Способ гемокоррекции при лечении печеночной недостаточности
HEMOCORRECTION METHOD IN TREATING HEPATIC IMPAIRMENT

Изобретение относится к клинической и экспериментальной медицине, а именно к гепатологии, трансплантологии и может быть использовано для лечения печеночной недостаточности.
Печеночная недостаточность является осложнением широкого круга заболеваний. Развившая печеночная недостаточность в значительной мере ухудшает прогноз и повышает риск смерти. В отличие от недостаточности других органов и систем, возможности протезирования функции печени во многом ограничены. Это обусловлено в первую очередь многообразием жизненно важных функций печени. Имеющиеся методы экстракорпоральной гемокоррекции, в настоящее время, лишь частично и на короткий срок компенсировать частично утраченные функции печени. Единственным радикальным методов лечения печеночной недостаточности является трансплантация печени. Однако низкий темп увеличения количества эффективных доноров в значительной мере ограничивает доступность этого метода лечения. Это требует разработки новых методов лечения печеночной недостаточности, направленных на комплексную компенсацию нарушений ее функций.
Известен способ коррекции печеночной недостаточности в эксперименте, в котором выделяют из костного мозга крысы-донора мононуклеарную фракцию клеток, затем после их культивирования выделяют из них фракцию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, далее из полученной фракции выделяют суммарную РНК мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и вводят ее экспериментальному животному - крысе внутрибрюшинно или в паренхиму печени в дозе 15-45 мкг на 100 г веса по меньшей мере, трехкратно с интервалом 1-3 суток между первым и вторым введением и далее через 2-5 суток между последующими введениями. (Патент РФ 2650209, МПК G09B 23/28, публ. 2018).
Недостатком указанного способа является сложность получения мононуклеарной фракции клеток (получение их из костного мозга), необходимость получения РНК мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, зависимость от регенераторного потенциала печени реципиента, а также отсроченный эффект во времени, что делает затруднительным его применение при острой печеночной недостаточности.
Наиболее близким является способ гемокоррекции печеночной недостаточности, при котором осуществляют эксфузию крови в экстракорпоральный контур. Кровь поступает в плазмофильтр, в котором происходит отделение клеток крови от плазмы. Далее плазма поступает в картридж, содержащий культуру клеток-гепатоцитов, после чего плазма вновь смешивается с клетками крови и возвращается пациенту (Thompson J. et al. Extracorporeal cellular therapy (ELAD) in severe alcoholic hepatitis: A multinational, prospective, controlled, randomized trial. Liver Transpl. 2018; 24(3):380-393. doi: 10.1002/lt.24986).
Недостатками этого метода является использование аллогенной клеточной культуры, отсутствие возможности повторного использования картриджа, а также перфузия через него высокоразмерных молекул (липопротеиды низкой и очень низкой плотности, антитела класса IgM, фибриноген), что повышает риск повреждения культуры клеток, образование «неомембраны» и снижает эффективность процесса гемокоррекции и сдерживают широкое распространение метода.
Задачей предлагаемого изобретения является улучшение результатов лечения печеночной недостаточности, повышения эффективности экстракорпоральной гемокоррекции, снижения риска осложнений, за счет использования культуры аутоклеток, возможности многократного применения полученной культуры клеток-гепатоцитов для коррекции нарушенной дезинтоксикационной и белково-синтетической функции печени.
Для решения поставленной задачи в способе гемокоррекции при лечении печеночной недостаточности, который включает эксфузию крови в экстракорпоральный контур, проведение фильтрации с отделением клеток печени крови от плазмы, перфузию плазмы крови через культуру клеток-гепатоцитов, смешивание обработанной плазмы с клетками крови и возврат пациенту, предложено дополнительно после фильтрации плазмы проводить сепарацию ее компонентов на мембране с размером пор 35-45 нм, а при перфузии плазмы крови в качестве культуры клеток использовать аутокультуру клеток печени в объеме 2-2,5 г на килограмм массы тела, зафиксированных на биоматриксе с синтетической основой из биосовместимого полимера. При этом сепарацию и перфузию сыворотки осуществлять со скоростью потока 10-20 мл/мин.
Достоинством предлагаемого способа лечения печеночной недостаточности является отсутствие необходимости поиска донора индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, компенсация не только дезинтоксикационной, но белково-синтетической функции печени; отсутствие риска повреждения культуры клеток-гепатоцитов факторами гуморального иммунитета; возможность многократного применения полученной культуры клеток для курсового лечения. Способ осуществляется следующим образом.
Эксперимент осуществляли на лабораторных животных - 4 кроликах породы «Белый гигант» (Large albino rabbits), весом от 4 до 6 килограмм и контрольной группе из 4 кроликов той же породы и веса. В каждой группе было по два самца и две самки. Проводили подготовку культуры клеток-гепатоцитов по известной технологии. Первым этапом у кролика весом получали мононуклеары периферической крови. Для этого осуществляли забор крови в вакутейнеры с ЭДТА. После этого периферическую кровь в стерильных условиях наслаивали на раствор фиколла в фелконе. Затем фэлконы центрифугировали при 400g в течение 30 минут. После центрифугирования происходило разделение на фазы. В интерфазе скапливались мононуклеары крови. Интерфазу (белый бэнд) отбирали дозатором и переносили в новую пробирку с фосфатно-солевым буфером, затем вновь центрифугировали при 300g в течение 15 минут. После этого отбирали супернатант и повторяли процедуру промывки фосфатно-солевым буфером, а также центрифугирование в течение 15 минут. Осадок замораживали в смеси 90%KoSR+10% диметилсульфоксида. После этого проводили подсчет клеток. Число мононуклеаров составляло 0,3-0,5 млн клеток.
Второй этап получения культуры клеток - репрограммирование полученных клеточных материалов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) по протоколу Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit. Полученные клетки нуклеофицируются эписомными векторами, экспрессирующими гены ОСТ4, SOX2, KLF4, L-MYC и LIN28.
Для этого рассаживали культивируемые клетки на StemPro CD34 клетки в культуральный планшет в среду StemPro-34 с содержанием цитокинов (SCF, IL-3 и GM-CSF). Проводили трансфекцию клеток с помощью системы трансфекции Neon. Рассаживали трансфецированные клетки на покрытые основой Geltrex чашки Петри, и инкубировали их в полной StemPro-34 среде. Затем меняли среду на полную N2B27 среду. Затем меняют среду на Е8 (Essential 8 Medium). Затем, после появления первых признаков колоний ИПСК, вручную переносили колонии ИПСК на свежую основу Geltrex.
После этого осуществляли направленную дифференцировку ИСПК в гепатоциты. Для дифференцировки использовали среду DMEM/F12 с добавлением антибиотика Penicillin/Streptomycin, линолевой кислоты и FBS (эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота), ITS (инсулин-трансферрин-селенида). В результате добавления в культуральную среду Активина A, LY294002 и BIO (bromo-indirubin-3'-oxime) происходил переход ИПСК в дефинитивную энтодерму и запускалась экспрессия специфичного для данного типа клеток маркера SOX17. Далее при культивировании клеток дефинитивной энтодермы в среде с добавлением ингибиторов (бутирата натрия и диметилсульфоксида), а также факторов роста (FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-8 и ВМР-4) происходила дифференцировка в гепатобласты. Для терминальной дифференцировки в гепатоциты добавляли селективный протеиновый ингибитор SB431542 и диметилсульфоксид, а также фактор роста гепатоцитов HGF и фоллистатин-288.
После получения культуры гепатоцитов проводили их фиксацию на матрикс. В качестве матрикса для картриджа применяли полотно из полимерных нановолокон.
Для изготовления нановолокон использовали биосовместимые полимеры (PLC поликапролактон, PLA полилактид или рекомбинантный спидроин). Раствор полимера на установке для электроспиннинга Nanon-01 electrospinning setup наносили на покровные стекла 15-22 мм, образуя при этом сетку нановолокон с характерным размером пор в несколько микрометров. Для прикрепления клеток, подложки инкубировали в течение 12 часов в растворе фибронектина плазмы. После этого клетки высаживали на волокна, с образованием монослоя и крепким сцеплением с субстратом. При таком способе, заселение клеток в картридж производили переносом нановолоконных сеток вместе с монослоем клеток и накладыванием сеток друг на друга, образуя «сендвич».
После получения картриджа с массой клеток 2-2,5 г на кг массы тела, кроликов вводили в наркоз и выполняли резекцию 2/3 печени хирургическим путем. После операции исследовали в крови динамику билирубина, альбумина, фибриногена, холестерина. Через сутки у всех животных был отмечен двукратный рост билирубина, при относительно стабильной концентрации альбумина, фибриногена, холестерина (≈5-10%). У 4 кроликов основной группы проводили эксфузию крови в экстракорпоральный контур. Проводили фильтрацию на плазмофильтре с отделением плазмы и клеток крови. После этого плазма поступала в сепаратор компонентов плазмы с размер пор мембраны 35-45 нм, где «отсекались» макромолекулы. После этого, плазма поступала в картридж, содержащий аутокультуру клеток-гепатоцитов, зафиксированных на биоматриксе с синтетической основой из биосовместимых полимеров, со скоростью 10-20 мл/мин. После картриджа плазма вновь смешивалась с клетками крови и макромолекулами и возвращалась животному. Перфузию осуществляли на протяжении 24 часов. При контрольном исследовании у животных основной группы концентрация билирубина снизилась на 26-41% от значения до начала перфузии, концентрация альбумина, фибриногена, холестерина снизилась на 5-6%. После этого картридж промывался физиологическим растворов и инкубировался в течение суток в среде, содержащей DMEM-low glucose, MCDB-201-water, Linoleic acid, Bovine serum albumin, Insulin-transferrin-selenium (ITS), Penicillin, Streptomycin, L-Ascorbic Acid, Dexamethasone 2-mercaptoethanol. После 24-часовой инкубации картридж вновь промывался физиологическим раствором, и проводилась вторая процедура перфузии по выше описанной методике.
У животных контрольной группы, у которых перфузия не проводилась, на вторые сутки после резекции 2/3 печени концентрация билирубина увеличилась в 3,5 раза, концентрация альбумина, фибриногена, холестерина снизилась на 15-23%.
Через 4 дня после резекции печени у животных основной группы (т.е. после завершения второй перфузии) концентрация билирубина была в 2,1 раза ниже, чем у животных контрольной группы, а концентрация альбумина, фибриногена, холестерина на 22-42% выше. В контрольной группе одно животное умерло через три дня после резекции печени. В основной группе все животные выжили в течение 4 суток после резекции печени. После завершения эксперимента все животные были усыплены.
Проведенные исследования показали, что предлагаемый способ гемокоррекции позволит повысить эффективность лечения печеночной недостаточности пациентов, в том числе и в острой фазе, компенсировать нарушение дезинтоксикационной и белково-синтетической функций печени, повысить выживаемость больных, снизить вероятность возникновения осложнений, использование аутологичной культуры клеток обеспечивает соблюдение этических норм, гарантированное осуществление данного способа гемокоррекции у любого больного без риска повреждения культуры клеток-гепатоцитов циркулирующими антителами.