Биохимические маркеры в водной экотоксикологии

БИОХИМИЯ

УДК 574:502 Н. В. Кулёва

БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ВОДНОЙ ЭКОТОКСИКОЛОГИИ

Задачей экотоксикологии, в отличие от гигиенической токсикологии, является изучение вредного воздействия химических веществ не только на человека, но и на другие виды организмов на различных уровнях организации — от молекулярного уровня до уровня экосистем. При этом большое внимание уделяется оценке риска для видов, не являющихся непосредственной мишенью целенаправленного применения этих соединений человеком, например влиянию пестицидов на птиц. Поэтому для оценки используются такие реакции изучаемых организмов, с помощью которых можно количественно судить о вызванных химическими веществами изменениях и/или токсическом эффекте — биомаркеры.

В качестве биомаркеров рассматривают реакции живых систем на уровнях от молекул до организма. Все биомаркеры можно разделить на две группы: биомаркеры воздействия, которые показывают наличие вещества в системе, и биомаркеры токсического эффекта, демонстрирующие степень вредного воздействия этого вещества [7].

Преимущество использования биомаркеров по сравнению с физико-химическим мониторингом состоит в возможности показать, находится ли рассматриваемый организм в пределах физиологической нормы или уже вышел за ее пределы.

При оценке качества окружающей среды ценными являются и специфические биомаркеры, демонстрирующие действие определенного поллютанта, и неспецифические, позволяющие оценивать состояние организма и экосистемы, в которой он находится.

Молекулярные биомаркеры представляют собой реакции определенных мишеней действия химических веществ в организме, например, системы их детоксикации (цитохром Р450, глутатионтрансфераза), системы их связывания (металлотионеины), нервной системы (ацетилхолинэстераза) или белковых компонентов клетки (белки теплового шока).

Загрязнение водной среды тяжелыми металлами, перекисями, хлорорганическими соединениями и хинонами может приводить к окислительному стрессу у водных организмов. В процессе биотрансформации ксенобиотиков (впрочем, как и в ходе нормального метаболизма) электроны могут передаваться молекуле кислорода, придавая ей большую реактивность. Так возникают активные формы кислорода (АФК). К ним

© Н. В. Кулёва, 2010

прежде всего относятся анион супероксида (О*-), гидроксильный радикал (ОН*) и перекись водорода (Н2О2). Попадание ксенобиотиков в организм увеличивает возможность образования АФК. АФК образуются при передаче электронов кислороду гербицидом паракватом и нитроароматическими соединениями, а также при взаимодействии полихлорированных бифенилов (PCB) с цитохромом Р450 [1].

В клетке имеются защитные ферменты для детоксикации АФК, такие как суперок-сиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT) и разнообразные пероксидазы (PX). Индукция этих ферментов при попадании в организм ксенобиотиков может рассматриваться как биохимический маркер экспонирования организма с поллютантом. Однако мощность этой защитной системы не всегда оказывается достаточной, чтобы ликвидировать те АФК, которые образовались в результате действия органических поллютантов. Тогда возникает состояние организма или клетки, называемое окислительным стрессом.

Показателем наступления окислительного стресса является усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ), которое в конечном итоге может приводить к нарушению структуры и функционирования биологических мембран. Степень ПОЛ — биохимический маркер процесса окислительного стресса и, следовательно, действия ксенобиотика, вызвавшего этот стресс. Как правило, степень ПОЛ выражают в концентрациях одного из конечных его продуктов — малонового диальдегида (MDA).

Биомаркеры загрязнения водных систем, определенные в тканях двустворчатых моллюсков, представлены в табл. 1. Помимо уже упоминавшихся биомаркеров CAT, SOD, PX и MDA, в таблице приведены ферменты глутатионредуктаза GRd, диафораза DT-d и глутатионтрансфераза GST. Первые два фермента имеют отношение к первой фазе биотрансформации ксенобиотиков, связанной с их окислением, а GST — ко второй, на которой происходит конъюгация ксенобиотиков с эндогенными веществами.

В качестве биомаркера также используют содержание восстановленного глутатиона GSH, так как баланс между окисленным и восстановленным глутатионом является основой для поддержания окислительно-восстановительного потенциала клетки.

Таблица 1. Биомаркеры окислительного стресса у двустворчатых моллюсков

Загрязнитель Моллюск Биомаркеры

Полихлорированные ароматические углеводороды (РАН) Perna viridis Mytilus edulis Saccostrea cucullata SOD, CAT, GPx, DTd, GSH, MDA SOD, CAT CAT, SOD, GPx, DT-d

РАН и полихлорированные бифенилы Mytilus galloprovinciales Unio tumidis SOD, SeGPx, CAT GRd, SeGPx, GPx, GSH, CAT, SOD, MDA

Смешанное загрязнение Crassostrea virginica Dreissena polymorfa Mytilus galloprovinciales Mytilus edulis GSH, MDA, стабильность лизосом MDA, DNA CAT, DT-d, SOD SOD, GPx, GST

Металлы Mytilus galloprovinciales GRd, SeGPx, GPx, CAT SOD, GSH, MDA

Как уже было отмечено, АФК реагируют и с белками, а поскольку белки в клетке представлены в значительно большей степени, чем липиды, то окислительные модификации белков, такие как карбонилирование, глутатионилирование, убиквитинирование, могут быть разноплановыми биомаркерами загрязнения. Некоторые из этих модификаций приводят к инактивации белков, другие защищают их структурную целостность, третьи рассматриваются как клеточные сенсоры изменений в окислительно-восстановительном статусе клетки.

Глутатионилирование представляет собой обратимое образование смешанных дисульфидов между С8И- и 8И-группами цистеина в белках. Это защитная стратегия, чтобы замаскировать сульфгидрильные группы до тех пор, пока клетка не преодолеет окислительный стресс. Показано, что основной мишенью глутатионилирования является цитоскелетный белок актин, что, по-видимому, позволяет цитоскелету «чувствовать» измененный окислительно-восстановительный статус клетки. При этом актин также может регулировать синтез белка, так как он ингибирует участие факторов элонгации в этом процессе. Таким образом, возникает возможность связи между синтезом белка, состоянием цитоскелета и окислительно-восстановительным статусом клетки.

Карбонилирование связано с появлением в аминокислотных остатках боковых цепей белков кетонных групп =С=0. Это может приводить к агрегации, инактивации или деградации белков. У мидии ШуШив вйиНв экспонирование с ионами меди индуцирует карбонилирование белков в пищеварительной железе. Облучение ШуШив вйиНв и Вавтт 1иртив вызывало тканеспецифическое карбонилирование, которое можно измерить количественно посредством спектрофотометрии или иммуноблоттинга электро-фореграмм на полиакриламидном геле (см. обзор [2]).

В работе ирландских ученых [3] белки жабр и пищеварительных желез мидий из контрольных и загрязненных местообитаний были исследованы посредством двухмерного электрофореза, и он не показал каких-либо различий в экспрессии белков. Однако иммуноблоттинг этих электрофореграмм с антителами к динитрофенолу, взаимодействующему с карбонильными группами, показал значительное усиление карбонилиро-вания белков жабр и пищеварительных желез мидий из загрязненного района. Таким образом, биомаркеры типа карбонилированных белков могут с успехом применяться даже в полевых исследованиях.

Еще одна окислительная модификация белка — убиквитинирование. Присоединение убиквитина делает поврежденные или короткоживущие белки доступными для протео-лиза в 208-части 268-протеасомы. В 208-частицах происходит деградация тех окисленных белков, для которых 268-комплекс является неактивным. Убиквитин — это высококонсервативный белок, который относительно недавно был обнаружен в моллюсках. В работе ирландских ученых [4] было показано, что такие модельные поллютанты, как менадион и хлористый кадмий, значительно и специфически стимулируют убиквитини-рование белков у ШуШив вйиНв. На других видах мидий было показано, что этот процесс стимулирует нефть и повышение температуры. Итак, вполне возможно использовать данный показатель в полевых исследованиях хронических эффектов поллютантов. Он является чувствительным и специфическим маркером раннего ответа на оксидативный стресс у двустворчатых моллюсков.

Таким образом, биохимические показатели, особенно новые маркеры, такие как окислительные модификации белков на профиле их экспрессии, самые чувствительные показатели загрязнения водных систем. Повышение активности ферментов, выполняющих в организме роль антиоксидантного буфера (супероксиддисмутаза, ка-талаза, пероксидаза), также является биомаркером, отражающим переход к состоянию адаптации организма к присутствующим в окружающей среде загрязняющим веществам. Срыв адаптации в результате невозможности преодоления организмом окислительного стресса приводит к патологическим изменениям в органах и тканях, сопровождающихся окислительными модификациями белков, в том числе усилением карбонилирования, которое приводит к агрегации и распаду белков. Поэтому усиление карбонилирования белков соответствует стадии нарушения функционирования органов и тканей. Именно такое состояние актина из мышц ноги беломор-

ской мидии Mytilus edulis наблюдали при действии in vivo хлорида меди концентрации 5 мг/л [6].

Эффект токсических агентов на живые системы является результатом множественных взаимодействий на организменном, клеточном и молекулярном уровнях. Хотя есть тенденция изучать какой-то отдельный механизм токсичности как единственно возможный (и следить по изменению одного биомаркера), на самом деле, токсичность состоит в последовательном или одновременном повреждении нескольких метаболических путей на организменном, клеточном и молекулярном уровнях. Поэтому для оценки токсичности поллютанта лучше использовать набор биомаркеров [1].

С возникновением технологии протеомики появилась надежда, что сложности механизма действия токсических агентов можно будет осознать более всеобъемлющим образом. Для получения такой информации используется последовательный ряд операций (табл. 2), который в конечном итоге позволяет идентифицировать различные белки-мишени того или иного поллютанта [5].

Таблица 2. Общая схема реализации протеомного подхода в токсикологии

№ п/п Операция Краткое описание методических приемов

1 Сбор и приготовление образцов Различные приемы солюбилизации белков изучаемого объекта. Использование тиомочевины, CHAPS, сульфо-бетаина, тритона Х-114 и других детергентов, а также различных ингибиторов протеиназ

2 Фракционирование белков посредством двухмерного электрофореза I стадия — изоэлектрофокусирование на полиакриламидном геле. Использование различных вариантов иммоби-линов, создающих на полосках полиакриламидного геля иммобилизованный градиент pH (IPG) II стадия — электрофорез разделенных изоэлектрофокусированием белков во II направлении на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия

3 Детекция белков на двухмерной электрофореграмме Окраска белковых пятен Кумасси R-250, серебрением, другими красителями или авторадиография

4 Сопоставление двухмерных белковых карт при различных воздействиях на объект исследования Использование компьютерного анализа изображений. Выявление изменений в белковых картах при воздействии токсикантов

5 Идентификация белков, экспрессия которых изменилась под действием токсикантов Масс-спектрометрия трипсиновых переваров вырезанных из геля и экстрагированных белковых пятен. Использование компьютерных баз данных в Интернете (Swis-sProt, NCB I и др.) Микросеквенирование. Иммуноблот-тинг

На первом этапе все белки или максимально возможные, содержащиеся в изучаемом образце, подвергаются солюбилизации и становятся объектами анализа. Следующим этапом является фракционирование полученной белковой смеси по двум независимым друг от друга физико-химическим свойствам полипептидных цепей, отражающих особенности их первичной структуры: изоэлектрической точке в горизонтальном направлении и молекулярной массе — в вертикальном. На следующем этапе отдельные белковые фракции визуализируются на геле с помощью высокочувствительных методов детекции белков.

Сравнивая с помощью специальных фотосистем соответствующие пятна белков в контроле и при действии поллютанта, выявляют профиль изменений, вносимых пол-лютантом. Это и есть так называемый биомаркер-паттерн, характеризующий действие данного поллютанта. В ряде случаев этот этап является завершающим.

Но для того, чтобы понять механизм действия поллютанта, производят идентификацию измененных белков методом масс-спектрометрии (см. табл. 2).

Как уже упоминалось вначале, экотоксикология как природное расширение токсикологии интегрирует понятия экологической химии, токсикологии и экологии. Она служит для предсказания эффектов потенциально опасных соединений на экосистемы и виды, не являющиеся мишенью их действия. Именно экотоксикология должна показать возможность применения протеомики для видов, не являющихся мишенями целенаправленного использования химических соединений человеком.

Так же как и в отношении токсикологии, цель применения протеомики в экотоксикологии состоит в раскрытии механизмов, лежащих в основе действия поллютантов и идентификации новых возможных биомаркеров. Следовательно, применение протеомики в экотоксикологии представляет по сути биомаркерный подход. В отличие от традиционной экспериментальной биологии и биохимии этот подход не основывается на гипотезе. Биомаркер здесь — это взаимосвязанный набор белков, проявляющихся одновременно, так называемый биомаркер-паттерн [5]. Такой паттерн изменений экспрессии потенциально может нести информацию по следующим вопросам:

1) характеристика относительных функций генов и их продуктов с одинаковыми профилями активности или общими механизмами регуляции;

2) использование для определения соединений с одинаковым механизмом действия по их токсикологическим «отпечаткам пальцев»;

3) выявление различных уровней стресса, объединяя общие (неспецифические) и высокоспецифические маркеры в одном определении, т. е. показать, испытывает ли организм стресс, какие соединения отвечают за этот стресс и насколько серьезным может быть это состояние.

Таким образом, невероятное количество информации молекулярного уровня, которое может быть получено от применения технологий протеомики, должно привести к переходу от использования одиночных экотоксикологических биомаркеров к комплексным мультимаркерным протеомным панелям.

Литература

1. Еропкин М. Ю., Кулева Н. В. Биохимические методы в токсикологии и экотоксикологии. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2008. 104 с.

2. Manduzio H., Rocher B., Durant F., Galap C., Leboulenger F. The point about oxidative stress in mollusks // ISJ. 2005. Vol. 2. P. 91-104.

3. McDonagh B., Sheehan D. Redox proteomics in the blue mussel Mytilus edulis; Carbonylation is not a pre-requisite for ubiquitination in acute free radical-mediated oxidative stress // Aquat. Toxicol. 2006. Vol. 79. P. 325-333.

4. McDonagh B., Tyler R., Sheehan D. Carbonylation and glutathionylation of proteins in the blue mussel Mytulis edulis detected by proteomic analysis and Western blotting: Actin is target of oxidative stress // Aquat. Toxicol. 2005. Vol. 73. P. 315-326.

5. Мonsinjon T., Knigge T. Proteomics applications in ecotoxicology. Proteomics 2007. Vol. 7. P. 2997-3009.

6. Vikhoreva N., Vikhorev P., Fedorova M., Hoffmann R., Mansson A., Kuleva N. V. The in vitro motility assay parameters of actin filaments from Mytilus edulis exposed in vivo to copper ions // Archives Biochem. Biophys. 2009. Vol. 491. P. 32-38.

7. Walker C. H., Hopkin S. P., Sibly R. M., Peacoll A. H. Principles of Ecotoxicology. Taylor and Frensis, 1996. 398 p.

Статья поступила в редакцию 3 декабря 2009 г.