Способ дифференциальной диагностики форм воспаления бактериального риносинусита
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF BACTERIAL RHINOSINUSITIS INFLAMMATION FORMS

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, иммунологии, отоларингологии и предназначено для дифференциальной диагностики острой и хронической формы воспаления бактериального риносинусита (БРС). Патогенетические механизмы данного заболевания сложны и до конца не изучены, что ведет к неэффективности традиционной терапии, частым рецидивам и осложнениям заболевания. Однако доказано, что нарушения функциональной активности нейтрофилов играют немаловажную роль в развитии БРС. Нейтрофильные гранулоциты составляют первую линию неспецифической противомикробной защиты, их патогенное действие связано, главным образом, с генерацией активных форм кислорода (АФК). При этом недостаточное образование АФК может свидетельствовать о слабости защитных сил организма. Известно, что при хронизации острого бактериального риносинсита (ОБРС) происходит дисбаланс в иммунной системе, имеются нарушения в функциональной активности нейтрофилов, что ведет к неполной элиминации патогена. Таким образом, способность нейтрофильных гранулоцитов образовывать достаточное количество АФК может служить прогностическим признаком для оценки дальнейшего хода воспалительного процесса, а ответ на стандартный стимул может характеризовать активность защитных сил организма. Одним из наиболее чувствительных методов исследования продукции АФК клетками является хемилюминесцентный метод. При этом существуют различные способы оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при различных заболеваниях.
Известен способ определения функциональной способности фагоцитирующих клеток, сущность которого заключается в оценке параметров кинетики хемилюминесценции (ХЛ), индуцированной взвесью клинического штамма метицилленрезистентного Staphylococcusaureus, и при значениях времени выхода кривой на максимум от 2287 до 3520 с, максимальной интенсивности сигнала от 4257 до 9516 у.е., а светосуммы от 169000 до 362000 у.е. регистрируют нормальную функциональную способность фагоцитирующих клеток, при других значениях показателей регистрируют нарушение функциональной способности фагоцитирующих клеток (патент РФ №2445626, МПК G01N 33/487, G01N 33/52). Недостатком данного способа является его трудоемкость, а также использование микробной тест культуры в качестве стимулятора нейтрофильного взрыва.
Известен способ  определения резерва реактивности (оксидантного потенциала) нейтрофилов, характеризующийся тем, что проводят измерение светосуммы спонтанной ХЛ цельной разведенной крови в растворе люминола сразу после взятия крови и через 4 ч после ее инкубации, затем проводят расчет разности светосуммы (РСС) как разность измерений через 4 ч и измерения, проведенного сразу после забора крови, при этом за норму значений РСС принимают 1-99% процентильный интервал общего диапазона значений контрольной группы здоровых доноров. Значения РСС ниже 1% процентильного интервала свидетельствуют о снижении резерва реактивности нейтрофилов, значения, превышающие 99% процентильный интервал, свидетельствуют о процессе оксидантного стресса, альтерации клеток и развитии воспалительно-деструктивного процесса (патент РФ №2457488, МПК G01N 33/49). Недостатком данного способа является определение только спонтанной продукции нейтрофильных гранулоцитов, без использования стимулов оксидативного взрыва, поэтому не может в полной мере охарактеризовать функциональную способность нейтрофилов.
Известен способ прогнозирования эффективности лечения острого риносинусита путем исследования периферической венозной крови больного, отличающийся тем, что с помощью хемилюминесцентного анализа исследуют функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, рассчитывают индекс активации, представляющий собой отношение площади под кривой люцигенин-зависимой ХЛ нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной зимозаном, к площади под кривой спонтанной люцигенин-зависимой ХЛ нейтрофильных гранулоцитов, и при значении индекса активации более 3,6 прогнозируют высокую эффективность применения стандартной терапии, а при значении индекса активации, равном или менее 3,6, прогнозируют низкую эффективность или отсутствие эффективности стандартной терапии (патент, РФ №2438134, МПК G01N 33/53, G01N 33/52, G01N 33/49). Недостатком данного способа является трудоемкость метода, использование люцигенина в качестве активатора ХЛ, что позволяет анализировать синтез только первичных АФК.
В основе нашего способа лежит новый хемилюмисцентный метод оценки функциональной активности нейтрофилов цельной крови методом двухстадийной стимуляции. В качестве активатора ХЛ использовали люминол, что позволяет охарактеризовать синтез нейтрофилами первичных и вторичных форм АФК. В качестве объекта была использована цельная кровь, поскольку выделение фагоцитов в градиенте плотности активирует клетки и усложняет процедуру анализа. В качестве стимулов использовали: форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА), который выполняет роль  праймирующего стимула (активирует нейтрофилы, при этом не происходит полноценного ответа, но запускаются процессы, ведущие к усиленному отклику) и N-формилметионил-лейцил-фенилаланином (фМЛФ), который является основным стимулом для люминол-зависимой хемилюминесценции (Образцов И.В., Годков М.А., Полимова А.М., Демин Е.М., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Оценка функциональной активности нейтрофилов цельной крови методом двухстадийной стимуляции: новый подход к хемилюминесцентному анализу. Российский иммунологический журнал. 2015, т. 9(18), № 4, с. 418–425).
Задачей нашего изобретения является создание точного способа дифференциальной диагностики форм воспаления БРС, что позволяет персонализированно подходить к терапии пациентов.
Технический результат достигается путем создания математической модели, включающей три достоверных информативных лабораторных показателя: удельная светосумма спонтанной продукции нейтрофилов, удельная светосуммафМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов, удельная максимальная интенсивность свечения фМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов и определены их пороговые величины. Выявлено, что эти показатели ХЛ являются наиболее значимыми критериями для дифференциальной диагностики форм воспаления БРС. Способ является простым, быстровыполнимым, недорогим методом диагностики. Построенная математическая модель и пороговые значения удельной светосуммы спонтанной продукции нейтрофилов, удельной светосуммыфМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов, удельной максимальной интенсивности свечения фМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов позволяют проводить дифференциальную диагностику форм воспаления БРС, что позволит, персонализировано подходить к назначению обоснованной патогенетической терапии.
Способ реализуется следующим образом.
Забор крови в объёме 5 мл осуществляют из кубитальной вены в вакутейнеры с Li-гепарином в конечной концентрация гепарина 5 ЕД/мл. Кровь хранят в холодильнике при температуре +6°С не более двух часов. Измерения ХЛ проводят на 12-канальном Lum-1200 («ДИСофт», Россия, с программным обеспечением PowerGraph 3.0). Для измерения показателей спонтанной продукции нейтрофилов в кювету хемилюминометра вносят 450 мкл среды, 25 мкл 1 мМ раствора люминола (конечная концентрация 45 мкМ), 25 мкл цельной крови и регистрируют ХЛ в течение 10 минут. В качестве среды используют раствор Хенкса с глюкозой (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН), стабилизированный 2 М НЕРЕS. Раствор 1 мМлюминола готовят путем растворения навески 2 мг сухого люминола (Sigma-Aldrich) в 10 мл стерильной воды, подщелоченной КОН, с последующим доведением рН до 7.4. Раствор 2 М НЕРЕS готовят путем растворения 47,66 г. навески HEPES в 58,74 мл дистиллированной воды и доведением ph до 7,0. Рабочая среда готовится путем добавления к 99,5 мл раствора Хенкса с глюкозой раствора HEPES в объёме 500 мкл. Для праймирования нейтрофилов в пробы добавляют 50 мкл ФМА с концентрацией 0,5 мкг/мл (конечная концентрация 0,081 нМ), регистрируют сигнал в течение 20 минут. Для оценки показателей стимулированной продукции нейтрофилов вносят 55 мкл 100 мкМфМЛФ (конечная концентрация 10 мкМ) и регистрируют ХЛ-ответ не менее 60 минут до полного угасания сигнала. Раствор ФМА с концентрацией 0,5 мкг/мл готовят путем добавления к 0,1 мг сухого вещества ФМА стерильной воды в объёме 200 мл, вортексируют и замораживают в аликвотах по 30 мкл.  Исходный раствор фМЛФ с концентрацией 1 мМ готовят путем добавления 4,6 мл диметилсульфоксида во флаконы, содержащие 10 мг фМЛФ (Sigma-Aldrich), вортексируют и замораживают в аликвоты по 100 мкл. Рабочий раствор концентрацией 100 мкМ готовят добавлением в аликвоты с исходным раствором фМЛФ среды в объёме 900 мкл. Данная методика реализуется по способу, предложенным Образцовым И.В.  для оценки функциональной активности нейтрофилов (Образцов И.В., Годков М.А., Кулабухов В.В., Владимирова Г.А., Измайлов Д.Ю., Проскурнина Е.В. Функциональная активность нейтрофилов при ожоговом сепсисе Общая реаниматология. 2017, т. 13; № 2, с. 40-51).
Вычисляют показатели удельной светосуммы спонтанной продукции нейтрофилов (ССсп.), удельной светосуммыфМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов (ССфМЛФ), удельной максимальной интенсивности свечения фМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов (МахфМЛФ) по формулам:
,
3
9
6
где а - показатель светосуммы спонтанной продукции нейтрофилов, kPPs (10импульсов света в секунду времени);b – абсолютное количество нейтрофилов, 10кл/л;k - коэффициент 10кл/л (пересчет на миллион нейтрофилов). Единица измерения показателя ССсп. – PPs (количество импульсов света в секунду времени).
,
3
9
6
где а - показатель светосуммыфМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов, kPPs (10импульсов света в секунду времени); b – абсолютное количество нейтрофилов, 10кл/л; k - коэффициент 10кл/л (пересчет на миллион нейтрофилов). Единица измерения показателя ССфМЛФ – PPs (количество импульсов света в секунду времени).
,
3
9
6
где а - показатель максимальной интенсивности свечения фМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов, kPPs (10импульсов света в секунду времени); b – абсолютное количество нейтрофилов, 10кл/л; k - коэффициент 10кл/л (пересчет на миллион нейтрофилов). Единица измерения показателя MaxфМЛФ – PPs (количество импульсов света в секунду времени).
1
2
3
Математическая модель, которая позволяет дифференцировать формы воспаления БРС на острую и хроническую, построена с помощью статистической обработки данных, в результате многофакторного анализа. Для решения поставленной задачи первым этапом многофакторного анализа стала оценка корреляционной связи независимых факторов-предикторов с формой заболевания. Корреляционный анализ показал наличие сильной достоверной связи формы заболевания с параметром ССфМЛФ (R = 0,8273, p = 0,0000), МахфМЛФ (R =0,8125, p = 0,0000) и ССсп. (R =0,6358, p = 0,0000). Следующим этапом стало построение непосредственно модели для дифференциации больных по форме заболевания методом пошагового регрессионного анализа. Обозначили у – форма заболевания БРС, х – ССфМЛФ (PPs), х – MaxфМЛФ (PPs), х – ССсп. (PPs), тогда модель для дифференциальной диагностики форм БРС будет иметь вид:
Анализ полученной регрессионной модели показал ее высокую информационную значимость (коэффициент детерминации R2 = 0,314476) и статистическую ценность (F(3,34) = 5,199032; p<0,0046).
При значении: у = 0-0,4 диагностируют хроническую форму воспаления БРС, а при значении y = 0,6 и выше – острую форму воспаления БРС.
Однако, в виду сложности дифференциации в случае, когда результат математической формулы будет попадать в промежуток от 0,41 до 0,59, было принято решение провести дополнительно RОC-анализ показателей ССсп., ССфМЛФ, МахфМЛФ. Данный анализ позволил определить пороговые значения указанных показателей, на основании которых можно распределять пациентов в две альтернативные группы – с хронической и острой формой БРС, с заданным уровнем чувствительности и специфичности теста для точного определения результата. Как известно, чувствительность отражает долю положительных результатов, полученных с помощью теста у пациентов, которые имеют заболевание. В свою очередь, специфичность показывает процент отрицательных результатов теста у пациентов, которые не больны.
Таким образом, если чувствительность и специфичность теста равны 100%, то проблем с интерпретацией теста нет, но зачастую тест не является совершенным, поэтому появляется необходимость выбрать такое сочетание чувствительности и специфичности для каждого теста, чтобы в общей сумме они дали наиболее точный результат.  В результате проведенного ROC-анализа были установлены пороговые значения показателей ССсп., ССфМЛФ, МахфМЛФ (значения показателей выше пороговых характерны только пациентам с острой формой воспаления бактериального риносинусита). Для показателя ССсп. пороговое значение составило – 7,631 PPs (чувствительность теста 91,3% и специфичность теста 80,0%), для показателя ССфМЛФ – 82,158 PPs (чувствительность теста 100,0% и специфичность теста 93,3%), для показателя MaxфМЛФ – 0,136 PPs (чувствительность теста 91,3%, специфичность теста 93,3%).
Реализация способа разобрана в примерах.
Пример 1.
9
Больная С., 41 год, жалобы на затрудненное носовое дыхание, гнойные выделения из носа, головную боль. Из анамнеза заболевания: указанные жалобы отмечает в течение двух недель, амбулаторное лечение без эффекта. Объективное состояние: удовлетворительное, кожа нормальной окраски, лимфатические узлы не увеличены, грудная клетка не изменена, дыхание в легких свободное, живот мягкий, безболезненный, область сердца не изменена, тоны сердца нормальные, ЧСС 78 в 1 минуту, ЧД 19 в 1 минуту, АД 120/80 мм рт.ст. Из локального статуса: наружный нос, область ОНП визуально без патологии, носовое дыхание затруднено с обеих сторон, полости носа гиперемированы, отечны, в носовых ходах гнойное отделяемое. Наружный слуховой проход широкий, чистый, отделяемого нет. Глотка симметрична, слизистая оболочка розовая, чистая. Диагноз: острый бактериальный риносинусит. Проведено обследование больного по предложенному способу, в результате которого получены следующие показатели: абсолютное количество нейтрофилов – 7,4×10кл/л, ССфМЛФ – 433 PPs, МахфМЛФ – 0,31 PPs,ССсп. – 92 PPs.
=0,72
Выявлена острая форма воспаления БРС.
Пример 2.
9
Больная М., 28 лет, жалобы на затрудненное носовое дыхание, гнойные выделения из носа, головную боль, припухлость в гайморовых пазухах. Из анамнеза заболевания: указанные жалобы отмечает в течение трех лет, амбулаторное лечение без эффекта. Объективное состояние: удовлетворительное, кожа нормальной окраски, лимфатические узлы не увеличены, грудная клетка не изменена, дыхание в легких свободное, живот мягкий, безболезненный, область сердца не изменена, тоны сердца нормальные, ЧСС 65 в 1 минуту, ЧД 17 в 1 минуту, АД 110/80 мм рт.ст. Диагноз: хронический бактериальный риносинусит, обострение. Проведено обследование больного по предложенному способу, в результате которого получены следующие показатели: абсолютное количество нейтрофилов – 4,3×10кл/л, ССфМЛФ – 33 PPs,МахфМЛФ – 0,05 PPs,ССсп. – 5,3 PPs.
=0,394
Выявлена хроническая форма воспаления БРС.
Пример 3.
9
Больной Г., 35 лет, жалобы на заложенность носа, выделения из носа слизистого характера, головные боли диффузного характера. Из анамнеза заболевания: указанные жалобы отмечает в течение длительного времени. Настоящее обострение заболевания наступило в результате переохлаждения и наблюдались в течение 7 дней. Данные объективного осмотра: удовлетворительное состояние, кожа нормальной окраски, лимфатические узлы не увеличены, грудная клетка не изменена, дыхание в легких свободное, живот мягкий, безболезненный, область сердца не изменена, тоны сердца нормальные, ЧСС 75 в 1 минуту, ЧД 18 в 1 минуту, АД 120/80 мм рт.ст. Из локального статуса: носовое дыхание затруднено, видео риноскопия показала искривление носовой перегородки, полости носа гиперемированы, отечны, в носовых ходах слизистое отделяемое. Наружный слуховой проход широкий, чистый, отделяемого нет. Глотка симметрична, слизистая оболочка розовая, чистая.  Диагноз: острый бактериальный риносинусит. Проведено обследование больного по предложенному способу, в результате которого получены следующие показатели: абсолютное количество нейтрофилов – 7,9×10кл/л, ССфМЛФ – 1300 PPs,МахфМЛФ – 1,34 PPs,ССсп. – 220 PPs.
=1,57
Выявлена острая форма воспаления БРС.
Пример 4.
9
Больная К., 49 лет, жалобы на затрудненное носовое дыхание, гнойные выделения из носа, головную боль. Из анамнеза заболевания: указанные жалобы отмечает в течение нескольких лет, амбулаторное лечение без эффекта. Объективное состояние: удовлетворительное, кожные покровы нормальной окраски, лимфатические узлы не увеличены. Грудная клетка не изменена, дыхание в легких свободное, живот мягкий, безболезненный, область сердца не изменена, тоны сердца ритмичные, ясные, ЧСС 70 в 1 минуту, ЧД 18 в 1 минуту, АД 110/70 мм рт.ст. Диагноз: хронический бактериальный риносинусит, обострение. Проведено обследование больного по предложенному способу, в результате которого получены следующие показатели: абсолютное количество нейтрофилов – 5.0×10кл/л, ССфМЛФ – 75 PPs,МахфМЛФ – 0,12 PPs,ССсп. – 7,1 PPs.
=0,45
Результат математической формулы попадает в промежуток от 0,41 до 0,59. Поэтому проведена оценка показателей ССсп., ССфМЛФ, МахфМЛФ по отношению к пороговым значениям и установлено, что данные показатели ниже установленных пороговых значений, что соответствует хронической форме БРС.
Выявлена хроническая форма воспаления БРС.
Предложенный способ повышает точность дифференциальной диагностики форм воспаления БРС, что позволяет персонализировано подходить к терапии пациентов и повышает ее эффективность.