Защитная среда для криохранения для анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в фекальной микробиоте
PROTECTIVE ENVIRONMENT FOR CRYOPRESERVATION FOR ANAEROBIC, AEROBIC, FACULTATIVE ANAEROBIC AND MICROAEROPHILIC MICROORGANISMS IN FECAL MICROBIOTA

Защитная среда для криохранения для анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов
Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности, изготовлению композиции из смеси химических веществ, составляющих в итоге среду для сохранения микроорганизмов и биологического материала в условиях низких температур.
Проблема сохранения микробиоты человека охватывает как медицинские, так и экологические аспекты сохранения биоразнообразия микроорганизмов для последующего использования в промышленных и биомедицинских технологиях. Самым надежным во всех отношениях способом сохранения кишечной микробиоты человека на сегодняшний день является замораживание и хранение симбиотических микробных сообществ при низких температурах, в том числе в жидком азоте.
Известен состав криопротектора для замораживания меристем черной смородины в жидком азоте (KZ патент №2404 опубл. 15.06.2011 г.). Известна также среда для криоконсервации спермы осетровых рыб (РФ патент №2683682, опубл. 1.04.2019 г.).
Близких аналогов заявленному из области техники не выявлено.
Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является обеспечение сохранения микроорганизмов разных таксономических групп, в подборе универсальной среды с криопротектором для сохранения длительного хранения анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов чистых культур и анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в фекальной микробиоте кишечника в условиях низкой температуры.
Технический результат достигается тем, что защитная среда для криоконсервации для долгосрочного хранения анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов чистых культур и анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в фекальной микробиоте кишечника в условиях низких температур и криоконсервации содержит основу и проникающий криопротектор, при этом основу среды готовят из расчета на 500 мл дистиллированной воды 2 г бактериологического сухого Европейского агара, 2,5 г - NaCl, 1 г дрожжевого экстракта, L-цистин 0,2 мг; 8,5 мг - панкреатического гидролизата казеина с содержанием аминного азота 700-900% мг, 5 г декстрозы и 10% проникающего криопротектора в качестве которого используют стерильный в течение 20 минут при 121 град цельсия глицерин, который готовят из концентрата глицерина путем разведения дистиллированной водой до соотношения 1:10.
Использование для криоконсервации анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов как чистых микроорганизмов, так и в фекальной микробиоте кишечника в качестве непроникающего криопротектора основу защитной среды и проникающего криопротектора 10% глицерина позволяет защитить микроорганизмы от повреждающего действия замораживания, сохранить жизнеспособность разных таксономических групп микроорганизмов как в чистой культуре, так и в условиях симбиоза в фекальных массах, с сохранением титра; снижает риск или исключает полностью формирование внутриклеточного льда и обезвоживание микроорганизмов в условиях низких температур.
Приготовление основы из расчета на 500 мл дистиллированной воды 2 г бактериологического сухого Европейского агара, 2,5 г - NaCl, 1 г дрожжевого экстракта, L-цистин 0,2 мг; панкреатический гидролизат казеина - 8,5 мг с содержанием аминного азота 700-900% мг, 5 г декстрозы, которая используется в качестве непроникающего криопротектора и дает возможность сохранить фекальную микробиоту в исходном титре, осуществить защиту клетки от осмотических перепадов и является дополнительным компонентом к проникающему криопротектору, дающего возможность дополнительной защиты сохранить жизнеспособность клетки микроорганизмов в течении длительного времени в условиях низких температур.
Использование в качестве проникающего криопротектора 10% стерильный в течение 20 минут при 121 град цельсия глицерин, который готовят из концентрата глицерина путем разведения дистиллированной водой до соотношения 1:10, препятствуют формированию кристаллов льда за счет образования водородных связей с молекулами воды.
Рекомендуемое содержание компонентов защитной среды установлено в процессе многочисленных экспериментов.
Осуществление изобретения.
Подготовка защитной среды сохранения микроорганизмов, в том числе анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов чистых культур и анаэробных, аэробных, факультативно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов в фекальной микробиоте кишечника в условиях низких температур готовят в два этапа: основу (непроникающий криопротектор) и затем в готовую среду добавляют проникающий криопротектор 10% глицерин. Основу среды готовят из расчета на 500 мл дистиллированной воды 2 г бактериологического сухого Европейского агара, 2,5 г - NaCl, 1 г дрожжевого экстракта, L-цистин 0,2 мг; панкреатический гидролизат казеина - 8,5 мг с содержанием аминного азота 700-900% мг, 5 г декстрозы. Размешивают и доводят до кипения, кипятят 5 минут после закипания до полного растворения бактериологического агара (оценку проводят визуально по отсутствию комков на предметном стекле, для чего опускают предметное стекло в приготовленную среду, вынимают, дают возможность стечь и осматривают на предмет отсутствия комков) при этом рН среды соответствует 7,2±0,2. Разливают основу по емкостям и стерилизуют в течении 20 минут при температуре 121°С. Конечная величина основы должна быть стерильной.
Приготовление проникающего криопротектора: 10% стерильный в течение 20 минут при 121 град цельсия глицерин готовят из концентрата глицерина путем разведения дистиллированной водой до соотношения 1:10.
В стерильную основу перед проведением заморозки культур микроорганизмов или 1 мг фекалий добавляют к основе защитной среды 10% раствора глицерина в следующих пропорциях: на 100 мл среды 14 мл глицерина; 200 мл - 28 мл глицерина; 20 мл - 2,8 мл; 30 мл - 4,2 мл; 40 мл - 5,6 мл глицерина; 500 мл - 70 мл.
Готовая среда для криозаморозки представляет собой полужидкий вязкий стерильный раствор в стерильном флаконе емкостью 500 мл, полностью готовый к использованию в качестве среды для сохранения микроорганизмов в условиях низких и сверхнизких температур
Сущность изобретения поясняется примерами.
Пример 1
Суточные бактериальные культуры Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumonia, выделенные из нативного кала пассировались на агаризованной среде - мясо-пептонном агаре при температуре 37°С в течение 24 часов.
Готовили миллиардную взвесь каждой культуры по оптическому стандарту мутности. Для осуществления контроля готовили серийные разведения с дальнейшим высевом на соответствующие каждому микроорганизму твердые дифференциальные среды. Бактерии высевали методом прямого посева по 0,1 мл на соответствующие плотные дифференциальные среды.
В качестве сред - криопротекторов для сохранения микроорганизмов при низких температурах использовали:
1000 мкл 0,9% физиологического раствора;
850 мкл 0,9% физиологического раствора с добавлением 150 мкл 10% глицерина;
Защитную среду, состоящую из основы непроникающего криопротектора и 10% глицерина в качестве проникающего криопротектора;
1000 мкл тиогликолевой среды;
тиогликолевая среда с добавлением 5% диметилсульфоксидом (ДМСО).
Для криоконсервации готовили не менее 3 образцов каждой аликвоты интестинальной микробиоты. В криопротекторные композиции стерильно в ламинарном или анаэробном боксе добавляли 0,1 мг биологического материала и перемешивали на вортексе в течении 2-5 минут до получения однородной массы, затем помещали в морозильную камеру на -70°С и на -196°С в соответствии с требуемым сроком заморозки и условиями хранения биологического материала.
Дифференциация живых и мертвых бактериальных клеток в аликвотируемых образцах микробиоты человека проводили по методу Виноградского-Брида прямого подсчета живых и мертвых бактериальных клеток в гетерогенной суспензии с использованием камеры Горяева.
Исследования проводили при комнатной температуре (24-26°С) в ламинарном боксе, соблюдая правила асептики.
Замораживание образца микробиоты кишечника проводили при температуре -70°С в криопробирках и в пробирках типа Эппендорфа.
После полной разморозки содержимое криопробирок гомогенизировали на вортексе и готовили бактериальные суспензии методом серийных разведений для бактериологического посева по 0,1 мл для дальнейшей инкубации на агаризованных дифференциальных средах. После суточной инкубации при 37°С посевов учитывали результаты путем подсчета выросших колоний на чашках с учетом разведения. Результаты продемонстрированы в таблице 1.
Пример 2
В стерильный контейнер для сбора биологического материала собиралась полная разовая дефекация от каждого участника исследований. Контейнер с биологическим материалом герметично закрывался крышкой и в течение 2 часов в сумках-холодильниках доставлялся в микробиологическую лабораторию. Затем пробы кала аликвотировали и помещали в соответствующие условия для проведения исследований в анаэробных (отсутствия кислорода) и аэробных условиях (в присутствии кислорода).
Фекалии интестинальной микробиоты человека аликвотировали: для проведения микробиологического посева и для закладки в низкотемпературный морозильник с разными криопротекторами. Для этого в каждую аликвоту добавляли 1 мг фекалиях интестинальной микробиоты человека и 800 мкл среды криопротектора, размешивал на вортексе и помещали в низкотемпературный морозильник на -70°С и хранили в течение 2-х летнего периода.
2
Пробоподготовку и микробиологическое исследование проводили в соответствующих для каждого микроорганизма условиях: для строгих, облигатных микроорганизмов в анаэробном боксе с последующими условиями культивирования, микроаэрофилов - в ламинарных боксах, с последующим культивированием в CO-инкубаторе; для культивирования факультативных анаэробов и аэробов пробоподготовку и микробиологические исследования проводили в ламинарных боксах при комнатной температуре с последующим термостатированием при +37°С. Микроорганизмы идентифицировали с применением MALDI-TOF масс-спектрометр microflex LT компании BRUKER, Германия. Результаты продемонстрированы в таблице 2.
Пример 3
Суточные бактериальные культуры Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumonia, выделенные из нативных фекалий пассировались на агаризованной среде - мясо-пептонном агаре при температуре 37°С в течение 24 часов.
Готовили миллиардную взвесь каждой культуры по оптическому стандарту мутности. Для осуществления контроля готовили серийные разведения с дальнейшим высевом на соответствующие каждому микроорганизму твердые агаризованные дифференциальные среды. Бактерии высевали методом прямого посева по 0,1 мл на соответствующие плотные дифференциальные среды.
В качестве сред - криопротекторов для сохранения микроорганизмов при низких температурах использовали:
1000 мкл 0,9% физиологического раствора;
850 мкл 0,9% физиологического раствора с добавлением 150 мкл 10% глицерина;
Защитную среду, состоящую из основы непроникающего криопротектора и 10% глицерина в качестве проникающего криопротектора;
1000 мкл тиогликолевой среды;
тиогликолевая среда с добавлением 5% диметилсульфоксидом (ДМСО).
Для криоконсервации готовили не менее 3 образцов каждой аликвоты интестинальной микробиоты. В криопротекторные композиции стерильно в ламинарном или анаэробном боксе добавляли 0,1 мг биологического материала и перемешивали на вортексе в течении 2-5 минут до получения однородной массы, затем помещали в морозильную камеру на -70°С и на -196°С в соответствии с требуемым сроком заморозки и условиями хранения биологического материала.
Дифференциация живых и мертвых бактериальных клеток в аликвотируемых образцах микробиоты человека проводили по методу Виноградского-Брида прямого подсчета живых и мертвых бактериальных клеток в гетерогенной суспензии с использованием камеры Горяева.
Исследования проводили при комнатной температуре (24-26°С) в ламинарном боксе, соблюдая правила асептики.
Замораживание образца микробиоты кишечника проводили при температуре -196°С в криопробирках.
После полной разморозки содержимое криопробирок гомогенизировали на вортексе и готовили бактериальные суспензии методом серийных разведений для бактериологического посева по 0,1 мл на агаризованные дифференциальные среды. После суточной инкубации при 37°С посевов учитывали результаты путем подсчета выросших колоний на чашках с учетом разведения. Результаты продемонстрированы в таблице 3.
Пример 4
В стерильный контейнер для сбора биологического материала собиралась полная разовая дефекация от каждого участника исследований. Контейнер с биологическим материалом герметично закрывался крышкой и в течение 2 часов в сумках-холодильниках доставлялся в микробиологическую лабораторию. Затем пробы кала аликвотировали и помещали в соответствующие условия для проведения исследований в анаэробных (отсутствия кислорода) и аэробных условиях (в присутствии кислорода).
Фекалии интестинальной микробиоты человека аликвотировали: для проведения микробиологического посева и для закладки в низкотемпературный морозильник с разными криопротекторами. Для этого в каждую аликвоту добавляли 1 мг фекалий интестинальной микробиоты человека и 800 мкл среды криопротектора, размешивали на вортексе и помещали в низкотемпературный морозильник на -196°C (жидкий азот) и хранили в течение 2-х летнего периода.
2
Пробоподготовку и микробиологические посевы проводили в соответствующих для каждого микроорганизма условиях: для строгих, облигатных микроорганизмов в анаэробном боксе с последующими условиями культивирования; микроаэрофилов в ламинарных боксах с последующим культивированием в атмосфере с повышенным содержанием С0, для культивирования факультативных анаэробов и аэробов пробоподготовку и микробиологические исследования проводили в ламинарных боксах при комнатной температуре с последующим термостатированием при +37°С. Микроорганизмы идентифицировали с применением технологии MALDI-TOF при использовании масс-спектрометра Microflex компании BRUKER (Германия). Результаты продемонстрированы в таблице 4.