ОРТОГОНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ Cas9 ДЛЯ РНК-НАПРАВЛЯЕМОЙ РЕГУЛЯЦИИ И РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОВ

1. Способ модулирования экспрессии двух или более целевых нуклеиновых кислот в эукариотической клетке, включающий
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или более направляющих РНК, комплементарных к двум или более целевым нуклеиновым кислотам,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей два или более ортогональных РНК-направляемых не обладающих нуклеазной активностью ДНК-связывающих белков CRISPR-системы Типа II, которые соответственно связываются с двумя или более целевыми нуклеиновыми кислотами и направляются двумя или более направляющими РНК,
введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей два или более транскрипционных регуляторных белка,
где экспрессируются направляющая РНК, ортогональные РНК-направляемые не обладающие нуклеазной активностью ДНК-связывающие белки и транскрипционные регуляторные белки,
где формируется два или более ко-локализованных комплекса между направляющей РНК, ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком, транскрипционным регуляторным белком и целевой нуклеиновой кислотой, и где транскрипционный регуляторный белок регулируют экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, где чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок, дополнительно кодирует транскрипционный регуляторный белок, слитый с ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком.
3. Способ по п. 1, где чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая две или более направляющих РНК, дополнительно кодирует мишень РНК-связывающего домена, и чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая транскрипционный регуляторный белок, дополнительно кодирует РНК-связывающий домен, слитый с транскрипционным регуляторным белком.
4. Способ по п. 1 где эукариотическая клетка является клеткой человека.
5. Способ по п. 1 где эукариотическая клетка представляет собой клетку дрожжей, клетку растения или клетку животного.
6. Способ по п. 1, где направляющая РНК включает от примерно 10 до примерно 500 нуклеотидов.
7. Способ по п. 1, где направляющая РНК включает от примерно 20 до примерно 100 нуклеотидов.
8. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок представляет собой активатор транскрипции.
9. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок увеличивает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
10. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок увеличивает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или вредного для здоровья состояния.
11. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок представляет собой репрессор транскрипции.
12. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок снижает уровень экспрессии целевой нуклеиновой кислоты.
13. Способ по п. 1, где транскрипционный регуляторный белок снижает уровень экспрессии целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или вредного для здоровья состояния.
14. Способ по п. 1, где целевая нуклеиновая кислота ассоциирована с заболеванием или состоянием, причиняющим ущерб здоровью.
15. Способ по п. 1, где каждая из двух или более направляющих РНК представляет собой слитую tracrРНК-crРНК.
16. Способ по п. 1, где ДНК представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
17. Способ по п. 1, где происходит активация первой целевой нуклеиновой кислоты и репрессия второй целевой нуклеиновой кислоты.
18. Способ по п. 1, где первое множество целевых нуклеиновых кислот активируется и второе множество целевых нуклеиновых кислот подавляется.
19. Способ по п. 1, где происходит активация первых одной или более целевых нуклеиновых кислот и репрессия второй одной или более целевых нуклеиновых кислот.
20. Способ по п. 1, где РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок представляет собой ортогональный не обладающий нуклеазной активностью белок Cas9.
21. Способ изменения одной или более целевых нуклеиновых кислот в эукариотической клетке одновременно с регуляцией экспрессии одной или более целевых нуклеиновых кислот в данной эукариотической клетке, включающий
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или более направляющих РНК, где, по меньшей мере, одна направляющая РНК является комплементарной к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены, и, по меньшей мере, одна направляющая РНК является комплементарной к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны регулироваться,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей 1) ортогональный РНК-направляемый белок с никазной активностью CRISPR-системы Типа II, имеющий один неактивный нуклеазный домен и направляемый одной или более направляющих РНК, комплементарными к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены, и 2) ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок который направляется одной или более РНК, комплементарными к целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены,
введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более транскрипционных регуляторных белка,
где экспрессируются направляющая РНК, ортогональный РНК-направляемый белок с никазной активностью, ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок и один или несколько транскрипционных регуляторных белка,
где формируется, по меньшей мере, один ко-локализованный комплекс между направляющей РНК, ортогональным РНК-направляемым белком с никазной активностью и целевой нуклеиновой кислотой, которая должна быть изменена, и где белок с никазной активностью расщепляет одну цепь целевой нуклеиновой кислоты, которая должна быть изменена,
где формируется, по меньшей мере, один ко-локализованный комплекс между направляющей РНК, ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком, транскрипционным регуляторным белком и целевой нуклеиновой кислотой, которая должна регулироваться, и где транскрипционный регуляторный белок регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты, которая должна регулироваться.
22. Способ изменения одной или более целевых нуклеиновых кислот в эукариотической клетке одновременно с регуляцией экспрессии одной или более целевых нуклеиновых кислот в данной эукариотической клетке, включающий
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или более направляющих РНК, где, по меньшей мере, одна направляющая РНК является комплементарной к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены, и, по меньшей мере, одна направляющая РНК является комплементарной к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны регулироваться,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей 1) ортогональный РНК-направляемый белок с нуклеазной активностью CRISPR-системы Типа II, который направляется одной или более направляющими РНК, комплементарными к одной или более целевым нуклеиновым кислотам, которые должны быть изменены, и 2) ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок CRISPR-системы Типа II, который направляется одной или более направляющих РНК, комплементарных к целевым нуклеиновым кислотам, которые должны регулироваться,
введение в клетку третьей чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более транскрипционных регуляторных белка,
где экспрессируются направляющая РНК, ортогональный РНК-направляемый белок с нуклеазной активностью, ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок и один или несколько транскрипционных регуляторных белка,
где формируется, по меньшей мере, один ко-локализованный комплекс между направляющей РНК, ортогональным РНК-направляемым белком с нуклеазной активностью и целевой нуклеиновой кислотой, которая должна быть изменена, и где нуклеаза расщепляет целевую нуклеиновую кислоту, которая должна быть изменена,
где формируется, по меньшей мере, один ко-локализованный комплекс между направляющей РНК, ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком, транскрипционным регуляторным белком и целевой нуклеиновой кислотой, которая должна регулироваться, и где транскрипционный регуляторный белок регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты, которая должна регулироваться.
23. Эукариотическая клетка, включающая:
первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую две или более направляющих РНК, комплементарные к двум или более соответствующим целевым нуклеиновым кислотам,
вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую два или более ортогональных РНК-направляемых не обладающих нуклеазной активностью ДНК-связывающие белка CRISPR-системы Типа II, и
третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую два или более транскрипционных регуляторных белка, где каждая направляющая РНК, ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок и транскрипционный регуляторный белок являются членами ко-локализованного комплекса для соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.
24. Эукариотическая клетка по п. 23, где чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая ортогональный РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок, дополнительно кодирует транскрипционный регуляторный белок, слитый с ортогональным РНК-направляемым не обладающим нуклеазной активностью ДНК-связывающим белком.
25. Эукариотическая клетка по п. 23, где чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая одну или более направляющих РНК, дополнительно кодирует мишень РНК-связывающего домена и чужеродная нуклеиновая кислота, кодирующая транскрипционный регуляторный белок, дополнительно кодирует РНК-связывающий домен, слитый с транскрипционным регуляторным белком.
26. Эукариотическая клетка по п. 23, где эукариотическая клетка является клеткой человека.
27. Эукариотическая клетка по п. 23, где эукариотическая клетка представляет собой клетку дрожжей, клетку растения или клетку животного.
28. Эукариотическая клетка по п. 23, где направляющая РНК включает от примерно 10 до примерно 500 нуклеотидов.
29. Эукариотическая клетка по п. 23, где направляющая РНК включает от примерно 20 до примерно 100 нуклеотидов.
30. Эукариотическая клетка по п. 23, где транскрипционный регуляторный белок представляет собой активатор транскрипции.
31. Эукариотическая клетка по п. 23, где транскрипционный регуляторный белок увеличивает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
32. Эукариотическая клетка по п. 23, где транскрипционный регуляторный белок увеличивает экспрессию целевой нуклеиновой кислоты для лечения заболевания или вредного для здоровья состояния.
33. Эукариотическая клетка по п. 23, где целевая нуклеиновая кислота ассоциирована с заболеванием или состоянием, причиняющим ущерб здоровью.
34. Эукариотическая клетка по п. 23, где каждая из двух или более направляющих РНК представляет собой слитую tracrРНК-crРНК.
35 Эукариотическая клетка по п. 23, где ДНК представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
36. Эукариотическая клетка по п. 23, где РНК-направляемый не обладающий нуклеазной активностью ДНК-связывающий белок представляет собой ортогональный не обладающий нуклеазной активностью белок Cas9.
37. Способ изменения двух или более целевых нуклеиновых кислот в эукариотической клетке, включающий
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или более направляющих РНК, комплементарных к двум или более целевым нуклеиновым кислотам,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей два или более ортогональных РНК-направляемых ДНК-связывающих белков с никазной активностью CRISPR-системы Типа II, которые соответственно связываются с двумя или более целевыми нуклеиновыми кислотами и направляются двумя или более направляющими РНК,
где экспрессируются направляющая РНК и ортогональные РНК-направляемые ДНК-связывающие белки с никазной активностью,
где формируется два или более ко-локализованных комплекса между направляющей РНК, РНК-направляемым ДНК-связывающим белком с никазной активностью и целевой нуклеиновой кислотой, и
где два или более ортогональных РНК-направляемых ДНК-связывающих белков с никазной активностью разрезают одну цепь у двух или более целевых нуклеиновых кислот.
38. Способ по п. 37 где эукариотическая клетка является клеткой человека.
39. Способ по п. 37 где эукариотическая клетка представляет собой клетку дрожжей, клетку растения или клетку животного.
40. Способ по п. 37, где направляющая РНК включает от примерно 10 до примерно 500 нуклеотидов.
41. Способ по п. 37, где направляющая РНК включает от примерно 20 до примерно 100 нуклеотидов.
42. Способ по п. 37 где каждая из двух или более направляющих РНК представляет собой слитую tracrРНК-crРНК.
43. Способ по п. 37, где ДНК представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
44. Способ изменения двух или более целевых нуклеиновых кислот в эукариотической клетке, включающий:
введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей две или более направляющих РНК, комплементарных к двум или более целевым нуклеиновым кислотам,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей два или более ортогональных РНК-направляемых ДНК-связывающих белков CRISPR-системы Типа II, которые соответственно связываются с двумя или более целевыми нуклеиновыми кислотами и направляются двумя или более направляющими РНК,
где экспрессируются направляющая РНК и ортогональные РНК-направляемые ДНК-связывающие белки,
где формируется два или более ко-локализованных комплекса между направляющей РНК, РНК-направляемым ДНК-связывающим белком и целевой нуклеиновой кислотой, и
где два или более РНК-направляемых ДНК-связывающих белков разрезают две или более целевые нуклеиновые кислоты.
45. Способ по п. 44 где эукариотическая клетка является клеткой человека.
46. Способ по п. 44 где эукариотическая клетка представляет собой клетку дрожжей, клетку растения или клетку животного.
47. Способ по п. 44, где направляющая РНК включает от примерно 10 до примерно 500 нуклеотидов.
48. Способ по п. 44, где направляющая РНК включает от примерно 20 до примерно 100 нуклеотидов.
49 Способ по п. 44 где каждая из двух или более направляющих РНК представляет собой слитую tracrРНК-crРНК.
50. Способ по п. 44, где ДНК представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.