НОВЫЙ ПОДХОД К ЛЕЧЕНИЮ КОМПАРТМЕНТ-СИНДРОМА
NEW APPROACH TO TREATMENT OF COMPARTMENT - SYNDROME

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области компартмент-синдрома и к различным состояниям, связанным с ним. Более конкретно, изобретение относится к переносу жидкостей, солей и веществ между клетками, с одной стороны, и с другой стороны, в другие внеклеточные пространства и сосудистую систему в компартменте, образованном тканью, органом и/или определенной структурой, в организме, необязательно с целью нормализации. Замкнутый компартмент включает в себя структуры различных размеров и протяженности, от клетки, ткани, определенной анатомической единицы до органа тела. Пораженная патологическим процессом структура может неправильно функционировать вследствие избыточной нагрузки, травмы, действия токсических агентов, лекарственных средств, кровотечения, опухоли, инфекции микробами, такими как бактерии и/или вирусы, вызывая патологическое повышение давления интерстициальной жидкости и/или другие болезненные состояния. Изобретение относится также к применению специфических антисекреторных белков при компартмент-синдроме как при нормальных, так и при патологических состояниях.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Термин «компартмент-синдром» используется в медицинской практике для описания патологического состояния, которое характеризуется патологически повышенным давлением в замкнутом объеме, компартменте, которое вызывает уменьшение и даже блокаду тока крови и лимфы через указанный определенный объем. Слишком высокое давление на кровеносные сосуды затрудняет кровоток через вены, капилляры и даже артериолы и артерии, изменяет рабочие условия интерстициальной жидкости во внеклеточной окружающей среде, что приводит к уменьшению адекватного снабжения питательными веществами и кислородом клеток и тканей внутри указанного пространства. Столь же важным фактором является недостаточное выведение отходов и метаболитов, часто кислых, которые, из-за своего накопления, еще более усугубляют нарушение функции и метаболизма клеток внутри указанного компартмента. Совокупный эффект указанных нарушений заключается в том, что давление в компартменте повышается и, в конечном итоге, достигает уровней, близких к системному артериальному давлению. Истинное давление крови на входе артериальной сосудистой системы в компартмент, таким образом, представляет собой ключевой элемент, определяющий максимальный уровень, до которого может увеличиться давление. В бессосудистых структурах, таких как хрящ и межпозвоночные диски, адекватное снабжение зависит от переноса жидкости и других составляющих в область и из области путем диффузии, с помощью систем клеточных ионных и жидкостных насосов и градиентов осмотического давления, требующих правильного функционирования клеток. Если сильно повышенное КД (давление в компартменте) персистирует, оно будет вызывать тяжелое повреждение соответствующих клеток, тканей и органов. Кровотечения и набухание клеток и тканей в указанном компартменте могут дополнительно усугубить повреждение, как и последующая ишемия. Чем длиннее промежуток времени при повышенном КД, тем более обширным и тяжелым является повреждение, которое в конечном итоге становится необратимым и вызывает некроз и гибель клеток. Механическая деформация, смещение и сдвиг усугубляют повреждение. Апоптотическая гибель клеток может впоследствии увеличить первоначальное повреждение. КС (компартмент-синдром) вызывает тревожные клинические признаки, такие как боль, болезненность при дотрагивании, набухание и снижение или даже утрату функции, и, в конечном итоге, некроз. Тяжесть повреждения зависит от расположения компартмента, участвующих типов клеток и тканей, характеристик внеклеточной окружающей среды, истинного КД, метаболических нарушений, его продолжительности, как некоторых из ключевых факторов, имеющих значение для исхода и отдаленных последствий.
Большинство компартментов в организме разграничиваются плотной соединительной тканью, часто специализированной, такой как оболочки, фасции, сухожилия, связки, суставные капсулы или подобные неподатливые коллагеновые мембраны, такие как перикард. Кроме того, многие эндокринные органы, такие как щитовидная железа и экзокринные железы заключены в соединительнотканные мембраны и влагалища, и подразделяются ими, образуя, таким образом, компартменты. Другим примером имеющего оболочку, замкнутого, ригидного компартмента являются костные структуры, такие как конечности, череп, позвонки и кости лицевого черепа. Каждый тип клетки и ткани, подвергающийся воздействию повышенного КД, характеризуется своей собственной устойчивостью к преобладающим метаболическим и механическим нарушениям. Однако облегчение КД до нормальных уровней за разумный промежуток времени смягчает повреждение.
Антисекреторный белок представляет собой белок 41 кДа, который, как было описано сначала, обеспечивает защиту от заболеваний, сопровождающихся диареей, и от воспаления кишечника (см. обзор Lange и Lonnroth, 2001). Последовательность антисекреторного белка была установлена, а его кДНК клонирована. Антисекреторной активностью, как представляется, обладает, главным образом, пептид, расположенный между позициями 35 и 50 последовательности антисекреторного белка. Иммунохимические и иммуногистохимические исследования установили, что антисекреторный белок присутствует и также может синтезироваться в большинстве тканей и органов тела. Были описаны свойства синтетических пептидов, включая антидиаррейную последовательность (WO 97/08202; WO 05/030246). Ранее были описаны антисекреторные факторы для нормализации патологического транспорта жидкости и/или воспалительных реакций, таких как в кишечнике и хороидном сплетении в центральной нервной системе после провокации холерным токсином (WO 97/08202). Таким образом, в WO 97/08202 было предложено добавлять антисекреторные факторы к пище и кормам для лечения отека, диареи, обезвоживания и воспаления. В WO 98/21978 описано использование продуктов, обладающих ферментативной активностью, для изготовления продукта питания, которое индуцирует образование антисекреторных белков. В WO 00/038535 описаны также продукты питания, обогащенные самими антисекреторными белками.
Антисекреторный белок и его фрагменты, также, как было показано, улучшают восстановление нервной ткани, а также пролиферацию, апоптоз, дифференцировку и/или миграцию стволовых клеток и недифференцированных клеток-предшественников и полученных из них клеток, для лечения состояний, связанных с утратой и/или приростом клеток (WO 05/030246).
В настоящее время не существует лекарственных средств, которые бы определенно блокировали повышение давления и возвращали его к нормальным уровням при установленном КС, или предотвращали развития повреждения при угрожающем или продолжающемся КС. Гипертонические растворы, например, мочевины или маннита в настоящее время используются для отобранных пациентов, страдающих повышенным ВЧД (внутричерепным давлением), но эффекты являются преходящими и длятся всего несколько часов, в зависимости от анатомического расположения и реальной схемы лечения. Кортикостероиды также используются для противодействия повышенному ВЧД, однако часто могут возникать тяжелые побочные эффекты. Рекомендовались дополнительные лекарственные средства, но, главным образом, для устранения возникающих симптомов. Снижение внутренней температуры тела в сочетании с анестезией барбитуратами считается благоприятным. Однако не существует надежной медикаментозной терапии при КС, возникающем, например, в мышцах, суставах и нервах. Часто в качестве лечения используется хирургическое вмешательство, однако оно имеет тот недостаток, что само по себе вызывает дополнительное повреждение и дискомфорт, а также имеет риск развития осложнений.
Надежная диагностика угрожающего, развивающегося или установленного КС может быть трудной даже для опытного врача. Используются диагностические инструменты, основанные, например, на использовании ультразвуковой или магнитно-резонансной визуализации (МРТ), в настоящее время часто в сочетании с компьютеризированными программами. В настоящем контексте определение давления интерстициальной жидкости в исследуемом компартменте осуществляли посредством измерения истинного давления с использованием очень маленького сенсора на конце стекловолоконного световода. Диаметр зонда составлял 0,4 мм, а диаметр гибкого стекловолокна - 0,3 мм, что означает, что повреждение, нанесенное измерительным оборудованием, по всей вероятности, не имеет значения, едва ли оказывая какое-либо заметное действие на уровни давления. Таким образом, использованное оборудование должно рассматриваться как представляющее надежные величины давления, преобладающего в компартменте, как во внеклеточной жидкости, так и, в некоторых случаях, внутриклеточно, в прилегающих клетках и/или клеточных агрегатах.
Антисекреторные факторы (АФ), особенно белки и пептиды, как подробно описано в WO 97/08202, являются эффективными для ликвидации гиперсекреторных условий и заболеваний кишечника, таких как диарея. Другие примеры, связанные с АФ в связи с гиперсекреторными условиями, представляют собой, например, воспалительные заболевания кишечника, отек головного мозга, глаукому, повышенное внутричерепное давление, болезнь Меньера и мастит. АФ также рассматривают в качестве лечения глаукомы (WO 97/08202).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, включающей в себя антисекреторный белок, его гомолог, производное и/или фрагмент, обладающий антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активную соль, для изготовления фармацевтической композиции и/или лечебного продукта питания для лечения и/или профилактики компартмент-синдрома. Изобретение относится также к лечению и/или профилактике различных состояний, связанных с компартмент-синдромом, таких как набухание клеток и тканей, инфекции микробами, включая бактерии и/или вирусы, и/или формирование тампонады, например, сердца, почки, семенника, яичника, кости, сустава, желез, иммунолимфатических структур, нерва, головного мозга, спинного мозга, кожи, мышц и/или сосудистой стенки.
Помимо этого, изобретение относится к способу лечения и/или профилактики компартмент-синдрома, такого как упомянуто выше; указанный способ включает в себя введение млекопитающему, которое в этом нуждается, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции и/или лечебного продукта питания, включающих в себя антисекреторный белок, его производное, гомолог и/или фрагмент, обладающие антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активную соль.
Изобретение относится также к различным дозам и путям введения, подходящим для предназначенной цели лечения, а также для возраста, пола, состояния пациента и т.п.
Лечение по настоящему изобретению, по всей вероятности, является наиболее подходящим для пациентов, входящих в группу риска развития компартмент-синдрома и/или страдающих компартмент-синдромом, и/или от поглощения и/или высвобождения патогенных веществ. Помимо этого, указанное лечение также является благоприятным при других состояниях, характеризующихся патологическим оборотом жидкости и ионов из замкнутых компартментов, таких как компартменты с ненормальными величинами давления.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 показывает аминокислотную последовательность антисекреторного белка, согласно SEQ ID NO 6 по настоящему изобретению. Последовательность соответствует SEQ ID NO 2 из US 6344440.
Фиг. 2 - ВЧД у крыс, измеренное с помощью зонда стекловолоконного световода, имплантированного в кору головного мозга в области боковых желудочков. Фиг. 2 показывает, что инфекция HSV-1 на 5 день вызывает повышение ВЧД на 40 мм рт.ст. выше нормы. Напротив, лечение крыс, инфицированных HSV-1, с использованием АФ дважды в день, как показано на фиг. 2b, вернуло ВЧД почти на нормальные уровни. Фиг. 2с показывает низкое ВЧД, которое можно видеть у здоровых, не подвергавшихся лечению, неинфицированных крыс. Зонд калибровали по атмосферному давлению.
Фиг. 3 - выживаемость крыс, инфицированных HSV-1, путем введения раствора, содержащего вирус, в правую ноздрю на день 0. Половину крыс (n=15) лечили дважды в день с использованием 1 мкг АФ-16 (верхняя линия) интраназально, в то время как другая половина получала только носитель после заражения HSV-1 (нижняя линия). Из животных, которые получали только носитель, на день 14 выжило только 10%, по сравнению с 60% выживших животных, которых лечили АФ-16. Таким образом, АФ-16 значимо увеличивает выживаемость при энцефалите, вызванном HSV.
Фиг. 4 - малое (a, b) и большое (c, d) увеличения срезов головного мозга после заражения HSV у грызунов путем закапывания раствора, содержащего вирус, в правую ноздрю. Нервные клетки, имеющие в своей цитоплазме белок HSV, отчетливо окрашиваются в темный цвет. Глиальные клетки (d) в таламусе четко очерчены в силу избытка белков HSV в их цитоплазме. Заметьте, что многие из нервных клеток были нереагирующими (не окрашивались). Не наблюдалось разницы по частоте или распределению HSV-1-положительных клеток головного мозга между теми животными, которые получали АФ-16 или только носитель.
Фиг. 5 - количественная ПЦР, осуществленная на тканях головного мозга от крыс, зараженных HSV-1 через правую ноздрю. Образцы головного мозга были получены между 5 и 14 днями после инокуляции вируса в правую ноздрю. Результаты не показывают никакой разницы между леченными носителем и леченными АФ группами в том, что касается количества ДНК HSV-1. Таким образом, АФ-16 не влиял значимым образом на выработку HSV-1, несмотря на то, что лечение АФ-16 значимо улучшало выживаемость (фиг. 2b) по сравнению с животными, которые получали только носитель (фиг. 2а).
Фиг. 6 - срезы через решетчатую пластинку, костную структуру, которая отделяет головной мозг от носа и через которую проходит обонятельный нерв. На левой фигуре (а) комплекс краски и белка Эванс синий-альбумин (ЕВА) инфузировали в субарахноидальное пространство на день 5 после заражения HSV-1. У животных развивался энцефалит средней тяжести. Заметьте, что красного ЕВА нет ни в решетчатой пластинке, ни в носу, поскольку пассаж между головным мозгом и носовой полостью блокирован. На правой фигуре (b) ЕВА инфузировали в субарахноидальное пространство неинфицированной, здоровой крысы. Заметьте интенсивное красное окрашивание по всей решетчатой пластинке, что выявляет пассаж ЦСЖ из головного мозга (вверху) в носовую полость (внизу). Лечение зараженных HSV-1 животных с использованием АФ-16 открывало проход для ЦСЖ через решетчатую пластинку, и, таким образом возникала картина, по внешнему виду идентичная здоровому, неинфицированному животному, как показано на фиг. (b).
ОПРЕДЕЛЕНИЯ И АББРЕВИАТУРЫ
АББРЕВИАТУРЫ
ВЧД: внутричерепное давление; ЦСЖ: цереброспинальная жидкость; ЦНС: центральная нервная система, т.е. головной мозг и спинной мозг; ДИЖ: давление интерстициальной жидкости; HSV: вирус простого герпеса; PBS: физиологический раствор с фосфатным буфером; КД: давление в компартменте; ЗК: замкнутый компартмент; КС: компартмент-синдром; АФ: антисекреторный фактор; АФ-16: пептид, состоящий из аминокислот VCHSKTRSNPENNVGL; октапептид IVCHSKTR; септапептид VCHSKTR; гексапептид CHSKTR; пентапептид HSKTR.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В настоящем документе «компартмент-синдром» определен как повышенное давление, приводящее к метаболическим нарушениям и, в конечном итоге, к повреждению, внутри определенного пространства в клетках, тканях, определенных структурах и/или органах, отграниченных резистентными к давлению структурами. Термин «компартмент-синдром» в медицинской практике используется для характеристики патологического состояния, которое характеризуется патологически повышенным давлением в замкнутом объеме, т.е. в компартменте, которое вызывает уменьшение и даже блокаду, например, тока крови и/или лимфы через указанный определенный объем. Компартмент-синдром может вызывать, а также вызываться рядом состояний, таких как вирусные и микробные инфекции, опухоли, кровотечения, ишемия, травма, избыточная и/или патологическая функция или нагрузка и т.п., как описано в настоящем документе. В настоящем контексте термин «замкнутый компартмент» относится к определенному пространству в клетках, тканях, органах и/или анатомических структурах, отграниченных резистентными к давлению структурами.
Белки представляют собой биологические макромолекулы, состоящие из аминокислотных остатков, связанных между собой пептидными связями. Белки, как линейные полимеры аминокислот, также называют полипептидами. Обычно белки состоят из 50-800 аминокислотных остатков и, следовательно, имеют молекулярные массы в пределах приблизительно от 6000 до нескольких сотен тысяч дальтон или более. Малые белки называют пептидами или олигопептидами. Термины «белок» и «пептид» в настоящем контексте можно использовать взаимозаменяемым образом.
«Фармацевтическая композиция» в настоящем контексте относится к композиции, включающей в себя терапевтически активное количество антисекреторного белка, необязательно, в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, таким как носитель или среда. Указанную фармацевтическую композицию изготавливают для соответствующего пути введения, который можно варьировать в зависимости от состояния пациента, а также от других факторов, таких как возраст или предпочтительный выбор. Фармацевтическая композиция, включающая в себя антисекреторный белок, служит в качестве системы доставки лекарственного средства. Фармацевтическая композиция после введения предоставляет активное вещество в организм человека или животного. Указанная фармацевтическая композиция может быть в форме, например, таблеток, пилюль, лепешек, капсул, ректальных таблеток, гелей и т.п., без ограничения.
Термин «фармацевтически активная соль» относится к соли антисекреторного белка, которая может представлять собой любую полученную из него соль, на основе так называемого ряда Hofmeiser. Другие примеры фармацевтически активные солей включают в себя трифторацетат, ацетат и хлорид лизина, но изобретение ими не ограничивается.
Термин «антисекреторный» в настоящем контексте относится к ингибированию или уменьшению секреции, особенно секреции в кишечнике. Таким образом, термин «антисекреторный белок» относится к белку, способному ингибировать или уменьшать секрецию в организме.
«Лечебный продукт питания» в настоящем контексте относится к продукту питания, который изготовлен с использованием композиции, включающей в себя антисекреторный белок по настоящему изобретению. Указанный продукт питания может представлять собой любой подходящий продукт питания, в жидкой или твердой форме, такой как жидкость или порошок, или любой другой подходящий пищевой продукт. Примеры указанных продуктов можно найти в WO 0038535.
В настоящем контексте «антисекреторный белок» или его гомолог, производное и/или фрагмент, можно использовать взаимозаменяемым образом с термином «антисекреторные факторы» или «белки антисекреторных факторов», как определено в патенте WO 97/08202, и он относится к антисекреторному белку или пептиду или его гомологу, производному и/или фрагменту, обладающим антисекреторной активностью. Таким образом, следует понимать, что «антисекреторный фактор», «белок антисекреторного фактора», «антисекреторный пептид», «антисекреторный фрагмент» или «антисекреторный белок» в настоящем контексте также может относится к его производному, гомологу и/или фрагменту. Указанные термины также можно использовать взаимозаменяемым образом в контексте настоящего изобретения. Помимо этого, в настоящем контексте термин «антисекреторный фактор» можно сократить до «АФ». Антисекреторный белок в настоящем контексте также относится к белку с антисекреторными свойствами, как ранее было определено в WO 97/08202 и WO 00/38535. Антисекреторные факторы также были описаны, например, в WO 05/030246. Под термином «антисекреторный фактор» также подразумевается яичный желток, обогащенный антисекреторными факторами, как описано в SE 900028-2 и WO 00/38535, как будет описано дополнительно ниже.
«Небулайзер» в настоящем контексте относится к медицинскому устройству, которое доставляет лекарственное средство в дыхательные пути в форме аэрозоля. Компрессоры «небулайзера» выталкивают воздух через трубки в медицинский колпачок, наполненный жидким лекарственным средством. Сила воздуха разбивает жидкость на аэрозольные частицы, которые можно вдыхать глубоко в дыхательные пути.
«Ингалятор» в настоящем контексте относится к медицинскому устройству, которое доставляет лекарственное средство в дыхательные пути в форме сухого порошка. Вдыхаемый воздух проходит через сухой порошок, предназначенный для ингаляции, и распределяет маленькие частицы, которые можно вдохнуть глубоко в дыхательные пути. Пациент, проходящий лечение, производит вдох, чтобы придать требуемую силу воздуху, или используется сжатый воздух, альтернативно, их комбинации.
Термин «аэрозоль» в настоящем контексте относится к газообразной суспензии мелких твердых или жидких частиц.
«Микроб», как описано в настоящем документе, относится к микроскопическому живому организму, такому как, например, бактерия, гриб, простейшее, а также вирус. Другие примеры микробов приведены в настоящем документе.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что лечение живого организма антисекреторными белками и/или пептидами (АФ) восстанавливает и нормализует перенос питательных веществ, отходов, метаболитов, ионов, воды и/или других молекул при компартмент-синдроме (КС). Таким образом, неожиданно было установлено, что антисекреторные белки и пептиды восстанавливают и/или нормализуют перенос воды, ионов, метаболитов и веществ, которые, например, переносятся из клеток, а также из кровеносных сосудов, в замкнутый компартмент (ЗК). Антисекреторные белки, таким образом, действительно уменьшают и/или препятствуют повреждающим эффектам и могут также предотвращать интернализацию и/или высвобождение веществ, входящих в клетки и/или высвобождающихся из клеток. Антисекреторные белки, их гомологи, производные, фрагменты и/или пептиды, действуют независимо от того, являлось исходной причиной компартмент-синдрома кровотечение, травма, тяжелая нагрузка, сосудистые нарушения, инфекция микробами и/или вирусом, токсические агенты или комбинация любой из указанных причин. Антисекреторные белки, их гомологи, производные, фрагменты и/или пептиды, таким образом, помогают улучшить выживание клеток и тканей в ЗК. Следовательно, по-другому индуцированное повреждение, возникшее вследствие КС, может быть уменьшено или даже предотвращено.
Уже длительное время ощущается потребность в улучшенных лекарственных средствах, предназначенных для фармакологического лечения компартмент-синдрома, поскольку в настоящее время не существует адекватного лечения. Примеры благоприятных эффектов антисекреторных белков по настоящему изобретению приведены в следующем тексте.
Авторы настоящего изобретения установили, что антисекреторные белки, их гомологи, производные, фрагменты и/или пептиды оказывают благоприятное действие в случаях КС различного патогенеза и в различных областях. Не желая ограничивать настоящее изобретение конкретным научным объяснением, в настоящее время полагают, что антисекреторные белки и пептиды (АФ) могут обладать способностью весьма эффективно препятствовать возникновению КС и нормализовать упомянутые выше состояния, благодаря эффекту, который, как было установлено, оказывают антисекреторные белки и пептиды (АФ) на липидные рафты и ямки в клеточных мембранах.
Липидные рафты представляют собой области мембраны средних размеров, исчисляемых нанометрами, которые характеризуются очаговыми высокими концентрациями холестерина и сфингомиелина (Cf. Lodish et al., 2004; Pollard & Earnshaw, 2002; Ross & Pawlina, 2006). Липидные рафты содержат ряд интегральных и периферических мембранных белков, участвующих в переносе масс и клеточной сигнализации. Указанные платформы для сигнализации плавают в клеточных мембранах и снабжены необходимыми элементами, чтобы должным образом функционировать в качестве рецепторов, факторов сопряжения, систем G-белков, эффекторов, ферментов и соединений, и субстратами, в соответствии с чем они способны воспринимать и передавать специфические ионы, молекулы и сигналы. Указанные области также взаимодействуют, например, с цитоскелетом, и, кроме того, влияют на состав и оборот интерстициальной жидкости, а также на ее давление. Флотиллин-1 представляет собой белок, который является индикатором распространенности липидных рафтов. Другим маркером липидных рафтов является сфинголипид Gmi. Кроме того, липидные рафты имеют отношение к ямкам, бутылкообразным инвагинациям, которые можно видеть у большого ряда клеток млекопитающих, и к участкам для важных клеточных функций, таких как везикулярный транспорт и сигнальная трансдукция, а также поглощение, интернализация и другой внутриклеточный процессинг, например, вируса. Именно оборот ямок дополнительно связан с высвобождением и интернализацией не только вируса, но также и микробов. На клеточных мембранах имеет образование кластеров липидных ямок и ямок рецепторов факторов роста, рецепторов сигналов воспаления, рецепторов нейротрансмиттеров и систем обратного захвата нейротрансмиттеров, ионных каналов, аквапоринов и других транспортеров. Липидные рафты и ямки претерпевают быстрые, динамические изменения, связанные с превалирующей функцией клеток и органов на каждый момент.
Авторы настоящего изобретения недавно смогли доказать, что антисекреторные белки, их гомологи, производные или фрагменты, обладающие антисекреторной и/или эквивалентной функциональной и/или аналогичной активностью, или их фармацевтически активные соли оказывают благоприятное действие для лечения и/или профилактики дисфункции липидных рафтов и/или ямок в клеточных мембранах, такой как патологическая, недостаточная, гипо- и/или гиперфункция.
Таким образом, антисекреторные белки, их гомологи, производные и/или фрагменты, обладающие эквивалентной функциональной активностью, или их фармацевтически активные соли, как было показано, оказывают благоприятное действие на дисфункцию липидных рафтов и/или ямок в клеточных мембранах, и могут, таким образом, использоваться для мониторинга и/или благоприятного воздействия на структуру, распределение и множество функций липидных рафтов и/или ямок в клеточных мембранах. Примером указанного благоприятного воздействия может служить противодействие патологической функции, такой как гипо- или гиперфункция, восстановление и/или нормализация липидных рафтов или ямок структурно и функционально, улучшение выживания и/или спасения при заболеваниях, повреждениях, процессах восстановления и других дисфункциях. Помимо этого, указанные антисекреторные белки можно использовать для мониторинга внутриклеточного транспорта и высвобождения продуктов жизнедеятельности клеток, а также для нормализации распределения тканевых составляющих.
Примерами состояний с высоким риском угрозы развития КС являются травма, связанная или не связанная с кровотечением, тяжелая нагрузка, опухоль или значительное повреждение конечности, такой как нога, или грудной клетки (например, тампонада сердца). Чрезмерная нагрузка на мышцу или сухожилие также может вызывать признаки КС. Это же относится и к инфекциям органа, ткани или сустава. Причинными агентами могут являться микробные токсины и микробы, включая бактерии, такие как Mycobacteria, Pseudomonas, Chlamydia, Cocci, Brucella и Listeria, а также обширный спектр вирусов. Чрезмерное использование лекарственных средств и высвобождение, например, нейротрансмиттеров, слизи, ферментов и вирусов представляют собой другие патогенные соединения. Опухоли, первичные или метастазы, а также кровотечения дополняют список примеров причин, потенциально приводящих к КС.
В настоящем контексте определение давления интерстициальной жидкости в компартменте, который исследуется, осуществляют путем измерения истинного давления с использованием сенсора на конце стекловолоконного световода. Таким образом, получают надежные величины давления, превалирующие в компартменте, и, в некоторых случаях, также в соседних клетках.
Из научной литературы известно, что, например, многие солидные опухоли имеют высокое давление интерстициальной жидкости, препятствующее транскапиллярному транспорту между опухолевыми клетками и циркуляции крови и лимфы. Таким образом, образуется препятствие с точки зрения лечения опухоли, в силу недостаточного поглощения терапевтических агентов, таких как цитотоксические лекарственные средства (Cf. Heldin et al., 2004). Далее, выработка свободных радикалов при лучевой терапии будет недостаточной в силу ограничений способностей кислорода из-за ограниченной циркуляции крови. Таким образом, существует крайняя необходимость в новых схемах лечения, улучшающих эффективность лечения злокачественных опухолей путем уменьшения давления интерстициальной жидкости.
Использование антисекреторных белков и пептидов (АФ) не ограничивается тканями, органами и анатомическими структурами, описанными в примерах, а включает в себя дополнительные симптомы и заболевания, которые также характеризуются повышенным давлением интерстициальной жидкости и поглощением и высвобождением конкретных веществ.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно в одном контексте вводить путем местного нанесения, локально in situ, перорально, через нос, подкожно и/или системно через кровеносные сосуды или через дыхательные пути.
Антисекреторный фактор представляет собой класс белков, которые имеются в организме в естественных условиях. Человеческий белок антисекреторного фактора представляет собой белок с массой 41 кДа, включающий в себя 382 аминокислоты, когда он выделен из гипофиза. Активный участок с точки зрения эффекта компартмент-синдрома, по настоящему изобретению, как представляется, расположен в белке в области, близкой к N-концу белка, наиболее вероятно, расположен в аминокислотах 1-163 SEQ ID NO 6, или во фрагменте указанной области.
Авторы настоящего изобретения показали, что антисекреторный фактор является до некоторой степени гомологичным белку S5a, также называемому Rpn 10, который представляет собой субъединицу составляющей, которая превалирует во всех клетках, 26 S протеасому, более конкретно, в 19 S/PA 700 кэп. В настоящем изобретении антисекреторные белки определены как класс гомологичных белков, имеющих одинаковые функциональные свойства. Протеасомы имеют множество функций, связанных с деградацией избыточных белков, а также короткоживущих нежелательных, денатурированных, неправильно уложенных и других ненормальных белков. Кроме того, антисекреторный фактор/S5a/Rpn10 участвует в распределении и транспортировке клеточных составляющих, наиболее очевидно, белков.
Гомологи, производные и фрагменты антисекреторных белков и/или пептидов по настоящему изобретению обладают аналогичной биологической активностью, и их можно использовать для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики компартмент-синдрома, а также в способе лечения компартмент-синдрома. Гомологи, производные и фрагменты в настоящем контексте включают в себя по меньшей мере 4 аминокислоты антисекреторного белка, встречающегося в естественных условиях, и могут быть дополнительно модифицированы изменением одной или более аминокислот с целью оптимизации биологической активности антисекреторного фактора для лечения и/или профилактики компартмент-синдрома.
Помимо этого, любая аминокислотная последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична, например, на 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности антисекреторного белка, пептида, гомолога, производного и/или фрагмента по настоящему изобретению, также считается входящей в объем настоящего изобретения. В настоящем контексте термин «гомологичность» и «идентичность» используются взаимозаменяемым образом, т.е. аминокислотная последовательность, имеющая описанную степень идентичности с другой аминокислотной последовательностью, имеет ту же степень гомологичности с описанной аминокислотной последовательностью.
Под производным в настоящем контексте подразумевается белок, обладающий антисекреторной активностью, как определено в настоящем документе, полученный из другого вещества как непосредственно, так и путем модификации или частичного замещения, в котором одна или более аминокислот замещены другими аминокислотами; указанная аминокислота может представлять собой модифицированную или неестественную аминокислоту. Например, производные антисекреторного фактора по настоящему изобретению могут включать в себя N-терминальную и/или С-терминальную защитную группу. Один пример N-терминальной защитной группы включает в себя ацетил. Один пример С-терминальной защитной группы включает в себя амид.
Под белками, его гомологами, производными, пептидами и/или фрагментами, имеющими аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную стандартной аминокислотной последовательности, подразумевается, что аминокислотная последовательность, например пептида, является идентичной стандартной последовательности, за исключением того, что аминокислотная последовательность может включать в себя до 5 точечных мутаций на каждые 100 аминокислот стандартной аминокислотной последовательности. Иными словами, чтобы получить полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную стандартной аминокислотной последовательности, до 5% аминокислот в стандартной последовательности можно опустить или заместить другой аминокислотой, или инсерцировать количество аминокислот до 5% от общего количества аминокислот стандартной последовательности в стандартную последовательность. Указанные мутации стандартной последовательности могут наблюдаться на амино- или карбокси-конце стандартной аминокислотной последовательности или на других позициях между указанными концевыми позициями, вкрапленными по отдельности среди аминокислот стандартной последовательности или в одной или более смежных групп в стандартной последовательности.
В настоящем изобретении программа локального алгоритма наилучшим образом подходит для определения идентичности. Программы локального алгоритма (такие как Smith Waterman) сравнивают подпоследовательность в одной последовательности с подпоследовательностью во второй последовательности и находят комбинацию подпоследовательностей и их выстраивание в указанных подпоследовательностях, которая дает наибольший общий балл сходства. Внутренние гэпы, если это позволительно, не учитывают. Локальные алгоритмы хорошо работают для сравнения двух мультидоменных белков, которые имеют единственный общий домен или сайт связывания.
Способы определения идентичности и сходства кодифицированы в общедоступных программах. Предпочтительные компьютерные программы для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают в себя, без ограничения, пакет программ GCG (Devereux, J. et al., (1994)). BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul, S.F. et al. (1990)). Программа BLASTX доступна из NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S.F. et al., Altschul, S.F. et al. (1990)). Каждая программа анализа последовательностей имеет матрицу подсчета очков по умолчанию и устранения гэпов по умолчанию. В целом, специалист в области молекулярной биологии, как предполагается, будет использовать установки по умолчанию, представленные в используемой компьютерной программе.
Антисекреторные белки или пептиды, или их гомологи, производные и/или фрагменты, обладающие антисекреторной активностью, как определено в настоящем документе, могут включать в себя 4 аминокислоты или более, например 5-16 аминокислот, например 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот или более. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антисекреторный фактор состоит из 42, 43, 45, 46, 51, 80, 128, 129 или 163 аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антисекреторный фактор состоит из 5, 6, 7, 8 или 16 аминокислот.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный антисекреторный белок предоставляется в концентрации по меньшей мере 1000 FIL единиц/мл в указанном яичном желтке. В настоящем контексте одна единица FIL соответствует 50% уменьшению потока жидкости в кишке по сравнению с контролем, не имеющим источника антисекреторных факторов, как описано в WO 00/38535 и SE 900002802.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антисекреторные белки или пептиды, или их гомологи, производные или фрагменты, обладающие антисекреторной активностью по настоящему изобретению, состоят из последовательности, согласно следующей формуле:
X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,
где Х1 представляет собой I, аминокислоты 1-35 SEQ ID NO 6, или отсутствует, Х2 представляет собой H, R или К, Х3 представляет собой S или L, Х4 представляет собой Т или А, Х5 представляет собой аминокислоты 43-46, 43-51, 43-80 или 43-163 SEQ ID NO 6 или отсутствует.
in vivo
in vitro
Антисекреторный фактор по настоящему изобретению можно производить  или , например, рекомбинантным, синтетическим путем и/или путем химического синтеза, и/или выделять их из естественного источника антисекреторных факторов, таких как гипофиз свиньи или птичьи яйца. После выработки антисекреторные факторы можно дополнительно обрабатывать, например, химическим или ферментативным расщеплением до более маленьких антисекреторных активных фрагментов или модификацией аминокислот. В настоящее время невозможно получить антисекреторный фактор в чистом виде путем очистки. Однако возможно получить биологически активный белок антисекреторного фактора рекомбинантным или синтетическим путем, как было описано ранее в WO 97/08202 и WO 05/030246. WO 97/08202 также описывает продукцию биологически активных фрагментов указанного белка из 7-80 аминокислот.
Антисекреторный фактор по настоящему изобретению может дополнительно содержать N-концевую и/или С-концевую защитную группу. Один пример N-концевой защитной группы включает в себя ацетил. Один пример С-концевой защитной группы включает в себя амид.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антисекреторный фактор выбран из SEQ ID NO 1-6, т.е. VCHSKTRSNPENNVGL (SEQ ID NO 1, в настоящем контексте также называется АФ-16), IVCHSKTR (SEQ ID NO 2), VCHSKTR (SEQ ID NO 3), CHSKTR (SEQ ID NO 4), HSKTR (SEQ ID NO 5) или аминокислотной последовательности антисекреторного белка, согласно SEQ ID NO 6, с использованием однобуквенных сокращений для аминокислот; SEQ ID NO 1, 2 и 3 ранее были описаны, например, в WO 05/030246. Как описано в прилагающемся списке последовательностей, некоторые из аминокислот в описанных выше последовательностях могут быть заменены на другие аминокислоты. Далее в настоящем абзаце позиция конкретной аминокислоты в конкретной аминокислотной последовательности считается слева, с обозначением наиболее N-концевой аминокислоты на позиции 1 в указанной конкретной последовательности. Любое замещение (замещения) аминокислот, как описано ниже, можно осуществлять независимо от любого другого замещения (замещений) аминокислот в указанной последовательности. В SEQ ID NO 1, С на позиции 2 может быть заменена на S, Н на позиции 3 может быть заменена на R или К, S на позиции 4 может быть заменена на L, и/или Т на позиции 6 может быть заменена на А. В SEQ ID NO 2, С на позиции 3 может быть заменена на S, Н на позиции 4 может быть заменена на R или К, S на позиции 5 может быть заменена на L, и/или Т на позиции 7 может быть заменена на А. В SEQ ID NO 3, С на позиции 2 может быть заменена на S, Н на позиции 3 может быть заменена на R или К, S на позиции 4 может быть заменена на L, и/или Т на позиции 6 может быть заменена на А. В SEQ ID NO 4, С на позиции 1 может быть заменена на S, Н на позиции 2 может быть заменена на R или К, S на позиции 3 может быть заменена на L, и/или Т на позиции 5 может быть заменена на А. В SEQ ID NO 5, Н на позиции 1 может быть заменена на R или К, S на позиции 2 может быть заменена на L, и/или Т на позиции 4 может быть заменена на А.
Настоящее изобретение также подразумевает комбинацию двух или более из любых фрагментов согласно SEQ ID NO 1-6, необязательно, в комбинации с яичным желтком, обогащенным антисекреторными факторами.
Настоящее изобретение также подразумевает возможность лечения и/или профилактики компартмент-синдрома путем введения яичного желтка, обогащенного антисекреторными факторами. SE 9000028-2 описывает, каким образом можно стимулировать образование антисекреторных факторов у птиц; затем антисекреторные факторы выделяют или концентрируют из гидролизатов яичного желтка. WO 00/38535 дополнительно описывает, каким образом указанные выделенные или концентрированные антисекреторные факторы можно вводить животным или людям с продуктами питания или кормами, или, в виде более или менее выделенных продуктов, изготавливать в форме фармацевтических продуктов. Таким образом, настоящая заявка также подразумевает применение яичного желтка, обогащенного антисекреторными факторами, для изготовления продуктов, таких как фармацевтические композиции, для лечения и/или профилактики компартмент-синдрома или для применения в указанном способе лечения.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно включает в себя фармацевтически приемлемый наполнитель. Выбор фармацевтически приемлемых наполнителей и их оптимальную концентрацию для использования по настоящему изобретению может легко определить специалист путем экспериментирования. Фармацевтически приемлемые наполнители для использования по настоящему изобретению включают в себя растворители, буферные агенты, консерванты, хелатирующие агенты, антиоксиданты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, суспендирующие агенты и/или разбавители. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно изготавливать в соответствии с обычной фармацевтической практикой, например, согласно “Remington: The science and practice of pharmacy”, 21-е издание, ISBN 0-7817-4673-6, или “Encyclopedia of pharmaceutical technology”, 2-е издание, изд. Swarbrick J., ISBN: 0-8247-2152-7. Фармацевтически приемлемый наполнитель представляет собой вещество, которое является практически безопасным для индивидуума, которому будет вводиться композиция. Подобный наполнитель обычно удовлетворяет требованиям, предъявляемым национальными учреждениями здравоохранения. Официальные фармакопеи, такие как, например, Британская фармакопея, фармакопея Соединенных Штатов Америки и европейская фармакопея, содержат стандарты для фармацевтически приемлемых наполнителей.
Далее приводится обзор композиций для возможного применения в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Обзор основан на конкретном пути введения. Однако следует принимать во внимание, что в тех случаях, когда фармацевтически приемлемый наполнитель может использоваться в различных лекарственных формах или композициях, применение конкретного фармацевтически приемлемого наполнителя не ограничивается конкретной лекарственной формой или конкретной функцией наполнителя. Следует подчеркнуть, что изобретение не ограничивается применением композиций, описанных далее.
Парентеральные композиции
Для системного применения композиции по настоящему изобретению могут содержать обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители и наполнители, включая микросферы и липосомы. Чрескожная доставка представляет собой альтернативный путь для системного введения.
Композиции для применения по настоящему изобретению могут включать в себя все виды твердых, полутвердых и жидких композиций.
Фармацевтически приемлемые наполнители могут включать в себя растворители, буферные агенты, консерванты, хелатирующие агенты, антиоксиданты, стабилизаторы, эмульгирующие агенты, суспендирующие агенты и/или разбавители. Примеры различных агентов приведены ниже.
Пример различных агентов
Примеры растворителей включают в себя, без ограничения, воду, спирты, кровь, плазму, цереброспинальную жидкость, асцитическую жидкость и лимфу.
Примеры буферных агентов включают в себя, без ограничения, лимонную кислоту, уксусную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, гидрофосфорную кислоту, бикарбонаты, фосфатные соли, диэтиламин и т.п.
Примеры хелатирующих агентов включают в себя, без ограничения, натрий-EDTA и лимонную кислоту.
Примеры антиоксидантов включают в себя, без ограничения, бутилированный гидроксиланизол (ВНА), аскорбиновую кислоту и ее производные, токоферол и его производные, цистеин и их смеси.
Примеры разбавителей и разрыхлителей включают в себя, без ограничения, лактозу, сахарозу, emdex, фосфаты кальция, карбонат кальция, сульфат кальция, маннит, крахмалы и микрокристаллическую целлюлозу.
Примеры связующих агентов включают в себя, без ограничения, сахарозу, полисахариды, сорбит, аравийскую камедь, альгинат натрия, желатин, крахмалы, целлюлозу, хитозаны, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, поливинилпирролидон и полиэтиленгликоль.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно, в одном контексте, вводить местно, или посредством инфузии в периферическую вену, или посредством внутримышечной или подкожной инъекции пациенту, или трансбуккальным, внутрилегочным, назальным, кожным или пероральным путями. Кроме того, возможно также введение фармацевтической композиции через хирургически имплантированный шунт в желудочек головного мозга пациента.
В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию, используемую по настоящему изобретению, изготавливают для внутриглазного, местного, интраназального, перорального, подкожного и/или системного введения. В предпочтительном варианте осуществления композицию по настоящему изобретению вводят путем нанесения в виде суспензии или, даже более предпочтительно, в виде порошка для ингаляции с использованием спрея, аэрозоля, ингалятора или небулайзера, назально и/или дыхательным путем.
Введение порошка, включающего в себя антисекреторные факторы, имеет дополнительные преимущества с точки зрения стабильности и дозирования. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно также наносить местно, вводить интраокулярно, интраназально, перорально, подкожно и/или системно через кровеносные сосуды. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию изготавливают для внутривенного, внутримышечного, местного, перорального или назального введения. Обычно, при местном нанесении в глаза, используемая концентрация в композиции по настоящему изобретению составляет от 1 мкг до 10 мг на одно нанесение, например, от 1 мкг до 1 мг на одно нанесение, предпочтительно, 50-1000 мкг, предпочтительно, 50-250 мкг, одной дозой в день или повторными дозами несколько раз в день (множеством доз), без ограничения.
При системном введении в кровь доза составляет от 0,1 мкг до 10 мг на введение и кг массы тела, например, от 0,1 мкг до 1 мг на введение и кг массы тела, предпочтительно, 1-1000 мкг/кг массы тела, например, 1-50, 10-100, 100-250 или 50-500 мкг/кг массы тела, одной дозой в день или повторными дозами несколько раз в день. В случае, когда используется яичный белок, обогащенный антисекреторными факторами по настоящему изобретению, указанную композицию предпочтительно вводить перорально.
Соответственно, настоящее изобретение относится к применению антисекреторного белка или его производного, гомолога и/или фрагмента, обладающего антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активной соли для изготовления фармацевтической композиции и/или лечебного продукта питания для лечения и/или профилактики компартмент-синдрома. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный антисекреторный белок состоит из последовательности следующей формулы:
X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,
где Х1 представляет собой I, аминокислоты 1-35 SEQ ID NO 6 или отсутствует, Х2 представляет собой H, R или К, Х3 представляет собой S или L, Х4 представляет собой Т или А, Х5 представляет собой аминокислоты 43-46, 43-51, 43-80 или 43-163 SEQ ID NO 6 или отсутствует. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антисекреторного белка, который включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антисекреторного белка, который включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антисекреторного белка, который включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:3. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антисекреторного белка, который включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антисекреторного белка, который включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5.
Помимо этого, в еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антисекреторного белка, который представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO 6, или его гомолог, производное и/или фрагмент, включающий в себя аминокислоты 38-42 SEQ ID NO 6.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции, как описано в настоящем документе, которая включает в себя два или более антисекреторных белков, выбранных из белков, представленных SEQ ID NO:1-6 и SEQ ID NO 6, или их гомолог, производное и/или фрагмент, включающий в себя аминокислоты 38-42 SEQ ID NO 6, или последовательность, представленную общими формулами, описанными в настоящем документе. Указанные последовательности являются одинаково предпочтительными для применения по настоящему изобретению.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный антисекреторный белок поставляется в яичном желтке, обогащенном указанным антисекреторным белком, и в котором указанный антисекреторный белок предпочтительно имеет концентрацию по меньшей мере 1000 FIL единиц/мл в указанном яичном желтке.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция дополнительно включает в себя фармацевтически приемлемый наполнитель. Указанным наполнителем может являться любой предпочтительный наполнитель, выбранный как подходящий для конкретной цели. Примеры наполнителей описаны в настоящем документе.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию изготавливают для внутриглазного, интраназального, перорального, местного, подкожного и/или системного введения. Выбранный путь введения будет изменяться в зависимости от состояния пациента, которого лечат, а также от возраста и пола пациента и т.п.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию изготавливают для введения в виде спрея, аэрозоля или с использованием небулайзера или ингалятора. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции и/или лечебному продукту питания, которую изготавливают для системного введения в кровь в дозе от 0,1 мкг до 10 мг на введение и кг массы тела, например, от 0,1 мкг до 1 мг на введение и кг массы тела, предпочтительно, 1-1000 мкг/кг массы тела, например, предпочтительно, 1-50, 10-100, 100-250 или 50-500 мкг/кг массы тела, одной дозой в день или повторными дозами несколько раз в день. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная доза составляет 1-100 мкг на введение и кг массы тела и день. Количество фармацевтической композиции, которое вводят пациенту, который в этом нуждается, будет, разумеется, варьироваться в зависимости от пациента, которого лечат, и будет определяться специалистом, практикующим врачом для каждого случая. Указанное введение можно осуществлять как однократной дозой, так и многократными дозами в день.
В одном варианте осуществления изобретение относится к применению антисекреторного белка, его производного, гомолога и/или фрагмента, обладающего антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активной соли для изготовления фармацевтической композиции и/или лечебного продукта питания для лечения и/или профилактики компартмент-синдрома, в котором указанный синдром вызывает патологическое набухание клеток и тканей. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный компартмент-синдром вызывается аномальной (патологической) нагрузкой, повреждением или заболеванием, связанными с мышцей, нервом, кровеносным сосудом и/или сухожилием. Указанная аномальная нагрузка на мышцу, нерв, кровеносный сосуд, сустав и/или сухожилие может наблюдаться, например, при травме, продолжительной двигательной активностью или при сильной нагрузке. Помимо этого, лекарственные средства могут вызывать повышение давления интерстициальной жидкости в тканях, а также набухание клеток. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается микробом. В контексте настоящего изобретения указанный микроб может представлять собой бактерию, а также вирус, например РНК-содержащий вирус или ДНК-содержащий вирус, такой как Herpes viridae, такой как вирус Herpes Simplex типа 1, Papovaviridae, Orthomyxoviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Hepadnaviridae, вирус иммунодефицита человека или вирус гепатита С; все указанные микробы входят в объем настоящего изобретения. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению антисекреторного белка или его производного, гомолога и/или фрагмента, обладающего антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активной соли для изготовления фармацевтической композиции и/или лечебного продукта питания для лечения и/или профилактики вирусной и/или микробной инфекции и/или симптомов, связанных с вирусной и/или микробной инфекцией. Примеры бактериальной инфекции, входящей в объем настоящего изобретения, включают в себя инфекции, вызванные патогенными штаммами, такими как Mycobacteria, Pseudomonas, Chlamydia, Brucella и Listeria. Однако настоящее изобретение ими не ограничивается. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный микроб, такой как бактерия, высвобождает ферменты, токсины и/или пигменты и/или индуцирует образование и/или высвобождение реактивных факторов в соседних клетках и тканях. Помимо этого, в контексте настоящего изобретения указанный микроб может быть выбран из группы, состоящей из Protista, Protozoan, червей или грибов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается прионом. Прион можно определить как белковоподобную инфекционную частицу, инфекционную белковую частицу, подобную вирусу, но не имеющую нуклеиновой кислоты, которая, как полагают, является агентом, ответственным за губчатый энцефалит овец и коз и другие дегенеративные заболевания нервной системы. Прион представляет собой тип белка, который считают причиной многих расстройств нервной системы, таких как болезнь Крейцфельдта-Якобса, включая ее спорадические наследственные и приобретенные варианты, соответствующая человеческая форма коровьего бешенства, губчатый энцефалит овец и коз и связанные с ними состояния и заболевания. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается нарушенным транспортом продуктов в клетке или ткани.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывает ишемию. Ишемию можно определить как низкий кислородный статус, который обычно возникает вследствие препятствия для снабжения артериальной кровью или неадекватного кровотока, приводящих к гипоксии ткани. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается лекарственным средством и/или терапевтическими или диагностическими мерами.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный компартмент-синдром вызывается кровотечениями, такими как кровотечение в черепе и/или в головном мозге и/или в позвоночнике и спинном мозге и/или из аневризмы, которая представляет собой мешок, образованный растяжением стенки артерии, вены или сердца. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается тампонадой органа или структуры, заключенных в капсулу, таких как сердце, семенник, яичник, железы, лимфоидный орган и/или почка. Тампонада сердца представляет собой сжатие сердца, вызванное накоплением крови или жидкости в пространстве между миокардом (сердечной мышцей) и перикардом (наружным мешком, покрывающим сердце). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается доброкачественной или злокачественной опухолью, присутствующей в любом месте тела, и/или связан с лечением опухоли и/или прилегающих структур. Опухоли характеризуются повышенным интерстициальным давлением, которое может уменьшать доступность опухолей клеток для лекарственных средств и терапевтических мероприятий. Помимо этого, повышенное давление в опухоли может влиять на ее склонность к метастазированию. Кроме того, опухоли могут, вследствие увеличения в размерах, вызывать повышение давления в прилегающих нормальных тканях и органах, генерируя КС. Таким образом, КС представляет собой частое и тяжелое осложнение у многих пациентов, страдающих опухолями. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается иммунной реакцией. Помимо этого, в одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывает повреждение межпозвоночных дисков, или, альтернативно, может являться следствием их повреждения или травмы.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается цитотоксическим набуханием сустава и/или сухожилия и/или связки. Помимо этого, в другом аспекте изобретения, указанный синдром вызывается цитотоксически зависимым набуханием нерва и/или стенки кровеносного сосуда. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается лекарственным средством и/или фармацевтической композицией. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается побочными эффектами, вызванными лечением опухоли рентгеновским облучением, радиацией высокой энергии, местным охлаждением, местным нагреванием, световой терапией и лекарственными средствами, используемыми для лечения опухоли.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики компартмент-синдрома у млекопитающего, которое в этом нуждается; указанный способ включает в себя введение эффективного количества фармацевтической композиции, включающей в себя антисекреторный белок или его производное, гомолог и/или фрагмент, обладающий антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активную соль. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу, в котором указанный антисекреторный белок состоит из последовательности следующей формулы
X1-V-C-X2-X3-K-X4-R-X5,
где Х1 представляет собой I, аминокислоты 1-35 SEQ ID NO 6 или отсутствует, Х2 представляет собой H, R или К, Х3 представляет собой S или L, Х4 представляет собой Т или А, Х5 представляет собой аминокислоты 43-46, 43-51, 43-80 или 43-163 SEQ ID NO 6 или отсутствует. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором указанный антисекреторный белок включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором указанный антисекреторный белок включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором указанный антисекреторный белок включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:3. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором указанный антисекреторный белок включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором указанный антисекреторный белок включает в себя аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:5. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором указанный антисекреторный белок представляет собой белок с аминокислотной последовательностью, представленную SEQ ID NO 6, или его гомолог, производное и/или фрагмент, включающий в себя аминокислоты 38-42 SEQ ID NO 6. В одном варианте осуществления изобретение относится к способу, в котором указанная фармацевтическая композиция включает в себя два или более антисекреторных белков, выбранных из белков, представленных SEQ ID NO:1-6 и SEQ ID NO 6, или их гомолог, производное и/или фрагмент, включающий в себя аминокислоты 38-42 SEQ ID NO 6, или последовательности, представленные общей формулой, описанной в настоящем документе. Помимо этого, в одном варианте осуществления изобретение относится к способу, описанному в настоящем документе, в котором указанный антисекреторный белок поставляется в яичном желтке, обогащенном указанным антисекреторным белком, и в котором указанный антисекреторный белок предпочтительно имеет концентрацию по меньшей мере 1000 FIL единиц/мл в указанном яичном желтке. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором указанная фармацевтическая композиция дополнительно включает в себя фармацевтически приемлемый наполнитель. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию изготавливают для внутриглазного, интраназального, перорального, местного, подкожного и/или системного введения. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанную фармацевтическую композицию и/или лечебный продукт питания изготавливают для введения в виде спрея, аэрозоля, или с использованием небулайзера или ингалятора. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу, в котором фармацевтическую композицию изготавливают для системного введения в кровь в дозе от 0,1 мкг до 10 мг на введение и кг массы тела, предпочтительно, 1-1000 мкг на введение и кг массы тела и день. В одном варианте осуществления указанного способа указанное введение осуществляют однократной дозой или множеством доз в день. Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики компартмент-синдрома у млекопитающего, которое в этом нуждается; указанный способ включает в себя введение эффективного количества фармацевтической композиции, включающей в себя антисекреторный белок или его производное, гомолог и/или фрагмент, обладающий антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активную соль, в котором указанный синдром вызывает патологическое набухание клеток и тканей. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается аномальной нагрузкой, повреждением или заболеванием, связанными с мышцей, нервом, кровеносным сосудом, суставом и/или сухожилием. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается микробом. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается вирусной инфекцией. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вирусная инфекция вызывается ДНК-содержащим вирусом или РНК-содержащим вирус, таким как Herpes viridae, вирус Herpes Simplex типа 1, Flaviviridae, Papovaviridae, Orthomyxoviridae, Hepadnaviridae, Togaviridae, вирус гепатита С и/или вирус иммунодефицита человека, которые входят в объем настоящего изобретения.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики компартмент-синдрома у млекопитающего, которое в этом нуждается; указанный способ включает в себя введение эффективного количества фармацевтической композиции, включающей в себя антисекреторный белок или его производное, гомолог и/или фрагмент, обладающий антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активную соль, в котором указанный синдром вызывается микробом, таким как, без ограничения, Protista, Protozoan, червь, гриб, бактерия. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из Mycobacteria, Pseudomonas, Chlamydia, Cocci, Brucella и Listeria. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный микроб, такой как бактерия, высвобождает ферменты, токсины и/или пигменты и/или индуцирует образование и/или высвобождение реактивных факторов в соседних клетках и тканях. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается прионом. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается патологическим транспортом продуктов в клетке или ткани. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывает ишемию. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается лекарственным средством и/или терапевтическими или диагностическими мерами. Помимо этого, настоящее изобретение также включает в себя вариант осуществления, в котором указанный синдром вызывает патологическую функцию головного мозга и спинного мозга. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается кровотечениями в черепе и/или в головном мозге и/или в позвоночнике и спинном мозге и/или из аневризм. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается тампонадой органа или структуры, заключенных в капсулу, таких как сердце, почка, семенник, яичник, железы и/или лимфоидный орган. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывается доброкачественной или злокачественной опухолью, присутствующей в организме, и/или связан с лечением опухоли и прилегающих структур.
Помимо этого, настоящее изобретение относится также к еще одному варианту осуществления, где указанный синдром вызывается иммунной реакцией. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный синдром вызывает повреждение межпозвоночных дисков.
Помимо этого, следует понимать, что способ, включающий в себя введение эффективного количества фармацевтической композиции млекопитающему, которое в этом нуждается, и/или второе медицинское применение фармацевтической композиции, включающей в себя антисекреторный белок или его производное, гомолог и/или фрагмент, обладающий антисекреторной активностью, и/или его фармацевтически активную соль по настоящему изобретению, предназначается для всех состояний, описанных в настоящем документе, связанных с компартмент-синдромом.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ
Пример № 1
7
Взрослых крыс инфицировали закапыванием раствора вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1; штамм 2762, серия 041028; 1,7×10 БОЕ/мл; 25 мкл) в правую ноздрю. Одна группа животных (n=6) получала через 10 мин после инъекции 25 мкл (10 мкг) АФ-16 в правую ноздрю, и далее получала ту же дозу АФ-16 закапыванием дважды в день, каждое утро в 8 часов и каждый вечер в 18 часов, вплоть до окончания эксперимента на день 6. Дополнительное количество инфицированных HSV-1 крыс (n=6) получало через нос через такие же интервалы времени 25 мкл носителя, физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS). На день 6 животным давали наркоз, осуществляли хирургический разрез через кожу головы и очищали череп от надкостницы и соединительной ткани. Высверливали отверстие диаметром приблизительно 1 мм в правой теменной кости и помещали миниатюрный сенсор давления на 3-5 мм в головной мозг или в боковой желудочек. Использовали световолоконную систему измерения давления (Samba System 3200 & сенсор Samba Preclin 420; Samba Sensors AB, V Frolunda, Швеция) с очень маленьким диаметром, ~0,4 мм. Неинфицированные здоровые крысы имели внутричерепное давление (ВЧД) 4-8 мм рт.ст., иногда до 12 мм рт.ст. (фиг. 2с). У крыс, инфицированных HSV-1, которые получали только носитель, определяли высокие величины давления, до 30-40 мм рт.ст. (фиг. 2а), что значительно влияло на животных, отражаясь в симптомах неврологических расстройств или возрастания тяжести. Напротив, у крыс, инфицированных HSV-1, которых лечили с момента заражения АФ-16 дважды в день, определяли почти нормальные величины ВЧД, 8-14 мм рт.ст. (фиг. 2b). Самым важным наблюдением явилось то, что интраназальное лечение дважды в день АФ-16 предотвращало развитие неврологических расстройств, таких как влажный нос, красные глаза, гиперсаливация, респираторный дистресс-синдром, двигательная неустойчивость, возбуждение, агрессивность, заторможенность, быстрые изменения настроения, повторяющиеся движения, припадки, признаки пареза и, в конечном итоге, бессознательное состояние.
Дополнительное количество животных, инфицированных HSV-1, с явными симптомами также лечили с использованием 10 или 25 мкг АФ-16 интраназально, начиная на день 5, 6 или 7, т.е. после получения носителя в течение предыдущих дней. В указанных случаях симптомы неврологических расстройств, описанных выше, уменьшились в течение получаса и через час более не появлялись. Одновременно были обнаружены благоприятные в отношении уменьшения давления эффекты АФ-16 у указанных инфицированных и леченных АФ-16 крыс в течение часа, которые продолжались несколько часов. Таким образом, ни у одной из интенсивно леченных АФ-16 крыс не наблюдалось персистирующих признаков опасного ВЧД, и, таким образом, КС не развивался.
Инфузия краски синего Эванса, конъюгированной с бычьим сывороточным альбумином (ЕВА), в субарахноидальное пространство и в боковые желудочки у нормальных крыс приводила к тому, что маркер через 15-30 минут можно было обнаружить в слизистой оболочке носа (фиг. 5b). Это показывает, что значительная часть ЦСЖ дренируется в лимфатическую систему слизистой оболочки носа и далее через шейные лимфатические узлы, приобретая синий цвет (красный, если использовать для исследования флюоресцентный микроскоп). У крыс, инфицированных HSV-1, с признаками неврологических расстройств, при той же инфузии ЕВА не наблюдается окрашивания ни решетчатой пластинки, ни слизистой оболочки носа (фиг. 5а). На упомянутой фигуре (фиг. 5а) можно видеть, что на правой половине изображения нет красного окрашивания. Однако лечение 10 или 25 мкг АФ-16 интраназально превращает картину у крыс, инфицированных HSV-1, в такую же, как у нормальных, неинфицированных крыс. Таким образом, интраназальная инфузия АФ-16 устраняла блок оттока ЦСЖ, индуцированный инфекцией HSV-1. Таким образом, отток ЦСЖ восстанавливался, и ВЧД становилось нормальным.
Авторы сделали вывод, что лечение грызунов с использованием АФ-16 сводит к минимуму клинические симптомы энцефалита, вызванного HSV-1, и, наиболее очевидно, нормализует повышенное при этом ВЧД, что контрастирует с вредными эффектами очень высокого ВЧД, измеренного у крыс, инфицированных HSV-1, которые получали носитель, PBS. Из клинической практики известно, что пациенты, страдающие энцефалитом, имеют повышенное ВЧД, что является важным как причина, вызывающая не только острое, но и персистирующее повреждение головного мозга. На самом деле высокое ВЧД считается главным фактором, как вызывающее в конечном итоге неврологические расстройства и смерть. Так, результаты эксперимента № 1, проведенного авторами, показали, что введение АФ-16 в организм, страдающий состоянием, отвечающим критериям КС, действительно быстро противодействует патологически повышенному ВЧД, уменьшает его и даже приводит его к нормальному уровню, предотвращая развитие неврологических расстройств и способствуя выживанию без остаточных нарушений функций головного мозга или персистирующих системных нарушений или с минимальными указанными нарушениями.
Пример № 2
7
Во втором эксперименте авторы изучали, улучшает ли АФ-16 в дозе, которая снижает повышенное ВЧД, как описано в примере № 1, также и выживание взрослых грызунов, инфицированных HSV-1. Таким образом, крыс заражали закапыванием в правую ноздрю 25 мкл раствора вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1; штамм 2762, серия 041028; 1,7×10 БОЕ/мл). Половина животных получала 10 мин позже 25 мкл (1, 10 или 25 мкг) АФ-16 в правую ноздрю, и далее получала ту же дозу АФ-16 закапыванием каждое утро в 8.00 и каждый вечер в 18.00, вплоть до окончания эксперимента на день 14. Другая половина инфицированных HSV-1 крыс получала 25 мкл носителя, PBS, по той же схеме. Несколько раз в день животных тщательно осматривали на предмет признаков нарушений поведения или общего недомогания. Если эти признаки обнаруживали, животных умерщвляли. Фиг. 3 иллюстрирует выживаемость животных, инфицированных HSV-1. Крысы, которых лечили 1 мкг АФ-16 (n=15; верхняя линия), выживали значительно чаще, приблизительно 60%, к концу 2 недель эксперимента (фиг. 3). Напротив, крысы, инфицированные HSV-1, которые получали только носитель (n=15) погибали чаще, и только 10% все еще оставались в живых в конце экспериментального периода, на день 14 (фиг. 3). У всех инфицированных крыс, которые получали носитель, развивались признаки неврологических расстройств. В результате лечения дважды в день интраназально 10 мкг или 25 мкг АФ-16 все инфицированные животные выживали, и ни у одного не наблюдалось признаков неврологического расстройства. При световой микроскопии образцов, фиксированных в формалине и обработанных с использованием стандартных процедур гистопатологических и иммуногистохимических исследований (Cf. Zhu, Wang & Hansson 2003), были выявлены воспалительные, дегенеративные и реактивные изменения в гиппокампе, мозжечке и стволе головного мозга, наиболее явные у инцифированных, а затем получавших носитель, животных. Необходимо подчеркнуть, что распространение и тяжесть поражения зависели от продолжительности воздействия и уровня повышения ВЧД, а также времени выживания. Иммуногистохимическое исследование головного мозга инфицированных, получавших носитель крыс, выявило, что, например, иммунореактивность в отношении флотиллина-1 и аквапорина 1 в хороидном сплетении более не проявлялась. Напротив, отчетливая иммунореактивность в отношении флотиллина-1 и аквапорина 1 легко выявлялась в хороидном сплетении инфицированных животных, которых лечили с использованием АФ-16, так же как и в головном мозге нормальных, неинфицированных и не получавших лечения крыс. Таким образом, лечение с использованием АФ-16 препятствовало потере клеток и облегчало нормализацию распространенности и распределения упорядоченных структур, таких как сосуды, нейроны, включая синапсы и поддерживающие клетки, в нервной системе. Далее, иммуногистохимически выявляемая утрата иммунореактивности в отношении флотиллина-1 и аквапорина 1 в хороидном сплетении указывает на серьезные нарушения в распространенности, распределении и организации липидных рафтов, выявляемых утратой окрашивания флотиллином-1, и на нарушенное распределение воды между компартментами, например, выработку, оборот и поток ЦСЖ, что выявляется низкой реактивностью аквапорина 1. Было сделано заключение о том, что лечение с использованием АФ-16 животных с HSV-1 энцефалитом нормализует основные функции центральной нервной системы, устраняя, таким образом, развитие повышенного ВЧД, приводящего к КС.
Было сделано заключение о том, что лечение закапыванием 1, 10 или 25 мкг АФ-16 два раза в день в ноздрю значимо повышает выживаемость взрослых крыс, инфицированных вызывающим энцефалит HSV-1, и препятствует развитию неврологических расстройств. Указанные эффекты происходят, вероятно, благодаря тому, что лечение АФ-16 предотвращает повышение ВЧД до повреждающих уровней, как показано в примере № 1, в ЗК, образованном в черепе, и возвращает ВЧД к почти нормальным величинам, предотвращая развитие повреждающего КС.
Пример № 3
7
Альтернативным объяснением улучшенного выживания инфицированных HSV-1 животных может быть то, что лечение с использованием АФ-16 препятствует размножению вируса и/или его распространению в головном мозге. То, что это не случайность, демонстрирует следующий эксперимент. Взрослых крыс заражали закапыванием в правую ноздрю раствора вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1; штамм 2762, серия 041028; 1,7×10 БОЕ/мл). Половина животных получала 10 мин позже 25 мкл (1 или 10 мкг) АФ-16 в правую ноздрю, и далее получала ту же дозу АФ-16 закапыванием каждое утро в 8.00 и каждый вечер в 18.00, вплоть до окончания эксперимента на день 6. Другие группы инфицированных HSV-1 крыс получали с такими же временными интервалами 25 мкл носителя, PBS. Животных тщательно осматривали на предмет признаков общего недомогания и нарушений поведения и моторики. Животных умерщвляли введением чрезмерной дозы анестетика на день 6, череп вскрывали и удаляли головной мозг. Головной мозг, включая обонятельные луковицы, фиксировали погружением в содержащий буфер формалин по меньшей мере на один день. Головной мозг рассекали и делили на несколько образцов, которые обрабатывали для исследования под световым микроскопом после заливки в парафин и изготовления срезов. Срезы обрабатывали для стандартного окрашивания и для иммуногистохимической визуализации белков HSV-1 (фиг. 4). Поразительной находкой оказалось то, что белки HSV-1 можно было обнаружить не только в нервных клетках (фиг. 4а-с), но также в глиальных клетках (фиг. 4d) головного мозга, включая обонятельную долю и ганглии тройничного нерва. Заметьте отчетливое окрашивание нервных клеток (черным на фиг. 4а-с). Однако не наблюдалось отчетливой разницы с точки зрения распространенности и распределения белков HSV-1 в головном мозге инфицированных животных, которых лечили АФ-16, по сравнению с инфицированными животными, которые получали только носитель. Параллельно, мышей заражали HSV-1 и вводили им АФ-16 или носитель закапыванием дважды в день в правую ноздрю, а затем по истечении шести дней животных умерщвляли и обрабатывали образцы головного мозга, как описано выше, на предмет демонстрации антигенов HSV-1. Как и у крыс, у них не наблюдалось очевидной разницы в распределении или распространенности вирусных антигенов, связанной с лечением.
Таким образом, авторы сделали вывод, что лечение с использованием АФ-16 грызунов, зараженных вызывающим энцефалит штаммом HSV-1, который был выделен от умершего человека, не изменяет ни распространенность, ни клеточное распределение вирусных белков HSV-1 в головном мозге, по сравнению с инфицированными животными, которые получали только носитель. Таким образом, лечение с использованием АФ-16 не изменяет распределение HSV-1 в ЦНС. Возможной причиной значимого улучшения выживания грызунов, как показано в примере № 2, следовательно, является то, что с помощью АФ-16 было предотвращено повышение ВЧД до повреждающих уровней в ЗК, образованным костями черепа, как сообщается в примере № 1. В результате было предотвращено развитие повреждающего КС.
Пример № 4
7
Улучшение выживания инфицированных HSV-1 грызунов, как показано в примере № 2, предположительно, может происходить благодаря тому, что АФ-16 блокирует или по меньшей мере уменьшает пролиферацию вируса HSV-1 в инфицированном головном мозге. Таким образом, взрослых крыс заражали закапыванием в правую ноздрю раствора вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1; штамм 2762, серия 041028; 1,7×10 БОЕ/мл). Половина инфицированных животных получала 10 мин позже 25 мкл (1 или 10 мкг) АФ-16 в правую ноздрю, и далее получала ту же дозу АФ-16 закапыванием каждое утро в 8.00 и каждый вечер в 18.00, вплоть до окончания эксперимента на день 6. Другие группы инфицированных HSV-1 крыс получали с такими же временными интервалами 25 мкл носителя, PBS. Животных тщательно осматривали на предмет признаков общего недомогания и нарушений поведения и моторики. Животных умерщвляли введением чрезмерной дозы анестетика на день 6, череп затем быстро вскрывали и удаляли головной мозг. Затем образцы ткани головного мозга обрабатывали с использованием ОТ-ПЦР для оценки количества копий HSV-1 в ткани головного мозга, согласно стандартным процедурам, которые используются в клинической вирусологической лаборатории университетской клиники Sahlgrenska, Гетеборг, Швеция. Поразительной находкой оказалось то, что не было выявлено значимой разницы с точки зрения распространенности и распределения копий ДНК HSV-1 у животных, которых лечили АФ-16, по сравнению с животными, которые получали только носитель (фиг. 5). Описанный эксперимент также был осуществлен параллельно на мышах, и были получены сходные результаты, подтверждающие эффективность АФ-16 у множества видов. Так, АФ-16 не оказывал никакого значимого влияния на размножение вируса HSV-1, о чем свидетельствуют данные ПЦР (фиг. 5). Благоприятные эффекты происходят, вероятно, благодаря тому, что АФ-16 устраняет патологическое повышение ВЧД (фиг. 2) в ЗК, образованном черепом, как описано в примере № 1, которое, если его не лечить, должно привести к возникновению вредного КС, серьезно повреждающего ЦНС инфицированных животных.
Пример № 5
7
Благоприятное воздействие АФ-16 на животных, страдающих вызванным HSV-1 энцефалитом, предположительно, может происходить благодаря тому, что АФ уменьшает воспалительные реакции в ЦНС. Для проверки данной гипотезы взрослых крыс заражали закапыванием в правую ноздрю раствора вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1; штамм 2762, серия 041028; 1,7×10 БОЕ/мл). Половина животных получала 10 мин позже 25 мкл (1 или 10 мкг) АФ-16 в правую ноздрю, и далее получала ту же дозу АФ-16 закапыванием каждое утро в 8.00 и каждый вечер в 18.00, вплоть до окончания эксперимента на день 6. Другая половина инфицированных HSV-1 крыс получала с такими же временными интервалами 25 мкл носителя, физиологического раствора с фосфатным буфером. На день 6 образцы цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) отбирали у животных, которые получали АФ-16 (n=3) или носитель (n=3), согласно процедуре, описанной Huang, Saljo и Hansson (1996). При проведении анализа на концентрации маркеров воспаления IL-1, IL-6 и TNF-α не было установлено значимой разницы концентраций в ЦСЖ от инфицированных животных, которых лечили АФ-16, и от инфицированных животных, которые получали только носитель. Сделано заключение, что лечение АФ-16, вероятно, улучшает выживание грызунов, страдающих энцефалитом, вызванным HSV-1, не путем изменения воспалительного ответа, а путем нормализации внутричерепного давления, что предотвращает возникновение высокого ВЧД в ЗК и, следовательно, развитие КС. Вредные эффекты, вызванные HSV-1 энцефалитом, таким образом, устранялись благодаря тому, что АФ препятствовал развитию КС.
Пример № 6
Другой тип церебрального КС индуцировали инъекцией аутологичной цельной крови в субарахноидальное пространство; как известно из литературы, указанная процедура приводит к развитию отека мозга и повышению ВЧД. Взрослым крысам под наркозом вводили 50-350 мкл гепаринизированной аутологичной крови в субарахноидальное пространство через маленькое отверстие, высверленное в затылочной кости, или путем инъекции в cisterna magna через атлантозатылочную мембрану. Отверстия, высверленные в черепной кости, в конечном итоге закрывали клеем SuperBond. Указанная процедура с введением крови в субарахноидальное пространство повышала ВЧД, включая развитие КС через день или в течение недели; точное время зависело от условий и количества введенной крови, в соответствии с сообщениями в медицинской литературе. В экспериментах авторов инъекция 0,2-0,3 мл аутологичной гепаринизированной крови в cisterna magna взрослых крыс Sprague-Dawley приводила в течение 1-3 дней к повышению ВЧД до 13-30 мм рт.ст., по результатам оценки с использованием миниатюрного зонда стекловолоконного световода для измерения давления (Samba System 3200 & сенсор Samba Preclin 420; Samba Sensors AB, Gruvgatan 6, SE 42130 V Frolunda, Швеция). ВЧД у нормальных взрослых крыс, которым ничего не вводили, или вводили вместо крови физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS), составляло 6-9 мм рт.ст. Лечение с использованием 25 мкг АФ-16 интраназально дважды в день приводило к снижению повышенного ВЧД, которое воспроизводимым образом возвращалось к нормальным уровням через 1-2 ч. У грызунов, которых лечили АФ, не наблюдалось ни признаков нарушения функции головного мозга, ни любого другого выраженного очевидного нарушения поведенческих или моторных функций, в противоположность животным с субарахноидально введенной кровью, которые затем получали носитель. Сделано заключение, что лечение с использованием АФ-16 уменьшает распространенность и тяжесть повреждения головного мозга, индуцированного субарахноидальным введением крови, по сравнению с животными, которые получали носитель, PBS. Это означает, что АФ-16 отменяет или, в случае уже возникшего церебрального КС, уменьшает его тяжесть. Быстрый ответ на АФ-16 имел решающее значение для благоприятного эффекта АФ-16.
Пример № 7
Суставы заключены в тонкие, неподатливые коллагеновые капсулы, которые дополнительно характеризуются низкой эластичностью, но пластичностью. При артрите давление синовиальной жидкости в полости сустава повышается, и к симптомам добавляет свой вклад воспаление. Преобладающим является КС. Для того чтобы установить, может ли АФ-16 предотвратить или по меньшей мере уменьшить развитие указанного КС, взрослых крыс заражали путем системной инъекции раствора, вызывающего артрит Staphylococcus areus (SA; штамм LS1). Одну группу животных (n=3) лечили АФ-16, в то время как вторая группа крыс (n=3) получала только носитель, PBS. Через несколько дней коленные и позднее на еще одной конечности суставы стопы стали болезненными, опухшими, а давление в суставных полостях повысилось, по результатам измерения с использованием зонда стекловолоконного световода для измерения давления Samba (Samba System 3200 & сенсор Samba Preclin 420; Samba Sensors AB, Gruvgatan 6, SE 42130 V. Frolunda, Швеция), а также в непосредственно прилегающих к суставам тканях. Давление в нормальном большом синовиальном суставе составляет 0-5 мм рт.ст., но может увеличиться более чем в пять раз в инфицированных, воспаленных суставах. Давление интерстициальной жидкости в подкожной ткани на расстоянии от инфицированного сустава измеряли для сравнения и установили, что оно оставалось на нормальном уровне, ±2 мм рт.ст. Напротив, у грызунов с инфицированным SA большим суставом, которых лечили АФ-16, не было чувствительных, распухших и болезненных суставов, а давление в суставе было близким к норме. У инфицированных животных, которые получали только носитель, PBS, развивался КС, тяжесть которого со временем возрастала. По результатам анализа синовиальной жидкости на предмет количественной и качественной распространенности бактерий в группах было установлено, что количество S.areus было приблизительно одинаковым в более крупных суставах, независимо от того, лечили крыс с использованием АФ-16 или нет.
Авторы сделали вывод, что лечение АФ-16 уменьшает давление в инфицированном суставе после инокуляции вызывающих артрит микробов, например бактерий, и, вероятно, также вирусов и иммунологических агентов. Однако не наблюдалось разницы в размножении и распределении в суставах патогенных бактерий, например Staphylococcus areus (штамм LS1). Таким образом, инфицированные суставы, вероятно, должны были повреждаться инфекцией SA, поскольку антибиотики животным не вводились. Однако животных умерщвляли гораздо раньше.
Основное открытие заключалось в том, что лечение с использованием АФ-16 воспроизводимым образом противодействовало в противном случае повышенному давлению в пораженном суставе, который представляет собой ЗК. Таким образом, в инфицированных суставах после лечения АФ-16 КС не развивался, по оценке настоящего исследования.
Пример № 8
Взрослые крысы имели состояние ЗК, индуцированное и оценивавшееся в скелетных мышцах. На задней конечности крупные сосуды, питающие musculus extensor digitorum longus (EDL), перекрывали на 1-3 часа путем приложения внешней сжимающей нагрузки (Cf. Jennische & Hansson, 1987; Jennische, Skottner & Hansson, 1987). После этого кровоток возобновляли, и мышечные оболочки и кожный разрез восстанавливали и сшивали. Указанное воздействие приводило к ишемическому повреждению, вызывая некроз фракции волокон скелетной мускулатуры EDL. КС развивался по мере накопления тканью и интерстициальной тканью в указанном замкнутом компартменте, и мышца становилась еще более набухшей и отечной. Давление внутри указанного замкнутого компартмента возрастало, что приводило к развитию КС. Требовалось хирургическое вмешательство, чтобы предотвратить некроз данных участков ткани скелетной мышцы, если не проводилось дополнительного лечения. Однако, если проводилось лечение АФ-16, компартмент-синдром не развивался, поскольку реактивное набухание поврежденной ткани и, следовательно, давление внутри компартмента, возвращались к приблизительной норме по данным сенсоров давления Samba. Световая микроскопия образцов из мышцы EDL подтвердила, что лечение АФ-16 уменьшало протяженность и объем повреждения ткани по сравнению с введением носителя. Таким образом, лечение АФ-16 предотвращало развитие КС, уменьшая, в конечном итоге, повреждение и утрату ткани.
Пример № 9
Взрослым крысам экспериментально создавали состояние ЗК воздействием на перикард и оценивали с точки зрения эффектов лечения пептидом АФ-16. Полость перикарда отграничивает сердце, образуя мешок, содержащий минимальное количество жидкости, облегчающей приспосабливание к скользящим движениям, возникающим в результате внезапных и сильных сокращений сердца. Полость перикарда по периферии заключена в париетальную мембрану, содержащую большое количество коллагена. У крыс, находившихся под наркозом, перикард открывали хирургическим путем через маленькое «окно» в диафрагме и средостении. Внутреннюю поверхность перикарда травмировали хирургическим путем, трением через разрез. Указанных животных делили на две группы; одну группу лечили с использованием АФ-16, в то время как другая получала только носитель, PBS. У животных, которых лечили с использованием АФ-16 в течение недели, наблюдалось минимальное накопление жидкости в полости перикарда, при низком давлении. Напротив, у животных, которые после травмирования перикарда получали носитель, наблюдалось наполнение перикарда жидкостью под давлением, а также многочисленные нити фибрина и клетки воспаления. Кроме того, париетальная перикардиальная оболочка была набухшей, воспаленной и инфильтрированной многочисленными увеличенными, местами вновь образованными, кровеносными сосудами.
Печень, селезенку, почку и щитовидную железу сходным образом повреждали сдавливанием и выскабливанием. Лечение АФ-16, как было показано для указанных случаев, также уменьшало отек и набухание указанных структур соответственно, по сравнению с животными, которые получали носитель. Далее уменьшалась распространенность асцита и связанных типов избытка внеклеточной жидкости при повышенном давлении. Таким образом, АФ-16 уменьшал протяженность и тяжесть КС в паренхиматозных органах и тканях.
Пример № 10
Межпозвоночные диски, которые отделяют друг от друга тела позвонков в позвоночнике, изменяют свои размеры в зависимости от фактической нагрузки много раз в день. Содержание воды в бессосудистых nucleus pulposus и annulus fibrosus в диске зависит от снабжения жидкостью, ионами, питательными веществами и кислородом из соседних связок и из концевых пластинок позвонков (Cf. Holm et al., 2007). Продукты обмена из бессосудистого диска должны пройти через те же препятствия, прежде чем достигнут системы кровообращения. Таким образом, грызунов, кроликов и свиней оценивали с точки зрения эффектов белка АФ и пептидов АФ с учетом влияния на межпозвоночные диски, при наличии и отсутствии нагрузки. Можно было продемонстрировать, что лечение с использованием АФ-16 уменьшает набухание и воспалительные реакции в поврежденных межпозвоночных дисках. Далее, при исследовании с использованием световой микроскопии окрашенные срезы, изготовленные из указанных дисков, как было показано, имели меньше повреждений nucleus pulposus у животных, которых лечили с использованием АФ-16, а также имели менее выраженные реактивные повреждения, которые иначе, как ожидалось, должны были распознаваться в annulus fibrosus и в отграничивающих связках и прилегающей соединительной ткани. Далее, эффекты АФ м АФ-16 после сверхмаксимальных нагрузок, а также после травмы межпозвоночных дисков, выявили, что жесткость межпозвоночных соединений и индуцированная деформация были ближе к нормальным после лечения АФ-16, чем таковые после получения носителя. Таким образом, описано, что АФ соединения являются благоприятными в отношении уменьшения набухания и повреждения тканей при травме или деформации и/или избыточной нагрузки на межпозвоночные диски.
Пример № 11
У взрослых крыс экспериментально вызывали КС, развивавшийся в определенных структурах, отграниченных сухожильной оболочкой, таких как сухожилие и нерв, который изучали с точки зрения воздействия на него АФ-16. Периферические и вегетативные нервы отграничиваются эндоневрием, периневрием и наиболее отдаленным от середины эпиневрием. Множество нервных пучков образует нерв (Cf. Hansson et al., 1987). Сухожилия и некоторые из связок в организме отграничиваются тонкой коллагеновой мембраноподобной структурой, синовиальным влагалищем. Внутренний пограничный слой последнего соединяет сухожилие с его синовиальным влагалищем, которое делает возможным скольжение с минимальным трением. Периферия последней структуры заключена в фиброзный мембраноподобный слой, фиброзное влагалище. Ограждающий паратендиний на некоторых участках удерживается на месте и получает питание с помощью мезотендиния и vinculae (Cf. Hansson et al., 1980). Помимо этого, другим смазывающим приспособлением являются синовиальные сумки, замкнутые фиброзные мешки, имеющие тонкую пленку жидкости и предотвращающие трение и тяжелую нагрузку на прилегающие твердые структуры и между ними. Набухание и отек вследствие избыточной нагрузки и травмы, а также воспаление, повреждают структуру и функцию периферических нервов, сухожилий и синовиальных сумок.
У крыс под наркозом раздавливали седалищный нерв с помощью специально разработанных щипцов, как было описано ранее (Stemme et al., 1985; Hansson et al., 1987). Указанная процедура приводила не только к нарушению функции и структуры нерва, но также к нарушению циркуляции крови и лимфы, и вызывала набухание седалищного нерва, развитие отека, который вовлекал прилегающие и покрывающие структуры. ДИЖ повышалось, по оценке помещения в пораженную ткань зонда стекловолоконного световода для измерения давления Samba. Каждую вторую крысу лечили АФ-16 в высокой дозе, начиная с момента повреждения. Каждая вторая идентичным образом получившая повреждение крыса получала носитель. Давление в периневрии повышалось через день у животных, получавших только носитель, в соответствии с макроскопически наблюдавшимися набуханием и местным отеком, т.е. у животных развивался КС. Напротив, в седалищных нервах животных, леченных АФ-16, было периневральное давление, которое было обычно слегка повышено или близким к давлению в нормальном нерве. Световая микроскопия тонких окрашенных срезов поврежденных седалищных нервов подтвердила, что АФ-16 уменьшал воспаление и отек и деформацию тканей.
Сходные результаты были получены при лечении поврежденных сухожилий (Hansson H.A. et al., 1980) с использованием АФ-16, по сравнению с результатами, которые наблюдались после введения носителя. У животных, которые получали носитель, развились признаки КС, в противоположность тем животным, которых лечили с использованием АФ и АФ-16.
Был сделан вывод о том, что АФ-16 препятствует развитию КС в месте повреждения, например, нерва, сухожилия или синовиальной сумки.
Пример № 12
Во время хирургического вмешательства и при травме могут повреждаться артерии, что вызывает набухание стенки сосуда. Указанные события будут приводить к повышению ДИЖ в стенке сосуда, вызывая воспалительные реакции и изменение структуры (Hansson, Jennische & Skottner, 1987). Крысам одной группы подкожно имплантировали осмотическую минипомпу Alza, наполненную АФ-16, и соединяли ее с участком повреждения посредством тонкой силиконовой трубки, которая делала возможной доставку пептида АФ-16 непосредственно в травмированную ткань. У дополнительного количества животных имелись для сравнения помпы, наполненные носителем. Поврежденные артерии исследовали спустя 3, 5, 7 или 14 дней. Кровеносные сосуды, восстановленные у животных, получавших носитель, были тонкие, имели увеличенный внешний диаметр и были набухшими. Напротив, сосуды у животных, которых лечили АФ-16, как было установлено, были менее набухшими и воспаленными. Степень очевидности была выше у животных, которых лечили АФ-16, по сравнению с животными, которые получали носитель. Когда окрашенные срезы бедренной артерии исследовали через 14 дней, было очевидно, что в сосудах от крыс, которых лечили АФ-16, были меньше повреждены и меньшей воспалены, а также имели меньшую распространенность реактивных изменений, таких как образование неоинтимы, включая гладкомышечные клетки, по сравнению с животными, которые получали только носитель. Далее, количество макрофагов, пенистых клеток и лимфоцитов также уменьшалось благодаря лечению АФ-16. Был сделан вывод о том, что АФ-16 оказывал благоприятное воздействие на заживление поврежденных кровеносных сосудов.
Пример № 13
Грызунам подкожно и внутримышечно имплантировали опухоли злокачественные, а также доброкачественные. Каждое второе животное, имеющее опухоль диаметром от 10 мм до 15 мм, лечили белками АФ или АФ-16, системно, с помощью подкожно имплантированных осмотических минипомп Alza, путем инъекций АФ-16 на опухоль или в опухоль. В другом эксперименте пептид АФ-16 доставляли из имплантированной помпы Alzet 2001 непосредственно на опухоль и/или в опухоль с помощью тонкой силиконовой трубки. Дополнительное количество крыс получало АФ-белок, индуцированный в их пищеварительном тракте, благодаря содержанию АФ в яичном желтке. Для сравнения такое же количество крыс получало то же лечение, только с использованием носителя. Давление интерстициальной жидкости (ДИЖ) в опухоли, а также в прилегающих к ней участках определяли с использованием сенсора стекловолоконного световода Samba (диаметром 0,4 мм), с защитной системой трубок или без нее, а также с оборудованием, которое делает возможным определение давления интерстициальной жидкости с помощью «фитильной» методики. ДИЖ в опухолях у животных, получавших носитель, было значимо повышено, более чем на 12 мм рт.ст. ДИЖ в прилегающей соединительной ткани было в пределах от 0 до 4 мм рт.ст., но время от времени могло быть отрицательным. В опухолях размером 10-15 мм, которые лечили АФ-16, как описано выше, наблюдалось уменьшение ДИЖ, обычно до 12 мм рт.ст. или менее. Далее, АФ-16 уменьшал интенсивность и распространенность воспалительной реакции, по оценке с использованием световой микроскопии окрашенных тонких срезов, изготовленных из фиксированных и обработанных образцов.
В параллельных экспериментах на грызунах можно было продемонстрировать благоприятное воздействие на рост и распространение имплантированных опухолей, с использованием яичного желтка, обогащенного белками АФ, по сравнению с эффектами носителя.
Был сделан вывод о том, что понижение ДИЖ в опухолях, возможно, улучшает микроциркуляцию, что делает внеклеточное окружение менее гипоксичным и способствует улучшению проникновения противоопухолевых лекарственных средств, которые также будут более эффективно распределяться. Был сделан вывод о том, что способность АФ-16 уменьшать ДИЖ в опухолях будет улучшать эффективность лечения специфическими лекарственными средствами. Далее, лучевая терапия, возможно, станет более эффективной, поскольку улучшенная микроциркуляция после лечения АФ-16 будет повышать уровни кислорода в ткани, на которую воздействуют, что способствует образованию свободных радикалов, которые имеют ключевое значение для препятствования росту опухоли, что в конечном итоге приводит к усилению гибели опухолевых клеток. Указанное воздействие АФ-16 на ДИЖ, как полагают, вносит свой вклад в улучшение ликвидации опухолей и делает возможным контроль диссеминации в организме пациента.
Пример № 14
Эффекты АФ изучали, помимо прочего, в прокариотических клетках, которые ограничиваются сложной клеточной стенкой, что делает возможным повышение давления из-за нарушения функций мембран. Указанные эксперименты проводили на бактериях, которые синтезируют и высвобождают широкий ряд веществ, которые могут вызывать повреждение клеток млекопитающих и, следовательно, их организма. Примерами указанных продуктов являются пигменты, ферменты и токсины, которые переносятся через внешнюю мембрану бактерии во внеклеточную окружающую среду. Ингибирование активности указанной мембраны будет уменьшать или даже блокировать перенос и/или высвобождение указанных патогенных веществ. Для того чтобы исследовать, влияет ли пептид АФ-16 на перенос бактериальных продуктов от места их синтеза в бактерии в окружающую ее среду, провели следующий эксперимент. Бактерию Staphylococcus areus, которая синтезирует желтый пигмент, культивировали в течение ночи или, иногда, в течение 2 дней, в присутствии или в отсутствии пептида АФ-16. Через один или два дня бактериальную культуру промывали, а затем концентрировали центрифугированием. Желтый пигмент, образованный Staphylococcus areus, экстрагировали из осажденных центрифугированием бактерий с нарушенной проницаемостью мембраны метанолом, и определяли абсорбцию света с использованием спектрометрии. В бактериальных культурах, которые росли в присутствии АФ-16, было гораздо больше желтого пигмента, чем у бактерий, на которые воздействовали носителем, после коррекции измеренных величин по количеству бактерий. Указанные результаты недвусмысленно показывают, что лечение с использованием АФ-16 аннулировало перенос и высвобождение составляющих, образованных в бактериях, в окружающую среду.
Был сделан вывод о том, что представленный эксперимент доказал, что АФ-16 эффективно влияет на внутриклеточный перенос и высвобождение продуктов из живых бактерий.
РЕЗЮМЕ И ВЫВОДЫ
Лечение пептидом АФ-16 отменяет или по меньшей мере уменьшает развитие повышенного давления в замкнутых компартментах. Лечение с использованием АФ-16 также уменьшает неблагоприятные клинические признаки при воздействии избыточной нагрузки, повреждения, ишемии, токсических агентов, лекарственных средств и инфекций. При лечении с использованием АФ-16 давление в замкнутых компартментах не повышалось до ожидавшихся повреждающих уровней, которые были очевидны, если животным вводили только носитель. Патологические состояния, по поводу которых осуществлялось лечение, не были связаны с какой-либо отменой гиперсекреторных состояний белками или пептидами АФ. Описанный эффект введения пептидов и белков АФ обычно проявлялся в течение часа и продолжался в течение нескольких часов. Ответ на введение АФ был быстрым и значительно уменьшал вредные эффекты повышенного давления в замкнутых компартментах. Белки и пептиды АФ, таким образом, были эффективными для лечения КС в живом организме, отменяя развитие замкнутого КС, иначе вредного для функции пораженной ткани и органа. Специалисту понятно, что нормализация давления в замкнутом компартменте облегчает введение других фармацевтических препаратов, предназначенных для уменьшения причины повышенного давления и его осложнений, а также нацеливание указанных лекарственных средств на их мишень.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ