СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ
METHOD FOR PREVENTING CEREBRAL ISCHEMIA

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.
В настоящее время количество пациентов с цереброваскулярными заболеваниями неуклонно растет. Все чаще нарушение мозгового кровообращения (НМК) происходит у трудоспособных и социально активных лиц среднего возраста. За последние годы изучения различных аспектов цереброваскулярной патологии значительно активизировалось, что привело к существенному прогрессу в области профилактики, лечения и восстановления после перенесенного инсульта, а также к снижению смертности от этого заболевания (Спасов A. A., Федорчук В. Ю., Гурова Н. A. и др. Методологический подход для изучения нейропротекторной активности в эксперименте [Текст]. Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2014; 4: 39-45).
Профилактику и коррекцию ишемии головного мозга теоретически возможно осуществить с помощью фармакологического прекондиционирования, суть которого состоит в активации эндогенных защитных механизмов, снижающих степень повреждения при последующем длительном ишемическом эпизоде (Должикова, И. Н. Дистантное и фармакологическое прекондиционирование с использованием эритропоэтина и тадалафила при экспериментальной ишемии почек: диссертация кандидата биологических наук: 14.03.06 / И.Н. Должикова. – Белгород).
Перспективным для изучения церебропротекторного действия при ишемическом инсульте является 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицин. Производные этилтиадиазола обладают широким спектром фармакологической активности, в том числе и нейропротективными эффектами (Neuroprotective activity of 2-amino-1,3,4-thiadiazole derivative 4BrABT-an in vitro study / M. Juszczak , K. Walczak , E. Langner ,et al. // Ann Agric Environ Med.- 2013.- Vol.20(3).-Р.575-9; Anticancer, neuroprotective activities and computational studies of 2-amino-1,3,4-thiadiazolebased compound /  W. Rzeski,  J. Matysiak,  M. Kandefer-Szerszeń // Bioorg Med Chem.- 2007.- Vol.15(9).-Р.3201-7). Среди них имеется большое число соединений с противовоспалительным, антимикробным, противосудорожным, гипотензивным, антиоксидантным, противоопухолевым действием (3-Arylsulphonyl-5-arylamino-1,3,4-thiadiazol-2(3H)ones as Anti-inflammatory and Analgesic Agents [Text] / S. Schenone, O. Bruno, A. Ranise [et al.] // Bioorganic & Medicinal Chemistry. – 2001. – Vol. 9. – P. 2149–2153.212). Выраженная биологическая активность данных соединений обусловлена их химическим строением, ведь, тиадиазолы являются гетероциклическими соединениями, в основе которых лежит кольцевой пятичленный гетероцикл, содержащий два атома азота и атом серы.
Известно техническое решение «Способ профилактики церебральной ишемии » (Черторижский Е.А., Овчинников И.В.). Средство содержит фармацевтическую композицию, включающую в качестве активных компонентов метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин и холина альфосцерат. Технический результат достигается за счет того, что фармацевтическая композиция, обладающая нейропротекторной, противогипоксической и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность. Осуществляется на белых нелинейных крысах-самцах массой 220-280 г, содержащихся в виварных условиях, у которых моделировали ишемический инсульт. Исследовали нейропротекторное действие композиции метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролина и холина альфосцерата у крыс с экспериментальной ишемией головного мозга. Ишемию головного мозга у крыс воспроизводили путем одномоментной перевязки (под эфирным наркозом) обеих общих сонных артерий. В подопытных группах животным вводили внутрибрюшинно различные вещества (метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролина и холина альфосцерат по отдельности и композицию их содержащую) 1 раз в сутки в течение 7 суток; в первые сутки - через 1 и 3 часа после операции. Животных после операции наблюдали в течение 2 недель с учетом выживаемости крыс. Неврологический дефицит у животных определяли (слепым методом) по шкале McGraw et al. (в баллах) каждый час в течение 24 часов, а затем 1 раз в сутки. Тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов.
Основным недостатком способа является то, что модель ишемии головного мозга не является специфичной для многих видов исследований, связанных с нарушением кровообращения головного мозга. Помимо этого, использование данной шкалы оценки неврологического дефицита McGraw не всегда информативно. В связи с широкой вариабельностью анатомии артериального русла, бассейнов, внутренней и внешней сонной артерии необходимо исключить возможность коллатерального питания головного мозга в эксперименте.
Наиболее близким к заявленному решению является способ профилактики ишемии головного мозга (RU 2642961 публ. 29.01.2018). Сущность изобретения состоит в том, что крысам за час до моделирования тотальной четырехсосудистой ишемии головного мозга вводится тадалафил в дозе 1 мг/кг. Далее, соблюдая нужные временные интервалы производится контроль когнитивных нарушений. После головной мозг животных исследуется на наличие морфофункциональных нарушений.
Основным недостатком способа является то, что эффективность используемого вещества ниже, чем при фармакологическом прекондиционировании 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином.
Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного способа церебропротекции, включающий применение производного этилтиадиазола в качестве церебропротектора.
Задача достигается тем, в способе, включающем воспроизведение четырехсосудистой модели патологии и введение крысе линии Wistar 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг, которое вводят однократно за 60 минут до эксперимента внутрижелудочно через зонд, а через 60 минут проводят моделирование ишемии головного мозга путем коагуляции двух вертебральных артерий и временной окклюзии двух общих сонных артерий.
Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что:
- в качестве церебропротектора вводят однократно 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг за 60 минут до эксперимента внутрижелудочно.
- эффективность вещества оценивается всесторонне: исследуется неврологический дефицит животного, поведенческий статус, уровень двух специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE, проводится гистологическое и морфометрическое исследование.
- с помощью электрофизиологического метода производится контроль правильно выполненной модели патологии.
-получаемый церебропротекторный эффект более выражен, чем в аналогичных заявленных способах.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ профилактики ишемии головного мозга с использованием  2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицин, обладающего антиоксидантной и антигипоксической активностью и блокирующем активацию свободнорадикальных процессов, а также перекисного окисления липидов клеточных мембран, имеющих место при развитии острого инфаркта миокарда, ишемического и геморрагического инсультов, острых нарушений регионального и общего кровообращения. Способ приводит к выраженной коррекции ишемии головного мозга.
Получение 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина.
В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, термометром и обратным холодильником загружают 6,6 г (0,05 м) глицилглицина, 350 мл воды. После растворения загружают 6,46 г (0,05 м) 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазола, массу нагревают до 70°C и перемешивают при 70-75°C в течение 40 минут. Полученный раствор фильтруют, отгоняют воду, остаток перекристаллизовывают из изопропилового спирта. Получают 11,2 г мелкокристаллического порошка с Tпл ~ 190-192°C.
Найдено, %: C 36,41; H 5,82; N 26,68; S 12,21; C8H15N5SO3Вычислено, %: С 36,79; H 5,78; N 26,82; S 12,24; O 18,37.ИК-спектр, ν см-1: 3270 (NH), 2800, 2780 (CH), 2560 (>N<), 1720 (C=O), 1545 (NHCO).
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Исследование выполнено на 40 половозрелых самцах крыс линии «Wistar» 5–6-месячного возраста массой 180–210 г. Содержание животных соответствовало всем правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований на территории РФ. Животные содержались в стандартных условиях, соответствующих санитарным правилам (№ 1045-73), утвержденным МЗ СССР 06.04.73 г. по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ Р 53434-2009. Вивисекцию проводили по этическим принципам обращения с лабораторными животными «European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No.123».
В эксперименте было выделено 4 группы крыс (n=10): 1) интактные, 2) ложнооперированные, 3) с тотальной церебральной ишемией, 4) с тотальной церебральной ишемией и предварительным введением за 60 минут 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг. 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицин вводили внутрижелудочно через зонд. Данное соединение синтезировано в ОАО «Всероссийский центр по изучению безопасности биологически активных веществ» (ВНЦ БАВ, Россия, Старая Купавна).
Наркотизацию животных в эксперименте выполняли с применением золетила 60 мг/кг и хлоралгидрата 150 мг/кг.
Все эксперименты были выполнены в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств при нарушениях мозгового кровообращения. В работе была использована модель патологии, при которой осуществляли временную окклюзию двух общих сонных артерий на 4 минуты, с предварительной коагуляцией двух вертебральных артерий. Оценка адекватности выполнения окклюзии артерий, кровоснабжающих мозг, осуществлялась с помощью регистрации электрической активности головного мозга животного на приборе Biopac Systems Inc. MP150 EEG100C (Tadalafil as an agent of pharmacological preconditioning in ischemic - reperfusion brain injury / Martynova O.V. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol.3, №3. – Р. 20-36. doi: 10.18413/2313-8971-2017-3-3-20-36).
Метод осуществляли при помощи программы AcqKnowledge 4.2. Критерием правильно выполненной методики являлось уменьшение амплитуды ЭЭГ.
Протокол исследования включал следующие этапы: моделирование ишемии головного мозга; оценку уровня электроэнцефалограммы животного; оценка поведенческого статуса (2 сут) и неврологического дефицита на 1, 3, 7 и 14 сут после моделирования патологии
О выраженности церебропротекторного эффекта судили по тяжести неврологического дефицита, поведенческого статуса, уровню специфических маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE, анализу гистологического и морфометрического состояния срезов головного мозга.
При статистической обработке данных рассчитывается среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считаются достоверными при p<0,05.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Для оценки неврологического статуса крыс использовали несколько методов: 1. Балльную шкалу оценки инсульта McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной. Внутри группы крыс с признаками неврологического дефицита подразделяли на животных с легкой, средней и тяжелой симптоматикой неврологического дефицита. Если у животного присутствовало несколько признаков неврологического дефицита, то баллы суммировали. За контроль принимали данные, полученные от животных с тотальной ишемией головного мозга. При оценке выраженности неврологического дефицита по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной после моделировании  ишемии, спустя 1 сутки, средний бал был высоким 3,95±0,57, что обусловлено наличием таких симптомов, как вялость и замедленность движений, односторонним полуптоз правого глаза. У 20% животных фиксировали летальный исход. Вялость и замедленность движений к 3 дню после моделирования патологии исчезали. На 3,7, 14 сут сохранялся полуптоз правого глаза.
Введение 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг так же ограничивало развитие неврологического дефицита. Спустя 1 сутки средний неврологический бал был 0,7±0,09. Неврологический дефицит проявлялся в вялости и замедленности,  движений, одностороннем полуптозе правого глаз. Вялость и замедленность движений к 3 дню после моделирования патологии исчезали. В данной группе летальности животных не наблюдалось (p<0,05) (Табл. 1).:
Таблица 1
Таблица 1 – Влияние ЛХТ 4-15 на динамику тяжести неврологических нарушений у крыс с ишемией головного мозга по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной (1996)(по среднему значению балла в группе) (М±m; n=10).
Примечание - здесь и везде далее* – p<0,05 по отношению к контролю.  «ЛО»- ложнооперированные животные; «ИГМ»- ишемия головного мозга; «ЛХТ+ИГМ» -ишемия головного мозга с предварительным введением производных этилтиадиазола.
Поведенческий статус крыс оценивали с помощью теста «Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) (Табл. 2). В группе с 4-сосудистой 4-минутной ИГМ (ишемия головного мозга) у животных наблюдалось значительное снижение горизонтальной активности, увеличение времени пребывания в темных рукавах. Снижение вертикальной активности проявлялось в снижении стоек, свешиваний приблизительно на 75%. Сохранялось минимальное ориентировочно-исследовательское поведение. В поведенческом тесте ПКЛ группа крыс с ИГМ и предварительным введением 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг проявляли себя более активно по сравнению с контрольной группой. Это проявлялось в увеличении горизонтальной и вертикальной активности, что отражалось в большем количестве стоек и свешиваний. Ориентировочно-исследовательское поведение снижалось, но незначительно (p<0,05).
Таблица 2
Влияние ишемии головного мозга на поведенческую активность животных в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (М±m; n=10).
При оценке двигательной активности животных в тесте актиметрии с инфракрасным мониторированием активности IR Actimeter после моделирования патологии активность крыс падала: уменьшались общая активность, количество стереотипных движений, максимальная скорость, общая дистанция. Время отдыха, в сравнении с ложнооперированными увеличивалось (Табл. 3).
Группа животных с предварительным введением 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг была более активнее, развивала большую скорость, проходила более длинную дистанцию. Время отдыха в данной группе ниже в сравнении с контролем (p<0,05) (Табл. 3).
Таблица 3
Влияние ишемии головного мозга на поведенческую активность животных в тесте актиметрии (М±m; n=10)
Далее осуществляли контроль уровня нейронспецифических маркеров S100b и NSE в данных группах (Табл. 4) .
Таблица 4
Концентрация маркеров повреждения головного мозга в плазме животных на 3-е сутки (М±m; n=10).
При анализе уровня S100b и NSE у животных данных экспериментальных групп регистрировали повышение концентрации маркеров в сыворотке крови. Статистически не значимо (p>0,05) повышение концентрации маркеров наблюдали у ложнооперированных животных. Статистически значимо (p<0,05) повышение концентрации было в группе с четырехсосудистой 4х минутной и ИГМ. При анализе уровня S100b и NSE у животных группы с ИГМ с предварительным введением 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг наблюдали снижение концентрации маркеров повреждения даже ниже уровня контрольной группы (p>0,05).
При обзорной микроскопии у интактных животных нейроны были преимущественно пирамидной, округлой или многоугольной формы, с крупными округлыми ядрами и мелкозернистой цитоплазмой. У многих нейронов базофильная субстанция цитоплазмы имела вид крупных глыбок, расположенных периферически. В некоторых нейронах чётко определялись одно или два центрально расположенных ядрышка, представлено на (Фиг. 1), где  А - лобная доля интактной крысы, X 100, окр. гематоксилин+эозин; Б – гиппокамп интактной крысы, X 400, окр. гематоксилин+эозин.
Область лобной доли характеризовалась низкой плотностью расположения, а область СА1 гиппокампа высокой плотностью, средних по размеру, нейронов.
При четырёхсосудистой модели ишемии отмечалась выраженная гиперхромия нейронов лобной доли с периваскулярным и перицеллюлярным отёком. Форма клеток была, преимущественно, многоугольной, вытянутой, ядра во многих из них не определялись. Капилляры паретически расширены, полнокровны. В области СА1 гиппокампа наблюдалась дезорганизация нейрональных слоев, хроматолиз, набухание и пикнотические изменения ядер, двуядрышковые нейроны практически не определялись, представлено на (Фиг.2), где  – четырёхсосудистая модель ишемии головного мозга: А - лобная доля, X 400, окр. гематоксилин+эозин; Б – СА1 область гиппокампа, X 400, окр. тионином по Нисслю.
При введении за час до моделирования патологии 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицина в дозе 50 мг/кг, морфологические изменения нейронов носили, преимущественно, некробиотический характер. Количество погибших нейронов было значительно ниже, чем без введения соединения. В гиппокампе нарушение стратификации слоев носили умеренный характер, представлено на (Фиг. 3), где - четырёхсосудистая модель ишемии головного мозга при коррекции 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином : А - лобная доля, X 100, окр. гематоксилин+эозин; Б – гиппокамп, X 400, окр. гематоксилин+эозин.
При статистическом исследовании установлено, что ишемическое повреждение нейронов и лобной доли, и гиппокампа достоверно более выражены в группе с четырёхсосудистой моделью ишемии мозга без коррекции веществом. Достоверно отличались минимальный диаметр, периметр и площадь нейронов, диаметр, периметр и площадь ядер (p<0.05). Количество двуядрышковых нейронов достоверно больше при коррекции 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином (p<0.05), что отражает функциональное состояние нейронов, их большую активность и способность к регенеративным и репаративным процессам. Достоверных отличий не обнаружено при измерении максимального диаметра ядер нейронов (p>0.05).
Таким образом, при четырехсосудистой модели ишемии повреждения большинства нейронов были необратимы, без признаков активации репаративных процессов. Коррекция ишемического повреждения 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином показала статистически достоверное повышение устойчивости нейронов лобной доли и СА1 области гиппокампа к гипоксии и ишемии, достоверное снижение количества погибших нейронов и большую активность репаративных процессов.
Таблица 5
Морфометрическая характеристика нейронов лобных долей головного мозга крыс (М±m; n=30).
Примечание: *-при (p<0.05), #- при (p>0.05). За контроль принимали гр. интактных животных.
Таблица 6
Морфометрическая характеристика нейронов гиппокампа крыс (М±m; n=30).
Примечание: *-при (p<0.05), #- при (p>0.05). За контроль принимали гр. интактных животных.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженной коррекции ишемических повреждений головного мозга в условиях тотальной четырехсосудистой модели ишемии головного мозга крыс 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолия глицилглицином в дозе 50 мг/кг массы тела животного при однократном внутрижелудночном введении.