Штамм микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer. f. globosa V. Andr. для очистки природных водоемов и сточных вод промышленных предприятий
MICROALGAE CHLORELLA VULGARIS BEIJER. f. GLOBOSA V. ANDR. STRAIN FOR PURIFICATION OF NATURAL WATER BODIES AND INDUSTRIAL WASTE WATER

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма микроводорослей, эффективного для очистки природных водоемов, сточных вод промышленных предприятий от нефтяных углеводородов, общего, аммонийного, нитратного азота, алюминия, хлоридов, общей серы.
Известен способ очистки водных сред от нефти и нефтепродуктов. В способе используется биопрепарат, состоящий из консорциума культур микроорганизмов бактерий Rhodococcus equi P-72-00, зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris Beijer, а также дрожжевого гриба Rhodotorula glutinis 2-4М и/или мицелиального гриба Trichoderma lignorum F-98, взятых в эффективном количестве. Способ позволяет снижать содержание нефтеуглеводородов за 90 суток на 56 – 91 % в воде и на 25 – 49 % в сорбенте при загрязнении нефтью, а также на 70 – 74 % в воде и на 91 – 95 % в сорбенте при загрязнении водорастворимыми токсичными нефтеуглеводородами. Недостатком этого способа является длительный период очищения и, следовательно, неприменимость способа в очистке сточных вод [Патент РФ №2 465 216].
Известен штамм микроводоросли Chlorella vulgaris IPPAS C-2015 [Патент РФ № 2 555 519], предназначенный для очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств. Исследование по очистке модельной воды было проведено только по нитратам и аммонийному азоту.
Известен способ биологической очистки сточных вод рыбообрабатывающих предприятий с использованием штамма Chlorella kessleri IPPA С-112 (Патент РФ № 2064454). Сущность способа заключается в обработке сточных вод микроводорослями Chlorella kessleri IPPA C-112 с целью формирования альгоценоза. Недостатком этого способа является узкий спектр очистки - только сточных вод рыбообрабатывающих предприятий.
Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN, предназначен для получения биомассы и очистки сточных вод [Патент РФ № 2192459]. Штамм имеет широкий спектр температуры культивирования (20-40°С). Отсутствует сезонность в его размножении. Штамм не требователен к питательной среде и способен к высокой степени очистки различных категорий сточных вод. Недостатком штамма является гибель клеток при температуре свыше 40°С.
Известен штамм зеленой микроводоросли Acutodesmus obliquus, обладающий способностью снижать содержание загрязняющих веществ в сточной воде, депонирован в Коллекции Микроводорослей ИФР РАН (IPPAS) под регистрационным номером IPPAS S-2016 [Патент РФ №2556131]. Штамм зеленой микроводоросли Acutodesmus obliquus IPPAS S-2016 может быть использован для очистки сточных очистных сооружений коммунального хозяйства и целлюлозно-бумажного предприятия от загрязняющих веществ (аммонийного азота, взвешенных веществ, железа) при высоких температурах. Недостатком штамма является узкий спектр очистки по загрязняющим веществам.
Задача изобретения – получение штамма микроводорослей, обеспечивающего биодеструкцию в водных нефтезагрязненных средах углеводородов и снижение содержания общего, аммонийного, нитратного азота, алюминия, хлоридов, общей серы в водных средах, имеющих превышения ПДК.
В этом состоит технический результат.
Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris Beijer. f. globosa V. Andr выделен в 2010г. из почвы на стоянке оленеводов в Приполярном Урале, способен к нефтеокислению и снижению содержания общего, аммонийного, нитратного азота, алюминия, хлоридов, общей серы в водных средах. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Штамму присвоен номер IPPAS C-2024.
3
4
2
2
4
2
4
Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды – KNO – 5.0 г, MgSO×7HO – 2.5 г, KHPO×3HO – 1.25 г, FeSO– 0.003 г в течении 7 суток в условиях жидкофазной ферментации.
Морфологическая характеристика штамма
Форма клеток – шаровидная, размер от 3.3 до 13.3 мкм в диаметре. Пириноид округлый с 2-4 крахмальными зернами, хорошо заметный. Хроматофор чашевидный, зеленый. Жгутиков нет, автоспоры освобождаются путем разрыва материнской оболочки и имеют форму от неправильно шаровидной до тетраэдрической, пустые оболочки материнских клеток двух-трехдольчатые. Особенности морфологии при длительном хранении: увеличение размеров клеток за счет вакуолизации, образование бесцветных капель масла в клетках. Особенности морфологии в условиях оптимального роста: большая часть клеток находится в диапазоне 6-8 мкм.
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
Режим хранения штамма – для подготовки биомассы с целевым использованием – периодические пересевы – 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды Болда следующего состава в табл. 1:
Табл. 1. Состав среды Болда.
В 936 мл дистиллированной воды необходимо добавить по 10 мл раствора каждого из 6 макроэлементов и по 1 мл каждого микроэлемента и по 1 мл каждого раствора микроэлементов, затем автоклавировать. рН конечного раствора – 6.6. Среда хранится в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 єС.
Способность штамма к биодеструкции нефти и нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах со сточной водой, загрязненных нефтью, результаты приведены в примерах ниже.
Пример 1. Разрушение углеводородов в воде
3
2
4
4
2
9
Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт в присутствии сырой нефти. На 1 л воды добавляли NaNO– 2.0 г; KHPO – 1.0 г; KCl – 0.5 г; MgSO×7HO – 0.5 г; сырой нефти – 0.1 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл стерилизовали их в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной суспензией живой культуры C. vulgaris f. globosa с титром живых клеток 3.4×10 кл/л. Контрольную колбу микроорганизмами не заражали. Условия опыта – температура + 23 ºС. Культивировали в течение 0, 14, 30 суток в при 220 об/мин в условиях суточного освещения.
Массовую концентрацию нефтепродуктов в образцах определяли гравиметрическим методом, ПНД Ф 14.1:2.116-97 [Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах вод методом колоночной хроматографии с гравиметрическим окончанием. ПНД Ф 14.1:2.116-97].
Результаты, представленные в Таблице 2, свидетельствуют о возможности миксотрофного роста штамма с использованием нефтепродуктов в качестве единственного источника углерода. Как видно из данных анализа, в присутствие штамма C. vulgaris f. globosa происходит снижение концентрации растворенных в воде углеводородов на 54 - 65 % за 30 суток.
Таблица 2. Концентрация углеводородов после внесения штамма Chlorella vulgaris f. globosa IPPAS C-2024
Варианты опыта
Содержание нефтепродуктов, мг
0 суток
14 суток
30 суток
Контроль (среда + 0.1 г нефти)
24.3
-
19.7
Среда + 0.1 г нефти + 10 мл штамма Chlorella vulgaris globosa
20.5
15.4
11
Контроль (среда + 0.1 г отработанного масла)
68.8
Среда + 0.1 г отработанного масла + 10 мл штамма Chlorella vulgaris globosa
37.5
38.0
23.9
3
2
4
4
2
10
Пример 2. На 1 л воды добавляли NaNO – 2.0 г; KHPO – 1.0 г; KCl – 0.5 г; MgSO×7HO – 0.5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл стерилизовали их в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, после чего вводили в содержимое колбы предварительно приготовленную суспензию живой культуры C. vulgaris f. globosa – 5 мл с титром живых клеток 5×10 кл/л. Контрольную колбу микроорганизмами не заражали. Во все колбы добавляли по 0.5 г сырой нефти. Условия опыта – температура + 23 ºС, культивировали в течение 17 суток в при 220 об/мин в условиях суточного освещния.
По окончанию эксперимента проведена оценка состава н-алканов и полиаренов. Разделение экстрактов проводили методом колоночной хроматографии. На колонке с оксидом алюминия отделяли фракцию н-алканов и полициклических ароматических соединений (фракция F1) от полярных соединений. Далее на колонке с силикагелем фракцию F1 разделяли на фракции н-алканов (F2) и полициклических ароматических соединений (F3).
3
Качественное и количественное определение содержания н-алканов проводили на хромато-масс-спектрометре Trace DSQ (Thermo) в режиме селективной регистрации ионов (SIM) при энергии электронов 70 эВ. Сканирование в режиме SIM вели по трем ионам с массами 57, 71 и 85, характерным для предельных углеводородов. Идентификацию н-алканов на хроматограмме проводили предварительно в режиме полного ионного тока по их стандартным растворам. Методом внутреннего стандарта (внутренний стандарт – н-декан, 0.05 мг/см) исследовали количественное содержание н-алканов.
В основу определения ПАУ в почве положена методика М 03-04-2002 – измерение массовой доли бенз[a]пирена в пробах почв, грунтов донных отложений и твердых отходов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием анализатора “Флюорат-02” в качестве флуориметрического детектора [Анчугова Е.М. Подходы к оценке методов рекультивации нефтезагрязненных почв / Е.М. Анчугова, Е.Н. Мелехина, М.Ю. Маркарова, Т.Н. Щемелинина // Почвоведение. 2016. № 2. С. 1–4; Габов Д.Н. Закономерности формирования полициклических ароматических углеводородов в почвах Северной и Средней тайги / Д.Н. Габов, В.А. Безносиков, Б.М. Кондратенок, Е.В. Яковлева // Почвоведение. – 2008. – № 11. – С. 1334–1343].
Таблица 3. Количество вещества ПАУ (мкмоль)
Контроль (среда + нефть)
Среда + нефть + штамм C. vulgaris f. globosa
флуорен
828700
352470
фенантрен
114700
26500
антрацен
1900
2480
флуорантен
380
0
пирен
21500
9900
бенз[а]антрацен
4360
3480
хризен
11550
13190
бенз[b]флуорантен
7550
6180
бенз[к]флуорантен
140
280
бенз[а]пирен
690
560
сумма ПАУ
991340
415040
13
25
Результаты свидетельствуют, что микроводоросль эффективно трансформирует н-алканы С – С (35 %) (рис.1) и низкомолекулярные ПАУ в миксотрофных условиях посредством диоксигеназ, тогда как высокомолекулярные ПАУ окислялись слабо, или же не окислялись совсем. Эксперимент показал, что за 7 дней метаболизировали 60 % низкомолекулярных ПАУ (от флуорена до пирена). В значительной степени за 7 суток произошло снижение доли отдельных ПАУ: флуорена, фенантрена, флуорантена и пирена (Табл.3).
Способность штамма к снижению содержания основных загрязняющих веществ (общего, аммонийного, нитратного азота, алюминия, хлоридов, общей серы) изучали в лабораторных экспериментах:
6
Пример 3. В сточную воду – 1.5 литра, отобранную из аэротенков станции биологической очистки лесопромышленного предприятия АО «Монди СЛПК» добавляли 1% от объема воды биомассы микроводорослей C. vulgaris f. globosa IPPAS C-2024 с титром живых клеток 1×10 кл/л. Контролем служила сточная вода без внесения инокулянта. Условия опыта – температура + 23 ºС. Культивировали в течение 24 часов в при 220 об/мин в условиях суточного освещения фитолампой. Эксперимент проводили в 3-х повторностях. В таблице 4 представлены усредненные результаты.
Как видно, из таблицы 4, количественное содержание основных загрязняющих веществ в сточной воде при инокулировании биомассой микроводорослей Chlorella vulgaris globosa снижается: алюминия – на 10 %, аммонийного азота – на 23 %, нитратного азота – на  23 %, общего азота - 39 %, общей серы – на 12 %, хлоридов – на 3 % за 24 часа.
Таблица 4. Количественное содержание основных загрязняющих веществ в сточной воде без водорослей (Контроль) и  с внесением биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris globosa IPPAS C-2024
Шифр пробы
Al, мкг/дм<sup>3</sup>
NH<sub>4</sub><sup>+</sup>, мг/дм<sup>3</sup>
NO<sub>3</sub><sup>-</sup>, мг/дм<sup>3</sup>
N<sub>общ.</sub>, мг/дм<sup>3</sup>
S <sub>общ.,</sub>мг/дм<sup>3</sup>
Cl,мг/дм<sup>3</sup>
Сточная вода + Chlorella vulgaris globosa
300
0,69
0,66
2,6
114
94
Контроль
330
0,9
0,86
4,3
130
97