СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА У МЛАДЕНЦЕВ
METHOD FOR PREDICTION OF ATOPIC DERMATITIS DEVELOPMENT IN INFANTS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и микробиологии, и может быть использовано для прогнозирования развития атопического дерматита у младенцев.
На современном этапе аллергическая патология занимает первое место среди наиболее распространенных хронических заболеваний в детском возрасте. Первым проявлением аллергии у детей раннего возраста чаще всего является атопический дерматит, который вызывает особую обеспокоенность в связи с ростом заболеваемости у детей первых месяцев жизни и торпидным течением на фоне проводимой терапии.
В связи с этим становится очевидной важность профилактики аллергических заболеваний в раннем детском возрасте, когда ребенок особенно уязвим. Поскольку до появления первых симптомов невозможно достоверно сказать, кто из детей будет страдать от аллергических заболеваний, профилактика направлена, прежде всего, на детей из так называемой группы риска. К этой группе относятся дети с отягощенным семейным анамнезом по аллергическим заболеваниям.
Уровень техники
Известно достаточно способов прогнозирования аллергии у детей.
Способ прогнозирования аллергии у детей на основании анамнеза, данных о распространенности аллергических болезней в детской популяции региона с расчетом суммарного прогностического коэффициента [1].
Способ прогнозирования развития сочетанных форм атопического дерматита у детей по выявлению клинических факторов (определение групп крови и сопутствующих заболеваний) и социальных факторов (наличие у родителей профессиональных вредностей, загрязненность окружающего воздуха, жилищные условия), представленных в виде прогностических коэффициентов [2].
Способ прогнозирования развития аллергических заболеваний на основе оценки окислительной модификации белков слюны у детей раннего возраста [3].
Способ определения риска развития аллергической сенсибилизации у детей с определением экскреции альфа-лактальбумина женского молока в моче однократно в период от 7 до 21 дня жизни ребенка [4].
Способ прогнозирования развития аллергии у детей с помощью исследования уровня общего иммуноглобулина Е в пуповинной крови методом радиоиммунного анализа [5].
Способ прогнозирования развития атопического дерматита у детей раннего возраста, включающий исследование периферической крови [6].
Способ прогнозирования развития атопического аллергического заболевания у новорожденного путем определения количественного содержания общего иммуноглобулина Е [7].
Способ прогнозирования развития аллергических реакций у детей раннего возраста, основанный на диагностике внутриутробной сенсибилизации и неспецифической геперреактивности у новорожденных, включающий определение липидных медиаторов аллергии, компонентов медленно действующего вещества анафилаксии - лейкотриенов, при экспозиции лейкоцитов пуповинной крови с аллергеном и фактором активации тромбоцитов [8].
Способ прогнозирования развития атопического дерматита у детей грудного возраста путем исследования пуповинной крови новорожденных [9].
Все эти способы не учитывают роль кишечной микробиоты в развитии атопического дерматита у детей раннего возраста и основаны на клинико-анамнестических и иммунологических методах исследования.
Вместе с тем, кишечная микробиота, выполняя большую функциональную нагрузку, не может не участвовать в возникновении и поддержании патологических расстройств при атопическом дерматите. Известно, что микроорганизмы, контактируя с образраспознающими рецепторами эпителиальных и иммунокомпетентных клеток, индуцируют продукцию широкого спектра различных медиаторов, в том числе гистамина - основного медиатора аллергии и воспаления.
Выявлено, что количество микроорганизмов с декарбоксилирующей активностью на слизистой оболочке носоглотки больше у больных, чем у здоровых людей. При наиболее часто встречаемых вариантах дисбактериоза кишечника увеличивается частота высева штаммов, декарбоксилирующих гистидин [10].
В отечественных работах описаны результаты исследований при изучении микробной экологии состояния слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта у больных аллергическими заболеваниями (Грачева Н.М. с со-авт., 2004; Матвеева Н.И., 2005), при оценке микроэкологических нарушений и их коррекции при хроническом рецидивирующем афтозном стоматите (Клюева Л.А., 2008), при оценке роли факторов патогенности золотистых стафилококков в развитии атопического дерматита (Тюрин Ю.А., Долбин Д.А., 2008). В работах зарубежных авторов представлены: дифференциальная характеристика биогенных аминов бактериальной природы, участвующих в пищевых отравлениях (Fernández-No I.C. et al. 2010; Kim S.H., 2001), содержание гистамина в ротовой жидкости при парадонтозе у лиц с вредными привычками (Bertl K. et al. 2012).
Однако данные о способности к гистаминообразованию представителей кишечной микробиоты, колонизирующей кишечник детей группы риска по возникновению аллергических заболеваний и степени выраженности их гистидиндекарбоксилазной активности, отсутствуют. Вместе с тем, выявление этих данных может служить одним из прогностических критериев риска развития атопического дерматита у младенцев.
Известны способы, использующие признак гистидиндекарбоксилазной активности бактерий как диагностический критерий возникновения аллергических состояний.
Способ комплексной диагностики аллергии у детей с инфекционной патологией включает определение гистидиндекарбоксилазной активности культуры микроорганизма, выделенного от больного, уровня IgG и IgE, эозинофилов, базофилов, показателя общей аллергической настроенности организма [11].
Количественное содержание на слизистой задней стенке глотки индикаторных микроорганизмов, декарбоксилирующих гистидин с образованием клинически значимого количества гистамина, является прогностическим критерием возникновения и развития острого бронхообструктивного синдрома [12]. Методика качественного определения гистидиндекарбоксилазной активности микроорганизмов описана в вышеприведенной диссертации.
Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является метод, основанный на определении содержания гистамина в слюне для оценки риска возникновения атопического дерматита у студенческой молодежи Севера количественным методом [13].
Предлагаемый нами способ прогнозирования развития атопического дерматита имеет следующие отличия: применяется у детей первого года жизни, так как атопический дерматит наиболее часто манифестирует именно в этом возрасте; позволяет учитывать роль представителей кишечной микробиоты в формировании пула свободного гистамина – медиатора, принимающего участие в развитии аллергопатологии у детей, еще на доклиническом этапе заболевания; используется методика качественного определения гистидиндекарбоксилазной активности микроорганизмов как более дешевая и простая в осуществлении.
Новизна исследования – впервые оценены диагностические возможности определения гистидиндекарбоксилазной активности бактерий, выделенных из кишечника младенцев. Способ позволяет своевременно определить риск развития атопического дерматита у детей раннего возраста и проводить профилактические мероприятия, направленные на предотвращение его развития.
Раскрытие сущности изобретения
Определяют продукцию гистамина штаммами (факультативными анаэробами), изолированными из кишечника детей качественным методом на среде Moeller с 1% L-гистидином через 24, 48, 72 и 96 часов инкубации при 37°С, интенсивность реакции оценивают по степени изменения цвета индикатора по 4-балльной шкале. При выявлении гистидиндекарбоксилирующего штамма с высокой интенсивностью признака (на 3 и 4 балла) либо более двух гистидиндекарбоксилирующих штаммов с незначительной интенсивностью (на 1 и 2 балла) прогнозируют развитие атопического дерматита у ребенка.
Осуществление изобретения
Определяют продукцию гистамина микроорганизмами качественным методом на среде Moeller ("Difco", США), содержащей на 1 литр: пептон - 5 г, мясной экстракт - 5 г, бромкрезоловый пурпурный - 0,01 г, крезоловый красный - 0,005 г, декстрозу - 0,5 г, пиридоксаль - 0,005 г, 1% L-гистидина, рН 6,0+0,2. Среду разливают по 3 мл в серологические пробирки. Стерилизуют при 0,5 атм 30 минут. Готовая среда имеет соломенно-желтый цвет. Для определения гистидиндекарбоксилазной активности в пробирки со средой вносят 0,1 мл суспензии 24-часовой агаровой культуры в 0,9% физиологическом растворе хлорида натрия (концентрация 10 единиц по отраслевому стандартному образцу для визуального определения мутности бактерийных взвесей). Для создания анаэробных условий на поверхность среды наносят стерильное вазелиновое масло (слоем 4-5 мм). Результаты качественной реакции учитывают через 24, 48, 72 и 96 часов инкубации при 37°С. Степень изменения цвета индикатора (от соломенно-желтого - до темно-фиолетового) учитывают по 4-балльной шкале.
При выявлении гистидиндекарбоксилирующего штамма с высокой интенсивностью признака (на 3 и 4 балла) либо более двух гистидиндекарбоксилирующих штаммов с незначительной интенсивностью (на 1 и 2 балла) прогнозируют развитие атопического дерматита у ребенка.
Было проведено клинико-микробиологическое обследование 70 детей с рождения до двухлетнего возраста с наследственной предрасположенностью к аллергическим заболеваниям. Атопический дерматит за время наблюдения развился у 51 ребенка. Микробиологическое обследование детей проводилось на первом месяце жизни при отсутствии клинических проявлений атопического дерматита. Была проведена идентификация 245 штаммов, изолированных из кишечника детей с определением их гистидиндекарбоксилазной активности качественным методом.
7
При микробиологическом исследовании выявлены выраженные отклонения в составе кишечной микробиоты уже в первый месяц жизни детей: значительное снижение (менее 10 КОЕ/г) бифидобактерий (78%) и лактобактерий (72%), синдром атипичных эшерихий (64%) с пролиферацией различных видов аэробных грамположительных и грамотрицательных УПБ (чаще Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Candida spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Klebsiella spp., Citrobacter freundii, Clostridium) в диагностических концентрациях (82%).
Наличие гистидиндекарбоксилазной активности  было выявлено у  52 из 245 выделенных штаммов (21%). Признак образования гистидиндекарбоксилазы существенно различался у микроорганизмов различных групп: наибольшая способность утилизировать гистидин обнаруживался у аэробных грамотрицательных бактерий: Citrobacter freundii, P. mirabilis, K. pneumonia, K. oxytoca, E. coli с измененными свойствами (таблица 1).
При этом частота встречаемости гистидиндекарбоксилазной активности у микроорганизмов, выделенных от детей, заболевших атопическим дерматитом и не заболевших, различалась незначительно и составляла соответственно 24% и 19% (χ2=0,8; р=0,38).
Однако интенсивность гистаминообразования штаммов, выделенных от детей, заболевших в последующем атопическим дерматитом, отличалась от таковой у детей, не заболевших (ОШ=19,3; ДИ=4,2-87,6; χ2=20,4; р=0). Так, у детей, в дальнейшем заболевших атопическим дерматитом уже на первом месяце жизни выявлялись гистидиндекарбоксилирующие штаммы с высокой интенсивностью признака (на 3 и 4 балла) или несколько гистидиндекарбоксилирующих штаммов с незначительной интенсивностью (на 1 и 2 балла). Кроме того, отмечается тенденция к корреляции между интенсивностью признака гистаминообразования и временем манифестации заболевания (таблица 2). Наибольшей она оказалась у детей с манифестацией заболевания в первое полугодие жизни.
Таблица 1. Гистидиндекарбоксилазная активность кишечной микробиоты детей с наследственной предрасположенностью к аллергическим заболеваниям (качественная реакция)
Микроорганизмы
Абс.число/число гистаминоб.штаммов245/52
Положительная реакция(баллы)
1
2
3
4
Candida spp.
6/2
2
E. coli тип
64/2
2
E. сoli гемолиз
16/5
2
1
2
E. сoli лн
20/4
2
1
1
E. сoli лд
18/3
1
1
1
Staphylococcus aureus
15/3
2
1
Staphylococcus epiderm.
12/3
2
1
K. pneumonia
17/7
1
3
1
2
K. oxytoca
21/6
1
1
2
2
P. mirabilis
14/9
1
3
3
2
Enterobacter cloacae
10/2
1
1
Enterobacter aerogenes
9/2
1
1
Еnterobacter agglomerans
4/0
Citrobacter freundii
4/4
1
3
Enterococcus faecium
8/1
1
Enterococcus faecalis
7/0
Таблица 2. Выраженность признака гистаминообразования в зависимости от факта манифестации атопического дерматита и времени его возникновения
Количество штаммов и интенсивность продукции ими гистамина (в баллах)
Дети, заболевшие АтД (количество)
Дети, не заболевшие АтД (количество)
до 3-х месяцев (17)
3-6 месяцев (19)
6-12 месяцев (13)
старше года (2)
(19)
2 штамма4 Б+3-4 Б
высокая  интенсивность
2
2
2 штамма3 Б+ 2-3 Б
1
2
1
1 штамм4 Б
3
2
1
1 штамм3 Б
2
1
2
1
1
3 штамма1-2 Б
2
2
1
1 или 2 штамма1-2 Б
5
5
3
1
6
нет гистидиндекарб.штаммов
2
5
5
0
12
Использованные источники
1. Балаболкин И.И. и др. Метод раннего прогнозирования развития аллергических болезней у детей. – Вопросы охраны материнства, 1989, № 2, с.19-22.
2. Шамов Б.А., Шамова А.Г., Газиев А.Р., Газиева Э.Г. (Россия) // БИ. - 2007. - № 12.
3. Патент РФ № 2424528. «Способ прогнозирования развития аллергических заболеваний у детей раннего возраста». Джумагазиев А.А., Мясищева А.Б., Безрукова Д.А., Теплый Д.Л.
4. Патент РФ № 2521276. «Способ определения риска развития аллергической сенсибилизации у детей». Тутельян В.А., Мазо В.К., Зорин С.Н., Березина Е.Ю., Ревякина В.А., Гмошинская М.В.
5. Kjellman N.J.M., Croner S. Cord blood IgE determination for allergy prediction //Ann. Allergy. - 1984. - Vol.53, N2. - p.167-171.
6. Патент РФ № 2353927. «Способ прогнозирования развития атопического дерматита у детей раннего возраста». Ратникова С.Ю., Жукова Т.П., Конева Т.Г.
7. Патент РФ. «Способ прогнозирования развития атопического аллергического заболевания у новорожденного». Углева Т.Н., Балашова Т.Ф.
8. Патент РФ. «Способ прогнозирования развития аллергических реакций у детей раннего возраста». Погомий Н.Н., Святкина О.Б., Пампура А.Н., Чебуркин А.А., Морозова О.В., Окунева Т.С.
9. Патент РФ № 2519134. «Способ прогнозирования развития атопического дерматита у детей грудного возраста». Терещенко С.Ю., Новицкий И.А.
10. Куяров А.В. Микробная экология детей Севера (клиника нарушений, диагностика, коррекция): монография / А.В. Куяров, Г.Н. Куярова, Л.А. Клюева. – Ханты-Мансийск: Полиграфист, 2008. – 100 с.
11. Патент №2195666. «Способ комплексной диагностики аллергии у детей с инфекционной патологией». Мотавкина Н.С., Чубенко Г.И.
12. Воропаева Е.А. Микробная экология и гистаминобразующая активность микроорганизмов задней стенки глотки детей, больных бронхиальной астмой: дисс. ... канд. биол. наук. – М., 2002. – 139 с.
13. Куяров А.В. Роль нормальной микрофлоры и лизоцима в выборе пробиотических штаммов для профилактики аллергических заболеваний у студенческой молодежи севера: автореф.дис....канд. биол. наук: 03.01.06, 03.02.03 / Куяров Артем Александрович. – М., 2015. – 24 с.