Молекулярные механизмы устойчивости atcpk1-трансгенных клеток марены сердцелистной ( Rubia cordifolia) к температурным стрессам

Вестник ДВО РАН. 2015. № 5

УДК 577.2

С.А. СИЛАНТЬЕВА, Г.Н. ВЕРЕМЕЙЧИК, ЮН. ШКРЫЛЬ, В.П. БУЛГАКОВ

Молекулярные механизмы устойчивости AtCPKl-трансгенных клеток марены сердцелистной (Rubia cordifolia) к температурным стрессам

Изучено влияние гетерологичной экспрессии гена кальций-зависимой протеинкиназы AtCPKl на молекулярные элементы системы генерации и детоксификации в стресс-устойчивых трансгенных клетках марены сердцелистной (Rubia cordifolia).

Ключевые слова: кальций-зависимые протеинкиназы, температурный стресс, марена сердцелистная, клеточные культуры растений.

Molecular mechanisms of AtCPKl-transgenlc cells tolerance of Indian madder (Rubia cordifolia) to temperature stresses. S.A. SILANT'EVA, G.N. VEREMEICHIK, Y.N. SHKRYL, VP. BULGAKOV (Institute of Biology and Soil Science, FEB RAS, Vladivostok).

The effect of heterologous expression of calcium-dependent protein kinase AtCPKl gene on molecular elements of generation and detoxification in stress resistant transgenic cells of Indian madder (Rubia cordifolia) was studied.

Key words: calcium-dependent protein kinases, temperature stress, Indian madder, plant cell cultures.

Температурный стресс оказывает неблагоприятное воздействие на метаболизм растений, нарушая клеточный гомеостаз и угнетая физиологические процессы. Одним из стресс-индуцированных ответов клетки растения является накопление активных форм кислорода (АФК), продуцируемых НАДФН-оксидазами - гомологами оксидаз респираторного взрыва Rboh (respiratory burst oxidase homologs) [8]. Известно, что устойчивость растений к температурному стрессу напрямую зависит от эффективности детоксификации АФК посредством антиоксидантных ферментов [7]. Процесс детоксификации АФК в растениях включает в себя повышение экспрессии генов, кодирующих белки, такие как супероксиддисмутазы - SOD, аскорбатпероксидазы - Apx и каталазы - CAT [3]. Баланс в функционировании элементов системы генерации и детоксификации АФК определяет окислительно-восстановительное равновесие клетки и обеспечивает ее нормальное функционирование. Существующие способы получения трансгенных растений, устойчивых к стрессам, включают как ингибирование НАДФН-оксидаз [10], так и повышение экспрессии генов отдельных антиоксидантных ферментов [6]. Новым подходом в данном направлении является генно-инженерное воздействие на молекулярный аппарат регуляции метаболизма АФК, например гены кальций-зависимых протеинкиназ.

Кальций-зависимые протеинкиназы - CDPK - обширное семейство протеинки-наз, специфичных для растений, водорослей и некоторых простейших [1]. Изоформа 1

*СИЛАНТЬЕВА Славена Анатольевна - ведущий инженер, ВЕРЕМЕЙЧИК Галина Николаевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ШКРЫЛЬ Юрий Николаевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, БУЛГАКОВ Виктор Павлович - член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией (Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток). *E-mail: slava.bar@mail.ru

арабидопсиса - AtCPKl опосредует передачу сигнала клетки в ответ на стрессовые воздействия и атаку патогена [2], а также участвует в регуляции биосинтеза салициловой кислоты [2] и вторичных соединений [9]. Получены мутантные варианты гена AtCPKl: KJMl-мутация (AtCPKl-Ca) преобразует дикий тип AtCPKl в постоянно активную Ca2+-независимую форму [4], КЖ2-мутация (AtCPKl-Na) преобразует дикий тип AtCPKl в неактивную форму [5].

Ранее мы получили трансгенные клеточные культуры марены сердцелистной (Rubia cordifolia) R-Ca и R-Na, экспрессирующие Са2+-независимую и неактивную форму AtCPKl, соответственно. Нами показано, что сверхэкспрессия AtCPKl-Ca привела к 10-кратной активации биосинтеза основных вторичных метаболитов марены - антрахинонов. Кроме того, культура R-Ca обладала повышенной устойчивостью к стрессовым температурным воздействиям - как к понижению, так и к подъему температуры.

Для выявления возможного молекулярного механизма устойчивости R-Ca культуры к температурным стрессам нами исследована экспрессия генов НАДФН-оксидаз марены -RcRbohl (стресс-индуцируемая изоформа) и RcRboh3 (постоянно-экспрессируемая изо-форма). Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени мы провели анализ экспрессии генов RcRbohl и RcRboh3 в нормальной и трансгенных клеточных линиях в экспоненциальной (20 дней) и стационарной (30 дней) фазах роста (см. таблицу).

Сверхэкспрессия AtCPKl-Ca приводила к трехкратному снижению уровня экспрессии RcRboh3 в экспоненциальной фазе роста и дальнейшему его снижению при последующем культивировании. Сверхэкспрессия AtCPKl-Na также оказывала влияние на экспрессию RcRboh3, снижая ее в логарифмической фазе роста трансгенных клеточных линий. Экспрессия RcRbohl под действием AtCPKl-Ca и AtCPKl-Na статистически не изменялась. При этом в экспоненциальной фазе роста уровень экспрессии RcRboh3 в культуре R-Ca был в 3 раза ниже, чем в культуре R, а в стационарной фазе роста эта разница составляла всего 1,7 раза.

Таким образом, показано, что AtCPKl-Ca приводит к снижению экспрессии постоян-но-экспрессируемой изоформы и не оказывает влияния на стресс-индуцируемую изофор-му генов НАДФН-оксидаз марены. Это указывает на снижение порога чувствительности к стрессовым воздействиям за счет модуляции работы основного источника АФК при стресс-индуцируемом окислительном взрыве.

Для выявления изменений в экспрессии генов супероксиддисмутазы, аскорбатперок-сидазы и каталазы марены выполнен анализ экспрессии генов RcCSDl, RcCSD2, RcCSD3, RcApxl, RcApx2, RcApx3 и RcCATв нормальной и трансгенных клеточных линиях в экспоненциальной (20 дней) и стационарной (30 дней) фазах роста.

В нормальных и трансгенных культурах CSDl, CSD2, CSD3 экспрессированы с различной интенсивностью (см. рисунок, a). AtCPKl-Ca в экспоненциальной фазе роста клеточных линий незначительно повышал экспрессию CSDl и оказывал влияние на экспрессию CSD3, приводя к 2-кратному увеличению. В AtCPKl-Na- и AtCPKl-Ca-трансформированных культурах к 20-му дню культивирования наблюдали 2-кратное увеличение экспрессии CSD3. К 30-му дню культивирования AtCPKl-Ca и AtCPKl-Na не оказывали статистически значимого влияния на экспрессию CSD2, CSD3, лишь незначительно снижая экспрессию CSDl.

В нормальных культурах уровень экспрессии Apxl, Apx2, Apx3 снижается со временем культивирования (см. рисунок, б). AtCPKl-Ca приводил к 2- и 2,5-кратному повышению экспрессии Apx2, и 5- и 3-кратному повышениюApx3 в экспоненциальной и стационарной

Экспрессия генов НАДФН-оксидаз в клеточных культурах марены

Гены Клеточные культуры

R R-Ca R-Na

RcRbohl RcRboh3 0,84 ± 0,05 / 0,80 ± 0,08 / 0,64 ± 0,01 / 0,76 ± 0,10 0,80 ± 0,07 0,75 ± 0,03 0,83 ± 0,08 / 0,28 ± 0,02 / 0,72 ± 0,02 / 0,47 ± 0,02 0,31 ± 0,01 0,28 ± 0,03

фазах роста, соответственно. AtCPK1-Na оказывал влияние на экспрессию Apx3, приводя к 2-кратному ее увеличению в стационарной фазе роста и 2,5-кратному увеличению экспрессии Apx2, а также незначительно снижая экспрессию Apx1 в экспоненциальной фазе роста клеточной линии.

Уровень экспрессии CAT в нормальных клеточных линиях марены снижается со временем культивирования (см. рисунок, в). В культурах, трансформированных AtCPK1-Ca и AtCPK1-Na, экспрессия CAT в экспоненциальной фазе роста незначительно снижена, к 30-му дню культивирования незначительно повышается в культурах, трансформированных AtCPK1-Na.

Таким образом, в трансгенных клеточных линиях отмечено повышение экспрессии генов антиоксидантных ферментов в экспоненциальной фазе роста, что соответствует снижению экспрессии RcRboh3. Мы показали, что в культуре R-Ca окислительный взрыв регулируется как на стадии генерации АФК, так и на стадии детоксификации. Это приводит к снижению у трансгенных клеток порога чувствительности к стрессовым воздействиям, которые в норме сопровождаются губительным для клеток окислительным взрывом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Cheng S.H., Willmann M.R., Chen H.C., Sheen J. Calcium signaling through protein kinases. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family // Plant Physiol. 2002. Vol. 129, N 2. P. 469-485.

2. Coca M., San Segundo B. AtCPK1 calcium-dependent protein kinase mediates pathogen resistance in Arabidopsis // Plant J. 2010. Vol. 63, N 3. P. 526-540.

3. Gill S.S., Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. // Plant Physiol. Biochem. 2010. Vol. 48, N 12. P. 909-930.

4. Harper J.F., Huang J.F., Lloyd S.J. Genetic identification of an autoinhibitor in CDPK, a protein kinase with a calmodulin-like domain // Biochemistry. 1994. Vol. 33, N 23. P. 7267-7277.

5. Huang J.F., Teyton L., Harper J.F. Activation of a Ca2+-dependent protein kinase involves intramolecular binding of a calmodulin-like regulatory domain // Biochemistry. 1996. Vol. 35, N 40. P. 13222-13230.

6. Lee S.H., Ahsan N., Lee K.W., Kim D.H., Lee D.G., Kwak S.S., Kwon S.Y., Kim T.H., Lee B.H. Simultaneous overexpression of both CuZn superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in transgenic tall fescue plants confers increased tolerance to a wide range of abiotic stresses // J. Plant Physiol. 2007. Vol. 164, N 12. P. 1626-1638.

7. Price A.H., Taylor A., Ripley S.J., Griffiths A., Trewavas A.J., Knight M.R. Oxidative signals in tobacco increase cytosolic calcium // Plant Cell. 1994. Vol. 6, N 9. P. 1301-1310.

8. Sagi M., Fluhr R. Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases // Plant Physiol. 2006. Vol. 141, N 2. P. 336-340.

9. Shkryl Y.N., Veremeichik G.N., Bulgakov V.P., Zhuravlev Yu.N. Induction of anthraquinone biosynthesis in Rubia cordifolia cells by heterologous expression of a calcium-dependent protein kinase gene // Biotechnol. Bioeng. 2011. Vol. 108, N 7. P. 1734-1738.

10. Wi S.J., Ji N.R., Park K.Y. Synergistic biosynthesis of biphasic ethylene and reactive oxygen species in response to hemibiotrophic Phytophthora parasitica in tobacco plants // Plant Physiol. 2012. Vol. 159, N 1. P. 251-265.

Экспрессия генов супероксиддисмутаз