НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ АМИНОИМИДАЗОПИРИМИДИНА В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ JANUS-КИНАЗ И ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
NEW DERIVATIVES OF AMINOIMIDAZOPYRIMIDINE AS JANUS KINASE INHIBITORS AND PHARMACEUTICAL APPLICATION THEREOF

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к соединениям, которые являются ингибиторами Janus-киназ, и к их производным, к указанным соединениям для применения в терапии и к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к новым соединениям, которые являются ингибиторами протеинтирозинкиназ, таких как Janus-киназы (JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2) и, в частности, Janus-киназа 1 (JAK1).
Протеинтирозинкиназы представляют собой семейство ферментов, катализирующих перенос концевого фосфата аденозинтрифосфата на остатки тирозина в белковых субстратах. Фосфорилирование остатков тирозина на белковых субстратах приводит к передаче внутриклеточных сигналов, которые регулируют широкое множество процессов, таких как рост, дифференцировка и активация клеток, метаболизм, гемопоэз, иммунная защита организма и иммунорегуляция. Поскольку установление молекулярных механизмов при ряде воспалительных состояний и других нарушениях иммунной системы (например, аутоиммунные заболевания) указало на ключевую роль этих внутриклеточных сигнальных путей, модулирование активности протеинтирозинкиназ, по-видимому, является перспективным способом контроля воспалительных заболеваний. Было идентифицировано большое количество протеинтирозинкиназ, которые могут представлять собой рецепторные протеинтирозинкиназы, например, рецептор инсулина, или нерецепторные протеинтирозинкиназы.
Протеинтирозинкиназы JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2 селективно ассоциируют с цитоплазматическими доменами различных цепей рецепторов цитокинов и имеют ключевые роли в цитокин-зависимой регуляции гомеостаза тканей, инициации врожденного иммунитета, формировании адаптивных иммунных ответов и воспалительных процессах. Они являются ключевыми при передаче сигнала в ответ на их активацию через фосфорилирование тирозина посредством стимуляции рецепторов цитокинов. (1) Schindler C. et al. JAK-STAT signaling: from interferons to cytokines. J. Biol. Chem 2007; 282(28):20059; (2) O’Shea J.J. Targeting the Jak/STAT pathway for immunosuppression; Ann. Rheum. Dis. 2004; 63 Suppl 2:ii67; (3) Schindler C. Series introduction. JAK-STAT signaling in human disease; J. Clin. Invest. 2002; 109(9):1133); (4) O’Shea et. Al. Cell, Vol. 109, S121-S131, 2002; (5) Schwartz D.M. et al. Nat. Rev. Rheumatol., 2016; 12(1): 25-36; (6) O’Shea et al. New. Eng. J. Med. 2013; 368(2): 161-170.
В то время как JAK1, JAK2 и TYK2 экспрессируются повсеместно JAK3 преимущественно экспрессируется в кроветворных клетках.
JAK1 играет ключевую роль в опосредовании биологических ответов и JAK1 широко экспрессируется и ассоциирована с несколькими большими семействами рецепторов цитокинов. Она вовлечена в передачу сигнала представителями семейства субъединицы γ рецептора IL-2 (IL-2, IL-4, IL-7R, IL-9R, IL-15R и IL-21R), семейства рецептора IL-4 (IL-4R, IL-13R), семейства рецептора gp130 и рецепторы цитокинов класса II, включающие семейство рецептора IL-10 и семейства рецепторов IFN как типа I, так и типа II.
JAK2 вовлечена в передачу сигнала несколькими одноцепочечными рецепторами (включая Epo-R, GHR, PRL-R), семейство рецептора IL-3, семейство рецептора gp130, семейство рецептора IL-12 (IL-12 и IL-23) и семейства некоторых рецепторов цитокинов класса II. Таким образом, JAK2 играет ключевую роль в передаче сигналов Epo, IL-3, GM-CSF, IL-5 и IFNγ. Мыши с нокаутом JAK2 имеют летальный эмбриональный фенотип.
JAK3 вовлечена в передачу сигнала посредством рецепторов, которые используют общую гамма-цепь семейства рецепторов цитокинов типа I, также известного как семейство рецепторов IL-2 (например, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21). Идентифицированы популяции пациентов с XSCID со сниженными уровнями белка JAK3 или с генетическими дефектами общей гамма-цепи, указывая на то, что иммунная супрессия должна быть результатом блокирующих сигналов через каскад JAK3. Исследования на животных показали, что JAK3 не только играет ключевую роль в созревании B- и T-лимфоцитов, но что JAK3 конститутивно необходима для поддержания функции T-клеток. Модулирование иммунной активности через этот новый механизм может оказаться полезным для лечения T-клеточных пролиферативных нарушений, таких как заболевания иммунной системы, в частности, аутоиммунные заболевания.
TYK2 вовлечена в передачу сигнала интерферонов типа I IL-6, IL-10, IL-12 и IL-23. Описан пациент-человек с дефицитом TYK2, и этот пациент имел первичный иммунодефицит, охарактеризованный как гипер-IgE-подобный синдром с множеством оппортунистических инфекций вирусами, бактериями и грибами. Поскольку было обнаружено, что IL-23 играет важную роль при многих хронических состояниях, ингибитор TYK2, вероятно, может быть очень эффективным при лечении заболеваний, в которых участвует IL-23.
Анемия и нейтропения могут быть связаны с ингибированием EPO и GM-CSF, соответственно, поскольку биологический эффект этих двух цитокинов, по-видимому, зависит исключительно от активации JAK2. Аналогично, IL-12 и IL-23 вовлечены во врожденную и адаптивную иммунную защиту от вирусов, бактерий и грибов. Поскольку эти цитокины связываются с рецепторами, которые привлекают JAK2 и TYK2 в их каскаде передачи сигнала, возможно, что селективный ингибитор JAK1 не повлияет на их биологическую активность и, таким образом, будет иметь более безопасный профиль по сравнению с соединениями, которые ингибируют JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2.
Активация JAK приводит к активации молекул STAT и, таким образом, к индукции каскада передачи сигнала JAK/STAT, который в высокой степени регулируется событиями фосфорилирования. Активация молекул STAT считается надежным фармакодинамическим маркером активности JAK, и активность конкретных молекул JAK можно оценивать по уровню преимущественно привлеченной активной молекулы STAT.
В частности, рецептор IL-4, экспрессируемый иммунными клетками, состоит из двух различных цепей, высокоаффинного к лиганду и передающего сигнал IL-4Ra и общей γ-цепи, активирующей JAK1 и JAK3, соответственно, при связывании лиганда, которое приводит к привлечению и активации STAT6. Аналогично, рецептор IL-6 представляет собой гетеродимерный рецептор, образованный высокоаффинной цепью рецептора IL-6 (IL-6Ra) и передающей сигнал цепью гликопротеина 130 (gp130), с которой предпочтительно связывается JAK1. Цепь gp130 активирует каскад передачи сигнала JAK1 и STAT3 при связывании лиганда. Таким образом, для исследования активности JAK1, уровень активных STAT6 или STAT3 можно оценивать в иммунных клетках после стимуляции либо IL-4, либо IL-6, соответственно.
Более того, рецептор для эритропоэтина (EPOR) представляет собой гомодимерный рецептор, состоящий из двух идентичных рецепторных цепей. Таким образом, цепь EPOR является как высокоаффинной связывающей лиганд, так и передающей сигнал, и активирует только ассоциированную с ней молекулу JAK2 при связывании лиганда, что ведет к привлечению и активации STAT5. Рецептор GM-CSF представляет собой гетеродимерный рецептор, состоящий из высокоаффинной рецепторной цепи GM-CSF (GM-CSFRα) и передающей сигнал цепи (GM-CSFRβ), с которой JAK2 специфически связывается. При связывании лиганда ассоциация рецепторных цепей α и β приводит к активации каскада передачи сигнала JAK2 и STAT5. Таким образом, для исследования активности JAK2, можно оценивать уровень активного STAT5 в иммунных клетках после стимуляции либо GM-CSF, либо эритропоэтином (EPO).
Ожидается, что ингибиторы Janus-киназ будут демонстрировать пригодность для лечения воспалительных и неинфекционных аутоиммунных заболеваний, в которые эти киназы вовлечены. Недавно на рынок выпустили общие ингибиторы JAK Тофацитиниб и Руксолитиниб для лечения ревматоидного артрита и миелофиброза, соответственно.
Таким образом, ингибиторы JAK, более того, могут быть пригодными для лечения заболеваний, связанных с активностью Janus-киназ, включая, например, заболевания кожи, такие как псориаз, атопический дерматит, склеродермия, красные угри, злокачественные опухоли кожи, дерматит, герпетиформный дерматит, дерматомиозит, витилиго, очаговая алопеция, контактный дерматит, экзема, ксероз, ихтиоз, крапивница и хронический идиопатический прурит; респираторные заболевания, такие как астма, хроническое обструктивное заболевание легких, фиброз легких, кистозный фиброз, ринит, бронхиолит, биссиноз, пневмокониоз, бронхэктаз, пневмонит с гиперчувствительностью, злокачественные опухоли легких, мезотелиома и саркоидоз; желудочно-кишечные заболевания, такие как воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, ретроперитонеальный фиброз, целиакия и злокачественные опухоли; заболевания глаз, такие как миастения, синдром Шегрена, конъюнктивит, склерит, увеит, сухой кератит, кератит, ирит; системные показания, такие как волчанка, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет типа I и осложнения диабета, злокачественные опухоли, анкилозирующий спондилит и псориатический артрит; а также другие аутоиммунные заболевания и показания, где является желательной иммуносупрессия, например, при трансплантации органов.
В WO2013007768 описаны трициклические гетероциклические соединения, композиции и способы их применения в качестве ингибиторов JAK.
В WO2013007765 описаны слитые трициклические соединения для применения в качестве ингибиторов Janus-киназ.
В WO2011086053 описаны трициклические гетероциклические соединения, композиции и способы их применения.
Остается потребность в новых соединениях, которые эффективно и селективно ингибируют специфические ферменты JAK, в частности, в ингибиторах, которые селективно ингибируют JAK1 относительно JAK2, для уменьшения неблагоприятных эффектов без влияния на общую противовоспалительную эффективность.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соединения по настоящему изобретению демонстрируют ингибиторную активность в отношении Janus-киназ; и, в частности, соединения по изобретению демонстрируют ингибиторную активность в отношении JAK1. Таким образом, соединения по настоящему изобретению демонстрируют селективность ингибирования JAK-киназ; в частности, соединения демонстрируют селективность ингибирования JAK1 против JAK2. Следовательно, соединения по настоящему изобретению также могу демонстрировать селективность ингибирования STAT6 или STAT3 относительно STAT5.
Таким образом, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I)
где
6
A обозначает C-циклоалкил;
1
1
1
R обозначает C-алкил, где указанный C-алкил необязательно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из дейтерия;
2
1
1
5
1
R обозначает C-алкил, где указанный C-алкил замещен заместителем, выбранным изR, и где указанный C-алкил необязательно замещен одним или несколькими атомами дейтерия;
3
2
2
6
2
R обозначает C-алкил, где указанный C-алкил замещен заместителем, выбранным из R и где указанный C-алкил необязательно замещен одним или несколькими атомами дейтерия;
4
R обозначает водород или дейтерий;
5
R обозначает циано;
6
R обозначает гидроксил;
или его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или сольватам.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение общей формулы (I), как определено в настоящем описании, вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем, или эксципиентом, или фармацевтически приемлемым носителем(ями), необязательно вместе с одним или несколькими другими терапевтически активными соединениями.
В другом аспекте изобретение относится к соединению общей формулы (I), как определено в настоящем описании, для применения в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте, изобретение относится к соединению общей формулы (I), как определено в настоящем описании, для применения для профилактики и/или лечения заболеваний иммунной системы, таких как аутоиммунные заболевания, или заболеваний, связанных с нарушением регуляции иммунной системы.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
a
b
a
b
1
4
1-
2
н
Термин "(C-C)алкил" указывает на радикал, который получается, когда один атом водорода удален из разветвленного или линейного углеводорода. Указанный алкил содержит 1-6, предпочтительно 1-4, например, 1-3, например, 2-3, или, например, 1-2 атома углерода. Термин включает подклассы нормального алкила (-алкил), вторичного и третичного алкила, такого как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил и изогексил. Количество атомов углерода в "алкиле" указывается приставкой "(C-C)", где a представляет собой минимальное количество и b представляет собой максимальное количество атомов углерода в углеводородном радикале. Таким образом, например, подразумевается, что (C-C)алкил указывает на алкильный радикал, содержащий 1-4 атома углерода. Под Cалкилом подразумевают алкильный радикал, содержащий 1 атом углерода, такой как метил. Под C-алкилом подразумевают алкильный радикал, содержащий 2 атома углерода, такой как этил.
Подразумевается, что термин "циано" указывает на группу -CN, связанную с родительской молекулярной частью через атом углерода.
a
b
a
b
5
8
Под термином "(C-C)циклоалкил" подразумевают насыщенный циклоалкановый углеводородный радикал, включая полициклические радикалы, такие как бициклические или трициклические радикалы, содержащие 3-8 атомов углерода, как например, 5-8 атомов углерода, как например, 5-7 атомов углерода, как например, 5-6 атомов углерода, как например, 3-6 атомов углерода, как например, 3-5 атомов углерода или, например, 3-4 атома углерода, как например, 6 атомов углерода, например циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил или циклогептил, адамантил и кубанил. Количество атомов углерода в "циклоалкиле" указывается приставкой "(C-C)", где a представляет собой минимальное количество и b представляет собой максимальное количество атомов углерода в углеводородном радикале. Таким образом, например, под (C-C)циклоалкилом подразумевают циклоалкильный радикал, содержащий от 5 до 8 атомов углерода.
Под термином "галоген" подразумевают заместитель из 7-й основной группы периодической таблицы, такой как фтор, хлор, бром и йод.
Под термином "углеводородный радикал" подразумевают радикал, содержащий только атомы водорода и углерода, он может содержать одну или несколько двойных и/или тройных углерод-углеродных связей, и она может содержать циклические части в комбинации с разветвленными или линейными частями. Указанный углеводород содержит 1-10 атомов углерода и предпочтительно содержит 1-4, например, 1-3, например, 1-2 атома углерода. Термин включает алкил, циклоалкил и арил, как указано в настоящем описании.
a
b
1
4
5
8
Количество атомов углерода в углеводородном радикале (например, алкил и циклоалкил) указывается приставкой "(C-C)", где a представляет собой минимальное количество и b представляет собой максимальное количество атомов углерода в углеводородном радикале. Таким образом, например, под (C-C)алкилом подразумевают алкильный радикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, и под (C-C)циклоалкилом подразумевают циклоалкильный радикал, содержащий от 5 до 8 атомов кольца.
Под терминами "гидрокси" или "гидроксил" подразумевают группу -OH.
a
b
a
b
Под термином "гидрокси(C-C)алкил" подразумевают (C-C)алкильную группу, как определено выше, замещенную одним или несколькими гидрокси, например, гидроксиметил, гидроксиэтил, гидроксипропил.
Когда два или более из определенных выше терминов используют в комбинации, такие как арилалкил, циклоалкилалкил и т.п., следует понимать, что первый упоминаемый радикал является заместителем на последнем из упоминаемых радикалов, где точка присоединения к исходной молекулярной части находится на последнем из радикалов. Когда два или более из определенных выше терминов используют в комбинации, такие как арилалкил, циклоалкилалкил и т.п., следует понимать, что первый упоминаемый радикал является заместителем на последнем из упоминаемых радикалов, где точка присоединения к исходной молекулярной части находится на последнем из радикалов.
Под группой C(O) подразумевают карбонильную группу (C=O).
Если заместители описаны как независимо выбранные из группы, каждый заместитель выбран независимо от другого. Таким образом, заместители могут быть идентичными или могут отличаться от другого заместителя(ей).
Термин "необязательно замещенный" означает "незамещенный или замещенный", и, таким образом, общие формулы, описанные в настоящем описании, охватывают соединения, содержащие конкретный необязательный заместитель(и), а также соединения, которые не содержат необязательный заместитель(и).
Под термином "фармацевтически приемлемая соль" подразумевают соли, полученные путем реакции соединения формулы (I), которое содержит основную часть, с подходящей неорганической или органической кислотой, такой как хлористоводородная, бромистоводородная, йодистоводородная, серная, азотная, фосфорная, муравьиная, уксусная, 2,2-дихлоруксусная, адипиновая, аскорбиновая, L-аспарагиновая, L-глутаминовая, галактаровая, молочная, малеиновая, L-яблочная, фталевая, лимонная, пропионовая, бензойная, глутаровая, глюконовая, D-глюкуроновая, метансульфоновая, салициловая, янтарная, малоновая, виннокаменная, бензолсульфоновая, этан-1,2-дисульфоновая, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, толуолсульфоновая, сульфаминовая или фумаровая кислота. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей приведены в Berge, S.M.; J. Pharm. Sci.; (1977), 66(1), 1-19, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Под термином "сольват" подразумевают структуру, образованную посредством взаимодействия между соединением, например, соединением формулы (I), и растворителем, например, спиртом, глицерином или водой, где указанная структура находится в кристаллической форме или в аморфной форме. Когда растворителем является вода, указанную структуру называют гидратом.
Термин "лечение", как используют в рамках изобретения, означает контроль и уход за пациентом для борьбы с заболеванием, нарушением или состоянием. Подразумевается, что термин включает замедление прогрессирования заболевания, нарушения или состояния, ослабление, облегчение или смягчение симптомов и осложнений, и/или излечение или устранение заболевания, нарушения или состояния. Термин включает предупреждение состояния, где под предупреждением подразумевают контроль и уход за пациентом для борьбы с заболеванием, состоянием или нарушением, и оно включает введение активных соединений для предупреждения возникновения симптомов или осложнений. Тем не менее, профилактическое (превентивное) и терапевтическое (излечивающее) лечение являются двумя отдельными аспектами.
Если нет иных указаний, все точные величины, указанные в настоящем описании, отражают соответствующие приблизительные величины, например, точные иллюстративные величины, приведенные в отношении конкретного показателя, можно считать также обеспечивающими соответствующий приблизительно показатель, определенный посредством "приблизительно", когда это целесообразно.
Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме и в той степени, как если бы было индивидуально и конкретно указано, что каждая ссылка включена в качестве ссылки, независимо от какого-либо отдельно указанного включения конкретных документов в настоящем описании.
Варианты осуществления изобретения
Вариант осуществления изобретения относится к соединению формулы (I) выше, где
6
A обозначает C-циклоалкил;
1
1
1
R обозначает C-алкил, где указанный C-алкил необязательно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из дейтерия;
2
1
1
5
R обозначает C-алкил, где указанный C-алкил замещен заместителем, выбранным изR;
3
2
2
6
R обозначает C-алкил, где указанный C-алкил замещен заместителем, выбранным из R;
4
R обозначает водород;
5
R обозначает циано;
6
R обозначает гидроксил;
или его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или сольватам.
Один вариант осуществления изобретения относится к соединению формулы (I), выше имеющему формулу (Ia) ниже:
где
1
1
1
R обозначает C-алкил, где указанный C-алкил необязательно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из дейтерия;
2
1
1
5
1
R обозначает C-алкил, где указанный C-алкил замещен заместителем, выбранным изR и где указанный C-алкил необязательно замещен одним или несколькими атомами дейтерия;
4
R обозначает водород или дейтерий;
5
R обозначает циано;
6
R обозначает гидроксил;
a
b
c
d
каждый из R, R, R и R независимо выбран из водорода или дейтерия;
или их фармацевтически приемлемым солям, гидратам или сольватам.
В одном варианте осуществления изобретение относится к соединению общей формулы (I); где соединение формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (Ib)
1
2
4
6
где R, R, Rи R являются такими, как определено выше, и где каждый из Ra, Rb, Rc и Rd независимо выбран из водорода и дейтерия; или его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или сольватам.
В одном варианте осуществления изобретение относится к соединению общей формулы (I); где соединение формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (Ic)
1
2
4
6
где R, R, R и R являются такими, как определено выше, и где каждый из Ra, Rb, Rc и Rd независимо выбран из водорода и дейтерия; или его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или сольватам.
В одном варианте осуществления изобретение относится к соединению общей формулы (I); где соединение формулы (I) представляет собой соединение общей формулы (Id)
1
2
4
6
где R, R, R и R являются такими, как определено выше, и где каждый из Ra, Rb, Rc и Rd независимо выбран из водорода и дейтерия; или его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или сольватам.
Один вариант осуществления изобретения относится к соединению формулы (I), причем указанное соединение выбрано из
транс-
R
2-[4-[8-[(1)-1-гидроксиэтил]-2-(метиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрила,
транс-
2-[4-[8-(1-гидроксиэтил)-2-(метиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрила
или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов или сольватов.
Один из вариантов осуществления изобретения относится к соединению формулы (I), причем указанное соединение выбрано из
транс-
R
2-[4-[8-[(1)-1-гидроксиэтил]-2-(метиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрила,
транс-
2-[4-[8-(1-гидроксиэтил)-2-(метиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрила,
транс-
R
2-[4-[8-[(1)-1-гидроксиэтил]-2-(тридейтериометиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрила
или их фармацевтически приемлемых солей, гидратов или сольватов.
Один из вариантов осуществления изобретения относится к соединению формулы (I), причем указанное соединение выбрано из
транс-
R
2-[4-[8-[(1)-1-гидроксиэтил]-2-(метиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрила,
или его фармацевтически приемлемых солей, гидратов или сольватов.
Любая комбинация двух или более вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, считается входящей в объем настоящего изобретения.
Соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, гидраты или сольваты можно получать в кристаллической форме либо прямо посредством концентрирования из органического растворителя, либо посредством кристаллизации или перекристаллизации из органического растворителя или смеси указанного растворителя и сорастворителя, который может быть органическим или неорганическим, такого как вода. Кристаллы можно выделять по существу в свободной от растворителя форме или в качестве сольвата, такого как гидрат. Изобретение охватывает все кристаллические формы, такие как полиморфы и псевдополиморфы, а также их смеси.
Соединения формулы (I) могут содержать или могут не содержать асимметрически замещенные (хиральные) атомы углерода, которые обеспечивают существование изомерных форм, например, энантиомеров и возможно диастереомеров. Настоящее изобретение относится ко всем таким изомерам, либо в оптически чистой форме, либо в качестве их смесей (например, рацемических смесей или частично очищенных оптических смесей). Чистые стереоизомерные формы соединений и промежуточные соединения по настоящему изобретению можно получать с использованием методик, известных в данной области. Различные изомерные формы можно разделять физическими способами разделения, такими как селективная кристаллизация и хроматографические способы, например, высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием хиральных стационарных фаз. Энантиомеры можно отделять друг от друга посредством селективной кристаллизации их диастереомерных солей, которые могут быть образованы с оптически активными аминами, такими как l-эфедрин, или с оптически активными кислотами. Затем оптически очищенные соединения можно освобождать от указанных очищенных диастереомерных солей. Энантиомеры также можно разделять посредством образования диастереомерных производных. Альтернативно энантиомеры можно разделять хроматографическими способами с использованием хиральных стационарных фаз. Чистые стереоизомерные формы также могут быть образованы из соответствующих чистых стереоизомерных форм соответствующих исходных материалов. Если является желательным конкретный стереоизомер, указанное соединение можно синтезировать стереоселективными или стереоспецифическими способами получения, и/или с использованием хиральных чистых исходных материалов. Более того, когда двойная связь или полностью или частично насыщенная кольцевая система присутствует в молекуле, могут образовываться геометрические изомеры. Подразумевается, что любой геометрический изомер, в качестве отделенных, чистых или частично очищенных изомеров или их смесей включены в объем изобретения.
1
2
3
12
13
14
14
15
2
in vivo
В соединениях общей формулы (I) атомы могут демонстрировать их естественное изотопное содержание, или один или несколько из атомов могут быть искусственно обогащены конкретным изотопом, имеющим то же атомное число, но атомную массу или массовое число, отличные от атомной массы или массового числа, встречающихся в природе. Подразумевают, что настоящее изобретение включает все подходящие изотопные варианты соединений общей формулы (I). Например, различные изотопные формы водорода включают H, H и H, и различные изотопные формы углерода включают C, C и C, различные изотопные формы азота включают N и N. Обогащение дейтерием (H) может, например, повышать время полужизни  или уменьшать частоту дозирования, или может обеспечить соединение, пригодное в качестве стандарта для охарактеризации биологических образцов. Изотопно обогащенные соединения общей формулы (I) можно получать общепринятыми способами, хорошо известными специалисту в данной области, или посредством процессов, аналогичных процессам, описанных в общих методиках и примерах настоящего описания с использованием подходящих изотопно обогащенных реагентов и/или промежуточных соединений.
В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения соединения формулы I, как определено выше, являются пригодными в терапии и, в частности, пригодны для лечения, например, заболеваний кожи, таких как пролиферативные и воспалительные нарушения кожи, псориаз, атопический дерматит, склеродермия, красные угри, злокачественные опухоли кожи, дерматит, герпетиформный дерматит, дерматомиозит, витилиго, очаговая алопеция, контактный дерматит, экзема, ксероз, ихтиоз, крапивница и хронический идиопатический прурит; респираторные заболевания, такие как астма, хроническое обструктивное заболевание легких, фиброз легких, кистозный фиброз, ринит, бронхиолит, биссиноз, пневмокониоз, бронхэктаз, пневмонит с гиперчувствительностью, злокачественные опухоли легких, мезотелиома и саркоидоз; желудочно-кишечные заболевания, такие как воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, ретроперитонеальный фиброз, целиакия и злокачественные опухоли; заболевания глаз, такие как миастения, синдром Шегрена, конъюнктивит, склерит, увеит, сухой кератит, кератит, ирит; системные показания, такие как волчанка, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет типа I и осложнения диабета, злокачественные опухоли, анкилозирующий спондилит и псориатический артрит; а также другие аутоиммунные заболевания и показания, где является желательной иммуносупрессия, например, при трансплантации органов.
В одном варианте осуществления изобретение относится к соединениям формулы I, как определено выше, для применения для профилактики и/или лечения псориаза или атопического дерматита.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу предупреждения, лечения или смягчения заболеваний иммунной системы, таких как аутоиммунные заболевания, причем способ включает введение индивидууму, страдающему от по меньшей мере одного из указанных заболеваний, эффективного количества одного или нескольких соединений общей формулы I, выше, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем или одним или несколькими эксципиентами, необязательно в комбинации с другими терапевтически активными соединениями.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу предупреждения, лечения или смягчения псориаза или атопического дерматита, причем способ включает введение индивидууму, страдающему от по меньшей мере одного из указанных заболеваний эффективного количества одного или нескольких соединений согласно общей формуле I, выше, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем или одним или несколькими эксципиентами, необязательно в комбинации с другими терапевтически активными соединениями.
В одном варианте осуществления изобретение относится к соединению формулы I для применения для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболеваний иммунной системы, таких как аутоиммунное заболевание, такое как псориаз или атопический дерматит.
В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения соединения формулы I, как определено выше, являются пригодными в качестве противовоспалительного средства, способного модулировать активность протеинтирозинкиназы семейства JAK протеинтирозинкиназ, такой как протеинтирозинкиназы JAK1, JAK2, JAK3 или TYK2.
В одном или нескольких вариантах осуществления изобретение относится к соединение общей формулы (I) для применения для лечения заболевания, которое отвечает на ингибирование активности киназы JAK1.
Помимо того, что они являются пригодными для лечения человека, соединения по настоящему изобретению также могут быть пригодными для ветеринарного лечения животных, включая млекопитающих, таких как лошади, крупный рогатый скот, овцы, свиньи, собаки и кошки.
Фармацевтические композиции по изобретению
Для применения в терапии соединения по настоящему изобретению, как правило, имеют форму фармацевтической композиции. Изобретение, таким образом, относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I), необязательно вместе с одним или несколькими другими терапевтически активным соединением(ями), вместе с фармацевтически приемлемым эксципиентом, наполнителем или носителем(ями). Эксципиент должен быть "приемлемым" в том смысле, что он является совместимым с другими ингредиентами композиции и не вредоносным для его реципиента.
Удобно, чтобы активный ингредиент составлял 0,0001-99,9% состава по массе.
В форме дозированной единицы соединение можно вводить один или несколько раз в сутки с соответствующими интервалами, всегда зависящими, однако, от состояния пациента, и в соответствии с назначением медицинского специалиста. Удобно, чтобы дозированная единица состава содержала от 0,001 мг до 1000 мг, предпочтительно от 0,01 мг до 100 мг, как например, 0,1-50 мг соединения формулы (I).
Подходящая дозировка соединения по изобретению зависит, среди прочего, от возраста и состояния пациента, тяжести подвергаемого лечению заболевания и других факторов, хорошо известны практикующему врачу. Соединение можно вводить перорально, парентерально, местным путем, трансдермально или внутрикожным путем и другими путями в соответствии с различными схемами дозирования, например, раз в сутки, раз в неделю или раз в месяц. Как правило однократная доза находится в диапазоне от 0,001 до 400 мг/кг массы тела. Соединение можно вводить в качестве болюса (т.е. целую суточную дозу вводят за один раз) или либо разделенными дозами два или более раз в сутки.
В контексте местного лечения может быть более пригодным указание на "единицу применения", которая обозначает однократную дозу, которую можно вводить пациенту и которой легко манипулировать и упаковывать, оставаясь физически и химически стабильной единичной дозой, содержащей либо сам активный материал, либо его смесь с твердыми, полутвердыми или жидкими фармацевтическими разбавителями или носителями.
Термин "единица применения" в отношении местного применения означает однократную, т.е. единичную дозу, которую можно вводить местным путем пациенту при применении на квадратный сантиметр подвергаемой лечению области от 0,001 микрограмма до 1 мг и предпочтительно от 0,05 микрограмма до 0,5 мг рассматриваемого активного ингредиента.
Также предусматривается, что в определенных режимах лечения может быть полезным введение с более длительными интервалами, например, раз в двое суток, каждую неделю, или даже с более длительными интервалами.
Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics
th
Если лечение вовлекает введение другого терапевтически активного соединения, рекомендуется принять во внимание , 9 Ed., J.G. Hardman and L.E. Limbird (Eds.), McGraw-Hill 1995, для пригодных дозировок указанных соединений.
Введение соединения по настоящему изобретению с одним или несколькими другими активными соединениями может быть либо одновременным, либо последовательным.
Составы включают, например, составы в форме, пригодной для перорального, ректального, парентерального (включая подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрисуставное и внутривенное), трансдермального, внутрикожного, офтальмического, местного, назального, сублингвального или буккального введения.
The Science и Practice of Pharmacy
Составы могут быть удобным образом предоставлены в виде единичной дозированной формы и могут быть получены, но не ограничиваясь этим, любыми способами, хорошо известными в области фармацевтики, например, как описано в Remington, , 21ed ed., 2005. Все способы включают стадию объединения активного ингредиента с носителем, который состоит из одного или нескольких дополнительных ингредиентов. Как правило, составы получают путем однородного и тщательного объединения активного ингредиента с жидким носителем, полутвердым носителем или тонко измельченным твердым носителем, или их комбинациями, а затем при необходимости придания продукту форму желаемого состава.
Составы по настоящему изобретению, пригодные для перорального и буккального введения, могут иметь форму дискретных единиц, таких как капсулы, саше, таблетки, жевательные резинки или пастилки, каждая из которых содержит заданное количество активного ингредиента; форму порошка, гранул или драже; форму раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости; или форму геля, нано- или микроэмульсии, эмульсии типа "масло-в-воде", эмульсии типа "вода-в-масле" или других систем распределения. Подходящие диспергирующие или суспендирующие вещества для водных суспензий включают синтетические или натуральные поверхностно-активные вещества и загустители. Активные ингредиенты также можно вводить в форме болюса, электуария или пасты.
Таблетка может быть получена прессованием, формованием или лиофилизации активного ингредиента, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки можно получать путем прессования в подходящем устройстве активного ингредиента(ов) в свободнотекучей, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанные со связующим веществом и/или наполнителем; смазывающего вещества; разрыхлителя или диспергирующего средства. Формованные таблетки можно получать путем формования в подходящем устройстве смеси порошкового активного ингредиента и подходящего носителя, смоченных инертным жидким разбавителем. Лиофилизированные таблетки можно получать в лиофилизаторе из раствора лекарственного вещества. Может быть включен подходящий наполнитель.
Составы для ректального введения могут иметь форму суппозиториев, в которых соединение по настоящему изобретению смешаны с растворимыми или не растворимыми в воде твердыми веществами с низкой температурой плавления.
Составы, пригодные для парентерального введения для удобства содержат стерильный масляный или водный препарат из активных ингредиентов, который предпочтительно является изотоническим с кровью реципиента, например, изотонический солевой раствор, изотонический раствор глюкозы или буферный раствор. Более того, состав может содержать сорастворитель, солюбилизирующее вещество и/или комплексообразующие средства. Состав для удобства может быть стерилизован, например, посредством фильтрации через задерживающий бактерии фильтр, добавления стерилизующего агента к составу, облучения состава или нагревания состава. Также для парентерального введения являются пригодными липосомальные составы, как описано, например, в Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, vol.9, 1994.
Альтернативно соединения формулы (I) могут быть предоставлены в стерильном твердом препарате, например, лиофилизированном порошке, который без труда растворяют в стерильном растворителе непосредственно перед применением.
Трансдермальные составы могут иметь форму гипса, пластыря, микроигл, липосомальных систем доставки или систем доставки в виде наночастиц, или других кожных составов, наносимых на кожу.
Составы, пригодные для офтальмического введения, могут быть в форме стерильного водного препарата активных ингредиентов, которые могут иметь микрокристаллическую форму, например, форму водной микрокристаллической суспензии. Липосомальные составы или биодеградируемые системы, например, как описано в Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, vol.2, 1989, также можно использовать для предоставления активного ингредиента для офтальмического введения.
Составы, пригодные для местного введения, такого как дермальное, интрадермального или офтальмическое введение, включают жидкие или полутвердые препараты, такие как линимент, лосьоны, гели, компрессы, спреи, пены, пленкообразующие системы, микроиглы, микро- или наноэмульсии, эмульсии типа "масло-в-воде" или "вода-в-масле", такие как кремы, мази или пасты; или растворы или суспензии, такие как капли.
Для местного введения соединение формулы (I), как правило, может присутствовать в количестве от 0,001 до 20% по массе композиции, таком как от 0,01% до приблизительно 10%, но также может присутствовать в количестве вплоть до приблизительно 100% композиции.
nd
th
Составы, пригодные для назального или буккального введения включают порошок, самораспыляющиея составы и составы спреев, такие как аэрозоли и тонкодиспергированные составы. Такие составы более подробно описаны, например, в Modern Pharmaceutics, 2 ed., G.S. Banker and C.T. Rhodes (Eds.), page 427-432, Marcel Dekker, New York; Modern Pharmaceutics, 3 ed., G.S. Banker and C.T. Rhodes (Eds.), page 618-619 и 718-721, Marcel Dekker, New York and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, vol. 10, J. Swarbrick и J.C. Boylan (Eds), page 191-221, Marcel Dekker, New York.
В дополнение к вышеупомянутым ингредиентам, составы соединения формулы (I) могут включать один или несколько дополнительных ингредиентов, таких как разбавители, буферы, вкусовые добавки, красители, поверхностно-активные вещества, загустители, усиливающие проникновение вещества, повышающие растворимость вещества, консерванты, например, метилгидроксибензоат (включая антиоксиданты), эмульгаторы и т.п.
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ
th
Соединения по настоящему изобретению можно получать рядом способов, хорошо известных специалистам в области синтеза. Соединения формулы (I) можно получать, например, с использованием реакций и способов, описанных ниже, а также способов известных в области синтетической органической химии, или их вариантов, как понятно специалистам в данной области. Предпочтительные способы включают, но не ограничиваются ими, способы, описанные ниже. Реакции проводят в растворителях, пригодных для используемых реагентов и материалов и подходящих для проведения трансформаций. Также в способах синтеза, описанных ниже, следует понимать, что все предложенные условия реакции, включая выбор растворителя, атмосферу реакции, температуру реакцию, длительность эксперимента и методики эксперимента, выбирают так, чтобы они представляли собой условия, стандартные для этой реакции, которые могут быть хорошо понятными специалисту в данной области. Не все соединения, относящиеся к данному классу, могут быть совместимыми с некоторыми из условий реакции, требуемых в некоторых из описанных способов. Такие ограничения заместителей, которые совместимы с условиями реакции, будут очевидными специалисту в данной области, и можно использовать альтернативные способы. Соединения по настоящему изобретению или любые промежуточные соединения можно при необходимости очищать с использованием стандартных способов, хорошо известных специалисту в области органического химического синтеза. Например, способов, описанных в "Purification of Laboratory Chemicals", 6 ed. 2009, W. Amarego and C. Chai, Butterworth-Heinemann. Исходные материалы представляют собой либо из известные коммерчески доступные соединения, либо их можно получать стандартными способами синтеза, хорошо известными специалисту в данной области.
Общие методики, препараты и примеры

1
Исходные материалы были коммерчески доступными или известными из литературы. Реагенты и растворители были коммерчески доступными, и их использовали без очистки, если нет иных указаний. Хроматографическую очистку проводили с использованием системы Grace REVELERIS с предварительно упакованными кассетами REVELERIS Silica Flash Cartridges, или системы Teledyne Isco CombiFlash Rf, или вручную с использованием силикагеля 60. Спектры H-ЯМР регистрировали на Bruker instruments при 300, 400 или 600 МГц с тетраметилсиланом (δ=0,00 м.д.) в качестве внутреннего стандарта.
На протяжении описания используются следующие сокращенные обозначения:
AcOH: уксусная кислота
DCM: дихлорметан
N, N
DIPEA: -диизопропилэтиламин
N, N
DMF: -диметилформамид
DMSO: диметилсульфоксид
Et: этил
EtOAc: этилацетат
EtOH: этанол
ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография
HRMS: масс-спектр высокого разрешения
MeCN: ацетонитрил
MeOH: метанол
мин: минута(ы)
MS: масс-спектрометрия или спектр масс
ЯМР: ядерная магнитно-резонансная спектроскопия
к.т.: комнатная температура, т.е. 18-30°C и, как правило, 20°C
THF: тетрагидрофуран
TLC: тонкослойная хроматография
R
t: время удержания
UPLC: сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография
УФ: Ультрафиолетовое излучение
Аналитическая LC-MS
Способ A
Анализ посредством UPLC-MS проводили с использованием системы Waters Acquity UPLC с колонкой 2,1×50 мм Acquity UPLC HSS T3 1,8µm и детектором Acquity SQ Detector, работающем в режиме электрораспыления с положительной ионизацией. Подвижные фазы состояли из 0,1% муравьиной кислоты в 10 мМ водном растворе ацетата аммония для буфера A и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле для буфера B. Использовали бинарный градиент (A:B 95:5→5:95) в течение 1,4 мин со скоростью потока 1,2 мл/мин, и температура колонки составляла 60°C.
Способ B
Анализ UPLC-MS с спектрами масс высокого разрешения проводили с использованием системы Waters Acquity UPLC с УФ-детекцией при 254 нм и масс-спектрометре TOF высокого разрешения Waters LCT Premier XE, работающем в режиме электрораспыления с положительной ионизацией. Использовали ту же колонку и подвижные фазы A и B, что и в способе A, но с более медленным градиентом (A:B 99:1→1:99 в течение 4,8 мин; 0,7 мл/мин; температура колонки 40°C).
Аналитическая ВЭЖХ с хиральной стационарной фазой
Анализ посредством ВЭЖХ с хиральной стационарной фазой проводили с использованием устройства Waters Acquity UPLC с детектором PDA и масс-спектрометром Waters LCT Premier XE, оборудованном колонкой Phenomenex Lux 3 µm Cellulose-2 (250×4,6 мм). Использовали изократические условия с подвижной фазой, состоящей из 10 мМ водного бикарбоната аммония:MeCN 70:30, и скорость потока 1 мл/мин. Колонку поддерживали при комнатной температуре.
ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
Промежуточное соединение 1
транс-
2-[4-[(5-амино-2-хлорпиримидин-4-ил)амино]циклогексил]еацетонитрил
транс-
3
4
Раствор 2,4-дихлор-5-нитропиримидина (5,0 г, 26 ммоль) в DMF (30 мл) охлаждали на ледяной бане и добавляли трифторацетат 4-(цианометил)циклогексиламмония (Li, Y.-L. et al. US-20140121198) (6,5 г, 26 ммоль) и DIPEA (5,5 мл, 31 ммоль). Смесь перемешивали при 0°C в течение 2 ч, а затем при к.т. в течение ночи. Летучие вещества выпаривали и остаток распределяли между EtOAc (200 мл) и насыщ. водн. раствором NaHCO (200 мл). Слои разделяли и водный слой экстрагировали три раза EtOAc. Объединенные органические слои сушили над MgSO, фильтровали и упаривали. Остаток растворяли в уксусной кислоте (5 мл) и порционно добавляли железные опилки (14 г, 260 ммоль) за 10 мин. Смесь перемешивали при к.т. в течение 2 ч, после чего ее фильтровали и летучие вещества выпаривали. Остаток очищали хроматографией (предварительно упакованная колонка 120 г с силикагелем, с элюированием градиентом DCM:MeOH от 100:0 до 50:50) с получением указанного в заголовке соединения (1,2 г), достаточно чистого для применения на следующих стадиях.
R
m
z
+
UPLC-MS (Способ A): t=0,53 мин, /=266,1 (M+H).
ПРИМЕРЫ
Пример 1
2-[
4-[8-[(1
)-1-гидроксиэтил]-2-(метиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрил (соединение 1)
транс-
R
Стадия 1
транс-
R
2-[4-[2-хлор-8-[(1)-1-гидроксиэтил]пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрил
R
R
К раствору тетрафторбората триэтилоксония (4,3 г, 23 ммоль) в THF (20 мл) в атмосфере аргона добавляли ()-лактамид (2,0 г, 23 ммоль). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение 2 ч, а затем добавляли к раствору промежуточного соединения 1 (1,2 г, 4,5 ммоль) в безводном этаноле (40 мл). Смесь перемешивали при 80°C в течение ночи. Для обеспечения полного конвертирования вторую часть тетрафторбората триэтилоксония (2,6 г, 14 ммоль) растворяли в THF (15 мл) в атмосфере аргона и добавляли ()-лактамид (1,2 г, 14 ммоль). Полученный раствор перемешивали при к.т. в течение 2 ч и добавляли к описанной выше реакционной смеси. Смесь вновь перемешивали при 80°C в течение ночи, летучие вещества выпаривали и остаток очищали хроматографией (предварительно упакованная колонка 80 г с силикагелем, с элюированием градиентом DCM:MeOH от 100:0 до 90:10) с получением продукта с примесями (1,9 г). Его растирали с простым эфиром с получением указанного в заголовке соединения (308 мг, 21%) в виде коричневого твердого вещества.
R
m
z
+
UPLC-MS (Способ A): t=0,56 мин, /=320,2 (M+H).
1
d
J
J
J
J
J
6
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-) δ 9,01 (с, 1H), 5,92 (д, =6,9 Гц, 1H), 5,13 (п, =6,6 Гц, 1H), 4,66 (тт, =12,3, 3,7 Гц, 1H), 2,55 (д, =6,2 Гц, 2H), 2,53-2,38 (м, 2H), 2,02-1,88 (м, 4H), 1,85-1,74 (м, 1H), 1,59 (д, =6,5 Гц, 3H), 1,36-1,25 (м, 2H).
Стадия 2
транс-
R
2-[4-[8-[(1)-1-гидроксиэтил]-2-(метиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрил
В пробирку с навинчивающейся крышкой помещали продукт стадии 1 (300 мг, 0,94 ммоль) и 33% метиламин в этаноле (5 мл) и смесь встряхивали при 70°C в течение 3 ч. Летучие вещества выпаривали и остаток очищали хроматографией (предварительно упакованная колонка 24 г с силикагелем с элюированием градиентом DCM:MeOH от 100:0 до 90:10) с получением указанного в заголовке соединения (200 мг, 68%).
R
m
z
+
UPLC-MS (Способ B): t=1,79 мин, /=315,1811 (M+H).
R
R
S
Аналитическая ВЭЖХ с хиральной стационарной фазой: t=10,1 мин. Не обнаружено других пиков. ()-энантиомер ожидается при t=11,0 мин, см. пример 2.
1
d
J
J
J
J
J
J
6
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-) δ 8,52 (с, 1H), 6,83 (ушир. с, 1H), 5,63 (д, =6,7 Гц, 1H), 4,95 (п, =6,5 Гц, 1H), 4,48 (тт, =12,0, 4,0 Гц, 1H), 2,82 (д, =4,7 Гц, 3H), 2,69-2,56 (м, 2H), 2,54 (д, =6,3 Гц, 2H), 1,95-1,80 (м, 4H), 1,76-1,67 (м, 1H), 1,53 (д, =6,5 Гц, 3H), 1,32-1,21 (м, 2H).
Пример 2
2-[
4-[8-(1-гидроксиэтил)-2-(метиламино)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрил (соединение 2)
транс-
Получали как в примере 1, но начиная с рацемического лактамида.
R
m
z
+
UPLC-MS (Способ B): t=1,79 мин, /=315,1894 (M+H).
R
S
R
R
R
R
R
Аналитическая ВЭЖХ с хиральной стационарной фазой: () энантиомер t=10,2 мин; () энантиомер t=11,0 мин. Абсолютные конфигурации устанавливали путем сравнения с образцом ()-энантиомера (t=10,1 мин), полученным из энантиомерно обогащенного ()-лактамида, см. пример 1.
1
d
J
J
J
J
J
6
H-ЯМР (300 МГц, DMSO-) δ 8,52 (с, 1H), 6,82 (ушир. кв, =4,0 Гц, 1H), 4,96 (кв, =6,5 Гц, 1H), 4,57-4,40 (м, 1H), 2,83 (д, =4,7 Гц, 3H), 2,74-2,56 (м, 2H), 2,54 (д, =6,3 Гц, 2H), 1,99-1,79 (м, 4H), 1,78-1,64 (м, 1H), 1,53 (д, =6,5 Гц, 3H), 1,36-1,17 (м, 2H).
Пример 3
2-[
4-[8-[(1
)-1-гидроксиэтил]-2-(
)пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрил (соединение 3)
транс-
R
тридейтериометиламино
транс-
R
В пробирку с навинчивающейся крышкой помещали 2-[4-[2-хлор-8-[(1)-1-гидроксиэтил]пурин-9-ил]циклогексил]ацетонитрил (10 мг, 31 мкмоль), гидрохлорид метил-3D-амина (22 мг, 313 мкмоль), DIPEA (56 мкл, 313 мкмоль) и изопропанол (0,2 мл) и встряхивали в течение ночи при 120°C. Очистка посредством кислотной препаративной ВЭЖХ с последующей лиофилизацией обеспечили указанное в заголовке соединение.
R
m
z
+
UPLC-MS (Способ B): t=1,79 мин, /=318,214 (M+H).
1
d
6
H-ЯМР (600 МГц, DMSO-) δ 8,52 (с, 1H), 6,80 (ушир. с, 1H), 5,64 (ушир. с, 1H), 4,99-4,92 (м, 1H), 4,48 (тт, J=12,1, 4,1 Гц, 1H), 2,71-2,56 (м, 2H), 2,54 (д, J=6,3 Гц, 2H), 1,96-1,80 (м, 4H), 1,76-1,67 (м, 1H), 1,53 (д, J=6,5 Гц, 3H), 1,26 (квт, J=4,3, 12,8 Гц, 2H).
Анализ с JAK-киназой
m
2
2
2
2
4
Экспрессируемую бакуловирусом человека Janus-киназу (JAK) 1, 2, 3 и тирозинкиназу (TYK) 2 приобретали от Carna Biosciences, Inc (#08-144, -045, -046, -147 соответственно). Все четыре очищенных фермента содержат только каталитический домен. JAK1 (aa 850-1154) и TYK2 (aa 871-1187) экспрессируются со слитой на N-конце GST-меткой, и JAK2 и JAK3 экспрессируются со слитой на N-конце His-меткой. Ингибирование фосфорилирования синтетического пептида определяли в анализе на основе HTRF (CisBio #62TK0PEC). Сначала 75 мл раствора тестируемого соединения (100% DMSO) добавляли в белый неглубокий 384-луночный планшет (NUNC #264706) с использованием устройства для обработки жидкостей Labcyte ECHO 550. После этого в лунки добавляли 1 мкл буфера для разведения соединения (50 мМ HEPES, 0,05% бычий сывороточный альбумин) и 2 мкл раствора TK (субстрат TK-биотин в киназном буфере [1x ферментный буфер из набора HTRFKinEASE TK, 1 мМ DTT]). Затем в лунки добавляли 5 мкл смеси киназа-ATP (полученной в киназном буфере) и планшеты инкубировали при к.т. в течение от 20 (JAK2, 3 и TYK2) до 40 (JAK1) мин. Для всех четырех киназ использовали концентрацию ATP, которая соответствовала K для ATP. Конечные концентрации буферов, субстрата, киназы и ATP представляли собой: JAK1: 50 мМ буфер Hepes, pH 7,0, 0,01% BSA, 10 мМ MgCl, 1 мМ DTT, 7 µM ATP, 50 нМ SEB, 1 мкМ субстрат TK-биотин и 5 нг JAK1; JAK2: 50 мМ буфер Hepes, pH 7,0, 0,01% BSA, 5 мМ MgCl, 1 мМ DTT, 4 мкМ ATP, 1 мкМ субстрат TK-Биотин и 0,1 нг JAK2; JAK3: 50 мМ буфер Hepes, pH 7,0, 0,01% BSA, 5 мМ MgCl, 1 мМ DTT, 2 мкМ ATP, 1 мкМ субстрат TK-Биотин и 0,3 нг JAK3; TYK2: 50 мМ буфер Hepes, pH 7,0, 0,01% BSA, 5 мМ MgCl, 1 мМ DTT, 13 мкМ ATP, 50 нМ SEB, 1 мкМ субстрат TK-биотин и 0,8 нг TYK2. После этого киназную реакцию останавливали добавлением 4 мкл смеси для детекции (конечные концентрации: 50 мМ буфер Hepes, pH 7,0, 0,01% BSA, 0,8 M KF, 20 мМ EDTA, 42 нМ стрептавидин-XL665 и 1:400 STK Ab Cryptate) и планшеты инкубировали в течение ночи в темноте. Устройство для считывания планшетов PerkinElmer Envision использовали для количественного определения сигнала HTRF с использованием следующих фильтров; фильтр возбуждения 320 нм, фильтр испускания 665 нм и 2-й фильтр испускания 615 нм. Для каждой лунки вычисляли соотношение ((665/615)×10).
Анализ STAT6
Двадцать пять мкл суспензии клеток STAT6 bla-RA1 (Invitrogen #K1243) высевали с плотностью 30-40000 клеток/лукна в 384-луночные планшеты Black View (PerkinElmer #6007460) с прозрачным дном в среде для анализа (Opti-MEM (Invitrogen #11058-021) + 0,5% инактивированная нагреванием эмбриональная телячья сыворотка (Invitrogen #10082-147) + 1% неосновных аминокислот (Invitrogen #11140-050) + 1% пируват натрия (Invitrogen #11360-070) + 1% пенициллин/стрептомицин (Invitrogen #15140-122)); содержавшей 550 нг/мл лиганда CD40 (Invitrogen #PHP0025). Планшеты с клетками инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C в воздухе/CO2 (95%/5%) с увлажнением. На следующий день 125 нл растворов тестируемых соединений и эталонных соединений переносили в планшеты с клетками с использованием устройства для обработки жидкостей Labcyte Echo 550. Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч в инкубаторе при 37°C в воздухе/CO2 (95%/5%) с увлажнением. После этого в планшеты добавляли рекомбинантный интерлейкин 4 человека (Invitrogen #PHC0045) также с использованием Labcyte Echo 550 до конечной концентрации 10 нг/мл. Затем клетки инкубировали в течение 4½-5 ч при 37°C в воздухе/CO2 (95%/5%) с увлажнением. Затем в планшеты для анализа добавляли 8 мкл смеси субстратов LiveBLAzer (Invitrogen #K1095), а затем инкубировали в течение ночи при к.т. Затем измеряли флуоресценцию: возбуждение: 405 нм; испускание: 460 нм (зеленый канал), испускание: 535 нм (синий канал). Фоновое значение вычитали для обоих каналов испускания, и для каждой лунки вычисляли соотношение 460/535 нм.
Анализ STAT5
Двадцать пять мкл суспензии клеток STAT5 irf1-bla TF1 (Invitrogen #K1219) высевали с плотностью приблизительно 10000 клеток/лукна в 384-луночные планшеты Black View (PerkinElmer #6007460) с прозрачным дном в среде для анализа (Opti-MEM (Invitrogen #11058-021) + 0,5% инактивированная нагреванием эмбриональная телячья сыворотка (Invitrogen #10082-147) + 1% неосновных аминокислот (Invitrogen #11140-050) + 1% пируват натрия (Invitrogen #11360-070) + 1% пенициллин/стрептомицин (Invitrogen #15140-122)); содержавшей 550 нг/мл лиганда CD40 (Invitrogen #PHP0025). Планшеты с клетками инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C в воздухе/CO2 (95%/5%) с увлажнением. На следующий день 125 нл растворов тестируемых соединений и эталонных соединений переносили в планшеты с клетками с использованием устройства для обработки жидкостей Labcyte Echo 550. Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч в инкубаторе при 37°C в воздухе/CO2 (95%/5%) с увлажнением. После этого в планшеты добавляли рекомбинантный интерлейкин 4 человека (Invitrogen #PHC0045) также с использованием Labcyte Echo 550 до конечной концентрации 10 нг/мл. Затем клетки инкубировали в течение 4½-5 ч при 37°C в воздухе/CO2 (95%/5%) с увлажнением. Затем в планшеты для анализа добавляли 8 мкл смеси субстратов LiveBLAzer (Invitrogen #K1095), а затем инкубировали в течение ночи при к.т. Затем измеряли флуоресценцию: возбуждение: 405 нм; испускание: 460 нм (зеленый канал), испускание: 535 нм (синий канал). Фоновое значение вычитали для обоих каналов испускания, и для каждой лунки вычисляли соотношение 460/535 нм.
Соединения по настоящему изобретению тестировали в анализах JAK-киназ, анализах STAT 5 и STAT6. Результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1
Соединение
JAK1EC<sub>50</sub> (нМ)
JAK2EC<sub>50</sub> (нМ)
JAK3EC<sub>50</sub> (нМ)
TYK2EC<sub>50</sub> (нМ)
STAT5 EC<sub>50</sub> (нМ)
STAT6 EC<sub>50</sub>(нМ)
1
5
157
602
19
5190
146
2
9
274
798
47
12800
213
3
3
129
510
13
4870
142