Живая пробиотическая вакцина, содержащая консервативные эпитопы вируса гриппа А (LAH+4M2e), для профилактики гриппозной инфекции
LIVE PROBIOTIC VACCINE CONTAINING CONSERVATIVE INFLUENZA A VIRUS EPITOPES (LAH+4M2e) FOR THE PREVENTION OF INFLUENZA INFECTION

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа. Возбудитель гриппа является одним из самых изученных вирусов на сегодняшний день, так как за ним пристально наблюдают ученые по всему миру. Однако, это до сих пор не приблизило человечество к управлению гриппозной инфекцией, что связано с невероятной изменчивостью ее возбудителя. Вирус гриппа относится к семейству Orthomyxoviridae и подразделяется на 4 типа: тип А - встречается у людей и животных, наиболее часто вызывает массовые вспышки болезни, тип В - человеческий, на его долю приходится менее 20% случаев болезни, тип С - человеческий, обнаруживается не более, чем в 5% случаев, тип D - встречается, в основном, у крупного рогатого скота и мелких жвачных животных.
Вирусы гриппа типа А, в свою очередь, подразделяются на подтипы в зависимости от белков наружной оболочки - гемагглютинина и нейраминидазы. Например, вирус типа А, несущий на себе гемагглютинин 1-го вида и нейраминидазу 1-го вида, кратко обозначается, как подтип H1N1. На сегодняшний день от человека выделены вирусы с антигенами H1, Н2, Н3 и N1, N2, остальные виды антигенов встречаются у возбудителей гриппа животных и птиц. На рубеже второго и третьего тысячелетий произошли кардинальные изменения эпидемического процесса при гриппе. Более 40 лет в мире наблюдается одновременная циркуляция двух подтипов вируса гриппа типа А. Кроме эпидемических штаммов вируса гриппа А подтипов А(H1N1) и A(H3N2), которые циркулируют в человеческой популяции, большую угрозу для людей представляют вирусы гриппа птиц, способные преодолевать межвидовой барьер - это высокопатогенные штаммы A(H5N1) и A(H7N9) [Bui С.et al. Transbound Emerg Dis. 12327(10):102-111, (2015)]. Заболевания, вызванные вирусами гриппа А, по распространению, показателям заболеваемости и смертности относятся к социально значимым для населения Российской Федерации. Ежегодно от гриппа умирает от 291 000 до 646 000 человек во всем мире.
В последние годы наблюдается усиление активности вирусов гриппа типа В. Однако, по сравнению с гриппом А грипп В обычно вызывает не такие массовые вспышки, и заболевание протекает легче. По-видимому, это связано с тем, что гемагглютинин и нейраминидаза вируса гриппа В подвергаются изменениям реже и в меньшей степени. Вирус гриппа С редко вызывает заболевание у людей, однако антитела к нему обнаруживаются часто. Очевидно, достаточно распространен бессимптомный грипп С. С каждым годом появляется все больше новых лекарственных препаратов, обладающих противовирусными и другими свойствами, способными предупреждать заболевания гриппом. Но, несмотря на значительные успехи медицинской науки, грипп по-прежнему остается мало контролируемой инфекцией, способной вызывать ежегодные эпидемии, а при появлении нового варианта возбудителя - и пандемии [Ерофеева М.К., Никоноров И.Ю., Terra medica nova. 2 (2009)].
Основные антигены вируса гриппа - это поверхностные гликопротеины - гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA). Постоянная эволюция этих антигенов приводит к почти ежегодному обновлению состава вакцин против гриппа. Отбор штаммов гриппа для предстоящего сезона - это очень сложный процесс, включающий скоординированный сбор и анализ огромного количества изолятов гриппа из многочисленных центров сотрудничества ВОЗ по всему миру. Однако довольно часто при циркуляции вируса возникает изменение антигенной структуры гемагглютинина, реже нейраминидазы, то есть вирус гриппа подвергается антигенному дрейфу и антигенно отличается от вакцинного штамма, что значительно снижает эффективность вакцинации [Belongia, Е.А., et al, J Infect Dis. 199(2): p.159-67, (2009); Erbelding, E.J., et al., J Infect Dis, 218 (3): p.347-3541, 2 (2018)]. Кроме того, при приготовлении вакцинного штамма могут возникнуть точечные мутации гена гемагглютинина, что также может снизить защитный потенциал вакцины [Belongia, E.A. and H.Q. McLean, Clin Infect Dis, 69(10): p.1817-1823, (2019)].
В настоящее время для специфической профилактики гриппа применяются инактивированные (убитые) или живые аттенуированные (ослабленные) гриппозные вакцины [Sridhar, S., K.А. Brokstad, and R.J. Сох, Vaccines (Basel), 3(2): 373-89, (2015)].
Инактивированные вакцины - цельновирионные вакцины из инактивированных цельных вирусов; расщепленные вакцины, или сплит-вакцины; субъединичные вакцины - вакцины, содержащие вирусные субъединицы [Rajao, D.S. and D.R. Perez, Front Microbiol, 9:123, (2018)]. Живые гриппозные вакцины, содержащие аттенуированные вирусы, полученные методом генетической реассортации, разработаны в России и США [Belshe, R.B., et al. N Engl J Med, 356(7): 685-96, (2007); Rudenko L. In proceedings of the international conference on options for the control of influenza VI, Toronto, Ontario, Canada. Jun 17-23, 122-124 (2007)]. Живые гриппозные вакцины обеспечивают не только общий гуморальный, но и местный иммунитет за счет синтеза секреторных IgA, вводятся естественным путем - распылением в нос, что в значительной мере облегчает их применение. Современные трехвалентные гриппозные вакцины включают штаммы вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. В последние несколько лет появились четырехвалентные гриппозные вакцины, включающие два вируса гриппа В - В/Виктория и В/Ямагата [Desheva YA, Smolonogina ТА, Doroshenko ЕМ, Rudenko LG. VoprVirusol, 61(1): 16-20, (2016)].
Однако такие классические гриппозные вакцины обычно индуцируют нейтрализующие антитела, нацеленные на иммунодоминантные, но сильно вариабельные участки глобулярного головного домена молекулы НА, в результате чего дрейфовый вариант вируса может легко уйти от действия этих антител [Petrie, J.G., et al, Clin Infect Dis. 65(10): p.1644-1651, (2017); Yamayoshi, S. and Y. Kawaoka, Nat Med,. 25(2): p.212-220, (2019)].
В связи с этим в последние десятилетия во всем мире ведутся работы по созданию универсальной вакцины против гриппа, то есть вакцины с широким спектром действия, способной обеспечить долговременную защиту не только от дрейфовых вариантов вирусов гриппа А одного подтипа, но и от вирусов других подтипов.
Одним из подходов к расширению спектра защитного действия гриппозных вакцин является усиление индукции перекрестно реагирующих факторов иммунного ответа, нацеленных на высоко консервативные антигены, присутствующие в вирусах гриппа различных подтипов [Krammer, F., Biotechnol J, 10(5): p.690-701, (2015); Krammer, F. and P. Palese, Nat Rev DrugDiscov, 14(3): p.167-82, (2015)].
Одним из альтернативных подходов к созданию вакцин против гриппа является встраивание консервативных последовательностей вирусных белков в пробиотические векторы. То есть, альтернативой использованию химических адъювантов для вакцинации является применение так называемых живых вакцин на основе пробиотиков. Живые вакцины применяют, как правило, однократно, вводят подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины перорально и ингаляционно. Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ.
Пробиотики - препараты, оказывающие общее благотворное влияние на организм человека (чаще всего молочнокислые бактерии). Установлено, что некоторые пробиотики являются эффективными неспецифическими стимуляторами выработки специфических иммуноглобулинов против различных инфекций [Vintini Е.О., Medina M.S., ВМС Immunol. 12: 46 (2011), Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Microb. Cell. Fact. 10: 17-24 (2011)]. Пробиотики стали использоваться в качестве векторов, в часть из которых успешно внесены плазмидные конструкции, обеспечивающие экспрессию антигенов патогенных бактерий [ME Y, Luo Y., Huang X., SongF., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012); De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. Et al. BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].
Персистенция подобных вариантов пробиотиков в организме способна не только стимулировать выработку протективных иммуноглобулинов, специфичных в отношении целевых антигенов возбудителя, но и обеспечить благоприятный фон для борьбы с инфекцией за счет усиления защитных реакций врожденного иммунитета.
Пробиотические микроорганизмы рассматриваются в настоящее время как хорошая основа для получения рекомбинантных живых вакцин, экспрессирующих вакцинные антигены возбудителей актуальных инфекций [Vintini Е.О., Medina M.S., ВМС Immunol., 12: 46 (2011); Bermudez-Hurnarun L.G., KharratP., ChatelJ.M., Microb. Cell. Fact. 10: 17-24 (2011); ME Y, Luo Y, Huang X., Song F., Liu G. Microbiology, 158: 498-504 (2012), De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. et al BMC Microbiol. 12: 299 (2011); Lei H. et al Virology. T. 476: 189-195 (2015)].
В 2015 г. Хан Л. со своими коллегами создали химерную конструкцию на основе бактерии Lactococcus lactis, содержащую на своей поверхности NA вируса гриппа А, и показали, что она способна защищать мышей от инфекции вирусами гриппа [Lei Н et al. Virology. Т. 476: 189-195, (2015)]. Таким образом, они показали, что такая химерная конструкция может быть кандидатом для создания универсальной противогриппозной вакцины.
Описано создание живой вакцины на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiae (СГВ). На основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 сконструирована первая генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка патогенного СГВ. [Гупалова Т.В., с соавт., 2013].
Запатентован подход, основанный на введении bac гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК в области кодирования белков пилей пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 с последующей экспрессией белка Вас в пилях. Пили энтерококков выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство бактериальных белков-антигенов. Пили состоят из белковых мономеров, способных к агрегации. За счет этого процесса может увеличиваться доза чужеродного антигена, встроенного в белок пилей. Последнее должно способствовать увеличению титров антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ.
Принцип введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 интересен тем, что рекомбинантный белок экспрессируется не в цитоплазме, а на поверхности бактерии [Суворов А.Н., с соавт. патент №RU 2640250].
Штамм Enterococcus faecium L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [Yermolenko Е., Suvorov А., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [Tarasova Е., et. al, 2010]. Осуществлено физическое картирование штамма Enterococcus faecium L3 [Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potencial for human health, 104-112, (2011)]. В экспериментах на здоровых самках мышей показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма Enterococcus faecium L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [Суворов А., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)] и способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном S.agalactiae и Staphylococcus aureus [Tarasova Е., Yermolenko Е., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)].
В штамме Enterococcus faecium L3, как и у других грамположительных бактерий, имеются пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 μm и диаметром 2-10nm [Telford JL, Barocchi MA, Margarit I et al. Nature Reviews Microbiology 4: 509-519, (2006)]. Это длинные белок-подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [Camille Danne, Shaynoor Dramsi.
Research in Microbiology, 163: 645-658, (2012)]. Принцип модификации пилей энтерококков вакцинными антигенами является идеальным подходом при создании эффективных живых вакцин благодаря экспозиции целевого антигена на поверхности энтерококка.
Настоящее исследование представляет собой интеграцию участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент вируса гриппа, в структуру хромосомной ДНК энтерококка. При этом задача генетической части работы состояла в осуществлении интеграции гетерологичного участка ДНК в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF.
В данном исследовании в качестве бактерии-реципиента использовался хорошо изученный пробиотический штамм Enterococcus faecium L3.
Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях, описанный в этом патенте, был использован для создания живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie [Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Кулешевич Е.В., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А, Патент №2701733.(2019)].
Авторами данного изобретения на основе штамма пробиотика сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена pspf патогенного Streptococcus pneumoniae. Интраназальное введение вакцины Enterococcus faecium L3-PSPF+ стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной пневмококковой инфекции у мышей линии СВА было показано, что трехкратная интраназальная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной пневмококковой инфекции. Эта живая вакцина принята в качестве прототипа заявляемого изобретения.
В работе использовался адаптированный к мышам штамм пандемического вируса гриппа A/California/7/2009 (H1N1) (Са109 МА).
Внеклеточный домен матриксного белка 2 (М2е) и длинная альфа-спираль (long alpha helix, LAH) из стеблевого домена молекулы НА вируса гриппа являются одними из наиболее консервативных антигенов вируса гриппа [Lu, I.N., et al, PLoS One, 13(9): p.e0204776. (2018); Kolpe, A., et al., 158: p., 244-254, (2018); Zheng, D., et al, Vaccine, 34(51): p.6464-64718-10, (2016)]. Однако эти антигены сами по себе являются слабыми иммуногенами из-за их небольшого размера (LAH составляет всего 72 а.а. М2е - 23 а.а.).
Многими научными группами используются различные носители для увеличения презентации данного участка иммунной системе. Показано, что создание вирусоподобных частиц с использованием корового фрагмента вируса гепатита В (LAH-HBc) привело к усилению специфического иммунного ответа к LAH белку и полностью защитило мышей от различных гетерологичных вирусов (H7N9, H3N2 and H1N1) [Zheng D., Chen S., Qu D., Chen J., WangF., Zhang R. and Chen Z. Vaccine 34(51):6464-6471, (2016).
Также многообещающие данные были получены в результате использования в качестве носителя гемоцианина лимфы улитки (KLH). И такой прототип (LAH-KLH) также обеспечил защиту против гетерологичного челлендж вируса [Wang Т.Т., Tan G.S., Hai R., Pica N., Ngai L., Ekiert D.C., Wilson I.A., Garcia-Sastre A., Moran T.M. and Palese P. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107(44):18979-18984, (2010)].
Были разработаны различные стратегии для индукции более мощного иммунного ответа с более широкой реактивностью при соответствующей презентации целевых консервативных белков вируса гриппа иммунной системе хозяина [Mezhenskaya, D., I. Isakova-Sivak, and L. Rudenko. J Biomed Sci,. 26(1): p.76, (2019); Zhang, H, et al. 6(5): p.1974-91, (2014); Jang, Y.H. and B.L. Seong, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 9, (2019).
Задачей настоящего изобретения явилось создание живой вакцины на основе биологически активного штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в структуру его пилей фрагмента гена, кодирующего консервативный участок молекулы гемагглютинина (LAH - long alpha helix от штамма H1N1pdm09) и четыре тандемных повтора эктодомена М2 белка вируса гриппа A. LAH является консервативным участком второй субъединицы молекулы гемагглютинина (аминокислотные остатки 59-130) -большая альфа-спираль, к которой вырабатываются кросс-реактивные антитела. Эктодомен М2 белка является консервативным среди всех вирусов гриппа А, однако он слабо иммуногенен ввиду своего маленького размера (23 аминокислоты) и экранирующего действия других более крупных вирусных белков. Для увеличения иммуногенности этого участка используют разные стратегии. Мы присоединили четыре тандемных повтора М2е белка к LAH домену молекулы гемагглютинина вируса гриппа.
Задача решена путем введения единой ДНК, содержащей фрагменты гена LAH и гена 4×М2е вируса гриппа, соединенные между собой гибким линкером, в хромосомную ДНК пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 для экспрессии в пилях, для чего осуществляли следующую последовательность действий:
а) получение единой ДНК, содержащей фрагменты гена lah и четырех копий гена т2е вируса гриппа;
б) получение слитого гена entF- (lah+4m2e) и его клонирование;
в) выявление бактериальных клонов, экспрессирущих ген слитого белка LAH+4М2е в пилях;
в) пероральная вакцинация мышей живой пробиотической вакциной;
г) определение LAH- и М2е-специфических антител в сыворотках крови;
д) исследование протективной эффективности вакцинации живой пробиотической вакциной в отношении летальной гриппозной инфекции
Авторами заявляемого изобретения на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена lah+4m2e. Пероральное введение вакцины Enterococcus faecium L3-(LAH+4M2e) стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной гриппозной инфекции у мышей было показано, что трехкратная пероральная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной гриппозной инфекции.
Конструирование живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 за счет включения в его пили антигена LAH+4M2e позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула. Созданная живая вакцина против вируса гриппа проявила выраженные иммуногенный и протективный эффекты.
Для получения слитого гена entF-(lah+4m2e) и его клонирования были сконструированы уникальные праймеры, представленные в таблице.
Подчеркнутые звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции.
Для получения необходимой конструкции lah+4m2e была взяты две плазмиды, одна из которых несла полноразмерный ген гемагглютинина (НА) штамма A/California/07/09 (H1N1), а другая - кассету из 4-х эпитопов М2е различной природы (человек, свинья, птица). На первом этапе исследования были проведены параллельные ПЦР с использованием специфических праймеров, которые были подобраны так, чтобы большая часть олигонуклеотидной последовательности была полностью комплементарна участку ДНК плазмиды, а другая - несла бы в себе участок перекрывания, одинаковый для обеих плазмид. В результате были получены два фрагмента ДНК, соответствующие lah и 4 т2е.
Далее с полученными участками была проведена дополнительная перекрывающая ПЦР, в результате которой был получен амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий фрагменты lah и 4m2е соединенные между собой гибким линкером (фиг. 1).
Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2, используя Clone JET™ PCR Cloning Kit (Fermentas). В результате клонирования было получено 17 клонов, из которых были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R.
11 трансформантов дали положительный ответ.Из одного из них была выделена плазмидная ДНК и обозначена, как pJET1.2-(lah+m2e). Наличие в ней нужной вставки было подтверждено реакцией гидролиза ферментами NdeI и EcoRI, сайты рестрикции которых были заложены в праймеры LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Она была переклонирована из плазмиды pJET1.2 в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf представляющая собой ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf описанная в предыдущей заявке на патент №2018144657 «Создание живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumoniae», (2018)], была использована для настоящей конструкции. Из плазмидной ДНК pentF-pspf нужно было удалить вставку гена пневмококка pspf и заменить ее на вставку гена lah+4m2e. Для этого плазмидную ДНК pentF-pspf гидролизовали ферментами NdeI и EcoRI, сайты для которых ограничивают последовательность гена pspf (фиг. 2). Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.
Фрагменты ДНК pJET1.2-(lah+4m2e) и pentF-pspf после гидролиза ферментами NdeI и EcoRI выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), дотировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина.
Из полученных 17 клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Три трансформанта дали положительный ответ. Из двух из них были выделены плазмиды, которые содержали ожидаемую вставку. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdeI и EcoRI (фиг. 3).
Таким образом, в результате клонирования была получена плазмида pentF-(lah+4m2e) с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.
В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой pentF-(lah+m2e) было получено 15 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали все трансформанты (фиг. 4).
Из них выбрали один и обозначили его как L3-(LAH+4M2e). Была проведена амплификация ДНК, выделенной из этого клона, с праймерами В1 и LAH+4M2e-R для проведения секвенирования, чтобы подтвердить интеграцию плазмидной ДНК pentF-(lah+m2e) в хромосомную ДНК энтерококка (фиг. 5).
Клон энтерококков L3-(LAH+4M2e), экспрессирующий ген LAH+4M2e белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.
Вакцинацию выбранным клоном L3-(LAH+4M2e), проводили перорально путем кормления мышей.
Мышей разделили на две группы. Первой группе мышей с помощью адаптера в пищевод вводили 5×10*9 КОЕ пробиотика Enterococcus faecium L3 в объеме 300 мкл. Второй группе в том же режиме вводили живую пробиотическую вакцину Enterococcus faecium L3-(LAH+4M2e). Курс вакцинации состоял в ежедневном введении бактерий в течение трех дней подряд. Курс вакцинации повторяли три раза с интервалом в две недели.
Через три недели после последней вакцинации per os двенадцать мышей из каждой группы были интраназально инфицированы 4,0 logl0EID50 адаптированного к мышам штамма A/California/7/09 (Са109 MA) в объеме 50 мкл. Эта доза соответствовала 10 50% мышиным летальным дозам (LD50). Снижение массы тела и выживаемость инфицированных мышей наблюдали ежедневно в течение 14 дней. В дополнение к мышам, которые были найдены мертвыми, мыши с потерей массы тела >30% были гуманно усыплены и зарегистрированы как мертвые. Кроме того, на 6-е сутки от каждой контрольной группы у четырех мышей забирали ткани легкого для оценки инфекционных титров вируса. Ткани легкого гомогенизировали в 1 мл стерильного PBS с помощью автоматического гомогенизатора, а осветленные супернатанты использовали для определения титра вируса методом предельных разведений в развивающихся куриных эмбрионах.
Трех последовательных процедур кормления было достаточно, чтобы индуцировать обнаруживаемые уровни М2е-специфичных IgG антител в сыворотках крови у мышей: титры антител в группе вакцины L3-(LAH+4M2e) достигали значения 1:80, в то время как в контрольной группе повышения антител не наблюдалось (фиг. 6). Характерно, что титры сывороточных IgG - антител, связывающих белок LAH, незначительно различались в контроле и вакцинной группе (фиг. 7). Это может быть связано с наличием потенциальной перекрестной реактивности между белками Enterococcus faecium L3 и LAH.
Вакцинированных per os мышей заражали высокой дозой вируса гриппа Ca109 МА и наблюдали в течение следующих 14 дней. Мыши, вакцинированные L3-(LAH+4M2e), в процессе инфекции продемонстрировали менее выраженную потерю веса по сравнению с контрольной группой. Животные из группы L3-(LAH+4M2e) выздоравливали быстрее и имели значительно меньшую смертность, чем контрольная группа (фиг. 8 А, Б).
Однако через шесть дней после заражения не было отмечено достоверного снижения титра вируса в легких у вакцинированных групп по сравнению с контролем. Возможно, этот результат объясняется не нейтрализующей природой М2е-антител и наличием высокой перекрестной реактивности L3 с самим белком LAH.
Пример 1. Получение слитого гена entF-(lah+4m2e) и его клонирование.
Для получения необходимой конструкции lah+4m2e была взяты две плазмиды, одна из которых несла полноразмерный ген гемагглютинина (НА) штамма A/California/07/09 (H1N1), а другая - кассету из 4-х эпитопов М2е различной природы (человек, свинья, птица). На первом этапе исследования были проведены параллельные ПЦР с использованием специфических праймеров, которые были подобраны так, чтобы большая часть олигонуклеотидной последовательности была полностью комплементарна участку ДНК плазмиды, а другая - несла бы в себе участок перекрывания, одинаковый для обеих плазмид. В результате были получены два фрагмента ДНК, соответствующие lah и 4m2е.
Далее с полученными участками была проведена дополнительная перекрывающая ПЦР, в результате которой был получен амплифицированный фрагмент ДНК, содержащий фрагменты lah и 4m2е, соединенные между собой гибким линкером (фиг. 1).
Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК осуществляли с использованием плазмиды pJET1.2, используя Clone JET™ PCR Cloning Kit (Fermentas). В результате клонирования было получено 17 клонов, из которых были выделены ДНК. которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R.
Положительный ответ дали 11 трансформантов. Из одного из них была выделена плазмидная ДНК и обозначена как pJET1.2-(lah+m2e). Наличие в ней нужной вставки было подтверждено реакцией гидролиза ферментами NdeI и EcoRI, сайты рестрикции которых были заложены в праймеры LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Она была переклонирована из плазмиды pJET1.2 в суицидную плазмиду pT7ERMB с геном устойчивости к эритромицину.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pentF-pspf, представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика Enterococcus faecium L3 и фрагмента гена pspf описанная в предыдущей заявке на патент №2018144657 «Создание живой вакцины на основе штамма пробиотиков Enterococcus faecium L3 для профилактики инфекции, вызванной Streptococcus pneumonie», (2018) была использована для создания слитого гена entF-(lah+m2e). Для этого из плазмидной ДНК pentF-pspf вырезали вставку гена пневмококка pspf, проведя гидролиз плазмидной ДНК pentF-pspf ферментами NdEI и EcoRI (фиг.2). Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования. На фиг. 1 показаны этапы получения конструкции, содержащей LAH+4М2е, где А и Б - проведение ПЦР со специфическими праймерами; В - полученные фрагменты, соответствующие фрагментам LAH и 4m2е; Г - получение единой ДНК, содержащей участки LAH и 4М2е, соединенные между собой гибким линкером.
На фиг. 2 приведена электрофореграмма рестрицированной плазмидной ДНК pentF-pspf ферментами NdEI и EcoRI, где цифрами обозначены:
1 - плазмида pentF-pspf - исходная;
2 - плазмида pentF-pspf рестрицированная;
3-100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
Фрагменты ДНК pSET1.2-(lah+m2e) и pentF-pspf после гидролиза ферментами NdEI и EcoRI выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему E.coli DH5a. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина.
Из полученных 17 клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Три трансформанта дали положительный ответ.Из одной из них были выделена плазмида и обозначена, как pentF-(lah+m2e), которая содержала ожидаемую вставку. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI. На фиг. 3. представлена электрофореграмма рестрицированной плазмиды NdEI и EcoRI, где 1 -плазмида pentF- (lah+m2e), 2-100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар). Таким образом, в результате клонирования была получена плазмида pentF-(lah+4m2e) с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину
Пример 2. Электропорация энтерококков.
Для электропорации энтерококков культуру Enterococcus faecium L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (ТНВ) («HiMedia», Индия) и выращивали в течение ночи при 37°С, затем пересевали в 50 мл бульона ТНВ 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности при длине волны 650 нм 0.3. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерина при температуре 40°С, полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали и конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разлили по 50 мкл в пробирки и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В. Во льду к клеткам добавили ДНК (полученную интегративную pentF- (lah+4m2e) плазмиду, 300 нг). Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл ТНВ, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 10 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа.
В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой pentF-(lah+m2e) было получено 15 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами. LAH+4M2e-F и LAH+4M2e-R. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали все трансформанты, как показано на фиг. 4, где представлена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов, а именно: 1 - 15 - продукты ПЦР ДНК из полученных клонов; 16 - 100 п. н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар); 17 - продукт ПЦР плазмидной ДНК pentF-{lah+4m2e).
Из них выбрали один и обозначили его как L3-(LAH+4M2e). Была проведена амплификация ДНК, выделенной из этого клона с праймерами В1 и LAH+4M2e-R для проведения секвенирования для подтверждения интеграции плазмидной ДНК pentF-(lah+4m2e) в хромосомную ДНК энтерококка. На фиг. 5 представлена нуклеотидная последовательность, показывающая интеграцию плазмидной ДНК pentF-(lah+m2e) в хромосомную ДНК энтерококка.
Жирным шрифтом выделены последовательности праймеров В1 и LAH+4M2e-R. Этот клон энтерококков, экспрессирующий ген LAH+4M2e белка, L3- (LAH+4M2e), выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.
Пример 3. Анализ иммуногенной активности живой пробиотической вакцины
9
Мышей разделили на две группы. Первой группе мышей с помощью адаптера в пищевод вводили 5×10 КОЕ пробиотика Enterococcus faecium L3 в объеме 300 мкл. Второй группе в том же режиме вводили живую пробиотическую вакцину Enterococcus faecium L3 (LAH+4M2e). Курс вакцинации состоял в ежедневном введении бактерий в течение трех дней подряд. Курс вакцинации повторяли три раза с интервалом в две недели.
После проведения трех курсов вакцинации per os в крови было достоверно зарегистрировано накопление сывороточных IgG антител против М2е белка у мышей. Титры антител в группе вакцины L3-(LAH+4M2e) достигали 1: 80, в то время как в контрольной группе повышения антител не наблюдалось (фиг. 6А). На фиг. 6 представлен иммунный ответ к антигену вируса гриппа в иммуноферментном анализе (уровни сывороточных IgG к М2е белку).
Установлено, что титры сывороточных IgG антител, связывающих белок LAH, незначительно различались в контрольной и исследуемой группе (фиг. 7). Это может быть связано с наличием в составе Enterococcus faecium L3 белков, антигенно сходных с LAH, что может являться причиной перекрестной реактивности антител. На фиг. 7 представлен иммунный ответ к антигену вируса гриппа в иммуноферментном анализе (уровни сывороточных IgG к LAH белку).
Пример 4. Анализ протективной эффективности живой пробиотической вакцины.
Вакцинированных per os мышей заражали высокой дозой вируса гриппа Са109 МА и наблюдали в течение следующих 14 дней. Мыши, вакцинированные L3-(LAH+4M2e), в процессе инфекции продемонстрировали менее выраженную потерю веса по сравнению с контрольной группой. Животные из группы L3-(LAH+4M2e) выздоравливали быстрее и имели значительно меньшую смертность, чем контрольная группа, как показано на фиг. 8, где (А) - потеря веса и (Б) - выживаемость мышей после заражения вирусом Ca109 МА).
Однако, через шесть дней после заражения не было отмечено достоверного снижения титра вируса в легких у вакцинированных групп по сравнению с контролем. Возможно, этот результат объясняется не нейтрализующей природой М2е-антител и наличием высокой перекрестной реактивности поверхностных белков L3 с вакцинным белком LAH вируса гриппа.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ФГБНУ "ИЭМ"
<120>  Живая пробиотическая вакцина, содержащая консервативные эпитопы вируса
гриппа А (LAH+4M2e), для профилактики гриппозной инфекции
<140>
<141>
<150>
<151>
<160>  2
<170>
<210>  1
<211>  1674
<212>  Нуклеотидная последовательность
<213>  Искусственная последовательность
<220>
LAH+4M2e
<223>  Нуклеотидная последовательность () вируса гриппа А,
Escherichia coli
экспрессированная в системе
<400>  1
atgagagcag ctggtattga gttgaatgat acatttctat ctatttacag tttaaatgga   60
cagtatcagc aacgtgtgtc ttggtataat gacaataatg aatctgtcgg tgaacgtaat  120
attgatatga gagaatttgt tgggtatgaa aaaatgggta gcttacctta ttttgtcaca  180
acagatacag catgtgcaga atacaaagct cctgcgttat caacaaacaa tttaacttca  240
aaagtagtgg gaggacgtgc agaaaaggct tatagctcga atgatcattt caccgatgtt  300
gtaggagctg atacttatca cagaagtggt gtaacgtata cgcttcaagg cgcttcccca  360
acattcatga ttggcgcaaa tacgaatagt atgatgttta gctttgatac tgcattgcta  420
tggacaccac aaccatcgaa gcctacaaaa gaagtgttta acaaagctaa tactgaagag  480
gcagcacaca atattgacaa aaaagtgatt ccacaaggat cagatgttta ctatcatatt  540
catcaaaagt ttgatgcatt aacagtcaac acaatgaaca aatacaaatc atttaaaatc  600
actgatacct ttgacagcaa aaattttgat atggtatcgg atgggaaaaa ctatgatggc  660
gcattgcata tgaatacaca gttcacagca gtaggtaaag agttcaacca cctggaaaaa  720
agaatagaga atttaaataa aaaagttgat gatggtttcc tggacatttg gacttacaat  780
gccgaactgt tggttctatt ggaaaatgaa agaactttgg actaccacga ttcaaatgtg  840
aagaacttat atgaaaaggt aagaagccag ctaaaaaaca atgccgaatt cgtcgacagc  900
cttctaaccg aggtcgaaac acctatcaga aacgaatggg ggtccagatc caacgattca  960
agtgacgctg ctgcaggtgg agcagctagc cttctaaccg aggtcgaaac acctatcaga 1020
aacgaatggg ggtccagatc caacgattca agtgacgctg ctgcaccagg agcagctagt 1080
cttctaaccg aggtcgaaac gcctaccaga agcgaatggg agtccagatc cagcgattca 1140
agtgatgctg ctgcaggtgg agcagctagt cttctaaccg aggtcgaaac gcctaccaga 1200
aacgaatggg agtcgcgctc gtctgacagt tcagatgaat tctacgaaaa aaacctgaaa 1260
gaatacaccg acaagctgga taaactcgag aaaggttctg cgcgagtgat agatatgagt 1320
acaggaaaag atattacttc agaaggtaca ctaacctatg atagcaattt aagaacgctg 1380
aaatgggaag cttccgctga tttcttaagt aaaaatcttt tagatggacg agaaattcaa 1440
ctgatattta cagctaaaac tccactacag tcagaaaaaa atattgataa ccaagccgta 1500
gcagcagtag agaatgtttc taataaaacg aatgttgtaa caattggtgt tgatcctaac 1560
ttaccacaag tcattgttcc tagaacaggt tctacacatt tagtaacaat tttagtggtt 1620
agcttagtat tacttgtgtt agctactctt agttatgtgg ctctgaagtt caat       1674
<210>  2
<211>  558
<212>  Аминокислотная последовательность
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гибридного белка LAH+4M2e
<400>  2
Met  Arg  Ala  Ala  Gly  Ile  Glu  Leu  Asn  Asp  Thr  Phe  Leu  Ser  Ile  Tyr
5                       10                       15
Ser  Leu  Asn  Gly  Gln  Tyr  Gln  Gln  Arg  Val  Ser  Trp  Tyr  Asn  Asp  Asn
20                       25                       30
Asn  Glu  Ser  Val  Gly  Glu  Arg  Asn  Ile  Asp  Met  Arg  Glu  Phe  Val  Gly
35                       40                       45
Tyr  Glu  Lys  Met  Gly  Ser  Leu  Pro  Tyr  Phe  Val  Thr  Thr  Asp  Thr  Ala
50                       55                       60
Cys  Ala  Glu  Tyr  Lys  Ala  Pro  Ala  Leu  Ser  Thr  Asn  Asn  Leu  Thr  Ser
65                       70                       75                       80
Lys  Val  Val  Gly  Gly  Arg  Ala  Glu  Lys  Ala  Tyr  Ser  Ser  Asn  Asp  His
85                       90                       95
Phe  Thr  Asp  Val  Val  Gly  Ala  Asp  Thr  Tyr  His  Arg  Ser  Gly  Val  Thr
100                      105                      110
Tyr  Thr  Leu  Gln  Gly  Ala  Ser  Pro  Thr  Phe  Met  Ile  Gly  Ala  Asn  Thr
115                      120                      125
Asn  Ser  Met  Met  Phe  Ser  Phe  Asp  Thr  Ala  Leu  Leu  Trp  Thr  Pro  Gln
130                      135                      140
Pro  Ser  Lys  Pro  Thr  Lys  Glu  Val  Phe  Asn  Lys  Ala  Asn  Thr  Glu  Glu
145                      150                      155                      160
Ala  Ala  His  Asn  Ile  Asp  Lys  Lys  Val  Ile  Pro  Gln  Gly  Ser  Asp  Val
165                      170                      175
Tyr  Tyr  His  Ile  His  Gln  Lys  Phe  Asp  Ala  Leu  Thr  Val  Asn  Thr  Met
180                      185                      190
Asn  Lys  Tyr  Lys  Ser  Phe  Lys  Ile  Thr  Asp  Thr  Phe  Asp  Ser  Lys  Asn
195                      200                      205
Phe  Asp  Met  Val  Ser  Asp  Gly  Lys  Asn  Tyr  Asp  Gly  Ala  Leu  His  Met
210                      215                      220
Asn  Thr  Gln  Phe  Thr  Ala  Val  Gly  Lys  Glu  Phe  Asn  His  Leu  Glu  Lys
225                      230                      235                      240
Arg  Ile  Glu  Asn  Leu  Asn  Lys  Lys  Val  Asp  Asp  Gly  Phe  Leu  Asp  Ile
245                      250                      255
Trp  Thr  Tyr  Asn  Ala  Glu  Leu  Leu  Val  Leu  Leu  Glu  Asn  Glu  Arg  Thr
260                      265                      270
Leu  Asp  Tyr  His  Asp  Ser  Asn  Val  Lys  Asn  Leu  Tyr  Glu  Lys  Val  Arg
275                      280                      285
Ser  Gln  Leu  Lys  Asn  Asn  Ala  Glu  Phe  Val  Asp  Ser  Leu  Leu  Thr  Glu
290                      295                      300
Val  Glu  Thr  Pro  Ile  Arg  Asn  Glu  Trp  Gly  Ser  Arg  Ser  Asn  Asp  Ser
305                      310                      315                      320
Ser  Asp  Ala  Ala  Ala  Gly  Gly  Ala  Ala  Ser  Leu  Leu  Thr  Glu  Val  Glu
325                      330                      335
Thr  Pro  Ile  Arg  Asn  Glu  Trp  Gly  Ser  Arg  Ser  Asn  Asp  Ser  Ser  Asp
340                      345                      350
Ala  Ala  Ala  Pro  Gly  Ala  Ala  Ser  Leu  Leu  Thr  Glu  Val  Glu  Thr  Pro
355                      360                      365
Thr  Arg  Ser  Glu  Trp  Glu  Ser  Arg  Ser  Ser  Asp  Ser  Ser  Asp  Ala  Ala
370                      375                      380
Ala  Gly  Gly  Ala  Ala  Ser  Leu  Leu  Thr  Glu  Val  Glu  Thr  Pro  Thr  Arg
385                      390                      395                      400
Asn  Glu  Trp  Glu  Ser  Arg  Ser  Ser  Asp  Ser  Ser  Asp  Glu  Phe  Tyr  Glu
405                      410                      415
Lys  Asn  Leu  Lys  Glu  Tyr  Thr  Asp  Lys  Leu  Asp  Lys  Leu  Glu  Lys  Gly
420                      425                      430
Ser  Ala  Arg  Val  Ile  Asp  Met  Ser  Thr  Gly  Lys  Asp  Ile  Thr  Ser  Glu
435                      440                      445
Gly  Thr  Leu  Thr  Tyr  Asp  Ser  Asn  Leu  Arg  Thr  Leu  Lys  Trp  Glu  Ala
450                      455                      460
Ser  Ala  Asp  Phe  Leu  Ser  Lys  Asn  Leu  Leu  Asp  Gly  Arg  Glu  Ile  Gln
465                      470                      475                      480
Leu  Ile  Phe  Thr  Ala  Lys  Thr  Pro  Leu  Gln  Ser  Glu  Lys  Asn  Ile  Asp
485                      490                      495
Asn  Gln  Ala  Val  Ala  Ala  Val  Glu  Asn  Val  Ser  Asn  Lys  Thr  Asn  Val
500                      505                      510
Val  Thr  Ile  Gly  Val  Asp  Pro  Asn  Leu  Pro  Gln  Val  Ile  Val  Pro  Arg
515                      520                      525
Thr  Gly  Ser  Thr  His  Leu  Val  Thr  Ile  Leu  Val  Val  Ser  Leu  Val  Leu
530                      535                      540
Leu  Val  Leu  Ala  Thr  Leu  Ser  Tyr  Val  Ala  Leu  Lys  Phe  Asn
545                      550                      555            558
<---