Оценка окислительного стресса в пуповинной крови и лизате эндотелиальных клеток сосудов пупочного канатика новорожденных

биохимия

ЛИТЕРАТУРА

1. Яковлев В.Н., Марченков Ю.В., Панова Н.С., Алексеев В.Г., Мороз В.В. Жировая эмболия. Общая реаниматология. 2013; 9 (4): 50-8.

8. Кузьков В.В., Фот Е.В., Сметкин А.А., Комаров С.А., Киров М.Ю. Связь между концентрацией триглицеридов плазмы и тяжестью острого респираторного дистресс-синдрома. Общая реаниматология. 2012; 8 (1): 22-5.

9. Яковлев А.Ю., Певнев А.А. Лабораторные методы диагностики жировой глобулемии (обзор литературы и собственные данные). Медицинский альманах, 2016; 45 (5): 240-3.

10. Борисов М.Б., Гаврилин С.В. Синдром жировой эмболии при тяжелых сочетанных травмах. Вестник хирургии имени И.И. Грекова. 2006; 165 (5): 68-71.

14. 14. Голохваст К.С., Чайка В.В. Альвеолярный макрофаг (краткий обзор). Вестник новых медицинских технологий. 2011; 18 (2): 23-4.

15. Титов В.Н., Рожкова Т.А., Амелюшкина В.А. Жирные кислоты, триглицериды, гипертриглицеридемия, гипергликемия и инсулин. М.: «Инфра-М»; 2016.

REFERENCES

1. Yakovlev V.N., Marchenkov Y.V., Panova N.S., Alekseev V.G., Moroz V.V. Fat Embolism. Obshchaya reanimatologiya. 2013; 9

2. Kwiatt M.E., Seamon M.J. Fat embolism syndrome. Int. J. Crit. Illn. Inj. Sci. 2013; 3: 64-8.

3. Gurd A.R. Fat embolism: an aid to diagnosis. J. Bone Joint Surg. 1970; 52 (4): 732-7.

4. Lehman E.P., Moore R.M. Fat embolism, including experimental production without trauma. Arch. Surg. 1927; 14: 621.

5. Szabo G., Magyar Z., Reffy A., The role of free fatty acids in pulmonary fat embolism. Injury. 1977; 8 (4): 278-83.

6. Nixon J.R., Brock-Utne J.G. Free fatty acid and arterial oxygen changes following major injury. A correlation between hypoxemia and increased free fatty acid level. J. Trauma. 1978; 18: 23-6.

7. Shi S., Gao Y., Wang L. et al. Elevated free fatty acid level is a risk factor for early postoperative hypoxemia after on-pump coronary artery bypass grafting: association with endothelial activation. J. Cardiothorac. Surg. 2015; 10: 122.

8. Kuzkov V.V., Fot E.V., Smetkin A.A., Komarov S.A., Kirov M.Y. The relationship between the plasma triglyceride concentration and the severity of acute respiratory distress syndrome. Obshchaya reanimatologiya. 2012; 8

9. Yakovlev A.Yu., Pevnev A.A. Laboratory methods of diagnostics of fat globulinaemia. Meditsinskiy al'manakh. 2016; 45

10. Borisov M.B., Gavrilin S.V. The fat embolism syndrome in severe combined traumas. Vestnik khirurgii imeni I.I. Grekova. 2006; 165

11. Lehman E.P., Moore R.M. Fat embolism, including experimental production without trauma. Arch. Surg. 1927; 14: 621.

12. Crocker G.H., Jones J.H. Effects of oleic acid-induced lung injury on oxygen transport and aerobic capacity. Respir. Physiol. Neurobiol. 2014; 196: 43-9.

13. Baker P.L., Pazell J.A., Peltier L.F. Free fatty acids, catecholamines, and arterial hypoxia in patients with fat embolism. J. Trauma. 1971; 11 (12): 1026-30.

14. Golokhvast K.S., Chayka V.V. Alveolar macrophage

15 Titov V.N., Rozhkova T.A., Amelyushkina V.A. Fatty Acids, Triglycerides, Hypertriglyceridemia, Hyperglycemia and Insum [Zhirnye kisloty, triglitseridy, gipertriglitseridemiya, giperglikemiya i insulin]. Moscow: Infra-M; 2016.

Поступила 23.12.16 Принята к печати 19.01.17

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.155-053.32-073.537.9

Попова ИТ.1, Ситникова ОТ.1, Назаров С.Б.1, Кузьменко Г.Н.1, Абрамова И.В.2, Чаша Т.В.1, Парейшвили В.В.1

ОЦЕНКА ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ПУПОВИННОЙ КРОВИ И ЛИЗАТЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СОСУДОВ ПУПОЧНОГО КАНАТИКА НОВОРОЖДЕННЫХ

1ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава РФ,153045, Иваново;

2ФГБОУ ВО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, 153012, Иваново

Обследованы новорожденные (n = 28), из которых 18 недоношенных детей составили основную группу (гестационный возраст - от 28 до 35 нед, масса тела 2067,3±76,7 г), а группу сравнения - 10 доношенных детей (гестационный возраст от 38 до 41 нед, масса тела 3380,2±57,2 г), родившихся от матерей с физиологически протекающей беременностью без экстрагенитальной патологии. У всех детей проводили определение в смешанной пуповинной крови и лиза-те эндотелиальных клеток, выделенных из вены пупочного канатика, показателей свободнорадикального окисления липидов, характеризующих окислительный стресс, и антиоксидантной активности методом хемилюминесценции. Результаты исследования показали у недоношенных новорожденных увеличение в пуповинной крови показателей хемилюминесценции быстрой вспышки (Imax), величины светосуммы (S) и тангенса угла наклона кинетической кривой (tgа), а также повышение параметров Imax и tgа в лизате эндотелиальных клеток пупочного канатика, что свидетельствует о развитии окислительного стресса у этих детей, сопровождающегося компенсаторным повышением антиоксидантной активности.

Ключевые слова: новорожденные; недоношенные новорожденные; окислительный стресс; антиоксидантная активность; хемилюминесценция.

Для корреспонденции: Попова Ирина Геннадьевна, канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. клин. биохимии и мед. генетики ФГБУ ИвНИИМиД им. В.Н. Городкова Минздрава РФ; e-mail: i_g_popova@mail.ru

biochemistry

Для цитирования: ПоповаИ.Г., Ситникова О.Г., Назаров С.Б., Кузьменко Г.Н., АбрамоваИ.В., Чаша Т.В., Парейшвили В.В. Оценка окислительного стресса в пуповинной крови и лизате эндотелиальных клеток сосудов пупочного канатика новорожденных. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (5): 274-277. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-5-274-277

Popova I.G.1, Sitnikova O.G.1, Nazarov S.B.1, Kuzmenko G.N.1, Abramova I.V.2, Chasha T. V.1, Pareishvili V.V.1

THE EVALUATION OF OXIDATION STRESS IN UMBILICAL BLOOD AND LYSATE OF ENDOTHELIAL CELLS OF VESSELS OF UMBILICAL CORD OF NEWBORNS

1The V.N. Gorodkov Ivanovskii institute of maternity and childhood of Minzdrav of Russia, 153045 Ivanovo, Russia 2The Ivanovskaia state medical academy of Minzdrav of Russia, 153012 Ivanovo, Russia

The .sampling of newborns (n=28) was examined. Out of them, 18 premature children formed main group (gestation age from 28 to35 weeks, body mass 2067,3±76,7g) and 10 mature children formed comparison group (gestation age from 38 to 41 weeks, body mass 3380,2±57,2g) born from mothers with physiologically occurring pregnancy without extra-genital pathology. In all children, the detection of endothelial cells isolatedfrom umbilical cord vein in mixed umbilical blood and lysate was applied and indices of free radical oxidation of lipids, characterizing oxidizing stress as well and anti-oxidation activity using chemiluminescence technique. The study results demonstrated in premature newborns increasing in umbilical blood of indices of fast flash chemiluminescence (Imax), light sun value (S) and tangent of kinetic curve slope (tga) and also increasing of parameters Imax and tga in lysate of endothelial cells of umbilical cord. Al these occurrences testify in these children development oxidation stress being accompanied by compensation increasing of antioxidant activity.

Keywords: newborns; premature newborns; oxidation stress; ant-oxidant activity; chemiluminescence.

For citation: Popova I.G., Sitnikova O.G., Nazarov S.B., Kuzmenko G.N., Abramova I.V., Chasha T.V., Pareishvili V.V. The evaluation of oxidation stress in umbilical blood and lysate of endothelial cells of vessels of umbilical cord of newborns. Klin-icheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (5): 274-277. (in Russ.). DOI: http:// dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-5-274-277

For correspondence: PopovaI.G., candidate of medical sciences, researcher of laboratory of clinical biochemistry and medical genetics. e-mail: i_g_popova@mail.ru

Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support

Received 07.02.2017 Accepted 15.02.2017

Введение. Известно, что окислительный стресс - один из патогенетических механизмов нарушений гестационного периода, таких как бесплодие, невынашивание, преэкламп-сия, которые могут привести к рождению недоношенных детей [1]. Установлено, что продукты свободнорадикальных реакций - свободные радикалы, супероксиданион (О2-), ги-дроксильный радикал (НО^), липидный радикал (ROO-) и радикалы оксида азота (NO) в значительных концентрациях приводят к образованию таких токсичных продуктов, как пе-роксинитрит (-ONOO), гидроксирадикал (НО') [2]. Последние являются инициаторами перекисного окисления липидов и способны напрямую окислять клеточные компоненты, вызывая повреждение мембран клеток, способствуя развитию окислительного стресса [1-3], в том числе нарушения функции эндотелия [4].

Важную роль в развитии эндотелиальной дисфункции на клеточном уровне играют процессы повреждения эндотелиальных клеток с нарастанием числа десквамированных эндо-телиоцитов (ДЭ), свидетельствующих о степени повреждения сосудов и об интенсивности регенеративных процессов в эндотелии [5].

В проведенных нами ранее исследованиях удалось проследить изменения показателей функционального состояния эндотелия в пуповинной крови. Выявлено, что у новорожденного от матери с гестозом в 1-е сутки жизни нарушаются функции эндотелия, что сопровождается повышением количества ДЭ и концентрации суммарных нитратов и нитритов (NOx) [6-8].

По данным литературы, недоношенные новорожденные по сравнению с доношенными детьми более склонны к окислительному стрессу, поскольку у них отмечена сниженная функциональная активность антиоксидантной защиты, повышенная чувствительность к инфекционным и воспалительным процессам [1, 9-11].

Однако сообщения об одновременном исследовании в

пуповинной крови доношенных и недоношенных новорожденных и в лизате эндотелиальных клеток сосудов пупочного канатика показателей окислительного стресса и антиоксидантной активности (АОА) малочисленны.

Цель работы - оценка окислительного стресса в пуповинной крови и в лизате эндотелиальных клеток, выделенных из вены пупочного канатика новорожденных.

Материал и методы. Взятие пуповинной крови проводили у рожениц, поступивших в акушерскую клинику Ивановского НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова.

Обследованы новорожденные (n = 28), из которых 18 недоношенных детей составили основную группу (гестацион-ный возраст - от 28 до 35 нед, масса тела 2067,3±76,7 г), а группу сравнения - 10 доношенных детей (гестационный возраст от 38 до 41 нед, масса тела 3380,2±57,2 г), родившихся от матерей с физиологически протекающей беременностью без экстрагенитальной патологии.

У всех детей проводили определение в смешанной пуповин-ной крови и лизате эндотелиальных клеток сосудов пупочного канатика показателей окислительного стресса (концентрацию свободных радикалов, АФК) и антиоксидантной активности (АОА). Выделение эндотелиальных клеток из вены пуповины проводили методом J.C. Gerlach и соавт. [12]. К осадку клеток добавляли 1 мл физиологического раствора, подсчет клеток проводили с использованием камеры Горяева [13]. Полученную суспензию разливали на аликвоты, которые в необходимом объеме содержали 500 клеток. Аликвоты замораживали при -20oC для получения лизата. В кювету биохемилюминометра помещали такой объем лизата, который предположительно содержит 500 клеток. Таким образом, интенсивность хемилюминесцен-ции стандартизировалась на число клеток.

Оценивали показатели окислительного стресса и АОА в пуповинной крови и в лизате клеток при помощи метода железоиндуцированной хемилюминесценции (ХЛ) на биохемилюминометре БХЛ-07 (Россия). Для этого исполь-

биохимия

Таблица 1

Показатели индуцированной хемилюминесценции пуповинной крови у доношенных и недоношенных новорожденных

Показатель Доношенные Недоношенные

Imax, мВ 146 [123; 158] 169* [133; 184]

S, мВ  с 2016 [1678; 2242] 2247* [1929; 2900]

a 0,461 [0,413; 0,489] 0,474 [0,438; 0,505]

Z, с 13,784 [12,364; 14,646] 13,962 [13,095; 15,185]

tga, мВ/с 20,25 [19,5; 22,5] 24* [21; 28,5]

Примечание. Здесь и в табл. 2: статистические показатели представлены в виде медианы - середины распределения изучаемого признака и интерквартильного интервала (МЕ^25; Q75]); * - достоверные отличия от группы сравнения (р* < 0,05).

зовали параметры ХЛ, которые отражают потенциальную способность биологического объекта к интенсивности сво-боднорадикальных реакций: Imax - значение максимальной интенсивности свечения за время опыта, мВ; S - площадь под кривой интенсивности, или полная светосумма; мощность антиоксидантного потенциала: Z - нормированная светосумма; а - относительная светосумма; tga - тангенс угла максимального наклона кривой к оси времени, которые рассчитывались автоматически. Представленные параметры наиболее информативны для оценки ХЛ. Так, показатели Imax и S дают представление о потенциальной способности биологического объекта к свободнорадикаль-ному окислению липидов, антиоксидантный потенциал коррелирует с параметрами a, Z, tga, снижение величин а и Z и повышение tga свидетельствует о повышении анти-оксидантной активности.

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6,0 (Statsoft) for Windows. Учитывая характер распределения, отличный от нормального, описание представлено в виде медианы - середины распределения изучаемого признака и интерквар-тильного интервала (ME[Q25; Q75]). Сравнение средних величин в группах проводили с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05. Корреляционный анализ проведен с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена [14].

Результаты и обсуждение. Результаты исследования СРО липидов и антиоксидантной активности у новорожденных в пуповинной крови представлены в табл. 1.

Кинетика индуцированной ХЛ, сопровождающая сво-боднорадикальное окисление липидов, показала, что максимум свечения, связанный с выходом свободных радикалов, наблюдался в течение первых 2 с от начала реакции. При

этом изменения относительных величин медиан интенсивности свечения - быстрой вспышки (Imax) сыворотки пупо-винной крови недоношенных детей возрастали в среднем на 16% (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателями у доношенных новорожденных, что связано с усиленным образованием свободных радикалов липидов и активных форм кислорода (Н02\ 02\ O2-, ОН) (реакция Фентона). Значения изменения относительных величин медиан величин свето-суммы (S) также оказались увеличенными на 11% (р < 0,05), что свидетельствует о развитии окислительного стресса у недоношенных детей.

Известно, что при нормальном функционировании организма существует оптимальный баланс между антиокси-дантами и прооксидантами. В нашей работе изменения относительных величин медиан показателей tg2, отражающих антиоксидантную активность организма в группе недоношенных новорожденных, превысила на 18% по сравнению с таковыми параметрами у доношенных детей (р < 0,05), что свидетельствует об активации антиоксидантной системы у недоношенных.

Данные исследования окислительного стресса и антиок-сидантной активности у новорожденных в лизате эндотели-альных клеток представлены в табл. 2.

Количество выделенных эндотелиальных клеток из вены пуповины у недоношенных новорожденных было достоверно выше по сравнению с доношенными (см. табл. 2). Исследование у группы недоношенных детей интенсивности процессов СРО липидов в лизате клеток показало увеличение изменений относительных величин медиан параметров ХЛ - Imax и tg2 (р < 0,05) по сравнению с таковыми в лизате у доношенных новорожденных. Показатели хемилюминесцен-ции (S) достоверно не изменились.

На основании анализа с использованием критерия Спир-мена в крови доношенных детей установлены следующие взаимозависимости между показателями ХЛ: положительные связи между быстрой вспышкой - Imax и величиной све-тосуммы свечения - S (r = 0,81, р = 0,0038), отрицательные зависимости между показателями ХЛ, отражающими АОА систему: а и tg2 (r = -0,89, р = 0,0004), Z и tg2 (r = -0,89, р = 0,0004), что подтверждает наличие баланса между про- и антиоксидантами.

В крови недоношенных новорожденных выявлены положительные корреляционные зависимости между показателями быстрой вспышки (Imax), величины светосуммы (S) и углом спада кинетической кривой tg2 (r = 0,61, р = 0,0094); в лизате клеток между показателями быстрой вспышки - Imax и углом спада кинетической кривой tg2 (r = 0,75, р = 0,0000). Обнаруженные связи свидетельствуют о компенсаторной активации антиоксидантной системы у недоношенных новорожденных, связанной с развитием окислительного стресса.

Заключение. На основании изменений относительных

Таблица 2

Показатели индуцированной хемилюминесценции в лизате эндотелиальных клеток вены пупочного канатика у доношенных и недоношенных новорожденных

Показатель Доношенные Недоношенные

Imax, мВ 43 [42; 49] 60* [51; 73]

S, мВ  с 408 [301; 488] 405 [348; 538]

0,278 [0,251; 0,333] 0,228 [0,210; 0,261]

Z, с 8,327 [7,525; 9,959] 6,824 [6,300; 7,804]

tga, мВ/с 13,5 [12,0; 13,5] 18* [15; 21]

Десквамированные эндотелиоциты, выделенные из вены пуповины, количество клеток/мкл 10 [9,0; 11] 13* [10,0; 15]

величин медиан параметров хемилюминесценции: интенсивности свечения, величины светосуммы, повышения тангенса угла наклона кинетической кривой у недоношенных новорожденных в пуповинной крови и лизате клеток сосудов пупочного канатика установлено развитие окислительного стресса, сопровождающегося повышением антиоксидантной активности. Корреляционный анализ у недоношенных новорожденных подтверждает эти изменения. Их можно расценить как компенсаторную реакцию организма, направленную на жизнеобеспечение и дальнейшую адаптацию организма ребенка к внеутробной жизни.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гармаза Ю.М., Козлова Н.М., Артюшевская М.В. и др. Маркеры окислительного стресса в плазме пуповинной крови недоношенных новорожденных. Медицинский академический журнал. 2013; 13 (4): 71-6.

4. Сидорова И.С., Боровкова Е.И., Мартынова И.В., Солоницын А.Н., Рыкунова О.В., Шемонаева Т.В. Роль окислительного стресса в патогенезе гестоза. Акушерство и гинекология. 2007; 3: 3-5.

5. Попова И.Г., Чаша Т.В., Кузьменко Г.Н., Ситникова О.Г., Назаров С.Б. Клинико-лабораторная оценка функции эндотелия при развитии перинатальных поражений ЦНС у новорожденных от матерей с гестозом. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2010; 55 (4): 18-22.

6. Попова И.Г., Назаров С.Б., Филькина Е.В., Кузьменко Г.Н., Ситникова О.Г. Особенности ранней постнатальной адаптации новорожденных. Педиатрия. 2013; 92 (2): 16-20.

7. Попова И.Г., Назаров С.Б., Филькина О.М., Кузьменко Г.Н., Ситникова О.Г. Особенности эндотелиальной функции в период ранней постнатальной адаптации у новорожденных от матерей с гестозом. Мать и дитя в Кузбассе. 2014; (2): 82-6.

8. Попова И.Г., Назаров С.Б., Кузьменко Г.Н., Ситникова О.Г. Циркулирующие эндотелиальные клетки и факторы роста у новорожденных от матерей с преэклампсией. Таврический медико-биологический вестник. 2015; 18 (1): 183-4.

13. Петрищев Н.Н., Беркович О.А., Власов Т.Д., Волкова Е.В., Зуева Е.Е., Мозговая Е.В. Дигностическая ценность определения де-сквамированных эндотелиальных клеток в крови. Клиническая лабораторная диагностика. 2001; (1): 50-2.

14. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера; 2002.

REFERENCES

1. Garmaza Yu.M., Kozlova N.M., Artyushevskaya M.V. et al. Markers of oxidative stress in plasma of cord blood of premature infants. Med-itsinskiy akademicheskiy zhurnal. 2013; 13

biochemistry

2. Taylor C.T., Moncada S. Nitric oxide, cytochrome С oxidase and the cellular response to hypoxia. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010; 30 (4): 643-7.

3. Poston L., Igosheva N., Mistry H.D., Seed P.T., Shennan A.H., Rana S. et al. Role of oxidative stress and antioxidant supplementation in pregnancy disorders. Am. J. Clin. Nutr. 2011; 94 (6): 1980-5.

4. Sidorova I.S., Borovkova E.I., Martynova I.V., Solonitsyn A.N., Rykunova O.V., Shemonaeva T.V. The role of oxidative stress in the pathogenesis of preeclampsia. Akusherstvo i ginekologiya. 2007; 3: 3-5.

5. Popova I.G., Chasha T.V., Kuz'menko G.N., Sitnikova O.G., Nazarov S.B. Clinical and laboratory evaluation of endothelial function in the development of perinatal CNS lesions in newborns from mothers with preeclampsia. Rossiyskiy vestnik perinatologii i pediatrii. 2010; 55

6. Popova I.G., Nazarov S.B., Fil'kina E.V., Kuz'menko G.N., Sitnikova O.G. Features of early postnatal adaptation of newborns. Pedia-triya. 2013; 92

7. Popova I.G., Nazarov S.B., Fil'kina E.V., Kuz'menko G.N., Sitnikova O.G. The features of endothelial function in early postnatal adaptation in newborns from mothers with preeclampsia.Mat'i ditya vKuzbasse. 2014; 2: 82-6.

8. Popova I.G., Nazarov S.B., Kuz'menko G. N., Sitnikova O.G. Circulating endothelial cells and growth factors in newborn infants of mothers with preeclampsia. Tavricheskiy mediko-biologicheskiy vestnik. 2015; 18

9. O'Donovan D.J., Fernandes C.J. Free radicals and diseases in premature infants. Antioxid. Redox. Signal. 2004; 6 (1): 169-76.

10. Dani C., Cecchi A., Bertini G. Role of oxidative stress as physio-pathologic factor in the preterm infant. Minerva. Pediatr. 2004; 56 (4): 381-94.

11. Perrone S., Negro S., Tataranno M.L., Buonocore G. Oxidative stress and antioxidant strategies in newborns. J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 2010; 23 (3): 63-5.

12. Cerlach J.C., Zeilinger K., Spatkowski G., Hentschel F., Schnoy N., Kolbeck S. et al. Large-Scale isolation endothelial cells from pig and human liver. Journal of Surgical Research. 2001; 100 (1): 39-45.

13. Petrishchev N.N., Berkovich O.A., Vlasov T.D., Volkova E.V., Zue-va E.E., Mozgovaya E.V. Diagnostic value assessment of desquamated endothelial cells in the blood. Klinicheskaya laborator-naya diagnostika. 2001;

14. Rebrova O.Yu. Statistical Analysis of Medical Data. Application Software Package STATISTICA [Statisticheskiy analiz meditsinskikh dannykh. Primenenie paketa prikladnykh programm STATISTICA]. Moscow: Media Sfera; 2002.

Поступила 07.02.17 Принята к печати 15.02.17