СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СУБКЛИНИЧЕСКОГО КЕТОЗА
METHOD FOR TREATMENT OF SUBCLINICAL KETOSIS

Изобретение относится к ветеринарии и животноводству, в частности к способам лечения и профилактики субклинического кетоза с использованием метаболического средства.
Один из критических в жизни коровы - новотельный период, во время которого в организме происходят значительные изменения направленности и интенсивности обмена веществ, связанные с физиологическим раздоем. Все это требует значительно больше энергетических и пластических затрат, чем обеспечивает даже максимально сбалансированный рацион. В результате в течение первых недель после отела складывается отрицательный энергетический баланс, который компенсируется путем мобилизации ресурсов организма, что приводит к потере живой массы, и становится причиной кетозов (Маевский Е. И. Обоснование использования биологически активных добавок Янтавит и Митомин на основе янтарной кислоты /Е. И. Маевский, Е. В. Гришина, А. С. Розенфельд // Материалы V юбилейной конференции по биологически активным добавкам: эффективность применения БАД в разных отраслях медицины. - Москва, 19 - 21 декабря 2000. - 102 - 105 с.). Многие применяемые средства нормализуют только отдельные звенья метаболических процессов, а поскольку кетоз- это тяжелое полиэтиологическое заболевание, то к его профилактике и лечению необходим адекватный подход, который заключается в поддержании или коррекции ключевых звеньев биохимических процессов, обеспечивающих гомеостаз в переходный период. Общеизвестно, что отрицательный энергетический баланс при кетозе покрывается в основном за счет глюконеогенеза, происходящего в основном в печени. Интенсивность глюконеогенеза и гликолиза регулируются биодоступностью фосфора, так как он играет важную роль в метаболизме углеводов в печени, в рамках которого все промежуточные продукты глюконеогенеза должны быть фосфорилированы (Berg, J. M., J. L. Tymoczo, and L. Stryer. 2006. Glycolysis and gluconeogenesis. Pages 433-474 in Biochemistry. 6th ed. J. M. Berg, J. L. Tymoczo, and L. Stryer, ed. W. H. Freeman and Company, New York, NY., Grunberg, W., R. Staufenbiel, P. D. Constable, H. M. Dann, D. E. Morin, and J. K. Drackley. 2009. Liver phosphorus content in Holstein-Friesian cows during the transition period. J. DairySci. 92:2106-2117.). Такую роль на себя берет бутафосфан, присутствующий в заявленном средстве. Кроме того, профилактика происходящих при кетозе нарушений связана с возможностью снятия нагрузки с глюконеогенеза и высвобождения, таким образом, оксалоацетата для получения энергии. Этот обходной путь связан с использованием пропионатного пути получения глюкозы в крови, а в качестве активаторов такого пути может быть использована янтарная кислота. Необходимо особо подчеркнуть, что при окислении глюкозы на синтез одной молекулы АТФ расходуется на 35-40% меньше кислорода, чем при окислении жирных кислот (ЖК), не только за счет метаболических особенностей процесса окисления глюкозы, но и за счет отсутствия необходимости активного транспорта жирных кислот в митохондрии, при котором происходит потребление АТФ. Увеличение утилизации свободных жирных кислот, которые активно накапливаются при кетозе, ведет к повышенному потреблению кислорода. В дальнейшем, при усугублении ишемии тканей, блокируется и бета-окисление ЖК, а затем и анаэробный гликолиз, что приводит к исчерпанию ресурсов для энергообразования (7 Смирнов, А.В. Янтарная кислота и ее применение в медицине / А.В. Смирнов. О.Б. Нестерова, Р.В. Голубев// Применение янтарной кислоты в медицине. - Нефрология. 2014 Том 18 №4. стр. 12-24).Процесс окисления жирных кислот идет с образованием большого количества побочных продуктов энергетического обмена - оксимасляной, ацетоуксусной кислот и ацетона, являющими причиной кетоза и ацидоза.
Выполняя каталитическую функцию по отношению к циклу Кребса, янтарная кислота снижает в крови концентрацию других интермедиатов данного цикла - лактата, пирувата и цитрата, накапливающихся в клетке на ранних стадиях гипоксии, обеспечивая уменьшение метаболического ацидоза. Суть антиацидотического действия состоит в следующем: если ресинтез АТФ происходит в реакциях гликолиза, протекающего вне митохондрий, то утилизируются не все продукты распада АТФ, а только АДФ и неорганический фосфат. Ионы водорода, которые и являются кислотными эквивалентами, остаются в клетке и выходят затем с избытком лактата в кровь. Если же энергообеспечение осуществляют митохондрии, то утилизируются все продукты гидролиза АТФ, включая ионы водорода. Таким образом, чем эффективнее работают митохондрии, чем больше их вклад в энергообеспечение, тем меньше метаболический ацидоз, вызванный интенсивной нагрузкой (см. интернет ресурс Е.И. Маевский, 2020 год,http://www.cardiometry.net/issues/no16-may-2020/high-performance-in-a-human-organism).
Таким образом, мы считаем, что композиция, состоящая из янтарной кислоты и органического соединения фосфора, может быть биологически активным средством направленного действия с целью профилактики и нормализации возможных нарушений в обмене веществ молочных коров, в т.ч. при кетозе (Грачева О.А. Острая токсичность и кумулятивные свойства нового метаболического препарата/ О.А. Грачева, Д.М. Мухутдинова.// Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2015, - №2. - стр. 284-286).
Известно средство, регулирующее метаболические процессы у животных «Катозал» (производство фирмы БАЙЕР АГ, Германия), представляющее собой комплексный препарат, в состав которого входят бутафосфан, цианокобаламин, солброл, вода (смотри интернет-ресурс https://animalhealth.bayer.ru/products/catosal-cows-pigs/.), который нашел свое применение для профилактики кетоза у сельскохозяйственных животных.
Недостатком известного технического решения является то, что Катозал и его аналоги обладают рядом побочных эффектов, за счет входящего в состав препарата цианокобаламина, который может вызывать аллергические явления, нервное возбуждение, активирует свертывающую систему крови, повышает риск тромбообразования. Кроме того, препарат импортного производства и имеет высокую стоимость.
Цианкобаламин способствует включению пропионовой кислоты в цикл Кребса и, как следствие, ускоряет использование ацетил-КоА в цикле трикарбоновых кислот, что особенно важно при возникновении в организме кетогенной ситуации, участвуя в переходе (реакция карбоксилирования) активированной пропионовой кислоты (пропенил-КоА) через метилмалонил-КоА в активированную янтарную кислоту (сукцинил-КоА)
Известен способ профилактики кетоза у высокопродуктивных молочных коров, включающий скармливание в рационе органической биологически активной добавки, причем в качестве добавки скармливают холинхлорид - 50 г/гол./дн., дигидрокверцетин - 200 мг/гол./дн. и кормовую добавку, содержащую 18% L-карнитина в дозе 15 г/гол./дн., которые вносят в комбикорм при кормлении коров по следующей схеме: в период за две недели перед отелом и в течение первого месяца лактации в комбикорм вносят холинхлорид, дигидрокверцетин и кормовую добавку, содержащую 18% L-карнитина, в течение второго месяца лактации - холинхлорид и кормовую добавку, содержащую 18% L-карнитина, в течение третьего и четвертого месяцев лактации в комбикорм вносят кормовую добавку, содержащую 18% L-карнитина. (Патент РФ № 2454228, МПК А61К 31/205; A61K 31/14; A61K 31/353; A61K 36/15; A61P 3/00, опубликованный 10.12.2011 г.)
Недостатком данного способа является длительность применения кормовой добавки (на протяжении полутора месяцев), что обуславливает снижение экономического эффекта при профилактике кетоза. Кроме того, дигидрокверцетин, используемый в составе кормовой добавки обладает низкой биологической доступностью, что является одним из основных затруднений, ограничивающих разработку новых фитопрепаратов на его основе, что в целом характерно для флавоноидов (Thilakarathna, S. H. Flavonoid Bioavailability and Attempts for Bioavailability Enhancement / S. H. Thilakarathna, H. P. V. Rupasinghe // Nutrients. - 2013. - Vol. 5 - P. 3367-3387, Akhlaghi, M. Bioavailability and Metabolism of Flavonoids: A Review / M. Akhlaghi, S. Foshati // International Journal of Nutrition Sciences. - 2017. - Vol. 2, N 4. - P. 180-184)
Наиболее близким является способ лечения субклинического кетоза у коров который включает введение пропиленгликоля в дозе 500 мл на голову с кормом 2 раза в день (утром 250 мл и вечером 250 мл) в течение 7 дней, дополнительно включают хотынецкие цеолиты в дозе 3% от сухой массы корма на голову и 15 г лецитина на 100 кг живой массы коровы в течение 7 дней однократно утром путем смешивания с комбикормом рациона. (Патент РФ №2492700, МПК А23K 1/175, опубликовано 20.09.2013 г.)
Недостатком данного способа является повышенная дозировка пропиленгликоля до 500 мл на голову в сутки. При дозировках выше 250-300 мл на голову в сутки, использование пропиленгликоля имеет побочный эффект, так как в рубце коровы он окисляется частично до - D-лактата (молочная кислота). В отличие от DL-лактата, в норме присутствующего в рубце, он плохо утилизируется рубцовой микрофлорой и подавляет ее, снижая рН и накапливаясь в организме. Вместе с тем передозировка пропиленгликолем вполне реальна при избыточном введении в рацион и недостаточном перемешивании с кормом.
В заявке указано, что положительное влияние хотынецких цеолитов при субклиническом кетозе объясняется тем, что данные цеолиты обладают сорбционной способностью по отношению к свободным радикалам и являются источниками минеральных элементов, в том числе и металлов с переменной валентностью, что приводит к увеличению активности ферментов-антиоксидантов. Но недостатком цеолитов является узкий спектр эффективности адсорбции; кроме того, наряду с микотоксинами, они связывают также и питательные вещества (витамины), так как имеют большой размер пор. Цеолиты представляют собой кристаллические водные алюмосиликатные минералы, имеющие более высокое в сравнении с микотоксинами сродство к воде; они связывают до 200% воды от своей первоначальной массы. Кроме того, при вводе данных сорбентов имеется риск блокирования элементов пищеварительной системы осаждающимися частицами глины. Также в указанном изобретении описано применение лецитина, гидролизованного - «Центролекс Ф», представляющего собой соевый лецитин в форме высококонцентрированных фосфолипидов. Наличие такого компонента, как соевый лецитин, обусловлено тем, что главным экспортером лецитина являются США, где соя составляет превалирующую масличную культуру. Однако большая часть используемой сои является генномодифицированной. Исследования показывают негативное воздействие пищи с добавлением генномодифицированной сои для здоровья лабораторных млекопитающих животных. С увеличением доли генномодифицированной сои в рационе животных обнаруживаются изменения в белково-липидном составе крови. Снижается устойчивость эритроцитов к гемолизу и их жизнеспособность, то есть выявлено влияние сои на некоторые показатели обменных процессов (Альба Н.А., Кузьмичева Л.В., Зиновьева Е.В., Бочкарева А.К., Лопатникова Е.А. Влияние ГМ-сои на белково-липидный состав крови животных // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2012. - №2. - с. 67-67 (6)). Кроме того, известно, что пищевая аллергия к соевым белкам - распространенное явление. Установленный рост повышенной чувствительности к соевым белкам требует дальнейшего более глубокого изучения аллергенного состава содержащих сою продуктов.
Цель заявляемого способа - создать эффективное лечение без проявления побочных осложнений.
Данный способ поясняется следующими иллюстрациями:
1) Фиг. 1. Содержание кетоновых тел у подопытных животных (M+m, п=10);
2) Фиг. 2. Некоторые показатели жирового обмена (M±m, п=10);
3) Фиг. 3. Динамика изменения общего билирубина в сыворотке крови подопытных коров;
4) Фиг. 4. Активность АСТ у подопытных коров;
5) Фиг. 5. Активность АЛТ у подопытных коров.
Поставленная цель достигается тем, что способ лечения субклинического кетоза у новотельных коров, включающий использование композиции, состоящей из 1% янтарной кислоты, 10% бутафосфана и 0,5% новокаина, дистиллированная вода - остальное, которую применяют трехкратно с интервалом 5-7 дней, внутримышечно в дозе 15 мл на животное, начиная с третьего-четвертого дня после отела.
Преимуществом заявленного средства по сравнению с Катозалом и его аналогами является то, что в составе уже содержится янтарная кислота, которая включается в биохимические реакции, сокращая путь образования энергии. Янтарная кислота в качестве антигипоксанта активирует сукцинатдегидрогеназный путь окисления глюкозы, что уменьшает кислородоемкий процесс окисления жирных кислот (продукция того же количества АТФ при меньшем потреблении О2).Способность прямо повышать энергосинтезирующую функцию митохондрий путем увеличения доставки и потребления сукцината ишемизированными клетками, участвовать в реализации феномена быстрого окисления янтарной кислоты сукцинатдегидрогеназой, а также активации митохондриальной дыхательной цепи, ведущих, в итоге, к быстрому ресинтезу АТФ. Бутафосфан, входящий в состав препарата, оказывает стимулирующее влияние на большинство обменных процессов в организме, повышает тонус гладкой мускулатуры, миокарда, улучшает регенерацию костной ткани. Стимулирует и нормализует метаболический и энергетический обмен, улучшает утилизацию глюкозы в крови, ускоряет процессы метаболизма за счет стимуляции АДФ-АТФ цикла, синтез протеина. Новокаин, входящий в состав препарата, обладает анальгезирующим действием при введении препарата в мышцу. Анализ масс-спектра смеси бутафосфана и янтарной кислоты указывает, что не происходит взаимодействия между компонентами смеси. В масс-спектре отсутствуют пики с другими значениями m/z. Пики ионов m/z 117 и m/z 178 относятся к аналитическим пикам молекул янтарной кислоты и бутафосфана соответственно. Данное вещество было запатентовано автором см патент РФ №2701503 «Лекарственное средство для нормализации метаболических процессов у животных», которое успешно применяется сегодня для лечения и профилактики заболеваний печени у животных.
Основанием для применения предлагаемой схемы является то, что в первую неделю после отела наступает наиболее критический период, когда в организме коровы складывается отрицательный энергетический баланс, связанный с неадекватным потреблением корма и расходом энергии на лактацию, который провоцирует тяжелые метаболические нарушения, в т.ч. кетоз. Ранее проведенными исследованиями установлено, что заявленное средство не является токсичным и может применяться в довольно больших дозах, однако нами в ниже приведенных результатах опыта средство испытано в дозах 10-15 мл на голову внутримышечно, наиболее выраженный эффект наблюдался от применения в дозе 15 мл на голову.
Пример. В целях изучения лечебного эффекта заявленного средства в условиях ООО «Сэт Иле» «Новая Шешма» отделения Тубылгытау Новошешминского района РТ было сформировано три группы коров, больных субклиническим кетозом, по 10 голов в каждой. Первой группе коров вводили трижды внутримышечно с интервалом в пять дней изучаемый состав в дозе 10 мл, второй - 15 мл, третья группа служила контролем.
Критериями оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий служили клинико-физиологические и морфологические показатели крови, которые изучали каждые 10 дней в течение опытного периода. Клинические исследования животных и морфологические исследования крови проводили общепринятыми методами.
Для начальной стадии заболевания характерны существенные изменения: кетонемия, кенонурия и кетолактия, что наблюдалось у животных на 8-10 день после отела.
Результаты исследования концентрации общих кетоновых тел и их фракций в сыворотке крови представлены в таблице, Фиг. 1. В наших исследованиях у коров, получавших препарат в различных дозах, основные показатели кетогенеза (ОКТ, АсАс, ВН) достоверно понижались, а коэффициент ВН/АсАс повышался. В то время как, в контрольной группе коров значение данных показателей снизилось незначительно, оставаясь на более высоком уровне относительно аналогов опытных групп.
Так, к третьему исследованию среднеарифметические значения концентрации общих кетоновых тел в крови животных опытных групп были достоверно ниже аналогичных показателей контрольной группы в 2-2,5 раза, что говорит о нормализации обменных процессов, тогда как в контрольной группе уровень кетогенеза остается без коррекции на высоком уровне.
Повышение второй фракции кетоновых тел (ацетон+ацетоуксусная кислота) в крови больных кетозом контрольных животных относительно первоначальных данных на фоне незначительного повышения ОКТ связано с нарушением синтетических процессов в организме, в частности в печени, и возрастающей степенью токсикоза, вызванной увеличением количества недоокисленных продуктов обмена.
Холестерин- предшественник гормонов надпочечников - глюкокортикоидов и минералокортикоидов, которые участвуют в процессах расщепления жирных кислот, образования кетоновых тел, развития секреторных клеток молочной железы. В начальный период лактации эти процессы усиливаются, в связи с чем повышение холестерина косвенно отражает интенсификацию метаболических процессов. К увеличению уровня холестерина может привести и избыточный кетогенез, поскольку холестерин синтезируется из молекул ацетилкоэнзима А.
В ходе проведенных нами исследований было установлено, что содержания холестерина у коров с субклиническим кетозом в нашем случае находится в пределах физиологических норм на протяжении всего периода эксперимента, однако к концу срока исследований в контрольной группе исследуемый показатель выше на 37-44% по сравнению с таковыми в опытных группах Фиг. 2.
Уровень триглицеридов во всех группах имел в динамике одинаковую тенденцию и был ниже нормативных значений на протяжении всего срока исследований в среднем на 44%.
При биохимическом исследовании крови выявлены изменения, характеризующие нарушения функциональной способности печени. В начале эксперимента уровень общего белка находился на высоком уровне, однако концентрация альбуминов в крови животных находилась на нижней границе нормы, что свидетельствует о нарушении белковосинтетической функции печени. Изменения наблюдались в показателях, имеющих непосредственное отношение к функциональному состоянию печени.
Так, в начале эксперимента у всех подопытных животных, уровень общего билирубина превышал нормативные значения в три раза, под влиянием терапии происходит его снижение в опытных группах к концу эксперимента, тогда как в контрольной группе незначительный рост показателя продолжается. К 30-м суткам исследований превышение концентрации общего билирубина у контрольных животных над таковыми у опытных коров составило 48-62 % Фиг. 3.
Аналогичная тенденция просматривается и в активности ферментов трансаминирования, которые являются наиболее значимым диагностическим параметром, поскольку они крайне чувствительны как показатели цитолитического синдрома. Повышение активности АСТ и АЛТ свидетельствует о повреждении гепатоцитов. Так при фоновом исследовании установлено повышение активности АСТ, Фиг. 4 в сыворотке крови больных кетозом коров на 20-25%. Введение в организм изучаемого препарата индуцировало нормализацию данного показателя, и к концу эксперимента активность АСТ у опытных животных было ниже, чем у животных в контрольной группе на 35-40% и достигла верхних границ референсных значений.
Уровень АЛТ в начале эксперимента был повышен незначительно на 8-10%, что типично для жирового поражения печени. Под влиянием препарата наблюдается аналогичное корректирующее действие, которое выражалось снижением практически в два раза уровня трансаминазы в группах, получавших терапию, тогда как у контрольных животных он оставался на исходном уровне, Фиг. 5.
Отмечено статистически значимое снижение и активности ГГТ в группах животных, принимающих препарат. Увеличенная в среднем на 35% активность данного фермента, снижается к концу сроков исследования до верхних нормативных значений в обеих опытных группах, получавших различные дозы испытуемого препарата, тогда как в контрольной он остается практически неизменным до конца опыта.
Активность щелочной фосфатазы у всех животных за весь период эксперимента находилась в пределах физиологически норм, незначительно повышаясь в контрольной группе.
Нормализация обменных процессов характеризовалась и повышением продуктивности, среднесуточный удой у новотельных коров в опытных группах был на 5,7 -9,6% выше, чем в контроле, что также что подтверждается нормализацией химического состава молока, его физико-химических свойств, а также санитарно-гигиенических показателей. За счет улучшения физиологического состояния и коррекции обменных процессов происходит увеличение массовой доли белка, лактозы и некоторых минеральных веществ в молоке, что, несомненно, повышает его биологическую ценность.
Таким образом, трехкратное внутримышечное введение средства коровам с субклиническим кетозом положительно влияет на состояние углеводно-белкового, жирового обменов, обладает гепатопротекторной активностью, устраняя основные патогенетические звенья кетоза.
Использование предлагаемого способа лечения кетоза дает возможность эффективно лечить коров без проявления побочных осложнений.