СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ CMV

1. Пентамерный комплекс, состоящий из CMV белков UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) и gL (UL115), получаемый по способу, который включает:
(i) совместное экспрессирование CMV белков UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) и gL (UL115) в клетке-хозяине с использованием бакуловируса;
(ii) очистку пентамерного комплекса из клеток-хозяев и/или супернатанта, полученных из указанной совместной экспресси; и
(iii) необязательно хранение очищенного пентамерного комплекса в буферном растворе, содержащем хелатирующий агент и/или стабилизирующий агент.
2. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого или клетку млекопитающего.
3. Пентамерный комплекс по п. 2, где клетка насекомого представляет собой Sf9, Sf21, HighFive, S2, Super Sf9-1, Super Sf9-2, или Super Sf-9-3.
4. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где стадия совместной экспресси включает
7
6
(i) инфицирование клетки-хозяева бакуловирусом, экспрессирующим указанные белки и имеющим титр приблизительно 10 БОЕ/мл или выше, при инфицировании указанной клетки-хозяина, имеющей количество клеток при инфицировании приблизительно 2⋅10 клеток/мл;
(ii) культивирование указанных клеток-хозяев в приемлемых условиях, и
(iii) сбор клеток указанных клеток-хозяев и/или супернатанта через 56-65 ч после инфицирования.
5. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где указанные клетки-хозяева инфицируются на 15 день и на 50 день, предпочтительно на 15 день и на 30 день, предпочтительно на 18 день после оттаивания и культивирования.
6. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где очистка включает ионообменную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, гель-проникающую хроматографию и/или аффинную хроматографию.
7. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где хелатирующий агент представляет собой ЭДТА или EGTA.
8. Пентамерный комплекс по п. 7, где ЭДТА присутствует в указанном буферном растворе при концентрации 20 мМ или меньше, например, 3 мМ или меньше.
9. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где стабилизирующий агент представляет собой полиэтиленгликоль, аргинин, сорбит, глицерин, сахарозу и/или NP-40.
10. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где указанный буферный раствор содержит Трис-буфер, NaCl, KCl.
11. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где открытые рамки считывания (ORF), кодирующие CMV белки UL128, UL130, UL131A, gH и gL находятся на одном или больше векторах, предпочтительно на одном векторе.
12. Пентамерный комплекс по п. 11, где вектор содержит элементы для размножения в бактерях (Е. coli), дрожжах (S. cerevisiae), клетках насекомых и/или клетках млекопитающих.
13. Пентамерный комплекс по п. 11 или 12, где ORF располагаются в следующем порядке от 5' до 3' в указанном векторе
(i) gH, gL, UL128, UL130, UL131A; или
(ii) gL, UL128, UL130, UL131A, gH.
14. Пентамерный комплекс по п. 13, где
(а) в (i) gH ORF транскрибируется в 3' направлении, gL ORF транскрибируется в 5' направлении, UL128 ORF транскрибируется в 3'
направлении, UL130 ORF транскрибируется в 3' направлении, и UL131A ORF транскрибируется в 3' направлении;
(b) в (i) gH ORF транскрибируется в 3' направлении, gL ORF транскрибируется в 3' направлении, UL128 ORF транскрибируется в 3' направлении, UL130 ORF транскрибируется в 3' направлении, и UL131A ORF транскрибируется в 3' направлении;
(c) в (ii) gL ORF транскрибируется в 5' направлении, UL128 ORF транскрибируется в 3' направлении, UL130 ORF транскрибируется в 3' направлении, UL131A ORF транскрибируется в 3' направлении, и gH ORF транскрибируется в 3' направлении.
15. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из пп. 11-14, где каждый из указанных ORF приводится в активность р10 промотором, polh промотором, IE-1 промотором, mCMV промотором, vp39 промотором, Ief2 промотором, CAG промотором, или HepB SV40 промотором и с последующей последовательностью терминатора, такого как HSVtk терминатор или SV40 терминатор
16. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где, по меньшей мере, один из указанных белков содержит тег.
17. Пентамерный комплекс по п. 16, где указанный тег представляет собой His-тег, Strep-тег, His-Strep-тег, Strepll-тег, Softag 1, TC-тег, myc-тег, FLAG-тег, HA-тег, V5-тег, Avi-тег, кальмодулин-тег, полиглутамат-тег, амилоид бета-тег, GST-тег, MBP-тег или S-тег.
18. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где один или больше из указанных белков содержит PreScission протеазу или PreScission и TEV протеазу, предпочтительно gH и/или gL белок содержит PreScission протеазу или PreScission и TEV протеазу.
19. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, где в указанном бакуловирусе v-cath и/или ChiA активность является функционально нарушенной.
20. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, который находится в виде композиции.
21. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из предшествующих пунктов, способен индуцировать нейтрализующую активность, которая ингибирует как эпителиальное/эндотелиальное (Epi/EC), так и фибробластное инфицирование.
22. Способ получения пентамерного комплекса, состоящего из CMV белков UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) и gL (UL115), включающий
(i) совместное экспрессирование CMV белков UL128, UL130, UL131A, gH (UL75) и gL (UL115) в клетке-хозяине с использованием бакуловируса;
(ii) очистку пентамерного комплекса от клеток-хозяев и/или супернатанта, полученных из указанной совместной экспресси; и
(iii) необязательно хранение очищенного пентамерного комплекса в буферном растворе, содержащем хелатирующий агент и/или стабилизирующий агент.
23. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из пп. 1-21, где один или больше из указанных белков содержит дополнительные В- и/или Т-клеточные эпитопы.
24. Пентамерный комплекс по п. 23, где указанный Т-клеточный эпитоп представляет собой CD4 Т-клеточный эпитоп или a CD8 Т-клеточный эпитоп.
25. Пентамерный комплекс по п. 23 или 24, где указанный эпитоп представляет собой какой-либо один из эпитопов, показанных в SEQ ID NOs: 22-66.
26. Фармацевтическая композиция или вакцинная композиция, содержащая пентамерный комплекс по какому-либо одному из пп. 1-21 и 23-25 или получаемый по способу по п. 22 и необязательно фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.
27. Пентамерный комплекс по какому-либо одному из пп. 1-21 и 23-25, в котором, по меньшей мере, один, два, три или четыре из указанных белков из штамма CMV, отличного от штамма CMV, из которого остальные белки.
28. Пентамерный комплекс по п. 27, где CMV белки из штамма CMV Towne, где Towne имеет геном такой, как хранится в NCBI GenBank под номером доступа FJ616285.1, Toledo (GU937742.1), AD169 (FJ527563), Merlin (AY446894.2), ТВ40/E (KF297339.1), VR1814 (GU179289).
29. Вакцинная композиция по п. 26, дополнительно содержащая gB белок, gM белок, рр65 белок, IE-1 белок, димер белка gL/gH, димер белка gM/gN, тример gL/gH/gO, вирусоподобные частицы (VLP), содержащие один или больше капсидных или капсид-предшествующих белков, один или больше поверхностных белков из CMV и/или один или больше тегументных белков.
30. Вакцинная композиция по п. 26, дополнительно содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует gB, gM, рр65, IE-1 или IE-2.
31. Вакцинная композиция, содержащая вектор, кодирующий пентамерный комплекс по какому-либо одному из пп. 1-25, 27 или 28.
32. Вакцинная композиция по п. 31, где указанный вектор основан на ДНК или РНК.
33. Вакцинная композиция по какому-либо одному из пп. 26 или 29-32, дополнительно содержащая модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA), содержащий один или больше белков пентамерного комплекса CMV, состоящего из UL128, UL130, UL131, gH (UL75) и gL (UL115).
34. Вакцинная композиция по какому-либо одному из пп. 26 или 29-33 для использования в способе вакцинирования субъекта против CMV, который включает введение, в качестве инициирующей композиции, указанной вакцинной композиции и, в качестве бустинг-иммунизирующей композиции, (i) gH/gL димера, (ii) UL130/UL131A-димера, (iii) gM/gN димера (iv) gH/gL/UL128/UL130/UL131A-пентамера, (v) gB, (vi) gM, (vii) pp65, (viii) IE-1, (ix) IE-2, (x) модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA), содержащего один или больше белков пентамерного комплекса CMV, состоящего из UL128, UL130, UL131, gH (UL75) и gL (UL115), (xi) модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA), содержащего gB, gH/gL димер, рр65 белок или IE-1 белок, (xii) вирусоподобных частиц (VLP), содержащих один или больше капсидных или капсид-предшествующих белков, одного или больше поверхностных белков из CMV, или одного или больше тегументных белков, (xiii) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей какое-либо одно из соединений, как определено в (i)-(xii), (xiv) пептидов из флагеллина, (xv) CpG мотивов, и/или (xvi) LCMV указанному субъекту.
35. Вакцинная композиция по п. 34, где указанная бустинг-иммунизирующая композиция используется в качестве инициирующей композиции, и указанная инициирующая композиция используется в качестве бустинг-иммунизирующей композиции.
36. Один или больше векторов, содержащие открытые рамки считывания (ORF), кодирующие CMV белки UL128, UL130, UL131, gH и gL.
37. Вектор по п. 36, где вектор содержит элементы для размножения в бактериях (например, Е. coli), дрожжах (например, S. cerevisiae), клетках насекомых и/или клетках млекопитающих.
38. Вектор по п. 36 или 37, где указанный вектор представляет собой вектор бакуловируса или вектор бакуловируса BacMam.
39. Вектор по какому-либо одному из пп. 36-38, где в указанном векторе бакуловируса ген v-cath и/или ChiA функционально нарушен и, где ORF расположены в следующем порядке от 5' к 3' в указанном векторе:
(a) gH, gL, UL128, UL130, UL131; или
(b) gL, UL128, UL130, UL131, gH.
40. Вектор по п. 39, где
(a) в (i) gH ORF транскрибируется в 3' направлении, gL ORF транскрибируется в 5' направлении, UL128 ORF транскрибируется в 3' направлении, UL130 ORF транскрибируется в 3' направлении, и UL131 ORF транскрибируется в 3' направлении;
(b) в (i) gH ORF транскрибируется в 3' направлении, gL ORF транскрибируется в 3' направлении, UL128 ORF транскрибируется в 3' направлении, UL130 ORF транскрибируется в 3' направлении, и UL131 ORF транскрибируется в 3' направлении;
(с) в (ii) gL ORF транскрибируется в 5' направлении, UL128 ORF транскрибируется в 3' направлении, UL130 ORF транскрибируется в 3' направлении, UL131 ORF транскрибируется в 3' направлении, и gH ORF транскрибируется в 3' направлении.
41. Вектор по какому-либо одному из пп. 36-40, где каждый из указанных ORF приводится в активность p10 промотором, polh промотором, IE-1 промотором, mCMV промотором, vp39 промотором, Ief2 промотором, CAG промотором, или HepB SV40 промотором и с последующей последовательностью терминатора, такого как HSVtk терминатор или SV40 терминатор.
42. Вакцина, содержащая вектор по какому-либо одному из пп. 36-41 и необязательно фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.