УСТРОЙСТВО И СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ
DEVICE AND METHODS FOR REVEALING NUCLEIC ACID IN BIOLOGICAL SAMPLES

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к устройству и способам выявления нуклеиновой кислоты в биологических образцах. В частности, настоящее изобретение относится к новому устройству и способу выявления последовательностей ДНК с использованием гибридизации нуклеиновой кислоты, стимулируемой электрическим полем, и к способам оптимизации рабочих параметров такого устройства, и, кроме того, настоящее изобретение распространяется на применение стимулируемой электрическим полем гибридизации в любом биологическом процессе, в котором участвуют заряженные объекты.
Уровень техники
Появление методики, основанной на высокоплотных матрицах полинуклеотидов (например, ДНК или РНК), изменило основные концепции анализов в геномике и протеомике. Переход от “дот-блот”-анализов к “матрицам на предметных стеклах” и затем к микроматрицам ДНК (также известным как ДНК-чипы) привел к революции в промышленности, сделав реальными для практических применений способы крупномасштабного клинического диагностического тестирования и скрининга. Как хорошо известно, обычная микроматрица с реакционноспособными участками в предварительно определенной конфигурации на субстрате будет иметь определенную картину связывания при воздействии на нее образца, содержащего фрагменты нуклеиновой кислоты-мишени с последовательностью оснований, комплементарной последовательности оснований, улавливающей фрагменты, связанные с реакционноспособными участками. Картину связывания и эффективность связывания можно определить оптическими или электронными способами при использовании подходящего механизма выявления, который может включать, например, флуоресцентное мечение, определение тока или измерение сопротивления.
Применение стимулируемой электрическим током гибридизации нуклеиновых кислот является известным способом анализа биологических образцов, содержащих ДНК, например крови, плазмы, мочи и т.д. Обычно чип для выявления ДНК получают из одного из множества материалов, включая стекло, диоксид кремния и металл. На поверхности чипа создают ряд электрических контактов, используя известные способы. Для выявления конкретной последовательности ДНК в биологическом образце улавливающие зонды, состоящие из фрагментов комплементарной ДНК, связывают с поверхностью чипа с помощью связывающего слоя, который обычно представляет собой агарозный гель. Если биологический образец содержит ДНК-мишень, то ДНК-мишень будет связываться с комплементарными фрагментами ДНК посредством гибридизации, и можно использовать различные способы визуализации, чтобы выявить такую гибридизацию, а следовательно, присутствие в образце ДНК-мишени.
Предшествующий уровень техники
Фрагменты нуклеиновой кислоты электрически заряжены и, следовательно, могут притягиваться к конкретному участку посредством электростатического притяжения при использовании электродов, и соответственно в результате применения подходящего электрического тока процесс гибридизации может быть ускорен и, таким образом, также ускорен процесс выявления. Однако нельзя применять электрод в непосредственном контакте с фрагментами нуклеиновой кислоты из-за опасности электрохимической деградации или электролиза образца. Поэтому обычно электрод покрывают слоем для проникновения/связывания, как показано в US 5605662 и 6306348. Слой для проникновения/связывания обычно делают из пористого материала, например материалов типа золь-гель, пористых гидрогелей, пористых оксидов, и он служит для обеспечения избирательной диффузии небольших ионов, а также в качестве поверхности для связывания улавливающих зондов. Прямой контакт фрагментов нуклеиновой кислоты с электродом уменьшается благодаря размеру пор пористых материалов, которые обычно слишком малы, чтобы позволить пройти более крупным фрагментам нуклеиновой кислоты.
Когда подают напряжение на электрод под слоем для проникновения/связывания, устройства согласно предшествующему уровню техники могут обеспечивать эффекты электрофоретического переноса без электрохимического разложения образца и соответственно могут усиливать гибридизацию. Однако такие способы обеспечения электрически индуцируемой гибридизации не лишены своих недостатков. Например, пористые материалы, такие как гидрогели и полимеры, подвергаются износу при контакте с водными растворами, различными химическими средствами и рядом факторов окружающей среды. Получение материалов типа золь-гель является дорогостоящим и сложным, повышая производственную себестоимость. Кроме того, пористые материалы обычно являются хрупкими и чувствительными к адсорбции и улавливанию нежелательных чужеродных веществ, таких как водосодержащие углеводороды в воздухе, приводя к более короткому сроку службы устройств.
Сущность изобретения
Согласно настоящему изобретению предлагается устройство для выявления нуклеиновой кислоты в образце, содержащее подложку, на которой образована по меньшей мере одна реакционная ячейка, при этом указанная реакционная ячейка содержит связывающую поверхность, образованную из диэлектрического материала, для связывания зондов для улавливания нуклеиновой кислоты, и которое снабжено металлическим электродом, находящимся в прямом контакте с указанным диэлектрическим материалом. Образец может содержать биологические вещества, и образец может представлять собой сточные воды, раствор или реагент. Образец также может представлять собой биологический образец, такой как кровь, плазма или моча.
Предпочтительно электрод помещают под связывающей поверхностью, то есть приводят в контакт со стороной диэлектрического материала, обратной связывающей поверхности. Однако, вероятно, его можно приводить в контакт со стороной диэлектрического материала или даже в контакт с самой связывающей поверхностью.
2
3
2
2
5
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения диэлектрическим материалом предпочтительно является оксид, например, он может быть выбран из группы, состоящей из AlO, SiO и TaO. Металлический электрод, например, может быть образован из алюминия.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения устройство может содержать многослойную структуру, содержащую первый основной слой, второй изолирующий слой, образованный на указанном основном слое, третий слой, образованный на указанном изолирующем слое и содержащий фигурные проводящие области, определяющие границы по меньшей мере одного металлического электрода, и четвертый слой, содержащий по меньшей мере одну область диэлектрического материала, при этом каждый указанный металлический электрод в указанном третьем слое покрыт областью диэлектрического материала в указанном четвертом слое. Предпочтительно проводящие области третьего слоя разделены областями, образованными диэлектрическим материалом. Еще более предпочтительно области диэлектрического материала в указанном четвертом слое разделены областями пассивирующего материала, и области пассивирующего материала могут расширяться по краям указанных областей диэлектрического материала, определяя границы указанных реакционных ячеек.
При рассмотрении с точки зрения другого широкого аспекта в настоящем изобретении предлагается способ осуществления стимулируемой электрическим полем гибридизации для выявления нуклеиновых кислот-мишеней в биологическим образце, предусматривающий стадии получения реакционной ячейки, имеющей связывающую поверхность, образованную из диэлектрического материала, обеспечения прямого контакта находящегося снизу металлического электрода и указанного диэлектрического материала, связывания зондов для улавливания нуклеиновой кислоты с указанной связывающей поверхностью, добавления образца в указанную реакционную ячейку и подачи электрического потенциала на указанный электрод. Образец может содержать биологические вещества, и образец может представлять собой сточные воды, раствор или реагент. Образец также может представлять собой биологический образец, такой как плазма крови или моча.
Электрический потенциал может подаваться в виде постоянного потенциала или может представлять собой монотонно изменяющийся или импульсный потенциал.
С точки зрения другого широкого аспекта настоящее изобретение также относится к способу притяжения или отталкивания электрически заряженных объектов к поверхности или от поверхности реакционной ячейки при осуществлении биологической реакции, предусматривающему стадии получения диэлектрического материала в виде указанной поверхности и образования электрического поля посредством индукции разделения зарядов в указанном диэлектрическом материале. Электрически заряженными объектами могут быть молекулы нуклеиновой кислоты.
С точки зрения еще одного аспекта изобретение также относится к способу образования матрицы из реакционных ячеек для осуществления биологических анализов, предусматривающему стадии нанесения металлических электродов на изолирующую подложку в виде определенного рисунка, осаждения областей диэлектрического материала на указанные металлические электроды и формирования каймы вокруг границ верхних поверхностей указанных областей диэлектрического материала, для того чтобы определить границы указанных реакционных ячеек.
Предпочтительно способ может предусматривать, например, осаждение слоя металла на изолирующей поверхности, нанесение на указанный слой металла покрытия фоторезиста в виде нужного рисунка и удаление остальной части указанного слоя металла способом травления, осаждение слоя указанного диэлектрического материала на указанный металл, нанесенный в виде рисунка, при этом указанный диэлектрический материал покрывает указанный металл и занимает области между указанными фигурными электродами, осаждение пассивирующего слоя на указанный слой диэлектрического материала, нанесение на указанный пассивирующий слой фоторезиста в виде определенного рисунка и удаление указанного пассивирующего слоя, чтобы открыть указанный диэлектрический материал там, где он покрывает указанные металлические электроды, чтобы определить границы указанных реакционных ячеек.
Краткое описание чертежей
Некоторые варианты изобретения теперь будут описаны с помощью примера и со ссылками на сопровождающие чертежи, где
на фиг. 1 представлено сечение чипа согласно варианту осуществления настоящего изобретения,
на фиг. 2 представлен вид, сходный с фиг. 1, но показывающий чип в использовании,
на фиг. 3 приведена схематичная иллюстрация принципа, лежащего в основе предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения,
на фиг. 4 проиллюстрированы стадии возможного способа производства,
на фиг. 5(a) и (b) показаны результаты первого теста,
на фиг. 6(a) и (b) показаны результаты второго теста, и
на фиг. 7 (a),  (b) и (c) показаны результаты третьего теста.
Подробное описание предпочтительных вариантов
На фиг. 1 показано сечение чипа согласно варианту настоящего изобретения, который содержит три ячейки для приема содержащего образец буферного раствора, но будет понятно, что может быть получено любое количество ячеек, и они, как правило, будут образованы в виде прямоугольной матрицы.
2
Устройство согласно варианту изобретения изготавливают последовательным осаждением на кремниевую подложку с использованием обычных способов осаждения. Сначала (фиг. 4(a)) получают изолирующий слой, образованный из SiO, толщиной примерно от 200 нм до 500 нм на подложке Si любым подходящим способом, включая термическое окисление, или любым подходящим способом осаждения, например, таким как напыление, выпаривание электронным лучом и тому подобные. Сверху изолирующего слоя формируют (фиг. 4(b)) слой алюминия толщиной примерно от 500 нм до 1000 нм, снова используя любой подходящий способ осаждения.
2
3
2
3
3
4
2
3
2
3
После получения слоя алюминия на него наносят рисунок (фиг. 4(c)), используя слой фоторезиста, и незамаскированные области удаляют травлением (фиг. 4(d)), и фоторезист удаляют (фиг. 4(e)). Затем чип покрывают (фиг. 4(f)) AlO до толщины 50-500 нм, при этом области AlO образуются между областями алюминия, которые образованы на подложке из диоксида кремния. Затем осаждают пассивирующий слой SiN (фиг. 4(g)) на AlO с помощью усиленного плазмой химического осаждения из паровой фазы или сходными способами. Затем на пассивирующий слой наносят рисунок, используя фоторезист (фиг. 4(h)), и затем пассивирующий слой подвергают травлению (фиг. 4(i)), чтобы открыть области AlO, которые становятся связывающими поверхностями реакционной ячейки. Наконец удаляют фоторезист (фиг. 4(j)).
2
3
2
3
2
3
3
4
2
3
2
3
Результатом указанного способа изготовления является многослойная структура, показанная на фиг. 1. Области алюминия образованы на изолирующем слое диоксида кремния и указанные области алюминия разделены AlO. Образованный сверху слоя алюминия и AlO слой является слоем, который содержит области AlO, расположенные над областями алюминия и отделенные друг от друга пассивирующим материалом SiN, который покрывает области AlO, разделяющие области алюминия более низкого слоя. Пассивирующий материал также расширяется, покрывая края верхнего AlO, так чтобы определить поверхность для биологического образца, помещаемого для анализа.
2
3
Таким образом, будет понятно, что в примере, показанном на фиг. 1, получают чип с тремя ячейками 1-3, каждая из которых образована из AlO с лежащим под ним слоем алюминия. Хотя на фиг. 1 это не показано, при образовании областей алюминия травлением также могут быть образованы электрические соединения, которые позволяют подавать электрический потенциал к областям алюминия.
После изготовления чипа, показанного на фиг. 1, его можно использовать в качестве основы для ряда различных биологических тестов и анализов. В частности, каждая ячейка 1-3, показанная на фиг. 1, может быть снабжена подходящими улавливающими зондами, как показано на фиг. 2. В зависимости от выполняемого теста в каждую ячейку могут быть внесены одни и те же улавливающие зонды или разные улавливающие зонды, при этом улавливающие зонды имеют фрагменты нуклеиновой кислоты, которые комплементарны фрагментам в образце, которые ищут в данном тесте или анализе. В примере, показанном на фиг. 2, все ячейки 1-3 идентичны, и в ячейку добавляют каплю образца, содержащего буферный раствор, так чтобы он покрыл все три ячейки.
Как будет понятно специалистам в данной области, если образец содержит фрагменты нуклеиновой кислоты, которые комплементарны улавливающим зондам, то они будут связываться с улавливающими зондами посредством гибридизации, и это можно выявить известными способами. Так как фрагменты нуклеиновой кислоты электрически заряжены, указанная гибридизация может быть усилена посредством образования электрического поля, которое будет притягивать требуемые фрагменты нуклеиновой кислоты к связывающей поверхности и улавливающим зондам. Механизм, посредством которого это происходит, показан на фиг. 3.
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
В частности, как показано на фиг. 3, если подают потенциал на алюминиевый электрод, лежащий снизу ячейки, то так как AlO является диэлектрическим материалом, будет происходить разделение зарядов в AlO, полярность которого будет зависеть от полярности напряжения, подаваемого на алюминиевый электрод под AlO. Как показано слева на фиг. 3, если на алюминиевый электрод подают положительный потенциал, то верхняя поверхность AlO также будет иметь положительный потенциал, который может притягивать отрицательно заряженные фрагменты и отталкивать положительно заряженные фрагменты. Наоборот, если на алюминиевый электрод подают отрицательный потенциал, то верхняя поверхность AlO также будет иметь отрицательный потенциал, который будет притягивать положительно заряженные фрагменты и отталкивать отрицательно заряженные фрагменты, как показано справа на фиг. 3. Таким образом, избирательная подача электрического потенциала на алюминиевые электроды, которые расположены непосредственно под связывающей поверхностью из AlO и в прямом контакте с ней, делает возможным избирательное притягивание/отталкивание фрагментов нуклеиновой кислоты и соответственно делает возможной индуцированную электрическим полем гибридизацию. Следует понимать, что потенциал можно подавать многими разными способами. Например, потенциал может представлять собой постоянный потенциал или может быть монотонно варьирующим, или может быть импульсным потенциалом, либо с регулярными импульсами, либо любого требуемого характера.
Особое преимущество настоящего изобретения, по меньшей мере в его предпочтительных формах, в отличие от предшествующего уровня техники, заключается в том, что нежелательные электрохимические реакции и/или электролиз могут быть полностью исключены, так как не происходит переноса электронов между раствором образца и поверхностью диэлектрического слоя. Таким образом, фрагменты нуклеиновой кислоты могут быть электрически притянуты к связывающей поверхности без электрохимического разложения. Следующее важное преимущество способа стимулируемой электрическим полем гибридизации и устройства согласно настоящему изобретению, по меньшей мере в предпочтительных формах, состоит в том, что концентрация соли и значение pH образца не будут меняться. Указанные параметры являются важными факторами, влияющими на эффективность гибридизации и стабильность гибридизованных фрагментов нуклеиновой кислоты. Способ электрически стимулируемой гибридизации предшествующего уровня техники приводил к значительным изменениям в концентрации соли и pH вследствие электрохимических реакций, и требовались другие способы, такие как специальные буферные растворы, чтобы компенсировать указанные эффекты. Следующее преимущество настоящего изобретения состоит в том, что не будет происходить электрохимических реакций, и, в свою очередь, это будет означать, что растворы/реагенты, используемые в способе выявления, не будут нарушены. Не будет образования пузырьков и/или осаждения в ходе процесса выявления, что является важным для улучшения качества регистрируемого сигнала.
Следует понимать, что несмотря на то, что предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в контексте ускоренной гибридизации при выявлении фрагментов нуклеиновой кислоты, изобретение в более общем виде применимо к любому биологическому процессу, в который вовлечены электрически заряженные объекты и при котором требуется возможность регуляции движения таких электрически заряженных объектов посредством притягивания таких объектов к поверхности или отталкивания их от поверхности.
На фиг. 5-7 показан ряд экспериментальных результатов с использованием структуры, изображенной на фиг. 1-3 с подачей или без подачи электрического потенциала на алюминиевые электроды, расположенные под ячейками. Конечно, будет понятно, что во всех приведенных примерах время реакции, подаваемое напряжение и другие параметры являются только иллюстративными и, при желании, их можно варьировать.
На фиг. 5(a) и (b) показан контроль, при котором ни в одном из случаев электрический потенциал на алюминиевые электроды не подается, и поэтому гибридизация происходит без помощи электрического поля. В данном примере олигомеры-мишени в образце представляют собой синтетический β-актин (91 основание, чистый) и время гибридизации составляет 90 минут. Олигомеры-мишени присутствуют в образце, показанном на фиг. 5(a), и не присутствуют в образце, показанном на фиг. 5 (b). Ни на фиг. 5(a), ни на фиг. 5(b) электрический потенциал не подают на алюминиевый электрод, но ячейки очевидно более темные на фиг. 5(a), чем на фиг. 5(b), вследствие присутствия олигомеров-мишеней в образце на фиг. 5(a).
На фиг. 6(a) и (b) условия такие же, как на фиг.5(a) и (b), так как в образце на фиг. 6(a) находятся те же самые олигомеры-мишени, а в образце на фиг. 6(b) олигомеры-мишени не присутствуют. Однако в данном примере на алюминиевые электроды подают потенциал +10 В и время гибридизации уменьшено до 10 минут. Сравнение фиг. 5(a) и 6(a) показывает, что на фиг. 6(a) ячейки намного темнее, что явно видно, даже хотя время гибридизации было существенно снижено, демонстрируя эффективность подаваемого напряжения для ускорения гибридизации. Сходство между фиг. 5(b) и 6(b), где олигомеры-мишени не присутствовали, показывает, что подаваемое напряжение не приводит к каким-либо ложноположительным результатам.
Фиг. 7(a)-(c) иллюстрируют третий пример, в котором олигомеры-мишени в образце представляют собой вирус птичьего гриппа (AIV) подтипа H5 (250 оснований, смешанный с другими неспецифичными олигомерами). Во всех трех случаях (a)-(c) время гибридизации составляет 10 минут. Различия между фиг. 7(a)-(c) заключаются в следующем: на фиг. 7(a) олигомеры-мишени присутствуют в образце, и на алюминиевые электроды, расположенные под ячейками, подают электрический потенциал +10 В; на фиг. 7(b) в образце отсутствуют олигомеры-мишени, и на алюминиевые электроды, расположенные под ячейками, подают электрический потенциал +10 В, и на фиг. 7(c) в образце присутствуют олигомеры-мишени, но электрический потенциал не подают на алюминиевые электроды, расположенные под ячейками. И снова данный пример показывает, что при времени гибридизации, составляющем только 10 минут, подача потенциала +10 В на электрод приводит к ускорению гибридизации и усиленному сигналу (очень темные области в ячейках на фиг. 7(a)). При сравнении сходство, наблюдаемое между фиг. 7(b) (без мишени и с подачей потенциала) и фиг. 7(c) (с мишенью, но без подаваемого потенциала), показывает, что невозможно получить эффективную гибридизацию за такой же период времени (10 минут) без стимулируемой электрическим полем гибридизации.
2
3
2
2
5
Настоящее изобретение, по меньшей мере в его применяемых формах, обеспечивает простое недорогое устройство, которое позволяет стимулируемой электрическим полем гибридизации нуклеиновых кислот и/или другим биологическим процессам происходить с намного более высокой скоростью и с высокой эффективностью, которое может быть использовано для большого количества возможных применений. В настоящем изобретении использован принцип разделения зарядов в диэлектрическом материале, который находится в контакте с электродом, на который подают потенциал. В описанных выше вариантах электрод образован из алюминия, а диэлектрическим материалом является AlO, но также возможны другие комбинации металлического электрода и диэлектрической связывающей поверхности. Например, можно использовать SiO, TaO в качестве основанных на оксидах диэлектрических материалов для связывающей поверхности.
В отличие от устройств согласно предшествующему уровню техники, в которых используют проницаемый слой, основанный на оксидах диэлектрический слой в прямом контакте с электродом обеспечивает структуру, которая является прочной, компактной, химически инертной по отношению к большинству кислот, щелочей и других реагентов, используемых в биологических реакциях. Структура также стабильна по отношению к факторам окружающей среды, таким как температура и влажность, и менее уязвима по отношению к физическому повреждению. Производство менее дорогостоящее, и устройство может быть изготовлено очень легко с использованием стандартных способов осаждения и других способов изготовления микроэлектроники. Несомненно, применение таких способов осаждения и изготовления микроэлектроники в производстве устройств согласно настоящему изобретению также имеет преимущество в том, что устройства можно легко включить в другие устройства, изготовленные с использованием такой же или сходной методики.