12
ПРОИЗВОДНЫЕ КОБАЛАМИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ОТСУТСТВИЕМ ПОСТУПЛЕНИЯ ВИТАМИНА B
12
COBALAMIN DERIVATIVES AND THEIR USE FOR TREATMENT OF DISEASES CAUSED BY LACK OF VITAMIN B INTAKE

12
12
Млекопитающие используют В или производные кобаламина в качестве кофакторов для двух ферментов, а именно метионинсинтазы и метилмалонил-СоА-мутазы. Метионинсинтаза катализирует метилирование гомоцистеина с образованием аминокислоты-метионина и одновременно превращение 5-метилтетрагидрофолата в тетрагидрофолат. Протекание этой реакции сильно зависит от метилкобаламина (MeCbl). Тетрагидрофолат необходим для поддержания биосинтеза пуринов и пиримидинов и поэтому он является необходимым для пролиферации клеток и гомеостазиса. Метилмалонил-СоА-мутаза является очищающим веществом для метилмалонил-СоА, образовавшейся вследствие разложения холестерина, обладающих разветвленной цепью аминокислот и жирных кислот, содержащих в цепи нечетное количество атомов углерода, и обеспечивает превращение метилмалонил-СоА в сукцинил-СоА, что поддерживает энергетический метаболизм. Протекание реакции метилмалонил-СоА-мутазы сильно зависит от 5'-дезоксиаденозилкобаламина (AdoCbl). Поскольку млекопитающие лишены способности заново синтезировать кобаламины, они используют стратегии поглощения поступающего с пищей В в двух биологически активных формах кофакторов, MeCbl и AdoCbl.
12
12
12
12
12
Для достаточного обеспечения клеток млекопитающего кобаламином, во-первых, необходим перенос кобаламина из пищи в клетки организма и, во-вторых, необходимо, чтобы организм млекопитающего мог использовать кобаламин с помощью правильного пути переработки, который сильно зависит от активности фермента CblC (также известного, как ММАСНС, шаперона В и шаперона CblC). Всасывание В и его последующее распределение в организме опосредовано сложным набором белков-носителей, рецепторов и переносчиков и можно описать последовательный путь В из пищи в клетки организма. Перенос В во внеклеточную жидкость зависит от трех гомологичных белков-носителей, а именно, внутреннего фактора, транскобаламина (также известного, как транскобаламин II) и гаптокоррина (также известного, как белок R или транскобаламин I). Нарушение пути всасывания в желудочно-кишечном тракте является наиболее частой причиной заболеваний, связанных с недостаточностью В, не вызванных с режимом питания (Nielsen et al., Nature Reviews (2012), 345-354).
12
12
12
12
12
Сообщали, что у пожилых людей скрытая недостаточность витамина Вможет быть связана с прогрессирующей атрофией головного мозга. Незначительно увеличенные концентрации гомоцистеина связывали с повышенным риском слабоумия, в частности, болезни Альцгеймера. Причины недостаточности витамина В могут быть разными. Одной причиной может являться недостаточное потребление витамина В с пищей, при этом группы повышенного риска включают вегетарианцев, строгих вегетарианцев и пожилых людей. Другой причиной может являться недостаточное всасывание витамина В вследствие отсутствия внутреннего фактора париетальных клеток, нарушенное всасывание витамина В из пищи вследствие недостатка кислоты желудочного сока или вследствие взаимодействия лекарственных средств. Другими причинами могут являться кишечные заболевания, такие как, например, резекция кишечника, тропическая спру или болезнь Крона.
12
Существуют нарушения, связанные с кобаламином, относящиеся к переработке витамина В в клетках, которые являются редкими и наследуются аутосомно-рецессивным образом. Нарушения, связанные с кобаламином, разделяют на несколько разных комплементационных групп. Мутации обычно вызывают нарушение в биохимическом пути, которое приводит к биосинтезу MeCbl и AdoCbl и заболевания проявляются в виде гомоцистинурии и метилмалоновой ацидурии. CblC перерабатывает кобаламины, попадающие в клетки, с образованием обычного промежуточного продукта, коб(II)аламина / коб(I)аламина. Мутации в CblC представляют собой наиболее частое врожденное нарушение метаболизма кобаламина (Gherasim et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 290 (2015) pp 11393-11402).
12
12
12
Задачей настоящего изобретения является получение серосодержащих производных кобаламина, которые являются полезными для лечения связанных с витамином В нарушений, вызванных или уменьшенным поступлением витамина В из пищи в нуждающиеся в нем клетки, или генетическим дефектом, или другим препятствием на пути переноса и внутриклеточной переработки В. Такие производные кобаламина, в частности, обладают улучшенной биологической активностью.
12
12
Применение серосодержащих производных кобаламина, описанных в настоящем изобретении, связано с дефицитом витамина В, который проявляется: 1) у пациентов, страдающих наследственными метаболическими заболеваниями, которые ухудшают перенос и переработку внутриклеточного кобаламина; 2) у индивидуумов, потребляющих малое количество витамина В (крайне нищих и не допускающих отклонений вегетарианцев / строгих вегетарианцев); 3) у пожилых людей. Для относящихся к этим категориям субъектов может быть благоприятным улучшение переработки внутриклеточного CblC-кобаламина и протекающих с его участием последующих ферментативных реакций.
У пациентов, страдающих генетическим нарушением метаболизма кобаламина, относящегося к группе CblC, наблюдаются нарушения в метионинсинтазе и метилмалонил-СоА-мутазе, которые находятся в соответствии с генным продуктом ММАСНС (метилмалоновая ацидурия типа С и гомоцистинурия). Предлагали переименовать этот белок в цианокобаламиндецианазу (Kim et al., PNAS (2008) pp 14551-14554). В публикации Hannibal et al. (Molecular Genetics and Metabolism (2009) pp 260-266) показано, что линии клеток, полученные от пациентов, имеющих мутированный белок CblC, не перерабатывают алкилкобаламин в такой же степени, как линии нормальных фибробластов кожи.
Соединения, описанные в настоящем изобретении, представляют собой серосодержащие кобаламины, содержащие аксиальные связи Co-S или Со-С, которые улучшают ферментативную активность нормального белка CblC, исправляют патогенный вариант белка CblC или заменяют отсутствующий белок CblC.
12
12
3+
Производные витамина В, также называющиеся кобаламинами, играют важную роль в ферментах В. Структура кобаламина представляет собой координационный комплекс, содержащий 6 координационных центров, связывающих ион Со, который окружен находящимися в экваториальном 4-ом положении атомами азота тетрапиррольного корринового кольца и находящимися аксиальном положении лигандами в верхнем β-положении и в нижнем α-положении. Находящийся в α-положении лиганд координирован с Со с помощью атома азота нуклеотидного основания, 5,6-диметилбензимидазола (DMB), который связан с корриновым кольцом с помощью нуклеотидной структуры. Комплекс может существовать в трех состояниях окисления кобальта, а именно Со(III), Со(II) и Со(I). Кобаламин имеет формулу (I), которая представлена ниже.
2
2
3
12
В формуле (I) возможные лиганды, которые могут связываться в β-положении, обозначены с помощью "X". Важными находящимися в β-положении лигандами являются цианид (CN) в цианокобаламине (CNCbl(III)), вода (НО) в аква-кобаламине (HOCbl(III)), алкильные группы, такие как СН-, в метилкобаламине (MeCbl(III)) и 5-деоксиаденозил в аденозилкобаламине (AdoCbl(III)), которые являются кофакторами для зависимых от В ферментов человека.
12
12
Настоящее изобретение относится к серосодержащим производным кобаламина, которые имеют формулу витамина В, однако где лиганд X имеет другое значение. Такие кобаламины являются полезными, поскольку они обладают улучшенной эффективностью при лечении разных дефицитов витамина В. Настоящее изобретение относится к производному кобаламина формулы (I)
2
1-5
2
0-3
3
2
1-5
2
в которой X обозначает лиганд, имеющий формулу, выбранную из группы, состоящей из -(CH)-S-(CH)-CH, -S-(CH)-NH или
1
3
, где R=Н, метил или этил,  и R=-Н или
2
2
2
В особенно предпочтительных вариантах осуществления кобаламин формулы (I) содержит лиганд X, который представляет собой -S-CH-CH-NH,
2
3
3
2
3
-CH-S-CH или -CH-CH-S-CH.
12
12
12
Производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения заболеваний, связанных с уменьшенным обеспечением витамина B. Эти заболевания могут быть вызваны редкими генетическими дефектами гена CblC, которые проявляются в гомоцистинурии и метилмалоновой ацидурии или других нарушениях правильной переработки витамина B в клетках. Альтернативно, производные кобаламина можно применять для лечения пожилых пациентов, которые не обеспечены достаточным количеством витамина B. У таких индивидуумов часто наблюдаются частые признаки снижения умственной деятельности, такие как слабоумие или болезнь Альцгеймера.
Производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить в виде состава для перорального введения, при этом предпочтительно, если фармацевтические составы готовят таким образом, что высвобождение активного ингредиента происходит в тонком кишечнике и толстом кишечнике. Предпочтительными являются таблетки или капсулы, которые содержат устойчивое к воздействию кислоты покрытие. После того, как таблетка или капсула проходят через желудок, покрытие растворяется в кишечнике вследствие изменения значения рН, и активный ингредиент высвобождается в тонком кишечнике при высокой концентрации. Это можно осуществить путем нанесения покрытия, содержащего один или большее количество пленочных покрытий, растворимость которых зависит от значения рН. Предпочтительно, если такими покрытиями являются полимеры Eudragit, которые устойчивы к воздействию кислоты и растворяются при значении рН примерно от 5,8 до 7,0.
Альтернативно, производное кобаламина можно вводить в виде состава для парентерального введения, такого как раствор для инъекции. Поскольку производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, могут легко разлагаться под воздействием света, предпочтительно готовить раствор для инъекции в лиофилизированной форме, которую можно восстановить путем добавления стерильной воды или буфера непосредственно перед введением. Контейнеры, содержащие лиофилизированное производное кобаламина, необходимо защищать от света.
В альтернативном варианте осуществления производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть приготовлены в виде пищевой добавки. Пищевая добавка может содержать кобаламины в форме частиц, которые также содержат добавки, такие как носители или матричные компоненты. Предпочтительными примерами являются крахмал, каррагенан, гуар или сахара, такие как лактоза, фруктоза или сахароза.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения производного кобаламина формулы (I)
в которой лиганд X представляет собой
2
1-5
2
0-3
3
2
1-5
2
-(CH)-S-(CH)-CH, -S-(CH)-NH или
1
3
, где R=Н, метил или этил, и R=-Н или
Предпочтительно, если в качестве исходного вещества используют имеющиеся в продаже кобаламины, такие как гидрохлорид гидроксикобаламина. Гидрохлорид гидроксикобаламина вводят в реакцию с лигандами, содержащими в своей структуре тиольную группу, такими например, как цистеамин или меркаптопропионилглицин, или реакционноспособную содержащую атом С группу, такую например, как хлорметилметилсульфид или 1-хлор-2-метилсульфанил. Предпочтительно, если все реакции синтеза проводят при условиях использования только красного света вследствие возможной чувствительности тиолятокобаламинов и алкилкобаламинов к воздействию света. Реакции синтеза обычно проводят при аэробных условиях.
12
Производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют преимущество в том, что они обладают улучшенной биологической активностью. Поэтому производные кобаламина можно применять для лечения заболеваний, которые связаны с уменьшенным обеспечением или ухудшенной переработкой кобаламина на стадиях его переработки в клетках. Производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения наследственных заболеваний, которые воздействуют на белок CblC. Заболевания также могут быть вызваны уменьшенным потреблением витамина В.
12
12
В другом варианте осуществления производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для лечения недостаточности витамина В, которая выражается в целом ряде неврологических проявлений, таких как парестезия, онемение кожи, нарушения координации движений и уменьшенная скорость проводимости нерва. У пожилых людей скрытая недостаточность витамина В может быть связана с прогрессирующей атрофией головного мозга. Наблюдали, что повышенные концентрации гомоцистеина в плазме связаны с регионарной и полной атрофией головного мозга не только при болезни Альцгеймера, но и у здоровых пожилых людей.
12
12
При лечении нарушения познавательной способности важно сделать выбор между пероральным или парентеральным введением. Следует понимать, что пероральное введение витамина В является неэффективным, поскольку, в особенности у пожилых людей, важную роль играют недостаточное всасывание, часто наблюдающиеся кишечные заболевания или нарушения, влияющие на переработку витамина В. Поэтому необходимым может являться парентеральное введение. Однако парентеральное введение является более затруднительным, чем пероральное введение, поскольку для этого необходимы люди с подготовкой в медицине, такие как врачи или медицинские сестры. Преимущество кобаламинов, предлагаемых в настоящем изобретении, а именно улучшенная биологическая активность и биологическая доступность, обеспечивает возможность введения производных кобаламина в виде составов для перорального введения.
12
Производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для пожилых людей, страдающих ухудшением познавательной способности. Кроме того, их можно применять для лечения депрессии, которая у пожилых людей часто связана с низкой концентрацией витамина В и повышенными концентрациями гомоцистеина и метилмалоновой кислоты. Производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, также можно применять для лечения или предотвращения возможности развития болезни Альцгеймера, поскольку повышенные концентрации гомоцистеина связаны с риском возникновения болезни Альцгеймера. Поэтому производные кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять не только для лечения, но и для профилактики слабоумия или болезни Альцгеймера.
Серосодержащие соединения кобаламина, предлагаемые в настоящем изобретении, относятся к кобаламинам содержащим связи Co-S и Со-С, обладающих приведенными ниже характеристиками, которые являются превосходными по сравнению с характеристиками имеющихся в настоящее время лекарственных форм, содержащих и гидроксикобаламин (HOCbl), и цианокобаламин (CNCbl), и метилкобаламин(MeCbl), использующихся в некоторых странах, таких как Япония, а именно:
• более высокое значение pKa перехода от координированной к центральному атому металла к протонированной форме;
• более высокое значение окислительно-восстановительного потенциала для восстановления центрального атома кобальта, и
• более легкое удаление находящегося в β-положении аксиального лиганда.
Кроме того, соединения кобаламина, описанные в настоящей заявке, обладают следующими преимуществами, относящимися к тиолятокобаламину и глутатионилкобаламину (GSCbl):
• превосходное восстановление ферментативной активности патогенных вариантов белка CblC, перерабатывающих кобаламин,
• долгосрочное уменьшения количества токсичной ММА (метилмалоновая кислота) в CblC фибробластов человека.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В приведенном ниже описании использующиеся аббревиатуры имеют следующие значения:
n
Настоящее изобретение относится к синтезу новых серосодержащих производных кобаламина, характеризующихся аксиальной координацией Co-S или Co-C-S-R, обладающих: (а) увеличенным значением pKa перехода от координированной к центральному атому металла к протонированной конфигурации, (b) более высоким значением среднеточечного потенциала, и (с) легким удалением находящегося в β-положении аксиального лиганда.
В настоящем изобретении проводили выбор и синтез некоторых находящихся в β-положении аксиальных лигандов и получали взаимодействия связей, которые компенсируют потерю функции аномального варианта белка CblC, возникающую вследствие естественных мутаций, которые приводят к заболеванию. Функциональные группы, содержащиеся в предпочтительных фрагментах цистеамина и меркаптопропионилглицина, обеспечивают возможность образования дополнительной водородной связи (в отличие от имеющихся в настоящее время лекарственных форм HOCbl или CNCbl) с аминокислотными остатками, находящимися на сайте связывания кобаламина белка CblC, что может являться критически важным для восстановления связывания и ферментативной активности патогенных вариантов CblC. Аналогичным образом, серосодержащие кобаламины, содержащие связь Со-С, предлагаемые в настоящем изобретении, являются аналогами природного кофактора метилкобаламина, для которого показано, что он является предпочтительным содержащим Со-С субстратом для фермента CblC, необходимого для переработки кобаламина.
Равновесие между координированной к центральному атому металла конфигурацией - протонированной конфигурацией
При значении рН, соответствующем физиологическому, все кобаламины находятся в координированной к центральному атому металла конфигурации, где находящийся в α-положении аксиальный лиганд, диметилбензимидазол, координирован к центральному атому кобальта посредством атома азота. Схема перехода от координированной к центральному атому металла к протонированной конфигурации для кобаламинов представлена на Фиг. 1.
На Фиг. 1 представлена структура цианокобаламина (лекарственная форма, имеющаяся в продаже в виде добавки для перорального введения, а также в виде инъекций) в координированной к центральному атому металла и протонированной конфигурации. Значение pKa для этого перехода равно 0,10. Такое значение рН невозможно обеспечить при физиологических условиях.
Для этого перехода необходима чрезвычайно кислая среда, которую невозможно обеспечить в клеточной среде. В Таблице 1 приведены значения pKa для нескольких находящихся в β-положении лигандов.
Как можно видеть из Таблицы 1, природа находящегося в β-положении аксиального лиганда существенно влияет на pKa равновесия между координированной к центральному атому металла конфигурацией - протонированной конфигурацией. Эта характеристика является существенной для задач настоящего изобретения, поскольку новые производные кобаламина, характеризуются более высоким значением pKa перехода от координированной к центральному атому металла к протонированной конфигурации и это повышает их биологическую активность. Эта повышенная биологическая активность означает улучшенную способность перерабатывающего фермента CblC дикого типа и патогенных вариантов CblC использовать новые кобаламины в качестве субстратов для образования активированных промежуточных продуктов, которые поступают к акцепторам - зависимым от кобаламина ферментам, метионинсинтазе и метилмалонил-СоА-мутазе.
Окислительно-восстановительный потенциал образования клеточного биологически активного коб(II)аламина и коб(I)аламина
Дополнительным аспектом химических характеристик Cbl, связанных с их поведением в биологических системах, является среднеточечный потенциал для восстановления центрального атома кобальта, которое является необходимым для последующей обработки (удаление находящегося в β-положении лиганда) по механизму восстановления, включающему нуклеофильную атаку восстановленным глутатионом (GSH). В Таблице 2 приведен перечень среднеточечных окислительно-восстановительных потенциалов для биологически активных Cbl.
Удаление находящегося в β-положении лиганда кобаламинов
Разрушение находящегося в β-положении лиганда (на Фиг. 2 обозначен как "X") поступающих с пищей кобаламинов является необходимый стадией переработки микроэлементов у людей. Эта стадия катализируется ферментом CblC. На Фиг. 2 представлена структура кобаламинов. Кобаламины представляют собой тетрапирролы, объединенные в корриновый макроцикл, содержащий кобальт в качестве центрального атома металла. Кобаламины содержат 7 боковых цепей, а именно, ацетамиды и пропионамиды. Пятое координационное положение (лиганд в α-положении) занято атомом азота, содержащимся в диметилбензимидазольном фрагменте. Шестое координационное положение (в настоящем изобретении обозначено, как "X"), известное как β-положение лиганда, может быть занято лигандами разных типов. Встречающиеся в природе лиганды включают метил (метилкобаламин), 5-дезоксиаденозин (аденозилкобаламин), гидрокси- или аква-(гидроксокобаламин, аква-кобаламин), цианогруппу (цианокобаламин), глутатионил (глутатионилкобаламин) и т.п.
12
Новые лиганды, раскрытые в настоящем изобретении, присоединены в положении X для того, чтобы сохранить структуру кобаламина для оптимального связывания и переноса с помощью транскобаламина. За исключением небольших заменимых лигандов, таких как, например сульфит, нитрит и имидазол, для содержащих связи Co-S и Со-С кобаламинов необходима ферментативная обработка внутри клеток, чтобы они стали биологически активными и подходящими для протекания ферментативных реакций получающих их ферментов, метионинсинтазы (MS) и метилмалонил-СоА-мутазы (МСМ). Белки CblC играют критически важную роль во внутриклеточной переработке всех поступающих с пищей кобаламинов: с помощью CblC образуется протонированная конфигурация кобаламинов, которая, в свою очередь, обеспечивает увеличение окислительно-восстановительного потенциала для восстановления центрального атома кобальта, тем самым облегчая удаление находящегося β-положении аксиального лиганда путем эффекта ослабления транс-связи (опосредуемого протонированной конфигурацией) и облегчая восстановительное элиминирование (опосредуемое увеличенным окислительно-восстановительным потенциалом). У пациентов, имеющих мутированный белок CblC, эти термодинамически и кинетически затрудненные реакции блокированы, что приводит к нарушению переработки кобаламина, которое приводит к увеличению концентрации гомоцистеина и метилмалоновой кислоты, субстратов для двух зависимых от В ферментов, MS и МСМ. Новые серосодержащие производные кобаламина, описанные в настоящем изобретении, являются химически "независимыми" и обладают своей собственной биологической активностью, поэтому они обходят критически важный белок CblC.
Производные кобаламина, описанные в настоящем изобретении, обладают своей собственной повышенной биологической активностью.
12
12
12
12
12
Производные витамина В нового поколения, описанные в настоящем изобретении, обладают характеристиками, которые являются благоприятными не только для лечения пациентов, страдающих нарушением CblC, но и для лечения или поддержки индивидуумов, страдающих другими генетическими нарушениями, связанных с витамином В, такие как связанные с CblA, CblB, CblD, CblF, CblJ, CblX, mut, CblG. Это включает внутриутробное лечение эмбрионов и плодов матерей, у которых наблюдается мутация любого из генов, вовлеченных в метаболизм витамина В, в качестве предупредительной меры во время эмбрионального развития и раннего развития. Новые биологически активные кобаламины также можно приспособить для поддержки или лечения пожилых людей (страдающих естественным возрастным плохим всасыванием витамина В), пациентов, страдающих неврологическими заболеваниями, страдающих от связанной с возрастом или режимом питания плохой доступностью витамина В, и вегетарианцев и строгих вегетарианцев, у которых количество поступающих с пищей микроэлементов может быть более низким, чем необходимое для оптимального состояния здоровья. Кроме того, благоприятное воздействие некоторых тиолятокобаламинов на выживаемость клеток при условиях окислительного стресса предполагает, что в дополнение к конкретным характеристикам, описанным в настоящем изобретении, новые разработанные соединения обладают дополнительными физиологическими преимуществами.
Пример 1: Лиганды, характеризующиеся образованием связи Co-S (тиолятокобаламины). Синтез производных тиолятокобаламина.
Новые тиолятокобаламины синтезировали по реакции аква-кобаламина (или гидроксокобаламина, оба представляют собой коб(III)аламин) с 1,3-1,9 экв. соответствующих лигандов по методике, аналогичной описанной для получения других тиолятокобаламинов.
Гидрохлорид гидроксикобаламина, который имеется в продаже, получали в виде водного раствора (обычно 10-15%). Раствор гидрохлорида гидроксикобаламина вводили в реакцию с лигандом, причем все реакции синтеза проводили при условиях использования только красного света вследствие чувствительности тиолятокобаламинов к воздействию света.
На Фиг. 3 представлены два типичных лиганда, цистеамин и меркаптопропионилглицин, имеющих структуру цистеамина (слева) и меркаптопропионилглицина (справа). Цистеамин является имеющимся в продаже аминотиолом, использующимся для лечения цистиноза. Меркаптопропионилглицин имеется в продаже. Эти аминотиолы вступают в реакцию с аква-кобаламином по реакции замещения лигандов, протекающей с образованием соответствующих тиолятокобаламинов.
1
Реакции проводили при комнатной температуре или на льду, при нормальных условиях, при защите от воздействия света. Тиолятокобаламины выделяли путем осаждения из холодного ацетона (-20°С), затем промывали холодным ацетоном, подвергали вакуумному фильтрованию и сушили при 60°С в течение ночи. Чистоту продуктов Cbl определяли с помощью H-ЯМР (ядерный магнитный резонанс), масс-спектрометрии и путем превращения дицианокобаламина с использованием стандартных для данной области техники методик. Новые синтезированные производные Cbl дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Образцы постоянно защищали от воздействия света, поскольку связь Co-S является фотолабильной.
Пример 2: Лиганды, характеризующиеся образованием связи Со-С (алкилкобаламины). Синтез содержащих метилсульфид аналогов метилкобаламина.
1
Хлорметилметилсульфид и хлорэтилметилсульфид, представленные на Фиг. 4, при анаэробных условиях, при тусклом красном свете вводили в реакцию с коб(I)аламином, предварительно восстановленным борогидридом натрия так, как это описано для получения других алкилкобаламинов. На Фиг. 4 представлена структура хлорметилсульфанилметана (слева) и 1-хлор-2-метилсульфанилэтана (справа). Эти два галогенированных серосодержащих углеводорода вводили в реакцию с чрезвычайно нуклеофильным коб(I)аламином с получением соответствующих производных алкилкобаламина. В этих реакциях галоген выполняет функцию отщепляющейся группы. Добавляли избыток лиганда и реакционной смеси давали реагировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Продукты Cbl осаждали из холодного ацетона, промывали и сушили при 60°С в течение ночи. Чистоту продуктов Cbl определяли с помощью H-ЯМР, масс-спектрометрии и путем превращения дицианокобаламина с использованием стандартных для данной области техники методик. Если чистота составляла менее 95%, то новые синтезированные производные Cbl дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ. Образцы постоянно защищали от воздействия света.
Пример 3: Спектроскопия в УФ (ультрафиолетовой) и видимой области.
Спектры в УФ и видимой области для новых синтезированных производных кобаламина снимали в буфере EPPS (40 мМ, рН 7,6, I=1,0 М с помощью трифлата натрия). За протеканием реакции аква-кобаламина с цистеамином и меркаптопропионилглицином следили с помощью исследования полученных с разрешением по времени спектров реакционных смесей, содержащих заданное количество аква-кобаламина (10-25 мкМ (микромоли)) и лиганд при разных концентрациях.
набл.
Меркаптопропионилглицин быстро вступает в реакцию с аква-кобаламином с образованием стабильного комплекса MPG-Cbl при значении рН равном 7,2. Наблюдающаяся скорость реакции (k) линейно зависит от концентрации лиганда, меркаптопропионилглицина.
2
+
Аква-кобаламин при заданной концентрации вводили в реакцию с лигандом MPG при разных концентрациях. За протеканием реакции следили с помощью спектроскопии в УФ и видимой области с разрешением по времени в течение всего 50 мин (Фиг. 5). Изменения в спектрах соответствовали превращению аква-кобаламина в MPG-Cbl (Фиг. 5а) по механизму, который не включает образование промежуточных продуктов реакции в поддающихся обнаружению количествах. Исходные и конечные спектры анализировали для подтверждения подлинности продукта-тиолятокобаламина (Фиг. 5б). Продолжительность действия определяли на основании максимальной интенсивности поглощения для каждого вещества (350 нм, HOCbl, и 372 нм, MPG-Cbl) (Фиг. 5в).
набл.
На Фиг. 6 представлена зависимость наблюдающейся скорости реакции (k) от концентрации лиганда-меркаптопропионилглицина при образовании MPG-Cbl в буфере EPPS (40 мМ, рН 7,2, I=1,0 М).
набл.
На Фиг. 7 представлена зависимость наблюдающейся скорости реакции (k) от концентрации лиганда-цистеамина при образовании Суа-Cbl в буфере EPPS (40 мМ, рН 7,2, I=1,0 М).
набл.
Цистеамин быстро вступает в реакцию с аква-кобаламином с образованием стабильного комплекса при значении рН равном 7,2. Наблюдающаяся скорость реакции (k) линейно зависит от концентрации лиганда, цистеамина.
Важно отметить, что зависимые от концентрации скорости реакций новых производных Cbl находятся в хорошем соответствии со скоростями реакций, описанными для других тиолятокобаламинов.
В Таблице 3 представлено сопоставление скоростей образования Суа-Cbl и MPG-Cbl (предлагаемых в настоящем изобретении) и других известных тиолятокобаламинов.
Пример 4: pKa перехода координированной к центральному атому металла конфигурации / к кпротонированной конфигурации для новых производных Cbl.
При переходе кобаламинов от координированной к центральному атому металла к протонированной конфигурации на спектре в УФ и видимой области наблюдается заметный сдвиг, который используют для определения значения pKa этого перехода. Спектры производных кобаламина в УФ и видимой области снимали при разных значениях рН с использованием универсальной буферной смеси. Для содержащих связь Co-S кобаламинов значение pKa перехода от координированной к центральному атому металла к протонированной конфигурации определяли по методике остановленной струи с использованием белка CblC человека в качестве реагента, вызывающего переход, при разных значениях рН, находящихся в диапазоне соответствующих физиологическим значениям. Тиолятокобаламины подвергаются катализируемому протоном разложению (с потерей тиолятного лиганда) и поэтому значение их pKa невозможно определить с использованием стандартных методик.
Спектры в УФ и видимой области представлены на Фиг. 8. Новые синтезированные тиолятокобаламины обладают спектральными характеристиками, идентичными характеристикам ранее синтезированных содержащих связь Co-S веществ. Максимальная интенсивность поглощения для Суа-Cbl и MPG-Cbl наблюдается при 370 нм и 531 нм, что находится в соответствии с характеристиками ранее описанных кобаламинов, содержащих связь Co-S.
На Фиг. 8 представлены спектры в УФ и видимой области для MPG-Cbl и Суа-Cbl в 40 мМ растворе EPPS, рН 7,6. Максимальная интенсивность поглощения для каждого кобаламина находится в соответствии с данными для описанных ранее тиолятокобаламинов.
Коэффициенты поглощения представлены в Таблице 4. С помощью спектрофотометрических методик также определяли молярные коэффициенты поглощения. Значения приведены в Таблице 4. GSCbl использовали в качестве положительного контроля, он представляет собой известный и хорошо исследованный тиолятокобаламин.
Пример 5: Определение среднеточечного потенциала (окислительно-восстановительного потенциала) кобаламинов.
Среднеточечный потенциал новых синтезированных Cbl определяли с использованием спектрохимических и электрохимических методик. В качестве стандарта в этих исследованиях использовали окислительно-восстановительный потенциал MeCbl и CNCbl, хорошо изученных кобаламинов.
Пример 6: Кристаллизация содержащих связи Со-С и Co-S производных.
Для исследования структуры новых производных Cbl получали кристаллы, подходящие для рентгеноструктурного анализа. Производные Cbl (50-100 мг/мл) помещали в сосуды с диффузией паров ацетона с использованием разных значений рН, солей и температур так, как описано в литературе.
Кристаллы Суа-Cbl и MPG-Cbl успешно выращивали путем диффузии паров ацетона при 4°С в темноте (Фиг. 9). Добавление CsCbl облегчало образование кристаллов, обладающих размером, подходящим для рентгеноструктурного анализа. Кристаллы Суа-Cbl образовывались с использованием и без использования диффузии паров ацетона; однако кристаллы MPG-Cbl образовывались только при использовании диффузии паров ацетона. Возможность выделения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, в форме чистых кристаллов является преимуществом для последующих разработок терапевтических средств. Путем проведения анализа с помощью масс-спектрометрии получили следующие соответствующие молекулярные массы [М/2+1], m/z=765 для MPG-Cbl и m/z=722 для Суа-Cbl.
На Фиг. 9 представлены кристаллы Суа-Cbl и MPG-Cbl, выращенные при разных условиях проведения эксперимента. В действительности кристаллы обладают красным цветом.
Пример 7: Стабильность находящегося в β-положении аксиального лиганда в содержащих связь Со-С и Co-S производных в присутствии биологически важных обладающих низкой молекулярной массой тиолов.
Стабильность новых синтезированных производных СЫ в присутствии избытка GSH, Cys и Нсу исследовали с помощью спектроскопии в УФ и видимой области с разрешением по времени. Использовали соответствующие концентрации этих клеточных тиолов, такие например, как 1-10 Мм GSH (восстановленный глутатион).
Способность новых разработанных соединений, связанных связью Co-S или Со-С, вступать в реакцию с основным внутриклеточном обладающим низкой молекулярной массой тиолом, глутатионом, исследовали с помощью спектрофотометрического анализа. При значении рН равном 7,4 и при аэробных условиях реакция не протекала, это означает, что новые синтезированные кобаламины являются стабильными при условиях, близких к физиологическим.
Пример 8: Способность вступать в реакцию с биологически важными белками редуктазами.
Способность новых производных Cbl вступать в реакцию с невыделенными клеточными редуктазами исследовали с помощью спектрофотометрического анализа. Вкратце, методика заключалась в следующем: новые кобаламины инкубировали при анаэробных условиях с новой редуктазой 1 (NR1), метионинсинтазой-редуктазой (MSR) и флаводоксинредуктазой (FLDR), и соответствующими кофакторами (NADPH, NADH, FAD и т.п.). На превращение содержащих связь Co-S или Со-С кобаламинов в коб(II)аламин или коб(I)аламин указывало появление полос поглощения при 450 и 467 нм соответственно.
Пример 9: Связывание новых производных кобаламина с транскобаламином (ТС) и с CblC.
12
12
Поскольку для доставки витамин В в клетки необходимо связывание с транскобаламином и распознавание комплекса ТС-В рецептором транскобаламина, CD320, проводили исследование возможности связывания синтетических производных Cbl с бычьим рекомбинантным ТС и ТС человека. Исследования связывания и определение сродства проводили с помощью спектроскопии в УФ и видимой области и гель-фильтрации. Фракции, содержащие ТС, собирали и наличие связанного кобаламина определяли с помощью спектрофотометрического анализа. Все исследованные кобаламины стабильно связываются с ТС и клетки поглощали соответствующие комплексы ТС•Cbl со сравнимыми скоростями и в сравнимых количествах, как и в случае имеющихся в настоящее время лекарственных форм, HOCbl и CNCbl.
12
Важным аспектом биологической активности новых соединений является их способность связываться с перерабатывающим ферментом CblC и переходить в протонированную конфигурацию, которая увеличивает их реакционную способность. Это является критически важной стадией во внутриклеточных путях метаболизма витамина В, которые вовлечены в патогенез и, безусловно, связаны с самим связанным с CblC заболеванием. Так, например, мутантные варианты белка CblC, для которых известно что они являются патогенными для человека, можно восстановить с помощью новых биологически активных кобаламинов, если их собственные химические характеристики превосходят характеристики поступающих с пищей изоформ MeCbl, AdoCbl и HOCbl. Исследования связывания проводили при рН 7,6 (буфер EPPS, 0,04 М) и анализ проводили с помощью спектрофотомерии в УФ и видимой области. Как можно видеть из Фиг. 10, связывание Суа-Cbl или MPG-Cbl с CblC дикого типа человека вызывает образование протонированной конфигурации. Это указывает на то, что выбранные находящиеся в β-положении лиганды не ухудшают способность белка стабильно связываться с новым кобаламином.
Фиг. 10. Связывание Суа-Cbl и MPG-Cbl с CblC дикого типа человека при рН 7,0. Связывание находящегося в координированной к центральному атому металла конфигурации Суа-Cbl или MPG-Cbl (тонкие черные линии) с CblC вызывает образование его протонированной конфигурации (жирные линии).
Пример 10: Связывание новых производных кобаламина с белком CblC дикого типа и мутантными вариантами CblC.
Связывание новых производных Cbl с CblC дикого типа и мутантным CblC исследовали с помощью спектроскопия в УФ и видимой области так, как это описано для встречающихся в природе изоформ Cbl. Сродство связывания определяли с помощью изотермической титрационной калориметрии (ИТК, Microcal) или микромасштабного термофореза (МСТ, Nanotemper).
Анализ полученных в УФ и видимой области спектров продукта MPG-Cbl, полученного после осаждения из ацетона и вакуумного фильтрования, указывает на то, что по меньшей мере часть этого производного Cbl может находиться в протонированной конфигурации даже при отсутствии белка CblC (Фиг. 11). На рисунке слева представлен полученный в УФ и видимой области спектр MPG-Cbl в воде, после осаждения из ацетона и вакуумного фильтрования. На рисунке справа представлен спектр аутентичного протонированного MPG-Cbl, когда он связан с белком CblC. Это указывает на то, что MPG-Cbl может являться самодостаточным для обеспечения его перехода от координированной к центральному атому металла к протонированной форме при отсутствии белка CblC, вследствие электронодонорного воздействия аксиального лиганда. Эта обнаруженная характеристика является особенно важной для пациентов, у которых полностью отсутствует ген CblC, которые, таким образом, страдают наиболее тяжелым фенотипом связанного с CblC заболевания.
Фиг. 11. Сходство спектров свежеочищенного MPG-Cbl, растворенного в воде, и находящегося в протонированной конфигурации MPG-Cbl, связанного с рекомбинантным белком CblC человека.
Пример 11: Исследование активности CblC.
Исследовали способность новых синтезированных производных Cbl выступать в роли субстратов для CblC (Фиг. 12). Активность CblC определяли с помощью спектроскопии в УФ и видимой области в соответствии с опубликованными методиками. Анализ продуктов реакции проводили с помощью масс-спектрометрии. Исследовали деалкилирование и детиолирование содержащих связи Со-С и Co-S производных Cbl соответственно, для того, чтобы с использованием белка CblC дикого типа и мутантного CblC определить, могут ли эти реакции обеспечить поддержку пациентов, у которых имеется аномальная изоформа CblC, обладающая низкой ферментативной активностью или не обладающая ферментативной активностью.
2
+
Фиг. 12. Изменения в спектрах, связанные с реакцией Суа-Cbl или MPG-Cbl, связанного с CblC человека, в присутствии GSH. Реакции завершались в течение менее 10 с. Исходные спектры представлены светло-серыми линиями. Продуктом реакции в обоих случаях являлся HOCbl, связанный с белком CblC человека.
Пример 12: Характеризация кандидатов в пролекарства в клетках.
Производные Cbl, обладающие перспективной биохимической активностью, исследовали в имеющемся в нашем распоряжении наборе культивированных контрольных и содержащих мутантный CblC фибробластах человека. К культивированным клеткам контрольных фибробластов (здоровых новорожденных субъектов) или фибробластов с нарушением CblC без добавления экзогенного Cbl (отрицательный контроль) добавляли имеющийся в продаже CNCbl (контроль с помощью использующегося в настоящее время лекарственного средства) или новые синтезированные кобаламины (исследуемая группа). Способность этих соединений поддерживать внутриклеточный метаболизм Cbl при отсутствии CblC исследовали путем слежения за концентрациями являющихся биомаркерами заболевания метаболитов Нсу и ММА в кондиционированной среде.
Ферментативную активность CblC в присутствии Суа-Cbl и MPG-Cbl, использующихся в качестве субстратов, исследовали при таких же условиях проведения эксперимента, как использованные для исследования деалкилирования MeCbl и AdoCbl. Примечательно, что детиолирование Суа-Cbl и MPG-Cbl протекает на порядки величины быстрее, чем в случае MeCbl и AdoCbl. Реакция завершалась в течение менее 10 с, это время являлось временем, необходимым для получения первого спектра после смешивания CblC, связанного с Суа-Cbl или MPG-Cbl, с 5 мМ GSH (Фиг. 12). Эти результаты указывают на то, что новые производные кобаламина обладают существенно увеличенной биологической активностью, выражающейся в ферментативной обработке белком CblC.
На Фиг. 12 представлено исследование биологической активности Суа-Cbl и MPG-Cbl - поддержки протекания ферментативной реакции рекомбинантного CblC человека.
Пример 13: Восстановление внутриклеточного метаболизма кобаламина с использованием радиоактивных производных новых лекарственных средств.
57
57
57
57
57
Содержащие (Со) соединения синтезировали для использования в качестве источника Cbl для обеспечения внутриклеточного пути Cbl, т.е. превращения новых (Со)-тиолято- или (Со)-серосодержащих алкилкобаламинов в Со-AdoCbl Со-MeCbl, как это описано в предшествующей публикации Hannibal et al. (Mol. Genet. Metab. (2009) p. 260).
Пример 14: Исследование протеомы CblC после лечения новыми содержащими связь Co-S или Со-С кобаламинами и сопоставление с результатами исследования, полученными с использованием гидроксокобаламина, применяющегося в данной области техники.
В предшествующих, описанных в литературе протеомных исследованиях показано, что протеома фибробластов кожи, полученных от пациентов, страдающих связанным с CblC заболеванием, плохо реагирует на лечение с помощью CNCbl или HOCbl, использующихся в настоящее время лекарственных форм. Общее протеомное исследование по методике SILAC (мечение аминокислот стабильными изотопами в клеточной культуре) проводили для сопоставления способности использующихся в настоящее время лекарственных средств (гидроксокобаламин/цианокобаламин) и новых кандидатов в лекарственные средства восстанавливать протеому клеточного CblC с получением такого же характера экспрессирования, как наблюдающийся в здоровых клетках, полученных у здоровых новорожденных субъектов. В качестве меры успешного лечения ex vivo использовали обращение фенотипа CblC (или соответствующего другим метаболическим заболеваниям, в которые вовлечены нарушения перемещения или переработки кобаламина) на соответствующий здоровым субъектам.
Пример 15: Исследование биологической активности Суа-Cbl, MPG-Cbl и Ме-S-MeCbl и сопоставление с описанными ранее тиолятокобаламином GSCbl (модель связи Co-S) и природным кофактором метилкобаламином (модель связи Со-С).
Сначала исследовали способность новых кобаламинов, описанных в настоящем изобретении, выступать в роли субстрата для CblC дикого типа и восстанавливать утерянную активность патогенных вариантов, таких как мутантный Arg161Gly, который приводит к возникновению юношеской формы связанного с CblC заболевания. В Таблице 5 представлены результаты исследования ферментативной активности с использованием рекомбинантного CblC дикого типа человека и патогенного мутантного Arg161Gly.
Аббревиатуры: PrCbl: пропилкобаламин (структурный аналог Me-S-MeCbl); BuCbl: бутилкобаламин (структурный аналог Me-S-Et-Cbl); GSCbl: глутатионилкобаламин (аналог тиолятокобаламинов)
*Деалкилирование содержащих связь Со-С кобаламинов проводили с помощью комплексов CblC-алкил-Cbl (20 мкМ:10 мкМ) в буфере EPPS (40 мМ, рН 7,6) с добавлением 150 мМ NaCl и 10% глицерина при 25°С.Реакции начинали путем добавления 5 мМ GSH и за их протеканием следили в течение 60 мин.
Детиолирование содержащих связь Co-S кобаламинов проводили с помощью комплексов CblC-алкил-Cbl (20 мкМ:10 мкМ) в буфере EPPS (40 мМ, рН 7,6) с добавлением 150 мМ NaCl и 10% глицерина при 25°С. Реакции начинали путем добавления 50 мкМ GSH и за их протеканием следили в течение 60 мин. За протеканием реакций следили с помощью спектрофотометрии в УФ и видимой области (одно полное сканирование (от 300 до 700 нм) проводили каждые 2 мин).
Во-первых, результаты показывают, что серосодержащие алкилкобаламины, Me-S-MeCbl и Me-S-EtCbl, являются лучше чем природный кофактор MeCbl и их соответствующие не содержащие серу аналоги, пропилкобаламин и бутилкобаламин. В действительности, PrCbl и BuCbl не способны восстанавливать ферментативную активность патогенного варианта CblC, Arg161Gly, тогда как два новых кобаламина, описанные в настоящем изобретении, могут поддерживать протекание этой реакции с образованием в качестве продукта коб(II)аламина. Стабилизация коб(II)аламина посредством мутантного Arg161Gly в присутствии MeCbl и при высокой концентрации GSH описана ранее. В настоящем изобретении обнаружен сходный механизм, но с увеличенной биологической активностью, т.е. периоды полупревращения при протекании реакции сравнимы с соответствующими CblC дикого типа.
Во-вторых, результаты анализа тиолятокобаламинов показывают, что описанный ранее тиолятокобаламин, GSCbl, может поддерживать протекание реакции CblC дикого типа и патогенного варианта Arg161Gly, хотя в 4-5 раз менее эффективно, чем два производных тиолятокобаламина, описанные в настоящем изобретении, а именно MPG-Cbl и Суа-Cbl.
Пример 16: Исследование биологической активности Суа-Cbl и MPG-Cbl в культивированных клетках человека, полученных у здоровых субъектов или пациентов с нарушением CblC: анализ метилмалоновой кислоты, биомаркера недостаточности кобаламина.
Исследовали клеточный ответ на лечение новыми производными Суа-Cbl и MPG-Cbl и результаты сопоставляли с результатами для использующейся в настоящее время лекарственной формы CNCbl. Способность новых производных кобаламина Суа-Cbl и MPG-Cbl, обеспечивать регулирование метаболизма, т.е. уменьшение, например, продуцирования ММА содержащими CblC фибробластами в культуре, исследовали так, как описано в опубликованных ранее экспериментальных методиках. На Фиг. 13 приведено сопоставление эффекта CNCbl (0,001 мМ) и эффекта такой же дозы Суа-Cbl или MPG-Cbl, добавленной к культивированным фибробластам, полученным у здоровых субъектов (HFF (постнатальные фибробласты человека линии Foreskin), NHDF (нормальные фибробласты кожи человека), PCS (клетки-предшественники), фибробласты Wiesel, контроль) или пациентов с нарушением CblC (WG1801, WG2176, WG3354, GM10011, GM02345B, GM02452C). Как можно видеть из этих результатов, Суа-Cbl и MPG-Cbl намного лучше уменьшают концентрацию ММА до концентрации, наблюдающейся в фибробластах здоровых субъектов, чем CNCbl.
Также проводили дополнительное исследование с целью сопоставления эффекта тиолятокобаламинов Суа-Cbl и MPG-Cbl и серосодержащего алкилкобаламина Me-S-MeCbl и структурных аналогов, которые не используют для лечения. Результаты клеточного ответа (фибробласты здоровых людей, контроль и фибробласты пациентов с нарушением CblC) на лечение кобаламином, выраженные с помощью концентрации ММА, приведены в Таблице 6.
*Клетки сначала выращивали в присутствии определенных кобаламинов в течение периода времени, составляющего всего 7 дней, без замены культуральной среды. Затем культуральную среду удаляли и заменяли на чистую среду, не содержащую добавочный кобаламин (эксперимент с вымыванием). Клетки выращивали в течение еще 7 дней (эксперимент с вымыванием) и с целью сопоставления определяли концентрации ММА.
Контрольными здоровыми фибробластами, использующимися в настоящем изобретении, являлись HFF, NHDF и Wiezel. Линии клеток, обозначенные с помощью WG и GM, представляли собой фибробласты, полученные у пациентов, страдающих связанным с CblC заболеванием.
В Таблице 6 представлены результаты, полученные с использованием разных линий клеток, часть которых получена у пациентов, страдающих связанным с CblC заболеванием.
Совместно эти результаты являются доказательством следующего:
(a) Суа-Cbl и MPG-Cbl успешно переносятся в клетки с помощью традиционного переносчика ТС и его клеточного рецептора CD320.
(b) Суа-Cbl и MPG-Cbl не являются цитотоксическими при экспериментальных условиях, использованных в настоящем изобретении.
(c) Суа-Cbl и MPG-Cbl могут обеспечивать протекание реакции митохондриальной МСМ в большей степени, чем CNCbl, одна из использующихся в настоящее время лекарственных форм.
12
(d) Тот факт, что митохондриальный метаболизм витамина В можно восстановить путем лечения с помощью Суа-Cbl или MPG-Cbl, указывает на то, что новые производные являются биологически активными в цитозоле (где происходит переработка Cbl) а также в митохондрионе, где питательный микроэлемент необходим для реакции МСМ.
(e) Me-S-MeCbl, MPG-Cbl и Суа-Cbl поддерживают ферментативную активность патогенного варианта CblC, Arg161Gly (юношеская форма связанного с CblC заболевания), обеспечивая более эффективное удаление находящихся в бета-положении аксиальных лигандов по сравнению с их соответствующими аналогами, GSCbl (для тиолятокобаламинов) и MeCbl (для содержащих связь Со-С серосодержащих кобаламинов).
(f) Me-S-MeCbl уменьшает концентрацию ММА в большей степени, чем его структурный аналог MeCbl, это означает, что этот серосодержащий алкилкобаламин обладает превосходной активностью по отношению к восстановлению внутриклеточного метаболизма кобаламина. Этот серосодержащий алкилкобаламин уменьшает накопление ММА в клеточной среде аналогично MPG-Cbl.
(g) Хотя GSCbl является более эффективным для уменьшения концентрации ММА в содержащих CblC фибробластах, эксперимент с вымыванием показал, что регулирование метаболизма, обеспеченное с помощью MPG-Cbl и Суа-Cbl, продолжается дольше, чем в случае GSCbl, т.е. это предотвращает образование токсичной ММА после того как в клетки не поступает дополнительный кобаламин (Таблица 6). Полученные в настоящем изобретении результаты показывают, что MPG-Cbl и Суа-Cbl лучше поддерживают метаболизм кобаламина в течение длительного времени в содержащих CblC фибробластах, чем их структурный аналог GSCbl.