СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ФОРМЫ БЕСПЛОДИЯ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR IMMUNOLOGICAL INFERTILITY

Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктивной иммунологии и акушерству и гинекологии, и может быть использовано для диагностики иммунологической формы бесплодия у пар с бесплодием неуточненного генеза.
При отсутствии анатомических дефектов репродуктивной системы женщины, мужского фактора, гормональных нарушений, гинекологических заболеваний причины бесплодия связывают с иммунными дисфункциями. Иммунные нарушения могут проявляться присутствием у женщины различных антител, направленных против антигенных детерминант собственных тканей (антифосфолипидные и антинуклеарные антитела, антитела к половым гормонам, хорионическому гонадотропину человека) или сперматозоидов, что может оказывать неблагоприятное влияние на имплантацию эмбриона и вынашивание беременности [1]. Кроме того, причина бесплодия может быть обусловлена снижением продукции протективных блокирующих факторов, предохраняющих эмбрион от иммунной атаки матери [2]. Следствием данных дисфункций может быть нарушение имплантации эмбриона при хороших эмбриологических показателях, что остается неразрешимой задачей при экстракорпоральном оплодотворении. Поиск параметров, отражающих иммунные нарушения, активно ведется во всем мире, однако найти универсальные биомаркеры, ассоциированные с бесплодием иммунного генеза, до сих пор не удается.
В последние годы особое внимание уделяется популяции регуляторных Т-клеток (Т-рег) с супрессорной активностью, которые принимают непосредственное участие в индукции толерантности при беременности [3]. Регуляторные Т-клетки составляют гетерогенную популяцию и включают клетки с различными фенотипами, которые различаются по функциям. Значение Т-рег для имплантации и развития беременности было показано в экспериментальных работах, где перенос Т-рег бесплодным самкам сопровождался вынашиванием беременности [4]. Снижение доли регуляторных Т-клеток продемонстрировано у женщин с привычным невынашиванием [5].
Для диагностики иммунных нарушений при бесплодии предложены различные способы. Так, в качестве биомаркера иммунных нарушений предложена диагностика гена, кодирующего ассоциированный с бесплодием протеин (FKBPL) [6]. Предполагается, что эффект FKBPL обусловлен подавлением экспрессии рецепторов к эстрогену.
Предложен также способ определения в крови у женщин концентрации фактора EBAF (endometrial bleeding associated factor) - цитокина семейства TGFβ. Повышенная продукция EBAF ингибирует продукцию пролактина (PRL) и протеина, связывающего инсулиновый ростовой фактор (IGFBP-1), которые принимают непосредственное участие в децидуализации и имплантации эмбриона [7]. Недостатком данных методов диагностики является невысокая частота встречаемости нарушений исследуемых параметров у женщин с бесплодием, которая составляет 5-7%.
3
Известен способ диагностики иммунных нарушений при бесплодии по ингибированию пролиферативного ответа лимфоцитов женщины на стимуляцию фитогемагглютинином (ФГА) в присутствии аутологичной сыворотки в течение 72 часов. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в культуре регистрируется по синтезу ДНК с использованием радиоактивно меченого H-тимидина [8].
Недостатками способа являются длительность инкубации клеток в стерильных условиях, наличие специального оборудования и персонала для работы в радиоизотопной лаборатории, отсутствие диагностических критериев.
В качестве модификации этого метода описан «Способ оценки определения блокирующего эффекта аутологичной сыворотки женщины» [9]. Метод основан на способности сывороток крови фертильных женщин ингибировать пролиферацию лимфоцитов, стимулированных фитогемагглютинином (ФГА). Из крови женщин выделяют лимфоциты методом центрифугирования в градиенте плотности. Для определения супрессорной активности лимфоциты женщины инкубируют в течение 72 часов в разных культуральных условиях - в среде с добавлением ФГА, в среде с добавлением ФГА и пулированной АВ-сыворотки доноров, в среде с добавлением ФГА и аутологичной сыворотки и в среде без добавок. Интенсивность пролиферации клеток оценивают методом проточной цитофлуориметрии с использованием прямых меченых FITC антител к CD69. Далее оценивают флуоресценцию в каждой из проб и определяют супрессорный эффект по предложенной формуле.
Недостатками данного способа являются необходимость 3-дневного культивирования клеток, требующая проведения исследований в стерильных условиях и специального оборудования, наличие высокопрофессионального персонала, а также отсутствие пороговых значений, определяющих оптимальные показатели специфичности и чувствительности. Кроме того, данный тест выявляет супрессорную активность безотносительно специфичности к аллоантигенам плода, что может уменьшать его значимость для диагностики иммунологического бесплодия.
+
+
+
high
+
+
+
high
+
+
Наиболее близким прототипом заявленного способа являются работы L. Arruvito с соавторами, основанные на оценке содержания циркулирующих регуляторных Т-клеток [10]. Согласно данному подходу в фолликулярную и лютеиновую фазы менструального цикла из периферической крови женщин методом центрифугирования в градиенте плотности выделяют лимфоциты. Методом проточной цитометрии оценивают содержание трех субпопуляций клеток - CD4CD25, CD4CD25, CD4+FoxP3+ клеток. У фертильных женщин содержание циркулирующих Т-клеток максимально нарастает в периовуляторный период. У женщин с привычным невынашиванием содержание CD4CD25, CD4CD25, CD4FoxP3 Т-клеток нарастает в меньшей степени и достоверно отличается от количества соответствующих Т-клеток у фертильных женщин.
Недостатками способа являются необходимость как минимум 2-кратного обследование женщин, определение 3-х субпопуляций лимфоцитов, отсутствие пороговых значений, определяющих оптимальные показатели специфичности и чувствительности и ограниченная область применения метода - только у женщин с невынашиванием беременности в анамнезе.
Предлагаемое изобретение решает задачу: создание метода диагностики иммунологической формы бесплодия, основанного на упрощенном (по сравнению с прототипом) способе оценки регуляторных Т-клеток, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, с расширенной сферой применения: как в случаях с привычным невынашиванием, так и при первичном бесплодии неуточненного генеза.
+
+
-
+
+
-
Поставленная задача решается следующим образом. Проводят однократное обследование в периимплантационный период как женщин с привычным невынашиванием, так и с первичным бесплодием. В качестве диагностического маркера исследуется только одна субпопуляция клеток CD4CD25CD127 Т-клеток. Эту популяцию оценивают в эндометриальной ткани, в которой содержание регуляторных Т-клеток характеризуется более высокой диагностической точностью, чем в периферической крови, методом проточной цитометрии. Диагностическим критерием является снижение относительного количества CD4CD25CD127 Т-клеток ниже порогового значения: при содержании этих клеток <7,5% диагностируется иммунологическое бесплодие.
Технический результат предложенного способа состоит в следующем.
+
+
-
- Определены пороговые значения популяции Т-клеток, определяющие оптимальные показатели специфичности и чувствительности. Разработанный способ позволяет диагностировать бесплодие со специфичностью 77% и чувствительностью 85%. Полученные данные позволяют рассматривать дефицит CD4CD25CD127 Т-клеток как маркер иммунологической формы бесплодия.
+
+
- Способ упрощен в исполнении: проводится однократное обследование женщин в периимплантационный период и исследуется только одна субпопуляция клеток CD4CD25CD127.
- Расширена сфера применения диагностического метода: обследование проводится в периимплантационный период как женщин с привычным невынашиванием, так и с первичным бесплодием.
Способ осуществляется следующим образом
У женщин с бесплодием неясного генеза в периимплантационный период (19-24 день цикла забирают биоптат эндометриальной ткани, который получают путем аспирации с помощью внутриматочного зонда «Пайпель». Биоптат эндометриальной ткани помещают в холодный физиологический раствор, затем механически измельчают, фильтруют через стальное сито, промывают в физиологическом растворе и собирают клеточную суспензию. Далее 50 мкл клеточной суспензии ресуспендируют в растворе «А» (5% желатиноля, 0,1% азида натрия, 0,02% ЭДТА, 10% сыворотки доноров АВ (IY) группы в фосфат-забуференном физиологическом растворе - ЗФР). Затем к суспензии клеток добавляют 20 мкл коктейля моноклональных антител (CD4CD25CD127, Becton Dickinson, США) и инкубируют 20 минут при комнатной температуре. После этого клетки однократно отмывают в растворе «А». Подготовленные таким образом клетки исследуют на проточном цитометре с применением программы Cell Quest (Dickinson, США).
Заявленный способ разработан на основании обследования 13 фертильных женщин, имеющих детей, и 13 женщин с бесплодием неясного генеза в период с сентября 2011 г. по июнь 2013 г. На момент исследования у женщин не была выявлена причина бесплодия (регулярный овуляторный менструальный цикл, проходимость маточных труб, фертильная сперма партнера, отсутствие анатомических дефектов репродуктивных органов, отсутствие гинекологических и эндокринных заболеваний). Возраст фертильных женщин составил 29,5±2,9; женщин с бесплодием 30,2±1,3. Факт овуляции оценивался с помощью динамической фолликулометрии.
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
Сравнение содержания CD4CD25CD127 клеток в эндометриальной ткани у женщин показало, что при бесплодии число Т-клеток достоверно ниже, чем у фертильных женщин (5,2±1,3 vs 12,7±1,5; p<0,05). Для определения диагностической значимости CD4CD25CD127 клеток, которые оцениваются в эндометриальной ткани, был проведен ROC анализ. Построение характеристических кривых (receiver-operator curve, ROC) выявило высокую информативность данного прогностического маркера. Площадь под кривой (AUG) теста относительного содержания CD4CD25CD127 Т-клеток в эндометриальной ткани составила 0,93 (p=0,0002). В этом случае относительное содержание CD4CD25CD127 клеток менее 7,5% позволяло диагностировать иммунологическое бесплодие со специфичностью 77% и чувствительностью 85%.
+
+
-
Пример №1. Пациентка М., 31 г. Соматические заболевания отсутствуют. Регулярный менструальный цикл, 28 дней. Беременность - 1. В 2007 г. - самопроизвольные роды живым доношенным плодом. Девочка, 3200 г, 51 см. В дальнейшем предохранение барьерным методом. На момент обследования (16.11.11 г.) по данным фолликулометрии - овуляторный цикл, забор крови на 19 день цикла, содержание CD4CD25CD127 клеток в эндометрии - 16%, в периферической крови - 11%.
+
+
-
Пример №2. Пациентка Г. Регулярный менструальный цикл, 31 день. Бесплодие в течение 4 лет. Кариотипирование супругов хромосомной патологии не выявило. HLA-типирование 3-х локусов (HLA-DR и HLA-DQA, B) сходства по антигенам гистосовместимости не выявило. На момент обращения гинекологических, эндокринных заболеваний не выявлено. 2008 г. - лапароскопия, без особенностей, маточные трубы проходимы. Уровень продукции репродуктивных гормонов в пределах нормы. Антитела к кардиолипину, антиовариальные антитела, антиспермальные антитела в пределах референсных значений. Антифосфолипидный синдром исключен. У мужа по данным спермограммы - нормозооспермия. На момент обследования (14.01.2012 г.) - овуляторный цикл по данным фолликулометрии, забор крови на 21 день цикла, содержание CD4CD25CD127 клеток в эндометрии - 3%, в периферической крови - 6%.
+
+
-
Пример №3. Пациентка К. Регулярный менструальный цикл, 32 дня. Бесплодие в течение 3 лет. Кариотипирование супругов хромосомной патологии не выявило. HLA-типирование 3-х локусов (HLA-DR и HLA-DQA, B) сходства по антигенам гистосовместимости не выявило. На момент обращения гинекологических, эндокринных заболеваний не выявлено. 2009 г. - гистеросальпингография, без особенностей, маточные трубы проходимы. Уровень продукции репродуктивных гормонов в пределах нормы. Антитела к кардиолипину, антитела к тиреоглобулину, тиреопероксидазе, антиспермальные антитела в пределах референсных значений. Антифосфолипидный синдром исключен. У мужа по данным спермограммы - нормозооспермия. На момент обследования (8.10.2012 г.) - овуляторный цикл по данным фолликулометрии, забор крови на 22 день цикла, содержание CD4CD25CD127 клеток в эндометрии - 3%, периферической крови - 5,3%.
+
+
-
+
-
Таким образом, исследования показали значимое возрастание CD4CD25CD127 клеток в эндометрии у фертильных женщин в периовуляторную фазу цикла и отсутствие таких изменений у женщин с бесплодием. Полученные данные позволяют рассматривать дефицит CD4CD25+CD127 клеток в эндометрии как универсальный биомаркер, ассоциированный с бесплодием иммунного генеза, применимый для различных форм женского бесплодия, как первичного, так и вторичного. Высокая чувствительность и специфичность метода, а также его упрощенность в выполнении могут позволить ему найти применение в гинекологической практике для диагностики иммунологической формы бесплодия у пар с бесплодием неуточненного генеза.
Список литературы
1. Shetty S, Ghosh К. Anti-phospholipid antibodies and other immunological causes of recurrent foetal loss--a review of literature of various therapeutic protocols. Am J Reprod Immunol. - 2009. - Vol.62. - P.19-24.
2. Pandey M.K., Agrawal S. Induction of MLR-Bf and protection of fetal loss: a current double blind randomized trial of paternal lymphocyte immunization for women with recurrent spontaneous abortion. International Immunopharm. - 2004. - Vol.4. - P.289-298.
high
3. Mei S., Tan J., Chen H., Chen Y., Zhang J. Changes of CD4+CD25 regulatory T cells and FOXP3 expression in unexplained recurrent spontaneous abortion patients. Fertil.Steril.2010; 94(6):2244-7.
4. Yin Y., Han X., Shi Q., Zhao Y., He Y. Adoptive transfer of CD4+CD25+ regulatory T cells for prevention and treatment of spontaneous abortion. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2012; 161(2):177-81.
+
+
+
5. Winger E.E., Reed J.L. Foxp3CD25 low circulating CD4T - regulatory cell levels predict miscarriage risk in newly pregnant women with a history of failure. Am. J. Reprod. Immunol. 2011;66(4):320-8.
6. WO 2009077158 (A1) - Use of FKBPL gene to identify a cause of infertility (патент).
7. WO 9955902 (A1) - Diagnostic markers of human female infertility (патент).
8. Шмагель К.В., Черешнев В.А. «Иммунитет беременной женщины». - М.: Медкнига, 2003, стр.225.
9. Патент РФ №.2396566. Способ оценки определения блокирующего эффекта аутологичной сыворотки женщины. Сухих Г.И., Ванько Л.В., Сидельникова В.М. и др. №2009116174/15; заявл. 29.04.2009; опубл. 10.08.2010.
10. Arruvito L., Sanz М., Banham А.Н., Fainboim L. Expansion of CD4+CD25+ and FOXP3+ regulatory T cells during the follicular phase of the menstrual cycle: implications for human reproduction. J. Immunol. 2007; 178:2572-8.