АНТИ-CD79b АНТИТЕЛА И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTI-CD79b ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES AND METHODS FOR USING THEM

Перекрестная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке, поданной в соответствии со статьей 37, § 1.53(b) Свода Федеральных Правил (CFR), испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 60/950052, поданной 16 июля 2007 г., предварительной заявки на патент США рег. № 61/025137, поданной 31 января 2008 г., предварительной заявки на патент США рег. № 61/032790, поданной 29 февраля 2008 г., и предварительной заявки на патент США рег. № 61/054709, поданной 20 мая 2008 г., в соответствии со статьей 35, § 119(е) Кодекса законов США, где описание каждой заявки во всей своей полноте вводится в настоящую заявку посредством ссылки.
Область, к которой относится изобретение
Настоящая группа изобретений относится к композициям, которые могут быть использованы для лечения гемопоэтической опухоли у млекопитающих, и к способам применения таких композиций.
Уровень техники
В США злокачественные опухоли (рак), после болезней сердца, являются вторым лидирующим заболеванием, приводящим к летальному исходу (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). Рак характеризуется увеличением числа патологических или опухолевых клеток, происходящих от нормальной ткани, которая пролифирует с образованием опухолевой массы и инвазией смежных тканей такими неопластическими опухолевыми клетками, с образованием злокачественных клеток, которые, в конечном счете, распространяются через систему кровообращения или лимфатическую систему в региональные лимфоузлы и в периферические области по механизму, называемому метастазированием. При раке клетки пролиферируют в условиях, при которых нормальные клетки расти не могут. Само раковое заболевание проявляется в различных формах широкого ряда, характеризующихся различной степенью инвазивности и агрессивности.
Раковые заболевания, в которых участвуют клетки, образующиеся в процессе гемопоэза, то есть в процессе, благодаря которому образуются клеточные элементы крови, такие как лимфоциты, лейкоциты, тромбоциты, эритроциты и природные клетки-киллеры, называются раком гемопоэтической системы. Лимфоциты, которые могут быть обнаружены в крови и в лимфатической ткани и играют решающую роль в иммунном ответе, подразделяются на два основных класса: В-лимфоциты (В-клетки) и Т-лимфоциты (Т-клетки), которые опосредуют гуморальный и клеточно-опосредуемый иммунный ответ, соответственно.
B-клетки созревают в костном мозге и покидают костный мозг, экспрессируя на своей поверхности антигенсвязывающее антитело. После того, первого контакта «необученных» В-клеток с антигеном, для которого мембраносвязанное антитело является специфическим, клетки начинают быстро делиться, а их потомство дифференцируется в В-клетки памяти и эффекторные клетки, называемые «плазматическими клетками». В-клетки памяти имеют более продолжительное время жизни и продолжают экспрессировать мембраносвязанное антитело, которое обладает такой же специфичностью, как и исходные родительские клетки. Плазматические клетки не продуцируют мембраносвязанное антитело, а вместо этого они продуцируют антитело в форме, которая может секретироваться. Секретируемыми антителами являются основные эффекторные молекулы гуморального иммунного ответа.
T-клетки созревают в тимусе и создают условия для пролиферации и дифференцировки незрелых Т-клеток. В процессе своего созревания T-клетки претерпевают реаранжировку генов, которая приводит к продуцированию Т-клеточного рецептора, и подвергаются позитивному и негативному отбору, который облегчает определение фенотипа клеточной поверхности зрелых Т-клеток. Характерными маркерами клеточной поверхности зрелых Т-клеток являются комплексы CD3:T-клеточный рецептор и один из корецепторов, CD4 или CD8.
В попытке выявления эффективных клеточных мишеней для противораковой терапии были проведены исследования по идентификации трансмембранных или других мембраносвязанных полипептидов, которые специфически экспрессируются на поверхности раковых клеток одного или нескольких конкретных типов по сравнению с одной или несколькими нормальными нераковыми клетками. В большинстве случаев такие мембраносвязанные полипептиды в большом количестве экспрессируются на поверхности раковых клеток, но не на поверхности нераковых клеток. Идентификация таких ассоциированных с опухолью полипептидов-антигенов клеточной поверхности дает возможность специфически разрушать раковые клетки-мишени путем терапии с использованием антител. В этой связи следует отметить, что терапия на основе антител оказалась очень эффективной для лечения некоторых раковых опухолей. Так, например, герцептин (HERCEPTIN) и ритуксан (RITUXAN) (оба этих антитела поставляются компанией Genentech Inc., South San Francisco, California) представляют собой антитела, которые с успехом применялись для лечения рака молочной железы и неходжкинской лимфомы, соответственно. Более конкретно, HERCEPTIN представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое было получено методами рекомбинантных ДНК и которое селективно связывается с внеклеточным доменом протоонкогена рецептора человеческого эпидермального фактора роста 2 (HER2). Сверхэкспрессия белка HER2 наблюдалось в 25-30% случаев заболеваний первичным раком молочной железы. RITUXAN представляет собой генетически сконструированное химерное моноклональное антитело «мышь/человек», направленное против антигена CD20, находящегося на поверхности нормальных и злокачественных В-лимфоцитов. Оба эти антитела рекомбинантно продуцируются в клетках СНО.
В попытке выявления эффективных клеточных мишеней для противораковой терапии были проведены исследования по идентификации (1) полипептидов, которые не являются мембраносвязанными и которые, в отличие от нераковых нормальных клеток конкретных типов, специфически продуцируются одной или несколькими раковыми клетками конкретных типов, (2) полипептидов, которые продуцируются раковыми клетками на уровне экспрессии, значительно превышающем уровень экспрессии полипептидов одной или несколькими нормальными нераковыми клетками, или (3) полипептидов, экспрессия которых, в частности, ограничивается тканями одного типа (или очень ограниченного числа тканей других типов), пораженными и не пораженными раком (например, нормальной тканью предстательной железы и опухолевой тканью предстательной железы). Такие полипептиды могут быть постоянно локализованы внутри клеток, либо они могут секретироваться раковыми клетками. Кроме того, такие полипептиды могут экспрессироваться не самими раковыми клетками, а клетками, которые продуцируют и/или секретируют полипептиды, оказывающие потенцирующее действие на раковые клетки или действие, стимулирующее рост раковых клеток. В большинстве случаев такими секретируемыми полипептидами являются белки, которые обеспечивают раковым клеткам, но не нормальным клеткам, преимущественный рост, и такими полипептидами являются, например, ангиогенные факторы, факторы клеточной адгезии, факторы роста и т.п. При этом предполагается, что идентификация антагонистов указанных полипептидов, которые не являются мембраносвязанными, позволит выявлять эффективные терапевтические средства для лечения указанных раковых заболеваний. Кроме того, идентификация характера экспрессии таких полипептидов может быть использована для диагностики конкретных раковых опухолей у млекопитающих.
Несмотря на упомянутые выше успехи в противораковой терапии млекопитающих, необходимость в получении дополнительных терапевтических средств, способных детектировать присутствие опухоли у млекопитающих и эффективно ингибировать рост опухолевых клеток, соответственно, остается особенно актуальной. В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является идентификация полипептидов, а именно мембраносвязанных, секретируемых полипептидов или внутриклеточных полипептидов, экспрессия которых, в частности, ограничивается тканями только одного типа (или очень ограниченного числа тканей других типов), гемопоэтическими тканями, пораженными и не пораженными раком; и применение таких полипептидов и нуклеиновых кислот, кодирующих указанные полипептиды, для получения композиций согласно изобретению, которые могут быть использованы в целях терапии и/или диагностики гемопоэтического рака у млекопитающих.
CD79 представляет собой сигнальный компонент В-клеточного рецептора, состоящий из ковалентно связанного гетеродимера, содержащего CD79a (Igα, mb-1) и CD79b (Igβ, B29). Каждый из CD79a и CD79b содержит внеклеточный домен иммуноглобулина (Ig), трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен и домен активации иммунорецептора, имеющий тирозиновый мотив (ITAM). CD79 экспрессируется на B-клетках и в клетках неходжкинской лимфомы (НХЛ) (Cabezudo et al., Haematologica, 84:413-418 (1999); D'Arena et al., Am. J. Hematol., 64:275-281 (2000); Olejniczak et al., Immunol. Invest., 35:93-114 (2006)). Все CD79a и CD79b и sIg необходимы для поверхностной экспрессии CD79 (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13(3):270-7 (2001)). Средний уровень поверхностной экспрессии CD79b на НХЛ аналогичен его экспрессии на нормальных В-клетках, но в более широких пределах (Matsuuchi et al., Curr. Opin. Immunol., 13(3):270-7 (2001)).
Что касается экспрессии CD79b, то можно сказать, что он более эффективен в продуцировании терапевтических антител против антигена CD79b и обладает минимальной антигенностью или вообще не обладает антигенностью при его введении пациентам, а в частности, при продолжительном лечении. Настоящее изобретение удовлетворяет всем этим и другим требованиям. Настоящее изобретение относится к анти-CD79b антителам, которые не имеют недостатков, присущих современным терапевтическим композициям, а также обладают другими преимуществами, которые будут очевидны из нижеследующего подробного описания.
Использование конъюгатов «антитело-лекарственное средство» (ADC), то есть иммуноконъюгатов, в целях локальной доставки цитотоксических или цитостатических агентов, например, лекарственных средств, для уничтожения или подавления роста опухолевых клеток при лечении рака (Lambert J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al., (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos & Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz & Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; патент США № 4975278) позволяет осуществлять направленную доставку лекарственного средства в опухоли и обеспечивать их аккумуляцию внутри клеток, тогда как системное введение этих неконъюгированных лекарственных средств может приводить к продуцированию уровней токсичности, которые являются неприемлемыми для нормальных клеток и недостаточными для уничтожения опухолевых клеток (Baldwin et al., 1986, Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, 1985, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review” in Monoclonal Antibodies 84:Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). В попытках повысить терапевтический индекс, то есть максимально повысить эффективность и максимально снизить токсичность ADC, все усилия были направлены на повышение селективности поликлональных антител (Rowland et al. (1986), Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87) и моноклональных антител (mAb), а также на улучшение таких свойств, как связывание с лекарственным средством и высвобождение лекарственных средств (Lambert J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549). Лекарственными средствами, используемыми в конъюгатах «антитело-лекарственное средство», являются бактериальные белковые токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные белковые токсины, такие как рицин, и небольшие молекулы, такие как ауристатины, гельданамицин (Mandler et al., (2000) J. of the Nat.Cancer Inst. 92 (19):1573-1581; Mandler et al. (2000), Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002), Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (ЕР 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342), дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al. (1986) см. выше). Лекарственные средства могут оказывать влияние на цитотоксические и цитостатические механизмы, включая связывание с тубулином, связывание с ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства, при их конъюгировании с крупными антителами или лигандами белков-рецепторов, имеют тенденцию к потере или уменьшению активности.
Лекарственные средства, а именно ауристатиновые пептиды, ауристатин Е (АЕ) и монометилауристатин (ММАЕ), т.е. синтетические аналоги доластатина (WO 02/088172), были конъюгированы: (i) с химерными моноклональными антителами cBR96 (специфичными к антигену Lewis Y на карциномах); (ii) с сАС10, которое является специфичным к CD30, присутствующему на гематологических злокачественных опухолях (Klussman et al. (2004) Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465; публикация заявки на патент США 2004/0018194); (iii) с анти-CD20 антителами, такими как ритуксан (WO 04/032828), используемый для лечения CD20-экспрессирующих раковых опухолей и иммунных расстройств; (iv) с анти-EphB2R антителом 2Н9, используемыми для лечения рака прямой и ободочной кишки (Mao et al. (2004) Cancer Research 64(3):781-788); (v) с антителом против Е-селектина (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6397); (vi) с трастузумабом (HERCEPTIN, заявка США 2005/0238649), и (vii) анти-CD30 антителами (WO 03/043583). Варианты ауристатина Е описаны в патентах США 5767237 и 6124431. Монометилауристатин Е, конъюгированный с моноклональными антителами, описан в работе Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, опубликованной 28 марта 2004 г. Ауристатиновые аналоги ММАЕ и MMAF были конъюгированы с различными антителами (заявка США 2005/0238649).
Стандартный метод присоединения, т.е. ковалентного связывания молекулы лекарственного средства с антителом, по существу позволяет получить гетерогенную смесь молекул, в которых лекарственные средства присоединены в различных участках молекулы антитела. Так, например, цитотоксические лекарственные средства обычно конъюгируют с антителами посредством большого количества лизиновых остатков антитела с получением гетерогенной смеси конъюгата “антитело-лекарственное средство”. В зависимости от условий реакции гетерогенная смесь обычно содержит определенное число антител, к которым присоединены от 0 и примерно до 8 или более молекул связанных лекарственных средств. Кроме того, в каждой подгруппе конъюгатов, с отношением молекул лекарственного средства к молекулам антитела, равным конкретному целому числу, может присутствовать гетерогенная смесь, в которой молекула лекарственного средства присоединена в различных участках антитела. Аналитические и препаративные методы могут быть неподходящими для разделения и характеризации молекул-конъюгатов “антитело-лекарственное средство” в гетерогенной смеси, полученной в результате реакции конъюгирования. Антитела представляют собой крупные, сложные и отличающиеся по своей структуре биомолекулы, которые в большинстве случаев имеют множество реакционноспособных функциональных групп. Способность этих групп реагировать с линкерными реагентами и промежуточными соединениями “лекарственное средство-линкер” зависит от таких факторов, как рН, концентрация, концентрация соли и присутствие сорастворителей. Кроме того, способ многостадийного конъюгирования может оказаться невоспроизводимым, что обусловлено трудностями регуляции условий реакции и характеризации реагентов и промежуточных соединений.
В отличие от большинства аминов, которые являются протонированными и менее нуклеофильными при рН~7, тиолы цистеинов являются реакционноспособными при нейтральном рН. Поскольку свободные тиоловые (RSH, сульфгидрильные) группы являются относительно реакционноспособными, то белки, содержащие цистеиновые остатки, часто имеют окисленную форму и представляют собой связанные с дисульфидом олигомеры, либо они содержат внутренние мостиковые дисульфидные группы. Внеклеточные белки обычно не содержат свободных тиоловых групп (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London, page 55). Тиоловые группы цистеина антитела обычно являются более реакционноспособными, то есть более нуклеофильными по отношению к электрофильным реагентам конъюгирования, чем аминогруппы или гидроксильные группы антитела. Цистеиновые остатки были введены в белки методами генной инженерии с образованием ковалентных связей с лигандами или с образованием новых внутримолекулярных дисульфидных связей (Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; патент США 6248564). Однако конструирование тиоловых групп цистеина путем замены различных аминокислотных остатков белка цистеиновыми остатками может быть связано с определенными проблемами, особенно, если присутствуют несвязанные (свободные Cys) остатки или остатки, которые являются относительно доступными для реакции или окисления. В концентрированных растворах белка, независимо от того, присутствуют ли они в периплазме E. coli, супернатантах культуры, или являются частично или полностью очищенными белками, несвязанные остатки Cys на поверхности белка могут связываться и окисляться с образованием межмолекулярных дисульфидов, а следовательно и димеров или мультимеров белка. Образование дисульфидных димеров сообщает новому остатку Cys неспособность образовывать конъюгаты с лекарственным средством, лигандом или другой меткой. Кроме того, если белок в результате окисления образует внутримолекулярную дисульфидную связь между новым сконструированным Cys и уже имеющимся остатком Cys, то обе тиоловые группы Cys становятся недоступными для функционирования в активном центре и к взаимодействию. Кроме того, такой белок может становиться неактивным или неспецифичным в результате неправильной укладки или потери третичной структуры (Zhang et al. (2002) Anal. Biochem. 311:1-9).
Сконструированные на основе цистеина антитела были получены в виде FAB-фрагментов антител (тио-Fab) и экспрессированы как полноразмерные моноклональные антитела IgG (тио-Mab) (Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol Methods 332:41-52; заявка США 2007/0092940, содержание которых вводится в настоящее описание посредством ссылки). Антитела тио-Fab и тио-Mab были конъюгированы посредством линкеров в положениях нововведенных тиолов цистеина с использованием реагирующих с тиолом линкерных реагентов и реагентов «лекарственное средство-линкер» с получением конъюгатов «антитело-лекарственное средство» (тио-ADC).
Все цитируемые здесь работы, включая патентные заявки и публикации, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к анти-CD79b антителам или к их функциональным фрагментам, а также к способу их применения для лечения гемопоэтических опухолей.
2
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается предпочтительно специфически с любым из вышеописанных или нижеописанных полипептидов. Таким антителом является, но необязательно, моноклональное антитело, фрагмент антитела, включая Fab-, Fab'-, F(ab')- и Fv-фрагмент, диантитело, однодоменное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим агентом или с цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин, майтанзиноид, производное долостатина или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, продуцированы в клетках СНО или в бактериальных клетках, а предпочтительно индуцируют гибель клеток, с которыми они связываются. Антитела согласно изобретению, используемые в целях детектирования, могут быть детектируемо помечены, присоединены к твердому носителю или т.п.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность одновалентного антитела (например, аффинность антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b) или аффинность двухвалентной формы антитела против CD79b (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG-фрагмента против CD79b) по существу аналогична, ниже или выше аффинности одновалентного или аффинности двухвалентного, соответственно, мышиного антитела (например, аффинности мышиного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента или IgG-фрагмента против CD79b), или химерного антитела (например, аффинности химерного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента или IgG-фрагмента против CD79b), содержащего последовательность вариабельного домена легкой и тяжелой цепи или состоящего или по существу состоящего из указанной последовательности, представленной на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность указанного антитела в его двухвалентной форме по отношению к CD79b (например, аффинность антитела типа IgG против CD79b) составляет 0,4 нМ, 0,2 нМ или 0,5 нМ.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с CD79b, где указанное антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из группы, состоящей из:
(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A15 представляет собой KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131),
(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой AASNLES (SEQ ID NO: 132),
(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133),
(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134),
(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135), и
(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F10, где F1-F10 представляет собой TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с CD79b, где указанное антитело содержит по меньшей мере один вариант HVR, где указанный вариант HVR содержит модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 или 136.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 164-166).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 156-158).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 183-185).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 175-177).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 202-204).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 194-196).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 221-223).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, включающему вариабельный домен легкой цепи, содержащий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 213-215).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к анти-CD79b антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 170, 189, 208 или 227. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к анти-CD79b антителу, содержащему вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 169, 188, 207 или 226.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к сконструированному на основе цистеина анти-CD79b антителу, содержащему одну или несколько свободных цистеиновых аминокислот и последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 251-298. Сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело может связываться с полипептидом CD79b. Сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело может быть получено способом, включающим замену одного или нескольких аминокислотных остатков родительского анти-CD79b антитела цистеином.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к сконструированному на основе цистеина анти-CD79b антителу, содержащему одну или несколько свободных аминокислот цистеинов, где указанное сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело связывается с полипептидом CD79b, и где указанное антитело было получено способом, включающим замену одного или нескольких аминокислотных остатков родительского анти-CD79b антитела цистеином, где указанное родительское антитело содержит по меньшей мере одну последовательность HVR, выбранную из:
(a) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A15 представляет собой KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) или KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137);
(b) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой AASNLES (SEQ ID NO: 132);
(c) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133);
(d) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134);
(e) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135); и
(f) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F10, где F1-F10 представляет собой TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136) или TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 138).
Сконструированным на основе цистеина анти-CD79b антителом может быть моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим агентом или с цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин или майтанзиноид. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, продуцированы в клетках СНО или в бактериальных клетках, а предпочтительно эти антитела ингибируют рост или пролиферацию клеток, с которыми они связываются, или индуцируют гибель этих клеток. Антитела согласно изобретению, используемые в диагностических целях, могут быть детектируемо помечены, присоединены к твердому носителю или т.п.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам получения антитела согласно изобретению. Так, например, настоящее изобретение относится к способу получения анти-CD79b антитела (которое, как определено в настоящей заявке, включает полноразмерное антитело и его фрагменты), где указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора согласно изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей антитело согласно изобретению или конъюгат ««антитело-лекарственное средство» согласно изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к промышленному изделию, содержащему контейнер, и к композиции, содержащейся в этом контейнере, где указанная композиция включает одно или несколько анти-CD79b антител согласно изобретению.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, включающий композицию, содержащую одно или несколько анти-CD79b антител согласно изобретению, и второй контейнер, содержащий буфер.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению анти-CD79b антитела согласно изобретению в целях получения лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению промышленного изделия согласно изобретению в целях получения лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению набора согласно изобретению в целях получения лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD79b, где указанный способ включает контактирование указанной клетки с антителом согласно изобретению и тем самым ингибирование роста указанной клетки. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения млекопитающего, страдающего раковой опухолью, содержащей клетки, экспрессирующие CD79b, где указанный способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела согласно изобретению и тем самым эффективное лечение указанного млекопитающего. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированного с повышенным уровнем экспрессии CD79b, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела согласно изобретению и тем самым эффективное лечение или предупреждение указанного клеточно-пролиферативного расстройства. В одном из вариантов изобретения указанным пролиферативным расстройством является рак. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста клеток, который по меньшей мере частично зависит от рост-потенцирующего действия CD79b, где указанный способ включает контактирование указанной клетки с эффективным количеством антитела согласно изобретению и тем самым ингибирование роста указанных клеток. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения опухоли у млекопитающего, рост которой, по меньшей мере частично, зависит от рост-потенцирующего действия CD79b, где указанный способ включает контактирование указанной клетки с эффективным количеством антитела согласно изобретению и тем самым эффективное лечение указанной опухоли. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей описанный здесь иммуноконъюгат и приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования пролиферации В-клеток, включающему обработку клеток иммуноконъюгатом, содержащим антитело согласно изобретению, в условиях, благоприятствующих связыванию иммуноконъюгата с CD79b.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу детектирования присутствия CD79b в образце, который, как предполагается, содержит CD79b, где указанный способ включает обработку указанного образца антителом согласно изобретению и определение уровня связывания указанного антитела с CD79b в указанном образце, где связывание указанного антитела с CD79b в указанном образце является показателем присутствия указанного белка в данном образце.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированного с увеличением числа клеток, таких как В-клетки, экспрессирующие CD79b, где указанный способ включает контактирование тестируемых клеток в биологическом образце с любыми из вышеупомянутых антител; определение уровня антитела, связанного с тестируемыми клетками в образце, посредством детектирования связывания указанного антитела с CD79b; и сравнение уровней антитела, связанного с клетками в контрольном образце, где уровень связанного антитела нормализуют по числу CD79b-экспрессирующих клеток в тестируемых и контрольных образцах, и где более высокий уровень связанного антитела в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом указывает на наличие клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированного с клетками, экспрессирующими CD79b.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу детектирования растворимого CD79b в крови или сыворотке, где указанный способ включает контактирование указанной тестируемой пробы крови или сыворотки, взятой у млекопитающего, у которого подозревается В-клеточно-пролиферативное расстройство, с анти-CD79b антителом согласно изобретению и детектирование увеличения уровня растворимого CD79b в тестируемой пробе крови по сравнению с его уровнем в контрольной пробе крови или сыворотки, взятой у здорового млекопитающего.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу связывания антитела согласно изобретению с клеткой, экспрессирующей CD79b, где указанный способ включает контактирование указанной клетки с указанным антителом согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) кДНК PRO36249, где SEQ ID NO: 1 представляет собой клон, обозначенный “DNA225786” (также называемый здесь “CD79b”). Нуклеотидная последовательность кодирует CD79b со старт- и стоп-кодонами, которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.
На фигуре 2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2), происходящая от кодирующей последовательности SEQ ID NO: 1, представленной на фигуре 1.
На фигуре 3 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 3) легкой цепи химерного мышиного анти-CD79b антитела (chMA79b) IgG1 (MA79b представляет собой мышиное моноклональное анти-CD79b антитело). Нуклеотидная последовательность кодирует легкую цепь chMA79b со старт- и стоп-кодонами, которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.
На фигуре 4 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4), не содержащая первых 18 аминокислот сигнальной последовательности и происходящая от кодирующей последовательности SEQ ID NO: 3, представленной на фигуре 3. Вариабельные области не подчеркнуты.
На фигуре 5 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 5) тяжелой цепи химерного мышиного антитела (chMA79b) IgG1 (MA79b представляет собой мышиное моноклональное анти-CD79b антитело). Нуклеотидная последовательность кодирует тяжелую цепь chMA79b со старт- и стоп-кодонами, которые выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.
На фигуре 6 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6), не содержащая первых 18 аминокислот сигнальной последовательности и последнего лизина (К) перед стоп-кодоном и происходящая от кодирующей последовательности SEQ ID NO: 5, представленной на фигуре 5. Вариабельные области не подчеркнуты.
На фигурах 7A-B показано выравнивание последовательностей вариабельных легких цепей: консенсусной последовательности человеческой легкой цепи каппа I (обозначенной “huKI”; SEQ ID NO: 9) с VL-FR1, VL-FR2, VL-FR3, VL-FR4 (SEQ ID NO: 139-142, соответственно), мышиного анти-CD79b антитела (обозначенного “MA79b”; SEQ ID NO: 10), MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b-гибрид; SEQ ID NO: 11), MA79b-связанного варианта 17 «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b.v17”; SEQ ID NO: 169), MA79b-связанного варианта 18 «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b.v18”; SEQ ID NO: 188), MA79b-связанного варианта 28 «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b.v28”; SEQ ID NO: 207) и MA79b-связанного варианта 32 «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b.v32”; SEQ ID NO: 226). Положения пронумерованы по Кабату, а гипервариабельные области (HVR) от MA79b, присоединенные к консенсусной каркасной области вариабельной области легкой цепи каппа I, указаны в рамках.
На фигурах 8A-B проиллюстрировано выравнивание последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей: консенсусной последовательности человеческой тяжелой цепи подгруппы III (обозначенной “humIII”; SEQ ID NO: 13) с VH-FR1, VH-FR2, VH-FR3 и VH-FR4 (SEQ ID NO: 143-146), мышиного анти-CD79b антитела (обозначенного “MA79b”; SEQ ID NO: 14), MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b-гибрид”; SEQ ID NO: 15) (содержащего 71A, 73T и 78A), MA79b-связанного варианта 17 «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b.v17”; SEQ ID NO: 170) (содержащего 71A, 73T и 78A), MA79b-связанного варианта 18 «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b.v18”; SEQ ID NO: 189) (содержащего 71A, 73T и 78A), MA79b-связанного варианта 28 «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b.v28”; SEQ ID NO: 208) (содержащего 71A, 73T и 78A) и MA79b-связанного варианта 32 «гуманизированного» антитела (обозначенного “huMA79b.v32”; SEQ ID NO: 227) (содержащего 71A, 73T и 78A). Положения пронумерованы по Кабату, а гипервариабельные области (HVR) от MA79b, присоединенные к консенсусной каркасной области вариабельной области тяжелой цепи подгруппы III, указаны в рамках.
На фигуре 9 представлены различные последовательности HVR выбранных вариантов MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (SEQ ID NOs: 17-21), где каждый вариант имеет одну аминокислотную замену в одной HVR MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (HVR-L1 (SEQ ID NO: 131); HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133)). Последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, находящиеся за пределами указанной одной аминокислотной замены, идентичны huMA79b-гибриду и на фигуре не показаны. Каких-либо изменений в HVR-H1 (SEQ ID NO: 134), HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) или HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) MA79b-связанного «гуманизированного» антитела не наблюдалось.
На фигуре 10 представлены различные последовательности HVR выбранных вариантов MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (SEQ ID NO: 22-106), включая huMA79b L2-2 (также обозначенное здесь “L2”) и huMA79b H3-10 (также обозначенное здесь “H3”), где каждый вариант имеет множество аминокислотных замен в одной области HVR MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (HVR-L2 (SEQ ID NO: 132); HVR-L3 (SEQ ID NO: 133); HVR-H1 (SEQ ID NO: 134); часть HVR-H3 (SEQ ID NO: 136) показана на фигуре 10 как SEQ ID NO: 107). Последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, находящиеся за пределами указанных аминокислотных замен, идентичны последовательности huMA79b-гибрида и на фигуре не показаны. Каких-либо изменений в HVR-L1 (SEQ ID NO: 131) или HVR-H2 (SEQ ID NO: 135) MA79b-связанного «гуманизированного» антитела не наблюдалось.
ecd
ecd
На фигуре 11 проиллюстрирован Biacore-анализ выбранных анти-CD79b антител, включая мышиное анти-CD79b антитело (обозначенное “MA79b”), MA79b-связанное «гуманизированное» антитело (обозначенное «huMA79b-гибрид») и варианты MA79b-связанного «гуманизированного» антитела, включая huMA79b L2-2 (52R, 53K, 55G, 56R; SEQ ID NO: 22), huMA79b H3-10 (98I, 99R, 100L; SEQ ID NO: 94), huMA79b H1-6 (28P, 30T, 31R, 35N; SEQ ID NO: 57) и huMA79b L2/H3 (мутации L2-2 и H3-10, описанные ниже) против указанных антигенов, включая внеклеточный домен человеческого CD79b (huCD79b), внеклеточный домен человеческого CD79b, присоединенный к Fc (huCD79b-Fc) и пептид из 16 аминокислот, содержащий эпитоп для MA79b и chMA79b (SEQ ID NO: 16).
ecd
variant
chimera
variant
chimera
На фигуре 12 проиллюстрирован Biacore-анализ выбранных анти-CD79b антител, включая MA79b-связанное «гуманизированное» антитело (обозначенное “huMA79b-гибрид”) и варианты MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (обозначенные как 1-34 в первом столбце или как «вся каркасная область» в первом столбце) против внеклеточного домена человеческого CD79b (антигена huCD79b). Варианты MA79b-связанного «гуманизированного» антитела включают варианты «всех каркасных областей», в которых присутствуют потенциально важные мышиные каркасные остатки, и варианты (обозначенные 1-34) с комбинациями мутаций в каркасной области в присутствии или в отсутствие мутаций HVR вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. Вариант 17 MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (обозначенный здесь “huMA79b.v17”) указан в первом столбце как 17, вариант 18 MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (обозначенный здесь “huMA79b.v18”) указан в первом столбце как 18, вариант 28 MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (обозначенный здесь “huMA79b.v28”) указан в первом столбце как 28, а вариант 32 MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (обозначенный здесь “huMA79b.v32”) указан в первом столбце как 32. Укладка, характерная для двухвалентного связывания, представлена как Kd конкретного варианта MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (обозначенная “Kd”)/Kd химерного антитела MA79b (chMA79b) (обозначенного “Kd”); величины под столбцом, озаглавленном «укладка, характерная для двухвалентного связывания», представляют Kd/Kd. Недетектируемое связывание обозначено на фигуре как “NDB”.
На фигурах 13A-B (консенсусные каркасные вариабельные области тяжелой цепи (VH)) и на фигуре 14 (консенсусные каркасные вариабельные области легкой цепи (VL)) указаны репрезентативные консенсусные каркасные акцепторные последовательности человеческого антитела, используемые для осуществления настоящего изобретения, вместе с последовательностями-идентификаторами, такими как: (фигуры 13A-B) консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы I без CDR по Кабату (SEQ ID NO: 108), консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы I без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 109-111), консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы II без CDR по Кабату (SEQ ID NO: 112), консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы II без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 113-115), консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы III без CDR по Кабату (SEQ ID NO: 116), консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы III без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 117-119), акцепторная каркасная область человеческой VH без CDR по Кабату (SEQ ID NO: 120), акцепторная каркасная область человеческой VH без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 121-122), акцепторная каркасная область человеческой VH2 без CDR по Кабату (SEQ ID NO: 123) и акцепторная каркасная область человеческой VH2 без удлиненных гипервариабельных областей (SEQ ID NO: 124-26) и (фигура 14) консенсусная каркасная область человеческой VL каппа подгруппы I (SEQ ID NO: 127), консенсусная каркасная область человеческой VL каппа подгруппы II (SEQ ID NO: 128), консенсусная человеческая каркасная область каппа подгруппы III (SEQ ID NO: 129) и консенсусная человеческая каркасная область каппа подгруппы IV (SEQ ID NO: 130).
На фигурах 15A (легкая цепь) и 15B (тяжелая цепь) представлены аминокислотные последовательности антитела согласно изобретению (huMA79b.v17). На фигуре 15A (легкая цепь) и 15B (тяжелая цепь) показаны аминокислотные последовательности каркасной области (FR), гипервариабельной области (HVR), первого константного домена (CL или CH1) и Fc-области (Fc) одного из вариантов антитела согласно изобретению (huMA79b.v17) (SEQ ID NO: 152-159 (фигура 15A) и SEQ ID NOs: 160-168 (фигура 15B)). Также представлены полноразмерные аминокислотные последовательности (вариабельные и константные области) легкой и тяжелой цепей huMA79b.v17 (SEQ ID NO: 303 (фигура 15A) и 304 (фигура 15B), соответственно, с подчеркнутыми константными доменами. Представлены аминокислотные последовательности вариабельных доменов (SEQ ID NO: 169 (фигура 15A для легкой цепи) и SEQ ID NO: 170 (фигура 15B для тяжелой цепи)).
На фигурах 16A (легкая цепь) и 16B (тяжелая цепь) представлены аминокислотные последовательности антитела согласно изобретению (huMA79b.v18). На фигуре 16A (легкая цепь) и 16B (тяжелая цепь) показаны аминокислотные последовательности каркасной области (FR), гипервариабельной области (HVR), первого константного домена (CL или CH1) и Fc-области (Fc) одного из вариантов антитела согласно изобретению (huMA79b.v18) (SEQ ID NO: 171-178 (фигура 16A) и SEQ ID NO: 179-187 (фигура 16B)). Также представлены полноразмерные аминокислотные последовательности (вариабельные и константные области) легкой и тяжелой цепей huMA79b.v18 (SEQ ID NO: 305 (фигура 16A) и 306 (фигура 16B), соответственно, с подчеркнутыми константными доменами. Представлены аминокислотные последовательности вариабельных доменов (SEQ ID NO: 188 (фигура 16A для легкой цепи) и SEQ ID NO: 189 (фигура 16B для тяжелой цепи)).
На фигурах 17A (легкая цепь) и 17B (тяжелая цепь) представлены аминокислотные последовательности антитела согласно изобретению (huMA79b.v28). На фигурах 17A (легкая цепь) и 17B (тяжелая цепь) показаны аминокислотные последовательности каркасной области (FR), гипервариабельной области (HVR), первого константного домена (CL или CH1) и Fc-области (Fc) одного из вариантов антитела согласно изобретению (huMA79b.v28) (SEQ ID NO: 190-197 (фигура 17A) и SEQ ID NO: 198-206 (фигура 17B)). Также представлены полноразмерные аминокислотные последовательности (вариабельные и константные области) легкой и тяжелой цепей huMA79b.v28 (SEQ ID NO: 307 (фигура 17A) и 308 (фигура 17B), соответственно, с подчеркнутыми константными доменами. Представлены аминокислотные последовательности вариабельных доменов (SEQ ID NO: 207 (фигуры 7A-В для легкой цепи) и SEQ ID NO: 208 (фигуры 8А-B для тяжелой цепи)).
На фигурах 18A (легкая цепь) и 18B (тяжелая цепь) представлены аминокислотные последовательности антитела согласно изобретению (huMA79b.v32). На фигурах 18A (легкая цепь) и 18B (тяжелая цепь) показаны аминокислотные последовательности каркасной области (FR), гипервариабельной области (HVR), первого константного домена (CL или CH1) и Fc-области (Fc) одного из вариантов антитела согласно изобретению (huMA79b.v32) (SEQ ID NO: 209-216 (фигура 18A) и SEQ ID NO: 217-225 (фигура 18В)). Также представлены полноразмерные аминокислотные последовательности (вариабельные и константные области) легкой и тяжелой цепей huMA79b.v32 (SEQ ID NO: 309 (фигура 18A) и 310 (фигура 18B), соответственно, с подчеркнутыми константными доменами. Представлены аминокислотные последовательности вариабельных доменов (SEQ ID NO: 226 (фигура 18А для легкой цепи) и SEQ ID NO: 227 (фигура 18B для тяжелой цепи)).
На фигуре 19 проиллюстрировано выравнивание аминокислотных последовательностей CD79b человека (SEQ ID NO: 2), собакоподобных обезьян (cyno) (SEQ ID NO: 7) и мышей (SEQ ID NO: 8). Аминокислотные последовательности CD79b человека и собакоподобных обезьян идентичны на 85%. Также показаны сигнальная последовательность, тестируемый пептид (эпитоп из 11 аминокислот для MA79b, chMA79b и антитела против CD79b собакоподобных обезьян, описанные в примере 1; ARSEDRYRNPK (SEQ ID NO: 12)), трансмембранный (TM) домен и домен мотива активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). Область, показанная в рамке, представляет собой область CD79b, которая отсутствует в сплайсированном варианте CD79b (как описано в примере 1).
На фигуре 20 представлен график ингибирования роста опухоли in vivo в BJAB-люциферазной модели ксенотрансплантата, где из указанного графика видно, что введение анти-CD79b антител ((a) chMA79b-SMCC-DM1, загрузка лекарственного средства составляет приблизительно 2,9 (таблица 9), и (b) huMA79b L2/H3-SMCC-DM1, загрузка лекарственного средства составляет приблизительно 2,4 (таблица 9)) мышам SCID, имеющим человеческую В-клеточную опухоль, приводит к значительному ингибированию роста опухоли. Контроль включает Herceptin (трастузумаб)-SMCC-DM1 (анти-HER2-SMCC-DM1).
На фигуре 21A представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата Granta-519 (человеческой лимфомы клеток коры головного мозга), где из указанного графика видно, что введение анти-CD79b антител ((a) chMA79b-SMCC-DM1, загрузка лекарственного средства составляет приблизительно 3,6 (таблица 10), (b) huMA79b.v17-SMCC-DM1, загрузка лекарственного средства составляет приблизительно 3,4 (таблица 10), (c) huMA79b.v28-SMCC-DM1, загрузка лекарственного средства составляет приблизительно 3,3 или 3,4 (таблица 10), (d) huMA79b.v18-SMCC-DM1, загрузка лекарственного средства составляет приблизительно 3,4 (таблица 10), и (e) huMA79b.v32-SMCC-DM1, загрузка лекарственного средства составляет приблизительно 2,9 (таблица 10)) мышам SCID, имеющим человеческую В-клеточную опухоль, приводит к значительному ингибированию роста опухоли. Контроль включает Herceptin (трастузумаб)-SMCC-DM1 (анти-HER2-SMCC-DM1). На фигуре 21В представлен график изменения процента по массе у исследуемых мышей с ксенотрансплантатом Granta-519 (фигура 21A и таблица 10), указывающий на отсутствие каких-либо значимых изменений массы в течение первых 7 дней проведения исследований. «hu» означает гуманизированное антитело, а “ch” означает химерное антитело.
На фигуре 22 представлены конъюгаты «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство» (ADC), где молекула лекарственного средства присоединена к сконструированной цистеиновой группе: в легкой цепи (LC-ADC); тяжелой цепи (HC-ADC) и в Fc-области (Fc-ADC).
На фигуре 23 проиллюстрированы стадии: (i) восстановления аддуктов цистеиновых дисульфидов и межцепьевых и внутрицепьевых дисульфидов в анти-CD79b антителе, сконструированном на основе цистеина (ThioMab), восстановителем TCEP (гидрохлоридом трис-(2-карбоксиэтил)фосфина); (ii) частичного окисления, то есть повторного окисления с образованием межцепьевых и внутрицепьевых дисульфидов под действием dhAA (дегидроаскорбиновой кислоты); и (iii) конъюгирования повторно окисленного антитела с промежуточным соединением «лекарственное средство-линкер» с образованием конъюгата «цистеиновое анти-CD79b антитело-лекарственное средство» (ADC).
На фигуре 24 показаны (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 229) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 228) гуманизированного анти-CD79b антитела, сконструированного на основе цистеина (тио-huMA79b.v17-HC-A118C), где аланин, присутствующий в положении 118 в соответствии с Европейской системой нумерации (положение аланина 118 в соответствии с последовательной системой нумерации; положение по Кабату - 114), в тяжелой цепи был заменен на цистеин. Молекула лекарственного средства может быть присоединена к введенной цистеиновой группе в тяжелой цепи. На каждой фигуре модифицированная аминокислота показана жирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Константные области подчеркнуты одной чертой. Вариабельные области не подчеркнуты. Fc-область показана курсивом. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 25 показаны (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 231) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 230) гуманизированного анти-CD79b антитела, сконструированного на основе цистеина (тио-huMA79b.v18-HC-A118C), где аланин, присутствующий в положении 118 в соответствии с Европейской системой нумерации (положение аланина 118 в соответствии с последовательной системой нумерации; положение по Кабату - 114) в тяжелой цепи был заменен на цистеин. Молекула лекарственного средства может быть присоединена к введенной цистеиновой группе в тяжелой цепи. На каждой фигуре модифицированная аминокислота показана жирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Константные области подчеркнуты одной чертой. Вариабельные области не подчеркнуты. Fc-область показана курсивом. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 26 показаны (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 233) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 232) гуманизированного анти-CD79b антитела, сконструированного на основе цистеина (тио-huMA79b.v28-HC-A118C), где аланин, присутствующий в положении 118 в соответствии с Европейской системой нумерации (положение аланина 118 в соответствии с последовательной системой нумерации; положение по Кабату - 114) в тяжелой цепи был заменен на цистеин. Молекула лекарственного средства может быть присоединена к введенной цистеиновой группе в тяжелой цепи. На каждой фигуре модифицированная аминокислота показана жирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Константные области подчеркнуты одной чертой. Вариабельные области не подчеркнуты. Fc-область показана курсивом. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 27 показаны (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 235) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 234) анти-CD79b антитела, сконструированного на основе цистеина (тио-huMA79b-LC-V205C), где валин в положении 205 по Кабату (положение валина 209 в соответствии с последовательной системой нумерации) легкой цепи был заменен на цистеин. Молекула лекарственного средства может быть присоединена к введенной цистеиновой группе в легкой цепи. На каждой фигуре модифицированная аминокислота показана жирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Константные области подчеркнуты одной чертой. Вариабельные области не подчеркнуты. Fc-область показана курсивом. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело.
На фигуре 28 показаны (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 237) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 236) анти-CD79b антитела, сконструированного на основе цистеина (тио-huMA79b-HC-A118C), где аланин, присутствующий в положении 118 в соответствии с Европейской системой нумерации (положение аланина 118 в соответствии с последовательной системой нумерации; положение по Кабату - 114) в тяжелой цепи был заменен на цистеин. Молекула лекарственного средства может быть присоединена к введенной цистеиновой группе в тяжелой цепи. На каждой фигуре модифицированная аминокислота показана жирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Константные области подчеркнуты одной чертой. Вариабельные области не подчеркнуты. Fc-область показана курсивом. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело.
На фигурах 29A-B представлены FACS-графики, указывающие на то, что связывание конъюгатов «анти-CD79b антитело тиоMAb-лекарственное средство» (TDC) согласно изобретению с CD79b, экспрессируемым на поверхности клеток BJAB, содержащих люциферазу, аналогично связыванию конъюгированных (A) вариантов LC(V205C) тио-MAb и (B) вариантов HC(A118C) тио-MAb антитела chMA79b с MMAF. Детектирование проводили с помощью масс-спектрометрии (МС) с использованием ФЭ-конъюгированного антитела против человеческого IgG. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело.
На фигурах 30A-D представлены FACS-графики, указывающие на то, что связывание конъюгатов «анти-CD79b антитело тиоMAb-лекарственное средство» (TDC) согласно изобретению с CD79b, экспрессируемым на поверхности клеток BJAB, содержащих люциферазу, аналогично связыванию (A) «оголенных» (неконъюгированных) вариантов HC (А118С) тио-MAb huMA79b.v18 и конъюгированных вариантов HC (A118C) тио-MAb антитела huMA79b.v18 с различными указанными конъюгатами лекарственных средств ((В) MMAF, (C) MMAE и (D) DM1)). Детектирование проводили с помощью масс-спектрометрии (МС) с использованием ФЭ-конъюгированного антитела против человеческого IgG. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигурах 31A-D представлены FACS-графики, указывающие на то, что связывание конъюгатов «анти-CD79b антитело тиоMAb-лекарственное средство» (TDC) согласно изобретению с CD79b, экспрессируемым на поверхности клеток BJAB, содержащих люциферазу, аналогично связыванию (A) «оголенных» (неконъюгированных) вариантов HC (А118С) тио-MAb huMA79b.v28 и конъюгированных вариантов HC (A118C) тио-MAb антитела huMA79b.v28 с различными указанными конъюгатами лекарственных средств ((В) MMAE, (C) DM1 и (D) MMAF)). Детектирование проводили с помощью масс-спектрометрии (МС) с использованием ФЭ-конъюгированного антитела против человеческого IgG. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигурах 32A-D представлены FACS-графики, указывающие на то, что связывание конъюгатов «антитело против CD79b собакоподобных обезьян тио-MAb-лекарственное средство» (TDC) согласно изобретению с CD79b, экспрессируемым на поверхности BJAB-клеток, экспрессирующих CD79b собакоподобных обезьян, аналогично связыванию (A) «оголенных» (неконъюгированных) вариантов HLC(А118с) тио-Mab против CD79b собакоподобных обезьян (ch10D10) и конъюгированных вариантов HC (A118C) тио-MAb против CD79b собакоподобных обезьян (ch10D10) с различными указанными конъюгатами лекарственных средств ((В) MMAE, (C) DM1 и (D) MMAF)). Детектирование проводили с помощью масс-спектрометрии (МС) с использованием ФЭ-конъюгированного антитела против человеческого IgG. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело.
На фигуре 33A представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у моделей ксенотрансплантата Granta-519 (человеческой лимфомы клеток коры головного мозга), на котором видно, что введение анти-CD79b TDC, которые отличаются в положениях введенного цистеина (LC (V205C) или HC (A118C)) и/или различными дозами лекарственного средства, мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводит к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,9 (таблица 11) или тио-chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,8 (таблица 11), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали hu-anti-HER2-MC-MMAF и тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF и chMA79b-MC-MMAF. На фигуре 33B представлен график изменения процента по массе у исследуемых мышей с ксенотрансплантатом Granta-519 (фигура 33A и таблица 11), указывающий на отсутствие каких-либо значимых изменений массы в течение первых 14 дней проведения исследований. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 34A представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата клеток BJAB, содержащих люциферазу (лимфомы Беркитта), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «линкер-лекарственное средство» (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 или MC-MMAF), мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,87 (таблица 12), тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 12), или тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,95 (таблица 12), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), контрольное антитело huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)) и контрольное анти-CD22 антитело (тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). На фигуре 34B представлен график изменения процента по массе у исследуемых мышей с ксенотрансплантатом BJAB-люциферазы (фигура 34А и таблица 12), указывающий на отсутствие каких-либо значимых изменений массы в течение первых 7 дней проведения исследований. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 35A представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата WSU-DLCL2 (диффузной крупноклеточной лимфомы), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «линкер-лекарственное средство» (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 или MC-MMAF), мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,87 (таблица 13), тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 13), или тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,95 (таблица 13), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), контрольное антитело huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)) и контрольное анти-CD22 антитело (тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). На фигуре 35B представлен график изменения процента по массе у исследуемых мышей с ксенотрансплантатом WSU-DLCL2 (фигура 35А и таблица 13), указывающий на отсутствие каких-либо значимых изменений массы в течение первых 7 дней проведения исследований. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 36 представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата DOHH2 (фолликулярной лимфомы), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «линкер-лекарственное средство» (BMPEO-DM1, MC-MMAF или MCvcPAB-MMAE)), мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-BMPEO-DM1 с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 14), тио-huMA79b.v28-MC-MMAF с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,95 (таблица 14), или тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE) с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,87 (таблица 14), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), контрольное антитело huMA79b.v28 (huMA79b.v28-SMCC-DM1 и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)) и контрольное анти-CD22 антитело (тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 37 представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата клеток BJAB, содержащих люциферазу, (лимфомы Беркитта), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «линкер-лекарственное средство» (MCvcPAB-MMAE, BMPEO-DM1 или MC-MMAF), и/или в различных дозах мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 15), тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,9 (таблица 15), или тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,9 (таблица 15), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали носитель (только буфер), контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), контрольное антитело huMA79b.v28 (тио-huMA79b.v28-HC(A118C)) и контрольное анти-CD22 антитело (тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF). «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 38A представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата Granta-519 (человеческой лимфомы клеток коры головного мозга), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «линкер-лекарственное средство» (BMPEO-DM1 или MC-MMAF), и/или в различных дозах мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 16) или тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,95 (таблица 16), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). На фигуре 38B представлен график изменения процента по массе у исследуемых мышей с ксенотрансплантатом Granta-519 (фигура 38А и таблица 16), указывающий на отсутствие каких-либо значимых изменений массы в течение первых 14 дней проведения исследований. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 39 представлен график ингибирование роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата WSU-DLCL2 (диффузной крупноклеточной лимфомы), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «линкер-лекарственное средство» (BMPEO-DM1, MC-MMAF или MCvcPAB-MMAE), и/или в различных дозах мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 17), тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,9 (таблица 17) или тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,9 (таблица 17), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали носитель (только буфер) и контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 40 представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата Granta-519 (человеческой лимфомы клеток коры головного мозга), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «линкер-лекарственное средство» (BMPEO-DM1 или MCvcPAB-MMAE), и/или в различных дозах мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 18) или тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,87 (таблица 18), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE). «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 41 представлен график, построенный по результатам анализа на пролиферацию опухолевых клеток in vitro (A) BJAB, (B) Granta-519 или (C) WSU-DLCL2, обработанных различными концентрациями 0,001-10000 нг TDC на мл, включая: (1) контрольное антитело тио-hu-anti-gD-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой 2,0 MMAE/Ab, (2) контрольное антитело тио-hu-anti-gD-HC(A118C)-MC-MMAF, c загрузкой 2,1 MMAF/Ab, (3) контрольное антитело тио-hu-anti-gD-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой 2,1 DM1/Ab, (4) тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF, с загрузкой 1,91 MMAF/Ab, (5) тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой 1,8 DM1/Ab, и (6) тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой 2,0 MMAE/Ab. “Тио” означает сконструированное на основе цистеина антитело, а “hu” означает гуманизированное антитело. “gD” означает гликопротеин D.
На фигуре 42 представлена нуклеотидная последовательность кДНК (SEQ ID NO: 238) PRO283627, где SEQ ID NO: 235 представляет собой клон, обозначенный “DNA548455” (также называемый здесь “cyno CD79b”). Нуклеотидная последовательность кодирует CD79b собакоподобных обезьян со старт- и стоп-кодонами, которые указаны жирным шрифтом и подчеркнуты.
На фигуре 43 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 239), происходящая от кодирующей последовательности SEQ ID NO: 235, представленной на фигуре 42.
На фигуре 44 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 240) легкой цепи антитела против CD79b собакоподобных обезьян (ch10D10). Нуклеотидная последовательность кодирует легкую цепь антитела против CD79b собакоподобных обезьян (ch10D10) со старт- и стоп-кодонами, которые указаны жирным шрифтом и подчеркнуты.
На фигуре 45 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 241), не содержащая первых 18 аминокислот сигнальной последовательности и происходящая от кодирующей последовательности SEQ ID NO: 240, представленной на фигуре 44. Вариабельные области (SEQ ID NO: 302) не подчеркнуты.
На фигуре 46 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 242) тяжелой цепи антитела против CD79b собакоподобных обезьян (ch10D10). Нуклеотидная последовательность кодирует тяжелую цепь антитела против CD79b собакоподобных обезьян (ch10D10) со старт- и стоп-кодонами, которые указаны жирным шрифтом и подчеркнуты.
На фигуре 47 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 243), не содержащая первых 18 аминокислот сигнальной последовательности и последнего лизина (К) перед стоп-кодоном и происходящая от кодирующей последовательности SEQ ID NO: 242, представленной на фигуре 46. Вариабельные области (SEQ ID NO: 301) не подчеркнуты.
На фигуре 48 показаны (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 245) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 244) антитела против CD79b собакоподобных обезьян, сконструированного на основе цистеина (тио-anti-cynoCD79b-HC-A118C), где аланин, присутствующий в положении 118 в соответствии с Европейской системой нумерации (положение аланина 118 в соответствии с последовательной системой нумерации; положение по Кабату - 114), в тяжелой цепи был заменен на цистеин. Аминокислота D в положении 6 в соответствии с Европейской системой нумерации (на фигуре заштрихована) в тяжелой цепи может альтернативно представлять собой Е. Молекула лекарственного средства может быть присоединена к введенной цистеиновой группе в тяжелой цепи. На каждой фигуре модифицированная аминокислота показана жирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Константные области подчеркнуты одной чертой. Вариабельные области не подчеркнуты. Fc-область показана курсивом. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело.
На фигуре 49 показаны (A) последовательность легкой цепи (SEQ ID NO: 300) и (B) последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO: 299) антитела против CD79b собакоподобных обезьян, сконструированного на основе цистеина (тио-anti-cynoCD79b-LC-V205C), где валин в положении 205 по Кабату (положение валина 209 в соответствии с последовательной системой нумерации) в легкой цепи был заменен на цистеин. Аминокислота D в положении 6 в соответствии с Европейской системой нумерации (на фигуре заштрихована) в тяжелой цепи может альтернативно представлять собой Е. Молекула лекарственного средства может быть присоединена к введенной цистеиновой группе тяжелой цепи. На каждой фигуре модифицированная аминокислота показана жирным шрифтом с двойным подчеркиванием. Константные области подчеркнуты одной чертой. Вариабельные области не подчеркнуты. Fc-область показана курсивом. «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело.
На фигуре 50 представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата BJAB-cynoCD79b (клетки BJAB, экспрессирующие cynoCD79b) (лимфомы Беркитта), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «линкер-лекарственное средство» (BMPEO-DM1, MC-MMAF или MCvcPAB-MMAE), мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 19), тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,9 (таблица 19), или тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,9 (таблица 19), тио-anti-cyno-CD79b (ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,8 (таблица 19), тио-anti-cyno-CD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,9 (таблица 19), или тио-anti-cyno-CD79b (ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,86 (таблица 19), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
На фигуре 51 представлен график ингибирования роста опухоли in vivo у модели ксенотрансплантата BJAB-cynoCD79b (клетки BJAB, экспрессирующие cynoCD79b) (лимфомы Беркитта), где показано, что введение анти-CD79b TDC, конъюгированных с различными молекулами «ВМРЕО-DM1-линкер-лекарственное средство», в различных дозах мышам SCID, имеющим человеческие В-клеточные опухоли, приводило к значительному ингибированию роста опухоли. Модели ксенотрансплантата, обработанные тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,85 (таблица 20), или тио-anti-cyno (ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1, с загрузкой лекарственного средства приблизительно 1,8 (таблица 20), обнаруживали значительное ингибирование роста опухоли во время исследования. В качестве контроля использовали контрольное анти-HER2 антитело (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1), контрольное антитело huMA79b.v28 (тио-huMA79b.v28-HC(A118C) и контрольное антитело anti-cynoCD79b(ch10D10) (тио-anti-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)). «Тио» означает сконструированное на основе цистеина антитело, а «hu» означает гуманизированное антитело.
Подробное описание предпочтительных вариантов изобретения
Настоящее изобретение относится к способам, композициям, наборам и промышленным изделиям, применяемым для идентификации композиций, используемых для лечения гемопоэтической опухоли у млекопитающих, и к способам применения таких композиций согласно изобретению в указанных целях.
Подробное описание указанных способов, композиций, наборов и промышленных изделий приводится ниже.
I. Общие методы
Настоящее изобретение может быть осуществлено, если это не оговорено особо, стандартными методами, применяемыми в молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), в микробиологии, биологии клетки, биохимии и иммунологии, и известными специалистам. Такие методы подробно описаны в литературе, например, в руководствах «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», second edition (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, и в современных периодических изданиях); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001).
II. Определения
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся определения терминов, употребляемых в настоящем описании, при этом, если это не оговорено особо, подразумевается, что термины, употребляемые в единственном числе, могут означать и существительные во множественном числе, и наоборот. Если при определении любого термина в данном описании возникают противоречия с определением, приводимым в любом документе, вводимом в настоящее описание посредством ссылки, то они могут быть урегулированы в соответствии с описанием, представленным ниже.
Используемый здесь термин “маркер В-клеточной поверхности” или “антиген В-клеточной поверхности” означает антиген, экспрессируемый на поверхности В-клетки, на которую может быть направлен антагонист, связывающийся с этой клеткой, включая, но не ограничиваясь ими, антитела против антигена В-клеточной поверхности или растворимой формы антигена В-клеточной поверхности, обладающие способностью ингибировать связывание лиганда с природным В-клеточным антигеном. Примерами маркеров В-клеточной поверхности являются маркеры поверхности лейкоцитов, такие как CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 (описание см. в публикации “The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition, 1997, ed. Barclay et al., Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York). Другими маркерами В-клеточной поверхности являются RP105, FcRH2, B-клеточный CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, BAFF, BLyS, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA и 239287. Маркер В-клеточной поверхности, представляющий особый интерес, экспрессируется преимущественно на В-клетках, в отличие от других не-В-клеточных тканях млекопитающего, и может экспрессироваться как на В-клетках-предшественниках, так и на зрелых В-клетках.
Используемый здесь термин «CD79b» означает любой природный CD79b, происходящий от любых позвоночных, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек, собакоподобные обезьяны (cyno) и грызуны (например, мыши и крысы), если это не оговорено особо. Человеческий CD79b также обозначается здесь «PRO36249» (SEQ ID NO: 2) и кодируется нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 1), также обозначаемой здесь «DNA225786». CD79b собакоподобных обезьян также обозначается здесь «cyno-CD79b» или «PRO283627» (SEQ ID NO: 239) и кодируется нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 238), также обозначаемой здесь «DNA548455». Термин «CD79b» охватывает «полноразмерный» непроцессированный CD79b, а также любую форму CD79b, которая образуется в результате процессинга в клетке. Этот термин также охватывает природные варианты CD79b, например сплайсированные варианты, аллельные варианты, и изоформы. Описанные здесь полипептиды CD79b могут быть выделены из различных источников, например из человеческих тканей или из других источников, либо они могут быть получены рекомбинантными методами или методами синтеза. «Нативная последовательность полипептида CD79b» включает полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как и соответствующий природный полипептид CD79b. Такие полипептиды CD79b с нативной последовательностью могут быть выделены из природного источника, либо они могут быть получены рекомбинантными методами или методами синтеза. Термин «полипептид CD79b с нативной последовательностью», в частности, охватывает природные усеченные или секретируемые формы специфического полипептида CD79b (например, последовательность внеклеточного домена), природные варианты (например, альтернативно сплайсированные формы) и природные аллельные варианты полипептида. В некоторых вариантах изобретения описанные здесь полипептиды CD79b с нативной последовательностью представляют собой зрелые полипептиды или полноразмерные полипептиды с нативной последовательностью, содержащие полноразмерные аминокислотные последовательности, представленные в описании графического материала. В описании графического материала, старт- и стоп-кодоны (если они указаны) показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Остатки нуклеиновой кислоты, обозначенные “N” в описании графического материала, представляют собой любые остатки нуклеиновой кислоты. Хотя полипептиды CD79b, указанные в описании графического материала, начинаются с метиониновых остатков, обозначенных в данном описании как положение аминокислоты 1, однако возможно, что в качестве начального аминокислотного остатка для полипептидов CD79b могут быть использованы и другие метиониновые остатки, расположенные выше или ниже от положения аминокислоты 1, как показано в описании графического материала.
Используемые здесь термины «MA79b» или «мышиное анти-CD79b антитело» или «мышиное антитело против CD79b», в частности, означают мышиное моноклональное анти-CD79b антитело, которое содержит вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B). Мышиное моноклональное анти-CD79b антитело может быть закуплено у коммерческих фирм, таких как Biomeda (антитело против человеческого CD79b; Foster City, CA), BDbioscience (антитело против человеческого CD79b; San Diego, CA) или Ancell (антитело против человеческого CD79b; Bayport, MN), либо оно может быть выделено из гибридомного клона 3A2-2E7, депонированного в Американской коллекции типовых культур (ATCC) под депозитарным номером HB11413, присвоенным ATCC 20 июля 1993 г.
Используемый здесь термин «chMA79b» или «химерное антитело MA79b», в частности, означает химерное антитело против человеческого CD79b (описанное ранее в заявке на патент США № 11/462336, поданной 3 августа 2006 г.), где указанное химерное анти-CD79b антитело содержит легкую цепь SEQ ID NO: 4 (фигура 4). Легкая цепь SEQ ID NO: 4 также содержит вариабельный домен SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и константный домен легкой цепи человеческого IgG1. Химерное анти-CD79b антитело также содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 6 (фигура 6). Тяжелая цепь SEQ ID NO: 6 также содержит вариабельный домен SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B) и константный домен тяжелой цепи человеческого IgG1.
Используемый здесь термин «анти-cynoCD79b» или «антитело против CD79b собакоподобных обезьян» означает антитела, которые связываются с CD79b собакоподобных обезьян (SEQ ID NO: 239 фигуры 43) (как было описано ранее в заявке на патент США № 11/462336, поданной 3 августа 2006 г.). Используемый здесь термин “анти-cynoCD79b (ch10D10)» или «ch10D10» означает химерное антитело против CD79b собакоподобных обезьян (описанное ранее в заявке на патент США № 11/462336, поданной 3 августа 2006 г.), которое связывается с CD79b собакоподобных обезьян (SEQ ID NO: 239 фигуры 43). Анти-cynoCD79b(ch10D10) или ch10D10 представляет собой химерное антитело против CD79b собакоподобных обезьян, которое содержит легкую цепь SEQ ID NO: 241 (фигура 45). Анти-cynoCD79b(ch10D10) или ch10D10 также содержит тяжелую цепь SEQ ID NO: 243 (фигура 47).
Используемый здесь термин «MA79b-гибрид» или «MA79b-связанное гуманизированное антитело» или «huMA79b-гибрид», в частности, означает гибрид, полученный путем присоединения гипервариабельных областей, происходящих от мышиного анти-CD79b антитела (MA79b), к акцепторной последовательности человеческой консенсусной VL каппа I (huKI) и человеческой консенсусной VH подгруппы III (huIII) с заменами R71A, N73T и L78A (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)) (см. пример 1A и фигуры 7 (SEQ ID NO: 11) и 8 (SEQ ID NO: 15)).
Используемый здесь термин «модификация» аминокислотного остатка/положения означает замену в первичной аминокислотной последовательности по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, где указанная замена происходит в результате модификации последовательности, включающей указанные аминокислотные остатки/положения. Так, например, типичными модификациями являются замена остатка (или остатка в указанном положении) другим аминокислотным остатком (например, консервативная или неконсервативная замена), инсерция одной или нескольких (обычно менее чем 5 или 3) аминокислот, смежных с указанным остатком/положением, и делеция указанного остатка/положения. Термин «аминокислотная замена» или ее вариант означает замену имеющегося аминокислотного остатка в предварительно определенной (исходной) аминокислотной последовательности другим аминокислотным остатком. Вообще говоря и предпочтительно, модификация приводит к изменению по меньшей мере одной физико-биохимической активности полипептидного варианта по сравнению с активностью полипептида, содержащего исходную аминокислотную последовательность (или «последовательность дикого типа»). Так, например, в случае антител, измененной физико-биохимической активностью может быть аффинность связывания с молекулой-мишенью, способность связываться с молекулой-мишенью и/или влияние на связывание с молекулой-мишенью.
2
Используемый здесь термин “антитело” применяется в самом широком смысле, а в частности охватывает отдельные моноклональные анти-CD79b антитела (включая агонисты, антагонисты, нейтрализующие антитела, полноразмерные моноклональные антитела или интактные моноклональные антитела), композиции анти-CD79b антител, обладающие полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, поливалентные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, при условии, что они обладают нужной биологической активностью), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, одноцепочечные анти-CD79b антитела и фрагменты анти-CD79b антител (см. ниже), включая Fab-, Fab'-, F(ab')- и Fv- фрагменты, диантитела, однодоменные антитела (sdAbs), при условии, что они обладают нужной биологической или иммунологической активностью. Используемые здесь термины «иммуноглобулин (Ig)» и «антитело» являются синонимами. Антитело может быть человеческим, гуманизированным и/или аффинно зрелым.
Термин «анти-CD79b антитело» или «антитело, которое связывается с CD79b» означает антитело, которое способно связываться с CD79b с аффинностью, достаточной для использования данного антитела в качестве диагностического и/или терапевтического средства, нацеленного на CD79b. Предпочтительно уровень связывания анти-CD79b антитела с неродственным белком, то есть белком, не являющимся CD79b, составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с CD79b, как было определено с помощью, например, радиоиммуноанализа (РИА). В некоторых вариантах изобретения антитело, связывающееся с CD79b, имеет константу диссоциации (Kd), составляющую ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ или ≤0,1 нМ. В некоторых вариантах изобретения анти-CD79b антитело связывается с эпитопом CD79b, который является консервативным у CD79b различных видов.
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и выделено и/или очищено от компонентов его природного окружения. Контаминирующими компонентами его природного окружения являются материалы, негативно влияющие на терапевтическую эффективность антитела, и такими компонентами могут быть ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения указанное антитело может быть очищено: (1) на более чем 95% по массе антитела, как может быть определено методом Лаури, а более предпочтительно не более чем на 99% по массе антитела, (2) до степени, достаточной для получения, по меньшей мере, 15 остатков у N-концевой или внутренней части аминокислотной последовательности, что может быть определено с использованием секвенатора, снабженного центрифужным сосудом, или (3) до гомогенности, что может быть подтверждено с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях с окрашиванием кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Термин “выделенное антитело” включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, если отсутствует, по меньшей мере, один природный компонент этого антитела. Однако, обычно, выделенное антитело может быть получено, по меньшей мере, в одной стадии очистки.
H
H
H
L
L
L
H
L
H
H
L
Основная 4-цепочечная молекула антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей (антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных молекул вместе с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, а поэтому оно содержит 10 антигенсвязывающих сайтов, а секретированные антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных конструкций, содержащих 2-5 основных 4-цепочечных молекулы вместе с J-цепью). В случае IgG 4-цепочечная молекула в основном имеет размер примерно 150000 дальтон. Каждая L-цепь связана с Н-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, а две Н-цепи связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями в зависимости от изотипа Н-цепи. Каждая H- и L-цепь также имеет равномерно расположенные внутрицепьевые дисульфидные мостики. Каждая Н-цепь имеет у своего N-конца вариабельный домен (V), за которым следуют три константных домена (C) для каждой из α- и γ-цепей, и четыре C-домена для изотипов μ и ε. Каждая L-цепь имеет у своего N-конца вариабельный домен (V), за которым следует константный домен (C) у его другого конца. V расположена на одной линии с V, а C расположена на одной линии с первым константным доменом тяжелой цепи (C1). Очевидно, что конкретные аминокислотные остатки образуют пограничную область между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Спаривание V и V приводит к образованию одного антигенсвязывающего сайта. Структура и свойства антител различных классов описаны, например, в публикации Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.
H
H
L-цепь, происходящая от антитела позвоночных любого вида, может принадлежать к одному из двух четко различаемых типов, называемых каппа и лямбда, исходя из аминокислотных последовательностей их константных доменов. Иммуноглобулины, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (C), могут быть отнесены к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющие тяжелые цепи, обозначаемые α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Классы γ и α также подразделены на подклассы, исходя из относительно небольших различий в последовательностях и функциях C, например, у человека экспрессируются иммуноглобулины следующих подклассов: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.
H
L
Термины «вариабельная область» или «вариабельный домен» антитела означает амино-концевые домены тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельный домен тяжелой цепи может называться “V”. Вариабельный домен легкой цепи может называться “V”. Эти домены в основном являются наиболее вариабельными частями антитела и содержат антигенсвязывающие сайты.
Термин “вариабельный” относится к некоторым сегментам вариабельных доменов, которые имеют значительные отличия в последовательностях различных антител. Домен V опосредует связывание с антигеном и определяет специфичность конкретного антитела к конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется по всем вариабельным доменам, состоящим из 110 аминокислот. Но обычно области V состоят из относительно инвариантных сегментов, называемых каркасными областями (FR), состоящими из 15-30 аминокислот, отделенных более короткими областями с гипервариабельностью, называемыми «гипервариабельными областями», каждая из которых имеет длину в 9-12 аминокислот. Каждый вариабельный домен нативной тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR, имеющих, главным образом, β-складчатую конфигурацию и соединенных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие, часть β-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга посредством FR и, вместе с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие антитела в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).
L
H
H
H
“Интактное” антитело представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающую вариабельную область, а также C и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи, C1, C2 и C3. Константные домены могут представлять собой константные домены нативной последовательности (например, константные домены человеческой нативной последовательности) или варианты их аминокислотных последовательностей. Интактное антитело предпочтительно обладает одной или несколькими эффекторными функциями.
Используемый здесь термин «оголенное антитело» означает антитело, которое не является конъюгированным с цитотоксической молекулой или радиоактивной меткой.
2
«Фрагменты антител» содержат часть интактного антитела, а предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примерами фрагментов антител являются Fab-, Fab'-, F(ab')- и Fv-фрагменты; диантитела; линейные антитела (см. патент США № 5641870, пример 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В одном из вариантов изобретения фрагмент антитела содержит антигенсвязывающий сайт интактного антитела, а поэтому он сохраняет свою способность связываться с антигеном.
H
H
2
H
2
В результате гидролиза антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых “Fab”-фрагментами, и один оставшийся “Fc”-фрагмент, название которого указывает на его способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент состоит из полноразмерной L-цепи вместе с доменом вариабельной области H-цепи (V), и первого константного домена одной тяжелой цепи (C1). Каждый Fab-фрагмент является одновалентным в отношении связывания с антигеном, то есть он имеет один антигенсвязывающий сайт. В результате обработки антитела пепсином образуется один крупный F(ab')-фрагмент, который приблизительно соответствует двум связанным дисульфидной связью Fab-фрагментам, обладающим двухвалентной антигенсвязывающей активностью и способностью перекрестно связываться с антигеном. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов присутствием нескольких дополнительных остатков у карбокси-конца домена C1, включая один или несколько цистеинов, происходящих от шарнирной области антитела. Fab'-SH, используемый в настоящей заявке, представляет собой Fab', в котором цистеиновый(е) остаток(тки) константных доменов имеют свободную тиоловую группу. F(ab')-фрагменты антитела первоначально были получены в виде пар Fab'-фрагментов, которые имеют расположенные между ними шарнирные цистеины. Специалистам также известны другие методы химического связывания фрагментов антител.
Fc-фрагмент содержит карбокси-концевые части обеих Н-цепей, связанных посредством дисульфидных связей. Эффекторные функции антител определяют по последовательностям Fc-области, которые представляют собой также части, распознаваемые Fc-рецепторами (FcR), находящимися на клетках некоторых типов.
«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полноразмерный антиген-распознающий сайт и антигенсвязывающий сайт. Этот фрагмент состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, жестко связанных друг с другом нековалентной связью. В одноцепочечном Fv (scFv) один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи могут быть ковалентно связаны гибким пептидным линкером, в результате чего легкая и тяжелая цепь могут ассоциироваться друг с другом с образованием «димерной» структуры, аналогичной структуре двухцепочечных Fv. После укладки этих двух доменов образуется шесть гипервариабельных петель (3 петли, каждая из которых происходит от Н- и L-цепи), которые обеспечивают аминокислотные остатки для связывания с антигеном и сообщают антителу специфичность связывания с антигеном. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать антиген и связываться с ним, хотя и с меньшей аффинностью, чем весь сайт связывания.
H
L
H
L
«Одноцепочечные Fv-фрагменты», также обозначаемые "sFv" или “scFv”, представляют собой фрагменты антитела, которые включают домены V и V антитела, соединенные в одной полипептидной цепи. Предпочтительно полипептид scFv также содержит между доменами V и V полипептидный линкер, который обеспечивает образование scFv со структурой, необходимой для связывания с антигеном. Описание scFv можно найти в работе Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, см. ниже.
H
L
H
L
Термин “диантитела” означает фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, где указанные фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). Небольшие фрагменты антител получают путем конструирования scFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с использованием коротких линкеров (примерно 5-10 остатков) между доменами V и V, так, чтобы достигалось межцепочечное, но не внутрицепочечное, спаривание доменов V, с образованием двухвалентного фрагмента, то есть фрагмента, имеющего два антигенсвязывающих сайта. Диантитела могут быть двухвалентными или биспецифическими. Биспецифическими диантителами являются гетеродимеры двух «перекрестно связанных» scFv-фрагментов, в которых домены V и V двух антител присутствуют на различных полипептидных цепях. Диантитела более подробно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Триантитела и тетраантитела также описаны в публикации Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Используемый здесь термин “моноклональное антитело” означает антитело, полученное от популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельных антител, входящих в данную популяцию и являющихся идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются в высокой степени специфическими и направлены против одной антигенной детерминанты. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Помимо своей специфичности, моноклональные антитела обладают тем преимуществом, что они могут быть синтезированы так, чтобы они не содержали примесей других антител. Термин “моноклональный” не означает, что данное антитело должно быть продуцировано каким-либо конкретным методом. Так, например, моноклональные антитела согласно изобретению могут быть получены с помощью гибридомной технологии, впервые описанной Kohler et al. (1975) Nature 256:495, либо они могут быть получены методами рекомбинантных ДНК в клетках бактерий, эукариотических организмов или растений (см. патент США № 4816567). “Моноклональные антитела” могут быть также выделены из фаговых библиотек антител методами, описанными, например, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
Используемые здесь моноклональные антитела включают, в частности, “химерные” антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, происходящих от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, а остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующим последовательностям антител, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также включают фрагменты таких антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью (см. патент США № 4816567 и публикацию Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющими интерес химерными антителами согласно изобретению являются «приматизированные» антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельных доменов, происходящие от последовательностей константной области приматов, не являющихся человеком (например, мартышек, человекообразных обезьян и т.п.), и человека.
“Гуманизированные формы” нечеловеческих антител (например, антител грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую от нечеловеческого антитела. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки, происходящие от гипервариабельной области данного антитела-реципиента, заменены остатками, происходящими от гипервариабельной области нечеловеческого антитела (донорного антитела), такого как мышиное антитело, крысиное антитело, кроличье антитело или антитело приматов, не являющихся человеком, где указанные антитела обладают нужной специфичностью, аффинностью и связывающей способностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками нечеловеческого антитела. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации вводят для улучшения свойств антитела. В общих чертах, гуманизированное антитело может содержать в основном все или по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или почти все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям не-человеческого иммуноглобулина, и все или почти все FR представляют собой FR с последовательностью человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также содержит, но необязательно, по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно области человеческого иммуноглобулина. Более подробное описание см. у Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-329 (1998) и Presta Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). См. также нижеследующие обзорные статьи и цитируемые там работы: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Используемый здесь термин «тио» или «thio» относится к антителу, сконструированному на основе цистеина, а используемый здесь термин “hu” относится к гуманизированному антителу.
TM
«Человеческое антитело» представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого у человека, и/или полученного любым из методов продуцирования человеческих антител, описанных в настоящей заявке. Это определение человеческого антитела, в частности, исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого антитела. Человеческие антитела могут быть получены различными методами, известными специалистам, включая использование библиотек фагового представления. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Для получения человеческих моноклональных антител могут быть также применены методы, описанные в публикации Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). См. также van Dijk & van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74 (2001). Человеческие антитела могут быть получены путем введения антигена трансгенному животному, которое было модифицировано в целях продуцирования таких антител в ответ на антигенную стимуляцию, но у которого были блокированы эндогенные локусы, например у иммунизированной мыши с ксенотрансплантатом (см, например, патенты США №№ 6075181 и 6150584, относящиеся к технологии XENOMOUSE). См., также, например, публикацию Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006), относящуюся к человеческим антителам, полученным с применением технологии человеческих В-клеточных гибридом.
Используемые здесь термины “гипервариабельная область”, “HVR” или “HV” означают области вариабельного домена антитела, которые являются в данной последовательности гипервариабельными и/или образуют петли определенной структуры. В общих чертах, указанные антитела содержат шесть гипервариабельных областей; три области в VH (Н1, Н2, Н3) и три области в VL (L1, L2, L3). В настоящей заявке используется ряд гипервариабельных областей, которые входят в объем настоящего изобретения. Гипервариабельные области (комплементарность-определяющие области (CDR)) по Кабату обладают высокой степенью вариабельности последовательности и находят широкое применение (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Вместо определения гипервариабельных областей по Кабату, Чотия предложил определять гипервариабельные области по локализации структурных петель (Chothia & Lesk, J. Mol.Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 по Чотия, при нумерации в соответствии с нумерацией Кабата, варьируется между положениями H32 и H34 в зависимости от длины петли (это происходит потому, что в соответствии со схемой нумерации по Кабату инсерции находятся в положениях H35A и H35B; при этом, если не присутствует ни 35A, ни 35B, то петля заканчивается в положении 32; если присутствует только 35A, то петля заканчивается в положении 33; а если присутствуют 35A и 35B, то петля заканчивается в положении 34). Определение гипервариабельных областей AbM представляет собой компромисс между “CDR” по Кабату и “структурными петлями” по Чотия, и такие определения используются в компьютерной программе по моделированию антител Oxford Molecular's AbM. «Контактные» гипервариабельные области определяют, исходя из анализа имеющихся сложных кристаллических структур. Остатки каждой из этих гипервариабельных областей приводятся ниже.
Петля
По Кабату
AbM
По Чотия
Контактные области
L1
L24-L34
L24-L34
L26-L32
L30-L36
L2
L50-L56
L50-L56
L50-L56
L46-L55
L3
L89-L97
L89-L97
L89-L97
L89-L96
Н1
Н31-Н35В
Н26-Н35В
Н26-Н32
Н30-Н35В
(Нумерация по Кабату)
Н1
Н31-Н35
Н26-Н35
Н26-Н32
Н30-Н35
(Нумерация по Чотия)
Н2
Н50-Н65
Н50-Н58
Н52-Н56
Н47-Н58
Н3
Н95-Н102
Н95-Н102
Н95-Н102
Н93-Н101
Термин “гипервариабельные области” может включать “удлиненные гипервариабельные области”, а именно: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в VL; и 26-35В (Н1), 50-65, 47-65 или 49-65 (Н2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (Н3) в VH. Остатки вариабельных доменов для каждого из указанных определений пронумерованы по Кабату и др., см. выше.
“Каркасными” или “FR” остатками являются остатки вариабельных доменов, за исключением остатков гипервариабельных областей, определенных выше.
Используемый здесь термин “остаток вариабельного домена, пронумерованный по Кабату” или “аминокислотное положение, пронумерованное по Кабату” и их варианты означает систему, используемую для нумерации вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи антител, описанной в справочнике по антителам Кабата (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). В соответствии с этой системой нумерации, фактическая первичная аминокислотная последовательность может содержать меньшее число или дополнительное число аминокислот, соответствующее укороченной или удлиненной FR- или CDR-области вариабельного домена. Так, например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать инсерцию одной аминокислоты (остатка 52а в соответствии с нумерацией Кабата) после остатка 52 Н2, и остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.п., в соответствии с нумерацией Кабата), встроенные после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков данного антитела по Кабату может быть осуществлена после выравнивания его последовательности в областях гомологии со “стандартной” последовательностью, пронумерованной по Кабату.
Система нумерации по Кабату обычно применяется к остаткам в вариабельном домене (приблизительно остаткам 1-107 легкой цепи и остаткам 1-113 тяжелой цепи)(например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Европейская система нумерации «EU» или «Eu-индекс» обычно применяется к остаткам константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, EU-индекс описан у Kabat et al., см. выше). Термин «EU-индекс по Кабату» означает нумерацию остатков человеческого антитела IgG1 в соответствии с Европейской системой нумерации. Если это не указано в настоящем описании, то указание на число остатков в вариабельном домене антител означает остатки, пронумерованные в соответствии с системой нумерации Кабата. Если это не указано в настоящем описании, то указание на число остатков в константном домене антител означает остатки, пронумерованные в соответствии с Европейской системой нумерации (см., например, предварительную заявку на патент США № 60/640323, на фигурах дана Европейская нумерация).
“Аффинно зрелым” антителом является антитело, имеющее одну или несколько модификаций в одной или нескольких HVR, где указанные модификации приводят к повышению аффинности антитела к антигену, по сравнению с родительским антителом, которое не имеет такую(их) модификацию(ий). Предпочтительные аффинно зрелые антитела имеют наномолярные или даже пикомолярные аффинности к антигену-мишени. Аффинно зрелые антитела получают методами, известными специалистам. В публикации Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описано созревание аффинности посредством перестановки доменов VH и VL. Неспецифический мутагенез HVR и/или каркасных остатков описан в публикациях Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
«Блокирующее» антитело или «антитело-антагонист» представляет собой антитело, ингибирующее или снижающее биологическую активность антигена, с которым оно связывается. Предпочтительные блокирующие антитела или антитела-антагонисты в основном или полностью ингибируют биологическую активность антигена.
Используемый здесь термин «антитело-агонист» означает антитело, которое имитирует по меньшей мере одну из функциональных активностей представляющего интерес полипептида.
-7
-8
-9
«Видоспецифическое антитело», например антитело млекопитающего против человеческого IgE, представляет собой антитело, которое обладает более высокой аффинностью связывания с антигеном, происходящим от млекопитающего первого вида, по сравнению с гомологом антигена, происходящего от млекопитающего второго вида. Обычно видоспецифическое антитело «специфически связывается» с человеческим антигеном (то есть имеет величину аффинности связывания (Kd) не более чем примерно 1×10 M, предпочтительно не более чем примерно 1×10, а наиболее предпочтительно не более чем примерно 1×10 M), тогда как аффинность связывания с гомологом антигена, происходящего от млекопитающего второго вида, не являющегося человеком, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 500 раз, или по меньшей мере примерно в 1000 раз ниже аффинности связывания с человеческим антигеном. Видоспецифическое антитело может представлять собой любое из антител различных типов, определенных выше, но предпочтительно таким антителом является гуманизированное или человеческое антитело.
Термин “аффинность связывания” по существу означает силу суммарных нековалентных взаимодействий одного сайта связывания молекулы (например, антитела) с его партнером по связыванию (например, с антигеном). Если это не оговорено особо, то используемый здесь термин “аффинность связывания” означает природную аффинность связывания, при которой происходит взаимодействие 1:1 между членами пар связывания (например, антитела с антигеном). Аффинность связывания молекулы Х с ее партнером Y, в общих чертах, может называться константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть определена стандартными методами, известными специалистам, включая описанные здесь методы. Низкоаффинные антитела обычно связываются с антигеном с меньшей скоростью и имеют тенденцию легко диссоциироваться, тогда как высокоаффинные антитела обычно связываются с антигеном с большей скоростью и имеют тенденцию оставаться связанными в течение более длительного периода времени. Специалистам в данной области известны различные методы измерения аффинности связывания, и для осуществления настоящего изобретения может быть применен любой из этих методов. Конкретные репрезентативные варианты осуществления изобретения описаны ниже.
Используемое здесь определение «или выше», если оно употребляется по отношению к аффинности связывания, означает более высокий уровень связывания молекулы с его партнером по связыванию. Используемое здесь определение «или выше», если оно употребляется в настоящей заявке, означает более сильное связывание, определяемое меньшим численным значением Kd. Так, например, антитело, которое имеет аффинность связывания с антигеном «0,6 нМ или выше»”, означает антитело, которое имеет аффинность связывания с антигеном <0,6 нМ, то есть 0,59 нМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ и т.п. или любую величину менее чем 0,6 нМ.
125
125
TM
TM
6
-1
-1
on
off
off
on
В одном из вариантов изобретения “Kd” или “величину Kd” согласно изобретению определяют с помощью анализа на связывание с радиоактивно меченным антигеном (РИА), осуществляемого с использованием Fab-варианта представляющего интерес антитела и его антигена, описанного ниже, где указанный анализ позволяет измерять аффинность связывания Fab с антигеном в растворе путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией (I)-меченного антигена в присутствии титрационного набора немеченных антигенов, с последующей иммобилизацией связанного антигена на планшете, сенсибилизированном антителом против Fab-фрагмента (Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). В целях создания соответствующих условий для анализа микротитрационные планшеты (Dynex) сенсибилизируют в течение ночи 5 мкг/мл связывающего анти-Fab антитела (Cappel Labs) в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6), а затем блокируют 2%-ым (масс./об.) альбумином бычьей сыворотки в PBS в течение 2-5 часов при комнатной температуре (приблизительно при 23°С). В неадсорбирующем планшете (Nunc # 269620), 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с оценкой анти-VEGF антитела, Fab-12, Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи, однако, для гарантии достижения равновесия, инкубирование может быть проведено в течение более длительного периода времени (например, 65 часов). После этого смеси переносят в планшет для иммобилизации и инкубируют при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют и планшет восемь раз промывают 0,1% Твином-20 в PBS. После сушки планшетов добавляют 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (MicroScint-20; Packard), и планшеты подсчитывают на гамма-счетчике Topcount (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые составляют 20% или менее от максимального связывания, отбирают для их использования в анализах на конкурентное связывание. В соответствии с другим вариантом изобретения Kd или величину Kd измеряют в анализе методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore-2000 или BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°С с использованием чипов СМ5 с иммобилизованным на них антигеном при величине единиц отклика (RU), составляющей ~10. Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (CM5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщиков. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ), а затем инъецируют при скорости потока 5 мкл/минуту до достижения величины единиц отклика (RU) связанного белка, составляющей ~10. После инъекции антигена для блокирования непрореагировавших групп вводят 1М этаноламин. Для измерения кинетики реакции вводят инъекции двукратных серийных разведений Fab (0,78 нМ-500 нМ) в PBS, содержащем 0,05% твина-20 (PBST) при 25°С и при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) вычисляют с использованием простой лангмюровской модели связывания 1:1 (BIAcore Evaluation Software version 3.2) при одновременном построении сенсорограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) вычисляют как отношение k/k. См., например, Chen, Y., et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 10 М · с, как было определено выше методом поверхностного плазмонного резонанса, то такая скорость ассоциации может быть определена методом гашения флуоресценции, который позволяет измерять увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм; излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С для 20 нМ антитела против антигена (в Fab-форме) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, как было измерено на спектрометре, таком как спектрофотометр, снабженный ограничителем потока (Aviv Instrumtnts), или на спектрофотометре SLM-Aminco серии 8000 (ThermoSpectronic), снабженном кюветой для перемешивания, содержащей красный краситель.
on
TM
TM
«Скорость ассоциации» («on-rate») или «k» согласно изобретению может быть также определена описанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore-2000 или BIAcore-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).
Используемые здесь термины “по существу аналогичный” или “по существу тот же самый” означают достаточно высокую степень сходства между двумя численными величинами (обычно между одной величиной, соответствующей антителу согласно изобретению, и другой величиной, соответствующей эталонному/сравниваемому антителу), а именно такую степень сходства, которая позволяла бы специалисту в данной области считать различие между этими двумя величинами несущественным или биологически и/или статистически незначимым в отношении их биологических свойств, определяемых указанными величинами (например, величинами Kd). Различия между указанными двумя величинами составляет предпочтительно менее чем примерно 50%, более предпочтительно менее чем примерно 40%, еще более предпочтительно менее чем примерно 30%, еще более предпочтительно менее чем примерно 20%, а наиболее предпочтительно менее чем примерно 10% по сравнению с величинами эталонного/сравниваемого антитела.
Используемые здесь термины «по существу пониженный» или «по существу отличающийся» означают достаточно высокую степень различия между двумя численными величинами (обычно между одной величиной, соответствующей антителу согласно изобретению, и другой величиной, соответствующей эталонному/сравниваемому антителу), а именно такую степень различия, которая позволяла бы специалисту в данной области считать такое различие между этими двумя величинами статистически значимым в отношении их биологических свойств, определяемых указанными величинами (например, величинами Kd, НАМА-ответ). Различия между указанными двумя величинами составляет предпочтительно более чем примерно 10%, более предпочтительно более чем примерно 20%, еще более предпочтительно более чем примерно 30%, еще более предпочтительно более чем примерно 40%, а наиболее предпочтительно более чем примерно 50% по сравнению с величинами эталонного/сравниваемого антитела.
Термин «антиген» означает предварительно определенный антиген, с которым может селективно связываться антитело. Антигеном-мишенью может быть полипептид, углевод, нуклеиновая кислота, липид, гаптен или другое природное или синтетическое соединение. Предпочтительным антигеном-мишенью является полипептид.
Используемый здесь термин «акцепторная человеческая каркасная область» означает каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области VL или VH, происходящую от человеческой каркасной области иммуноглобулина, или от человеческой консенсусной каркасной области. Акцепторная человеческая каркасная область, «происходящая от» человеческой каркасной области иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, может содержать одну и ту же аминокислотную последовательность, либо она может содержать аминокислотную последовательность с уже имеющимися изменениями. Если в аминокислотной последовательности уже имелись изменения, то предпочтительно, чтобы число таких изменений не превышало 5, а предпочтительно 4 или менее, или 3 или менее. Если аминокислотные изменения уже присутствовали в VH, то предпочтительно, чтобы эти изменения были только в трех, двух или в одном из положений 71H, 73H и 78H; так, например, аминокислотными остатками в этих положениях могут быть 71A, 73T и/или 78A. В одном из вариантов изобретения акцепторная человеческая каркасная область VL идентична последовательности человеческой каркасной области VL иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной последовательности.
«Человеческая консенсусная каркасная область» представляет собой каркасную область, которая включает наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки, используемые при выборе каркасных последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина. Обычно последовательности VL или VH человеческого иммуноглобулина выбирают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. В основном подгруппа последовательностей определяется по Кабату и др. В одном из вариантов изобретения, для VL, такой подгруппой является подгруппа каппа I по Кабату и др. В одном из вариантов изобретения, для VH, такой подгруппой является подгруппа III по Кабату и др.
«Консенсусная каркасная область VH подгруппы III» содержит консенсусную последовательность, выделенную из аминокислотных последовательностей тяжелой цепи подгруппы III по Кабату и др. В одном из вариантов изобретения аминокислотная последовательность консенсусной каркасной области VH подгруппы III содержит по меньшей мере часть каждой из нижеследующих последовательностей или все эти последовательности: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
«Консенсусная каркасная область VL подгруппы I» содержит консенсусную последовательность, выделенную из аминокислотных последовательностей вариабельной легкой цепи каппа подгруппы I по Кабату и др. В одном из вариантов изобретения аминокислотная последовательность консенсусной каркасной области VL подгруппы I содержит по меньшей мере часть каждой из нижеследующих последовательностей или все эти последовательности: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 139)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142).
«Немодифицированная человеческая каркасная область» представляет собой человеческую каркасную область, имеющую такую же аминокислотную последовательность, как и акцепторная человеческая каркасная область, например, в ней отсутствуют замены человеческих аминокислот на нечеловеческие аминокислоты, как и в акцепторной человеческой каркасной области.
Используемый здесь термин «модифицированная гипервариабельная область» означает гипервариабельную область, содержащую одну или несколько (например, от одной и примерно до 16) аминокислотных замен.
Используемый здесь термин «немодифицированная гипервариабельная область» означает гипервариабельную область, имеющую такую же аминокислотную последовательность, как и последовательность нечеловеческого антитела, от которого она происходит, то есть последовательность, не содержащую одной или нескольких аминокислотных замен.
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Антитело, которое “связывается” с представляющим интерес антигеном, например, с опухолеассоциированным полипептидным антигеном-мишенью, представляет собой антититело, связывающееся с антигеном с аффинностью, которая является достаточной для того, чтобы это антитело можно было использовать в качестве терапевтического средства для доставки в клетку или в ткань, экспрессирующую этот антиген, и чтобы это антитело не обладало бы значительной перекрестной реактивностью с другими белками. В указанных вариантах изобретения уровень связывания антитела с белком, который «не является мишенью», составляет менее чем примерно 10% от уровня связывания антитела с его конкретным белком-мишенью, как было определено с помощью анализа, проводимого с применением клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS) или радиоиммунопреципитации (РИА). Что касается связывания антитела с молекулой-мишенью, то термин «специфически связывающееся с» или «специфически связывается с» конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде-мишени или «является специфичным к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает, что такое связывание антитела значительно отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, путем определения уровня связывания молекулы по сравнению с уровнем связывания контрольной молекулы, которая по существу представляет собой молекулу, имеющую аналогичную структуру, но не обладающую связывающей активностью. Так, например, специфическое связывание может быть определено путем оценки конкурентного связывания с контрольной молекулой, которая является аналогичной данной мишени, например, по избытку немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание обнаруживается, когда связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Используемый здесь термин «специфически связывающееся с» или «специфически связывается с» конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде-мишени или «является специфичным к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени может, например, означать, что данная молекула имеет Kd по отношению к мишени по меньшей мере примерно 10M, альтернативно по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно по меньшей мере примерно 10M, альтернативно по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно по меньшей мере примерно 10 M, альтернативно по меньшей мере примерно 10 M или более. В одном из вариантов изобретения термин «специфическое связывание» означает связывание, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, но в основном не связывается с любым другим полипептидом или полипептидным эпитопом.
Антитело, которое «ингибирует рост опухолевых клеток, экспрессирующих полипептид CD79b» или «рост-ингибирующее антитело» представляет собой антитело, которое значительно ингибирует рост раковых клеток, экспрессирующих или сверхэкспрессирующих соответствующий полипептид CD79b. Полипептидом CD79b может быть трансмембранный полипептид, экспрессируемый на поверхности раковых клеток, либо им может быть полипептид, продуцируемый и секретируемый раковыми клетками. Предпочтительные рост-ингибирующие анти-CD79b антитела ингибируют рост CD79b-экспрессирующих опухолевых клеток более чем на 20%, предпочтительно примерно на 20%-50%, а еще более предпочтительно более чем на 50% (примерно на 50%-100%), по сравнению с соответствующим контролем, который обычно представляет собой опухолевые клетки, не обработанные тестируемым антителом. В одном из вариантов изобретения ингибирование роста может быть измерено при концентрации антитела, составляющей примерно 0,1-30 мкг/мл или примерно 0,5 нм-200 нМ в клеточной культуре, где указанное ингибирование роста определяют через 1-10 дней после обработки опухолевых клеток антителом. Ингибирование роста опухолевых клеток in vivo может быть определено различными методами, описанными ниже в разделе «Экспериментальные примеры». Указанное антитело ингибирует рост in vivo, если введение анти-CD79b антитела в количестве примерно 1 мкг/кг-примерно 100 мг/кг массы тела приводит к снижению размера опухоли или пролиферации опухолевых клеток в течение периода времени примерно от 5 дней до 3 месяцев, а предпочтительно примерно от 5 до 30 дней с момента первого введения антитела.
Антитело, которое “индуцирует апоптоз”, представляет собой антитело, которое индуцирует запрограммированную клеточную гибель, как было определено по связыванию с аннексином V, фрагментации ДНК, сморщиванию клеток, расширению эндоплазматического ретикулума, фрагментации клеток и/или по образованию мембранных везикул (называемых апоптотическими тельцами). Такой клеткой обычно является клетка, сверхэкспрессирующая полипептид CD79b. Предпочтительной клеткой являются опухолевые клетки, например, гемопоэтические клетки, такие как В-клетки, Т-клетки, базофилы, эозинофилы, нейтрофилы, моноциты, тромбоциты или эритроциты. Для оценки клеточных событий, ассоциированных с апоптозом, существуют различные методы. Так, например, транслокация фосфатидилсерина (PS) может быть определена по связыванию с аннексином; фрагментация ДНК может быть оценена по образованию ДНК-лэддера; а конденсация ядра/хроматина вместе с фрагментацией ДНК может быть оценена по любому увеличению гиподиплоидных клеток. Предпочтительно антителом, индуцирующим апоптоз, является антитело, которое приводит примерно к 2-50-кратному, предпочтительно примерно к 5-50-кратному, а наиболее предпочтительно примерно к 10-50-кратному индуцированию связывания с аннексином по сравнению с необработанными клетками в анализе на связывание с аннексином.
Антителом, которое «индуцирует гибель клеток», является антитело, которое превращает жизнеспособные клетки в нежизнеспособные клетки. Такими клетками являются клетки, экспрессирующие полипептид CD79b, и клетки определенного типа, которые специфически экспрессируют или сверхэкспрессируют полипептид CD79b. Указанными клетками могут быть раковые или нормальные клетки конкретного типа. Полипептидом CD79b может быть трансмембранный полипептид, экспрессируемый на поверхности раковых клеток, либо им может быть полипептид, продуцируемый и секретируемый раковыми клетками. Указанными клетками могут быть раковые клетки, например, В-клетки или Т-клетки. Гибель клеток in vitro может быть определена в отсутствие комплемента и иммунных эффекторных клеток для идентификации гибели клеток, индуцированной антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичностью (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC). Таким образом, анализ на гибель клеток может быть осуществлен с использованием термоинактивированной сыворотки (то есть в отсутствие комплемента) и в отсутствие иммунных эффекторных клеток. Для того чтобы определить, может ли антитело индуцировать гибель клеток, может быть оценена потеря целостности мембраны путем поглощения йодида пропидия (PI), трипанового синего (см. Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) или 7AAD по сравнению необработанными клетками. Предпочтительными антителами, индуцирующими гибель клеток, являются антитела, индуцирующие поглощение PI в анализе на поглощение PI в клетках BT474.
Термин «эффекторные функции» антитела означает биологические активности, приписываемые Fc-области (Fc-области с нативной аминокислотной последовательностью или Fc-области с измененной аминокислотной последовательностью) антитела и варьирующиеся в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антител являются: связывание с C1q и комплемент-зависимая цитотоксичность; связывание с Fc-рецептором; антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; ингибирование функции рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активация В-клеток.
Используемый здесь термин «Fc-область» означает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-области с нативной последовательностью и Fc-области с измененной последовательностью. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, однако Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяется как фрагмент, простирающийся от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230, до карбокси-конца. С-концевой лизин (остаток 447 в соответствии с Европейской системой нумерации) Fc-области может быть удален, например, в процессе продуцирования или очистки антитела, либо посредством рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. В соответствии с этим, композиция интактных антител может включать популяции антител со всеми удаленными остатками K447, популяции антител с остатками К447, которые не были удалены, и популяции антител со смесью антител, в которых присутствует или отсутствует остаток K447.
«Функциональная Fc-область» обладает «эффекторной функцией» Fc-области с нативной последовательностью. Репрезентативными эффекторными функциями являются связывание с C1q; CDC; связывание с Fc-рецептором; ADCC; фагоцитоз; ингибирование функции рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора; BCR) и т.п. Для достижения эффекторных функций обычно необходимо, чтобы Fc-область была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и такие эффекторные функции могут быть оценены с помощью различных анализов, описанных, например, в разделе «Определения» настоящей заявки.
«Fc-область с нативной последовательностью» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природной Fc-области. Человеческими Fc-областями с нативной последовательностью являются Fc-область нативной последовательности человеческого IgG1 (не-A и A-аллотипов); Fc-область нативной последовательности человеческого IgG2; Fc-область нативной последовательности человеческого IgG3 и Fc-область нативной последовательности человеческого IgG4, а также их природные варианты.
«Вариант Fc-области» содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной последовательности Fc-области по меньшей мере одной аминокислотной модификацией, а предпочтительно одной или несколькими аминокислотными заменами. Предпочтительно вариант Fc-области имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену, например, по меньшей мере замену примерно 1-10 аминокислот, а предпочтительно примерно 1-5 аминокислот, по сравнению с нативной последовательностью Fc-области или Fc-области родительского полипептида. Вариант Fc-области, описанный в настоящей заявке, предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, а наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% гомологичен нативной последовательности Fc-области и/или Fc-области родительского полипептида.
“Антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность” или “ADCC” означает форму цитотоксичности, при которой секретируется Ig, связанный с Fc-рецепторами (FcR), присутствующими на некоторых цитотоксических клетках (например, на природных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), что позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с антиген-несущими клетками-мишенями и тем самым уничтожать эти клетки-мишени под действием цитотоксинов. Эти антитела «вооружают» цитотоксические клетки и являются абсолютно необходимыми для такого цитолиза. Первичные клетки, опосредующие ADCC, то есть NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные, полученные для экспрессии FcR на гемопоэтических клетках, систематизированы в таблице 3 на странице 464 Ravetch & Kinet Annu. Rev. Immunol. (1991) 9:457-92. Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может быть проведен анализ на ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Эффекторными клетками, подходящими для таких анализов, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животного, такой как модель, описанная Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:652-656 (1998).
Термины «Fc-рецептор» или «FcR» используются для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является человеческий FcR с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор), и рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторами FcγRII являются FcγRIIA (“активирующий рецептор”) и FcγRIIB (“ингибирующий рецептор”), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, отличающиеся, главным образом, своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в своем цитоплазматическом домене активирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в своем цитоплазматическом домене ингибирующий мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITIM). (см. обзор М. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcR описаны в публикациях Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Используемый здесь термин “FcR” также охватывает и другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем. Этот термин также включает рецептор, имеющийся у новорожденных, FcRn, который является ответственным за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).
Связывание с человеческим FcRn in vivo и время полужизни полипептидов, связывающихся с человеческим FcRn с высокой аффинностью связывания, могут быть проанализированы, например, у трансгенных мышей или в трансфицированных человеческих клеточных линиях, экспрессирующих человеческий FcRn, или у приматов, которым были введены полипептиды с вариантом Fc-области. В WO 2000/42072 (Presta) описаны варианты антител, обладающих повышенной или пониженной активностью связывания с FcR. См., также, например, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
«Человеческие эффекторные клетки» представляют собой лейкоциты, экспрессирующие один или несколько FcR и обладающие эффекторными функциями. Предпочтительно указанные клетки экспрессируют, по меньшей мере, FcγRIII и обладают эффекторной ADCC-функцией. Примерами человеческих лейкоцитов, опосредующих ADCC, являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительными являются МКПК и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например из крови.
«Комплемент-зависимая цитотоксичность» или «CDC» означает лизис клеток-мишеней в присутствии комплемента. Классический путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связываются с их когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ на CDC, например, как описано Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996). Полипептидные варианты, имеющие модифицированные аминокислотные последовательности Fc-области (полипептиды с вариантом Fc-области) и обладающие повышенной или пониженной способностью связываться с C1q, описаны в патенте США № 6194551B1 и в WO99/51642. См. также Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
Термин «антитело, содержащее Fc-область» означает антитело, включающее Fc-область. C-концевой лизин (остаток 447 в соответствии с Европейской системой нумерации EU) Fc-области может быть удален, например, в процессе очистки антитела или путем рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей данное антитело. В соответствии с этим, композиция, содержащая антитело, имеющее Fc-область согласно изобретению, может содержать антитело с остатком K447; антитело, где все K447 были удалены; или смесь антител, содержащих и не содержащих остаток K447.
«Внеклеточный домен» полипептида CD79b или «ECD» представляет собой форму полипептида CD79b, в основном не содержащего трансмембранных и цитоплазматических доменов. Обычно ECD полипептида CD79b составляет менее 1% от указанных трансмембранных и/или цитоплазматических доменов, а предпочтительно менее чем 0,5% таких доменов. Следует отметить, что любой из трансмембранных доменов, идентифицированных для полипептидов CD79b согласно изобретению, идентифицируют в соответствии с критериями, обычно применяемыми специалистами для идентификации гидрофобного домена такого типа. Точные границы трансмембранного домена могут варьироваться, но наиболее вероятно, что они отличаются не более чем примерно на 5 аминокислот у любого конца первоначально идентифицированного домена. Поэтому внеклеточный домен полипептида CD79b может содержать, но необязательно, примерно 5 или менее аминокислот на любой стороне пограничной области «трансмембранный домен/внеклеточный домен», идентифицированной, как описано в примерах или в описании настоящей заявки, и такие полипептиды, содержащие или не содержащие присоединенный к ним сигнальный пептид, и нуклеиновая кислота, кодирующая эти полипептиды, входят в объем настоящего изобретения.
Предполагаемая локализация «сигнальных пептидов» описанного здесь полипептида CD79b может быть указана в описании настоящей заявки и/или в описании графического материала. Однако следует отметить, что С-концевая граница сигнального пептида может варьироваться, но наиболее вероятно, что она отличается не более чем примерно на 5 аминокислот с любой стороны С-концевой границы сигнального пептида, первоначально идентифицированного в настоящей заявке, где указанная С-концевая граница сигнального пептида может быть идентифицирована в соответствии с критериями, обычно применяемыми специалистами для идентификации элемента аминокислотной последовательности такого типа (например, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) и von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Кроме того, также известно, что в некоторых случаях отщепление сигнальной последовательности от секретированного полипептида не является полностью равномерным, что приводит к образованию более чем одной секретируемой молекулы. Такие зрелые полипептиды, в которых сигнальный пептид отщепляется в пределах не более чем примерно 5 аминокислот с любой стороны от С-концевой границы сигнального пептида, идентифицированного в настоящей заявке, и полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, входят в объем настоящего изобретения.
Термин «вариант полипептида CD79b» означает полипептид CD79b, а предпочтительно активный полипептид CD79b, определенный в настоящем описании и имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80% идентична полноразмерной последовательности нативного полипептида CD79b, описанного в настоящей заявке; последовательности полипептида CD79b, не содержащего сигнального пептида, описанного в настоящей заявке; последовательности внеклеточного домена полипептида CD79b, содержащего или не содержащего сигнальный пептид, описанный в настоящей заявке; или последовательности любого другого фрагмента полноразмерного полипептида CD79b, описанного в настоящей заявке (такого как полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая представляет собой лишь часть полноразмерной последовательности, кодирующей полноразмерный полипептид CD79b). Такими вариантами полипептида CD79b являются, например, полипептиды CD79b, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавлены или делетированы у N- или С-конца полноразмерной нативной аминокислотной последовательности. Обычно вариант полипептида CD79b имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80% и альтернативно по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности полноразмерного нативного полипептида CD79b, описанного в настоящей заявке; последовательности полипептида CD79b, не содержащего сигнального пептида, описанного в настоящей заявке; последовательности внеклеточного домена полипептида CD79b, содержащего или не содержащего сигнальный пептид, описанный в настоящей заявке; или последовательности любого другого конкретно определенного фрагмента полноразмерного полипептида CD79b, описанного в настоящей заявке. Обычно варианты полипептида CD79b имеют длину по меньшей мере примерно 10 аминокислот или альтернативно по меньшей мере примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 аминокислот или более. Варианты полипептидов CD79b имеют, но необязательно, не более чем одну консервативную замену и альтернативно не более чем 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 консервативных аминокислотных замен по сравнению с нативной последовательностью полипептида CD79b.
«Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» пептидов или полипептидов, то есть последовательностей полипептида CD79b, идентифицированного в настоящей заявке, определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной пептидной или полипептидной последовательности, то есть последовательности полипептида CD79b, после выравнивания этих последовательностей и введения в них “пробелов”, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, причем какие-либо консервативные замены не рассматриваются как часть идентичных последовательностей. Выравнивание, осуществляемое в целях определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, может быть проведено различными методами, известными специалистам, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или MegAlign (DNASTAR). Специалист в данной области может самостоятельно определить соответствующие параметры выравнивания, включая использование любых алгоритмов, необходимых для достижения оптимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако, в целях настоящего изобретения, % идентичности аминокислотных последовательностей вычисляют с применением компьютерной программы ALIGN-2, используемой для сравнения последовательностей, где полный исходный код программы ALIGN-2 представлен ниже в таблице 1. Компьютерная программа ALIGN-2, используемая для сравнения последовательностей, была разработана фирмой Genentech, Inc., и указанный исходный код, представленный ниже в таблице 1, был зарегистрирован в документации для пользователей в Ведомстве по копирайту США, Вашингтон, D.C., 20559, под регистрационным номером U.S. Copyright Registration № TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной программой, поставляемой фирмой Genentech, Inc., South San Francisco, California, либо она может быть составлена на основе исходного кода, представленного ниже в таблице 1. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения в операционной системе UNIX, а предпочтительно в системе UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей были установлены в программе ALIGN-2 и не изменялись.
В случае когда для сравнения аминокислотных последовательностей используется программа ALIGN-2, то % идентичности данной аминокислотной последовательности А с данной аминокислотной последовательностью В (которая альтернативно может быть названа данной аминокислотной последовательностью А, имеющей или составлящей определенный % идентичности с данной аминокислотной последовательностью В) вычисляют следующим образом:
100 • Х/Y,
где Х представляет собой число аминокислотных остатков, которые были оценены как полностью соответствующие при выравнивании последовательностей с использованием программы ALIGN-2, с помощью которой проводили сравнение последовательностей А и В, и где Y представляет собой полное число аминокислотных остатков в последовательности В. При этом следует отметить, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то % идентичности аминокислотной последовательности А с аминокислотной последовательностью В не равен % идентичности аминокислотной последовательности В с аминокислотной последовательностью А.
Термин «вариант полинуклеотида CD79b» или «последовательность нуклеиновой кислоты варианта CD79b» означает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид CD79b, а предпочтительно активный полипептид CD79b, определенный в настоящем описании и имеющий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере примерно на 80% идентична полноразмерной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный нативный полипептид CD79b, описанный в настоящей заявке; полноразмерный нативный полипептид CD79b, не содержащий сигнального пептида, описанного в настоящей заявке; внеклеточный домен полипептида CD79b, содержащий или не содержащий сигнальный пептид, описанный в настоящей заявке; или последовательность любого другого фрагмента полноразмерного полипептида CD79b, описанного в настоящей заявке (такого как полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая представляет собой лишь часть полноразмерной последовательности, кодирующей полноразмерный полипептид CD79b). Обычно вариант полинуклеотида CD79b имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере примерно на 80%, и альтернативно по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный нативный полипептид CD79b, описанный в настоящей заявке; полноразмерную последовательность нативного полипептида CD79b, не содержащего сигнального пептида, описанного в настоящей заявке; внеклеточный домен полипептида CD79b, содержащего или не содержащего сигнальную последовательность, описанный в настоящей заявке; или последовательность любого другого фрагмента полноразмерного полипептида CD79b, описанного в настоящей заявке. Эти варианты не содержат нативную нуклеотидную последовательность.
Обычно полинуклеотидные варианты CD79b имеют длину по меньшей мере примерно 5 нуклеотидов, и альтернативно по меньшей мере примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 или 1000 нуклеотидов, где в контексте настоящего описания термин «приблизительно» означает длину указанной нуклеотидной последовательности ±10% от длины рассматриваемой последовательности.
«Процент (%) идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты», то есть последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующей CD79b, идентифицированной в настоящей заявке, определяют как процент нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые идентичны нуклеотидам в представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты CD79b, после выравнивания этих последовательностей и введения в них “пробелов”, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Выравнивание, осуществляемое в целях определения процента идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты, может быть проведено различными методами, известными специалистам, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или MegAlign (DNASTAR). Однако, в целях настоящего изобретения, % идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты вычисляют с применением компьютерной программы ALIGN-2, используемой для сравнения последовательностей, где полный исходный код программы ALIGN-2 представлен ниже в таблице 1. Компьютерная программа ALIGN-2, используемая для сравнения последовательностей, была разработана фирмой Genentech, Inc., и указанный исходный код, представленный ниже в таблице 1, был зарегистрирован в документации для пользователей в Ведомстве по копирайту США, Вашингтон, D.C., 20559, под регистрационным номером U.S. Copyright Registration № TXU510087. Программа ALIGN-2 является общедоступной программой, поставляемой фирмой Genentech, Inc., South San Francisco, California, либо она может быть составлена на основе исходного кода, представленного ниже в таблице 1. Программа ALIGN-2 должна быть составлена для применения в операционной системе UNIX, а предпочтительно в системе UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей были установлены в программе ALIGN-2 и не изменялись.
В случае когда для сравнения последовательностей нуклеиновой кислоты используется программа ALIGN-2, то % идентичности данной последовательности нуклеиновой кислоты С с данной последовательностью нуклеиновой кислоты D (которая альтернативно может быть названа данной последовательностью нуклеиновой кислоты С, имеющей или составлящей определенный % идентичности с данной последовательностью нуклеиновой кислоты D) вычисляют следующим образом:
100 • W/Z,
где W представляет собой число нуклеотидов, которые были оценены, как полностью идентичные при выравнивании последовательностей с использованием программы ALIGN-2, с помощью которой проводили сравнение последовательностей С и D, и где Z представляет собой полное число нуклеотидов в последовательности D. При этом следует отметить, что если длина последовательности нуклеиновой кислоты C не равна длине последовательности нуклеиновой кислоты D, то % идентичности последовательности нуклеиновой кислоты С с последовательностью нуклеиновой кислоты D не равен % идентичности нуклеиновой кислоты С с последовательностью нуклеиновой кислоты D. Если это не оговорено особо, все используемые здесь величины % идентичности последовательностей нуклеиновой кислоты получают, как описано в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.
В других вариантах изобретения полинуклеотидными вариантами CD79b являются молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид CD79b и которые обладают способностью гибридизоваться, предпочтительно в жестких условиях гибридизации и промывки, с нуклеотидными последовательностями, кодирующими описанный здесь полноразмерный полипептид CD79b. Вариантами полипептида CD79b могут быть полипептиды, кодируемые полинуклеотидным вариантом CD79b.
Термин «полноразмерная кодирующая область», если он относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид CD79b, означает нуклеотидную последовательность, кодирующую полноразмерный полипептид CD79b согласно изобретению (который локализуется между старт- и стоп-кодонами включительно, как это часто иллюстрируется в графическом материале). Термин «полноразмерная кодирующая область», если он относится к нуклеиновой кислоте, депонированной в ATCC, означает часть кДНК, кодирующую полипептид CD79b и встроенную в вектор, депонированный в ATCC (который локализуется между старт- и стоп-кодонами включительно, как это часто иллюстрируется в графическом материале (где старт- и стоп-кодоны показаны жирным шрифтом и подчеркнуты)).
Термин «выделенный», если он относится к различным описанным здесь полипептидам CD79b, означает полипептид, который был идентифицирован и выделен и/или очищен от компонентов его природного окружения. Контаминирующими компонентами его природного окружения являются материалы, негативно влияющие на терапевтическую эффективность данного полипептида, и такими компонентами могут быть ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения указанный полипептид может быть очищен (1) до степени, достаточной для введения, по меньшей мере, 15 остатков у N-концевой или внутренней части аминокислотной последовательности, с использованием секвенатора, снабженного центрифужным сосудом, или (2) до гомогенности, что может быть подтверждено с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях с окрашиванием кумасси синим или, предпочтительно, серебром. Термин «выделенный полипептид» включает полипептид in situ в рекомбинантных клетках, если отсутствует, по меньшей мере, один компонент этого полипептида CD79b, присутствующий в его природном окружении. Однако, обычно, выделенный полипептид может быть получен, по меньшей мере, в одной стадии очистки.
«Выделенная» нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид CD79b, или другая нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая была идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной примесной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциируется в природном источнике нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, имеет форму или структуру, отличающиеся от формы или структуры природной молекулы. Следовательно, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, отличаются от конкретной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид и присутствующей в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид и содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид, где, например, молекула нуклеиновой кислоты присутствует в хромосоме в положении, отличающемся от положения этой нуклеиновой кислоты в природных клетках.
Термин «регуляторные последовательности» означает последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально присоединенной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регуляторными последовательностями, подходящими для прокариотов, являются, например, промотор, необязательно операторная последовательность и сайт связывания с рибосомой. Эукариотические клетки, как известно, используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота «функционально присоединена», если она находится в функциональной взаимосвязи с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Так, например, ДНК для препоследовательности или секреторной лидерной последовательности является функционально присоединенной к ДНК полипептида, если она экспрессируется как пребелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально присоединены к кодирующей последовательности, если они влияют на транскрипцию данной последовательности; а сайт связывания с рибосомой функционально присоединен к кодирующей последовательности, если он расположен в положении, благоприятствующем трансляции. Вообще говоря, термин «функционально присоединенный» означает, что последовательности ДНК, связанные друг с другом, являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности они являются смежными и расположены в одной рамке считывания. Однако энхансеры необязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется посредством лигирования в подходящих рестрикционных сайтах. Если такие сайты отсутствуют, то такие синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры используются в соответствии с общепринятой практикой.
«Жесткость условий реакции гибридизации» может быть легко определена средним специалистом в данной области, и обычно она вычисляется эмпирически в зависимости от длины зонда, температуры промывки и концентрации соли. В основном, чем длиннее зонды, тем выше должна быть температура гибридизации, и чем короче зонды, тем ниже должна быть температура. Гибридизация обычно зависит от способности денатурированной ДНК к повторному отжигу, если комплементарные цепи присутствуют в среде, температура которой ниже их температуры плавления. Чем выше степень желаемой гомологии между зондом и гибридизуемой последовательностью, тем выше должна быть относительная температура. Из этого следует, что более высокие относительные температуры создают более жесткие условия реакции, а более низкие температуры создают менее жесткие условия реакции. Более подробное описание и объяснение условий жесткости реакций гибридизации можно найти в руководстве Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
«Условия жесткости» или «условия высокой жесткости», определенные в настоящем изобретении, могут быть установлены как условия, которые включают (1) промывку при низкой ионной силе и высокой температуре, например промывку 0,015 M хлоридом натрия/0,0015 M цитратом натрия/0,1% додецилсульфатом натрия при 50°С; (2) использование в процессе гибридизации денатурирующего агента, такого как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% альбумином бычьей сыворотки/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ натрийфосфатным буфером, pH 6,5, с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°С; или (3) гибридизацию в течение ночи в растворе, содержащем 50% формамид, 5×SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5× раствора Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% ДСН и 10% сульфат декстрана при 42°С с 10-минутной промывкой при 42°С в 0,2×SSC (хлорид натрия/цитрат натрия), с последующей 10-минутной промывкой в условиях высокой жесткости, состоящей из 0,1×SSC, содержащего EDTA при 55°С.
«Условия умеренной жесткости» могут быть определены, как описано в руководстве Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, и включают использование менее жестких условий промывки и гибридизации (таких как, например, температура, ионная сила и % ДСН), чем условия, описанные выше. Примером условий умеренной жесткости является инкубирование в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем 20% формамид, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрата), 50 мМ фосфата натрия (pH 7,6), 5× раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 1×SSC примерно при 37-50°С. Если необходимо адаптировть данные условия к соответствующим параметрам, таким как длина зонда и т.п., то температура, ионная сила и т.п. могут быть скорректированы способами, известными специалистам.
Используемый здесь термин «меченный эпитопом» означает химерный полипептид, содержащий полипептид CD79b или анти-CD79b антитело, присоединенное к «полипептиду-метке». Полипептид-метка должна иметь определенное число остатков, достаточное для создания эпитопа, против которого может быть направлено данное антитело, и должна быть достаточно короткой, то есть такой, чтобы она не влияла на активность полипептида, к которому она присоединена. Кроме того, предпочтительно, чтобы такой полипептид-метка был достаточно уникальным, то есть таким, чтобы антитело не обладало значительной перекрестной реактивностью с другими эпииопами. Подходящие полипептиды-метки обычно имеют по меньшей мере шесть аминокислотных остатков, а в основном примерно 8-50 аминокислотных остатков (предпочтительно примерно 10-20 аминокислотных остатков).
Используемые здесь термины «активный» или «активность» относятся к форме(ам) полипептида CD79b, который сохраняет биологическую и/или иммунологическую активность природного или нативного CD79b, где термин «биологическая активность» означает биологическую функцию (ингибирующую или стимулирующую), сообщаемую нативным или природным CD79b, за исключением способности индуцировать продуцирование антитела против антигенного эпитопа, находящегося на нативном или природном CD79b, а термин «иммунологическая активность» означает способность индуцировать продуцирование антитела против антигенного эпитопа, находящегося на нативном или природном CD79b.
Термин «антагонист» используется здесь в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность нативного полипептида CD79b. Аналогичным образом, термин «агонист» используется здесь в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая частично или полностью имитирует биологическую активность нативного полипептида CD79b. Подходящими молекулами агонистов или антагонистов, в частности, являются антитела-агонисты или антагонисты или фрагменты антител, фрагменты или варианты аминокислотных последовательностей нативных полипептидов, пептидов, антисмысловых олигонуклеотидов, небольших органических молекул CD79b и т.п. Методы идентификации агонистов или антагонистов полипептида CD79b могут включать контактирование полипептида CD79b с молекулой-агонистом или антагонистом, используемым в качестве кандидата, и определение детектируемого изменения одной или нескольких биологических активностей, обычно ассоциированных с полипептидом CD79b.
Термин «очищенный» относится к молекуле, присутствующей в образце в концентрации по меньшей мере 95 масс.% или по меньшей мере 98 масс.% образца, в котором она содержится.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, отделенную по меньшей мере от одной другой молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциируется в природном окружении. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты также включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют данную молекулу нуклеиновой кислоты, но при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или положении хромосомы, отличающемся от ее природного положения в хромосоме.
Используемый здесь термин “вектор” означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединена. Одним типом векторов является “плазмида”, представляющая собой кольцевую двухцепочечную ДНК-петлю, с которой могут быть лигированы дополнительные ДНК-сегменты. Другим типом вектора является фаговый вектор. Еще одним типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные ДНК-сегменты могут быть лигированы с вирусным геномом. Некоторые векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они были введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после их введения в указанную клетку-хозяина, в результате чего они могут реплицироваться вместе с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны регулировать экспрессию генов, к которым они были функционально присоединены. Такие векторы называются здесь “рекомбинантными экспрессионными векторами” (или просто “рекомбинантными векторами”). В общих чертах, экспрессионные векторы, обычно применяемые в методах рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. В настоящем описании термины “плазмида” и “вектор” могут быть взаимозаменяемыми, поскольку плазмида является наиболее распространенной формой вектора.
2
2
Используемые здесь термины “полинуклеотид” или “нуклеиновая кислота” являются взаимозаменяемыми и означают полимеры любой длины, состоящие из нуклеотидов, и такими полимерами являются ДНК и РНК. Нуклеотидами могут быть дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть включен в полимер посредством ДНК- или РНК-полимеразы, либо посредством реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если это необходимо, то модификация нуклеотидной структуры может быть осуществлена до или после сборки полимера. Нуклеотидные последовательности могут прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после синтеза, например, путем его конъюгирования с меткой. Модификациями других типов являются, например, “кэпы”; замена одного или нескольких природных нуклеотидов их аналогами; межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации путем введения незаряженных связей (например, метилфосфонатов, фосфотриэфиров, фосфоамидатов, карбаматов и т.п.) и заряженных связей (например, фосфотиоатов, фосфодитиоатов и т.п.); модификации, содержащие боковые группы, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.п.); модификации, содержащие интеркалирующие агенты (например, акридин, псорален и т.п.); модификации, содержащие хелатообразующие агенты (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, металлы-окислители и т.п.); модификации, содержащие алкилирующие агенты; модификации, содержащие модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.п.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любые гидроксильные группы, обычно присутствующие в сахарах, могут быть заменены, например, фосфонатными группами и фосфатными группами; защищены стандартными защитными группами; или активированы с образованием дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами; либо они могут быть конъюгированы с твердыми или полутвердыми носителями. 5'- и 3'-концевые ОН могут быть фосфорилированы или замещены аминами или органическими “кэпирующими” группами, состоящими из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы могут быть также дериватизированы стандартными защитными группами. Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы сахаров, таких как рибоза или дезоксирибоза, известных специалистам, включая, например, 2'-О-метил-рибозу, 2'-О-аллилрибозу; 2'-фтор- или 2'-азидорибозу; карбоциклические аналоги сахаров; альфа-аномерные сахара; эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилоза или ликсоза; сахар пиранозу, сахар фуранозу; седогептулозу; ациклические аналоги и неоснόвные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными линкерными группами. Такими альтернативными линкерными группами являются, но не ограничиваются ими, варианты, в которых фосфат заменен Р(О)S (“тиоат”), Р(S)S (“дитиоат”), (О)NR (“амидат”), Р(О)R, Р(О)OR', СО или СН (“формацеталь”), где каждый из R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (С1-20), необязательно содержащий эфирную связь (-О-), арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Вышеприведенное описание относится ко всем используемым здесь полинуклеотидам, включая РНК и ДНК.
Используемый здесь термин “олигонуклеотид”, в общих чертах, означает короткие, в основном одноцепочечные, обычно синтетические полинуклеотиды, длина которых составляет, главным образом, но необязательно, менее чем примерно 200 нуклеотидов. Термины “олигонуклеотид” и “полинуклеотид” не являются взаимоисключающими. Вышепривиденное описание полинуклеотидов может в равной степени и полностью относиться к олигонуклеотидам.
Используемые здесь термины “рак” и “раковый” относятся к физиологическому состоянию млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примерами раковых заболеваний являются, но не ограничиваются ими, рак гемопоэтической системы или рак крови, такой как лимфома, лейкоз, миелома или лимфоидные злокачественные заболевания, а также рак селезенки, рак лимфоузлов, карцинома, бластома и саркома. Более конкретными примерами таких раковых заболеваний являются В-клеточный рак, включая, например, высокозлокачественную, среднезлокачественную и низкозлокачественную лимфому (включая В-клеточные лимфомы, такие как, например, В-клеточная лимфома лимфоидной ткани слизистой и неходжкинская лимфома (НХЛ), лимфома клеток коры головного мозга, лимфома Беркитта, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, лимфома маргинальной зоны, диффузная крупноклеточная лимфома, фолликулярная лимфома, ходжкинская лимфома и Т-клеточные лимфомы) и лейкоз (включая вторичный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), такой как В-клеточный лейкоз (CD5+-В-лимфоциты), миелоидный лейкоз, такой как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфоидный лейкоз, такой как острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) и миелодисплазия), и другие гематологические и/или В-клеточные или Т-клеточные раковые опухоли. В настоящее изобретение также входят раковые заболевания других гемопоэтических клеток, включая полиморфоядерные лейкоциты, такие как базофилы, эозинофилы, нейтрофилы и моноциты, дендритные клетки, тромбоциты, эритроциты и природные клетки-киллеры. В настоящее изобретение также входят раковые В-клеточные пролиферативные расстройства, выбранные из нижеследующих заболеваний, таких как лимфома, неходжкинская лимфома (НХЛ), агрессивная НХЛ, рецидивирующая агрессивная НХЛ, рецидивирующая бессимптомная НХЛ, не поддающаяся лечению НХЛ, не поддающаяся лечению бессимптомная НХЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, лейкоз, ретикулоэндотелиоз (РЭ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и лимфома клеток коры головного мозга. Участками образования В-клеточного рака являются следующие участки, например, В-клеточная лимфома маргинальной зоны развивается в В-клетках памяти в маргинальной зоне, фолликулярная лимфома и диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома развивается в центроцитах в светлой зоне зародышевых центров; хронический лимфоцитарный лейкоз и мелкоклеточный лимфоцитарный лейкоз развивается в клетках В1 (CD5+); лимфома клеток коры головного мозга развивается в «необученных» В-клетках в зоне коры головного мозга, а лимфома Беркитта развивается в центробластах в темной зоне зародышевых центров. Тканями, которые включают гемопоэтические клетки и которые называются здесь «тканями гемопоэтичеких клеток», являются тимус и костный мозг, а также периферические лимфоидные ткани, такие как селезенка и лимфоузлы; лимфоидные ткани, ассоциированные со слизистой, такие как лимфоидные ткани кишечника, миндалины, Пейеровы бляшки и аппендикс, и лимфоидные ткани, ассоциированные с другими участками слизистой, например выстилка бронхов. Другими конкретными примерами таких раковых заболеваний являются плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарцинома легких, плоскоклеточная карцинома легких, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиома, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой и ободочной кишки, карцинома эндометрия или матки, карцинома слюнных желез, рак почек, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени, лейкоз и другие лимфопролиферативные расстройства, и различные типы рака головы и шеи.
Используемый здесь термин «В-клеточная злокачественная опухоль» охватывает неходжкинскую лимфому (НХЛ), включая низкозлокачественную/фолликулярную НХЛ, мелкоклеточную лимфоцитарную (МЛ) НХЛ, среднезлокачественную/фолликулярную НХЛ, среднезлокачественную диффузную НХЛ, высокозлокачественную иммунобластную НХЛ, высокозлокачественную лимфобластную НХЛ, высокозлокачественную мелкоклеточную недифференцированную НХЛ, генерализованную НХЛ, лимфому клеток коры головного мозга, лимфому, ассоциированную со СПИДом и макроглобулинемию Вальденстрема; неходжкинскую лимфому (НХЛ), лимфоцитарную предоминантную болезнь Ходжкина (ЛПБХ), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (МЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), бессимптомную НХЛ, включая рецидивирующую бессимптомную НХЛ и бессимптомную НХЛ, не поддающуюся лечению ритуксимабом; лейкоз, включая острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), ретикулоэндотелиоз, хронический миелобластный лейкоз; лимфому клеток коры головного мозга и другие гематологические злокачественные опухоли. Такие злокачественные заболевания могут быть подвергнуты лечению антителами против маркеров В-клеточной поверхности, таких как CD79b. Такие заболевания рассматриваются здесь как заболевания, которые могут быть подвергнуты лечению путем введения антитела против маркера В-клеточной поверхности, такого как CD79b, где указанное лечение включает введение неконъюгированного («оголенного») антитела или антитела, конъюгированного с цитотоксическим средством, описанным в настоящей заявке. Такие заболевания также рассматриваются здесь как заболевания, которые могут быть подвергнуты лечению методами комбинированной терапии, включающей введение анти-CD79b антитела или конъюгата «анти-CD79b антитело-лекарственное средство» согласно изобретению в комбинации с введением другого антитела или другого конъюгата «антитело-лекарственное средство», или другого цитотоксического средства, с лучевой терапией или другим курсом терапии, проводимым одновременно или последовательно. В репрезентативном способе лечения согласно изобретению, анти-CD79b антитело согласно изобретению вводят в комбинации с анти-CD20 антителом, иммуноглобулином или его CD20-связывающим фрагментом, и такое лечение может быть проведено одновременно или последовательно. Анти-CD20 антителом может быть «оголенное» антитело или конъюгат «антитело-лекарственное средство». В варианте комбинированной терапии анти-CD79b антителом является антитело согласно изобретению, а анти-CD20 антителом является Rituxan (ритуксимаб).
Используемый здесь термин “неходжкинская лимфома” или «НХЛ» означает рак лимфатической системы, за исключением лимфомы Ходжкина. В общих чертах, лимфомы Ходжкина и неходжкинские лимфомы могут отличаться тем, что в лимфоме Ходжкина присутствуют клетки Рида-Штернберга, а в неходжкинской лимфоме эти клетки отсутствуют. Примерами неходжкинских лимфом, охватываемых используемым здесь термином, являются все лимфомы, которые могут быть идентифицированы специалистом в данной области (например, онкологом или патологом) в соответствии с известными схемами классификации, такими как Пересмотренная Евро-Американская схема классификации лимфом (REAL), описанная в “Цветном атласе клинической гематологии” (3-е издание) (Color Atlas of Clinical Hematology (3rd edition), A. Victor Hoffbrand and John E.Pettit (eds.)(Harcourt Publishers Ltd., 2000). См., в частности, списки, представленные на фиг.11.57, 11.58 и 11.59. Более конкретными примерами таких лимфом являются, но не ограничиваются ими, рецидивирующая или не поддающаяся лечению НХЛ; пограничная низкозлокачественная НХЛ первой линии; НХЛ на стадии III/IV; НХЛ, резистентная к химиотерапии; лимфобластный лейкоз и/или лимфома, содержащая В-клетки-предшественники; мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома; В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз и/или пролимфоцитарный лейкоз и/или мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома; В-клеточная пролимфоцитарная лимфома; иммуноцитома и/или лимфоплазматическая лимфома; лимфоплазмацитарная лимфома; В-клеточная лимфома маргинальной зоны; лимфома маргинальной зоны селезенки; лимфома экстранодальной маргинальной зоны - MALT; нодальная лимфома маргинальной зоны; ретикулоэндотелиоз; плазмацитома и/или плазмаклеточная миелома; низкозлокачественная/фолликулярная лимфома; среднезлокачественная/фолликулярная НХЛ; лимфома коры головного мозга; фолликулярно-центроклеточная лимфома (фолликулярная); среднезлокачественная диффузная НХЛ; диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома; агрессивная НХЛ (включая агрессивную пограничную и агрессивную рецидивирующую НХЛ); НХЛ, рецидивирующая после трансплантации аутологичных стволовых клеток, или НХЛ, резистентная к такой трансплантации; первичная медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома; первичная эффузионная лимфома; высокозлокачественная иммунобластная НХЛ; высокозлокачественная лимфобластная НХЛ; высокозлокачественная мелкоклеточная недифференцированная НХЛ; генерализованная НХЛ; лимфома Беркитта; гранулоцитарный крупноклеточный лейкоз клеток-предшественников (периферических); грибовидный микоз и/или синдром Сезари; лимфома кожи (кожная лимфома); анапластическая крупноклеточная лимфома и ангиоцентрическая лимфома.
Термин «расстройство» означает любое состояние, которое восприимчиво к лечению веществом/молекулой или способом согласно изобретению. Такими расстройствами являются хронические и острые расстройства или заболевания, включая патологические состояния, которые создают у данного млекопитающего предрасположенность к рассматриваемому расстройству. Неограничивающими примерами описанных здесь расстройств, подвергаемых лечению, являются раковые заболевания, такие как злокачественные и доброкачественные опухоли; не являющиеся лейкозом, и лимфоидные злокачественные опухоли; поражения нейронов, глиальных клеток, астроцитов, гипоталамуса и другие поражения эндокринной системы, макрофагов, эпителия, стромы и бластоцеля; воспалительные и иммунные растройства и другие расстройства, ассоциированные с ангиогенезом. Кроме того, такими расстройствами также являются раковые заболевания, такие как В-клеточные пролиферативные расстройства и/или В-клеточные опухоли, например, лимфома, неходжкинская лимфома (НХЛ), агрессивная НХЛ, рецидивирующая агрессивная НХЛ, рецидивирующая бессимптомная НХЛ, не поддающаяся лечению НХЛ, не поддающаяся лечению бессимптомная НХЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, лейкоз, ретикулоэндотелиоз (РЭ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и лимфома клеток коры головного мозга.
Термины “клеточно-пролиферативное расстройство” и “пролиферативное расстройство” означают расстройства, ассоциированные с определенной степенью аномальной пролиферации клеток. В одном из вариантов изобретения указанным клеточно-пролиферативным расстройством является рак.
Используемый здесь термин “опухоль” означает все неопластические клетки, подвергающиеся росту и пролиферации, независимо от того, являются ли они доброкачественными или злокачественными, и все предраковые и раковые клетки и ткани.
Используемый здесь термин “аутоиммунное заболевание” означает заболевание или расстройство, вызываемое реакцией, продуцируемой организмом против своих собственных тканей или органов, либо ко-сегрегацию или манифестацию этих расстройств или ассоциированное с ними состояние. При многих таких аутоиммунных и воспалительных расстройствах может присутствовать определенное число клинических лабораторных маркеров, включая, но не ограничиваясь ими, гипергаммаглобулинемия, высокие уровни аутоантител, осаждение комплекса «антиген-антитело» в тканях, благоприятный эффект лечения кортикостероидами или иммунодепрессантами и агрегаты лимфоидных клеток в пораженных тканях. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией относительно В-клеточного аутоиммунного заболевания, можно сказать, что при человеческих аутоиммунных заболеваниях В-клетки демонстрируют свое патогенное действие по множеству механизмов, включая продуцирование аутоантител, образование иммунных комплексов, активацию дендритных клеток и Т-клеток, синтез цитокинов, прямое высвобождение хемокинов и появление очага эктопического неолимфогенеза. Каждый из этих механизмов в той или иной степени может участвовать в развитии аутоиммунных заболеваний.
«Аутоиммунным заболеванием» может быть орган-специфическое заболевание (то есть иммунный ответ конкретно направлен на систему органов, такую как эндокринная система, гемопоэтическая система, кожа, сердечно-легочная система, желудочно-кишечный тракт и печень, а также почечная система, щитовидная железа, уши, нервно-мышечная система, центральная нервная система и т.п.) или системное заболевание, которое может поражать системы многих органов (например, системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит, полимиозит и т.п.). Предпочтительно такими заболеваниями являются аутоиммунные ревматологические расстройства (такие как, например, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, склеродермия, волчанка, такая как СКВ и волчаночный нефрит, полимиозит/дерматомиозит, криоглобулинемия, синдром антифосфолипидных антител и псориатический артрит), аутоиммунные заболевания желудочно-кишечного тракта и болезни печени (такие как, например, воспалительные заболевания кишечника (например, язвенный колит и болезнь Крона), аутоиммунный гастрит и пернициозная анемия, аутоиммунный гепатит, первичный биллиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит и глютеновая болезнь), васкулит (такой как, например, ANCA-негативный васкулит и ANCA-ассоциированный васкулит, включая васкулит Черга-Штраусса, гранулематоз Вегенера и микроскопический полиангиит), аутоиммунные нервные расстройства (такие как, например, рассеянный склероз, синдром пляшущих глаз, тяжелая миастения, нейромиелит зрительного нерва, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и аутоиммунная полиневропатия), болезни почек (такие как, например, гломуролонефрит, синдром Гудпасчера и болезнь Бергера), аутоиммунные кожные болезни (такие как, например, псориаз, крапивница, сыпи, вульгарная пузырчатка, буллезный пемфигоид и кожная красная волчанка), гематологические расстройства (такие как, например, тромбоцитопеническая пурпура, тромбоцитарная тромбоцитопеническая пурпура, пурпура, возникающая после переливания крови, и аутоиммунная гемолитическая анемия), атеросклероз, увеит, аутоиммунные заболевания слуховых путей (такие как, например, заболевание внутреннего уха и потеря слуха), болезнь Бехчета, синдром Рейно, заболевание, ассоциированное с трансплантацией органов, и аутоиммунные заболевания эндокринной системы (такие как, например, аутоиммунные заболевания, ассоциированные с диабетом, такие как инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), болезнь Аддисона и аутоиммунное заболевание щитовидной железы (например, болезнь Грейвса и тиреоидит)). Из указанных заболеваний более предпочтительными являются, например, ревматоидный артрит, язвенный колит, ANCA-ассоциированный васкулит, волчанка, рассеянный склероз, синдром Шегрена, болезнь Грейвса, ИЗСД, пернициозная анемия, тиреоидит и гломерулонефрит.
Конкретными примерами других аутоиммунных заболеваний, указанных в настоящей заявке, которые в некоторых случаях охватывают перечисленные выше заболевания, являются, но не ограничиваются ими, артрит (острый и хронический артрит, ревматоидный артрит, включая ювенильный ревматоидный артрит и его стадии, такие как ревматоидный синовит, подагра или подагрический артрит, острый иммунный артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, артрит, индуцированный коллагеном типа II, инфекционный артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла, артрит позвонков, остеоартрит, проградиентный хронический артрит, деформирующий артрит, хронический первичный полиартрит, реактивный артрит, климактерический артрит, артрит, вызываемый истощением эстрогена, и анкилозирующий спондилит/ревматоидный спондилит), аутоиммунное лимфопролиферативное заболевание, воспалительные гиперпролиферативные заболевания кожи, псориаз, такой как бляшковый псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей; атопии, включая атопические заболевания, такие как сенная лихорадка и синдром Джоба; дерматит, включая контактный дерматит, хронический контактный дерматит, эксфолиативный дерматит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, крапивницу, герпетиформный дерматит, монетовидный дерматит, себорейный дерматит, неспецифический дерматит, первичный простой контактный дерматит и атопический дерматит; сцепленный с Х-хромосомой гипер-IgM-синдром, аллергические внутриглазные воспалительные заболевания, крапивница, такая как хроническая аллергическая крапивница и хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, миозит, полимиозит/дерматомиозит, ювенильный дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, склеродермия (включая системную склеродермию), склероз, такой как системный склероз, рассеянный склероз (РС), такой как РС, сопровождающийся нарушением функции спинного мозга и органов зрения, первичный прогрессирующий РС (ППРС) и рецидивирующий-ремитирующий РС (РРРС), прогрессирующий системный склероз, атеросклероз, артериосклероз, рассеянный (множественный) склероз, атаксический склероз, нейромиелит зрительного нерва (НЗН), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК)(например, болезнь Крона, аутоиммунные желудочно-кишечные расстройства, воспаления желудочно-кишечного тракта, колиты, такие как язвенный колит, неспецифический язвенный колит, микроскопический колит, коллагенозный колит, полипозный колит, некрозирующий энтероколит и трансмуральный колит, и аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника); воспаление кишечника, гангренозная пиодермия, узелковая эритема, первичный склерозирующий холангит, респираторный дистресс-синдром, включая респираторный дистесс-синдром взрослых (РДСВ) или острый респираторный дистресс-синдром, менингит, воспаление всего увеального тракта или его части, ирит, хороидит, аутоиммунное гематологическое расстройство, реакция «трансплантат против хозяина», ангиоэдема, такая как наследственная ангиоэдема, поражение черепного нерва, как при менингите, герпес беременных, пемфигоид беременных, зуд в области мошонки, аутоиммунное преждевременное угасание функции яичника, внезапная потеря слуха, вызываемая аутоиммунным состоянием, IgE-опосредуемые заболевания, такие как анафилаксия и аллергический и атопический ринит, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена и энцефалит с поражением конечностей и/или ствола головного мозга, увеит, такой как передний увеит, острый передний увеит, грануломатозный увеит, негрануломатозный увеит, факоантигенный увеит, задний увеит или аутоиммунный увеит, гломерулонефрит (ГН) с нефротическим синдромом или без нефротического синдрома, такой как хронический или острый гломерулонефрит, такой как первичный ГН, иммуноопосредованный ГН, мембранозный ГН (мембранозная нефропатия), идиопатический мембранозный ГН или идиопатическая мембранозная нефропатия, мембранозный или мембранозно-пролиферативный ГН (МПГН), включая гломерулонефрит типа I и типа II, и быстро прогрессирующий ГН (БПГН), пролиферативный нефрит, аутоиммунная плюригландулярная эндокринная недостаточность, баланит, включая плазмаклеточный огибающий баланит, баланопостит, кольцевая центробежная эритема, пепельный дерматоз, многоформная эритема, кольцевидная гранулема, блестящий лишай, склеротический атрофический лишай, простой хронический лишай, шиповидный лишай, плоский лишай, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предраковый кератоз, гангренозная пиодермия, аллергические состояния и ответы, пищевые аллергии, аллергии на лекарственные средства, аллергии на насекомых, редкие аллергические расстройства, такие как мастоцитоз, аллергические реакции, экзема, включая аллергическую или атопическую экзему, астеатопическую экзему, дисгидротическую экзему и пузырчатую ладонно-подошвенную экзему; астма, такая как бронхиальная астма и аутоиммунная астма; состояния, вызываемые инфильтрацией Т-клеток и хронические воспалительные ответы, иммунные реакции против чужеродных антигенов, таких как антигены группы крови А-В-О плода, продуцируемые при беременности, хроническое воспалительное заболевание легких, аутоиммунный миокардит, недостаточная адгезия лейкоцитов; волчанка, включая волчаночный нефрит, волчаночный энцефалит, детскую волчанку, непочечную волчанку, внепочечную волчанку, дискоидную волчанку, дискоидную красную волчанку и волчаночную алопецию; системная красная волчанка (СКВ), такая как кожная СКВ или подострая кожная СКВ, волчаночный синдром новорожденных (ВСР) и диссеминированная красная волчанка; юношеский сахарный диабет (типа I), включая детский инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД), сахарный диабет взрослых (диабет типа II), аутоиммунный диабет, идиопатический несахарный диабет, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, диабетический колит, диабетическое поражение крупных артерий; иммунные реакции, ассоциированные с острой гиперчувствительностью замедленного типа, опосредуемой цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, включая лимфоматоидный гранулематоз, агранулоцитоз; васкулитиды (включая васкулит крупных кровеносных сосудов, такой как ревматическая полимиалгия и гигантоклеточный артериит (Такаясу), васкулит средних кровеносных сосудов, такой как болезнь Кавазаки и узелковый полиартериит/узелковый периартериит, иммуноваскулит, васкулит ЦНС, кожный васкулит, аллергический васкулит, некрозирующий васкулит, такой как фибриноидный некрозирующий васкулит и системный некрозирующий васкулит, ANCA-негативный васкулит, ANCA-ассоциированный васкулит, такой как синдром Черга-Штраусса (СЧШ), гранулематоз Вегенера, и микроскопический полиангиит), височный артериит, апластическая анемия, аутоиммунная апластическая анемия, позитивная анемия Кумбса, анемия Даймонда-Блекфана, гемолитическая анемия или имунная гемолитическая анемия, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (АИГА), злокачественная анемия (пернициозная анемия), болезнь Аддисона, истинная эритроцитарная анемия или аплазия (ИЭА), дефицит фактора VIII, гемофилия А, аутоиммунная нейтропения, цитопения, такая как панцитопения, лейкопения, заболевания, приводящие к диапедезу лейкоцитов, воспалительные расстройства ЦНС, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром поражения многих органов, такой как вторичный синдром, ассоциированный с сепсисом, травмой или геморрагией; заболевания, опосредуемые образованием комплекса “антиген-антитело”, болезнь гломерулярных базальных мембран, катализируемая реакцией антитело-антиген, антифосфолипидный синдром, нейрит двигательного нерва, аллергический нейрит, болезнь/синдром Бехчета, синдром Кастелмана, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Сьегрена, синдром Стивенса-Джонсона, пемфигоид или пузырчатка, такой как буллезный пемфигоид, рубцующийся пемфигоид (слизистой оболочки), кожный пемфигоид, пузырчатка вульгарная, паранеопластическая пузырчатка, пузырчатка листовидная, пемфигоид слизистых оболочек-мембранозный пемфигоид и пузырчатка эритематозная, приобретенный буллезный эпидермолиз, воспаление глаз, предпочтительно аллергическое воспаление глаз, такое как аллергический конъюнктивит, буллезное заболевание, ассоциированное с линейным IgA, воспаление конъюнктивы, индуцированное аутоиммунным заболеванием, аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь или синдром Райтера, ожоговая травма, вызванная аутоиммунным заболеванием, преэклампсия, болезнь иммунных комплексов, такая как нефрит иммунных комплексов, антитело-опосредуемый нефрит, нейровоспалительные расстройства, полиневропатии, хроническая невропатия, такая как IgM-полиневропатия или IgM-опосредованная невропатия, тромбоцитопения (например, развивающаяся у пациента с инфарктом миокарда), включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП), посттрансфузионную пурпуру (ПТП), индуцированную гепарином тромбоцитопению, и аутоиммунную или иммуно-опосредованную тромбоцитопению, включая, например, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), включая хроническую или острую ИТП; склерит, такой как идиопатический кератосклерит, эписклерит, аутоиммунное заболевание яичек и яичника, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоидит, гипопаратиреоидит, аутоиммунные эндокринные заболевания, включая тиреоидит, такой как аутоиммунный тиреоидит, болезнь Хашимото, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), или подострый тиреоидит, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, идиопатический гипотиреоидит, болезнь Грейвса, глазная болезнь Грейвса (офтальмопатия или офтальмопатия, ассоциированная с поражением щитовидной железы), плюригландулярные синдромы, такие как аутоиммунные плюригландулярные синдромы, например, типа I (или синдромы плюригландулярной эндокринопатии), паранеопластические синдромы, включая неврологические паранеопластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром Итона-Ламберта, синдром “негнущегося человека”, энцефаломиелит, такой как аллергический энцефаломиелит (или encephalomyelitis allergica) и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ), тяжелая миастения, такая как тяжелая миастения, ассоциированная с тимомой, дегенерация мозжечка, невромиотония, опсоклонус или синдром “пляшущих глаз” (СПГ) и невропатия органов чувств, мультифокальная невропатия двигательной системы, синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит, волчаночный гепатит, гигантоклеточный гепатит, хронический активный гепатит или аутоиммунный хронический активный гепатит, пневмонит, такой как лимфоидный интерстициальный пневмонит (ЛИП), облитерирующий бронхиолит (не передающийся, в отличие от NSIP); синдром Гийена-Барре, болезнь Бергера (IgA-нефропатия), идиопатическая IgA-нефропатия, линейный IgA-дерматоз, острый фебрильный нейтрофильный дерматоз, субкорнеальный пустулезный дерматоз, преходящий акантолитический дерматоз, цирроз, такой как первичный билиарный цирроз и пневмоцирроз, синдром аутоиммунной энтеропатии, заболевание кишечника или целиакия, кишечная спру (глютеновая энтеропатия), не поддающаяся лечению спру, идиопатическая спру, криоглобулинемия, такая как смешанная криоглобулинемия, амилотрофический боковой склероз (АБС; болезнь Луи Герига), ишемическая болезнь сердца; аутоиммунное заболевание уха, такое как аутоиммунное заболевание внутреннего уха (АЗВУ); аутоиммунная потеря слуха; полихондрит, такой как не поддающийся лечению или рецидивирующий полихондрит; легочный альвеолярный протеиноз, кератит, такой как синдром Когана/несифилитический интерстициальный кератит, паралич Белла, болезнь/синдром Свита, аутоиммунная розацея, боли, ассоциированные с опоясывающим лишаем, амилоидоз, нераковый лимфоцитоз, первичный лимфоцитоз, включая моноклональный В-клеточный лимфоцитоз (например, доброкачественную моноклональную гаммопатию и моноклональную гаммопатию неясной этиологии, MGUS); периферическая невропатия, паранеопластический синдром; “каналопатии”, такие как эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные расстройства, глухота, слепота, периодический паралич и “каналопатии” ЦНС, аутизм, воспалительная миопатия и очаговый или сегментарный, либо очаговый сегментарный гломерулосклероз (ОСГС), эндокринная офтальмопатия, увеоретинит, хореоретинит, аутоиммунное заболевание печени, фибромиалгия, множественная эндокринная недостаточность, синдром Шмидта, адреналит, атрофия желудка, пресенильная деменция, демиелинизирующие заболевания, такие как аутоиммунные демиелинизирующие заболевания и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, синдром Дресслера, гнездная алопеция, общая алопеция, синдром CREST (кальциноз, феномен Рейно, нарушение моторики пищевода, склеродактилия и телеангиэктазия), аутоиммунное бесплодие у мужчин и женщин, например, вызываемое антителами против сперматозоидов, смешанное заболевание соединительных тканей, болезнь Чагаса, ревматическая лихорадка, привычный выкидыш, болезнь легких у фермеров, многоформная эритема, посткардиотомный синдром, синдром Кушинга, болезнь легких любителей птиц, аллергический гранулематозный ангиит, доброкачественный лимфоцитарный ангиит, синдром Альпорта, альвеолит, такой как аллергический альвеолит и фиброзный альвеолит, интерстициальная болезнь легких, трансфузионная болезнь, лепра, малярия, паразитарные болезни, такие как лейшманиоз, кипаносомоз, шистосомоз, аскариоз, аспергиллез, синдром Сэмптера, синдром Каплана, лихорадка денге, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, диффузный интерстициальный легочный фиброз, интерстициальный легочный фиброз, фиброзный медиастинит, легочный фиброз, идиопатический фиброз легких, кистозный фиброз, эндофталамит, эритема возвышенная стойкая, эритробластоз плода, эозинофильный фасцит, синдром Шульмана, синдром Фелти, фляриоз, циклит, такой как хронический циклит, гетерохронический циклит, иридоциклит (острый или хронический) или циклит Фукса, пурпура Геноха-Шенлейна, инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД), синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), инфекции, вызываемые эховирусом; сепсис (системный синдром, ассоциированный с воспалительным ответом); эндотоксемия; панкреатит; тироксикоз; инфекции, вызываемые парвовирусом; инфекции, вызываемые вирусом коревой краснухи; синдром, развивающийся после вакцинации; наследственная инфекция, вызываемая вирусом коревой краснухи; инфекции, вызываемые вирусом Эпштейна-Барра; паротит, синдром Эванса, аутоиммунная гонадная недостаточность, хорея Сиденгама, пост-стрептококковый нефрит, облитерирующий тромбоангиит, тиротоксикоз, сухотка спинного мозга, хориодит, гигантоклеточная полимиалгия, хронический аллергический пневмонит, конъюнктивит, такой как весенний аллергический конъюнктивит, сухой кератоконъюнктивит, эпидермический кератоконъюнктивит, синдром идиопатического нефрита, нефропатия, характеризующаяся минимальными изменениями почечной ткани, доброкачественные наследственные и вызываемые ишемией реперфузионные нарушения, реперфузионные повреждения при трансплантации органов, аутоиммунное заболевание сетчатки, воспаление суставов, бронхит, хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей/легких, силикоз, афты, афтозный стоматит, артериосклеротические расстройства (недостаточность цереброваскулярной функции), такие как артериосклеротическая энцефалопатия и артериосклеротическая ретинопатия, аспермиогенез, аутоиммунный гемолиз, болезнь Бека, криоглобулинемия, контрактура Дюпюитрена, факоанафилактическая эндофтальмия, аллергический энтерит, нодозная лепроматозная эритема, идиопатический лицевой паралич, синдром хронической усталости, ревматическая лихорадка, синдром Хаммена-Рича; нейросенсорная потеря слуха, пароксизмальная гемоглобинурия, гипогонадизм, регионарный илеит, лейкопения, инфекционный мононуклеоз, поперечный миелит, первичная идиопатическая миксидема, нефроз, симпатическая офтальмия (симпатический офтальмит), офтальмит новорожденных, нейрит зрительного нерва, гранулематозный орхит, панкреатит, острый полирадикулит, гангренозная пиодермия, тиреоидит Кервена, приобретенная атрофия спинного мозга, незлокачественная тимома, лимфофолликулярный тимит, витилиго, синдром токсического шока, отравление пищевыми продуктами, состояния, вызываемые инфильтрацией Т-клеток, недостаточная адгезия лейкоцитов, иммунные ответы, ассоциированные с острой гиперчувствительностью и с гиперчувствительностью замедленного типа, опосредуемой цитокинами и Т-лимфоцитами, заболевания, ассоциированные с диапедезом лейкоцитов, синдром поражения многих органов, заболевания, опосредуемые образованием комплекса “антиген-антитело”, болезнь гломерулярных базальных мембран, катализируемая реакцией “антиген-антитело”, аутоиммунная полиэндокринопатия, оофорит, первичная микседема, аутоиммунный атрофический гастрит, ревматические заболевания, смешанное заболевание соединительных тканей, нефротический синдром, инсулит, полиэндокринная недостаточность, аутоиммунные плюригландулярные синдромы, включая плюригландулярный синдром типа I, идиопатический гипопаратиреоидит взрослых (ИГВ), кардиомиопатия, такая как застойная (дилатационная) кардиомиопатия, такая как застойная кардиомиопатия, приобретенный буллезный эпидермолиз (ПБЭ), гемохроматоз, миокардит, нефротический синдром, первичный склерозирующий холангит, гнойный или негнойный синусит, острый или хронический синусит; решетчатый синусит, фронтит, верхнечелюстной синусит или сфеноидит; аллергический синусит, эозинофильные расстройства, такие как эозинофилия, легочная инфильтрирующая эозинофилия, синдром эозинофилии-миалгии, синдром Лефлера, хроническая эозинофильная пневмония, тропическая легочная эозинофилия, бронхопневмонический аспергиллез, аспергиллема или гранулемы, содержащие эозинофилы; анафилаксия, спондилоартропатии, серонегативные спондилоартриты, полиэндокринное аутоиммунное заболевание, склерозирующий холангит, склерит, эписклерит, хронический слизисто-кожный кандидоз, синдром Брутона, преходящая гипогаммаглобулинемия у детей, синдром Вискотта-Алдрича, синдром атаксии-телеангиэктазии, ангиэктазия, аутоиммунные расстройства, ассоциированные с коллагеновой болезнью, ревматизм, такой как хронический артроревматизм, лимфаденит, реакция на снижение кровяного давления, сосудистая дисфункция, повреждение ткани, сердечно-сосудистая ишемия, гипералгезия, почечная ишемия, ишемия головного мозга и заболевание, сопровождающееся васкуляризацией, аллергические расстройства, ассоциированные с гиперчувствительностью, гломерулонефрит, реперфузионное повреждение, ишемическое реперфузионное повреждение, реперфузионное повреждение миокарда или других тканей, лимфоматозный трахеобронхит, воспалительные дерматозы, дерматозы с компонентами острого воспаления, недостаточность многих органов, буллезные заболевания, некроз коркового вещества почки, острый гнойный менингит или другие воспалительные расстройства центральной нервной системы, воспалительные заболевания глаз и глазницы; синдромы, ассоциированные с трансфузией гранулоцитов; токсичность, индуцированная цитокинами, нарколепсия, острое серозное воспаление, хроническое трудноизлечимое воспаление, пиелит, гиперплазия внутренней оболочки артерии, пептическая язва, вальвувит и эндометриоз. Такие заболевания рассматриваются здесь как заболевания, которые могут быть подвергнуты лечению путем введения антитела, которое связывается с маркером В-клеточной поверхности, таким как CD79b, и такое лечение включает введение неконъюгированного («оголенного») антитела или антитела, конъюгированного с цитотоксическим средством, описанным в настоящей заявке. Такие заболевания также рассматриваются здесь как заболевания, которые могут быть подвергнуты лечению путем проведения комбинированной терапии, включающей введение анти-CD79b антитела или конъюгата «анти-CD79b антитело-лекарственное средство» согласно изобретению в комбинации с другим антителом или конъюгатом «антитело-лекарственное средство», с другим цитотоксическим средством, а также с лучевой терапией или другим способом лечения, проводимого одновременно или последовательно.
Термины «лечение», «терапия» или «ослабление симптомов» означают терапевтическое лечение и профилактические или превентивные меры, которые направлены на предупреждение или замедление (ослабление) нежелательного физиологического изменения или расстройства у индивидуума. Индивидуумом, нуждающимся в лечении, является индивидуум, у которого уже имеется указанное расстройство, а также индивидуум, у которого имеется предрасположенность к развитию такого расстройства, или индивидуум, который нуждается в превентивных мерах по предупреждению такого расстройства. Лечение рака у индивидуума или млекопитающего, в опухолях которых экспрессируется полипептид CD79b, считается успешным, если после введения терапевтического количества анти-CD79b антител способами согласно изобретению у данного пациента наблюдается заметное и/или измеримое снижение числа раковых клеток или их отсутствие; снижение размера опухоли; ингибирование (то есть замедление до некоторой степени, а предпочтительно прекращение) инфильтрации раковых клеток в периферические органы, включая распространение раковых клеток в мягкие ткани и кость; ингибирование (то есть замедление до некоторой степени, а предпочтительно прекращение) метастазирования опухоли; ингибирование до некоторой степени роста опухоли; и/или ослабление до некоторой степени одного или нескольких симптомов, ассоциированных с конкретным раковым заболеванием; снижение заболеваемости и смертности, и улучшение качества жизни этих индивидуумов. Анти-CD79b антитело, в зависимости степени его способности предупреждать рост раковых клеток и/или уничтожать уже имеющиеся раковые клетки, может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Ослабление таких признаков или симптомов может также ощущаться самим пациентом.
Вышеуказанные параметры для оценки эффективности лечения и положительной динамики заболевания могут быть легко определены с помощью рутинных процедур, известных врачу. Что касается лечения рака, то эффективность лечения может быть оценена, например, путем определения времени, прошедшего до прогрессирования заболевания (ТТР), и/или определения скорости ответа (RR). Метастазы могут быть выявлены с помощью анализов на стадии развития опухолей и путем сканирования кости, а также с помощью анализов на уровни кальция и ферментов для определения распространения опухоли в кость. Может быть также проведено сканирование методами компьютерной томографии (КТ) в целях выявления распространения опухоли в область таза и лимфоузлов. Для выявления метастазов опухоли в легкие и печень, соответственно, может быть сделана рентгенограмма грудной клетки и проведено измерение уровней ферментов в печени известными методами. Другими рутинными методами мониторинга заболевания являются трансректальная ультразвуковая эхография (ТУЭ) и трансректальная биопсия (ТБ).
Что касается рака мочевого пузыря, который является более четко локализованным раковым заболеванием, то способы определения прогрессирования данного заболевания включают цитологический анализ мочи под цистоскопом, мониторинг присутствия крови в моче, визуализацию уротелиального тракта путем проведения эхографии или внутривенной пиелографии, компьютерной томографии (КТ) и визуализации методом магнитного резонанса (МР). Присутствие периферических метастазов может быть оценено с помощью КТ брюшной полости, по рентгенограмме грудной клетки или радионуклидной визуализации скелета.
«Постоянное» введение, в отличие от однократного введения, означает введение средства (средств) в непрерывном режиме, что позволяет поддерживать постоянное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени. «Периодическое» введение означает введение, которое не является непрерывным, а проводится циклами.
Термин «индивидуум» означает позвоночное. В некоторых вариантах изобретения указанным позвоночным является млекопитающее. Млекопитающими являются, но не ограничиваются ими, сельскохозяйственные животные (такие как коровы), животные, участвующие в спортивных состязаниях, животные-компаньоны (такие как кошки, собаки и лошади), приматы, мыши и крысы. В некоторых вариантах изобретения указанным млекопитающим является человек.
«Млекопитающее», которое может быть подвергнуто лечению или ослаблению симптомов рака, означает любое животное, классифицированное как млекопитающее, включая человека, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных, содержащихся в зоопарках, животных, участвующих в спортивных состязаниях, или животных-компаньонов, таких как собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошадей, овец, свиней, коз, кроликов и т.п. Предпочтительным млекопитающим является человек.
Термин «введение в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами» включает одновременное (конкурентное) и последовательное введение в любом порядке.
Используемый здесь термин «носители» включает фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, являющиеся нетоксичными для клеток, в которые их вводят, или для млекопитающих, которым вводят эти носители, наполнители или стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях. В большинстве случаев физиологически приемлемым носителем является водный рН-забуференный раствор. Примерами физиологически приемлемых носителей являются буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; полипептид с низкой молекулярной массой (менее чем примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; спирты ряда сахаров, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и PLURONICS.
Термин «твердая фаза» или «твердый носитель» означает безводную матрицу, на которую может быть нанесено или к которой может быть присоединено антитело согласно изобретению. Примерами твердых фаз, рассматриваемых в настоящей заявке, являются твердые фазы, полученные частично или полностью из стекла (например, стекла с регулируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливинилового спирта и силиконов. В некоторых вариантах изобретения, в зависимости от контекста описания, твердая фаза может представлять собой лунку аналитического планшета, а в других вариантах изобретения такой твердой фазой является колонка для очистки (например, колонка для аффинной хроматографии). Этот термин также включает неоднородную твердую фазу, состоящую из дискретных частиц, например фазу, описанную в патенте США № 4275149.
«Липосома» представляет собой небольшую везикулу, состоящую из липидов различных типов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которые могут быть использованы для доставки лекарственного средства (такого как анти-CD79b антитело) млекопитающему. Компоненты липосомы обычно расположены так, что они образуют бислой, аналогичный липидной структуре биологических мембран.
«Небольшая» молекула или «небольшая» органическая молекула определяется здесь как молекула, имеющая молекулярную массу примерно ниже 500 Дальтон.
Термин «индивидуум», «особь» или «пациент» означает позвоночное. В некоторых вариантах изобретения указанным позвоночным является млекопитающее. Млекопитающими являются, но не ограничиваются ими, сельскохозяйственные животные (такие как коровы), животные, участвующие в спортивных состязаниях, животные-компаньоны (такие как кошки, собаки и лошади), приматы, мыши и крысы. В некоторых вариантах изобретения указанным млекопитающим является человек.
Термин «фармацевтическая композиция» означает препарат, который, при его приготовлении в данной форме, обеспечивает эффективное биологическое действие активного ингредиента и не содержит других компонентов, которые могут быть чрезмерно токсичными для индивидуума, которому вводят указанный препарат. Такой препарат может быть стерильным.
«Стерильный» препарат является асептическим, то есть он не содержит живых микроорганизмов и их спор.
Используемый здесь термин «эффективное количество» антитела означает количество, достаточное для достижения конкретных целей. «Эффективное количество», в зависимости от конкретной цели, может быть определено эмпирически и рутинным способом.
Термин “терапевтически эффективное количество” означает количество антитела или другого лекарственного средства, эффективного для «лечения» заболевания или расстройства у индивидуума или млекопитающего. В случае рака такое терапевтически эффективное количество лекарственного средства может снижать число раковых клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени, а предпочтительно прекращать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени, а предпочтительно прекращать) развитие метастазов опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли; и/или ослаблять до некоторой степени один или несколько симптомов, ассоциированных с раком. См. определение термина «лечение». Лекарственное средство до некоторой степени может предотвращать рост раковых клеток и/или уничтожать раковые клетки, и такое лекарственное средство может иметь цитостатическое и/или цитотоксическое действие. Термин «профилактически эффективное количество» означает количество, которое, при его введении в нужной дозе или в течение необходимого периода времени, является эффективным для достижения нужного профилактического результата. Поскольку профилактическая доза вводится индивидууму до начала развития заболевания или на ранней стадии его развития, то обычно, но необязательно, профилактически эффективное количество должно быть меньше терапевтически эффективного количества.
«Рост-ингибирующее количество» анти-CD79b антитела представляет собой количество, способное ингибировать рост клеток, а в частности опухоли, например, раковых клеток, либо in vitro, либо in vivo. «Рост-ингибирующее количество» анти-CD79b антитела, используемое в целях ингибирования роста опухолевых клеток, может быть определено эмпирически и рутинным способом.
«Цитотоксическое количество» анти-CD79b антитела представляет собой количество, способное вызывать деструкцию клеток, а в частности опухоли, например, раковых клеток, либо in vitro, либо in vivo. «Цитотоксическое количество» анти-CD79b антитела, используемое в целях ингибирования роста опухолевых клеток, может быть определено эмпирически и рутинным способом.
«CD79b-экспрессирующей клеткой» является клетка, которая экспрессирует эндогенный или трансфицированный полипептид CD79b, либо на клеточной поверхности, либо в секретируемой форме. «Раковая опухоль, экспрессирующая CD79b» представляет собой раковую опухоль, содержащую клетки, которые имеют на своей поверхности полипептид CD79b или продуцируют и секретируют полипептид CD79b. «Раковая опухоль, экспрессирующая CD79b» продуцирует, но необязательно, достаточные уровни полипептида CD79b на клеточной поверхности, что позволяет анти-CD79b антителу связываться с этим полипептидом и оказывать терапевтическое действие на раковое заболевание. В другом варианте изобретения «раковая опухоль, экспрессирующая CD79b» продуцирует и секретирует, но необязательно, достаточные уровни полипептида CD79b, что позволяет анти-CD79b антителу-антагонисту связываться с этим полипептидом и оказывать терапевтическое действие на раковое заболевание. В последнем случае указанным антагонистом может быть антисмысловой олигонуклеотид, который снижает, ослабляет, ингибирует или предупреждает продуцирование и секрецию секретируемого полипептида CD79b опухолевыми клетками. Раковой опухолью, которая «сверхэкспрессирует» полипептид CD79b, является опухоль, имеющая значительно более высокие уровни полипептида CD79b на клеточной поверхности, или продуцирует и секретирует такие более высокие уровни по сравнению с нераковыми клетками тканей того же типа. Такая сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией гена или повышением уровня транскрипции или трансляции. Сверхэкспрессия полипептида CD79b может быть определена с помощью детектирующего или прогностического анализа путем оценки повышения уровней белка CD79b, присутствующего на поверхности клетки, или секретируемого клеткой (например, с помощью иммуногистохимического анализа с использованием анти-CD79b антител, продуцируемых против выделенного полипептида CD79b, который может быть получен методами рекомбинантных ДНК из выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CD79b; FACS-анализа и т.п.). Альтернативно или дополнительно, уровни нуклеиновой кислоты или мРНК, кодирующей полипептид CD79b, в клетках могут быть измерены посредством флуоресцентной гибридизации in situ с использованием нуклеиновокислотного зонда, соответствующего CD79b-кодирующей нуклеиновой кислоте или ее комплементу (FISH; см. заявку WO98/45479, опубликованную в октябре 1998 г.), с помощью саузерн-блот-анализа, нозерн-блот-анализа или методами на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), такой как количественная ПЦР в реальной времени (ОТ-ПЦР). Может быть также проведен анализ на сверхэкспрессию полипептида CD79b путем измерения уровня «слущивания» антигена в биологическую жидкость, такую как сыворотка, например, с помощью анализов на основе антител (см. также патент США № 4933294, выданный 12 июня 1990 г.; заявку WO91/05264, опубликованную 18 апреля 1991 г.; патент США № 5401638, выданный 28 марта 1995 г.; и Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Помимо вышеописанных анализов, специалистами в данной области могут быть проведены различные анализы in vivo. Так, например, клетки в организме пациента могут быть подвергнуты контактированию с антителом, которое помечено, но необязательно, детектируемой меткой, например, радиоактивным изотопом, а связывание антитела с клеткой данного пациента может быть оценено, например, путем внешнего сканирования на радиоактивность или путем анализа биоптата, взятого у пациента, которому было введено это антитело.
Используемый здесь термин «иммуноадгезин» означает антитело-подобные молекулы, которые обладают специфичностью связывания гетерологичного белка («адгезина») в комбинации с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. По своей структуре иммуноадгезины содержат гибрид аминокислотной последовательности, обладающей нужной специфичностью связывания, но не являющейся антиген-распознающей последовательностью и антигенсвязывающим сайтом антитела (то есть является «гетерологичным»), и последовательности константного домена иммуноглобулина. Адгезиновая часть молекулы иммуноадгезина обычно представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере сайт связывания с рецептором или лигандом. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине может происходить от любого иммуноглобулина, такого как иммуноглобулин подтипов IgG-1, IgG-2, IgG-3 или IgG-4, IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM.
Используемый здесь термин «метка» означает детектируемое соединение или композицию, которые непосредственно или опосредованно конъюгированы с антителом, так, чтобы они образовывали «меченое» антитело. Такая метка, сама по себе, может быть детектируемой (например, метки-радиоизотопы или флуоресцентные метки), или, в случае ферментативной метки, она может катализировать химическую модификацию соединения-субстрата или композицию, которая является детектируемой.
211
131
125
90
186
188
212
32
Используемый здесь термин “цитотоксический агент” означает вещество, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает деструкцию клеток. Этот термин включает радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, 153Sm, Bi, Р и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты, например, метотрексат, адриамицин, винкаалкалоиды (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты, ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, происходящие от бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые и противораковые агенты, описанные ниже. Другие цитотоксические агенты описаны ниже. Опухолецидное средство вызывает деструкцию опухолевых клеток.
«Токсин» представляет собой любое вещество, способное оказывать ингибирующее действие на рост или пролиферацию клетки.
«Химиотерапевтическое средство» представляет собой химическое соединение, которое, независимо от механизма его действия, может быть использовано для лечения рака. Классами химиотерапевтических средств являются, но не ограничиваются ими, алкилирующие агенты, антиметаболиты, алкалоиды веретена ядовитых растений, цитотоксические/противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомеразы, антитела, фотосенсибилизирующие агенты и ингибиторы киназы. Химиотерапевтическими средствами являются соединения, используемые в «терапии направленного действия» и в стандартной химиотерапии. Примерами химиотерапевтических средств являются эрлотиниб (TARCEVA; Genentech/OSI Pharm.), доцетаксел (TAXOTERE, Sanofi-Aventis), 5-FU (фторурацил, 5-фторурацил, CAS No. 51-21-8), гемцитабин (GEMZAR, Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), цисплатин (цис-диамин, дихлорплатина(II), CAS No. 15663-27-1), карбоплатин (CAS No. 41575-94-4), паклитаксел (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), трастузумаб (HERCEPTIN, Genentech), темозоломид (4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8-пентазабицикло-[4.3.0]-нона-2,7,9-триен-9-карбоксамид, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR, TEMODAL, Schering Plough), тамоксифен ((Z)-2-[4-(1,2-дифенилбут-1-енил)фенокси]-N,N-диметил-этанамин, NOLVADEX, ISTUBAL, VALODEX), и доксорубицин (ADRIAMYCIN), Akti-1/2, HPPD и рапамицин.
Другими примерами химиотерапевтических средств являются оксалиплатин (ELOXATIN, Sanofi), бортезомиб (VELCADE, Millennium Pharm.), сутент (SUNITINIB, SU11248, Pfizer), летрозол (FEMARA, Novartis), мезилат иматиниба (GLEEVEC, Novartis), XL-518 (ингибитор Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (ингибитор Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (ингибитор PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (ингибитор PI3K, Novartis), XL-147 (ингибитор PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), фульвестрант (FASLODEX, AstraZeneca), лейковорин (фолиновая кислота), рапамицин (sirolimus, RAPAMUNE, Wyeth), лапатиниб (TYKERB, GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафарниб (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), сорафиниб (NEXAVAR, BAY43-9006, Bayer Labs), гефитиниб (IRESSA, AstraZeneca), иринотекан (CAMPTOSAR, CPT-11, Pfizer), типифарниб (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (не содержащий кремофора), сконструированные на основе альбумина композиции наночастиц паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), вандетаниб (rINN, ZD6474, ZACTIMA, AstraZeneca), хлорамбуцил, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), темсиролимус (TORISEL, Wyeth), пазопаниб (GlaxoSmithKline), канфосфамид (TELCYTA, Telik), тиотепа и цислофосфамид (CYTOXAN, NEOSAR); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его адозелезиновые, карзелезиновые и бизелезиновые синтетические аналоги); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая его синтетические аналоги, KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорофосфамид, экстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый аналог горчичного газа; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, а в частности калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., (1994) 33: 183-186); динемицин, включая динемицин А; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин, а также неокарзиностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибиотики-хромофоры), аклациномизины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицины, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин и зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин и триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн и тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин и флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон; антиадренергические средства, такие как аминоглютетимид, митотан и трилостан; средство, восполняющее недостаток фолиевой кислоты, такое как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; эльфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и анзамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофилиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенаузоновая кислота; триазиквон; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (“Ara-C”); циклофосфамид; тиотепа; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин, этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин (NAVELBINE); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; капецитабин (XELODA, Roche); ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДМФО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные всех вышеуказанных соединений.
В определение термина «химиотерапевтическое средство» также входят: (i) антигормональные средства, регулирующие или ингибирующие действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая NOLVADEX, цитрат тамоксифена), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и FARESTON (цитрат торемифена); (ii) ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу и регулируют продуцирование эстрогенов в коре надпочечника, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, MEGASE (ацетат мегестрола), AROMASIN (эксеместан, Pfizer), форместанин, фадрозол, RIVISOR (ворозол), FEMARA (летрозол, Novartis) и ARIMIDEX (анастрозол, AstraZeneca); (iii) антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также троксацитабин (нуклеозидный цитозиновый аналог 1,3-диоксолана); (iv) ингибиторы протеинкиназы, такие как ингибиторы МЕК (WO 2007/044515); (v) ингибиторы липид-киназы; (vi) антисмысловые олигонуклеотиды, а в частности олигонуклеотиды, ингибирующие экспрессию генов путей передачи сигнала, участвующих в пролиферации нежелательных клеток, таких как, например, PKC-альфа, Ralf и H-Ras, такие как облимерсен (GENASENSE, Genta Inc.); (vii); рибозимы, такие как ингибиторы экспрессии VEGF (например, ANGIOZYME) и ингибиторы экспрессии HER2; (viii) вакцины, такие как вакцины для генотерапии, например, вакцина ALLOVECTIN, вакцина LEUVECTIN и вакцина VAXID; rIL-2 PROLEUKIN; ингибиторы топоизомеразы 1, такие как LURTOTECAN; rmRH ABARELIX; (ix) антиангиогенные агенты, такие как бевацизумаб (AVASTIN, Genentech); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные всех вышеперечисленных соединений.
В определение термина «химиотерапевтическое средство» также входят терапевтические антитела, такие как алемтузумаб (Campath), бевацизумаб (AVASTIN, Genentech); цетуксимаб (ERBITUX, Imclone); панитумумаб (VECTIBIX, Amgen), ритуксимаб (RITUXAN, Genentech/Biogen Idec), пертузумаб (OMNITARG™, 2C4, Genentech), трастузумаб (HERCEPTIN, Genentech), тозитумомаб (Bexxar, Corixia), и конъюгат «антитело-лекарственное средство», гемтузумаб озогамицин (MYLOTARG, Wyeth).
Используемый здесь термин “рост-ингибирующее средство” означает соединение или композицию, ингибирующие рост клеток, а в частности раковых клеток, экспрессирующих CD79b, либо in vitro, либо in vivo. Таким образом, средством, ингибирующим рост клеток, может быть средство, значительно снижающее процент клеток, экспрессирующих CD79b, в фазе S. Примерами средств, ингибирующих рост клеток, являются средства, блокирующие прохождение клеточного цикла (в другой фазе, кроме фазы S), такие как средства, индуцирующие блокирование фазы G1 и фазы М. Классическими средствами, блокирующими фазу М, являются винкаалкалоиды (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Средствами, блокирующими фазу G1, а также блокирующими переход в фазу S, являются, например, ДНК-алкилирующие агенты, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дополнительную информацию можно найти в публикации The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn & Israel, eds., Chapter 1, entitled “Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs”, Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), а в частности, на стр.13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) представляют собой противораковые лекарственные средства, получаемые из дерева тис. Доцетаксел (Таксотер, Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из Европейского тиса, представляет собой полусинтетический аналог паклитаксела (Таксола, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел индуцируют сборку микротрубочек из тубулиновых димеров и стабилизируют микротрубочки путем предупреждения деполимеризации, что приводит к ингибированию митоза клеток.
“Доксорубицин” представляет собой антрациклиновый антибиотик. Доксорубицин имеет полное химическое название (8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-α-L-ликсо-гексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион.
Термин “цитокин” является общим термином, относящимся к белкам, которые высвобождаются одной клеточной популяцией и которые действуют на другие клетки как межклеточные медиаторы. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины и стандартные полипептидные гормоны. Помимо вышеуказанных определений, понятие “цитокины” также включает гормоны роста, такие как человеческий гормон роста, N-метионильный человеческий гормон роста и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреоид-стимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли-α и -β; мюллеровский ингибирующий фактор; пептид, ассоциированный с мышиным гонадотропином; ингибин; активин; васкулярный эндотелиальный фактор роста; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервных тканей, такие как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); факторы, индуцирующие остеогенез; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитарный-макрофагальный CSF (GM-CSF); и гранулоцитарный CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; фактор некроза опухоли, такой как TNF-α или TNF-β; и другие полипептидные факторы, включая LIF и лиганд кit (KL). Используемый здесь термин “цитокин” включает белки, происходящие от природных источников или от рекомбинантной клеточной культуры, и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.
Используемый здесь термин “вкладыш в упаковку” означает инструкции, которые обычно вложены в предназначенные для продажи упаковки терапевтических продуктов и в которых имеется информация, касающаяся показаний, способа применения, дозы, способа введения, противопоказаний и/или предупреждений относительно применения таких терапевтических продуктов.
Термин «внутриклеточный метаболит» означает соединение, образующееся в результате метаболического процесса или метаболической реакции конъюгата «антитело-лекарственное средство» (ADC) внутри клетки. Такими метаболическими процессами или реакциями может быть ферментативная реакция, такая как протеолитическое расщепление пептидного линкера ADC, или гидролиз функциональной группы, такой как гидразон, сложный эфир или амид. Внутриклеточными метаболитами являются, но не ограничиваются ими, антитела и свободное лекарственное средство, которые подвергаются внутриклеточному расщеплению после поступления в клетку, диффузии или поглощения в клетке, или транспорта в клетку.
Термины «расщепляемый внутри клеток» и «внутриклеточное расщепление» относятся к процессу метаболизма или реакции конъюгата «антитело-лекарственное средство» (ADC) внутри клетки, где под действием таких процессов или реакций происходит разрыв ковалентной связи, то есть линкера, между молекулой лекарственного средства (D) и антителом (Ab), что приводит к образованию свободного лекарственного средства, диссоциируемого из антитела внутри клеток. Таким образом, отщепляемыми группами ADC являются внутриклеточные метаболиты.
Термин “биологическая доступность” означает системную биологическую доступность (то есть уровни лекарственного средства в крови/плазме) для данного количества лекарственного средства, вводимого пациенту. “Биологическая доступность” является абсолютным термином, который определяет такие параметры, как время действия (скорость) и общее количество (уровень) лекарственного средства, которое высвобождается из введенной лекарственной формы и поступает в общий кровоток.
50
Термин «цитотоксическая активность» означает цитотоксическое, цитостатическое или рост-ингибирующее действие ADC или внутриклеточного метаболита ADC. Цитотоксическая активность может быть выражена как величина IC, которая представляет собой концентрацию (молярную или по массе на единицу объема), при которой выживает 50% клеток.
1
12
1
8
1
6
3
2
3
2
2
3
2
3
2
2
2
2
3
2
3
2
3
2
3
3
3
2
2
2
2
3
3
2
2
3
2
3
2
3
2
2
3
3
3
2
2
2
3
2
2
3
2
3
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
2
3
2
2
3
3
2
2
2
3
3
3
2
3
3
2
3
2
3
2
3
2
2
3
3
2
3
2
3
2
3
3
3
Используемый здесь термин «алкил» означает насыщенный прямой или разветвленный одновалентный углеводородный радикал, состоящий из 1-12 атомов углерода (С-С), где указанный алкильный радикал может быть, но необязательно, независимо замещен одним или несколькими заместителями, описанными ниже. В другом варианте изобретения алкильный радикал имеет 1-8 атомов углерода (C-C) или 1-6 атомов углерода (C-C). Примерами алкильных групп являются, но не ограничиваются ими, метил (Ме, -СН), этил (Et, -СНСН), 1-пропил (n-Pr, н-пропил, -СНСНСН), 2-пропил (i-Pr, изопропил, СН(СН)), 1-бутил (n-Bu, н-бутил, -СНСНСНСН), 2-метил-1-пропил (i-Bu, изобутил, -СНСН(СН)), 2-бутил (s-Bu, втор-бутил, -СН(СН)СНСН), 2-метил-2-пропил (t-Bu, трет-бутил, -С(СН)), 1-пентил (н-пентил, -СНСНСНСНСН), 2-пентил (-СН(СН)СНСНСН), 3-пентил (-СН(СНСН)), 2-метил-2-бутил (-С(СН)СНСН), 3-метил-2-бутил (-СН(СН)СН(СН)), 3-метил-1-бутил (-СНСНСН(СН)), 2-метил-1-бутил (-СНСН(СН)СНСН), 1-гексил (-СНСНСНСНСНСН), 2-гексил (-СН(СН)СНСНСНСН), 3-гексил (-СН(СНСН)(СНСНСН)), 2-метил-2-пентил (-С(СН)СНСНСН), 3-метил-2-пентил (-СН(СН)СН(СН)СНСН), 4-метил-2-пентил (-СН(СН)СНСН(СН)), 3-метил-3-пентил (-С(СН)(СНСН)), 2-метил-3-пентил (-СН(СНСН)СН(СН)), 2,3-диметил-2-бутил (-С(СН)СН(СН)), 3,3-диметил-2-бутил (-СН(СН)С(СН)), 1-гептил, 1-октил и т.п.
2
8
2
2
2
2
Термин «алкенил» означает прямой или разветвленный одновалентный углеводородный радикал, состоящий из 2-8 атомов углерода (C-C) по меньшей мере с одной ненасыщенной связью, то есть с углерод-углеродной связью и с sp-двойной связью, где алкенильный радикал может быть, но необязательно, независимо замещен одним или несколькими заместителями, описанными в настоящей заявке, и включает радикалы, имеющие «цис»- и «транс»-ориентации, или альтернативно "E"- и "Z"-ориентации. Примерами являются, но не ограничиваются ими, этиленил или винил (-CH=CH), аллил (-CHCH=CH) и т.п.
2
8
2
Термин «алкинил» означает прямой или разветвленный одновалентный углеводородный радикал, состоящий из 2-8 атомов углерода (C-C) по меньшей мере с одной ненасыщенной связью, то есть с углерод-углеродной связью и с sp-тройной связью, где алкинильный радикал может быть, но необязательно, независимо замещен одним или несколькими заместителями, описанными в настоящей заявке. Примерами являются, но не ограничиваются ими, этинил (-C°CH), пропинил (пропаргил, -CHC°CH) и т.п.
3
12
Термины «карбоцикл», «карбоциклил», «карбоциклическое кольцо» и «циклоалкил» означают одновалентное неароматическое насыщенное или частично ненасыщенное кольцо, имеющее 3-12 атомов углерода (C-C) в качестве моноциклического кольца или 7-12 атомов углерода в качестве бициклического кольца. Бициклические карбоциклы, имеющие 7-12 атомов, могут быть расположены, например, в виде бицикло-[4,5]-, -[5,5]-, -[5,6]- или -[6,6]-системы, а бициклические карбоциклы, имеющие 9 или 10 атомов углерода на кольце, могут быть расположены, например, в виде бицикло-[5,6]- или -[6,6]-системы, либо в виде мостиковых систем, таких как бицикло[2.2.1]гептан, бицикло[2.2.2]октан и бицикло[3.2.2]нонан. Примерами моноциклических карбоциклов являются, но не ограничиваются ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-1-енил, 1-циклопент-2-енил, 1-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-1-енил, 1-циклогекс-2-енил, 1-циклогекс-3-енил, циклогексадиенил, циклогептил, циклооктил, циклононил, циклодецил, циклоундецил, циклододецил и т.п.
6
20
Термин «арил» означает одновалентный ароматический углеводородный радикал, состоящий из 6-20 атомов углерода (С-С) и образующийся в результате удаления одного атома водорода у одного атома углерода исходной ароматической системы. Некоторые арильные группы в репрезентативных структурах обозначены как “Ar”. Типичными арилами являются бициклические радикалы, содержащие ароматическое кольцо, конденсированное с насыщенным, частично насыщенным или ароматическим карбоциклическим кольцом. Типичными арильными группами являются, но не ограничиваются ими, радикалы, происходящие от бензола (фенила), замещенного бензола, нафталина, антрацена, бифенила, инденила, инданила, 1,2-дигидронафталина, 1,2,3,4-тетрагидронафталина и т.п. Арильные группы независимо замещены, но необязательно, одним или несколькими заместителями, описанными в настоящей заявке.
Термины «гетероцикл», «гетероциклил» и «гетероциклическое кольцо» являются взаимозаменяемыми и означают насыщенный или частично ненасыщенный (то есть имеющий одну или две двойных и/или тройных связи на кольце) карбоциклический радикал, имеющий от 3 до 20 атомов на кольце, где по меньшей мере один атом на кольце представляет собой гетероатом, выбранный из атомов азота, кислорода, фосфора и серы, а остальными атомами на кольце являются атомы С, где один или несколько атомов на кольце независмо замещены, но необязательно, одним или несколькими заместителями, описанными ниже. Гетероцикл может представлять собой моноцикл, имеющий от 3 до 7 членов на кольце (2-6 атомов углерода и 1-4 гетероатома, выбранных из N, О, Р и S), или бицикл, имеющий от 7 до 10 членов на кольце (4-9 атомов углерода и 1-6 гетероатомов, выбранных из N, О, Р и S), например, бицикло [4,5]-, [5,5]-, [5,6]- или [6,6]-систему. Гетероциклы описаны у Paquette, Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W.A. Benjamin, New York, 1968), а в частности, в главах 1, 3, 4, 6, 7 и 9; в “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), а в частности, в томах 13, 14, 16, 19 и 28; и в J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. Термин «гетероциклил» также включает радикалы, а именно гетероциклические радикалы, конденсированные с насыщенным, с частично ненасыщенным или ароматическим карбоциклическим или гетероциклическим кольцом. Примерами гетероциклических колец являются, например, но не ограничиваются ими, пирролидинил, тетрагидрофуранил, дигидрофуранил, тетрагидротиенил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, тетрагидротиопиранил, пиперидино, морфолино, тиоморфолино, тиоксалил, пиперазинил, гомопиперазинил, азетидинил, оксетанил, тиетанил, гомопиперидинил, оксепанил, тиепанил, оксазепинил, диазепинил, тиазепинил, 2-пирролинил, 3-пирролинил, индолинил, 2H-пиранил, 4H-пиранил, диоксанил, 1,3-диоксоланил, пиразолинил, дитианил, дитиоланил, дигидропиранил, дигидротиенил, дигидрофуранил, пиразолидинилимидазолинил, имидазолидинил, 3-азабицикло[3.1.0]гексанил, 3-азабицикло[4.1.0]гептанил, азабицикло[2.2.2]гексанил, 3H-индолил, хинолизинил и N-пиридилмочевины. В объем данного определения также входят спиро-молекулы. Примерами гетероциклических групп, в которых 2 атома углерода на кольце замещены оксо (=О) группами, являются пиримидинонил и 1,1-диоксо-тиоморфолинил. Описанные здесь гетероциклические группы независимо замещены, но необязательно, одним или несколькими заместителями, описанными в настоящей заявке.
Термин «гетероарил» означает одновалентный ароматический радикал, состоящий из 5-, 6- или 7-членных колец, и включает конденсированные циклические системы (по меньшей мере одна из которых является ароматической), состоящие из 5-20 атомов, содержащих один или несколько гетероатомов, независимо выбранных из атомов азота, кислорода и серы. Примерами гетероарильных групп являются пиридинил (включая, например, 2-гидроксипиридинил), имидазолил, имидазопиридинил, пиримидинил (включая, например, 4-гидроксипиримидинил), пиразолил, триазолил, пиразинил, тетразолил, фурил, тиенил, изоксазолил, тиазолил, оксазолил, изотиазолил, пирролил, хинолинил, изохинолинил, индолил, бензимидазолил, бензофуранил, циннолинил, индазолил, индолизинил, фталазинил, пиридазинил, триазинил, изоиндолил, птеридинил, пуринил, оксадиазолил, триазолил, тиадиазолил, тиадиазолил, фуразанил, бензофуразанил, бензотиофенил, бензотиазолил, бензоксазолил, хиназолинил, хиноксалинил, нафтиридинил и фуропиридинил. Гетероарильные группы независимо замещены, но необязательно, одним или несколькими заместителями, описанными в настоящей заявке.
Гетероциклические или гетероарильные группы могут быть связаны, где это возможно, через атом углерода (связаны с атомом углерода) или через атом азота (связаны с атомом азота). Неограничивающими примерами связанных через углерод гетероциклов или гетероарилов являются гетероциклы или гетероарилы, связанные в положении 2, 3, 4, 5 или 6 пиридина, в положении 3, 4, 5 или 6 пиридазина, в положении 2, 4, 5 или 6 пиримидина, в положении 2, 3, 5 или 6 пиразина, в положении 2, 3, 4 или 5 фурана, тетрагидрофурана, тиофурана, тиофена, пиррола или тетрагидропиррола, в положении 2, 4 или 5 оксазола, имидазола или тиазола, в положении 3, 4 или 5 изоксазола, пиразола или изотиазола, в положении 2 или 3 азиридина, в положении 2, 3 или 4 азетидина, в положении 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 хинолина или в положении 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 изохинолина.
Неограничивающими примерами связанных через азот гетероциклов или гетероарилов являются гетероциклы или гетероарилы, связанные в положении 1 азиридина, азетидина, пиррола, пирролидина, 2-пирролина, 3-пирролина, имидазола, имидазолидина, 2-имидазолина, 3-имидазолина, пиразола, пиразолина, 2-пиразолина, 3-пиразолина, пиперидина, пиперазина, индола, индолина, 1Н-индазола; в положении 2 изоиндола или изоиндолина, в положении 4 морфолина и в положении 9 карбазола или β-карболина.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
“Алкилен” представляет собой насыщенный, разветвленный, одноцепочечный или циклический углеводородный радикал, состоящий из 1-18 атомов углерода и имеющий два одновалентных радикальных центра, образованных в результате удаления двух атомов водорода у двух одинаковых или различных атомов углерода исходного алкана. Типичными алкиленовыми радикалами являются, но не ограничиваются ими, метилен (-СН-), 1,2-этил (-СНСН-), 1,3-пропил (-СНСНСН-), 1,4-бутил (-СНСНСНСН-) и т.п.
1
10
2
1-10
1
10
«С-Салкилен» представляет собой прямую насыщенную углеводородную группу формулы -(СН)-. Примерами С-Салкиленов являются метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, октилен, нонилен и декален.
“Алкенилен” представляет собой ненасыщенный, разветвленный, одноцепочечный или циклический углеводородный радикал, состоящий из 2-18 атомов углерода и имеющий два одновалентных радикальных центра, образованных в результате удаления двух атомов водорода у двух одинаковых или различных атомов углерода исходного алкена. Типичными алкениленовыми радикалами являются, но не ограничиваются ими, 1,2-этилен (-СН=СН-).
2
2
2
2
“Алкинилен” представляет собой ненасыщенный, разветвленный, одноцепочечный или циклический углеводородный радикал, состоящий из 2-18 атомов углерода и имеющий два одновалентных радикальных центра, образованных в результате удаления двух атомов водорода у двух одинаковых или различных атомов углерода исходного алкина. Типичными алкиниленовыми радикалами являются, но не ограничиваются ими, ацетилен (-С°С-), пропаргил (-СНС°С-) и 4-пентинил (-СНСНСНС°СН-).
«Арилен» представляет собой арильную группу, которая имеет две ковалентных связи и может присутствовать в орто-, мета- или пара-конфигурациях, как показано на нижеследующих структурах:
1
8
1
8
2
2
2
3
2
2
1
8
где фенильная группа может бть незамещенной, либо она может быть замещена 1-4 группами, включая, но не ограничиваясь ими, -C-C-алкил, -O-(C-C-алкил), -арил, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH , -C(O)NHR', -C(O)N(R') -NHC(O)R', -S(O)R', -S(O)R', -OH, галоген, -N , -NH, -NH(R'), -N(R') и -CN; где каждый из R' независимо выбран из H, -C-C-алкила и арила.
3
«Арилалкил» представляет собой ациклический алкильный радикал, в котором один из атомов водорода, связанных с атомом углерода, обычно концевой атом углерода или sp-атом углерода, заменен арильным радикалом. Типичными арилалкильными группами являются, но не ограничиваются ими, бензил, 2-фенилэтан-1-ил, 2-фенилэтен-1-ил, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-ил, 2-нафтилэтен-1-ил, нафтобензил, 2-нафтофенилэтан-1-ил и т.п. Арилалкильная группа содержит от 6 до 20 атомов углерода; так, например, алкильная часть, включая алканильную, алкенильную или алкинильную части арилалкильной группы, имеет 1-6 атомов углерода, а арильная часть имеет 5-14 атомов углерода.
3
«Гетероарилалкил» представляет собой ациклический алкильный радикал, в котором один из атомов водорода, связанных с атомом углерода, обычно концевой атом углерода или sp-атом углерода, заменен гетероарильным радикалом. Типичными гетероарилалкильными группами являются, но не ограничиваются ими, 2-бензимидазолилметил, 2-фурилэтил и т.п. Гетероарилалкильная группа имеет от 6 до 20 атомов углерода; так, например, алкильная часть, включая алканильную, алкенильную или алкинильную части гетероарилалкильной группы, имеет 1-6 атомов углерода, а гетероарильная часть имеет 5-14 атомов углерода и 1-3 гетероатома, выбранных из N, О, Р и S. Гетероарильная часть гетероарилалкильной группы может представлять собой моноцикл, имеющий от 3 до 7 членов на кольце (2-6 атомов углерода), или бицикл, имеющий от 7 до 10 членов на кольце (4-9 атомов углерода и 1-3 гетероатома, выбранных из N, О, Р и S), например, бицикло-[4,5]-, -[5,5]-, -[5,6]- или -[6,6]-систему.
Используемый в данной заявке термин «пролекарство» означает предшественник или производное соединения согласно изобретению, которые, по сравнению с родительским соединением или лекарственным средством, являются менее цитотоксичными по отношению к опухолевым клеткам и способны ферментативно или гидролитически активироваться или превращаться в более активную зрелую форму. См., например, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp.375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella et al. “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985). Пролекарствами согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, фосфатсодержащие пролекарства; тиофосфатсодержащие пролекарства; сульфатсодержащие пролекарства; пептидсодержащие пролекарства; пролекарства, модифицированные D-аминокислотой; гликозилированные пролекарства; β-лактамсодержащие пролекарства; пролекарства, содержащие необязательно замещенный феноксиацетамид; или пролекарства, содержащие необязательно замещенный фенилацетамид; 5-фторцитозиновые и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активное цитотоксическое свободное лекарственное средство. Примерами цитотоксических лекарственных средств, которые могут быть дериватизированы с получением пролекарственной формы для ее использования в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, соединения согласно изобретению и химиотерапевтические средства, описанные выше.
Термин «метаболит» означает продукт, продуцируемый в результате метаболизма конкретного соединения или его соли в организме. Метаболиты соединения могут быть идентифицировны рутинными методами, известными специалистам, а их активность может быть определена с помощью анализов, описанных в настоящей заявке. Такие продукты могут образовываться, например, в результате окисления, восстановления, гидролиза, амидирования, дезамидирования, этерификации, деэтерификации, ферментативного расщепления вводимого соединения и т.п. В соответствии с этим, настоящее изобретение охватывает метаболиты соединений согласно изобретению, включая соединения, продуцируемые способом, включающим контактирование соединения согласно изобретению с организмом млекопитающего в течение периода времени, достаточного для образования продукта метаболизма.
«Липосома» представляет собой небольшую везикулу, состоящую из липидов различных типов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которые могут быть использованы для доставки лекарственного средства млекопитающему. Компоненты липосомы обычно расположены так, что они образуют бислой, аналогичный липидному бислою в биологических мембранах.
2
n
2
n
TM
Термин «линкер» означает химическую группу, содержащую ковалентную связь или цепь атомов, которые ковалентно связывают антитело с молекулой лекарственного средства. В различных вариантах изобретения линкером является двухвалентный радикал, такой как алкилдиил, арилдиил, гетероарилдиил, такие группы, как -(CR)O(CR)-, повторяющиеся звенья алкилокси (например, полиэтиленокси, ПЭГ, полиметиленокси) и алкиламино (например, полиэтиленамино, Jeffamine), и двухосновный сложный эфир и амиды, включая сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат и капроамид.
Термин “хиральный” относится к молекулам, которые не совмещаются с их зеркально отображенным аналогом, а термин “ахиральный” относится к молекулам, которые совмещаются с их зеркально отображенным аналогом.
Термин “стереоизомеры” означает соединения, которые имеют идентичную химическую структуру, но отличаются пространственным расположением атомов или групп.
Термин “диастереомер” означает стереоизомер с двумя или несколькими хиральными центрами, молекулы которого не являются зеркальным отображением друг друга. Диастереомеры имеют различные физические свойства, например температуры плавления, точки кипения, спектральные свойства и реакционную способность. Смеси диастереомеров могут быть разделены высокоразрешающими аналитическими методами, такими как электрофорез и хроматография.
Термин “энантиомеры” означает два стереоизомера соединения, зеркальные отображения которых не совмещаются друг с другом.
Определения и обозначения используемых здесь стереохимических терминов в общих чертах приводятся у S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, то есть они способны вращать плоскость плоскополяризованного света. В описании оптически активного соединения префиксы D и L или R и S используются для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно его (их) хирального(ых) центра(ов). Префиксы d и l или (+) и (-) используются для обозначения знака вращения плоскополяризованного света данным соединением, а (-) или l означает, что данное соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры являются идентичными, за исключением того, что они являются зеркальным отображением друг друга. Специфический стереоизомер может также называться энантиомером, а смесь таких изомеров часто называется энантиомерной смесью. Смесь 50:50 энантиомеров называется рацемической смесью или рацематом, который может образовываться в том случае, если в химической реакции или в химическом процессе отсутствует стереоселективность или стереоспецифичность. Термины “рацемическая смесь” и “рацемат” означают эквимолярную смесь двух энантиомерных молекул, не обладающих оптической активностью.
Термин «таутомер» или «таутомерная форма» означает структурные изомеры с различными энергиями, которые могут превращаться друг в друга из-за низкого энергетического барьера. Так, например, протонными таутомерами (также известными как прототропные таутомеры) являются таутомеры, которые превращаются друг в друга под действием миграции протона, такой как кето-енольная и имин-енаминовая изомеризация. Валентность таутомеров определяется взаимными превращениями в результате реорганизации некоторых связанных электронов.
Используемый здесь термин “фармацевтически приемлемая соль” означает фармацевтически приемлемые органические или неорганические соли соединения согласно изобретению. Примерами таких солей являются, но не ограничиваются ими, сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, йодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат «мезилат», этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и памоат (т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)). Термин “фармацевтически приемлемая соль” может включать и другую молекулу, такую как ион ацетата, ион сукцината или другой противоион. Такой противоион может представлять собой любую органическую или неорганическую молекулу, которая стабилизирует заряд на исходном соединении. Кроме того, фармацевтически приемлемая соль может иметь в своей структуре более чем один заряженный атом. В случае если множество заряженных атомов является частью фармацевтически приемлемой соли, то такая соль может иметь множество противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или несколько заряженных атомов и/или один или несколько противоионов.
Если соединением согласно изобретению является основание, то нужная фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим методом, известным специалистам, например путем обработки свободного основания неорганической кислотой, такой как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, метансульфоновая кислота, фосфорная кислота и т.п., или органической кислотой, такой как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, миндальная кислота, фумаровая кислота, малоновая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, гликолевая кислота, салициловая кислота, пиранозидиловая кислота, такая как глюкуроновая кислота или галактуроновая кислота; альфа-гидроксикислота, такая как лимонная кислота или винная кислота, аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, ароматическая кислота, такая как бензойная кислота или коричная кислота, сульфоновая кислота, такая как п-толуолсульфоновая кислота или этансульфоновая кислота или т.п.
Если соединением согласно изобретению явлется кислота, то нужная фармацевтически приемлемая соль может быть получена любым подходящим методом, например путем обработки свободной кислоты неорганическим или органическим основанием, таким как амин (первичный, вторичный или третичный), гидроксид щелочного металла или гидроксид щелочноземельного металла, или т.п. Репрезентативными примерами подходящих солей являются, но не ограничиваются ими, органические соли, происходящие от аминокислот, таких как глицин и аргинин, аммиака, первичных, вторичных и третичных аминов, и циклических аминов, таких как пиперидин, морфолин и пиперазин, и неорганические соли, происходящие от натрия, кальция, калия, магния, марганца, железа, меди, цинка, алюминия и лития.
Термин «фармацевтически приемлемый» означает, что вещество или композиция должны быть химически и/или токсикологически совместимыми с другими ингредиентами, составляющими данную композицию, и/или с организмом млекопитающего, которому вводят данную композицию.
Термин «сольват» означает ассоциацию или комплекс одной или нескольких молекул растворителя и соединения согласно изобретению. Примерами растворителей, которые образуют сольваты, являются, но не ограничиваются ими, вода, изопропанол, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусная кислота и этаноламин. Термин «гидрат» означает комплекс, в котором молекулой растворителя является вода.
Термин «защитная группа» означает заместитель, который обычно используется для блокирования или защиты конкретной функциональной группы, реагирующей с другой функциональной группой на соединении. Так, например, «аминозащитная группа» представляет собой заместитель, присоединенный к аминогруппе, который блокирует или защищает функциональную аминогруппу в данном соединении. Подходящими аминозащитными группами являются ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (BOC), бензилоксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Аналогичным образом, «гидроксизащитная группа» означает заместитель гидроксигруппы, который блокирует или защищает функциональную гидроксигруппу. Подходящими защитными группами являются ацетил и силил. «Карбоксизащитная группа» означает заместитель карбоксигруппы, который блокирует или защищает функциональную карбоксигруппу. Стандартными карбоксизащитными группами являются фенилсульфонилэтил, цианоэтил, 2-(триметилсилил)этил, 2-(триметилсилил)этоксиметил, 2-(п-толуолсульфонил)этил, 2-(п-нитрофенилсульфенил)этил, 2-(дифенилфосфино)этил, нитроэтил и т.п. Общее описание защитных групп и их применение можно найти в публикации T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.
Термин “уходящая группа” означает функциональную группу, которая может быть замещена другой функциональной группой. Некоторые уходящие группы хорошо известны специалистам и примерами этих групп являются, но не ограничиваются ими, галогенид (например, хлорид, бромид, йодид), метансульфонил (мезил), п-толуолсульфонил (тозил), трифторметилсульфонил (трифлат) и трифторметилсульфонат.
Обозначения
Линкерные компоненты:
MC = 6-малеимидокапроил
Val-Cit или “vc” = валин-цитруллин (репрезентативный дипептид в линкере, отщепляемом протеазой)
Цитруллин = 2-амино-5-уреидопентановая кислота
РАВ = п-аминобензилоксикарбонил (пример «самоудаляющегося» линкерного компонента)
Me-Val-Cit = N-метил-валин-цитруллин (где пептидная связь линкера была модифицирована в целях предотвращения его расщепления катепсином B)
MC(PEG)6-OH = малеимидокапроил-полиэтиленгликоль (может быть присоединен к цистеинам антител)
Цитотоксические лекарственные средства:
MMAE = монометилауристатин E (молекулярная масса (MW) 718)
MMAF = вариант ауристатина E (MMAE) с фенилаланином у C-конца лекарственного средства (MW 731,5)
MMAF-DMAEA = MMAF с DMAEA (диметиламиноэтиламин), связанным амидной связью с С-концевым фенилаланином (MW 801,5)
MMAF-TEG = MMAF с тетраэтиленгликолем, связанным с фенилаланином сложноэфирной связью
MMAF-NtBu = N-трет-бутил, связанный с C-концом MMAF амидной связью
DM1 = N(2')-деацетил-N(2')-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзин
DM3 = N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзин
DM4 = N(2')-деацетил-N2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтанзин
3
Другие используемые здесь сокращения имеют следующие значения: АЕ означает ауристатин Е, Вос означает N-(трет-бутоксикарбонил), cit означает цитруллин, dap означает долапроин, DCC означает 1,3-дициклогексилкарбодиимид, DCM (ДХМ) означает дихлорметан, DEA означает диэтиламин, DEAD означает диэтилазодикарбоксилат, DEPC означает диэтилфосфорилцианидат, DIAD означает диизопропилазодикарбоксилат, DIEA означает N,N-диизопропилэтиламин, dil означает долаизолейцин, DMA означает диметилацетамид, DMAP означает 4-диметиламинопиридин, DME означает диметиловый эфир этиленгликоля (или 1,2-диметоксиэтан), DMF (ДМФ) означает N,N-диметилформамид, DMSO (ДМСО) означает диметилсульфоксид, doe означает долафенин, dov означает N,N-диметилвалин, DTNB означает 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту), DTPA означает диэтилентриаминопентауксусную кислоту, DTT означает дитиотреитол, EDCl означает гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, EEDQ означает 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин, ES-MS означает масс-спектрометрию электрораспылением, EtOAc означает этилацетат, Fmoc означает N-(9-флуоренилметоксикарбонил), gly означает глицин, HATU означает гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония, HOBt означает 1-гидроксибензотриазол, HPLC (ЖХВД) означает жидкостную хроматографию высокого давления, ile означает изолейцин, lys означает лизин, MeCN (CHCN) означает ацетонитрил, MeOH означает метанол, Mtr означает 4-анизилдифенилметил (или 4-метокситритил), nor (нор) означает (1S,2R)-(+)-норэфедрин, PBS означает забуференный фосфатом физиологический раствор (рН 7,4), PEG (ПЭГ) означает полиэтиленгликоль, Ph означает фенил, Pnp означает п-нитрофенил, МС означает 6-малеимидокапроил, phe означает L-фениламин, PyBrop означает гексафторфосфат бром-трис-пирролидинофосфония, SEC означает эксклюзионную хроматографию, Su означает сукцинимид, TFA означает трифторуксусную кислоту, TLC (ТСХ) означает тонкослойную хроматографию, UV (УФ) означает ультрафиолетовое излучение, а val означает валин.
«Свободная аминокислота цистеин» означает цистеиновый аминокислотный остаток, который был введен в родительское антитело, имеет тиоловую функциональную группу (-SH) и не образует пару в виде внутримолекулярного или межмолекулярного дисульфидного мостика.
Термин “величина тиоловой реактивности” означает количественную характеристику реакционной способности свободных цистеиновых аминокислотных остатков. Величина тиоловой реактивности представляет собой процентное содержание свободных цистеиновых аминокислотных остатков в сконструированном на основе цистеина антителе, которое реагирует с реагентом, взаимодействущем с тиолом, при этом максимальную величину такой реактивности принимают равной 1. Так, например, свободная цистеиновая аминокислота в сконструированном на основе цистеина антителе, которое реагирует со взаимодействущим с тиолом реагентом, таким как биотин-малеимидный реагент, со 100% выходом с образованием меченного биотином антитела, имеет величину тиоловой реактивности, составляющую 1,0. Другая цистеиновая аминокислота, введенная в то же самое или другое родительское антитело, которое реагирует со взаимодействущим с тиолом реагентом, с 80% выходом, имеет величину тиоловой реактивности, составляющую 0,8. Другая цистеиновая аминокислота, введенная в то же самое или другое родительское антитело, которое совсем не реагирует со взаимодействущим с тиолом реагентом, имеет величину тиоловой реактивности, составляющую 0. Определение величины тиоловой реактивности конкретного цистеина может быть осуществлено с помощью ELISA-анализа, масс-спектроскопии, жидкостной хроматографии, ауторадиографии или других количественных аналитических тестов.
“Родительское антитело” представляет собой антитело, содержащее аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков заменены одним или несколькими цистеиновыми остатками. Родительское антитело может содержать нативную последовательность или последовательность дикого типа. Родительское антитело может иметь уже существующие модификации аминокислотной последовательности (такие как добавления, делеции и/или замены), по сравнению с другими нативными антителами, антителами дикого типа или модифицированными формами антитела. Родительское антитело может быть направлено против представляющего интерес антигена-мишени, например, важного с биологической точки зрения полипептида. Также рассматриваются антитела против неполипептидных антигенов (таких как опухолеассоциированные гликолипидные антигены; см., патент США № 5091178).
III. Композиции и способы согласно изобретению
Настоящее изобретение относится к анти-CD79b антителам или к их функциональным фрагментам, а также к способу их применения для лечения гемопоэтических опухолей.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается, предпочтительно специфически, с любым из вышеописанных или нижеописанных полипептидов. Таким антителом является, но необязательно, моноклональное антитело, фрагмент антитела, включая Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагмент, диантитело, однодоменное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим агентом или с цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин, майтанзиноид, производное долостатина или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, продуцированы в клетках СНО или в бактериальных клетках, а предпочтительно индуцируют гибель клеток, с которыми они связываются. Антитела согласно изобретению, используемые в целях детектирования, могут быть детектируемо помечены, присоединены к твердому носителю или т.п.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность одновалентного антитела против CD79b (например, аффинность антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b) по существу аналогична аффинности одновалентного мышиного антитела (например, аффинности мышиного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b), или химерного антитела (например, аффинности химерного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b), содержащего последовательность вариабельного домена легкой и тяжелой цепи, или состоящего или по существу состоящего из указанной последовательности, представленной на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность одновалентного антитела против CD79b (например, аффинность антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b), например, по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 раз ниже аффинности одновалентного мышиного антитела (например, аффинности мышиного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b), или химерного антитела (например, аффинности химерного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b), содержащего последовательность вариабельного домена легкой и тяжелой цепи, или состоящего или по существу состоящего из указанной последовательности, представленной на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность одновалентного антитела против CD79b (например, аффинность антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b), например, по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше аффинности одновалентного мышиного антитела (например, аффинности мышиного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b), или химерного антитела (например, аффинности химерного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b), содержащего последовательность вариабельного домена легкой и тяжелой цепи, или состоящего или по существу состоящего из указанной последовательности, представленной на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность указанного анти-CD79b антитела в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) по существу аналогична аффинности мышиного антитела (например, аффинности антитела, используемого в качестве IgG против CD79b), или химерного антитела (например, аффинности химерного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b) в его двухвалентной форме, содержащего последовательность вариабельного домена легкой и тяжелой цепи, или состоящего или по существу состоящего из указанной последовательности, представленной на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b), например, по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 раз ниже аффинности мышиного антитела (например, аффинности антитела, используемого в качестве IgG против CD79b), или химерного антитела (например, аффинности химерного антитела, используемого в качестве Fab-фрагмента против CD79b) в его двухвалентной форме, содержащего последовательность вариабельного домена легкой и тяжелой цепи, или состоящего или по существу состоящего из указанной последовательности, представленной на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b), например, по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше аффинности мышиного антитела (например, аффинности мышиного антитела, используемого в качестве IgG против CD79b), или химерного антитела (например, аффинности химерного антитела, используемого в качестве IgG-фрагмента против CD79b) в его двухвалентной форме, содержащего последовательность вариабельного домена легкой и тяжелой цепи, или состоящего или по существу состоящего из указанной последовательности, представленной на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,4 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,4 нМ ± 0,04.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,3 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,32 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,36 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,4 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,44 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,48 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,5 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,3 нМ-0,5 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,32-0,48 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,36-0,44 нМ.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,2 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,2 нМ ± 0,02.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,1 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,12 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,14 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,16 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,18 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,2 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,22 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,24 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,26 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,28 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,30 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,1-0,3 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,12-0,28 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,14-0,26 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,16-0,24 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,18-0,22 нМ.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,5 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,5 нМ ± 0,1.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,4 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,5 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,6 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,7 нМ или выше. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,3-0,7 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,4-0,6 нМ. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к гуманизированному анти-CD79b антителу, где аффинность антитела против CD79b в его двухвалентной форме (например, аффинность антитела, используемого в качестве IgG против CD79b) составляет 0,5-0,55 нМ.
В одном из аспектов изобретения аффинность одновалентного мышиного антитела против CD79b по существу аналогична аффинности связывания Fab-фрагмента, содержащего последовательности вариабельных доменов SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B). В другом аспекте изобретения аффинность одновалентного мышиного антитела против CD79b по существу аналогична аффинности связывания Fab-фрагмента, содержащего последовательности вариабельных доменов антитела, полученного из гибридомы, депонированной в ATCC под № HB11413 20 июля 1993 г., или химерного антитела, содержащего вариабельные домены антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC под № HB11413 20 июля 1993 г.
Как хорошо известно специалистам, аффинность связывания лиганда с рецептором может быть определена с помощью любого из различных анализов и выражена в виде ряда количественных величин. В соответствии с этим, в одном из вариантов изобретения аффинность связывания выражена в величинах Kd и определяет природную аффинность связывания (например, с минимизированными эффектами авидности). Вообще говоря и предпочтительно, аффинность связывания антитела измеряют in vitro, независимо от того, присутствует ли оно во внеклеточной или в клеточно-ассоциированной среде. Как подробно описано в настоящей заявке, кратное различие в аффинности связывания может быть количественно оценено как отношение величины аффинности одновалентного связывания гуманизированного антитела (например, в Fab-форме) и величины аффинности одновалентного связывания эталонного/сравниваемого антитела (например, в Fab-форме) (например, мышиного антитела, имеющего последовательности донорной гипервариабельной области), где величины аффинности связывания определяют в аналогичных условиях проведения анализа. Таким образом, в одном из вариантов изобретения кратное различие в аффинности связывания определяют как отношение величин Kd гуманизированного антитела в Fab-форме и указанного эталонного/сравниваемого Fab-антитела. Так, например, в одном из вариантов изобретения, если антитело согласно изобретению (A) имеет аффинность, которая «в 3 раза ниже» аффинности эталонного антитела (M), то, если величина Kd для A равна 3x, величина Kd для M должна составлять 1x, и отношение «Kd для A:Kd для M» должно составлять 3:1. И наоборот, в одном из вариантов изобретения, если антитело согласно изобретению (С) имеет аффинность, которая «в 3 раза выше» аффинности эталонного антитела (R), то, если величина Kd для С равна 1x, величина Kd для R должна составлять 3x, и отношение «Kd для С:Kd для R» должно составлять 1:3. Для определения аффинности связывания может быть применен ряд различных анализов, известных специалистам, включая анализы, описанные в настоящей заявке, такие как, например, анализ Biacore, радиоиммунноанализ (РИА) и ELISA.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с CD79b, где указанное антитело содержит:
(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из группы, состоящей из:
(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A15 представляет собой KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131);
(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой AASNLES (SEQ ID NO: 132);
(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133);
(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134);
(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135); и
(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F10, где F1-F10 представляет собой TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136).
В одном из вариантов изобретения HVR-L1 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 131. В одном из вариантов изобретения HVR-L2 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 132. В одном из вариантов изобретения HVR-L3 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 133. В одном из вариантов изобретения HVR-Н1 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 134. В одном из вариантов изобретения HVR-Н2 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 135. В одном из вариантов изобретения HVR-Н3 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 136. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению, содержащее эти последовательности (в комбинации, описанной в настоящей заявке), является гуманизированным или человеческим.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с CD79b, где указанное антитело содержит:
(a) по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из группы, состоящей из:
(i) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A15 представляет собой KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131);
(ii) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой AASNLES (SEQ ID NO: 132);
(iii) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133);
(iv) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134);
(v) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135); и
(vi) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F10, где F1-F10 представляет собой TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136); и
(b) по меньшей мере один вариант HVR, где указанный вариант последовательности HVR имеет модификацию по меньшей мере одного остатка последовательности, представленной в SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 или 136. В одном из вариантов изобретения HVR-L1 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 131. В одном из вариантов изобретения HVR-L2 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 132. В одном из вариантов изобретения HVR-L3 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 133. В одном из вариантов изобретения HVR-Н1 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 134. В одном из вариантов изобретения HVR-Н2 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 135. В одном из вариантов изобретения HVR-Н3 антитела согласно изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 136. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению, содержащее эти последовательности (в комбинации, описанной в настоящей заявке), является гуманизированным или человеческим.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, где каждая HVR содержит последовательность, состоит или по существу состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 и 136, и где SEQ ID NO: 131 соответствует HVR-L1, SEQ ID NO: 132 соответствует HVR-L2, SEQ ID NO: 133 соответствует HVR-L3, SEQ ID NO: 134 соответствует HVR-H1, SEQ ID NO: 135 соответствует HVR-H2, а SEQ ID NO: 136 соответствует HVR-H3. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждая из них в указанном порядке содержит SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134, 135 и 136.
Варианты HVR в антителе согласно изобретению могут иметь модификации одного или нескольких остатков в HVR. В одном из вариантов изобретения вариант HVR-L1 содержит одну замену в следующих положениях: A4 (K), A9 (E или S) и A10 (A или S). В одном из вариантов изобретения вариант HVR-L2 содержит 1-5 (1, 2, 3, 4 или 5) замен в любом одном положении или в комбинации следующих положений: B2 (S или G), B3 (R или G), B4 (K, R, Y, I, H или Q), B5 (R), B6 (G, K, A, R, S или L) и B7 (R, N, T или G). В одном из вариантов изобретения вариант HVR-L3 содержит 1-4 (1, 2, 3 или 4) замены в любом одном положении или в комбинации следующих положений: C1 (N или D), C2 (N или P), C3 (D или R), C5 (S, K, A, Q, D, L или G), C6 (A, E или N), C7 (A), C8 (R) и C9 (N). В одном из вариантов изобретения вариант HVR-H1 содержит 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) замен в любом одном положении или в комбинации следующих положений: D1 (P), D2 (F), D3 (P, S, Y, G или N), D4 (L или V), D5 (T, R, N, K, C, G или P), D6 (R, T, K или G), D8 (F), D9 (V или L) и D10 (S, Q, N или D). В одном из вариантов изобретения вариант HVR-H3 содержит 1-3 (1, 2 или 3) замены в любом одном положении или в комбинации следующих положений: F4 (R или I), F6 (I или F), F7 (K, C, R, V или F), F8 (L) и F9 (S). Буква(ы) в скобках после каждого положения означает(ют) репрезентативную замену аминокислоты; и как будет очевидно специалисту в данной области, исходя из контекста настоящего описания, допустимость замены других аминокислот может быть оценена рутинными методами, известными специалистам и/или описанными в настоящей заявке. В одном из вариантов изобретения A9 в варианте HVR-L1 представляет собой E. В одном из вариантов изобретения F6 в варианте HVR-H3 представляет собой I. В одном из вариантов изобретения F7 в варианте HVR-H3 представляет собой R. В одном из вариантов изобретения F8 в варианте HVR-H3 представляет собой L. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H3, где F6 представляет собой I, F7 представляет собой R, а F8 представляет собой L. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L1, где A9 представляет собой E, и вариант HVR-H3, где F6 представляет собой I, F7 представляет собой R, а F8 представляет собой L. В одном из вариантов изобретения A9 в варианте HVR-L1 представляет собой S. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L1, где A9 представляет собой S, и вариант HVR-H3, где F6 представляет собой I, F7 представляет собой R, а F8 представляет собой L.
В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L1, где A4 представляет собой K. В некоторых вариантах изобретения указанный вариант HVR-L1 содержит HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждый из них в указанном порядке содержит последовательность SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135 и 136. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-L1, также содержит HVR-L1, где A9 представляет собой E или S, и/или A10 представляет собой A или S. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-L1, также содержит вариант HVR-L3, где C6 представляет собой E или N, и/или C7 представляет собой A. В некоторых вариантах изобретения указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител консенсусная каркасная последовательность содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител положение 71 представляет собой A, 73 - T, и/или 78 - А. В одном из вариантов этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В некоторых вариантах этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой каркасной легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах указанных антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L, и/или положение 47 представляет собой F. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 и/или 80. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III) 48 представляет собой I, положение 67 представляет собой A, положение 69 представляет собой F, положение 71 представляет собой A, положение 73 представляет собой T, положение 75 представляет собой S, положение 78 представляет собой A, и/или положение 80 представляет собой M. В некоторых вариантах этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой каркасной легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (в консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или положение 47 представляет собой F.
В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где B3 представляет собой R, B4 представляет собой K, B6 представляет собой G, а B7 представляет собой R. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где B3 представляет собой R, B4 представляет собой Y, B6 представляет собой K, а B7 представляет собой R. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L2, где B3 представляет собой R, B4 представляет собой K, а B6 представляет собой G. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-L2, также содержит HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждый из них по порядку содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 131, 133, 134, 135 и 136. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-L2, также содержит вариант HVR-L1, где A9 представляет собой E или S и/или A10 представляет собой A или S. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-L2, также содержит вариант HVR-L3, где C6 представляет собой E или N и/или C7 представляет собой A. В некоторых вариантах изобретения указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител положение 71 представляет собой A, 73 представляет собой T и/или 78 представляет собой A. В одном из вариантов этих антител,указанные антитела также содержат консенсусноую последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В некоторых вариантах этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или 47 представляет собой F. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 и/или 80. В одном из вариантов этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III) 48 представляет собой I, 67 представляет собой A, 69 представляет собой F, 71 представляет собой A, 73 представляет собой T, 75 представляет собой S, 78 представляет собой A и/или 80 представляет собой M. В некоторых вариантах этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или 47 представляет собой F.
В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L3, где С5 представляет собой К. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-L3, где С5 представляет собой S. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-L3, также содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3, где каждый из них по порядку содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 131, 132, 134, 135 и 136. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-L3, также содержит вариант HVR-L1, где A9 представляет собой E или S и/или A10 представляет собой A или S. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-L3, также содержит вариант HVR-L3, где C6 представляет собой E или N и/или C7 представляет собой A. В некоторых вариантах изобретения указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител положение 71 представляет собой A, 73 представляет собой T и/или 78 представляет собой A. В одном из вариантов этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В некоторых вариантах этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или 47 представляет собой F. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 и/или 80. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III) 48 представляет собой I, 67 представляет собой A, 69 представляет собой F, 71 представляет собой A, 73 представляет собой T, 75 представляет собой S, 78 представляет собой A и/или 80 представляет собой M. В некоторых вариантах этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или 47 представляет собой F.
В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H1, где D3 представляет собой P, D5 представляет собой T, D6 представляет собой R и D10 представляет собой N. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H1, где D3 представляет собой P, D5 представляет собой N, D6 представляет собой R и D10 представляет собой N. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-Н1, также содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H2 и HVR-H3, где каждый из них по порядку содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 131, 132, 133, 135 и 136. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-Н1, также содержит вариант HVR-L1, где A9 представляет собой E или S и/или A10 представляет собой A или S. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-Н1, также содержит вариант HVR-L3, где C6 представляет собой E или N и/или C7 представляет собой A. В некоторых вариантах изобретения указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител положение 71 представляет собой A, 73 представляет собой T и/или 78 представляет собой A. В одном из вариантов этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В некоторых вариантах этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или 47 представляет собой F. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 и/или 80. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III) 48 представляет собой I, 67 представляет собой A, 69 представляет собой F, 71 представляет собой A, 73 представляет собой T, 75 представляет собой S, 78 представляет собой A и/или 80 представляет собой M. В некоторых вариантах этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или 47 представляет собой F.
В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H3, где F6 представляет собой I и F8 представляет собой L. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант HVR-H3, где F6 представляет собой I, F7 представляет собой R, а F8 представляет собой L. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-Н3, также содержит HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 и HVR-H1, где каждый из них по порядку содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134 и 135. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-Н3, также содержит вариант HVR-L1, где A9 представляет собой E или S и/или A10 представляет собой A или S. В некоторых вариантах изобретения антитело, содержащее указанный вариант HVR-Н3, также содержит вариант HVR-L3, где C6 представляет собой E или N и/или C7 представляет собой A. В некоторых вариантах изобретения указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой тяжелой цепи подгуппы III) 71 представляет собой A, 73 представляет собой T и/или 78 представляет собой A. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 48, 67, 69, 71, 73 и/или 78. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III) 48 представляет собой I, 67 представляет собой A, 69 представляет собой F, 71 представляет собой A, 73 представляет собой T и/или 78 представляет собой A. В одном из вариантов этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В некоторых вариантах этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или 47 представляет собой F. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 и/или 80. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой тяжелой цепи подгруппы III) 48 представляет собой I, 67 представляет собой A, 69 представляет собой F, 71 представляет собой A, 73 представляет собой T, 75 представляет собой S, 78 представляет собой A и/или 80 представляет собой M. В некоторых вариантах этих антител указанные антитела также содержат консенсусную последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1. В одном из вариантов этих антител консенсусная последовательность каркасной области человеческой легкой цепи к1 содержит замену в положении 4 и/или 47. В некоторых вариантах этих антител положение (консенсусной последовательности каркасной области человеческой легкой цепи к1) 4 представляет собой L и/или 47 представляет собой F.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему одну, две, три, четыре, пять или все последовательности HVR, представленные на фигуре 9 (SEQ ID NO: 17-21) и/или на фигуре 10 (SEQ ID NO: 22-106).
Используемое терапевтическое средство при его введении хозяину предпочтительно вызывает слабый иммунный ответ или вообще не вызывает иммунного ответа у указанного хозяина. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к указанному средству. Так, например, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, которое вырабатывает и/или предположительно вырабатывает гуморальный ответ у человека против мышиного антитела (HAMA) на значительно более низком уровне по сравнению с антителом, содержащим последовательность SEQ ID NO: 10 и 14 у индивидуума-хозяина. В другом примере настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, которое вырабатывает и/или предположительно вырабатывает ответ у млекопитающего или у млекопитающего, не являющегося человеком, против мышиного антитела (HAMA). В одном из примеров антитело согласно изобретению вырабатывает ответ против мышиного антитела на клинически приемлемом уровне или на более низком уровне.
Гуманизированное антитело согласно изобретению может содержать одну или несколько человеческих и/или человеческих консенсусных последовательностей негипервариабельной области (например, каркасной области) в вариабельном домене тяжелой и/или легкой цепи. В некоторых вариантах изобретения в человеческих и/или в человеческих консенсусных последовательностях негипервариабельной области присутствуют одна или несколько дополнительных модификаций. В одном из вариантов изобретения вариабельный домен тяжелой цепи антитела согласно изобретению содержит человеческую консенсусную каркасную последовательность, которая в одном из вариантов изобретения представляет собой консенсусную каркасную последовательность подгруппы III. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант консенсусной каркасной последовательности подгруппы III, модифицированной в одном положении аминокислотного остатка. Так, например, в одном из вариантов изобретения вариант консенсусной каркасной последовательности подгруппы III может содержать замену в одном или нескольких положениях, выбранных из положений 71, 73 и/или 78. В одном из вариантов изобретения такой заменой является R71A, N73T и/или L78A, в любой их комбинации. Так, например, в одном из вариантов изобретения вариант каркасной консенсусной последовательности тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 48, 67, 69, 71, 73 и/или 78. В одном из вариантов изобретения указанной заменой является V48I, F67A, I69F, R71A, N73T и/или L78A. Так, например, в одном из вариантов изобретения вариант каркасной консенсусной последовательности тяжелой цепи подгруппы III содержит замену в положении 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 и/или 80. В одном из вариантов изобретения указанной заменой является V48I, F67A, I69F, R71A, N73T, K75S, L78A и/или L80M. В одном из вариантов изобретения вариабельный домен легкой цепи антитела согласно изобретению содержит человеческую консенсусную каркасную последовательность, которая в одном из вариантов изобретения представляет собой консенсусную каркасную последовательность к1. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант консенсусной каркасной последовательности к1, модифицированной по меньшей мере в одном положении аминокислоты. Так, например, в одном из вариантов изобретения вариант консенсусной каркасной последовательности к1 может содержать замену в положении 4. В одном из вариантов изобретения указанной заменой является M4L. Так, например, в одном из вариантов изобретения вариант консенсусной каркасной последовательности к1 может содержить замену в положении 4 и/или 47. В одном из вариантов изобретения указанной заменой является M4L и/или L47F.
Как известно специалистам, и как более подробно описано ниже, положение аминокислоты/пограничная аминокислота, определяющая гипервариабельную область антитела, может варьироваться в зависимости от окружения данной аминокислоты и от различных ее характеристик, известных специалистам (как описано ниже). Некоторые положения в вариабельном домене могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения, то есть эти положения могут, предположительно, находиться в гипервариабельной области в соответствии с одним набором критериев, а могут находиться за пределами гипервариабельной области в соответствии с другим набором критериев. Одно или несколько таких положений могут также присутствовать в удлиненных гипервариабельных областях (как более подробно определено ниже). Настоящее изобретение относится к антителам, содержащим модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. В одном из вариантов изобретения такими гипервариабельными положениями являются одно или несколько положений 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94 и 101-102 в вариабельном домене тяжелой цепи. В одном из вариантов изобретения такими гибридными гипервариабельными положениями являются одно или несколько положений 24-29, 35-36, 46-49, 56 и 97 в вариабельном домене легкой цепи. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант человеческой консенсусной каркасной последовательности подгруппы человеческих антител, модифицированный в одном или нескольких гибридных гипервариабельных положениях.
В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий вариант консенсусной каркасной последовательности человеческой подгруппы III, модифицированный в одном или нескольких положениях 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 и 101. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену G26P. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену F27Y. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену T28P, S, Y, G или N. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену F29L или F29V. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену S30T, R, N, K, C, G или P. В одном из вариантов изобретения, антитело содержит замену A33W или A33F. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену M34I, V или L. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену S35E, Q, N или D. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену V48I. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену S49G. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену Y58N. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену A60N. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену D61E. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену S62I. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену V63F. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену A93T. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену D101S.
В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий вариант консенсусной каркасной последовательности человеческой подгруппы I каппа, модифицированный в одном или нескольких положениях 24, 27-29, 56 и 97. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену R24K. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену Q27K. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену S28D или E. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену I29G, A или S. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену S56R, N, T или G. В одном из вариантов изобретения антитело содержит замену T97N.
В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий вариант консенсусной каркасной последовательности человеческой подгруппы III, модифицированный в положениях 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или во всех положениях 26-30, 33-35, 48-49, 58, 60-63, 93 и 101. В одном из вариантов изобретения такую модификацию выбирают из группы, состоящей из G26P, F27Y, T28P (S, Y, G или N), F29L (V), S30T (R, N, K, C, G или P), A33W (F), M34I (V или L), S35E (Q, N или D), V48I, S49G, Y58N, A60N, D61E, S62I, V63F, A93T и D101S. В некоторых вариантах изобретения антитело согласно изобретению сождержит вариант консенсусной каркасной последовательности подгруппы III, модифицированный в положениях 48, 67, 69, 71, 73, 75, 78 и/или 80. В одном из вариантов изобретения указанной заменой является V48I, F67A, I69F, R71A, N73T, K75S, L78A и/или L80M.
В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий вариант консенсусной каркасной человеческой последовательности каппа подгруппы I, модифицированный в положениях 1, 2, 3, 4, 5 или во всех положениях 24, 27-29, 56 и 97. В одном из вариантов изобретения указанную модификацию выбирают из группы, состоящей из R24K, Q27K, S28D (E), I29G (A или S), S56R (N, T или G) и T97N. В некоторых вариантах изобретения антитело согласно изобретению содержит вариант консенсусной каркасной последовательности к1, модифицированный в положении 4 и/или 47. В одном из вариантов изобретения указанной заменой является M4L и/или L47F.
Антитело согласно изобретению может содержать любую подходящую человеческую или человеческую консенсусную каркасную последовательность легкой цепи, при условии, что такое антитело будет обладать нужными биологическими свойствами (например, желаемой аффинностью связывания). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит по меньшей мере часть каркасной последовательности человеческой легкой цепи каппа (или всю указанную последовательность). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит по меньшей мере часть каркасной консенсусной последовательности человеческой подгруппы I каппа (или всю указанную последовательность).
В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, включающий каркасную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9 (фигуры 7A-B) и/или 13 (фигуры 8A-B).
В одном из аспектов изобретения антителом согласно изобретению является гуманизированное анти-CD79b антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством. В одном из аспектов изобретения гуманизированное анти-CD79b антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, ингибирует прогрессирование опухоли в ксенотрансплантатах.
В одном из аспектов изобретения гуманизированное антитело и химерное антитело являются одновалентными. В одном из вариантов изобретения гуманизированное и химерное антитело содержат одну Fab-область, связанную с Fc-областью. В одном из вариантов изобретения эталонное химерное антитело содержит последовательности вариабельных доменов, представленные на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14) и связанные с человеческой Fc-областью. В одном из вариантов изобретения человеческой Fc-областью является область IgG (например, IgG1, 2, 3 или 4).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 164-166). В одном из вариантов изобретения вариабельный домен содержит последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 160-163). В одном из аспектов изобретения антитело содержит последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 167 и/или 168). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 15, SEQ ID NO: 164-166), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 15, SEQ ID NO: 160-163). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 15, SEQ ID NO: 164-166), и последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 5 (SEQ ID NO: 167 и/или 168). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 15, SEQ ID NO: 164-166), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 15, SEQ ID NO: 160-163), и последовательность CH1 и/или Fc (фигура 15, SEQ ID NO: 167 и/или 168).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 156-158). В одном из вариантов изобретения вариабельный домен содержит последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 152-155). В одном из вариантов изобретения указанное антитело содержит последовательность CL1, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 159). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO: 152-155), представленную на фигуре 15. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158), и последовательность CL1 (SEQ ID NO: 159), представленную на фигуре 15. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 156-158), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO: 152-155), представленную на фигуре 15, и последовательность CL1, представленную на фигуре 15 (SEQ ID NO: 159).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 183-185). В одном из вариантов изобретения вариабельный домен содержит последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 179-182). В одном из аспектов изобретения антитело содержит последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 186 и/или 187). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 16, SEQ ID NO: 183-185), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 16, SEQ ID NO: 179-182). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 16, SEQ ID NO: 183-185), и последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 5 (SEQ ID NO: 186 и/или 187). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 16, SEQ ID NO: 183-185), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 16, SEQ ID NO: 179-182), и последовательность CH1 и/или Fc (фигура 16, SEQ ID NO: 186 и/или 187).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 175-177). В одном из вариантов изобретения вариабельный домен содержит последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 171-174). В одном из вариантов изобретения указанное антитело содержит последовательность CL1, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 178). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO: 171-174), представленную на фигуре 16. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), и последовательность CL1 (SEQ ID NO: 178), представленную на фигуре 16. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 175-177), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO: 171-174), представленную на фигуре 16, и последовательность CL1, представленную на фигуре 16 (SEQ ID NO: 178).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 202-204). В одном из вариантов изобретения вариабельный домен содержит последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 198-201). В одном из аспектов изобретения антитело содержит последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 205 и/или 206). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 17, SEQ ID NO: 202-204), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 17, SEQ ID NO: 198-201). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 17, SEQ ID NO: 202-204), и последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 205 и/или 206). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 17, SEQ ID NO: 202-204), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 17, SEQ ID NO: 198-201), и последовательность CH1 и/или Fc (фигура 17, SEQ ID NO: 205 и/или 206).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 194-196). В одном из вариантов изобретения вариабельный домен содержит последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 190-193). В одном из вариантов изобретения указанное антитело содержит последовательность CL1, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 197). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO: 190-193), представленную на фигуре 17. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), и последовательность CL1 (SEQ ID NO: 197), представленную на фигуре 17. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 194-196), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO: 190-193), представленную на фигуре 17, и последовательность CL1, представленную на фигуре 17 (SEQ ID NO: 197).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 221-223). В одном из вариантов изобретения вариабельный домен содержит последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 217-220). В одном из аспектов изобретения антитело содержит последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 224 и/или 225). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 18, SEQ ID NO: 221-223), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 18, SEQ ID NO: 217-220). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 18, SEQ ID NO: 221-223), и последовательность CH1 и/или Fc, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 224 и/или 225). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен тяжелой цепи, включающий последовательность HVR1-HC, HVR2-HC и/или HVR3-HC (фигура 18, SEQ ID NO: 221-223), и последовательность FR1-HC, FR2-HC, FR3-HC и/или FR4-HC (фигура 18, SEQ ID NO: 217-220), и последовательность CH1 и/или Fc (фигура 18, SEQ ID NO: 224 и/или 225).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 213-215). В одном из вариантов изобретения вариабельный домен содержит последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 209-212). В одном из вариантов изобретения указанное антитело содержит последовательность CL1, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 216). В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO: 209-212), представленную на фигуре 18. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), и последовательность CL1 (SEQ ID NO: 216), представленную на фигуре 18. В одном из вариантов изобретения антитело согласно изобретению содержит вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность HVR1-LC, HVR2-LC и/или HVR3-LC (SEQ ID NO: 213-215), и последовательность FR1-LC, FR2-LC, FR3-LC и/или FR4-LC (SEQ ID NO: 209-212), представленную на фигуре 18, и последовательность CL1, представленную на фигуре 18 (SEQ ID NO: 216).
В одном из аспектов изобретения антителами согласно изобретению являются сконструированные на основе цистеина антитела, в которых одна или несколько аминокислот родительского антитела заменены свободной цистеиновой аминокислотой, как описано в заявке WO 2006/034488; и в заявке на патент США 2007/0092940 (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Таким образом может быть сконструирована любая форма анти-CD79b антитела, то есть мутированное антитело. Так, например, Fab-фрагмент родительского антитела может быть сконструирован так, чтобы он представлял собой сконструированный на основе цистеина Fab, обозначенный здесь «ThioFab». Аналогичным образом, может быть сконструировано родительское моноклональное антитело, представляющее собой «ThioMab». Следует отметить, что мутация в одном сайте приводит к включению одного цистеинового остатка в ThioFab, а мутация в двух сайтах приводит к включению двух цистеиновых остатков в ThioMab, что обусловлено димерной природой антитела IgG. Сконструированными на основе цистеина анти-CD79b антителами согласно изобретению являются моноклональные антитела, гуманизированные или химерные моноклональные антитела, и антигенсвязывающие фрагменты антител, гибридные полипептиды и аналоги, которые преимущественно связываются с клеточно-ассоциированными полипептидами CD79b. Сконструированное на основе цистеина антитело может альтернативно включать антитело, содержащее цистеин в описанных здесь положениях антитела или Fab, и такая конструкция может быть получена после конструирования последовательности и/или отбора антител, избегая необходимости модификации родительского антитела, где такое конструирование проводят путем создания антител методом фагового представления и отбора таких антител или посредством конструирования каркасных последовательностей и константных областей легкой и/или тяжелой цепи de novo. Сконструированное на основе цистеина антитело содержит одно или несколько свободных цистеиновых аминокислот, имеющих величину тиоловой реактивности в пределах 0,6-1,0; 0,7-1,0 или 0,8-1,0. Свободная цистеиновая аминокислота представляет собой цистеиновый остаток, который был введен в родительское антитело и не является частью дисульфидного мостика. Сконструированное на основе цистеина антитело может быть использовано для присоединения цитотоксических и/или визуализирующих соединений в сайте введенного цистеина посредством, например, малеимида или галогенацетила. Нуклеофильная реактивность тиоловых функциональных групп остатка Cys с малеимидной группой приблизительно в 1000 раз выше, чем реактивность любых других функциональных групп аминокислот в белке, таких как аминогруппа лизиновых остатков или N-концевая аминогруппа. Тиол-специфическая функциональная группа в йодацетильных и малеимидных реагентах может реагировать с аминогруппами, но при более высоком рН (>9,0), и такая реакция занимает больше времени (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London).
В одном из аспектов изобретения сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело согласно изобретению содержит цистеин, введенный в любое одно из нижеследующих положений, где положения в легкой цепи пронумерованы по Кабату (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), а положения в тяжелой цепи пронумерованы в соответствии с Европейской системой нумерации (включая Fc-область) (см. Kabat et al. (1991), см. выше), где константная область легкой цепи, представленная и подчеркнутая на фигурах 24A, 25A, 26A, 27A, 28, 48A и 49A, начинается с положения 109 (нумерация по Кабату), а константная область тяжелой цепи, представленная и подчеркнутая на фигурах 24B, 25B, 26B, 27B, 28B, 48B и 49B, начинается с положения 118 (в соответствии с Европейской системой нумерации (EU)). Таким положением может быть также положение в последовательной нумерации аминокислот полноразмерной легкой цепи или тяжелой цепи, представленной на фигурах 24-28, 48 и 49. В одном из вариантов изобретения анти-CD79b антитело содержит цистеин, введенный в LC-V205C (номер по Кабату: Val 205; порядковый номер 209 на фигуре 27A и 49A означает Cys, введенный в это положение). Цистеин, введенный в легкую цепь, показан жирным шрифтом и подчеркнут двойной чертой на фигурах 27A и 49A. В одном из вариантов изобретения анти-CD79b антитело содержит цистеин, введенный в HC-A118C (номер EU: Ala 118; номер по Кабату 114; порядковый номер 118 на фигуре 24B, 25B, 26B, 28B или 48B означает Cys, введенный в этом положении). Цистеин, введенный в тяжелую цепь, показан жирным шрифтом и подчеркнут двойной чертой на фигурах 24B, 25B, 26B, 28B или 48B. В одном из вариантов изобретения анти-CD79b антитело содержит цистеин, введенный в Fc-S400C (номер EU: Ser 400; номер по Кабату 396; порядковый номер 400 на фигурах 24B, 25B, 26B, 28B или 48B означает Cys, введенный в этом положении). В других вариантах изобретения цистеин, введенный в тяжелую цепь (включая Fc-область), присутствует в любом одном из следующих положений (в соответствии с нумерацией по Кабату, а в скобках в соответствии с нумерацией EU): 5, 23, 84, 112, 114 (номер по EU 118), 116 (номер по EU 120), 278 (номер по EU 282), 371 (номер по EU 375) или 396 (номер по EU 400). Таким образом, модификациями аминокислот в этих положениях для родительского гуманизированного анти-CD79b антитела согласно изобретению являются: V5C, A23C, A84C, S112C, A114C (номер по EU A118C), T116C (номер по EU T120C), V278C (номер по EU V282C), S371C (номер по EU S375C) или S396C (номер по EU S400C). Таким образом, модификациями аминокислот в этих положениях для родительского химерного анти-CD79b антитела согласно изобретению являются: Q5C, K23C, S84C, S112C, A114C (номер по EU A118C), T116C (номер по EU T120C), V278C (номер по EU V282C), S371C (номер по EU S375C) или S396C (номер по EU S400C). Таким образом, модификациями аминокислот в этих положениях для родительского антитела против CD79b собакоподобных обезьян (anti-cynoCD79b) согласно изобретению являются: Q5C, T23C, S84C, S112C, A114C (номер по EU A118C), T116C (номер по EU T120C), V278C (номер по EU V282C), S371C (номер по EU S375C) или S396C (номер по EU S400C). В других вариантах изобретения цистеином, введенным в легкую цепь, является цистеин в любом из следующих положений: (в соответствии с нумерацией по Кабату): 15, 110, 114, 121, 127, 168, 205. Таким образом, модификациями аминокислот в этих положениях для родительского гуманизированного анти-CD79b антитела согласно изобретению являются: V15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C или V205C. Таким образом, модификациями аминокислот в этих положениях для родительского химерного анти-CD79b антитела согласно изобретению являются: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C или V205C. Таким образом, модификациями аминокислот в этих положениях для родительского анти-cynoCD79b антитела согласно изобретению являются: L15C, V110C, S114C, S121C, S127C, S168C или V205C.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение включает сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело, содержащее одну или несколько свободных цистеиновых аминокислот, где указанное сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело связывается с полипептидом CD79b, и где указанное антитело получают способом, включающим замену одного или нескольких аминокислотных остатков родительского анти-CD79b антитела цистеином, где указанное родительское антитело содержит по меньшей мере одну последовательность HVR, выбранных из:
(a) HVR-L1, содержащей последовательность A1-A15, где A1-A15 представляет собой KASQSVDYDGDSFLN (SEQ ID NO: 131) или KASQSVDYEGDSFLN (SEQ ID NO: 137);
(b) HVR-L2, содержащей последовательность B1-B7, где B1-B7 представляет собой AASNLES (SEQ ID NO: 132);
(c) HVR-L3, содержащей последовательность C1-C9, где C1-C9 представляет собой QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 133);
(d) HVR-H1, содержащей последовательность D1-D10, где D1-D10 представляет собой GYTFSSYWIE (SEQ ID NO: 134);
(e) HVR-H2, содержащей последовательность E1-E18, где E1-E18 представляет собой GEILPGGGDTNYNEIFKG (SEQ ID NO: 135); и
(f) HVR-H3, содержащей последовательность F1-F10, где F1-F10 представляет собой TRRVPVYFDY (SEQ ID NO: 136) или TRRVPIRLDY (SEQ ID NO: 138).
В некоторых своих аспектах настоящее изобретение относится к сконструированному на основе цистеина анти-CD79b антителу, содержащему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80% и, альтернативно, по меньшей мере примерно на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности сконструированного на основе цистеина антитела, имеющего полноразмерную последовательность, описанную в настоящей заявке, или аминокислотной последовательности сконструированного на основе цистеина антитела, не содержащего сигнального пептида и описанного в настоящей заявке.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенному сконструированному на основе цистеина анти-CD79b антителу, содержащему аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, гибридизующейся с комплементом молекулы ДНК, кодирующей (a) сконструированное на основе цистеина антитело, имеющее полноразмерную аминокислотную последовательность, описанную в настоящей заявке, (b) аминокислотную последовательность сконструированного на основе цистеина антитела, не содержащую сигнального пептида и описанную в настоящей заявке, (c) внеклеточный домен трансмембранного белка сконструированного на основе цистеина антитела, содержащего или не содержащего сигнальный пептид, как описано в настоящей заявке, (d) аминокислотную последовательность, кодируемую любыми описанными здесь последовательностями нуклеиновой кислоты, или (e) любой другой конкретно определенный фрагмент полноразмерной аминокислотной последовательности сконструированного на основе цистеина антитела, описанного в настоящей заявке.
В своем конкретном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному сконструированному на основе цистеина анти-CD79b антителу, не содержащему N-концевой сигнальной последовательности и/или инициирующего метионина и кодируемому нуклеотидной последовательностью, которая кодирует такую аминокислотную последовательность, описанную в настоящей заявке. В настоящей заявке также описаны способы получения таких антител, где указанные способы включают культивирование клеток-хозяев, содержащих вектор, включающий соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, в условиях, подходящих для экспрессии указанного сконструированного на основе цистеина антитела, и выделение сконструированного на основе цистеина антитела из клеточной культуры.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенному сконструированному на основе цистеина анти-CD79b антителу, которое представляет собой антитело с делетированным трансмембранным доменом или с инактивированным трансмембранным доменом. В настоящей заявке также описаны способы получения таких антител, где указанные способы включают культивирование клеток-хозяев, содержащих вектор, включающий соответствующую кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, в условиях, подходящих для экспрессии указанного сконструированного на основе цистеина антитела, и выделение сконструированного на основе цистеина антитела из клеточной культуры.
В других своих аспектах настоящее изобретение относится к выделенным химерным и сконструированным на основе цистеина анти-CD79b антителам, содержащим любое из описанных здесь сконструированных на основе цистеина антител, связанных с гетерологичным полипептидом (не являющимся CD79b). Примеры таких химерных антител содержат любое из описанных здесь сконструированных на основе цистеина антител, связанных с гетерологичным полипептидом, таким как, например, последовательность эпитопной метки или Fc-область иммуноглобулина.
Сконструированным на основе цистеина анти-CD79b антителом может быть моноклональное антитело, фрагмент антитела, химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело или антитело, которое конкурентно ингибирует связывание антитела против полипептида CD79b с его соответствующим антигенным эпитопом. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, конъюгированы с рост-ингибирующим агентом или с цитотоксическим средством, таким как токсин, включая, например, ауристатин, майтанзиноид, производное долостатина или калихеамицин, антибиотик, радиоактивный изотоп, нуклеолитический фермент или т.п. Антитела согласно изобретению могут быть, но необязательно, продуцированы в клетках CHO или в бактериальных клетках, и предпочтительно ингибируют рост или пролиферацию клеток, с которыми они связаны, или индуцируют гибель таких клеток. Антитела согласно изобретению, используемые в диагностических целях, могут быть детектируемо помечены, присоединены к твердому носителю или т.п.
В других своих аспектах настоящее изобретение относится к векторам, содержащим ДНК, кодирующую любое из описанных здесь анти-CD79b антител и сконструированных на основе цистеина анти-CD79b антител. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим любой из таких векторов. Так, например, клетками-хозяевами могут быть клетки CHO, клетки E. coli или дрожжевые клетки. Настоящее изобретение также относится к способу получения любого из описанных здесь полипептидов, и такой способ включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии нужного полипептида, и выделение нужного полипептида из клеточной культуры.
Сконструированные на основе цистеина антитела могут быть использованы для лечения рака, и такими антителами являются антитела, специфичные к рецепторам клеточной поверхности и трансмембранным рецепторам, и к опухолеассоциированным антигенам (TAA). Такие антитела могут быть использованы в качестве «оголенных» антител (неконъюгированных с лекарственным средством или с молекулой-меткой) или конъюгатов «антитело-лекарственное средство» (ADC). Сконструированные на основе цистеина антитела согласно изобретению могут быть сайт-специфически и эффективно присоединены к реагенту, реагирующему с тиолом. Реагирующим с тиолом реагентом может быть многофункциональный линкерный реагент, реагент-метка для захвата, реагент-флуорофор и промежуточное соединение «лекарственное средство-линкер». Сконструированное на основе цистеина антитело может быть помечено детектируемой меткой, иммобилизовано на твердофазном носителе и/или конъюгировано с молекулой лекарственного средства. Реакционная способность тиоловой группы может быть сообщена любому антителу, где могут быть сделаны замены аминокислот реакционноспособными цистеиновыми аминокислотами в пределах легких цепей, выбранных из следующих областей аминокислотных последовательностей: L10-L20, L105-L115, L109-L119, L116-L126, L122-L132, L163-L173, L200-L210; и в пределах тяжелых цепей, выбранных из следующих областей аминокислотных последовательностей: H1-H10, H18-H28, H79-H89, H107-H117, H109-H119, H111-H121, и Fc-области в пределах, выбранных из H270-H280, H366-H376, H391-401, где нумерация положений аминокислот начинается с положения 1 по системе нумерации Кабата (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) и далее продолжается, как описано в WO2006034488, US 2007/0092940. Реакционная способность тиоловой группы может быть сообщена некоторым доменам антитела, таким как константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Цистеиновые замены, дающие величину реакционной способности тиоловой группы 0,6 и выше, могут быть сделаны в константных доменах тяжелой цепи α, δ, ε, γ и μ интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая подклассы IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Такие антитела и их применение описаны в WO2006/034488, US 2007/0092940.
Сконструированные на основе цистеина антитела согласно изобретению предпочтительно сохраняют антигенсвязывающую способность их родительских аналогов дикого типа. Таким образом, сконструированные на основе цистеина антитела обладают способностью связываться, предпочтительно специфически, с антигенами. Такими антигенами являются, например, опухолеассоциированые антигены (ТАА), белки рецепторов клеточной поверхности и другие молекулы клеточной поверхности, трансмембранные белки, сигнальные белки, факторы регуляции выживаемости клеток, факторы регуляции пролиферации клеток, молекулы, ассоциированные с развитием или дифференцировкой ткани (например, молекулы, которые, как известно или как предполагается, участвуют в таком развитии или в такой дифференцировке), лимфокины, цитокины, молекулы, участвующие в регуляции клеточного цикла, молекулы, участвующие в образовании сосудов, и молекулы, ассоциированные с ангиогенезом (например, молекулы, которые, как известно или как предполагается, участвуют в таком ангиогенезе). Опухолеассоциированным антигеном может быть фактор дифференцировки кластера (то есть белок CD, включая, но не ограничиваясь им, CD79b). Сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела согласно изобретению сохраняют антигенсвязывающую способность родительских аналогов анти-CD79b антитела. Таким образом, сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела согласно изобретению обладают способностью связываться, предпочтительно специфически, с антигенами CD79b, включая изоформы бета и/или альфа человеческого анти-CD79b антитела, если указанные антигены экспрессируются на поверхности клеток, включая, но не ограничиваясь ими, В-клетки.
В одном из аспектов изобретения антитела согласно изобретению могут быть конъюгированы с любой молекулой-меткой, которая может быть ковалентно связана с антителом посредством реакционноспособной молекулы, активированной группы или реакционноспособной тиоловой группы цистеина (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL). Присоединенная метка может обладать следующими функциями, а именно: (i) продуцировать детектируемый сигнал; (ii) взаимодействовать со второй меткой и тем самым модифицировать детектируемый сигнал, передаваемый первой или второй меткой, например, посредством FRET (переноса флуоресцентной резонансной энергии); (iii) стабилизировать взаимодействие или повышать аффинность связывания с антигеном или лигандом; (iv) влиять на подвижность, например электрофоретическую подвижность или на клеточную проницаемость посредством заряда, гидрофобности, формы или других физических параметров; или (v) образовывать иммобилизованную молекулу и тем самым модулировать аффинность к лиганду, связывание антитела с антигеном или образование ионных комплексов.
Меченые антитела, сконструированные на основе цистеина, могут быть использованы в диагностических анализах, например, для детектирования экспрессии представляющего интерес антигена в конкретных клетках, тканях или в сыворотке. Для применения в диагностических целях указанное антитело обычно метят детектируемой молекулой. Существуют различные метки, которые могут быть по существу подразделены на группы по следующим категориям:
3
11
14
18
32
35
64
68
86
99
111
123
124
125
131
133
177
211
213
Радиоизотопы (радионуклиды), такие как Н, С, С, F, Р, S, Cu, Ga, Y, Tc, In, I, I, I, I, Xe, Lu, At или Bi. Меченные радиоизотопами антитела могут быть использованы в экспериментах по визуализации рецепторов-мишеней. Антитело может быть помечено реагентами-лигандами, которые связываются либо образуют хелатный комплекс или какой-либо другой комплекс с металлом-радиоизотопом, где указанный реагент способен реагировать с тиолом цистеинов, введенных в указанное антитело, в соответствии с методами, описанными в Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Хелатообразующими лигандами, которые могут образовывать комплекс с ионами металла, являются DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA и TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Радионуклиды могут быть присоединены посредством образования комплекса с конъюгатами “антитело-лекарственное средство” согласно изобретению (Wu et al. (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146).
Линкерные реагенты, такие как DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), могут быть получены посредством реакции взаимодействия аминобензил-DOTA с 4-малеимидомасляной кислотой (Fluka), активированной изопропилхлорформиатом (Aldrich), в соответствии с процедурой, описанной Axworthy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807). DOTA-малеимидные реагенты реагируют со свободными цистеиновыми аминокислотными остатками сконструированных на основе цистеина антител и способствуют образованию комплекса металл-лиганд на указанном антителе (Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Реагенты для мечения хелатообразующего линкера, такие как DOTA-NHS (моно-N-гидрокси-сукцинимидоэфир l,4,7,10-тетраазациклододекан-l,4,7,10-тетрауксусной кислоты), являются коммерчески доступными (Macrocyclics, Dallas, TX). Визуализация рецептора-мишени меченными радионуклидом антителами позволяет идентифицировать активацию пути посредством детектирования и количественной оценки прогрессирующей аккумуляции антител в опухолевой ткани (Albert et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210). Конъюгированные радиоактивные металлы могут оставаться внутри клеток после деградации лизосом.
Хелатные комплексы с металлом, подходящие для мечения антитела в экспериментах по визуализации, описаны в патентах США 5342606; 5428155; 5316757; 5480990; 5462725; 5428139; 5385893; 5739294; 5750660; 5834456; и в публикациях Hnatowich et al. (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al. (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al. (1990) J. Cancer l990, Suppl. 10:21-26; Izard et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al. (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al .(1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al. (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al. (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al. (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al. (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al. (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al. (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al. (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
Флуоресцентные метки, такие как хелаты, образованные редкоземельными металлами (хелаты, образованные европием), флуоресцеины нескольких типов, включая ФИТЦ, 5-карбоксифлуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин; родамины нескольких типов, включая TAMRA; данзил; лиссамин; цианины; фикоэритрины; техасский красный и их аналоги. Флуоресцентные метки могут быть конъюгированы с антителами методами, описанными, например, в руководстве Current Protocols in Immunology, см. выше. Флуоресцентными красителями и флуоресцентными реагентами-метками являются коммерчески доступные реагенты, поставляемые фирмами Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) и Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).
Различные метки “фермент-субстрат” являются доступными или описаны в литературе (в патенте США 4275149). Фермент обычно катализирует химическое превращение хромогенного субстрата, которое может быть измерено различными методами. Так, например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое может быть измерено спектрофотометрическим методом. Альтернативно фермент может изменять интенсивность флуоресценции или хемилюминесценции субстрата. Методы количественной оценки изменения интенсивности флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат подвергается электронному возбуждению под действием химической реакции, после чего он может излучать свет, который может быть затем измерен (например, на хемилюминометре), или сообщать энергию флуоресцентному акцептору. Примерами ферментативных меток являются люциферазы (например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза; патент США 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малат-дегидрогеназа, уреаза, пероксидаза, такая как пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза (ЩФ), β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахарид-оксидазы (например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантин-оксидаза), лактопероксидаза, микропероксидаза и т.п. Методы конъюгирования ферментов с антителами описаны в публикациях O'Sullivan et al. (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166.
Примерами комбинаций “фермент-субстрат” являются, например:
(i) пероксидаза хрена (ПХ) с ее субстратом пероксидом водорода, где указанный пероксид водорода окисляет краситель-предшественник (например, ортофенилендиамин (OPD) или гидрохлорид 3,3',5,5'- тетраметилбензидина (TMB));
(ii) щелочная фосфатаза (ЩФ) с ее хромогенным субстратом пара-нитрофенилфосфатом; и
(iii) β-D-галактозидаза (β-D-Gal) с ее хромогенным субстратом (например, п-нитрофенил-β-D-галактозидазой) или флуорогенным субстратом 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозидазой.
Специалистам известны и различные другие комбинации “фермент-субстрат”. Общее их описание можно найти в патентах США 4275149 и 4318980.
Метка может быть непосредственно конъюгирована с аминокислотной боковой цепью, с активированной аминокислотной боковой цепью, с антителом, сконструированным на основе цистенина и т.п. Так, например, антитело может быть конъюгировано с биотином, а любая из меток трех вышеуказанных широких категорий может быть конъюгирована с авидином или со стрептавидином, или наоборот. Биотин селективно связывается со стрептавидином, и, таким образом, данная метка может быть опосредованно конъюгирована с антителом. Альтернативно, для осуществления непрямого конъюгирования метки с полипептидным вариантом, такой полипептидный вариант конъюгируют с небольшим гаптеном (например, дигоксином), а одну из меток вышеупомянутых различных типов конъюгируют с антигаптеновым полипептидным вариантом (например, с антителом против дигоксина). Таким образом, может быть достигнуто опосредованное конъюгирование метки с полипептидным вариантом (Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).
Антитело согласно изобретению может быть использовано в любом известном аналитическом методе, таком как ELISA, в анализах на конкурентное связывание, в прямых и непрямых “сэндвич”-анализах и в анализах, проводимых путем иммунопреципитации (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158, CRC Press, Inc.).
Детектируемая метка может быть использована для определения локализации, для визуализации и количественной оценки события связывания или распознавания. Меченые антитела согласно изобретению могут распознавать рецепторы клеточной поверхности. Другим применением детектируемо меченных антител является метод иммунной иммобилизации на сферах, включающий конъюгирование сферы с флуоресцентно меченным антителом и детектирование флуоресцентного сигнала после связывания с лигандом. В аналогичных методах детектирования связывания, для измерения и детектирования взаимодействий антитела с антигеном применяется эффект поверхностного плазмонного резонанса (ППР).
Детектируемые метки, такие как флуоресцентные красители и хемилюминесцентные красители (Briggs et al. (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids", J. Chem. Soc, Perkin-Trans. 1:1051-1058), дают детектируемый сигнал и обычно используются для мечения антител, предпочтительно обладающих нижеследующими свойствами, а именно: (i) меченое антитело должно продуцировать сигнал с очень высокой интенсивностью при низком фоновом сигнале, так, чтобы небольшие количества антител могли быть детектированы высокочувствительным методом в бесклеточном или клеточном анализе; и (ii) меченое антитело должно быть фотостабильным, так чтобы флуоресцентный сигнал мог детектироваться, наблюдаться и регистрироваться без применения значительного уровня оптического отбеливания. В методах, в которых применяется связывание меченого антитела с клеточными мембранами или с клеточными поверхностями, особенно “живых” клеток, данные метки предпочтительно (iii) должны иметь хорошую растворимость в воде, что позволяет достичь эффективной концентрации конъюгата и высокой чувствительности детекции, и (iv) должны быть нетоксичными по отношению к “живым” клеткам во избежание нарушения нормальных метаболических процессов в клетках или преждевременной гибели клеток.
Прямая количественная оценка интенсивности флуоресценции клеток и подсчет событий флуоресцентного мечения, например событий связывания конъюгатов “пептид-краситель” с клеточной поверхностью, могут быть осуществлены на системе FMAT 8100 HTS System (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), которая позволяет проводить автоматическое смешивание и считывание, и нерадиоактивные анализы на “живых” клетках или на сферах (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). Применение меченых антител также предусматривает проведение анализов на связывание с рецептором клеточной поверхности, анализов с иммунной иммобилизацией, флуоресцентных твердофазных анализов (ELISA), анализа путем расщепления каспазой (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; US 6372907), анализа на апоптоз (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184:39-51) и анализа на цитотоксичность. Метод флуориметрического анализа на уровне микрообъемов может быть применен для идентификации позитивной или негативной регуляции под действием молекулы, доставленной на клеточную поверхность (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).
Меченые антитела согласно изобретению могут быть использованы в качестве визуализирующих биологических маркеров и зондов в различных методах и технологиях биомедицины и молекулярной визуализации, таких как (i) MRI (визуализация методом магнитного резонанса); (ii) MicroCT (компьютерная томография); (iii) SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография); (iv) PET (позитронная эмиссионная томография) Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) биолюминесценция; (vi) флуоресценция; и (vii) ультразвуковое обследование. Иммуносцинтиграфия представляет собой способ визуализации, в котором антитела, меченные радиоактивными веществами, вводят животному или человеку, и по изображению определяют место локализации антитела в организме животного или человека (патент США 6528624). Визуализирующие биомаркеры могут быть объективно измерены и оценены как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических ответов на терапевтическое лечение. Биологическими маркерами могут быть маркеры несколько типов: маркеры типа 0, которые представляют собой природные давно известные маркеры данного заболевания и линейно коррелируют с известными клиническими показателями, например, оценкой воспаления синовия при ревматоидном артрите, проводимой методом ЯМР-томографии; маркеры типа I, которые позволяют детектировать эффект терапевтического лечения в соответствии с действующим механизмом, даже если этот механизм не может быть ассоциирован с клиническим результатом; маркеры типа II, которые действуют как “суррогатные” конечные точки, где изменения в биомаркере или изменения сигнала, поступающего от биомаркера, позволяют предсказывать благоприятный клинический эффект для «подтверждения» целевого ответа, такого как эрозия кости при ревматоидном артрите, измеренная с помощью компьютерной томографии (КТ). Таким образом, с помощью визуализирующих биомаркеров могут быть получены фармакодинамические (ФД) терапевтические данные, относящиеся (i) к экспрессии белка-мишени, (ii) к связыванию терапевтического средства с белком-мишенью, то есть к селективности, и (iii) к клиренсу и времени полужизни; а также фармакокинетические данные. Преимуществами in vivo визуализирующих биомаркеров по сравнению с лабораторными биологическими маркерами являются: возможность их применения для осуществления неинвазивной обработки, возможность их количественной оценки и применения для обследования всего организма, возможность многократного введения доз и проведения анализов, то есть в различные моменты времени, и возможность применения результатов, полученных в преклинических исследованиях (для мелких животных), для проведения клинических исследований (для человека). В некоторых случаях биологическая визуализация позволяет не проводить ряд экспериментов или свести до минимума количество экспериментов на животных в преклинических исследованиях.
Методы мечения пептидов хорошо известны специалистам. См. Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al. (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; и Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al. (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al. (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.
Пептиды и белки, меченные двумя молекулами, флуоресцентным репортером и гасителем, находящимися в непосредственной близости друг от друга, участвуют в переносе резонансной энергии флуоресценции (FRET). Репортерные группы обычно представляют собой флуоресцентные красители, которые возбуждаются под действием света на определенных длинах волн и переносят энергию на акцептор или гаситель, то есть на группу с соответствующим стоксовым сдвигом, обеспечивающую излучение с максимальной яркостью. Флуоресцентными красителями являются молекулы с более явно выраженной ароматичностью, такие как флуоресцеин и родамин и их производные. Флуоресцентный репортер может быть частично или в значительной степени погашен молекулой-гасителем в интактном пептиде. После расщепления пептида пептидазой или протеазой может наблюдаться детектируемое увеличение интенсивности флуоресценции (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18-34).
Меченые антитела согласно изобретению могут быть также использованы в качестве средства для аффинной очистки. В этом способе меченое антитело иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола сефадекс или фильтровальная бумага, методами, хорошо известными специалистам. Иммобилизованное антитело подвергают контакту с образцом, содержащим очищаемый антиген, а затем носитель промывают подходящим растворителем для удаления почти всего материала в образце, за исключением очищаемого антигена, и присоединяют к иммобилизованному полипептидному варианту. И наконец, носитель промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, pH 5,0, который высвобождает антиген из полипептидного варианта.
Реагенты для мечения обычно имеют реакционноспособные функциональные группы, которые могут реагировать (i) непосредственно с тиолом цистеина антитела, сконструированного на основе цистеина, с образованием меченого антитела, (ii) с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения “линкер-метка” или (iii) с линкерным антителом с образованием меченого антитела. Реакционноспособными функциональными группами реагентов для мечения являются малеимид, галогенацетил, йодацетамидосукцинимидиловый эфир (например, NHS, N-гидроксисукцинимид), изотиоцианат, сульфонилхлорид, 2,6-дихлортриазинил, пентафторфениловый эфир и фосфорамидит, хотя могут быть также использованы и другие функциональные группы.
Репрезентативной реакционноспособной функциональной группой является N-гидроксисукцинимидоэфир (NHS), в котором карбоксигруппа замещена детектируемой меткой, например, биотином или флуоресцентным красителем. NHS-эфир указанной метки может быть предварительно получен, выделен, очищен и/или охарактеризаван, либо он может быть образован in situ и подвергнут реакции с нуклеофильной группой антитела. Обычно карбоксильную форму метки активируют посредством реакции взаимодействия с определенной комбинацией карбодиимидных реагентов, например, с дициклогексилкарбодиимидом, диизопропилкарбодиимидом, или урониевым реагентом, например, TSTU (тетрафторборатом O-(N-сукцинимидил)-N,N,N',N'-тетраметилурония), HBTU (гексафторфосфатом (O-бензотриазол-1-ил)-N,N,N'N'-тетраметилурония) или HATU (гексафторфосфатом O-(7-азабензотриазол-l-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония); и с активатором, таким как 1-гидроксибензотриазол (HOBt) и N-гидроксисукцинимид, с получением NHS-эфира метки. В некоторых случаях метка и антитело могут быть связаны посредством in situ активации метки и взаимодействия с антителом с получением конъюгата “метка-антитело” в одну стадию. Другими активирующими и связывающими реагентами являются TBTU (гексафторфосфат 2-(lH-бензотриазо-l-ил)-l,l,3,3-тетраметилурония), TFFH (2-фторгексафторфтосфат N,N',N",N'"-тетраметилурония), PyBOP (гексафторфосфат бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидинофосфония), EEDQ (2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин), DCC (дициклогексилкарбодиимид); DIPCDI (диизопропилкарбодиимид), MSNT (l-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-lH-l,2,4-триазол) и арилсульфонилгалогениды, например, триизопропилбензолсульфонилхлорид.
Соединения «альбумин-связывающий пептид-Fab» согласно изобретению
В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению присоединено к альбумин-связывающему белку. Связывание белка плазмы может быть эффективным средством улучшения фармакокинетических свойств короткоживущих молекул. Альбумин является самым распространенным белком в плазме. Пептиды, связывающиеся с альбумином сыворотки, (АВР), могут изменять фармакодинамику гибридных белков, содержащих активные домены, например изменять поглощающую способность ткани, ее проницаемость и диффузию. Эти фармакодинамические параметры могут быть модулированы путем специфического отбора соответствующей последовательности пептида, связывающегося с альбумином сыворотки (заявка на патент США 2004/0001827). Ряд альбумин-связывающих пептидов был идентифицирован посредством скрининга методом фагового дисплея (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J. Biol. Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Соединения согласно изобретению включают АВР-последовательности, описанные в работах (i) Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:35035-35043, таблицы III и IV, стр. 35038; (ii) в заявке на патент США 20040001827, абзац [0076], SEQ ID NO: 9-22; и (iii) WO 01/45746, стр. 12-13: которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Альбумин-связывающие (АВР)-Fab были сконструированы путем присоединения альбумин-связывающего пептида к С-концу тяжелой цепи Fab в стехиометрическом отношении 1:1 (1 АВР/1 Fab). Было показано, что связывание этих АВР-Fab с альбумином увеличивает время полужизни антитела у кроликов и мышей более чем в 25 раз. Поэтому вышеописанные реакционноспособные остатки Cys могут быть введены в эти АВР-Fab и использованы для сайт-специфического конъюгирования с цитотоксическими лекарственными средствами с последующим проведением исследований на животных in vivo.
Репрезентативными последовательностями альбумин-связывающего пептида являются, но не ограничиваются ими, аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 246-250:
CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 246
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 247
QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 248
RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 249
DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 250
Конъюгаты «антитело-лекарственное средство»
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам или к конъюгатам «антитело-лекарственное средство» (ADC), содержащим антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство, лекарственное средство, рост-ингибирующий агент, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (то есть радиоконъюгат). В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам применения таких иммуноконъюгатов. В одном из аспектов изобретения иммуноконъюгат содержит любое из вышеупомянутых анти-CD79b антител, ковалентно связанных с цитотоксическим средством или с детектируемым агентом.
В одном из аспектов изобретения анти-CD79b антитело согласно изобретению связывается с тем же эпитопом на CD79b, с которым связывается другое антитело против CD79b. В другом варианте изобретения анти-CD79b антитело согласно изобретению связывается с тем же эпитопом на CD79b, с которым связывается Fab-фрагмент моноклонального антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC под номером HB11413 20 июля 1993 г., моноклонального антитела, содержащего вариабельные домены SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B), или химерного антитела, содержащего вариабельный домен антитела, полученного из гибридом HB11413, депонированных в ATCC 20 июля 1993 г., и константные домены от IgG1, или вариабельные домены моноклонального антитела, содержащего последовательности SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B). В другом варианте изобретения анти-CD79b антитело согласно изобретению связывается с тем же эпитопом на CD79b, с которым связывается другое анти-CD79b антитело (то есть CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (AbD Serotec Catalog #MCA2209), антитело против человеческого CD79b (BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA)).
В другом аспекте изобретения анти-CD79b антитело согласно изобретению связывается с эпитопом на CD79b, отличающимся от эпитопа, с которым связывается другое анти-CD79b антитело. В другом варианте изобретения анти-CD79b антитело согласно изобретению связывается с эпитопом на CD79b, отличающимся от эпитопа, с которым связывается Fab-фрагмент моноклонального антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC под номером HB11413 20 июля 1993 г., моноклонального антитела, содержащего вариабельные домены SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B), или химерного антитела, содержащего вариабельный домен антитела, полученного из гибридом HB11413, депонированных в ATCC 20 июля 1993 г., и константные домены от IgG1, или вариабельные домены моноклонального антитела, содержащего последовательности SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B). В другом варианте изобретения анти-CD79b антитело согласно изобретению связывается с эпитопом на CD79b, отличающимся от эпитопа, с которым связывается другое анти-CD79b антитело (то есть CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (AbD Serotec Catalog #MCA2209), антитело против человеческого CD79b (BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA)).
В другом аспекте изобретения анти-CD79b антитело согласно изобретению отличается от (то есть не является им) Fab-фрагмента моноклонального антитела, полученного из гибридом, депонированных в ATCC под номером HB11413 20 июля 1993 г., моноклонального антитела, содержащего вариабельные домены SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B), или химерного антитела, содержащего вариабельный домен антитела, полученного из гибридом HB11413, депонированных в ATCC 20 июля 1993 г., и константные домены от IgG1, или вариабельные домены моноклонального антитела, содержащего последовательности SEQ ID NO: 10 (фигуры 7A-B) и SEQ ID NO: 14 (фигуры 8A-B). В другом аспекте изобретения анти-CD79b антитело согласно изобретению отличается от (то есть не является им) Fab-фрагмента другого анти-CD79b антитела (то есть CB3.1 (BD Biosciences Catalog #555678; San Jose, CA), AT105-1 (AbD Serotec Catalog #MCA2208; Raleigh, NC), AT107-2 (AbD Serotec Catalog #MCA2209), антитела против человеческого CD79b (BD Biosciences Catalog #557592; San Jose, CA)).
В одном из аспектов изобретения антитело согласно изобретению специфически связывается с CD79b животного первого вида, но специфически не связывается с CD79b животного другого вида. В одном из вариантов изобретения животным первого вида является человек и/или примат (например, собакоподобная обезьяна), а животным второго вида является животное семейства мышиных (например, мышь) и/или животное семейства собачьих. В одном из вариантов изобретения животным первого вида является человек. В одном из вариантов изобретения животным первого вида является примат, например, собакоподобная обезьяна. В одном из вариантов изобретения животным второго вида является животное семейства мышиных, например, мышь. В одном из вариантов изобретения животным второго вида является животное семейства собачьих.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к композициям, содержащим одно или несколько антител согласно изобретению и носитель. В одном из вариантов изобретения указанным носителем является фармацевтически приемлемый носитель.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим анти-CD79b антитело согласно изобретению.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту согласно изобретению.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению. Вектором может быть вектор любого типа, например рекомбинантный вектор, такой как экспрессионный вектор. При этом могут быть использованы клетки-хозяева любого вида. В одном из вариантов изобретения клетками-хозяевами являются прокариотические клетки, например, E. coli. В одном из вариантов изобретения клетками-хозяевами являются эукариотические клетки, например клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам получения антитела согласно изобретению. Так, например, настоящее изобретение относится к способу получения анти-CD79b антитела (которое, как определено в настоящей заявке, включает полноразмерную последовательность и его фрагменты), где указанный способ включает экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора согласно изобретению, кодирующего указанное антитело (или его фрагмент), и выделение указанного антитела.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к промышленному изделию, содержащему контейнер, и композиции, содержащейся в данном контейнере, где указанная композиция содержит одно или несколько анти-CD79b антител согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения указанная композиция содержит нуклеиновую кислоту согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения композиция, содержащая антитело, также содержит носитель, который, в некоторых вариантах изобретения, является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов изобретения промышленное изделие согласно изобретению также содержит инструкции по введению композиции (например, антитела) индивидууму.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к набору, содержащему первый контейнер, включающий композицию, содержащую одно или несколько анти-CD79b антител согласно изобретению; и второй контейнер, содержащий буфер. В одном из вариантов изобретения указанный буфер является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов изобретения композиция, содержащая антитело-антагонист, также включает носитель, который, в некоторых вариантах изобретения, является фармацевтически приемлемым. В одном из вариантов изобретения набор также содержит инструкции по введению композиции (например, антитела) индивидууму.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению анти-CD79b антитела согласно изобретению в целях приготовления лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В одном из вариантов изобретения рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты согласно изобретению в целях приготовления лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В одном из вариантов изобретения рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению экспрессионного вектора согласно изобретению в целях приготовления лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В одном из вариантов изобретения рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению клетки-хозяина согласно изобретению в целях приготовления лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В одном из вариантов изобретения рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению промышленного изделия согласно изобретению в целях приготовления лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В одном из вариантов изобретения рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к применению набора согласно изобретению в целях приготовления лекарственного препарата для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания, такого как рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство. В одном из вариантов изобретения рак, опухоль и/или клеточно-пролиферативное расстройство выбраны из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD79b, где указанный способ включает контактирование указанных клеток с антителом согласно изобретению, приводящее к ингибированию роста указанных клеток. В одном из вариантов изобретения антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения млекопитающего, имеющего раковую опухоль, содержащую клетки, экспрессирующие CD79b, где указанный способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела согласно изобретению, и тем самым эффективное лечение указанного млекопитающего. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитиотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированного с повышенным уровнем экспрессии CD79b, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества антитела согласно изобретению, и тем самым эффективное лечение или предупреждение указанного клеточно-пролиферативноого расстройства. В одном из вариантов изобретения указанным клеточно-пролиферативным расстройством является рак. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста клеток, рост которых, по меньшей мере частично, зависит от рост-потенцирующего действия CD79b, где указанный способ включает контактирование указанных клеток с эффективным количеством антитела согласно изобретению и тем самым ингибирование роста указанных клеток. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитиотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу терапевтического лечения опухоли у млекопитающего, рост которой, по меньшей мере частично, зависит от рост-потенцирующего действия CD79b, где указанный способ включает контактирование указанных клеток с эффективным количеством антитела согласно изобретению и тем самым эффективное лечение указанной опухоли. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитиотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей описанный здесь иммуноконъюгат, приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель. В одном из вариантов изобретения указанное раковое заболевание выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга. В одном из вариантов изобретения пациенту вводят цитотоксическое средство в комбинации с соединением-конъюгатом «антитело-лекарственное средство».
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования пролиферации В-клеток, включающему обработку клеток иммуноконъюгатом, содержащим антитело согласно изобретению, в условиях, благоприятствующих связыванию иммуноконъюгата с CD79b. В одном из вариантов изобретения заболевание, ассоциированное с пролиферацией В-клеток, выбрано из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга. В одном из вариантов изобретения В-клеткой является ксенотрансплантат. В одном из вариантов изобретения указанную обработку проводят in vitro. В одном из вариантов изобретения указанную обработку проводят in vivo.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу определения присутствия CD79b в образце, предположительно содержащем CD79b, где указанный способ включает обработку указанного образца антителом согласно изобретению и определение уровня связывания указанного антитела с CD79b в указанном образце, где уровень связывания указанного антитела с CD79b в указанном образце является показателем присутствия указанного белка в указанном образце. В одном из вариантов изобретения указанным образцом является биологический образец. В другом варианте изобретения указанный биологический образец содержит В-клетки. В одном из вариантов изобретения биологический образец берут у млекопитающего, страдающего или предположительно страдающего В-клеточным расстройством и/или В-клеточно-пролиферативным расстройством, включая, но не ограничиваясь ими, лимфому, неходжкинскую лимфому (НХЛ), агрессивную НХЛ, рецидивирующую агрессивную НХЛ, рецидивирующую бессимптомную НХЛ, не поддающуюся лечению НХЛ, не поддающуюся лечению бессимптомную НХЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лейкоз, ретикулоэндотелиоз (РЭ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и лимфому клеток коры головного мозга.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированного с увеличением числа клеток, таких как В-клетки, экспрессирующие CD79b, где указанный способ включает контактирование тестируемых клеток в биологическом образце с любыми из вышеупомянутых антител; определение уровня антитела, связанного с тестируемыми клетками в образце, путем детектирования связывания антитела с CD79b; и сравнение с уровнем антитела, связанного с клетками, в контрольном образце, где уровень связанного антитела нормализуют по числу CD79b-экспрессирующих клеток в тестируемых и контрольных образцах, и где более высокий уровень связанного антитела в тестируемом образце, по сравнению с контрольным образцом, указывает на присутствие клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированного с клетками, экспрессирующими CD79b.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу детектирования растворимого CD79b в крови или в сыворотке, где указанный способ включает контактирование тестируемого образца крови или сыворотки, взятого у млекопитающего, предпочтительно страдающего В-клеточно-пролиферативным расстройством, с анти-CD79b антителом согласно изобретению, и детектирование увеличения уровня растворимого CD79b в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом крови или сыворотки, взятым у здорового млекопитающего. В одном из вариантов изобретения указанный способ детектирования может быть применен для диагностики В-клеточно-пролиферативного расстройства, ассоциированного с повышением уровня растворимого CD79b в крови или сыворотке млекопитающего.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу связывания антитела согласно изобретению с клеткой, экспрессирующей CD79b, где указанный способ включает контактирования указанной клетки с антителом согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов изобретения указанное антитело конъюгировано с рост-ингибирующим агентом.
Способы согласно изобретению могут быть применены для лечения любого подходящего патологического состояния, например состояния, при котором клетки и/или ткани экспрессируют CD79b. В одном из вариантов изобретения, в способе согласно изобретению, клеткой-мишенью является гемопоэтическая клетка. Так, например, гемопоэтической клеткой может быть клетка, выбранная из группы, состоящей из лимфоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов и природных клеток-киллеров. В одном из вариантов изобретения, в способе согласно изобретению, клеткой-мишенью является В-клетка или Т-клетка. В одном из вариантов изобретения, в способе согласно изобретению, клеткой-мишенью является раковая клетка. Так, например, раковыми клетками могут быть клетки, выбранные из группы, состоящей из клеток лимфомы, лейкоза или миеломы.
Способы согласно изобретению могут также включать дополнительные стадии обработки. Так, например, в одном из вариантов изобретения, указанный способ также включает стадию, в которой клетку-мишень и/или ткань-мишень (например, раковую клетку) облучают или обрабатывают химиотерапевтическим средством.
Как описано в настоящей заявке, CD79b представляет собой сигнальный компонент В-клеточного рецептора. В соответствии с этим, в одном из вариантов способов согласно изобретению указанной клеткой-мишенью (например, раковой клеткой) является клетка, в которой экспрессируется CD79b, по сравнению с клеткой, в которой не экспрессируется CD79b. В другом варианте изобретения указанной клеткой-мишенью является раковая клетка, в которой наблюдается повышенный уровень экспрессии CD79b, по сравнению с нормальной нераковой клеткой ткани того же типа. В одном из вариантов изобретения способ согласно изобретению направлен на уничтожение клетки-мишени.
В других своих аспектах настоящее изобретение относится к векторам, содержащим ДНК, кодирующую любое из описанных здесь антител. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим любой такой вектор. Так, например, клетками-хозяевами могут быть клетки CHO, клетки E. coli или дрожжевые клетки. Настоящее изобретение также относится к способу получения любого из описанных здесь антител, где указанный способ включает культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии нужного антитела, и выделение нужного антитела из клеточной культуры.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к рассматриваемой композиции, содержащей описанное здесь анти-CD79b антитело в комбинации с носителем. Указанным носителем является, но необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению описанного здесь антитела против полипептида CD79b в целях приготовления лекарственного препарата для лечения состояния, которое является восприимчивым к антителу против полипептида CD79b.
Другим аспектом настоящего изобретения является композиция, содержащая смесь соединений «антитело-лекарственное средство» формулы I, где средняя загрузка лекарственного средства на антитело составляет примерно 2-5 или примерно 3-4.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение ADC формулы I, смесь соединений ADC формулы I или их фармацевтически приемлемые соли или сольваты, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической комбинации, содержащей соединение ADC формулы I и второе соединение, обладающее противораковыми или другими терапевтическими свойствами.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу предотвращения или ингибирования пролиферации опухолевых или раковых клеток, где указанный способ включает обработку клеток конъюгатом «антитело-лекарственное средство» формулы I или его фармацевтически приемлемой солью или сольватом в количестве, эффективном для предотвращения или ингибирования пролиферации опухолевых или раковых клеток.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей ADC формулы I.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к промышленным изделиям, то есть к наборам, содержащим конъюгат «антитело-лекарственное средство», контейнер, а также вкладыш в упаковку или этикетку с инструкцией по лечению.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу получения соединения-конъюгата «антитело-лекарственное средство» формулы I, где указанный способ включает стадии: (a) реакции взаимодействия цистеиновой группы, введенной в сконструированное на основе цистеина антитело, с линкерным реагентом, с образованием промежуточного соединения антитело-линкер Ab-L; и (b) реакции взаимодействия Ab-L с активированной молекулой лекарственного средства D с образованием конъюгата «антитело-лекарственное средство»; или стадии: (c) реакции взаимодействия нуклеофильной группы молекулы лекарственного средства с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения «лекарственное средство-линкер» D-L; и (d) реакции взаимодействия D-L с цистеиновой группой, введенной в сконструированное на основе цистеина антитело с образованием конъюгата «антитело-лекарственное средство».
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к анализу для детектирования раковых клеток, включающему: (a) обработку клеток конъюгатом «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство», и (b) определение степени связывания соединения-конъюгата «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство» с указанными клетками.
A. Анти-CD79b антитела
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к анти-CD79b антителам, которые могут быть применены здесь в качестве терапевтических средств. Репрезентативными антителами являются поликлональные, моноклональные, гуманизированные, биспецифические и гетероконъюгированные антитела.
1. Поликлональные антитела
2
1
1
Поликлональные антитела предпочтительно вырабатываются у животных после множества подкожных (s.c.) или внутрибрюшинных (i.p.) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Они могут использоваться для конъюгирования соответствующего антигена (в частности, если используются синтетические пептиды) с белком, который является иммуногенным для видов, подвергаемых иммунизации. Так, например, указанный антиген может быть конъюгирован с гемоцианином лимфы улитки (KLH), сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или соевым ингибитором трипсина с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидоэфира (конъюгированного посредством цистеиновых остатков), N-гидроксисукцинимида (посредством лизиновых остатков), глутаральдегида, ангидрида янтарной кислоты, SOCl, или RN=C=NR, где R и R представляют собой различные алкильные группы.
Животных иммунизируют антигеном, иммуногенными конъюгатами или дериватами путем объединения, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и путем подкожной инъекции раствора во множество участков. Через месяц животных повторно иммунизируют во множество участков путем подкожной инъекции 1/5-1/10 от первоначального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда. Через 7-14 дней у животных берут кровь и анализируют сыворотку на титр антител. Затем животных повторно иммунизируют до достижения плато титра. Конъюгаты могут быть также получены в рекомбинантной клеточной культуре в виде гибридных белков. Кроме того, для усиления иммунного ответа могут быть также использованы агрегирующие агенты, такие как квасцы.
2. Моноклональные антитела
Моноклональные антитела могут быть получены с применением гибридомной технологии, впервые описанной Kohler et al. Nature, 256:495 (1975), либо они могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567).
Для получения гибридом, мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют, как описано выше, для вырабатывания у них лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и подвергают слиянию с миеломными клетками с использованием подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, в результате чего образуются гибридомные клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и культивируют в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских миеломных клеток (также называемых «партнером по слиянию»). Так, например, если родительские миеломные клетки не содержат фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), то селективная культуральная среда для получения гибридом обычно включает гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда НАТ), то есть вещества, предупреждающие рост HGPRT-дефицитных клеток.
Предпочтительными миеломными клетками, называемыми партнерами по слиянию, являются клетки, которые способны подвергаться эффективному слиянию, поддерживать стабильное продуцирование высоких уровней антител указанными выбранными антитело-продуцирующими клетками и являются чувствительными к селективной среде, на которой проводят отбор на неслитые родительские клетки. Предпочтительными миеломными клеточными линиями являются мышиные миеломные линии, такие как клеточные линии, происходящие от клеток мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, имеющихся в институте Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, и клетки SP-2 и их производные, например, клетки X63-Ag8-653, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур, Manassas, Virginia, USA. Для продуцирования человеческих моноклональных антител также используются человеческие миеломные клеточные линии и гетеромиеломные клеточные линии “мышь-человек” (Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984) и Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
Культуральную среду для роста гибридомных клеток анализируют на продуцирование моноклональных антител против антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют предпочтительно путем иммунопреципитации или путем проведения in vitro анализа на связывание, такого как радиоиммуноанализ (РИА) или твердофазный иммунноферментный анализ (ELISA).
Аффинность связывания моноклонального антитела может быть, например, определена с помощью анализа Скэтчарда, описанного Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела с нужной специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы путем проведения процедур лимитирующего разведения и культивированы стандартными методами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящими культуральными средами, предназначенными для достижения данной цели, являются, например, среда D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки могут быть выращены in vivo в качестве асцитных опухолей у животных, например, путем i.p. инъекции этих клеток мышам.
Моноклональные антитела, секретированные субклонами, соответствующим образом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки путем проведения стандартных процедур очистки антител, таких как, например, аффинная хроматография (например, на белке А или на G-белке-сефарозе), или ионнообменная хроматография, хроматография на гидроксиапатитах, гель-электрофорез, диализ и т.п.
ДНК, кодирующая моноклональные антитела, может быть легко выделена и секвенирована в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Предпочтительным источником такой ДНК служат гибридомные клетки. После выделения эта ДНК может быть встроена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые в иных случаях не продуцируют белок антитела, в результате чего в этих рекомбинантных клетках-хозяевах синтезируются моноклональные антитела. Обсуждение рекомбинантной экспрессии антитело-кодирующей ДНК в бактериях можно найти в статьях Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
В другом варианте изобретения моноклональные антитела или фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, созданных методами, описанными McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). В работе Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) описано выделение мышиных и человеческих антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В более поздних публикациях описано продуцирование высокоаффинных (порядка нМ) человеческих антител посредством перестановки генов цепей антитела (Marks et al. Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также путем комбинированного инфицирования и рекомбинации in vivo, применяемой в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse et al. Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти методы являются приемлемой альтернативой традиционной гибридомной технологии получения моноклональных антител, применяемой для выделения моноклональных антител.
H
L
ДНК, кодирующая антитело, может быть модифицирована для продуцирования полипептидов химерных или гибридных антител, например, путем замены последовательности, кодирующей константные домены (C и C) тяжелой цепи и легкой цепи человеческого антитела, гомологичными последовательностями мышиных антител (патент США № 4816567 и Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), или путем присоединения иммуноглобулин-кодирующей последовательности ко всей кодирующей последовательности (или ее части) для неиммуноглобулинового полипептида (гетерологичного полипептида). Такие последовательности неиммуноглобулиновых полипептидов используют для замены константных доменов антитела, либо их используют для замены вариабельных доменов одного антигенсвязывающего сайта антитела для создания химерного двухвалентного антитела, содержащего один антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к одному антигену, и другой антигенсвязывающий сайт, обладающий специфичностью к другому антигену.
3. Человеческие и гуманизированные антитела
2
Анти-CD79b антитела согласно изобретению могут также содержать гуманизированные антитела или человеческие антитела. Гуманизированные формы нечеловеческих антител (например, мышиных антител) представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab') или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую от нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированными антителами являются человеческие иммуноглобулины (антитело реципиента), в которых остатки, происходящие от гипервариабельной области (CDR) данного антитела-реципиента, заменены остатками, происходящими от гипервариабельной области (CDR) нечеловеческого антитела (донорного антитела), такого как мышиное антитело, крысиное антитело или кроличье антитело, обладающее нужной специфичностью, аффинностью и связывающей способностью. В некоторых случаях остатки каркасной области (Fv) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, не обнаруженные в антителе реципиента или в «импортных» последовательностях CDR или каркасной области. В общих чертах, гуманизированное антитело может содержать в основном все или, по меньшей мере, один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или почти все области CDR соответствуют областям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или почти все FR представляют собой FR с человеческой иммуноглобулиновой консенсусной последовательностью. Гуманизированное антитело также содержит, но необязательно, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно области человеческого иммуноглобулина [Jones et al. (1986) Nature, 321:522-525; Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-329 и Presta Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Методы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны специалистам. Вообще говоря, гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, не являющегося человеком. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют “импортными” остатками, которые обычно берут из “импортного” вариабельного домена. Гуманизация может быть осуществлена в основном методом Винтера (Winter) и сотрудниками [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)], путем замены последовательностей CDR грызунов или CDR-последовательностей соответствующими последовательностями человеческого антитела. В соответствии с этим, такие “гуманизированные” антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), в которых в основном меньшая часть, по сравнению с вариабельным доменом интактного человеческого антитела, заменена соответствующей последовательностью от нечеловеческого антитела. Фактически, гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки CDR, а возможно и некоторые остатки FR, заменены остатками, происходящими от аналогичных участков антител грызунов.
При создании гуманизированных антител, в целях снижения антигенности и НАМА-ответа (вырабатывания человеческих антимышиных антител) при использовании данного антитела для терапевтического лечения человека, очень важно выбрать вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепи человеческого антитела. Снижение уровня НАМА-ответа или продотвращение такого ответа является важным аспектом клинической разработки подходящих терапевтических средств. См., например, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al., Nature (1988), 332:323; Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495. Как описано в данной заявке, настоящее изобретение относится к антителам, которые были гуманизованы в целях снижения или предотвращения НАМА-ответа. Варианты этих антител могут быть также получены рутинными методами, известными специалистам, некоторые из которых подробно описаны ниже. В соответствии с так называемым методом “подгонки”, последовательность вариабельного домена антитела грызуна скринируют по всей библиотеке известных последовательностей вариабельных доменов человеческого антитела. Затем идентифицируют последовательность V-домена человеческого антитела, которая является наиболее схожей с последовательностью грызунов, и берут в качестве человеческой каркасной области (FR) для создания гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). В другом методе используют конкретную каркасную область, происходящую от консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких и тяжелых цепей. Эта же самая каркасная область может быть использована для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)).
Так, например, аминокислотная последовательность антитела, описанного в настоящей заявке, может служить в качестве исходной (родительской) последовательности для диверсификации последовательности(ей) каркасной области и/или гипервариабельной области. Выбранная каркасная последовательность, к которой присоединена исходная гипервариабельная последовательность, называется здесь акцепторной человеческой каркасной последовательностью. Акцепторные человеческие каркасные последовательности могут быть получены или могут происходить от человеческого иммуноглобулина (областей VL и/или VH), предпочтительно акцепторные человеческие каркасные последовательности могут быть получены или могут происходить от человеческой консенсусной каркасной последовательности, поскольку такие каркасные последовательности, как было продемонстрировано, обладают минимальной иммуногенностью, либо вообще не обладают иммуногенностью у человека.
Если акцептор происходит от человеческого иммуноглобулина, то человеческая каркасная последовательность может быть, но необязательно, выбрана на основе ее гомологии с донорной каркасной последовательностью путем выравнивания донорной каркасной последовательности с различными человеческими каркасными последовательностями, имеющимися в коллекции человеческих каркасных последовательностей, и отбора наиболее гомологичной каркасной последовательности в качестве акцептора.
В одном из вариантов изобретения человеческие консенсусные каркасные области происходят от консенсусных каркасных последовательностей VH подгруппы III и/или VL каппа подгруппы I.
Таким образом, акцепторная человеческая каркасная область VH может содержать одну, две, три или все нижеследующие каркасные последовательности:
FR1, содержащую EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143),
FR2, содержащую WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144),
1
2
3
1
2
3
FR3, содержащую RFTISXDXSKNTXYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 147), где X представляет собой A или R, X представляет собой T или N, и X представляет собой A или L,
FR4, содержащей WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
Примерами консенсусных каркасных областей VH, являются:
консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы I минус CDR по Кабату (SEQ ID NO: 108);
консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы I минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 109-111);
консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы II минус CDR по Кабату (SEQ ID NO: 112);
консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы II минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 113-115);
консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы III минус CDR по Кабату (SEQ ID NO: 116);
консенсусная каркасная область человеческой VH подгруппы III минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 117-119);
акцепторная каркасная область человеческой VH минус CDR по Кабату (SEQ ID NO: 120);
акцепторная каркасная область человеческой VH минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 121-122);
акцепторная каркасная область 2 человеческой VH минус CDR по Кабату (SEQ ID NO: 123); или
акцепторная каркасная область 2 человеческой VH минус удлиненные гипервариабельные области (SEQ ID NO: 124-126).
В одном из вариантов изобретения акцепторная каркасная область человеческой VH содержит одну, две, три или все нижеследующие каркасные последовательности:
FR1, содержащую EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 143),
FR2, содержащую WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 144),
FR3, содержащую RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 145),
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 148),
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 149),
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCS (SEQ ID NO: 150) или
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSR (SEQ ID NO: 151),
FR4, содержащую WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 146).
Акцепторная каркасная область человеческой VL может содержать одну, две, три или все нижеследующие каркасные последовательности:
FR1, содержащую DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 139),
FR2, содержащую WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 140),
FR3, содержащую GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 141),
FR4, содержащую FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 142).
Примерами консенсусных каркасных последовательностей VL являются:
консенсусная каркасная последовательность человеческой VL каппа подгруппы I (SEQ ID NO: 127);
консенсусная каркасная последовательность человеческой VL каппа подгруппы II (SEQ ID NO: 128);
консенсусная каркасная последовательность человеческой VL каппа подгруппы III (SEQ ID NO: 129); или
консенсусная каркасная последовательность человеческой VL каппа подгруппы IV (SEQ ID NO: 130).
Хотя последовательность акцептора может быть идентична выбранной человеческой каркасной последовательности, независимо от того, происходит ли она от человеческого иммуноглобулина или от человеческой консенсусной каркасной последовательности, однако в настоящем изобретении рассматривается акцепторная последовательность, которая, по сравнению с человеческой последовательностью иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной последовательностью, может содержать уже имеющиеся аминокислотные замены. Эти уже имеющиеся замены, по сравнению с человеческой последовательностью иммуноглобулина или консенсусной каркасной последовательностью, предпочтительно являются минимальными, а обычно отличаются только на четыре, три, два аминокислотных остатка или один аминокислотный остаток.
Остатки гипервариабельных областей нечеловеческого антитела вводят в акцепторные каркасные области человеческих VL и/или VH. Так, например, могут быть включены остатки, соответствующие остаткам CDR по Кабату, остаткам гипервариабельной петли по Чотия, остаткам Abm и/или контактирующим остаткам. При этом могут быть включены, но необязательно, остатки удлиненной гипервариабельной области: 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3), 26-35B (H1), 50-65, 47-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3).
Хотя «введение» остатков гипервариабельной области обсуждается в описании настоящего изобретения, однако следует отметить, что такое введение может быть осуществлено различными методами, например нуклеиновая кислота, кодирующая нужную аминокислотную последовательность, может быть получена путем внесения мутаций в нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность мышиного вариабельного домена, с последующей заменой каркасных остатков на остатки акцепторной человеческой каркасной области, или путем внесения мутаций в нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность человеческого вариабельного домена, с последующей заменой остатков гипервариабельного домена на остатки нечеловеческого антитела, или путем синтеза нуклеиновой кислоты, кодирующей нужную последовательность, и т.п.
В описанных здесь примерах варианты с присоединенной гипервариабельной областью были получены методом мутагенеза Kunkel нуклеиновой кислоты, кодирующей человеческие акцепторные последовательности, с использованием отдельного олигонуклеотида для каждой гипервариабельной области (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)). Соответствующие замены могут быть введены в каркасную и/или гипервариабельную область рутинными методами для коррекции и восстановления нужных взаимодействий «гипервариабельная область-антиген».
Фаговое (фагмидное) представление (также называемое здесь в некоторых случаях фаговым дисплеем) может быть применено как удобный и быстрый метод продуцирования и скрининга многих различных потенциальных вариантов антител в библиотеке, полученной путем рандомизации последовательностей. Однако специалистам известны и другие методы получения и скрининга модифицированных антител.
Технология фагового (фагмидного) представления является эффективным средством для продуцирования и отбора новых белков, связывающихся с лигандом, таким как антиген. Применение технологии фагового (фагмидного) дисплея позволяет получать крупные библиотеки вариантов белков, которые могут быть быстро отсортированы на последовательности, которые связываются с молекулой-мишенью с высокой аффинностью. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептидные варианты, обычно присоединяют к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок вирусной оболочки, такой как белок, кодируемый геном III, или белок, кодируемый геном VIII. Были разработаны одновалентные системы фагмидного представления, в которых последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок или полипептид, присоединена к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка, кодируемого геном III (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). В одновалентной системе фагмидного представления, гибридный ген экспрессируется на низком уровне, и при этом белки гена III дикого типа экспрессируются так, что инфекционность частиц сохраняется. Методы получения пептидных библиотек и скрининга этих библиотек описаны во многих патентах (например, в патенте США № 5723286, в патенте США № 5432018, в патенте США № 5580717, в патенте США № 5427908 и в патенте США № 5498530).
Библиотеки антител или антигенсвязывающих полипептидов были получены различными методами, включая модификацию одного гена путем встраивания рандомизированных последовательностей ДНК или клонирования семейства родственных генов. Методы представления антител или антигенсвязывающих фрагментов с применением технологии фагового дисплея описаны в патентах США №№ 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 и 5658727. Затем библиотеку скринируют на присутствие антител или антигенсвязывающих белков, обладающих нужными свойствами.
Методы замены выбранной аминокислоты на уровне матричной нуклеиновой кислоты хорошо известны специалистам, и некоторые из них описаны в настоящей заявке. Так, например, остатки гипервариабельной области могут быть заменены методом Кункеля. См., например, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).
Последовательность олигонуклеотидов включает один или несколько сконструированных наборов кодонов для модифицируемых остатков гипервариабельной области. Набором кодонов является набор из различных нуклеотидных триплетов, используемых для кодирования нужных аминокислотных вариантов. Наборы кодонов могут быть представлены символами, обозначающими конкретные нуклеотиды или эквимолярные смеси нуклеотидов, представленных ниже в соответствии с кодом IUB.
Коды IUB
G Гуанин
A Аденин
T Тимин
C Цитозин
R (A или G)
Y (C или T)
M (A или C)
K (G или T)
S (C или G)
W (A или T)
H (A или C или T)
B (C или G или T)
V (A или C или G)
D (A или G или T) H
N (A или C или G или T).
Так, например, в серии кодонов DVK D может представлять собой нуклеотиды A или G или T; V может представлять собой A или G или C, а K может представлять собой G или T. Такой набор кодонов может составлять 18 различных кодонов и может кодировать аминокислоты Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys.
Наборы олигонуклеотидов или праймеров могут быть синтезированы стандартными методами. Набор олигонуклеотидов может быть синтезирован, например, методом твердофазного синтеза, и может содержать последовательности, которые представляют собой все возможные комбинации нуклеотидных триплетов, имеющихся в таком наборе кодонов, и которые кодируют желаемую группу аминокислот. Синтез олигонуклеотидов с «вырожденностью» отобранных нуклеотидов в некоторых положениях хорошо известен специалистам. Такие наборы нуклеотидов, имеющие определенные наборы кодонов, могут быть синтезированы на коммерчески доступных синтезаторах нуклеиновых кислот (поставляемых, например, Applied Biosystems, Foster City, CA), либо они могут быть закуплены у поставщиков (например, у Life Technologies, Rockville, MD). Поэтому набор синтезированных олигонуклеотидов, имеющих конкретный набор кодонов, обычно включает множество олигонуклеотидов с различными последовательностями, отличающимися набором кодонов в полноразмерной последовательности. Олигонуклеотиды, используемые в соответствии с настоящим изобретением, имеют последовательности, позволяющие гибридизироваться с матрицей нуклеиновой кислоты вариабельных доменов, а также могут включать рестрикционные сайты для клонирования.
В одном из этих методов последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислот, могут быть созданы методом олигонуклеотид-опосредуемого мутагенеза. Такой метод хорошо известен специалистам и описан Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987). Вкратце, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислот, получают путем гибридизации набора олигонуклеотидов, содержащих нужные наборы кодонов, с матричной ДНК, где указанной матрицей является одноцепочечная форма плазмиды, содержащая последовательность матричной нуклеиновой кислоты вариабельной области. После гибридизации для синтеза полноразмерной второй комплементарной цепи матрицы используют ДНК-полимеразу, что позволяет встраивать олигонуклеотидный праймер, и такая цепь будет содержать наборы кодонов, обеспечиваемые набором олигонуклеотидов.
Обычно используют олигонуклеотиды длиной по меньшей мере 25 нуклеотидов. Оптимальный олигонуклеотид имеет 12-15 нуклеотидов, которые являются полностью комплементарными матрице с любой стороны нуклеотида(ов), кодирующего(их) мутацию(и). Это будет гарантировать правильную гибридизацию олигонуклеотида с одноцепочечной молекулой матричной ДНК. Олигонуклеотиды могут быть легко синтезированы методами, известными специалистам и описанными в публикации Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).
ДНК-матрицу получают с использованием векторов, происходящих от векторов бактериофага М13 (подходящими являются коммерчески доступные векторы M13mp18 и M13mp19), или с использованием векторов, которые содержат одноцепочечный ориджин репликации фага, описанный Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Таким образом, ДНК, которая является мутированной, может быть встроена в один из этих векторов с получением одноцепочечной матрицы. Получение одноцепочечной матрицы описано в разделах 4.21-4.41 руководства Sambrook et al., см. выше.
Для модификации нативной последовательности ДНК олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечной матрицей в подходящих условиях гибридизации. Затем, для синтеза комплементарной цепи матрицы, проводимого с использованием олигонуклеотида в качестве праймера, добавляют ДНК-полимеризующий фермент, обычно ДНК-полимеразу Т7 или фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I. В результате образуется гетеродуплексная молекула, в которой одна цепь ДНК кодирует мутированную форму гена 1, а другая цепь (исходная матрица) кодирует нативную немодифицированную последовательность гена 1. Затем такую гетеродуплексную молекулу переносят в подходящую клетку-хозяина, обычно в прокариот, такой как E. coli JM101. После культивирования клеток их высевают на планшеты с агарозой и скринируют с использованием олигонуклеотидного праймера, радиоактивно помеченного 32-фосфатом в целях идентификации бактериальных колоний, содержащих мутированную ДНК.
Только что описанный метод может быть модифицирован в целях создания гомодуплексной молекулы, в которой обе цепи плазмиды содержат мутацию(и). Такую модификацию проводят следующим образом: одноцепочечный олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечной матрицей, как описано выше. Смесь из трех дезоксирибонуклеотидов, а именно дезоксирибоаденозина (dATP), дезоксирибогуанозина (dGTP) и дезоксириботимидина (dTT), объединяют с модифицированным тиодезоксирибоцитозином, обозначаемым dCTP-(aS) (который может быть получен от Amersham). Эту смесь добавляют к комплексу «матрица-олигонуклеотид». После добавления ДНК-полимеразы к этой смеси образуется цепь ДНК, идентичная матрице, за исключением мутированных оснований. Кроме того, эта новая цепь ДНК будет содержать dCTP-(aS) вместо dCTP, что будет обеспечивать защиту ДНК от расщепления рестриктирующей эндонуклеазой. После образования одноцепочечного разрыва в цепи-матрице двухцепочечного гетеродуплекса под действием соответствующего рестриктирующего фермента, цепь-матрица может быть гидролизована нуклеазой ExoIII или другой соответствующий нуклеазой в положении, находящемся за областью мутагенного(ых) сайта(ов). Затем реакцию прекращают, в результате чего образуется молекула, которая является одноцепочечной только наполовину. Затем получают полноразмерный двухцепочечный ДНК-гомодуплекс с использованием ДНК-полимеразы в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеотид-трифосфатов, АТР и ДНК-лигазы. Затем такая гомодуплексная молекула может быть перенесена в подходящую клетку-хозяина.
Как было показано выше, последовательность набора олигонуклеотидов имеет длину, достаточную для гибридизации с матричной нуклеиновой кислотой, и может также, но необязательно, содержать рестрикционные сайты. ДНК-матрица может быть получена с помощью векторов, которые происходят от векторов бактериофага М13 или векторов, содержащих одноцепочечный ориджин репликации фага, как описано в публикации Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Таким образом, ДНК, которая является мутированной, должна быть встроена в один из этих векторов с получением одноцепочечной матрицы. Получение одноцепочечной матрицы описано в разделах 4.21-4.41 руководства Sambrook et al., см. выше.
В соответствии с другим методом связывание с антигеном может быть восстановлено в процессе гуманизации антител путем отбора повторно спаренных гипервариабельных областей (см. заявку № 11/061841, поданную 18 февраля, 2005 г.). Такой метод включает введение нечеловеческих гипервариабельных областей в акцепторную каркасную последовательность, а затем введение одной или нескольких аминокислотных замен в одну или несколько гипервариабельных областей без модификации акцепторной каркасной последовательности. Альтернативно введение одной или нескольких аминокислотных замен может сопровождаться модификацией в акцепторной каркасной последовательности.
В соответствии с другим методом библиотека может быть получена путем конструирования наборов вышерасположенных и нижерасположенных олигонуклеотидов, где каждый из этих наборов имеет множество олигонуклеотидов с различными последовательностями, образуемыми сериями кодонов, присутствующих в последовательности олигонуклеотидов. Наборы вышерасположенных и нижерасположенных олигонуклеотидов, вместе с последовательностью матричной нуклеиновой кислоты вариабельного домена, могут быть использованы в полимеразной цепной реакции с образованием «библиотеки» ПЦР-продуктов. ПЦР-продукты могут называться «кластерами нуклеиновых кислот», поскольку они могут быть присоединены к другим родственным или неродственным последовательностям нуклеиновой кислоты, например, к белкам вирусной оболочки и к доменам димеризации, с применением хорошо разработанных методов молекулярной биологии.
Последовательность ПЦР-праймеров включает один или несколько сконструированных наборов кодонов в положениях, доступных для растворителя, и в различных положениях широкого ряда в гипервариабельной области. Как было описано выше, набором кодонов является набор из различных последовательностей нуклеотидных триплетов, используемых для кодирования нужных вариантов аминокислот.
Подходящие антитела, удовлетворяющие нужным критериям и отобранные путем проведения соответствующих стадий скрининга/отбора, могут быть выделены и клонированы стандартными рекомбинантными методами.
Также важно, чтобы гуманизированные антитела сохраняли высокую аффинность связывания с антигеном и другие желаемые биологические свойства. Для достижения этой цели, в соответствии с предпочтительным методом, гуманизированные антитела получают путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с применением трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина являются общедоступными и известны специалистам. Также существуют компьютерные программы для иллюстрации и представления вероятных трехмерных комбинаторных структур выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулина. Изучение такого представления позволяет проанализировать вероятную роль, которую играют данные остатки в функционировании последовательности-кандидата иммуноглобулина, то есть провести анализ влияния этих остатков на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с антигеном. В этом методе остатки FR могут быть выбраны из последовательностей реципиента и «импортных» последовательностей и объединены так, чтобы можно было получить антитело с нужными свойствами, такими как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени(ям). В основном, непосредственное и наибольшее влияние на связывание с антигеном оказывают остатки гипервариабельной области.
Рассматриваются также различные формы гуманизированного анти-CD79b антитела. Так, например, гуманизированным антителом может быть фрагмент антитела, такой как Fab, который конъюгируют, но необязательно, с одним или несколькими цитотоксическими средствами, с образованием иммуноконъюгата. Альтернативно гуманизированным антителом может быть интактное антитело, такое как интактное антитело IgG1.
H
В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены человеческие антитела. Так, например, в настоящее время могут быть получены трансгенные животные (например, мыши), которые после иммунизации будут обладать способностью продуцировать полный репертуар человеческих антител в отсутствие эндогенно продуцируемого иммуноглобулина. Так, например, указывалось, что гомозиготная делеция гена в области стыка тяжелой цепи антитела (J) у химерных мышей и у мышей с мутированной зародышевой линией приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Перенос массива генов иммуноглобулина человеческой зародышевой линии таким мышам с мутированной зародышевой линией приводит к продуцированию человеческих антител после введения антигена. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); патенты США №№ 5545806, 5569825, 5591669 (все от GenPharm); 5545807; и WO 97/17852.
Альтернативно технология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) может быть использована для продуцирования человеческих антител и фрагментов антител in vitro из наборов генов вариабельного домена иммуноглобулина (V) от неиммунизированных доноров. В соответствии с этим методом гены домена V антител клонируют с сохранением рамки считывания в мажорный или минорный ген белковой оболочки нитчатого фага, такого как M13 или fd, и представляют на поверхности фаговой частицы как функциональные фрагменты антител. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, то отбор, проводимый на основе функциональных свойств антитела, также позволяет отбирать ген, кодирующий антитело, обладающее этими свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клеток. Фаговый дисплей может быть осуществлен в различных форматах, описанных в публикациях Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея может быть использовано несколько источников V-генных сегментов. В публикации Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) описано выделение разнообразных массивов антител против оксазолона из небольшой рандомизированной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизированных мышей. Может быть также сконструирован набор V-генов от неиммунизированных людей-доноров, и могут быть получены антитела против разнообразного массива антигенов (включая аутоантигены), в основном методами, описанными в публикации Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См., также патенты США №№ 5565332 и 5573905.
Как обсуждалось выше, человеческие антитела могут быть также получены с использованием in vitro активированных В-клеток (см., также патенты США №№ 5567610 и 5229275).
4. Фрагменты антител
В некоторых случаях желательно использовать не полноразмерные антитела, а их фрагменты. Меньший размер фрагментов позволяет обеспечивать быстрый клиренс, что может улучшать доступ к солидным опухолям.
2
2
2
Для получения фрагментов антител были разработаны различные методы. Традиционно эти фрагменты образуются в результате протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992), и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты могут продуцироваться непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Fab-, Fv- и scFv-фрагменты антител могут экспрессироваться в E. coli и секретироваться из E. coli, что облегчает продуцирование этих фрагментов в большом количестве, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно выделены из E. coli и химически связаны с образованием F(ab')-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом, F(ab')-фрагменты могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантной клетки-хозяина. Fab- и F(ab')-фрагмент с более длительным временем полужизни in vivo, содержащий остатки, связывающиеся с эпитопом рецептора «спасения», описаны в патенте США № 5869046. Специалистам известны и другие методы получения фрагментов антител. В других вариантах изобретения выбранным антителом является одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185, патент США № 5571894 и патент США № 5587458. Fv- и sFv-фрагменты присутствуют только у видов с интактными комбинированными сайтами, не содержащими константных областей, а поэтому они являются подходящими для снижения уровня неспецифического связывания в процессе их применения in vivo. Могут быть сконструированы гибридные sFv-белки с получением гибридного эффекторного белка у амино- или карбокси-конца sFv. См. Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, см. выше. Фрагментом антитела может быть также “одноцепочечное антитело”, например антитело, описанное в патенте США № 5641870. Такие одноцепочечные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
5. Биспецифические антитела
2
Биспецифическими антителами являются антитела, которые обладают специфичностью связывания, по меньшей мере, с двумя различными эпитопами. Репрезентативные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами. Репрезентативные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами белка CD79b, описанного в настоящей заявке. Другие такие антитела могут представлять собой комбинацию CD79b-связывающего сайта с сайтом связывания для других белков. Альтернативно ветвь антитела против CD79b может быть объединена с ветвью, которая связывается с триггерной молекулой на лейкоцитах, такой как молекула Т-клеточного рецептора (например, CD3) или Fc-рецепторы для IgG (FcγR), такими как FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), так, чтобы клеточные защитные механизмы были сфокусированы в CD79b-экспрессирующих клетках и локализованных в этих клетках. Биспецифические антитела могут быть также использованы для определения локализации цитотоксических агентов в клетках, экспрессирующих CD79b. Эти антитела имеют CD79b-связывающую ветвь и ветвь, которая связывается с цитотоксическим агентом (таким как, например, сапорин, антитело против интерферона-α, винкаалкалоид, цепь рицина А, метотрексат или гаптен, меченный радиоактивным изотопом). Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические F(ab')-антитела).
В WO 96/16673 описано биспецифическое анти-ErbB2/анти-FcγRIII антитело, а в патенте США № 5837234 описано биспецифическое анти-ErbB2/анти-FcγRI антитело. Биспецифическое анти-ErbB2/Fcα антитело описано в WO98/02463. В патенте США № 5821337 описано биспецифическое анти-ErbB2/анти-CD3 антитело.
Методы получения биспецифических антител известны специалистам. Традиционное продуцирование полноразмерных биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, где эти две цепи обладают различной специфичностью (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Эти гибридомы (квадромы), из-за рандомизированного набора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна молекула имеет “правильную” биспецифическую структуру. Очистка такой “правильной” молекулы, которую обычно осуществляют путем постадийного проведения аффинной хроматографии, представляет собой определенные трудности и дает низкий выход продукта. Аналогичные процедуры описаны в WO 93/08829 и у Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Н
Н
Н
В соответствии с другим подходом вариабельные домены антитела с нужными специфичностями связывания (объединенные сайты “антитело-антиген”) присоединяют к последовательностям константного домена иммуноглобулина. Такое присоединение предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи Ig, содержащим, по меньшей мере, часть шарнирной области, С2 и С3. При этом предпочтительно, чтобы этот гибрид имел первую константную область тяжелой цепи (С1), содержащую сайт, необходимый для связывания с легкой цепью, присутствующей, по меньшей мере, в одном из гибридов. ДНК, кодирующая гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина и, если это необходимо, легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессионные векторы, и котрансфицируют в подходящую клетку-хозяина. Это обеспечивает высокую степень гибкости при коррекции соотношений трех полипептидных фрагментов в тех вариантах изобретения, в которых неравные содержания трех полипептидных цепей, используемых в данной конструкции, дают оптимальные выходы нужного биспецифического антитела. Однако можно встраивать кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессионный вектор, если экспрессия, по меньшей мере, двух полипептидных цепей при равном соотношении дает высокие выходы, или если такие соотношения не оказывают значительного влияния на выход нужной комбинации цепи.
В предпочтительном варианте такого подхода, биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющей первую специфичность связывания, в одной ветви, и гибридной пары “тяжелая цепь-легкая цепь” иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания), в другой ветви. Было обнаружено, что такая асимметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций иммуноглобулиновой цепи, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы обеспечивает простой способ его выделения. Этот способ описан в WO 94/04690. Более подробное описание получения биспецифических антител см., например, у Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
Н
В соответствии со вторым подходом, описанным в патенте США № 5731168, граница между парой молекул антитела может быть сконструирована для максимизации процента гетеродимеров, выделенных из рекомбинантной клеточной культуры. Такая граница предпочтительно содержит, по меньшей мере, часть домена С3. В этом методе небольшие боковые цепи одной или нескольких аминокислот в пограничной области первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). В пограничной области второй молекулы антитела создают компенсирующие «полости», имеющие размер, идентичный или аналогичный размеру более крупной(ых) боковой(ых) цепи(ей), путем замены крупных боковых цепей аминокислот более мелкими боковыми цепями (например, аланина или треонина). Это позволяет увеличить выход гетеродимеров по отношению к другим нежелательным конечным продуктам, таким как гомодимеры.
Биспецифические антитела включают перекрестно-сшитые антитела или их “гетероконъюгаты”. Так, например, одно из антител в указанном гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела были, например, предложены для доставки клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (патент США № 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекций (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089). Антитела-гетероконъюгаты могут быть получены любыми стандартными методами перекрестного сшивания. Подходящие перекрестно-сшивающие агенты хорошо известны специалистам и описаны в патенте США № 4676980 наряду с различными методами перекрестного сшивания.
2
Методы продуцирования биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Так, например, биспецифические антитела могут быть получены путем химического связывания. В работе Brennan et al., Science, 229:81 (1985) описана процедура, в которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению с образованием F(ab')-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего дитиоловый комплекс, такого как арсенит натрия, для стабилизации смежных дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Затем полученные Fab'-фрагменты превращают в производные тионитробензоата (TNB). После этого одно из производных Fab'-TNB снова превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB, в результате чего получают биспецифическое антитело. Такие продуцированные биспецифические антитела могут быть использованы в качестве агентов для селективной иммобилизации ферментов.
2
Последние достижения в данной области позволяют проводить прямое выделение из E. coli фрагментов Fab'-SH, которые могут быть химически связаны с образованием биспецифических антител. В работе Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) описано продуцирование полностью гуманизированной молекулы F(ab') биспецифического антитела. Каждый Fab'-фрагмент был отдельно секретирован из E. coli и подвергнут прямому химическому связыванию in vitro с образованием биспецифического антитела. Таким образом, полученное биспецифическое антитело обладает способностью связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2, и с нормальными человеческими Т-клетками, а также запускает литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов против опухоли-мишени человеческой молочной железы.
H
L
L
H
L
H
Были также описаны различные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Так, например, биспецифические антитела были продуцированы с использованием “лейциновых молний”. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии, происходящие от белков Fos и Jun, были присоединены к Fab'-частям двух других антител путем лигирования генов. Гомодимеры антитела были восстановлены в шарнирной области с образованием мономеров, а затем снова окислены с образованием гетеродимеров антител. Этот метод может быть также использован для продуцирования гомодимеров антитела. Технология “диантител”, описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6444-6448 (1993), обеспечивает альтернативный механизм получения фрагментов биспецифического антитела. Эти фрагменты содержат V, присоединенный к V посредством линкера, который является слишком коротким для создания пары между двумя доменами одной и той же цепи. В соответствии с этим V- и V-домены одного фрагмента вынуждены спариваться с комплементарными V- и V-доменами другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих сайта. Также была описана другая стратегия получения фрагментов биспецифического антитела с использованием одноцепочечных Fv(sFv)-димеров. См. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Рассматриваются также антитела с более чем двумя валентностями. Так, например, могут быть получены и триспецифические антитела. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
6. Гетероконъюгированные антитела
Гетероконъюгированные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгированные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела, например, как предполагается, нацеливают клетки иммунной системы на нежелательные клетки [патент США № 4676980], а поэтому они могут быть использованы для лечения ВИЧ-инфекций [WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 03089]. Известно, что антитела могут быть получены in vitro методами синтеза белков, включая методы с использованием перекрестно-сшивающих агентов. Так, например, иммунотоксины могут быть сконструированы путем проведения реакции дисульфидного обмена или образования тиоэфирной связи. Примерами подходящих реагентов, используемых для этой цели, являются иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат, и такие реагенты описаны, например, в патенте США № 4676980.
7. Поливалентные антитела
Поливалентное антитело может быть быстрее интернализовано (и/или оно может быстрее подвергаться катаболизму), чем двухвалентное антитело благодаря экспрессии антигена в клетке, с которым связываются антитела. Антителами согласно изобретению могут быть поливалентные антитела (не принадлежащие к классу IgM) с тремя или более антигенсвязывающими сайтами (например, четырехвалентные антитела), которые могут быть легко продуцированы посредством рекомбинантной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидные цепи данного антитела. Поливалентное антитело может содержать домен димеризации и три или более антигенсвязывающих сайтов. Предпочтительный домен димеризации содержит (или состоит из них) Fc-область или шарнирную область. В этом случае антитело может содержать Fc-область и три или более антигенсвязывающих сайта, расположенных со стороны амино-конца по отношению к Fc-области. Описанное здесь предпочтительное поливалентное антитело содержит (или состоит из них) от трех и примерно до восьми антигенсвязывающих сайтов, а предпочтительно четыре антигенсвязывающих сайта. Поливалентное антитело содержит по меньшей мере одну полипептидную цепь (предпочтительно две полипептидных цепи), где указанная(ые) полипептидная(ые) цепь(и) содержит(ат) два или более вариабельных доменов. Так, например, полипептидная(ые) цепь(и) может (могут) содержать VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен, VD2 представляет собой второй вариабельный домен, Fc представляет собой одну полипептидную цепь Fc-области, X1 и X2 представляют собой аминокислоту или полипептид, а n равно 0 или 1. Так, например, полипептидная(ые) цепь(и) может (могут) содержать: цепь «VH-CH1-гибкий линкер-VH-CH1-Fc-область»; или цепь «VH-CH1-VH-CH1-Fc-область». Поливалентное антитело согласно изобретению также предпочтительно содержит по меньшей мере два (предпочтительно четыре) полипептида вариабельного домена легкой цепи. Описанное здесь поливалентное антитело может, например, содержать примерно от двух до восьми полипептидов вариабельного домена легкой цепи. Рассматриваемые здесь полипептиды вариабельного домена легкой цепи содержат вариабельный домен легкой цепи, а также, но необязательно, домен CL.
8. Конструирование антител с эффекторными функциями
Может оказаться желательным модифицировать антитело согласно изобретению для придания ему эффекторных функций, например, для повышения антиген-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичности (ADCC) и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) антитела. Это может быть достигнуто путем введения одной или нескольких аминокислотных замен в Fc-область антитела. Альтернативно или дополнительно, цистеиновый(е) остаток(ки) может (могут) быть введен(ы) в Fc-область, что будет приводить к образованию межцепочечных дисульфидных связей в этой области. Таким образом, полученное гомодимерное антитело может обладать повышенной способностью к интернализации и/или повышенной способностью к комплемент-опосредуемому цитолизу клеток, и повышенной антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела, обладающие повышенной противоопухолевой активностью, могут быть также получены с использованием гетеробифункциональных перекрестно-сшивающих агентов, описанных в публикации Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно может быть сконструировано антитело, имеющее две Fc-области, в результате чего может быть усилен лизис комплемента и повышена ADCC. См. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Для увеличения времени полужизни антитела в сыворотке, в указанное антитело (в частности, в его фрагмент) может быть введен эпитоп, связывающийся с рецептором «спасения», например, как описано в патенте США № 5739277. Используемый здесь термин «эпитоп, связывающийся с рецептором «спасения» означает эпитоп Fc-области молекулы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), который является ответственным за увеличение времени полужизни молекулы IgG в сыворотке in vivo.
9. Иммуноконъюгаты
Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгатам (которые являются синонимами терминов «конъюгаты антитело-лекарственное средство» или «ADC»), включающим антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтическое средство, рост-ингибирующий агент, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (то есть радиоактивный конъюгат).
212
131
131
90
186
14
В некоторых вариантах изобретения иммуноконъюгат содержит антитело и химиотерапевтическое средство или другой токсин. Химиотерапевтические средства, используемые для получения указанных иммуноконъюгатов, описаны выше. Ферментативно активными токсинами и их фрагментами, которые могут быть использованы для этих целей, являются А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (от Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. Для продуцирования радиоактивно конъюгированных антител могут быть использованы различные радионуклиды. Примерами таких радионуклидов являются Bi, I, In, Y и Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического лекарственного средства получают с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Так, например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в публикации Vitetta et al. Science, 238:1098 (1987). С-меченная 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (МХ-DTPA) является репрезентативным хелатообразующим агентом для конъюгирования радионуклида с антителом. См. WO 94/11026.
В настоящем изобретении также рассматриваются конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, ауристатиновые пептиды, такие как монометилауристатин (ММАЕ) (синтетический аналог доластатина), майтанзиноиды, такие как DM1, трихотен и СС1065, и производные этих токсинов, обладающие токсической активностью.
Репрезентативные иммуноконъюгаты - конъюгаты «антитело-лекарственное средство»
Иммуноконъюгат (или «конъюгат антитело-лекарственное средство» (“ADC”)) согласно изобретению может представлять собой иммуноконъюгат формулы I, указанной ниже, где антитело конъюгировано (то есть ковалентно связано) с одной или несколькими молекулами лекарственного средства (D) посредством, но необязательно, линкера (L). ADC могут включать конъюгаты «тио-Mab-лекарственное средство» («TDC»).
Ab-(L-D)р
I
В соответствии с этим, антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством либо непосредственно, либо посредством линкера. В формуле I р означает среднее число молекул лекарственного средства на антитело, где указанное число может составлять, например, примерно от 1 до 20 молекул лекарственного средства на антитело, а в некоторых вариантах изобретения от 1 и примерно до 8 молекул лекарственного средства на антитело. Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей смесь соединений «антитело-лекарственное средство» формулы I, где средняя нагрузка лекарственного средства на антитело составляет примерно 2-5 или примерно 3-4.
а. Репрезентативные линкеры
Линкер может содержать один или более линкерных компонентов. Репрезентативными линкерными компонентами являются 6-малеимидокапроил («MC»), малеимидопропаноил («MP»), валин-цитруллин («val-cit»), аланин-фенилаланин («ala-phe»), п-аминобензилоксикарбонил («PAB»), и компоненты, образующиеся в результате конъюгирования с линкерными реагентами: N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат («SPP»), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат («SMCC», также обозначенный здесь «МСС») и N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоат («SIAB»). Специалистам известны различные линкерные компоненты, некоторые из которых описаны ниже.
Линкером может быть «отщепляемый линкер», облегчающий высвобождение лекарственного средства в клетке. Так, например, могут быть использованы линкеры, чувствительные к воздействию кислоты (например, гидразон); линкеры, чувствительные к действию протеазы (например, пептидазы); фотохимически неустойчивые линкеры; диметиловые линкеры или дисульфидсодержащие линкеры (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992), патент США № 5208020).
В некоторых вариантах изобретения линкер представлен нижеследующей формулой II:
-Aa-Ww-Yy-
II,
где А представляет собой удлиняющий компонент; а равно целому числу 0 или 1; W представляет собой аминокислоту; w независимо представляет собой целое число от 0 до 12; Y означает спейсерный компонент; у равно 0, 1 или 2, а Ab, D и p определены выше для формулы I. Репрезентативные варианты таких линкеров описаны в заявке США 2005-0238649 A1, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
В некоторых вариантах изобретения линкерный компонент может содержать «удлиняющий компонент», который связывает антитело с другим линкерным компонентом или с молекулой лекарственного средства. Репрезентативные удлиняющие компоненты представлены ниже (где волнистая линия означает сайты ковалентного связывания с антителом):
В некоторых вариантах изобретения линкерный компонент может содержать аминокислотный компонент. В одном из таких вариантов изобретения аминокислотный компонент обеспечивает расщепление линкера протеазой, что облегчает высвобождение лекарственного средства из иммуноконъюгата после его обработки внутриклеточными протеазами, такими как лизосомные ферменты. См., например, Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784. Репрезентативными аминокислотными компонентами являются, но не ограничиваются ими, дипептид, трипептид, тетрапептид и пентапептид. Репрезентативными дипептидами являются валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe), фенилаланин-лизин (fk или phe-lys); или N-метил-валин-цитруллин (Me-val-cit). Репрезентативными трипептидами являются глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотный компонент может содержать природные аминокислотные остатки, а также небольшие аминокислоты и неприродные аминокислотные аналоги, такие как цитруллин. Аминокислотные компоненты могут быть сконструированы и оптимизированы по их селективности в отношении ферементативного расщепления конкретными ферментами, например, опухолеассоциированной протеазой, катепсином В, C и D, или плазминовой протеазой.
В некоторых вариантах изобретения линкерный компонент может содержать «спейсерный» компонент, который связывает антитело с молекулой лекарственного средства, либо непосредственно, либо посредством удлиняющего компонента и/или аминокислотного компонента. Спейсерным компонентом может быть «самоэлиминирующийся» или «несамоэлиминирующийся» компонент. «Несамоэлиминирующийся» спейсерный компонент представляет собой компонент, где часть спейсерного компонента или весь этот компонент остаются связанными с молекулой лекарственного средства после ферментативного (например, протеолитического) расщепления ADC. Примерами несамоэлиминирующихся спейсерных компонентов являются, но не ограничиваются ими, глициновый спейсерный компонент и глицин-глициновый спейсерный компонент. Также рассматриваются и другие комбинации пептидных спейсеров, чуствительных к последовательность-специфическому ферментативному расщеплению. Так, например, ферментативное расщепление ADC, содержащего глицин-глициновый спейсерный компонент, протеазой, ассоциированной с опухолевыми клетками, будет приводить к высвобождению молекулы «глицин-глицин-лекарственное средство» из остальной части ADC. В одном из таких вариантов молекула «глицин-глицин-лекарственное средство» подвергается одностадийному гидролизу в опухолевой клетке, что приводит к отщеплению глицин-глицинового спейсерного компонента от молекулы лекарственного средства.
1
8
1
8
«Самоэлиминирующийся» спейсерный компонент обеспечивает высвобождение молекулы лекарственного средства без проведения одностадийного гидролиза. В некоторых вариантах изобретения спейсерный компонент линкера содержит п-аминобензильную группу. В одном из таких вариантов п-аминобензиловый спирт присоединен к аминокислотному компоненту посредством амидной связи, а карбамат, метилкарбамат или карбонат образуются в результате реакции взаимодействия бензилового спирта с цитотоксическим агентом. См., например, Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103. В одном из вариантов изобретения спейсерным компонентом является п-аминобензилоксикарбонил (PAB). В некоторых вариантах изобретения фениленовая часть п-аминобензильной группы замещена Qm, где Q представляет собой -С-Салкил, -О-(С-Салкил), галоген, нитро или циано; m равно целому числу от 0 до 4. Другими примерами самоэлиминирующихся спейсерных компонентов являются, но не ограничиваются ими, ароматические соединения, которые по своим электронным свойствам аналогичны п-аминобензиловому спирту (см. например, заявку US 2005/0256030 A1), такому как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) и орто- или пара-аминобензилацетали. Могут быть использованы спейсеры, которые подвергаются циклизации после гидролиза амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223), соответствующим образом замещенные кольцевые бицикло[2.2.1]- и бицикло[2.2.2]-системы (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867). Примерами самоэлиминирующихся спейсеров, используемых в ADC, являются аминосодержащие лекарственные средства, замещенные в α-положении глицина (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
В одном из вариантов изобретения указанный спейсерный элемент представляет собой нижеуказанный разветвленный бис(гидроксиметил)стирол (BHMS), который может быть использован для включения и высвобождения множества лекарственных средств и который имеет структуру:
,
1
8
1
8
где Q представляет собой -С-Салкил, -О-(С-Салкил), галоген, нитро или циано; m равно целому числу от 0 до 4; n равно 0 или 1; а p равно числу от 1 и примерно до 20.
В другом варианте изобретения линкером L может быть линкер дендритного типа, используемый для ковалентного связывания более чем одной молекулы лекарственного средства с антителом посредством ветвящейся многофункциональной линкерной молекулы (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Дендритные линкеры могут повышать молярное отношение лекарственного средства к антителу, то есть нагрузку, которая соответствует эффективности ADC. Таким образом, если сконструированное на основе цистеина антитело содержит только одну реакционноспособную тиоловую группу цистеина, то посредством дендритного линкера может быть присоединено большое количество молекул лекарственного средства.
Репрезентативные линкерные компоненты и их комбинации представлены ниже для ADC формулы II:
Линкерные компоненты, включая удлиняющие, спейсерные и аминокислотные компоненты, могут быть синтезированы методами, известными специалистам, например методами, описанными в заявке US 2005-0238649 A1.
b. Репрезентативные молекулы лекарственного средства
(1) Майтанзин и майтанзиноиды
В некоторых вариантах изобретения иммуноконъюгат содержит антитело, конъюгированное с одной или несколькими молекулами майтанзиноида. Майтанзиноиды представляют собой митотические ингибиторы, которые действуют посредством ингибирования полимеризации тубулина. Майтанзин был впервые выделен у восточно-африканской землеройки Maytenus serrata (патент США № 3896111). Затем было обнаружено, что некоторые микробы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и сложные эфиры С-3-майтанзинола (патент США № 4151042). Синтетический майтанзинол и его производные и аналоги описаны, например, в патентах США №№ 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533.
Молекулы майтанзиноидных лекарственных средств являются привлекательными молекулами лекарственных средств для использования в конъюгатах «антитело-лекарственное средство», поскольку они (i) могут быть относительно легко получены путем ферментации или химической модификации или дериватизации продуктов ферментации, (ii) являются пригодными для дериватизации функциональными группами, подходящими для конъюгирования посредством присоединения дисульфидных и недисульфидных линкеров к антителам, (iii) являются стабильными в плазме и (iv) являются эффективными против различных опухолевых клеточных линий.
Майтанзиновые соединения, которые могут быть использованы в качестве майтанзиноидных лекарственных средств, хорошо известны специалистам и могут быть выделены из природных источников известными методами, либо они могут быть получены методами генной инженерии и ферментации (US 6790952; US 2005/0170475; Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973). Майтанзинол и его аналоги могут быть также получены известными методами синтеза.
Репрезентативными майтанзиноидными лекарственными средствами являются лекарственные средства, имеющие модифицированное ароматическое кольцо, такие как C-19-десхлоро (патент США 4256746) (полученные путем восстановления анзамитоцина Р2 алюмогидридом лития); C-20-гидрокси (или C-20-десметил) +/-C-19-десхлор (патенты США N№ 4361650 и 4307016) (полученные путем деметилирования с использованием Streptomyces или Actinomyces, или путем дехлорирования с использованием LAH); и C-20-десметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-десхлоро (патент США № 4294757) (полученные путем ацилирования с использованием ацилхлоридов), и молекулы, имеющие модификации в других положениях.
2
2
5
2
2
2
Репрезентативными молекулами майтанзиноидного лекарственного средства являются молекулы, имеющие модификации, такие как: C-9-SH (патент США 4424219) (полученные путем реакции взаимодействия майтанзинола с HS или PS); C-14-алкоксиметил(десметокси/CHOR)(патент США 4331598); C-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (CHOH или CHOAc) (патент США 4450254) (полученные от Nocardia); C-15-гидрокси/ацилокси (патент США 4364866) (полученные путем превращения майтанзинола под действием Streptomyces); C-15-метокси (патенты США №№ 4313946 и 4315929) (выделенные из Trewia nudlflora); C-18-N-десметил (патенты США №№ 4362663 и 4322348) (полученные путем деметилирования майтанзинола под действием Streptomyces); и 4,5-дезокси (патент США 4371533) (полученные путем восстановления майтанзинола трихлоридом титана/LAH).
Известно, что многие положения в майтанзиновых соединениях, в зависимости от типа связи, могут быть использованы в качестве положения присоединения. Так, например, для образования сложноэфирной связи, подходящими являются C-3-положение, имеющее гидроксильную группу, C-14-положение, модифицированное гидроксиметилом, C-15-положение, модифицированное гидроксильной группой, и C-20-положение, имеющее гидроксильную группу (US 5208020; US RE39151; US 6913748; US 7368565; US 2006/0167245; US 2007/0037972).
Молекулами майтанзиноидного лекарственного средства являются молекулы, имеющие структуру:
,
1
6
где волнистая линия означает ковалентное связывание атома серы молекулы майтанзиноидного лекарственного средства с линкером ADC. R может независимо представлять собой H или С-Салкил. Алкиленовой цепью, связывающей амидную группу с атомом серы, может быть метанил, этанил или пропил, то есть, где m равно 1, 2 или 3 (US 633410; US 5208020; US 7276497; Chari et al. (1992) Cancer Res. 52:127-131; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623).
В настоящем описании рассматриваются все стереоизомеры молекул майтанзиноидного лекарственного средства соединений согласно изобретению, то есть любая комбинация R- и S-конфигураций у хиральных атомов углерода D. В одном из вариантов изобретения молекула майтанзиноидного лекарственного средства имеет нижеследующую стереохимическую структуру:
Репрезентативными вариантами молекул майтанзиноидного лекарственного средства являются: DM1; DM3 и DM4, имеющие структуры:
,
где волнистая линия означает ковалентное связывание атома серы молекулы лекарственного средства с линкером (L) конъюгата «антитело-лекарственное средство» (WO 2005/037992; US 2005/0276812 A1).
Другие репрезентативные конъюгаты «майтанзиноид-антитело-лекарственное средство» имеют нижеследующие структуры и обозначения (где Ab представляет собой антитело, а p равно от 1 до примерно 8):
Репрезентативные конъюгаты «антитело-лекарственное средство», где DM1 присоединен посредством линкера BMPEO к тиоловой группе антитела, имеют нижеследующую структуру и обозначения:
,
где Ab представляет собой антитело, n равно 0, 1 или 2, а p равно 1, 2, 3 или 4.
Иммуноконъюгаты, содержащие майтанзиноиды, способы их получения и их терапевтическое применение описаны, например, в публикации Erickson, et al. (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; в патентах США №№ 5208020, 5416064, в заявке US 2005/0276812 A1 и в Европейском патенте ЕР 0425235В1, которые во всей своей полноте вводятся в настоящую заявку посредством ссылки.
Конъюгаты “антитело-майтанзиноид” получают путем химического связывания антитела с молекулой майтанзиноида, где указанное связывание не приводит к значительному снижению биологической активности антитела или молекулы майтанзиноида. См., например, патент США № 5208020 (который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). Майтанзиноиды могут быть синтезированы известными методами, либо они могут быть выделены из природных источников. Подходящие майтанзиноиды описаны, например, в патенте США № 5208020 и в других патентах и в непатентных публикациях, описанных выше, и такими майтанзиноидами являются майтанзинол и аналоги майтанзинола, имеющие модификации в ароматическом кольце или в других положениях молекулы майтанзинола, такие как различные сложные эфиры майтанзинола.
Для создания конъюгатов «антитело-майтанзиноид» может быть использовано множество линкерных групп, известных специалистам, включая, например, группы, описанные в патенте США № 5208020 или в Европейском патенте ЕР 0425235В1, и в публикации Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) и в заявке на патент US 2005/016993 A1, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Конъюгаты «антитело-майтанзиноид», содержащие линкерный компонент SMCC, могут быть получены, как описано в заявке на патент US 2005/0276812 A1, в разделе «Конъюгаты антитело-лекарственное средство и методы». Линкерными группами являются дисульфидные группы, тиоэфирные группы, группы, чувствительные к воздействию кислоты, фотохимически неустойчивые группы, группы, чувствительные к действию пептидазы, или группы, чувствительные к действию эстеразы, описанные в вышеупомянутых патентах. Дополнительные линкерные группы описаны и проиллюстрированы в настоящей заявке.
Конъюгаты «антитело-майтанзиноид» могут быть получены с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). В некоторых вариантах изобретения связывающими агентами для создания дисульфидной связи являются N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) или N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP).
Линкер может быть присоединен к молекуле майтанзиноида в различных положениях, в зависимости от типа связи. Так, например, сложноэфирная связь может быть образована посредством реакции с гидроксильной группой стандартными методами связывания. Такая реакция может осуществляться в положении С-3, имеющем гидроксильную группу, в положении С-14, модифицированном гидроксиметилом, в положении С-15, модифицированном гидроксильной группой, и в положении С-20, имеющем гидроксильную группу. В одном из вариантов изобретения указанная связь образуется в положении С-3 майтанзинола или его аналога.
(2) Ауристатины и доластатины
В некоторых вариантах изобретения иммуноконъюгат содержит антитело, конъюгированное с доластатином или с пептидным аналогом доластатина или их производными, например, с ауристатином (патенты США №№ 5635483, 5780588). Было обнаружено, что доластатины и ауристатины негативно влияют на динамику образования микротрубочек, гидролиз GTP и деление ядер и клеток (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), и обладают противораковой (патент США 5663149) и противогрибковой активностью (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Молекулы доластатиновых или ауристатиновых лекарственных средств могут быть присоединены к антителу у N-(амино)-конца или у С-(карбокси)-конца молекулы пептидного лекарственного средства (WO 02/088172).
Репрезентативными вариантами ауристатина являются молекулы лекарственного средства, содержащие присоединенный к N-концу монометилауристатин, DE и DF (заявка US 2005/0238649, описанная Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, и представленная 28 марта 2004 г., и указанная заявка во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).
E
F
Пептидная молекула лекарственного средства может быть выбрана из соединений формул D и D, представленных ниже:
,
E
F
где волнистая линия в D и D обозначает сайт ковалентного присоединения к антителу или к компоненту антитело-линкер;
и в каждом положении, независимо:
2
1
8
R выбран из H и C-Cалкила;
3
1
8
3
8
1
8
1
8
3
8
3
8
1
8
3
8
R выбран из H, C-Cалкила, C-Cкарбоцикла, арила, C-Cалкил-арила, C-Cалкил-(C-Cкарбоцикла), C-Cгетероцикла и C-Cалкил-(C-Cгетероцикла);
4
1
8
3
8
1
8
1
8
3
8
3
8
1
8
3
8
R выбран из H, C-Cалкила, C-Cкарбоцикла, арила, C-Cалкил-арила, C-Cалкил-(C-Cкарбоцикла), C-Cгетероцикла и C-Cалкил-(C-Cгетероцикла);
5
R выбран из H и метила;
4
5
a
b
a
b
n
1
8
3
8
или R и R, взятые вместе, образуют карбоциклическое кольцо и имеют формулу -(CRR)-, где R и R независимо выбраны из H, C-Cалкила и C-Cкарбоцикла, а n выбран из 2, 3, 4, 5 и 6;
6
1
8
R выбран из H и C-Cалкила;
7
1
8
3
8
1
8
1
8
3
8
3
8
1
8
3
8
R выбран из H, C-Cалкила, C-Cкарбоцикла, арила, C-Cалкил-арила, C-Cалкил-(C-Cкарбоцикла), C-Cгетероцикла и C-Cалкил-(C-Cгетероцикла);
8
1
8
3
8
1
8
каждый из R независимо выбран из H, OH, C-Cалкила, C-Cкарбоцикла и O-(C-Cалкила);
9
1
8
R выбран из H и C-Cалкила;
10
3
8
R выбран из арила или C-Cгетероцикла;
12
12
1
8
Z представляет собой O, S, NH или NR, где R представляет собой C-Cалкил;
11
13
14
13
15
1
20
3
8
m
m
2
R выбран из H, C-Cалкила, арила, C-Cгетероцикла, -(RO)-R или -(RO)-CH(R);
m равно целому числу 1-1000;
13
2
8
R представляет собой C-Cалкил;
14
1
8
R представляет собой H или C-Cалкил;
15
16
2
n
2
2
n
3
2
n
3
1
8
R в каждом случае независимо представляет собой H, COOH, -(CH)-N(R), -(CH)-SOH или -(CH)-SO-C-Cалкил;
16
1
8
2
n
R в каждом случае независимо представляет собой H, C-Cалкил или -(CH)-COOH;
18
8
8
8
8
8
8
2
2
2
2
3
8
2
2
3
8
R выбран из -C(R)-C(R)-арила, -C(R)-C(R)-(C-Cгетероцикла) и -C(R)-C(R)-(C-Cкарбоцикла); и
n равно целому числу от 0 до 6.
3
4
7
5
3
4
5
7
В одном из вариантов изобретения R, R и R независимо представляют собой изопропил или втор-бутил, а R представляет собой -H или метил. В предпочтительном варианте изобретения каждый из R и R представляет собой изопропил, R представляет собой -H, а R представляет собой втор-бутил.
2
6
9
В другом варианте изобретения каждый из R и R представляет собой метил, а R представляет собой -H.
8
3
В еще одном варианте изобретения R в каждом случае представляет собой -OCH.
3
4
2
6
5
7
8
9
3
В репрезентативном варианте изобретения каждый из R и R представляет собой изопропил, каждый из R и R представляет собой метил, R представляет собой -H, R представляет собой втор-бутил, R в каждом случае представляет собой -OCH, а R представляет собой -H.
В одном из вариантов изобретения Z представляет собой -O- или -NH-.
10
В одном из вариантов изобретения R представляет собой арил.
10
В репрезентативном варианте изобретения R представляет собой фенил.
11
В репрезентативном варианте изобретения, если Z представляет собой -O-, то R представляет собой -H, метил или трет-бутил.
11
15
15
16
16
2
2
n
2
1
8
2
n
В одном из вариантов изобретения, если Z представляет собой -NH, то R представляет собой -CH(R), где R представляет собой -(CH)-N(R), а R представляет собой -C-Cалкил или -(CH)-COOH.
11
15
15
2
2
n
3
В другом варианте изобретения, если Z представляет собой -NH, то R представляет собой -CH(R), где R представляет собой -(CH)-SOH.
E
Репрезентативным вариантом ауристатина формулы D является MMAE, где волнистая линия означает ковалентное связывание конъюгата «антитело-лекарственное средство» с линкером (L):
Репрезентативным вариантом ауристатина формулы D является MMAF, где волнистая линия означает ковалентное связывание конъюгата «антитело-лекарственное средство» с линкером (L) (см. заявку US 2005/0238649 и публикацию Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124):
Другими репрезентативными вариантами являются монометилвалиновые соединения, имеющие фенилаланинкарбокси-модификации у С-конца пентапептидного ауристатинового лекарственного средства (WO 2007/008848), и монометилвалиновые соединения, имеющие фенилаланиновые модификации боковой цепи у С-конца пентапептидного ауристатинового лекарственного средства (WO 2007/008603).
Другими молекулами лекарственного средства являются нижеследующие производные MMAF, где волнистая линия означает ковалентное связывание конъюгата «антитело-лекарственное средство» с линкером (L):
11
В одном из аспектов изобретения гидрофильными группами являются, но не ограничиваются ими, сложные эфиры триэтиленгликоля (TEG), представленные выше, которые могут быть присоединены к молекуле лекарственного средства в положении R. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно лишь отметить, что гидрофильные группы улучшают интернализацию молекулы лекарственного средства и предотвращают ее агломерацию.
Репрезентативные варианты ADC формулы I, содержащие ауристатин/доластатин или их производные, описаны в заявке US 2005-0238649 и в публикации Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Репрезентативные варианты ADC формулы I, содержащие MMAE или MMAF и различные линкерные компоненты, имеют нижеследующие структуры и обозначения (где “Ab” представляет собой антитело; p равно от 1 до примерно 8, “Val-Cit” или “vc” представляет собой дипептид валин-цитруллин, а “S” представляет собой атом серы). При этом следует отметить, что в некоторых описаниях структуры ADC, связанного с атомом серы, антитело имеет обозначение “Ab-S”, которое указывает лишь на связь с атомом серы, но не указывает на то, что конкретный атом серы присоединен к нескольким молекулам «линкер-лекарственное средство». В нижеследующих структурах скобка слева может быть также поставлена слева от атома серы Ab и S, и такая запись будет эквивалентна формуле ADC согласно изобретению, представленной в настоящем описании.
Репрезентативные варианты ADC формулы I, содержащие MMAF и различные линкерные компоненты, также включают Ab-MC-PAB-MMAF и Ab-PAB-MMAF. Интересно отметить, что иммуноконъюгаты, содержащие MMAF, присоединенные к антителу посредством линкера, который не подвергается протеолитическому расщеплению, обладают активностью, сравнимой с активностью иммуноконъюгатов, содержащих MMAF, присоединенный к антителу посредством протеолитически расщепляемого линкера. См., Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. В таких случаях высвобождение лекарственного средства, очевидно, происходит благодаря разложению антитела в клетке. См. ниже.
Обычно пептидные молекулы лекарственного средства могут быть получены путем образования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи могут быть образованы, например, методом синтеза в жидкой фазе (см. E. Schröder and K. Lübke, “The Peptides”, volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press), хорошо известным специалистам в области пептидного синтеза. Молекулы ауристатиновых/доластатиновых лекарственных средств могут быть получены методами, описанными в заявке US 2005-0238649 A1; в патентах США № 5635483; № 5780588; в публикациях Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; и Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784.
F
E
В частности, молекулы ауристатиновых/доластатиновых лекарственных средств формулы D, таких как MMAF и их производные, могут быть получены методами, описанными в заявке США 2005-0238649 A1 и в публикации Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124. Молекулы ауристатиновых/доластатиновых лекарственных средств формулы D, таких как MMAE и их производные, могут быть получены методами, описанными в публикации Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784. Молекулы «лекарственное средство-линкер» MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF и MC-vc-PAB-MMAE могут быть соответствующим образом синтезированы рутинными методами, например, как описано в публикации Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784, и в публикации патентной заявки № US 2005/0238649 A1, а затем они могут быть конъюгированы с представляющим интерес антителом.
(3) Калихеамицин
1
2
3
1
1
I
I
I
I
I
В других вариантах изобретения иммуноконъюгат содержит антитело, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Антибиотики семейства калихеамицинов способны продуцировать двухцепочечные ДНК-разрывы в субпикомолярных концентрациях. Описание получения конъюгатов семейства калихеамицинов можно найти в патентах США №№ 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (все патенты принадлежат компании American Cyanamid Company). Структурными аналогами калихеамицина, которые могут быть использованы в этих целях, являются, но не ограничиваются ими, γ , α , α , N-ацетил-γ , PSAG и θ  (см. Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) и вышеупомянутые патенты США, принадлежащие компании American Cyanamid). Другим противоопухолевым лекарственным средством, с которым может быть конъюгировано антитело, является средство QFA, которое представляет собой антифолат. Калихеамицин и QFA имеют внутриклеточные активные сайты и с трудом проходят через плазматическую мембрану. Поэтому поглощение этих агентов клетками путем интернализации, опосредуемой антителом, приводит к значительному усилению их цитотоксических эффектов.
с. Другие цитотоксические средства
Другими противоопухолевыми средствами, которые могут быть конъюгированы с антителом, являются BCNU, стрептозоцин, винкристин и 5-фторурацил, семейство агентов, известных под общим названием комплекс LL-Е33288, описанный в патентах США №№ 5053394, 5770710, а также эсперамицины (патент США № 5877296).
Ферментативно активными токсинами и их фрагментами, которые могут быть использованы в этих целях, являются А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (от Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белка диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, заявку WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 г.
В настоящем изобретении также рассматривается иммуноконъюгат, образуемый антителом и соединением, обладающим нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКазой).
211
131
25
90
186
188
153
212
32
212
99m
123
В некоторых вариантах изобретения иммуноконъюгат может содержать высокорадиоактивный атом. Для продуцирования радиоактивно конъюгированных антител могут быть использованы различные радиоактивные изотопы. Примерами таких радионуклидов являются At, I, 1I, Y, Re, Re, Sm, Bi, Р, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Если указанный иммуноконъюгат используется для детекции, то он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Tc или I, или спин-метку для визуализации методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (известной также как МР-визуализация, МРВ), такую как йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
99m
123
186
188
111
Радиоактивные или другие метки могут быть включены в иммуноконъюгат известными методами. Так, например, пептид может быть синтезирован биологическими методами, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза аминокислот с использованием подходящих аминокислотных предшественников, включающих, например, фтор-19 вместо водорода. Такие метки, как Tc или I, Re, Re и In, могут быть присоединены посредством цистеинового остатка пептида. Иттрий-90 может быть присоединен посредством лизинового остатка. Для введения йода-123 может быть применен метод IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57). Другие методы подробно описаны в публикации «Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CRC Press 1989).
В некоторых вариантах изобретения иммуноконъюгат может содержать антитело, конъюгированное с пролекарством-активирующим ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидиловое химиотерапевтическое средство, см. WO 81/01145) в активное лекарственное средство, такое как противораковое лекарственное средство. Такие иммуноконъюгаты могут быть использованы в антитело-зависимой опосредуемой ферментами пролекарственной терапии (“ADEPT”). Ферментами, которые могут быть конъюгированы с антителом, являются, но не ограничиваются ими, щелочные фосфатазы, которые могут быть использованы для превращения фосфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазы, которые могут быть использованы для превращения сульфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминаза, которая может быть использована для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство, а именно в 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), которые могут быть использованы для превращения пептидсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, которые могут быть использованы для превращения пролекарств, содержащих D-аминокислотные заместители; углевод-расщепляющие ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, которые могут быть использованы для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамаза, которая может быть использована для превращения лекарственных средств, дериватизированных β-лактамами, в свободные лекарственные средства; и пенициллин-амидазы, такие как пенициллин V-амидаза или пенициллин G-амидаза, которые могут быть использованы для превращения лекарственных средств, дериватизированных у атомов азота амина феноксиацетильными или фенилацетильными группами, соответственно, в свободные лекарственные средства. Ферменты могут быть ковалентно присоединены к антителам методами рекомбинантных ДНК, хорошо известными специалистам. (см., например, Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984)).
d. Загрузка лекарственного средства
Загрузка лекарственного средства обозначается p, то есть средним числом молекул лекарственного средства на антитело в молекуле формулы I. Загрузка лекарственного средства может составлять от 1 до 20 молекул лекарственного средства (D) на антитело. Конъюгатами «антитело-лекарственное средство» (ADC) формулы I являются наборы антител, конъюгированных с различными молекулами лекарственного средства, от 1 до 20. Среднее число молекул лекарственного средства на антитело в препаратах ADC, полученных в результате реакций конъюгирования, может быть охарактеризовано стандартными средствами, такими как масс-спектроскопия, ELISA-анализ и ВЭЖХ. Может быть также определено количественное распределение ADC, выраженное в «p». В некоторых случаях разделение, очистка и характеризация гомогенного ADC, где р представляет собой определенную величину, полученную для ADC с другой загрузкой лекарственного средства, могут быть осуществлены с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ или электрофореза. Так, например, фармацевтические композиции «антитело-лекарственное средство» формулы I могут быть гетерогенной смесью таких конъюгатов с антителами, присоединенными к 1, 2, 3, 4 или более молекулам лекарственного средства.
Для некоторых конъюгатов «антитело-лекарственное средство» p может ограничиваться числом сайтов связывания на антителе. Так, например, если присоединение происходит посредством тиола цистеина, как в репрезентативных вариантах, описанных выше, то антитело может иметь только одну или несколько тиоловых групп цистеина, либо оно может иметь только одну или несколько достаточно реакционноспособных тиоловых групп, посредством которых может присоединяться линкер. В некоторых вариантах изобретения более высокая загрузка лекарственного средства, например, p>5, может приводить к агрегации, нерастворимости, токсичности или к потере способности некоторых конъюгатов «антитело-лекарственное средство» проникать через клетки. В некоторых вариантах изобретения загрузка лекарственного средства на ADC согласно изобретению составляет в пределах от 1 и примерно до 8, примерно от 2 до 6 или примерно от 3 до 5. Действительно, было показано, что для некоторых ADC оптимальное отношение молекул лекарственного средства на антитело может составлять менее чем 8, а может составлять примерно от 2 до 5. См. заявку США 2005-0238649 A1.
В некоторых вариантах изобретения молекулы лекарственного средства в количестве меньше теоретического максимума конъюгируют с антителом в процессе реакции конъюгирования. Антитело может содержать, например, лизиновые остатки, которые не реагируют с промежуточным соединением «лекарственное средство-линкер» или с линкерным реагентом, обсуждаемыми ниже. Обычно антитела не содержат большого количества свободных и реакционноспособных тиоловых групп цистеина, которые могут быть связаны с молекулой лекарственного средства, и действительно, большинство тиоловых групп цистеиновых остатков в антителах присутствуют в виде дисульфидных мостиков. В некоторых вариантах изобретения антитело может быть восстановлено под действием восстановителя, такого как дитиотреитол (DTT) или трикарбонилэтилфосфин (TCEP), в условиях частичного или полного восстановления с образованием реакционноспособных тиоловых групп цистеина. В некоторых вариантах изобретения антитело подвергают реакции в денатурирующих условиях с образованием реакционноспособных нуклеофильных групп, таких как лизин или цистеин.
Загрузка ADC (отношение лекарственное средство/антитело) может регулироваться различными методами, например, путем (i) ограничения молярного избытка промежуточного соединения «лекарственное средство-линкер» или линкерного реагента по отношению к антителу, (ii) ограничения времени реакции или температуры реакции конъюгирования и (iii) неполного или лимитирующего восстановления для модификации тиоловых групп цистеина.
Следует отметить, что в случае, когда с промежуточным соединением «лекарственное средство-линкер» или с линкерным реагентом, а затем с реагентом, таким как молекула лекарственного средства, реагирует более чем одна нуклеофильная группа, то полученным продуктом является смесь соединений ADC с распределением одной или более молекул лекарственного средства, присоединенных к антителу. Среднее число молекул лекарственного средства на антитело может быть вычислено для смеси с помощью «сэндвич»-ELISA-анализа с использованием антител, который является специфическим для антитела и для лекарственного средства. Отдельные молекулы ADC в этой смеси могут быть идентифицированы с помощью масс-спектроскопии и разделены с помощью ВЭЖХ, например, гидрофобной хроматографии (см., например, McDonagh et al. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate”, Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. “Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates”, Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). В некоторых вариантах изобретения гомогенный ADC с загрузкой одного лекарственного средства может быть выделен из смеси для конъюгирования с помощью электрофореза или хроматографии.
e. Некоторые способы получения иммуноконъюгатов
ADC формулы I может быть получен несколькими способами с проведением реакций органического химического синтеза в соответствующих условиях и с использованием реагентов, известных специалистам, где указанные способы включают: (1) реакцию взаимодействия нуклеофильной группы антитела с двухвалентным линкерным реагентом с образованием Ab-L посредством ковалентной связи, а затем реакцию взаимодействия с молекулой лекарственного средства D; и (2) реакцию взаимодействия нуклеофильной группы молекулы лекарственного средства с двухвалентным линкерным реагентом с образованием D-L посредством ковалентной связи, а затем реакцию взаимодействия с нуклеофильной группой антитела. Репрезентативные методы получения ADC формулы 1 с помощью последней реакции описаны в заявке US 2005-0238649 A1, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Нуклеофильными группами, присутствующими на антителах, являются, но не ограничиваются ими: (i) N-концевые аминогруппы, (ii) аминогруппы боковой цепи, например, лизина, (iii) тиоловые группы боковой цепи, например, цистеина, и (iv) гидроксильные или аминогруппы сахаров, где указанное антитело является гликозилированным. Аминогруппы, тиоловые группы и гидроксильные группы являются нуклеофильными и могут подвергаться реакции взаимодействия с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных молекулах или линкерных реагентах, включая: (i) активные сложные эфиры, такие как NHS-эфиры, HOBt-эфиры, галогенформиаты и галогенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы. Некоторые антитела имеют восстанавливаемые межцепочечные дисульфиды, то есть цистеиновые мостики. Для конъюгирования с линкерными реагентами антитела могут быть сделаны реакционноспособными путем их обработки восстановителем, таким как DTT (дитиотреитол) или трикарбонилэтилфосфин (ТСЕР), в результате чего такие антитела будут полностью или частично восстановленными. Каждый цистеиновый мостик, теоретически, может образовывать два реакционноспособных тиоловых нуклеофила. В антитела могут быть введены дополнительные нуклеофильные группы посредством модификации лизиновых остатков, например, посредством реакции взаимодействия лизинов с 2-иминотиоланом (реагентом Траута), что будет приводить к превращению амина в тиол. Реакционноспособные тиоловые группы могут быть включены в антитело путем введения одного, двух, трех, четырех или более цистеиновых остатков (например, получения вариантов антител, содержащих один или несколько неприродных цистеиновых аминокислотных остатков).
Конъюгаты “антитело-лекарственное средство” согласно изобретению могут быть также получены путем реакции взаимодействия электрофильной группы антитела, такой как карбонильная группа альдегида или кетона, с нуклеофильной группой линкерного реагента или лекарственного средства. Подходящими нуклеофильными группами на линкерном реагенте являются, но не ограничиваются ими, гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, карбоксилат гидразина и арилгидразид. В одном из вариантов изобретения антитело модифицируют так, чтобы оно включало электрофильные группы, способные реагировать с нуклеофильными заместителями на линкерном реагенте или лекарственном средстве. В другом варианте изобретения сахара гликозилированных антител могут быть окислены, например, периодатными окислителями с образованием альдегидных или кетоновых групп, которые могут реагировать с аминогруппой линкерных реагентов или молекул лекарственного средства. Полученные иминовые группы Шиффова основания могут образовывать стабильную связь, либо они могут быть восстановлены, например, борогидридными реагентами с образованием стабильных аминовых связей. В одном из вариантов изобретения реакция взаимодействия углеводной части гликозилированного антитела с галактозооксидазой или с метапериодатом натрия может приводить к образованию карбонильных (альдегидных и кетоновых) групп в антителе, которые могут реагировать с соответствующими группами на лекарственном средстве (Hermanson, Bioconjugate Techniques). В другом варианте изобретения антитела, содержащие N-концевые сериновые или треониновые остатки, могут реагировать с метапериодатом натрия с образованием альдегида вместо первой аминокислоты (Geoghegan & Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3:138-146; патент США № 5362852). Такой альдегид может взаимодействовать с молекулой лекарственного средства или с линкерным нуклеофилом.
Нуклеофильными группами на молекуле лекарственного средства являются, но не ограничиваются ими, аминогруппы, тиольные, гидроксильные, гидразидные, оксимовые, гидразиновые, тиосемикарбазоновые, гидразинкарбоксилатные и арилгидразидные группы, способные реагировать, с образованием ковалентных связей, с электрофильными группами на линкерных молекулах и линкерных реагентах, включая: (i) активные сложные эфиры, такие как NHS-эфиры, HOBt-эфиры, галогенформиаты и галогенангидриды кислот; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегиды, кетоны, карбоксильные и малеимидные группы.
Короче говоря, рассматриваемыми соединениями согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими: ADC, полученные с использованием нижеследующих перекрестно-сшивающих реагентов, таких как BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, поставляются Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A; см. страницы 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog).
14
Иммуноконъюгаты, содержащие антитело и цитотоксическое средство, могут быть получены с использованием различных бифункциональных белок-связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Так, например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в публикации Vitetta et al. Science, 238:1098 (1987). С-меченная 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминопентауксусная кислота (МХ-DTPA) является репрезентативным хелатообразующим агентом для конъюгирования радионуклида с антителом. См. WO 94/11026.
Альтернативно гибридный белок, содержащий антитело и цитотоксическое средство, может быть получен, например, рекомбинантными методами или методом пептидного синтеза. Рекомбинантая молекула ДНК может содержать области, кодирующие антитело и цитотоксические части конъюгата, либо смежные друг с другом, либо разделенные областью, кодирующей линкерный пептид, который не оказывает негативного влияния на желаемые свойства данного конъюгата.
В еще одном варианте изобретения указанное антитело может быть конъюгировано с “рецептором” (таким как стрептавидин) для его предварительного нацеливания на опухоль, где указанный конъюгат “антитело-рецептор” вводят пациенту с последующим удалением несвязанного конъюгата из кровотока с использованием агента для клиренса, а затем вводят “лиганд” (например, авидин), конъюгированный с цитотоксическим средством (например, радионуклеотидом).
Репрезентативные иммуноконъюгаты - конъюгаты «тио-антитело-лекарственное средство»
a. Получение сконструированных на основе цистеина анти-CD79b антител
ДНК, кодирующую вариант аминокислотной последовательности сконструированных на основе цистеина анти-CD79b антител и родительских анти-CD79b антител согласно изобретению, получают различными методами, которые включают, но не ограничиваются ими, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотных последовательностей), получение препарата с помощью сайт-направленного (или олигонуклеотид-опосредуемого) мутагенеза (Carter (1985) et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443; Ho et al. (1989) Gene (Amst.) 77:51-59; Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488; Liu et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260), ПЦР-мутагенеза (Higuchi, (1990) in PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al. (1991) Gene 102:67-70; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; и Vallette et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:723-733), и кластерного мутагенеза (Wells et al. (1985) Gene 34:315-323) ранее полученной ДНК, кодирующей полипептид. Протоколы, наборы и реагенты для осуществления мутагенеза являются коммерчески доступными, например, такие как набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Multi Site-Direct Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Одиночные мутации также вводят с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием двухцепочечной плазмидной ДНК в качестве матрицы посредством ПЦР-мутагенеза (Sambrook and Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al. (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, M.J. and Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500). Варианты рекомбинантных антител могут быть также сконструированы путем модификации рестрикционными фрагментами или с помощью удлиняющей ПЦР с перекрыванием, проводимой с использованием синтетических олигонуклеотидов. Мутагенные праймеры кодируют замену(ы) цистеиновых кодонов. Стандартные методы мутагенеза могут быть применены для продуцирования ДНК, кодирующей такие мутантные антитела, сконструированные на основе цистеина (Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; и Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993).
Технология фагового дисплея (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553) может быть использована для продуцирования человеческих анти-CD79b антител и фрагментов антител in vitro из наборов генов вариабельного домена иммуноглобулина (V) от неиммунизованных доноров. В соответствии с этим методом гены домена V антител клонируют с сохранением рамки считывания в мажорный или минорный ген белковой оболочки нитчатого фага, такого как M13 или fd, и представляют на поверхности фаговой частицы как функциональные фрагменты антител. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, то отбор, проводимый на основе функциональных свойств антитела, также позволяет отбирать ген, кодирующий антитело, обладающее этими свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клеток (Johnson et al. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571; Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Griffith et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; US 5565332; US 5573905; US 5567610; US 5229275).
Анти-CD79b антитела могут быть химически синтезированы с применением известного метода олигопептидного синтеза, либо они могут быть получены и очищены рекомбинантным методом. Соответствующая аминокислотная последовательность или ее части могут быть получены методом прямого твердофазного синтеза пептидов (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, (1969) W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154). Синтез белка in vitro может быть осуществлен вручную или автоматизированным методом. Автоматизированный метод твердофазного синтеза может быть осуществлен, например, с использованием t-BOC- или Fmoc- защищенных аминокислот на пептидном синтезаторе Applied Biosystems (Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителей. Различные части анти-CD79b антитела или полипептида CD79b могут быть получены методом химического синтеза и комбинированным методом химического или ферментативного синтеза с продуцированием нужного анти-CD79b антитела или полипептида CD79b.
2
Для получения фрагментов антитела были разработаны различные методы. Традиционно эти фрагменты образуются в результате протеолитического расщепления интактных антител (Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al. (1985) Science, 229:81), либо они могут продуцироваться непосредственно рекомбинантными клетками-хозяевами. Fab-, Fv- и scFv-фрагменты анти-CD79b антител могут экспрессироваться в E. coli и секретироваться из E. coli, что облегчает продуцирование этих фрагментов в большом количестве. Фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Альтернативно Fab'-SH-фрагменты могут быть непосредственно выделены из E. coli и химически связаны с образованием F(ab')-фрагментов (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)), либо они могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Анти-CD79b антителом может быть одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) (WO 93/16185; US 5571894; US 5587458). Фрагментом анти-CD79b антитела может быть также «линейное антитело» (US 5641870). Такие фрагменты линейных антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
Ниже описано, главным образом, продуцирование анти-CD79b антител путем культивирования клеток, трансформированных или трансфицированных вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-CD79b антитело. ДНК, кодирующая анти-CD79b антитела, может быть получена из библиотеки кДНК, выделенной из ткани, которая, как очевидно, содержит мРНК анти-CD79b антитела и экспрессирует ее на детектируемом уровне. В соответствии с этим, ДНК человеческого анти-CD79b антитела или полипептида CD79b обычно может быть получена из библиотеки кДНК, выделенной из человеческой ткани. Ген, кодирующий анти-CD79b антитело, может быть также получен из геномной библиотеки или с применением известных методов синтеза (например, автоматизированного синтеза нуклеиновых кислот).
Способы конструирования, отбора и получения препаратов согласно изобретению позволяют получать сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела, которые реагируют с электрофильной функциональной группой. Эти методы также позволяют получать соединения-конъюгаты антител, такие как соединения-конъюгаты «антитело-лекарственное средство» (ADC), с молекулами лекарственных средств в определенных, сконструированных селективных сайтах. Реакционноспособные цистеиновые остатки на поверхности антитела позволяют осуществлять специфическое конъюгирование молекулы лекарственного средства посредством реагирующей с тиолом группы, такой как малеимид или галогенацетил. Нуклеофильная реактивность тиоловых функциональных групп остатка Cys с малеимидной группой приблизительно в 1000 раз выше, чем реактивность любых других функциональных групп аминокислот в белке, таких как аминогруппа лизиновых остатков или N-концевая аминогруппа. Тиолоспецифическая функциональная группа в йодацетильных и малеимидных реагентах может реагировать с аминогруппами, но при более высоком рН (>9,0), и такая реакция занимает больше времени (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London). Количество свободного тиола в белке может быть оценено с помощью стандартного анализа Эллмана. Иммуноглобулин M является примером дисульфид-связанного пентамера, а иммуноглобулин G является примером белка с внутренними дисульфидными мостиками, связанными с субъединицами. В белках, таких как указанный белок, для продуцирования реакционноспособного свободного тиола необходимо восстановление дисульфидных связей под действием реагента, такого как дитиотреитол (DTT) или селен (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304:147-156). Такая процедура может приводить к потере третичной структуры антитела и специфичности связывания с антигеном.
Анализ PHESELECTOR (фаговый ELISA для отбора реакционноспособных тиолов) позволяет детектировать реакционноспособные цистеиновые группы в антителах в формате фагового ELISA, что облегчает конструирование антител на основе цистеина (Junutula, J.R. et al. (2008) J. Immunol Methods 332:41-52; WO 2006/034488; US 2007/0092940). На поверхности лунок наносят сконструированное на основе цистеина антитело, а затем инкубируют с фаговыми частицами и добавляют ПХ-меченное “второе” антитело с последующим определением оптической плотности. Мутантные белки, представленные на фаге, могут быть скринированы быстрым, надежным и высокоэффективным методом. Этим же самым методом могут быть получены библиотеки сконструированных на основе цистеина антител, которые могут быть подвергнуты селективному связыванию для идентификации включения соответствующих реактивных сайтов свободных Cys из рандомизированных фаговых библиотек белков антител или других белков. Этот метод включает проведение реакции цистеиновых мутантных белков, представленных на фаге, с аффинным реагентом или репортерной группой, которая также взаимодействует с тиолом.
2
Анализ PHESELECTOR позволяет осуществлять скрининг реакционноспособных тиоловых групп в антителах. В качестве примера может служит идентификация варианта А121С этим методом. Для идентификации большего числа вариантов тио-Fab с реакционноспособными тиоловыми группами может быть проведен эффективный поиск полноразмерной молекулы Fab. Для идентификации и количественной оценки доступности растворителя для аминокислотных остатков в полипептиде был использован такой параметр, как относительная доступность поверхности. Доступность поверхности может быть выражена как площадь поверхности (А), которая может контактировать с молекулой растворителя, например, с водой. Пространство, занятое водой, выражают приблизительно как сферу радиусом 1,4 Å. В пакете кристаллографических программ ССР4, которые являются либо бесплатными, либо требуют лицензионной оплаты (Компании по разработке программы CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA44AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825, или по интернету: www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html), используются алгоритмы для вычисления поверхностной доступности каждой аминокислоты белка с известными рентгеноструктурными кристаллографическими координатами ("The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. D50:760-763). Двумя репрезентативными программными модулями, с помощью которых проводят вычисления поверхностной доступности, являются программы "AREAIMOL" и "SURFACE", разработанные на основе алгоритмов B. Lee & F.M.Richards (1971) J.Mol. Biol. 55:379-400. Программа AREAIMOL позволяет определять доступность поверхности белка для растворителя, как точку центра сферы зонда (представляющего молекулу растворителя), когда эта точка «обкатывает» ван-дер-ваальсовскую поверхность белка. Программа AREAIMOL позволяет вычислять площадь поверхности, доступную для растворителя, путем генерирования точек поверхности на большой сфере вокруг каждого атома (на расстоянии от центра атома, равном сумме радиусов атома и зонда) и элиминации тех точек, которые находятся в эквивилентных сферах, ассоциированных с соседними атомами. Программа AREAIMOL позволяет определять доступную для растворителя площадь атомов в PDB-файле координат и систематизировать доступную площадь остатка, цепи и всей молекулы. Площади (или разности площадей), доступные для отдельных атомов, могут быть зарегистрированы в выходном псевдо-PDB-файле. Программа AREAIMOL использует только один радиус для каждого элемента и распознает только ограниченное число различных элементов.
Программы AREAIMOL и SURFACE позволяют достигать абсолютную доступность, то есть число ангстрем (Å) в квадрате. Относительную доступность поверхности вычисляют по сравнению с доступностью стандартного пептида с характерными аминокислотами в данном полипептиде. Стандартным пептидом является трипептид Gly-Х-Gly, где Х означает представляющую интерес аминокислоту, и данный стандартный пептид должен иметь “удлиненную” конформацию, то есть конформацию, подобную бета-цепям. Такая удлиненная конформация максимизирует доступность остатка Х. Вычисленную доступную площадь делят на доступную площадь для стандартного пептида в трипептиде Gly-Х-Gly и получают частное, которое представляет собой относительную доступность. Процент доступности представляет собой относительную доступность, умноженную на 100. Другой репрезентативный алгоритм для вычисления доступности поверхности основан на SOLV-модуле программы xsae (Broger, C, F. Hoffman-LaRoche, Basel), которая позволяет вычислять относительную доступность аминокислотного остатка для водной сферы, исходя из рентгенографических координат данного полипептида. Относительная доступность поверхности для каждой аминокислоты в антителе может быть вычислена с использованием данных о его кристаллической структуре (Eigenbrot et al. (1993) J MoI Biol. 229:969-995).
ДНК, кодирующая сконструированные на основе цистеина антитела, может быть легко выделена и секвенирована в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Гибридомные клетки служат в качестве источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или другие клетки-хозяева млекопитающих, такие как миеломные клетки (патент США 5807715; заявки на патент США 2005/0048572 и 2004/0229310), которые обычно не продуцируют белок антитела, в результате чего в этих рекомбинантных клетках-хозяевах синтезируются моноклональные антитела.
После конструирования и отбора сконструированные на основе цистеина антитела, например, тио-Fab, имеющие в высокой степени реакционноспособные неспаренные остатки Cys, а именно «свободные цистеиновые аминокислотные остатки», могут быть получены путем (i) экспрессии в бактериях, например, в E. coli-системе (Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262; Plückthun (1992) Immunol. Revs. 130:151-188) или в системе клеточной культуры млекопитающих (WO 01/00245), например, в клетках яичника китайского хомячка (СНО); и (ii) очистки стандартными методами очистки белка (Lowman et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988).
Тиоловые группы сконструированного Cys реагируют с электрофильными линкерными реагентами и с промежуточными соединениями «лекарственное средство-линкер» с образованием конъюгатов «сконструированное на основе цистеина антитело-лекарственное средство» и других меченых антител, сконструированных на основе цистеина. Остатки Cys, которые присутствуют в сконструированных на основе цистеина антителах и в родительских антителах, и которые спариваются и образуют межцепочечные и внутрицепочечные дисульфидные связи, не имеют каких-либо реакционноспособных тиоловых групп (если только они не обработаны восстановителем) и не реагируют с электрофильными линкерными реагентами или с промежуточными соединениями “лекарственное средство-линкер”. Только что введенный остаток Cys может оставаться неспаренным и может реагировать, то есть образовывать конъюгат с электрофильным линкерным реагентом или промежуточным соединением «лекарственное средство-линкер», таким как «лекарственное средство-малеимид». Репрезентативными промежуточными соединениями «лекарственное средство-линкер» является MC-MMAE, MC-MMAF, MC-vc-PAB-MMAE и MC-vc-PAB-MMAF. Структурные положения сконструированных остатков Cys в тяжелой и легкой цепях пронумерованы согласно системе последовательной нумерации. Такая система последовательной нумерации коррелирует с системой нумерации Кабата (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), начиная с N-конца, по сравнению со схемой нумерации по Кабату (нижний ряд), где вставки обозначены а,b,c. С использованием системы нумерации Кабата, фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее или большее число аминокислот вследствие укорочения или вставки в FR или CDR вариабельного домена. Сайты сконструированных на основе цистеина вариантов тяжелой цепи идентифицируют с применением схемы последовательной нумерации и схемы нумерации Кабата.
В одном из вариантов изобретения сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело получают способом, включающим:
(a) замену одного или нескольких аминокислотных остатков родительского анти-CD79b антитела цистеином; и
(b) определение реакционной способности тиоловых групп цистеина анти-CD79b антитела посредством реакции взаимодействия сконструированного на основе цистеина антитела с реагентом, реагирующим с тиолом.
Сконструированное на основе цистеина антитело может реагировать с реагентом, реагирующим с тиолом, лучше, чем родительское антитело.
Свободные цистеиновые аминокислотные остатки могут быть локализованы в тяжелых или легких цепях, или в константном или вариабельном доменах. Фрагменты антител, например Fab, могут быть также сконструированы путем замены одной или нескольких аминокислот фрагмента антитела одной или несколькими цистеиновыми аминокислотами, с образованием сконструированных на основе цистеина фрагментов антител.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу получения (создания) сконструированного на основе цистеина анти-CD79b антитела, где указанный способ включает:
(a) введение одной или нескольких цистеиновых аминокислот в родительское анти-CD79b антитело с получением сконструированного на основе цистеина анти-CD79b антитела; и
(b) определение способности тиоловой группы сконструированного на основе цистеина антитела реагировать с реагентом, реагирующим с тиолом;
где указанное сконструированное на основе цистеина антитело может реагировать с реагентом, реагирующим с тиолом, лучше, чем родительское антитело.
Стадия (a) способа получения сконструированного на основе цистеина антитела может включать:
(i) мутагенез последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сконструированное на основе цистеина антитело;
(ii) экспрессию сконструированного на основе цистеина антитела; и
(iii) выделение и очистку указанного сконструированного на основе цистеина антитела.
Стадия (b) способа получения сконструированного на основе цистеина антитела может включать экспрессию сконструированного на основе цистеина антитела на вирусной частице, выбранной из фага или фагмидной частицы.
Стадия (b) способа получения сконструированного на основе цистеина антитела может также включать:
(i) реакцию взаимодействия сконструированного на основе цистеина антитела с аффинным реагентом, реагирующим с тиолом, с получением аффинно меченного сконструированного на основе цистеина антитела; и
(ii) измерение уровня связывания аффинно меченного сконструированного на основе цистеина антитела со средой для захвата.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу скрининга сконструированных на основе цистеина антител, имеющих в высокой степени реакционноспособные неспаренные цистеиновые аминокислоты, на реакционную способность их тиоловых групп, где указанный способ включает:
(a) введение одной или нескольких цистеиновых аминокислот в родительское антитело с получением сконструированного на основе цистеина антитела;
(b) реакцию взаимодействия сконструированного на основе цистеина антитела с аффинным реагентом, реагирующим с тиолом, с получением аффинно меченного сконструированного на основе цистеина антитела;
(с) измерение уровня связывания аффинно меченного сконструированного на основе цистеина антитела со средой для захвата; и
(d) определение способности тиоловой группы сконструированного на основе цистеина антитела реагировать с реагентом, реагирующим с тиолом.
Стадия (a) способа скрининга сконструированных на основе цистеина антител может включать:
(i) мутагенез последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сконструированное на основе цистеина антитело;
(ii) экспрессию сконструированного на основе цистеина антитела; и
(iii) выделение и очистку указанного сконструированного на основе цистеина антитела.
Стадия (b) способа скрининга сконструированных на основе цистеина антител может включать экспрессию сконструированного на основе цистеина антител на вирусной частице, выбранной из фага или фагмидной частицы.
Стадия (b) способа скрининга сконструированного на основе цистеина антитела может также включать:
(i) реакцию взаимодействия сконструированного на основе цистеина антитела с аффинным реагентом, реагирующим с тиолом, с получением аффинно меченного сконструированного на основе цистеина антитела; и
(ii) измерение уровня связывания аффинно меченного сконструированного на основе цистеина антитела со средой для захвата.
b. Конструирование вариантов анти-CD79b IgG на основе цистеина
Цистеин был введен в положение 118 тяжелой цепи (в соответствии с Европейской системой нумерации) (эквивалентное положению 118 тяжелой цепи, последовательная нумерация) в полноразмерные химерные родительские моноклональные анти-CD79b антитела или в положение 205 легкой цепи (в соответствии с нумерацией по Кабату) (эквивалентное положению 209 легкой цепи, последовательная нумерация) в полноразмерные химерные родительские моноклональные анти-CD79b антитела методами введения цистеина, описанными в настоящей заявке.
Были получены нижеследующие сконструированные на основе цистеина антитела, содержащие цистеин в положении 118 тяжелой цепи (в соответствии с Европейской системой нумерации): (a) тио-MA79b.v17-HC(A118C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO: 228) и с последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO: 229), фигура 24; (b) тио-MA79b.v18-HC(A118C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO: 230) и с последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO: 231), фигура 25; (c) тио-MA79b.v28-HC(A118C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO: 232) и с последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO: 233), фигура 26; (d) тио-MA79b-HC(A118C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO: 236) и с последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO: 237), фигура 28; и (e) тио-анти-cynoCD79b-HC(A118C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO: 244) и с последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO: 245), фигура 48.
Были получены нижеследующие сконструированные на основе цистеина антитела, содержащие цистеин в положении 205 легкой цепи (в соответствии с нумерацией по Кабату): (a) тио-MA79b-LC(V205C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO: 234) и с последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO: 235), фигура 27, и (b) тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-LC(V205C) с последовательностью тяжелой цепи (SEQ ID NO: 299) и с последовательностью легкой цепи (SEQ ID NO: 300), фигура 49.
Эти сконструированные на основе цистеина моноклональные антитела были экспрессированы в клетках СНО (яичника китайского хомячка) путем временной ферментации в среде, содержащей 1 мМ цистеин.
В одном из вариантов изобретения гуманизированные сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела MA79b содержат одну или несколько нижеследующих последовательностей тяжелой цепи со свободной цистеиновой аминокислотой (SEQ ID NO: 251-259, таблица 2).
Таблица 2Сравнение последовательностей тяжелой цепи гуманизированных сконструированных на основе цистеина вариантов анти-CD79b антитела MA79b, пронумерованных в соответствии с последовательной системой нумерации, нумерацией по Кабату и Европейской системой нумерации
Последовательность
Последовательная нумерация
Нумерация по Кабату
Европейская система нумерации
SEQ ID NO:
EVQL<u>C</u>ESGGG
V5C
V5C
251
LRLSC<u>C</u>ASGYT
A23C
A23C
252
MNSLR<u>C</u>EDTAV
A88C
A84C
253
TLVTV<u>C</u>SASTK
S116C
S112C
254
VTVSS<u>C</u>STKGP
A118C
A114C
A118C
255
VSSAS<u>C</u>KGPSV
T120C
T116C
T120C
256
WYVDG<u>C</u>EVHNA
V282C
V278C
V282C
257
KGFYP<u>C</u>DIAVE
S375C
S371C
S375C
258
PPVLD<u>C</u>DGSFF
S400C
S396C
S400C
259
В одном из вариантов изобретения химерные сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела MA79b содержат одну или несколько нижеследующих последовательностей тяжелой цепи со свободной цистеиновой аминокислотой (SEQ ID NO: 260-268, таблица 3).
Таблица 3Сравнение последовательностей тяжелой цепи сконструированных на основе цистеина вариантов анти-CD79b антитела chMA79b, пронумерованных в соответствии с последовательной системой нумерации, нумерацией по Кабату и Европейской системой нумерации
Последовательность
Последовательная нумерация
Нумерация по Кабату
Европейская система нумерации
SEQ ID NO:
EVQL<u>C</u>QSGAE
Q5C
Q5C
260
VKISC<u>C</u>ATGYT
K23C
K23C
261
LSSLT<u>C</u>EDSAV
S88C
S84C
262
TSVTV<u>C</u>SASTK
S116C
S112C
263
VTVSS<u>C</u>STKGP
A118C
A114C
A118C
264
VSSAS<u>C</u>KGPSV
T120C
T116C
T120C
265
WYVDG<u>C</u>EVHNA
V282C
V278C
V282C
266
KGFYP<u>C</u>DIAVE
S375C
S371C
S375C
267
PPVLD<u>C</u>DGSFF
S400C
S396C
S400C
268
В одном из вариантов изобретения химерные сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела, а именно анти-cynoCD79b(ch10D10), содержат одну или несколько нижеследующих последовательностей тяжелой цепи со свободной цистеиновой аминокислотой (SEQ ID NO: 269-277, таблица 4).
Таблица 4Сравнение последовательностей тяжелой цепи сконструированных на основе цистеина вариантов анти-CD79b антитела, анти-cynoCD79b(ch10D10), пронумерованных в соответствии с последовательной системой нумерации, нумерацией по Кабату и Европейской системой нумерации
Последовательность
Последовательная нумерация
Нумерация по Кабату
Европейская система нумерации
SEQ ID NO:
EVQL<u>C</u>ESGPG
Q5C
Q5C
269
LSLTC<u>C</u>VTGYS
T23C
T23C
270
LNSVT<u>C</u>EDTAT
S88C
S84C
271
TTLTV<u>C</u>SASTK
S111C
S112C
272
LTVSS<u>C</u>STKGP
A113C
A114C
A118C
273
VSSAS<u>C</u>KGPSV
T115C
T116C
T120C
274
WYVDG<u>C</u>EVHNA
V282C
V278C
V282C
275
KGFYP<u>C</u>DIAVE
S370C
S371C
S375C
276
PPVLD<u>C</u>DGSFF
S395C
S396C
S400C
277
В одном из вариантов изобретения гуманизированные сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела MA79b содержат одну или несколько нижеследующих последовательностей легкой цепи со свободной цистеиновой аминокислотой (SEQ ID NO: 278-284, таблица 5).
Таблица 5Сравнение последовательностей легкой цепи гуманизированных сконструированных на основе цистеина вариантов анти-CD79b антитела MA79b, пронумерованных в соответствии с последовательной системой нумерации и нумерацией по Кабату
Последовательность
Последовательная нумерация
Нумерация по Кабату
SEQ ID NO:
SLSAS<u>C</u>GDRVT
V15C
V15C
278
EIKRT<u>C</u>AAPSV
V114C
V110C
279
TVAAP<u>C</u>VFIFP
S118C
S114C
280
FIFPP<u>C</u>DEQLK
S125C
S121C
281
DEQLK<u>C</u>GTASV
S131C
S127C
282
VTEQD<u>C</u>KDSTY
S172C
S168C
283
GLSSP<u>C</u>TKSFN
V209C
V205C
284
В одном из вариантов изобретения химерные сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела MA79b содержат одну или несколько нижеследующих последовательностей легкой цепи со свободной цистеиновой аминокислотой (SEQ ID NO: 285-291, таблица 6).
Таблица 6Сравнение последовательностей легкой цепи химерных сконструированных на основе цистеина вариантов анти-CD79b антитела MA79b, пронумерованных в соответствии с последовательной системой нумерации и нумерацией по Кабату
Последовательность
Последовательная нумерация
Нумерация по Кабату
SEQ ID NO:
SLAVS<u>C</u>GQRAT
L15C
L15C
285
ELKRT<u>C</u>AAPSV
V114C
V110C
286
TVAAP<u>C</u>VFIFP
S118C
S114C
287
FIFPP<u>C</u>DEQLK
S125C
S121C
288
DEQLK<u>C</u>GTASV
S131C
S127C
289
VTEQD<u>C</u>KDSTY
S172C
S168C
290
GLSSP<u>C</u>TKSFN
V209C
V205C
291
В одном из вариантов изобретения сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела, а именно анти-cynoCD79b(ch10D10), содержат одну или несколько нижеследующих последовательностей легкой цепи со свободной цистеиновой аминокислотой (SEQ ID NO: 292-298, таблица 7).
Таблица 7Сравнение последовательностей легкой цепи сконструированных на основе цистеина вариантов анти-CD79b антитела, анти-cynoCD79b(ch10D10), пронумерованных в соответствии с последовательной системой нумерации и нумерацией по Кабату
Последовательность
Последовательная нумерация
Нумерация по Кабату
SEQ ID NO:
SLAVS<u>C</u>GQRAT
L15C
L15C
292
EIKRT<u>C</u>AAPSV
V114C
V110C
293
TVAAP<u>C</u>VFIFP
S118C
S114C
294
FIFPP<u>C</u>DEQLK
S125C
S121C
295
DEQLK<u>C</u>GTASV
S131C
S127C
296
VTEQD<u>C</u>KDSTY
S172C
S168C
297
GLSSP<u>C</u>TKSFN
V209C
V205C
298
c. Меченые и сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела
Сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела могут быть сайт-специфически и эффективно присоединены к реагенту, реагирующему с тиолом. Реагентом, реагирующим с тиолом, может быть многофункциональный линкерный реагент для захвата, то есть реагент, используемый в качестве аффинной метки (например, реагент «биотин-линкер»), детектируемая метка (например, реагент флуорофор), реагент для иммобилизации на твердой фазе (например, SEPHAROSE™, полистирол или стекло) или промежуточное соединение «лекарственное средство-линкер». Одним из примеров реагента, реагирующего с тиолом, является N-этилмалеимид (NEM). В репрезентативном варианте изобретения, в результате реакции взаимодействия тио-Fab с реагентом «биотин-линкер» образуется биотинилированный тио-Fab, посредством которого могут быть детектированы и определены присутствие и реакционная способность введенного цистеинового остатка. В результате реакции взаимодействия тио-Fab с многофункциональным линкерным реагентом образуется тио-Fab с функциональным линкером, который может также реагировать с молекулой лекарственного средства или другой меткой. В результате реакции взаимодействия тио-Fab с промежуточным соединением «лекарственное средство-линкер» образуется конъюгат «тио-Fab-лекарственное средство».
Описанные здесь репрезентативные способы могут быть применены в основном для идентификации и продуцирования антител, а в основном других белков, путем проведения описанных здесь стадий конструирования и скрининга.
Такой способ может быть применен для конъюгирования других реагирующих с тиолом реагентов, в которых реакционноспособной группой является, например, малеимид, йодацетамид, пиридилдисульфид или другой реагирующий с тиолом партнер по конъюгированию (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). Реагентом, реагирующим с тиолом, может быть молекула лекарственного средства, флуорофор, такой как флуоресцентный краситель, подобный флуоресцеину или родамину, хелатообразующий агент для визуализации или радиоактивный металл, применяемый в терапии, пептидильная или непептидильная метка, или детектируемая метка, либо агент, модифицирующий клиренс, такой как различные изомеры полиэтиленгликоля, пептид, связывающийся с третьим компонентом, или другой углевод или липофильный агент.
d. Применение сконструированных на основе цистеина анти-CD79b антител
Сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела и их конъюгаты могут быть использованы в качестве терапевтических и/или диагностических средств. Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, лечения, терапии или ослабления одного или нескольких симптомов, ассоциированных с В-клеточно-опосредуемым расстройством. В частности, настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, лечения, терапии или ослабления одного или нескольких симптомов, ассоциированных с клеточно-пролиферативным расстройством, таким как рак, например лимфома, неходжкинская лимфома (НХЛ), агрессивная НХЛ, рецидивирующая агрессивная НХЛ, рецидивирующая бессимптомная НХЛ, не поддающаяся лечению НХЛ, не поддающаяся лечению бессимптомная НХЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, лейкоз, ретикулоэндотелиоз (РЭ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и лимфома клеток коры головного мозга. Настоящее изобретение также относится к способам диагностики CD79b-опосредуемого расстройства или предрасположенности к развитию такого расстройства, а также к способам идентификации антител и антигенсвязывающих фрагментов антител, которые преимущественно связываются с В-клеточно-ассоциированными полипептидами CD79b.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к применению сконструированного на основе цистеина анти-CD79b антитела в целях приготовления лекарственного препарата для лечения состояния, которое является восприимчивым к В-клеточно-опосредуемому расстройству.
e. Конъюгаты «сконструированное на основе цистеина антитело-лекарственное средство» (конъюгаты «тио-антитело-лекарственное средство» (TDC))
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к соединению-конъюгату «антитело-лекарственное средство», содержащему сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело (Ab) и молекулу ауристатинового лекарственного средства (D), где указанное сконструированное на основе цистеина антитело связано с D линкерной молекулой (L) посредством одной или нескольких свободных цистеиновых аминокислот, где указанное соединение имеет формулу I:
Ab-(L-D)p
I,
где p равно 1, 2, 3 или 4; и где сконструированное на основе цистеина антитело получают способом, включающим замену одного или нескольких аминокислотных остатков родительского анти-CD79b антитела одной или несколькими свободными цистеиновыми аминокислотами.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей смесь соединений «антитело-лекарственное средство» формулы I, где средняя загрузка лекарственного средства на антитело составляет примерно от 2 до 5 или примерно от 3 до 4.
На фигурах 24-28 и 48-49 представлены варианты конъюгатов «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство» (ADC), где молекула ауристатинового лекарственного средства присоединена к введенной цистеиновой группе в легкой цепи (LC-ADC) или в тяжелой цепи (HC-ADC).
Возможными преимуществами конъюгатов «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство» являются повышенная безопасность (более высокий терапевтический индекс); улучшенные фармакокинетические параметры; сохранение межцепочечных дисульфидных связей антитела, которые могут стабилизировать конъюгат и поддерживать его конформацию, способствующую активному связыванию; возможность идентификации сайтов конъюгирования лекарственного средства; и возможность получения конъюгатов «сконструированное на основе цистеина антитело-лекарственное средство» в результате реакции конъюгирования сконструированных на основе цистеина антител с реагентами «лекарственное средство-линкер», которая приводит к образованию более гомогенного продукта.
Линкеры
«Линкер», «линкерный компонент» или «связь» означает химическую группу, содержащую ковалентную связь или цепь атомов, которые ковалентно связывают антитело с молекулой лекарственного средства. В различных вариантах изобретения линкер обозначен L. “Линкер” (L) представляет собой бифункциональную или мультифункциональную молекулу, которая может быть использована для связывания одной или нескольких молекул лекарственного средства (D) и молекулы антитела (Ab) с образованием конъюгатов “антитело-лекарственное средство” (ADC) формулы I. Конъюгаты “антитело-лекарственное средство” (ADC) обычно получают с использованием линкера, имеющего реакционноспособную функциональную группу для связывания с лекарственным средством и с антителом. Тиол цистеина, введенного в антитело (Ab), может образовывать связь с электрофильной функциональной группой линкерного реагента, молекулы лекарственного средства или промежуточного соединения «лекарственное средство-линкер».
В одном из аспектов изобретения линкер имеет реакционноспособный сайт, содержащий электрофильную группу, реагирующую с нуклеофильным цистеином, присутствующим на антителе. Тиол цистеина указанного антитела реагирует с электрофильной группой на линкере и образует ковалентную связь с этим линкером. Подходящими электрофильными группами являются, но не ограничиваются ими, малеимидные и галогенацетамидные группы.
2
n
2
n
Линкерами являются двухвалентный радикал, такой как алкилдиил, арилен, гетероарилен, молекулы, такие как: -(CR)O(CR)-, повторяющиеся звенья арилокси (например, полиэтиленокси, ПЭГ, полиметиленокси) и алкиламино (например, полиэтиленамино, Jeffamine™); и сложный эфир двухосновной кислоты, а также амиды, включая сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат и капроамид.
Сконструированные на основе цистеина антитела подвергают реакции взаимодействия с линкерными реагентами или с промежуточными соединениями «лекарственное средство-линкер», электрофильными функциональными группами, такими как малеимид или α-галогенкарбонил, в соответствии с методами конъюгирования, описанными на странице 766 публикации Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, и в соответствии с протоколом, описанным в примере 6.
2
2
Линкер может состоять из одного или более линкерных компонентов. Репрезентативными линкерными компонентами являются 6-малеимидокапроил («MC»), малеимидопропаноил («MP»), валин-цитруллин («val-cit» или «vc»), аланин-фенилаланин («ala-phe» или «af»), п-аминобензилоксикарбонил («PAB»), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат («SPP»), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат («SMCC»), N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоат («SIAB»), этиленокси-CHCHO- в качестве одного или нескольких повторяющихся элементов («ЕО» или «PEO»). Специалистам известны и другие линкерные компоненты, некоторые из которых описаны в настоящей заявке.
В одном из вариантов изобретения линкер L в ADC имеет формулу:
w
y
-Aa-W-Y-,
где: А представляет собой удлиняющий компонент, ковалентно связанный с тиолом цистеина антитела (Ab);
а равно 0 или 1;
каждый -W- независимо представляет собой аминокислоту,
w независимо представляет собой целое число от 0 до 12,
Y означает спейсерный компонент, ковалентно связанный с молекулой лекарственного средства; и
у равно 0, 1 или 2.
Удлиняющий компонент
17
b
b
b
b
b
b
b
2
r
3
8
2
r
2
r
2
r
2
r
3
8
3
8
2
r
3
8
2
r
3
8
3
8
2
r
2
r
2
r
2
2
r
2
2
r
2
2
r
2
2
r
2
r
2
2
r
2
2
2
r
2
2
r
2
2
r
2
2
r
2
2
2
r
2
r
1
6
Удлиняющий компонент (-А-), если он присутствует, способен связывать антитело с аминокислотой (-W-). В этом случае антитело (Ab) имеет функциональую группу, которая может образовывать связь с функциональной группой удлиняющего компонента. Подходящими функциональными группами, которые могут присутствовать на антителе и которые могут быть либо природными, либо химически синтезированными, являются, но не ограничиваются ими, сульфгидрил (-SH), амино, гидроксил, карбокси, аномерная гидроксильная группа углевода и карбоксил. В одном аспекте изобретения функциональными группами антитела являются сульфгидрил или амино. Сульфгидрильные группы могут образовываться путем восстановления внутримолекулярной дисульфидной связи антитела. Альтернативно сульфгидрильные группы могут образовываться посредством взаимодействия аминогруппы лизиновой молекулы антитела в присутствии 2-иминотиолана (реагента Траута) или другого сульфгидрил-образующего реагента. В одном из вариантов изобретения антитело (Ab) имеет свободную тиоловую группу цистеина, которая может образовывать связь с электрофильной функциональной группой удлиняющего компонента. Репрезентативные удлиняющие компоненты в конъюгатах формулы I представлены формулами II и III, где Ab-, -W-, -Y-, -D, w и y определены выше, а R представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из -(СН), С-Скарбоциклила, -О-(СН), арилена, (СН)-арилена, арилен-(СН), (СН)-(С-С-карбоциклила), -(С-С-карбоциклил)-(СН)-, С-С-гетероциклила, (СН)-(С-С-гетероциклила), (С-С-гетероциклил)-(СН)-, -(СН)C(О)NR(СН), -(СНСНО)-, -(СНСНО)-СН-, -(СН)C(О)NR(СНСНО), -(СН)C(О)NR(СНСНО)-СН, -(СНСНО)C(О)NR(СНСНО)-, -(СНСНО)C(О)NR(СНСНО)-СН- и -(СНСНО)C(О)NR(СН), где R представляет собой H, С-Салкил, фенил или бензил, а r независимо представляет собой целое число 1-10.
Ариленами являются двухвалентные ароматические углеводородные радикалы с 6-20 атомами углерода, полученные путем удаления двух атомов водорода из исходной ароматической циклической системы. Типичными ариленовыми группами являются, но не ограничиваются ими, радикалы, происходящие от бензола, замещенного бензола, нафталина, антрацена, бифенила и т.п.
Гетероциклические группы включают кольцевую систему, в которой один или несколько атомов на кольце представляют собой гетероатом, например атом азота, кислорода и серы. Гетероциклический радикал включает 1-20 атомов углерода и 1-3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S. Гетероцикл может представлять собой моноцикл, имеющий 3-7 атомов на кольце (2-6 атомов углерода и 1-3 гетероатомов, выбранных из N, O, P и S), или бицикл, имеющий 7-10 атомов на кольце (4-9 атомов углерода и 1-3 гетероатомов, выбранных из N, О, Р и S), например, бицикло [4,5]-, [5,5]-, [5,6]- или [6,6]-систему. Гетероциклы описаны в публикациях Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), в частности, в главах 1, 3, 4, 6, 7 и 9; в публикации "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950, с исправлениями), в частности, в томах 13, 14, 16, 19 и 28; и в публикации J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Примерами гетероциклов являются, например, но не ограничиваются ими, пиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридил (пиперидил), тиазолил, тетрагидротиофенил, окисленный серой тетрагидротиофенил, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тетразолил, бензофуранил, тианафталенил, индолил, индоленил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, пиперидинил, 4-пиперидонил, пирролидинил, 2-пирролидонил, пирролинил, тетрагидрофуранил, бис-тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, бис-тетрагидропиранил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, декагидрохинолинил, октагидроизохинолинил, азоцинил, триазинил, 6H-l,2,5-тиадиазинил, 2H,6H-l,5,2-дитиазинил, тиенил, тиантренил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксантинил, 2Н-пирролил, изотиазолил, изоксазолил, пиразинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3Н-индолил, 1Н-индазолил, пуринил, 4Н-хинолизинил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, птеридинил, 4Ah-карбазолил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, пиримидинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, фуразанил, феноксазинил, изохроманил, хроманил, имидазолидинил, имидазолинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиперазинил, индолинил, изоиндолинил, хинуклидинил, морфолинил, оксазолидинил, бензотриазолил, бензизоксазолил, оксиндолил, бензоксазолинил и изатиноил.
Карбоциклические группы включают насыщенное или ненасыщенное кольцо, имеющее от 3 до 7 атомов углерода в качестве моноцикла, или от 7 до 12 атомов углерода в качестве бицикла. Моноциклические карбоциклы имеют от 3 до 6 атомов на кольце, а обычно 5 или 6 атомов на кольце. Бициклические карбоциклы имеют от 7 до 12 атомов на кольце, например, расположенных в виде бицикло-[4,5]-, [5,5]-, [5,6]- или [6,6]-системы, или 9 или 10 атомов на кольце, расположенных в виде бицикло-[5,6]- или [6,6]- системы. Примерами моноциклических карбоциклов являются циклопропил, циклобутил, циклопентил, 1-циклопент-l-енил, l-циклопент-2-енил, l-циклопент-3-енил, циклогексил, 1-циклогекс-l-енил, l-циклогекс-2-енил, l-циклогекс-3-енил, циклогептил и циклооктил.
Следует отметить, что во всех репрезентативных вариантах ADC формулы I, таких как соединения II-VI, даже если они не указаны конкретно, от 1 до 4 молекул лекарственного средства связаны с антителом (р=1-4), в зависимости от числа введенных цистеиновых остатков.
17
2
5
Репрезентативным удлиняющим компонентом является компонент формулы II, происходящий от малеимидо-капроила (МС), где R представляет собой (СН)-:
17
2
2
Репрезентативным удлиняющим компонентом является компонент формулы II, происходящий от малеимидо-пропаноила (МР), где R представляет собой (СН)-:
17
2
2
r
2
Другим репрезентативным удлиняющим компонентом является компонент формулы II, где R представляет собой -(СНСНО)-СН-, а r равно 2:
17
b
b
2
r
2
2
r
2
Другим репрезентативным удлиняющим компонентом является компонент формулы II, где R представляет собой -(СН)C(О)NR(СНСНО)-СН-, где R представляет собой Н, а каждый из r равен 2:
17
2
5
Другим репрезентативным удлиняющим компонентом является компонент формулы III, где R представляет собой -(СН)-:
17
В другом варианте изобретения указанный удлиняющий компонент связан со сконструированным на основе цистеина анти-CD79b антителом посредством дисульфидной связи, находящейся между атомом серы цистеина антитела и атомом серы удлиняющего компонента. Репрезентативный удлиняющий компонент данного варианта изобретения показан в формуле IV, где R, Ab-, -W-, -Y-, -D, w и y определены выше.
17
В еще одном варианте изобретения реакционноспособная группа удлиняющего компонента содержит реагирующую с тиолом функциональную группу, которая может образовывать связь со свободным тиолом цистеина антитела. Примерами реагирующих с тиолом функциональных групп являются, но не ограничиваются ими, малеимид, α-галогенацетил, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидоэфиры, 4-нитрофениловые эфиры, пентафторфениловые эфиры, тетрафторфениловые эфиры, ангидриды, хлорангидриды, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. Репрезентативные удлиняющие компоненты данного варианта изобретения показаны в формулах Va и Vb, где R, Ab-, -W-, -Y-, -D, w и y определены выше.
В другом варианте изобретения указанным линкером может быть линкер дендритного типа для ковалентного связывания более чем одной молекулы лекарственного средства с антителом посредством ветвящейся многофункциональной линкерной молекулы (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Дендритные линкеры могут повышать молярное отношение лекарственного средства к антителу, т.е. при загрузке, которая соответствует эффективности ADC. Таким образом, если сконструированное на основе цистеина антитело имеет только одну реакционноспособную тиоловую группу цистеина, то множество молекул лекарственного средства могут быть ковалентно связаны посредством дендритного линкера.
Аминокислотный компонент
Линкер может содержать аминокислотные остатки. Аминокислотный компонент (-Ww-), если он присутствует, связывает антитело (Ab) с молекулой лекарственного средства (D) сконструированного на основе цистеина конъюгата «антитело-лекарственное средство» (ADC) согласно изобретению.
-Ww- представляет собой дипептидный, трипептидный, тетрапептидный, пентапептидный, гексапептидный, гептапептидный, октапептидный, нонапептидный, декапептидный, ундекапептидный или додекапептидный компонент. Аминокислотными остатками, составляющими указанный аминокислотный компонент, являются природные остатки, а также небольшие аминокислоты, и неприродные аминокислотные аналоги, такие как цитруллин. Каждый из компонентов -W- независимо имеет формулу, представленную ниже в квадратных скобках, а w означает целое число от 0 до 12:
,
19
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
3
2
3
2
4
2
2
4
2
4
3
2
4
2
3
2
2
4
2
2
2
2
2
где R представляет собой водород, метил, изопропил, изобутил, втор-бутил, бензил, п-гидроксибензил, -СНОН, -СН(ОН)СН, -CHCHSCH, -CHCONH, -СНСООН, -CHCHCONH, -СНСНСООН, -(СН)NHC(=NH)NH, -(СН)NH, -(СН)NHCOCH, -(СН)NHCHO, -(СН)NHC(=NH)NH, -(СН)NH, -(СН2)NHCOCH, -(СН)NHCHO, -(СН)NHCONH, -(СН)NHCONH, -СНСНСН(ОН)CHNH, 2-пиридилметил, 3-пиридилметил, 4-пиридилметил, фенил, циклогексил,
19
19
19
Если R не является водородом, то атом углерода, к которому присоединен R, является хиральным. Каждый атом углерода, к которому присоединен R, независимо присутствует в (S)- или (R)-конфигурации, или в виде рацемической смеси. Таким образом, аминокислотные компоненты могут быть энантиомерно чистыми, рацемическими или диастереомерными.
Примерами аминокислотных компонентов -Ww- являются дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Примерами дипептидов являются валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe). Примерами трипептидов являются глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотными остатками, составляющими линкерный компонент, являются природные аминокислотные остатки, а также небольшие аминокислоты и неприродные аминокислотные аналоги, такие как цитруллин.
Аминокислотный компонент может быть ферментативно расщеплен одним или несколькими ферментами, включая опухолеассоциированную протеазу, с высвобождением молекулы лекарственного средства (D), которая, в одном из вариантов изобретения, после высвобождения подвергается протонированию in vivo с образованием лекарственного средства (D). Аминокислотные линкерные компоненты могут быть сконструированы и оптимизированы по их селективности к ферментативному расщеплению конкретными ферментами, такими как, например, опухолеассоциированная протеаза, катепсин В, С и D, или плазминовая протеаза.
Спейсерный компонент
Спейсерный компонент (-Y-), если он присутствует (y=1 или 2), связывает аминокислотный компонент (-Ww-) c молекулой лекарственного средства (D), если такой аминокислотный компонент присутствует (w=1-12). Альтернативно, если такой аминокислотный компонент отсутствует, то указанный спейсерный компонент связывает удлиняющий компонент с молекулой лекарственного средства. Если отсутствуют аминокислотный компонент и удлиняющий компонент (w, y=0), то указанный спейсерный компонент также связывает молекулу лекарственного средства с молекулой антитела. Спейсерными компонентами являются компоненты двух общих типов: самоэлиминирующиеся и несамоэлиминирующиеся. Несамоэлиминирующийся спейсерный компонент представляет собой компонент, где часть спейсерного компонента или весь этот компонент остаются связанными с молекулой лекарственного средства после отщепления, а в частности, ферментативного отщепления аминокислотного компонента от конъюгата “антитело-лекарственное средство” или от конъюгата “лекарственное средство-линкер”. Если ADC, содержащий глицин-глициновый спейсерный компонент или глициновый спейсерный компонент, подвергаются ферментативному расщеплению протеазой, ассоциированной с опухолевыми клетками, протеазой, ассоциированной с раковыми клетками, или протеазой, ассоциированной с лимфоцитами, то молекула «глицин-глицин-лекарственное средство» или молекула «глицин-лекарственное средство» отщепляется от Ab-Aa-Ww. В одном из вариантов изобретения независимая реакция гидролиза происходит в клетках-мишенях и приводит к расщеплению связи в молекуле глицин-лекарственное средство с высвобождением лекарственного средства.
1
8
1
8
В другом варианте изобретения -Yy- представляет собой п-аминобензилкарбамоиловый компонент (РАВ), фениленовая часть которого замещена Qm, где Q представляет собой -С-Салкил, -О-(С-Салкил), галоген, нитро или циано, а m равно целому числу от 0 от 4.
Репрезентативными вариантами несамоэлиминирующихся спейсерных компонентов (-Y-) являются -Gly-Gly-; -GIy-; -AIa- Phe-; -Val-Cit-.
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к конъюгату “лекарственное средство-линкер” или ADC, в которых отсутствует спейсерный компонент (y=0), или к их фармацевтически приемлемой соли или сольвату.
Альтернативно ADC, содержащий самоэлиминирующийся спейсерный компонент, может высвобождать молекулу D. В одном из вариантов изобретения -Y- представляет собой группу PAB, которая связана с -Ww- посредством атома азота аминогруппы PAB, и непосредственно связана с молекулой -D через карбонатную, карбаматную или эфирную группу, где ADC имеет нижеследующую репрезентативную структуру:
,
1
8
1
8
где Q представляет собой С-Салкил, О-(С-Салкил), галоген, нитро или циано; m равно целому числу от 0 до 4; а p равно 1-4.
Другими примерами самоэлиминирующихся спейсеров являются, но не ограничиваются ими, ароматические соединения, которые по своим электронным свойствам, аналогичны группе РАВ, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), гетероциклические аналоги РАВ (US 2005/0256030), бета-глюкуронид (WO 2007/011968) и орто- или пара-аминобензилацетали. Могут быть использованы спейсеры, которые подвергаются циклизации после гидролиза амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223), соответствующим образом замещенные кольцевые бицикло[2.2.1]- и бицикло[2.2.2]-системы (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867). Примерами самоэлиминирующихся спейсеров, используемых в ADC, являются аминосодержащие лекарственные средства, замещенные в положении глицина (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
Репрезентативные спейсерные компоненты (-Yy-) представлены формулами Х-XII:
Дендритные линкеры
В другом варианте изобретения линкером L может быть линкер дендритного типа, используемый для ковалентного связывания более чем одной молекулы лекарственного средства с антителом посредством ветвящейся многофункциональной линкерной молекулы (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Дендритные линкеры могут повышать молярное отношение лекарственного средства к антителу, то есть нагрузку, которая соответствует эффективности ADC. Таким образом, если сконструированное на основе цистеина антитело содержит только одну реакционноспособную тиоловую группу цистеина, то посредством дендритного линкера может быть присоединено большое количество молекул лекарственного средства. Репрезентативными вариантами разветвленных дендритных линкеров являются дендримерные компоненты, такие как 2,6-бис(гидроксиметил)-п-крезол и 2,4,6-трис(гидроксиметил)-фенол (WO 2004/01993; Szalai et al. (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al. (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499).
В одном из вариантов изобретения спейсерным компонентом является разветвленный бис(гидроксиметил)стирол (BHMS), который может быть использован для введения и высвобождения множества лекарственных средств, и имеет структуру:
,
1
8
1
8
содержащую 2-(4-аминобензилиден)пропан-1,3-диоловый дендримерный компонент (WO 2004/043493; de Groot et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494), где Q представляет собой -С-Салкил, -О-(С-Салкил), галоген, нитро или циано; m равно целому числу от 0 до 4, n равно 0 или 1; а р равно 1-4.
Репрезентативными вариантами соединений-конъюгатов “антитело-лекарственное средство” формулы I являются соединения XIIIa (МС), XIIIb (val-cit), XIIIc (MC-val-cit) и XIIId (MC-val-cit-PAB):
Другими репрезентативными вариантами соединений-конъюгатов “антитело-лекарственное средство” формулы Ia являются соединения XIVa-e:
,
где Х представляет собой:
Y представляет собой:
1
6
а R независимо представляет собой Н или С-Салкил, и n равно 1-12.
В другом варианте изобретения линкер имеет реакционноспособную функциональную группу, которая содержит нуклеофильную группу, реагирующую с электрофильной группой, присутствующей на антителе. Подходящими электрофильными группами, присутствующими на антителе, являются, но не ограничиваются ими, карбонильные группы альдегида и кетона. Гетероатом нуклеофильной группы линкера может реагировать с электрофильной группой на антителе и образовывать ковалентную связь с молекулой антитела. Подходящими нуклеофильными группами на линкере являются, но не ограничиваются ими, гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, карбоксилат гидразина и арилгидразид. Электрофильная группа на антителе обеспечивает подходящий сайт для присоединения к линкеру.
Обычно пептидоподобные линкеры могут быть получены путем образования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи могут быть образованы, например, методом синтеза в растворе (E. Schroder & K. Lubke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press), хорошо известным специалистам в области пептидной химии. Линкерные промежуточные соединения могут быть получены с помощью любых комбинаций или последовательностей реакций, в которых участвуют спейсерные, удлиняющие и аминокислотные компоненты. Такие спейсерные, удлиняющие и аминокислотные компоненты могут содержать реакционноспособные функциональные группы, которые по своей природе являются электрофильными, нуклеофильными или свободно-радикальными. Реакционноспособными функциональными группами являются, но не ограничиваются ими, карбоксилы, гидроксилы, пара-нитрофенилкарбонат, изотиоцианат и уходящие группы, такие как О-мезил, О-тозил, -Cl, -Br, -I или малеимид.
3
Так, например, заряженный заместитель, такой как сульфонат (-SO-) или аммоний, может повышать растворимость реагентов в воде и облегчать реакцию взаимодействия линкерного реагента с антителом или с лекарственным средством, либо облегчать реакцию взаимодействия Ab-L (промежуточного соединения “антитело-линкер”) с молекулой D, либо D-L (промежуточного соединения “лекарственное средство-линкер”) с Ab, в зависимости от способа синтеза, применяемого для получения ADC.
Линкерные реагенты
Конъюгаты антитела и ауристатина могут быть получены с использованием различных бифункциональных линкерных реагентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат-HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).
2
3
Конъюгаты «антитело-лекарственное средство» могут быть также получены с использованием линкерных реагентов: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоата), и с использованием бис-малеимидных реагентов: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-бис-малеимидодиэтиленгликоля (BM(PEO)), и 1,11-бис-малеимидотриэтиленгликоля (BM(PEO)), которые являются коммерчески доступными и поставляются компанией Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, и другими поставщиками реагентов. Бис-малеимидные реагенты позволяют последовательно или одновременно присоединять тиоловую группу цистеинового антитела к тиол-содержащей молекуле лекарственного средства, к метке или к линкерному промежуточному соединению. Помимо малеимида, другими функциональными группами, которые реагируют с тиоловой группой цистеинового антитела, молекулой лекарственного средства, меткой или промежуточным линкерным соединением, являются йодацетамид, бромацетамид, винилпиридин, дисульфид, пиридилдисульфид, изоцианат и изотиоцианат.
Подходящие линкерные реагенты могут быть также получены из других коммерческих источников, таких как Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), либо они могут быть синтезированы в соответствии с процедурами, описанными Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; в патенте США 6214345; в WO 02/088172; патентных заявках США 2003130189 и 2003096743; в WO 03/026577; WO 03/043583 и WO 04/032828.
Удлиняющие компоненты формулы (IIIa) могут быть введены в линкер посредством реакции взаимодействия нижеследующих линкерных реагентов с N-концом аминокислотного компонента:
,
3
где n равно целому числу от 1 до 10, а T представляет собой -H или -SONa;
,
где n равно целому числу от 0 до 3;
Удлиняющие компоненты могут быть введены в линкер посредством реакции взаимодействия нижеследующих бифункциональных реагентов с N-концом аминокислотного компонента:
,
где Х представляет собой Br или I.
Удлиняющие компоненты указанной формулы могут быть также введены в линкер посредством реакции взаимодействия нижеследующих бифункциональных реагентов с N-концом аминокислотного компонента:
Репрезентативный дипептидный линкерный реагент валин-цитруллин (val-cit или vc), включающий малеимидный удлиняющий компонент и пара-аминобензилкарбамоильный (PAB) самоэлиминирующийся спейсер, имеет структуру:
Репрезентативный phe-lys(Mtr,моно-4-метокситритил)-дипептидный линкерный реагент, включающий малеимидный удлиняющий компонент и самоэлиминирующийся спейсерный компонент РАВ, может быть получен, как описано в работе Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60, и имеет структуру:
Получение конъюгатов «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство»
ADC формулы I могут быть получены несколькими способами с применением реакций органического синтеза, условий и реагентов, известных специалистам, включая: (1) реакцию взаимодействия цистеиновой группы сконструированного на основе цистеина антитела с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения “антитело-линкер” Ab-L посредством ковалентной связи, и последующую реакцию взаимодействия с активированной молекулой лекарственного средства D; и (2) реакцию взаимодействия нуклеофильной группы молекулы лекарственного средства с линкерным реагентом с образованием промежуточного соединения “лекарственное средство-линкер” D-L посредством ковалентной связи, и последующую реакцию взаимодействия с цистеиновой группой антитела, сконструированного на основе цистеина. В методах конъюгирования (1) и (2) для получения конъюгатов “антитело-лекарственное средство” формулы I могут быть использованы различные сконструированные на основе цистеина антитела, молекулы лекарственного средства и линкеры.
Тиоловые группы цистеина антитела являются нуклеофильными и обладают способностью взаимодействовать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных реагентах и на промежуточных соединениях “лекарственное средство-линкер”, включая (i) активные сложные эфиры, такие как NHS-эфиры, HOBt-эфиры, галогенформиаты и галогенангидриды; (ii) алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; (iii) альдегидные, кетоновые, карбоксильные и малеимидные группы; и (iv) дисульфиды, включая пиридилдисульфиды, образующиеся в результате сульфидного обмена. Нуклеофильными группами на молекуле лекарственного средства являются, но не ограничиваются ими, аминовые, тиоловые, гидроксильные, гидразидные, оксимные, гидразиновые, тиосемикарбазоновые, гидразинкарбоксилатные и арилгидразидные группы, способные реагировать с электрофильными группами на линкерных частях и линкерных реагентах с образованием ковалентных связей.
4
Сконструированные на основе цистеина антитела, способные образовывать конъюгаты с линкерными реагентами, могут быть получены путем обработки восстановителем, таким как DTT (реагент Клиланда, дитиотреитол) или TCEP (гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol. 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA), с последующим проведением повторной реакции окисления для образования межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидных связей (пример 5). Так, например, полноразмерные сконструированные на основе цистеина моноклональные антитела (тио-Mab), экспрессируемые в клетках CHO, подвергают реакции восстановления примерно с 50-кратным избытком TCEP в течение 3 часов при 37°С для восстановления дисульфидных связей в продуктах присоединения цистеина, которые могут образовываться между вновь введенными цистеиновыми остатками и цистеином, присутствующим в культуральной среде. Восстановленный тио-Mab разводят и загружают на колонку HiTrap S в 10 мМ ацетата натрия, pH 5, и элюируют PBS, содержащим 0,3 M хлорид натрия. Дисульфидные связи между цистеиновыми остатками, присутствующими в родительском Mab, снова восстанавливают с использованием разведенного (200 нМ) водного сульфата меди (CuSO) при комнатной температуре в течение ночи. Альтернативно, после восстановительного расщепления цистеиновых аддуктов, для повторного восстановления внутрицепочечных дисульфидных групп сконструированного на основе цистеина антитела, может быть использован эффективный окислитель, такой как дегидроаскорбиновая кислота (DHAA). Могут быть также использованы и другие окислители, то есть окисляющие агенты, и условия окисления, известные специалистам. Эффективным также является окисление на воздухе. Такая стадия мягкого неполного повторного окисления с высокой степенью надежности способствует образованию внутрицепочечных дисульфидов и сохранению тиоловых групп только что введенных цистеиновых остатков. Затем добавляют приблизительно 10-кратный избыток промежуточного соединения “лекарственное средство-линкер”, например, MC-vc-PAB-MMAE, перемешивают и оставляют примерно на 1 час при комнатной температуре для осуществления конъюгирования с образованием конъюгата “анти-CD79b антитело-лекарственное средство”. Затем конъюгированную смесь подвергают гель-фильтрации, загружают на колонку HiTrap S и элюируют с этой колонки для удаления избытка промежуточного соединения “лекарственное средство-линкер” и других примесей.
На фигуре 23 проиллюстрирован общий способ получения сконструированного на основе цистеина антитела, экспрессируемого в клеточной культуре, для последующего конъюгирования. Если среда для культивирования клеток содержит цистеин, то между только что введенной цистеиновой аминокислотой и цистеином среды могут образовываться дисульфидные аддукты. Эти цистеиновые аддукты, обозначенные кружками для репрезентативного тио-Mab (слева) на фигуре 23, должны быть восстановлены с получением сконструированных на основе цистеина антител, которые могут быть использованы для последующей реакции конъюгирования. Цистеиновые аддукты, предположительно вместе с различными межцепочечными дисульфидными связями, подвергают восстановительному расщеплению под действием восстанователей, таких как ТСЕР, с получением восстановленной формы антитела. Межцепочечные дисульфидные связи между связанными цистеиновыми остатками снова образуются в условиях неполного окисления, таких как обработка сульфатом меди, DHAA или воздействие атмосферного кислорода. Вновь введенные, сконструированные и несвязанные цистеиновые остатки становятся доступными для реакции с линкерными реагентами или промежуточными соединениями “лекарственное средство-линкер”, в результате чего образуются конъюгаты антител согласно изобретению. Тио-Mab, экспрессируемые в клеточных линиях млекопитающих, образуют внешний Cys-аддукт, конъюгированный с введенным Cys посредством образования -S-S-связи. Следовательно, очищенные тио-Mab должны быть подвергнуты восстановлению и окислению, как описано в примере 5, с получением реакционноспособных тио-Mab. Эти тио-Mab используют для получения конъюгата с малеимидом, содержащего цитотоксические лекарственные средства, флуорофоры и другие метки.
Иммунолипосомы
Описанные здесь анти-CD79b антитела могут быть также получены в виде иммунолипосом. «Липосома» представляет собой небольшую везикулу, состоящую из липидов различных типов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которые могут быть использованы для доставки лекарственного средства млекопитающему. Компоненты липосомы обычно расположены так, что они образуют бислой, аналогичный липидному бислою в биологических мембранах. Липосомы, содержащие антитело, получают методами, известными специалистам, такими как методы, описанные в публикации Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); в патентах 4485045 и 4544545; и в заявке WO 97/38731, опубликованной 23 октября 1997 г. Липосомы с увеличенным временем полужизни в кровотоке описаны в патенте США № 5013556.
Конкретно используемые липосомы, в состав которых входят такие липиды, как фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ), могут быть получены методом выпаривания с обратной фазой. Липосомы подвергают экструзии через фильтры с определенным размером пор, в результате чего получают липосомы нужного диаметра. Fab'-фрагменты антитела согласно изобретению могут быть конъюгированы с липосомами, как описано в публикации Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982), в результате проведения реакции дисульфидного обмена. Липосома может содержать, но необязательно, химиотерапевтическое средство. См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).
B. Некоторые методы получения антител
1. Скрининг на анти-CD79b антитела с нужными свойствами
Методы получения антител, связывающихся с полипептидами CD79b, описаны выше. При желании, могут быть также выбраны и другие антитела с определенными биологическими свойствами.
3
Рост-ингибирующее действие анти-CD79b антитела согласно изобретению может быть оценено методами, известными специалистам, например, с использованием клеток, которые экспрессируют полипептид CD79b либо эндогенно, либо после трансфекции геном CD79b. Так, например, соответствующие опухолевые клеточные линии и CD79b-трансфицированные клетки могут быть обработаны моноклональным анти-CD79b антителом согласно изобретению в различных концентрациях в течение нескольких дней (например, 2-7 дней), и окрашены кристаллическим фиолетовым или МТТ, либо проанализированы с помощью некоторых других колориметрических анализов. Другой метод измерения уровня пролиферации может представлять собой сравнение поглощения H-тимидина клетками, обработанными в присутствии или в отсутствие анти-CD79b антитела согласно изобретению. После обработки клетки собирают, и уровень радиоактивности, включенной в ДНК, подсчитывают в сцинтилляционном счетчике. Соответствующий позитивный контроль включает обработку выделенной клеточной линии рост-ингибирующим антителом, которое, как известно, ингибирует рост такой клеточной линии. Ингибирование роста опухолевых клеток in vivo может быть определено различными методами, известными специалистам. Опухолевой клеточной линией может быть клеточная линия, сверхэкспрессирующая полипептид CD79b. В одном из вариантов изобретения анти-CD79b антитело ингибирует пролиферацию CD79b-экспрессирующих опухолевых клеток in vitro или in vivo примерно на 25-100%, более предпочтительно примерно на 30-100%, а еще более предпочтительно примерно на 50-100% или 70-100% по сравнению с необработанными опухолевыми клетками при концентрации антитела примерно от 0,5 до 30 мкг/мл. Ингибирование роста может быть измерено при концентрации антитела примерно от 0,5 до 30 мкг/мл или примерно от 0,5 нМ до 200 нМ в клеточной культуре, где указанное ингибирование роста определяют через 1-10 дней после обработки опухолевых клеток антителом. Антитело обладает рост-ингибирующим действием in vivo, если введение анти-CD79b антитела в количестве примерно от 1 мкг/мл до 100 мг/кг массы тела приводит к уменьшению размера опухоли или к снижению уровня пролиферации опухолевых клеток за период времени примерно от 5 дней до 3 месяцев, а предпочтительно за период времени примерно от 5 до 30 дней после первого введения антитела.
Для отбора анти-CD79b антитела, которое индуцирует гибель клеток, может быть оценена потеря целостности мембраны, как было установлено, например, по поглощению йодида пропидия (PI), трипанового синего или 7AAD по сравнению с контролем. Анализ на поглощение PI может быть осуществлен в отсутствие комплемента и иммунных эффекторных клеток. Опухолевые клетки, экспрессирующие полипептид CD79b, инкубируют либо только со средой, либо со средой, содержащей соответствующее анти-CD79b антитело (например, примерно 10 мкг/мл). Клетки инкубируют в течение 3 дней. После каждой обработки клетки промывают и разделяют на аликвоты в пробирках (35 мм, 12×75) с плотно закрывающейся крышкой (1 мл на пробирку, 3 пробирки на каждую группу обработки) для удаления скоплений клеток. Затем в пробирки добавляют PI (10 мкг/мл). Образцы могут быть проанализированы на проточном цитометре FACSCAN и с использованием компьютерной программы FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). Анти-CD79b антитела, которые индуцируют статистически значимые уровни гибели клеток, как было определено по поглощению PI, могут быть отобраны как анти-CD79b антитела, индуцирующие гибель клеток.
Для скрининга антител, которые связываются с эпитопом на полипептиде CD79b, связанном с представляющим интерес антителом, может быть проведен рутинный анализ на перекрестное блокирование, такой как анализ, описанный в руководстве Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Этот анализ может быть осуществлен для того, чтобы определить, связывается ли тестируемое антитело с тем же сайтом или эпитопом, с которыми связывается известное анти-CD79b антитело. Альтернативно или дополнительно может быть осуществлено картирование эпитопов известными методами. Так, например, последовательность антитела может быть подвергнута мутагенезу, такому как аланин-сканирующий мутагенез для идентификации контактирующих остатков. Мутантное антитело сначала тестируют на связывание с поликлональным антителом для гарантии «правильной» укладки. В другом методе пептиды, соответствующие различным областям полипептида CD79b, могут быть использованы в анализах на конкурентное связывание с тестируемыми антителами или с тестируемым антителом и с антителом, которое связывается с охарактеризованным или известным эпитопом.
2. Некоторые методы скрининга библиотек
Анти-CD79b антитела согласно изобретению могут быть получены с использованием комбинаторных библиотек для скрининга антител с нужной активностью или с нужными активностями. Так, например, специалистам известен ряд методов получения библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие желаемыми связывающими свойствами. Такие методы в основном описаны в публикации Hoogenboom et al. (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ), а некоторые их варианты в публикации Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093.
В принципе, клоны синтетических антител отбирают путем скрининга фаговых библиотек, содержащих фаг, который представляет различные фрагменты вариабельной области антитела (Fv), присоединенные к белку оболочки фага. Такие фаговые библиотеки подвергают пэннингу с помощью аффинной хроматографии против нужного антигена. Клоны, экспрессирующие Fv-фрагменты, способные связываться с нужным антигеном, подвергают адсорбции на антигене и тем самым их отделению от несвязывающихся клонов в библиотеке. Затем связывающиеся клоны элюируют с антигена, после чего число этих клонов может быть увеличено путем проведения дополнительных циклов адсорбции/элюирования антигена. Любое из анти-CD79b антител согласно изобретению может быть получено с применением подходящей процедуры скрининга антигена для отбора на представляющий интерес клон фага с последующим конструированием полноразмерного клона анти-CD79b антитела с использованием последовательностей Fv, происходящих от представляющего интерес клона фага, и подходящих последовательностей константной области (Fc), описанных Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
В некоторых вариантах изобретения антигенсвязывающий домен антитела образуется из двух вариабельных (V) областей, состоящих примерно из 110 аминокислот, одна из которых находится в легкой цепи (VL), а другая в тяжелой цепи (VH), и в этих вариабельных областях присутствуют три гипервариабельные петли (HVR) или комплементарность-определяющие области (CDR). Вариабельные домены могут быть функционально представлены на фаге либо как одноцепочечные Fv- (scFv)-фрагменты, в которых VH и VL ковалентно связаны друг с другом посредством короткого гибкого пептида, либо как Fab-фрагменты, в которых каждый из этих вариабельных доменов присоединен к константному домену и подвергается нековалентному взаимодействию, как описано Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). Используемые здесь scFv-кодирующие фаговые клоны и Fab-кодирующие фаговые клоны в целом называются «фаговыми Fv-клонами» или «Fv-клонами».
Наборы генов VH и VL могут быть отдельно клонированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и подвергнуты неспецифической рекомбинации в фаговых библиотеках, а затем они могут быть проанализированы на антигенсвязывающие клоны, как описано в публикации Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). Библиотеки от иммунизированных источников позволяют получить антитела, обладающие высокой аффинностью к иммуногену, и при этом не требуется проведения процедуры конструирования гибридом. Альтернативно может быть клонирован набор человеческих антител дикого типа с получением одного источника человеческих антител против не-аутоантигенов, а также аутоантигенов широкого ряда, не прибегая при этом к какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). И наконец, исходные библиотеки могут быть также синтезированы путем клонирования неаранжированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с использованием ПЦР-праймеров, содержащих рандомизированную последовательность, кодирующую в высокой степени вариабельные CDR3-области, в целях достижения реаранжировки in vitro, как описано Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).
В некоторых вариантах изобретения, для представления фрагментов антител путем их присоединения к минорному оболочечному белку pIII, используют нитчатый фаг. Фрагменты антител могут быть представлены в виде одноцепочечных Fv-фрагментов, в которых домены VH и VL присоединены на одной и той же полипептидной цепи посредством гибкого полипептидного спейсера, например, как описано Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), или в виде Fab-фрагментов, в которых одна цепь присоединена к pIII, а другая секретируется в периплазму бактериальной клетки хозяина, где происходит сборка структуры оболочечного белка Fab, который отображается на поверхности фага посредством замены некоторых из оболочечных белков дикого типа, например, как описано в публикации Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).
Обычно нуклеиновые кислоты, содержащие гены, кодирующие фрагменты антител, получают из иммунных клеток, взятых у человека или животных. Если необходимо получить библиотеку, состоящую преимущественно из клонов анти-CD79b антител, то индивидуума иммунизируют CD79b для вырабатывания у него гуморального ответа, а затем, для конструирования библиотеки, выделяют клетки селезенки и/или циркулирующие В-клетки, не принадлежащие к популяции лимфоцитов периферической крови (ЛПК). В предпочтительном варианте изобретения библиотеку генов фрагментов человеческого антитела, содержащую преимущественно клоны анти-CD79b антитела, получают посредством вырабатывания ответа в виде продуцирования анти-CD79b антител у трансгенных мышей, несущих массив функциональных генов человеческого иммуноглобулина (и не содержащих функциональной системы продуцирования эндогенного антитела), где такая CD79b-иммунизация будет приводить к образованию В-клеток, продуцирующих человеческие антитела против CD79b. Генерирование трансгенных мышей, продуцирующих человеческое антитело, описано ниже.
Дополнительное обогащение клеточной популяции реакционноспособными анти-CD79b антителами может быть достигнуто с помощью подходящей процедуры скрининга для выделения В-клеток, экспрессирующих CD79b-специфическое мембрано-связанное антитело, например, путем разделения клеток с помощью CD79b-аффинной хроматографии или адсорбции клеток на CD79b, меченном флуорохромом, и последующего клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS).
Альтернативно использование клеток селезенки и/или В-клеток или других ЛПК, взятых от неиммунизированного донора, обеспечивает лучшее представление возможного репертуара антител, а также позволяет конструировать библиотеку антител у животных любого вида (у человека или у других животных), у которых CD79b не является антигенным. Для создания библиотек, включающих конструкцию генов антител in vitro, у индивидуума берут стволовые клетки и выделяют нуклеиновые кислоты, кодирующие неаранжированные сегменты генов антител. Представляющие интерес иммунные клетки могут быть выделены у животных различных видов, таких как человек, мыши, крысы, зайцеобразные, волки, собаки, кошки, свиньи, коровы, лошади, птицы и т.п.
Нуклеиновую кислоту, кодирующую сегменты генов вариабельных областей антитела (включая VH- и VL-сегменты), выделяют из представляющих интерес клеток и амплифицируют. В случае использования библиотек реаранжированных генов VH и VL, нужная ДНК может быть получена путем выделения геномной ДНК или мРНК из лимфоцитов с последующим проведением полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, соответствующих 5'- и 3'-концам реаранжированных генов VH и VL, описанных в публикации Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:3833-3837 (1989), и тем самым получения различных наборов V-генов для экспрессии. V-гены могут быть амплифицированы из кДНК и геномной ДНК с использованием обратных праймеров у 5'-конца экзона, кодирующего зрелый V-домен, и прямых праймеров, полученных на основе J-сегмента, как описано в публикациях Orlandi et al. (1989) и Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989). Однако для амплификации из кДНК обратные праймеры могут быть также получены на основе лидерного экзона, как описано в публикации Jones et al., Biotechnol., 9:88-89 (1991), а прямые праймеры могут быть введены в константную область, как описано в публикации Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:5728-5732 (1989). Для максимизации комплементарности могут быть получены вырожденные праймеры, описанные в публикации Orlandi et al. (1989) или Sastry et al. (1989). В некоторых вариантах изобретения разнообразие библиотек максимизируют с использованием ПЦР-праймеров, нацеленных на каждое семейство V-генов, в целях амплификации всех имеющихся аранжировок VH и VL, присутствующих в образце нуклеиновой кислоты иммунной клетки, например, методом, описанным в публикации Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), или методом, описанным в публикации Orum et al., Nucleic Acids Res., 21:4491-4498 (1993). Для клонирования амплифицированной ДНК в экспрессионные векторы, в ПЦР-праймер могут быть введены редкие рестрикционные сайты в качестве метки у одного конца, как описано Orlandi et al. (1989), либо такое введение может быть осуществлено с помощью ПЦР-амплификации с использованием меченого праймера, как описано Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).
Наборы синтетически реаранжированных генов V могут быть получены in vitro из V-генных сегментов. Большинство сегментов человеческих генов VH были клонированы и секвенированы (как сообщалось в публикации Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227:776-798 (1992)), а затем картированы (как сообщалось в публикации Matsuda et al., Nature Genet., 3:88-94 (1993); и эти клонированные сегменты (включая все основные конформации петли H1 и H2) могут быть использованы для получения различных наборов генов VH с использованием ПЦР-праймеров, кодирующих петли H3, имеющие различные последовательности и различные длины, как описано в публикации Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992). Могут быть также получены наборы VH, имеющие все разнообразие последовательностей, сосредоточенное в длинной петле H3 одной длины, как описано в публикации Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457-4461 (1992). Были клонированы и секвенированы человеческие сегменты Vκ и Vλ (как сообщалось в публикации Williams & Winter, Eur. J. Immunol., 23:1456-1461 (1993)), и такие сегменты могут быть использованы для получения синтетических наборов легких цепей. Наборы синтезированных генов V, полученных на основе складчатой структуры ряда VH и VL, и L3 и H3 различной длины, будут кодировать антитела со значительно варьирующейся структурой. После амплификации кодирующей ДНК гена V, сегменты гена V зародышевой линии могут быть реаранжированы in vitro методами, описанными в публикации Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992).
12
-1
-8
Наборы фрагментов антител могут быть сконструированы путем объединения наборов генов VH и VL несколькими путями. Каждый набор может быть создан в различных векторах, и эти векторы подвергают рекомбинации in vitro, например, как описано в публикации Hogrefe et al., Gene, 128:119-126 (1993), или in vivo путем комбинаторного инфицирования, например, системой loxP, описанной в публикации Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993). В методе рекомбинации in vivo используется двухцепочечная природа Fab-фрагментов для устранения ограничения, налагаемого на размер библиотеки и связанного с эффективностью трансформации E. coli. Исходные наборы VH и VL клонируют отдельно, один в фагмиду, а другой - в фаговый вектор. Затем две библиотеки объединяют путем инфицирования бактерии, содержащей фагмиду, фагом, так, чтобы каждая клетка содержала различные комбинации, а размер библиотеки был ограничен только числом присутствующих клеток (примерно 10 клонов). Оба вектора содержат сигналы рекомбинации in vivo, в результате чего гены VH и VL подвергаются рекомбинации с образованием одного репликона и совместно упаковываются в фаговые вирионы. Эти огромные библиотеки представляют большое число различных антител с высокой аффинностью (Kdпримерно 10 M).
Альтернативно такие наборы могут быть последовательно клонированы в один и тот же вектор, например, как описано в публикации Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991), либо они могут быть собраны вместе с помощью ПЦР, а затем клонированы, например, как описано в публикации Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991). ПЦР-сборка может быть также осуществлена для присоединения ДНК VH и VL к ДНК, кодирующей гибкий пептидный спейсер, с образованием наборов одноцепочечных Fv (scFv). В еще одном методе «ПЦР-сборка в клетках» применяется для объединения генов VH и VL в лимфоцитах с помощью ПЦР с последующим клонированием наборов сцепленных генов, как описано в публикации Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20:3831-3837 (1992).
-1
6
7
-1
-9
Антитела, продуцируемые исходными библиотеками (природными или синтетическими), могут иметь невысокую аффинность (Kd примерно от 10 до 10 M), однако созревание аффинности может быть также смоделировано in vitro путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек, как описано в публикации Winter et al. (1994), см. выше. Так, например, мутация может быть введена случайно in vitro с использованием полимеразной реакции с вероятностью ошибки (Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989)) в методе, описанном Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992), или методе, описанном Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:3576-3580 (1992). Кроме того, созревание аффинности может быть осуществлено посредством случайной мутации одной или нескольких CDR, например, с помощью ПЦР, проводимой с использованием праймеров, несущих рандомизированную последовательность, охватывающую представляющую интерес CDR в отдельно выбранных Fv-клонах, и с помощью скрининга клонов с более высокой аффинностью. В заявке WO 9607754 (опубликованной 14 марта 1996 г.) описан метод индуцирования мутагенеза в гипервариабельной области легкой цепи иммуноглобулина с получением библиотеки генов легкой цепи. Другим эффективным методом является рекомбинация доменов VH или VL, отобранных с помощью фагового дисплея, с наборами природных вариантов V-домена, выделенных у неиммунизованных доноров, и скрининг на более высокую аффинность, проводимый в несколько раундов перестановки цепей, как описано в публикации Marks et al., Biotechnol., 10:779-783 (1992). Этот метод позволяет продуцировать антитела и фрагменты антител с аффинностями примерно 10 M или менее.
Скрининг библиотек может быть осуществлен различными методами, известными специалистам. Так, например, CD79b может быть использован для покрытия лунок адсорбционных планшетов или экспрессирован на клетках-хозяевах, прикрепленных к адсорбционным планшетам, либо он может быть использован для клеточного сортинга, или конъюгирован с биотином для захвата на сферах, покрытых стрептавидином, либо он может быть использован в любом другом методе пеннинга библиотек фагового дисплея.
Образцы фаговых библиотек подвергают контактированию с иммобилизованным CD79b в условиях, подходящих для связывания по меньшей мере части фаговых частиц с адсорбентом. Обычно для имитации физиологических условий выбирают соответствующие рН, ионную силу, температуру и т.п. Фаги, связанные с твердой фазой, промывают, а затем элюируют кислотой, например, как описано в публикации Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88:7978-7982 (1991), или щелочью, например, как описано в публикации Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), или путем конкурентного связывания с антигеном CD79b, например, в соответствии с процедурой, аналогичной процедуре, осуществляемой в методе конкурентного связывания с антигеном, как описано в публикации Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991). Фаги могут быть подвергнуты 20-1000-кратному обогащению в одном раунде отбора. Кроме того, обогащенные фаги могут быть выращены в бактериальной культуре и подвергнуты дополнительным раундам отбора.
Эффективность отбора зависит от многих факторов, включая кинетику диссоциации во время промывки, и от способности множества фрагментов антитела одновременно связываться с антигеном на одном фаге. Антитела с быстрой кинетикой диссоциации (и слабой аффинностью связывания) могут быть фиксированы благодаря кратковременным промывкам, применению мультивалентного фагового представления и высокой плотности покрытия антигена на твердой фазе. Такая высокая плотность не только позволяет стабилизировать фаг благодаря мультивалентным взаимодействиям, но также благоприятствует повторному связывания фага, который является диссоциированным. Отбор антител со слабой кинетикой диссоциации (и с высокой аффинностью связывания) может быть улучшен благодаря более длительным промывкам и применению моновалентного фагового представления, описанного в публикации Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990) и в WO 92/09690, а также благодаря низкой плотности покрытия антигена, как описано в публикации Marks et al., Biotechnol., 10:779-783 (1992).
Может быть проведен отбор между фаговыми антителами с различными аффинностями, даже с немного отличающейся аффинностью по отношению к CD79b. Однако случайная мутация выбранного антитела (например, внесеннная при осуществлении некоторых из описанных выше методов созревания аффинности), вероятно, будет приводить к образованию множества мутантов, большинство из которых будут связываться с антигеном, а некоторые из них с еще большей аффинностью. При ограниченном уровне CD79b редкий фаг с высокой аффинностью может выдержать такую конкуренцию. Для сохранения всех мутантов с более высокой аффинностью фаги могут быть инкубированы с избытком биотинилированного CD79b, но этот биотинилированный CD79b должен иметь более низкую молярную концентрацию, чем молярная константа аффинности мишени для CD79b. Затем фаги с высокой аффинностью связывания могут быть захвачены парамагнитными сферами, покрытыми стрептавидином. Такой «равновесный захват» дает возможность проводить отбор антител по их аффинности связывания с чувствительностью, которая позволяет из большого избытка фагов с меньшей аффинностью выделить мутантные клоны, имеющие лишь в два раза более высокую аффинность. Условия, используемые для промывки фагов, связанных с твердой фазой, могут быть также изменены для выявления их отличий, исходя из кинетики диссоциации.
Клоны анти-CD79b антител могут быть отобраны по их активности. В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к анти-CD79b антителам, которые связываются с живыми клетками, обычно экспрессирующими CD79b. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к анти-CD79b антителам,которые блокируют связывание лиганда CD79b с CD79b, но не блокируют связывание лиганда CD79b со вторым белком. Fv-клоны, соответствующие таким анти-CD79b антителам, могут быть отобраны путем: (1) выделения клонов анти-CD79b антител из фаговой библиотеки, как описано выше, и, но необязательно, амплификации выделенной популяции фаговых клонов путем культивирования такой популяции в подходящем бактериальном хозяине; (2) выбора CD79b и второго белка, против которого необходимо продуцировать блокирующую и неблокирующую активность, соответственно; (3) адсорбции фаговых клонов анти-CD79b антител на иммобилизованном CD79b; (4) использования избытка второго белка для элюирования любых нежелательных клонов, распознающих CD79b-связывающиеся детерминанты, которые перекрываются со связывающими детерминантами второго белка или имеют общие с ним связывающие детерминанты; и (5) элюирования клонов, которые остаются адсорбированными после проведения стадии (4). Клоны с нужными блокирующими/неблокирующими свойствами могут быть также, но необязательно, обогащены путем проведения одной или нескольких повторных процедур отбора, описанных в настоящей заявке.
ДНК, кодирующая продуцируемые гибридомой моноклональные антитела или Fv-клоны фагового представления согласно изобретению, могут быть легко выделены и секвенированы в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием олигонуклеотидных праймеров, которые способны специфически амплифицировать представляющие интерес кодирующие области тяжелой и легкой цепей из гибридомы или фаговой ДНК-матрицы). После выделения эта ДНК может быть встроена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или миеломные клетки, которые в иных случаях не продуцируют белок иммуноглобулина, в результате чего в этих рекомбинантных клетках-хозяевах синтезируются нужные моноклональные антитела. Обсуждение рекомбинантной экспрессии антитело-кодирующей ДНК в бактериях можно найти в обзорных статьях Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
ДНК, кодирующая Fv-клоны согласно изобретению, может быть объединена с известными последовательностями ДНК, кодирующими константные области тяжелой цепи и/или легкой цепи (например, соответствующие последовательности ДНК могут быть получены, как описано в публикации Kabat et al., см. выше), с образованием клонов, кодирующих полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи или их фрагменты. Следует отметить, что в этих целях могут быть использованы константные области любого изотипа, включая константные области IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, и такие константные области могут быть получены от человека или животных любых видов. В определение используемого здесь термина «химерное» и «гибридное» антитело входит Fv-клон, происходящий от ДНК вариабельного домена животного одного вида (например, человека), который был затем присоединен к ДНК константной области животного другого вида с образованием кодирующей(их) последовательности(ей) «гибрида» полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи. В некоторых вариантах изобретения Fv-клон, происходящий от ДНК человеческого вариабельного домена, присоединяют к ДНК человеческой константной области с образованием кодирующей(их) последовательности(ей) для всех человеческих полноразмерных тяжелых и/или легких цепей или их фрагментов.
ДНК, кодирующая анти-CD79b антитело, происходящее от гибридомы, может быть также модифицирована, например, путем замены гомологичных мышиных последовательностей, происходящих от гибридомного клона, кодирующей последовательностью для человеческих константных доменов тяжелой и легкой цепей (например, как в способе, описанном Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). ДНК, кодирующая антитело, происходящее от гибридомы или Fv-клона, или его фрагмент, может быть также модифицирована путем ковалентного связывания иммуноглобулин-кодирующей последовательности с полноразмерной последовательностью, кодирующей неиммуноглобулиновый полипептид, или с ее частью. Таким образом могут быть получены «химерные» или «гибридные» антитела, обладающие специфичностью связывания с антителами, происходящими от Fv-клона или гибридомного клона согласно изобретению.
C. Антитело-зависимая опосредуемая ферментом пролекарственная терапия (ADEPT)
Антитела согласно изобретению могут быть также использованы в ADEPT в виде антитела, конъюгированного с пролекарство-активирующим ферментом, который превращает пролекарство (например, пептидильное химиотерапевтическое средство, см. WO 81/01145) в активное противораковое лекарственное средство. См., например, WO 88/07378 и патент США № 4975278.
Ферментный компонент иммуноконъюгата, подходящего для ADEPT, включает любой фермент, способный действовать на пролекарство, а именно превращать такое пролекарство в более активную цитотоксическую форму.
Ферментами, которые могут быть использованы в способе согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, щелочные фосфатазы, которые могут быть использованы для превращения фосфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазы, которые могут быть использованы для превращения сульфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминаза, которая могут быть использована для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство, а именно в 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины В и L), которые могут быть использованы для превращения пептидсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, которые могут быть использованы для превращения пролекарств, содержащих D-аминокислотные заместители; углевод-расщепляющие ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, которые могут быть использованы для превращения гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамаза, которая может быть использована для превращения лекарственных средств, дериватизированных β-лактамами, в свободные лекарственные средства; и пенициллин-амидазы, такие как пенициллин V-амидаза или пенициллин G-амидаза, которые могут быть использованы для превращения лекарственных средств, дериватизированных у атомов азота амина феноксиацетильными или фелилацетильными группами, соответственно, в свободные лекарственные средства. Альтернативно антитела с ферментативной активностью, также известные специалистам как «абзимы», могут быть использованы для превращения пролекарств согласно изобретению в свободные активные лекарственные средства (см., например, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Конъюгаты «антитело-абзим» могут быть получены, как описано в настоящей заявке, для доставки абзима в популяцию опухолевых клеток.
Ферменты согласно изобретению могут быть ковалентно присоединены к анти-CD79b антителам методами, известными специалистам, например, с применением гетеробифункциональных перекрестно-сшивающих реагентов, обсуждаемых выше. Альтернативно гибридные белки, содержащие по меньшей мере антигенсвязывающую область антитела согласно изобретению, связанную по меньшей мере с функционально активной частью фермента согласно изобретению, могут быть сконструированы методами рекомбинантных ДНК, известными специалистам (см., например, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984).
D. Анти-CD79b антитело
Помимо описанных здесь анти-CD79b антител, также рассматривается получение вариантов анти-CD79b антител. Варианты анти-CD79b антител могут быть получены путем введения соответствующих нуклеотидных модификаций в кодирующую ДНК и/или путем синтеза нужного антитела или полипептида. Следует отметить, что аминокислотные модификации могут влиять на посттрансляционные процессы анти-CD79b антитела, например, изменять число или положения сайтов гликозилирования, или изменять мембрано-заякоривающие свойства.
Изменения в описанных здесь анти-CD79b антителах могут быть внесены, например, с применением любых методов и руководств по внесению консервативных и неконсервативных замен, описанных, например, в патенте США № 5364934. Такими модификациями могут быть замена, делеция или инсерция одного или нескольких кодонов, кодирующих антитело или полипептид, что приводит к изменению аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью природного антитела или полипептида. Такой модификацией является, но необязательно, замена по меньшей мере одного аминокислотного остатка любой другой аминокислотой в одном или нескольких доменах анти-CD79b антитела. Для того чтобы определить, можно ли встроить, заменить или делетировать аминокислотный остаток без какого-либо негативного воздействия на желаемую активность антитела, может быть проведено сравнение последовательности анти-CD79b антитела с последовательностью гомологичных известных молекул белков для минимизации числа модификаций аминокислотной последовательности, внесенных в обасти с высокой гомологией. Аминокислотные замены могут быть результатом замены одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства, такой как замена лейцина серином, то есть консервативных аминокислотных замен. Инсерции или делеции могут, но необязательно, составлять в пределах примерно от 1 до 5 аминокислот. Допустимые модификации могут быть определены путем систематического введения инсерций, делеций или замен аминокислот в данной последовательности и тестирования полученных вариантов на активность, обнаруживаемую полноразмерной или зрелой нативной последовательностью.
Настоящее изобретение также относится к фрагментам анти-CD79b антитела. Такие фрагменты могут иметь усечения у N-конца или у С-конца, либо они могут не содержать внутренних остатков, например, по сравнению с полноразмерным нативным антителом или белком. В некоторых фрагментах отсутствуют аминокислотные остатки, которые не играют важной роли в нужной биологической активности анти-CD79b антитела.
Фрагменты анти-CD79b антитела могут быть получены любыми различными стандартными методами. Нужные пептидные фрагменты могут быть получены методом химического синтеза. Альтернативный метод включает продуцирование фрагментов антитела или полипептида путем ферментативного расщепления, например, путем обработки белка ферментом, который, как известно, расщепляет белки в сайтах, определенных конкретными аминокислотными остатками, или путем гидролиза ДНК подходящими рестриктирующими ферментами, и выделения нужного фрагмента. Еще один подходящий метод включает выделение и амплификацию ДНК-фрагмента, кодирующего нужный фрагмент антитела или полипептида с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Олигонуклеотиды, которые определяют нужные концы ДНК-фрагмента, используются в ПЦР в качестве 5'- и 3'-праймеров. Предпочтительно фрагменты анти-CD79b антитела обладают по меньшей мере одной биологической и/или иммунологической активностью, аналогичной активности описанного здесь нативного анти-CD79b антитела.
В конкретных вариантах изобретения представляющие интерес консервативные замены представлены в таблице 8 под заголовком «Предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более значительные замены, называемые в таблице 8 «репрезентативными заменами», или также описанные ниже в разделе, относящемся к классу аминокислот, а затем полученные продукты могут быть скринированы.
Таблица 8
Исходные остатки
Репрезентативные замены
Предпочтительные замены
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn
Lys
Asn (N)
Gln; His; Lys; Arg
Gln
Asp (D)
Glu
Glu
Cys (C)
Ser
Ser
Gln (Q)
Asn
Asn
Glu (E)
Asp
Asp
Gly (G)
Pro; Ala
Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala;Phe; норлейцин
Leu
Leu (L)
Норлейцин; Ile; Val;Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Leu
Pro (P)
Ala
Ala
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe;Ala; норлейцин
Leu
Значительные изменения функций или иммунологических свойств анти-CD79b антитела могут быть достигнуты путем выбора замен, которые значительно отличаются по своему влиянию на сохранение (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в нужном сайте, или (с) объема боковой цепи. Природные остатки подразделяются на нижеследующие группы по общим свойствам боковых цепей:
(1) гидрофобные остатки: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;
(2) нейтральные гидрофильные остатки: cys, ser, thr;
(3) кислотные остатки: asp, glu;
(4) основные остатки: asn, gln, his, lys, arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и
(6) ароматические остатки: trp, tyr, phe.
Неконсервативные замены приводят к заменам члена одного из этих классов членом другого класса. Такие замены могут быть также введены в области консервативных замен, или более предпочтительно в остальные (неконсервативные) области.
Такие модификации могут быть внесены методами, известными специалистам, такими как олигонуклеотид-опосредуемый (сайт-направленный) мутагенез, аланин-сканирующий мутагенез и ПЦР-мутагенез. Для продуцирования варианта ДНК анти-CD79b антитела, клонированная ДНК может быть подвергнута сайт-направленному мутагенезу [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], кластерному мутагенезу [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], рестрикционному мутагенезу [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] или мутагенезу, проводимому другими методами.
Для идентификации одной или нескольких аминокислот по всей последовательности может быть также проведен сканирующий аминокислотный анализ. Предпочтительными сканирующими аминокислотами являются относительно небольшие нейтральные аминокислоты. Такими аминокислотами являются аланин, глицин, серин и цистеин. Обычно предпочтительной сканирующей аминокислотой для данной группы является аланин, поскольку он элиминирует боковую цепь за бета-углеродом и, очевидно, но с меньшей вероятностью, изменяет конформацию главной цепи данного варианта [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Аланин также является предпочтительным, поскольку он представляет собой наиболее распространенную аминокислоту. Кроме того, он часто присутствует как в скрытых, так и в открытых положениях [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Если аланиновая замена не дает адекватных количеств варианта, то может быть использована изотерическая аминокислота.
Для повышения устойчивости молекулы к окислению и для предотвращения образования нежелательных перекрестных связей, может быть также заменен любой цистеиновый остаток, не участвующий в поддержании «правильной» конфомации анти-CD79b антитела, и обычно такой заменой является замена цистеина серином. И наоборот, для повышения его стабильности (в частности, если антителом является его фрагмент, такой как Fv-фрагмент) к анти-CD79b антителу может (могут) быть добавлена(ы) цистеиновая(ые) связь(и).
Особенно предпочтительным вариантом замены является замена одного или нескольких остатков гипервариабельной области родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). В общих чертах, полученный(ые) вариант(ы), выбранный(ные) для дальнейшей разработки, будет(ут) способствовать улучшению биологических свойств по сравнению со свойствами родительского антитела, от которого они происходят. Стандартный способ генерирования таких вариантов с заменами предусматривает созревание аффинности с применением метода фагового представления. Для этого несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации для генерирования всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антител могут быть представлены на частицах нитчатого фага в виде одновалентных гибридов с продуктом гена III, упакованных в каждой частице фага М13. Затем варианты, представленные на фаге, скринируют на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как описано в настоящей заявке. Для идентификации сайтов гипервариабельной области, являющихся кандидатами на модификацию, может быть осуществлен аланин-сканирующий мутагенез, который позволяет идентифицировать остатки гипервариабельной области, играющие важную роль в связывании с антигеном. Альтернативно или дополнительно может оказаться полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации контактных участков между антителом и полипептидом CD79b. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами на замену, осуществляемую в соответствии с разработанными здесь способами. После получения таких вариантов, панель этих вариантов подвергают скринингу, описанному в настоящей заявке, и антитела, обнаруживающие превосходные свойства в одном или нескольких релевантных анализах, могут быть выбраны для дальнейшего исследования.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей анти-CD79b антитела, получают различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничивается ими, выделение из природного источника (в случае природных вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью опосредуемого олигонуклеотидом (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кластерного мутагенеза ранее полученного варианта или немодифицированного варианта анти-CD79b антитела.
E. Модификации анти-CD79b антител
Ковалентные модификации анти-CD79b антител входят в объем настоящего изобретения. Одним из типов ковалентной модификации является реакция взаимодействия нужных аминокислотных остатков анти-CD79b антитела с органическим дериватизирующим агентом, способным реагировать с выбранными боковыми цепями N- или C-концевых остатков анти-CD79b антитела. Дериватизация с использованием бифункциональных агентов может быть осуществлена, например, для проведения перекрестного связывания анти-CD79b антитела с нерастворимой в воде матрицей-носителем или с поверхностью, используемых в методе очистки анти-CD79b антител, и наоборот. Наиболее часто используемыми перекрестно-связывающими агентами являются, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидоэфиры, например, сложные эфиры, образованные 4-азидосалициловой кислотой; гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые сложные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан, и такие агенты, как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат.
Другими модификациями являются дезамидирование глутаминильных и аспарагинильных остатков до соответствующих глутамильных и аспартильных остатков, соответственно; гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], ацетилирование N-концевого амина и амидирование любых C-концевых карбоксильных групп.
Другой тип ковалентной модификации анти-CD79b антитела, входящей в объем настоящего изобретения, включает изменение характера нативного гликозилирования антитела или полипептида. Термин «изменение характера нативного гликозилирования», используемый в описании настоящего изобретения, означает делецию одной или нескольких углеводных групп, присутствующих в нативной последовательности анти-CD79b антитела (либо путем удаления скрытых сайтов гликозилирования, либо путем удаления гликозильных остатков химическими и/или ферментативными методами), и/или добавление одного или нескольких сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в нативной последовательности анти-CD79b антитела. Кроме того, этот термин включает качественные изменения характера гликозилирования нативных белков, приводящие к изменению природы и количества различных присутствующих углеводных групп.
Гликозилирование антител и других полипептидов обычно является либо N-связанным, либо О-связанным. N-связанное гликозилирование означает присоединение углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности “аспарагин-Х-серин” и “аспарагин-Х-треонин”, где Х означает любую аминокислоту за исключением пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводной части к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде способствует созданию потенциального сайта гликозилирования. О-связанное гликозилирование означает присоединение одного из сахаров, таких как N-ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза, к гидроксиаминокислоте, главным образом, к серину или треонину, хотя ими могут быть также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
Присоединение сайтов гликозилирования к анти-CD79b антителу обычно осуществляют путем такой модификации аминокислотной последовательности, в результате которой эта аминокислотная последовательность будет содержать одну или несколько вышеописанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Такая модификация может быть также осуществлена путем добавления к последовательности исходного анти-CD79b антитела одного или нескольких сериновых или треониновых остатков или их замены в такой последовательности исходного антитела (для сайтов О-связанного гликозилирования). Аминокислотная последовательность анти-CD79b антитела может быть, но необязательно, изменена посредством ее модификации на уровне ДНК, а в частности, посредством мутации ДНК, кодирующей анти-CD79b антитело, в предварительно выбранных основаниях, в результате чего будут образовываться кодоны, транслирующиеся в нужные аминокислоты.
Другим способом увеличения числа углеводных молекул на анти-CD79b антителе является химическое или ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду. Такие методы описаны в литературе, например, в заявке WO 87/05330, опубликованной 11 сентября 1987 г., и в публикации Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
Удаление углеводных групп, присутствующих на анти-CD79b антителе, может быть осуществлено химически или ферментативно, либо путем мутационной замены кодонов, кодирующих аминокислотные остатки, которые служат в качестве мишеней для гликозилирования. Методы химического дегликозилирования известны специалистам и описаны, например, в публикации Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) и Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Ферментативное расщепление углеводных молекул на полипептидах может быть осуществлено с использованием различных эндо- и экзогликозидаз, как описано в публикации Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Другой тип ковалентной модификации анти-CD79b антитела включает связывание антитела с одной из различных молекул небелковых полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, как описано в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337. Антитело может быть также заключено в приготовленные микрокапсулы, например, методами коацервации или межфазной полимеризации (например, в гидроксиметилцеллюлозную или желатиновую микрокапсулу и полиметилметакрилатную микрокапсулу, соответственно), в системы для доставки коллоидальных лекарственных средств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такая методика описана в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).
Анти-CD79b антитело согласно изобретению может быть также модифицировано с образованием химерных молекул, содержащих анти-CD79b антитело, связанное с другим гетерологичным полипептидом или с другой аминокислотной последовательностью.
В одном из вариантов изобретения такая химерная молекула содержит гибрид анти-CD79b антитела с полипептидной меткой, обеспечивающей наличие эпитопа, с которым может селективно связываться антитело против метки. Эпитопная метка обычно находится у амино- или карбокси-конца анти-CD79b антитела. Присутствие таких меченных эпитопом форм анти-CD79b антитела может быть детектировано с использованием антитела против полипептида-метки. Кроме того, наличие эпитопной метки позволяет легко очищать анти-CD79b антитело методом аффинной очистки с использованием анти-CD79b антитела против метки или аффинной матрицы другого типа, которая связывается с эпитопной меткой. Различные полипептиды-метки и их соответствующие антитела хорошо известны специалистам. Примерами являются полигистидиновые метки (поли-his) или метки «поли-гистидин-глицин (поли-his-gly); полипептидная метка HA вируса гриппа и антитело против этого полипептида, 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)], c-myc-метка и антитела против такой метки, 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; и метка «гликопротеин D (gD) вируса простого герпеса и антитело против такой метки [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Другими полипептидными метками являются Flag-пептид [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; пептид эпитопа KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид эпитопа α-тубулина [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; и метка «пептид белка 10, кодируемого геном T7» [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
2
3
1
2
3
В альтернативном варианте изобретения химерная молекула может содержать гибрид «анти-CD79b антитело-иммуноглобулин или конкретная область иммуноглобулина». В случае двухвалентной формы химерной молекулы (также называемой «иммуноадгезином») такой гибрид может быть присоединен к Fc-области молекулы IgG. IgG-гибриды предпочтительно включают замену по меньшей мере одной вариабельной области в молекуле Ig на растворимую форму (с делетированным или инактивированным трансмембранным доменом) анти-CD79b антитела. В особенно предпочтительном варианте изобретения гибрид иммуноглобулина включает шарнирную область, CH и CH, или шарнирную область, CH, CH и CH, молекулы IgG1. Описание продуцирования гибридных иммуноглобулинов можно также найти в патенте США № 5428130, выданном 27 июня 1995 г.
F. Получение анти-CD79b антител
Ниже описано, главным образом, продуцирование анти-CD79b антител путем культивирования клеток, трансформированных или трансфицированных вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-CD79b антитело. При этом предусматривается, что для получения анти-CD79b антител могут быть применены альтернативные методы, хорошо известные специалистам. Так, например, соответствующая аминокислотная последовательность или ее части могут быть продуцированы методом прямого пептидного синтеза на твердой фазе [см., например, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. In vitro синтез белков может быть осуществлен вручную или автоматически. Автоматический синтез может быть осуществлен, например, на пептидном синтезаторе Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителей. Различные части анти-CD79b антитела могут быть химически синтезированы отдельно и в комбинации с химическими или ферментативными методами с получением желаемого анти-CD79b антитела.
1. Выделение ДНК, кодирующей анти-CD79b антитело
ДНК, кодирующая анти-CD79b антитело, может быть получена из библиотеки кДНК, выделенной из ткани, которая предположительно мРНК анти-CD79b антитела и экспрессирует такую мРНК на детектируемом уровне. В соответствии с этим, человеческая ДНК анти-CD79b антитела может быть легко получена из библиотеки кДНК, выделенной из человеческой ткани. Ген, кодирующий анти-CD79b антитело, может быть также получен из геномной библиотеки или с применением известных методов синтеза (например, автоматизированного синтеза нуклеиновых кислот).
Библиотеки могут быть скринированы с использованием зондов (таких как олигонуклеотиды, состоящие по меньшей мере примерно из 20-80 оснований), сконструированных в целях идентификации представляющего интерес гена или белка, кодируемого этим геном. Скрининг кДНК или геномной библиотеки с использованием выбранного зонда может быть осуществлен в соответствии со стандартными процедурами, такими как процедуры, описанные в публикации Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Альтернативным методом выделения гена, кодирующего анти-CD79b антитело, является ПЦР-технология [Sambrook et al., см. выше; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
32
Методы скрининга библиотеки кДНК хорошо известны специалистам. Олигонуклеотидные последовательности, выбранные в качестве зондов, должны иметь длину, достаточную и достаточно точно определенную для минимизации ложноположительных результатов. Олигонуклеотиды предпочтительно метят так, чтобы они могли быть детектированы после гибридизации с ДНК в библиотеке, подвергаемой скринингу. Методы мечения хорошо известны специалистам и включают использование радиоактивных меток, таких как P-меченный ATP, биотинилирование или ферментативное мечение. Условия гибридизации, включая условия умеренной и высокой жесткости, описаны в руководстве Sambrook et al., см. выше.
Последовательности, идентифицированные в таких методах скрининга библиотек, могут быть подвергнуты сравнению и выравниванию с другми известными последовательностями, депонированными и имеющимися в общедоступных базах данных, таких как GenBank или в других частных базах данных последовательностей. Идентичность последовательностей (на уровне аминокислот или нуклеотидов) в определенных областях молекулы или по всей полноразмерной последовательности может быть определена методами, известными специалистам и описанными в настоящей заявке.
Нуклеиновая кислота, имеющая белок-кодирующую последовательность, может быть получена путем скрининга выбранной кДНК или геномных библиотек с использованием выведенной аминокислотной последовательности, впервые описанной в настоящей заявке, и, если это необходимо, в соответствии со стандартными процедурами удлинения праймеров, описанными в руководстве Sambrook et al., см. выше, для обнаружения предшественников и процессинга промежуточных форм мРНК, которые не могут быть подвергнуты обратной транскрипции в кДНК.
2. Отбор и трансформация клеток-хозяев
Клетки-хозяева трансфицируют или трансформируют с использованием описанных здесь экспрессионных или клонирующих векторов в целях продуцирования анти-CD79b антител, а затем культивируют в стандартной питательной среде, модифицированной, если это необходимо, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности. Условия культивирования, такие как среда, температура, рН и т.п., могут быть выбраны специалистом без излишнего экспериментирования. В основном принципы, протоколы и практические методы максимизации продуктивности клеточных культур можно найти в публикации Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) и Sambrook et al., см. выше.
2
4
Методы трансфекции эукариотических и трансформации прокариотических клеток, включающие введение ДНК в клетку-хозяина в целях репликации ДНК либо в качестве внехромосомного или хромосомного интегратора, известны среднему специалисту в данной области, например, такими методами являются методы, опосредуемые CaCl, CaPO и липосомами, методы с использованием полиэтиленгликоля/ДМСО и электропорация. В зависимости от используемых клеток-хозяев трансформацию осуществляют стандартными методами, подходящими для таких клеток-хозяев. В случае использования прокариотов, обычно проводят обработку кальцием, а именно хлоридом кальция, как описано в руководстве Sambrook et al., см. выше, или электропорацию. Инфицирование Agrobacterium tumefaciens проводят в целях трансформации некоторых клеток растений, как описано в публикации Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) и в заявке WO 89/05859, опубликованной 29 июня 1989 г. В случае использования клеток млекопитающих, не содержащих клеточных стенок, может быть применен метод преципитации фосфатом кальция, описанный Graham и van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Общие аспекты трансфекции систем клеток-хозяев млекопитающих описаны в патенте США № 4399216. Трансформацию в дрожжах обычно осуществляют методом, описанным Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) и Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Однако для введения ДНК в клетки могут быть применены и другие методы, например, такие как микроинжекция в ядро, электропорация, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками, либо методы с использованием поликатионов, например, полибрена, полиорнитина. Различные методы трансформации клеток млекопитающих можно найти в публикациях Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) и Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессия ДНК в векторах являются прокариотические клетки, дрожжевые клетки или высшие эукариотические клетки.
a. Прокариотические клетки-хозяева
r
P
7
r
R
λ
Подходящими прокариотами являются, но не ограничиваются ими, архебактерии и эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные микроорганизмы, например, Enterobacteriaceae, такие как E. coli. Различные штаммы E. coli являются общедоступными, такие как E. coli K12 штамм MM294 (ATCC 31446); E. coli X1776 (ATCC 31537); E. coli штамм W3110 (ATCC 27325) и K5 772 (ATCC 53635). Другими подходящими прокариотическими клетками-хозяевами являются Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как B. subtilis и B. licheniformis (например, B. licheniformis 41P, описанные в DD 266710, опубликованной 12 апреля 1989 г.), Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, Rhizobia, Vitreoscilla, Paracoccus и Streptomyces. Эти примеры приводятся лишь в иллюстративных, но не ограничивающих целях. Одним из наиболее предпочтительных хозяев или родительских клеток-хозяев является штамм W3110, поскольку он является наиболее распространенным штаммом-хозяином для ферментации рекомбинантных продуктов ДНК. Клетки-хозяева предпочтительно секретируют минимальное количество протеолитических ферментов. Так, например, штамм W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC, депозит № 27325) может быть модифицирован так, чтобы он имел генетическую мутацию в генах, кодирующих белки, которые являются эндогенными для хозяина, где примерами таких хозяев являются E. coli W3110 штамм 1A2, который имеет полный генотип tonA; E. coli W3110 штамм 9E4, который имеет полный генотип tonA ptr3; E. coli W3110 штамм 27C7 (ATCC 55244), который имеет полный генотип tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan; E. coli W3110 штамм 37D6, который имеет полный генотип tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 deg ompT rbs ilvG kan; E. coli W3110 штамм 40B4, который представляет собой штамм 37D6 с делеционной мутацией degP и который не является резистентным к канамицину; E. coli W3110 штамм 33D3, имеющий генотип W3110 ∆fhuA (∆tonA) ptr3 lac Iq lacL8 ∆ompT∆(nmpc-fepE) degP41 kan (патент США № 5639635), и штамм E. coli, имеющий мутантную периплазматическую протеазу и описанный в патенте США № 4946783, выданном 7 августа 1990 г. Подходящими также являются и другие штаммы и производные, такие как E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31537) и E. coli RV308(ATCC 31608). Эти примеры приводятся лишь в целях иллюстрации и не являются ограничивающими. Методы конструирования производных любых вышеупомянутых бактерий, имеющих определенные генотипы, известны специалистам и описаны, например, Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Вообще говоря, соответствующие бактерии должны быть выбраны с учетом реплицируемости репликона в клетках бактерий. Так, например, клетки вида E. coli, Serratia, или Salmonella могут быть использованы в качестве хозяев, если для доставки репликона используются хорошо известные плазмиды, такие как pBR322, pBR325, pACYC177 или pKN410. Обычно клетки-хозяева должны секретировать минимальное количество протеолитических ферментов, а при желании в клеточную культуру могут быть введены дополнительные ингибиторы протеазы. Альтернативно подходящими методами клонирования in vitro являются, например, ПЦР или другие полимеразные реакции нуклеиновых кислот.
Полноразмерное антитело, фрагменты антител и гибридные белки антител могут быть продуцированы в бактериях, а в частности, если отсутствует потребность в гликозилировании и в эффекторых функциях Fc, например, в том случае, если терапевтическое антитело конъюгировано с цитотоксическим средством (например, с токсином), а сам иммуноконъюгат является эффективным для деструкции опухолевых клеток. Полноразмерные антитела имеют более длительное время полужизни в кровотоке. Продуцирование в E. coli является более быстрым и менее дорогостоящим методом. Экспрессия фрагментов антител и полипептидов в бактериях проиллюстрирована, например, в патенте США № 5648237 (Carter et. al.), в патенте США № 5789199 (Joly et al.), и в патенте США № 5840523 (Simmons et al.), где описаны последовательности области инициации трансляции (TIR) и сигнальные последовательности для оптимизации экспрессии и секреции, и указанные патенты вводятся в настоящее описание посредством ссылки. После экспрессии антитело выделяют из клеточной пасты E. coli в виде растворимой фракции, и такое антитело может быть очищено, например, на колонке с белком А или G-белком, в зависимости от изотипа. Конечная очистка может быть осуществлена способом, аналогичным способу очистки антител, экспрессируемых в клетках СНО.
b. Эукариотические клетки-хозяева
Помимо прокариотов, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих анти-CD79b антитело, являются эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы. Наиболее часто используемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином являются Saccharomyces cerevisiae. Другими микроорганизмами являются Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139383, опубликованный 2 мая 1985 г.); клетки-хозяева Kluyveromyces (патент США № 4943529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), такие как, например, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans и K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis (EP 394538, опубликованный 31 октября 1990 г.); и нитчатые грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (заявка WO 91/00357, опубликованная 10 января 1991 г.), и клетки-хозяева Aspergillus, такие как A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 [1984]) и A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Подходящими также являются, но не ограничиваются ими, метилотропные дрожжи, например, дрожжи, способные расти на метаноле и выбранные из рода, состоящего из Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis и Rhodotorula. Список конкретных видов, принадлежащих к этому классу дрожжей, можно найти в публикации C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии и гликозилирования анти-CD79b антитела, могут быть получены из многоклеточных организмов. Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9, а также клетки растений, такие как клеточные культуры хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петуньи, томатов и табака. Были идентифицированы различные бакуловирусные штаммы и варианты, и соответствующие пермиссивные клетки-хозяева насекомых, происходящие от таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Ряд вирусных штаммов для трансфекции является общедоступным, например, вариант L-1 Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы могут быть использованы в качестве вируса согласно изобретению, а в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) становится рутинной процедурой. Примерами подходящих клеточных линий хозяев млекопитающих являются клетки почки обезьяны CV1, трансформированные вирусом SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); клеточная линия почки человеческого эмбриона (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки детеныша хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собак (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени лабораторной крысы Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065 опухолевые клетки мышиной молочной железы (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и клеточная линия человеческой гепатомы (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными экспрессирующими или клонирующими векторами для продуцирования анти-CD79b антитела и культивируют в стандартной питательной среде, модифицированной, если это необходимо, для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности.
3. Отбор и применение реплицирующегося вектора
Для рекомбинантного продуцирования антитела согласно изобретению нуклеиновую кислоту (например, кДНК или геномную ДНК), кодирующую такое антитело, выделяют и встраивают в реплицируемый вектор для последующего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. ДНК, кодирующая антитело, может быть легко выделена и секвенирована в соответствии со стандартными процедурами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела). Для этой цели подходящими являются многие векторы. Выбор вектора отчасти зависит от используемой клетки-хозяина. В основном предпочтительными клетками-хозяевами являются либо прокариотические клетки, либо эукариотические клетки (обычно клетки млекопитающих).
Этот вектор может быть, например, получен в форме плазмиды, космиды, вирусной частицы или фага. Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты может быть встроена в вектор в соответствии с различными процедурами. В основном ДНК встраивают в соответствующий(ие) сайт(ы) рестриктирующей эндонуклеазы методами, известными специалистам. Векторными компонентами обычно являются, но не ограничиваются ими, одна или несколько сигнальных последовательностей, ориджин репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. Конструирование подходящих векторов, содержащих один или несколько из указанных компонентов, осуществляют стандартными методами лигирования, известными специалистам.
CD79b может быть продуцирован рекомбинантно не только прямым методом, но также в виде гибрида полипептида с гетерологичным полипептидом, который может представлять собой сигнальную последовательность, или с другим полипептидом, имеющим специфический сайт расщепления у N-конца зрелого белка или полипептида. В общих чертах, указанной сигнальной последовательностью может быть компонент вектора, либо такой последовательностью может быть часть ДНК, кодирующая анти-CD79b антитело, которую встраивают в данный вектор. Сигнальной последовательностью может быть прокариотическая сигнальная последовательность, выбранная, например, из группы, состоящей из лидерной последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или термостабильного энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах сигнальной последовательностью может быть, например, лидерная последовательность дрожжевой инвертазы, лидерная последовательность альфа-фактора (включая лидерные последовательности α-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces, причем вторая из этих последовательностей описана в патенте США № 5010182) или лидерная последовательность кислой фосфатазы, лидерная последовательность глюкоамилазы C. albicans (патент EP 362179, опубликованный 4 апреля 1990 г.), или сигнальная последовательность, описанная в заявке WO 90/13646, опубликованной 15 ноября 1990 г. При экспрессии в клетках млекопитающих, для прямой секреции белка могут быть использованы сигнальные последовательности млекопитающих, такие как сигнальные последовательности, происходящие от секретируемых полипептидов того же самого вида или родственных видов, а также вирусные секреторные лидерные последовательности.
а. Прокариотические клетки-хозяева
Полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные компоненты антитела согласно изобретению, могут быть получены стандартными рекомбинантными методами. Нужные полинуклеотидные последовательности могут быть выделены и секвенированы из антитело-продуцирующих клеток, таких как гибридомные клетки. Альтернативно полинуклеотиды могут быть синтезированы с помощью синтезатора нуклеотидов или ПЦР-методами. После получения последовательностей, кодирующих полипептиды, эти последовательности встраивают в рекомбинантный вектор, способный реплицироваться и экспрессировать гетерологичные полинуклеотиды в прокариотических хозяевах. В целях настоящего изобретения могут быть использованы многие доступные и известные векторы. Выбор соответствующего вектора зависит, главным образом, от размера нуклеиновых кислот, встраиваемых в указанный вектор, и от конкретной клетки-хозяина, трансформируемой этим вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты, в зависимости от его функции (амплификации или экспрессии гетерологичного полинуклеотида, или того и другого) и от его совместимости с конкретной клеткой-хозяином, в которой он находится.
В основном плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, происходящие от видов, совместимых с клеткой-хозяином, используются вместе с этими же хозяевами. Такие экспрессирующие и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, способствующую репликации вектора в одной или нескольких выбранных клетках-хозяевах, а также последовательности-маркеры, позволяющие проводить фенотипический отбор в трансформированных клетках. Такие последовательности различных бактерий, дрожжей и вирусов хорошо известны. Ориджин репликации, происходящий от плазмиды pBR322 и содержащий гены, кодирующие резистентность к ампициллину (Amp) и к тетрациклину (Tet), а также позволяющий легко идентифицировать трансформированные клетки, является подходящим для большинства грамотрицательных бактерий; ориджин плазмиды 2μ является подходящим для дрожжей, а различные вирусные ориджины (SV40, вируса полиомы, аденовируса, VSV или BPV) являются подходящими для клонирования векторов в клетки млекопитающих. pBR322, ее производные или другие микробные плазмиды или бактериофаг могут также содержать промоторы, которые могут быть использованы этим микробным организмом для экспрессии эндогенных белков, либо они могут быть модифицированы так, чтобы они содержали такие промоторы. Примеры производных pBR322, используемых для экспрессии конкретных антител, подробно описаны в патенте США № 5648237, Carter et al.
Кроме того, фаговые векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, совместимые с микроорганизмом-хозяином, могут быть использованы в качестве трансформирующих векторов в комбинации с этими хозяевами. Так, например, бактериофаг, такой как λGEM.TM.-11, может быть использован для получения рекомбинантного вектора, который может быть применен для трансформации восприимчивых клеток-хозяев, таких как E.coli LE392.
Экспрессионный вектор согласно изобретению может содержать две или более пар промотор-цистрон, кодирующих каждый из полипептидных компонентов. Промотором является нетранслируемая регуляторная последовательность, локализованная выше (со стороны 5'-конца) от цистрона, модулирующего ее экспрессию. Прокариотические промоторы обычно подразделяются на два класса, индуцибельные и конститутивные. Индуцибельным промотором является промотор, который инициирует повышение уровней транскрипции цистрона, находящегося под его контролем, в ответ на изменения условий культивирования, например, в присутствии или в отсутствие питательных элементов или при изменении температуры.
Большинство промоторов, распознаваемых различными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны специалистам. Выбранный промотор может быть функционально присоединен к цистронной ДНК, кодирующей легкую или тяжелую цепь, путем выделения промотора из ДНК-источника посредством ее гидролиза рестриктирующими ферментами и встраивания выделенной промоторной последовательности в вектор согласно изобретению. Нативная промоторная последовательность и многие гетерологичные промоторы могут быть использованы для прямой амплификации и/или экспрессии генов-мишеней. В некоторых вариантах изобретения используются гетерологичные промоторы, поскольку они, по сравнению с нативным промотором для нужных полипептидов, позволяют значительно повышать уровень транскрипции и увеличивать выходы экспрессируемого гена-мишени.
Промоторы, распознаваемые различными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны специалистам. Промоторами, подходящими для использования в прокариотических хозяевах, являются промотор PhoA, промоторные системы β-галактамазы и лактозы [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], промоторная система щелочной фосфатазы и триптофана (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36776] и гибридные промоторы, такие как промотор tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)] или промотор trc. Промоторы, используемые в бактериальных системах, также могут содержать последовательность Шайна-Дальгарно (S.D.), функционально присоединенную к ДНК, кодирующей анти-CD79b антитело. Однако могут быть также использованы и другие промоторы, которые являются функциональными в бактериях (например, другие известные бактериальные или фаговые промоторы). Нуклеотидные последовательности этих промоторов были опубликованы, что облегчает специалистам в данной области проводить их функциональное лигирование с цистронами, кодирующими нужные легкие и тяжелые цепи (Siebenlist et al. (1980) Cell 20:269), с использованием линкеров или адаптеров для доставки всех требуемых рестрикционных сайтов.
В одном из аспектов изобретения каждый цистрон в рекомбинантном векторе содержит такой компонент, как секреторная сигнальная последовательность, регулирующая транслокацию экспрессируемых полипептидов через мембрану. В общих чертах, указанной сигнальной последовательностью может быть компонент вектора, либо такой последовательностью может быть часть нужного ДНК-полипептида, встраиваемого в этот вектор. Сигнальной последовательностью, выбранной в целях осуществления изобретения, должна быть последовательность, распознаваемая и процессируемая (то есть отщепляемая сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. В случае использования прокариотических клеток-хозяев, не распознающих и не процессирующих сигнальные последовательности, которые являются нативными для гетерологичных полипептидов, эту сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью, выбранной, например, из группы, состоящей из лидерной последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или термостабильного энтеротоксина II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA и МВР. В одном из вариантов изобретения сигнальными последовательностями, используемыми в обоих цистронах экспрессионной системы, являются сигнальные последовательности STII или их варианты.
В другом аспекте изобретения продуцирование иммуноглобулинов согласно изобретению может происходить в цитоплазме клетки-хозяина, и поэтому в данном случае не требуется присутствия секретирующих сигнальных последовательностей в каждом цистроне. В соответствии с этим, легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина экспрессируются и подвергаются укладке и сборке с образованием функциональных иммуноглобулинов в цитоплазме. Некоторые штаммы хозяев (например, trxB-штаммы E.coli) имеют соответствующие условия в цитоплазме, которые благоприятствуют образованию дисульфидных связей и тем самым способствуют правильной укладке и сборке субъединиц экспрессируемого белка. Proba & Pluckthun, Gene, 159:203 (1995).
Настоящее изобретение относится к экспрессионной системе, в которой количественное отношение экспрессируемых полипептидных компонентов может быть смодулировано для максимизации выхода секретируемых и соответствующим образом собранных антител согласно изобретению. Такую модуляцию осуществляют, по меньшей мере частично, посредством одновременной модуляции активности трансляции полипептидных компонентов.
Один из методов модуляции трансляционной активности описан в патенте США 5840523 Simmons et al. В этом методе используются варианты области инициации трансляции (TIR) в цистроне. Для данной TIR может быть создана серия вариантов аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты с рядом трансляционных активностей, что дает возможность корректировать этот фактор для достижения нужного уровня экспрессии конкретной цепи. Варианты TIR могут быть продуцированы стандартными методами мутагенеза, в результате чего в кодоны могут быть внесены изменения, которые могут модифицировать аминокислотную последовательность, хотя предпочтительными являются молчащие мутации в нуклеотидной последовательности. Модификациями в TIR могут быть, например, изменения числа последовательностей Шайна-Дальгарно или расстояния между ними, а также изменения в сигнальной последовательности. Одним из способов получения мутантных сигнальных последовательностей является создание «банка кодонов» в начале кодирующей последовательности, которая не изменяет аминокислотную последовательность сигнальной последовательности (то есть такие модификации являются молчащими). Это может быть достигнуто путем замены третьего нуклеотида каждого кодона, а также замены некоторых аминокислот, таких как лейцин, серин и аргинин, во многих первых и вторых положениях, которые могут создавать определенные трудности при получении такого банка. Этот метод мутагенеза подробно описан в публикации Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.
Набор векторов предпочтительно генерируют с использованием TIR-активности для каждого цистрона. Этот ограниченный набор дает возможность сравнивать уровни экспрессии каждой цепи, а также выходы нужных продуктов антител при различных комбинациях TIR-активности. TIR-активность может быть определена путем количественной оценки уроней экспрессии гена-репортера, как подробно описано в патенте США № 5840523 Simmons et al. Исходя из сравнения трансляционных активностей, могут быть выбраны отдельные нужные TIR, которые могут быть объединены в конструкциях экспрессионных векторов согласно изобретению.
b. Эукариотические клетки-хозяева
Компонентами векторов обычно являются, но не ограничиваются ими, один или несколько из следующих компонентов: сигнальная последовательность, ориджин репликации, один или несколько маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции.
(1) Компонент сигнальная последовательность
Вектор, используемый в эукариотических клетках-хозяевах, может также содержать сигнальную последовательность или другой полипептид, имеющий специфический сайт расщепления у N-конца зрелого белка, или представляющий интерес полипептид. Выбранной гетерологичной сигнальной последовательностью предпочтительно является последовательность, которая распознается и процессируется (то есть отщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Для экспрессии в клетках млекопитающих используются сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например, сигнальная последовательность gD вируса простого герпеса.
ДНК для такой области предшественника лигируют с антитело-кодирующей ДНК с сохранением рамки считывания.
(2) Ориджин репликации
Обычно такой компонент, как ориджин репликации, не является необходимым для экспрессионных векторов млекопитающих. Так, например, ориджин репликации SV40 обычно используется только потому, что он содержит ранний промотор.
(3) Компонент селективный ген
Экспрессионный и клонирующий векторы обычно содержат селективный ген, также называемый селективным маркером. Обычно селективные гены кодируют белки, которые (а) сообщают резистентность к антибиотиками или к другим токсинам, например, к ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, (b) компенсируют дефицит, обусловленный ауксотрофией, если это необходимо, или (с) обеспечивают доставку важных питательных веществ, которые не поступают из комплексных сред, например, гена, кодирующего D-аланин-рацемазу для Bacilli.
Одним из примеров схемы отбора является использование лекарственного средства, прекращающего рост клетки-хозяина. Клетки, которые были успешно трансформированы гетерологичным геном, продуцируют белок, сообщающий резистентность к лекарственному средству и тем самым способствующий выживанию этих клеток в селективной среде. Для такого доминантного отбора могут быть использованы, например, лекарственные средства, такие как неомицин, микофеноловая кислота и гигромицин.
Примером подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих являются маркеры, которые позволяют идентифицировать клетки, способные встраивать нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-CD79b антитело, такую как гены DHFR, тимидинкиназы, металлотионеина-I и II, а предпочтительно гены, кодирующие металлотионеин приматов, аденозин-дезаминазу, орнитин-декарбоксилазу и т.п. В случае DHFR дикого типа подходящей клеткой хозяином является клеточная линия CHO, дефицитная по DHFR-активности (например, ATCC CRL-9096), и такая клеточная линия была получена и размножена, как описано в публикации Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Так, например, клетки, трансформированные селективным геном DHFR, сначала идентифицируют путем культивирования всех трансформантов в культуральной среде, содержащей метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Альтернативно клетки-хозяева (в частности, хозяева дикого типа, содержащие эндогенный DHFR), трансформированные или котрансформированные ДНК-последовательностями, кодирующими антитело, белок DHFR дикого типа и другой селективный маркер, такой как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (АРН), могут быть отобраны путем культивирования клеток в среде, содержащей агент для отбора, проводимого с использованием селективного маркера, такого как аминогликозидный антибиотик, например, канамицин, неомицин или G418. См. патент США № 4965199.
Подходящим селективным геном для использования в дрожжах является ген trp1, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. Ген trp1 представляет собой селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, который не способен расти в присутствии триптофана, например, штамма, депонированного в ATCC № 44076 или РЕР4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
(4) Компонент промотор
Экспрессионные и клонирующие векторы обычно содержат промотор, функционально присоединенный к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-CD79b антитело, для прямого синтеза мРНК. Промоторы, распознаваемые различными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны специалистам.
Фактически, все гены эукариотов имеют АТ-богатую область, локализованную приблизительно в области, расположенной на 25-30 нуклеотидов выше от сайта инициации транскрипции. Другой такой последовательностью, локализованной приблизительно в области, расположенной на 70-80 нуклеотидов выше от сайта инициации транскрипции многих генов, является область CNCAAT, где N может означать любой нуклеотид. У 3'-конца большинства эукариотических генов расположена последовательность ААТААА, которая может служить сигналом для присоединения поли A-хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности. Все указанные последовательности могут быть соответствующим образом встроены в эукариотические экспрессионные векторы.
Примерами промоторных последовательностей, подходящих для использования в дрожжевых клетках-хозяевах, являются промоторы 3-фосфоглицерат-киназы [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)], или других гликолитических ферментов [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, гексокиназа, пируват-декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат-изомераза, 3-фосфоглицерат-мутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.
Другими дрожжевыми промоторами, которые представляют собой индуцибельные промоторы, имеющие дополнительное преимущество, заключающееся в их способности регулировать транскрипцию в определенных условиях культивирования, являются промоторные области генов алкоголь-дегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, гидролитических ферментов, ассоциированных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Векторы и промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжах, также описаны в ЕР 73657.
Транскрипция анти-CD79b антител из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих регулируется, например, промоторами, полученными из геномов таких вирусов, как вирус полиомы, вирус оспы домашней птицы (заявка UK 2211504, опубликованная 5 июля 1989 г.), аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус коровьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В, а наиболее предпочтительно обезьяний вирус 40 (SV40); гетерологичными промоторами млекопитающих, например, промотором актина или промотором иммуноглобулина; и промоторами белков теплового шока, при условии, что такие промоторы являются совместимыми с системами клеток-хозяев.
Ранние и поздние промоторы вируса SV40 обычно получают в виде рестрикционного фрагмента SV40, который также содержит ориджин репликации вируса SV40. Предранний промотор человеческого цитомегаловируса обычно получают в виде рестрикционного HindIII-фрагмента Е. Система экспрессии ДНК в клетках-хозяевах млекопитающих, полученная на основе коровьего папилломавируса, используемого в качестве вектора, описана в патенте США № 4419446. Модификация такой системы описана в патенте США № 4601978. Экспрессия кДНК человеческого β-интерферона в мышиных клетках под контролем промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса также описана в публикации Reyers et al., Nature 297:598-601 (1982). Альтернативно в качестве промотора может быть использован вирус саркомы Рауса, имеющий длинный концевой повтор.
(5) Компонент энхансерный элемент
Транскрипция ДНК, кодирующей анти-CD79b антитело, в высших эукариотах может быть усилена при встраивании в вектор энхансерной последовательности. Энхансерами являются цис-действующие элементы ДНК, обычно примерно от 10 до 300 п.н., которые, действуя на промотор, усиливают его активность в инициации транкрипции. В настоящее время известно много энхансерных последовательностей, происходящих от генов млекопитающих (генов глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина). Однако, обычно используется энхансер от вируса эукариотической клетки. Примерами является энхансер вируса SV40, локализованный в поздней области ориджина репликации (100-270 п.н.), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомавируса, локализованный в поздней области ориджина репликации, и энхансеры аденовируса. См. также публикацию Yaniv, Nature 297:17-18 (1982), в которой описаны энхансерные элементы для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в 5'- или 3'-положении по отношению к последовательности, кодирующей анти-CD79b антитело, но предпочтительно, чтобы он находился в 5'-положении от промотора.
(6) Компонент терминации транскрипции
Экспрессионные векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (в дрожжах, грибах, насекомых, растениях, у животных, у человека или в ядро-содержащих клетках, происходящих от других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно расположены со стороны 5'-конца, а иногда 3'-конца от нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибированные в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслированной части мРНК, кодирующей анти-CD79b антитело. Одним из подходящих компонентов терминации транскрипции является область полиаденилирования коровьего гормона роста. См. описание экспрессионных векторов в WO 94/11026 и в настоящей заявке.
Другие методы, векторы и клетки-хозяева, подходящие для адаптации к синтезу анти-CD79b антитела в рекомбинантных клеточных культурах позвоночных, описаны в публикации Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); в ЕР 117060 и ЕР 117058.
4. Культивирование клеток-хозяев
Клетки-хозяева, используемые для продуцирования анти-CD79b антитела согласно изобретению, могут быть культивированы в различных средах.
а. Прокариотические клетки-хозяева
Прокариотические клетки, используемые для продуцирования полипептидов согласно изобретению, культивируют в среде, известной специалистам и подходящей для культивирования выбранных клеток-хозяев. Примерами подходящей среды является бульон Луриа (LB) с необходимыми питательными добавками. В некоторых вариантах изобретения такая среда также содержит средство для отбора, выбранное, исходя из конструирования экспрессионного вектора, которое способствуют селективному росту прокариотических клеток, содержащих экспрессионный вектор. Так, например, в среду для культивирования клеток, экспрессирующих ген резистентности к ампициллину, добавляют ампициллин.
Помимо источников углерода, азота и неорганического фосфата, в среду могут быть также включены любые необходимые добавки в соответствующих концентрациях, вводимые как отдельно, так и в смеси с другими добавками или средой, такими как комплексный источник азота. Культуральная среда может, но необязательно, содержать один или несколько восстановителей, выбранных из группы, состоящей из глутатиона, цистеина, цистамина, тиогликолята, дитиоэритритола и дитиотреитола.
Прокариотические клетки-хозяева культивируют при соответствующих температурах. Для культивирования E. coli предпочтительной температурой является, например, температура примерно от 20°С до 39°С, более предпочтительно примерно от 25°С до 37°С, а еще более предпочтительно примерно при 30°С. рН среды может варьироваться в пределах примерно от 5 до 9, в зависимости, главным образом, от организма хозяина. Для E. coli, рН составляет предпочтительно примерно от 6,8 до 7,4, а более предпочтительно примерно 7,0.
Если в экспрессионном векторе согласно изобретению используется индуцибельный промотор, то экспрессия белка индуцируется в условиях, подходящих для активации данного промотора. В одном из аспектов изобретения, для регуляции транскрипции полипептидов, используются промоторы PhoA. В соответствии с этим, трансформированные клетки-хозяева культивируют в среде для индуцирования с ограниченным содержанием фосфата. Предпочтительной средой с ограниченным содержанием фосфата является среда С.R.А.Р. (см., например, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002) 263:133-147). В комбинации с используемой векторной конструкцией могут быть использованы и различные другие индукторы, известные специалистам.
В одном из вариантов изобретения экспрессируемые полипептиды согласно изобретению секретируются в периплазму клеток-хозяев и могут быть выделены из этой периплазмы. Выделение белка, главным образом, осуществляют путем дизрупции микроорганизма, обычно такими методами, как осмотический шок, обработка ультразвуком или лизис. После дизрупции клеток клеточный дебрис или целые клетки могут быть удалены путем центрифугирования или фильтрации. Эти белки могут быть дополнительно очищены, например, с помощью хроматографии на аффинной смоле. Альтернативно белки могут транспортироваться в клеточную среду и отделяться от нее. Клетки могут быть удалены из культуры, а супернатант культуры может быть подвергнут фильтрации и концентированию для дополнительной очистки полученных белков. Экспрессированные полипептиды могут быть затем выделены и идентифицированы хорошо известными методами, такими как электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) и Вестерн-блот-анализ.
В одном из аспектов изобретения антитела продуцируют в большом количестве посредством ферментации. Для получения рекомбинантных белков могут быть проведены различные крупномасштабные процедуры ферментации в культуре с подпиткой. Крупномасштабную ферментацию проводят в ферментере емкостью по меньшей мере 1000 литров, а предпочтительно примерно от 1000 до 100000 литров. Такие ферментеры снабжены лопастной мешалкой для равномерного распределения кислорода и микроэлементов, а в частности, глюкозы (предпочтительного источника углерода/энергии). Термин “лабораторная ферментация”, в общих чертах, означает ферментацию в ферментере объемом не более чем примерно 100 литров, и такой объем может варьироваться примерно от 1 литра до 100 литров.
550
В процессе ферментации индуцирование экспрессии белков обычно инициируют после того, как клетки, культивируемые в подходящих условиях, достигнут нужной плотности, например, OD, составляющей примерно 180-220, то есть ранней стационарной фазы. В комбинации с используемой векторной конструкцией могут быть использованы и различные другие индукторы, известные специалистам и описанные выше. Перед индуцированием клетки могут быть культивированы в течение меньшего периода времени. Клетки обычно индуцируют в течение примерно 12-50 часов, хотя время индуцирования может быть увеличено или уменьшено.
Для увеличения выхода продукта и для улучшения качества полипептидов согласно изобретению могут быть изменены различные условия ферментации. Так, например, для обеспечения “правильной” сборки и укладки секретированных полипептидов антител могут быть использованы дополнительные векторы, в которых происходит сверхэкспрессия белков-шаперонов, таких как белки Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD и/или DsbG) или FkpA (пептидилпролил-цис,транс-изомераза с шаперонной активностью), и которые предназначены для котрансформации прокариотических клеток-хозяев. Было продемонстрировано, что белки-шапероны облегчают правильную укладку и растворимость гетерологичных белков, продуцируемых в бактериальных клетках-хозяевах. Chen et al. (1999) J. Bio. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., патент США № 6083715; Georgiou et al., патент США № 6027888; Bothmann & Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm & Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.
Для минимизации протеолиза экспрессируемых гетерологичных белков (а в частности, белков, которые являются протеолитически чувствительными), в настоящем изобретении могут быть использованы некоторые штаммы-хозяева, дефицитные по протеолитическим ферментам. Так, например, штаммы клеток-хозяев могут быть модифицированы для введения генетической(их) мутации(й) в гены, кодирующие известные бактериальные протеазы, такие как протеаза III, OmpT, DegP, Tsp, протеаза I, протеаза Mi, протеаза V, протеаза VI и их комбинации. Некоторые дефицитные по протеазе штаммы E. coli являются доступными и описаны, например, в публикации Joly et al. (1998), см. выше; Georgiou et al., патент США № 5264365; Georgiou et al., патент США № 5508192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
В одном из вариантов изобретения штаммы E. coli, дефицитные по протеолитическим ферментам и трансформированные плазмидами, сверхэкспрессирующими один или несколько белков-шаперонов, используются в качестве клеток-хозяев в экспрессионной системе согласно изобретению.
b. Эукариотические клетки-хозяева
ТМ
Коммерчески доступными средами, подходящими для культивирования клеток-хозяев, являются среды, такие как среда Хэмса F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ((МЕМ), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по Дульбекко среда Игла (DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве культуральной среды для культивирования клеток-хозяев может быть использована любая среда, описанная в публикации Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), в патентах США №№ 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 или 5122469; в WO 90103430; в WO 87/00195 или в патенте США Re. № 30985. В любую из этих сред могут быть добавлены, если это необходимо, гормоны и/или другие факторы роста (такие как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), соли (такие как хлорид натрия и фосфат кальция и магния), буферы (такие как HEPES), нуклеотиды (такие как аденозин и тимидин), антибиотики (такие как лекарственное средство гентамицин), микроэлементы (определенные как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярных дозах) и глюкоза или эквивалентный источник энергии. Могут быть также включены любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, известных специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., аналогичны условиям, ранее используемым для экспрессии выбранных клеток-хозяев, и известны среднему специалисту в данной области.
5. Детектирование амплификации/экспрессии гена
Амплификация и/или экспрессия гена может быть измерена в образце непосредственно, например, с помощью Саузерн-блоттинга, нозерн-блоттинга для количественной оценки транскрипции мРНК [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], дот-блоттинга (анализа ДНК) или гибридизации in situ с использованием соответствующим образом помеченного зонда, исходя из описанной здесь последовательности. Альтернативно могут быть использованы антитела, которые могут распознавать специфические дуплексы, включая ДНК-дуплексы, РНК-дуплексы и гибридные дуплексы ДНК-РНК или дуплексы ДНК-белок. Антитела, в свою очередь, могут быть помечены, и может быть проведен анализ, в котором дуплекс присоединяют к поверхности так, чтобы после образования дуплекса на поверхности можно было детектировать присутствие антитела, связанного с дуплексом.
Альтернативно экспрессия гена может быть измерена иммунологическими методами, такими как иммуногистохимическое окрашивание клеток или тканевых срезов и анализ клеточной культуры или физиологических жидкостей для прямой и количественной оценки экспрессии генного продукта. Антитела, подходящие для иммуногистохимического окрашивания и/или анализа образцов физиологической жидкости, могут быть моноклональными или поликлональными и могут быть получены у любого млекопитающего. В основном могут быть получены антитела против нативной последовательности полипептида CD79b или против синтетического пептида, полученного на основе описанных здесь последовательностей ДНК, или против экзогенной последовательности, присоединенной к ДНК CD79b и кодирующей эпитоп для специфического антитела.
6. Очистка анти-CD79b антитела
Формы анти-CD79b антитела могут быть выделены из культуральной среды или из лизатов клеток-хозяев. Если антитела являются мембраносвязанными, то они могут быть выделены из мембраны с использованием подходящего раствора детергента (например, тритона Х-100) или путем ферментативного расщепления. Клетки, используемые для экспрессии анти-CD79b антитела, могут быть подвергнуты дизрупции различными физическими или химическими методами, такими как проведение цикла замораживания-оттаивания, обработка ультразвуком, механическая дизрупция или использование агентов для лизиса клеток.
Может оказаться желательной очистка анти-CD79b антитела от рекомбинантных клеточных белков или полипептидов. Подходящими методами очистки являются следующие методы: фракционирование на ионообменной колонке, преципитация этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на двуокиси кремния или на катионообменной смоле, такой как DEAE; хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ, преципитация сульфатом аммония; гель-фильтрация с использованием, например, сефадекса G-75; очистка на колонках с белок А-сефарозой для удаления примесей, таких как IgG; и очистка на колонках, образующих хелатные комплексы с металлом, связывающиеся с меченными эпитопом формами анти-CD79b антитела. Могут быть применены различные методы очистки белков, и такие методы известны специалистам и описаны, например, в публикации Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Выбор стадии(й) очистки зависит, например, от природы используемого способа продуцирования и от конкретно продуцируемого анти-CD79b антитела.
C применением техники рекомбинантных ДНК антитело может быть продуцировано внутри клеток, либо оно может быть непосредственно секретировано в среду. Если в первой стадии антитело продуцируется внутри клеток, то клеточный дебрис или клетки-хозяева или их лизированные фрагменты удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. В публикации Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) описана процедура выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство E. coli. Вкратце, клеточную пасту оттаивают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), EDTA и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в течение приблизительно 30 минут. Клеточный дебрис может быть удален путем центрифугирования. Если антитело секретируется в среду, то обычно сначала концентрируют супернатанты, полученные из таких экспрессионных систем, с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например, устройства для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. Для ингибирования протеолиза в любой из предшествующих стадий может быть использован ингибитор протеазы, такой как PMSF, а для предупреждения размножения случайно вносимых примесных микроорганизмов могут быть использованы антибиотики.
Н
ТМ
Композиция антитела, полученная из клеток, может быть очищена, например, с помощью хроматографии на гидроксиапатитах, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, при этом предпочтительным методом очистки является аффинная хроматография. Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, присутствующего в данном антителе. Белок А может быть использован для очистки антител, содержащих тяжелые цепи γ1, γ2 или γ4 человеческого иммуноглобулина (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Для всех мышиных изотипов и для человеческой цепи γ3 рекомендуется G-белок (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). В качестве матрицы, с которой связывается аффинный лиганд, наиболее часто используется агароза, но могут быть использованы и другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с регулируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол, обеспечивают более высокую скорость потока и позволяют сократить время обработки, чем это может быть достигнуто с использованием агарозы. Если антитело содержит домен С3, то для его очистки может быть использована смола Bakerbond ABXTM (J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.). В зависимости от выделяемого антитела могут быть также применены и другие методы очистки белка, такие как фракционирование на ионообменной колонке, преципитация этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на двуокиси кремния, хроматография на гепарин-сефарозе, хроматография на анионо- или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ и преципитация сульфатом аммония.
После проведения любой(ых) предварительной(ых) стадии(й) очистки смесь, содержащая представляющее интерес антитело и примеси, может быть подвергнута гидрофобной хроматографии при низком рН с использованием элюирующего буфера при рН примерно 2,5-4,5, а предпочтительно при низкой концентрации соли (например, примерно 0-0,25 М).
G. Фармацевтические композиции
Конъюгаты «антитело-лекарственное средство» (ADC) согласно изобретению могут быть введены любым способом, подходящим для лечения данного состояния. ADC обычно вводят парентерально, то есть путем вливания, подхожно, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, интратекально и эпидурально.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В одном из вариантов изобретения, для лечения раковых заболеваний, конъюгат «антитело-лекарственное средство» вводят путем внутривенного вливания. Доза, вводимая путем вливания, составляет в пределах примерно от 1 мкг/м до примерно 10000 мкг/м на дозу и обычно вводится один раз в неделю, а всего могут быть введены одна, две, три или четыре дозы. Альтернативно такая доза составляет примерно от 1 мкг/м до 1000 мкг/м, примерно от 1 мкг/м до 800 мкг/м, примерно от 1 мкг/м до 600 мкг/м, примерно от 1 мкг/м до 400 мкг/м, примерно от 10 мкг/м до 500 мкг/м, примерно от 10 мкг/м до 300 мкг/м, примерно от 10 мкг/м до 200 мкг/м и примерно от 1 мкг/м до 200 мкг/м. Для устранения или ослабления симптомов заболевания доза может быть введена один раз в день, один раз в неделю, несколько раз в неделю, но при этом не каждый день; несколько раз в месяц, но при этом не каждый день; несколько раз в месяц, но при этом не каждую неделю; один раз в месяц или периодически. Введение может осуществляться в течение любого из указанных промежутков времени, до тех пор, пока не будет достигаться уменьшение опухоли или ослабление симптомов лимфомы и лейкоза, подвергаемого лечению. Введение может быть продолжено после ремиссии или ослабления симптомов заболевания, в случае, если при таком непрерывном введении ремиссия или ослабление симптомов все еще продолжаются.
2
2
2
2
Настоящее изобретение также относится к способу лечения аутоиммунного заболевания, где указанный способ включает введение пациенту, страдающему аутоиммунным заболеванием, терапевтически эффективного количества конъюгата «гуманизированное антитело MA79b-лекарственное средство» в соответствии с любым из предыдущих вариантов. В предпочтительных вариантах изобретения антитело вводят внутривенно или подкожно. Указанный конъюгат «антитело-лекарственное средство» вводят внутривенно в дозе, составляющей примерно от 1 мкг/м до 100 мкг/м на дозу, а в конкретном варианте изобретения от 1 мкг/м и примерно до 500 мкг/м. Для устранения или ослабления симптомов заболевания доза может быть введена один раз в день, один раз в неделю, несколько раз в неделю, но при этом не каждый день; несколько раз в месяц, но при этом не каждый день; несколько раз в месяц, но при этом не каждую неделю; один раз в месяц или периодически. Введение может осуществляться в течение любого из указанных промежутков времени, до тех пор, пока не будет достигаться устранение или ослабление симптомов указанного аутоиммунного заболевания, подвергаемого лечению. Введение может быть продолжено после ремиссии или ослабления симптомов заболевания, в случае, если при таком непрерывном введении такая ремиссия или ослабление симптомов все еще продолжается.
2
2
Настоящее изобретение также относится к способу лечения В-клеточного расстройства, включающему введение пациенту, страдающему В-клеточным расстройством, таким как В-клеточно-пролиферативное расстройство (включая, но не ограничиваясь ими, лимфому и лейкоз), или аутоиммунным заболеванием, терапевтически эффективного количества гуманизированного антитела MA79b в соответствии с любым из предыдущих вариантов, где указанное антитело не является конъюгированным с цитотоксической молекулой или с детектируемой молекулой. Указанное антитело обычно вводят в дозе примерно от 1 мкг/м до 1000 мкг/м.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одно анти-CD79b антитело и/или по меньшей мере один его иммуноконъюгат и/или по меньшей мере один конъюгат анти-CD79b антитело-лекарственное средство согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения фармацевтический препарат содержит (1) антитело согласно изобретению и/или его иммуноконъюгат, и (2) фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах изобретения фармацевтическая композиция содержит (1) антитело согласно изобретению и/или его иммуноконъюгат, и необязательно (2) по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство. Дополнительными терапевтическими средствами являются, но не ограничиваются ими, средства, описанные ниже. ADC обычно вводят парентерально, то есть путем вливания, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, интратекально и эпидурально.
Терапевтические композиции, содержащие анти-CD79b антитело или иммуноконъюгат с CD79b, используемые в соответствии с настоящим изобретением, получают в удобных для хранения формах путем смешивания антитела или иммуноконъюгата, имеющего нужную степень чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), с получением лиофилизованных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы в используемых дозах и концентрациях должны быть нетоксичными для реципиентов, и ими являются буферы, такие как ацетат, трис, фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; феноловый спирт, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (имеющие примерно менее чем 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; агенты, придающие тоничность, такие как трегалоза и хлорид натрия; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлокомплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как твин, плюроник или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Фармацевтические композиции, используемые для введения in vivo, обычно должны быть стерильными. Это может быть легко достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Описанные здесь композиции могут также содержать несколько активных соединений, необходимых для конкретного показания, а предпочтительно имеющих дополнительные активности, не оказывающие негативного влияния друг на друга. Так, например, помимо анти-CD79b антитела, в одну композицию может оказаться желательным включение дополнительного антитела, например, «второго» анти-CD79b антитела, которое связывается с другим эпитопом конкретной раковой опухоли. Альтернативно или дополнительно указанная композиция может также содержать химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, цитокин, рост-ингибирующий агент, антигормональный агент, кардиопротективное средство. Такие молекулы могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для применения в нужных целях.
Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулу, полученную, например, методами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозную или желатиновую микрокапсулу и полиметилметакрилатную микрокапсулу, соответственно, в системы для доставки коллоидальных лекарственных средств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такая методика описана в руководстве (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)).
Могут быть получены препараты пролонгированного высвобождения. Подходящими примерами препаратов пролонгированного высвобождения являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих иммуноглобулин согласно изобретению, где указанные матрицы имеют форму готовых изделий, например, пленок или микрокапсул. Примерами матриц пролонгированного высвобождения являются полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый сополимер этилена-винилацетата, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Полимеры, такие как сополимер этилена-винилацетата и сополимер молочной кислоты-гликолевой кислоты, способны высвобождать молекулы в течение более 100 дней, а некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Если инкапсулированные иммуноглобулины сохраняются в организме в течение длительного периода времени, то они могут денатурироваться или агрегироваться под воздействием влаги при 37°С, что приводит к потере биологической активности и к возможным изменениям иммуногенности. Для стабилизации, в зависимости от конкретного механизма, могут быть разработаны рациональные стратегии. Так, например, если было обнаружено, что механизмом агрегации является образование межмолекулярной S-S-связи посредством тио-дисульфидного обмена, то стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислотных растворов, регуляции содержания влаги с использованием соответствующих добавок и получения конкретных композиций на основе полимерной матрицы.
Антитело может быть получено в любой подходящей форме для доставки в нужные клетки/ткани. Так, например, антитела могут быть приготовлены в виде иммунолипосом. «Липосома» представляет собой небольшую везикулу, состоящую из липидов различных типов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, которые могут быть использованы для доставки лекарственного средства млекопитающему. Компоненты липосомы обычно расположены так, что они образуют бислой, аналогичный липидному бислою в биологических мембранах. Липосомы, содержащие антитело, получают методами, известными специалистам, такими как методы, описанные в публикации Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); в патентах 4485045 и 4544545; и в заявке WO 97/38731, опубликованной 23 октября 1997 г. Липосомы с увеличенным временем полужизни в кровотоке описаны в патенте США № 5013556.
Конкретно используемые липосомы, в состав которых входят такие липиды, как фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ), могут быть получены методом выпаривания с обратной фазой. Липосомы подвергают экструзии через фильтры с определенным размером пор, в результате чего получают липосомы нужного диаметра. Fab'-фрагменты антитела согласно изобретению могут быть конъюгированы с липосомами, как описано в публикации Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982), в результате проведения реакции дисульфидного обмена. Липосома может содержать, но необязательно, химиотерапевтическое средство. См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).
Фармацевтические композиции, используемые для введения in vivo, обычно должны быть стерильными. Это может быть легко достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
H. Лечение анти-CD79b антителами
Для определения экспрессии CD79b при раковом заболевании могут быть проведены различные детектирующие анализы. В одном из вариантов изобретения сверхэкспрессия полипептида CD79b может быть оценена с помощью иммуногистохимического анализа (IHC). Залитые в парафин срезы ткани, полученные при биопсии опухоли, могут быть подвергнуты IHC-анализу и оценены по интенсивности окраски белка CD79b в соответствии с нижеследующими критериями:
Оценка 0 - окрашивание отсутствует или наблюдается окрашивание мембраны у менее чем 10% опухолевых клеток.
Оценка 1+ - очень слабое/едва заметное окрашивание мембраны, детектируемое у более чем 10% опухолевых клеток. При этом указанные клетки окрашены только в части своей мембраны.
Оценка 2+ - слабое или умеренное окрашивание всей мембраны, наблюдаемое у более чем 10% опухолевых клеток.
Оценка 3+ - умеренное или сильное окрашивание всей мембраны, наблюдаемое у более чем 10% опухолевых клеток.
Опухоли, проанализированные на сверхэкспрессию CD79b и получившие оценки 0 или 1+, могут быть охарактеризованы как опухоли, в которых не наблюдается сверхэкспрессия CD79b, а опухоли с оценками 2+ или 3+ могут быть охарактеризованы как опухоли, сверхэкспрессирующие CD79b.
Альтернативно или дополнительно анализы FISH, такие как INFORM (разработанные Ventana Co., Arizona) или PATHVISION (Vysis, Illinois), могут быть осуществлены на фиксированных формалином и залитых в парафин опухолевых тканях для определения уровня сверхэкспрессии CD79b (если она присутствует) в опухоли.
Сверхэкспрессия или амплификация CD79b может быть оценена с помощью детектирующего анализа in vivo, например, путем введения молекулы (такой как антитело), которая связывается с детектируемой молекулой; мечения детектируемой меткой (например, радиоактивным изотопом или флуоресцентной меткой) и наружного сканирования пациента для определения локализации метки.
Как было описано выше, анти-CD79b антитела согласно изобретению, помимо терапевтического применения, могут быть использованы и в других различных целях. Анти-CD79b антитела согласно изобретению могут быть использованы для определения стадии развития раковой опухоли, экспрессирующей полипептид CD79b (например, при радиоактивной визуализации). Эти антитела могут быть также использованы для очистки или иммунопреципитации полипептида CD79b из клеток, для детектирования и количественной оценки полипептида CD79b in vitro, например, в ELISA-анализе или в вестерн-блот-анализе, в целях уничтожения и элиминации CD79b-экспрессирующих клеток из популяции смешанных клеток, как в стадии очистки других клеток.
В настоящее время, в зависимости от стадии развития рака, лечение рака включает проведение нижеследующей терапии отдельно или в комбинации друг с другом, а именно хирургической операции по удалению раковой ткани, лучевой терапии и химиотерапии. Лечение анти-CD79b антителом может быть особенно желательным для пожилых пациентов, которые плохо переносят токсическое и побочное действие химиотерапии, и при метастазах, когда лучевая терапия имеет ограничеснное применение. Противоопухолевые анти-CD79b антитела согласно изобретению могут быть использованы для подавления роста CD79b-экспрессирующей раковой опухоли после первоначального установления диагноза заболевания или во время рецидива заболевания. В терапевтических целях анти-CD79b антитело может быть использовано отдельно или в комбинированной терапии, например, вместе с гормональной терапией, антиангиогенной терапией или терапией с использованием радиоактивно меченных соединений, или вместе с хирургическим вмешательством, криотерапией и/или лучевой терапией. Лечение анти-CD79b антителом может быть осуществлено в комбинации с другими формами стандартной терапии, либо одновременно со стандартной терапией, либо до или после проведения такой терапии. При лечении рака, а в частности, у пациентов с высоким риском развития данного заболевания, используются такие химиотерапевтические средства, как TAXOTERE (доцетаксел), TAXOL (паклитаксел), эстрамустин и митоксантрон. В способе согласно изобретению, применяемом для лечения или ослабления симптомов рака, пациенту с раком может быть введено анти-CD79b антитело в комбинации с введением одного или нескольких вышеуказанных химиотерапевтических средств. В частности, рассматривается также комбинированная терапия, осуществляемая вместе с введением паклитаксела и его модифицированных производных (см., например, EP0600517). Анти-CD79b антитело вводят вместе с терапевтически эффективной дозой химиотерапевтического средства. В другом варианте изобретения, анти-CD79b антитело вводят в комбинации с химиотерапией для повышения активности и эффективности химиотерапевтического средства, например, паклитаксела. В справочном руководстве для врачей (PDR) указаны дозы средств, которые были использованы для лечения различных раковых заболеваний. Схемы лечения и введения доз вышеупомянутых химиотерапевтических лекарственных средств, которые являются терапевтически эффективными, зависят от конкретного ракового заболевания, подвергаемого лечению, степени развития данного заболевания и других факторов, которые известны специалисту в данной области и которые могут быть определены лечащим врачом.
В одном из конкретных вариантов изобретения пациенту вводят конъюгат, содержащий анти-CD79b антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством. Предпочтительно иммуноконъюгат, связанный с белком CD79b, интернализуется в клетке, что приводит к повышению терапевтической эффективности иммуноконъюгата в отношении уничтожения раковых клеток, с которыми они связываются. В предпочтительном варианте изобретения цитотоксическое средство нацелено на нуклеиновую кислоту раковых клеток или ингибирует ее действие. Примеры таких цитотоксических средств описаны выше, и такими средствами являются майтанзиноиды, калихеамицины, рибонуклеазы и ДНК-эндонуклеазы.
Анти-CD79b антитела или их конъюгаты с токсинами вводят человеку в соответствии с известными методами, такими как внутривенное введение, например, в виде ударной дозы или путем непрерывного вливания в течение определенного периода времени, а также внутримышечно, внутрибрюшинно, вовнутрь цереброспинальной жидкости, подкожно, внутрисуставно, вовнутрь синовиальной жидкости, интратекально, перорально, местно или путем ингаляции. Предпочтительным является внутривенное или подкожное введение антитела.
Другие курсы терапии могут быть объединены с введением анти-CD79b антитела. Комбинированное введение включает совместное введение отдельных препаратов или одного фармацевтического препарата и их последовательное введение в любом порядке, предпочтительно в течение периода времени, за который оба (или все) активных агента одновременно проявляют свою биологичесую активность. При этом предпочтительно, чтобы такая комбинированная терапия давала синергический терапевтический эффект.
Может также оказаться желательным проведение комбинированного введения анти-CD79b антитела или антител вместе с введением антитела против другого опухолевого антигена, ассоциированного с конкретным раковым заболеванием.
В другом варианте изобретения способы терапевтического лечения согласно изобретению включают комбинированное введение анти-CD79b антитела (или антител) и одного или нескольких химиотерапевтических средств или рост-ингибирующих средств, включая совместное введение смеси из различных химиотерапевтических средств или другого(их) химиотерапевтического(их) средства (средств) или другого(их) терапевтического(их) средства (средств), которые также ингибируют рост опухоли. Химиотерапевтическими средствами являются фосфат эстрамустина, преднимустин, цисплатин, 5-фторурацил, мелфалан, циклофосфамид, гидроксимочевина и гидроксимочевинные таксаны (такие как паклитаксел и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики. Способы получения и схемы введения таких химиотерапевтических средств могут быть проведены в соответствии с инструкциями производителей, либо они могут эмпирически подобраны самим специалистом. Способы получения и схемы введения химиотерапевтических средств также описаны в публикации "Chemotherapy Service", Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md (1992). Антитело может быть объединено с противогормональным соединением, например, антиэстрогенным соединением, таким как тамоксифен; антипрогестероновым соединением, таким как онапристон (см. EP 616812), или антиандрогеновым соединением, таким как флутамид, в дозах, обычно применяемых для введения таких молекул. Если раком, подвергаемым лечению, является андроген-зависимый рак, то пациент быть предварительно подвергнут антиандрогенной терапии, а затем, после того как рак станет андроген-независимым, пациенту может быть введено анти-CD79b антитело (и необязательно другие описанные здесь средства).
Иногда может также оказаться желательным совместное введение пациенту средства для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний (для предупреждения или снижения нарушения функции миокарда, ассоциированного с данной терапией) или одного или нескольких цитокинов. Помимо вышеуказанных терапевтических схем лечения, пациент может быть подвергнут хирургической операции по удалению раковых клеток, и/или он может быть подвергнут лучевой терапии (например, наружному облучению или терапии с использованием радиоактивно меченного агента, такого как антитело), проводимой до, во время или после терапии антителом. Подходящими дозами для любых из вышеуказанных совместно вводимых средств являются используемые здесь дозы, и эти дозы могут быть снижены благодаря комбинированному (синергическому) действию указанного средства и анти-CD79b антитела.
Антитело-содержащую композицию согласно изобретению приготавливают, разделяют на дозы и вводят в соответствии с хорошо известной медицинской практикой. Факторами, учитываемыми для приготовления таких композиций, являются конкретное расстройство, подвергаемое лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние конкретного пациента, этиологический фактор, вызывающий данное расстройство, участок, на который направлено данное средство, способ введения, схема введения и другие факторы, известные практическим врачам. Указанное антитело должно быть, но необязательно, приготовлено в виде композиции с одним или несколькими современными средствами, используемыми для предупреждения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела согласно изобретению, присутствующего в данной композиции, типа расстройства или способа его лечения и от других факторов, обсуждаемых выше. Указанные другие средства обычно вводятся в тех же самых дозах и теми же способами, которые обычно использовались ранее, либо эти дозы составляют примерно 1-99% от используемых ранее доз.
Для предупреждения или лечения заболевания подходящие дозы и схемы введения лекарственного средства могут быть выбраны врачом в соответствии с известными критериями. Соответствующие дозы антитела зависят от типа заболевания, подвергаемого лечению, как определено выше, тяжести и курса лечения заболевания, независимо от того, вводят ли указанное антитело в профилактических или терапевтических целях, от проводимого ранее лечения, от истории болезни пациента и его восприимчивости к данному антителу, и от назначения лечащего врача. Такое антитело может быть введено пациенту один раз или несколько раз во время проведения курса лечения. Предпочтительно антитело вводят путем внутривенной инъекции или подкожной инъекции. В зависимости от типа и тяжести заболевания начальная предварительно установленная доза антитела, вводимого пациенту, составляет примерно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг массы тела (например, примерно 0,1-15 мг/кг/дозу), независимо от того, осуществляют ли одноразовое или многократное введение или непрерывную инфузию данного антитела. Схема введения дозы может включать введение первоначальной нагрузочной дозы анти-CD79b антитела, составляющей примерно 4 мг/кг, с последующим еженедельным введением поддерживающей дозы, составляющей примерно 2 мг/кг анти-CD79b антитела. Однако могут быть проведены и другие схемы введения доз. Типичная суточная доза может составлять примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение может проводиться до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое подавление симптомов заболевания. Мониторинг эффекта такой терапии может быть легко проведен стандартными методами, с помощью анализов и в соответствии с критериями, известными врачу или другим специалистам в данной области.
В настоящей заявке, помимо введения белка-антитела пациенту, рассматривается также введение антитела методом генотерапии. Такое введение нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, входит в объем термина «введение терапевтически эффективного количества антитела». См., например, заявку WO 96/07321, опубликованную 14 марта, 1996 г., и относящуюся к применению генотерапии для продуцирования внутриклеточных антител.
Существует два основных способа введения нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетки пациента, in vivo и ex vivo. Для in vivo доставки нуклеиновую кислоту непосредственно вводят пациенту, а обычно на участок, на который требуется введение антитела. Для лечения ex vivo делают забор клеток пациента, а затем в эти выделенные клетки вводят нуклеиновую кислоту, и модифицированные клетки вводят пациенту либо непосредственно, либо, например, в виде капсул в пористых мембранах, которые имплантируют пациенту (см., например, патенты США 4892538 и 5283187). Существует ряд методов введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Такие методы могут варьироваться в зависимости от того, вводят ли нуклеиновую кислоту в клетки, культивированные in vitro, или ее вводят in vivo в клетки представляющего интерес хозяина. Методами, подходящими для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, являются методы с применением липосом, электропорация, микроинжекция, слияние клеток, метод с применением DEAE-декстрана, метод преципитации фосфатом кальция и т.п. Наиболее часто используемым вектором для доставки гена ex vivo является ретровирусный вектор.
В настоящее время предпочтительными методами переноса нуклеиновой кислоты in vivo являются трансфекция вирусными векторами (такими как аденовирсус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус) и липидные системы (подходящими липидами для липид-опосредуемого переноса гена являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). Описание используемых в настоящее время протоколов мечения генов и генотерапии можно найти в публикации Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). См. также заявку WO 93/25673 и цитируемые в ней работы.
В объем употребляемого здесь термина «антитело» могут входить различные формы анти-CD79b антител согласно изобретению. Таким образом, указанными антителами являются полноразмерное или интактное антитело, фрагменты антитела, антитело с нативной последовательностью или его аминокислотные варианты, гуманизированные, химерные или гибридные антитела, иммуноконъюгаты и их функциональные фрагменты. В гибридных антителах последовательность антитела присоединена к гетерологичной полипептидной последовательности. Антитела могут быть модифицированы в Fc-области для сообщения нужных эффекторных функций. Как обсуждалось более подробно в представленных здесь разделах, посвященных соответствующии Fc-областям, «оголенное» антитело, связанное с клеточной поверхностью, может индуцировать цитотоксичность, например, благодаря антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или рекрутинга комплемента в случае комплемент-зависимой цитотоксичности или по некоторым другим механизмам. Альтернативно, если желательно элиминировать или ослабить эффекторную функцию, в целях минимизации побочных эффектов или осложнений при терапии, то могут быть использованы некоторые другие Fc-области.
В одном из вариантов изобретения антитело конкурирует за связывание или по существу связывается с тем же эпитопом, с которым связываются антитела согласно изобретению. Также рассматриваются антитела, обладающие биологическими свойствами анти-CD79b антител согласно изобретению, а в частности, включая доставку в опухоль in vivo и любое ингибирование пролиферации клеток, или цитотоксическими свойствами.
Методы продуцирования вышеуказанных антител подробно описаны в настоящей заявке.
Анти-CD79b антитела согласно изобретению могут быть использованы для лечения CD79b-экспрессирующей раковой опухоли или ослабления одного или нескольких симптомов рака у млекопитающего. Такими раковыми заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, рак гемопоэтической системы или рак крови, такой как лимфома, лейкоз, миелома или лимфоидные злокачественные опухоли, а также рак селезенки и рак лимфоузлов. Более конкретными примерами таких В-клеточно-ассоциированных раковых заболеваний являются, например, высокозлокачественная, среднезлокачественная и низкозлокачественная лимфома (включая В-клеточные лимфомы, такие как, например, В-клеточная лимфома лимфоидной ткани слизистой и неходжкинская лимфома, лимфома клеток коры головного мозга, лимфома Беркитта, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, лимфома маргинальной зоны, диффузная крупноклеточная лимфома, фолликулярная лимфома, ходжкинская лимфома и Т-клеточные лимфомы) и лейкоз (включая вторичный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, такой как В-клеточный лейкоз (CD5+-В-лимфоциты), миелоидный лейкоз, такой как острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, лимфоидный лейкоз, такой как острый лимфобластный лейкоз и миелодисплазия) и другие гематологические и/или В-клеточные или Т-клеточные раковые опухоли. Термин «рак» включает метастазы любого из вышеупомянутых заболеваний. Указанное антитело обладает способностью связываться по меньшей мере с частью раковых клеток, экспрессирующих полипептид CD79b у млекопитающего. В предпочтительном варианте изобретения указанное антитело является эффективным для разрушения или уничтожения CD79b-экспрессирующих опухолевых клеток, или ингибирования роста таких опухолевых клеток in vitro или in vivo после связывания указанного антитела с полипептидом CD79b на клетках. Таким антителом является «оголенное» анти-CD79b антитело (не конъюгированное с каким-либо агентом). «Оголенные» антитела, которые обладают цитотоксическими свойствами или свойствами, направленными на ингибирование росте клеток, могут быть также присоединены к цитотоксическому средству, что делает их еще более эффективными в отношении деструкции опухолевых клеток. Цитотоксические свойства могут быть сообщены анти-CD79b антителу, например, путем конъюгирования указанного антитела с цитотоксическим средством, с образованием описанного здесь иммуноконъюгата. Такое цитотоксическое средство или рост-ингибирующее средство предпочтительно являются низкомолекулярными. Предпочтительными также являются токсины, такие как калихеамицин или майтанзиноид и его аналоги или производные.
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей анти-CD79b антитело согласно изобретению и носитель. Для лечения рака композиции могут быть введены пациенту, нуждающемуся в таком лечении, где указанная композиция может содержать одно или несколько анти-CD79b антител, присутствующих в виде иммуноконъюгата или в виде «оголенного» антитела. В другом варианте изобретения указанные композиции могут содержать эти антитела в комбинации с другими терапевтическими средствами, такими как цитотоксические средства или рост-ингибирующие средства, включая химиотерапевтические средства. Настоящее изобретение также относится к препаратам, содержащим анти-CD79b антитело согласно изобретению и носитель. В одном из вариантов антитела указанным препаратом является терапевтический препарат, содержащий фармацевтически приемлемый носитель.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим анти-CD79b антитела. Этот термин также охватывает нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи H и L, а в частности, остатки гипервариабельной области; цепи нуклеиновых кислот, кодирующие антитело с нативной последовательностью, а также их варианты, модификации и гуманизированные варианты антитела.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения раковой опухоли, экспрессирующей полипептид CD79b, или к ослаблению одного или нескольких симптомов рака у млекопитающего, где указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества анти-CD79b антитела млекопитающему. Антитело-содержащие терапевтические композиции могут быть введены в течение непродолжительного периода времени (однократное введение) или в течение длительного периода времени, либо периодически, в зависимости от назначения врача. Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования роста клеток, экспрессирующих полипептид CD79b, и цитолиза этих клеток.
Настоящее изобретение также относится к наборам и промышленным изделиям, содержащим по меньшей мере одно анти-CD79b антитело. Наборы, содержащие анти-CD79b антитела, могут быть использованы, например, для анализа на цитолиз CD79b-клеток, а также для очистки или иммунопреципитации полипептида CD79b из клеток. Так, например, для выделения и очистки CD79b указанный набор может содержать анти-CD79b антитело, связанное со сферами (например, сефарозными сферами). Могут быть получены наборы, которые содержат антитела для детектирования и количественной оценки CD79b in vitro, например, с помощью ELISA или вестерн-блот-анализа. Антитело, используемое для детектирования, может быть связано с меткой, такой как флуоресцентная или радиоактивная метка.
I. Лечение конъюгатом “антитело-лекарственное средство”
Предполагается, что конъюгаты “антитело-лекарственное средство” (ADC) согласно изобретению могут быть использованы для лечения различных заболеваний или расстройств, характеризующихся, например, сверхэкспрессией опухолевого антигена. Репрезентативными состояниями или гиперпролиферативными расстройствами являются доброкачественные или злокачественные опухоли; лейкоз и лимфоидные злокачественные заболевания. Другими заболеваниями являются расстройства, ассоциированные с нарушением функций нервных клеток, глиальных клеток, гипоталамуса, железистых клеток, макрофагов, клеток эпителия, стромы и бластоцеля, а также воспалительные, ангиогенные и иммунологические расстройства, включая аутоиммунные расстройства.
ADC-соединения, которые были идентифицированы у животных-моделей и в клеточных анализах, могут быть дополнительно протестированы у высших приматов, имеющих опухоли, и в клинических испытаниях с участием человека. Клинические испытания с участием человека могут быть разработаны в целях определения эффективности моноклонального анти-CD79b антитела или иммуноконъюгата согласно изобретению у пациентов, страдающих В-клеточно-пролиферативным расстройством, включая, но не ограничиваясь ими, лимфому, неходжкинскую лимфому (НХЛ), агрессивную НХЛ, рецидивирующую агрессивную НХЛ, рецидивирующую бессимптомную НХЛ, не поддающуюся лечению НХЛ, не поддающуюся лечению бессимптомную НХЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лейкоз, ретикулоэндотелиоз (РЭ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и лимфому клеток коры головного мозга. Клинические испытания могут быть разработаны для оценки эффективности ADC в комбинации с известными терапевтическими схемами лечения, такими как лучевая терапия и/или химиотерапия с использованием известных химиотерапевтических и/или цитотоксических средств.
В общих чертах, заболеванием или расстройством, подвергаемым лечению, является гиперпролиферативное заболевание, такое В-клеточно-пролиферативное расстройство и/или В-клеточный рак. Примерами раковых заболеваний, подвергаемых лечению, являются, но не ограничиваются ими, В-клеточно-пролиферативное расстройство, выбранное из лимфомы, неходжкинской лимфомы (НХЛ), агрессивной НХЛ, рецидивирующей агрессивной НХЛ, рецидивирующей бессимптомной НХЛ, не поддающейся лечению НХЛ, не поддающейся лечению бессимптомной НХЛ, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лейкоза, ретикулоэндотелиоза (РЭ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ) и лимфомы клеток коры головного мозга.
Раковая опухоль может включать CD79b-экспрессирующие клетки, с которыми может связываться ADC согласно изобретению. Для определения уровней экспрессии CD79b в раковой опухоли могут быть проведены различные диагностические/прогностические анализы. В одном из вариантов изобретения уровень сверхэкспрессии CD79b может быть проанализирован с помощью IHC. Залитые в парафин срезы тканей, взятых путем биопсии опухоли, могут быть подвергнуты IHC-анализу и оценены на степень окрашивания и количество опухолевых клеток в соответствии со следующими критериями оценки интенсивности окрашивания белка CD79b.
Для предупреждения или лечения заболевания выбор соответствующей дозы ADC зависит от типа подвергаемого лечению заболевания, указанного выше, тяжести и течения этого заболевания, от типа молекулы, вводимой в профилактических или терапевтических целях, от проводимой ранее терапии, от истории болезни пациента и его восприимчивости к данному антителу, а также от назначения лечащего врача. Указанную молекулу соответствующим образом вводят пациенту за один курс или в течение нескольких курсов лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания начальная доза молекулы, назначенной для введения пациенту, составляет примерно 1 мкг/кг-15 мкг/кг (например, 0,1-20 мг/кг), и эта доза может быть введена в виде разовой дозы или дробных доз, либо она может быть введена путем непрерывного вливания. Типичная суточная доза может составлять примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Репрезентативная доза ADC, вводимая пациенту, составляет примерно от 0,1 до 10 мг/кг массы тела пациента.
Для повторного введения в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния пациента, лечение может быть продолжено до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое ослабление симптомов заболевания. Репрезентативная схема введения доз включает введение начальной ударной дозы примерно 4 мг/кг, а затем еженедельное введение поддерживающей дозы анти-ErbB2 антитела, составляющей примерно 2 мг/кг. При этом могут быть применены и другие схемы введения доз. Эффект такой терапии может быть легко прослежен с применением стандартных методов и анализов.
J. Комбинированная терапия
Конъюгат «антитело-лекарственное средство» (ADC) согласно изобретению может быть объединен со вторым соединением, обладающим противораковыми свойствами, с получением комбинированной фармацевтической композиции, либо он может быть применен вместе с другими курсами лечения в виде комбинированной терапии. Указанное второе соединение такой фармацевтической комбинированной композиции или комбинированного курса лечения обеспечивает дополнительную активность комбинации ADC, при условии, что компоненты такой комбинированной комбинации не оказывают негативного воздействия друг на друга.
Таким вторым соединением может быть химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, цитокин, средство, ингибирующее рост клеток, противогормональное средство и/или средство для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. Указанные молекулы обычно присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для достижения данной цели. Фармацевтическая композиция, содержащая ADC согласно изобретению, может также содержать терапевтически эффективное количество химиотерапевтического средства, такого как ингибитор образования тубулина, ингибитор топоизомеразы или ДНК-связывающий агент.
В одном из аспектов изобретения первым соединением является анти-CD79b ADC согласно изобретению, а вторым соединением является анти-CD20 антитело (либо «оголенное» антитело, либо ADC). В одном из вариантов изобретения вторым соединением является анти-CD20 антитело (ритуксимаб, Rituxan), или 2H7 (Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Другими антителами, используемыми в комбинированной иммунотерапии с анти-CD79b ADC согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, анти-VEGF антитело (например, Avastin).
Другие курсы терапии могут быть объединены с применением другой противораковой терапии согласно изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, лучевую терапию и/или трансплантацию костного мозга и клеток периферической крови, и/или введение цитотоксического средства, химиотерапевтического средства или рост-ингибирующего агента. В одном из таких вариантов химиотерапевтическим средством является средство или комбинация средств, таких как, например, цислофосфамид, гидроксидаунорубицин, адриамицин, доксорубицин, винкристин (Oncovin™), преднизолон, CHOP, CVP или COP, или иммунотерапевтические средства, такие как анти-CD20 антитело (например, Rituxan) или анти-VEGF антитело (например, Avastin).
Комбинированная терапия может быть осуществлена путем одновременного или последовательного проведения отдельных курсов лечения. При последовательном режиме проведения таких курсов, указанная комбинация лекарственных средств может быть введена в два этапа или в несколько этапов. Такая комбинированная терапия включает совместное введение отдельных препаратов или их введения в виде одного фармацевтического препарата, и последовательное их введение в любом порядке, предпочтительно в течение периода времени, за который оба (или все) активных агента одновременно проявляют свою биологичесую активность.
В одном из вариантов изобретения лечение с использованием ADC включает комбинированное введение идентифицированного здесь противоракового средства и одного или нескольких химиотерапевтических средств или ингибиторов роста, включая совместное введение смеси из различных химиотерапевтических средств. Химиотерапевтическими средствами являются таксаны (такие как паклитаксел и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики. Способы получения и схемы введения таких химиотерапевтических средств могут быть проведены в соответствии с инструкциями производителя, либо они могут эмпирически подобраны специалистом. Способы получения и схемы введения доз химиотерапевтических средств также описаны в публикации "Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
Подходящими дозами для любых из вышеуказанных совместно вводимых средств являются используемые здесь дозы, и эти дозы могут быть снижены благодаря комбинированному (синергическому) действию только что идентифицированного средства и других химиотерапевтических средств или курсов лечения.
Комбинированная терапия может обеспечивать “синергию” и “синергическое действие” активных ингредиентов, то есть когда эффект, достигаемый в случае совместного использования активных ингредиентов, превышает сумму эффектов, достигаемых при отдельном использовании данных соединений. Синергический эффект может достигаться в том случае, если активные ингредиенты (1) приготовлены в смеси друг с другом и введены или доставлены одновременно в виде комбинированной унифицированной лекарственной формы; (2) доставлены путем поочередного или параллельного введения в виде отдельных препаратов; или (3) доставлены в соответствии с некоторыми другими схемами введения. При введении посредством альтернативной терапии синергический эффект может быть достигнут в том случае, если указанное соединение вводят или доставляют последовательно, например, путем различных инъекций в отдельных шприцах. В общих чертах, во время альтернативной терапии эффективную дозу каждого активного ингредиента вводят последовательно, то есть поочередно, а во время комбинированной терапии эффективные дозы двух или более активных ингредиентов вводят совместно.
К. Промышленные изделия и наборы
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к промышленному изделию, содержащему материалы, используемые для лечения, предупреждения и/или диагностики CD79b-экспрессирующей раковой опухоли. Такое промышленное изделие содержит упаковку, а также этикетку, наклеенную на эту упаковку, или вкладыш, вложенный в такую упаковку. Подходящими упаковками являются, например, бутыли, флаконы, шприцы и т.п. Такие упаковки могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Указанная упаковка содержит композицию, которая является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики ракового заболевания, и может иметь стерильное входное отверстие (например, такой упаковкой может быть пакет для внутривенного введения раствора или сосуд, имеющий пробку, протыкаемую иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере, одним активным агентом в указанной композиции является анти-CD79b антитело согласно изобретению. На этикетке или во вкладыше, вложенном в упаковку, должно быть указано, что такая композиция используется для лечения рака. Этикетка или вкладыш в упаковку может также содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту, страдающему раковым заболеванием. Альтернативно указанное промышленное изделие может также включать вторую упаковку, содержащую фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, такое изделие может также включать и другие материалы, необходимые с точки зрения промышленного производства и потребителя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Настоящее изобретение также относится к наборам, которые могут быть использованы в различных целях, например, для анализов на цитолиз CD79b-экспрессирующих клеток, для очистки или иммунопреципитации полипептида CD79b из клеток. Для выделения и очистки полипептида CD79b набор может содержать анти-CD79b антитело, связанное со сферами (например, с сефарозными сферами). Могут быть получены наборы, которые содержат антитела для детектирования и количественной оценки полипептида CD79b in vitro, например, в ELISA-анализе или в вестерн-блот-анализе. Указанный набор, как и промышленное изделие, содержит упаковку, а также этикетку, наклеенную на эту упаковку, или вкладыш, вложенный в такую упаковку. Эта упаковка содержит композицию, включающую по меньшей мере одно анти-CD79b антитело согласно изобретению. Могут быть также включены и другие упаковки, которые содержат, например, разбавители, буферы и контрольные антитела. Этикетка или вкладыш в упаковку могут содержать описание композиции, а также инструкции по применению in vitro или детектированию.
L. Применение полипептидов CD79b
Настоящее изобретение охватывает способы скрининга соединений для идентификации соединений, имитирующих полипептид CD79b (агонисты), или предотвращения действия полипептида CD79b (антагонисты). Скрининг-анализы для выявления кандидатов-антагонистов, используемых в качестве лекарственных средств, были разработаны для идентификации соединений, которые связываются или образуют комплекс с полипептидами CD79b, кодируемыми идентифицированными здесь генами, или, наоборот, препятствуют взаимодействию кодируемых полипептидов с другими клеточными белками, включая, например, ингибирование экспрессии полипептида CD79b из клеток. Такие скрининг-анализы включают анализы, подходящие для крупномасштабного скрининга химических библиотек, а поэтому подходящими для идентификации небольших молекул-кандидатов на лекарственные средства.
Анализы могут быть разработаны в различных форматах, включая анализы на связывание белок-белок, биохимические скрининг-анализы, иммуноанализы и клеточные анализы, хорошо известные специалистам.
Все анализы на антагонисты являются стандартными, то есть для их осуществления требуется контактирование лекарственного средства-кандидата с полипептидом CD79b, кодируемым нуклеиновой кислотой, идентифицированной здесь в условиях и в течение периода времени, достаточного для взаимодействия этих двух компонентов.
В анализах на связывание указанным взаимодействием является связывание, и образованный комплекс может быть выделен из реакционной смеси или детектирован в этой смеси. В конкретном варианте изобретения полипептид CD79b, кодируемый идентифицированным здесь геном, или лекарственное средство-кандидат иммобилизуют на твердой фазе, например, на микротитрационном планшете, посредством ковалентного или нековалентного связывания. Нековалентное связывание обычно осуществляют путем нанесения на твердую поверхность раствора полипептида CD79b и сушки. Альтернативно иммобилизированное антитело, например, моноклональное антитело, специфичное к иммобилизированному полипептиду CD79b, может быть использовано для заякоривания на твердой поверхности. Такой анализ осуществляют путем добавления неиммобилизированного компонента, который может быть помечен детектируемой меткой, на иммобилизиированный компонент, например, на поверхность с покрытием, содержащим заякоренный компонент. Если реакция осуществляется полностью, то непрореагировавшие компоненты удаляют, например, путем промывки, а затем детектируют комплексы, заякоренные на твердой поверхности. Если первоначально неиммобилизированный компонент несет детектируемую метку, то детектирование метки, иммобилизованной на поверхности, свидетельствует об образовании комплекса. Если первоначально неиммобилизированный компонент не несет детектируемую метку, то образование комплекса может быть детектировано, например, с использованием меченого антитела, специфически связывающегося с иммобилизированным комплексом.
TM
Если соединение-кандидат взаимодействует, но не связывается с конкретным полипептидом CD79b, кодируемым идентифицированным здесь геном, то его взаимодействие с полипептидом может быть проанализировано методами, хорошо известными как методы детектирования взаимодействий «белок-белок». Такие анализы предусматривают применение традиционных методов, таких как, например, перекрестное связывание, коиммунопреципитация и совместная очистка в градиенте или на хроматографических колонках. Кроме того, мониторинг взаимодействия «белок-белок» может быть осуществлен с использованием дрожжевой генетической системы, описанной Fields и сотрудниками (Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) и Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Многие активаторы транскрипции, такие как дрожжевой GAL4, состоят из двух физически дискретных модульных доменов, один из которых действует как ДНК-связывающий домен, а другой действует как домен активации транскрипции. Экспрессионная дрожжевая система, описанная в вышеуказанных публикациях (в основном называемая «двухкомпонентной гибридной системой»), имеет то преимущество, что в ней используются гибрид из двух белков, один из которых представляет собой белок-мишень, связанный с ДНК-связывающимся доменом GAL4, а другой представляет собой активирующий белок-кандидат, связанный с активирующим доменом. Экспрессия гена-репортера GAL1-lacZ под контролем GAL4-активированного промотора зависит от восстановления активности GAL4 посредством взаимодействия «белок-белок». Колонии, содержащие взаимодействующие полипептиды, детектируют с использованием хромогенного субстрата для β-галактозидазы. Полный набор (MATCHMAKER) для идентификации «белок-белок»-взаимодействий между двумя специфическими белками, осуществляемых методами с применением двухкомпонентных гибридов, является коммерчески доступным и поставляется фирмой Clontech. Эта система может быть также использована для картирования доменов белка, участвующих в специфических белковых взаимодействиях, а также для точного определения аминокислотных остатков, играющих важную роль в таких взаимодействиях.
Соединения, которые ингибируют взаимодействие гена, кодирующего идентифицированный здесь полипептид CD79b, с другими внутри- или внеклеточными компонентами, могут быть протестированы следующим образом: обычно получают реакционную смесь, содержащую продукт гена и внутри- и внеклеточного компонента, в определенных условиях и в течение определенного периода времени, достаточного для взаимодействия и связывания двух продуктов. Для анализа способности соединения-кандидата ингибировать связывания, реакцию проводят в отсутствие и в присутствии тестируемого соединения. Кроме того, к третьей реакционной смеси может быть добавлено плацебо, которое служит в качестве позитивного контроля. Мониторинг связывания (образования комплекса) тестируемого соединения с внутри- или внеклеточным компонентом, присутствующим в смеси, проводят как описано выше. Образование комплекса в контрольной(ых) реакции(ях), но не в реакционной смеси, содержащей тестируемое соединение, указывает на то, что тестируемое соединение препятствует взаимодействию тестируемого соединения с его реакционным партнером.
Для анализа на антагонисты полипептид CD79b сожет быть добавлен в клетки вместе с соединением, скринируемым на конкретную активность, а способность соединения ингибировать представляющую интерес активность в присутствии полипептида CD79b означает, что указанное соединение является антагонистом полипептида CD79b. Альтернативно антагонисты могут быть детектированы путем объединения полипептида CD79b и потенциального антагониста с мембраносвязанными рецепторами полипептида CD79b или рекомбинантными рецепторами в условиях, подходящих для проведения анализа на конкурентное ингибирование. Полипептид CD79b может быть помечен, например, радиоактивной меткой, в результате чего различные молекулы полипептида CD79b, связанные с рецептором, могут быть использованы для определения эффективности потенциального антагониста. Ген, кодирующий рецептор, может быть идентифицирован различными методами, известными специалистам, например, методами пэннинга лиганда и FACS-сортинга. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991). Если полиаденилированную РНК получают из клетки, восприимчивой к полипептиду CD79b, то предпочтительно осуществляют экспрессионное клонирование, и библиотеку кДНК, созданную из этой РНК, разделяют на пулы и используют для трансфекции клеток COS или других клеток, которые не являются восприимчивыми к полипептиду CD79b. Трансфицированные клетки, выращенные на предметных стеклах, обрабатываают меченым полипептидом CD79b. Полипептид CD79b может быть помечен различными методами, включая йодирование или включение сайта распознавания для сайт-специфической протеинкиназы. После фиксации и инкубирования предметные стекла подвергают авторадиографическому анализу. Позитивные пулы идентифицируют, а затем получают субпулы, которые повторно трансфицируют итерационным методом получения субпулов и повторного скрининга, в результате чего получают один клон, кодирующий предполагаемый рецептор.
В альтернативном способе идентификации рецептора меченый полипептид CD79b может быть фотоаффинно связан с клеточной мембраной, либо могут быть получены препараты, экспрессирующие молекулы рецептора. Перекрестно-связанный материал разделяют с помощью электрофореза в ПААГ и экспонируют с рентгеновской пленкой. Меченый комплекс, содержащий рецептор, может быть вырезан, разделен на пептидные фрагменты, и белки подвергают микросеквенированию. Аминокислотная последовательность, полученная после микросеквенирования, может быть использована в целях конструирования набора вырожденных олигонуклеотидных зондов для скрининга библиотеки кДНК, проводимого в целях идентификации гена, кодирующего предполагаемый рецептор.
В другом анализе на антагонисты клетки млекопитающих или мембранный препарат, экспрессирующий данный рецептор, могут быть инкубированы с меченым полипептидом CD79b в присутствии соединения-кандидата. Затем может быть определена способность данного соединения усиливать или блокировать такое взаимодействие.
Более конкретными примерами потенциальных антагонистов являются олигонуклеотид, который связывается с гибридами иммуноглобулина и полипептида CD79b, а в частности, антитела, включая, но не ограничиваясь ими, поликлональные и моноклональные антитела и их фрагменты, одноцепочечные антитела, антиидиотипические антитела и химерные или гуманизированные варианты таких антител или их фрагментов, а также человеческие антитела и их фрагменты. Альтернативно потенциальным антагонистом может быть близкородственный белок, например, мутированная форма полипептида CD79b, который распознает рецептор, но не оказывает какого-либо действия на него, и тем самым конкурентно ингибирует действие полипептида CD79b.
Антитела, специфически связывающиеся с идентифицированным здесь полипептидом CD79b, а также другие молекулы, идентифицированные в вышеупомянутых скрининг-анализах, могут быть введены в форме фармацевтических композиций для лечения различных заболеваний, включая рак.
Если полипептид CD79b является внутриклеточным, а в качестве ингибиторов используют целые антитела, то предпочтительными являются интернализующие антитела. Однако для доставки антитела или фрагмента антитела в клетке могут быть также использованы липофектанты или липосомы. Если используются фрагменты антител, то предпочтительным является самый короткий ингибирующий фрагмент, который специфически связывается со связывающим доменом белка-мишени. Так, например, исходя из последовательностей вариабельной области антитела, могут быть сконструированы пептидные молекулы, которые сохраняют способность связываться с последовательностью белка-мишени. Такие пептиды могут быть синтезированы химическим методом и/или могут быть продуцированы методами рекомбинантных ДНК. См., например, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993).
Описанный здесь препарат может также содержать более чем одно активное соединение, необходимое для лечения конкретного заболевания, а предпочтительно соединение, обладающее комплементарными активностями, которые не оказывают негативного влияния друг на друга. Альтернативно или дополнительно указанная композиция может содержать агент, усиливающий ее функцию, такой как, например, цитотоксический агент, цитокин, химиотерапевтическое средство или рост-ингибирующее средство. Такие молекулы обычно присутствуют в комбинации в количестве, эффективном для достижения нужной цели.
M. Производные антител
Антитела согласно изобретению могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы они содержали другие небелковые молекулы, которые известны специалистам и являются легко доступными. Предпочтительными молекулами, подходящими для дериватизации антител, являются водорастворимые полимеры. Неограничивающими примерами водорастворимых полимеров являются полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. При промышленном изготовлении следует отдать предпочтение пропиональдегиду полиэтиленгликоля благодаря его стабильности в воде. Этот полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединяемых к антителу, может варьироваться, и если присоединяют более чем один полимер, то эти полимеры могут иметь одинаковые или различные молекулы. В общих чертах, число и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, могут быть выбраны, исходя из нескольких факторов, включая, но не ограничиваясь ими, конкретные свойства или функции антитела, которые должны быть улучшены, независимо от конкретных условий проведения терапии, при которых будет использоваться указанное производное антитела и т.п.
N. Способ скрининга
В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к способу определения присутствия полипептида CD79b в образце, предположительно содержащем полипептид CD79b, где указанный способ включает обработку образца конъюгатом «антитело-лекарственное средство», который связывается с полипептидом CD79b, и определение уровня связывания указанного конъюгата «антитело-лекарственное средство» с полипептидом CD79b в образце, где наличие такого связывания указывает на присутствие полипептида CD79b в образце. Такой образец может, но необязательно, содержать клетки (которые могут быть раковыми клетками), предположительно экспрессирующие полипептид CD79b. Конъюгат «антитело-лекарственное средство», используемый в данном способе, может быть, но необязательно, детектируемо помечен, присоединен к твердому носителю или т.п.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу диагностики присутствия опухоли у млекопитающего, где указанный способ включает (а) контактирование тестируемого образца, содержащего клетки ткани, выделенные у млекопитающего, с конъюгатом «антитело-лекарственное средство», который связывается с полипептидом CD79b, и (b) детектирование образование комплекса между конъюгатом «антитело-лекарственное средство» и полипептидом CD79b в тестируемом образце, где образование комплекса указывает на присутствие опухоли у млекопитающего. Конъюгат «антитело-лекарственное средство», используемый в данном способе, может быть, но необязательно, детектируемо помечен, присоединен к твердому носителю или т.п., и/или тестируемый образец клеток ткани может быть получен от индивидуума с подозрением на раковую опухоль.
IV. Другие способы применения анти-CD79b антител и иммуноконъюгатов
A. Диагностические способы и способы детектирования
В одном из аспектов изобретения анти-CD79b антитела и иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть использованы для детектирования присутствия CD79b в биологическом образце. Используемый здесь термин «детектирование» охватывает количественное и качественное детектирование. В некоторых вариантах изобретения биологический образец содержит клетки или ткани. В некоторых вариантах изобретения такими тканями являются нормальные или раковые ткани, которые, по сравнению с другими тканями, экспрессируют CD79b на более высоком уровне, например, В-клетки и/или ткани, ассоциированные с В-клетками.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу детектирования присутствия CD79b в биологическом образце. В некоторых вариантах изобретения указанный способ включает контактирование биологического образца с анти-CD79b антителом в условиях, благоприятствующих связыванию анти-CD79b антитела с CD79b, и детектирование образования комплекса между анти-CD79b антителом и CD79b.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики расстройства, ассоциированного с повышением уровня экспрессии CD79b. В некоторых вариантах изобретения указанный способ включает контактирование тестируемой клетки с анти-CD79b антителом; определение уровня экспрессии (либо количественное, либо качественное) CD79b в тестируемых клетках путем детектирования связывания анти-CD79b антитела с CD79b; и сравнение уровней экспрессии CD79b в тестируемых клетках с уровнем экспрессии CD79b в контрольных клетках (например, в нормальных клетках, происходящих от той же ткани, от которой происходят тестируемые клетки, или в клетках, которые, по сравнению с нормальными клетками, экспрессируют CD79b), где более высокий уровень экспрессии CD79b в тестируемых клетках, по сравнению с контрольными клетками, указывает на наличие заболевания, ассоциированного с повышенным уровнем экспрессии CD79b. В некоторых вариантах изобретения тестируемые клетки получают от индивидуума с подозрением на расстройство, ассоциированное с повышенным уровнем экспрессии CD79b. В некоторых вариантах изобретения таким расстройством является клеточно-пролиферативное заболевание, такое как рак или опухоль.
Репрезентативными клеточно-пролиферативными расстройствами, которые могут быть диагностированы с использованием антитела согласно изобретению, являются В-клеточные расстройства и/или В-клеточно-пролиферативные расстройства, включая, но не ограничиваясь ими, лимфому, неходжкинскую лимфому (НХЛ), агрессивную НХЛ, рецидивирующую агрессивную НХЛ, рецидивирующую бессимптомную НХЛ, не поддающуюся лечению НХЛ, не поддающуюся лечению бессимптомную НХЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лейкоз, ретикулоэндотелиоз (РЭ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и лимфому клеток коры головного мозга.
В некоторых вариантах изобретения способ диагностики или детектирования, такой как способ, описанный выше, включает детектирование связывания анти-CD79b антитела с CD79b, экспрессируемым на поверхности клеток или в мембранном препарате, выделенном из клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD79b. В некоторых вариантах изобретения указанный способ включает контактирование клеток с анти-CD79b антителом в условиях, благоприятствующих связыванию анти-CD79b антитела с CD79b, и детектирование образования комплекса между анти-CD79b антителом и CD79b на клеточной поверхности. Репрезентативным анализом для детектирования связывания анти-CD79b антитела с CD79b, экспрессируемым на поверхности клеток, является «FACS»-анализ.
Для детектирования связывания анти-CD79b антитела с CD79b могут быть применены и некоторые другие методы. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, анализы на связывание с антигеном, хорошо известные специалистам, такие как вестерн-блот-анализы, радиоиммуноанализы, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), «сэндвич»-иммуноанализы, анализы с применением иммунопреципитации, флуоресцентные иммуноанализы и иммуноанализы с использованием белка А, и иммуногистохимические анализы (ИГХ).
32
14
125
3
131
В некоторых вариантах изобретения анти-CD79b антитела являются мечеными. Метками являются, но не ограничиваются ими, метки или молекулы, которые могут быть детектированы непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронноплотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также молекулы, такие как ферменты или лиганды, которые детектируют непрямым методом, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Репрезентативными метками являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы P, C, I, H и I, флуорофоры, такие как хелатные комплексы редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахарид-оксидазы, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантин-оксидаза, присоединенные к ферменту, который использует пероксид водорода для окисления красителя-предшественника, такого как ПХ; лактопероксидаза или микропероксидаза; биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и т.п.
В некоторых вариантах изобретения анти-CD79b антитела иммобилизуют на нераствормимой матрице. Иммобилизация приводит к отделению анти-CD79b антитела от любого CD79b, оставшегося в растворе в свободном состоянии. Такую процедуру обычно осуществляют путем инсолюбилизации анти-CD79b антитела перед проведением процедуры анализа, как это происходит при адсорбции на нерастворимой в воде матрице или поверхности (Bennich et al., патент США 3720760), или путем ковалентного связывания (например, перекрестного связывания с глутаральдегидом), или путем инсолюбилизации анти-CD79b антитела после образования комплекса между анти-CD79b антителом и CD79b, например, посредством иммунопреципитации.
Любой из вышеуказанных вариантов диагностики или детектирования может быть осуществлен с использованием иммуноконъюгата согласно изобретению вместо анти-CD79b антитела или наряду с этим антителом.
B. Терапевтические методы
Антитело или иммуноконъюгат согласно изобретению могут быть использованы, например, в терапевтических методах in vitro, ex vivo и in vivo. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам ингибирования роста или пролиферации клеток, либо in vivo, либо in vitro, где указанный способ включает обработку клеток анти-CD79b антителом или иммуноконъюгатом в условиях, способствующих связыванию иммуноконъюгата с CD79b. Термин «ингибирование роста или пролиферации» клеток означает снижение роста или пролиферации клеток по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% и включает индуцирование гибели клеток. В некоторых вариантах изобретения указанной клеткой является опухолевая клетка. В некоторых вариантах изобретения указанной клеткой является В-клетка. В некоторых вариантах изобретения указанной клеткой является ксенотрансплантат, например, проиллюстрированный в описании настоящей заявки.
В одном из аспектов изобретения антитело или иммуноконъюгат согласно изобретению используют для лечения или предупреждения В-клеточно-пролиферативного расстройства. В некоторых вариантах изобретения указанное клеточно-пролиферативное расстройство ассоциируется с повышенным уровнем экспрессия и/или активности CD79b. Так, например, в некоторых вариантах изобретения В-клеточно-пролиферативное расстройство ассоциируется с повышенным уровнем экспрессии CD79b на поверхности В-клеток. В некоторых вариантах изобретения В-клеточно-пролиферативным расстройством является опухоль или рак. Примерами В-клеточно-пролиферативных расстройств, подвергаемых лечению антителами или иммуноконъюгатами согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, лимфома, неходжкинская лимфома (НХЛ), агрессивная НХЛ, рецидивирующая агрессивная НХЛ, рецидивирующая бессимптомная НХЛ, не поддающаяся лечению НХЛ, не поддающаяся лечению бессимптомная НХЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома, лейкоз, ретикулоэндотелиоз (РЭ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и лимфома клеток коры головного мозга.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения В-клеточно-пролиферативного расстройства, включающим введение индивидууму эффективного количества анти-CD79b антитела или его иммуноконъюгата. В некоторых вариантах изобретения способ лечения В-клеточно-пролиферативного расстройства включает введение индивидууму эффективного количества фармацевтического препарата, содержащего анти-CD79b антитело или анти-CD79b иммуноконъюгат, и необязательно по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, такое как средство, описанное ниже. В некоторых вариантах изобретения способ лечения В-клеточно-пролиферативного расстройства включает введение индивидууму эффективного количества фармацевтического препарата, содержащего (1) иммуноконъюгат, включающий анти-CD79b антитело и цитотоксическое средство; и необязательно (2) по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, такое как средство, описанное ниже.
В одном из аспектов изобретения по меньшей мере некоторые антитела или иммуноконъюгаты согласно изобретению могут связываться с CD79b, происходящим от вида, не являющегося человеком. В соответствии с этим антитела или иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть использованы для связывания с CD79b, например, в клеточной культуре, содержащей CD79b, в организме человека или других млекопитающих (например, шимпанзе, павианов, игрунок, собакоподобных обезьян и макак резусов, а также свиней или мышей), имеющих CD79b, с которым перекрестно реагирует антитело или иммуноконъюгат согласно изобретению. В одном из вариантов изобретения анти-CD79b антитело или иммуноконъюгат могут быть использованы для доставки CD79b в В-клетки путем контактирования антитела или иммуноконъюгата с CD79b с образованием комплекса «антитело-антиген» или «иммуноконъюгат-антиген» и тем самым для обеспечения проникновения конъюгированного цитотоксина иммуноконъюгата вовнутрь клетки. В одном из вариантов изобретения указанным CD79b является человеческий CD79b.
В одном из вариантов изобретения анти-CD79b антитело или иммуноконъюгат могут быть использованы в способе связывания CD79b у индивидуума, страдающего расстройством, ассоциированным с повышенным уровнем экспрессии и/или активности CD79b, где указанный способ включает введение индивидууму антитела или иммуноконъюгата в целях осуществления связывания CD79b у индивидуума. В одном из вариантов изобретения связанное антитело или связанный иммуноконъюгат интернализуется в В-клетках, экспрессирующих CD79b. В одном из вариантов изобретения указанным CD79b является человеческий CD79b, а указанным индивидуумом является человек. Альтернативно индивидуумом может быть млекопитающее, экспрессирующее CD79b, с которым связывается анти-CD79b антитело. Кроме того, указанным индивидуумом может быть млекопитающее, которому вводят CD79b (например, путем доставки CD79b или экспрессии трансгена, кодирующего CD79b).
Анти-CD79b антитело или иммуноконъюгат могут быть введены человеку в терапевтических целях. Кроме того, анти-CD79b антитело или иммуноконъюгат могут быть введены млекопитающему, не являющемуся человеком, у которого экспрессируется CD79b, с которым перекрестно связывается данное антитело (например, примату, свинье, крысам или мышам), где указанное введение проводят в целях лечения данного животного или в целях использования этого животного в качестве модели человеческого заболевания. В последнем случае такие животные-модели могут быть использованы для оценки терапевтической эффективности антител или иммуноконъюгатов (например, определения доз и времени проведения курса лечения).
При проведении терапии антитела или иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими терапевтическими композициями. Так, например, антитела или иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть введены вместе с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим средством и/или адъювантом. В некоторых вариантах изобретения другим терапевтическим средством являются цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство или рост-ингибирующее средство. В одном из таких вариантов химиотерапевтическим средством является средство или комбинация средств, таких как, например, цислофосфамид, гидроксидаунорубицин, адриамицин, доксорубицин, винкристин (Oncovin™), преднизолон, CHOP, CVP или COP, или иммунотерапевтические средства, такие как анти-CD20 антитело (например, Rituxan) или анти-VEGF антитело (например, Avastin), где указанная комбинированная терапия может быть применена для лечения рака и/или В-клеточных расстройств, таких как В-клеточно-пролиферативные расстройства, включая лимфому, неходжкинскую лимфому (НХЛ), агрессивную НХЛ, рецидивирующую агрессивную НХЛ, рецидивирующую бессимптомную НХЛ, не поддающуюся лечению НХЛ, не поддающуюся лечению бессимптомную НХЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лейкоз, ретикулоэндотелиоз (РЭ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и лимфому клеток коры головного мозга.
Такая вышеуказанная комбинированная терапия включает комбинированное введение (где два или более терапевтических средства включены в один и тот же препарат или в отдельные препараты) и раздельное введение, при котором введение антитела или иммуноконъюгата согласно изобретению может осуществляться до, во время и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта. Антитела или иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть также использованы в комбинации с лучевой терапией.
Антитело или иммуноконъюгат согласно изобретению (и любое дополнительное терапевтическое средство или адъювант) могут быть введены любыми подходящими способами, включая парентеральное введение, подкожное введение, внутрибрюшинное введение, внутрилегочное введение и интраназальное введение, и, если это необходимо для местного лечения, введение в пораженный участок. Парентеральными вливаниями являются внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антитело или иммуноконъюгат могут быть введены путем периодического вливания, а в частности, со снижением доз антитела или иммуноконъюгата. Доза может быть введена любым подходящим способом, например, путем инъекции, такой как внутривенная или подкожная инъекция, отчасти, в зависимости от того, осуществляется ли такое введение сразу или в течение длительного периода времени.
Антитела или иммуноконъюгаты согласно изобретению приготавливают, разделяют на дозы и вводят в соответствии с хорошо известной медицинской практикой. Факторами, учитываемыми для приготовления таких композиций, являются конкретное расстройство, подвергаемое лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние конкретного пациента, этиологический фактор, вызывающий данное расстройство, участок, на который направлено данное средство, способ введения, схема введения и другие факторы, известные практическим врачам. Указанное антитело или иммуноконъюгат должны быть, но необязательно, приготовлены в виде композиции с одним или несколькими современными средствами, используемыми для предупреждения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела согласно изобретению, присутствующего в данной композиции, типа расстройства или способа его лечения и от других факторов, обсуждаемых выше. Указанные другие средства обычно вводятся в тех же самых дозах и теми же способами, которые обычно использовались ранее, либо эти дозы составляют примерно 1-99% от используемых ранее доз, либо такие средства могут быть введены в любой дозе и любым способом, которые могут быть при необходимости определены эмпирически или клиническим методом.
Для предупреждения или лечения заболевания подходящая доза антитела или иммуноконъюгата согласно изобретению (при их использовании отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, такими как химиотерапевтические средства) зависит от типа заболевания, подвергаемого лечению, типа антитела или иммуноконъюгата, тяжести и курса лечения заболевания, независимо от того, вводят ли указанное антитело или иммуноконъюгат в профилактических или терапевтических целях, от проводимого ранее лечения, от истории болезни пациента и его восприимчивости к данному антителу или иммуноконъюгату, и от назначения лечащего врача. Такое антитело или иммуноконъюгат могут быть введены пациенту один раз или несколько раз во время проведения курса лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания начальная предварительно установленная доза антитела или иммуноконъюгата, вводимого пациенту, составляет примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг/дозу), независимо от того, осуществляют ли одноразовое или многократное введение или непрерывную инфузию данного антитела. Одна типичная суточная доза может составлять примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторного введения в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение может проводиться до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое подавление симптомов заболевания. Одна репрезентативная доза указанного антитела или иммуноконъюгата может составлять примерно от 0,05 мг/кг до 10 мг/кг. Таким образом, пациенту могут быть введены одна или несколько доз, составляющих примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации) антитела или иммуноконъюгата. Такие дозы могут быть введены периодически, например, через каждую неделю или через каждые три недели (например, так, чтобы пациент получал примерно от 2 до 20 или, например, примерно 6 доз антитела или иммуноконъюгата). Вначале может быть введена более высокая нагрузочная доза, а затем могут быть введены одна или несколько более низких доз. Репрезентативная схема введения доз включает введение первоначальной нагрузочной дозы, а затем еженедельное введение поддерживающей дозы примерно 2 мг/кг антитела. Однако могут быть применеы и другие схемы введения доз. Мониторинг эффекта такой терапии может быть легко проведен с применением стандартных методов и анализов.
C. Анализы на активность
Анти-CD79b антитела и иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть охарактеризованы на их физическую/химическую и/или биологическую активность с применением различных анализов, известных специалистам.
1. Анализы на активность
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к анализам для идентификации анти-CD79b антител или их иммуноконъюгатов, обладающих биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, способность ингибировать рост или пролиферацию клеток (например, активность, направленную на «уничтожение клеток») или способность индуцировать гибель клеток, включая запрограммированную клеточную гибель (апоптоз). Настоящее изобретение также относится к антителам или иммуноконъюгатам, обладающим такой биологической активностью in vivo и/или in vitro.
TM
В некоторых вариантах изобретения анти-CD79b антитело или его иммуноконъюгат тестируют на способность ингибировать рост или пролиферацию клеток in vitro. Анализы на ингибирование роста или пролиферации клеток хорошо известны специалистам. Некоторые анализы на пролиферацию клеток, называемые здесь анализами на «уничтожение клеток», позволяют определять жизнеспособность клеток. Одним из таких анализов является люминесцентный анализ на жизнеспособность клеток CellTiter-Glo, который является коммерчески доступным и был разработан фирмой Promega (Madison, WI). Такой анализ позволяет определять число жизнеспособных клеток в культуре, исходя из количественной оценки присутствия ATP, которое является показателем наличия метаболически активных клеток. См. Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, патент США № 6602677. Анализ может быть проведен в 96- или 384-луночном формате, что делает возможным проведение автоматизированного высокоэффективного скринига (HTS). См. Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. Процедура анализа включает добавление одного реагента (реагента CellTiter-Glo) непосредственно в культивируемые клетки. Это приводит к лизису клеток и к продуцированию люминесцентного сигнала, вырабатываемого посредством люциферазной реакции. Люминесцентный сигнал пропорционален количеству присутствующего АТР, которое прямо пропорционально числу жизнеспособных клеток, присутствующих в культуре. Данные могут быть зарегистрированы на люминометре или на визуализирующем устройстве, снабженном камерой с зарядовой связью. Люминесцентный сигнал, полученный на выходе такого устройства, выражали в относительных световых единицах (RLU).
TM
Другой анализ на пролиферацию клеток представляет собой анализ «MTT», а именно колориметрический анализ, в котором измеряют уровень окисления бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия до формазана под действием митохондриальной редуктазы. Подобно анализу CellTiter-Glo, этот анализ позволяет определять число метаболически активных клеток, присутствующих в клеточной культуре. См., например, Mosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63, и Zhang et al. (2005) Cancer Res. 65:3877-3882.
6
2+
2
В одном из аспектов изобретения анти-CD79b антитело тестируют на способность индуцировать гибель клеток in vitro. Анализы на индуцирование гибели клеток хорошо известны специалистам. В некоторых вариантах изобретения такие анализы позволяют определять, например, потерю целостности мембраны, на что указывает поглощение иодида пропидия (PI), трипанового синего (см. Moore et al. (1995) Cytotechnology, 17:1-11), или 7AAD. В репрезентативном анализе с поглощением PI клетки культивируют в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM):среде Хэмса F-12 (50:50), в которую были добавлены 10% термоинактивированная FBS (Hyclone) и 2 мМ L-глутамин. Таким образом, данный анализ осуществляют в отсутствие комплемента и иммунных эффекторных клеток. Клетки высевают в 100×20-мм чашки при плотности 3×10 клеток на чашку и оставляют на ночь для адгезии. Затем среду удаляют и заменяют только свежей средой или средой, содержащей различные концентрации антитела или иммуноконъюгата. Затем клетки инкубируют в течение 3 дней. После обработки монослои промывают PBS и отделяют путем трипсинизации. После этого клетки центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 минут при 4°C, затем осадок ресуспендируют в 3 мл холодного Ca-связывающего буфера (10 мМ Hepes, pH 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl), и разделяют на аликвоты в пробирках (35 мм, 12×75) с плотно закрывающейся крышкой (1 мл на пробирку, 3 пробирки на каждую группу обработки) для удаления скоплений клеток. Затем в пробирки добавляют PI (10 мкг/мл). Образцы анализируют на проточном цитометре FACSCAN и с использованием компьютерной программы FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). Таким образом могут быть идентифицированы антитела или иммуноконъюгаты, которые индуцируют статистически значимые уровни гибели клеток, как было определено по поглощению PI.
2+
В одном из аспектов изобретения анти-CD79b антитело или иммуноконъюгат тестируют на способность индуцировать апоптоз (запрограммированную клеточную гибель) in vitro. Репрезентативным анализом на антитела или иммуноконъюгаты, индуцирующие апоптоз, является анализ на связывание с аннексином. В репрезентативном анализе на связывание с аннексином клетки культивируют и высевают в чашки, как описано в предыдущем абзаце. Среду удаляют и заменяют только свежей средой или средой, содержащей 0,001-10 мкг/мл антитела или иммуноконъюгата. После инкубирования в течение трех дней, монослои промывают PBS и отделяют путем трипсинизации. После этого клетки центрифугируют, ресуспендируют в Ca-связывающем буфере и разделяют на аликвоты в пробирках, как описано в предыдущем абзаце. В пробирки добавляют меченый аннексин (например, аннексин V-ФИТЦ) (1 мкг/мл). Образцы анализируют на проточном цитометре FACSCAN™ и с помощью компьютерной программы FACSCONVERT™ CellQuest (BD Biosciences). Таким образом идентифицируют антитела или иммуноконъюгаты, индуцирующие статистически значимые уровни связывания с аннексином по сравнению с контролем. Другим репрезентативным анализом на антитела или иммуноконъюгаты, которые индуцируют апоптоз, является колориметрический ELISA-анализ с использованием ДНК гистона, который позволяет детектировать межнуклеосомную деградацию геномной ДНК. Такой анализ может быть осуществлен с использованием, например, ELISA-набора для детектирования гибели клеток (Roche, Palo Alto, CA).
Клетками, используемыми в любом из вышеупомянутых анализов in vitro, являются клетки или клеточные линии, которые обычно экспрессируют CD79b или которые были сконструированы так, чтобы они экспрессировали CD79b. Такими клетками являются опухолевые клетки, экспрессирующие CD79b по сравнению с нормальными клетками, происходящими от той же самой ткани. Такими клетками также являются клеточные линии (включая опухолевые клеточные линии), которые экспрессируют CD79b, и клеточные линии, которые обычно не экспрессируют CD79b, но были трансфицированы нуклеиновой кислотой, кодирующей CD79b.
В одном из аспектов изобретения анти-CD79b антитело или его иммуноконъюгат тестируют на способность ингибировать рост или пролиферацию клеток in vivo. В некоторых вариантах изобретения анти-CD79b антитело или его иммуноконъюгат тестируют на способность ингибировать рост опухоли in vivo. Для такого тестирования могут быть использованы системы модели in vivo. В репрезентативной системе ксенотрансплантата человеческие опухолевые клетки вводят животному с ослабленным иммунитетом, не являющемуся человеком, например, мышам SCID. Этому животному вводят антитело или иммуноконъюгат согласно изобретению. Затем оценивают способность антитела или иммуноконъюгата ингибировать или снижать рост опухоли. В некоторых вариантах вышеуказанной системы ксенотрансплантата, человеческими опухолевыми клетками являются опухолевые клетки, происходящие от человека. Такими клетками, подходящими для получения модели ксенотрансплантата, являются клетки человеческого лейкоза и клеточные линии человеческой лимфомы, которыми являются, но не ограничиваются ими, клетки BJAB-luc (например, EBV-негативные клеточные линии лимфомы Беркитта, трансфицированные люциферазным репортерным геном), клетки Ramos (ATCC, Manassas, VA, CRL-1923), клетки SuDHL-4 (DSMZ, Braunschweig, Germany, AAC 495), клетки DoHH2 (см. Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 5:221-224 (1991), и Kluin-Neilemans, H.C. et al., Leukemia 8:1385-1391 (1994)), клетки Granta-519 (см. Jadayel, D.M. et al, Leukemia 11(1):64-72 (1997)). В некоторых вариантах изобретения человеческие опухолевые клетки вводят животному с ослабленным иммунитетом, не являющемуся человеком, путем подкожной инъекции или трансплантации в подходящий участок, например, в жировое тело молочной железы.
2. Анализ на связывание и другие анализы
В одном из аспектов изобретения анти-CD79b антитело тестируют на антигенсвязывающую активность. Так, например, в некоторых вариантах изобретения анти-CD79b антитело тестируют на способность связываться с CD79b, экспрессируемым на поверхности клеток. Такое тестирование может быть проведено с помощью FACS-анализа.
В одном из аспектов изобретения для идентификации моноклонального антитела, которое конкурирует с мышиным антителом MA79b, с гуманизированным антителом MA79b.v17 и/или с гуманизированным антителом MA79b.v28 и/или с гуманизированным антителом MA79b.v32 за связывание с CD79b, могут быть проведены анализы на конкурентное связывание. В некоторых вариантах изобретения такое конкурирующее антитело связывается с тем же самым эпитопом (например, с линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается мышиное антитело MA79b, гуманизированное антитело MA79bv.17 и/или гуманизированное антитело MA79b.v18 и/или гуманизированное антитело MA79b.v28 и/или гуманизированное антитело MA79b.v32. Репрезентативными анализами на конкурентное связывание являются, но не ограничиваются ими, рутинные анализы, такие как анализы, описанные в публикации Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Подробное описание репрезентативных методов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, можно найти в публикации Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Считается, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если каждое из них блокирует связывание другого на 50% или более.
В репрезентативном анализе на конкурентное связывание иммобилизованный CD79b инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с CD79b (например, мышиное антитело MA79b, гуманизированное антитело MA79bv.17 и/или гуманизированное антитело MA79b.v18 и/или гуманизированное антитело MA79b.v28 и/или гуманизированное антитело MA79b.v32), и второе немеченое антитело, которое тестируют на его способность конкурировать с первым антителом за связывание с CD79b. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный CD79b инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубирования в условиях, благоприятствующих связыванию первого антитела с CD79b, избыток несвязанного антитела удаляют и определяют количество метки, ассоциированной с иммобилизованным CD79b. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным CD79b, в тестируемом образце значительно ниже количества метки в контрольном образце, то это означает, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с CD79b. В некоторых вариантах изобретения иммобилизированный CD79b присутствует на поверхности клеток или в мембранном препарате, полученном из клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD79b.
В одном из аспектов изобретения очищенные анти-CD79b антитела могут быть дополнительно охарактеризованы путем проведения серии анализов, включая, но не ограничиваясь ими, N-концевое секвенирование, аминокислотный анализ, эксклюзионную жидкостную хроматографию высокого давления (ЖХВД), проводимую в неденатурирующих условиях, масс-спектрометрию, ионообменную хроматографию и гидролиз папаином.
В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к модифицированному антителу, которое обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желаемым кандидатом на применение во многих целях, а именно в том случае, когда важным фактором является время полужизни антитела in vivo, а некоторые эффекторные функции (такие как комплемент и ADCC) либо являются необязательными, либо нежелательными. В некоторых вариантах изобретения определяют активность Fc антитела для гарантии того, что будут сохраняться лишь желаемые свойства. Для подтверждения снижения/истощения CDC- и/или ADCC-активности могут быть проведены анализы на цитотоксичность in vitro и/или in vivo. Так, например, для гарантии того, что данное антитело не будет связываться с FcγR (а следовательно, вероятно, не будет обладать ADCC-активностью), но будет сохранять способность связываться с FcRn, могут быть проведены анализы на связывание с Fc-рецептором (FcR). Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK-клетки, экспрессируют только Fc(RIII, тогда как моноциты экспрессируют Fc(RI, Fc(RII и Fc(RIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках систематизирована в таблице 3 на странице 464 публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Пример in vitro анализа для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы описан в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Подходящими эффекторными клетками для проведения таких анализов являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, в модели животного, такой как модель, описанная в публикации Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Для подтверждения того, что данное антитело неспособно связываться с C1q, а поэтому оно не обладает CDC-активностью, могут быть также проведены анализы на связывание с C1q. Для анализа активации комплемента может быть проведен CDC-анализ, например, анализ, описанный в публикации Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Оценка связывания с FcRn, а также клиренса/времени полужизни in vivo может быть также осуществлена методами, известными специалистам.
Нижеследующие примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не рассматриваются как ограничение объема изобретения.
Все патенты и публикации, цитируемые в описании настоящей заявки, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Примеры
Коммерчески доступные реагенты, указанные в примерах, были использованы в соответствии с инструкциями производителей, если это не оговорено особо. Антителами, используемыми в примерах, являются коммерчески доступные антитела, и такими антителами являются, но не ограничиваются ими, анти-CD79b антитело (антитело, закупленное фирмой Biomeda (Foster City, CA) или BDbioscience (San Diego, CA) или Ancell (Bayport, MN)), анти-CD79b антитело (выделенное из гибридом, депонированных в ATCC как HB11413 20 июля, 1993 г.) и химерные анти-CD79b антитела (содержащие вариабельные домены антител, продуцируемых из гибридом, депонированных в ATCC как HB11413 20 июля, 1993 г.). Источником получения этих клеток, идентифицированных в нижеследующих примерах и во всем описании изобретения под регистрационными номерами АТСС, является Американская коллекция типовых культур, Manassas, VA.
Пример 1: Получение гуманизированного анти-CD79b антитела
Номера остатков даны по Кабату . В описании изобретения используются однобуквенные обозначения аминокислот. Вырожденность ДНК представлена кодом IUB (N=A/C/G/T, D=A/G/T, V=A/C/G, B=C/G/T, H=A/C/T, K=G/T, M=A/C, R=A/G, S=G/C, W=A/T, Y=C/T).
A. Гибридное гуманизированное анти-CD79b антитело
Были получены различные гуманизированные анти-CD79b антитела. Последовательности доменов VL и VH мышиного антитела MA79b (MA79b) (Roswell Park Cancer Institute; Okazaki et al., Blood, 81:84-94 (1993)) выравнивали с последовательностями доменов человеческой консенсусной VL каппа I (huKI) и человеческой консенсусной VH подгруппы III (huIII). Для получения HVR-гибрида использовали акцепторную каркасную область VH, которая отличалась от домена человеческой консенсусной VH подгруппы III в 3 положениях: R71A, N73T и L78A . Гипервариабельные области мышиного MA79b (MA79b) присоединяли к каркасной области акцепторной человеческой консенсусной последовательности и получали прямой HVR-гибрид MA79b (называемый здесь “гибридом MA79b” или “MA79b-гибридом” или «MA79b-связанным «гуманизированным антителом» или «huMA79b-гибридом»). В домене VL нижеследующие области присоединяли к человеческой консенсусной акцепторной последовательности в положениях 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) (фигуры 7A-B). В домене VH присоединяли области в положениях 26-35 (H1), 49-65 (H2) и 93-102 (H3) (фигуры 8A-B). В публикации MacCallum et al. (MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996)) проанализированы кристаллические структуры комплекса «антиген-антитело», и было обнаружено, что положения 49, 93 и 94 тяжелой цепи являются частью контактной области, и в случае гуманизированных антител они входят в определение HVR-H2 и HVR-H3.
Вариант, полученный путем прямого присоединения (huMA79b-гибрид), был продуцирован методом мутагенеза Kunkel как Fab, представленный на фаге, и как IgG, с использованием отдельного олигонуклеотида для каждой гипервариабельной области. Соответствующие клоны оценивали путем секвенирования ДНК.
B. Варианты гибридов гуманизированного анти-CD79b антитела
Варианты гибридов анти-CD79b антитела, которые включают разнообразие мутантов в гипервариабельных областях MA79b-связанного «гуманизированного» антитела, получали с использованием фаговых библиотек. Варианты гибридов анти-CD79b антител включают мутации в одном положении в HVR (фигура 9) или мутации во многих положениях в HVR (фигура 10).
C. Отбор фага
ecd
ecd
Для отбора фага внеклеточный домен CD79b (huCD79b) (2 мкг/мл) иммобилизовали в PBS на микротитрационных планшетах MaxiSorp (Nunc) в течение ночи при 4°C. Планшеты блокировали в течение 1 часа с использованием казеинового блокатора (Pierce). Фаг собирали из супернатанта культуры и суспендировали в PBS, содержащем 0,5% BSA и 0,05% твина 20 (PBSBT). После добавления фаговой библиотеки и отбора фага в течение 2 часов лунки микротитрационного планшета интенсивно промывали PBS, содержащим 0,05% твина 20 (PBST) для удаления несвязанного фага, а связанный фаг элюировали путем инкубирования лунок со 100 мМ HCl в течение 30 минут. Жесткость отбора может быть повышена в процессе проведения последовательных раундов отбора путем увеличения числа промывок PBST или путем инкубирования с растворимым huCD79b для увеличения периода времени до элюирования.
Элюированный фаг нейтрализовали 1M Трис, pH 8, и амплифицировали с использованием клеток XL1-Blue и фага-помощника M13/KO7, а затем культивировали в течение ночи при 37°C в 2YT, 50 мкг/мл карбенациллина. Титры фага, элюированного с мишень-содержащей лунки, сравнивали с титрами фага, выделенного из лунки, не содержащей мишени, для оценки уровня обогащения.
D. Получение Fab и получение IgG
В целях экспрессии белка Fab для измерения аффинности, между тяжелой цепью и g3 в векторе фагового представления встраивали стоп-кодон. Клоны переносили в клетки E. coli 34B8 и культивировали в полной среде C.R.A.P. при 30°C (Presta et al. Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Клетки собирали путем центрифугирования, суспендировали в PBS, 100 мкМ PMSF, 100мкМ бензамидина, 2,4 мМ EDTA, и разрушали в открытом виде с использованием микрофлюидизатора. Fab очищали с помощью аффинной хроматографии на G-белке.
2
Для проведения скрининга варианты IgG сначала продуцировали в клетках 293. Векторы, кодирующие VL и VH (25 мкг), переносили в клетки 293 с использованием системы FuGene. 500 мкл FuGene смешивали с 4,5 мл среды DMEM, не содержащей FBS, и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. К этой смеси добавляли каждую цепь (25 мкг) и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем переносили в колбу для трансфекции в течение ночи при 37°C в 5% CO. На следующий день среду, содержащую смесь для трансфекции, удаляли и заменяли 23 мл среды PS04, содержащей 0,1 мл/л микроэлементов (A0934) и 10 мг/л инсулина (A0940). Клетки инкубировали еще 5 дней, а затем среду собирали при 1000 об/мин в течение 5 минут и подвергали стерильной фильтрации через 0,22-мкм фильтр, связывающийся с белком, присутствующим в небольшом количестве. После добавления 2,5 мл 0,1% PMSF для каждых 125 мл среды, образцы можно хранить при 4°C.
E. Определение аффинности (анализ Biacore)
ecd
ecd
Для определения аффинности MA79b-связанных вариантов «гуманизированного» антитела, внеклеточный домен человеческого CD79b (huCD79b) экспрессировали в клетках CHO отдельно или в виде Fc-гибрида (huCD79b-Fc) и очищали стандартными методами. Кроме того, пептид из 16 аминокислот (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16), содержащий эпитоп для MA79b, синтезировали стандартными методами.
Характеризация эпитопа для антитела MA79b (обозначенного на фигуре 19 как «тестируемый пептид») описана в заявке на патент США № 11/462336, поданной 3 августа 2006 г. Эпитоп для MA79b был локализован во внеклеточной пептидной области, расположенной на значительном расстоянии от трансмембранного домена, и присутствовал в полноразмерной и в усеченной формах человеческого CD79b (см. публикацию Cragg, Blood, 100(9):3068-76 (2002)), относящуюся к нормальным и злокачественным B-клеткам (Hashimoto, S. et al., Mol. IмМunol., 32(9):651-9 (1995); Alfarano et al., Blood, 93(7):2327-35 (1999)). Усеченная форма CD79b не содержала полноразмерного внеклеточного Ig-подобного домена (внеклеточный Ig-подобный домен, который не присутствует в сплайсированной усеченной форме CD79b, представлен в рамке на фигуре 19).
ecd
ecd
ecd
TM
Уровень связывания Fab- и IgG-вариантов MA79b, MA79b-связанного «гуманизированного» антитела или MA79b-связанных вариантов «гуманизированного» антитела с иммобилизованным huCD79b или huCD79b-Fc или с пептидом из 16 аминокислот, содержащим эпитоп для MA79b, измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса. Измерение аффинности осуществляли методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore-2000. Антиген, huCD79b или huCD79b-Fc иммобилизовали (приблизительно 50-200 ЕО) в 10 мМ ацетата натрия, pH 4,8, на сенсорном чипе CM5. Величины аффинности зависят от количества иммобилизованного huCD79b, что в значительной степени обусловлено эффектом авидности. По этой причине величины аффинности, полученные для образцов в различные дни, нормализовали по MA79b, который был одновременно использован в качестве стандарта. В тех экспериментах, в которых оценивали уровень связывания с пептидом из 16 аминокислот, содержащим эпитоп для MA79b (ARSEDRYRNPKGSACK) (SEQ ID NO: 16), биотинилированный пептид иммобилизовали (приблизительно 20 ЕО) на сенсорном чипе, покрытом стрептавидином. Очищенный MA79b-присоединенный вариант «гуманизированного» антитела (в виде Fab или IgG) (2-кратное серийное разведение 0,5-1000 нМ в PBST) впрыскивали при скорости потока 30 мкл/мин. Каждый образец анализировали по 4-минутной ассоциации и 10-минутной диссоциации. После каждого впрыска чип регенерировали с использованием 10 мМ глицина, рН 1,7.
on
off
Величину отклика реакции связывания корректировали путем вычитания величины, полученной для контрольной проточной кюветы, из величины, полученной для проточной кюветы, содержащей MA79b-присоединенный вариант «гуманизированного» антитела (в виде Fab или IgG). Для кинетического анализа использовали лангмюровскую модель 1:1 построения кривой по данным k и k.
F. Анализ на связывание (FACS-анализ)
Для дополнительного определения уровня связывания Fab-фрагмента MA79b-связанного «гуманизированного» антитела или его вариантов проводили оценку связывания вариантов Fab и/или IgG с клетками DoHH-2 с помощью FACS-анализа. Кроме того, с помощью FACS-анализа проводили оценку уровня связывания MA79b-связанных вариантов «гуманизированного» антитела с клетками BJAB, содержащими люциферазу.
6
Для проведения FACS-анализа Fab-вариантов MA79b-связанных вариантов «гуманизированного» антитела (MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (варианта IgG, используемого в качестве контроля)), клетки DoHH-2 (1×10 в объеме 100 мкл) сначала инкубировали в присутствии или в отсутствие 1 мкг исходного мышиного моноклонального анти-CD79b антитела (MA79b) в течение 30 минут, а затем добавляли 1 мкг отдельного варианта Fab (или контрольного антитела). В качестве «второго» детектирующего антитела использовали ФЭ-конъюгированное мышиное антитело против человеческой легкой цепи Ig каппа (клон G20-193, BD Biosciences, San Diego, CA), поскольку все варианты Fab несут легкую цепь каппа, а клетки DoHH-2 не экспрессируют на своей поверхности легкую цепь каппа.
Для дополнительного FACS-анализа вариантов IgG MA79b-связанных вариантов «гуманизированного» антитела (варианта IgG chMA79b, используемого в качестве контроля), 1,0 мкг, 0,1 мкг или 0,01 мкг антитела титровали на миллион клеток BJAB, содержащих люциферазу. В качестве «второго» детектирующего антитела использовали ФЭ-конъюгированное мышиное антитело против человеческого Ig.
G. Определение аффинности (анализ Скэтчарда)
Для дополнительного определения уровня связывания вариантов IgG, имеющих модификации в HVR-L2 и HVR-H3 (huMA79b L2/H3), анализировали связывание йодированных вариантов IgG с клетками BJAB, экспрессирующими человеческий CD79b и CD79b собакоподобных обезьян, а затем проводили анализ Скэтчарда.
125
Для проведения анализа Скэтчарда 0,5 нМ I-меченного MA79b или huMA79b L2/H3 подвергали конкурентному связыванию с немеченым MA79b или huMA79b L2/H3, соответственно, в концентрации в пределах от 50 до 0,02 нМ (12-стадийное серийное разведение 1:2) в присутствии трансфицированной клеточной линии BJAB, стабильно экспрессирующей CD79b собакопободных обезьян и эндогенный человеческий CD79b. После 4-часового инкубирования при 4°C клетки промывали, и клеточный осадок считывали на гамма-счетчике (на автоматическом гамма-счетчике 1470 WIZARD Automatic GaмМa Counter; Perkin Elmer, Walthem, MA). Все вычисления проводили с тремя повторностями, и подсчет осуществляли в течение 10 минут. Для вычисления Kd использовали среднее число импульсов в минуту (СРМ), и такое вычисление осуществляли с помощью компьютерной программы New Ligand (Genentech, South San Francisco, CA).
Результаты и обсуждение
A. Результаты продуцирования гуманизированного анти-CD79b антитела
Человеческая акцепторная каркасная область, используемая для получения гуманизированного анти-CD79b антитела, содержит домен VL консенсусной человеческой последовательности каппа I и вариант домена VH человеческой консенсусной последовательности подгруппы III. Вариант домена VH имеет 3 замены в человеческой консенсусной последовательности в положениях R71A, N73T и L78A. Последовательности доменов VL и VH MA79b выравнивали с человеческими последовательностями каппа I и подгруппы III, где каждую HVR идентифицировали, а затем присоединяли к человеческой акцепторной каркасной области с получением HVR-гибрида, который может быть представлен на фаге как Fab (фигуры 7 и 8).
ecd
ecd
Фаг представляет MA79b-гибрид в виде Fab, связанного с иммобилизированным huCD79b (данные не приводятся). Однако, если последовательность huMA79b-гибрида экспрессировалась как IgG, то FACS-анализ на аффинность его связывания с huCD79b указывал на то, что аффинность связывания снижалась в более чем 100 раз (данные не приводятся), а анализ Biacore указывал на более чем 50-кратное снижение (фигура 11).
1. Репарация CDR
ecd
MA79b-связанные варианты «гуманизированного» антитела, которые обладали способностью связываться с иммобилизированным huCD79b, идентифицировали с использованием нижеследующих замен в последовательностях.
Изменения в HVR в VL имелись лишь в библиотеках, содержащих замены в одном положении, и такие изменения приводится на фигуре 9 (для мутации L1: Q27K (SEQ ID NO: 17; мутации SPL-2), (для мутации L2: L54R (SEQ ID NO: 18), E55K (SEQ ID NO: 19)), и (для мутации L3: E93S (SEQ ID NO: 20; мутация SPL-5), E93K (SEQ ID NO: 21)).
Изменения в HVR в L2, L3, H1 и H3 в HVR имелись лишь в библиотеках, содержащих замены в нескольких положениях, и такие изменения приводится на фигуре 10 (для мутации L2: S52R, N53K, E55G и S56R (SEQ ID NO: 22; мутация L2-2); N53R (SEQ ID NO: 23); S52R, N53K, E55G и S56N (SEQ ID NO: 24); S52R, N53K, E55K и S56R (SEQ ID NO: 25); S52R, N53Y, E55K и S56R (SEQ ID NO: 26; мутация L2-29); S52R, N53K и E55K (SEQ ID NO: 27); S52R, N53K и E55A (SEQ ID NO: 28); S52G, N53I, E55A и S56R (SEQ ID NO: 29); S52R, N53K, E55R (SEQ ID NO: 30); S52R, N53K и E55G (SEQ ID NO: 31; мутация L2-38); S52R, N53H, E55K и S56R (SEQ ID NO: 32); A51S, S52R, N53Y, E55S и S56R (SEQ ID NO: 33); A51G, N53K, E55L и S56R (SEQ ID NO: 34); L54R и E55K (SEQ ID NO: 35); N53K и E55G (SEQ ID NO: 36); S52R, N53Y, E55R и S56R (SEQ ID NO: 37); S52R, N53R, E55R и S56T (SEQ ID NO: 38); S52R, N53R, E55G и S56R (SEQ ID NO: 39); S52R, N53Q, L54R, E55K и S56R (SEQ ID NO: 40); S52R, N53K, E55L и S56R (SEQ ID NO: 41); S52R, N53K, E55K и S56N (SEQ ID NO: 42); S52R, N53K, E55G и S56T (SEQ ID NO: 43); S52R, N53K, E55G и S56G (SEQ ID NO: 44); и S52R, N53K, E55A и S56R (SEQ ID NO: 45)), (для мутации L3: E93A (SEQ ID NO: 46); E93Q (SEQ ID NO: 47); отсутствие мутации (SEQ ID NO: 48); E93D (SEQ ID NO: 49); E93L (SEQ ID NO: 50); Q89N, Q90N, E93G и T97N (SEQ ID NO: 51); Q90P, S91D, D94A и L96R (SEQ ID NO: 52); Q89D, S91R и E93A (SEQ ID NO: 53)), (для мутации H1: T28P, S30T, S31R и E35S (SEQ ID NO: 54); T28P, S30R и E35Q (SEQ ID NO: 55); T28P, S30T и E35N (SEQ ID NO: 56); T28P, S30T, S31R и E36N (SEQ ID NO: 57; мутация H1-6)); S30N, S31R и E35N (SEQ ID NO: 58); T28S и S30K (SEQ ID NO: 59); G26P, T28S, F29L, S30C, S31T, W33F и E35D (SEQ ID NO: 60); T28Y и S30T (SEQ ID NO: 61); T28P, S30G, S31R, I34V и E35N (SEQ ID NO: 62); S30K и S31K (SEQ ID NO: 63); T28P, S30T и E35Q (SEQ ID NO: 64); T28P, S30R и S31R (SEQ ID NO: 65); T28P, F29V, S30G, S31R и E35S (SEQ ID NO: 66); T28P, S30N, S31R и E35N (SEQ ID NO: 67; мутация H1-1); T28G, S30T и E35S (SEQ ID NO: 68); S30T, I34L и E35S (SEQ ID NO: 69); S30T (SEQ ID NO: 70); S31G и E35N (SEQ ID NO: 71); S30R, S31R и E35N (SEQ ID NO: 72); T28S, S30R и E35N (SEQ ID NO: 73); T28S, S30R, S31R и E35N (SEQ ID NO: 74); T28S, S30R и S31R (SEQ ID NO: 75); T28S, S30P, I34L и E35Q (SEQ ID NO: 76); T28P, S30T и S31R (SEQ ID NO: 77); T28P и S31G (SEQ ID NO: 78); T28P, S30R и E35S (SEQ ID NO: 79); T28P, S30R и E35N (SEQ ID NO: 80); T28P, S30R и S31G (SEQ ID NO: 81); T28P, S30N и S31R (SEQ ID NO: 82); T28P, S30N, S31G и E35N (SEQ ID NO: 83); T28N, F29V, I34L и E35S (SEQ ID NO: 84); Y27F, T28P, S30T и E35S (SEQ ID NO: 85); и Y27F, T28P, S30N, S31R и E35N (SEQ ID NO: 86)) и (для мутации H3: V98I и F100L (SEQ ID NO: 87; мутация H3-12); мутация отсутствует (SEQ ID NO: 88); Y99K и F100L (SEQ ID NO: 89); F100L (SEQ ID NO: 90); V98I (SEQ ID NO: 91); V98F, Y99C и F100L (SEQ ID NO: 92); F100L (SEQ ID NO: 93); V98I, Y99R и F100L (SEQ ID NO: 94; мутация H3-10); V98I, Y99K и F100L (SEQ ID NO: 95); V98I и Y99R (SEQ ID NO: 96); V98I (SEQ ID NO: 97); D101S (SEQ ID NO: 98); Y99V и F100L (SEQ ID NO: 99); Y99R и F100L (SEQ ID NO: 100); Y99R (SEQ ID NO: 101); Y99F и F100L (SEQ ID NO: 102); V98I и F100L (SEQ ID NO: 103); V98I (SEQ ID NO: 104); V96R, Y99C и F100L (SEQ ID NO: 105); и V96I (SEQ ID NO: 106)).
Отбор клонов проводили в другом формате в виде Fab для FACS-анализа и в виде IgG для последующего анализа Biacore и Скэтчарда.
a. Определение аффинности (анализ Biacore)
ecd
ecd
Как показано на фигуре 11, где проиллюстрирован анализ Biacore, такой метод CDR-репарации позволяет идентифицировать множество изменений в отдельной последовательности, которые повышают аффинность MA79b-связанного «гуманизированного» антитела. Анализ, проводимый с помощью поверхностного плазмонного резонанса, показал, что, хотя ни один из протестированных вариантов с одной HVR-заменой не обладал аффинностью, аналогичной аффинности MA79b, однако, комбинация замен, идентифицированных в HVR-L2 и HVR-H3 (MA79b-связанный вариант «гуманизированного» антитела L2/H3; также обозначаемый здесь huMA79b L2/H3), приводила к образованию варианта (фигура 11), обладающего аффинностью, аналогичной аффинности антитела MA79b при его связывании с иммобилизованным huCD79b или huCD79b-Fc или пептидом из 16 аминокислот, содержащим эпитоп для MA79b, как было определено в анализе Biacore.
ecd
Анализ на связывание мономера (Fab) и димера (IgG) MA79b с антигеном (huCD79b-Fc) (фигура 11, ряд 1, ср. столбцы для Fab и IgG) дал основание предположить, что компонент, обладающий в 100 раз большей авидностью и присутствующий в MA79b, может отсутствовать в вариантах с улучшенной аффинностью. В частности, в MA79b-связанном варианте «гуманизированного» антитела L2-2 (также обозначаемого здесь huMA79b L2-2), который обнаруживает 5-кратное повышение уровня мономерного связывания по сравнению с MA79b (фигура 11, ряды 1 и 3, см. столбцы для Fab), после изменения формата huMA79b L2-2 как IgG (фигура 11, ряд 4, ср. столбцы для Fab с IgG), какого-либо кажущегося повышения аффинности не наблюдалось. Кроме того, исходное HVR-связанное «гуманизированное» антитело MA79b (huMA79b-гибрид) продемонстрировало потерю связывания такого компонента с авидностью (фигура 11, ряд 2, ср. столбцы для Fab с IgG). Способность повышения уровня связывания посредством авидности может оказаться желательной при связывании с антигенами клеточной поверхности.
b. Определение аффинности (анализ Скэтчарда)
Как было определено в анализе Скэтчарда, такой метод CDR-репарации позволяет идентифицировать множество замен в отдельной последовательности, которые повышают аффинность MA79b-связанного «гуманизированного» антитела. В частности, анализы на клеточное связывание показали, что аффинность связывания MA79b и MA79b-связанного варианта «гуманизированного» антитела L2/H3 (huMA79b L2/H3) (полученного в другом формате, таком как IgG) с клетками BJAB, стабильно экспрессирующими CD79b собакоподобных обезьян и эндогенный человеческий CD79b, имела величины Kd 0,63 нМ (MA79b; Kd=0,63±0,14 нМ) и 0,52 нМ (huMA79b L2/H3; Kd=0,52±0,1 нМ), соответственно (данные не приводятся), как было определено в анализе Скэтчарда.
c. Определение уровня связывания (FACS-анализ)
Как было оценено с помощью FACS-анализа, такой метод CDR-репарации позволяет идентифицировать множество замен в отдельной последовательности, приводящих к повышению уровня связывания MA79b-связанного «гуманизированного» антитела (huMA79b-гибрида) с клетками DoHH-2 (данные не приводятся). В частности, FACS-анализ Fab-вариантов (мутации L2-2, H3-10 и H1-1), выделенных из библиотек SP и 6 библиотек SR, в клетках DoHH-2, указывал на связывание Fab-вариантов и huMA79b-гибрида (представленного в новом формате, таком как IgG) с клетками DoHH-2 (данные не приводятся). Кроме того, FACS-анализ Fab-вариантов показал, что связывание Fab-вариантов с клетками DoHH-2 блокируется в результате предварительного инкубирования с мышиным анти-CD79b моноклональным антителом (MA79b) (данные не приводятся).
2. Репарация каркасной области
Модификации последовательности HVR, введенные в HVR-L2 huMA79b L2/H3-вариант, радикально отличались от модификаций, наблюдаемых в любой человеческой зародышевой линии. Было обнаружено, что вариант huMA79b L2/H3, при его конъюгировании с DM1, эффективно ингибирует рост опухоли у мышей с моделью ксенотрансплантата in vivo (таблица 9). Поскольку анализ на мономерное связывание (Fab) и димерное связывание (IgG) huMA79b L2/H3-варианта с антигеном указывал на потерю авидности (фигура 11), то репарацию каркасной области осуществляли, как описано ниже.
Для выявления роли положений каркасных остатков в связывании димера с антигеном, конструировали вариант, имеющий положения «всех остатков каркасной области», в котором потенциально важные положения остатков мышиной каркасной области были включены в MA79b HVR-связанное «гуманизированное» антитело (huMA79b-гибрид). Такой вариант (называемый на фигуре 12 вариантом, имеющим «все остатки каркасной области»), не содержащий каких-либо модификаций в HVR, обладал димерной аффинностью связывания, аналогичной аффинности связывания с химерным антителом MA79b (chMA79b) (фигура 12), как было определено с помощью анализа Biacore и анализа Скэтчарда.
IgG-варианты, включающие мышиные каркасные остатки в положениях 4 и/или 47 (VL) и/или в положениях 47, 48, 67, 69, 71, 73, 74, 78 и/или 80 (VH), получали в целях определения минимального набора положений каркасной области, необходимого для сохранения высокой аффинности связывания с димером (фигура 12). Остатки мышиной каркасной области представлены на фигурах 7A-B (SEQ ID NO: 10) и на фигурах 8A-B (SEQ ID NO: 14). Было обнаружено, что положения каркасной области 47 в VL и 75 и 80 в VH не играют важной роли, как показал анализ MA79b-связанного варианта «гуманизированного антитела» 17 (huMA79b.v17) (фигура 12, ряд, обозначенный 17).
MA79b-связанный вариант «гуманизированного антитела» 18 (huMA79b.v18; фигура 12, ряд, обозначенный 18), который включает остатки мышиной каркасной области в положениях 4 в VL и 48, 67, 69, 71, 73 и 78 в VH, а также замены в HVR-H3 (обозначенные на фигуре 12 как “H3-10” и описанные выше как мутация H3-10), включая V98I, Y99R и F100L, обнаруживают дополнительное 2-кратное увеличение (фигура 12, ряд, обозначенный 28) уровня связывания с димером по сравнению с вариантом 17 (фигура 12, ряд, обозначенный 17).
Во избежании возможных трудностей, возникающих при получении этих антител, потенциальный сайт, образующий изоаспарагиновую кислоту (Asp-Gly) в HVR-L1 MA79b-связанных вариантов «гуманизированного антитела», удаляли путем превращения D28 в Glu (глутаминовую кислоту) (D28E; см. вариант 28; также обозначенный здесь как “huMA79b.v28”; фигура 12, ряд, обозначенный 28). Допустимыми также являются и другие замены, которые могут быть введены для придания стабильности VL MA79b-связанных вариантов «гуманизированного антитела», включая замену D28 на Ser (серин) (D28E; см. вариант 32; также обозначенный здесь “huMA79b.v32”; фигура 12, ряд, обозначенный 32).
MA79b-связанный вариант «гуманизированного антитела» 28 (huMA79b.v28; фигура 12, ряд, обозначенный 28), который включает: (1) остатки мышиной каркасной области в положениях 4 в VL и 48, 67, 69, 71, 73 и 78 в VH, а также включает (2) замены в HVR-H3 (обозначенные на фигуре 12 как “H3-10” и описанные выше как мутация H3-10), включая V98I, Y99R и F100L, и, кроме того, включает: (3) замены в HVR-L1 (D28E, описанный выше), был охарактеризован с помощью анализа Biacore.
MA79b-связанный вариант «гуманизированного антитела» 32 (huMA79b.v32; фигура 12, ряд, обозначенный 32), который включает: (1) остатки мышиной каркасной области в положениях 4 в VL и 48, 67, 69, 71, 73 и 78 в VH, а также включает (2) замены в HVR-H3 (обозначенные на фигуре 12 как “H3-10” и описанные выше как мутация H3-10), включая V98I, Y99R и F100L, и, кроме того, включает: (3) замены в HVR-L1 (D28S, описанный выше), был охарактеризован с помощью анализа Biacore.
a. Определение аффинности (анализ Biacore)
ecd
Как показано на фигуре 12, иллюстрирующей анализ Biacore, данный метод репарации каркасной цепи позволяет идентифицировать множество замен в отдельной последовательности, которые повышают аффинность связывания гибрида «MA79b-гуманизированное антитело» с huCD79becd. Анализы, проводимые методом поверхностного плазмонного резонанса, показали, что MA79b-связанный вариант «гуманизированного антитела» 28 (huMA79b.v28; с мышиными остатками каркасной области в положениях 4 в VL, 48, 67, 69, 71, 73 и 78 в VH, а также с мутацией H3-10 в HVR-H3 (V98I, Y99R и F100L (также описанный выше) и мутацией D28E в HVR-L1 (введенной для повышения стабильности, см. выше); фигура 12, ряд, обозначенный 28) и MA79b-связанный вариант «гуманизированного антитела» 32 (huMA79b.v32; с мышиными остатками каркасной области в положениях 4 в VL, 47, 48, 67, 69, 71, 73 и 78 в VH, а также с мутацией H3-10 в HVR-H3 (V98I, Y99R и F100L (также описанной выше) и с мутацией D28S в HVR-L1 (введенной для повышения стабильности, см. выше); фигура 12, ряд, обозначенный 32) обладают аффинностью связывания с иммобилизованным huCD79b, эквивалентной аффинности связывания химерного антитела MA79b (chMA79b) с указанным антигеном, как было определено с помощью анализа Biacore.
b. Определение аффинности (анализ Скэтчарда)
Как было оценено с помощью анализа Скэтчарда, аналогичного анализу Biacore, данный метод репарации каркасной цепи позволяет идентифицировать множество замен в отдельной последовательности, которые повышают аффинность связывания гибрида «MA79b-гуманизированное антитело» (huMA79b-гибрид). Анализы на связывание с клетками показали, что аффинность связывания MA79b, MA79b-связанного варианта «гуманизированного» антитела 28 (huMA79b.v28; см. фигуру 12, ряд, обозначенный 28) (полученного в новом формате как IgG) и MA79b-связанного варианта «гуманизированного» антитела 32 (huMA79b.v32; см. фигуру 12, ряд, обозначенный 32) с клетками BJAB, стабильно экспрессирующими CD79b собакоподобных обезьян и эндогенный человеческий CD79b, имеет величину Kd, составляющую 0,63 нМ (MA79b; Kd=0,63±0,14 нМ), 0,44 нМ (huMA79b.v28; Kd=0,44±0,04 нМ) и 0,24 нМ (huMA79b.v32; Kd=0,24±0,02 нМ), соответственно (данные не приводятся), как было определено с помощью анализа Скэтчарда.
c. Определение уровня связывания (FACS-анализ)
Как было определено с помощью FACS-анализа, данный метод репарации каркасной цепи позвоялет идентифицировать множество замен в отдельной последовательности, которые повышают уровень связывания гибрида «MA79b-гуманизированное антитело» (MA79b-гибрида) с клетками BJAB, содержащими люциферазу (данные не приводятся). В частности, FACS-анализ IgG-вариантов MA79b-связанных вариантов «гуманизированного» антитела (вариантов huMA79b.v28 и huMA79b.v32) с клетками BJAB, содержащими люциферазу, выявил связывание с указанными клетками BJAB, содержащими люциферазу (данные не приводятся).
B. Обсуждение продуцирования гуманизированных анти-CD79b антител
Для идентификации замен в HVR 1-6, которые повышают аффинность связывания, была проведена репарация CDR путем присоединения 6 мышиных HVR MA79b (определенных как положения 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35 (H1), 49-65 (H2) и 93-102 (H3)) к человеческой консенсусной последовательности VL каппа I и VH подгруппы III VH (содержащие A71, T73 и A78). Замены в последовательности HVR, идентифицированные на фигуре 10 и 11, или комбинации этих замен приводят к образованию гуманизированных вариантов MA79b с аффинностью, аналогичной аффинности MA79b.
ecd
Альтернативно репарация каркасной области была применена для повторного «захвата» авидности связывания с димером путем добавления остатков каркасной области 4 в VL и 48, 67 и 69 в VH к huMA79b-гибриду (который включает мышиные остатки каркасной области в положениях 71, 73 и 78 VH) (фигура 12; MA79b-связанный вариант «гуманизированного» антитела 17 (huMA79b.v17)). Аффинность связывания вариантов с заменами в каркасной области антитела против антигена huCD79b была также дополнительно увеличена путем введения 3 замен в HVR-H3: V98I, Y99R и F100L (фигура 12; MA79b-связанный вариант «гуманизированного» антитела 18 (huMA79b.v18)). Потенциальный сайт образования изоаспарагиновой кислоты в HVR-L1 был удален путем введения мутации D28E (фигура 12; MA79b-связанный вариант «гуманизированного» антитела 28 (huMA79b.v28)).
Пример 2: Получение конъюгатов «анти-CD79b антитело - лекарственное средство» (ADC)
Для анализа эффективности IgG-вариантов MA79b-связанных вариантов «гуманизированного» антитела, указанные MA79b-связанные варианты «гуманизированного» антитела конъюгировали с лекарственными средствами, такими как DM1. Вариантами, конъюгированными с DM1, являются варианты, имеющие замены в HVR-L2 и HVR-H3 (huMA79b L2/H3), huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 и huMA79b.v32.
ε
ε
Лекарственными средствами, используемыми для получения конъюгатов «анти-CD79b антитело-лекарственное средство» (ADC), являются майтанзиноид DM1 и производные долостатина 10, а именно монометилауристатин E (MMAE) и монометилауристатин F (MMAF). (заявки США 2005/0276812; 2005/0238649; Doronina et al., Bioconjug. Chem., 17:114-123 (2006); Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21:778-784 (2003); Erickson et al., Cancer Res., 66:4426-4433 (2006), которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Линкерами, используемыми для получения ADC, являются BMPEO, SPP или SMCC (также обозначаемый здесь «MCC») для DM1 и MC или MC-vc-PAB для MMAE и MMAF. В случае DM1 антитела присоединяли к тио-группе DM1 посредством ε-аминогруппы лизина с использованием линкерного реагента SMCC. Альтернативно, в случае DM1, антитела присоединяли к DM1 посредством e-аминогруппы лизина с использованием линкера SPP. SPP (N-сукцинимидил-4-(2'-пиридилдитио)пентаноат) реагирует с эпсилон-аминогруппой лизинов с образованием реакционноспособного 2-пиридилдисульфидного линкера на белке. Под действием линкеров SPP, после реакции взаимодействия со свободным сульфгидрилом (например, DM1), пиридильная группа удаляется, в результате чего образуется DM1, присоединенный посредством восстанавливаемой дисульфидной связи. DM1, присоединенный посредством линкера SPP, высвобождается в восстанавливающих условиях (то есть, например, в клетках), а DM1, присоединенный посредством линкера SMCC, является резистентным к расщеплению в условиях восстановления. Кроме того, ADC SMCC-DM1 индуцирует клеточную токсичность в случае, если ADC является интернализованным и доставляется в лизосому с высвобождением лизин-N-DM1, который представляет собой эффективный антимитотический агент, присутствующий в клетках, а при его высвобождении из клеток лизин-N-DM1 становится нетоксичным (Erickson et al., Cancer Res., 66:4426-4433 (2006)). В случае MMAE и MMAF антитела были присоединены к MMAE или MMAF посредством цистеина через малеимидокапроил-валин-цитруллин-(vc)-п-аминобензилоксикарбонил (MC-vc-PAB). В случае MMAF эти антитела были альтернативно присоединены к MMAF посредством цистеина через малеимидокапроильный (MC) линкер. MC-vc-PAB-линкер расщепляется межклеточными протеазами, такими как катепсин В, и после расщепления высвобождается свободное лекарственное средство (Doronina et al., Nat. Biotechnol., 21:778-784 (2003)), а линкер MC является резистентным к расщеплению внутриклеточными протеазами.
Конъюгаты «антитело-лекарственное средство» (ADC) для анти-CD79b антитела получали с использованием SMCC и DM1 в соответствии с процедурой, описанной в заявке US 2005/0276812. После очистки анти-CD79b антител проводили буферный обмен с введением раствора, содержащего 50 мМ фосфат калия и 2мМ EDTA, pH 7,0. SMCC (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) растворяли в диметиацетамиде (DMA) и добавляли к раствору антитела для получения конечного молярного отношения SMCC/Ab=10:1. Реакцию проводили в течение трех часов при комнатной температуре с перемешиванием. SMCC-модифицированное антитело затем очищали на обессоливающей колонке GE Healthcare HiTrap (G-25), уравновешенной в 35 мМ цитрате натрия с 150 мМ NaCl и 2 мМ EDTA, pH 6,0. DM1, растворенный в DMA, добавляли к SMCC-препарату антитела с получением молярного отношения DM1 к антителу 10:1. Реакцию проводили в течение 4-20 часов при комнатной температуре с перемешиванием. Раствор DM1-модифицированного антитела подвергали диафильтрации 20 объемами PBS для удаления непрореагировавшего DM1, а затем стерильной фильтрации и хранили при 4°С. Обычно при проведении такой процедуры выход антитела составлял 40-60%. Данный препарат обычно более чем на 95% был мономерным, как было оценено с помощью гель-фильтрации и методом рассеяния света на лазере. Поскольку максимальное поглощение DM1 наблюдалось при 252 нм, то количество лекарственного средства, связанного с антителом, может быть определено путем измерения уровня дифференциального поглощения при 252 и 280 нм. Обычно отношение лекарственного средства к антителу составляло 3:4.
Описанные здесь конъюгаты «антител -лекарственное средство» (ADC) для анти-CD79b антител могут быть получены с использованием линкеров SPP-DM1 в соответствии с процедурой, описанной в заявке US 2005/0276812. После очистки анти-CD79b антител проводили буферный обмен с введением раствора, содержащего 50 мМ фосфат калия и 2мМ EDTA, pH 7,0. SPP (Immunogen) растворяли в DMA и добавляли к раствору антитела для получения конечного молярного отношения SPP/Ab=10:1, при этом точное отношение зависит от нужной загрузки лекарственного средства в антитело. Исходя из отношения 10:1, можно получить отношение лекарственного средства к антителу, составляющее приблизительно 3-4. SPP оставляли для реакции на 3-4 часа при комнатной температуре с перемешиванием. SPP-модифицированное антитело затем очищали на обессоливающей колонке GE Healthcare HiTrap (G-25), уравновешенной в 35 мМ цитрате натрия с 150 мМ NaCl и 2 мМ EDTA, pH 6,0, или забуференным фосфатом физиологическим раствором, рН 7,4. DM1 растворяли в DMA и добавляли к SPP-препарату антитела с получением молярного отношения DM1 к антителу 10:1, которое дает 3-4-кратный молярный избыток по сравнению с SPP-линкерами, присутствующими на антителе. Реакцию с DM1 проводили в течение 4-20 часов при комнатной температуре c перемешиванием. Раствор DM1-модифицированного антитела подвергали диафильтрации 20 объемами PBS для удаления непрореагировавшего DM1, а затем стерильной фильтрации и хранили при 4°С. Обычно при проведении такой процедуры выход антитела составлял 40-60%. Данный конъюгат «антитело-лекарственное средство» обычно более чем на 95% был мономерным, как было оценено с помощью гель-фильтрации и методом рассеяния света на лазере. Количество связанного лекарственного средства определяли путем измерения уровня дифференциального поглощения при 252 и 280 нм, как описано для получения конъюгатов SMCC-DM1 (как описано выше).
Описанные здесь конъюгаты «антитело-лекарственное средство» (ADC) для анти-CD79b антител могут быть также получены с использованием соединений «лекарственное средство-линкер», а именно MC-MMAF, MC-MMAE, MC-val-cit(vc)-PAB-MMAE или MC-val-cit(vc)-PAB-MMAF, в соответствии с процедурой, описанной в заявке США 2005/0238649. Очищенное анти-CD79b антитело растворяли в 500 мМ бората натрия и 500 мМ хлорида натрия при pH 8,0, а затем обрабатывали избытком 100 мМ дитиотреитола (DTT). После инкубирования при 37°С в течение примерно 30 минут буфер заменяли путем элюирования на смоле Sephadex G25, и смесь элюировали PBS с использованием 1 мМ DTPA. Величину тиола/Ab оценивали путем определения концентрации восстановленного антитела, исходя из оптической плотности раствора 280 нм, и концентрации тиола посредством реакции с DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI), а также определения оптической плотности при 412 нм. Восстановленное антитело растворяли в PBS и охлаждали на льду. Конъюгат «лекарственное средство-линкер», например, MC-val-cit(vc)-PAB-MMAE, в ДМСО, растворяли в ацетонитриле и воде, а затем добавляли к охлажденному восстановленному антителу в PBS. После инкубирования в течение 1 часа добавляли избыток малеимида для гашения реакции, и любые тиоловые группы непрореагировавшего антитела кэпировали. Реакционную смесь концентрировали путем центрифужной ультрафильтрации, а затем конъюгат «антитело-лекарственное средство» очищали и обессоливали путем элюирования через смолу G25 в PBS, после чего фильтровали через 0,2-мкм фильтры в стерильных условиях и замораживали для хранения.
Конъюгаты «антитело-лекарственное средство» (полученные с использованием описанных здесь анти-CD79b антител) разводили при 2 x 10 мкг/мл в аналитической среде. Конъюгаты были присоединены посредством перекрестно связывающих линкеров SMCC (для присоединения SPP к майтанзиноидному токсину DM1 может быть использован альтернативный дисульфидный линкер) (см. заявку US 2005/0276812 и US 2005/0238649). Кроме того, конъюгаты могут быть связаны посредством MC-валин-цитруллин-(vc)-PAB или MC с производными доластатина 10, токсином монометилауристатином Е (MMAE) или токсином монометилауристатином F (MMAF) (см. заявку на патент США № 11/141344, поданную 31 мая 2005 г., и заявку на патент США № 10/983340, поданную 5 ноября 2004 г.). Негативный контроль включает конъюгаты на основе HERCEPTIN (трастузумаба) (анти-HER2 антитела) (SMCC-DM1 или SPP-DM1 или MC-vc-MMAE или MC-vc-MMAF). Позитивный контроль может включать свободный L-DM1, эквивалентный нагрузочной дозе конъюгата. Образцы перед их разведением интенсивно перемешивали для гарантии получения гомогенной смеси.
Анти-CD79b антителами для их конъюгирования с лекарственным средством являются химерные антитела MA79b (chMA79b) и вариант L2/H3 антитела huMA79b, а также описанные здесь варианты huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 и huMA79b.v32 (см. пример 1). Другими антителами для конъюгирования могут быть любые описанные здесь антитела (см. Пример 1).
Пример 3: Анализ in vivo на уничтожение опухолевых клеток
A. Ксенотрансплантаты
Для анализа эффективности IgG-вариантов MA79b-связанных вариантов «гуманизированного» антитела, имеющего замены в HVR-L2 и HVR-H3 (huMA79b L2/H3), вариант huMA79b L2/H3 конъюгировали с DM1 и анализировали влияние конъюгированного варианта на опухоли у мышей.
В частности, может быть проанализирована способность антител обеспечивать регрессию опухолей во многих моделях ксенотрансплантатов, включая клетки RAMOS, клетки BJAB (клеточную линию лимфомы Беркитта, которая содержит транслокацию t(2;8)(p112;q24) (IGK-MYC), мутированный ген Р53, и которая является негативной по вирусу Эпштейна-Барра (EBV)) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), клетки Granta 519 (клеточную линию лимфомы клеток коры головного мозга, которая содержит: транслокацию t(11;14)(q13;q32) (BCL1-IGH), приводящую к сверхэкспрессии циклина D1 (BCL1); делеции P16INK4B и P16INK4A и является EBV-позитивной) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)), клетки U698M (В-клеточную линию лимфобластной лимфосаркомы; (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001) и клетки DoHH2 (клеточную линию фолликулярной лимфомы, содержащую транслокацию, ответственную за развитие фолликулярной лимфомы, а именно t(14;18)(q32;q21), которая приводит к сверхэкспрессии Bcl-2, регулируемой тяжелой цепью Ig; делецию P16INK4A, и транслокацию t(8;14)(q24;q32) (IGH-MYC), а также является EBV-негативной) (Drexler, H.G., The Leukemia-Lymphoma Cell Line Facts Book, San Diego: Academic Press, 2001)).
7
2
2
3
2
2
3
Для анализа на эффективность MA79b-связанных вариантов «гуманизированного антитела», самкам мышей CB17 ICR SCID (в возрасте 6-8 недель, поставляемым лабораторией Charles Rivers Laboratories; Hollister, CA) подкожно инокулировали 2×10 клеток BJAB, содержащих люциферазу, или клеток Granta-519 путем инъекции в бока мышей CB17 ICR SCID, и этих мышей оставляли до тех пор, пока средний размер опухолевых трансплантатов не достигал 200 мм. День 0 означает день, на который размер опухоли составлял в среднем 200 мм и в который была введена первая или только одна доза, вводимая при данной обработке, если это конкретно не оговорено ниже. Объем опухоли, выражаемый в мм, измеряли штангенциркулем по двум параметрам и вычисляли по формуле: V=0,5a×b, где a и b означают большой и малый диаметры опухоли, соответственно. Данные, собранные для каждой экспериментальной группы, выражали как среднее ± ср.кв.от. Группам из 10 мышей вводили одну внутривенную (i.v.) дозу 50-210 мкг связанного с антителом лекарственного средства/м мыши (соответствующую 1-4 мг/кг мыши), а именно были введены конъюгаты «вариант MA79b-связанного гуманизированного антитела или контрольного антитела-лекарственное средство». Во время всего эксперимента опухоли измеряли один или два раза в неделю. Массу тела мышей измеряли один или два раза в неделю во время всего эксперимента. Когда объем опухоли достигал 3000 мм или когда опухоли обнаруживали угрожающие жизни признаки изъязвления, мышей подвергали эвтаназии. Все протоколы по экспериментам на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).
Используемыми линкерами, связывающими антитело и токсин, являются тиоэфирный перекрестно-связывающий линкер SMCC, связывающийся с DM1. Другими линкерами могут быть дисульфидный линкер SPP или тиоэфирный перекрестно-сшивающий линкер SMCC для DM1 или MC или MC-валин-цитруллин(vc)-PAB или дипептидный линкерный реагент (валин-цитруллин(vc)), имеющий малеимидный компонент и пара-аминобензилкарбамоильный (PAB) самоэлиминирующийся компонент для монометилауристатина E (MMAE) или монометилауристатина F (MMAF). Используемыми токсинами являются DM1. Дополнительными токсинами могут быть MMAE или MMAF.
Анти-CD79b антителами, используемыми в данном эксперименте, являются химерные антитела MA79b (chMA79b), описанные в заявке на патент США №11/462336, поданной 3 августа 2006 г., а также описанные здесь MA79b-связанные варианты «гуманизированного» антитела (см. пример 1A). Другими антителами могут быть коммерчески доступные антитела, включая анти-CD79b антитело, и моноклональные антитела MA79b, полученные от гибридом, депонированных в ATCC как HB11413 20 июля 1993 г.
Негативный контроль включает конъюгаты на основе анти-HER2 антитела (HERCEPTIN (трастузумаба))(SMCC-DM1).
B. Результаты
1. Ксенотрансплантаты BJAB, содержащие люциферазу
3
После проведения 35-дневного курса лечения конъюгатом лекарственных средств в дозах, указанных в таблице 9, а именно MA79b-связанного варианта гуманизированного антитела L2/H3 (варианта huMA79b L2/H3) (полученного в новом формате, IgG) и химерного анти-CD79b антитела (chMA79b), конъюгированного с DM1 (huMA79b L2/H3-SMCC-DM1 и chMA79b-SMCC-DM1, соответственно), было выявлено ингибирование роста опухолей BJAB, содержащих люциферазу, у мышей SCID по сравнению с негативным контролем, а именно антителом HERCEPTIN (трастузумаб)-SMCC-DM1 (анти-HER2-SMCC-DM1). Для всех ADC и контроля вводили одну дозу ADC (как показано в таблице 9) на день 0. В частности, L2/H3-SMCC-DM1-антитела huMA79b (полученные в новом формате как IgG) и chMA79b-SMCC-DM1 значительно ингибировали рост опухоли (фигура 20). Кроме того, в таблице 9 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)).
Таблица 9
Вводимое антитело (обработка)
PR
CR
Доза «лекарственное средство-DM1»(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
Отношение (Лекарственное средство/Ab)
Контроль анти-HER2-SMCC-DM1
0/10
0/10
100
2
3,3
chMA79b-SMCC-DM1
3/10
3/10
100
2,4
2,9
chMA79b-SMCC-DM1
1/10
0/10
50
1,2
2,9
huMA79b L2/H3-SMCC-DM1
2/10
0/10
100
2,9
2,4
huMA79b L2/H3-SMCC-DM1
0/10
0/10
50
1,4
2,4
2. Ксенотрансплантаты Granta-519
После проведения 14-дневного курса лечения конъюгатом лекарственных средств в дозах, указанных в таблице 10, а именно MA79b-связанного варианта гуманизированного антитела, а именно варианта 17, варианта 18, варианта 28 и варианта 32 (huMA79b.v17, huMA79b.v18, huMA79b.v28 и huMA79b.v32, соответственно) (полученных в новом формате как IgG) и химерного анти-CD79b антитела (chMA79b), конъюгированного с DM1 (huMA79b.v17-SMCC-DM1, huMA79b.v18-SMCC-DM1, huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1 и chMA79b-SMCC-DM1, соответственно), было выявлено ингибирование роста опухолей Granta-519 у мышей SCID по сравнению с негативным контролем, а именно антителом HERCEPTIN (трастузумаб)-SMCC-DM1 (анти-HER2-SMCC-DM1). Для всех ADC и контроля вводили одну дозу ADC (как показано в таблице 9) на день 0. В частности, антитела huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1, huMA79b.v17-SMCC-DM1 и huMA79b.v18-SMCC-DM1 (полученные в новом формате как IgG) и chMA79b-SMCC-DM1 значительно ингибировали рост опухоли (фигура 21A).
3
Кроме того, обработка антителами huMA79b.v28-SMCC-DM1, huMA79b.v32-SMCC-DM1, huMA79b.v17-SMCC-DM1, huMA79b.v18-SMCC-DM1 и chMA79b-SMCC-DM1, и контрольным антителом HERCEPTIN (трастузумаб)-SMCC-DM1 (анти-HER2-SMCC-DM1) не приводила к снижению процента массы тела мышей (фигура 21B). Более того, в таблице 10 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)).
Таблица 10
Вводимое антитело (обработка)
PR
CR
Доза «лекарственное средство-DM1»(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
Отношение (Лекарственное средство/Ab)
Контроль анти-HER2-SMCC-DM1
0/10
0/10
208
4
3,4
chMA79b-SMCC-DM1
0/10
0/10
107
2
3,6
chMA79b-SMCC-DM1
1/10
0/10
213
4
3,6
huMA79b.v17-SMCC-DM1
0/10
0/10
202
4
3,4
huMA79b.v18-SMCC-DM1
4/10
0/10
196
4
3,3
huMA79b.v28-SMCC-DM1
0/10
0/10
101
2
3,4
huMA79b.v28-SMCC-DM1
2/10
2/10
202
4
3,4
huMA79b.v32-SMCC-DM1
0/10
0/10
172
4
2,9
Исходя из способности ADC «MA79b-связанное гуманизированное антитело» значительно ингибировать прогрессирование опухоли в ксенотрансплантате, можно сказать, что молекулы CD79b могут служит превосходной мишенью для лечения опухолей у млекопитающих, включая В-клеточно-ассоциированные раковые опухоли, такие как лимфомы (то есть, неходжкинская лимфома), лейкоз (то есть, хронический лимфоцитарный лейкоз) и другие раковые опухоли гемопоэтических клеток. Кроме того, MA79b-связанные гуманизированные ADC могут быть использованы для снижения роста опухолей in vivo, включая В-клеточно-ассоциированные раковые опухоли, такие как лимфомы (то есть, неходжкинская лимфома), лейкоз (то есть, хронический лимфоцитарный лейкоз) и другие раковые опухоли гемопоэтических клеток.
Пример 4: Солокализация анти-CD79b антитела
Для того чтобы определить участок доставки MA79b-связанных гуманизированных антител и их вариантов после интернализации в клетку, могут быть проведены исследования по солокализации анти-CD79b антител, интернализованных в В-клеточные линии, а именно в клеточные линии Ramos. LAMP-1 представляет собой маркер для поздних эндосом и лизосом (Kleijmeer et al., Journal of Cell Biology, 139(3):639-649 (1997); Hunziker et al., Bioessays, 18:379-389 (1996); Mellman et al., Annu. Rev. Dev. Biology, 12:575-625 (1996)), включая компартменты MHC класса II (MIIC), которые представляют собой компартмент, подобный поздней эндосоме/лизосоме. HLA-DM представляет собой маркер для MIIC.
4
Клетки Ramos инкубировали в течение 3 часов при 37°С с 1 мкг/мл MA79b-связанных гуманизированных антител и их вариантов, с FcR-блоком (Miltenyi) и 25 мкг/мл Alexa647-трансферрина (Molecular Probes) в полной не содержащей карбоната среде (Gibco) в присутствии 10 мкг/мл лейпептина (Roche) и 5 мкМ пепстатина (Roche) для ингибирования разложения лизосом. Затем клетки два раза промывали, фиксировали 3% параформальдегидом (Electron Microscopy Sciences) в течение 20 минут при комнатной температуре, гасили 50 мМ NHCl (Sigma) и делали проницаемыми с использованием 0,4% сапонина/2% FBS/1% BSA в течение 20 минут, после чего инкубировали с 1 мкг/мл антитела против мышиного Cy3 (Jackson IмМunoresearch) в течение 20 минут. Затем реакцию блокировали в течение 20 минут мышиным IgG (Molecular Probes), а затем смесь инкубировали в течение 30 минут с усилителем сигнала Image-iT FX (Molecular Probes). И наконец, клетки инкубировали с Zenon Alexa488-меченным мышиным антителом против LAMP1 (BD Pharmingen), маркером для лизосом и MIIC (лизосомо-подобным компартментом, который является частью пути MHC класса II), в течение 20 минут, а затем фиксировали 3% PFA.
Клетки ресуспендировали в 20 мкл сапонинового буфера и оставляли для адгезии на предметных стеклах, покрытых полилизином (Sigma), а затем помещали на покровное стекло с использованием DAPI-содержащего вектора VectaShield (Vector Laboratories). Для иммунофлуоресценции MIIC или лизосом клетки фиксировали, делали проницаемыми, и сигнал усиливали, как описано ниже, после чего подвергали совместному окрашиванию меченным Zenon Alexa555-HLA-DM (BD Pharmingen) и Alexa488-Lamp1 в присутствии избытка мышиного IgG в соответствии с инструкциями производителей (Molecular Probes).
В соответствии с этим солокализация MA79b-связанных гуманизированных антител или их вариантов с MIIC или лизосомами В-клеточных линий, как было оценено с помощью иммунофлуоресценции, может указывать на то, что данные молекулы являются превосходными средствами для лечения опухолей у млекопитающих, включая В-клеточно-ассоциированные раковые опухоли, такие как лимфомы (то есть, неходжкинская лимфома), лейкоз (то есть, хронический лимфоцитарный лейкоз) и другие раковые опухоли гемопоэтических клеток.
Пример 5: Получение сконструированных на основе цистеина анти-CD79b антител
Сконструированные на основе цистеина анти-CD79b антитела получали, как описано в настоящей заявке.
ДНК, кодирующую антитело MA79b (легкую цепь, SEQ ID NO: 4, фигура 4; и тяжелую цепь, SEQ ID NO: 5, фигура 5), подвергали мутагенезу описанными здесь методами для модификации легкой и тяжелой цепи. ДНК, кодирующая антитело MA79b (тяжелую цепь, SEQ ID NO: 5; фигура 5), может быть также подвергнута мутагенезу описанными здесь методами для модификации Fc-области тяжелой цепи.
ДНК, кодирующую антитело huMA79b.v17 (тяжелую цепь, SEQ ID NO: 304, фигура 15), подвергали мутагенезу описанными здесь методами для модификации тяжелой цепи. ДНК, кодирующая антитело huMA79b.v17 (легкую цепь, SEQ ID NO: 303; фигура 15 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 304; фигура 15), может быть также подвергнута мутагенезу описанными здесь методами для модификации легкой цепи или Fc-области тяжелой цепи.
ДНК, кодирующую антитело huMA79b.v18 (тяжелую цепь, SEQ ID NO: 306, фигура 16), подвергали мутагенезу описанными здесь методами для модификации тяжелой цепи. ДНК, кодирующая антитело huMA79b.v18 (легкую цепь, SEQ ID NO: 305; фигура 16 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 306; фигура 16), может быть также подвергнута мутагенезу описанными здесь методами для модификации легкой цепи или Fc-области тяжелой цепи.
ДНК, кодирующую антитело huMA79b.v28 (тяжелую цепь, SEQ ID NO: 308, фигура 17), подвергали мутагенезу описанными здесь методами для модификации тяжелой цепи. ДНК, кодирующая антитело huMA79b.v28 (легкую цепь, SEQ ID NO: 307; фигура 17 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 308; фигура 17), может быть также подвергнута мутагенезу описанными здесь методами для модификации легкой цепи или Fc-области тяжелой цепи.
ДНК, кодирующая антитело huMA79b.v32 (легкую цепь, SEQ ID NO: 310; фигура 18 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 309; фигура 18), может быть также подвергнута мутагенезу описанными здесь методами для модификации легкой цепи и тяжелой цепи.
ДНК, кодирующую антитело против CD79b собакоподобных обезьян (легкую цепь, SEQ ID NO: 241, фигура 45; и тяжелую цепь, SEQ ID NO: 243, фигура 47), подвергали мутагенезу описанными здесь методами для модификации легкой и тяжелой цепи. ДНК, кодирующая антитело против CD79b собакоподобных обезьян (тяжелую цепь, SEQ ID NO: 243; фигура 47), может быть также подвергнута мутагенезу описанными здесь методами для модификации Fc-области тяжелой цепи.
Для получения сконструированных на основе цистеина анти-CD79b антител, ДНК, кодирующую легкую цепь, подвергали мутагенезу путем замены валина цистеином в положении 205 по Кабату в легкой цепи (положение 209 в соответствии с последовательной нумерацией), как показано на фигуре 27 (легкая цепь SEQ ID NO: 235 тио-MAB MA79b) и на фигуре 49 (легкая цепь SEQ ID NO: 300 тио-MAb против CD79b собакоподобных обезьян (ch10D10)). ДНК, кодирующую тяжелую цепь, подвергали мутагенезу путем замены аланина цистеином в тяжелой цепи в положении 118 в соответствии с Европейской нумерацией (положение 118 в соответствии с последовательной системой нумерации; номер 114 по Кабату), как показано на фигуре 48 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 244 тио-Mab-антитела против CD79b собакоподобных обезьян (ch10D10)), на фигуре 28 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 236 тио-Mab MA79b), на фигуре 24 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 228 тио-MAb huMA79b.v17), на фигуре 25 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 230 тио-MAb huMA79b.v18) и на фигуре 26 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 232 тио-MAb huMA79b.v28). Fc-область анти-CD79b антител может быть подвергнута мутагенезу путем замены серина цистеином в положении 400 в Fc-области тяжелой цепи в соответствии с Европейской системой нумерации (положение 400 в соответствии с последовательной нумерацией; номер по Кабату - 396), как показано в таблице 2-4.
A. Получение сконструированных на основе цистеина анти-CD79b антител для конъюгирования путем восстановления и повторного окисления
4
Полноразмерные сконструированные на основе цистеина анти-CD79b моноклональные антитела (ThioMab) экспрессировали в клетках CHO и очищали путем проведения аффинной хроматографии на белке А, а затем эксклюзионной хроматографии. Очищенные антитела разводили в 500 мМ бората натрия и 500 мМ хлорида натрия при pH примерно 8,0, а затем восстанавливали приблизительно 50-100-кратным молярным избытком 1 мМ TCEP (гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol. 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) в течение примерно 1-2 часов при 37°C. Восстановленный тио-Mab разводили и загружали на колонку HiTrap S в 10 мМ ацетата натрия, pH 5, и элюировали PBS, содержащим 0,3 M хлорида натрия. Элюированный восстановленный тио-Mab обрабатывали 2 мМ дегидроаскорбиновой кислоты (dhAA) при pH 7 в течение 3 часов или 2 мМ водного сульфата меди (CuSO) при комнатной температуре в течение ночи. Может также оказаться эффективным окисление на воздухе. Буфер заменяли путем элюирования на смоле Sephadex G25, и смесь элюировали PBS с использованием 1 мМ DTPA. Величину тиола/Ab вычисляли путем определения концентрации восстановленного антитела, исходя из оптической плотности раствора при 280 нм и концентрации тиола, путем проведения реакции взаимодействия с DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI), и определения оптической плотности при 412 нм.
Пример 6: Получение конъюгатов «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство» путем проведения реакции конъюгирования сконструированных на основе цистеина анти-CD79b антител с промежуточными соединениями «лекарственное средство-линкер»
После процедур восстановления и повторного оксиления, описанных в примере 5, сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело разводили в PBS-буфере (в забуференном фосфатом физиологическом растворе) и охлаждали на льду. Приблизительно 1,5 молярных эквивалентов промежуточного соединения «ауристатиновое лекарственное средство-линкер», такого как MC-MMAE (малеимидокапроил-монометилауристатин E), MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE или MC-val-cit-PAB-MMAF, содержащих реагирующую с тиолом функциональную группу, такую как малеимидо, по отношению к цистеинам, введенным в антитело, растворяли в ДМСО, разводили в ацетонитриле и воде и добавляли к охлажденному восстановленному и повторно окисленному антителу в PBS. Примерно через один час добавляли избыток малеимида для гашения реакции, и любые непрореагировавшие тиоловые группы антитела кэпировали. Реакционную смесь концентрировали путем центрифужной ультрафильтрации, а затем конъюгат «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство» очищали и обессоливали путем элюирования через смолу G25 в PBS, после чего фильтровали через 0,2-мкм фильтры в стерильных условиях и замораживали для хранения.
Получение thioMAb-BMPEO-DM1 huMA79b.v18-HC(A118C) осуществляли следующим образом. Свободный цистеин на huMA79b.v18-HC(A118C) тио-MAb модифицировали бис-малеимидо-реагентом BM(PEO)3 (Pierce Chemical), в результате чего непрореагировавшая малеимидо-группа оставалась на поверхности антитела. Это осуществляли путем растворения BM(PEO)3 в 50% смеси этанола/воды до достижения концентрации 10 мМ и добавления 10-кратного молярного избытка BM(PEO)3 в раствор, содержащий тио-MAb huMA79b.v18-HC(A118C) в забуференном фосфатом физиологическом растворе в концентрации приблизительно 1,6 мг/мл (10 микромоль), а затем оставляли на 1 час для прохождения реакции. Избыток BM(PEO)3 удаляли путем гель-фильтрации (на колонке HiTrap, Pharmacia) в 30 мМ цитрата, pH 6, в присутствии 150 мМ NaCl-буфера. Приблизительно 10-кратный избыток DM1, растворенный в диметилацетамиде (DMA), добавляли к промежуточному соединению тио-MAb-BMPEO huMA79b.v18-HC(A118C). Для растворения реагента, а именно молекулы лекарственного средства, может быть также использован диметилформамид (ДМФ). Реакционную смесь оставляли на ночь для прохождения реакции, а затем подвергали гель-фильтрации или диализу в PBS для удаления непрореагировавшего лекарственного средства. Гель-фильтрацию на колонках S200 в PBS проводили для удаления высокомолекулярных агрегатов и загружали очищенное тио-MAb-BMPEO-DM1 huMA79b.v18-HC(A118C).
В соответствии с теми же самыми протоколами получали контрольное тио-антитело hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, контрольное тио-антитело hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF, контрольное тио-антитело hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE и контрольное тио-антитело анти-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF.
В соответствии с вышеописанными процедурами были получены и протестированы нижеследующие конъюгаты «сконструированное на основе цистеина анти-CD79b антитело-лекарственное средство» (TDC):
1. тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF, полученный путем конъюгирования A118C-тио-huMA79b.v18-HC(A118C) и MC-MMAF;
2. тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1, полученный путем конъюгирования A118C-тио-huMA79b.v18-HC(A118C) и BMPEO-DM1;
3. тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE полученный путем конъюгирования A118C-тио-huMA79b.v18-HC(A118C) и MC-val-cit-PAB-MMAE;
4. тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, полученный путем конъюгирования A118C-тио-huMA79b.v28-HC(A118C) и MC-MMAF;
5. тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, полученный путем конъюгирования тио-huMA79b.v28-HC(A118C) и BMPEO-DM1;
6. тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-val-cit-PAB-MMAE, полученный путем конъюгирования тио-huMA79b.v28-HC(A118C) и MC-val-cit-PAB-MMAE;
7. тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF, полученный путем конъюгирования A118C-тио-анти-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) и MC-MMAF;
8. тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1, полученный путем конъюгирования A118C-тио-анти-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) и BMPEO-DM1;
9. тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-ММАЕ, полученный путем конъюгирования A118C-тио-анти-cynoCD79b (ch10D10)-HC(A118C) и MC-val-cit-PAB-MMAE;
10. тио-MA79b-HC(A118C)-MC-MMAF, полученный путем конъюгирования тио-MA79b-HC(A118C) и MC-MMAF; и
11. тио-MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF, полученный путем конъюгирования тио-MA79b-LC(V205C) и MC-MMAF.
Пример 7: Характеризация аффинности связывания конъюгатов «сконструированное на основе цистеина тио-
-лекарственное средство» с антигеном клеточной поверхности
Mab
Аффинность связывания конъюгатов «тио-huMA79b.v18, тио-huMA79b.v28-лекарственное средство» и конъюгатов «тио-MA79b-лекарственное средство» с CD79b, экспрессируемым на клетках BJAB, содержащих люциферазу, оценивали с помощью FACS-анализа. Кроме того, аффинность связывания конъюгатов «тио-анти-cynoCD79b(ch10D10) антитело-лекарственное средство» с CD79b, экспрессируемым на клетках BJAB, экспрессирующих CD79b собакоподобных обезьян, определяли с помощью FACS-анализа.
6
Вкратце, приблизительно 1×10 клеток в 100 мкл подвергали контактированию с различными количествами (1,0 мкг, 0,1 мкг или 0,01 мкг Ab на миллион клеток BJAB, содержащих люциферазу, или клеток BJAB, экспрессирующих CD79b собакоподобных обезьян (для анти-cynoCD79b тио-Mab) одного из нижеследующих конъюгатов «анти-CD79b тио-MAb-лекарственное средство» или «оголенного» антитела (неконъюгированного Ab, используемого в качестве контроля): (1) тио-MA79b-LC(V205C)-MC-MMAF или (2) тио-MA79b-HC(A118C)-MC-MMAF (фигуры 29A-B, соответственно; (3) тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-MMAF, (4) тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-MC-vcPAB-MMAE или (5) тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1 (фигуры 30B-D, соответственно); (6) тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, (7) тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 или (8) тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF (см. фигуры 31B-31D, соответственно); или (9) тио-анти-cynoCDb79(ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, (10) тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 или (11) тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF (см. фигуры 32B-32D, соответственно). ФЭ-конъюгированное мышиное антитело против человеческих Ig использовали в качестве «второго» детектирующего антитела (BD Cat#555787).
Анти-CD79b антитело, связанное с клеточной поверхностью, детектировали с использованием ФЭ-конъюгированного мышиного антитела против человеческих Ig. На графиках, представленных на фигуре 29-32, показано, что связывание с антигеном является приблизительно одинаковым для всех тестируемых конъюгатов «тио-MAb-лекарственное средство».
Пример 8: Анализ in vitro на снижение пролиферации клеток под действием конъюгатов «анти-CD79b тио-Mab-лекарственное средство»
Эффективность in vitro конъюгатов «анти-CD79b тио-Mab-лекарственное средство» (включая тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-MCMMAF, тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE и тио-huMA79b.v18-HC(A118C)-BMPEO-DM1) определяли с помощью анализа на пролиферацию клеток (фигура 41A, клетки BJAB, содержащие люциферазу; фигура 41B, Granta-519; фигура 41C, WSU-DLCL2). Люминесцентный анализ на жизнеспособность клеток CellTiter-Glo является коммерчески доступным (Promega Corp., Madison, WI) и представляет собой специально разработанный анализ, осуществляемый методом рекомбинантной экспрессии люциферазы Coleoptera (US 5583024; US 5674713; US 5700670). В этом анализе на пролиферацию клеток определяют число жизнеспособных клеток в культуре, исходя из количества присутствующего ATP, которое является показателем метаболической активности клеток (Crouch et al., J. Immunol. Metho., 160:81-88 (1993); US 6602677). Анализ CellTiter-Glo проводили в 96-луночном формате, что позволяло осуществлять автоматизированный высокоэффективный скрининг (HTS) (Cree et al., AntiCancer Drugs, 6:398-404 (1995)). Процедура такого специально разработанного анализа включает добавление одного реагента (реагента CellTiter-Glo), который непосредственно добавляют в клетки, культивированные в среде, содержащей сыворотку.
Процедура, проводимая в формате «добавление-смешивание-измерение», позволяет осуществлять лизис клеток с продуцированием люминесцентного сигнала, пропорционального количеству присутствующего АТР. Субстрат, люциферин жуков, подвергают окислительному декарбоксилированию под действием рекомбинантной люциферазы светляка с последующим превращением ATP в AMP и генерированием фотонов. Число жизнеспособных клеток соответствует относительным единицам люминесценции (RLU, ОЕЛ). Данные могут быть зарегистрированы на люминометре или на визуализирующем устройстве, снабженном камерой с ПЗС. Выходной люминесцентный сигнал выражают как RLU, измеряемые в зависимости от времени. % RLU представляет собой процент относительных единиц люминесценции, нормализованный по данным для контроля, то есть «антитела, которое не было конъюгировано с лекарственным средством». Альтернативно фотоны, генерированные люминесцентным излучением, могут быть подсчитаны в сцинтилляционном счетчике в присутствии сцинтилляционной жидкости. Световые единицы могут быть далее представлены как CPS (число импульсов в секунду).
Эффективность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» определяли с помощью анализа на пролиферацию клеток, проводимого в соответствии с протоколом, адаптированным для люминесцентного анализа на жизнеспособность клеток (CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega Corp. Technical bulletin TB288; Mendoza et al., Cancer Res., 62:5485-5488 (2002)):
1. Аликвоту 40 мл клеточной культуры, содержащей примерно 3000 клеток BJAB, Granta-519 или WSU-DLCL2 в среде, помещали в каждую лунку 384-луночного планшета с непрозрачными стенками.
2. TDC (конъюгат «тио-Mab-лекарственное средство») (10 мкл) добавляли в экспериментальные лунки с четырьмя повторностями до конечной концентрации 10000, 3333, 1111, 370, 123, 41, 13,7, 4,6 или 1,5 нг/мл, а в контрольные лунки добавляли только среду, не содержащую конъюгата с лекарственным средством, и инкубировали в течение 3 дней.
3. Планшеты уравновешивали до комнатной температуры приблизительно в течение 30 минут.
4. Добавляли реагент CellTiter-Glo (50 мкл).
5. Содержимое перемешивали в течение 2 минут на орбитальном шейкере для индуцирования клеточного лизиса.
6. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут для стабилизации люминесцентного сигнала.
7. Люминесценцию регистрировали и на графике выражали в %RLU (относительных единицах люминесценции, ОЕЛ). По данным, полученным для клеток при 0,51 нг/мл, инкубированных со средой, не содержащей конъюгата с лекарственным средством, строили график.
Среда: клетки BJAB, Granta-519 и WSU-DLCL2 культивировали в среде RPMI1640/10%FBS/2мМ глутамина.
Пример 9: Анализ на ингибирование роста опухоли in vivo с использованием конъюгатов «анти-CD79b тио-Mab-лекарственное средство»
A. Granta-519 (лимфома клеток коры головного мозга человека)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали эффективность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» в ксенотрансплантатах Granta-519 (лимфомы клеток коры головного мозга человека) у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и для контроля) представлены ниже в таблице 11.
Контрольное Ab представляло собой hu-anti-HER2-MC-MMAF или MA79b-MC-MMAF. Контрольное тио-MAb HC(A118C) представляло собой тио-MAb тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MMAF. Результаты представлены в таблице 11 и на фигуре 33.
На фигуре 33A представлен график зависимости изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантата Granta-519 у мышей CB17 SCID, которым вводили конъюгат TDC «тяжелая цепь с A118C или легкая цепь с V205C анти-CD79b антитела» в дозах, представленных в таблице 11. В частности, введение тио-chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с негативным контролем (anti-hu-HER2-MC-MMAF и тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). В качестве другого контроля использовали MA79b-MC-MMAF.
Кроме того, в том же исследовании, для каждой группы, которой вводили дозы, определяли процент изменения массы тела за первые 14 дней. Результаты (фигура 33B) показали, что введение этих конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» не приводило к значительному снижению процента массы тела или к потере массы в течение данного периода времени.
3
Более того, в таблице 11 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 11Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-chMA79b-HC(A118C) или тио-chMA79b-LC(V205C)MMAF мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами Granta-519
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
DAR (Лекарст-венное средство /Ab)
Контроль hu-anti-HER2-MC-MMAF
0/8
0/8
413
6,8
4,0
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF
0/9
0/9
191
6,8
1,85
Контроль chMA79b-MC-MMAF
1/8
0/8
100
2,3
3,0
Контроль chMA79b-MC-MMAF
8/9
1/9
300
6,8
3,0
Тио-chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF
0/8
0/8
63
2,3
1,9
Тио-chMA79b-HC(A118C)-MC-MMAF
4/9
0/9
190
6,8
1,9
Тио-chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF
0/8
0/8
60
2,3
1.8
Тио-chMA79b-LC(V205C)-MC-MMAF
5/9
4/9
180
6,8
1.8
B. Ксенотрансплантаты BJAB, содержащие люциферазу (лимфомы Беркитта)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали эффективность других конъюгатов лекарственных средств в ксенотрансплантатах BJAB, содержащих люциферазу (лимфомы Беркитта) у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и для контроля) представлены ниже в таблице 12.
Контрольное антитело представляло собой huMA79b.v28 (конъюгированное с SMCC-DM1). Контрольное тио-MAb HC(A118C) представляло собой антитело тио-Mab тио-hu-anti-HER2-HC(A118C) (конъюгированное с BMPEO-DM1, MC-MMAF или MCvcPAB-MMAE), тио-Mab тио-huMA79b.v28-HC(A118C) или тио-Mab тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C) (конъюгированное с MC-MMAF). Результаты представлены ниже в таблице 12 и на фигуре 34.
На фигуре 34A представлен график зависимости изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантатов BJAB, содержащих люциферазу, у мышей CB17 SCID, обработанных конъюгатами «тио-MAb huMA79b.v28-HC(A118C)-лекарственное средство, как показано в таблице 12. В частности, введение конъюгата тио-Mab, «тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE-лекарственное средство» приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с ростом опухоли после обработки конъюгатами «антитело-лекарственное средство» (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), используемыми в качестве негативного контроля. Другой контроль представлял собой тио-huMA79b.v28-HC(A118C), huMA79b.v28-SMCC-DM1 и тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF.
Кроме того, в том же исследовании, для каждой группы, которой вводили дозы, определяли процент изменения массы тела за первые 7 дней. Результаты (фигура 34B) показали, что введение этих конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» не приводило к значительному снижению процента массы тела или к потере массы в течение данного периода времени.
3
Более того, в таблице 12 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0)) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 12Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-HuMA79b.v28-HC(A118C)MMAE, MMAF и DM1 мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами BJAB, содержащими люциферазу
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF, ММАЕ или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
DAR (Лекар-ственное средство /Ab)
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
0/10
57
2
1,86
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF
1/10
0/10
58
2
1,9
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/10
0/10
46
2
1,55
Контроль huMA79b.v28-SMCC-DM1
2/10
3/10
101
2
3,4
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
3/10
2/10
55
2
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
0/10
10/10
57
2
1,95
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/10
10/10
54
2
1,87
Тио-контроль huMA79b.v28-HC(A118C)
0/10
0/10
NA
2
NA
Тио-контроль hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF
1/10
4/10
59
2
1,96
C. Ксенотрансплантаты WSU-DLCL2 (диффузной крупноклеточной лимфомы)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали эффективность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» в ксенотрансплантатах фолликулярной лимфомы (диффузной крупноклеточной лимфомы) WSU-DLCL2 у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы представлены ниже в таблице 13.
Контрольное антитело представляло собой huMA79b.v28 (конъюгированное с SMCC-DM1). Контрольное тио-MAb HC(A118C) представляло собой антитело тио-Mab тио-hu-anti-HER2-HC(A118C) (конъюгированное с BMPEO-DM1, MC-MMAF или MCvcPAB-MMAE), тио-Mab тио-huMA79b.v28-HC(A118C) или тио-Mab тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C) (конъюгированное с MC-MMAF). Результаты представлены ниже в таблице 13.
На фигуре 35A представлен график зависимости изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантатов WSU-DLCL2 (диффузной крупноклеточной лимфомы) у мышей CB17 SCID, обработанных конъюгатами TDC «тяжелая цепь с А118С анти-CD79b антитела» в дозах, указанных в таблице 13. В частности, введение конъюгата тио-Mab, «тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE» приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с ростом опухоли после обработки негативным контролем (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), тио-huMA79b.v28-HC(A118C). Другой контроль представлял собой тио-huMA79b.v28-HC(A118C), huMA79b.v28-SMCC-DM1 и тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C)-MC-MMAF.
TDC тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, очевидно, является наиболее эффективным из всех тестируемых агентов в данном исследовании.
Кроме того, в том же исследовании, для каждой группы, которой вводили дозы, определяли процент изменения массы тела за первые 7 дней. Результаты (фигура 35B) показали, что введение этих конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» не приводило к значительному снижению процента массы тела или к потере массы в течение данного периода времени.
3
Более того, в таблице 13 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 13Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-HuMA79b.v28-HC(A118C)MMAE, MMAF и DM1 мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами WSU-DLCL2
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF, ММАЕ или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
DAR (Лекар-ствен-ное средство /Ab)
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
0/10
114
4
1,86
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF
0/10
0/10
115
4
1,9
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/10
0/10
92
4
1,55
Контроль huMA79b.v28-SMCC-DM1
1/10
0/10
202
4
3,4
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
0/10
110
4
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
3/10
1/10
115
4
1,95
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
4/10
3/10
108
4
1,87
Тио-контрольhuMA79b.v28-HC(A118C)
0/10
0/10
NA
4
NA
Тио-контроль 10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF
1/10
0/10
118
4
1,96
Тио-контроль huMA79b.v28-HC(A118C)
0/10
0/10
NA
4
NA
D. Ксенотрансплантаты DOHH2 (фолликулярная лимфома)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали способность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» снижать объем В-клеточной опухоли у мышей CB17 SCID с моделью ксенотрансплантатов DOHH2. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и для контроля) представлены ниже в таблице 14.
Контрольное антитело представляло собой huMA79b.v28 (конъюгированное с SMCC-DM1). Контрольное тио-MAb HC(A118C) представляло собой антитело тио-Mab тио-hu-anti-HER2-HC(A118C) (конъюгированное с BMPEO-DM1, MC-MMAF или MCvcPAB-MMAE), тио-Mab тио-huMA79b.v28-HC(A118C) или тио-Mab тио-hu-anti-CD22-HC(A118C) (конъюгированное с MC-MMAF). Результаты представлены ниже в таблице 14 и на фигуре 36.
На фигуре 36A представлен график зависимости изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантатов клеток DOHH2 у мышей CB17 SCID, обработанных конъюгатами TDC «тяжелая цепь с A118C» в дозах, указанных в таблице 14. В частности, введение конъюгата тио-Mab, «тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE-лекарственное средство» в дозах, указанных в таблице 14, приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с ростом опухоли после обработки конъюгатами «антитело-лекарственное средство» (тио-контроль тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-контроль тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-контроль тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE), используемыми в качестве негативного контроля. Другой контроль представлял собой тио-контроль huMA79b.v28-HC(A118C), тио-контроль анти-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF, тио-контроль huMA79b.v28-HC(A118C) и контроль huMA79b.v28-SMCC-DM1.
3
Более того, в таблице 14 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 14Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-HuMA79b.v28-HC(A118C)DM1, MMAF и ММАЕ мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами DOHH2
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
DAR (Лекарст-венное средство/Ab)
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/9
0/9
114
4
1,86
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF
0/9
0/9
115
4
1,9
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/9
0/9
92
4
1,55
Контроль huMA79b.v28-SMCC-DM1
1/8
1/8
202
4
3,4
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
1/9
1/9
110
4
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
5/9
4/9
115
4
1,95
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/9
9/9
108
4
1,87
Тио-контроль huMA79b.v28-HC(A118C)
1/9
0/9
NA
4
NA
Тио-контроль анти-CD22-HC(A118C)-MC-MMAF
0/9
0/9
118
4
1,96
E. Ксенотрансплантаты клеток BJAB, содержащих люциферазу (лимфомы Беркитта)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами «антитело-лекарственное средство» и с различными их дозами, оценивали эффективность других конъюгатов лекарственных средств в ксенотрансплантатах BJAB, содержащих люциферазу (лимфомы Беркитта) у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и для контроля) представлены ниже в таблице 15.
Контрольное антитело представляло собой носитель (только буфер (для ADC)). Контрольное тио-MAb HC(A118C) представляло собой антитело тио-Mab тио-hu-anti-HER2-HC(A118C) (конъюгированное с BMPEO-DM1, MCvcPAB-MMAE или MC-MMAF), тио-Mab тио-huMA79b.v28-HC(A118C) или тио-Mab тио-hu-anti-CD22(10F4v3)-HC(A118C) (конъюгированное с MC-MMAF). Результаты представлены ниже в таблице 15.
На фигуре 37A представлен график зависимости изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантатов BJAB, содержащих люциферазу, у мышей CB17 SCID, обработанных TDC «тяжелая цепь с A118C анти-CD79b антитела» в дозах, указанных в таблице 15. В частности, введение «тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF» приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с ростом опухоли после обработки негативным контролем (тио-анти-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-анти-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, тио-анти-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF). Другой контроль представлял собой тио-huMA79b.v28-HC(A118C) и тио-10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF.
3
Более того, в таблице 15 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 15Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-HuMA79b.v28-HC(A118C)MMAE, MMAF и DM1 мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами BJAB, содержащими люциферазу
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF, ММАЕ или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
DAR (Лекарст-венное средство/Ab)
контроль носитель
0/10
0/10
NA
NA
NA
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
1/10
57
2
1,86
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/10
0/10
23
1
1,55
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF
0/10
0/10
29
1
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
2/10
0/10
27
1
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
4/10
0/10
55
2
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
4/10
1/10
27
1
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
3/8
1/8
28
1
1,9
Тио-контроль huMA79b.v28-HC(A118C)
0/10
0/10
NA
1
NA
Тио-контроль 10F4v3-HC(A118C)-MC-MMAF
0/10
1/10
30
1
1,96
F. Ксенотрансплантаты Granta-519 (лимфомы клеток коры головного мозга)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали эффективность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» в ксенотрансплантатах Granta-519 (лимфомы клеток коры головного мозга человека) у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и для контроля) представлены ниже в таблице 16.
Контрольное тио-MAb HC(A118C) представляло собой тио-MAb тио-hu-anti-HER2-HC(A118C) (конъюгированное с BMPEO-DM1 или MC-MMAF). Результаты представлены в таблице 16 и на фигуре 38.
На фигуре 38A представлен график зависимости изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантата Granta-519 у мышей CB17 SCID, которым вводили конъюгат TDC «тяжелая цепь с A118C анти-CD79b антитела» в дозах, представленных в таблице 16. В частности, введение конъюгатов тио-MAb «тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-ВМРЕО-DM1 и тио-huMA79b.v28-НС(А118С)-MC-MMAF-лекарственное средство» в дозах, представленных в таблице 16, приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с конъюгатами лекарственного средства, используемыми в качестве контроля.
Кроме того, в том же исследовании, для каждой группы, которой вводили дозы, определяли процент изменения массы тела за первые 14 дней. Результаты (фигура 38B) показали, что введение этих конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» не приводило к снижению процента массы тела или к потере массы в течение данного периода времени.
3
В таблице 16 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)). (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 16Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-DM1 и MMAF мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами Granta-519
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
DAR (Лекарст-венное средство /Ab)
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/8
0/8
342
12
1,86
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF
0/8
0/8
346
12
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/6
0/6
55
2
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/8
0/8
110
4
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
4/8
4/8
219
8
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
3/8
5/8
329
12
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
1/8
1/8
57
2
1,95
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
2/8
1/8
115
4
1,95
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
6/8
2/8
229
8
1,95
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
4/8
4/8
344
12
1,95
G. Ксенотрансплантаты WSU-DLCL2 (диффузной крупноклеточной лимфомы)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали эффективность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» в ксенотрансплантатах WSU-DLCL2 (диффузной крупноклеточной лимфомы) у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и контроля) представлены ниже в таблице 17.
Контрольное антитело представляло собой носитель (только буфер (для ADC)). Контрольное тио-MAb представляло собой антитело тио-Mab тио-hu-anti-HER2-HC(A118C) (конъюгированное с BMPEO-DM1, MCvcPAB-MMAE или MC-MMAF). Результаты представлены в таблице 17 и на фигуре 39.
На фигуре 39 представлен график зависимости изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантатов WSU-DLCL2 у мышей CB17 SCID, обработанных конъюгатами TDC «тяжелая цепь с А118С анти-CD79b антитела» в дозах, указанных в таблице 17. В частности, введение конъюгата тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE (при дозе Ab 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг и 4,0 мг/кг) приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с ростом опухоли после обработки негативным контролем (тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF и А-носитель).
3
Более того, в таблице 17 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 17Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-HuMA79b.v28-HC(A118C)MMAE, MMAF и DM1 мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами WSU-DLCL2
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF, ММАЕ или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
DAR (Лекарст-венное средство /Ab)
контроль носитель
0/9
0/9
NA
NA
NA
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/9
0/9
114
4
1,86
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/9
0/9
92
4
1,55
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF
0/9
0/9
115
4
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
5/9
2/9
112
4
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
4/9
0/9
110
4
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
1/9
0/9
14
0,5
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/9
0/9
27
1,0
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
2/9
1/9
55
2,0
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
1/9
7/9
110
4,0
1,9
Н. Ксенотрансплантаты Granta-519 (лимфомы клеток коры головного мозга)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали эффективность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» в ксенотрансплантатах Granta-519 (лимфомы клеток коры головного мозга человека) у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и для контроля) представлены ниже в таблице 18.
Контрольное тио-MAb представляло собой тио-hu-anti-HER2-HC(A118C) (конъюгированное с BMPEO-DM1) и антитело тио-MAb тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE. Результаты представлены ниже в таблице 18.
На фигуре 40A представлен график зависимости изменения среднего объема опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантата Granta-519 у мышей CB17 SCID, которым вводили конъюгат TDC «тяжелая цепь с A118C анти-CD79b антитела» в дозах, представленных в таблице 18. В частности, введение тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1 и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE (в дозе Ab 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг и 4,0 мг/кг) приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с негативным контролем (тио-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1 и тио-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE.
3
Более того, в таблице 18 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 18Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-HuMA79b.v28-HC(A118C)DM1 и MMAE мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами Granta-519
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF, ММАЕ или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
ДозаAb(мг/кг)
DAR (Лекарст-венное средство /Ab)
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
0/10
114
4
1,86
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
2/10
1/10
92
4
1,55
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
3/10
0/10
110
4
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/10
1/10
13
0,5
1,87
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
1/10
0/10
27
1,0
1,87
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
1/10
7/10
54
2,0
1,87
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/10
10/10
108
4,0
1,87
I. Ксенотранспланты BJAB, содержащие CD79b собакоподобных обезьян (BJAB-cynoCD79b)
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали эффективность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» в ксенотрансплантатах клеток BJAB (лимфомы Беркитта), экспрессирующих CD79b собакоподобных обезьян (BJAB-cynoCD79b), у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и для контроля) представлены ниже в таблице 18.
Контрольное Ab представляло собой носитель (только буфер). Контрольные тио-MAb представляли собой антитела тио-Mab, а именно тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF и тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE. Результаты представлены ниже в таблице 19 и на фигуре 50.
На фигуре 50 представлен график зависимости ингибирования роста опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантатов (BJAB-cynoCD79b) у мышей CB17 SCID, обработанных TDC «тяжелая цепь с A118C анти-CD79b антитела» в дозах, указанных в таблице 19. В частности, введение тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE и тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF, а также тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE и тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с ростом опухоли после обработки негативным контролем (тио-анти-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-анти-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE, тио-анти-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF и А-носитель).
3
Более того, в таблице 19 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 19Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-анти-cyno CD79b(ch10D10)-HC(A118C) DM1, MMAF или MMAE или Тио-HuMA79b.v28 DM1, MMAF или MMAE мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами BJAB-cynoCD79b
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF, ММАЕ или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
Доза Ab(мг/кг)
DAR (Лекарст-венное средство /Ab)
контроль носитель
0/9
0/9
NA
NA
NA
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/9
0/9
57
2
1,86
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
0/9
0/9
23
1
1,55
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-MC-MMAF
0/9
0/9
29
1
1,9
Тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1
3/8
1/8
53
2
1,8
Тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
1/9
2/9
27
1
1,86
Тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-MC-MMAF
0/9
1/9
28
1
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
3/9
0/9
55
2
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MCvcPAB-MMAE
2/9
2/9
27
1
1,9
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-MC-MMAF
7/9
1/9
28
1
1,9
J. Ксенотрансплантаы BJAB-cynoCD79b
В аналогичном исследовании, проводимом в соответствии с тем же самым протоколом анализа ксенотрансплантата, описанным в примере 3 (см. выше), но с различными конъюгатами лекарственных средств и с различными их дозами, оценивали эффективность конъюгатов «тио-Mab-лекарственное средство» в ксенотрансплантатах клеток BJAB (лимфомы Беркитта), экспрессирующих CD79b собакоподобных обезьян (BJAB-cynoCD79b), у мышей CB17 SCID. Конъюгаты лекарственного средства и дозы (вводимые на день 0 для всех ADC и для контроля) представлены ниже в таблице 19.
Контрольные тио-MAb представляли собой антитела тио-MAb, а именно тио-hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1, тио-huMA79b.v28-HC(A118C) и тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C). Результаты представлены ниже в таблице 20 и на фигуре 51.
На фигуре 51 представлен график зависимости ингибирования роста опухоли в зависимости от времени для ксенотрансплантатов BJAB-cynoCD79b у мышей CB17 SCID, обработанных TDC «тяжелая цепь с A118C анти-CD79b антитела» в дозах, указанных в таблице 20. В частности, введение тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1, а также тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1 приводило к ингибированию роста опухоли по сравнению с ростом опухоли после обработки негативным контролем (тио-анти-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1). Другой контроль представлял собой тио-hu-MA79b.v28-HC(A118C) и тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C).
3
Результаты представлены ниже в таблице 20. В таблице 20 указано число мышей из общего числа протестированных мышей, обнаруживающих PR (PR = частичная регрессия) (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался менее чем на 50% от объема опухоли, измеренного на день 0) или CR (CR = полная ремиссия (где объем опухоли через любой период времени после введения снижался до 0 мм)), NA = не определяли. (DAR = отношение лекарственного средства к антителу).
Таблица 20Снижение объема опухоли in vivo путем введения конъюгата тио-анти-cyno CD79b(ch10D10)-HC(A118C) DM1 или тио-HuMA79b.v28-HC(A118C)DM1 мышам CB17 SCID с ксенотрансплантатами BJAB-cynoCD79b
Вводимое антитело
PR
CR
Доза MMAF, ММАЕ или DM1(мкг/м<sup>2</sup>)
ДозаAb(мг/кг)
DAR (Лекарст-венное средство /Ab)
Тио-контроль hu-anti-HER2-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
0/10
57
2
1,86
Тио-контроль huMA79b.v28-HC(A118C)
0/10
0/10
NA
2
NA
Тио-контроль анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)
0/10
0/10
NA
2
NA
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
1/10
0/10
27
1
1,85
Тио-huMA79b.v28-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
2/10
55
2
1,85
Тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
0/10
27
1
1,8
Тио-анти-cynoCD79b(ch10D10)-HC(A118C)-BMPEO-DM1
0/10
1/10
53
2
1,8
Представленное выше описание является вполне достаточным для практического осуществления настоящего изобретения специалистом в данной области. Объем настоящего изобретения не ограничивается заявленной конструкцией, поскольку заявленный вариант был представлен лишь в целях иллюстрации некоторых аспектов изобретения, и в объем настоящего изобретения могут быть включены любые конструкции, которые являются функциональным эквивалентом заявленных конструкций. Заявленный материал не должен быть истолкован как указание на то, что этот материал является неадекватным для практического осуществления любого аспекта изобретения, включая наилучший вариант его осуществления, и такие конкретно проиллюстрированные варианты не должны рассматриваться как ограничение объема притязаний. Действительно, исходя из представленного выше описания, специалистом в данной области могут быть сделаны различные модификации, которые, помимо проиллюстрированных и описанных в настоящей заявке, также будут входить в объем прилагаемой формулы изобретения.