Молекулярная онкология

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Л.З. Болиева1, И.И. Басыева1, Ф.К. Джиоев1, А.В. Сергеев2, М.Я. Шашкина2 Влияние каскатола

на химически индуцированный канцерогенез

1 Северо-Осетинская государственная медицинская академия, Владикавказ

2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Цель исследования. Оценить антиканцерогенную активность антиоксидантного препарата каскатол (КСТ).

Материалы и методы. Использовали драже КСТ (состав: бета-каротин, витамины Е и С), производства ОАО «ЭДАС»; крысы линии Вистар. Опухоли молочной железы (ОМЖ) индуцировали ме-тилнитрозомочевиной (МНМ) по 2,5 мг на крысу; опухоли пищевода - N-метил-Ы бензилнитрозамином (МБН) по 0,5 мг/кг в 10% растворе этанола с питьевой водой в течение 8 нед; пищевода и печени - N-нитрозодиэтиламином (НДЭА) по 100 мг/л питьевой воды в течение 4 мес; п/к сарком - диметилбензантраценом (ДМБА) по

2 мг на крысу п/к в оливковом масле. КСТ добавляли в корм по 2-4 драже на крысу 4 раза в нед в течение 8 нед. Продолжительность опытов 37-38 нед. Эффективность КСТ оценивали по количеству животных с опухолями в сравнении с контролем, множественности опухолей на 1 крысу, латентному периоду появления 1 опухоли, продолжительности жизни животных, темпов роста новообразований, степени малигнизации. Микроскопическую оценку неопластических изменений проводили по 3-бальной шкале условных единиц.

Результаты. Прием КСТ способствовал увеличению латентного периода возникновения ОМЖ на 30 % и продолжительности жизни животных на 35 % (162 суток против 125 в контроле). Частота появления новообразований пищевода, индуцированных МБН и НДЭА снижалась соответственно до 56,5 % против 100% в контроле и на 30 % (61,1 % против 91,3 %); индекс множественности опухолей был в 2,3 раза ниже (1,83±0,46 против 4,13±0,35); микроскопическая оценка в баллах на 30% ниже (1,56±0,17 против 2,13±0,11). В печени количество неопластических образований имело тенденцию к снижению на 14 %, а микроскопическая оценка в баллах в опытных группах была в 2 раза ниже. Комбинация с селеном усиливала защитное действие КСТ. В группах с ДМБА 100 % животных пали через 28 нед, однако латентный период появления опухолей возрастал в опытной группе на 36 % (134,2 дня против 98,3).

Выводы. Каскатол можно рассматривать как антиканцерогенное средство для химиопрофилактики различных опухолей в группах риска.

В.Э. Гурцевич

Опухоли человека вирусного происхождения: механизмы их развития и профилактика

ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Доказано, что примерно 15-20 % всех новообразований человека имеют вирусное происхождение. Среди наиболее часто встречающихся опухолей, в возникновении которых вирус принимает непосредственное участие, следует назвать рак печени и рак шейки матки, этиологическими агентами для которых являются вирус гепатита В и вирусы папилломы человека (HPV) соответственно.

В настоящее время в мире более 350 млн. человек инфицированы HBV. Каждый год от этой инфекции умирают 1-2 млн. человек, из них 700 тыс. - от рака печени (РП). Каждый 5-й онкологический больной - это больной РП, причем среди всех случаев РП 53 % составляют случаи, вызванные HBV, 25 % - HCV и 22% - не связаны с вирусной инфекцией. В России от РП ежегодно умирают около 6 тыс. человек и согласно расчетам в 2012-2017 гг. количество больных этой формой опухоли достигнет 20 тыс.

Тесная связь РШМ с HPV-инфекцией базируется на эпидемиологических и экспериментальных данных. В опухолевом материале больных РШМ в 90-100 % случаев обнаруживают ДНК этого вируса, в то время, как инфицированность в группах здоровых женщин

не превышает 5-20 %. В различных этнико-географических регионах инфированность женщин HPV существенно варьирует и колеблется от 5 % до 40 %, при этом уровень инфицированности напрямую коррелирует с уровнем заболеваемости РШМ. Среди населения планеты в год регистрируют около 500 тыс. новых случаев РШМ, из них 415 тыс. в развивающихся и 85 тыс. в индустриально развитых странах. В России заболеваемость РШМ составляет 14,9 случаев на 100 тыс. женского населения (2003 г.) и выражается в 12229 новых случаев и 6209 смертей в год - показатели, приближающиеся к таковым для большинства стран Европы и США.

Установление этиологической роли HBV для РП, с одной стороны, и HPV для РШМ, с другой, - 2 важнейших открытия в изучении причин возникновения злокачественных новообразований человека. Эти открытия имеют чрезвычайно важное не только теоретическое, но и практическое значение. Они позволяют формировать группы риска и осуществлять целый комплекс профилактических мероприятий, включающий вакцинирование против соответствующих инфекций.

В докладе будет представлена информация о геномной организации HBV и HPV и клинических последствиях инфицирования этими вирусами. Особое внимание будет уделено молекулярным механизмам HBV- и HPV-ассоциированного канцерогенеза и современным методам терапии и профилактики этих новообразований.

Д.В. Демидов, Т.А. Маньчева, Н.А .Плотникова, С.П. Кемайкин, С.В. Харитонов,

О.Н. Куликова, Т.В. Харитонова Динамика процессов канцерогенеза, индуцируемого бенз(а)пиреном под влиянием мелатонина

ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», Саранск

Цель исследования. Изучение влияния мелатонина на процессы морфологических и биохимических изменений в условиях экспериментального опухолевого роста, мезенхимального генеза, индуцированного бенз(а)пиреном у мышей.

Материалы и методы. Изучалась динамика морфологических и биохимических показателей на бенз(а)пиреновой модели соединительнотканных опухолей тонкой кожи. Эксперимент проводился на нелинейных белых мышах массой 20-22 г в возрасте 2 мес. Животные содержались в условиях вивария при стандартном режиме освещения (12 ч свет - 12 ч темнота). Все животные получали водопроводную воду и гранулированный корм без ограничений. В возрасте 3 мес 100 мышей были поделены на 2 группы по 50 мышей. Животным обеих групп 2 раза в нед на кожу спинки наносили канцероген -бенз(а)пирен (Fluka, Busch, Швейцария) в дозе 0,2 мл в концентрации 0,05% в растворе ацетона. После введения канцерогена животные 2-й - экспериментальной группы получали с питьевой водой в ночные часы (с 19.00 ч до 07.00 ч) мелатонин (Sigma, St.Louis; MS, США) в дозе 2 мг/л. Животные 1-й группы составили контрольную группу и получали питьевую воду без добавления мелатонина. По окончании эксперимента, через 24 нед, все мыши были умерщвлены путем дека-питации. У всех взяты кровь и ткань кожи для биохимических и гистологических исследований.

Результаты. У животных контрольной группы с 84-х сут после начала аппликаций бенз(а)пирена отмечено появление округлых опухолевидных образований размерами 1-2 мм, возвышающихся над поверхностью кожи. По мере роста опухолевые узлы становились бугристыми, приобретали неправильную форму. Наблюдалось изъязвление опухолей и формирование язвенных дефектов с подрытыми, плотными краями и западающим дном, отмечались явления перифо-кального гиперкератоза. Микроскопическая картина опухолевой ткани характерна для полиморфноклеточного варианта злокачественной фиброзной гистиоцитомы. В экспериментальной группе введение мелатонина не привело к статистически значимому изменению показателя времени обнаружения 1-й опухоли и составило в среднем 86 сут от начала эксперимента. Частота развития опухолей кожи у

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОНКОЛОГИЯ

9

мышей составила: в контрольной группе 76 % (31 животное из 41); в экспериментальной группе 57 % (25 животных из 44).

Выводы. Таким образом, отмечается выраженный антиканцерогенный эффект мелатонина в условиях экспериментального опухолевого роста, индуцированного бенз(а)пиреном.

С.В. Дидук, К.В. Смирнова, В.Э. Гурцевич

Влияние мутаций гена LMP1 на внутриклеточную генерацию активных форм азота как важнейшего фактора в усилении трансформирующей активности вируса Эпштейна-Барр

ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Экспрессия латентного мембранного белка 1 (LMP1) вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) приводит к трансформации крысиных фибробластов, а также вызывает множественные изменения в клетках, являющихся естественными мишенями для ВЭБ, а именно в B-лимфоцитах и эпителиальных клетках человека. C-концевые трансактивирующие домены CTAR1 и CTAR2 LMP1 принимают непосредственное участие в нарушении регуляции многих сигнальных путей клетки, а также вызывают индукцию синтазы окиси азота (iNOS). Исследование генома изолятов вируса Эпштейна-Барр, выделенных из опухолевой ткани больных ВЭБ-ассоциированными заболеваниями, выявило ряд мутаций, локализованных в CTAR регионах LMP1. Наибольший интерес среди обнаруженных мутаций представляют замены глицина серином в 212-м положении (G212S) и серина треонином в 366-м положении (S366T), а также Cao-делеция (делеция в 30 п.н.). Перечисленные мутации ведут к инактивации HOS-сайтов связывания LMP1 с белком-рецептором ß-TrCP/HOS SCF комплекса Е3 убиквитин лигазы, что вызывает нарушение регуляции NF-kB и усиление трансформирующей активности LMP1.

Цель исследования. Определить влияние наиболее важных мутаций гена LMP1 на внутриклеточную генерацию активных форм азота (NO).

Материалы и методы. В ходе эксперимента использовались дериваты клеток HEK 293, Phoenixamph, клеточная линия крысиных фибробластов Rat-1, ретровирусный вектор pBabe-puro, полноразмерный ген LMP1 с мутациями в HOS-сайтах, а также контрольные варианты LMP1-B95-8 и Сао. В работе использовались методы молекулярного клонирования, трансфекция, иммуноблотинг, спектрофотометрический анализ.

Результаты. В ходе исследования выявлены различия в уровнях образования активных форм азота для конститутивно экспрессируемых HOS-мутантов LMP1 в клеточной линии Rat-1. Образование NO в клетках с экспрессирующими HOS-мутантами, имеющими 3 аминокислотных замены (Triple), а также в Cao варианте ниже, чем в клетках с HOS-мутантами LMP1, имеющими только 1 аминокислотную замену в CTAR регионах и сравнимых с накоплением NO в клетках, трансфецированных прототипным вариантом LMP1-B95-8.

Выводы. Полученные данные указывают на возможную роль HOS-мутаций в снижении уровня NO в клетках, трансфецирован-ных вариантами LMP1 с более высокой трансформирующей активностью, такими, как Cao и Triple, что может способствовать увеличению выживаемости и усилению туморогенных свойств трансформированных ими клеток.

Работа поддержана грантом РФФИ № 07-04-00604.

А.В. Лихтенштейн

Представления о канцерогенезе: вчера и сегодня

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Представления о канцерогенезе опираются на ряд основополагающих положений: о мутагенезе как движущей силе канцерогенеза; о многостадийной клеточной трансформации как его механизме; о внешней среде как основном источнике мутагенных воздействий; о моноклональности опухоли и об опухолевой прогрессии как дарвиновском процессе последовательных циклов мутации-селекции.

Открытия последних лет значительно усложняют устоявшиеся представления:

а) главным источником мутагенных воздействий является, видимо, внутренняя среда организма;

б) эпимутации (модификации ДНК и хроматина) и миРНК-регуляция играют в канцерогенезе роль, не меньшую, чем мутации;

в) концепция раковых стволовых клеток (современное возрождение идей Вирхова-Конгейма об «эмбриональных зачатках») ведет к пересмотру представлений о трансформации;

г) опухолевый очаг, первоначально моноклональный, может становиться с течением времени поликлональным;

д) опухоль характеризуется сложным иерархическим устройством, а ее взаимоотношения с организмом не антагонистичны, как казалось ранее, а, скорее, синергичны (феномен «рекрутирования»).

В целом онкологический процесс, характеризующийся последовательной сменой стадий, координированным взаимодействием опухоли и «хозяина» и как итог закономерным финалом, предстает как программируемая гибель организма. Подобно апоптозу, этому альтруистическому акту суицида дефектной клетки, угрожающей генетической стабильности многоклеточного организма, рак, по-видимому, является альтруистическим актом суицида особи, несущей мутантные аллели и угрожающей генетической стабильности популяции.

Т.А. Маньчева, Д.В. Демидов, Н.А. Плотникова,

О.Н. Куликова, Т.В. Харитонова,

С.П. Кемайкин, С.В. Харитонов Изучение влияния метформина на процессы морфогенеза опухолей дермы в условиях экспериментального опухолевого роста

ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», Саранск

Введение. Возможность экспериментального моделирования процессов канцерогенеза у животных позволяет исследовать возникновение и развитие опухолей, а также оценить результаты применения новых способов их распознавания и лечения. Основной задачей исследования явилось изучение влияния метформина на динамику процессов морфогенеза опухолей тонкой кожи и биохимических изменений крови экспериментальных мышей в условиях опухолевого роста, индуцированного бенз(а)пиреном. Оценивались частота возникновения, количество и размеры опухолевых узлов в дерме, динамика патоморфологических изменений, определялись основные показатели перекисного окисления липидов в сыворотке крови и опухолевой ткани.

Материалы и методы. Эксперимент проводился на 100 нелинейных белых мышах массой 20-22г в возрасте 2 мес. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Мыши получали водопроводную воду и гранулированный корм без ограничений. В возрасте 3 мес 100 мышей были разделены на 2 группы по 50 мышей. Животным обеих групп вводился канцероген - бенз(а)пирен (Fluka, Busch, Швейцария) 2 раза в нед, накожно, в дозе 0,2 мл, в концентрации 0,05% в растворе ацетона. 1-я группа - контроль по канцерогенезу - получали питьевую воду без добавления метфор-мина. Животные 2-й (экспериментальной) группы после введения канцерогена получали с питьевой водой в течение всего дня мет-формин (сиофор 500, Берлин-Хеми АГ/Менарини групп, Германия) в дозе 200 мг/л. Водный раствор метформина готовился ежедневно ex tempore. Продолжительность опыта составила 24 нед, по окончании эксперимента все выжившие мыши умерщвлены путем декапи-тации.

Результаты. Опухоли дермы развивались в месте введения канцерогена у 76% животных в контроле, в экспериментальной группе -у 70 %. Введение метформина не привело к статистически значимому изменению показателя времени обнаружения 1-й опухоли и составило в среднем 88 сут от начала эксперимента, в контрольной группе -84. На коже спинки формировались выступающие узелки плотноэластической консистенции. В динамике узлы теряли подвижность, увеличивались в размерах, становились несмещаемыми. Макроскопически опухолевые узлы у животных экспериментальной группы не отличались от таковых у мышей в контроле.

Выводы. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что метформин достоверно влияет на частоту развития опухолей кожи у мышей в условиях экспериментального канцерогенеза.

10

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОНКОЛОГИЯ

А.Е. Хубулова1, Ф.К. Джиоев1,

А.В. Сергеев2, М.Я. Шашкина2 Антиканцерогенная активность препаратов эссенциале-Н и чаговит

1 Северо-Осетинская государственная медицинская академия, Владикавказ

2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Препарат эссенциале-Н (ЭН) представляет собой экстракт из бобов сои и содержит смесь незаменимых фосфолипидов (1,2 - дилинолеоил-фосфатидилхолин и др.) и ненасыщенных жирных кислот (линолевая, линоленовая и др.). Чаговит (ЧТ) разработан в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН на основе сухого экстракта березового гриба чаги и витаминов группы В. Оба препарата обладают широким спектром фармакологической активности, в том числе антитоксическим, антиоксидантным, иммуномодулирующим действием и рекомендуются в качестве лечебно-профилактических средств при заболеваниях желудочно-кишечного тракта.

Цель исследования. Изучение влияния препаратов ЭН и ЧТ на возникновение опухолей печени и пищевода, индуцированных у крыс диэтилнитрозамином (ДЭНА).

Материалы и методы. Опыты проводили на крысах самцах линии Вистар с исходной массой тела 120-140 г. Опухоли печени и пищевода индуцировали добавлением к питьевой воде ДЭНА в

концентрации 100 мг/л в течение 4 мес. Крысы опытных групп наряду с канцерогеном получали ежедневно ЭН в дозе 75 мг/кг и ЧТ в дозе 50 мг/кг на протяжении всего эксперимента. В конце опыта ткани печени и пищевода подвергались гистологическому изучению.

Результаты. В контрольной группе неопластические образования в ткани печени обнаружены у 89,7 % животных. Гистологически был идентифицирован высоко-, умеренно- и низкодифференцированный гепатоцеллюлярный рак и гепатоцеллюлярная аденома. Опухоли пищевода развились у 82,8 % крыс контрольной группы. Гистологически новообразования классифицированы как высокодифференцированный и низкодифференцированный плоскоклеточный рак. В группах животных, получавших ЭН и ЧТ, опухоли печени обнаружены у 63,6 % и 72,7 % крыс соответственно. Опухоли пищевода обнаружены у 54,5 % крыс, получавших ЭН. Индекс множественности новообразований при этом снижался в 1,7 раза. У крыс, получавших ЧТ, опухоли пищевода развились в 63,6 % случаев, а индекс множественности также снизился в 1,7 раза.

Выводы. Применение препаратов ЭН и ЧТ приводило к достоверному снижению частоты возникновения опухолей печени и пищевода, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных средств для химиопрофилактики рака.