СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ НАКОПЛЕНИЯ КАДМИЯ В ПОЧКАХ У КРЫС
METHOD FOR DETERMINING THE RATE OF ACCUMULATION OF CADMIUM IN THE KIDNEYS OF RATS

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, может быть использовано для определения скорости накопления кадмия в почках у крыс.
Кадмий является широко распространенным и не поддающимся биологическому разложению загрязнителем, представляющим серьезную проблему для здоровья человека. Из-за широкого использования в промышленности и антропогенной деятельности содержание кадмия в окружающей среде продолжает увеличиваться. Эпидемиологические исследования связывают воздействие кадмия из окружающей среды с нарушением функций выделительной, опорно-двигательной, репродуктивной и других систем, а также с сердечно-сосудистыми заболеваниями и увеличением заболеваемости раком. Хотя интоксикация кадмием нарушает работу большинства органов и систем организма, печень и почки считаются критическими органами из-за их способности накапливать металл. Аккумуляция металла связана с большим содержанием в печени специфических белков с сульфгидрильными группами - металлотионеинами (МТ), которые способны связывать металлы, концентрируя их в этом органе. Металлсвязывающие белки, в том числе МТ, являются мощными энтеросорбентами для тяжелых металлов и занимают центральное место в естественном ответе организма на воздействие токсичных элементов. Несмотря на достаточное понимание токсичности кадмия, профили экспрессии МТ в различных тканях все еще неизвестны, и диагностический потенциал МТ в распознавании токсичности Cd все еще неясен.
Известен способ оценки кадмия в печени и легких крупного рогатого скота, характеризующийся тем, что проводят микроэлементный анализ волоса крупного рогатого скота. Определяют в волосе концентрацию Fe и/или Ti и рассчитывают уравнение регрессии [патент RU 2548774, 2015].
Наиболее близким аналогом изобретения является способ определения содержания кадмия в органах и мышечной ткани свиней, заключающийся в том, что проводят химический анализ копытного рога свиней методом атомно-абсорбционной спектрометрии, при этом для определения содержания кадмия в мышечной ткани, сердце, печени и почках определяют в копытном роге концентрацию Mn и содержание Cd рассчитывают из уравнения регрессии; для определения содержания кадмия в легких определяют в копытном роге концентрацию Mn и/или К и рассчитывают уравнения регрессии; для определения содержания кадмия в селезенке определяют в копытном роге концентрацию К и рассчитывают уравнение регрессии [патент RU 2342659, 2008]. Недостатком прототипа является отсутствие уравнения регрессии для определения содержания кадмия в почках.
Задачей изобретения является разработка способа определения скорости накопления кадмия в почках у крыс.
Техническим результатом изобретения является повышение точности определения кадмия в почках за счет оценки скорости накопления кадмия по экспрессии генов в крови.
Предлагаемый способ определения скорости накопления кадмия в почках у крыс осуществляется следующим образом. Проводят выделение РНК и количественный анализ мРНК гена МТ2А (Metallothionein-like protein 2А), затем определяют скорость накопления кадмия в почках. Для этого образцы РНК выделяют из лимфоцитов периферической венозной крови крыс. Целостность РНК оценивают электрофорезом в 1%-ном агарозном геле по соотношению интенсивностей полос в геле, соответствующих 28S и 18S рРНК. Синтез первой цепи кДНК проводят с помощью реакции обратной транскрипции. Для изучения количества мРНК гена МТ2А проводят ПЦР со специфичными праймерами. Нормализацию количества мРНК до эндогенного контроля проводят по количеству мРНК гена GAPDH. GAPDH - ген «домашнего хозяйства», экспрессия которого стабильна практически во всех клетках организма. Затем проводят статистический анализ экспрессии гена МТ3А.
При кратности экспрессии гена МТ2А относительно экспрессии GAPDH от -10 до -0,1 определяют низкую скорость накопления кадмия в почках у крыс, составляющую 0,2±0,02 мг/кг/мес, при кратности экспрессии от 0,1 до 5 определяют среднюю скорость накопления кадмия в почках у крыс, составляющую 0,4±0,03 мг/кг/мес, при кратности экспрессии от 5,1 до 10 определяют высокую скорость накопления кадмия в почках у крыс, составляющую 0,8±0,06 мг/кг/мес.
В экспериментальном исследовании белых беспородных крыс обоего пола случайным образом разделили на три опытные (Cd1, Cd10, Cd100) и контрольную группу, каждая из которых состояла из 10 крыс. Животных содержали в стандартных условиях с комнатной температурой от 20 до 25°С, влажностью от 55 до 60% и циклом 12/12 часов света и темноты. Крысам в исследуемых группах ежедневно через желудочный зонд вводили водный раствор хлорида кадмия, содержащий 1, 10 и 100 мкг кадмия/кг массы тела в группах Cd1, Cd10 и Cd100, соответственно. Воздействие кадмием в группах оценивали через 30 дней. Животных содержали и выводили из эксперимента декапитацией с соблюдением требованиям Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123). Образцы почек замораживали при температуре -80°С для будущих анализов. Для определения массовой доли кадмия образцы почек подготавливали в системе микроволнового разложения в соответствии с рекомендациями производителя (Speedwave XPERT, Berghof, Германия) и измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией (AA240Z, Varian, Австралия).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы SPSS Statistics 21.0. Для количественных переменных данные выражали как среднее ± ошибка среднего. В качестве критерия нормальности распределения признаков в изучаемых группах использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Для сравнения независимых групп по количественным признакам, распределение которых не отличалось от нормального, использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Попарно повторные сравнения проводились с использованием критерия Тьюки и Тамхейна. Критерий Тьюки использовался при предполагаемом равенстве дисперсий, Тамхейна в случаях, когда дисперсии различались. Силу связи между парами измеряемых параметров определяли с помощью коэффициента корреляции Пирсона, а ее значимость оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия и взаимосвязи считали статистически значимыми при р<0,05.
Сравнение уровня экспрессии исследуемых генов в почках показало, что экспрессия гена МТ2А имела корреляцию со скоростью накопления кадмия в почках у крыс (r=0,876; р=0,016).
В ходе экспериментального отравления кадмием показано, что уровень накопления кадмия в почках крыс имел статистически значимые различия (F=60,454; р=0,0001). В группе Cd1 среднее содержания кадмия составило 0,2±0,02 мг/кг, уровень кратности экспрессии варьировал от -10 до 0. В группе Cd10 среднее содержания кадмия составило 0,4±0,03 мг/кг, уровень кратности экспрессии варьировал от 0,1 до 5. В группе Cd100 среднее содержания кадмия составило 0,8±0,06 мг/кг, уровень кратности экспрессии варьировал от 5,1 до 10.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.
Животное 1, мужского пола, вес 204 г. Получало кадмий в дозе 1 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна -10, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,2±0,02 мг/кг кадмия.
Пример 2.
Животное 2, мужского пола, вес 201 г. Получало кадмий в дозе 1 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна -5,3, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,2±0,02 мг/кг кадмия.
Пример 3.
Животное 3, мужского пола, вес 207 г. Получало кадмий в дозе 1 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна -0,1, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,2±0,02 мг/кг кадмия.
Пример 4.
Животное 4, мужского пола, вес 202 г. Получало кадмий в дозе 10 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна 0,1, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,4±0,03 мг/кг кадмия.
Пример 5.
Животное 5, мужского пола, вес 201 г. Получало кадмий в дозе 10 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста берут 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна 2,5, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,4±0,03 мг/кг кадмия.
Пример 6.
Животное 6, мужского пола, вес 202 г. Получало кадмий в дозе 10 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна 5, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,4±0,03 мг/кг кадмия.
Пример 7.
Животное 7, мужского пола, вес 204 г. Получало кадмий в дозе 100 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна 5,1, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,8±0,06 мг/кг кадмия.
Пример 8.
Животное 8, мужского пола, вес 204 г. Получало кадмий в дозе 100 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна 7,5, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,8±0,06 мг/кг кадмия.
Пример 9.
Животное 9, мужского пола, вес 206 г. Получало кадмий в дозе 100 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ2А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ2А равна 10, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в почках у крысы составила 0,8±0,06 мг/кг кадмия.