Филогенетические взаимоотношения сибирских видов рода Iris L. (Iridaceae), выявленные с помощью RAPD-PCR метода

ХРОМОСОМНЫЕ ЧИСЛА И ХЕМОСИСТЕМАТИКА

УДК 575.17:582.579.2

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ СИБИРСКИХ ВИДОВ РОДА IRIS L. (IRIDACEAE), ВЫЯВЛЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ RAPD-PCR МЕТОДА APPLICATION OF RAPD-PCR METHOD IN THE STUDY OF PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS BETWEEN SIBERIAN SPECIES OF THE GENUS IRIS L.

Пятнадцать сибирских видов рода Iris L. и три вида из близких родов сем. Iridaceae (Pardanthopsis dichotoma (Pall.) Lenz, Aristea ecklonii Baker и Belamcanda chinensis Adans.) были исследованы с целью выявления филогенетических взаимоотношений видов рода Iris. Проведена количественная оценка внутри- и межвидового полиморфизма. Выявлены RAPD маркеры, которые могут быть использованы для определения викарных видов. На основе полученных 56 RAPD маркеров построена дендрограмма, отражающая взаимоотношения изученных видов и родов. P dichotoma формирует отдельную ветвь, что указывает на его удаленность от видов рода Iris, а P. dichotoma - вид монотипного рода филогенетически самый близкий к видам рода Iris. Исследованные сибирские виды рода Iris разделяются на три группы. Сравнивая принятые классификации по роду Iris (Родио-ненко, 1961; Mathew, 1990; Доронькин, 1990), видно, что полученные данные, за некоторым исключением, не противоречат принятым объемам подродов. В базальную группу входят I. sibirica L. (подрод Limniris (Tausch) Spach) и виды подрода Xyridion (Tausch) Spach: I. ludwigii Maxim. и I. halophila Pall. Вторая группа - это виды только подрода Limniris : I. laevigata Fisch. et Mey., I. pseudacorus L., I. ruthenica Ker-Gawl. и I. uniflora Pall. ex Link. Основу третьей группы составляют виды подрода Iris: I. glaucescens Bunge, I. bloudowii Ledeb., I. humilis Georgi и I. tigridiaBunge, I. ivanovae V Doronkin, I. lactea Pall., I. biglumis Vahl, а также I. setosa Pall. ex Link из подрода Limniris. На основании выявления генетической дистанции между викарными видами подтверждается таксономическая самостоятельность I. ivanovae. Наблюдается, что виды подрода Limniris входят в состав всех трех групп и этот подрод, по нашим данным, менее естественен. I. sibirica L., по всей вероятности, близок к предковому виду.

ВВЕДЕНИЕ. Род Iris L. - самый большой и наиболее сложный род семейства Касатиковых, или Ирисовых (Iridaceae). Таксономические взаимо-

А. Г. Блинов

И.Ф. Макаревич

B. М. Доронькин

C.В. Щербик

Makarevicz I. F. Doronkin V.M. Sherbik S. W. Blinov A. G.

отношения более чем 300 видов рода чрезвычайно запутаны и неоднозначны. Единой. общепринятой классификации рода не существует. а наиболее популярные и известные классификационные схемы различаются положением не только отдельных видов. но и более крупных систематических единиц - подродов и секций (Родионенко, 1961; Mathew, 1990; Доронькин. 1990). Большинство классификаций рода Iris основаны на сравнении анатомо-морфологических признаков и отчасти на результатах цитогенетического анализа (Родионенко. 1961; Доронькин. Красников. 1984; Амехин. 1984; Доронькин. 1987. 1990; Mathew. 1990 и др.). Объем и таксономический уровень различных групп видов до сих пор остается предметом разногласий и споров. В целом. вопрос о системе рода остается открытым. а взаимоотношения видов рода Iris требуют дальнейшего изучения и уточнения (Goldblatt. 1990).

В последние годы появились молекулярно-биологические исследования систематики и филогении семейства Ирисовых (Шнеер, Антонов. 1975; Reeves et al.. 1997; Antonov, Valiejo-Roman. Pimenov, 1998; Шнеер, 2000). Т.Т. Souza-Chies с соавторами (1997) исследовали филогению семейства Iridaceae на основе сравнения последовательностей ядерного гена rps4. Только три вида рода Iris (I. ensata Thunb., I. lutescens Guss., I. pallida Lam.) были включены в эту работу. Ю.Н. Журавлев с соавторами (1998) использовали метод RAPD-PCR для оценки генетического сходства некоторых видов рода Iris. произрастающих на территории российского Дальнего Востока. В этой работе были определены случайные праймеры. дающие видоспецифичные для видов рода Iris паттерны амплификации. и продемонстрирована возможность использования метода RAPD-PCR с этими праймерами для исследования таксономических взаимоотношений видов рода Iris.

Применение RAPD-PCR анализа. в дополнение к традиционным морфологическим методам. позволяет сравнивать свойства непосредственно ДНК организмов (Welsh. McCleland, 1990; Williams et al.. 1990). Этот метод успешно используют для ДНК фингерпринтинга (Svitashev, Bryngelsson, Wang. 1998). исследования возникновения близкородственных видов и их гибридов (Суворова. Фунатсуки. Терами. 1999; Стегний. Чудинова. Салина, 2000; Bartish, Rumpunen, Nybom. 2000). выявления межпопуляционного полиморфизма (Sun et al.. 1999) и создания классификационных систем для различных групп организмов (Camincini et al.. 1996; Swoboda, Bhalla, 1997).

Сибири род Iris представлен двадцатью двумя видами и двумя подвидами (Доронькин. 1987). Одиннадцать видов рода являются эндемиками Азии. а у I. glaucescens Bunge, I. tigridia Bunge и I. ivanovae V. Doronkin по территории Сибири проходит граница ареала. I. ludwigii Maxim.- один из наиболее редких в мире видов рода. К настоящему времени он известен из очень ограниченного числа мест естественного произрастания. одно из которых находится в Сибири в предгорьях Алтая (Доронькин. 1984). Большинство сибирских видов рода Iris нуждаются в охране и они уже включены в государственные и региональные «Красные книги» (Доронькин. 1989). Все виды рода высоко декоративны и ряд

видов уже использовались при селекции, но потенциал рода для выведения новых сортов еще не полностью исчерпан (Родионенко, 1961, 1977).

Сибирские виды рода Iris - чрезвычайно гетерогенная группа. Они сосдставляют большую часть подродов рода Iris. Исследование таксономических взаимоотношений сибирских видов ирисов поможет прояснить систематику рода в целом и разрешить некоторые противоречия современных классификаций. Таким образом, разработка надежных, быстрых и эффективных методов для определения объема видов рода Iris, особенно викарных видов, и построения филогенетических систем рода сегодня представляются чрезвычайно актуальными.

Настоящее исследование - это первая попытка разрешения таксономических взаимоотношений сибирских видов рода Iris на основе молекулярнобиологических данных RAPD-PCR анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Представители пятнадцати видов сибирских ирисов и трех родственных родов были собраны одним из авторов в природных популяциях или получены из коллекции Центрального сибирского ботанического сада СО РАН (г. Новосибирск). (Табл. 1).

ДНК выделяли из 50-170 мг замороженных листьев стандартным CTAB методом (набор Plant NucleoSpin «Macherey Nagel»). Количество и качество ДНК в образце проверяли методом электрофореза в 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (0,5 mg/ml), в 1 x TAE.

Четыре случайных праймера (десятибуквенные олигонуклеотиды; Operon 0PD08, OPD11, OPD13, OPB12) были использованы для амплификации геномной ДНК. PCR проводили в объеме 10 мкл, в смеси, содержащей 65мM Tris-HCl (pH 8.9), ^M (NH4)2SO4, 1^M MgCl2, 0,2M dATP, dGTP, dTTP, dCTP, 10мШ праймера и 1ед.а. Taq DNA полимеразы. Температурный режим реакций: начальный шаг денатурации - 920C 3 мин., затем 30 циклов: денатурация - 920C 30 сек., отжиг - 360C 45 сек. и элонгация - 720C 1 мин. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (0,5 mg/ml) в 0,5xTBE и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Для определения размеров амплифицированных фрагментов использовали в качестве маркеров HindIII/EcoRI - рестрикты ДНК фага лямбда.

Профили ДНК анализировали вручную, непосредственно с фотографий гелей. Для каждого генотипа наличие и отсутствие фрагментов независимо от их интенсивности рассматривали как 1 или 0 соответственно и анализировали как отдельные признаки. Коэффициенты генетического сходства для каждой пары видов вычисляли согласно методу Nei, Li (1979) по общей формуле: SAB=2 г‘ число общих фрагментов / (число фрагментов в наборе А + число фрагментов в наборе B). Для проведения всех расчетов использовали пакет программ RAPD (ftp://ftp. simtel.net/pub/simtelnet/msdos/biology).

Достоверность набора данных оценивали с помощью стандартного PTP (Permutation Tail of Probability) теста (Faith, Cranston, 1991).

Дендрограмма была построена на основе сравнения генетических дистанций,

вычисленных как d=1- SAB, методом кластерного анализа (UPGMA, (Sneath. Sokal, 1973)).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Целью нашего исследования было выявление филогенетических взаимоотношений видов рода Iris. произрастающих в Сибири. при помощи метода RAPD-PCR анализа. Представители пятнадцати сибирских видов ирисов. охватывающих все систематические группы рода. были собраны в природных популяциях или получены из коллекции Центрального сибирского ботанического сада СО РАН (г. Новосибирск). Четыре вида были представлены несколькими популяциями. Для уточнения систематического положения рода Pardanthopsis (Hance) Lenz. в исследование были включены виды из трлх родов родственных роду Iris: Pardanthopsis dichotoma. Aristea ecklonii Baker и Belamcanda chinensis Adans. Список исследованных родов и видов приведен в табл. 1.

Таблица 1

Список родов и видов. места сбора материалов представителей сем. Iridaceae. использованных при анализе

Исследованные виды и популяции

Iris biglumis Vahl Iris biglumis Vahl I. bloudowii Bunge *

I. glaucescens Bunge *

I. halophila Pall. *

I. halophila Pall. *

I. humilis Georgi *

I. ivanovae V. Doronkin I. lactea Pall.

I. laevigata Fish. et Mey. *

I. ludwigii Maxim.

I. pseudacorus L. *

I. ruthenica Ker-Gawl.

I. setosa Pall. ex Link *

I. sibirica L. *

I. tigridia Bunge *

I. uniflora Pall.

Pardanthopsis dichotoma

Aristea ecklonii Baker *

Место сбора

Республика Тыва Красноярский край Алтайский край Алтайский край Курганская область Алтайский край Новосибирская область Читинская область Красноярский край Иркутская область Алтайский край Курганская область Новосибирская область Якутия

Алтайский край Республика Горный Алтай Читинская область Читинская область Коллекция

Коллекция

Примечание: виды рода Iris, отмеченные звездочкой (*), взяты для анализа из коллекции экспозиции “Редкие и исчезающие растения Сибири”, а Belamcanda chinensis и Aristea ecklonii - из оранжерей тропических растений Центрального сибирского ботанического сада СО РАН (г. Новосибирск).

При проведении RAPD анализа наиболее принципиальным моментом является выбор случайных праймеров, используемых для амплификации ДНК. Праймеры OPD08, OPD11, OPD13, OPB12 успешно использовались ранее для изучения таксономических взаимоотношений дальневосточных видов рода Iris, они давали стабильные, хорошо воспроизводимые, видоспецифичные наборы фрагментов для видов рода Iris при отсутствии внутривидовой и внутрипопуляционной вариабельности (Журавллв и др., 1998), что и определило наш выбор в их пользу.

Для повышения достоверности и оценки воспроизводимости получаемых данных, для каждой пары генотип - праймер RAPD-PCR реакции проводили, по крайней мере, дважды. Наборы амплифицированных фрагментов стабильно воспроизводились в реакциях с различной температурой отжига (360C -390C) и различным количеством ДНК (10-50 нг на реакцию). Основываясь на воспроизводимости амплифицируемых фрагментов и интенсивности видимых полос, мы выбрали 360C как оптимальную температуру отжига для проведения дальнейших экспериментов.

Для оценки индивидуального полиморфизма RAPD фрагментов, амплифи-цируемых с помощью использованных нами случайных праймеров на генотипах сибирских видов рода Iris, мы анализировали несколько образцов для каждой изучаемой популяции. Во всех случаях наборы амплифицированных фрагментов были строго специфичны для каждой из популяций. Для исследования межпо-пуляционного полиморфизма мы включили в анализ образцы из трех различных популяций вида I. lactea Pall. (Красноярский край) и из двух популяции каждого из видов I. biglumis Vahl (Красноярский край и Республика Тыва), I. halophila Pall. (Алтайский край) и I. laevigata Fish. et Mey. (Иркутская обл.). Наборы амплифицируемых фрагментов разных популяций мало отличались между собой. Хорошо различимые отличия были обнаружены только между RAPD паттернами, полученными на праймере OPD08 для популяций I. biglumis и на праймере OPB12 для популяций I. halophila и I. lactea. RAPD паттерны популяций I. laevigata не отличались для всех четырех праймеров (данные не представлены). Таким образом, амплифицируемые с помощью выбранных нами праймеров наборы фрагментов действительно видоспецифичны для сибирских видов рода Iris, а значит, использование этих праймеров отвечает требованиям настоящего исследования.

Наборы RAPD фрагментов всех пар викарных видов - I. humilis и I. bloudowii (рис.1а-в, дорожки hu и bl), I. uniflora и I. ruthenica (Рис.1а-в, дорожки un и ru), I. tigridia и I. ivanovae (Рис.1а-в, дорожки ti и iv), I. biglumis и I. lactea (рис. 1а-в, дорожки bi и la) - имели явные различия при амплификации ДНК с праймерами OPD11, OPB12, OPD08, что позволяет легко определять эти виды. Поиск видоспецифичных маркеров, позволяющих легко и эффективно определять и различать близкородственные виды - важная проблема, как при решении таксономических вопросов, так и при селекционной работе по декоративным особенностя этих видов. RAPD анализ позволяет выявлять видовой полиморфизм, представляя надежный и простой метод для определения викарных видов.

Общее число амплифицированных в реакциях с четырьмя десятибуквен-

ными праймерами фрагментов было достаточно большим. В результате всех экспериментов были идентифицированы и проанализированы 56 полиморфных фрагментов. Размер анализируемых фрагментов составил от 0,2 до 4 тыс. п. н. (рис. 1).

RAPD амплификация ДНК видов рода Iris обнаруживает высокий уровень генетической вариабельности среди исследованных видов, что подтверждается амплификацией уникальных наборов RAPD фрагментов. Фрагментов, общих для всех изученных генотипов, обнаружено не было. Мы выявили несколько специфичных маркеров для различных таксономических групп видов рода: подрода Iris (праймер OPD08, рис. 1c), секции Ioniris (праймер OPB12, рис. 1b), серии Laevigatae (праймер OPD13, Рис. 1d). OPD13 дает мономорфный фрагмент (видоспецифичный маркер) для I. ludwigii (дорожка lu на рис. 1d). OPB12 дает фрагмент, специфичный для всех видов рода Iris, кроме видов подрода Xyridion (рис. 1b).

ДНК фингерпринты, полученные при амплификации ДНК с каждым праймером, использовали для вычисления попарных коэффициентов генетического сходства (SAB) по методу Nei и Li (1979). Вычисление коэффициента генетического сходства основывается на наличии общих амплифицированных фрагментов и предполагает, что фрагменты с одинаковой электрофоретической подвижностью - аллельны, а фрагменты с разной электрофоретической подвижностью -неаллельны. Вычисленные коэффициенты генетического сходства варьировали от 1.00 для популяций I. laevigata, до 0.16, для P. dichotoma и I. pseudacorus L. (табл. 2). В целом, внутривидовое сходство было относительно велико: от 0.94 для популяций I. biglumis, до 1.00 для популяций I. laevigata. Коэффициенты генетического сходства для разных видов значительно ниже: от 0.84 для викарных видов I. ruthenica и I. uniflora, до 0.24 для I. biglumis и I. pseudacorus. Среднее значение коэффициентов генетического сходства между представителями разных видов 0.68. Коэффициенты генетического сходства существенно уменьшаются при сравнении видов разных родов (среднее значение - 0.44).

Впервые в этой работе при анализе I. ivanovae V. Doronkin рассматривается как вид, недавно описанный для науки (Доронькин, 1987). Ранее этот вид включался в объем таксона I. tigridia Bunge. Согласно результатам нашего исследования, генетическая дистанция между этими видами близка к таковой между парами викарных видов, и значительно выше, чем генетическая дистанция между различными популяциями одного вида. Таким образом, выделение I. ivanovae в отдельный вид представляется обоснованным.

На основе генетических дистанций методом кластерного анализа мы построили UPGMA дендрограмму, отражающую филогенетические взаимоотношения сибирских видов рода Iris (рис. 2). Достоверность полученного нами набора данных была оценена с помощью стандартного PTP (Permutation Tail Probability) теста (Sneath, Sokal, 1973). Этот тест позволяет проверить, отражает ли построенное древо реальную, содержащуюся в анализируемом наборе данных, информацию по структуре древа. PTP тест основан на сравнении суммарной длины ветвей

Таблица 2

Матрица коэффициентов подобия, основанная на попарном сравнении ЯАРБ паттернов изученных видов

Виды 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1 I. biglumis 0,44 0,44 0,64 0,44 0,53 0,20 0,72 0,43 0,76 0,68 0,54 0,58 0,44 0,62 0,36 0,54 0,71

2 I. bloudowii 0,56 0,46 0,66 0,18 0,44 0,44 0,68 0,73 0,54 0,55 0,56 0,60 0,37 0,54 0,40 0,68 0,73

3 I. glaucescens 0,56 0,54 0,57 0,37 0,35 0,46 0,56 0,50 0,57 0,49 0,17 0,67 0,42 0,43 0,48 0,55 0,55

4 I. halophila 0,36 0,34 0,43 0,49 0,51 0,64 0,49 0,42 0,61 0,51 0,62 0,44 0,49 0,60 0,33 0,63 0,79

5 I. humilis 0,56 0,82 0,63 0,51 0,44 0,44 0,63 0,62 0,54 0,50 0,51 0,60 0,37 0,54 0,46 0,68 0,73

6 I. ivanovae 0,47 0,56 0,65 0,49 0,56 0,55 0,65 0,64 0,62 0,48 0,44 0,62 0,30 0,56 0,38 0,64 0,79

7 I. lactea 0,80 0,56 0,54 0,36 0,56 0.45 0,74 0,44 0,72 0,72 0,56 0,56 0,44 0,58 0,38 0,54 0,72

8 I. laevigata 0,28 0,32 0,44 0,51 0,37 0,35 0,26 0,66 0,44 0,45 0,47 0,79 0,52 0,53 0,26 0,66 0,76

9 I. ludwigii 0,57 0,27 0,50 0,58 0,38 0,36 0,56 0,34 0,63 0,63 0,64 0,58 0,56 0,62 0,37 0,60 0,65

10 I. pseudacorus 0,24 0,46 0,43 0,39 0,46 0,38 0,28 0,56 0,37 0,41 0,52 0,72 0,64 0,40 0,17 0,84 0,74

11 I. ruthenica 0,32 0,45 0,51 0,49 0,50 0,52 0,28 0,55 0,37 0,59 0,53 0,66 0,50 0,16 0,44 0,63 0,67

12 I. setosa 0,46 0,44 0,83 0,38 0,49 0,56 0,44 0,53 0,36 0,48 0,47 0,67 0,51 0,52 0,39 0,55 0,64

13 I. sibirica 0,42 0,40 0,33 0,56 0,40 0,38 0,44 0,21 0,42 0,28 0,34 0,33 0,64 0,55 0,33 0,58 0,68

14 I. tigridia 0,56 0,63 0,58 0,51 0,63 0,70 0,56 0,48 0,44 0,36 0,50 0,49 0,36 0,58 0,31 0,61 0,80

15 I. uniflora 0,38 0,46 0,57 0,40 0,46 0,44 0,42 0,47 0,38 0,60 0,84 0,48 0,45 0,42 0,40 0,62 0,57

16 P .dichotoma 0,64 0,60 0,52 0,67 0,54 0,62 0,62 0,74 0,63 0,83 0,56 0,62 0,67 0,69 0,60 0,58 0,53

17 В .chinensis 0,46 0,32 0,45 0,37 0,32 0,36 0,46 0,34 0,40 0,16 0,37 0,45 0,42 0,39 0,38 0,42 0,45

18 A .ecklonii 0,29 0,27 0,45 0,21 0,27 0,21 0,28 0,24 0,35 0,26 0,33 0,36 0,32 0,20 0,43 0,47 0,55

Коэффициенты подобия SAB Nei и Li (ниже диагонали), дистанции d = 1 - SAB (выше диагонали).

древа, построенного на основе анализируемых данных, и древа, построенного на основе случайных дистанций между изучаемыми видами. Последний должено иметь большую суммарную длину ветвей, чем реальное древо со “структурой”, разница между длинами ветвей этих деревьев - значение PTP теста. Чем выше значение PTP, тем более достоверен анализируемый набор данных. PTP значение в нашем случае высокое - 10,78, что позволяет считать полученную дендрогамму достоверной.

Топология построенного нами на основе анализа молекулярных данных RAPD анализа позволяет сделать некоторые выводы о филогенетических взаимоотношениях сибирских видов рода Iris и использованных при анализе других близких родов семейства Касатиковые. Pardanthopsis dichotoma формирует отдельную ветвь, что указывает на его удаленность от видов рода Iris. В тоже время этот род самый близкий к роду Iris из включенных в работу родов. Aristea ecklonii Baker и Belamcanda chinensis Adans. также формируют отдельные и наиболее отдаленные от рода Iris ветви. Исследованные сибирские виды рода Iris образуют три различные группы, отмеченные римскими цифрами на рис. 2, с некоторыми исключениями соответствующие подродам, выделяемым Г. И. Родионенко (1961). В базальную (I) группу входят I. sibirica L. из подрода

kh

2.00

0.94

0,83

0.56

kb

2,000,940.83 ~ 0.56 ~

b

kli

2,00-

c

kb M P lu А В ha bi ps ru si un hu bl se iv ti gl la

2,00

0.94

0.56

d

Рис. 1 RAPD паттерны сибирских видов рода Iris, амплифицированных в реакциях с праймерами: a) OPD11, b) OPB12, с) OPDO8, d) OPD13. Сокращения: A - Aristea ecklonii, B - Belamcanda chinensis, P - Pardanthopsis dichotoma, bl - Iris bloudowii, bi - I. biglumis, gl - I. glaucescens, ha - I. halophila, hu - I. humilis, iv - I. ivanovae, la - I. laevigata, lu -I. ludwigii, ps - I. pseudacorus, ru - I. ruthenica, se - I. setosa, si - I. sibirica, ti - I. tigridia, un - I. uniflora. M - маркер молекулярного веса (HindIII/EcoRIрестрикты ДНК фага лямбда).

_5_ 5

I

II

А В ha bi si se lu ps hu bl ru un i\ ti ці la P M

a

Limniris (Tausch) Spach и виды подродаXyridion (Tausch) Spach: I. ludwigii Maxim. и I. halophila Pall. Вторая группа - это виды только из подрода Limniris: I. laevigata Fisch. et Mey., I. pseudacorus L., I. ruthenica Ker-Gawl. и I. uniflora Pall. ex Link. Основу третьей группы составляют виды, в основном, подрода Iris: I. glaucescens Bunge, I. bloudowii Ledeb., I. humilis Georgi, I. tigridia Bunge, I. ivanovae V. Doronkin, I. lactea Pall., I. biglumis Vahl и только I. setosa Pall. ex Link из подрода Limniris, а вид I. dichotoma Pall., включаемый в монотипный подрод Pardanthopsis (Hance) Baker, выделяется в отдельную ветвь на уровне самостоятельного рода.

В целом, с некоторыми исключениями, топология построенной дендрограммы совпадает с основными классификациями рода, основанными на морфологических признаках. Так, согласно Родионенко (1961), эти виды, как отмечалось выше, принадлежат к подродам - Limniris (Tausch) Spach, Xyridion (Tausch) Spach, Iris и Pardanthopsis (Hance) Baker. B. Mathew (1990) считает монотипный подрод Pardanthopsis (Hance) Baker отдельным родом Pardanthopsis (Hance) Lenz, а

Рис. 2 Дендрограмма филогенетических взаимоотношний сибирских видов рода Iris. Шкала показывает генетические дистанции между видами.

виды подрода Xyridion помещает внутри подрода Limniris. По В. М. Доронькину (1990). виды включенные в анализ. распределяются в подроды Limniris. Eremiris Spach. Xyridion и Iris. а Pardanthopsis также выделяется в самостоятельный род.

Впервые L.W. Lenz (1972) выделил I. dichotoma Pall. в отдельный монотипный род Pardanthopsis (Hanze) Lenz. Наши данные также свидетельствуют о правомерности выделения I. dichotoma в самостоятельный род Pardanthopsis. Коэффициенты генетического сходства между P dichotoma и другими видами рода подтверждают. что P. dichotoma ближе. чем другие виды рода Iris к видам других исследованных родов. и что он равноудален от разных видов рода Iris независимо от их филогенетического положения. что было подтверждено и другими методами (Доронькин. 1987).

Классификации. предложенной Mathew (1990). противоречат следующие положения. Во-первых. по результатам нашего анализа I. halophila и I. ludwigii. не принадлежат к подроду Limniris. они формируют отдельную группу. соответствующую подроду Xyridion, выделяемому Родионенко (1961). Во-вторых. согласно нашим данным. I. biglumis и I. lactea ближе к другим видам подрода Iris, что противоречит помещению этих видов в подрод Limniris. Согласно предложенной системы сибирских видов рода Iris (Доронькин. 1990) противоречия заключаются в том. что в подрод Limniris включаются виды из всех трех групп (6 видов). Выделение видов. включенных в подроды Eremiris Spach и Xyridion, возможно. но. по всей вероятности. в другом ранге. По данным молекулярного RAPD анализа. I. setosa следует включать в подрод Iris, в то время как во всех современных классификациях он помещен его в подрод Limniris. Положение I. sibirica также остается спорным. По нашим данным. этот вид близок к видам подрода Xyridion, а не Limniris. Наблюдается. что виды подрода Limniris входят в состав всех трех групп и этот подрод. по нашим данным. менее естественени является сборным. Необходимо уточнение его объема. I. sibirica. по всей вероятности. наиболее близок к исходному предковому виду.

Молекулярные методы анализа предоставляют сегодня альтернативный. основанный на изучении непосредственно ДНК организмов подход для выявления и изучения видового полиморфизма на различных таксономических уровнях. Использование молекулярных методов дает ряд преимуществ по сравнению с традиционными морфологическими способами построения классификационных систем. так как молекулярные маркеры не зависят от стадии развития организма и не подвержены влиянию внешней среды. что позволяет уточнять родственные отношения таксонов и создавать схемы филогенетических взаимоотношений между организмами (Comincini et al.. 1996; Swoboda. Bhalla. 1997; Lakshmi et al.. 2000).

Авторы выражают благодарность заведующей группой “Редких и исчезающих растений Сибири”. к.б.н.. с.н.с. Г. П. Семеновой и заведующему Группой тропических растений. н.с. Ю.В. Овчинникову (ЦСБС СО РАН) за предоставление растительные материалы. Dr. J. Armstrong. Dr. A. Gibbs. Dr. R.

Peakall, Dr. G. Weiller за предоставление пакета программ для обработки данных RAPD анализа. Мы также благодарим к.б.н., с.н.с. Т.Г. Ламанову (ЦСБС СО РАН) за помощь в проведении работы.

Исследования выполнены при поддержке Российским фондом фундаментальных исследований (гранты 01-04-49140, 01-04-48988).

ЛИТЕРАТУРА

Амехин О.А. Анатомические особенности листа группы ирисов секции Limniris Tausch. // 1 Всеросс. конф. по анатомии растений. Ленинград, октябрь 1984. - Л., 1984. - C. 5.

Доронькин В.М. Iris ludwigii (Iridaceae) - новый вид для флоры Сибири // Бот. журн., 1984. - Т. 69, №> 10. - C. 1416-1418.

Доронькин В.М., Красников А.А. Цитотаксономические исследования сибирских видов рода Iris (Iridaceae) // Бот. журн., 1984. - T. 69, N° 5. - C. 683-685.

Доронькин В. М. Iris dichotoma Pall. и его место в системе семейства Iridaceae Juss. // Изв. СО АН СССР, 1987. Сер. биол. наук. Вып. 1. - С. 6-9.

Доронькин В.М. Семейство Iridaceae - Касатиковые. Флора Сибири (Araceae -Orchidaceae). - Новосибирск: Наука, 1987. - C. 113-125.

Доронькин В.М. Состояние и перспективы охраны касатиковых (Iridaceae Juss.) в Сибири // Изв. СО АН СССР, 1989. Сер. биол. наук. Вып. 2. - С. 56-62.

Доронькин В.М. Обзор сибирских видов рода Iris (Iridaceae) // Бот. журн., 1990. - Т. 75, №> 3. - С. 409-416.

Журавлев Ю.Н., Козыренко М.Н., Артюкова Е.В., Реунова Г.Д., Илюшко М.В. ДНК-типирование дальневосточных видов рода Iris L. с помощью метода RAPD PCR // Генетика, 1998. - Т. 34. - С. 368-372.

Родионенко Г.И. Род Ирис - Iris L. - М.-Л.: Изд-во Акад. Наук СССР, 1961. - 216 с.

Родионенко Г.И. Род Iris L. - Ирис, или Касатики // Декоративные травянистые растения. - Л.: Наука, 1977. - Т. 1. - С. 225-274.

Стегний В.Н., Чудинова Ю.В., Салина Е.А. RAPD - анализ разнопродуктивных сортов и гибридов льна культурного Linum usitatissimum L. // Генетика, 2000. - Т. 36. - С. 1370-1373.

Суворова Г.Н., Фунатсуки Х., Терами Ф. Филогенетическое родство некоторых сортов, видов и гибридов рода Fagopirum Mill., установленное на основе RAPD-анализа // Генетика, 1999. - Т. 35. - С. 1659-1664.

Шнеер В. С., Антонов А. С. Гомологии в ДНК видов рода Iris L. // Докл. АН СССР, 1975. -T 222, №> 1. - C. 247-250.

Шнеер В. С. Филогенетические отношения таксонов в семействах Iridaceae и Apiaceae по результатам серологического анализа: Автореф...д. б. н. - СПб, 2000. - 45 c.

Antonov A. S., K. M. Valiejo-Roman, M. G. Pimenov, N. A. Beridze Non-equivalency of genera in Angiospermae: evidence from DNA hybridization studies // Pl. Syst. Evol., 1988. - Vol. 161. - P. 155-168.

Bartish I. V., Rumpunen K., Nybom H. Combined analyses of RAPDs, cpDNA and morphology demonstrate spontaneous hybridization in the plant genus Chaenomeles // Heredity, 2000. - Vol. 85. - P. 383-392.

Comincini S., SironiM., Bandi C., Giunta C., Rubini M., Fontana F. RAPD analysis of systematics relationships among the Cervidae // Heredity, 1996. - Vol. 76. - P. 215-221.

Faith D.P., Cranston P.S. Could a cladogram this short have arisen by chance alone? On permutation tests for cladistic structure // Cladistics, 1991. - Vol. 7. - P. 1-28.

Goldblatt P. Phylogeny and classification of Iridaceae // Ann. Miss. Bot. Gard., 1990. -Vol. 7. - P. 607-627.

Lakshmi M., Parani M., Ram N., Parida A. Molecular phylogeny of mangroves. VI. Intraspecific genetic variation in mangrove species Excoecaria agallocha L. (Euphorbiaceae) // Genome, 2000. Vol. 43. - P. 110-115.

Lenz L. W. The status of Pardanthopsis (Iridaceae). // Aliso, 1972. - Vol. 7. - P. 4.

MathewB. The Iris. - Portland: Oregon Timber Press, 1990. - 215 р

NeiM., Li W.H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979. - Vol. 76. - P. 5269-5273.

Reeves G., Chase M. W., De Chies et al. Molecular systematics of Iridaceae : A combined analysis of three plastid DNA, sequence matrices // Amer. J. Botany, 1997. - Vol. 84, N° 6.

Sneath P.H., Sokal R.R. Numerical taxonomy. The principles and practice of numerical classification. - San Francisco: W. H. Freeman and Co., 1973. - 200 pp.

Souza-Chies T. T., Bittar G., Nadot S., Carter L., Besin E., Lejeune B. Phylogenetic analysis of Iridaceae with parsimony and distance methods using the plastid gene rps4 // Pl. Syst. Evol., 1997. - Vol. 204. - P. 109-123.

Sun G.L., Diaz O., Salomon B., von Bothmer R. Genetic diversity in Elymus caninus as revealed by isozyme, RAPD, and microsatellite markers // Genome, 1999. - Vol 42. - P. 420-31.

Svitashev S., Bryngelsson T.L.X., Wang R.R. Genome-specific repetitive DNA and RAPD markers for genome identification in Elymus and Hordelymus // Genome, 1998. - Vol. 41. - P. 120-128.

Swoboda I., Bhalla P.L. RAPD analysis of genetic variation in the Australian fan flower, Scaevola // Genome, 1997. - Vol. 40. - P. 600-606.

Welsh J., McCleland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucl. Acids Res., 1990. - Vol. 18. - P. 7213-7218.

Williams J.G.K., KubelikA.R.,LivakK.J., Rafalski J.A., Tingey S.V.DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res., 1990. - Vol. 18.-P. 6531-6535.

SUMMARY

Fifteen Siberian species of genus Iris and three species of allied genus from Iridaceae family (Pardanthopsis dichotoma (Pall.) Lenz, Aristea ecklonii Baker, Belamcanda chinensis Adans.) were studied for revealing of phylogenetic relationships of species of genus Iris. The quantitative evaluation of intra- and interspecies polymorphism has been performed. RAPD markers which could be used for determination vicarious species have been revealed. Dendrogram of phylogenetic relationships of studied species and genus was calculated on the basis of 56 RAPD markers. P. dichotoma, A. ecklonii and B. chinensis form separate branches on dendrogram. It indicates their phylogenetic remoteness from species of the genus Iris. At that, P. dichotoma is closest the species to species of the genus of Iris. Studied Siberian species of Iris genus are subdivided into 3 groups. Performed comparisons of existed classifications of Iris genus (Rodionenko, 1961, Mathew, 1990, Doronkin, 1990) revealed that the results of present study are not at variance (with some exceptions) with accepted volumes of subgenus. The basal group is formed by I. sibirica (subgenus Limniris (Tausch) Spach) and species of subgenus Xyridion (Tausch) Spach: I. ludwigii Maxim. and I. halophila Pall. Second group includes

species of Limniris subgenus (I. laevigata Fisch. et Mey., I. pseudacorus L., I. ruthenica Ker-Gawl. and I. uniflora Pall.). The basis of third group is formed by species of the Iris subgenus: I. glaucescens Bunge, I. bloudowii Ledeb., I. humilis Georgi, I. tigridia Bunge, I. ivanovae V. Doronkin, I. lactea Pall., I. biglumis Vahl, and by I. setosa Pall. ex Link from the subgenus Limniris as well. Taxonomic independence of I. ivanovae is confirmed on the basis of revealed genetic distance between vicarious species. Joining species of the Limniris subgenus to all three groups is observed. Received data denote that last subgenus is less natural in comparison with other subgenera. Iris sibirica L. is very close to the ancestor species.

Институт Цитологии и Генетики СО РАН Получено 12.10.2001 г.

г. Новосибирск Центральный сибирский ботанический сад СО РАН г.Новосибирск