СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА СТЕРИЛЬНОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ
METHOD OF MANUFACTURE OF STERILE PHARMACEUTICAL SUBSTANCE

Изобретение относится к области химико-фармацевтической, пищевой и косметической промышленности и касается способа получения субстанций препаратов нуклеиновых кислот иммуномодулирующего действия.
В настоящее время препараты нуклеиновых кислот иммуномодулирующего действия достаточно широко применяются в практической медицине, причем как в виде официальных лекарств, так и в виде БАД к пище. В частности известны препараты - нуклеинат натрия (РНК, полученная из дрожжей), деринат (натриевая соль нативной ДНК, выделенная из молок осетровых рыб), плацентекс-интегро (ДНК из молок форели), БАД к пище «Биостим» (ДНК из молок осетровых рыб) и др. (http://www.dissercat.com/content/immunomoduliruyushchaya-aktivnost-nizkomolekulyarnoi-dezoksiribonukleinovoi-kisloty-dnk-iz-m).
Для получения иммуномодуляторов на основе производных нуклеиновых кислот в основном используются химически синтезированные нуклеиновые компоненты. Однако синтез нуклеиновых компонентов достаточно дорог и приводит к образованию побочных продуктов, что требует тщательной очистки препарата. Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется разработке альтернативных путей получения нуклеиновых компонентов, например, из природного сырья - ДНК микроорганизмов и животных.
Известен способ получения натриевой соли ДНК из семенников животных и/или их спермы, который включает измельчение и гомогенизацию исходного сырья в растворе детергента, обработку раствора при повышенной температуре с одновременным перемешиванием раствора, отделение жидкой фазы фильтрованием и осаждение продукта спиртом. Полученный препарат ДНК растворяют в водном растворе NaCl концентрации 0,01-4,5М при температуре, не превышающей 50°C, полученный раствор пропускают через гомогенизатор высокого давления при давлении до 2000 кг/см2, обрабатывают полученную фрагментированную ДНК спиртом, причем осажденную в спирте натриевую фрагментированную ДНК отделяют центрифугированием, после чего отделенный осадок еще раз промывают спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре не выше 50°C с получением порошка (RU 2268730, опубл. 27.01.2006).
5
5
Известен способ получения стерильного раствора, включающий перевод ДНК в жидкую фазу, обработку раствора ДНК ультразвуком, фильтрацию, стандартизацию по хлористому натрию и стерильную микрофильтрацию, при чем перевод ДНК в жидкую фазу осуществляют путем гомогенизации молок рыб в цитратно-солевом растворе, разделения гомогената, обработки осадка детергентом и концентрированным солевым раствором при 55-60°C, охлаждения реакционной массы, предварительной ультразвуковой обработки, а также осуществляют повторную обработку ультразвуком в условиях, обеспечивающих получение ДНК с мол. м. 2,5×10 - 6,0×10 дальтон и концентрирование (RU 2055837).
Известен способ производства иммунотропного апирогенного толерантного препарата на основе натриевой соли низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты, заключающийся в том, что обезжиренные молоки осетровых рыб, лососевых рыб, тимуса теленка, крови цыплят гомогенизируют в цитратно-солевом растворе, гомогенат центрифугируют в отстойной центрифуге при 2500 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, субстрат повторно гомогенизируют, далее очищенный гомогенат инкубируют в присутствии 3% детергента, в процессе непрерывного перемешивания при повышенной температуре, в реакционную массу добавляют концентрированный раствор натрия хлорида, реакционную массу охлаждают до температуры ниже комнатной (15°C), обрабатывают ультразвуком, в ваннах с пьезокерамическими излучателями при амплитуде колебаний 4-10 мкм; далее сорбентом, отделяют жидкую фазу, сорбент элюируют пермеатом, элюат, объединенный с жидкой фазой, микрофильтруют, концентрируют, спиртом выделяют осадок натрия дезоксирибонуклеата, центрифугируют, отделяют от жидкой фазы, высушивают в течение 4 ч в асептических условиях при 40°C (RU2236853 С1, опубл. 2004-09-27).
В качестве ближайшего аналога может быть указан способ производства унифицированного апирогенного иммуномодулятора, представляющего собой натриевую соль нативной низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты, заключающийся в том, что молоки лососевых или осетровых рыб обезжиривают, измельчают и гомогенизируют в цитратно-солевом водном растворе при 12000 об/мин, гомогенат центрифугируют в отстойной центрифуге при 3500 об/мин при охлаждении, надосадочную жидкость удаляют, субстрат повторно 3-4 раза гомогенизируют с добавлением расчетного количества цитратно-солевого раствора с созданием воздушно-жировой пены и декантацией, далее очищенный гомогенат инкубируют в присутствии 3-6% детергента в процессе непрерывного перемешивания при повышенной температуре, в реакционную массу добавляют насыщенный раствор натрия хлорида, затем реакционную массу охлаждают до температуры ниже комнатной (10°C), обрабатывают ультразвуком в ваннах с пьезокерамическими излучателями с частотой колебаний 21,7-23 кГц и изгибающим моментом не менее 9 мкм при мощности генератора 1,5-2 кВт, далее сорбентом отделяют жидкую фазу, сорбент элюируют пермеатом, элюат объединенный с жидкой фазой микрофильтруют, концентрируют, спиртом осаждают осадок натрия дезоксирибонуклеата, центрифугируют, отделяют от жидкой фазы, высушивают при асептических условиях в течение 4-6 ч при температуре 40-60°C (RU 2309759 С1, опубл. 2007-11-10). Используемая субстанция не сохраняет свою стерильность в течение длительного времени.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения стерильной субстанции натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, который обладает рядом технологических преимуществ и позволяет получить субстанцию, которую можно широко использовать в производстве фармацевтических, пищевых и косметических продуктов, в том числе требующих повышенных требований к стерильности, например инъекционных форм.
Задача решается новым способом производства стерильной фармацевтической субстанции натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты из животного сырья заключающимся в том, что животные ткани измельчают на дезинтеграторе до частиц с размерами 0,1-1 мкм, удаляют балластные вещества в виде жира, белка и соединительной ткани путем последовательного отделения в отстойной центрифуге сначала легких фракций с плотностью до 0,8 г/см3 при 2000 об/мин, далее средних фракций с плотностью до 1,0 г/см3 при 3000 об/мин и затем целевой фракции с плотностью более 1,1 г/см3 при 4000 об/мин, целевую фракцию подвергают лизису в присутствии детергента с концентрацией от 1 до 10% при температурах от 20 до 80°C и давлении от 0,9 до 1.1 атм. в течение временного интервала от 30 до 150 минут, полученную дегазированную массу обрабатывают раствором хлористого натрия с концентрацией 15-25% масс., затем подвергают ультразвуковой обработке с частотой от 15 до 45 Гц при температуре от 10 до 70°C в течение временного интервала от 30 до 200 минут, раствор фильтруют под вакуумом 0,8-0,9 атм. для осветления, концентрируют мембранной фильтрацией с селективностью мембран от 5000 до 100000 Дальтон, концентрат обрабатывают этиловым спиртом в соотношении 1:1 - 1:2 по объему для образования осадка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, высушивают осадок под вакуумом 0,8-0,9 атм. при температуре 40-90°C в течение 60-300 минут до остаточной влаги 5-20% с последующей электронно-лучевой стерилизацией или стерилизацией полученного порошка гамма излучением с интенсивностью от 5 кГр до 25 кГр на дм3 с экспозицией от 30 мин до 120 мин.
Получают стерильный порошок натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, водорастворимый, очищенный от балластных веществ, апирогенный, нетоксичный, пригодный для приготовления лекарственных препаратов как в жидкой форме (капли, растворы для инъекции и прочее) так и в твердой форме (таблетки, порошки, суппозитории).
Технический результат: увеличение сроков хранения, снижение требований по температурному хранению, параметры влажности обеспечивающие лучшее растворение, повышение степени микробиологической чистоты, возможность приготовления стерильного препарата перед применением прямо в шприце путем добавления инъекционной воды, приготовление стерильных твердых форм.
В качестве животного сырья пригодны кровь, тимус, печень, мозг, селезенка, семенники сельскохозяйственных животных или птиц, а также молоки и/или печень промысловых рыб, таких как осетровые, лососевые. Предпочтительно животная ткань выбирается из молок рыб, тимуса теленка, крови цыплят, селезенки свиньи, наиболее предпочтительно - из молок рыб.
В качестве детергентов могут быть использованы любые используемые в данной области детергенты, как ионогенные, так и неионогенные. Как примеры неионогенных детергентов могут быть указаны твины или спаны. Примерами ионогенных детергентов могут быть додецилсульфат натрия, желчные кислоты, производные четвертичных аммонийных соединений.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими конкретными примерами осуществления изобретения.
Пример 1
Молоки осетровых рыб измельчают на дезинтеграторе до частиц с размерами 0,1-1 мкм и потом от полученной массы отделяют балластные вещества в виде жира, белка и соединительной ткани путем последовательного отделения в отстойной центрифуге сначала легких фракций с плотностью до 0,8 г/см3 при 2000 об/мин, далее средних фракций с плотностью до 1,0 г/см3 при 3000 об/мин и осаждение целевой фракции с плотностью более 1,1 г/см3 при 4000 об/мин. Целевую фракцию состоящую на 60-80% из ядер клеток подвергают лизису в присутствии детергента с концентрацией от 1 до 10% при температурах от 20 до 80°C и давлении от 0,9 до 1.1 атм в течение временного интервала от 30 до 150 минут. При этом масса активно дегазируется. Дегазированная масса содержащая в растворе молекулы ДНК обрабатывается раствором хлористого натрия с концентрацией 25% масс., которая потом подвергается ультразвуковой обработке с частотой 40--45 Гц при температуре от 40 до 70°C в течении 100 минут. Обработанный раствор фильтруют под вакуумом 0,8-0,9 атм. для осветления. Проводят концентрирование отфильтрованного раствора мембранной фильтрацией с селективностью мембран от 5000 до 100000 Дальтон, концентрат обрабатывают этиловым спиртом в соотношении 1:1 для образования осадка натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты. Полученный осадок высушивают под вакуумом 0,8-0,9 атм при температуре 70-90°C в течение 180 минут до остаточной влаги 20%. Высушенный (возможно упакованный) порошок стерилизуют гамма или электроннолучевой стерилизацией с интенсивностью 20 кГр с экспозицией от 30 мин до 120 мин.
Пример 2
Селезенку свиньи измельчают на дезинтеграторе до частиц с размерами 0,1-1 мкм. От полученной массы отделяют балластные вещества в виде жира, белка и соединительной ткани путем последовательного отделения в отстойной центрифуге: сначала легких фракций с плотностью до 0,8 г/см3 при 2000 об/мин, далее средних фракций с плотностью до 1,0 г/см3 при 3000 об/мин и осаждение целевой фракции с плотностью более 1,1 г/см3 при 4000 об/мин. Целевую фракцию, состоящую на 60-80% из ядер клеток, подвергают лизису в присутствии детергента с концентрацией от 10% при температурах от 20-40°C и давлении от 0,9 до 1.1 атм в течение 30 минут. При этом масса активно дегазируется. Дегазированная масса, содержащая в растворе молекулы ДНК, обрабатывается раствором хлористого натрия с концентрацией 20% массовых, которая потом подвергается ультразвуковой обработке с частотой от 15 Гц при температуре 20°C в течение 200 минут. Обработанный раствор фильтруют под вакуумом 0,8-0,9 атм для осветления, концентрируют мембранной фильтрацией с селективностью мембран от 5000 до 100000 Дальтон, концентрат обрабатывают этиловым спиртом в соотношении 1:2 для образования осадка натриевой соли дезоксирибонуклеата. Полученный осадок высушивают под вакуумом 0,8-0,9 атм при температуре 80°C в течение 60 минут до остаточной влаги 5%. Высушенный и упакованный порошок стерилизуют гамма или электронной стерилизацией с интенсивностью от 5 кГр с экспозицией от 30 мин до 60 мин.
Пример 3
Раствор для внутримышечного введения получают путем отвешивают в асептических условиях расчетного количества порошка по примеру 1 (для приготовления 1% раствора), растворения в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида с последующим стерильным разливом в ампулы по 1 мл.
Пример 4
Средство в виде суппозитория получают путем помещения твердого кондитерского жира А (90%) в емкость, снабженную водяной рубашкой и перемешивающим устройством, где она расплавляется до однородной массы при температуре 45-50°C при постоянном перемешивании, охлаждения, добавления субстанции активного вещества (10%), полученной по примеру 2, гомогенизации при помощи коллоидной мельницы до однородного состояния, с последующим заполнением дозатором полученной смесью ячеек контурной упаковки, которые охлаждаются до комнатной температуры в охладительном туннеле.
Пример 5
Исследование биологической активности.
Подтверждение биологической активности проводилось путем измерения миграции макрофагов в зону заживления экспериментальных ран у лабораторных крыс где в одной из групп назначался препарат деринат в форме для внутримышечного введения зарегистрированный в Госреестре РФ, а в другой по примеру 3.
Первоначально, для получения культуры макрофагов, на половозрелых крысах-самцах (Rattus rattus L.), начальной массой 150-200 г в асептических условиях проводилось моделирование раны по модифицированной методике И.А. Сыченникова (1974 г.)
Животные в эксперименте были разделены на 3 группы:
1. Контрольная группа (12 животных) - моделировалась рана без последующего введения
2. Группа Деринат (12 животных) - однократное ежедневное введение в область мягких тканей раны препарата Деринат в средней терапевтической дозе 0.015 мл 1,5% раствора Деринат (0.11 мг на крысу).
3. Группа НДРП-3 (12 животных) - однократное ежедневное введение в область мягких тканей раны препарата по примеру 3 в средней терапевтической дозе 0,015 мл 1,5% раствора препарата по примеру 3 (0.11 мг на крысу).
Препарат вводили внутримышечно, в ткани, около раны сразу после моделирования раны, на первые, вторые и на третьи сутки после моделирования. Это сроки обусловлены наибольшей интенсивностью миграции в очаг поражения макрофагов.
На каждом сроке исследования из-под повязки, из зоны регенерации собиралась отделяемое содержимое, которое с использованием маркеров макрофагальной реакции, проверялось в мазках-отпечатках на количественное наличие искомых клеток (макрофагов).
Далее проводилась окраска мазка метиленовым синим, после чего определялось число клеток в поле зрения для каждого срока и каждого лабораторного животного.
Примечание: * - р<0,01
НДРП-3 - натрия дезоксирибонуклеат, препарат полученный по примеру 3
Исследование мазков-отпечатков взвеси ткани раневого содержимого показало, что введение препарата Деринат и препарата полученного по примеру 3 вызывало миграцию макрофагов в область моделированной раны активнее, чем в контрольной группе. Эта разница составляла значение от 30 до 90% (по сравнению с контрольной группой) и зависела от дозы вводимого препарата. Наиболее выраженной миграция становилась на третьи сутки введения, она превысила данные контрольной группы почти в 2 раза.
Таким образом, можно говорить, что введение препарата Деринат и НДРП-3 вызывало усиление процесса регенерации и активацию макрофагов.
Предложенный способ может быть широко внедрен в промышленности для получения субстанции с улучшенными свойствами (стерильность, высокая активность, сохранность нативной структуры, высокая степень очистки).