Культивирование эпителиоподобных клеток на пленочных матриксах из хитозана

Культивирование эпителиоподобных клеток на пленочных матриксах из хитозана

Д.А. Бузинова 1, Е.А. Хмельницкая12, А.Б. Шиповская1, Н.В. Островский 1 2

1 Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов

2 МУЗ Городская клиническая больница № 7 - Саратовский центр термических поражений, Саратов

Epithelium-Like Cell Cultivation on Chitosan Film Matrices

D.A. Buzinova 1, E.A. Khmel'nitskaya 12, A.B. Shipovskaya 1, N.V. Ostrovsky12

1 Saratov State University named after N.G. Chernyshevsky, Saratov

2 Urban clinical hospital No 7, Saratov Thermal Burn Center, Saratov

Представлены результаты адгезии и пролиферации эпителиоподобных клеток эмбрионального и постнатального происхождения на пленочных матриксах из хитозана. Использовали три клеточных линии эпителиоцитов: эпителий почки эмбриона макаки (МА-104), почки собаки (MDCKJ, а также карциномы легкого человека (А 549). Выявлена достаточно высокая адгезия и пролифериративная активность всех типов клеточных культур на исследуемых пленочных субстратах. В зависимости от молекулярной массы хитоза-на формирование полноценного монослоя эпителиоцитов МА-104 и MDCK наблюдалось на 3—4 и 4—6 сут. культивирования соответственно. Эпителиальные опухолевые клетки А 549 полноценный монослой не образовывали.

Ключевые слова: хитозан, полимерные пленки, эпите-лиоподобные клетки, культивирование.

В современной комбустиологии остается нерешенной проблема замещения дефектов кожного покрова при глубоких обширных ожогах, когда выполнение аутодермопластики затруднено из-за дефицита донорских ресурсов кожи [1]. В этом случае оптимальной является пересадка выращенных вне организма эпителиальных и соединительнотканных клеток человека (кератиноцитов, фибробластов] [2—4]. Однако существующие способы переноса эпителиальных пластов на раневую поверхность приводят к повреждению и гибели значительной части пролиферативно активных клеток. В связи с этим, культивирование клеточных культур целесообразнее проводить на биорезорбируемых полимерных матриксах с последующей трансплантацией тканеинженерной конструкции (фармацевтического биотрансплантата] на рану [5—7].

В этом плане представляется перспективным использование в качестве биодеградируемой подложки для создания таких тканеинженерных конструкций хитозана — производного аминополисахарида хитина. Это сравнительно дешевый полимер, обладает ежегодно возобновляемой и потому практически неограниченной сырьевой базой. В процессе получения хитозана практически полностью утрачивается его антигенность. Кроме того, данный аминополи-сахарид близок по функциональным качествам к компонентам дермы in vivo. Ранее нами показано, что пленочные материалы из хитозана обладают ярко выраженным бактерицидным действием [8] и высокой сорбционной способностью к раневому экссудату [9]. В клинических исследованиях (Центр термических поражений, г. Саратов] установлена нетоксичность пленочных матриксов из хитозана и

e-mail: Buzinova-8B@mail.ru

Our results of adhesion and proliferation of epithelium-like cells of both embryonic and postnatal origin on chitosan film matrices are presented. Three cellular lines of epitheliocytes were used, namely: the epithelium of macaque embryo kidneys (MA-104), that of dog kidneys (MDCK), and human lung carcinoma (A 549). Rather high adhesion and proliferation activity of all the types of cellular cultures on the tested film substrates were revealed. Depending on the molecular weight of chitosan, the formation of a full monolayer of MA-104 and MDCK epitheliocytes was observed in 3—4 and 4—6 days of cultivation, respectively. Epithelial tumor cells A 549 form no full monolayer.

Key words: chitosan, polymeric films, epithelium-like cells, cultivation.

их биосовместимость с дермальными тканями [10]. При лечении ожогов II-III А степени выявлено снижение уровня бактериальной обсемененности раны и ускорение репаративных процессов (практически в 2 раза] по сравнению с традиционной терапией [11].

В литературе имеются сведения о культивировании фибробластов человека и млекопитающих на подложках из хитина [12—14] и хитозана [14— 15], на хитозановых [1B] и хитозан-коллагеновых скаффолдах [17, 18], а также гибридных хитозан-полилактидных наноструктурированных матриксах [19]. Данных о культивировании кератиноцитов сравнительно немного [20, 21]. Способность кера-тиноцитов к адгезии, дифференцировке и пролиферации на хитозановых матриксах практически не исследована. Между тем, ввиду быстрого перехода фибробластов в фиброциты, обладающих менее выраженными ростстимулирующими свойствами [22], а также развития гипертрофии соединительной ткани (келоидный рубец], для получения фармацевтических биотрансплантатов для восстановления эпидермальных тканей целесообразнее использовать кератиноциты.

Цель настоящей работы — культивирование эпи-телиоцитов человека и млекопитающих на пленочных матриксах из хитозана.

Материал и методы

Использовали образцы хитозана со средневязкостной молекулярной массой (СММ) 87 и 200 кДа, степенью деацетилирования 83,6 и 82,0 мольн.% (ЗАО «Биопрогресс», Россия). Пленки получали поливом 2% растворов хитозана в 2% уксусной

кислоте на полиэтилентерефталатные подложки с последующим испарением растворителя. Формование проводили при температуре 22±2°С и нормальном атмосферном давлении. Для перевода полимера из солевой формы в форму основания пленки выдерживали в 1 М NaOH [23], затем промывали дистиллированной водой до рН = 7, высушивали на воздухе и стерилизовали УФ-светом в ламинарном боксе в течение 1 ч. Все полученные пленки были прозрачными, толщина составила 10—15 мкм.

Для культивирования выбраны эпителиоподобные по морфологии клетки человека и млекопитающих эмбрионального и постнатального происхождения из коллекции НИИ вирусологии РАМН: эпителий почки эмбриона макаки (МА-104), эпителий почки собаки (MDCK) и карцинома легкого человека (А 549). Ферментативную дезагрегацию для пассирования клеток проводили смесью 0,25% раствора трипсина с 0,2% раствором версена в соотношении 3:1 при 37°С. Жизнеспособность клеток оценивали на флуоресцентном микроскопе «МИКМЕД 2» (Россия), окрашивание проводили акридиновым оранжевым и этидиум бромидом. Для всех трех видов клеточных культур жизнеспособность клеток составила не менее 98%. Суспензию клеток в концентрации 30х104 кл/см2 наносили на образцы пленок. В качестве контроля использовали стандартные культуральные флаконы с внутренней поверхностью, обработанной поли^-лизином («Orange Scientific»,

Бельгия). Клетки культивировали в ростовой среде йМЕМ:Р12 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров (ООО «БиолоТ», Россия) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Питательную среду меняли через

2—3 сут. Наблюдение за адгезией и пролиферацией клеток проводили на инвертированном микроскопе «Биолам П» (Россия) с цифровой ССй-камерой йМС 300 («Бсорс^ек», Китай): объектив 40х, разрешение 3 Мрх. Эффективность адгезии клеток к субстрату оценивали по количеству прикрепившихся клеток, видимых в поле зрения микроскопа, через 1,5 ч после высева, результат культивирования — по срокам формирования монослоя.

Результаты и обсуждение

Проведены четыре серии экспериментов. Каждая серия включала три параллельных опыта по выращиванию клеток каждого типа на пленочном матриксе из хитозана определенной молекулярной массы. Во всех случаях, вне зависимости от СММ полимера и типа клеточной культуры, эффективность прикрепления клеток к субстрату составляла 90—95% и более.

Результаты наблюдения за адгезией и пролиферацией клеток на пленке из хитозана с СММ = 87 кДа в разное время культивирования представлены на рисунке. Видно, что спустя сутки инкубирования наблюдается высокая адгезия и пролиферация всех типов клеток на полимерной матрице (рис. А—В).

Эпителиоциты через 1 (А-В) и 7 сут. (Г-Е) культивирования на хитозановом матриксе с средневязкостной молекулярной массой 87 кДа: А, Г-эпителий почки эмбриона макаки (МА-104); Б, Д - эпителий почки собаки (МйОК);

В, Е - карцинома легкого человека (А 549). Световая микроскопия. Ув. х400

Формирование полного монослоя эпителиоцитов МА-104 наблюдалось в среднем на 4-е сут. культивирования, а MDCK — на 6-7-е сут. (рис. Г, Д). Общее количество клеток в сформированном монослое составило 3,3х106 кл/см2. Клетки карциномы легкого человека А 549 не образуют полноценного монослоя ни в одном из опытов (рис. Е), в том числе и при использовании пленочного матрикса, полученного из образца полимера с СММ 200 кДа.

Наилучший результат роста клеток выявлен для пленок из хитозана с СММ = 200 кДа. Так, в отличие от образцов с более низкой СММ, образование сплошного слоя клеток МА-104 наблюдалось на

3-и сут., а MDCK — на 4-е сут. культивирования.

Следует отметить, что в принятых условиях проведения опытов воспроизводимость культивирования клеток во всех сериях экспериментов составила 98±2%.

При использовании в качестве субстрата стандартной подложки с нанесенным слоем поли-D-лизина формирование монослойного пласта клеток

ЛИТЕРАТУРА:

1. Алексеев А.А., Лавров В.А. Актуальные вопросы организации и состояние медицинской помощи пострадавшим от ожогов в РФ. Избранные труды по комбустиологии. Саратов: Научная книга; 2009. С. 8-18.

2. Смирнов С.В., Киселев И.В., Васильев А.В. и др. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов. Хирургия 2003; 12: 58-62.

3. Бояринцев В.В., Самойлов А.С., Давыдов Д.В. и др. Перспективы применения клеточных технологий в травматологии и ортопедии: влияние стволовых клеток на течение репаративных процессов в костной ткани. Военно-медицинский журнал 2009; 330(4): 68-9.

4. Алексеев А.А. Современные методы лечения ожогов и ожоговой болезни. http://www.burn.ru/library_print/n01/lecture/treatm/ index.html.

5. Jun Y., Shoshana L., GuangHui Y. et al. Construction and clinical application of a human tissue-engineered epidermal membrane. Plast. Reconst. Surg. 2010; '125(3): 901-9.

6. Carty M., Taghinia A., Upton J. Fascial flap reconstruction of the hand: a single surgeon's 30-year experience. Plast. Reconst. Surg. 2010; 125(3): 953-62.

7. Grishkevich V.M. The post-burn elbow medial flexion scar contracture treatment with trapeze-flap plasty. Burns 2009; 35(2): 280-7.

8. Бузинова Д.А., Шиповская А.Б. Сорбционные и бактерицидные свойства пленок хитозана. Известия Саратовск. ун-та. Серия химия, биология, экология. 2008; 8(2): 42-5.

9. Юсупова К.А., Бузинова Д.А., Шиповская А.Б. Некоторые свойства пленок хитозана разных химических форм. Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине: Матер. ежегодной Всероссийск. науч. школы-семинара; Саратов: Изд-во Саратовск. ун-та; 2009. С. 185-8.

10. Островский Н.В., Шиповская А.Б., Бузинова Д.А. и др. Новый взгляд на применение полимерных матриксов и клеточных технологий в хирургии термических поражении. Клеточные технологии и регенеративная медицина в хирургии и трансплантологии: Матер. городской научно-практич. конф. Москва; 2009; 207: 22-6.

11. Шиповская А.Б., Островский Н.В., Бузинова Д.А. и др. Пленочные матриксы на основе хитозана: свойства и перспективы использования в комбустиологии. Избранные труды по комбустио-логии. Саратов: Научная книга; 2009. С. 201-10.

для всех трех типов клеточных культур наблюдалось на 3-и сут. культивирования.

Сравнительный анализ полученных результатов показал, что, несмотря на некоторое снижение эффективности роста клеток на пленочных субстратах из хитозана по сравнению с контролем, она остается на достаточно высоком уровне. Это может свидетельствовать о наличии на поверхности хитозановых матриксов специфических сайтов связывания с рецепторами клеток.

Таким образом, полученные результаты указывают на перспективность использования матриксов из хитозана в качестве подложки для культивирования эпителиальных клеток. Это позволит подойти к созданию комбинированных полимерно-клеточных биокомпозитов на основе полимерных матриц, ре-зорбируемых естественным метаболическим путем, необходимых для реализации процессов регенерации поврежденного термической травмой кожного покрова, что является предметом дальнейших публикаций.

12. Михайлов Г.М., Лебедева М.Ф., Пинаев Г.П. и др. Новые тканые матрицы на основе рассасывающегося природного полисахарида хитина для культивирования и трансплантации клеток кожи человека. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 4(6): 56-61.

13. Михайлов Г.М. Матрицы из хитиновых волокон и трансплантаты клеток кожи для регенерации кожных покровов. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии 2008; 4(2): 12-8.

14. Панарин Е.Ф., Нудьга Л.А., Петрова В.А. и др. Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов - хитина и хитозана. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; 4(3): 42-6.

15. Verma P., Verma V., Ray P. et al. Formation and characterization of three dimensional human hepatocyte cell line spheroids on chitosan matrix for in vitro tissue engineering applications. In Vitro Cell. Dev. Biol. 2007; 43: 328-37.

16. Seda Tigli R., Karakegili A., Gumu§derelioglu M. In vitro characterization of chitosan scaffolds: influence of composition and deacetylation degree. J. Mater. Sci.: Mater. Med. 2007; 18: 1665-74.

17. Suphasiriroj W., Yotnuengnit P., Surarit R. et al. The fundamental parameters of chitosan in polymer scaffolds affecting osteoblasts (MC3T3-E1). J. Mater. Sci.: Mater. Med. 2009; 20: 309-20.

18. Еремеев А.В, Светлаков А.В., Большаков И.Н. и др. Функции культивируемых эмбриональных клеток на коллаген-хитозановой матрице. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; 4(2): 55-62.

19. Duan B., Wu L., Yuan X. et al. Hybrid nanofibrous membranes of PLGA/chitosan fabricated via an electrospinning array. J. Biomed. Mater. Res. 2007; 83A: 868-78.

Noh H.K., Lee S.W., Kim J.-M. et al. Electrospinning of chitin nanofibers: degradation behavior and cellular response to normal human keratinocytes and fibroblasts. Biomaterials 2006; 27: 3934-44.

20. Tan W., Krishnaraj R., Desai T.A. Evaluation of nanostructured composite collagen-chitosan matrices for tissue engineering. Tissue engineering 2001; 7(2): 203-10.

21. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань: Функциональная морфология и общая патология. М: Медицина; 1981.

22. Вихорева Г.А., Енгибарян Л.Г., Голуб М.А. и др. Модифицирование хитозановых пленок поверхостно-активными веществами с целью регулирования их растворимости и набухания. Химич. волокна. 1998; (1): 14-9.

Поступила 23.05.2010