Устойчивость штаммов Vibrio cholerae к фагоцитозу Dictyostelium discoideum

46

ЗНиСО июль N7

УДК 579.61:579.843.1:612.017

УСТОЙЧИВОСТЬ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE К ФАГОЦИТОЗУ DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM

О.В. Маркина, А.И. Шелохович, Е.Ю. Люкшина, А.Н. Терентьев

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора,

г. Ростов-на-Дону, Россия

Моделирование фагоцитоза с использованием простейших Dictyostelium discoideum позволяет оценить вклад в этот процесс внеклеточного полисахарида (ЭПС). Одиночные бактериальные клетки ругозных колоний поедаются простейшими аналогично бактериям S-вариантов. При наличии скопления вибрионов, связанного с продукцией ЭПС, этот процесс ингибируется. Ключевые слова: Vibrio cholerae, ругозные колонии, фагоцитоз, Dictyostelium discoideum.

O.V. Markina, A.I. Shelohovich, E.Yu. Lyukshina, A.N. Terent'ev  STABILITY STRANS OF VIBRIO CHOLERAE TO PREDATION OF DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM  Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.

Modeling process of phagocytosis using the protists Dictyostelium discoideum allows to assess the contribution to the process of extracellular polysaccharide (EPS). Single bacterial cells of rugose colonies are eaten by protozoa similar to bacteria of S-variants. In the presence of vibrios clustering associated with the presence of EPS, this process is inhibited.

Key words: Vibrio cholerae, rugose colonies, phagocytosis, Dictyostelium discoideum.

Известно, что при высеве холерных вибрионов на твердых питательных средах регистрируются колонии как типичного S-фенотипа (от англ. - smooth), так и измененные: плотные, складчатые, слизистые и другие. Такая феноти-пическая гетерогенность культуры является необходимым условием ее нормального развития, при этом разные типы клеток (некультиви-руемые, L-формы, клетки-персистеры и др.) по-своему отвечают за ее сохранность в неблагоприятных условиях окружающей среды [1]. Одним из таких факторов внешней среды является поедание простейшими, и в настоящее время уже установлено, что устойчивость вибрионов к этому процессу обеспечивает экзопо-лисахарид (ЭПС), участвующий в формировании плотных складчатых колоний - ругозный фенотип. Вибрионы, покрытые им, способны выживать внутри простейших и после гибели последних вновь попадают в окружающую среду. Этот способ защиты имеет большое значение для поддержания экологического равновесия бактерий в водной среде, так как в противном случае они бы подверглись быстрому уничтожению. За рубежом при моделировании этого процесса in vitro, как правило, используют Acanthamoeba castellanii, Rhynchonomas nasuta и др. [7]. Но поскольку это свободножи-вущие в воде организмы, то все опыты проходят в жидкой среде, и учет результатов фагоцитоза проводится путем подсчета клеток вибрионов после их совместного культивирования с Protozoa. Использование же простейших, способных расти на агаризованных средах, позволило бы получить быструю визуальную оценку результатов фагоцитоза по появлению зон просветления, и таким модельным организмом может стать Dictyostelium discoideum - клеточный слизевик, относящийся к типу Mycetozoa. Эти простейшие способны расти как в жидкой среде, так и на поверхности твердых питательных

сред. Ранее нами были получены стабилизированные фазовые варианты штамма V. cholerae El Tor P-18895, продуцирующие полисахарид и формирующие плотные складчатые (ругозные) колонии [2].

Цель исследования - изучение устойчивости холерных вибрионов гладких и ругозных колоний к фагоцитозу D. discoideum.

Материалы и методы. В работе были использованы стабилизированные ругозные и гладкие варианты штамма V. cholerae El Tor P-18895 (ctx , tcp ) [2], а также штаммы V. cholerae 0139 Р-16063 (ctx+, tcp+), V. cholerae El Tor P-15865 (ctx-, tcp ) и V. cholerae El Tor P-14932 (ctx-, tcp), полученные из музея живых культур ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора. Для культивирования вибрионов использовали агар LB (рН 7,3) и TCBS (рН 7,4), для получения ругозных колоний - среду М9 (рН 9,0). Индекс диссоциации популяции определяли как долю (%) колоний определенного морфотипа от общего числа колоний. Полученные гладкие прозрачные колонии были обозначены как S-колонии, а мутные складчатые как ругозные. Микроскопию ЭПС проводили с помощью окраски мазков конго красным. Наличие генов синтеза ЭПС -vps A и vps L - определяли с помощью ПЦР. Способность формировать пленку на твердой поверхности изучали в боросиликатных пробирках [3]. Окраску образовавшихся пленок проводили раствором 0,1 %-го генцианвиолета после 3-кратного промывания поверхности пробирок фосфатно-солевым буферным раствором. Подвижность вибрионов определяли в чашках Петри с 0,3 %-м агаром Мартена. Оценку способности фазовых вариантов сохранять свой фенотип определяли путем их длительного выдерживания (в течение 3 месяцев) в среде М9, ФСБ (рН 7,7), а также в автоклавированной речной воде (р. Темерник). Фагоцитоз вибрио-

июль IW (200) ЗНиСО

47

нов изучали с помощью штамма D. discoideum XM3. D. discoideum выращивали на газоне Es-cherichia coli M-17, получаемом из коммерческого пробиотического препарата «Колибакте-рин» во влажной камере при 23 °С (условия |_^ термостата) на специальных средах SM и SM/5 (рН 6,2 ± 0,2) [4]. Для оценки устойчивости ^ штамма к фагоцитозу были использованы плотные питательные среды BCYEa, СЭЛ и Б-2, применяемые для культивирования Legionella pneumophila. Эксперимент по совместному культивированию вибрионов и миксамеб проводили следующим образом: на поверхность агара наносили бактериальную взвесь V. cholerae 109 КОЕ/мл, подсушивали, а затем добавляли споры D. discoideum, чашки инкубировали во влажной камере при 23 °С. Учет результатов проводили через 24-72 ч, оценивая наличие зон просветления (бляшек), образованных при поедании бактерий миксамебами. Фотографирование колоний вибрионов проводили с помощью цифрового фотоаппарата, подсоединенного к микроскопу МБС-10.

Результаты исследования. В результате выдерживания клеток штаммов V. cholerae El Tor P-18895, V. cholerae O139 P-16063, V. cholerae El Tor P-15865 и V. cholerae El Tor Р-14932 в минимальной среде М9 при 23 °С были получены ругозные и гладкие варианты колоний, которые при культивировании на среде LB росли в виде гладких прозрачных колоний, на среде TCBS - в виде гладких желтых колоний, на агаре Мартена формировали плотные складчатые и гладкие прозрачные колонии. После нахождения клеток обоих вариантов в минимальной питательной среде М9, речной воде (р. Темерник) или физиологическом растворе (ФСБ, рН 7,4) диссоциация стабилизированных ругозных и гладких колоний V. cholerae El Tor P-18895, отобранных из среды М9 и речной воды, составляла не более 10 %, из ФСБ - не более 1-5 %, вибрионы гладкого варианта формировали только прозрачные и гладкие колонии (100 % случаев). Индексы диссоциации фазовых вариантов V. cholerae O139 P-16063, V. cholerae El Tor P-15865 и V. cholerae El Tor Р-14932 составили 20—30 %. ПЦР анализ свидетельствовал о присутствии у всех изучаемых штаммов генов синтеза ЭПС - vps A и vps L, хотя при окраске мазков конго красным между темно-розовыми клетками зарегистрировалось аморфное вещество кораллового цвета, по-видимому, ЭПС, только у ругозных колоний. В мазках S-колоний его не обнаружили по причине его отсутствия или невысокого содержания. Способность продуцировать ЭПС ругоз-ными вариантами была подтверждена путем постановки теста формирования и последующего окрашивания генцианвиолетом биопленок на поверхности жидкости и стекла в среде М9, бульоне Мартена и пептонной воде при выращивании бактерий при 23 °С и 37 °С.

В многочисленных зарубежных работах установлено, что в составе биопленок вибрионы резистентны к истреблению простейшими, однако насколько устойчивы к этому процессу бактерии, способные продуцировать ЭПС, но находящиеся на стадии планктонных клеток, пока малоизвестно. В сравнительном изучении этого процесса были использованы вибрионы стабилизированных ругозных и гладких вариантов штамма V. cholerae El Tor Р-18895, характеризующегося низкой степенью диссоциации, а также штаммов V. cholerae O139 P-16063, V. cholerae El Tor Р-14932 и V. cholerae El Tor P-15865. Первоначально были подобраны оптимальные условия для роста миксамеб и ругозных вариантов холерных вибрионов, поскольку на агаре Мартена вибрионы способны формировать колонии ру-гозного фенотипа, тогда как миксамебы на нем практически не размножаются, возможно, из-за неоптимального для их роста рН среды (7,7) и отсутствия глюкозы. На средах SM и SM/5, используемых для культивирования D. discoideum и содержащих в своем составе глюкозу, ругозные варианты переходят в S-фенотип. В результате была подобрана питательная среда BCYEa, которую используют в экспериментах по совместному культивированию легионелл и D. Discoi-deum, и ее отечественные аналоги - СЭЛ и Б-2. Учитывая, что все они содержат в своем составе L-цистеин, препятствующий, по данным литературы, развитию амеб [6], готовили среды СЭЛ и Б-2 со сниженным его содержанием - 40 мг/л, исходное содержание - 400 мг/л. Для подавления роста посторонней микрофлоры в них добавляли антибиотик полимиксин В 200 000 ЕД/л, к которому резистентны вибрионы сероваров Эль Тор и 0139. В результате были получены варианты питательных сред, которые удалось использовать для кратковременного культивирования простейших и ругозных вариантов вибрионов (рис. 1). Через 24 ч после начала их совместного культивирования на чашках регистрировали небольшие зоны просветления (бляшки), которые продолжали медленно увеличиваться в течение последующих 2 суток. Они свидетельствовали о наличии фагоцитирующей активности миксамеб. Через 48 ч внутри бляшек на чашке, засеянной клетками ругозного варианта штамма V. cholerae El Tor P-18895, появлялись плоские колонии бактерий, которые при отсеве на агар Мартена формировали колонии ругозного фенотипа. Присутствие их внутри зон просветления можно объяснить наличием скоплений клеток, устойчивых к фагоцитозу, из-за присутствия ЭПС. Результаты эффективности фагоцитоза, полученные при использовании штаммов V. cholerae O139 P-16063, V. cholerae El Tor Р-14932 и V. cholerae El Tor P-15865, были неопределенными, высокий индекс их диссоциации (20-30 %) не позволил ответить на вопрос: клетки каких фазовых вариантов штаммов подверглись истреблению простейшими в эксперименте.

40

ЗНиСО июль N7

A Б

Рис. 1. Общий вид ругозной колонии V. cholerae El Tor P-18895

Выводы. После совместного инкубирования при 23 °С простейших D. discoideum и бактерий V. cholerae El Tor P-18895 на агаре появляются зоны просветления, свидетельствующие о поедании миксамебами клеток как S-, так и ругозного вариантов. По-видимому, простейшие поедают клетки обоих вариантов в планктонной форме, и только при наличии ЭПС на поверхности ругозных колоний, бактерии приобретают к ним устойчивость. Не исключено, что помимо ЭПС существуют и другие факторы, оказывающие влияние на фагоцитоз. Например, описаны антипротозойные вещества, которые продуцируются вибрионами в составе биопленок и, высвобождаясь во внешнюю среду, вызывают гибель простейших [5]. Возможно, аналогичные соединения могут секретиро-ваться и в составе ругозных колоний. Изучение факторов, препятствующих истреблению холерных вибрионов простейшими в водной среде, является предметом дальнейших исследований.

ЛИТЕРАТУРА

1. Магданова Л.А. и др. Гетерогенность как адаптивное свойство бактериальной популяции / Л.А. Магданова, Н.В. Голясная // Микробиология. 2013. Т. 82. № 1. С. 3-13.

2. Маркина О.В. и др. Стабилизированные варианты Vibrio cholerae El Tor P-18895 / О.В. Маркина, А.И. Ше-

лохович, А.Н. Терентьев [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2015. Вып. 1. С. 67-70.

3. Татаренко О.А. и др. Влияние некоторых факторов на формирование биопленки токсигенными и атоксиген-ными холерными вибрионами эльтор / О.А. Татаренко, Л.П. Алексеева, Н.Р. Телесманич [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2012. № 5. С. 36-40.

4. Eichinger L. et al. Dictyostelium discoideum protocols / L. Eichinger, F. Rivero // Methods in molecular biology 346. 2006. P. 113-115.

5. Erken M. et al. In situ grazing resistance of Vibrio cholerae in the marine environment / M. Erken, M. Weitere, S. Kjel-leberg, D. McDougald // FEMS Microbiol Ecol. 2011. Т. 76. № 3. P. 504-512.

6. Solomon J.M. et al. Intracellular Growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum, a System for Genetic Analysis of Host-Pathogen Interactions / J.M. Solomon, A. Rupper, J.A. Cardelli, R.R. Isbergi // Inf. and Immune. 2000. Т. 68. № 5. P. 2939-2947.

7. Sun S. et al. Relative Contributions of Vibrio Polysaccha-ride and Quorum Sensing to the Resistance of Vibrio chol-erae to Predation by Heterotrophic Protists / S. Sun, S. Kjelleberg, D. McDougald // PLoS One. 2013. Т. 8. № 2. Р. 56338.

Контактная информация:

Маркина Ольга Владимировна, тел.: +7 (863) 240-91-22, e-mail: pochtamov@mail.ru

Contact information: Markina Olga, р^эм: +7 (863) 240-91-22, e-mail: pochtamov@mail.ru

V