КЛЕТОЧНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕФИБРОТИДА
CELLULAR METHOD OF DETERMINING DEFIBROTIDE EFFECTIVENESS

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Лекарственные вещества должны быть получены с соблюдением их постоянного уровня специфической активности, с целью безопасного введения. Например, у проб для биологических молекул, таких, как гепарин, присутствует изменчивость от партии до партии с точки зрения длины цепи, молекулярной массы, состава, степени сульфатирования, и т.д. Должны также быть стандартизированы (титрованы) и прочие вещества, которые извлечены из натуральных веществ. См., например, U.S. Patent No. 7,575,886. Одним из таких веществ является дефибротид. Дефибротид является разнородной смесью одноцепочечных полинуклеотидов переменных длин, которая извлечена из органов млекопитающих.
Для определения биологической активности дефибротида используют тесты, включая чашечный тест (определения лизиса) фибрина и тромбоэластографическое измерение времени лизиса эуглобулина (Prino G. et al., Indagini preliminari sull'attivitfibrinolitica, nell'animale e nell'uomo, di una nuova sostanza presente in diversi organi animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nell'industria farmaceutica in Italia, Rome, 2-4 Oct. 1975-II Farmaco, Ed. Prat.) (1969), 24, 552-561), плазменный метод (United States Patent No. 7,338,777), и эуглобулинный метод (WO 2013/190582). Несмотря на то, что данные методы представляют собой эффективные меры контроля качества на фармацевтическом производстве, все методы, основанные на про-фибринолитических характеристиках дефибротида, включают оценку активности дефибротида на изолированных белках или энзимах.
Таким образом, присутствует потребность в данной области техники в разработке нового способа определения биологической активности дефибротида в клеточном контексте, который обеспечивает точный и надежный процесс, позволяющий определять активность дефибротида путем оценки жизнеспособности клеток по одной или более концентрациям дефибротида, например, для сравнения с эталонной партией новых партий дефибротида, независимо от особенностей используемого производственного процесса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение базируется, частично, на обнаруженном свойстве дефибротида защищать клетки млекопитающих от цитотоксичности, вызванной конкретными цитостатическими агентами дозозависимым способом. Авторы использовали в целях изобретения этот эффект защиты клеток, разработали клеточный способ для определения биологической активности партий дефибротида и установили мерную плитку, чтобы обеспечить эффективное и безопасное введение. Такие методы предусматривают, помимо прочего, контроль качества во время производственного процесса, стандартизацию партий дефибротида, произведенных различными методами или из различных исходных материалов и последовательное дозирование дефибротида пациентам.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Жизнеспособность клеток НМЕС, инкубированных с флударабином в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций дефибротида, в результате измерений на основе МТТ-теста (анализа на основе 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолия бромида). НМЕС-1 инкубировали с флударабином (F-Ara) при 10 мкг/мл в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций дефибротида (ДФ, DF) (1 мкг/мл-100 мкг/мл) в течение 72 ч и измерили жизнеспособность клеток при помощи МТТ-теста. t-критерий Стьюдента: §р < 0.01, F-ara 10 мкг/мл в сравнении с контролем (ctr); * р < 0.05, клетки обработали с DF при 1 мкг/мл в сравнении с F-ara 10 мкг/мл; ** р < 0.001, DF при 10 и 100 мкг/мл в сравнении с F-ara 10 мкг/мл.
Фиг. 2. Жизнеспособность клеток SK-HEP-1, инкубированных с доксорубицином, в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций дефибротида, в результате измерений на основе CCK-8 теста. Клетки SK-HEP-1 инкубировали с доксорубицином (Докc, Dox) при 0.1 мкг/мл в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций дефибротида (ДФ, DF) (1 мкг/мл-100 мкг/мл) в течение 72 ч и измерили жизнеспособность клеток при помощи CCK-8 теста, t-критерий Стьюдента: §р < 0.01, Dox 0.1 мкг/мл в сравнении с контролем (ctr); * р < 0.01, клетки обработали с DF при 50 или 100 мкг/мл в сравнении с. Dox 0.1 мкг/мл.
Фиг. 3. Жизнеспособность клеток НМЕС-1, инкубированных с флударабином в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций дефибротида, в результате измерений на основе МТТ-теста, АС или ACTG. Клетки НМЕС-1 инкубировали с флударабином (F-Ara) при 50 мкг/мл в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций рандомизированных синтетических олигонуклеотидов аденин-цитозина (АС) примерно 16 кДа (1-500 мкг/мл) (Фиг. 3А), рандомизированных синтетических олигонуклеотидов аденин-цитозин-гуанин-тимина (ACGT) примерно 17 кДа (12.5-50 мкг/мл) (Фиг. 3В), или дефибротида (5-100 мкг/мл) (Фиг. 3С) в течение 72 ч и измерили жизнеспособность клеток при помощи МТТ-теста. t-критерий Стьюдента: * р < 0.01, F-ara 50 мкг/мл в сравнении с контролем (Ctr), ** р < 0.01 F-ara 50 мкг/мл в сравнении с дефибротидом. Не наблюдали какого-либо значительного защитного действия со стороны синтетических олигонуклеотидов обоих типов.
Фиг. 4. Жизнеспособность клеток SK-HEP-1, инкубированных с флударабином в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций ACTG, tpA, или глутатиона, в результате измерений на основе CCK-8 теста. Клетки SK-HEP-1 инкубировали с флударабином (F-Ara) при 10 мкг/мл в присутствии или отсутствии, (A-G), варьирующихся концентраций рандомизированных синтетических олигонуклеотидов аденин-цитозин-гуанин-тимина (ACGT) примерно 17 кДа (1.25-80 мкг/мл), tPA (10-320 МЕ/мл), или глутатиона (1.25-80 мкг/мл) в течение 72 ч и измерили жизнеспособность клеток при помощи CCK-8 теста, t-критерий Стьюдента: * р < 0.01, F-Ara 10 мкг/мл в сравнении с контролем (Ctr). Не наблюдали какого-либо значительного защитного действия ACGT, tPA, или глутатиона от индуцированной F-Ara токсичности.
Фиг. 5. Сравнение динамических характеристик дозозависимых кривых эталонного дефибротида в сравнении с обработанными кислотой (Фиг. 5А) и обработанными основой (Фиг. 5В) образцами дефибротида в испытании клеточной защиты. Полученные данные о спектральной поглощательной способности были обработаны с использованием программы статистического анализа PLA2 (логистический анализ функции с 4 параметрами). Спектральная поглощательная способность краски индикатора жизнеспособности клеток (CCK-8) представлена на Оси Y как «ответ». Доза представлена на Оси X и является серией 2-кратных разбавлений дефибротида в испытании (1.25 - 80 мкг/мл); STD представляет эталонный стандарт дефибротида. Более низкие следы в каждой группе, которые соответствуют обработанным образцам, указывают на пониженную активность. При помощи данной программы статистического анализа, оба обработанных образца признаны не соответствующими статистическим критериям годности.
Фиг. 6. Жизнеспособность клеток SK-HEP-1, инкубированных с флударабином в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций дефибротида, в результате измерений на основе CCK-8 теста. Клетки SK-HEP-1 инкубировали с флударабином (F-Ara) при 10 мкг/мл в присутствии или отсутствии варьирующихся концентраций дефибротида (ДФ, DF) (1 мкг/мл-100 мкг/мл) в течение 72 ч и измерили жизнеспособность клеток при помощи CCK-8 теста, t-критерий Стьюдента: р < 0.01, F-Ara 10 мкг/мл в сравн. с контролем (Ctr) и для клеток, обработанных DF при >1 мкг/мл в сравнении с F-Ara 10 мкг/мл.
Фиг. 7. Оценка соотношения активности стандартизированного эталонного образца дефибротида (титр, стандарт) и образца дефибротида с неизвестной биологической активностью. Клетки SK-HEP-1 подвергли шести-серийному разбавлению (1:2) эталонного и простого образцов дефибротида для получения концентраций 80, 40, 20, 10, 5, 2.5 и 1.25 мкг/мл в присутствии флударабина (F-Ara) (10 мкг/мл). Каждая концентрация эталонного и простого образцов включала 4 реплики. После инкубации в течение 72 ч при 37°С, измерили жизнеспособность клеток при помощи CCK-8 теста. Измерения поглощаемости (абсорбируемости) подвергли статистическому анализу для определения активности образцов (4-показательный логический анализ).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение предоставляет надежный способ определения биологической активности дефибротида на основе его способности защищать живые клетки от воздействия определенных цитостатических агентов. Этот эффект защиты клеток важен для использования дефибротида в качестве лекарственного препарата. Данный способ позволяет осуществить титрование активности дефибротида, полученного различными методами или из различных исходных веществ. Способ также позволяет установить единицы измерения для эффективного и безопасного введения дефибротида.
В одном воплощении изобретения, способ оценки активности контрольной партии дефибротида включает (i), выращивание клеток млекопитающих в культуре, (ii) инкубирование клеток с раствором, содержащим по крайней мере один цитостатический агент и по крайней мере одну концентрацию дефибротида из контрольной партии, (iii) определение жизнеспособности клеток после инкубационного периода, и (iv) вычисление активности контрольной партии дефибротида на основе измерения жизнеспособности клетки. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает сравнение жизнеспособности клеток для контрольной партии дефибротида с жизнеспособностью клеток для эталонной партии дефибротида и вычисления активности контрольной партии дефибротида на основе результатов сравнения.
В целях заявленного изобретения, термин «активность» относится к измерению биологической активности дефибротида, в частности, на основе измерения способности дефибротида защищать живые клетки от воздействия цитотоксических агентов.
Дефибротид (Merck Index, 1996, no. 2915; CAS number 83712-60-1) представляет собой вещество натурального происхождения, натриевую соль низкомолекулярных полидезоксирибонуклеотидов, полученных экстрагированием из органов животных. Молекулярная масса (ММ) составляет от 14 до 19 кДа, а по результатам измерений (по специальным методикам), усредненная ММ составляет примерно 16.1 кДа ± 2.0 кДа (эксклюзионная ВЭЖХ); примерно 17.6 кДа ± 1.0 кДа (электрофорез в полиакриламидном геле); и примерно 16.7 кДа ± 1.6 кДа (многостороннее рассеяние лазерного излучения). "Analysis of Aggregates and Particles in Protein Pharmaceuticals" H. Mahler and W. Jiskoot (eds.), 2012 John Wiley & Sons, Inc.
Дефибротид имеет широкое терапевтическое применение, включая применение в качестве антитромботического агента (U.S. Patent No. 3,829,567), лечение периферийной артериопатии, острой почечной недостаточности (U.S. Pat. No. 4,694,134), и острой миокардиальной ишемии (U.S. Pat. No. 4,693,995). Относительно недавно, дефибротид нашел применение в лечении и профилактике синдрома синусоидальной обструкции/веноокклюзионной болезни (клинические испытания в ЕС EudraCT:2004-000592-33, клинические испытания в США 2005-01 (ClinicalTrials.gov identifier: NCT00358501). Прочее применение дефибротида описано в следующих патентах и патентных заявках, каждая из которых приведена в данном описании в развернутом ссылочном порядке: патенты США Nos. 3,770,720; 3,829,567; 3,899,481; 4,693,134; 4,693,995; 4,938,873; 4,985,552; 5,081,109; 5,116,617; 5,223,609; 5,646,127; 5,646,268; 5,977,083; 6,046,172; 6,699,985; 6,767,554; 7,338,777; 8,551,967; 8,771,663, патентные публикации США Nos. 20080194506; 20090131362; 20110092576; 20130231470; 20140005256, патентная заявка США Nos. 14/323,918; и WO 2013/190582.
Описанные здесь способы возможно использовать, чтобы оценить активность партий дефибротида, произведенных различными методами или извлеченных из различных органов животных. Например, в некоторых воплощениях, контрольная (опытная) партия дефибротида извлечена из тканей коров, таких, как легкое, кишечник или слизистые оболочки. В других воплощениях контрольная (опытная) партия дефибротида извлечена из тканей свиней, таких, как легкое, кишечник или слизистые оболочки. Опытные партии дефибротида могут также быть извлечены из других органов другого вида животных, включая овец и лошадей. В определенных воплощениях, контрольные партии дефибротида для измерения активности с использованием методов, описанных в данном изобретении, производят при помощи процесса, описанного в патентах США Nos. 4,985,552 и 5,223,609, которые приведены в данном описании в развернутом ссылочном порядке. В частности, дефибротид, полученный при помощи заявленного процесса, представляет собой полидезоксирибонуклеотид в соответствии со следующей формулой со случайной последовательностью:
где:
Р = фосфорный радикал
dAp = дезоксиадениловый мономер
dGp = дезоксигуаниловый мономер
dTp = дезокситимидиловый мономер
dCp = дезоксицитидииловый мономер
Контрольные партии дефибротида могут иметь одно, или борлее, или все из следующих физико-химических свойств: электрофорез = гомогенная анодная подвижность;
1cm
230
260
1%
20
Коэффициент экстинкции, E при 260±1 нм = 220±10; коэффициент поглощения, Е/Е=0.45±0.04; коэффициент молярной экстинкции (относительно фосфора), ε(Р)=7750±500; ротационный момент [α]D°=53°±6; реверсивный гиперхромизм, в % от нативной ДНК, h=15±5; и соотношение пурина : пиримидина 0.95±0.5.
В определенных воплощениях возможно, чтобы контрольные партии дефибротида для измерения активности с использованием методов, описанных в данном изобретении, подвергались физико-химическим нагрузкам, таким, как высокая температура, экстремальные уровни рН, воздействие перекиси водорода, и т.д. Таким образом, действия способа согласно изобретению возможно также использовать, чтобы оценить активность партий дефибротида или составов, включающих дефибротид, которые были сохранены в субоптимальных условиях или в течение длительных периодов времени. В определенных воплощениях, действия способа возможно использовать, чтобы контролировать стабильность партий дефибротида или составов, включающих дефибротид, например, для расчета срока годности.
Способ по изобретению включает этап выращивания клеток млекопитающих в культуре. В определенных воплощениях заявленного изобретения клетки млекопитающих являются клетками человека. В некоторых воплощениях клетки человека являются человеческими эпителиальными клетками. В других воплощениях клетки человека являются человеческими эндотелиальными клетками. В одном конкретном варианте человеческие эндотелиальные клетки представляют собой синусоидальные эндотелиальные клетки печени человека, такие как клетки SK-HEP-1. В другом конкретном варианте человеческие эндотелиальные клетки являются человеческими капиллярными эндотелиальными клетками, такими, как клетки НМЕС-1. В другом конкретном варианте эпителиальные клетки являются кератиноцитами (напр., клетки НаСаТ) или альвеолярными эпителиальными клетками (напр., клетки А549).
Клетки млекопитающих могут быть получены из признанных депозитариев, таких, как Американская коллекция клеточных культур (АТСС), а также из других источников. Подходящая питательная среда для роста клеток млекопитающих в культуре известна в технике и раскрыта, например, в «Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications)) R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell. Оптимальная среда для каждого типа клеток может быть получена от специализированных поставщиков клеток (напр.: ATCC-LGC, M1, Италия; CDC, Атланта, GA, США). В определенных воплощениях заявленного изобретения, клетки млекопитающих выращены в минимальной эссенциальной среде Игла (ЕМЕМ), с добавлением 10% (обход.) фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, и 2.5 мкг/мл амфотерицина В. В других воплощениях заявленного изобретения клетки млекопитающих выращены в среде RPMI 1640, с добавлением 10% (об.сод.) фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, и 2.5 мкг/мл амфотерицина В. В определенных воплощениях, среда может содержать L-глутамин (напр., 2 мМ), гидрокортизон (напр., 10 мкг/мл), и фактор роста эпителия (напр., 10 мкг/мл).
4
5
4
5
4
5
4
5
4
Плотность клеток млекопитающих может составлять от примерно 5×10 клеток/мл до примерно 5×10 клеток/мл, от примерно 2.5×10 клеток/мл до примерно 2.5×10 клеток/мл, или от примерно 5×10 клеток/мл до примерно 2×10 клеток/мл. Для получения оптимальных результатов испытаний, плотность клеток, в определенных воплощениях, могут оптимизировать, принимая во внимание типы цитотоксического агента и клеток, используемых в исследовании. Например, в воплощениях, в которых человеческие эндотелиальные клетки используются для испытания, особенно предпочтительная удельная плотность клеток составляет от примерно 2.5×10 клеток/мл до примерно 2×10 клеток/мл, более предпочтительно примерно 5×10 клеток/мл. Эта удельная плотность клеток особенно подходят для испытания, в котором доксорубицин или флударабин являются цитостатическим агентом.
В другом аспекте изобретения способ включает этап инкубирования клеток млекопитающих в культуре с раствором, содержащим цитостатический агент и, по крайней мере, одну концентрацию дефибротида из испытуемой контрольной партии. Согласно использованию в данном описании, термин «цитостатический агент» относится к соединению, который оказывает токсичное воздействие на клетки, например, стимулирование некроза клетки, ингибирование роста клеток или клеточного деления или стимулирования апоптоза клетки. Цитотоксичность соединений может происходить из различных свойств, включая, но не ограничиваясь, свойствами антиметаболизма, алкилирования, вставления (интеркалирования) нуклеиновой кислоты или апоптотическими свойствами. Свойства антиметаболита является способностью соединения или его метаболитов вмешаться в синтез биомолекул, таких как ДНК и РНК. Примерами соединений, имеющих свойства антиметаболита, включают аналоги нуклеиновых оснований (например, аналоги пурина и пиримидина), нуклеозид и аналоги нуклеотида и комплексы антифолата. Показательные аналоги нуклеиновых оснований и нуклеозида, которые имеют цитостатические эффекты, включают, но не ограничены, имуран, тиопурины (например, тиогуанин, меркаптопурин), флударабин, пентостатин, 5-фтороурацилы, 6-азаурацил, клофарабин, неларабин, кладрибин, цитарабин, флоксуридин, капецитабин, гемцитабин, азацитидин, и децитабин. Примеры антифолатов включают метотрексат, аминоптерин, пеметрексед, пралатрексат, и ралтитрехед.
Свойство алкилирования является способностью соединения или его метаболитов и проявляется в переносе алкилированных групп биомолекулам или формировании ковалентных связей с реактивными группами в биомолекулах (например, аминопласт, карбоксил, сульфгидрил, и группы фосфата), которые могут инактивировать или вмешаться в их биологическую функцию. Много алкилирующих агентов могут перекрестно сшивать нити ДНК, ослабляя репликацию ДНК, что может привести к индукции апоптоза. Примеры алкилирующих агентов включают азотистые иприты (например, хлорметин, циклофосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, ифосфамид и бусульфан), нитрозомочевину (например, N нитрозо N метилмочевина, кармустин, ломустин, и семустин, фотемустин и стрептозотоцин), тетразины (например, дакарбазин, митозоломид и темозоломид), азиридины (например, тиотепа, митомицин и диазиквон), и цисплатины (например, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин).
Свойство интеркалирования нуклеиновой кислоты является способностью соединения или его метаболитов, вставить в ДНК двойную винтовую спираль, которая может вызвать мутации или вставиться в областях спиральных структур РНК. Примеры вставляющихся агентов включают этидиум бромид, митомицин, актиномицин, пликамицин, антрациклины (например, доксорубицин, дауномицин, эпирубицин, идарубицин, вальрубицин, и митоксантрон), талидомид и блеомицины.
Апоптотическое свойство является способностью соединения или его метаболитов вызвать апоптоз. Одним конкретным классом соединений, которые могут вызвать апоптоз, являются ингибиторы полимеризации тубулина (агенты, оказывающие воздействие на микротрубочки), которые вмешиваются в митоз и приводят к ингибированию клеточного цикла, таким образом вызывая апоптоз. Агенты, оказывающие воздействие на микротрубочки, включают алкалоиды барвинка, такие как винкристин, винбластин, винорелбин, виндезин, винфлюнин и таксаны, такие как паклитаксел и доцетаксел.
Ингибиторы топоизомеразы также являются цитостатическими на основании их способности предотвратить репликацию и транскрипцию ДНК и/или вызывая разрывы нити ДНК, таким образом, вызывая апоптоз. Ингибиторы топоизомеразы включают, но не ограничиваются, иринотекан, топотеан, этопозид, доксорубицин, митоксантрон и тенипозид.
Цитостатический агент, используемый в способах согласно заявленному изобретению, обычно является синтетическим продуктом, полусинтетическим продуктом или естественным химическим соединением. Соединение может обладать одним или более свойствами, описанными выше. Цитостатическое вещество может быть любым из соединений, описанных в данном описании или его метаболитом. В некоторых воплощениях цитостатический агент может быть выбран из флударабина, цитарабина, 5-фторурацила, метотрексата, бусульфана, мелфалана, цисплатина, этидиум бромида, доксорубицина, антрациклинов, талидомида или их сочетания. В определенных воплощениях цитостатический агент, используемый в способах по заявленному изобретению, является флударабином или его активным метаболитом, 9-бета-D-арабинофуранозилом-2-фтораденином (F-Ara-A). В других воплощениях цитостатический агент, используемый в способах по заявленному изобретению, является доксорубицином. Альтернативные цитостатические агенты, обычно известные специалистам в данной области техники, одинаково подходят для использования в способах согласно заявленному изобретению. Например, в некоторых воплощениях, цитостатические агенты замедляют или останавливают прогрессию клеточного цикла и/или вызывают апоптоз клеток. Такие типы цитостатических агентов включают стауроспорин, бендамустин, кармустин, иматиниб и его соли (коммерческое наименование - гливек), Апа-К, гемтузумаб (такие, как гемтузумаб озогамицин, коммерческое наименование - милотарг), азацитидин (коммерческое наименование - вайдаза), децитабин (коммерческое наименование - дакоген), вориностат (коммерческое наименование - золинза), и тапсигаргин, H2O2 и Форбол Ацетат миристат. См. также Перечень НИОТ по противораковым и прочим потенциально опасным лекарственным препаратам в Healthcare Settings 2012, HHS, Publication No. 2012-150 (http://www.cdc.gov/niosh/docs/2012-150/pdfs/2012-150.pdf).
Концентрация цитостатического агента, используемого в способах согласно заявленному изобретению, изменится в зависимости от конкретного цитостатического агента и используемого типа клетки млекопитающих. В воплощениях, в которых флударабин или F-Ara-A являются цитостатическим агентом, агент присутствует в питательной среде в конечной концентрации от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В других воплощениях, в которых доксорубицин является цитостатическим агентом, агент присутствует в питательной среде в конечной концентрации от приблизительно 0.1 мкг/мл до приблизительно 10 мкг/мл.
Цитостатические агенты могут использоваться отдельно или в комбинации 2, 3, 4, 5, 6, или больше агентов. В определенных воплощениях, активность единственной контрольной партии дефибротида может быть измерена путем независимой оценки ее эффекта защиты клетки для двух различных цитостатических агентов. Как пример, первое значение активности контрольной партии дефибротида может быть получено при воплощении способа с первым цитостатическим агентом (например, флударабином), а второе значение активности может быть получено при воплощении способа со вторым цитостатическим агентом (например, доксорубицином). Общая активность контрольной партии дефибротида может быть определена математическим сравнением первого и второго значений активности, например, усредняя эти два значения или вычисляя соотношение двух значений.
В некоторых воплощениях, определенный набор параметров культуры может использоваться, чтобы вызвать цитотоксичность клеток млекопитающих вместо того, чтобы использовать определенный цитостатический агент(ы). Например, способы могут включать клетки млекопитающих, подвергнутые воздействию вызывающей апоптоз питательной среды в присутствии по крайней мере одной концентрации дефибротида, определение жизнеспособности клеток после инкубационного периода и вычисления активности дефибротида на основе измерения жизнеспособности клетки. Вызывающая апоптоз питательная среда может включать среду, имеющую кислый рН (например, рН от приблизительно 2 до приблизительно 6 или от приблизительно 4.5 до приблизительно 6.5) или основной рН (например, рН от приблизительно 7.5 до приблизительно 10 или от приблизительно 8 до приблизительно 9.5). Вызывающая апоптоз питательная среда также включает среду, которая не содержит существенные факторы роста (например, фактор роста фибробласта, фактор роста эпидермиса, фактор роста тромбоцитов), поскольку исключение факторов роста признано индуктором апоптоза. В соответствии с использованием в данном описании, термин «вызывающая апоптоз среда» может также относиться к среде в конкретном диапазоне температур (например, больше, чем 37°С) или диапазоне концентрации кислорода (меньше чем 5%-й кислород), который вызывает апоптоз. Вызывающая апоптоз питательная среда или условия могут быть с готовностью приспособлены специалистом обычной квалификации в данной области техники для конкретного типа клетки млекопитающих, используемого в заявленных способах. УФ или другие типы радиации могут также использоваться, чтобы вызвать апоптоз. В некоторых воплощениях, инкубационный раствор включает, по крайней мере, одну концентрацию дефибротида из контрольной партии при оценке в дополнение к цитостатическому агенту. Концентрация дефибротида из контрольной партии (например, конечная концентрация в содержащей клетки среде) может быть в диапазоне от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 1 мг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 100 мкг/мл, от приблизительно 1.25 мкг/мл до приблизительно 80 мкг/мл, или от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.
В определенных воплощениях проверены множественные концентрации дефибротида из контрольной партии. Например, в одном воплощении, отдельно проверены по крайней мере две различных концентрации дефибротида из контрольной партии. В другом воплощении, отдельно проверены по крайней мере три различных концентрации дефибротида из контрольной партии. В конкретном варианте отдельно проверены по крайней мере четыре различных концентрации дефибротида из контрольной партии. Множественные концентрации дефибротида из контрольной партии предпочтительны в вышеуказанных диапазонах. В некоторых воплощениях множественные концентрации дефибротида из контрольной партии подготовлены последовательным 1:2 растворением маточного раствора.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает тестирование эталонной партии дефибротида одновременно с контрольной партией дефибротида. Эталонная партия дефибротида, как правило, проверяется при различных известных концентрациях дефибротида. Могут быть проверены множественные концентрации эталонной партии дефибротида, в некоторых воплощениях. Как и с множественными концентрациями контрольной партии дефибротида, многожественные концентрации эталонной партии дефибротида могут быть подготовлены последовательным растворением маточного раствора в соответствии с предопределенным коэффициентом разбавления. Концентрации эталонной партии дефибротида находятся предпочтительно в том же самом диапазоне концентрации, что и концентрации контрольной партии дефибротида. Например, концентрации эталонной партии дефибротида (например, конечная концентрация в содержащей клетки среде) могут быть в диапазоне приблизительно от 1 мкг/мл до приблизительно 1 мг/мл, приблизительно от 1 мкг/мл до приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно от 1.25 мкг/мл до приблизительно 80 мкг/мл, или приблизительно от 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.
В некоторых воплощениях способа, по крайней мере, 4 концентрации контрольной партии дефибротида и эталонной партии дефибротида приготовлены с, по крайней мере, 3 репликами для каждой концентрации контрольной партии и эталонной партии.
В определенных воплощениях способы включают позитивный контроль цитотоксичности. Например, клетки млекопитающих инкубируют только с одним цитостатическим агентом (т.е. без какого-либо дефибротида) при тех же самых условиях.
В некоторых воплощениях, способы включают отрицательный контроль цитотоксичности. Например, в одном воплощении, клетки млекопитающих инкубируют в растворе без какого-либо дефибротида или цитостатического вещества при тех же самых условиях. Такие растворы могут содержать среду роста клеток и произвольно любой носитель или растворитель.
В одном конкретном варианте инкубация клеток млекопитающих с цитостатическим агентом с и без дефибротида (эталонная и контрольная партии, позитивный и отрицательный контроль) проводится в многолуночном планшете для микротитрования (например, 96-луночном). Последующее определение жизнеспособности клетки может также быть выполнено в титровальном планшете. В некоторых близких вариантах воплощения лунки титровального планшета покрывают матрицей приклеивания клеток, такой как поли-D-лизин.
Инкубационный период для получения приемлемого ответа по испытаниям может быть оптимизирован относительно цитостатического агента и типа клетки, используемой в способе. Специалист в данной области техники может изменить эти параметры на основе общедоступных сведений.
В определенных воплощениях способов клетки могут инкубировать с цитостатическим агентом и дефибротидом из контрольной и/или эталонной партий в течение периода в пределах от приблизительно 12 до приблизительно 120 часов, от приблизительно 24 до приблизительно 96 часов, от приблизительно 48 приблизительно до 72 часов, или от приблизительно 48 приблизительно до 96 часов. В одном воплощении инкубационный период составляет, по крайней мере, приблизительно 24 часа. В другом воплощении, инкубационный период составляет, по крайней мере, приблизительно 48 часов. Опять-таки, в еще одном воплощении, инкубационный период составляет, по крайней мере, приблизительно 72 часа.
Подходящие условия инкубации для определенных типов клетки млекопитающих могут быть найдены в общих лабораторных руководствах, таких как «Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications)) R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell. Заданные величины для температуры и С02% во время инкубационного периода являются прочими переменными, которые могут быть приспособлены, чтобы оптимизировать ответ по испытанию. Согласно одному воплощению данного изобретения, клетки млекопитающих инкубированы при температуре, в диапазоне от приблизительно 35°С до приблизительно 39°С. В другом воплощении клетки млекопитающих инкубированы при температуре в диапазоне от приблизительно 36°С до 38°С. Согласно дальнейшему аспекту данного изобретения, клетки млекопитающих инкубированы при концентрации CO2 в пределах от приблизительно 0 до приблизительно 10% (об/об), чтобы поддержать оптимальный рН среды для роста клеток. В другом воплощении концентрация CO2 может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 5%. В другом аспекте воплощения способов изобретения жизнеспособность клеток млекопитающих определена после инкубации с цитостатическим агентом и дефибротидом из контрольной партии. Доступны множественные методы оценки клеточной жизнеспособности (см., напр., Assay Guidance Manual, NCBI, 2013, G. Sitta Sittampalam et al. Eds., который можно найти в интернете по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/; Stoddart MJ., Cell viability assays: introduction; Methods Mol Biol. 2011;740:1-6 and Riss et al., ASSAY and Drug Development Technologies, Vol. 2(1): 51-62, 2004, оба из которых включены в ссылочном порядке в данном описании), и каждая из описанных здесь методик носит иллюстративный характер. В некоторых воплощениях, клеточную жизнеспособность оценивают, используя имеющиеся в продаже наборы, напр., Cell Counting Kit 8 (Dojindo Molecular Technology Inc.; Sigma-Aldrich) и выпускаемые компанией Life Technologies (см. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/assavs-for-cell-viability-proliferation-and-function.html) и компанией Thermo Scientific (см. http://www.piercenet.com/product/alamarblue-cell-viabilitv-assay-reagent).
Некоторые подходящие методы для определения жизнеспособности клетки, которые могут использовать со способами изобретения, включают методы оценки мембранной целостности, испытание, измеряющее восстановление или окисление, методы, которые измеряют содержание АТФ в клетках, митохондриальную активность и каспазный анализ. Методы оценки мембранной целостности (например, цитолиз или испытание на мембранное просачивание) включают жизненные методы исключения витального красителя, которые используют трипановый синий, йодид пропидия, эритрозин В или 7-аминоактимицин D, тест на дегидрогеназу лактозы и тест на биомаркеры протеазы. Такие методы обычно включают измерение присутствия внутриклеточных ферментов во внеклеточной среде (например, дегидрогеназы лактозы) или внутриклеточного присутствия мембранных непроницаемых красок как признака поврежденных клеточных мембран.
Окислительно-восстановительные тесты являются типично колориметрическими или флюорометрическими методами, в которых определенные классы соединений (красители/пятна) изменяют цвет или флюоресценцию в результате биохимических реакций, осуществленных живыми клетками. Одним из примеров данных типов испытаний является МТТ-тест, в котором клеточные ферменты оксидоредуктазы уменьшают окрашивание тетразолия МТТ 3-(4,5 диметилтиазол 2 ил) - 2,5-дифенилтетразолий бромида до его нерастворимого формазана, у которого есть фиолетовый цвет. Другие тесно связанные красители тетразолия могут использоваться в подобном испытании, чтобы измерить клеточную жизнеспособность. Таким образом, в определенных воплощениях способов согласно изобретению, жизнеспособность клеток определяют, выполнив колориметрическое испытание на основе восстановления красителей тетразолия. Подходящие красители тетразолия включают 3-(4,5 диметилтиазол 2 ил) - 2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), 2,3-бис-(2 метокси 4 нитро 5 сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилид (ХТТ), 3-(4,5 диметилтиазол 2 ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий (MTS) и растворимые в воде соли тетразолия, такие как WST-1 и WST-8 (2-(2 метокси 4 нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2Н-тетразолий). Такие методы известны в технике и описаны, например, в Mosmann, «Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays,» J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65: 55-63, которые включены в ссылочном порядке в данном описании. Аналогичное окислительно-восстановительное испытание для определения жизнеспособности клеток использует флуоресцентную краску, ресазурин (7 гидрокси 3Н феносказин 3-он 10-оксид). Ресазурин восттанавливается до ярко-красного флуоресцентного резофурина в живых клетках, и таким образом жизнеспособность клетки может быть определена, измерив увеличение флюоресценции в присутствии красителя.
2+
2+
2+
Жизнеспособность клеток можно оценить, измерив изменения во внутриклеточных процессах, таких как изменения во внутриклеточных свободных радикалах (например, реактивные кислородные разновидности, окись азота), свободная концентрация иона (например, Са, Mg, Zn), и мембранный потенциал. Индикаторы флюоресценции для контроля и количественного анализа таких изменений коммерчески доступны из различных источников, например, флуоресцентные реактивы, выпускаемые компаниями Life Technologies и Promega. Одно такое испытание включает использование AM кальцеина, который является клеточно водопроницаемой краской, которая служит субстратом для клеточных эстераз. Ферментативная активность в живых клетках преобразовывает AM кальцеин во флуоресцентный продукт, таким образом, позволяющий определить количества живых клеток при увеличении флюоресценции. Количественный анализ содержания аденозинового трифосфата (АТФ, АТР) также используется в качестве маркера жизнеспособности клетки. Клеточное содержание АТР может быть измерено объемом света, произведенного посредством реакции с использованием фермента люциферазы, например, люминометром. В некоторых воплощениях жизнеспособность клеток может быть измерена вручную, например, путем пересчета живых клеток при помощи подходящих микроскопов или посредством подходящего оборудования, оценив изменение спектральной поглощательной способности/флюоресценции, выбранных из спектрофотометра, спектрофлуориметра, цитометра потока или их комбинации. Другие методы для оценки жизнеспособности клеток известны специалистам в данной области техники и могут быть приняты для использования со способами данного изобретения.
В зависимости от испытания, используемого для оценки жизнеспособности клеток, измерение жизнеспособности клетки может быть изменением в спектральной поглощательной способности или флюоресценции содержащего клетки раствора или среды, процента или количества живых клеток, или процента или количества мертвых клеток. В некоторых воплощениях изменение в спектральной поглощательной способности или флюоресценции может быть преобразовано в процент или количество живых клеток или мертвых клеток. Например, в воплощениях, в которых изменение в цвете или флюоресценция происходят в результате окрашивания или красителя, проникающего через поврежденную клеточную мембрану (например, трипановый синий, эритрозин В или йодид пропидия), увеличение спектральной поглощательной способности или флюоресценции в конкретной длине волны указывает на увеличение количества мертвых клеток. В других воплощениях, в которых изменение в цвете или флюоресценция происходят в результате клеточной реакции (например, МТТ-тест, тест AM кальцеина), количество живых клеток коррелируется с увеличением спектральной поглощательной способности или флюоресценции в конкретной длине волны. Таким образом, в определенных воплощениях методов изобретения, жизнеспособность клеток определяют, измерив спектральную поглощательную способность или флюоресценцию раствора, содержащего клетки млекопитающих после инкубации с цитостатическим агентом и дефибротидом. В одном воплощении жизнеспособность клетки (например, спектральная поглощательная способность или флюоресценция) для каждой концентрации дефибротида из контрольной партии (например, спектральная поглощательная способность/флюоресценция каждой лунки микротитровального планшета, содержащей различные концентрации дефибротида из контрольной типовой партии), измеряют и размещают напротив соответствующей концентрации дефибротида, чтобы создать дозозависимую кривую. В некоторых воплощениях дозозависимая кривая является сигмоидальной кривой (т.е. «S-образной»). Диапазон концентраций дефибротида, которые проверены, может быть расширен, или добавлено дополнительное количество концентраций, чтобы получить сигмоидальную дозозависимую кривую.
Спектральная поглощательная способность или измерения флюоресценции или другие измерения жизнеспособности клеток (например, число или процент живых клеток; например, число или процент мертвых клеток) для каждого из образцов (например, позитивный и отрицательный контроль, эталонная и контрольная партии дефибротида), известные как исходные данные, могут быть обработаны и подвергнуты дальнейшему статистическому анализу. Специальное программное обеспечение может использоваться для статистического анализа, как, например, специально разработанный для оценки биопробы продукт, PLA 2 (Stegmann Systems GmbH, Германия) или, альтернативно, имеющаяся в продаже электронная таблица, настроенная для статистической оценки биологических данных об испытании.
20
В определенных воплощениях способ изобретения включает сравнение жизнеспособности клеток, измеренной для образцов, содержащих контрольную партию дефибротида, с жизнеспособностью клеток, измеренной для эталонной партии дефибротида. В некоторых воплощениях измерения жизнеспособности клеток для эталонной партии дефибротида были получены до анализа контрольной партии дефибротида. Такие предшествующие измерения для эталонных партий дефибротида могут быть сохранены в справочной базе данных или компьютере в удобочитаемом носителе данных. В определенных воплощениях измерения жизнеспособности клеток для эталонной партии представляют среднее число измерений жизнеспособности клеток, полученных из популяции контрольных партий дефибротида. Таким образом, активность контрольной партии дефибротида может быть вычислена на основе измерений жизнеспособности клеток для контрольной партии для сравнения с стандартной калибровочной кривой, полученной из предшествующего анализа эталонной партии дефибротида или популяции партий дефибротида. В других воплощениях измерения жизнеспособности клеток для эталонной партии дефибротида получены в то же время, что и измерения жизнеспособности клеток для контрольной партии дефибротида. Например, серию концентраций контрольной партии дефибротида получают параллельно с серией концентраций для эталонной партии дефибротида. Эталонная партия дефибротида является предпочтительно стандартизированной партией дефибротида, имеющей установленную биологическую активность (например, про-фибринолитическая активность, клеточно-защитная активность). Например, в одном конкретном варианте, у эталонной партии дефибротида есть активность защиты клеток в диапазоне 630-905 единиц/мг. Стандартизированная партия дефибротида может иметь одну или больше следующих характеристик: средняя молекулярная масса от приблизительно 14 до приблизительно к 19 кДа, по результатам эксклюзионной ВЭЖХ, коэффициент экстинкции (е 1%) приблизительно 207-233, коэффициент затухания (Emin/Emax) приблизительно 0.41-0.49, соотношение пурина к пиримидину, больше, чем приблизительно 0.80 (например, от приблизительно 0.80 до приблизительно 1.50), коэффициент молярной экстинкции (ε(Р), относительно фосфора) приблизительно от 7200 до приблизительно 8400, ротационная сила ([α]D°) приблизительно от 45° приблизительно до 60° и обратимый гиперхромизм, обозначенный как % в нативной ДНК (h) от приблизительно 8 до приблизительно 22. В некоторых воплощениях, эталонная партия дефибротида является партией дефибротида, произведенного при условиях GMP для клинического использования. В других воплощениях, эталонная партия дефибротида является коммерческой партией дефибротида, выпускаемого компанией Gentium (Villa Guardia, Italy).
В некоторых воплощениях измерения жизнеспособности клеток для множественных концентраций дефибротида из эталонной партии получены извне, чтобы создать калибровочную кривую. В одном воплощении создание калибровочной кривой включает приобретение (получение) данных о спектральной поглощательной способности, касающихся образцов при известных увеличивающихся концентрациях дефибротида от эталонной партии и статистической обработки этих данных, чтобы получить калибровочную кривую, которая представляет корреляцию между увеличением жизнеспособности клеток в присутствии цитостатического агента и дозой дефибротида. В определенных воплощениях жизнеспособность клеток, измеренную для контрольной партии дефибротида, сравнивают с калибровочной кривой, полученной на основе измерений жизнеспособности клеток с эталонной партией дефибротида, чтобы определить активность контрольной партии дефибротида.
В некоторых воплощениях дозозависимую кривую, полученную на основе данных измерений жизнеспособности клеток от контрольной партии дефибротида, сравнивают с калибровочной кривой, полученной из данных измерений жизнеспособности клеток из эталонной партии дефибротида. В таких воплощениях дозозависимая кривая и калибровочная кривая могут быть сигмоидальными кривыми (см. Фиг. 7, например). Различием между двумя кривыми является функция различия в биологической активности между дефибротидом контрольной партии и дефибротидом эталонной партии. Этим различием является активность контрольной партии дефибротидом по сравнению с эталонной партией. В одном воплощении логистическая модель функции с четырьмя параметрами (4-PL, Европейская Фармакопея, раздел 5.3.2) используют, чтобы определить различие между дозозависимой кривой для контрольной партии дефибротида и калибровочной кривой для эталонной партии дефибротида, чтобы вычислить актвиность контрольной партии дефибротида. В другом воплощении используют логистическую модель функции с пятью параметрами (5-PL, R.A. Dudley et al., "Guidelines for immunoassay data processing," Clin. Chem., 1985, 31: 1264-1271), чтобы определить различие между между дозозависимой кривой для контрольной партии дефибротида и калибровочной кривой для эталонной партии дефибротида и поределить активность контрольной партии дефибротида.
В некоторых воплощениях данные, полученные из измерений жизнеспособности клетки образцов с контрольной партии дефибротида, могут быть оценены для получения дополнительных статистических параметров, чтобы гарантировать достоверность данных. Например, могут потребоваться данные, чтобы удовлетворять определенным статистическим критериям, таким, например, как контролируемым регулирующими органами. Такие тесты могут включать тесты на линейность, параллелизм и линейный регресс на уровне значения, например 0.05, таким образом, чтобы ,  и , соответственно, как описано детально в Европейской Фармакопее, раздел 5.3.2, 2014 и Фармакопее США, Раздел (1034) Analysis of Biological Assays, 2014. Активность контрольной партии дефибротида, вычисленной на основе вышеуказанных статистических методов, может быть выражена как процент эталонной партии дефибротида, защитных единиц активности на вес дефибротида или других единиц, которые могут или могут не быть произвольными. В некоторых воплощениях, дефибротидная единица защиты является концентрацией дефибротида, которая добивается полумаксимальной защиты клеток SK-HEP-1 клеток в присутствии 10 мкг/мл флударабина при заданных режимах испытания. В одном воплощении, активность контрольной партии дефибротида выражена как отношение к активности эталонной партии дефибротида. В определенных воплощениях отношение активности для контрольной партии дефибротида вычислено с использованием следующей формулы:
ref
samp
Соотношение активности = C/C,
ref
где - C - концентрация эталонных материалов дефибротида,
samp
- C - концентрация контрольных материалов дефибротида,
ref
samp
где C и C достигают одинакового действия. Методы оценки активности контрольной партии дефибротида, как описано здесь, могут использоваться в приготовлении фармацевтических составов, включающих дефибротид, для контроля содержания дефибротида в составах, и гарантии содержания в составах точных и устойчивых дозировок. Таким образом, способы изобретения могут использоваться во время производственного процесса, чтобы оценить активность различных партий дефибротида, подготовленного в различных местоположениях различными методами, или из различных источников.
Способы по заявленному изобретению могут также использоваться, чтобы контролировать стабильность партий дефибротида или фармацевтических составов, включающих дефибротид, в течение определенных промежутков времени. Например, активность партии или состава может определяться методами, описанными здесь, периодически во времени (например, ежемесячно, два раза в год, ежегодно) или разово - после воздействия чрезвычайных условий, для контроля активности дефибротида и определения партий или составов, которые ухудшились.
Эти и другие аспекты изобретения будут более подробно проиллюстрированы в следующих примерах, которые не должны, однако, рассматриваться как ограничение сущности заявленного изобретения.
Все патентные и непатентные документы, на которые следуют ссылки в данном раскрытии, включены в ссылочном порядке в своей полноте во всех аспектах.
ПРИМЕРЫ
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
В нижеприведенных Примерах использовали следующие материалы.
Устройство
Планшет-ридер Victor 3, оборудованный различными эмиссионными и абсорбционными фильтрами (Perkin Elmer, Milan, Italy), с ПО Wallac (Perkin Elmer, Milan, Italy).
Одно- и многоканальные пипетки с непрерывной настройкой объема со стерильными наконечниками для молекулярной биологии (Gilson, Milan, Italy). Инкубатор клеток с контролем температуры и СО2 (Thermo Fischer Scientific, Milan, Italy).
Укрытия с ламинарным потоком воздуха модели тканевых культур HERAcell-150 (Thermo Fischer Scientific, Milan, Italy).
Аналитический баланс AX 26 DR (Mettler, Milan, Italy).
Измеритель рН модель 780 (Metrohom Italia, Milan, Italy).
2
Флаконы для клеточных культур, 25 и 75 см, вент кап (Corning Incorporated, NY, USA).
Стерильный, чистый 96-луночный, (не)покрытый поли-D-лизином (Sigma Aldrich, Milan, Italy).
Счетная камера Нойбауэра и оптический микроскоп (Carl Zeiss, Milan, Italy).
Вакуумный блок стерилизации антибактериального фильтра (Sigma Aldrich, Milan, Italy).
Компьютерные программы
Microsoft Excel 2003. (Microsoft Corporation, Redmond, Wash., USA)
PLA 2 (Stegmann Systems GmbH, Germany)
Клетки
Линия капиллярных эндотелиальных клеток человека (НМЕС-1, CDC, Atlanta, GA, USA)
Линия синусоидальных клеток печени человека (SK-HEP-1, АТСС, Manassas, VA, USA)
Реагенты и химические вещества
Дефибротид (Gentium, Italy)
9-бета-D-арабинофуранозил-2-фтораденин, для аналитических целей (Sigma Aldrich, Milan, Italy), со ссылкой как флударабин или F-ara в Фиг. и Примерах далее по тексту.
Доксорубицин, для аналитических целей (Sigma Aldrich, Milan, Italy)
Амфотерицин В (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Диметил сульфоксид (ДМСО, DMSO) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Желатин, 2% в воде, для выращивания тканевых культур (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (D-PBS) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Этанол Абсолют (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Фетальная бычья сыворотка (ФБС, FBS) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Пенициллин-стрептомицин 100Х (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
MTT (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
CCK-8 (Sigma Aldrich, Milan, Italy)
Трипановый синий (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Минимальная эссенциальная среда Игла (ЕМЕМ) АТСС Number: 30-2003 (АТСС Manassas, VA, USA)
n
Олигонуклеотид (АЦГТ) примерно 17 кДа (Sigma Genosys, Milan, Italy)
n
Олигонуклеотид (АЦ) примерно 17 кДа (Sigma Genosys, Milan, Italy)
Глутатион (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Тканевой активатор плазминогена (тАП) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Вода для молекулярной биологии (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
Подготовка среды Роста клеток для SK-HEP-1
Средой роста клеток для SK-HEP-1 была минимальная эссенциальная среда Игла (ЕМЕМ), с добавлением 10% (о/о) из эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1х Пенициллин-Стрептомицина и 1х Амфотерицина В. Из 500 мл среды ЕМЕМ удалили 65 мл и добавили 50 мл FBS, 5 мл 100х концентрата Пенициллин-Стрептомицинового стока и 10 мл 50х, концентрата Амфотерицина В. Среду простерилизовали при помощи блока стерилизации фильтра среды.
Приготовление среды роста клеток для НМЕС-1
Среда роста клеток для НМЕС-1 - среда 1640 RPMI, с добавлением с 10% (о/о) ФБС, 1х Стрептомицин-Пенициллина и 1х Амфотерицина В. От 500 мл RPMI удалили 65 мл и добавили 50 мл ФБС, 5 мл 100х концентрата стока Стрептомицина Пенициллина и 10 мл 50х концентрата Амфотерицина, 2 мМ L-глутамина, 10 мкг/мл гидрокортизона. Среда была простерилизована использованием среднего фильтра стерилизации, и стерильный эпидермального фактора роста добавили к концентрации 10 мкг/мл.
Культивация и приготовление SK-HEP-1
5
5
5
Линию синусоидальных эндотелиальных клеток человеческой печени SK-HEP-1 получили из Американской коллекции клеточных культур (АТСС) и культивировали в полной среде ЕМЕМ о влажном клеточном инкубаторе, содержащем 5%-й CO2 при 37°С, с использованием покрытых желатином флаконов для тканевой культуры. Клетки пересевались установленным разделением трипсина каждые 2-3 дня, следуя инструкциям, предоставленным АТСС. Клетки были последовательно перенесены во флаконы культуры, когда культура была конфлюентна на 80-90% и использованы для испытания защиты между проходами +3 к +10. Таким образом, 3-10 проходов помимо характеризуемого количества прохода клеток получены от АТСС. Суспензию SK-HEP-1 для использования в испытании защиты клетки подготовлени и подсчитали. Вкратце, клетки были промыты с D-PBS, и разделены с использованием 1 мл раствора трипсина и повторно суспендированы в полной среде при концентрации 10, 2×10 или 4×10 клеток/мл. Клетки были посчитаны, используя счетную камеру Нойбауэра в присутствии трипанового синего, чтобы оценить жизнеспособность культур в процентах. У клеточной культуры, используемой в испытании защиты клетки, была жизнеспособность ≥90%.
Культивация и приготовление НМЕС-1
Капиллярная эндотелиальная человеческая клеточная линия (НМЕС-1) была получена из Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и культивирована в полной среде 1640 RPMI в увлажненном клеточном инкубаторе, содержащем 5%-й CO2 при 37°С. Клетки пересевались трипсином, при отделении каждые 2-3 дня и последовательно перенесены в культуральные флаконы, когда культура была конфлюентна на 80-90% и использована для испытания защиты между проходами от +3 до +10.
Суспензия НМЕС-1 для использования в испытании клеточной защиты была подготовлена и просчитана. Вкратце, клетки были промыты с Д-ФСБ, и отделены при помощи 1 мл раствора трипсина и повторно суспендированы в полной среде до клеточной концентрации 105,2×105 или 4×105 клеток/мл. Клетки пересчитали, используя счетную камеру Нойбауэра в присутствии трипанового синего, чтобы оценить жизнеспособность в процентах культур. У клеточной культуры, используемой в испытании защиты клеток, была жизнеспособность ≥90%.
Приготовление стоковых растворов
1. Флударабин
Флакон 10 мг флударабина разбавили с 1 мл диметилсульфоксида, чтобы получить раствор 10 мг/мл и хранили при 4°С. Стоковый раствор разбавили 1:1 с полной питательной средой, чтобы получить рабочий стоковый (основной) раствор 5 мг/мл.
2. Дефибротид
Основной раствор дефибротида был подготовлен в день использования. Приблизительно 100 мг препарата вещества дефибротида были точно взвешены в стерильную трубку на 50 мл и растворили в 20 мл Д-ФСБ, чтобы получить раствор 5 мг/мл. Этот раствор разбавили 1:10 с полной питательной средой, чтобы получить рабочий основной раствор 0.5 мг/мл, используемый для получения серии растворений концентраций.
3. Тканевой активатор плазминогена (тАП)
Содержание двух 10 мкг флаконов тПА (примерно 400,000 МЕ/мг на флакон) растворили в 2 мл Д-ФСБ для получения раствора 4000 МЕ/мл и хранили при -80°С.
4. ACGT олигонуклеотид,
Флакон 1 мг олигонуклеотида ACGT растворили в 2 мл Д-ФСБ для получения раствора 0.5 мг/мл и хранили при 4°С.
5. Глутатион
100 мг глутатиона растворили в 20 мл ФСБ и разбавили 1:10 с готовой питательной средой до конечной концентрации 0.5 мг/мл.
6. Доксорубицин
Флакон 10 мг доксорубицина растворили в 10 мл ДМСО и хранили при - 80°С. Приготовили рабочий раствор путем разбавления в полной среде до 200 мкг/мл.
Высев на планшет
Пятьдесят мкл клеточных суспензий или только среда для пустых лунок, подготовленных при концентрациях, описанных выше, были помещены в микротитровальный планшет с 96 лунками, покрытыми поли-D-лизином. Плашки были помещены в клеточный инкубатор на 3 часа, после чего 50 мкл раствора для испытаний добавили к содержащим клетки лункам. Три или четыре репликатных лунки использовались для каждого экспериментального режима. Например, подготовка растворов, содержащих флударабин в отсутствии или присутствии дефибротида, приведена в Таблице 1. После добавления раствора в лунки, планшет вернули в инкубатор, и оценили клеточную жизнеспособность после 24, 48 или 72 часов. Для исходного измерения, 100 мкл только полной среды добавили в 3-4 репликатных лунках.
(*) конечная концентрация в каждой лунке после добавления 50 мкл клеточной суспензии и 50 мкл обозначенного раствора.
Клеточная жизнеспособность на основе результатов МТТ-теста
После установленного периода инкубации, измерили жизнеспособность клеток в каждой лунке при помощи МТТ-теста. МТТ-тест основан на расщеплении солей тетразолия митохондриальной дегидрогеназой в жизнеспособных клетках, приводя к образованию нерастворимого красителя формазан. Краситель МТТ, 10 мкл 2 мг/мл раствора в Д-ФСБ добавили в каждую лунку, и затем плашки инкубировали в течение 3 часов. Затем плашки центрифугировали и аспирировали каждую лунку. Краситель растворили с 200 мкл смеси Диметилсульфоксида (ДМСО)/Этанола (1:1), и спектральная поглощательная способность в лунках была прочитана на уровне 570-590 нм на микротировальном ридере. Пустая лунка, содержащая только среды и цитотоксический препарат (флударабин или доксорубицин), также использовали как контроль во всех экспериментах.
Клеточная жизнеспособность на основе результатов теста CCK-8
После установленного периода инкубации, измерили жизнеспособность клеток в каждой лунке при помощи набора для подсчета клеток CCK-8 (Sigma Aldrich, Milan, Italy), следуя инструкциям производителя. Анализ основан на сокращении под воздействием дегидрогеназы жизнеспособных клеток растворимой в воде соли тетразолия WST-8 (2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2Н-тетразолий). Восстановленный краситель формазан растворим культуральной тканевой среде. Количество формазана прямо пропорционально количеству жизнеспособных клеток. Чувствительность обнаружения CCK-8 выше, чем других солей тетразолия, таких как МТТ. В отличие от МТТ, не требуется никакой солюбилизаци, и таким образом испытание может быть измерено постоянно.
Вкратце, после указанного времени инкубации, 10 мкл поставляемого реактива добавили к каждой лунке микротировального планшета, который вернули в инкубатор. После 3 часов спектральная поглощательная способность была измерена на уровне 450 нм со второстепенной коррекцией на уровне 590 нм. Спектральная поглощательная способность среднего бланка была исключена из образцов для испытаний.
Пример 1
Данный пример показывает масштаб защитного действия дефибротида в отношении вызванной флударабином цитотоксичности клеток НМЕС-1 при физиологически соответствующих концентрациях флударабина и дефибротида. Клетки НМЕС-1 были выращены согласно вышеупомянутой процедуре. Плотность клеток 500,000 /мл использовали для испытания. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 10 мкг/мл. Дефибротид был добавлен в лунку микропланшета при концентрации 100, 10 или 1 мкг/мл. Четыре реплики каждого режима испытаний были выполнены. Жизнеспособность клеток НМЕС оценили после 72 часов при помощи МТТ-теста, описанного выше. Дефибротид защищал клетки от вызванной флударабином цитотоксичности дозозависимым способом с эффектом защиты больше чем 50%, наблюдаемым при 100 мкг/мл дефибротида. (Фиг. 1)
Пример 2
Данный пример показывает масштаб защитного действия дефибротида в отношении вызванной доксорубицином цитотоксичности клеток SK-HEP-1 при физиологически соответствующих концентрациях доксорубицина и дефибротида.
Клетки SK-HEP-1 были выращены согласно вышеупомянутой процедуре. Плотность клеток примерно 50,000 клеток/мл использовали для испытания. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 0.1 мкг/мл. Дефибротид был добавлен в лунку микропланшета при концентрации 100, 50, 20, 10, 5 или 1 мкг/мл. Три реплики каждого режима испытаний были выполнены. Жизнеспособность клеток оценили после 72 часов при помощи набора для CCK-8 теста, как описано выше. При концентрации 50 мкг/мл или выше, дефибротид значительно защищал клетки SK-HEP-1 от вызванной вызванной доксорубицином цитотоксичности. (Фиг. 2).
Пример 3
Существующий пример сравнивает защитное действие защитного действия в отношении вызванной флударабином цитотоксичности дефибротида и синтетических олигонуклеотидов, имеющих одинаковую среднюю длину и основной состав с дефибротидом.
Клетки НМЕС-1 были выращены согласно вышеупомянутой процедуре. Плотность приблизительно 500,000 клеток/мл использовалась для эксперимента. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 50 мкг/мл. Синтетические олигонуклеотиды (аденин-цитозин (АЦ) приблизительно 16 кДа или аденин-цитозин-гуанин-тимина (АЦГТ) примерно 17 кДа) или дефибротид были добавлены в каждую лунку при переменных концентрациях. В частности, олигонуклеотиды АЦ были добавлены в каждую лунку при концентрации 1, 10,100 или 500, тогда как олигонуклеотиды АЦГТ были добавлены к каждой лунке при концентрации 12.5, 25 или 50 мкг/мл. Дефибротид был добавлен к каждой лунке при концентрации 5, 25, 50, или 100 мкг/мл. Каждый режим обработки был выполнен в трех репликах. Жизнеспособность оценили при помощи МТТ-теста после 24, 48 и 72 часов.
Как показано на Фиг. 3А и 3В, ни олигонуклеотиды АЦ, ни олигонуклеотиды АЦГТ не оказывали никакого защитного эффекта в отношении вызванной флударабином цитотоксичности клеток НМЕС-1 после 72 часов инкубации. Наоборот, дефибротид показал дозозависимую защиту клеток в отношении вызванной флударабином цитотоксичности (Фиг. 3С).
Пример 4
Эксперименты, описанные в этом примере, проверили способность синтетического олигонуклеотида АЦГТ, тАП, и глутатиона защитить SK-HEP-1 клетки от вызванной флударабином токсичности.
Клетки SK-HEP-1 были выращены согласно вышеупомянутой процедуре. Плотность приблизительно 50,000 клеток/мл использовалась для эксперимента. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 10 мкг/мл. Случайный синтетический олигонуклеотид (ACGT), тАП, или глутатион добавили в каждую лунку при переменных концентрациях. В частности, олигонуклеотид АЦГТ или глутатион добавили в каждую лунку при концентрации 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, или 80 мкг/мл, тогда как тАП был добавлен при концентрации 10, 20, 40, 80, 160, или 320 МЕ/мл. Каждый режим обработки был выполнен в трех репликах. Жизнеспособность оценили при помощи комплекта для CCK-8 теста после инкубации 72 часов. Не наблюдали какую-либо защиту SK-HEP-1 клеток от вызванной флударабином токсичности ни с одним из трех соединений (Фиг. 4).
Пример 5
Данный пример оценивает защитное действие в отношении вызванной флударабином цитотоксичности дефибротида, который был изменен в результате физико-химических нагрузок.
Образцы дефибротида подвергли напряжениям, подвергнув стандартный образец дефибротида или 1) кислотному напряжению или 2) основному напряжению. Кислотное напряжение включало инкубацию стандартного образца дефибротида в фосфатном буфере, имеющем рН приблизительно 3 при примерно 80°С в течение 18 часов. Основное напряжение включало инкубацию стандартного образца дефибротида в фосфатном буфере, имеющем рН приблизительно 12 в приблизительно 80°С в течение 18 часов. После инкубационного периода растворы были приведены в нейтральное состояние с фосфорной кислотой или гидроокисью натрия.
Клетки SK-HEP-1 были выращены согласно вышеупомянутой процедуре. Плотность приблизительно 50,000 клеток/мл использовалась для эксперимента. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 10 мкг/мл. Стандартный образец дефибротида (неизмененный), дефибротид, подвергнутый кислотному напряжению или дефибротид, подвергнутый основному напряжению, был добавлен в каждую лунку при концентрации 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, или 1.25 мкг/мл. Каждый режим обработки был выполнен в трех экземплярах. Жизнеспособность клеток была оценена с комплектом для CCK-8 теста после инкубации 72 часов. Дозозависимые кривые были построены для неизмененного дефибротида, подвергнутого кислотному напряжению дефибротида или подвергнутого основному напряжению дефибротида. Сравнение дозозависимых кривых представлено на Фиг. 5. Подвергнутые кислотному и основному напряжению образцы дефибротида были менее активными, чем неизмененный дефибротид при защите SK-HEP-1 клеток от вызванной флударабином цитотоксичности (Фиг. 5).
Пример 6
Данный пример показывает масштаб защитного действия дефибротида в отношении вызванной флударабином цитотоксичности SK-HEP-1 клеток при физиологически значимых концентрациях дефибротида и флударабина. Клетки SK-HEP-1 были высеяны согласно вышеупомянутой процедуре, при концентрации 50,000 клеток/мл, в покрытом поли-D-лизином 96-луночном микропланшете. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 10 мкг/мл. Дефибротид был добавлен в каждую лунку при концентрации 100, 50, 40, 20, 10, 5 или 1 мкг/мл. Каждый режим обработки прогнали в 4 репликах лунок. Жизнеспособность оценили после 72 часов инкубации с комплектом для CCK-8 теста. Дефибротид показывал дозозависимую защиту клетки от вызванной флударабином цитотоксичности у более, чем 80% клеток, выживающих с концентрациями дефибротида 40 мкг/мл или более (Фиг. 6).
Пример 7
Данный пример показывает применение клеточного испытания защиты для оценки активности образца дефибротида неизвестной биологической активности. Клетки SK-HEP-1 были выращены согласно вышеупомянутой процедуре. Клетки были высеяны при концентрации примерно 50,000 клеток/мл, в покрытом поли-D-лизином 96-луночном микропланшете Клетки были покрыты металлом в плотности клетки приблизительно 50,000 камер/мл на микроплашках, покрытых поли-D-лизином. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 10 мкг/мл. Эталонный стандарт дефибротида и образец для испытаний дефибротида были добавлены, чтобы отделить лунки при концентрации 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, или 1.25 мкг/мл. Четыре реплики лунок использовали для каждого экспериментального режима. Жизнеспособность клеток была оценена с комплектом для CCK-8 теста после 72 часов инкубации.
Спектральные поглощательные способности, измеренные для эталонного стандарта дефибротида и образца для испытаний дефибротида, были подвергнуты логистическому анализу функции с 4 параметрами. Таким образом, дозозависимые кривые эталонного стандарта дефибротида и образца для испытаний дефибротида могут быть описаны логистической функцией с 4 параметрами:
The potency ratio for the defibrotide test sample was 1.157 (Figure 7). Где, υ - ответ, α является верхней асимптотой, δ является более низкой асимптотой, β является наклонным фактором, и γ является горизонтальным местоположением типовой кривой на оси X. Активность образца дефибротида для испытаний была определена путем вычисления отношение активности в сравнении с эталонным стандартом дефибротида. Соотношение активности образца дефибротида для испытаний составляло 1.157 (Фиг. 7).
Пример 8
Существующий пример оценивает точность определения активности дефибротида, основанного на клеточном способе испытания защиты. Активность того же самого образца дефибротида для испытаний была измерена, в сравнении с эталонным стандартом дефибротида, в повторяемых испытаниях различными лаборантами, используя различные партии подходящей среды, партии клеток и пипеточные устройства.
Клетки SK-HEP-1 были выращены согласно вышеупомянутой процедуре. Клетки были высеяны при клеточной плотности приблизительно 50,000 клеток/мл на микроплашках, покрытых поли-D-лизином. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 10 мкг/мл. Эталонный стандарт дефибротида и образец для испытаний дефибротида были добавлены, чтобы отделить лунки в том лее самой серии концентраций, как описано в Примере 7. Четыре реплики лунок использовали для каждого экспериментального режима. Жизнеспособность клеток была оценена с комплектом для испытаний CCK-8 после 72 часов инкубации. Спектральные поглощательные способности, измеренные для каждой лунки в каждом пробеге испытания, подвергались логистическому анализу функции с 4 параметрами, и отношение активности дефибротида в сравнении с эталонным стандартом дефибротида было рассчитано согласно Примеру 7. Отношение потенции того же самого образца для испытаний дефибротида в каждом пробеге испытания представлено в Таблице 2. В отличие от измерений активности различными лаборантами при переменных условиях, показанных в Таблице 2, у испытания есть верхний уровень точности (относительное среднеквадратичное отклонение в % 7.8) и низкий порог < 3%.
Пример 9
Данный пример показывает сравнение активности на основе результатов испытания на клеточную защиту для трех различных партий дефибротида и дефибротида эталонного стандарта.
Клетки SK-HEP-1 были выращены согласно вышеупомянутой процедуре. Клетки были высеяны при клеточной плотности приблизительно 50,000 клеток/мл в покрытых поли-D-лизином микроплашках. Цитостатический агент - флударабин - при концентрации 10 мкг/мл. Эталонный стандарт дефибротида и различные образцы дефибротида для испытаний из трех отдельных партий были добавлены, чтобы отделить лунки при концентрации 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, или 1.25 мкг/мл. Четыре реплики - лунки использовали для каждого экспериментального режима. Жизнеспособность клеток была оценена с комплектом для тестов CCK-8 после 72 часов инкубации.
Спектральные поглощательные способности, измеренные для каждой лунки, были подвергнуты логистическому анализу функции с 4 параметрами, и вычислено соотношение активности для каждой партии дефибротида, как описано в Примере 7. Соотношение активности относительно стандарта дефибротида, каждого из образцов дефибротида для испытаний из трех партий представлено в Таблице 3.
Подразумевается, что раскрытое изобретение не ограничено описанными конкретной методологией, протоколами и материалами, поскольку таковые могут измениться. Также подразумевается, что используемая здесь терминология предназначена для описания конкретных вариантов, но не ограничивая объем данного изобретения, которое охвачено только прилагаемой Формулой. Специалисты в данной области техники признают или будут в состоянии установить использование как обычное экспериментирование, во многих эквивалентах - определенных воплощений заявленного изобретения. Такие эквиваленты охвачены Формулой.
Пример 10
Представляется полезным добавить экспериментальные данные, непосредственно сравнивающие способ согласно заявленному изобретению со способом согласно D3.