Способ выделения вирусных нуклеиновых кислот из различных фракций экстраклеточных везикул
METHOD OF EXTRACTING VIRAL NUCLEIC ACIDS FROM DIFFERENT FRACTIONS OF EXTRACELLULAR VESICLES

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной и молекулярной технологии, и может быть использовано в медицинских исследованиях в вирусологии для изучения состава вирусных нуклеиновых кислот в экстраклеточных везикулах с целью выявления роли везикулярного транспорта в распространении вирусных инфекций в организме.
В последние годы была показана принципиальная роль иммунной системы в прогрессировании атеросклероза, а также дестабилизации и разрыве атеросклеротических бляшек [Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2012. - №32. - P. 2045-2051; Jonasson L, Holm J, Skalli O, Bondjers G, Hansson GK. Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Arteriosclerosis.- 1986. - №6. - P. 131-138]. Несмотря на интенсивные исследования в этой области, до сих пор остается неизвестным триггер активации иммунной системы. Одним из кандидатов на роль триггера в атерогенезе могут быть бактерии и вирусы [Bruggeman С. Cytomegalovirus is involved in vascular pathology. Am Heart J. - 1999. - №138. - P. S473-475]. Так, имеется целый ряд данных о том, что повышенное содержание антител к вирусам гриппа, гепатита, хламидиям, энтеробактериям, цитомегаловирусу (ЦМВ), вирусам герпеса человека 1 и 2 типа и др. коррелирует с развитием и прогрессированием атеросклероза [Jha НС, Srivastava Р, Sarkar R, Prasad J, Mittal A. Chlamydia pneumoniae IgA and elevated level of IL-6 may synergize to accelerate coronary artery disease. J Cardiol. - 2008. - №52. - P. 140-145; Crumpacker CS. Invited commentary: human cytomegalovirus, inflammation, cardiovascular disease, and mortality. Am J Epidemiol. - 2010. - №172. - P. 372-374; Alyan O, Kacmaz F, Ozdemir O, et al. Hepatitis С infection is associated with increased coronary artery atherosclerosis defined by modified Reardon severity score system. Circ J. - 2008. - №72. - P. 1960-1965; Siscovick DS, Schwartz SM, Corey L, et al. Chlamydia pneumoniae, herpes simplex virus type 1, and cytomegalovirus and incident myocardial infarction and coronary heart disease death in older adults: the Cardiovascular Health Study. Circulation. - 2000. - №102. - P. 2335-2340; Cheng J, Ke Q, Jin Z, et al. Cytomegalovirus infection causes an increase of arterial blood pressure. PLoS Pathog. - 2009. - №5. - P. e1000427]. Кроме того, дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) многих из этих агентов также находили внутри самих атеросклеротических бляшек [Keller ТТ, van der Meer JJ, Teeling P, et al. Selective expansion of influenza A virus-specific T cells in symptomatic human carotid artery atherosclerotic plaques. Stroke. - 2008. - №39. - P. 174-179; Reszka E, Jegier B, Wasowicz W, Lelonek M, Banach M, Jaszewski R. Detection of infectious agents by polymerase chain reaction in human aortic wall. Cardiovasc Pathol. - 2008. - №17. - P. 297-302]. Среди изучаемых инфекционных агентов - триггеров атеросклероза, особое место занимает семейство герпесвирусов человека, являющихся широко распространенными в популяции патогенами, способными вызывать хроническую иммунную активацию [Horvath R, Cerny J, Benedfk J, Hokl J, Jelmkova I, Benedfk J. The possible role of human cytomegalovirus (HCMV) in the origin of atherosclerosis. J Clin Virol. - 2000. - №16. - P. 17-24; Aguilar D, Fisher MR, O'Connor CM, et al. Metabolic syndrome, C-reactive protein, and prognosis in patients with established coronary artery disease. Am Heart J. - 2006. - №152. - P. 298-304]. Однако, результаты описанных работ о связи между хронической герпесвирусной инфекцией и атеросклерозом крайне противоречивы, что во многом связано со сложностью определения не только наличия, но и признаков активации инфекции [Heybar Н, Alavi SM, Farashahi Nejad М, Latifi М. Cytomegalovirus infection and atherosclerosis in candidate of coronary artery bypass graft. Jundishapur J Microbiol. - 2015. - №8. -P. el5476; Nieto FJ, Adam E, Sorlie P, et al. Cohort study of cytomegalovirus infection as a risk factor for carotid intimal-medial thickening, a measure of subclinical atherosclerosis. Circulation. - 1996. - №94. - P. 922-927; Barbarash OL, Zykov MV, Pecherina ТВ, Kashtalap VV, Barbarash LS, Kutikhin AG. The prognostic value of peripheral artery diseases in patients with ST-segment elevation myocardial infarction. Dis Markers. - 2013. - №35. - P. 877-882]. В нашей предварительной работе мы обнаружили, что присутствие и распределение ДНК различных герпес-вирусов в ткани атеросклеротических бляшек у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) и интактных артериях пациентов без ИБС достоверно не отличается, что может быть связано с обнаружением латентных форм инфекции, не вызывающих иммунной активации и атерогенеза [Никитская ЕА, Гривель ЖШ, Иванова ОИ, и др. Исследование герпесвирусной ДНК в коронарных артериях пациентов, умерших в острой стадии инфаркта миокарда. Креативная кардиология. - 2014. - №4. - С. 52-64]. Однако, в дальнейших исследованиях мы выявили, что цитомегаловирус часто реактивируется у пациентов с острым коронарным синдромом. При этом цитомегаловирусная ДНК определяется не только в клетках крови, но и в плазме, где ее количество в 2 раза выше у пациентов с острыми формами ИБС, чем у здоровых добровольцев [Nikitskaya ЕА, Grivel JC, Maryukhnich EV, et al. Cytomegalovirus in plasma of acute coronary syndrome patients. Acta Naturae. - 2016. - №8. - P. 102-107].
Известно, что одним из механизмов передачи вирусного материала от клетки к клетки в многоклеточном организме может быть транспорт через экстраклеточные везикулы (ЭВ) [Schorey JS, Cheng Y, Singh PP, Smith VL. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Rep.- 2015. - №16. - P. 24-43]. Вирусные белки и нуклеиновые кислоты (НК), продуцируемые инфицированными клетками и передаваемые микровезикулами и экзосомами, могут как усиливать иммунный ответ [Walker JD, Maier CL, Pober JS. Cytomegalovirus-infected human endothelial cells can stimulate allogeneic CD4+ memory T cells by releasing antigenic exosomes. J Immunol. - 2009. - №182. - P. 1548-1559], так и ингибировать его [Dukers DF, Meij P, Vervoort MB, et al. Direct immunosuppressive effects of EBV-encoded latent membrane protein 1. J Immunol. - 2000. - №165. -P. 663-670].
Выделен отдельный класс экстраклеточных везикул, вирусоподобные везикулы, внутри которых была обнаружена вирусная ДНК, рибонуклеиновая кислота (РНК) и белки. Было показано, что эти везикулы могут участвовать в процессе передачи и распространения инфекции внутри организма, в том числе клеткам иммунной системы [Jorfi S, Inal JM. The role of microvesicles in cancer progression and drug resistance. Biochem Soc Trans. -2013. - №41. - P. 293-298]. Особенно подробно изучен этот механизм для вируса иммунодефицита человека [Wiley RD, Gummuluru S. Immature dendritic cell-derived exosomes can mediate HIV-1 trans infection. Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. - №103. - P. 738-743]. Показана подобная передача вирусной инфекции через экстраклеточные везикулы для вируса гриппа, вирусов гепатита В и С, а также для вируса герпеса 1 и 2 типа [Meckes DG, Raab-Traub N. Microvesicles and viral infection. J Virol. - 2011. - №85. - P. 12844-12854]. Мы показали, что наравне с активацией цитомегаловирусной инфекции у пациентов с острыми формами ИБС отмечается значительное увеличение в крови количества ЭВ, особенно везикул тромбоцитарного происхождения [Vagida М, Arakelyan A, Lebedeva A, et al. Flow analysis of individual blood extracellular vesicles in acute coronary syndrome. Platelets. - 2017. - №28. - P. 165-173].
Определение вируса и резервуара инфекции у пациентов с атеросклерозом осложняется тем, что вирусы потенциальные триггеры, в частности, цитомегаловирус и/или вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - находятся в латентной фазе, а передача вирусных частиц при реактивации может происходить путем межклеточного транспорта через экстраклеточные везикулы. В этих условиях количество копий определяемого вируса может быть экстремально мало, кроме того такая упаковка может затруднять выделение НК.
Чтобы решить эти задачи, необходимо создать методологический подход, позволяющий объединить в общий рабочий процесс метод избирательного выделения ЭВ, очистки НК из различных субпопуляций ЭВ и высокоточной детекции малых количеств различных вирусных НК.
Для выделения ЭВ наиболее часто используют методы, основанные на дифференциальном центрифугировании биологических жидкостей и сред с добавлением преципитирующих реагентов и без них, и методы, основанные на аффинном выделении из бесклеточных сред. Оба подхода имеют свои недостатки и достоинства, но для задач выделения ЭВ несущих НК вирусов нужна специфическая сепарация частиц продуцируемых инфицированными клетками. Кроме того, было показано, что везикулы способны сливаться при центрифугировании, что приводит к кросс-контаминации разных популяций [Momen-Heravi F, Balaj L, Alian S, et al. Impact of biofluid viscosity on size and sedimentation efficiency of the isolated microvesicles. Front Physiol. - 2012. - №3. - P. 162]. Выделение везикул с помощью антител, специфичных к мембранным молекулам, отвечает на вопросы происхождения ЭВ и позволяет выделять различные субпопуляции ЭВ. Всем необходимым требованиям удовлетворяет принцип выделения и анализа ЭВ с помощью магнитных наночастиц, конъюгированных с антителами, специфичными к различным везикулярным и вирусным маркерам. Для точного определения низких значений искомых вирусных НК, выделенных из различных фракций ЭВ, перспективным является использование цифровой полимеразной реакции (ПЦР) и количественной ПЦР в реальном времени [Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep. - 2017. - №7. - P. 2409].
Для более полной характеристики состава экстраклеточных везикул и их роли в процессе активации и распространения инфекции в организме необходимо проанализировать состав нуклеиновых кислот в различных популяциях экстраклеточных везикул в плазме человека. Одним из основных препятствий к использованию современной технологии полимеразной цепной реакции для всестороннего изучения состава нуклеиновых кислот в экстраклеточных везикулах является сложность выделения отдельных фракций экстраклеточных везикул, из которых в дальнейшем будет возможно провести экстракцию нуклеиновых кислот без их загрязнения или потери в процессе выделения.
Известен способ выделения РНК энтеровируса из экстраклеточных везикул, полученных из культуры клеток нейробластомы человека. В способе используется метод центрифугирования и ультрафильтрации культуральной среды для получения фракции экзосом (фракции экстраклеточных везикул малых размеров) с дальнейшим совместным выделением клеточной ДНК и вирусной РНК из общей популяции экзосом. Далее вирусная РНК подвергается амплификации по методике полимеразной цепной реакции в реальном времени для анализа ее количественного состава [Мао L, Wu J, Shen L, Yang J, Chen J, Xu H. Enterovirus 71 transmission by exosomes establishes a productive infection in human neuroblastoma cells. Virus Genes. - 2016. - №52(2). - P. 189-194]. В данном способе анализировались только ЭВ малых размеров, выделенные из культуральной среды клеток нейробластомы человека, что не позволяло оценить состав вирусных нуклеиновых кислот внутри других типов экстраклеточных везикул. Кроме того, в способе проводилось выделение нуклеиновых кислот из общего раствора экзосом, что не позволяло определить фенотип клеток, выделяющих данные везикулы с вирусными нуклеиновыми кислотами. Поэтому данный способ не дает возможности оценить полный состав нуклеиновых кислот энтеровируса в зависимости от фенотипа различных фракций экстраклеточных везикул.
Кроме того, известны способы выделения нуклеиновых кислот вируса гепатита С из экзосом, полученных из клеточных линий гепатомы человека [Ramakrishnaiah V, Thumann С, Fofana I, Habersetzer F, Pan Q, de Ruiter P, Willemsen R, Demmers J, Raj V, Jenster G, Kwekkeboom J, Tilanus H, Haagmans B, Baumert T, der Laan L. Exosome-mediated transmission of hepatitis С virus between human hepatoma Huh 7.5 cells. Proc Natl Acad Sci USA.-2013.-№110(32).-P. 13109-13113; Saha B, Kodys K, Adejumo A, Szabo G. Circulating and Exosome-Packaged Hepatitis С Single-Stranded RNA Induce Monocyte Differentiation via TLR7/8 to Polarized Macrophages and Fibrocytes. J Immunol. - 2017. - №198(5). - P. 1974-1984], где из культуральной среды гепатоцитов человека, зараженных вирусом гепатита С, выделялись экзосомы с помощью методики ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте. Далее проводилось выделение вирусной РНК из общей популяции выделенных экзосом. Однако, в данных способах нуклеиновые кислоты также выделялись только из фракции экзосом, что не позволяло оценить состав вирусных нуклеиновых кислот внутри других типов экстраклеточных везикул. Кроме того, в обоих способах проводилось выделение нуклеиновых кислот из общей популяции экзосом, что не позволяло определить фенотип клеток, выделяющих данные везикулы с вирусными нуклеиновыми кислотами.
Описаны также способы определения нуклеиновых кислот вирусов гепатита Е и гепатита В в составе экзосом, выделенных из культуры инфицированных гепатоцитов человека. В способах проводилось выделение фракции экзосом с помощью ультрацентрифугирования. После этого проводилось отделение определенных фракций экзосом с помощью магнитных бус, специфичных к поверхностным маркерам, типичным для различных фракций экзосом. В дальнейшем проводилась экстракция нуклеиновых кислот из выбранных фракций экзосом [Sanada Т, Hirata Y, Naito Y, Yamamoto N, Kikkawa Y, Ishida Y, Yamasaki C, Tateno C, Ochiya T, Kohara M. Transmission of HBV DNA Mediated by Ceramide-Triggered Extracellular Vesicles. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. - 2016. - №3(2). - P. 272-283; Nagashima S, Takahashi M, Kobayashi T, Nishizawa T, Nishiyama T, Primadharsini PP, Okamoto H. Characterization of the Quasi-Enveloped Hepatitis E Virus Particles Released by the Cellular Exosomal Pathway. J Virol. - 2017. - №91(22). - P. е00822-17]. Так же, как и в предыдущих способах, выделение нуклеиновых кислот в данных исследованиях проводилось из фракции экзосом, выделяющихся одной клеточной линией, что не позволяло оценивать состав НК в остальных субпопуляциях экстраклеточных везикул.
Таким образом, по данным литературы существующие на сегодняшний день методы определения состава вирусных нуклеиновых кислот позволяют анализировать их только внутри избранных минорных субпопуляций экстраклеточных везикул без детального определения фенотипа ЭВ и с потерей большого количества везикул за счет необходимости отделения везикул от клеточной фракции методиками градиентного центрифугирования или ультрацентрифугирования. Однако, важно отметить, что большое количество нуклеиновых кислот вирусов может переноситься также другими фракциями ЭВ, отделение которых от клеточных структур затруднено из-за необходимости дополнительной очистки ЭВ от примесей свободно циркулирующих НК. В связи с этим выделение НК из всех субпопуляций ЭВ требует отработки этапов сортировки и фильтрации образцов для отбора ЭВ без их загрязнения свободно циркулирующими нуклеиновыми кислотами и вирусными частицами.
Известен способ выделения нуклеиновых кислот вируса иммунодефицита человека из субпопуляций лейкоцитарных экстраклеточных везикул [Arakelyan A, Fitzgerald W, Zicari S, Vanpouille С, Margolis L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. - 2017. - №7. - P. 1695], заключающийся в том, что в качестве материала для определения вирусных нуклеиновых кислот используют образцы культуральной среды от клеток и тканей, инфицированных ВИЧ. Для получения фракции экстраклеточных везикул проводится связывание культуральной среды с магнитными наночастицами (МНЧ) размерами 15 нм, состоящими из оксида железа и покрытыми карбоксильными группами. Эти частицы на предварительном этапе конъюгируют с антителами, специфичными к отобранному поверхностному маркеру ЭВ, который практически не содержится в мембране вирусных частиц (CD45). Для этого 1 мг МНЧ инкубируется 10 минут при комнатной температуре в 200 мкл активирующего буфера, содержащего 1.7 mM 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида и 0.76 mM N-гидроксисульфосукцинимида. После активации 500 мкл связывающего буфера добавляют к магнитным наночастицам, в полученную суспензию немедленно добавляют 1 мг очищенных антител. После двухчасовой инкубации в термомиксере при комнатной температуре при перемешивании реакция останавливается добавлением 10 мкл раствора гашения и проводится 2 отмывки моющим буфером с использованием магнитного сепаратора при 4°С. Конъюгированные с антителами МНЧ растворяют в 2 мл буфера хранения и хранят при 4°С в концентрации 0.5 мг/мл оксида железа.
Подготовленные таким образом комплексы МНЧ, конъюгированных с антителами, инкубируют с культуральной средой в течение 40 минут при температуре 37°С.Затем проводится выделение образовавшихся комплексов МНЧ-ЭВ с помощью магнитных колонок в сильном магнитном поле для их очистки от вирусных частиц и свободных нуклеиновых кислот. После иммобилизации комплексов МНЧ-ЭВ в магнитном поле, проводится трехкратное промывание магнитных колонок моющим раствором, содержащим фосфатный буфер, 0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА. Следующим этапом содержимое колонки вымывается вне магнитного поля и растворяется в 400 мкл фосфатного буфера. Полученные МНЧ-ЭВ комплексы используются для экстракции нуклеиновых кислот на магнитных кремниевых частицах в высоко-солевых условиях. Для этого выполняется лизис материала путем добавления 200 мкл полученного образца МНЧ-ЭВ к стандартному лизирующему буферу, затем проводится добавление высоко-солевого буфера в лизат для абсорбции выделяющихся НК на магнитных частицах, в процессе чего также абсорбируются магнитные частицы, используемые для выделения ЭВ, что позволяет очистить получаемый раствор НК. Далее проводится отделение НК от магнитных кремниевых частиц путем снижения солевой концентрации раствора с использованием стандартных низко-солевых элюирующих буферов. По окончании экстракции получается раствор вирусных и клеточных нуклеиновых кислот, выделенных из фракций экстраклеточных везикул, который подвергается анализу методом полимеразной цепной реакции. Этот способ выбран за прототип. Недостаток данного способа заключается в том, что при выделении нуклеиновых кислот из экстраклеточных везикул используется среда от клеточных или тканевых культур, в которой содержится ограниченный набор ЭВ преимущественно лейкоцитарного происхождения, что не соответствует распределению популяций ЭВ в организме человека, которые могут участвовать в переносе вирусных НК. Более того, для отделения ЭВ от свободных вирусных частиц используется только поверхностный маркер CD45, который позволяет анализировать состав ЭВ только лейкоцитарного происхождения. В связи с этим, анализ вирусных нуклеиновых кислот внутри ЭВ другого клеточного происхождения с использованием данного способа становится не возможным.
Задачей изобретения является повышение эффективности оценки состава нуклеиновых кислот вирусов в различных субпопуляциях экстраклеточных везикул.
Технический результат заключается в выделении вирусных нуклеиновых кислот из различных фракций экстраклеточных везикул человека, необходимых для определения механизмов распространения вирусной инфекции в организме человека с помощью везикулярного транспорта.
Это достигается за счет того, что для анализа используют полный состав экстраклеточных везикул из обедненной тромбоцитами плазмы крови человека, при выделении везикул из обедненной тромбоцитами плазмы используют магнитную сортировку вирусных частиц специфичным гликопротеином, а вслед за этим проводят выделение фракций экстраклеточных везикул за счет использования магнитных наночастиц с антителами, специфичными к различным поверхностным маркерам везикул.
В предлагаемом способе выделения нуклеиновых кислот из субпопуляций экстраклеточных везикул в качестве источника образца вирусных нуклеиновых кислот вместо культуральной среды от инфицированных клеток и тканей используется обедненная тромбоцитами плазма пациентов, инфицированных вирусом, за счет чего для анализа становятся доступными фракции ЭВ любого клеточного происхождения, циркулирующие в крови.
Кроме того, вместо проведения магнитной сортировки на наиболее редкие для вирусных частиц поверхностные маркеры, введен этап конъюгации раствора вирусных частиц и экстраклеточных везикул с магнитными бусами, связанными с антителами к гликопротеину вируса, необходимому для его инфицирования клеток. В экспериментах было показано, что гликопротеины оболочки вируса больших размеров содержатся в мембране менее, чем у 15% общей популяции экстраклеточных везикул, что подтверждает эффективность предлагаемого способа. В связи с этим для анализа вирусных нуклеиновых кислот внутри ЭВ возможно использование раствора везикул, не связавшихся с вирусным гликопротеином и проходящих через магнитную колонку. За счет этого проводилось отделение свободных вирусных частиц от экстраклеточных везикул без утраты основных субпопуляций ЭВ. Более того, также был добавлен следующий этап конъюгации раствора экстраклеточных везикул с магнитными наночастицами, связанными с антителами к разнообразным клеточным маркерам. За счет этого проводилось выделение нуклеиновых кислот из фракций ЭВ различного клеточного происхождения (тромбоцитарного, лейкоцитарного и т.д.).
Способ осуществляется следующим образом:
В качестве материала для выделения нуклеиновых кислот используют образец крови пациента, инфицированного вирусом, взятый из периферической вены в вакуумную пробирку с 3,2% раствором цитратом натрия, образец крови хранят при комнатной температуре не более 15 минут; пробирки с кровью центрифугируют дважды в течение 15 мин при ускорении 3000g при комнатной температуре, отбирают верхнюю фракцию, получая обедненную тромбоцитами плазму; после чего раствор плазмы замораживают, хранят при температуре не выше -80°С не менее 6 часов до продолжения исследования; затем плазму размораживают при комнатной температуре; после чего проводят связывание свободных вирусных частиц из подготовленной плазмы крови с МНЧ размерами 15 нм, предварительно конъюгированными с антителами, специфичными к гликопротеину оболочки вируса; для связывания вирусных частиц с МНЧ и отделения их от ЭВ, раствор плазмы инкубируют в течение 40 минут при температуре 37°С при постоянном перемешивании; затем с помощью магнитных колонок в магнитном поле проводят выделение образовавшихся комплексов МНЧ-вирусная частица путем трехкратного промывания магнитных колонок моющим раствором, содержащим фосфатный буфер, 0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА; далее проводят сбор раствора плазмы с ЭВ, которые повторно связывают с МНЧ размерами 15 нм, предварительно конъюгированными с антителами, специфичными к различным поверхностным маркерам везикул (CD45, CD31, CD41 и т.д.); после иммобилизации меченых антителами комплексов МНЧ-ЭВ в магнитном поле проводят трехкратное промывание магнитных колонок моющим раствором; затем содержимое колонки вымывают вне магнитного поля и растворяют в 400 мкл фосфатного буфера; далее проводят лизис выделенных фракций ЭВ путем добавления 200 мкл образца МНЧ-ЭВ к стандартному лизирующему буферу с абсорбцией лизата в высоко-солевом буфере на магнитных кремниевых частицах; нуклеиновые кислоты отделяют от магнитных кремниевых частиц путем снижения солевой концентрации раствора и подвергают анализу методом полимеразной цепной реакции.
Пример №1.
В качестве источника исследуемого материала была взята плазма крови пациента мужского пола 36 лет, инфицированного цитомегаловирусом. Кровь была взята из периферической вены в вакуумную пробирку с 3,2% раствором цитратом натрия. Образец крови хранился при комнатной температуре 5 минут. Затем образцы крови были центрифугированы двукратно в течение 15 минут при ускорении 3000g. Из пробирок была отобрана верхняя фракция - плазма крови, свободная от тромбоцитов. Раствор плазмы был заморожен и хранился до последующего анализа в течение 1 месяца при температуре -83°С. Далее образцы плазмы разморозили при комнатной температуре. Затем образцы плазмы связывали с МНЧ, которые на подготовительном этапе были конъюгированы с антителами, специфичными к гликопротеину оболочки цитомегаловируса gpB. Для связывания вирусных частиц с МНЧ, конъюгированными с антителами, образцы плазмы крови инкубировали с комплексами МНЧ в течение 40 минут при температуре 37°С при постоянном перемешивании. Далее проводилось трехкратное промывание магнитных колонок моющим раствором, содержащим фосфатный буфер, 0,5% BSA, 2 мМ ЭДТА.
Следующим этапом раствор ЭВ, прошедших через магнитную колонку, разделяли на 3 части и связывали с МНЧ, которые на подготовительном этапе были конъюгированы с антителами, специфичными к поверхностным маркерам ЭВ (CD31, CD41, CD45, CD63, CD81). Далее была проведена иммобилизация образовавшихся комплексов МНЧ-ЭВ с помощью магнитных колонок в сильном магнитном поле и трехкратное промывание магнитных колонок моющим раствором. Затем содержимое колонок вымывали вне магнитного поля, растворяли в 400 мкл фосфатного буфера и проводили лизис выделенных фракций ЭВ путем добавления 200 мкл образца МНЧ-ЭВ к стандартному лизирующему буферу с абсорбцией лизата в высоко-солевом буфере на магнитных кремниевых частицах. Полученные нуклеиновые кислоты отделяли от магнитных кремниевых частиц путем снижения солевой концентрации раствора и подвергали анализу их концентрации методом полимеразной цепной реакции.
При анализе с помощью полимеразной цепной реакции цитомегаловирусной ДНК, выделенной из различных фракций экстраклеточных везикул, были получены следующие результаты:
Количество ДНК цитомегаловируса в обедненной тромбоцитами плазме = 6893 копии на 1 мл плазмы крови.
Количество ДНК цитомегаловируса в общей фракции ЭВ, не несущих на поверхности вирусного гликопротеина = 4554 копии на 1 мл плазмы крови.
Количество ДНК цитомегаловируса во фракции ЭВ, несущих на своей поверхности маркер CD31 = 924 копии на 1 мл плазмы крови.
Количество ДНК цитомегаловируса во фракции ЭВ, несущих на своей поверхности маркер CD41 = 1320 копий на 1 мл плазмы крови.
Количество ДНК цитомегаловируса во фракции ЭВ, несущих на своей поверхности маркер CD45 = 858 копий на 1 мл плазмы крови.
Количество ДНК цитомегаловируса во фракции ЭВ, несущих на своей поверхности маркер CD63 = 858 копий на 1 мл плазмы крови.
Количество ДНК цитомегаловируса во фракции ЭВ, несущих на своей поверхности маркер CD81 = 396 копий на 1 мл плазмы крови.
Таким образом, нами было успешно исследовано распределение цитомегаловирусных нуклеиновых кислот в различных фракциях экстраклеточных везикул.