Оценка устойчивости штаммов ризобий сои к различным концентрациям молибдата аммония

Вестник ДВО РАН. 2017. № 3

УДК 633.853.52:631.468:576.8 М.В. ЯКИМЕНКО, С.А. БЕГУН

Оценка устойчивости штаммов

сои к различным концентрациям молибдата аммония

Представлены результаты исследований влияния различных концентраций соли молибдена на рост чистых культур ризобий и развитие растений сои. Установлено, что чем ниже доза молибдата аммония в среде, тем выше показатели роста бактериальной массы. Доза соли молибдена 25 г/л вызывает в большинстве случаев гибель коллекционных штаммов клубеньковых бактерий сои. Штаммы ризобий сои вида Sinorhizobium fredii (Scholia, Elkan, 1984) являются более устойчивыми к внесению соли молибдена в среду, чем Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982). Минимальные дозы молибдата аммония (0,1 и 1,0 г/л) в контролируемых условиях помимо заметного ухудшения развития растений вызывают резкое угнетение корневой системы сои.

Ключевые слова: соя, штаммы, ризобии, соль молибдена.

Assessment of resistance of strains of soybean rhyzobia to different concentrations of ammonium molybdate.

M.V. YAKIMENKO, S.A. BEGUN (All-Russian Scientific Research Institute of Soybean, Blagoveshchensk).

Research results on the influence of various molybdenum salt concentrations on growth of pure rhyzobia cultures and development of soybean plants are presented. It is established that the lower is ammonium molybdate dose in the environment, the higher is growth performance of bacterial weight. The dose of molybdenum salt 25 g/l in most cases causes death of collection strains of soybean nodule bacteria. Soybean rhyzobia strains of Sinorhizobium fredii species (Scholla, Elkan, 1984) are more resistant to introduction of molybdenum salt in the environment than Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982). Minimum doses of Ammonium molybdate (0.1 and 1.0 g/l) in controlled conditions, besides noticeable deterioration in development ofplants, cause sharp oppression of soybean root system.

Key words: soybean, strains, rhyzobia, molybdate salt.

Одним из важных элементов технологии усиления симбиотической азотфикса-ции в посевах сои является применение молибденовых удобрений для предпосевной обработки семян [2, 3]. Однако рекомендуемые дозы этого микроэлемента могут отрицательно влиять на выживаемость чистых культур ризобий сои [4]. Цель наших исследований - изучить влияние различных концентраций соли молибдена на рост чистых культур ризобий и развитие растений сои.

Методы исследований

При изучении влияния возрастающих доз молибдата аммония на интенсивность роста штриха чистых культур ризобий сои использовали агаризованную минерально-растительную среду (МРС) с соевой мукой следующего состава (г/л): К2НРО4 - 0,5; КН2РО4 - 0,5; MgSО4 - 0,1; CaSO4 - 0,1; NaCl - 0,2; маннит - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 20,0. Молибдат аммония вносили в питательную среду в концентрациях 0-25 г/л.

*ЯКИМЕНКО Мария Владимировна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, БЕГУН Степан Алексеевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (Всероссийский научно-исследовательский институт сои, Благовещенск). *Е-таП: mariy-y@yandex.ru

ризобий

Питательную среду разливали по пробиркам и стерилизовали в автоклаве при 1,0 атм. в течение 30 мин. Каждый коллекционный штамм чистой культуры ризобий пересевали в 2 пробирки на косяк агаризованной среды МРС. Пробирки с засеянными культурами бактерий термостатировали при оптимальной (+27 ± 1 °С) температуре в течение 3-10 сут. Отмечали интенсивность роста штриха штаммов ризобий, которая обозначалась в баллах: 1- скудный, 2 - умеренный, 3 - хороший, 4 - обильный рост [1].

Результаты и обсуждение

На первом этапе изучали влияние возрастающих доз молибдата аммония на интенсивность роста чистых культур ризобий сои видов Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982) и Sinorhizobium fredii (Scholia, Elkan, 1984). Питательная минерально-растительная среда имела следующий состав, г/л: K2HPO4 - 0,5; KH2PO4 - 0,5; MgSO4 - 0,1; CaSO4 - 0,1; NaCl - 0,2; (NH4)6Mo7O24 x 4Н2О - 0; 0,2; 1,0; 5,0; 10,0; 25,0; соевая мука - 10,0; маннит -20,0; агар-агар - 20,0. Установлено, что невысокие дозы соли молибдена (0,2 и 1,0 г/л) не угнетали интенсивность роста чистых культур штаммов ризобий сои (табл. 1). Доза соли молибдена 10 г/л в питательной среде вызывала гибель ризобий сои вида B. japonicum и несколько тормозила рост штаммов быстрорастущего вида S. fredii. Доза соли молибдена 25 г/л вызывала гибель не только штаммов B. japonicum, но и штамма ББ-49, отнесенного к виду S. fredii.

В последующих лабораторных опытах изучили и отобрали штаммы ризобий сои, устойчивых к дозам молибдена, используемым для предпосевной обработки семян сои (табл. 2).

Таблица 2

Интенсивность роста (в баллах) штаммов ризобий сои В. }аротсит и Я. /ге&1 в агаризованной МРС с маннитом при разных концентрациях соли молибдена

Штамм B. japonicum Интенсивность роста при концентрации соли молибдена, г/л Штамм S. fredii Интенсивность роста при концентрации соли молибдена, г/л

0 10,0 25,0 0 10,0 25,0

648а 3 0 0 ЗБ-73 3 1 0

АС-17 3 1 0 071 3 3 1

ММ-117 3 1 0 ББ-55 4 2 0

ТА-40 3 1 0 КБ-24 3 2 0

ТА-125р 2 1 1 СБ-51 1 1 0

БМ-85 3 1 0 КБ-11 3 2 0

АС-26 3 2 2 МБ-85 4 2 1

БуД-63 3 2 1 ББ-87 3 2 1

МиД-10 3 1 1 ТБ-642 3 1 0

ТМ-437 2 1 1 ТБ-643 4 2 2

639а 3 3 1 ТБ-508 4 3 2

БМ-99 2 1 0 ТБ-467 3 2 1

ТА-125 2 2 2 ТБ-490 3 2 2

ВМ-8 2 1 1 ББ-49 4 4 1

ЕМ-7 3 2 0 ББ-90 3 3 2

БМ-58 2 1 0 БД-32 3 0 0

ЗМ-75 2 1 0

СМ-42 3 0 0

Таблица 1

Интенсивность роста (в баллах) штаммов ризобий сои в агаризованной МРС при разных концентрациях соли молибдена

Доза соли B. japonicum S. fredii

молибдена, г/л 648а СМ-42 ББ-49 МБ-85

0 4 4 4 4

0,2 4 4 4 4

1,0 3 4 4 4

10,0 0 0 3 3

25,0 0 0 0 1

Установлено, что повышенные концентрации соли молибдена в питательной среде снижают интенсивность роста чистых культур ризобий обоих видов. Культурами, способными расти при концентрации соли молибдена 25 г/л, оказались штаммы АС-26 и ТА-125 (B. japonicum), а также ТБ-643, ТБ-508, ТБ-490, ББ-90 (S. fredii). Поскольку такая доза соли молибдена в большинстве случаев вызывает гибель коллекционных штаммов клубеньковых бактерий сои, изучалась устойчивость штаммов при внесении в питательную среду молибдата аммония в количестве 10 г/л. При такой дозе резко снижается хороший рост бактериальной массы. Из 30 штаммов ризобий вида B. japonicum 63 % культур гибнет или дает скудный рост бактериальной массы. Кроме того, у ряда штаммов изменяются окраска и консистенция бактериальной массы при внесении в агаризованную средумолибдата аммония. В то же время для штаммов ризобий сои 639а, 648а, АС-17, 044, ТА-125, ТМ-464, БМ-68, БМ-83, БМ-91, ВМ-13, ОМ-38 интенсивность роста снизилась незначительно (табл. 3).

Таблица 3

Оценка устойчивости (в баллах) штаммов ризобий сои видов B. japonicum и S. fredii по интенсивности роста штриха на агаризованной МРС с маннитом и молибдатом аммония

Штамм B. При концентрации молибдата аммония, г/л Штамм S. fredii При концентрации молибдата аммония, г/л

japonicum 0 10,0 0 10,0

639а* 3 2 БД-32* 3 3

648а* 4 3 ББ-49* 4 3

АС-17* 3 3 КБ-11* 4 1

СМ-42** 3 1 ББ-55* 4 0

БМ-85** 3 1 ТБ-467* 4 1

ММ-117** 4 1 ТБ-508* 4 3

044 3 2 ТБ-643* 4 3

052 1 0 ТБ-372 4 1

854 3 1 ТБ-376 4 1

092 4 1 ТБ-407 4 2

095 3 0 ТБ-461 4 2

ТА-40 4 1 ТБ-498 4 2

ТА-125 2 2 ТБ-488 4 2

ТМ-412 3 1 ТБ-490 4 3

ТМ-455 3 1 ТБ-496 4 1

ТМ-464 4 3 ТБ-518 4 1

ТМ-570 3 1 ТБ-640 4 2

ТМ-578 3 1 ТБ-642 3 1

БД-43 4 1 061 3 3

БМ-68 3 2 062 3 3

БМ-83 4 3 065 4 2

БМ-91 4 2 071 4 3

ВМ-6 3 1 ББ-90 4 3

ВМ-13 3 2 ЗБ-73 2 1

АС-26 2 1 ЗБ-75 4 1

СМ-40 3 1 СБ-39 4 2

ЗМ-72 1 0 СБ-51 2 1

ЗМ-80 1 1 МБ-85 4 2

ОМ-38 4 2 МБ-139 4 2

ММ-123 4 1

Сумма баллов 92 42 Сумма баллов 108 55

*Получены авторские свидетельства на штаммы в 1982-1989 гг. **Получены патенты на штаммы в 2014-2016 гг.

Внесение в питательную среду 10 г/л молибдата аммония приводит к снижению в среднем в 2 раза интенсивности роста штаммов ризобий сои обоих видов. Если без молибдата аммония 79 % штаммов ризобий X fredii давали обильный рост бактериальной массы, то при внесении в среду 10 г/л соли молибдена штаммов с обильным ростом не оказалось, 38 % штаммов дали скудный рост бактериальной массы. Штамм ББ-55 погиб. Способность к хорошему росту бактериальной массы показали 9 штаммов: БД-32, ББ-49, ТБ-508, ТБ-643, ТБ-490, 061, 062, 071, ББ-90 (табл. 3).

В серии лабораторных опытов испытали 173 штамма ризобий сои вида В. japonicum и 96 штаммов вида & fredii на агаризованной МРС с внесением 5 г/л молибдата аммония. Все штаммы ризобий обоих видов показали обильный и хороший рост бактериальной массы на питательной среде без соли молибдена. При внесении в питательную среду 5 г/л молибдата аммония 50 % штаммов ризобий сои вида В. japonicum дали хороший рост бактериальной массы. В то же время 18 % штаммов погибли, а 32 % резко затормозили рост бактериальной массы. При этом некоторые штаммы показали усыхающий рост бактериальной массы (табл. 4).

Анализ быстрорастущего вида ризобий & fredii выявил, что на контрольной среде (МРС без соли молибдена) 81 % штаммов дали обильный, а остальные 19 % - хороший рост бактериальной массы. При внесении в питательную среду 5 г/л соли молибдата аммония интенсивность роста штаммов замедлилась. Исчезли штаммы ризобий, дающие обильный рост, однако 73 % штаммов этого вида показали хороший рост бактериальной массы, 3 % погибли или дали скудный рост. Выявлена группа штаммов & fredii с усыхающим штрихом через 10-15 сут после посева, хотя на 3-7-е сутки эти штаммы демонстрировали хороший рост без признаков усыхания бактериальной массы.

В 2016 г. лабораторные опыты были продолжены на питательной среде с 1 г/л молибдата аммония. Испытывали 24 штамма ризобий сои вида В. japonicum и 18 штаммов - & fredii. Установлено, что 92 % штаммов ризобий сои вида В. japonicum и 94 % штаммов вида & fredii обладают обильным и хорошим ростом бактериальной массы на МРС без молибдена. Внесение в питательную среду 1 г/л соли молибдена замедляет рост бактериальной массы анализируемых штаммов ризобий обоих видов. 17 штаммов ризобий вида & fredii дали умеренный или хороший, 1 штамм - обильный рост бактериальной массы (табл. 5).

Изучали влияние минимальных доз молибдата аммония (0,1 и 1,0 г/л) в питательной среде на вирулентность штамма 648а, интенсивность клубенькоо-бразования и состояние растений сои сорта Гармония.

Таблица 4

Характеристика роста коллекционных штаммов ризобий сои видов В. }аротсит (в числителе) и 8./тейи (в знаменателе) на МРС без молибдена и с молибдатом аммония

Интенсивность роста штаммов Количество штаммов в испытании, шт. % штаммов при концентрации молибдата аммония, г/л

0 5,0

Нет роста 0 / 0 0 / 0 18 / 3

Скудный 0 / 0 0 / 0 10 / 5

Умеренный 0 / 0 0 / 0 22 / 19

Хороший 163 / 18 94 / 19 50 / 73

Обильный 10 / 78 6 / 81 0 / 0

Всего штаммов 173 / 96 100 / 100 100 / 100

Таблица 5

Характеристика роста коллекционных штаммов ризобий сои видов В. }аротсит (в числителе) и Я. /гейИ (в знаменателе) на МРС без молибдена и с молибдатом аммония

Интенсивность роста штаммов Количество штаммов в испытании, шт. % штаммов при концентрации молибдата аммония, г/л

0 1,0

Нет роста 0 / 0 0 / 0 0 / 3

Скудный 0 / 0 0 / 0 8 / 5

Умеренный 2 / 1 8 / 6 63 / 39

Хороший 21 / 9 88 / 50 29 / 55

Обильный 1 / 8 4 / 44 0 / 6

Всего штаммов 24 / 18 100 / 100 100 / 100

Таблица 6

Влияние молибдата аммония в питательной среде на состояние растений сои

Показатель При концентрации молибдата аммония, г/л

0 0,1 1,0

Длина проростка на 7-е сутки

после всходов, см 5,8 / 6,8 3,4 / 5,9 1,3 / 2,1

Показатели на 20-е сутки после всходов

Высота надземной части, см 27,0 / 26,8 15,8 / 15,5 2,9 / 2,5

Длина корня, см 18,0 / 17,6 11,7 / 12,7 3,7 / 3,3

Количество клубеньков, шт/раст. 0 / 2,3 0 / 0,2 0 / 0

Состояние корневой системы Корни Корни светло- Корни темные,

белые, без коричневые, с с сильными

повреждений повреждениями повреждениями

Установлено, что в контролируемых условиях внесение в питательную среду минимальных доз молибдата аммония вызывает резкое ухудшение развития растений (табл. 6).

В контрольных опытах без молибдена (с инокуляцией штаммом 648а и без нее) длина проростка на 7-е сутки, а также высота надземной части и длина корня сои на 20-е сутки после всходов были в очень близких пределах. В варианте с инокуляцией штаммом на корнях сои образовались клубеньки. Состояние корневой части было хорошее. При внесении в питательную среду 0,1 г/л молибдата аммония показатели развития растений заметно ухудшились. Корневая система сои приобрела светло-коричневую окраску с явными признаками деформации. При внесении в питательную среду 1 г/л молибдата аммония показатели развития растений сои снизились в 3-10 раз, клубеньки на корнях сои не образовывались. Корневая система на 20-е сутки выращивания растений приобрела темную окраску, сильные повреждения и деформации.

Выводы

В результате проведенных экспериментов установлено, что чем ниже доза молибдата аммония в питательной среде, тем меньше его влияние на показатели роста бактериальной массы. Для интенсивности роста штаммов ризобий сои видов В. japonicum и & fredii безопасной дозой можно считать 1,0 г/л. Доза 25 г/л приводит в большинстве случаев к гибели коллекционных штаммов клубеньковых бактерий сои. Штаммы ризобий сои вида & fredii являются более устойчивыми к внесению соли молибдена в среду по сравнению с В. japonicum.

Показано, что дозы молибдата аммония 0,1 и 1,0 г/л в контролируемых условиях помимо заметного ухудшения развития растений вызывают резкое угнетение корневой системы сои.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бегун С.А., Тильба В.А. Способы, приемы изучения и отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Методы аналитической селекции. Благовещенск: Зея, 2005. 70 с.

2. Голов В.И. Почвенно-агрохимические и экологические основы применения удобрений, содержащих серу и микроэлементы: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Владивосток: Дальнаука, 1997. 39 с.

3. Тильба В.А., Бегун С.А. Влияние молибдена на титр клубеньковых бактерий сои // Вопр. генетики и микробиологии сои: науч.-техн. бюл. ВНИИ сои. 1981. Вып. 30/31. С. 73-77.

4. Тильба В.А., Бегун С.А., Якименко М.В. Роль молибдена в образовании клубеньков у некоторых сортов сои в контролируемых условиях // Земледелие. 2012. № 7. С. 45-46.