Хроматографическое выделение клеток и других сложных биологических материалов
CHROMATOGRAPHIC ISOLATION OF CELLS AND OTHER COMPLEX BIOLOGICAL MATERIALS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к хроматографическому выделению клетки-мишени или другого (сложного) биологического материала, в частности, с помощью колоночной хроматографии, такой как аффинная хроматография или гель-проникающая хроматография. Данное изобретение использует реагент связывания рецептора, который связывается с молекулой рецептора, расположенной на поверхности клетки-мишени. Способ, раскрытый здесь, также может быть определен как бесследовая технология аффинной хроматографии клеток (cell affinity chromatography technology, CATCH). Изобретение в целом дает новые способы бесследового выделения биологических материалов, таких как клетки, клеточные органеллы, вирусы и т.п. Изобретение также относится к устройству для выделения клеток и других сложных биологических материалов.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Выделение чистых и функциональных клеточных популяций того или иного типа клеток необходимо в различных терапевтических, диагностических и биотехнологических приложениях.
Авторы (Bonnafous et al., J. Immunol. Methods. 1983 Mar 11; 58 (1-2):93-107) описывают аффинную хроматографию клеток с лигандами, иммобилизованными расщепляемыми связями ртуть-сера, что означает лиганды, иммобилизованные ковалентными связями. В этом методе Bonnafous и др. Конъюгируют ртуть органический мерсалил натрисакриловые гранулы, несущие первичные аминогруппы. По Bonnafous и др., тиолированные лиганды могут быть ковалентно иммобилизованы на этой матрице посредством расщепляемых связей Hg-S. Два модельных исследования разделения клеток описаны Bonnafous и др.: (i) конканавалин А, тиолированный N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионатом и иммобилизованный на мерсалил-трисакриле; тимоциты мыши, связанные с Con-A-мерсалил-трисакрилом, были элюированыс подложки короткой тиольной обработкой, сохраняющей жизнеспособность клеток; (ii) анти-динитрофениловые антитела, модифицированные S-ацетил-меркаптоянтарным ангидридом и иммобилизованные на мерсалил-трисакриле; эритроциты барана, ранее помеченные тринитробензолсульфоновой кислотой, связанные с этой подложкой, были извлечены с помощью тиольнойобработки без гемолиза.
В этом контексте следует отметить, что хроматография является хорошо отработанной технологией разделения низкомолекулярных и высокомолекулярных молекул, в том числе белков. Этот метод также применяется для разделения клеток, в частности, в форме аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных лигандов, специфичных для желаемого типа клеток, таких как иммунолиганды. Например, различные подмножества Т-клеток были разделены путем помечения их моноклональными иммуноглобулинами и ввода в колонку с полиакриламидными гранулами, с которыми были ковалентно связаны кроличьи антимышиные lgG (Braun, R., et al., Journalof Immunological Methods (1982) 54, 251-258). В качестве дополнительного примера: лектин-аффинная хроматографии на колонке с использованием сефарозы 6МВ, ковалентно конъюгированной с агглютинином Dolichos biflorus, была использована для отделения лейкозных клеток от здоровых лейкоцитов (Ohba, H., et al, CancerLetters (2002) 184, 207-214).
Поскольку клетки, как правило, на порядки величин больше, чем молекулы белков, они вряд ли входят, в отличие от молекул белков, в поры гранул обычных хроматографических сорбентов. Использование сорбентов с большими порами не преодолевает существенно этот недостаток разделения из-за диффузионных ограничений. С другой стороны, площадь поверхности пор, доступной только для белков, обычно значительно превышает площадь поверхности, доступной для и молекул белков, и клеток. Таким образом, использование обычных хроматографических сорбентов для иммобилизации белковых или других рецепторосвязывающих лигандов для приготовления аффинной матрицы для клеток обычно требует использования расточительно большого избытка рецепторосвязывающих лигандов, поскольку большинство из них иммобилизованы в тех порах или полостях, которые недоступны клеткам. Специфические рецепторосвязывающие реагенты часто дороги и сложны в производстве в нужных масштабах, тем самым обращая на этот аспект серьезное внимание. Поэтому было предложено использовать монолитные сорбенты в форме криогелей в качестве альтернативного метода аффинной хроматографии клеток (см., напр., Dainiak, M.B., et al., Adv.Biochem.Engin./Biotechnol. (2007), 106, 101-127). Однако монолитные сорбенты редки, так что желательный сорбент может и не быть коммерчески доступным в виде монолитной колонки. Кроме того, в случае аффинной хроматографии, как правило, сохраняется необходимость удалять конкурирующее соединение, используемое для элюирования целевых клеток, из этих клеток.
Потенциальные преимущества монолитных сорбентов с точки зрения жизнеспособности клеток, таким образом, могут быть сведены на нет дополнительными процедурами, необходимыми для удаления соединения, используемого для элюирования клеток, из колонки аффинной хроматографии.
10
Наиболее важными используемыми в настоящее время методами выделения клеток являются магнито-ассистируемая сортировка клеток (MACK) и флуоресцентно-ассистируемая сортировка клеток (FACS™). Сортировка клеток с помощью проточной цитометрии, где обычно используются флуорофоры, в сочетании с антителами для маркировки клеток анализирует клетки индивидуально. Клетки разделяются с высокой скоростью под очень высокими давлениями с помощью устройства сортировки клеток. Технология FACS™ позволяет выделять клетки, помеченные с помощью набора маркеров, в одну стадию путем применения соответствующего набора антител с различными флуорофорами. Этот метод, таким образом, надежен, но долог, затратен и трудоемок. Очень долгие времена сортировки проточных цитометров неприемлемы для надлежащего процесса отбора, особенно для отбора из очень больших, разнообразных клеточных популяций, например, продуктов афереза, содержащих 1⋅10 клеток. Другим недостатком FACS™ является то, что сложные и подверженные помехам проточные цитометры вряд ли могут быть адаптированы к среде GMP, необходимой для выделения терапевтических клеточных продуктов. Кроме того, применяемые давления во время процедуры отбора клеток могут привести к нарушению функции клеточных эффекторов.
Магнито-ассистируемое выделение клеток является широко используемой системой для исследовательских и терапевтических применений. Хотя выход и чистота выделенных клеток умеренные, по сравнению с технологией FACS™, процедура отбора надежна и не требует сложной автоматизации. Основные недостатки магнито-ассистируемого выделения- остающиеся реагенты окрашивания, в том числе магнитные гранулы на выделенных клетках, которые могут поставить под угрозу эффекторную функцию выделенных клеточных популяций. Кроме того, последовательные позитивные процессы отбора невозможны из-за этих остающихся магнитных реагентов на выделенных клетках. Последовательные положительные процедуры отбора являются обязательными для выбора клеточных популяций, помеченных набором маркеров. Хотя до сих пор используются магнитные или флуоресцентные метки, значительным прогрессом в выделении клеток является технология Streptamer, которая описана, например, в международной патентной заявке WO 02/054065 и в патенте США 7776562, и в которой для обратимого окрашивания и выделения клеток используется реагент связывания рецептора, выказывающий низкоаффинное связывание с рецептором, расположенном на поверхности клетки. В отличие от используемой в настоящее время единичной позитивной селекции в сочетании с магнитной негативной селекцией (направленными на удаление всех клеточных популяций, кроме одной, интересующей),последовательная позитивная селекция с использованием технологии Streptamer с удалением низкоаффинного реагента связывания рецептора после каждого этапа выбора генерирует клеточные популяции с очень высокими чистотой и выходом.
Задачей настоящего изобретения является создание способа, а также устройства, которое преодолевает недостатки известных технологий для выделения клеток, например технологий FACS™ and MACK, описанных выше. Например, настоящее изобретение направлено на создание быстрой, эффективной и мягкой процедуры отбора клеток, особенно благоприятной для последовательного положительного отбора клеток для выделения сложных клеточных популяций, таких как регуляторные Т-клетки или центральные Т-клетки памяти для исследовательских, диагностических и особенно терапевтических целей. В идеале, этот новый способ и устройство также должны быть пригодны для выделения сложных биологических материалов, отличных от клеток.
Эта задача решается с помощью независимых пунктов формулы изобретения, в частности, способов, использований и расположений, как они изложены в независимых пунктах формулы.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает способы, наборы, расположения (каскады), комбинацию реагентов и использование хроматографической неподвижной фазы для выделения желаемой клетки, имеющей известную молекулу рецептора на поверхности, в том числе отделение такой клетки от других клеток, лишенных такого рецептора на их поверхности.
В соответствии с первым аспектом, изобретение предусматривает способ выделения клетки-мишени, где клетка-мишень имеет молекулу рецептора на поверхности клетки-мишени, способ включает:
получение образца, содержащего клетки-мишени,
D
-5
-1
получение реагента связывания рецептора, содержащего сайт связывания В и партнер связывания С, где сайт связывания В, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен специфически связываться с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени, причем константа диссоциации (K) связывания между реагентом связывания рецептора через сайт связывания В и молекулой рецептора имеет низкое сродство или же константа скорости диссоциации (koff) связывания между реагентом связывания рецептора через сайт связывания В и молекулой рецептора имеет значение примерно 3×10 c и более, где партнер связывания С, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен обратимо связываться с сайтом связывания гаффинного реагента, и
хроматографирование образца на подходящей неподвижной фазе, причем неподвижная фаза имеет иммобилизованный на ней аффинный реагент, где аффинный реагент содержит сайт связывания Z, причем указанный сайт связывания Ζ образует обратимую связь с партнером связывания С, присутствующем в реагенте связывания рецептора, и где сайт связывания В реагента связывания рецептора связывается с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени, тем самым обратимо иммобилизуя клетку-мишень на неподвижной фазе.
В соответствии со вторым аспектом, настоящее изобретение обеспечивает способ выделения клетки-мишени, где клетка-мишень имеет молекулу рецептора на поверхности клетки-мишени, способ включает:
получение образца, содержащего клетки-мишени, и реагента связывания рецептора, который содержит сайт связывания В и партнер связывания С, причем сайт связывания В, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен специфически связываться с молекулой рецептора, и
хроматографирование образца на подходящей неподвижной фазе, которая является матрицей гель-фильтрации и/или матрицей аффинной хроматографии, причем матрица гель-фильтрации и/или аффинной хроматографии содержит аффинный реагент, который содержит сайт связывания Ζ, специфически связывающийся с партнером связывания С, содержащимся в реагенте связывания рецептора, тем самым изолируя клетки-мишени.
В соответствии с третьим аспектом, данное изобретение обеспечивает способ хроматографического выделения клетки-мишени из образца, причем клетка-мишень имеет молекулу рецептора на поверхности клетки-мишени, каковой способ включает:
получение образца, содержащего клетки-мишени,
получение реагента связывания рецептора, содержащего сайт связывания В и партнер связывания С,
где сайт связывания В, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен специфически связываться с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени,
где партнер связывания С, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен обратимо связываться с сайтом связывания Ζ аффинного реагента, и
хроматографирование образца на подходящей неподвижной фазе, имеющей иммобилизованный на ней аффинный реагент,
причем аффинный реагент содержит сайт связывания Ζ, каковой сайт связывания Ζ образует обратимую связь с партнером связывания С, содержащемся в реагенте связывания рецептора, и сайт связывания В реагента связывания рецептора связывается с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени, тем самым обратимо иммобилизуя клетку-мишень на неподвижной фазе,
получение конкурирующего реагента, содержащего сайт связывания,
специфически связывающегося с сайтами связывания Ζ аффинного реагента;
нанесение конкурирующего реагента на первую неподвижную фазу, тем
самым разрушая нековалентные обратимые комплексы, образованные между (множеством) реагента(ов) связывания рецептора, молекулой рецептора и аффинным реагентом;
восстановление элюированного образца из элюата первой неподвижной фазы, где элюированный образец содержит клетки-мишени;
хроматографирование элюированного образца на второй подходящей неподвижной фазе, являющейся матрицей гель-фильтрации и/или матрицей аффинной хроматографии, причем матрица гель-фильтрации и/или аффинной хроматографии содержит аффинный реагент, содержащий сайты связывания Ζ, специфически связывающиеся с партнером связывания С, присутствующем в реагенте связывания рецептора, и
пропускание элюированного образца через вторую хроматографическую колонку.
-5
-1
В соответствии с четвертым аспектом, изобретение предусматривает использование реагента связывания рецептора и/или аффинного реагента для выделения клетки-мишени с помощью хроматографии с использованием неподвижной фазы, причем клетка-мишень имеет молекулу рецептора на поверхность клетки-мишени, а реагент связывания рецептора содержит сайт связывания В и партнер связывания С, сайт связывания реагента связывания рецептора способен специфически связываться с молекулой рецептора клетки-мишени, причем константа диссоциации (KD) связи между реагентом связывания рецептора через сайт связывания В и молекулой рецептора имеет низкую аффинность или константа скорости диссоциации (Koff) связи между реагентом связывания рецептора через сайт связывания В и молекулой рецептора имеет значение примерно 3×10 с и выше, и где партнер связывания С, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен обратимо связываться с сайтом связывания Ζ аффинного реагента.
В соответствии с пятым аспектом, изобретение обеспечивает применение одного из: стрептавидин, стрептавидин мутеин (аналог), авидин и аналог авидина, для выделения клетки-мишени с помощью хроматографии, где хроматография представляет собой гель-фильтрационную хроматографию.
В соответствии с шестым аспектом, настоящее изобретение предусматривает применение хроматографической матрицы, одной из: целлюлозная мембрана, пластмассовая мембрана, полисахаридный гель, полиакриламидный гель, агарозный гель, привитый на диоксид кремния полисахарид, привитый на диоксид кремния поливинилпирролидон, привитый на диоксид кремния полиэтиленоксид, поли-(2-гидроксиэтиласпартиамид) на диоксиде кремния, привитый на диоксид кремния поли-(N-изопропилакриламид), стирол-дивинилбензоловый гель, сополимер акрилата или акриламида и диола, сополимер полисахарида и N,N'-метиленбис акриламида и сочетание любых двух или более из них для разделения клеток, причем клетки содержат ядра.
В соответствии с седьмым аспектом, настоящее изобретение предусматривает каскад первой и второй неподвижной фаз для хроматографии, где первая неподвижная фаза предназначена для отделения клеток и определяется как матрица аффинной хроматографии, причем матрица аффинной хроматографии имеет иммобилизованный на ней аффинный реагент, а аффинный реагент имеет по крайней мере один сайт связывания Z, способный обратимо связываться с партнером связывания С, входящим в состав реагента связывания рецептора, вторая неподвижная фаза предназначена для отделения клеток-мишеней от других компонентов и является матрицей гель-фильтрации и/или матрицей аффинной хроматографии, причем матрица аффинной хроматографии или матрица гель-фильтрации и аффинной хроматографии содержит аффинный реагент с сайтом связывания Z, специфически связывающимся с названным партнером связывания С, присутствующим в реагенте связывании рецептора. В некоторых вариантах осуществления аффинный реагент, присутствующий в/иммобилизованный на первой неподвижной фазе, и вторая неподвижная фаза идентичны. В некоторых вариантах осуществления аффинным реагентом, присутствующим в/иммобилизованным на первой неподвижной фазе, и вторичной неподвижной фазой являются стрептавидин, стрептавидин мутеин, авидин или авидин мутеин.
Согласно восьмому аспекту, изобретение обеспечивает набор для выделения клетки-мишени, где клетка-мишень имеет молекулу рецептора на поверхности клетки-мишени, каковой набор включает
реагент связывания рецептора, содержащий сайт связывания В, и партнер связывания С, где сайт связывания В, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен специфически связываться с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени, при этом партнер связывания С, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен обратимо связываться с сайтом связывания Ζ на реагенте мультимеризации; и неподвижную фазу, предназначенную для отделения клеток, которая является матрицей гель-фильтрации и/или матрицей аффинной хроматографии, причем матрица аффинной хроматографии или матрица гель-фильтрации и аффинной хроматографии содержит аффинный реагент, имеющий сайт связывания Z, способный обратимо связываться с партнером связывания С, содержащимся в реагенте связывания рецептора.
В соответствии с девятым аспектом, настоящее изобретение обеспечивает способ выделения клетки-мишени, где клетка-мишень имеет молекулу рецептора на поверхности клетки-мишени, каковой способ включает:
получение образца, содержащего клетки-мишени,
получение реагента связывания рецептора, содержащего одновалентный сайт связывания В и партнер связывания С, где реагент связывания рецептора выбирается из группы: одновалентный фрагмент антитела, белковая связывающая молекула с иммуноглобулино-подобными функциями, аптамер и молекула МНС,
где одновалентный сайт связывания В, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен специфически связываться с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени, а партнер связывания С, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен обратимо связываться с сайтом связывания Z аффинного реагента, и хроматографирование образца на подходящей неподвижной фазе, имеющей иммобилизованный на ней аффинный реагент, который содержит сайт связывания Z, каковой сайт связывания Ζ образует обратимую связь с партнером связывания С, присутствующим в реагенте связывании рецептора, и сайт связывания В реагента связывания рецептора связывается с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени, тем самым обратимо иммобилизуя клетки-мишени на неподвижной фазе.
В соответствии с десятым аспектом, изобретение обеспечивает устройство для очистки клеток-мишеней, каковое устройство содержит по меньшей мере один каскад первой и второй неподвижной фаз для хроматографии. Первая неподвижная фаза этой системы предназначена для отделения клеток и является матрицей аффинной хроматографии, каковая матрица аффинной хроматографии имеет иммобилизованный на ней аффинный реагент, каковой аффинный реагент имеет по крайней мере один сайт связывания Ζ, способный обратимо связываться с партнером связывания С, входящим в состав реагента связывания рецептора. Вторая неподвижная фаза предназначена для отделения клеток и представляет собой матрицу гель-фильтрации и/или матрицу аффинной хроматографии. Матрица аффинной хроматографии или матрица гель-фильтрации и аффинной хроматографии содержит аффинный реагент, имеющий сайт связывания Ζ, специфически связывающийся с указанным партнером связывания С, присутствующим в реагенте связывания рецептора.
В соответствии с одиннадцатым аспектом, изобретение обеспечивает способ скрининга клетки-мишени для рекомбинантной экспрессии желаемой молекулы рецептора на поверхности клетки-мишени, при чем желаемая молекула рецептора должна экспрессироваться на поверхности клетки-мишени, каковой метод включает в себя:
получение образца, содержащего клетки-мишени, подозреваемые в рекомбинантной экспрессии желаемого целевого рецептора,
получение реагента связывания рецептора, содержащего сайт связывания В и партнер связывания С,
где сайт связывания В, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен специфически связываться с желаемой молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени,
где партнер связывания С, присутствующий в реагенте связывания рецептора, способен обратимо связываться с сайтом связывания Z аффинного реагента, и
хроматографирование образца на подходящей неподвижной фазе, имеющей иммобилизованный на ней аффинный реагент, причем аффинный реагент содержит сайт связывания Ζ, каковой сайт связывания Ζ образует обратимую связь с партнером связывания С, присутствующим в реагенте связывания рецептора, а сайт связывания В реагента связывания рецептора связывается с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени, тем самым обратимо иммобилизуя клетки-мишени на неподвижной фазе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Настоящее изобретение будет лучше понято на основе подробного описания при рассмотрении совместно с неограничивающими примерами и прилагаемыми рисунками. Эти рисунки иллюстрируют варианты способов осуществления настоящего изобретения. Без намерения быть связанными теорией, рисунки включают выводы в отношении основного механизма разделения. Выводы даются только в иллюстративных целях и служат лишь для визуализации того, как достижимое эффективное разделение могло бы выглядеть на молекулярном уровне.
На фиг. 1 показан вариант осуществления способа выделения клетки-мишени (2), имеющей на поверхности молекулу рецептора (4) (то есть клетка-мишень определяется наличием, по крайней мере, одной общей специфичной молекулы рецептора (4)). Образец, содержащий клетки-мишени, может также содержать дополнительные клетки (22), лишенные молекул рецептора (4), но вместо этого имеющие на своей поверхности различные рецепторные молекулы (44). Предусмотрен реагент связывания рецептора (1), например, в образце, содержащем клетки-мишени. Реагент связывания рецептора (1) имеет сайт связывания В (3), специфически связывающийся с молекулой рецептора (4). Реагент связывания рецептора (1) также включает в себя партнер связывания С (5), который может специфически и обратимо связываться с сайтом связывания Ζ (6) аффинного реагента (8). В некоторых вариантах осуществления реагент связывания рецептора может иметь одновалентный сайт связывания В и может быть одновалентным фрагментом антитела (например, фрагментом Fab, одноцепочечным фрагментом Fv или фрагментом Fv) или белковой связывающей молекулой с иммуноглобулино-подобными функциями, аптамером или молекулой МНС. В этом контексте следует отметить, что используемый в настоящем изобретении аффинный реагент также может иметь два или более сайтов связывания Z, которые могут быть связаны с партнером связывания С, тем самым обеспечивая мультимеризацию реагента связывания рецептора. Используемый здесь аффинный реагент может, таким образом, служить также реагентом мультимеризации. Аффинным реагентом может, например, быть стрептавидин, стрептавидин мутеин, авидин, авидин мутеин или их смесь. Кроме того, различные хроматографические матрицы в сочетании с различными аффинными реагентами могут быть расположены в колонке слоями, образуя многокомпонентную систему для разделения. Образец, содержащий реагент связывания рецептора (1) и клетки-мишени (2), приводят в контакт с хроматографической матрицей (19), на которой иммобилизован аффинный реагент (8). Аффинный реагент (8) имеет множество сайтов связывания Ζ (6), специфически связывающихся с партнером связывания С (5), присутствующем в реагенте связывания рецептора (1). Реагент связывания рецептора (1) связывается через партнера связывания С с сайтом связывания Ζ (6) на аффинном реагенте (8), тем самым иммобилизуя клетки-мишени (2) с помощью комплекса, образуемым одним или несколькими сайтами связывания Ζ аффинного реагента и сайтом связывания Ζ реагента связывания рецептора на хроматографической матрице (19). В результате образец обедняется клетками-мишенями (2), и клетка-мишень (2), таким образом, отделяется от других компонентов в образце, включая реагент связывания рецептора (1). В этом контексте следует отметить, что реагент связывания рецептора (1) может быть либо включен в образец, содержащий клетки-мишени, которые должны быть выделены, либо реагент связывания рецептора (1) может быть добавлен к хроматографической матрице (19) для связывания с иммобилизованным на ней реагентом мультимеризации (8) перед добавлением образца, содержащего клетки-мишени (см. также Экспериментальную часть). Когда такой матрицей аффинной хроматографии (19) заполнен картридж, ион используется для выделения клетки-мишени с помощью аффинной хроматографии, такой картридж также называется здесь «Картридж выделения». В этом отношении следует отметить, что этот метод хроматографии можно проводить как колоночную хроматографию или планарную хроматографию.
На фиг. 2 изображен еще один вариант осуществления способа выделения клетки-мишени (2) с рецепторными молекулами (4) на ее поверхности. Способ, показанный на фиг. 2, может быть осуществлен сам по себе или в сочетании с методом, показанным на фиг. 1 (в последнем случае способ по фиг. 2 осуществляется после способа по фиг. 1). Образец, используемый в способе по фиг. 2, включает в себя клетку-мишень (2), реагент связывания рецептора (1) и конкурирующий реагент (7). Реагент связывания рецептора (1) имеет сайт связывания В (3), который может специфически связываться с молекулой рецептора (4). Реагент связывания рецептора (1) также включает в себя партнер связывания С (5), который может специфически связываться с сайтом связывания Ζ (6) на аффинном реагенте (8) (аффинный реагент (8) может быть идентичен аффинному/мультимеризационному реагенту (8), показанному на фиг. 1). Аффинный реагент (8) имеет множество сайтов связывания Ζ (6), которые способны специфически связываться с партнером связывания С (5), который включен в реагент связывания рецептора (1). Кроме того, конкурирующий реагент (7) имеет сайт связывания (9), который способен связываться с сайтом связывания (6) на аффинном реагенте (8). Также может быть, что весь конкурирующий реагент (7) образует сайт связывания (9). В качестве примера случая, когда весь конкурирующий реагент образует сайт связывания (9): конкурирующий реагент (7) может быть биотином или производным биотина, имеющим сродство к стрептавидину или стрептавидин мутеину, в то время как партнер связывания С (5) реагента связывания рецептора (1) может быть стрептавидин-связывающим пептидом, «сплавленным» с реагентом связывания рецептора (1). И конкурирующий реагент (7), и реагент связывания рецептора (1) связываются с сайтом связывания (6) из множества сайтов связывания Ζ (6), которые включены в аффинный реагент (8). Таким образом, конкурирующий реагент (7) и реагент связывания рецептора (1) иммобилизованы на хроматографической матрице (19). В результате образец, содержащий клетки, обедняется конкурирующим реагентом (7) и реагентом связывания рецептора (1). Так как конкурирующий реагент (7) и реагент связывания рецептора (1) связываются с аффинным реагентом, который находится на хроматографической матрице (19), клетка-мишень (2) не связывается с хроматографической матрицей и будет, например, проходить через колонку, в которой такая хроматографическая матрица присутствует в качестве неподвижной фазы. Когда такой хроматографической матрицей (19) заполнен картридж, и он используется для обеднения/удаления реагентов из образца, содержащего (популяцию) клеток-мишеней, такой картридж в данном описании также называется «Картридж удаления». В этом отношении следует отметить, что этот метод хроматографии можно проводить как колоночную хроматографию или планарную хроматографию.
На фиг. З показан вариант осуществления способа разделения/выделения клетки-мишени, содержащей ядро (2). Готовится образец, содержащий клетку-мишень (2) и, необязательно, например, реагент связывания рецептора (1) и конкурирующий реагент (7). Образец загружают в хроматографическую колонку с матрицей гель-фильтрации (19), выбранной из матрицы, использующей хроматографическую матрицу, выбранную из группы: полисахаридный гель, полиакриламидный гель, агарозный гель, привитый на диоксид кремния полисахарид, привитый на диоксид кремния поливинилпирролидон, привитый на кремнезем полиэтиленоксид, поли-(2-гидроксиэтиласпартамид) на диоксиде кремния, привитый на диоксид кремния поли-(N-изопропилакриламид), стирол-дивинилбензольный гель, сополимер акрилата или акриламида и диола, сополимер полисахарида и N,N'-метиленбисакриламида и комбинация любых двух или более из них. Как только образец проходит через матрицу гель-фильтрации (19), реагент связывания рецептора (1) и конкурирующий реагент (7) остаются на колонке дольше. Данные реагенты могут, например, входить в поры матрицы гель-фильтрации, а клетки-мишени (2) элюируются и зхроматографической колонки раньше и могут быть собраны для дальнейшего использования.
На фиг. 4 изображен еще один вариант осуществления способа выделения клетки-мишени (2), заданной присутствием, по меньшей мере, одной общей специфичной молекулы рецептора (4) на ее поверхности. В этом способе используются первая хроматографическая колонка (картридж выбора) и вторая хроматографическая колонка (картридж удаления). Готовится образец, содержащий, среди прочего, клетки-мишени (2) с рецепторными молекулами (4) и другие клетки (22) с различными рецепторными молекулами (44) на поверхности. Образец также содержит реагент связывания рецептора (1), который имеет сайт связывания В (3), специфически связывающийся с молекулой рецептора (4). Реагент связывания рецептора (1) также включает в себя партнер связывания С (5), специфически связывающийся с сайтом связывания Ζ (6) аффинного реагента (8). Образец загружают в первую хроматографическую колонку с подходящей неподвижной фазой в виде матрицы аффинной хроматографии (29), каковая матрица аффинной хроматографии (29) имеет иммобилизованный на ней аффинный реагент (8). Образуется нековалентный обратимый комплекс между большим количеством реагента связывания рецептора (1), аффинным (мультимеризационным) реагентом (8) и клеткой-мишенью (2), но не другими клетками (22). Другие клетки будут проходить через первую хроматографическую колонку спонтанно или после промывки хроматографической колонки (необязательный этап промывки на фиг. 4 не показан). Затем в хроматографическую колонку загружают конкурирующий реагент (7). Конкурирующий реагент (7) имеет сайт связывания (9) (или весь представляет собой сайт связывания), способный связываться с сайтом связывания Ζ (6) аффинного реагента (8). Присутствует много конкурирующего реагента (7), и его часть образует комплекс с аффинным реагентом (8), тем самым иммобилизуясь на хроматографической матрице (29). В результате этого конкурентного связывания нарушается связь партнера связывания С (5), включенного в реагент связывания рецептора (1), с сайтом связывания Ζ. Тем самым реагент связывания рецептора высвобождается из хроматографической матрицы (29) и, следовательно, также распадается нековалентный обратимый комплекс, образованный между реагентом связывания рецептора (1), аффинным реагентом (8) и клеткой-мишенью (2). Собирают элюированный образец из элюата первой хроматографической колонки, который включает клетки-мишени (2), конкурирующий реагент (7) и реагент связывания рецептора (1). Элюированый образец загружают во вторую хроматографическую колонку с подходящей неподвижной фазой, являющейся одновременно матрицей аффинной хроматографии (19) и, в то же время, которая может действовать как гель-проникающая матрица. Матрица аффинной хроматографии (19) имеет иммобилизованный на ней аффинный реагент (8). Аффинный реагент (8) может, например, быть стрептавидином, стрептавидин мутеином, авидином, авидин мутеином или их смесью. Реагент связывания рецептора (1) и конкурирующий реагент (7) связываются с сайтом связывания Ζ (6) на аффинном реагенте (8), тем самым иммобилизуясь на хроматографической матрице (19). В результате элюированный образец, содержащий выделенные клетки-мишени, обедняется реагентом связывания рецептора(1) и конкурирующим реагентом (7). Клетки-мишени, освобожденные от любых реагентов, теперь находятся в состоянии для дальнейшего использования, например, для диагностических приложений (например, дальнейшей сортировки FACS™) или любых клеточных терапевтических применений.
На фиг. 5 показаны результаты эксперимента по обогащению клеток CD8+ из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Этот эксперимент проводили на двух колонках, обе содержали смолу Sephadex-50 в сочетании со Streptactin как аффинным реагентом, и с использованием фрагмента Fab, связывающего CD8, в качестве одновалентного реагента связывания рецептора, несущего стрептавидин-связывающий пептид в качестве партнера связывания С. Диаграммы В-D показывают результаты выделения в соответствии со способом настоящего изобретения, а диаграммы E-G показывают результат для отрицательного контроля.
Фиг. 6а и фиг. 6b - схематические чертежи варианта реализации устройства согласно изобретению для выделения клеток с использованием, по меньшей мере, одного последовательного каскада картриджа выбора и картриджа удаления. Устройство 10 на фиг. 6а содержит перистальтический насос 102 и различные клапаны (например магнитные клапаны), контролирующие потоки жидких фаз (образец буфера, промывочный буфер, элюент), которые используются в хроматографическом выделении клеток-мишеней. Перистальтический насос и клапаны управляются микропроцессором (не показан). Отдельные резервуары и картриджи в устройстве 10 соединены друг с другом гидравлически с помощью трубок 400. Устройство 10 содержит буферный резервуар 114, который гидравлически соединен через отверстие для впуска образца трубкой 400 с резервуаром 116, содержащим образец (например, клетки крови или другие клетки организма), включающим клетки-мишени, подлежащими очищению. Образец клеток, содержащийся в подходящем буфере, затем пропускается через первый картридж у выбора 104, содержащий соответствующую неподвижную фазу, как объяснено на фиг. 3, в виде матрицы аффинной хроматографии с иммобилизованным на ней аффинным реагентом. В картридже выбора клетки-мишени, несущие специфическую общую рецепторную молекулу первого вида, иммобилизованы посредством реагента связывания рецептора, специфически связывающим рецепторные молекулы первого вида. Клетки, не несущие молекулы рецептора первого вида, проходят через колонку и выбрасываются в резервуар с отходами 112. Затем в колонку вводят элюент (конкурирующий агент, как описано в настоящем документе), хранящийся в резервуаре элюирующего буфера 110, что разрушает обратимую связь между аффинным реагентом и реагентом связывания рецептора и, следовательно, приводит к элюированию клеток-мишеней. Элюат, содержащий клетки-мишени, затем пропускается через картридж удаления 106, который содержит, как объяснено на фиг. 3, вторую неподвижную фазу, на которой присутствует аффинный реагент. В то время как аффинный реагент иммобилизует реагент связывания рецептора и конкурирующий реагент, очищенные клетки-мишени проходят через эту колонку и направляются на второй каскад картриджа выбора 204 и картриджа удаления 206. Эти клетки-мишени очищаются на этом втором каскаде посредством общей специфической рецепторной молекулы второго вида, как объяснялось выше, причем клетки, не несущие рецепторную молекулу второго видана своей поверхности, протекают через картридж выбора и удаляются через второй резервуар для отходов 212. На фиг. 6а буферный резервуар элюирования 110, гидравлически соединенный с картриджем выбора 204 второго последовательного каскада картриджа выбора и картриджа удаления, изображен в качестве дополнительного резервуара к тому (резервуару), который подключен к картриджу выбора 104. Однако в случае использования такого же конкурирующего реагента, устройство 10 может включать только один буферный резервуар элюирования, гидравлически соединенный с картриджем выбора каждого из множества «каскадов картриджей». Наконец, картридж удаления 206 гидравлически соединен с отверстием выпуска образца 214 для сбора выделенных клеток-мишеней. Устройство на фиг. 6b имеет аналогичную конструкцию из трех последовательно соединенных «каскадов картриджей», каждый из которых состоит из картриджа выбора и картриджа удаления. Устройство на фиг. 6b также включает в себя узел управления температурой для поддержания постоянной температуры, например, 4°С, 15°С или 25°С.
На фиг. 7а-7с показаны результаты дальнейшего эксперимента по обогащению человеческих клеток CD8+ из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), причем фиг. 7а показывает начальный образец МКПК, фиг. 7b - фракцию промывки с негативной реакцией на клетки CD8+, a фиг. 7с - фракцию элюата с положительной реакцией на CD8+.
Фиг. 8а-8с показывают результаты эксперимента по обогащению клеток человека CD8+ из цельной крови, причем фиг. 8а показывает исходный образец цельной крови, фиг. 8b - фракцию промывки с негативной реакцией на клетки CD8+, и фиг. 8в - фракцию элюата с положительной реакцией на CD8+.
На фиг. 9а-9с показаны результаты эксперимента по обогащению мышиных клеток CD4+ из спленоцитов, причем фиг. 9а показывает начальный образец спленоцитов, фиг. 9b - фракцию промывки с негативной реакцией на клетки CD4+, и фиг. 9в - фракцию элюата с положительной реакцией на CD4+.
Фиг. 10а-10с показывают результаты эксперимента по обогащению клеток человека CD4+ из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), причем фиг. 10а показывает начальный образец МКПК, фиг. 10b - фракцию промывки с негативной реакцией на клетки CD4+, и фиг. 10с - фракцию элюата с положительной реакцией на CD4+.
Фиг. 11a-11с показывают результаты эксперимента по обогащению клеток человека CD4+ из цельной крови, причем фиг. 11а показывает начальный образец цельной крови, фиг. 11b - фракцию промывки с негативной реакцией на клетки CD4+, и фиг. 11с - фракцию элюата с положительной реакцией на CD4+.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает способы и устройства выполнения жидкостного хроматографического разделения клеток и других биологических объектов, таких как клеточные органеллы, вирусы, липосомы и т.п. (ссылка на клетки-мишени в нижеследующем, таким образом, также подразумевает ссылку на все другие биологические объекты). Клетка-мишень или популяция клеток-мишеней выделяется из образца, который, например, может включать в себя множество различных клеток или клеточных популяций. Практически любая названная клетка-мишень, которая имеет, по крайней мере, одну общую рецепторную молекулу на своей поверхности, может быть отделена от других компонентов, содержащихся в образце. Для достижения эффекта авидности, как обсуждается ниже, для аффинной хроматографии, как описано здесь, молекула рецептора обычно присутствует в двух или более экземплярах на поверхности клетки-мишени. Термин «клетка-(мишень)», используемый здесь, охватывает все биологические объекты/везикулы, в которых мембрана (которая может быть липидным бислоем) отделяет внутреннее содержание от внешней среды (атмосферы) и которые содержат один или несколько видов специфических рецепторных молекул(ы) на поверхности биообъекта/везикулы. Это означает, что клетка-мишень/биологический объект/везикула или популяция клеток-мишеней определяется наличием, по крайней мере, одной общей специфичной молекулы рецептора на поверхности. «Выделение», в том смысле, как используется здесь, означает, что образец, получающийся в результате способа по настоящему изобретению, обогащается клетками-мишенями по сравнению с их содержанием (концентрацией) в образце, который был дан для выделения клетки-мишени. Это означает, что образец может быть обогащен клетками-мишенями, например, от содержания около 0,1% от общего количества клеток в образце, до, скажем, около 10% или более, или 20% или более, 30% или более, 40% или более, в образце, полученном способом по настоящему изобретению. «Выделенный» также означает, что полученный образец содержит клетки-мишени как по существу единственный вид клеток (клеточных популяций), например, клетки-мишени составляют более 75%, или более 80%, или более 85%, или более 90%; или более 95%, или более 97%, или более 99% от клеток, присутствующих в образце. «Выделенный» также включает то, что образец, содержащий клетки-мишени, лишен реагентов (например, реагентов связывания рецептора или конкурирующих реагентов, как определено здесь) после прохождения выделения/очистки по настоящему изобретению. Термин «выделение» также включает обнаружение (детекцию)отсутствия клеток-мишеней в образце. Соответственно, выделение клеток-мишеней может быть использовано либо в аналитических, либо в препаративных целях (например, для обнаружения присутствия популяции клеток-мишеней, также для количественной оценки присутствующих в образце клеток или для выделения клеток в большом масштабе для клеточной терапии). Аналитические цели включают диагностические приложения, а также фундаментальные исследования, в которых, например, способ выделения по изобретению используется для целей скрининга, например, является ли определенная молекула рецептора, например рецептор, связанный c G-белком (GPCR), или любой другой физиологически соответствующий рецептор (например, рецептор инсулина), рекомбинантно экспрессированной в выбранных клетках-хозяевах (см. также ниже).
+
+
+
+
В некоторых вариантах осуществления клетка может быть прокариотической клеткой, такой как бактериальная клетка. Клетка может в некоторых вариантах быть архебактерией. «Клетка»в некоторых вариантах может быть вирусом или органеллой, такой как митохондрия, хлоропласт, микросома, лизосома, аппарат Гольджи или ядро. В некоторых вариантах осуществления клетка может быть эукариотической клеткой, такой как растительная клетка, грибковая клетка, дрожжевая клетка, одноклеточное простейшее или животная клетка. Клетка-мишень включает в некоторых вариантах клеточное ядро. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, в том числе клетки грызунов, или амфибий, например подкласса Lissamphibia, который включает, например, лягушек, жаб, саламандр и тритонов. Примеры клеток млекопитающих включают, не ограничиваясь, клетки крови, клетки спермы и клетки ткани, например, клетки гепатоцитов или стволовые клетки, например, CD34-позитивные периферические стволовые клетки или экспрессирующие стволовые клетки Nanog или Oct-4, полученные из соответствующего источника. Клеткой крови может быть, например, лейкоцит или эритроцит. Лейкоцитом может быть, например, нейтрофил, эозинофил, базофил, моноцит, лимфоцит, макрофаг или дендритная клетка. Соответствующим лимфоцитом может быть, например, Т-клетка- в том числе CMV-специфический CD8+ Т-лимфоцит, цитотоксическая Т-клетка, Т-клетка памяти (иллюстративный пример Т-клетки памяти - специфические центральные Т-клетки памяти CD62LCD8) или регуляторная Т-клетка (иллюстративный пример Treg - клетки CD4CD25CD45RA+ Treg), Т-хелпер, например CD4+ Т-хелпер, В-клетка или естественная клетка-киллер, это лишь несколько наглядных примеров.
Тот факт, что популяция клеток-мишеней или, как упоминалось выше, любая другая популяция биологических объектов, в которых мембрана (которая может быть липидным бислоем) разделяет внутреннее содержимое от внешней среды, и которые дополнительно характеризуются наличием общей специфичной рецепторной молекулы на поверхности, могут быть очищены с помощью способов по настоящему изобретению с последующим удалением любого используемого реагента очистки (реагента связывания рецептора, конкурирующего реагента, аффинного/мультимеризационного реагента), предлагает - кроме того преимущества, что, если цель - клетка или органелла, ее физиологический статус не будет изменен - то официальное преимущество, что пациенту не вводятся реагенты очистки при использовании таких очищенных биообъектов в качестве лекарственных средств. В таких случаях регулирующие органы, такие как FDA (США) или ЕМЕА (Европа), требуют менее дорогостоящих ограничений в отношении производственных процессов для указанных реагентов очистки, чем в случаях, когда реагент очистки вводится вместе с медикаментом, которым является клетка или липосома. Таким образом, существует также ясное техническое преимущество в отношении способов по настоящему изобретению для очистки объектов, чей физиологический статус не может меняться, таких как липосомы, например, если такие липосомы должны быть очищены и использованы в качестве лекарственных средств.
Примеры млекопитающих включают, не ограничиваясь, крыс, мышей, кроликов, морских свинок, белок, хомяков, ежей, кошек, утконосов, американскую пищуху, броненосецев, собак, лемуров, коз, свиней, опоссумов, лошадей, слонов, летучих мышей, сурков, орангутангов, макак-резусов, шерстистых обезьян, макак, шимпанзе, тамаринов (saguinusoedipus), мартышек и человека. Клетка может быть, например, клеткой ткани, такой как орган или его часть. Примеры соответствующего органа включают, не ограничиваясь, ткани надпочечников, кости, крови, мочевого пузыря, мозга, хрящей, толстой кишки, глаза, сердца, почек, печени, легких, мышц, нервов, яичников, поджелудочной железы, простаты, кожи, тонкого кишечника, селезенки, желудка, яичек, тимуса, опухоли, сосудистую ткань или ткань матки или соединительную ткань. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой стволовую клетку.
Образец, из которого должна быть выделена клетка-мишень, может быть любого происхождения. Он может, например (не ограничиваясь), быть получен из людей, животных, растений, бактерий, грибков или простейших. Соответственно, любой из следующих образцов выбирается из, не ограничиваясь, группы, состоящей из образца почвы, пробы воздуха, экологического образца, образца культивирования клеток, образца костного мозга, образца осадков, образца радиоактивных осадков, образца сточных вод, образца грунтовых вод, образца абразива, археологического образца, образца пищи, образца крови (в том числе цельной крови), образца сыворотки, образца плазмы, мочи, кала, спермы, лимфатического жидкого образца, образца спинномозговой жидкости, образца смыва носоглотки, образца мокроты, образца мазка изо рта, образца мазка из зева, образца мазка из носа, образца бронхоальвеолярного смыва, образца бронхиальной секреции, образца молока, образца амниотической жидкости, образца биопсии, образца раковой опухоли, образца опухоли, образца ткани, образца клеток, образца культуры клеток, образца клеточного лизата, образца вирусной культуры, образца ногтей, образца волос, образца кожи, судебного образца, образца инфекции, образца нозокомиальной инфекции, космического образца или любой их комбинации. Где необходимо, соответствующий образец может быть предварительно обработан в любой степени. Как иллюстративный пример, образец ткани может быть сброжен, гомогенизирован или центрифугирован перед использованием в способе согласно настоящему изобретению. В другом иллюстративном примере образец жидкости организма, такой как кровь, может быть получен стандартным выделением клеток крови. Если описанный здесь метод выделения используется для фундаментальных исследований, образцом могут быть клетки экспериментов in vitro по культивированию клеток. Образец обычно подготовлен в виде жидкости, например, в виде раствора или дисперсии.
Как правило, хроматографический способ по настоящему изобретению представляет собой флюидную (газо- или жидкостную) хроматографию, обычно жидкостную хроматографию. Такая хроматография может проводиться в проточном режиме, при котором образец жидкости, содержащей клетки, которые должны быть выделены, вводится, например, самотеком или с помощью насоса, с одного конца колонки, содержащей хроматографическую матрицу, и жидкий образец покидает колонку на другом ее конце (см. тж. примеры 1-7). Кроме того, хроматографию можно проводить в режиме «вверх и вниз», в котором образец жидкости, содержащей клетки, которые должны быть выделены, вводится, например с помощью пипетки, с одного конца колонки, содержащей хроматографическую матрицу, упакованную в наконечник пипетки, и образец жидкость поступает в и покидает хроматографическую матрицу/наконечник пипетки с другого конца колонки (см. примеры 8-10). Альтернативно, хроматографию также можно проводить в пакетном режиме, когда материал хроматографии (неподвижную фазу) инкубируют с образцом, который содержит клетки, например, путем встряхивании, вращения или повторного контакта, и удаляют жидкий образец, например, с помощью пипетки. Любой материал может быть использован в качестве хроматографической матрицы в контексте настоящего изобретения, при условии, что этот материал пригоден для хроматографического выделения клеток. Подходящий хроматографический материал, по меньшей мере, по существу безвреден, т.е. не влияет на жизнеспособность клеток (или жизнеспособность или стабильность биологического объекта) при использовании в набивной хроматографической колонке при обычных условиях выделения клеток и/или разделения клеток. Хроматографическая матрица, используемая в настоящем изобретении, остается в заранее определенном месте, обычно в заранее определенном положении, в то время как расположение образца, подлежащего разделению, и его компонентов изменяется. Таким образом, хроматографическая матрица служит«неподвижной фазой» в соответствии с обычным пониманием специалиста в данной области, т.е. неподвижная фаза является частью хроматографической системы, через которую протекает подвижная фаза (сквозным потоком или в пакетном режиме), и где происходит распределение между фазами компонентов, содержащихся в жидкой фазе (растворенных или диспергированных). Термины «хроматографическая матрица» и «неподвижная фаза», таким образом, в данном документе используются взаимозаменяемо. В этой связи следует отметить, что частицы, такие как свободно подвижные магнитные гранулы, которые добавляются в жидкий образец, смешиваются с образцом и затем удаляются из него, например, путем сливания супернатанта (жидкость) при удержании гранул временно на месте (например, с помощью внешнего магнитного поля или центрифугирования), не являются неподвижной фазой, как она понимается здесь. Таким образом, способ, в котором такие (магнитные) гранулы добавляют к образцу, содержащему клетки-мишени для иммобилизации клеток-мишеней (через комплекс, образованный между клетками-мишенями, реагентом связывания рецептора и аффинным/мультимеризационным реагентом) на таких гранулах, и гранулы затем отделяют от образца, например, временно удерживая гранулы на месте при сливании супернатанта, не является способом согласно настоящему изобретению.
Как правило, соответствующая хроматографическая матрица имеет вид твердой или полутвердой фазы, а образец, содержащий клетки-мишени, подлежащие выделению/разделению, является жидкой фазой. Подвижная фаза, используемая для достижения хроматографического разделения, подобна жидкой фазе. Хроматографическая матрица может быть материалом в виде частиц (любого подходящего размера и формы) или монолитным хроматографическим материалом, в том числе бумажной подложкой или мембраной (см. раздел Примеры). Таким образом, хроматография может быть колоночной хроматографией, а также планарной хроматографией. В дополнение к стандартным хроматографическим колонкам, колонки, предусматривающие двунаправленный поток, например, колонки PhyTip, фирма PhyNexus, Inc, Сан-Хосе, Калифорния, США, или наконечники пипеток могут быть использованы для хроматографического разделения клеток в колоночном/проточном режиме, как описано здесь. Таким образом, наконечники пипеток или колонки, предусматривающие двунаправленный поток, также охватываются используемым здесь термином «хроматографические колонки». Если используется матричный материал в виде частиц, этот матричный материал в виде частиц может, например, иметь средний размер частиц от примерно 5 мкм до примерно 200 мкм, или от примерно 5 мкм до примерно 400 мкм, или от примерно 5 мкм до примерно 600 мкм. Как подробно объясняется ниже, хроматографическая матрица может, например, представлять собой или включать в себя полимерную смолу или оксид металла или оксид металлоида. При использовании планарной хроматографии материал матрицы может быть любым материалом, подходящим для планарной хроматографии, таким как обычная целлюлозная мембрана или мембрана на основе органического полимера(например, бумажная мембрана, нитроцеллюлозная мембрана или поливинилидендифторидная (ПВДФ) мембрана) или стеклянная пластина, покрытая кремнеземом. В одном варианте осуществления хроматографической матрицей/неподвижной фазой является немагнитный материал или ненамагничивающийся материал.
Немагнитные или ненамагничивающиеся хроматографические неподвижные фазы, использующиеся в данной области техники и также пригодные в настоящем изобретении, включают дериватизированный диоксид кремния или сшитый гель. Сшитый гель (обычно в форме гранул) может быть на основе природного полимера, т.е. класса полимеров, которые встречаются в природе. Например, природный полимер, на котором основана хроматографическая неподвижная фаза, представляет собой полисахарид. Соответствующий полисахарид обычно сшит. Примером полисахаридной матрицы является агарозный гель (например, агароза SuperflowAo™ или материал Sepharose, такой как SuperflowTM Sepharose, которые коммерчески доступны с различными размерами гранул и пор) или гель сшитого декстрана(ов). Дополнительный иллюстративный пример - агарозная матрица из сшитых частиц, с которой ковалентно связан декстран, которая коммерчески доступна (с различными размерами гранул и пор), такая как Sephadex или Superdex, обе производятся компанией GE Healthcare. Другим показательным примером такого хроматографического материала является Sephacryl, который также доступен с различными размеры гранул и пор в компании GE Healthcare.
Сшитый гель может также основываться на синтетическом полимере, т.е. на классе полимеров, которые не встречаются в природе. Обычно такой синтетический полимер, на котором основана хроматографическая неподвижная фаза для отделения клеток, представляет собой полимер с полярными мономерными звеньями, который, следовательно, полярен сам по себе. Такой полярный полимер является гидрофильным. Гидрофильные («влаголюбивые») молекулы, также называемые липофобными («боящимися жира»), содержат фрагменты, способные к диполь-дипольным взаимодействиям с молекулами воды. Гидрофобные («боящиеся воды») молекулы, также называемые липофильными, имеют тенденцию отделяться от воды.
Иллюстративные примеры подходящих синтетических полимеров - полиакриламид(ы), стирол-дивинилбензольный гель и сополимер акрилата и диола или акриламида и диола. Иллюстративным примером является полиметакрилатный гель, коммерчески доступный как Fractogel. Еще одним примером является сополимер этиленгликоля и метакрилата, коммерчески доступный как Toyopearl. В некоторых вариантах хроматографическая неподвижная фаза может также включать природные и синтетические полимерные компоненты, такие как композитная матрица или композит или сополимер полисахарида и агарозы, например, композит полиакриламид/агароза или полисахарид и N,N'-метиленбисакриламид. Иллюстративным примером сополимера декстрана и N,N'-метиленбисакриламида является вышеупомянутая серии материалов Sephacryl. Производные кремнезема могут включать частицы кремнезема, которые соединены с синтетическим или натуральным полимером. Примеры таких вариантов включают, не ограничиваясь, привитый на диоксид кремния полисахарид, привитый на диоксид кремния поливинилпирролидон, привитый на диоксид кремния полиэтиленоксид, привитый на кремнезем поли-(2-гидроксиэтиласпартамид)и привитый на диоксид кремния поли-(N-изопропилакриламида).
Хроматографической матрицей, используемой в настоящем изобретении, в некоторых вариантах его осуществления может быть гель-фильтрационная (также известная как эксклюзионная) матрица, например, при использовании в картридже удаления, как описано здесь. Гель-фильтрация может быть охарактеризована тем свойством, что она не предусматривает, по меньшей мере, существенно, никакого взаимодействия с клетками, которые подлежат разделению. Таким образом, матрица гель-фильтрации позволяет разделять клетки или другие биологические объекты, как описано здесь, в значительной степени на основе их размера. Соответствующая хроматографическая матрица, как правило, предстает в виде пористых частиц материала, как упоминалось выше. Хроматографическая матрица может иметь определенный предел эксклюзии, который обычно задается в единицах молекулярной массы, выше которой молекулы полностью исключаются от попадания в поры. Соответствующий молекулярный вес, определяющий эксклюзионный предел, может быть выбран ниже веса, соответствующего весу клетки-мишени (или биологического объекта), которые должны быть выделены. В таком варианте осуществления исключается попадание клеток-мишеней в поры матрицы эксклюзионной хроматографии. Подобно этому, неподвижная фаза, являющаяся матрицей аффинной хроматографии, может иметь поры размером меньше, чем размер выбранной клетки-мишени. В иллюстративных вариантах осуществления матрица аффинной хроматографии и/или матрица гель-фильтрации имеет средний размер пор от 0 до примерно 500 нм.
Другие компоненты, присутствующие в образце, такие как рецепторо-связывающие молекулы или конкурирующий реагент, могут иметь размер ниже предела эксклюзии пор и могут входить в поры матрицы эксклюзионной хроматографии. Из таких компонентов, которые способны полностью или частично входить в объем пор, более крупные молекулы, с меньшим доступом к объему пор, обычно элюируют раньше, тогда как меньшие молекулы элюируют позже. В некоторых вариантах осуществления эксклюзионный предел матрицы эксклюзионной хроматографии выбирается ниже максимальной ширины клетки-мишени. Таким образом, компоненты, имеющие доступ к объему пор, как правило, остаются в эксклюзионной хроматографической матрице дольше, чем клетки-мишени. Таким образом, клетки-мишени могут быть собраны в элюате хроматографической колонки отдельно от других компонентов образца. Поэтому такие компоненты, как реагент связывания рецептора, или, где используется, конкурирующий реагент, элюируются в более поздний момент времени с гель-фильтрационной матрицы, чем клетки-мишени. Этот эффект разделения возрастает еще больше, если гель-проникающая матрица содержит аффинный реагент (обычно ковалентно связанный с ней), который содержит участки связывания, например, сайты связывания Z, способные связывать реагенты, такие как реагент связывания рецептора и/или конкурирующий реагент, присутствующие в образце. Реагент связывания рецептора и/или конкурирующий реагент будут связаны с сайтами связывания Ζ аффинного реагента и тем самым иммобилизованы на гель-проникающей матрице. Этот метод обычно осуществляют в картридже удаления, используемом в настоящем изобретении, и в некоторых вариантах способ, сочетание и комплект в соответствии с изобретением включают и/или используют такую матрицу гель-фильтрации. В соответствующем способе клетки соответственно разделяются на основе их размера.
Хроматографическая матрица, используемая в настоящем изобретении, может также включать магнитнопритягиваемое вещество, такое как один или более магнитнопритягиваемых частиц или феррожидкость. Соответствующая магнитно-притягиваемая частица может содержать реагент мультимеризации или аффинный реагент с сайтом связывания, способным связывать клетки-мишени. Магнитно-притягиваемые частицы могут содержать диамагнитный, ферромагнитный, парамагнитный или суперпарамагнитный материал. Суперпарамагнитный материал реагирует на магнитное поле путем индуцирования магнитного поля без результирующего постоянного намагничивания. Магнитные частицы на основе оксида железа, например, коммерчески доступны как Dyna Beads фирмы Dynal Biotech, как магнитные MicroBeads (микрошарики) фирмы Miltenyi Biotec, как магнитные пористые стеклянные гранулы фирмы CPGInc., а также из различных других источников, таких как Roche Applied Science, BIOCLON, Bio Source International Inc., micromod, AMBION, Merck, Bangs Laboratories, Polysciences, or Novagen Inc. (названы только некоторые из них). Магнитные наночастицы на основе суперпарамагнитных Со и FeCo, а также ферромагнитных нанокристаллов Со были описаны, например, в статье: Hütten, A. et al. (J. Biotech. (2004), 112, 47-63). Тем не менее, в некоторых вариантах хроматографическая матрица, используемая в настоящем изобретении, является свободной от любого магнитно-притягиваемого вещества.
В некоторых вариантах осуществления способа выделения клетки-мишени хроматографическая матрица является матрицей аффинной хроматографии. Сама матрица аффинной хроматографии включает постоянно-связанные (обычно ковалентно-связанные) фрагменты, способные специфически связываться с выбранной мишенью. Например, обычная матрица аффинной хроматографии может включать в себя антитело, связывающее конкретную заданную мишень. Альтернативно, хроматографическая матрица, используемая для аффинной хроматографии «иммобилизованный металл-хелат» (IMAC), модифицируется хелирующим лигандным агентом, таким как тридентатная иминодиуксусная кислота, чтобы имелась возможность образовывать координационные связи между ионами металлов и некоторыми боковыми цепочками протеина или олигогистидиновыми тегами, например. Таким образом, в данной области техники матрица аффинной хроматографии, как правило, разрабатывается таким образом, что сама по себе способна специфически связывать аналит или мишень, которые должны быть выделены. В настоящем изобретении, в котором используется хроматографическая матрица, или, например, в «картридже выбора», как подробнее описано ниже, сама по себе матрица аффинной хроматографии не предназначена для специфического связывания клеток-мишеней, которые должны быть выделены. Напротив, в таких вариантах матрица аффинной хроматографии (неподвижная фаза), используемая в настоящем изобретении, включает аффинный реагент, который имеет, по крайней мере, один или несколько сайтов связывания Z, способных специфически связываться с реагентом связывания рецептора, который также используется в настоящем изобретении. Когда реагент связывания рецептора вступает в контакт с аффинным/мультимеризационным реагентом, образуется обратимый комплекс между партнером связывания С реагента связывания рецептора и одним или несколькими сайтами связывания Ζ аффинного/мультимеризационного реагента. Таким образом, это комплексообразование опирается на нековалентные взаимодействия между лигандом и его соответствующим партнером связывания и, таким образом, принципиально отличается от использования расщепляемых ковалентных связей, как описано в статье Bonnafous др. (см. выше). Как правило, достаточно, чтобы аффинный реагент содержал один сайт связывания Z, способный образовывать обратимую связь с партнером связывания С, при условии, что аффинный реагент присутствует на матрице аффинной хроматографии с достаточно высокой поверхностной плотностью, чтобы вызвать эффект авидности, когда комплекс между реагентом связывания рецептора и аффинным реагентом образуется с помощью сайта связывания и партнера связывания С. Однако также возможно, что аффинный реагент содержит два или более сайтов связывания Ζ для партнера связывания С. В затем образующемся комплексе с нековалентным связыванием два или более реагентов связывания рецептора иммобилизованы на матрице аффинной хроматографии, тесно расположенные друг к другу таким образом, что может иметь местоэффект авидности, если клетка-мишень, имеющая (по крайней мере, два экземпляра) рецепторной молекулы, присутствует в образце, ее приводят в контакт с реагентом связывания рецептора, который имеет один или несколько сайтов связывания В, способных связывать определенную молекулу рецептора. Таким образом, в этих вариантах может иметь место эффект авидности (мультимеризации), аналогичный описанному в патенте США 7776562, патенте США 8298782 или Международной патентной заявке WO 02/054065 для обратимой иммобилизации клеток-мишеней на матрице аффинной хроматографии. Так как связь между сайтами связывания Ζ аффинного реагента (который затем может также действовать в качестве агента мультимеризации) и партнером связывания С реагента связывания рецептора может быть разрушена добавлением конкурирующего агента, клетки-мишени могут быть затем элюированы в мягких условиях, в которых реагент связывания рецептора полностью диссоциирует с клетки-мишени, тем самым избегается случай, когда реагент связывания рецептора влияет на функциональное состояние клетки-мишени. Это выделение клеток-мишеней с помощью метода аффинной хроматографии, таким образом, имеет не только то преимущество, что позволяет выделять/очищать популяции клеток-мишеней (или любого другого биологического материала, описанного здесь) без изменения функционального состояния популяции клеток-мишеней, которое определяется общей специфичной рецепторной молекулой. Этот способ также имеет то дополнительное преимущество, что полностью устраняет необходимость использования магнитных гранул для очистки клеток и тем самым упрощает дальнейшую обработку клеток и открывает путь к автоматизации выделения клеток-мишеней, как описано здесь также.
В других вариантах осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением используется хроматографическая матрица, которая имеет иммобилизованный на ней аффинный реагент. Аффинный реагент способен связывать партнер связывания С, включенный в реагент связывания рецептора (см. ниже). Такойхроматографическойматрицейможетбытьматрицааффиннойхроматографии. Она также может быть матрицей гель-фильтрации, с которой связан аффинный реагент. Хроматографическая матрица в некоторых вариантах осуществления включена в хроматографическую колонку, например, упакована в ней. Посредством иммобилизованного аффинного реагента хроматографическая матрица может обеднять подвижную фазу реагентом связывания рецептора. Образец, который контактирует с хроматографической матрицей, например, загружен в колонку, заполненную ею, также может быть обеднен реагентом связывания рецептора. В одном способе в соответствии с изобретением реагент связывания рецептора включен в образец, который контактирует с соответствующей неподвижной фазой, т.е. хроматографической матрицей.
После внесения образца, содержащего клетки-мишени, хроматографическая матрица (независимо от того, используется ли аффинная хроматография или гель-проникающея) может быть впоследствии промыта подвижной фазой, например, водной средой, например, буфером, чтобы удалить любое вещество, которое не было иммобилизовано на хроматографической матрице. Диссоциация описанного выше нековалентного комплекса, образование которого иммобилизует клетки-мишени на матрице аффинной хроматографии, затем может быть вызвана, например, изменением условий. Таким изменением условий может быть, например, изменение ионной силы водной подвижной фазы или изменение температуры. В некоторых вариантах осуществления конкурирующий реагент используется для того, чтобы вызвать диссоциацию обратимого нековалентного комплекса между рецептором, реагентом связывания рецептора и аффинным реагентом. Конкурирующий реагент способен ассоциировать с аффинным реагентом, занимая или блокируя сайт связывания аффинного реагента для партнера связывания, включенного в реагент связывания рецептора. Используя конкурирующий реагент с особенно высоким сродством к аффинному реагенту или с помощью избытка конкурирующего реагента по отношению к по меньшей мере одной клетки-мишени и реагенту связывания рецептора (в данном случае конкурирующий реагент может также иметь более низкое сродство к сайту связывания Ζ аффинного реагента, чем партнер связывания С реагента связывания рецептора), можно разрушить нековалентную связь между реагентом связывания рецептора и реагентом мультимеризации. Клетке-мишени дают элюировать из хроматографической матрицы, например, из колонки, в которую упакована хроматографическая матрица. Элюат собирают и, таким образом, собирают клетки-мишени.
В некоторых вариантах осуществления используется исходный образец, который включает или предположительно включает клетки-мишени, и к которому добавляют реагент связывания рецептора для того, чтобы вызвать образование вышеописанного нековалентного комплекса, который включает клетку-мишень и аффинный реагент на матрице аффинной хроматографии. Как иллюстративный пример, образец крови (например цельной крови) или образец лимфы может быть таким исходным образцом (см.раздел Примеры). Может быть выбран реагент связывания рецептора, который имеет сайт связывания для желаемой клетки-мишени, присутствующей в крови или лимфе, соответственно. К образцу крови или лимфы может быть добавлен реагент связывания рецептора, возможно, также с буфером. Используемый буфер может быть, по меньшей мере, по существу идентичен буферу, используемому для уравновешивания (приведения в равновесие) хроматографической матрицы, и используется для последующей промывки. Затем образец вносят в хроматографическую колонку. Эта хроматографическая колонка может иметь аффинный реагент, иммобилизованный на ее матрице, который может связывать реагент связывания рецептора. Альтернативно, реагент связывания рецептора уже может быть иммобилизован на матрице аффинной хроматографии, прежде чем образец клеток-мишеней будет внесен в матрицу аффинной хроматографии. После того как образец, например, образец крови или лимфы, при необходимости с реагентом связывания рецептора будет полностью загружен в хроматографическую колонку, хроматографическая матрица может быть промыта подвижной фазой. Конкурирующий реагент, который может быть включен в буфер, используемый для промывки хроматографической матрицы, может затем быть внесен в хроматографическую колонку. В последствии хроматографическая матрица может быть промыта подвижной фазой. Элюирование клетки-мишени можно контролировать с помощью стандартных методов обнаружения, таких как устройство оптического обнаружения. Клетки-мишени могут затем быть собраны. Таким образом, такой элюат может включать в себя реагент связывания рецептора и/или конкурирующий реагент.
Чтобы иметь возможность дальнейшей очистки такого элюата клеток-мишеней, хроматографическая матрица (например, матрица гель-хроматографии) может включать аффинный реагент, например, молекулу, иммобилизованную на хроматографической матрице, которая имеет сайты связывания Z, способные специфически связываться с партнером связывания В, включенным в реагент связывания рецептора и/или конкурирующий реагент.
Таким образом, в соответствии с вышеизложенным, используемая здесь матрица эксклюзионной хроматографии может иметь иммобилизованный на нейаффинный реагент. Поскольку соответствующая хроматографическая матрица также может отделять вещества в соответствии с размером и/или формой, она может быть реализована в виде хроматографической матрицы смешанного режима. Таким образом, в тех вариантах осуществления, где аффинный реагент, иммобилизованный на такой матрице эксклюзионной хроматографии, не соответствует реагенту связывания рецептора в том, что аффинный реагент имеет сайт связывания, который не может образовывать комплекс с выбранным реагентом связывания рецептора, хроматографическая матрица смешанного режима все же может быть использована в качестве матрицы эксклюзионной хроматографии. В тех вариантах осуществления, где иммобилизованный аффинный реагент имеет сайт связывания, неспособный образовывать комплекс с выбранным реагентом связывания рецептора, аффинный реагент может служить для обратимой иммобилизации клетки-мишени на хроматографической матрице.
Флюидная фаза, используемая в качестве подвижной фазы в хроматографии, может быть любым флюидом, подходящим для сохранения биологической активности клетки-мишени. Как правило, флюид (газ или жидкость) представляет собой жидкость. В некоторых вариантах осуществления соответствующей жидкостью является (или она включает) вода, например, в виде водного раствора. В соответствующий водный раствор могут быть включены другие компоненты, например, растворенными или суспендированными в нем. В качестве иллюстративного примера, водный раствор может включать в себя один или несколько буферных соединений. В данной области используются многочисленные буферные соединения и могут быть взяты для выполнения различных процессов, описанных здесь. Примеры буферов включают, не ограничиваясь, растворы фосфатных солей, такие как фосфатно-солевой буфер (PBS), карбонат, сукцинат, карбонат, цитрат, ацетат, формиат, барбитурат, оксалат, лактат, фталат, малеат, какодилат, борат, N-(2-ацетамидо)-2-амино-этансульфонат (также называемый ACES), N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота (также называемая HEPES), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-пропансульфоновая кислота (также называемая HEPPS), пиперазин-1,4-бис(2-этансульфоновая кислота) (также называемый PIPES), (2-[трис(гидроксиметил)-метиламино]-1-этансульфоновая кислота (также называемая TES), 2-циклогексиламино-этансульфоновая кислота (также называемая CHES) и N-(2-ацетамидо)-иминодиацетат (также называемый ADA). Любой противоион может быть использован в этих солях; аммоний, натрий, калий могут служить иллюстративными примерами. Другие примеры буферов включают, не ограничиваясь, триэтаноламин, диэтаноламин, цвиттер-ионные буферы, такие как бетаин, этиламин, триэтиламин, глицин, глицилглицин, гистидин, трис-(гидроксиметил) аминометан (также называемый TRIS), бис-(2-гидроксиэтил)-имино-трис(гидроксиметил)-метан (также называемый BIS-TRIS) и N-[трис(гидроксиметил)-метил]-глицин (также называемый ТРИЦИН) - названы только некоторые из них. Буфер может дополнительно содержать компоненты, стабилизирующие клетки-мишени, которые должны быть выделены, например белки, такие как (сывороточный) альбумин, факторы роста, микроэлементы и т.п. Выбор подходящей подвижной фазы находится в компетенции специалиста средней квалификации в данной области и может быть осуществлен эмпирически.
d
d
d
off
on
off
off
on
D
-3
-7
-7
-10
-5
-1
-5
-1
-5
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-4
-1
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-3
-1
-2
-1
-2
-1
-1
-1
-1
-1
В соответствии с совместно рассматриваемой международной заявкой РСТ/ЕР 2012/063969, опубликованной как WO 2013/011011, (полное содержание которой включено здесь в качестве ссылки для всех целей) сила связывания между реагентом связывания рецептора и молекулой рецептора на клетке-мишени может быть несущественной для обратимости связывания клетки-мишени с аффинным реагентом через реагент связывания рецептора. Наоборот, независимо от силы связывания, то есть имеет ли константа диссоциации (K) связывания между реагентом связывания рецептора через сайт связывания В и молекулой рецептора низкое сродство, например, K в диапазоне от около 10 до около 10 М, или высокое сродство, например, K в диапазоне от приблизительно 10 до 1×10, клетка-мишень может быть обратимо окрашена, пока диссоциация связи между реагентом связывания рецептора через сайт связывания В и молекулой рецептора происходит достаточно быстро. В этом отношении константа скорости диссоциации (k) связи между реагентом связывания рецептора через сайт связывания В и молекулой рецептора может иметь значение от примерно 3×10c или более (это константа скорости диссоциации - константа, характеризующая реакцию диссоциации комплекса, образованного между сайтом связывания В реагента связывания рецептора и молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени). Константа скорости ассоциации (k) реакции ассоциации между сайтом связывания В реагента связывания рецептора и молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени может иметь любое значение. Для того чтобы обеспечить достаточно обратимое связывание между молекулой рецептора и реагентом связывания рецептора, целесообразно выбрать значение k равновесия связывания, приблизительно равное 3×10 с или более, примерно 5×10 c или более, например, около 1×10 c или более, примерно 1.5×10 c или более, примерно 2.0×10 с или более, примерно 2.5×10 c или более, примерно 3×10 c или более, примерно 3.5×10 c или более, примерно 4×10 c из более, примерно 5×10 c или более, примерно 7.5×10 с или более, примерно 1×10 с или более, примерно 1.5×10 с или более, примерно 2×10 с или более, примерно 2.5×10 с или более, примерно 3×10 c или более, примерно 4×10 с, приблизительно 5×10 с или более, примерно 7.5×10 с или более, примерно 1×10 с или более, примерно 5×10 с или более, примерно 1×10 с или более или примерно от 5×10 с и либо лее. Термин «примерно», когда используется здесь по отношению к скорости k, скорости копили k или K (см. ниже) означает, что включающая погрешность составляет ± 20,0%, в том числе ± 15,0%, ± 10,0%, ± 8,0%, ± 9,0%, ± 7,0%, ± 6,0%, ± 5,0%, ± 4,5%, ± 4.0.%, ± 3,5%, ± 3,0%, ± 2,8%, ± 2,6%, ± 2,4,%, ± 2,2%, ± 2,0%, ± 1,8,%, ± 1,6%, ± 1,4%, ± 1,2%, ± 1,0,%, ± 0,9%, ± 0,8%, ± 0,7%, ± 0,6%, ± 0,5%, ± 0,4%, ± 0,3%, ± 0,2%, ± 0,1% или ± 0,01%. Следует отметить, что значения кинетических и термодинамических констант, использующиеся здесь, относятся к условиям атмосферного давления, т.е. 1013 бар, и комнатной температуры, т.е. 25°С.
Если реагент связывания рецептора обозначить «А», рецептор на поверхности клетки-мишени обозначить«В», и комплекс между реагентом связывания рецептора и рецептором обозначить «АВ», бимолекулярное взаимодействие между реагентом связывания рецептора и рецептором может быть описано с помощью процесса с двумя состояниями:
d
Соответствующая константа диссоциации K этого процесса определяется как
d
on
off
В этих уравнениях [А], [В] и [АВ] - равновесные молярные концентрации рецептора, реагента связывания рецептора (лиганда) и соответствующего комплекса при заданной температуре и заданном давлении. Константа диссоциации K также может быть выражена как отношение константы скорости "on" (k) для скорости ассоциации, которая также называется константой скорости ассоциации комплекса, и константы скорости "off" (k) диссоциации комплекса, также называем j-й константой скорости диссоциации:
d
off
d
-1
-5
-1
Следует отметить в этой связи, что константа диссоциации K определяет состояние, в котором было достигнуто равновесие. Равновесие не может, однако, быть достигнуто в условиях хроматографического разделения. Это может объяснить, почему в некоторых вариантах осуществления именно константа скорости off (k), а не константа диссоциации K, которая может определить обратимое связывание, может быть равна или больше, чем - то есть в числовом выражении (с) быть, по крайней мере, выше, чем - 3×10 c в контексте настоящего изобретения.
off
2
off
-5
-1
-5
-1
В некоторых вариантах реагент связывания рецептора имеет один (одновалентный) сайт связывания В, способный специфически связываться с молекулой рецептора. В некоторых вариантах реагент связывания рецептора имеет, по крайней мере, два (т.е. множество сайтов связывания В, в том числе три, четыре или также пять) одинаковых сайта связывания В, способных связываться с молекулой рецептора. В любом из этих вариантов осуществления связывание молекулы рецептора через (каждый из) сайт(ы) связывания В может иметь значение k около 3×10 с или более. Таким образом, реагент связывания рецептора может быть одновалентным (например, одновалентным фрагментом антитела или одновалентной искусственной связывающей молекулой (белковой или другой), такой как мутеин на основе полипептида семейства липокалина (также известный как «Anticalin ), или двухвалентной молекулой, такой как антитело или его фрагмент, в котором сохранены оба сайта связывания, такое как фрагмент F(ab'). В некоторых вариантах осуществления молекулой рецептора может быть поливалентная молекула, такая как пентамерная молекула IgE, при условии, что скорость k равна 3×10 c или более.
off
D
-5
-1
-3
-7
В некоторых вариантах осуществления изобретения, на молекулярном уровне скорость k (3×10 c или более) связывания реагента связывания рецептора через, по меньшей мере, сайт связывания В и молекулы рецептора на клетке-мишени обеспечивает (бесследовое) выделение биологического материала по обратимой технологии клеточной аффинной хроматографии, описанной здесь. Наоборот, как описано, например, в патенте США 7776562 или Международной патентной заявке WO 02/054065, низкоаффинное связывание между молекулой рецептора и сайтом связывания В реагента связывания рецептора вместе с эффектом авидности, опосредованным через иммобилизованный аффинный реагент, позволяет проводить обратимое и бесследовое выделение клеток-мишеней. В этих вариантах осуществления может образовываться комплекс между двумя или более сайтами связывания Ζ аффинного реагента и партнером связывания С, по крайней мере, двух реагентов связывания рецептора, что позволяет провести обратимую иммобилизацию и последующее элюирование клеток-мишеней с матрицы аффинной хроматографии (через добавление конкурирующего агента, который будут разрушать связь (комплекс)между партнером связывания С и сайтами связывания Ζ, что, в свою очередь, приводит к диссоциации реагента связывания рецептора из клетки-мишени. Как упоминалось выше, такая низкая аффинность связывания может характеризоваться константой диссоциации (K) в диапазоне от приблизительно 1.0×10 М до приблизительно 1.0×10 М для связывания реагента связывания рецептора через сайт связывания В с молекулой рецептора на поверхности клетки-мишени.
Способ согласно настоящему изобретению может в некоторых вариантах использоваться для обеднения образца реагентами, ранее использованными при разделении клеток. Реагент связывания рецептора и конкурирующий агент могут, например, присутствовать в элюате метода аффинной хроматографии в картридже выбора, как описано выше. Используя метод в соответствии с изобретением, такие реагенты могут быть, по крайней мере, по существу, полностью удалены из образца, например, из клеточной популяции. В качестве иллюстративного примера: реагент связывания рецептора, как определено выше, может быть убран из образца до уровней ниже предела обнаружения, например, FACS или Western Blot. Конкурирующий реагент может быть использован для того, чтобы элюировать клетки-мишени из аффинной очистительной среды, такой как гранулы аффинной хроматографии. Этот конкурирующий реагент имеет сайт связывания, способный специфически связываться с сайтом связывания Ζ аффинного реагента. В таком варианте соответствующий способ по изобретению может служить для обеднения реагентом связывания рецептора и конкурирующим реагентом, в том числе их удаления.
В некоторых вариантах осуществления способ выделения клетки-мишени может включать в себя две стадии очистки, из которых только вторая стадия, а именно удаление реагента связывания рецептора и/или конкурирующего реагента в «картридже удаления» осуществляется в соответствии с настоящим изобретением. Первым шагом может быть способ выделения клетки-мишени, описанный в патенте США 7776562, патенте США 8298782 или Международной патентной заявке WO 02/054065. «Способ удаления» в соответствии с настоящим изобретением может затем быть проведенна так омобразце с целью далее убирать из образца клетки-мишени другие клетки, а также реагент связывания рецептора и конкурирующий реагент. Подобно этому, образец, полученный на первой стадии, в соответствии с патентом США 7776562, патентом США 8298782 или Международной патентной заявкой WO 02/054065, также может быть подвергнут гель-проникающей хроматографии, как описано выше, в которой используется немодифицированная хроматографическая матрица, не имеющая иммобилизованного на ней аффинного реагента. Кроме того, возможно, что первый шаг выделения - любой другой известный ранее способ для выделения клеток, например, способ, описанный в примере 11 патента США 6022951, который затем дополняют способом очистки, осуществляемым в картридже удаления по настоящему изобретению.
2+
+
Молекула рецептора, расположенная на поверхности клетки-мишени (или доступной поверхности биообъекта), может быть любой молекулой, лишь бы она оставалась ковалентно или нековалентно присоединенной к поверхности клетки во время хроматографического процесса разделения по способу в соответствии с изобретением. Молекула рецептора представляет собой молекулу, которая может образовывать связь с реагентом связывания рецептора. В некоторых вариантах осуществления этот рецептор представляет собой пептид или белок, такой как мембранный рецепторный белок. В некоторых вариантах осуществления рецептор представляет собой липид, полисахарид или нуклеиновую кислоту. Рецептор, который представляет собой белок, может быть периферическим мембранным белком или интегральным мембранным белком. В некоторых вариантах осуществления он может иметь один или несколько доменов, которые охватывают мембрану. Несколько иллюстративных примеров: мембранный белок с трансмембранным доменом может быть рецептором, связанным c G-белком, таким как одорантовые рецепторы, родопсиновый рецептор, родопсиновый феромонный, пептидный гормонный рецептор, вкусовой рецептор, рецептор ГАМК, опиатный рецептор, серотониновый рецептор, рецептор Са, меланопсин, нейромедиаторный рецептор, такой как лигандо управляемый, потенциало упряавляемый или механически управляемый рецептор, в том числе ацетилхолиновый, никотиновый, адренергический, норадреналиновый, катехоламиновый, Z-ДОФА, допаминовый и серотониновый (биогенный аминный, эндорфинный/энкефалинный) нейропептидный рецептор, рецептор киназы, такой как серин/треонин киназа, тирозинкиназ, пориновый канал, такой как хлоридный канал, калиевый канал, натриевый канал, наружный белок мембран, транспортер ABC (АТФ-связывающий кассетный транспортер), такой как транспортер аминокислоты, транспортер Na-глюкозы, транспортер Na/иодида, ионный переносчик, такой как светособирающий комплекс, цитохром с оксидаза, АТФ-азы Na/K, Н/K, Са, рецептор клеточной адгезии, такой как металло-протеаза, интегрино или катерин.
+
+
+
+
В некоторых вариантах молекулой рецептора может быть антиген, определяющий желаемую клеточную популяцию или субпопуляцию, например, популяцию или субпопуляцию клеток крови, напр. лимфоциты (например, Т-клетки, Т-хелперы, например, Т-хелперы CD4+, В-клетки или естественные клетки-киллеры), моноциты, или стволовые клетки, напр. CD34-позитивные периферийные стволовые клетки или экспрессирующие стволовые клетки Nanog или Oct-4. Примеры Т-клеток включают такие клетки, как CMV-специфические CD8 Т-лимфоциты, цитотоксические Т-клетки, Т-клетки памяти и регуляторные Т-клетки (Treg). Наглядным примером Treg являются клетки CD4CD25CD45RATreg, и наглядным примером Т-клеток памяти являются специфичные центральные Т-клетки памяти CD62LCD8+. Рецептор может также быть маркером опухолевой клетки.
D
D
D
D
off
on
-2
-13
-2
-13
-3
-12
-4
-11
-5
-10
Как указано выше, реагент связывания рецептора имеет, в дополнение к сайту связывания В, способному связываться с молекулой рецептора, партнер связывания С. Этот партнер связывания С способен связываться с сайтом связывания Ζ аффинного реагента, причем реагент мультимеризации имеет один или более сайтов связывания для партнера связывания С. Нековалентная связь, образующаяся между партнером связывания С, включенным в реагент связывания рецептора, и сайтом(ами) связывания Ζ аффинного реагента, может иметь любую требуемую прочность и сродство, если только она разрушаема или обратима в условиях, в которых реализуется способ согласно изобретению. Константа диссоциации (K) связи между партнером связывания С, включенным в реагент связывания рецептора, и сайтом связывания Ζ аффинного реагента может иметь значение в диапазоне от приблизительно 10 М до около 10 М. Таким образом, эта обратимая связь может, например, иметь K от приблизительно 10 M до около 10 М, или от примерно 10 M до около 10 М, или от приблизительно 10 M до примерно 10 М, или от примерно 10 M до примерно 10 М. K этой связи, а также K, скорости k and k связи, образованной между сайтом связывания В реагента связывания рецептора и молекулой рецептора, может быть определена с помощью любых подходящих средств, например, с помощью флуоресцентного титрования, равновесного диализа или поверхностного плазмонного резонанса. Молекула реагента связывания рецептора может включать, по меньшей мере, один, в том числе два, три или более, вторых партнеров связывания С, и аффинный реагент может включать, по меньшей мере, два, например, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или более сайтов связывания для партнера связывания, входящего в молекулу реагента связывания рецептора. Как описано в патенте США 7776562, патенте США 8298782 и Международной патентной заявке WO 2002/054065, может быть выбрано любое сочетание партнера связывания С и аффинного агента с одним или более соответствующими сайтами связывания Z, при условии, что партнер связывания С и сайт связывания Ζ аффинного агента способны обратимо связываться или мультимеризоваться в (мультивалентный) комплекс, чтобы вызвать эффект авидности.
Партнер связывания, включенный в реагент связывания рецептора, может быть, например, на основе углеводорода (в том числе полимерного) и включать азот-, фосфор-, серо-, карбен- галоген- или псевдогалогеновые группы. Это может быть спирт, органическая кислота, неорганическая кислота, амин, фосфин, тиол, дисульфид, алкан, аминокислота, пептид, олигопептид, полипептид, белок, нуклеиновая кислота, липид, сахарид, олигосахарид или полисахарид. В качестве дополнительных примеров, им также может быть катион, анион, поликатион, полианион, электролит, полиэлектролит, углеродные нанотрубки или углеродная нанопена. Как правило, такой партнер связывания имеет более высокое сродство к сайту связывания реагента мультимеризации, чем к другим материалам. Примеры соответствующего партнера связывания включают, не ограничиваясь, краун-эфир, иммуноглобулин, его фрагмент и белковую связывающую молекулу с функциями, подобнымиантителу.
В некоторых вариантах партнер связывания С, включенный в реагент связывания рецептора, включает биотин, и аффинный реагент включает аналог стрептавидина или аналог авидина, обратимо связывающийся с биотином. В некоторых вариантах партнер связывания С, включенный в реагент связывания рецептора, включает в себя аналог биотина, обратимо связывающийся со стрептавидином или авидином, и аффинный реагент включает стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина или аналог авидина, обратимо связывающийся с соответствующим аналогом биотина. В некоторых вариантах партнер связывания С, включенный в реагент связывания рецептора, включает в себя стрептавидин- или авидин-связывающий пептид, и аффинный реагент включает стрептавидин, авидин, аналог стрептавидина или аналог авидина, обратимо связывающийся с соответствующим стрептавидин- или авидин-связывающим пептидом.
В некоторых вариантах партнер связывания, включенный в реагент связывания рецептора, может включать в себя стрептавидин-связывающий пептид Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys, и аффинный реагент может включать в себя стрептавидин мутеин (аналог) Val44-Thr45-Ala46-Arg47 или стрептавидин мутеин (аналог) Ile44-Gly45-Ala46-Arg47, оба описаны в патенте США 6103493, например, и коммерчески доступны под торговой маркой Strep-Tactin. Стрептавидин-связывающие пептиды могут, например, представлять собой отдельные пептиды, такие как "Strep-tag", описанный в патенте США 5506121, например, или стрептавидин-связывающие пептиды, имеющие последовательное расположение двух или более отдельных модулей связывания, как описано в международной патентной публикации WO 02/077018 или в патенте США 7981632.
В некоторых вариантах партнер связывания С реагента связывания рецептора включает в себя фрагмент, известный специалисту в данной области, в качестве аффинной метки (тэга). В таком варианте аффинный реагент включает в себя соответствующий партнер связывания, например, антитело или фрагмент антитела, известный как связывающийся с аффинной меткой. Как несколько иллюстративных примеров известных аффинных меток(тегов): партнер связывания, включенный в реагент связывания рецептора, может включать динитрофенол или дигоксигенин, олигогистидин, полигистидин, домен иммуноглобулина, мальтозо-связывающий белок, глутатион-S-трансферазу (GST), хитин-связывающий белок (СВР) или тиоредоксин, калмодулин-связывающий пептид (СВР), пептид FLAG', НА-тег (последовательность: Tyr-Рго-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala), тег VSV-G (последовательность: Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys), тег HSV (последовательность: Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp), эпитоп Т7 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), мальтозо-связывающий белок (МВР), эпитоп HSV последовательности Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp гликопротеин D вируса простого герпеса, эпитоп "myc" из фактора транскрипции с-myc последовательности Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu, тег V5 (последовательность: Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr) или глутатион-S-трансфераза (GST). В таком варианте комплекс, образованный между одной или более сайтами связывания аффинного реагента, в этом случае антитело или фрагмент антитела, и антигеном может быть разрушена конкуренто, добавлением свободного антигена, т.е. свободного пептида (тега эпитопа) или свободного белка (например, МВР или СВР). Аффинная метка также может быть олигонуклеотидным тегом. Такой олигонуклеотидный тег может, например, быть использован для гибридизации с олигонуклеотидом с комплементарной последовательностью, связанной с или включенной в аффинный реагент.
Дальнейшие примеры подходящего партнера связывания включают, не ограничиваясь: лектин, белок А, белок G, металл, ион металла, производные нитрилотриуксусной кислоты (NTA), RGD-мотивы, декстран, полиэтиленимин (PEI), окислительно-восстановительный полимер, гликопротеины, аптамеры AN, краситель, амилоза, мальтоза, целлюлоза, хитин, глутатион, кальмодулин, желатин, полимиксин, гепарин, NAD, НАДФ, лизин, аргинин, бензамидин, поли-U, или олиго-DT. Лектины, такие как конкавалин А, как известно, связываются с полисахаридами и гликозилированными белками. Наглядный пример красителя - триазиновый краситель, такой как Cibacron синий F3G-A (СВ) или Красный НЕ-3В, которые специфически связывают NADH-зависимые ферменты. Зеленый А связывается с белками KoA, человеческим сывороточным альбумином и дегидрогеназами. Красители 7-аминоактиномицин D и 4',6-диамидино-2-фенилиндол связываются с ДНК. Катионы металлов, таких как Ni, Cd, Zn, Со или Cu, как правило, используется для связывания аффинных меток (тегов), таких как содержащие олигогистидин последовательности, в том числе гексагистидиновый тег или тег His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys (тегМАТ), иметиловый эфир N-метакрилоил-(L)-цистеина.
+
2+
2+
2+
2+
3+
4+
2+
2+
2+)
2+
2+
В некоторых вариантах связывание между партнером связывания С, включенным в реагент связывания рецептор, и одним или несколькими сайтами связывания аффинного реагента происходит в присутствии двухвалентного, трехвалентного или четырехвалентного катиона. В связи с этим в некоторых вариантах осуществления аффинный/мультимеризационный реагент включает двухвалентный, трехвалентный или четырехвалентный катион, как правило, удерживаемый, например, в комплексе, с помощью подходящего хелатообразующего агента. Партнер связывания, включенный в реагент связывания рецептора, может в таком варианте содержать фрагмент, включающий в себя, например, комплексы, двухвалентный, трехвалентный или четырехвалентный катион. Примеры соответствующего металло-хелирующего агента, включают, не ограничиваясь, этилендиамин, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), этиленгликоль-тетрауксусную кислоту (ЭГТА), диэтилентриаминопентауксусную кислоту (DTPA), N,N-бис (карбоксиметил)глицин (также называемый нитрилотриуксусной кислотой, NTA), 1,2-бис (о-аминофенокси)-этан-N,N,N,N'-этилендиаминтетрауксусную кислоту (ВАРТА), 2,3-димеркапто-1-пропанол (димеркапрол), порфин и гем. В качестве примера, ЭДТА образует комплекс с большинством одновалентных, двухвалентных, трехвалентных и четырехвалентных ионов металлов, таких как, например, серебро (Ag), кальций (Са), марганец (Mn), медь (Cu), железо (Fe), кобальт (Со) и цирконий (Zr), в то время как ВАРТА специфичная для Са. В качестве иллюстративного примера: стандартным методом, используемым в данной области, является образование комплекса между олигогистидновым тегом и ионами меди (Cu), никеля (Ni, кобальта (Со) или цинка (Zn), которые вводятся с помощью хелатообразующего агента - нитрилотриуксусной кислоты (NTA).
В некоторых вариантах партнер связывания С, включенный в реагент связывания рецептора, включает калмодулин-связывающий пептид, и аффинный реагент включает мультимерный кальмодулин, как описано в патенте США 5985658, например. В некоторых вариантах партнер связывания С, включенный в реагент связывания рецептора, содержит пептид FLAG, и аффинный реагент включает антитело, связывающееся с пептидом FLAG, например, пептид FLAG, который связывается с моноклональным антителом 4Е11, как описано в патенте США 4851341. В одном варианте осуществления партнер связывания С, включенный в реагент связывания рецептора, содержит олигогистидиновый тег, и аффинный реагент включает антитело или ион переходного металла, связывающий этот олигогистидиновый тег. Разрушение всех этих комплексов связывания может быть осуществлено путем хелирования ионов металлов, например, хелирования кальция, например, путем добавления ЭДТА или ЭГТА (см. выше). Кальмодулин, антитела, такие как 4Е11, или хелированные ионы металлов или свободные хелатообразующие агенты могут быть мультимеризованы обычными методами, например, биотинилированием и комплексообразованием с стрептавидином или авидином или их мультимерами, или путем введения карбоксильных групп в полисахарид, например декстран, по существу, как описано в Noguchi, A, et al. BioconjugateChemistry (1992) 3, 132-137 на первой стадии и связывание кальмодулина или антител или хелированных ионов металлов или свободных хелатообразующих агентов через первичные аминогруппы с карбоксильными группами в основной цепи полисахарида, например декстрана, с использованием традиционной химии карбодиимидов на второй стадии. В таких вариантах связь между партнером связывания С, включенным в реагент связывания рецептора, и одним или несколькими сайтами связывания Ζ реагента мультимеризации может быть разрушена путем хелирования ионов металлов. Хелирование металлов может быть, например, достигнуто путем добавления ЭГТА или ЭДТА.
В некоторых вариантах осуществления аффинный реагент представляет собой олигомер или полимер стрептавидина или авидина, или любого аналога стрептавидина или авидина. Сайт связывания Ζ является естественным биотином, связывающим авидин или стрептавидин. Соответствующий олигомер или полимер могут быть сшиты с помощью полисахарида. В одном варианте олигомеры или полимеры стрептавидина или авидина, или аналогов стрептавидина или авидина готовят путем введения карбоксильных групп в полисахарид, например декстран, по существу, как описано в Noguchi, A, et al., Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137 на первой стадии. Затем стрептавидин или авидин или их аналоги могут быть сшиты через первичные аминогруппы внутреннего остатка лизина и/или свободные N-концы с карбоксильными группами в основной цепи декстрана с использованием традиционной химии карбодиимидов на второй стадии. Тем не менее, сшитые олигомеры или полимеры стрептавидина или авидина, или любого аналога стрептавидина или авидина также могут быть получены путем сшивания с помощью бифункциональных молекул, выступающих в качестве сшивателей, таких как глутаровый диальдегид, или с помощью других методов, описанных в данной области техники.
В способе согласно изобретению один или более сайтов связывания молекулы реагента связывания рецептора, который специфически связывается с молекулой рецептора, могут, например, представлять собой антитело, его фрагмент и белковую связывающую молекулу с функций, подобной антителу. Примерами (рекомбинантных) фрагментов антител являются фрагменты Fab, фрагменты Fv, одноцепочечные фрагменты Fv (ScFv), двухвалентный фрагмент антитела, такой как (FAB) 2'-фрагмент, диатела, триатела (Iliades, P., et al., FEBSLett (1997) 409, 437-441), decabodies (Stone, Ε., et al., Journalof Immunological Methods (2007) 318, 88-94) и другие доменовые антитела (Holt, L.J., et al., Trend sBiotechnol. (2003), 21, 11, 484-190). В некоторых вариантах осуществления один или несколько сайтов связывания молекулы реагента связывания рецептора могут быть двухвалентной белковой искусственной связывающей молекулой, такой как димерный липокалин мутеин, известный также как «дуокалин». В некоторых вариантах осуществления реагент связывания рецептора может иметь единичный второй сайт связывания, то есть может быть одновалентным. Примеры одновалентных реагентов связывания рецептора включают, не ограничиваясь, одновалентный фрагмент антитела, белковую связывающую молекулу со связующими свойствами, подобными таковым антитела, или молекулу МНС. Примеры одновалентных фрагментов антител включают, не ограничиваясь, фрагмент Fab, фрагмент Fv и одноцепочечный фрагмент Fv (ScFv), в том числе двухвалентный одноцепочечный фрагмент Fv.
Как упоминалось выше, примером белковой связывающей молекулы с функциями, подобными таковым антител, является мутеин на основе полипептида семейства липокалина (см., например, WO 03/029462, Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903). Липокалины, такие как билин-связывающий белок, человеческий нейтрофил желатиназа-ассоциированный липокалин, человеческий аполипопротеин D или человеческий слезовый липокалин, обладают природными лиганд-связывающими сайтами, которые можно модифицировать так, чтобы они связывали данную мишень. Дальнейшие примеры белковой связывающей молекулы со связывающими свойствами, подобными таковым антител, которые могут быть использованы в качестве реагента связывания рецептора, специфически связывающегося с молекулой рецептора, включают, не ограничиваясь, так называемые глютела, глюбоди (см., напр. международную патентную заявку WO 96/23879), белки на основе анкириновогоскаффолда (Mosavi, L.K., et al., ProteinScience (2004) 13, 6, 1435-1448) или кристаллический скаффолд (напр. международная патентная заявка WO 01/04144), белки, описанные в статье: Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187, АдНектины, тетранектиныиавимеры. Авимеры, в том числе мультивалентные авимерные белки, вырабатываемые перетасовкой (перемешиванием) экзонов семейства доменов рецепторов человека, содержат так называемые А-домены, как цепочки нескольких доменов в нескольких рецепторах клеточной поверхности (Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). Аднектины, вырабатываемые доменом человеческого фибронектина, содержат три петли, которые могут быть применены для иммуноглобулин-подобного связывания мишеней (Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinionin Biotechnology (2006) 17, 653-658). Тетранектины, полученные из соответствующего человеческого гомотримерного белка, также содержат участки петель в домене лектинов С-типа, которые могут быть использованы для желаемого связывания (там же). Пептоиды, которые могут выступать в качестве белковых лигандов, являются олиго(N-алкил) глицинами, отличающимися от пептидов тем, что боковая цепочка соединена с амидным азотом, а не α-атомом углерода. Пептоиды, как правило, устойчивы к протеазам и другим модифицирующим ферментам и могут иметь гораздо более высокую клеточную проницаемость, чем пептиды (см., например Kwon, Y.-U., and Kodadek, Т., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509).
Дальнейшие примеры подходящих белковых связывающих молекул - EGF-подобный домен, Kringle-домен, домен фибронектина I типа, домен фибронектина II типа, домен фибронектина III тип, домен PAN, домен G1a, домен SRCR, домен ингибитора трипсина бычьей поджелудочной железы Кунитса, тендамистат, домен ингибитора серин-протеазы типа Казаль, домен трилистника (Р-типа), домен фактора Виллебранда типа С, анафилатоксин-подобный домен, домен CUB, тиреоглобулиновый повтор I типа, домен ЛПНП-рецептора класса А, домен Суши, домен Линка, домен тромбоспондина типа I, домена иммуноглобулина или иммуноглобулино-подобный домен (например, доменные антитела или верблюжьи тяжелые цепные антитела), домен лектина типа С, домен МАМ, домен фактора Виллебранда типа А, домен соматомедина В, четырех дисульфидный основной домен типа WAP, домен F5/8 типа С, домен гемопексина, домен SH2, домен SH3, EGF-подобный домен ламининового типа, домен С2, "каппа-тела" (ср. Ill. et al., ProteinEng (1997) 10, 949-57, так называемое "мини-антитело" (Martinetal., EMBOJ (1994) 13, 5303-5309), ди-антитело (ср. Holliger et al., PNASUSA (1993)90, 6444-6448), так называемый "Янус" (ср. Traunecker et al., EMBOJ (1991) 10, 3655-3659, или Traunecker et al., IntJCancer (1992) Suppl 7, 51-52), нанотело, микротело, аффилин, аффи-антитело, ноттин, убиквитин, «цинковый палец», аутофлюоресцентный белок или лейцин-обогащенный повторный белок. Пример молекулы нуклеиновой кислоты с функциями антитела - аптамер. Аптамер складывается в определенный трехмерный мотив (структуру) и показывает высокое сродство к заданной целевой структуре.
Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый здесь, относится к любой нуклеиновой кислоте в любой возможной конфигурации, такой как одноцепочечная, двухцепочечная или их комбинации. Нуклеиновые кислоты включают, например, молекулы ДНК, молекулы РНК, аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием нуклеотидных аналогов или с помощью химии нуклеиновых кислот, блокированные молекулы нуклеиновых кислот (LNA), молекулы ПНК (см. выше) и молекулы текто-РНК (напр. Liu, В., et al., J. Am. Chem. Soc. (2004) 126, 4076-4077). Молекула ΠΗΚ является синтетическим аналогом нуклеиновой кислоты с псевдопептидной основной цепью, в которой фосфодиэфирный скелет, присутствующий, например, в ДНК или РНК, заменяется повторяющимися звеньями коротких алифатических остатков с концевой аминогруппой и концевым карбоксилом, образующими амидную связь в олигомере или полимере Молекула LNA имеет модифицированный скелет РНК с метиленовым мостиком между С4' и O2', который блокирует фуранозное кольцо в конфигурации TV-типа, придавая соответствующей молекуле более высокую дуплексную стабильность и нуклеазное сопротивление. В отличие от молекулы ПНК, молекула LNA имеет заряженный скелет. ДНК или РНК могут быть геномного или синтетического происхождения и могут быть одно- или двухцепочечными. Такой нуклеиновой кислотой может быть, например, мРНК, кРНК, синтетическая РНК, геномная ДНК, кДНК, синтетическая ДНК, сополимер ДНК и РНК, олигонуклеотиды и т.п. Соответствующая нуклеиновая кислота может, кроме того, содержать неприродные аналоги нуклеотидов и/или быть связанной с аффинным тегом или меткой.
Способ в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлен при любой температуре, при которой жизнеспособность клетки-мишени, по меньшей мере, в основном сохраняется. Когда в данном описании делается ссылка на условия, которые, по крайней мере, по существу не опасны, не вредны или, по крайней мере, существенно не ставят под угрозу жизнеспособность, то имеются в виду условия, при которых процент клеток-мишеней, которые могут быть восстановлены с полной жизнеспособностью, по меньшей мере, 70%, в том числе по меньшей мере 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97%, по меньшей мере, 98%, по крайней мере 99% или по меньшей мере 99,5%. В некоторых вариантах способ согласно изобретению осуществляют при температуре примерно 20°С или ниже, например, около 14°С или ниже, около 9°С или ниже, или около 6°С или ниже. В зависимости от клетки-мишени, которая должна быть выделена, подходящий температурный интервал может быть, например, от приблизительно 2°С до приблизительно 45°С, в том числе от приблизительно 2°С до примерно 40°С, примерно от 3°С до около 35°С, или примерно от 4°С до около 30°С, если для охвата клетки-мишени используется водная среда. В некоторых вариантах способ согласно изобретению осуществляют при постоянной температуре или при выбранном значении температуры около ± 5°С, около ± 4°С, около ± 3°С, около ± 2°С, около ± 1°С или около ± 0,5°С. Температура может, например, быть выбрана около 5°С, примерно 10°С, примерно 15°С, примерно 20°С или приблизительно 25°C. В некоторых вариантах осуществления температуру изменяют, то есть увеличивают, уменьшают или варьируют в комбинации, во время осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением. Температура может, например, быть изменена в пределах диапазона, как определено выше, например, в диапазоне от приблизительно 2°С до примерно 40°С или в диапазоне от приблизительно 3°С до около 35°С. Специалист в данной области техники способен эмпирически оценить подходящую температуру, принимая во внимание природу клеток и условия выделения. Например, температурно-нечувствительные клетки, такие как раковые клетки, могут изолироваться при комнатной температуре или даже повышенной температуре, такой как 37°С.
Способ может также осуществляться с использованием набора компонентов, например, предназначенного для выполнения способа, как описано выше. Набор может включать в себя реагент связывания рецептора, как определено выше. Набор может включать, например, контейнер, заполненный реагентом связывания рецептора, например, в растворе. Набор может также включать в себя хроматографическую матрицу, как определено выше, которая может быть (предварительно) упакована в колонку, например картридж. К такой хроматографической матрице и/или контейнеру(ам) в некоторых вариантах предусматривается сопровождение в виде инструкции по применению этого набора для выполнения способа в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также относится к применению стрептавидина, стрептавидин мутеина (аналога), авидина, авидин мутеина (аналога) или их смеси для выделения клетки-мишени с помощью хроматографии, которая представляет собой гель-фильтрационную хроматографию. С этой целью стрептавидин, стрептавидин мутеин, авидин, авидин мутеин или смесь любых из них, например, смесь стрептавидина и стрептавидин мутеина, иммобилизуют в качестве аффинного реагента на неподвижной фазе «картриджа удаления». Термин «стрептавидин», используемый здесь, включает стрептавидин «дикого» типа, стрептавидин мутеины и стрептавидино-подобные полипептиды. Аналогично, термин «авидин», используемый здесь, включает авидин «дикого» типа, а также мутеины авидина, такие как неутравидин, дегликозилированный авидин с модифицированными аргининами, который проявляет более нейтральный pI и доступен в качестве альтернативы природному авидину. Дегликозилированные, нейтральные формы авидина включают коммерчески доступные формы, например такие как "Экстравидин" фирмы Sigma-Aldrich, или "НеутрАвидин" фирмы ThermoScientific или Invitrogen.
Подстрептавидином «дикого» типа (wt-стрептавидином) имеется в виду аминокислотная последовательность,раскрытая в статье: Argaranaetal., NucleicAcidsRes. 14 (1986) 1871-1882. Стрептавидин мутеины- это полипептиды, отличающиеся от последовательности стрептавидина «дикого» типа одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями или дополнениями и сохраняющие связывающие свойства wt-стрептавидина. Стрептавидин-подобные полипептиды и стрептавидин мутеины являются полипептидами, которые по существу иммунологически эквивалентны стрептавидину«дикого» типа и, в частности, способны связывать биотин, производные биотина или аналоги биотина с тем же или отличным сродством, что и wt-стрептавидин. Стрептавидин-подобные полипептиды или стрептавидин мутеины могут содержать аминокислоты, не являющиеся частью стрептавидина «дикого» типа, или они могут включать в себя только часть стрептавидина «дикого» типа. Стрептавидин-подобные полипептиды - это также полипептиды, которые не идентичны стрептавидину«дикого» типа, так как хозяин не имеет ферментов, необходимых для трансформирования производимого хозяином полипептида в структуру стрептавидина«дикого» типа. Термин «стрептавидин» также включает в себя стрептавидиновые тетрамеры и стрептавидиновые димеры, в частности, гомотеррамеры стрептавидина, гомодимеры стрептавидина, гетеротетрамеры стрептавидина и гетеродимеры стрептавидина. Каждая субъединица обычно имеет сайт связывания биотина или аналогов биотина или стрептавидин-связывающих пептидов. Примеры стрептавидинов или стрептавидин мутеинов упоминаются, например, в WO 86/02077, DE 19641876 A1, США 6022951, WO 98/40396 и WO 96/24606.
В предпочтительном варианте осуществления стрептавидин мутеины, использующиеся для выделения клетки-мишени с помощью хроматографии, где хроматография - этогель-фильтрационная хроматография, это те стрептавидин мутеины, которые описаны в патенте США 6103493, а также в DE 196 41 876,3. Эти стрептавидин мутеины имеют, по крайней мере, одну мутацию внутри интервала аминокислотных позиций от 44 до 53, и основаны на аминокислотной последовательности стрептавидина «дикого» типа. Предпочтение отдается мутеинам минимального стрептавидина, которые начинаются с N-конца в области аминокислот от 10 до 16 стрептавидина «дикого» типа и заканчиваются С-концом в области аминокислот от 133 до 142 стрептавидина«дикого» типа. Примеры таких предпочтительных стрептавидин мутеинов имеют гидрофобную алифатическую аминокислоту вместо Glu в позиции 44, любую аминокислоту в позиции 45, гидрофобную алифатическую аминокислоту в позиции 46 и/или основную аминокислоту вместо Val в позиции 47. Стрептавидин мутеин может быть мутеином Val44-Thr45-Ala46-Arg47 или стрептавидин мутеином (аналогом) Ile44-Gly45-Ala46-Arg47, оба описаны, например, в патенте США 6103493 и коммерчески доступны под торговой маркой Strep-Tactin.
Настоящее изобретение также обеспечивает устройство для очистки клеток-мишеней, каковое устройство содержит, по меньшей мере, один каскад первой и второй неподвижных фаз для хроматографии, как описано выше, что означает хроматографическую колонку для селекции клеток (картридж выбора) и вторую хроматографическую колонку (картридж удаления) для удаления реагентов выделения или окрашивания клеток-мишеней. Проведение такой двух шаговой процедуры выделения дает клетки-мишени, которые могут быть непосредственно подвергнуты следующему требуемому циклу приложения или отбора. В отличие от селекции методами FACS и MACK, в предлагаемом способе хроматографического отбора не требуется никаких дополнительных процедур, таких как промывание и центрифугирование, между двумя циклами отбора и клетки функционально не отягощены связыванием с реагентами выделения, такими как реагент связывания рецептора или магнитные гранулы. Таким образом, данное изобретение впервые обеспечивает надежный, простой в конструкции, но эффективный аппарат для очистки клетки-мишени.
В соответствии с вышеизложенным, аппарат согласно настоящему изобретению может включать ряд каскадов первой и второй неподвижных фаз (хроматографические колонки),гидравлически соединенных последовательно. Устройство может содержать отверстие ввода образца, гидравлически соединенное с первой неподвижной фазой первого каскада первой и второй неподвижных фаз для хроматографии. Устройство также может содержать отверстие для выпуска образца очищенных клеток-мишеней, каковое отверстие выхода образца гидравлически соединено со второй неподвижной фазой последнего из, по меньшей мере, одного каскада первой и второй неподвижных фаз для хроматографии. Устройство также может содержать контейнер для конкурирующего реагента, гидравлически соединенный с, по меньшей мере, одной из первых неподвижных фаз каскадов первой и второй неподвижных фаз для хроматографии.
Как легко поймет специалист в данной области техники из раскрытия настоящего изобретения, другие композиции, вещества, средства, использования, методы или шаги, существующие в настоящее время или которые будут разработаны позже, выполняющие по существу ту же функцию или достигающие по существу такого же результата, как соответствующие примерные варианты осуществления, описанные здесь, могут также быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
Экспериментальные примеры
В настоящих примерах в качестве реагента связывания рецептора используются рекомбинантно полученные фрагменты Fab, ориентированные против маркеров клеточной поверхности. Фрагменты Fab рекомбинантно экспрессированы в E.coli или других хозяевах и содержат стрептавидин-связывающий пептид как партнер связывания С. Тетрамерный стрептавидин или тетрамерные стрептавидин му теины представляет один или более сайтов связывания Z. Фрагменты Fab связаны со стрептавидином, которые сам ковалентно связан с гранулами. Эти гранулы используются для аффинной колоночной хроматографии клеточных суспензий с субпопуляцией клеток, имеющих внеклеточный белок (молекулу рецептора), способный быть связанным фрагментами Fab. Несвязанные клетки вымываются в этом «картридже выбора»,а связанные клетки затем элюируются биотин-содержащим буфером, нарушающим связь стрептавидин мутеина со стрептавидин-связывающим пептидом фрагмента Fab (действующего в качестве реагента связывания рецептора). Как следствие, фрагменты Fab сосвязанными с нимиклетками освобождаются из колонки и, в связи с отсутствием эффекта авидности, фрагменты Fab диссоциируют от клеток-мишеней. Суспензию теперь можно очистить от остальных фрагментов Fab и биотина с помощью второй колоночной хроматографии (картридж удаления) с помощью другой гелевой (хроматографической) матрицы с ковалентно связанным стрептавидином, в результате чего клетки элюируют в свободный объем, афрагменты Fab и биотин количественно связаны на хроматографической матрице. Клетки теперь могут быть подвергнуны дальнейшему циклу очистки с использованием другого фрагмента Fab или любого другого реагента связывания рецептора аналогичным образом. Колонны с фрагментами Fab (картридж выбора) и последующая колонка для удаления Fab и биотина (картридж удаления) могут быть соединены последовательно, просто располагая колонки линейно друг за другом. Поступая таким образом, с помощью настоящего изобретения может быть обеспечена автоматизированная система очистки клеток, как показано на фиг. 6, лишенная магнитных гранул или любого ручного вмешательства и позволяющая быструю, простую и экономически эффективную очистку клеток-мишеней.
Эта процедура обеспечивает, например, серийную очистку Т-клеток, начиная с очистки CD4+ с последующей очисткой CD25+ из фракции CD8+, в результате чего получается сильно обогащенная фракции регуляторных Т-клеток, как показано ниже. Дальнейшие циклы очистки с использованием различных фрагментов Fab, конечно, возможны.
Выделение Т-клеток CD8+ из крови человека (типичная одношаговая очистка)
Материал и методы
Была использована кровь человека, чтобы выделить PCMBs по стандартной процедуре.
Пример 1: одношаговая очистка клеток CD8+ с помощью колоночной хроматографии
2
Сефадекс G50 (Sigma) был использован в качестве неподвижной фазы и был ковалентно связан со Strep-tactin (рекомбинантный вариант стрептавидина, IBA GmbH, Германия) с использованием метода CNBr. 50%-я суспензия SephadexG50 содержала ковалентно связанные 70 мкг Strep-tactin/мл суспензии гранул. Strep-tactin служил в качестве аффинного реагента, иммобилизованного на аффинной матрице перед добавлением реагента связывания рецептора и образца, содержащего клетки-мишени. (CD8+)-связывающий фрагмент Fab, тяжелая цепь которого была сшита карбокси-концом с последовательным расположением двух стрептавидин-связывающих модулей (SAWSHPQFEK(GGGS)GGSAWSHPQFEK), доступный коммерчески (номер по каталогу: 6-8003) фирмы IBA GmbH, Gottingen, Германия), использовали в качестве (одновалентного) реагента связывания рецептора, а стрептавидин-связывающий пептид выступал в качестве партнера связывания С.
2 мл суспензии Сефадекс G50 со Strep-tactin инкубировали с 10 мкг CD8+ связывающего фрагмента Fab в течение 20 мин при 4°С, с тем чтобы обеспечить связывание фрагмента Fab с клетками-мишенями CD8+. Затем суспензию загружали в пластиковую миниколонку (Mobitec, Gottingen, Германия) с 90-микрометровой фриттой в нижней части. Таким образом, эта колонка действует как картридж выбора, как определено здесь. Колонку уравновешивали с помощью PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (буфер PBSA) с получением слоя объемом 1 мл. 5 млн. клеток из PCMBs (?) в 1 мл PBSA затем наносили на колонку, чтобы позволить образцу проникнуть в матрицу аффинной хроматографии. Затем колонку промывали 12 мл PBSA. Промывочный буфер собирали и центрифугировали при 3000 g в течение 6 мин для осаждения клеток, которые были вымыты из колонки (таблетка 1). Затем 6 мл PBSA, содержащие 0,1 миллимолярного биотина (Sigma) в качестве конкурирующего реагента, были добавлено в колонку с тем, чтобы элюировать CD8+ клетки, обратимо иммобилизованные на колонке через агент связывания рецептора и агент мультимеризации. Биотин-содержащую фракцию собирали и центрифугировали, как указано выше, для осаждения клеток (таблетка 2).
Таблетки обеих фракций ресуспендировали в 1 мл буфере PBSA для анализа.
Таблетка 1 содержала около 3,9 млн. клеток, таблетка 2 - 0,7 млн. клеток.
FACS-анализ (данные не приведены) показал, что исходный материал в сравнении с таблеткой 1 был сильно обеднен клетками CD8+ (около 70%), таблетка 2 содержала клетки СВ8+ 68%-ой чистоты. Таким образом, клетки-мишени CD8+ могут быть выделены с помощью обратимой иммобилизации/аффинной хроматографии.
Этот результат был подтвержден с помощью следующего эксперимента для обогащения клетками CD8+ из МКПК, результаты которого показаны на фиг. 5. Обогащение проводили на двух колонках, содержащих смолу Sephadex-50 в сочетании с Strep-Tactin, как описано выше. В первую колонку (картридж выбора) (диаграммы B-D) был загружен CD8-связывающий фрагмент Fab, коммерчески доступный в фирме IBA GmbH, описанный выше. Вторая колонка (диаграммы E-G) служила в качестве отрицательного контроля для этого картриджа выбора (не путать с картриджем удаления, который является «второй колонкой»,расположенной после картриджа выбора) и не был загружен этим CD8-связывающим фрагментом Fab. Таким образом, первая колонка должна показать CD8-Fab-специфичное обогащение клеток, тогда как вторая колонка (отрицательный контроль) не должна. Чтобы измерить обогащение, клеточная популяция Т-клеток CD8+ в МКПК была проанализирована прежде, чем начать процедуру выбора (фиг. 5, схема A, CD8+ Т-клетки 18,4%, верхний правый квадрант). После помещения фракции МКПК в первую колонку измеряли сквозной поток не задержанных клеток (схема В, Т-клетки CD8+ 6,3%). 12,1% (18,4-6,3%) или 66% Т-клеток CD8+ было связано с колонкой. Затем эти клетки были специфически элюированы добавлением биотинового буфера, нарушающего взаимодействие Strep-tag/Strep-tactin и последующим этапом промывки (схема C+D, Т-клетки CD8+ 47% и 62,2%). В отличие, во второй колонке не наблюдалось обогащения Т-клетками CD8+ (схема D-E-F-G-), поскольку популяция Т-клеток CD8+ в потоке через фракцию (схема Е, Т-клетки CD8+ 17,0%) и элюированные фракции (схема F и G) существенно не отличаются от таковой, измеренной до процедуры отбора (схема А). Различия примерно в 1% от внесенных клеток составляют неспецифически связанные клетки на колонке, показывая, что 95% подвергнутых МКПК проходят через колонку.
Пример 2: Удаление биотина и Fab из клеток С8+
Клетки CD8+ выделяли, как описано выше, за исключением того, что клетки после биотинового элюирования (6 мл буфера) непосредственно пропускали через колонку с гранулами Superflow™ Sepharose (объем слоя 6 мл), которые имели ковалентно присоединенный к ним Strep-Tactin (IBA GmbH, Gottingen, Германия) со связывающей емкостью 300 нмоль биотина/мл. В то время как гранулы Superflow™ Sepharose служили гель-проникающей матрицей для выделения/обогащения клеток-мишеней, Strep-Tactin, иммобилизованный на этих гранулах, имеет сродство связывания к обоим фрагментам Fab CD8+, которые включают стрептавидин-связывающий пептид и биотин. Таким образом, Strep-Tactin служил аффинным реагентом/ реагентом удаления для биотина и фрагментов Fab CD8+. Был собран элюат (6 мл) этой второй колонки (которая выступала в качестве картриджа удаления), заполненной гранулами Superflow.
Биотин и фрагменты Fab не были обнаружены в элюате, который содержал клетки-мишени, с использованием анализа на биотин и анализа на фрагмент Fab с помощью Вестерн-блоттинга (результаты не показаны). Аналогичный эксперимент проводили с использованием FITC-меченого биотина (Sigma) и флуоресцентно-меченого Fab CD8+ (IBA GmbH). Тот факт, что конечный элюат также не содержал никаких фрагментов Fab или биотина, был подтвержден с помощью чувствительного флуориметра. Таким образом, было обнаружено, что в то время как биотин и Fab были полностью удалены, элюат после хроматографии на Superflow™/Strep-Tactin содержал от 95% до 100% клеток CD8+, без очевидной потери клеток.
Пример 3: последовательная очистка в «линейной поточной»хроматографии
Поскольку окончательная фракция, как описано в примере 2, не содержит биотин и Fab (оба мешали бы последующей процедуре очистки путем блокирования Fab-связывающих сайтов на Strep-Tactin), очищенные клетки CD8+ могут пойти в другой цикл очистки с помощью, например, фрагмента Fab CD25+ (или любой другой молекулы рецептора, присутствующей на поверхности выделенных клеток-мишеней CD8+). Такая последовательная очистка Т-клеток, например, может быть осуществлена с использованием устройства, изображенного на фиг. 6а или фиг. 6b.
Пример 4: Очистка клеток с помощью хроматографии на плоской матрицей (нитроцеллюлозная мембрана, покрытая Strep-Tactin)
В этом эксперименте ("трехмерная") колоночная хроматографическая матрица (гранулы, покрытые Strep-Tactin), использовавшаяся для очистки клеток в примерах 1 и 2, была заменена на плоскую матрицу, покрытую Strep-Tactin.
Экспериментальная процедура:
Нековалентное прикрепление Strep-Tactin к нитроцеллюлозной мембране и очистка Т-клеток CD8+
Для нековалентного прикрепления Strep-Tactin к мембране кусочек нитроцеллюлозной мембраны (24 см, Whatman, Великобритания) был положен в чашку Петри и инкубирован с 4 мг Strep-tactin (МБА GmbH) в 10 мл PBS в течение 10 мин, а затем промыт 5 раз 20-ю мл PBS. Затем 5 мкг фрагмента Fab CD8+ (номер по каталогу: 6-8003-005, МБА GmbH, Геттинген, см. выше) было добавлено в 5 мл PBS и инкубировано в течение 5 мин при 4°С. Затем добавили 5 млн. клеток (МКПК) в буфере FACS (0,5% БСА (вес/объем) в PBS, рН 7,4) и инкубировали при 4°С в течение 10 мин. Затем мембрану промыли пять раз 10-ю мл FACS буфера и фракции промывки собирали для анализа FACS. Затем мембрану инкубировали в течение 5 мин в 10 мл буфера FACS, содержащего 1 ммоль биотина. Полученную фракцию собирали для анализа FACS.
Анализ методом FACS показывает, что биотин-содержащая фракция имела 99,1% чистоту по отношению к Т-клеткам CD8+. Выход клеток CD8+ составлял примерно 1,5% по сравнению с исходным материалом. Таким образом, этот эксперимент показывает, что клетки-мишени могут быть эффективно выделены с использованием планарной хроматографии в режиме, «подобном пакетному».
Пример 5: одношаговая очистка клеток CD8+ человека с помощью колоночной хроматографии с агарозой Superflow™
2
3 мл SuperflowStrep-Tactin (емкость связывания биотина 300 наномоль, MEAGmbH, Геттинген, Германия) наносили на мини-колонку (Mobitec, Геттинген, Германия). Колонку уравновешивали буфером (PBS плюс 0,5% бычьего сывороточного альбумина, «буфер FACS»), а затем добавляли МКПК из крови человека (1 млн. клеток в 0,2 мл буфера FACS), которые ранее были инкубированы с 12 мкг Fab, направленного против CD8 (номер по каталогу: 6-8003, МБА GmbH, Геттинген) (как сказано выше, тяжелая цепь фрагмента Fab была сшита карбокси-концомс последовательным расположением двух стрептавидин-связывающих модулей SAWSHPQFEK(GGGS)GGSAWSHPQFEK). Эта колонка действует как картридж выбора, как определено здесь. Колонку промывали 12 мл буфера FACS самотеком, а затем проводили элюирование 12-ю мл буфера FACS, содержащего 1 мМ биотина.
Промывочная фракция (12 мл) буфера FACS содержала только 1,77% клеток CD8+ по сравнению с исходной фракцией (А), содержавшей 7,98% клеток CD8+, при этом 77,8% клеток CD8+ тормозились на колонке. Элюирование биотин-содержащей буферной фракцией (В, 12 мл) привело к приблизительно 65% связанных клеток CD8+ с чистотой 98,5%. Кроме того, этот эксперимент показывает, что клетки-мишени CD8+ могут быть выделены с помощью обратимой иммобилизации/аффинной хроматографии, как описано здесь, с использованием коммерчески доступных хроматографических матриц.
Пример 6: Одношаговая очистка клеток CD8+ человека с помощью колоночной хроматографии
2
8
Человеческие клетки CD8+ очищали от (Ficoll) очищенных МКПК с градиентом плотности с помощью колонки, приготовленной из 500 мкл Strep-Tactin-агарозной (сшитая агароза из фирмы AgaroseBeadsTechnologies, Мадрид, Испания, с пониженным эксклюзионным размером по сравнению с агарозой Superflow) гранулированной смолы, функционализированной 10 мкг анти-CD8 Fab-фрагментов (номер по каталогу: 6-8003, МБА GmbH, Геттинген). Для этого фрагмент Fab, несущий последовательное расположение двух стрептавидин-связывающих модулей SAWSHPQFEK(GGGS)GGSAWSHPQFEK на С-конце тяжелой цепи, был загружен (иммобилизован) на агарозной матрице Strep-Tactin путем прокачки 1000 мл содержащего Fab промывочного буфера (PBS плюс 0,5% бычьего сывороточного альбумина) через колонку со скоростью 300 мкл/мин доочистки клеток. Для очистки клеток-мишеней 1×10 свежеприготовленных МКПК (в 2 мл промывочного буфера) были автоматически внесены в колонку со скоростью потока 300 мкл/мин перистальтическим насосом. Несвязанные (CD8-негативные) клетки были впоследствии удалены из колонки повторяющимися циклами промывки (4х) в общей сложности 7 мл промывочного буфера со скоростью 2 мл/мин. Наконец, клетки-мишени CD8+ были элюированы из колонки путем удаления связанных клеток из аффинной матрицы добавлением 5 мл 100 мкМ раствора D-биотина (V=600 мкл/мин) и элюированием5 мл промывочного буфера при 2 мл/мин. Полученные CD8-позитивные и негативные фракции анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки-мишени CD8+ очищали с выходом 80% и чистотой 88%. Точечные диаграммы соответствующих исходных, отрицательных и положительны x фракций, а также соответствующая чистота и выход (представительная выборка) показаны на фиг. 7.
Пример 7: Одношаговая очистка клеток CD8+ человека в цельной крови с помощью колоночной хроматографии
2
Человеческие клетки CD8+ из цельной крови очищали с использованием колонки, приготовленной из 1200 мкл Strep-Tactin-агарозной (сшитая агароза фирмы Agarose Beads Technologies, Испания с уменьшенным эксклюзионным размером по сравнению с агарозой Superflow™) гранулированной смолы, функционализированной 30 мкг анти-CD8 Fab-фрагмента (номер по каталогу: 6-8003, МБА GmbH, Геттинген). Для этого фрагмент Fab, несущий последовательное расположение двух стрептавидин-связывающих модулей SAWSHPQFEK(GGGS)GGSAWSHPQFEK на С-конце тяжелой цепи, был иммобилизован на Strep-Tactin-агарозной матрице путем прокачки 1500 мкл содержащего фрагмент Fab промывочного буфера (PBS плюс 0,5% бычьего сывороточного альбумина) через колонку со скоростью 300 мкл/мин доочистки клеток. Для очистки клеток-мишеней 10 мл недавно отобранной цельной крови (разбавленной 1:01 промывочным буфером) автоматически вносили в колонку со скоростью потока 300 мкл/мин перистальтическим насосом. Несвязанные (CD8-негативные) клетки были впоследствии удалены с колонки повторяющимися циклами промывки (4х) в общей сложности 13-ю мл промывочного буфера со скоростью 2 мл/мин. Наконец, клетки-мишени CD8+ были элюированы из колонки путем удаления связанных клеток из аффинной матрицы добавлением 10 мл 100 мкМ раствора D-биотина (V=600 мкл/мин) и элюирования 10 мл промывочного буфера при 2 мл/мин. Полученные CD8-позитивные и негативные фракции анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки-мишени CD8+ очищали с выходом 80% и чистотой 88%. Точечные диаграммы соответствующих исходных, отрицательных и положительных фракций, а также соответствующая чистота и выход (представительная выборка) показаны на фиг. 8.
Пример 8: Пипеточная одношаговая очистка мышиных CD4+ клеток из спленоцитов
7
Клетки CD4+ были выделены из спленоцитов с использованием кончика пипетки, заполненного 80 мкл Strep-Tactin-агарозной гранулированной смолы (сшитая агароза из фирмы Agarose Beads Technologies, Мадрид, Испания с уменьшенным эксклюзионным размером по сравнению с агарозой Superflow™), функционализированной 2 мкг анти-CD4 фрагмента Fab. Наконечники пипеток были заполнены агарозным материалом в фирме Phynexus Inc, США. Используемый фрагмент Fab содержал вариабельные домены «дикого» типа CD4-связывающего антитела GK1.5 (Dialynas DP et al, Immunol Rev. 1983;74:29-56, Gen Bank Entrykappalightchain: M84148.1 Gen Bank Entryheavychain: M84149.1), несущие последовательное расположение двух стрептавидин-связывающих модулей SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK на С-конце тяжелой цепи). Внесение/иммобилизация фрагмента Fab на Streptactin-агарозную матрицу были достигнуты пипетированием ручной электрической пипеткой 400 мкл содержащего фрагмент Fab промывочного буфера (PBS плюс 0,5% бычьего сывороточного альбумина) со скоростью 300 мкл/мин на агарозную хроматографическую матрицу доочистки клеток. Для очистки клеток-мишеней 1×10 мышиных спленоцитов (в 0,5 мл промывочного буфера) вносили в хроматографическую матрицу, присутствующую в наконечнике, трехкратно повторяющимися «вверх и вниз» циклами с образцом с помощью пипетки со скоростью 300 мкл/мин. Эта«похожая на пакетную» процедура хроматографии с движением содержащего клетки буфер вверх и вниз эквивалентна использованию поточного способа для иммобилизации клеток на хроматографической матрице. Несвязанные (CD4-негативные) клетки были впоследствии удалены с кончика тройной повторной промывкой (пипетированием промывочного буфера вверх и вниз) 1 мл промывочного буфера со скоростью 2 мл/мин. Наконец, клетки-мишени CD4+ были элюированы из наконечника путем удаления связанных клеток из аффинной матрицы добавлением 1 мл 100 мкМ раствора D-биотина (V=600 мкл/мин) и элюирования 2 мл (2×1 мл) промывочного буфера при скорости потока 2 мл/мин. Полученные CD4-положительные и отрицательные фракции анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки-мишени CD8+ очищали с выходом 95% и чистотой 85%. Точечные диаграммы соответствующих исходных, отрицательных и положительных фракций, а также соответствующая чистота и выход (представительная выборка) показаны на фиг. 9.
Пример 9: Одношаговая очистка клеток CD4+ человека с помощью колоночной хроматографии
2
7
Человеческие клетки CD4+ были выделены из очищенных МНПК с градиентом плотности (Ficoll) с использованием кончика пипетки, заполненного 80 мкл Strep-Tactin-агарозной (сшитая агароза из фирмы Agarose Beads Technologies, Мадрид, Испания с уменьшенным эксклюзионным размером по сравнению с агарозой Superflow™) гранулированной смолы, функционализованной 2 мкг анти-CD4 фрагмента Fab. Использованный CD4 фрагмент Fab был мутантом фрагмента Fab13B8.2, описанного в патенте США 7482000 и в статье Bes, С., et al. JBiol Chem 278, 14265-14273 (2003)). Мутантный фрагмент Fab, называемый «m13B8.2», несет вариабельный домен CD4-связывающего мышиного антитела 13 В8.2 и константный домен, состоящий из константного человеческого СН1-домена типа gamma 1 для тяжелой цепи и константного человеческого домена легкой цепи типа каппа, как описано в патенте США 7482000. По сравнению с вариабельными доменами фрагмента Fab 13 В8.2, в m13B8.2 остаток His в позиции 91 легкой цепи (позиция 93 в SEQ ID NO: 2) мутирован на Ala, и остаток Arg в позиции 53 тяжелой цепи (позиция 55 в SEQ ID NO: 1) мутирован на Ala. Кроме того, фрагмент Fabm13B8.2 несет последовательное расположение двух стрептавидин-связывающих модулей SAWSHPQFEK(GGGS)GGSAWSHPQFEK на С-конце тяжелой цепи. Фрагмент Fab был иммобилизован на Strep-Tactin-агарозной матрице ручной электрической пипеткой путем пипетирования 200 мкл содержащего фрагмент Fab промывочного буфер при скорости 300 мкл/мин до очистки клеток. Для отбора клеток-мишеней 1×10 свежеприготовленных МНПК (в 0,5 мл промывочного буфера) (PBS плюс 0,5% бычьего сывороточного альбумина) были автоматически внесены в присутствующую в наконечнике хроматографическую матрицу путем трехкратных повторных циклов«вверх-вниз» для образца с помощью пипетки со скоростью 300 мкл/мин. Несвязанные (CD4-негативные)клетки были впоследствии удалены из кончика тройной повторной промывкой (пипетированием промывочного буфера вверх и вниз) 1 мл промывочного буфера со скоростью 2 мл/мин. Наконец, клетки-мишени CD4+ были элюированы из наконечника путем удаления связанных клеток из аффинной матрицы добавлением 1 мл 100 мкМ раствора D-биотина (V=600 мкл/мин) и элюирования 2 мл (2×1 мл) промывочным буфером при скорости потока 2 мл/мин. Полученные CD4-положительные и отрицательные фракции анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки-мишени CD4+ очищали с выходом 90% и чистотой 99%. Точечные диаграммы соответствующих исходных, отрицательных и положительных фракций, а также соответствующая чистота и выход (представительная выборка) показаны на фиг. 10.
Пример 10: Пипеточная одношаговая очистка человеческих CD4+ клеток из цельной крови
Клетки CD4+ выделяли из цельной крови с использованием кончика пипетки, заполненного 80 мкл Strep-Tactin-агарозной (сшитая агароза из фирмы Agarose Beads Technologies, Мадрид, Испания с уменьшенным эксклюзионным размером по сравнению с агарозой Superflow™) гранулированной смолы, функционализированной 0.5 мкг анти-CD4 фрагмента Fab. CD4-связывающий фрагмент Fab«m13B8.2», использованный в примере 9, фигурировал также в примере 10. Фрагмент Fab был иммобилизован на Strep-Tactin-агарозной матрицы ручной электрической пипеткой путем пипетирования 200 мкл содержащего Fab промывочного буфера со скоростью 300 мкл/мин перед выделением клеток. Для выделения клеток-мишеней 2 мл свежеотобранной цельной крови (разбавленной 1:1 промывочным буфером) (PBS плюс 0,5% бычьего сывороточного альбумина) автоматически вносили в присутствующую в наконечнике хроматографическую матрицу трехкратными повторными циклами«вверх и вниз» с помощью пипетки со скоростью 300 мкл/мин. Несвязанные (CD4-негативные) клетки были затем удалены из наконечника пятикратной повторной промывкой (пипетированием вверх и вниз) 1 мл промывочного буфера со скоростью 2 мл/мин. Наконец, клетки-мишени CD4+ были элюированы из наконечника путем удаления связанных клеток из аффинной матрицы добавлением 1 мл 100 мкМ раствора D-биотина (V=600 мкл/мин) и элюирования 2 мл (2×1 мл) промывочного буфера при 2 мл/мин. Полученные CD4-положительные и отрицательные фракции анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки-мишени CD4+ очищали с выходом 88% и чистотой 70%. Точечные диаграммы соответствующих исходных, отрицательных и положительных фракций, а также соответствующая чистота и выход (представительная выборка) показаны на фиг. 11.
В этом контексте следует отметить, что при дальнейшей очистке или дальнейшем использовании клеток-мишеней, полученных в примерах 4-11, биотин в качестве элюента и фрагмент Fab как соответствующей реагент связывания рецептора могут быть удалены из образца клетки-мишени посредством «картриджа удаления», как описано в примере 2.
Называние или обсуждение ранее опубликованного документа в этой спецификации не обязательно должно быть принято в качестве подтверждения, что соответствующий документ является частью современного уровня техники или является общим знанием.
Изобретение, иллюстративно описанное здесь, может соответствующим образом быть осуществлено в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно не раскрытых здесь. Так, например, термины "содержащий", "включающий в себя" и т.п. должны трактоваться расширительно и без каких-либо ограничений. Кроме того, термины и выражения, используемые в данном описании, были использованы в качестве терминов описания, а не ограничения, без намерения при использовании таких терминов и выражений исключать любые эквиваленты показанных и описанных признаков или их частей, но признавая, что возможны различные модификации в пределах объема заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение было специфически раскрыто примерными вариантами осуществления и дополнительными функциями, модификация и вариация изобретений, воплощенных в нем и раскрытых здесь, могут быть осуществлены специалистами в данной области техники, и что такие модификации и вариации считается входящими в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение описано в данном документе в широком смысле и в общем плане. Каждый из узких видов и подродовых групп, входящих в общее раскрытие, также составляет часть настоящего изобретения. Это включает в себя общее описание изобретения с условием или отрицательным ограничением, исключающим любой предмет из рода, независимо от того, был ли исключенный материал специально приведен в настоящем документе.
Другие варианты осуществления находятся в пределах формулы изобретения. Кроме того, если признаки или аспекты настоящего изобретения описаны в терминах групп Маркуша, специалистам в данной области техники будет понятно, что данное изобретение также тем самым описано в терминах любого отдельного элемента или подгруппы членов группы Маркуша.