Способ прогноза рака молочной железы
METHOD FOR BREAST CANCER PREDICTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для определения прогноза рака молочной железы на ранних стадиях заболевания (стадии Т1, Т2, N0).
В данном изобретении под прогнозом рака молочной железы понимается вероятностная оценка исхода заболевания у больных раком молочной железы, в том числе ожидаемая общая выживаемость.
В настоящее время известно, что биологическое поведение злокачественной опухоли, которое характеризует скорость ее роста, способность к инвазии и распространению зависит от многих причин, связанных как с ее особенностями, так и с эффективностью или неэффективностью системных защитных механизмов, среди которых важное место занимают иммунные.
В этой связи актуальным является поиск новых подходов к прогнозированию течения заболевания с использованием параметров, учитывающих качественный и количественный состав иммунокомпетентных клеток, в частности, различных видов Т-лимфоцитов и их субпопуляций.
Так, известен, способ прогнозирования пятилетней выживаемости пациенток с инфильтрующим раком молочной железы [RU 2547561], основанный на определении суммарного балла злокачественности, учитывающего, в том числе, показатель лимфогистиоцитарной инфильтрации опухоли.
Суммарный балл злокачественности определяется путем простого суммирования значений баллов шести микроморфологических параметров. В число указанных параметров входит степень лимфогистиоцитарной инфильтрации по периферии опухолевого узла (в зоне инвазивного роста), о которой судят по количеству лимфоцитов в указанной области.
Способ осуществляют путем суммирования баллов шести основных микроморфологических параметров ткани опухолевого узла: степень дифференцировки, клеточный полиморфизм, митотическая активность опухолевых клеток, характер инвазивного роста, степень лимфогистиоцитарной инфильтрации, наличие опухолевых эмболов в сосудах стромы. Каждому показателю присваивают значения баллов. При значении суммарного балла, равном 14 и менее, прогнозируют благоприятный исход заболевания с 95% вероятностью. Значения суммарного балла злокачественности, равные 15 и более, прогнозируют неблагоприятный исход заболевания.
Однако данный способ требует осуществления большого количества разноплановых микроскопических исследований, что обуславливает его сложность.
В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения выбран способ прогноза рака молочной железы [US 2013260378].
Данный способ включает в себя анализ количества инфильтрующих опухоль Т-лимфоцитов (ОТЛ) на основе статуса метилирования по меньшей мере одной позиции CpG в одном или нескольких генах для CD3 γ, -δ и -ε в образце опухоли, полученном от пациента, при этом большое количество ОТЛ указывает на более низкую выживаемость у пациента с раком молочной железы.
Способ является очень сложным и дорогостоящим, поскольку основан на осуществлении микроскопических генетических исследований, включающих большое количество манипуляций с биочипами, полученными из гистологического препарата, изготовленного из ткани опухоли.
Кроме того, в данном способе не используется четкий количественный прогностический показатель, что снижает точность прогноза.
Проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является упрощение и удешевление способа прогноза рака молочной железы.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе прогноза рака молочной железы, включающем микроскопическое исследование гистологического препарата, изготовленного из отобранной у пациента опухоли, в ходе которого идентифицируют по меньшей мере один вид инфильтрующих опухоль Т-лимфоцитов, оценивают их количество и используют полученные данные для прогностической оценки, согласно изобретению в ходе исследования идентифицируют CD4+ Т-лимфоциты в строме опухоли, идентификацию осуществляют путем проведения специфичной для CD4 антигенов реакции с использованием вызывающего их окрашивание биомаркера, подсчитывают отношение количества окрашенных клеток в строме опухоли к общему количеству клеток в строме опухоли и используют полученное отношение для прогностической оценки, при этом при значении указанного отношения менее или равного 50% прогноз оценивают как благоприятный.
В заявляемом способе предлагается новый критерий прогноза рака молочной железы, основанный на количественной оценке субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов в строме опухоли, а именно, процентного содержания CD4+ Т-лимфоцитов в строме опухоли, при этом при значении указанного процентного содержания менее или равного 50% прогноз оценивают как благоприятный.
Идентификацию CD4+ Т-лимфоцитов осуществляли путем проведения специфичной для CD4 антигенов реакции с использованием вызывающего их окрашивание биомаркера.
Количество CD4+ Т-лимфоцитов определяли путем подсчета клеток с полностью окрашенной мембраной, что соответствует показателю 3+ по трех бальной шкале (+1, +2, +3) интенсивности окраски и полноты окрашивания клеточной мембраны.
Значение прогностического параметра определяли как отношение количества вышеуказанных окрашенных клеток в строме опухоли к общему количеству клеток в строме опухоли.
Вышеуказанный критерий был установлен на основании статистической обработки результатов микроскопического исследования гистологических препаратов, отобранных у большой когорты больных с диагнозом рак молочной железы (стадии T1, Т2, N0). В ходе исследования осуществляли автоматический анализ изображений препаратов, изготовленных по технологии тканевых матриц.
Как показали исследования, предлагаемый критерий применим для всех подтипов рака молочной железы.
Высокая вероятность правильности прогноза по заявляемому способу была подтверждена с помощью исследования выживаемости пациентов по методу Каплана - Мейера [http.://ru.wikipedia.org/wiki].
Реализация способа основана на использовании автоматизированных приемов обработки и анализа цифровых изображений исследуемых гистологических препаратов с использованием компьютерных программ. При этом не требуется осуществления сложных трудоемких манипуляций с исследуемым материалом и использования дорогостоящих препаратов и специального оборудования.
Процедура определения прогностического параметра является практически оператор независимой, что повышает точность и объективность способа.
Таким образом, техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение и удешевление способа прогноза рака молочной железы при обеспечении высокой вероятности прогноза.
Способ осуществляют следующим образом.
Проводят микроскопическое исследование гистологических препаратов, приготовленных из образцов опухоли, отобранных у пациентов с диагнозом рак молочной железы.
Образцами опухоли могут быть биопсия опухоли или материал ее хирургической резекции.
В способе предпочтительно используют гистологические препараты, приготовленные в виде тонких срезов (3-4 мкм) из фиксированных в парафине образцов опухолевой ткани (парафиновый блок) и окрашенных гематоксилином и эозином, но могут быть использованы и другие виды препаратов, приготовленные по известным в области гистологии методикам.
Обрабатывают исследуемый препарат сывороткой, содержащей антитела к CD4 антигенам, в частности, используют кроличьи моноклональные антитела к CD4 клон SP35, CONFIRM Ventana.
Определяют количество CD4+ Т-лимфоцитов в строме опухоли путем подсчета количества клеток с полностью окрашенной мембраной, что соответствует показателю 3+ по трех бальной шкале интенсивности окраски и полноты окрашивания клеточной мембраны.
Подсчитывают общее количество клеток в строме опухоли (без опухолевых клеток).
Значение прогностического параметра определяют как отношение количества окрашенных клеток в строме опухоли к общему количеству клеток в строме опухоли.
Для осуществления способа используют аппаратуру, способную обеспечить получение цифрового (виртуального) микроскопического изображения гистологического препарата, обработку и анализ изображения, снабженную пакетом программ, обеспечивающих подсчет количества CD4+ Т-лимфоцитов в строме опухоли, общего количества клеток в строме опухоли и отношения указанных значений.
В частности, может быть использована система Pannoramic 250 (3DHISTECH) [www.3dhistech.com], снабженная пакетом программ Pannoramic Viewer.
Полученное значение используют в качестве прогностического параметра.
В случае, когда значение прогностического параметра составляет величину равную или менее 50%, прогноз расценивают как благоприятный, при котором выживаемость пациента составляет 10 и более лет.
Возможность формирования прогноза рака молочной железы с использованием заявляемого способа подтверждена следующими исследованиями.
Осуществляли наблюдение за 394 больными с диагнозом инфильтративный рак молочной железы (стадии T1, Т2, N0). После оперативного лечения осуществляли исследование гистологических препаратов, приготовленных из образцов опухоли, полученных при ее хирургической резекции. В результате гистологического исследования для каждого больного определяли процентное содержание CD4+ Т-лимфоцитов в стромальных клетках опухоли.
Среди исследуемых больных у 296 человек указанное процентное содержание составляло величину равную или менее 50%. За 10 лет общая выживаемость больных в указанной группе составила 93%, что при раке молочной железы (стадии T1, Т2, N0) считается статистически благоприятной группой.
Среди исследуемых больных у 98 человек указанное процентное содержание составляло величину более 50%. За 10 лет общая выживаемость больных в данной группе составила 82%, что при раке молочной железы (стадии T1, Т2, N0) считается статистически не благоприятной группой.
Указанные результаты свидетельствуют о высокой вероятности прогноза рака молочной железы по заявляемому способу.