Методические подходы при определении чувствительности Bacillus anthracis к антибактериальным препаратам

Є

Методические подходы при определении чувствительности Bacillus anthracis к антибактериальным препаратам

Н. П. БУРАВЦЕВА, Л. Ю. АКСЕНОВА, А. Г. РЯЗАНОВА

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Methodic Approaches to Testing Bacillus anthracis Susceptibility to Antibacterials

N. P. BURAVTSEVA, L. YU. AKSENOVA, A. G. RYAZANOVA Stavropol Research Antiplague Institute

Представлены материалы по определению чувствительности 5G штаммов Bacillus anthracis к 24 антибиотикам двумя методами: диско-диффузионным методом и методом серийных разведений антибиотиков в плотной питательной среде. Определены пограничные значения зон задержки роста микробов и значения минимальных подавляющих концентраций антибиотиков для чувствительных и устойчивых к антибиотикам штаммов сибиреязвенного микроба. Даны рекомендации по использованию питательных сред и контрольных штаммов для определения чувствительности возбудителя сибирской язвы к антибиотикам.

Ключевье слова: Bacillus anthracis, чувствительность к антибиотикам.

Susceptibility of 5G isolates of Bacillus anthracis to 24 antibiotics was tested by the disk-diffusion method and the method of serial dilutions in solid media. The tests allowed to determine the boundary values of the growth inhibition zones and the minimum inhibitory concentrations of the antibiotics for susceptible and resistant strains of B.anthracis. Nutrient media and reference strains for testing antibiotic susceptibility of B.anthracis are recommended.

Key words: Bacillus anthracis, antibiotic susceptibility.

Введение

Сибирская язва продолжает оставаться особо опасной социально значимой инфекцией. После актов биологического терроризма в 2001 г. в США с использованием спор Bacillus anthracis в качестве средства поражения проблема сибирской язвы приобрела новые аспекты [1].

Основными медикаментозными средствами, используемыми как для лечения сибирской язвы, так и в случае экстренной профилактики являются антибактериальные препараты.

Большинство природных изолятов B.anthracis чувствительны ко многим антибиотикам, используемым в лечебной практике, однако в литературе описаны штаммы сибиреязвенного микроба, выделенные от больных и из других источников, устойчивые к пенициллину, амоксициллину, стрептомицину, тетрациклину, рифампицину [2—4]. Использование цефалоспоринов при лечении сибирской язвы может быть малоэффективным, так как к некоторым препаратам II и III поколения возбудитель сибирской язвы природноустойчив [5, 6]. Кроме того, по

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 355106 Ставрополь, ул. Советская, 13—15. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

данным отечественных авторов, получение антибиотикорезистентных штаммов B.anthracis в эксперименте не составляет особых трудностей [7].

Отличительной особенностью сибирской язвы при ингаляционном пути заражения, который наиболее вероятен и опасен при биотеррористических атаках, является длительная задержка спор в легких. Возможность развития легочной формы заболевания в более поздние сроки (40 дней и более), как вследствие прорастания в легких так называемых «дремлющих» спор после раннего прекращения лечения или профилактики антибиотиками, вынудила в США в 2001 г. к проведению экстренной профилактики антибактериальными препаратами в течение 60—90 дней. Такое длительное назначение антибиотиков сопровождалось развитием частых осложнений, вплоть до 20% [8, 9].

Исходя из вышеизложенного, определение чувствительности B.anthracis к антибактериальным препаратам перед назначением профилактики является необходимым этапом лабораторной диагностики.

Из всех методов определения чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузионный метод (ДДМ) является наиболее распространён-

-е-

Є

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ным. На основании полученных значений диаметров зон подавления роста микробов вокруг дисков с антибиотиками исследуемые штаммы подразделяются на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные. Для разграничения этих трёх категорий чувствительности используются так называемые пограничные значения диаметров зон подавления роста микробов, которые для каждого вида микроба и антибиотика различны [10]. Пограничные значения не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться в зависимости от изменения чувствительности к антибиотикам популяции микроорганизмов или с появлением новых антибиотиков [11].

Возбудитель сибирской язвы имеет ряд особенностей, с которыми сталкиваются лабораторные работники при определении чувствительности микроба к антибиотикам. Во-первых, сибиреязвенный микроб на питательной среде растёт в Я-фор-ме и взвесь при её приготовлении негомогенна. Во-вторых, выросшие колонии микроба имеют большие размеры (3—5 мм в диаметре), формируются в короткие сроки (15—18 ч), поэтому при определении ДДМ диаметры зон задержки роста могут быть заниженными.

Многолетний опыт работы с данным микробом позволяет нам дать рекомендации для определения чувствительности сибиреязвенного микроба к антибиотикам двумя методами — методом серийных разведений и ДДМ.

Материал и методы

При исследованиях придерживались инструкции [10] и методических рекомендаций [12].

Питательные среды. Для определения чувствительности B.anthracis к антибактериальным препаратам методом серийных разведений и ДДМ использовали три среды: агар Мюллера-Хинтон (МХА) (рН 7,3+0,1), агар Хоттингера (АХ) (рН 7,2+0,2) и агар Гивенталя—Ведьминой (АГВ).

Контрольные штаммы. Для контроля точности и стандартности проведения исследований были использованы две тест-культуры с известной чувствительностью к антибиотикам. ВОЗ рекомендует для этой цели использовать Staphylococcus aureus АТСС 25923. В ряде случаев критерии чувствительности для S.aureus АТСС 25923 не соответствуют критериям для B.anthracis, поэтому в качестве контрольного использовали также вакцинный штамм B.anthracis СТИ, применяемый для иммунизации людей, основные биологические свойства которого, в том числе и антибиотикочувствитель-ность, изучены наиболее полно.

Антибактериальные препараты. Для определения чувствительности B.anthracis использовали 24 коммерческих антибактериальных препарата. Среди них препараты первого ряда — бен-зилпенициллин, ампициллин, доксициклин, тетрациклин, ципрофлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, рифампицин, ме-ропенем, имипенем, к препаратам второго ряда относят антибиотики группы аминогликозидов, цефалоспоринов, макролидов. Следует отметить, что сибиреязвенный микроб чувствителен только к цефалоспоринам I поколения (цефазолин, цефалексин), тогда как к цефалоспоринам II—III поколения (цефуроксим, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим и др.) — устойчив.

Для метода серийных разведений в плотной питательной среде использовали соответствующие разведения антибиоти-

ков. Для препаратов первого ряда: ампициллин (или бензил-пенициллин) — 0,002—0,004—0,008—0,015—0,03—0,06—0,125 мг/л; доксициклин (или тетрациклин) — 0,008—0,015—0,03— 0,06—0,125 мг/л; ципрофлоксацин (или офлоксацин, пефлоксацин) — 0,004—0,008—0,015—0,03—0,06—0,125—0,25 мг/л; рифампицин — 0,008—0,015—0,03—0,06—0,125 мг/л; меропе-нем (или имипенем) — 0,008—0,015—0,03—0,06—0,125 мг/л; препаратов второго ряда: цефазолин (или цефалексин) — 0,125—0,25—0,5—1,0—2,5 мг/л; азитромицин — 0,125—0,25— 0,5—1,0—2,5 мг/л; линкомицин — 0,5—1,0—2,5—5,0 мг/л; ка-намицин (или гентамицин, амикацин, стрептомицин) — 0,03—0,06—0,125—0,25 мг/л.

Для постановки ДДМ использовали коммерческие диски с определёнными концентрациями антибактериальных препаратов.

Посевная доза, инокуляция, инкубация. Для определения чувствительности к антибиотикам использовали 50 типичных вирулентных штаммов В.апіЬгасІ8. При определении ДДМ для посева отбирали типичные колонии 16—18-часовых агаровых культур, из которых готовили взвесь микробов в 0,9% растворе хлорида натрия, доводя плотность инокулюма в соответствии с отраслевым стандартом мутности ГИСК им. Л. А. Тара-севича (10 единиц), что соответствует ~ 2 • 107 КОЕ/мл. Эту взвесь в объёме 0,3 мл наносили на поверхность питательной среды и равномерно распределяли шпателем. Чашки выдерживали 30 мин при комнатной температуре для впитывания суспензии. Затем накладывали диски стерильным пинцетом на поверхность засеянной питательной среды (не более 4 дисков на чашку), вновь выдерживали 30 мин при комнатной температуре, а затем, перевернув чашки с посевами, инкубировали при (36±1)°С в течение 18—20 ч (не более). Измеряли диаметр зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска, с точностью до 1 мм. Мелкие колонии в пределах зоны задержки роста не учитывали.

Для метода серийных разведений использовали суспензию той же концентрации микробных клеток, нанося небольшими каплями с помощью штампа-репликатора или пипеток с тонким концом на агаровые пластинки с разными концентрациями антибактериальных препаратов, начиная со среды с минимальным содержанием антибиотиков. Посевная доза составляла 104—105 КОЕ/мл. Посевы инкубировали 18—24 ч при (36±1)°С. Чувствительность/устойчивость культур устанавливали по минимальной концентрации препарата, подавляющей рост возбудителя (МПК, мг/л или мкг/мл) на среде культивирования.

Результаты и обсуждение

Результаты определения чувствительности 50 штаммов В.апїкгасі& двумя методами с использованием двух питательных сред (МХА и АХ) представлены в табл. 1. Исходя из того, что метод серийных разведений более точный, чем ДДМ, были сопоставлены значения МПК антибиотиков с пограничными значениями диаметров зон задержки роста микроба, установленных ДДМ (средние данные для 50 штаммов). Были обнаружены несоответствия при определении чувствительности двумя методами, особенно это касается тех препаратов, к которым возбудитель сибирской язвы устойчив (цефуроксим, цефтазидим, цефотаксим, цефтриаксон) или к тем препаратам, которые не нашли применения при лечении сибиреязвенной инфекции (эритромицин). Так, минимальные пограничные значения диаметра зон задержки роста сибиреязвенного микроба от 15 до 20 мм свидетельствуют о небольшой активности препа-

О

e

Таблица 1. Диапазон значений МПК антибактериальных препаратов и диаметров зон подавления роста для 50 штаммов B.аnthracis

Антибактериальные препараты

Содержание

препарата

Диаметры зон подавления роста, мм

Значение МПК, мг/л

в диске, мкг МХА

Бензилпенициллин 10 26-30 34-46 0,002-0,06 0,002-0,06

Ампициллин 10 27-35 27-35 0,008-0,06 0,008-0,015

Цефазолин 30 29-35 29-35 0,125-0,25 0,06-0,125

Цефалексин 30 29-35 29-33 0,25-1,0 0,25-1,0

Цефуроксим 30 17-23 17-23 10,0-25,0 10,0-25,0

Цефтазидим 30 15-20 15-20 50,0-100,0 50,0-100,0

Цефотаксим 30 20-28 20-28 10,0-25,0 10,0-25,0

Цефтриаксон 30 20-25 20-25 5,0-10,0 5,0-10,0

Эритромицин 15 18-24 18-24 0,25-1,0 0,5-1,0

Азитромицин 30 24-30 24-30 0,5-2,5 0,5-2,5

Линкомицин 15 22-30 22-30 1,0-5,0 1,0-2,5

Канамицин 10 22-30 22-30 0,06-0,5 0,06-0,25

Гентамицин 10 24-32 24-30 0,03-0,125 0,03-0,05

Стрептомицин 10 18-30 18-30 0,06-0,125 0,06-0,125

Амикацин 30 26-32 26-32 0,125-0,25 0,125-0,25

Тетрациклин 30 30-40 30-40 0,008-0,015 0,008-0,015

Доксициклин 10 30-40 30-40 0,008-0,015 0,008-0,015

Рифампицин 5 20-26 20-26 0,008-0,06 0,008-0,06

Ципрофлоксацин 5 27-35 27-35 0,004-0,015 0,004-0,015

Офлоксацин 5 27-35 27-35 0,05-0,125 0,05-0,125

Пефлоксацин 10 27-35 27-35 0,05-0,125 0,05-0,125

Ломефлоксацин 10 27-35 27-35 0,05-0,5 0,05-0,5

Меропенем 10 30-37 30-37 0,002-0,008 0,002-0,008

Имипенем - - 0,002-0,008 0,002-0,008

Таблица 2. Диапазон значений диаметров зон подавления роста контрольных штаммов Staphylococcus aureus (АТСС 25923) и Bacillus anthracis СТИ

Антибактериальные препараты Содержание препарата Диаметр зон подавления роста, мм

МХА

в диске, мкг S.aureus АТСС 25923 B.anthracis СТИ S.aureus АТСС 25923 B.anthracis СТИ S.aureus АТСС 25923 B.anthracis СТИ

Бензилпенициллин 10 26-37 32-39 26-37 34-40 26-30 32-39

Ампициллин 10 27-35 27-35 27-35 27-35 27-35 27-32

Цефазолин 30 29-35 29-35 29-35 29-35 29-35 29-35

Цефалексин 30 29-37 29-35 29-37 29-33 29-35 29-35

Цефуроксим 30 27-35 17-23 27-35 17-23 27-35 16-23

Цефтазидим 30 16-20 15-20 16-20 15-20 16-20 15-22

Цефотаксим 30 25-31 20-28 25-31 20-28 25-31 19-26

Цефтриаксон 30 29-35 20-25 29-35 20-25 25-30 20-25

Эритромицин 15 22-30 18-24 22-30 18-24 22-30 18-24

Азитромицин 30 24-30 24-30 24-30 24-30 21-26 21-26

Линкомицин 15 22-32 22-30 22-32 22-30 22-32 22-30

Канамицин 30 19-26 22-30 19-26 22-30 19-26 19-26

Гентамицин 10 19-27 24-32 19-27 24-30 19-27 24-30

Стрептомицин 10 18-22 18-30 18-22 18-30 18-22 19-29

Амикацин 30 20-26 26-32 20-26 26-32 20-26 20-26

Тетрациклин 30 24-30 30-40 24-30 30-40 24-30 30-35

Доксициклин 10 23-29 30-40 23-29 30-40 23-29 27-32

Рифампицин 5 26-34 20-26 26-34 20-26 26-34 19-22

Ципрофлоксацин 5 22-30 27-35 22-30 27-35 22-30 25-30

Офлоксацин 5 24-28 27-35 24-28 27-35 24-28 23-30

Пефлоксацин 10 17-28 27-35 17-28 27-35 17-28 22-30

Ломефлоксацин 10 23-29 27-35 23-29 27-35 23-29 22-30

Меропенем 10 29-37 30-37 29-37 30-37 27-35 27-30

рата, однако диаметры зон задержки роста микроба этими же препаратами могут быть и максимальными — от 20 до 28, что может свидетельствовать об их чувствительности. Поэтому для определения чувствительности к этим препаратам мы рекомендуем использовать только метод серийных разве-

дений. Что же касается питательных сред, то данные табл. 1 свидетельствуют о возможности использования агара Хоттингера, если в лаборатории отсутствует среда Мюллера-Хинтон.

Среда АГВ, широко используемая в лабораторной практике, имеет ряд недостатков, и по-

-о-

Є

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 3. Пограничные значения диаметров зон подавления роста и величин МПК антибактериальных препаратов для B.anthracis

Антибактериальные препараты

Содержание

препарата

Диаметры зон подавления роста, мм

Значение МПК, мг/л

в диске, мкг S* R* S R

Бензилпенициллин 10 >26 <16 <0,1 >1,0

Ампициллин 10 >27 <16 <0,1 >1,0

Цефазолин 30 >29 <16 <0,2 >1,0

Цефалексин 30 >29 <16 <1,0 >4,0

Эритромицин 15 >24 <16 <1,0 >4,0

Азитромицин 30 >24 <16 <1,0 >4,0

Линкомицин 15 >23 <16 <1,0 >4,0

Канамицин 10 >23 <16 <1,0 >4,0

Гентамицин 10 >23 <16 <1,0 >4,0

Cтрептомицин 10 >23 <16 <1,0 >4,0

Амикацин 30 >23 <16 <1,0 >4,0

Tетрациклин 30 >23 <16 <0,1 >1,0

Доксициклин 10 >23 <16 <0,1 >1,0

Рифампицин 5 >20 <13 <0,1 >1,0

Ципрофлоксацин 5 >19 <15 < 0,1 >1,0

Офлоксацин 5 >19 <15 < 0,1 >1,0

Пефлоксацин 10 >19 <15 < 0,1 >1,0

Ломефлоксацин 10 >20 <15 < 0,1 >1,0

Mеропенем 10 >26 <15 < 0,1 >1,0

Имипенем — — < 0,1 >1,0

Примечание. S* - чувствителен; R* - устойчив.

этому некоторые исследователи не рекомендуют использовать её для определения чувствительности к антибиотикам [11]. Однако, как видно из табл. 2, значения зон задержек роста тест-культур — Б.аитет (АТСС 25923) и В.аШНгаш СТИ на трёх испытанных средах быши практически аналогичными. Важными условиями для стандартизации проводимых определений являются толщина и равномерность слоя агара в чашках Петри, для чего в чашку диаметром 90 мм заливают 20 мл агара, а при диаметре 100 мм — 25 мл.

При выборе контрольного штамма, как видно из представленных в табл. 2, предпочтение можно отдать вакцинному штамму В.аЫЬгааз СТИ. Значения диаметра зон задержки роста такими антибиотиками, как бензилпенициллин, цефуроксим, цефтриаксим, эритромицин, всеми аминоглико-зидами, тетрациклином и доксициклином, не совпадают у штамма Б.аыгет АТСС 25923 и штамма В.аЫЬгааз СТИ, в то же время значения диаметра зон задержки роста штамма СТИ и вирулентных штаммов сибиреязвенного микроба оказались аналогичными (см. табл. 1 и 2).

Нами определены пограничные значения диаметра зон подавления роста (в мм) и величин

МПК (в мг/л) для антибактериальных препаратов, к которым возбудитель сибирской язвы чувствителен (табл. 3). На основании полученных значений диаметров зон подавления роста вокруг дисков с антибиотиками и МПК для штаммов сибиреязвенного микроба изученные штаммы были подразделены на чувствительные (8) и резистентные (Я) (см. табл. 3).

Заключение

Таким образом, для разграничения двух категорий чувствительности (или резистентности) выделяемых штаммов В.апїкгасї5 можно использовать так называемые пограничные значения диаметров зон подавления роста микроорганизмов или значения минимальной подавляющей концентрации антибиотиков в плотной питательной среде. Увеличение МПК или снижение зоны подавления роста для исследуемых штаммов по сравнению с контрольным штаммом В.апїкгасї5 СТИ может свидетельствовать о тенденции повышения устойчивости культуры, что требует изменения схемы терапии данным антибиотиком или использования для лечения и профилактики другого, более эффективного антибактериального препарата.

ЛИТЕРАТУРА

1. Черкасский Б. Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: 2002; 332-352.

2. Буравцева Н. П. Роль пенициллиназы в механизме устойчивости сибиреязвенного микроба к бензилпенициллину. Антибиотики 1971; 2: 168-173.

3. Cavallo J. D, Ramisse F., Girardet M. et al. Antibiotic susceptibilities of 96 Bacillus anthracis isolated in France between 1994 and 2000. Antimicrob Agents Chemother 2002; 2307—2309.

Chen Y., Tenover F. C., Kohler T. M. Beta-lactamase gene expression in a penicillin-resistant B.anthracis strain. Ibid; 2004; 48: 12: 4873—4877. Буравцева H. П., Саркисова H. В., Еременко Е. И., Цыганкова О. И. и др. Чувствительность сибиреязвенного микроба к антибиотикам, в том числе к цефалоспоринам. Актуальные аспекты природноочаговых болезней: Мат. науч.-практ. конф., посвященной 80-летию Омского НИИПИ, 16—17 окт. 2001 г. Омск 2001; 208—209. Coker P. R., Smith K. L., Hugh-Jones M. E. Antimicrobial susceptibilities of diverse Bacillus anthracis isolates. Antimicrob. Agents Chemother 2002; 46: 3843—3845.

-Q-

e

7. Буравцева H. П. Специфическая и экстренная профилактика сибирской язвы. Дис. ...д-ра мед.наук. Саратов 1991; 389.

8. Perkins B. Bioterrorism-related anthrax, USA 2001. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France March 30 — April 3 2003; 38.

9. Shepard C. W, Soriano-Gabarro M., Zell E. R. Antimicrobial postexposure prophylaxis for anthrax: adverse events and adherence. Emerging for Emerging Diseases 2002.

10. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам. М.: 1990; 36.

11. Решедъко Г. К., Стецюк О. У. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2001; 3: 4: 348—354.

12. Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» /МУК 4.2.1890-04/. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2004; 6: 4: 306—359.