ОЧИСТКА ПЕГИЛИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ

1. Способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий стадии получения раствора, содержащего моно-, поли- и непегилированный эритропоэтин, осуществления двух последовательных катионообменных хроматографических стадий и выделения очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии, отличающийся тем, что на обеих катионообменных хроматографических стадиях используется одинаковый тип катионита, и тем, что две последовательные катионообменные хроматографические стадии осуществляют с использованием различных способов элюирования, в соответствии с которым две последовательные катионообменные хроматографические стадии включают следующие этапы:
а) введение забуференного водного раствора, содержащего смесь моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, а также форм с низкой молекулярной массой, в первую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной первой колонке,
б) выделение монопегилированного эритропоэтина из первой катионообменной хроматографической колонки с помощью способа ступенчатого элюирования со ступенчатым повышением ионной силы проточного буфера, где относительное содержание монопегилированного эритропоэтина в выделенном растворе повышено по сравнению с исходно введенной смесью,
в) введение выделенного монопегилированного эритропоэтина со стадии б) во вторую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной второй колонке, где катионит, содержащийся в таковой второй колонке, того же типа, что и катионит в первой колонке,
г) выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, из упомянутой второй катионообменной хроматографической колонки с помощью способа непрерывного элюирования с непрерывным повышением ионной силы проточного буфера.
2. Способ согласно п.1, отличающийся тем, что упомянутый катионит является сульфопропильным катионитом.
3. Способ согласно п.1, отличающийся тем, что упомянутое ступенчатое повышение ионной силы на стадии б) способа является трехступенчатым повышением ионной силы.
4. Способ согласно п.3, отличающийся тем, что выделенный на стадии б) монопегилированный эритропоэтин выделяют на второй ступени способа ступенчатого элюирования.
5. Способ согласно п.4, отличающийся тем, что на упомянутой стадии б) полипегилированный эритропоэтин выделяют после первого повышения ионной силы проточного буфера, монопегилированный эритропоэтин выделяют после второго повышения ионной силы проточного буфера, а непегилированный эритропоэтин выделяют после третьего повышения ионной силы проточного буфера.
6. Способ согласно любому из пп.1-5, отличающийся тем, что разница концентраций вызывающей элюирование соли на стадии б) способа ступенчатого элюирования составляет 120% или более на каждой из ступеней способа ступенчатого элюирования.
7. Способ согласно любому из пп.1-5, отличающийся тем, что упомянутый забуференный водный раствор содержит фосфорную кислоту или ее соли, или лимонную кислоту или ее соли, или гистидин или его соли в качестве буферного вещества.
8. Способ согласно любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на упомянутой стадии г) монопегилированный эритропоэтин выделяют из второй катионообменной хроматографической колонки под действием линейного градиента, начиная от калий-фосфатного буфера с концентрацией около 100 мМ, содержащего около 50 мМ хлорида натрия при рН около 3,0 и заканчивая калий-фосфатным буфером с концентрацией около 100 мМ, содержащего около 500 мМ хлорида натрия при рН около 3,0, где изменение концентрации хлорида натрия линейно в течение времени пропускания объема элюента, равного десяти объемам колонки.
9. Способ получения монопегилированного эритропоэтина, включающий следующие стадии:
а) пегилирование эритропоэтина,
б) очистку монопегилированного эритропоэтина с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях задействуют одинаковый тип катионита,
в) выделение монопегилированного эритропоэтина из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной.
10. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что второй катионит принадлежит к тому же типу, что и первый катионит, но не является той же самой его фракцией.
11. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый остаток ПЭГ характеризуется молекулярной массой 20-35 кДа в случае линейного ПЭГ и 40 кДа в случае разветвленного ПЭГ.
12. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый монопегилированный эритропоэтин получают в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, содержащей более 95% по площади монопегилированного эритропоэтина по данным эксклюзионной ВЭЖХ.
13. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый монопегилированный эритропоэтин выделяют на первой катионообменной хроматографической стадии с чистотой более 60% по площади по данным эксклюзионной ВЭЖХ.
14. Способ согласно любому из пп.3-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый забуференный водный раствор содержит около 100 мМ калий-фосфатного буфера и характеризуется рН около 3,0.
15. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что величина рН растворов на упомянутых хроматографических стадиях составляет около 3,0.
16. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что соль, вызывающая элюирование пегилированного эритропоэтина из катионообменных хроматографических колонок является цитратом натрия, или хлоридом натрия, или хлоридом калия.
17. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый эритропоэтин характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или номером 2.