УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ КЛЕТОК
DEVICE TO GROW AND TRANSFER CELLS

Область техники
Данное изобретение относится к биологии, а более точно к культурам клеток. Настоящее изобретение относится к одноразовым устройствам для выращивания и транспортировки клеток. Данное изобретение включает в себя новое одноразовое устройство, которое может быть использовано для поддержания пленки, мембраны или губчатого вещества с целью изоляции, роста, транспортировки и/или трансплантации клеток.
Предшествующий уровень техники
Выращивание клеток - это процесс роста и поддержки клеток в лабораторных условиях. Процесс предусматривает взятие клеток у животных или растений, которые в последующем выращиваются и поддерживаются в живом состоянии в лабораторных устройствах, используя искусственные питательные среды для поддержания их основных биологических функций. Клеточные культуры извлекаются или из первичного тканевого эксплантата, или из клеточных суспензий. В зависимости от природы извлекаемых клеток, клетки могут быть либо адгезивными, либо суспензионными. Известны различные способы по выращиванию клеток в культуре как в больших, так и в малых масштабах.
Множество устройств по выращиванию культур было спроектировано или произведено, чтобы соответствовать обновляющимся нуждам по поддержанию и пересадке (транспортировке) клеточных культур.
Устройства для выращивания клеток коммерчески доступны в нескольких видах и конструкциях, причем стандартной формой является представление культур в пробирке и в чашке. Пробирки снабжаются колпачками, в то время как чашки, доступные как отдельные чашки или планшеты, снабжаются крышками.
Типовые доступные индивидуальные чашки для выращивания содержат основание для получения культуры и крышку для его закрытия. Основная задача чашек для выращивания состоит в поддержании роста клеток. В случае выращивания клеток, клетки, изолированные от ткани, помещаются в устройство для выращивания вместе с питательной средой для питания клеток, последующей их инкубацией в контролируемых окружающих условиях. Чтобы сделать возможной визуализацию выращенных клеток под микроскопом, в производстве чашек для выращивания клеток используется прозрачный материал, такой как полистирол.
Загрязнение является одной из основных проблем для успешной техники выращивания клеток и тканей; для чашек для выращивания клеток требуется обеспечить защиту от микробного загрязнения. В случае чашек для выращивания загрязнение обычно минимизируется за счет использования стерилизованных чашек. Крышка служит в качестве барьера от микробов и предупреждает испарение среды. Клетки поддерживаются в водной среде, которая обеспечивает их жизнеспособность. Транспортировка живых клеток в коммерчески доступных чашках не представляется возможной ввиду отсутствия плотной герметизации чашек, что может привести к высокому риску загрязнения, а также вытекание среды способно привести к смерти клеток. Специальные клетки выращиваются в чашках в стерильных условиях до желаемой степени роста для специальных целей, в частности медицинских, научных или производственных требований. Однако вслед за ростом эти клетки должны быть извлечены из их питательной среды, заморожены и доставлены в требуемые центры в жидком азоте. В центрах клеткам должны восстанавливать жизнеспособность и вновь начинать выращивать. Кроме того, время и ресурсы, требуемые для повторного выращивания клеток, приводят к значительным задержкам. Неблагоприятные условия перевозки приводят к значительным потерям в жизнеспособности клеток, а также к высоким ценам на транспортировку.
Современные клеточные терапии, касающиеся кожных покровов, роговой оболочки глаза, хрящей и т.д., требуют доставки клеток к месту трансплантации. Это возможно путем роста клеток как монослойной культуры на соответствующих мембранах, как это описано в патенте US №5693332, и/или путем разделения культуры на несколько слоев, как это указано в патентной публикации US 2003/0208266 A1, до трансплантации, или путем выращивания клеток на пористом или губчатом веществе, которое может быть трансплантировано. Важными факторами, касающимися системы доставки клеток, основанной на мембране, являются: клеточная фиксация, клеточная живучесть, клеточная плотность и контроль над дифференциацией. Тонкая взаимосвязь между клеточными слоями и мембраной может быть нарушена во время перевозки в результате сдвига, разрыва и/или других механических повреждений отдельных клеток и их контакта друг с другом. Все это ведет к разрушению имплантата и приведению его в негодное состояние. Хотя клетки также могут быть выращены на мембранах в чашках для культуры, их перевозка в тех же чашках не осуществима из-за их конструкции.
С целью предотвращения загрязнения чашек были изобретены колбы. Эти колбы обычно имеют отсек для выращивания, небольшое трубчатое отверстие, расположенное на одном из концов колбы, и соответствующую пробку. Наиболее важные принципы конструкций колб для выращивания описаны в патентах US №4334028, 4851351 и 5398837. Так как эти колбы для выращивания требуют довольно большое количество дорогостоящей среды для полного заполнения, эти колбы не рентабельны. Такие колбы также не пригодны для выращивания клеток на пленках/мембранах, так как они не могут быть размещены внутри колбы для роста клеток для их трансплантации.
В дальнейшем, помимо чашек и колб, были изобретены роллерные колбы. Роллерные колбы обеспечивают большую площадь поверхности для клеточной фиксации и роста. В то же время, ввиду наличия значительных сдвигов слоев, связанных с этими роллерными колбами, эта методика подходит только к тем клеткам, которые способны прилипать к стенкам этих роллерных колб. Также поддержание клеточных культур в роллерных колбах на длительные периоды ведет к появлению трудностей, связанных с постоянной высокой силой сдвига слоев и возможным загрязнением. Патент US №3450598 затрагивает вопросы фиксации и роста клеток на внутренних поверхностях пластиковых или стеклянных роллерных трубок и колб. Патентами, направленными на изучение роллерных колб, являются следующие патенты: US №5527705 и №4962033. В патенте US №5010013 описана улучшенная методика для роллерных колб с увеличенной поверхностью для фиксации клеток, в которой к внутренней площади поверхности роллерных колб добавлены рифленые каналы. Тем не менее, методика роллерных колб не обеспечивает должной вентиляции клеток, что устанавливает ограничения для длительности жизни клеток.
Сравнительно недавно, использование пористого волокна или капилляров было выявлено как поддерживающая матрица для выращивания клеток. Идеи этих технологий описаны в патентах US №3821087, 3883393, 4187822, 4200689, 4206015, 4220725, 4391912, в которых были описаны новые различные устройства и методики по росту клеток в искусственных условиях в полупроводимых трубчатых мембранах или капиллярах. Изначально эти клетки можно было подсаживать на поверхности капиллярных стенок в питательную среду. Нутриенты распространяются из пропускающей среды через капиллярные стенки и используются клетками. Метаболиты распространяются из клеток через капиллярные стенки и попадают в перфузионную жидкость, из которой метаболиты могут быть возвращены. Тем не менее, было обнаружено, что нутриенты, протекающие через полые капилляры, делают невозможным полное проникновение капиллярных узлов клетками, и нежелательный результирующий градиент жидкой среды ведет к неполному использованию доступных поверхностей капилляра для клеточной фиксации, и клетки становятся неравномерно распределенными по поверхности. Кроме того, эти устройства требуют высоких скоростей циркуляции среды для поддержания соответствующего уровня оксигенации клеток. Также эти устройства имеют еще один недостаток: они механически запутаны, сложны в установке и чрезмерно велики.
Учитывая раскрытия современного уровня техники, для выращивания клеток все еще необходимы эффективные и экономичные устройства для выращивания, роста и более легкой транспортировки культур клеток.
Таким образом, желательно иметь методику и одноразовое устройство, подходящие для выращивания и транспортировки клеток, прикрепленных к мембранам, губчатым веществам/пенистым веществам, которые готовы к использованию после доставки.
Настоящее изобретение решает указанные выше проблемы и, впервые, представляет специально разработанное устройство, которое является компактным, портативным, рентабельным и простым в обращении, с обеспечением загрузки в устройство мембраны по выбору с целью выращивания клеток и их транспортировки к реципиенту для трансплантации, что помогает в регенерации поврежденных тканей.
Объект изобретения
Объектом настоящего изобретения является конструирование такого устройства для выращивания клеток, которое было бы одноразовым, стерильным и безопасным для выращивания и транспортировки плотно прилегающих клеток.
Объектом настоящего изобретения является создание такого устройства, при котором исключается возможность деформации мембраны.
Кольцевидная структура устройства настоящего изобретения сделана таким образом, чтобы поддерживать натяжение в течение всего периода выращивания.
Поскольку устройства предшествующего уровня техники, такие как чашки и колбы, не подходят для транспортировки в стерильных условиях, это является первостепенной задачей настоящего изобретения для создания устройства, которое удобно в обращении и обеспечивает транспортировку клеток без микробного загрязнения.
Устройство настоящего изобретения направлено на использование малого объема среды. Таким образом, устройство будет рентабельно и станет выгодным для транспортировки клеток без каких-либо потерь.
Устройство настоящего изобретения сконструировано таким образом, что оно использует прокладку, предотвращающую утечку во время транспортировки, поддерживая таким образом жизнеспособность клеток. Таким образом, устройство настоящего изобретения предназначено для двух целей: для выращивания клеток и также для их транспортировки.
Устройство настоящего изобретения было изготовлено из безопасного, не токсичного, совместимого с живыми тканями материала, полученного из полиэтилена, полистирола, полиэтиленового терефталата, поликарбоната. Эти медицинские качественные материалы прозрачны, что позволяет рассматривать клетки под микроскопом.
Устройство настоящего изобретения было сконструировано таким образом, чтобы занимать минимум места, что обеспечивает легкую и более дешевую транспортировку.
Еще одной задачей изобретения также является предоставление устройства, подходящего и приспособленного для трансплантации клеток в практике различного рода лечениях, основанных на клетках.
Устройство настоящего изобретения в коммерческом применении пригодно для транспортировки клеток, что поддерживает их жизнеспособность так, что они остаются пригодными для пересадки ткани, как трансплантат или имплантат после перевозки.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предоставляет одноразовое устройство для выращивания и/или транспортировки клеток на моно- или мультислоях. Представлен один наглядный пример осуществления, устройство для выращивания, имеющее квадратную форму.
Устройство имеет два компонента:
1) основная пластинка и
2) верхняя крышка.
Основная пластинка снабжена наружной стенкой, проходящей вниз, и плоской верхней частью, поддерживающей круглое вмещающее устройство, которое также проходит вниз. Вмещающее устройство в основной пластинке соприкасается с вытянутой канавкой, имеет донную стенку, опорное кольцо и боковую стенку, проходящую вниз от плоской части основной пластинки. Глубина вмещающего устройства находится на том же уровне, что и внешняя стенка основной пластинки. Основание каждой стенки в середине основной пластинки снабжено выемкой для фиксации защелкой.
Желаемая мембрана/губчатое вещество располагаются внутри вмещающего устройства и удерживаются на месте кольцом. Канавка, предусмотренная для силиконовой прокладки, проходит как раз по внешней стороне вмещающего устройства в компоненте основания.
Кольцо устройства настоящего изобретения служит для различных целей, например.
Мембраны, изготовленные из биологических материалов, такие как амниотические мембраны, или полимеров, имеют тенденцию сморщиваться, что приводит к неравномерному распределению клеток на мембране. Предусмотренное кольцо будет обеспечивать то, что мембраны будут находиться в натянутом состоянии в течение посева клеток (если выращивание является частью цели, для которой предназначено устройство).
Некоторые мембраны, такие как хитозан/активатор плазминогена (PLA), имеют тенденцию к всплыванию в чашке, что приводит к прямому контакту клеток с крышкой вмещающего устройства. Благодаря предусмотренному кольцу мембраны надежно прикреплены к дну вмещающего устройства.
Перед трансплантацией мембраны/губки в основном промывают буферными растворами для удаления транспортировочной среды. Наличие кольца гарантирует, что мембрана не сминается и не повреждает клетки.
Это в основном предпочтительно в клинических условиях, что мембраны находятся в натянутом состоянии с тем, чтобы поддерживать гладкую поверхность, обеспечивающую одинаковую клеточную фиксацию и рост клеток, чтобы избежать сморщивания мембран, так как такое сморщивание будет влиять на клеточную фиксацию в трещинах, приводя к неравномерной клеточной фиксации.
Изображенный компонент квадратной крышки снабжен наружной стенкой, идущей вниз от верхней части. Плоская часть крышки имеет углубление, которое уходит вниз. Круглое основание углубления соприкасается с канавкой. Углубление и канавка в крышке плотно и точно прилегают во вмещающем устройстве, предусмотренном на компоненте основной пластинки, и служат в качестве крышки для вмещающего устройства. В середине каждой стенки крышки есть защелка, которой соответствует выемка на основной пластинке. На внутренней стороне крышки имеется выступ, идущий вдоль всего углубления, который совпадает с круговой канавкой на основной пластинке во время закрытия устройства. Краткое описание чертежей
Фиг.1: показывает перспективный вид сборки изобретения для выращивания/транспортировки клеток на мембранах.
Фиг.2: основание, вид сверху.
Фиг.3: основная пластинка, вид сбоку.
Фиг.4: внешний вид кольца.
Фиг.5: крышка, вид сбоку.
Фиг.6: крышка, вид снизу.
Фиг.7: поясняющий вид выемки.
Фиг.8: вид полностью собранного устройства.
Подробное описание
Некоторые термины, использованные в изобретении, определяются следующим образом.
Определения.
Термин "устройство" используется здесь для описания любого типа контейнеров, аппаратов или сосудов, использующихся для выращивания и транспортировки культур клеток.
Во всем описании данной заявки используются различные термины, такие как "верх", "низ", "выше", "ниже", "диагональ" и прочие. Эти термины использованы для удобства, чтобы различать разные элементы. Хотя эти термины были использованы для объяснения устройства для выращивания клеток относительно положений, в которых обычно может быть использовано устройство по выращиванию клеток, эти термины не предусмотрены для ограничения того, как могут быть использованы различные элементы.
Использованный здесь термин "клетки", для целей данного описания и формулы изобретения, означает одну или более живых клеток, клетки, включающие клеточную массу, или организованную структуру, или сетчатую структуру клеток, образующих ткань, как очевидно для специалистов в этой области техники.
Использованный здесь термин "среда или среды", в рамках данного описания и формулы изобретения, означает жидкий раствор, использующийся для получения достаточного количества питательных веществ (например, витамины, аминокислоты, необходимые питательные вещества, соли и т.п.) и свойства (например, осмолярность, накопление) для поддержания жизнедеятельности живых клеток (или живых клеток в ткани) и поддержания их роста.
Использованный здесь термин "мембрана", в рамках данного описания и формулы изобретения, означает пластинку, пленку, пенистое вещество, губчатое вещество и т.п. Мембрана, использованная в изобретении, может быть изготовлена из биологического, полусинтетического или синтетического материала. Эти мембраны могут быть легко отделены или извлечены из устройства.
Термин "биологический материал" включает в себя (но не ограничивается) человеческую амниотическую мембрану, обесклеточенный кожный покров, малую интестинальную подслизистую (МИП) мембрану и/или их комбинации. Термин "полусинтетический материал" включает в себя (но не ограничивается) полимолочную кислоту (ПМК), полигликолевую кислоту (ПГК), полигиалуроновую кислоту и/или их комбинации.
Настоящее описание относится к устройству для выращивания клеток, которые могут быть использованы для трансплантации.
Изображенный пример реализации настоящего изобретения не ограничивается только квадратной формой, но может быть также круглым, шестиугольным и треугольным. Устройство содержит пластичные части, изготовленные из различных качественных медицинских материалов, выбранных из полиэтилена, полистирола, полиэтиленового терефталата, поликарбоната и т.п. Сорт выбранного материала идеально чист, что дает возможность наблюдать клетки, выращиваемые на мембранах, и позволяет осматривать и фотографировать клетки в течение эксперимента, используя высокоточный микроскоп.
На фиг.1 представлено устройство настоящего изобретения для выращивания и/или транспортировки клеток на мембранах или губчатых/гелиевых веществах. Собранное устройство включает в себя следующие компоненты: основная пластинка (1), кольцо (2), силиконовое кольцо (3) и крышка (4). Мембрана с клетками (5) не является частью устройства.
На фиг.2 изображен вид сверху основной пластинки устройства, включающей вмещающее устройство (6). Раковинообразная область (7), которая контактирует с вмещающим устройством, необходима для легкого изменения среды, при котором пипетка используется для удаления или добавления среды во вмещающее устройство, не затрагивая клетки. Раковинообразная часть также может быть использована для окончательной промывки мембраны или губки от среды, в которой она транспортировалась, перед трансплантацией. Раковинообразная область обеспечивает, что воздух, захваченный в области выше кольца, перемещается в канавку, обеспечивая таким образом отсутствие воздушных пузырей во вмещающей части устройства. Канавка (8), идущая вокруг вмещающего устройства, предназначена для фиксации силиконовой прокладки, для обеспечения условий герметичности, а также и водонепроницаемости, поддерживаемых в течение транспортировки клеток. Опорное кольцо (9) проходит вдоль внешней стенки (10) основной пластинки и служит в качестве опоры при открывании и закрывании устройства. Выемки (11), которые можно видеть в середине каждой стенки, предназначены для закрепления защелки (15) основной пластинки.
На фиг.3, отражающей вид сбоку основной пластинки, изображены внешняя стенка (10) основной пластинки с опорным кольцом (9). Основание (12) вмещающего устройства (6) находится в той же плоскости, что и основание стенки (13) нижнего устройства, но выше, чем опорное кольцо (9). Выемки (11) расположены в середине каждой стенки основного устройства для закрывания соответствующих защелок (15), находящихся на крышке.
На фиг.4 показан вид кольца. Высота кольца такова, что при помещении кольца во вмещающее устройство и закрывании крышкой, основание углубления, расположенного на крышке, садится вплотную с кольцом. Основное предназначение кольца - поддерживать мембрану в натянутом состоянии во время выращивания и/или транспортировки культуры клеток. Ширина кольца минимальна, что обеспечивает большую область покрытия мембраны/губчатого вещества клетками.
На фиг.5 изображена верхняя крышка, вид сверху. Конструкция верхней крышки сходна с конструкцией основной пластинки, так что углубление (14) в крышке плотно прилегает к кольцу внутри вмещающего устройства. В середине каждой стенки крышки предусмотрена защелка (15). Эта защелка сконструирована таким образом, чтобы плотно закрываться при помощи выемки (11), выполненной на основной пластинке.
Уголок (16) защелки, изображенный на фиг.6, предназначен для легкого открывания и закрывания. По высоте защелка (15) тянется от верха крышки до основания основной пластинки. Число защелок (15) в каждом устройстве будет зависеть от геометрической конструкции пластинки, например, в трехгранном устройстве защелок будет три штуки.
В одном из примеров реализации изобретения основание и крышка включают ориентирующие элементы, использующиеся для ориентировки крышки по отношению к основанию, чтобы удостовериться, что крышка подходит к основанию. Углубление в крышке прилегает к удлинению, которое совпадает с раковинообразной областью, присутствующей в основании. Во время закрытия крышка ориентирована таким образом, что удлиненная часть на углублении в крышке совмещается с раковинообразной областью во вмещающем устройстве.
Фиг.7 показывает внутренний вид верхней крышки. Выступ (17), идущий вдоль углубления (14), видимого на крышке, соответствует силиконовому кольцу, закрепленному в канавке (8) основной пластинки. Давление, оказываемое им на силиконовое кольцо, гарантирует герметичность и водонепроницаемость закрывания крышки на основании.
Полностью собранный вид устройства представлен на фиг.8. Матовая поверхность (18), которой снабжена внешняя поверхность крышки, служит для нанесения маркировки пользователем.
Основание, крышка и кольцо могут быть отлиты с использованием стандартных способов отливки (например, литье под давлением), в основном известных в технике. Стерилизация устройства может быть также осуществлена стандартным гамма-излучением или автоклавной обработкой. В некоторых случаях, как в случае лабораторных исследований, устройство может быть использовано повторно после тщательной промывки и стерилизации.
Полезные свойства устройства для выращивания клеток
Для выращивания клеток, используя настоящее устройство, суспензия интересующих клеток добавляется на мембрану/губчатое вещество, поддерживаемое кольцом изнутри вмещающего устройства. Альтернативно, суспензия клеток в гелиевом растворе может быть добавлена в устройство для выращивания. После посадки гелиевого раствора в устройство клетки могут выращиваться следующим образом.
Количество среды, добавленной в устройство, таково, что оно заполняет пространство, созданное внутри кольца. Крышка свободно посажена на основную пластинку, и устройство инкубируется в контролируемых условиях окружающей среды. Для изменения среды крышка открывается, основная пластинка слегка наклоняется, и среда стекает по кончику пипетки, введенному в раковинообразную область, которая предусмотрена во вмещающем устройстве. Новая среда может быть добавлена аналогичным способом во вмещающее устройство, как это было описано выше.
Для транспортировки клеток, используя настоящее устройство, клетки, выращенные непосредственно в настоящем устройстве или выращенные в других устройствах, могут быть перевезены после добавления подходящей среды для транспортировки к клеткам. Силиконовая прокладка расположена внутри канавки и крышки, плотно защелкивается на основании, для обеспечения того, чтобы не захватывались воздушные пузырьки. Устройство настоящего изобретения воздухо- и водонепроницаемо. Устройство с клетками может быть доставлено реципиенту при правильных условиях доставки.
При получении клеток врачи открывают защелки и сливают транспортную среду (как это упоминалось выше при замене среды). Мембрана/губчатое вещество промывается буферным раствором, кольцо поднимается, и лежащая внизу мембрана/губчатое вещество трансплантируется непосредственно пациенту.
Устройство настоящего изобретения имеет следующие свойства.
Оно направлено на создание одноразового и готового к использованию одиночного устройства для выращивания и транспортировки клеток.
Устройство может быть стерилизовано методами стандартной автоклавной обработки или гамма-излучения.
Среда, необходимая для данного устройства, меньше 10 мл по сравнению с 25 мл, необходимыми для обычных чашек или колб для выращивания клеток. Следовательно, настоящее устройство эффективно с точки зрения цены.
Крышка настоящего изобретения предотвращает микробное загрязнение, а также обеспечивает насыщение клеток кислородом для их оптимального роста.
Силиконовая прокладка, которой снабжено устройство, обеспечивает воздухонепроницаемость, а также предотвращает протечку во время транспортировки клеток, что поддерживает их жизнеспособность.
Для выращивания клеток в чашках чашки без силиконовой прокладки могут быть инкубированы в обычных углекислотных инкубаторах. Это обеспечит газообмен. Далее, композиционный материал устройства прозрачен, что дает возможность наблюдать клетки под микроскопом в течение эксперимента.
Отсутствуют задержки при трансплантации, так как устройство обеспечивает готовность использовать клетки для трансплантации после их промывки.
Конструкция настоящего устройства проста и занимает меньше места, что снижает стоимость перевозки.
Были описаны несколько иллюстрированных и наглядных примеров реплизации изобретения, различные альтернативы, модификации и улучшения могут быть сделаны специалистом в данной области техники. Предполагается, что такие альтернативы, модификации и улучшения будут в духе и в рамках объема изобретения.