НЕПАТОГЕННЫЙ ШТАММ F18 Е. COLI И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
NON-PATHOGENIC F18 ESCHERICHIA COLI STRAIN AND USE THEREOF

Перекрестная ссылка на родственную заявку
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/674179, поданной 20 июля 2012 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.
Область техники
Настоящая заявка относится к непатогенному штамму F18 E. coli и к его применению.
Уровень техники
Отечное заболевание и диарея, как правило, являются распространенными заболеваниями среди животных, выращенных заводчиками. Например, отечное заболевание у отнятых поросят, как правило, вызвано кодирующими токсин Шига штаммами Escherichia coli (STEC), кодирующими токсин Шига типа 2e (Stx2e) (MacLeod et al., 1991, Vet Pathol 28:66-73), тогда как секреторная диарея у молочных и отнятых поросят, как правило, вызвана энтеротоксигенными штаммами Escherichia coli (ETEC), кодирующими термостабильные (STa, STb, EAST1) и/или термолабильные (LT) энтеротоксины (Gyles и Fairbrother, 2010, Escherichia coli. In: Pathogenesis of bacterial infections in animals, ed. Gyles CL, Prescott JF, Songer G, Thoen CO, 4th ed., pp 267-308. Blackwell Publishing, Ames, IA; Nagy et al., 1997, Microb Pathog 22:1-11). Некоторые патогенные штаммы экспрессируют как гены Stx2e, так и гены энтеротоксина и, следовательно, могут быть способны вызывать симптомы отечного заболевания и симптомы диареи у одного и того же животного (STEC/ETEC) (Barth et al., 2007, Berl Munch Tierarztl Wochenschr 120:307-316).
Недостатком, связанным со многими общепринятыми терапевтическими или профилактическими композициями и способами для интестинальных бактериальных инфекций, связанных с симптомами отечного заболевания и/или диарейного заболевания, является их низкая надежность или эффективность. Следовательно, существует потребность в улучшенных терапевтических или профилактических композициях и способах для отечного заболевания и/или диарейного заболевания.
Сущность изобретения
В неограничивающем обширном варианте предоставлен выделенный штамм Escherichia coli, который был внесен в Международный депозитарий Канады (International Depositary Authority of Canada, IDAC) 20 июня 2013 года и ему был присвоен номер доступа 200613-01.
В другом неограничивающем обширном варианте предоставлен способ предотвращения интестинальной инфекции F18 патогенной Escherichia coli (E. coli) у животного, содержащий интестинальную доставку животному эффективного количества живого штамма E. coli, внесенного в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получившего номер доступа 200613-01.
В другом неограничивающем обширном варианте предоставлен способ предотвращения отечного заболевания или диареи, вызванных инфекцией F18 патогенной Escherichia coli (E. coli), у животного, содержащий интестинальную доставку животному эффективного количества живого штамма E. coli, внесенного в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получившего номер доступа 200613-01.
В неограничивающем варианте осуществления живой штамм E. coli находится в лиофилизированной форме. В другом неограничивающем варианте осуществления живой штамм E. coli ассоциирован с приемлемым для кормления носителем, например, живой штамм E. coli может быть разбавлен, включен в или суспендирован в приемлемом для кормления носителе. В другом неограничивающем варианте осуществления живой штамм E. coli представлен в замороженной форме.
Указанные и другие аспекты и свойства настоящего изобретения станут очевидными для специалиста в данной области при обзоре следующего описания конкретных вариантов осуществления изобретения в сочетании с прилагаемыми чертежами.
Краткое описание чертежей
Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения предоставлено в данном документе далее со ссылкой на прилагаемые чертежи, в которых:
Фиг. 1: неограничивающий график, который иллюстрирует фекальную экскрецию непатогенного штамма F18 после введения живого непатогенного штамма F18 с соответствующими варьирующимися дозировками, показан в виде обратного log среднего логарифмических колониеобразующих единиц (КОЕ).
Фиг. 2: неограничивающий график, который иллюстрирует фекальную экскрецию патогенного штамма F18-STEC для стимуляции: сравнение между животными, подвергаемыми обработке с комбинированной композицией, и контрольными животными.
Фиг. 3: неограничивающий график, который иллюстрирует колонизацию патогенным штаммом F18-STEC для стимуляции в различных интестинальных сегментах: сравнение между животными, подвергаемыми обработке с комбинированной композицией, и контрольными животными.
Фиг. 4: неограничивающий график, который иллюстрирует иммунологическое детектирование IgM против фимбрий F18 в серологических образцах: сравнение между животными, подвергаемыми обработке с комбинированной композицией, и контрольными животными.
Подробное описание вариантов осуществления
Обычно свиной STEC и многие свиные штаммы ETEC экспрессируют детерминанту F18. Детерминанта F18 является фимбрией, которая облегчает бактериальную колонизацию поверхности слизистой кишечника (Fairbrother et al. 2006, Postweaning Escherichia coli diarrhea and edema disease. In: Diseases of swine, ed. Straw B, Zimmermann JJ, D'Allaire S, Taylor DJ, 9th ed., pp. 649-662. Blackwell Publishing, Ames, IA). Считается, что фимбрии F18 опосредуют адгезию экспрессирующей F18 бактериальной клетки к рецептору энтероцита, рецептору ECF18R, который экспонирован энтероцитами тонкого кишечника на их апикальной цитоплазматической мембране (Vogeli et al. 1996, Anim Genet 27:321-328; Waddell et al. 1996, Infect Immun 64:1714-1719).
Некоторые свиные штаммы STEC и STEC/ETEC могут экспрессировать другие цитоадгезивные фимбрии или нефимбриальные адгезины в дополнение к фимбриям F18, в частности фимбрии F4 или F5 или "адгезин, задействованный в диффузной адгезии" (AIDA) (Barth et al., 2007, Berl Munch Tierarztl Wochenschr 120:307-316; DebRoy et al. 2009, J Vet Diagn Invest 21:359-364; Fairbrother et al., указано выше, Niewerth et al.: 2001, Clin Diagn Lab Immunol 8:143-149). Тогда как адгезин AIDA встречается в обоих патогенах, фимбрии F4 или F5 являются редкими в этих штаммах.
На ферме диарея после отъема (post-weaning diarrhea, (PWD) и отечное заболевание (edema disease, ED) у свиней обычно происходят в первые 2 недели после отъема и связаны с инфекцией энтеротоксигенными патогенными штаммами E. coli (ETEC) F4 или F18 в отношении PWD и патогенными продуцирующими токсин Шига штаммами F18 E. coli (STEC) в отношении ED. Для обоих штаммов фимбрии (т.е. F4 или F18) позволяют адгезию бактерий к их специфическим рецепторам, расположенным на малых кишечных ворсинках с последующим делением бактерий и колонизацией кишечника.
При PWD рецепторы F4 экспрессируются у приблизительно от 30 до 40% свиней и рецепторы F18 детектированы у приблизительно от 70 до 80% свиней. Патогенные штаммы продуцируют комбинацию нескольких токсинов, таких как LT, STa и STb. Свиньи, инфицированные с ETEC-F4, в целом демонстрируют очень высокую заболеваемость, задержку роста, водянистую и реактивную диарею, что часто приводит к смерти инфицированного животного.
Для ED рецепторы F18 детектированы у приблизительно от 70 до 80% свиней. Токсином, связанным с STEC, является Stx2e, вазотоксин, который воздействует на васкулярные эндотелиальные клетки, приводя к отеку и последующим неврологическим признакам, включая атаксию, лежание и в конечном счете в отношении PWD часто приводит к смерти инфицированного животного.
В используемом в данном документе значении выражение "E. coli F18" или "штамм F18" относится к штамму E. coli, который экспрессирует детерминанту F18 (фимбрии).
В используемом в данном документе значении выражение "E. coli F4" или "штамм F4" относится к штамму E. coli, который экспрессирует детерминанту F4 (фимбрии).
Специалист в данной области без чрезмерных усилий распознает, что описанным в данном документе непатогенным штаммом F18 можно манипулировать так, чтобы получить мутант или вариант его штамма, штамм, который имеет все идентификационные характеристики штамма, описанного в данном документе. Способы создания мутантов или вариантов широко распространены и хорошо известны в данной области. Например, патент США № 7371558 (который полностью включен в данный документ посредством ссылки) раскрывает краткое изложение некоторых способов для создания "мутанта или его варианта". Конкретные способы для создания мутантов с применением радиации или химических агентов также хорошо задокументированы в данной области. См., например, Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., или Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992). Мутант или вариант его штамма может также быть идентифицирован как имеющий геном или его значительную часть, которая гибридизируется при очень жестких условиях с геном штамма, описанного в данном документе. Специалист в данной области распознает, насколько значительной должна быть часть генома, чтобы данный штамм можно было считать "мутантом или его вариантом". По существу, специалист в данной области может обоснованно ожидать, что данное изобретение может быть без чрезмерных усилий воплощено на практике с применением такого варианта или его мутанта.
6
10
В используемом в данном документе значении выражение "эффективное количество" относится к количеству, которое вызовет требуемый биологический ответ в ткани, системе или животном. Такое эффективное количество описанного в данном документе живого штамма E. coli F18 может являться, например, но без ограничения им, количеством, которого достаточно для предотвращения интестинальной бактериальной инфекции, минимизируя бактериальную экскрецию, предотвращая заболевание, вызванное интестинальной бактериальной инфекцией, и ему подобным. Применяемое эффективное количество может варьироваться в соответствии с рядом факторов. К примеру, ряд факторов может быть выбран по типу животного, начальному весу животного, фазе роста животного, условиям окружающей среды, приемлемому для кормления носителю, ассоциированному с живым штаммом, т.е. приспособления для животных, тип и управление производством, гигиеническое состояние приспособлений, стресс животного после отъема или вывода, применяемые питание и добавки, здоровье животного и сопутствующие заболевания или лечение и тому подобное. Например, эффективное количество может быть, но без ограничения ими, любым количеством, выбранным в диапазоне от приблизительно 5×10 до приблизительно 3×10 КОЕ. Специалист в данной области будет способен определить пригодное эффективное количество без чрезмерных усилий.
В используемом в данном документе значении термин "животное" относится к любому молодому или взрослому животному, пригодному для применения в соответствии с данным изобретением. В неограничивающем варианте осуществления термин "животное" относится к свиньям. В неограничивающем варианте осуществления термин "животное" относится к свинье. В неограничивающем варианте осуществления свинья является свиньей перед отъемом. В другом неограничивающем варианте осуществления свинья является свиньей после отъема. Специалист в данной области будет способен определить пригодное животное без чрезмерных усилий.
В используемом в данном документе значении термин "интестинальная доставка" относится к форме введения, которая в конечном счете позволяет штамму достигнуть желудочно-кишечный тракт и более предпочтительно кишечник. В неограничивающем варианте осуществления интестинальная доставка выполняется оральным введением штамма. В другом неограничивающем варианте осуществления интестинальная доставка выполняется ректальным введением, например, посредством суппозитория. Специалист в данной области будет способен без чрезмерных усилий определить пригодную форму введения.
В используемом в данном документе значении выражение "приемлемый для кормления носитель" относится к любому носителю, разбавителю или наполнителю, совместимому с описанным в данном документе штаммом и может быть назначен животному без побочных явлений. Пригодные приемлемые для кормления носители, известные в данной области, содержат, но не ограничены ими, воду, физиологический раствор, глюкозу, декстрозу, забуференные растворы и тому подобное. Такой носитель предпочтительно является нетоксичным по отношению к штамму и невредным для животного. Он может также быть биодеградируемым. Носитель может быть твердым или жидким, приемлемым для кормления носителем. Пригодный твердый приемлемый для кормления носитель является нетоксичным перевариваемым носителем. К примеру, этот твердый приемлемый для кормления носитель может быть общераспространенным твердым кормовым продуктом, таким как компонент типичного рациона животного, состоящий из зерновых продуктов, таких как ячменная мука, кукурузная мука или кормовой продукт из пшеницы, продукты из орехов и семян, такие как жмых из очищенного земляного ореха, или хлопковые жмыхи, или извлеченные хлопковые жмыхи, вместе с незначительными количествами, например, перьевой муки, муки из морских водорослей, костной муки, костной пудры, мела, соли, мочевины и витаминов; или он может быть инертным твердым разбавителем или носителем без питательной ценности, например, каолином, тальком, карбонатом кальция, фуллеровой глиной, глинопорошком тонкого помола из аттапульгированной глины, молотыми ракушками устриц или молотым известняком; или он может быть крахмалом или лактозой. В другом конкретном варианте выполнения твердый приемлемый для кормления носитель может являться молотой кукурузой, соевой мукой, сывороткой, животным жиром и тому подобным. Пригодный жидкий приемлемый для кормления носитель является, например, водой и предпочтительно питьевой водой; молоком, таким как цельное или обезжиренное молоко; или культуральной средой, такой как трипсоновый соевый бульон (TSB). Специалист в данной области будет способен определить пригодный приемлемый для кормления носитель без чрезмерных усилий.
Объем формулы изобретения не должен быть ограничен предпочтительными вариантами осуществления, приведенными в последующих примерах, а это предусматривает ее расширенное истолкование, совместимое с описанием в целом.
Примеры
Пример 1
а) Непатогенный штамм F18 E. coli
Штамм E. coli, внесенный в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получивший номер доступа 200613-01, был выделен из экскрементов свиньи в 1996 году в справочной лаборатории ΟΙΕ для Escherichia coli (EcL) в Faculte de medicine veterinaire (FMV), Universite de Montreal (UdeM), Saint-Hyacinthe, Quebec, Canada Dr. J.M. Fairbrother.
Идентификация штамма была осуществлена с применением системы API. Кодом API 20E для Master Seed является 5004552. Серотипирование штамма выявило серотип 0141:K94:H-.
Виротипирование штамма было осуществлено гибридизацией колоний и/или полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Результаты виротипирования продемонстрировали, что штамм являлся позитивным на F18 и AIDA, тогда как он был негативен на следующие токсины: STa, STb, LT, EAST1, Stx1, Stx2, CNF, F4, F5, F6, F17, F41, P, AFA, Eae, Paa, Tsh, гены Aerobactin. Этот штамм, таким образом, является непатогенным штаммом E. coli.
Штамм является резистентным к следующим антимикробным средствам: амоксициллин, ампициллин, клиндамицин, доксициклин, эритромицин, неомицин, пенициллин, спектиномицин, стрептомицин, сульфахлорпиридазин, сульфадиметоксин, сульфатиазол, тиамулин, тилмикозин, тетрациклин (хлор и окси) и тилозин, при этом является чувствительным к следующим антимикробным средствам: апрамицин, цефтиофур, колистин, данофлоксацин, энрофлоксацин и гентамицин.
b) Непатогенный штамм F4 E. coli
Непатогенный штамм F4 Ε. coli может также быть применен в комбинации с непатогенным штаммом F18, описанным в данном документе. В неограничивающем варианте осуществления непатогенный штамм F4 E. coli является любым непатогенным штаммом, который экспрессирует детерминанту F4. В неограничивающем варианте осуществления непатогенный штамм F4 E. coli является рекомбинантным штаммом, например, штаммом pMK005 (Kehoe et al., J Bacteriol. 1983 Sep;155(3):1071-7). В другом неограничивающем варианте осуществления непатогенный штамм F4 E. coli является природным штаммом, например, штаммом, внесенным в Международный депозитарий Канады 21 января 2005 года и получившим номер доступа IDAC 210105-01, как описано в патенте США 7981411 (его содержание полностью включено в данный документ посредством ссылки).
Пример 2
В обширном варианте целью этого исследования была оценка влияния различных оральных доз, описанных в данном документе, непатогенного штамма F18 на его фекальную экскрецию и на анти-F18 системный гуморальный ответ.
Следующая таблица 1 в общем суммирует план исследования:
День
Событие
0
Поступление свиней в экспериментальный блок и распределение на 3 группы
0-5
Период акклиматизации
2 и 5-19
Отбор образцов фекалий для ПЦР
5
Вакцинация
5-8, 10, 12, 14, 16, 18 и 19
Отбор образцов фекалий для определения количества жизнеспособного вакцинного штамма (на основании гемолитических колоний)
5, 10, 12, 15 и 19
Отбор образца крови
8
Первая некропсия
19
Завершающая некропсия и конец эксперимента
I - План исследования
а) Животные
Отбирали образцы крови 50 молочных поросят для детекционного анализа состояния рецептора F18 и уши поросят помечали. Выбранных отлученных от матери поросят (самцы и самки) возрастом между 17 и 20 днями, приобретали на местной ферме, расположенной в Монтережи, Квебек, Канада. Животных переносили в приспособления для отделения. На выбранной ферме не имели место недавних (менее чем 6 месяцев) свиного репродуктивного и респираторного синдрома (PRRS) и случаев заболевания после отъема. Поросята являлись здоровыми поросятами и весили между 4 и 6 кг. В общей сложности использовали двадцать одного (21) поросенка, позитивного по отношению к состоянию F18-рецептора, случайно разделенных с применением номеров, обозначенных на ушах на три (3) группы из 7 животных (три различные дозы композиции F18). На день 2 после отъема отбирали образец фекалий для определения существующей колонизации с F4 позитивными и F18 позитивными штаммами с применением ПЦР. Не было обнаружено ни одного животного, позитивного или на F4 позитивные, или на F18 позитивные бактерии на день 2 после отъема.
b) Распределение по загонам и вскармливание
Группы обработки выдерживали в отдельных помещениях. Животные имели неограниченный доступ к воде, и их кормили два раза в сутки во время исследования. Рацион животных был составлен из питания с высоким содержанием соевой муки, как описано патенте США 6355859 (его содержание полностью включено в данный документ посредством ссылки). Во время исследования не вводили сопутствующую лекарственную терапию или вакцинацию.
с) Приготовление и введение штамма
8
9
9
Подготавливали кривые роста таким же образом для оценки времени, требуемого для непатогенного штамма F18 для достижения оптимального выхода. Рабочую затравку (Working Seed,WS) применяли для подготовки кривой роста и культуры, которую применяли для приготовления композиции F18. Один миллилитр WS применяли для инокулирования 500 мл триптического соевого бульона без веществ животного происхождения. Культуру инкубировали примерно 6,5 часов при 37°C со взбалтыванием (180 об./мин). Определяли жизнеспособное количество для оценки выхода культуры штамма F18 и применяли реакцию ПЦР для демонстрации того, что подходящий штамм был применен во время анализа. На основании результатов культуру регулировали так, чтобы она удовлетворяла дозам, которые должны быть тестированы с применением стерильного TSB без веществ животного происхождения: группа 1,5×10 КОЕ/доза; группа 2,1×10 КОЕ/доза и группа 3,5×10 КОЕ/доза.
Девять (9) доз композиции непатогенного штамма F18 готовили для каждого состава, на 2 больше, чем количество поросят, которые должны быть обработаны для компенсации любой потери композиции. Шесть (6) мл композиции F18 вводили орально каждому поросенку. F18-композицию вводили на день 5 после отъема с применением пищеводной трубки.
II - Наблюдения и оценка
а) Общее состояние здоровья
За поросятами наблюдали два раза в сутки относительно общего состояния здоровья: поведение, обезвоживание, аппетит и общее физическое состояние. Также оценивали подвижность и состояние шерсти.
b) Диарея
Консистенцию фекалий оценивали раз в сутки следующим образом: 0, нормальная; 1, пастообразная; 2, наличие жидкости, но больше твердых частиц, чем жидких; 3, наличие большего количества жидкости, чем твердых частиц; и 4, полностью жидкая.
с) Экскреция введенного непатогенного штамма F18
На день 2 и дни 5-19 после отъема экскременты тестировали с ПЦР (multiplex: LT, STa, STb и F4; F18, Stx2e и AIDA) после обогащения в бульоне Луриа-Бертани (LB) для оценки наличия введенного непатогенного штамма F18 в каждой группе. Образец, позитивный на F18, считали позитивным на введенный непатогенный штамм F18. В дни 5-8, 10, 12, 14, 16, 18 и 19 после отъема, определение жизнеспособного количества осуществляли с образцами экскрементов с применением триптического соевого агара II (TSA II) - 5% овечьей крови для оценки уровня введенного непатогенного штамма F18, экскретированного после введения. Подсчитывали только гемолитические колонии с типичной морфологией E. coli.
d) Оценка иммунизации
Образцы крови отбирали в дни 5, 10, 12, 15 и 19 после отъема для оценки посредством ELISA оптимального иммунного ответа в соответствии с дозировкой введенного непатогенного штамма F18.
III - Некропсия
a) Некропсия
Первую некропсию проводили через 3 дня после вакцинации на день 8 после отъема на 2 животных, выбранных случайно, и оценивали общие отклонения. Вторую некропсию проводили в конце исследования, таким образом на день 19 после отъема, что являлось 14 днем после вакцинации всех оставшихся животных.
b) Консистенция интестинального содержимого
Консистенцию интестинального содержимого оценивали в тощей кишке, подвздошной кишке, слепой кишке, толстой кишке и прямой кишке следующим образом: 0, нормальная; 1, пастообразная; 2, наличие жидкости, но больше твердых частиц, чем жидких; 3, наличие большего количества жидкости, чем твердых частиц, или полностью жидкая.
c) Колонизация подвздошной кишки вакцинным штаммом
2 сантиметра участка подвздошной кишки отделяли в 10 см от илеоцекального соединения. Живой бактериальный подсчет выполняли с применением TSA II - 5% овечья кровь, где подсчитывали только гемолитические колонии с типичной морфологией E. coli.
IV - Результаты
Не наблюдали смертность как у обработанных, так и у контрольных животных во всем исследовании. Все выбранные свиньи являлись позитивными на F18 рецептор в соответствии со способом ПЦР-RFLP. В целом, поросята имели хорошее здоровье в течение всего исследования. Несколько животных демонстрировали сниженную подвижность, что проявлялось перед введением непатогенного штамма F18 или вследствие повреждений, таким образом, не связанную с введением непатогенного F18.
Во время этого исследования оценку 2 или более считали диареей. Из 21 животного 5 демонстрировали кратковременную умеренную диарею после введения F18. Одно животное (свинья 5 в группе 3) имело диарею (оценка 3) в течение 2 последовательных дней (таблицы 2a, 2b и 2c).
9
9
8
Образцы фекалий тестировали раз в сутки посредством ПЦР для детектирования наличия штамма с введенным F18; 3 животных в группе 2 (1×10 КОЕ/доза) являлись позитивными на введенный штамм F18, самое позднее на день 11 после вакцинации, где в группе 3 (5×10 КОЕ/доза) имел место 1 поросенок, позитивный на день 10, 1 на день 8, и 3 на день 7 после вакцинации. Для группы 1 (5×10 КОЕ/доза) 1 поросенок являлся позитивным на непатогенный штамм F18 на день 8 после вакцинации, 1 поросенок на день 7 и 2 на день 6 после вакцинации (таблицы 2a, 2b и 2c).
8
9
Фекальную экскрецию непатогенного штамма с введенным F18 также оценивали бактериальным подсчетом из образцов фекалий на день 5-8, 10, 12, 14, 16, 18 и 19. Фиг. 1 демонстрирует экскрецию штамма после введения. Уровень бактерий, экскретированных с более низкими дозами (5×10 КОЕ), был ниже, чем два других, при этом наивысшая экскреция наблюдалась с животными из группы 2, которым вводили дозу 1×10 КОЕ.
Не наблюдали никаких больших отклонений для внутренних органов. Консистенции интестинального содержимого оценивали на накопление жидкой среды.
В этом исследовании оценкой 2 или более считалось накопление жидкой среды в интестинальном сегменте в день некропсии. Таблицы 3a, 3b и 3c демонстрируют, что у одного животного в группе 1 были представлены два последовательных сегмента с накоплением жидкой среды (оценка 2). Другие животные не демонстрировали накопление жидкой среды.
Не наблюдали никаких нежелательных явлений, связанных с введением непатогенного штамма F18 во время исследования, что указывает на то, что тестируемые дозировки в целом являются безопасными.
9
9
На основании оценки экскреции штамма как ПЦР, так и подсчет бактерий предполагал, что 1×10 КОЕ/доза является пригодной дозировкой для получения пролонгированной фекальной экскреции этого штамма. Оба теста демонстрировали, что введение непатогенного штамма F18 при 1×10 КОЕ/доза экскретировалось в течение более длительного периода, чем другие тестируемые дозировки.
Пример 3
В обширном варианте целью этого исследования являлась оценка эффективности комбинированной композиции, включающей описанные в данном документе непатогенные штаммы E. coli F4 и F18.
Следующая таблица 4 в общем суммирует расписание исследования:
Дней
Событие
0
Поступление свиней в экспериментaльный блок и распределение на 2 группы
0-5
Акклиматизационный период
1,12, 14, 16,18 и 19
Отбор образцов фекалий для ПЦР
4, 12, 17 и 19
Отбор образца крови
5
Оральное введение дозы или плацебо
12,13 и 14
Стимуляция
12, 14,16, 18 и 19
Отбор образцов фекалий для определения жизнеспособного количества штамма для стимуляции
19
Завершающая некропсия и конец эксперимента
I - План исследования
a) Животные
Отбирали образцы крови 50 молочных поросят для детектционного анализа на рецептор F18 и уши поросят помечали. Выбранных отнятых поросят (самцы и самки) возрастом между 17 и 21 днями, приобретали в коммерческой ферме, расположенной рядом с Монтережи, Квебек, Канада. Животных переносили в приспособления для отделения. На ферме не было недавнего (менее чем 6 месяцев) свиного репродуктивного и респираторного синдрома (PRRS) и случаев заболевания после отъема. Поросята являлись здоровыми поросятами и весили между 4 и 6 кг.
В общей сложности использовали двадцать (20) поросят, случайно разделенных по номерам на бирках на ушах. Программное обеспечение рандомизатор применяли для случайного распределения 20 животных на две (2) группы из 10 животных (контрольная группа и группа введения). На день 1 после отъема образец фекалий отбирали для определения существующей колонизации с патогенным F4-ETEC позитивным штаммом и F18-ETEC/STEC позитивными штаммами, имеющим происхождение из фермы с применением анализа ПЦР. Мечеными генами являлись STa, STb, LT, F4, Stx2 и F18. Не было обнаружено ни одного животного, позитивного или на бактерии F4-ETEC, или на F18-ETEC/STEC на день 1 после отъема.
b) Распределение по загонам и вскармливание
Обработанные и контрольные группы выдерживали в отдельных помещениях. Животные имели неограниченный доступ к воде и питанию во время исследования. Рацион животных был составлен из муки с высоким содержанием сои как описано в патенте США 6355859. Во время исследования не вводили никакую сопутствующую лекарственную терапию или вакцинацию.
с) Приготовление и введение штамма
8
Регидратированную комбинированную композицию разбавляли для получения минимум 5×10 КОЕ/штамм в расчете на 6-мл дозу. Плацебо было составлено из 6 мл стерильной воды. Комбинированную композицию и плацебо вводили орально с применением шприца с резиновой трубкой.
d) Приготовление и введение штамма для стимуляции (F18-STEC EcL 14724)
Этот штамм для стимуляции был внесен в Международный депозитарий Канады (IDAC) 9 июля и получил номер доступа 090713-01.
11
11
3
Готовили культуру для получения инфекционной дозы 1×10 КОЕ в расчете на поросенка. После введения 10 мл карбоната кальция 1,2% (CaCO), каждому поросенку орально вводили пять (5) мл штамма для стимуляции с применением пищеводной трубки. Штамм для стимуляции вводили в течение трех (3) последовательных дней, т.е. день 12, 13 и 14 после отъема в концентрации 1×10 КОЕ/доза каждый день.
e) Наблюдения и оценка
За поросятами наблюдали два раза в сутки относительно общего состояния здоровья: поведение, аппетит, общее физическое состояние, подвижность и состояние шерсти. Наблюдали за обезвоживанием и температурой тела раз в сутки. Экскрецию штамма для стимуляции оценивали по ПЦР и количеству жизнеспособных бактерий (КОЕ). Образцы крови анализировали с применением специфического фермент-связанного иммуносорбентного исследования (ELISA). Результаты представлены в виде процентов положительного результата анализа (PP%) относительно позитивного контроля.
II - Некропсия
Колонизацию подвздошной кишки и слепой кишки штаммом для стимуляции определяли следующим образом. 2 сантиметра участка подвздошной кишки отбирали в 10 см от илеоцекального соединения также как и для участка слепой кишки. Живой бактериальный подсчет выполняли с применением TSA II - 5% овечья кровь, где только гемолитические колонии с типичной морфологией E. coli подсчитывали после от 12 до 18 часов инкубирования при 37°C.
III - Результаты
a) Общая информация
Из тестированных 50 поросят 30 являлись восприимчивыми к адгезии штамма F18 и 20 животных случайно выбирали для испытаний. В целом поросята имели хорошее здоровье перед стимуляцией.
Следующая таблица 5 демонстрирует результаты ПЦР экскретированного штамма для стимуляции из экскрементов обработанных и контрольных животных:
Свиньи (%), экскретирующие штамм для стимуляции в день после последней стимуляции (день после отъема)
0 (14)
2 (16)
4 (18)
5 (19)
Плацебо
100%
100%
67%
56%
Комбинированная композиция
100%
60%
0%
0%
Как продемонстрировано в таблице 5, введение комбинированной композиции снижало экскрецию стимулирующих штаммов по сравнению со свиньями, которые получали плацебо. Более чем половина животных с плацебо (56%) все еще экскретировала штамм для стимуляции через 5 дней после последней стимуляции (конец исследования), тогда как штамм для стимуляции не был детектирован в животных, обработанных с комбинированной композицией уже через 4 дня после последней стимуляции.
Фиг. 2 демонстрирует количество жизнеспособных бактерий (КОЕ)/г экскретированного штамма для стимуляции из экскрементов обработанных и контрольных животных. Пик концентрации экскретированного штамма для стимуляции виден на день 14 после отъема (день 0 после стимуляции) как для обработанных, так и для контрольных животных. В обработанных животных концентрация штамма для стимуляции в экскрементах начинала снижаться на день 2 после последней стимуляции (день 16 после отъема), и дальнейшие снижения наблюдали по сравнению с плацебо в дни 4 и 5 после последней стимуляции. Эти результаты соответствуют результатам ПЦР. Более конкретно введение комбинированной композиции снижало уровень экскреции штамма для стимуляции на приблизительно 2 log через 5 дней после последней стимуляции (конец исследования).
b) Колонизация подвздошной кишки и слепой кишки штаммом для стимуляции
Различия в интестинальной колонизации между обработанными и животными с плацебо наблюдали для обоих сегментов интестинальной ткани (подвздошная кишка и слепая кишка). Фиг. 3 демонстрирует, что введение комбинированной композиции значительно снижало колонизацию кишечника штаммом для стимуляции. Более конкретно введение комбинированной композиции снижало колонизацию штаммом для стимуляции подвздошной кишки и слепой кишки на приблизительно 2 log через 5 дней после последней стимуляции (конец исследования).
c) Оценка иммунного ответа
Наличие системных IgM против фимбрий F18 оценивали в образцах сыворотки с применением специфического ELISA. Животные, обработанные комбинированной композицией, демонстрировали специфический иммунный ответ уже через 7 дней после введения (фиг. 4).
На основании полученного в результате снижения колонизации штаммом для стимуляции, снижения экскреции и стимуляции специфических анти-F18 антител, это исследование предполагает, что интестинальная доставка композиции, включая описанный в данном документе непатогенный штамм F18, способна к предотвращению интестинальной бактериальной инфекции E. coli F18.
Пример 4
В обширном варианте целью этого исследования являлась оценка эффективности описанного в данном документе непатогенного штамма F18 E. coli.
I - План исследования
a) Животные
Перед поступлением животных в приспособления десять молочных поросят из 10 приплодов в общей сложности 100 поросят подвергали отбору в опоросном блоке для выделения ДНК и скринировали на состояние F18 рецептора (RF18+) способом RFLP-PCR. Тридцать (30) RF18+ поросят случайно распределяли между группами блокированием по приплодам (соотношение 1:1) с генерированием размера блока n=6. Поросят распределяли в одну из следующих групп: T1, которым вводили непатогенный тестируемый штамм F18 (n=15); и T2, которым вводили плацебо (n=15).
Животных обработанной группы (T1) собирали в загоне экспериментального помещения и животных группы с плацебо (T2) собирали в загоне экспериментального помещения до фазы стимуляция. В день стимуляции, то есть через 11 дней после введения непатогенного штамма F18 или плацебо, животных групп T1 (n=15) и T2 (n=15) переносили перед стимуляцией в 2 раздельных загона, расположенных в помещении для стимуляции. Все 15 поросят конкретной группы обработки собирали в соответствующем загоне. Во время всего исследования животные имели неограниченный доступ к воде, за исключением приостановки доступа к воде перед вакцинацией. Животных кормили два раза в сутки нелекарственной мукой с высоким содержанием сои (патент США 6355859).
На день 1 после отъема отбирали образец фекалий для определения существующей колонизации патогенным F4-ETEC позитивным штаммом и F18-ETEC/STEC позитивными штаммами, имеющими происхождение с фермы с применением анализа ПЦР. Мечеными генами являлись STa, STb, LT, F4, Stx2 и F18. Не было обнаружено никаких животных, являющихся позитивными или на бактерии F4-ETEC, или на F18-ETEC/STEC на день 1 после отъема. Три (3) животных из группы T1 исключали из исследования в целях надлежащего ухода за животными. Эти нежелательные явления считались не являющимися связанными с введением непатогенного штамма F18.
Следующая таблица 6 в общем суммирует использованных животных:
Разновидности:
Домашние свиньи (Pen Ar Lan Naїma). Эта порода свиней является гибридной породой, коммерциализированной в Америке, Европе и Азии.
Количество и пол:
30 животных; кастрировано 30% самцов и 70% самок.
Поставщик:
Товарная ферма, Монтережи, Квебек, Канада
Возраст при тестировании:
Испытуемый образец был предназначен для введения тестового штамма для поросят возрастом от примерно 17 дней.
Диапазон веса в начале исследования:
3,120-7,295 кг
Акклиматизация:
1 день
Лекарственное лечение:
Ни одному из исследуемых животных не вводили никакую сопутствующую лекарственную терапию или вакцинацию в пределах 3 дней перед и во время исследования
Следующая таблица 7 в общем суммирует план исследования:
День активности
T1
T2
День -2
Поступление свиней RF18+ в приспособления для отделения и случайное распределение, общий контроль здоровья и веса
День 0 (возраст прибл. 17 дней)
введение непатогенного F18
Плацебо
Дни 1-11
Ежесуточный контроль здоровья
День 11-12-13
Стимуляция с F8-STEC
День 11-18
Наблюдения за здоровьем
День 18
Некропсия и микробиология
II - Процедура и оценка
Животные группы T1 и группы T2 не могли быть перемешаны из-за природы тестируемого продукта (т.е. живая вакцина), которая требует, чтобы обработанные животные располагались отдельно от контрольных с плацебо. Растворы непатогенного штамма F18 и плацебо готовили индивидуумы, не задействованные в фазе с животными. Код "A" и "B" случайно присваивали растворам непатогенного штамма F18 и плацебо. Помещения случайно распределяли для обработки и идентифицировали как помещения 1 и 2. В каждом помещении содержались все животные группы T1 или все группы T2, перемешанные в одном загоне. Для персонала, задействованного в животной фазе и осуществляющего обработку лабораторного анализа, расположение помещений было замаскировано. Для фазы некропсии последовательность животных, которые должны были подвергнуться некропсии, была случайно присвоена и животные были заново идентифицированы в виде A-AD. Для индивидуума, выполняющего некропсию поросенка, идентификация и обработка была замаскирована. Коды рандомизации в запечатанном конверте сохранял ответственный специалист по медико-санитарной статистике.
a) Приготовление и введение непатогенного штамма F18
Непатогенный штамм F18 культивировали в ферментере, затем бактерии замораживали и хранили при -78°C в 10 мл стеклянных флаконах, содержащих 200 номинальных доз. Замороженные бактерии перед применением разбавляли водой при комнатной температуре.
8
Дозу вводили один раз за одни сутки после отъема (день 0) при примерно 3×10 КОЕ в расчете на 2-мл дозу. Дозу вводили орально с применением шприца, оснащенного резиновой трубкой. Контрольные животные получали такое же количество раствора плацебо (вода).
b) Штамм для стимуляции (F18-STEC штамм EcL 14724)
10
Штамм для стимуляции, применяемый в этом анализе, заново выделяли из поросенка (#381), ранее стимулированного со штаммом EcL 14724 (позитивным на Stx2, F18ab, AIDA и Paa). Штамм для стимуляции вводили орально один раз в 3 последовательных дня 11, 12 и 13 исследования с примерно 1×10КОЕ в расчете на поросенка. Каждую стимулирующую дозу вводили с применением желатиновой капсулы в качестве замещения пищеводной инкубации. Карбадокс (антибиотик, стимулирующий высвобождение шигатоксина) вводили орально в желатиновой капсуле непосредственно после введения штамма для стимуляции для запускания высвобождения Шигатоксина.
c) Оценка общего состояния здоровья
За общим состоянием здоровья свиней наблюдали один раз в сутки перед периодом стимуляции. После первой стимуляции за животными наблюдали два раза в сутки, относительно общего состояния здоровья, включая депрессию, обезвоживание, аппетит и любые клинические признаки, связанные с отечным заболеванием: атаксия, отек морды и конечностей, внезапная смерть.
d) Оценка выделения штамма для стимуляции
Фекальное выделение штамма для стимуляции оценивали количественно с применением способа наиболее вероятной количественной ПЦР (MPN-PCR), метящего ген, кодирующий FedA, главный белок фимбрии F18.
e) Некропсия
2
Некропсии осуществляли через 7 дней после первой стимуляции. Колонизацию слепой кишки штаммом для стимуляции оценивали количественно с применением способа наиболее вероятной количественной ПЦР (MPN-PCR), метящего ген, кодирующий FedA, главный белок фимбрии F18 с применением участка ткани примерно 2 см.
III - Результаты
5
Анализ ПЦР продемонстрировал эффективность введения непатогенного штамма F18 для предотвращения экскреции стимулирующего F18 шигатоксигенного патогенного штамма. Уменьшение приблизительно 2,5 log фекального выделения наблюдали для обработанных животных по сравнению с плацебо животными через 4 дня после последней стимуляции (таблица 8). Через 4 дня после последней стимуляции у 93% плацебо животных было выделено более 1×10 КОЕ штамма для стимуляции в расчете на грамм образца фекалий, тогда как среди обработанных животных было выделено у только 42% (таблица 9).
Следующая таблица 8 демонстрирует выделение штамма для стимуляции на день 4 после последней стимуляции:
Медиана выделения (КОЕ штамма для стимуляции/г образца фекалий)
Животные с плацебо
7,8×10<sup>6</sup>
Обработанные животные
5,2×10<sup>4</sup>
Следующая таблица 9 демонстрирует процент свиней с выделением стимулирующего штамма при различной бактериальной нагрузке на день 4 после последней стимуляции:
КОЕ стимулирующего штамма/г образцов фекалий
<1×10<sup>4</sup>
10<sup>4</sup>
10<sup>5</sup>
>1×10<sup>6</sup>
Животные с плацебо
0%
7%
33%
60%
Обработанные животные
25%
33%
17%
25%
5
4
Снижение приблизительно 1 log штамма для стимуляции, детектированное в слепой кишке, наблюдали для обработанных животных (введенный непатогенный штамм F18) по сравнению с животными с плацебо через 5 дней после последней стимуляции (таблица 10). Через 5 дней после последней стимуляции более чем у 53% животных с плацебо было выделено более чем 1×10 КОЕ штамма для стимуляции в расчете на грамм ткани слепой кишки, тогда как у обработанных животных было выделено только у 8% (таблица 11). Более чем у 80% животных с плацебо была колонизирована слепая кишка с более чем 1×10 КОЕ штамма для стимуляции в расчете на грамм слепой кишки по сравнению с 50% обработанных животных через 5 дней после последней стимуляции (таблица 11).
Следующая таблица 10 демонстрирует колонизациию слепой кишки штаммами для стимуляции на день 5 после последней стимуляции:
Медиана колонизации слепой кишки (КОЕ штамма для стимуляции/г ткани слепой кишки)
Животные с плацебо
3,4×10<sup>5</sup>
Обработанные животные
1,5×10<sup>4</sup>
Следующая таблица 11 демонстрирует процент свиней, слепая кишка которых была колонизирована штаммом для стимуляции при различной бактериальной нагрузке на день 5 после последней стимуляции:
КОЕ стимулирующего штамма/г образцов слепой кишки
<1×10<sup>2</sup>
10<sup>2</sup>
10<sup>3</sup>
10<sup>4</sup>
>1×10<sup>5</sup>
Животные с плацебо
7%
7%
7%
27%
53%
Обработанные животные
8%
17%
25%
42%
8%
На основании полученного в результате уменьшения колонизации стимулирующим штаммом и уменьшения экскреции это исследование предполагает, что интестинальная доставка композиции, содержащей непатогенный штамм F18, способна к предотвращению интестинальной бактериальной инфекции F18 E. coli, вызывающей отек.
Следующие положения предоставляют дополнительное описание примеров неограничивающих вариантов осуществления в соответствии с данным изобретением:
Положения:
Положение 1: Выделенный штамм E. coli, внесенный в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получивший номер доступа 200613-01.
Положение 2: Выделенный штамм E. coli по положению 1 в лиофилизированной форме.
Положение 3: Выделенный штамм E. coli по положению 1 в замороженной форме.
Положение 4: Выделенный штамм E. coli по положению 1, в котором штамм ассоциирован с приемлемым для кормления носителем.
Положение 5: Композиция, содержащая выделенный штамм E. coli по любому из положений 1-3 и приемлемый для кормления носитель.
Положение 6: Композиция по положению 5, дополнительно содержащая выделенную живую непатогенную E. coli, которая экспрессирует фимбрии F4.
Положение 7: Композиция по положению 6, в котором указанная непатогенная E. coli, которая экспрессирует фимбрии F4 является штаммом, внесенным в Международный депозитарий Канады 21 января 2005 года и получившим номер доступа IDAC 210105-01.
Положение 8: способ предотвращения интестинальной F18 патогенной инфекции E. coli у животного, содержащий интестинальную доставку животному эффективного количества живого штамма E. coli, внесенного в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получившего номер доступа 200613-01
Положение 9: Способ по положению 8, в котором указанную интестинальную доставку получают оральным введением живого штамма E. coli.
Положение 10: Способ по положению 8 или 9, в котором указанный живой штамм E. coli представлен в лиофилизированной форме.
Положение 11: Способ по положению 8 или 9, в котором указанный живой штамм E. coli представлен в замороженной форме.
Положение 12: Способ по положению 8 или 9, в котором указанный живой штамм E. coli ассоциирован с приемлемым для кормления носителем.
7
Положение 13: Способ в соответствии с любым из положений 8-12, в котором указанное эффективное количество составляет по меньшей мере 5×10 КОЕ.
Положение 14: способ в соответствии с любым из положений 8-12, в котором указанное животное является свиньей.
Положение 15: способ предотвращения отечного заболевания или диареи, вызванных инфекцией F18 патогенной E. coli, у животного, содержащий интестинальную доставку животному живого штамма E. coli, внесенного в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получившего номер доступа 200613-01.
Положение 16: Способ по положению 15, в котором указанную интестинальную доставку получают оральным введением живого штамма E. coli.
Положение 17: Способ по положению 15 или 16, в котором указанный живой штамм E. coli представлен в лиофилизированной форме.
Положение 18: Способ по положению 15 или 16, в котором указанный живой штамм E. coli представлен в замороженной форме.
Положение 19: Способ по положению 15 или 16, в котором указанный живой штамм E. coli ассоциирован с приемлемым для кормления носителем.
7
Положение 20: способ в соответствии с любым из положений 15-19, в котором указанное эффективное количество составляет по меньшей мере 5×10 КОЕ.
Положение 21: способ в соответствии с любым из положений 15-20, в котором указанное животное является свиньей.
Положение 22: Применение для предотвращения интестинальной инфекции F18 патогенной E. coli у животного эффективного количества живого штамма E. coli, внесенного в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получившего номер доступа 200613-01, при этом штамм является адаптированным для интестинальной доставки животному.
Положение 23: Применение в производстве композиции для применения в предотвращении интестинальной инфекции F18 патогенной E. coli у животного эффективного количества живого штамма E. coli, внесенного в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получившего номер доступа 200613-01, при этом композиция является адаптированной для интестинальной доставки животному.
Положение 24: Применение для предотвращения отечного заболевания или диареи, вызванных инфекцией F18 патогенной E. coli у животного, эффективного количества живого штамма E. coli, внесенного в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получившего номер доступа 200613-01, при этом штамм является адаптированным для интестинальной доставки животному.
Положение 25: Применение в производстве композиции для применения в предотвращении отечного заболевания или диареи, вызванных инфекцией F18 патогенной E. coli у животного, эффективного количества живого штамма E. coli, внесенного в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 года и получившего номер доступа 200613-01, при этом композиция является адаптированной для интестинальной доставки животному.
Положение 26: Применение по любому из положений 22-25, в котором указанный живой штамм E. coli адаптирован для орального введения.
Положение 27: Применение по любому из положений 22-26, в котором указанный живой штамм E. coli представлен в лиофилизированной форме.
Положение 28: Применение по любому из положений 22-26, в котором указанный живой штамм E. coli представлен в замороженной форме.
Положение 29: Применение по любому из положений 22-26, в котором указанный живой штамм E. coli ассоциирован с приемлемым для кормления носителем.
7
Положение 30: Применение в соответствии с любым из положений 22-29, в котором указанное эффективное количество составляет по меньшей мере приблизительно 5×10 КОЕ.
Положение 31: Применение в соответствии с любым из положений 22-30, в котором указанное животное является свиньей.
Положение 32: Выделенный штамм E. coli по любому из положений 1-4, для применения в предотвращении интестинальной инфекции F18 патогенной E. coli у животного, при этом штамм адаптирован для интестинальной доставки животному.
Положение 33: Выделенный штамм E. coli по любому из положений 1-4, для применения в производстве композиции для применения в предотвращении интестинальной инфекции F18 патогенной E. coli у животного, при этом композиция адаптирована для интестинальной доставки животному.
Положение 34: Выделенный штамм E. coli по любому из положений 1-4, для применения в предотвращении отечного заболевания или диареи, вызванной инфекцией F18 патогенной E. coli у животного, при этом штамм адаптирован для интестинальной доставки животному.
Положение 35: Выделенный штамм E. coli по любому из положений 1-4, для применения в производстве композиции для применения в предотвращении отечного заболевания или диареи, вызванных инфекцией F18 патогенной E. coli у животного, при этом композиция адаптирована для интестинальной доставки животному.
Необходимо отметить, что заголовки и подзаголовки по всему данному документу предоставлены в целях удобства чтения, что никак не должно ограничивать объем изобретения. Кроме того, некоторые теории предложены и раскрыты в данном документе; однако они никоим образом независимо от того, правильные они или нет, не должны ограничивать объем изобретения при условии, что изобретение воплощено на практике в соответствии с раскрытием данного изобретения независимо конкретной теории или схемы действия.
Специалист в данной области признает, что во всем описании данного изобретения применение термина в единственном числе охватывает варианты осуществления, содержащие один или более терминов, к которому он относится. Специалист в данной области признает, что во всем описании данного изобретения термин "содержащий", который является синонимичным терминам "включающий", "содержащий в себе" или "характеризуемый тем, что" является включающим в себя или неограниченным и не исключает дополнительные неизложенные элементы или этапы способа.
Если особо не оговорено иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют такое же значение как общепринято среди рядовых специалистов в области, к которой относится данное изобретение. В случае несоответствия данный документ, включая определения, будет определяющим.
Хотя в описанных в данном документе исследованиях использовали отнятых свиней, специалист в данной области без труда поймет, что свиньи, которые будут обработаны, могут альтернативно являться свиньями до отъема.
В используемом в данном документе значении "около", "приблизительно" или "примерно" обычно означает в пределах 20 процентов, предпочтительно в пределах 10 процентов и более предпочтительно в пределах 5 процентов приведенной величины или диапазона. Численные величины, приведенные в данном документе, являются в целом приблизительными; что обозначает, что может подразумеваться термин "около", "приблизительно" или "примерно", если не предусмотрено иное.
Все ссылочные материалы, приведенные во всем данном описании, настоящим полностью включены в данный документ посредством ссылки.
Объем формулы изобретения не должен быть ограничен предпочтительными вариантами осуществления, описанными в примерах, но ему должна быть дана более широкая интерпретация в соответствии со всем описанием.