СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИГМАСТ-4-ЕН-3-ОНА ИЗ БЕТА-СИТОСТЕРОЛА
METHOD OF PRODUCING STIGMAST-4-EN-3-ONE FROM BETA-SITOSTEROL

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении лекарственного препарата на основе стигмаст-4-ен-3-она-продукта биотрансформации β-ситостерола.
Уровень техники
Известно, что продукты микробиологической трансформации стеролов растительного и животного происхождения: андрост-4-ен-3,17-дион, андроста-1,4-диен-3,17-дион - ключевые интермедиаты синтеза лекарственных стероидных препаратов (эстрогенов и анаболических стероидов, в частности). Разработаны эффективные биотехнологические способы получения данных соединений на основе стеролов при использовании высоких концентраций исходных субстратов (см. Патент РФ №2039824, 1995). В качестве продуктов биоконверсии стеролов получены также 9α-гидрокси-производные (см. US Patent 5.298.398, 1994), сложные эфиры стеролов (см. US Patent 7078544, 2006), прегнановые производные (см. US Patent 4.212.940, 1980), тестостерон и продукты его окисления (см. CN Patent 1670185, 2005). При исследовании биологической активности среди оксигенированных метаболитов стеролов выявлены вещества с противовирусным, гипохолестеринемическим и спазмолитическим действием.
Как правило, в качестве катализаторов процесса биотрансформации стеролов используют представителей рода Mycobacterium. Исследована также способность к биотрансформации стеролов бактерий родов Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus. Наиболее близкими к настоящему изобретению являются работы в области исследований, касающихся сравнительной оценки продукции и особенностей каталитической активности микробной холестеролоксидазы родококков (см. Kreit J., Lefebvre G., Germain P. Extracelullar cholesterol oxidase from Rhodococcus sp. cells // J. Biotechnol. - 1992. - V.24. - P.177-188; см. Kreit J. Lefebvre G., Germain P. Membrane-bound cholesterol oxidase from Rhodococcus sp. cells II J. Biotechnol. - 1994. - V.33. - P.271-282). При этом поиск оптимальных условий направленной конверсии образования β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он - продукт холестеролоксидазной реакции не описан. Вместе с тем, стигмаст-4-ен-3-он используется в качестве лекарственного средства при лечении андроген зависимых заболеваний (см. US Patent 5264428, 1993), а также проявляет гипогликемическое действие (см. Alexander-Lindol R.L., Morrison E.Y.S.A., Muraleedharan G.N. Hypoglycaemic effect of stigmast-4-еn-3-оnе and its corresponding alcohol from the bark of Anacardium occidentale (Cashew) // Phytother. Res. 2004. V.18. P.403-407).
Известен способ получения стигмаст-4-ен-3-она в качестве продукта биотрансформации 5 г/л β-ситостерола (60% чистоты), при этом его выход не превышает 40% (см. Kreit J. Lefebvre G., Germain P. Membrane-bound cholesterol oxidase from Rhodococcus erythropolis // J. Biotechnol. - 1994. - V.33. - P.271-282).
Относительно невысокий выход стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола обусловлен снижением уровня каталитической активности холестеролоксидазы в отношении β-ситостерола по сравнению с холестеролом, а также низкой растворимостью β-ситостерола в водной среде.
Раскрытие изобретения
Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке эффективного биотехнологического способа получения стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в проведении селективной конверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он; увеличении степени образования стигмаст-4-ен-3-она при использовании высоких концентраций β-ситостерола; возможности масштабирования процесса.
Для достижения технического результата предлагается заявляемый способ получения стигмаст-4-ен-3-она, предусматривающий биотрансформацию β-ситостерола с помощью штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1901 в среде ферментации, содержащей н-гексадекан и пальмитиновую кислоту, при этом β-ситостерол вносят в среду ферментации в виде смеси с β-циклодекстрином 1:1 в растворе Твина-80. Штамм хранится в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768, www.iegm.ru/iegmcol). В результате осуществления заявляемого способа достигается максимальная степень образования стигмаст-4-ен-3-она. Общий выход целевого продукта после выделения составляет 89,2% от теоретического. Такие показатели возможны в связи с тем, что технология способа допускает использование высоких концентраций β-ситостерола, а также в связи с тем, что субстрат находится в среде в виде смеси с β-циклодекстрином в растворе Твина.
Осуществление изобретения
Предлагаемый способ получения стигмаст-4-ен-3-она заключается в следующем: β-ситостерол трансформируют при участии штамма R. erythropolis ВКПМ АС-1901 в условиях добавления 0,15 г/л пальмитиновой кислоты и 2,5 г/л н-гексадекана. При этом β-ситостерол добавляют в среду ферментации в виде смеси с β-циклодекстрином и Твином-80. Разработанный способ позволяет существенно повысить уровень конверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он (свыше 90%) и концентрацию трансформируемого стерола.
2
4
2
4
Продукты биотрансформации β-ситостерола экстрагируют 3-х-кратным объемом этилацетата, объединенные этилацетатные вытяжки выдерживают над обезвоженным NaSO. Образование стигмаст-4-ен-3-она регистрируют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). При анализе методом ТСХ аликвоты экстракта (5-20 мкл) наносят на ТСХ-пластины с флуоресцентной добавкой "Merck" (Германия) 4×8 см на расстоянии 10 мм от края. После нанесения пластины помещают в хроматографическую камеру, содержащую смесь петролейный эфир (60-80°C): этилацетат (объемное соотношение 7:3). После прохождения фронта растворителя пластину вынимают, подсушивают на воздухе. Присутствие продуктов биотрансформации оценивают путем сравнения хроматографической подвижности (Rf) с образцами стандартов, при этом образование стигмаст-4-ен-3-она определяют с помощью УФ облучателя LG/58 (Россия), остаточный β-ситостерол регистрируют после опрыскивания 5% HSO и последующего прогревания пластины при 95-100°C в течение 2-3 мин. Качественное и количественное содержание продуктов реакции определяют с помощью метода хромато-масс-спектрометрии (ХМС) на газовом хроматографе Agilent 6890N фирмы "Agilent technology" (США) и кварцевой капиллярной колонки RTX-5MS "United Instruments" (Австралия) с внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м с предколонкой 5 м (неподвижная фаза - 5% фенилполисилфениленсилоксан; газ-носитель - гелий), при этом в качестве детектора используют квадрупольный масс-спектрометр Agilent MSD 5973N производства фирмы "Agilent technology" (США). ХМС анализ 1 мкл 0,1% раствора смеси продуктов биотрансформации в этилацетате проводят при температуре испарителя и интерфейса 280°C; начальной температуре термостата 50°С, с выдержкой в изотермическом режиме 5 мин, с последующим нагреванием до 280°C со скоростью 15 град/мин и выдержкой в изотермическом режиме в течение 25 мин; объемная скорость газа-носителя - 1,0 мл/мин. Содержание стигмаст-4-ен-3-она в г/л определяют с помощью калибровочной кривой, для получения которой используют растворы в этилацетате 0,25; 0,5; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0 мг/мл стигмаст-4-ен-3-она. В связи с тем, что молекулярная масса исходного субстрата и продукта отличаются незначительно (412,7 и 414,7 соответственно), уровень биоконверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он в экспериментах по подбору оптимальных условий образования 4-ен-3-онового соединения выражают в процентах от суммарного веса продуктов биотрансформации стерола. В экспериментах по выделению стигмаст-4-ен-3-она выход целевого продукта рассчитывают в процентах, исходя из молярного соотношения β-ситостерола и стигмаст-4-ен-3-она в сумме продуктов реакции, при этом учитывают 85,7%-ную чистоту исходного β-ситостерола.
Способ иллюстрируют 3 примера.
Пример 1.
3
2
4
2
4
4
2
Процесс биоконверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он проводят с использованием культуры R. erythropolis ВКПМ АС-1901 в течение 5 сут. в среде следующего состава: (г/л): KNO - 1,0; KHPO - 1,0; KHPO - 1,0; NaCl - 1,0; MgSO - 0,2; CaCl - 0,02 в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке (150 об/мин) при 28°C в течение 5 сут. В ростовую среду дополнительно вносят 0,15 г/л пальмитиновой кислоты и 2,5 г/л н-гексадекана. β-Ситостерол (0,5; 1,0; 1,5 или 2,0 г/л) добавляют в виде растворов в 5, 10, 15, или 20 мл изопропанола или Твина-80, соответственно. Максимальная (47-49,5%) степень образования стигмаст-4-ен-3-она достигается в присутствии Твина-80 в условиях добавления 1,5-2,0 г/л β-ситостерола.
Пример 2.
Способ осуществляют по примеру 1. β-Ситостерол вносят в концентрациях от 4,0 до 10 г/л в виде смеси с β-циклодекстрином (1:1) в 80-200 мл 1,2% водного раствора Твина-80. При добавлении в ростовую среду 6,0 г/л β-ситостерола достигается максимальный уровень конверсии стерола, при этом содержание стигмаст-4-ен-3-она в смеси продуктов реакции составляет 89,5-93,4%.
Пример 3.
3
2
4
Способ осуществляют по примеру 2. β-Ситостерол вносят в концентрации 6,0 г/л. После удаления растворителя из этилацетатного экстракта, сумму продуктов биотрансформации β-ситостерола ацилируют. Для этого 6 г смеси продуктов биотрансформации растворяют в 10,0 мл пиридина и 2,5 мл уксусного ангидрида и выдерживают в течение 20 ч при комнатной температуре. Далее реакционную смесь растворяют в 350 мл этилацетата, переносят в делительную воронку и последовательно обрабатывают: 600 мл воды, 300 мл 10% раствором HCl, 300 мл насыщенными растворами NaHCO и NaCl. Полученный этилацетатный экстракт сушат над NaSO (безвод.). Колоночную хроматографию под давлением проводят с использованием круглодонной колбы с отводом (250 мл) и воронки Шотта ВФ - 2-40 пор. 100 19/26 ТС (Россия) высотой 4,7 см, диаметром 4,6 см, диаметром фильтра 3,4 см со 100 г силикагеля "Merck" (Германия) диаметром частиц 0,06-0,2 мМ. На слой силикагеля наносят ацилированную смесь продуктов реакции в виде сухого порошка, который получают добавлением к этилацетатному раствору ацилированной смеси продуктов биотрансформации 3,0 г силикагеля, с последующим удалением растворителя. Далее силикагель промывают 300 мл петролейного эфира (60-80°C), порционно 200 мл 2%-го раствора этилацетата в петролейном эфире и 300 мл этилацетата. Полученные порции анализируют методом ТСХ. После удаления растворителя фракций получают 4,8 г технического продукта, содержащего 92% чистого стигмаст-4-ен-3-она. Выход стигмаст-4-ен-3-она после выделения составляет 89,2%.
Описание чертежей
Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых изображено:
На Фиг.1. Степень образования стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола под действием R. erythropolis ВКПМ АС-1901 в присутствии н-гексадекана (2,5 г/л), пальмитиновой кислоты (0,15 г/л), в условиях добавления 0,5-2,0 г/л β-ситостерола в виде раствора в изопропаноле (черные столбцы) или Твина-80 (заштрихованные столбцы).
На Фиг.2. Степень образования стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола под действием R. erythropolis ВКПМ АС-1901 в присутствии н-гексадекана (2,5 г/л) и пальмитиновой кислоты (0,15 г/л) в условиях добавления смеси 4-10 г/л β-ситостерола в виде смеси с β-циклодекстрином (1:1) в 80-200 мл 1,2% водного раствора Твина-80.