СТАБИЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ АНТИГЕНОВ Neisseria meningitidis rLP2086
STABLE COMPOSITIONS OF ANTIGENS Neisseria meningitidis rLP2086

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композициям антигенов подсемейства B Neisseria meningitidis rLP2086 в иммуногенных композициях, которые описаны в данном документе. Настоящее изобретение также относится к способам сохранения конформации антигенов Neisseria meningitidis rLP2086 и к способам определения эффективности антигенов Neisseria meningitidis rLP2086.
Предшествующий уровень техники
rLP2086 представляет собой рекомбинантный липопротеин 28 кДа, который индуцирует перекрестно-реагирующие бактериальные антитела против целого ряда штаммов Neisseria meningitidis. На основе установленной гомологии аминокислотных последовательностей были идентифицированы два разных подсемейства rLP2086, A и B. Эти два подсемейства были использованы в приготовлении образцов вакцины MnB-rLP2086, содержащих 20, 60, 120 и 200 мкг/мл, каждые в 10 мМ гистидине (pH 6,0), 150 мМ NaCl и 0,5 мг/мл алюминия с варьирующими уровнями Полисорбата 80 (PS-80). Полисорбат 80, также известный как TWEEN 80, является неионным поверхностно-активным веществом и эмульгатором, получаемым из сорбита, и его часто используют в фармацевтических композициях в качестве эмульгатора, солюбилизатора и стабилизатора. Полагают, что присутствие Полисорбата 80 в иммуногенной композиции MnB rLP2086 предотвращает агрегацию в процессе приготовления, обработки, фильтрации, заполнения и транспортировки, снижает адсорбцию на мембране фильтра и снижает адсорбцию в трубопроводах.
Краткое изложение сущности изобретения
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предложена стабильная иммуногенная композиция, где эффективность полипептида подсемейства B LP2086 сохраняется в течение по меньшей мере примерно 1-12 месяцев, примерно 6-18 месяцев, примерно 12-24 месяцев, примерно 24-36 месяцев или примерно 36-48 месяцев. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит полипептид подсемейства ALP2086.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит детергент. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок составляет от примерно 0,5:1 до примерно 10:1; от примерно 1:1 до примерно 5:1; или от примерно 1,4:1 до 4,2:1. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок составляет примерно 2,8:1. В некоторых воплощениях количество детергента является достаточным для снижения связывания полипептида с кремнием в контейнере, таком как шприц или флакон. В некоторых воплощениях детергент представляет собой неионный детергент, такой как полисорбатный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой Полисорбат 80.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит многовалентный катион. В некоторых воплощениях многовалентным катионом является кальций или алюминий. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит фосфат кальция. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит алюминий в виде фосфата алюминия, гидроксида алюминия, сульфата алюминия или квасцов. В некоторых воплощениях концентрация алюминия составляет от примерно 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл. В некоторых воплощениях концентрация алюминия составляет примерно 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит гистидин. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ или от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет примерно 10 мМ. В некоторых воплощениях pH гистидина составляет от примерно 5,0 до примерно 8,0 или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет 10 мМ, pH 6,0.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит сукцинат. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет от примерно 2 мМ до примерно 10 мМ или от примерно 3 мМ до примерно 7 мМ. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет примерно 5 мМ. В некоторых воплощениях pH сукцината составляет от примерно 5,0 до примерно 8,0 или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет 5 мМ, pH 6,0.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция является лиофилизированной. В некоторых воплощениях лиофилизированная композиция ресуспендирована в буфере, содержащем алюминий. В некоторых воплощениях алюминий присутствует в виде фосфата алюминия, гидроксида алюминия, сульфата алюминия или квасцов.
4
4
4
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит Полисорбат 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 10 мМ гистидина pH 6,0 и 150 мМ NaCl. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по существу состоит из 200 мкг/мл полипептида подсемейства B LP2086 (fHBP), Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 10 мМ гистидина pH 6,0 и 150 мМ NaCl. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по существу состоит из 200 мкг/мл полипептида подсемейства A rLP2086 (fHBP), 200 мкг/мл полипептида подсемейства B LP2086 (fHBP), Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 10 мМ гистидина pH 6,0 и 150 мМ NaCl.
4
4
4
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит Полисорбат 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 5 мМ сукцината pH 6,0 и 150 мМ NaCl. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по существу состоит из 200 мкг/мл полипептида подсемейства В LP2086 (fHBP), Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 5 мМ сукцината pH 6,0 и 150 мМ NaCl. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по существу состоит из 200 мкг/мл полипептида подсемейства A rLP2086 (fHBP), 200 мкг/мл полипептида подсемейства B LP2086 (fHBP), Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 5 мМ сукцината pH 6,0 и 150 мМ NaCl.
В другом аспекте изобретения предложен способ стабилизации эффективности полипептида подсемейства В LP2086 в иммуногенной композиции путем хранения полипептида подсемейства В LP2086 в буфере с молярным отношением детергент:белок от примерно 0,5:1 до 10:1; от примерно 1:1 и примерно 5:1; или от примерно 1,4:1 до примерно 4,2:1. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок составляет примерно 2,8:1. В некоторых воплощениях количество детергента является достаточным для снижения связывания полипептида с кремнием в контейнере, таком как шприц или флакон. В некоторых воплощениях детергент представляет собой неионный детергент, такой как полисорбатный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой Полисорбат-80.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит многовалентный катион. В некоторых воплощениях многовалентным катионом является кальций или алюминий. В некоторых воплощениях буфер содержит фосфат кальция. В некоторых воплощениях буфер содержит алюминий в виде фосфата алюминия, гидроксида алюминия, сульфата алюминия или квасцов. В некоторых воплощениях концентрация алюминия составляет от примерно 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл. В некоторых воплощениях концентрация алюминия составляет примерно 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит гистидин. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ или от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет примерно 10 мМ. В некоторых воплощениях рН гистидина составляет от примерно 5,0 до примерно 8,0 или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет 10 мМ, pH 6,0.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит сукцинат. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет от примерно 2 мМ до примерно 10 мМ или от примерно 3 мМ до примерно 7 мМ. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет примерно 5 мМ. В некоторых воплощениях pH сукцината составляет от примерно 5,0 до примерно 8,0 или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет 10 мМ, pH 6,0.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция является лиофилизированной. В некоторых воплощениях лиофилизированная композиция ресуспендирована в буфере, содержащем алюминий. В некоторых воплощениях алюминий присутствует в виде фосфата алюминия, гидроксида алюминия, сульфата алюминия или квасцов.
4
4
В некоторых воплощениях буфер по существу состоит из Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 10 мМ гистидина pH 6,0 и 150 мМ NaCl. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по существу состоит из 200 мкг/мл полипептида подсемейства B LP2086 (fHBP), Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 10 мМ гистидина pH 6,0 и 150 мМ NaCl.
4
4
В некоторых воплощениях буфер по существу состоит из Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 5 мМ сукцината pH 6,0 и 150 мМ NaCl. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по существу состоит из 200 мкг/мл полипептида подсемейства B LP2086 (fHBP), Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 5 мМ сукцината pH 6,0 и 150 мМ NaCl.
В другом аспекте изобретения предложен способ стабилизации эффективности полипептида подсемейства A LP2086 и полипептида подсемейства B LP2086 в иммуногенной композиции путем хранения полипептида подсемейства A LP2086 и полипептида подсемейства В LP2086 в буфере с алюминием в количестве от примерно 0,1 мг/мл до примерно 10 мг/мл и с молярным отношением детергент:белок от примерно 0,5:1 до 10:1. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок составляет от примерно 1:1 до примерно 5:1 или от примерно 1,4:1 до примерно 4,2:1. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок составляет примерно 2,8:1. В некоторых воплощениях количество детергента является достаточным для снижения связывания полипептида с кремнием в контейнере, таком как шприц или флакон. В некоторых воплощениях детергент представляет собой неионный детергент, такой как полисорбатный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой Полисорбат 80.
В некоторых воплощениях алюминий присутствует в виде фосфата алюминия, гидроксида алюминия, сульфата алюминия или квасцов. В некоторых воплощениях концентрация алюминия составляет примерно 0,5 мг/мл.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит гистидин. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ или от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет примерно 10 мМ. В некоторых воплощениях рН гистидина составляет от примерно 5,0 до примерно 8,0 или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет 10 мМ, pH 6,0.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит сукцинат. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет от примерно 2 мМ до примерно 10 мМ или от примерно 3 мМ до примерно 7 мМ. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет примерно 5 мМ. В некоторых воплощениях pH сукцината составляет от примерно 5,0 до примерно 8,0 или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет 10 мМ, pH 6,0.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция является лиофилизированной. В некоторых воплощениях лиофилизированная композиция ресуспендирована в буфере, содержащем алюминий. В некоторых воплощениях алюминий присутствует в виде фосфата алюминия, гидроксида алюминия, сульфата алюминия или квасцов.
4
4
В некоторых воплощениях буфер по существу состоит из Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 10 мМ гистидина pH 6,0 и 150 мМ NaCl. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по существу состоит из 200 мкг/мл полипептида подсемейства A LP2086 (fHBP), 200 мкг/мл полипептида подсемейства B LP2086 (fHBP), Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 10 мМ гистидина pH 6,0 и 150 мМ NaCl.
4
4
В некоторых воплощениях буфер по существу состоит из Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 5 мМ сукцината pH 6,0 и 150 мМ NaCl. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция по существу состоит из 200 мкг/мл полипептида подсемейства A LP2086 (fHBP), 200 мкг/мл полипептида подсемейства B LP2086 (fHBP), Полисорбата 80 в молярном отношении к белку примерно 2,8:1, 0,5 мг/мл алюминия в виде AlPO, 5 мМ сукцината pH 6,0 и 150 мМ NaCl.
В другом аспекте изобретения предложен способ определения эффективности полипептида подсемейства A rLP2086 и/или полипептида подсемейства B rLP2086, включающий следующие стадии: (а) связывание первого и второго функционального моноклонального антитела, распознающего конформационные эпитопы на белке каждого подсемейства с иммуногенной композицией, и (б) количественное определение связывания антитела с полипептидами. В некоторых воплощениях количественное определение осуществляют электрохемилюминисценцией. В некоторых воплощениях определяют количество полипептидов, презентирующих эпитопы, распознаваемые обоими антителами. В некоторых воплощениях первое антитело конъюгировано с меткой, такой как биотин. В некоторых воплощениях первое антитело выделяют соединением, которое связывает конъюгированную метку, таким как стрептавидиновые гранулы или стрептавидиновая колонка. В некоторых воплощениях второе антитело связывают количественной меткой. В некоторых воплощениях эффективность иммуногенной композиции сравнивают с эффективностью эталонного вещества.
Краткое описание графических материалов
Фиг.1: Стабильность подсемейства B в композициях с различными концентрациями Полисорбата 80.
200 мкг/мл каждого из подсемейств A и В готовили в 10 мМ гистидиновом буфере при pH 6,3 с 0,5 мг/мл алюминия и различными концентрациями Полисорбата 80. Композиции заполняли в BD шприцы и хранили при 2-8°C или 25°C. Показаны значения эффективности для подсемейства В в начальной точке времени и в точке времени 3 месяца.
Фиг.2: Форсированная стабильность подсемейства B с различными концентрациями Полисорбата 80.
Лекарственное вещество на основе подсемейства B, приготовленное в виде композиции с 0,09% Полисорбата 80, 10 мМ гистидина, pH 6,5, разводили Полисорбатом 80, варьируя его концентрацию, для оценки влияния Полисорбата 80 на стабильность. Образцы хранили при 2-8°C или 25°C, и эффективность оценивали в начальной точке времени, в точке времени 6 суток и в точке времени 14 суток.
Фиг.3: Эффективность подсемейства B при 200 мкг/мл в течение 28 суток.
Подсемейства A+B MnB rLP2086 готовили в дозировке 200 мкг/мл каждого с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия в присутствии различных концентраций Полисорбата 80 (A=0%, B=0,02%, C=0,005% и D=0,01%) и хранили либо при 2-8°C, либо при 25°C. Молярные соотношения Полисорбат 80 : белок A, B, C и D равны 0, 1,1, 2,7 и 5,3 соответственно. Эффективность белка подсемейства B затем тестировали в точках времени 0, 7, 14 и 28 суток. В каждой точке времени перед тестированием образцы перемешивали в течение 24 часов.
Фиг.4: Эффективность подсемейства B при 20 мкг/мл в течение 28 суток.
Подсемейства A+B MnB rLP2086 готовили в дозировке 20 мкг/мл каждого с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия в присутствии различных концентраций Полисорбата 80 (A=0%, B=0,0005% и C=0,001%) и хранили либо при 2-8°C, либо при 25°C. Молярные соотношения Полисорбат 80 : белок A, B и C равны 0, 2,7 и 5,3 соответственно. Эффективность белка подсемейства B затем тестировали в точках времени 0, 7, 14 и 28 суток. В каждой точке времени перед тестированием образцы перемешивали в течение 24 часов.
Фиг.5: Результаты по эффективности для 200 мкг/мл с разными молярными отношениями.
Подсемейства A+B MnB rLP2086 готовили в дозировке 200 мкг/мл с молярными отношениями Полисорбат 80 : белок 1,4, 2,3, 3,4, 3,9, 4,3, 4,7, 10,7 для партий 50A, 50B, 50C, 50D, 50E, 50F, 50G, соответственно. T-0, T-10 и T-20 означают точки времени 0, 10 и 20 суток, соответственно. На верхней диаграмме представлены результаты по эффективности для подсемейства A, а на нижней диаграмме представлены результаты по эффективности для подсемейства B. В каждой точке времени перед тестированием образцы перемешивали в течение 24 часов.
Фиг.6: Результаты по эффективности для 20 мкг/мл с разными молярными отношениями.
Подсемейства A+B MnB rLP2086 готовили в дозировке 20 мкг/мл с молярными отношениями Полисорбат 80 : белок 1,4, 2,3, 3,4, 3,9, 4,3, 4,7, 10,7 для партий 53A, 53B, 53C, 53D, 53E, 53F, 53G, соответственно. T-0, T-10 и T-20 означают точки времени 0, 10 и 20 суток, соответственно. На верхней диаграмме представлены результаты по эффективности для подсемейства A, а на нижней диаграмме представлены результаты по эффективности для подсемейства B. В каждой точке времени перед тестированием образцы перемешивали в течение 24 часов.
Фиг.7: Связывание белка с фосфатом алюминия при pH 6,5.
Подсемейства A+В MnB rLP2086 готовили в дозировке 400 мкг/мл в 10 мМ гистидиновом буфере с 150 мМ NaCl и концентрацией Полисорбата 80 0,02% при pH 6,5. Ось X отображает содержание алюминия в композиции, а ось Y отображает процент связанного белка, измеренный анализом методом IEX HPLC.
Фиг.8: Связывание подсемейств A и B MnB rLP2086 в зависимости от pH.
Композиции подсемейств А+В MnB в дозировке белков подсемейств A и В 200 мкг/мл каждого готовили с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия в 10 мМ гистидиновом буфере с 150 мМ NaCl при разных pH. Множество партий представляют собой композиции, приготовленные с различными партиями DS (лекарственное вещество), как показано на Фиг.8.
Фиг.9: Влияние pH, буфера и концентрации белка на связывание подсемейств A и B rLP2086.
2
Одиннадцать композиций подсемейств A+B MnB с белками подсемейств A+B были приготовлены в дозировке 200 мкг/мл каждого с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия в 10 мМ гистидиновом буфере с 150 мМ NaCl и 0,02% PS-80 при разных pH (F1-F3 каждая с 200 мкг/мл белка и 0,02% Полисорбата 80); с разными концентрациями Полисорбата 80 от 0,01% до 0,005% (F4-F5); с разной белковой концентрацией до 250 мкг/мл для каждого белка подсемейства (F6-F8); с разными концентрациями гистидинового буфера: 5 мМ и 20 мМ (F9 и F10); с добавлением 10 мМ MgCl (F11).
2
F1: pH 6,0; F2: pH 5,8; F3: pH 5,6; F4: pH 6,0, 0,01% PS 80; F5: pH 6,0, 0,005% PS 80; F6: pH 6,0, 0,25 мг белка; F7: pH 5,8, 0,25 мг белка; F8: pH 5,6, 0,25 мг белка; F9: pH 6,0, 5 мМ His; F10: pH 6,0, 20 мМ His; F11: pH 6,0, 10 мМ MgCl; общее: 10 мМ His, 0,15 М NaCl, 0,5 мг/мл Al, 0,2 мг белка, 0,02% PS80.
Фиг.10: Внешний вид композиций rLP2086 без фосфата алюминия.
Фотография двух композиций белков A+B rLP2086 в дозировке 200 (слева) и 20 (справа) мкг/мл без фосфата алюминия с различными концентрациями Полисорбата 80, выраженными в процентах, указанными сверху (1=0%, 2=0,002%, 3=0,005%, 4=0,01%, 5=0%, 6=0,0005%, 7=0,001%). Все пробирки инкубировали при 5°C в течение 14 суток и перемешивали в течение 2 часов перед тестированием. Вода и стандарт мутности 50 NTU (нефелометрические единицы мутности) включены на каждом конце для визуального сравнения; вода показывает прозрачность, а 50 NTU показывает внешний вид мутного раствора. Примечание: аналогичные результаты были также получены после инкубирования в течение 1, 7 и 28 суток.
Фиг.11: Измерения OD (оптическая плотность) образцов внешнего вида, 2-8°C.
Измерения оптической плотности образцов, приготовленных без фосфата алюминия при λ=320 нм для композиций rLP2086 200 мкг/мл, обозначение 15С (0,005% Полисорбата 80), в течение одного месяца при 5°C. Перемешанные образцы указаны красными квадратиками, а образцы без перемешивания указаны синими ромбиками.
4
Фиг.12: Результаты по эффективности для подсемейства A для композиций с и без AlPO.
4
4
Подсемейства A+B MnB rLP2086, приготовленные в дозировке 200 мкг/мл каждого подсемейства. Композиции были приготовлены в гистидин-забуференном физиологическом растворе с и без AlPO и с разными уровнями Полисорбата 80. На верхней диаграмме представлены композиции без AlPO, а на нижней диаграмме представлены композиции с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия. Четыре группы в левой половине диаграммы представляют собой образцы без перемешивания, а остальные четыре группы на правой половине представляют собой образцы с перемешиванием, как отмечено на каждой диаграмме внизу по оси X. Ось Y отображает относительную эффективность в процентах. Концентрации Полисорбата в конечных композициях следующие: 0%, 0,0005%, 0,001% и 0,01% для партии 15A или 13A, 15B или 13B, 15C или 13С и 15D или 13D, соответственно. Образцы хранили при 2-8°C и 25°C. T-0, T-7 с, T-14 с и Т-28 с означают ноль, 7, 14 и 28 суток. Каждый столбик отображает данные для каждой точки времени.
4
Фиг.13: Результаты по эффективности для подсемейства B для композиций с и без AlPO.
4
4
Подсемейства A+B MnB rLP2086, приготовленные в дозировке 200 мкг/мл каждого подсемейства. Композиции были приготовлены в гистидин-забуференном физиологическом растворе с и без AlPO и с разными уровнями Полисорбата 80. На верхней диаграмме представлены композиции без AlPO, а на нижней диаграмме представлены композиции с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия. Четыре группы в левой половине диаграммы представляют собой образцы без перемешивания, а остальные четыре группы на правой половине представляют собой образцы с перемешиванием, как отмечено на каждой диаграмме внизу по оси X. Ось Y отображает относительную эффективность в процентах. Концентрации Полисорбата в конечных композициях следующие: 0%, 0,0005%, 0,001% и 0,01% для партии 15A или 13A, 15B или 13B, 15C или 13C и 15D или 13D, соответственно. Образцы хранили при 2-8°C и 25°C. T-0, T-7 с, T-14 с и T-28 с означают ноль, 7, 14 и 28 суток. Каждый столбик отображает данные для каждой точки времени.
Фиг.14: Результаты по Полисорбату 80 в rLP2086 Плацебо с 0,5 мг/мл алюминия.
Фиг.15: Результаты по Полисорбату 80 для подсемейства A.
Фиг.16: Результаты по Полисорбату 80 для подсемейства B.
Фиг.17: Корреляция эффективности и связанного молярного отношения для подсемейства B.
Фиг.18: Результаты по молярному отношению для подсемейства A.
Фиг.19: Результаты по молярному отношению для подсемейства B.
Фиг.20: Результаты по молярному отношению для композиций rLP2086 приблизительно 400 мкг/мл.
Фиг.21: Результаты по Полисорбату 80 для лекарственного продукта rLP2086 в разные моменты времени.
Фиг.22: Результаты по связанному молярному отношению для лекарственного продукта rLP2086 в разные моменты времени.
Фиг.23: Результаты по эффективности и связанному молярному отношению для подсемейства A.
Фиг.24: Результаты по эффективности и связанному молярному отношению для подсемейства B.
4
Фиг.25: Связывание подсемейства A с AlPO в сукцинатном и гистидиновом буферах.
2
Связывание белка подсемейства A из препаратов бивалентных композиций MnB, приготовленных в дозировке 200 мкг/мл каждого белка с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия в 10 мМ гистидиновом буфере с 150 мМ NaCl и 0,02% PS-80 при разных pH (F1-F3 каждая с 200 мкг/мл белка и 0,02% PS-80); с разными концентрациями полисорбата PS-80 0,01, 0,05 (F4-F5); с разной белковой концентрацией до 250 мкг/мл (F6-F8); с разными концентрациями гистидинового буфера 5 мМ и 20 мМ (F9 и F10); с добавлением 10 мМ MgCl (F11).
4
Фиг.26: Связывание подсемейства B с AlPO в сукцинатном и гистидиновом буферах.
2
Связывание белка подсемейства B из препаратов бивалентных композиций MnB, приготовленных в дозировке 200 мкг/мл каждого белка с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия в 10 мМ гистидиновом буфере с 150 мМ NaCl и 0,02% PS-80 при разных pH (F1-F3 каждая с 200 мкг/мл белка и 0,02% PS-80); с разными концентрациями полисорбата PS-80 0,01, 0,05 (F4-F5); с разной концентрацией белка до 250 мкг/мл (F6-F8); с разными концентрациями гистидинового буфера 5 мМ и 20 мМ (F9 и F10); с добавлением 10 мМ MgCl (F11).
Фиг.27: Сравнение связывания в сукцинатном, гистидиновом и фосфатном буфере.
4
Фиг.28: pH-зависимое связывание подсемейства A с AlPO.
4
Фиг.29: pH-зависимое связывание подсемейства B с AlPO.
Подробное описание изобретения
Если не дано иного определения, все использованные в данном описании технические и научные термины имеют общепринятые значения, понятные специалисту в области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя способы и вещества, подобные или эквивалентные способам и веществам, описанным в данном документе, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и вещества описаны ниже. Вещества, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, патенты и другие документы, упомянутые в данном документе, во всей их полноте включены посредством ссылки.
По всему тексту данного документа слово "содержать" или его варианты, такие как "содержит" или "содержащий", подразумевают включение указанного целого или групп целых, но не исключение никакого другого целого или группы целых.
Определения
Использованные в данном документе формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если контекст четко не диктует иное. Так, например, ссылка на "способ" включает один или более способов и/или стадий описанного здесь типа, и/или которые станут очевидными специалисту в данной области при прочтении этого описания, и тому подобное.
Использованные в данном документе формы множественного числа включают объекты в единственном числе, если контекст четко не диктует иное. Так, например, ссылка на "способы" включает один или более способов и/или стадий описанного здесь типа, и/или которые станут очевидными специалисту в данной области при прочтении этого описания, и т.д.
В данном документе "примерно" означает, что значение параметра находится в пределах статистически значимого диапазона значения, такого как указанный диапазон концентраций, период времени, молекулярная масса, температура или pH. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, обычно в пределах 20%, в более типичных случаях в пределах 10% и даже еще более типично в пределах 5% от данного значения или диапазона. Допустимый разброс, охватываемый термином "примерно", будет зависеть от конкретной исследуемой системы и может быть легко определен специалистом в данной области. В любом месте в данной заявке, где указан диапазон, каждое целое число в этом диапазоне также предусмотрено в качестве воплощения данного изобретения.
Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которое(ая) усиливает иммунный ответ на антиген, как дополнительно описано и проиллюстрировано в данном описании. Не являющиеся ограничивающими примеры адъювантов, которые могут быть использованы в вакцине по настоящему изобретению, включают адъювантную систему RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), квасцы, минеральные гели, такие как гель гидроксида алюминия, эмульсии масло-в-воде, эмульсии вода-в-масле, такие как, например, полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif), адъювант AMPHIGEN(R), сапонин, Quil A или другая сапониновая фракция, монофосфориллипид A и липид-аминный адъювант Avridine.
Термин "связывание алюминия с белком" относится к проценту молекул белка в композиции, который связан с алюминием. Связывание алюминия с белком может быть определено с использованием методов, описанных в данном описании, или известных в данной области.
Используемый в данном документе термин "эффективное иммуногенное количество" относится к количеству полипептида или композиции, содержащей полипептид, которое является эффективным в вызывании иммунного ответа у позвоночного носителя. Например, эффективное иммуногенное количество белка rLP2086 по данному изобретению представляет собой количество, которое является эффективным в вызывании иммунного ответа у позвоночного носителя. Конкретная "эффективная иммуногенная дозировка или количество" будет зависеть от возраста, массы тела и медицинского состояния носителя, а также от способа введения. Подходящие дозы без труда смогут определить специалисты в данной области.
Используемый в данном документе термин "молярное отношение" относится к отношению количества молей двух разных компонентов в композиции. В некоторых воплощениях молярное отношение представляет собой отношение молей детергента к молям белка. В некоторых воплощениях молярное отношение представляет собой отношение молей Полисорбата 80 к молям белка. Исходя из концентраций белка и Полисорбата 80, молярное отношение вычисляют, используя следующее уравнение:
Например, композиция, содержащая 0,01% Полисорбата 80 и 200 мкг, имеет молярное отношение детергент:белок 10,8:1 [(0,01/0,2)×216]. Отношение 3 молей Полисорбата 80 к 2 молям белка может быть выражено как молярное отношение PS-80 : белок 3:2. Кроме того, если молярное отношение указано как одно число, то оно относится к отношению этого одного числа к 1. Например, отношения Полисорбат 80 : белок 0,5, 2 и 10 относятся к отношениям 0,5:1, 2:1 и 10:1 соответственно. Используемые в данном документе термины молярное отношение "детергент:белок" и молярное отношение "Полисорбат 80 : белок" относятся в общем к молярному отношению детергента (или Полисорбата 80) к белковым антигенам, в частности антигенам Р2086. На основе сведений, раскрытых в данном описании, специалист в данной области будет способен определить, как вычислить молярные отношения для других детергентов и оптимальное молярное отношение для композиций с другими детергентами. В данном документе "низкое" молярное отношение относится обычно к молярному отношению детергент : белковый антиген в иммуногенной композиции, которое меньше, чем "высокое" молярное отношение. "Высокое" молярное отношение относится обычно к молярному отношению детергент : белковый антиген в иммуногенной композиции, которое больше, чем "низкое" молярное отношение. В некоторых воплощениях "высокое молярное отношение" детергента к белку относится к молярному отношению больше 10:1. В некоторых воплощениях "низкое молярное отношение" детергента к белку относится к молярному отношению от 0,5:1 до 10:1.
Используемый в данном документе термин "ORF2086" относится к открытой рамке считывания 2086 из бактерий вида Neisseria. ORF2086 Neisseria, кодируемые белки из нее, фрагменты этих белков и иммуногенные композиции, содержащие эти белки, известны в данной области и описаны, например, в публикациях патентных заявок США №№ US 20060257413 и US 20090202593, полное содержание каждой из которых включено в данное описание посредством ссылки. Термин "Р2086" обычно относится к белку, кодируемому ORF2086. Белки Р2086 по изобретению могут быть липидированными или нелипидированными. "LP2086" и "Р2086" обычно относятся к липидированной и нелипидированной формам белка 2086 соответственно. Белок Р2086 по изобретению может быть рекомбинантным. "rLP2086" и "rP2086" обычно относятся к липидированной и нелипидированной формам рекомбинантного белка 2086 соответственно.
Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" охватывает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., совместимые с введением людям или другим позвоночным хозяевам. Типично, фармацевтически приемлемый носитель представляет собой носитель, использованием которого разрешено регулирующим ведомством Федеральным, правительственным или другим регулирующим ведомством, или указанный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее в списке для использования у животных, включая людей, а также млекопитающих, не являющихся людьми. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым вводят фармацевтическую композицию. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения. Воду, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Композиция, если желательно, может также содержать небольшие количества увлажняющих, увеличивающих объем, эмульгирующих агентов или pH буферных агентов. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, препаратов длительного высвобождения и т.п. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Композиция должна соответствовать способу введения. Подходящий носитель будет очевиден специалистам в данной области и будет зависеть от пути введения.
0
Термин "эффективность" относится к способности антигена вызывать иммунный ответ. В некоторых воплощениях эффективность измеряют способностью эпитопов связываться с антителом. Эффективность может исчезать или снижаться со временем вследствие потери целостности антигена или эпитопа или изменения конформации антигена или эпитопа. Эффективность может исчезать или снижаться под воздействием факторов, включающих, без ограничения, свет, температуру, циклы замораживания/оттаивания, перемешивание и pH. Эффективность может быть измерена способами, раскрытыми в данном описании, и анализами, известными в данной области. Такие анализы для определения эффективности включают, без ограничения, модели вакцинации животных, сывороточные бактерицидные анализы (SBA), проточную цитометрию и анализы эффективности in vitro. Предпочтительными методами определения эффективности являются SBA и анализы эффективности in vitro. Более предпочтительным методом определения эффективности является SBA. В некоторых воплощениях эффективность может быть определена с использованием по меньшей мере одного моноклонального антитела, направленного против по меньшей мере одного эпитопа, который вовлечен в иммунный ответ. В некоторых воплощениях эффективность тестируемого образца сравнивают с эффективностью эталонного образца. В некоторых воплощениях эталонный образец представляет собой тестируемый образец в момент времени T. В некоторых воплощениях эталонный образец представляет собой иммуногенную композицию без детергента. В некоторых воплощениях эталонный образец представляет собой иммуногенную композицию с молярным отношением детергент:белок выше 10:1.
"Защитный" иммунный ответ относится к способности иммуногенной композиции вызывать иммунный ответ, либо гуморальный, либо клеточно-опосредованный, который служит для защиты субъекта от инфекции. Обеспечиваемая защита не обязательно является абсолютной, т.е. инфекция не обязательно полностью предотвращена или искоренена, когда имеет место статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией субъектов, например инфицированных животных, которым не вводили вакцину или иммуногенную композицию. Защита может ограничиваться уменьшением тяжести симптомов инфекции или быстроты их появления. Как правило, "защитный иммунный ответ" может включать вызывание увеличения уровней антител, специфичных к конкретному антигену, у по меньшей мере 50% субъектов, включая уровень измеряемых функциональных антительных ответов на каждый антиген. В конкретных ситуациях "защитный иммунный ответ" может включать вызывание двукратного увеличения уровней антител или четырехкратного увеличения уровней антител, специфичных конкретному антигену, у по меньшей мере 50% субъектов, включая уровень измеряемых функциональных антительных ответов на каждый антиген. В некоторых воплощениях опсонизирующие антитела коррелируют с защитным иммунным ответом. Так, защитный иммунный ответ можно проанализировать путем измерения снижения процента количества бактерий в анализе опсонофагоцитоза, например как описано ниже. В некоторых воплощениях имеет место снижение количества бактерий по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более по сравнению с количеством бактерий в отсутствие иммуногенной композиции.
Термины "белок", "полипептид" и "пептид" относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной продукта. Так, пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и т.п. охвачены данным определением. Как полномерные белки, так и их фрагменты охвачены данным определением. Эти термины также охватывают модификации, такие как делеции, присоединения и замещения (обычно консервативные по характеру, но которые могут быть неконсервативными), нативной последовательности, предпочтительно такие, при которых белок сохраняет способность вызывать иммунный ответ у животного, которому этот белок вводят. Также охвачены модификации после экспрессии, например гликозилирование, ацетилирование, липидирование, фосфорилирование и т.п.
Используемый в данном документе термин "рекомбинантный" относится к любому белку, полипептиду или клетке, экспрессирующему(ей) интересующий ген, которые получены методами генной инженерии. Термин "рекомбинантный", используемый в отношении белка или полипептида, означает полипептид, полученный в результате экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Белки по настоящему изобретению могут быть выделены из природного источника или получены методами генной инженерии. Используемый в данном документе термин "рекомбинантный" также характеризует молекулу нуклеиновой кислоты, которая, в силу ее происхождения или обработки, не ассоциируется со всем полинуклеотидом или частью полинуклеотида, с которым она ассоциируется в природе. Термин "рекомбинантный", используемый в отношении клетки-хозяина, означает клетку-хозяина, которая содержит рекомбинантный полинуклеотид.
Термины "стабильный" и "стабильность" относятся к способности антигена оставаться иммуногенным в течение некоторого периода времени. Стабильность можно определять по эффективности с течением времени. Термины "стабильный" и "стабильность" также относятся к физической, химической и конформационной стабильности иммуногенной композиции. Нестабильность белковой композиции может быть вызвана химическим разложением или агрегацией молекул белка с образованием полимеров высшего порядка, диссоциацией гетеродимеров на мономеры, дегликозилированием, модификацией гликозилирования или любой структурной модификацией, которая снижает по меньшей мере одну биологическую активность белковой композиции, охваченной настоящим изобретением. Стабильность может быть оценена методами, известными в данной области, в том числе методами измерения светорассеяния образца, кажущегося затухания света (поглощение или оптическая плотность), размера (например, эксклюзионная хроматография), биологической активности in vitro или in vivo и/или свойств методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Другие методы оценки стабильности известны в данной области и также могут быть использованы согласно настоящему изобретению.
В некоторых воплощениях антиген в стабильной композиции по изобретению может сохранять по меньшей мере 50%-ную, 60%-ную, 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную эффективность по сравнению со стандартным образцом в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 24 месяцев, 30 месяцев, 36 месяцев, 42 месяцев, 48 месяцев, 54 месяцев или 60 месяцев. В некоторых воплощениях антиген в стабильном препарате по изобретению может сохранять по меньшей мере 50%-ную эффективность по сравнению со стандартным образцом в течение по меньшей мере 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет или 5 лет. Термины "стабильный" и "стабильность" также относятся к способности антигена сохранять эпитопы или иммунореактивность в течение некоторого периода времени. Например, антиген в стабильном препарате по изобретению может сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% его эпитопов или иммунореактивности по сравнению со стандартным образцом в течение по меньшей мере 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев, 18 месяцев, 24 месяцев, 30 месяцев, 36 месяцев, 42 месяцев, 48 месяцев, 54 месяцев или 60 месяцев. В некоторых воплощениях стабильность измеряют в отношении условий окружающей среды. Не являющиеся ограничивающими примеры условий окружающей среды включают свет, температуру, циклы замораживания/оттаивания, перемешивание и pH. Специалист в данной области способен определить присутствие антигенных эпитопов или иммунореактивности с использованием методов, описанных в данном документе, или других методов, известных в данной области (см., например, McNeil et al. Vaccine, 27:3417-3421 (2009)). В некоторых воплощениях стабильность антигена измеряют от даты его приготовления. В некоторых воплощениях стабильность антигена измеряют от даты изменения условий его хранения. Не являющиеся ограничивающими примеры изменений условий хранения включают переход от условий замораживания к условиям охлаждения, переход от условий замораживания к условиям комнатной температуры, переход от условий охлаждения к условиям комнатной температуры, переход от условий охлаждения к условиям замораживания, переход от условий комнатной температуры к условиям замораживания, переход от условий комнатной температуры к условиям охлаждения, переход от света к темноте или включение перемешивания.
Термин "стабилизатор" относится к соединению, которое связывается с антигеном и сохраняет эпитопы или иммунореактивность антигена в течение некоторого периода времени. Стабилизаторы известны в данной области. Примеры стабилизаторов включают многовалентные катионы, например кальций или алюминий.
Термин "субъект" относится к млекопитающему, птице, рыбе, рептилии или другому животному. Термин "субъект" также охватывает людей. Термин "субъект" также охватывает домашних животных. Не являющиеся ограничивающими примеры домашних животных включают собак, кошек, свиней, кроликов, крыс, мышей, песчанок, хомяков, морских свинок, хорьков, птиц, змей, ящериц, рыбу, черепах и лягушек. Термин "субъект" также охватывает домашний скот. Не являющиеся ограничивающими примеры домашнего скота включают альпаку, бизона, верблюда, крупный рогатый скот, оленя, свиней, лошадей, лам, мулов, ослов, овцу, коз, кроликов, северного оленя, яка, цыплят, гусей и индюков.
Термины "вакцина" или "вакцинная композиция", которые используются взаимозаменяемым образом, относятся к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одну иммуногенную композицию, которая индуцирует иммунный ответ у субъекта.
Общее описание
Настоящее изобретение является результатом того, что обнаружены новые факты, свидетельствующие о том, что именно антигены подсемейства B rLP2086, а не антигены подсемейства A rLP2086, с течением времени теряют эффективность в бивалентной вакцинной композиции и поэтому являются нестабильными. В результате варьирования компонентов в бивалентной композиции было установлено, что высокие молярные отношения детергент:белок в бивалентной вакцинной композиции обуславливают специфическую нестабильность антигена подсемейства B rLP2086. Снижение молярного отношения детергент:белок в бивалентных и моновалентных композициях приводит к увеличению стабильности, которую определяли по сохранению эффективности с течением времени, антигена подсемейства B rLP2086, и не влияет на стабильность антигена подсемейства A rLP2086. Этот результат является неожиданным, так как липобелки обычно очищают и хранят при высоких концентрациях детергента для предотвращения агрегации их гидрофобных липидных частей. Соответственно, в некоторых воплощениях данного изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген подсемейства В rLP2086 и имеющая низкое молярное отношение детергент:белок. В некоторых воплощениях данного изобретения предложен способ сохранения стабильности антигена подсемейства В rLP2086 в иммуногенной композиции, включающий стадию хранения антигена подсемейства B rLP2086 в буфере, имеющем низкое молярное отношение детергент:белок.
Дополнительные исследования выявили, что в композициях с низким молярным отношением детергент:белок происходит агрегация антигенов подсемейства A и B rLP2086 при перемешивании иммуногенных композиций с низким молярным отношением детергент:белок. Однако увеличение концентрации алюминия в композициях с низким молярным отношением детергент:белок предотвращало агрегацию антигенов подсемейства A и B rLP2086 даже при перемешивании. Более того, в отсутствие алюминия антигены подсемейства A rLP0286 в большей степени ощущают влияние низких молярных отношений детергент:белок. Соответственно, в некоторых воплощениях данного изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая антиген подсемейства A rLP2086, антиген подсемейства B rLP2086, алюминий в высокой концентрации и имеющая низкое молярное отношение детергент:белок. В некоторых воплощениях данного изобретения предложен способ сохранения стабильности антигена подсемейства A rLP2086 и антигена подсемейства B rLP2086 в иммуногенной композиции, включающий стадию хранения антигена подсемейства A rLP2086 и антигена подсемейства B rLP2086 в буфере, имеющем высокую концентрацию алюминия и низкое молярное отношение детергент:белок.
Иммуногенные композиции
Иммуногенные композиции, которые содержат белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью из Neisseria meningitidis ORF2086, известны в данной области. Иллюстративные иммуногенные композиции включают композиции, описанные в публикациях патентных заявок США №№ US 20060257413 и US 20090202593, полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки. Такие иммуногенные композиции, описанные в вышеуказанных заявках, содержат белок, проявляющий бактерицидную активность, идентифицированный как белок ORF2086, его иммуногенные участки и/или его биологические эквиваленты. Белок ORF2086 относится к белку, кодируемому открытой рамкой считывания 2086 из Neisseria species.
Белок может представлять собой рекомбинантный белок или изолированный белок из нативных Neisseria species. Например, белки ORF2086 Neisseria могут быть изолированы из бактериальных штаммов, таких как штаммы Neisseria species, включая штаммы Neisseria meningitidis (серогруппы A, B, C, D, W-135, X, Y, Z и 29Е), Neisseria gonorrhoeae и Neisseria lactamica, а также иммуногенные участки и/или биологические эквиваленты указанных белков.
Белки ORF2086 включают белки подсемейства A и белки подсемейства B 2086, их иммуногенные участки и/или их биологические эквиваленты. Белки ORF2086 или их эквиваленты и т.д. могут быть липидированными или нелипидированными. Предпочтительно, белок ORF2086 Neisseria является липидированным.
В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит изолированный белок, имеющий по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с белком, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.
В одном из воплощений иммуногенная композиция содержит изолированный белок, имеющий по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с белком подсемейства A, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно, иммуногенная композиция содержит изолированный белок подсемейства A, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.
В другом воплощении иммуногенная композиция содержит изолированный белок, имеющий по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с белком подсемейства B, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно, иммуногенная композиция содержит изолированный белок подсемейства B, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В некоторых воплощениях белок подсемейства B ORF2086 представляет собой вариант В01.
В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит изолированный белок, имеющий по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с белком подсемейства A, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, и изолированный белок, имеющий по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности с белком подсемейства B, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно, иммуногенная композиция содержит изолированный белок подсемейства A, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, и изолированный белок подсемейства В, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.
В одном из воплощений иммуногенная композиция имеет отношение 1:1 белка подсемейства A к белку подсемейства В.
Иммуногенная композиция может содержать белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, его полинуклеотиды или эквиваленты в качестве единственного активного иммуногена в иммуногенной композиции. Альтернативно, иммуногенная композиция может дополнительно содержать активные иммуногены, включая другие иммуногенные полипептиды Neisseria sp. или иммуногенно-активные белки одного или более других микробиологических патогенов (например, вируса, приона, бактерии или гриба, без ограничения), или капсульный полисахарид. Композиции могут содержать один или более желаемых белков, фрагментов или фармацевтических соединений, если это нужно для выбранного показания.
Любая мультиантигенная или мультивалентная иммуногенная композиция предусмотрена настоящим изобретением. Например, иммуногенная композиция может содержать комбинации двух или более белков ORF2086, комбинацию белка ORF2086 с одним или более белками Por A, комбинацию белка ORF2086 с полисахаридами и/или полисахаридными конъюгатами менингококков серогруппы A, C, Y и W135, комбинацию белка ORF2086 с комбинациями менингококков и пневмококков или комбинация любого из вышеуказанных в форме, подходящей для желаемого введения, например для мукозальной доставки. Специалисты в данной области без труда смогут приготовить такие мультиантигенные или мультивалентные иммуногенные композиции.
Настоящее изобретение также предусматривает режимы мультииммунизации, когда любую композицию, полезную против патогена, можно вводить в комбинации с композициями по настоящему изобретению. Например, без ограничения, пациенту может быть введена иммуногенная композиция по настоящему изобретению и другая иммунологическая композиция для иммунизации против вируса папилломы человека (HPV), такая как HPV-вакцина GARDASIL(R), как часть режима мультииммунизации. Специалисты в данной области без труда смогут выбрать иммуногенные композиции для использования совместно с иммуногенными композициями по настоящему изобретению в целях разработки и осуществления режимов мультииммунизации.
Полипептиды, фрагменты и эквиваленты ORF2086 могут быть использованы как часть конъюгированной иммуногенной композиции, где один или более белков или полипептидов конъюгированы с носителем для создания композиции, которая обладает иммуногенными свойствами против нескольких серотипов и/или против нескольких заболеваний. Альтернативно, один из полипептидов ORF2086 может быть использован в качестве белка-носителя для других иммуногенных полипептидов. Приготовление таких иммуногенных композиций общеизвестно специалистам в данной области.
Иммуногенные композиции по изобретению предпочтительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и/или разбавители включают любые и все традиционные растворители, дисперсионные среды, наполнители, твердые носители, водные растворы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, задерживающие всасывание, и т.п. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, например, один или более из следующих веществ: вода, физиологический раствор, забуференный фосфатами физиологический раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации.
Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые повышают срок жизни или эффективность антитела. Получение и применение фармацевтически приемлемых носителей общеизвестно в данной области. Использование любых традиционных сред или агентов предусмотрено в иммуногенных композициях по настоящему изобретению, если только они совместимы с активным ингредиентом.
Иммуногенные композиции можно вводить парентерально, например инъецированием, либо подкожно, либо внутримышечно, а также перорально или интраназально. Способы интраназальной иммунизации описаны в Wolff et al. Biotechniques: 11(4):474-85 (1991) и в Sedegah et al. PNAS Vol.91, p.9866-9870 (1994). В других способах введения используются, например, пероральные препараты, легочные препараты, суппозитории и трансдермальные аппликации, без ограничения. Пероральные препараты включают, например, такие обычно используемые эксципиенты, как, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарата натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.п., без ограничения. Предпочтительно, иммуногенную композицию вводят внутримышечно.
Иммуногенные композиции по изобретению могут содержать один или более адъювантов. Примеры адъювантов включают, но ими не ограничены, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, STIMULON™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.), MPL™ (3-O-деацилированный монофосфориллипид A; Corixa, Hamilton, Mont.), 529 (соединение аминоалкилглюкозаминфосфата, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.), GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.), N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, называемый нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамил-L-аланин-2-(1'-2'-ципальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси-этиламин) (CGP 19835А, называемый МТР-PE) и холерный токсин. В некоторых предпочтительных воплощениях адъювантом является QS-21.
Дополнительные примеры адъювантов включают нетоксичные производные холерного токсина, включая его субъединицу A, и/или конъюгаты или генно-инженерные слияния полипептида N. meningitidis с холерным токсином или его субъединицей B ("СТВ"), прохолерагеноидом, полисахаридами грибов, включая шизофиллан, мурамилдипептид, производные мурамилдипептида ("MDP"), форболовые эфиры, термолабильный токсин Е.coli, блок-полимеры или сапонины.
Фосфат алюминия использовали в качестве адъюванта в фазе 1 клинических испытаний до концентрации 0,125 мг/доза, намного ниже, чем предел 0,85 мг на дозу, установленный в Своде федеральных нормативных актов США [610.15(a)]. Алюминий-содержащие адъюванты широко используются у людей для потенцирования иммунного ответа антигенов при введении внутримышечно или подкожно.
В некоторых предпочтительных воплощениях белки по данному изобретению используют в иммуногенной композиции для перорального введения, содержащей мукозальный адъювант, и используют для лечения или предупреждения инфекции N. meningitidis у человека-носителя. Мукозальным адъювантом может быть холерный токсин; однако предпочтительно, мукозальные адъюванты, иные, чем холерный токсин, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают нетоксичные производные холерного голотоксина, где субъединица A мутагенизирована, химически модифицированный холерный токсин или родственные белки, продуцированные посредством модификации аминокислотной последовательности холерного токсина. Конкретный холерный токсин, который может быть особенно полезным в приготовлении иммуногенных композиций по данному изобретению, представляет собой мутантный холерный голотоксин E29H, который раскрыт в публикации международной заявки WO 00/18434, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки. Они могут быть присоединены к полипептидам по данному изобретению или конъюгированы с ними. Такие же методы можно применять к другим молекулам со свойствами мукозального адъюванта или доставки, таким как термолабильный токсин Escherichia coli (LT). Могут быть использованы другие соединения с активностью мукозального адъюванта или доставки, такие как желчь; поликатионы, такие как DEAE-декстран и полиорнитин; детергенты, такие как додецилбензолсульфат натрия; липид-конъюгированные вещества; антибиотики, такие как стрептомицин; витамин A; и другие соединения, которые изменяют структурную или функциональную целостность поверхностей слизистых оболочек. Другие мукозально активные соединения включают производные микробиологических структур, такие как MDP; акридин и циметидин. STIMULON™ QS-21, MPL и IL-12, как описано выше, также могут быть использованы.
Иммуногенные композиции по данному изобретению можно доставлять в форме ISCOMS (иммуностимулирующие комплексы), ISCOMS, содержащие СТВ, липосомы или инкапсулированные в соединениях, таких как акрилаты или поли(DL-лактид-ко-гликозид), с образованием микросфер, имеющих размер, пригодный для всасывания. Белки по данному изобретению могут быть также инкорпорированы в масляные эмульсии.
Количество (т.е. доза) иммуногенной композиции, которое вводят пациенту, может быть определено стандартными методами, известными специалисту в данной области, принимая во внимание такие факторы, как конкретный антиген, адъювант (если он присутствует), возраст, пол, масса тела, вид, состояние конкретного пациента и путь введения.
Например, дозировка для взрослого пациента-человека может содержать по меньшей мере 0,1 мкг, 1 мкг, 10 мкг или 50 мкг белка ORF2086 Neisseria и не больше 80 мкг, 100 мкг, 150 мкг или 200 мкг белка ORF2086 Neisseria. Для определения подходящего диапазона можно комбинировать любое минимальное значение и любое максимальное значение.
Анализ эффективности in vitro
Эффективность определяют путем определения количества функциональных эпитопов в белках подсемейства A и подсемейства B в иммуногенной композиции с использованием специфичных в отношении конформации моноклональных антител по сравнению с эталонным веществом rLP2086. Эффективность определяют путем измерения количества функциональных эпитопов в белках подсемейства A или подсемейства B rLP2086, которые будут вызывать иммунный ответ in vivo для выработки бактерицидных антител. Количественную технологию используют для анализа эффективности с выбранными моноклональными антителами (mAb). Два функциональных моноклональных антитела, которые являются конформационными и неперекрывающимися, выбирают для каждого белка подсемейства rLP2086 в иммуногенных композициях. Из двух очищенных моноклональных антител первое антитело конъюгируют с первой меткой, которую используют для иммобилизации молекулы белка rLP2086. В некоторых воплощениях первой меткой является биотин, глутатион-S-трансфераза (GST), 6xHis метка или гранулы (например, гранулы из карбоксилированного полистирола или парамагнитные гранулы). В некоторых воплощениях первая метка иммобилизована на стрептавидиновых гранулах, стрептавидиновой колонке, никелевых гранулах, никелевой колонке, с использованием центрифугирования или с использованием магнитного поля. Второе антитело конъюгировано со второй меткой, которая поддается количественной оценке. В некоторых воплощениях вторая метка представляет собой биотин, пероксидазу хрена (HRP), флуорофор или радиоактивную метку. В некоторых воплощениях вторую метку детектируют с использованием стрептавидина, конъюгированного с флуорофором или HRP, посредством электрохемилюминисценции, детектирования флуоресценции или детектирования радиоактивности. Будут измерять только белки, которые презентируют оба эпитопа, распознаваемые двумя mAbs в каждой иммуногенной композиции. Будут отображаться изменения в любом одном или обоих эпитопах белка. Эффективность образца приводят относительно эффективности эталонного вещества.
В некоторых воплощениях изобретение охватывает способ определения эффективности белка 2086. В некоторых воплощениях способ включает следующие стадии: (1) инкубирование первого моноклонального антитела (mAb) и второго mAb с иммуногенной композицией, содержащей белок 2086, где первое mAb конъюгировано с первой меткой, которую используют для иммобилизации mAb, и второе mAb конъюгировано со второй меткой, которая детектируется, и где первое и второе mAb направлены на разные конформационные эпитопы на эталонном белке 2086; (2) иммобилизация первого mAb-связанного белка 2086 с использованием первой метки; и (3) детектирование и определение количества захваченного второго mAb-связанного белка 2086 с использованием второй метки. В некоторых воплощениях белок 2086 является белком подсемейства A. В некоторых воплощениях белок 2086 является белком подсемейства В. В некоторых воплощениях белок 2086 является липидированным. В некоторых воплощениях белок 2086 не является липидированным. В некоторых воплощениях белок 2086 является рекомбинантным. В некоторых воплощениях первая метка представляет собой биотин, 6xHis метку или гранулы (например гранулы из карбоксилированного полистирола или парамагнитные гранулы). В некоторых воплощениях первая метка иммобилизована на стрептавидиновых гранулах, стрептавидиновой колонке, глутатионовых гранулах, глутатионовой колонке, никелевых гранулах, никелевой колонке, с использованием центрифугирования или с использованием магнитного поля. В некоторых воплощениях вторая метка представляет собой биотин, HRP, флуорофор или радиоактивную метку. В некоторых воплощениях вторую метку детектируют с использованием стрептавидина, конъюгированного с флуорофором или HRP, посредством электрохемилюминисценции, детектирования флуоресценции или детектирования радиоактивности. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит множество вариантов белка 2086.
Стабильность эффективности антигена подсемейства В rLP2086
В некоторых воплощениях данного изобретения предложена иммуногенная композиция для стабилизации антигенов подсемейства В rLP2086 с течением времени, содержащая буфер с низким молярным отношением детергент:белок.
В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в иммуногенной композиции составляет от примерно 0,5 до примерно 10. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в иммуногенной композиции составляет от примерно 1 до примерно 5. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в иммуногенной композиции составляет от примерно 1,4 до примерно 4,2. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в иммуногенной композиции составляет примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,7, примерно 0,8, примерно 0,9, примерно 1,0, примерно 1,1, примерно 1,2, примерно 1,3, примерно 1,4, примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,7, примерно 1,8, примерно 1,9, примерно 2,0, примерно 2,1, примерно 2,2, примерно 2,3, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,6, примерно 2,7, примерно 2,8, примерно 2,9, примерно 3,0, примерно 3,1, примерно 3,2, примерно 3,3, примерно 3,4, примерно 3,5, примерно 3,6, примерно 3,7, примерно 3,8, примерно 3,9, примерно 4,0, примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8, примерно 4,9, примерно 5,0, примерно 5,5, примерно 6,0, примерно 6,5, примерно 7,0, примерно 7,5, примерно 8,0, примерно 8,5, примерно 9,0, примерно 9,5 или примерно 10. В некоторых воплощениях детергент представляет собой неионный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой полисорбатный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой Полисорбат 80.
4
3
2
4
3
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит многовалентный катион. В некоторых воплощениях многовалентным катионом является кальций или алюминий. В некоторых воплощениях алюминий присутствует в виде одного или более из AlPO, Al(OH), Al(SO) и квасцов. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 1 мг/мл, от примерно 0,25 мг/мл до примерно 0,75 мг/мл, или от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл алюминия. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит примерно 0,1 мг/мл, примерно 0,15 мг/мл, примерно 0,2 мг/мл, примерно 0,25 мг/мл, примерно 0,3 мг/мл, примерно 0,35 мг/мл, примерно 0,4 мг/мл, примерно 0,45 мг/мл, примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,55 мг/мл, примерно 0,6 мг/мл, примерно 0,65 мг/мл, примерно 0,7 мг/мл, примерно 0,75 мг/мл, примерно 0,8 мг/мл, примерно 0,85 мг/мл, 0,9 мг/мл, примерно 0,95 мг/мл или примерно 1 мг/мл алюминия. В некоторых воплощениях имеет место связывание алюминия с белком по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит буфер, содержащий гистидин. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ или от примерно 8 мМ до 12 мМ. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ или примерно 20 мМ.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит буфер, содержащий сукцинат. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ, от примерно 2 мМ до примерно 10 мМ или от примерно 3 мМ до 7 мМ. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ или примерно 20 мМ.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция имеет pH от примерно 5,0 до примерно 8,0; от примерно 5,5 до примерно 7,0; или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция имеет рН примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5,9, примерно 6,0, примерно 6,1, примерно 6,2, примерно 6,3, примерно 6,4 или примерно 6,5.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция на основе белкового антигена подсемейства B MnB rLP2086 содержит 10 мМ гистидин-забуференного физиологического раствора, pH 6,0, содержащего 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, и имеет молярное отношение Полисорбат 80 : белок 2,8.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция на основе белкового антигена подсемейства B MnB rLP2086 содержит 5 мМ сукцинат-забуференного физиологического раствора, pH 6,0, содержащего 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, и имеет молярное отношение Полисорбат 80 : белок 2,8.
В некоторых воплощениях данного изобретения предложен способ стабилизации антигена подсемейства В rLP2086s с течением времени, включающий хранение антигенов в буфере с низким молярным отношением детергент:белок.
В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в буфере составляет от примерно 0,5 до примерно 10. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в буфере составляет от примерно 1 до примерно 5. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в буфере составляет от примерно 1,4 до примерно 4,2. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в буфере составляет примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,7, примерно 0,8, примерно 0,9, примерно 1,0, примерно 1,1, примерно 1,2, примерно 1,3, примерно 1,4, примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,7, примерно 1,8, примерно 1,9, примерно 2,0, примерно 2,1, примерно 2,2, примерно 2,3, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,6, примерно 2,7, примерно 2,8, примерно 2,9, примерно 3,0, примерно 3,1, примерно 3,2, примерно 3,3, примерно 3,4, примерно 3,5, примерно 3,6, примерно 3,7, примерно 3,8, примерно 3,9, примерно 4,0, примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8, примерно 4,9, примерно 5,0, примерно 5,5, примерно 6,0, примерно 6,5, примерно 7,0, примерно 7,5, примерно 8,0, примерно 8,5, примерно 9,0, примерно 9,5 или примерно 10. В некоторых воплощениях детергент представляет собой неионный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой полисорбатный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой Полисорбат 80.
4
3
2
4
3
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит многовалентный катион. В некоторых воплощениях многовалентным катионом является кальций или алюминий. В некоторых воплощениях алюминий присутствует в виде одного или более из AlPO, Al(OH), Al(SO) и квасцов. В некоторых воплощениях содержание стабилизатора в буфере составляет от примерно 0,1 мг/мл до примерно 1 мг/мл; от примерно 0,25 мг/мл до примерно 0,75 мг/мл или от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл алюминия. В некоторых воплощениях содержание стабилизатора в буфере составляет примерно 0,1 мг/мл, примерно 0,15 мг/мл; примерно 0,2 мг/мл, примерно 0,25 мг/мл, примерно 0,3 мг/мл, примерно 0,35 мг/мл, примерно 0,4 мг/мл, примерно 0,45 мг/мл, примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,55 мг/мл, примерно 0,6 мг/мл, примерно 0,65 мг/мл, примерно 0,7 мг/мл, примерно 0,75 мг/мл, примерно 0,8 мг/мл, примерно 0,85 мг/мл, 0,9 мг/мл, примерно 0,95 мг/мл или примерно 1 мг/мл алюминия. В некоторых воплощениях имеет место связывание алюминия с белком по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит гистидин. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ; от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ, или от примерно 8 мМ до 12 мМ. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ или примерно 20 мМ.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит сукцинат. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ; от примерно 2 мМ до примерно 10 мМ, или от примерно 3 мМ до 7 мМ. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ или примерно 20 мМ.
В некоторых воплощениях буфер имеет pH от примерно 5,0 до примерно 8,0; от примерно 5,5 до примерно 7,0; или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях буфер имеет pH примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5.9, примерно 6,0, примерно 6,1, примерно 6,2, примерно 6,3, примерно 6,4 или примерно 6,5.
В некоторых воплощениях буфер, в котором хранят белковый антиген подсемейства B MnB rLP2086, состоит из 10 мМ гистидин-забуференного физиологического раствора, pH 6,0, содержащего 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, и имеет молярное отношение Полисорбат 80 : белок 2,8.
В некоторых воплощениях буфер, в котором хранят белковый антиген подсемейства B MnB rLP2086, состоит из 5 мМ сукцинат-забуференного физиологического раствора, pH 6,0, содержащего 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, и имеет молярное отношение Полисорбат 80 : белок 2,8.
Стабильность эффективности антигенов подсемейств A и B rLP2086
В некоторых воплощениях данного изобретения предложена иммуногенная композиция для стабилизации антигена подсемейства A rLP2086 и/или антигена подсемейства В rLP2086 с течением времени, содержащая буфер с высокой концентрацией стабилизатора и низким молярным отношением детергент:белок.
В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в иммуногенной композиции составляет от примерно 0,5 до примерно 10. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в иммуногенной композиции составляет от примерно 1 до примерно 5. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в иммуногенной композиции составляет от примерно 1,4 до примерно 4,2. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в иммуногенной композиции составляет примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,7, примерно 0,8, примерно 0,9, примерно 1,0, примерно 1,1, примерно 1,2, примерно 1,3, примерно 1,4, примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,7, примерно 1,8, примерно 1,9, примерно 2,0, примерно 2,1, примерно 2,2, примерно 2,3, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,6, примерно 2,7, примерно 2,8, примерно 2,9, примерно 3,0, примерно 3,1, примерно 3,2, примерно 3,3, примерно 3,4, примерно 3,5, примерно 3,6, примерно 3,7, примерно 3,8, примерно 3,9, примерно 4,0, примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8, примерно 4,9, примерно 5,0, примерно 5,5, примерно 6,0, примерно 6,5, примерно 7,0, примерно 7,5, примерно 8,0, примерно 8,5, примерно 9,0, примерно 9,5 или примерно 10. В некоторых воплощениях детергент представляет собой неионный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой полисорбатный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой Полисорбат 80.
4
3
2
4
3
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит многовалентный катион. В некоторых воплощениях многовалентным катионом является кальций или алюминий. В некоторых воплощениях алюминий присутствует в виде одного или более из AlPO, Al(OH), Al(SO) и квасцов. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит от примерно 0,1 мг/мл до примерно 1 мг/мл; от примерно 0,25 мг/мл до примерно 0,75 мг/мл, или от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл алюминия. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция содержит примерно 0,1 мг/мл, примерно 0,15 мг/мл, примерно 0,2 мг/мл, примерно 0,25 мг/мл, примерно 0,3 мг/мл, примерно 0,35 мг/мл, примерно 0,4 мг/мл, примерно 0,45 мг/мл, примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,55 мг/мл, примерно 0,6 мг/мл, примерно 0,65 мг/мл, примерно 0,7 мг/мл, примерно 0,75 мг/мл, примерно 0,8 мг/мл, примерно 0,85 мг/мл, 0,9 мг/мл, примерно 0,95 мг/мл или примерно 1 мг/мл алюминия. В некоторых воплощениях имеет место связывание алюминия с белком по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит буфер, содержащий гистидин. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ, от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ или от примерно 8 мМ до 12 мМ. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ или примерно 20 мМ.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция дополнительно содержит буфер, содержащий сукцинат. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ; от примерно 2 мМ до примерно 10 мМ, или от примерно 3 мМ до 7 мМ. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ или примерно 20 мМ.
В некоторых воплощениях иммуногенная композиция имеет pH от примерно 5,0 до примерно 8,0; от примерно 5,5 до примерно 7,0; или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция имеет pH примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5.9, примерно 6,0, примерно 6,1, примерно 6,2, примерно 6,3, примерно 6,4 или примерно 6,5.
В некоторых воплощениях композиция на основе белковых антигенов подсемейства A и B MnB rLP2086 содержит 10 мМ гистидин-забуференного физиологического раствора, pH 6,0, содержащего 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, и имеет молярное отношение Полисорбат 80 : белок 2,8.
В некоторых воплощениях композиция на основе белковых антигенов подсемейства A и B MnB rLP2086, содержит 5 мМ сукцинат-забуференного физиологического раствора, pH 6,0, содержащего 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия, и имеет молярное отношение Полисорбат 80 : белок 2,8.
В некоторых воплощениях данного изобретения предложен способ стабилизации антигена подсемейства A rLP2086 и/или антигена подсемейства B rLP2086 с течением времени, включающий хранение антигенов в буфере с высокой концентрацией стабилизатора и низким молярным отношением детергент:белок.
В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок составляет менее чем 10:1. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в буфере составляет от примерно 0,5 до примерно 10. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в буфере составляет от примерно 1 до примерно 5. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в буфере составляет от примерно 1,4 до примерно 4,2. В некоторых воплощениях молярное отношение детергент:белок в буфере составляет примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,7, примерно 0,8, примерно 0,9, примерно 1,0, примерно 1,1, примерно 1,2, примерно 1,3, примерно 1,4, примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,7, примерно 1.8, примерно 1.9, примерно 2,0, примерно 2,1, примерно 2,2, примерно 2,3, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,6, примерно 2,7, примерно 2,8, примерно 2,9, примерно 3,0, примерно 3,1, примерно 3,2, примерно 3,3, примерно 3,4, примерно 3,5, примерно 3,6, примерно 3,7, примерно 3,8, примерно 3,9, примерно 4,0, примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8, примерно 4,9, примерно 5,0, примерно 5,5, примерно 6,0, примерно 6,5, примерно 7,0, примерно 7,5, примерно 8,0, примерно 8,5, примерно 9,0, примерно 9,5 или примерно 10. В некоторых воплощениях детергент представляет собой неионный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой полисорбатный детергент. В некоторых воплощениях детергент представляет собой Полисорбат 80.
4
3
2
4
3
В некоторых воплощениях стабилизатором в буфере является многовалентный катион. В некоторых воплощениях многовалентным катионом является кальций или алюминий. В некоторых воплощениях алюминий присутствует в виде одного или более из AlPO, Al(ОН), Al(SO) и квасцов. В некоторых воплощениях содержание стабилизатора в буфере составляет от примерно 0,1 мг/мл до примерно 1 мг/мл; от примерно 0,25 мг/мл до примерно 0,75 мг/мл, или от примерно 0,4 мг/мл до примерно 0,6 мг/мл алюминия. В некоторых воплощениях содержание стабилизатора в буфере составляет примерно 0,1 мг/мл, примерно 0,15 мг/мл; примерно 0,2 мг/мл, примерно 0,25 мг/мл, примерно 0,3 мг/мл, примерно 0,35 мг/мл, примерно 0,4 мг/мл, примерно 0,45 мг/мл, примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,55 мг/мл, примерно 0,6 мг/мл, примерно 0,65 мг/мл, примерно 0,7 мг/мл, примерно 0,75 мг/мл, примерно 0,8 мг/мл, примерно 0,85 мг/мл, 0,9 мг/мл, примерно 0,95 мг/мл или примерно 1 мг/мл алюминий. В некоторых воплощениях имеет место связывание алюминия с белком по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит гистидин. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ; от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ, или от примерно 8 мМ до 12 мМ. В некоторых воплощениях концентрация гистидина составляет примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ или примерно 20 мМ.
В некоторых воплощениях буфер дополнительно содержит сукцинат. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет от примерно 2 мМ до примерно 20 мМ; от примерно 2 мМ до примерно 10 мМ или от примерно 3 мМ до 7 мМ. В некоторых воплощениях концентрация сукцината составляет примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно O мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ или примерно 20 мМ.
В некоторых воплощениях буфер имеет pH от примерно 5,0 до примерно 8,0; от примерно 5,5 до примерно 7,0; или от примерно 5,8 до примерно 6,0. В некоторых воплощениях буфер имеет pH примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5.9, примерно 6,0, примерно 6,1, примерно 6,2, примерно 6,3, примерно 6,4 или примерно 6,5.
В некоторых воплощениях буфер, в котором хранят белковые антигены подсемейства A и B MnB rLP2086, представляет собой 10 мМ гистидин-забуференный физиологический раствор, pH 6,0, содержащий 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия и имеет молярное отношение Полисорбат 80 : белок 2,8.
В некоторых воплощениях буфер, в котором хранят белковые антигены подсемейства A и В MnB rLP2086, представляет собой 5 мМ сукцинат-забуференный физиологический раствор, pH 6,0, содержащий 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия и имеет молярное отношение Полисорбат 80 : белок 2,8.
Для лучшего понимания данного изобретения ниже приведены примеры. Эти примеры предназначены только для иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Все процитированные в данном описании источники информации включены в него посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Экспериментальные методики
Определение связывания с алюминием
Композицию, содержащую алюминий и по меньшей мере один белковый антиген, центрифугировали с получением в осадке алюминия. Центрифугирование адсорбируемых алюминием белков известно в данной области (см., например, Egan et al., Vaccine, Vol.27(24):3175-3180 (2009)). Связанный с алюминием белок также был в осадке, а белок, не связанный с алюминием, оставался в надосадочной жидкости. Суммарное количество белка в надосадочной жидкости и в осадке после центрифугирования определяли анализом Лоури. Процент связанного белка вычисляли путем деления суммарного количества белка в надосадочной жидкости на суммарное количество белка, добавленного в композицию, и умножения на 100%. Аналогично, процент несвязанного белка вычисляли путем деления суммарного количества белка в надосадочной жидкости на суммарное количество белка, добавленного в композицию, и умножения на 100%.
Для композиций, содержащих антигены как подсемейства A, так и подсемейства B, отдельные концентрации белков подсемейства A и B в надосадочной жидкости определяли ионообменной хроматографией. Разделение и элюирование белков подсемейства A и B проводили с использованием сильно-анионной колонки и элюента с высокой концентрацией соли. Белки обоих подсемейств A и B детектировали и количественно оценивали с использованием детектора флуоресценции, установленного на Возбуждение = 280 нм и Эмиссия = 310 нм. Белки подсемейства A и подсемейства B элюируются с разными временами удерживания, и их количественно оценивали с использованием стандартной кривой, построенной относительно эталонного вещества белка rLP2086. Процент несвязанного белка вычисляли путем деления суммарного количества белка в надосадочной жидкости на суммарное количество белка, добавленного в композицию, и умножения на 100%. Процент связанного белка вычисляли путем вычитания процента несвязанного белка из 100%.
Анализ эффективности in vitro
Анализ эффективности rLP2086 представляет собой гомогенный анализ с иммобилизацией или сэндвич-анализ, который основан на двух функциональных моноклональных антителах, которые распознают конформационные и неперекрывающиеся эпитопы на одной молекуле белка лекарственного вещества rLP2086. Одно очищенное моноклональное антитело (mAb) служит в качестве антитела для иммобилизации и химически конъюгировано с гранулами из карбоксилированного полистирола, которые имеют уникальный цветовой идентификатор. Второе антитело является биотинилированным и служит в качестве детектируемого антитела, которое впоследствии связывается стрептавидином, конъюгированным с флуорофором R-фикоэритрином (SA-PE). Струйная автоматика детекторного прибора Bio-Plex количественно оценивает индивидуальные микросферы и ассоциированный с ними сигнал SA-PE. Сигнал флуоресценции от R-фикоэритрина, ассоциированного с микросферой, будет детектироваться только при образовании тройничного комплекса между конъюгированным с гранулами антителом, антигеном и детектируемым антителом и будет пропорционален количеству функциональных эпитопов в образцах rLP2086. Изменение в одном или обоих эпитопах, приводящее к потере флуоресценции относительно стандартного образца, будет указывать на потерю эффективности.
Реагенты
- Моноклональное антитело, конъюгированное с микросферами (конъюгированное с областью гранул #12 или с областью гранул #66 Luminex MicroPlex Microsphere).
- Биотинилированное моноклональное антитело.
- эталонные вещества rLP2086, подсемейства A и B, 2 мг/мл. Хранить при -70°C.
- подсемейства A и B rLP2086, бивалентный контроль.
- Стрептавидин, R-фикоэритрин, конъюгированный, лиофилизированный.
Буферы
- 10 мМ гистидин, 150 мМ NaCl, pH 6,0
- 5% масс./об. Полисорбата 80 (PS-80) в 0,85% масс./об. физиологическом растворе.
- Буфер для матрицы (10 мМ гистидина, 0,02% Полисорбата 80, 150 мМ NaCl, pH 6,0).
- Буфер для анализа (PBS, рН 7,4 с 0,1% BSA, 0,02% Полисорбата 80, 0,1% азида).
- 100x стрептавидин, R-фикоэритрин-конъюгированный (SA-PE). Открыть флакон с лиофилизированным стрептавидином и R-фикоэритрином и добавить 1 мл дистиллированной воды. Вращать на вортексе до полного растворения.
Методика
200 мл белка подсемейства A и 200 мл белка подсемейства B добавляли к 600 мкл буфера для матрицы для получения концентрации каждого подсемейства 400 мкг/мл. Стандартную кривую по восьми концентрациям (3333-1,5 нг/мл) строили при разведении исходного раствора в буфере для анализа.
200 мкл бивалентного контроля добавляли к 800 мкл буфера для матрицы для получения концентрации каждого подсемейства 400 мкг/мл. Исходный раствор 400 мкг/мл для получения рабочих концентраций 100, 50 и 12,5 нг/мл разводили в буфере для анализа. 100 и 12,5 нг/мл представляли собой высший и низший контроли (CH) и (CL) соответственно.
Тестируемые образцы разводили в буфере для матрицы до концентрации 400 мкг/мл. Рабочие растворы 100, 50 и 12,5 нг/мл готовили из исходного раствора 400 мкг/мл.
5
Готовили смесь для гомогенного анализа с использованием конъюгированных гранул в концентрации 2×10 гранул/мл и детектируемого антитела в концентрации 30 мкг/мл в буфере для анализа. Планшет для образцов подготавливали добавлением 0,4 мл стандарта, контроля, образца или пустого контроля в 96-луночный планшет с глубокими лунками 2 мл. Фильтры 96-луночного фильтр-планшета MultiScreenHTs-BV предварительно смачивали добавлением 100 мкл буфера для анализа, который затем удаляли через фильтр отсосом под разрежением. 25 мкл приготовленной смеси для гомогенного анализа добавляли в 96-луночный планшет. По 25 мкл каждого раствора стандарта, контроля, образца или пустого контроля добавляли в каждую лунку 96-луночного фильтр-планшета. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа, встряхивая.
После инкубирования антигена-антитела буфер удаляли отсосом под разрежением через фильтр. Фильтр каждой лунки промывали три раза 100 мкл буфера для анализа с последующим отсосом под разрежением. После последней промывки в каждую лунку добавляли 50 мкл 1×SA-PE. Планшет инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре при встряхивании в темноте.
После инкубации SA-PE в каждую лунку планшета добавляли 75 мкл буфера для анализа до общего объема 125 мкл. Планшет немедленно считывали на системе Bio-Plex 200.
Сывороточный бактерицидный анализ
4
Новозеландских самок белых кроликов, 2,5-3,0 кг, доставленных из Charles River Canada (St. Constant, QC, Canada), подвергали предварительному скринингу методом анализа ELISA на цельных клетках для идентификации тех клеток, которые имеют низкую реактивность против двух штаммов менингококков (по одному из каждого подсемейства Р2086). Кролики, как правило, имели очень низкие фоновые значения, и кролики с самыми низкими значениями были отобраны для использования. Кроликов вакцинировали внутримышечно через 0, 4 и 9 недель либо моновалентной вакциной rLP2086-А05, либо моновалентной вакциной rLP2086-B01, либо бивалентной вакциной rLP2086-A05+В01. Каждая доза содержала 100 мкг белка в моновалентных вакцинах и 100 мкг каждого белка в бивалентной вакцине, приготовленных в буфере, состоящем из 10 мМ гистидина, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 0,02% Полисорбата 80 и 250 мкг AlPO. Вакцину вводили инъекцией в правую заднюю лапу (0,5 мл/доза). Одну группу кроликов вакцинировали только одним буфером в качестве контроля. Преиммунные (неделя 0) и иммунные (неделя 10) образцы сыворотки брали для анализов. Все протоколы испытаний на животных соответствовали инструкциям Institutional Animal Care и Use Committee (Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию).
2+
2+
650
Сывороточные бактерицидные антитела у кроликов, иммунизированных вакциной rLP2086, определяли с использованием сывороточных бактерицидных антител (SBA) с комплементом человека. Иммунные сыворотки кроликов термически инактивировали для удаления внутренней комплементарной активности и затем последовательно разводили 1:2 в PBS (забуференный фосфатами физиологический раствор), модифицированном по Дульбекко ионами Са и Mg (D-PBS), в 96-луночном микротитровальном планшете для тестирования в отношении сывороточной бактерицидной активности против штаммов N. meningitidis. Бактерии, использованные в анализе, выращивали в GC-среде, дополненной добавкой Kellogg (GCK), и осуществляли мониторинг оптической плотности при 650 нм. Бактерии собирали для использования в анализе при конечной OD 0,50-0,55, разводили в D-PBS и 1000-3000 CFU (колониеобразующие единицы) добавляли в смесь для анализа с 20% комплемента человека.
Сыворотку человека с недетектируемой бактерицидной активностью использовали в качестве экзогенного источника комплемента. Источники комплемента тестировали на пригодность против каждого индивидуального тестируемого штамма. Источник комплемента использовали только в том случае, если количество бактерий, выживающих в контролях без добавленной иммунологической сыворотки, составляло >75%. Десять уникальных источников комплемента потребовались для осуществления SBA, описанных в этом исследовании.
2
2
После инкубирования в течение 30 минут при 37°C с 5% CO в реакционную смесь добавляли D-PBS, и аликвоты переносили в микротитровальные планшеты, заполненные 50% GCK-средой. Микротитровальные планшеты фильтровали, инкубировали в течение ночи при 37°C с 5% CO, и микроколонии окрашивали и подсчитывали. Сывороточные бактерицидные титры определяли как интерполированное обратное разведение сыворотки, которое давало 50%-ное снижение количества CFU по сравнению с количеством CFU в контрольных лунках без иммунологической сыворотки. SBA-титр определяют как обратную величину интерполированного разведения тестируемой сыворотки, которое вызывает 50%-ное снижение количества бактерий после инкубирования в течение 30 минут при 37°C. Восприимчивость к цитолизу иммунологическими сыворотками P2086 устанавливали, если имело место 4-кратное или большее возрастание SBA-титра для иммунных сывороток Р2086 по сравнению с соответствующими преиммунными сыворотками. Пределом детектирования был титр 8 для кроличьих сывороток. Сывороткам, которые были негативными против анализируемого штамма при начальном разведении, присваивали титр половина предела детектирования для анализа (т.е. 4 для кролика).
Проточная цитометрия
650
Клетки MnB выращивали до OD 0,45-0,55 и затем фиксировали в 1% (об./об.) параформальдегиде в 1×PBS в течение 10 мин. Сто микролитров бактерий на лунку наносили в 96-луночные полистирольные планшеты с U-образным дном, вращали и промывали один раз в 1% (масс./об.) BSA в 1×PBS. Анти-LP2086 моноклональные антитела добавляли к бактериальным осадкам, ресуспендировали и инкубировали на льду в течение 30 мин. После двух промывок в 1% BSA/PBS биотинилированные козьи антитела против IgG мыши (подклассы 1+2а+2b+3) (Jackson Immunoresearch) добавляли к клеточным осадкам, ресуспендировали и инкубировали на льду в течение 30 мин. Клетки промывали дважды и ресуспендировали в стрептавидин-PE (BD Biosciences) и инкубировали на льду в течение 30 мин. После двух промывок в 1% BSA/PBS клеточные осадки ресуспендировали в 1% параформальдегиде. Мышиный IgG включали как негативный контроль. Двадцать тысяч (20000) событий на лунку получали на проточном цитометре BD LSR II и анализировали их с использованием программного обеспечения Flow Jo v7 (Treestar, Ashland, Oregon). Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) РЕ канала определяли для каждого образца после открытия мембранного канала на бактериальных клетках в логарифмической точечной диаграмме FSC (рассеяние вперед) против SSC (рассеяние в сторону). MFI считали положительной, если MFI была в три раза выше, чем MFI в случае контрольных мышиных IgG.
Пример 2: Связывание Полисорбата 80 с белками rL2086
Чтобы понять стабильность связывания Полисорбата 80 с каждым белком A и B rLP2086, образец rLP2086, приготовленный с 200 мкг/мл подсемейства A с алюминием (Al), и другой образец rLP2086, приготовленный с 200 мкг/мл подсемейства В, которые оба хранились при 2-8°C и 25°C, тестировали спустя 5 месяцев в отношении содержания в них белка и Полисорбата 80. Плацебо (буфер + Al без белка) также анализировали. Распределение Полисорбата 80 в Плацебо показано на Фиг.14, а распределение Полисорбата 80 для белка подсемейства A и распределение для белка подсемейства B показано на Фиг.15 и Фиг.16 соответственно. Относительную эффективность (%) для подсемейства B сравнивали со связанным молярным отношением, как показано на Фиг.17.
Результаты
Как показано на Фиг.14, суммарный % Полисорбата 80 и % Полисорбата 80 в надосадочной жидкости были одинаковыми (0,017%), что указывает на то, что Полисорбат 80 не связывался с алюминием или не захватывался в осадок после центрифугирования. Кроме того, Полисорбат 80 был стабильным после хранения в течение 5 месяцев при температуре 2-8°C и при температуре 25°C.
Распределение Полисорбата 80 в связанном состоянии (остаток после центрифугирования), несвязанном состоянии (надосадочная жидкость) и суммарно в образцах подсемейства A и подсемейства B rLP2086 показано на Фиг.15 и Фиг.16 соответственно. В то время как % Полисорбата 80 в надосадочной жидкости и в осадке после центрифугирования для подсемейства A при 2-8°C и 25°C в точке времени 5 месяцев не изменялся, тем не менее, больше Полисорбата 80 наблюдалось в остатке после центрифугирования для образца подсемейства B при 25°C в точке времени 5 месяцев. Несмотря на разные концентрации Полисорбата 80 в надосадочной жидкости и в остатке после центрифугирования при 2-8°C и 25°C, точный массовый баланс достигался для обоих подсемейств. Так как белки rLP2086 на 100% связываются с фосфатом алюминия на этой матрице, Полисорбат 80, ассоциированный в остатке после центрифугирования, вероятней всего был связан с белковыми молекулами.
0
Хотя оба белка A и B связывались с Полисорбатом 80, связывание белка A было одинаковым для образцов, хранившихся при 2-8°C и при 25°C, а связывание белка B было почти в два раза выше для образцов, хранившихся при 25°C по сравнению с образцами, хранившимися при 2-8°C. Относительную эффективность для подсемейства B определяли при температуре 2-8°C и при температуре 25°C в точках времени То и 5 месяцев, и было обнаружено, что они ведут себя обратно пропорционально по отношению к связанному молярному отношению, как показано на Фиг.17. % эффективности падал со 120 при Т до 16% при 5M/25°C, и связанное молярное отношение увеличивалось с 5,3 до 13,9 за тот же период времени.
Пример 3: Исследование в отношении критического молярного отношения
0
Для определения критической концентрации Полисорбата 80, необходимой для стабилизации rLP2086, было приготовлено сорок (40) композиций rLP2086, содержащих только подсемейство A, только Подсемейство B и оба Подсемейства A и B в количестве 200 мкг/мл и 400 мкг/мл с разными концентрациями Полисорбата 80, как указано в Таблице 1. Для каждого образца определяли суммарные и связанные белки, а также суммарный % Полисорбата 80, % Полисорбата 80 в надосадочной жидкости и % Полисорбата 80 в осадке после центрифугирования в точках времени ноль (Т), 14 суток и 1 месяц при температуре 2-8°C и при температуре 25°C. Результаты этого исследования приведены на Фиг.18-24.
Таблица 1
Суммарный антигенный белок
Подсемейство белков
% Полисорбата 80
0
Плацебо
0,003
X
0,005
X
X
X
0,02
200
A
X
0,004
0,005
0,006
0,008
0,01
0,02
200
B
0,003
0,004
0,005
0,006
0,008
0,01
0,02
400
A+B
X
X
X
0,007
X
0,01
0,02
400
A
X
X
X
0,007
X
0,01
0,02
400
B
X
X
X
0,007
X
0,01
0,02
Результаты
Концентрации Полисорбата 80 в надосадочной жидкости, в остатке после центрифугирования и в сумме определяли для всех 40 образцов композиций rLP2086 с фосфатом алюминия. Суммарное и связанное молярные отношения определяли для обоих Подсемейств A и B, и оказалось, что они сходны для обоих подсемейств при 200 мкг/мл, содержащих 0,005% Полисорбата 80 (молярное отношение 5,4) или меньше, как показано на Фиг.18 и Фиг.19 соответственно. Суммарное молярное отношение для подсемейства B, однако, было намного выше, чем связанное молярное отношение для образцов, содержащих 0,0065% Полисорбата 80 (молярное отношение 7,0) или больше. Данные для суммарного и связанного молярных отношений для подсемейства A, подсемейства В и подсемейств A+B при 400 мкг/мл, каждого, также были близки для композиций, содержащих 0,008% Полисорбата 80 (молярное отношение 8,6) или меньше; однако суммарное молярное отношение было намного выше, чем связанное молярное отношение для композиций, содержащих 0,017% Полисорбата 80 (молярное отношение 18,4), как показано на Фиг.20.
Пример 4: Связывание Полисорбата 80 с течением времени
4
0
0
4
0
Процент (%) Полисорбата 80 в надосадочной жидкости и в остатке после центрифугирования для образцов композиций подсемейств A и B с AlPO определяли в точках времени T, 14 суток/25°C, 1 месяц/4°C и 1 месяц/25°C. % Полисорбата 80 в надосадочной жидкости для образцов композиций обоих подсемейства A и B был относительно одинаковым для образцов, хранившихся при 2-8°C. % Полисорбата 80 в надосадочной жидкости, однако, резко снижался для образцов, хранившихся при 25°C, даже после всего лишь 14 суток. % Полисорбата 80 в остатке после центрифугирования для обоих подсемейств A и B был относительно сходным в точках времени T/5°C и 1 месяц/5°C. % Полисорбата в надосадочной жидкости, однако, значительно увеличивался для образцов, хранившихся при 25°С, особенно для подсемейства B, содержащего 0,008% Полисорбата 80 (молярное отношение 8,6) или выше. % Полисорбата 80 также определяли в надосадочной жидкости и в остатке после центрифугирования для композиций подсемейств A и B rLP2086 с AlPO в точках времени T, 14 суток/25°С, 1 месяц/4°C и 1 месяц/25°C. Как показано на Фиг.21, концентрации Полисорбата 80 для образцов, содержащих 0,008%, были приблизительно одинаковыми для всех 4 точек времени. Однако концентрации Полисорбата 80 увеличивались для образца, содержащего 0,017% Полисорбата 80, хранившегося при 25°C. Полисорбат 80 не обнаруживался в надосадочной жидкости образцов, содержащих 0,008% Полисорбата 80 или меньше. Как показано на Фиг.22, связанное молярное отношение было стабильным для образцов, содержащих 0,008% Полисорбата 80 или меньше во всех 4 точках времени. Связанное молярное отношение, однако, увеличивалось для образца, содержащего 0,017% Полисорбата 80, хранившегося при 25°C.
4
0
Эффективность для образцов композиций подсемейств A и B с AlPO определяли при T и 14 суток/25°C (Фиг.23 и Фиг.25 соответственно). Как показано на Фиг.23, эффективность для подсемейства A при разных суммарных молярных отношениях была в пределах от 91 до 102 при обеих температурах, 5°C и 25°C. Хотя результаты по связанному молярному отношению также были относительно одинаковыми при любой температуре, небольшое увеличение эффективности наблюдалось по мере увеличения суммарного/связанного молярного отношения.
Эффективность для подсемейства B для образцов при 5°C составляла примерно 95% для суммарных молярных отношений вплоть до 9,0. Эффективность подсемейства B, однако, снижалась до 79% по мере увеличения суммарного молярного отношения до 18,1. Кроме того, образец с суммарным молярным отношением 18,1 имел связанное молярное отношение выше по сравнению с другим образцом. При 25°C эффективность подсемейства B демонстрировала значительное падение с 83% доо 5% по мере увеличения молярного отношения с 5,3 до 18,1. Значения связанного молярного отношения для образцов при 25°C увеличивались с 5,3 до 13,8 по мере увеличения суммарного молярного отношения. Таким образом, эффективность для подсемейства B обратно пропорциональна связанному молярному отношению.
Белки подсемейства A и подсемейства B оба связывались с Полисорбатом 80. Связывание подсемейства A было одинаковым для образцов, хранившихся при 2-8°C и 25°C, а связывание подсемейства В было почти в два раза выше для образцов, хранившихся при 25°C. Кроме того, исследование критического молярного отношения показало, что образца композиции 200 мкг/мл стабильны при содержании Полисорбата 80 0,008% или меньше, что эквивалентно суммарному молярному отношению 4,2 или меньше.
Пример 5: Концентрация детергента и эффективность антигена подсемейства B rLP2086
Дополнительные исследования стабильности с варьированием концентраций Полисорбата 80 подтвердили критичность молярного отношения Полисорбат 80 : белок для сохранения эффективности. В одном эксперименте иммуногенную композицию готовили в дозировке 200 мкг (суммарная концентрация белка 400 мкг/мл) при pH 6,3 в 10 мМ гистидин-забуференном физиологическом растворе (HBS) с 0,5 мг/мл алюминия (в виде фосфата алюминия) и с добавлением 0,01%, 0,02%, 0,05% или 0,1% Полисорбата 80 (соответствующее молярное отношение Полисорбат 80 : белок rLP2086 5,3, 10,7, 26,7 и 53,4). Приготовленные образцы инкубировали при 25°C, и контрольные образцы хранили 2-8°C. Не было никаких значительных изменений эффективность в точке времени "0" при концентрациях Полисорбата 80 вплоть до 0,1%. Однако за более длительные периоды времени при 2-8°C и 25°C наблюдалось снижение эффективности в зависимости от температуры и концентрации Полисорбата 80. С увеличением концентрации Полисорбат 80 с 0,01% до 0,1% в иммуногенной композиции стабильность в точке времени 3 месяца продемонстрировали снижение эффективности белка подсемейства B до менее чем 10% и 25% при 25°C и 2-8°C соответственно (Фиг.1).
Дополнительное исследование стабильности (Фиг.2) было выполнено с целью оценки белка подсемейства B в концентрации 4 мг/мл в HBS и с добавлением Полисорбата 80 до конечной концентрации 0,06, 0,5 и 1% (соответствующие молярные отношения 3,3, 26,7 и 53,4). Контрольный образец содержал 0,09% Полисорбата 80. Белок подсемейства B в присутствии 0,06% Полисорбата 80 (молярное отношение 3,3) был стабильным. Такие же образцы с более высокой концентрацией Полисорбата 80 до 0,5% и 1% (молярные отношения 26,7 и 53,4 соответственно) были нестабильными. Что касается образцов иммуногенной композиции 400 мкг/мл, нестабильность белка подсемейства B была отмечена во всех образцах, содержащих Полисорбат 80 в концентрации 0,01% (молярное отношение 5,3) или выше. Однако при концентрации белка 4 мг/мл и концентрации Полисорбата 80 0,06% снижение эффективности не наблюдалось, поскольку отношение Полисорбат 80 : белок (3,3) ниже, чем при концентрации белка 400 мкг/мл и концентрации Полисорбат 80 0,01% (молярное отношение 5,3). Таким образом, снижение эффективности белка подсемейства B вследствие Полисорбата 80 коррелируется с молярным отношением детергента Полисорбат 80 к белку, а не с абсолютной концентрацией Полисорбата 80 в матрице.
Соответственно, концентрация Полисорбата 80 должна быть сниженной в иммуногенной композиции для сохранения стабильности белка подсемейства B в вакцине и при последующем хранении при 2-8°C. Форсированное 28-суточное исследование стабильности было выполнено для иммуногенной композиции с варьирующими молярными отношениями Полисорбата 80 (0, 1,1, 2,7 и 5,3) при дозировках 20 и 200 мкг (Фиг.3 и Фиг.4). Бивалентную (подсемейство A и подсемейство В) композицию получали в 10 мМ гистидин-забуференном физиологическом растворе, pH 6,0, с 0,5 мг/мл алюминия в виде фосфата алюминия и с различными концентрациями Полисорбата 80. Образцы инкубировали при 25°С параллельно с контрольной группой 2-8°C. Образцы анализировали в отношении эффективности в точках времени 0, 7, 14 и 28 суток. Белки обоих подсемейств A (данные не показаны) и В были стабильными для всех групп, имеющих молярное отношение Полисорбат 80 : белок менее 5,3. Считается, что значение эффективности выше 80% находится в пределах аналитической вариабельности. При молярном отношении 5,3 наблюдалась тенденция к снижению эффективности для белка подсемейства B для образцов 25°C.
Было проведено всестороннее исследование для оценки всех потенциальных клинических дозировок (дозировка 20, 60, 120 и 200 мкг), приготовленных с различными молярными отношениям Полисорбат 80 : белок в форсированных условиях в отношении стабильности при хранении для исследования влияния молярных отношений Полисорбат 80:белок на стабильность белков MnB rLP2086. Использовали бивалентные иммуногенные композиции MnB rLP2086, приготовленные с молярными отношениями Полисорбат 80 : белок в диапазоне от приблизительно 1,4 до 10,7. Для получения иммуногенных композиций с увеличивающими молярными отношениями Полисорбат 80 : белковые антигены (1,4, 2,4, 3,4, 3,9, 4,3, 4,7 и 10,7) доводили до различных молярных отношений путем добавления Полисорбата 80 таким образом, чтобы во время приготовления иммуногенной композиции дополнительное количество Полисорбата 80 не требовалось. В этом исследовании использовали две совокупности групп антигенов. Одна совокупность групп подсемейств A и B была получена с молярным отношением Полисорбат 80 : белок 1,4, а другая с молярным отношением 2,4. Совокупность белков с молярным отношением 2,4 использовали для доведения молярного отношения до значений 3,4, 3,9, 4,3 и 10,7 путем добавления Полисорбата 80. Конечная матрица иммуногенных композиций была следующая: 10 мМ гистидин, 150 мМ NaCl, pH 6,0, 0,5 мг/мл фосфат алюминия с молярными отношениями Полисорбат 80 : белок, упомянутыми выше. После хранения при 2-8°C или 25°C в течение конкретных интервалов времени применяли мягкое смешивание на качалке за 24 часа до тестирования. Выполняли тесты на суммарное содержание белка методом IEX-HPLC (ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография), эффективность, внешний вид, оптическую плотность при 320 нм надосадочной жидкости и pH.
Результаты по эффективности доз 200 и 20 мкг представлены на Фиг.5 и Фиг.6 соответственно. Анализ на эффективность был более чувствительным, чем остальные тесты, использованные в исследовании. В целом, не наблюдалось значительного снижения эффективности ни для антигенов подсемейства A, ни для антигенов подсемейства B по сравнению с начальной точкой времени для всех дозировок с молярными отношениями 4,3 и ниже. Композиции с молярным отношением 4,7 рассматривались как предельные из-за небольшого снижения эффективности для белка подсемейства B, хранившегося при 25°C. Результаты по эффективности для антигена подсемейства B для композиций с молярным отношением 10,7 были значительно ниже для образцов, хранившихся при 25°C, чем для образцов, хранившихся при 2-8°C.
Пример 6: Концентрация алюминия и эффективность антигенов подсемейств A и B rLP2086
Серию экспериментов проводили для определения оптимального уровня фосфата алюминия для обеспечения более чем 95%-ного связывания белков обоих подсемейств A и B. Начальные исследования фокусировались на оптимизации композиции при pH 6,5. Композиции готовили с целевой дозировкой 200 мкг/мл каждого белка из белков подсемейств A и B в 10 мМ гистидиновом буфере при pH 6,5 с 0,02% Полисорбата 80 и либо 0,25, либо 0,5 мг/мл алюминия (в виде фосфата алюминия). Белок подсемейства B связывался с фосфатом алюминия в меньшей степени, чем белок подсемейства A (Фиг.7). Увеличение содержания алюминия с 0,25 мг/мл до 0,5 мг/мл увеличивало связывание белок подсемейства B до >80%. Поскольку механизм связывания белка и алюминия в суспензии носит главным образом характер ионного взаимодействия, pH суспензии является фактором, который оказывает влияние на связывание.
pH композиции оптимизировали для обеспечения более чем 90-95%-ного связывания белка подсемейства B. Было исследовано множество композиций с 200 мкг/мл каждого из белков A и B с pH в пределах от 5,6 до 6,5 с разными партиями иммуногенных композиций (Фиг.8). Более чем 90-95%-ное связывание обоих белков происходило, когда композиции имели pH в пределах от 5,6 до 6,4. По мере увеличения pH композиций до 6,5 и выше связывание белка подсемейства B значительно снижалось. Целевое значение pH 6,0 рекомендуется для обеспечения более чем 90%-ного связывания белков обоих подсемейств A и B.
Оценивали также устойчивость композиции при переменных и/или предельных показателях состава, варьируя pH, буфер, белок и концентрации Полисорбата 80 (Фиг.9). В то время как связывание белка подсемейства A было устойчиво высоким (>95%) при суммарной концентрации белка до 500 мкг/мл (250 мкг/мл каждого белка), связывание белка подсемейства B было более чувствительным к концентрации белка и pH. Поскольку использованы коммерческие композиции с дозировкой 200 мкг, результаты этого эксперимента также подтвердили рекомендуемую композицию при pH 6,0 с 0,5 мг/мл фосфата алюминия.
Композиции с фосфатом алюминия и без фосфата алюминия оценивали с целью исследования осуществимости получения стабильной композиции без фосфата алюминия при концентрациях Полисорбата 80, достаточно низких для обеспечения стабильности белка подсемейства В. Иммуногенные композиции готовили с дозировками 20 и 200 мкг в гистидин-забуференном физиологическом растворе с концентрацией Полисорбата 80 в диапазоне молярных отношений от 0 до 5,3. Половину образцов подвергали перемешиванию с использованием цифрового многопробирочного вихревого перемешивателя при 500 об/мин в пульсационном режиме (2 секунды включен и одна секунда выключен) в течение 24 часов перед тестированием. Это условие предназначено для того, чтобы стимулировать тесты ISTA (International Safe Transit Association), обычно выполняемые на этапе транспортной упаковки конечной иммуногенной композиции для имитации экстремальных вибраций в условиях транспортировки.
С перемешиванием, композиции без фосфата алюминия осаждались, что в конечном счете приводило к потере эффективности антигенов обоих подсемейств A и B. Тест с целью оценки по внешнему виду (Фиг.10) и измерения поглощения при λ=320 нм (Фиг.11) продемонстрировали наличие агрегатов и/или осадков при перемешивании композиций без фосфата алюминия. Тестирование на эффективность этих образцов (Фиг.12 и Фиг.13) показало значительную потерю эффективности белков обоих подсемейств A и B во всех точках времени. Потеря эффективности было самой заметной у композиций, содержащих небольшие количества Полисорбата 80. Поскольку небольшие количества Полисорбата 80 необходимы для поддержания стабилизации белка подсемейства B, включение фосфата алюминия в композицию требуется для сохранения стабильности. Иммуногенные композиции на основе rLP2086 могут быть приготовлены с фосфатом алюминия, который будет выполнять функцию повышения стабильности эффективности, как измерено в анализе эффективности in vitro.
Пример 7: Сукцинат и гистидин в качестве буферов
2
Готовили серию композиций для сравнения связывания белков подсемейств A и B rLP2086 в сукцинате и гистидине, а также влияния pH, Полисорбата 80 и MgCl на связывание (Таблица 2). Оценивали также устойчивость композиции при переменных и/или предельных показателях состава, варьируя pH, буфер, белок и концентрации полисорбата (Фиг.25 и 26). Связывание алюминия с белком подсемейства A и белком подсемейства B было сходным безотносительно к используемому буферу (гистидин или сукцинат).
Таблица 2:
Композиции для оценки влияния гистидиновых и сукцинатных буферов, MgCl<sub>2</sub>, Полисорбата 80 и pH 5,6-6,0 на связывание rLP2086 с AlPO<sub>4</sub> <sup>1</sup>
rLP2086 A (мкг/мл)
rLP2086 B (мкг/мл)
Гистидин (мМ)
Сукцинат (мМ)
PS-80 (%)
Физиологический раствор (%)
MgCl<sub>2 </sub>(мМ)
Целевой pH
200
200
0
5
0,020
0,9
0
6,0
200
200
0
5
0,020
0,9
0
5,8
200
200
0
5
0,020
0,9
0
5,6
200
200
0
5
0,010
0,9
0
6,0
200
200
0
5
0,005
0,9
0
6,0
250
250
0
5
0,020
0,9
0
6,0
250
250
0
5
0,020
0,9
0
5,8
250
250
0
5
0,020
0,9
0
5,6
200
200
0
10
0,020
0,9
0
6,0
200
200
0
20
0,020
0,9
0
6,0
200
200
0
5
0,020
0,9
10
6,0
200
200
10
0
0,020
0,9
0
6,0
200
200
10
0
0,020
0,9
0
5,8
200
200
10
0
0,020
0,9
0
5,6
200
200
10
0
0,010
0,9
0
6,0
200
200
10
0
0,005
0,9
0
6,0
250
250
10
0
0,020
0,9
0
6,0
250
250
10
0
0,020
0,9
0
5,8
250
250
10
0
0,020
0,9
0
5,6
200
200
5
0
0,020
0,9
0
6,0
200
200
20
0
0,020
0,9
0
6,0
200
200
10
0
0,020
0,9
10
6,0
<sup>1</sup>Все композиции, описанные в Таблице 2, содержат 0,5 мг Al/мл.
Влияние буферной соли и времени смешивания на связывание с алюминием оценивали с тремя обычно используемыми буферными солями, выбранными по той причине, что их pKa находятся в физиологическом диапазоне, и что эти соли обычно считаются безопасными. Композиции белков подсемейств A и B rLP2086 готовили с одной из трех буферных солей: 5 мМ сукцинат, 10 мМ гистидин или 10 мМ фосфат при pH, подходящем для pKa каждой соли, для определения степени связывания при каждом из условий. Время, необходимое для связывания до достижения завершения, оценивали путем перемешивания образцов в течение либо 5, либо 120 минут и затем измерения количества связанного белка.
4
Как показано на Фиг.27, белок подсемейства В продемонстрировал связывание при pH 6,8 в фосфатном буфере, тогда как белок подсемейства А белок не оказывал значительного влияния при таких же условиях. Количество белка, связанного с алюминием, было сходным в образцах, приготовленных с гистидином или сукцинитом. Поэтому эти две буферные соли были выбраны для дальнейшей оценки. Без всякой связи с какой-либо теорией, возможно, что пониженное связывание в фосфатном буфере является результатом конкуренции за сайты связывания на AlPO с добавленными фосфат-ионами.
4
При этих условиях и концентрациях белка и AlPO связывание было полным после смешивания в течение 5 минут при комнатной температуре, так как сходные результаты были получены после смешивания в течение 2 часов.
Для дополнительного исследования в отношении того, является ли пониженное связывание белка подсемейства B в фосфатном буфере при рН 6,8 следствием pH или различий между буферными солями, измеряли связывание в диапазоне значений pH от 5,3 до 7,0 либо в гистидин-забуференных, либо в сукцинат-забуференных композициях. Готовили бивалентные композиции, содержащие 0,2 мг/мл белка каждого подсемейства (0,4 мг/мл суммарного белка), 0,02% PS-80, 0,5 мг Al/мл и 150 мМ NaCl. Образцы готовили либо в 10 мМ гистидине, либо в 5 мМ сукцинате для сравнения влияния буферной соли. После приготовления pH каждого образца проверяли по отдельности.
4
Профиль связывания при pH от 5,3 до 7,0 показан для белка подсемейства A на Фиг.28 и для белка подсемейства B на Фиг.28. Белок подсемейства A продемонстрировал небольшое изменение количества связанного белка, причем связывание оставалось выше 95% по всему протестированному диапазону pH. Композиция, содержащая гистидин с целевым pH 7,0, имела в результате pH 6,8. pH не доводили до 7,0 (например, путем добавления основания) во избежание возможных воздействий на белок или AlPO, и поэтому результаты для этого значения недоступны.
Профиль связывания белка подсемейства B (показан на Фиг.29) продемонстрировал pH-зависимую тенденцию. Независимо от того, осуществлялось ли связывание в гистидин- или сукцинат-забуференных композициях, количество белка, связанного с алюминием, было, тем не менее, сходным. Связывание зависело от pH композиции, а не от буферной соли. Связывание оставалось на уровне 95% вплоть до pH 6,5 (94% в гистидине, 95% в сукцинате), но снижалось, когда pH становился больше 6,5. При pH 7,0 связывание снижалось до примерно 82%, причем с небольшой разницей между буферными солями.
4
Для достижения устойчивого связывания белка подсемейства B с AlPO при этих концентрациях предпочтительным является pH 6,5 или менее.
Пример 8: Исследование в отношении безопасности, толерантности и иммуногенности
Проводили исследование для оценки безопасности, толерантности и иммуногенности вакцины rLP2086, которую вводили здоровому взрослому населению в соответствии сом следующими режимами: 0 и 2 месяца; 0, 2 и 6 месяцев; 0 и 2 месяца с последующей реиммунизацией на 12 месяц.
3+
4
Иммуногенная композиция представляет собой вакцину rLP2086 (рекомбинантную липидированную). Иммуногенная композиция содержит рекомбинантный белок ORF2086 N. meningitidis серогруппы B, который был экспрессирован в Escherichia coli и приготовлен в виде бивалентной вакцины, содержащей один штамм подсемейства A и один штамм подсемейства B rLP2086. В частности, иммуногенная композиция представляет собой дозу 0,5 мл, содержащую 60 мкг, 120 мкг или 200 мкг каждого из очищенного белка подсемейства A и очищенного белка подсемейства B rLP2086, Полисорбат 80 в молярном отношении 2,8 и 0,25 мг Al в виде AlPO, 10 мМ гистидин-забуфенный физиологический раствор при pH 6,0. Контрольная композиция содержит нормальный физиологический раствор (0,9%-ный раствор хлорида натрия) в дозе 0,5 мл.
Субъектов случайным образом причисляли к 5 группам (см. Таблицу 3). Субъектов распределяли по двум возрастным группам, от ≥11 до <14 и от ≥14 до <19 лет.
Таблица 3:
Дизайн исследования
Вакцинация 1
Вакцинация 2
Взятие крови после вакцинации 2
Вакцинация 3
Взятие крови после вакцинации 3
Вакцинация 4
Взятие крови после вакцинации 4
Номер визита
1
2
3
4
5
6
7
Приблизит. месяц
0
2
3
6
7
12
13
Группа 1
rLP2086
rLP2086
Физ. раствор
Физ. раствор
Группа 2
rLP2086
rLP2086
rLP2086
Физ. раствор
Группа 3
rLP2086
rLP2086
Физ. раствор
rLP2086
Группа 4
rLP2086
Физ. раствор
rLP2086
Физ. раствор
Группа 5
Физ. раствор
Физ. раствор
TLP2086
rLP2086
Взятая кровь
20 мл
20 мл
20 мл
20 мл
20 мл
Физиологический раствор использовали в качестве плацебо, поскольку нет испытанной безопасной, иммуногенной и эффективной вакцины против MnB, которая могла бы служить в качестве активного контроля.
Субъекты получают одну дозу rLP2086 вакцины или физиологического раствора при каждом визите для вакцинации (например, визиты 1, 2, 4 и 6) согласно Таблице 3. Соблюдают стандартную практику вакцинации, и вакцину не вводят в кровеносные сосуды. rLP2086 вакцину вводят внутримышечно инъекцией 0,5 мл в верхнюю часть дельтовидной мышцы. Физиологический раствор вводят внутримышечно в верхнюю часть дельтовидной мышцы.
A. Визит 1
При Визите 1, день 1, вакцинация 1, у субъекта сначала берут кровь, а затем он получает вакцинацию. При Визите 1 взятие крови и вакцинация 1 происходят в один и тот же день. Перед вакцинацией у субъекта берут образец крови (приблизительно 20 мл). Субъектам, случайным образом причисленным к группам 1, 2, 3 и 4, делают однократную внутримышечную инъекцию 0,5 мл rLP2086 вакцины в верхнюю часть дельтовидной мышцы.
B. Визит 2 (от 42 до 70 суток после Визита 1), Вакцинация 2
Субъектам групп 1, 2 и 3 делают однократную внутримышечную инъекцию 0,5 мл rLP2086 вакцины в верхнюю часть дельтовидной мышцы. Субъектам групп 4 и 5 делают однократную внутримышечную инъекцию 0,5 мл физиологического раствора в верхнюю часть дельтовидной мышцы.
C. При Визите 3 (от 28 до 42 суток после Визита 2) после вакцинации 2 у субъекта берут образец крови (приблизительно 20 мл).
D. Визит 4 (от 105 до 126 суток после Визита 2), Вакцинация 3
Субъектам групп 2, 4 и 5 делают однократную внутримышечную инъекцию 0,5 мл rLP2086 вакцины в верхнюю часть дельтовидной мышцы. Субъектам групп 1 и 3 делают однократную внутримышечную инъекцию 0,5 мл физиологического раствора в верхнюю часть дельтовидной мышцы.
E. При Визите 5 (от 28 до 42 суток после Визита 4), после вакцинации 3 у субъекта берут образец крови (приблизительно 20 мл).
F. Визит 6 (от 161 до 175 суток после Визита 4), Вакцинация 4
При Визите 6 у субъекта сначала берут кровь, а затем он получает вакцинацию. При Визите 6 взятие крови и вакцинация 4 происходят в один и тот же день. Перед вакцинацией у субъекта берут образец крови (приблизительно 20 мл). Субъектам групп 3 и 5 делают однократную внутримышечную инъекцию 0,5 мл rLP2086 вакцины в верхнюю часть дельтовидной мышцы. Субъектам групп 1, 3 и 4 делают однократную внутримышечную инъекцию 0,5 мл физиологического раствора в верхнюю часть дельтовидной мышцы.
G. При Визите 7 (от 28 до 42 суток после Визита 6) после вакцинации 4 у субъекта берут образец крови (приблизительно 20 мл).
Результаты по иммуногенности
Первичная задача этого исследования заключается в том, чтобы оценить иммуногенность вакцины 60 мкг, 120 мкг и 200 мкг rLP2086 по результатам SBA-анализа, который выполняют с использованием штаммов MnB, экспрессирующих белки подсемейств A и B LP2086.
Вторичная задача этого исследования заключается в том, чтобы оценить иммуногенность вакцины 60 мкг, 120 мкг и 200 мкг rLP2086 по результатам количественного определения связывания lg с белками подсемейств A и B rLP2086.
SBA активность оценивали с использованием 3 штаммов подсемейства A и 3 штаммов подсемейства В, как указано в Таблице 4.
Таблица 4:
Анализ субъектов с ≥4-кратным повышением SBA титра из предозы 1 - популяция mITT (Исследование 6108A1-2001-WW/B1971005)
Штамм
Рандомизированная вакцинная группа
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup> (%)
(95% Cl<sup>c</sup>)
p-значение
1 - Месяц постдоза 2
Штамм 1 подсемейства A
Контроль
80
1 (1,3)
(0,0; 6,8)
>0,9999
вакцина 60 мкг rLP2086
18
16 (88,9)
(65,3; 98,6)
0,0007
вакцина 120 мкг rLP2086
115
96 (83,5)
(75,4; 89,7)
<0,0001
вакцина 200 мкг rLP2086
106
93 (87,7)
(79,9; 93,3)
<0,0001
Штамм 1 подсемействаB
Контроль
84
0 (0,0)
(0,0; 4,3)
>0,9999
вакцина 60 мкг rLP2086
21
15 (71,4)
(47,8; 88,7)
0,0392
вакцина 120 мкг rLP2086
121
72 (59,5)
(50,2; 68,3)
0,0225
вакцина 200 мкг rLP2086
114
68 (59,6)
50,1; 68,7)
0,0244
1-Месяц постдоза 3
Штамм 1 подсемейства A
Контроль
73
4 (5,5)
(1,5; 13,4)
>0,9999
вакцина 60 мкг rLP2086
19
17 (89,5)
(66,9; 98,7)
0,0004
вакцина 120 мкг rLP2086
111
103 (92,8)
(86,3; 96,8)
<0,0001
вакцина 200 мкг rLP2086
100
94 (94,0)
(87,4; 97,8)
<0,0001
Штамм 1 подсемейства B
Контроль
79
1 (1,3)
(0,0; 6,9)
>0,9999
вакцина 60 мкг rLP2086
21
17 (81,0)
(58,1; 94,6)
0,0036
вакцина 120 мкг rLP2086
112
97 (86,,6)
(78,9; 92,3)
<0,0001
вакцина 200 мкг rLP2086
105
89 (84,8)
(76,4; 91,0)
<0,0001
Сокращения: Cl = доверительный интервал; SBA = сывороточный бактерицидный анализ.
Примечание: Аналитическая проверка подтверждает нижний предел количественного определения (LLOQ) штамма 1 подсемейства A=9 и штамма 1 подсемейства B=10. SBA титры выше LLOQ считаются точными, и их количественно определенные значения будут приведены. Значения ниже LLOQ или обозначенные как ниже LLOQ будут установлены до 0,5*LLOQ для анализа.
Доли субъектов с титрами, достигающими определенного уровня, приведены в Таблице 5. Для обоих подсемейств доли субъектов, у которых достигаются определенные уровни SBA титров, были больше при постдозе 3, чем при постдозе 2.
Таблица 5:
Субъекты с SBA титрами, достигающими определенных уровней, на стадии 1 - популяция mITT (Исследование 6108A1-2001-WW/B1971005)
Штамм
Точка времени отбора проб
SBA титр
Вакцинная группа (как рандомизировано)
Контроль
60 мкг
rLP2086 вакцина 120 мкг
200 мкг
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
Подсемейство A Штамм 2
Предоза 1
32
64
7
10,9
(5,3, 21,2)
15
0
0,0
(0,2, 35,8)
90
9
10,0
(5,3, 18,1)
92
11
12,0
(6,7, 20,3)
64
64
2
3,1
(0,8, 11,7)
15
0
0,0
(0,2, 35,8)
90
7
7,8
(3,8, 15,4)
92
5
5,4
(2,3, 12,4)
128
64
0
0,0
(0,0, 11,2)
15
0
0,0
(0,2, 35,8)
90
1
1,1
(0,2, 7,5)
92
0
0,0
(0,0, 8,0)
1 - месяц постдоза 2
32
69
3
4,3
1,4, 12,6)
21
20
95,2
(72,9, 99,3)
115
113
98,3
(93,3, 99,6)
115
105
91,3
(84,6, 95,3)
64
69
1
1,4
(0,2, 9,6)
21
18
85,7
(63,9, 95,3)
115
95
82,6
(74,6, 88,5)
115
83
72,2
(63,3, 79,6)
128
69
1
1,4
(0,2, 9,6)
21
11
52,4
(31,8, 72,1)
115
51
44,3
(35,5, 53,5)
115
49
42,6
(33,9, 51,8)
1 - месяц постдоза 3
32
57
5
8,8
(3,7, 19,4)
19
18
94,7
70,6, 99,3)
108
108
100,0
(93,1, 100,0)
99
98
99,0
(93,2, 99,9)
64
57
3
5,3
(1,7, 15,1)
19
18
94,7
(70,6, 99,3)
108
103
95,4
(89,4, 98,1)
99
90
90,9
(83,4, 95,2)
128
57
2
3,5
(0,9, 13,0)
19
13
68,4
(45,2, 85,1)
108
73
67,6
(58,2, 75,7)
99
67
67,7
(57,9, 76,10
Подсемейство A
Предоза 1
16
81
10
12,3
(6,8, 21,4)
21
1
4,8
(0,7, 27,1)
122
11
9,0
(5,1, 15,6)
114
7
6,1
(3,0, 12,3)
Таблица 5:
Субъекты с SBA титрами, достигающими определенных уровней, на стадии 1 - популяция mITT (Исследование 6108A1-2001-WW/B1971005)
Штамм
Точка времени отбора проб
SBA титр
Вакцинная группа (как рандомизировано)
Контроль
60 мкг
rLP2086 вакцина 120 мкг
200 мкг
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
Штамм 1
32
81
6
7,4
(3,4, 15,5)
21
1
4,8
(0,7, 27,1)
122
7
5,7
(2,8, 11,5)
114
5
4,4
(1,8,10,1)
64
81
4
4,9
(1,9, 12,4)
21
0
0,0
(0,1, 28,2)
122
3
2,5
(0,8,  7,3)
114
2
1,8
(0,4, 6,7)
128
81
1
1,2
(0,2, 8,2)
21
0
0,0
(0,1, 28,2)
122
1
0,8
(0,1, 5,6)
114
0
0,0
(0,0, 6,6)
1 - месяц постдоза 2
16
83
6
7,2
(3,3, 15,2)
18
16
88,9
(64,8, 97,2)
118
105
89,0
(81,9, 93,5)
110
100
90,9
(83,9, 95,0)
32
83
3
3,6
(1,2, 10,6)
18
16
88,9
(64,8, 97,2)
118
101
85,6
(78,0, 90,9)
110
90
81,8
(73,5, 88,0)
64
83
1
1,2
(0,2, 8,1)
18
15
83,3
(59,1, 94,5)
118
70
59,3
(50,2, 67,8)
110
71
64,5
(55,2 72,9)
128
83
0
0,0
0,0, 8,9)
18
6
33,3
(15,8, 57,1)
114
33
28,0
(20,6, 36,7)
110
44
40,0
(31,3, 49,4)
1 - месяц постдоза 3
16
76
9
11,8
(6,3, 21,2)
20
18
90,0
(67,6, 97,5)
114
118
96,5
(91,0, 98,7)
104
100
96,2
(90,2, 98,5)
32
76
6
7,9
(3,6, 16,5)
20
18
90,0
(67,6, 97,5)
114
108
94,7
(88,8, 97,6)
104
99
95,2
(89,0, 98,0)
64
76
3
3,9
(1,3, 11,5)
20
17
85,0
(62,4, 95,1)
114
102
89,5
(82,4, 93,9)
104
91
87,5
(79,7, 92,6)
128
76
1
1,3
(0,2, 8,8)
20
8
40,0
(21,4, 62,0)
114
78
68,4
(59,3, 76,3)
104
63
60,6
(50,9, 69,5)
Подсемейство
Предоза 1
16
80
8
10,0
(5,1,
21
1
4,8
(0,7, 27,1)
119
9
7,6
(4,0, 13,9)
115
7
6,1
(2,9, 12,2)
Таблица 5:
Субъекты с SBA титрами, достигающими определенных уровней, на стадии 1 - популяция mITT (Исследование 6108A1-2001-WW/B1971005)
Штамм
Точка времени отбора проб
SBA титр
Вакцинная группа (как рандомизировано)
Контроль
60 мкг
rLP2086 вакцина 120 мкг
200 мкг
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
A Штамм 3
32
80
6
7,5
(3,4, 15,5)
21
1
4,8
(0,7, 27,1)
119
6
5,0
(2,3, 10,8)
115
5
4,3
(1,8, 10,0)
64
80
2
2,5
(,6, 9,4)
21
0
0,0
(0,1, 28,2)
119
1
0,8
(0,1, 5,7)
115
4
3,5
(1,3, 8,9)
128
80
1
1,3
(0,2, 8,32)
21
0
0,0
(0,1,28,2)
119
0
0,0
(0,0, 6,3)
115
0
0,0
(0,0, 6,5)
1 - месяц постдоза 2
16
81
10
12,3
6,8, 21,4)
20
17
85,0
(62,4, 95,1)
117
111
94,9
(89,1, 97,77)
107
103
96,3
(90,5, 98,6)
32
81
9
11,1
(5,9, 20,0)
20
17
85,0
(62,4, 95,1)
117
106
90,6
(83,8, 94,7)
107
95
88,8
(81,3, 93,5)
64
81
8
9,9
(5,0, 18,5)
20
16
80,0
(57,2, 92,3)
117
94
80,3
(72,1, 86,6)
107
76
71,0
(61,8, 78,8)
128
81
2
2,5
0,6, 9,3)
20
9
45,0
(25,3, 66,4)
117
46
39,3
30,9, 48,4)
107
49
45,8
(36,6, 55,3)
1 - месяц постдоза 3
16
78
9
11,5
(6,1, 20,7)
21
20
95,2
72,9, 99,3)
114
111
97,4
(92,2, 99,1)
112
107
95,5
(89,7, 98,1)
32
78
7
9,0
(3,6, 16,5)
21
18
85,7
(63,9, 95,3)
114
107
93,9
(87,7, 97,0)
112
105
93,8
(87,5, 97,0)
64
78
3
3,8
(1,2, 11.3)
21
15
71,4
(49,2, 86,6)
114
104
91,2
(84,5, 95,2)
112
95
84,8
(76,9, 90,4)
128
78
2
2,6
(0.6, 9.7)
21
13
61,9
40,2, 79,7)
114
85
74,6
(65,8, 81,7)
112
75
67,0
(57,8, 75,0)
Подсемейство
Предоза 1
16
84
3
3,6
(1,2,
22
0
0,0
(0,1, 27,3)
124
2
1,6
(0,4, 6,2)
118
3
2,5
(0,8, 7,6)
Таблица 5:
Субъекты с SBA титрами, достигающими определенных уровней, на стадии 1 - популяция mITT (Исследование 6108A1-2001-WW/B1971005)
Штамм
Точка времени отбора проб
SBA титр
Вакцинная группа (как рандомизировано)
Контроль
60 мкг
rLP2086 вакцина 120 мкг
200 мкг
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
N<sup>a</sup>
n<sup>b</sup>
%
(95% Cl<sup>c</sup>)
32
83
2
2,4
(0,6, 9,1)
22
0
0,0
(0,1, 27,3)
118
3
2,5
(0,8, 7,6)
117
3
2,6
(0,8, 7,6)
64
83
1
1,2
(0,2, 8,1)
22
0
0,0
(0,1, 27,3)
118
0
0,0
(0,0,  6,4)
117
1
0,9
(0,1, 5,8)
128
83
0
0,0
(0,0, 8,9)
22
0
0,0
(0,1, 27,3)
118
0
0,0
(0,0, 6,4)
117
0
0,0
(0,0, 6,4)
1 - месяц постдоза 2
16
84
2
2,4
(0,6, 9,0)
19
4
21,1
(8,1, 44,6)
102
33
32,4
(24,0, 42,0)
96
29
30,2
(21,9, 40,1)
32
84
2
2,4
(0,6,9,0)
19
4
21,1
(8,1, 44,6)
102
31
30,4
(22,3, 40,0)
96
27
28,1
(20,0, 37,9)
64
84
1
1,2
(0,2,8,0)
19
1
5,3
(0,7, 29,4)
102
23
22,5
(15,5, 31,7)
96
19
19,8
(13,0 29,0)
128
84
0
0,0
(0,0, 8,8)
19
0
0,0
(0,2, 30,4)
102
11
10,8
(6,1, 18,4)
96
8
8,3
(4,2, 15,8)
1 - месяц постдоза 3
16
68
4
5,9
(2,2, 14,6)
15
8
53,3
(29,3 75,9)
86
65
75,6
(65,4, 83,5)
81
55
67,9
(57,0, 77,1)
32
68
3
4,4
(1,4, 12,8)
15
8
53,3
(29,3, 75,9)
86
65
75,6
(65,4, 83,5)
81
54
66,7
(55,8, 76,0)
64
68
1
1,5
(0,2, 9,7)
15
7
46,7
(24,1, 70,7)
86
52
60,5
(49,8, 70,2)
81
47
58,0
(47,1, 68,2)
128
68
0
0,0
(0,0, 10,6)
15
4
26,7
(10,4, 53,3)
86
24
27,9
(19,5, 38,3)
81
20
24,7
(16,5, 35,2)
Подсемейство B Штамм 3
Предоза 1
8
81
2
2,5
(0,6, 9,3)
22
0
0,0
(0,1, 27.3)
120
4
3,3
(1,3, 8,5)
116
3
2,6
(0,8, 7,7)
16
81
1
1,2
(0,2, 8,2)
22
0
0,0
(0,1, 27,3)
120
2
1,7
(0,4, 6,4)
116
3
2,6
(0,8, 7,7)
32
81
0
0,0
(0,0, 9,1)
22
0
0,0
(0,1, 27,3)
120
0
0,0
(0,0, 6,3)
116
2
1,7
(0,4, 6,6)
Данные по иммуногенности показывают, что вакцина может вырабатывать антитела со значительной SBA активностью против штаммов подсемейства A и подсемейства В MnB. В случае штамма 2 подсемейства A, после дозы 2 SBA частота ответов находилась в пределах от 88,9% до 90,9% и после дозы 3 SBA частота ответов находилась в пределах от 90,0% до 97,4%. В случае варианта штамма 1 подсемейства A, после дозы 2 и после дозы 3 100,0% субъектов имели SBA ответы на этот вариант при уровнях дозы 60 мкг и 120 мкг. При уровне дозы 200 мкг 96,5% и 99,0% субъектов имели SBA ответы после дозы 2 и после дозы 3 соответственно. В случае варианта штамма 1 подсемейства A SBA частота ответов находилась в пределах от 85,0% до 96,3% после дозы 2 и от 95,2% до 97,4% после дозы 3.
В случае варианта штамма 1 подсемейства B, после дозы 2 SBA частота ответов находилась в пределах от 76,2% до 81,0% и после дозы 3 SBA частота ответов находилась в пределах от 89,5% до 92,0%. В случае варианта штамма 2 подсемейства B, после дозы 2 процент субъектов с SBA частотой ответов находился в пределах от 21,1% до 33,3%. Однако после третьей дозы 53,3%, 75,6% и 67,9% субъектов имели SBA ответы при уровнях дозы 60 мкг, 120 мкг и 200 мкг соответственно. В случае варианта штамма 3 подсемейства B, SBA частота ответов находилась в пределах от 61,9% до 70,8% после дозы 2 и от 76,2% до 88,7% после дозы 3.
В целом, высокая доля субъектов отвечала с SBA титром >LLOQ безотносительно к протестированному штамму подсемейства A или штамму подсемейства В. Данные hSBA продемонстрировали устойчивые иммунные ответы при дозах от 60 мкг до 200 мкг без четкой зависимости доза-ответ. Частота ответов, независимо от исследованного анализа, была численно самой высокой в группе 120 мкг. Группа 200 мкг не имела повышенных иммунных ответов выше уровня дозы 120 мкг.