Способ получения живых кормов для личинок морских рыб
METHOD FOR PRODUCTION OF LIVE FODDERS FOR SEA FISH LARVAE

Изобретение относится к морскому рыбоводству, в частности к производству качественных живых кормов для личинок ценных морских рыб, и может быть использовано на рыбоводческих фермах.
Правильное развитие личинок ценных морских рыб (особенно, камбалообразных) невозможно без введения в их рацион кормовых организмов, адекватных пищевым потребностям морских рыб. Одним из наиболее важных параметров определения адекватности корма для личинок ценных морских рыб является содержание в нем незаменимых высоконенасыщенных жирных кислот (ВНЖК) в определенной пропорции, нарушение которой вызывает отклонения в развитии рыб, вызывая аномалии развития пигментации и скелета, и снижает иммунитет и выживаемость рыб. Низкий уровень выживаемости личинок рыб может быть как результатом неадекватного потребностям личинок рыб биохимического состава коловраток, в частности, их липидного состава, в особенности содержания высоконенасыщенных жирных кислот и их соотношения, так и неправильного формирования кишечной микрофлоры и высокой смертности в результате микробиальных проблем. В обоих случаях смертность связана с неадекватным состоянием кормовых организмов, которыми питаются личинки.
При использовании в аквакультуре стандартного способа интенсивной технологии выращивания личинок морских рыб в качестве незаменимых начальных живых кормов непременно используют солоноватоводных коловраток Brachionus plicatilis Muller, которые считаются высокотехнологичными, так как в оптимальных условиях интенсивного промышленного культивирования их можно выращивать при высокой скорости роста популяции и в отсутствии аутоингибирования при содержании в условиях высокой плотности (Ханайченко, 1988). Однако, солоноватоводные коловратки не способны к самостоятельному синтезу особенно важных для развития рыб незаменимых полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) n-3 : эйкозапентаеновой 20:5(n-3) (ЭПК) и докозагексаеновой кислоты 22:6(n-3) (ДГК), необходимых для повышения течести клеточных мембран, и развития нормального зрения личинок рыб. Тем не менее содержание незаменимых компонентов в составе коловраток можно варьировать, насыщая их определенными питательными смесями, повышающими их питательную ценность для личинок рыб.
Для определения адекватности биохимического состава живых кормов биохимическим потребностям личинок рыб необходимо сопоставлять его с биохимическим составом кормовых организмов, которыми преимущественно питаются личинки рыб в естественных морских условиях. Таковыми являются морские каланоидные копеподы. В жирнокислотном составе морских каланоидных копепод разных видов ВНЖК варьируют в пределах 17-40% ДГК и 7-32% ЭПК от общего количества жирных кислот (Evjemo et al., 2003; van der Meeren et al., 2008; Karlsen et al., 2015). Искусственное выращивание морских каланоидных копепод возможно, но не в таких масштабах, как коловраток, так как для них необходимо высокое качество воды и низкая плотность посадки. Поэтому одним из основных параметров оценки адекватности коловраток потребностям личинок рыб после их насыщения является содержание в них ЭПК и ДГК, приближенное к таковому морских копепод. Для повышения качества коловраток и их соответствия пищевым потребностям личинок морских рыб, особенно камбалообразных, обычно производят предварительное насыщение коловраток перед внесением их в рыбоводные бассейны. Для насыщения коловраток используют либо микроводоросли, либо используют готовые промышленные стандартные насыщающие смеси. Содержание липидов и жирных кислот в коловратках предопределяют как состав их пищи, так и температурные условия.
Известен способ насыщения коловраток микроводорослями и снижения температуры выращивания коловраток (Ханайченко и др., 1988), наиболее близкий по осуществлению к заявляемому. При снижении температуры культивирования коловраток от 30 до 15°С и питании их микроводорослями Platymonas viridis содержание ПНЖК повышается с 0.3 до 0.8% сух.м, а при питании микроводорослями Monochrysis galbana - с 1.0 до 1.4% сух.м. (Ханайченко и др., 1988). Известны способы насыщения разными микроводорослями, в результате которого соотношение ДГК к ЭПК показывает тенденцию к его возрастанию у коловраток, питающихся Tetraselmis suecica - 0.05 (Lewis et al., 1998); Nannochloropsis - 0.06 (Lubzens et al., 1995; Kobayashi et al., 2008); Pavlova lutheri - 0.45 (Nichols et al., 1989); Monochrysis lutheri - 0.89; Rhodomonas salina - 1.2; Isochrysis galbana - 1.5 ( et al., 1995, в соответствии с возрастанием этого соотношения в составе микроводорослей. Применение при насыщении коловраток совместно обоих видов микроводорослей R.salina и I.galbana повышает выживаемость и рост личинок рыб ( et al., 1995). Самое высокое соотношение ДГК (5%) к ЭПК (1.7% от общих жирных кислот), равное 3, в составе коловраток достигалось при насыщении их микроводорослями Isochrysis galbana, выращиваемых в 40% проточном режиме (Ferreira et al., 2008).
Известны способы кратковременного (6-12 час) и долговременного (16-24 час) насыщения коловраток промышленными эмульсиями (Dhert et al., 2001). Способ насыщения эмульсией с высоким содержанием липидов - HR приводит к повышению в составе коловраток содержания ЭПК и ДГК до 8.8 и 11.3% от жирных кислот, соответственно, при соотношении ДГК/ЭПК=1.3 (Reitan et al., 1994). Известен способ длительного насыщения промышленными липидными эмульсиями с наиболее высоким содержанием в липидах ДГК (DHA_Super Selco), который приводит к повышению в составе коловраток соотношения ДГК к ЭПК до 1.8 (Lavens, Sorgeloos, 1996). Известен способ насыщения в течение 16 час эмульсиями ICES 30/0.6/С и ICES 30/4/С, в результате которого содержание ДГК в составе коловраток повышается до 11.7 и 17.0%, от общего содержания жирных кислот, а соотношение ДГК к ЭПК составляет 0.9 и 4.5, соответственно (Castel et al., 2003).
Известен способ использования для насыщения специализированной пасты Red Pepper (производство Bernaqua, Belgium), содержащей 28.6% ДГК от всех жирных кислот (Hamre, 2016), при котором происходит наиболее активная аккумуляция ВНЖК, в результате насыщения которой соотношение ДГК к ЭПК составляет 3.5, однако доля их в жирнокислотном составе коловраток перед внесением личинкам невысока - 1.2 и 0.35%, соответственно (Eryalcin, 2018). Известно применение насыщающих смесей, разработанных (но ДСП) Bergen High Technology Centre, которые позволяют повысить содержание ЭПК до 7%, а ДГК до 19% от жирных кислот коловраток (Folkvord et al., 2018). Известен способ последовательного использование в течение более 24 часов нескольких насыщающих смесей, включающих пасту Red Pepper, что приводит к повышению содержания в коловратках в среднем ДГК - 20%, а ЭПК - 5% от общего содержания в коловратках жирных кислот (Hamre, 2016).
Однако использование любых липидных эмульсий для насыщения коловраток приводит к быстрому загрязнению среды выращивания личинок рыб органическими отходами и, как следствие, к повышению титра нежелательных потенциально патогенных бактерий, и влечет за собой применение различных дезинфекционных мер, снижающих эффективность применения искусственных насыщающих смесей.
Задачей «Способа получения живых кормов для личинок морских рыб» является разработка технологии, обеспечивающей получение коловраток, имеющих высокое содержание и соотношение ДГК к ЭПК, приближенное к таковому у морских каланоидных копепод, без применения искусственных химических эмульсий и смесей.
Технический результат от использования заявленного изобретения заключается в том, что применение предложенного кормления коловраток позволяет получить высокое содержание в них ценных незаменимых жирных кислот омега-3, аналогичному таковому у копепод; использование коловраток в качестве живых кормов позволяет улучшить качество питания личинок рыб, и улучшает правильное развитие их пигментного комплекса; внесение коловраток, насыщенных в соответствии с предлагаемым способом, позволяет замедлить их репродуктивную функцию и снижает количество яиц, продуцируемых самками (т.е. не происходит нежелательный рост численности популяции коловраток в системе выращивания личинок рыб).
4
Поставленная задача достигается путем аппроксимации жирнокислотного состава солоноватоводных коловраток к жирнокислотному составу морских каланоидных копепод. Для получения коловраток с высоким содержанием и соотношением ДГК к ЭПК на последнем этапе их культивирования за двое суток до использования в качестве живых кормов для личинок рыб, их переводят на кормление динофлагеллятами Prorocentrum cordatum и Prorocentrum micans (с содержанием 14.5% ДГК и 4.4% ЭПК (Nichols et al., 1984), при начальной концентрации микроводорослей в среде 5×10 кл/мл.
Заявляемый способ соответствует критериям новизна и технический уровень, т.к.:
- впервые предложены оптимальные трофические условия для получения продукции солоноватоводных коловраток Brachionus plicatilis с жирнокислотным составом, аппрокисмированным к составу морских каланоидных копепод (акарций) без применения липидных насыщающих смесей;
- предлагаемый способ позволяет получать полноценные по жирнокислотному составу живые корма, используя интенсивный способ выращивания коловраток, вместо экстенсивного способа выращивания, применяемого при выращивании;
- получаемые кормовые организмы обеспечивают личинок морских рыб адекватными их потребностям незаменимыми ненасыщенными жирными кислотами, и, как следствие, обеспечивают формирование правильной пигментации личинок рыб;
- предлагаемый способ насыщения коловраток не привносит в систему выращивания нежелательных дополнительных метаболитов, что снижает бактериальную нагрузку на систему выращивания.
Известно, что среди микроводорослей разных таксонов наибольшее количество ВНЖК с преобладанием ДГК над ЭПК содержится в динофлагеллятах (Zhukova, Aizdacher, 1995). Предварительно проведенные экспериментальные работы показали, что два вида нетоксичных динофлагеллят P. cordatum и P. micans активно потребляются живыми кормовыми организмами разного генезиса, используемыми при культивировании личинок камбалы калкан: солоноватоводными коловратками Brachionus plicatilis, морскими копеподами Acartia tonsa (Khanaichenko et al., 1998; Ханайченко и др., 2016) и метанауплиями артемий (Смирнов и др., 2019). Известно, что повышенного загрязнения среды отходами эмульсий и бактериального загрязнения от насыщенных коловраток можно избежать подбором для питания коловраток микроводорослями, которые, помимо улучшения жирнокислотного состава коловраток, дополнительно являются источником витаминов.
Способ реализуется следующим образом.
1) Культивирование массы коловраток партеногенетического клона Brachionus plicatilis производили в стандартных условиях при кормлении микроводорослями при оптимальной температуре роста популяции 23±2°С.
2) Кормление коловраток производили смесью микроводорослей, повышающих скорость роста их популяции.
4
3) За двое суток до использования коловраток в качестве корма для личинок рыб их сгущали, промывали и переводили на питание динофлагеллятами (при их начальной концентрации в среде 5×10 кл/мл).
4) Перед кормлением личинкам рыб коловраток промывали дезинфицирующим раствором, и после вторичного промывания стерильной морской водой в сгущенном состоянии перемещали в темноту и температурные условия, снижающие метаболизм коловраток (~10°С) до момента их внесения в выростные емкости с личинками рыб.
Пример реализации способа
-1
4
Массовые культуры коловраток Brachionus plicatilis содержали в лабораторных условиях при кормлении микроводорослями на протяжении множественных генераций, поддерживая концентрацию микроводорослей в среде 30 мкг⋅мл. Микроводоросли культивировали на стандартной среде Уолна, приготовленной на стерилизованной  черноморской воде. Температура, фотопериод и освещенность при культивировании микроводорослей и коловраток были идентичны: 23±2°С; Свет : Темн = 12:12; 5000 люкс. За двое суток до использования коловраток в качестве корма для личинок рыб их сгущали, промывали, и переводили на питание динофлагеллятами при их начальной концентрации в среде 5×10 кл/мл. После двухсуточного питания динофлагеллятами, коловраток промывали дезинфицирующим раствором, и вторично стерильной морской водой и в сгущенном состоянии перемещали в темноту и температурные условия, снижающие метаболизм коловраток (~10°С) до начала кормления ими личинок.
-1
В результате подобной процедуры насыщения коловраток по разработанной схеме на унифицированной диете, состоящей из динофлагеллят Prorocentrum cordatum и Prorocentrum micans, соотношение ДГК/ЭПК в составе коловраток возрастало до 3.2 и 3.8, что сопоставимо с содержанием ДГК и ЭПК в морских копеподах Acartia tonsa (Khanaychenko et al., 1998) и значительно превышает ДГК/ЭПК коловраток, получаемом при использовании большинства промышленных эмульгированных смесей SELCO. Общее содержание жирных кислот у коловраток, культивированных заявляемым способом, варьировало в пределах 30.2-34.7 мг МЭЖК, г сухой массы. Питание динофлагеллятами Prorocentrum увеличивало содержание общих полиеновых жирных кислот, n-3 ВНЖК, ЭПК и ДГК (в составе ВНЖК, %) сопоставимых с копеподами (Таблица 1).
Список литературы
1. Castell, J., Blair, Т., Neil, S., Howes, K., Mercer, S., Reid, J., & Sorgeloos, P. (2003). The effect of different HUFA enrichment emulsions on the nutritional value of rotifers (Brachionus plicatilis) fed to larval haddock (Melanogrammus aeglefinus). Aquaculture International, 11(1-2), 109-117.
2. Dhert, P., Rombaut, G., Suantika, G., & Sorgeloos, P. (2001). Advancement of rotifer culture and manipulation techniques in Europe. Aquaculture, 200(1-2), 129-146.
3. Dhont, J., Dierckens, K.,  J., Van Stappen, G., Wille, M., & Sorgeloos, P. (2013). Rotifers, Artemia and copepods as live feeds for fish larvae in aquaculture. In Allan G, Burnell G (eds) Advances in aquaculture hatchery technology Woodhead Publishing, Cambridge, pp 157-202.
4.  K.M. (2018). Effects of different commercial feeds and enrichments on biochemical composition and fatty acid profile of rotifer (Brachionus plicatilis,  1786) and Artemia franciscana. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 18(1), 81-90.
5. Evjemo, J.O., Reitan, K.I., Olsen, Y. (2003). Copepods as live food organisms in the larval rearing of halibut larvae (Hippoglossus hippoglossus L.) with special emphasis on the nutritional value. Aquaculture, 227(1-4), 191-210 DOI 10.1016/S0044-8486(03)00503-9.
6. Ferreira, M., Maseda, A.,  J., & Otero, A. (2008). Enriching rotifers with "premium" microalgae. Isochrysis aff. galbana clone T-ISO. Aquaculture, 279(1), 126-130.
7. Folkvord, A., Koedijk, R., Grahl-Nielsen, O., Meier, S., Rydland Olsen, В., Blom, G., … Imsland, A.K. 2018. You are what you eat? Differences in lipid composition of cod larvae reared on natural zooplankton and enriched rotifers. Aquaculture Nutrition, 24(1), 224-235.
8. Hamre, K. 2016. Nutrient profiles of rotifers (Brachionus sp.) and rotifer diets from four different marine fish hatcheries. Aquaculture, 450, 136-142.
9. Karlsen,  van der Meeren, Т., , I., Mangor-Jensen, A., Galloway, T.F., , E., Hamre, K. 2015. Copepods enhance nutritional status, growth and development in Atlantic cod (Gadus morhua L.) larvae - can we identify the underlying factors?. Peer J, 3, e902.
10. Khanaychenko A.N., Dhert P., Van Ryckeghem K., Sorgeloos P. 1998. Evaluation of fatty acid composition of live feed fed Dinophyceae // Aquaculture and Water: Fish Culture, Shellfish Culture and Water Usage. - Grizelth H., P. Kestemont (eds). EAS Spec. Publ. 26: 133-134
11. Kobayashi, Т., Nagase, Т., Hino, A., Takeuchi, T. 2008. Effect of combination feeding of Nannochloropsis and freshwater Chlorella on the fatty acid composition of rotifer Brachionus plicatilis in a continuous culture. Fisheries science, 74(3), 649-656.
12. Lavens, P., & Sorgeloos, P. 1996. Manual on the production and use of live food for aquaculture (No. 361). Food and Agriculture Organization (FAO).
13. Lewis, Т., Nichols, P.D., Hart, P.R., Nichols, D.S., & McMeekin, T.A. 1998. Enrichment of rotifers Brachionus plicatilis with eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid produced by bacteria. Journal of the World Aquaculture Society, 29(3), 313-318
14. Lubzens, E., Gibson, О., Zmora, О., Sukenik, A. (1995). Potential advantages of frozen algae (Nannochloropsis sp.) for rotifer (Brachionus plicatilis) culture. Aquaculture, 133(3-4), 295-309.
15. Nichols, P.D., Holdsworth, D.G., Volkman, J.K., Daintith, M., Allanson, S. 1989. High incorporation of esential fatty acids by the rotifer Brachionus plicatilis fed on the Prymnesiophyte alga Pavlova lutheri. Marine and Freshwater Research, 40(6), 645-655.
16. Reitan, K.I., Rainuzzo, J.R., & Olsen, Y. 1994. Influence of lipid composition of live feed on growth, survival and pigmentation of turbot larvae. Aquaculture International, 2(1), 33-48.
17. , J.G., Gravningen, K., & Norsker, N.H. 1995. The role of different algae in the growth and survival of turbot larvae (Scophthalmus maximus L.) in intensive rearing systems. In ICES Marine Science Symposia Vol. 201, pp. 173-186.
18. van der Meeren T, Olsen RE, Hamre K, Fyhn HJ. 2008. Biochemical composition of copepods for evaluation of feed quality in production of juvenile marine fish. Aquaculture 274:375-397 DOI 10.1016/j.aquaculture.2007.11.041.
19. Zhukova NV, Aizdaicher NA 1995. Fatty acid composition of 15 species of marine microalgae. Phytochemistry 39:351-356.
20. Смирнов Д.Ю., Аганесова Л.О., Ханайченко А.Н. 2019. Влияние микроводорослей как кормовых объектов на размерные характеристики и выживаемость науплиусов крымских артемий Artemia spp. (Branchiopoda: Anostraca). Морской биологический журнал (в печати).
21. Ханайченко А.Н., 1988. Питание и продуцирование коловраток в экспериментальных популяциях при комбинированном воздействии температуры и трофических условий (на примере Brachionus plicatilis Muller, 1786). Канд. Дисс. Минск/Севастополь, 159 С.