ШТАММ БАЗИДИОМИЦЕТА LAETIPORUS SULPHUREUS ВКПМ F-1286 - ПРОДУЦЕНТ ЛИПИДОВ
STRAIN BATIDOMICETTE STAINS LAETIPORUS SULPHUREUS VKPM F-1286 - PRODUCER OF LIPIDES

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма базидиомицета Laetiporus sulphureus, продуцирующего липиды. Липиды, полученные микробиологическим путем, могут быть использованы в качестве сырья для получения биодизельного топлива, в медицине, фармацевтике и в парфюмерно-косметической, пищевой и химической промышленностях.
Уровень техники
Известны штаммы базидиомицетов Ganoderma tsugae var.jannieae Tay-1 [Wasser S.P. et al. New Ganoderma tsugae var. jannieae strain Tay-1 and biologically active biomass and extracts therefrom. WO 2009017462 A2. - 2007] и Pleurotus ostreatus CBS 101937 [Wasser S.P. et al. For higher Basidiomycetes mushrooms grown as biomass in submerged culture. US 6372964 B1 - 2002], содержащие в составе мицелия до 10,2 и 7,2% липидов от сухого веса грибов, соответственно. Недостатком указанных штаммов является низкое содержание липидной фракции.
Наиболее близким к заявленному штамму является штамм Laetiporus sulphureus LS 1-06, способный накапливать в составе мицелия до 8,4% липидов от сухого веса грибов. Недостатком указанного штамма является низкая скорость роста и низкое содержание липидной фракции [Уфимцева О.В., Миронов П.В. Получение биомассы мицелия грибов вешенки обыкновенной Р 05/88 Pleurotus ostreatus и серно-желтого трутовика LS 1-06 Laetiporus sulphureus в глубинных условиях //Хвойные бореальной зоны. - 2009. - Т. 26. - №. 2. - С. 294-296].
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является получение нового штамма базидиомицета Laetiporus sulphureus, продуцирующего липиды в условиях погруженного культивирования.
Поставленная задача решается штаммом базидиального гриба Laetiporus sulphureus ВКПМ F-1286 (Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика), продуцирующего липиды в условиях погруженного культивирования.
Техническим результатом заявляемого изобретения является выделение штамма базидиомицета Laetiporus sulphureus, продуцирующего липиды в условиях погруженного культивирования с максимальным выходом липидной фракции до 24% от веса воздушно высушенной биомассы, а также в расширении арсенала технических средств заявляемого назначения.
Осуществление изобретения
Новый штамм Laetiporus sulphureus выделен из природного плодового тела, найденного на стволе Querqus robur. Кусочки гриба, вырезанные из середины плодового тела, в асептических условиях были перенесены на селективную плотную питательную среду (сусловый агар), содержащую 30 мг/л цефотаксима. Выросший мицелий был идентифицирован как чистая базидиальная культура по наличию пряжек на мицелии. Таксономическая принадлежность заявляемого штамма к виду Laetiporus sulphureus подтверждена молекулярно-генетическим методом. Штамм базидиального гриба Laetiporus sulphureus депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика и имеет регистрационный номер ВКПМ F-1286.
Характеристики штамма Laetiporus sulphureus.
Выделенный штамм относится к отделу Basidiomycota, подотделу Agaricomycotina, классу Agaricomycetes, порядку Polyporales, роду Laetiporus, виду sulphureus. Вид L. sulphureus не патогенен для человека и не образует токсичные метаболиты ни на одной из стадий морфогенеза.
Условия культивирования: сусловый агар, температура +28°С.
Условия хранения: в пробирках с сусловым агаром при +4°С в течение 12-18 месяцев без пересева.
Макроморфологические признаки: колония округлая, концентрически зональная, пушится вокруг инокулюма, профиль слабоприподнятый, воздушный мицелий бледно-оранжевого цвета, цвет субстратного мицелия бесцветный, по мере старения мицелий становится ярко-оранжевым за счет наличия пигментов-каратиноидов.
Микроморфологические признаки: гифы воздушного мицелия до 5-6 мкм в диаметре, длинные, отсутствие пряжек на гифах, характерно образование бластоспор.
При культивировании штамма в жидкой среде окрашивает среду в ярко-оранжевый цвет (за счет наличия пигментов-каратиноидов).
Вегетативный мицелий базидиомицета выращивают в погруженной культуре в асептических аэробных условиях. Культивирование осуществляют в качалочных колбах объемом 750 мл на орбитальной качалке при температуре 28°С. Среда для погруженного культивирования содержит: глюкозу - 10-30 г/л, соевую муку - 5-15 г/л, дигидрофосфат калия - 2-3 г/л, сульфат магния - 0,2-0,3 г/л и водопроводную воду. Значение рН среды доводят до 5,5-6,2. Питательную среду автоклавируют при температуре 121°С в течение 30 минут. Длительность процесса получения жидкого посевного мицелия составляет 10 суток, ферментации - 6 суток.
Биомассу отделяют от культуральной жидкости фильтрованием через лавсановую ткань. Липиды выделяют из влажной биомассы (влагосодержание 80-85%) по методу Фолча [Folch J. et al. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues //J biol chem. - 1957. - Vol. 226. - №. 1. - pp. 497-509].
Сведения, подтверждающие возможность осуществления предлагаемого изобретения.
Пример 1. Получение погруженного мицелия L. sulphureus.
Погруженное культивирование штамма L. sulphureus проводят на орбитальном шейкере со скоростью вращения 250 об/мин при температуре 28°С в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава: глюкоза - 20 г/л, соевая мука - 10 г/л, дигидрофосфат калия - 2,5 г/л и сульфат магния - 0,25 г/л. Уровень рН среды доводят до 5,5-6,2. Процесс погруженного культивирования проводят в два этапа. На первом этапе получают жидкий посевной материал, на втором этапе осуществляют ферментацию.
Для приготовления посевного материала используют культуру, выращенную в пробирках на сусловом агаре. Кусочки агара размером не более 3×3 мм в количестве 30-40 штук асептически вносят в качалочные колбы, содержащие 100 мл питательной среды, и культивируют в течение 10 суток. Затем 10 л посевного материала в асептических условиях вносят в качалочные колбы, содержащие 100 мл питательной среды, и культивируют в течение 6 суток. Выход воздушно высушенной биомассы составляет 4,1 г/л питательной среды на 6 сутки ферментации. Содержание суммарных липидов в погруженном мицелии, определенное весовым методом, составляет 24% от веса воздушно высушенной биомассы.
Пример 2. Получение погруженного мицелия L. sulphureus.
Получение погруженного мицелия L. sulphureus проводят, как описано в примере 1, но глюкозу, соевую муку, дигидрофосфат калия и сульфат магния в питательную среду вносят в количестве 10 г/л, 5 г/л, 3 г/л и 0,3 г/л, соответственно. Выход воздушно высушенной биомассы составляет 3,7 г/л питательной среды на 6 сутки ферментации. Содержание суммарных липидов в погруженном мицелии, определенное весовым методом, составляет 18,1% от веса воздушно высушенной биомассы.
Пример 3. Получение погруженного мицелия L. sulphureus.
Получение погруженного мицелия F. pinicola проводят, как описано в примере 1, но глюкозу, соевую муку, дигидрофосфат калия и сульфат магния в питательную среду вносят в количестве 30 г/л, 15 г/л, 2 г/л и 0,2 г/л, соответственно. Выход воздушно высушенной биомассы составляет 3,9 г/л питательной среды на 6 сутки ферментации. Содержание суммарных липидов в погруженном мицелии, определенное весовым методом, составляет 17,2% от веса воздушно высушенной биомассы.
Пример 4. Получение липидов L. sulphureus
Получают погруженную культуру L. sulphureus, как описано в примере 1. Биомассу отделяют от культуральной жидкости фильтрованием через лавсановую ткань и однократно промывают дистиллированной водой. Навеску влажной биомассы (влагосодержание 80-85%) растирают с песком в жидком азоте до пастообразного состояния и экстрагируют смесью хлороформа и метанола (1:1 по объему). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр, твердый остаток подвергают повторной экстракции. К объединенному фильтрату добавляют дистиллированную воду. Водно-метанольную и хлороформную фазу разделяют в делительной воронке. Хлороформный слой, содержащий липиды, сушат над слоем безводного сульфата натрия, растворитель упаривают на вакуумном ротационном испарителе.
Пример 5. Динамика накопления липидов штаммом L. sulphureus
Получают погруженную культуру L. sulphureus, как описано в примере 1. Отбор проб для определения содержания липидов в мицелии проводят каждые 24 часа. Липиды из биомассы выделяют, как описано в примере 5. Максимальный выход липидной фракции составляет 21,3% от веса воздушно высушенной биомассы на 6 сутки культивирования (таблица 1).
Жирно-кислотный состав липидов, выделенных из L. sulphureus, определяют методом газовой хроматографии. В составе липидной фракции преобладают линолевая, олеиновая и пальмитиновая кислоты (таблица 2).
Таким образом, выделен штамм базидиомицета Laetiporus sulphureus, продуцирующий липиды в условиях погруженного культивирования с максимальным выходом липидной фракции до 24% от веса воздушно высушенной биомассы.