ПОЛУЧЕНИЕ ГЕТЕРОМУЛЬТИМЕРНЫХ БЕЛКОВ

1. Способ получения гетеромультимерного белка, включающего первый полипептид, содержащий шарнирную область и имеющий первый домен гетеродимеризации, и второй полипептид, содержащий шарнирную область и имеющий второй домен гетеродимеризации, где указанный второй домен гетеродимеризации взаимодействует с указанным первым доменом гетеродимеризации, и где первый и второй полипептиды, содержащие шарнирную область, связаны друг с другом, по меньшей мере, одной межцепьевой дисульфидной связью; причем указанный способ включает стадии:
(a) получения очищенного первого полипептида, содержащего шарнирную область и имеющего первый домен гетеродимеризации;
(b) получения очищенного второго полипептида, содержащего шарнирную область и имеющего второй домен гетеродимеризации;
(c) объединения первого и второго полипептидов, содержащих шарнирную область;
in vitro
(d) рефолдинга первого полипептида, содержащего шарнирную область, со вторым полипептидом, содержащим шарнирную область,  в условиях, благоприятствующих мультимеризации выделенных полипептидов; и
(e) выделения комплекса гетеромультимерного белка.
2. Способ получения гетеромультимерного белка, включающего первый полипептид, содержащий шарнирную область и имеющий первый домен гетеродимеризации, и второй полипептид, содержащий шарнирную область и имеющий второй домен гетеродимеризации, где указанный второй домен гетеродимеризации взаимодействует с указанным первым доменом гетеродимеризации, и где первый и второй полипептиды, содержащие шарнирную область, связаны друг с другом, по меньшей мере, одной межцепьевой дисульфидной связью; причем указанный способ включает стадии:
(a) культивирования первой клетки-хозяина, содержащей первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, содержащий шарнирную область, в условиях, при которых экспрессируется полипептид, содержащий шарнирную область;
(b) культивирования второй клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, содержащий шарнирную область, в условиях, при которых экспрессируется полипептид, содержащий шарнирную область;
(c) разрушения клеточных мембран первой и второй клеток-хозяев, где указанные первая и вторая клетки-хозяева были объединены в одну суспензию; и
(d) выделения гетеромультимерного белка,
где указанный способ не требует добавления восстановителя.
3. Способ по п. 1 или 2, где указанный первый домен гетеродимеризации и указанный второй домен гетеродимеризации встречаются на интерфейсе, и присутствующая на интерфейсе часть второго домена гетеродимеризации содержит выступ, который быть помещен в полость в присутствующей на интерфейсе части первого домена гетеродимеризации.
4. Способ по п. 1 или 2, где указанный второй домен гетеродимеризации представляет собой Fc-полипептид, содержащий выступ, или указанный первый домен гетеродимеризации представляет собой Fc-полипептид, содержащий полость, или то и другое.
5. Способ по п. 1 или 2, где указанный первый Fc-полипептид и указанный второй Fc-полипептид встречаются на интерфейсе, где указанный интерфейс второго Fc-полипептида содержит выступ (узел), который может быть помещен в полость (дырку) интерфейса первого Fc-полипептида, и где указанные полость или выступ или то, и другое были введены в интерфейс первого и второго Fc-полипептидов, соответственно.
6. Способ по п. 1 или 2, где указанный первый домен гетеродимеризации и указанный второй домен гетеродимеризации содержат лейциновую застежку.
7. Способ по п. 1 или 2, где указанный первый домен гетеродимеризации и указанный второй домен гетеродимеризации содержат суперспирализованную спираль.
8. Способ по п. 1 или 2, где межцепьевая дисульфидная связь присутствует в шарнирной области антитела.
9. Способ по п. 1 или 2, где межцепьевая дисульфидная связь присутствует между шарнирными областями.
10. Способ по п. 1 или 2, где указанная дисульфидная связь является межмолекулярной.
11. Способ по п. 1 или 2, где указанная межмолекулярная дисульфидная связь присутствует между цистеинами двух полипептидных цепей иммуноглобулина, содержащих шарнирную область.
H
12. Способ по п. 1 или 2, где полипептид, содержащий шарнирную область, включает C-домен или его вариант.
13. Способ по п. 1 или 2, где полипептид, содержащий шаринирную область, включает Fc-область или ее вариант.
14. Способ по п. 1 или 2, где первый полипептид, содержащий шарнирную область, представляет собой тяжелую цепь антитела.
15. Способ по п. 1 или 2, где второй полипептид, содержащий шарнирную область, представляет собой тяжелую цепь антитела.
16. Способ по п. 1 или 2, где первый полипептид, содержащий шарнирную область, представляет собой тяжелую цепь антитела, которая спарена с легкой цепью антитела.
17. Способ по п. 1 или 2, где второй полипептид, содержащий шарнирную область, представляет собой тяжелую цепь антитела, которая спарена с легкой цепью антитела.
18. Способ по п. 16, где полипептид, содержащий шарнирную область, спарен с полипептидом легкой цепи антитела, с образованием мишень-связывающей «руки».
19. Способ по п. 17, где полипептид, содержащий шарнирную область, спарен с полипептидом легкой цепи антитела, с образованием мишень-связывающей «руки».
н
н
20. Способ по п. 1 или 2, где полипептиды, содержащие шарнирную область, включают, по меньшей мере, часть C2- и/или C3-домена человека.
21. Способ по п.1 или 2, где одна или обе пары полипептидов, содержащих шарнирную область, и полипептидов легкой цепи являются гуманизованными.
22. Способ по п. 2, где полипептиды, содержащие шарнирную область, и полипептиды легкой цепи кодируются отдельными экспрессионными плазмидами.
23. Способ по п. 2, где полипептиды, содержащие шарнирную область, и полипептиды легкой цепи кодируются одними и теми же экспрессионными плазмидами.
24. Способ по п. 2, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из прокариотических клеток, эукариотических клеток, клеток млекопитающих и клеток растений.
25. Способ по п. 2, где указанная клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку.
E. coli
26. Способ по п. 25, где указанная прокариотическая клетка представляет собой клетку .
E. coli
27. Способ по п. 26, где указанная клетка  является lpp-дефицитной.
28. Способ по п. 2, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего.
29. Способ по п. 28, где указанная клетка млекопитающих представляет собой клетку CHO.
30. Способ по п. 2, где первая клетка-хозяин и вторая клетка-хозяин находятся в отдельных клеточных культурах.
31. Способ по п. 2, где клетки стадий (a) и (b) присутствуют в смешанной культуре, содержащей обе клетки-хозяина.
32. Способ по п. 30, где клетки стадий (a) и (b) объединяют, центрифугируют и ресуспендируют в буфере перед разрушением клеточной мембраны.
33. Способ по п. 30, где клетки стадий (a) и (b) центрифугируют и ресуспендируют в буфере, а затем перед разрушением клеточной мембраны объединяют.
34. Способ по п. 2, где разрушение клеточной мембраны выбрано из группы, состоящей из сообщения клеточной мембране проницаемости и дезинтеграции клеточной мембраны.
35. Способ по п. 2, где разрушение клеточной мембраны выбрано из группы, состоящей из лизиса клеток, обработки ультразвуком, осмотического шока, пропускания через микрофлюидизатор, добавления EDTA, различных детергентов, растворителей (таких как толуол, диметилсульфксид и т.п.), поверхностно-активных веществ (таких как Triton-X 100, Tween 20 и т.п.) и гипотонических буферов, применения методов замораживания/оттаивания, электропорации и пропускания через шаровой гомогенизатор из нержавеющей стали.
36. Способ по п. 1 или 2, где стадия выделения также включает, по меньшей мере, одну стадию очистки.
37. Способ по п. 1 или 2, который также включает стадии:
(a) захвата указанного антитела на колонке, содержащей белок А;
(b) элюирования указанного антитела с указанной колонки, и
(c) разведения указанного элюированного антитела в растворе, содержащем хаотропный агент или слабый детергент.
38. Способ по п. 1 или 2, где указанный гетеромультимерный белок выбран из группы, состоящей из антитела, биспецифического антитела, мультиспецифического антитела, антитела с одной «рукой», мультиспецифического одновалентного антитела, биспецифического максиантитела, моноантитела, иммуноадгезина, пептидного антитела, биспецифического пептидного антитела, одновалентного пептидного антитела и аффинного антитела.
39. Способ по п. 38, где указанный гетеромультимерный белок представляет собой антитело.
40. Способ по п. 38, где указанный гетеромультимерный белок представляет собой биспецифическое антитело.
41. Способ по п. 38, где указанный гетеромультимерный белок представляет собой мультиспецифическое антитело.
42. Способ по п. 38, где указанный гетеромультимерный белок представляет собой антитело с одной «рукой».
43. Способ по п. 38, где указанное антитело содержит константный домен тяжелой цепи и константный домен легкой цепи.
44. Способ по п. 38, где указанное антитело является гуманизованным.
45. Способ по п. 38, где указанное антитело представляет собой полноразмерное антитело.
46. Способ по п. 45, где указанное полноразмерное антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь.
47. Способ по п. 16, где одна или обе пары полипептидов тяжелой и легкой цепей являются человеческими.
48. Способ по п. 17, где одна или обе пары полипептидов тяжелой и легкой цепей являются человеческими.
49. Способ по п. 38, где указанное антитело является человеческим.
H
H
50. Способ по п. 38, где указанное антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий, по меньшей мере, часть C2- и/или C3-домена человеческого антитела.
51. Способ по п. 50, где указанный фрагмент антитела представляет собой Fc-слитыйный полипептид.
52. Способ по п. 38, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из IgG, IgA и IgD.
53. Способ по п. 52, где указанное антитело представляет собой IgG.
54. Способ по п. 53, где указанное антитело представляет собой IgG1.
55. Способ по п. 53, где указанное антитело представляет собой IgG2.
56. Способ по п. 38, где указанное антитело представляет собой терапевтическое антитело.
57. Способ по п. 38, где указанное антитело представляет собой антитело-агонист.
58. Способ по п. 38, где указанное антитело представляет собой антитело-антагонист.
59. Способ по п. 38, где указанное антитело представляет собой диагностическое антитело.
60. Способ по п. 38, где указанное антитело представляет собой блокирующее антитело.
61. Способ по п. 38, где указанное антитело представляет собой нейтрализующее антитело.
62. Способ по п. 38, где указанное антитело обладает способностью связываться с опухолевым антигеном.
63. Способ по п. 62, где указанный опухолевый антиген не является молекулой клеточной поверхности.
64. Способ по п. 62, где указанный опухолевый антиген не является фактором дифференцировки кластеров.
65. Способ по п. 38, где указанное антитело обладает способностью связываться с фактором дифференцировки кластеров.
66. Способ по п. 38, где указанное антитело обладает способностью связываться с фактором регуляции выживания клеток.
67. Способ по п. 38, где указанное антитело обладает способностью специфически связываться с фактором регуляции пролиферации клеток.
68. Способ по п. 38, где указанное антитело обладает способностью связываться с молекулой, ассоциированной с развитием или дифференцировкой ткани.
69. Способ по п. 38, где указанное антитело обладает способностью связываться с молекулой клеточной поверхности.
70. Способ по п. 38, где указанное антитело обладает способностью связываться с лимфокином.
71. Способ по п. 38, где легкие цепи первой пары и второй пары содержат различные последовательности вариабельных доменов.
72. Способ по п. 38, где, по меньшей мере, 45% полипептидов образуют указанное биспецифическое антитело.
73. Способ по п. 40, где указанное биспецифическое антитело обладает способностью специфически связываться с двумя молекулами-мишенями.
74. Способ по п. 73, где первая «рука» специфически связывается с первой молекулой-мишенью, а вторая «рука» специфически связывается со второй молекулой-мишенью.
75. Способ по п. 1 или 2, где, по меньшей мере, 45% полипептидов присутствуют в комплексе, включающем первый полипептид, содержащий шарнирную область, и пару легких цепей, и второй полипептид, содержащий шарнирную область, и пару легких цепей.
76. Способ по п. 1 или 2, где до проведения стадии очистки антител не более чем 10% выделенных полипептидов присутствует в виде мономеров или гомодимеров.
77. Способ по п. 73, где легкие цепи первой пары и второй пары содержат различные последовательности вариабельных доменов.
78. Способ по п. 73, где первая и вторая пара «тяжелая цепь-легкая цепь» содержат тяжелые и легкие цепи, связанные друг с другом дисульфидной связью.
79. Способ по п. 73, где разница величин pI между первой парой и второй парой составляет, по меньшей мере, 0,5.
80. Гетеромультимерный белок, полученный способом по любому из пп. 1 и 2.
81. Гетеромультимерный белок по п. 80, где указанный гетеромультимерный белок представляет собой мультиспецифическое антитело.
82. Гетеромультимерный белок по п. 80, где указанный гетеромультимерный белок обладает способностью связываться, по меньшей мере, с 2 молекулами-мишенями.
83. Гетеромультимерный белок по п. 80, где указанный гетеромультимерный белок представляет собой антитело, способное связываться, по меньшей мере, с 2 эпитопами на одном и том же антигене.
84. Биспецифическое антитело, полученное способом по п. 1 или 2.
85. Биспецифическое антитело, содержащее первую пару полипептидов тяжелой и легкой цепей и вторую пару полипептидов тяжелой и легкой цепей, где полипептиды легкой цепи содержат различные последовательности вариабельных доменов.
86. Композиция, содержащая гетеромультимерный белок по п. 80 и носитель.
87. Композиция, содержащая, по меньшей мере, 10% гетеромультимерного белка по п.80.
88. Фармацевтическая композиция, содержащая гетеромультимерный белок по п.80.
89. Способ создания комбинаторной библиотеки гетеромультимерных белков, включающей первый полипептид, содержащий шарнирную область и имеющий первый домен гетеродимеризации, и второй полипептид, содержащий шарнирную область и имеющий второй домен гетеродимеризации, где указанный второй домен гетеродимеризации взаимодействует с указанным первым доменом гетеродимеризации, и где первый и второй полипептиды, содержащие шарнирную область, связаны друг с другом, по меньшей мере, одной межцепьевой дисульфидной связью; причем,указанный способ включает стадии:
(a) культивирования первой клетки-хозяина и, по меньшей мере, двух дополнительных клеток-хозяев, где:
i. указанная первая клетка-хозяин включает первую нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий первый домен гетеродимеризации, и
ii. указанные дополнительные клетки-хозяева включают нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий второй домен гетеродимеризации,
(b) разрушения клеточных мембран первой клетки-хозяина и, по меньшей мере, двух дополнительных клеток-хозяев так, чтобы полипептиды, содержащие первый и второй домены гетеродимеризации, высвобождались во внеклеточную среду, где указанная первая клетка-хозяин и указанные, по меньшей мере, две дополнительных клетки-хозяина были объединены вместе в одной суспензии; и
(c) выделения комплексов гетеромультимерных белков,
где указанный способ не требует добавления восстановителя.
90. Способ по п. 1 или 2, где первый полипептид, содержащий шарнирную область, спарен с полипептидом легкой цепи антитела с образованием первой мишень-связывающей «руки», а второй полипептид, содержащий шарнирную область, спарен с полипептидом легкой цепи антитела с образованием второй мишень-связывающей «руки».
91. Способ по п. 90, где каждая связывающая «рука» или обе связывающих «руки» могут связываться более чем с одной мишенью.