Антагонистическая активность бактерийдеструкторов хлорфеноксикислот рода Bacillus

Антагонистическая активность бактерий-деструкторов хлорфеноксикислот рода Bacillus*

Н.В. Жарикова, к.б.н., Т.Р. Ясаков, к.б.н.,

Е.Ю. Журенко, к.б.н., Институт биологии УНЦ РАН

Явление антагонизма широко распространено в природных сообществах. Среди бактерий антагонистические свойства наблюдались у грамположительных бацилл Bacillus mesentericus и Bacillus subtilis, а у грамотрицательных бактерий они обнаружены у Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas aeruginosa. Псевдомонады — один из немногочисленных родов бактерий, у которых к настоящему времени обнаружены антибиотики — ß-лактоны, в частности обафлюорин, синтезируемый штаммом P. fluorescens Sc 12936 [1].

Понимание антагонистических взаимоотношений микроорганизмов является важным усло-

вием создания эффективных микробных консорциумов для практического применения, например в целях утилизации гербицидов в местах их ненормативного накопления в окружающей среде.

Цель настоящей работы — выявить характер взаимодействий природных штаммов-деструкторов хлорфеноксикислот рода Bacillus, выделенных из смешанных популяций почвенных микроорганизмов.

Объекты и методы. Объектами исследования являлись оригинальные штаммы природных бактерий-деструкторов ароматических гало-генидов, выделенные из образцов почвенных сообществ микроорганизмов, подвергавшихся воздействию факторов нефтехимического производства на территории Уфимского промузла.

* Работа выполнена при поддержке гранта программы фундаментальных исследований президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития», программы АН РБ проекта «Биотехнологические способы воспроизводства и рационального использования биологических ресурсов» и гранта Республики Башкортостан молодым учёным и молодёжным научным коллективам

Чистые культуры были получены методом Коха с небольшими модификациями. Штаммы были идентифицированы согласно принципам культурально-морфологической и физиологобиохимической дифференциации, а также типирования по последовательности гена 16S рРНК как представители нескольких таксонов бактерий, а именно родов Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Enterobacter, Pseudomonas, Raoultella и Stenotrophomonas [2].

Антагонистические взаимоотношения культур изучали с применением методов перпендикулярных штрихов и агаровых блоков. Все эксперименты проводили в 3-кратной повторности. При использовании метода перпендикулярных штрихов на питательный агар в чашке Петри штрихом высевали клетки исследуемого штамма, обозначаемого как продуцент. Затем, после часовой инкубации в термостате при оптимальной для роста культуры температуре, перпендикулярно к штриху продуцента подсевали штрихи тест-культур, начиная от краёв чашки Петри. Антагонистическую активность оценивали по характеру развития колоний после 48-часовой инкубации в термостате. Если рост тест-культур происходил на расстоянии от роста продуцента, то эта культура считалась чувствительной к продуценту. В качестве контроля применяли оценку развития тест-культуры на богатой питательной среде (МПА) [3]. При применении метода агаровых блоков изучаемую культуру — продуцент высевали на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. После формирования газона из среды вырезали агаровые блоки диаметром 9 мм, которые переносили на предварительно засеянную тест-культурой поверхность МПА в другой чашке Петри. Чашки инкубировали 48 ч. в термостате. После этого проводили оценку зон отсутствия роста тест-культур вокруг агаровых блоков [2].

Результаты. Известно, что микроорганизмы способны вступать между собой в сложные

взаимодействия, которые в значительной степени определяются их физиолого-биохимическими особенностями. В основном эти взаимоотношения условно подразделяют на две большие группы: благоприятные — синергизм и неблагоприятные — антагонизм. Антагонистические взаимоотношения можно охарактеризовать путём оценки подавления развития клеток микроорганизма (тест-культура) другой культурой, используемой в качестве продуцента антагонистических веществ в условиях роста на агаризированных средах.

В ходе изучения антагонистических взаимодействий штаммов-деструкторов хлорфенок-сикислот рода Bacillus было обнаружено, что рост большей части тест-культур происходил в непосредственной близости от продуцентов, что указывало на отсутствие антагонизма (табл. 1). Так, между тремя штаммами рода Bacillus и тремя культурами рода Raoultella, а также штаммами родов Achromobacter, Enterobacter и Stenotrophomonas не наблюдалось антагонистических взаимоотношений.

Не обнаружено зон подавления роста тест-культур Bacillus subtilis 16S и Bacillus subtilis 21SW продуцентом Bacillus polifermenticus. Bacillus subtilis 16S не влиял на рост всех испытанных тест-культур. Штамм-продуцент Bacillus subtilis 21 SW не подавлял рост тест-культур Bacillus polifermenticus, Citrobactersp. 36-4 Ch, Pseudomonas fluorescens 34 DCP и Pseudomonas kilonensis 34 T

Вместе с тем в отдельных случаях рост тест-культур происходил на некотором расстоянии от продуцентов (табл. 1). Полученные данные свидетельствовали в пользу того, что у части испытанных культур существуют антагонистические взаимодействия. Из таблицы 1 видно, что в ходе исследования были выявлены два штамма рода Bacillus, подавлявших рост тест-организмов. Штамм B. polifermenticus подавлял рост трёх тест-культур, а именно Citrobacter sp.

1. Оценка антагонистической активности культур бактерий

Тест-организм Продуцент

Bacillus polifermenticus Bacillus subtilis 16S Bacillus subtilis 21SW

Achromobacter xylosoxidans 33 P + + +

Bacillus polifermenticus + +

Bacillus subtilis 16S + -

Bacillus subtilis 21SW + +

Citrobacter sp. 36-4 Ch - + +

Enterobacter cloacea 34-4 Ch + + +

Raoultella planticola 33-4 Ch + + +

Raoultella planticola 36 D + + +

Raoultella planticola 36 T + + +

Pseudomonas fluorescens 34 DCP - + +

Pseudomonas kilonensis 34 T - + +

Stenotrophomonas sp.33 T + + +

Примечание: «+» — рост тест-культуры вблизи штамма-продуцента, «—» — отсутствие роста тест-культуры вблизи штамма-продуцента

36-4 Ch, P. fluorescens 34 DCP и P. kilonensis 34 T Культура B. subtilis 21 SW проявляла антагонистические свойства в отношении штамма B. subtilis 16 S.

Принимая во внимание то, что при использовании метода перпендикулярных штрихов продуцент и тест-культуры инкубируются одновременно на одной среде, в то время как условия роста не всегда могут быть благоприятными как для развития продуцента и образования им антибиотических веществ(а), так и для роста тест-культур в работе дополнительно был применен метод агаровых блоков. Штаммы-антагонисты, выявленные методом перпендикулярных штрихов B. subtilis 21SW и B. polifermenticus, а также соответствующие им тест-культуры B. subtilis 16S, Citrobacter sp. 36-4 Ch, P. fluorescens 34 DCP, P. kilonensis 34 T и B. subtilis 21SW высевали на разные чашки Петри. После образования газона агаровые блоки с культурой антагониста переносили на чашку тест-культуры. В случае чувствительности тест-культуры к продуценту вокруг агаровых блоков после инкубации при оптимальной температуре наблюдались зоны отсутствия роста, которые подвергали оценке (табл. 2).

2. Оценка антагонистической активности методом агаровых блочков

Продуцент Тест-культура Диаметр зоны подавления роста, мм

B. subtilis 21SW B. subtilis 16S 14,67±1,4

B. polifermenticus Citrobacter sp. 36-4 Ch P. fluorescens 34 DCP P. kilonensis 34 T 0 12,33±1,4 11±0,1

Из данных таблицы видно, что при тестировании методом агаровых блоков выбранных штаммов было выявлено 4 случая угнетения роста тест-культур с образованием зоны подавления роста в диапазоне от 9 до 14,67 мм, а именно В. subtilis 21SW подавлял рост В. subtilis

16S, а культура B. polifermenticus — P. fluorescens 34 DCP и P. kilonensis 34 T

Приведённые данные свидетельствуют о том, что два штамма B. subtilis 21SW и B. polifermenticus способны к подавлению роста других бактерий, вследствие образования диффундирующего в среду вещества антимикробной природы.

В случае пары B. polifermenticus и Citrobacter sp. 36-4 Ch подавления роста не наблюдалось, что указывает на то, что антагонистические взаимоотношения между B. polifermenticus и тест-культурой Citrobacter sp. 36-4 Ch методом агаровых блоков не подтвердились. Можно полагать, что задержка роста тест-культуры Citrobacter sp. 36-4 Ch при применении метода перпендикулярных штрихов могла быть вызвана неравномерным развитием культур.

Таким образом, в результате проделанной работы установлено, что штаммы-деструкторы бациллярной линии грамположительных бактерий не проявляют антагонистической активности в отношении культур родов Raoultella, Achromobacter, Enterobacter и Stenotrophomonas. Вместе с тем штаммы рода Bacillus проявляют антагонистическую активность в отношении культур гамма-подкласса протеобактерий рода Pseudomonas. Кроме того, обнаружено наличие антагонизма между штаммами одного таксона B. subtilis 21SW и B. subtilis 16S.

Для создания эффективного консорциума с целью конверсии хлорфеноксикислот следует избегать совместного применения штаммов B. subtilis 21SW и B. subtilis 16S, B. polifermenticus и P. fluorescens 34 DCP, P. kilonensis 34 T из-за наличия у них антагонистических взаимодействий.

Литература

1. Павлюшин В. А. Научные основы использования энтомо-патогенезов и микробов-антагонистов в фитосанитарной оптимизации тепличных агробиоценозов: дисс. в виде науч. докл. докт. биол. наук. ВИЗР. СПб., 1998. 66 с.

2. Маркушева Т.В, Журенко Е.Ю., Кусова И.В. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных. Уфа: Гилем, 2002. 108 с.

3. Практикум по микробиологии / под ред. А.И. Нетрусова. М.: Академия, 2005. 608 с.