КОМПОЗИЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА

1. Композиция рекомбинантных антител, содержащая, по меньшей мере, 3 различные молекулы антител против EGFR, причем антитела связывают различные первый, второй и третий эпитопы EGFR.
2. Композиция рекомбинантных антител по п.1, в которой эпитопы являются неперекрывающимися.
3. Композиция рекомбинантных антител по п.1, в которой, по меньшей мере, одна индивидуальная молекула антитела способна подавлять связывание EGF.
4. Композиция рекомбинантных антител по п.1, в которой, по меньшей мере, одна индивидуальная молекула антитела способна предотвращать фосфорилирование EGFR.
5. Композиция рекомбинантных антител по п.1, в которой, по меньшей мере, одна индивидуальная молекула антитела способна усиливать интернализацию/разрушение EGFR.
6. Композиция рекомбинантных антител по п.1, содержащая, по меньшей мере, одну дополнительную отличающуюся молекулу антитела против EGFR, причем указанное дополнительное антитело связывает четвертый индивидуальный эпитоп.
7. Композиция рекомбинантных антител по п.6, содержащая, по меньшей мере, одну дополнительную отличающуюся молекулу антитела против EGFR, причем указанное дополнительное антитело связывает пятый индивидуальный эпитоп.
8. Композиция рекомбинантных антител по п.7, содержащая, по меньшей мере, одну дополнительную отличающуюся молекулу антитела против EGFR, причем указанное дополнительное антитело связывает шестой индивидуальный эпитоп.
9. Композиция рекомбинантных антител по п.1, содержащая, по меньшей мере, одно антитело домена III и, по меньшей мере, одно антитело домена I/II.
10. Композиция рекомбинантных антител по п.1, содержащая, по меньшей мере, два антитела домена III и, по меньшей мере, одно антитело домена I.
11. Композиция рекомбинантных антител по п.1, содержащая, по меньшей мере, два антитела домена III, например, по меньшей мере, три антитела домена III.
12. Композиция рекомбинантных антител по п.1, содержащая, по меньшей мере, одно антитело, способное усиливать связывание, по меньшей мере, одного дополнительного антитела с отличающимся индивидуальным эпитопом.
13. Композиция рекомбинантных антител по п.1, в которой антитела являются химерными антителами с вариабельными цепями мыши и константными цепями человека.
14. Композиция рекомбинантных антител по п.13, в которой константная цепь человека представляет собой IgG1 или IgG2.
15. Композиция рекомбинантных антител по п.1, в которой, по меньшей мере, одно антитело является гуманизированным антителом.
16. Композиция рекомбинантных антител по п.1, в которой, по меньшей мере, одно антитело является антителом человека.
17. Композиция рекомбинантных антител по п.1, где EGFR выбирают из группы, состоящей из EGFR человека, мутантного EGFR человека и делеционных вариантов EGFR человека.
18. Композиция рекомбинантных антител по п.17, где EGFR представляет собой как EGFR человека, так и EGFR примата, не являющегося человеком.
19. Композиция рекомбинантных антител, содержащая, по меньшей мере, 2 различные молекулы антитела против EGFR, в которой одну индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антител, имеющих области CDR антител: 992, 1024, 1030, 1042, 1208, 1229, 1254, 1257, 1260, 1261, 1277, 1284, 1308, 1320, 1344 и 1347.
20. Композиция рекомбинантных антител по п.19, в которой, по меньшей мере, одну индивидуальную молекулу антитела против  EGFR выбирают из группы, состоящей из антител, имеющих области CDR антител 992, 1030, 1024, 1347, 1277, 1254, 1320, 1260, 1261 и 1284.
21. Композиция рекомбинантных антител по п.19, в которой две различные молекулы антитела против EGFR выбирают из группы комбинаций, состоящих из антител с областями CDR антител 992+1030, 992+1024, 992+1042, 992+1320, 1277+1024.
22. Композиция антител, содержащая, по меньшей мере, 2 различные молекулы антитела против EGFR человека,
а. в которой первую индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 992, антитела, содержащего последовательности VL (аминокислоты 3-109 из SEQ ID NO 72) и VH (аминокислоты 3-124 из SEQ ID NO 40) антитела 992, антитела, имеющего области CDR3 из антитела 992 (SEQ ID NO 116 и 111), антитела, связывающегося с тем же эпитопом, что и антитело 992, и антитела, способного подавлять связывание антитела 992 с EGFR человека, и
b. в которой вторую индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 1024, антитела, содержащего последовательности VL (аминокислоты 3-114 из SEQ ID NO 73) и VH (аминокислоты 3-120 из SEQ ID NO 41) антитела 1024, антитела, имеющего области CDR3 из антитела 1024 (SEQ ID NO 120 и 114), антитела, связывающегося с тем же эпитопом, что и антитело 1024, и антитела, способного подавлять связывание антитела 1024 с EGFR человека.
23. Композиция по п.22, в которой
a. указанную первую индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 992, антитела, содержащего последовательности VL и VH антитела 992, антитела, имеющего области CDR3 из антитела 992, и антитела, связывающегося с тем же эпитопом, что и антитело 992, и
b. указанную вторую индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 1024, антитела, содержащего последовательности VL и VH антитела 1024, антитела, имеющего области CDR3 из антитела 1024, и антитела, связывающегося с тем же эпитопом, что и антитело 1024.
24. Композиция по п.22, в которой
a. указанную первую индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 992, антитела, содержащего последовательности VL и VH антитела 992, и антитела, имеющего области CDR3 из антитела 992, и
b. указанную вторую индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 1024, антитела, содержащего последовательности VL и VH антитела 1024, и антитела, имеющего области CDR3 из антитела 1024.
25. Композиция по п.22, в которой
a. указанную первую индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 992, и антитела, содержащего последовательности VL и VH антитела 992, и
b. указанную вторую индивидуальную молекулу антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 1024 и антитела, содержащего последовательности VL и VH антитела 1024.
26. Композиция по п.22, содержащая антитела 992 и 1024.
27. Композиция по п.22, в которой первое и второе антитела против EGFR не подавляют связывание друг друга с EGFR человека.
28. Композиция по п.22, в которой, по меньшей мере, одно из антител способно увеличивать максимальную способность связывания другого антитела с EGFR человека.
29. Композиция по п.22, в которой пропорция первого антитела по отношению ко второму антителу в композиции составляет от 5 до 95%, например от 10 до 90%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 70%, более предпочтительно от 40 до 60%, например от 45 до 55%, например приблизительно 50%.
30. Композиция по п.22, в которой первое и второе антитела относятся к изотипу IgG1 или IgG2.
31. Композиция по п.22, в которой антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и антитело 992, выбирают из кластера антител, содержащего клоны 1209, 1204, 992, 996, 1033 и 1220.
32. Композиция по п.22, в которой антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и антитело 1024, выбирают из кластера антител, содержащего клоны 1031, 1036, 1042, 984, 1024, 1210, 1217, 1221 и 1218.
33. Композиция по п.22, в которой антитело, содержащее область CDR3 из антитела 992, может дополнительно содержать области CDR1 и CDR2 из VH и VL антитела 992.
34. Композиция по п.22, в которой антитело, содержащее область CDR3 из антитела 1024, может дополнительно содержать области CDR1 и CDR2 из VH и VL антитела 1024.
35. Композиция по п.22, в которой антитело, конкурирующее с антителом 992, выбирают из группы, состоящей из антител 1208, 1254 и 1277.
36. Композиция по п.22, в которой антитело, конкурирующее с антителом 1024, выбирают из группы, состоящей из антител 1042 и 1320.
37. Композиция по п.22, которая не содержит дополнительных антител против EGFR в дополнение к указанным первому и второму антителам.
38. Композиция по п.22, дополнительно содержащая третье отличающееся антитело против EGFR, в которой молекулу указанного третьего отличающегося антитела против EGFR выбирают из группы, состоящей из антитела 1030, антитела, содержащего последовательности VL (аминокислоты 3-114 из SEQ ID NO 74) и VH (аминокислоты 3-120 из SEQ ID NO 42) антитела 1030, антитела, имеющего области CDR3 из антитела 1030 (SEQ ID NO 112 и 119), антитела, связывающегося с тем же эпитопом, что и антитело 1030, и антитела, способного подавлять связывание антитела 1030 с EGFR человека.
39. Композиция по п.37, в которой указанное третье антитело приводит к усиленному связыванию указанного первого и/или второго антитела с EGFR человека.
40. Композиция по п.37, в которой антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и антитело 1030, выбирают из кластера антител, состоящего из клонов 1195, 1030, 1034, 1194, 980, 981, 1246 и 1223.
41. Композиция по п.37, в которой антитело, содержащее область CDR3 из антитела 1030, дополнительно содержит области CDR1 и CDR2 из VH и VL антитела 1030.
42. Композиция по п.38, которая не содержит дополнительных антител против EGFR в дополнение к указанным первому, второму и третьему антителам.
43. Композиция по п.22, в которой различные антитела предназначены для одновременного, последовательного или раздельного введения.
44. Композиция по п.22, которая приводит к интернализации рецептора.
45. Композиция по п.22, которая приводит к регрессии опухолей A431NS in vivo.
46. Композиция по п.22, которая способна индуцировать терминальную дифференциацию клеток A431NS in vivo.
47. Композиция по п.22, которая способна активировать экспрессию опухолевого инволюкрина in vivo.
48. Биспецифическая связывающая молекула, обладающая специфичностями связывания композиции антител по п.22.
49. Биспецифическая связывающая молекула по п.48, содержащая области CDR из антител 992 и 1024.
50. Биспецифическая связывающая молекула по п.48, представляющая собой антитело с двойным вариабельным доменом.
51. Биспецифическая связывающая молекула по п.48, представляющая собой биспецифический фрагмент Fab или биспецифический scFV.
52. Способ получения композиции антител, включающий:
H
L
a) трансфицирование первой популяции эукариотических клеток первой экспрессирующей конструкцией, кодирующей первое антитело, содержащее первую когнатную пару цепей V и V, способных связывать первый индивидуальный эпитоп EGFR,
H
L
b) трансфицирование второй популяции эукариотических клеток второй экспрессирующей конструкцией, кодирующей второе антитело, содержащее вторую когнатную пару цепей V и V, способных связывать второй индивидуальный эпитоп EGFR,
c) необязательное повторение этапа b) для третьей или последующих клеточных популяций, экспрессирующих конструкций, когнатных пар и эпитопов EGFR,
d) отбор трансфицированных первой, второй и (необязательно) последующих клеточных популяций,
e) объединение трансфицированных популяций в одном сосуде для получения клеточного банка,
f) культивирование клеток из клеточного банка в условиях, обеспечивающих экспрессию антител, и
g) восстановление композиции антител из супернатанта и ее очистка.
53. Способ по п.52, в котором композиция антител представляет собой композицию антител по любому из пп.1-18.
54. Способ по п.52, в котором клетки трансфицированы посредством сайт-специфической интеграции.
55. Способ по п.52, в котором цепи VH и VL являются мышиными, а константные области антител являются человеческими.
56. Способ по п.55, в котором все антитела содержат одну и ту же константную область тяжелой цепи.
H
L
57. Клеточный банк, содержащий, по меньшей мере, две субпопуляции эукариотических клеток, причем каждая субпопуляция трансфицирована или трансдуцирована одной экспрессирующей конструкцией, кодирующей антитело, содержащее когнатную пару цепей V и V, способных связывать индивидуальный эпитоп EGFR.
58. Клеточный банк по п.57, который кодирует композицию антител по любому из пп.1-18.
59. Клеточный банк по п.57, в котором клетки трансфицированы посредством сайт-специфической интеграции.
60. Способ уменьшения передачи сигнала EGFR, включающий введение в композицию клеток, экспрессирующих EGFR, композиции антител по любому из пп.1-47 или биспецифической связывающей молекулы по любому из пп.48-51, что вызывает уменьшение передачи сигнала EGFR.
61. Способ уничтожения клеток, экспрессирующих EGFR, включающий введение в композицию клеток, экспрессирующих EGFR, композиции антител по любому из пп.1-47 или биспецифической связывающей молекулы по любому из пп.48-51, что вызывает уничтожение клеток, экспрессирующих EGFR.
62. Способ индуцирования апоптоза в клетках, экспрессирующих EGFR, включающий введение в композицию клеток, экспрессирующих EGFR, композиции антител по любому из пп.1-47 или биспецифической связывающей молекулы по любому из пп.48-51, посредством чего индуцируется апоптоз.
63. Способ подавления пролиферации клеток, экспрессирующих EGFR, включающий введение в композицию клеток, экспрессирующих EGFR, композиции антител по любому из пп.1-47 или биспецифической связывающей молекулы по любому из пп.48-51, посредством чего подавляется пролиферация.
64. Способ индуцирования дифференциации опухолевых клеток in vivo, включающий введение индивиду, страдающему раком, композиции антител по любому из пп.1-47 или биспецифической связывающей молекулы по любому из пп.48-51, посредством чего индуцируется дифференциация опухолевых клеток.
65. Способ по п.64, в котором указанная дифференциация является терминальной.
66. Способ по п.64, в котором указанная дифференциация сопровождается увеличением экспрессии инволюкрина.
67. Способ индуцирования интернализации EGFR, включающий введение в клетки, экспрессирующие EGFR, эффективного количества композиции антител по любому из пп.1-47 или биспецифической связывающей молекулы по любому из пп.48-51, посредством чего индуцируется интернализация EGFR.
68. Фармацевтическая композиция, содержащая два или более антитела по любому из пп.1-47 или биспецифическую связывающую молекулу по любому из пп.48-51, в виде комбинации для одновременного, раздельного или последовательного введения при терапии рака.
69. Фармацевтическая композиция по п.68, дополнительно содержащая, по меньшей мере, одно соединение, способное индуцировать дифференциацию раковых клеток, в виде комбинации для одновременного, раздельного или последовательного введения при терапии рака.
70. Фармацевтическая композиция по п.69, в которой соединение выбирают из группы, состоящей из ретиноевой кислоты, фенилбутирата, полностью транс-ретиноевой кислоты, активной формы витамина D.
71. Фармацевтическая композиция по п.68, дополнительно содержащая, по меньшей мере, одно химиотерапевтическое или противоопухолевое соединение, в виде комбинации для одновременного, раздельного или последовательного введения при терапии рака.
72. Фармацевтическая композиция по п.71, в которой химиотерапевтическое соединение выбирают из группы, состоящей из адриамицина, цисплатина, таксола, доксорубицина, топотекана, фторпиримидина, оксалиплатина и иринотекана.
73. Полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из
a. нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO 100,
b. нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID No 101,
c. нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO 102,
d. нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 103, и
e. нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, комплементарную любой из a.-d.
74. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.73, функционально связанную с промоторной последовательностью, способной управлять экспрессией указанной нуклеиновой кислоты.
75. Клетка, трансфицированная или трансдуцированная вектором экспрессии по п.74.
76. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 101.
77. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO 103.
78. Способ скрининга антител по связыванию с EGFR cynomolgous, включающий стадии
a. получения, по меньшей мере, одного испытуемого антитела,
b. проведения анализа по определению связывания антитела с
i) внеклеточным доменом EGFR cynomolgous (SEQ ID NO 101) или полноразмерным EGFR cynomolgous (SEQ ID NO 103), или
ii) поверхностью клеток, экспрессирующих внеклеточный домен EGFR cynomolgous (SEQ ID NO 101) или экспрессирующих полноразмерный EGFR cynomolgous (SEQ ID NO 103),
c. выбора, по меньшей мере, одного антитела, которое связывается с внеклеточным доменом EGFR cynomolgous.
79. Способ по п.78, дополнительно включающий скрининг на связывание с внеклеточным доменом EGFR человека или связывание с клетками, экспрессирующими EGFR человека.
80. Способ идентификации антител против EGFR, способных усиливать одновременное связывание другого антитела против EGFR с EGFR, включающий
a. в первом анализе определение максимальной способности связывания первого антитела с фиксированным количеством антигена EGFR,
b. во втором анализе насыщение фиксированного количества антигена EGFR вторым антителом против EGFR,
c. контактирование комплекса EGFR-антитело с указанным первым антителом и определение максимальной способности связывания, и
d. сравнение способностей связывания для определения того, превышает ли максимальная способность связывания на стадии c. максимальную способность связывания на стадии a.
81. Способ по п.80, в котором указанный антиген EGFR представляет собой рекомбинантный белок, иммобилизованный на твердой поверхности.
82. Способ по п.80, в котором указанный антиген EGFR презентирован на поверхности клетки, экспрессирующей EGFR.
83. Способ по п.82, в котором клетка содержит экспрессирующую конструкцию, кодирующую EGFR.
84. Способ по п.80, в котором первое антитело представляет собой иммуноглобулин, а указанное второе антитело представляет собой фрагмент Fab.
85. Способ по п.80, в котором анализы представляют собой ELISA.
86. Способ по п.80, в котором антиген EGFR содержит внеклеточный домен EGFR человека (SEQ ID NO 108) или внеклеточный домен EGFR cynomolgous (SEQ ID NO 101).