Состояния потомства крыс-самцов, получавших ингибиторы топоизомеразной активности

СОСТОЯНИЯ ПОТОМСТВА КРЫС-САМЦОВ, ПОЛУЧАВШИХ ИНГИБИТОРЫ ТОПОИЗОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

Т.Г. Боровская1, Ю.Ф. Щемерова1, В.Е. Гольдберг2

ГУ «НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН»1 ГУ «НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН»2

В эксперименте выявлен ряд патологических изменений в потомстве крыс-самцов, получавших однократно в максимально переносимой дозе за 1, 3 и 6 мес до скрещивания противоопухолевые препараты, принадлежащие к ингибиторам топоизомеразной активности (вепезид, иринотекан). Генетически детерминированные изменения у потомства выражены в большей степени на фоне введения ингибитора топоизомеразы II вепезида, чем ингибитора топоизомеразы I иринотекана. Наиболее оптимальным сроком скрещивания с точки зрения наименьшего повреждающего действия на потомство как для того, так и другого препарата являются 3 мес после цитостатического воздействия.

EFFECT OF TOPOISOMERASA ACTIVITY INHIBITORS ON THE POSTERITY OF MALE RATS T.G. Borovskayal, Yu.F. Schemeroval, VE. Goldberg2 Pharmacolgy Research Institute, Tomsk Scientific Center of SB RAMS1 Oncology Research Institute, Tomsk Scientific Center of SB RAMS2 A series of pathological changes in the posterity of male rats was observed after administration of anti-tumor drugs (Vepeside and Irinotekan) at a single maximum tolerable dose 1, 3 and 6 months before crossing. Genetically determined changes in the posterity of male rats were pronounced in a greater extent after administering Vepeside (topoisomerasa II inhibitor) than after Irinotekan (topoisomerasa I inhibitor). In view of the least adverse effect on the posterity, the most preferable time for crossing is 3 months after administration of these cytostatic drugs.

В настоящее время возрастает количество случаев рождения детей у онкологических пациентов, находящихся в полной длительной ремиссии после цитостатической химиотерапии [6, 11, 12]. Особенно это касается лиц, перенесших лекарственное лечение по поводу таких заболеваний, как лимфогранулематоз, опухоли яичка, считающихся принципиально излечимыми. В то же время известно, что противоопухолевые препараты, являясь заведомо мутагенными соединениями, оказывают токсическое действие не только на соматические, но и на половые клетки [5]. Генетически детерминированные изменения выявлены у потомства экспериментальных животных, получавших антрациклиновые антибиотики, алкилирую-щие соединения [3]. Менее изученными в этом плане являются антибластомные средства, принадлежащие к ингибиторам топоизомеразной активности (ИТА). Между тем препараты этой группы занимают прочные позиции в арсенале современной противоопухолевой химиотерапии. К числу наиболее широко используемых из них относится ингибитор топоизомеразы I иринотекан и ингибитор топоизомеразы II

вепезид. Клинические наблюдения последних лет свидетельствуют о том, что эти препараты обладают более широкими потенциальными возможностями в отношении как солидных опухолей, так и гемабластозов [4, 7, 9]. Случаи появления потомства у пациентов, получавших схемы лечения, включающие ИТА, описаны рядом авторов [11, 12]. Однако данные о состоянии здоровья детей при этом носят фрагментарный характер. В экспериментальных исследованиях выявлена возможность появления потомства у крыс-самцов, перенесших воздействие ИТА-1 иринотеканом и ИТА-2 вепезидом [2, 10].

Целью настоящей работы явилось изучение состояния потомства крыс-самцов, получавших ингибиторы топоизомеразной активности (вепезид, иринотекан) за 1, 3 и 6 мес до скрещивания.

Материал и методы

Эксперименты проведены на 30 беспородных крысах-самцах и 180 крысах-самках, массой 250-300 г. Животные получены из лаборатории биологического моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами,

принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Вепезид (этопозид, Тева, Израиль) и иринотекан (Кампто, Rhone-Poulens Rorer, Великобритания) вводили крысам-самцам (10 животных в каждой группе) однократно, внутривенно в максимально переносимых дозах (МПД), которая составила как для того, так и другого препарата 30 мг/кг. Дозу препаратов рассчитывали методом графического пробит-анализа. Самцы контрольной группы (n=10) получали эквиобъемное количество растворителя. Через 1, 3, 6 мес после введения препаратов крыс-самцов подсаживали к интактным крысам-самкам (n=20 на каждый срок эксперимента). Спаривание регистрировали с помощью вагинальных мазков. Часть самок на 20-й день беременности забивали методом дислокации шейных позвонков, вскрывали и подсчитывали количество желтых тел в яичниках, мест имплантации в матке, живых и мертвых плодов (из расчета на 1 самку). Затем вычисляли показатели пре- и постимплантаци-онной гибели [8]. Плоды извлекали, взвешивали, проводили макроскопический осмотр, часть из них помещали в раствор Боуэна для фиксации и последующего исследования состояния внутренних органов по методу Вильсона, а часть - в 96 % спирт для фиксации и окраски по методу Доусона с целью изучения процессов оссифика-ции [8]. Остальных самок оставляли до родов. Состояние потомства оценивали в течение 2 мес после рождения. Определяли индекс выживаемости, следили за общим физическим развитием (динамика массы тела, сроки отлипания ушной раковины, появление первичного волосяного покрова, прорезание резцов, открытие глаз, половое созревание), на 5, 15 и 30-й дни жизни изучали скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов по тестам «переворачивание на плоскости», «избегание обрыва», «мышечная сила», «открытое поле». На 60-й день жизни оценивали способность к выработке условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [8] и адаптивному поведению в тесте Хандерсона в модификации Н.А. Бондаренко [1]. При статистической обработке использовали критерий Манна-Уитни и угловое преобразование Фишера.

Результаты и обсуждение

Результаты интегральной оценки состояния потомства по всем тестируемым показателям представлены в таблице. Установлено, что на фоне однократного введения в МПД ИТА-1 не наблюдалось увеличения эмбриональной смертности по сравнению с контролем. У крыс-самок, скрещенных с самцами, получавшими ИТА-2 (за 1 и б мес до начала опыта), возрастала доля преимплантационных потерь (до 25,45 ± 5,1б % ; в контроле - 7,27 ± 4,57 %; р^^). Полученные данные подтверждают выявленную на мышах-самцах способность вепезида индуцировать доминантные летальные мутации в мужских половых клетках [5]. Повышенная эмбриональная летальность выявляется также при скрещивании крыс-самцов после длительного введения вепе-зида в низких дозах [1Q].

При макроскопическом осмотре всех исследуемых живых плодов и крысят грубых внешних аномалий развития обнаружено не было. Динамика массы, индекс выживаемости, скорость физического развития крысят в опыте, и в контроле были сходными. В то же время ПOTOMCTBO крыс-самцов, получавших как вепезид, так и иринотекан, характеризовалось в антенатальном периоде возрастанием по сравнению с контролем на б-15 % (р^^ ) числа плодов с гемоперикардом, нефроптозом, тимомегалией. На фоне введения вепезида значительно увеличивалось количество плодов с кровоизлияниями на 30 % (р^^). В потомстве обеих экспериментальных групп была выявлета также задержка процесса формирования скелета. В значительной степени это касалось костей черепа, замедление оссифи-кации которого отмечалось у 2З-З7 % плодов, в контроле - у 4-1Q % (р< Q,Q5). Степень выраженности отмеченных выше токсических эффектов в обеих опытных группах была в основном сходной. Однако, судя по срокам проявления, ИТА-1 оказал большее повреждающее действие при воздействии на сперматоциты (скрещивание через 1 мес), а ИТА-2 - на сперматогонии (скрещивание через З мес).

В постнатальном периоде у 55-б9 % крысят в потомстве обеих опытных групп выявлялся пониженный по сравнению с контролем мышечный тонус (р^^). Оно характеризовалось также

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 35

Таблица

Состояние потомства интактных крыс-самок и самцов, скрещенных через 1, 3 и 6 мес после введения ИТА

Показатели 1В ЗВ бВ 1И ЗИ бИ

Преимплантационная смертность + - + - - -

Постимплантационная смертность - - - - - -

Внешние аномалии - - - - - -

Патологические изменения внутренних органов плодов + ++ + ++ + +

Состояние процессов оссификации плодов + ++ + + ++ +

Динамика массы крысят _ _ _ _ _ _

Индекс выживаемости _ _ _ _ _ _

Физическое развитие _ _ _ _ _ _

Мышечный тонус + - + + - -

Рефлексы «переворачивания на плоскости» и «избегания обрыва» ++ - + - - -

Поведение в условиях «открытого поля» + - ++ + - -

Способность к обучению - ++ + - - ++

Адаптивное поведение + - ++ - - -

Примечание:

«- » - отсутствие токсического эффекта по тестируемому показателю;

«+» - умеренная степень выраженности токсического эффекта;

«++» - высокая степень выраженности токсического эффекта.

«В» - вепезид, «И» - иринотекан; 1, 3, 6 - срок скрещивания после введения препарата.

угнетением вертикальной двигательной активности, «норкового рефлекса», эмоциональной реакции (тест «открытое поле»), значительным снижением способности крысят к обучению. Так, процент животных с выработанным УРПИ уменьшался на 43-70 % от контроля (р<0,05). Степень выраженности этих токсических эффектов была сходной в обеих опытных группах. Однако на фоне введения вепезида они выявлялись во все сроки исследования, что было нехарактерно для потомства крыс-самцов, получавших иринотекан. О более выраженных отрицательных последствиях для потомства ИТА-2 по сравнению с ИТА-1 свидетельствуют также выявленные только на фоне использования вепе-зида факты замедления скорости формирования ряда других сенсорно-двигательных рефлексов, а также снижения и нарушения способности

к адаптивному поведению. Так, количество крысят в этой опытной группе с более поздним формированием рефлексов «переворачивания на плоскости», «избегания обрыва» возрастало на 10-33 % по сравнению с контролем (р<0,05). Способность к избеганию в стресс-ситуации была нарушена у 17 % крысят, в то время как все крысята контрольной группы подныривали под край внутреннего цилиндра (р<0,05).

Анализируя состояние потомства в зависимости от сроков скрещивания после цитоста-тического воздействия, следует отметить, что патологические изменения на фоне введения вепезида, выявленные при скрещивании через 1 мес, наблюдались и при спаривании через 6 мес после начала опыта. Причем степень их выраженности в ряде случаев возрастала (в тестах «открытое поле», «адаптивное поведение»).

Токсическое действие на потомство ириноте-кана было выражено, как правило, в большей степени при скрещивании животных через 1 мес, чем через 3 и 6 мес после цитостатического воздействия. Введение как того, так и другого препарата за 3 мес до спаривания оказывало наименьшее повреждающее действие.

Следует отметить, что отмеченные выше на фоне использовагния ИТА патологические изменения у потомства не являются специфическими и наблюдаются после введения анти-бластомных средств, принадлежащих к другим классам химических соединений. Однако одним из последствий реализации мутагенных эффектов антибластомных средств таких групп, как антрациклиновые антибиотики, комплексные соединения платины, может быть появление у потомства внешних уродств, снижение индекса выживаемости, торможение физического развития [3]. При использовании ИТА отмеченные изменения не выявлялись. В то же время особенностью состояния потомства крыс-самцов, получавших препараты этой группы, является значительное снижение способности к обучению, наблюдаемое при скрещивании в наиболее отдаленные сроки после введения препаратов.

Таким образом, потомство крыс-самцов, получавших ИТА-1 и 2 за 1, 3 и 6 мес до скрещивания, характеризовалось сниженной жизнеспособностью. Более токсичным в этом плане оказался ИТА-2, о чем свидетельствовала повышенная антенатальная гибель и более высокая частота обнаружения других патологических

нарушений у потомства. Наиболее оптимальный срок скрещивания для обоих препаратов с точки зрения наименьшего повреждающего действия на потомство - 3 мес после цитостатического воздействия.

Литература

1. Бондаренко Н.А. Рукопись дел ВИНИТИ. 1980. № 20. С. 38-80.

2. Боровская Т.Г., Гольдберг В.Е., Щемерова Ю.А. и др. Влияние ингибиторов топоизомеразной активности на морфологические и функциональные показатели сперматогенеза крыс // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005. Прил. 1. С. 26-30.

3. ГольдбергЕ.Д., Боровская Т.Г. Гонадотоксические эффекты противоопухолевых препаратов // Бюл. эксперим. биол. и мед.

2003. № 3. С. 244-252.

4. ДеминаЕА. Лимфома Ходжкина. Возможности современной терапии первичных больных // Русский медицинский журнал.

2004. Т. 12, № 19. С. 1113-1116.

5. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены (скрининг и фармакологическая профилактика воздействий). М., 1998. 327 с.

6. Моисеенко Е.И., Заева Г.Е., Озолин Г.Э. и др. Показатели здоровья новорожденных лиц, в детстве излеченных от злокачественных новообразований // Материалы VI Всесоюзного съезда онкологов. Ростов н/Д. 2005. Т. 2. С. 55.

7. Орел Н.Ф. Возможности использования паклитаксела, этопозида, цисплатина, метотрексата и 5-фторурацила у больных солидными опухолями // Русский медицинский журнал. 2004. Т. 12, № 19. С. 1001-1007.

8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. М., 2005. 560 с.

9. Селинов Н.Н. Кампто в химиотерапии злокачественных опухолей // Фарматека. Онкология ASCO. 2005. С. 22-26.

10. Freitas F.E.L., Mori F.C., Cerri E.S. et al. Alterations of spermatogenesis in etoposide - treated rats stereological study // INCI. 2002. Vol. 27. P. 1-17.

11. Gaffan J., Holden L., NewlandsE. et al. Infertility rates following POMB/ACE chemotherapy for male and female germ cell tumours - a retrospective long - term follow - up study // Br. J. Cancer. 2003. Vol. 89, № 10. P. 1849-1854.

12. PectasidesM., PectasidesD., FarmakisD. Testicular function cancer treated with bleomycin - etoposide - carboplatin combination chemotherapy // Eur. Urol. 2004. № 2. P. 187-193.

Поступила 3.04.06