СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ НЕОПЛАЗИЙ ЖЕНСКИХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ
DIAGNOSTIC METHODS FOR FEMALE REPRODUCTIVE ORGAN NEOPLASIAS

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] 1. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к диагностике злокачественных новообразований. Более конкретно, изобретение относится к способу диагностики злокачественных новообразований с учетом статуса метилирования выбранных маркеров.
[0003] 2. ОПИСАНИЕ СВЯЗАННОЙ ОБЛАСТИ
[0004] Злокачественные новообразования женских репродуктивных органов представляют собой неконтролируемый рост аномальных клеток, происходящих из женских репродуктивных органов. Множество типов злокачественных новообразований женских репродуктивных органов включает злокачественные новообразования шейки матки, яичников, эндометрия/матки (далее в настоящем описании обозначаемых как рак эндометрия), влагалища и наружных половых органов, в то время как некоторые редкие злокачественные новообразования женских репродуктивных органов включают гестационную трофобластическую болезнь (GTD) и первичный рак брюшины.
[0005] Рак эндометрия (EC) является основным гинекологическим злокачественным новообразованием в США и шестым по частоте диагностики злокачественным новообразованием у женщин во всем мире. Согласно проекту GLOBOCAN Всемирной организации здравоохранения, в 2012 году частота и смертность при EC составляли приблизительно 310000 и 76000, соответственно, и ожидают более 380000 новых случаев и 93000 случаев гибели от EC в 2020 году.
[0006] Большинство случаев рака эндометрия обнаруживают у женщин, проходящих или прошедших период менопаузы. Однако, в случае тех, у кого не наблюдают каких-либо признаков или симптомов, нет простых и надежных способов тестирования на рак матки. В случае пациентов, у которых наблюдают симптомы или имеющих более высокий риск рака эндометрия, для облегчения диагностики или исключения рака матки можно осуществлять биопсию эндометрия или трансвагинальное ультразвуковое исследование.
[0007] EC можно приблизительно классифицировать на два типа посредством гистопатологической оценки. EC типа I включает хорошо или умеренно дифференцированные (степени 1-2) эндометриоидные аденокарциномы. EC типа II включает серозные, светлоклеточные и плохо дифференцированные (степени 3) формы эндометриоидного типа. Большинство EC типа I диагностируют на ранних стадиях (стадии I или II), и они имеют благоприятный исход, в то время как EC типа II, как правило, диагностируют на поздних стадиях, и они имеют относительно неблагоприятный прогноз. Хотя большинство пациентов с EC эндометриоидного типа диагностируют на ранних стадиях, 15% пациентов с эндометриоидным EC на поздних стадиях имеют плохой 5-летний коэффициент выживаемости, составляющий менее 50% (40-50% для стадии III, 15-20% для стадии IV). Ранняя диагностика остается лучшим способом улучшения исхода. Однако в настоящее время не существует удовлетворительных способов скрининга EC.
[0008] Аномальное маточное кровотечение является наиболее частым симптомом EC, но многие другие нарушения имеют тот же симптом. Даже когда кровотечение происходит у женщин после менопаузы, только 10% его случаев вызвано EC. Выбор идеальной стратегии диагностики зависит от чувствительности, специфичности, точности и затрат. Для исключения используют EC трансвагинальное ультразвуковое исследование (TVU). Однако, пороговое значение при TVU у женщин перед менопаузой с симптомами и женщин, подвергаемых гормонозаместительной терапии, является более низким из-за изменений толщины эндометрия под действием циркулирующих женских стероидных гормонов. В случае образцов эндометрия, получаемых посредством вакуумного выскабливания в амбулаторных условиях, можно достигать более высокой чувствительности и специфичности по сравнению с TVU. Кроме того, частота ошибок при этой инвазивной процедуре может составлять до 54%. В клинических руководствах рекомендуют фракционную дилатацию и выскабливание (D & C) под анестезией, если анализ образца эндометрия является недостаточным или не исключает диагноз. Таким образом, многих пациентов подвергают повторным инвазивным анализам посредством получения образца эндометрия или D & C, что является неудобным, вызывающим стресс и затратным.
[0009] С другой стороны, диагностическая точность гистероскопии может достигать общей чувствительности 86,4% и специфичности 99,2% у женщин до и после менопаузы. Несмотря на это, существует дискуссия вокруг лучшего порогового значения толщины эндометрия, определяемой с использованием TVU, обосновывающей получение образца эндометрия или гистероскопии. Неинвазивными способами детекции наличия или отсутствия EC являются измерения концентраций антигена злокачественной опухоли 125 (CA-125) в сыворотке и в шейке матке и влагалище. Точности при использовании CA-125 в качестве индикатора мешают доброкачественные состояния, такие как аденомиоз, миомы матки и эндометриоз. Для детекции EC также используют цитологический анализ цервикальных соскобов, но коэффициент аномальных результатов составляет от 32,3% до 86,0% в случае EC типа I и от 57,1% до 100% в случае EC типа II.
[0010] В свете изложенного выше, с этой области существует потребность в способах для применения в диагностике опухолей женских репродуктивных органов, в частности, рака эндометрия.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Далее представлена упрощенная сущность изобретения для обеспечения базового понимания читателем. Эту сущность не представляет собой обширный обзор изобретения, и в нем не определены ключевые/критические элементы настоящего изобретения или объем настоящего изобретения. Единственной целью является представление некоторых идей, представленных в настоящем описании, в упрощенной форме в качестве вступления к более подробному описанию, представленному ниже.
[0012] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу оценки того, имеет ли индивидуум рак эндометрия (EC).
[0013] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает следующие стадии:
(a) получения образца из индивидуума;
(b) определения статуса метилирования по меньшей мере одного гена-мишени в образце, где по меньшей мере один ген-мишень является BHLHE22 (SEQ ID NO: 1) или THY1 (SEQ ID NO: 2) или и тем, и другим;
(c) определения того, является ли по меньшей мере один ген-мишень гиперметилированным; и
(d) оценки того, имеет ли индивидуум EC с учетом результатов стадии (c), где гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет EC.
[0014] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения образец является образцом, полученным из индивидуума, предпочтительно - человека, или находящимся в индивидууме, предпочтительно - человеке. Например, образец получают из образцов ткани или клеток эндометрия (например, клеток цервикального соскоба) индивидуума.
[0015] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из следующих дополнительных генов: ADARB2 (SEQ ID NO: 3), CDO1 (SEQ ID NO: 4), CELF4 (SEQ ID NO: 5), CLVS2 (SEQ ID NO: 6), GATA4 (SEQ ID NO: 7), HOXA9 (SEQ ID NO: 8), MTMR7 (SEQ ID NO: 9), NTM (SEQ ID NO: 10), PRKCDBP (SEQ ID NO: 11), TBX5 (SEQ ID NO: 12) и ZNF662 (SEQ ID NO: 13). В этих вариантах осуществления определяют статус метилирования BHLHE22 и/или THY1 и статус метилирования по меньшей мере одного из дополнительных генов, и на стадии (d) анализ осуществляют с учетом статуса гиперметилирования указанных выбранных генов.
[0016] В других вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP и TBX5.
[0017] В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22 и CDO1. В других случаях по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22 и CELF4. Альтернативно, по меньшей мере один ген включает BHLHE22, CDO1 и CELF. В этих случаях на стадии (b) определяют статус метилирования BHLHE22 и одного или обоих из CDO1 и CELF4, и на стадии (d) анализ осуществляют с учетом статуса гиперметилирования BHLHE22 и одного или обоих из CDO1 и CELF4. В необязательных вариантах осуществления настоящего изобретения образец получают из клеток цервикального соскоба индивидуума.
[0018] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения рак эндометрия является раком эндометрия типа I, в то время как в других вариантах осуществления рак эндометрия является раком эндометрия типа II.
[0019] Необязательно, стадию определения статуса метилирования гена, как описано в указанных выше вариантах осуществления настоящего изобретения, можно осуществлять посредством метилирование-специфической полимеразной цепной реакции (MSP), количественной метилирование-специфической полимеразной цепной реакции (qMSP), бисульфитного секвенирования (BS), бисульфитного пиросеквенирования, микрочипов, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), пиросеквенирования, иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP или mDIP) в комбинации с количественной полимеразной цепной реакцией, секвенирования с иммунопреципитацией метилированной ДНК (MeDIP-seq) или нанопорового секвенирования.
[0020] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа того, имеет ли индивидуум карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника.
[0021] В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает следующие стадии:
(a) получения образца из индивидуума;
(b) определения статуса метилирования по меньшей мере одного гена-мишени в образце, где по меньшей мере один ген-мишень выбран из группы, состоящей из ADARB2 (SEQ ID NO: 3), CLVS2 (SEQ ID NO: 6), HOXA9 (SEQ ID NO: 8), MTMR7 (SEQ ID NO: 9) и NTM (SEQ ID NO: 10);
(c) определения того, является ли по меньшей мере один ген-мишень гиперметилированным; и
(d) анализа того, имеет ли индивидуум карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника, с учетом результата, полученного на стадии (c), где гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника.
[0022] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения образец является образцом, полученным из индивидуума, предпочтительно - человека, или находится в индивидууме, предпочтительно - человеке. Например, образец получают из образцов ткани или клеток эндометрия (например, клеток цервикального соскоба) индивидуума.
[0023] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения карцинома женских репродуктивных органов является карциномой эндометрия типа I, карциномой эндометрия типа II, карциномой яичников, карциномой влагалища, карциномой наружных половых органов, гестационной трофобластической болезнью (GTD) и первичным раком брюшины.
[0024] Необязательно, стадию определения статуса метилирования гена, как описано в указанных выше вариантах осуществления настоящего изобретения, можно осуществлять посредством метилирование-специфической полимеразной цепной реакции (MSP), количественной метилирование-специфической полимеразной цепной реакции (qMSP), бисульфитного секвенирования (BS), бисульфитного пиросеквенирования, микрочипов, масс-спектрометрии, денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), пиросеквенирования, иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP или mDIP) в комбинации с количественной полимеразной цепной реакцией, секвенирования с иммунопреципитацией метилированной ДНК (MeDIP-seq) или нанопорового секвенирования.
[0025] В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению биомаркеров, идентифицированных по настоящему изобретению. В частности, биомаркеры можно применять для получения диагностического набора для оценки того, имеет ли индивидуум карциному, ассоциированную с одним или несколькими из этих биомаркеров.
[0026] Как можно отметить, диагностические наборы, содержащие материалы, подходящие для измерения статуса метилирования указанных биомаркеров, также включены в объем настоящего изобретения.
[0027] Многие из сопутствующих признаков и преимуществ настоящего изобретения будут более понятны с учетом следующего подробного описания и сопутствующих чертежей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0028] Настоящее изобретение будет более понятным из следующего подробного описания с учетом сопутствующих чертежей, где:
[0029] Фигура 1 представляет собой корреляционную матрицу (панель A) и тепловую карту (панель B), на которых показаны сигнатуры метилирования генов-кандидатов в тканях согласно общедоступным данным из MBDcap-Seq и Атласа ракового генома (TCGA) в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания;
[0030] На фигуре 2 представлена точечная диаграмма, на которой представлено распределение статуса метилирования BHLHE22, CDO1, CELF4 и ZNF662 (панель A) и параметры указанных четырех генов (панель B) в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания;
[0031] На фигуре 3 приведен уровень метилирования ДНК 15 генов с использованием ткани эндометрия индивидуума для определения рака эндометрия в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания;
[0032] На фигуре 4 приведен уровень метилирования ДНК 1 генов с использованием цервикальных соскобов индивидуума для определения рака эндометрия в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания;
[0033] На фигуре 5 представлены графики, на которых указаны параметры генов-кандидатов с использованием образца из обучающей выборки (панель A) и тестовой выборки (панель B) в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания; и
[0034] На фигуре 6 приведены результаты перекрестного тестирования шести генов-кандидатов в других карциномах толстого кишечника, шейки матки или яичников в соответствии с демонстрационным примером из настоящего описания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0035] Подробное описание, представленное ниже со ссылкой на сопутствующие чертежи, должно служить описанием примеров настоящего изобретения, а не единственных форм, в которых пример можно осуществлять или использовать. В описании приведены функций примера и последовательности стадий для осуществления и использования примера. Однако те же или эквивалентные функции и последовательности можно осуществлять с помощью разных примеров.
[0036] Для удобства здесь собраны конкретные термины, используемые в описании, примерах и формулы изобретения. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают значением, общепринято понятным специалисту в области, к которой относится изобретение.
[0037] Если контекст не указывает на иное, следует понимать, что термины в единственном числе должны включать их формы во множественном числе, и термины во множественном числе должны включать формы в единственном числе. В частности, в рамках изобретения формы в единственном числе включают ссылку на множественное число, если контекст четко не указывает на иное. Кроме того, в рамках изобретения термины "по меньшей мере один" и "один или несколько" обладают одинаковым значением и включают один, два, три или более. Кроме того, в рамках изобретения фразы "по меньшей мере один из A, B и C", "по меньшей мере один из A, B или C" и "по меньшей мере один из A, B и/или C" предназначены для включения только A, только B, только C, A и B вместе, B и C вместе, A и C вместе, а также A, B и C вместе.
[0038] Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, приведенные в описании, являются приблизительными, числовые значения, приведенные в конкретных примерах, представлены настолько точно, насколько это возможно. Однако, любое числовое значение, по существу, содержит конкретные ошибки, неизбежно возникающие из стандартного отклонения при соответствующих измерениях. Кроме того, в рамках изобретения термин "приблизительно", как правило, означает в пределах 10%, 5%, 1%, или 0,5% от указанного значения или диапазона. Альтернативно, термин "приблизительно" означает в пределах приемлемой стандартной ошибки среднего при рассмотрении специалистом в этой области. Кроме как в эксплуатационных/демонстрационных примерах, или если четко не указано иное, все числовые диапазоны, количества, значения и процентные доли, такие как количества материалов, длительность периодов времени, температуры, режим работы, соотношения количеств и т.п., представленные в настоящем описании, следует понимать как модифицированные термином "приблизительно" во всех случаях. Таким образом, если не указано иное, числовые параметры, приведенные в настоящем описании, являются приближениями, которые, при желании, можно варьировать. Как минимум, каждый числовой параметр следует, по меньшей мере, истолковывать в свете количества приведенных значимых знаков и с использованием общепринятых способов округления. В настоящем описании диапазоны можно выражать в виде диапазона от одной конечной точки до другой или диапазона между двумя конечными точками. Все диапазоны, представленные в настоящем описании, включают конечные точки, если не указано иное.
[0039] В рамках изобретения термин "диагностика" относится к идентификации патологического состояния или заболевания, такого как неоплазии различных органов женской репродуктивной системы, включая шейку матки, яичник, эндометрий/матку, влагалище, наружные половые органы, матку и перитонеальную выстилку матки. В некоторых случаях термин "диагностика" также относится к различению злокачественных и доброкачественных опухолей. В некоторых других случаях термин "диагностика" относится к различению злокачественной неоплазии и нормальных тканей.
[0040] На всем протяжении настоящего описания термин "неоплазия" относится к новому и аномальному росту клеток или росту аномальных клеток, воспроизводящихся быстрее нормальных. Неоплазия образует неструктурированную массу (опухоль), которая может являться доброкачественной или злокачественной. Термин "доброкачественный" относится к неоплазии или опухоли, являющейся незлокачественной, например, ее клетки не инвазируют окружающие ткани или не метастазируют в отдаленные участки; в то время как термин "злокачественный" относится к неоплазии или опухоли, являющейся метастазирующей, инвазирует смежную ткань или больше не находится под нормальным контролем роста клеток.
[0041] В рамках изобретения термин "злокачественное новообразование" относится ко всем типам злокачественных новообразований или злокачественной неоплазии или опухоли, обнаруживаемым у животных. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения способы направлены на диагностику одной или нескольких карцином гинекологического происхождения. Термин "карцинома" относится к злокачественной опухоли, происходящей из эпителиальных клеток. Неограничивающие примеры карцином женской репродуктивной системы по вариантам осуществления настоящего изобретения включают рак яичников, рак эндометрия, рак влагалища, рак наружных половых органов и первичный рак брюшины.
[0042] В рамках изобретения термин "метилирование" относится к ковалентному присоединению метильной группы в C5-положении цитозина в CpG-динуклеотидах основной промоторной области гена. Термин "статус метилирования" относится к наличию или отсутствию 5-метил-цитозина (5-mCyt) в одном или множестве CpG динуклеотидов в интересующем гене или последовательности нуклеиновой кислоты. В рамках изобретения термин "уровень метилирования" относится к степени метилирования в одной или нескольких копиях интересующего гена или последовательности нуклеиновой кислоты. Уровень метилирования можно вычислять в виде абсолютного значения метилирования в интересующем гене или последовательности нуклеиновой кислоты. Кроме того, "относительный уровень метилирования" можно определять как количество метилированной ДНК относительно общего количества присутствующей ДНК или как количество метилированных копий интересующего гена или последовательности нуклеиновой кислоты относительно общего количества копий гена или последовательность нуклеиновой кислоты. Кроме того, "уровень метилирования" можно определять как процентную долю метилированных участков CpG в интересующем фрагменте ДНК.
[0043] В рамках изобретения термин "профиль метилирования" относится к набору данных, соответствующих уровню метилирования одного или нескольких генов-мишеней в интересующем образце. В некоторых вариантах осуществления профиль метилирования сравнивают с референсным профилем метилирования, полученным из известного типа образца (например, образца злокачественного или незлокачественного новообразования или образцов на разных стадиях злокачественного новообразования).
[0044] В рамках изобретения термин "дифференциальное метилирование" относится к различию уровня метилирования одного или нескольких генов-мишеней в одном образце или группе по сравнению с уровнем метилирования указанного одного или нескольких генов-мишеней в другом образце или группе. Дифференциальное метилирование можно классифицировать как повышенное метилирование ("гиперметилирование") или сниженное метилирование ("гипометилирование"). В рамках изобретения термин "гиперметилирование" гена-мишени в тестируемом образце относится к повышенному уровню метилирования по меньшей мере на 10%, относительно среднего уровня метилирования гена-мишени в референсном образце. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения повышенный уровень метилирования может составлять по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50%.
[0045] Как можно отметить, все гены или полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем описании, соответственно, включают их варианты, имеющие по меньшей мере 75% идентичности нуклеотидной последовательности в отношении указанных генов или полинуклеотидных последовательностей. Кроме того, последовательности генов-мишеней также включают их нуклеотидную последовательность после бисульфитной конверсии. Таким образом, если четко не указано иное, все гены или полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем описании, следует понимать как модифицированные во всех случаях с помощью фразы "и их нуклеотидная последовательность после бисульфитной конверсии и полинуклеотидная последовательность, имеющая по меньшей мере 75% идентичности нуклеотидной последовательности по отношению к указанному гену или указанной нуклеотидной последовательности после бисульфитной конверсии".
[0046] Термин "процент (%) идентичности нуклеотидной последовательности" в отношении гена или нуклеотидной последовательности, определенных в настоящем описании, определяют как процентную долю нуклеотидных остатков в последовательности-кандидате, являющихся идентичными нуклеотидным остаткам в референсной полинуклеотидной последовательности после выравнивания последовательностей и включения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности последовательности можно осуществлять различными способами, известными специалистам в этой области, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в этой области могут определять подходящие параметры выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Процент идентичности указанной полинуклеотидной последовательности A по отношению к референсной полинуклеотидной последовательности B (которую альтернативно можно обозначать как указанную полинуклеотидную последовательность A, имеющую конкретный % идентичности нуклеотидной последовательности по отношению к референсной полинуклеотидной последовательности B) вычисляют по следующей формуле:
где X является количеством нуклеотидных остатков, подсчитанных как идентичные совпадения с помощью программы для выравнивания последовательностей BLAST при выравнивании A и B, и где Y является общим количеством нуклеотидных остатков в A или B, в зависимости от того, что является более коротким.
[0047] Термины "индивидуум" и "пациент" в настоящем описании используют взаимозаменяемо, и они предназначены для обозначения животного, включая человека, которое можно подвергать способам диагностики по настоящему изобретению. Таким образом, термин "индивидуум" или "пациент" включает любое млекопитающее, которое может получить пользу от способа по настоящему изобретению. Термин "млекопитающее" относится ко всем членам класса Млекопитающие, включая людей, приматов, домашних и сельскохозяйственных животных, таких как кролик, свинья, овца и крупный рогатый слой; а также животных, содержащихся в зоопарках, спортивных или домашних животных; и грызунов, таких как мышь и крыса. Термин "не относящееся к человеку млекопитающее" относится ко всем членам класса Млекопитающие, за исключением человека. В одном из примеров варианта осуществления пациент является человеком.
[0048] Термин "образец", используемый в настоящем описании, включает любые образцы, полученные от пациента. В вариантах осуществления настоящего изобретения образец содержит молекулы ДНК и, можно определять их уровень метилирования. Неограничивающие примеры таких образцов включают кровь, мазки, мокроту, мочу, стул, ликвор, желчь, желудочно-кишечные жидкости, лимфу, костный мозг при остеосаркоме, аспираты органов и биоптаты органов или тканей. Эти образцы можно получать из пациента общепринятыми способами, известными специалисту в этой области. Кроме того, специалистам в этой области также известны способы и реагенты для выделения ДНК из образца, например, выделения с использованием фенола/хлороформа или с помощью коммерческих наборов.
[0049] Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на обнаружении того, что дифференциальное метилирование (в частности, гиперметилирование) одного или нескольких генов-мишеней, как определено ниже, связано с прогрессированием опухоли или ее отсутствием у индивидуума. Таким образом, эти гены-мишени, в отдельности или в комбинации, можно использовать в качестве биомаркеров для прогнозирования риска или предрасположенности индивидуума к неоплазии, определения злокачественного характера неоплазии. Кроме того, профиль метилирования соответствующих генов пациента можно использовать в качестве руководства для индивидуальной адаптации подходящего режима терапии. Например, в случае пациентов с одним или несколькими гиперметилированными генами-мишенями, указанными в настоящем описании, для лечения неоплазии пациентам можно вводить деметилирующие средства или другие эпигенетические лекарственные средства.
[0050] В свете изложенного выше, настоящее изобретение относится к различным способам диагностики, которые будут отдельно описаны ниже. Например, все способы включают определение статуса метилирования или уровня метилирования по меньшей мере одного гена-мишени. Таким образом, стадии, общие для большинства, если не всех, способов по изобретению, сначала описаны в следующем параграфе.
[0051] В различных аспектах и/или вариантах осуществления настоящего изобретения общие стадии способов по настоящему изобретению включают, по меньшей мере, (a) стадию получения образцов, (b) по меньшей мере одну стадию определения статуса метилирования; и (c) по меньшей мере одну стадию определения гиперметилирования.
[0052] На стадии получения образцов, в случае способов, включающих использование живого индивидуума, по меньшей мере, биологический образец получают из индивидуума. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения образец является образцом, полученным из индивидуума, предпочтительно - человека, или находящимся в индивидууме, предпочтительно - человеке, включая ткань, образец ткани или образец клеток (например, образец, полученный посредством биопсии ткани, например, аспирационной биопсии, браш-биопсии, поверхностной биопсии, пункционной биопсии, щипковой биопсии, эксцизионной биопсии, операционной биопсии, инцизионной биопсии, эндоскопической биопсии, клетки цервикального соскоба, клетки соскоба матки или вагинальный лаваж), опухоль, образец опухоли или биологическую жидкость (например, перитонеальную жидкость, кровь (включая плазму), сыворотку, лимфу, спинномозговую жидкость). В конкретных демонстрационных примерах по настоящему изобретению образец получают из ткани яичника, образцов клеток (например, клетки цервикального соскоба) и физиологической жидкости (например, сыворотки и плазмы) индивидуума. Что касается способов, напрямую осуществляемых с использованием существующих биологических образцов, таких как образцы биоптатов ткани, клетки цервикального соскоба и образцы физиологических жидкостей (например, крови или мочи), указанную выше стадию получения пропускают и получают существующий образец для дальнейшего анализа.
[0053] Что касается стадии (b), статус метилирования определяют с использованием qMSP или бисульфитного пиросеквенирования в соответствии с демонстрационными примерами, представленными ниже. Однако, как можно отметить, способ по настоящему изобретению не ограничен способами, описанными выше; вернее, объем описываемого в заявке изобретения включает использование других эквивалентных способов для количественного определения статуса или уровня метилирования конкретного гена. Как можно отметить, указанные выше способы и их эквиваленты также применимы к вариантам осуществления, представленным в настоящем описании ниже, таким образом, способ, подходящий для определения статуса метилирования или уровня метилирования гена для краткости изложения не повторяют в следующих аспектах/вариантах осуществления.
[0054] На стадии определения гиперметилирования определяют наличие или отсутствие гиперметилирования указанного по меньшей мере одного гена-мишени.
[0055] В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа того, имеет ли индивидуум рак эндометрия (EC), включающему стадию получения образца, стадию определения метилирования; и стадию анализа, как описано выше, и стадию анализа (d), на которой наличие или отсутствие EC у индивидуума определяют с учетом результата, полученного на стадии (c). В частности, гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет EC. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отсутствие гиперметилирования по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум не имеет EC. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отсутствие гиперметилирования по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум не имеет неоплазию эндометрия, или неоплазия эндометрия является доброкачественной; например, миома является распространенной доброкачественной неоплазией эндометрия.
[0056] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один ген-мишень является BHLHE22 или THY1 или и тем, и другим.
[0057] В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к BHLHE22 и/или THY1, ген-мишень дополнительно включает по меньшей мере один из ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662.
[0058] В конкретных необязательных вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22 и CDO1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, CDO1 и TBX5. В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, THY1, CDO1 и CLVS2. В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, CDO1 и CELF4. В качестве другого примера, по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22 и CELF4. Альтернативно, по меньшей мере один ген-мишень включает THY1 и CDO1. Альтернативно, по меньшей мере один ген-мишень включает THY1 и CDO1, а также один или оба из CLVS2 и GATA4. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один ген-мишень включает BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP и TBX5.
[0059] В вариантах осуществления, в которых определяют статус метилирования нескольких генов-мишеней, анализ можно осуществлять с учетом наличия или отсутствия гиперметилирования указанных генов-мишеней.
[0060] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения образец получают из клеток цервикального соскоба или образца эндометрия индивидуума.
[0061] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения способ по настоящему изобретению используют для анализа того, имеет ли индивидуум карциному эндометрия на ранней стадии (стадии I или II в соответствии с рекомендациями Международной федерации гинекологии и акушерства). В некоторых необязательных вариантах осуществления образец получают из клеток цервикального соскоба индивидуума, и гиперметилирование BHLHE22 и по меньшей мере одного из CDO1 и CELF4 является показателем того, что индивидуум имеет карциному эндометрия. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения карцинома эндометрия может являться карциномой эндометрия типа I или типа II. По сравнению с общепринятыми способами диагностики, с помощью которых карциному эндометрия которых типа II часто диагностируют на поздней стадии развития злокачественного новообразования (например, стадии 3 или 4), способ по настоящему изобретению обладает существенным преимуществом, заключающимся в получении диагноза до развития злокачественного новообразования в более злокачественную стадию.
[0062] Как можно отметить, биомаркеры, идентифицированные по настоящему изобретению, можно использовать для получения способов диагностики для анализа того, имеет ли индивидуум карциному эндометрия.
[0063] Например, набор может содержать материалы, которые можно использовать для определения уровня метилирования одного или нескольких из указанных выше биомаркеров, таких как, BHLHE22, THY1, ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и ZNF662.
[0064] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу анализа того, имеет ли индивидуум карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника. Способ также включает общие стадии (a), (b) и (c), как описано выше, и стадию анализа (d), на которой наличие карциномы женских репродуктивных органов или карциномы толстого кишечника у индивидуума определяют с учетом результата, полученного на стадии (c). В частности, гиперметилирование по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум имеет карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отсутствие гиперметилирования по меньшей мере одного гена-мишени свидетельствует о том, что индивидуум не имеет неоплазию женских репродуктивных органов или неоплазию толстого кишечника, или неоплазия женских репродуктивных органов или неоплазия толстого кишечника является доброкачественной.
[0065] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один ген-мишень выбран из группы, состоящей из ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7 и NTM.
[0066] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения карцинома женских репродуктивных органов является карциномой эндометрия типа I, карциномой эндометрия типа II, карциномой яичника, карциномой влагалища, карциномой наружных половых органов, гестационной трофобластической болезнью (GTD) и первичным раком брюшины.
[0067] Аналогично, биомаркеры, идентифицированные по настоящему изобретению, можно использовать для получения способов диагностики для анализа того, имеет ли индивидуум карциному женских репродуктивных органов или карциному толстого кишечника.
[0068] Например, набор может содержать материалы, которые можно использовать для определения уровня метилирования одного или нескольких из указанных выше биомаркеров, таких как, ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7 и NTM.
[0069] Следующие примеры представлены для разъяснения конкретных аспектов настоящего изобретения и помощи специалистам в этой области в практическом осуществлении настоящего изобретения. Эти примеры ни в коем случае не следует истолковывать как какое-либо ограничение объема изобретения. Без дальнейших уточнений, полагают, что специалист в этой области с помощью изложенного в настоящем описании может в полной мере использовать настоящее изобретение. Все публикации, процитированные в настоящем описании, включены, таким образом, в него в качестве ссылок в полном объеме.
Материалы и способы
[0070]
[0071] 1. Образцы ткани
[0072] Все образцы ткани собирали в период с октября 2014 года по май 2016 года в Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital, New Taipei, Taiwan. Согласно критериям включения, участниками исследования должны быть женщины возрастом 30-80 лет. Возраст, гистологический тип опухоли, стадия согласно критериям Международной федерации гинекологии и акушерства и степень гистологической дифференцировки узнавали из карт пациентов в случае каждого участника. Исследования осуществляли с одобрения Экспертного совета Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital в соответствии с Хельсинкской декларацией 2000 года. От каждого участника исследования получали информированное согласие.
[0073] Образцы эндометрия получали в ходе хирургического вмешательства, сразу замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до проведения анализа. Патологический диагноз для каждого образца подтверждали с помощью гистологического анализа гинекологами-патологами. Нормальную эпителиальную ткань получали из пациентов с миомой.
later
[0074] Клетки цервикального соскоба получали из пациентов с диагностированной миомой или карциномой эндометрия, и у пациенток не было заболеваний яичников и шейки матки на момент забора образца. Клетки эндоцервикального соскоба получали следующим образом. Новую эндоцервикальную щеточку вставляли в канал шейки матки и осторожно вращали ее 3-5 раз для обеспечения забора образца. Затем щеточку вставляли в центрифужную пробирку (15 мл) содержащую 2 мл RNA (Ambion, Life technologies, USA) и закрывали крышку центрифужной пробирки. Образцы клеток эндоцервикального соскоба хранили при 4°C. После перемешивания на центрифуге типа вортекс в течение 10 секунд образец, содержащий клетки, аликвотировали в три микроцентрифужные пробирки (1 мл на пробирку), которые хранили при -80°C до дальнейшего анализа.
[0075] 2. Анализ и валидация
[0076] В анализируемой когорте для идентификации биомаркеров метилирования использовали общедоступные данные из Атласа ракового генома (TCGA) (включая использование 270 образцов тканей злокачественной опухоли эндометрия и 28 образцов нормальных тканей эндометрия), Em-MethylCap-seq (включая 78 образцов тканей злокачественной опухоли эндометрия и 11 образцов нормальных тканей эндометрия), и данные HCL (включая 10 образцов тканей злокачественной опухоли эндометрия и 10 образцов нормальных тканей эндометрия). Образцы, используемые для верификации биомаркеров метилирования, включали 25 образцов тканей злокачественной опухоли эндометрия, 5 образцов нормальных тканей при миоме, и 15, 10 и 15 цервикальных соскобов, полученных от индивидуумов со злокачественной опухолью эндометрия, миомой и нормальным эндометрием, соответственно.
[0077] Для обучающей выборки, используемой в когорте валидации, использовали образцы цервикальных соскобов, каждый размера 28, полученных от индивидуумов с раком эндометрия, миомой и здоровых индивидуумов. Что касается тестовой выборки для когорты валидации в примере 1, использовали образцы того же размера. Для тестовой выборки, используемой в когорте валидации в примере 2, использовали 50, 40 и 56 образцов клеток цервикального соскоба, соответственно, полученных от индивидуумов со злокачественной опухолью эндометрия, миомой и нормальным эндометрием.
[0078] 3. Полногеномный метиломный анализ ДНК
[0079] 3.1. Анализ метилирования 450K с использованием частиц
[0080] Первый метиломный анализ 298 образцов тканей эндометрия (EC эндометриоидного типа и 28 образцов смежных нормальных тканей) осуществляли с использованием анализа метилирования 450K BeadChip array (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) для идентификации профиля дифференциального метилирования EC. Использовали данные уровня 3 с портала TCGA. Баллы метилирования для каждого CpG представляли в виде β-значения и нормализовали. В образцах карциномы наблюдали≥40% неопластической клеточности. Авторы настоящего изобретения исключали зонды, картированные на половой хромосоме и охватывающие однонуклеотидный полиморфизм (SNP), и фокусировались на остальных 379054 участках CpG, анализируемых в этом исследовании. В этих образцах карциномы наблюдали≥40% неопластической клеточности. Значимо отличающиеся метилированные участки CpG анализировали с использованием критерия Манна-Уитни и P≤0,001. Кроме того, авторы настоящего изобретения фокусировались на участках CpG, локализующихся как можно ближе (±1000 п.н.) к участкам инициации транскрипции (TSS) кодирующих генов. И наконец, авторы настоящего изобретения выбирали гиперметилированных кандидатов с≥5 оставшихся участков CpG в кодирующем гене. Кроме того, выбирали лучшие 5% гиперметилированных отличий от медианных ридов для значений EC минус нормальное значение.
[0081] 3.2. Секвенирование MethylCap
[0082] Метилированную ДНК обогащали с использованием 2 мкг геномной ДНК с помощью набора для обогащения метилированной ДНК MethylMiner methylated DNA Enrichment Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) по инструкциям производителя. В кратком изложении, геномную ДНК обрабатывали ультразвуком до достижения приблизительно 200 п.н., фиксировали с помощью белков MBD и осаждали с использованием 1 M солевого буфера. Обогащенную метилированную ДНК использовали для получения библиотек для секвенирования, следуя стандартным протоколам Illumina (San Diego, CA). Библиотеки MethylCap-seq секвенировали с использованием системы Illumina Genome Analyzer IIx System. Анализ изображений и распознавание оснований осуществляли с использованием стандартной последовательности действий Illumina. Уникальные риды (риды до 36 п.н.) картировали по референсному геному человека (hg18) с помощью алгоритма ELAND с использованием до двух неправильно спаренных пар оснований.
[0083] Уникально картированные риды использовали для дополнительной линейной нормализации и анализа дифференциального метилирования. Уровень метилирования вычисляли посредством сложения количества ридов с использованием следующих уравнений 1 и 2.
(уравнение 1)
N_(рид,i) представляет собой количество нормализованных ридов в i-ом бине; U_(рид,i) представляет собой количество уникально картированных ридов в i-ом бине, и N_U представляет собой количество всех уникально картированных ридов. С помощью "INT" округляют элемент до ближайшего целого числа в сторону минус бесконечности, "^" означает порядковый оператор. Область уровня метилирования представляют в виде среднего значения для нормализованных уникальных ридов. При сравнении групп A и B (G=A или B) средний уровень метилирования (AVGR,G) вычисляли раздельно для двух групп в указанной области R (включающей размер бина m и начинающейся с s-ого бина). Количество образцом представляет собой S_A для группы A и S_B для группы B.
(уравнение 2)
AVG
R,G
R,G
означает средний уровень метилирования в группе G в области R. M является уровнем метилирования в каждом образце в группе G в области R. Статистическую значимость дифференциального метилирования в области R определяли с использованием двухстороннего U критерия Манна-Уитни (P≤0,001). Дифференциально метилированные локусы анализировали посредством сравнения образцов пораженной ткани и контрольных образцов. Анализировали уровень метилирования области размером 2000 п.н., располагающейся на 1000 п.н. выше и ниже TSS кодирующих генов. Авторы настоящего изобретения исключали области TSS на половой хромосоме и в этом исследовании анализировали остальные 23215 областей TSS, среди которых выбирали лучшие 5% гиперметилированных отличий от медианных ридов для значений EC минус нормальное значение.
[0084] В данных с портала TCGA использовали чип для анализа метилирования 450K для анализа образцов ткани, и портал данных содержал наборы данных для 417 образцов тканей эндометрия. Из них для настоящего исследования выбирали 371 случай злокачественного новообразования с≥40% неопластической клеточности. Непараметрический критерий использовали для исследования дифференциального метилирования участков CpG посредством сравнения образцов пораженной ткани и контрольных образцов. Исходно выбирали зонды с P≤0,001 и лучшие 5% высоких β-значений дифференциального метилирования. Затем идентифицировали значимые зонды, локализованные в области, охватывающей участок -1000-+1000 относительно участка инициации транскрипции кодирующих генов. Гиперметилированные гены с по меньшей мере пятью из идентифицированных зондов выбирали в соответствии с критериями выбора авторов настоящего изобретения.
[0085] 3.3. Кластерный анализ профиля метилирования ДНК и выбор кандидатов
[0086] Профили метилирования ДНК получали с использованием способа полного сцепления агломеративной иерархической кластеризации с использованием расстояния городских кварталов в виде функции в MeV4 версии 4.9. В каждой группе выбирали одного-двух кандидатов, реже встречающихся при анализе изменений метилирования при злокачественных новообразованиях и имеющих низкие сигналы при анализе нормального эндометрия у участников исследования без EC.
[0087] 4. Количественная полимеразная цепная реакция для анализа метилирования ДНК
[0088] 4.1. Получение геномной ДНК и бисульфитная конверсия
[0089] Геномную ДНК выделяли из образцов с использованием набора QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). Геномную ДНК (1 мкг) подвергали бисульфитной модификации с использованием набора EZ DNA Methylation Kit (ZYMO RESEARCH, CA, USA) по инструкциям производителя и растворяли в 70 мкл воды, не содержащей нуклеазу. Бисульфитную ДНК использовали в качестве матрицы для анализа метилирования ДНК.
[0090] 4.2. qMSP
[0091] Количественную метилирование-специфичную ПЦР (qMSP) с использованием специфичных зондов и праймеров осуществляли для идентификации относительного уровня метилирования ДНК с использованием в качестве референса неметилированной (COL2A1) тотальной входящей ДНК.
[0092] Продукты ПЦР амплифицировали с использованием LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Indianapolis, IN, USA) и LightCycler 480. 20 мкл реакционной смеси содержали 2 мкл бисульфит-конвертированной ДНК, 250 нМ каждого праймера и 10 мкл мастер-микса. Реакции осуществляли с помощью LightCycler 480 с использованием следующих термических профилей: 95°C в течение 5 минут, 50 циклов 95°C в течение 10 секунд, 60°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 30 секунд и конечная элонгация при 72°C в течение 5 минут. Для каждого гена во всех образцах осуществляли тестирование в двух повторениях. Уровень метилирования ДНК будут оценивать с помощью ΔCp с использованием формулы: (Cp гена) - (Cp COL2A)]. Результаты теста со значениями Cp COL2A >36 определяли как неудачу определения. Праймеры конструировали с помощью программного обеспечения Oligo 7.0 Primer Analysis.
[0093] 5 Статистический анализ
[0094] Для идентификации различий уровня метилирования между двумя категориями использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, и для идентификации различий уровня метилирования между более чем двумя категориями использовали критерий Крускала-Уоллиса.
2
2
P
[0095] Для независимой когорты строили график частоты истинно положительных результатов (т.е. чувствительности) относительно частоты ложноположительных результатов (т.е. 1-специфичность) для получения графика зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов (ROC). Для оценки лучшей точности площадь под кривой (AUC) ROC использовали для идентификации оптимального порогового значения для различения двух групп образцов. Оптимальное пороговое значение вычисляли с использованием способа "closest.topleft" и 200 итераций бутстрепа в пакете pROC на языке R. В осуществляемом способе формула представляет собой минимальную сумму [(1-чувствительность)+(1-специфичность)]. Для оценки OR и 95% CI для описания риска EC, ассоциированного со статусом метилирования каждого гена-кандидата и комбинации генов, использовали логистическую регрессию. Все значимые различия анализировали с использованием двухстороннего <0,05. Указанные выше анализы и построение графиков осуществляли с использованием статистического пакета на языке R (версии 3.1.2) и MedCalc (версии 14.12.0). Парный точный апостериорный критерий Фишера и предполагаемую долю ошибок первого рода 0,01 использовали для оценки статистической мощности с помощью G*Power версии 3.1.9.2.
1
[0096] Пример
Идентификация гиперметилированных генов, ассоциированных с раком эндометрия
[0097]
[0098] В исследуемой когорте новые гиперметилированные гены при раке эндометрия идентифицировали с использованием данных секвенирования MethyCap и анализа метилирования BeadChip для идентификации DMR, локализующихся на±1 т.п.н. от TSS каждого гена. На первой стадии анализа сравнивали уровни метилирования генов в образцах карциномы эндометрия и нормальных образцах из различных наборов данных, таким образом, идентифицируя 180 генов с использованием консенсусной кластеризации паттернов метилирования. После фильтрации с использованием критериев выбора авторов настоящего изобретения для клинической значимости и функционального обогащения выбирали 23 гена (см. панель A, фигуру 1).
[0099] 23 гена-кандидата, идентифицируемых в анализируемой когорте, подвергали дальнейшей верификации, при которой объединенную ДНК из образцов тканей нормального эндометрия (n=15), эндометрия при миоме (n=10) и злокачественные ткани эндометрия при карциноме (n=15) подвергали qMSP, при котором идентифицировали 14 генов. 14 генов-кандидатов подвергали дальнейшей валидации, при которой объединенную ДНК из цервикальных соскобов пациентов со злокачественной карциномой эндометрия (EC, n=56) или миомой (Myo, n=40) и индивидуумов с нормальным эндометрием (Nor, n=50) подвергали бисульфитному пиросеквенированию. Результаты (фигура 2 и таблица 1) свидетельствуют о том, что с помощью указанных выше девяти генов также можно различать индивидуумов с карциномой эндометрия и нормальной тканью эндометрия или тканью эндометрия при миоме при использовании образцов цервикальных соскобов.
Таблица 1
Название гена
Количество положительных результатов
Пороговое значение<sup>a</sup>
Случай
Контроль
Se (%)
Sp (%)
OR<sup>b</sup> (95%CI)
<b>Все стадии EC</b>
<i>BHLHE22</i>
21,9
41/49
6/95
83,7
93,7
76,0 (24,8-233,3)
<i>CDO1</i>
67,5
41/50
6/96
82,0
93,8
68,3 (22,8-204,7)
<i>CELF4</i>
14,0
48/50
19/89
96,0
78,7
88,4 (19,7-397,3)
<i>ZNF662</i>
5034,8
46/50
19/96
92,0
80
46,6 (14,9-145,5)
<i>BHLHE22+CDO1+CELF4</i>
Любые два положительных значения
45/49
4/88
91,8
92,5
236,3 (56,4-989,6)
<b>Ранние стадии EC</b>
<i>BHLHE22+CDO1+CELF4</i>
Любые два положительных значения
34/38
4/88
89,5
95,5
178,5 (42,2-754,9)
Сокращения: Se, чувствительность; Sp, специфичность; OR, отношение рисков. Ранняя стадия включает стадию I и стадию II. <sup>a</sup>Дихотомизация уровней метилирования основана на распределении участников исследования с раком эндометрия и участников исследования без злокачественного новообразования с использованием способа Юдена. <sup>b</sup>OR вычисляют с использованием одномерной логистической регрессии. Точные значения α ≤0,10 и мощность (1-β)>0,99 вычисляли с использованием парного точного апостериорного критерия Фишера.
[0100] В частности, на точечной диаграмме на панели A фигуры 2 показано распределение статуса метилирования BHLHE22, CDO1, CELF4 и ZNF662. Используя отдельные цервикальные соскобы, подтверждали, что статус метилирования ДНК был более высоким в образцах EC, чем образцах нормального эндометрия и миомы. Горизонтальной линией на графике представлены пороговые значения, указанные в таблице 1. Значения P вычисляли с помощью критерия Крускала-Уоллиса.
[0101] Кроме того, как показано на панели B фигуры 2, для всех четырех генов наблюдали исключительную площадь под кривой зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов, при этом их значение AUC близко к 1 (от 0,89 до 0,95), что свидетельствует о получении лучшего кластера.
[0102] Также оценивали характеристики комбинации генов, и результаты, как показано в таблице 1, свидетельствовали о достижении лучшей специфичности с использованием комбинации генов по сравнению с отдельным геном. Более конкретно, при комбинированном тестировании BHLHE22, CELF4 и CDO1 достигали чувствительности 91,8%, специфичности 95,5% и 236,3-кратного повышения риска (95% CI, 56,4-989,6) для любых двух положительных результатов. Эти результаты были схожи с результатами определения EC на более ранних стадиях (чувствительность 89,5%; специфичность 95,5%; OR, 178,5, 95% CI, 42,2-754,9). Статус метилирования генов-кандидатов с использованием цервикальных соскобов некоторых пациентов с раком эндометрия типа II представлен в таблице 2.
Таблица 2
№ участника исследования
Возраст (годы)
Гистология
Стадия
Степень
M-индекс <i>BHLHE22</i>
M-индекс <i>CELF4</i>
M-индекс <i>CDO1</i>
Любые два положительных результата<sup>a</sup>
GYCA-03-2001
57
Ser
1A
G3
2579,2
577,1
1533,6
да
GYCA-03-2002
59
En
G3
2,0
14,8
142,3
да
GYCA-03-2003
64
Ser
G2
153,0
37,7
559,4
да
GYCA-03-2004
54
En
1B
G3
365,2
14,2
320,2
да
GYCA-03-2005
58
En
3A
G3
810,5
106,0
796,6
да
GYCA-03-2006
43
En
3A
G3
13707,8
563,3
3110,0
да
GYCA-03-2007
60
Mu
2
G1
9,0
340,8
1353,7
да
GYCA-03-2008
73
CC
4B
G3
311,4
82,3
1725,4
да
GYCA-03-2009
74
Ser
1A
G3
37,9
6,4
1220,0
да
GYCA-03-2010<sup>b</sup>
45
Ser
1
5,9
10,4
6,4
нет
GYCA-03-2011
68
Ser
2
G3
2044,8
10,8
2102,2
да
GYCA-03-2012
56
Mu
1B
G1
240,1
85,8
172,8
да
GYCA-03-2013
33
Mu
1A
G1
53,4
22,4
12,6
да
GYCA-03-2014
57
Mu
1A
G2
375,5
172,2
217,2
да
Mu, слизистый; CC, светлоклеточный; Ser, серозный; G, степень; M-индекс, индекс метилирования. Стадию определяли по рекомендациям Международной федерации гинекологии и акушерства. <sup>a</sup>Пороговые значения основаны на результатах, вычисленных для эндометриоидного типа. Пороговые значения М-индекса составляли 21,9, 14,0 и 69, 5 для <i>BHLHE22, CELF4</i> и <i>CDO1</i>, соответственно. <sup>b</sup>У пациента диагностировали серозный тип рака эндометрия посредством дилатации и выскабливания в сторонней клинике, но в образцах, полученных посредством гистерэктомии, в клинике, в которой проводили настоящее исследование, обнаруживали только комплексную атипичную гиперплазию.
Пример 2
[0103]
Идентификация гиперметилированных генов, ассоциированных с карциномой эндометрия
[0104]
[0105] В исследуемой когорте новые гиперметилированные гены при раке эндометрия идентифицировали с использованием наборов данных, определенных выше. Идентифицировали области дифференциального метилирования (DMR), локализующиеся на±1 т.п.н. от участка инициации транскрипции (TSS) каждого гена. На первой стадии анализа сравнивали уровни метилирования генов в образцах опухоли и нормальных образцах из наборов данных TCGA, таким образом, идентифицируя 46 генов. Кроме того, сравнивали уровни метилирования генов в образцах опухоли и нормальных образцах из наборов данных TCGA для идентификации генов-кандидатов. Идентифицировали всего 15 генов, неизменно проявляющих высокие уровни метилирования (см. панель B, фигуру 1).
[0106] 15 генов-кандидатов, идентифицируемых в анализируемой когорте, подвергали дальнейшей верификации, при которой объединенную ДНК из образцов тканей нормального эндометрия при миоме (EmN_Myo, n=5) и злокачественные ткани рака эндометрия (EC, n=25) подвергали qMSP. Результаты (фигура 3) свидетельствуют о том, что все 15 генов-кандидатов проявляют значимое гиперметилирование в злокачественных тканях рака эндометрия.
[0107] Гены-кандидаты также подвергали дальнейшей верификации, при которой объединенную ДНК из цервикальных соскобов индивидуумов с нормальными тканями эндометрия (N_Em, n=15) или пациентов со злокачественной опухолью эндометрия (EC, n=15) или миомой (Myo, n=10) подвергали qMSP. Результаты (фигура 4) свидетельствуют о том, что с помощью 11 из 15 генов также можно различать индивидуумов со злокачественной опухолью, нормальными тканями или миомой с использованием образцов цервикальных соскобов. Указанными 11 генами являются ADARB2, BHLHE22, CDO1, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5 и THY1. Необходимо отметить, что хотя для FOXI2 наблюдали дифференциальное метилирование, сигнал был относительно слабым, и таким образом, его исключали из дальнейшего исследования.
[0108] Далее исследовали профили метилирования указанных одиннадцати генов-кандидатов, а также ранее идентифицированного гена CELF4. На фигуре 5 показаны характеристики генов-кандидатов для различения образцов EC и не-EC с использованием площади под кривой зависимости чувствительности от частоты ложноположительных результатов в обучающей выборке (панель A) и тестовой выборке (панель B). Значения P для всех анализов составляли <0,001 в случае сравнения площади, равной 0,5. Пороговые значения помечены незаштрихованным кругом и приведены в таблице 3.
Таблица 3
Название гена
В обучающей выборке
В тестовой выборке
Пороговое значение
Sen
Spe
AUC (95%CI)
Пороговое значение
Sen
Spe
AUC (95%CI)
<i>ADARB2</i>
6,37
78,57
63,64
0,75 (0,64-0,85)
<i>BHLHE22</i>
8,83
78,57
92,86
0,91 (0,84-0,98)
7,69
79,31
88,71
0,83 (0,90-0,97)
<i>CDO1</i>
7,47
82,14
92,86
0,93 (0,88-0,99)
6,97
89,66
88,71
0,89 (0,94-0,99)
<i>CELF4</i>
8,42
78,57
85,71
0,91 (0,85-0,97)
7,40
85,19
82,98
0,90 (0,81-0,96)
<i>CLVS2</i>
6,75
67,86
67,86
0,76 (0,65-0,87)
6,49
88,89
92,00
0,89 (0,95-1,0)
<i>GATA4</i>
4,33
75,00
72,73
0,78 (0,67-0,88)
4,69
74,07
82,00
0,68 (0,79-0,91)
<i>HOXA9</i>
7,19
82,14
76,79
0,88 (0,81-0,96)
<i>MTMR7</i>
4,99
67,86
64,29
0,66 (0,54-0,78)
<i>NTM</i>
4,13
78,57
64,29
0,73 (0,62-0,85)
3,80
68,97
79,03
0,69 (0,80-0,90)
<i>PRKCDBP</i>
7,72
89,29
58,93
0,73 (0,62-0,85)
5,87
68,97
69,35
0,66 (0,76-0,86)
<i>TBX5</i>
3,81
71,43
91,07
0,83 (0,72-0,93)
4,90
65,52
69,35
0,66 (0,77-0,88)
<i>THY1</i>
2,35
75,00
83,64
0,85 (0,76-0,94)
3,66
92,59
90,00
0,89 (0,95-0,99)
Сокращения: Sen, чувствительность; Spe, специфичность; AUC, площадь под кривой зависимости чувствительности от частоты ложно положительных результатов; CI, доверительный интервал. В случае ADARB2, HOXA9 и MTMR7 точность не улучшалась при анализе комбинаций генов в обучающей выборке, таким образом, их исключали при валидации в тестовой выборке.
[0109] Данные, представленные в таблице 3 свидетельствует о том, что в случае шести из тестируемых генов (BHLHE22, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4 и THY1) наблюдали значимую точность (по меньшей мере 80%) при различении индивидуумов с нормальным эндометрием и миомой и индивидуумов с карциномой эндометрия. Кроме того, значения AUC для BHLHE22, CDO1, CELF4, CLVS2 и THY1 находились в диапазоне от 0,83 до 0,9, что свидетельствует о получении лучшего кластера. Гены с лучшей точностью выбирали для последующего анализа, касающегося характеристик комбинаций генов, и результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
Комбинация генов
Пороговое значение RS
Sen
Spe
AUC (95%CI)
<i>BHLHE22+CDO1</i>
-0,88
89,10
89,10
0,95 (0,90-0,98)
CDO1+THY1
-0,34
83,60
94,10
0,95 (0,90-0,98)
<i>BHLHE22+CDO1+TBX5</i>
-0,54
85,50
91,10
0,95 (0,90-0,98)
CDO1+THY1+CLVS2
-0,07
83,64
94,10
0,95 (0,90-0,98)
CDO1+THY1+GATA4
-1,17
90,91
85,15
0,95 (0,90-0,98)
CDO1+THY1+CLVS2+GATA4
-0,11
81,82
96,04
0,95 (0,90-0,98)
<i>BHLHE22+CDO1+</i>THY1+CLVS2
-0,49
87,27
92,08
0,95 (0,90-0,98)
9 генов: <i>BHLHE22+CDO1+ </i>THY1+CLVS2+GATA4+ NTM+PRKCDBP+TBX5+CELF4
-0,18
85,45
96,04
0,96 (0,91-0,98)
Сокращения: RS, степень риска; Sen, чувствительность; Spe, специфичность; AUC, площадь под кривой зависимости чувствительности от частоты ложно положительных результатов; CI, доверительный интервал. Степень риска вычисляли с использованием всех цервикальных соскобов и модели логистической регрессии.
[0110] Данные, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что эти комбинации генов имеют лучшую точность, чем любой отдельный ген при использовании всех цервикальных соскобов (таблица 4, 56 образцов EC, 56 образцов миомы и 56 нормальных образцов).
Пример 3
[0111]
[0112] ПРЕКРЕСТНОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ ПРИ ДРУГИХ КАРЦИНОМАХ ЖЕНСКИХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ и карциномЕ толстого кишечника
[0113] ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7, NTM и PRKCDBP дополнительно исследовали на их применимость в различении аномальных заболеваний женских репродуктивных органов или карциномы толстого кишечника, и результаты представлены на фигуре 6 (каждый символ соответствует данным для объединенной ДНК 5 человек). В образцах ткани толстого кишечника (Co) наблюдали высокое метилирование ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7 и NTMпри раке толстого кишечника (Ca) по сравнению с уровнем метилирования в нормальной ткани толстого кишечника (1N). В случае тканей яичника (Ov), у всех семи генов наблюдали высокий уровень метилирования при раке яичников. Каждый треугольник и кружок соответствуют объединенным 5 равным количествам ДНК образцов.
[0114] Следует понимать, что приведенное выше описание вариантов осуществления представлено исключительно в качестве примера, и что специалисты в этой области могут осуществлять различные модификации. Представленное выше описание, примеры и данные представляют собой полное описание структуры и применения примеров вариантов осуществления изобретения. Хотя различные варианты осуществления изобретения описаны выше с определенной степенью детализации или со ссылкой на один или несколько отдельных вариантов осуществления, специалисты в этой области могут осуществлять многочисленные изменения описанных вариантов осуществления без отклонения от сущности или объема настоящего изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Lai Hung-Cheng
<120> СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ НЕОПЛАЗИЙ ЖЕНСКИХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ
<130> P2947-PCT
<150> US62368182
<151> 2016-07-29
<160> 13
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 3199
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 1
cgtctacgta gtatttctgt ccccggaaga ctggatctca gggaattatt atggaagata       60
ctgctgagcc cctttcatcc tttccaggtg aaaatacaga catttttgtg tcgccctcac      120
ccttccttta tgaaataagg tgcccaactg ttctgatatt accattcaaa aacaggttct      180
gtggcgaacc tcatttgtga atctattaca gagattaata gattatttct cctttttcaa      240
ctaattctca gtggggaaat ttaaccatat ggtaaggaga gaattagaat ttcatcacat      300
tagagcaaaa tgtaatgaaa agagtccaac acctggggcc aactccgaaa gccacaatta      360
aaaggttttt aatgaaacca gagaaaccaa aaattgcata gtcttcagta cttctgccat      420
ataagaaaga gttattggaa ggtgttggga aatattgttt ttacttatgt cataaggatg      480
aaaaccagct gctaaatacc atgtgtaccc agagaccgaa ctcaggagtg agatgaccgc      540
gtgtaccagt gcccatccgg agaggagcac ttgtttttac attctccctt cccgaaccct      600
ccaagaacaa ccgaggctga tccagatgtc cttaaatggc ttccgggtaa ataaatatgc      660
ataaatgcct cacttcgtgt gggagcggat ttgactcctg gtgaagttga ctcttttgaa      720
gcaatcagat tttcatctta aggaaagttt gagaaaccgg tttgtttgtt tgttttcttc      780
ctgtttagga aattgtgtac ttcacaatta ccatcactgt aacagttatt tggagaccac      840
tgcaaaatca ctgccacccc accttaaaaa aaaatgggct gcatgatcac ttgctcttca      900
ttttgctttt ttctttcttt ttttccaatc tgggtaggaa atgggcagtg gcgggtgtgg      960
aaacgaggca gagtgttcgg ggggacgact gctttgctct ctgaccagct gaaaacctag     1020
agtgaatttt gggcaagcca gctgggacac caccttctct cggaaagtcc catccccaaa     1080
tccagaccag tcatcctacg aacaggggtg gagtataatt ctcgcccgga agggtaattt     1140
agcacaagct gagacagcag tggcgaggga agggcagtgg ggggtggggt gcggtgggtg     1200
ggggcgtctg ctttccacag gactcccagg cttcgccgcc gatctacaat ttgctgaagg     1260
agcaaagaac atcctcggct ctaagtaggg cttttagtgt gctcattgat gagtgaaagt     1320
cgccacacat gtcaagctaa aggcagttgt tgggttacta acaggaccca gcgccttgca     1380
aacatatgcg ctaagctgtg tatacagatg gcaggcagaa taatggagca ggcgcctttt     1440
ataaagctct agctgctgcc tgtcttcaga cctgggaaat gaaactattc agacttgcgg     1500
ccagatagcg cctgcgattg tttgttaccg ttttaatcct attaattaaa acgttaacct     1560
gattgggtag aaagcgctgt cccaacaggc gagtcttctt cataataacc tactcagaga     1620
taatgatgta aaagactccc ccgtctgtgg cggcggctgt ttgatgggtc cggaaatctc     1680
ttgaaggtga atccaagcaa gataaacggt gcggagagga ggcgcggggc tgggctcaga     1740
gcggcggcgg cggcggctcc actccctccg cgcccaccct cccaccatgc ggggccgcgg     1800
cccatggtga gccccagcag ccagcaccat cggctggaga cgaagaagaa gaagaagagg     1860
aggcggcgag cgcgggggaa ggcgaaaaag aaaaagaaag aaggggagag ggctcccggc     1920
agcaccagga ccgacgcgcg caccagctcc ggagcccagc tcgcgcgcgt ctgtggggcc     1980
gcctgactcc ggggccgagg cggcggcggc ggcagcgggc gcggcggccc gggctgcgcg     2040
ccggcgcggg accatggagc gcgggatgca cctcggtgca gcggccgccg gcgaggacga     2100
cctcttcctg cacaagagcc tgagcgcctc cacctccaag cgcttggaag cggctttccg     2160
ctccacgccc ccgggcatgg acctgtccct ggcgccgccg cctcgggaac gcccggcgtc     2220
ctcctcctcg tcgcccctgg gctgcttcga gccggctgac cccgaggggg cagggctgct     2280
gttgccgccg cctggaggag gcggcggcgg cagcgcggga agtggcggcg gcggcggcgg     2340
cggggtgggt gtccccgggc tgctagtagg ttcagccggc gttgggggcg accctagcct     2400
aagcagcctg ccggccgggg ccgccctttg cctcaagtac ggcgaaagcg cgagccgggg     2460
ctcggtggcc gagagcagcg gcggcgagca gagccccgac gacgacagcg acggtcgctg     2520
cgagctcgtg ctgcgggccg gagtagccga cccgcgggcc tccccgggag cgggaggtgg     2580
tggcgcgaag gcagccgagg gctgctccaa tgcccacctc cacggcggcg ccagcgtccc     2640
cccggggggc ctgggcggcg gcggcggcgg gggtagcagc agcggtagca gtggcggcgg     2700
tggcggtagc ggtagcggca gcggcggcag cagcagcagc agcagcagca gcagcaagaa     2760
atccaaagag caaaaggcgc tgcggcttaa catcaatgcc cgagagcgcc ggcggatgca     2820
cgacctgaac gacgcgctgg acgagctgcg cgcggtgatc ccctacgcgc acagcccctc     2880
ggtgcgaaag ctctccaaga tcgccacgct gctgctcgcc aagaactaca tcctcatgca     2940
ggcgcaggcc ctggaggaga tgcggcgcct agtcgcctac ctcaaccagg gccaggccat     3000
ctcggctgcc tccctgccca gctcggcggc tgcagcggca gcagctgctg ccctgcaccc     3060
ggcgctcggc gcctacgagc aggcagccgg ctacccgttc agcgccggac tgcccccggc     3120
tgcctcctgc ccggagaagt gcgccctgtt taacagcgtc tcctccagcc tctgcaaaca     3180
gtgcacggag aagccttaa                                                  3199
<210> 2
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggcctcagcc agcagagccc agatgccttc tgcagttaag atccctggac tcagaatcag       60
aaagctgtta agcaggaagg agtgcgctgc catgaagagg cagacagaag ccagagccag      120
tgtgtctgga atgcatcagg tagatgaatg ggaagatggc tgggatggag ttggagggag      180
gagggaagtc agcagccagg ggccaggaca ttcatggcct taaaaagtat cctacaaaca      240
agaagccagg ttagctcacc tatgaagagg gacagtctta ccagatcatg tgttagagtc      300
cccagatcct ggggagcgtg agaaaagtgc agactcagct ggctctagta ctagattaag      360
gaggtcctag gtgggcaagg ccagctgcat ttttcataaa atgccctaga aacctctgca      420
gtttaccaaa gtgaatagct cctttggact taaccatctg caaggctcat tccagttaga      480
gtgttccatc accctaaatg ctgggaaacc aagcgaatct cctcccactt gcaagcttcc      540
aacagtggct tccaacagtg ccactgcagt atcagaaact gcagggaagg tgccagggct      600
gacttccatg aagaaatagg agaacaggca ggcagacatt ggggaggccc acagaatgtc      660
gtgatcagaa ttcataaaga ggctggcagg atacaaatca atcaaataaa cgttagttca      720
aaaaaattca ctacacctgt gagtgagaga aagtcatcag cactgtctct aaaaatgagc      780
ctagggcttc tggtgacatc caatcggtgg gttatcagga gtgccccagg tgatcaggag      840
ttggcctcga ctcagtcctt tttgtgctgt ctcctcctct ttcccagagt tcctctctct      900
cttctcccac taggcaggga tgagcaagag gaatggctca cccttgagag ctggggtcca      960
tagcccaggt cagttctcca gctctcccac ttaccagcca agacaggagg tgaggattga     1020
gatgggatga acccagcagg cggccatggg ttaaaggtcg ccatgaatgt aatgtgccca     1080
gcacagtgcc tgctaaaagg caacactccc ttcctggtct gaagaccaaa caagcagact     1140
gtactcagga aagccagaag aaccttccag ctgtctggac cagaaggtgc cagcccaggg     1200
gctgaagaag acgtaatgcc cagagcaaaa agcgcctgca gccccctgaa gggctgggtg     1260
ctctggaata gatgaggggg cgaaatgggg ctggggacca gggacggaca gggtgggtcc     1320
agcacctgcc tcgcttccga agggctgctc caacactgaa aaacacccaa ccagcttcct     1380
ttcagaaaga ctggaatatt ccaaaacttc tcactggagg ctccggagga ggtgggctcc     1440
agctgaaaag gaaatgtgga ggcgtgggcg ctcccggcct gcatcctgca cctcttacac     1500
tttggttttc ccacagactc ctgaagaata ggtcagaaga aagggttaaa gccttaaaag     1560
gggaacaacc attgcggggc tcagggagga ggataatgtt ctttgggctg ccgcaccctg     1620
atccccgggg tcccgaaccc tcccgtccct ggccaggcct gccagccaca gggtgagggc     1680
ccccttccgc cgcaacctgc cactctcaca ccaatgcggg accgccttct cttccttccc     1740
caccccccac cccaccctgc cgtcctttct cccccaatct ccgcctctga ttggctgagc     1800
ccccggctcc ccgctccccc tctcctccat ccccggtgaa aactgcgggc tccgagctgg     1860
gtgcagcaac cggaggcggc ggcgcgtctg gaggaggctg cagcagcgga agaccccagt     1920
ccaggtggga actggagccg gtgggacctg gggctcgggg accgccgtca ggcgcccatg     1980
caagacttcc caacactagg cttcgggcca cggtccgagg gcgcccaggg aagaagggcg     2040
cagagcttag ggaggggcct gctttccagg caggggcggg agggggatgc ttctgcaggg     2100
caggggccgc gtggcaccct gatgtctttc ggggaaggcg ctcccgggct ttcgcccgct     2160
gggggactgg tgtctggggc tggggcgctg gagaacaggg aggaagggca ccaaggacag     2220
cctgtgggtc tacattccac ccagacgtcc ccaaacccag ctcgcagagg cggggaggag     2280
gacggatgaa actgcgggga gaggatggag gatggcgagc tagagggaat ctgccgggtg     2340
acctcgcggc gggctgggtg cggggcaccg gaggagaagg aagccgcagt gccgcaggcg     2400
gggactgggt ggaaggcggg cggacggggg aggggagagc tggaaaagga tgagagaggg     2460
ggaaggggga ctcatttggg aaaggagagg attggaatac ggaaatggat taaggatgag     2520
gcccgccggg ggcttgagag ggaggaagag cagaccttct ctgggtctgg agccgcctga     2580
ggacacagac cagaggaaat gaatacagac tgcacctccc cagccgctct ccacccctcc     2640
cctggctctt ctaccctctc cagccccaga cccatttctt ccctttcttg ctctggccat     2700
tgctccccct tcccctccta gatcccaagc ccgcacaaca tctcaaacaa gagtcctcga     2760
ttcaaaagcc agatgccgac cccccttcct cctggatctg gctcagggca gcagctccac     2820
cccgggacag agagagcatt gattgtagct gcagccgccg cgggatccta gcctcacccg     2880
tcaaggggct gagcgccagg gaccctgaac tcgtctagtg gtgcgccctg cgcacccggg     2940
cgcactcaac cgaggcaatg ccctgcgcgc tctcgcgggt gcacgcccct tctgtggcct     3000
ctcctgggcg agcactgctc tgcagatagg ctagactacc ggctccgcgt cgcctcgcca     3060
agggttggtt cagccaaggc tgcaaaaaac aaaaaaagac caggcagaca gcctatccag     3120
ggtggctatt gaaactgggc tggaaaactg cagtcccagg aactccagag agctggacat     3180
tgggaagcat ccttggctca catacaatcg gagatcacta tgtctttctc tcctccagga     3240
acacgattag cttgtgtcct atccagatag gaatagatgc tccctatctg ggagcatcct     3300
tagctatggt gaatggtatc tagccatcca ctggggatgg cgagtgactt agggatttgt     3360
gtctcacgta tatgaagcag tcatcgccag atgttggttg tttttcttaa cccccatcat     3420
aacccggtgg gtatgtaaga ttcagagaga ttcattcatt cattcacaat aaatatcttt     3480
ggagtgtatg ctatatgcca gtaatctgca aacggaaacg gttttgagca ttggggattt     3540
tcttctgaac aggaaatggg aagtccctaa atggggagtc tttgtttaac agatacagag     3600
ttttactttg aaagacaaaa agagttccgg agatgggctg catagcaacg tgaatgtatc     3660
cagcactgct gaatatactg aatttaagta ctgaatttaa atggttaaaa tagtaattat     3720
tatgcttttt gtattttacc acgattaaat ttttttttta aatacgaagc ctcagccctc     3780
ataggtctta tattaccata cactatgtta atgtaagaag aggagaaaga gtggtaaagt     3840
tacttaaagt cacccagcta gtaagtgctc catggccaag cgcagaaaca caccgtgact     3900
gggcttgttc tccctccttc cttgctttcc ctgagcagga aagagccagt ggcagtatca     3960
tgttcagtga gatgcaggga cgagaggggg aatggagaga                           4000
<210> 3
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
attctaaaag gaaaacgcag aagccctgtc tttctgaggc ttgtctgcaa catacgctca       60
ttccttccaa attatttgct ggaaaaaatt taataaataa tcatagagta attaacatgt      120
tccagttcct gtctatactg gttgatactg attcaacgag tatgaatgaa cttatgaggt      180
gggtgacgtt gttatcccca gtttacagat gaggaaactg aggcacggtt taacttaccc      240
gaggtcatag cagtagagtt aagatttgaa atcaaatgtc ttactctctc tcatcaatga      300
aaactgagct acgatctatc agctcagcac ataacaacac aggatcatcc taattatttc      360
caatgtcccc cagagtgatt cttttttctt atgataaaaa ttatctggaa atttctaggc      420
acataagcag ctgaaaaggt tgcatgtgag gcaatgaata gcagaaatat ttgtgtgcca      480
tttttatatc aacatgttaa tgtgtgctaa tgaattttag agtggatttt tttaaaaaca      540
tgactattgt aattaaaagc ttatgtgatt taaatacaag atgcaatgat gattaccaga      600
ttctattcct ctttatattt tacataagac ttccagggtt ccataagtat aatcttgaaa      660
cataggacat tcctggaaaa aaaaattgct taaaactatt tcagtgtgca atccacctct      720
ttgtaaatgt tactttcttc catccaaata ttacatttgg caacaaaact ctccgctgag      780
agctttctct tccttttgtg tcattgttcc ctaaataaag caacacatga aattcctgac      840
ggcaaaaatc agactcagat cccaaaacct ctgtctttat gcaagattta tcttttgcat      900
tggaaacggc caaggaatat gaagagggga aagaagaggc aaacagacaa gcatgcaggc      960
tctgaggaat aaatgcccct caggacgctg tctcctgggg aattgcaaac ctcagtccgt     1020
ttctgaggaa gtgcggtctc tgcatttctg aaagaggtat ttccccccct tgacacaagg     1080
agcatggtaa tgaattgact agttaaaaac tgttggttgg aaaaacccgt ccctgtgtct     1140
ttctgagcag ggcgagctga gctgtccgcg aggctgcggc aggaggcctc gtcctcccgg     1200
gcagggtccc tcctggaggc tcccccggtc tctcccagac gcacccgcgc cgcgtccttg     1260
ttccccggga gcagcctccc tccagccgcc ggtcctggga gcttcaccgt ccaaacggga     1320
gctgagtttg caagcggcca ggcggcggtg cggctggtgc tgctgctgat gtcagagcca     1380
gaaagcagtt gtgattggat ctaattagac gctgctgcag caaatagaca agctccctgc     1440
gtgattggct tcaaagtggc tggtgccaaa caactagcag aggcgcaaaa gtagcctccc     1500
tgcgctggga gcccagagca ggaggcagag cccgcgggaa gctcggagca ctcaggacgc     1560
cgcgcgccct tccccgccct ccctgaccag ggagcagctc gctccaggcg cccagccgag     1620
gcccccagcc cagtgggagc aagtcataga gaacaattcg agagacagag agacggagcg     1680
cgctttcctg ctcagtcctg aaaagtgagc cgctcccggg tttgcaacct caagcttcgc     1740
agcagcggcg gcggcggctg ccgggaagga ggcaggtgca ggtgcaggag ggaggcggct     1800
ctgggctccg cgcctgggtc tcggccatgg cctcggtcct ggggagcggc agagggtctg     1860
gagggctgag cagtcaactc aaatgcaagt ccaagaggag gaggaggcgg aggtccaagc     1920
ggaaaggtaa ggaccgcgtg gcgcgccggc ccctgccccc cttcaccccc ggcttctcca     1980
ccccggcctc tcatggggtc tccgggcttg tccgttgtga gcagcttcac tttggggtgc     2040
tggcgggatg gctgctccgt gcagggcgct cgggagttca gatcccgtgg aaatgtctgg     2100
ggcctcctct tgcccagagg ggacagtgag cagccacgct gcgacatgtt tgagggaccc     2160
ggacgaagtg gggcgagggc ggcgaggagc tccccgggga ccccgcgcgt ctccgggccc     2220
cgcagtcccc agtggccggc cgggctggca ctgccttcca ccctccggag gccatctcgt     2280
ctcccagtgc caaaggaatt acccaaaaac gggggaacga gccctcgcgc cagctactcc     2340
catccaaact gtcccggagg aagggatagg cgaagccctg cgatcgcctc tccaaattgg     2400
ctggcagttt ttactcaatg tggtgcccgt cgatttgtaa acattgggtc gtaaagagaa     2460
cacagggctc gtccttggag aaataagcag aaatgaatac aggaaaacag aaagaagcat     2520
catattttgt tagtggtaga aaaaaaccgc aaaccaggaa agcaggaaaa gcagccggct     2580
gacagcggcc actgacaaac tcagctgtgc cttgttactg atattcctgg ggctgggccg     2640
cgctgaagtt agtcaatgct acagcaaggg agggctttca cactggggat tttgcaaaat     2700
tagcaatcgc tccaatatga gagcaatgcc cccagtgcca tcgtagcctg tgtgcatgcc     2760
aggaagaatt aaaagattct tctcatgccg acccttctct cctagaggaa cctgtgttat     2820
tgtcagttcc tagtgagcct gcaggagaaa gttcagttct aatcatgatt tgaaatgtgc     2880
tgattttttt taagtgaggt agaagtataa agaacggttg gaaaaacaca gctagaattg     2940
atcagctttg ccagttgttt gaaagcagga ggcaacgtta ggtgtgtttg gggttgtcca     3000
tctttcctga agaattttca tctttgcatt ggcctaagat aagtttctac cagaccgttt     3060
cctgtgtgcc ctcgaaccgt caccaggtcc tttattgcct cttccaataa tagaaattat     3120
ccagacagtc agcaggcata aatgtcaata gcaaacagtc attcattatg accgaacgtc     3180
aggaccactg ggagggattg gcccccacaa cttcctcaaa aggttttgga gcctttggtt     3240
tcagaaggga ggtgatgttg tggttctcat ttacctctca gctgctaagt gtgcgcttgc     3300
gattcacttt gttgtttgaa attatcattt tgaaacagac ctgttagtgt cctccaaaga     3360
taatgccaac acaaagtggc attgatattg agaaagtcac cggattgaat aatgaatatg     3420
acttttaaaa gaggaaaaag gaagcatcat ctttacactt gaaatgttca catttcccaa     3480
tattttttga ttagtctatt taaatattta gagttgaaga atgtggagta atagttcgca     3540
ataatgcatt ttataaatat aaacaggagg aaagtgttgc ctttctccaa attcacttgc     3600
cttgccagga agcgtcagtc atgctagctt agaaagtatt caatttaggg ggaaaaagga     3660
aatctgggga aagacttcat ttgctataaa cttaacttta gcaattcaaa ataaaactcc     3720
tatagcaaat atttccatac cttggttatt ttgaatatgt caagtccctt aattttcata     3780
gccaaaaatt gaagcgggaa agggcattca ggttttgtac actgatttct gttacgaaga     3840
gatttctggc gtgcgggaga atttcccagg gcacctgccg gcagctatct tgataggaaa     3900
gtcaaatcaa acggctaaag attcaatttt tggggaaacg ttaaccatgt agatgtaact     3960
gatcaaatta aaaggtaaag taaccagcta agagacacat                           4000
<210> 4
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
cgtgaatata ttactttcat aaaaatgtaa aaagaaaaag aggagtcaga gaaagaaaat       60
gaattgtcag aaaaatttag aagttttatc aactgaaatg cagaaaagat aaattgtgct      120
tgcatttcat ttttgttgtt cattccaaac atttatggat tagactagct gaaatgaagt      180
aattaagaga ctcaatagaa aacattgcca agaataaaaa ataatttgag gaaaccatga      240
aaagtttaca ggttactctg tcacaaaata ctttgttaat tcactacccc gcagcaacac      300
acatcaccaa ggctggcttc tggaatgctt tctacttgta gccatttttg aacaataggt      360
gattccgctt ttaacaacac tgttagaata taatgtagcg agttttacca gagatgttta      420
agactacctg gcacaagtaa atttcattgt atacatgtat atacacgagg gagggtgatc      480
atagtctaga aaaaaacagg tcttcagaag tctagaactt taataacctt aaatccaaat      540
tattccctgc gtccatccat aatgagaagg aagaaatcta cacttgcatt tcttccacct      600
ttcacatctt tctcatttaa atcctactgt acttgatttg tgttgttccc aacgtactag      660
gtgctatgca tgacgtagaa acgtgtttcc ttatatgtat gtactagcag gctccttcaa      720
gcacatgcct aaggttgaaa gattcaaata taattatagc ctcttaaatt attgcgtcag      780
agcccgccct atcccctcag aaaaagcccc cttttacacc atcaaatgaa atatcaggtt      840
atttgcactg gatatttttt aaaagaaaat atttgatttt aaaatcaaag agttcttggt      900
tttccatcat ttcactaatt gtcttactag agacccgagt ctcctttgtc aaaatatatt      960
tcagtacgca ttttaaaaaa tatgtgtgtg tgtatactta aatatatata tatataaagt     1020
cttggactta ttttcaccta gcctggggca tatcgtggat agtttcaatc gacaaaacag     1080
gcactctctg gcctaggagt ggaatccatc ctcaattttc gcaggctcct cacaattctc     1140
tatttggaag aagtgtccct ctccttccct tttcttttcc tcctttactc agcgtcagtc     1200
cccgcagcca tctcctccga ccctttttgt ctacgtccca gcgtcgcgaa ccacagcggc     1260
ggaggtggag cggggagagg cgttaggccg ggcggctaaa acgcgccgtt aaagtggggg     1320
agagattgcg cggagcccac gcgatccctg ggacgccgga gacaacgggg ctcttgggaa     1380
ggcgcggagc ccggggaagc cggggatgtg cgcgtgagcc gtgcccgcag ggtctccccg     1440
cctccgccac ctttcttggg tggctctccg cctcgtcctc cctccgaggg ccgttggtac     1500
attcctagtg actccaagcg cttaaaaggg gcccgggagg atgaacccca cagatctgaa     1560
cctgatttgt gtgtgcaccg cgtctccagc gatcccggat ccactgcgct gccaggggcc     1620
tgggggtggg tctcttgctg tctctgcgac gacatcctta cgtttcggca ctctaatgct     1680
gggtttgtgc gtgtgtgtct gcttagcggt ctagcgggct gttaggctcc ctcgccccca     1740
gctccttggc tcgctcagct cctccaccgc agcccagcag tgagacgcgc gcgcagccag     1800
ctccccacga gatggaacag accgaagtgc tgaagccacg gaccctggct gatctgatcc     1860
gcatcctgca ccagctcttt gccggcgatg aggtcaatgt agaggaggtg caggccatca     1920
tggaagccta cgagagcgac cccaccgagt gggcaatgta cgccaagttc gaccagtaca     1980
ggtgagcgcg ctgcagcttc aatgccaggc ggcgcccact cgccccgtct gaggaggaat     2040
ggacgtgggg gacgcagccc aaagtgactg gctcgggaag ctcgggccgc gctgcgtccg     2100
ccgctcgccc cctcgctggc cagccgcggg gctggcacga ctcgcttggg gctccgcggc     2160
cacagcgcag gcggaaggtg gatcctactg gccttgctga cctccggccg ggaacggcgg     2220
acaggcgccg ggaagggagg ccaccgcgcg tctgcgagat tttctgttct cttctctccc     2280
gcaaacccct ctgcttctaa accaccagtc ctcctgcccc tggcctcggg agcaatgccc     2340
acactcccaa gccatcgtta accccgggcg cggagatgcg gagagaccgc actcaggttc     2400
gggccctcct gacaccttaa ggaaccgtct ggccggacta gcagagggtg ctcccagggg     2460
agcactacat cagccatcgg gagaagtgtg tgatgttgaa gaagacaagt cacccgcgtc     2520
agttctccat cactgcgcct tcggtcgcct gcaaccgggc accttatagc aagcattttt     2580
actcatgtaa aatagcgtct tgtggccgtc agctgccact acggaatttc tgctgttccc     2640
tttcccaaac caatttaact aacttccccg actgtgggtt tattcaaatc cactgccaag     2700
tttcgcagat taaatattcg accgtcgttt ttttcagccc ccaaatgatc tgatttatct     2760
tatccttgct tctgacgatc tgtaatgtaa attaaagacc cctacttccc agatgtactt     2820
gagtgaggtg ccctggtaag ctggcttttt tgcagccccg gcttggtgat taagtcgaat     2880
ctctctacca atcctccggg gccagaggta aaatttaatc accccgaagt gtgagaggtt     2940
ctactttttc tgagcagtta gtgcgtcagt ctttgtggtt ttttgggttt agggttagga     3000
gaaaggggta agtgaaagaa aagaataagg aaagaagtaa gtttgttttt cttgggagca     3060
ggttctttta gtcactcttc aacatgtggg atgtttcgta aagttttgtt ggcatgggcg     3120
gtttcaactg tattttagga tttgaaatag aaaaagtgaa gaccactaag gatcccattt     3180
ttcatataca agtgacttga ggaaattcct ttggctccta tcagcttagt tcatggtaga     3240
gcccttctgt agccgtgaaa gctagcagag agtctagctt ttaaattttc ttgcatttgc     3300
tccaggtaat tgaagacttg ttatgggaca ggtactcttc cagacacttg acacatatga     3360
ggaatggcag gcaatgaaga agttgaatga cttgcactag gtcttctatc gatagcggct     3420
ccaggctccc ggggttagca ttgttgttcc agagcctaca ctctaaacca ctgttaaacc     3480
aggacaggtt gtaacagttt ttaatcttta atctttagaa caagtgtatt ttcaaggacc     3540
ttgaactagt ctcgattgac aaactctaaa gcttttgaag tgcaaccagc tgggttgatc     3600
ggtcttttca cagatatctg aggtacagct cattaacata atggatgtag tcccgagggg     3660
gcagttgggg gaagacagga gatgggagag aagtcaattc tacagtattt tttgcattaa     3720
ataggtgcct agcgctgtga aggattctgt tctctgactt tgggagggcc agtgcagaag     3780
aatcaagaca gaatatgctc ccgtgtgggc caggctgtga attctttgaa agaagctgca     3840
gagaagcaac aaagattatc ctaagacttc tggaggaaga attaggatcc ttctgcagga     3900
actcagttta ctgtgaattg aaggttgtgt acacagcttc ttgttaggtc ataaaggcta     3960
caaagtaggg aaaactgagg ctaaaaagca cttactaagt                           4000
<210> 5
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 5
gaggctgccc tgaaaaagca aacatgagag aggacggggt gcaggtaaat atcattaacg       60
tgaaaatctg ctaccccagc caagttcacc accagtattc acccctacag gcggggccgc      120
tcggaccctg ctcccggctc cgcgcctgcc actccctttc ccgcgcagcc gagatgccag      180
ccccagtggg cctggcgggg agtccggcgg ggtccggacc gggcggctcg acccccggtc      240
cccacggcag gaacgactca gcctcgcacc tcgggagctg taggtgccga aaacgaaacc      300
cgcgggggca gcgcacgccg cgcgagtctc ggtccggcgg caacccagat agcgattcag      360
gggctttatt cttttgatgg tgattaaaaa aatatattct atttgaaccc gtaaagcaga      420
cgagggcaaa tcaagccatc ccccgcgctg gctcaccggc caccgcgccc agcgccttcc      480
tccccctccg gcgggcgagc gggcaggggc gcccgactcc taccttcctc ccgccagcca      540
ccgggggacc agccgcgctc tccggggcgg gggaggccgc ccgggacggg gacccccacc      600
ttccgccttc ggaagcgggt tggggcgggg gtcggacccc gagtctctac tccccgtccc      660
tctgcccccc ggcgcggccc gacagctccc agccccatcc tggcaggtgg cttgggtggc      720
ggtagatgcc gggcgggagg aagatgtggg gctgctctgg caggttgggg gtgcgaggag      780
gaaaaaaaaa cagagaaaga cacacacaga gagacaggga gagagcgcgc gcgagagagc      840
tcttgtctat agatttatcc acataatata tatttatgta gctttttttc tctcgacact      900
gatgaatgcg cgctcggatc cccgggcgga ctccctccaa gccggctcgc ttttctagtc      960
taaataaata aataaagcca gatggaagaa aaaagcgccc attccacctc cgccgccgcc     1020
ccgcccgcca tccctgcctt tgcttcgccc gcctggcgcc ctaatagagc atagcttggt     1080
ggataaagcc cccctacata cccacacgaa aataaaaatc actattttta aaatacaaaa     1140
agttgcacct gctgctatta caaaaagaac ccccaaaagg caaagagagg aggccggctg     1200
cccggctcct cacggacacc cgctccccgc ggccgccggg cccggaatct cagcgcctcc     1260
cgaagagcca tgcgcctggc gctatttata gccgggggcc gtctcggact gtaccatcgc     1320
cacggcgcgg ggccgccgac gggggaggcg cggtggccgc cgccccacgc cgccctgccc     1380
ccggccgccg cccgccgtgg cgcgggcccc cacagcgcgc ccattcccgg ccccccgcgc     1440
cctcctccgc gcgcgcacac tcgccacccc cacccctggt ctggctggga acttgaaccg     1500
gtccagcctg tttaaacgga aaggacagag atcctgtctg ttcaatgtaa aaaaaaaaaa     1560
aaaaaaaaaa aaaagaaaaa aagaaaaaaa aaatcagatc agaccgagag agagaggaga     1620
gagggagaga gagagggaga gagagaggga gagagagagg agagggaggg agggagagag     1680
agagggggga gagcagagag agagcgcgag cgcgagcgag cgagagaaga ggagaaagag     1740
agagagcaga gagcgagcgg agagcgaggt gtagagaaac cgagggggag agaacccgag     1800
tgtgtgtatg cgtgtgcgtg tgtgagcgcg agcgagcgag agagaggagc gagagagtgt     1860
gagcgagaaa gaataaaagg aaagaagatt ttctctatgt atataaagat ggccacgtta     1920
gcaaacggac aggctgacaa cgcaagcctc agtaccaacg ggctcggcag cagcccgggc     1980
agtgccgggc acatgaacgg attaagccac agcccgggga acccgtcgac cattcccatg     2040
aaggaccacg atgccatcaa gctgttcatt gggcagatcc cccgcaacct ggatgagaag     2100
gacctcaagc ccctcttcga ggagtttggc aaaatctacg agcttacggt tctgaaggac     2160
aggttcacag gcatgcacaa aggtgagtac acctttccct cccaactttg ccggggagca     2220
ggagcgggct ggcgggccga ccggccggcc ggcgactgac gagcggcgga ctaagcgaga     2280
ggaagcctcg ggcgggcgcg gtggagggag gcgctcgggc agcggagacc agagctgggg     2340
tgcgtgggga gctgttcgct ggggcaagac tgggttttgg gcgaggtgct gataggaacg     2400
atgccatgga gagagcagcg ggcgccgatg aagagaaaga gagaggggat cgaggagacg     2460
gggcttggat ttttgggtac agcgacctga aagatgggga tggggaaggc tgcaccggtc     2520
gagcccagga cgctgagcgg acggactcgc gggctcctgg ccggccgagg accgagggtg     2580
ctgtccatcg ccgtggtgct gaaaatacta aaggaggtgg tctcctcatc ctttgctccg     2640
ggctagagta gcaggagcgc agccgtctaa aagggagaga ggtgacaaat tcaaagagaa     2700
atttttattt aaatgtaaca gtaaactctc cctgtcgagc tgtgtgcctc aataatctga     2760
ttgtggtgtg aatggtggtg tgtgttgggg gtgggggggt tggatgtttg aaggaaccag     2820
tgataaaacc taaggcaaga attagcaagg aaccagccat cccctgggtg gagtgggggg     2880
tctggcaagc ctggatagtc cccttcccag gaaagcgggg ctttgggaaa aaaatatgtg     2940
tgtgcgagat ttgcattttg aaaggtgtac cctaatttat cccaaactca ccatgcagag     3000
agctttatag tacattattt ctcccttgaa gcgatcattg ccagtgagtg cttgggggag     3060
ggggagacag aataatcaaa gaattaaaac acagcaactt tttaggaaag tggtcatggg     3120
aattgtccgc agcctgcctg ttttctcctt gttttattat ctttaaagca gagccccaaa     3180
cgtgttcagt tgtagaatgt gtgtgggtgg ctggtgggtg acgaaattag cccagtgctc     3240
cgcttcctaa cagtaatata taggatgtgc agcgggaatg aatcggtgct ggatctatgt     3300
gggcaagtta aatgctttct gagagagatt gatcgccagg cagggaagga gcacggggct     3360
aaggaagttg taggggatgt gtatggatgt tccgttttta ataaacagta gtgtggagag     3420
ccgccgaaga tgctgttaca gctggtggtt ttaaagatga aaacacacgc acacccaccc     3480
ccacatagag agcagcctca tccttggcca caaatgggct atggacacag ctgatcctcc     3540
agcacattag gtgcagagcg cagagctgtc tggctctcta agcagcagcg attttcacta     3600
tcacaaccac cctctttctc cagccctccc ttcgttcgaa tactaaacag agctccaaac     3660
tcttcatagt tggagtccca gagagcagtt tttattggct ttagtatctt ccagcttgcc     3720
tgctgaggag taaatcttaa agttaatggc atgttgagta acacaaaaac acagcagaat     3780
ggaaatatac tgggtttgtt ggggtggggt gagggtgggg gctgtaatgg agagagaagg     3840
caacctttat ccaatatgga gaaaatgtct gtctgttcaa aagagagatt ggaaaggtgg     3900
aacggggagg cagccttcaa aataatattc gaagaaaaaa agaaaacact ttctttttcc     3960
ccccctccct ctcaagtcaa ccatatcttt gtagtttttc                           4000
<210> 6
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 6
tcacttaaaa tcctagaagg accttatata tagtgcatat atataacaca catatacaca       60
cacttaagtg gtttattttc tgccttcccc atttaaaaca taaattcctt gacaataatg      120
actgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgta atttattgtc ttattcgggt tcctacatta      180
atttgcatta atttaattaa taaatgctct agctctacca tacaaccctt ttccttcttt      240
ctttttatca acaccatcgc catgagaaga gcaaaaacaa gtgtgcctgt attttgaggg      300
ttctcatagt catcaacatt gaaaatgaca agataagaaa tgtcaagata agaaaatgac      360
aaaatttgct tatcttcaag accacctcct atacacagaa tgcagaaaaa tgccccacac      420
ctcgtggaac tcagtaaata ttagttgcat tgaattaact tcaattcaag accccattct      480
acagtttata aagtcaaaag ttgctcttag taacacgctc agtaatatgt gctgtgtttt      540
gaaaatagaa aatatccctt ttcctcaaat ccatagatag tcatattaag cgcaaggact      600
tctgtttatt tataatgatt ctcatataca gatgcataca actgaaggaa ggatggtatg      660
tgtttccaga aatatttgct ttatgatgag atatgagtga agttcctatt tttttcttcc      720
tttgagaatt atgtttttat tatcatttac cctagtgctc attttcatcc tcttcaacag      780
aaatttagca gggagactgg ttgaaaaact attcatataa gttcctccgg aggcttaatc      840
atcagtacat tgtcttggaa ccactctggt gttttctaaa ttaaatatct ctgtctacaa      900
caaatgcgaa aagtacagaa tgtttccgta ctccttctac atcaaaattg cctcctacag      960
gaacgagaaa atgcgtgtca atgtgaatta ccgtctacaa cagctactct ccaggctgat     1020
ctggggtctt gcacacaaag ggcgaagaga ggggcgtggg gaggctggaa agcatggttg     1080
ccccgcctgg cccggcgacg cccgctcagc agcctgctga ggagtgggga cgaagagcag     1140
cctaaactta gggctcggga tatttcgatg ccacccaaat tgccgtccta ccccaacgag     1200
gcagggaaag gagcggagcg cgcgcgcgag ctgagtgagt gcttacgtcg cagcgagatc     1260
tgtgctggga taattagaga ggagttgggc tgagccgagt cctctttcag cagcagcagc     1320
cggagccgcc gccgcagccc ggtggggcaa ccctgactcg gaccgctcgg gagagcccca     1380
ggagaggcca gcgccgcgca gcagccgccc cgctgcgccc acctccccgg ctgctcccgg     1440
agggctcaca aaggcggtgg ccgcccgagt ggccttctcc atccaggcgt tcgcgtcctc     1500
ctccccacct tctctcccga aggcgaaaat ggcagggcca ggcgagaacc tgggacagcg     1560
gtggccctag ccctgcgatc ctcacccctc ctgctaggag aggctgcggg ctgcccgcgg     1620
acgatgtggc cgcggctgct cccgagcgca tcttcggccc gggtccccgc cgccacccct     1680
cttctctgct ccttccatcc cgcccagagg agttgatgcc gctgtcgccg ccgccgccgc     1740
tgctgaagcc gcggctgatg gatgccaggg agtgccgcat tgcttagcga ccccgcctct     1800
gggtttgctg gtaggagcgg ctgctctttc ttctttcttg ctttggggtt ttatagaaaa     1860
gataaggaca tttttatttt attcttcaca acgtcctccc cttctcttcg tttttgaaat     1920
gtgcattccc agagatatcc ccggtcccct ccctccccct cccccctttt ctccaacccc     1980
gcggcaagtc cgtggaaatg aagggctaga ggaaggcaga agttgggggt ggggttgggg     2040
gagcccacgc tggtaccaac gccaccagaa cccctgctgg tgccttatga gatcacggtg     2100
tatctcagag gggtggtggg aaggtgcgct atctgcagag tcttcaccta attggatcac     2160
aataatctta aataaatcac acaaatttgt cttttaaaaa tagcgtcttt gaataagtac     2220
agggagaaat aatctccttt ctcccccctc tttctctctg tctctttttc tttctggcaa     2280
agatgatctc tctccgccct ggagctcagc gctgaagagc taccttatta ttaatcagaa     2340
tttccatcgc cacccctggc aggcgtatcc ttcagcaggg accgcaggaa cattcacagt     2400
gcaggggctg agatgtgcgt gggggttgtt tttgttacat cttggaagag aagagaagag     2460
gacagtacca agatcagaaa cacccgtgct aggtggaatt aggggtgatt tgttaggaaa     2520
gagaaaggac aagaagagga gtgcggagcc cttcaggggt tcacatctct ttaaaggaaa     2580
ggaaagaggg agccaaagta gggtgttgta ttttaggggg cagaggaaga agtttacacc     2640
ccccggcccc cccagctttg ctgggggaaa gcaggagcaa cagggcactt gattggacac     2700
caagattatt aatttcctgt aggggagagg aagcaggcag caggaggtct gggggctgga     2760
gtctggtggt ggcaaggacc aggtttgctt tgggacagtc aacaaggtct tctgagggaa     2820
agctcagaga taggcagaac aatgactcat ttgcaagccg gtctctcccc tgagaccctg     2880
gagaaagctc gcctggagct caatgaaaac ccagacacgc tgcaccagga catccaggag     2940
gtgagggata tggtcatcac caggccggac attggctttc tgcgcacgga tgatgccttc     3000
atcttacgct tcttgcgggc taggaagttt catcactttg aggccttccg cctcctggcg     3060
cagtactttg agtaccggca gcagaacctg gacatgttca aaagctttaa ggccaccgac     3120
cctggcatca agcaggcact gaaggatggc ttccctgggg gcctggccaa tctggaccac     3180
tatggcagga agattctagt cctttttgct gccaattggg atcagagcag gtaaatccta     3240
aatccaaact tgtattctcc ttttactctc ccattttcca gaatttaccc cgagtagtgt     3300
catggttttg tagatttgat atttttgttt atttggcttg gagaaaagag aaacaaacca     3360
ggagatgagt ttttggtggg caccctggga agggaggagg gcttgtattt ttacttttaa     3420
aacttacttc actaacaccc actttctact gcagctttaa ggtgctacct taaccacgtt     3480
attgcacaga gatctaaatc acttaacttg taaataaagc ttctctgtat gtttcacctt     3540
ctgaaaaagt ttattgggct ggataaacca gtaagaaaat ggggacaact tttcctcctt     3600
cttcctaaaa aaattcttaa actagaccca tcatcattgt catcatcatc atcatcatcc     3660
tctctttggt actgacgttt tatcttttaa gcatagcctg gcgttcgacc aaaagcaagt     3720
agttttgttg cttgggaagt tctctgtttg gtgatgtgta gaagaaggaa taatatgatt     3780
tgtgtccctt cagtgaaagg aagagttgca tcctctgtcg ctgagcatgc ctgctgacac     3840
tgaaaatgta cactgactgg tgtatgtgtc ctacacctgc cactaatcta aagaatctgt     3900
ctcctgtctc atgtgatttt tcatcttttg gaaggaagtg gaaaatattc agatgtgtca     3960
gttggtggac tttttgagct catgtgctac ttaatagaga                           4000
<210> 7
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 7
tgtcgccccc agcttccggg atgcaggccc gccggggtct agaggggcgg ctgccgtgcg       60
tccagcctgt gcgcaggcct ttcgccgctc ggcgccccag gcagcctcag tttcctttcc      120
tctgtttgcg ccccagtgaa cctccgcacc tctcattcag ggaagagaat tccccgcgca      180
gccgcgctcg tttcttcctc tgggattttc ctgagaatcc ccaggagttg gccacgatcc      240
catggggggt ttccttctac ccagccccgc gtcctggcct cgtccttaac ccccgggttg      300
ccttcactca ggctgggaat ccacgattga tttcctacta cggaagcggg tggcgttccc      360
agcctgcttt cggagcagca cgggtttcgt gcagggtgtt atcccgaccc cttcccccat      420
ccctctaatc tggcttgaga agcccgtgct ggagagaaaa acgcggcctt aaaaaaaaaa      480
aaaagtttaa ccgaaagcgt gagagccacc cgccggctgt tatctggggc tgaaggctgc      540
ggtaatcgat gggttatttt tacgcggtaa tagggccctg tgattgctct attaaccttt      600
agacctgtct gagggactct ccggctcgca gccccgctgc gctggggcct ccaggctctg      660
acgccgactc ccaactcagg cctgacacat tcccctcccc cataccctgg aagagccccc      720
tccatgaaga agctcccctg gaccgcctgg ctccccagcc cttgccacgt cccttggatt      780
ggtgcagagc cgccgcaggc tgcagaaaaa agggggaaag attagaagag aggaggccac      840
aggagatggg aagtgtcgcc aggaagggat gcagattgca taaatacata aaattgaggc      900
tgaggcctgg gctcccgacc atctccctgg gattttggga aggcaaaagg gaggcttcgg      960
tctctacgct ctgattttag gaggcagtct gggtgtctcc tgaacctcca aggaatccgg     1020
ggctgggagg atccccacta cccctgccca ggaactagca tccagccggg caccccgggt     1080
gacccagtgc cccacacaag atcgagagtt gagcccaaga ggtcaccttc ttctctactg     1140
gccccgcccc tcgcccgccg ctgcgggatg aggaccacag gaaggggggg cggggaggga     1200
gaaagggaac tcattaataa agctgaccct gggcaccaca gcgaacccaa tcgacctccg     1260
gctgggttgc gggtgattcc ccgctccctg gcggtagcac ttgggcattt tccgcggaga     1320
ccccagagcc tggactttgc ctgctggggg agctttccgc acagtcccgc agcctgcgcc     1380
cagcggaggt gtagccgggg ccgcgcaccc ccgccccgcc cttgcacgtg actcccacag     1440
gccagtcagc gccctagggc cgagttgctg ggccggggac ccgagccgcg agctggggac     1500
ttggaggcgg ccggcgcagg ggccgcgaga ggcttcgtcg ccgctgcagc tccgggggct     1560
cccaggggag cgtgcgcgga acctccaggc ccagcaggta gggctttttt cttccctttc     1620
tttgctcctt cccgcggtcc cccaaactcg gagcttctcc gcctttgctt gtctggaggt     1680
agagaggtag ctagtgggag gaaaagagac gtgcgctact cacttcaccg aaattgccca     1740
acccctgctc tgcttttgac tttgccttag caacttcttt aagtcaaagt aagacttggg     1800
ggcaaaacag agaaatattg gaagcgcctt tggattcttt ccgtgtgaac ttgaacgctt     1860
tcaatccctg tccccgtgtg cacattctcc aacccttgtt tgcatatcgc aggccggggc     1920
ctgggtggtg atggtggccg cgtgaagtta ccgggactga cgggcccggg acaggctgca     1980
cggcagctcg cacatggagg gaagtagacg gaggcttgtc gcccaccagc gactccgggg     2040
acgcagggtg gcagtgccag gcagctccgc tgggcctcag gggcccccgg gagccgctct     2100
gaggtgcgga gaggctgctg agtggcggaa ctattcatgc cctttctggc cggcctcctc     2160
gccctcgggg ctggggtcca gggactgaat gctcctctgg aagctcacca ccccacctgc     2220
ccgcgctgct tctacctgaa actggccaag ggcccgagcc cggaccggag ccgtgacttc     2280
cctccgccgg ccacggggct gcccggatcc gccgggttat gtcgcttggc tttgggctca     2340
ggggtcaccg tgggcagagg ggggtgccgg ggtcgcggac tgccaccagg ttgaggaaag     2400
gaggggcctt ttggctgggg aaagagcgtg gtgggggacc cgcggccgat ggaatccctg     2460
gggcagcgcg gcccgcaccg tggaggttgg ggaagcgcct cggggaagtg tttcctgtgt     2520
tcccagaaaa ggaagacaac cgagagcagg tttcaggctt ttaaagaaag cctggggtgt     2580
ggaggtgatg ctccgcacac gtctgtgtct cctcccctgc tgcggccggc ttggttgtgc     2640
cggctagcgt gcgaccgtcc tcctcgctgc aggccgagag cggaggcgta aacccaggcc     2700
agcgaggagt gtcctataaa gggacgggga cttttcggcg cttgcaattc tcccattctg     2760
aaaaatagat cggaagaggg ctattggttg attcttgaaa ggggagcgca tttcctgttg     2820
gcctgcgaat ttggggtgaa ctgggacaag tgatcagaag gagagcaaaa actccccgat     2880
tttggcagcc tcgggagctg ctgggctttc tccgccaact gcaggatcca ggctcaattt     2940
caacaaccag ccagaggcgt tttccaagag cagctaattc cttgtttttc cagaaagtta     3000
tagaggagta ttttctccac cttctgttgt tctagtaatc caactcaggc actatatcag     3060
ccatttgaaa aggcagagaa tgtgataaag acaaatatta gattgatgac attttttgca     3120
tttacctttt aaagtctgca agttactacc tgtgtgtata ctggaagttg gattataaaa     3180
ttctaaatct cctttctttt ccaaagttat gaaagaaaaa aaattacatt atcttgaaga     3240
actgcaggag ttgagtattc cagaaaatgc aatgaaatag gtcagctact tgattttaaa     3300
agtcaaatac tggatctttt attaaggtaa acccataatt ctttaacttt attttcaaag     3360
ggaaaagttg gtgacctcag gtcaattttt aaaaaaatct attctctaac caaacttgct     3420
ggaatgaact atttgccaaa ccaataagtt attgcatatt ttgaaagcaa ataagctttt     3480
aggagttacc atgtgactat ataatacaat acagtactat tccattatta ttactagtga     3540
tgttgcaaaa aatggtgaaa agcattatgt agtgtgtatt aaagattcca tttccagatt     3600
tttacagtaa taaagatgat catttattat agtatataca tttgaggtac tttcttgtat     3660
tatactagaa atctgtagta atagtcaact gttatttaga actttctttt tgcctgttag     3720
gacagtttta taaaaatctg ttataagtgt tttacaaata ttaatttata atcctcactc     3780
ctaagcttca cgatgactct acaaaataag tacctttaat atctgcattt tgcagatgag     3840
gaaactaagg cacagagagg ctaagtaatt tgtctaaagg tgtttattcc gtaagtctca     3900
gagcctggat tcatatatag ttaacattct tgtaaatcta ctattgaaat aaaaaagaaa     3960
actttgtcgg gagtagttgc ctcttcttaa agagagaaat                           4000
<210> 8
<211> 3428
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 8
agtttccttc caattaacgg agtggcggcg accttttaat ttacccccaa cgggtgagaa       60
ataaacttcc ccaacgtggc caggcccagg aatgggactg gagtcgatgc ccttttaccc      120
ctccccgttc taatttccag ccctggcctt gagctgtggc tgcctctctt tgggccttgt      180
acctctccgc cgagtctccg ggccccgtag gtaaccaagg cgaggcccgg agtagcagct      240
ggaaagggag gaaggagccc tgaaaggctc acgcggcccc gggacaggcc acatcggtgc      300
gggcctccca ggttccggag ctgcggggtc tcttaggcga ggctgccttt tcccaaaccg      360
aacttgcctt ccattcatgc cacttgtagt tttttcccca gctgggattc acggagcgca      420
accaggcttg cagcgctcat ggttagagcc tctgaggctg gagcacaggg ctgggtcgcc      480
agccgcctgc gcctgggaat cctgattgcc agctgatgag aaaggcgggc tgggcgcgcg      540
tgtgcgtggg gtcgagggcc ggggaccgag cgcgccgcac aaccaaccag gccctcaaaa      600
ccttcgccct ggtggcggct ggccgctccc tcctggccag ctcctccgtg gggtcctcgt      660
agcaaaggcg aatttaaggg ttgcccgggc gcccctcgct ccaggcgggt agctgtgggg      720
acctacaccc gcggtactcc ctgagcggcc ggtccctgcc tggagtgccc tggtagggcc      780
ggcggcggct ccgtttggga cggatcctgc gttgaatttg acttttcgag ggcggccgcg      840
ggtaaactcg cctctcccgg ggaccgcagg gattatttac agggagctcg ccaaccaaac      900
acaacagtct aacctttcca agtcctcgta aatttttaca gctgggagcc acggcgaggc      960
aaacgaatct gttggtcgtt tccgacttcc cgccagcctg tgtggcttct gaaacaataa     1020
ctccttatga aatatcataa atatagattt aaatacagta gagcgacaat gcgatttggc     1080
tgctttttta tggcttcaat tattgtctaa ttttatgtga ggggctccgc tggccgcact     1140
cgcacgcggg acccgcgcct tcttgatggc gtgattaatt gtgatataaa atagtccgct     1200
taagaagtgt gtgtatgggg ggggagacgg gagagtacag agacaaggct agatttgatc     1260
ttttaatcgt cgttggccac aattaaaaca aaccccatcg tagagcggca cgatcccttt     1320
acataaaaac atatggcttt tgctataaaa attatgactg caaaacatcg gaccattaat     1380
agcgtgcgga gtgatttacg cgttattgtt ctgctggacg ggcacgtgac gcgcacggcc     1440
aatgggggcg cgggcgccgg caacttatta ggtgactgta cttccccccc ggtgccacca     1500
agttgttaca tgaaatctgc agtttcataa tttccgtggg tcgggccggg cgggccaggc     1560
gctgggcacg gtgatggcca ccactggggc cctgggcaac tactacgtgg actcgttcct     1620
gctgggcgcc gacgccgcgg atgagctgag cgttggccgc tatgcgccgg ggaccctggg     1680
ccagcctccc cggcaggcgg cgacgctggc cgagcacccc gacttcagcc cgtgcagctt     1740
ccagtccaag gcgacggtgt ttggcgcctc gtggaaccca gtgcacgcgg cgggcgccaa     1800
cgctgtaccc gctgcggtgt accaccacca tcaccaccac ccctacgtgc acccccaggc     1860
gcccgtggcg gcggcggcgc cggacggcag gtacatgcgc tcctggctgg agcccacgcc     1920
cggtgcgctc tccttcgcgg gcttgccctc cagccggcct tatggcatta aacctgaacc     1980
gctgtcggcc agaaggggtg actgtcccac gcttgacact cacactttgt ccctgactga     2040
ctatgcttgt ggttctcctc cagttgatag agaaaaacaa cccagcgaag gcgccttctc     2100
tgaaaacaat gctgagaatg agagcggcgg agacaagccc cccatcgatc ccagtaagtg     2160
tctcctccct tcaaatccgc cgccgcctcc acgccggcct cccggatctg ctggcccgcc     2220
aggtttctct cgagcctgcc ttcgtcctcg ctggaagcct ctcgagttgg ggccaggagc     2280
cagaagttgg tgtttgggac gcctcagata gggccccaag tctggagagc agtgaagagc     2340
ggcccgcagg gctacgggag aggaggcggc tgctgcagcg agagggggcg gggcgggcac     2400
ttcgggacga gccaagactg gccgcccctc tccttggctg cccaggccca ggaccgagat     2460
actttgggcc gttcttcgaa agcagtgcag cccagagagc cttttgtaca actagattgt     2520
ccgtgagcgg cggcagccag ggcagccgga gctgggacgc tgggggagac ggccgattcc     2580
ttccacttct tgccttcggc cagtggcggc gtaaatcctg ccaagatgag gctgcgggcg     2640
acccgggcca caagggtccc catgacagat tattcaaata agccacagac gtgatcagcg     2700
gccttagggc gccctgacgg cttgcccagc tccgaaggcc ttccaggaag gttaaataag     2760
gagtgggggg cgtagaggga caggttggga aagaaagacg aagtcagtga acgggacaga     2820
ggaatcctaa tcttgctaca gaacacaagg cagcatgctt tccctctgcg tggcaaggag     2880
acctgtttcc aaatttcatt ctatacagcg ttttgagagt gggaggaagg agaaggggga     2940
caagaggaca gagtaggaga aaggaaggtc tcggagggga gggcgagcca aagttttact     3000
gcgtgcaatt ttaagtgact gtctgtgcgt ctgtctgcca gggttccatt gtgtccgagg     3060
cctgactgcc tttcctaacc agttcagcag agttctgcac ttcggccaga gaccccatgc     3120
aggaggctca tttgccccag cgggatgtgc gtcttctgct cctaaaccca gtgtttctct     3180
tccccgcaga taacccagca gccaactggc ttcatgcgcg ctccactcgg aaaaagcggt     3240
gcccctatac aaaacaccag accctggaac tggagaaaga gtttctgttc aacatgtacc     3300
tcaccaggga ccgcaggtac gaggtggctc gactgctcaa cctcaccgag aggcaggtca     3360
agatctggtt ccagaaccgc aggatgaaaa tgaagaaaat caacaaagac cgagcaaaag     3420
acgagtga                                                              3428
<210> 9
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 9
taattacgct gaataggatc gtattgagtt tgtaataatt agcaatacca tccctaagga       60
aacagggttt ggtctcactg ccaaatcaga agtttgcctt gcctcaagag aaatataagt      120
attctggaaa aagtcttgca agtgtttttg ataagaattc aaatctcctc aggccattga      180
atatcacagg attttgggaa aatgcccagt taaaatcaag gttgtatttt aaaattctgt      240
tagcaaaagt atttgcaact gaattatcta tgtgataaaa gttgcataag aagaattctc      300
tagaagacgt ttggtaactt gcaatcaagt agtttaggtc ttgcttatgg ttaggtgtcc      360
ctagagatct ttaaaggcat taccaactcc ctctttaaaa aaatcacaaa cacaaaggta      420
gagacagtgc attattttga ctctcaaatt ccctttccac ttcaacatag tataggctag      480
gctcaattca gcgttaaagt tcagtggctt tatgtgacaa caacaacgaa agtgttcttt      540
tcacttccaa aagaatcagc tgtggctttc cagagtagtt cttctaataa tgtaaactaa      600
tggtaaactt gttctaattg cctcccaaag cagtaggagg atgaaatggt agaagacctg      660
tgaaagaggg atctggaatt ttaaaaataa attcaacacc gtattaatta tttgctggaa      720
ggctgcaatg tgtccaggta ttagataaaa aaacggtaag cagagtctct acggaaaaaa      780
aaaaaaaatc acaatccagc ctgaaagatg agtaagagcg aggaaaaaat tgaacagaac      840
tatgtagaat tctataaaat ttcacttatg gtggagcatt gtactcttag ggctgcaaga      900
aaaaaaaaat ggagggcgtt cttcctctct ttggcttttc ccaagaggcc taacgctaac      960
aatggcacca actactgtta ataccatcaa tagggaaatg gtaccgcata atggatgctt     1020
tgtatctcta tctctcagtt cagttggagc taaataaaga gggcaaatga gcacccaaca     1080
ctgtgccagg ggaaaagtgt cgcctgcaac agtgaagtcg caggtggatg tgagatgcct     1140
gacttaggag cgcgcttacc aaggcgctaa cactgctgct attatttcca cccgcacccc     1200
gagcgctatg ccggccgcgc ctgggatgaa acacacacat tgagcctaca agaccgtcct     1260
gggtctagag tgtctgtggc agccttcttt tctgccccac cctgaaatcc tagctatccc     1320
aggacgccct agaaggaagc ccagggacgg tgtggagcag cctgtactcc ccatctctct     1380
tccaggaggc cacacccaaa acaaggccct ctttgtgtct cggagaacag tggccgtata     1440
gtgctccgcc ggctgcccct gttaagagag agcgagcagc cctcgccccg gcaaccccag     1500
gcagaggcgc gtcgcggcgg cggcgcaggt gggcgcaggc gcggaggtgg gctctctagg     1560
gccgcgcggg agccccgggt ccgcacgccg cgcgcggaac acctgggggc ggagccaaga     1620
ccgcgtcccg cccactcccg ggcgcgaagc cccctccccg cgcccctccc atcgcgccgc     1680
agaggcgcgc aggtgcgtga ggccgcgccc gcccgggacc ctgcagacgt gggccagcca     1740
tggagcacat ccgtacgccc aaggttggtg acaccagcgc gggcggagga gggacgggag     1800
gagatggggg aggaggagga gggatgctga gcgcgcggga ggccgactgc tttgaggggc     1860
accggcggag cctggaccgc gggcgaggga ggagcaggca ttgcctgagc atcccggggt     1920
gcctgcgagc ccggtcgttc tcttgctgcc tcccaggcct agccttagct gctgctgggt     1980
ctgacctctt ggttttgggg gagcgcagtg gacacaaggg tgaacgggag ggaacctcag     2040
ttgtctgcta gtaactgggt gtagatcaac ccttctttct cctggcacga ggctttctct     2100
tttagctgtt ggccgctcag agtagttgaa agggaaataa gcctttcggt gacaggtgca     2160
aggaaaacga gctaaatgca gagggactcc tgcgcttgga agcttgttaa atctagggtg     2220
tcaggcccac ccggctcggc cttcccagtc agcatcctca tcctgagcgt agcagctgca     2280
aggggcctta cacagaacgg ataatcaata ttcattgtag gttgaatgat ggtgtgttct     2340
tgccttttcc agtccgtttt gttcgttaga gaaaaggatg cagcttacgg attcgtcacg     2400
cactgttgtg ttttaacaac accagctttt gctaattaac aaaagcaaat ggtccctgat     2460
cactccagta aattaacatt ggaaacgttg atcgctgtac caaatcttcc tcctcagttg     2520
tactgataat ctaatttaga atgaaaatga tgatcgacgt tactgcatga taaaaaccct     2580
aaacgagtga aagaatatgc ttaaaaaccc tattggctgt ctgttgttac taccaccaca     2640
gctccttgcg tttttgcagg atgaacttcc attcaaaatg taggcccctg acaggtcaaa     2700
gctaggtcag agtggccata gctcaggtgg ttccagggat cccacacatt taagaggggt     2760
gggggcaatt gctttatggc cagcaagaat tgattcctaa attttggaat agttcctgag     2820
tacctttttg taaaagcaga ttaaaatgat ctcatgtcat tggaagaaga aatcttttag     2880
tttgctggag aatgtcagtt ccgacagtaa atttaaattg tattgatttt gcactaggga     2940
attaagttgt cgcttcacaa tcatgaaatt gtaaacttag aagacaatgc tacaaaccac     3000
agaataggtg gctcaaagct ttcagagttt aagtggtact aaataattta ttccagaagg     3060
gtgaatttaa ctcatggact ctgcccttgc caagggcatt cttcctcctt ccatgatgaa     3120
gggagccgtt tgtaaaagtg atagctgttg tggatattga tagcaagaat gatacagtga     3180
catggcagtg gatgccactt tgttagagaa tatgaatttg ggggagtcaa ggccttttct     3240
gttctatata caaagccacc tggtacaaag tcacgtgtga acctgagttg caagcagtgt     3300
tcttactctt aaaattggtg tttatggata ccctctaagc agtgcagtac ttgaagtcag     3360
aaatccttat ttatctggaa atggaaacaa attgggggaa aatggaaaat tgtctgaagt     3420
gttactgaat tgggtgagtc attaacattt gggataaagc tggtgaaaaa aataagaaat     3480
tacagaggtt ggatggatcg gattcattta ttcatttatt ttattctaca agcatttaga     3540
acctttcatg tgccaggctc tgtgttaagt gctggaagcg tccaggaact cacaatctct     3600
aaggggaggc agttgtaaat atgtcagtgt atgatagaga catgtgcaag gtgcagtggg     3660
tagagaggga gactgaagag aggatcagct ctgccctcaa ggtcaaggga agccttctta     3720
gaagagccgt cttaacatgg aaggacttaa ggaggactag gagcattttc aacagtggtc     3780
atgtacttgt ataaatatat attgtaataa ataattacaa ccctaaagaa actgaaaaca     3840
ataacaatgg tcaaagataa atgattcctt gaggttaaat aacatcctcc ttttgtttta     3900
catttttaag ggcaaaatta attttcacag tctaaatgaa aaagagaaca acattactta     3960
cagagcttgc agagttaaat atataattgt tactggtcat                           4000
<210> 10
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 10
agtgattggt actgctcgaa ggttgccaga atgagtattg taccgaagcc cttatggtta       60
tatgactcag ttataatggt tcagtctctt tgataccgga tggctttttg gaagaccatt      120
tttctgttat ttaacagttg ttaacaacaa caacaacaaa aagcttcctg gttgtgtttg      180
atagagtcta ggggaaaaac aaagccactg ttgcctcctc tccatcccca aggagaatgt      240
gggtcagggc tggaggccgg ctctgggaat ccctgagaag ggagcattat taatgtcacc      300
accactgtgc ctgctgagct gctctgtgct tcccccttgc acaagaacca ggcccagcca      360
gggaaaggaa acgcaggcca ttccctcaga gccgaagtta agggagaaat aataatacag      420
gcacaggagg accagcagca gccagagagg agaagtgaca gggaccgagg caaatccagt      480
ctctccccgg gtttcaagaa tttgagaaac acacctctta aagatgaaat cagctgtgcg      540
agagtgtgag gcccaggaaa cctgggagtc tgctgtataa atacagcaag tggctcacac      600
tcatccaccc aagtgagcac ttttgcaggc ccagcatctt ttaatggcga caaaacaaga      660
ataaagaatg taagtgggtg tctgaacttg accaacattt tgatgatgcg atttttccag      720
tttcgcacac taagaggctt ctgtgatttt ggatttgttt tatatatggc agatctctag      780
aatggtagtg ttgagtctct ggggttttga gcagctttgt ggggggctgc tgggcgggtg      840
ctgtactact gaataactat gaggttcttc taaaacatcc tccgaacact ctgagtttac      900
tctgaatgct aatgggatta atctgatcat tttaaaggtg catgtatgca tgctgcaggg      960
tgttcctttc ccagttaatt agtttgtgac ccttattaag atgtctcaag tctgaggctg     1020
attaaggctg catggtaact ttgtcttttt tcctaatttg gaagcgcgta aatggttaaa     1080
ctcctggcct gggctgggct ggtgcacagc ctgggcccgg cgcggcgggg gttaaggtgg     1140
gcgcccgcgc cccgcgcccc gcgccctccc gccgggatga gagcgcagtc cgcgccgcca     1200
gcccgcccgc tcgctccgag gcggcaccgg gagaaagtgg cggtcaggga tggagctgct     1260
gccatgacaa ccccggcggt cggggcccgc gcgcgtcggg gctgctcccg ggaggaaggc     1320
ggcgcggagg ccgggggcgg ccgctgagct tggcgtccgc gcggctccgg tgcgggctgc     1380
gccgcgcctt ccccagcgag ctaccgagct tggggccgcc gcggtccgct cccgccgccc     1440
ggcctctccc tcctcggcca ccgccgcagc ccctgccccg ccgagccccg ccggacagcg     1500
gcggccgcag cgcgcatttg ggctccgagg aagttgaccg aggcggctgc cgcaggatcc     1560
cgggcccgga tcgcacgaag cccgcgcggc cgtctcctcc gcgcgccacc cctgcgcctc     1620
ccgcgagctc cacttcccat ctgctattgt ttccgattgt tttccggtgg cgagcccggc     1680
tccgaaactt acaaagtgtt ggatgtcccc cgttcgaact gagggactgc agaccgcctc     1740
tgggtagctg gatgaagccc accccgtccc cttctggtac caaagtgctt actcctctcc     1800
aaagtgccgt gtctgaactg ccgctgggaa gaagcggctc ctgagacgcg cccacacctt     1860
tcacctgccg cgcgcttccc cctcctcggc caccttcccg gcggaagcag cgaggaggga     1920
gccccctttg gccgtcctcc gtggaaccgg ttttccgagg ctggcaaaag ccgaggctgg     1980
atttggggga ggaatattag actcggagga gtctgcgcgc ttttctcctc cccgcgcctc     2040
ccggtcgccg cgggttcacc gctcagtccc cgcgctcgct ccgcacccca cccacttcct     2100
gtgctcgccc ggggggcgtg tgccgtgcgg ctgccggagt tcggggaagt tgtggctgtc     2160
gagaatgggg gtctgtgggt acctgttcct gccctggaag tgcctcgtgg tcgtgtctct     2220
caggctgctg ttccttgtac ccacaggagt gcccgtgcgc agcggagatg ccaccttccc     2280
caaagctatg gacaacgtga cggtccggca gggggagagc gccaccctca ggtagggagc     2340
tgacattgtt ctgcgaactg atggtttgta tggggtcggg gtaaggggca ggggtgcagg     2400
tgtgtgcact gaggcgtgcc tgggttggcg gagaggtcgc tggttccctg ggctgcacaa     2460
tttatggctg cgctgggggc tctgcccggg aatgtggcag tcgtagggaa aggctcagag     2520
gttctggcgg tgagcttttt cccaaaaact ggcctctgcg gctcaggcac ttgttaaagg     2580
tgaggggtgg ctggaccagg tggtcgccga gattgaggga cttgtgcctg gcactgtctg     2640
tgcctgagcc tggtggccgt ggtgacaggg ggcttggagg ggctccccgc gagcagtctt     2700
ctctgaagtt aatgagcccc aaaggagggg tctggcttgg agtgaatgcc cccactcgcc     2760
catgccatag ggctttgcca gccctggctc ctgcactctg ggagagccgc tgctttgtcc     2820
tgggcctgac tgtgcccggg ctttcctggg gtgccttcat gccgtgagct ggtgggcaga     2880
cagagatgct ttctcctgtc tgaacgtggc tttctgaggc ccaagtcatg gagtctgatt     2940
tgtccgtgga aaatggcatt tactgtagtg aactgtgttc tgttcctgct ctccaccaaa     3000
acggtacatg caaaactcgt ctactgaaga gaaactaggt ttcagtgttg ggttgggtcc     3060
tgattggctt ctggggttaa ggcttacagg cactggggga ggagaagaag aagaatcttg     3120
gttatgcttt gtgtaaggta gaatgattct atctccctga ttaccttgcc tgcagaaacg     3180
ctaactgaat ttccagtgtt gataaaccac acctctcata tgcgggcaaa acacttaatg     3240
attgcgatgg gaaattttat tctctgggat tttataagag aataagcatg aggtggacgt     3300
taagaaggtt catgggaacg atttccctgc ctctccttgg tttagtctgc cctcctaaat     3360
aaagttttcc aaactaagcg acagaactaa ccacaaggca acatggcaat attcctgtcc     3420
tttgcacatg aagatttctg gaaagataac cctggtgctg gtgtctactg ttttgcccct     3480
ctgatgactt cttctaggat tgggttgttt tggactgtat acttaaggca atatctatag     3540
gatagaaaat ggtgaagagg aggcaatgtc aatacagagc tgagttatca ggacattgcc     3600
aaaggaagtg tgtaatttag ggacccgtgc agggctacaa gcatccagtg atcctttgtc     3660
taggcaaagc ttaacctcat ggctctggtg aactcctagt tatttgttgg ctcacgagac     3720
ccacctcttc cactcttctg agcaaaaata aagcaacttc cttcccccac tcagaaatga     3780
ttgtgtatct gctttaaaaa tggatttcag gggagttaca aatatgcagt gatttcagac     3840
tacttaaata aaaaaccaaa aataaatgtc tagagcagta ataatcaagg aaattttctt     3900
gttcaagaaa tgcttgttct ctggatgccc tctttgtccc tagtccttgg ctgcaaggag     3960
ggcctcccag ggacagagac attctgaatg gggaacattt                           4000
<210> 11
<211> 2848
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 11
tttctggcat tagctgccca cgtctgtggc acttcaggcc catgtaacta tttccagagt      60
gacacaagtt tcttccacag ttgtcaacaa gtggccctca caggttcagt gagaagagga     120
agagggagag agatcatcag gattaatgga ttacttgcat ttgtgagacg gtttgccaag     180
tattgctaca aacaaggcac gggattttct tttttctttt cttttttttt tgagatggag     240
tcttgctctg tcctccaggc tgtagtgcag tggagcaatc ttggtttact gcattctctg     300
cctcccaggt tcaaacgatt cttctgcctc agccctcccg agtagctggg attacaggcg     360
tgtgtcacaa cgccctgcta atttttgtat ttttagtaga gacggggttt tgccatgttg     420
cccaggctgg tctggaactc cctgcctcac gtgatcctcc cccctcggcc tcccaaagtg     480
gtgggattac aagcatgagc caccgcgccc ggctaaggca tgggatgttt cgaactgctg     540
acattagaaa ttcacaatcc acatcattaa ctggatcctc catgcccact ctctccctct     600
ctgcagcagc aatttcaaat ctttactctc cgcagttcca cagaacacaa gaaacaaaca     660
aacaagcaaa aaaagtcagg caggagccca agtaacctct atcaaagcaa agaccagtgc     720
ctagtctaac gcttttaagg attttaaaag aggtgaaggt gtcctgctta tcctccaagc     780
ttgggtgctg gggccggggc ggctgagatt taccagtgaa acccaaagaa agagagggca     840
gaaaactaga gaaaagaaac cagataatgc tacccaagag gacgaaataa agaagcagga     900
aacgaagcct gaggctaaac cctggagatg actattagga aaacaccaga ggatgccccg     960
cccgccagcc cacaatgagc agcctgtcca agtcacaaag cggggcctcg ggccttgaca    1020
gttcgcgatc tgtaagcaga atgttccagg gcctccctgt cgcctgcatc cagcctgggg    1080
gcaatcttca ctggtgtggg aggccgaaag tggacggcga cggaggcccc tctggttatc    1140
tctttgccgt gccaacacag tctctgcgcc cactaagatg catgaaataa aaatttccgt    1200
gactcgccct ttgcagtgga gaactgaaac aggcacacca gggaattgga gcggaggagg    1260
gtaactcaaa ctcagagtga gagggtttgc agggggccga tttggggcca acaggcttcc    1320
cagcaggccc ccggcgcggg acagcggaag gcgaaacgct ttcaagagac cccgctgcca    1380
acatccccac gccctcgcgc cctcccgccg ccccagaagg ccaactccgc ctgcctgagt    1440
cacagctgga gctggggagg agccagggaa aggaggcccc tgaccgtagt gcggccagca    1500
gttgcaggca gacggagcag agcggtcagg gatcatgagg gagagtgcgt tggagcgggg    1560
gcctgtgccc gaggcgccgg cggggggtcc cgtgcacgcc gtgacggtgg tgaccctgct    1620
ggagaagctg gcctccatgc tggagactct gcgggagcgg cagggaggcc tggctcgaag    1680
gcagggaggc ctggcagggt ccgtgcgccg catccagagc ggcctgggcg ctctgagtcg    1740
cagccacgac accaccagca acaccttggc gcagctgctg gccaaggcgg agcgcgtgag    1800
ctcgcacgcc aacgccgccc aagagcgcgc ggtgcgccgc gcagcccagg tgcagcggct    1860
ggaggccaac cacgggctgc tggtggcgcg cgggaagctc cacgttctgc tcttcaaggt    1920
cagtgacctc aaacggtccc caatccgagg cctttgccgg cctgtgggcc accagctggg    1980
ggctccccgc ttccatccac ctaccacacc cacattcctg acccctcccg ccgtctgttg    2040
ctgtggaaca gactcacaga gccgcaccca cttcccaaga cccagcccca tccctccctc    2100
tcacgcctga gccccgcctg gccaatccaa gcccgcccag ctctagctca ggccacgtcc    2160
gcagaatttg gtctgagtcc cagccaatcc ctaaaataac ggtggttgaa agggcattcc    2220
gtgactgcgg gcactatcct cttctcgccc ctcaccaggc ctcacctact ttacagcgtt    2280
ttgcagttcg cacgcagctt tccctcccct taccttccca cgcctgcctt tccccccaga    2340
ctctggctgc ggaggtaaaa ggtttccctt gtgtaattaa ggagtgagtt tcgggctgct    2400
gggggtaagg agctgccagg atcagtgctg tgtccgtcac atgcaggagg agggtgaagt    2460
cccagccagc gctttccaga aggcaccaga gcccttgggc ccggcggacc agtccgagct    2520
gggcccagag cagctggagg ccgaagttgg agagagctcg gacgaggagc cggtggagtc    2580
cagggcccag cggctgcggc gcaccggatt gcagaaggta cagagcctcc gaagggccct    2640
ttcgggccgg aaaggccctg cagcgccacc gcccaccccg gtcaagccgc ctcgccttgg    2700
gcctggccgg agcgctgaag cccagccgga agcccagcct gcgctggagc ccacgctgga    2760
gccagagcct ccgcaggaca ccgaggaaga tcccgggaga cctggggctg ccgaagaagc    2820
tctgctccaa atggagagtg tagcctga                                       2848
<210> 12
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 12
cctggcaaga atggattctc tcgaaaggtt tgaaaatccc tattttgctt ggtggcccag       60
accatctgtg ctcaatgagc taagcaaatc tggctgggct attacctggg agagtccaga      120
tttttcctct ctggaggggc ctgaagatta tttatgggaa ttaattttat ccccaaatct      180
ctgagaactt aaagggattg ggaaggtctt tctggatttc cctttccctc tactggagat      240
gtagcggttc agccttcttc cgatgccatg tttgtttttc gtgtcttcgg cctagggtcg      300
ccttgccagc aagcctaaag gcctccaagc tgacttggag ggtgagggtg ttttcacaaa      360
taaatacatc gcctgggcaa agggaaaata tctgtttgca aacaaacctg gaaggtggag      420
tgagcaccat agcaaaggag ggctggcttt ctccccggtt gccccacatt cagggttgga      480
gattctccac tttggcattt tgcagcaatg gcctggcctg ggattttagc agagcagtca      540
cagagggtta cacagctgct gacctcgggg catttctcct ccctccatcc ctttctccag      600
accttgactt gcaggcccaa gtctcttatc agaaccctag aaaaatcagt atgatggggg      660
tacaggaggt aaggatggga aacagaacag gactcctgac atttactcca agcaccaata      720
ttcggtgtcc caatctgggt ctgctcagac tgagacctac tgactgtgtt tgtgctttta      780
ttgacctctt caactcaccc taaaaaaaaa aaatacatct cagagaggga aagggcaagg      840
agaggagacc agtggagatg aaaaccctag ccagtcccca gtgactgttt gattatttta      900
ataaaactgg gcactgcctt gtgtacacct ggagcagggg acgtctggtg gccccactgg      960
gtggggggtg agggcccgca gcgatttctt agcatctttg atctcggccc ccatcccaat     1020
gcaccttcac cctgccttca ccccagagtc gttgagagta ggggtgatga gtagggggtg     1080
gaggggagat gtcaggaagg cgagcgccgg ccaggcgggg tcaggcagct ctccttctcg     1140
aggtcagcgt tggagagaat gtctgcaagg ctgcggaggc ccgcggtgtg tttgtgtgtg     1200
tgcgtccaga ctcggttctc tgcaccgcca gcgtcactga gattacttcc cgattagaag     1260
ccgaccgcgt ttgaaatgat ttgtgcagga gtttttgcag ccaccgcttg ctcagagaag     1320
cagagatgga tggaggttgg gaaaggggta gagaggaggg agttattgca ggtctgtgtt     1380
gagagtcgta ttgtgatttg agtgttcggg aaatctagtg gaaatttggg gtggggggaa     1440
gggaggacgg gagggtggga gggagagaga agggggaggg cgacagagtg cagtgggagc     1500
tagttggata ggcgatttca gtactttgtg agcatcgagg caacccaacg tcactgtgct     1560
cagctgagtt ggcttgtatt tcagagagag agagagaggg agagagagtg agagagactg     1620
actcttacct cgaatccggg aactttaatc ctgaaagctg cgctcagaaa ggacttcgac     1680
cattcactgg gcttccaact ttccctccct gggggtgtaa aggaggagcg gggcactgag     1740
attatatggt tgccggtgct cttggaggct attttgtgtt ctttggcgct tgccaactgg     1800
gaagtattta gggagagcaa gcgcacagca gaggaggtgt gtgttggagg tgggcagtcg     1860
ccgcggaggc tccagcggta ggtgcgccct agtaggcagc agtagccgct attctgggta     1920
agcagtaaac cccgcataaa ccccggagcc accatgcctg ctcccccgcc tcaccgccgg     1980
cttccctgct aggagcagca gaggatgtgg tgaatgcacc ggcttcaccg aacgaggtaa     2040
ccgtcccggc agatggcccg ggaggctcag gagggagctc gtcggccgag tcggctgggg     2100
cggcgggaat ggcggattcc agcccggctt tgcattctgc agagcacagc ttgcagagat     2160
tttgcgcggc tcggagctcc ccggcaaatg gagtctggga ggccgccgcg gctggcggag     2220
cggcattgag gtttgcagaa gcacggcctg gttctgtcaa accgcatctt gttcgcctcc     2280
gccagcccag agctccccgg gaccctggcg agggcgcggg gtaggattct ccccgcggcc     2340
ggcagtgaat gggagcgcgt gtaggggcgc cagccctgct ttcttttgtt gtgagtaggc     2400
agcggggctc cagtcgccgc ctccctgaag ccccgagaac gaggcgaaga aagctgcttg     2460
caagtcaggc ctcagaagct gtccttctcc tcggccccat ttctagatct ctggccacag     2520
caggtcaggg tgggatctgg ccgcttgctt aagcagctgc tgaggttttg ggggaccatc     2580
gcttgtgccc gcttcccaaa gtcttcccgt tctaggggga attcctactt gcgtatagaa     2640
gagattggaa ggagatcaga gagcaggaga caggctcatc gggcttgaac agctctgcgg     2700
cagttatttt gtgtgttcta agctcatacg cctgcaaacc cgggccgttc tatgcattgc     2760
ggggacccgg gctgcagatt caatgtctcc agcctaggac ttatccgaga atgattttgt     2820
cctcgccaat cctgagcctg agcctgcagt tttagcaggc caggcctggc tgaagttcag     2880
agaaacccct ttcggcctgg tcactccaca aaatgcccgc catcccccgc ccggcatcag     2940
agcgctggtg gcgggcaccc agtgacgagc cttcctcgga acggctgcac ggtgactttc     3000
ttcatctagt cttctgtttg gctacttttt atcttttaac gaatcttact taaggttggg     3060
ataaagaaaa ggatgtttaa ttttaaagga cttttaatgt taaggcctgt aactggtaaa     3120
aggtgtatat gaattctctt ttgaacctag tctcaatctg cacaaccttc cccttctgtg     3180
tttttctttt tgcaagaggc gggttatttc acacatttct gcctgctgca gaaaactatt     3240
cctcttgtga ggtttaataa aaagagtttc gacggcatct tgtaatttgg cgaagaaaga     3300
aattctctaa aggacactgg gtttttgttt tgttttgttt ttggttccta cccagtggct     3360
tccaaaaata cccacgcctt atctttattg gctcttccag aagtccagac aaatttgacg     3420
ggcagcttgc ttatcacgga gagcctgcgc aggggagatg cgggcctcac cttctccggg     3480
tctgacgcgg gtcttttgca agaagttgtg cctgcttata aagtaatagt aatactacta     3540
ggaatactag taacagtaat aattctaggg ccttctgcag tcaccttcgg ctgggaacgg     3600
aggtgctggt agctggaaac tgggggccaa actgctccct cctgtcacta gaattgtgct     3660
ctccaacctt tctctcgttc tctctctgtc ctccccaccc ccatctcccc ctgcttcttg     3720
tcctcagagc agaaccttgc gcgggcacag ggccctgggc gcaccatggc cgacgcagac     3780
gagggctttg gcctggcgca cacgcctctg gagcctgacg caaaagacct gccctgcgat     3840
tcgaaacccg agagcgcgct cggggccccc agcaagtccc cgtcgtcccc gcaggccgcc     3900
ttcacccagc aggtaaggag acctcgcgct tcgggtccct ttgcagagat caaagtcaga     3960
gtctggcttt cctgctcggc ttctcttgcg gggacagaac                           4000
<210> 13
<211> 4000
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 13
gagaaagcca aaaatttccc cctaccaatt acataagatt ccctgcttct agttagcccg       60
cctgtagttt ccccatgcca gcaacttcca ataagggaat acctgaagcc attccttttt      120
tccactgtga agctttcccc actcttctgc ctgactttca gtctgctgaa tgcaagtgat      180
gagggctgac tctcttgtca tatatagcaa gctctgaata atagtctttg ttctcatttg      240
aataatcttt attttcacac ttcttaaaaa atttaatttc ctggcatgtt gcataatgtt      300
aggtaagcca ttttctctct ttgggcctta ctttcttcaa ctgaaaaact ggttcaacat      360
ttattcattc ttttattccg taagccaaaa ataaaattca aagccctctg accatatgaa      420
tggatctctc ctcttggcta agggcattcc aaagttaacg tgaaaaactg gttcaggcca      480
taatgggaag gaggagttgg acatggctca ttatgctccc ctaccttttg aaattcagga      540
ccagctgacc agcattaaca tcaacacaga ccttaagact gatagaacag cctctttaag      600
tctcacagac tatccggtag tgtgataatg atgagaaaca tttgcagtct attctctgaa      660
gcctgctaca ggctccatct gcatgataaa actttggtct ccacaagccc ttatcttaac      720
tgagacatcc ctttctattg attctaagtc tttatacaat aacttaactc tttcaaccaa      780
ttgccactca gaaaatcttt gaatccacct atgtcctgaa agcctcctct tccagttgtc      840
ccacctttcc ataccgaacc aacgtacatc ttacatgtat taattgatgt cttatgtctt      900
cctaaaatgt gtaaaaccaa gttgtagccc gaccacgttg ggcacatgtt ctcaggatct      960
cctggggctg tggcacgggc catggtcact catatttggc tcaggataaa tcccttcaaa     1020
tattttacag tttgactttt cgtggacaat tctacaaata ttccttggca gttaaagaaa     1080
taactcccca ggaggtgcta gacatcgggc gcatgttaga ggcacaaaga tgagaatgtt     1140
aaaagacata aaatacaggt ctgctctggg aatgcaaaaa ctggtaaaag gagagataaa     1200
agagcaggtg cagtctagtg aagtacccgc tacctcctat cagcaaatat ctgtccacct     1260
agggtgcagc gagctggaga ggaaggggtg gcctagagcg caggggaagg attcctcccc     1320
agccgcctgc acccctaccc cggtagcggt ccctgggatc gtccgtgtct ccaggagaac     1380
cggaccgctc tcccctccct ccccgagcga gaaaggagga ccacagagat gcggcgccct     1440
ccgccgtcct agagcaaccg gagcggcccg agccccggcc tcccggatgc tggggcctgg     1500
cgggtgtgga gcacggggag tcgggcgtgg ggcgggcagg gagtggagtc ggggtcttac     1560
tccggtggct gcagggcgca gggtagccgt gtcaggcctg cccaggtgca gagcgctctt     1620
ccgcgacccc aacagcctct ggtccggtct ggcgcgccct cgctttccca gagggcgacc     1680
tgggctatgg cggccgtggc gctggcgagc gggacacgcc tcggccttgt cctcgagctg     1740
ctcccgggac agcccgcgct gccccgggcg cgccgggtga gtgcggggcc ggagcctgga     1800
agcagtcttg gccctgccct gggttctagg cccggagacg gggtggtgcg gcggctggga     1860
aatgggggta caacccagag tgaggggcct cgagggacag gcagcacagc ggagtcgaca     1920
cccctggacc tgagcctcaa ggagagcaga cgtgcagcgg cacggggttg agccgactgc     1980
tggggcagag cgcacagagt gctgtcgggg gcgatgaatg gccagaattt cagagctgcc     2040
tttacagagc tggttatgtt tgagctgggt attaggttga aaaggaattt gcaatgcagg     2100
agcaggaagg aagaactgga tattcaggca agagtagccg caggtgcaag gacacagaac     2160
agggtgagga aagagtttgg tttcccaatg caatggtgag aggatcggag atgagagtgg     2220
tggtggctga tgatcctggc caggaaagct gggtctgtga gtagtgaatg gaattgtctg     2280
tagtgcagag gaatgtggac tctattaggc agacaaagtt gagccagcca aagccttgga     2340
gccctggagt gctggataaa tagctgtgga gactttctag tgcgcaagga ctgaagtgca     2400
gtggaccaga atgggctcct ccacagtgtg gagactgaga ccctgaagga ggcagtggct     2460
gagaattacg ggaagtccca acggctggag gtcagcagta tttgtttctt aagaggatga     2520
gagaaagaag gtgcaggagc tgagactcct agagatatag aaaatgggga catggagatt     2580
gggacgtggg taagcaagtg aggtgggatc tttgtgagag tgttgcgggt ggtgggggtg     2640
cagggagtaa agtcacaacg aggatctgcc ctgttgagta cagtgttcag agcaacctga     2700
atgttctgag gagccctagc tgcctctgtg gctggtggca gtgactgggg aggacaaagg     2760
aggaagagtc ctatacaggg gcagcaggga tggcaggaat ggggacggaa ggcagtgtgg     2820
cataacaggc aagagccaga gtcaaacagg cctgggttct gtctcagttc tggaactttg     2880
ggggaagtta atccctccga gtctcagttt cctcttctaa aaaacggatc tgatagtagg     2940
ctatgagaca taacaaagaa tatatgtcaa gtgcttggca caggcttaat aaatgatagt     3000
tgttatcaag ggtgggtgac ctctgaagga ggacacattg tggagagagg atgggaccta     3060
gagcacagat gtggtttggg gtataaggat gaaacaagaa aacttttgca gactcatgaa     3120
aaagaggaga aaatgtttgc tgaaataaag atgaagagac atgagaaaat tgatggctga     3180
tgccttgtct ctttgtacat aggaggcaaa aatcttctgc tgatagagtt cctgtagaca     3240
ttcagaatcc agaatcccca caggcacccc cacagtacct tttgatgccc tgtctcccct     3300
tcctcttggc ctggtcctgg ggttgtccta gggcatttaa acacatgttg tttcaggagt     3360
cagtgacctt cgaggatgtg gccgtctact tctctgagaa cgaatggatc ggcctgggcc     3420
ctgctcagag agccctgtac agggatgtga tgctggagaa ttatggggct gtggcttccc     3480
tgggtaaggg tctctccctt tgggccctgc ctccaccctt gagagtttgc tggctccttt     3540
tttctcaaag gctcaggagt tgttgataac cctcagctca atggcagctt caggctcttg     3600
gatttttaat gacctaacct cagcagccgt tggaaagtag gaagtcctgg tatcagtttg     3660
ggccttatac aggacttcct tgctccagag tgagaggtgc caaaccccta cccttgtgtt     3720
gtgggtatag tgagaagaga gcaaattcat ggtgctccac tgagccttca gttccctccc     3780
ctctcggttt gcaagatcca gcctaattcc aagcatcctc atgaggatgt ctgaacttga     3840
gagctctaag agggagagga caggtaagaa ttgaggactc aattcctcaa tgagtgaaat     3900
catccatttg ctgactcaaa cagttactga gtcgtctgtc aacttcctga cctttgtaag     3960
tctcctggcc cctctcttgt cctttcccct ggaattcctt                           4000
<---