A
ПРИМЕНЕНИЕ МОДУЛЯТОРОВ GABA-РЕЦЕПТОРА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗУДА
A
USE OF GABA-RECEPTOR MODULATORS FOR TREATMENT OF ITCH

Область техники, к которой относится изобретение
A
Настоящее изобретение относится к применению положительных аллостерических модуляторов α2- и α3-GABA-рецепторов для лечения зуда.
Предпосылки изобретения
Зуд (лат. pruritus) представляет собой неприятное ощущение на коже, которое вызывает желание чесаться. Интенсивность зуда может быть слабой, умеренной или сильной, приводящей к расстройствам сна, дискомфорту и увеличенной раздражительности или общему стрессу. Симптомы генерализованного зуда могут быть связаны с рядом разных причин. Зуд может быть спровоцирован или усилен рядом химических веществ, таких как гистамин, простагландины, протеазы, цитокины, нейропептиды, в частности вещество Р, и соли желчных кислот. Некоторые из веществ действуют непосредственно на свободное нервное окончание, тогда как другие действуют опосредованно посредством тучных клеток или других клеток. Факторы, которые, как считается, усиливают ощущение зуда, включают сухость эпидермиса и дермы, аноксию тканей, расширение капилляров, раздражающие стимулы, первичные кожные заболевания и психические расстройства.
Зудящее ощущение передается от периферических нервов через дорсальный рог спинного мозга в головной мозг. Однако тормозные рецепторы, присутствующие в нервных волокнах, вовлеченных в передачу сигнала зуда в головной мозг, недостаточно изучены, хотя они могут представлять собой перспективную мишень лекарственного средства для облегчения зудящего ощущения независимо от причины. Большинство случаев зуда лечат с помощью Н1-антигистаминов, которые гарантированно действуют, если причина зуда связана с гистамином. Частые причины гистамин-независимого зуда включают без ограничения атопический дерматит, заболевания почек или печени и лечение опиоидами. Другие лекарственные препараты, применяемые против зуда, представляют собой кортикостероиды, габапентиноиды, антагонисты опиоидных рецепторов, капсаицин и местные анестетики, которые либо предназначены только для местного применения, либо могут иметь нежелательные побочные эффекты при их системном применении.
Задача, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в обеспечении альтернативных способов лечения зуда, в частности случаев зуда, не поддающихся лечению антигистаминами. Эту задачу решают с помощью объектов независимых пунктов формулы изобретения.
Сущность изобретения
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения представлено соединение для применения в лечении зуда, предусматривающее:
общую формулу
общую формулу  или
общую формулу  в частности формулу (1а) и (1b), более конкретно (1а), где
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
- X, X, X, X и X независимо друг от друга представляют собой -С, -N, -S или -О, где по меньшей мере два из X, X, X, X и X представляют собой -N,
1
2
- Y и Y независимо друг от друга представляют собой -С или -N,
1
m
- m для R равняется 1,
1
3
3
6
6
- R представляет собой замещенный или незамещенный Сарил или -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил,
2
n
- n для R равняется 1 или 2,
2
2
4
4
3
8
1
6
1
6
6
2
4
- каждый R независимо от любого другого R представляет собой замещенный или незамещенный С-Сциклоалкил, замещенный или незамещенный C-Салкил, замещенный или незамещенный C-Сспирт, замещенный или незамещенный Сгетероарил, галоген, в частности -F, или -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил,
1
2
3
4
5
- Z, Z, Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -С, -N, -S или -О,
1
2
3
7
7
- А, А и А независимо друг от друга представляют собой -С, -N или -(C=O)-O-R, при этом R представляет собой алкил,
5
I
- I для R равняется 1 или 2,
5
1
4
- каждый R независимо от каждого другого представляет собой С-Салкинил или галоген, в частности -Cl,
6
k
- k для R равняется 1, 2, 3 или 4, в частности 1 или 2,
6
1
3
- каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
1
6
2
1
4
C-Салкил в контексте настоящего описания означает насыщенный линейный или разветвленный углеводород с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомами углерода, при этом одна углерод- углеродная связь может быть ненасыщенной, и один фрагмент СН может быть заменен на кислород (эфирный мостик). Неограничивающие примеры C-Салкила представляют собой метил, этил, пропил, проп-2-енил, н-бутил, 2-метилпропил, трет-бутил, бут-3-енил, проп-2-инил и бут-3-инил.
5
10
Термин «арил» в контексте настоящего описания означает циклический ароматический С- Суглеводород. Примеры арила включают без ограничения фенил, нафтил и гетероарил. Гетероарил в контексте настоящего изобретения представляет собой арил, который содержит один или несколько атомов азота, кислорода и/или серы. Примеры гетероарила включают без ограничения пиррол, тиофен, фуран, имидазол, пиразол, тиазол, оксазол, пиридин, пиримидин, тиазин, хинолин, бензофуран и индол. Арил или гетероарил в контексте настоящего изобретения дополнительно могут быть замещены одной или несколькими алкильными группами.
Применяемый в данном документе термин "арил" относится к углеводороду с чередующимися двойными и одинарными связями между атомами углерода, образующими кольцевую структуру (в дальнейшем "ароматический углеводород"). Термин "гетероарил" относится к арильным соединениям, в которых по меньшей мере один атом углерода заменен атомом кислорода, азота или серы. Ароматический углеводород может быть нейтральным или заряженным. Примеры арильных или гетероарильных групп представляют собой бензол, пиридин, пиррол или циклопента-1,3-диен-анион. Арильные или гетероарильные группы, применяемые в данном документе, могут необязательно включать дополнительные группы-заместители.
В контексте настоящего описания термин аллостерический модулятор применяют в его значении, известном в области биохимии и фармакологии; он относится к веществу, которое опосредованно модулирует эффекты агониста на рецептор. Положительный аллостерический модулятор вызывает усиление эффекта агониста, при этом не оказывая собственного эффекта в отсутствие агониста. Аллостерический модулятор связывается с участком, отличным от участка (аллостерического) связывания агониста.
A
B
A
A
1-6
1-3
1-3
1-3
A
A
A
В контексте настоящего описания термин GABA-рецептор применяют в его значении, известном в области биохимии; он относится к рецепторам тормозного нейромедиатора гамма-аминомасляной кислоты (GABA). Известны два основных типа GABA-рецепторов, GABA-рецепторы (ионотропные рецепторы), представляющие собой лиганд-управляемые ионные каналы, и GABA-рецепторы, также известные как метаботропные рецепторы, представляющие собой G-белок-сопряженные рецепторы. GABA-рецепторы являются наиболее распространенными и наиболее важными тормозными рецепторами в центральной нервной системе. GABA-рецепторы содержат пять субъединиц, которые сгруппированы в восемь классов: α, β, γ, δ, ε, π, θ и ρ. Большинство рецепторов GABA содержат две α, две β и одну γ субъединицы. Разные типы субъединиц α придают GABA-рецептору разные свойства. В то время как субъединица α1 среди прочих функций ответственна за седативный эффект бензодиазепинов, субъединица α2 связана с анксиолитической функцией рецепторов, а субъединица α3 придает GABA-рецептору свойства мышечной релаксации.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
1
1
6
3
3
6
2
2
2
4
4
m
n
3
8
1
6
1
6
6
2
4
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу (1а), где X, X, X, X и X независимо друг от друга представляют собой -С, -N, -S или -О, где по меньшей мере два из X, X, X, X и X представляют собой -N, Y и Y независимо друг от друга представляют собой -С или -N, m для R равняется 1, R представляет собой замещенный или незамещенный Сарил или -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, n для R равняется 1 или 2, каждый R независимо от любого другого R представляет собой замещенный или незамещенный С-Сциклоалкил, замещенный или незамещенный C-Салкил, замещенный или незамещенный C-Сспирт, замещенный или незамещенный Сгетероарил, галоген, в частности -F, или -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил.
3
4
5
1
2
3
7
7
5
5
6
6
I
1
4
k
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу (1b), где Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -С, -N, -S или -О, А, А и А независимо друг от друга представляют собой -С, -N или -(С=O)-O-R, при этом R представляет собой алкил, I для R равняется 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой С-Салкинил или галоген, в частности -Cl, k для R равняется 1, 2, 3 или 4, в частности 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
1
2
3
4
5
5
5
6
6
I
1
4
k
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу (1с), где Z, Z, Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -С, -N, -S или -О, I для R равняется 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой С-Салкинил или галоген, в частности -Cl, k для R равняется 1, 2, 3 или 4, в частности 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
A
В определенных вариантах осуществления соединение представляет собой положительный аллостерический модулятор а2- и/или а3-GABA-рецептора.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
1
1
3
3
6
2
2
2
4
4
1
2
3
4
5
1
2
3
7
7
5
5
6
6
m
6
n
3
8
1
6
1
6
6
2
4
I
1
4
k
1
3
В определенных вариантах осуществления соединение для применения в лечении зуда предусматривает общую формулу (1а), общую формулу (1b) или общую формулу (1с), где X, X, X, X и X независимо друг от друга представляют собой -С, -N, где по меньшей мере два из X, X, X, X и X представляют собой -N, Y и Y независимо друг от друга представляют собой -С или -N, m для R равняется 1, R представляет собой замещенный или незамещенный Сарил или -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, n для R равняется 1 или 2, каждый R независимо от любого другого R представляет собой замещенный или незамещенный С-Сциклоалкил, замещенный или незамещенный С-Салкил, замещенный или незамещенный C-Сспирт, замещенный или незамещенный Сгетероарил, галоген, в частности -F, или -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, Z, Z, Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -С, -N или -О, А, А и Анезависимо друг от друга представляют собой -С, -N или -(C=O)-O-R, при этом R представляет собой алкил, I для R равняется 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой С-Салкинил или галоген, в частности -Cl, k для R равняется 1, 2, 3 или 4, каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
1
1
3
3
2
2
2
4
4
m
6
6
n
3
8
1
6
1
6
6
2
4
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу (1а), где X, X, X, X и X независимо друг от друга представляют собой -С или -N, где по меньшей мере два из X, X, X, X и X представляют собой -N, Y и Y независимо друг от друга представляют собой -С или -N, m для R равняется 1, R представляет собой замещенный или незамещенный Сарил или -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, n для R равняется 1 или 2, каждый R независимо от любого другого R представляет собой замещенный или незамещенный С-Сциклоалкил, замещенный или незамещенный C-Салкил, замещенный или незамещенный C-Сспирт, замещенный или незамещенный Сгетероарил, галоген, в частности -F, или -О-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил.
3
4
5
1
2
3
7
7
5
5
6
6
I
1
4
k
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу (1b), где Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -С или -N, А, А и А независимо друг от друга представляют собой -С, -N или -(C=O)-O-R, при этом R представляет собой алкил, I для R равняется 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой С-Салкинил или галоген, в частности -Cl, k для R равняется 1, 2, 3 или 4, в частности 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
1
2
3
4
5
5
5
6
6
I
1
4
k
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу (1с), где Z, Z, Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -С, -N или -О, I для R равняется 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой C-Салкинил или галоген, в частности -Cl, k для R равняется 1, 2, 3 или 4, в частности 1 или 2, каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2), (3), (4), (5), (6) или (7):
1
2
1
4
5
1
1
3
2
2
4
5
5
6
6
1
2
3
m
n
I
k
при этом Y, Y, Z, Z, Z, m для R, R, R, n для R, R, R, I для R, R, k для R, R, А, А и А имеют такое же значение, как определено выше.
1
2
1
1
3
2
2
4
m
n
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2), (3), (4) или (5), при этом Y, Y, m для R, R, R, n для R, R и R имеют такое же значение, как определено выше.
1
4
5
5
5
6
6
I
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (6), при этом Z, Z, Z, I для R, R, k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
4
5
5
5
6
6
1
2
3
I
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (7), при этом Z, Z, I для R, R, k для R, R, А, А и А имеют такое же значение, как определено выше.
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а), (3а), (4а), (5а), (5b), (6а), (6b) или (7а):
1
1
3
2
2
4
5
5
6
6
m
n
I
k
при этом m для R, R, R, n для R, R, R, I для R, R, k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
1
1
3
2
2
4
m
n
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а), (3а), (4а), (5а) или (5b), при этом m для R, R, R, n для R, R и R имеют такое же значение, как определено выше.
5
5
6
6
I
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (6а) или (6b), при этом m для I для R, R, k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
5
5
6
6
I
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (7а), при этом m для I для R, R, k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
1
1
3
3
5
5
2
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1a, 1b, 1с, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 2а, 3а, 4а, 5а, 5b, 6а, 6b или 7а, где m для R равняется 1, и R представляет собой незамещенный фенил, замещенный фенил, содержащий по меньшей мере один -F в качестве заместителя, незамещенный бифенил, замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, или замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя или -(C=O)-R, при этом R представляет собой пиридин, и I для R равняется 1, и R представляет собой Cl, Br, F или Салкинил.
1
1
3
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1а, 2, 3, 4, 5, 2а, 3а, 4а, 5а или 5b, где m для R равняется 1, и R представляет собой незамещенный фенил, замещенный фенил, содержащий по меньшей мере один -F в качестве заместителя, незамещенный бифенил, замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, или замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя или -(C=O)-R, при этом R представляет собой пиридин.
5
5
2
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1b, 7 или 7а, где I для R равняется 1, и R представляет собой Cl, Br, F или Салкинил.
5
5
2
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1с, 6, 6а или 6b, где I для R равняется 1, и R представляет собой Cl, Br, F или Салкинил.
2
2
4
4
4
2
6
6
6
3
8
4
1
6
2
4
1
6
4
1
6
4
6
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1a, 1b, 1с, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 2а, 3а, 4а, 5s, 5b, 6а, 6b или 7а, где n для R равняется 1 или 2, и в случае, если n равняется 2, то каждый R независимо от каждого другого представляет собой незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил или -О-СН-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности R представляет собой замещенный или незамещенный триазол, незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, галоген, в частности -F, при этом в случае, если n равняется 1, то R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, незамещенный Сгетероарил, в частности пиридин, и k для R равняется 1 или 4, и в случае, если k равняется 1, то R представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, при этом в случае, если k равняется 4, то каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
2
2
4
4
4
2
6
6
6
3
8
4
1
6
2
4
1
6
4
1
6
4
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1a, 1b, 1с, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 2а, 3а, 4а, 5а, 5b, 6а, 6b или 7а, где n для R равняется 1 или 2, и в случае, если n равняется 2, то каждый R независимо от каждого другого представляет собой незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил, или -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности R представляет собой замещенный или незамещенный триазол, незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, галоген, в частности -F, при этом в случае, если n равняется 1, то R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, незамещенный С6гетероарил, в частности пиридин, и k для R равняется 1 или 4, и в случае, если k равняется 1, то R представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, при этом в случае, если k равняется 4, то каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
2
2
4
4
4
2
3
8
4
1
6
2
4
1
6
4
1
6
4
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1а, 2, 3, 4, 5, 2а, 3а, 4а, 5а или 5b, где n для R равняется 1 или 2, и в случае, если n равняется 2, то каждый R независимо от каждого другого представляет собой незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил, или -О-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности R представляет собой замещенный или незамещенный триазол, незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, галоген, в частности -F, при этом в случае, если n равняется 1, то R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, незамещенный С6гетероарил, в частности пиридин.
6
6
6
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1b, 7 или 7а, где k для R равняется 1 или 4, и в случае, если k равняется 1, то R представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, при этом в случае, если k равняется 4, то каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
6
6
6
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1с, 6, 6а или 6b, где k для R равняется 1 или 4, и в случае, если k равняется 1, то R представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, при этом в случае, если k равняется 4, то каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
2
2
2
4
4
2
2
6
6
6
3
8
4
1
6
2
4
1
6
4
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1a, 1b, 1с, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 2а, 3а, 4а, 5s, 5b, 6а, 6b или 7а, где n для R равняется 2, и один R представляет собой незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, или незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил, и другой R представляет собой О-СН-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, или один R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, и другой R представляет собой галоген, в частности -F, и k для R равняется 4, и два R представляют собой кислород, другие R независимо от каждого другого представляют собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил или водород.
2
2
2
4
4
2
2
3
8
4
2
4
1
6
4
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1а, 2, 3, 4, 5, 2а, 3а, 4а, 5s или 5b, где n для R равняется 2, и один R представляет собой незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, или незамещенный С1-С6алкил, в частности трет-бутил, и другой R представляет собой О-СН-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, или один R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, и другой R представляет собой галоген, в частности -F.
6
6
6
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1b, 7 или 7а, где k для R равняется 4, и два R представляют собой кислород, другие R независимо от каждого другого представляют собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил или водород.
6
6
6
1
3
В определенных вариантах осуществления представлено соединение, предусматривающее общую формулу 1с, 6, 6а или 6b, где k для R равняется 4, и два R представляют собой кислород, другие R независимо от каждого другого представляют собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил или водород.
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а'), (3а'), (4а'), (5а'), (5b'), (6а'), (6b') или (7а'):
1
3
2
2
4
5
6
6
n
k
при этом R, R, n для R, R, R, R, k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
1
3
2
2
4
n
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а'), (3а'), (4а'), (5а') или (5b'), при этом R, R, n для R, R и R имеют такое же значение, как определено выше.
6
6
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (6а') или (6b'), при этом k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
6
6
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (7а'), при этом k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
1
3
3
3
5
2
6
6
6
2
n
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а'), (3а'), (4а'), (5а'), (5b'), (6а'), (6b') или (7а'), где R в случае формулы (2а') представляет собой замещенный или незамещенный Сарил, в частности незамещенный фенил, замещенный фенил, содержащий по меньшей мере один -F в качестве заместителя, в случае формулы (3а'), (5а') или (5b') представляет собой замещенный или незамещенный бифенил, в частности незамещенный бифенил, замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, или в случае формулы (4а') представляет собой -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности R представляет собой пиридин, R в случае формулы (6а') или (6b') представляет собой Cl, Br или F, в случае формулы (7а') представляет собой Салкинил, где R и R имеют такое же значение, как определено выше.
1
3
3
3
2
6
6
n
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а'), (3а'), (4а'), (5а') или (5b'), где R в случае формулы (2а') представляет собой замещенный или незамещенный Сарил, в частности незамещенный фенил, замещенный фенил, содержащий по меньшей мере один -F в качестве заместителя, в случае формулы (3а'), (5а') или (5b') представляет собой замещенный или незамещенный бифенил, в частности незамещенный бифенил, замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, или в случае формулы (4а') представляет собой -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности R представляет собой пиридин, где R имеет такое же значение, как определено выше.
5
6
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (6а') или (6b'), где R представляет собой Cl, Br или F, где R имеет такое же значение, как определено выше.
5
6
2
k
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (7а'), где R представляет собой Салкинил, где R имеет такое же значение, как определено выше.
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а''), (3а''), (4а''), (5а''), (5b''), (6а'') или (7а''):
7
7
7
8
4
4
8
4
4
8
9
9
9
10
11
11
11
5
1
6
3
8
4
1
6
4
1
6
3
8
4
1
6
4
2
4
1
6
4
2
4
1
6
4
6
6
1
3
2
при этом R представляет собой незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил, незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, в частности, R в случае формулы (2а'') представляет собой незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил, или незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, или R в случае формулы (5а'') или (5b'') представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, R представляет собой -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, или незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, в частности, R в случае формулы (2а'') представляет собой -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, или R в случае формулы (3а'') представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, R представляет собой незамещенный Сгетероарил, в частности пиридин, или галоген, в частности -F, R в случае формулы (4а'') представляет собой незамещенный Сгетероарил, в частности пиридин, или R в случае формулы (5b'') представляет собой галоген, в частности -F, R представляет собой C-Салкил или водород, R представляет собой замещенный или незамещенный арил или замещенный или незамещенный гетероарил, в частности, R в случае формулы (6а'') представляет собой замещенный или незамещенный арил, в частности фенил, R в случае формулы (7а'') представляет собой замещенный или незамещенный гетероарил, в частности пиридин, замещенный или незамещенный арил, в частности фенил, R в случае формулы (6а'') представляет собой Cl, Br или F, в случае формулы (7а'') представляет собой Салкинил.
7
7
7
8
4
4
8
4
4
8
9
9
9
1
6
3
8
4
1
6
4
1
6
3
8
4
1
6
4
2
4
1
6
4
2
4
1
6
4
6
6
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а''), (3а''), (4а''), (5а'') или (5b''), при этом R представляет собой незамещенный C- Салкил, в частности трет-бутил, незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, в частности, R в случае формулы (2а'') представляет собой незамещенный С-Салкил, в частности трет-бутил, или незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, или R в случае формулы (5а'') или (5b'') представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, R представляет собой -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, или незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, в частности, R в случае формулы (2а'') представляет собой -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, или R в случае формулы (3а'') представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, R представляет собой незамещенный Сгетероарил, в частности пиридин, или галоген, в частности -F, R в случае формулы (4а'') представляет собой незамещенный Сгетероарил, в частности пиридин, или R в случае формулы (5b'') представляет собой галоген, в частности -F.
10
11
11
11
5
1
3
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (6а''), при этом R представляет собой C-Салкил или водород, R представляет собой замещенный или незамещенный арил или замещенный или незамещенный гетероарил, в частности, R в случае формулы (6а'') представляет собой замещенный или незамещенный арил, в частности фенил, R в случае формулы (7а'') представляет собой замещенный или незамещенный гетероарил, в частности пиридин, R представляет собой Cl, Br или F.
11
11
11
5
2
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (7а''), при этом R представляет собой замещенный или незамещенный арил или замещенный или незамещенный гетероарил, в частности, R в случае формулы (6а'') представляет собой замещенный или незамещенный арил, в частности фенил, R в случае формулы (7а'') представляет собой замещенный или незамещенный гетероарил, в частности пиридин, R представляет собой Салкинил.
1
7
8
4
4
1
8
1
3
3
3
9
1
7
1
7
9
1
6
3
8
4
2
4
1
6
4
6
6
1
6
4
1
6
4
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а''), (3а''), (4а''), (5а'') или (5b''), при этом в случае формулы (2а'') R представляет собой незамещенный фенил, замещенный фенил, содержащий по меньшей мере один -F в качестве заместителя, R представляет собой незамещенный C-Салкил, в частности трет- бутил, или незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, и R представляет собой -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, в случае формулы (3а'') R представляет собой незамещенный бифенил, замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, в случае формулы (4а'') R представляет собой -(C=O)-R, при этом R представляет собой незамещенный Сгетероарил, в частности, R представляет собой пиридин, и R представляет собой незамещенный Сгетероарил, в частности пиридин, в случае формулы (5а'') R представляет собой незамещенный бифенил, замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, в случае формулы (5а'') R представляет собой незамещенный бифенил, замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, R представляет собой галоген, в частности -F.
В определенных вариантах осуществления соединение выбрано из соединений, изображенных на фиг. 11, а именно L-838417, ТРА023 (MK-0777), ТРА123, MRK-409 (MK-0343), NS11394, оцинаплона (DOV-273547), ТРА023В, ТР003, N-десметилклобазама, 1, 2, 3, 4 и 5.
В определенных вариантах осуществления представлено соединение в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения для применения в предупреждении зуда, вызванного серотонином, гистамином, хлорохином, соединением 48/80 и желчной кислотой, в частности зуда, вызванного серотонином, хлорохином, соединением 48/80 и желчной кислотой, более конкретно зуда, вызванного серотонином.
В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предусмотрен модулятор α2 или α3 GABA для применения в лечении зуда, в частности модулятор в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.
5
6
12
13
11
14
I
k
p
q
Ниже описаны подаспекты настоящего изобретения. Формулы (Ic) и (VI) подаспектов соответствуют формулам (1с) и (6) соответственно. Заместители в соединениях в соответствии с формулой (Ic) или (VI) для ясности были перенумерованы по отношению к формуле (1с) и (6). R и R из формулы (1с) в данном случае называют R и R в формуле (Ic). R из формулы (6) в данном случае называют R в формуле (VI).
В соответствии с первым подаспектом настоящего изобретения представлено соединение для применения в лечении зуда, где соединение предусматривает общую формулу (1а), общую формулу (1b) или общую формулу (Ic):
(Ic), в частности формулу (1a) и (1b), более конкретно (1а), где
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
- X, X, X, X и X независимо друг от друга представляют собой -С, -N, -S или -О, где по меньшей мере два из X, X, X, X и X представляют собой -N,
1
2
- Y и Y независимо друг от друга представляют собой -С или -N,
1
m
- m для R равняется 1,
1
3
3
1
4
6
- R представляет собой незамещенный фенил, фенил, замещенный C-С-алкилом, F, Cl, Br, I, -CN, замещенный или незамещенный бифенил или -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный арил или 5-6-членный гетероарил, в частности Сарил или 6-членный гетероарил, более конкретно 6-членный гетероарил,
2
n
- n для R равняется 1 или 2,
2
2
4
4
3
8
1
6
1
6
2
- каждый R независимо от любого другого R представляет собой замещенный или незамещенный С-Сциклоалкил, замещенный или незамещенный C-Салкил, замещенный или незамещенный C-Сспирт, замещенный или незамещенный 6-членный гетероарил, галоген, в частности -F, или -О-СН-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный 5- или 6-членный гетероарил, в частности 5-членный гетероарил,
1
3
4
5
1
3
4
- Z, Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -С, -N, -S или -О, в частности Z представляет собой -С или -N, и Z и Z представляют собой -С, -N, -S или -О,
1
2
7'
3
7'
7'
1
2
3
7'
7'
1
6
1
6
1
2
2
- А и А независимо друг от друга представляют собой -С, -N или -(C=O)-O-R, и А представляет собой -(C=O)-O-R, при этом R представляет собой C-С-алкил, в частности А и А независимо друг от друга представляют собой -С или -N, и А представляет собой -(C=O)-O-R, при этом R представляет собой C-С-алкил, в частности C-С-алкил, более конкретно С-алкил,
5
I
- I для R равняется 1 или 2,
5
1
4
- каждый R независимо от каждого другого представляет собой C-Салкинил или галоген,
6
k
- k для R равняется 1, 2, 3 или 4, в частности 1 или 2,
6
1
3
1
3
- каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород, в частности замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, более конкретно замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил,
12
- р для R равняется 1 или 2, в частности 1,
12
1
4
- R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный С-С-алкил, I, Br, О или F,
13
- q для R равняется 1, 2, 3 или 4,
13
1
3
- R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
A
В определенных вариантах осуществления соединение для применения в лечении зуда представляет собой положительный аллостерический модулятор α2- и/или α3-GABA- рецептора.
В определенных вариантах осуществления соединение для применения в лечении зуда предусматривает общую формулу (1а), общую формулу (1b) или общую формулу (Ic), в частности формулу (1а) и (1b), более конкретно (1а), где
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
- X, X, X, X и X независимо друг от друга представляют собой -С или -N, где по меньшей мере два из X, X, X, X и X представляют собой -N,
1
2
- Y и Y независимо друг от друга представляют собой -С или -N,
1
m
- m для R равняется 1,
1
3
3
1
4
6
- R представляет собой незамещенный фенил, фенил, замещенный С-С-алкилом, F, Cl, Br, I, -CN, замещенный или незамещенный бифенил или -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный арил или 5-6-членный гетероарил, в частности Сарил или 6-членный гетероарил, более конкретно 6-членный гетероарил,
2
n
- n для R равняется 1 или 2,
2
2
4
4
3
8
1
6
1
6
2
- каждый R независимо от любого другого R представляет собой замещенный или незамещенный С-Сциклоалкил, замещенный или незамещенный C-Салкил, замещенный или незамещенный C-Сспирт, замещенный или незамещенный 6-членный гетероарил, галоген, в частности -F, или -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный 5- или 6-членный гетероарил, в частности 5-членный гетероарил,
1
3
4
5
- Z, Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -С или -N,
1
2
3
7'
7'
1
4
1
2
2
- А и А независимо друг от друга представляют собой -С или -N, и А представляет собой -(C=O)-O-R, при этом R представляет собой С-С-алкил, в частности С-С-алкил, более конкретно С-алкил,
5
I
- I для R равняется 1 или 2,
5
1
4
- каждый R независимо от каждого другого представляет собой С-Салкинил или галоген,
6
k
- k для R равняется 1, 2, 3 или 4, в частности 1 или 2,
6
1
3
1
3
- каждый R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород, в частности замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, более конкретно замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил,
12
- р для R равняется 1,
12
1
4
- R представляет собой замещенный или незамещенный С-С-алкил, I, Br, Cl или F,
13
- q для R равняется 1, 2, 3 или 4,
13
1
3
- R независимо от каждого другого представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил, кислород или водород.
В определенных вариантах осуществления соединение в соответствии с первым подаспектом предусматривает общую формулу (2), (3), (4), (5), (Ic) или (7), в частности (2), (3), (4), (5) или (7), более конкретно (2), (3), (4) или (5):
1
2
4
5
1
1
3
2
2
4
12
12
13
13
5
5
6
6
1
2
3
m
n
I
k
при этом Y, Y, Z, Z, m для R, R, R, n для R, R, R, p для R, R, q для R, R, Iдля R, R, k для R, R, А, А и А имеют такое же значение, как определено выше.
В определенных вариантах осуществления соединение в соответствии с первым подаспектом предусматривает общую формулу (2а), (3а), (4а), (5а), (5b), (Ic) или (7а), в частности (2а), (3а), (4а), (5а), (5b) или (7а), более конкретно (2а), (3а), (4а), (5а) или (5b):
1
1
3
2
2
4
12
12
13
13
5
5
6
6
m
n
I
k
при этом m для R, R, R, n для R, R, R, р для R, R, q для R, R, I для R, R, k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
1
1
3
3
1
4
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой незамещенный фенил, замещенный фенил, содержащий С-С-алкил, F, Cl, Br, I, -CN в качестве заместителей, где, в частности, указанный замещенный фенил содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, незамещенный бифенил, замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, или замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, или -(C=O)-R, при этом R представляет собой пиридин.
1
1
1
4
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный фенил, содержащий С-С-алкил, F, Cl, Br, I, -CN в качестве заместителей, где, в частности, указанный замещенный фенил содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя. Замещенный фенил представляет собой фенильный фрагмент в соответствии с формулой (8):
15
16
1
4
где r равняется 1, 2, 3, 4 или 5, и R представляет собой F, и s равняется 0, 1, 2, 3 или 4, и R представляет собой С-С-алкил, Cl, Br, I, -CN, где сумма r и s не превышает 5.
1
1
15
16
1
4
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный фенил в соответствии с формулой (8), где r равняется 1 или 2, и R представляет собой F, и где s равняется 0, 1, 2, 3 или 4 (в случае, если r равняется 2, то s равняется 0, 1, 2 или 3), и R представляет собой С-С-алкил, Cl, Br, I, -CN.
1
1
15
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный фенил в соответствии с формулой (8), где r равняется 1 или 2, и R представляет собой F, и где s равняется 0.
1
1
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту. Замещенный бифенил представляет собой бифенильный фрагмент в соответствии с формулой (9):
17
18
1
4
19
1
4
где t равняется 0, 1, 2, 3 или 4, u равняется 0, 1, 2, 3, 4 или 5, и R представляет собой -CN, где по меньшей мере t и/или u равняются 1 или больше, v равняется 0, 1, 2, 3 или 4, и R представляет собой С-С-алкил, Cl, Br, I или -CN, и w равняется 0, 1, 2, 3, 4 или 5, и R представляет собой C-С-алкил, Cl, Br, I или -CN, где сумма t, u, v и w не превышает 9.
1
1
18
19
17
1
4
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный бифенил в соответствии с формулой (9), где v и w равняются 0 или 1, R и R представляют собой C-С-алкил, Cl, Br, I или -CN, t и/или u равняются 1, и R представляет собой -CN.
1
1
17
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный бифенил в соответствии с формулой (9), где v и w равняются 0, t и/или u равняются 1, и R представляет собой -CN.
1
17
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R1 представляет собой замещенный бифенил в соответствии с формулой (9), где v, w и t равняются 0, u равняется 1, и R представляет собой -CN.
1
1
В определенном варианте осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя. Этот замещенный бифенил представляет собой бифенильный фрагмент в соответствии с формулой (10):
,
17
18
19
20
1
4
1
4
где t равняется 0, 1, 2, 3 или 4, u равняется 0, 1, 2, 3, 4 или 5, и R представляет собой -CN, где по меньшей мере t и/или u равняются 1 или больше, v равняется 0, 1, 2, 3 или 4, и R представляет собой С-С-алкил, Cl, Br, I или -CN, w равняется 0, 1, 2, 3, 4 или 5, и R представляет собой С-С-алкил, Cl, Br, I или -CN, х равняется 0, 1, 2, 3 или 4, у равняется 0, 1, 2, 3, 4 или 5, и R представляет собой F, где по меньшей мере х и/или у равняются 1 или больше, где сумма t, u, v, w, х и у не превышает 9.
1
1
17
20
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный бифенил в соответствии с формулой (10), где v и w равняются 0, t и/или u равняются 1, R представляет собой -CN, х и/или у равняются 1, и R представляет собой -F.
1
1
17
20
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный бифенил в соответствии с формулой (10), где v, w и t равняются 0, u равняется 1, R представляет собой -CN, х и/или уравняются 1, и R представляет собой -F.
1
1
17
20
В определенных вариантах осуществления m для R равняется 1, и R представляет собой замещенный бифенил в соответствии с формулой (10), где v, w и t равняются 0, u равняется 1, R представляет собой -CN, х и у равняются 1, и R представляет собой -F.
2
2
4
4
4
3
8
4
1
6
2
1
6
3
В определенных вариантах осуществления n для R равняется 1 или 2, и R представляет собой незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, незамещенный С-Салкил, в частности трет-бутил, или -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный 5-членный гетероарил, в частности R представляет собой замещенный или незамещенный триазол, незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, более конкретно изопропанол, галоген, в частности -F, незамещенный 6-членный гетероарил, в частности пиридин.
2
2
2
4
4
3
8
4
1
6
2
В определенных вариантах осуществления n для R равняется 2, и один R представляет собой незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, или незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил, и другой R представляет собой O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный 5-членный гетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол.
2
2
2
1
6
3
В определенных вариантах осуществления n для R равняется 2, и один R представляет собой незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, более конкретно изопропанол, и другой R представляет собой галоген, в частности -F.
2
2
1
6
В определенных вариантах осуществления n для R равняется 1, и R представляет собой незамещенный C-Сспирт или незамещенный 6-членный гетероарил.
2
2
3
В определенных вариантах осуществления n для R равняется 1, и R представляет собой Сспирт или пиридин.
2
2
3
В определенных вариантах осуществления n для R равняется 1, и R представляет собой Сспирт.
2
2
В определенных вариантах осуществления n для R равняется 1, и R представляет собой изопропанол.
5
5
2
В определенных вариантах осуществления I для R равняется 1, и R представляет собой I, Cl, Br, F или Салкинил.
5
5
2
В определенных вариантах осуществления I для R равняется 1, и R представляет собой -I или Салкинил.
6
6
1
3
В определенных вариантах осуществления k для R равняется 1, и R представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный гетероарил, замещенный или незамещенный C-Салкил.
6
6
6
В определенных вариантах осуществления k для R равняется 1, и R представляет собой замещенный или незамещенный Сарил, 5-6-членный замещенный или незамещенный гетероарил.
6
6
В определенных вариантах осуществления k для R равняется 1, и R представляет собой фенил, фенил, замещенный F или Cl, тиофен или пиридин.
В определенных вариантах осуществления соединение в соответствии с первым подаспектом предусматривает общую формулу (2а'), (3а'), (4а'), (5а'), (5b'), (VI) или (7а'), в частности (2а'), (3а'), (4а'), (5а'), (5b') или (7а'), еще более конкретно (2а'), (3а'), (4а'), (5а') или (5b'):
10
1
3
- R представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил или водород, в частности водород,
11
1
3
- R представляет собой замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C-Салкил или водород, в частности замещенный или незамещенный арил, более конкретно фенил,
12
12
- р для R равняется 1, и R представляет собой I, Br, Cl или F, в частности Cl,
1
3
2
2
4
10
11
12
12
5
6
6
n
k
- при этом R, R, n для R, R, R, R, R, р для R, R, R, k для R и R имеют такое же значение, как определено выше.
В определенных вариантах осуществления соединение в соответствии с первым подаспектом предусматривает общую формулу (2а'), (3а'), (4а'), (5а'), (5b'), (VI) или (7а'), в частности (2а'), (3а'), (4а'), (5а'), (5b') или (7а'), еще более конкретно (2а'), (3а'), (4а'), (5а') или (5b'), где
1
- R представляет собой
- в случае формулы (2а'):
6
замещенный или незамещенный Сарил, в частности незамещенный фенил,
1
4
замещенный фенил, содержащий С-С-алкил, F, Cl, Br, I, -CN в качестве заместителей, где, в частности, указанный замещенный фенил содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя,
- в случае формулы (3а'), (5а') или (5b'):
- замещенный или незамещенный бифенил, в частности незамещенный бифенил,
- замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, или
- в случае формулы (4а'):
3
3
3
6
- -(C=O)-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный Сгетероарил, в частности R представляет собой пиридин,
5
- R представляет собой
- в случае формулы (7а'):
2
2
- Салкинил или I, в частности Салкинил,
2
10
11
12
6
n
p
k
где R, R, R и R и R имеют такое же значение, как определено выше.
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а''), (3а''), (4а''), (5а''), (5b''), (VIa'') или (7а''), в частности (2а''), (3а''), (4а''), (5а''), (5b'') или (7а''), более конкретно (2а''), (3а''), (4а''), (5а'') или (5b''):
1
при этом R имеет такое же значение, как определено выше, и
7
- R представляет собой
1
6
- незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил,
3
8
4
- незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил,
1
6
3
- незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, в частности,
7
- R представляет собой в случае формулы (2а''):
1
6
- незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил, или
3
8
4
- незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, или
7
- R представляет собой в случае формулы (5а'') или (5b''):
1
6
3
- незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт,
8
- R представляет собой
2
4
4
- -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный 5-членный гетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, или
1
6
3
- незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, в частности,
8
- R представляет собой в случае формулы (2а''):
2
4
4
- -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный 5-членный гетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол, или
8
- R представляет собой в случае формулы (3а''):
1
6
3
- незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт,
9
- R представляет собой
6
- незамещенный Сгетероарил, в частности пиридин, или
- галоген, в частности -F,
9
- R представляет собой в случае формулы (4а''):
- незамещенный 6-членный гетероарил, в частности пиридин, или
9
- R представляет собой в случае формулы (5b''):
- галоген, в частности -F,
10
- R представляет собой
1
3
- C-Салкил или водород, в частности водород,
11
- R представляет собой замещенный или незамещенный арил или гетероарил, в частности пиридин, тиофен, фенил или фенил, замещенный F или Cl,
14
- R представляет собой замещенный или незамещенный арил или гетероарил, в частности замещенный или незамещенный арил, более конкретно фенил,
12
- R представляет собой I, Cl, Br или F, в частности Cl,
5
2
2
- R представляет собой Салкинил или I, в частности Салкинил.
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а''), (3а''), (4а''), (5а'') или (5b''):
при этом
- в случае формулы (2а''):
1
- R представляет собой
- незамещенный фенил,
1
4
- замещенный фенил, содержащий С-С-алкил, F, Cl, Br, I, -CN в качестве заместителей, где, в частности, указанный замещенный фенил содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя,
7
- R представляет собой
1
6
- незамещенный C-Салкил, в частности трет-бутил, или
3
8
4
- незамещенный С-Сциклоалкил, в частности С-циклоалкил, и
8
- R представляет собой
2
4
4
- -O-CH-R, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный 5-членный гетероарил, в частности замещенный или незамещенный триазол,
- в случае формулы (3а''):
1
- R представляет собой
- незамещенный бифенил,
- замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, или
- замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя,
1
- где, в частности, R представляет собой
- замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту,
8
- R представляет собой
1
6
3
- незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, более конкретно изопропанол,
- в случае формулы (4а''):
1
- R представляет собой
3
3
3
- -(C=O)-R, при этом R представляет собой незамещенный 6-членный гетероарил, в частности R представляет собой пиридин, и
9
- R представляет собой
6
- незамещенный Сгетероарил, в частности пиридин,
- в случае формулы (5а''):
1
- R представляет собой
- незамещенный бифенил,
- замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя,
1
- где, в частности, R представляет собой
- замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя,
7
- R представляет собой
1
6
3
- незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, более конкретно изопропанол,
- в случае формулы (5b''):
1
- R представляет собой
- незамещенный бифенил,
- замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя,
1
- где, в частности, R представляет собой
- замещенный бифенил, содержащий по меньшей мере один -CN в качестве заместителя, в частности при фенильном фрагменте, не присоединенном к основному фрагменту, где, в частности, один фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя, более конкретно каждый фенильный фрагмент дополнительно содержит по меньшей мере один -F в качестве заместителя,
7
- R представляет собой
1
6
3
- незамещенный C-Сспирт, в частности Сспирт, более конкретно изопропанол,
9
- R представляет собой
- галоген, в частности -F.
В определенных вариантах осуществления соединение предусматривает общую формулу (2а''), (3а''), (5а'') или (5b''), описанную выше.
В определенном варианте осуществления соединение предусматривает общую формулу (5а''), описанную выше.
В определенных вариантах осуществления соединение выбрано из соединений, изображенных на фиг. 11, а именно L-838417, TPA023 (MK-0777), TPA123, MRK-409 (MK-0343), NS11394, оцинаплона (DOV-273547), ТРА023В, ТР003, N-десметилклобазама, 1, 2, 3, 4 и 5, в частности L-838417, ТРА023 (MK-0777), ТРА123, MRK-409 (MK-0343), NS11394, оцинаплона (DOV-273547), ТРА023В, ТР003, N-десметилклобазама, 1, 2, 3 и 5.
В определенных вариантах осуществления соединение выбрано из соединений, изображенных на фиг. 11, а именно L-838417, ТРА023 (MK-0777), ТРА123, MRK-409 (MK-0343), NS11394, оцинаплона (DOV-273547), ТРА023В, ТР003, 1, 2, 3 и 5.
В определенных вариантах осуществления соединение выбрано из соединений, изображенных на фиг. 11, а именно L-838417, ТРА023 (MK-0777), ТРА123, MRK-409 (MK-0343), NS11394, оцинаплона (DOV-273547), ТРА023В, ТР003, в частности ТРА023 В.
В другом аспекте настоящего изобретения представлено соединение в соответствии с первым подаспектом для применения в предупреждении зуда, вызванного серотонином, гистамином, хлорохином, соединением 48/80 (CAS №94724-12-6) и желчной кислотой.
В определенных вариантах осуществления представлено соединение для применения в предупреждении зуда, вызванного серотонином, хлорохином, соединением 48/80 (CAS №94724-12-6) и желчной кислотой.
В определенных вариантах осуществления представлено соединение для применения в предупреждении зуда, вызванного серотонином.
В определенных вариантах осуществления представлено соединение в соответствии с первым подаспектом для применения в лечении зуда у животного.
A
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен положительный аллостерический модулятор α2- и/или α3-GABA-рецептора для применения в лечении зуда.
A
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен положительный аллостерический модулятор α2- и/или α3-GABA-рецептора в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения для применения в лечении зуда.
В тех случаях, когда альтернативы для отдельных индивидуальных признаков, таких как, например, функциональная группа, представлены в данном документе как "варианты осуществления", следует понимать, что такие альтернативы можно свободно объединять с образованием отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения, раскрытого в данном документе.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами и фигурами, из которых могут быть получены дополнительные варианты осуществления и преимущества. Эти примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, но не для ограничения его объема.
Краткое описание графических материалов
A
A
На фиг. 1 показаны противозудные эффекты перорального приема диазепама (DZP) у мышей с точечной мутацией в GABAR с генетическим фоном 129X1/SvJ. DZP снижает число приступов чесания, вызванных инъекцией в щеку 20 мкг α-Ме-5-НТ мышам с тройной точечной мутацией в GABAR, нацеливающейся на α2, α3 или α5 по отдельности. DZP вводили за 1 ч. до инъекции α-Ме-5-НТ. Временная динамика: (а) точки данных представляют собой среднее значение +\- s.e.m., и статистический анализ вызванных приступов чесания, направленных на ипсилатеральную щеку (b), количественно определенных в течение 20 минут.***Р<0,001; *Р<0,05 в сравнении с мышами, обработанными инертной средой (ANOVA с последующим апостериорным критерием Бонферрони, F(5,44)=8,5). Мыши RHRR, RRHR и RRRH представляют собой мышей, у которых все чувствительные к DZP субъединицы α были сделаны нечувствительными к DZP, за исключением α2, α3 или α5 соответственно. Нечувствительность к DZP вводили посредством замен аминокислот гистидина на аргинин в положениях 101 для α1 и α2, 126 для α3 и 105 для α5. Число мышей (обработанных инертной средой/DZP): n RHRR=8/10, n RRHR=8/8 и n RRRH=7/9 соответственно. RHRR: только α2, RRHR: только α3, RRRH: только α5.
A
A
На фиг. 2 показаны дозозависимые противозудные эффекты перорального приема DZP против зуда, вызванного внутрикожной инъекцией 20 мкг α-Me-5-HT у мышей с генетическим фоном 129X1/SvJ. DZP давали за 1 ч. до инъекции α-Me-5-HT. (а) Временная динамика: точки данных представляют собой среднее значение +/- s.e.m., и статистический анализ вызванных приступов чесания, направленных на ипсилатеральную щеку, количественно определенных в течение 30 минут; *Р<0,05 в сравнении с мышами, обработанными инертной средой (ANOVA с последующим апостериорным критерием Даннета, F(6,37)=6). Число мышей: n=7, 7, 4, 6, 6, 7 и 6 в случае с инертной средой, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 и 30 мг/кг соответственно. (b) Дозозависимость противозудных эффектов диазепама у мышей RHRR (только α2-GABAR чувствительны к диазепаму). ANOVA с последующим апостериорным критерием Даннета, F(6,36)=6,02; *, Р<0,05; **, Р<0,01, n=4-7 на группу. (с) Аналогично (b), но для мышей RRHR (только α3-GABAR чувствительны к диазепаму). ANOVA с последующим апостериорным критерием Даннета, F(6,37)=4,42; *, Р<0,05; **, Р<0,01, n=6-8 мышей на группу.
A
На фиг. 3 показаны эффекты перорального приема DZP у мышей с тройной точечной мутацией в GABAR с генетическим фоном 129X1/SvJ, оцененные на модели хронического контактного дерматита. Мышей RHRR, RRHR и RRRH обрабатывали с помощью 100 мкл 10% оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она, Sigma), растворенного в смеси ацетон/оливковое масло (4:1), в день 1 на загривке, и с помощью 100 мкл 1% оксазолона в дни 7-17 через день для индукции контактного дерматита и хронического зуда. В день 18 мышам вводили 10 мг/кг DZP i.p. Временная динамика: (а) точки данных представляют собой среднее значение +\- s.e.m., и статистический анализ (b) числа приступов чесания, направленных на загривок, в течение 0-240 мин; *Р<0,05 в сравнении с мышами, обработанными инертной средой (ANOVA с последующим апостериорным критерием Бонферрони, F(3,35)=0,63). Число мышей (обработанных инертной средой/DZP): n RHRR=6/7, n RRHR=6/7 и n RRRH=7/7. (с-е) Приступы чесания подсчитывали в течение 6 часов, начиная с 15 мин после введения лекарственного средства или инертной среды. Число приступов чесания наносили на график в зависимости от времени после введения лекарственного средства или инертной среды мышам RHRR (с), мышам RRRH (d) и мышам RRHR (е).
На фиг. 4 показаны противозудные эффекты перорального приема ТРА023 В против зуда, вызванного внутрикожной инъекцией 100 мкг гистамина у мышей C57BL6/J дикого типа. Временная динамика: (а) точки данных представляют собой среднее значение +/- s.e.m., и статистический анализ вызванных приступов чесания, направленных на ипсилатеральную щеку (b), количественно определенных в течение 30 минут. **Р<0,01 в сравнении с мышами, обработанными инертной средой (ANOVA с последующим апостериорным критерием Даннета, F(5,42)=5,2). Число мышей: n=10, 8, 10, 7, 6 и 6 в случае с инертной средой, 0,01, 0,03, 0,1, 1 и 3 мг/кг соответственно, (с) Отсутствие седативных эффектов от перорального приема ТРА023В. ТРА023В вводили непосредственно перед тем, как мышь помещали на площадку "открытого поля". ***Р<0,001 в сравнении с мышами, обработанными инертной средой (ANOVA с последующим апостериорным критерием Даннета, F(5,34)=7,6). Число мышей: n=7, 5, 7, 7, 7 и 7 в случае с инертной средой, 0,3, 1, 3, 10 и 30 мг/кг соответственно. Все точки данных представляют собой среднее значение +/- s.e.m., полученное в течение 1-2 ч. после инъекции.
На фиг. 5 показаны противозудные эффекты перорального приема дозы ТРА023В против зуда, вызванного внутрикожной инъекцией 100 мкг хлорохина у мышей C57BL6/J дикого типа. Временная динамика: (а) точки данных представляют собой среднее значение +/- s.e.m., и статистический анализ вызванных приступов чесания, направленных на ипсилатеральную щеку (b), количественно определенных в течение 30 минут. ***Р<0,001; **Р<0,01; *Р<0,05 в сравнении с мышами, обработанными инертной средой (ANOVA с последующим апостериорным критерием Даннета, F(5,30)=6,4). Число мышей: n=6, 6, 6, 6, 6 и 5 в случае с инертной средой, 0,01, 0,03, 0,1, 1 и 3 мг/кг соответственно.
На фиг. 6 показана противозудная эффективность ТРА023В на модели контактного дерматита с хроническим зудом. Мышей C57BL6/J дикого типа обрабатывали с помощью 100 мкл 10% оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она, Sigma), растворенного в смеси ацетон/оливковое масло (4:1), в день 1 на загривке, и с помощью 100 мкл 1% оксазолона в дни 7-17 через день. В день 18 мышам вводили 1 мг/кг ТРА023В i.p. Временная динамика (а): точки данных представляют собой среднее значение ± s.e.m., и статистический анализ (b) числа приступов чесания, направленных на загривок, количественно определенных в течение 15-210 мин после инъекции. ***Р<0,001 (непарный t-критерий), n=10 для мышей, обработанных инертной средой и ТРА023В.
На фиг. 7 показано отсутствие развития устойчивости к противозудным эффектам ТРА023В у мышей C57BL6/J дикого типа. Мышей обрабатывали с помощью 10% оксазолона в день 1 и с помощью 1% оксазолона в дни 7-27. Начиная с дня 17 мышей обрабатывали с помощью инертной среды или 1 мг/кг ТРА023В один раз в день в течение девяти последовательных дней. В день 28 мышам вводили инертную среду либо ТРА023В (1 мг/кг i.p.). Временная динамика (а): точки данных представляют собой среднее значение ± s.e.m., и статистический анализ (b) числа приступов чесания, направленных на загривок, количественно определенных в течение 15-90 мин после инъекции. *Р<0,05; **Р<0,01 (непарный t-критерий). Двухфакторный ANOVA для взаимодействия предварительная обработка × кратковременная обработка F(3,16)=1, n=5, 5, 6 и 6 в случае мышей, обработанных инертной средой/инертной средой (v/v), инертной средой/ТРА023В (v/d), ТРА023В/инертной средой (d/v) и ТРА023В/ТРА023В (d/d) соответственно.
A
A
На фиг. 8 показаны противозудные эффекты селективного в отношении α3-GABA-рецептора соединения ТР003 (10 мг/кг, перорально) против зуда, индуцированного 20 мкг α-Me-5-НТ, у мышей 129X1/SvJ дикого типа, но не мышей с точечной мутацией, у которых α3-GABAR был сделан нечувствительным к DZP (мыши HHRH). ТР003 вводили посредством инъекции за 1 ч. до инъекции мкг α-Ме-5-НТ. Временная динамика: (а) точки данных представляют собой среднее значение +/- s.e.m., и статистический анализ вызванных приступов чесания, направленных на ипсилатеральную щеку (b), количественно определенных в течение 20 минут. **Р<0,01 в сравнении с мышами, обработанными инертной средой (непарный t-критерий). Двухфакторный ANOVA для взаимодействия предварительная обработка × кратковременная обработка F(3,20)=8,7, n=6 и 7 в случае мышей дикого типа, обработанных инертной средой и ТР003 соответственно, n=6 и 5 в случае мышей HHRH, обработанных инертной средой и ТР003 соответственно.
На фиг. 9 показаны противозудные эффекты NDMC на модели контактного дерматита с хроническим зудом. Мышей C57BL6/J дикого типа обрабатывали с помощью 100 мкл 10% оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она, Sigma), растворенного в смеси ацетон/оливковое масло (4:1), в день 1 на загривке, и с помощью 100 мкл 1% оксазолона в дни 7-17 через день. В день 18 мышам вводили 10 мг/кг NDMC i.p. Временная динамика (а): точки данных представляют собой среднее значение ±s.e.m., и статистический анализ (b) числа приступов чесания, направленных на загривок, количественно определенных в течение 15-210 мин после инъекции. *Р<0,05 (непарный t-критерий), n=9 в случае мышей, обработанных инертной средой и NDMC.
На фиг. 10 показан противозудный эффект нейростероида ганаксолона, вводимого посредством внутрибрюшинной инъекции (30 мг/кг), против зуда, вызванного внутрикожной инъекцией 100 мкг хлорохина у мышей C57BL6/J дикого типа. Временная динамика: (а) точки данных представляют собой среднее значение +/-s.e.m., и статистический анализ вызванных приступов чесания, направленных на ипсилатеральную щеку (b), количественно определенных в течение 30 минут. *Р<0,05 в сравнении с мышами, обработанными инертной средой (непарный t-критерий). Число мышей: n=8 и 9 в случае с инертной средой и ганаксолоном соответственно.
A
На фиг. 11 показаны структуры аллостерических модуляторов GABA-рецепторов.
На фиг. 12 показаны результаты для доз α-метил-5-НТ у мышей 129 SvJ. (А) Реакции чесания у 129X1/SvJ дикого типа, вызванные метаболически более стабильным аналогом серотонина α-метил-5-НТ. Разные дозы α-метил-5-НТ вводили посредством внутрикожной инъекции в правую щеку и подсчитывали реакции чесания в течение 30 мин (А) число приступов чесания (среднее значение ± SEM) в течение периода времени после инъекции α-метил-5-НТ. (В) Количественное определение и статистические анализы (ANOVA с последующим апостериорным критерием Даннета). Кружки представляют собой значения, полученные от отдельных мышей. Планки и планки погрешностей представляют собой средние значения и SEM. F(4,21)=8,84; *, Р<0,05; ***, Р<0,001; n=3-10 на группу.
На фиг. 13 показан фармакологический профиль ТРА023В in vitro и in vivo. (а) Примеры GABA-эргических IPSC (среднее по 10 последовательным записям токов), которые регистрировали в контрольных условиях (черный цвет), в присутствии ТРА023В (1 мкМ, серый цвет) и бикукуллина (bic 10 мкМ, отмечен стрелкой). Нанесенные зеленым цветом подходят для двойных экспоненциальных функций. IPSC вызывали путем стимулирования электрическим полем с предварительным гиперполяризующим скачком потенциала для контроля сопротивления доступа и токов утечки. Изменения взвешенной постоянной времени затухания (b) и амплитуды (с) IPSC. Кружки представляют отдельные клетки. Планки и планки погрешностей представляют собой среднее значение ± SEM. Значения Р получены с помощью парных t-критериев. Число клеток n составляло 7 для обоих анализов.
На фиг. 14 показано противозудное действие ТРА023В (р.о.) на мышиных моделях острого зуда. Реакции зуда вызывали путем внутрикожной инъекции α-Ме-5-НТ (20 мкг), n=8, 6, 7, 7, 6 и 6 мышей в случае с инертной средой, 0,01, 0,03, 0,1, 1,0 и 3,0 мг/кг.
A
A
На фиг. 15 показано, что противозудное действие ТРА023В реализуется посредством участка связывания бензодиазепина на GABAR. α-метил-5-НТ (20 мкг) вводили посредством внутрикожной инъекции в правую щеку. ТРА023В (1 мг/кг, р.о.) оказывал сильное противозудное действие у мышей дикого типа. У мышей HRRR, у которых все чувствительные к ТРА023В подтипы GABAR были сделаны нечувствительными к бензодиазепину, ТРА023В полностью потерял свое противозудное действие. Двухфакторный ANOVA, F(2,22)=6,45. Р=0,019 для "генотип × обработка". Р=0,005 (**) и 0,60 (ns) для эффекта обработки у мышей дикого типа и HRRR соответственно (n=6-7 мышей на группу). ++, Р<0,01 относительно мышей дикого типа, обработанных ТРА023В. (С) Противозудное действие ТРА023В (0,3 мг/кг), введенного посредством интратекальной инъекции, у мышей дикого типа. Хлорохин (100 мкг) вводили посредством внутрикожной инъекции в кожу правого бедра.
A
A
A
3
3
На фиг. 16 показано, что точечная мутация по типу замены Н->R в субъединицах а GABAR предупреждает модулирование GABAR с помощью ТРА023В и его связывание с ним. (А) Положительное аллостерическое модулирование α2-GABAR с помощью ТРА023В (1 мкМ) в клетках HEK293 устраняется за счет точечной мутации по типу замены Н->R в субъединице α2. (В) Соответственно, ТРА023В не удалось вытеснить [H]Ro15-4513, связанного с мембранами головного мозга, полученными от мышей с точечной мутацией по типу замены Н->R в α1, 2, 3, 5. То же самое подтвердили для диазепама, который связывается только с рецепторами α(Н/Н). В отличие от этого, бретазенил, который связывается как с рецепторами α(Н/Н), так и α(R/R), дозозависимым образом ингибировал связывание [H]Ro15-4513. Средние значения ± SD, n=4. Планки погрешностей, размер которых меньше, чем символ, не отображены.
-/-
f1/f1
-/-
R/R
A
A
A
A
На фиг. 17 показано противозудное действие ТРА023В (0,3 мг/кг), введенного посредством интратекальной инъекции (т.е. в спинномозговой канал), у мышей дикого типа. Хлорохин (100 г) вводили посредством внутрикожной инъекции в кожу правого бедра. (а) Время, затраченное на прикусывание области кожи, в которую делали инъекцию (с/мин). (b) Общее число приступов чесания, подсчитанное в течение 0-10 мин после инъекции вещества, вызывающего зуд. Р=0,008, непарный t-критерий (n=6-7 мышей). (с) Противозудное действие ТРА023В (1 мг/кг) у мышей hoxB8-α2, у которых α2-GABAR отсутствует исключительно в спинном мозге. Данные от мышей α2 GABAR и мышей с общей точечной мутацией по типу замены (H->R) в α2GABAR показаны для сравнения. Хлорохин (100 мкг) вводили посредством внутрикожной инъекции в правое бедро. Вызванные хлорохином реакции прикусывания (общее время, затраченное на прикусывание области кожи, в которую делали инъекцию) были практически одинаковыми у всех трех генотипов (ANOVA с последующим апостериорным критерием Бонферрони, F(14,2)=0,39, Р=1,0 для всех сравнений). В отличие от этого, реакции прикусывания у мышей, обработанных ТРА023В (1 мг/кг, р.о.), значимо различались среди генотипов (ANOVA с последующим апостериорным критерием Бонферрони, F(2,13)=10,6). +, Р≤0,05; ++, Р≤0,01. Никакого значимого различия (Р=0,45) не обнаружили среди мышей hoxB8-α2 и мышей с общей α2, что указывает на то, что по меньшей мере опосредованный α2-GABAR компонент реализуется через спинномозговой участок.
Примеры
A
A
A
A
A
A
A
A
Тормозные нейроны дорсального рога спинного мозга высвобождают два быстродействующих аминокислотных трансмиттера, GABA и глицин, для снижения возбудимости их постсинаптических целевых нейронов. В данных примерах авторы настоящего изобретения сосредоточили свои усилия на GABA-эргической системе и исследовали, может ли зуд, в частности хронический зуд, подавляться путем усиления торможения посредством фармакологического модулирования конкретных подтипов спинномозговых GABA-рецепторов (GABAR). GABAR представляют собой анионные каналы, состоящие из комбинации 19 субъединиц. Большинство GABAR в головном и спинном мозге состоят из субъединиц α, β и γ в стехиометрическом соотношении 2:2:1. Геном млекопитающих содержит 12 генов, кодирующих эти субъединицы (α1-6, β1-3 и γ1-3). Спинномозговые GABAR в основном содержат субъединицы α1, α2, α3 или α5 наряду с субъединицами β2/3 и субъединицей γ, тогда как субъединицы α4 и α6 только слабо экспрессируются или полностью отсутствуют. Различия в физиологических функциях и фармакологических свойствах этих GABAR в основном определяются субъединицей α. Авторы настоящего изобретения использовали генетически модифицированных мышей для идентификации α2/α3-содержащих GABAR в качестве ключевых элементов спинномозгового контроля зуда. Основываясь на этих результатах авторы настоящего изобретения оценили потенциальное противозудное действие селективных в отношении α2/α3-GABAR соединений и показали, что они не только снижают острый гистамин-зависимый и гистамин-независимый зуд у мышей, но и хронический зуд у мышей и собак без видимых побочных эффектов.
Пример 1. Противозудный эффект диазепама (DZP)
A
A
A
Для проверки влияния DZP на вызванный серотонином зуд использовали мышей с тройной точечной мутацией GABA-рецептора, несущих чувствительный к бензодиазепину α2-, α3- или α5-GABA-рецептор (Ralvenius et al., Nat Comm 6:6803, 2015). Поскольку мышей с таким конкретным генетическим фоном (129SvJ) еще систематически не анализировали в экспериментах с зудом, авторы настоящего изобретения сначала оценивали чувствительность этих мышей к набору веществ, вызывающих зуд, которые вводили посредством инъекции в правую щеку. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что инъекция α-метилсеротонина (α-метил-5-НТ), метаболически более стабильного производного центрального мессенджера зуда серотонина, вызывала дозозависимое устойчивое поведение чесания, направленное на участок инъекции (фиг. 12). Для проверки возможных противозудных эффектов, вызванных активацией определенных подтипов GABA-рецептора, мыши получали 10 мг/кг DZP или инертной среды путем перорального введения. Через час после введения DZP мыши получали 20 мкг α-метил-5-гидрокситриптамина (α-Ме-5-НТ), агониста серотонинового рецептора, путем инъекции в щеку, чтобы вызвать зуд. В течение 20 минут регистрировали приступы чесания, направленные на ипсилатеральную щеку, и мышей, которым вводили DZP, сравнивали с контрольными мышами, которым вводили инертную среду (фиг. 1a, b).
A
A
A
Мыши с чувствительными к DZP α2- или α3-GABA-рецепторами демонстрировали значительное снижение приступов чесания в ответ на обработку DZP, тогда как мыши только с чувствительными к DZP α5 GABA-рецепторами не демонстрировали значительного снижения приступов чесания после обработки DZP. Возможный вклад α1-рецепторов в противозудный эффект DZP нельзя было исследовать, поскольку α1-рецепторы обеспечивают седативный эффект бензодиазепинов. Остальные α-субъединицы α4 и α6 являются нечувствительными к DZOP и, следовательно, весьма маловероятно могут способствовать противозудным эффектам DZP. Вследствие этого авторы настоящего изобретения продемонстрировали противозудный эффект бензодиазепина, DZP, против вызванного серотонином зуда, который опосредовали α2- и α3-GABA-рецепторы.
Пример 2. Дозозависимый противозудный эффект DZP
A
A
Мышам только с α2-GABA-рецепторами, чувствительными к DZP (мыши RHRR), перорально вводили инертную среду или 0,1, 0,3, 1, 3, 10 и 30 мг/кг DZP, чтобы установить зависимость доза-ответ в отношении зуда, вызванного с помощью 20 мкг α-Ме-5-НТ. В течение тридцати минут регистрировали приступы чесания, направленные на щеку, в которую делали инъекцию α-Me-5-HT, и мышей, обработанных с помощью DZP, сравнивали с контрольными мышами, которых обрабатывали инертной средой (фиг. 2а, b). DZP или инертную среду вводили за один час до α-Me-5-HT. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали дозозависимое снижение приступов чесания путем обработки с помощью DZP, и его опосредовали α2-GABA-рецепторы.
Пример 3. Противозудный эффект диазепама на модели контактного дерматита с хроническим зудом
A
A
Мышей с тройной точечной мутацией GABA-рецептора, несущих только чувствительные к DZP α2-, α3- или α5-GABA-рецепторы, обрабатывали с помощью 100 мкл 10% оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она; Sigma Aldrich), растворенного в смеси ацетон/оливковое масло (4:1), на загривке. Со дня 7 по день 17 этих мышей ежедневно обрабатывали с помощью 100 мкл 1% оксазолона для индукции контактного дерматита и хронического зуда. В день 18 мыши получали 10 мг/кг DZP или инертной среды путем внутрибрюшинной инъекции. Число приступов чесания, направленных на загривок, регистрировали в течение 4 часов после инъекции (фиг. 3а, b).
A
Мыши, получавшие DZP, демонстрировали значительное снижение числа приступов чесания по сравнению с мышами, получавшими только инертную среду (фиг. 2b). Это демонстрирует, что противозудный эффект DZP обеспечивается посредством α2- и α3-GABA-рецепторов и также эффективен на мышиной модели хронического зуда.
Пример 4. Противозудный эффект ТРА023В
A
A
Авторы настоящего изобретения исследовали модуляторы, специфические к другому подтипу GABA-рецепторов, такие как ТРА023В (Russell et al. J Med Chem, 49(4): 1235-8, 2006), в отношении их пригодности в качестве противозудных веществ для дополнительного подтверждения своего открытия, что в принципе все агонисты α2- и α3-GABA-рецепторов являются подходящими противозудными веществами.
ТРА023В, являющийся агонистом α2, α3 и α5 и антагонистом α1, впервые оценивали в отношении его противозудных эффектов в ответ на инъекцию в щеку 100 мкг гистамина у мышей C57BL/6 дикого типа (фиг. 4а, b). Мышам перорально вводили ТРА023В за 90 минут до инъекции гистамина. Дозы ТРА023В представляли собой инертную среду, 0,01, 0,03, 0,1, 1 и 3 мг/кг. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали дозозависимое снижение приступов чесания путем обработки с помощью ТРА023В против гистаминергического зуда, показывая, что ТРА023В является противозудным средством у мышей дикого типа.
Чтобы исключить какие-либо седативные эффекты ТРА023В, которые могут иметь место у мышей, включали эксперимент по определению зависимости доза-ответ (фиг. 4с). Мышам перорально вводили ТРА023В в различных дозах (инертная среда, 0,3, 1, 3, 10 и 30 мг/кг). После введения мышей помещали на площадку "открытого поля" и регистрировали их активность в течение одного часа, начиная через час после введения. Мыши, которым вводили дозу 10 мг/кг и 30 мг/кг, демонстрировали значительное повышение активности по сравнению с мышами, которым вводили только инертную среду, исключая какие-либо седативные эффекты ТРА023В у мышей дикого типа.
Второе вещество, вызывающее зуд, включали для того, чтобы подтвердить противозудный эффект ТРА023В у животных дикого типа и доказать эффективность в отношении негистаминергического зуда. Те же дозы ТРА023В, что и на фиг. 4, вводили за 90 минут до инъекции в щеку 100 мкг хлорохина (фиг. 5а, b). Авторы настоящего изобретения продемонстрировали дозозависимое снижение приступов чесания путем обработки с помощью ТРА023В против вызванного хлорохином зуда, подтверждая, что ТРА023В является противозудным средством против негистаминергического зуда у мышей дикого типа. Для того, чтобы оценить противозудный эффект ТРА023В при клинически значимом заболевании, использовали модель контактного дерматита с хроническим зудом. С этой целью мышей C57BL/6 дикого типа обрабатывали с помощью 100 мкл 10% оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она; Sigma Aldrich), растворенного в смеси ацетон/оливковое масло (4:1), на загривке. Со дня 7 по день 17 этих мышей ежедневно обрабатывали с помощью 100 мкл 1% оксазолона для индукции контактного дерматита и хронического зуда. В день 18 мыши получали внутрибрюшинную инъекцию 1 мг/кг ТРА023В. Число приступов чесания, направленных на загривок, регистрировали с 15 по 210 минуту после инъекции (фиг. 6а). Мыши, которым вводили ТРА023В, демонстрировали значительное снижение приступов чесания по сравнению с мышами, которым вводили инертную среду (фиг. 6b). Таким образом, ТРА023В в соответствии с другими результатами авторов настоящего изобретения подходит в качестве противозудного вещества.
Развитие устойчивости к противозудному эффекту ТРА023В после длительной обработки снова исследовали на модели контактного дерматита с хроническим зудом. С этой целью мышей C57BL/6 дикого типа обрабатывали с помощью 100 мкл 10% оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она; Sigma Aldrich), растворенного в смеси ацетон/оливковое масло (4:1), на загривке. Со дня 7 по день 27 этих мышей через день обрабатывали с помощью 100 мкл 1% оксазолона для индукции и поддержания контактного дерматита и хронического зуда. Начиная с дня 17 мышей обрабатывали с помощью внутрибрюшинной инъекции инертной среды или 1 мг/кг ТРА023В в течение девяти последовательных дней. В день 28 мышам делали внутрибрюшинную инъекцию инертной среды или ТРА023В (1 мг/кг). Число приступов чесания, направленных на загривок, регистрировали с 15 по 210 минуту после инъекции (фиг. 7а). Мыши, которые получали инъекцию ТРА023В в день 28, демонстрировали значительное снижение приступов чесания по сравнению с мышами, получавшими инъекцию инертной среды. Это не зависело от обработки, которую они получали с дня 7 по день 27. Мыши, получавшие обработку ТРА023В (d/d), демонстрировали такое же снижение, как и мыши, получавшие инертную среду с дня 7 по день 27 и ТРА023В в день 28 (v/d), по сравнению с мышами, получавшими только инертную среду (v/v), или мышами, получавшими ТРА023В с дня 7 по день 27 и инертную среду в день 28 (d/v) (фиг. 7b). Таким образом, авторы настоящего изобретения исключили развитие устойчивости к противозудным эффектам ТРА023В.
Пример 5. Противозудный эффект ТР003 при вызванном серотонином зуде
A
A
Функцию α3-GABA-рецепторов при противозудных эффектах бензодиазепинов дополнительно рассматривали с использованием специфического к подтипу α3-GABA-рецептора агониста ТР003 (4,2'-дифтор-5'-[8-фтор-7-(1-гидрокси-1-метилэтил)имидазо[1,2-а]пиридин-3-ил]бифенил-2-карбонитрила; Dias et al., J Neurosci, 25(46): 10682-10688; 2005).
A
Мышам дикого типа и мышам с единичной точечной мутацией GABAR, у которых только α3 делали нечувствительным к DZP (мыши HHRH), перорально вводили 10 мг/кг ТР003 или инертную среду. Через час после введения мыши получали инъекцию в щеку 20 мкг α-Ме-5-НТ, чтобы вызвать зуд. В течение двадцати минут регистрировали приступы чесания, направленные на ипсилатеральную щеку, и мышей, которым вводили ТР003, сравнивали с контрольными мышами, которым вводили инертную среду (фиг. 8а, b).
A
Мыши дикого типа, которым вводили ТР003, демонстрировали снижение приступов чесания по сравнению с контрольными мышами, которым вводили инертную среду. У мышей HHRH противозудный эффект ТР003 отсутствовал. Таким образом, активация α3-GABA-рецептора является достаточной для получения противозудного эффекта в отношении вызванного серотонином зуда.
Пример 6. Противозудный эффект NDMC при вызванном контактным дерматитом зуде
A
Авторы настоящего изобретения стремились подтвердить противозудную эффективность агонистов α2- и α3-GABA-рецепторов при вызванном контактным дерматитом хроническом зуде. С этой целью оценивали N-десметилклобазам, бензодиазепин с улучшенной активностью к α2 по сравнению с α1, в отношении его противозудных эффектов (Jensen et al. PLoS One. 2014 Feb 12; 9(2):e88456). Мышей C57BL/6 дикого типа обрабатывали с помощью 100 мкл 10% оксазолона (4-этоксиметилен-2-фенил-2-оксазолин-5-она; Sigma Aldrich), растворенного в смеси ацетон/оливковое масло (4:1), на загривке. Со дня 7 по день 17 этих мышей ежедневно обрабатывали с помощью 100 мкл 1% оксазолона для индукции контактного дерматита и хронического зуда. В день 18 мыши получали внутрибрюшинную инъекцию 10 мг/кг NDMC. Число приступов чесания, направленных на загривок, регистрировали с 15 по 210 минуту после инъекции (фиг. 9а). Мыши, которым вводили NDMC, демонстрировали значительное снижение приступов чесания по сравнению с мышами, которым вводили инертную среду (фиг. 9b). Таким образом, NDMC в соответствии с результатами, полученными с ТРА023В в примере 4, также подходит в качестве противозудного вещества.
Пример 7. Противозудный эффект нейростероида ганаксолона при вызванном хлорохином зуде
A
A
A
Нейростероиды представляют собой класс молекул, отдельных от бензодиазепинов, которые потенцируют GABA-рецепторы, как, например, ганаксолон (Carter et al., J Pharmacol Exp Ther. 1997 Mar; 280(3): 1284-95). Для того, чтобы подтвердить GABA-рецептор в качестве мишени для лечения зуда, авторы настоящего изобретения предварительно обрабатывали мышей C57BL/6J дикого типа с помощью 30 мг/кг ганаксолона внутрибрюшинно (фиг. 10а, b). Животные, которым вводили ганаксолон, демонстрировали значительное снижение числа приступов чесания по сравнению с мышами, обработанными инертной средой. Эти данные показывают, что потенцирование тормозных эффектов GABA-рецепторов, будь то благодаря обработке бензодиазепином или нейростероидом, является реалистичной стратегией снижения зуда.
Пример 8. Тормозной входной сигнал в спинномозговые рецепторы зуда на нейронах 2-го порядка, отвечающих за зуд
Авторы настоящего изобретения подтвердили, что передающие сигнал зуда нейроны GRP (гастрин-высвобождающий пептид) получают входной сигнал от локальных тормозных интернейронов. С этой целью авторы настоящего изобретения проводили эксперименты по ретроградному моно/транссинаптическому отслеживанию с помощью вируса бешенства с началом от нейронов GRP на трансгенных мышах GRP::cre. С помощью этого ретроградного отслеживания идентифицировали множество тормозных и возбуждающих нейронов, пресинаптических по отношению к нейронам GRP. Поперечные разрезы среза дорсального рога, в который делали инъекцию, анализировали с помощью иммунофлуоресцентной визуализации. Визуализировали cre-положительные нейроны GRP, инфицированные AAV.flex.RabG, и нейроны, вторично инфицированные вирусом бешенства. С помощью совместного окрашивания в отношении Lmx1b и Рах2 выявили соответственно 39% возбуждающих и 45% тормозных транссинаптически меченых нейронов. 16% транссинаптически инфицированных нейронов не окрашивались антителами ни к Lmx1b, ни к Рах2 и оставались неклассифицированными. Приблизительно половина тормозных нейронов (48%) локализовалась в I/II пластинах дорсального рога, где большинство тормозных нейронов являются исключительно GABA-эргическими. Другая половина (52%) находилась в более глубоких слоях (III/IV пластины), где большинство тормозных нейронов совместно экспрессируют глицин и GABA.
A
Пример 9. Подтипы GABAR, экспрессируемые на окончаниях первичных рецепторов зуда и нейронах 2-го порядка, отвечающих за зуд
A
A
A
A
A
Авторы настоящего изобретения исследовали наличие субъединиц α1, α2, α3 и α5 GABAR на нейронах GRP (рецепторы зуда 2-го порядка) и спинномозговых аксонах, а также окончаниях первичных MrgprA3-положительных рецепторов зуда. Как нейроны GRP, так и волокна MrgprA3 сконцентрированы во II пластине, которая содержит субъединицы α2 и/или α3 GABAR с высокой плотностью. Для идентификации GRP-положительных нейронов и MrgprA3-положительных аксонов и окончаний авторы настоящего изобретения использовали трансгенных мышей GRP::eGFP и MrgprA3::cre-eGFP. Анализ срезов спинного мозга, полученных от этих мышей, подтвердил, что экспрессия субъединиц α2 и α3 GABAR перекрывается с экспрессией в нейронах GRP и MrgrpA3-положительных окончаниях. В отличие от этого, субъединицы α1 и α5 GABAR в основном отсутствовали во II пластине, но были сконцентрированы в глубоком дорсальном роге. Анализ с помощью конфокального микроскопа при более высоких увеличениях дополнительно показал, что субъединицы α2 и α3 GABAR действительно экспрессировались волокнами MrgprA3 и нейронами GRP.
A
Пример 10. Противозудная эффективность модулятора, селективного в отношении α2/α3-GABAR
A
A
A
A
A
A
A
A
Авторы настоящего изобретения проверяли, будут ли данные, полученные с генетически модифицированными мышами, переводиться на терапевтическую эффективность соединений, селективных в отношении подтипа GABAR. С этой целью авторы настоящего изобретения проверяли противозудную эффективность модулятора ТРА023В, антагонизирующего α1 GABAR, у мышей дикого типа. Перед тем, как тестировать ТРА023В на моделях зуда, проверяли его фармакологический профиль in vitro на клетках HEK293, транзиентно трансфицированных разными подтипами GABAR. ТРА023В характеризовался частичной агонистической активностью в участке связывания бензодиазепина в α2β3γ2 и α3β3γ2 GABAR, но не потенцировал GABA-индуцированные токи в α1β2γ2 GABAR и характеризовался очень слабыми потенцирующими эффектами в отношении α5β2γ2 GABAR. Он не активировал GABAR в отсутствие GABA. Эта частичная агонистическая активность в участке связывания бензодиазепина в α2- и α3-GABAR переводилась в облегчение GABA-эргического торможения нейронов GRP (фиг. 13). Регистрация показателей в конфигурации "целая клетка", проведенная на быстро полученных срезах спинного мозга мышей GRP::eGFP, показала, что ТРА023В (1 мкМ) значительно продлевает затухание GABA-эргических тормозных постсинаптических токов (GABA-IPSC) в нейронах GRP на 43±10% (Р<0,01, парный t-критерий, n=7), но не влияет на амплитуду GABA-IPSC.
A
A
Будет ли этот благоприятный профиль ТРА023В in vitro переводиться в сниженную склонность к побочным эффектам? С учетом отсутствия агонистической активности в отношении α1-GABAR ТРА023В не проявлял седативных эффектов при дозах, составляющих не более 3 мг/кг (р.о.), а вместо этого увеличивал локомоторную активность в тесте "открытого поля" при 1 и 3 мг/кг, что, вероятно, отражало анксиолитическую активность α2-GABAR. ТРА023В не вызывал мышечной релаксации в ходе теста с подвешиванием на горизонтальной проволоке и не снижал координацию движений в анализе с вращающимся стержнем.
A
A
A
A
A
A
A
-/-
Затем авторы настоящего изобретения продолжили исследовать эффективность системного (р.о.) ТРА023В против острого зуда, вызванного хлорохином (100 мкг) и α-метил-5-НТ (20 мкг), двумя медиаторами негистаминергического зуда, и гистамином (100 мкг), которые вводили внутрикожно в правую щеку (фиг. 5b и фиг. 14). Вызванное хлорохином поведение чесания снижалось с помощью ТРА023В у мышей дикого типа в дозах ≥0,03 мг/кг. Аналогичные эффекты получали в случае зуда, вызванного α-метил-5-НТ и вызванного гистамином. Для проверки того, что противозудный эффект ТРА023В был обусловлен его эффектами в участке связывания бензодиазепина в GABAR, авторы настоящего изобретения оценивали его эффект на мышах с тройной точечной мутацией GABAR, у которых все GABAR, чувствительные к модулированию с помощью ТРА023В (α2-, α3- и α5-GABAR), были сделаны нечувствительными к бензодиазепину (т.е. на мышах HRRR). Противозудное действие ТРА023В у этих мышей полностью исчезало (фиг. 15). В качестве необходимого условия для этих экспериментов авторы настоящего изобретения также проверяли, что точечная мутация по типу замены Н->R в субъединице α предотвращает связывание и потенцирование GABAR с помощью ТРА023В (фиг. 16). Последующие эксперименты с интратекальной инъекцией ТРА023В (0,3 мг/кг) на уровне поясничного отдела спинного мозга мышам дикого типа (фиг. 17) и с системным введением ТРА023В (3 мг/кг, р.о.) мышам hoxB8-GABARα2, у которых отсутствует α2-GABAR исключительно в спинном мозге (фиг. 17), подтвердили, что противозудное действие ТРА023В берет свое начало от спинного мозга или, в случае входного сигнала от кожи мордочки, от медуллярного дорсального рога.
Материалы и способы
A
A
A
Мыши. Гомозиготных мышей с тройной или четверной точечной мутацией по типу замены (Н→R) в GABAR получали путем скрещивания мышей с единичной точечной мутацией, описанных ранее (Sun, Y.G., et al. Science, 2009, 325, 1531-1534; Ross, S.E., et al. Neuron, 2010, 65, 886-898; Rudolph, U. & , H. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2014, 54, 483-507). Мыши с точечной мутацией в GABAR и соответствующие контрольные мыши имели фон (129X1/SvJ). Другие трансгенные мыши (в том числе мыши с единичной точечной мутацией в GABAR) и соответствующие контрольные мыши имели генетический фон C57BL/6. ВАС-трансгенных GRP::eGFP (Tg(Grp-EGFP)DV197Gsat/Mmucd) и GRP::cre (Tg(Grp-cre)KH288Gsat/Mmucd) получали из проекта GENSAT (http://www.gensat.org), кроме того, использовали ВАС-трансгенных MrgprA3::cre-eGFP (Tg(Mrgpra3-GFP/cre)#Xzd) (Han, L, et al. Nat Neurosci, 2013, 16, 174-182). Эти три линии ВАС-трансгенных мышей поддерживали в гетерозиготном состоянии. Мыши с репортерным геном TVA (Gt(ROSA)26Sor<tm1(Tva)Dsa) (Seidler, В., et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105, 10137-10142) экспрессировали трансген TVA под контролем универсального промотора зависимым от cre образом.
Лекарственные средства. Диазепам получали от Sigma. ТРА023В (6,2'-дифтор-5'-[3-(1-гидрокси-1-метилэтил)имидазо[1,2-b][1,2,4]триазин-7-ил]бифенил-2-карбонитрил) синтезировали в ANAWA, чистота составляла >95%. Для перорального (р.о.) и внутрибрюшинного (i.p.) введения мышам диазепам и ТРА023В суспендировали в 0,9% физиологическом растворе/1% Tween80. Для электрофизиологических экспериментов и связывания радиолиганда ТРА023В растворяли в DMSO и разбавляли внеклеточной жидкостью до 0,001-1 мкМ (конечная концентрация DMSO≤0,12%).
Получение AAV. Вектор AAV.flex.mCherry-2A-RabG клонировали на собственной базе и осуществляли его упаковку в Perm Vector Core (школа медицины им. Перельмана, Пенсильванский университет) с использованием их специализированной услуги. Вектор AAV.flex.mCherry-2A-RabG клонировали путем вырезания слитого белка ChR2-mCherry из pAAV-Efla-DIO-hChR2(H134R)-mCherryWPRE-pA с помощью AscI и NheI и его замены на кДНК mCherry-2A-RabG, амплифицированную с помощью ПЦР. В этом исследовании использовали вектор на основе AAV серотипа 1.
Интраспинальные инъекции вируса. Животных анестезировали 2-5% изофлураном и обнажали поясничные позвонки L4 и L5. Затем животное помещали в моторизованную стереотаксическую рамку и позвоночный столб иммобилизовали с помощью пары держателей позвоночника. Позвоночную пластину и дорсальный остистый отросток удаляли для обнажения поясничного сегмента L4. Твердую мозговую оболочку просверливали приблизительно на 500 мкм левее дорсального кровеносного сосуда с применением иглы 30G со скошенным концом. Вирусные векторы вводили на глубину 200-300 мкм с применением стеклянной микропипетки (диаметр наконечника 30-40 мкм), прикрепленной к шприцу Гамильтона объемом 10 мкл. Скорость введения (30 нл/мин) контролировали с помощью шприцевого насоса PHD Ultra с насадкой Nanomite (Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс). Микропипетку оставляли на месте в течение 5 мин после введения. Раны зашивали, и животным вводили i.p. 0,03 мг/кг бупренорфина и оставляли для восстановления на тепловом мате. Мышей, которым вводили вирус бешенства, подвергали перфузии через 3-5 дней после инъекции.
9
6
Эксперименты по ретроградному отслеживанию. Эксперименты по ретроградному моносинаптическому отслеживанию начинали с нейронов поясничного отдела спинного мозга, экспрессирующих GRP::cre. Применяли двустадийную стратегию. Она включала сначала инъекцию вируса-помощника AAV (AAV.flex.mCherry-2A-RabG; 2,9×10 GC на инъекцию в 300 нл), содержащего бицистронную Cre-зависимую кассету экспрессии mCherry и гликопротеина вируса бешенства (RbG), и через четырнадцать дней следующую инъекцию псевдотипированного EnvA (гликопротеином оболочки вируса лейкоза-саркомы птиц "А") гликопротеин-дефицитного вируса бешенства (EnvA.RabiesΔG.eGFP; 1×10 GC на инъекцию в 500 нл). Белок TVA, экспрессируемый в Rosa26-репортерной линии мышей (Seidler, В., et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105, 10137-10142), обеспечивал возможность специфического для типа клеток инфицирования нейронов Grp::Cre+, и RbG экспрессировали для транс-дополнения гликопротеин-дефицитного вируса бешенства в первично инфицированных нейронах. Для последующих нейрохимических анализов мышей перфузировали 4% параформальдегидом (PFA) в PBS с последующей постфиксацией в 4% PFA в PBS в течение 1-2 часов через пять дней после инъекции вируса бешенства. Ткань разрезали на коронарные криосрезы толщиной 25 мкм, которые устанавливали на предметные стекла Superfrost Plus (Thermo Scientific, Цюрих, Швейцария). Применяли следующие антитела: крысиное антитело к mCherry (1:1000), кроличье антитело к GFP (1:1000), куриное антитело к GFP (1:1000), антитело морской свинки к Lmx1b (1:10000; дар от Carmen Birchmeier), кроличье антитело к Рах2 (1:400) и конъюгированные с цианин 3 (Су3), Alexa Fluor 488, DyLight 488, 647 и 649 ослиные вторичные антитела (1:500; Dianova, Гамбург, Германия).
Анализ изображений. Флуоресцентные изображения получали на конфокальном микроскопе Zeiss LSM710 Pascal с использованием объектива 0,8 NA 20х Plan-apochromat или иммерсионного объектива 1,3 NA 63х ЕС Plan-Neofluar и программного обеспечения ZEN2012 (Carl Zeiss). По возможности контраст, освещение и искусственную расцветку настраивали в ImageJ или Adobe Photoshop (Adobe Systems, Дублин, Ирландия). Число клеток количественно оценивали на срезах, полученных от 4-8 животных, и по меньшей мере по четыре среза анализировали у одного животного. Во избежание двойного подсчета клеток в смежных срезах все срезы, используемые для количественной оценки, размещали на расстоянии по меньшей мере 50 мкм. Число иммунореактивных клеток определяли с помощью плагина Cell Counter в ImageJ.
A
A
A
Иммуногистохимия и анализ изображений субъединиц GABAR. Совместную локализацию субъединиц GABAR с окончаниями MrgprA3 и нейронами GRP визуализировали на горизонтальных криосрезах поясничного отдела спинного мозга мыши толщиной 40 мкм. Мышей подвергали глубокой анестезии пентобарбиталом (нембутал, 50 мг/кг, i.p.) и перфузировали aCSF, насыщенной кислородом. Образцы спинного мозга быстро собирали посредством извлечения под давлением и помещали в ледяной 4% PFA на 90 мин. Затем образцы спинного мозга подвергали криозащите в течение ночи в 30% растворе сахарозы/PBS, подвергали мгновенной заморозке с помощью сухого льда и разрезали на коронарные свободно плавающие срезы толщиной 40 мкм, содержащиеся в антифризе при -20°С до дня окрашивания (Seidler, В., et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105, 10137-10142 (2008). Антитела представляли собой специфическую к субъединицам антисыворотку собственного производства (Seidler, В., et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105, 10137-10142 (2008). Конечные разведения составляли 1:20000 (α1), 1:1000 (α2), 1:10000 (α3) и 1:3000 (α5). Распределение субъединиц α GABAR в нейронах GRP дорсального рога анализировали путем иммунофлуоресцентного окрашивания на коронарных срезах, полученных от 2-3 самцов трансгенных мышей GRP::eGFP, как описано выше. Для окрашивания срезы инкубировали в течение ночи при 4°С со смесью первичных антител, разведенных в Tris-буфере, содержащем 2% нормальную козью сыворотку крови. Срезы интенсивно промывали и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с Су3 (1:500), Су5 (1:200) (Jackson ImmunoResearch) или Alexa488 (1:1000, Molecular Probes, Юджин, Орегон). Срезы снова промывали и накрывали покровными стеклами с флуоресцентной заливочной средой (DAKO, Карпинтерия, Калифорния).
2
Получение и анализ изображений выполняли, как описано ранее (Paul, J., Zeilhofer, H.U. & Fritschy, J.M. J Comp Neurol, 2012, 520, 3895-3911). Двойные иммунофлуоресцентные сигналы визуализировали с помощью конфокальной микроскопии (LSM710; Zeiss AG, Йена, Германия) с использованием объектива 63х Plan-Apochromat (N.A. 1,4). Точечную диафрагму устанавливали на 1 единицу Эри для каждого канала, и значения отдельных цветовых каналов получали последовательно. Настройки сбора данных корректировали так, чтобы охватить весь динамический диапазон фотоумножителей. Как правило, комплекты конфокальных изображений (1024×1024 пикселя) с промежутком 0,3 мкм получали при увеличении 56-130 нм/пиксель. Для отображения изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Imaris (Bitplane; Цюрих, Швейцария). Изображения со всех каналов накладывали (проекция максимальной интенсивности) и при необходимости вычитали фон. Фильтр нижних частот использовали для изображений, отображающих окрашивание α-субъединиц. Анализ распределения α-субъединиц-IR в нейронах и дендритах GRP::eGFP выполняли на отдельных конфокальных изображениях срезов от 2-3 мышей, полученных при увеличении 78 нм/пиксель в виде 8-битных полутоновых изображений, с применением алгоритма пороговой сегментации (минимальная интенсивность, 90-130; площадь >0,08 мкм).
2
Гистологический и иммунофлуоресцентный анализ кожи. Собирали образцы воспаленной и здоровой кожи спины. Ткани заливали реактивом OCT (Sakura Finetek, Торранс, США) и замораживали с помощью сухого льда. Криостатные срезы (7 мкм) помещали на стеклянные предметные стекла, высушивали на воздухе, фиксировали ацетоном в течение 2 мин при -20°С и затем регидратировали 80% метанолом в течение 5 мин при 4°С. Образцы инкубировали с 5% ослиной сывороткой крови, 0,1% Triton-X и 1% BSA в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией в течение ночи с крысиным антителом к CD68 мыши (1:200; Abcam, Кембридж, Великобритания) при 4°С. Образцы инкубировали со вторичными антителами, связанными с Alexa Fluor 488 или 594, и Hoechst 33342 (все от Invitrogen, Life Technologies, Карлсбад, США) в течение 30 мин при комнатной температуре. Окрашенные в отношении CD68 срезы исследовали с помощью микроскопа Axioskop 2 mot plus (Carl Zeiss, Фелдбах, Швейцария), оснащенного камерой AxioCam MRc (Zeiss) и объективом 0,45 NA 10х Plan-Apochromat (Zeiss). Получали изображения по меньшей мере четырех отдельных полей зрения на срез с применением программного обеспечения Axio-Vision 4.8. С применением ImageJ v1.49 определяли площадь флуоресценции между роговым слоем эпидермиса и его контуром, сдвинутым на 300 мкм в ткань. Результаты выражали в виде CD68-положительной площади (мкм) на мкм базальной мембраны.
A
A
A
A
2
2
2
5
5
50
H
GABA
max
50
max
nH
nH
nH
Регистрация электрофизиологических показателей в клетках HEK293. Эффекты ТРА023В на токи через рекомбинантные GABAR исследовали на клетках HEK293 (АТСС), транзиентно экспрессирующих GABAR. Клетки HEK293 трансфицировали с использованием липофектамина LTX (Dugue, G.P., et al. Neuron, 2009, 61, 126-139). Для обеспечения экспрессии γ2-субъединицы (необходимой для модулирования GABAR с помощью BDZ) во всех регистрируемых клетках авторы настоящего изобретения трансфицировали клетки плазмидой, экспрессирующей γ2-субъединицу и eGFP из IRES, и для регистрации показателей выбирали только eGFP-положительные клетки. Смесь для трансфекции содержала (в мкг): 1 α1, 1 β2, 3 γ2/eGFP (использовали в качестве маркера успешной трансфекции) или 1 αx, 1 β3, 3 γ2/eGFP в случае α2-, α3- или α5-GABAR. Регистрацию показателей выполняли через 18-36 ч. после трансфекции. Регистрацию токов, вызванных GABA, по методу пэтч-клемп в конфигурации "целая клетка" выполняли при комнатной температуре (20-24°С) и при исходном потенциале -60 мВ. Регистрирующие электроды заполняли раствором, содержащим (в мМ): 120 CsCl, 10 EGTA, 10 HEPES (рН 7,40), 4 MgCl, 0,5 GTP и 2 АТР. Внешний раствор содержал (в мМ): 150 NaCl, 10 KCl, 2,0 CaCl, 1,0 MgCl, 10 HEPES (рН 7,4) и 10 глюкозы. GABA наносили на регистрируемую клетку с применением управляемого вручную импульса (4-6 с) низкой субнасыщающей концентрации GABA (ЕС). Значения ЕС GABA определяли для всех анализируемых комбинаций субъединиц. Значения ЕС и коэффициенты Хилла (n) получали из сглаживания нормализованных кривых концентрация-ответ по уравнению I=I[GABA]/([GABA]+[EC]). I определяли как средний максимальный ток, вызванный концентрацией 1 мМ GABA. ТРА023В растворяли в DMSO и затем разбавляли регистрируемым раствором и совместно наносили вместе с GABA без предварительной инкубации.
2
4
2
3
2
2
2
2
w
w
1
1
2
2
1
2
1
2
1
2
Регистрация электрофизиологических показателей в срезах спинного мозга. Поперечные срезы спинного мозга (толщиной 400 мкм) получали от 20-29-дневных мышей GRP::eGFP любого пола, как описано ранее (Dugue, G.P., et al. Neuron, 2009, 61, 126-139). Регистрацию показателей по методу пэтч-клемп в конфигурации "целая клетка" выполняли при комнатной температуре с нацеливанием на eGFP-положительные нейроны. В ходе регистрации показателей срезы непрерывно поливали со скоростью 1-2 мл/мин с помощью aSCF, содержащей (в мМ): 120 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaHPO, 26 NaHCO, 5 HEPES, 1 MgCl, 2 CaCl и 14,6 глюкозы (pH 7,4), уравновешенной 95% O2, 5% CO2. Регистрируемым нейронам фиксировали потенциал при -70 мВ с использованием усилителя ЕРС 9 (HEKA Elektronic, Ламбрехт, Германия), управляемого программным обеспечением Patchmaster для сбора данных. Пэтч-пипетки (боросиликатное стекло; 3,5-4,5 МΩ) заполняли внутриклеточной жидкостью, содержащей (в мМ): 120 CsCl, 2 MgCl, 6HO, 10 HEPES, 0,05 EGTA, 2 MgATP, 0,1 NaGTP, 5 QX-314 (pH 7,35). IPSC вызывали с помощью электрического стимулирования (300 мкс, 0,2-50 В) при 0,05 Гц с применением стеклянного электрода, заполненного aCSF и размещенного в 50-100 мкм от тела регистрируемой клетки. Эксперименты проводили в присутствии NBQX (20 мкМ), АР5 (50 мкМ) и стрихнина (0,5 мкМ) для выделения GABA-эргического компонента IPSC. По окончании регистрации показателей добавляли бикукуллин (10 мкМ) для подтверждения GABA-эргической природы зарегистрированных IPCS. Взвешенную постоянную времени затухания (T) рассчитывали по двухэкспоненциальным сглаживаниям с применением следующего уравнения: T=(TA+ТА)/(A+А), где T и Т представляют собой постоянные времени быстрого и медленного затухания, и A и А представляют собой эквивалентные коэффициенты взвешивания амплитуды (Labrakakis, С., Lorenzo, L.E., Bories, С., Ribeiro-da-Silva, А. & De Koninck, Y Mol Pain, 2009, 5, 24). Сопротивление доступа каждого нейрона непрерывно контролировали с помощью короткого гиперполяризующего скачка потенциала, применяемого перед электрическим стимулированием. Клетки, в которых сопротивление доступа изменялось более чем на 20%, исключали из анализа.
3
3
3
Связывание [H]Ro15-4513. Ткань головного мозга от 8-10-недельных мышей с четверной точечной мутацией RRRR по типу (H->R), у которых все высокоаффинные чувствительные к диазепаму участки связывания были инактивированы, гомогенизировали в 20 объемах 10 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 100 мМ KCl, содержащих ингибиторы протеазы (Complete Mini, Roche Diagnostics), и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость центрифугировали в течение 20 мин при 30000 g и полученный осадок неочищенных мембран один раз промывали буфером. Для связывания радиолиганда аликвоты неочищенных мембран (100 мкг) инкубировали с возрастающими концентрациями диазепама (связывается с чувствительными к диазепаму участками), бретазенила (связывается с чувствительными и нечувствительными к диазепаму участками, ссылка 48) или ТРА023В и 4 нМ [H]Ro15-4513 (22,7 Ки/ммоль, PerkinElmer, связывается с чувствительными и нечувствительными к диазепаму участками) в общем объеме 0,2 мл в течение 90 мин на льду. Неспецифическое связывание [H]Ro15-4513 оценивали путем добавления 10 мкМ флумазенила к реакционной смеси. Инкубацию останавливали путем быстрой вакуумной фильтрации с применением полуавтоматического сборщика клеток (Skatron Instruments), и промытые фильтры подвергали жидкостному сцинтилляционному счету.
Поведенческие эксперименты на мышах. Все поведенческие эксперименты проводили на 7-12-недельных самках и самцах мышей. Предпринимали меры для обеспечения равных количеств самок и самцов мышей. Все поведенческие эксперименты проводил экспериментатор-мужчина, ослепленный в отношении генотипа мышей или их обработки лекарственным средством или инертной средой. В экспериментах, включающих сравнения диазепама или ТРА023В с инертной средой, мышей случайным образом распределяли в разные группы.
A
Острый зуд оценивали у мышей, которые получали внутрикожные микроинъекции веществ, вызывающих зуд, или 0,9% физиологического раствора в правую щеку, которую брили по меньшей мере за один день до эксперимента. В двух сериях экспериментов, посвященных вкладу GABAR в первичные и вторичные рецепторы зуда, вещества, вызывающие зуд, вводили в правое бедро (фиг. 17). Перед инъекцией обеспечивали акклиматизацию мышей к цилиндрическому корпусу диаметром 15 см в течение более 30 минут с подстилкой из клетки на полу. Фоновый белый шум, создаваемый радиоприемником в комнате на нормальном уровне громкости, применяли для предотвращения слухового отвлечения. Иглу 30 калибра вставляли скосом вверх и продвигали в горизонтальном направлении на 5 мм в кожу за пределы места введения перед инъекцией вещества, вызывающего зуд (в общем объеме 10 мкл). Анестезию не использовали. Правильную инъекцию подтверждали по появлению слегка куполообразного вздутия после инъекции. После инъекции мышей помещали обратно в цилиндрический корпус и снимали на видеокамеру в течение 30 мин. Видео анализировали в режиме офлайн. Чесание задней лапой, направленное на ипсилатеральную щеку, подсчитывали в приступах, где один приступ чесания определяется как случай, когда мышь поднимает лапу, чтобы почесаться, и до тех пор, пока она не вернет лапу на пол клетки. В случае экспериментов, в которых вещество, вызывающее зуд, вводили в кожу бедра, подсчитывали время, затраченное на прикусывание области кожи, в которую делали инъекцию, в с/мин в качестве показателя зуда.
Хронический зуд исследовали на модели контактного дерматита (Kido-Nakahara, М., et al. J Clin Invest, 2014, 124, 2683-2695). Мышей обрабатывали один раз 10% оксазолоном в смеси ацетон/оливковое масло (4:1 об/об) на выбритом загривке (100 мкл) в день 0. После 7-дневного периода покоя мышей обрабатывали 1% оксазолоном в смеси ацетон/оливковое масло (4:1 об/об) на загривке (100 мкл) через день в течение 10 дней. В день эксперимента мышам вводили лекарственное средство или инертную среду i.p. под кратковременной и легкой изофлурановой анестезией. Чесание задней лапой, направленное на ипсилатеральную щеку, количественно оценивали как число приступов чесания.
Локомоторную активность, эффекты мышечной релаксации и координацию движений оценивали, как описано ранее (Ralvenius, W.T., Benke, D., , M.A., Rudolph, U. & Zeilhofer, H.U. Nature Communications, 2015, 6). Вкратце, TPA023B (1 мг/кг, р.о.) или инертную среду вводили за 60 мин до проведения тестов. Локомоторную активность анализировали в течение периода времени от 60 до 120 мин после введения ТРА023В. Координацию движений оценивали с помощью вращающегося стержня с ускорением от 4 об/мин до 40 об/мин в течение 5 мин. Через шестьдесят минут после введения ТРА023В мышей помещали на вращающийся стержень. Пятнадцать измерений получали от каждой мыши. Для оценки мышечной релаксации мышей помещали передними лапами на металлическую горизонтальную проволоку, расположенную в 20 см над полом. Успешные и неудачные попытки захвата проволоки по меньшей мере одной задней лапой регистрировали в течение 60-120 мин после введения ТРА023В.