ЛИПОСОМАЛЬНОЕ ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА В КАПСУЛИРОВАННОЙ ФОРМЕ ДЛЯ ВАГИНАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
ENCAPSULATED LYPOSOMAL ANTIVIRAL AGENT BASED ON HUMAN INTERFERON ALPHA-2b FOR VAGINAL APPLICATION

Изобретение относится к сухим лечебно-профилактическим формам интерферона альфа-2b человека в виде липосомальных частиц, размещенных в капсулах с наполнителем, и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине для вагинального применения. Препарат рекомендуется использовать в составе комплексной терапии инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта: генитальный герпес, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, рецидивирующий кандидоз, гарднеллез, трихомониаз, папилломавирусные инфекции, бактериальный вагиноз, эрозии шейки матки, цервицит, вульвовагинит.
В клинической практике для лечения вирусных инфекций, в частности гепатита В, широко применяется рекомбинантный интерферон альфа-2b человека - один из известных субтипов лейкоцитарного интерферона.
Известно, что включение рекомбинантного альфа-интерферона в липосомы усиливает его антипролиферативную активность в эксперименте на опухолевых клетках (Eppstein D.A., Stewart W.E. Altered Pharmacological Properties of Liposome-Associated Human Interferon-Alpha. J. Virology, 1982, vol. 41, N 2, p.575-582). Причем различные способы ассоциации с мембраной липосом в зависимости от состава липидов приводят к измененной фармакокинетике интерфероновых препаратов в эксперименте на мышах (Killion J.J., Fan D., Bucana C.D., Frangos D.N., Price J.E., Fidler I.J. Augmentation of Antiproliferative Activity of Interferon Alfa Against Human Bladder Tumor Cell Lines by Encapsulation of Interferon Alta Within Liposomes. J. of the Nat. Cancer Inst, 1989, vol.81, N 18 p. 1387-1392).
Известен противовирусный препарат местного действия для внутрикожного введения на основе интерферона-альфа, включенного в липосомы (международная заявка, WO №91/01719, МПК А61К 9/127, опубл. 1991). Препарат исследован на экспериментальной модели инфекции герпеса у морских свинок. Липосомы получены из липидов, характерных для рогового слоя кожи.
Известна липосомальная лекарственная форма для перорального применения, содержащая человеческий альфа-интерферон (патент США №5503828, МПК А61К 38/00, опубл. 02.04.1996 г.). Однако конкретный состав лекарственной формы не указан.
Вышеприведенные препараты не предназначены для вагинального применения.
Известен другой противовирусный препарат на основе рекомбинантного бета-интерферона, включенного в липосомы, предназначенный для местного или парентерального (подкожного, внутримышечного) применения (Европейский патент №172007, МПК А61К 9/127, опубл. 1986). Для парентерального применения противовирусный препарат в липосомальной форме содержит:
рекомбинантный бета-интерферон, ME
2×10<sup>8</sup>
человеческий сывороточный альбумин, г
1,25
декстроза, г
1,25
смесь диарахидоилфосфатидилхолина и
дипальмитоилфосфатидилглицерина (7:3), моль
2,0
солевой раствор (0,9%), мл
100
Недостатком такого липосомального препарата является содержание в композиции человеческого сывороточного альбумина, что приводит к возможному развитию аллергических состояний у больных, длительно применяющих интерферон. Кроме того, состав данной композиции не предназначен для вагинального применения.
Известно липосомальное противовирусное лекарственное средство для перорального применения, содержащее биологически активный компонент - рекомбинантный интерферон альфа-2 человека, компоненты, формирующие липосомы - фосфатидилхолин и холестерин, стабилизатор - сахарозу, антиоксиданты - альфа-токоферол и аскорбиновую кислоту, представляющее собой лиофилизат или изотонический раствор (патент РФ №2123328, МПК А61К 9/127, опубл. 20.12.98), при следующем соотношении компонентов лиофилизата, мг:
рекомбинантный интерферон альфа-2, ME
(2,5-10)×10<sup>5</sup>
фосфатидилхолин
60-80
холестерин
6-10
альфа-токоферол
6-10
витамин С
1-2
сахароза
40-90
Такое липосомальное лекарственное средство обеспечивает проявление биологической активности, свойственной интерферону альфа-2, при пероральном пути введения препарата и достижение терапевтического эффекта от применения этой лекарственной формы без проявления побочных эффектов, сопровождающих парентеральный способ введения интерферона.
Указанное липосомальное лекарственное средство не предназначено и не эффективно для вагинального применения.
Известно липосомальное пероральное противовирусное лечебно-профилактическое средство (патент РФ №2361572, МПК А61К 9/127, опубл. 20.07.2009 г.), включающее рекомбинантный интерферон альфа-2 человека, фосфатидилохолин, холестерин, альфа-токоферол, лактозу, натрия хлорид, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный и натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, при этом оно представляет собой лиофилизат.
Наличие в липосомальной мембране холестерина и витамина Е в заявленных соотношениях обеспечивают относительную стабильность липосом в желудочно-кишечном тракте до места всасывания липидов в организме, и, соответственно, сохранение биологической активности интерферона, заключенного в них.
Однако такое липосомальное лекарственное средство не предназначено для вагинального применения.
Известны суппозитории Генферон (производитель ЗАО «БиоКад») в качестве активных веществ содержат три основных компонента (http://www.tiensmed.ru/news/genefron-q2d.html):
- человеческий интерферон альфа-2b в дозировке 250000 ME, 500000 ME и 1000000 ME;
- аминосульфоновая кислота - таурин в количестве 0,01 г;
- местное обезболивающее - бензокаин или анестезин в количестве 0,055 г.
Поскольку активные компоненты препарата нуждаются в специальной среде для быстрого проникновения в кровоток, и фиксации на слизистых оболочках влагалища или прямой кишки, в качестве оптимального вещества для этой цели выбран твердый жир. В твердом жире равномерно распределены активные компоненты и другие вспомогательные вещества, которые обеспечивают проникновение в кровоток, стабилизацию в объеме суппозитория и т.д. Вспомогательные компоненты - совершенно одинаковы, и содержатся в равных количествах. Вагинальное применение суппозиториев (свечей) Генферон. При введении Генферона во влагалище достигается выращенный местный эффект с накоплением большой части дозы именно в патологическом очаге. Слизистая оболочка влагалища не обладает высокой всасывающей способностью, поэтому попадание активных компонентов в кровоток минимально. В силу данного обстоятельства при влагалищном введении препарат оказывает, в основном, местное действие, и лишь незначительное системное. Максимальная концентрация в кровотоке и в очаге воспаления на слизистой оболочке достигается, в среднем, спустя 5 часов после введения свечей.
Основным недостатком свечей Генферон является непродолжительное время действия препарата на слизистой влагалища.
Известно пероральное липосомальное средство в капсулированной форме (международная заявка на изобретение WО 94/28876, МПК А61К 9/127, опубл. 22.12.1994 г.), включающее капсулу, выполненную в виде полой оболочки из желатина с наружным пленочным энтеропокрытием из материала Eudragit, в которой размещены порошкообразный наполнитель и распределенные в наполнителе липосомы, причем наполнитель состоит из лактозы, а каждая из липосом выполнена в виде полой оболочки из смеси фосфатидилглицерола и фосфатидилхолина и расположенного внутри оболочки ядра, включающего биологически активное вещество.
Однако конструкция данного липосомального средства в капсулированной форме не предназначена и не эффективна для вагинального применения.
Наиболее близким аналогом (прототипом) по назначению является липосомальное противовирусное средство на основе интерферона в виде суппозитория для вагинального применения, содержащее фосфолипид из бобовых, холестерин, жирные масла, коллоидный силикон и рекомбинантный интерферон альфа-2b человека (патент Китая №1704117, МПК А61К 38/21, опубл. 07.12.2005 г.).
Однако в указанном суппозитории содержатся жирные масла, которые постепенно при хранении растворяют липосомы, содержащие интерферон, вследствие чего препарат имеет недостаточных срок хранения, а также не обеспечивает эффективного пролонгированного действия при вагинальном применении.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого липосомального средства в капсулированной форме, которое позволило бы длительное время сохранять активность интерферона в липосомах при хранении, а при вагинальном применении - удерживать на слизистой препарат интерферона альфа-2 человека для обеспечения его пролонгированного действия.
Указанный технический результат достигается тем, что липосомальное противовирусное средство на основе интерферона альфа-2b человека в капсулированной форме для вагинального применения характеризуется тем, что каждая капсула выполнена в виде полой оболочки, в которой размещены порошкообразный наполнитель и распределенные в наполнителе липосомы, причем наполнитель состоит из водорастворимого полимерного гелеобразователя, лактозы, натрия хлорида, натрия фосфата двузамещенного 12-водного и натрия фосфата однозамещенного 2-водного, а каждая из липосом выполнена в виде полой оболочки, содержащей лецитин, холестерин и альфа-токоферол и расположенного внутри оболочки ядра, включающего рекомбинантный интерферон-альфа 2 человека при следующем содержании всех компонентов капсулы (мг):
наполнитель:
лактоза
90,0-92,0
натрия хлорид
7,8-8,1
натрий фосфорнокислый
двузамещенный 12-водный
4,0-5,0
натрий фосфорнокислый
однозамещенный 2-водный
0,5-0,6
оболочки липосом:
фосфатидилхолин
40,0-42,0
холестерин
4,0-5,0
альфа-токоферол
0,5-0,6
ядра липосом:
рекомбинантный интерферон альфа-
2 человека, ME
(1,0-30)105
водорастворимый полимерный
гелеобразователь
0,6-8,0
В качестве водорастворимого полимерного гелеобразователя средство содержит альгинат натрия, а оболочка каждой капсулы выполнена из желатина и диоксида титана при следующем количественном содержании компонентов оболочки, мас.%:
диоксид титана
2,0
желатин
98,0
Экспериментальные исследования показали, что концентрации на 1 капсулу фосфатидилхолина 40,0-42,0 мг, холестерина 4,0-5,0 мг, альфа-токоферола 0,5-0,6 мг оптимальны для включения заданного количества рекомбинантного интерферона альфа-2b человека в липосомы со средним размером частиц от 0,15 до 0.70 мкм.
Содержание лактозы в диапазоне 90,0-92 мг для вышеуказанного количества липидной композиции обеспечивает стабильное сохранение липосомальной мембраны в процессе лиофилизации и последующего хранения, а ее большее содержание не дает дополнительных преимуществ.
Введение таких компонентов, как натрий хлорид, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный и натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный в заявляемых концентрациях обеспечивает сохранение активности биологически активных веществ (рекомбинантного интерферона альфа-2b человека) на стадии приготовления липосом в капсулированной форме.
Витамин Е (альфа-токоферол), присутствующий в липосомах в заявленных соотношениях, оказывает достаточное антиокислительное и стабилизирующее действие на биологически активные вещества и липидные компоненты.
При использовании интерферона в количестве менее 100 тыс. МЕ выявляется недостаточная клиническая эффективность заявляемой лекарственной формы при пероральном приеме, а увеличение количества интерферона в разовой дозе более 3 млн ME нецелесообразно, так как не приводит к дальнейшему усилению терапевтического эффекта препарата и может вызвать нежелательные побочные эффекты, характерные для высоких доз интерферона.
Кроме того, лактоза обеспечивает повышение устойчивости готовой лекарственной формы на стадии хранения. Лактоза - невосстанавливающий дисахарид, и поэтому мало подвержена окислению.
Витамин Е (альфа-токоферол), присутствующий в липосомах в заявленных соотношениях, оказывает достаточное антиокислительное и стабилизирующее действие на интерферон и липидные компоненты.
Повышение устойчивости интерферона на стадии приготовления лекарственной формы достигается за счет введения в состав регидратирующего раствора фосфатно-солевого буфера с характеристиками, близкими к таковым у субстанции интерферона, что снижает инактивирующее воздействие таких факторов, как осмоляльность и кислотно-щелочной баланс.
Водорастворимый полимерный гелеобразователь, например альгинат натрия, после введения в полость организма капсулы и расплавления желатиновой оболочки набухает от окружающей влаги, превращается в липкую гелевую матрицу, содержащую равномерно распределенные липосомы с интерфероном. Липкая гелевая матрица легко прикрепляется к слизистой оболочке в полости организма и обеспечивает пролонгированное высвобождение интерферона из липосом.
На фиг.1 приведена схема капсулы с липосомальной формой интерферона. На фиг.2 изображена схема липосомы. На фиг.3 приведена схема капсулы после растворения ее оболочки и образования гелевой матрицы с распределенными в ней липосомами.
Каждая капсула выполнена в виде полой оболочки 1 из желатина, в которой размещены порошкообразный наполнитель 2 и распределенные в наполнителе липосомы 3, а также водорастворимый полимерный гелеобразователь 4. Наполнитель 2 состоит из лактозы, натрия хлорида, натрия фосфата двузамещенного 12-водного и натрия фосфата однозамещенного 2-водного, а каждая из липосом 3 выполнена из полой оболочки 5, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и альфа-токоферол и расположенного внутри оболочки ядра 6, включающего рекомбинантный интерферон альфа-2b человека.
Вес одной оболочки (1) капсулы из желатина составляет 90-112 мг. Водорастворимый полимерный гелеобразователь 4, например альгинат натрия, после введения в полость организма капсулы и расплавления желатиновой оболочки 1 набухает от окружающей влаги, превращается в липкую гелевую матрицу 7, содержащую равномерно распределенные липосомы 3 с интерфероном.
Ниже приведены примеры составов липосомального средства в капсулах
Пример 1. Состав средства при минимальном содержании всех компонентов капсулы (мг):
Наполнитель (2):
лактоза
90,0
натрия хлорид
7,8
натрий фосфорнокислый
двузамещенный 12-водный
4,0
натрий фосфорнокислый
однозамещенный 2-водный
0,5
оболочки липосом (5):
фосфатидилхолин
40,0
холестерин
4,0
альфа-токоферол
0,5
ядра липосом (6):
рекомбинантный интерферон альфа-
2 человека, ME
1,0·10<sup>5</sup>
водорастворимый полимерный
гелеобразователь (4)
0,6
Пример 2. Состав средства при среднем содержании всех компонентов капсулы (мг):
Наполнитель (2):
лактоза
91,34
натрия хлорид
8,01
натрий фосфорнокислый
двузамещенный 12-водный
4,52
натрий фосфорнокислый
однозамещенный 2-водный
0,56
оболочки липосом (5):
фосфатидилхолин
41,18
холестерин
4,53
альфа-токоферол
0,56
ядра липосом (6):
рекомбинантный интерферон альфа-2
2 человека, ME
5,0·10<sup>5</sup>
водорастворимый полимерный
гелеобразователь (4)
1,58
Пример 3. Состав средства при максимальном содержании всех компонентов капсулы (мг):
Наполнитель (2):
лактоза
92,0
натрия хлорид
8,1
натрий фосфорнокислый
двузамещенный 12-водный
5,0
натрий фосфорнокислый
однозамещенный 2-водный
0,6
оболочки липосом (5):
фосфатидилхолин
42,0
холестерин
5,0
альфа-токоферол
0,6
ядра липосом (6):
рекомбинантный интерферон альфа-
2 человека, ME
30·10<sup>5</sup>
водорастворимый полимерный
гелеобразователь (4)
8,0
Пример 4. Технология получения липосомальной формы интерферона в капсулах
В круглодонную колбу (V=20 л), содержащую 400 мл этанола вносят лецитин, растворяют при перемешивании, добавляют холестерин, растворенный в смеси хлороформа с этанолом в объемном соотношении 1:2, перемешивают, добавляют альфа-токоферол и выпаривают под вакуумом до получения сухой липидной пленки на стенках колбы. После выпаривания продувают липидную пленку инертным газом для предотвращения окисления липидов. Добавляют в колбу раствор субстанции рекомбинантного интерферона альфа-2b человека. Содержимое перемешивают до полной гидратации липидной пленки в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученную липосомальную суспензию подвергают последовательной формирующей и стерилизующей фильтрации через поликарбонатные мембраны фирмы ′′Nuclepore′′ (диаметр пор 0,4; 0,2 и 0,1 мкм) под давлением инертного газа (азот, аргон). Далее в полученный полупродукт вводят следующие компоненты: натрия хлорид, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, лактозу, гелеобразователь, воду дистиллированную.
В асептических условиях разливают суспензию в лотки, замораживают при температуре 40°C и проводят лиофильную сушку препарата до достижения остаточной влажности (7±1) мас.%. На 50 л полупродукта получают 8 кг лиофилизированного порошка, который передают на фасовку в твердые непрозрачные желатиновые капсулы с помощью машины ZIBO 40F для автоматического наполнения продуктом. Состав липосомального средства интерферона в капсулах, полученный по вышеприведенной технологии, представлен в примерах 1-3.
Средний диаметр липосом, полученных методом экструзии мультиламеллярных везикул через поликарбонатные мембраны и имеющих заявляемый состав, составляет от 0,15 до 0,70 мкм.
При анализе антивирусной активности липосомальной суспензии установлено, что не более 25% интерферона остается не инкапсулированным.
2
6
5
6
50
50
Пример 5. Для тестирования in vitro антивирусной активности липосомальной формы интерферона, полученной как указано в примере 1, используют метод подавления цитопатогенного действия вируса везикулярного стоматита (ВВС) штамм ′′Индиана′′ в культуре диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека (Л-68), выращенной в монослое в 96-луночных микропланшетах фирмы ′′Linbro′′ (Реаферон для инъекций сухой. Фармакопейная статья. ВФС-42-227 ВС-89). Предварительно ВВС пассируют на куриных эмбрионах по ТУ 42-14-97-79, не менее 3-х пассажей (заражающая доза 10-10 ТЦД/0,1 мл при инфекционной активности 10-10 ТЦД/0,1 мл). Для контроля степени окисленности липидов используют метод, основанный на измерении концентрации продуктов перекисного окисления липидов по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Yagi K. - Lipid peroxidation. Assay for blood plasma and serum. Methods Enzymol, 1984, vol. 105, p.328-333).
2
50
50
50
2
Перед определением антивирусной активности липосомальную суспензию инкубируют (20±2) мин при температуре (22±1°C) в присутствии 1% (V/V) тритона Х-100 для разрушения липосом. Для определения активности готовят двукратные разведения (выше и ниже предполагаемого титра) исследуемых препаратов и ОСО активности (активность которого выражена в международных единицах - МЕ-ОСО активности, ФС 42-28-90-87) в среде 199 или Игла с 2%-ной сыворотки плодов коров по ФС 42-7 ВС-85 (поддерживающая среда) и антибиотиками. На каждое разведение используют не менее 4-х лунок с монослоем культуры клеток. Из лунок удаляют среду и вносят по 0,1 мл предполагаемых разведений липосомального интерферона. 4 лунки с культурой клеток оставляют в качестве контрольных. Кроме того, 16 лунок оставляют для контроля дозы индикаторного вируса. В эти лунки вносят по 0,1 мл поддерживающей среды. Инокулированные и контрольные культуры инкубируют в течение 1 сут при (37±1)°C в атмосфере с (5,0±0,5)%СО, после чего в каждую с испытываемыми материалами вносят определенную заранее дозу ВВС, соответствующую 100 ТЦД в 0,1 мл. Одновременно осуществляют контроль взятой дозы вируса на предназначенных для этой цели 16 лунках с культурой. Используют по 4 лунки на каждое разведение вируса, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД, до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД, с коэффициентом разведения, равным 10. После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы, культуру клеток инкубируют на протяжении 2-х суток при температуре, равной (37±1)°C, в атмосфере с (5,0±1)% CO, под контролем дозы вируса.
50
50
Учет результатов противовирусной активности липосомального интерферона осуществляют, когда доза внесенного вируса соответствует 100 ТЦД. Если дозу вируса, соответствующую 100 ТЦД, рассчитывают на основании учета результатов через 24 ч после заражения, то и учет титрования препарата осуществляют через 24 ч. Учет результатов опыта возможен, если нет признаков дегенерации в контрольной культуре. За титр липосомального интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказывается полностью защищенной от цитопатического действия вируса. Пересчет активности в ME осуществляют по формуле
Как известно, фармацевтически приемлемым является срок хранения лекарственного средства не менее 6 месяцев, предпочтительнее не менее 1 года.
Для подтверждения стабильности лиофильно высушенной липосомальной лекарственной формы рекомбинантного интерферона альфа-2 в капсулах заявленного состава в течение 36 месяцев исследовалась противовирусная активность препарата. Препарат хранился в рефрижераторе при температуре 4°C. В течение всего срока наблюдения степень окисленности липидов оставалась неизменной.
Как показали исследования, в течение 36 месяцев хранения не обнаружено значительного снижения противовирусной активности заявляемого лекарственного средства (табл.1). По сравнению с прототипом срок хранения препарата увеличился в 2 раза.
Пример 6. Исследование капсул для вагинального применения с рекомбинантным интерфероном альфа-2b в липосомах
Материалы и методы. Исследование капсул для вагинального применения с рекомбинантным интерфероном альфа-2b проводили на лабораторных животных. Использовали 12 самок кроликов породы «Шиншилла» с массой 1,5-2 кг.
Кролики были разделены на 2 группы по 6 животных. Кроликам группы 1 вводились вагинальные капсулы с рекомбинантным интерфероном альфа-2b 500 тыс. ME, кролики контрольной группы (группа 2) получали свечи Генферон 500 тыс. ME. В обеих группах препараты применялись 1 раз в сутки в течение 7 дней (табл.2).
Исследование клинико-лабораторных показателей проводилось непосредственно перед первым введением капсул/свечей и на 7-й день после введения.
Были проведены следующие исследования:
1. Микроскопическое исследование вагинальных мазков (количество лейкоцитов в поле зрения, количество плоского эпителия в поле зрения, наличие микрофлоры).
2. Активность нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест).
3. Показатели периферической крови (общее количество лейкоцитов, содержание палочко-ядерных нейтрофилов, сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов, моноцитов).
4. Исследование иммунограммы (общее количество Т-лимфоцитов CD3, количество Т-хелперов CD4, количество Т-киллеров CD8, иммунорегуляторный индекс CD4/CD8).
Все цифровые данные, полученные по группам в ходе исследования, были подвергнуты статистической обработке с использованием критерия Стьюдента. Различие средних величин перед началом исследования и на 7-й день считалось достоверным при Р≤0,05.
Результаты
При микроскопическом исследовании вагинальных мазков обнаружено достоверное уменьшение количества лейкоцитов на 7-й день с 4,5 до 0 в поле зрения в группе 1(Р≤0,05) и с 3,5 до 0,75 - в контрольной группе (Р≤0,05). Количество плоского эпителия также достоверно уменьшилось с 5 до 2 в группе 1(Р≤0,05) и с 4,5 до 2 в контрольной группе (Р≤0,05). Непатогенные палочки обнаруживались и перед началом исследования и на 7-й день в обеих группах (табл.3).
Исследование активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) показало достоверное увеличение активности на 7-й день в 4,06 раз в группе, получавших вагинальные капсулы (Р≤0,05), и в 3,26 раз в контрольной группе (получавших Генферон) (Р≤0,05) (табл.4).
Показатели периферической крови в обеих группах находились в пределах нормальных значений на протяжении всего периода исследования. При этом отмечалось увеличение общего количества лейкоцитов (Р≤0,05 в обеих группах), количества лимфоцитов (Р≤0,05 в группе 1) и снижение количества эозинофилов (Р≤0,05 в группе 1). Более выраженные изменения по всем вышеперечисленным показателям произошли в группе кроликов, получавших вагинальные капсулы (табл.5).
Показатели иммунограммы в обеих группах также находились в пределах нормальных значений на протяжении всего периода исследования. При исследовании иммунограммы выявлены увеличение общего числа Т-лимфоцитов (CD3) в группе 1(Р≤0,05) и тенденция к снижению их количества в контрольной группе на 7-й день. Количество Т-хелперов (CD4) достоверно увеличилось в группе 1 (Р≤0,05) и практически не изменилось в контрольной группе. Незначительно уменьшилось содержание Т-киллеров (CD8) в обеих группах (различия недостоверны). Иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) достоверно повысился в группе 1(Р≤0,05) (табл.6).
Выводы
1. Достоверно (Р≤0,05) уменьшилось количество лейкоцитов и плоского эпителия по результатам исследования вагинальных мазков в обеих группах. Более выраженное уменьшение произошло в группе кроликов, получавших вагинальные капсулы.
2. Произошло достоверное (Р≤0,05) увеличение активности нейтрофилов на 7-й день в обеих группах животных, при этом более выраженное увеличение отмечено в группе, получавших вагинальные капсулы, по сравнению с группой, получавших Генферон (в 4,06 и в 3,26 раз соответственно).
3. По результатам анализа периферической крови выявлено достоверное (Р≤0,05) увеличение общего количества лейкоцитов в обеих группах, более выраженное в группе 1. Количество лимфоцитов достоверно (Р≤0,05) повысилось в группе 1 и имело тенденцию к повышению в контрольной группе. В обеих группах произошло снижение числа эозинофилов, причем в группе 1 достоверно (Р≤0,05).
4. Показатели иммунограммы свидетельствуют об активации Т-клеточного звена системы иммунитета на 7-й день исследования в группе 1 (достоверно повысилось общее число Т-лимфоцитов (CD3), Т-хелперов (CD4), иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8)). Показатели иммунограммы в контрольной группе колебались незначительно.
Таким образом, по результатам анализа вагинальных мазков подтверждено сопоставимое местное воздействие при вагинальном введении капсул с интерфероном и свечей Генферон (достоверное уменьшение количества лейкоцитов и плоского эпителия).
По результатам исследования активности нейтрофилов на 7-й день исследования выявлено также сопоставимое стимулирующее воздействие на систему общего иммунитета, более выраженное у капсул с интерфероном, чем у свечей Генферон.
Результаты анализа иммунограммы свидетельствуют о достоверном влиянии капсул с интерфероном на иммунную систему (активация Т-клеточного звена системы иммунитета). При этом при применении свечей Генферон подобного влияния не наблюдалось.
Промышленная применимость
Создано липосомальное средство на основе рекомбинантного альфа-2 интенферона человека в капсулированной форме для вагинального применения, которое позволяет длительное время (до 36 месяцев, табл.1) сохранять активность интерферона в липосомах при хранении. Известный наиболее близкий аналог, выпускаемый фармацевтической промышленностью, - свечи с интерфероном Генферон имеет срок хранения 1 год. Условия хранения свечей Генферон - при температуре 2-8°C (http://site-zdorovie.ru/lekarstvennie-sredstva/genferon-svechi-instrukciya.htm). Препарат-прототип (липосомальная форма интерферона в свечах) имеет срок хранения не более 18 месяцев.
При вагинальном применении заявляемого препарата обеспечивается его пролонгированное эффективное действие, которое подтверждается данными, приведенными в таблицах 2-6, за счет удерживания на слизистой липосомального препарата интерферона альфа-2 человека посредством гелевой матрицы на основе альгината натрия.