СУХАЯ ФОРМА ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА - ПРОБИОТИКА ВЕТОЦИЛ

Полезная модель относится к биотехнологии, а именно к производству биопрепаратов-пробиотиков.
В настоящее время существует целый ряд биопрепаратов из бактерий рода Bacillus, подавляющих рост патогенных и условно-патогенных бактерий: биоспорин, бактиспорин, бактисубтил и др. Их терапевтическая эффективность определяется комплексным действием широкого набора метаболитов, которые способны продуцировать живые микробные клетки штаммов бактерий, входящих в состав препаратов.
Изучение механизма лечебно-профилактического действия препаратов-пробиотиков на организм человека и животных показывает, что бациллы обладают способностью проникать из желудочно-кишечного тракта (жкт) в кровь, а оттуда в очаг поражения, сохранять жизнеспособность, продуцировать антибиотики, протеолитические ферменты и иммуномодуляторы. Установлено, что после перорального приема, уже в первые минуты через слизистые ротоглотки, пищевода и желудка примерно 0,1% от общего числа бактерий проникают в паренхиматозные органы - бессимптомная транслокация микроорганизмов, она длится 6-8 часов после однократного приема препарата до элиминации микробных клеток из органов, во время которой и осуществляется воздействие препарата на организм (Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол.ж. 1992. - Т.54, N6. - С.82-92.).
Антагонистическое действие бацилл осуществляется за счет продукции различных по природе биологически-активных веществ: полипептидных антибиотиков, лизоцима, литических ферментов (Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов // Антибиотики и химиотерапия. - 1996. -Т.41, N10. - С.13-15).
Высокая ферментативная активность бацилл имеет положительное значение с
точки зрения обогащения желудочного секрета дополнительными, в том числе парадигестативными ферментами (Слабоспицкая А.Т., Пирог Т.П., Гринберг Т.А. и др. Влияние некоторых компонентов среды бактерий рода Bacillus на процессы синтеза экзополисахаридов // Контроль и управление биотехнологическими процессами: Тез. докл. Всесоюзн. конф. - Горький, 1985. - С. 33.; Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов // Микробиол. ж. -1990. -N2. - С. 9-14). Бациллы не формируют биопленок, поскольку их адгезивные свойства слабо выражены. Их активность осуществляется в просвете желудочно-кишечного тракта и связана прежде всего не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой, а с - высокой антагонистической активностью в отношении патогенных микроорганизмов, без антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры, что создает условия для бесконкурентного восстановления аутофлоры.
Известен способ получения препарата "Бактиспорин" на основе штамма Bacillus subtilis 3 Н (ГИСК N 248), включающий культивирование штамма в жидкой питательной среде, отделение биомассы от питательной среды ультрафильтрацией, концентрированно и лиофильное высушивание (Патент РФ №2067616, МПК С 12 N 1/20, опубл. 10.10.96).
Известен лечебно-профилактический биопрепарат "Бактиспорин" на основе антагонистически активного штамма В. subtilis 3H, предусматривающий получение биомассы штамма, смешивание ее с защитной средой (сахарозожелатиновой смесью или лактозой), ампулирование и лиофильное высушивание (Патент РФ №2130316, МПК А 61 К 35/74, опубл. 20.05.99 г.). Препарат применяют для лечения широкого круга заболеваний и перед употреблением ампулу вскрывают, сухую биомассу растворяют в небольшом количестве воды и используют перорально в виде раствора. Поскольку штамм, входящий в состав Бактиспорина, является строгим аэробом, то осуществлять свою жизнедеятельность он может только в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, где есть аэробные условия. Однако ампульная форма препарата "Бактиспорин" требует разведения водой перед применением, что снижает удобство употребления и ограничивает покупательский спрос. Кроме того, при
вскрытии ампулы требуется осторожность для предотвращения попадания ампульного стекла в препарат.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является таблетированный препарат-пробиотик, выполненный в виде дискообразного монолитного тела, содержащего биомассу на основе Bacillus subtilis, стабилизаторы на основе сахарожелатиновой среды или лактозы, отличающийся тем, что он дополнительно содержит глюконат кальция в количестве 1-10 мас.%, или сорбент и вспомогательные вещества. В качестве сорбента используют активированный уголь, карболонг, лактулозу, ацетилфталилцеллюлозу или гель фосфата алюминия. Биомасса бактерий и вспомогательные вещества в препарате находятся в соотношении (2:1)-(3:1). В качестве вспомогательных веществ используют стеарат кальция, тальк, и (или) крахмал, и (или) аэросил, глюкозу, сухое молоко и (или) метилцеллюлозу (патент РФ №2182009, МПК А 61 К 35/74, А 61 К 9/20, опубл. 2002 г.).
Недостатком препарата-прототипа является сложный многокомпонентный состав таблетированной формы препарата и дорогостоящая и энергозатратная технология его получения, связанная с суспензионным культивированием бактерий, их концентрированном и лиофильной сушкой.
Техническим результатом предлагаемой полезной модели является получение более простого и дешевого препарата в таблетированной, или капсулированной, или порошковой пакетированной форме с сохранением всех его лечебно-профилактических свойств.
6
Указанный технический результат достигается тем, что в сухой форме лечебно-профилактического препарата-пробиотика, состоящей из дозы биомассы спор бактерий рода Bacillus и сорбента, согласно полезной модели, сорбент состоит из природного цеолита, биомасса спор бактерий рода Bacillus имеет титр в конечном препарате не менее 10 кл/г, а сухая форма лечебно-профилактического препарата представляет собой таблетку, выполненную в виде монолитного дискообразного твердого тела, состоящего из смеси цеолита и биомассы спор бактерий рода Bacillus, или цилиндрическую пустотелую разъемную капсулу или пакет, заполненные порошком, состоящим из смеси цеолита и биомассы спор бактерий рода Bacillus.
Биомасса спор бактерий рода Bacillus содержит штамм бактерий Bacillus
subtilis ВКПМ В 7048, и/или штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7092, и/или штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038.
В качестве цеолита используют порошок минерала глауконит с размером частиц 0,01-0,1 мм.
Разъемная пустотелая капсула выполнена из материала плавящегося под действием температуры организма, например из желатина.
В таблетке, или капсуле, или порошковой пакетированной форме смесь штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7048. ВКПМ В 7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038, или смесь штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7048 и ВКПМ В 7092, или смесь штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ 7048 и Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038, или смесь штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038 содержатся в равных соотношениях.
Энтеросорбент на основе цеолитов применяется в медицине при многих патологических процессах. В частности, препарат нормализует функциональное состояние печени, беря на себя значительную часть ее антитоксической функции. Вступая в прямой контакт с кишечной стенкой и потенцируя регенеративные процессы, цеолит оказывает выраженное положительное действие при таких заболеваниях как колит, энтерит, энтероколит. При этом улучшаются функции нервно-мышечного аппарата кишечника и устраняются поносы и запоры. Цеолиты способны избирательно удалять из кишечника патогенную микрофлору, не затрагивая при этом нормальную микрофлору, что устраняет дисбактериоз.
Природные цеолиты специфически влияют на микроорганизмы рубца, желудка и кишечника. Они снижают процессы брожения и гниения в кишечнике. Бактерицидные эффекты природных цеолитов в пищеварительном тракте связывают с выбросом свободных радикалов кислорода.
2
2
3
В качестве цеолита может быть использован минерал глауконит, полученный с Карийского месторождения в Челябинской области путем измельчения его до фракции 0,01-0,1 мм. Название глауконит происходит от греческого "глаукос" -голубовато-зеленый. По решению Международного номенклатурного комитета глауконитом следует называть железистую диоктаэдрическую слюду. Содержание основных компонентов обычно находится в пределах,%: Si-47-50,5; А;lO-5-10;
2
3
2
2
2
FeО-15-22; FeO-2-4; MgO-3-4; CaO-0-0,8; NaO-0-0,5; KO-6-8; НО-7-9. Колебания состава связаны с изоморфными замещениями.
Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7048 относится к аэробам. Это грамположительная бактерия, образующая споры. Штамм размножается при 15-50°С. Оптимальный рост наблюдается при температуре 36-37°С. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7048 продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост и развитие грибков, стафилокков, стрептококков и синегнойной палочки.
Штамм бактерий Bacillus lichenifbrmis ВКПМ В 7038 относится к аэробам. Это грамположительная палочка, способная образовывать споры. Штамм бактерий Bacillus lichenifbrmis ВКПМ В 7038 продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост грибков, стафилокков, стрептококков и синегнойной палочки.
Рекомбинантный штамм бактерий Bacillus subilis ВКПМ В 7092 получен путем трансформации штамма Bacillus subtilis ВКПМ В 7048 рекомбинантной плазмидой ДНК рВМВ 5, содержащий ген альфа-2 интерферона. Полученный штамм IC-16 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ГНИЙ Генетика под номером ВКПМ В 7092. Плазмида рВМВ 5 способна реплицироваться в бациллах и содержит в своем составе ген альфа-2- интерферона человека, промотор для экспрессии этого гена, сайт посадки рибосом (SD-сайт) и сигнальный пептид альфа-амилазы В. amyloliquefaciens для секреции интерферона в культуральную среду, а также несущую устойчивость к канамицину.
Исследована антибиотическая активность производственных штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В 7048, ВКПМ В 7092 и Bacillus lichenifbrmis ВКПМ В 7038 по отношению друг к другу как составных частей комплексных препаратов. При этом можно сделать вывод, что антагонизм клеток Bacillus subtilis и Bacillus lichenifbrmis не является существенной помехой для их совместного использования в препаратах.
На фиг.1 изображена таблетированная форма препарата в разрезе. На фиг.2 представлена капсулированная форма препарата. На фиг.3 приведена схема пакета с порошковой формой препарата.
Таблетированная форма Ветацила выполнена в виде дискообразного монолитного тела 1 (фиг.1), распадающегося под действием влаги, органических кислот и температуры организма в желудочно-кишечном тракте. Масса тела 1 таблетки содержит следующие компоненты:
Пример 1
6
Смесь природного цеолита с биомассой спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ 7048 с титром не менее 10 кл/г.
Пример 2
6
Смесь природного цеолита с биомассой спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ 7048 и ВКПМ В 7092 в соотношении 1:1 с титром не менее 10 кл/г.
Пример 3
6
Смесь природного цеолита с биомассой спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ 7048, ВКПМ В 7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038 в соотношении 1:1:1 с титром не менее 10 кл/г.
В другом варианте (фиг.2) форма выполнения препарата представляет собой порошкообразную массу 2, которая помещена в желатиновую разъемную капсулу 3, распадающаяся под действием температуры. Порошкообразная масса 2 препарата содержит следующие компоненты:
Пример 4
6
Смесь природного цеолита (глауконита) с биомассой спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ 7048 и Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038 в соотношении 1:1 с титром не менее 10 кл/г.
Пример 5
6
Смесь природного цеолита (глауконита) с биомассой спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7092 с титром не менее 10 кл/г.
Пример 6
6
Смесь природного цеолита (глауконита) с биомассой спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ 7048, ВКПМ В 7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038 в соотношении 1:1:1 с титром не менее 10 кл/г/
В третьем варианте (фиг.3) форма выполнения препарата представляет собой порошкообразную массу 4, которая размещена в пластиковый или бумажный герметично закрытый пакет 5. Порошкообразная масса 4 препарата
содержит следующие компоненты (масс.%):
Пример 7
6
Смесь природного цеолита с биомассой спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В 7048 с титром не менее 10 кл/г.
Пример 8
6
Смесь природного цеолита с биомассой спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ 7048, ВКПМ В 7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ В 7038 в соотношении 1:1:1 с титром не менее 10 кл/г/
Для медицинских целей препарат ВЕТОЦИЛ целесообразно выпускать в виде таблеток или капсул. Применяют препарат внутрь по 2 таблетки или капсулы (1 г) утром и вечером до выздоровления.
Для ветеринарных целей препарат выпускают расфасованным по 2, 5, 10, 50, 100, 200, 500 и 1000 грамм в пакеты из пленки полиэтиленовой. По согласованию с потребителем возможны другие виды фасовки.
Пример 9. Фармакологические свойства препарата
Препарат ВЕТОЦИЛ обладает следующими свойствами:
1. Высокой антагонистической активностью по отношению к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, в том числе относительно возбудителей заболеваний - сальмонеллез, кокцидиоз, колибактериоз, дизентерия.
2. Обладает адсорбционным, ионообменным, детоксикационным и антистрессовым действием.
3. Способствует адсорбции экзо - и эндотоксинов и выведению их из организма.
4. Предупреждает развитие дисбактериозов.
5. Стимулирует рост и развитие молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.
6. Нормализует и активизирует окислительные процессы, клеточное дыхание и обмен минеральных веществ в организме.
7. Повышает буферную активность крови.
8 Повышает неспецифическую резистентность организма.
9. Снижает процессы брожения и гниения в кишечнике и повышает
усвояемость питательных веществ корма.
10. Регулирует содержание свободной жидкости в кишечнике и способствует формированию плотных каловых масс при диарейных состояниях.
11. При использовании рекомбинантного штамма ВКПМ 7092 препарат обладает противовирусным действием.
Пример 10. Способы применения препарата в ветеринарии.
1. ВЕТОЦИЛ применяют для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний с синдромом диареи, а также для профилактики иммунодефицитных состояний у телят, поросят и собак, стимуляции роста и развития молодняка сельскохозяйственных животных. В качестве детоксицирующего средства назначают при токсикозах экзо - и эндогенного происхождения.
2. Препарат назначают животным внутрь индивидуально или групповым методом с кормом (молоком, молозивом, кипяченой остуженной водой и др.) Растворы готовят перед употреблением.
3. С лечебной целью ВЕТОЦИЛ применяют 4 раза в сутки по 75-100 мг/кг массы ежедневно до выздоровления.
4. Для профилактики болезней органов пищеварения ВЕТОЦИЛ назначают животным сразу после рождения 1 раз в сутки 100 мг/кг массы в течение 15-30 дней.
5. Для стимуляции роста и развития дают животным в дозе 75 мг/кг массы 1 раз в сутки или в двое суток в течение 15-30 дней.
6. В рекомендуемых дозах ВЕТОЦИЛ не оказывает побочного действия и не вызывает осложнений.
Пример 11. Данные по исследованию лечебно-профилактических свойств препарата ВЕТОЦИЛ в ветеринарии
Для этого было сформировано 2 опытных и контрольная группы по 10 телят в каждой в возрасте 1-10 дней. Животные 1 подопытной группы получали ветоцил по 25 мг/кг живой массы 1 раз в день в течении месяца. Телятам 2 опытной группы ветоцил назначали по 100 мг/кг живой массы. Телята контрольной группы препарат не получали.
Результаты проведенных исследований
Под влиянием ветоцила-2 интенсивность роста и развития телят повышается. Через месяц после начала применения препарата у телят 1
подопытной группы среднесуточный привес составил 1060 гр., у телят 2 опытной группы - 939 грамм, у животных контрольной группы - 856 гр. Таким образом подопытные телята 1 группы по интенсивности роста превысили контрольную группу животных на 23.8%, второй опытной руппы - на 9.7%. Заболеваний у животных 1 опытной группы не регистрировалось. У 5 телят 2 опытной группы отмечали диспепсию, которая протекала в легкой форме и выздоровление животных наступало преимущественно на 4 - 5 день. Среднесуточный привес у переболевших телят составил - 232 гр., в связи с чем среднесуточный привес у подопытных телят 2 группы был ниже аналогов из 1 опытной группы. При применении ветоцил-2 в указанных дозировках побочных явлений не отмечали.
При гематологическом исследований крови телят до введения препарата не регистрировали характерных различий у животных опытных и контрольной групп (табл.1).
Таблица 1
Показатели лейкограммы телят до введения препаратов
Группа
Контрольная
1-я опытная
2-я опытная
Показатель
М±m
С<sub>v</sub>
M±m
С<sub>v</sub>
M±m
С<sub>v</sub>
Эр 10<sup>12</sup>/л
5,05±0,222
8,7
5,05±0,24
9,4
4,96±0,28
12,6
Лейк. 10<sup>9</sup>/л
6,93±0,21
6
7,35±0,646
17,5
6,92±0,424
13,6
Нb, г%
6,7±0,342
10,1
6,6±0,374
11,3
7,04±0,331
10,5
Нейтрофилы:
Ю.Н.,%
0,3±0,25
200
1,3±0,25
40
0,6±0,24
91,2
П.Н.,%
5,5±1,32
48,1
6,3±1,49
47,7
3,4±0,75
49,2
С.Н.,%
61±1,96
6,4
56±2,83
10,1
58,4±2,82
10,8
Эозин,%
2,3±1,11
98,5
2±0,71
70,7
2,6±0,98
84,2
Базофил,%
0,8±0,25
66,6
0,8±0,25
66,6
0,6±0,24
91,2
Моноцит,%
1,3±0,75
120
1,3±0,63
100,6
0,8±0,37
104,5
Лимфоцит,%
30,5±2,22
14,5
32,5±2,53
15,5
33,4±2,73
18,2
12
12
9
К 10 дню исследований у животных контрольной группы по сравнению с начальным периодом исследования концентрация гемоглобина увеличивалась с (6,7±0,342)г/% до (7,5±0,265)г/%, содержание эритроцитов с (5,05±0,222)10/л до (5,45±0,132)10/л, лейкоцитов с (6,93±0,21)10/л до (10,73±0,65)10%, лимфоцитов с (30,5±2,22)% до (44,5±2,1)% (табл.2).
Табдица 2
Показатели лейкограммы телят на 30-й день после введения препаратов
Группа
Контрольная
1-я опытная
2-я опытная
Показатель
М±m
С<sub>v</sub>
М±m
С<sub>v</sub>
M±m
С<sub>v</sub>
Эр 10<sup>12</sup>/л
5,45±0,132
4,8
5,47±0,111
4
5,32±0,185
7,7
Лейк. 10<sup>9</sup>/л
10,73±0,65
12,1
8,45±0,189
4,4
11,4±0,51
10
Нb, г%
7,5±0,265
7
7,1±0,367
10,3
7,32±0,287
8,7
Нейтрофилы:
Ю.Н.,%
0,5±0,29
115,4
0,3±0,25
200
0,2±0,2
223,6
П.Н.,%
5,8±0,85
29,7
2,8±0,25
18,1
3,2±0,37
26,1
С.н.,%
48±1,58
6,5
36,±2,84
15,5
45±2,45
12,1
Эозин,%
3,3±1,25
76,9
2,5±0,65
51,6
2,6±0,93
79,7
Базофил,%
0,5±0,29
115,4
0,5±0,29
115,4
0,2±0,2
223,6
Моноцит,%
1,5±0,65
86
1,5±0,29
38,4
1,4±0,24
39,1
Лимфоцит,%
44,5±2,1
9,4
51±1,96
7,6
47,8±1,24
5,8
Таким образом, как у телят опытной, так и контрольной группы количественные изменения гематологических показателей и всех популяций Т-лимфоцитов происходят в сторону их увеличения, что обусловлено возрастной спецификой. Однако у животных опытных групп происходили более выраженные их изменения, по сравнению с аналогами из контроля. Характер изменений изучаемых гематологических показателей крови зависел как от применяемого препарата, так и от длительности его назначения.
У телят первой опытной группы при исследовании крови через 10 дней после начала введения Ветоцил-2 увеличивалось количество лейкоцитов на 6,2%, по сравнению с аналогами из контроля.
У животных второй опытной в крови увеличивалось содержание гемоглобина на 4,7%, количество эритроцитов на 2,35%, лейкоцитов на 4,6% и лимфоцитов на 22,5%, по сравнению с аналогами из контрольной группы.
На 30 день исследования у телят первой опытной группы в крови регистрировалось увеличение лимфоцитов на 14,6%, во второй опытной группе увеличивалось количество лейкоцитов на 6,3% и лимфоцитов на 7,4%.
Заключение. Таким образом Ветоцил обладает ростостимулирующим действием, стимулирует клеточные факторы иммунитета и повышает устойчивость организма к действию неблагоприятных факторов внешней среды.
Телята хорошо переносят препарат, побочных явлений во время проведения опыта у них не отмечалось.