Oпиоидные пептиды как нейромодуляторы адаптивных процессов

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

УДК 612.614

С.Б. Егоркина, Е.В. Елисеева

ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ КАК НЕЙРОМОДУЛЯТОРЫ АДАПТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ

При центральном внутрижелудочковом введении нейропептидов (лей-энкефалина и бета-эндорфина) наблюдается изменение офтальмотонуса и гидродинамических показателей глаза, гормонального профиля крови, а также биополимеров соединительной ткани.

Ключевые слова: нейропептиды, офтальмотонус, гормоны, биополимеры соединительной ткани.

Нейропептиды - биологически активные соединения, синтезируемые, главным образом в нервных клетках. Нейропептиды занимают важное место в химической передаче информации. Многие из них выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов, осуществляя контроль за экспрессией вторичных мессенджеров, цитокинов и других сигнальных молекул, а также за запуском генетических программ апоптоза, антиапоптозной защиты,усиления нейротрофического обеспечения [1]. Система эндогенных опиоидных пептидов является одной из наиболее универсальных стресс-лимитирующих систем организма, обеспечивающих адаптацию к изменениям, вызванным реакцией на действие стрессорного фактора [2; 3]. Нейропептиды, являясь нейромодуляторами адаптивных процессов, включаются в поддержание не только лабильных, но и стабильных гомеостатических констант.

Целью нашей работы явилось исследование влияния опиоидных пептидов - лей-энкефалина и Р-эндорфина на изменение офтальмотонуса и гидродинамики глаз, содержания в крови экспериментальных животных гормонов гипофиза, щитовидной железы и надпочечников, а также показателей обмена биополимеров соединительной ткани в условиях стресса.

Материал и методика исследований

Опыты проведены на 18 половозрелых кроликах. Эмоциогенный стресс моделировали конфликтной ситуацией (жесткая фиксация животных к лабораторным станкам в течение часа ежедневно на протяжении 30 дней).

Введение лей-энкефалина и Р-эндорфина в дозе 150 нг осуществляли по стереотаксическим координатам атласа мозга [4] под местной новокаиновой анестезией через канюли микроинъектором-хемитродом в левый латеральный желудочек мозга. В качестве контроля проведена серия опытов с интравентрикулярным введением физиологического раствора в том же объеме.

Состояние обмена биополимеров в соединительной ткани изучали по содержанию свободного и пептидносвязанного гидроксипролина в сыворотке крови; свободного гидроксипролина и суммарного гидроксипролина в аорте, миокарде, скелетной мышце и печени по методу П.Н. Шараева [5].

Кровь для биохимического анализа брали на 10-й день эксперимента из сонной артерии. В сыворотке крови определяли свободный и пептидносвязанный гидроксипролин по методу П.Н.Шараева [5]. В три центрифужные пробирки наливали по 0,5 мл сыворотки крови и 0,5 мл 5%-го раствора три-хлоруксусной кислоты. Содержимое перемешивали и нагревали в кипящей водяной бане 2 мин, затем охлаждали до 20 оС и центрифугировали 5 мин со скоростью 3000 об./мин. Надосадок количественно переносили в мерные центрифужные пробирки. Содержимое 1-й пробирки после добавления 1 капли 0,1%-го спиртового раствора фенолфталеина нейтрализовали 6Н раствором едкого натрия до появления устойчивой светлорозовой окраски по всему объему жидкости. Содержимое 2-й и 3-й пробирок закрывали каплеуловителем и помещали в кипящую водяную баню на 40 мин, после чего охлаждали до 20 оС. Затем содержимое этих пробирок нейтрализовали как указано выше. Объем жидкости во всех трех пробирках доводили до 4 мл и добавляли по 0,5 мл 7%-го раствора хлорамина Б. Через 4 мин в 1-ю и 2-ю пробирки (опытные пробы) добавляли 0,5 мл 57%-й хлорной кислоты и 0,5 мл 10%-го спиртового раствора парадиметиламинобензальдегида, а в 3-ю пробирку (контрольную) - 0,5 мл 57%-й хлорной кислоты и 0,5 мл 96%-го этанола. Все смеси перемешивали, нагревали на кипящей водяной бане 2 мин, а после охлаждения до 20 оС добавляли по 4 мл смеси четыреххлористого углерода и н-бутанола (1:3), встряхивали, центрифугировали 10 мин при 3000 об./мин. Содержимое

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

пробирок фотометрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. Содержание гид-роксипролина рассчитывали по калибровочной кривой и выражали в мкмолях на 1 л сыворотки крови. В 1-й пробирке определяли содержание свободного гидроксипролина, а по разности со 2-й пробиркой (суммарный коллаген) находили пептидносвязанный гидроксипролин. В тканях аорты, миокарда, скелетной мышцы и печени исследовали содержание биополимера соединительной ткани путем предварительного экстрагирования его из гомогенатов тканей и последующим определением в экстрактах суммарного коллагена соединительной ткани и свободного гидроксипролина по методу П.Н.Шараева и соавт. [5] и Т.В.Замараевой [6]. Содержание биополимера соединительной ткани выражали в ммоль гидроксипролина на 1 кг сухой обезжиренной ткани (ммоль/кг ткани).

Полученные в опытах результаты биохимического исследования сравнивали с контролем. В качестве контроля были использованы результаты исследований, проведенных на интактных животных, животных с введением физиологического раствора.

Результаты и их обсуждение

В контроле уровень тонометрического внутриглазного давления составлял 18,96±0,11 мм рт.ст. справа и 18,79±0,15 мм рт.ст. слева, истинный офтальмотонус был равен - 14,15±0,11 мм рт.ст. справа и 13,94±0.11 мм рт.ст. слева, минутный объем камерной влаги 0,92±0,03 мм3/мин и 0,84±0,03 мм3/мин соответственно, коэффициент легкости оттока 0,22±0,004 мм3/мин /мм рт ст. справа и 0,21±0.004 мм3/мин/мм рт. ст.

Многократное введение лей-энкефалина ( в течение месяца через день) в боковой желудочек мозга вызывало значительное снижение тонометрического внутриглазного давления, которое проявлялось с первой декады опытов 17.33±0,12 мм рт.ст. (Р<0,01) справа и 17.37±0,12 мм рт.ст. (Р<0,01) слева, снижаясь к 30-му дню до 15,55±0,12 мм рт.ст. и 15,72±0,1 мм рт.ст соответственно (Р<0,01). Истинный офтальмотонус изменялся однонаправлено, максимально снижаясь в третьей декаде опытов до 8,82±0,11 мм рт.ст. (Р<0,01) справа и 8,83±0,09 мм рт. ст. (Р<0,01) слева.

Продукция камерной влаги резко снижалась при введении лей-энкефалина. В первые 10 дней введения лей-энкефалина продукция камерной влаги снижалась более чем в 20 раз с обеих сторон.

Такая выраженная гипосекреция камерной влаги глаза сопровождалась постепенным компенсаторным снижением коэффициента легкости оттока. Так, к 30-му дню введения лей-энкефалина в боковой желудочек мозга отток снижался до 0,132±0,005 мм3/мин/мм рт.ст. (Р<0,01) на правый глаз и до

0,121±0,005 мм3/мин/мм рт.ст. (Р<0,01) на левый.

Таким образом, многократные введения лей-энкефалина в боковой желудочек мозга приводят к выраженной гипотонии глаза, обусловленной значительным снижением камерной влаги глаза.

В серии опытов при введении микродоз Р-эндорфина в латеральный желудочек мозга до начала эксперимента определяли контрольное значение тонометрического давления 19.07±0.11 мм рт.ст. справа и 19,0±0,12 мм рт. ст. слева; показатели истинного офтальмотонуса 13,74±0.16 мм рт.ст. на правый глаз и 13,7±0.13 мм. рт.ст. на левый глаз. Продукция камерной влаги в контроле составляла

0,90±0,04 мм3/мин справа и 0,88±0,03 мм3/мин слева, коэффициент легкости оттока 0.241±0.004 мм3/мин/мм рт.ст. и 0,235±0,003 мм3/мин/мм рт.ст. соответственно.

Введение Р-эндорфина в боковой желудочек мозга сопровождалось резким снижением тонуса глаза. Так, уже на 10-й день введения тонометрическое давление снизилось до 16,48±0,11 мм рт.ст. (Р<0,001) на правый глаз и до 16,29±0,14 мм рт.ст. (Р<0.001) на левый, в последующие дни эксперимента наблюдалась еще более выраженная гипотония, и к 30-му дню тонометрическое давление было равно 15.95±0,12 мм рт.ст. справа и 15,92±0,13 мм рт. ст. слева (Р<0,001), что на 16,4% ниже исходного уровня на оба глаза.

Истинный офтальмотонус также значительно снижался на протяжении всего времени воздействий, достигая к 30-му дню справа 10,05±0.17 мм рт.ст. (Р<0.001) и слева 9,56 ±0,12 мм рт ст. (Р<0.001) мм рт ст., что на 27% и 30% соответственно ниже фона.

Продукция камерной влаги при введении Р-эндорфина, так же как и при введении лей-энкефалина, значительно снижалась уже в первую декаду опытов наблюдалась выраженная гипосекреция внутриглазной жидкости, а к 30-му дню продукция камерной влаги глаза уменьшалась в несколько десятков раз. Параллельно снижению секреции камерной влаги замедлялся ее отток, но, вероятно, этого снижения было недостаточно, чтобы удержать уровень внутриглазного давления и не допустить его снижения.

Опиоидные пептиды как нейромодуляторы адаптивных процессов БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

Таким образом, многократные интравентрикулярные введения Р-эндорфина приводят к выраженной гипотонии глаза, причиной которой является нарушение гидродинамики глаза, а именно значительное снижение продукции внутриглазной жидкости.

Полученные результаты влияния нейропептидов на офтальмотонус в условиях эмоциогенного стресса представляют, на наш взгляд, не только научный интерес, но и тесно связаны с актуальнейшей для клинической медицины проблемой патогенетических механизмов развития первичной открытоугольной глаукомы и путей ее коррекции.

Уровень исследуемых гормонов в крови при введении этих пептидов существенно не изменялся. Так, при введении лей-энкефалина происходило только незначительное снижение гормонов гипо-физарно-тиреоидной оси. Количество ТТГ снижалось на 38%

При введении Р-эндорфина в боковой желудочек мозга наблюдались незначительные изменения содержания только норадреналина и гормонов щитовидной железы. Количество норадреналина к 20-му дню повышалось на 74% (с 17,6±2,63 нмоль/л в контроле до 30,7±2,74 нмоль/л, Р<0,05).Содержание Т3 и Т4, наоборот, снижалось на 46% и 30% соответственно к 30-му дню экспериментов.

Внутрижелудочковое введение лей-энкефалина не приводило к достоверным изменениям содержания биополимеров соединительной ткани как в крови, так и в исследованных тканях. Однако при сочетании стрессорного воздействия с введением лей-энкефалина наблюдалось существенное ослабление стрессорного воздействия, либо эффект последнего не проявлялся. Так, эффект стрессового воздействия был слабее выражен в изменении содержания свободного гидроксипролина в крови на 92%, в аорте - на 53%, в печени - на 62%. В скелетной мышце и миокарде стресс не вызывал достоверных изменений по сравнению с контролем, и сочетание его с введением лей-энкефалина также не сопровождалось достоверными изменениями. Повышенный уровень пептидносвязанного гидро-ксипролина, обусловленный стрессом, при сочетании последнего с введением лей-энкефалина нормализовался.

Таким образом, внутрижелудочковое введение лей-энкефалина не изменяет уровень обмена биополимеров соединительной ткани, но существенно ослабляет или полностью блокирует эффект стрессового воздействия.

Выводы

1. Внутрижелудочковое введение лей-энкефалина и бета-эндорфина приводят к выраженной гипотонии, причиной которой является нарушение гидродинамики глаза, а именно значительное снижение продукции внутриглазной жидкости.

2. Центральное введение опиоидных пептидов вызывало разнонаправленные изменения гормонального профиля крови.

3. Внутримозговое введение лей-энкефалина ослабляет или полностью блокирует эффект стрессового воздействия на содержание биополимеров соединительной ткани.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ашмарин И.П., Каменская М.А Нейропептиды в синаптической передаче // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Физиология человека и животных. М., 1988. Т. 34. С. 1-184.

2. Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца. М.: Наука. 1993. 168 с.

3. Юматов. Е.А., Гехт К., Скоцелляс Ю.Г.Субстанция Р, как фактор устойчивости к эмоциональному стрессу // Журн. ВНД. 1984. Т. 34, № 4. С. 771-777.

4. Буреш Я., Петрань М., Захар И. Электрофизиологические методы исследования. М.: Изд-во иностр. литер., 1962. 456 с.

5. Шараев П.Н. Метод определения свободного и связанного оксипролина в сыворотке крови // Лабораторное дело. 1981. № 5. С. 283-285.

6. Замараева Т.В. Метод определения содержания коллагеновых белков по оксипролину // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С. 262-264.

Поступила в редакцию 02.09.10

2Б______________

2010. Вып. З

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

S.B. Egorkina, candidate of medicine, associate professor E. V. Eliseeva, candidate of medicine, associate professor Opioid peptides as neuromodulators of adaptive processes

Central intraventricle introduction of neuropeptides decreases intraocular pressure and hydrodynamic indicators of an eye, arises hormones changes of hypophysis, adrenal and thyroid body and biopolymers of connective tissue.

Keywords: neuropeptides, ophthalmotonus, hormones and biopolymers of connective tissue, intraocular pressure.

Егоркина Светлана Борисовна, кандидат медицинских наук, доцент ГОУВПО «Ижевская государственная медицинская академия» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Коммунаров, 281 E-mail: norm-phys igma@mail.ru

Елисеева Елена Владимировна, кандидат медицинских наук, доцент ГОУВПО «Ижевская государственная медицинская академия» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Коммунаров, 281 E-mail: norm-phys igma@mail.ru