Биоразнообразие бактерий деструкторов хлорированных феноксикислот

Жарикова Н.В., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Ясаков Т.Р.,

Анисимова Л.Г., Маркушева Т.В.

Учреждение РАН Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа

БИОРАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ -ДЕСТРУКТОРОВ ХЛОРИРОВАННЫХ ФЕНОКСИКИСЛОТ

Исследованы микроорганизмы, спосбные к вовлечению в процессы обмена веществ хлорированных производных ароматического ряда. Описаны новые бактериальные деструкторы, выделенные из образцов почв крупнейшего предприятия Уфимского промузла ОАО «Уфахимп-ром», проведена их идентификация и рассмотрена субстратная активность в отношении хлорированных феноксикислот.

Ключевые слолова: бактерии-деструкторы, хлорированные феноксикислоты, ксенобиотики.

В ряде исследований было отмечено, что в биоценозах, подвергавшихся долговременному действию ксенобиотиков, формировались микроорганизмы, поддерживавшие свою численность за счет утилизации присутствовавших в окружающей среде синтетических молекул. Прежде всего это замечание было отнесено к бактериям. Популяции таких бактерий становились частью природных сообществ, способной вовлечь в круговорот органического вещества разные производные, в том числе загрязнители промышленного ряда. С учетом указанных наблюдений был предпринят поиск бактерий - деструкторов 4-хлорфеноксиуксусной (4-ХФУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д) и

2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот (2,4,5-Т) в популяциях почвенных микроорганизмов, подвергавшихся воздействию факторов нефтехимического производства.

В работе были использованы почвенные образцы, отобранные методом случайных проб на территории крупнейшего предприятия по производству гербицидов - ОАО «Уфахимпром». В качестве контроля использовали почву, полученную из Зилаирского района, удаленного от техногенной зоны.

Чистые культуры микроорганизмов-деструкторов выделяли по методу Коха с модификациями. Идентификацию штаммов осуществляли согласно признакам фенотипической и физиолого-биохимической дифференциации бактерий [1, 2].

Посевной материал бактерий получали выращиванием культур в разбавленном мясопеп-тонном бульоне (1МПБ:7Н2О) при температуре +30 оС. Далее его засевали в количестве 0,01% от объема в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): КН4С1 - 1.0; К2НР04 - 5.0; М§Б04 Ч 7Н20 - 0.05; Ре804Ч7Н20 - 0.005;

СиБ04Ч5Н20 -0.001; 7пБ04 - 0.0008; pH - 6.87.0. В качестве единственного источника углерода и энергии в среду добавляли 4-ХФУК, 2,4-Д или 2,4,5-Т. Рост контролировали по изменению плотности клеточной суспензии.

На первом этапе работ был проведен анализ бактериального компонента исследуемого биоценоза. Результаты количественных оценок показали, что в микробном сообществе отмечалось присутствие сапрофитных бактерий (табл. 1).

При этом численность представителей указанной группы во всех пробах, отобранных на территории ОАО «Уфахимпром», была существенно ниже контрольной. Оценка бациллярных форм в состоянии спор проводилась в четырех пробах и позволила установить, что такие формы отсутствовали в одном образце, а в остальных трех этот показатель был меньше контрольного и только в одном варианте превышал контроль.

Приведенные результаты указывали на то, что в целом популяции микроорганизмов исследованных почв были обеднены бактериальной составляющей. Одним из объяснений причин этого явления могло быть сильное отрицательное воздействие загрязнителей (или их комплекса) на популяции почвенных микроорганизмов в указанных точках отбора, следствием которого и явилось отсутствие разнообразия микроорганизмов в средах, подвергнутых анализу.

С целью выявления деструкторов хлорированных феноксиуксусных кислот среди обнаруженной группы отдельные колонии бактерий были высеяны на селективные жидкие среды с ксенобиотиками, присутствовавшими в их составе в качестве единственного источника углерода и энергии. По положительным оценкам роста в указанных условиях были выявлены 4 изолята, обладавшие способностью использовать в качестве субстрата 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т. При

Таблица 1. Количественные оценки бактериальной составляющей популяций почвенных микроорганизмов

Характеристика почвенной пробы Число КОЕ бактерий в пробе,

источник № пробы бактерии, n х 103, мл -1 спорообразующие формы, n х 103, мл -1

ОАО «Уфахимпром» 32 2 ± 0,42 10 і 0,1

35 12 ± 1,68 8 і 0,42

39 238 ± 1,26 96 і 1,68

207 14 ± 0,42 0

300 8 ± 1,26 не опр.

208 472 ± 2,1 не опр.

209 22 ± 0,4 не опр.

Зилаирский район 44 272 ± 1,6 48 і0,42

Таблица 2. Штаммы-деструкторы и оценки их роста в условиях использования ксенобиотиков в качестве единственного источника углерода и энергии

Источник пробы № пробы Штаммы Субстраты

4-ХФУК 2,4-Д 2,4,5-T

ОАО «Уфахимпром» 32 1. Arthrobacter globiformis IBRB 17S + + +

БОС 2. Bacillus subtilis IBRB 16 + + +

39 3. Pseudomonas fluorescens IBRB 39D + + +

35 4. Pseudomonas putida IBRB 19S + + +

этом штаммы-деструкторы были обнаружены во всех исследованных образцах почв ОАО «Уфахимпром» (№ 32, 35, 39), а также в составе активного ила БОС ОАО «Уфахим-пром». Они были определены по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам и обозначены как Arthrobacter globiformis IBRB-17S, Bacillus subtilis IBRB-16, Pseudomonas fluorescens IBRB-39D, Pseudomonas putida IBRB-19S (таб. 2).

Оценки роста бактерий в условиях использования 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве источников углерода и энергии приведены в таблице 2. Из этих данных понятно, что все четыре исследованных штамма, а именно: Art. globiformis IBRB-17S, B. subtilis IBRB-16, Ps. fluorescens IBRB-39D и. Pseudomonas putida IBRB-19S, были способны метаболизировать все указанные соединения.

С целью обсуждения новизны полученных результатов было проведено их сравнение с известными сведениями о деструкторах 4-ХФУК,

2,4-Д и 2,4,5-Т. Оказалось, что ранее было выявлено несколько штаммов - деструкторов фенола и его производных, отнесенных к родам Arthrobacter, Bacillus и Pseudomonas, представители которых также присутствовали в составе

смешанных популяций трансформированного экотопа.

Например, несколько культур Arthrobacter sp. использовали в качестве источника питания

2.4-Д [3, 4]. Однако среди деструкторов хлор-феноксиуксусных кислот ранее не был описан штамм, относящийся к виду Arthrobacter globiformis, а именно такой штамм был обнаружен в пробе почвы ОАО «Уфахимпром».

Имеются сведения о Bacillus subtilis KCM-RG5, способном к конверсии 2,4-Д [5]. В то же время штаммы рода Bacillus как деструкторы

2.4.5-Т и 4-ХФУК ранее отмечены не были. Большинство исследованных ранее деструкторов хлорароматических соединений было отнесено к роду Pseudomonas. Согласно разным авторам, конверсию 4-ХФУК мог метаболизировать один штамм, 2,4-Д - двадцать один, а

2.4.5-Т - один из представителей псевдомонад [6]. Вместе с тем штаммы вида Ps. fluorescens среди деструкторов 4-ХФУК и 2,4,5-Т, относящихся к роду Pseudomonas, не были описаны, в то время как такой штамм были обнаружен в исследованном биоценозе. Некоторые штаммы вида Ps. putida были выявлены как деструкторы

2.4-Д [7]. Отмечено, что в ряде случаев деструкторы рода Pseudomonas обладали полисубстрат-

ной активностью, но ни для одного из них не была установлена полисубстратная активность в отношении 2,4-ДХФ, 4-ХФУК и 2,4,5-Т, как это показано выше для Ps. putida IBRB-19S.

Обобщая полученные данные и их обсуждение, можно заключить, что в составе популяций почвенных микроорганизмов, подвергавшихся воздействию факторов нефтехимического производства, обнаружено четыре штамма - деструктора 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-

Т, принадлежавших к родам Arthrobacter, Bacillus и Pseudomonas. На примере вновь выделенных штаммов Arthrobacter globiformis, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas putida впервые была обнаружена полисубстратная активность бактерий упомянутых родов по отношению к 4-ХФУК,

2,4-Д и 2,4,5-Т, которые использовались в экспериментах как единственные источники углерода и энергии.

Список использованной литературы:

1. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. 9-е изд. В 2-х т. М: Мир, 1997. 799 с.

2. Скворцова И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus. М.: Изд-во МГУ, 1984. 26 с.

3. Bollag J.-M., Helling C.S., Alexander M. 2,4-D metabolism. Enzymatic hydroxylation of chlorinated phenols // J. Agr. Food Chem. 1968. Vol. 16. P. 826-828.

4. Tiedje J.M., Alexander M. Enzymatic cleavage of the ether bond of 2.4-D // J. Agr. Food Chem. 1969. Vol.17, №5. P.1080-1084.

5. Satchanska G., Topalova Y., Ivanov I., Golovinsky E. Xenobiotic biotransformation potential of Pseudomonas rhodesiae KCM-R5 and Bacillus subtilis KCM-RG5, tolerant to heavy metals and phenol derivatives // Biotechnology and Biotechnological Equipment. 2006. Vol. 20. №1. P. 97-102.

6. Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Кусова И.В. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных. Уфа: Гилем, 2002. 108 с.

7. Short K.A., Seidler R.J., Olsen R.H. Survial and degradative capacity of Pseudomonas putida induced or constitutively expressing plasmid-mediated degradation of 2,4-dichlorophenoxyacetate (TFD) in soil // Can. J. Microbiol. - 1990. Vol. 36. P. 821-829.

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых», гранта «Биоразнообразие и динамика генофондов», гранта Роснауки «Поддержка сети ЦКП, мероприятие 5.2» и программы УМНИК.