АНТИИДИОТИПИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ СПОСОБЫ
ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES AND METHODS RELATED TO THEM

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ
Заявка испрашивает приоритет в отношении предварительной заявки на патент США 62/369008, поданной 29 июля 2016 г., озаглавленной «ANTIBODIES AND RELATED METHODS», содержание которой настоящим включено в качестве ссылки в полном объеме для всех целей.
Включение в качестве ссылки на список последовательностей
Настоящая заявка подается вместе со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей предоставляется в виде файла 735042006540SeqList.TXT, созданного 15 июля 2017 года, размер которого составляет 86050 байт. Информация в электронном формате Списка последовательностей включена посредством ссылки в полном объеме.
Область техники, к которое относится изобретение
Настоящее описание относится в некоторых аспектах к антиидиотипическим антителам, которые специфически распознают фрагменты антител против CD19, в частности, фрагменты антител против CD19, присутствующие в рекомбинантных рецепторах, включающих химерные антигенные рецепторы (CAR). Описание дополнительно относится к применению антиидиотипических антител для специфической идентификации или селекции клеток, экспрессирующих такие рекомбинантные рецепторы, таких как анти-CD19 CAR T-клетки. Описание дополнительно относится к применению антиидиотипических антител для специфической активации таких клеток.
Уровень техники
in vitro
in vivo
Доступны способы адоптивной клеточной терапии с использованием сконструированных клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы, таких как химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий внеклеточные антиген-связывающие домены антител. Доступны различные стратегии для оценки активности таких клеток у пациента, либо , либо . Усовершенствованные методы необходимы для конкретной оценки активности CAR-экспрессирующих клеток. Настоящее описание относится к реагентам, композициям и изделиям, которые удовлетворяют таким потребностям.
Сущность изобретения
В настоящем описании предлагаются агенты, которые специфически связываются с антителами, включая фрагменты антител, такие как scFv, и химерные молекулы, содержащие их, такие как химерные антигенные рецепторы. Также предлагаются композиции и изделия, содержащие такие агенты, включая те, которые включают поверхность, с которой связан агент, такую как твердая поверхность, например планшет или микросфера. Также среди вариантов осуществления, предложенных в настоящем описании, есть применения и способы применения таких агентов, композиций и изделий, в том числе для детектирования, использования, манипуляции и/или стимулирования клеток или при терапиях, включающих или предположительно включающих антитело или химерную молекулу, как например, при детектировании, стимулировании или использовании CAR-экспрессирующих клеток.
В некоторых аспектах антитело представляет собой или включает антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которое представляет собой или содержит вариабельную область(и) антитела, обозначенного SJ25C1, и/или с его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления агент, например, антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержит вариабельную область легкой цепи (VL), которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности (и/или по меньшей мере 95% или 99% идентичности последовательности, или 100% идентичности) с аминокислотной последовательностью области VL SEQ ID NO: 5; и/или вариабельную область (VH) тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности (и/или по меньшей мере 95% или 99% идентичности последовательности или 100% идентичности) с аминокислотной последовательностью области VH SEQ ID NO: 1.
В настоящем описании предлагается антитело или его антиген-связывающий фрагмент, где антитело или антиген-связывающий фрагмент содержат область VL, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности (и/или по меньшей мере 95% или 99% идентичности последовательности или 100% идентичности) с аминокислотной последовательностью области VL SEQ ID NO: 5; и/или область VH, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности (и/или по меньшей мере 95% или 99% идентичности последовательности или 100% идентичности) с аминокислотной последовательностью области VH SEQ ID NO: 1.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит область 3, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 84, или содержащую CDR-H3, содержащуюся в последовательности VH SEQ ID NO: 1; и/или область VL содержит область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 87, или содержащую CDR-L3, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 5.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит CDR-H1 и CDR-H2, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1 и CDR-H2, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1; и/или область VL содержит CDR-L1 и CDR-L2, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-L1 и CDR-L2, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит CDR-H1 c SEQ ID NO: 9, 78, 79 или 80, CDR-H2 c SEQ ID NO: 10, 81, 82 или 83 и CDR-H3 c SEQ ID NO: 11 или 84; и/или область VL содержит CDR-L1 c SEQ ID NO: 12 или 85, CDR-L2 c SEQ ID NO: 13 или 86, и CDR-L3 c SEQ ID NO: 14 или 87.
В настоящем описании предлагается антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1; и/или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5.
В настоящем описании предлагается антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащий CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 78, 79 или 80, CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 81, 82 или 83, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 84; и/или CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 85, CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или 86, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 87.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и/или область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который специфически связывается с антителом-мишенью, которое представляет собой или содержит вариабельную область(и) антитела, обозначенного FMC63, или с его антиген-связывающим фрагментом, и/или специфически связывается с химерной молекулой, содержащей такой фрагмент антитела, такой как CAR со связывающим доменом, содержащим вариабельные области антитела или их части, полученные из FMC63, такие как в форме scFv. В некоторых вариантах осуществления агент, например, антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержат вариабельную область легкой цепи (VL), которая по меньшей мере на 90% идентична с аминокислотной последовательностью области VL SEQ ID NO: 40 или 62; и/или вариабельную область (VH) тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности (и/или по меньшей мере 95% или 99% идентичности последовательности или 100% идентичности) с аминокислотной последовательностью области VH SEQ ID NO: 36 или 58. В некоторых вариантах осуществления антитело или антиген-связывающий фрагмент содержат область VL, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности (и/или по меньшей мере 95% или 99% идентичности последовательности или 100% идентичности) с аминокислотной последовательностью области VL SEQ ID NO: 40 или 62; и/или область VH, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности (и/или по меньшей мере 95% или 99% идентичности последовательности или 100% идентичности) с аминокислотной последовательностью области VH SEQ ID NO: 36 или 58.
3
5
6
8
10
3
5
6
8
10
4
6
8
9
10
11
13
14
17
20
4
6
8
9
10
11
13
14
17
20
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
1
3
4
5
6
7
8
10
11
1
3
4
5
6
7
8
10
11
1
2
3
5
6
7
8
11
1
2
3
5
6
7
8
11
2
3
4
5
6
8
2
3
4
5
6
8
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), включающую аминокислотную последовательность GYXFXXYXMX (SEQ ID NO: 108), где X представляет собой T или S, X представляет собой T или S, X представляет собой D или R, X представляет собой Y или W, и X представляет собой K или N; область 2, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H2), включающую аминокислотную последовательность WIGXIXPXXXXTXXNQXFKX (SEQ ID NO: 109), где X представляет собой D или M, X представляет собой N или H, X представляет собой N или S, X представляет собой N или D, X представляет собой G или S, X представляет собой G или E, X представляет собой D или R, X представляет собой Y или L, X представляет собой N или K, и X представляет собой G или D; область 3, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H3), включающую аминокислотную последовательность AXXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 110), где X представляет собой R или S, X представляет собой E или I, X представляет собой G или Y, X представляет собой N или Y, X представляет собой N или E, X представляет собой Y или отсутствует, X представляет собой G или отсутствует, X представляет собой S или отсутствует, X представляет собой R или отсутствует, X представляет собой D или отсутствует, X представляет собой A или отсутствует, X представляет собой М или отсутствует, X представляет собой D или E, а X представляет собой Y или A; и/или область VL содержит область 1, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L1), включающую аминокислотную последовательность XAXXXXXXYXXWY (SEQ ID NO: 111), где X представляет собой S или R, X представляет собой S или R, X представляет собой S или G, X представляет собой G или N, X представляет собой V или I, X представляет собой I или H, X представляет собой N или отсутствует, X представляет собой M или L, и X представляет собой Y или A; область 2, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L2), включающую аминокислотную последовательность XXXYXXXXLAX (SEQ ID NO: 112), где X представляет собой P или L, X представляет собой W или L, X представляет собой I или V, X представляет собой L или N, X представляет собой T или A, X представляет собой S или K, X представляет собой N или T, и X представляет собой S или D; область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), включающую аминокислотную последовательность QXXXXXPXT (SEQ ID NO: 113), где X представляет собой Q или H, X представляет собой W или F, X представляет собой S или W, X представляет собой S или W, X представляет собой N или T, а X представляет собой L или Y.
В некоторых вариантах осуществления область 3, определяющая комплементарность (CDR-H3), содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 или 104, или содержит CDR-H3, содержащуюся в последовательности VH SEQ ID NO: 36 или 58; и/или область 3, определяющая комплементарность легкой цепи, (CDR-L3), содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 или 107, или содержит CDR-L3, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 40, или 62.
В некоторых вариантах осуществления область VH содержит CDR-H1 и CDR-H2, соответственно, включая аминокислотные последовательности CDR-H1 и CDR-H2, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 58; и/или область VL содержит CDR-L1 и CDR-L2, соответственно, включая аминокислотные последовательности CDR-L1 и CDR-L2, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 62.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит CDR-H1 c SEQ ID NO: 88, 89, 90, 98, 99 или 100, CDR-H2 c SEQ ID NO: 91, 92, 93, 101, 102 или 103 и CDR-H3 c SEQ ID NO: 94 или 104; и/или область VL содержит CDR-L1 c SEQ ID NO: 95 или 105, CDR-L2 c SEQ ID NO: 96 или 106, и CDR-L3 c SEQ ID NO: 97 или 107
В настоящем описании предлагается антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 58; и/или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 соответственно, включая аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 62.
В настоящем описании предлагается антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие CDR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88, 89, 90, 98, 99 или 100, CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, 92, 93, 101, 102 или 103, и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 или 104; и/или CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95 или 105, CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96 или 106, и CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 или 107.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или 58; и/или область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 62. В некоторых случаях область VH антитела или фрагмента включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или 58, а область VL антитела или фрагмента включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 62.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит CDR-H1 c SEQ ID NO: 44, 88, 89 или 90, CDR-H2 c SEQ ID NO: 45, 91, 92 или 93 и CDR-H3 c SEQ ID NO: 46 или 94; и/или область VL содержит CDR-L1 c SEQ ID NO: 47 или 95, CDR-L2 c SEQ ID NO: 48 или 96, и CDR-L3 c SEQ ID NO: 49 или 97. В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит CDR-H1 c SEQ ID NO: 65, 98, 99 или 100, CDR-H2 c SEQ ID NO: 66, 101, 102 или 103, и CDR-H3 c SEQ ID NO: 67 или 104; и/или область VL содержит CDR-L1 c SEQ ID NO: 68 или 105, CDR-L2 c SEQ ID NO: 69 или 106, и CDR-L3 c SEQ ID NO: 100 или 107.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, включающие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36; и/или область VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно, включающие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, включающие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58; и/или область VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и/или область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40. В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH антитела или фрагмента включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; и/или область VL антитела или фрагмента включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный фрагмент. В некоторых аспектах фрагмент содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером. В некоторых из любых таких вариантов осуществления фрагмент содержит scFv.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24; и/или представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31; и/или представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом антитела-мишени или его антиген-связывающего фрагмента, что и эпитоп, специфически связанный с антиидиотипическим антителом или антиген-связывающим фрагментом согласно любому из описанных в настоящем документе вариантов осуществления.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент находятся внутри или включены в антиген-связывающий домен внеклеточной части химерного антигенного рецептора (CAR); и/или антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с антителом-мишенью или антиген-связывающим фрагментом, содержащихся внутри или включенных в антиген-связывающий домен внеклеточной части CAR. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент представляют собой scFv, а антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с эпитопом в scFv CAR.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело или фрагмент специфически связываются с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), полученным из антитела SJ25C1, содержащимся во внеклеточной части химерного антигенного рецептора, где необязательно scFv, полученный из антитела SJ25C1, содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24; и/или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело или фрагмент специфически связываются с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), полученным из антитела FMC63, содержащимся во внеклеточной части химерного антигенного рецептора, где необязательно scFv, полученный из антитела FMC63, содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31; и/или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с эпитопом внутри или во всей или в части области, определяющей комплементарность, (CDR), антитела-мишени или антиген-связывающего фрагмента.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления CAR дополнительно содержит трансмембранный домен, связанный с антиген-связывающим доменом через спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит внеклеточную часть из CD28, который необязательно является человеческим CD28. В некоторых аспектах внеклеточная часть из CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых из любых таких вариантов осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28, который необязательно является человеческим CD28. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело или его фрагмент не связываются с эпитопом в спейсерном домене CAR.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело или его фрагмент не связываются совсем или не связывается специфически с CD28 или его частью, который необязательно является человеческим CD28, который необязательно содержит внеклеточную часть CD28, которая необязательно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело или его фрагмент не связываются с эпитопом в Fc-домене, который необязательно является Fc-доменом человеческого IgG1.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с человеческим CD19. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его фрагмент не вступают в перекрестную реакцию с другим антителом против CD19, которое необязательно содержится во внеклеточном антиген-связывающем домене другого CAR. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или фрагмент не вступают в перекрестную реакцию с другим CAR.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или фрагмент представляют собой антагонистическое антитело CAR, содержащего антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело или фрагмент являются антагонистом CAR, содержащего антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент являются гуманизированными. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент являются рекомбинантными. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент являются моноклональными.
2
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляет собой антиген-связывающий фрагмент. В некоторых аспектах антиген-связывающий фрагмент выбран из антиген-связывающих фрагментов (Fab), F(ab'), Fab', Fv, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) или однодоменного антитела.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина содержит Fc-область или часть Fc, содержащую домены CH2 и CH3. В некоторых аспектах константная область получена из человеческого IgG. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляют собой интактное антитело или полноразмерное антитело.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления предлагается конъюгат, содержащий антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления, описанных выше, и гетерологичную молекулу или фрагмент. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная молекула или фрагмент представляют собой метку. В некоторых аспектах метка выбрана из флуоресцентного красителя, флуоресцентного белка, радиоизотопа, хромофора, иона металла, частицы золота, частицы серебра, магнитной частицы, полипептида, фермента, стрептавидина, биотина, люминесцентного соединения или олигонуклеотида. В некоторых случаях гетерологичная молекула или фрагмент представляют собой белок, пептид, нуклеиновую кислоту или низкомолекулярное соединение, которые необязательно представляют собой или содержат токсин, Strep-метку.
В некоторых вариантах осуществления предлагается молекула(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь и/или легкую цепь антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе. В некоторых аспектах молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 15, (ii) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 15; или (iii) вырожденную последовательность (i) или (ii); и/или последовательность нуклеотидов, кодирующую (iv) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 19, (v) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 19; или (vi) вырожденную последовательность (iv) или (v).
В некоторых из любых таких вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) тяжелую цепь SEQ ID NO: 17, (ii) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 17; или (iii) вырожденную последовательность (i) или (ii); и/или последовательность нуклеотидов, кодирующую (iv) легкую цепь SEQ ID NO: 21, (v) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 21; или (vi) вырожденную последовательность (iv) или (v).
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 50 или 71, (ii) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 50 или 71; или (iii) вырожденную последовательность (i) или (ii); и/или последовательность нуклеотидов, кодирующую (iv) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 54 или 75, (v) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 54 или 75; или (vi) вырожденную последовательность (iv) или (v). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) тяжелую цепь SEQ ID NO: 52 или 73, (ii) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 52 или 73; или (iii) вырожденную последовательность (i) или (ii); и/или последовательность нуклеотидов, кодирующую (iv) легкую цепь SEQ ID NO: 56 или 76, (v) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 56 или 76; или (vi) вырожденную последовательность (iv) или (v). В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь и/или легкую цепь, содержит сигнальную последовательность.
В настоящем описании предлагается вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе. Также в настоящем описании предлагается клетка, содержащая антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, или молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе.
В настоящем описании предлагается способ получения антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий экспрессию тяжелой и/или легкой цепи, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, или вектора в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, в подходящей клетке-хозяине, и извлечение или выделение антитела. В некоторых вариантах осуществления способ получения антиидиотипического антитела или антиген-связывающего фрагмента включает культивирование клетки в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, при условиях, в которых экспрессируется тяжелая цепь и/или легкая цепь, и извлечение или выделение антитела. Также в настоящем документе предлагается антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, полученные способом в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления предлагается композиция, содержащая антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, конъюгат в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, или клетка в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе. В некоторых из любых таких вариантов осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В некоторых вариантах осуществления предлагается набор, содержащий одно или более из антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, конъюгат в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, нуклеиновую кислоту в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, и, необязательно, инструкции по применению. В некоторых случаях набор дополнительно содержит реагент или подложку для иммобилизации антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента или конъюгата, где указанным реагентом или подложкой является микросфера, колонка, микролунка, палочка, фильтр, полоска или растворимый олигомерный реагент мутеина стрептавидина.
Также предлагаются способы детектирования с использованием любого из предложенных агентов, таких как антиидиотипические антитела. В некоторых вариантах осуществления предлагается способ детектирования антитела-мишени или его антиген-связывающего фрагмента, как например, CAR, содержащего их, причем способ включает (а) контактирование композиции, содержащей антитело-мишень (как например, антитела, содержащего вариабельные области, полученные из антитела SJ25C1 или из антитела FMC63 или из антиген-связывающего фрагмента любого из таких антител) с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом; и (b) детектирование антиидиотипического антитела, связанного с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом, и/или детектирование присутствия или отсутствия антитела-мишени или агента.
В некоторых вариантах осуществления способ включает (а) контактирование композиции, содержащей или предположительно содержащей антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) детектирование антиидиотипического антитела, связанного с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом, и/или детектирование присутствия или отсутствия антитела-мишени или агента.
В некоторых аспектах антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент связаны с клеткой или экспрессированы на поверхности клетки, и детектирование в (b) включает детектирование клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых случаях клетка экспрессирует на своей поверхности CAR, содержащий антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают детектирование CAR, содержащего антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления, такого как CAR, содержащий вариабельные домены, полученные из FMC63 или SJ25C. В некоторых аспектах способы включают (а) контактирование клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (CAR), содержащей антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающим фрагментом; и (b) детектирование клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления способ включает (а) контактирование клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) детектирование клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент прямо или косвенно помечены для детектирования.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ селекции клеток из клеточной популяции, включающий (а) контактирование популяции клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, или клетки, связанной с антителом-мишенью, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, где антитело-мишень представляет собой антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) селекцию клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления способ включает (а) контактирование популяции клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, или клетки, связанной с антителом-мишенью, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающим фрагментом, где антитело-мишень представляет собой антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) селекцию клеток, связанных с антиидиотипическим антителом.
В некоторых случаях клетки, связанные с антиидиотипическим антителом, селектируют путем аффинного разделения. В некоторых аспектах аффинное разделение представляет собой иммуноаффинное разделение. В некоторых из любых таких вариантов осуществления аффинное разделение осуществляется проточной цитометрией. В некоторых вариантах осуществления аффинное разделение осуществляют посредством магнитно-активированной сортировки клеток. В некоторых аспектах аффинное разделение содержит аффинную хроматографию. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело обратимо связывается или иммобилизуется на подложке или в стационарной фазе.
Также в число предложенных способов входят способы стимулирования клеток с использованием агентов, как например, стимулирование клеток, содержащих молекулу, такую как CAR, которая представляет собой или содержит антитело-мишень, распознаваемое антиидиотипическим антителом. В некоторых аспектах способы включают инкубацию исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связывается с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, тем самым генерируя итоговую композицию, содержащую стимулированные клетки. В некоторых вариантах осуществления способ включает инкубацию исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связывается с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент, тем самым генерируя итоговую композицию, содержащую стимулированные клетки.
В некоторых вариантах осуществления способы приводят к пролиферации, активации, стимулированию, высвобождению цитокинов или другим функциональным результатам, таким как положительная регуляция маркера активации или высвобождение или продуцирование цитокинов, клеток, экспрессирующих химерный рецептор, такой как CAR, распознаваемый анти-Id антителом. В некоторых аспектах такая пролиферация или другой функциональный ответ или полученные данные индуцируются в таких клетках до степени, сходной или большей, чем та, что индуцируется инкубацией клеток с агентом и/или при условиях, которые стимулируют пролиферацию Т-клеток, как например, инкубация с микросферами с антителами против CD3/CD28 и/или перекрестное связывание антитела против CD3. В некоторых аспектах способы не включают перекрестное связывание антиидиотипического антитела. В некоторых аспектах любого из вариантов осуществления антиидиотипические агенты способны индуцировать указанный пролиферативный или функциональный результат или их степень без перекрестного связывания антиидиотипического антитела. В некоторых аспектах антиидиотипические агенты по настоящему изобретению имеют преимущество в их способности стимулировать или вызывать конкретную функциональную реакцию Т-клеток или других иммунных клеток, экспрессирующих целевой рецептор, без необходимости перекрестного связывания анти-Id-антитела или использования вторичного агента. В некоторых аспектах результата достигают с помощью растворимой или связанной с планшетами формы антиидиотипического антитела. В некоторых аспектах результата достигают с помощью антиидитипического антитела, связанного с микросферой.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ получения клеточной композиции, включающий (а) введение в клетки молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), тем самым генерируя исходную композицию; и (b) инкубацию исходной композиции с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, специфичным для антигенного рецептора CAR, получая тем самым клеточную композицию.
В некоторых аспектах CAR содержит антитело-мишень, которое специфически связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляют собой антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых случаях антителом-мишенью является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфически связывается с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которое специфически связывается с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающим фрагмент.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления введение в (а) включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем вирусной трансдукции, транспозиции, электропорации или химической трансфекции. В некоторых случаях введение в (а) включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем трансдукции ретровирусным вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, где вирусный вектор необязательно представляет собой ретровирусный вектор или лентивирусный вектор. В некоторых аспектах введение в (а) включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем транспозиции транспозоном, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты. В некоторых случаях введение в (а) включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем электропорации или трансфекции вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления способ дополнительно включает стадию активации клеток перед стадией (а). В некоторых аспектах стадия активации клеток включает контактирование клеток с агонистом CD3 и необязательно агонистом CD28. В некоторых случаях стадия активации клеток включает контактирование клеток с реагентом, содержащим агонистические антитела против CD3 и против CD28.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления инкубацию проводят в условиях, в которых антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с CAR, индуцируя или модулируя тем самым сигнал в одной или более клетках исходной композиции. В любом из таких вариантов осуществления клетки содержат Т-клетки. В некоторых случаях Т-клетки содержат CD4+ и/или CD8+ Т-клетки.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы на твердой подложке, которая необязательно содержит или конъюгирована с реагентом, содержащим множество сайтов связывания, способных обратимо связываться с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы на растворимом реагенте, который необязательно представляет собой или содержит множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых аспектах реагент содержит мутеин стрептавидина.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления инкубацию проводят в течение, по меньшей мере или примерно, по меньшей мере в течение 5 минут, 10 минут, 30 минут, 60 минут, 2 часов, 6 часов, 12 часов, 24 часов, 36, 48 часов, 72 часов или 96 часов.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления исходная композиция содержит менее чем или менее чем примерно 60%, менее чем или менее чем примерно 50%, менее чем или менее чем примерно 40%, менее чем или менее чем примерно 30%, менее чем или менее чем примерно 20% или менее чем или менее чем примерно 10% CAR-экспрессирующих клеток в процентном содержании от общего числа клеток в композиции.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления количество CAR-экспрессирующих клеток в итоговой композиции увеличивается более чем в 1,2 раза, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз или более по сравнению с количеством CAR-экспрессирующих клеток во исходной композиции; и/или процент экспрессии CAR в итоговой композиции по сравнению с общим количеством клеток в композиции увеличивается более чем на 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления до введения и/или инкубации клетки не селектируют и не обогащают CAR-экспрессирующими клетками.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ очистки антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий (а) контактирование композиции, содержащей антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) выделение комплексов, содержащих антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления способ включает (а) контактирование композиции, содержащей антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или с конъюгатом в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) выделение комплексов, содержащих антиидиотипическое антитело.
В некоторых вариантах осуществления комплексы, содержащие антиидиотипическое антитело, выделяют путем аффинного разделения. В некоторых аспектах аффинное разделение представляет собой иммуноаффинное разделение. В некоторых случаях аффинное разделение представляет собой разделение на основе магнитного поля. В некоторых вариантах осуществления аффинное разделение включает аффинную хроматографию.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ идентификации антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий (а) введение пациенту растворимого иммунизирующего реагента, содержащего антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени, слитый с солюбилизирующим фрагментом; и (b) идентификацию антитела пациента, которое специфически связывается с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный фрагмент. В некоторых аспектах антиген-связывающий фрагмент представляет собой scFv. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиген-связывающий фрагмент находится внутри или включен в антиген-связывающий домен внеклеточной части химерного рецептора антигена (CAR).
В некоторых из любых таких вариантов осуществления солюбилизирующий фрагмент представляет собой Fc-домен или его фрагмент, который необязательно представляет собой Fc человеческого IgG1. В некоторых аспектах солюбилизирующий фрагмент представляет собой Fc-домен, лишенный шарнирной области. В некоторых случаях солюбилизирующий фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления идентификация антитела включает (i) выделение B-клеток из селезенки пациента и слияние их с иммортализованными B-клетками для создания гибридом; (ii) скрининг гибридом на продуцирование антител, которые специфически связываются с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом или химерным антигенным рецептором, содержащим антиген-связывающий фрагмент; и (iii) секвенирование антитела из гибридомы, продуцирующей антитело, которое специфически связывается, идентифицируя тем самым антиидиотипическое антитело.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антитело-мишень связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени получен из антитела SJ25C1, где антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени необязательно содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из антитела SJ25C1, где scFv необязательно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени получают из антитела FMC63, где антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени необязательно содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из антитела FMC63, где scFv необязательно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ истощения клеток, включающий введение пациенту композиции, содержащей антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, или конъюгата в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающим фрагментом, где пациенту вводят клетку, экспрессирующую химерный антигенный рецептор (CAR), включающий антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение пациенту композиции, содержащей антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления или конъюгата в соответствии с любым из описанных вариантов осуществления, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63, или с его антиген-связывающим фрагментом, где пациенту вводят клетку, экспрессирующую химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления истощение происходит посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).
В настоящем описании предлагается способ определения присутствия или отсутствия молекулы, которая связывается с химерным антигенным рецептором (CAR), причем способ включает (а) контактирование связывающего реагента с образцом, взятым у пациента, которому вводили клеточную терапию, включающую клетки, сконструированные с CAR, содержащим антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент, в условиях для образования комплекса, содержащего связывающий реагент и молекулу из образца, которая связывается со связывающим реагентом, где связывающий реагент содержит внеклеточный домен из CAR или его часть, содержащий антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) детектирование присутствия или отсутствия комплекса, определяя тем самым присутствие или отсутствие молекулы, которая связывается с CAR. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выполнение стадий (а) и (b) с образцом положительного контроля и, необязательно, определение присутствия или отсутствия молекулы путем сравнения с положительным контролем, где образец положительного контроля содержит любое из антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, описанных в настоящем документе, или любой из конъюгатов, описанных в настоящем документе, которые специфически связываются с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом.
В настоящем описании предлагается способ определения присутствия или отсутствия молекулы, которая связывается с химерным антигенным рецептором (CAR), причем способ включает (а) контактирование связывающего реагента с образцом, взятым у пациента, которому вводили клеточную терапию, содержащую клетки, сконструированные с CAR, содержащим антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, в условиях для образования комплекса, включающего связывающий реагент и молекулу из образца, которая связывается со связывающим реагентом, где связывающий реагент содержит внеклеточный домен CAR или часть внеклеточного домена, содержащего антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) детектирование присутствия или отсутствия комплекса. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выполнение стадий (а) и (b) с образцом положительного контроля и, необязательно, определение присутствия или отсутствия молекулы путем сравнения с положительным контролем, где образец положительного контроля содержит любые из антиидиотипического антитела или его антиген-связывающиего фрагмента, описанных в настоящем документе, или любой из конъюгатов, описанных в настоящем документе, которые специфически связываются с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления молекула, которая связывается со связывающим реагентом, представляет собой или содержит антитело. В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент детектируемо помечен или способен генерировать детектируемый сигнал. В некоторых случаях связывающий реагент связан с твердой подложкой или является растворимым.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления комплекс детектируют с помощью иммуноанализа. В некоторых примерах иммуноанализ представляет собой иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, электрохемилюминесцентный анализ, биосенсор на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (например, BIAcore), проточную цитометрию или вестерн-блотинг. В некоторых вариантах осуществления иммуноанализ включает мезомасштабное детектирование. В некоторых случаях иммуноанализ представляет собой сэндвич-анализ или мостиковый анализ.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления связывающий реагент является первым связывающим реагентом, и детектирование присутствия или отсутствия комплекса включает: (i) контактирование комплекса, образованного на стадии (а), со вторым связывающим реагентом, где второй связывающий реагент (1) содержит внеклеточный домен CAR или его часть, содержащую антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент, и (2) детектируемо помечен или способен генерировать детектируемый сигнал; и (ii) оценку присутствия или отсутствия детектируемого сигнала. В некоторых аспектах первый связывающий реагент связан с твердой подложкой, где первый связывающий реагент необязательно связан, прямо или косвенно, с биотином и/или связан с твердой подложкой через стрептавидин; и/или второй связывающий реагент растворим. В некоторых случаях внеклеточный домен CAR или его часть первого и второго связывающего реагента одинаковы.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления детектируемая метка представляет собой или содержит флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, электролюминесцентную метку, колориметрическую метку, биолюминесцентную метку или радиоактивную метку; и/или детектируемый сигнал представляет собой или содержит флуоресцентный сигнал, хемилюминесцентный сигнал, электролюминесцентный сигнал, колориметрический сигнал, биолюминесцентный сигнал или радиоактивный сигнал. В некоторых из любых таких вариантов осуществления детектируемая метка представляет собой или содержит SULFO-метку.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени. В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени представляет собой одноцепочечный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени представляет собой scFv.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления образец содержит цельную кровь, сыворотку или плазму.
В настоящем описании предлагается изделие, содержащее любые из антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, описанных в настоящем документе, или любой из описанных конъюгатов и инструкции по применению антиидиотипического антитела для детектирования антитела SJ25C1 или его антиген-связывающего фрагмента или химерного антигенного рецептора, содержащего антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; для селекции или обогащения из клеточной популяции сконструированных клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; стимулирования исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор, содержащий антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент.
В настоящем описании предлагается изделие, содержащее любые из антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, описанных в настоящем документе, или любой из конъюгатов, описанных в настоящем документе, и инструкции по применению антиидиотипического антитела для детектирования антитела FMC63 или его антиген-связывающего фрагмент или химерного антигенного рецептора, содержащего антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; для селекции или обогащения из клеточной популяции сконструированных клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; для стимулирования исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор, содержащий антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент.
В настоящем описании предлагается изделие, содержащее связывающий реагент, включающий внеклеточный домен химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего антитело-мишень, которое является антителом FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанный внеклеточный домен или его часть содержат антитело или его антиген-связывающий фрагмент; и содержащее антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, или любой из конъюгатов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент представляет собой первый связывающий реагент, и изделие дополнительно включает второй связывающий реагент, содержащий внеклеточный домен или его часть CAR.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления внеклеточный домен CAR или его часть первого и второго связывающего реагента являются одинаковыми.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления изделие дополнительно включает инструкции по применению связывающего реагента, необязательно первого и второго связывающего реагента, для анализа образца на присутствие или отсутствие молекулы, которая связывается со связывающим реагентом, с использованием иммуноанализа, где иммуноанализ необязательно представляет собой мостиковый или сэндвич-иммуноанализ, где образец необязательно взят от пациента, которому вводили клеточную терапию, включающую клетки, сконструированные с CAR, содержащим антитело-мишень, которое представляет собой антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент.
В настоящем описании предлагается изделие, содержащее связывающий реагент, включающий внеклеточный домен химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего антитело-мишень, которое является антителом SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанный внеклеточный домен или его часть содержат антитело или его антиген-связывающий фрагмент; и содержащее антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, или любой из конъюгатов, описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент представляет собой первый связывающий реагент, и изделие дополнительно содержит второй связывающий реагент, содержащий внеклеточный домен или его часть CAR. В некоторых аспектах внеклеточный домен CAR или его часть первого и второго связывающего реагента являются одинаковыми.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления изделие дополнительно содержит инструкции по применению связывающего реагента, необязательно первого и второго связывающего реагента, для анализа образца на присутствие или отсутствие молекулы, которая связывается со связывающим реагентом, с использованием иммуноанализа, где иммуноанализ необязательно представляет собой мостиковый или сэндвич-иммуноанализ, где образец необязательно взят от пациента, которому вводили клеточную терапию, включающую клетки, сконструированные с CAR, содержащим антитело-мишень, которое представляет собой антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент, необязательно первый и/или второй связывающий реагент, детектируемо помечен или способен генерировать детектируемый сигнал. В некоторых случаях один из первого и второго связывающего реагента прикреплен к твердой подложке или способен прикрепляться к твердой подложке, а другой из первого и второго связывающих реагентов является детектируемой меткой или способен генерировать детектируемый сигнал. В некоторых вариантах осуществления изделие дополнительно включает твердую подложку, где необязательно один из первого и второго связывающих реагентов прямо или косвенно связан с биотином, а твердая подложка содержит поверхность, покрытую стрептавидином.
Краткое описание чертежей
ФИГ. 1 демонстрирует результаты проточной цитометрии для оценки функциональной активности scFv-специфического антиидиотипического антитела клона A-1 (анти-ID A-1), полученного из SJ25C1, для стимулирования фосфорилирования Erk1/2 в клетках Jurkat, созданных с помощью CAR, полученного из SJ25C1. Активация антителом против CD3 была включена в качестве положительного контроля. Нестимулированные или стимулированные изотипическим контролем клетки были включены в качестве отрицательных контролей.
ФИГ. 2А-В демонстрируют результаты анализа пролиферации Т-клеток, экспрессирующих CAR, содержащий либо связывающий домен, полученный из SJ25C1 (ФИГ. 2А), либо связывающий домен, полученный из FMC63 (ФИГ. 2В), согласно оценкам с помощью разбавления красителя с использованием проточной цитометрии после стимулирования антителом против CD3 (OKT3), анти-ID A-1 или анти-ID B-1 антиидиотипическими антителами. Нестимулированные клетки были включены в качестве отрицательного контроля.
ФИГ. 2C демонстрирует результаты анализа пролиферации Т-клеток, ложно трансдуцированных и трансдуцированных CAR (меченых красителем), после культивирования в присутствии стимулированных антиидиотипическим антителом, связанным с планшетом, и распознающим связывающий домен CAR, согласно оценкам с помощью разведения красителя с использованием проточной цитометрии.
ФИГ. 3 демонстрирует результаты по оценке экспрессии двух маркеров активации T-клеток, CD69 и CD25, в CD4+ или CD8+ T-клетках, экспрессирующих CAR с вариабельными областями, полученными из SJ25C1, согласно оценкам с помощью проточной цитометрии после стимулирования антителами против CD3 (OKT3), анти-ID A-1 или анти-ID B-1, связанными с планшетом.
ФИГ. 4 демонстрирует результаты по оценке экспрессии двух маркеров активации T-клеток, CD69 и CD25, в CD4+ или CD8+ T-клетках, экспрессирующих CAR со связывающим доменом, имеющим вариабельные области, полученные из FMC63, согласно оценкам с помощью проточной цитометрии после стимулирования с помощью связанных с планшетом антител против CD3 (OKT3), анти-ID A-1 или анти-ID B-1, или с помощью отрицательного контроля в виде антиидиотипического антитела, не являющегося мишенью. Нестимулированные клетки были включены в качестве отрицательного контроля.
ФИГ. 5 демонстрирует результаты мостикового ИФА для детектирования антител против CAR с использованием анти-ID B-1 и анти-ID B-2 антител, распознающих связывающий домен CAR, в диапазоне концентраций, в качестве положительных контролей.
ФИГ. 6 и ФИГ. 7 демонстрируют кратное увеличение и совокупное количество клеток EGFRt+/CD4+ T-клеток или EGFRt+/CD8+ T-клеток, соответственно, стимулированных с использованием указанного соотношения микросфер, покрытых антиидиотипическим антителом (анти-ID B-1) или контрольным антителом CD3/CD28 в присутствии или в отсутствие цитокинов.
ФИГ. 8 демонстрирует уровень экспрессии PD-1 в CD4+ T-клетках, положительных на окрашивание антителом против EGFR и, таким образом, положительных по маркеру трансдукции EGFRt после стимулирования указанным соотношением микросфер, покрытых антиидиотипическим антителом (анти-ID B-1) или контрольным антителом CD3/CD28, в присутствии или в отсутствие цитокинов, согласно оценкам с помощью проточной цитометрии на 3, 7, 10 и 14 день культивирования.
ФИГ. 9 демонстрирует жизнеспособность CD4+ или CD8+ Т-клеток, экспрессирующих CAR, полученный из FMC63, согласно оценкам проточной цитометрии после стимулирования указанным соотношением микросфер, покрытых антиидиотипическим антителом (анти-ID B-1) или контрольным CD3/CD28 антителом, в присутствии или в отсутствие цитокинов, согласно оценке с помощью проточной цитометрии на 3, 7, 10 и 14 день культивирования.
ФИГ. 10А демонстрирует внутриклеточное окрашивание на цитокины IL-2, TNFα и IFNγ для Т-клеток, экспрессирующих CAR, полученный из FMC63, после стимулирования микросферами, покрытыми scFv-специфичным антиидиотипическим антителом (анти-ID B-1), полученным из FMC63. Представлены результаты для CD8+ Т-клеток, положительных или отрицательных по суррогатному маркеру трансдукции EGFRt (EGFR+ или EGFRt-).
ФИГ. 10В демонстрирует внутриклеточное окрашивание цитокинов IL-2, TNFα и IFNγ для Т-клеток, экспрессирующих CAR, полученный из FMC63, после стимулирования антиген-экспрессирующими клетками K562-CD19. Представлены результаты для CD8+ Т-клеток, положительных по антителу против EGFR в качестве суррогата для экспрессии CAR.
ФИГ. 11 демонстрирует количество удвоений популяции в анализе последовательного стимулирования в течение 14-дневного периода культивирования Т-клеток, экспрессирующих полученный из FMC63 scFv-специфичный CAR, после стимулирования с использованием указанного соотношения микросфер, покрытых антиидиотипическим антителом (анти-ID B-1) или контрольным антителом против CD3/CD28, в присутствии или в отсутствие цитокинов. Представлены результаты для CD4+ T-клеток, положительных по суррогатному маркеру трансдукции EGFRt (EGFRt+/CD4+) или CD8+ T-клеток, положительных по EGFRt (EGFRt+/CD8+).
ФИГ. 12A-12C демонстрирует результаты после стимулирования CD4+ или CD8+ T-CAR-экспрессирующих клеток полученный из FMC63, культивируемых индивидуально или совместно с микросферами, покрытыми полученным из FMC63 scFv-специфичным антиидиотипическим антителом (анти-ID B-1). Результаты представлены для двух разных доноров. На ФИГ. 12А изображена кратная экспансия CD4+ T-клеток или CD8+ T-клеток в культурах, которые были положительными по суррогатному маркеру трансдукции EGFRt (EGFRt+/CD4+ или EGFRt+/CD8+). ФИГ. 12B демонстрирует частоту CD4+ T-клеток или CD8+ T-клеток в культурах, которые были положительными по EGFRt (EGFRt+/CD4+ или EGFRt+/CD8+). ФИГ. 12C демонстрирует жизнеспособность CD4+ T-клеток или CD8+ T-клеток в культурах.
ФИГ. 13А и 13В демонстрируют результаты проточной цитометрии для поверхностных маркеров Т-клеток на 5, 7 и 9 день культивирования после стимулирования CD4+ или CD8+ Т-CAR-экспрессирующих клеток полученный из FMC63, культивируемых индивидуально или в виде совместной культуры с микросферами, покрытыми полученным из FMC63 scFv-специфичным антиидиотипическим антителом (анти-ID B-1). ФИГ. 13А демонстрирует поверхностную экспрессию PD-1 на CD4+ T-клетках или CD8+ T-клетках в культурах, которые были положительными по суррогатному маркеру трансдукции EGFRt (EGFRt+/CD4+ или EGFRt+/CD8+). ФИГ. 13B демонстрирует поверхностную экспрессию CD25 на CD4+ T-клетках или CD8+ T-клетках в культурах, которые были положительными по антителу против EGFR в качестве суррогата для экспрессии CAR (EGFRt+/CD4+ или EGFRt+/CD8+).
ФИГ. 14А демонстрирует внутриклеточные уровни цитокинов TNFα, IFNγ и IL-2 согласно оценке с помощью проточной цитометрии CD4+ или CD8+ T-клеток, присутствующих в размороженной композиции, содержащей T-клетки, экспрессирующие полученный из FMC63 CAR, которые наращивали в культуре либо с CD19-экспрессирующими K562 клетки или с PMA/иономицином. Представлен уровень цитокинов в CD4+ и CD8+ Т-клетках, индивидуально или в виде совместной культуры, в день разморозки (д=0) или после дополнительного культивирования в течение дополнительных 9 дней в присутствии микросфер, конъюгированных с анти-ID В-1.
ФИГ. 14В демонстрирует частоту клеток, положительных по CD25 или Ki67, согласно оценке с помощью проточной цитометрии CD4+ или CD8+ T-клеток, присутствующих в размороженной композиции, содержащей Т-клетки, экспрессирующие полученный из FMC63 CAR, которые наращивали в культуре либо с клетками K562, экспрессирующими CD19, либо с PMA/иономицином. Представлен уровень маркеров в CD4+ и CD8+ Т-клетках, индивидуально или в виде совместной культуры, в день разморозки (д=0) или после дополнительного культивирования в течение дополнительных 9 дней в присутствии в присутствии микросфер, конъюгированных с анти-ID В-1.
ФИГ. 15А и 15В демонстрирует график, изображающий результаты окрашивания клеток анти-EGFR-антителом или scFv-специфическими антиидиотипическими антителами, полученными из FMC63 (анти-ID B-1 и анти-ID B-2). ФИГ. 15А демонстрирует график, изображающий среднюю интенсивность флуоресценции клеток, которые были окрашены различными концентрациями антител. Клетки включали смесь PBMC и CAR-экспрессирующих клеток. ФИГ. 15B демонстрирует график, изображающий процент CAR-экспрессирующих клеток в присутствии полученного из FMC63 scFv-специфического антиидиотипического антитела (анти-ID B-1), детектированный в клетках, которые окрашивали с использованием различных концентраций антител. Клетки включали смесь PBMC и CAR-экспрессирующих клеток и только PBMC.
Подробное описание изобретения
В настоящем описании предлагаются агенты, такие как антиидиотипические антитела и антиген-связывающие фрагменты (такие как одноцепочечные фрагменты, включая scFv), которые специфично распознают фрагменты антитела против CD19 (такие как фрагменты антитела против CD19, присутствующие в рекомбинантных рецепторах, включая химерные антигенные рецепторы). Также предлагаются применения и способы применения, а также композиции и изделия, включающие такие агенты, в том числе для специфической идентификации, селекции, и/или стимулиирования, и/или активации клеток, экспрессирующих или включающих антитела-мишени или фрагменты, таких как анти-CD19 CAR Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела могут быть использованы для специфической идентификации и/или селекции различных анти-CD19 CAR, таких как CAR, связанных или экспрессируемых на поверхности клетки, и также могут быть использованы для специфической активации клеток, экспрессирующих целевые CAR, таких как CAR-Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления предлагаются антитела, которые специфичны к антителам против CD19, обозначенным SJ25C1 или FMC63, или полученным из них фрагментам антител, включая антитела и CAR, содержащие вариабельные области, полученные из таких антител, и/или антитело, содержащее идиотоп, содержащийся там.
В некоторых аспектах предложенные антиидиотипические антитела обладают преимуществами по сравнению с обычными реагентами для детектирования, идентификации, манипулирования и/или воздействия и/или конструирования клеток, которые экспрессируют CAR, и, в частности, CAR, содержащий внеклеточный домен scFv антитела против CD19, или CAR, содержащий распознаваемый идиотип. В некоторых доступных способах детектирования в образце присутствия или отсутствия или количества CAR или CAR-экспрессирующих клеток (и/или стимулирование или манипуляция с CAR) осуществляется путем оценки присутствия или отсутствия, или количества суррогатной молекулы, такой как включенная в конструкцию, кодирующую CAR и, таким образом, служащая в качестве косвенного или суррогатного маркера для его экспрессии. В некоторых доступных способах детектирование проводят с использованием характерного реагента антител и/или реагента, который не специфичен для конкретного оцениваемого CAR, например, по сравнению с другими CAR, которые могут иметь сходные или идентичные домены, отличные от антиген-связывающей области.; например, такие антитела могут включать антивидовые антитела, распознающие спейсерные или другие домены из видов, из которых был получен домен CAR, и/или антитела, распознающие конкретные компоненты, используемые в спейсерных областях мишени, а также другие химерные рецепторы. В некоторых доступных способах, разработанных для детектирования присутствия или отсутствия CAR, детектирование выполняется с использованием агента, распознающего константную область CAR. В некоторых доступных способах CAR-клетки стимулируют путем использования обычных реагентов, таких как анти-CD3/CD28-распознающие агенты. В некоторых способах используют рекомбинантный лиганд CAR (например, CD19-Fc). Такие методы в определенных контекстах могут быть не совсем удовлетворительными и/или иметь определенные ограничения. В некоторых случаях CAR-лиганды, такие как CD19, не всегда могут быть полностью эффективными, например, для использования в комплексных панелях проточной цитометрии. Необходимы улучшенные методы и агенты, в том числе обеспечивающие улучшенную чувствительность и/или селективность. В настоящем описании предложены варианты осуществления, удовлетворяющие таким потребностям.
Предложенные антиидиотипические антитела и антиген-связывающие фрагменты в некоторых вариантах осуществления преодолевают проблемы низкой аффинности связывания, связанной с лигандами антител-мишеней и с неспецифическим связыванием, связанным с реагентами антител, нацеленными на константные области антител-мишеней, обеспечивая реагент как высокой аффинностью, так и специфичностью для его антитела-мишени или его антиген-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела проявляют большую специфичность и аффинность связывания с их антителами-мишенями или антиген-связывающими фрагментами, такими как антитело против CD19, обозначенное SJ25C1 или FMC63, по сравнению с CD19-Fc и другими реагентами, доступными в настоящее время для обнаружения или идентификации CAR.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления антиидиотипические антитела и антиген-связывающие фрагменты, которые могут быть выбраны в качестве агонистов или антагонистов химерных рецепторов, включающих их антитела-мишени или антиген-связывающие фрагменты, допускают селективное детектирование, выделение, абляцию и/или истощение (например, уничтожение посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности ADCC) и/или стимулирование или активация клеток с использованием таких химерных рецепторов, связанных или экспрессированных на их поверхности. В настоящем описании предлагаются агонисты антиидиотипических антител, которые проявляют активность стимулирования, например активации, CAR, содержащего внеклеточный связывающий домен, полученный из антител против CD19, обозначенных SJ25C1 или FMC63. В некоторых аспектах такие антитела можно использовать в способах стимулирования и экспансии специфических CAR-экспрессирующих клеток, в том числе в способах получения и приготовления CAR-экспрессирующих клеток.
Также в настоящем описании предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие предложенные антиидиотипические антитела и фрагменты, и клетки, такие как рекомбинантные клетки, экспрессирующие и предназначенные для получения этих антиидиотипических антител и фрагментов. Также предлагаются способы получения и применения антиидиотипических антител и их фрагментов, а также клеток, экспрессирующих или содержащих антиидиотипические антитела и их фрагменты.
Все публикации, включая патентные документы, научные статьи и базы данных, упомянутые в настоящей заявке, включены в качестве ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была отдельно включена посредством ссылки. Если приведенное в настоящем описании определение противоречит или иным образом не согласуется с определением, изложенным в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, которые включены сюда посредством ссылки, определение, изложенное в настоящем описании, имеет преимущественную силу над определением, которое включено в настоящее описание посредством ссылки.
Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие предмет описания.
I. Антиидиотипические антитела
В некоторых аспектах предложены связывающие молекулы, такие как антиидиотипические антитела или антиген-связывающие фрагменты («анти-ID»), которые специфически распознают мишень в виде фрагмента антитела против CD19. В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела распознают мишень в виде антитела против CD19, которое представляет собой SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент или представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, полученные из SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела распознают мишень в виде антитела против CD19, которое представляет собой FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент или представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, полученные из FMC63.
SJ25C1 представляет собой мышиное моноклональное антитело IgG1, созданное против клеток Nalm-1 и -16, экспрессирующих CD19 человеческого происхождения (Ling, NR, et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). Антитело SJ25C1 содержит CDRH1, H2 и H3, представленные в SEQ ID NO: 114-116, соответственно, и последовательности CDRL1, L2 и L3, представленные в SEQ ID NO: 117-119, соответственно. Антитело SJ25C1 содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления антителом-мишенью является SJ25C1 или антитело, полученное из SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления антитело, полученное из SJ25C1, представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, которые содержат VH и/или VL SJ25C1, идиотип SJ25C1, паратоп SJ25C1 или одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR) SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которое представляет собой SJ25C1, или антитело, полученное из SJ25C1, представляют собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащие VH SJ25C1 SEQ ID NO: 23, или ее вариант, имеющий, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 23, и/или VL SJ25C1 SEQ ID NO: 24, или ее вариант, имеющий, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которое представляет собой SJ25C1, или антитело, полученное из SJ25C1, представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащие VH SJ25C1 SEQ ID NO: 23, или ее вариант, имеющий, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 23, и/или VL SJ25C1 SEQ ID NO: 24, или ее вариант, имеющий, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат VH или VL SJ25C1, представленные в SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24, соответственно. В некоторых вариантах осуществления вариант имеет, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 23 и/или SEQ ID NO: 24.
2
В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которым является SJ25C1, или антитело, полученное из SJ25C1, представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащий одну или более CDR тяжелой цепи (CDR-H) VH SJ25C1, представленных в SEQ ID NO: 23, как например, представленные в SEQ ID NO: 114-116, и/или одну или более CDR легкой цепи (CDR-L) VL SJ25C1, представленных в SEQ ID NO: 24, как например, представленные в SEQ ID NO: 117-119. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат CDR-H3 SJ25C1 (например SEQ ID NO: 116) и/или CDR-L3 SJ25C1 (например SEQ ID NO: 119). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат CDR-H3 и CDR-L3 SJ25C1 (например SEQ ID NO: 116 и 119, соответственно). В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которым является SJ25C1, или антитело, полученное из SJ25C1, представляют собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащие одну или более из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 SJ25C1 (например, представленных в SEQ ID NO: 114, 115, 116, соответственно) и/или одну или более из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 SJ25C1 (например, представленных в SEQ ID NO: 117, 118, 119, соответственно). В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которое является SJ25C1, или антитело, полученное из SJ25C1, представляют собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащие CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 SJ25C1 (например, представленные в SEQ ID NO: 114, 115, 116, соответственно) и/или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 SJ25C1 (например, представленные в SEQ ID NO: 117, 118, 119, соответственно). В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которым является SJ25C1, или антитело, полученное из SJ25C1, представляют собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащие одну или более из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 SJ25C1 (например, представленных в SEQ ID NO: 114, 115, 116, соответственно) и/или одну или более из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 SJ25C1 (например, представленных в SEQ ID NO: 117, 118, 119, соответственно). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит антиген-связывающий фрагмент, такой как фрагмент (Fab), F(ab'), Fab', вариабельный фрагмент (Fv) или одноцепочечный фрагмент Fv (scFv). Смотри, например, Bejcek, BE, et al. (1995). Cancer research. 55 (11): 2346-2351.
FMC63 представляет собой мышиное моноклональное антитело IgG1, созданное против клеток JVM3, экспрессирующих CD19 человеческого происхождения (Nicholson et al. (1997). Molecular Immunology. 34 (16-17): 1157-1165). Антитело FMC63 содержит CDRH1, H2 и H3, представленные в SEQ ID NO: 120-122, соответственно, и последовательности CDRL1, L2 и L3, представленные в SEQ ID NO: 123-125, соответственно. Антитело FMC63 содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой FMC63 или антитело, полученное из FMC63. В некоторых вариантах осуществления антитело, полученное из FMC63, представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, которые содержат VH и/или VL FMC63, идиотип FMC63, паратоп FMC63 или одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR) FMC63. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которое представляет собой FMC63, или антитело, полученное из FMC63, представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащие VH FMC63 SEQ ID NO: 30, или ее вариант, имеющий, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 30, и/или VL FMC63 SEQ ID NO: 31, или ее вариант, имеющий, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которое представляет собой FMC63, или антитело, полученное из FMC63, представляют собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащие VH FMC63 SEQ ID NO: 30, или ее вариант, имеющий, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 30, и/или VL FMC63 SEQ ID NO: 31, или ее вариант, имеющий, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления антитело или антиген-связывающий фрагмент содержит VH или VL FMC63, представленные в SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31, соответственно. В некоторых вариантах осуществления вариант имеет, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 30 и/или SEQ ID NO: 31.
2
В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень, которым является FMC63, или антитело, полученное из FMC63, представляет собой антитело или антиген-связывающий фрагмент, содержащий одну или более CDR тяжелой цепи (CDR-H) VH FMC63, представленных в SEQ ID NO: 30, как например, представленные в SEQ ID NO: 120-122, и/или одну или более CDR легкой цепи (CDR-L) VL FMC63, представленных в SEQ ID NO: 31, как например, представленные в SEQ ID NO: 123-125. В некоторых вариантах осуществления антитело или антиген-связывающий фрагмент содержат CDR-H3 FMC63 (например SEQ ID NO: 122) и/или CDR-L3 FMC63 (например SEQ ID NO: 125). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат CDR-H3 (например SEQ ID NO: 122) и CDR-L3 FMC63 (например SEQ ID NO: 125). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат одну или более из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 FMC63 (представленных в SEQ ID NO: 120, 121, 122, соответственно) и/или одну или более из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из FMC63 (представленных в SEQ ID NO: 123, 124, 125, соответственно). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 из FMC63 (представленные в SEQ ID NO: 120, 121, 122, соответственно) и/или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 FMC63 (представленные в SEQ ID NO: 123, 124, 125, соответственно). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 FMC63 (представленных в SEQ ID NO: 120, 121, 122, соответственно) и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из FMC63 (представленных в SEQ ID NO: 123, 124, 125, соответственно). В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат антиген-связывающий фрагмент, такой как фрагмент (Fab), F(ab'), Fab', вариабельный фрагмент (Fv) или одноцепочечный фрагмент Fv (scFv).
В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела включают антитела, которые специфически связываются с вариабельным доменом (Fv), таким как одноцепочечный Fv (scFv), полученный из SJ25C1 или FMC63. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипические антитела специфически связываются с конкретным эпитопом или областью Fv, причем, как правило, эпитоп или область содержат одну или более областей, определяющих комплементарность. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипические антитела специфически связываются с эпитопом или областью, перекрывающей паратоп Fv.
В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела включают антитела, которые специфически связываются с фрагментом антитела против CD19, полученным из SJ25C1 или FMC63, который содержится как часть внеклеточного домена мишени в виде химерного антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR-мишень содержит антиген-связывающую часть, которая содержит молекулу антитела SJ25C1 или FMC63 или антиген-связывающий фрагмент, или часть антител SJ25C1 или FMC63. В некоторых вариантах осуществления CAR-мишень включает антиген-связывающий домен, который представляет собой scFv, полученный из цепей VH или VL антител SJ25C1 или FMC63. В некоторых вариантах осуществления предложено антиидиотипическое антитело, которое специфически связывается с анти-CD19 CAR, который содержит scFv, полученный из антител SJ25C1 или FMC63. Примерные особенности CAR описаны ниже.
2
Термин «антитело» используется в настоящем описании в самом широком смысле и включает поликлональные и моноклональные антитела, включая интактные антитела и функциональные (антиген-связывающие) фрагменты антител, включая фрагменты антиген-связывающих (Fab) фрагментов, F(ab')-фрагменты, Fab'-фрагменты, Fv-фрагменты, фрагменты рекомбинантного IgG (rIgG), фрагменты одноцепочечных антител, включая одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), и фрагменты однодоменных антител (например, sdAb, sdFv, нанотело). Этот термин охватывает генетически сконструированные и/или иным образом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интратела, пептидные антитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и гетероконъюгатные антитела, полиспецифичные, например, биспецифичные, антитела, диатела, триатела и тетратела, тандем ди-scFv, тандем три-scFv. Если не указано иное, следует понимать, что термин «антитело» охватывает его функциональные фрагменты. Термин также охватывает интактные или полноразмерные антитела, включая антитела любого класса или подкласса, включая IgG и его подклассы, IgM, IgE, IgA и IgD.
Термин «антиидиотипическое антитело» относится к антителу, включая его антиген-связывающие фрагменты, которые специфически распознают, специфически нацелены и/или специфически связываются с идиотопом антитела, таим как антиген-связывающий фрагмент. Идиотопы антитела могут включать, но не ограничиваются ими, остатки в одной или более областях, определяющих комплементарность (CDR) антитела, вариабельные области антитела и/или неполные части, или части таких вариабельных областей, и/или таких CDR, и/или любую комбинацию вышеуказанного. CDR может представлять собой одну или более выбранную из группы, состоящей из CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. Вариабельные области антитела могут представлять собой вариабельные области тяжелой цепи, вариабельные области легкой цепи или комбинацию вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи. Неполные фрагменты или части вариабельных областей тяжелой цепи и/или вариабельных областей легкой цепи антитела могут представлять собой фрагменты, включающие 2 или более, 5 или более или 10 или более непрерывно расположенных аминокислот, например, примерно от 2 примерно до 100, примерно от 5 примерно до 100, примерно от 10 примерно до 100, примерно от 2 примерно до 50, примерно от 5 примерно до 50 или примерно от 10 примерно до 50 непрерывно расположенных аминокислот в вариабельных областях тяжелой цепи или легкой цепи антитела; идиотоп может включать множество несмежных участков аминокислот. Неполные фрагменты вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи антитела могут представлять собой фрагменты, включающие 2 или более, 5 или более или 10 или более непрерывно расположенных аминокислот, например, примерно от 2 примерно до 100, примерно от 5 примерно до 100, примерно от 10 примерно до 100, примерно от 2 примерно до 50, примерно от 5 примерно до 50 или примерно от 10 примерно до 50 непрерывно расположенных аминокислот в вариабельных областях, и в некоторых вариантах осуществления содержат одну или более CDR или фрагментов CDR. Фрагменты CDR могут представлять собой последовательно или непоследовательно расположенные 2 или более, или 5 или более аминокислот в CDR. Следовательно, идиотопы антитела могут составлять примерно от 2 примерно до 100, примерно от 5 примерно до 100, примерно от 10 примерно до 100, примерно от 2 примерно до 50, примерно от 5 примерно до 50 или примерно от 10 примерно до 50 последовательно расположенных аминокислот, содержащих одну или более CDR или один или более фрагментов CDR в вариабельных областях тяжелой цепи или вариабельных областях легкой цепи антитела. В другом варианте осуществления идиотопы могут представлять собой одну аминокислоту, которая расположена в вариабельных областях антитела, например в сайтах CDR.
В некоторых вариантах осуществления идиотоп представляет собой любую единственную антигенную детерминанту или эпитоп в вариабельной части антитела. В некоторых случаях он может перекрывать фактический антиген-связывающий сайт антитела, а в некоторых случаях он может содержать последовательности вариабельной области вне антиген-связывающего сайта антитела. Набор отдельных идиотопов антитела в некоторых вариантах осуществления называют «идиотипом» такого антитела.
В данной области известно, что термины «область, определяющая комплементарность», и «CDR», являются синонимами «гипервариабельной области» или «HVR», и относятся к несмежным последовательностям аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают антигенную специфичность и/или аффинность связывания. Как правило, в каждой вариабельной области тяжелой цепи имеется три CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) и три CDR в каждой вариабельной области легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). В данной области известно, что «каркасные области» и «FR» относятся к не-CDR частям вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Как правило, в каждой вариабельной области полноразмерной тяжелой цепи имеется четыре FR (FR-H1, FR-H2, FR-H3 и FR-H4) и четыре FR в каждой вариабельной области полноразмерной легкой цепи (FR- L1, FR-L2, FR-L3 и FR-L4).
Точные границы аминокислотной последовательности данной CDR или FR могут быть легко определены с использованием любой из ряда хорошо известных схем, в том числе описанных Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest,» 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD («Kabat» схема нумерации), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 («Chothia» схема нумерации), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), «Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,» J. Mol. Biol. 262, 732-745. («Contact» схема нумерации), Lefranc MP et al., «IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,» Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1): 55-77 («IMGT» схема нумерации), и Honegger A and  A, «Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,» J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3): 657-70, («Aho» схема нумерации).
Границы данных CDR или FR могут варьироваться в зависимости от схемы, используемой для идентификации. Например, схема Kabat основана на структурном выравнивании, а схема Chothia основана на структурной информации. Нумерация как для схем Kabat, так и для Chothia основана на наиболее распространенных длинах последовательностей областей антител, где вставки снабжены буквами вставки, например, «30a», и делециями, встречающимися в некоторых антителах. Эти две схемы помещают определенные вставки и делеции («Indels») в разные положения, что приводит к дифференциальной нумерации. Схема Contact основана на анализе сложных кристаллических структур и во многом похожа на схему нумерации Chothia.
В приведенной ниже Таблице 1 перечислены примерные положения границ CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, которые определены схемами Kabat, Chothia и Contact, соответственно. Для CDR-H1 нумерация остатков указана с использованием схем нумерации Kabat и Chothia. FR расположены между CDR, например, FR-L1, расположенным между CDR-L1 и CDR-L2, и так далее. Следует отметить, что, поскольку показанная схема нумерации Kabat размещает вставки в H35A и H35B, конец петли CDR-H1 согласно Chothia при нумерации с использованием представленного соглашения о нумерации Kabat варьируется между H32 и H34 в зависимости от длины петли.
Таблица 1
CDR
Kabat
Chothia
Contact
CDR-L1
L24--L34
L24--L34
L30--L36
CDR-L2
L50--L56
L50--L56
L46--L55
CDR-L3
L89--L97
L89--L97
L89--L96
CDR-H1(Kabat Нумерация<sup>1</sup>)
H31--H35B
H26--H32..34
H30--H35B
CDR-H1(Chothia Нумерация<sup>2</sup>)
H31--H35
H26--H32
H30--H35
CDR-H2
H50--H65
H52--H56
H47--H58
CDR-H3
H95--H102
H95--H102
H93--H101
1 - Kabat et al. (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest,» 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273 927-948
Таким образом, если не указано иное, следует понимать, что «CDR» или «область, определяющая комплементарность» или отдельные указанные CDR (например, CDR-H1, CDR-H2) данного антитела или его области, такой как его вариабельная область, охватывает (или определяет) область, определяющую комплементарность, как определено любой из вышеуказанных схем. Например, если указано, что конкретная CDR (например, CDR-H3) содержит аминокислотную последовательность соответствующей CDR в данной аминокислотной последовательности VH или VL, подразумевается, что такая CDR имеет последовательность соответствующей CDR (например, CDR-H3) в вариабельной области, как определено любой из вышеуказанных схем. В некоторых вариантах определены конкретные последовательности CDR.
Таким образом, если не указано иное, следует понимать, что «FR» или отдельные указанные FR (например, FR-H1, FR-H2) данного антитела или его области, такой как его вариабельная область, охватывает (или определяет) каркасную область, как определено любой из вышеуказанных схем. В некоторых случаях указана схема для идентификации конкретных CDR, FR или множества FR или CDR, таких как CDR, как определено методом Kabat, Chothia или Contact. В других случаях указана конкретная аминокислотная последовательность CDR или FR.
Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH или VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (FR) и три CDR. (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания антиген-связывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывается с антигеном, путем скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. Смотри, например, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
2
Среди предложенных антител есть фрагменты антител. «Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'); диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. В конкретных вариантах осуществления антитела представляют собой одноцепочечные фрагменты антител, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, такие как scFv.
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело.
Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продуцирование рекомбинантными клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой рекомбинантно продуцируемые фрагменты, такие как фрагменты, содержащие перестановки, которые не встречаются в природе, такие как фрагменты, содержащие две или более области антитела или цепи, соединенные синтетическими линкерами, например пептидными линкерами, и/или которые не могут быть получены путем ферментативного расщепления природного интактного антитела. В некоторых аспектах фрагменты антител представляют собой scFv.
«Гуманизированное» антитело представляет собой антитело, в котором все или по существу все аминокислотные остатки CDR получены из CDR, не являющихся человеческими, а все или по существу все аминокислотные остатки каркасных областей (FR) получены из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные формы антитела, не являющегося человеческим, например мышиного антитела, представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальные последовательности, полученные из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела представляют собой антитела видов, отличных от человека, содержащие одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR), из видов, отличных от человека, и каркасную область (FR) из молекулы иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело необязательно может включать, по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из антитела человека. «Гуманизированная форма» антитела, не являющегося человеческим, относится к варианту антитела, не являющегося человеческим, которое было подвергнуто гуманизации, обычно для снижения иммуногенности для людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим, (например, антитела, из которого получены остатки CDR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела. (См., например, Queen, патент США №5585089 и Winter, патент США №5225539). Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены методами рекомбинантной ДНК, известными в данной области.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин (антитело-реципиент), в котором остатки из вариабельной области тяжелой цепи реципиента заменены остатками из вариабельной области тяжелой цепи вида, отличного от человека, (донорское антитело), такого как мышь крыса, кролик или примат, отличный от человека, имеющими целевую специфичность, аффинность и/или способность. В некоторых случаях остатки FR человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорском антителе. В некоторых вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные тяжелые цепи и вариабельные легкие цепи человека, изменяют для замены одной или более последовательностей CDR человеческой (акцепторной) последовательности на последовательность, кодирующую соответствующую CDR в последовательности антитела, не являющегося человеческим (донорской последовательности). В некоторых вариантах осуществления акцепторная последовательность человека может содержать FR, полученный из разных генов. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело будет содержать по существу все, по меньшей мере один и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым у иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все из FR представляют собой последовательности иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело необязательно будет также включать, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Для получения дополнительной информации см., например, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). См. также, например, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); и пат. №№9982321 и 7087409, включенные в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления в настоящем описании предлагаются гуманизированные антиидиотипические антитела.
В конкретных вариантах осуществления антитело, например антиидиотипическое антитело, является гуманизированным. В определенных вариантах осуществления антитело гуманизируют любым подходящим известным способом. Например, в некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело может иметь один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти аминокислотные остатки, не являющиеся человеческими, часто называют «импортными» остатками, которые обычно берут из «импортного» вариабельного домена. В конкретных вариантах осуществления гуманизация может быть по существу выполнена согласно способу Winter и коллег (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536), например, путем замены последовательностей гипервариабельной области соответствующими последовательностями человеческого антитела. Соответственно, такими «гуманизированными» антителами являются химерные антитела (патент США №4816567), в которых существенно меньшая область, чем интактный вариабельный человеческим домен, была заменена соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело человека, в котором некоторые остатки гипервариабельной области и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов.
Последовательности, кодирующие полноразмерные антитела, могут быть впоследствии получены путем присоединения предоставленных вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепей к константным областям тяжелой цепи и легкой цепи человека. Подходящие константные последовательности легкой цепи человека включают константные последовательности легкой цепи каппа и лямбда. Подходящие человеческие константные последовательности тяжелой цепи включают IgG1, IgG2 и последовательности, кодирующие мутанты IgG1, которые обладают иммуностимулирующими свойствами. Такие мутанты могут обладать пониженной способностью активировать комплемент и/или антителозависимую клеточную цитотоксичность и описаны в патенте США No. №5624821; WO 99/58572, патенте США №6737056. Подходящая константная область тяжелой цепи также включает IgG1, содержащий замены E233P, L234V, L235A, A327G, A330S, P331S и делецию остатка 236. В другом варианте осуществления полноразмерное антитело содержит последовательность IgA, IgD, IgE, IgM, IgY или IgW.
Подходящие человеческие донорские последовательности могут быть определены путем сравнения пептидных последовательностей, кодируемых мышиными донорскими последовательностями, с группой человеческих последовательностей, предпочтительно с последовательностями, кодируемыми генами иммуноглобулина зародышевой линии человека или генами зрелых антител. Человеческая последовательность с высокой гомологией последовательности, предпочтительно с самой высокой определенной гомологией, может служить в качестве акцепторной последовательности для процесса гуманизации.
В дополнение к обмену человеческих CDR на мышиные CDR могут проводиться дальнейшие манипуляции с человеческой донорной последовательностью для получения последовательности, кодирующей гуманизированное антитело с оптимизированными свойствами (такими как аффинность антигена).
Кроме того, измененные последовательности вариабельного домена человеческого акцепторного антитела также могут воспроизводиться для кодирования одной или более аминокислот (в соответствии с системой нумерации Kabat) в положении 4, 35, 38, 43, 44, 46, 58, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 73, 85, 98 вариабельной области легкой цепи и 2, 4, 36, 39, 43, 45, 69, 70, 74, 75, 76, 78, 92 вариабельной области тяжелой цепи, соответствующей последовательности донора, не являющегося человеком (Carter and Presta, патент США №6,407,213)
В конкретных вариантах осуществления обычно желательно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели в некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела получают с помощью процесса анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно доступны и знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулина. Изучение этих изображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, то есть анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать свой антиген. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны и объединены из реципиентной и импортированной последовательностей, так что достигается целевая характеристика антитела, такая как повышенная аффинность к целевому антигену (антигенам). В общем, остатки гипервариабельной области непосредственно и наиболее существенно участвуют во влиянии на связывание антигена.
В конкретных вариантах осуществления выбор вариабельных доменов человека, как легкой, так и тяжелой цепи, для использования при получении гуманизированных антител может быть важным для снижения антигенности. Согласно так называемому методу «наилучшего соответствия» последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу по всей библиотеке известных последовательностей вариабельного домена человека. Человеческая последовательность, которая наиболее близка к последовательности грызуна, затем принимается в качестве человеческого каркаса для гуманизированного антитела. Смотри, например, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901. Другой метод использует конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител определенной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас может быть использован для нескольких разных гуманизированных антител. Смотри, например, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. США, 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.
Среди предложенных антител присутствуют человеческие антитела. «Человеческое антитело» представляет собой антитело с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцируемого человеком, человеческой клеткой или источником, отличным от человека, в котором используется репертуар человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела, включая библиотеки человеческих антител. Термин исключает гуманизированные формы антител, не являющихся человеческими, содержащих антиген-связывающие области, не являющиеся человеческими, такие как те, в которых все или по существу все CDR не являются человеческими.
Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для производства интактных человеческих антител или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенное стимулирование. Такие животные обычно содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина или которые присутствуют вне хромосом или случайным образом интегрированы в хромосомы животного. У таких трансгенных животных эндогенные локусы иммуноглобулина обычно инактивированы. Человеческие антитела также могут быть получены из библиотек антител человека, включая фаговый дисплей и бесклеточные библиотеки, содержащие последовательности, кодирующие антитела, полученные из репертуара человека.
В число предложенных антител входят моноклональные антитела, включая фрагменты моноклональных антител. Используемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции или внутри популяции, по существу, гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных вариантов, содержащих природные мутации или возникающие во время получения препарата моноклонального антитела, такие варианты обычно присутствуют в небольших количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, нацеленные против различных эпитопов, каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител нацелено против одного эпитопа на антигене. Термин не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Моноклональное антитело может быть получено различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, получение из гибридомы, методы рекомбинантной ДНК, фаговый дисплей и другие методы дисплея для получения антител.
A. Антитела, полученные из SJ25C1
В некоторых вариантах осуществления предлагаются антиидиотипические антитела, специфичные к антителу-мишени в виде антитела против CD19, которое является или получено из антитела SJ25C1 или его антиген-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела или антиген-связывающие фрагменты являются специфичными к scFv, полученному из SJ25C1.
В некоторых вариантах осуществления предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую, по меньшей мере 90% идентичности области VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности.
В некоторых вариантах осуществления предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую область 3, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H3), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 84, и/или CDR-H3, содержащуюся в вариабельной последовательности (VH) тяжелой цепи SEQ ID NO: 1.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH включает область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 78, 79 или 80, и/или CDR-H1, содержащуюся в последовательности VH SEQ ID NO: 1; и/или область 2, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 81, 82 или 83, и/или CDR-H2, содержащуюся в последовательности VH SEQ ID NO: 1.
Предложены антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 78, 79 или 80; CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 81, 82 или 83; и/или CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 84. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 78, 79 или 80; CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 81, 82 или 83; и CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 84.
Предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), CDR-H2 и CDR-H3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит последовательности каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и/или FR4, имеющие, по меньшей мере 90% идентичности последовательности, соответственно, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и/или FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления область VH содержит последовательности каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и/или FR4, имеющие, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% идентичности последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и/или FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления область VH содержит последовательности каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и FR4, имеющие, по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% идентичности последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляют собой только тяжелую цепь, только VH и/или не включают VL или ее антиген-связывающую часть, и/или антиген-связывающий сайт антиидиотипического антитела или фрагмент включают остатки только из тяжелой цепи и/или не включают остатки из легкой цепи.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его фрагмент не содержат вариабельную область (VL) легкой цепи, не содержат CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3, и/или представляют собой однодоменное антитело (sdAb), содержащее только область VH. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент представляют собой sdAb, которое содержит только область VH из любого описанного.
В некоторых вариантах осуществления любого из антиидиотипических антител или их фрагментов, содержащих любую из указанных выше последовательностей области VH, антиидиотипическое антитело или его фрагмент дополнительно содержит вариабельную (VL) область легкой цепи. В некоторых таких вариантах осуществления область VL имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью областью VL SEQ ID NO: 5, например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% идентичности области VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 87. В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 87.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит область 1, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 85, и/или CDR-L1, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 5; и/или область 2, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или 86, и/или CDR-L2, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 5. В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит область 1, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L1), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 85, и/или CDR-L1, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 5; и/или область 2, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L2), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или 86, и/или CDR-L2, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 5.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 85; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или 86; и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 57.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно, включая аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в аминокислотная последовательность области VL SEQ ID NO: 5.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит каркасную область 1 (FR1), FR2, FR3 и/или FR4, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и/или FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления область VL содержит последовательность каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и/или FR4, имеющую по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% идентичности последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и/или FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления область VL содержит последовательность каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и FR4, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% идентичности последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
Предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые содержат аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1; и/или содержат аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в аминокислотной последовательности вариабельной области (VL) легкой цепи SEQ ID NO: 5.
Предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают области VH или VL, имеющие аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с SEQ ID NO: 1 и 5, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления предложены антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают области VH или VL, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1 и 5, соответственно.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления области VH или VL включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 и 5, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к антителу SJ25C1 или его антиген-связывающему фрагменту, представляет собой одноцепочечный фрагмент антитела, такой как scFv или диатело. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело включает один или более линкеров, соединяющих два домена или области антитела, таких как вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL). Линкер, как правило, представляет собой пептидный линкер, например, гибкий и/или растворимый пептидный линкер. Среди линкеров имеются те, которые богаты глицином и серином и/или, в некоторых случаях, треонином. В некоторых вариантах осуществления линкеры дополнительно включают заряженные остатки, такие как лизин и/или глутамат, которые могут улучшить растворимость. В некоторых вариантах осуществления линкеры дополнительно включают один или более остатков пролина.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой интактное антитело или полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ID может содержать, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, такую как один или более доменов константной области. В некоторых вариантах осуществления константные области включают константную область легкой цепи (CL) и/или константную область 1 тяжелой цепи (CH1). В некоторых вариантах осуществления анти-ID включает домен CH2 и/или CH3, такой как Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область человеческого IgG, такого как IgG1 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело содержит домен СН, представленный в SEQ ID NO: 2, или его часть, или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 2 или ее частью. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело содержит домен CL, представленный в SEQ ID NO: 6, или его часть, или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 6 или ее частью.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3, или последовательность, которая демонстрирует, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 3, и/или содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 7, или последовательность, которая демонстрирует, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 3, и/или последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь и/или легкая цепь антиидиотипического антитела дополнительно содержит сигнальный пептид. В некоторых случаях сигнальный пептид имеет последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8.
2
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из антиген-связывающих фрагментов (Fab), F(ab'), Fab', Fv, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) или однодоменного антитела.
Соответственно, предлагаются одноцепочечные фрагменты антител, такие как scFv и диатела, в частности человеческие одноцепочечные фрагменты, обычно содержащие линкер(ы), соединяющий два домена или области антиидиотипического антитела, такие как домены VH или VL. Линкер, как правило, представляет собой пептидный линкер, например гибкий и/или растворимый пептидный линкер, такой как линкер, богатый глицином и серином.
В некоторых аспектах линкеры, богатые глицином и серином (и/или треонином), включают, по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% таких аминокислот. В некоторых вариантах осуществления они включают, по меньшей мере примерно 50%, 55%, 60%, 70% или 75%, глицина, серина и/или треонина. В некоторых вариантах осуществления линкер состоит по существу полностью из глицина, серина и/или треонина. Линкеры обычно имеют длину примерно от 5 примерно до 50 аминокислот, обычно примерно от 10 примерно до 30 или примерно 30, например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20., 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, а в некоторых примерах линкеры имеют длину от 10 до 25 аминокислот. Типичные линкеры включают линкеры, имеющие различное количество повторов последовательности GGGS (3GS; SEQ ID NO: 29) или GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 26), например от 2, 3, 4 и 5 повторов такой последовательности. Типичные линкеры включают те, которые имеют или состоят из последовательности SEQ ID NO: 25 (GGGGSGGGGSGGGGS). Типичные линкеры дополнительно включают те, которые имеют или состоят из последовательности SEQ ID NO: 33 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG).
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипические антитела включают выделенные антитела. В некоторых вариантах осуществления анти-ID является гуманизированным, рекомбинантным и/или моноклональным. В некоторых вариантах осуществления анти-ID является человеческим.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, является гуманизированным. В конкретных вариантах осуществления все или по существу все аминокислотные остатки CDR гуманизированного антиидиотипического антитела, специфичного к SJ25C1, получены из CDR антитела SJ25C1, не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, включает, по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из человеческого антитела.
В определенных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, включает человеческий иммуноглобулин (антитело-реципиент), в котором остатки вариабельной области тяжелой цепи реципиента заменены остатками вариабельной области тяжелой цепи не являющегося человеческим антиидиотипического антитела, специфичного к SJ25C1. В некоторых случаях остатки FR человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит FR, полученные из различных генов. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, содержит, по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, содержит измененные последовательности вариабельного домена человеческого акцепторного антитела, которые были предоставлены для кодирования одного или более аминокислотных остатков в положении 4, 35, 38, 43, 44, 46, 58, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 73, 85, 98 (Kabat) вариабельной области легкой цепи и 2, 4, 36, 39, 43, 45, 69, 70, 74, 75, 76, 78, 92 (Kabat) вариабельной области тяжелой цепи, соответствующей донорской последовательности, не являющейся человеческой.
В определенных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, является гуманизированным. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, содержит одну или более областей CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, которое специфично к SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления некоторые или все области CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 содержат одну или более аминокислотных модификаций. В некоторых вариантах осуществления модификации заменяют остаток, не являющийся человеческим, на человеческий аминокислотный остаток. В конкретных вариантах осуществления одна или более из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 вставляются в области FR человеческого антитела. В конкретных вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, представляют собой CDR областей VH или VL, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1 и 5, соответственно. В некоторых вариантах осуществления все CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, специфичного для SJ25C1, вставляются в FR человеческого антитела. В конкретных вариантах осуществления области CDR и FR являются областями, которые идентифицированы посредством схем Kabat, Chothia, AbM и/или Contact.
В конкретных вариантах осуществления одна или более или все из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, которое специфично к SJ25C1, вставляются в каркасные области человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело представляет собой антитело IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В конкретных вариантах осуществления человеческое антитело является одним из подкласса человеческих IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, например, человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2. В некоторых вариантах осуществления одна или более или все из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, которое специфично к SJ25C1, вставляются в каркасные области антиген-связывающей область, которая взята и/или получена из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент происходит и/или получен из человеческого антитела IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов человека хорошо известны и описаны в целом, например, в Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (WB Saunders, Co., 2000). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть частью более крупной слитой молекулы, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией человеческого антитела с одним или более другими белками или пептидами.
В некоторых вариантах осуществления одна или более или все из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, которое специфично к SJ25C1, вставляются в каркасные области человеческого антитела или его антиген-связывающего фрагмента, содержащего всю или часть Fc-области. В определенных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, содержит всю или часть Fc-области. В некоторых вариантах осуществления Fc-область имеет одну или более модификаций, таких как аминокислотная модификация (например, замена, вставка или делеция) в одном или более аминокислотных положениях. Такие модификации могут быть сделаны, например, для улучшения периода полужизни, изменения связывания с одним или более типами Fc-рецепторов и/или для изменения эффекторных функций. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Fc-области имеют измененное (например, пониженное) связывание с FcαR по сравнению с немодифицированной Fc-областью. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело содержит всю или часть модифицированной Fc-области, имеющей измененное (например, уменьшенное) связывание с Fc-рецептором по сравнению с таковым не модифицированной области Fc. Неограничивающие примеры модификаций Fc, которые изменяют ее связывание с рецепторами Fc, описаны, например, в патентах США No. №№7217797 и 7732570; и заявках США № US 2010/0143254 и 2010/0143254.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к SJ25C1, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137.
B. Антитела, полученные из FMC63
В некоторых вариантах осуществления предлагаются антиидиотипические антитела, специфичные к антителу-мишени в виде антитела против CD19, которое является или получено из антитела FMC63 или его антиген-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела или антиген-связывающие фрагменты являются специфичными для scFv, полученного из FMC63.
В некоторых вариантах осуществления предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают вариабельную область (VH) тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична области VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 58, например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности.
3
5
6
8
10
3
5
6
8
10
4
6
8
9
10
11
13
14
17
20
4
6
8
9
10
11
13
14
17
20
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
В некоторых вариантах осуществления предложены антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают область VH, имеющую область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), содержащую аминокислотную последовательность GYXFXXYXMX (SEQ ID NO: 108), где X представляет собой T или S, X представляет собой T или S, X представляет собой D или R, X представляет собой Y или W, и X представляет собой K или N; и/или область 2, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H2), содержащую аминокислотную последовательность WIGXIXPXXXXTXXNQXFKX (SEQ ID NO: 109), где X представляет собой D или M, X представляет собой N или H, X представляет собой N или S, X представляет собой N или D, X представляет собой G или S, X представляет собой G или E, X представляет собой D или R, X представляет собой Y или L, X представляет собой N или K, и X представляет собой G или D; и/или область 3, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H3), содержащую аминокислотную последовательность AXXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 110), где X представляет собой R или S, X представляет собой E или I, X представляет собой G или Y, X представляет собой N или Y, X представляет собой N или E, X представляет собой Y или отсутствует, X представляет собой G или отсутствует, X представляет собой S или отсутствует, X R или отсутствует, X D или отсутствует, X А или отсутствует, X М или отсутствует, X представляет собой D или E, и X представляет собой Y или A.
В некоторых вариантах осуществления предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую область 3, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H3), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, 67, 94 или 104, и/или CDR-H3, содержащуюся в вариабельной последовательности (VH) тяжелой цепи SEQ ID NO: 36 или 58.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH включает область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, 65, 88, 89, 90, 98, 99 или 100, и/или CDR-H1, содержащуюся в последовательности VH SEQ ID NO: 36 или 58; и/или область 2, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, 66, 91, 92, 93, 101, 102 или 103, и/или CDR- H2 содержащуюся в последовательности VH SEQ ID NO: 36 или 58.
Предложены антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают вариабельную область (VH) тяжелой цепи, содержащую область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, 65, 88, 89, 90, 98, 99, или 100; CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, 66, 91, 92, 93, 101, 102, или 103; и/или CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, 67, 94 или 104. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают CDR-H1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, 65, 88, 89, 90, 98, 99, или 100; CDR-H2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, 66, 91, 92, 93, 101, 102, или 103; и CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, 67, 94 или 104.
Предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), CDR-H2 и CDR-H3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 58.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент включает CDR-H1 c SEQ ID NO: 44, 88, 89 или 90; CDR-H2 c SEQ ID NO: 45, 91, 92 или 93; и/или CDR-H3 c SEQ ID NO: 46 или 94. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент включает CDR-H1 c SEQ ID NO: 65, 98, 99 или 100; CDR-H2 c SEQ ID NO: 66, 101, 102 или 103; и/или CDR-H3 c SEQ ID NO: 67 или 104, соответственно.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VH содержит последовательность каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и/или FR4, имеющие, по меньшей мере 90% идентичности последовательности, соответственно, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и/или FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36 или 58. В некоторых вариантах осуществления область VH содержит последовательность каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и/или FR4, имеющую по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% идентичности последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и/или FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36 или 58. В некоторых вариантах осуществления область VH содержит последовательность каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и FR4, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% идентичности последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36 или 58.
В некоторых из таких вариантов осуществления область VH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или 58.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляет собой только тяжелую цепь, только VH и/или не включает VL или ее антиген-связывающую часть, и/или антиген-связывающий сайт антиидиотипического антитела или фрагмент включают остатки только из тяжелой цепи и/или не включают остатки из легкой цепи.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления антиидиотипическое антитело или его фрагмент не содержат вариабельную область (VL) легкой цепи, не содержат CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3, и/или представляют собой однодоменное антитело (sdAb), содержащее только область VH. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент представляют собой sdAb, которое содержит только область VH из любого описанного.
В некоторых вариантах осуществления любого из антиидиотипических антител или их фрагментов, содержащих любую из указанных выше последовательностей области VH, антиидиотипическое антитело или его фрагмент дополнительно содержит вариабельную (VL) область легкой цепи. В некоторых таких вариантах осуществления область VL имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью областью VL SEQ ID NO: 40 или 62, например, по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% идентичности области VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 62.
1
3
4
5
6
7
8
10
11
1
3
4
5
6
7
8
10
11
1
2
3
5
6
7
8
11
1
2
3
5
6
7
8
11
2
3
4
5
6
8
2
3
4
5
6
8
В некоторых вариантах осуществления предложены антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают область VH, имеющую область 1, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L1), содержащую аминокислотную последовательность XAXXXXXXYXXWY (SEQ ID NO: 111), где X представляет собой S или R, X представляет собой S или R, X представляет собой S или G, X представляет собой G или N, X представляет собой V или I, X представляет собой I или H, X представляет собой N или отсутствует, X представляет собой M или L, и X представляет собой Y или A; и/или область 2, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L2), содержащую аминокислотную последовательность XXXYXXXXLAX (SEQ ID NO: 112), где X представляет собой P или L, X представляет собой W или L, X представляет собой I или V, X представляет собой L или N, X представляет собой T или A, X представляет собой S или K, X представляет собой N или T, и X представляет собой S или D; и/или область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность QXXXXXPXT (SEQ ID NO: 113), где X представляет собой Q или H, X представляет собой W или F, X представляет собой S или W, X представляет собой S или W, X представляет собой N или T, и X представляет собой L или Y.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, 97, 70, или 107. В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, 97, 70 или 107.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит область 1, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L1), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, 68, 95, или 105, и/или CDR-L1, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 40 или 62; и/или область 2, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L2), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, 69, 96, или 106, и/или CDR-L2, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 40 или 62. В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит область 1, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L1), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, 68, 95, или 105, и/или CDR-L1, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 40 или 62; и/или область 2, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L2), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, 69, 96, или 106, и/или CDR-L2, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 40 или 62.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, 68, 95, или 105; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, 69, 96, или 106; и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, 97, 70, или 107.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно, включая аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 62.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент включают CDR-L1 c SEQ ID NO: 47 или 95; CDR-L2 c SEQ ID NO: 48 или 96; и/или CDR-L3 c SEQ ID NO: 49 или 97. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент включают CDR-L1 c SEQ ID NO: 68 или 105; CDR-L2 c SEQ ID NO: 69 или 106; и/или CDR-L3 c SEQ ID NO: 70 или 107, соответственно.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL содержит каркасную область 1 (FR1), FR2, FR3 и/или FR4, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и/или FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 64. В некоторых вариантах осуществления область VL содержит последовательность каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и/или FR4, имеющую по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% идентичности последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и/или FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 62. В некоторых вариантах осуществления область VL содержит последовательность каркасной области 1 (FR1), FR2, FR3 и FR4, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99% идентичности последовательности, соответственно, с FR1, FR2, FR3 и FR4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 62.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления область VL имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 62.
Предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые содержат аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 58; и/или содержат аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в аминокислотной последовательности вариабельной области (VL) легкой цепи SEQ ID NO: 40 или 62.
Предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают область VH, имеющую аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с SEQ ID NO: 36 или 58, и область VL, имеющую аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с SEQ ID NO: 40 или 62.
В некоторых вариантах осуществления предлагаются антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые включают область VH, имеющую аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 36 или 58, и область VL, имеющую аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 40 или 62. В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело содержит область VH SEQ ID NO: 36, и область VL SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело содержит область VH SEQ ID NO: 58, и область VL SEQ ID NO: 62.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент антитела, такой как scFv или диатело. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело включает один или более линкеров, соединяющих два домена или области антитела, таких как вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL). Линкер, как правило, представляет собой пептидный линкер, например, гибкий и/или растворимый пептидный линкер. Среди линкеров имеются те, которые богаты глицином и серином и/или, в некоторых случаях, треонином. В некоторых вариантах осуществления линкеры дополнительно включают заряженные остатки, такие как лизин и/или глутамат, которые могут улучшить растворимость. В некоторых вариантах осуществления линкеры дополнительно включают один или более остатков пролина.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой интактное антитело или полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-ID может содержать, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, такую как один или более доменов константной области. В некоторых вариантах осуществления константные области включают константную область легкой цепи (CL) и/или константную область 1 тяжелой цепи (CH1). В некоторых вариантах осуществления анти-ID включает домен CH2 и/или CH3, такой как Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область человеческого IgG, такого как IgG1 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело содержит домен СН, представленный в SEQ ID NO: 37 или 59, или его часть, или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 37 или 59 или ее частью. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело содержит домен CL, представленный в SEQ ID NO: 41 или 63, или его часть, или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 41 или 63 или ее частью.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 38 или 60, или последовательность, которая демонстрирует, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90и%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 38 или 60, и/или содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 42 или 63, или последовательность, которая демонстрирует, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 42 или 63. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 38, и/или последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 60, и/или последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь и/или легкая цепь антиидиотипического антитела дополнительно содержит сигнальный пептид. В некоторых случаях сигнальный пептид имеет последовательность SEQ ID NO: 39, 43, 61 или 64.
2
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из антиген-связывающих фрагментов (Fab), F(ab'), Fab', Fv, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) или однодоменного антитела.
Соответственно, предлагаются одноцепочечные фрагменты антител, такие как scFv и диатела, в частности человеческие одноцепочечные фрагменты, обычно содержащие линкер(ы), соединяющий два домена или области антиидиотипического антитела, такие как домены VH или VL. Линкер, как правило, представляет собой пептидный линкер, например гибкий и/или растворимый пептидный линкер, такой как линкер, богатый глицином и серином.
В некоторых аспектах линкеры, богатые глицином и серином (и/или треонином), включают, по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% таких аминокислот. В некоторых вариантах осуществления они включают, по меньшей мере примерно 50%, 55%, 60%, 70% или 75%, глицина, серина и/или треонина. В некоторых вариантах осуществления линкер состоит по существу полностью из глицина, серина и/или треонина. Линкеры обычно имеют длину примерно от 5 примерно до 50 аминокислот, обычно примерно от 10 примерно до 30 или примерно 30, например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20., 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, а в некоторых примерах линкеры имеют длину от 10 до 25 аминокислот. Типичные линкеры включают линкеры, имеющие различное количество повторов последовательности GGGS (3GS; SEQ ID NO: 29) или GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 26), например от 2, 3, 4 и 5 повторов такой последовательности. Типичные линкеры включают те, которые имеют или состоят из последовательности SEQ ID NO: 25 (GGGGSGGGGSGGGGS). Типичные линкеры дополнительно включают те, которые имеют или состоят из последовательности SEQ ID NO: 33 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG).
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипические антитела включают выделенные антитела. В некоторых вариантах осуществления анти-ID является гуманизированным, рекомбинантным и/или моноклональным. В некоторых вариантах осуществления анти-ID является человеческим.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, является гуманизированным. В конкретных вариантах осуществления все или по существу все аминокислотные остатки CDR гуманизированного антиидиотипического антитела, специфичного к FMC63, получены из CDR антитела FMC63, не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, включает, по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из человеческого антитела.
В определенных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, включает человеческий иммуноглобулин (антитело-реципиент), в котором остатки вариабельной области тяжелой цепи реципиента заменены остатками вариабельной области тяжелой цепи не являющегося человеческим антиидиотипического антитела, специфичного к FMC63. В некоторых случаях остатки FR человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит FR, полученные из различных генов. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, содержит, по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, содержит измененные последовательности вариабельного домена человеческого акцепторного антитела, которые были предоставлены для кодирования одного или более аминокислотных остатков в положении 4, 35, 38, 43, 44, 46, 58, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 73, 85, 98 (Kabat) вариабельной области легкой цепи и 2, 4, 36, 39, 43, 45, 69, 70, 74, 75, 76, 78, 92 (Kabat) вариабельной области тяжелой цепи, соответствующей донорской последовательности, не являющейся человеческой.
В определенных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, является гуманизированным. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, содержит одну или более из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим и специфичного к FMC63. В некоторых вариантах осуществления некоторые или все области CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 содержат одну или более аминокислотных модификаций. В некоторых вариантах осуществления модификации заменяют нечеловеческий аминокислотный остаток на человеческий остаток. В конкретных вариантах осуществления одну или более из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 вставляют в области FR человека. В конкретных вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, представляют собой CDR областей VH, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 36 или 58. В некоторых вариантах осуществления CDR области VH антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, представляют собой или включают CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, 65, 88, 89, 90, 98, 99 или 100; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, 66, 91, 92, 93, 101, 102 или 103; и/или CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, 67, 94 или 104. В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, представляют собой CDR областей VL, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 40 или 62. В некоторых вариантах осуществления CDR области VL антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, представляют собой или включают CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, 68, 95 или 105; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, 69, 96 или 106; и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, 97, 70 или 107. В некоторых вариантах осуществления все области CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, специфичного для FMC63, вставляют в FR человеческого антитела. В конкретных вариантах осуществления области CDR и FR являются областями, которые идентифицированы посредством схем Kabat, Chothia, AbM и/или и Contact.
В конкретных вариантах осуществления одну или более или все из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, специфичным к FMC63, вставляют в каркасные области человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело представляет собой антитело IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В конкретных вариантах осуществления человеческое антитело является одним из подкласса человеческих IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, например, человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2. В некоторых вариантах осуществления одна или более или все из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, которое специфично к FMC63, вставляются в каркасные области антиген-связывающей область, которая взята и/или получена из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент происходит и/или получен из человеческого антитела IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов человека хорошо известны и описаны в целом, например, в Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть частью более крупной слитой молекулы, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией человеческого антитела с одним или более другими белками или пептидами.
В некоторых вариантах осуществления одна или более или все из CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 антиидиотипического антитела, не являющегося человеческим, которое специфично к FMC63, вставляются в каркасные области человеческого антитела или его антиген-связывающего фрагмента, содержащего всю или часть Fc-области. В определенных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, содержит всю или часть Fc-области. В некоторых вариантах осуществления Fc-области имеет одну или несколько модификаций, таких как аминокислотная модификация (например, замена, вставка или делеция) в одном или более аминокислотных положениях. Такие модификации могут быть сделаны, например, для улучшения периода полужизни, изменения связывания с одним или более типами Fc-рецепторов и/или изменения эффекторных функций. В некоторых вариантах осуществления модифицированные Fc-области имеют измененное (например, пониженное) связывание с FcαR по сравнению с немодифицированной Fc-областью. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело содержит всю или часть модифицированной Fc-области, имеющей измененное (например, уменьшенное) связывание с Fc-рецептором по сравнению с таковым в немодифицированной Fc-области. Неограничивающие примеры модификаций Fc, которые изменяют его связывание с рецепторами Fc, описаны, например, в патентах США No. №№7217797 и 7732570; и заявках США № US 2010/0143254 и 2010/0143254.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 144, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 145. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 146, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антиидиотипическое антитело, специфичное к FMC63, имеет тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 148, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 149.
C. Типичные признаки
Антиидиотипические антитела, предложенные в настоящем описании, могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу или охарактеризованы по их физическим/химическим свойствам и/или биологическим активностям с помощью различных известных анализов. В одном аспекте антиидиотипическое антитело тестируют на его антиген-связывающую активность, например, с помощью известных методов, таких как ИФА, вестерн-блотинг и/или проточная цитометрия, включая анализы связывания на основе клеток, например, для оценки связывания антиидиотипического антитела (например, конъюгированного с флуоресцентным маркером или меченное) с клеткой, презентирующей фрагмент антитела-мишени против CD19, в некоторых случаях по сравнению с результатами с использованием клеток, которые не экспрессируют фрагмент антитела-мишени против CD19. Аффинность связывания может быть измерена как Kd или EC50.
В некоторых вариантах осуществления любого из предложенных антител, например, любого из предложенных антител в разделе A выше, фрагмент антитела-мишени в виде антитела против CD19 представляет собой SJ25C1, или представляет собой антитело, полученное из SJ25C1.
В некоторых вариантах осуществления любого из предложенных антител, например любого из предложенных антител в разделе B выше, фрагмент антитела-мишени против CD19 представляет собой FMC63 или представляет собой антитело, полученное из FMC63.
Конкурентные анализы могут быть использованы для идентификации антитела, которое конкурирует с любым из антиидиотипических антител, описанных в настоящем документе. Анализы для картирования эпитопов, связанных антиидиотипическими антителами и эталонными антителами, также известны и могут быть использованы.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело не вступает в перекрестную реакцию с фрагментом антитела против CD19, отличным от фрагмента антитела-мишени против CD19. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела-мишени против CD19 получают из антитела SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела-мишени против CD19 получают из антитела SJ25C1, и антиидиотипическое антитело не вступает в перекрестную реакцию с фрагментом антитела-мишени против CD19, полученного из антитела FMC63, которое представляет собой антитело против CD19, содержащее VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела-мишени против CD19 получают из антитела FMC63. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела-мишени против CD19 получают из антитела FMC63, и антиидиотипическое антитело не вступает в перекрестную реакцию с фрагментом антитела-мишени против CD19, полученного из антитела FMC63, которое представляет собой антитело против CD19, содержащее VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с фрагментом антитела-мишени против CD19, который является частью слитого белка, такого как рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело не связывается с каким-либо эпитопом в слитом белке за пределами фрагмента антитела мишени против CD19. Например, в некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела-мишени против CD19 представляет собой целый или является частью антиген-связывающего домена химерного антигенного рецептора (CAR), и антиидиотипическое антитело не связывается с каким-либо эпитопом вне антиген-связывающего домена. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий домен CAR содержит или состоит из scFv.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с фрагментом антитела-мишени против CD19, который представляет собой scFv, содержащийся в CAR. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело специфически связывается с эпитопом, перекрывающим одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR) scFv антитела-мишени против CD19. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело не связывается с какими-либо эпитопамит в CAR вне scFv; в некоторых вариантах осуществления оно не связывается с эталонным антителом. В некоторых вариантах осуществления эталонное антитело специфически связывается с тем же антигеном, что и антитело-мишень, например, с CD19, и/или содержит одну или более каркасных областей вариабельной области тяжелой и/или вариабельной области легкой цепи, имеющих, по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с соответствующей каркасной областью (областями) антитела-мишени (в некоторых аспектах одна или более каркасных областей содержат FR1, FR2, FR3 и/или FR4 тяжелой и/или легкой цепь); и/или содержит тот же самый v-ген тяжелой и/или легкой цепи (или использование v-гена), что и антитело-мишень, и/или получен из той же последовательности v-гена, что и антитело-мишень. В некоторых аспектах эталонным антителом является FMC63. В некоторых аспектах эталонным антителом является SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит спейсер, связывающий scFv с его трансмембранным доменом, и антиидиотипическое антитело не связывается с каким-либо эпитопом в спейсере. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой последовательность, полученную из CD28, такую как внеклеточная часть из CD28. В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело не связывается с каким-либо эпитопом в Fc-домене, таком как Fc-домен IgG1. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1, в котором отсутствует шарнирная область. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело не вступает в перекрестную реакцию с другим CAR. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело не вступает в перекрестную реакцию с другим анти-CD19 CAR. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело не вступает в перекрестную реакцию с фрагментом антитела против CD19, например, с эталонным антителом, имеющим один или более разных идиотопов по сравнению с scFv антитела-мишени против CD19. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело является специфичным для мишени в виде анти-CD19 scFv из CAR, полученного из антитела SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела-мишени против CD19 получают из антитела SJ25C1, и антиидиотипическое антитело не вступает в перекрестную реакцию с CAR, содержащим фрагмент антитела против CD19, полученный из антитела FMC63. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело является специфичным для мишени в виде анти-CD19 scFv из CAR, полученного из антитела FMC63. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела-мишени против CD19 получают из антитела FMC63, и антиидиотипическое антитело не вступает в перекрестную реакцию с CAR, содержащим фрагмент антитела против CD19, полученный из антитела SJ25C1.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело является агонистом CAR. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело является антагонистом CAR.
В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела способны связываться с фрагментом антитела-мишени против CD19, таким как антитело SJ25C1 или FMC63, по меньшей мере с определенной аффинностью, измеренной любым из ряда известных способов. В некоторых вариантах осуществления аффинность представлена константой диссоциации равновесия (KD); в некоторых вариантах осуществления аффинность представлена EC50. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания (ЕС50) и/или константа диссоциации фрагмента антиидиотипического антитела против CD19 составляет или примерно равна или менее, чем примерно 100 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ, как например находится в диапазоне или примерно от 1 нМ и примерно до 15 нМ, например, примерно от 5 и примерно до 10 нМ. В одном варианте осуществления степень связывания антиидиотипического антитела с фрагментом, не связанным с фрагментом антитела-мишени против CD19, составляет менее чем или примерно 10% от связывания антитела с фрагментом антитела-мишени против CD19, как измерено, например, с помощью радиоиммуноанализа (RIA).
D. Нуклеиновые кислоты
Также предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и/или их части, например их цепи. Среди предложенных нуклеиновых кислот находятся те, которые кодируют антиидиотипические антитела, описанные в настоящем документе. Нуклеиновые кислоты могут включать те, которые включают природные и/или неприродные нуклеотиды и основания, например, такие, которые имеют модификации цепи остова. Термины «молекула нуклеиновой кислоты», «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к полимеру нуклеотидов. Такие полимеры нуклеотидов могут содержать природные и/или неприродные нуклеотиды и включают, но не ограничиваясь ими, ДНК, РНК и ПНК. «Последовательность нуклеиновой кислоты» относится к линейной последовательности нуклеотидов, которые включают молекулу нуклеиновой кислоты или полинуклеотид. Примерами нуклеиновых кислот и векторов являются те, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 15-22, 50-57, 71-77 и их CDR-кодирующие части, а также последовательности, имеющие с ними, по меньшей мере 90 или 91, 91 или 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности. Нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антиидиотипического антитела (например, легкие и/или тяжелые цепи антитела).
Также предложены векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, содержащие векторы, например, для продуцирования антител. Также предложены способы получения антител. В дополнительном варианте осуществления предложены один или более векторов (например, экспрессирующих векторов), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В дополнительном варианте осуществления предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном таком варианте осуществления клетка-хозяин содержит (например, трансформирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения антиидиотипического антитела, который включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как указано выше, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, возможно, извлечение антитела из клетки-хозяина (или среды культивирования клеток-хозяев).
E. Способы получения антител
Также предложены способы получения антиидиотипического антитела, такого как в соответствии с любым из предложенных вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления для рекомбинантного продуцирования антиидиотипического антитела нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано выше, можно выделить и вставить в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована с использованием традиционных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).
В дополнение к прокариотам эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии для векторов, кодирующих антитела, включая грибы и штаммы дрожжей, пути гликозилирования которых были модифицированы, чтобы имитировать или приблизить их к клеткам человека, что приводит к образованию антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).
Типичные эукариотические клетки, которые можно использовать для экспрессии полипептидов, включают, но не ограничиваются ими, клетки COS, включая клетки COS 7; клетки 293, включая клетки 293-6E; клетки CHO, включая CHO-S, клетки DG44. Lec13 СНО и клетки FUT8 СНО; Клетки PER.C6; и клетки NSO. В некоторых вариантах осуществления тяжелые цепи и/или легкие цепи антитела могут быть экспрессированы в дрожжах. См., например, публикацию США № US 2006/0270045 A1. В некоторых вариантах осуществления конкретная эукариотическая клетка-хозяин выбирается на основании ее способности производить целевые посттрансляционные модификации тяжелых цепей и/или легких цепей. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки СНО продуцируют полипептиды, которые имеют более высокий уровень сиалилирования, чем тот же полипептид, продуцируемый в клетках 293.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело продуцируется в бесклеточной системе. Иллюстративные бесклеточные системы описаны, например, в Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).
Предложенные варианты осуществления дополнительно включают векторы и клетки-хозяева и другие экспрессирующие системы для экспрессии и продуцирования антител и других связывающих белков, включая эукариотические и прокариотические клетки-хозяева, включая бактерии, нитчатые грибы и дрожжи, а также клетки млекопитающих, такие как клетки человека, а также бесклеточные экспрессирующие системы.
Антиидиотипические антитела или фрагменты антител могут представлять собой гуманизированные антитела или антитела человека. «Гуманизированное» антитело представляет собой антитело, в котором все или по существу все аминокислотные остатки CDR получены из CDR, не являющихся человеческими, а все или по существу все аминокислотные остатки каркасных FR получены из человеческих FR. Гуманизированное антитело необязательно может включать, по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, не являющегося человеческим, относится к варианту антитела, не являющегося человеческим, которое было подвергнуто гуманизации, обычно для снижения иммуногенности для людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим, (например, антитела, из которого получены остатки CDR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.
Среди предложенных антиидиотипических антител или фрагментов антител присутствуют человеческие антитела. «Человеческое антитело» представляет собой антитело с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцируемого человеком, человеческой клеткой или источником, отличным от человека, в котором используется репертуар человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела, включая библиотеки человеческих антител. Термин исключает гуманизированные формы антител, не являющихся человеческими, содержащих антиген-связывающие области, не являющиеся человеческими, такие как те, в которых все или по существу все CDR не являются человеческими.
Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для производства интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенное стимулирование. Такие животные обычно содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина или которые присутствуют вне хромосом или случайным образом интегрированы в хромосомы животного. У таких трансгенных животных эндогенные локусы иммуноглобулина обычно инактивированы. Человеческие антитела также могут быть получены из библиотек антител человека, включая фаговый дисплей и бесклеточные библиотеки, содержащие последовательности, кодирующие антитела, полученные из репертуара человека.
F. Иммуноконъюгаты
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой цельный или является частью иммуноконъюгата (иммуноконъюгата антиидиотипического антитела), в котором антиидиотипическое антитело конъюгировано с одной или более гетерологичными молекулами, такими как, но не ограничиваясь ими, цитотоксический или визуализирующий агент. Цитотоксические агенты включают, но не ограничиваются ими, радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты (например, майтанзиноиды, таксаны, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопосид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, ингибирующие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины. В некоторых вариантах осуществления антитело конъюгировано с одним или более цитотоксическими агентами, такими как химиотерапевтические агенты или лекарственные средства, агенты, ингибирующие рост, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.
Среди иммуноконъюгатов антиидиотипического антитела присутствуют конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), в которых антиидиотипическое антитело конъюгировано с одним или более лекарственными средствами, включая, но не ограничиваясь этим, майтанзиноид (см. Патенты США №№52082020, 5416064 и Европейский патент EP 0425235 B1); ауристатин, такой как монометилауристатиновые лекарственные составляющие DE и DF (MMAE и MMAF) (см. патенты США №№5635483 и 5780588 и 7,498,298); доластатин; калихеамицин или его производное (см. патенты США №5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993); и Lode et al., Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998)); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16: 358-362 (2006); Torgov). et al., Bioconj.Chem. 16: 717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12: 1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45: 4336-4343 (2002); и патент США №6630579); метотрексат; виндезин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецен; и CC1065.
Также среди иммуноконъюгатов антиидиотипического антитела присутствуют те, в которых антитело конъюгировано с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но не ограничиваясь этим, А-цепьдифтерии, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктин, феномицин, эномицин и трихотецены.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
Среди иммуноконъюгатов антиидиотипического антитела также присутствуют те, у которых антиидиотипическое антитело конъюгировано с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Типичные радиоактивные изотопы включают At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu.
Конъюгаты антиидиотипического антитела и цитотоксического агента могут быть получены с использованием любого из ряда известных белковых связующих агентов, например линкеров (см. Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)), WO 94/11026. Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке, такого как кислоточувствительные линкеры, пептидазачувствительные линкеры, светочувствительные линкеры, диметиловые линкеры и дисульфидсодержащие линкеры (Chari et al., Cancer Res 52: 127-131 (1992); патент США №5208020).
3
14
32
35
123
125
131
99
123
Также предложены иммуноконъюгаты антиидиотипического антитела, содержащие антиидиотипическое антитело, присоединенное к метке, например к детектируемой метке, которая может генерировать детектируемый сигнал, прямо или косвенно. Эти иммуноконъюгаты антиидиотипических антител можно использовать для исследовательских или диагностических целей. Метка предпочтительно способна генерировать, прямо или косвенно, детектируемый сигнал. Например, метка может быть рентгеноконтрастной или радиоизотопной, такой как H, C, P, S, I, I, I; флуоресцентным (флуорофор) или хемилюминесцентным (хромофор) соединением, таким как изотиоцианат флуоресцеина, родамин или люциферин; фермент, такой как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза или пероксидаза хрена; агент визуализации; или ион металла. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например Tc или I, или спиновую метку для ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) (также известную как магнитно-резонансная томография, МРТ), такую как цирконий-89, йод -123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо. Цирконий-89 может образовывать комплекс с различными агентами, хелатирующими металлы, и конъюгирован с антителами, например, для получения PET-изображений (WO 2011/056983).
Примеры детектируемых меток включают, но не ограничиваются ими, радионуклеотиды, ферменты, коферменты, флуоресцеры, хемилюминесцеры, хромогены, ферментные субстраты или кофакторы, ингибиторы ферментов, комплексы простетических групп, свободные радикалы, частицы, красители и тому подобное. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетической группы включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин, кумарин, Alexa488, Oregon green 488, родамин зеленый, Alexa 532, Cy3, Bodipy 588/586, Alexa586, TAMRA, Rox, Alexa 594, Texas красный, Bodipy 630/650, Cy5, Alexa647, IR Dye 680, IR Dye 680, IR Dye 700 DX, Cy5.5, Alexa 750, IR Dye 800CW, IR Dye 800, Atto 532 и Atto 465.
В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат антиидиотипического антитела детектируется опосредованно. Например, вторичное антитело, которое специфично для иммуноконъюгата антиидиотипического антитела и содержит детектируемуюметку, может быть использовано для детектирования иммуноконъюгата антиидиотипического антитела.
Полиспецифичные антитела
В определенных вариантах осуществления антиидиотипические антитела являются полиспецифичными. Среди полиспецифичных связывающих молекул присутствуют полиспецифичные антитела, в том числе, например, биспецифичные. Полиспецифичные связывающие партнеры, например антитела, обладают специфичностями связывания, по меньшей мере для двух разных сайтов, которые могут находиться в одном и том же или в разных антигенах. В некоторых вариантах осуществления одна из специфичностей связывания относится к фрагменту антитела против CD19, а другая относится к другому антигену. В некоторых вариантах осуществления биспецифичные антитела могут связываться с двумя различными эпитопами фрагмента антитела против CD19. Биспецифичные антитела также можно использовать для локализации цитотоксических агентов в клетках, которые экспрессируют фрагмент антитела против CD19 на их поверхности, таких как анти-CD19 CAR T-клетки. Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. К биспецифичным антителам относятся полиспецифичные одноцепочечные антитела, например, диатела, триатела и тетратела, тандемные ди-scFv и тандемные три-scFv.
G. Варианты
В определенных вариантах осуществления антиидиотипические антитела включают одну или более аминокислотных вариаций, например замен, делеций, вставок и/или мутаций, по сравнению с последовательностью антиидиотипического антитела, описанной в настоящем документе. Типичные варианты включают варианты, предназначенные для улучшения аффинности связывания и/или других биологических свойств антиидиотипического антитела. Варианты аминокислотной последовательности антиидиотипического антитела можно получить путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антиидиотипическое антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антиидиотипического антитела. Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть осуществлена для достижения конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает целевыми характеристиками, например, связыванием антигена.
В определенных вариантах осуществления антиидиотипические антитела включают одну или более аминокислотных замен, например, по сравнению с последовательностью антиидиотипического антитела, описанной в настоящем документе. Сайты, представляющие интерес для заместительного мутагенеза, включают CDR и FR. Аминокислотные замены могут быть введены в интересующее антиидиотипическое антитело, и продукты будут подвергнуты скринингу на требуемую активность, например, сохраненное/улучшенное связывание антигена, пониженную иммуногенность, улучшенный период полужизни и/или улучшенную эффекторную функцию, такую как способность стимулирования антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности (CDC). В некоторых вариантах осуществления вариантное антиидиотипическое антитело демонстрирует сохраненное или улучшенное связывание с антителом-мишенью против CD19 или его фрагментом. Например, в некоторых вариантах осуществления вариантное антиидиотипическое антитело демонстрирует увеличение аффинности связывания с антителом-мишенью против CD19, по меньшей мере примерно на 10% (например, по меньшей мере примерно на любую величину из 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000% или более) по сравнению с немодифицированным антиидиотипическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления один или более остатков в CDR исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела) заменены. В некоторых вариантах осуществления замена выполняется для превращения последовательности или положения в последовательности в последовательность зародышевой линии, такой как последовательность антитела, обнаруженная в зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии), например, для уменьшения вероятности иммуногенности, например, после введения человеку.
В некоторых вариантах осуществления изменения вносятся в «горячие точки» CDR, остатки, кодируемые кодонами, которые подвергаются мутации с высокой частотой во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)) и/или остатки, которые связываются с антигеном, причем полученный вариант VH или VL тестируют на аффинность связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного выбора из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom et al. в Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых вариантах осуществления аффинного созревания разнообразие вводят в вариабельные гены, выбранные для созревания любым из множества способов (например, ПЦР пониженной точности, перетасовка цепей или олигонуклеотид-направленный мутагенез). Затем создается вторичная библиотека. Затем библиотеку подвергают скринингу для выявления любых вариантов антител с целевой аффинностью. Другой метод введения разнообразия включает CDR-направленные подходы, в которых несколько остатков CDR (например, 4-6 остатков за раз) рандомизированы. Остатки CDR, участвующие в связывании антигена, могут быть конкретно идентифицированы, например, с использованием сканирующего аланином мутагенеза или моделирования. CDR-H3 и CDR-L3, в частности, часто являются мишенями.
В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут происходить в одной или более CDR при условии, если такие изменения существенно не снижают способность антитела связываться с антигеном. Например, в CDR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, как предложено в настоящем документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут, например, быть вне антиген-связывающих остатков в CDR. В некоторых вариантах осуществления вариантов последовательностей VH или VL, представленных выше, каждая CDR либо не изменяется, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.
Вставки аминокислотной последовательности включают слияния амино- и/или карбоксиконцевых областей длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки внутри последовательности, состоящие из одного или более аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионина. Другие варианты вставок молекулы антитела включают слияние N- или C-конца антитела с ферментом или полипептидом, который увеличивает период полужизни антитела в сыворотке.
Модификации
В некоторых вариантах осуществления антитело изменяют для увеличения или уменьшения степени гликозилирования, например, путем удаления или вставки одного или более сайтов гликозилирования путем изменения аминокислотной последовательности и/или путем модификации присоединенного олигосахарида(ов) с сайтами гликозилирования, например, с использованием определенных клеточных линий.
Примерные модификации, варианты и клеточные линии описаны, например, в патентных публикациях США №2003/0157108, США 2004/0093621, США 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); Патентная заявка США No US 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4): 680-688 (2006); и WO 2003/085107); WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Патент США №6602684 (Umana et al.); и US 2005/0123546 (Umana et al.); WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).
Среди модифицированных антител имеются антитела, имеющие одну или более модификаций аминокислот в Fc-области, как например, антитела, имеющие последовательность Fc-области человека или другую часть константной области (например, Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более аминокислотных положениях.
Такие модификации могут быть сделаны, например, для улучшения периода полужизни, изменения связывания с одним или более типами Fc-рецепторов и/или изменения эффекторных функций.
Также среди вариантов присутствуют сконструированные антитела, содержащие цистеин, такие как «thioMAb», и другие варианты, сконструированные с использованием цистеина, в которых один или более остатков антитела заменены остатками цистеина с целью получения реакционноспособных тиоловых групп в доступных сайтах, например, для использования при конъюгации агентов и линкер-агентов для получения иммуноконъюгатов. Антитела, сконструированные с использованием цистеина, описаны, например, в патентах США №№7855275 и 7521541.
В некоторых вариантах осуществления антитела модифицированы, чтобы содержать дополнительные небелковые фрагменты, включая водорастворимые полимеры. Типичные полимеры включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль пропиональдегид может иметь преимущества при производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться, и если присоединено более одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем, количество и/или тип полимеров, используемых для модификации, может быть определено на основе соображений, включающих, но не ограничивающихся ими, конкретные свойства или функции антитела, подлежащего улучшению, независимо от того, будет ли производное антитела использоваться в терапии при определенных условиях и т.д.
II. Методы идентификации антиидиотипических антител
В некоторых вариантах осуществления предложен способ идентификации антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который специфически связывается с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом, например, с использованием гибридомных методов с иммуногеном, содержащим антитело-мишень или его фрагмент (см., например, Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975) и Sergeeva et al., Blood, 117 (16): 4262-4272). Иммуноген может содержать часть, повышающую иммуногенность, слитую с антителом-мишенью или фрагментом. Такая часть, повышающая иммуногенность, может обладать свойствами, которые включают, без ограничения, увеличение растворимости и времени полужизни иммуногена. Типичные фрагменты, повышающие иммуногенность, включают Fc-домены или их фрагменты. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, усиливающий иммуногенность, представляет собой Fc-домен (такой как IgG1, необязательно человеческий). В некоторых вариантах осуществления фрагмент, усиливающий иммуногенность, представляет собой Fc-домен (например, из IgG1, необязательно человека), в котором отсутствует целая или часть шарнирной области.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ идентификации антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который специфически связывается с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом, включающий: (а) введение пациенту растворимого иммуногена, содержащего антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени, слитый с частью, усиливающей иммуногенность; и (b) идентификацию антитела у пациента, которое специфически связывается с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий фрагмент находится внутри или включен в антиген-связывающий домен внеклеточной части химерного антигенного рецептора (CAR).
В некоторых вариантах осуществления фрагмент, усиливающий иммуногенность, представляет собой Fc-домен или его фрагмент, который необязательно представляет собой Fc человеческого IgG1. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, усиливающий иммуногенность, представляет собой Fc-домен, лишенный шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления фрагмент, усиливающий иммуногенность, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
В некоторых вариантах осуществления идентификация антитела включает использование гибридомных методов для идентификации отдельных клонов антител, продуцируемых пациентом, и скрининг клонов на связывание с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления идентификация антитела включает: (i) выделение B-клеток из селезенки пациента и слияние их с иммортализованными B-клетками для создания гибридом; (ii) скрининг гибридом на продуцирование антител, которые специфически связываются с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом или химерным антигенным рецептором, содержащим антиген-связывающий фрагмент; и (iii) секвенирование антитела из гибридомы, продуцирующей антитело, которое специфически связывается, идентифицируя тем самым антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления скрининг гибридомы включает определение аффинности связывания гибридомного антитела с молекулой-мишенью, содержащей антитело-мишень или идиотоп антитела-мишени, такое как scFv или CAR или их фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени или ее части, такую как одна или более CDR областей VH и/или VL. В некоторых вариантах осуществления скрининг гибридомы дополнительно включает определение аффинности связывания антитела гибридомы с молекулой, не являющейся мишенью, которая не содержит идиотоп антитела-мишени, такого как Fc или его фрагмент, или другое антитело или его фрагмент, которые не содержат вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени или их части, такие как одна или более CDR областей VH и/или VL, где связывание антитела гибридомы с молекулой-мишенью, но не с молекулой, не являющейся мишенью, указывает, что антитело гибридомы специфически связывается с антителом-мишенью.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления способ включает: (а) введение пациенту растворимого иммуногена, содержащего scFv антитела-мишени, слитого с Fc-доменом или его фрагментом; и (b) идентификацию антитела у пациента, которое специфически связывается с молекулой, содержащей идиотоп антитела-мишени, такого как иммуноген. В некоторых вариантах осуществления scFv находится внутри или включен в антиген-связывающий домен внеклеточной части химерного рецептора антигена (CAR). В некоторых вариантах осуществления Fc-домен или его фрагмент представляют собой Fc человеческого IgG1 или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен или его фрагмент представляют собой Fc-домен, в котором отсутствует шарнирная область. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен или его фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления идентификация антитела включает использование гибридомных методов для идентификации отдельных клонов антител, продуцируемых пациентом, и скрининг клонов антител на связывание с молекулой, содержащей идиотоп антитела-мишени, такого как иммуноген. В некоторых вариантах осуществления идентификация антитела включает: (i) выделение B-клеток из селезенки пациента и слияние их с иммортализованными B-клетками для генерирования гибридом; (ii) скрининг гибридом на продуцирование антител, которые специфически связываются с молекулой, содержащей идиотоп антитела-мишени, такого как иммуноген; и (iii) секвенирование антитела из гибридомы, продуцирующей антитело, которое специфически связывается с молекулой, содержащей идиотоп антитела-мишени, такого как иммуноген, идентифицируя тем самым антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления скрининг гибридомы включает определение аффинности связывания гибридомного антитела с молекулой-мишенью, содержащей антитело-мишень или идиотоп антитела-мишени, такое как scFv или CAR или их фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени или ее части, такую как одна или более CDR областей VH и/или VL. В некоторых вариантах осуществления скрининг гибридомы дополнительно включает определение аффинности связывания антитела гибридомы с молекулой, не являющейся мишенью, которая не содержит идиотоп антитела-мишени, такого как Fc или его фрагмент, или другое антитело или его фрагмент, который не содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени или их части, такие как одна или более CDR областей VH и/или VL, где связывание антитела гибридомы с молекулой-мишенью, но не с молекулой, не являющейся мишенью, указывает, что гибридомное антитело специфически связывается с антителом-мишенью.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления способ включает: (а) введение пациенту растворимого иммуногена, содержащего scFv антитела-мишени, слитого с Fc-доменом или его фрагментом; и (b) идентификацию антитела у пациента, которое (i) связывается с молекулой-мишенью, содержащей идиотоп антитела-мишени, такой как иммуноген, scFv, или CAR или его фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени или ее части, такую как одна или более CDR областей VH и/или VL; и (ii) не связывается с молекулой, не являющейся мишенью, которая не содержит идиотоп антитела-мишени, такого как Fc или его фрагмент, или другого антитела или его фрагмента, который не содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени или ее части, такие как одна или более CDR областей VH и/или VL. В некоторых вариантах осуществления scFv находится внутри или включен в антиген-связывающий домен внеклеточной части химерного антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления Fc-домен или его фрагмент представляет собой Fc человеческого IgG1 или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен или его фрагмент представляет собой Fc-домен, в котором отсутствует шарнирная область. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен или его фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления идентификация антитела включает использование гибридомных методов для идентификации отдельных клонов антител, продуцируемых пациентом, и скрининг клонов антител на связывание с молекулами-мишенями и молекулами, не являющимися мишенями. В некоторых вариантах осуществления идентификация антитела включает: (i) выделение B-клеток из селезенки пациента и слияние их с иммортализованными B-клетками для генерирования гибридом; (ii) скрининг гибридом на продуцирование антител, которые связываются с молекулой-мишенью, но не с молекулой, не являющейся мишенью; и (iii) секвенирование антитела из гибридомы, продуцирующего антитело, которое связывается с молекулой-мишенью, но не с молекулой, не являющейся мишенью, тем самым идентифицируя антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления скрининг гибридомы включает определение аффинности связывания антитела гибридомы с молекулой-мишенью и молекулой, не являющейся мишенью.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления способ включает: (а) введение пациенту растворимого иммуногена, содержащего scFv, полученного из антитела FMC63 (такого как scFv, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34), слитого с Fc-доменом или его фрагментом; и (b) идентификацию антитела у пациента, которое (i) связывается с молекулой-мишенью, содержащей идиотоп антитела FMC63, такой как иммуноген, scFv или CAR или его фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела FMC63 или их части, такие как одна или более CDR областей VH и/или VL; и (ii) не связывается с молекулой, не являющейся мишенью, которая не содержит идиотопа антитела FMC63, такого как Fc или его фрагмент, или другого антитела или его фрагмента, который не содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела FMC63 или ее части, такие как одна или более CDR областей VH и/или VL. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 32, необязательно разделенную линкером, например, представленным в SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления антитело, идентифицированное в (b), связывается с иммуногеном и не связывается ни с Fc-доменом или его фрагментом, ни с молекулой, содержащей scFv, полученный из антитела SJ25C1 (такой как scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления антитело, идентифицированное в (b), связывается с молекулой-мишенью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35, и не связывается ни с молекулой, не являющейся мишенью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, ни с молекулой, не являющейся мишенью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
В некоторых из любых таких вариантов осуществления способ включает: (а) введение пациенту растворимого иммуногена, содержащего scFv, полученный из антитела SJ25C1 (такого как scFv, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28), слитого с Fc-доменом или его фрагментом; и (b) идентификацию антитела у пациента, которое (i) связывается с молекулой-мишенью, содержащей идиотоп антитела SJ25C1, такой как иммуноген, scFv или CAR или его фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи антитела SJ25C1 или их части, такие как одна или более CDR областей VH и/или VL; и (ii) не связывается с молекулой, не являющейся мишенью, которая не содержит идиотоп антитела SJ25C1, такого как Fc или его фрагмент, или другого антитела или его фрагмента, который не содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела SJ25C1 или ее части, такие как одна или более CDR областей VH и/или VL. В некоторых вариантах осуществления иммуноген содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 32, необязательно разделенную линкером, например, представленным в SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления антитело, идентифицированное в (b), связывается с иммуногеном и не связывается ни с Fc-доменом или его фрагментом, ни с молекулой, содержащей scFv, полученный из антитела FMC63 (такой как scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34). В некоторых вариантах осуществления антитело, идентифицированное в (b), связывается с молекулой-мишенью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, и не связывается ни с молекулой, не являющейся мишенью, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, или нецелевая молекула, содержащая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В некоторых вариантах осуществления идентификация антитела включает использование гибридомных методов для идентификации отдельных клонов антител, продуцируемых пациентом, и скрининг клонов антител на связывание с молекулами-мишенями и молекулами, не являющимися мишенями. В некоторых вариантах осуществления идентификация антитела включает: (i) выделение B-клеток из селезенки пациента и слияние их с иммортализованными B-клетками для генерирования гибридом; (ii) скрининг гибридом на продуцирование антител, которые связываются с молекулой-мишенью, но не с молекулой, не являющейся мишенью; и (iii) секвенирование антитела из гибридомы, продуцирующей антитело, которое связывается с молекулой-мишенью, но не с молекулой, не являющейся мишенью, тем самым идентифицируя антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления скрининг гибридомы включает определение аффинности связывания антитела гибридомы с молекулой-мишенью и молекулой, не являющейся мишенью.
В типичном варианте осуществления идентификация антиидиотипических антител, распознающих часть scFv типичного анти-CD19 химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего scFv против CD19, полученный из SJ25C1, может быть осуществлена с использованием иммуногена, содержащего последовательность, представленную ниже:
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления иммуноген может дополнительно содержать Fc-домен или его фрагмент, например, представленный в SEQ ID NO: 32.
В типичном варианте осуществления идентификация антиидиотипических антител, распознающих часть scFv типичного анти-CD19 химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего scFv против CD19, полученный из FMC63, может быть осуществлена с использованием иммуногена, содержащего последовательность, представленную ниже:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 34).
В некоторых вариантах осуществления иммуноген может дополнительно содержать Fc-домен или его фрагмент, например, представленный в SEQ ID NO: 32. В типичном варианте осуществления идентификация антиидиотипических антител, распознающих часть scFv типичного анти-CD19 химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего scFv против CD19, полученный из FMC63, может быть осуществлена с использованием иммуногена, содержащего последовательность, представленную ниже:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSpcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgveVHnaktkpreeqynstyrvvsVLtVLhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppVLdsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 35).
III. Химерные антигенные рецепторы (CAR) и генетически сконструированные клетки
В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела специфически связываются с антиген-связывающей частью химерного антигенного рецептора (CAR), как например анти-CD19 CAR, содержащий антиген-связывающую часть, полученную из антител SJ25C1 или FMC63. В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела связываются с такими CAR, экспрессированными на клетках, таких как клетки, используемые в связи с адоптивной клеточной терапией. В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более нуклеиновых кислот, введенных посредством генной инженерии, и тем самым экспрессируют рекомбинантные или генетически сконструированные продукты CAR таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления химерные рецепторы, когда они генетически сконструированы в иммунных клетках, могут модулировать активность Т-клеток и, в некоторых случаях, могут модулировать дифференцировку или гомеостаз Т-клеток, тем самым приводя к получению генетически сконструированных клеток с улучшенной продолжительностью жизни, выживаемостью и/или устойчивостью in vivo, например, для использования в методах адоптивной клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела можно использовать в способах для модулирования одной или более из этих активностей, включая активацию, стимулирование и/или размножение сконструированных клеток, экспрессирующих целевой CAR.
В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более нуклеиновых кислот, введенных посредством генетической инженерии в соответствии с предложенными способами, и тем самым экспрессируют рекомбинантные или генетически сконструированные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, то есть обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, такие как полученные из другого организма или клетки, которые, например, обычно не детектируются в сконструированной клетке и/или организме, из которого получена такая клетка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не встречаются в природе, как например, нуклеиновая кислота, не обнаруженная в природе, включая такую, которая содержит химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из множества различных типов клеток. В конкретных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты содержат ген, который кодирует CAR.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы могут быть выполнены одновременно, последовательно или одновременно с одной или более стадий обработки для получения или приготовления генетически сконструированных клеток. Стадии обработки способов могут включать любую одну или более из множества стадий обработки клеток, по отдельности или в комбинации. В конкретных вариантах осуществления стадии обработки включают трансдукцию или трансфекцию клеток одной или более нуклеиновыми кислотами, например гетерологичным полинуклеотидом, содержащим ген, кодирующий рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируются частицами вирусного вектора, содержащими ретровирусный вектор, такой как тот, который кодирует рекомбинантный продукт для экспрессии в клетках. В некоторых вариантах осуществления клетки трансфецируют одной или более невирусными нуклеиновыми кислотами, например, эписомной плазмидой или транспозоном. Способы могут дополнительно и/или альтернативно включать другие стадии обработки, такие как стадии выделения, разделения, селекции, промывки, суспендирования, разбавления, концентрирования и/или приготовления клеток. В некоторых случаях способы также могут включать стадию ex vivo культивирования, стимулирования или экспансии клеток (например, стимулирования клеток, например, для индукции их пролиферации и/или активации), которые в некоторых случаях могут быть осуществлены в соответствии с предложенными методами. В некоторых вариантах осуществления способы включают выделение клеток у пациента, их подготовку, обработку, культивирование и/или конструирование и их повторное введение тому же пациенту до или после криоконсервации.
В некоторых вариантах осуществления способ включает стадии обработки, выполняемые в таком порядке: клетки, например, первичные клетки, сначала выделяют, например, селектируют или отделяют из биологического образца; селектированные клетки инкубируют с частицами вирусного вектора для трансдукции; и трансдуцированные клетки включают в композицию. В некоторых случаях трансдуцированные клетки активируют, наращивают или размножают ex vivo, например, путем стимулирования в присутствии стимулирующего реагента, например, в соответствии с предложенными способами. В некоторых вариантах осуществления способ может включать одну или более стадий обработки из числа промывки, суспендирования, разбавления и/или концентрирования клеток, которые могут происходить до, во время или одновременно или после одной или более из стадий выделения, как например, отделения или селекции, трансдукции, стимулирования и/или приготовления состава.
В конкретных вариантах осуществления клетки, подлежащие трансфекции или трансдукции, не выделяют, не селектируют или не обогащают до контакта с одной или более нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления клетки не селектируют до контакта клеток с одной или более нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления клетки, подлежащие трансфекции или трансдукции, не обогащают до контакта клеток с одной или более нуклеиновыми кислотами.
В некоторых вариантах осуществления одна или более из стадий обработки клеток в связи с получением, обработкой и/или инкубацией клеток в связи с предложенным способом, в том числе в связи с получением композиции, содержащей генетически сконструированные клетки, могут быть выполнены во внутренней полости центрифужной камеры, такой как по существу жесткая камера, которая обычно имеет цилиндрическую форму и может вращаться вокруг оси вращения, что может обеспечить определенные преимущества по сравнению с другими доступными способами. В некоторых вариантах осуществления все стадии обработки проводят в одной и той же центрифужной камере. В некоторых вариантах осуществления одну или более стадий обработки выполняют в разных центрифужных камерах, таких как несколько центрифужных камер одного типа. Такие способы включают любые из тех, которые описаны в международной публикации № WO 2016/073602.
Типичные центрифужные камеры включают камеры, производимые и продаваемые Biosafe SA, в том числе для использования с системами Sepax и Sepax 2, включая центрифужные камеры A-200/F и A-200 и различные наборы для использования с такими системами. Типичные камеры, системы, а также технологическое оборудование и шкафы описаны, например, в патенте США №6125555, патенте США №6733433 и опубликованной заявке на патент США, публикация №: US 2008/0171951, а также опубликованной международной патентной заявке, публикация № WO 00/38762, содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. В зависимости от конкретного процесса (например, разбавление, промывка, трансдукция, приготовление состава) квалифицированный специалист может выбрать конкретный набор, который подходит для процесса. Типичные наборы для использования с такими системами включают, но не ограничиваются ими, одноразовые наборы, продаваемые BioSafe SA в виде продуктов под названиями CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 или CS-900.2.
В некоторых вариантах осуществления система включена и/или помещена в ассоциацию с другими контрольно-измерительными приборами, включая контрольно-измерительные приборы для управления, автоматизации, контроля и/или мониторинга аспектов различных стадий обработки, выполняемых в системе. Эта аппаратура в некоторых вариантах осуществления содержится внутри шкафа. В некоторых вариантах осуществления измерительная аппаратура включает в себя шкаф, который включает в себя корпус, содержащий схему управления, центрифугу, крышку, двигатели, насосы, датчики, дисплеи и пользовательский интерфейс. Типичное устройство описано в патенте США №6125555, патенте США №6733433 и US 2008/0171951.
В некоторых вариантах осуществления система содержит ряд контейнеров, например пакеты, трубки, запорные краны, зажимы, соединители и центрифужные камеры. В некоторых вариантах осуществления контейнеры, такие как пакеты, включают один или более контейнеров, таких как пакеты, содержащие клетки, которые должны быть трансдуцированы или трансфецированы, и векторные частицы, например частицы вирусного вектора или невирусные плазмиды, в одном и том же контейнере или в отдельных контейнерах, таких как один пакет или отдельные пакеты. В некоторых вариантах осуществления система дополнительно включает один или более контейнеров, таких как пакеты, содержащие среду, такую как разбавитель и/или промывочный раствор, который втягивается в камеру, и/или другие компоненты для разбавления, ресуспендирования и/или промывки компонентов и/или композиций во время способов. Контейнеры могут быть соединены в одном или более положениях в системе, например в положении, соответствующем линии ввода, линии разбавителя, линии промывки, линии отвода и/или линии вывода.
В некоторых вариантах осуществления система, такая как закрытая система, является стерильной. В некоторых вариантах осуществления все соединения компонентов системы, например, между трубопроводом и контейнером через соединитель, выполняются в стерильных условиях. В некоторых вариантах осуществления соединения выполнены под ламинарным потоком. В некоторых вариантах осуществления соединения выполняют с использованием стерильного соединительного устройства, которое создает стерильные соединения, такие как стерильные сварные швы, между трубками и контейнером. В некоторых вариантах осуществления стерильное соединительное устройство осуществляет соединение в термических условиях, с достаточно высокой температурой для поддержания стерильности, такой как температура, по меньшей мере 200°С, например, по меньшей мере 260°С или 300°С.
В некоторых вариантах осуществления система может быть одноразовой, такой как набор одноразового использования. В некоторых вариантах осуществления одноразовый набор может использоваться во множестве циклов процесса или процессов, таких как, по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более раз, например, в процессах, которые происходят непрерывно или полунепрерывно. В некоторых вариантах осуществления система, такая как набор одноразового использования, используется для обработки клеток одного пациента. В аспектах способов процессы не обязательно должны выполняться в одной и той же закрытой системе, такой как одна центрифужная камера, но могут выполняться в другой закрытой системе, такой как другая центрифужная камера; в некоторых вариантах осуществления такие разные центрифужные камеры находятся в соответствующих точках в способах, размещенных в связи с одной и той же системой, таких как размещенные в связи с одной и той же центрифугой. В некоторых вариантах осуществления все стадии обработки выполняют в замкнутой системе, в которой все стадии или подгруппу каждой из одной или более стадий обработки выполняют в одной и той же или в другой центрифужной камере.
A. Целевые химерные антигенные рецепторы (CAR)
В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела специфически связываются с внеклеточным доменом целевого CAR, который содержит антиген-связывающий домен антитела или фрагмента антитела, который обеспечивает специфичность для целевого антигена (например, опухолевого антигена) и который функционально связан или соединен с внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий домен включает антитело SJ25C1 или фрагмент антитела части, полученной из SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий домен включает антитело FMC63 или фрагмент антитела части, полученной из FMC63. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен представляет собой активирующую часть внутриклеточного домена, такую как домен активации Т-клеток, обеспечивающий первичный сигнал активации. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит или дополнительно содержит костимулирующий сигнальный домен для облегчения эффекторных функций.
В некоторых вариантах осуществления предложены сконструированные клетки, такие как Т-клетки, которые экспрессируют CAR со специфичностью к конкретному антигену (или маркеру или лиганду), такому как антиген, экспрессируемый на поверхности определенного типа клеток. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления это углевод или другая молекула. В некоторых вариантах осуществления антиген избирательно экспрессируется или сверхэкспрессируется на клетках заболевания или состояния, например на опухолевых или патогенных клетках, по сравнению с нормальными или нецелевыми клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессируется на нормальных клетках и/или экспрессируется на сконструированных клетках.
В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как химерный рецептор, содержит внутриклеточную сигнальную область, которая включает цитоплазматический сигнальный домен (также взаимозаменяемо называемый внутриклеточный сигнальный домен), такой как цитоплазматическая (внутриклеточная) область, способная индуцировать сигнал первичной активации в Т-клетке, например, цитоплазматический сигнальный домен компонента Т-клеточного рецептора (TCR) (например, цитоплазматический сигнальный домен дзета-цепи цепи CD3-дзета (CD3ζ) или ее функциональный вариант или сигнальная часть), который содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM).
В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор дополнительно содержит внеклеточный лиганд-связывающий домен, который специфически связывается с лигандом (например, антигеном). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор представляет собой CAR, который содержит внеклеточный домен распознавания антигена, который специфически связывается с антигеном. В некоторых вариантах осуществления лиганд, такой как антиген, представляет собой белок, экспрессируемый на поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой TCR-подобный CAR, а антиген представляет собой процессированный пептидный антиген, такой как пептидный антиген внутриклеточного белка, который, подобно TCR, распознается на поверхности клетки в контексте молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC).
Типичные антигенные рецепторы, включая CAR, и способы конструирования и введения таких рецепторов в клетки включают те, которые описаны, например, в международных публикациях патентных заявок WO 200014257, WO 2013126726, WO 2012/129514, WO 2014031687, WO 2013/166321, WO 2013/071154, WO 2013/123061 заявке на патент США номер публикации US 2002131960, US 2013287748, US 20130149337, в патентах США №:6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118, и в заявке на европейский патент номер EP 2537416, и/или те, которые описаны Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. В некоторых аспектах антигенные рецепторы включают CAR, как описано в патенте США №7446190, и рецепторы, описанные в публикации международной патентной заявки № WO/2014055668 A1. Примеры CAR включают CAR, раскрытые в любой из вышеупомянутых публикаций, таких как WO 2014031687, патент США №8339645, патент США №7446179, US 2013/0149337, патент США №7446190, патент США №8389282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; и Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5 (177). См. также WO 2014031687, Патент США №8339645, Патент США №7446179, US 2013/0149337, Патент США №7446190 и Патент США №8389282.
В некоторых вариантах осуществления CAR конструируется со специфичностью к конкретному антигену (или маркеру или лиганду), такому как антиген, экспрессируемый в конкретном типе клеток, который подлежит воздействию адоптивной терапии, например онкомаркер и/или антиген, предназначенный для индуцирования ослабляющего ответа, такой как антиген, экспрессируемый на клетках нормального или здорового типа. Таким образом, CAR обычно включает в свою внеклеточную часть одну или более антиген-связывающих молекул, таких как один или более антиген-связывающих фрагментов, домен или часть, или один или более вариабельных доменов антител и/или молекул антител. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антиген-связывающую часть или части молекулы антитела, такие как одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), полученный из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела (mAb).
В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающая часть экспрессируется на клетках в виде части CAR. Как правило, CAR, содержащий антитело или антиген-связывающий фрагмент, который проявляет TCR-подобную специфичность, нацеленную против комплексов пептид-MHC, также может называться TCR-подобным CAR. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антиген-связывающий домен, специфичный для комплекса MHC-пептид TCR-подобного CAR, связан с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, в некоторых аспектах через линкеры и/или трансмембранный домен(ы). В некоторых вариантах осуществления такие молекулы обычно могут имитировать или аппроксимировать сигнал через рецептор природного антигена, такого как TCR, и, необязательно, сигнал через такой рецептор в сочетании с костимулирующим рецептором.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как химерный рецептор (например, CAR), включает лиганд-связывающий домен, который связывается, например, специфически связывается, с антигеном (или лигандом). Среди антигенов, на которые нацелены химерные рецепторы, есть антигены, экспрессируемые в контексте заболевания, состояния или типа клеток, которые подлежат направленному воздействию посредством адоптивной клеточной терапии. К числу заболеваний и состояний относятся пролиферативные, опухолевые и злокачественные заболевания и расстройства, включая онкологические заболевания и опухоли, включая гематологические онкологические заболевания, онкологические заболевания иммунной системы, такие как лимфомы, лейкозы и/или миеломы, такие как B, T и миелоидные лейкозы, лимфомы и множественные миеломы.
В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления это углевод или другая молекула. В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) избирательно экспрессируется или сверхэкспрессируется на клетках заболевания или состояния, например на опухолевых или патогенных клетках, по сравнению с нормальными или нецелевыми клетками или тканями. В других вариантах осуществления антиген экспрессируется на нормальных клетках и/или экспрессируется на сконструированных клетках.
В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело или антиген-связывающий фрагмент (например, scFv), который специфически распознает антиген, такой как интактный антиген, экспрессируемый на поверхности клетки.
В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой опухолевый антиген или онкомаркер. В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой интегрин αvβ6 (интегрин avb6), антиген созревания В-клеток (BCMA), B7-H6, карбоангидразу 9 (CA9, также известную как CAIX или G250), антиген рака яичка, антиген 1B рака/яичка (CTAG, также известный как NY-ESO-1 и LAGE-2), канцероэмбриональный антиген (CEA), циклин, циклин A2, C-C Мотив Хемокина Лиганд 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, белок фактора роста эпидермиса (EGFR), укороченный белок фактора роста эпидермиса (tEGFR), мутация рецептора эпидермального фактора роста типа III (EGFR vIII), эпителиальный гликопротеин 2 (EPG-2), эпителиальный гликопротеин 40 (EPG-40), эфрин B2, рецептор эфрина A2 (EPHa2), рецептор эстрогена, Fc-подобный рецептор 5 (FCRL5; также известный как гомолог Fc-рецептора 5 или FCRH5), фетальный ацетилхолиновый рецептор (фетальный AchR), фолатсвязывающий белок (FBP), фолатный рецептор альфа, фетальный ацетилхолиновый рецептор, ганглиозид GD2, O-ацетилированный GD2 (OGD2), ганглиозид GD3, гликопротеин 100 (gp100), Her2/neu (рецепторная тирозинкиназа erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), димеры erbB, антиген, ассоциированный с высокомолекулярной меланомой человека (HMW-MAA), поверхностный антиген гепатита B, человеческий лейкоцитарный антиген A1 (HLA-AI), человеческий лейкоцитарный антиген A2 (HLA-A2), рецептор IL-22 альфа (IL-22Ra), рецептор IL-13 альфа 2 (IL-13Ra2), рецептор киназного домена вставки (kdr), легкая цепь каппа, молекула адгезии клеток L1 (L1CAM), эпитоп CE7 L1-CAM, член А семейства, содержащего повтор, богатый лейцином (LRRC8A), Lewis Y, антиген, ассоциированный с меланомой (MAGE) -A1, MAGE -A3, MAGE-A6, мезотелин, c-Met, мышиный цитомегаловирус (CMV), муцин 1 (MUC1), MUC16, лиганды члена D группы 2 естественных киллеров (NKG2D), мелан A (MART-1), молекула адгезии нервных клеток (NCAM), онкофетальный антиген, преимущественно экспрессируемый антиген меланомы (PRAME), рецептор прогестерона, простат-специфический антиген, антиген стволовых клеток простаты (PSCA), простат-специфический мембранный антиген (PSMA), Орфанный рецептор 1, подобный рецептору тирозинкиназы (ROR1), сурвивин, гликопротеин трофобласта (TPBG, также известный как 5T4), гликопротеин 72, ассоциированный с опухолью (TAG72), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), рецептор 2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2), опухоль Вильмса 1 (WT-1), патоген-специфический антиген, антиген, связанный с универсальной меткой, и/или биотинилированные молекулы, и/или молекулы, экспрессируемые и/или характерные или специфичные для ВИЧ, HCV, HBV, HPV и/или другие патогены и/или их онкогенные варианты. Антигены, на которые нацелены рецепторы, в некоторых вариантах осуществления включают антигены, связанные со злокачественной опухолью В-клеток, такие как любой из ряда известных маркеров В-клеток. В некоторых вариантах осуществления антиген, на который нацелен рецептор, представляет собой CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b или CD30.
В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой патоген-специфический антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой вирусный антиген (такой как вирусный антиген из HIV, HCV, HBV и т. д.), бактериальные антигены и/или паразитарные антигены.
Антигены, на которые нацелены рецепторы, в некоторых вариантах осуществления включают в себя антигены, связанные со злокачественной опухолью В-клеток, такие как любой из ряда известных маркеров В-клеток. В некоторых вариантах осуществления антиген, на который нацелен рецептор, представляет собой CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b или CD30. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой CD19 и специфически связан антителом против CD19, таким как SJ25C1 или антиген-связывающий фрагмент, полученный из SJ25C1 или FMC63, или антиген-связывающий фрагмент, полученный из FMC63.
2
В некоторых вариантах осуществления антиген-связывающие белки, антитела и их антиген-связывающие фрагменты специфически распознают антиген полноразмерного антитела. В некоторых вариантах осуществления тяжелая и легкая цепи антитела могут быть полноразмерными или могут представлять собой антиген-связывающую часть (Fab, F(ab'), Fv или одноцепочечный фрагмент Fv (scFv)). В других вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела выбрана, например, из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE, в частности, выбрана, например, из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, более конкретно, IgG1 (например, человеческий IgG1). В другом варианте осуществления константная область легкой цепи антитела выбрана, например, из каппа или лямбда, в частности из каппа.
2
Среди представленных антител есть фрагменты антител. «Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'); димеры; линейные антитела; вариабельные области тяжелой цепи (VH), молекулы одноцепочечных антител, такие как scFvs и одиночные однодоменные антитела VH; и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. В конкретных вариантах осуществления антитела представляют собой одноцепочечные фрагменты антител, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, такие как scFv.
Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH или VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (FR) и три CDR. (См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания антиген-связывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывается с антигеном, путем скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело. В некоторых вариантах осуществления CAR включает домен тяжелой цепи антитела, который специфически связывается с антигеном, таким как онкомаркер или антиген клеточной поверхности клетки или заболевания, которые подлежат воздействию, таких как опухолевая клетка или злокачественная клетка, такие как любой из антигенов-мишеней, описанных в настоящем документе или известных в данной области.
Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продуцирование рекомбинантными клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой рекомбинантно продуцируемые фрагменты, такие как фрагменты, содержащие перестановки, которые не встречаются в природе, такие как фрагменты, содержащие две или более области антитела или цепи, соединенные синтетическими линкерами, например пептидными линкерами, и/или которые не могут быть получены путем ферментативного расщепления природного интактного антитела. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антител представляют собой scFv.
«Гуманизированное» антитело представляет собой антитело, в котором все или по существу все аминокислотные остатки CDR получены из CDR, не являющихся человеческими, а все или по существу все аминокислотные остатки каркасных FR получены из человеческих FR. Гуманизированное антитело необязательно может включать, по меньшей мере часть константной области антитела, полученной из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, не являющегося человеческим, относится к варианту антитела, не являющегося человеческим, которое было подвергнуто гуманизации обычно для снижения иммуногенности для людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим, (например, антитела, из которого получены остатки CDR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.
Химерные рецепторы, такие как CAR, обычно включают внеклеточный антиген-связывающий домен, такой как часть молекулы антитела (например, SJ25C1 или FMC63), как правило, вариабельная область тяжелой (VH) цепи и/или вариабельная область легкой (VL) цепи антитела, например фрагмент антитела scFv.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент антитела. В некоторых аспектах химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент включает scFv. В некоторых вариантах осуществления scFv получен из SJ25C1 и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления scFv получен из FMC63 и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как CAR, такой как его часть антитела, дополнительно включает спейсер, который может представлять собой или включать, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина или ее вариант или модифицированную версию, такую как шарнирная область например, шарнирная область IgG4 и/или область CH1/CL и/или Fc-область. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть представляет собой человеческий IgG, такой как IgG4 или IgG1. В некоторых аспектах часть константной области служит в качестве спейсерной области между антиген-распознающим компонентом, например scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может иметь длину, которая обеспечивает повышенную чувствительность клетки после связывания антигена по сравнению с отсутствием спейсера. В некоторых примерах спейсер имеет длину равную или примерно 12 аминокислот или не более чем 12 аминокислот. Типичные спейсеры включают те, которые имеют, по меньшей мере примерно от 10 до 229 аминокислот, примерно от 10 до 200 аминокислот, примерно от 10 до 175 аминокислот, примерно от 10 до 150 аминокислот, примерно от 10 до 125 аминокислот, примерно от 10 до 100 аминокислот, примерно от 10 до 75 аминокислот, примерно от 10 до 50 аминокислот, примерно от 10 до 40 аминокислот, примерно от 10 до 30 аминокислот, примерно от 10 до 20 аминокислот или примерно от 10 до 15 аминокислот, и включая любое целое число между конечными точками любого из перечисленных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит примерно 12 аминокислот или менее, примерно 119 аминокислот или менее или примерно 229 аминокислот или менее. Типичные спейсеры включают только шарнир IgG4, шарнир IgG4, связанный с доменами СН2 и СН3, или шарнир IgG4, связанный с доменом СН3. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность SEQ ID NO: 150, и кодируется последовательностью SEQ ID NO: 151. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность SEQ ID NO: 152. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность SEQ ID NO: 153. Типичные спейсеры включают, но не ограничиваются ими, те, что описаны в Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, в международной публикация патентной заявки № WO 2014031687, в патенте США №8822647 или в опубликованной заявке № US 2014/0271635.
В некоторых вариантах осуществления константная область или часть относится к IgD. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность SEQ ID NO: 154. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 4 и 5.
В некоторых вариантах осуществления антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен, связанный прямо или косвенно с внеклеточным доменом. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает трансмембранный домен, связывающий внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен слит с внеклеточным доменом. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит ITAM. Например, в некоторых аспектах домен распознавания антигена (например, внеклеточный домен) обычно связан с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, такими как сигнальные компоненты, которые имитируют активацию через антигенный рецепторный комплекс, такой как комплекс TCR, в случае CAR, и/или сигнал через другой рецептор клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит трансмембранный домен, связанный или слитый между внеклеточным доменом (например, scFv) и внутриклеточным сигнальным доменом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиген-связывающий компонент (например, антитело) связан с одним или более трансмембранными и внутриклеточными сигнальными доменами.
В одном варианте осуществления используется трансмембранный домен, который естественным образом связан с одним из доменов в рецепторе, например, CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен селектируют или модифицируют аминокислотной заменой, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одного и того же или разных мембранных поверхностных белков, чтобы минимизировать взаимодействия с другими членами рецепторного комплекса.
Трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления имеет происхождение из природного или синтетического источника. Если источник является природным, домен в некоторых аспектах получают из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают области, полученные из (то есть включают, по меньшей мере трансмембранную область(и)) альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154. Альтернативно, трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления является синтетическим. В некоторых аспектах синтетический трансмембранный домен содержит преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах триплет фенилаланина, триптофана и валина будет обнаружен на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления связь осуществляется линкерами, спейсерами и/или трансмембранным доменом(ами). В некоторых аспектах трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28.
В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный домен могут быть связаны прямо или косвенно. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный связаны спейсером, таким как любой описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внеклеточную часть молекулы, из которой получают трансмембранный домен, такую как внеклеточная часть CD28.
К внутриклеточным сигнальным доменам относятся те, которые имитируют или аппроксимируют сигнал через рецептор природного антигена, сигнал через такой рецептор в сочетании с костимулирующим рецептором и/или сигнал только через один костимуляторный рецептор. В некоторых вариантах осуществления присутствует короткий олиго- или полипептидный линкер, например линкер длиной от 2 до 10 аминокислот, такой как линкер, содержащий глицины и серины, например глицин-сериновый дублет, и образует связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR.
Т-клеточная активация в некоторых аспектах описывается как опосредуемая двумя классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и теми, которые действуют антиген-независимым образом, чтобы обеспечить вторичный или костимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах CAR включает один или оба из таких компонентов сигнализации.
Рецептор, например, CAR, обычно включает, по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный компонент или компоненты. В некоторых аспектах CAR включает первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, известные как иммунорецепторные мотивы активации на основе тирозина или ITAM. Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают в себя последовательности, происходящие из дзета-цепи CD3, FcR-гамма, CD3-гамма, CD3-дельта и CD3-эпсилон. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(молекулы) в CAR содержит цитоплазматический сигнальный домен, его часть или последовательность, происходящую из CD3-дзета.
В некоторых вариантах осуществления рецептор включает внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как цепь CD3 TCR, которая обеспечивает активацию Т-клеток и цитотоксичность, например, дзета-цепь CD3. Таким образом, в некоторых аспектах антиген-связывающая часть связана с одним или более клеточными сигнальными модулями. В некоторых вариантах осуществления клеточные сигнальные модули включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или другие трансмембранные домены CD. В некоторых вариантах осуществления рецептор, например CAR, дополнительно включает часть одной или более дополнительных молекул, таких как Fc-рецептор γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в некоторых аспектах CAR или другой химерный рецептор включает химерную молекулу, образованную между CD3-дзета (CD3-ζ) или Fc-рецептором γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.
В некоторых вариантах осуществления после лигирования CAR или другого химерного рецептора цитоплазматический домен или внутриклеточный сигнальный домен рецептора активирует, по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или ответов иммунной клетки, например, T-клетки, сконструированной для экспрессии CAR. Например, в некоторых контекстах CAR индуцирует функцию T-клетки, такую как цитолитическая активность или активность T-хелпера, такую как секреция цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления вместо интактной иммуностимулирующей цепи используют укороченную часть внутриклеточного сигнального домена антигенного рецепторного компонента или костимулирующей молекулы, например, если она передает сигнал эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или домены включают цитоплазматические последовательности рецептора Т-клеток (TCR), а в некоторых аспектах также последовательности корецепторов, которые в естественном контексте действуют совместно с такими рецепторами, инициируя трансдукцию сигнала после взаимодействия с антигенным рецептором, и/или любое производное или вариант таких молекул, и/или любую синтетическую последовательность, которая обладает такой же функциональной способностью.
В контексте естественного TCR для полной активации обычно требуется не только передача сигналов через TCR, но и костимулирующий сигнал. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, чтобы способствовать полной активации, компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала также включен в CAR. В других вариантах осуществления CAR не включает в себя компонент для генерации костимулирующего сигнала. В некоторых аспектах дополнительный CAR экспрессируется в той же клетке и обеспечивает компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала.
Т-клеточная активация в некоторых аспектах описывается как опосредуемая двумя классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и теми, которые действуют антиген-независимым образом, чтобы обеспечить вторичный или костимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах CAR включает один или оба из таких компонентов сигнализации.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления CAR включает сигнальный домен и/или трансмембранную часть костимулирующего рецептора, такого как CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 и ICOS. В некоторых аспектах один и тот же CAR включает как активирующий, так и костимулирующий компоненты. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен, полученный из костимулирующей молекулы Т-клеток или ее функционального варианта, например между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых аспектах костимулирующей молекулой Т-клеток является CD28 или 41BB.
В некоторых вариантах осуществления активирующий домен включен в один CAR, тогда как костимуляторный компонент обеспечивается другим CAR, распознающим другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включают активирующие или стимулирующие CAR, костимулирующие CAR, причем и те и другие экспрессируются в одной и той же клетке (см. WO 2014/055668). В некоторых аспектах клетки включают один или более стимулирующих или активирующих CAR и/или костимулирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно включают ингибирующие CAR (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013), такие как CAR, распознающие антиген, отличный от антигена, ассоциированного и/или специфичного для заболевания или состояния, посредством чего активирующий сигнал, доставляемый через CAR, нацеленный на заболевание, уменьшается или ингибируется связыванием ингибирующего CAR с его лигандом, например, для уменьшения нецелевых эффектов.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит трансмембранный CD28 и сигнальный домен, связанный с внутриклеточным доменом CD3 (например, CD3-дзета). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит химерные CD28 и CD137 (4-1BB, TNFRSF9) костимулирующие домены, связанные с внутриклеточным доменом CD3-дзета.
В некоторых вариантах осуществления CAR включает один или более, например, два или более костимулирующих домена и домен активации, например, первичный домен активации, в цитоплазматической части. Типичные CAR включают внутриклеточные компоненты CD3-дзета, CD28 и 4-1BB.
В некоторых вариантах осуществления антигенный рецептор дополнительно включает маркер и/или CAR-экспрессирующие клетки, или другой антигенный рецептор дополнительно включает суррогатный маркер, такой как маркер клеточной поверхности, который можно использовать для подтверждения трансдукции или конструкции клетки для экспрессии рецептора. В некоторых аспектах маркер включает полностью или частично (например, укороченную форму) CD34, NGFR или рецептор эпидермального фактора роста, такой как укороченная версия такого рецептора клеточной поверхности (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим последовательность линкера, такую как последовательность расщепляемого линкера, например, T2A. Например, маркер и, необязательно, линкерная последовательность могут быть любыми, как описано в опубликованной патентной заявке № WO 2014031687. Например, маркер может представлять собой укороченный EGFR (tEGFR), который, необязательно, связан с последовательностью линкера, такой как последовательность расщепляемого линкера T2A. В вариантах осуществления tEGFR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 155 или 156. В некоторых вариантах осуществления tEGFR содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности, равную или примерно равную 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более 99% с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 155 или 156.
В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой молекулу, например белок клеточной поверхности, который не обнаружен в природе в Т-клетках или не обнаружен в естественных условиях на поверхности Т-клеток, или его часть. В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой чужеродную молекулу, например, чужеродный белок, то есть тот, который не распознается как «свой» иммунной системой хозяина, в которую клетки будут адоптивно перенесены.
В некоторых вариантах осуществления маркер не выполняет терапевтической функции и/или не производит никакого эффекта, кроме как для использования в качестве маркера для генетического конструирования, например, для селекции успешно сконструированных клеток. В других вариантах осуществления маркером может быть терапевтическая молекула или молекула, иным образом оказывающая некоторый целевой эффект, как например, лиганд для клетки, встречающийся in vivo, такой как костимулирующая или иммунная контрольная молекула, для усиления и/или ослабления ответов клеток после адоптивного переноса и встречи с лигандом.
В некоторых случаях CAR относятся к CAR первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах CAR первого поколения представляет собой тот, который обеспечивает только индуцированный CD3-цепью сигнал при связывании антигена; в некоторых аспектах CAR второго поколения представляют собой такой, который обеспечивает такой сигнал и костимулирующий сигнал, например, такой, который включает внутриклеточный сигнальный домен от костимулирующего рецептора, такого как CD28 или CD137; в некоторых аспектах CAR третьего поколения представляет собой тот, который включает в себя множество костимулирующих доменов различных костимулирующих рецепторов.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент, описанные в настоящем документе. В некоторых аспектах химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент, описанные в настоящем документе, и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент включают scFv или однодоменное VH-антитело, а внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых аспектах внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен дзета-цепи CD3-дзета (CD3ζ) цепи. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает трансмембранный домен, расположенный между внеклеточным доменом и внутриклеточной сигнальной областью.
В некоторых аспектах трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28. Внеклеточный домен и трансмембранный могут быть связаны прямо или косвенно. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный связаны спейсером, таким как любой описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы Т-клеток, такой как между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых аспектах костимулирующей молекулой Т-клеток является CD28 или 4-1BB.
Например, в некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например фрагмент антитела, трансмембранный домен, который является или содержит трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть CD28 или ее функциональный вариант и сигнальную часть CD3-дзета или ее функциональный вариант. Например, в некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например фрагмент антитела, трансмембранный домен, который является или содержит трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть 4-1BB или ее функциональный вариант и сигнальную часть CD3-дзета или ее функциональный вариант. В некоторых таких вариантах осуществления рецептор дополнительно включает спейсер, содержащий часть молекулы Ig, такой как молекула Ig человека, как например, шарнир Ig, например шарнир IgG4, такой как спейсер, содержащий только шарнир.
В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен рецептора, например, CAR, представляет собой трансмембранный домен человеческого CD28 или его вариант, например, трансмембранный домен из 27 аминокислот человеческого CD28 (номер доступа: P10747.1), или представляет собой трансмембранный домен, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157, или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 157; в некоторых вариантах осуществления изобретения часть рекомбинантного рецептора, содержащая трансмембранный домен, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 158, или аминокислотную последовательность, имеющую с ней, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности.
В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы Т-клеток. В некоторых аспектах костимулирующая молекула Т-клеток представляет собой CD28 или 4-1BB.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен CD28 человека или его функциональный вариант или часть, такую как его 41-аминокислотный домен и/или такой домен с заменой LL-GG в положениях 186-187 нативного белка CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159 или 160, или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 159 или 160. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная область содержит внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен 4-1BB или его функциональный вариант или часть, такую как цитоплазматический домен из 42 аминокислот 4-1BB человека (номер доступа Q07011.1) или функциональный вариант или его часть, такие как аминокислотную последовательность, представленная в SEQ ID NO: 161, или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 161.
В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит CD3-цепь человека, необязательно стимулирующий сигнальный домен CD3-дзета или его функциональный вариант, такой как цитоплазматический домен 112 AA изоформы 3 CD3ζ человека (номер доступа: P20963.2) или сигнальный домен CD3-дзета, как описано в патенте США №7446190 или патенте США №8911993. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 162, 163 или 164, или аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 162, 163 или 164.
В некоторых аспектах спейсер содержит только шарнирную область IgG, такую как только шарнир IgG4 или IgG1, такой как только шарнирный спейсер, представленный в SEQ ID NO: 150. В других вариантах осуществления спейсер представляет собой, например, шарнир Ig, и шарнир IgG4, связанный с доменами СН2 и/или СН3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например шарнир IgG4, связанный с доменами СН2 и СН3, такой как представленный в SEQ ID NO: 152. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например шарнир IgG4, связанный только с доменом СН3, такой как представленные в SEQ ID NO: 153. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит последовательность, богатую глицином-серином, или другой гибкий линкер, такой как известные гибкие линкеры.
Например, в некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело, такое как фрагмент антитела, включающий scFv, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одна или более константных областей молекулы тяжелой цепи, такая как спейсер, содержащий Ig-шарнир, трансмембранный домен, содержащий весь или часть трансмембранного домена, полученного из CD28, внутриклеточный сигнальный домен, полученный из CD28, и сигнальный домен CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело или его фрагмент, такой как scFv, спейсер, такой как любой из спейсеров, содержащих Ig-шарнир, трансмембранный домен, полученный из CD28, внутриклеточный сигнальный домен, полученный из 4-1BB, и сигнальный домен, полученный из CD3-дзета.
В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие конструкции CAR, дополнительно включают последовательность, кодирующую элемент пропуска рибосом T2A и/или последовательность tEGFR, например, ниже последовательности, кодирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления T-клетки, экспрессирующие антигенный рецептор (например, CAR), также могут быть получены для экспрессии укороченного EGFR (EGFRt) в качестве неиммуногенного селективного эпитопа (например, путем введения конструкции, кодирующей CAR и EGFRt, разделенных рибосомным переключателем T2A для экспрессии двух белков из одной и той же конструкции), которые затем можно использовать в качестве маркера для детектирования таких клеток (см., например, патент США №8802374). В некоторых вариантах осуществления один промотор может направлять экспрессию РНК, которая содержит в одной открытой рамке считывания (ORF) два или три гена (например, кодирующих молекулу, участвующую в модулировании метаболического пути, и кодирующих рекомбинантный рецептор), отделенных друг от друга последовательностями, кодирующими саморасщепляемый пептид (например, последовательности 2А) или сайт узнавания протеазы (например, фурин). Таким образом, ORF кодирует один полипептид, который либо во время трансляции (в случае 2А), либо после трансляции превращается в отдельные белки. В некоторых случаях пептид, такой как T2A, может заставить рибосому пропускать (пропуск рибосомы) синтез пептидной связи на C-конце элемента 2A, приводя к разделению между концом последовательности 2A и следующим пептидом, расположенным далее (см., например, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) and deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Многие элементы 2А известны в данной области. Примеры последовательностей 2А, которые можно использовать в способах и нуклеиновых кислотах, раскрытых в настоящем документе, без ограничения, включают последовательности 2А из вируса ящура (F2A, например, SEQ ID NO: 131), вируса лошадиного ринита A (E2A, например, SEQ ID NO: 130), вируса Thosea asigna (T2A, например, SEQ ID NO: 126 или 127) и свиного тешовируса-1 (P2A, например, SEQ ID NO: 128 или 129), как описано в публикации патента США. №20070116690.
Рекомбинантные рецепторы, такие как CAR, экспрессируемые клетками, вводимыми пациенту, обычно распознают или специфически связываются с молекулой, которая экспрессируется, ассоциируется и/или специфична для заболевания или состояния или его клеток, подлежащих лечению. При специфическом связывании с молекулой, например антигеном, рецептор обычно доставляет иммуностимулирующий сигнал, такой как ITAM-трансдуцироавнный сигнал, в клетку, тем самым стимулируя иммунный ответ, направленный на заболевание или состояние. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки экспрессируют CAR, который специфически связывается с антигеном, экспрессируемым клеткой или тканью заболевания или состояния или ассоциирован с заболеванием или состоянием. Рецептор может быть другим рецептором, таким как иммуноингибирующий или костимулирующий рецептор, стимулирующий сигнал, такой как CCR или iCAR, или не сигнальный рецептор, например, для использования при истощении или элиминации клеток с использованием антител.
B. Генетически сконструированные клетки и способы получения клеток
Среди клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы, имеются сконструированные клетки. Генетическое конструирование обычно включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный или сконструированный компонент, в композицию, содержащую клетки, например, путем ретровирусной трансдукции, трансфекции или трансформации. Различные способы введения генетически сконструированных компонентов, например рекомбинантных рецепторов, например, CAR, хорошо известны и могут быть использованы. Типичные способы включают способы переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, в том числе посредством вирусный, например, ретровирусный или лентивирусный перенос, трансдукцию, транспозоны и электропорацию.
1. Векторы и методы генной инженерии
Также предложены один или более полинуклеотидов (например, молекул нуклеиновой кислоты), кодирующих химерные антигенные рецепторы (CAR), векторы для генетически сконструированных клеток для экспрессии таких CAR и способы получения сконструированных клеток. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR. В некоторых случаях вектор представляет собой вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор, например, лентивирусный вектор или гамма-ретровирусный вектор.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносятся в клетки с использованием рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, таких как, например, векторы, полученные из обезьяньего вируса 40 (SV40), аденовирусы, аденоассоциированный вирус (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносятся в Т-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557.
В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор имеет длинную концевую повторяющуюся последовательность (LTR), например, ретровирусный вектор, полученный из вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса мышиных эмбриональных стволовых клеток (MESV), мышиного вируса стволовых клеток (MSCV), вирус некроза селезенки (SFFV), или аденоассоциированного вируса (AAV). Большинство ретровирусных векторов получают из мышиных ретровирусов. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают те, которые получены из любого источника клеток птиц или млекопитающих. Ретровирусы, как правило, являются амфотропными, что означает, что они способны инфицировать клетки-хозяева нескольких видов, включая людей. В одном варианте осуществления экспрессируемый ген заменяет ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Был описан ряд иллюстративных ретровирусных систем (например, патенты США №5219740; 6207453; 5219740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990; Miller, AD (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.
Известны методы лентивирусной трансдукции. Типичные способы описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101: 1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102 (2): 497-505.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносятся в Т-клетки посредством электропорации (см., например, Chicaybam et al., (2013) PLoS ONE 8 (3): e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7 (16): 1431-1437). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносятся в Т-клетки посредством транспозиции (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Другие способы введения и экспрессии генетического материала в иммунных клетках включают трансфекцию фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. NY), слияние протопластов, катионную опосредованную липосомами трансфекцию; бомбардировку микрочастицами частиц вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и копреципитацию ДНК с фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
Другими подходами и векторами для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, являются те, которые описаны, например, в международной заявке на патент, публикация №: WO 2014055668, и в патенте США №7446190.
В некоторых вариантах осуществления клетки, например, Т-клетки, могут быть трансфецированы либо во время, либо после наращивания, например, Т-клеточным рецептором (TCR) или химерным антигенным рецептором (CAR). Эта трансфекция для введения гена целевого рецептора может быть осуществлена, например, с использованием любого подходящего ретровирусного вектором. Затем генетически модифицированная клеточная популяция может быть выделена от исходного стимула (например, стимул антитела против CD3/CD28) и впоследствии может стимулироваться стимулом второго типа, например, через введенный рецептор de novo). Этот второй тип стимула может включать антигенный стимул в форме молекулы пептид/МНС, родственного (перекрестно связывающего) лиганда генетически введенного рецептора (например, естественного лиганд CAR) или любого лиганда (такого как антитело), который непосредственно связывается внутри каркаса рецептора (например, путем распознавания константных областей внутри рецептора). См., например, Cheadle et al, «Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy» Methods Mol Biol. 2012; 907: 645-66 or Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014). В некоторых вариантах осуществления клетки стимулируют предложенным антиидиотипическим антителом в соответствии с предложенными способами.
В некоторых случаях может использоваться вектор, который не требует активации клеток, например, Т-клеток. В некоторых таких случаях клетки могут быть селектированы и/или трансдуцированы до активации. Таким образом, клетки могут быть сконструированы до или после культивирования клеток, а в некоторых случаях одновременно или во время, по меньшей мере части процесса культивирования.
Среди дополнительных нуклеиновых кислот, например, присутствуют гены для введения, это гены, которые повышают эффективность терапии, например, путем стимулирования жизнеспособности и/или функции перенесенных клеток; гены для обеспечения генетического маркера для селекции и/или оценки клеток, например, для оценки выживаемости или локализации in vivo; гены для повышения безопасности, например, делающие клетку восприимчивой к отрицательной селекции in vivo, как описано в публикациях Lupton SD et al., Mol. и Cell Biol., 11: 6 (1991); и Riddell et al. Human Human Therapy 3: 319-338 (1992); см. также публикации PCT/US 91/08442 и PCT/US 94/05601 Lupton et al., описывающих использования бифункциональных селектируемых слитых генов, полученных в результате слияния доминантного положительного маркера селекции с отрицательным маркером селекции. См., например, Riddell et al., Патент США №6040177, в столбцах 14-17.
2. Клетки и подготовка клеток для генетического конструирования
В настоящем описании предложены клетки, включая сконструированные клетки, которые содержат химерный антигенный рецептор (CAR). Также предложены популяции таких клеток и композиции, содержащие такие клетки. Среди композиций присутствуют вводимые композиции, содержащие клетки, в которых, как известно или как вероятно, одна или более клеток будут экспрессировать рекомбинантный рецептор, способный распознаваться или связываться связывающей молекулой, присутствующей на одной или более частицах, с которыми клетки инкубируются или контактируют. Также среди композиций присутствуют композиции, полученные с помощью предложенных способов, включая итоговые композиции, в которых содержатся стимулированные или нарощенные клетки, включая композиции, обогащенные клетками, содержащими рекомбинантный рецептор, связанный или распознаваемый связывающей молекулой частицы, такими как клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, например химерный рецептор, составляет, по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более процентов от общего числа клеток в композиции или клеток определенного типа, таких как Т-клетки или CD8+ или CD4+ клетки. Таким образом, предложены генетически сконструированные клетки, экспрессирующие рекомбинантные рецепторы, например, CAR.
Среди композиций присутствуют фармацевтические композиции и составы для введения, например для адоптивной клеточной терапии. Также предложены способы конструирования, производства или генерирования таких клеток, терапевтические способы введения клеток и композиций индивидуумам, например пациентам, и способы обнаружения, выбора, выделения или разделения таких клеток.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, то есть обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, такие как полученные из другого организма или клетки, которые, например, обычно не детектируются в сконструированной клетке и/или организме, из которого получена такая клетка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не встречаются в природе, как например, нуклеиновая кислота, не обнаруженная в природе, включая такую, которая содержит химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из множества различных типов клеток.
Клетки, как правило, представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, и, как правило, представляют собой клетки человека. В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов, представляют собой клетки иммунной системы, такие как клетки врожденного или адаптивного иммунитета, например миелоидные или лимфоидные клетки, включая лимфоциты, обычно Т-клетки и/или NK-клетки. Другие типичные клетки включают стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, в том числе индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC).
Клетки, как правило, представляют собой первичные клетки, такие как клетки, выделенные непосредственно из тканей пациента и/или выделенные из тканей пациента и замороженные. В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более подгрупп Т-клеток или других типов клеток, таких как целые популяции Т-клеток, клетки CD4+, клетки CD8+ и их субпопуляции, такие как те, которые определяются функцией, состоянием активации, зрелостью, потенциалом для способности дифференцировки, размножения, рециркуляции, локализации и/или персистенции, антигенспецифичности, типа антигенного рецептора, присутствия в конкретном органе или компартменте, профиля секреции маркера или цитокина и/или степени дифференцировки. Применительно к подлежащему лечению пациенту клетки могут быть аллогенными и/или аутологичными. В число методов входят готовые методы. В некоторых аспектах, таких как для готовых технологий, клетки являются плюрипотентными и/или мультипотентными, такими как стволовые клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). В некоторых вариантах осуществления способы включают выделение клеток у пациента, их подготовку, обработку, культивирование и/или конструирование и повторное введение их тому же пациенту до или после криоконсервации.
Среди подтипов и субпопуляций T-клеток и/или CD4+ и/или CD8+ T-клеток присутствуют наивные T-клетки (TN), эффекторные T-клетки (TEFF), T-клетки памяти и их подтипы, такие как стволовые Т-клетки памяти (TSCM), Т-клетки центральной памяти (TCM), Т-клетки эффекторной памяти (TEM) или терминально дифференцированные эффекторные T-клетки памяти, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), незрелые T-клетки, зрелые T-клетки, вспомогательные T-клетки, цитотоксический T клетки, слизисто-ассоциированные инвариантные Т-клетки (MAIT), природные и адаптивные регуляторные Т-клетки (Treg), хелперные Т-клетки, такие как клетки TH1, клетки TH2, клетки TH3, клетки TH17, клетки TH9, клетки TH22, фолликулярные хелперные T-клетки, альфа/бета Т-клетки и дельта/гамма Т-клетки.
В некоторых вариантах осуществления клетки являются натуральными киллерами (NK). В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой моноциты или гранулоциты, например миелоидные клетки, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и/или базофилы.
В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более нуклеиновых кислот, введенных посредством генной инженерии, и тем самым экспрессируя рекомбинантные или генетически сконструированные продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гетерологичными, то есть обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, такие как полученные из другого организма или клетки, которые, например, обычно не детектируются в сконструированной клетке и/или организме, из которого получена такая клетка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не встречаются в природе, как например, нуклеиновая кислота, не обнаруженная в природе, включая такую, которая содержит химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из множества различных типов клеток.
В некоторых вариантах осуществления получение сконструированных клеток включает одну или более стадий культивирования и/или приготовления. Клетки для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансгенный рецептор, такой как CAR, могут быть выделены из образца, такого как биологический образец, например, полученный от пациента или имеющие происхождение из него. В некоторых вариантах осуществления пациент, из которого выделена клетка, является пациентом, страдающим заболеванием или состоянием или нуждающимся в клеточной терапии, или которому будет назначена клеточная терапия. Пациентом в некоторых вариантах осуществления является человек, нуждающийся в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, обрабатывают и/или конструируют.
Соответственно, клетки в некоторых вариантах осуществления являются первичными клетками, например первичными клетками человека. Образцы включают ткани, жидкости и другие образцы, взятые непосредственно у пациента, а также образцы, полученные в результате одной или более стадий обработки, таких как разделение, центрифугирование, генетическое конструирование (например, трансдукция с вирусным вектором), промывание и/или инкубация. Биологический образец может быть образцом, полученным непосредственно из биологического источника, или образцом, который обрабатывается. Биологические образцы включают, но не ограничиваются ими, жидкости организма, такие как кровь, плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов, включая обработанные образцы, полученные из них.
В некоторых аспектах образец, из которого получены или выделены клетки, представляет собой кровь или образец, полученный из крови, или является или получен из продукта для афереза или лейкофереза. Примеры образцов включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), лейкоциты, костный мозг, тимус, биопсию ткани, опухоль, лейкоз, лимфому, лимфатический узел, лимфоидную ткань, связанную со слизистой оболочкой, лимфоидную ткань, связанную со слизистой оболочкой, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкое, желудок, кишечник, толстую кишку, почки, поджелудочную железу, молочную железу, кости, предстательную железу, шейку матки, яички, яичники, миндалины или другой органа и/или полученные из них клетки. Образцы включают, в контексте клеточной терапии, например, адоптивной клеточной терапии, образцы из аутологичных и аллогенных источников.
В некоторых вариантах осуществления клетки получены из клеточных линий, например, Т-клеточных линий. Клетки в некоторых вариантах осуществления получают из ксеногенного источника, например, от мыши, крысы, примата, не являющегося человеком, и свиньи.
В некоторых вариантах осуществления выделение клеток включает одну или более стадий приготовления и/или разделения, не на основе аффинности. В некоторых примерах клетки промывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствии одного или более реагентов, например, для удаления нежелательных компонентов, обогащения до желаемых компонентов, лизиса или удаления клеток, чувствительных к конкретным реагентам. В некоторых примерах клетки разделяют на основе одного или более свойств, таких как плотность, адгезивные свойства, размер, чувствительность и/или устойчивость к конкретным компонентам.
В некоторых примерах клетки из циркулирующей крови пациента получают, например, путем афереза или лейкофереза. Образцы, в некоторых аспектах, содержат лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и/или тромбоциты, и в некоторых аспектах содержат клетки, отличные от эритроцитов и тромбоцитов. В некоторых вариантах осуществления перед селекцией и/или обогащением клеток образец или клетки в образце могут быть покоящимися или удерживаемыми перед дальнейшими этапами обработки. В некоторых вариантах осуществления образец выдерживают или поддерживают при температуре от или примерно от 2 до 8°С в течение до 48 часов, например, до 12 часов, 24 часов или 36 часов. В определенных вариантах осуществления клетки не селектируют и/или не обогащают до контакта клеток с одной или более нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления образец или клетки могут быть в состоянии покоя или удерживаться перед контактом или инкубацией клеток с одной или более нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления образец выдерживают или поддерживают при температуре от или примерно от 2 до 8°С в течение до 48 часов, например, до 12 часов, 24 часов или 36 часов до контакта или инкубации клеток с одной или более нуклеиновыми кислотами.
В некоторых вариантах осуществления клетки крови, собранные у пациента, промывают, например, с удалением фракции плазмы и помещая клетки в соответствующий буфер или среду для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В некоторых вариантах осуществления в промывочном растворе нет кальция и/или магния, и/или многих, или всех двухвалентных катионов. В некоторых аспектах стадия промывки выполняется полуавтоматической центрифугой с «проточным» потоком (например, клеточным процессором Cobe 2991, Baxter) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых аспектах стадия промывки выполняется посредством фильтрации с тангенциальным потоком (TFF) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых вариантах осуществления клетки ресуспендируют в различных биосовместимых буферах после промывки, таких как, например, PBS, свободный от Ca++/Mg++. В определенных вариантах осуществления компоненты образца клеток крови удаляют, и клетки непосредственно ресуспендируют в культуральной среде.
В некоторых вариантах осуществления способы включают методы разделения клеток на основе плотности, такие как получение лейкоцитов из периферической крови путем лизиса эритроцитов и центрифугирования в градиенте перколла или фиколла.
В некоторых вариантах осуществления способы выделения включают разделение клеток различных типов на основе экспрессии или наличия в клетке одной или более специфических молекул, таких как поверхностные маркеры, например поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления может использоваться любой известный способ разделения на основе таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления разделение представляет собой разделение на основе аффинности или иммуноаффинности. Например, выделение в некоторых аспектах включает разделение клеток и клеточных популяций на основе экспрессии клеток или уровня экспрессии одного или более маркеров, обычно маркеров клеточной поверхности, например, путем инкубации с антителом или партнером по связыванию, который специфически связывается с такими маркерами, за которыми обычно следуют стадии промывки и отделения клеток, содержащих связанное антитело или связывающий партнер, от тех клеток, которые не связаны с антителом или связывающим партнером.
Такие стадии разделения могут быть основаны на положительной селекции, при которой клетки, содержащие связанные реагенты, сохраняются для дальнейшего использования, и/или на отрицательной селекции, при которой клетки, не связанные с антителом или партнером по связыванию, сохраняются. В некоторых примерах обе фракции сохраняются для дальнейшего использования. В некоторых аспектах отрицательная селекция может быть особенно полезной, когда нет доступных антител, которые бы конкретно идентифицировали тип клеток в гетерогенной популяции, так что разделение лучше всего проводить на основе маркеров, экспрессируемых клетками, отличными от целевой популяции.
Разделение не должно приводить к 100% обогащению или удалению конкретной клеточной популяции или клеток, экспрессирующих определенный маркер. Например, положительная селекция или обогащение для клеток определенного типа, таких как клетки, экспрессирующие маркер, относится к увеличению количества или процента таких клеток, но не обязательно приводит к полному отсутствию клеток, не экспрессирующих маркер. Аналогично, отрицательная селекция, удаление или истощение клеток определенного типа, таких как клетки, экспрессирующие маркер, относится к уменьшению количества или процента таких клеток, но не должно приводить к полному удалению всех таких клеток.
В некоторых примерах выполняется несколько раундов стадий разделения, где положительно или отрицательно отселектированная фракция из одной стадии подвергается другой стадии разделения, такой как последующая положительная или отрицательная селекция. В некоторых примерах одна стадия разделения может истощать клетки, экспрессирующие несколько маркеров одновременно, например, путем инкубации клеток с множеством антител или партнеров по связыванию, каждый из которых специфичен для маркера, на который нацелена отрицательная селекция. Аналогичным образом, несколько типов клеток могут быть одновременно положительно отселектированы путем инкубации клеток с множеством антител или партнеров по связыванию, экспрессируемых на различных типах клеток.
Например, в некоторых аспектах конкретные субпопуляции Т-клеток, такие как клетки, экспрессирующие на высоком уровне один или более поверхностных маркеров, или положительные, например, по CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и/или CD45RO+ Т-клетки выделяют методами положительной или отрицательной селекции.
Например, CD3+, CD28+ T-клетки могут быть положительно отселектированы с использованием CD3/CD28 конъюгированных магнитных микросфер (например, DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander). В конкретных вариантах осуществления клетки контактируют с магнитными микросферами, конъюгированными с антителом против CD3/CD28 (например, DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T-клеточный экспандер) для размножения CD3+, CD28+ T-клеток перед контактом клеток с одной или более нуклеиновыми кислотами. В определенных вариантах осуществления клетки не контактируют с магнитными микросферами, конъюгированными с антителом против CD3/CD28 до контакта клеток с одной или более нуклеиновыми кислотами.
В некоторых вариантах осуществления выделение осуществляется путем обогащения определенной популяции клеток путем положительной селекции или истощения определенной популяции клеток путем отрицательной селекции. В некоторых вариантах осуществления положительную или отрицательную селекцию осуществляют путем инкубации клеток с одним или более антителом или другим агентом, которые специфически связываются с одним или более поверхностными маркерами, экспрессированными (маркер+)или экспрессированными на относительно более высоком уровне (маркер высокий) на положительно или отрицательно селектированных клетках, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления T-клетки отделяют от образца PBMC путем отрицательной селекции маркеров, таких как CD14, экспрессируемых на клетках, отличных от T-клеток, таких как B-клетки, моноциты или другие лейкоциты. В некоторых аспектах стадия селекции CD4+ или CD8+ используется для разделения CD4+ хелперов и CD8+ цитотоксических Т-клеток. Такие популяции CD4+ и CD8+ могут быть далее отсортированы на субпопуляции путем положительной или отрицательной селекции маркеров, экспрессируемых или экспрессируемых на относительно более высоком уровне на одной или более субпопуляциях Т-клеток из наивных Т-клеток, Т-клеток памяти и/или эффекторных Т-клеток.
В некоторых вариантах осуществления CD8+ клетки дополнительно обогащают или истощают по отношению к наивным клеткам, клеткам центральной памяти, эффекторной памяти и/или стволовым клеткам центральной памяти, как например, путем положительной или отрицательной селекцией на основе поверхностных антигенов, связанных с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления обогащение Т-клетками центральной памяти (TCM) проводят для повышения эффективности, например, для улучшения долгосрочной выживаемости, экспансии и/или приживления после введения, которое в некоторых аспектах является особенно устойчивым в таких субпопуляциях, См. Terakura et al. (2012) Blood.1: 72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701. В некоторых вариантах осуществления объединение обогащенных TCM CD8+ T-клеток и CD4+ T-клеток дополнительно повышает эффективность.
В вариантах осуществления Т-клетки памяти присутствуют как в CD62L +, так и в CD62L- подгруппах CD8+ лимфоцитов периферической крови. РВМС могут быть обогащены или истощены фракциями CD62L- CD8+ и/или CD62L+ CD8+, например, с использованием антител против CD8 и против CD62L.
В некоторых вариантах осуществления обогащение Т-клетками центральной памяти (TCM) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD127; в некоторых аспектах оно основано на отрицательной селекции клеток, экспрессирующих или высокоэкспрессирующих CD45RA и/или гранзим B. В некоторых аспектах выделение популяции CD8+, обогащенной клетками TCM, осуществляется путем истощения клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA, и положительной селекцией или обогащением клетками, экспрессирующими CD62L. В одном аспекте обогащение Т-клетками центральной памяти (TCM) осуществляют, начиная с отрицательной фракции клеток, отселектированных на основе экспрессии CD4, которая подвергается отрицательной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA и положительной селекции на основе CD62L. Такую селекцию в некоторых аспектах выполняют одновременно, а в других аспектах - последовательно, в любом порядке. В некоторых аспектах одна и та же стадия селекции на основе экспрессии CD4, используемая при получении популяции или субпопуляции клеток CD8+, также используется для генерирования популяции или субпопуляции клеток CD4+, так что как положительные, так и отрицательные фракции из разделения на основе CD4 сохраняются и используются на последующих стадиях методов, необязательно после одной или более дополнительных стадий положительной или отрицательной селекции.
В конкретном примере образец PBMC или другой образец лейкоцитов подвергают селекции клеток CD4+, где сохраняются как отрицательная, так и положительная фракции. Отрицательную фракцию затем подвергают отрицательной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA или CD19 и положительной селекции на основе характеристики маркеров Т-клеток центральной памяти, таких как CD62L или CCR7, где положительную и отрицательную селекцию проводят в любом порядке.
CD4+ хелперные Т-клетки сортируются на наивные, Т-клетки центральной памяти и эффекторные клетки путем идентификации популяций клеток, которые имеют антигены клеточной поверхности. CD4+ лимфоциты могут быть получены стандартными методами. В некоторых вариантах осуществления наивными CD4+ T-лимфоцитами являются CD45RO-, CD45RA +, CD62L +, CD4+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления CD4+ клетки центральной памяти представляют собой CD62L+ и CD45RO+. В некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки CD4+ представляют собой CD62L- и CD45RO-.
В одном примере для обогащения клеток CD4+ путем отрицательной селекции коктейль моноклональных антител обычно включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или связывающий партнер связаны с твердой подложкой или матрицей, такой как магнитная микросфера или парамагнитная микросфера, чтобы обеспечить разделение клеток для положительной и/или отрицательной селекции. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и популяции клеток разделяют или выделяют, используя иммуномагнитные (или аффинно-магнитные) методы разделения (рассмотрено в Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
В некоторых аспектах образец или композицию клеток, подлежащих разделению, инкубируют с небольшим намагничиваемым или магнитно-чувствительным материалом, таким как магнитно-чувствительные частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные микросферы (например, такие как микросферы Dynalbeads или микросферы MACS). Магнитно-чувствительный материал, например частица, обычно прямо или косвенно связан с партнером по связыванию, например антителом, которое специфически связывается с молекулой, например поверхностным маркером, присутствующим на клетке, клетках или популяции клеток, которые желательно отделить, например, которые желательно отрицательно или положительно отселектировать.
В некоторых вариантах осуществления магнитная частица или микросфера содержит магнитно-чувствительный материал, связанный с конкретным связывающим элементом, таким как антитело или другой связывающий партнер. Существует много известных магнитно-чувствительных материалов, используемых в методах магнитной сепарации. Подходящие магнитные частицы включают те, которые описаны в Molday, Патент США 4452773 и в Европейском патенте EP 452342 B, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Другими примерами являются частицы коллоидного размера, такие как описанные в патенте США Owen US Pat. 4795698 и Liberti et al., Пат. 5200084 являются другими примерами.
Инкубацию обычно проводят в условиях, при которых антитела или партнеры по связыванию или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реагенты, которые специфически связываются с такими антителами или партнерами по связыванию, которые прикреплены к магнитной частице или микросфере, специфически связываются с молекулами клеточной поверхности, если они присутствуют на клетках в образце.
В некоторых аспектах образец помещают в магнитное поле, и те клетки, к которым прикреплены магнитно-чувствительные или намагничиваемые частицы, будут притягиваться к магниту и отделяться от немеченых клеток. Для положительной селекции клетки, которые притягиваются к магниту, сохраняются; для отрицательной селекции сохраняются клетки, которые не притягиваются (немеченые клетки). В некоторых аспектах комбинацию положительной и отрицательной селекции выполняют во время одной и той же стадии селекции, где положительные и отрицательные фракции сохраняются и дополнительно обрабатываются или подвергаются дополнительным стадиям разделения.
В некоторых вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы покрыты первичными антителами или другими связывающими партнерами, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В определенных вариантах осуществления магнитные частицы прикрепляются к клеткам посредством покрытия первичными антителами, специфичными для одного или более маркеров. В некоторых вариантах осуществления клетки, а не микросферы, метят первичным антителом или партнером по связыванию, а затем добавляют магнитные частицы, покрытые специфическим к клеточному типу вторичным антителом или другим партнером по связыванию (например, стрептавидином). В некоторых вариантах осуществления магнитные частицы, покрытые стрептавидином, используют в сочетании с биотинилированными первичными или вторичными антителами.
В некоторых вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы оставляют прикрепленными к клеткам, которые затем должны быть инкубированы, культивированы и/или подвергнуты конструированию; в некоторых аспектах частицы остаются прикрепленными к клеткам для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые или магнитно-чувствительные частицы удаляются из клеток. Способы удаления намагничиваемых частиц из клеток известны и включают, например, использование конкурирующих немеченых антител и намагничиваемых частиц или антител, конъюгированных с расщепляемыми линкерами. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые частицы являются биоразлагаемыми.
В некоторых вариантах осуществления селекцию на основе аффинности осуществляют посредством магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Системы магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) способны с высокой степенью чистоты селектировать клетки с намагниченными частицами, прикрепленными к ним. В некоторых вариантах осуществления MACS работает в режиме, в котором нецелевые и целевые виды последовательно элюируются после приложения внешнего магнитного поля. То есть клетки, прикрепленные к намагниченным частицам, удерживаются на месте, в то время как незакрепленные частицы элюируются. Затем, после того, как эта первая стадия элюирования завершена, образцы, которые были пойманы в ловушку в магнитном поле и не были элюированы, освобождаются каким-либо образом, так что их можно элюировать и восстанавливать. В некоторых вариантах осуществления нецелевые клетки метят и истощают из гетерогенной популяции клеток.
В некоторых вариантах осуществления выделение или разделение осуществляют с использованием системы, устройства или аппарата, которые выполняют одну или более стадий способов в виде выделения, подготовки, разделения, обработки, инкубации, культивирования и/или приготовления составов. В некоторых аспектах система используется для выполнения каждой из этих стадий в закрытой или стерильной среде, например, чтобы минимизировать ошибки, манипуляции пользователя и/или загрязнение. В одном примере система представляет собой систему, описанную в международной заявке на патент, номер публикации WO 2009/072003 или US 20110003380 A1. В одном примере система представляет собой систему, описанную в международной публикации № WO 2016/073602.
В некоторых вариантах осуществления система или устройство выполняет одну или более, например, все стадии выделения, обработки, конструирования и приготовления состава в интегрированной или автономной системе и/или автоматизированным или программируемым образом. В некоторых аспектах система или устройство включают в себя компьютер и/или компьютерную программу, находящуюся в связи с системой или устройством, которая позволяет пользователю программировать, контролировать, оценивать результат и/или настраивать различные аспекты стадий обработки, выделения, конструирования и приготовления состава.
В некоторых аспектах разделение и/или другие стадии проводят с использованием системы CliniMACS (Miltenyi Biotec), например, для автоматического разделения клеток на уровне клинического масштаба в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать встроенный микрокомпьютер, блок магнитной сепарации, перистальтический насос и различные пережимные клапаны. Встроенный компьютер в некоторых аспектах контролирует все компоненты прибора и дает указание системе выполнять повторяющиеся процедуры в стандартизированной последовательности. Блок магнитного разделения в некоторых аспектах включает в себя подвижный постоянный магнит и держатель для селекционной колонки. Перистальтический насос контролирует скорость потока по всему трубопроводу и вместе с пережимными клапанами обеспечивает контролируемый поток буфера через систему и постоянную суспензию клеток.
Система CliniMACS в некоторых аспектах использует связанные с антителами намагничиваемые частицы, которые поставляются в стерильном непирогенном растворе. В некоторых вариантах осуществления после мечения клеток магнитными частицами клетки промывают для удаления избытка частиц. Затем пакет для подготовки клеток соединяют с комплектом трубок, который, в свою очередь, соединяют с пакетом, содержащим буфер и пакет для сбора клеток. Комплект трубок состоит из предварительно собранных стерильных трубок, включая предколонку и разделительную колонку, и предназначен только для одноразового использования. После запуска программы разделения система автоматически наносит образец клеток на разделительную колонку. Меченые клетки сохраняются в колонке, в то время как немеченые клетки удаляются с помощью ряда стадий промывки. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции для использования со способами, описанными в настоящем документе, являются немечеными и не сохраняются в колонке. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции для использования со способами, описанными в настоящем документе, помечены и сохраняются в колонке. В некоторых вариантах осуществления клеточные популяции для использования со способами, описанными в настоящем документе, элюируют из колонки после удаления магнитного поля и собирают в пакет для сбора клеток.
В некоторых вариантах осуществления разделение и/или другие стадии проводят с использованием системы CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). Система CliniMACS Prodigy в некоторых аспектах оснащена блоком обработки клеток, который позволяет автоматически промывать и фракционировать клетки центрифугированием. Система CliniMACS Prodigy может также включать в себя встроенную камеру и программное обеспечение для распознавания изображений, которое определяет оптимальную конечную точку фракционирования клеток путем определения макроскопических слоев исходного клеточного продукта. Например, периферическая кровь автоматически разделяется на слои эритроцитов, лейкоцитов и плазмы. Система CliniMACS Prodigy также может включать в себя встроенную камеру для культивирования клеток, которая выполняет протоколы клеточных культур, такие как, например, дифференцировка и экспансия клеток, загрузка антигена и длительное культивирование клеток. Исходные порты могут обеспечить стерильное удаление и пополнение среды, а клетки можно контролировать с помощью встроенного микроскопа. Смотри, например, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1: 72-82, и Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.
В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, описанная в настоящем документе, собирается и обогащается (или истощается) посредством проточной цитометрии, в которой клетки, окрашенные для множества маркеров клеточной поверхности, переносятся в жидком потоке. В некоторых вариантах осуществления описанная в настоящем документе популяция клеток собирается и обогащается (или истощается) посредством сортировки по препаративной шкале (FACS). В определенных вариантах осуществления популяция клеток, описанная в настоящем документе, собирается и обогащается (или истощается) путем использования чипов микроэлектромеханических систем (MEMS) в сочетании с системой детектирования на основе FACS (см., например, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; и Godin et al. (2008) J Биофотон. 1 (5): 355-376. В обоих случаях клетки могут быть помечены несколькими маркерами, что позволяет выделить четко определенные подгруппы Т-клеток с высокой степенью чистоты.
В некоторых вариантах осуществления антитела или партнеры связывания помечены одним или более детектируемыми маркерами для облегчения разделения для положительной и/или отрицательной селекции. Например, разделение может быть основано на связывании с флуоресцентно меченными антителами. В некоторых примерах разделение клеток на основе связывания антител или других партнеров связывания, специфичных для одного или более маркеров клеточной поверхности, осуществляют в жидком потоке, как например путем сортировки клеток активируемой флуоресценцией (FACS), включая препаративную шкалу (FACS) и/или чипы микроэлектромеханических систем (MEMS), например, в сочетании с системой детектирования проточной цитометрии. Такие методы допускают положительную и отрицательную селекцию на основе нескольких маркеров одновременно.
В некоторых вариантах осуществления способы получения включают стадии замораживания, например, криоконсервации клеток, до или после выделения, инкубации и/или конструирования. В некоторых вариантах осуществления стадия замораживания и последующего оттаивания удаляет гранулоциты и, в некоторой степени, моноциты в клеточной популяции. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в замораживающем растворе, например, после стадии промывания для удаления плазмы и тромбоцитов. В некоторых аспектах может быть использован любой из множества известных растворов и параметров замораживания. Один пример включает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% человеческого сывороточного альбумина (HSA), или другие подходящие среды для замораживания клеток. Затем его разбавляют 1:1 средой, так что конечная концентрация DMSO и HSA составляет 10% и 4%, соответственно. Затем клетки обычно замораживают до -80°С со скоростью 1°С в минуту и хранят в паровой фазе резервуара для хранения жидкого азота.
В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или культивируют до или в связи с генетическим конструированием. Стадии инкубации могут включать культивирование, культивацию, стимулирование, активацию и/или экспансию. Инкубацию и/или конструирование можно проводить в сосуде для культивирования, таком как блок, камера, лунка, колонка, пробирка, набор трубок, клапан, флакон, культуральная чашка, пакет или другой контейнер для культивирования или культивации клеток. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего агента. Такие условия включают условия, предназначенные для того, чтобы вызывать пролиферацию, размножение, активацию и/или выживание клеток в популяции, имитировать воздействие антигена и/или примировать клетки для генетического конструирования, как например, для введения рекомбинантного антигенного рецептора.
Условия могут включать одно или более из следующего: конкретных сред, температуры, содержания кислорода, содержания диоксида углерода, времени, агентов, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, связывание партнеры, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы и любые другие агенты, предназначенные для активации клеток.
В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия или агенты включают один или более агентов, например лиганд, который способен активировать внутриклеточный сигнальный домен комплекса TCR. В некоторых аспектах агент включает или инициирует внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в Т-клетке. Такие агенты могут включать антитела, такие как антитела, специфичные для TCR, например антитела против CD3. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие состояния включают один или более агентов, например лиганд, который способен стимулировать костимулирующий рецептор, например антитело против CD28. В некоторых вариантах осуществления такие агенты и/или лиганды могут быть связаны с твердой подложкой, такой как микросфера, и/или с одним или более цитокинами. Необязательно, способ экспансии может дополнительно включать стадию добавления антитела против CD3 и/или антитела против CD28 к культуральной среде (например, в концентрации, по меньшей мере примерно 0,5 нг/мл). В некоторых вариантах осуществления стимулирующие агенты включают IL-2, IL-15 и/или IL-7. В некоторых аспектах концентрация IL-2 составляет, по меньшей мере примерно 10 единиц/мл.
В некоторых аспектах инкубацию проводят в соответствии с методиками, такими как описанные в патенте США №6040177, согласно Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1: 72-82 и/или Wang et al. (2012) J Immunother. 35 (9): 689-701.
В некоторых вариантах осуществления Т-клетки наращивают путем добавления фидерных клеток к композиции инициирующей культуры, таких как неделящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) (например, так, чтобы полученная популяция клеток содержала, по меньшей мере примерно 5, 10 20 или 40 или более фидерных клеток РВМС для каждого Т-лимфоцита в исходной популяции, которая подлежит наращиванию); и путем инкубации культуры (например, в течение времени, достаточного для наращивания количества Т-клеток). В некоторых аспектах неделящиеся фидерные клетки могут содержать гамма-облученные фидерные клетки РВМС. В некоторых вариантах осуществления РВМС облучают гамма-лучами в диапазоне примерно от 3000 до 3600 рад для предотвращения деления клеток. В некоторых аспектах фидерные клетки добавляют в культуральную среду перед добавлением популяций Т-клеток.
В некоторых вариантах осуществления условия стимулирования включают температуру, подходящую для роста человеческих Т-лимфоцитов, например, по меньшей мере примерно 25 градусов Цельсия, обычно, по меньшей мере примерно 30 градусов и, как правило, при температуре, равной или примерно равной 37 градусов Цельсия. Необязательно, инкубация может дополнительно включать добавление неделящихся EBV-трансформированных лимфобластоидных клеток (LCL) в качестве фидерных клеток. LCL могут быть облучены гамма-лучами в диапазоне примерно от 6000 до 10000 рад. Фидерные клетки LCL в некоторых аспектах представлены в любом подходящем количестве, таком как при отношении фидерных клеток LCL к исходным Т-лимфоцитам, составляющем, по меньшей мере, примерно 10:1.
IV. Композиции
Также предложены композиции, включающие связывающие молекулы, такие как антитела, как предложено в настоящем документе, включая фармацевтические композиции и составы. Композиции и составы обычно включают один или более необязательных приемлемых носителей или вспомогательных веществ.
Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет биологической активности активного ингредиента, содержащегося в нем, быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для пациента, которому композицию будут вводить.
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для пациента. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается ими, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.
В некоторых аспектах выбор носителя частично определяется конкретной клеткой, связывающей молекулой и/или антителом, и/или способом введения. Соответственно, существует множество подходящих составов. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах используется смесь двух или более консервантов. Консервант или их смеси обычно присутствуют в количестве примерно от 0,0001% примерно до 2% от общей массы композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Фармацевтически приемлемые носители, как правило, нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают, но не ограничиваются ими: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмоний; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Буферные агенты в некоторых аспектах включены в композиции. Подходящие буферные агенты включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах используется смесь двух или более буферных агентов. Буферный агент или их смеси обычно присутствуют в количестве примерно от 0,001% примерно до 4% от общей массы композиции. Способы приготовления вводимых фармацевтических композиций известны. Типичные способы описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).
В некоторых аспектах композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах используется смесь двух или более консервантов. Консервант или их смеси обычно присутствуют в количестве примерно от 0,0001% примерно до 2% от общей массы композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Составы антител могут включать лиофилизированные составы и водные растворы.
Композиции в некоторых вариантах осуществления предложены в виде стерильных жидких препаратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые в некоторых аспектах могут быть забуферены до выбранного рН. Жидкие препараты обычно легче приготовить, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции несколько удобнее вводить, особенно инъекцией. Вязкие композиции, с другой стороны, могут быть приготовлены в пределах соответствующего диапазона вязкости, чтобы обеспечить более длительные периоды контакта с конкретными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут содержать носители, которые могут быть растворителем или диспергирующей средой, содержащей, например, воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси.
Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения связывающей молекулы в растворитель, такой как смесь с подходящим носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, декстроза или тому подобное. Композиции также могут быть лиофилизированы. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие, диспергирующие или эмульгирующие агенты (например, метилцеллюлозу), рН-буферные агенты, гелеобразующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы, красители и тому подобное, в зависимости от способа введения и целевого препарата. Стандартные методики могут в некоторых аспектах быть приняты во внимание для приготовления подходящих препаратов.
Могут быть добавлены различные добавки, которые повышают стабильность и стерильность композиций, включая антимикробные консерванты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты и буферы. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой и тому подобным. Пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть достигнута путем использования агентов, замедляющих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.
Композиции также могут быть лиофилизированы. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие, диспергирующие или эмульгирующие агенты (например, метилцеллюлозу), рН-буферные агенты, гелеобразующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, красители и тому подобное. Стандартные методики могут в некоторых аспектах быть приняты во внимание для приготовления подходящих препаратов.
Составы, используемые для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
V. Методы и применения антител
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предлагаются способы, включающие использование одного или более антиидиотипических антител. В некоторых аспектах в настоящем документе предложены способы измерения или детектирования антитела-мишени, такого как CAR, или клетки, экспрессирующей CAR, и способы модификации активности антитела-мишени, такой как активность CAR или активность клетки, экспрессирующей CAR. В некоторых вариантах осуществления одно или более антиидиотипических антител связывают, детектируют, идентифицируют и/или количественно определяют CAR и/или CAR-экспрессирующие клетки. В некоторых вариантах осуществления способы, предложенные в настоящем документе, обеспечивают одну или более стадий контактирования и/или инкубации одного или более антиидиотипических антител с клеткой или образцом, содержащим или предположительно содержащими клетки, которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело обрабатывают, инкубируют и/или приводят в контакт с композицией или образцом в условиях, которые обеспечивают образование комплекса между антиидиотипическим антителом и антителом-мишенью, например, CAR. В некоторых аспектах комплекс может использоваться для целей детектирования, выделения и/или измерения CAR. В некоторых вариантах осуществления образование комплекса модифицирует активность антитела-мишени, например, CAR, например, посредством стимулирования сигнальной активности рецептора, или в некоторых вариантах осуществления посредством антагонизма активности антитела-мишени, например, CAR, путем предотвращения ассоциации CAR с антигеном.
А. Методы детектирования/выделения
В некоторых вариантах осуществления предлагаются способы, включающие использование одного или более антиидиотипических антител и/или молекул (таких как конъюгаты и комплексы), содержащих одно или более таких антиидиотипических антител, для детектирования, связывания и/или выделение антитела, например антитела-мишени. В некоторых вариантах осуществления способы обеспечивают одну или более стадий контактирования, инкубации и/или экспонирования одного или более антиидиотипических антител с образцом и/или композицией. В некоторых вариантах осуществления образец и/или композиция, вероятно, содержат и/или предположительно содержат антитело-мишень и/или его антиген-связывающий фрагмент, которые связываются и/или распознается одним или более антиидиотипическими антителами. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые связаны или распознаются одним или более антиидиотипическими антителами, содержат один или более слитых доменов и/или представляют собой слитый белок. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень и/или его антиген-связывающий фрагмент представляют собой CAR. В определенных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело связывается и/или распознает антитело против CD19 (например, антитело SJ25C1 или FMC63) или его антиген-связывающий фрагмент, включая химерную молекулу или конъюгат, включающий CAR, содержащий такое антитело против CD19 (например, фрагмент антитела).
Способы в некоторых вариантах осуществления включают инкубацию, обработку и/или контактирование образца и/или композиции, содержащей или предположительно содержащей антитело-мишень, с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в условиях, допускающих связывание антиидиотипического антитела с антителом-мишенью, присутствующим в композиции, например, для образования комплекса, содержащего антиидиотипическое антитело и антитело-мишень.
В некоторых вариантах осуществления образец и/или композиция содержат или предположительно содержат антитело-мишень, например, CAR. В некоторых вариантах осуществления образец и/или композиция содержат или предположительно содержат клетки, которые экспрессируют антитело-мишень, например, CAR. В определенных вариантах осуществления образец представляет собой биологический образец. В конкретных вариантах осуществления образец представляет собой образец сыворотки или образец крови. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит одну или более иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой ткань или получен из ткани, такой как соединительная ткань, мышечная ткань, нервная ткань или эпителиальная ткань. В конкретных вариантах осуществления биологический образец представляет собой или получен из сердца, сосудистой сети, слюнных желез, пищевода, желудка, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, кишечника, толстой кишки, прямой кишки, гипоталамуса, гипофиза, шишковидной железы, щитовидной железы, околощитовидной железы, надпочечников, почек, мочеточников, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, лимфатической системы, кожи, мышц, мозга, спинного мозга, нервов, яичников, матки, яичек, предстательной железы, глотки, гортани, трахеи, бронхов, легких, диафрагмы, кости, хряща, связок или сухожилий. В конкретных вариантах осуществления биологический образец отбирают, собирают и/или получают от человека. В определенных вариантах осуществления образец содержит клетки, которые являются живыми и/или интактными. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой или содержит гомогенат и/или клетки, которые были разрушены и/или лизированы. В некоторых вариантах осуществления биологический образец содержит белки и/или антитела, которые были выделены из крови, сыворотки и/или ткани.
В конкретных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело образует или способно образовывать комплекс с антителом-мишенью, например, CAR. В конкретных вариантах осуществления комплекс детектируют, измеряют, количественно определяют и/или оценивают, например, для обеспечения детектирования, идентификации, измерения и/или количественного определения антитела-мишени, например, в композиции или образце. В некоторых вариантах осуществления способы включают детектирование того, образуется ли комплекс между антиидиотипическим антителом и антителом-мишенью в образце, и/или детектирование присутствия или отсутствия или уровня такого связывания. В некоторых вариантах осуществления комплекс содержит детектируемую метку. В конкретных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой иммуноконъюгат, который содержит детектируемую метку. В определенных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело содержит, конъюгируется, связывается и/или присоединяется к детектируемой метке. В некоторых вариантах осуществления комплекс содержит антитело, которое связывается и/или распознает антиидиотипическое антитело, например, вторичное антитело, которое конъюгировано, связано и/или присоединено к детектируемой метке.
В некоторых вариантах осуществления способы детектирования, количественного определения, детектирования и/или оценки антитела-мишени, например, в образце или композиции, включают детектирование комплекса антитела-мишени и антиидиотипического антитела. В некоторых вариантах осуществления комплекс содержит детектируемую метку. В некоторых вариантах осуществления комплекс гибридизуется и/или контактирует с детектируемой меткой. В некоторых вариантах осуществления комплекс детектируют любым подходящим способом или средствами, такими как, но не ограничиваясь этим, проточная цитометрия, иммуноцитохимия, иммуногистохимия, вестерн-блот-анализ и ИФА.
В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент связаны с клеткой или экспрессируются на поверхности клетки. В конкретных вариантах осуществления антитело-мишень, например, CAR, не связано или не содержится в клетке, например, в некоторых вариантах осуществления антитело-мишень секретируется. В некоторых вариантах осуществления антитело было отделено, удалено и/или лизировано с поверхности клетки.
В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержатся в химерном антигенном рецепторе (CAR), таком как CAR, экспрессируемый на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой стволовую клетку, например, iPSC или иммунную клетку. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой T-клетку, например, CD4+ T-клетку, CD8+ T-клетку, наивную T (TN) клетку, эффекторную T-клетку (TEFF), T-клетку памяти, инфильтрирующий опухоль лимфоцит (TIL), незрелые Т-клетки, зрелые Т-клетки, хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-клетки, ассоциированные со слизистой оболочкой инвариантные Т-клетки (MAIT), природные и адаптивные регуляторные Т-клетки (Treg), хелперные Т-клетки, такие как клетки TH1, клетки TH2, клетки TH3, клетки TH17, клетки TH9, клетки TH22, фолликулярные хелперные T-клетки, альфа/бета T-клетки и/или дельта/гамма T-клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка происходит из ткани, например, сердца, сети сосудов, слюнных желез, пищевода, желудка, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, кишечника, толстой кишки, прямой кишки, гипоталамуса, гипофиза, шишковидной железы, щитовидной железы, околощитовидной железы, надпочечников, почек, мочеточника, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, лимфатической системы, кожи, мышцы, мозга, спинного мозга, нервов, яичников, матки, яичек, предстательной железы, глотки, гортани, трахеи, бронхов, легких, диафрагмы, кости, хряща, связки или сухожилия.
В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой антитело против CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой или получено из антитела SJ25C1 или его антиген-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой или получено из антитела FMC63 или его антиген-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ детектирования антитела-мишени, такого как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающего фрагмента (и/или химерных молекул, содержащих такое антитело, например фрагмент антитела, такого как CAR), включающий контактирование композиции, содержащей антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом или иммуноконъюгатом антиидиотипического антитела, описанным в настоящем документе, и детектирование антиидиотипического антитела, связанного с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает детектирование того, образуется ли комплекс между антиидиотипическим антителом и антителом-мишенью в композиции, например, детектирование присутствия или отсутствия или уровня такого связывания. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент связаны с клеткой или экспрессируются на поверхности клетки, и детектирование включает детектирование клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент прямо или косвенно помечены для детектирования. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ выделения антитела-мишени, такого как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающего фрагмента (и/или химерных молекул, содержащих такое антитело, например фрагмент антитела, такого как CAR), включающий контактирование композиции и/или образца, содержащих антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом или иммуноконъюгатом антиидиотипического антитела, описанными в настоящем документе, и выделение комплексов, содержащих антиидиотипическое антитело, связанное с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень выделяют с помощью антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, такого как иммуноконъюгат, такой как иммуноконъюгат, описанный в разделе I-F. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент связаны с клеткой или экспрессируются на поверхности клетки, и выделение включает выделение клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления комплексы, содержащие антиидиотипическое антитело, выделяют путем аффинного разделения. В некоторых вариантах осуществления аффинное разделение выбирают из группы, состоящей из иммуноаффинного разделения, магнитного разделения и аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ детектирования клетки, экспрессирующей CAR, содержащий антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или их антиген-связывающие фрагменты, включающий контактирование клетки, экспрессирующей CAR с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, или иммуноконъюгатом антиидиотипического антитела, описанным в настоящем документе, и детектирование клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент прямо или косвенно помечены для детектирования. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В определенных вариантах осуществления способы детектирования антитела-мишени с помощью антиидиотипического антитела, описанные в настоящем документе, используются для оценки антитела-мишени у пациента. Например, в некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложены способы применения антиидиотипического антитела для оценки, измерения и/или количественного определения фармакокинетики in vivo, экспансии и/или персистенции CAR-экспрессирующих клеток терапевтической клеточной композиции. В некоторых вариантах осуществления фармакокинетика in vivo, экспансия и/или персистенция клеток и/или изменения в клеточных фенотипах или функциональной активности клеток, таких как CAR-экспрессирующие клетки, которые вводят для иммунотерапии, например клеточной терапии CAR-T, в способах, предложенных в настоящем документе, могут быть измерены с помощью антиидиотипических антител, предложенных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления измеряют фармакокинетику, экспансию и/или персистентность CAR-экспрессирующих клеток путем определения наличия и/или количества CAR-экспрессирующих клеток у пациента и/или в образце, полученном от пациента, после введения терапевтической клеточной композиции во время и/или после введения терапии с использованием антиидиотипического антитела, предложенного в настоящем документе.
В некоторых аспектах антиидиотипическое антитело используется с проточной цитометрией для оценки количества клеток, экспрессирующих рекомбинантный рецептор (например, CAR-экспрессирующие клетки, вводимые для терапии на основе T-клеток) в крови, сыворотке, органе или ткани (например, в сайте заболевания, например в образце опухоли) пациента. В некоторых аспектах персистентность определяют количественно как количество CAR-экспрессирующих клеток на микролитр образца, например крови или сыворотки, или на общее количество мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или лейкоцитов или Т-клеток на микролитр образца. В определенных аспектах экспансию количественно определяют как увеличение количества CAR-экспрессирующих клеток на микролитр между образцами, например, крови или сыворотки, или на общее количество мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или лейкоцитов или Т-клеток на микролитр образцов со временем. В некоторых вариантах осуществления фармакокинетику, экспансию и/или персистенцию измеряют или оценивают путем определения количества CAR-экспрессирующих клеток у пациента и/или в образцах, собранных у пациента в нескольких временных точках. В определенных вариантах осуществления один или более образцов отбирают, получают и/или собирают у пациента в течение периода времени, составляющего 24 часов, 48 часов, 72 часов, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 10 дней, 14 дней, 21 дни, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель, 3 месяца, 4 месяца, 6 месяцев, один год или более одного года после введения терапевтической клеточной композиции.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ селекции CAR-экспрессирующих клеток содержащий антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или их антиген-связывающие фрагменты, включающий контактирование популяции клеток, содержащей CAR-экспрессирующие клетки, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, или иммуноконъюгатом антиидиотипического антитела, описанным в настоящем документе, и селекцию клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления клетки, связанные с антиидиотипическим антителом, селектируют путем аффинного разделения. В некоторых вариантах осуществления аффинное разделение выбрано из группы, состоящей из иммуноаффинного разделения, проточной цитометрии, магнитного разделения и аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент или иммуноконъюгат антиидиотипического антитела обратимо связаны или иммобилизованы на подложке или неподвижной фазе. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ подтверждения CAR, содержащего антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63 или их антиген-связывающие фрагменты, включающий а) инкубацию образца, содержащего T-клетки, трансдуцированные CAR, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, нацеленными на CAR; b) определение процента клеток, связанных с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом; и c) подтверждение CAR на основе процента Т-клеток, связанных с антиидитипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело метят, и связанные с антиидиотипическим антителом Т-клетки анализируют проточной цитометрией. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
Также предлагаются способы, включающие использование предложенных антиидиотипических антител и молекул (таких как конъюгаты и комплексы), содержащих одно или более таких антиидиотипических антител, для информирования человека о решениях по лечению, как например, детектирование CAR, распознаваемых антиидиотипическим антителом, таких как CAR, содержащих антитело-мишень, такое как антитело против CD19 (например, антитело SJ25C1 или FMC63), или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления способы предназначены для информирования о решениях по лечению индивидуума в сочетании с терапией, включающей введение T-клеток CAR, таких как анти-CD19 CAR T-клетки. Способы в некоторых вариантах осуществления включают инкубацию и/или исследование биологического образца с антиидиотипическим антителом и/или введение антиидиотипического антитела индивидууму. В определенных вариантах осуществления биологический образец включает клетку или ткань или ее часть, такую как опухолевая ткань или ткань злокачественного новообразования, или биопсия, или ее часть. В некоторых вариантах осуществления инкубацию проводят в условиях, позволяющих связывание антиидиотипического антитела с CAR, присутствующими в образце. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают детектирование того, образуется ли комплекс между антиидиотипическим антителом и CAR в образце, например, обнаружение наличия или отсутствия или уровня такого связывания. Такой способ может представлять собой метод in vitro или in vivo.
В одном варианте осуществления антиидиотипическое антитело используется для определения того, необходима ли индивидууму адаптация к CAR Т-клеточной терапии, например, когда низкие уровни CAR Т-клеток у индивидуума указывают на необходимость корректировки терапии. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой антитело против CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой или получено из антитела SJ25C1 или его антиген-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой или получено из антитела FMC63 или его антиген-связывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ оценки CAR-Т-клеточной терапии у индивидуума, где CAR содержит антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, причем способ включает инкубацию образца от индивидуума с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, нацеленными на CAR, и определение количества Т-клеток, связанных с антиидиотипическим антителом, и определение потенциальной терапевтической пользы терапии на основе количества Т-клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело метят, и связанные с антиидиотипическим антителом Т-клетки анализируют проточной цитометрией. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец, полученный из крови, или представляет собой или получен из продукта для афереза или лейкофереза. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ оценки CAR-Т-клеточной терапии у индивидуума. В некоторых аспектах CAR содержит антитело-мишень, такое как антитело, которое представляет собой или получено из SJ25C1 или FMC63, такое как антиген-связывающий фрагмент полноразмерного SJ25C1 или FMC63. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение индивидууму антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, нацеленных на CAR (например, нацеленных на антитело, например, на фрагмент антитела CAR). В некоторых аспектах введение осуществляют после начала первой дозы терапии. Способ может включать определение присутствия антиидиотипического антитела в одной или более тканях/органах индивидуума. В некоторых аспектах способ включает определение потенциальной терапевтической пользы терапии на основе присутствия антиидиотипического антитела, по меньшей мере в одной из одной или более тканей/органов. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело метят, и присутствие антиидиотипического антитела у индивидуума определяют путем его визуализации у индивидуума для детектирования метки. В некоторых вариантах осуществления определение присутствия антиидиотипического антитела в одной или более тканях/органах у индивидуума включает или проводится путем определения уровня антиидиотипического антитела или его связывания в одной или более тканях/органах.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антиидиотипического антитела индивидууму после иницииации второй или последующей дозы терапии и/или определение присутствия антиидиотипического антитела в одной или более тканях/органах индивидуума. В некоторых аспектах способ дополнительно включает определение потенциальной терапевтической пользы терапии на основе разницы в уровне антиидиотипического антитела, по меньшей мере в одной из одной или более тканей/органов у индивидуума между первым и вторым введением антиидиотипического антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ корректировки CAR-Т-клеточной терапии у индивидуума, где CAR содержит антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых аспектах способ включает инкубацию или контактирование образца индивидуума с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, нацеленным на CAR. В некоторых аспектах способ включает определение количества Т-клеток, связанных с антиидиотипическим антителом. В некоторых аспектах способ включает корректировку терапии на основании количества связанных с антиидиотипическим антителом Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело метят прямо или косвенно. В некоторых аспектах таких вариантов осуществления Т-клетки, связанные с антиидиотипическим антителом, визуализируют in vivo или ex vivo, как например, в некоторых случаях, путем анализа с помощью проточной цитометрии образца пациента, которому вводят CAR-T-клетки и антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец, полученный из крови, и/или представляет собой или получен из продукта для афереза или лейкофереза. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ корректировки CAR-Т-клеточной терапии у индивидуума. В некоторых аспектах такой способ осуществляют для CAR-T-клеточной терапии, где CAR включает антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, включая антиген-связывающий фрагмент SJ25C1 или FMC63. Способ в некоторых вариантах осуществления включает введение индивидууму антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, который нацелен на CAR или связывается с CAR после начала введения первой дозы терапии, и определение присутствия, отсутствия или уровня антиидиотипического антитела в одной или более тканях/органах у индивидуума. В некоторых аспектах способ включает корректировку терапии на основании присутствия, отсутствия или уровня антиидиотипического антитела, по меньшей мере в одной из одной или более тканей/органов. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело метят прямо или косвенно, и в некоторых таких вариантах осуществления присутствие антиидиотипического антитела у индивидуума определяют путем его визуализации у индивидуума для детектирования метки. В некоторых вариантах осуществления определение присутствия антиидиотипического антитела в одной или более тканях/органах у индивидуума включает определение уровня антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента в одной или более тканях/органах. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антиидиотипического антитела индивидууму после начала второй или последующей дозы введения терапии и в некоторых аспектах определение присутствия, отсутствия или уровня антиидиотипического антитела в одной или более тканях/органов у индивидуума и/или корректировка терапии на основе наблюдений, таких как, например, на основании разницы в уровне антиидиотипического антитела, по меньшей мере в одном или более из тканей/органов у индивидуума между первым и вторым введением антиидиотипических антител. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых аспектах терапию корректируют (i), если количество клеток Т-клеточной терапии, детектируемых в крови или другом биологическом образце, после того, как они были детектированы, не детектируются или количество уменьшается, при этом уменьшается необязательно по сравнению с предшествующим моментом времени после введения Т-клеточной терапии; (ii) количество клеток Т-клеточной терапии, детектируемых в крови или другом биологическом образце, уменьшается ровно или более чем в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз или больше пика или максимального количества клеток Т-клеточной терапии, детектируемых в крови или биологическом образце пациента после начала введения Т-клеточной терапии, необязательно первой, второй или последующей дозы; (iii) в то время, когда пиковый или максимальный уровень клеток Т-клеточной терапии детектируется в крови пациента, количество Т-клеток или клеток, полученных из Т-клеток, детектируемых в крови у пациента, составляет менее чем 10%, менее чем 5%, менее чем 1% или менее чем 0,1% от общего числа мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в крови пациента; и/или (iv) если количество CD3+или CD8+ клеток клеточной терапии, детектируемых в крови, составляет менее чем 20 клеток на мкл, 15 клеток на мкл, 10 клеток на мкл, менее чем 5 клеток на мкл или менее чем 1 клетка на мкл. В некоторых вариантах осуществления терапию корректируют путем введения одной или более дополнительных доз CAR-T-клеточной терапии, введения увеличенной дозы CAR-T-клеточной терапии, введения альтернативной CAR-T-клеточной терапии, специфичной для того же или другого антигена, введение одного или более иммуномодулирующих агентов или других агентов для стимулирования или увеличения экспансии или персистенции CAR-T-клеток.
125
131
35
3
32
51
57
18
153
159
68
166
115
113
112
111
125
123
121
140
177
54
99
103
32
142
149
186
188
105
97
153
47
75
85
35
99
201
113
117
3
133
169
175
90
Можно использовать различные способы, известные в данной области, для выявления специфического связывания антитело-антиген. Типичные иммуноанализы включают иммуноанализ с флуоресцентной поляризацией (FPIA), иммуноанализ с флуоресценцией (FIA), иммуноферментный анализ (EIA), иммуноанализ с ингибированием нефелометрическим методом (NIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA). Индикаторный фрагмент или группа меток может быть присоединена к антиидиотипическим антителам и выбрана таким образом, чтобы удовлетворить потребностям различных применений метода, которые часто определяются наличием оборудования для анализа и совместимых процедур иммуноанализа. Примеры меток включают радионуклиды (например, I, I, S, H или P и/или хром (Cr), кобальт (Co), фтор (F), гадолиний (Gd, Gd), германий (Ge), гольмий (Ho), индий (In, In, In, In), йод (I, I, I), лантан (La), лютеций (Lu), марганец (Mn), молибден (Mo), палладий (Pd), фосфор (P), празеодим (Pr), прометий (Pm), рений (Re, Re), родий (Rh), рутений (Ru), самарий (Sm), скандий (Sc), селен (Se), (Sr), сера (S), технеций (Tc), таллий (Tl), олово (Sn, Sn), тритий (H), ксенон (Xe), иттербий (Yb, Yb), иттрий (Y)), ферменты (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, люцифераза или β-галактозидаза), флуоресцентные фрагменты или белки (например, флуоресцеин, родамин, фикоэритрин, GFP или BFP) или люминесцентные фрагменты (например, наночастицы Qdot™, поставляемые компанией Quantum Dot Corporation, Пало-Альто, Калифорния). Известны различные общие методики, которые должны использоваться при выполнении различных иммуноанализов, отмеченных выше.
В некоторых вариантах осуществления нет необходимости мечения антиидиотипических антител, и их присутствие можно детектировать с использованием меченого антитела, которое связывается с любым антиидиотипическим антителом.
Антиидиотипические антитела, предложенные в настоящем документе, можно использовать в любом известном методе анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
111
99
14
131
125
3
Антиидиотипические антитела также можно использовать для диагностических анализов in vivo, таких как визуализация in vivo. Как правило, антиидиотипическое антитело метят радионуклидом (таким как In, Tc, C, I, I или H), так что представляющие интерес клетки или ткань могут быть локализованы in vivo после введения индивидууму.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы или связаны с твердой подложкой, где одна или более клеток-мишеней, содержащих CAR-T-клетки, контактируют с твердой подложкой. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой микросферу. В некоторых вариантах осуществления твердой подложкой является поверхность лунки или планшета, например планшета для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой смолу или матрицу, присутствующую или содержащуюся в хроматографической колонке, например, для обеспечения хроматографического выделения или селекции CAR+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент обратимо связаны или способны к обратимому связыванию с твердой подложкой. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой матрицу аффинной хроматографии, содержащую один или более сайтов связывания, способных связываться, например, обратимо связываться, с партнером связывания, присутствующим в антиидиотипическом антителе. В одном иллюстративном варианте осуществления антиидиотипическое антитело содержит стрептавидин-связывающий пептид или другой стрептавидин-связывающий фрагмент, способный связываться с молекулой мутеина стрептавидина или стрептавидина, присутствующей или иммобилизованной на твердой подложке, и которая в некоторых случаях может диссоциировать в присутствии конкурентного вещества, такого как биотин. Примеры таких систем включают те, которые описаны в опубликованной патентной заявке США № US 20150024411.
В некоторых аспектах анти-ID антитела, предложенные в настоящем документе, могут быть экспрессированы на поверхности клетки. В некоторых аспектах анти-ID антитело, экспрессированное клеткой, может быть использовано для индукции или стимулирования CAR-экспрессирующей клетки, такой как часть системы для селективного роста CAR-клеток. В некоторых аспектах анти-ID антитело или его антиген-связывающий фрагмент экспрессиру.тся на искусственной антигенпрезентирующей клетке (aAPC). AAPC, экспрессирующие анти-ID, можно использовать в качестве реагентов для стимулирования или экспансии популяций CAR-T-клеток.
Способы получения или генерации aAPC известны, см., например, патент США. 6225042, 6355479, 6362001, 6790662; 7754482; Публикации патентных заявок США №2009/0017000 и 2009/0004142; и международную публикацию № WO 2007/103009. В данной области известны различные aAPC, см., например, патент США №8722400, опубликованную заявку № US 2014/0212446; Butler and Hirano (2014) Immunol Rev., 257(1):10. 1111/imr.12129; Suhoshki et al. (2007) Mol. Ther., 15: 981-988).
aAPC включают признаки природных APC, включая экспрессию молекулы MHC, стимулирующей и костимулирующей молекулы (молекул), рецептора Fc, молекулы (молекул) адгезии и/или способность продуцировать или секретировать цитокины (например, IL-2). Обычно aAPC представляет собой клеточную линию, в которой отсутствует экспрессия одного или более из вышеперечисленных, и она генерируется путем введения (например, путем трансфекции или трансдукции) одного или более недостающих элементов, необходимых для стимулирования клетки, например, CAR-Т-клетки.
В некоторых вариантах осуществления клетки, отобранные, чтобы стать aAPC, имеют недостатки во внутриклеточном процессинге антигена, внутриклеточном транспорте пептидов и/или внутриклеточной молекулярно-пептидной нагрузке МНС класса I или класса II. В некоторых аспектах такие клетки также не обладают способностью экспрессировать молекулу МНС класса I или класса II и/или молекулы, вовлеченные в процессинг антигена или связанные с ним. Типичные aAPC представляют собой или получены из клеточной линии, дефицитной по транспортеру, ассоциированному с процессингом антигенов (TAP), такой как клеточная линия насекомых. Иллюстративная клеточная линия представляет собой клеточную линию дрозофилы, такую как клеточная линия Schneider 2 (см., например, Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 1972 Vol 27, pp. 353-365). Иллюстративные способы получения, роста и культивирования клеток Schneider 2 представлены в патентах США No. 6225042, 6355479 и 6362001.
В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку K652 или клетку, полученную из K562.В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клеточную линию, доступную в ATCC № CCL-243.
В некоторых аспектах aAPC дополнительно конструируют для экспрессии дополнительной молекулы для усиления, потенцирования или повышения стимулирования CAR-экспрессирующей T-клетки. В некоторых вариантах осуществления дополнительная молекула представляет собой иммуностимулирующий лиганд, костимулирующий лиганд, цитокин или молекулу адгезии. В некоторых вариантах осуществления костимулирующий лиганд специфически связывается, по меньшей мере с одной костимулирующей молекулой, присутствующей на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления aAPC генерируется, например, путем трансдукции или трансфекции для экспрессии одного или более костимулирующих сигналов (например, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ICOS-L, ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, бета-рецептор лимфотоксина, ILT3, ILT4, 3/TR6 или лиганд B7-H3 или антитело, которое специфически связывается с CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, рецептором Toll-лиганда или лиганда CD83), молекулы клеточной адгезии (например, ICAM-1 или LFA-3) и/или цитокина (например, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL -15, IL-21, интерферона-альфа (IFNα), интерферона-бета (IFNβ), интерферона-гамма (IFNγ), альфа-фактора некроза опухоли (TNFα), бета-фактора некроза опухоли (TNFβ), гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и гранулоцит колониестимулирующего фактора (GCSF)). В некоторых случаях aAPC обычно не экспрессирует молекулу MHC, но может быть сконструирована для экспрессии молекулы MHC или, в некоторых случаях, индуцируется или может индуцироваться для экспрессии молекулы MHC, например, путем стимулирования цитокинами. В некоторых случаях aAPC также могут иметь нагрузку в виде стимулирующего или костимулирующего лиганда, который может включать, например, антитело против CD3, антитело против CD28 или антитело против CD2. В некоторых вариантах осуществления aAPC экспрессирует молекулу, способную опосредовать первичный сигнал в клетке, такой как сигнал, опосредованный через T-клеточный рецептор/CD3 комплекс на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления aAPC содержат стимулирующий лиганд, который специфически связывается с комплексом TCR/CD3, так что происходит передача первичного сигнала.
В некоторых вариантах осуществления, поскольку анти-ID способно доставлять сигнал через CAR, aAPC не экспрессирует стимулирующий лиганд, который специфически связывается с комплексом TCR/CD3. В некоторых вариантах осуществления aAPC не экспрессирует костимулирующую молекулу.
В некоторых вариантах осуществления анти-ID экспрессируется в виде одноцепочечного фрагмента (scFv) для экспрессии на поверхности клетки. Нуклеиновая кислота, кодирующая scFV, может быть слита с последовательностями ДНК, кодирующими трансмембранный домен. Предпочтительно используемые трансмембранные области включают области, полученные из трансмембранной области (областей) альфа-, бета- или дзета-цепи рецептора Т-клеток, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33., CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Альтернативно, трансмембранный домен может быть синтетическим, и в этом случае он будет содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых случаях триплет фенилаланина, триптофана и валина будет обнаружен на каждом конце синтетического трансмембранного домена. Типичные трансмембранные домены включают домены, полученные из CD8 или CD28.
B. Использование в стимулировании клеток
В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты являются агонистами и/или проявляют специфическую активность для стимулирования клеток, экспрессирующих антитело-мишень, включая конъюгаты или химерные рецепторы, содержащие его, такое как антитело против CD19 (например, антитело SJ25C1 или FMC63) или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления предложены способы, включающие использование предложенных антиидиотипических антител и молекул (таких как конъюгаты и комплексы), содержащих одно или более таких антиидиотипических антител, для стимулирования или активации CAR-экспрессирующих клеток или экспрессирующих другой химерный рецептор, таких как Т-клетки. В некоторых аспектах CAR или другой рецептор содержит антитело-мишень, такое как антитело против CD19 (например, антитело SJ25C1 или FMC63), или его антиген-связывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать в связи со способами получения генетически сконструированных Т-клеток, такими как способы экспансии генетически сконструированных Т-клеток или других клеток, в которые была введена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный рецептор, такой как CAR, содержащий антитело-мишень, например, путем трансфекции, трансдукции или невирусным способом переноса нуклеиновой кислоты, таким как подход на основе использования транспозона. В некоторых аспектах антитело-мишень представляет собой антитело против CD19 (например, антитело SJ25C1 или FMC63) или его антиген-связывающий фрагмент. В конкретных вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой или содержит CAR, например, анти-CD19 CAR. В конкретных вариантах осуществления анти-CD19 CAR содержит scFv, который взят и/или получен из антитела против CD19, такого как антитело SJ25C1 или FMC63.
Способы в некоторых вариантах осуществления включают инкубацию образца, содержащего Т-клетки, трансдуцированные с помощью CAR, с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают детектирование того, активированы или стимулированы CAR-T-клетки, например, путем оценки жизнеспособности, пролиферации и/или экспрессии маркеров активации в CAR-T-клетках. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой антитело против CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой или получено из антител SJ25C1 или FMC63 или их антиген-связывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ стимулирования клеток, включающий инкубацию исходной композиции, содержащей CAR-экспрессирующие клетки, содержащий антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, описанными в настоящем документе, тем самым генерируя итоговую композицию, содержащую стимулированные клетки. В некоторых вариантах осуществления инкубацию проводят в условиях, в которых антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с CAR, таким образом индуцируя или модулируя сигнал в одной или более клетках во исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления клетки включают Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки включают CD4+ и/или CD8+ Т-клетки.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложен способ стимулирования или экспансии клеток, которые экспрессируют CAR, путем инкубации исходной композиции, содержащей CAR-экспрессирующие клетки, с анти-ID антителом, которое связывается с CAR и/или распознает его. В некоторых вариантах осуществления связывание между анти-ID антителом и CAR индуцирует экспансию CAR-экспрессирующих клеток тем самым получая итоговую композицию, содержащую размноженные клетки.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело приводят в контакт или инкубируют с исходной композицией одной или более клеток для генерирования итоговой композиции. В определенных вариантах осуществления исходные клетки и/или исходная композиция представляют собой композицию и/или множество клеток, которые подвергаются или должны подвергаться обработке, инкубации или контактированию в условиях, которые приведут к одному или более изменениям, по меньшей мере части клеток исходной композиции, тем самым преобразуя исходную композицию в итоговую композицию. В некоторых вариантах вводимые клетки представляют собой композицию иммунных клеток, например, композицию Т-клеток, которые содержат CAR-экспрессирующие клетки. В конкретных вариантах осуществления, по меньшей мере часть клеток во исходной композиции активируется, наращивается и/или обогащается в сгенерированной итоговой композиции посредством применения предложенных способов.
В определенных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело способствует экспансии или обогащению клеток исходной композиции, экспрессирующих CAR. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих. В определенных вариантах осуществления исходная композиция содержит клетки человека. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит клетки, которые получены из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов. В конкретных вариантах осуществления исходная композиция содержит клетки иммунной системы, т.е. клетки врожденного или приобретенного иммунитета, например, миелоидные или лимфоидные клетки, включая лимфоциты, обычно Т-клетки и/или NK-клетки. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, в том числе индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). В конкретных вариантах осуществления исходная композиция содержит клетки CD3+. В определенных вариантах осуществления исходная композиция содержит CD4+ клетки. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит клетки CD8+. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция представляет собой композицию клеток CD4+. В конкретных вариантах осуществления исходная композиция представляет собой композицию клеток CD8+.
В некоторых вариантах осуществления способы и агенты способны стимулировать Т-клетки, дефицитные или подвергнутые отрицательной регуляции одной или более природными сигнальными молекулами, такими как один или более костимулирующих рецепторов, или антигенных рецепторов, или рецепторов цитокинов, но клетки при этом экспрессируют химерный рецептор, например, CAR, распознаваемый анти-Id антителом. В некоторых вариантах осуществления клетки исходной композиции имеют низкий уровень или отрицательны по поверхностной экспрессии CD28 или другой костимулирующей молекулы или другой сигнальной молекулы. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предложенные агенты и способы имеют определенные преимущества по сравнению с некоторыми другими активирующими или стимулирующими агентами или способами, которые могут требовать или зависеть от поверхностной экспрессии CD28 или другой эндогенной сигнальной молекулы для обеспечения желаемого сигнала и/или полной степени такого сигнала, например, для обеспечения костимулирующего сигнала и/или для достижения полной активации. В некоторых вариантах осуществления предложенные агенты и способы являются предпочтительными в таких отношениях по сравнению с реагентами против CD3/CD28 (например, микросферами); в некоторых аспектах предложенные анти-ID антитела имеют преимущество в том, что они способны стимулировать или достигать желаемого эффекта, такого как активация или пролиферация клеток, которые имеют низкий уровень или отрицательны по CD28 или по другой природной сигнальной молекуле. В некоторых аспектах передача сигнала через CAR посредством стимулирования анти-ID антителом приводит к первичному и вторичному (костимулирующему) сигналу через CAR с использованием только одного реагента. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит клетки CD3+, которые экспрессируют на низком уровне CD28 или другую эндогенную сигнальную молекулу. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит клетки CD3+, которые являются CD28-отрицательными или являются отрицательными по другой эндогенной сигнальной молекуле. В некоторых вариантах осуществления анти-ID антитело стимулирует активацию и/или экспансию клеток, экспрессирующих на низком уровне CD28, или клеток, которые являются отрицательными по CD28. В некоторых вариантах осуществления клетки контактируют с антиидиотипическим антителом или антиген-связывающим фрагментом, который иммобилизован на твердой подложке или связан с ней. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой микросферу. В некоторых вариантах осуществления твердой подложкой является поверхность лунки или планшета, например планшета для культивирования клеток. В некоторых примерах анти-ID антитело является растворимым. В определенных вариантах осуществления клетки не контактируют с реагентами, конъюгированными с антителом против CD3/CD28, до контакта клеток с антиидиотипическим антителом или антиген-связывающим фрагментом.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело наносят, связывают или инкубируют с исходной композицией клеток, которые были трансдуцированы или трансфицированы нуклеотидом, кодирующим CAR. В конкретных вариантах осуществления инкубация, обработка и/или контактирование исходных клеток с антиидиотипическим антителом приводит к экспансии и/или обогащению клеток, экспрессирующих CAR. В конкретных вариантах осуществления инкубация, обработка и/или контактирование исходных клеток с антиидиотипическим антителом не приводит к экспансии и/или обогащению клеток, которые не экспрессируют CAR. В конкретных вариантах осуществления инкубация, обработка и/или контактирование исходных клеток с антиидиотипическим антителом приводит к экспансии и/или обогащению клеток, которые не экспрессируют CAR, что составляет, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,9% или по меньшей мере на 99,99% меньше, чем экспансия и/или обогащение клеток, которые экспрессируют CAR. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипические антитела, предложенные в настоящем документе, используются для экспансии CAR-экспрессирующих клеток исходной композиции, которая испытала низкую эффективность трансдукции и/или трансфекции и/или которая содержит небольшое количество CAR-экспрессирующих клеток. В определенных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело способствует селективным экспансии и/или обогащению CAR-экспрессирующих клеток.
Некоторые варианты осуществления предполагают, что антиидиотипическое антитело является более эффективным для экспансии и/или обогащения клеток исходной композиции с низкой эффективностью трансдукции или трансфекции и/или которая имеет небольшое количество CAR-экспрессирующих клеток, чем экспансия и/или обогащения клеток путем поликлонального стимулирования, например, стимулирования антителом против CD3 и/или антителом против CD28. В конкретных вариантах осуществления поликлональное стимулирование приводит к экспансии клеток, которые экспрессируют, и клеток, которые не экспрессируют CAR, во исходной композиции, и, следовательно, в некоторых вариантах осуществления, может быть не в состоянии обогащать CAR-экспрессирующие клетки, особенно, когда исходная композиция содержит низкое количество CAR-экспрессирующих клеток. Напротив, в некоторых вариантах осуществления инкубация с антиидиотипическим антителом приводит к селективной экспансии CAR-экспрессирующих клеток, и, следовательно, в определенных вариантах осуществления приводит к селективной экспансии и/или обогащению CAR-экспрессирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления инкубация, контактирование и/или обработка исходных клеток с использованием антиидиотипического антитела приводит к большему обогащению и/или экспансии CAR-экспрессирующих клеток, чем путем поликлонального стимулирования.
5
5
6
6
6
6
6
6
7
В конкретных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело инкубируют, наносят и/или связывают с исходными клетками, которые были трансфецированы и/или трансдуцированы меньшим количеством вирусных частиц, соотношением копий частиц вирусного вектора к клеткам, и/или инфекционных единиц (ИЕ), чем исходные клетки, которые наращиваются и/или обогащаются с помощью поликлонального стимулирования. Например, в некоторых вариантах осуществления исходная композиция, которая инкубируется с антиидиотипическим антителом, генерируется из клеток, которые были трансдуцированы с использованием ИЕ на клетку, составляющих или по меньшей мере составляющих на 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или на 60 ИЕ меньше на клетку, чем у исходной композиции, которая наращивается и/или обогащается с помощью поликлонального стимулирования. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция, которая инкубируется с антиидиотипическим антителом, генерируется из клеток, которые были трансдуцированы титром частиц вирусного вектора, или по меньшей мере составляющим на 1×10 ИЕ/мл, 5×10 ИЕ/мл, 1×10 ИЕ/мл, 5×10 ИЕ/мл, 6×10 ИЕ/мл, 7×10 ИЕ/мл, 8×10 ИЕ/мл, 9×10 ИЕ/мл или на 1×10 ИЕ/мл меньше, чем исходная композиция, которая наращивается и/или обогащается с помощью поликлонального стимулирования.
В конкретных вариантах осуществления трансдукция клеток высоким значением ИЕ/на клетку будут приводить к высокой эффективности трансдукции, но в некоторых вариантах осуществления может также приводить к получению трансфецированных клеток с высоким числом копий векторов (VCN), что может представлять риски для безопасности и может не соответствовать нормативным требованиям. В конкретных вариантах осуществления снижение ИЕ/на клетку, которым клетки трансдуцируются, снизит эффективность трансдукции, но снизит VCN. В конкретных вариантах осуществления увеличение ИЕ/на клетку, которым трансдуцируются клетки, увеличит эффективность трансдукции, но также увеличит VCN.
В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит популяцию клеток, которые были трансдуцированы или трансфецированы, или клеток, которые получены из клеток, которые были трансдуцированы или трансфецированы одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими CAR, который связывается или распознается антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах исходная композиция содержит менее чем 80%, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%, менее чем 55%, менее чем 50%, менее чем 45%, менее чем 40%, менее чем 35%, менее чем 30%, менее чем 25%, менее чем 20%, менее чем 15%, менее чем 10%, менее чем 5% или менее чем 1% клеток, которые являются CAR-экспрессирующими клетками. В конкретных вариантах осуществления клетки исходной композиции трансфецировали или трансдуцировали, как описано в разделе III. В некоторых вариантах осуществления исходные клетки содержат популяцию клеток, которые были трансдуцированы или трансфецированы одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими анти-CD19 CAR, такими как анти-CD19 CAR, который содержит scFv, взятый и/или полученный из антитела против CD19, такого как антитело SJ25C1 или FMC63, или популяцию клеток, которые были получены из них.
В конкретных вариантах осуществления инкубацию, контактирование или обработку клеток из исходной композиции антиидиотипическим антителом проводят в условиях для стимулирования, экспансии и/или активации клеток, причем условия могут включать в себя одно или более из следующих: конкретные среды, температуру, содержание кислорода, содержание диоксида углерода, время, агенты, например, питательные вещества, аминокислоты, антибиотики, ионы и/или стимулирующие факторы, такие как цитокины, хемокины, антигены, партнеры связывания, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы и любые другие агенты, предназначенные для активации клеток.
В некоторых вариантах осуществления клетки исходной композиции трансфецировали или трансдуцировали одной нуклеиновой кислотой, содержащей ген, кодирующий CAR, и клетки связывали, инкубировали или обрабатывали антиидиотипическим антителом, которое связывается или распознает рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления клетки исходной композиции обрабатывают, инкубируют или связывают с антиидиотипическим антителом после того, как клетки трансдуцируют или трансфецируют нуклеиновой кислотой, кодирующей CAR. В конкретных вариантах осуществления клетки исходной композиции обрабатывают, инкубируют или приводят в контакт с антиидиотипическим антителом немедленно, в течение примерно 1 минуты, в течение примерно 5 минут, в течение примерно 30 минут, в течение примерно 1 часа, в течение примерно 2 часов, в течение примерно 4 часов, в течение примерно 6 часов, в течение примерно 8 часов, в течение примерно 12 часов, в течение примерно 24 часов, в течение примерно 2 дней, в течение примерно 3 дней, в течение примерно 4 дней, в течение примерно 5 дней, в течение примерно 6 дней, в течение примерно 1 недели, в течение примерно 2 недель, в течение примерно 3 недель, в течение примерно 4 недель, в течение примерно 5 недель или в течение примерно 6 недель после того, как клетки исходной композиции были трансдуцированы или трансфецированы.
В некоторых вариантах осуществления клетки исходной композиции обрабатывают, инкубируют и/или приводят в контакт с растворимым антиидиотипическим антителом, с антителом, которое не связывается перекрестно, и/или с антителом, которое не связано или не прикреплено к твердой подложке.
В некоторых вариантах осуществления способы приводят к пролиферации, активации, стимулированию, высвобождению цитокинов или другим функциональным результатам, таким как положительная регуляция маркера активация или высвобождение или продуцирование цитокинов, клеток, экспрессирующих химерный рецептор, такой как CAR, распознаваемый анти-Id антителом. В некоторых аспектах такая пролиферация или другой функциональный ответ или результат индуцируются в таких клетках до степени, сходной или большей, чем та, что индуцируется инкубацией клеток с агентом и/или при условиях, которые стимулируют пролиферацию Т-клеток, таких как в присутствии микросфер с антителом против CD3/CD28 и/или при перекрестном связывании антитела против CD3. В некоторых аспектах способы не включают перекрестное связывание антиидиотипического антитела. В некоторых аспектах любого из вариантов осуществления антиидиотипические агенты способны индуцировать указанный пролиферативный или функциональный исход или его степень без перекрестного связывания антиидиотипического антитела. В некоторых аспектах антиидиотипические агенты настоящего описания имеют преимущество, связанное с их способностью стимулировать или вызывать конкретный функциональный ответ Т-клеток или других иммунных клеток, экспрессирующих целевой рецептор, без необходимости перекрестного связывания анти-Id антитела или использования вторичного агента. В некоторых аспектах результата достигают с помощью растворимой или связанной с планшетами формы антиидиотипического антитела. В некоторых аспектах результата достигают с помощью антиидитипического антитела, связанного с микросферой.
В конкретных вариантах осуществления клетки исходной композиции обрабатывают, инкубируют и/или приводят в контакт при концентрации от 10 пг/мл до 100 мкг/мл, от 1 пг/мл до 1 нг/мл, от 1 нг/мл до 1 мкг /мл от 100 нг/мл до 1,0 мкг/мл, от 1 нг/мл до 100 нг/мл, от 10 нг/мл до 1,0 мкг/мл, от 100 нг/мл до 10 пг/мл, от 250 нг/мл и 10 мкг/мл, от 250 до 1 нг/мл, от 1 до 10 мкг/мл, от 250 до 2,5 мкг/мл или от 1 до 10 мкг/мл.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы на твердой подложке, которая необязательно содержит или конъюгирована с реагентом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой поверхность планшета или лунки. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы в растворимом реагенте, который необязательно представляет собой или содержит множество сайтов связывания, способных обратимо связываться с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления реагент содержит мутеин стрептавидина. В одном иллюстративном варианте осуществления антиидиотипическое антитело содержит стрептавидин-связывающий пептид или другой стрептавидин-связывающий фрагмент, способный связываться с молекулой мутеина стрептавидина или стрептавидина, присутствующей или иммобилизованной на растворимом реагенте, и которая в некоторых случаях может диссоциировать в присутствии конкурентного вещества, такого как биотин. Примеры таких систем включают системы, описанные в опубликованной патентной заявке РСТ № WO 2015/158868.
В конкретных вариантах осуществления клетки исходной композиции обрабатывают, инкубируют и/или приводят в контакт с антиидиотипическим антителом, которое прикреплено, связано, нанесено в виде покрытия и/или конъюгировано с твердой поверхностью или носителем, например планшетом или лункой. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело прикрепляли, связывали, наносили в виде покрытия и/или конъюгировали с твердой поверхностью или подложкой путем инкубации твердой поверхности или подложки с антиидиотипическим антителом некоторой концентрации. В конкретных вариантах осуществления твердую поверхность или подложку инкубируют с антиидиотипическим антителом, концентрация которого составляет от 10 нг/мл до 100 мкг/мл, от 100 нг/мл до 1,0 мкг/мл, от 250 нг/мл до 10 мкг/мл, от 250 нг/мл до 1 мкг/мл, от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл, от 250 нг до 2,5 мкг/мл или от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления твердую поверхность или подложку инкубируют с антиидиотипическим антителом, концентрация которого составляет от 250 нг/мл до 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления твердую поверхность или подложку инкубируют с антиидиотипическим антителом, концентрация которого составляет или примерно составляет 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 2 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл или 10 мкг/мл.
В некоторых вариантах осуществления инкубация длится, по меньшей мере или примерно, по меньшей мере 5 минут, 10 минут, 30 минут, 60 минут, 2 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 36, 48 часов, 72 часа или 96 часов. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит менее чем или менее чем примерно 60%, менее чем или менее чем примерно 50%, менее чем или менее чем примерно 40%, менее чем или менее чем примерно 30%, менее чем или менее чем примерно 20% или менее чем или менее чем примерно 10% CAR-экспрессирующих клеток в процентном содержании от общего числа клеток в композиции. В некоторых вариантах осуществления количество CAR-экспрессирующих клеток в итоговой композиции увеличивается более чем в 1,2 раза, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз или более по сравнению с количеством CAR-экспрессирующих клеток во исходной композиции; и/или процент CAR-экспрессирующих клеток в итоговой композиции по сравнению с общим количеством клеток в композиции увеличивается более чем на 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более. В некоторых вариантах осуществления до инкубации клетки не селектированы или не обогащены CAR-экспрессирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело приводят в контакт или инкубируют с клетками из исходной композиции, например, содержащей CAR-экспрессирующие клетки, в течение некоторого времени, чтобы нарастить одну или более клеток исходной композиции, например, чтобы нарастить клетки исходной композиции, которые экспрессируют рекомбинантный рецептор. В конкретных вариантах осуществления клетки из исходной композиции приводят в контакт, инкубируют или обрабатывают антиидиотипическим антителом в течение, по меньшей мере примерно 12 часов, по меньшей мере примерно 24 часов, по меньшей мере примерно 2 дней, по меньшей мере примерно 3 дней, по меньшей мере примерно 4 дней, по меньшей мере примерно 5 дней, по меньшей мере примерно 6 дней, по меньшей мере примерно 7 дней, по меньшей мере примерно 8 дней, по меньшей мере примерно 9 дней, по меньшей мере примерно 10 дней, по меньшей мере примерно 11 дней, по меньшей мере примерно 12 дней, по меньшей мере примерно 13 дней, по меньшей мере примерно 14 дней, по меньшей мере примерно 3 недель или в течение, по меньшей мере примерно 4 недель. В конкретных вариантах осуществления клетки из исходной композиции приводят в контакт, инкубируют или обрабатывают антиидиотипическим антителом в течение менее чем примерно 1 дня, менее чем примерно 2 дней, менее чем примерно 3 дней, менее чем примерно 4 дней, менее чем примерно 5 дней, менее чем примерно 6 дней или менее чем примерно 12 дней. В некоторых вариантах осуществления клетки из исходной композиции приводят в контакт, инкубируют или обрабатывают антиидиотипическим антителом в течение примерно от 1 дня примерно до 14 дней, примерно от 3 дней до 7 дней или от 4 дней до 6 дней.
В конкретных вариантах осуществления клетки из исходной композиции, например, содержащей клетки, которые экспрессируют CAR, инкубируют, связывают или обрабатывают антиидиотипическим антителом при температурах, превышающих комнатную, для наращивания клеток исходной композиции, которые экспрессируют рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления обработку, инкубацию или контактирование проводят при температуре, более чем примерно 25°С, как например обычно более чем или более чем примерно 32°С, 35°С или 37°С. В некоторых вариантах осуществления обработку, контактирование или инкубацию проводят при температуре, равной или составляющей примерно 37°С ± 2°С, как например при температуре, равной или составляющей примерно 37°С.
В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,9%, примерно 100% или 100% клеток итоговой композиции экспрессируют CAR.
В конкретных вариантах осуществления количество клеток, которые экспрессируют CAR в итоговой композиции, которую инкубировали, обрабатывали и/или приводили в контакт с антиидиотипическим антителом, составляет по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере, в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз больше, чем количество клеток, которые экспрессируют CAR во исходной композиции.
В конкретных вариантах осуществления процент клеток, которые экспрессируют CAR, в итоговой композиции, которую инкубировали, обрабатывали и/или приводили в контакт с антиидиотипическим антителом, составляет, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз больше, чем количество клеток, которые экспрессируют CAR, во исходной композиции.
В некоторых вариантах осуществления количество клеток, которые экспрессируют CAR, в итоговой композиции, которую инкубировали, обрабатывали и/или приводили в контакт с антиидиотипическим антителом, составляет, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере, в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз больше, чем количество клеток итоговой композиции, которые получали поликлональное стимулирование, и которые инкубировали с антителами против CD3 и CD28.
В некоторых вариантах осуществления процент клеток, которые экспрессируют CAR, в итоговой композиции, которую инкубировали, обрабатывали и/или приводили в контакт с антиидиотипическим антителом, составляет, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 2 раза, по меньшей мере 3 раза, по меньшей мере 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере, в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз больше, чем количество клеток итоговой композиции, которые получали поликлональное стимулирование, например, которые инкубировали с антителами против CD3 и CD28.
В некоторых вариантах осуществления клетки, которые экспрессируют CAR, в итоговой композиции, которую инкубировали, обрабатывали и/или приводили в контакт с антиидиотипическим антителом, содержат, по меньшей мере на 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, при, по меньшей мере, 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере на 99% ниже VCN, чем клетки итоговой композиции, которые получала поликлональное стимулирование, например, их инкубировали с антителами против CD3 и CD28. В некоторых вариантах осуществления среднее значение VCN CAR-экспрессирующих клеток на выходе составляет не более чем или примерно 10, 5, 4, 2,5, 1,5 или 1.
В некоторых вариантах осуществления такие способы могут быть использованы как часть способов получения, анализа и/или контроля качества, например, в связи с созданием клеточной терапии с клетками, экспрессирующими рекомбинантные полипептиды, содержащие антитело или его фрагмент, распознаваемые антиидиотипическим антителом, такими как CAR-T-клетки, для целей тестирования, включая тестирование экспрессии и/или активности сконструированного рецептора, например, в клетках, сконструированных для использования в терапии индивидуума. В некоторых вариантах осуществления клеточные композиции могут быть протестированы на любой стадии в процессе генерирования Т-клеток, экспрессирующих CAR. В конкретных вариантах осуществления образец клеток может быть собран из клеточной композиции на любой стадии процесса и сохранен, например, путем крио-замораживания и/или криоконсервации для последующего тестирования и/или анализа. Тестируемые композиции могут быть фармацевтическими композициями, например, включая те, которые содержат клетки и фармацевтически приемлемый реципиент и/или криоконсервант.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело стимулирует клетки, экспрессирующие антитело-мишень, например, CAR, in vivo. Конкретные варианты осуществления предполагают, что терапия CAR-T-клетками эффективна при лечении онкологического заболевания и других заболеваний и расстройств. Однако в некоторых контекстах доступные подходы к терапии CAR-T-клетками не всегда могут быть полностью удовлетворительными. Например, в некоторых вариантах осуществления экспонирование и персистенция CAR-экспрессирующих клеток у пациента уменьшается или уменьшается со временем. Тем не менее, наблюдения показывают, что в некоторых случаях повышенное экспонирование CAR-экспрессирующих клеток может улучшить эффективность и терапевтические результаты в терапии CAR-T-клетками. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят для усиления, повышения и/или увеличения персистенции и/или экспансии клеток, экспрессирующих CAR.
В определенных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят пациенту, такому пациенту, которому ранее вводили терапевтическую клеточную композицию, содержащую CAR-экспрессирующие клетки. В некоторых вариантах осуществления введение антиидиотипического антитела пациенту способствует повторной экспансии CAR-экспрессирующих клеток у пациента, которая в некоторых случаях может достигать или превышать начальный пиковый уровень экспансии до введения антиидиотипического антитела. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят для модулирования экспансии и/или персистенции CAR-экспрессирующих клеток в моменты, когда уровни CAR-экспрессирующих клеток снижаются или не обнаруживаются. В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки, которые повторно наращиваются с помощью антиидиотипического антитела, проявляют повышенную активность у пациента, которому их вводят, например, по сравнению с эффективностью до введения антиидиотипического антитела.
В некоторых вариантах осуществления введение антиидиотипического антитела увеличивает или усиливает персистентность CAR-экспрессирующих клеток у пациента. В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки, детектируются у пациента через или по меньшей мере через 7 дней, 14 дней, 21 дня, 28 дней, 35 дней, 42 дней, 49 дней, 56 дней, 63 дня, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев или более чем через 6 месяцев после введения антиидиотипического антитела. В некоторых аспектах повышенное экспонирование пациента с клетками включает в себя экспансию и/или повышенную экспансию клеток.
В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки наращиваются у пациента после введения антиидиотипического антитела. В конкретных вариантах осуществления введение антиидиотипического антитела приводит к максимальной концентрации в крови, сыворотке или другой жидкости организма, органе или ткани пациента, которая составляет, по меньшей мере, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000 или 15000 копий нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, на микрограмм ДНК, или по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9 CAR-экспрессирующих клеток на микролитр. В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки, детектируются как, по меньшей мере при 10, 20, 30, 40, 50 или 60% от общего количества PBMC в крови пациента, так и/или на таком уровне, по меньшей мере в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48 или 52 недель после введения антиидиотипического антитела, или в течение 1, 2, 3, 4 или 5 или более лет после введения антиидиотипического антитела. В некоторых аспектах введение антиидиотипического антитела приводит к увеличению по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 10 или по меньшей мере в 20 раз количества копий нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный рецептор, например, CAR на микрограмм ДНК, например, в сыворотке, плазме, крови или ткани, например, в образце опухоли пациента. В конкретных вариантах осуществления введение антиидиотипического антитела приводит к увеличению, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 10 или по меньшей мере в 20 раз количества циркулирующих CAR-экспрессирующих клеток у пациента.
2
3
4
5
6
6
7
7
8
В некоторых аспектах, по меньшей мере примерно 1×10, по меньшей мере примерно 1×10, по меньшей мере примерно 1×10, по меньшей мере примерно 1×10, или по меньшей мере примерно 1×10, или по меньшей мере примерно 5×10, или по меньшей мере примерно 1×10, или по меньшей мере примерно 5×10, или по меньшей мере примерно 1×10 CAR-экспрессирующих клеток и/или по меньшей мере 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 или 1000, CAR-экспрессирующих клеток на микролитр например, по меньшей мере 10 на микролитр, обнаруживаются или присутствуют у пациента или в жидкости, плазме, сыворотке, ткани или их компартменте, например в крови, например, в периферической крови, или в месте заболевания после введения антиидиотипического антитела. В некоторых вариантах осуществления такое количество или концентрация клеток детектируется у пациента в течение, по меньшей мере примерно 20 дней, по меньшей мере примерно 40 дней, или по меньшей мере примерно 60 дней, или по меньшей мере примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев или по меньшей мере в течение 2 или 3 лет после введения антиидиотипического антитела.
Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения антиидиотипического антитела. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят путем инкапсуляции и/или прикрепления к липосомам, микрочастицам и микрокапсулам. Способы введения антиидиотипического антитела включают, но не ограничиваются ими, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Антиидиотипическое антитело может вводиться любым удобным путем, например, инфузией, болюсной инъекцией, абсорбцией через эпителиальную или слизистую оболочку (например, слизистую оболочку полости рта, прямой кишки и кишечника и т. д.), и может вводиться вместе с другими биологически активными веществами. Введение может быть системным или локальным. Легочное введение также можно применять, например, с использованием ингалятора или небулайзера и композиции с аэрозольным агентом. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело доставляется в везикуле, в частности, в липосоме (Langer, 1990, Science 249: 1527-1533), например, в катионной липосоме (WO 98140052).
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ получения клеточной композиции, включающий введение в клетки молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, тем самым генерируя исходную композицию, и инкубацию исходной композиции с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, специфичным для антиген-связывающего домена CAR, получая тем самым клеточную композицию. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент, который специфически связывается с CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой антитело SJ25C1 или FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляют собой антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент являются агонистами CAR. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем вирусной трансдукции, транспозиции, электропорации или химической трансфекции. В некоторых вариантах осуществления введение включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем трансдукции ретровирусным вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, путем трансдукции лентивирусным вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, путем транспозиции с транспозоном, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, или путем электропорации или трансфекции вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию стимулирования или активации клеток перед введением молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR. В некоторых вариантах активация клеток включает контактирование клеток с агонистом CD3 и необязательно агонистом CD28. В некоторых вариантах осуществления активация клеток включает контактирование клеток с реагентом, содержащим агонистические антитела против CD3 и против CD28. В некоторых таких вариантах осуществления, во время, по меньшей мере части контакта с антителом против CD3/CD28 и/или во время, по меньшей мере части введения нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, способ включает инкубацию или контактирование клеток с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления инкубацию проводят в условиях, в которых антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связываются с CAR, таким образом индуцируя или модулируя сигнал в одной или более клетках во исходной композиции. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат Т-клетки.
В некоторых таких вариантах осуществления Т-клетки содержат CD4+ и/или CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы на твердой подложке, которая необязательно содержит или конъюгирована с реагентом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы в растворимом реагенте, который необязательно представляет собой или содержит множество сайтов связывания, способных обратимо связываться с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах осуществления реагент содержит мутеин стрептавидина. В одном иллюстративном варианте осуществления антиидиотипическое антитело содержит стрептавидин-связывающий пептид или другой стрептавидин-связывающий фрагмент, способный связываться с молекулой стрептавидина или мутеина стрептавидина, присутствующей или иммобилизованной на растворимом реагенте, и которая в некоторых случаях может диссоциировать в присутствии конкурентного вещества, такого как биотин. Примеры таких систем включают системы, описанные в опубликованной патентной заявке РСТ № WO 2015/158868. В некоторых вариантах осуществления инкубация длится по меньшей мере или примерно, по меньшей мере 5 минут, 10 минут, 30 минут, 60 минут, 2 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 36, 48 часов, 72 часа или 96 часов. В некоторых вариантах осуществления исходная композиция содержит менее чем или менее чем примерно 60%, менее чем или менее чем примерно 50%, менее чем или менее чем примерно 40%, менее чем или менее чем примерно 30%, менее чем или менее чем примерно 20% или менее чем или менее чем примерно 10% CAR-экспрессирующих клеток в процентном содержании от общего числа клеток в композиции. В некоторых вариантах осуществления количество CAR-экспрессирующих клеток в итоговой композиции увеличивается более чем в 1,2 раза, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз или более по сравнению с количеством CAR-экспрессирующих клеток во исходной композиции; и/или процент CAR-экспрессирующих клеток в итоговой композиции по сравнению с общим количеством клеток в композиции увеличивается более чем на 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более. В некоторых вариантах осуществления до инкубации клетки не селектированы или не обогащены CAR-экспрессирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ мониторинга активности CAR, содержащего антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, включающий стадии инкубации образца, содержащего T-клетки, трансдуцированные с помощью CAR, с агонистическим антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, которые нацелены или связываются с CAR; и/или определения присутствия, отсутствия или количества активации, стимулирования и/или экспансии CAR-Т-клеток, тем самым контролируя активность CAR-T-клеток. В некоторых вариантах осуществления такие способы могут использоваться для проверки достоверности CAR, и в этом случае способ может включать в себя: c) проверку достоверности CAR на основании уровня активации, стимулирования и/или экспансии CAR-T-клеток.
В некоторых вариантах осуществления активацию, стимулирование и/или экспансию CAR-T-клеток оценивают путем определения жизнеспособности, пролиферации и/или экспрессии маркеров активации T-клеток в CAR-T-клетках после периода инкубации с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность CAR-Т-клеток оценивают путем подсчета процента живых по отношению к суммарным Т-клеткам, трансдуцированным CAR, после инкубации с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления пролиферацию CAR-Т-клеток оценивают путем разбавления красителя, используемого для окрашивания CAR-Т-клеток, перед инкубацией с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркеров активации Т-клеток оценивают проточной цитометрией с окрашиванием на антитела, распознающие маркеры активации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления маркеры активации T-клеток выбраны из группы, состоящей из CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD69, CD71, CD134, CD137 и CD154. В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет примерно от 1 примерно до 10 дней (например, примерно любой диапазон из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ мониторинга препарата CAR-T-клеток, где CAR включает антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, причем способ включает а) инкубацию части препарата с агонистическим антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, который нацелен на CAR или связывается с ним; и b) определение присутствия, отсутствия или количества активации, стимулирования и/или экспансии CAR-Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки могут представлять собой клетки, произведенные или изготовленные в конкретных условиях, целесообразных для тестирования. В некоторых вариантах осуществления мониторинг проводят в связи с релиз-анализом, таким как валидация клеток перед введением пациенту. В некоторых аспектах способ дополнительно включает валидацию препарата на основе уровня активации CAR-Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления активацию CAR-T-клеток в препарате оценивают путем определения жизнеспособности, пролиферации и/или экспрессии маркеров активации T-клеток в CAR-T-клетках после периода инкубации с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления жизнеспособность CAR-Т-клеток оценивают путем подчета процента живых по отношению к суммарным Т-клеткам, трансдуцированным CAR, после инкубации с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления пролиферацию CAR-T-клеток оценивают путем разбавления красителя, используемого для окрашивания CAR-T-клеток, перед инкубацией с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления экспрессию маркеров активации Т-клеток оценивают проточной цитометрией с окрашиванием на антитела, распознающие маркеры активации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления маркеры активации T-клеток выбраны из группы, состоящей из CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD69, CD71, CD134, CD137 и CD154. В некоторых вариантах осуществления период инкубации составляет примерно от 1 примерно до 10 дней (например, примерно любой из диапазонов, составляющих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, включая любые диапазоны между этими значениями). В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
C. Использование в инактивации/истощении клеток
В некоторых вариантах осуществления предложенные антиидиотипические антитела или их антиген-связывающие фрагменты являются антагонистами и/или проявляют специфическую активность в отношении ингибирования, абляции и/или истощения (например, уничтожения через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, ADCC) клеток, экспрессирующих антитело-мишень, такое как антитело против CD19 (например, антитело SJ25C1 или FMC63) или его антиген-связывающий фрагмент. Также предложены способы, включающие использование предложенных антиидиотипических антител и молекул (таких как конъюгаты и комплексы), содержащих одно или более таких антиидиотипических антител, для инактивации, абляции и/или истощения CAR-T-клеток, где CAR включает антитело-мишень, такое как антитело против CD19 (например, антитело SJ25C1 или FMC63), или его антиген-связывающий фрагмент.
Способы в некоторых вариантах осуществления включают обработку, контактирование и/или инкубацию композиции и/или образца, содержащего Т-клетки, трансдуцированные CAR, с антиидиотипическим антителом. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают детектирование того, инактивированы ли CAR-T-клетки, например, путем оценки жизнеспособности, пролиферации и/или экспрессии маркеров активации в CAR-T-клетках. В некоторых вариантах осуществления способы связаны с терапией, включающей введение CAR-T-клеток. Способы в некоторых вариантах осуществления включают введение антиидиотипического антитела индивидууму. В одном варианте осуществления антиидиотипическое антитело или конъюгат используют для удаления и/или истощения (например, уничтожения) CAR-T-клеток у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой антитело против CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень представляет собой или получено из антитела SJ25C1 или FMC63 или их антиген-связывающих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят для истощения, снижения и/или уменьшения количества CAR-экспрессирующих клеток у пациента. В конкретных вариантах осуществления введение антиидиотипического антитела истощает, снижает и/или уменьшает количество CAR-экспрессирующих клеток например циркулирующих CAR-T-клеток, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,9%, на 100% или примерно на 100%. В некоторых вариантах осуществления истощение, снижение и/или уменьшение связано с количеством CAR-экспрессирующих клеток у пациента до введения антиидиотипического антитела. В конкретных вариантах осуществления истощение, снижение и/или уменьшение связано с количеством CAR-экспрессирующих клеток у пациента, которому не вводят антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления CAR-экспрессирующие клетки, не детектируются у пациента после введения антиидиотипического антитела. В конкретных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой человеческое или гуманизированное антитело.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ инактивации CAR-T-клеток, в котором CAR включает антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, причем способ включает инкубацию образца, содержащего CAR-T-клетки, с антагонистическим антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, нацеленным на CAR, инактивируя тем самым CAR-T-клетки в образце. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело используется в количестве, достаточном для ослабления активации CAR-T-клеток в образце. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело используется в количестве, достаточном для существенной инактивации CAR-T-клеток в образце. В некоторых вариантах осуществления инкубация с антиидиотипическим антителом приводит к абляции и/или истощению CAR-T-клеток в образце. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело используется в количестве, достаточном для того, чтобы привести к клиренсу CAR-T-клеток в образце. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят для истощения, снижения и/или уменьшения активности CAR и/или CAR-экспрессирующих клеток у пациента. В конкретных вариантах осуществления введение антиидиотипического антитела уменьшает и/или снижает стимулирование и/или активацию CAR и/или CAR-экспрессирующей клетки по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,9%, на 100% или примерно на 100%. В некоторых вариантах осуществления уменьшение и/или снижение связано со стимулированием и/или активностью CAR-экспрессирующих клеток и/или CAR у пациента до введения антиидиотипического антитела. В конкретных вариантах осуществления уменьшение и/или снижение связано со стимулированием и/или активностью CAR и/или CAR-экспрессирующих клеток у пациента, которому не вводят антиидиотипическое антитело. В некоторых вариантах осуществления активность и/или стимулирование относятся к одному или более аспектам активности рецептора CAR или CAR-T-клеток, и могут оцениваться любыми подходящими известными способами, в том числе любыми способами, представленными в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления активность и/или стимулирование CAR и/или CAR-экспрессирующих клеток у пациента не детектируется у пациента после введения антиидиотипического антитела. В конкретных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой человеческое или гуманизированное антитело.
В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят для предотвращения, снижения и/или уменьшения связывания и/или способности CAR и/или CAR-экспрессирующих клеток связываться с антигеном. В конкретных вариантах осуществления введение антиидиотипического антитела уменьшает и/или снижает антигенное связывание CAR и/или CAR-экспрессирующей клетки по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,9%, на 100% или примерно на 100%. В некоторых вариантах осуществления снижение и/или уменьшение имеет отношение к антигенному связыванию и/или способности CAR и/или CAR-экспрессирующих клеток связываться с антигеном у пациента до введения антиидиотипического антитела. В конкретных вариантах осуществления снижение и/или уменьшение имеет отношение к связыванию антигена и/или способности связывать антиген CAR и/или CAR-экспрессирующих клеток у пациента, которому не вводили антиидиотипическое антитело. В конкретных вариантах осуществления антиидиотипическое антитело представляет собой человеческое или гуманизированное антитело.
В некоторых вариантах осуществления предлагается способ абляции и/или истощения (например, уничтожения) CAR-T-клеток, где CAR включает антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, причем способ включает инкубацию образца, содержащего CAR-T-клетки, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, нацеленным на CAR, тем самым удаляя и/или истощая CAR-T-клетки в образце. В некоторых вариантах осуществления абляция и/или истощение происходят посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело используется в количестве, достаточном для того, чтобы привести к абляции и/или истощению по существу всех CAR-T-клеток в образце. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ регуляции CAR-T-клеточной терапии у индивидуума, где CAR включает антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, причем способ включает введение индивидууму антагонистического антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, нацеленного на CAR, тем самым инактивируя CAR-Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят в количестве, достаточном для ослабления активации CAR-T-клеток у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят в количестве, достаточном для существенной инактивации CAR-T-клеток у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления введение антиидиотипического антитела приводит к абляции и/или истощению CAR-T-клеток у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело вводят в количестве, достаточном для того, чтобы привести к клиренсу CAR-T-клеток у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления предложен способ регуляции CAR-T-клеточной терапии у индивидуума, где CAR включает антитело-мишень, такое как антитело SJ25C1 или FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, причем способ включает введение индивидууму иммуноконъюгата антиидиотипического антитела, нацеленного на CAR, где иммуноконъюгат антиидиотипического антитела содержит цитотоксический агент. В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат антиидиотипического антитела вводят в количестве, достаточном для ослабления CAR-T-клеточной терапии у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат антиидиотипического антитела вводят в количестве, достаточном, чтобы по существу прекратить CAR-T-клеточную терапию у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат антиидиотипического антитела вводят в количестве, достаточном для того, чтобы привести к клиренсу CAR-T-клеток у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из химиотерапевтических агентов или лекарственных средств, агентов, ингибирующих рост, токсинов (например, белковых токсинов, ферментативно активных токсинов бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагментов) или радиоактивных изотопов. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
D. Использование в анализе связывания или в способе
В настоящем документе предложены способы оценки присутствия или отсутствия молекулы в образце, которая связывается с химерным антигенным рецептором (CAR), таким как внеклеточный домен CAR, или с его частью, содержащей антиген-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для оценки присутствия или отсутствия гуморального ответа или ответа антител пациента на введенную клеточную терапию, включающую химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит антитело-мишень, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, специфичный к внеклеточному домену CAR, такие как любой из описанных в настоящем документе, можно использовать в качестве положительного контроля способа.
В конкретных вариантах осуществления способ включает контактирование образца с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, специфичным для внеклеточного домена CAR, при концентрации антиидиотипического антитела от 10 нг/мл до 100 мкг/мл, от 100 нг/мл. и 1,0 мкг/мл, от 250 нг/мл до 10 мкг/мл, от 250 нг/мл до 1 мкг/мл, от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл, от 250 нг до 2,5 мкг/мл или от 1 мкг/мл и 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация антиидиотипического антитела составляет от 250 нг/мл до 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация антиидиотипического антитела составляет примерно 0,1 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 2 мкг/мл, 2,5 мкг/мл или 5 мкг/мл.
В некоторых аспектах адоптивная клеточная терапия может быть связана с развитием иммунного ответа пациента на вводимые клетки и/или конструкцию. Например, в некоторых случаях воздействие химерного рецептора может быть ограничено иммунным ответом хозяина против рекомбинантных рецепторов, экспрессируемых введенными клетками, который может преждевременно уничтожить клетки. Наблюдается, что даже у некоторых пациентов, имеющих В-клеточные злокачественные новообразования, которые часто имеют ослабленный иммунитет, может быть обнаружен иммунный ответ, специфичный для областей рецепторов, экспрессируемых клетками, которые вводят в адоптивной клеточной терапии. Например, у пациентов, например людей, которым вводят клетки, генетически сконструированные с использованием CAR, может развиться специфический иммунный ответ на иммуногенную область химерной области, включая области, которые могут содержать последовательности, не являющиеся человеческими (например, мышиные scFv), и/или на область содержащую соединение между двумя доменами или частями химерного рецептора, например трансмембранным и костимулирующим доменом CAR.
В некоторых вариантах осуществления предлагаются способы, которые включают контактирование или инкубацию связывающего реагента с образцом пациента, которому вводили клеточную терапию, включающую клетки, сконструированные с химерным антигенным рецептором, где связывающий реагент представляет собой белок, который включает внеклеточный домен CAR или его часть, содержащие антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают детектирование того, образуется ли комплекс между связывающим реагентом и молекулой, например, связывающей молекулой, такой как антитело, присутствующее в образце, и/или детектирование присутствия или отсутствия или уровня такого связывания. В некоторых вариантах осуществления контактирование или инкубацию осуществляют в условиях, допускающих связывание связывающего реагента с молекулой, присутствующей в образце пациента. В определенных аспектах способ может быть далее осуществлен на образце положительного контроля, содержащем антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, специфичный для CAR, такой как любой из описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления определение присутствия, отсутствия или уровня связывания молекулы со связывающим реагентом может включать сравнение связывания или детектирование связывания или детектирование образца положительного контроля со связывающим реагентом.
В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия представляет собой или содержит генетически сконструированные клетки, экспрессирующие анти-CD19 CAR, включающий антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент, где связывающий реагент содержит внеклеточный домен CAR или его часть, содержащие антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления положительный контроль включает антиидитопическое антитело, как описано в подразделе I.A.
В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия представляет собой или содержит генетически сконструированные клетки, экспрессирующие анти-CD19 CAR, включающие антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, где связывающий реагент содержит внеклеточный домен CAR или его часть, содержащие антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления положительный контроль включает в себя антиидитопическое антитело, как описано в подразделе I.B.
В некоторых вариантах осуществления способы включают детектирование того, образуется ли комплекс между связывающим реагентом и молекулой, например, связывающей молекулой, такой как антитело, присутствующее в образце, и/или детектирование присутствия или отсутствия или уровня такого связывания. В некоторых вариантах осуществления контактирование или инкубацию осуществляют в условиях, допускающих связывание связывающего реагента с молекулой, присутствующей в образце пациента. В некоторых аспектах комплекс детектируют с помощью иммуноанализа, необязательно, сэндвич-анализа или мостикового анализа. Например, иммуноанализ представляет собой иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный, электрохемилюминесцентный, биосенсор на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (например, BIAcore), проточную цитометрию или вестерн-блот-анализ. В некоторых вариантах осуществления иммуноанализ представляет собой или включает мезомасштабное обнаружение.
В некоторых аспектах иммуноанализ представляет собой сэндвич-анализ или мостиковый анализ. В сэндвич-анализе или мостиковом анализе связывающий реагент является первым связывающим реагентом, и детектирование присутствия или отсутствия молекулы или комплекса, включающего молекулу, включает контактирование комплекса, образованного между первым связывающим реагентом и молекулой, со вторым связывающим реагентом, в котором второй связывающий реагент представляет собой агент, способный связываться с той же или сходной молекулой, что и первый связывающий реагент. В некоторых вариантах осуществления второй связывающий реагент содержит внеклеточный домен CAR или его часть. В некоторых аспектах внеклеточный домен CAR или его часть первого связывающего агента и второго связывающего агента являются одинаковыми или по существу одинаковыми.
В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент, такой как первый и/или второй связывающий реагент, детектируемо помечены или способны генерировать детектируемый сигнал. Связывающий реагент, такой как первый и/или второй связывающий реагент, прямо или косвенно связаны с детектируемой меткой. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка представляет собой или включает флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, электролюминесцентную метку, колориметрическую метку, биолюминесцентную метку или радиоактивную метку. В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент, такой как первый и/или второй связывающий реагент, прямо или косвенно связан с SULFO-меткой. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из первого и второго связывающих реагентов детектируемо помечен или способен генерировать детектируемый сигнал, а другой из первого и второго связывающих реагентов прикреплен или иммобилизован на твердой подложке. В некоторых аспектах первый связывающий реагент прикреплен или иммобилизован на твердой подложке или может быть прикреплен или иммобилизован на твердой подложке. Способы прямого или косвенного прикрепления связывающего реагента к твердой подложке хорошо известны в данной области. Способы прикрепления обычно включают неспецифическую адсорбцию связывающего реагента на твердой подложке или ковалентное присоединение связывающего реагента, обычно через свободную аминогруппу, к химически реакционноспособной группе на твердой подложке, такой как активированная карбоксильная, гидроксильная, или альдегидная группа. Способы прикрепления также включают косвенное прикрепление связывающего реагента к твердой подложке, например, путем нанесения на твердую подложку реагента захвата, такого как стрептавидин, и добавления к твердой подложке аффинно-меченных связывающих реагентов, таких как меченные биотином реагенты, так что взаимодействие между аффинной меткой (например, биотином) и реагентом захвата (например, стрептавидином) связывает связывающий реагент с твердой подложкой. В некоторых вариантах осуществления первый связывающий реагент прямо или косвенно связан с биотином. В некоторых примерах первый растворимый реагент связан с твердой подложкой, покрытой стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления второй связывающий реагент прямо или косвенно связан с детектируемой меткой, необязательно SULFO-меткой.
В конкретных вариантах осуществления образец контактирует с первым связывающим реагентом, который прикреплен, связан, нанесен в виде покрытия и/или конъюгирован с твердой поверхностью или подложкой, например планшетом или лункой. В некоторых вариантах осуществления первый связывающий реагент прикреплен, связан, нанесен в виде покрытия и/или конъюгирован с твердой поверхностью или путем косвенного прикрепления связывающего реагента к твердой подложке, как например, путем нанесения на твердую подложку реагента захвата, такого как стрептавидин, и добавления к твердой подложке аффинно-меченных связывающих реагентов, таких как меченные биотином реагенты, так что взаимодействие между аффинной меткой (например, биотином) и реагентом захвата (например, стрептавидином) связывает связывающий реагент с твердой подложкой. В некоторых вариантах осуществления образец контактирует со вторым связывающим реагентом, который прямо или косвенно связан с SULFO-меткой. В конкретных вариантах осуществления первый и/или второй связывающий реагент используют при концентрации антиидиотипического антитела, которая составляет от 10 нг/мл до 100 мкг/мл, от 100 нг/мл до 1,0 мкг/мл, от 250 нг/мл до 10 мкг/мл, от 250 нг/мл до 1 мкг/мл, от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл, от 250 нг до 2,5 мкг/мл или от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления твердую поверхность или подложку инкубируют с антиидиотипическим антителом, концентрация которого составляет от 250 нг/мл до 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления твердую поверхность или подложку инкубируют с концентрацией, составляющей или примерно составляющей 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 2 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл или 10 мкг/мл.
В некоторых вариантах осуществления образец от пациента, которому вводили клеточную терапию, включающую клетки, сконструированные с химерным антигенным рецептором, представляет собой или содержит любой образец телесной жидкости пациента. В некоторых аспектах образец представляет собой или содержит цельную кровь, сыворотку или плазму. В некоторых вариантах осуществления образец получают от пациента в течение или примерно в течение от 1 часа до 1 года после начала введения клеточной терапии или дозы клеток, например в течение или примерно в течение 6 часов, 12 часов, 24 часа, одной недели, двух недель, трех недель, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев или двенадцати месяцев. В некоторых аспектах образец получают от пациента в срок от или примерно от 1 месяца до 6 месяцев от начала введения клеточной терапии, например от 2 месяцев до 6 месяцев или от 2 месяцев до 4 месяцев, например, примерно или приблизительно через 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев или 6 месяцев после начала применения клеточной терапии.
VI. Изделия
Также предложены изделия или наборы, содержащие предложенные антиидиотипические антитела и/или композиции. В некоторых вариантах осуществления предложены изделия, содержащие антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых случаях антиидиотипическое антитело связывается с антителом против CD19 или его антиген-связывающим фрагментом или химерным антигенным рецептором, содержащим антитело против CD19 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых примерах антитело против CD19 представляет собой SJ25C1 или FMC63. В некоторых аспектах в изделиях или наборах предлагается конъюгат, содержащий антиидиотипические антитела, описанные в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления набор или изделие включают антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент и связывающий реагент, содержащий внеклеточный домен или часть внеклеточного домена химерного антигенного рецептора (CAR), с которым связывается антиидиотипическое антитело, например, специфически связывается. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен CAR представляет собой или включает антитело против CD19 (например, FMC63 или SJ25C1) или его антиген-связывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент представляет собой первый связывающий реагент, и набор или изделие производства дополнительно включает второй связывающий реагент. В таких примерах второй связывающий реагент представляет собой агент, который способен связываться с той же или сходной молекулой, что и первый связывающий реагент. В некоторых вариантах осуществления второй связывающий реагент содержит внеклеточный домен CAR или его часть. В некоторых аспектах внеклеточный домен CAR или его часть первого связывающего агента и второго связывающего агента являются одинаковыми или по существу одинаковыми.
В некоторых вариантах осуществления связывающий реагент или по меньшей мере один из первого и второго связывающих реагентов прикреплен к метке (например, детектируемой метке), такой как метка, описанная в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один из первого и второго связывающих реагентов прикреплен к твердой подложке или способен прикрепляться к твердой подложке, такой как описанная в настоящем документе. В некоторых аспектах один из первого и второго связывающих реагентов детектируемо помечены или способны генерировать детектируемый сигнал, а другой из первого и второго связывающих реагентов прикреплен или иммобилизован на твердой подложке. В некоторых вариантах осуществления связывающие реагенты предлагаются в виде набора или в виде части системы, как описано в другом месте настоящего документа, для использования в связи с иммуноанализом (например, сэндвич-анализом или мостиковым анализом). В некоторых вариантах осуществления первый связывающий реагент связан с твердой подложкой, необязательно с твердой подложкой, покрытой стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления второй растворимый белок прямо или косвенно связан с детектируемой меткой, такой как SULFO-метка.
В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент. В некоторых аспектах антиидиотипическое антитело связывается с антителом против CD19 или его антиген-связывающим фрагментом или химерным антигенным рецептором, содержащим антитело против CD19 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых примерах антитело против CD19 представляет собой SJ25C1 или FMC63. В некоторых вариантах осуществления антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент предлагается в качестве образца положительного контроля. В некоторых примерах образец положительного контроля образует комплекс с первым и вторым растворимыми белками или реагентами, которые содержат области внеклеточного домена химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего антитело против CD19 или его антиген-связывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления набор или изделие содержат реагенты или компоненты для осуществления любого из предложенных способов. В некоторых вариантах осуществления изделие или набор содержат один или более реагентов или других материалов, целесообразных с коммерческой, терапевтической и пользовательской точек зрения, включая вторичные антитела, аффинные метки, реагенты захвата, буферы, разбавители, агенты для детектирования сигналов, фильтры, иглы, шприцы, капиллярные трубки и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
В некоторых вариантах осуществления наборы могут быть предоставлены в виде изделий, которые включают упаковочные материалы для упаковки антител или их композиций или одного или более дополнительных реагентов, например, связывающих реагентов или компонентов. Например, наборы могут содержать контейнеры, бутылки, пробирки, флаконы и любой упаковочный материал, подходящий для разделения или организации компонентов набора.
В некоторых вариантах осуществления набор включает один или более контейнеров. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы (например, двухкамерные флаконы), шприцы (такие как однокамерные или двухкамерные шприцы) и пробирки. Один или более контейнеров могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Один или более контейнеров содержат композицию, содержащую антитело или другие реагенты, например связывающие реагенты, для использования в способах. Изделие или набор могут содержать антитела или реагенты в отдельных контейнерах или в одном и том же контейнере. В некоторых вариантах осуществления один или более контейнеров, содержащих композицию, могут представлять собой флакон одноразового использования или флакон многоразового использования, что в некоторых случаях может позволить повторное использование восстановленной композиции.
В некоторых вариантах осуществления изделие или набор могут дополнительно содержать второй контейнер, содержащий подходящий разбавитель. Изделие или набор могут дополнительно включать другие материалы, целесообразные с коммерческой, терапевтической и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, терапевтические агенты и/или вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
Изделия могут включать контейнер и этикетку или вкладыш внутри упаковки или связаны с ними. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты для внутривенного введения и т. д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер в некоторых вариантах осуществления содержит композицию, содержащую антиидиотипическое антитело, предложенное в настоящем документе, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией эффективна для лечения, предотвращения и/или диагностики заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления контейнер имеет стерильный порт доступа. Типичные контейнеры включают внутривенные растворы, флаконы, в том числе с пробками, прокалываемыми иглой для инъекции. Изделие может включать первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция включает антиидиотипическое антитело. Альтернативно или дополнительно, изделие может дополнительно включать другой или такой же контейнер, содержащий приемлемый буфер. Кроме того, он может включать другие материалы, такие как другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и/или шприцы.
В некоторых вариантах осуществления изделие или набор содержат твердую подложку, включая твердую подложку, образованную из стекла (например, пористого стекла с порами контролируемого размера), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливинилового спирта, нитроцеллюлозы, целлюлозы, нейлона, силикона и других материалов, хорошо известных в данной области, которые используют в твердой подложке для прямого или косвенного присоединения связывающего реагента, как описано в настоящем документе. Твердые подложки, включенные в изделия или комплекты, предложенные в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, микросферу, колонку (например, хроматографическую колонку и т. д.), чип (например, микрочип, наночип и т. д.), аналитический планшет, картридж, палочку, фильтр, полоску или любую другую твердую подложку, описанную в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления изделие или набор могут дополнительно содержать второй контейнер, содержащий подходящий разбавитель. Изделие или набор могут дополнительно включать другие материалы, целесообразные с коммерческой, терапевтической и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, терапевтические агенты и/или вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
В некоторых вариантах осуществления набор может, необязательно, включать инструкции. Инструкции, как правило, включают вещественное выражение, описывающее антитела и, необязательно, другие компоненты, включенные в набор, например, связывающий реагент, и способы использования антител и/или других компонентов в любых из применений или способов или в сочетании с ними, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления инструкции предоставляются в виде этикетки или вкладыша в упаковку, которая находится на контейнере или связана с ним. В некоторых вариантах осуществления инструкции могут указывать направления для восстановления и/или использования композиции.
В некоторых вариантах осуществления приведены инструкции по использованию антиидиотипического антитела для детектирования антитела SJ25C1 или его антиген-связывающего фрагмента или химерного антигенного рецептора, содержащего антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, например, в соответствии или в сочетании с любым из методов или анализов, как описано в настоящем документе. В некоторых примерах даны инструкции по использованию антиидиотипического антитела для селекции или обогащения из клеточной популяции сконструированных клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых примерах приведены инструкции по использованию антиидиотипического антитела для стимулирования исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор, содержащий антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления приведены инструкции по использованию антиидиотипического антитела для детектирования антитела FMC63 или его антиген-связывающего фрагмента или химерного антигенного рецептора, содержащего антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент, например, в соответствии или в сочетании с любым из методов или анализов, как описано в настоящем документе. В некоторых примерах даны инструкции по использованию антиидиотипического антитела для селекции или обогащения из клеточной популяции сконструированных клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых примерах приведены инструкции по использованию антиидиотипического антитела для стимулирования исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор, содержащий антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент.
В некоторых вариантах осуществления приведены инструкции по использованию набора, предложенного для детектирования молекулы, которая связывается с рецептором химерного антигенного рецептора клеточной терапии, такой как антитело, например антитело, продуцируемое при гуморальном иммунном ответе на химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления приведены инструкции по контактированию связывающего реагента с образцом пациента, которому вводили клеточную терапию, включающую клетки, сконструированные с использованием CAR, содержащего антитело-мишень, которым является антитело против CD19 (например, FMC63 или SJ25C1), или его антиген-связывающий фрагмент, где связывающий реагент содержит внеклеточный домен CAR или часть внеклеточного домена, содержащих антитело-мишень, или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых аспектах инструкции также определяют детектирование присутствия или отсутствия комплекса, включающего связывающие реагенты и молекулу из образца, которая связывается как с первым, так и со вторым связывающим реагентом, где молекула необязательно представляет собой или содержит антитело. В некоторых аспектах антитело против CD19 представляет собой SJ25C1 или FMC63. В некоторых дополнительных вариантах осуществления приведены инструкции по использованию связывающих реагентов и образца положительного контроля.
VII. Определения
Если не указано иное, все термины данной области техники, замечания и другие технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. В некоторых случаях термины с общепринятыми значениями определены в настоящем документе для ясности и/или для удобства ссылки, и включение таких определений в данное описание не обязательно должно истолковываться как представляющее существенную разницу по сравнению с тем, что обычно понимается в данной области техники.
Используемый в настоящем описании термин «соответствующая форма» антитела означает, что при сравнении свойства или активности двух антител это свойство сравнивается с использованием одной и той же формы антитела. Например, если указано, что антитело обладает большей активностью по сравнению с активностью соответствующей формы первого антитела, это означает, что конкретная форма, такая как scFv этого антитела, обладает большей активностью по сравнению с формой scFv первого антитела.
Используемое в настоящем описании выражение, что положения нуклеотидов или аминокислот «соответствуют» положениям нуклеотидов или аминокислот в раскрытой последовательности, такой как представленная в списке последовательностей, относится к положениям нуклеотидов или аминокислот, идентифицированных при выравнивании с раскрытой последовательностью, чтобы максимизировать идентичность с использованием стандартного алгоритма выравнивания, такого как алгоритм GAP. Выравнивая последовательности, специалист в данной области может идентифицировать соответствующие остатки, например, используя консервативные и идентичные аминокислотные остатки в качестве направляющих. В общем, чтобы идентифицировать соответствующие положения, последовательности аминокислот выравнивают так, чтобы получить соответствие наивысшего порядка (см., например: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. и Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
«Эффекторные функции» относятся к таким биологическим активностям, которые относятся к Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора); и активацию B-клеток.
Термин «Fc-область» используется в настоящем описании для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Термин включает Fc-область с нативной последовательностью и варианты Fc-областей. В одном варианте осуществления Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако C-концевой лизин (Lys447) Fc-области может присутствовать или не присутствовать. Если в настоящем описании не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу сходную со структурой нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, как определено в настоящем документе.
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонентов его естественной среды. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают до чистоты более 95% или 99%, что определяется, например, электрофоретическим методом (например, SDS-PAGE, изоэлектрическим фокусированием (IEF), капиллярным электрофорезом) или хроматографическим (например, ионнообменная ВЭЖХ или ВЭЖХ с обращенной фазой) методами. Для обзора способов оценки чистоты антител см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).
«Выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонентов ее естественной среды. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном расположении, которое отличается от его естественного хромосомного расположения.
«Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антиидиотипическое антитело» относится к одной или более молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты), включая такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в одном векторе или отдельных векторах, и причем такая молекула(ы) нуклеиновой кислоты присутствуют в одном или более местах в клетке-хозяине.
Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичную трансформированную клетку и производное от нее потомство без учета количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновых кислот с родительской клеткой, но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое имеет ту же функцию или биологическую активность, что и скринированные или отселектированные первоначально трансформированные клетки, включено в данное описание.
Используемый в настоящем описании термин «процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» и «процент идентичности» при использовании в отношении аминокислотной последовательности (эталонной полипептидной последовательности) определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате (например, антитела или его фрагмента), которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности полипептида сравнения после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые известны специалисту в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
Замена аминокислоты может включать замену одной аминокислоты в полипептиде на другую аминокислоту. Замена может представлять собой консервативную аминокислотную замену или неконсервативную аминокислотную замену. Аминокислотные замены могут быть введены в связывающую молекулу, например интересующее антитело, и в продукты, подвергнутые скринингу на целевую активность, например, сохраненное/улучшенное связывание антигена, пониженную иммуногенность или улучшенные ADCC или CDC.
Аминокислоты, как правило, могут быть сгруппированы в соответствии со следующими общими свойствами боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
В некоторых вариантах осуществления консервативные замены могут включать замену члена одного из этих классов на другой член того же класса. В некоторых вариантах осуществления неконсервативные аминокислотные замены могут включать замену члена одного из этих классов на другой класс.
Используемый в настоящем описании термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Определенные векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы упоминаются здесь как «экспрессирующие векторы».
Термин «вкладыш в упаковку» используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования таких терапевтических продуктов.
При использовании в настоящем документе, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явно не предписывает иное. Например, формы единственного числа означают «по меньшей мере, один» или «один или более». Понятно, что аспекты и варианты, описанные в настоящем документе, включают в себя «состоящий» и/или «состоящий по существу из» аспектов и вариантов.
На всем протяжении этого раскрытия различные аспекты заявленного объекта представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона дано просто для удобства и краткости и не должно рассматриваться как негибкое ограничение объема заявленного объекта изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные субдиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, когда предлагается диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом этого диапазона и любым другим заявленным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в заявленный объект. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться в меньшие диапазоны и также охватываются заявленным объектом с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. Если заявленный диапазон включает одно или оба из этих пределов, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включаются в заявленный объект. Это применяется независимо от широты диапазона.
Используемый в настоящем описании термин «примерно» относится к обычному диапазону ошибок для соответствующего значения, хорошо известного специалисту в данной области. Ссылка на «примерно» в отношении значения или параметра в настоящем документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к этому значению или параметру, как таковые. Например, описание, относящееся к «примерно X», включает в себя описание «X».
Термины «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной. Полипептиды, включая предложенные антитела и цепи антител и другие пептиды, например линкеры, могут включать аминокислотные остатки, включая природные и/или неприродные аминокислотные остатки. Термины также включают модификации полипептида после экспрессии, например, гликозилирование, сиалилирование, ацетилирование, фосфорилирование и тому подобное. В некоторых аспектах полипептиды могут содержать модификации в отношении нативной или природной последовательности при условии, что белок поддерживает целевую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, введенные путем сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например, в результате мутаций хозяев, которые продуцируют белки, или ошибок вследствие амплификации ПЦР.
Используемый в настоящем описании термин «композиция» относится к любой смеси двух или более продуктов, веществ или соединений, включая клетки. Это может быть раствор, суспензия, жидкость, порошок, паста, водные, неводные, или любая их комбинация.
Используемое в настоящем описании утверждение о том, что клетка или популяция клеток являются «положительными» по конкретному маркеру, относится к детектируемому присутствию на клетке или внутри клетки определенного маркера, обычно поверхностного маркера. При ссылке на поверхностный маркер термин относится к наличию поверхностной экспрессии, детектируемой с помощью проточной цитометрии, например, путем окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и детектирования указанного антитела, где окрашивание выявляется с помощью проточной цитометрии на уровне, существенно превышающем окрашивание, детектированное при проведении той же процедуры с изотипически сопоставимым контролем при прочих идентичных условиях, и/или на уровне, по существу аналогичном уровню для клетки, о которой известно, что она является положительной для маркера, и/или на уровне, существенно более высоком чем, для клетки, известной как отрицательная для маркера.
Используемое в настоящем описании утверждение о том, что клетка или популяция клеток являются «отрицательными» по конкретному маркеру, относится к отсутствию детектируемого существенного присутствия на клетке или внутри клетки определенного маркера, обычно поверхностного маркера. При ссылке на поверхностный маркер термин относится к отсутствию поверхностной экспрессии, детектируемой с помощью проточной цитометрии, например, путем окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и путем детектирования указанного антитела, где окрашивание не обнаруживают с помощью проточной цитометрии на уровне, существенно превышающем выявленное окрашивание, выполняя ту же самую процедуру с изотипически сопоставимым контролем при прочих идентичных условиях, и/или на уровне, существенно более низком, чем уровень для клетки, о которой известно, что она является положительной для маркера, и/или на уровне существенно схожем с уровнем для клетки, которая, как известно, является отрицательной для маркера.
VIII. Примерные варианты осуществления
Варианты осуществления, предложенные в настоящем документе, представляют собой:
1. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, который специфически связывается с антителом-мишенью, которое представляет собой антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент.
2. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 1, отличающиеся тем, что антитело или антиген-связывающий фрагмент содержат:
вариабельную область легкой цепи (VL), которая по меньшей мере на 90% идентична области VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5; и/или
вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая по меньшей мере на 90% идентична области VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
3. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, где антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат:
область VL, которая по меньшей мере на 90% идентична области VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5; и/или
область VH, которая по меньшей мере на 90% идентична области VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
4. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно вариантам осуществления 2 или 3, отличающиеся тем, что
область VH содержит область 3, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 84, или содержащую CDR-H3, содержащуюся в последовательности VH, представленноц в SEQ ID NO: 1; и/или
область VL содержит область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 87, или содержащую CDR-L3, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 5,
5. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 2-4, отличающиеся тем, что:
область VH содержит CDR-H1 и CDR-H2, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности последовательностей CDR-H1 и CDR-H2, содержащихся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1; и/или
область VL содержит CDR-L1 и CDR-L2, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности последовательностей CDR-L1 и CDR-L2, содержащихся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5.
6. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 2-5, отличающиеся тем, что:
область VH содержит CDR-H1, указанный в SEQ ID NO: 9, 78, 79 или 80, CDR-H2, указанный в SEQ ID NO: 10, 81, 82 или 83, и набор CDR-H3 далее в SEQ ID NO: 11 или 84; и/или
область VL содержит CDR-L1 c SEQ ID NO: 12 или 85, CDR-L2 c SEQ ID NO: 13 или 86, и CDR-L3 c SEQ ID NO: 14 или 87.
7. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие:
CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1; и/или
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5.
8. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие:
CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 78, 79 или 80, CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, 81, 82 или 83, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 84; и/или
CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или 85, CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или 86, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или 87.
9. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-8, отличающиеся тем, что
область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и/или
область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
10. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 9, отличающиеся тем, что область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
11. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-10, отличающиеся тем, что антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24.
12. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которое представляет собой антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент.
13. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 12, отличающиеся тем, что антитело или антиген-связывающий фрагмент содержат:
вариабельную область легкой цепи (VL), которая по меньшей мере на 90% идентична области VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 62; и/или
вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая по меньшей мере на 90% идентична области VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 58.
14. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент, отличающиеся тем, что антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержат:
область VL, которая по меньшей мере на 90% идентична области VL с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 62; и/или
область (VH), которая по меньшей мере на 90% идентична области VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 58.
15. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-14, отличающиеся тем, что
область VH содержит:
3
5
6
8
10
3
5
6
8
10
область 1, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H1), содержащую аминокислотную последовательность GYXFXXYXMX (SEQ ID NO: 108), где X представляет собой T или S, X представляет собой T или S, X представляет собой D или R, X представляет собой Y или W, и X представляет собой K или N;
4
6
8
9
10
11
13
14
17
20
4
6
8
9
9
10
11
13
14
17
20
область 2, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H2), содержащую аминокислотную последовательность WIGXIXPXXXXTXXNQXFKX (SEQ ID NO: 109), где X представляет собой D или M, X представляет собой N или H, X представляет собой N или S, X представляет собой N или D, X представляет собой N или D X представляет собой G или S, X представляет собой G или E, X представляет собой D или R, X представляет собой Y или L, X представляет собой N или K, и X представляет собой G или D;
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
область 3, определяющую комплементарность тяжелой цепи (CDR-H3), содержащую аминокислотную последовательность AXXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 110), где X представляет собой R или S, X представляет собой E или I, X представляет собой G или Y, X представляет собой N или Y, X представляет собой N или E, X представляет собой Y или отсутствует, X представляет собой G или отсутствует, X представляет собой S или отсутствует, X представляет собой R или отсутствует, X представляет собой D или отсутствует, X представляет собой A или отсутствует, X представляет собой М или отсутствует, X представляет собой D или E, и X представляет собой Y или A; и/или
область VL содержит:
1
3
4
5
6
7
8
10
11
1
3
4
5
6
7
8
10
11
область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L1), содержащую аминокислотную последовательность XAXXXXXXYXXWY (SEQ ID NO: 111), где X представляет собой S или R, X представляет собой S или R, X представляет собой S или G, X представляет собой G или N, X представляет собой V или I, X представляет собой I или H, X представляет собой N или отсутствует, X представляет собой M или L, и X представляет собой Y или A;
1
2
3
5
6
7
8
11
1
2
3
5
6
7
8
11
область 2, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L2), содержащую аминокислотную последовательность XXXYXXXXLAX (SEQ ID NO: 112), где X представляет собой P или L, X представляет собой W или L, X представляет собой I или V, X представляет собой L или N, X представляет собой T или A, X представляет собой S или K, X представляет собой N или T, и X представляет собой S или D;
2
3
4
5
6
8
2
3
4
5
6
8
область 3, определяющую комплементарность легкой цепи (CDR-L3), содержащую аминокислотную последовательность QXXXXXPXT (SEQ ID NO: 113), где X представляет собой Q или H, X представляет собой W или F, X представляет собой S или W, X представляет собой S или W, X представляет собой N или T, и X представляет собой L или Y.
16. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 15, отличающиеся тем, что
область 3, определяющая комплементарность (CDR-H3), содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 или 104, или содержит CDR-H3, содержащуюся в последовательности VH SEQ ID NO: 36 или 58; и/или
область 3, определяющая комплементарность легкой цепи (CDR-L3), содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 или 107, или содержит CDR-L3, содержащуюся в последовательности VL SEQ ID NO: 40 или 62.
17. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-16, отличающиеся тем, что
область VH содержит CDR-H1 и CDR-H2, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1 и CDR-H2, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или 58; и/или
область VL содержит CDR-L1 и CDR-L2, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-L1 и CDR-L2, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 62.
18. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-17, отличающиеся тем, что
область VH содержит CDR-H1 c SEQ ID NO: 88, 89, 90, 98, 99 или 100, CDR-H2 c SEQ ID NO: 91, 92, 93, 101, 102 или 103, и CDR-H3 c SEQ ID NO: 94 или 104; и/или
область VL содержит CDR-L1 c SEQ ID NO: 95 или 105, CDR-L2 c SEQ ID NO: 96 или 106, и CDR-L3 c SEQ ID NO: 97 или 107.
19. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие:
CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или58; и/или
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 62.
20. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащие:
CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88, 89, 90, 98, 99 или 100, CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, 92, 93, 101, 102 или 103, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 или 104; и/или
CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95 или 105, CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96 или 106, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97 или 107.
21. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-21, отличающиеся тем, что
область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или 58; и/или
область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 62.
22. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 21, отличающиеся тем, что область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или 58, а область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 62.
23. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-22, отличающиеся тем, что
область VH содержит CDR-H1 c SEQ ID NO: 44, 88, 89 или 90, CDR-H2 c SEQ ID NO: 45, 91, 92 или 93, и CDR-H3 c SEQ ID NO: 46 или 94; и/или
область VL содержит CDR-L1 c SEQ ID NO: 47 или 95, CDR-L2 c SEQ ID NO: 48 или 96, и CDR-L3 c SEQ ID NO: 49 или 97.
24. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-23, отличающиеся тем, что
область VH содержит CDR-H1 c SEQ ID NO: 65, 98, 99 или 100, CDR-H2 c SEQ ID NO: 66, 101, 102 или 103, и CDR-H3 c SEQ ID NO: 67 или 104; и/или
область VL содержит CDR-L1 c SEQ ID NO: 68 или 105, CDR-L2 c SEQ ID NO: 69 или 106, и CDR-L3 c SEQ ID NO: 100 или 107.
25. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-24, отличающиеся тем, что
область VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36; и/или
область VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40.
26. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-24, отличающиеся тем, что
область VH содержит CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие аминокислотные последовательности CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащиеся в области VH c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58; и/или
область VL содержит CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно, содержащие аминокислотные последовательности CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащиеся в области VL c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 62.
27. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-25, отличающиеся тем, что
область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; и/или
область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.
28. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 13-24 и 26, отличающиеся тем, что
область VH антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; и/или
область VL антитела или фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62.
29. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-28, отличающиеся тем, что антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент представляют собой одноцепочечный фрагмент.
30. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 29, отличающиеся тем, что фрагмент содержит вариабельные области антитела, соединенные гибким линкером.
31. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 29 или 30, отличающиеся тем, что фрагмент содержит scFv.
32. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-31, отличающиеся тем, что антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент:
содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24; и/или
представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
33. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент по пп.12-31, отличающиеся тем, что антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент:
содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31; и/или
представляет собой scFv, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
34. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, где антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с тем же самым или с перекрывающимся эпитопом антитела-мишени или его антиген-связывающего фрагмента, что и эпитоп, специфически связанный антиидиотипическим антителом или антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 1-33.
35. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-34, отличающиеся тем, что
антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент находятся внутри или включены в антиген-связывающий домен внеклеточной части химерного антигенного рецептора (CAR); и/или
антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с антителом-мишенью или антиген-связывающим фрагментом, содержащимися или включенными в антиген-связывающий домен внеклеточной части CAR.
36. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 35, отличающиеся тем, что антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент представляют собой scFv, а антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с эпитопом в scFv CAR.
37. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-11, 29-32 и 35, отличающиеся тем, что антитело или фрагмент специфически связываются с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), полученным из антитела SJ25C1, содержащимся во внеклеточной части химерного антигенного рецептора, где необязательно scFv, полученный из антитела SJ25C1, содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24; и/или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
38. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 12-31 и 33-35, отличающиеся тем, что антитело или фрагмент специфически связываются с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), полученным из антитела FMC63, или содержащим вариабельные области, полученные из FMC63, содержащимся во внеклеточной части химерного антигенного рецептора, где необязательно scFv, полученный из антитела FMC63, содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31; и/или содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
39. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38, отличающиеся тем, что антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с эпитопом внутри или в пределах всей или части области, определяющей комплементарность (CDR), антитела-мишени или антиген-связывающего фрагмента.
40. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 35-39, отличающиеся тем, что CAR дополнительно содержит трансмембранный домен, связанный с антиген-связывающим доменом через спейсер.
41. Антиидиотипическое антитело согласно варианту осуществления 40, отличающееся тем, что спейсер содержит внеклеточную часть из CD28, который необязательно представляет собой человеческим CD28.
42. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 41, отличающиеся тем, что внеклеточная часть CD28 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
43. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 40-42, отличающиеся тем, что трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28, который необязательно представляет собой человеческий CD28.
44. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 40-43, отличающиеся тем, что антитело или фрагмент не связываются с эпитопом в спейсерном домене CAR.
45. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-44, отличающиеся тем, что антитело или фрагмент не связываются или не связываются специфически с CD28 или его частью, который необязательно является человеческим CD28, который необязательно содержит внеклеточную часть CD28, которая необязательно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
46. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-45, отличающиеся тем, что антитело или фрагмент не связываются с эпитопом в Fc-домене, который необязательно является Fc-доменом человеческого IgG1.
47. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-46, отличающиеся тем, что антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с человеческим CD19.
48. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-47, отличающиеся тем, что антиидиотипическое антитело или фрагмент не вступают в перекрестную реакцию с другим антителом против CD19, которое необязательно содержится во внеклеточном антиген-связывающем домене другого CAR.
49. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-48, отличающиеся тем, что антиидиотипическое антитело или фрагмент не вступают в перекрестную реакцию с другим CAR.
50. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-49, отличающиеся тем, что антиидиотипическое антитело или фрагмент представляют собой агонистическое антитело для CAR, содержащего антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент.
51. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-49, отличающиеся тем, что антитело или фрагмент представляют собой антагонист для CAR, содержащего антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент.
52. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-51, которые являются гуманизированными.
53. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-52, которые являются рекомбинантными.
54. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-53, которое является моноклональным.
55. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-54, которое представляет собой антиген-связывающий фрагмент.
2
56. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 55, отличающиеся тем, что антиген-связывающий фрагмент выбран из антиген-связывающих фрагментов (Fab), F(ab'), Fab', Fv, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) или однодоменного антитела.
57. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-54, включающие, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина.
58. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 57, отличающиеся тем, что, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина содержит Fc- область или часть Fc, содержащую домены СН2 и СН3.
59. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно варианту осуществления 57 или 58, отличающиеся тем, что константная область получена из человеческого IgG.
60. Антиидиотипическое антитело или антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 57-59, которое является интактным антителом или полноразмерным антителом.
61. Конъюгат, содержащий антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-60 и гетерологичную молекулу или фрагмент.
62. Конъюгат согласно варианту осуществления 61, отличающийся тем, что гетерологичная молекула или фрагмент является меткой.
63. Конъюгат согласно варианту осуществления 62, отличающийся тем, что метка выбрана из флуоресцентного красителя, флуоресцентного белка, радиоизотопа, хромофора, иона металла, частицы золота, частицы серебра, магнитной частицы, полипептида, фермента, стрептавидина, биотина, люминесцентного соединения или олигонуклеотида.
64. Конъюгат согласно варианту осуществления 62, отличающийся тем, что гетерологичная молекула или фрагмент представляют собой белок, пептид, нуклеиновую кислоту или низкомолекулярное соединение, которые необязательно представляют собой или содержат токсин или Strep-метку.
65. Молекула(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь и/или легкую цепь антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента согласно любому из вариантов осуществления 1-60.
66. Молекула нуклеиновой кислоты согласно варианту осуществления 65, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 15, (ii) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 15; или (iii) вырожденную последовательность (i) или (ii); и/или
последовательность нуклеотидов, кодирующую (iv) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 19, (v) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 19; или (vi) вырожденную последовательность (iv) или (v).
67. Молекула нуклеиновой кислоты согласно варианту осуществления 65 или 66, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) тяжелую цепь SEQ ID NO: 17, (ii) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 17; или (iii) вырожденную последовательность (i) или (ii); и/или
последовательность нуклеотидов, кодирующую (iv) легкую цепь SEQ ID NO: 21, (v) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 21; или (vi) вырожденную последовательность (iv) или (v).
68. Молекула нуклеиновой кислоты согласно варианту осуществления 65, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 50 или 71, (ii) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 50 или 71; или (iii) вырожденную последовательность (i) или (ii); и/или
последовательность нуклеотидов, кодирующую (iv) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 54 или 75, (v) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 54 или 75; или (vi) вырожденную последовательность (iv) или (v).
69. Молекула нуклеиновой кислоты согласно варианту осуществления 65 или 68, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) тяжелую цепь SEQ ID NO: 52 или 73, (ii) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 52 или 73; или (iii) вырожденную последовательность (i) или (ii); и/или
последовательность нуклеотидов, кодирующую (iv) легкую цепь SEQ ID NO: 56 или 76, (v) последовательность нуклеотидов, которая имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 56 или 76; или (vi) вырожденную последовательность (iv) или (v).
70. Молекула нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов осуществления 65-69, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь и/или легкую цепь, содержит сигнальную последовательность.
71. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов осуществления 65-70.
72. Клетка, содержащая антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-41 или молекулу нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов осуществления 65-70.
73. Способ получения антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий экспрессию тяжелой и/или легкой цепи, кодируемых молекулой нуклеиновой кислоты согласно любому из вариантов осуществления 65-70 или вектором согласно варианту осуществления 71, в подходящей клетке-хозяине и извлечение или выделение антитела.
74. Способ получения антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий культивирование клетки согласно варианту осуществления 72 при условиях, в которых экспрессируется тяжелая цепь и/или легкая цепь, и извлечение или выделение антитела.
75. Антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, полученные способом согласно варианту осуществления 73 или 74.
76. Композиция, содержащая антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-60, конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64 или клетку согласно варианту осуществления 72.
77. Композиция согласно варианту осуществления 76, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
78. Набор, содержащий одно или более антиидиотипических антител или их антиген-связывающих фрагментов согласно любому из вариантов осуществления 1-60, конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 161-64, нуклеиновую кислоту согласно любому из вариантов осуществления 65-70 и, необязательно, инструкции по применению.
79. Набор согласно варианту осуществления 78, дополнительно содержащий реагент или подложку для иммобилизации антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента или конъюгата, где указанным реагентом или подложкой являются микросфера, колонка, микролунка, палочка, фильтр, полоска или растворимый олигомерный реагент мутеина стрептавидина.
80. Способ детектирования антитела-мишени или его антиген-связывающего фрагмента, включающий:
(а) контактирование композиции, содержащей антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60 или конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) детектирование антиидиотипического антитела, связанного с антителом-мишенью или антиген-связывающим фрагментом.
81. Способ детектирования антитела-мишени или его антиген-связывающего фрагмента, включающий:
(а) контактирование композиции, содержащей антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36 и 38-60 или конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) детектирование антиидиотипического антитела, связанного с антителом-мишенью или антиген-связывающим фрагментом.
82. Способ согласно варианту осуществления 81, отличающийся тем, что антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент связаны с клеткой или экспрессированы на поверхности клетки, и детектирование в (b) включает детектирование клеток, связанных с антиидиотипическим антителом.
83. Способ согласно варианту осуществления 82, отличающийся тем, что клетка экспрессирует на своей поверхности CAR, содержащий антитело-мишень или антиген-связывающий фрагмент.
84. Способ детектирования CAR, содержащего антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент, включающий:
(а) контактирование клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (CAR), содержащей антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент, согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60, или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64, который специфически связывается с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) детектирование клеток, связанных с антиидиотипическим антителом.
85. Способ детектирования CAR, содержащего антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент, включающий:
(а) контактирование клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36, 34-37 и 38-60 или с конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) детектирование клеток, связанных с антиидиотипическим антителом.
86. Способ согласно любому из вариантов осуществления 80-85, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент помечены прямо или косвенно для детектирования.
87. Способ селекции клеток из клеточной популяции, включающий:
(а) контактирование популяции клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, или клетки, связанной с антителом-мишенью, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60 или с конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, где антитело-мишень представляет собой антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) селекцию клеток, связанных с антиидиотипическим антителом.
88. Способ селекции клеток из клеточной популяции, включающий:
(а) контактирование популяции клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, или клетки, связанной с антителом-мишенью, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36 и 38-60 или с конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент, где антитело-мишень представляет собой антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) селекцию клеток, связанных с антиидиотипическим антителом.
89. Способ согласно варианту осуществления 87 или 88, отличающийся тем, что клетки, связанные с антиидиотипическим антителом, селектируют путем аффинного разделения.
90. Способ согласно варианту осуществления 89, отличающийся тем, что аффинное разделение представляет собой иммуноаффинное разделение.
91. Способ согласно варианту осуществления 89 или 90, отличающийся тем, что аффинное разделение осуществляют с помощью проточной цитометрии.
92. Способ согласно варианту осуществления 89 или 90, отличающийся тем, что аффинное разделение осуществляют с помощью магнитно-активированной сортировки клеток.
93. Способ согласно варианту осуществления 89 или 90, отличающийся тем, что аффинное разделение включает аффинную хроматографию.
94. Способ согласно варианту осуществления 92 или 93, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело обратимо связывается или иммобилизуется на подложке или в стационарной фазе.
95. Способ стимулирования клеток, включающий инкубацию исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60 или с конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент, с получением посредством этого итоговой композиции, содержащей стимулированные клетки.
96. Способ стимулирования клеток, включающий инкубацию исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36 и 38-60 или с конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связывается с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент, с получением посредством этого итоговой композиции, содержащей стимулированные клетки.
97. Способ получения клеточной композиции, включающий:
(а) введение в клетки молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), посредством чего генерируется исходная композиция; и
(b) инкубацию исходной композиции с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом, специфичными для антигенного рецептора CAR, получая посредством этого клеточную композицию.
98. Способ согласно варианту осуществления 97, отличающийся тем, что CAR содержит антитело-мишень, которое специфически связывается с CD19.
99. Способ согласно варианту осуществления 98, отличающийся тем, что антителом-мишенью является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент.
100. Способ согласно любому из вариантов осуществления 97-99, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент представляют собой антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент.
101. Способ согласно варианту осуществления 98, отличающийся тем, что антителом-мишенью является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент.
102. Способ согласно любому из вариантов осуществления 97-98 и 101, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36 и 38-60, которое специфически связывается с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент.
103. Способ согласно любому из вариантов осуществления 97-102, отличающийся тем, что введение в (a) включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем вирусной трансдукции, транспозиции, электропорации или химической трансфекции.
104. Способ согласно любому из вариантов осуществления 97-103, отличающийся тем, что введение в (а) включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем трансдукции вирусным вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, где вирусный вектор необязательно представляет собой ретровирусный вектор или лентивирусный вектор.
105. Способ согласно любому из вариантов осуществления 97-103, отличающийся тем, что введение в (а) включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем транспозиции транспозоном, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты.
106. Способ согласно любому из вариантов осуществления 97-103, отличающийся тем, что введение в (а) включает введение молекулы нуклеиновой кислоты в клетки путем электропорации или трансфекции вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты.
107. Способ согласно любому из вариантов осуществления 97-106, дополнительно включающий стадию активации клеток перед стадией (а).
108. Способ согласно варианту осуществления 107, отличающийся тем, что стадия активации клеток включает контактирование клеток с агонистом CD3 и необязательно агонистом CD28.
109. Способ согласно варианту осуществления 108, отличающийся тем, что стадия активации клеток включает контактирование клеток с реагентом, содержащим агонистические антитела против CD3 и против CD28.
110. Способ согласно любому из вариантов осуществления 95-109, отличающийся тем, что инкубацию проводят при условиях, в которых антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связываются с CAR, индуцируя или модулируя посредством этого сигнал в одной или более клетках во исходной композиции.
111. Способ согласно любому из вариантов осуществления 95-110, отличающийся тем, что клетки содержат Т-клетки.
112. Способ согласно варианту осуществления 111, отличающийся тем, что Т-клетки содержат CD4+ и/или CD8+ Т-клетки.
113. Способ согласно любому из вариантов осуществления 95-112, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы на твердой подложке, которая необязательно содержит или конъюгирована с реагентом, содержащим множество сайтов связывания, способных обратимо связываться с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом.
114. Способ согласно любому из вариантов осуществления 95-112, отличающийся тем, что антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент иммобилизованы на растворимом реагенте, который необязательно представляет собой или содержит множество сайтов связывания, способных обратимо связываться с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом.
115. Способ согласно варианту осуществления 113 или 114, отличающийся тем, что реагент содержит мутеин стрептавидина.
116. Способ согласно любому из вариантов осуществления 95-115, отличающийся тем, что инкубация составляет, по меньшей мере или примерно, по меньшей мере 5 минут, 10 минут, 30 минут, 60 минут, 2 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 72 часа или 96 часов.
117. Способ согласно любому из вариантов осуществления 95-116, отличающийся тем, что исходная композиция содержит менее чем или менее чем примерно 60%, менее чем или менее чем примерно 50%, менее чем или менее чем примерно 40%, менее чем или менее чем примерно 30%, менее чем или менее чем примерно 20% или менее чем или менее чем примерно 10% CAR-экспрессирующих клеток в процентном содержании от общего числа клеток в композиции.
118. Способ согласно любому из вариантов осуществления 95-117, отличающийся тем, что
количество CAR-экспрессирующих клеток в итоговой композиции увеличивается более чем в 1,2 раза, в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз или более по сравнению с количеством CAR-экспрессирующих клеток во исходной композиции; и/или
процентное содержание CAR-экспрессирующих клеток в итоговой композиции по сравнению с общим количеством клеток в композиции увеличивается более чем на 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более.
119. Способ согласно любому из вариантов осуществления 95-118, отличающийся тем, что перед введением и/или инкубацией клетки не селектируют и не обогащают CAR-экспрессирующими клетками.
120. Способ согласно любому из вариантов осуществления 80, 82-84, 86, 87, 89-95, 97-100, 103-119, отличающийся тем, что антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24.
121. Способ согласно любому из вариантов осуществления 81, 82, 83, 85, 86, 88-94, 96-99, 101 и 102-119, отличающийся тем, что антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ. ID NO:  30, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
122. Способ очистки антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий:
(а) контактирование композиции, содержащей антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент, с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60 или конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) выделение комплексов, содержащих антиидиотипическое антитело.
123. Способ очистки антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий:
(а) контактирование композиции, содержащей антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент с антиидиотипическим антителом или его антиген-связывающим фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36 и 38-60 или конъюгатом согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) выделение комплексов, содержащих антиидиотипическое антитело.
124. Способ согласно варианту осуществления 122 или 123, отличающийся тем, что комплексы, содержащие антиидиотипическое антитело, выделяют аффинным разделением.
125. Способ согласно варианту осуществления 124, отличающийся тем, что аффинное разделение представляет собой иммуноаффинное разделение.
126. Способ согласно варианту осуществления 124, отличающийся тем, что аффинное разделение представляет собой магнитное разделение.
127. Способ согласно варианту осуществления 124, отличающийся тем, что аффинное разделение включает аффинную хроматографию.
128. Способ идентификации антиидиотипического антитела или его антиген-связывающего фрагмента, включающий:
(а) введение пациенту растворимого иммунизирующего реагента, содержащего антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени, слитый с солюбилизирующим фрагментом; и
(b) идентификацию антитела у пациента, которое специфически связывается с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом.
129. Способ согласно варианту осуществления 128, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени.
130. Способ согласно варианту осуществления 128 или 129, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный фрагмент.
131. Способ согласно варианту осуществления 130, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент представляет собой scFv.
132. Способ согласно любому из вариантов осуществления 128-131, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент находится внутри или включен в антиген-связывающий домен внеклеточной части химерного антигенного рецептора (CAR).
133. Способ согласно любому из вариантов осуществления 128-132, отличающийся тем, что солюбилизирующий фрагмент представляет собой Fc-домен или его фрагмент, который необязательно представляет собой человеческий Fc IgG1.
134. Способ согласно варианту осуществления 133, отличающийся тем, что солюбилизирующий фрагмент представляет собой Fc-домен, в котором отсутствует шарнирная область.
135. Способ согласно варианту осуществления 134, отличающийся тем, что солюбилизирующий фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
136. Способ согласно любому из вариантов осуществления 128-135, отличающийся тем, что идентификация антитела включает:
(i) выделение В-клеток из селезенки пациента и слияние их с иммортализованными В-клетками для создания гибридом;
(ii) скрининг гибридом на продуцирование антител, которые специфически связываются с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом, или с химерным антигенным рецептором, содержащим антиген-связывающий фрагмент; и
(iii) секвенирование антитела из гибридомы, продуцирующего антитело, которое специфически связывается, идентифицируя посредством этого антиидиотипическое антитело.
137. Способ согласно любому из вариантов осуществления 128-136, отличающийся тем, что антитело-мишень связывается с CD19.
138. Способ согласно любому из вариантов осуществления 128-137, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени получен из антитела SJ25C1, где антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени необязательно содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 23, и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 24.
139. Способ согласно любому из вариантов осуществления 128-138, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из антитела SJ25C1, где scFv необязательно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
140. Способ согласно любому из вариантов осуществления 128-137, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени получен из антитела FMC63, где антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени необязательно содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 30 и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31.
141. Способ согласно любому из вариантов осуществления 128-137 и 140, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из антитела FMC63, где scFv необязательно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
142. Способ истощения клеток, включающий введение пациенту композиции, содержащей антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60 или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело SJ25C1, или с его антиген-связывающим фрагментом, где пациенту вводили клетку, экспрессирующую химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент.
143. Способ истощения клеток, включающий введение пациенту композиции, содержащей антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36 и 38-60 или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью, которым является антитело FMC63, или с его антиген-связывающим фрагментом, где пациенту вводили клетку, экспрессирующую химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент.
144. Способ согласно варианту осуществления 137 или 138, отличающийся тем, что истощение происходит посредством антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).
145. Способ определения присутствия или отсутствия молекулы, которая связывается с химерным антигенным рецептором (CAR), включающий:
(а) контактирование связывающего реагента с образцом пациента, которому вводили клеточную терапию, включающую клетки, сконструированные с помощью CAR, содержащего антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент, в условиях образования комплекса, содержащего связывающий реагент и молекулу из образца, которая связывается со связывающим реагентом, причем связывающий реагент содержит внеклеточный домен CAR или его часть, содержащию антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент; и
(b) детектирование присутствия или отсутствия комплекса, определяя тем самым присутствие или отсутствие молекулы, которая связывается с CAR.
146. Способ согласно варианту осуществления 145, дополнительно включающий выполнение стадий (а) и (b) с образцом положительного контроля и, необязательно, определение присутствия или отсутствия молекулы путем сравнения с положительным контролем, где образец положительного контроля содержит антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60 или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом.
147. Способ определения присутствия или отсутствия молекулы, которая связывается с химерным антигенным рецептором (CAR), включающий:
(а) контактирование связывающего реагента с образцом пациента, которому вводили клеточную терапию, включающую клетки, сконструированные с помощью CAR, содержащего антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, в условиях образования комплекса, содержащего связывающий реагент и молекулу из образца, которая связывается со связывающим реагентом, причем связывающий реагент содержит внеклеточный домен CAR или его часть, содержащие антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент;
(b) детектирование присутствия или отсутствия комплекса.
148. Способ согласно варианту осуществления 147, дополнительно включающий выполнение стадий (а) и (b) с образцом положительного контроля и, необязательно, определение присутствия или отсутствия молекулы путем сравнения с положительным контролем, где образец положительного контроля содержит антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36 и 38-60 или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64, которые специфически связываются с антителом-мишенью или его антиген-связывающим фрагментом.
149. Способ согласно любому из вариантов осуществления 145-148, отличающийся тем, что молекула, которая связывается со связывающим реагентом, представляет собой антитело или содержит его.
150. Способ согласно любому из вариантов осуществления 145-149, отличающийся тем, что связывающий реагент детектируемо помечен или способен генерировать детектируемый сигнал.
151. Способ согласно любому из вариантов осуществления 145-150, отличающийся тем, что связывающий реагент связан с твердой подложкой или растворим.
152. Способ согласно любому из вариантов осуществления 145-153, отличающийся тем, что комплекс детектируют с помощью иммуноанализа.
153. Способ согласно варианту осуществления 152, отличающийся тем, что иммуноанализ представляет собой иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, электрохемилюминесцентный анализ, биосенсор на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (например, BIAcore), проточную цитометрию или вестерн-блотинг.
154. Способ согласно варианту осуществления 152 или 153, отличающийся тем, что иммуноанализ включает обнаружение мезомасштабов.
155. Способ согласно любому из вариантов осуществления 152-154, отличающийся тем, что иммуноанализ представляет собой сэндвич-анализ или мостиковый анализ.
156. Способ согласно любому из вариантов осуществления 145-155, отличающийся тем, что связывающий реагент является первым связывающим реагентом, а детектирование присутствия или отсутствия комплекса включает:
(i) контактирование комплекса, образованного на стадии (а), со вторым связывающим реагентом, где второй связывающий реагент (1) содержит внеклеточный домен CAR или его часть, содержащие антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент, и (2) детектируемо помечен или способен генерировать детектируемый сигнал; и
(ii) оценку присутствия или отсутствия детектироуемого сигнала.
157. Способ согласно варианту осуществления 156, отличающийся тем, что
первый связывающий реагент связан с твердой подложкой, где первый связывающий реагент необязательно связан, прямо или косвенно, с биотином и/или связан с твердой подложкой через стрептавидин; и/или
второй связующий реагент растворим.
158. Способ согласно варианту осуществления 156 или 157, отличающийся тем, что внеклеточный домен CAR или его часть у первого и второго связывающего реагента являются одинаковыми.
159. Способ согласно любому из вариантов осуществления 150-158, отличающийся тем, что
детектируемая метка представляет собой или содержит флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, электролюминесцентную метку, колориметрическую метку, биолюминесцентную метку или радиоактивную метку; и/или
детектируемый сигнал представляет собой или содержит флуоресцентный сигнал, хемилюминесцентный сигнал, электролюминесцентный сигнал, колориметрический сигнал, биолюминесцентный сигнал или радиоактивный сигнал.
160. Способ согласно любому из вариантов осуществления 150-159, отличающийся тем, что детектируемая метка представляет собой или содержит SULFO-метку.
161. Способ согласно любому из вариантов осуществления 145-160, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени содержит вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела-мишени.
162. Способ по пп.145-161, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени представляет собой одноцепочечный фрагмент.
163. Способ согласно любому из вариантов осуществления 145-162, отличающийся тем, что антиген-связывающий фрагмент антитела-мишени представляет собой scFv.
164. Способ согласно любому из вариантов осуществления 145-163, отличающийся тем, что образец содержит цельную кровь, сыворотку или плазму.
165. Изделие, содержащее антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60 или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64 и инструкции по применению антиидиотипического антитела для детектирования антитела SJ25C1 или его антиген-связывающего фрагмента или химерного антигенного рецептора, содержащего антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; для селекции или обогащения из клеточной популяции сконструированных клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент; для стимулирования исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор, содержащий антитело SJ25C1 или его антиген-связывающий фрагмент.
166. Изделие, содержащее антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 12-31, 33-36 и 38-60 или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64 и инструкции по применению антиидиотипического антитела для детектирования антитела FMC63 или его антиген-связывающего фрагмента или химерного антигенного рецептора, содержащего антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; для селекции или обогащения из клеточной популяции сконструированных клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент; для стимулирования исходной композиции, содержащей клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор, содержащий антитело FMC63 или его антиген-связывающий фрагмент.
167. Изделие, содержащее:
связывающий реагент, содержащий внеклеточный домен химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего антитело-мишень, которым является антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанный внеклеточный домен или его часть содержат антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент; и
антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 12-, 33-36 и 38-60 или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64.
168. Изделие согласно варианту осуществления 167, отличающееся тем, что связывающий реагент представляет собой первый связывающий реагент, а изделие дополнительно содержит второй связывающий реагент, содержащий внеклеточный домен CAR или его часть.
169. Изделие согласно варианту осуществления 167 или 168, отличающееся тем, что внеклеточный домен CAR или его часть у первого и второго связывающего реагента являются одинаковыми.
170. Изделие согласно любому из вариантов осуществления 167-169, дополнительно содержащее инструкции по применению связывающего реагента, необязательно первого и второго связывающего реагента, для анализа образца на присутствие или отсутствие молекулы, которая связывается со связывающим реагентом, с использованием иммуноанализа, где иммуноанализ необязательно представляет собой мостиковый или сэндвич-иммуноанализ, где образец необязательно взят у пациента, которому вводили клеточную терапию, содержащую клетки, сконструированные с помощью CAR, содержащего антитело-мишень, которое представляет собой антитело FMC63, или его антиген-связывающий фрагмент.
171. Изделие, содержащее:
связывающий реагент, содержащий внеклеточный домен химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанный внеклеточный домен или его часть содержат антитело-мишень или его антиген-связывающий фрагмент; и
антиидиотипическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-11 и 29-32, 34-37 и 39-60 или конъюгат согласно любому из вариантов осуществления 61-64.
172. Изделие согласно варианту осуществления 171, отличающееся тем, что связывающий реагент представляет собой первый связывающий реагент, а изделие дополнительно содержит второй связывающий реагент, содержащий внеклеточный домен CAR или его часть.
173. Изделие согласно варианту осуществления 171 или 172, отличающееся тем, что внеклеточный домен CAR или его часть у первого и второго связывающего реагента являются одинаковыми.
174. Изделие согласно любому из вариантов осуществления 171-173, дополнительно содержащее инструкции по применению связывающего реагента, необязательно первого и второго связывающего реагента, для анализа образца на присутствие или отсутствие молекулы, которая связывается со связывающим реагентом, с использованием иммуноанализа, где иммуноанализ необязательно представляет собой мостиковый или сэндвич-иммуноанализ, где образец необязательно взят у пациента, которому вводили клеточную терапию, содержащую клетки, сконструированные с помощью CAR, содержащего антитело-мишень, которым является антитело SJ25C1, или его антиген-связывающий фрагмент.
175. Изделие согласно любому из вариантов осуществления 167-174, отличающееся тем, что связывающий реагент, необязательно первый и/или второй связывающий реагент, детектируемо помечен или способен генерировать детектируемый сигнал.
176. Изделие согласно любому из вариантов осуществления 168-170 и 172-175, отличающееся тем, что один из первого и второго связывающего реагента прикреплен к твердой подложке или способен прикрепляться к твердой подложке, а другой из первого и второго связывающих реагентов является детектируемой меткой или способен генерировать детектируемый сигнал.
177. Способ согласно варианту осуществления 176, отличающийся тем, что изделие дополнительно содержит твердую подложку, в которой один из первого и второго связывающего реагента необязательно прямо или косвенно связан с биотином, а твердая подложка содержит покрытую стрептавидином поверхность.
IX. Примеры
Следующие примеры включены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Пример 1. Получение антиидиотипических антител против антител, полученных из вариабельной области SJ25C1
Этот пример описывает генерирование антиидиотипических антител (анти-ID), распознающих часть scFv примерного анти-CD19 химерного антигенного рецептора (CAR), содержащую анти-CD19 scFv с вариабельными областями тяжелой и легкой цепи, полученными из SJ25C1 (антитело (в данном случае scFv), имеющее последовательности вариабельной области SEQ ID NO: 23 и 24, разделенные линкером, представленным в SEQ ID NO: 25), внеклеточную часть, полученную из человеческого CD28, трансмембранный домен, полученный из человеческого CD28, внутриклеточный сигнальный домен, полученный из человеческого CD28, и сигнальный домен, полученный из человеческого CD3-дзета.
А. Генерирование гибридомы и скрининг антител
Мышей иммунизировали частью внеклеточного домена (ECD) CAR (содержащей анти-CD19 scFv с вариабельными областями, полученными из SJ25C1). Часть ECD содержала последовательность
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 28) и внеклеточную часть из CD28 (SEQ ID NO: 27).
Сыворотку, выделенную из иммунизированных мышей, проверяли с помощью ИФА на ее способность связываться с рекомбинантной растворимой частью ECD путем детектирования с помощью вторичного антитела. Гибридомные слитые клоны генерировали и дополнительно охарактеризованы методом ИФА для связывания с ECD, и было отобрано пять (5) положительных клонов. Каждый отобранный гибридомный клон наращивали, и антитела очищали. Для возможности детектирования антитела в последующих анализах каждое антитело было конъюгировано с Alexa647.
Антитела оценивали на способность специфически связываться с Т-клетками, созданными с помощью анти-CD19 CAR (полученного из SJ25C1), (оценивали путем сравнения со связыванием с ложно-трансдуцированными контрольными Т-клетками). Т-клетки выделяли путем иммуноаффинного обогащения у людей, и клетки активировали и трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим анти-CD19 CAR (полученный из SJ25C1). Последовательности двукратных серийных разведений (начиная с 20 мкг/мл и разбавленных до 0,0195 мкг/мл) каждого из антиидиотипических антител индивидуально использовали для выявления поверхностной экспрессии CAR с помощью проточной цитометрии. В качестве положительного контроля клетки также оценивали на поверхностную экспрессию CAR с использованием сходных концентраций козьего антимышиного антитела («GAM»), которое было способно обнаружить мышиную часть вариабельной области ECD-части CAR. Контрольное антитело не тестировали. Кривая доза-ответ для процента клеток, положительных по сигналу Alexa647 в Т-клетках, трансдуцированных CAR, была сходной для каждого из протестированных антиидиотипических антител и сравнима с таковой для антитела положительного контроля GAM, ни одно из которых не распознало ложные Т-клетки, трансдуцированные пустым вектором. Был также определен индекс окрашивания, который представляет собой разницу между значениями положительного и фонового (ложного) пика и разбросом фонового пика антиидиотипических антител и GAM-антител, и было обнаружено, что они сопоставимы между антиидиотипическими антителами и антителом положительного контроля GAM. Клон A-1 антиидиотипического антитела (анти-ID A-1) был отобран для дальнейшей характеристики.
B. Функциональная активность
Фосфорилирование Erk1/2 в клетках Jurkat, сконструированных для экспрессии CAR, описанного выше, оценивали проточной цитометрией после стимулирования антителом анти-ID A-1 или антителом против CD3, в каждом случае в присутствии или в отсутствие перекрестно связывающего антитела. После инкубации клетки фиксировали формальдегидом, пермеабилизировали, инкубировали с антителом, специфичным к фосфорилированному Erk1/2, и анализировали проточной цитометрией. Как показано на Фиг. 1, после инкубации клеток в присутствии антитела анти-ID A-1 наблюдали увеличение фосфорилирования Erk1/2 на уровне, аналогичном наблюдаемому для стимулирования антителом против CD3 в присутствии перекрестно связывающего антитела. Было обнаружено, что оба антитела индуцируют одинаковые степени фосфорилирования Erk1/2 даже в отсутствие перекрестного связывания.
Вестерн-блот-анализ далее использовали для сравнения фосфорилирования Erk в CAR-экспрессирующих клетках Jurkat или родительских клетках Jurkat, не экспрессирующих CAR, после стимулирования анти-ID A-1, изотипическим контролем или анти-CD3 или в отсутствие стимула, в присутствии или в отсутствие перекрестно связывающего антитела. Результаты выявили, что стимулирование антиидиотипическим антителом специфически увеличивало фосфорилирование Erk1/2 в клетках Jurkat, трансдуцированных анти-CD19 CAR (полученного из SJ25C1), но не в родительских клетках Jurkat (в которых наблюдался только фоновый сигнал, аналогично нестимулированным клеткам и клеткам, стимулированным изотипическим контролем), до степени, сходной со степенью фосфорилирования, индуцированной антителом против CD3. Напротив, антитело против CD3 индуцировало фосфорилирование неспецифическим образом, то есть как в CAR-экспрессирующей, так и в родительской клетке Jurkat.
C. Идентификация последовательности
Определяли последовательности антитела анти-ID A-1. Суммарную РНК экстрагировали из гибридомных клеток, содержащих гибридмный клон, экспрессирующий анти-ID A-1, и кДНК получали с использованием специфических для изотипа антисмысловых праймеров или универсальных праймеров с использованием набора для синтеза кДНК 1-й цепи PrimeScript™ (Takara, Кат. No. 6110A). RACE-ПЦР проводили для амплификации вариабельных (тяжелых и легких цепей) и константных областей антитела, которые затем клонировали отдельно в вектор клонирования и секвенировали. В Таблице 2 приведены соответствующие SEQ ID NO нуклеотидной или аминокислотной последовательности антитела.
Таблица 2. Последовательность анти-ID A-1
Легкая цепь
Тяжелая цепь
Полная
вариабельная
константная
Полная
вариабельная
константная
Нуклеотидная
SEQ ID NO: 21
SEQ ID NO: 19
SEQ ID NO: 20
SEQ ID NO: 17
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 16
Аминокислотная
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2
Пример 2. Получение антиидиотипических антител против антител, полученных из FMC63
В этом примере описано получение антиидиотипических антител, распознающих часть связывающего домена (scFv) примерного анти-CD19 химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего анти-CD19 scFv с доменами VH или VL, полученными из FMC63 (антитело, содержащее вариабельный домен), вариабельные последовательности тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL), представленные в SEQ ID NO: 30 и 31, соответственно). ScFv представлен в SEQ ID NO: 34 и содержит области VH или VL, разделенные линкером, представленным в SEQ ID NO: 33.
А. Генерирование гибридом и скрининг антител
Мышей иммунизировали растворимым белком, содержащим часть scFv этого CAR (SEQ ID NO: 34), слитую с Fc-доменом человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 32; у белка отсутствовала шарнирная область). Растворимый белковый реагент, используемый для иммунизации, представлен в SEQ ID NO: 35.
Сыворотку, выделенную из иммунизированных мышей, тестировали с помощью ИФА на способность связываться с частью scFv-Fc путем детектирования с помощью вторичного антитела. Клоны подвергали контрольному скринингу против пептида, содержащего только Fc-домен (SEQ ID NO: 32), для отбора антиидиотипических антител, у которых нет перекрестной реактивности с частью Fc scFv-Fc, используемой для иммунизации мышей. Клоны также подвергали контрольному скринингу против конструкции, содержащей scFv, полученной из другого антитела против CD19, SJ25C1 (последовательности вариабельной области SEQ ID NO: 23 и 24, разделенные линкером, представленным в SEQ ID NO: 25), слитые с бесшарнирным Fc-доменом (SEQ ID NO: 32) для дополнительного отбора антиидиотипических антител, у которых отсутствует перекрестная реактивность с другим антителом против CD19.
6
Были получены гибридные гибридомные клоны, и 12 кандидатных клонов дополнительно охарактеризовывали проточной цитометрией. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли у людей, и клетки активировали и трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим анти-CD19 CAR. Для проточной цитометрии приблизительно 1×10 клеток на 100 мкл инкубировали с 10 мкл биотин-конъюгированного антиидиотипического антитела с последующим окрашиванием PE-конъюгированным стрептавидином. В качестве положительного контроля поверхностной экспрессии CAR клетки окрашивали антителом против EGFR для проверки экспрессии маркера трансдукции EGFRt, который был суррогатом экспрессии CAR. В качестве ложного контроля PBMC трансдуцировали пустым вектором, который не экспрессировал CAR. Клетки селектировали на РВМС CD3+ CD4+/CD8+ и определяли флуоресцентный сигнал. Результаты показали, что антиидиотипические антитела-кандидаты демонстрировали специфическое связывание с CAR на поверхности PBMC. Чтобы подтвердить, что антитела являются специфичными для scFv, полученного из антитела против CD19, полученного из FMC63, аналогичные эксперименты были выполнены на клетках, трансдуцированных антителом против CD19, полученным из SJ25C1, как описано в Примере 1. Ни одно из потенциальных антиидиотипических антител против антитела, происходящего от FMC63, не проявляло специфического связывания для клеток, экспрессирующих другой анти-CD19 CAR, содержащий scFv, полученный из SJ25C1. Клоны антиидиотипического антитела, B-1 (анти-ID B-1) и B-2 (анти-ID B-2) были отобраны для дальнейшей характеристики.
B. Идентификация последовательности
Последовательности антител анти-ID B-1 и B-2 были определены. Суммарную РНК экстрагировали из гибридомных клеток, содержащих гибридомные клоны, экспрессирующие анти-ID В-1 или анти-ID В-2, и кДНК получали с использованием специфических для изотипа антисмысловых праймеров или универсальных праймеров с использованием набора для синтеза кДНК 1-й цепи PrimeScript™ (Takara, Кат. No. 6110A). RACE-ПЦР проводили для амплификации вариабельных (тяжелых и легких цепей) и константных областей антител, которые затем клонировали отдельно в вектор клонирования и секвенировали. В Таблице 3 представлены соответствующие SEQ ID NO нуклеотидных или аминокислотных последовательностей антител.
Таблица 3. Последовательности анти-ID B-1 и B-2
Легкая цепь
Тяжелая цепь
Полная (SEQ ID NO)
вариабельная (SEQ ID NO)
константная (SEQ ID NO)
Полная (SEQ ID NO)
вариабельная (SEQ ID NO)
константная (SEQ ID NO)
Анти-ID B-1 Нуклеотидная
56
54
55
52
50
51
Анти-ID B-1 Аминокислотная
42
40
41
38
36
37
Анти-ID B-2 Нуклеотидная
76
75
55
73
71
72
Анти-ID B-2 Аминокислотная
63
62
41
60
58
59
Пример 3 Влияние связанного с планшетом антиидиотипического антитела на стимулирование Т-клеток
В этом примере описаны результаты после инкубации CAR-Т-клеток в присутствии SJ25C1-специфического антиидиотипического антитела (анти-ID A-1), описанного в Примере 1, или в присутствии scFv-специфического антиидиотипического антитела, полученного из антитела FMC63 (анти-ID B-1), описанного в Примере 2.
Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из крови людей, и клетки активировали и трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим анти-CD19 CAR, имеющим связывающий домен, включающий scFv с доменами VH или VL, полученными из FMC63 или из SJ25C1. Такие векторы вводили в клетки для генерирования Т-клеток, сконструированных для экспрессии scFv-содержащих CAR, полученных из FMC63, и Т-клеток, сконструированных для экспрессии scFv-содержащих CAR, полученных из SJ25C1, соответственно. В случае CAR, полученного из FMC63, конструкция, кодирующая CAR, дополнительно включала последовательность, которая кодировала укороченный EGFR (EGFRt), который служил суррогатным маркером для трансдукции и для экспрессии CAR; область, кодирующая EGFRt, была отделена от последовательности, кодирующей CAR, последовательностью пропуска T2A. Сконструированные клетки оценивали в различных анализах.
Для исследований пролиферации сконструированные Т-клетки метили 50 нМ сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) или красителем CELL TRACE VIOLET (CTV). Там, где это уместно, экспрессию суррогатного маркера EGFRt определяли путем окрашивания антителом против EGFR. Клетки высевали с фиксированным числом клеток на лунку в лунки, предварительно покрытые 10, 5, 2,5 или 1,25 мкг/мл OKT3 (антитело против CD3) или антиидиотипическими антителами, распознающими SJ25C1 и FMC63 (анти-ID A-1 и анти-ID B-1, соответственно) в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (pH 9) в течение ночи. Клетки, высеянные в лунки без покрытия антителом, были включены в качестве отрицательных контролей. Клетки культивировали в течение 4 дней и оценивали на жизнеспособность, пролиферацию и экспрессию CD69 и CD25.
Оценивали пролиферацию анти-CD19 (SJ25C1 или FMC63) CAR-экспрессирующих Т-клеток разбавлением красителя с использованием проточной цитометрии. Процент CD3+/CFSElow-клеток, наблюдаемый после стимулирования анти-CD19 (SJ25C1) CAR-экспрессирующих Т-клеток с помощью анти-ID A-1, показан на ФИГ. 2А. Процент CD3+/EGFR+/CFSElow-клеток, наблюдаемый после стимулирования анти-CD19 (FMC63) CAR-экспрессирующих Т-клеток с помощью анти-ID B-1, показан на ФИГ. 2B. Наблюдали, что инкубация в присутствии scFv-специфического анти-ID A-1 антитела, полученного из SJ25C1, приводит к пролиферации анти-CD19 (SJ25C1) CAR-экспрессирующих Т-клеток на уровне, сравнимом со стимулированием антителом против CD3 (ФИГ. 2А). Напротив, пролиферация, наблюдаемая в анти-CD19 (SJ25C1) CAR-экспрессирующих Т-клетках, инкубированных в присутствии другого анти-ID, специфичного для другого анти-CD19-CAR-связывающего домена, scFv-специфичного полученного из FMC63 анти-ID B-1, была аналогична той, которую наблюдали в клетках в отсутствие какого-либо стимулирующего агента. Подобным образом, наблюдали, что инкубация в присутствии scFv-специфического антиидиотипического антитела анти-ID B-1, полученного из FMC63, приводит к пролиферации анти-CD19 CAR-экспрессирующих Т-клеток (связывающий домен, полученный из FMC63) на уровне, сопоставимом с уровнем при стимулировании антителом против CD3. Напротив, клетки, инкубированные в присутствии другого анти-ID, распознающего другой анти-CD19 CAR (scFv-специфичное анти-ID A-1 антитело, полученное из SJ25C1), были сходны с клетками, инкубированными в отсутствие стимулирующих агентов. (Фиг. 2B). Эти результаты продемонстрировали, что каждый из анти-ID A-1 и анти-ID B-1 был способен стимулировать и индуцировать пролиферацию Т-клеток, экспрессирующих CAR, содержащий соответствующий scFv, к которому антитело было специфичным, и не индуцировал пролиферацию Т-клеток, экспрессирующих разные CAR, нацеленные на один и тот же антиген, но не содержащие специфический связывающий домен, к которому антитело было специфичным. Результаты согласуются со способностью анти-ID A-1 и анти-ID B-1 специфически распознавать их соответствующие мишени, а не CAR, содержащие другие связывающие домены против того же антигена.
Результаты другого анализа подтвердили способность типичных анти-ID, оцениваемых в этом анализе, предоставлять сигнал CAR-spec для Т-клеток зависимым от концентрации анти-ID способом, что согласуется с полезностью анти-ID по части настройки количества сигнала, полученного через Т-клетки, экспрессирующие CD19-специфичный CAR. В этом анализе ложно трансдуцированные и CAR-трансдуцированные Т-клетки метили CELL TRACE VIOLET (CTV). Перед посевом на лунки наносили покрытие в виде 0,25, 0,5 или 1 мкг/мл типичного антиидиотипического антитела, специфичного для связывающего домена анти-CD19 CAR. Клетки культивировали в течение 4 дней, и пролиферацию оценивали путем оценки степени разбавления красителя с помощью проточной цитометрии. На ФИГ.2C показана индукция пролиферации CD8+ CAR-T-клеток в зависимости от концентрации антиидиотипического антитела. Эти результаты демонстрируют способность настраивать количество типичных связанных с планшетами антиидиотипических антител, представленных в настоящем документе, например, для настройки количества сигнала и/или обеспечения контролируемого уровня стимулирования и/или оптимизации степени стимулирования CAR-экспрессирующих Т-клеток в разных контекстах.
Чтобы дополнительно исследовать стимулирующую способность анти-ID A-1 и анти-ID B-1, Т-клетки, трансдуцированные целевым анти-CD19 CAR (полученным из SJ25C1 или FMC63, соответственно), оценивали с использованием проточной цитометрии для экспрессии двух маркеров активации Т-клеток, CD69 и CD25, после стимулирования с использованием антител, связанных с планшетом, в концентрациях, включающих 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг/мл. Трансдуцированные Т-клетки селектировали на EGFR в качестве суррогата для экспрессии CAR, а CD4+ или CD8+ EGFR+ клетки оценивали на экспрессию CD69 или CD25.
Как показано на ФИГ. 3 для T-клеток, трансдуцированных анти-CD19 CAR, полученным из SJ25C1, анти-ID A-1 индуцировало большую экспрессию CD25 как в CD4+, так и в CD8+ T-клетках, чем в клетках, стимулированных антителом против CD3. Анти-ID A-1 также индуцировало экспрессию CD69 в CD4+ и CD8+ T-клетках на уровнях, которые были аналогичны или немного меньше, чем когда клетки стимулировали антителом против CD3. Экспрессия CD69 и CD25 не наблюдалась в нестимулированных клетках или клетках, обработанных scFv-специфическим анти-ID B-1, полученным из FMC63. Как показано на ФИГ. 4 для T-клеток, трансдуцированных анти-CD19 CAR, полученным из FMC63, анти-ID В-1 индуцировало большую экспрессию CD25 как в CD4+, так и в CD8+ T-клетках, чем в клетках, стимулированных антителом против CD3. По сравнению со стимулированием антителом против CD3, антитело анти-ID B-1 индуцировало экспрессию CD69 на более высоком уровне в CD4+/EGFR+T-клетках и на уровне, который был аналогичным или немного выше в CD8+/EGFRT+ T-клетках. Экспрессия CD69 была сходной или немного выше при более высоких концентрациях антител в CD8+/EGFR+ T-клетках. Экспрессию CD69 и CD25 не наблюдали в нестимулированных клетках или в клетках, обработанных SJ25C1-специфическим антителом анти-ID A-1. Эти результаты показывают, что как антитело анти-ID A-1, так и анти-ID B-1, были способны специфически стимулировать Т-клетки, экспрессирующие CAR, содержащий их scFv-мишень.
Пример 4 Анализ иммунных ответов хозяина, специфических для трансгенного продукта
Был разработан мостиковый анализ для антитерапевтических антител (ATA) для детектирования присутствия или отсутствия антител в сыворотке обработанных пациентов, распознающих введенные анти-CD19 CAR. Определенные анти-ID антитела, описанные в Примерах 1-3, использовали в качестве положительных контролей и для подтверждения способности анализа обнаруживать присутствие таких антител.
Использовали биотинилированный человеческий Fc-слитый белок (биотинилированный ECD-слитый белок), содержащий scFv-часть CAR с вариабельными областями, полученными из FMC63 (представлено в SEQ ID NO: 34). Биотинилированный ECD-слитый белок добавляли в лунки, покрытые стрептавидином; планшеты инкубировали в условиях, обеспечивающих связывание слитого белка, и промывали. В лунки, покрытые биотинилированным слитым белком, добавляли различные концентрации анти-ID B-1 или анти-ID B-2 и оставляли для инкубации в условиях, обеспечивающих специфическое связывание антитела. После промывки, получали сульфо-меченный вариант ECD-слитого белка (сульфо-ECD-слитый белок), содержащий Fc-scFv, полученный из FMC63. Лунки промывали и считывали сигнал электрохемилюминесценции (ECL) на секторном аппарате для визуализации Meso Scale Discovery (MSD).
Как показано на ФИГ. 5, сигнал ECL увеличивался при увеличении концентрации анти-ID B-1 и анти-ID B-2, указывая на то, что анализ можно использовать для оценки присутствия или отсутствия и уровня антител в образцах сыворотки с любым из иллюстративных анти-ID-антител, используемых в качестве положительного контроля.
В некоторых вариантах осуществления анализ ATA с использованием анти-ID B-1 и/или анти-ID B-2 антител в качестве положительного контроля используют для оценки присутствия или отсутствия антител ATA против CAR в образцах от пациентов, получавших инфузионно дозы клеточной терапии, содержащей анти-CD19 (FMC63) CAR-экспрессирующие Т-клетки. Такие АТА могут в некоторых случаях потенциально указывать на гуморальный иммунный ответ хозяина против введенного CAR. В типичном анализе образцы плазмы получают от пациентов в различные моменты времени, такие как до инфузии и/или в дни 14 и 28, а в некоторых случаях через 3, 6 и/или 12 месяцев после начала введения клеточной терапии. Образцы, полученные из таких образцов плазмы, используются вместе с контрольными образцами, содержащими анти-ID антитела, в анализе, как описано выше.
Аналогичный мостиковый анализ также осуществляли для оценки образцов пациентов, получавших инфузионно дозы клеточной терапии, содержащей анти-CD19 (SJ25C1) CAR-экспрессирующих Т-клеток. В этом анализе анти-ID A-1 антитело использовали в качестве положительного контроля. Наблюдали, что анализ имеет чувствительность менее 100 нг/мл, как определено на основании положительного контроля анти-ID антитела и > 4-5-кратного сигнала на фоне плазмы.
Пример 5 Конъюгация антиидиотипического антитела с микросферами
Либо анти-ID B-1, либо анти-ID-B1, как описано в Примере 2, ковалентно связывали с поверхностью коммерчески доступных активированных тозилом магнитных микросфер (ThermoFisher, Waltham MA), которые представляют собой суперпарамагнитные, непористые, монодисперсные, тозилактивированные микросферы. Микросферы ковалентно связывают первичные амино- и сульфгидрильные группы. Конъюгацию осуществляли с использованием микросфер, имеющих диаметр приблизительно 2,8 мкм (обозначен М-280) или 4,5 мкм (обозначен М-450).
9
8
200 мкг анти-ID антитела добавляли к приблизительно 1 мл тозил-активированных микросфер (например, приблизительно 4×10 тозил-активированных микросфер, имеющих диаметр 2,8 мкм или приблизительно 4×10 тозил-активированных микросфер, имеющих диаметр 4,5 мкм), и ковалентное связывание выполняли с помощью инкубация в течение ночи при 37°C в фосфатно-буферном растворе (PBS), содержащем 0,1% человеческого сывороточного альбумина (HSA). Микросферы промывали и ресуспендировали в 1 мл PBS с 0,1% HSA. После конъюгации концентрацию микросфер определяли с помощью Cellometer.
Для оценки стабильности микросфер, конъюгированных с анти-ID, микросферы осаждали, супернатант удаляли и наносили на 4-12% гель Bis-Tris SDS-PAGE и гель окрашивали кумасси синим. В качестве контроля суммарного белка, конъюгированного с микросферами, осажденные микросферы кипятили в буфере для образцов LDS 4X (додецилсульфат лития) при температуре примерно 70°C в течение 20 минут, и примерно 12,5 мкл или 25 мкл кипяченного супернатанта также обрабатывали на геле SDS-PAGE и оценивали с помощью Кумаси синего. Приблизительно 2,5 мкг или 5 мкг анти-ID антитела, которое не было конъюгировано с мироксферами (положительный контроль), или 5 мкл 0,1% HSA (отрицательный контроль) также оценивали с помощью окрашивания SDS-PAGE и Кумасси. В супернатанте не было обнаружено анти-ID антител из конъюгированных образцов, которые не кипятили, что указывает на то, что конъюгация была стабильной, в то время как анти-ID антитело было обнаружено в супернатанте из конъюгированных образцов, которые кипятили.
Пример 6 Оценка стимулирования Т-клеток, культивируемых с микросферами, конъюгированными с антиидиотипическими антителами
Полученные из FMC63 scFv-специфичные анти-ID B-1-конъюгированные микросферы инкубировали с Т-клетками. CD3-очищенные Т-клетки выделяли путем иммуноаффинного обогащения из образцов лейкофереза от здоровых доноров. Выделенные клетки трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим анти-CD19 CAR, имеющий scFv, полученный из FMC63. Вирусная векторная конструкция дополнительно кодировала укороченный EGFR (EGFRt), который служил суррогатным маркером для экспрессии CAR; EGFRt-кодирующая область была отделена от последовательности CAR последовательностью пропуска T2A. После трансдукции клетки наращивали в культуре и замораживали путем криоконсервации.
Для исследований стимулирования Т-клеток оттаявшие CD4+ или CD8+ CAR-экспрессирующие клетки высевали отдельно в количестве приблизительно 50000 суммарных клеток на лунку. В некоторых случаях в культуральную среду дополнительно добавляли цитокины следующим образом: для клеток CD4+ - приблизительно 1200 МЕ/мл рекомбинантного IL-7, 20 МЕ/мл рекомбинантного IL-15 и 100 МЕ/мл рекомбинантного IL-2; для клеток CD8+ приблизительно 200 МЕ/мл рекомбинантного IL-2 и 20 МЕ/мл рекомбинантного IL-15. Микросферы, конъюгированные с анти-ID B-1, добавляли к клеткам в соотношении 1:1 или 1:5 клетки:микросферы и инкубировали до 14 дней с 50% заменой сред каждые 2-3 дня. В качестве положительного контроля клетки культивировали с анти-CD3/анти-CD28 магнитными микросферами при соотношении клеток:микросфер 3:1 в присутствии или в отсутствие указанных цитокинов.
В различные периоды культивирования CD4+ или CD8+ трансдуцированные клетки (как обнаружено с помощью анти-EGFR для экспрессии суррогатного маркера) оценивали на экспансию, экспрессию PD-1 и жизнеспособность.
Как показано на ФИГ.6 и 7, экспансию CD4+ и CD8+ Т-клеток, соответственно, наблюдали, когда клетки культивировали с микросферами, конъюгированными с анти-ID при соотношении 1:1 или 1:5 клетки:микросферы, особенно в присутствии цитокинов. Степень экспансии была выше, чем при культивировании клеток с контрольными анти-CD3/анти-CD28 магнитными микросферами.
Поверхностную экспрессию PD-1 в подгруппе CD4+ клеток оценивали с помощью проточной цитометрии на 3, 7, 10 и 14 дни культивирования. Как показано на ФИГ. 8, экспрессия PD-1 была высокой на клетках, культивируемых с анти-CD3/анти-CD28 магнитными микросферами, однако уровни PD-1 были существенно ниже или не детектировались в клетках, которые культивировали с микросферами, конъюгированными с анти-ID.
Как показано на ФИГ. 9, процент жизнеспособности CD4+ и CD8+ T-клеток, культивируемых с соотношением 1:1 или 1:5 микросфер, конъюгированных с анти-ID, или контрольных микросфер, конъюгированных с анти-CD3/анти-CD28, оставался стабильно высоким в течение периода культивирования, когда клетки дополнительно культивировали в присутствии цитокинов. Однако при всех условиях жизнеспособность клеток снижалась в отсутствие добавленных цитокинов, при этом наибольшая потеря жизнеспособности клеток происходила в более поздние дни культивирования клеток.
Пример 7 Оценка продуцирования цитокинов Т-клетками, культивированными с микросферами, конъюгированными с антиидиотипическими антителами
+
-
+
Т-клетки, сконструированные с анти-CD19 CAR, имеющие scFv, полученный из FMC63, генерировали, по существу, как описано в Примере 6. Оттаявшие CD8+ Т-клетки культивировали с микросферами, конъюгированными с анти-ID B-1, в течение 4 часов в присутствии ингибитора Гольджи. Внутриклеточные уровни цитокинов TNFα, IFNγ и IL-2 определяли с помощью проточной цитометрии в подгруппе CAR T-клеток (как определено по положительному окрашиванию поверхности для суррогатного маркера трансдукции EGFRt анти-EGFR) или в подгруппе CAR T-клеток (как определено отрицательным окрашиванием поверхности для EGFRt с анти-EGFR). Для сравнения, CAR T-клетки (EGFR+) также культивировали с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями (клетки K562, трансдуцированные для экспрессии CD19, K562-CD19) при соотношении эффектор:T-клетки 1:2.
+
-
+
Как показано на ФИГ. 10А, внутриклеточные уровни цитокинов TNFα, IFNγ и IL2 индуцировались в CAR T-клетках (EGFRt+), но не в CAR T-клетках (EGFR-), когда клетки культивировали в присутствии микросфер, конъюгированных с анти-ID B-1. В этом исследовании степень стимулирования, наблюдаемая в присутствии анти-ID-конъюгированных микросфер, была аналогична стимулированию CAR T-клеток с использованием антиген-экспрессирующих клеток K562-CD19, которые являются альтернативным CAR-специфическим стимулирующим реагентом (ФИГ. 10B). Эти результаты продемонстрировали, что анти-ID, конъюгированные с микросферами, являются агонистическими и специфически стимулируют Т-клетки, экспрессирующие CAR, имеющий антиген-связывающий домен, распознаваемый анти-ID антителом. Кроме того, реагент микросфер обеспечивает лучший CAR-специфический стимулирующий реагент по сравнению с клеточными линиями, которым требуется культивирование и которые подвержены изменчивости от партии к партии.
Пример 8 Оценка экспансии после серийного рестимулирования
+
+
+
Способность клеток наращиваться ex vivo после повторных стимулирований может быть потенциальным суррогатом способности CAR T-клеток сохраняться (например, после первоначальной активации) и/или быть показателем функции in vivo (Zhao et al. (2015) Cancer Cell, 28: 415-28). CAR T-клетки генерировали, как описано выше, и оттаявшие CD4+ или CD8+ CAR-экспрессирующие T-клетки высевали отдельно при 50000 CAR клеток/лунку. Микросферы, конъюгированные с анти-ID B-1, добавляли к клеткам в соотношении 1:1 или 1:5 клетка:микросферы в присутствии или в отсутствие цитокинов, как описано в Примере 6. В качестве контроля к клеткам добавляли магнитные микросферы анти-CD3/анти-CD28 в соотношении 3:1 клетка:микросферы в присутствии или в отсутствие цитокинов. Клетки собирали каждые 3-4 дня и подсчитывали, и повторно стимулировали новыми клетками-мишенями с использованием тех же условий культивирования после сброса числа клеток до начальной плотности высевания для каждого раунда. Всего было проведено 4 раунда стимулирования в течение 14-дневного периода культивирования. Для каждого раунда стимулирования определяли количество удвоений.
Как показано на ФИГ. 11, продолжалась экспансия CAR-экспрессирующих (EGFR+) CD4+ клеток после рестимулирования с помощью микросфер, конъюгированных с анти-ID, хотя степень экспансии была выше, когда клетки культивировали в присутствии цитокинов. Кроме того, степень экспансии была выше, чем при культивировании клеток с анти-CD3/анти-CD28 микросферами. Для CD8+ Т-клеток подобная кинетика экспансии наблюдалась, когда клетки культивировали в присутствии либо микросфер, конъюгированных с анти-ID, либо анти-CD3/анти-CD28 микросфер, хотя экспансия была несколько больше, когда клетки культивировали с микросферами, конъюгированными с анти-ID, особенно в отсутствие добавленных рекомбинантных цитокинов.
Пример 9 Дополнительный анализ CAR-специфической экспансии клеток с использованием микросфер, конъюгированных с антиидиотипическим антителом
Были проведены исследования, подобные тем, которые описаны в Примерах 7 и 8, за исключением того, что использовали CAR-экспрессирующие Т-клетки, полученные от двух разных пациентов-доноров. CD3-очищенные Т-клетки выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) двух пациентов-доноров, трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим анти-CD19 CAR, имеющий scFv, полученный из FMC63, наращивали в культуре, замораживали и оттаивали.
6
Оттаявшие CD4+, CD8+ или совместные культуры CD4/CD8 (соотношение 1:1) высевали в лунки 6-луночного планшета в количестве приблизительно 5×10 клеток/на лунку в культуральной среде, которая была дополнительно дополнена цитокинами следующим образом: для CD4+ клеток или совместных культур CD4+/CD8+ среды были дополнены приблизительно 1200 МЕ/мл рекомбинантного IL-7, 20 МЕ/мл рекомбинантного IL-15 и 100 МЕ/мл рекомбинантного IL-2; для клеток CD8+ в среду добавляли 200 МЕ/мл рекомбинантного IL-2 и 20 МЕ/мл рекомбинантного IL-15. Микросферы, конъюгированные с анти-ID B-1, добавляли к клеткам в соотношении 1:1 клетка:микросферы и инкубировали до 9 дней с 50% заменой сред каждые 2-3 дня.
В различные периоды культивирования оценивали количество клеток, трансдуцированных CD4+ или CD8+ (как обнаружено с помощью анти-EGFR для экспрессии суррогатного маркера), присутствующих в культуре для каждого условия, и определяли кратность экспансии или частоту CAR-экспрессирующих клеток в виде процента от суммарных клеток. Также определяли экспрессию PD-1 и CD25 и жизнеспособность клеток.
Как показано на ФИГ. 12A, более чем 60-кратное увеличение CAR-экспрессирующих (EGFRt+) CD4+ T-клеток наблюдали, когда CD4+ клетки культивировали отдельно с микросферами, конъюгированными с анти-ID. Что касается CD8+ Т-клеток, то в присутствии микросфер, конъюгированных с анти-ID, происходила существенно более высокая экспансия CAR-экспрессирующих (EGFRt+) CD8+ Т-клеток, когда CD8+ Т-клетки совместно культивировали с CD4+ клетками. Как показано на ФИГ. 12B, частота CAR-экспрессирующих (EGFRt+) CD4+ или CD8+ клеток увеличивалась в течение 9 дней культивирования в присутствии микросфер, конъюгированных с анти-ID, при > 90% трансдуцированных клеток (EGFRt+), присутствующих в культуре на 9 день. Жизнеспособность CD4+ и CD8+ клеток также оставалась близкой к 100% во время культивирования, при этом несколько большую жизнеспособность CD8+ Т-клеток наблюдали при совместном культивировании с CD4+ Т-клетками (ФИГ. 12C). Аналогичные результаты наблюдали для обоих доноров.
Поверхностную экспрессия PD-1 и CD25 на трансдуцированных (EGFRt+) CD4+ или CD8+ клетках оценивали с помощью проточной цитометрии на 5, 7 и 9 дни культивирования с микросферами, конъюгированными с анти-ID. Как показано на ФИГ. 13А, экспрессия PD-1 как на CD4+, так и на CD8+ Т-клетках существенно снижалась с течением времени при культивировании с микросферами, конъюгированными с анти-ID. Как показано на ФИГ. 13B, экспрессия CD25 также снижалась после 9 дней культивирования в присутствии анти-ID-конъюгированных микросфер. Аналогичные результаты наблюдали для обоих доноров.
Пример 10 Сравнение уровней цитокинов и фенотипа после культивирования с микросферами, конъюгированными с антиидиотипическим антителом
CD3-очищенные Т-клетки выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) двух пациентов-доноров, трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим анти-CD19 CAR, имеющий scFv, полученный из FMC63, и наращивали в культуре с микросферами, покрытыми каждым из антител против CD3 и против CD28. После наращивания размноженные Т-клетки замораживали путем криоконсервации. Для исследований замороженные Т-клетки оттаивали и CD4+ и CD8+Т-клетки оценивали на внутриклеточные уровни цитокинов или поверхностный фенотип (д=0), или оттаявшие CD4+, CD8+ Т-клетки или совместно культивируемые CD4+/CD8+ Т-клетки культивировали в течение дополнительных 9 дней в присутствии анти-ID B-1-конъюгированных микросфер до оценки внутриклеточных уровней цитокинов и фенотипа поверхностного маркера после стимулирования с помощью PMA/иономицина или CD19-трансдуцированных клеток K562 (д=9).
Для оценки уровней внутриклеточных цитокинов ингибитор Гольджи добавляли в течение 4 часов, а затем оценивали TNFα, IFNγ и IL-2 с помощью проточной цитометрии. Для всех условий степень внутриклеточной экспрессии цитокинов была значительно выше, когда клетки стимулировали PMA/иономицином, по сравнению с CAR-специфическим стимулированием CD19-трансдуцированными клетками K562. Как показано на ФИГ. 14A, уровни цитокинов TNFα и IL-2 были сходными в клетках CD4+ или CD8+ сразу после оттаивания по сравнению с соответствующим уровнем в клетках CD4+ или CD8+ или в совместных культурах CD4/CD8 T-клеток, дополнительно культивируемых в присутствии микросфер, конъюгированных с анти-ID, в течение 9 дней. Повышенный уровень IFNγ наблюдали в оттаявших CD4+, CD8+ Т-клетках или в совместной культуре CD4/CD8 Т-клеток, которые дополнительно культивировали в присутствии микросфер, конъюгированных с анти-ID, в течение 9 дней по сравнению с уровнем IFNγ в CD4+ или CD8+ Т-клетках сразу после оттаивания. Эти результаты продемонстрировали, что функция Т-клеток поддерживалась после 9-дневного наращивания в присутствии микросфер, конъюгированных с анти-ID. Аналогичные результаты были получены в клетках от двух доноров.
Поверхностную экспрессию маркера активации CD25, поверхностную экспрессию ингибиторных рецепторов PD-1 и LAG-3 и ядерную экспрессию маркера пролиферации Ki-67 также оценивали в клетках CD4+ или CD8+ сразу после оттаивания (д=0) или в CD4+ или CD8+ Т-клетках, которые наращивали отдельно или в виде совместной культуры CD4/CD8 Т-клеток в течение дополнительных 9 дней в присутствии анти-ID-конъюгированных микросфер (д=9). Как показано на ФИГ. 14B, пониженную экспрессию CD25, но не Ki-67, наблюдали в клетках, которые дополнительно культивировали в присутствии анти-ID-конъюгированных микросфер в течение 9 дней по сравнению с Т-клетками сразу после оттаивания. Пониженная экспрессия CD25 была значительно выше в клетках CD8+, чем в клетках CD4+. Кроме того, пониженную экспрессию PD-1 и LAG-3 также наблюдали как в клетках CD4+, так и в клетках CD8+, культивированных отдельно или в виде совместной культуры CD4/CD8 после инкубации в течение 9 дней с микросферами, конъюгированными с анти-ID, по сравнению с экспрессией в клетках сразу после оттаивания. Этот результат продемонстрировал, что после инкубации с микросферами, конъюгированными с анти-ID, ранее замороженные трансдуцированные клетки сохраняли функциональную способность, о чем свидетельствует высокий процент клеток, которые были положительными по маркеру Ki-67, что свидетельствует о пролиферации клеток, но также демонстрировали другое состояние активации, характеризующееся низкой поверхностной экспрессией маркера активации CD25 и ингибирующих рецепторных маркеров PD-1 и LAG-3.
Пример 11 Детектирование CAR-экспрессирующих клеток с использованием антиидиотипических антител.
Были получены композиции Т-клеток, содержащие CAR-T-клетки, экспрессирующие анти-CD19 CAR, содержащий анти-CD19 scFv с вариабельными областями, полученными из антитела FMC63, спейсер иммуноглобулина, трансмембранный домен, полученный из CD28, костимулирующую область, полученную из 4-1BB, и внутриклеточный сигнальный домен CD3-дзета. Вирусная конструкция, кодирующая CAR, дополнительно кодировала суррогатный маркер EGFRt, который был отделен от последовательности CAR последовательностью пропуска T2A.
Клетки, экспрессирующие анти-CD19 CAR, вносили в образец клеток, содержащих мононуклеарные клетки периферической крови здорового человека (РВМС). Полученные клеточные композиции инкубировали с различными концентрациями анти-CD19 FMC63 scFv-специфичных анти-ID B1 или анти-ID B2 антител. В качестве контроля образцы каждого условия также инкубировали с концентрацией анти-EGFR-антитела, способного детектировать суррогатный маркер EGFRt на трансдуцированных клетках. Контрольные образцы включали образцы, содержащие только РВМС без добавления Т-клеток, экспрессирующих CAR. Среднее геометрическое значение интенсивности флуоресценции (MFI) определяли количественно в положительно меченных клетках для оценки окрашивания антител.
Как показано на ФИГ. 15А, оба антиидиотипических антитела детектировали Т-клетки с анти-CD19 CAR, имеющим scFv с вариабельными областями, полученными из FMC63, зависимым от концентрации образом. Как показано на ФИГ. 15B, анти-ID B1 и анти-ID B2-антитела детектировали положительные клетки в композициях, которые содержали CAR-экспрессирующие клетки, а не в композициях, которые содержали только РВМС. Окрашивание на EGFRt показало, что соотношение клеток, экспрессирующих трансген, и РВМС, было постоянным во всех условиях. Результаты подтвердили способность анти-ID B1 и анти-ID B2 антител специфически выявлять анти-CD19 FMC63 scFv CAR-экспрессирующие клетки даже среди образцов, содержащих человеческие PBMC, которые не экспрессировали CAR. Результаты согласуются с интерпретацией, что антиидиотипические антитела можно использовать для детектирования CAR-экспрессирующих клеток в образцах от пациентов, которым вводили CAR-экспрессирующие клетки, распознаваемые антителами, например, в образцах периферической крови, собранных у людей, например для измерения экспансии, направленной миграции и/или персистентности таких клеток с течением времени в различных тканях и/или жидкостях пациента.
Настоящее изобретение не предназначено для ограничения по объему конкретными раскрытыми вариантами осуществления, которые предоставлены, например, для иллюстрации различных аспектов изобретения. Различные модификации описанных композиций и способов станут очевидными из описания и идей, приведенных в настоящем документе. Такие вариации могут быть осуществлены без отклонения от истинного объема и сущности раскрытия и, как подразумевается, охвачены объемом настоящего раскрытия.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
#
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
АННОТАЦИЯ
1
QVQLQQPGSELVRPGGSVKLSCKASDYTFTSYWMHWVRQRPGQGLEWIGNIYPGSGGTNYDEKFKRKATLTVDTSSSTAYMQLRSLTSEDSAVYYCTREVTTVAYYYSMDYWGQGTSVTVSS
анти-ID VH
2
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
анти-ID CH
3
QVQLQQPGSELVRPGGSVKLSCKASDYTFTSYWMHWVRQRPGQGLEWIGNIYPGSGGTNYDEKFKRKATLTVDTSSSTAYMQLRSLTSEDSAVYYCTREVTTVAYYYSMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
анти-ID тяжелая цепь
4
MGWSSIILFLVATASGVHS
анти-ID HC сигнальная последовательность
5
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKTVPFTFGSGTKLEIK
анти-ID VL
6
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNNYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
анти-ID CL
7
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKTVPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNNYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
анти-ID легкая цепь
8
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRC
анти-ID LC сигнальная последовательность
9
SYWMH
анти-ID HC-CDR1
10
NIYPGSGGTNYDEKFKR
анти-ID HC-CDR2
11
EVTTVAYYYSMDY
анти-ID HC-CDR3
12
RASQDISNYLN
анти-ID LC-CDR1
13
YTSRLHS
анти-ID LC-CDR2
14
QQGKTVPFT
анти-ID LC-CDR3
15
CAGGTCCAACTGCAACAACCTGGGTCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGGTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGACTACACTTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTTATCCTGGTAGTGGTGGTACTAACTACGATGAGAAGTTCAAGAGGAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGAGGTTACTACAGTAGCTTATTACTATTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
анти-ID VH
16
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA
анти-ID CH
17
CAGGTCCAACTGCAACAACCTGGGTCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGGTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGACTACACTTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTTATCCTGGTAGTGGTGGTACTAACTACGATGAGAAGTTCAAGAGGAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGAGGTTACTACAGTAGCTTATTACTATTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA
анти-ID тяжелая цепь
18
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCCTCAGGTGTCCACTCC
анти-ID HC сигнальная последовательность
19
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGTCAGCAGGGTAAAACGGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA
анти-ID VL
20
CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAACTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG
анти-ID CL
21
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGTCAGCAGGGTAAAACGGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAACTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG
анти-ID легкая цепь
22
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGT
анти-ID LC сигнальная последовательность
23
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS
SJ25C1 VH
24
DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR
SJ25C1 VL
25
GGGGSGGGGSGGGGS
Линкер
26
GGGGS
4GS линкер
27
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
Внеклеточная часть CD28
28
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR
SJ25C1 scFv
29
GGGS
3GS линкер
30
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
FMC63 VH
31
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
FMC63 VL
32
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
IgG1 Fc без шарнира
33
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
Линкер
34
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
FMC63 scFv
35
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FMC63 реагент
36
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQCHGKSLEWIGDINPNNGGTDYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAREGNNYGSRDAMDYWGQGTSVTVSS
Анти-ID B-1 VH
37
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
Анти-ID B-1 CH
38
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQCHGKSLEWIGDINPNNGGTDYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAREGNNYGSRDAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
анти-ID B-1 тяжелая цепь
39
MGWSWIFLFLLSGTAGVLS
анти-ID B-1 HC сигнальная последовательность
40
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSGVIYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
Анти-ID B-1 VL
41
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
Анти-ID B-1 CL
42
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSGVIYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
анти-ID B-1 легкая цепь
43
MDFQVQIFSFLLMSASVIMSRG
анти-ID B-1 LC сигнальная последовательность
44
DYYMK
анти-ID B-1 HC-CDR1
45
DINPNNGGTDYNQNFKG
анти-ID B-1 HC-CDR2
46
EGNNYGSRDAMDY
анти-ID B-1 HC-CDR3
47
SASSGVIYMY
анти-ID B-1 LC-CDR1
48
LTSNLAS
анти-ID B-1 LC-CDR2
49
QQWSSNPLT
анти-ID B-1 LC-CDR3
50
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAGCAGTGTCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGGTACTGACTACAACCAGAACTTTAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGGGAATAACTACGGTAGTAGAGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACGTCAGTCACCGTCTCCTCA
Анти-ID B-1 VH
51
GCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
анти-ID B-1 CH
52
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAGCAGTGTCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGGTACTGACTACAACCAGAACTTTAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGGGGAATAACTACGGTAGTAGAGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACGTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA
анти-ID B-1 тяжелая цепь
53
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCTTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCT
анти-ID B-1 HC сигнальная последовательность
54
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAGGTGTAATTTACATGTACTGGTACCAACAGAAGCCAAGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAGCTGAAA
анти-ID B-1 VL
55
CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
анти-ID B-1 CL
56
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAGGTGTAATTTACATGTACTGGTACCAACAGAAGCCAAGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
анти-ID B-1 легкая цепь
57
ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATGAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGGGGA
анти-ID B-1 LC сигнальная последовательность
58
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYSFTRYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDNSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCASIYYEEAWGQGTLVTVSA
анти-ID B-2 VH
59
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
анти-ID B-2 CH
60
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYSFTRYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDNSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCASIYYEEAWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
анти-ID B-2 тяжелая цепь
61
MGWSSIILFLVATATGVHS
анти-ID B-2 HC сигнальная последовательность
62
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADSVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK
анти-ID B-2 VL
63
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADSVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
анти-ID B-2 легкая цепь
64
MSVLTQVLALLLLWLTGARC
анти-ID B-2 LC сигнальная последовательность
65
RYWMN
анти-ID B-2 HC-CDR1
66
MIHPSDSETRLNQKFKD
анти-ID B-2 HC-CDR2
67
IYYEEA
анти-ID B-2 HC-CDR3
68
RASGNIHNYLA
анти-ID B-2 LC-CDR1
69
NAKTLAD
анти-ID B-2 LC-CDR2
70
QHFWSTPYT
анти-ID B-2 LC-CDR3
71
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACTCCTTCACCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGCATGATTCATCCTTCCGATAGTGAAACTAGGTTAAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGCATCTACTATGAAGAGGCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
анти-ID B-2 VH
72
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
анти-ID B-2 CH
73
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACTCCTTCACCAGGTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGCATGATTCATCCTTCCGATAGTGAAACTAGGTTAAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGCATCTACTATGAAGAGGCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
анти-ID B-2 тяжелая цепь
74
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCC
анти-ID B-2 HC сигнальная последовательность
75
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATAGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
анти-ID B-2 VL
76
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATAGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
анти-ID B-2 легкая цепь
77
ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGCGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCCAGATGT
анти-ID B-2 LC сигнальная последовательность
78
DYTFTSY
анти-ID HC-CDR1
79
DYTFTSYWMH
анти-ID HC-CDR1
80
TSYWMH
анти-ID HC-CDR1
81
YPGSGG
анти-ID HC-CDR2
82
NIYPGSGGTN
анти-ID HC-CDR2
83
WIGNIYPGSGGTN
анти-ID HC-CDR2
84
TREVTTVAYYYSMD
анти-ID HC-CDR3
85
SNYLNWY
анти-ID LC-CDR1
86
LLIYYTSRLH
анти-ID LC-CDR2
87
QQGKTVPF
анти-ID LC-CDR3
88
GYTFTDY
анти-ID B-1 HC-CDR1
89
GYTFTDYYMK
анти-ID B-1 HC-CDR1
90
TDYYMK
анти-ID B-1 HC-CDR1
91
NPNNGG
анти-ID B-1 HC-CDR2
92
DINPNNGGTD
анти-ID B-1 HC-CDR2
93
WIGDINPNNGGTD
анти-ID B-1 HC-CDR2
94
AREGNNYGSRDAMD
анти-ID B-1 HC-CDR3
95
IYMYWY
анти-ID B-1 LC-CDR1
96
PWIYLTSNLA
анти-ID B-1 LC-CDR2
97
QQWSSNPL
анти-ID B-1 LC-CDR3
98
GYSFTRY
анти-ID B-2 HC-CDR1
99
GYSFTRYWMN
анти-ID B-2 HC-CDR1
100
TRYWMN
анти-ID B-2 HC-CDR1
101
HPSDSE
анти-ID B-2 HC-CDR2
102
MIHPSDSETR
анти-ID B-2 HC-CDR2
103
WIGMIHPSDSETR
анти-ID B-2 HC-CDR2
104
ASIYYEE
анти-ID B-2 HC-CDR3
105
HNYLAWY
анти-ID B-2 LC-CDR1
106
LLVYNAKTLA
анти-ID B-2 LC-CDR2
107
QHFWSTPY
анти-ID B-2 LC-CDR3
108
GYX<sub>3</sub>FX<sub>5</sub>X<sub>6</sub>YX<sub>8</sub>MX<sub>10</sub>
HC-CDR1 Консенсус
X<sub>3</sub>=T или S;
X<sub>5</sub>=T или S;
X<sub>6</sub>=D или R;
X<sub>8</sub>=Y или W;
X<sub>10</sub>=K или N
109
WIGX<sub>4</sub>IX<sub>6</sub>PX<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>TX<sub>13</sub>X<sub>14</sub>NQX<sub>17</sub>FKX<sub>20</sub>
HC-CDR2 Консенсус
X<sub>4</sub>=D или M;
X<sub>6</sub>=N или H;
X<sub>8</sub>=N или S;
X<sub>9</sub>=N или D;
X<sub>10</sub>=G или S;
X<sub>11</sub>=G или E;
X<sub>13</sub>=D или R;
X<sub>14</sub>=Y или L;
X<sub>17</sub>=N или K;
X<sub>20</sub>=G или D
110
AX<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>13</sub>X<sub>14</sub>X<sub>15</sub>
HC-CDR3 Консенсус
X<sub>2</sub>=R или S;
X<sub>3</sub>=E или I;
X<sub>4</sub>=G или Y;
X<sub>5</sub>=N или Y;
X<sub>6</sub>=N или E;
X<sub>7</sub>=Y или отсутствует;
X<sub>8</sub>=G или отсутствует;
X<sub>9</sub>=S или отсутствует;
X<sub>10</sub>=R или отсутствует;
X<sub>11</sub>=D или отсутствует;
X<sub>12</sub>=A или отсутствует;
X<sub>13</sub>=M или отсутствует;
X<sub>14</sub>=D или E;
X<sub>15</sub>=Y или A
111
X<sub>1</sub>AX<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub> X<sub>7</sub>X<sub>8</sub> YX<sub>10</sub>X<sub>11</sub>WY
LC-CDR1 Консенсус
X<sub>1</sub>=S или R;
X<sub>3</sub>=S или R;
X<sub>4</sub>=S или G;
X<sub>5</sub>=G или N;
X<sub>6</sub>=V или I;
X<sub>7</sub>=I или H;
X<sub>8</sub>=N или отсутствует;
X<sub>10</sub>=M или L;
X<sub>11</sub>=Y или A
112
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>YX<sub>5</sub>X<sub>6</sub> X<sub>7</sub>X<sub>8</sub> LAX<sub>11</sub>
LC-CDR2 Консенсус
X<sub>1</sub>=P или L;
X<sub>2</sub>=W или L;
X<sub>3</sub>=I или V;
X<sub>5</sub>=L или N;
X<sub>6</sub>=T или A;
X<sub>7</sub>=S или K;
X<sub>8</sub>=N или T;
X<sub>11</sub>=S или D
113
QX<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>PX<sub>8</sub>T
LC-CDR3 Консенсус
X<sub>2</sub>=Q или H;
X<sub>3</sub> =W или F;
X<sub>4</sub>=S или W;
X<sub>5</sub>=S или W;
X<sub>6</sub>=N или T;
X<sub>8</sub>=L или Y
114
SYWMN
SJ25C1 HC-CDR1
115
QIYPGDGDTNYNGKFKG
SJ25C1 HC-CDR2
116
KTISSVVDFYFDY
SJ25C1 HC-CDR3
117
KASQNVGTNVA
SJ25C1 LC-CDR1
118
SATYRNS
SJ25C1 LC-CDR2
119
QQYNRYPYT
SJ25C1 LC-CDR3
120
DYGVS
FMC63 HC-CDR1
121
VIWGSETTYYNSALKS
FMC63 HC-CDR2
122
HYYYGGSYAMDY
FMC63 HC-CDR3
123
RASQDISKYLN
FMC63 LC-CDR1
124
HTSRLHS
FMC63 LC-CDR2
125
QQGNTLPYT
FMC63 LC-CDR3
126
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
T2A
127
EGRGSLLTCGDVEENPGP
T2A
128
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
P2A
129
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
P2A
130
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
E2A
131
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
F2A
132
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVS DYTFTSY GVHWVRQSPGKGLEWLGVI YPGSGG TDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR EVTTVAYYYSMDY WGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 тяжелая цепь
133
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC RASQDISNYLN WYQQRTNGSPRLLIK YTSRLHS GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQGKTVPFT FGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 легкая цепь
134
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSL TSYWMH WVRQSPGKGLE WIGNIYPGSGGTN YNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYC TREVTTVAYYYSMD YWGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 тяжелая цепь
135
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSI SNYLNWY QQRTNGSPR LLIYYTSRLH SGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQGKTVPF TFGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 легкая цепь
136
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT SYWMH WVRQSPGKGLEWLG NIYPGSGGTNYDEKFKR RLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR EVTTVAYYYSMDY WGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 тяжелая цепь
137
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC RASQDISNYLN WYQQRTNGSPRLLIK YTSRLHS GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQGKTVPFT FGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 легкая цепь
138
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVS GYTFTDY GVHWVRQSPGKGLEWLGVI NPNNGG TDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR EGNNYGSRDAMDY WGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
139
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC SASSGVIYMY WYQQRTNGSPRLLIK LTSNLAS GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQWSSNPLT FGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
140
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT DYYMK WVRQSPGKGLEWLG DINPNNGGTDYNQNFKG RLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR EGNNYGSRDAMDY WGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
141
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC SASSGVIYMY WYQQRTNGSPRLLIK LTSNLAS GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQWSSNPLT FGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
142
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSL TDYYMK WVRQSPGKGLE WIGDINPNNGGTD YNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYC AREGNNYGSRDAMD YWGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
143
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSI IYMYWY QQRTNGSPR PWIYLTSNLA SGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QQWSSNPL TFGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
144
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVS GYSFTRY GVHWVRQSPGKGLEWLGVI HPSDSE TDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR IYYEEA WGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
145
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC RASGNIHNYLA WYQQRTNGSPRLLIK NAKTLAD GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QHFWSTPYT FGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
146
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT RYWMN WVRQSPGKGLEWLG MIHPSDSETRLNQKFKD RLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR IYYEEA WGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
147
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC RASGNIHNYLA WYQQRTNGSPRLLIK NAKTLAD GIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QHFWSTPYT FGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
148
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSL TRYWMN WVRQSPGKGLE WIGMIHPSDSETR YNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYC ASIYYEE YWGQGTLVTVSA TLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
149
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSI HNYLAWY QQRTNGSPR LLVYNAKTLA SGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC QHFWSTPY TFGAGTKLELKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
150
ESKYGPPCPPCP
спейсер (IgG4 шарнир) (ак) Homo sapiens
151
GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT
спейсер (IgG4 шарнир) (нт) Homo sapiens
152
ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Шарнир-CH3 спейсер Homo sapiens
153
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Шарнир-CH2-CH3 спейсер Homo sapiens
154
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH
IgD-шарнир-Fc Homo sapiens
155
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
tEGFR искусственный
156
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
tEGFR искусственный
157
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
CD28 (аминокислоты 153-179 номер доступа No. P10747) Homo sapiens
158
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
CD28 (аминокислоты 114-179 номер доступа No. P10747) Homo sapiens
159
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD28 (аминокислоты 180-220, P10747) Homo sapiens
160
RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD28 (LL - GG) Homo sapiens
161
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
4-1BB (аминокислоты 214-255, Q07011.1) Homo sapiens
162
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета Homo sapiens
163
RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета Homo sapiens
164
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3-дзета Homo sapiens
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ДЖУНО ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
ХОСКИНС, Коллин
ХЕЙПЕЛ, Марк, Д.
СУТЕРЛЭНД, Клэр, Л.
САТАЛИЯ, Тахер
СМИТ, Джефф
<120> АНТИ-ИДИОТИПИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ СПОСОБЫ
<130> 735042006540
<140> не присвоен
<141> -
<150> 62/369,008
<151> 2016-07-29
<160> 164
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID VH
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Gly
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Val Thr Thr Val Ala Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 2
<211> 324
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID CH
<400> 2
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1               5                  10                  15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85                  90                  95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100                 105                 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115                 120                 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130                 135                 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145                 150                 155                 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165                 170                 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180                 185                 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195                 200                 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210                 215                 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225                 230                 235                 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245                 250                 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260                 265                 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275                 280                 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290                 295                 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305                 310                 315                 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 3
<211> 446
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID тяжелая цепь
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Gly
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Val Thr Thr Val Ala Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
115                 120                 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
130                 135                 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
195                 200                 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210                 215                 220
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
245                 250                 255
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
275                 280                 285
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
290                 295                 300
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
305                 310                 315                 320
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
340                 345                 350
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
355                 360                 365
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
405                 410                 415
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
420                 425                 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210> 4
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC сигнальная последовательность
<400> 4
Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ser Gly
1               5                  10                  15
Val His Ser
<210> 5
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID VL
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Val Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210> 6
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID CL
<400> 6
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                  10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Asn Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100                 105
<210> 7
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID легкая цепь
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Val Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Asn Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 8
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID LC сигнальная последовательность
<400> 8
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1               5                  10                  15
Gly Thr Arg Cys
20
<210> 9
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR1
<400> 9
Ser Tyr Trp Met His
1               5
<210> 10
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR2
<400> 10
Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys
1               5                  10                  15
Arg
<210> 11
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR3
<400> 11
Glu Val Thr Thr Val Ala Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr
1               5                  10
<210> 12
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID LC-CDR1
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                  10
<210> 13
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID LC-CDR2
<400> 13
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210> 14
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID LC-CDR3
<400> 14
Gln Gln Gly Lys Thr Val Pro Phe Thr
1               5
<210> 15
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID VH
<400> 15
caggtccaac tgcaacaacc tgggtctgag ctggtgaggc ctggaggttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctgacta cactttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttatcctg gtagtggtgg tactaactac 180
gatgagaagt tcaagaggaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagagaggtt 300
actacagtag cttattacta ttctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca                                                            366
<210> 16
<211> 975
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID CH
<400> 16
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctggta aatga                                                  975
<210> 17
<211> 1341
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID тяжелая цепь
<400> 17
caggtccaac tgcaacaacc tgggtctgag ctggtgaggc ctggaggttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctgacta cactttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggaaat atttatcctg gtagtggtgg tactaactac 180
gatgagaagt tcaagaggaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240
atgcagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagagaggtt 300
actacagtag cttattacta ttctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccactgg cccctggatc tgctgcccaa 420
actaactcca tggtgaccct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtgaca 480
gtgacctgga actctggatc cctgtccagc ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 540
tctgacctct acactctgag cagctcagtg actgtcccct ccagcacctg gcccagcgag 600
accgtcacct gcaacgttgc ccacccggcc agcagcacca aggtggacaa gaaaattgtg 660
cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata tgtacagtcc cagaagtatc atctgtcttc 720
atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc accattactc tgactcctaa ggtcacgtgt 780
gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc gaggtccagt tcagctggtt tgtagatgat 840
gtggaggtgc acacagctca gacgcaaccc cgggaggagc agttcaacag cactttccgc 900
tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag gactggctca atggcaagga gttcaaatgc 960
agggtcaaca gtgcagcttt ccctgccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggc 1020
agaccgaagg ctccacaggt gtacaccatt ccacctccca aggagcagat ggccaaggat 1080
aaagtcagtc tgacctgcat gataacagac ttcttccctg aagacattac tgtggagtgg 1140
cagtggaatg ggcagccagc ggagaactac aagaacactc agcccatcat ggacacagat 1200
ggctcttact tcgtctacag caagctcaat gtgcagaaga gcaactggga ggcaggaaat 1260
actttcacct gctctgtgtt acatgagggc ctgcacaacc accatactga gaagagcctc 1320
tcccactctc ctggtaaatg a                                           1341
<210> 18
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC сигнальная последовательность
<400> 18
atgggatgga gctctatcat cctcttcttg gtagcaacag cctcaggtgt ccactcc    57
<210> 19
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID VL
<400> 19
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgtcagcag ggtaaaacgg ttccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a                                           321
<210> 20
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID CL
<400> 20
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240
cgacataaca actatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300
agcttcaaca ggaatgagtg ttag                                        324
<210> 21
<211> 645
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID легкая цепь
<400> 21
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgtcagcag ggtaaaacgg ttccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac aactatacct gtgaggccac tcacaagaca 600
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag                 645
<210> 22
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID LC сигнальная последовательность
<400> 22
atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60
<210> 23
<211> 122
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 VH
<400> 23
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 24
<211> 108
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 VL
<400> 24
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210> 25
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                  10                  15
<210> 26
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4GS Линкер
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 27
<211> 39
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Внеклеточная часть CD28
<400> 27
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1               5                  10                  15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20                  25                  30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 28
<211> 245
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 scFv
<400> 28
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115                 120                 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130                 135                 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145                 150                 155                 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165                 170                 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180                 185                 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195                 200                 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210                 215                 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 29
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 3GS Линкер
<400> 29
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 30
<211> 120
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> FMC63 VH
<400> 30
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 31
<211> 107
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> FMC63 VL
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100                 105
<210> 32
<211> 220
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG1 Fc без шарнира
<400> 32
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1               5                  10                  15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20                  25                  30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35                  40                  45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50                  55                  60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65                  70                  75                  80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85                  90                  95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100                 105                 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115                 120                 125
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145                 150                 155                 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165                 170                 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180                 185                 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195                 200                 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210                 215                 220
<210> 33
<211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер
<400> 33
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1               5                  10                  15
Lys Gly
<210> 34
<211> 245
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 scFv
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100                 105                 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115                 120                 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130                 135                 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165                 170                 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195                 200                 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210                 215                 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 35
<211> 465
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FMC63 реагент
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100                 105                 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115                 120                 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130                 135                 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165                 170                 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195                 200                 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210                 215                 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225                 230                 235                 240
Val Thr Val Ser Ser Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245                 250                 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260                 265                 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275                 280                 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290                 295                 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305                 310                 315                 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325                 330                 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340                 345                 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355                 360                 365
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370                 375                 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385                 390                 395                 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405                 410                 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420                 425                 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435                 440                 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450                 455                 460
Lys
465
<210> 36
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 VH
<400> 36
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Cys His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Asn Tyr Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210> 37
<211> 330
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 CH
<400> 37
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1               5                  10                  15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85                  90                  95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145                 150                 155                 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165                 170                 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195                 200                 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210                 215                 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245                 250                 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275                 280                 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290                 295                 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305                 310                 315                 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325                 330
<210> 38
<211> 452
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 тяжелая цепь
<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Cys His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Asn Tyr Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro
115                 120                 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser
130                 135                 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180                 185                 190
Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His
195                 200                 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro
210                 215                 220
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
275                 280                 285
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
290                 295                 300
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
325                 330                 335
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
355                 360                 365
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
370                 375                 380
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
405                 410                 415
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
435                 440                 445
Thr Pro Gly Lys
450
<210> 39
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC сигнальная последовательность
<400> 39
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1               5                  10                  15
Val Leu Ser
<210> 40
<211> 106
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 VL
<400> 40
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ile Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210> 41
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 CL
<400> 41
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                  10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100                 105
<210> 42
<211> 213
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 легкая цепь
<400> 42
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ile Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100                 105                 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130                 135                 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145                 150                 155                 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180                 185                 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 43
<211> 22
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 LC сигнальная последовательность
<400> 43
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Met Ser Ala Ser
1               5                  10                  15
Val Ile Met Ser Arg Gly
20
<210> 44
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR1
<400> 44
Asp Tyr Tyr Met Lys
1               5
<210> 45
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR2
<400> 45
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1               5                  10                  15
Gly
<210> 46
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR3
<400> 46
Glu Gly Asn Asn Tyr Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr
1               5                  10
<210> 47
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 LC-CDR1
<400> 47
Ser Ala Ser Ser Gly Val Ile Tyr Met Tyr
1               5                  10
<210> 48
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 LC-CDR2
<400> 48
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210> 49
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 LC-CDR3
<400> 49
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1               5
<210> 50
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 VH
<400> 50
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgtaagg cttctggata cacattcact gactactaca tgaagtgggt gaagcagtgt 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtgg tactgactac 180
aaccagaact ttaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagagggg 300
aataactacg gtagtagaga tgctatggac tactggggtc aaggaacgtc agtcaccgtc 360
tcctca                                                            366
<210> 51
<211> 990
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 CH
<400> 51
gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc 60
tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgagca cctggcccag ccagtccatc 240
acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgagcccaga 300
gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc aaatgcccag cacctaacct cttgggtgga 360
ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc aaggatgtac tcatgatctc cctgagcccc 420
atagtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg 480
tttgtgaaca acgtggaagt acacacagct cagacacaaa cccatagaga ggattacaac 540
agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc atccagcacc aggactggat gagtggcaag 600
gagttcaaat gcaaggtcaa caacaaagac ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca 660
aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 720
atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt 780
tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc 840
ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 900
gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg 960
actaagagct tctcccggac tccgggtaaa                                  990
<210> 52
<211> 1356
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 тяжелая цепь
<400> 52
gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgtaagg cttctggata cacattcact gactactaca tgaagtgggt gaagcagtgt 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtgg tactgactac 180
aaccagaact ttaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagagggg 300
aataactacg gtagtagaga tgctatggac tactggggtc aaggaacgtc agtcaccgtc 360
tcctcagcca aaacaacagc cccatcggtc tatccactgg cccctgtgtg tggagataca 420
actggctcct cggtgactct aggatgcctg gtcaagggtt atttccctga gccagtgacc 480
ttgacctgga actctggatc cctgtccagt ggtgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 540
tctgacctct acaccctcag cagctcagtg actgtaacct cgagcacctg gcccagccag 600
tccatcacct gcaatgtggc ccacccggca agcagcacca aggtggacaa gaaaattgag 660
cccagagggc ccacaatcaa gccctgtcct ccatgcaaat gcccagcacc taacctcttg 720
ggtggaccat ccgtcttcat cttccctcca aagatcaagg atgtactcat gatctccctg 780
agccccatag tcacatgtgt ggtggtggat gtgagcgagg atgacccaga tgtccagatc 840
agctggtttg tgaacaacgt ggaagtacac acagctcaga cacaaaccca tagagaggat 900
tacaacagta ctctccgggt ggtcagtgcc ctccccatcc agcaccagga ctggatgagt 960
ggcaaggagt tcaaatgcaa ggtcaacaac aaagacctcc cagcgcccat cgagagaacc 1020
atctcaaaac ccaaagggtc agtaagagct ccacaggtat atgtcttgcc tccaccagaa 1080
gaagagatga ctaagaaaca ggtcactctg acctgcatgg tcacagactt catgcctgaa 1140
gacatttacg tggagtggac caacaacggg aaaacagagc taaactacaa gaacactgaa 1200
ccagtcctgg actctgatgg ttcttacttc atgtacagca agctgagagt ggaaaagaag 1260
aactgggtgg aaagaaatag ctactcctgt tcagtggtcc acgagggtct gcacaatcac 1320
cacacgacta agagcttctc ccggactccg ggtaaa                           1356
<210> 53
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC сигнальная последовательность
<400> 53
atgggatgga gctggatctt tctcttcctc ttgtcaggaa ctgcaggtgt cctctct    57
<210> 54
<211> 318
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 VL
<400> 54
caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aggtgtaatt tacatgtact ggtaccaaca gaagccaaga 120
tcctccccca aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggc 300
accaagctgg agctgaaa                                               318
<210> 55
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 CL
<400> 55
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300
agcttcaaca ggaatgagtg t                                           321
<210> 56
<211> 639
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 легкая цепь
<400> 56
caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aggtgtaatt tacatgtact ggtaccaaca gaagccaaga 120
tcctccccca aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggc 300
accaagctgg agctgaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 360
agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 420
aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 480
agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 540
accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 600
acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgt                        639
<210> 57
<211> 66
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 LC сигнальная последовательность
<400> 57
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatga gtgcctcagt cataatgtcc 60
agggga                                                            66
<210> 58
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 VH
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Ile Tyr Tyr Glu Glu Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ala
115
<210> 59
<211> 324
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 CH
<400> 59
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1               5                  10                  15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50                  55                  60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65                  70                  75                  80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85                  90                  95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100                 105                 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115                 120                 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130                 135                 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145                 150                 155                 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165                 170                 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180                 185                 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195                 200                 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210                 215                 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225                 230                 235                 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245                 250                 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260                 265                 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275                 280                 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290                 295                 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305                 310                 315                 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 60
<211> 439
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 тяжелая цепь
<400> 60
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Ile Tyr Tyr Glu Glu Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115                 120                 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130                 135                 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145                 150                 155                 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165                 170                 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180                 185                 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195                 200                 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210                 215                 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225                 230                 235                 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245                 250                 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260                 265                 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275                 280                 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290                 295                 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305                 310                 315                 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325                 330                 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340                 345                 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355                 360                 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370                 375                 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385                 390                 395                 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405                 410                 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420                 425                 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 61
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC сигнальная последовательность
<400> 61
Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1               5                  10                  15
Val His Ser
<210> 62
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 VL
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210> 63
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 легкая цепь
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                  10                  15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 64
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 LC сигнальная последовательность
<400> 64
Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                  10                  15
Gly Ala Arg Cys
20
<210> 65
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR1
<400> 65
Arg Tyr Trp Met Asn
1               5
<210> 66
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR2
<400> 66
Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                  10                  15
Asp
<210> 67
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR3
<400> 67
Ile Tyr Tyr Glu Glu Ala
1               5
<210> 68
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 LC-CDR1
<400> 68
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala
1               5                  10
<210> 69
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 LC-CDR2
<400> 69
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1               5
<210> 70
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 LC-CDR3
<400> 70
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr
1               5
<210> 71
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 VH
<400> 71
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaaga cttctggcta ctccttcacc aggtactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggcatg attcatcctt ccgatagtga aactaggtta 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagcatctac 300
tatgaagagg cctggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca                 345
<210> 72
<211> 972
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 CH
<400> 72
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctggta aa                                                     972
<210> 73
<211> 1317
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 тяжелая цепь
<400> 73
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg 60
tcctgcaaga cttctggcta ctccttcacc aggtactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gccttgagtg gattggcatg attcatcctt ccgatagtga aactaggtta 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca attcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagcatctac 300
tatgaagagg cctggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagccaa aacgacaccc 360
ccatctgtct atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg 420
ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc 480
ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct gtcctgcagt ctgacctcta cactctgagc 540
agctcagtga ctgtcccctc cagcacctgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc 600
cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag 660
ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag 720
gatgtgctca ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag 780
gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag 840
acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc actttccgct cagtcagtga acttcccatc 900
atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc 960
cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg 1020
tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg 1080
ataacagact tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg 1140
gagaactaca agaacactca gcccatcatg gacacagatg gctcttactt cgtctacagc 1200
aagctcaatg tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta 1260
catgagggcc tgcacaacca ccatactgag aagagcctct cccactctcc tggtaaa    1317
<210> 74
<211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC сигнальная последовательность
<400> 74
atgggatgga gctctatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcc    57
<210> 75
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 VL
<400> 75
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatag tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a                                           321
<210> 76
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 легкая цепь
<400> 76
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatag tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggagta ctccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt                    642
<210> 77
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 LC сигнальная последовательность
<400> 77
atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60
<210> 78
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR1
<400> 78
Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1               5
<210> 79
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR1
<400> 79
Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1               5                  10
<210> 80
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR1
<400> 80
Thr Ser Tyr Trp Met His
1               5
<210> 81
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR2
<400> 81
Tyr Pro Gly Ser Gly Gly
1               5
<210> 82
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR2
<400> 82
Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn
1               5                  10
<210> 83
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR2
<400> 83
Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn
1               5                  10
<210> 84
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID HC-CDR3
<400> 84
Thr Arg Glu Val Thr Thr Val Ala Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp
1               5                  10
<210> 85
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID LC-CDR1
<400> 85
Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr
1               5
<210> 86
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID LC-CDR2
<400> 86
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His
1               5                  10
<210> 87
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID LC-CDR3
<400> 87
Gln Gln Gly Lys Thr Val Pro Phe
1               5
<210> 88
<211> 7
<212> Белок
<213> анти-ID B-1 HC-CDR1
<400> 88
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
1               5
<210> 89
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR1
<400> 89
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Lys
1               5                  10
<210> 90
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR1
<400> 90
Thr Asp Tyr Tyr Met Lys
1               5
<210> 91
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR2
<400> 91
Asn Pro Asn Asn Gly Gly
1               5
<210> 92
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR2
<400> 92
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asp
1               5                  10
<210> 93
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR2
<400> 93
Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asp
1               5                  10
<210> 94
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 HC-CDR3
<400> 94
Ala Arg Glu Gly Asn Asn Tyr Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp
1               5                  10
<210> 95
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 LC-CDR1
<400> 95
Ile Tyr Met Tyr Trp Tyr
1               5
<210> 96
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 LC-CDR2
<400> 96
Pro Trp Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala
1               5                  10
<210> 97
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-1 LC-CDR3
<400> 97
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu
1               5
<210> 98
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR1
<400> 98
Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
1               5
<210> 99
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR1
<400> 99
Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp Met Asn
1               5                  10
<210> 100
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR1
<400> 100
Thr Arg Tyr Trp Met Asn
1               5
<210> 101
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR2
<400> 101
His Pro Ser Asp Ser Glu
1               5
<210> 102
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR2
<400> 102
Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg
1               5                  10
<210> 103
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR2
<400> 103
Trp Ile Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg
1               5                  10
<210> 104
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 HC-CDR3
<400> 104
Ala Ser Ile Tyr Tyr Glu Glu
1               5
<210> 105
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 LC-CDR1
<400> 105
His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
1               5
<210> 106
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 LC-CDR2
<400> 106
Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala
1               5                  10
<210> 107
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> анти-ID B-2 LC-CDR3
<400> 107
Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr
1               5
<210> 108
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HC-CDR1 Консенсус
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 3
<223> Xaa = T или S
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> Xaa = T или S
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Xaa = D или R
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 8
<223> Xaa = Y или W
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 10
<223> Xaa = K или N
<400> 108
Gly Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Xaa Met Xaa
1               5                  10
<210> 109
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HC-CDR2 Консенсус
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> Xaa = D или M
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Xaa = N или H
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 8
<223> Xaa = N или S
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 9
<223> Xaa = N или D
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 10
<223> Xaa = G или S
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (11)...(11)
<223> Xaa = G или E
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (13)...(13)
<223> Xaa = D или R
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (14)...(14)
<223> Xaa = Y или L
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (17)...(17)
<223> Xaa = N или K
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (20)...(20)
<223> Xaa = G или D
<400> 109
Trp Ile Gly Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Asn Gln
1               5                  10                  15
Xaa Phe Lys Xaa
20
<210> 110
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HC-CDR3 Консенсус
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 2
<223> Xaa = R или S
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 3
<223> Xaa = E или I
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> Xaa = G или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> Xaa = N или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Xaa = N или E
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Y или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = G или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (9)...(9)
<223> Xaa = S или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = R или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (11)...(11)
<223> Xaa = D или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (12)...(12)
<223> Xaa = A или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (13)...(13)
<223> X13 = M или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (14)...(14)
<223> X14 = D или E
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (15)...(15)
<223> X15 = Y или A
<400> 110
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                  10                  15
<210> 111
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> LC-CDR1 Консенсус
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = S или R
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = S или R
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = S или G
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = G или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = V или I
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = I или H
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = N или отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = M или L
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (11)...(11)
<223> Xaa = Y или A
<400> 111
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Trp Tyr
1               5                  10
<210> 112
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> LC-CDR2 Консенсус
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = P или L
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = W или L
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = I или V
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = L или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = T или A
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = S или K
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = N или T
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (11)...(11)
<223> Xaa = S или D
<400> 112
Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Ala Xaa
1               5                  10
<210> 113
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> LC-CDR3 Консенсус
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Q или H
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)...(3)
<223> Xaa =W или F
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = S или W
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = S или W
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = N или T
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = L или Y
<400> 113
Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1               5
<210> 114
<211> 5
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 HC-CDR1
<400> 114
Ser Tyr Trp Met Asn
1               5
<210> 115
<211> 17
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 HC-CDR2
<400> 115
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1               5                  10                  15
Gly
<210> 116
<211> 13
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 HC-CDR3
<400> 116
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1               5                  10
<210> 117
<211> 11
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 LC-CDR1
<400> 117
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1               5                  10
<210> 118
<211> 7
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 LC-CDR2
<400> 118
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1               5
<210> 119
<211> 9
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 LC-CDR3
<400> 119
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210> 120
<211> 5
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> SJ25C1 LC-CDR3
<400> 120
Asp Tyr Gly Val Ser
1               5
<210> 121
<211> 16
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> FMC63 HC-CDR2
<400> 121
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1               5                  10                  15
<210> 122
<211> 12
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 122
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                  10
<210> 123
<211> 11
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> FMC63 LC-CDR1
<400> 123
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1               5                  10
<210> 124
<211> 7
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 124
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210> 125
<211> 9
<212> Белок
<213> Mus musculus
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 125
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210> 126
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> T2A
<400> 126
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1               5                  10                  15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 127
<211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> T2A
<400> 127
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1               5                  10                  15
Gly Pro
<210> 128
<211> 22
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P2A
<400> 128
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1               5                  10                  15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 129
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> P2A
<400> 129
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1               5                  10                  15
Pro Gly Pro
<210> 130
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> E2A
<400> 130
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1               5                  10                  15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 131
<211> 22
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> F2A
<400> 131
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1               5                  10                  15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 132
<211> 459
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 тяжелая цепь
<400> 132
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe
50                  55                  60
Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Val Thr Thr Val Ala Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
130                 135                 140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195                 200                 205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225                 230                 235                 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245                 250                 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260                 265                 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275                 280                 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290                 295                 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325                 330                 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340                 345                 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355                 360                 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370                 375                 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405                 410                 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435                 440                 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210> 133
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 легкая цепь
<400> 133
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Val Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 134
<211> 459
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 тяжелая цепь
<400> 134
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Thr Pro Phe
50                  55                  60
Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Val Thr Thr Val Ala Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
130                 135                 140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195                 200                 205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225                 230                 235                 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245                 250                 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260                 265                 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275                 280                 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290                 295                 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325                 330                 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340                 345                 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355                 360                 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370                 375                 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405                 410                 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435                 440                 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210> 135
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 легкая цепь
<400> 135
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Val Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 136
<211> 459
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 тяжелая цепь
<400> 136
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Arg Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Val Thr Thr Val Ala Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
130                 135                 140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195                 200                 205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225                 230                 235                 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245                 250                 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260                 265                 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275                 280                 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290                 295                 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325                 330                 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340                 345                 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355                 360                 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370                 375                 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405                 410                 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435                 440                 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210> 137
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-SJ25C1 легкая цепь
<400> 137
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys Thr Val Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 138
<211> 459
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
<400> 138
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe
50                  55                  60
Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Asn Tyr Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
130                 135                 140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195                 200                 205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225                 230                 235                 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245                 250                 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260                 265                 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275                 280                 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290                 295                 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325                 330                 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340                 345                 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355                 360                 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370                 375                 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405                 410                 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435                 440                 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210> 139
<211> 213
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
<400> 139
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ile Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 140
<211> 459
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
<400> 140
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Asn Tyr Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
130                 135                 140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195                 200                 205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225                 230                 235                 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245                 250                 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260                 265                 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275                 280                 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290                 295                 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325                 330                 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340                 345                 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355                 360                 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370                 375                 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405                 410                 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435                 440                 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210> 141
<211> 213
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
<400> 141
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ile Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 142
<211> 459
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
<400> 142
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Lys Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe
50                  55                  60
Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Asn Asn Tyr Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser
115                 120                 125
Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
130                 135                 140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145                 150                 155                 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165                 170                 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195                 200                 205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210                 215                 220
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225                 230                 235                 240
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245                 250                 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260                 265                 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275                 280                 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290                 295                 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305                 310                 315                 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325                 330                 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340                 345                 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355                 360                 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370                 375                 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385                 390                 395                 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405                 410                 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420                 425                 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435                 440                 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210> 143
<211> 213
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
<400> 143
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Pro Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100                 105                 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115                 120                 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130                 135                 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165                 170                 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180                 185                 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195                 200                 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 144
<211> 452
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
<400> 144
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe
50                  55                  60
Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Tyr Tyr Glu Glu Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 145
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
<400> 145
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 146
<211> 452
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
<400> 146
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Tyr Tyr Glu Glu Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 147
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
<400> 147
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 148
<211> 452
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 тяжелая цепь
<400> 148
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Thr Pro Phe
50                  55                  60
Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe
65                  70                  75                  80
Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Ile Tyr Tyr Glu Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ala Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 149
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Иллюстративное гуманизированное анти-FMC63 легкая цепь
<400> 149
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile His Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 150
<211> 12
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> спейсер (IgG4 шарнир) (ак)
<400> 150
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1               5                  10
<210> 151
<211> 36
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> спейсер (IgG4 шарнир) (нт)
<400> 151
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct                           36
<210> 152
<211> 119
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Шарнир-CH3 спейсер
<400> 152
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1               5                  10                  15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20                  25                  30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35                  40                  45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50                  55                  60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85                  90                  95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100                 105                 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 153
<211> 229
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Шарнир-CH2-CH3
<400> 153
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                  10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 154
<211> 282
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IgD-шарнир-Fc
<400> 154
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1               5                  10                  15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20                  25                  30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35                  40                  45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50                  55                  60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65                  70                  75                  80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85                  90                  95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100                 105                 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115                 120                 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130                 135                 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165                 170                 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180                 185                 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195                 200                 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210                 215                 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225                 230                 235                 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245                 250                 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260                 265                 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275                 280
<210> 155
<211> 335
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> tEGFR
<400> 155
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1               5                  10                  15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20                  25                  30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35                  40                  45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50                  55                  60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65                  70                  75                  80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85                  90                  95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100                 105                 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115                 120                 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130                 135                 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145                 150                 155                 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165                 170                 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180                 185                 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195                 200                 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210                 215                 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225                 230                 235                 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245                 250                 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260                 265                 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275                 280                 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290                 295                 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305                 310                 315                 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325                 330                 335
<210> 156
<211> 357
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> tEGFR
<400> 156
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1               5                  10                  15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20                  25                  30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35                  40                  45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50                  55                  60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65                  70                  75                  80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85                  90                  95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100                 105                 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115                 120                 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130                 135                 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145                 150                 155                 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165                 170                 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180                 185                 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195                 200                 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210                 215                 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225                 230                 235                 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245                 250                 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260                 265                 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275                 280                 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290                 295                 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305                 310                 315                 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325                 330                 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340                 345                 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 157
<211> 27
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (аминокислоты 153-179, номер доступна No. P10747)
<400> 157
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1               5                  10                  15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20                  25
<210> 158
<211> 66
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (аминокислоты 114-179, номер доступа No. P10747)
<400> 158
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1               5                  10                  15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20                  25                  30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35                  40                  45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50                  55                  60
Trp Val
65
<210> 159
<211> 41
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (аминокислоты 180-220, P10747)
<400> 159
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1               5                  10                  15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20                  25                  30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35                  40
<210> 160
<211> 41
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28 (LL - GG)
<400> 160
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1               5                  10                  15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20                  25                  30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35                  40
<210> 161
<211> 42
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 4-1BB (аминокислоты 214-255, Q07011.1)
<400> 161
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1               5                  10                  15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20                  25                  30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35                  40
<210> 162
<211> 112
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 162
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                  10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 163
<211> 112
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3-дзета
<400> 163
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1               5                  10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<210> 164
<211> 112
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3-дзета
<400> 164
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1               5                  10                  15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20                  25                  30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35                  40                  45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50                  55                  60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85                  90                  95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100                 105                 110
<---