Штамм бактерий Bacillus megaterium V3 в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности винограда, зерновых, овощных и древесных культур
BACILLUS MEGATERIUM V3 BACTERIA STRAIN AS A MEANS FOR ACCELERATING GROWTH AND INCREASING THE PRODUCTIVITY OF GRAPE, CEREAL, VEGETABLE AND TREE CROPS

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 для растениеводства в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур.
4
Известен биопрепарат Фосфоробактерин для повышения плодородия почвы на основе штамма бактерий Bacillus megaterium subsp. Phosphaticum 49, описанный в авт. св. СССР №97943 на изобретение «Способ получения фосфоробактерина» (з. 447504, пр. 26.01.1952), МКИ кл. 16, 14; автор - Менкина Р.А.
В указанном способе бактерии выращивают на картофельной среде, высушивают и смешивают с порошкообразным каолином, служащим субстратом для сохранения спор высушенных бактерий. При использовании Фосфоробактерина происходит минерализация сложных фосфороорганических соединений, что приводит к повышению плодородия почвы.
Известны также зарубежные публикации, в которых описано использование бактерий вида Bacillus megaterium в качестве средства стимуляции роста растений и/или их корней (например, в патенте KR 20100963774 В1 от 14.06.2010 г. на штамм Bacillus megaterium KNUC 251 или в заявке США 20130014434, опубликованной 17.01.2013 г., в которой питательная композиция для корней пересаживаемого растения содержит в числе других микроорганизмов бактерии Bacillus megaterium) или в качестве средства для борьбы с болезнями растений (например, в патенте US 054035830, опубликованном 04.04.1995 г. на штамм Bacillus megaterium АТСС 55000 в качестве средства биологической борьбы с заболеваниями сои, вызванными грибом Rhizoctonia solani).
Известен также Патент РФ №2327737 с пр. 01.08.2006 г. на изобретение «Штамм бактерий Bacillus megaterium, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину», МПК C12N 1/20, C05F 11/08, C12R 1/11, опубликовано 27.06.2008 г.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и геохимии. Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д способен выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчив к полигексаметиленгуанидину. Штамм может быть использован для получения бактериального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожайность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загрязненных земель, а также в биотехнологических работах в области геохимии.
Известен также штамм ризосферных бактерии Bacillus subtilis Ч-13, используемый в качестве средства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности овощных, зерновых и технических культур (патент РФ №2259397 с пр. 02.04.2003 г. ). Штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 используют для производства микробиологического удобрения в торфяной форме «Бисолби», сухой форме «БисолбиФит» и жидкой форме «Экстрасол» (Свидетельство о гос.регистрации №0680-07-2018-216-0-0-0-1 от 29.03.2007).
Известен патент РФ №2558291 с пр. 24.12.2013 г. на изобретение «Полифункциональное средство для растениеводства», МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано: заявка 27.062015 г., патент 27.07.2015 г. (прототип).
Описанный штамм споровых бактерий Bacillus megaterium 501 GR обладает ростостимулирующим эффектом, улучшает фосфорное питание растений, а также способствует биоремедиации загрязненных пестицидами почв. Использование штамма Bacillus megaterium 501 GR позволяет повысить продуктивность растений, а также защитить их от фитопатогенных грибов и микроорганизмов, вызывающих заболевания корней.
Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для использования в сельском и лесном хозяйстве в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур, позволяющего расширить арсенал подобных средств.
Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур в сельском и лесном хозяйстве используется штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3.
Штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 был выделен из внутренних тканей черенков винограда (Vitus vinifera L.), сорта «Мускат черный» и депонирован 07.11.2016 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) в ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 04324. Справка о депонировании штамма прилагается.
Среда культивирования: питательный агар (готовая питательная среда производства ООО «Биокомпас-С», ТУ 10-02-02-789-176-94). Оптимальная температура для роста 32°С. Культивирование в течение 48 часов.
Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.
Бактерии представляют собой мелкие прямые палочки длиной 1,5-2 мкм, образуют споры. На питательном агаре образуют кожистые колонии кремового цвета пастообразной консистенции с неровными изрезанными ризоидными краями и плоским профилем; матовая поверхность в центре переходит в блестящую к краю колонии. Диаметр колоний 10-15 мм. Оптимальная температура роста 32°С; при температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 7,1; рост происходит также при рН от 4,5 до 8,0.
В качестве единственного источника углерода штамм использует декстрин, мальтозу, целлобиозу, сахарозу, туранозу, стахиозу, раффинозу, глюкозу, маннозу, фруктозу, галактозу, манитол, глицерол, пектин. Использует минеральные формы азота: соли аммония и нитраты. Каталазо- и оксидазо-положительный желатин не гидролизует. Утилизирует аминокислоты: L-аланин, L-аргинин, L-аспартам, L-глутамин, L-серин; органические кислоты: лимонную, яблочную, γ-аминомасляную, α-кетомасляную, ацетоуксусную, уксусную. Проявляет сахаролитическую, амилолитическую, липолитическую активность. Обладает способностью к денитрификации и азотфиксации. Растет при 10% NaCl.
Экспериментально установлено, что штамм Bacillus megaterium V3 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, в частности, к овсу, кресс-салату, редису, томатам, винограду, а также древесным культурам, в частности к ели и сосне.
9
Так, в лабораторном опыте определяли ростостимулирующую активность штаммов Bacillus megaterium V3 и Bacillus megaterium 501 GR на растениях кресс-салата сорта «Данский». Для этого были приготовлены 0,1%, 1% и 10% растворы бактериальных суспензий исследуемых штаммов с изначальным титром бацилл (1,2-1,3)10 КОЕ/мл. Семена кресс-салата помещали в стерильные пробирки, заливали приготовленными растворами исследуемых штаммов и замачивали на 30 мин. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Подготавливали «влажные камеры»: в стерильные чашки Петри раскладывали фильтровальную бумагу и увлажняли стерильной водопроводной водой объемом 6 мл на камеру. Семена кресс-салата стерильным пинцетом помещали на поверхность влажных камер по 20 шт. на чашку. На каждый вариант делалось минимум 3 повторности. Влажные камеры помещали в фитотрон и инкубировали 5 суток при температуре 28°C. После инкубации измеряли длину побега и корня проростков. Полученные данные обрабатывали с помощью программы Excel. Результаты опыта представлены в Таблице 1.
Из данных, представленных в Таблице 1, видно, что 0,1-10% растворы бактериальной суспензии Bacillus megaterium V3 оказывали эффективное влияние на длину корней кресс-салата, увеличивая ее на 17,6-65,2% по сравнению с контролем, а также большее стимулирующее влияние на длину корней кресс-салата по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus megaterium 501 GR.
Были проведены микровегетационные опыты, в которых определяли влияние бактерий Bacillus megaterium на развитие корневой системы и на развитие зеленой массы растений овса сорта «Боррус» (Avena sativa L.).
2
4
Опыты по влиянию бактерий Bacillus subtilis Ч-13 и Bacillus megaterium V3 на развитие корней овса в зависимости от концентрации изучаемых штаммов проводили в вегетационном боксе с 16 часовым световым днем, температурой 22°C и интенсивностью света 5000-6000 лк. В качестве субстрата использовали предварительно просеянный и отмытый от глинистых и иных примесей кварцевый песок с фракцией 0,6-1,0 мм. Песок стерилизовали в течение часа при 1,5 атм., остужали и набивали сосуды по весу. Для полива и питания растений применяли минеральный раствор PNS. Инокуляцию проростков проводили ночной (20-ти часовой) культурой штаммов бактерий, выращенных на жидкой среде LB следующего состава (г/л): триптон - 10,0, дрожжевой экстракт -5,0, MgSO - 2,5, рН=7,2. Для этого семена овса помещали в чашку Петри и замачивали на 30 минут в рабочем растворе бактериальной суспензии с известным титром, после чего высаживали в песок. На сосуд высаживали по 9 семян овса, замоченных в суспензии изучаемых штаммов в течение 30 минут, без предварительного проращивания. Растения выращивали в течение 16 дней, после чего корневую систему отмывали от песка и анализировали в программе ImageJ 1.50b. Для анализа из каждого варианта отбирали по 5 типичных растений. Результаты опыта представлены в Таблице 2.
7
Микровегетационный опыт по влиянию бактерий Bacillus subtilis Ч-13 и Bacillus megaterium V3 на развитие зеленой массы растений овса сорта «Боррус» также проводили в вегетационном боксе с 16 часовым световым днем, температурой 22°C и интенсивностью света 5000-6000 люкс. Пластиковые стаканчики, объемом 0,5 л, набивали стерильным кварцевым песком по 470 г и проливали 72 мл раствора PNS. На сосуд высаживали по 9 семян овса, предварительно замоченных в суспензии изучаемых штаммов (10 КОЕ/мл) в течение 30 минут, без проращивания. Растения выращивали в течение 28 дней, после чего замеряли биометрические параметры. Результаты опыта представлены в Таблице 3.
6
7
Таким образом, из данных Таблицы 2 видно, что растворы бактериальной суспензии Bacillus megaterium V3, титром 10-10 КОЕ/мл оказывают существенное влияние на общую длину зародышевых корней овса с. «Боррус», увеличивая ее на 43-52% по сравнению с контролем. При этом штамм Bacillus megaterium V3 оказал большее стимулирующее влияние на общую длину зародышевых корней овса по сравнению со штаммом-аналогом Bacillus subtilis Ч-13, используемым для производства микробиологического удобрения в торфяной форме (Бисолби), сухой (БисолбиФит) и жидкой форме (Экстрасол).
Эти результаты были подтверждены также в другом микровегетационном опыте по изучению влияния указанных выше штаммов бактерий на биометрические показатели растений овса с. «Боррус». Из данных Таблицы 3 видно, что штамм Bacillus megaterium V3 увеличил биомассу растений овса на 21,1%, и длину корней растений на 6,8% по сравнению с контролем, а также что он более эффективно влияет на увеличение биомассы и длину корней растений овса с. «Боррус» по сравнению со штаммом - аналогом Bacillus subtilis Ч-13.
Был проведен также вегетационный опыт с овсом сорта «Боррус» для изучения эффективности агрономически полезных штаммов бактерий Bacillus subtilis Ч-13 и Bacillus megaterium V3. Опыт проводили в пленочной теплице на опытном поле ФГБНУ ВНИИСХМ, с 19/06 по 25/09 2015 года. Для опыта использовали почвогрунт следующего состава: просеянная дерново-подзолистая окультуренная почва - 60% и готовый почвогрунт Terra Vita (производство ЗАО «МНПП ФАРТ») - 40%. Сосуды набивали предварительно подготовленным грунтом по весу, после чего проливали водой. Полив осуществляли одинаковым объемом воды по мере подсыхания почвы.
7
Нестерильные семена предварительно проращивали при 28°C в течение двух суток до появления корешков 2-5 мм. Инокуляцию проростков проводили ночной (20-ти часовой) культурой изучаемых штаммов, выращенных на жидкой среде LB. Для этого семена помещали в чашку Петри и замачивали на 30 минут в рабочем растворе бактериальной суспензии с титром 10 КОЕ/мл, после чего высаживали в почву по 12 штук на сосуд. Титр бактериальных суспензий определяли методом последовательного разведения при высеве на агаризованную среду LB. В качестве аналога для оценки эффективности использовали штамм Bacillus subtilis Ч-13. Растения выращивали в течение 98 дней, после чего производили съем и оценку биометрических показателей и урожайности растений. Результаты опытов представлены в Таблице 4.
Из данных Таблицы 4 видно, что штамм Bacillus megaterium V3 увеличил по сравнению с контролем биомассу растений овса на 11%, высоту - на 7,8%, и урожай зерна овса - на 18,9%, а также, что он более эффективно влияет на агрономические показатели и урожайность овса (выше на 30%) по сравнению со штаммом - аналогом Bacillus subtilis Ч-13.
Были проведены опыты по определению влияния штамма Bacillus megaterium и Bacillus subtilis Ч-13 на биометрические показатели ели и сосны
6
В опыте пластиковые стаканчики объемом 0,2 л набивали стерильным кварцевым песком по 285 г и проливали 50 мл раствора солей PNS. На сосуд высаживали по 5 семян ели или по 4 семени сосны. Семена предварительно проращивали в ванночках из марли со стерильной водой в течение 10 дней, до появления корешка 1-2 мм. Проросшие семена замачивали в бактериальной суспензии штамма Bacillus subtilis Ч-13 и Bacillus megaterium V3 с титром 10 КОЕ/мл (в контроле - водой) в течение 30 минут и высаживали в песок. Растения выращивали в течение 62 дней, после чего корневую систему отмывали от песка и анализировали побеги и корни в программе ImageJ 1.50b, отбирая из каждого варианта по 10 типичных растений. Результаты опыта представлены в Таблице 5.
Таким образом, из данных, представленных в Таблице 5, видно, что заявляемый штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 оказал сильное влияние по сравнению с контролем на увеличение общей длины корневой системы ели и сосны - на 65% и 78% соответственно, а также на среднюю длину побега растений - увеличение на 62% и на 64% соответственно. При этом заявляемый штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 был более эффективен по сравнению со штаммом-аналогом  Bacillus subtilis Ч-13.
Высокая ростостимулирующая активность заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 вызвана способностью создавать с растением растительно-микробную систему путем колонизации эндофитными бактериями корневой системы и внутренних тканей (эндосферы) растения, что было подтверждено опытным путем.
Для исследований в качестве растительного материала использовали редис сорта «Ранний красный» (агрофирма «Поиск») и томаты сорта «Carmello» (Голландия). Для опыта из лаборатории были отобраны по две грам-положительных бактерии Bacillus megaterium V3 и Bacillus subtilis Ч-13. Колонизацию корней растений бактериями изучали в гнотобиотических системах, содержащих стерильный кварцевый песок с добавлением 15% питательного раствора (PNS).
2
5
Семена редиса стерилизовали 30 сек 70% раствором этилового спирта (СНОН) и затем 6 мин - 0,1% сулемы (HgCl2). После стерилизации семена тщательно отмывали стерильной водой, раскладывали в стерильные чашки Петри на увлажненную фильтровальную бумагу (5 мл на чашку) и проращивали при температуре 28°С в течение суток.
2
5
Семена томатов стерилизовали 30 сек 70% раствором этилового спирта (СНОН) и затем 3 мин - 4% раствором гипохлорита (HCLO). После стерилизации семена тщательно отмывали стерильной водой, раскладывали на агаризованную среду PNS и помещали в холодильник при t=6°C, а перед анализом - переносили в термостат и выдерживали при t=28°C двое суток.
Для инокуляции использовали ночную, 20 часовую, культуру микроорганизмов, выращенных на среде LB на качалке при 28°C. После этого клетки бактерий отделяли от ростовой среды центрифугированием и отмывали 0,85% раствором хлористого натрия (NaCl).
5
Стерильные проростки растений инокулировали, замачивая в течение 30 минут в суспензии бактериальных клеток с концентрацией 10 КОЕ/мл.
После инокуляции проростки растений высаживали в кварцевый песок (на глубину 5-6 мм) в стерильные гнотобиотические системы по 1 растению в каждую систему. Повторность опыта - шестикратная, т.е. для каждого варианта опыта анализировали по 6 растений. Растения выращивали в фитотроне при 21°C в течение 5 суток.
Для определения численности интродуцируемых бактерий в ризосфере и на поверхности корней, гнотобиотические системы разбирали, ризосферный слой песка с корней смывали водой и помещали на качалку на 1 час (5 мл воды на 1 корень растения).
Отмытый с корней песок использовали в качестве образцов ризосферы. Делали ряд последовательных разведений и учитывали численность интродуцированных бактерий в ризосфере высевом на среду LC. Ризосферный песок, отмытый с корней, высушивали при t=105°C для учета количества бактерий в массе ризосферы растений.
Для определения количества интродуцированных бактерий на поверхности корней (ризоплана), корни растений, отмытые от ризосферного песка, дополнительно промывали 0,85% раствором NaCl, растирали в ступке с 2 мл физ. раствора и делали ряд последовательных разведений. Численность бактерий учитывали на среде LC через 2 суток роста бактерий в термостате при t=28°C. Результаты опытов представлены в Таблицах 6 и 7.
Из данных, приведенных в Таблицах 6 и 7, видно, что заявляемый штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 способен так же колонизировать ризосферу и корни растений (редис, томаты), как и штамм - аналог ризосферных бактерий Bacillus subtilis Ч-13. Показатели колонизационной активности ризосферы и корней растений для штамма Bacillus megaterium V-3 были меньше, что объясняется в целом физиологией бактерий данного вида: крупными клетками, менее активной скоростью роста, наличием различных жизненных форм, а также тем, что данный штамм приспособлен к эндофитному существованию во внутренних тканях растений. Так, данный вид бактерий был обнаружен также в составе эндофитной микрофлоры различных растений, например, табака (Liu et al., 2014).
При использовании заявляемого штамма бактерии Bacillus megaterium V3 в составе различных микробных препаратов важным является то, что бактерии образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 12 месяцев после их получения.
5
9
5
9
Результаты исследований позволяют сделать вывод, что титр (количество жизнеспособных клеток и спор) штамма бактерий Bacillus megaterium V3 для его эффективного использования в составе различных микробных препаратов должен составлять 10-10 кл. в 1 мл культуральной жидкости. Так как экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 10 кл/мл ведет к снижению ростостимулирующего действия, а увеличение концентрации свыше 10 кл/мл приводит к ингибированию роста растений.
Ниже приведен пример получения жидкой формы микробного препарата на основе заявляемого штамма эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3.
Маточная культура
Для получения маточной культуры штамма бактерий Bacillus megaterium V3 использовали жидкую питательную среду, следующего состава: соевая мука -100 г/л; дрожжевой экстракт - 10 г/л; калий фосфорнокислый двузамещенный - 3 г/л; натрий хлористый - 1,0 г/л; магний сернокислый семиводный -1,0 г/л; дистиллированная вода - 1000 мл. Значение рН среды довели до 7,0.
9
Полученную жидкую питательную среду разлили в 750 мл - качалочные колбы по 100 мл и стерилизовали при 1 атм. 30 минут. Затем стерильно провели инокуляцию питательной среды в колбах микробиологической петлей из пробирки со скошенным питательным агаром (состав среды см. выше), содержащим чистую культуру Bacillus megaterium V3. После этого колбы поместили на качалку (220 об/мин) и культивировали в течение 48 часов при температуре 34°C. Таким образом в колбах была получена маточная культура Bacillus megaterium V3 с титром бактерий около 6⋅10 КОЕ/мл, которую хранили в холодильнике до 1 месяца при температуре +4°C для последующего засева бутылей или ферментеров.
Рабочая культура
9
Для промышленного культивирования штамма бактерий Bacillus megaterium V3 рабочую культуру получали в бутылях или ферментерах на аналогичной указанной выше среде (допускается ее разбавление в 2 раза). Норма инокуляции маточной культурой 2-5%, продолжительность культивирования - 72 часа при температуре 34°C. При выращивании рабочих культур допускается повышение температуры до 36°C. Так получали концентрат бактериальной суспензии с титром бактерий не менее 10 КОЕ/мл.
Жидкая форма биопрепарата на основе штамма Bacillus megaterium V3
8
Полученный концентрат бактериальной суспензии на основе штамма Bacillus megaterium V3 разводили стерильной водой в соотношении 1:10 или 1:20. Полученную жидкую форму выдерживали в течение 3-5 дней при температуре 20-25°C до получения титра бактерий не менее 1⋅10 КОЕ в 1 мл препарата, после чего препарат готов к применению для обработки сельскохозяйственных культур. Жидкий препарат стерильно разливали в полиэтиленовые бутылки или канистры емкостью 0,25; 0,5; 1,0 и 10,0 литров, которые предварительно ополаскивали спиртом.
Благодаря относительно высокой биологической активности используемого штамма и высокой скорости его роста, жидкий препарат в готовом виде, а также в производстве практически не заражается посторонней микрофлорой. Тем не менее необходим постоянный контроль всех этапов получения микробного препарата на основе штамма Bacillus megaterium V3.
Эффективность микробного препарата, полученного на основе штамма бактерий Bacillus megaterium V3 указанным выше способом, была проверена в полевых опытах на южном берегу Крыма, в ГП «Ливадия» г. Ялта в отношении продуктивности винограда сорта «Бастардо магарачский».
Почва коричневая горная некарбонатная, удобрения в течение сезона не вносили. В течение вегетационного сезона были выполнены все традиционные мероприятия по защите растений от болезней и вредителей. Всего было проведено пять обработок 0,33% водными растворами Bacillus megaterium V3 и препарата Экстрасол на основе штамма - аналога Bacillus subtilis Ч-13, а в контроле - водопроводной водой из расчета 1000 л/га.
Учет проводили по методике «Методическое и аналитическое обеспечение организации и проведение исследований по технологии производства винограда», г. Краснодар, 2010 г. Длину побегов и вызревание лозы определяли в период вегетации растений, а учет массы урожая и его кондиций проводили при уборке урожая. Результаты опыта представлены в Таблицах 8 и 9.
Из данных, приведенных в Таблицах 7 и 8 видно, что применение полученного указанным выше способом микробного препарата на основе штамма Bacillus megaterium V3 в период вегетации виноградного растения способствовало усилению силы роста растений, а также положительно повлияло на формирование площади листовой поверхности куста, усиливая фотосинтез (Таблица 7). В контрольном варианте опыта (только вода) такие показатели, как: средняя площадь листовой поверхности куста, средняя длинна побега, длина вызревшей части лозы, были существенно меньше, чем в вариантах с обработкой микробными препаратами. При этом по всем биометрическим показателям, приведенным в Таблице 7, применение полученного указанным выше способом препарата на основе штамма Bacillus megaterium V3 было эффективнее, чем при использовании препарата Экстрасол на основе штамма - аналога Bacillus subtilis Ч-13.
В описанном опыте формирование и созревание урожая проходило в условиях жаркого лета. На неполивных виноградниках внесение полученного указанным выше способом препарата на основе штамма Bacillus megaterium V3 по сравнению с контролем привело к улучшению условий произрастания растений и оказало положительное влияние на урожайность винограда (увеличение на 7,7%). При этом применение препарата на основе штамма Bacillus megaterium V3 оказалось несколько эффективнее препарата Экстрасол на основе штамма - аналога Bacillus subtilis Ч-13 (Таблица 8).
Таким образом, опытным путем было установлено, что штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 пригоден и перспективен для использования в сельском и лесном хозяйстве в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных и древесных культур, позволяющего расширить арсенал подобных средств.