2-([{ 4-Нитрофенил} имино](фенил)метил)изоиндолин-1,3-дион, способ его получения, анальгезирующее и противовоспалительное средство на его основе
2-([{4-NITROPHENYL}IMINO](PHENYL)METHYL)ISOINDOLINE-1,3-DIONE, METHOD FOR PRODUCTION THEREOF, ANALGESIC AND ANTI-INFLAMMATORY AGENT BASED THEREON

Изобретение относится к области органической и медицинской химии, а именно к 2-([{4-нитрофенил}имино](фенил)метил)изоиндолин-1,3-диону формулы I. Изобретение также относится к способу его получения и к анальгезирующему и противовоспалительному средству на основе 2-([{4-нитрофенил}имино](фенил)метил)изоиндолин-1,3-диона.
Описан метод получения некоторых фталимидов общей формулы IV, который реализуется ангидридом фталевой кислоты (II) и ариламином (III) в среде диметилформамида между при кипячении в микроволновом реакторе в течение 40-60 минут [Sunil K. Upadhyay; Subramanya R.K. Pingali; Branko S. Jursic / Comparison of microwave-assisted and conventional preparations of cyclicimides // Tetrahedron Letters, 2010, Vol. 51, No 17, P. 2215-2217].
Описан метод получения N-замещенных фталимидов VI, основанный на взаимодействии ангидрида фталевой кислоты (II) и арил- или гетариламина (V) в среде кипящей уксусной кислоты в течение 5 часов [Vamecq Joseph; Вас Pierre; Herrenknecht Christine; Maurois Pierre; Delcourt Philippe; Stables James P. / Synthesis and Anticonvulsant and Neurotoxic Properties of Substituted 7V-Phenyl Derivatives of the Phthalimide Pharmacophore // Journal of Medicinal Chemistry, 2000, Vol. 43, No 7, P. 1311-1319].
Описан метод получения имидазолин-1,3-дионов VIII, осуществляемый при кипячении ангидрида фталевой кислоты (II) с арил- или гетариламином (VII) в нитробензоле (NB) около 1 часа [Vera L.M Sena; Rajendra М Srivastava; Ricardo О Silva; Vera L.M Lima / Synthesis and hypolipidemic activity of N-substituted phthalimides // II Farmaco, 2003, Vol. 58, No 12, P. 1283-1288].
Из патентной и научно-технической литературы не выявлены ни способ получения нового, заявляемого авторами соединения, ни сама структура, ни его биологическая активность.
Задачей предполагаемой группы изобретений является создание нового неописанного в литературе соединения - 2-([{4-нитрофенил}имино](фенил)метил)изоиндолин-1,3-диона (I), что позволит расширить ассортимент потенциальных анальгезирующих и противовоспалительных средств.
Техническими результатами, на решение которых направлена группа изобретений, являются получение нового гетероциклического соединения формулы I; разработка технологичного способа его синтеза.
Поставленная задача осуществляется путем взаимодействия N-(4-нитрофенил)бензолкарбоксимидамида с фталевым ангидридом по схеме:
Способ получения 2-([{4-нитрофенил}имино](фенил)метил)изоиндолин-1,3-диона (I) изучен и проведен в лабораторных условиях.
Предлагаемая группа изобретений проиллюстрирована примерами практического осуществления.
Пример 1. Получение 2-([{4-нитрофенил}имино](фенил)метил)изоиндолин-1,3-диона (I).
В грушевидную колбу объемом 50 мл помещают 1,0 г (4,1 ммоль) N-(4-нитрофенил)бензолкарбоксимидамид (IX), и 0,7 г (4,7 ммоль) ангидрида фталевой кислоты (II). Реакционную смесь расплавляют и греют в течение 30 минут при температуре 250°С, затем охлаждают, добавляют 96% этанол и кипятят в течение 15 минут. Полученную суспензию фильтруют в горячем виде, оставляя маточный раствор. Маточный раствор охлаждают, кристаллизуют, затем отфильтровывают целевой продукт (97,2% чистота методом ВЭЖХ). Для достижения более высокой степени чистоты полученного продукта его дополнительно перекристаллизовывают из этанола, применяя активированный уголь в качестве сорбента (99,6% чистота методом ВЭЖХ). Синтезированный продукт желтого цвета, выход составляет 0,96 г (62,4% от теоретического из расчета на N-(4-нитрофенил)бензолкарбоксимидамид).
f
21
13
3
Температура плавления 184-186°С. Хроматографическая однородность целевого продукта подтверждалась хроматографированнем раствора его в этаноле с использованием в качестве элюента смесь этилацетат-гексан (3:4). R=0,66. Состав синтезированного соединения подтвержден элементным анализом. Брутто-Формула: CHNO4.
Найдено %: С - 67.87; H - 3.59; N - 11.30.
Вычислено %: С - 67.92; Н - 3.53; N - 11.32.
1
13
Строение синтезированного вещества было доказано физико-химическими методами идентификации органических соединений: ЯМР Н и С, масс-спектрометрией.
1
6
В спектре ЯМР Н полученного соединения в ДМСО-d, 400 МГц присутствуют сигналы протонов бензольных колец фрагмента N-(4-нитрофенил)бензолкарбоксимидамида (δ 8.17 (d, 2Н, J=7.8 Гц); 8.05 (d, 2Н, J=7.8 Гц); 7.68 (t, 1Н, J=7.5 Гц); 7.55 (t, 2Н, J=7.7 Гц); 7.06 (d, 2Н, J=7.8 Гц) и сигналы протонов бензольного кольца фрагмента фталевого ангидрида 7.90 (m, 4Н) (табл. 1).
13
Спектр ЯМР С этого соединения характеризуется сигналами ядер углерода бензольных колец (125.33, 125.40, 129.56, 130.15, 134.06, 134.37, 135.82, 138.45, 140.75, 149.42, 153.14 м.д.), карбонильных атомов углерода фталимидного цикла (170.74 м.д.) и атома углерода, связанного с иминогруппой (158.65 м.д.) (табл. 2).
+
21
13
3
Масс-спектрометрия электрораспыления в режиме положительной ионизации MS-ESI: m/z [М+Н] вычислено для CHNO4: 372,09; найдено: 372,01.
Пример 2. Определение острой токсичности соединения I.
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. N 81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств» и Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
Все опытные и контрольные животные были взяты из одного привоза и прошли карантин в течение 14 суток. Лабораторных животных содержали в стандартных условиях центра экспериментальной фармакологии. Все проводимые манипуляции с лабораторными животными были рассмотрены и одобрены на заседании биоэтической комиссии ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России.
50
50
Определение острой токсичности проводили на белых аутбредных мышах-самцах массой 20±2 г. Соединение I вводили однократно, внутрибрюшинно в интервале доз от 600 до 2000 мг/кг в виде суспензии в смеси диметилсульфоксид (ДМСО) : вода для инъекций (1:5) с использованием в качестве стабилизатора образующейся суспензии гидроксиэтилированного сорбитана - твин-80. Выживаемость животных определяли, наблюдая за ними через 24 и 48 ч от момента введения препарата. Наблюдение за животными осуществляли в течение 72 ч. Регистрировали развитие основных симптомов и время гибели животных. Экспериментальная среднелетальная доза (LD) рассчитана с использованием инсталлированного программного обеспечения «STATISTICA 7.0», которое использует для расчета LD метод наименьших квадратов. Среднелетальная доза соединения I составила 2000 мг/кг. Согласно классификации Сидорова К.К. соединение I относится к 5 классу токсичности - «практически нетоксично».
Пример 3. Соединение I обладает анальгезирующей активностью.
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Приказом Минздрава РФ от 01.04.16 г. №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» и Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Все опытные и контрольные животные были взяты из одного привоза и прошли карантин в течение 14 суток. Лабораторных животных содержали в стандартных условиях центра экспериментальной фармакологии. Все проводимые манипуляции с лабораторными животными были рассмотрены и одобрены на заседании биоэтической комиссии ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России.
Для моделирования уксуснокислых «корчей» использовали белых аутбредных мышей-самцов массой 20±2 г., из которых были сформированы 3 группы по 5 особей в каждой. Судороги у животных вызывали при помощи внутрибрюшинного введения 0.5% раствора уксусной кислоты. Соединение I суспендировали в смеси диметилсульфоксид (ДМСО): вода для инъекций (1:5) с использованием в качестве стабилизатора образующейся суспензии гидроксиэтилированного сорбитана (твин-80) и вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг. Препарат сравнения - метамизол натрия, вводили тем же путем в дозе 168.57 мг/кг. Животные первой опытной группы внутрибрюшинно получали соединение I за 40 минут до начала эксперимента. Животные второй опытной группы внутрибрюшинно получали препарат сравнения за 40 минут до начала эксперимента. Особям контрольной группы внутрибрюшинно вводили только раствор 0.5% уксусной кислоты. Регистрировали время начала судорог и их количество в течение 20 минут. Анальгезирующую активность исследуемого соединения оценивали по достоверному уменьшению числа корчей в получавшей препарат группе относительно контрольной группы. Показателем эффективности являлся коэффициент угнетения болевой реакции (УБР), который рассчитывался по формуле:
Исследование показало, что соединение I обладает выраженной анальгезирующей активностью, действуя при боли, вызванной химическими раздражителями-альгогенами (модель перитовисцеральной боли). По степени угнетения болевой реакции исследуемое соединение превышает препарат сравнения. Результаты оценки анальгезирующей активности представлены в табл. 3.
Пример 4. Соединение I обладает противовоспалительной активностью.
Все эксперименты проводили в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Приказом Минздрава РФ от 01.04.16 г. №199 н "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики". Лабораторных животных содержали в стандартных условиях центра экспериментальной фармакологии: обычный пищевой рацион, свободный доступ к питьевой воде. Все опытные и контрольные животные были взяты из одного привоза и прошли карантин в течение 14 суток. Лабораторных животных содержали в стандартных условиях центра экспериментальной фармакологии. Все проводимые манипуляции с лабораторными животными были рассмотрены и одобрены на заседании биоэтической комиссии ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России.
Для экспериментальной оценки противовоспалительной активности были использованы две модели: «формалиновый отек лап мышей» и «ватная гранулема у крыс». Для моделирования «формалинового отека» использовали белых аутбредных мышей-самцов массой 20±2 г., из которых были сформированы 3 группы по 10 особей в каждой. Особям контрольной группы вводили только 2% раствор формалина. Животные опытных групп получали исследуемое соединение и препарат сравнения, которые вводили внутрибрюшинно за 1 час до начала эксперимента. Острый отек вызывали субплантарным введением (под подошвенный апоневроз) 2% раствора формалина в количестве 0,5 мл каждому животному. Исследуемое соединение I вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг в виде суспензии в воде для инъекций с добавкой ДМСО. Препарат сравнения - диклофенак вводили тем же путем в дозе 12.6 мг/кг. Выраженность отека оценивали по изменению толщины лапки (мм) с помощью электронного микрометра до и через 1, 2, 24 и 48 часов после введения раствора формалина. Противовоспалительную активносмть соединения I оценивали по показателю «% угнетения воспаления», рассчитанному по формуле:
1
2
3
4
где S - толщина лапки, измеренной через определенный промежуток времени после введения формалина у животного, получавшего исследуемый препарат; S - толщина лапки, измеренной до введения формалина у животного, получавшего исследуемый препарат; S - толщина лапки, измеренной через определенный промежуток времени после введения формалина у контрольного животного; S - толщина лапки до введения формалина у контрольного животного (табл. 4).
Для моделирования «ватной гранулемы» брали белых крыс-самок массой 300±20 грамм, из которых были сформированы 3 группы по 5 особей в каждой. Крысам, находящимся под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг), в области спины выбривали шерсть и делали продольный надрез кожи и подкожной клетчатки. Затем пинцетом в подкожной клетчатке формировали полости, в которые помещали стерильные ватные шарики (15 мг) в количестве 5 штук и накладывали швы. Испытуемый препарат соединения I (7.90 мг/кг (эквимолярная концентрация)), приготовленный в виде суспензии в воде и препарат сравнения диклофенак в дозе 6.32 мг/кг вводили перорально с помощью зонда 1 раз в сутки в течение 7 дней. Контрольная группа в течение 7 дней перорально получала воду. На 8 день имплантированные шарики с образовавшейся фиброзно-грануляционной тканью извлекали и высушивали до постоянной массы при 60°С. Противовоспалительную активность оценивали по расчетным величинам массы гранулемы, характеризующим воспаление (табл. 5, фиг. 1).
Фиг. 1 - Результаты оценки противовоспалительной активности на модели «ватная гранулема» у крыс, n=5