СПОСОБ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ
METHOD OF EMBRYO CULTURED CELL VIABILITY EVALUATION

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к трансплантологии и может быть использовано при оценке жизнеспособности культивируемого клеточного материала.
6
Известен способ оценки жизнеспособности культивируемых клеток in vitro путем проведения теста «на исключение красителя» и подсчета абсолютного количества клеток в 1 мкл. Сущность известного способа заключается в добавлении водного раствора красителя - трипановый синий - в суспензию культивируемых клеток. Через 1-5 минут после смешивания суспензии с красителем в камере Фукса-Розенталя подсчитывают число неокрашенных клеток. Авторы рекомендуют подсчет клеток проводить при их концентрации 0,5-2×10 кл/мл (Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Р.Фрешни. - М.:. Мир, 1989. С.116).
К недостаткам данного способа следует отнести его низкую точность, так как оценку жизнеспособности культивируемых клеток проводят по целостности их мембран, а не по функциональной активности клеток.
Кроме этого, для проведения суправитальной окраски трипановым синим необходимо снять клетки с культивации, что приводит к их потере и, следовательно, к необходимости дополнительной закладки клеточного материала.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ оценки жизнеспособности культивируемых гепатоцитов путем оценки их альбуминсинтезирующей функции (Лечение печеночной недостаточности методами трансплантации и экстракопорального подключения печени и других тканей (биологические и клинические аспекты). Под ред. акад. РАМН В.И.Шумакова, проф. Н.А.Онищенко, с.24).
Сущность известного способа заключается в том, что в качестве оценочного критерия жизнеспособности клеток используют показатель их функциональной активности - альбуминсинтезирующую функцию с последующим определением альбумина в среде культивации.
К недостаткам известного способа оценки жизнеспособности культивируемых гепатоцитов следует отнести недостаточную точность, так как функционально активные гепатоциты синтезируют и выделяют альбумин в среду культивирования, а в то же время альбумин является необходимым компонентом среды для культивирования клеток. Следовательно, сложно отделить количество синтезированного альбумина от внесенного.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа оценки жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени в среде культивации.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности оценки за счет установления максимальной готовности клеток к трансплантации без снятия их с культивирования.
Технический результат заявляемого способа достигается тем, что оценку жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени проводят по определению продуктов их жизнедеятельности в среде культивирования.
Отличие заявляемого технического решения заключается в том, что определяют в динамике содержание регуляторного пептида HGF в среде культивирования, по которому и судят о пролиферативной активности культивируемых клеток.
При достижении наибольшей концентрации регуляторного пептида HGF в среде культивирования жизнеспособность эмбриональных клеток печени оценивают высокой и считают максимальной готовность клеток к трансплантации.
Определение содержания регуляторного пептида HGF в динамике дает возможность установить состояние клеточной культуры и выявить пик пролиферативной активности.
Проведенный сопоставительный анализ заявляемого способа и прототипа показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».
Заявленный способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата - повышение точности оценки за счет установления максимальной готовности клеток к трансплантации без снятия их с культивирования.
Авторами заявляемого способа установлено, что определение содержания регуляторного пептида HGF в среде культивирования позволяет оценить жизнеспособность клеток в процессе роста, т.е. без снятия клеток с культивирования можно установить высокую готовность клеток к трансплантации.
При изменении условий культивирования возможно замедление процессов пролиферативной активности культивируемых клеток, что требует удлинения сроков культивирования клеток. Предлагаемое определение регуляторного пептида HGF в среде культивирования в динамике позволяет независимо от календарного срока культивирования выявить максимум пролиферативной активности эмбриональных клеток печени и, тем самым, обеспечить оптимальную пригодность клеточного материала к трансплантации.
Исследованиями авторов заявляемого способа установлено, что содержание регуляторного пептида HGF 46,8 нг/мл и выше соответствует высокой жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени.
Авторам заявляемого способа неизвестно использование приема определения содержания регуляторного пептида HGF в среде культивирования в известных технических решениях, а также неизвестен прием определения пролиферативной активности - маркера готовности клеток к трансплантации, по содержанию регуляторного пептида HGF в среде культивации.
При анализе известных способов оценки жизнеспособности клеток печени в культуре в них было выявлено отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков заявляемого способа на достижение технического результата, следовательно, предлагаемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Способ оценки жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в здравоохранении. Осуществление его возможностей подтверждено описанными в заявке приемами и средствами. Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».
Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Из флакона, в котором культивируют эмбриональные клетки печени, забирают 0,5 мл среды культивирования для определения содержания регуляторного пептида HGF. Определение HGF проводят в динамике (один раз в сутки в течение всего срока культивирования) методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием анализатора Stat Fax-2000 (Awareness tehnology INC USA) и набора для определения HGF (HGF ELISA KitBiosource, Бельгия) в сыворотке, в супернатанте и среде клеточных культур, буферных растворах. При выявлении максимальной концентрации HGF устанавливают высокую готовность клеток к трансплантации.
Сущность предлагаемого способа поясняется примером конкретного выполнения.
Для сравнения оценку жизнеспособности эмбриональных клеток печени проводили тремя способами: по способу-аналогу - окраска трипановым синим, по способу-прототипу - по содержанию альбумина в среде культивирования и по предлагаемому способу - по количеству регуляторного пептида HGF в среде культивирования. Для каждого способа были проведены исследования in vitro на 38 образцах клеточной взвеси, приготовленной из эмбриональной печени свиньи. Во всех случаях максимальный срок культивирования составил 144 часа.
6
6
При подсчете окрашенных и неокрашенных клеток в камере Фукса-Розенталя по способу-аналогу число жизнеспособных клеток составило 98,5+1,2%. Для оценки пролиферативной активности клеток рассчитывали прирост клеточной массы в процессе культивирования. Прирост клеточной массы в процессе культивирования к 5 суткам составил 135×10 против 40×10клеток, засеянных во флакон. Пролиферативную активность культивируемых эмбриональных клеток печени оценивали по митотическому индексу (см. таблицу).
Митотический индекс (МИ) культуры эмбриональных клеток печени
МИ
24 часа
48 часов
72 часа
96 часов
120 часов
144 часа
Индекс пролиферативной активности
0,01 (0,01-0,01) (n=6)
0,12 (0,09-0,2) (n=6)
0,26 (0,1-0,3) (n=6)
0,39 (0,3-0,5) (n=6)
0,65 (0,6-0,7) (n=6)
0,36 (0,1-0,4) (n=6)
Примечание. Значимость различий определена по сравнению с МИ на 1 сутки.
При использовании способа-прототипа определяли уровень альбумина в среде культивирования на анализаторе «Синхрон-5» (Beckman, США) с использованием стандартного набора реактивов фирмы Beckman. Авторами установлено: уровень альбумина в среде культивирования был неизменным в динамике наблюдения, так, в первые сутки культивирования уровень альбумина составил 8 (6,5-9) г/л, на 5-е сутки - 8,7 (6,2-10) г/л. Из полученных данных следует, что невозможно оценить жизнеспособность культивируемых клеток, так как содержание альбумина в среде культивирования практически не меняется.
При оценке жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени по предлагаемому способу было выявлено, что содержание регуляторного пептида HGF менялось в динамике исследования:
среда после центрифугирования клеток (супернатант) - 0,66 (0,47-1,02) нг/мл;
среда культивирования через 2-е суток - 14,3 (13-15,6) нг/мл;
среда культивирования через 5 суток - 46,8 (38,4-50) нг/мл;
среда культивирования через 6 суток - 31,2 (26,8-34) нг/мл.
Из приведенных данных следует, что на 5-е сутки культивирования содержание регуляторного пептида HGF было максимальным. Выявлено достоверное увеличение количества регуляторного пептида HGF на 5-е сутки до 46,8 (38,4-50,0) нг/мл (р=0,003) против 14,3 (13-15,6) нг/мл на 2-е сутки.
Для доказательства связи уровня HGF и показателя митотического индекса, характеризующего пролиферативную активность культивируемых клеток, был проведен корреляционный анализ Кендала. Выявлена положительная корреляционная связь: коэффициент корреляции Кендала составил tb=1,0, p=0,042. Это служит доказательством того, что содержание регуляторного пептида HGF в среде культивации свидетельствует об уровне пролиферативной активности и не требует расчета МИ.
Таким образом, предложенный способ оценки жизнеспособности культивируемых клеток печени позволяет точно установить сроки максимальной готовности их к трансплантации. Способ также позволяет стандартизировать клетки по содержанию HGF в среде культивации.