Анализ биофизической теории электрофореза живых клеток

В ПОРЯДКЕ ДИСКУССИИ

FOR

DISCUSSION

© М. В. Голованов, 1998 УДК 511.18:577.1

М. В. Голованов

АНАЛИЗ БИОФИЗИЧЕСКОЙ ТЕОРИИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ЖИВЫХ КЛЕТОК

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей

Классическая теория электрофореза исходит из концепции: формирование электрического заряда на поверхности неживой частицы определяется только диссоциацией и адсорбцией ионов, спонтанным формированием адсорбционного, двойного электрического и диффузного слоев. При этом величина двойного электрического слоя

Эта же концепция в настоящее время используется для объяснения процесса формирования поверхностного электрического заряда плазматической мембраны клетки.

Цель данного исследования — критический анализ современной биофизической теории электрофореза живых клеток.

Материалы и методы. В эксперименте были использованы следующие объекты исследования: нормальные эритроциты и лейкоциты периферической крови доноров, лейкозные клетки крови больных с диагнозом хронического лимфолейкоза, а также физические объекты — частицы кварца, латекса, крахмала, туши, полистирола. Использовали витальные красители (метиленовый синий), алциановый синий для окрашивания гликокаликса, световой микроскоп фирмы «Ьекг» (Германия).

Исследование электрофоретической подвижности изучаемых объектов проводили в стандартной камере Абрамсона [7]. С этой целью в электродные отсеки, которые имели платиновые электроды и пористые перегородки, изготовленные из фильтров Шамберлана, наливали 10% раствор №С1. На пористые перегородки со стороны клеточной суспензии наливали расплавленный 2% агар, приготовленный на физиологическом растворе (0,9% раствор 1ЧаС1), для предохранения от засорения пор фильтров Шамберлана частицами туши. После застывания агара в камеру помещали клеточную суспензию, приготовленную из эритроцитов или лейкозных клеток крови человека и соединенную с тушью и раствором хлористого натрия в концентрации 5%. Входы в камеру закрывали резиновыми пробками и через 5—10 мин (после успокоения суспензии) на электроды подавали напряжение. Расстояние между электродами составляло 150 мм, градиент Е в месте исследования электрофоретической подвижности клеток был равен

0,3 В/см. Объем электродных отсеков равен 6,5 мл, объем камеры, где проводилось измерение, 3,5 мл. Электрическое сопротивление заполненной камеры с электродными отсеками составляло 5000 Ом, подаваемое напряжение от универсального источника питания УИП-1 равнялось 50 В.

Электрофоретическую подвижность исследуемых объектов определяли по формуле:

и =

где О — диэлектрическая проницаемость, Е, — электрокинетический потенциал, г| — вязкость жидкости, и — электрофоретическая подвижность — скорость электрофореза частицы, Н — напряженность электрического поля.

Камера, в которой мы проводили исследования, отличалась от многочисленных используемых камер тем, что высота плоского капилляра в ней равнялась 100 мкм, в то время как обычно используется высота капилляра 600 мкм. Высота капилляра 100 мкм обусловлена изучением необычного объекта исследования: клетка с набухшим гликокаликсом в среде инкубации с частицами туши (ограниченная видимость объекта). С помощью секундомера и окуляр-микрометра определяли скорость движения клеток (частиц) в прямом и обратном горизонтальном направлениях.

M. V. Golovanov

ANALYSIS OF BIOPHYSICAL THEORY OF LIVING CELL ELECTROPHORESIS

Research Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors

The classical theory of electrophoresis teaches that electric charge is formed on a non-living particle only due to ion dissociation and adsorption with spontaneous generation of an adsorption, a double electric and a diffuse layers. Thickness of the double electric layer

The same concept is currently used to explain the process of generation of surface electric charge on cell plasmatic membranes.

The purpose of this study was to make a critical analysis of modern biophysical theory of living cell electrophoresis.

Materials and Methods. The following objects were used in this study: normal peripheral red and white blood cells, leukemic blood cells from patients with chronic lymphatic leukemia as well as physical objects such as quartz, latex, starch, drawing ink, polystyrene; vital dyes (methylene blue), alcian blue were used to stain glycocalyx. Microscopy was performed using a Leitz (Germany) light microscope.

Electrophoretic mobility of the subjects was studied in a standard Abramson’s chamber [7]. 10% NaCl solution was poured in its electrode sections with platinum electrodes and porous partitions made of Chamberland filters. Melted 2% agar in 0.9%) saline was transferred onto the porous partitions from the side of cell suspension to protect the filter pores from ink particles. After agar setting cell suspension made of human red blood cells or leukemic cells and mixed with ink and 5%. NaCl solution was placed in the chamber. The chamber inlets were closed with rubber stoppers. At 5-10 min (after suspension settling) voltage was applied to the electrodes. The inter-electrode distance was 150 mm, gradient E in the place of cell electrophoretic mobility reading was 0.3 V/cm. The electrode section and the chamber volumes were 6.5 ml and 3.5 ml, respectively. Electric resistance of the filled chamber with electrode sections was 5,000 Ohm, voltage delivered from a UIP-1 universal power source was 50 V.

Electrophoretic mobility of the tested object was calculated by formula:

U = HDi,l4ia\,

where D is the dielectric permeability; \ is the electrokinetic potential; r) is the liquid viscosity; U is the electrophoretic mobility, particle electrophoretic velocity; H is the electric intensity.

Unlike standard chambers with 600 mcm flat capillaries, our chamber was equipped with a 100 mcm flat capillary because the unusual tested objects, i.e. cells with swollen glycocalyx in ink-containing incubation medium, had limited visibility. Cell (particle) horizontal (direct and opposite) movement velocity was measured using a stop-watch and an ocular macrometer.

Results and Discussion. We found experimentally that there was a clear-cut border line dividing the classical theory of electrophoresis of nonliving particles from a new biophysical theory of electrophoresis of living cells.

According to the classical theory confirmed experimentally the DEL of a physical particle (quartz) reduces to zero (Z potential is zero) as the electrolyte solution ionic strength is increasing. As a result, the particle stops its movement in the external electric field [6].

In contrast, living cells continue to move with increase in the electrolyte ionic strength, i.e. Z potential is not zero. This observation contra-

Таблица Table

Движение взвешенных неживых частиц

Объект Вода дистиллированная Ионная сила электролита NaCI, моль/л

0,017 0,034 0,068 0,154 0,85 1,7 2,6

Толщина ДЭС (Angstrom) DEL thickness (Angstrom) [Debye P., Huchel E„ 1923] 26,0 10,2 7,1 5,0 3,2 2,1 1,9

Живые клетки R = 5—6 мкм Living cells R=5-6 mcm [Golovanov М., 1994] Набухание клеток Cell swelling + + + + +

Частицы кварца R = 1 —5 мкм Quartz particles R=1 -5 mcm [Derjaguin В. V., Duhin S. S., 1976; Golovanov М., 1982] + + + + - - - -

Конец действия классической теории электрофореза Classical theory of electrophoresis ends here ^ Начало действия биофизической теории электрофореза Biophysical theory of electrophoresis starts here

Object Distilled water Electrolyte NaCI ionic strength, mol/l

«+» — движение есть, «-» — движения нет. +, movement; -, no movement.

Результаты и обсуждение. Опытным путем установлено, что имеется четкая граница, на которой классическая теория электрофореза неживых частиц заканчивается и начинается действие новой биофизической теории электрофореза живых клеток.

Согласно классической теории, подтвержденной экспериментом, с повышением ионной силы раствора электролита, ДЭС физической частицы (кварца) уменьшается в размере и практически «схлопывается», г-потен-циал = 0. В результате этого частица прекращает свое движение во внешнем электрическом поле [6].

В то же время живые клетки при повышении ионной силы электролита продолжают свое движение, т. е. 2-потенциал * 0. Этот факт противоречит объяснению перемещения живых клеток во внешнем электрическом поле, исходя только из физико-химических процессов диссоциации и адсорбции ионов на поверхности частицы (табл. 1).

Такое экспериментальное поведение живых и неживых объектов привело нас к необходимости подробного анализа строения ДЭС на поверхности клетки, анализу процесса формирования адсорбционного слоя и слоя противоионов, функционирования селективного (гликокаликса) и диффузного слоев за пределами плазматической мембраны клетки, общей концепции биофизической теории электрофореза живых клеток.

Анализ теории

Общая концепция биофизической теории электрофореза живых клеток [8—10] сводится к следующим положениям:

1. ДЭС поверхности клеток представляет собой результат действия пассивных и активных процессов: ионизация молекул мембраны и перепое ионов из клетки через гликокаликс в межклеточную среду.

2. Слой потенциалопределяющих ионов формируется на поверхности плазматической мембраны и определяется направленной деятельностью клетки.

3. Слой противоионов динамически соответствует слою потенциалопределяющих ионов вследствие электрической активности ионогенных групп плазматической мембраны и молекул гликокаликса (селективный слой).

4. Величина электрического заряда на поверхности плазматической мембраны определяется уровнем метаболизма, активностью молекул, участвующих в формировании ДЭС живой клетки.

5. Селективный слой — набухающий гликокаликс (как депо рецепторов, молекулярных комплексов) функционирует как катионообменник, стабилизируя и сохраняя электрический заряд клетки.

6. Межклеточная среда как депо свободных ионов формирует диффузный слой, определяющий вместе с гликокаликсом электрическое взаимодействие клеток.

diets to the explanation of living cell movement in external electric field basing on the physico-chemical processes of ion dissociation and adsorption on particle surfaces (table 1).

This experimental behavior of living and non-living objects made us analyze in detail composition of the cell surface DEL, generation of the adsorption and antiion layers, functioning of the selective (glycocalyx) and diffuse layers beyond the cell plasmatic membrane as well as the concept of biophysical theory of living cell electrophoresis in general.

Analysis of the Theory

The concept of the biophysical theory of living cell electrophoresis [8-10] is based on the following principles:

1. The cell surface DEL is a result of active and passive processes, i.e. membrane molecule ionization and ion transfer from the cell through the glycocalyx to intercellular medium.

2. A potential-determining ion layer is generated on plasmatic membrane surface and depends on cell specific activity.

3. The antiion layer corresponds dynamically to the potential-determining ion layer due to the electric activity of plasmatic membrane and glycocalyx molecular ion-generation groups (selective layer).

4. Magnitude of electric charge on cell membrane surface depends on degree of metabolism and activity of molecules contributing to DEL generation on the living cell.

5. The selective layer, i.e. the swollen glycocalyx (as a depot of receptors and molecular complexes) fulfills the cation-exchange function: stabilizes and maintains the cell electric charge.

6. Intercellular medium as a free ion depot forms a diffuse layer that together with the glycocalyx controls cell electric interactions.

7. Changes in Z-potential mainly depend upon cell response to drugs, viruses, antigens and other substances or upon cell state, including activity, degree of differentiation or transformation (fig. 1).

Of much importance in the biophysical theory is the purposeful process of electric charge generation by cells which depends upon cellular metabolism.

The surface electric charge on living cells plays an important part in the organism life: it maintains the tissular and organic structure in compact, ready-to-operate state. The cellular and extracellular charges prevent dissociation of tissues or organs into individual cells as it happens in neoplastic disease, immune reactions, etc. The electric charge also provides functional interaction between cells, cell interaction with metabolites and other agents (viruses, microorganisms, etc.). The Z-potential stability cannot be explained only by uncontrolled ion dissociation and adsorption on plasmatic membranes.

В порядке дискуссии

Клетка

Cell

Плазматическая

мембрана

Plasmatic

membrane

Адсорбционнй слой Adsorption layer

Двойной электрический слой Double electric layer

Селективный слой Selective layer

Набухший гл и ко кал и кс Swollen glycocalyx

Диффузный слой Diffuse layer

Межклеточная

среда

Intercellular

medium

Рис. 1. Схема расположения адсорбционного, двойного, селективного и диффузного слоев на поверхности живой клетки.

Fig. 1. Diagram of the adsorption, selective and diffuse layers on living cell surface.

7. Изменение значения Z-пoтeнциaлa в основном зависит от реакции клетки на действие лекарств, вирусов, антигенов и других веществ или ее состояния, включая активность, степень дифференциации, трансформации (рис. I).

Существенным фактором в биофизической теории является целенаправленный процесс формирования клеткой электрического заряда, исходя из соответствующего уровня метаболизма клетки.

Это объясняется тем, что электрический заряд, расположенный на поверхности живых клеток, играет важную роль в жизни организма: он держит структуру тканей, органов в компактном, рабочем состоянии. Клетки своими зарядами в сообществе с зарядами в межклеточной среде не позволяют развалиться ткани, органу на отдельные клетки, как это происходит при нарушении межклеточных контактов при опухолевом процессе, иммунных реакциях и др. Электрический заряд обеспечивает также функциональное взаимодействие клеток между собой, с метаболитами и другими объектами (вирусами, микробами). Устойчивость величины г-потенциала невозможно обосновать только неуправляемыми процессами диссоциации и адсорбции ионов на поверхности плазматической мембраны.

Значение постоянной величины электрического заряда соответствующих клеток ткани, органа, организма можно соотнести с другими постоянными физиологическими параметрами организма: температура тела, pH периферической крови.

Анализ строения ДЭС живых клеток

Важнейшим понятием в явлении электрофореза — движении заряженных частиц под действием электрического поля — является понятие ДЭС на поверхности частицы.

Для живой клетки ДЭС формируется в результате двух процессов: пассивного и активного.

Пассивный процесс происходит за счет диссоциации ионогенных групп молекул поверхности плазматической мембраны в растворе электролита, активный процесс — за счет переноса ионов из цитоплазмы

Рис. 2. Периодическая структура лейкозных клеток крови (хронический лимфолейкоз), образованная из лейкоцитов, имеющих набухший гликокаликс около поверхности плазматической мембраны (световой микроскоп. Ув. х 100. Фон"— тушь).

Fig. 2. Periodical structure of leukemic blood cells (chronic lymphatic leukemia) formed of leukocytes having a swollen glycocalyx near plasmatic membrane surface.

Values of constant electric charges of certain cells of a tissue or an organ may be related to other constant physiological parameters, such as body temperature, peripheral blood pH, etc.

Analysis of Living Cell DEL Structure

The surface DEL concept is a key notion of electrophoresis, i.e. movement of charged particles in electric field.

The DEL on a living cell is formed as a result of an active and a passive processes.

The passive process involves dissociation of molecular ion-generation groups on membrane surface in electrolyte solutions. The active process is ion transfer from cytoplasm through plasmic membrane and glycocalyx into intercellular medium depending on living cell metabolism.

The DEL resulting from the passive process consists of an adsorption and an antiionic layers.

The adsorption layer consists of charges of molecular ionogenic groups on plasmatic membranes and depends on cell metabolism, membrane molecular composition and dissociation and adsorption of mobile ions. The antiionic layer is composed of free ionic charges located in the selective layer.

The DEL formation due to the active process is a many-step transfer of a charged particle (ion) from cytoplasm into intercellular medium through cell membranes. Here again it is cell vital activity that plays the leading role by determining functions of membrane and glycocalyx ion carriers .

Under electrokinetic effects the layer of water moleculcs adjacent to plasmatic membrane surface remains immobile while the next layers are mobile [2,3,5].

Analysis of Functioning of Glycocalyx Selective Layer

Glycocalyx regulates positive to negative ionic ratio near the DEL. It plays the role of cation-exchanger [1,4,9] and actively changes dielectric

сквозь плазматическую мембрану и гликокаликс в межклеточную среду, то есть благодаря метаболизму живой клетки.

ДЭС в случае пассивного процесса можно представить в виде двух взаимодействующих слоев: адсорбционного и соответствующего ему слоя противоионов.

Адсорбционный слой представлен зарядами ионогенных групп молекул плазматической мембраны и определяется метаболизмом клетки, молекулярной структурой плазматической мембраны, а также процессами диссоциации и адсорбции подвижных ионов. Слой противоионов представлен свободными зарядами ионов, локализованными в селективном слое.

В случае активного процесса формирование ДЭС можно представить в виде многоступенчатого переноса заряженной частицы (иона) из цитоплазмы в межклеточную среду через поверхность клетки. Ведущая роль в этом случае также принадлежит жизнедеятельности клетки, которая выражается в функциях переносчиков иопов, находящихся в плазматической мембране и гликокаликсе.

Слой молекул воды, непосредственно прилегающий к поверхности плазматической мембраны, при электрокинетических явлениях остается неподвижным, тогда как следующие слои подвижные [2, 3, 5].

Анализ функционирования селективного слоя гликокаликса

Фактором, регулирующим соотношение положительных и отрицательных ионов вблизи ДЭС, является гликокаликс, который выполняет в клетке функцию катионообменника [1, 4, 9] и активно изменяет такие параметры, как диэлектрическая проницаемость и вязкость жидкости в формуле (1).

Электролиты и другие вещества поступают в клетку из межклеточной среды и удаляются из нее путем пассивного и активного транспорта: пассивный — с помощью диффузии, а активный — с помощью электрохимических процессов, то есть процессов, связанных с переносом ионов.

Исходя из этого, мы полагаем, что электрический заряд на поверхности живой клетки формируется следующим образом.

Ионы, несущие электрический заряд, постоянно и направленно поставляются на поверхность клетки вследствие метаболитических процессов в клетке, когда переносчик на внутренней поверхности мембраны (или в самой мембране) захватывает из цитоплазмы от полианиона катионы и переносит их сквозь мембрану на внешнюю поверхность плазматической мембраны клетки.

Здесь с помощью катионообменника (гликокаликса как депо положительных ионов) катионы отщепляются, а к переносчику присоединяются более или менее энергетически активные катионы (ионы калия или водорода или другие), с которыми он движется снова к внутренней поверхности плазматической мембраны клетки.

Электрический заряд постоянно и направленно стекает с поверхности клетки вследствие динамического неравновесия зарядов в межклеточную среду с помощью гликокаликса, а на поверхности плазматической мембраны некоторое время остается отрицательный электрический заряд, который затем нейтрализуется положительным зарядом. Гликокаликс действует как донор-акцептор ионов, представляя собой объемный массив электрических зарядов обоих знаков (гигантские полианионы типа гиа-луроновой кислоты), в том случае, если клетка забирает необходимые ей ионы из межклеточной среды.

В реакции клетки на внешнее электрическое поле набухший в электролите гликокаликс электрически пассивен (электрически нейтрален) и перемещается вместе с клеткой как ее структурный элемент, отставая от клетки в своем движении.

Считается общепринятым положение, что ионогенные группы находятся на поверхности клеток и могут изменять свое положение, количество, структуру и это отражается на динамике электрического заряда.

Постоянный электрический заряд клетки формируется на поверхности плазматической мембраны, а ее рецепторы расположены в гликокаликсе, выполняя не только физиологические функции (реакции антиген — антитело, контакт с вирусами, бактериями), но и функции катионообменника.

Внешний примембранный слой — гликокаликс, динамически изменяя свой объем и как следствие стабилизируя количество ионов (катионов и анионов) в ДЭС на поверхности плазматической мембраны и в диффузном слое, первым принимает участие в контакте со своими и чужеродными клетками, молекулами, ионами и т. д., то есть гликокаликс определяет не только иммунологические, но и биологические процессы в самой клетке и на ее поверхности (рис. 2).

Анализ диффузного слоя

Функциональные особенности межклеточной среды способствуют формированию дисперсионной среды за пределами клеточной поверхности, то есть в пределах 10 мкм расстояния между клетками. В этом промежутке находятся: вода, метаболиты, элементы разрушенных клеток, ионы и др. Именно через этот важнейший слой и при его непосредственном участии происходит взаимодействие клеток друг с другом, с вирусами, микробами и т. д.

Данная статья выполнена при активном участии проф. J. Bauer, Institut Max-Planck f. biochemia, Martinsried, Germany.

permeability and liquid viscosity in formula (1).

Electrolytes and other substances penetrate into cells from intercellular medium and are evacuated from them by active (electrochemical) and passive (diffusion) transport.

Thus, generation of electric charge on living cell surface proceeds as follows.

Electric charge carrier ions are pushed continuously to the cell surface due to cellular metabolic processes, i.e. a carrier on the membrane internal surface (or inside the membrane) catches cytoplasmatic cations to transfers them through the membrane onto the membrane external surface.

Then the cations split off under the action of glycocalyx while more or less active cations (potassium or hydrogen ions) adhere to the carrier to be transported again to the membrane internal surface.

The electric charge continuously flows down from the cell surface into the intercellular medium due to charge dynamical dysbalance, though negative charge remains for some time on membrane surface to be further neutralized by positive charge. Glycocalyx acts as an ion donor-acceptor and contains a large amount of positive and negative charges (giant polyanions such as hyaluronic acid) if the cell takes ions from intercelular medium.

When a cell reacts to external electric field the swollen glycocalyx is electrically passive (neutral) and moves together with the cell as its structural element.

It is commonly adopted that the ionogenic groups are located on cell surface and may change their position, quantity, structure, with the changes influencing electric charge dynamics.

Constant electric charge is formed on cell membranes, their receptors are located in glycocalyx and fulfill both physiological (antigen-antibody reactions, interaction with viruses and bacteria) and cation-exchange functions.

The glycocalyx (an external layer adjacent to the membrane) changes in volume and thus stabilizes the ion (cation and anion) number in the cell surface and diffuse layer DEL; it is the first element to meet self and foreign cells, molecules, ions etc. Thus, the glycocalyx plays an active part in both physiological and biological processes on the cell surface and inside the cell (fig.2).

Analysis of the Diffuse Layer

Intercellular medium functional peculiarities influence disperse medium beyond cell surface, i.e. within 10 mcm of intercellular distance. This space contains water, metabolites, cell destruction remnants, ions etc. This layer plays the most important role in intercellular interactions, in cell interactions with viruses, microorganisms etc.

This study was performed with an active participation of Professor J.Bauer, Institut Max-Planck f. biochemia. Martinsried, Germany.

ЛИТЕРА ТУРА /REFERENCES

1. Голованов М. В., Дерягин Б. В. //Докл. АН СССР. — 1983. — Т. 272, № 2. — С. 479—480.

2. Голованов М. В. //Биофизика. — 1991. — Т. 36, № 3. — С. 463— 466.

3. Голованов М. В. //Коллоид, жури. — 1991. — Т. 53, № 3. — С. 449—452.

4. Голованов М. В., Дерягин Б. В. //Бюл. экспер. биол. — 1992. —

Ха 8. — С. 210—211.

5. Голованов М. В. И Биофизика. — 1995. — Т. 40, вып. 2. — С. 372—376.

6. Духип С. С., Дерягин Б. В. //Электрофорез. — М., 1976. — С. 332.

7. Abramson Н. A. I/}, exp. Med. — 1928. — N 47. — Р. 677.

8. Bauer J. (Ed.) The negative surface charge density of cells and their actual state of differentiation or activation, in Cell Electrophoresis. — Boca Raton, 1994. — P. 267—280.

9. Golovanov М. V. Electophoresis of cells at a physiologic high ionic strenght, in Cell Electrophoresis /Ed. J. Bauer. — Boca Raton,

1994.— P. 181—198.

10. Golovanov М. V., Bauer J. Herald of the Cancer Research Center of AMS ofRussia. — Moskow, 1997. — Vol. 3. — P. 19—24.

Поступила 16.01.98/ Submitted 16.01.98