ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ПУТЕМ БЫСТРОГО ИНКУБИРОВАНИЯ И ОБОГАЩЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Способ идентификации и анализа жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов в образце, включающий:
(a) отбор образца, содержащего или предположительно содержащего один или более видов микроорганизмов;
(b) инкубирование образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включены в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты;
(c) введение метки в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты путем приведения свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контакт с реагентом метки, который селективно связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов;
(d) выделение или очистку меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот; и
(e) определение идентичности жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов в образце по результатам секвенирования или определение идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот.
2. Способ по п. 1, в котором образец получают от субъекта с подозрением на наличие или наличием микробной инфекции.
3. Способ по п. 2, в котором у субъекта диагностирован или подозревается сепсис.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором для стадии (a) полученный образец перед стадией (b) обрабатывают с использованием способа удаления нуклеиновых кислот хозяина, чтобы селективно удалить немикробные нуклеиновые кислоты.
5. Способ по п. 4, в котором способ удаления нуклеиновых кислот хозяина включает:
удаление немикробных нуклеиновых кислот путем:
(а) селективного расщепления немикробной ДНК путем приведения полученного образца в контакт с рекомбинантным белком, содержащим: связывающийся домен, который селективно связывается с немикробными нуклеиновыми кислотами, связанными гистоном (-ами), или с немикробными нуклеиновыми кислотами, содержащими метилированные CpG остатки, и нуклеазный домен, обладающий активностью при расщеплении нуклеиновых кислот; или
(b) использования аффинного агента, связанного с твердой подложкой, который селективно связывается с нуклеиновыми кислотами, связанными гистоном (-ами), или селективно связывается с метилированными CpG остатками немикробных нуклеиновых кислот.
6. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой образец окружающей среды, взятый с природоохранного испытательного участка.
7. Способ по п. 6, в котором проводят тестирование природоохранного участка на предмет загрязнения микроорганизмами.
8. Способ по п. 1, в котором образец представляет собой образец продукта питания с подозрением на загрязнение микроорганизмами.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором к одному или более видов микроорганизмов относятся бактерии, грибы, вирусы, водоросли, археи и/или простейшие.
Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica
Yersinia pseudotuberculosis
10. Способ по п. 9, в котором бактерии выбраны из и/или.
Absidia corymbifera, Absidia ramose, Achorion gallinae, Actinomadura spp., Ajellomyces dermatididis, Aleurisma brasiliensis, Allersheria boydii, Arthroderma spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatu, Basidiobolus spp, Blastomyces spp, Cadophora spp, Candida albicans, Cercospora apii, Chrysosporium spp, Cladosporium spp, Cladothrix asteroids, Coccidioides immitis, Cryptococcus albidus, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Cunninghamella elegans, Dematium wernecke, Discomyces israelii, Emmonsia spp, Emmonsiella capsulate, Endomyces geotrichum, Entomophthora coronate, Epidermophyton floccosum, Filobasidiella neoformans, Fonsecaea spp., Geotrichum candidum, Glenospora khartoumensis, Gymnoascus gypseus, Haplosporangium parvum, Histoplasma, Histoplasma capsulatum, Hormiscium dermatididis, Hormodendrum spp., Keratinomyces spp, Langeronia soudanense, Leptosphaeria senegalensis, Lichtheimia corymbifera, Lobmyces loboi., Loboa loboi, Lobomycosis, Madurella spp., Malassezia furfur, Micrococcus pelletieri, Microsporum spp, Monilia spp., Mucor spp., Mycobacterium tuberculosis, Nannizzia spp., Neotestudina rosatii, Nocardia spp., Oidium albicans, Oospora lactis, Paracoccidioides brasiliensis, Petriellidium boydii, Phialophora spp., Piedraia hortae, Pityrosporum furfur, Pneumocystis jirovecii (
Pneumocystis carinii), Pullularia gougerotii, Pyrenochaeta romeroi, Rhinosporidium seeberi, Sabouraudites (Microsporum), Sartorya fumigate, Sepedonium, Sporotrichum spp., Stachybotrys, Stachybotrys chartarum, Streptomyce spp., Tinea spp., Torula spp, Trichophyton spp, Trichosporon spp
Zopfia rosatii
11. Способ по п. 9, в котором грибы выбраны из илии/или.
симплексвируса
вируса ветряной оспы
цитомегаловируса
розеоловируса
лимфокриптовируса
радиновируса
мастаденовируса
α-папилломавируса
β-папилломавируса
Χ-папилломавируса
γ-папилломавируса
мю-папилломавируса
ню-папилломавируса
альфа-полиомавируса
бета-полиомавируса
γ-полиомавируса
дельта-полиомавируса
поксвируса моллюсков
ортопоксвируса
парапоксвируса
α-вируса гепатита TTV, β-вируса гепатита TTV, γ-вируса гепатита TTV, цикловируса, гемициркулярного вируса, гемикибивируса, гемивонгвируса
эритровируса, депендовируса, бокавируса, ортогепаднавируса
гамма-ретровируса
дельта-ретровируса
лентивируса
вируса пенистости обезьян
вируса колорадской клещевой лихорадки
ротавируса
сидорнавируса
α-коронавируса, β-коронавируса, торовируса, мамастровируса
норовируса
саповируса
флавивируса
вируса гепатита С
пегивируса
ортогепевируса
кардиовируса
козавируса
энтеровируса
вируса гепатита А
кобувируса
парэховируса
розавируса
саливируса
альфавируса
вируса краснухи
вируса Эбола
вируса Марбурга
хенипавируса
вируса кори
вируса респираторных заболеваний
вируса паротита
метапневмовируса
ортопневмовируса
ледантевируса
лиссавируса
везикуловируса
маммаренавируса
ортохантавируса
ортонайровируса
ортобуньявируса
флебовируса
α-вируса гриппа
β-вируса гриппа
γ-вируса гриппа
куараньявируса
тоготовируса
дельтавируса
12. Способ по п. 9, в котором вирусы выбраны из , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,,,,,,,,,,,,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,  и/или .
6
4
4
4
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинил-цитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинил-уридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 8-азидоаденозина, N-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG-уридина, 5-азидо-PEG-цитидина, 5-азидо-PEG-2'-дезоксицитидина, 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинилцитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинилуридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина и (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина.
6
4
4
4
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 8-азидоаденозина, N-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, причем один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG-уридина, 5-азидо-PEG-цитидина и 5-азидо-PEG-2'-дезоксицитидина.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором образец инкубируют в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 5 мин до 180 мин.
18. Способ по п. 17, в котором образец инкубируют в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 30 мин до 120 мин.
19. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором реагент метки представляет собой антитело, которое связывается с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов.
20. Способ по п. 19, в котором антитело связывается с высокой специфичностью с 5-бром-2'-дезоксиуридином или иоддезоксиуридином.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором реагент метки связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов посредством клик-химической реакции, реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения или лигирования Штаудингера.
22. Способ по п. 21, в котором реагент метки содержит азидную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими алкинильную группу, посредством клик-химической реакции.
23. Способ по п. 21, в котором реагент метки содержит алкинильную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими азидную группу, посредством клик-химической реакции.
24. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором реагент метки содержит биотиновую группу.
25. Способ по п. 24, в котором реагент метки, содержащий биотиновую группу, выбран из:
,  ,
,
и  .
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором реагент метки дополнительно содержит химически расщепляемый линкер или ферментативно расщепляемый линкер.
27. Способ по п. 26, в котором расщепляемый линкер представляет собой кислотно-неустойчивый линкер или дисульфидный линкер.
цис
28. Способ по п. 27, в котором кислотно-неустойчивый линкер содержит гидразоновые или -аконитильные группы.
29. Способ по п. 26, в котором ферментативно расщепляемый линкер содержит пептидный линкер или β-глюкуронидоновый линкер.
30. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором для выделения или очистки меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот используют аффинный адсорбент.
31. Способ по п. 30, в котором аффинный адсорбент представляет собой антитело, иммобилизированное на твердой подложке, причем антитело связывается с высокой специфичностью с реагентом метки или с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов.
32. Способ по п. 30, в котором аффинным адсорбентом является стрептавидин или авидин, иммобилизованный на твердой подложке, и при этом реагент метки содержит биотиновую группу.
33. Способ по п. 31 или 32, в котором твердая подложка выполнена из нано- или микроматериалов, гранул или представляет собой планшет.
34. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором реагент метки или метку удаляют или отщепляют от выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот до стадии (e) по п. 1.
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот определяют с помощью микроматрицы с зондами для нуклеиновых кислот различных микроорганизмов.
36. Способ по п. 35, в котором идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот определяют посредством:
(i) амплификации выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот с применением способа, основанного на первой ПЦР, с использованием праймеров, содержащих флуоресцентный краситель, с образованием меченых продуктов, причем такие праймеры содержат последовательность, специфичную к консервативному участку гена 16S микробной рРНК;
(ii) нанесения меченых продуктов на микроматрицу с зондами, которые содержат уникальные последовательности 16S рРНК вариабельной области 20 или более микроорганизмов;
(iii) определения идентичности жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов на основе визуализации микроматрицы для флуоресцентных продуктов гибридизации и определения идентичности микроорганизма на основании последовательности зонда микроматрицы.
37. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот определяют или подтверждают посредством секвенирования выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот.
38. Способ по п. 37, в котором выделенные или очищенные свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты секвенируют с помощью метода секвенирования на основе транспосом.
39. Способ по п. 38, в котором секвенирование свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот проводят посредством:
(a) нанесения выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот на связанные с гранулами транспосомы, причем транспосомы, связанные с гранулами, опосредуют одновременную фрагментацию микробных нуклеиновых кислот и добавление праймеров для секвенирования;
(b) амплификации фрагментов микробной нуклеиновой кислоты с праймерами, которые содержат индексные и адапторные последовательности, с образованием библиотеки амплифицированных продуктов;
(c) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов;
(d) секвенирования библиотеки амплифицированных продуктов; и
(e) определения идентичности жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов на основании корреляции последовательностей, полученных из библиотеки амплифицированных продуктов, с базами данных известных последовательностей микроорганизмов с помощью биоинформатического анализа.
40. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты представляют собой РНК, причем микробная РНК проходит обратную транскрипцию в кДНК до стадии (e) по п. 1, и при этом экспрессию генов жизнеспособных и/или пролиферирующих микроорганизмов можно установить на основании анализа уровня экспрессии генных продуктов из свежесинтезированной микробной РНК с помощью микроматрицы и/или секвенирования.
41. Способ определения эффективности противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма (-ов) в образце, включающий:
(a) отбор образца, содержащего или предположительно содержащего один или более видов микроорганизмов;
(b) разделение образца на два образца - контрольный образец и обработанный образец;
(с) инкубирование контрольного образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включаются в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты;
(c’) инкубирование обработанного образца в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов и противомикробного агента, причем нуклеозидные или нуклеотидные аналоги одного или более типов включаются в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты;
(d) введение метки в свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты контрольного образца и обработанного образца путем приведения свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контакт с реагентом метки, который селективно связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов;
(e) выделение или очистку меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца и обработанного образца;
(f) определение уровня экспрессии генов, и/или количества, или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце;
(f’) определение уровня экспрессии генов, и/или количества, и идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце; и
(g) сравнение и определение любых изменений в уровне экспрессии генов, и/или количествах, и/или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце с уровнем экспрессии генов, и/или количествами, или идентичностью выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце,
причем снижение уровня экспрессии генов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом или уменьшение количества и/или идентичности свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма (-ов).
42. Способ по п. 41, в котором противомикробный агент выбран из антибиотика, противогрибкового и противовирусного средства.
43. Способ по п. 42, в котором антибиотик выбран из амоксициллина, ампициллина, бакампициллина, карбенициллина, клоксациллина, диклоксациллина, флуклоксациллина, мезлоциллина, нафциллина, оксациллина, пенициллина G, пенициллина V, пиперациллина, пивампициллина, пивмециллинама, тикарциллина, цефацетрила, цефадроксила, цефалексина, цефалоглицина, цефалония, цефалоридина, цефалотина, цефапирина, цефатризина, цефазафлура, цефазедона, цефазолина, цефрадина, цефроксадина, цефтезола, цефаклора, цефамандола, цефметазола, цефоницида, цефотетана, цефокситина, цефпрозила, цефуроксима, цефузонама, цефкапена, цефдалоксима, цефдинира, цефдиторена, цефетамета, цефиксима, цефменоксима, цефодизима, цефотаксима, цефпимизола, цефподоксима, цефтерама, цефтибутена, цефтиофура, цефтиолена, цефтизоксима, цефтриаксона, цефоперазона, цефтазидима, цефклидина, цефепима, цефлупренама, цефоселиса, цефозопрана, цефпирома, цефкинома, цефтобипрола, цефтаролина, цефакломезина, цефалорама, цефапарола, цефканела, цефедролора, цефемпидона, цефетризола, цефивитрила, цефматилена, цефмепидиума, цефовецина, цефоксазола, цефротила, цефсумида, цефурацетима, цефтиоксида, азтреонама, имипенема, дорипенема, эртапенема, меропенема, азитромицина, эритромицина, кларитромицина, диритромицина, рокситромицина, телитромицина, клиндамицина, линкомицина, амикацина, гентамицина, канамицина, неомицина, нетилмицина, паромомицина, стрептомицина, тобрамицина, флумекина, налидиксиновой кислоты, оксолиновой кислоты, пиромидиновой кислоты, пипемидиновой кислоты, розоксацина, ципрофлоксацина, эноксацина, ломефлоксацина, надифлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина, пефлоксацина, руфлоксацина, балофлоксацина, гатифлоксацина, грепафлоксацина, левофлоксацина, моксифлоксацина, пазуфлоксацина, спарфлоксацина, темафлоксацина, тосуфлоксацина, безифлоксацина, делафлоксацина, клинафлоксацина, гемифлоксацина, прулифлоксацина, ситафлоксацина, тровафлоксацина, сульфаметизола, сульфаметоксазола, сульфизоксазола, триметоприм-сульфаметоксазола, демеклоциклина, доксициклина, миноциклина, окситетрациклина, тетрациклина, тигециклина, ванкомицина, тейкопланина, телаванцина, линезолида, циклосерина, рифампицина, рифабутина, рифапентина, рифалазила, виомицина, капреомицина, бацитрацина, полимиксина В, хлорамфеникола, метронидазола, тинидазола и нитрофурантоина.
44. Способ по п. 42, в котором противогрибковый препарат выбран из аморолфина, бутенафина, нафтифина, тербинафина, бифоназола, бутоконазола, клотримазола, эконазола, фентиконазола, кетоконазола, изоконазола, люликоназола, миконазола, омоконазола, оксиконазола, сертаконазола, сульконазола, тиоконазола, терконазола, албаконазола, эфинаконазола, флуконазола, изавуконазола, итраконазола, позаконазола, равуконазола, терконазола, вориконазола, абафунгина, амфотерицина B, нистатина, натамицина, трихомицина, анидулафунгина, каспофунгина, микафунгина, толнафтата, флуцитозина, бутенафина, гризеофульвина, циклопирокса, сульфида селена, таваборола.
45. Способ по п. 42, в котором противовирусное средство выбрано из ацикловира, бривудина, докозанола, фамцикловира, фоскарнета, идоксуридина, пенцикловира, трифлуридина, видарабина, цитарабина, валацикловира, троматандина, прителивира, амантадина, римантадина, осельтамивира, перамивира, занамивира, асунапревира, боцепревира, цилупревира, данопревира, фалдапревира, глекапревира, гразопревира, нарлапревира, паритапревира, симепревира, совапревира, телапревира, ванипревира, ведропревира, воксилапревира, даклатасвира, элбасвира, ледипасвира, одаласвира, омбитасвира, пибрентасвира, равидасвира, рузасвира, саматасвира, велпатасвира, беклабувира, дасабувира, делеобувира, филибувира, сетробувира, софосбувира, радалбувира, уприфосбувира, ламивудина, телбивудина, клевудина, адефовира, дизопроксилтенофовира, алафенамидтенофовира, энфувиртида, маравирока, викривирока, ценикривирока, PRO 140, ибализумаба, фостемсавира, диданозина, эмтрицитабина, ламивудина, ставудина, зидовудина, амдоксовира, априцитабина, цензавудина, элвуцитабина, рацивира, стампидина, 4′-этинил-2-фтор-2′-дезоксиаденозина, залцитабина, эфавиренза, невирапина, делавирдина, этравирина, рилпивирина, доравирина, долутегравира, элвитегравира, ралтегравира, BI 224436, каботегравира, биктегравира, MK-2048, бевиримата, BMS-955176, ампренавира, фосампренавира, индинавира, лопинавира, нелфинавира, ритонавира, саквинавира, атазанавира, дарунавира, типранавира, долутегравира, элвитегравира, ралтегравира, BI 224436, каботегравира, биктегравира, MK-2048, кобицистата, ритонавира, интерферона-α, пегинтерферона-α, метизазона, рифампицина, имиквимода, ресиквимода, подофиллотоксина, фомивирсена, цидофовира, плеконарила, фавипиравира, галидезивира, ремдезивира, мерицитабина, MK-608, NITD008, мороксидина, тромантадина и триазавирина.
46. Способ по любому из пп. 41-45, в котором образец получают от субъекта с подозрением на наличие или наличием микробной инфекции.
47. Способ по п. 46, в котором у субъекта диагностирован или подозревается сепсис.
48. Способ по любому из пп. 41-47, в котором к одному или более видов микроорганизмов относятся бактерии, грибы и/или вирусы.
Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica
Yersinia pseudotuberculosis
49. Способ по п. 48, в котором бактерии выбраны из и/или.
Absidia corymbifera, Absidia ramose, Achorion gallinae, Actinomadura spp., Ajellomyces dermatididis, Aleurisma brasiliensis, Allersheria boydii, Arthroderma spp., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatu, Basidiobolus spp., Blastomyces spp., Cadophora spp., Candida albicans, Cercospora apii, Chrysosporium spp., Cladosporium spp., Cladothrix asteroids, Coccidioides immitis, Cryptococcus albidus, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Cunninghamella elegans, Dematium wernecke, Discomyces israelii, Emmonsia spp, Emmonsiella capsulate, Endomyces geotrichum, Entomophthora coronate, Epidermophyton floccosum, Filobasidiella neoformans, Fonsecaea spp., Geotrichum candidum, Glenospora khartoumensis, Gymnoascus gypseus, Haplosporangium parvum, Histoplasma, Histoplasma capsulatum, Hormiscium dermatididis, Hormodendrum spp., Keratinomyces spp, Langeronia soudanense, Leptosphaeria senegalensis, Lichtheimia corymbifera, Lobmyces loboi., Loboa loboi, Lobomycosis, Madurella spp., Malassezia furfur, Micrococcus pelletieri, Microsporum spp, Monilia spp., Mucor spp., Mycobacterium tuberculosis, Nannizzia spp., Neotestudina rosatii, Nocardia spp., Oidium albicans, Oospora lactis, Paracoccidioides brasiliensis, Petriellidium boydii, Phialophora spp., Piedraia hortae, Pityrosporum furfur, Pneumocystis jirovecii (
Pneumocystis carinii), Pullularia gougerotii, Pyrenochaeta romeroi, Rhinosporidium seeberi, Sabouraudites (Microsporum), Sartorya fumigate, Sepedonium, Sporotrichum spp., Stachybotrys, Stachybotrys chartarum, Streptomyce spp., Tinea spp., Torula spp, Trichophyton spp., Trichosporon spp.
Zopfia rosatii
50. Способ по п. 48, в котором грибы выбраны из илии/или.
симплексвируса
вируса ветряной оспы
цитомегаловируса
розеоловируса
лимфокриптовируса
радиновируса
мастаденовируса
α-папилломавируса
β-папилломавируса
Χ-папилломавируса
γ-папилломавируса
мю-папилломавируса
ню-папилломавируса
альфа-полиомавируса
бета-полиомавируса
γ-полиомавируса
дельта-полиомавируса
поксвируса моллюсков
ортопоксвируса
парапоксвируса
α-вируса гепатита TTV, β-вируса гепатита TTV, γ-вируса гепатита TTV, цикловируса, гемициркулярного вируса, гемикибивируса, гемивонгвируса
эритровируса, депендовируса, бокавируса, ортогепаднавируса,
гамма-ретровируса
дельта-ретровируса
лентивируса
вируса пенистости обезьян
вируса колорадской клещевой лихорадки
ротавируса
сидорнавируса
α-коронавируса, β-коронавируса, торовируса, мамастровируса
норовируса
саповируса
флавивируса
вируса гепатита С
пегивируса
ортогепевируса
кардиовируса
козавируса
энтеровируса
вируса гепатита А
кобувируса
парэховируса
розавируса
саливируса
альфавируса
вируса краснухи
вируса Эбола
вируса Марбурга
хенипавируса
вируса кори
вируса респираторных заболеваний
вируса паротита
метапневмовируса
ортопневмовируса
ледантевируса
лиссавируса
везикуловируса
маммаренавируса
ортохантавируса
ортонайровируса
ортобуньявируса
флебовируса
α-вируса гриппа
β-вируса гриппа
γ-вируса гриппа
куараньявируса
тоготовируса
дельтавируса
51. Способ по п. 48, в котором вирусы выбраны из , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , и/или .
6
4
4
4
52. Способ по любому из пп. 41-51, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинил-цитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинил-уридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 8-азидоаденозина, N-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG-уридина, 5-азидо-PEG-цитидина, 5-азидо-PEG-2'-дезоксицитидина, 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина.
53. Способ по любому из пп. 41-52, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2-этиниладенозина, N6-пропаргиладенозина, 2'-(O-пропаргил)-аденозина, 3'-(O-пропаргил)-аденозина, 5-этинилцитидина, 5-этинил-2'-дезоксицитидина, 2'-(O-пропаргил)-цитидина, 3'-(O-пропаргил)-цитидина, 2'-(O-пропаргил)-гуанозина, 3'-(O-пропаргил)-гуанозина, 5-этинилуридина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, 2'-(O-пропаргил)-уридина, 3'-(O-пропаргил)-уридина, (2'S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина, (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина, 2'(S)-2'-дезокси-2'-фтор-5-этинилуридина и (2'S)-2'-фтор-5-этинилуридина.
6
4
4
4
54. Способ по любому из пп. 41-53, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 8-азидоаденозина, N-(6-азидо)гексил-2'-дезоксиаденозина, причем один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 2'-азидо-2'-дезоксиаденозина, 5-азидометилуридина, 5-(15-азидо-4, 7, 10, 13-тетраоксапентадеканоиламиноаллил)-2'-дезоксиуридина, 5-(3-азидопропил)-уридина, 5-азидо-PEG-уридина, 5-азидо-PEG-цитидина и 5-азидо-PEG-2'-дезоксицитидина.
55. Способ по любому из пп. 41-54, в котором один или более типов нуклеозидных или нуклеотидных аналогов выбраны из 5-бром-2'-дезоксиуридина, 5-бромуридина, 5-иод-2'-дезоксиуридина и 5-иодуридина.
56. Способ по любому из пп. 41-55, в котором контрольный образец и обработанный образец инкубируют в течение одинакового периода времени в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 5 мин до 180 мин.
57. Способ по п. 56, в котором контрольный образец и обработанный образец инкубируют в течение одинакового периода времени в присутствии нуклеозидных или нуклеотидных аналогов одного или более типов от 30 мин до 120 мин.
58. Способ по любому из пп. 41-57, в котором реагент метки представляет собой антитело, которое связывается с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов.
59. Способ по п. 58, в котором антитело связывается с высокой специфичностью с 5-бром-2'-дезоксиуридином или иоддезоксиуридином.
60. Способ по любому из пп. 41-59, в котором реагент метки связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов посредством клик-химической реакции, реакции напряженного [3+2] циклоприсоединения или лигирования Штаудингера.
61. Способ по п. 60, в котором реагент метки содержит азидную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими алкинильную группу, посредством клик-химической реакции.
62. Способ по п. 60, в котором реагент метки содержит алкинильную группу, которая связывается с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами, содержащими азидную группу, посредством клик-химической реакции.
63. Способ по любому из пп. 41-62, в котором реагент метки содержит биотиновую группу.
64. Способ по п. 63, в котором реагент метки, содержащий биотиновую группу, выбран из:
,  ,
,
и  .
65. Способ по любому из пп. 41-64, в котором реагент метки дополнительно содержит химически расщепляемый линкер или ферментативно расщепляемый линкер.
66. Способ по п. 65, в котором расщепляемый линкер представляет собой кислотно-неустойчивый линкер или дисульфидный линкер.
цис
67. Способ по п. 66, в котором кислотно-неустойчивый линкер содержит гидразоновые или -аконитильные группы.
68. Способ по п. 65, в котором ферментативно расщепляемый линкер содержит пептидный линкер или β-глюкуронидоновый линкер.
69. Способ по любому из пп. 41-68, в котором для выделения или очистки меченых свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот используют аффинный адсорбент.
70. Способ по п. 69, в котором аффинный адсорбент представляет собой антитело, иммобилизированное на твердой подложке, причем антитело связывается с высокой специфичностью с реагентом метки или с высокой специфичностью с нуклеозидными или нуклеотидными аналогами одного или более типов.
71. Способ по п. 69, в котором аффинным адсорбентом является стрептавидин или авидин, иммобилизованный на твердой подложке, и при этом реагент метки содержит биотиновую группу.
72. Способ по п. 70 или п. 71, в котором твердая подложка выполнена из нано-или микроматериалов, гранул или представляет собой планшет.
73. Способ по любому из пп. 41-72, в котором реагент метки или метку удаляют или отщепляют от выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот до стадий (f), (f’) и (g) по п. 42.
74. Способ по любому из пп. 41-73, в котором определение уровня экспрессии генов, и/или количества, и/или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце и обработанном образце определяют с помощью микроматрицы с зондами для нуклеиновых кислот различных микроорганизмов.
75. Способ по п. 74, в котором уровень экспрессии генов, и/или количество, и/или идентичность выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном образце и обработанном образце определяют посредством:
(i) амплификации выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца с применением способа, основанного на первой ПЦР, с использованием праймеров, содержащих флуоресцентный краситель, с образованием меченых продуктов, причем такие праймеры содержат последовательность, специфичную к консервативному участку гена 16S микробной рРНК;
(i’) амплификации выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из обработанного образца с применением способа, основанного на первой ПЦР, с использованием праймеров, содержащих флуоресцентный краситель, с образованием меченых продуктов, причем такие праймеры содержат последовательность, специфичную к консервативному участку гена 16S микробной рРНК;
(ii) нанесения меченых продуктов из контрольного образца на первую микроматрицу с зондами, которые содержат уникальные последовательности 16S рРНК вариабельной области 20 или более микроорганизмов;
(ii’) нанесения меченых продуктов из обработанного образца на вторую микроматрицу, причем вторая микроматрица является дубликатом первой микроматрицы; и
(iii) определения эффективности противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма (-ов) в образце по результатам визуализации первой микроматрицы и визуализации второй микроматрицы для флуоресцентных продуктов гибридизации и определения каких-либо изменений в интенсивности, месте расположения или отсутствия флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении микроматриц,
причем снижение интенсивности флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении первой и второй микроматриц, или изменения в месте расположения, или отсутствие флуоресцентных продуктов гибридизации при сравнении первой и второй микроматриц указывают на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма (-ов).
76. Способ по любому из пп. 41-75, в котором эффективность противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма (-ов) в образце определяют или подтверждают секвенированием выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного образца и из обработанного образца,
причем снижение уровня экспрессии генов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом или уменьшение количества и/или идентичности свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в обработанном образце по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что противомикробный агент эффективно модулирует рост и пролиферацию микроорганизма (-ов).
77. Способ по п. 76, в котором выделенные или очищенные свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты из контрольного и обработанного образцов секвенируют с помощью метода секвенирования на основе транспосом.
78. Способ по п. 77, в котором секвенирование свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов проводят посредством:
(a) нанесения выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов на связанные с гранулами транспосомы, причем транспосомы, связанные с гранулами, опосредуют одновременную фрагментацию микробных нуклеиновых кислот и добавление праймеров для секвенирования;
(b) амплификации фрагментов микробной нуклеиновой кислоты с праймерами, которые содержат индексные и адапторные последовательности, с образованием библиотеки амплифицированных продуктов;
(c) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов из контрольного образца;
(c’) промывки и объединения библиотеки амплифицированных продуктов из обработанного образца;
(d) секвенирования библиотек амплифицированных продуктов из контрольного образца;
(d’) секвенирования библиотек амплифицированных продуктов из обработанного образца; и
(е) определения любых изменений в уровне экспрессии генов, и/или количествах, и/или идентичности выделенных или очищенных свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот в контрольном и обработанном образцах с помощью биоинформатического анализа.
79. Способ по любому из пп. 41-78, в котором свежесинтезированные микробные нуклеиновые кислоты представляют собой РНК, причем микробная РНК проходит обратную транскрипцию в кДНК до стадий (f), (f') и (g) по п. 41, и при этом эффективность противомикробного агента в модуляции роста и пролиферации микроорганизма (-ов) можно установить по результатам определения изменений в уровнях экспрессии генов свежесинтезированных микробных нуклеиновых кислот из контрольного и обработанного образцов с помощью микроматрицы и/или секвенирования.