СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ НАЦЕЛЕННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПАРНЫХ ГИДОВЫХ РНК

1. Способ введения биаллельной модификации в геном в клетке, включающий в себя приведение генома в контакт с:
(a) первым белком Cas;
(b) первой РНК CRISPR, которая гибридизуется с первой последовательностью распознавания РНК CRISPR в пределах целевого геномного локуса;
(c) второй РНК CRISPR, которая гибридизуется со второй последовательностью распознавания РНК CRISPR в пределах целевого геномного локуса;
(d) тракрРНК; и
(e) нацеливающим вектором, содержащим полинуклеотидную вставку, фланкированную 5' гомологичным плечом, гибридизующимся с целевой 5'-последовательностью, и 3' гомологичным плечом,- гибридизующимся с целевой 3'-последовательностью, при условии, что если клетка представляет собой эмбрион на стадии единственной клетки, то нацеливающий вектор имеет длину не более 5 т.п.н.;
причем геном содержит пару из первой и второй гомологичных хромосом, содержащих целевой геномный локус; и
при этом первый белок Cas расщепляет по меньшей мере одну из первой и второй последовательностей распознавания РНК CRISPR с получением по меньшей мере одного двухцепочечного разрыва в по меньшей мере одной из первой и второй гомологичных хромосом.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий в себя идентификацию клетки, содержащей модифицированный геном.
3. Способ по п. 2, в котором полинуклеотидная вставка содержит кассету селекции, примыкающую к первому гомологичному плечу, которое гибридизуется с первой целевой последовательностью,
причем первое гомологичное плечо представляет собой 5' гомологичное плечо, а первая целевая последовательность представляет собой целевую 5'-последовательность, или причем первое гомологичное плечо представляет собой 3' гомологичное плечо, а первая целевая последовательность представляет собой целевую 3'-последовательность,
при этом идентификация включает в себя:
(a) получение ДНК из клетки;
(b) воздействие на ДНК клетки зондом, связывающимся в пределах первой целевой последовательности, зондом, связывающимся в пределах полинуклеотидной вставки, и зондом, связывающимся в пределах эталонного гена, имеющего известное число копий, при этом каждый зонд генерирует обнаруживаемый сигнал при связывании;
(c) обнаружение сигналов, обусловленных связыванием каждого из зондов; и
(d) сравнение сигнала от зонда эталонного гена с сигналом от зонда первой целевой последовательности для определения числа копий первой целевой последовательности и сравнение сигнала от зонда эталонного гена с сигналом от зонда полинуклеотидной вставки для определения числа копий полинуклеотидной вставки,
при этом число копий полинуклеотидной вставки, равное одной или двум, и число копий первой целевой последовательности, равное двум, указывает на нацеленную вставку полинуклеотидной вставки в целевой геномный локус, и
при этом число копий полинуклеотидной вставки, равное одной или более, и число копий первой целевой последовательности, равное трем или более, указывает на случайную вставку полинуклеотидной вставки в геномный локус, отличный от целевого геномного локуса.
4. Способ по любому предшествующему пункту, в котором первый белок Cas расщепляет по меньшей мере одну из первой и второй последовательностей распознавания РНК CRISPR в каждой из первой и второй гомологичных хромосом с получением по меньшей мере одного двухцепочечного разрыва в каждой из первой и второй гомологичных хромосом.
5. Способ по любому предшествующему пункту, в котором первый белок Cas расщепляет первую и вторую последовательности распознавания РНК CRISPR в по меньшей мере одной из первой и второй гомологичных хромосом с получением по меньшей мере двух двухцепочечных разрывов в по меньшей мере одной из первой и второй гомологичных хромосом.
6. Способ по любому предшествующему пункту, дополнительно включающий в себя приведение генома в контакт с:
(f) третьей РНК CRISPR, которая гибридизуется с третьей последовательностью распознавания РНК CRISPR в пределах целевого геномного локуса; и
(g) четвертой РНК CRISPR, которая гибридизуется с четвертой последовательностью распознавания РНК CRISPR в пределах целевого геномного локуса.
7. Способ по п. 6, в котором:
(a) первая последовательность распознавания РНК CRISPR и третья последовательность распознавания РНК CRISPR разделены на расстояние от приблизительно 25 до приблизительно 50 п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 100 п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 200 п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 250 п.н., от приблизительно 250 до приблизительно 300 п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 350 п.н., от приблизительно 350 до приблизительно 400 п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 450 п.н., от приблизительно 450 до приблизительно 500 п.н., от приблизительно 500 до приблизительно 600 п.н., от приблизительно 600 до приблизительно 700 п.н., от приблизительно 700 до приблизительно 800 п.н., от приблизительно 800 до приблизительно 900 п.н., от приблизительно 900 п.н. до приблизительно 1 т.п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 2 т.п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 3 т.п.н., от приблизительно 3 до приблизительно 4 т.п.н., от приблизительно 4 до приблизительно 5 т.п.н., от приблизительно 5 до приблизительно 6 т.п.н., от приблизительно 6 до приблизительно 7 т.п.н., от приблизительно 7 до приблизительно 8 т.п.н., от приблизительно 8 до приблизительно 9 т.п.н., от приблизительно 9 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 30 т.п.н., от приблизительно 30 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 50 т.п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 70 т.п.н., от приблизительно 70 до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 90 т.п.н. или от приблизительно 90 до приблизительно 100 т.п.н.; и/или
(b) вторая последовательность распознавания РНК CRISPR и четвертая последовательность распознавания РНК CRISPR разделены на расстояние от приблизительно 25 до приблизительно 50 п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 100 п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 200 п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 250 п.н., от приблизительно 250 до приблизительно 300 п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 350 п.н., от приблизительно 350 до приблизительно 400 п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 450 п.н., от приблизительно 450 до приблизительно 500 п.н., от приблизительно 500 до приблизительно 600 п.н., от приблизительно 600 до приблизительно 700 п.н., от приблизительно 700 до приблизительно 800 п.н., от приблизительно 800 до приблизительно 900 п.н., от приблизительно 900 п.н. до приблизительно 1 т.п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 2 т.п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 3 т.п.н., от приблизительно 3 до приблизительно 4 т.п.н., от приблизительно 4 до приблизительно 5 т.п.н., от приблизительно 5 до приблизительно 6 т.п.н., от приблизительно 6 до приблизительно 7 т.п.н., от приблизительно 7 до приблизительно 8 т.п.н., от приблизительно 8 до приблизительно 9 т.п.н., от приблизительно 9 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 30 т.п.н., от приблизительно 30 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 50 т.п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 70 т.п.н., от приблизительно 70 до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 90 т.п.н. или от приблизительно 90 до приблизительно 100 т.п.н.
8. Способ по п. 6 или 7, в котором первая иФ третья последовательности распознавания РНК CRISPR представляют собой первую пару последовательностей распознавания РНК CRISPR, а вторая и четвертая последовательности распознавания РНК CRISPR представляют собой вторую пару последовательностей распознавания РНК CRISPR, причем первая пара и вторая пара разделены на расстояние от приблизительно 25 до приблизительно 50 п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 100 п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 200 п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 250 п.н., от приблизительно 250 до приблизительно 300 п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 350 п.н., от приблизительно 350 до приблизительно 400 п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 450 п.н., от приблизительно 450 до приблизительно 500 п.н., от приблизительно 500 до приблизительно 600 п.н., от приблизительно 600 до приблизительно 700 п.н., от приблизительно 700 до приблизительно 800 п.н., от приблизительно 800 до приблизительно 900 п.н., от приблизительно 900 п.н. до приблизительно 1 т.п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 5 т.п.н., от приблизительно 5 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 т.п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 400 т.п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 500 т.п.н. до приблизительно 1 млн п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 1,5 млн п.н., от приблизительно 1,5 до приблизительно 2 млн п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 2,5 млн п.н., от приблизительно 2,5 до приблизительно 3 млн п.н., от приблизительно 3 до приблизительно 4 млн п.н., от приблизительно 4 до приблизительно 5 млн п.н., от приблизительно 5 до приблизительно 10 млн п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 млн п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 30 млн п.н., от приблизительно 30 до приблизительно 40 млн п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 50 млн п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 60 млн п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 70 млн п.н., от приблизительно 70 до приблизительно 80 млн п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 90 млн п.н. или от приблизительно 90 до приблизительно 100 млн п.н.
9. Способ по п. 8, в котором первый белок Cas расщепляет по меньшей мере две из первой, второй, третьей и четвертой последовательностей распознавания РНК CRISPR с получением по меньшей мере двух двухцепочечных разрывов в по меньшей мере одной из первой и второй гомологичных хромосом.
10. Способ по п. 9, в котором первый белок Cas расщепляет по меньшей мере две из первой, второй, третьей и четвертой последовательностей распознавания РНК CRISPR с получением по меньшей мере двух двухцепочечных разрывов как в первой, так и во второй гомологичных хромосомах.
11. Способ по любому предшествующему пункту, в котором приведение генома в контакт как с первой, так и со второй РНК CRISPR приводит к повышенной эффективности биаллельной модификации по сравнению с приведением генома в контакт или только с первой РНК CRISPR, или только со второй РНК CRISPR.
12. Способ по любому предшествующему пункту, в котором полинуклеотидную вставку вставляют между целевыми 5'- и 3'-последовательностями.
13. Способ по любому предшествующему пункту, в котором клетка является диплоидной, а биаллельная модификация приводит к гомозиготности, компаунд-гетерозиготности или гемизиготности в целевом геномном локусе.
14. Способ по любому предшествующему пункту, в котором биаллельная модификация включает в себя делецию между первой и второй последовательностями распознавания РНК CRISPR в первой гомологичной хромосоме.
15. Способ по п. 14, в котором биаллельная модификация включает в себя делецию между первой и второй последовательностями распознавания РНК CRISPR как в первой, так и во второй гомологичных хромосомах.
16. Способ по п. 15, в котором биаллельная модификация дополнительно включает в себя вставку полинуклеотидной вставки между целевыми 5'- и 3'-последовательностями как в первой, так и во второй гомологичных хромосомах.
17. Способ по п. 14, в котором биаллельная модификация включает в себя:
(а) делецию между первой и второй последовательностями распознавания РНК CRISPR как в первой, так и во второй гомологичных хромосомах, и вставку полинуклеотидной вставки между целевыми 5'- и 3'-последовательностями в первой гомологичной хромосоме, но не во второй гомологичной хромосоме;
(b) делецию между первой и второй последовательностями распознавания РНК CRISPR в первой гомологичной хромосоме и нарушение локуса между первой и второй последовательностями распознавания РНК CRISPR во второй гомологичной хромосоме;
(c) делецию между первой и второй последовательностями распознавания РНК CRISPR в первой гомологичной хромосоме, вставку полинуклеотидной вставки между целевыми 5'- и 3'-последовательностями в первой гомологичной хромосоме и нарушение локуса между целевыми 5'- и 3'-последовательностями во второй гомологичной хромосоме; или
(d) делецию между первой и второй последовательностями распознавания РНК CRISPR в первой гомологичной хромосоме и вставку полинуклеотидной вставки между целевыми 5'- и 3'-последовательностями в первой гомологичной хромосоме, причем последовательность полинуклеотидной вставки гомологична или ортологична удаленной последовательности.
18. Способ по любому предшествующему пункту, в котором:
(a) каждая из первой и второй последовательностей распознавания РНК CRISPR расположена на расстоянии по меньшей мере 50 п.н., по меньшей мере 100 п.н., по меньшей мере 200 п.н., по меньшей мере 300 п.н., по меньшей мере 400 п.н., по меньшей мере 500 п.н., по меньшей мере 600 п.н., по меньшей мере 700 п.н., по меньшей мере 800 п.н., по меньшей мере 900 п.н., по меньшей мере 1 т.п.н., по меньшей мере 2 т.п.н., по меньшей мере 3 т.п.н., по меньшей мере 4 т.п.н., по меньшей мере 5 т.п.н., по меньшей мере 6 т.п.н., по меньшей мере 7 т.п.н., по меньшей мере 8 т.п.н., по меньшей мере 9 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 20 т.п.н., по меньшей мере 30 т.п.н., по меньшей мере 40 т.п.н., по меньшей мере 50 т.п.н., по меньшей мере 60 т.п.н., по меньшей мере 70 т.п.н., по меньшей мере 80 т.п.н., по меньшей мере 90 т.п.н. или по меньшей мере 100 т.п.н. как от целевой 5'-последовательности, так и от целевой 3'-последовательности;
(b) каждая из первой и второй последовательностей распознавания РНК CRISPR расположена на расстоянии более, чем 50 п.н., более, чем 100 п.н., более, чем 200 п.н., более, чем 300 п.н., более, чем 400 п.н., более, чем 500 п.н., более, чем 600 п.н., более, чем 700 п.н., более, чем 800 п.н., более, чем 900 п.н., более, чем 1 т.п.н., более, чем 2 т.п.н., более, чем 3 т.п.н., более, чем 4 т.п.н., более, чем 5 т.п.н., более, чем 6 т.п.н., более, чем 7 т.п.н., более, чем 8 т.п.н., более, чем 9 т.п.н., более, чем 10 т.п.н., более, чем 20 т.п.н., более, чем 30 т.п.н., более, чем 40 т.п.н., более, чем 50 т.п.н., более, чем 60 т.п.н., более, чем 70 т.п.н., более, чем 80 т.п.н., более, чем 90 т.п.н. или более, чем 100 т.п.н. как от целевой 5'-последовательности, так и от целевой 3'-последовательности; или
(с) каждая из первой и второй последовательностей распознавания РНК CRISPR расположена на расстоянии от приблизительно 50 до приблизительно 100 п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 300 п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 400 п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 500 п.н., от приблизительно 500 до приблизительно 600 п.н., от приблизительно 600 до приблизительно 700 п.н., от приблизительно 700 до приблизительно 800 п.н., от приблизительно 800 до приблизительно 900 п.н., от приблизительно 900 п.н. до приблизительно 1 т.п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 2 т.п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 3 т.п.н., от приблизительно 3 до приблизительно 4 т.п.н., от приблизительно 4 до приблизительно 5 т.п.н., от приблизительно 5 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 30 т.п.н., от приблизительно 30 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 50 т.п.н. или от приблизительно 50 до приблизительно 100 т.п.н. как от целевой 5'-последовательности, так и от целевой 3'-последовательности.
19. Способ по любому предшествующему пункту, в котором:
(а) первая и вторая последовательности распознавания РНК CRISPR разделены на расстояние от приблизительно 1 до приблизительно 5 т.п.н., от приблизительно 5 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 т.п.н. или от приблизительно 150 до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 400 т.п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 500 т.п.н. до приблизительно 1 млн п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 1,5 млн п.н., от приблизительно 1,5 до приблизительно 2 млн п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 2,5 млн п.н. или от приблизительно 2,5 до приблизительно 3 млн п.н.;
(b) первая и вторая последовательности распознавания РНК CRISPR разделены на расстояние по меньшей мере 1 т.п.н., по меньшей мере 2 т.п.н., по меньшей мере 3 т.п.н., по меньшей мере 4 т.п.н., по меньшей мере 5 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 20 т.п.н., по меньшей мере 30 т.п.н., по меньшей мере 40 т.п.н., по меньшей мере 50 т.п.н., по меньшей мере 60 т.п.н., по меньшей мере 70 т.п.н., по меньшей мере 80 т.п.н., по меньшей мере 90 т.п.н., по меньшей мере 100 т.п.н., по меньшей мере 110 т.п.н., по меньшей мере 120 т.п.н., по меньшей мере 130 т.п.н., по меньшей мере 140 т.п.н., по меньшей мере 150 т.п.н., по меньшей мере 160 т.п.н., по меньшей мере 170 т.п.н., по меньшей мере 180 т.п.н., по меньшей мере 190 т.п.н., по меньшей мере 200 т.п.н., по меньшей мере 250 т.п.н., по меньшей мере 300 т.п.н., по меньшей мере 350 т.п.н., по меньшей мере 400 т.п.н., по меньшей мере 450 т.п.н. или по меньшей мере 500 т.п.н.;
(c) первая и вторая последовательности распознавания РНК CRISPR разделены на расстояние от приблизительно 25 до приблизительно 50 п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 100 п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 200 п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 250 п.н., от приблизительно 250 до приблизительно 300 п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 350 п.н., от приблизительно 350 до приблизительно 400 п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 450 п.н., от приблизительно 450 до приблизительно 500 п.н., от приблизительно 500 до приблизительно 600 п.н., от приблизительно 600 до приблизительно 700 п.н., от приблизительно 700 до приблизительно 800 п.н., от приблизительно 800 до приблизительно 900 п.н. или от приблизительно 900 п.н. до приблизительно 1 т.п.н.; или
(d) первая и вторая последовательности распознавания РНК CRISPR разделены на расстояние менее, чем 25 п.н., менее, чем 50 п.н., менее, чем 100 п.н., менее, чем 150 п.н., менее, чем 200 п.н., менее, чем 250 п.н., менее, чем 300 п.н., менее, чем 350 п.н., менее, чем 400 п.н., менее, чем 450 п.н., менее, чем 500 п.н., менее, чем 600 п.н., менее, чем 700 п.н., менее, чем 800 п.н., менее, чем 900 п.н., менее, чем 1 т.п.н., менее, чем 2 т.п.н., менее, чем 3 т.п.н., менее, чем 4 т.п.н., менее, чем 5 т.п.н. или менее, чем 10 т.п.н.
20. Способ по любому одному из пп. 14-19, в котором:
(a) удаленная нуклеиновая кислота составляет от приблизительно 5 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 т.п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 400 т.п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 500 т.п.н. до приблизительно 1 млн п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 1,5 млн п.н., от приблизительно 1,5 до приблизительно 2 млн п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 2,5 млн п.н. или от приблизительно 2,5 до приблизительно 3 млн п.н.; или
(b) удаленная нуклеиновая кислота составляет по меньшей мере 20 т.п.н., по меньшей мере 30 т.п.н., по меньшей мере 40 т.п.н., по меньшей мере 50 т.п.н., по меньшей мере 60 т.п.н., по меньшей мере 70 т.п.н., по меньшей мере 80 т.п.н., по меньшей мере 90 т.п.н., по меньшей мере 100 т.п.н., по меньшей мере 110 т.п.н., по меньшей мере 120 т.п.н., по меньшей мере 130 т.п.н., по меньшей мере 140 т.п.н., по меньшей мере 150 т.п.н., по меньшей мере 160 т.п.н., по меньшей мере 170 т.п.н., по меньшей мере 180 т.п.н., по меньшей мере 190 т.п.н., по меньшей мере 200 т.п.н., по меньшей мере 250 т.п.н., по меньшей мере 300 т.п.н., по меньшей мере 350 т.п.н., по меньшей мере 400 т.п.н., по меньшей мере 450 т.п.н. или по меньшей мере 500 т.п.н.; или
(c) удаленная нуклеиновая кислота составляет по меньшей мере 550 т.п.н., по меньшей мере 600 т.п.н., по меньшей мере 650 т.п.н., по меньшей мере 700 т.п.н., по меньшей мере 750 т.п.н., по меньшей мере 800 т.п.н., по меньшей мере 850 т.п.н., по меньшей мере 900 т.п.н., по меньшей мере 950 т.п.н., по меньшей мере 1 млн п.н., по меньшей мере 1,5 млн п.н. или по меньшей мере 2 млн п.н.
21. Способ по любому предшествующему пункту, в котором целевые 5'- и 3'-последовательности находятся в пределах целевого геномного локуса.
22. Способ по любому предшествующему пункту, в котором нацеливающий вектор имеет линейную форму.
23. Способ по любому предшествующему пункту, в котором нацеливающий вектор является одноцепочечным или двухцепочечным.
24. Способ по любому предшествующему пункту, в котором клетка представляет собой эукариотическую клетку.
25. Способ по п. 24, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, человеческую клетку, нечеловеческую клетку, клетку грызуна, мышиную клетку, крысиную клетку, плюрипотентную клетку, неплюрипотентную клетку, нечеловеческую плюрипотентную клетку, человеческую плюрипотентную клетку, плюрипотентную клетку грызуна, мышиную плюрипотентную клетку, крысиную плюрипотентную клетку, мышиную эмбриональную стволовую (ЭС) клетку, крысиную ЭС-клетку, человеческую ЭС-клетку, стволовую клетку взрослого человека, ограниченную в развитии человеческую клетку-предшественник, человеческую индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (ИПС) или эмбрион на стадии единственной клетки.
26. Способ по п. 25, в котором клетка представляет собой эмбрион на стадии единственной клетки и в котором:
(a) нацеливающий вектор имеет длину от приблизительно 50 нуклеотидов до приблизительно 5 т.п.н.; или
(b) нацеливающий вектор представляет собой одноцепочечную ДНК и имеет длину от приблизительно 60 до приблизительно 200 нуклеотидов.
27. Способ по п. 25, в котором клетка не является эмбрионом на стадии единственной клетки и в котором:
(а) нацеливающий вектор представляет собой большой нацеливающий вектор (LTVEC) длиной по меньшей мере 10 т.п.н.; или
(b) нацеливающий вектор представляет собой большой нацеливающий вектор (LTVEC), в котором общая длина 5' и 3' гомологичных плеч LTVEC составляет по меньшей мере 10 т.п.н.
28. Способ по п. 27, в котором:
(a) LTVEC составляет от приблизительно 50 до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 75 т.п.н., от приблизительно 75 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 125 т.п.н., от приблизительно 125 до приблизительно 150 т.п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 175 т.п.н., от приблизительно 175 до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 225 т.п.н., от приблизительно 225 до приблизительно 250 т.п.н., от приблизительно 250 до приблизительно 275 т.п.н. или от приблизительно 275 до приблизительно 300 т.п.н.; или
(b) общая длина 5' и 3' гомологичных плеч LTVEC составляет от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 30 т.п.н., от приблизительно 30 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 50 т.п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 70 т.п.н., от приблизительно 70 до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 90 т.п.н., от приблизительно 90 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 110 т.п.н., от приблизительно 110 до приблизительно 120 т.п.н., от приблизительно 120 до приблизительно 130 т.п.н., от приблизительно 130 до приблизительно 140 т.п.н., от приблизительно 140 до приблизительно 150 т.п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 160 т.п.н., от приблизительно 160 до приблизительно 170 т.п.н., от приблизительно 170 до приблизительно 180 т.п.н., от приблизительно 180 до приблизительно 190 т.п.н. или от приблизительно 190 до приблизительно 200 т.п.н.
29. Способ по любому одному из пп. 1-3, в котором клетка не является эмбрионом на стадии единственной клетки,
причем нацеливающий вектор представляет собой большой нацеливающий вектор (LTVEC), при этом общая сумма длин 5' и 3' гомологичных плеч составляет по меньшей мере 10 т.п.н.;
при этом каждая из первой и второй последовательностей распознавания РНК CRISPR расположена на расстоянии более, чем 200 п.н., более, чем 300 п.н., более, чем 400 п.н., более, чем 500 п.н., более, чем 600 п.н., более, чем 700 п.н., более, чем 800 п.н., более, чем 900 п.н., более, чем 1 т.п.н., более, чем 2 т.п.н., более, чем 3 т.п.н., более, чем 4 т.п.н., более, чем 5 т.п.н., более, чем 6 т.п.н., более, чем 7 т.п.н., более, чем 8 т.п.н., более, чем 9 т.п.н., более, чем 10 т.п.н., более, чем 20 т.п.н., более, чем 30 т.п.н., более, чем 40 т.п.н., более, чем 50 т.п.н., более, чем 60 т.п.н., более, чем 70 т.п.н., более, чем 80 т.п.н., более, чем 90 т.п.н. или более, чем 100 т.п.н. как от целевой 5'-последовательности, так и от целевой 3'-последовательности;
при этом первый белок Cas расщепляет первую и вторую последовательности распознавания РНК CRISPR в по меньшей мере одной из первой и второй гомологичных хромосом с получением по меньшей мере двух двухцепочечных разрывов в по меньшей мере одной из первой и второй гомологичных хромосом; и
при этом биаллельная модификация включает в себя делецию между первой и второй последовательностями распознавания РНК CRISPR в первой гомологичной хромосоме и вставку полинуклеотидной вставки между целевыми 5'- и 3'-последовательностями в первой гомологичной хромосоме, при этом последовательность полинуклеотидной вставки гомологична или ортологична удаленной последовательности.
30. Способ модификации генома в клетке, являющейся гетерозиготной по первому аллелю, включающий в себя приведение генома в контакт с:
(a) первым белком Cas;
(b) тракрРНК; и
(c) первой РНК CRISPR, которая гибридизуется с первой не аллель-специфической последовательностью распознавания РНК CRISPR, причем первый аллель находится на первой гомологичной хромосоме, а последовательность распознавания РНК CRISPR расположена в центромерном направлении от локуса, соответствующего первому аллелю на второй гомологичной хромосоме; и
при этом первый белок Cas расщепляет первую последовательность распознавания РНК CRISPR с получением двухцепочечного разрыва, а клетку модифицируют так, чтобы она стала гомозиготной по первому аллелю.
31. Способ по п. 30, дополнительно включающий в себя приведение генома в контакт со второй РНК CRISPR, гибридизующейся со второй не аллель-специфической последовательностью распознавания РНК CRISPR в центромерном направлении от локуса, соответствующего первому аллелю на второй гомологичной хромосоме,
при этом первый белок Cas расщепляет по меньшей мере одну из первой и второй последовательностей распознавания РНК CRISPR с получением по меньшей мере одного двухцепочечного разрыва.
32. Способ по п. 31, в котором первый белок Cas расщепляет первую последовательность распознавания РНК CRISPR и вторую последовательность распознавания РНК CRISPR.
33. Способ по любому одному из пп. 30-32, в котором потеря гетерозиготности происходит в теломерном направлении от двухцепочечного разрыва.
34. Способ по любому одному из пп. 31-33, в котором первая и вторая последовательности распознавания РНК CRISPR расположены на второй гомологичной хромосоме, но не на первой гомологичной хромосоме.
35. Способ по любому одному из пп. 30-34, в котором первый сайт распознавания РНК CRISPR находится на расстоянии от приблизительно 100 п.н. до приблизительно 1 т.п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 1 млн п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 10 млн п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 млн п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 30 млн п.н., от приблизительно 30 до приблизительно 40 млн п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 50 млн п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 60 млн п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 70 млн п.н., от приблизительно 70 до приблизительно 80 млн п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 90 млн п.н. или от приблизительно 90 до приблизительно 100 млн п.н. от центромеры.
36. Способ по любому одному из пп. 30-35, в котором первый аллель находится на расстоянии от приблизительно 100 п.н. до приблизительно 1 т.п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 1 млн п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 10 млн п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 млн п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 30 млн п.н., от приблизительно 30 до приблизительно 40 млн п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 50 млн п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 60 млн п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 70 млн п.н., от приблизительно 70 до приблизительно 80 млн п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 90 млн п.н. или от приблизительно 90 до приблизительно 100 млн п.н. от первого сайта распознавания РНК CRISPR.
37. Способ по любому одному из пп. 30-36, в котором область второй гомологичной хромосомы, заменяемая при потере гетерозиготности, составляет от приблизительно 100 п.н. до приблизительно 1 т.п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 1 млн п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 10 млн п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 млн п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 30 млн п.н., от приблизительно 30 до приблизительно 40 млн п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 50 млн п.н., от приблизительно 50 до приблизительно 60 млн п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 70 млн п.н., от приблизительно 70 до приблизительно 80 млн п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 90 млн п.н. или от приблизительно 90 до приблизительно 100 млн п.н.
38. Способ по любому одному из пп. 30-37, в котором:
(a) первый аллель содержит мутацию; или
(b) первый аллель представляет собой аллель дикого типа, а соответствующий локус на второй гомологичной хромосоме содержит мутацию.
39. Способ по п. 38, в котором первый аллель содержит мутацию, причем мутация представляет собой нацеленную модификацию.
40. Способ модификации генома в клетке, являющейся гетерозиготной по первому аллелю, включающий в себя приведение генома в контакт с:
(a) первым белком Cas;
(b) тракрРНК;
(c) первой РНК CRISPR, которая гибридизуется с первой последовательностью распознавания РНК CRISPR в пределах второго аллеля, причем первый аллель находится на первой гомологичной хромосоме, а второй аллель находится в соответствующем локусе на второй гомологичной хромосоме; и
(d) второй РНК CRISPR, которая гибридизуется со второй последовательностью распознавания РНК CRISPR в пределах второго аллеля;
при этом первый белок Cas расщепляет по меньшей мере одну из первой и второй последовательностей распознавания РНК CRISPR с получением по меньшей мере одного двухцепочечного разрыва и концевых последовательностей, подвергающихся рекомбинации, при этом рекомбинация осуществляется между первым и вторым аллелями с получением модифицированного генома, гомозиготного по первому аллелю.
41. Способ по п. 40, в котором первый белок Cas расщепляет первую последовательность распознавания РНК CRISPR и вторую последовательность распознавания РНК CRISPR.
42. Способ по п. 40 или 41, в котором первая и вторая последовательности распознавания РНК CRISPR расположены в пределах второго аллеля, но не первого аллеля.
43. Способ по любому одному из пп. 40-42, в котором:
(а) первая и вторая последовательности распознавания РНК CRISPR разделены на расстояние от приблизительно 1 до приблизительно 5 т.п.н., от приблизительно 5 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 т.п.н. или от приблизительно 150 до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 400 т.п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 500 т.п.н. до приблизительно 1 млн п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 1,5 млн п.н., от приблизительно 1,5 до приблизительно 2 млн п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 2,5 млн п.н. или от приблизительно 2,5 до приблизительно 3 млн п.н.; или
(b) первая и вторая последовательности распознавания РНК CRISPR разделены на расстояние по меньшей мере 1 т.п.н., по меньшей мере 2 т.п.н., по меньшей мере 3 т.п.н., по меньшей мере 4 т.п.н., по меньшей мере 5 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 20 т.п.н., по меньшей мере 30 т.п.н., по меньшей мере 40 т.п.н., по меньшей мере 50 т.п.н., по меньшей мере 60 т.п.н., по меньшей мере 70 т.п.н., по меньшей мере 80 т.п.н., по меньшей мере 90 т.п.н., по меньшей мере 100 т.п.н., по меньшей мере 110 т.п.н., по меньшей мере 120 т.п.н., по меньшей мере 130 т.п.н., по меньшей мере 140 т.п.н., по меньшей мере 150 т.п.н., по меньшей мере 160 т.п.н., по меньшей мере 170 т.п.н., по меньшей мере 180 т.п.н., по меньшей мере 190 т.п.н., по меньшей мере 200 т.п.н., по меньшей мере 250 т.п.н., по меньшей мере 300 т.п.н., по меньшей мере 350 т.п.н., по меньшей мере 400 т.п.н., по меньшей мере 450 т.п.н. или по меньшей мере 500 т.п.н.
44. Способ по любому одному из пп. 40-43, в котором:
(а) различия в последовательностях между первым аллелем и вторым аллелем охватывают от приблизительно 100 до приблизительно 200 п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 400 п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 600 п.н., от приблизительно 600 до приблизительно 800 п.н., от приблизительно 800 п.н. до приблизительно 1 т.п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 2 т.п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 3 т.п.н., от приблизительно 4 до приблизительно 5 т.п.н., от приблизительно 5 до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 до приблизительно 150 т.п.н., от приблизительно 150 до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 300 до приблизительно 400 т.п.н., от приблизительно 400 до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 500 т.п.н. до приблизительно 1 млн п.н., от приблизительно 1 до приблизительно 1,5 млн п.н., от приблизительно 1,5 до приблизительно 2 млн п.н., от приблизительно 2 до приблизительно 2,5 млн п.н. или от приблизительно 2,5 до приблизительно 3 млн п.н; или
(b) различия в последовательностях между первым аллелем и вторым аллелем охватывают по меньшей мере 100 п.н., по меньшей мере 200 п.н., по меньшей мере 300 п.н., по меньшей мере 400 п.н., по меньшей мере 500 п.н., по меньшей мере 600 п.н., по меньшей мере 700 п.н., по меньшей мере 800 п.н., по меньшей мере 800 п.н., по меньшей мере 1 т.п.н., по меньшей мере 2 т.п.н., по меньшей мере 3 т.п.н., по меньшей мере 4 т.п.н., по меньшей мере 5 т.п.н., по меньшей мере 6 т.п.н., по меньшей мере 7 т.п.н., по меньшей мере 8 т.п.н., по меньшей мере 9 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., 20 т.п.н., по меньшей мере 30 т.п.н., по меньшей мере 40 т.п.н., по меньшей мере 50 т.п.н., по меньшей мере 60 т.п.н., по меньшей мере 70 т.п.н., по меньшей мере 80 т.п.н., по меньшей мере 90 т.п.н., по меньшей мере 100 т.п.н., по меньшей мере 110 т.п.н., по меньшей мере 120 т.п.н., по меньшей мере 130 т.п.н., по меньшей мере 140 т.п.н., по меньшей мере 150 т.п.н., по меньшей мере 160 т.п.н., по меньшей мере 170 т.п.н., по меньшей мере 180 т.п.н., по меньшей мере 190 т.п.н., по меньшей мере 200 т.п.н., по меньшей мере 250 т.п.н., по меньшей мере 300 т.п.н., по меньшей мере 350 т.п.н., по меньшей мере 400 т.п.н., по меньшей мере 450 т.п.н. или по меньшей мере 500 т.п.н.
45. Способ по любому одному из пп. 40-44, в котором:
(a) первый аллель содержит нацеленную модификацию, а второй аллель представляет собой аллель дикого типа; или
(b) первый аллель представляет собой аллель дикого типа, а второй аллель содержит вызывающую заболевание мутацию.
46. Способ по любому одному из пп. 40-45, в котором рекомбинация включает в себя генную конверсию или потерю гетерозиготности (LOH).
47. Способ по любому одному из пп. 30-46, дополнительно включающий в себя идентификацию клетки, гомозиготной по первому аллелю.
48. Способ по любому одному из пп. 30-47, в котором белок Cas и первая РНК CRISPR в природе вместе не встречаются.
49. Способ по любому одному из пп. 30-48, в котором клетка представляет собой эукариотическую клетку.
50. Способ по п. 49, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, человеческую клетку, нечеловеческую клетку, клетку грызуна, мышиную клетку, крысиную клетку, плюрипотентную клетку, неплюрипотентную клетку, нечеловеческую плюрипотентную клетку, человеческую плюрипотентную клетку, плюрипотентную клетку грызуна, мышиную плюрипотентную клетку, крысиную плюрипотентную клетку, мышиную эмбриональную стволовую (ЭС) клетку, крысиную ЭС-клетку, человеческую ЭС-клетку, стволовую клетку взрослого человека, ограниченную в развитии человеческую клетку-предшественник, человеческую индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (ИПС) или эмбрион на стадии единственной клетки.
51. Способ по любому предшествующему пункту, в котором первый белок Cas представляет собой Cas9.
52. Способ по любому предшествующему пункту, в котором первый белок Cas имеет нуклеазную активность в отношении обеих цепей двухцепочечной ДНК.
53. Способ по любому одному из пп. 1-51, в котором первый белок Cas представляет собой никазу.
54. Способ по любому одному из пп. 1-39 и 41-53, в котором первый белок Cas представляет собой никазу, и причем способ дополнительно включает в себя приведение генома в контакт с:
(f) вторым белком Cas, представляющим собой никазу;
(g) третьей РНК CRISPR, гибридизующейся с третьей последовательностью распознавания РНК CRISPR; и
(h) четвертой РНК CRISPR, гибридизующейся с четвертой последовательностью распознавания РНК CRISPR;
при этом первый белок Cas расщепляет первую цепь геномной ДНК в пределах первой последовательности распознавания РНК CRISPR и в пределах второй последовательности распознавания РНК CRISPR, а второй белок Cas расщепляет вторую цепь геномной ДНК в пределах третьей последовательности распознавания РНК CRISPR и в пределах четвертой последовательности распознавания РНК CRISPR.
55. Способ по любому одному из пп. 1-29 и 31-54, в котором:
(a) первая РНК CRISPR и тракрРНК слиты вместе в первую гидовую РНК (гРНК) и/или вторая РНК CRISPR и тракрРНК слиты вместе во вторую гРНК; или
(b) первая РНК CRISPR и тракрРНК представляют собой отдельные молекулы РНК и/или вторая РНК CRISPR и тракрРНК представляют собой отдельные молекулы РНК.
56. Способ по любому предшествующему пункту, в котором приведение в контакт включает в себя введение первого белка Cas, первой и второй РНК CRISP и тракрРНК в клетку.
57. Способ по п. 56, в котором:
(a) первый белок Cas вводят в клетку в виде белка, матричной РНК (мРНК), кодирующей первый белок Cas, или ДНК, кодирующей первый белок Cas;
(b) первую РНК CRISPR вводят в клетку в виде РНК или в виде ДНК, кодирующей первую РНК CRISPR;
(c) вторую РНК CRISPR вводят в клетку в виде РНК или в виде ДНК, кодирующей вторую РНК CRISPR; и/или
(d) тракрРНК вводят в клетку в виде РНК или в виде ДНК, кодирующей тракрРНК.
58. Способ по п. 57, в котором первый белок Cas, первую РНК CRISPR и тракрРНК вводят в клетку в виде первого комплекса белок-РНК и/или первый белок Cas, вторую РНК CRISPR и тракрРНК вводят в клетку в виде второго комплекса белок-РНК.
59. Способ по п. 57, в котором:
(а) ДНК, кодирующая первый белок Cas, функционально связана с первым промотором в первом экспрессионном конструкте;
(b) ДНК, кодирующая первую РНК CRISPR, функционально связана со вторым промотором во втором экспрессионном конструкте;
(c) ДНК, кодирующая вторую РНК CRISPR, функционально связана с третьим промотором в третьем экспрессионном конструкте; и/или
(d) ДНК, кодирующая тракрРНК, функционально связана с четвертым промотором в четвертом экспрессионном конструкте;
причем первый, второй, третий и четвертый промоторы активны в клетке.
60. Способ по п. 59, в котором первый, второй, третий и/или четвертый экспрессионные конструкты являются компонентами одной молекулы нуклеиновой кислоты.
61. Способ по п. 57, в котором:
(a) ДНК, кодирующая первый белок Cas, функционально связана с первым промотором в первом экспрессионном конструкте;
(b) молекулы ДНК, кодирующие первую РНК CRISPR и тракрРНК, слиты вместе в ДНК, кодирующую первую гидовую РНК (гРНК), и функционально связаны со вторым промотором во втором экспрессионном конструкте; и/или
(c) молекулы ДНК, кодирующие вторую РНК CRISPR и тракрРНК, слиты вместе в ДНК, кодирующую вторую гРНК, и функционально связаны с третьим промотором в третьем экспрессионном конструкте;
причем первый, второй и третий промоторы активны в клетке.
62. Способ по п. 61, в котором первый, второй и/или третий экспрессионные конструкты являются компонентами одной молекулы нуклеиновой кислоты.
63. Способ по любому предшествующему пункту, в котором клетка модифицирована для снижения негомологичного соединения концов (NHEJ) и/или для повышения генной конверсии или направляемой гомологией репарации (HDR).
64. Способ по п. 63, в котором клетка модифицирована для снижения экспрессии или активности одной или более из следующего: DNA-PK, PARP1 и лигазы IV.
65. Способ по п. 64, в котором снижение экспрессии или активности является индуцируемым, обратимым, время-специфическим и/или пространственно-специфическим.
66. Способ получения не относящихся к человеку животных поколения F0, включающий в себя:
(a) введение нечеловеческой ЭС-клетки в нечеловеческий эмбрион-хозяин, причем нечеловеческая ЭС-клетка получена способом по любому одному из пп. 1-25 и 27-65; и
(b) вынашивание нечеловеческого эмбриона-хозяина в теле суррогатной матери;
при этом суррогатная мать дает потомство не относящегося к человеку животного поколения F0, имеющее биаллельную модификацию.
67. Способ получения не относящегося к человеку животного поколения F0, включающий в себя имплантацию генетически модифицированного эмбриона на стадии единственной клетки, полученного способом по любому одному из пп. 1-26 и 30-65, в тело суррогатной матери;
при этом суррогатная мать дает потомство не относящегося к человеку животного поколения F0, имеющее биаллельную модификацию.
68. Способ по п. 66 или 67, в котором не относящееся к человеку животное представляет собой мышь или крысу.
69. Способ идентификации нацеленной вставки полинуклеотидной вставки в целевой геномный локус в диплоидной клетке, не являющейся эмбрионом на стадии единственной клетки, включающий в себя:
(a) получение ДНК из клетки, причем клетку приводили в контакт с большим нацеливающим вектором (LTVEC), содержащим полинуклеотидную вставку, фланкированную первым гомологичным плечом, гибридизующимся с первой целевой последовательностью, и вторым гомологичным плечом, гибридизующимся со второй целевой последовательностью, при этом полинуклеотидная вставка содержит кассету селекции, прилегающую к первому гомологичному плечу;
(b) воздействие на ДНК клетки зондом, связывающимся в пределах первой целевой последовательности, зондом, связывающимся в пределах полинуклеотидной вставки, и зондом, связывающимся в пределах эталонного гена, имеющего известное число копий, при этом каждый зонд генерирует обнаруживаемый сигнал при связывании;
(c) обнаружение сигналов, обусловленных связыванием каждого из зондов; и
(d) сравнение сигнала от зонда эталонного гена с сигналом от зонда первой целевой последовательности для определения числа копий первой целевой последовательности и сравнение сигнала от зонда эталонного гена с сигналом от зонда полинуклеотидной вставки для определения числа копий полинуклеотидной вставки,
при этом число копий полинуклеотидной вставки, равное одной или двум, и число копий первой целевой последовательности, равное двум, указывает на нацеленную вставку полинуклеотидной вставки в целевой геномный локус, и
при этом число копий полинуклеотидной вставки, равное одной или более, и число копий первой целевой последовательности, равное трем или более, указывает на случайную вставку полинуклеотидной вставки в геномный локус, отличный от целевого геномного локуса.
70. Способ по п. 69, в котором сигнал, обусловленный связыванием зонда первой целевой последовательности, используют для определения значения порогового цикла (Ct) для первой целевой последовательности, а сигнал, обусловленный связыванием зонда эталонного гена, используют для определения значения порогового цикла (Ct) для эталонного гена, и число копий первой целевой последовательности определяют путем сравнения значения Ct первой целевой последовательности и значения Ct эталонного гена, и
при этом сигнал, обусловленный связыванием зонда полинуклеотидной вставки, используют для определения значения порогового цикла (Ct) для полинуклеотидной вставки, и число копий полинуклеотидной вставки определяют путем сравнения значения Ct первой целевой последовательности и значения Ct эталонного гена.
71. Способ по п. 69 или 70, в котором кассета селекции содержит ген резистентности к лекарственному средству.
72. Способ по любому одному из пп. 69-71, в котором полинуклеотидная вставка составляет по меньшей мере 5 т.п.н., по меньшей мере 10 т.п.н., по меньшей мере 20 т.п.н., по меньшей мере 30 т.п.н., по меньшей мере 40 т.п.н., по меньшей мере 50 т.п.н., по меньшей мере 60 т.п.н., по меньшей мере 70 т.п.н., по меньшей мере 80 т.п.н., по меньшей мере 90 т.п.н., по меньшей мере 100 т.п.н., по меньшей мере 150 т.п.н., по меньшей мере 200 т.п.н., по меньшей мере 250 т.п.н., по меньшей мере 300 т.п.н., по меньшей мере 350 т.п.н., по меньшей мере 400 т.п.н., по меньшей мере 450 т.п.н. или по меньшей мере 500 т.п.н.
73. Способ по любому одному из пп. 69-72, в котором расстояние между последовательностями, с которыми связываются зонды в первой целевой последовательности, и кассетой селекции составляет не более, чем 100 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 300 нуклеотидов, 400 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 600 нуклеотидов, 700 нуклеотидов, 800 нуклеотидов, 900 нуклеотидов, 1 т.п.н., 1,5 т.п.н., 2 т.п.н., 2,5 т.п.н., 3 т.п.н., 3,5 т.п.н., 4 т.п.н., 4,5 т.п.н. или 5 т.п.н.
74. Способ по любому одному из пп. 69-73, дополнительно включающий в себя определение числа копий второй целевой последовательности.
75. Способ по п. 74, в котором этап (b) дополнительно включает в себя воздействие на ДНК клетки зондом, связывающимся со второй целевой последовательностью, и
причем этап (с) дополнительно включает в себя обнаружение сигнала, обусловленного связыванием зонда второй целевой последовательности, и
при этом этап (d) дополнительно включает в себя сравнение сигнала от зонда эталонного гена с сигналом от зонда второй целевой последовательности для определения числа копий второй целевой последовательности.
76. Способ по любому одному из пп. 69-75, дополнительно содержащий определение числа копий одной или более дополнительных последовательностей в пределах полинуклеотидной вставки.
77. Способ по п. 76, в котором этап (b) дополнительно включает в себя воздействие на ДНК клетки одним или более дополнительными зондами, связывающимися с полинуклеотидной вставкой, и
причем этап (с) дополнительно включает в себя обнаружение сигнала, обусловленного связыванием одного или более дополнительных зондов, и
при этом этап (d) дополнительно включает в себя сравнение сигнала от зонда эталонного гена с сигналом от одного или более дополнительных зондов полинуклеотидной вставки для определения числа копий одной или более дополнительных последовательностей в пределах полинуклеотидной вставки.
78. Способ по п. 76 или 77, в котором одна или более дополнительных последовательностей в пределах полинуклеотидной вставки содержит последовательность, примыкающую ко второй целевой последовательности.
79. Способ по любому одному из пп. 69-78, в котором LTVEC выполнен с возможностью удаления эндогенной последовательности из целевого геномного локуса, или
в котором клетку дополнительно приводили в контакт с белком Cas, первой РНК CRISPR, которая гибридизуется с первой последовательностью распознавания РНК CRISPR в пределах целевого геномного локуса, второй РНК CRISPR, которая гибридизуется со второй последовательностью распознавания РНК CRISPR в пределах целевого геномного локуса, и тракрРНК.
80. Способ по п. 79, дополнительно включающий в себя определение числа копий эндогенных последовательностей в целевом геномном локусе.
81. Способ по п. 80, в котором этап (b) дополнительно включает в себя воздействие на ДНК клетки зондом, связывающимся с эндогенной последовательностью в целевом геномном локусе, и
причем этап (с) дополнительно включает в себя обнаружение сигнала, обусловленного связыванием зонда эндогенной последовательности, и
при этом этап (d) дополнительно включает в себя сравнение сигнала от зонда эталонного гена с сигналом от зонда эндогенной последовательности для определения числа копий эндогенной последовательности.