаткам белка IL-10 через линкер, так что это соединение является стабильным. Термины «монопегилированный IL-10» и «моно-ПЭГ-IL-10» означают, что по меньшей мере одна молекула полиэтиленгликоля через линкер ковалентно присоединена к одному аминокислотному остатку на одной субъединице димера IL-10. Термины «дипегилированный IL-10» и «ди-ПЭГ-IL-10» означают, что по меньшей мере одна молекула ПЭГ через линкер присоединена к одному остатку на каждой субъединице димера IL-10. Средняя молекулярная масса молекулы ПЭГ предпочтительно составляет от примерно 5000 до примерно 50000 дальтон. Способ или место присоединения ПЭГ к IL-10 не является критичным, но предпочтительно, чтобы пегилирование не изменяло или только минимально изменяло активность биологически активной молекулы. Предпочтительно, чтобы увеличение времени полужизни было больше, чем любое уменьшение биологической активности. Для ПЭГ-IL-10 биологическая активность обычно измеряется путем оценки уровня воспалительных цитокинов (например, ФНОα, ИФНγ) в сыворотке субъектов, которых сенсибилизировали бактериальным антигеном (липополисахаридом, ЛПС) и которым вводили ПЭГ-IL-10, как описано в патенте США № 7052686.
1/2
Используемый в настоящем изобретении термин «время полужизни в сыворотке», сокращенно «t», означает период полувыведения, т.е. время, за которое концентрация агента в сыворотке достигает половины от своего начального или максимального значения. Термин «увеличенное время полужизни», используемый в настоящем изобретении по отношению к синтетическому агенту, означает, что синтетический агент выводится с меньшей скоростью, чем несинтетический, эндогенный агент или его вариант, полученный рекомбинантным способом.
II. Общие сведения
Настоящее изобретение относится к способам получения смеси моно- и ди-ПЭГ-IL-10. Было показано, что пегилированный IL-10 является более эффективным при лечении опухолей (см., например, заявку на патент США 20080081031). Настоящее изобретение относится к способу увеличения выхода пегилированного IL-10 путем очистки монопегилированного (по меньшей мере одна молекула ПЭГ на одной субъединице гомодимера IL-10) и дипегилированного (по меньшей мере одна молекула ПЭГ на каждой субъединице гомодимера IL-10) IL-10.
III. Полиэтиленгликоль («ПЭГ»)
et al.
J. Fermentation Bioengineering
Полиэтиленгликоль («ПЭГ») является химическим веществом, которое используется для приготовления лечебных белковых продуктов. Глагол «пегилировать» означает присоединить по меньшей мере одну молекулу ПЭГ к другой молекуле, например лечебному белку. Например, Адаген, пегилированный препарат аденозиндеаминазы, одобрен для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита; пегилированная супероксиддисмутаза проходила клинические испытания для лечения черепно-мозговых травм; пегилированный интерферон альфа проходил проверку в первой фазе клинических испытаний для лечения гепатита; сообщалось, что пегилированная глюкоцереброзидаза и пегилированный гемоглобин проходили доклинические испытания. Было показано, что присоединение полиэтиленгликоля защищает от протеолиза (см., например, Sada, , (1991)  71: 137-139).
В своей наиболее распространенной форме ПЭГ представляет собой линейный или разветвленный простой полиэфир с концевыми гидроксильными группами и имеющий общую формулу
2
2
n
2
2
HO-(CHCHO)-CHCH-OH
Для того чтобы присоединить ПЭГ к молекуле (полипептидам, полисахаридам, полинуклеотидам и низкомолекулярным органическим соединениям), ПЭГ необходимо активировать путем приготовления производного ПЭГ, имеющего функциональную группу на одном или обоих концах. Наиболее распространенным способом конъюгации ПЭГ с белками является активация ПЭГ при помощи функциональных групп, способных реагировать с лизином и группами N-концевой аминокислоты. В частности, наиболее распространенными реакционноспособными группами, вовлеченными в связывание ПЭГ с полипептидами, являются альфа- и эпсилон-аминогруппы лизина.
Реакция пегилирования линкера с белком приводит к присоединению молекулы ПЭГ преимущественно к следующим сайтам: альфа-аминогруппа на N-конце белка, эпсилон-аминогруппа на боковой цепи остатков лизина и имидазольная группа на боковой цепи остатков гистидина. Так как большинство рекомбинантных белков имеет одну альфа- и несколько эпсилон-аминогрупп и имидазольных групп, многочисленные позиционные изомеры могут быть получены в зависимости от химической природы линкера.
Biotehnol. Appl. Biochem.
Bioconjug. Chem.
Двумя широко используемыми монометоксипроизводными ПЭГ (мПЭГ) первого поколения являются сукцинимидилкарбонат ПЭГ (СК-ПЭГ; см., например, Zalipsky, et al. (1992)  15: 100-114; и Miron and Wilcheck (1993)  4: 568-569) и бензотриазолкарбонат ПЭГ (БТС-ПЭГ; см., например, Dolence, et al. Патент США № 5650234), которые реагируют преимущественно с остатками лизина, образуя карбаматную связь, но также известно, что они реагируют с остатками гистидина и тирозина. Было показано, что связь с остатками гистидина ИФНα является гидролитически нестабильной имидазолкарбаматной связью (см., например, Lee and McNemar, Патент США № 5985263).
Чтобы избежать этих нестабильных связей, а также отсутствия избирательности при реагировании с остатками, была разработана технология пегилирования второго поколения. Применение ПЭГ-альдегидного линкера делает мишенью один сайт на N-конце полипептидной и/или белковой субъединицы через восстановительное аминирование. Для того чтобы получить различные формы пегилированных молекул, IL-10 может быть пегилирован с применением различных типов линкеров и значений pH (см., например, патенты США № 5252714, 5643575, 5919455, 5932462, 5985263, 7052686).
IV. Биологическая активность ПЭГ-IL-10
IL-10 человека при введении иммунокомпетентным мышам индуцирует быстрое образование нейтрализующих антител. Чтобы избежать нейтрализации этого типа, подкожное введение ПЭГ-чIL-10 делали мышам, дефицитным по B-клеткам, т.е. мышам, неспособным сформировать иммунный ответ. Точно диагностированные сингенные опухоли у этих иммунодефицитных мышей или значительно замедлили свой рост или были полностью отторгнуты ПЭГ-чIL-10. Ограничение или ингибирование роста опухоли зависело как от CD4, так и от CD8 T-клеток. После истощения CD8 клеток ингибирующий эффект ПЭГ-чIL-10 полностью исчезал. Таким образом, ПЭГ-чIL-10 индуцирует CD8 опосредованный цитотоксический ответ.
Дальнейший анализ опухолевой ткани показал, что ПЭГ-IL-10 увеличивает инфильтрацию CD8+ T-клеток в опухоль в большей степени, чем непегилированный IL-10. Уровень экспрессии воспалительных цитокинов инфильтрующими CD8 клетками был также выше при обработке ПЭГ-IL-10 по сравнению с обработкой непегилированным IL-10. Лечение пациентов с опухолями ПЭГ-IL-10 должно вызвать значительный противоопухолевый ответ и дать значительный терапевтический эффект.
Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison
Используемый в настоящем изобретении белок IL-10 содержит аминокислотную последовательность, которая имеет установленную гомологию по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% или более, например, по меньшей мере 95% с последовательностью зрелого белка IL-10, т.е. белка без любой лидерной последовательности (см., например, патент США № 6217857). Гомология аминокислотных последовательностей или идентичность последовательностей определяется путем оптимизации выравнивания остатков и, при необходимости, путем введения пробелов по мере надобности. Предполагается, что гомологичные аминокислотные последовательности, как правило, включают природные аллели, полиморфные и межвидовые разновидности каждой соответствующей последовательности. Типичные гомологичные белки или пептиды имеют от 25-100% гомологии (если пробелы могут быть введены) до 50-100% гомологии (если включены консервативные замены) с аминокислотной последовательностью полипептида IL-10 (см. Needleham et al, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Sankoff et al. , 1983, Addison-Wesley, Reading, Mass.; и пакеты программ от IntelliGenetics, Mountain View, Calif., и the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, Wis.).
Молекула IL-10 в конъюгатах ПЭГ-IL-10 может быть гликозилирована или может быть модифицирована негликозилированными мутеинами или другими аналогами, включая белок BCRF1 (вирусный IL-10 вируса Эпштейна-Барр). Модификации последовательностей, кодирующих IL-10, могут быть сделаны с применением различных методов, например сайт-направленного мутагенеза [Gillman et al., Gene 8: 81-97 (1979); Roberts et al., Nature 328: 731-734 (1987)], и могут быть оценены с помощью рутинного скрининга в соответствующем анализе активности IL-10. Модифицированные белки IL-10, например варианты, могут отличаться от существующих в природе последовательностей на уровне первичной структуры. Такие модификации могут быть сделаны путем аминокислотных инсерций, замен, делеций или слияний. Варианты IL-10 могут быть получены, имея в виду различные цели, включая увеличение времени полужизни в сыворотке, уменьшение иммунного ответа на IL-10, облегчение очистки или получения, уменьшение превращения IL-10 в свои мономерные субъединицы, улучшение терапевтической эффективности и ослабление тяжести или возникновения побочных эффектов во время терапевтического применения. Варианты аминокислотных последовательностей обычно предопределены вариантами, не встречающимися в природе, хотя они могут быть посттрансляционными вариантами, например, гликозилированными вариантами. Любой вариант IL-10 может быть применен в настоящем изобретении при условии, что он сохраняет надлежащий уровень активности IL-10. В контексте опухолей, надлежащая активность IL-10 может заключаться, например, в инфильтрации CD8+ T-клеток в области локализации опухоли, экспрессии воспалительных цитокинов, таких как ИФНγ, IL-4, IL-6, IL-10 и RANK-L (лиганд рецептора активатора ядерного фактора каппа B) этими инфильтрующими клетками, увеличении уровня ФНОα или ИФНγ в биологических образцах.
Используемый в настоящем изобретении IL-10 может быть получен от млекопитающего, например человека или мыши. IL-10 человека (чIL-10) является предпочтительным для лечения людей, нуждающихся в лечении IL-10. Используемый в настоящем изобретении IL-10 предпочтительно является рекомбинантным IL-10. Способы, описывающие получение человеческого и мышиного IL-10, можно найти в патенте США № 5231012. Также в настоящее изобретение включены существующие в природе или консервативно замещенные варианты человеческого и мышиного IL-10. В другом варианте осуществления настоящего изобретения IL-10 может быть вирусного происхождения. Клонирование и экспрессия вирусного IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (белок BCRF1) раскрыты в Moore et al., Science 248: 1230 (1990).
Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach
IL-10 может быть получен несколькими путями с применением стандартных методов, известных из уровня техники, например выделен и очищен из культуральной среды активированных клеток, способных секретировать белок (например, T-клеток), химически синтезирован или получен рекомбинантными методами (см., например, Merrifield, Science 233: 341-47 (1986); Atherton et al., , 1989, I.R.L. Press, Oxford; патент США № 5231012, в котором раскрываются способы получения белков, обладающих активностью IL-10, включая рекомбинантные и другие синтетические методы). Предпочтительно, белок IL-10 получают из нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид IL-10, с применением рекомбинантных технологий. Рекомбинантный IL-10 человека также является коммерчески доступным, например, производства фирмы PeproTech, Inc., Rocky Hill, N.J.
Chemical Reagents for Protein Modification CRC Press, Inc., vol. 1, pp. 105-125
ПЭГ-IL-10 может быть получен с помощью методов, хорошо известных из уровня техники. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) может быть синтезирован так, как описано, например, в Lundblad, R.L. et al. (1988) . ПЭГ может быть конъюгирован с IL-10 с применением линкера, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения используемый в изобретении ПЭГ-IL-10 является моно-ПЭГ-IL-10, в котором от одной до девяти молекул ПЭГ ковалентно присоединены через линкер к альфа-аминогруппе аминокислотного остатка на N-конце одной субъединицы димера IL-10.
V. Терапевтические композиции, способы
ПЭГ-IL-10 может входить в состав рецептуры фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество IL-10 и фармацевтический носитель. «Терапевтически эффективным количеством» является количество, достаточное для того, чтобы обеспечить желаемый терапевтический результат. Предпочтительно, такое количество обладает минимальными отрицательными побочными эффектами. Количество ПЭГ-IL-10, вводимое для лечения заболевания, поддающегося лечению IL-10, основывается на активности конъюгированного белка IL-10, которая может быть определена с помощью известного из уровня техники анализа активности IL-10. Терапевтически эффективное количество для конкретного пациента, нуждающегося в таком лечении, может быть определено с учетом различных факторов, таких как заболевание, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, способ введения, тяжесть побочных эффектов и тому подобное. В контексте опухолей, надлежащая активность IL-10 может заключаться, например, в инфильтрации CD8 T-клеток в области локализации опухоли, экспрессии воспалительных цитокинов, таких как ИФНγ, IL-4, IL-6, IL-10 и лиганд рецептора активатора ядерного фактора каппа B, этими инфильтрующими клетками, увеличении уровня ФНОα или ИФНγ в биологических образцах.
Терапевтически эффективное количество пегилированного IL-10 может находиться в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 100 мкг белка на кг массы тела в день. Предпочтительно, количество пегилированного IL-10 находится в диапазоне от примерно 0,1 до 20 мкг белка на кг массы тела в день, более предпочтительно от примерно 0,5 до 10 мкг белка на кг массы тела в день и наиболее предпочтительно от примерно 1 до 4 мкг белка на кг массы тела в день. Менее частый режим введения может быть применен при применении ПЭГ-IL-10 настоящего изобретения, так как эта конъюгированная форма действует дольше, чем IL-10. Пегилированный IL-10 вводят в состав рецептуры в очищенном виде и в значительной степени свободным от агрегаций и других белков. Предпочтительно, ПЭГ-IL-10 вводится путем непрерывной инфузии, так, чтобы количество поступающего в день белка находилось в диапазоне от примерно 50 до 800 мкг (т.е. от примерно 1 до 16 мкг белка ПЭГ-IL-10 на кг массы тела в день). Скорость введения в течение суток может меняться в зависимости от наблюдаемых побочных эффектов и количества клеток крови.
Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary
et al.
Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics
Remington: The Science and Practice of Pharmacy
et al.
Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications
et al
Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets
et al
Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems
Excipient Toxicity and Safety
Для приготовления фармацевтических композиций, содержащих моно-ПЭГ-IL-10, терапевтически эффективное количество ПЭГ-IL-10 смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. Предпочтительно, носитель или наполнитель является инертным. Фармацевтическим носителем может быть любое совместимое нетоксичное вещество, пригодное для доставки композиций IL-10 настоящего изобретения пациенту. Примеры подходящих носителей включают физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и раствор Хенкса. Неводные носители, такие как нелетучие масла и этилолеат, также могут быть применены. Предпочтительным носителем является 5% раствор декстрозы в физиологическом растворе. Носитель может содержать небольшие количества добавок, таких как вещества, которые повышают изотоничность и химическую стабильность, например, буферы и консерванты, см., например, , Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Препараты терапевтических и диагностических агентов могут быть приготовлены путем смешивания физиологически приемлемых носителей, наполнителей или стабилизаторов в виде, например, лиофилизированных порошков, густых суспензий, водных растворов или суспензий (см., например, Hardman,  (2001) , McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) , Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis,  (eds.) (1993) , Marcel Dekker, NY; Lieberman, . (eds.) (1990) , Marcel Dekker, NY; Lieberman, . (eds.) (1990) , Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) , Marcel Dekker, Inc., New York, NY).
Композиции настоящего изобретения могут вводиться в организм перорально или путем инъекций. Препараты для перорального применения могут также включать химические соединения, дополнительно защищающие IL-10 от действия протеаз в желудочно-кишечном тракте. Инъекции обычно делаются внутримышечно, подкожно, внутрикожно или внутривенно. Кроме того, внутрисуставная инъекция или другие пути введения могут применяться в соответствующих обстоятельствах.
Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications
Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets
Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems
Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol
Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals
При парентеральном введении пегилированный IL-10 предпочтительно готовят в виде единичной дозы в инъецируемой форме (раствор, суспензия, эмульсия) в сочетании с фармацевтическим носителем (см., например, Avis et al., eds., , Dekker, N.Y. (1993); Lieberman et al., eds., , Dekker, N.Y. (1990); и Lieberman et al., eds., , Dekker, N.Y. (1990)). Кроме того, композиции настоящего изобретения могут быть введены в организм пациента с помощью вживляемой или инъецируемой системы доставки лекарственного средства, например, описанной в Urquhart et al. . 24: 199-236, (1984); Lewis, ed.,  Plenum Press, New York (1981); патентах США № 3773919; 3270960; и тому подобного. Пегилированный IL-10 может быть введен в водных средах, таких как вода, физиологический раствор или буферные среды, как с различными добавками и/или растворителями, так и без них.
et al
A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice
Good Laboratory and Good Clinical Practice
Эффективное количество для конкретного пациента может меняться в зависимости от таких факторов, как заболевание, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, способ и доза введения и тяжесть побочных эффектов (см., например, Maynard, . (1996) , Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) , Urch Publ., London, UK).
К числу типичных животных, экспериментальных или подопытных субъектов относятся обезьяны, собаки, кошки, крысы, мыши, кролики, морские свинки, лошади и люди.
et al
Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics
Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach
Cancer Chemotherapy and Biotherapy
th
Определение подходящей дозы осуществляется врачом-клиницистом, например, используя параметры или факторы, о которых в данной области известно или предполагается, что они влияют на лечение, или прогнозируется, что они повлияют на лечение. Как правило, величина дозы начинается с количества, несколько меньшего, чем оптимальная доза, и в дальнейшем оно увеличивается небольшими приращениями до тех пор, пока желаемый или оптимальный эффект не будет достигнут по отношению к любым отрицательным побочным эффектам. Важные диагностические показатели включают симптомы, например воспаления, или уровень продуцируемых воспалительных цитокинов. Предпочтительно, биологический препарат, который будет применен, получают от животного того же вида, к какому относится животное-объект лечения, тем самым минимизируя гуморальный ответ на реагент. Способы совместного введения или лечения со вторым терапевтическим агентом, например, цитокином, стероидом, химиотерапевтическим агентом, антибиотиком или радиацией хорошо известны из уровня техники (см., например, Hardman, . (eds.) (2001) , 10 ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) , Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) , Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA). Эффективное количество терапевтического средства будет уменьшать симптомы, например размер опухоли, или ингибировать рост опухоли, как правило, по меньшей мере на 10%; обычно по меньшей мере на 20%; предпочтительно по меньшей мере примерно на 30%; более предпочтительно по меньшей мере на 40% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 50%.
VI. Применение
et al
Oncogene
et al
New Engl. J. Med
et al
J. Immunol
et al
J. Immunol
New Engl. J. Med
New Engl. J. Med
New Engl. J. Med
New Engl. J. Med
et al
New Engl. J. Med
et al
New Engl. J. Med
et al
Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer, 4
ed.
th
Настоящее изобретение относится к способам лечения пролиферативного заболевания или нарушения, например, рака матки, шейки матки, молочной железы, предстательной железы, семенников, пениса, желудочно-кишечного тракта, например пищевода, ротоглотки, желудка, тонкого или толстого кишечника, толстой кишки или прямой кишки, почки, клетки почечного эпителия, мочевого пузыря, кости, костного мозга, кожи, головы или шеи, кожи, печени, желчного пузыря, сердца, легкого, поджелудочной железы, слюнной железы, надпочечников, щитовидной железы, мозга, например глиомы, ганглия, центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), и иммунной системы, например селезенки или тимуса. Настоящее изобретение относится к способам лечения, например, иммуногенных опухолей, неиммуногенных опухолей, опухолей в неактивной стадии, вирус-индуцированного рака, например рака эпителия, рака эндотелия, плоскоклеточной карциномы, рака, вызываемого папилломавирусом, аденокарциномы, лимфомы, карциномы, меланомы, лейкоза, миеломы, саркомы, тератокарциномы, химически индуцированного рака, метастазирования и ангиогенеза. Настоящее изобретение также предусматривает уменьшение толерантности опухолевых клеток или антигенов раковых клеток, например, путем регулирования активности Т-супрессоров и/или CD8 T-клеток (см., например, Ramirez-Montagut, . (2003)  22: 3180-3187; Sawaya, . (2003) . 349: 1501-1509; Farrar, . (1999) . 162: 2842-2849; Le, . (2001) . 167: 6765-6772; Cannistra and Niloff (1996) . 334: 1030-1038; Osborne (1998) . 339: 1609-1618; Lynch and Chapelle (2003) . 348: 919-932; Enzinger and Mayer (2003) . 349: 2241-2252; Forastiere, . (2001) . 345: 1890-1900; Izbicki, . (1997) . 337: 1188-1194; Holland, . (eds.) (1996) , Academic Press, San Diego, CA).
et al
Radiotherapy of Prostate Cancer
New Engl. J. Med
New Engl. J. Med
New Engl. J. Med
Int. Immunopharmacol
New Engl. J. Med
et al
New Engl. J. Med
et al
New Engl. J. Med
et al
New Engl. J. Med
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения пролиферативного заболевания, рака, опухоли или предракового состояния, такого как дисплазия, с помощью ПЭГ-IL-10 и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического или диагностического агента. Дополнительный терапевтический агент может быть, например, цитокином или антагонистом цитокина, таким как IL-12, интерферон альфа или антирецептор эпидермального фактора роста, доксорубицином, эпирубицином, антифолатом, например метотрексатом или фторурацилом, иринотеканом, циклофосфамидом, лучевой терапией, гормональной или антигормональной терапией, например, андрогеном, эстрогеном, антиэстрогеном, флутамидом или диэтилстилбестролом, хирургической операцией, тамоксифеном, ифосфамидом, митолактолом, алкилирующим агентом, например, мелфаланом или цисплатином, этопозидом, винорелбином, винбластином, виндезином, глюкокортикоидом, антагонистом гистаминового рецептора, ингибитором ангиогенеза, радиацией, радиосенсибилизатором, антрациклином, алкалоидом барвинка, таксаном, например, паклитакселем и доцетакселем, ингибитором клеточного цикла, например, ингибитором циклинзависимой киназы, моноклональным антителом против другого опухолевого антигена, комплексом моноклонального антигена и токсина, адъювантом T-клеток, трансплантатом костного мозга или антиген-презентирующими клетками, например, терапией дендритными клетками. Вакцины могут быть приготовлены, например, в виде растворимого белка или в виде нуклеиновой кислоты, кодирующей этот белок (см., например, Le, ., выше; Greco and Zellefsky (eds.) (2000) , Harwood Academic, Amsterdam; Shapiro and Recht (2001) . 344: 1997-2008; Hortobagyi (1998) . 339: 974-984; Catalona (1994) . 331: 996-1004; Naylor and Hadden (2003) . 3: 1205-1215; The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group (2004) . 350: 351-360; Slamon, . (2001) . 344: 783-792; Kudelka, . (1998) . 338: 991-992; van Netten, . (1996) . 334: 920-921).
et al
Leuk. Lymphoma
et al
J. Cutan. Pathol
Также предложены способы лечения экстрамедуллярного гемопоэза (ЭМГ) при раке. ЭМГ описан, например, в Rao, . (2003)  44: 715-718; Lane, . (2002) . 29: 608-612.
Полный объем настоящего изобретения лучше всего понятен из нижеследующих примеров, которые не предназначены для ограничения изобретения конкретными вариантами осуществления. Все цитируемые в настоящем описании библиографические источники включены в него путем ссылки в такой же степени, как если бы для каждой отдельной публикации или патентной заявки было специально и отдельно указано, что они включены в настоящее описание путем ссылки.
Многие модификации и варианты настоящего изобретения могут быть выполнены, не выходя за пределы его сущности и объема, как это будет очевидным для специалиста в данной области техники. Конкретные варианты осуществления изобретения, описанные здесь, предлагаются только в качестве примеров, и настоящее изобретение ограничено терминами прилагаемой формулы изобретения, а также полным объемом эквивалентов, на которые эта формула изобретения предоставляет право; и настоящее изобретение не ограничено конкретными вариантами осуществления, которые были представлены здесь в качестве примеров.
Примеры
I. Общие методы
et al
Molecular Cloning, A Laboratory Manual
Molecular Cloning, 3
ed
Recombinant DNA, Vol. 217
et al
Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4
rd
Стандартные молекулярно-биологические методики описаны в Maniatis, . (1982) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) , Academic Press, San Diego, CA. Стандартные методики также опубликованы в Ausubel, . (2001) , John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, где описываются клонирование в бактериальные клетки и ДНК-мутагенез (Том 1), клонирование в клетки млекопитающих и дрожжей (Том 2), гликоконъюгаты и экспрессия белка (Том 3) и биоинформатика (Том 4).
et al
Current Protocols in Protein Science, Vol. 1
et al
Current Protocols in Protein Science, Vol. 2
et al
Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3
Products for Life Science Research
BioDirectory
et al
Current Protcols in Immunology, Vol. 1
Using Antibodies
et al
Current Protcols in Immunology, Vol. 4
Способы очистки белка, включая иммунопреципитацию, хроматографию, электрофорез, центрифугирование и кристаллизацию, описаны в Coligan, . (2000) , John Wiley and Sons, Inc., New York. Химический анализ, химическая модификация, посттрансляционная модификация, получение слитых белков, гликозилирование белков описаны, например, в Coligan, . (2000) , John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, . (2001) , John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp.16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) , St. Louis, MO; pp.45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) , Piscataway, N.J., pp.384-391. Получение, очистка и фрагментация поликлональных и моноклональных антител описаны в Coligan, . (2001) , John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, выше. Стандартные методики для характеристики взаимодействий лиганд-рецептор доступны, например, из Coligan, . (2001) , John Wiley, Inc., New York. Способы получения ПЭГ-IL-10 описаны, например, в патенте США № 7052686.
et al
Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice
Flow Cytometry, 2
ed
Practical Flow Cytometry
Catalogue
Catalogue
nd
Способы проточной цитометрии, включая флуоресцентную сортировку клеток (FACS), доступны, например, из Owens, . (1994) , John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) .; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) , John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. Флуоресцентные реагенты, пригодные для модификации нуклеиновых кислот, включая нуклеотидные праймеры и зонды, полипептидов и антител для применения, например, в качестве диагностических реагентов, доступны из Molecular Probes (2003) , Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) , St. Louis, MO.
Human Thymus: Histopathology and Pathology
et al
Color Atlas of Histology
et al
Basic Histology: Text and Atlas
Стандартные методы гистологии иммунной системы описаны, например, в Muller-Harmelink (ed.) (1986) , Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, . (2000) , Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, . (2002) , McGraw-Hill, New York, NY.
The Cancer Handbook
Principles of Cancer Biotherapy, 3
ed
et al
Textbook of Melanoma
et al
Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6
ed
et al
Holland-Frei Cancer Medicine
Cellular Cancer Markers
Skin Cancer, 2
ed
New Engl. J. Med
Semin. Oncol
et al
Onkologie
rd
th
nd
Способы лечения и диагностики рака описаны, например, в Alison (ed.) (2001) , Grove's Dictionaries, Inc., St. Louis, MO; Oldham (ed.) (1998) ., Kluwer Academic PubL, Hingham, MA; Thompson, . (eds.) (2001) , Martin Dunitz, Ltd., London, UK; Devita, . (eds.) (2001) ., Lippincott, Phila, PA; Holland, . (eds.) (2000) , BC Decker, Phila., PA; Garrett and Sell (eds.) (1995) , Humana Press, Totowa, NJ; MacKie (1996) ., Mosby, St. Louis; Moertel (1994) . 330: 1136-1142; Engleman (2003) . 30(3 Suppl. 8): 23-29; Mohr, . (2003)  26: 227-233.
et al
Bioinformatics
et al
Bioinformatics Applications Note
et al
Comput. Methods Programs Biomed
Eur. J. Biochem
Nucleic Acids Res
Пакеты программ и базы данных для определения, например, антигенных фрагментов, лидерных последовательностей, сворачивания белка, функциональных доменов, сайтов гликозилирования и выравнивания последовательностей доступны, например, из GenBank, Vector NTI Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, . (2000)  16: 741-742; Menne, . (2000)  16: 741-742; Wren, . (2002) . 68: 177-181; von Heijne (1983) . 133: 17-21; von Heijne (1986) . 14: 4683-4690.
II. Пегилированный IL-10
IL-10 (например, грызунов или приматов) диализовали против 50 мM фосфата натрия, 100 мM хлорида натрия с диапазоном pH от 5 до 7,4. При молярном соотношении от 1:1 до 1:7 5К ПЭГ-пропилальдегид реагировал с IL-10, находящимся в концентрации от 1 до 12 мг/мл, в присутствии от 0,75 мМ до 30 мM цианоборгидрида натрия. В другом варианте реакция аналогичным образом может быть активирована пиколин-бораном. Реакцию инкубировали при температуре от 5°С до 30°С в течение 3-24 часов.
В частности, значение pH реакции пегилирования было доведено до 6,3. чIL-10 в концентрации 7,5 мг/мл реагировал с ПЭГ при отношении IL-10 к ПЭГ-линкеру 1:3,5. Конечная концентрация цианоборгидрида была 25 мМ, и реакцию проводили при температуре 15°С в течение 12-15 часов. На фиг.1 показана кинетика реакции образования моно- и ди-ПЭГ-IL-10. Моно- и ди-ПЭГ-IL-10 являются основными продуктами реакции с концентрацией каждого 50% на выходе.
Реакцию останавливали, используя аминокислоты, такие как глицин и лизин, или, в качестве варианта, Трис-буферы. Для очистки использовались различные способы, такие как гель-фильтрация, анионообменная и катионообменная хроматография и эксклюзионная хроматография, для того чтобы выделить желаемые пегилированные прототипы.
Альтернативно, IL-10 диализовали против 10 мМ фосфата натрия pH 7,0, 100 мМ NaCl. Диализированный IL-10 разбавляли в 3,2 раза до концентрации примерно от 0,5 до 12 мг/мл, используя для этого диализирующий буфер. Перед добавлением линкера SC-ПЭГ-12К (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, IL), 1 объем 100 мМ Na-тетрабората с pH 9,1 добавляли в 9 объемов разбавленного IL-10, чтобы повысить pH раствора IL-10 до 8,6. Линкер SC-ПЭГ-12К растворяли в диализирующем буфере и соответствующий объем раствора линкера (от 1,8 до 3,6 моль линкера на моль IL-10) добавляли в раствор разбавленного IL-10 для того, чтобы запустить реакцию пегилирования. Реакцию проводили при температуре 5°С для того, чтобы контролировать скорость реакции. Во время реакции пегилирования реакционный раствор слегка взбалтывали. Когда выход моно-ПЭГ-IL-10, определяемый эксклюзионной ВЭЖХ (эВЭЖХ), становился близким к 40%, реакцию останавливали добавлением 1M раствора глицина до конечной концентрации 30 мМ. Значение pH реакционного раствора медленно доводили до 7,0, используя для этого раствор HCl, и реакционный раствор пропускали через фильтр с порами 0,2 микрона и хранили при температуре -80°С.
III. Сравнение эффективности
6
3
Для сравнения различных прототипов ПЭГ-IL-10 10 мышам экспериментальной группы подкожно имплантировали 10 клеток плоскоклеточной карциномы PDV6 в матригеле в правый бок в объеме 100 мкл. Как только средний размер опухоли достигал 100 мм (примерно через 2-3 недели после имплантации), начинали лечение следующими мышиными прототипами ПЭГ-IL-10 или контрольным препаратом один раз в день (в качестве линкера использовали PPA, если не указано иное):
Контроль
HEPES буфер
0,2 мг/кг (mpk)
2 × 5К ди-ПЭГ-IL-10
0,02 мг/кг
2 × 5К ди-ПЭГ-IL-10
0,2 мг/кг
1 × 5К моно-ПЭГ-IL-10
0,02 мг/кг
1 × 5К моно-ПЭГ-IL-10
0,2 мг/кг
1 × 5К моно-ПЭГ-IL-10 + 2 × 5К ди-ПЭГ-IL-10
0,02 мг/кг
1 × 5К моно-ПЭГ-IL-10 + 2 × 5К ди-ПЭГ-IL-10
0,2 мг/кг
1 × 12К моно-ПЭГ-IL-10 (SC линкер)
0,02 мг/кг
1 × 12К моно-ПЭГ-IL-10 (SC линкер)
Измеряемые конечные результаты включали размер опухоли (измеряемый два раза в неделю), вес (измеряемый один раз в неделю) и сывороточную концентрацию (измеряемую в начале, середине и конце лечения). На фиг.2 показана эффективность различных прототипов, описанных выше.
Все цитируемые в настоящем описании библиографические источники включены в него путем ссылки в такой же степени, как если бы для каждой отдельной публикации или патентной заявки было специально и отдельно указано, что они включены в настоящее описание путем ссылки.
Многие модификации и варианты настоящего изобретения могут быть выполнены, не выходя за пределы его сущности и объема, как это будет очевидным для специалиста в данной области техники. Конкретные варианты осуществления изобретения, описанные здесь, предлагаются только в качестве примеров, и настоящее изобретение ограничено терминами прилагаемой формулы изобретения, а также полным объемом эквивалентов, на которые эта формула изобретения предоставляет право; и настоящее изобретение не ограничено конкретными вариантами осуществления, которые были представлены здесь в качестве примеров.