Анализ многокомпонентного лекарственного препарата от простуды методом градиентной ВЭЖХ

УДК 543.544 Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

по-видимому, связано с нарушением образования в печени фермента лецитин-холестерин-ацилтрансферазы, участвующего в обмене липопротеиновых частиц крови.

Метаболические нарушения, возникающие при токсическом гепатите, усугубляются стимуляцией процессов ПОЛ, протекающих на фоне функциональной несостоятельности ферментов антирадикальной защиты.

Положительная динамика биохимических показателей крови (повышение коэффициентов АСТ/АЛТ, ЭХС/НЭХС; снижение ГГТП/АСТ, КА; уменьшение концентрации ТБК-РП, нормализация в работе каталазы и СОД), а также морфологической картины печени на фоне применения масла ореха черного свидетельствуют о наличии у исследуемого продукта гепатопро-тективных, гиполипидемических и антиоксидантных свойств, что позволяет рекомендовать его для дальнейшего использования в гепатологии в качестве эффективного терапевтического средства.

ЛИТЕРАТУРА

1. Герасимов А. Н. Медицинская статистика: Учебное пособие. -М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. - 480 с.

2. Доркина Е. Г., Сергеева Е. О., Саджая Л. А, Терехов А. Ю, Парфентьева Е. П., Скульте И. В. Изучение влияния флаво-ноидов на системы детоксикации ксенобиотиков при курсовой алкоголизации у крыс // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2009. - № 1, Т. XIX, приложение № 33. - С. 74.

3. Ерохин Ю. А. Изменение иммунной системы при алкогольной болезни // Проблема демографии, медицины и здоровья населения России: История и современность: Статьи IV Международной научно-практической конференции. Май, 2007 г. - Пенза: РИО ПГСХА, 2007. - С. 95-98.

4. Ерохин Ю. А., Ануфриева Е. Ю. Злоупотребление алкоголем в России и его последствия // Экология и безопасность жизнедеятельности: Сборник статей VI Международной научно-практической конференции. - Пенза: РИО ПГСХА, 2006. - С. 111-113.

5. Ивашкин В. Т., Маевская М. В. Алкогольно-вирусные заболевания печени. - М.: Литера, 2007. - 160 с.

6. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. - М.: МЕДпресс-ин-форм, 2004. - 920 с.

7. Коржевский Д. Э. Краткое изложение основ гистологической техники для врачей и лаборантов-гистологов. - СПб: Кроф, 2005. - 48 с.

8. Королюк М. А, Иванов Л. И., Майорова И. Г., Токарев В. П. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. -1988. - № 1. - С. 16-19.

9. Костюк В. А, Потапович А. И., Ковалева Ж. И. Простой и чувствительный метод определения супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцитина // Вопр. мед. химии. - 1990. -№ 2. - С. 88-91.

10. Кушнерова Н. Ф, Рахманин Ю. А, Гордейчук Т. Н., Фоменко С. Е., Добряков Ю. И., Лесникова Л. Н., Добряков Е. Ю. Применение биологически активных веществ морских гидробионтов для коррекции нарушений липидного обмена при алкогольной интоксикации // Гигиена и санитария. - 2000. - № 3. - С. 70-73.

11. Лесникова Л. Н., Кушнерова Н. Ф., Добряков Е. Ю. Особенности метаболизма организма при остром стрессе и его коррекция хаурантином и эссенциале // Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке: Материалы V Региональной науч.-практ. конф. Хабаровск, 2002 г. - Владивосток: Дальнаука, 2002. - С. 71.

12. Меньщикова Е. Б., Зенков Н. К., Ланкин В. З., Бондарь И. А., Труфакин В. А. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания. - Новосибирск: АРТА, 2008. - 284 с.

13. Оковитый С. В., Шуленин С. Н., Смирнов А. В. Клиническая фармакология антигипоксантов и антиоксидантов. - СПб: ФАРМиндекс, 2005. - 72 с.

14. Стальная И. Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.

Поступила 14.04.2009

Г. Б. ГОЛУБИЦКИЙ

АНАЛИЗ

МНОГОКОМПОНЕНТНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ОТ ПРОСТУДЫ

МЕТОДОМ ГРАДИЕНТНОЙ ВЭЖХ

ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия, 305909, г. Курск, ул. 2-я Агрегатная, 1а/18, тел.: (47122) 6-01-65, 8-903-877-26-32. E-mail: iirogirg@narod.ru

Предложена экспрессная одностадийная методика качественного и количественного анализа нового многокомпонентного препарата от простуды методом градиентной ВЭЖХ. По сравнению с методикой, включенной в нормативную документацию разработчиками технологии, получен значительный положительный эффект: определение аскорбиновой кислоты проводится одновременно с остальными действующими веществами препарата. Изучены метрологические характеристики новой методики, подтверждены достоверность и воспроизводимость результатов при анализе модельных смесей и образцов препарата.

Ключевые слова: многокомпонентный лекарственный препарат от простуды, экспрессная одностадийная методика, метрологические характеристики методики, модельные смеси и образцы препарата, достоверность и воспроизводимость результатов.

G. B. GOLUBITCKII

HPLC ANALYSIS OF MULTICOMPONENT COLD PREPARATION WITH MOBILE PHASE GRADIENT

JSC «Pharmstandard-Leksredstva»,

Russia, 305909, Kursk, 2-d Agregatnaya str, 1a/18, tel.: (47122) 6-01-65, 903-877-26-32. E-mail: iirogirg@narod.ru

A rapid single-stage HPLC method was proposed for qualitative and quantitative analysis of the new multicomponent cold preparation. In comparison with the method included to the normative documentation by authors of the drug technology a considerable positive effect was observed: the determination of ascorbic acid is carrying out simultaneously with the other components of the preparation. The metrological characteristics of the method proposed were examined. Analyzing model mixtures and samples of this preparation, the accuracy and precision of results were substantiated.

Key words: multicomponent cold preparation, rapid single-stage HPLC method, metrological characteristics of the method, model mixtures and samples of this preparation, the accuracy and precision.

Введение

В научно-исследовательской организации была разработана технология многокомпонентного лекарственного препарата от простуды в форме саше с составом, аналогичным зарубежному «Терафлю». В качестве действующих веществ препарат содержит аскорбиновую кислоту (АК), парацетамол (П), гидрохлорид фени-лэфрина (Ф), малеат фенирамина (МФ) и ряд вспомогательных веществ и наполнителей - сахар, лимонную кислоту и другие.

Для контроля технологического процесса и обеспечения качества препарата необходима точная экспрессная методика определения подлинности и количественного содержания действующих веществ. Методика анализа, предложенная предприятию разработчиками технологии, не отвечала этим требованиям. Так, для определения содержания П, Ф и МФ был предусмотрен метод ВЭЖХ, а содержание АК определяли иодомет-рическим титрованием.

Цель настоящей работы - разработка одностадийной методики количественного анализа всех действующих веществ препарата.

Методика исследования

Хроматографический анализ проводили на хроматографе Waters Alliance 2695 с диодно-матричным детектором Waters 2996. Величина «мертвого» объема хроматографа по паспорту - менее 0,650 мл. Использовали колонку длиной 150 мм и внутренним диаметром 4,6 мм с предколонкой 20х4,6 мм, заполненные обращенно-фазовым сорбентом Zorbax SB C8 с размером частиц 3,5 мкм (Agilent Technologies, США).

Для контроля рН использовали рН-метр-милли-вольтметр рН-673М со стеклянным индикаторным электродом и хлорсеребряным электродом сравнения.

Для приготовления элюентов и растворения стандартных и испытуемых препаратов использовали ацетонитрил для градиентной хроматографии («Мерк», Германия) и сверхчистую воду с удельным сопротивлением 18,2 МОм/см, полученную на установке Direct Q5 (Millipore). В качестве стандартов определяемых лекарственных веществ использовали фармацевтические субстанции, проверенные отделом контроля качества предприятия и соответствующие всем требованиям нормативной документации. Все остальные использованные реактивы имели квалификацию не ниже чда.

Для выполнения анализа около 7,500 г (точная навеска) порошка в течение 3 мин встряхивали в мерной колбе вместимостью 100 мл в 20 мл смеси (1:3) ацетонитрил - 0,1%-ная ортофосфорная кислота. Полученный раствор доводили 0,1%-ной ортофосфорной кислотой до метки и перемешивали. Параллельно готовили раствор рабочих стандартных образцов (РСО), содержащий около 0,1620 г П, 0,0250 г АК, 0,0100 г МФ

и 0,0050 г Ф (точные навески) в 100 мл смеси (1:19) ацетонитрил - 0,1%-ная ортофосфорная кислота. Все растворы фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (предпочтительны фторопластовые фильтры, устойчивые в водно-ацетонитрильных растворах).

Хроматографировали по 5,0 мкл испытуемого раствора и раствора РСО с изменением состава подвижной фазы в течение анализа по следующей программе:

Время, мин Элюент А, % Элюент В, %

0 100,0 0,0

10 20,0 80,0

11 20,0 80,0

12 100,0 0,0

16 100,0 0,0

В качестве элюента А использовали 0,34%-ный раствор калия фосфата однозамещенного, подкисленного до рН 3,0 добавлением ортофосфорной кислоты, элю-ента В - смесь (1:1) ацетонитрила и элюента А. Расход подвижной фазы составил 1,0 мл/мин. Определяемые вещества детектировали при 273 нм.

Подлинность препарата подтверждали соответствием времен удерживания определяемых компонентов на хроматограммах испытуемого раствора и раствора РСО. Рассчитывали площади пиков определяемых компонентов и находили количество каждого компонента в анализируемом препарате по формуле:

Э/а/Ь Х =----------------’

Эо*а1

где Б1 и Б0 - средние значения площадей пиков определяемых компонентов на хроматограммах испытуемого раствора и раствора РСО соответственно, в мкВ * с;

а0, а1 и Ь - массы стандартов определяемых веществ в растворе РСО, навеска порошка, взятая для приготовления испытуемого раствора, и масса одной дозы препарата (15 г) соответственно, в граммах.

Результаты и их обсуждение

Поиск оптимальных условий анализа. Ранее нами были предложены оригинальные методики анализа новых лекарственных препаратов - таблеток и гранулированного порошка «Пятикомпонентный препарат от простуды» [1]. Четкое разделение действующих и вспомогательных веществ было получено в режиме линейного градиента при изменении состава подвижной фазы от 0,34%-ного раствора калия фосфата однозамещенного (рН 3,0) до смеси (1:1) ацетонитрил - 0,34%-ный раствор

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009

Таблица 1

Некоторые метрологические характеристики методики определения действующих веществ в многокомпонентном лекарственном препарате от простуды

Компоненты Интервал содержаний по НД, % от номинала Метрологические характеристики

s , г £ , % e , % Aer, % К

Аскорбиновая кислота ± 10,0 6 * 0 4 3,0 - 0,383 0,2 44 0,994

Парацетамол ± 5,0 0 * ,9 СО 1,7 - 0,238 0,280 0,992

Гидрохлорид фенилэфрина ± 10,0 ю О * ,0 2, 1,4 - 0,541 0,221 0,998

Малеат фенирамина ± 7,5 ю О * ,0 1,4 - 0,241 0,226 0,998

Таблица 2

Результаты анализа трех образцов многокомпонентного лекарственного препарата от простуды

Компоненты Содержание в одной дозе, г

Интервал содержаний по НД Хср s ^ср р х° с £, %

Аскорбиновая кислота 0,045-0,055 0,0475 0,0500 0,0487 0,00100 0,00020 0,00060 0,00033 0,00007 0,00020 0,00079 0,00002 0,00047 1,66 0,03 0,97

Парацетамол 0,308-0,341 0,3200 0,3120 0,3160 0,00300 0,00200 0,00200 0,00130 0,00067 0,00067 0,00240 0,00160 0,00160 0,74 0,50 0,50

Гидрохлорид фенилэфрина 0,009-0,011 0,0098 0,0097 0,0101 0,00010 0,00008 0,00007 0,00003 0,00003 0,00002 0,00008 0,00006 0,00006 0,80 0,65 0,55

Малеат фенирамина 0,0185-0,0215 0,0199 0,0201 0,0203 0,00010 0,00006 0,00010 0,00003 0,00002 0,00003 0,00008 0,00005 0,00008 0,40 0,23 0,39

калия фосфата однозамещенного (рН 3,0) в течение 16 минут. Детектирование вели при 216 нм, что обеспечивало оптимальную чувствительность при определении компонентов, содержащихся в относительно малых количествах. Состав саше, исследуемого в данной работе, отличается от указанных препаратов отсутствием кодеина фосфата, заменой малеата хлорфенирамина на МФ и более высоким содержанием П. Несмотря на меньшее число действующих веществ, количественный анализ этого препарата не менее сложен. Так, при 216 нм разрешение пика АК с одним из соседних пиков недостаточно для получения правильных и воспроизводимых количественных результатов. Изменение продолжительности градиента в данном случае положительного эффекта не дает в связи с малым удерживанием АК и соседних пиков. Повышение рН подвижной фазы приводит к диссоциации АК (рК 4,17) и других органических кислот, входящих в состав порошка, и их одновременному элюированию. Кроме того, при 216 нм высота пика П для раствора РСО соответствует 2,2-2,4 единицы оптической плотности. Нами установлено, что при

этих условиях нет линейной зависимости между концентрацией П и площадью его пика. Так, в модельном растворе, в который ввели 1,44 мг/мл П, было найдено 1,50 мг/мл. Расчет вели по раствору РСО, содержащему 1,62 мг/мл П.

По этим причинам было принято решение вести детектирование при 273 нм. Эта длина волны соответствует максимуму поглощения Ф - компонента, содержащегося в пробе в наименьшем количестве. При этой длине волны отсутствует мешающее влияние при определении АК. Линейная зависимость между концентрацией П и площадью его пика соблюдается в диапазоне концентраций ±10% от номинальной.

Одно из действующих веществ препарата - МФ обладает меньшим удерживанием, чем содержащийся в таблетках «Пятикомпонентный препарат от простуды» малеат хлорфенирамина. Поэтому в данной работе при использовании такой же колонки мы снизили конечную концентрацию органического модификатора в подвижной фазе (соотношение с фосфатным буферным раствором 2:3 вместо 1:1) и сократили время линейного участка градиента

Рис. 1, а, б. Хроматограмма испытуемого раствора для анализа многокомпонентного

лекарственного препарата от простуды:

1 - аскорбиновая кислота, 2 - фенилэфрин, 3 - парацетамол, 4 - фенирамин

до 10 мин. При использовании колонок других размеров с обращенно-фазовыми сорбентами, отличными по селективности, возможно изменение продолжительности градиента. Кроме этого для оптимизации времени удерживания последнего пика можно рекомендовать градиент рН (повышение рН буферной составляющей элюента В до 4,6, что соответствует 0,34%-ному раствору КН2РО4 без добавления Н3РО4). Этот прием аналогичен способу, использованному нами в работе [1], и позволяет улучшить разделение пика МФ с соседним пиком одного из вспомогательных веществ.

Полученная хроматограмма испытуемого раствора представлена на рисунке 1, а, б.

АК нестабильна в водных и водно-органических растворах: при растворении происходит ее обратимое окисление до дегидроаскорбиновой кислоты. Дегидроаскорбиновая кислота подвержена дальнейшему разложению [3, 4]. В связи с этим при анализе препаратов, содержащих АК, для получения достоверных и воспроизводимых результатов необходима стабилизация растворов. Такие условия можно обеспечить разными способами, например, добавлением в испытуемый раствор метафосфор-ной кислоты [5]. При анализе гранулированного порошка «Пятикомпонентный препарат от простуды» разложение АК в растворе замедляли добавлением фосфатного буфера с рН 7,4 и сульфита натрия [1]. Позднее нами было показано, что АК также относительно стабильна в смеси (1:19) ацетонитрил -0,1%-ная ортофосфорная кислота [2]. По нашему мнению, для анализа многокомпонентного препарата от простуды последний вариант оптимален, поскольку обеспечивает постоянство площади пика АК в течение как минимум двух часов после приготовления раствора.

Метрологические характеристики. Для подтверждения достоверности результатов определения анализировали 17 модельных смесей, содержащих все действующие и все вспомогательные (плацебо) вещества препарата. Смеси отличались количеством действующих веществ, которые вводили в диапазоне от 80 до 120% от нормируемого количества для АК, Ф и МФ и от 90 до 110% для П. Сравнение величин средних относительных погрешностей определения компонентов егср с соот-

ветствующими доверительными интервалами Aer показывает, что при определении АК, Ф и МФ имеет место систематическая погрешность (егср>Аег). Учитывая, что это превышение незначительно по величине, а интервал содержаний компонентов согласно нормативной документации превышает егср в несколько раз, этот результат можно считать положительным. Площади пиков определяемых веществ линейно зависят от их концентраций в указанном диапазоне (коэффициент корреляции Ккорр>0,99). Некоторые метрологические характеристики методики представлены в таблице 1.

Анализ образцов. По предлагаемой методике проанализированы три образца препарата. Все образцы соответствуют требованиям нормативной документации по подлинности и количественному содержанию действующих веществ. Полученные результаты и метрологические характеристики анализа представлены в таблице 2.

Предложенная методика включена в ФСП на данный препарат.

ЛИТЕРАТУРА

1. Голубицкий Г. Б., Будко Е. В., Прохода Е. Ф., Покровский М. В., Захарова Е. В. Способ количественного определения состава многокомпонентных лекарственных препаратов жаропонижающего, аналгезирующего, противопростудного действия. - Пат. 2267115 Российская Федерация. Опубл. 27.12.05. - Бюл. № 36. -22 с.

2. Голубицкий Г. Б., Будко Е. В., Басова Е. М., Костарной А. В., Иванов В. М. Устойчивость аскорбиновой кислоты в водных и водно-органических растворах для количественного определения // Ж. аналит. химии. - 2007. - Т. 62. № 8. -С.823-828.

3. Deutsch John C. Dehydroascorbic acid // J. Chromatogr. A. -2000. - V. 881. № 1-2. - P. 299-307.

4. Gokmen V., Kahraman N., Demir N., Acar J. Enzymatically validated liquid chromatographic method for the determination of ascorbic and dehydroascorbic acids in fruit and vegetables // J. Chromatogr. A. - 2000. - V. 881. № 1-2. - P. 309-316.

5. Iwase H., Ono I. Determination of ascorbic acid in food by column liquid chromatography with electrochemical detection using eluent for prerun sample stabilization. Technical note // J. Chromatogr. A. - 1998. - V. 806, № 2. - P. 361-364.

Поступила 02.03.2009

Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009