СПОСОБ СЕЛЕКЦИИ ФРАГМЕНТОВ ДНК, ПРОЧНО СВЯЗАННЫХ С БЕЛКАМИ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ И ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR SELECTION OF IMMUNOMODULATING DNA FRAGMENTS TIGHTLY BOUND WITH CELL SURFACE PROTEINS

Изобретение относится к области молекулярной и клеточной биологии и медицины, а именно к способам селекции ДНК последовательностей, обладающих иммуномодулирующей активностью.
Прочное связывание клеточных рецепторов с лигандами необходимо для реализации множества процессов: рецепции и транспорта, передачи активирующего/ингибирующего сигналов, клеточной миграции и.т.д. В качестве клеточных рецепторов выступают, как правило, биополимеры, в которых узнавание лиганда происходит за счет взаимодействия с белковой частью молекулы. Действительно, было показано, что нуклеиновые кислоты, в частности ДНК, так же связываются с поверхностными белками клеток и это связывание необходимо для их транспорта в клетки и реализации биологических эффектов. Влияние экзогенных внеклеточных ДНК на клеточные функции, такие как экспрессия генов (малые интерферирующие РНК, антисмысловые олигонуклеотиды, генная иммунизация), могут быть реализованы только после проникновения ДНК в клетки. Для реализации иммуномодулирующего действия ДНК также необходимо проникновение ДНК в клетки, поскольку основной рецептор ДНК TLR-9 не экспонирован на клеточной мембране, а локализован внутри клетки в эндосомальных компартментах. В случае взаимодействия иммуностимулирующей ДНК с внутриклеточными рецепторами, связывание ДНК с клеточной поверхностью является ключевым моментом в иммуностимуляции, поскольку оно определяет эффективность транспорта ДНК. Таким образом, иммунологически активные молекулы ДНК должны обладать повышенным сродством к клеточной поверхности [1].
Известно, что на поверхности эукариотических клеток постоянно и в значительном количестве (1-3% геномной ДНК) присутствуют внеклеточные ДНК эндогенного происхождения [2]. Эти ДНК находятся в составе прочных комплексов с клеточной поверхностью, поскольку стабильны к действию ДНКаз (гидролизуется от 0 до 30% в зависимости от типа клеток) и могут быть элюированы с поверхности клеток обработкой протеазами, например трипсином. Очевидно, что такие ДНК препятствуют связыванию экзогенных ДНК с клетками и могут быть вовлечены в регуляцию клеточных процессов и поддержание гомеостаза. В частности, среди фрагментов ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности, потенциально могут встречаться последовательности, обладающие иммуномодулирующим действием. Поиск таких последовательностей является актуальной задачей, поскольку молекулы ДНК, активирующие неспецифический иммунный ответ и помогающие бороться с инфекцией, могут стать основой для создания антибактериальных и вирусных вакцин.
Наиболее близким к заявленному способу - прототипом, является способ селекции фрагментов ДНК, способных прочно связываться с белками клеточной поверхности эукариотических клеток [3], включающий:
- синтез библиотеки двуцепоченных ДНК (дцДНК), состоящей из вырожденной последовательности длиной 10 нуклеотидов, фланкированной с обеих сторон 23-нуклеотидными фрагментами известной последовательности,
- 6 раундов селекции, каждый из которых включает инкубацию библиотеки дцДНК с клетками, отмывку клеток от несвязавшейся ДНК, выделение коротких фрагментов ДНК из мембранно-цитозольной фракции, их амплификацию при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных фланкирующим последовательностям, и повтор этих раундов 6 раз,
- клонирование полученных фрагментов ДНК, определение их последовательностей при помощи секвенирования клонов и поиск повторяющихся элементов последовательностей в области рандомизованного фрагмента (10 нуклеотидов) ДНК конструкции.
- исследование взаимодействия с клетками найденного мотива, путем синтеза олигонуклеотидов, содержащих тандемно повторенные последовательности этого ДНК-мотива.
10
Недостатком описанного способа является то, что эукариотические клетки, с которыми ведется инкубация библиотеки дцДНК, уже содержат на своей поверхности прочно связанные эндогенные ДНК. Эти ДНК выступают в качестве конкурентов для взаимодействия экзогенных нуклеиновых кислот с клетками. Поскольку библиотеки рандомизованных последовательностей длиной 10 нуклеотидов теоретически содержат не менее 4 последовательностей, экзогенные ДНК определенной последовательности представлены в очень низкой концентрации и не могут конкурировать с эндогенными последовательностями. Значительное количество белков, экспонированных на поверхности клеток, связывают ДНК сиквенс-неспецифично, что дополнительно мешает отбору селективно взаимодействующих с клеточной поверхностью ДНК, а последовательность фланкирующих олигонуклеотидов зачастую вносит больший вклад во взаимодействие, чем рандомизованная ДНК последовательность. Кроме того, эффективная отмывка ДНК с поверхности эукариотических клеток практически не осуществима в силу того, что она должна проводиться в условиях, близких к физиологическим (чтобы не разрушить клетки и не изменить структуру биополимеров клеточной поверхности), что также препятствует селекции прочно связанных ДНК.
Технической задачей изобретения является разработка эффективного способа селекции фрагментов ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности первичных клеток человека и обладающих иммуномодулирующей активностью.
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующих последовательных стадиях.
1. Выделение ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности.
4
Первичные клетки человека отмывают от культуральной среды и инкубируют с 0,125-0,25% раствором протеазы в течение 5 минут. Протеазу ингибируют, клетки осаждают центрифугированием при 400 g в течение 10-15 минут. Полученный супернатант инкубируют с активированной смолой, преимущественно с сефарозой CL-4B, активированной цианогенбромидом, в течение 4-6 часов. Оставшиеся реакционно-способные группы инактивируют добавлением 0,2 М раствора Глицин/NaOH (pH 8.0). Сефарозу переносят в хроматографическую колонку и отмывают фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (3 объема колонки), затем фосфатным буфером, содержащим 0.5 М NaCl (2 объема колонки) и затем элюируют фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности буфером 30 мМ HCOOH/NHOH (pH 2,6).
2. Разделение полученных фрагментов ДНК по длине, выделение фрагментов длиной 6-16 нуклеотидов, с последующим лигированием адаптеров согласно методике, описанной ранее в [4], их амплификацией, клонированием и секвенированием.
3. Идентификация среди полученных фрагментов ДНК мотивов длиной 5-8 нуклеотидов, которые встречаются среди секвенированных последовательностей с частотой выше 10%. Полученные после стадии 3 ДНК-мотивы прочно связываются с белками клеточной поверхности и могут быть использованы для селекции фрагментов ДНК, обладающих иммуномодулирующей активностью.
4. Поиск в геноме человека последовательностей ДНК, содержащих выбранные мотивы с частотой не менее 50% (не менее 3-х мотивов ДНК на участке генома длиной 30 оснований), с использование возможностей, предоставляемых сервером Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
5. Химический синтез олигонуклеотидов с последовательностью, найденной в результате выполнения предыдущей стадии способа, иммуномодулирующее действие которых проверяют по способности активировать секрецию противовоспалительных цитокинов клетками иммунной системы человека.
Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, является следующее.
1. Первичные клетки человека обрабатывают раствором фермента, преимущественно 0,125-0,25% раствором трипсина, в условиях, не приводящих к лизису клеток, но приводящих к освобождению ДНК-белковых комплексов клеточной поверхности, что позволяет выделить эндогенные природные ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности.
2. Полученный после центрифугирования супернатант инкубируют с активированной смолой, преимущественно с сефарозой CL-4B, активированной цианогенбромидом, в течение 4-6 часов, что позволяет эффективно удалить непрочно связанные молекулы ДНК и выделить фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности благодаря формированию ковалентных связей между адсорбентом и белковыми компонентами нуклеопротеиновых комплексов клеточной поверхности (что в отличие от прототипа элиминирует не эффективную стадию отмывки ДНК с поверхности живых клеток).
3. Осуществляют последовательную отмывку сефарозы в хроматографической колонке фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (3 объемами колонки), и фосфатным буфером, содержащим 0.5 М NaCl (2 объема колонки), что позволяет удалять неспецифические и непрочно связанные с сорбентом молекулы ДНК.
4
4. Элюцию фрагментов ДНК с сефарозы проводят буфером, содержащим 30 мМ HCOOH/NHOH (pH 2,6), что позволяет выделять прочно связанные с белками клеточной поверхности фрагменты ДНК с их последующим клонированием и секвенированием.
5. Полученные фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности разделяют по длине и выделяют короткие фрагменты ДНК с длиной 6-16 нуклеотидов, что позволяет селектировать фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности по размеру.
6. Идентифицируют среди полученных фрагментов ДНК мотивы длиной 5-8 нуклеотидов с последующим поиском в геноме человека последовательностей ДНК, содержащих выбранные мотивы с частотой не менее 50%, что позволяет провести химический синтез олигонуклеотидов с последовательностью, найденной в результате селекции фрагментов ДНК для оценки иммуномодулирующей активности (в прототипе используются тандемно повторенные последовательности найденных мотивов).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1.
6
4
Первичные эндотелиальные клетки из пупочной вены человека (5·10 клеток) отмывали от культуральной среды тремя сменами изотонического фосфатного солевого раствора, инкубировали с 0,25% раствором трипсина в течение 5 минут. Трипсин инактивировали добавлением ингибитора трипсина. Клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 10 минут. Полученный супернатант инкубировали с активированной цианогенбромидом се фарозой CL-4B в течение 4 часов. Оставшиеся реакционно-способные группы инактивировали добавлением 0,2 М раствора Глицин/NaOH (pH 8.0). Сефарозу переносили в хроматографическую колонку и отмывали фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (3 объемами колонки), затем фосфатным буфером, содержащим 0.5 М NaCl (2 объема колонки) и затем элюировали ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности буфером 20 мМ HCOOH/NHOH (pH 2,6).
32
Полученную ДНК прогревали при 100°C, охлаждали на льду и вводили радиоактивный фосфор при помощи полинуклеотидкиназы Т4 и γ-P-АТФ, как описано в [4]. Для выделения фрагментов ДНК длиной 8-16 нуклеотидов ДНК разделяли электрофорезом в 20% ПААГ с 7М мочевиной и определяли места локализации ДНК в геле при помощи радиоавтографии. Одноцепочечные фрагменты длиной 6-16 нуклеотидов элюировали из геля при помощи электроэлюции и лигировали адапторы с 5'- и 3'-концов, как описано ранее [4]. Фрагменты амплифицировали при помощи ПЦР и обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI, затем клонировали в вектор pBluescript II KS, предварительно обработанный рестриктазами EcoRI и BamHI. Последовательность вставок определяли при помощи автоматического секвенатора ABI PRISM™ 3100 (Applied Biosystems).
Последовательности полученных фрагментов ДНК представлены в таблице 1:
№
последовательность
комплементарная последовательность
примечания
Ф-1
5'-CTACGTCNT-3'
5'-ANGACGTAG-3'
(N=Т или C)
Ф-2
5'-CATGCATT-3'
5'-AATGCATG-3'
Ф-3
5'-NGNCTT-3'
5'-AAGNCN-3'
(N<sub>1</sub>=T или C; N<sub>2</sub>=G или T)
Ф-4
5'-NGGAAGAA-3'
5'-TTCTTCCN-3'
(N=G или C)
Ф-5
5'-TGTCATCAT-3'
5'-ATGATGACA-3'
Ф-6
5'-ATGCAT-3'
5'-ATGCAT-3'
Ф-7
5'-CGTAGTA-3'
5'-TACTACG-3'
Ф-8
5'-GCATGCATT-3'
5'-AATGCATGC-3'
Ф-9
5'-AGTNGTGGG-3'
5'-CCCACNACT-3'
(N=А или C)
Ф-10
5'-GATCCA-3'
5'-TGGATC-3'
Ф-11
5'-STNNRTCC-3'
5'-GGAYNNAS-3'
(S=G/C, N<sub>1</sub>=A/G, N<sub>2</sub>=G/C)
Ф-12
5'-AGCNGGA-3'
5'-TCCNGCT-3'
N=T/G
Ф-13
5'-CGTGGTCT-3'
5'-AGACCACG-3'
Ф-14
5'-CGTCCGGC-3'
5'-GCCGGACG-3'
Ф-15
5'-GATCCAGG-3'
5'-CCTGGATC-3'
Ф-16
5'-ACGAGT-3'
5'-ACTCGT-3'
Ф-17
5'-AGAAGG-3'
5'-ССТТСТ-3'
Ф-18
5'-CTACGTTC-3'
5'-GAACGTAG-3
Ф-19
5'-ATGCGTGT-3'
5'-ACACGCAT-3
Ф-20
5'-TCCGTAC-3'
5'-GTACGGA-3'
Ф-21
5'-CTACGTAC-3'
5'-GTACGTAG-3'
Ф-22
5'-CTACGTCG-3'
5'-CGACGTAG-3'
Ф-23
5'-GCCCCCCGTA-3'
5'-TACGGGGGGC-3'
Ф-24
5'-GTCTACGTCTTCA-3'
5'-TGAAGACGTAGAC-3'
На основании последовательностей полученных фрагментов были идентифицированы ДНК-мотивы длиной 5-8 нуклеотидов, последовательности которых представлены в таблице 2:
ОДН
Последовательность
F-1
5'-GCATGCATT-3'
F-2
5'-GATCCA-3'
F-3
5'-TACGT-3'
1-15
0-15
В геноме человека были найдены последовательности ДНК, содержащие комбинации отсеквенированных мотивов с частотой не менее 50%. Один из вариантов последовательности ДНК можно описать общей формулой: (Ф-23)N(Ф-7)N(Ф-23). На основе геномных последовательностей, содержащих секвенированные фрагменты, были синтезированы искусственные олигодезоксирибонуклеотиды (ОДН), представленные в таблице 3:
№
Последовательность
ИЛ-6, пкг/мл
ИЛ-8, нг/мл
1
5'-pGCATGCATTGCATGCATTGCATGCATTGCATGCATTT-3'
150
0.2
2
5'-pTGATATAGCATGCATTTATGCATGCATTTTGAAAACT-3'
600
1.575
3
5'-pTCATCTGGTGCATGCATTTTCGCATGCATTTCTTGTT-3'
550
1.55
4
5'-pAGGAGGCATGCATTGTCAGAGGCATGCATTGTCAGGT-3'
550
1.25
5
5'-pAGTAAGCATGCATTTGAGGGTGGAGCATGCATTTCAT-3'
700
1.575
6
5'-pATAGGCATGCATTTAATTTATTGGCATGCATTTAATT-3'
670
1.7
7
5'-pCTGCATCCCAGAGCATGGATCCAGGAGGTGGGAAGAT-3'
600
2.1
8
5'-pGATCCAGGGATCCAGGGATCCAGGGATCCAGGT-3'
620
1.45
9
5'-pCTACGTCGATGCGTGTTCCGTACCTACGTCTTT-3'
530
1.05
10
5'-pCACCTGCCAGATCCAGATCCAGGTGAATCTGAT-3'
300
0.525
11
5'-pATACGTGGATCCAATACGTGGATCCAATATGTT-3'
110
2.05
12
5'-pGATCCAATACGTGGATCCAATACGTGGATCCAT-3'
640
2.15
13
5'-pCTGCATGCATTTCCTTCTGCATTCCAGCTGGAT-3'
670
2.05
14
5'-pTGAAGGTAGAAGGAATCCCGGCCTGGATCCACT-3'
450
0.95
15
5'-pCGGAGGAATCCCGGGAGTAGTGGGAAGAAAAGT-3'
550
1.3
4
2
Иммуномодулирующие свойства этих олигодезоксинуклеотидов были исследованы на модели первичных эндотелиальных клеток человека. Для этого клетки рассаживали на 24-луночные планшеты (Linbro, США) в плотности 2·10 клеток в лунке, дважды отмывали культуральной средой без сыворотки и добавляли культуральную среду без сыворотки, содержащую 1 мкМ ОДН. В качестве контролей использовали LPS в концентрации 0.5 мкг/мл или IMDM. После двух часов инкубации к клеткам добавляли ЭТС в количестве 1/10 объема культуральной среды в лунке. Клетки инкубировали 24 часа при 37°C в атмосфере 5% CO. После окончания инкубации собирали супернатанты HUVEC, центрифугировали для удаления клеток и измеряли концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 при помощи коммерческих наборов (Вектор-Бест, Новосибирск). Концентрация ИЛ-6 и ИЛ-8 в супернатанте клеток без стимуляторов составила 160 пкг/мл и 0.325 нг/мл соответственно, в супернатанте LPS-стимулированных клеток концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 составили 2600 пкг/мл и 6 нг/мл.
Установлено, что в зависимости от последовательности ОДН существенно отличаются по уровню индукции секреции ИЛ-6 и ИЛ-8, при этом некоторые ОДН активируют синтез интерлейкинов, а некоторые - ингибируют.
Пример 2.
Первичные фибробласты из десны человека обрабатывали 0,125% химотрипсином, ингибировали добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Дальнейшее выделение ДНК, прочно связанных с белками клеточной поверхности, проводили аналогично примеру 1.
32
Полученную ДНК прогревали при 100°C, охлаждали на льду и вводили радиоактивный фосфор при помощи полинуклеотидкиназы Т4 и γ-P-АТФ, как описано в [4]. Для выделения фрагментов ДНК длиной 8-16 нуклеотидов ДНК разделяли электрофорезом в 20% ПААГ с 7М мочевиной и определяли места локализации ДНК в геле при помощи радиоавтографии. Одноцепочечные фрагменты длиной 6-16 нуклеотидов элюировали из геля при помощи электроэлюции и лигировали адапторы с 5'- и 3' - концов, как описано ранее [4]. Фрагменты амплифицировали при помощи ПЦР и обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI, затем клонировали в вектор pBluescript II KS, предварительно обработанный рестриктазами EcoRI и BamHI. Последовательность вставок определяли при помощи автоматического секвенатора ABI PRISM™ 3100 (Applied Biosystems).
На основании отсеквенированных фрагментов ДНК длиной 6-16 нуклеотидов, были выбраны мотивы, последовательности двух выборочных мотивов представлены в таблице 4:
ОДН
Последовательность
F-1
5'-GATCCA-3'
F-2
5'-TACGT-3'
Поскольку найденные мотивы частично совпадали с мотивами, найденными в примере 1, в качестве олигонуклеотидов, содержащих последовательности геномной ДНК человека, были выбраны олигонуклеотиды из таблицы №3, а именно ОДН 12 и ОДН 13. Иммуномодулирующее воздействие ОДН было исследовано, как описано в примере 1. Было показано, что в результате стимуляции первичных фибробластов ОДН не наблюдалось изменения в продукции интерлейкинов 6-го и 8-го, однако данные ОДН ингибировали PolyIC-индуцированную секрецию интелейкинов, и, таким образом, обладали иммуномодулирующей активностью.
Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с прототипом:
- получать природные фрагменты ДНК, прочно связанные с белками клеточной поверхности и использовать их в качестве исходного материала для поиска сиквенс-специфичных последовательностей;
- исключить влияние фланкирующих фрагментов в последовательностях нуклеиновых кислот на эффективность и прочность связывания последовательностей с белками клеточной поверхности;
- эффективно удалять непрочно связанные нуклеиновые кислоты за счет ковалентного присоединения нуклеопротеиновых комплексов клеточной поверхности к поверхности сорбента за счет белковой компоненты комплекса.
Источники информации
1. Lamphier M.S. et al, TLR9 and the Recognition of Self and Non-Self Nucleic acids // Ann. N.Y. Acad. Sci, 2006, V.1082, P.31-43.
2. Skvortsova Т.Е., et al, Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumors: DNA quantification and analysis of tumor-related gene methylation // British J. Cancer, 2006, V.94 (10), P.1492-1495.
3. Mende, M., et al, Hexanucleotide selected for increased cellular uptake in cis contains a highly active CpG motif in human В cells and primary peripheral blood mononuclear cells // Immunology, 2007, V.120 (2), P.261-272.
4. Лактионов П.П., Мальшакова B.C., Морозкин E.C., Пышный Д.В., Власов В.В. Способ анализа неизвестных последовательностей одноцепочечных нуклеиновых кислот. Патент РФ №2322508, оп. 20.04.2008, Бюл. №11.