НОВАЯ БАКТЕРИЯ И ЕЕ ЭКСТРАКТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕРАПИИ
NEW BACTERIUM AND ITS EXTRACTS AND THEIR APPLICATION IN THERAPY

Настоящее изобретение относится к новому штамму бактерий, выделенных из почвенно-грунтовых вод и охарактеризованных. Изобретение также относится к бактериальным экстрактам и их терапевтическому применению, особенно, в контексте лечения воспаления.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым композициям, представляющим интерес в лечении и предупреждении хронических кишечных воспалительных нарушений и периодонтита.
В развитых странах отмечается рост заболеваемости острым колитом, синдромом раздраженного кишечника и болезнью Крона, этими заболеваниями страдает приблизительно 1,4 миллиона американцев (Arijs, I. et al., 2009. PLoS ONE.4:e7984, and Hill, D.A. and D. Artis. 2010. Annu. Rev. Immunol. 28:623-67 and Kaser, A. et al., 2010. Annu. Rev. Immunol. 28:573-621). Болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника, поражает отделы пищеварительного тракта, преимущественно подвздошную кишку (терминальный отдел тонкого кишечника) и толстую кишку. Стенка пораженного кишечника становится отечной. При прогрессировании отек стенки кишечника приводит к уменьшению диаметра кишечника. Также может иметь место эволюция в направлении фиброза, на почве которого развивается стеноз (контрактация).
Заболевание характеризуется наличием изъязвлений различной площади и глубины, которые пронизывают стенку (фиссуры), вызывая таким образом появление абсцессов и фистул. Это заболевание поражает лиц обоего пола и возникает, как правило в возрасте от 20 до 40 лет. При типичной форме оно развивается медленно и постепенно. Эпизоды диареи и неясно выраженной абдоминальной боли являются типичной симптоматикой на протяжении нескольких месяцев или лет.
При развернутой стадии заболевания основным симптомом является диарея умеренной интенсивности, иногда сопровождающаяся жирным стулом и изредка появлением крови. С заболеванием также ассоциированы постоянная непроходящая боль в правой подвздошной ямке или пароксизмальная или атипическая боль. Другими важными симптомами являются потеря веса и лихорадка. Признаки варьируют в зависимости от локализации поражений.
При прогрессировании заболевания наблюдаются внезапные обострения, которые различаются по интенсивности и часто подвергаются спонтанной регрессии.
Однако, часто наблюдаются осложнения, которые могут требовать проведения множественных хирургических вмешательств: обструкция кишечника, кишечные фистулы, прободение кишечника, фистулы (отверстия), сообщающиеся с кожей или органами брюшной полости, аноректальные осложнения (фиссуры, абсцессы).
Помимо хирургических процедур существует лечение моноклональными антителами (анти-TNF, анти-IL-12/р40 или анти-IL-23/р40), которое вызывает временное облегчение при болезни Крона, но его недостатком является чрезвычайно высокая стоимость.
В этой связи, в изобретении, описанном в данной патентной заявке, предложен другой эффективный и гораздо менее дорогостоящий подход для облегчения состояния пациентов, страдающих этим заболеванием.
Болезнь Крона является многофакторным и комплексным заболеванием. Один факторов, связанных с этим заболеванием, имеет иммунологическую природу. В последних публикациях было показано, что происходит «срыв» иммунной системы хозяина: было доказано, что провоспалительные и противовоспалительные реакции становятся несоразмерными и усиленными. Предполагают нарушение регуляции иммунной системы: изменение профиля Th1, усиленное продукцией IL-12, и профиля Th17, усиленное повышением IL-23, нарушение естественной флоры кишечника и нарушенную толерантность, что приводит к неадекватным местным и системным иммунным ответам, вызывающим иммунный ответ против нарушенной кишечной флоры, в результате чего запускаются патогенетические процессы (активация Т клеток, появление воспалительных цитокинов, антител к кишечным бактериям) (Abraham С.and Cho J.H., N Engl J Med 2009:361:2066-78).
Cenac et al., (Am J Pathol. 2002.161:1903-1915) обнаружили, что активация активируемого протеиназами рецептора-2 (proteinase-activated receptor-2, PAR2) вызывала острое воспаление кишечника у животных. В желудочно-кишечном тракте имеет место повышенная экспрессия PAR2: в эндотелиальных клетках, миоцитах толстой кишки, энтероцитах, нейронах кишечника, иммунных клетках и т.д. Протеазы (трипсин, триптаза), присутствующие в большом количестве в желудочно-кишечном тракте, расщепляют PAR2 со стороны М-конца, что приводит к экспонированию особого пептида, активирующего этот же самый рецептор (феномен аутоактивации). Вследствие этого активируется образование провоспалительных цитокинов и запускаются воспалительные реакции (Vergnolle, N. 2005. Gut. 54:867-874 and Vergnolle, N. 2009. Pharmacol. Ther. 123:292-309). Этот феномен наблюдается у мышей дикого типа, но не проявляется у мышей с генным нокаутом (KO) (с отсутствием PAR2). Лечение антипротеазами и/или антагонистами PAR2 дает возможность избежать развития этих воспалительных явлений.
Подобно гингивиту, периодонтит представляет собой воспалительное заболевание периодонта, т.е. специализированных тканей, окружающих и поддерживающих зуб: десен, зубного цемента, периодонтальных связок и альвеолярной кости. Он часто сопровождается альвеолоклазией (разрушением костной ткани). Хронический периодонтит может развиться в любом возрасте, но чаще наблюдается у взрослых. Он является многофакторным заболеванием (связан с генетическими факторами и факторами окружающей среды). Хронический периодонтит вызывают и поддерживают бактерии биопленки на поверхности зубов.
Вместе с тем, механизмы иммунной защиты играют важную роль в его патогенезе. В последних исследованиях было обнаружено, что PAR2 играет важную роль при периодонтите, поскольку его экспрессируют остеобласты, эпителиальные клетки полости рта и десневые фибробласты (Holzhausen, M. et al., 2006. Am J Pathol. 168:1189-1199).
Согласно опубликованным данным, протеаза гингипаин-R, вырабатываемая Porphyromonas gingivalis (основным патогеном при хроническом периодонтите), способна активировать PAR2 путем протеолитического расщепления со стороны N-конца, таким образом вызывая экспонирование особого пептида, активирующего этот же самый рецептор (феномен аутоактивации) (Abraham, L.A. et al., 2000. Bone. 26:7-14 and Lourbakos, A. et al., 2001. Infect. Immun. 69:5121-5130). Это запускает образование провоспалительных цитокинов с последующим развитием воспаления, приводящим к разрушению костной ткани.
Терапия, нацеленная на ингибирование протеаз или применение антагонистов PAR2, представляет собой возможный подход к регулированию патологических процессов воспалительного происхождения, например, воспалительных заболеваний, таких как периодонтит.
В этой связи настоящее изобретение предлагает решение для лечения этих воспалительных заболеваний путем выделения, характеризации и получения фракций новых бактерий, не описанных ранее.
Заявителю неожиданно удалось впервые выделить из почвенно-грунтовых вод штамм, принадлежащий новому виду бактерий, этот новый бактериальный штамм (или бактерия) был назван LMB64.
Эта бактерия LMB64 была не только выделена, но и охарактеризована, и была установлена ее принадлежность классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, и возможно, новому роду, который еще не был описан. Анализ последовательности гена, кодирующего 16S рРНК, позволил поместить эту бактерию близко к родам Chromobacterium, Paludimonas, Lutelia и Glubenkiana, с соответствующими последовательностями которых наблюдается 95% сходство.
Эта непатогенная бактерия является грамотрицательной и будет более подробно описана в Примерах. Эта бактерия также характеризуется тем, что не является нитчатой. Кроме того, эту бактерию выгодно отличает способность расти в среде, содержащей любой тип воды, и более конкретно, обычную воду. Например, в отличие от Vitreoscilla filiformis (V. filiformis), культивирование бактерии LMB64 по настоящему изобретению не требует конкретных условий культивирования и, более конкретно, не требует среды, содержащей по меньшей мере один вид минеральной и/или термальной воды, не содержащей серы (в этой связи можно упомянуть патентный документ ЕР2018891 (Gueniche A., 2009) и публикацию Gueniche et al. 2006 (European Journal of Dermatology, 16, 4, 380-384), в которых описано применение бактериального экстракта V. filiformis для лечения атопического дерматита). Это является явным преимуществом как в отношении условий культивирования и оборудования, так и с экономической точки зрения.
Ген, кодирующий 16S рРНК был практически полностью секвенирован (1487 пн). Бактерия LMB64 имеет кольцевую плазмиду размером 10948 пн. Эта плазмида была полностью секвенирована и ее последовательность представлена в последовательности SEQ ID No.2.
Согласно первому воплощению, настоящее изобретение касается непатогенной грамотрицательной бактерии, принадлежащей классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, у которой нуклеотидная последовательность гена, кодирующего 16S рРНК, включает или содержит последовательность SEQ ID No.1 или любую нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична указанной последовательности SEQ ID No.1.
Предпочтительно, настоящее изобретение касается непатогенной грамотрицательной бактерии, принадлежащей классу Betaproteobacteria, подсемейству Neisseriaceae, характеризующейся тем, что нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК указанной бактерии включает или содержит последовательность SEQ ID No.1.
В контексте настоящего изобретения "процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот обозначает процентное содержание идентичных нуклеотидов между двумя сравниваемыми последовательностями, полученный после наилучшего выравнивания (оптимального выравнивания), причем это процентное содержание является сугубо статистическим, а отличия между двумя последовательностями случайным образом распределены по всей их длине. Сравнение последовательностей двух нуклеиновых кислот как правило выполняют путем сравнения этих последовательностей после их выравнивания оптимальным образом, причем указанное сравнение можно выполнять по сегментам или по "окнам сравнения". Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно выполнять не только вручную, но и при помощи алгоритма поиска локальной гомологии, предложенного Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], при помощи алгоритма поиска локальной гомологии, предложенного Needleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], при помощи методики поиска сходства, разработанной Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. The USA 85:2444] или при помощи компьютерных программ, использующих эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Group Computer, 575 Science Dr., Madison, Wl, или программ BLAST N или BLAST P, выполняющих сравнение).
Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот определяют путем сравнения этих двух выровненных оптимальным образом последовательностей, причем сравниваемая последовательность нуклеиновой кислоты может иметь вставки или делеции по отношению к референсной последовательности для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Процент идентичности рассчитывают путем определения числа позиций, в которых нуклеотиды идентичны между двумя последовательностями, путем деления этого числа идентичных позиций на общее число позиций в окне сравнения и умножения полученного результата на 100 для получения процента идентичности между этими двумя последовательностями.
Например, можно использовать программу "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences," FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), доступную по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с используемыми по умолчанию значениями параметров (в частности, с параметрами "штраф за открытие гэпа": 5, и "штраф за удлинение гэпа": 2; с выбором в качестве матрицы, например, матрицы "BLOSUM 62", предлагаемой программой), с расчетом процента идентичности между двумя сравниваемыми последовательностями непосредственно самой программой. Также возможно использовать другие программы, такие как программы "ALIGN" или "Megalign" (DNASTAR).
Согласно другому воплощению, бактерия по изобретению имеет по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID No.2 или любую последовательность, идентичную по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% с указанной последовательностью SEQ ID No.2.
Предпочтительно, бактерия LMB64 имеет по меньшей мере одну плазмиду, содержащую последовательность SEQ ID No.2.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения, бактерия LMB64 характеризуется тем, что она не является нитчатой.
Другие характеристики указанной бактерии LMB64 будут подробно описаны ниже в Примерах.
Кроме того, бактерия LMB64 по настоящему изобретению была депонирована от имени Заявителя в Национальную Коллекцию Культур Микроорганизмов (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, CNCM) в институте Пастера в Париже 8 апреля 2010 г. под номером 1-4290.
Таким образом, один объект изобретения представляет собой бактерию, депонированную в CNCM 8 апреля 2010 г. под номером 1-4290, или ее гомолога, потомка или любого мутанта.
Термин "мутант" обозначает любую бактерию, которая непосредственно происходит из штамма I-4290 и может содержать естественные мутации или рекомбинации, такие как, например, любые рекомбинации, связанные с клеточной пролиферацией, клеточным делением (мутации вследствие ошибок, возникающих в ходе деления бактерий или репликации ДНК) или любым иным механизмом естественного отбора или селекции в культуральной среде, такой как селекция мутантов, резистентных или становящихся резистентными к заданному соединению. Эти мутанты включают любых бактерий, происходящих из штамма I-4290, имеющих одну или более мутаций в их геномной последовательности (или последовательности их плазмиды), у которых мутации вызваны радиацией, вирусом, транспозонами или мутагенными химическими веществами.
Согласно первому воплощению изобретения, из бактериальной культуры можно выделить общую биомассу при помощи различных известных способов, например, таких как фильтрация, осаждение спиртом (этанолом, изопропанолом, изобутанолом), высушивание на цилиндре с предслоем с очищаемой поверхностью, и т.д., а затем использовать в высушенной вымораживанием или инактивированной нагреванием форме.
Согласно другому предпочтительному воплощению, изобретение в общем касается бактериального экстракта, также называемого бактериальной фракцией, полученного(ой) из суспензии бактерий, описанных выше, а именно бактерии LMB64.
Термин "бактериальный экстракт" обозначает любой экстракт или фракцию бактериальной биомассы или любую активную фракцию указанного экстракта. Например, такой экстракт можно получить из культуры бактерии LMB64, при этом способ получения включает по меньшей мере один этап лизиса бактерий и один этап разделения различных составляющих его фракций путем центрифугирования или путем фильтрации.
Экстракт согласно изобретению может состоять из бактериальных клеток, выделенных из культуральной среды, которую сконцентрировали, например, путем центрифугирования; или из концентрата бактериальных клеток, прошедших обработку, при которой клеточная оболочка была разрушена любым способом, известным специалистам в данной области, например, под воздействием ультразвука или автоклавирования; или из супернатанта, полученного путем фильтрования, но не исчерпывается этим.
Важный этап способа приготовления экстракта по изобретению состоит в удалении различных внутриклеточных компонентов, например, таких как нуклеиновые кислоты (хромосомная ДНК, внехромосомная кольцевая ДНК, плазмиды), рибосомы и внутриклеточные запасные вещества, такие как гликоген, крахмал и поли-β-гидроксибутират и т.д.
Предпочтительно, бактериальный экстракт согласно изобретению получают после обработки указанной бактериальной суспензии таким образом, чтобы удалить внутриклеточные компоненты.
В результате экстракт по изобретению преимущественно содержит компоненты, происходящие из мембраны, периплазматического пространства и/или из внеклеточного пространства.
Более конкретно, указанные внутриклеточные компоненты содержат, по меньшей мере нуклеиновые кислоты.
Помимо удаления внутриклеточных компонентов, в качестве примера, не являющегося исчерпывающим, после проведения лизиса бактерий и центрифугирования также возможно разделение компонентов культурального супернатанта (далее обозначается фракция S0) и компонентов, составляющих осадок (далее обозначаются Е0), которое может быть легко выполнено специалистами в данной области. Например, можно предложить, чтобы пороговое значение для разделения компонентов S0 и Е0 приблизительно соответствовало молекулярному весу 100 кДа. Таким образом, компоненты фракции S0 будут преимущественно иметь молекулярный вес менее 100 кДа, тогда как компоненты фракции Е0 будут преимущественно иметь молекулярный вес более 100 кДа.
Более конкретно, при помощи методик, известных специалистам в данной области, возможно экстрагировать и отделять биомолекулы, присутствующие в культуральном супернатанте (S0), от тех, которые главным образом представлены поверхностными белками и белками, находящимися в периплазматическом пространстве бактерий (Е0).
Согласно одному воплощению изобретения, бактериальный экстракт включает фракцию Е0, содержащую по меньшей мере мембранные белки, периплазматические белки и белки, происходящие из жгутика.
rd
Периплазматические белки включают белки, находящиеся в периплазматическом пространстве грамотрицательных бактерий, которые могут высвобождаться при осмотическом шоке или при инкубации со средой, содержащей хаотропные агенты или детергенты (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 edition: Sambrook and Russell. CSHL Press).
Белки, происходящие из жгутика, включают мультимерные белки жгутика или фрагменты жгутика. Способы выделения и очистки целых бактериальных жгутиков при помощи детергентов с последующим разделением при помощи ультрацентрифугирования (в градиенте CsCI) описаны в литературе. В изобретении приведенные примеры способов экстракции позволили выделить фрагменты жгутиков.
Мембранные белки включают белки, закрепленные в мембране и частично экспонированные на поверхность (такие как белки наружной мембраны, или Omp, от англ. outer membrane proteins), белки, адгезированные к поверхности мембраны, липопротеины и порины (Ward JB., Microbial adhesion to surfaces, 1980).
Предпочтительно, указанные мембранные белки состоят из поринов, OmpA, липополисахаридов и/или липопротеинов.
Согласно другому воплощению изобретения может быть предпочтительно применять фракцию S0.
Более конкретно, бактериальный экстракт согласно изобретению включает фракцию S0, содержащую по меньшей мере секретируемые пептиды и белки, а также вторичные метаболиты.
Секретируемые пептиды и белки включают пептиды и белки, которые естественным образом вырабатывают и секретируют бактерии LMB64 и которые можно получить путем центрифугирования или фильтрации.
Вторичные метаболиты включают низкомолекулярные молекулы, вырабатываемые и секретируемые в культуральную среду бактериями LMB64.
Следует здесь отметить присутствие липополисахаридов в составе фракции S0. В действительности, липополисахариды, хотя они преимущественно обнаруживаются во фракции Е0, также обнаруживаются в меньших количествах во фракции S0.
Предпочтительно, фракции Е0 и S0 можно комбинировать таким образом, чтобы получить фракцию ES0, например, оставляя культуральную среду для инкубации и реагирования в щелочной среде (рН от 9 до 11) приблизительно в течение 5 часов при температуре 4°С, центрифугируя и фильтруя через фильтр 0,2 мкм для получения прозрачного раствора ES0.
Бактериальный экстракт ES0, таким образом, состоит, помимо прочего, из мембранных белков, липополисахаридов, периплазматических белков, фрагментов белков жгутика и первичных и вторичных метаболитов, вырабатываемых бактериями.
Предпочтительно, экстракт ES0 имеет белковый профиль, в котором при помощи электрофореза в полиакриламидном геле можно выделить, по меньшей мере, двенадцать полос, включая три основных полосы, соответствующие молекулярным весам (с приблизительной оценкой по стандартам с известным молекулярным весом, Bio-Rad), находящимися в пределах:
- полоса 1: 30 кДа и 36 кДа, преимущественно 34 кДа;
- полоса 2: 41 кДа и 45 кДа, преимущественно 43 кДа;
- полоса 3: 47 кДа и 51 кДа, преимущественно 49 кДа.
Согласно другому воплощению изобретения, бактериальный экстракт включает фракцию ES0, содержащую по меньшей мере фракцию Е0 и фракцию S0.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения бактериальный экстракт включает фракцию ES0, у которой белковый профиль, полученный при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, включает три основных полосы, соответствующие молекулярным весам, находящимся в пределах 30 кДа и 36 кДа, 41 кДа и 45 кДа, 47 кДа и 51 кДа соответственно.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения бактериальный экстракт включает фракцию ES0, у которой белковый профиль, полученный при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, включает три основных полосы, соответствующие молекулярным весам 34 кДа, 43 кДа и 49 кДа, соответственно.
В другом аспекте изобретения описан способ приготовления бактериального экстракта, включающий этапы:
a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде; и
b) удаления внутриклеточных компонентов.
Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта S0, причем указанный способ включает этапы:
a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;
b) центрифугирования указанной культуры; и
c) сбора супернатанта S0.
Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта Е0, причем указанный способ включает этапы:
a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;
b) центрифугирования указанной культуры и удаления супернатанта;
c) обработки биомассы, полученной на этапе b) таким образом, чтобы удалить внутриклеточные компоненты; и
d) сбора осадка Е0.
Предпочтительно, этап с) состоит из ультразвуковой обработки биомассы, полученной на этапе b), с последующим предварительным центрифугированием, предназначенным для удаления осадка, содержащего указанные внутриклеточные компоненты, а затем вторым центрифугированием супернатанта.
Согласно другому воплощению способ по изобретению состоит из способа приготовления бактериального экстракта Е0, причем указанный способ включает этапы:
a) культивирования бактерии LMB64 в подходящей среде;
b) центрифугирования указанной культуры и удаления супернатанта;
c) обработки ультразвуком биомассы, полученной на этапе b);
d) центрифугирования указанной биомассы, обработанной ультразвуком и удаления полученной биомассы;
e) центрифугирования супернатанта, полученного на этапе d); и
f) сбора осадка Е0.
Следует отметить, что различные способы, описанные выше, приведены только в качестве иллюстрации и что можно применять любые способы, известные с специалистам в данной области.
Как станет очевидным из приведенных ниже Примеров, помимо активности, предполагаемой для экстрактов такого типа, Заявитель продемонстрировал некоторые новые виды активности, не описанные ранее.
Первый преимущественный аспект изобретения, касающийся иммуномодуляции, основан на модуляции свойств провоспалительных цитокинов. Более конкретно, применение бактерии и/или экстракта согласно изобретению способно, в случае если ответ связан с Th1 или Th17 профилем, как при болезни Крона, восстанавливать гомеостаз.
Другое преимущество изобретения основано на том факте, что, как станет очевидно из Примеров, применение бактерии и/или экстракта согласно изобретению индуцирует образование противомикробных пептидов, например, таких как пептиды hBD-2, hBD-3, S1007A и LL-31, но не исчерпывается ими. Эти пептиды обладают антимикробным эффектом в отношении патогенов, заселяющих кишечный тракт, без ущерба для нормального роста симбиотической микрофлоры. В результате их действие восстанавливает нормальную микрофлору кишечника.
Более конкретно, как упоминалось выше, бактериальный экстракт Vitreoscilla filiformis (Gueniche A. et al., 2006) известен своей активностью в отношении TLR2, благодаря наличию OmpA, и в отношении TLR4, благодаря наличию липополисахаридов. Из-за отсутствия жгутиков у бактерии V. filiformis экстракт, получаемый из V. filiformis, не обладает активностью в отношении TLR5.
Впервые Заявителем был описан бактериальный экстракт по изобретению, который помимо активности в отношении TLR2 и TLR4, обладает активностью в отношении TLR5.
Таким образом, изобретение относится к применению бактерии и/или бактериального экстракта, описанных выше, в качестве активатора TLR2, TLR4 и TLR5.
Предпочтительно, указанный бактериальный экстракт, активирующий TLR2, TLR4 и TLR5, состоит из экстракта, содержащего все или некоторые из белков, происходящих из жгутика. В этом случае, например, указанный экстракт предпочтительно представляет собой экстракт ЕО или экстракт ES0.
Указанная активность, приводящая к стимуляции TLR5, представляет значительный интерес, поскольку известно, что TLR5 повышает уровень некоторых противомикробных пептидов, таких как псориазин (S100A7) и hBD-2 (Glaser et al., Journal of Investigative Dermatology (2009) 129, 641-649). Кроме того, агонисты TLR5 действуют синергично с агонистами TLR2 и TLR4, что потенциирует выработку противомикробных пептидов. Было показано, что при блокировании TLR5 при помощи антител, последние вырабатываются в малых количествах или не вырабатываются совсем.
Таким образом, данный аспект является особенно инновационным в части, касающейся использования бактерии и/или экстрактов согласно изобретению для иммуномодуляции.
Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ лечения или предупреждения патологии, в частности, патологии, относящейся к инфекции или нарушению иммунного ответа, причем указанная патология связана с нарушением активности TLR2, TLR4 и TLR5, а указанное лечение или предупреждение включает модуляцию активности, в частности, повышение активности указанных TLR2, TLR4 и TLR5 путем введения активатора указанных рецепторов, причем указанный способ включает введение пациенту, имеющему или возможно имеющему указанную патологию, эффективного количества бактерии или бактериального экстракта согласно настоящему изобретению.
Кроме того, в противоположность бактериальным экстрактам, описанным до настоящего времени, Заявителем была неожиданно продемонстрирована антагонистическая активность в отношении PAR2. Эта активность представляет значительный интерес в контексте противовоспалительного лечения.
Таким образом, изобретение в частности касается применения бактерии и/или бактериального экстракта, описанных выше, в качестве антагониста PAR2.
Объектом изобретения также является способ лечения или предупреждения патологии, в частности, патологии, относящейся к воспалению, причем указанная патология связана с нарушением функции PAR2, а указанное лечение или предупреждение включает модуляцию активности указанного PAR2, в частности путем введения антагониста указанного рецептора, причем указанный способ включает введение пациенту, имеющему или возможно имеющему указанную патологию, эффективного количества бактерии или бактериального экстракта согласно настоящему изобретению.
Предпочтительно, указанный бактериальный экстракт, являющийся антагонистом PAR2, состоит из экстракта S0 или экстракта ES0.
Повышенная экспрессия PAR2 наблюдается в эндотелиальных клетках, миоцитах толстой кишки, энтероцитах, нейронах кишечника, иммунных клетках и кератиноцитах. Протеазы (трипсин, триптаза), присутствующие в большом количестве в окружающей среде, расщепляют PAR2 со стороны N-конца, что приводит к экспонированию особого пептида, активирующего этот же самый рецептор (феномен аутоактивации). В результате это активирует выработку провоспалительных цитокинов и запускает воспалительные реакции (Vergnolle, N. 2009, Pharmacol. Ther. 123:292-309). Этот феномен наблюдается у мышей дикого типа, но отсутствует у мышей с генным нокаутом (с отсутствием PAR2). Лечение антипротеазами и/или антагонистами PAR2 позволяет избежать этих воспалительных явлений.
Сочетание всех этих видов активности и синергия между ними обеспечивают бактерии LMB64 или любому экстракту, получаемому из этих бактерий, большие потенциальные возможности в лечении воспалительных заболеваний и, в частности, воспалительных заболеваний, в которые вовлечен PAR2 и/или при которых происходит ослабление, нарушение или дисбаланс иммунной системы.
Таким образом, изобретение касается применения бактерии, описанной выше, и/или бактериального экстракта, полученного из указанных бактерий, для изготовления композиции, предназначенной для лечения и/или предупреждения воспалительных нарушений желудочно-кишечного тракта или полости рта.
Предпочтительно, указанные воспалительные нарушения желудочно-кишечного тракта или полости рта состоят из болезни Крона, колита или периодонтита.
Согласно другому воплощению изобретение, представленное в данной патентной заявке, относится к композициям, содержащим, в качестве активного ингредиента, по меньшей мере одну бактерию и/или один бактериальный экстракт согласно изобретению.
Композиция согласно изобретению имеет отношение к лечению воспалительных нарушений желудочно-кишечного тракта или полости рта.
Предпочтительно указанные воспалительные нарушения желудочно-кишечного тракта или полости рта состоят из болезни Крона, колита или периодонтита.
Таким образом, изобретение касается фармацевтической композиции, также содержащей фармацевтически приемлемый носитель.
В настоящем описании "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает соединение или комбинацию соединений, являющиеся частью фармацевтической композиции, которые не вызывают побочных реакций и которые, например, облегчают введение активных соединений, повышают длительность их существования и/или эффективность в организме, повышают их растворимость в растворе или улучшают их сохранность. Указанные фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и могут быть адаптированы специалистами в данной области в зависимости от природы и способа введения выбранных активных соединений.
Предпочтительно, указанные соединения можно вводить системно внутримышечным, интрадермальным, интраперитонеальным или подкожным путем, или оральным путем. Композиции, содержащие антитела по изобретению, можно вводить в виде нескольких доз, разделенных во времени.
Их оптимальные способы введения, режимы дозирования и галеновые формы могут быть установлены в соответствии с критериями, обычно принимаемыми во внимание при разработке лечения, адаптированного для пациента, например, с учетом возраста или веса пациента, общего состояния здоровья пациента, переносимости лечения и отмеченных побочных эффектов.
Приведенные ниже Примеры, иллюстрирующие изобретение, позволяют лучше понять изобретение, но не ограничивают его объема.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фигуре 1 изображено филогенетическое положение последовательности, кодирующей 16S рРНК штамма LMB64. Последовательности, представленные на этом дереве, являются последовательностями из базы данных GenBank, наиболее близкими последовательности LMB64.
На Фигурах 2А и 2Б представлен вид бактерии LMB64 в трансмиссионном электронном микроскопе (А) и сканирующем электронном микроскопе (Б).
На Фигуре 3 представлены оптимальные условия культивирования, установленные в зависимости от температуры, рН и минерализации культуральной среды R3.
На Фигуре 4 показана индукция экспрессии поверхностных молекул CD80, CD86, CD83 и CD54 под воздействием экстракта ЕО (дозозависимое действие).
На Фигуре 5 показано ингибирование рецепторов IgE под воздействием экстракта Е0.
На Фигуре 6 показана активация TLR2 под воздействием экстракта ES0.
На Фигуре 7 показана активация TLR4 под воздействием экстракта ES0.
На Фигуре 8 показана активация TLR5 под воздействием экстракта ES0.
На Фигуре 9 показана антагонистическая активность экстракта ES0, специфическая в отношении PAR2.
На Фигуре 10 продемонстрировано разделение экстракта ES0 в полиакриламидном геле.
На Фигуре 11 продемонстрирован эффект ES0 в виде индукции TLR5-зависимой экспрессии генов, кодирующих противомикробные пептиды.
На Фигуре 12 показана активность ES0 в отношении кератиноцитов полости рта человека опосредована TLR5.
На Фигуре 13 показан противовоспалительный эффект ES0 на модели острого колита у крыс.
На Фигурах 14А и 14Б продемонстрировано, что превентивное введение штамма LMB64 существенно сокращает поражение кишечника, вызванное TNBS [А], а также воспалительный ответ (активность МПО) [Б].
Пример 1: Выделение и характеристика бактерии LMB64
Бактерия LMB64 была выделена из почвенно-грунтовых вод.
Таксономическое положение новой бактерии LMB64 предложено на Фигуре 1.
Более конкретно, бактерия LMB64 имеет палочковидную форму, длиной приблизительно 2,3 мкм (±0,3) и толщиной приблизительно 1,0 мкм (±0,1). Отличительной чертой этой бактерии является наличие полярно расположенного жгутика (Фигуры 2А и 2Б). Как видно из рисунков, бактерия LMB64 представляет собой бактерию, которая не относится к нитчатым бактериям.
Как было упомянуто выше, бактерия LMB64 имеет кольцевую плазмиду размером приблизительно 11 тпн. Эта плазмида была полностью секвенирована (SEQ ID No.2).
Ген, кодирующий 16S рРНК, также был секвенирован (SEQ ID No.1). Бактерию культивировали в ферментере в искусственной среде. Скорость роста была выше, когда среда содержала углеродные субстраты в низких концентрациях.
Были апробированы культуральные среды R3, MS-глюкоза и LB, состав которых представлен ниже в Таблицах 1а, 16 и 1в, соответственно.
Таблица 1а
Состав среды R3
Дрожжевой экстракт
1 г/л
Протеозопептон Difco
1 г/л
Казаминовые кислоты
1 г/л
Глюкоза
1 г/л
Растворимый крахмал
1 г/л
Пируват натрия
0,5 г/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,6 г/л
MgSO<sub>4</sub>,7H<sub>2</sub>O
0,1 г/л
Таблица 1б
Состав среды MS-Глюкоза
Глюкоза
6,0 г/л
Лимонная кислота
0,84 г/л
MgSO<sub>4</sub>, 7H<sub>2</sub>O
0,25 г/л
NH<sub>4</sub>Cl
1,06 г/л
Безводный K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
8,75 г/л
Пируват натрия
0,5 г/л
Сульфат цинка, 7Н<sub>2</sub>О
4 мг/л
Хлорид кобальта, 6H<sub>2</sub>O
3,5 мг/л
Молибдат натрия, 2H<sub>2</sub>O
3,5 мг/л
Сульфат марганца, 1 H<sub>2</sub>O
5 мг/л
Борная кислота
2 мг/л
Концентрированная соляная кислота
50 мг/л
Сульфат меди, 5H<sub>2</sub>O
4 мг/л
Хлорид железа, 6H<sub>2</sub>O
27 мг/л
Таблица 1в
Состав среды LB
Триптон
10 г/л
Дрожжевой экстракт
5 г/л
NaCl
5 г/л
Скорость роста бактерии LMB64 в зависимости от культуральной среды представлена ниже в Таблице 2.
Таблица 2
Скорость роста (/ч)
LB
0,25 (±0,05)
LB (разведение 1/2)
0,46 (±0,11)
LB (разведение 1/5)
0,60 (±0,14)
LB (разведение 1/10)
0,69 (±0,15)
MS-глкжоза
0,13 (±0,04)
R3
0,62 (±0,14)
Были установлены оптимальные условия культивирования в зависимости от температуры, рН и минерализации культуральной среды R3 (Фигура 3).
Источники углерода, усваиваемого бактериями, были охарактеризованы при помощи тест-системы API 50CH (температура инкубации: 25°С). Результаты кратко представлены ниже в Таблице 3.
Таблица 3
Время инкубации
4 сут
5 сут
1. Глицерол
2. Эритритол
3. D-арабиноза
4. L-арабиноза
5. D-рибоза
6. D-ксилоза
7. L-ксилоза
8. D-адонитол
9. Метил-β-D-ксилопиранозид
10. D-галактоза
11. D-глюкоза
+
+
12. D-фруктоза
+
+
13. D-манноза
14. L-сорбоза
15. L-рамноза
16. Дульцит
17. Инозитол
I
+
18. D-маннитол
19. D-сорбитол
20. Метил-α-D-маннопиранозид
21. Метил-α-D-глюкопиранозид
22. N-ацетилглюкозамин
23. Амигдалин
24. Арбутин
25. Эскулин/цитрат железа
26. Салицин
27. D-целлобиоза
28. D-мальтоза
I
+
29. D-лактоза (бычья)
30. D-мелибиоза
31. D-сахароза
+
+
32. D-трегалоза
I
+
33. Инулин
34. D-мелецитоза
35. D-Раффиноза
36. Крахмал
37. Гликоген
38. Ксилитол
39. Гентиобиоза
40. D-тураноза
I
+
41. D-ликсоза
42. D-тагатоза
43. D-фукоза
44. L-фукоза
45. D-арабит
46. L-арабит
47. Клюконат калия
48. 2-кетоглюконат калия
49. 5-кетоглюконат калия
+: используемый субстрат, I: ограниченное использование
При помощи тест-системы API ZYM была выявлена активность следующих ферментов: щелочной фосфатазы, эстеразы (С4), эстеразы/липазы (С8), лейцин ариламидазы, валин ариламидазы, кислой фосфатазы, нафтол-AS-BI-фосфогидролазы и α-глюкозидазы.
Бактерия LMB64 чувствительна ко всем протестированным антибиотикам, представленным ниже в Таблице 4.
Таблица 4
Протестированные антибиотики
Диаметр зоны подавления роста (мм)
Ингибиторная активность
R3
LB1/2
LB 1/5
Ампициллин (10 мкг)
29
28
29
+
Хлорамфеникол (30 мкг)
29
26
24
+
Ципрофлоксацин (5 мкг)
38
34
34
+
Канамицин (30 мкг)
27
30
27
+
Пенициллин (6 мкг)
21
26
20
+
Полимиксин В (50 мкг)
11
15
13
+
Рифампицин (30 мкг)
20
19
15
+
Тетрациклин (30 мкг)
30
25
20
+
Стрептомицин (10 мкг)
25
25
24
+
Ванкомицин (30 мкг)
20
21
21
+
Пример 2: Способ выделения фракций ЕО. SO и ES0
600
Прекультура: Штамм AV13 инокулировали в колбы Эрленмейера, содержащие 250 мл среды MS с глюкозой и пируватом (см. Таблицу 5 ниже), с последующей инкубацией при перемешивании приблизительно в течение 40 часов при 30°С (рН 7) и 200 об/мин до достижения OD≈1,5.
Таблица 5
MS Глюкоза Пируват
Лимонная кислота
0,84 г
MgSO<sub>4</sub>, 7Н<sub>2</sub>О
0,25 г
NH<sub>4</sub>Cl
1,06 г
Безводный K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
8,75 г
Пируват натрия
0,5 г
Смесь Oligo
1 мл
ddH<sub>2</sub>O qsp
1000 мл
Проверка рН
7
Автоклавирование
121°С, 30 мин
Добавление после автоклавирования: 20% глюкоза
30 мл
Смесь OLIGO
Растворить в 100 мл дистиллированной воды:
Сульфат цинка, 7H<sub>2</sub>O
4 г
Хлорид кобальта, 6H<sub>2</sub>O
3,5 г
Молибдат натрия, 2H<sub>2</sub>O
3,5 г
Сульфат марганца, 1H<sub>2</sub>O
5 г
Борная кислота
2 г
Концентрированная соляная кислота
50 г
Сульфат меди, 5H<sub>2</sub>O
4 г
Растворить в 50 мл дистиллированной воды: Хлорид железа, 6H<sub>2</sub>O
27 г
ddH<sub>2</sub>OW qsp
1000 мл
600
Культура: Прекультуру затем инокулировали в ферментер (Applikon), в котором содержалось 3,7 л среды MS с пируватом +114 мл 20% раствора глюкозы. При помощи температурных сенсоров поддерживали температуру предпочтительно около 30°С. Кислородный сенсор (AppliSens) использовали для поддержания концентрации растворенного кислорода в среде на уровне 18-25%. Сенсор рН (AppliSens) использовали для поддержания рН 7 путем добавления 10% NI-UOH при помощи помпы с фиксированной скоростью потока. Для мониторинга изменений оптической плотности в реальном времени использовали сенсор Wedgewood Analytical. Культивирование осуществляли методом периодических культур с подпиткой; при помощи помпы с переменной скоростью тока в культуру добавляли 20% раствор глюкозы. Ферментацию останавливали при OD≈22-26, как правило, по прошествии приблизительно 30 часов.
Выделение S0: Супернатант отделяли от биомассы путем центрифугирования в течение 1 часа при 4°С и 4000 g.
Выделение Е0: Влажную биомассу ресуспендировали в растворе NaCl (1 М). После центрифугирования в течение 15 мин при 4°С и 9000 g, супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в растворе 1 М NaCl. Затем пробирку с образцом на несколько минут погружали в охлаждаемую ванну соникатора с мощностью, настроенной на 50-60 W. После центрифугирования в течение 30 мин при 4°С и 6000 g осадок отбрасывали и собирали супернатант. Добавляли два объема холодного этанола и оставляли суспензию на ночь при 4°С. После центрифугирования в течение 30 мин при 4°С и 6000 g супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 25 мМ Tris буфере, рН 8,8.
Выделение ES0: Приводили рН культуры к щелочным значениям (рН 9-11) при помощи основного буфера. На следующем этапе проводили инкубацию при перемешивании в течение 5 часов при температуре 4°С. После центрифугирования супернатант пропускали через фильтр предварительной очистки для удаления остатков дебриса биомассы, а затем фильтровали с помощью 0,2 мкм фильтра. Получали прозрачный желтый раствор (ES0).
Белки анализировали согласно протоколу набора DC Protein Assay Kit II (Bio-Rad). Углеводы определяли по реакции с фенолом и серной кислотой (Dubois, М. et al., 1956), выражая результаты в глюкозном эквиваленте.
В качестве примера в Таблице 6 ниже представлены некоторые специфические характеристики экстракта ES0, полученного в условиях, описанных выше.
Таблица 6
Тестовая проба
Доклиническая проба 1
Органолептические характеристики
Гомогенная и прозрачная желто-оранжевая жидкость. Плотность близка к плотности воды
рН (в присутствии основного буфера)
10,0
10,2
Сухой остаток (температурное равновесие)
5,9%
5,1%
Белковый профиль (SDS-PAGE)
12 детектируемых полос (включая 3 основные полосы размером приблизительно 34 кДа, 43 кДа и 49 кДа соответственно)
Определение общего белка (μВСА)
2,9 мг/мл
3,0 мг/мл
Очевидно, что данные, приведенные выше, представлены здесь исключительно в иллюстративных целях.
Более подробно приводятся данные, относящиеся к белковому профилю, полученному при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, который позволил выявить три основные полосы.
Протокол электрофореза в полиакриламидном геле:
Экстракт ES0 ресуспендировали в буфере (20 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 1 мМ EDTA; 2,5% SDS и 0,01% бромофеноловый синий) и 1 М DTT (1,4-дитиотрейтол). Образец и смесь маркеров молекулярного веса (WesternC, Bio-Rad) наносили соответственно в лунки 8-16% полиакриламидного геля (GeBaGel, Gene Bio-Application). Буфер для миграции содержал 2,5 мМ Tris, 19,2 мМ глицина и 0,01% SDS (вес/объем). Миграцию осуществляли при постоянном напряжении 160 В приблизительно в течение 1 часа (GeBaGel system). После этого полосы белков окрашивали кумасси синим (Instant Blue, Expedeon). Размеры рассчитывали по отношению к известным стандартам (STD).
Полученный гель показан на Фигуре 10.
Согласно одному воплощению изобретения, эти три полосы имеют молекулярный вес приблизительно 34 кДа, 43 кДа и 49 кДа, соответственно.
Пример 3: Демонстрация фармакологической активности фракций ЕО и ES0
Клетки Лангерганса (LC) получали in vitro из моноцитов человека, выделенных из лейкоконцентрата, полученного из Французской Национальной Службы Крови (Etablissement Frangais du Sang (EFS) Pyrenees Mediterranee):
выделение осуществляли в градиенте фиколла (Lymphocyte Separation Medium, плотность 1,077 г/мл) и очищали при помощи магнитной иммуноселекции (Miltenyi Biotec); дифференцировку LC осуществляли в течение 6 дней в присутствии коктейля цитокинов (GM-CSF/IL-4/TGFβ). LC помещали в 24-луночные планшеты в культуральной среде RPMI-5% FCS и инкубировали в течение 24 часов с экстрактом ES0.
Поверхностные молекулы анализировали при помощи проточной цитометрии (FACSCalibur, BD Biosciences) с окрашиванием по трем или четырем маркерам: CD1a/CD54/CD80/CD83/CD86/FceRI; цитокины, секретируемые в культуральный супернатант, анализировали при помощи Cytometry Bead Array (кат номер 550749, BD) с использованием проточной цитометрии: IL-6, IL-8, TNF, IL-4, IL-10, IL-12.
3.1 Созревание клеток Лангерганса и ингибирование рецептора IgE (FcεRI)
Экстракт ЕО индуцировал созревание клеток Лангерганса, которое регистрировали по дозозависимой индукции экспрессии поверхностных молекул CD80, CD86, CD83 и CD54 (Фигура 4). Таким же образом, экстракт ЕО ингибировал экспрессию рецепторов IgE (FceRI), проявляя дозозависимый эффект (Фигура 5).
3.2 Активация Toll-подобных рецепторов (TLR)
Активность ES0 в отношении TLR оценивали по TLR2, TLR4 и TLR5 с использованием в качестве модели клеток HEK293, совместно трансфецированных геном TLR2, TLR4 или TLR5 и геном-репортером NFΚB-sAP (секретируемой щелочной фосфатазы). Связывание лиганда со своим TLR приводит к активации транскрипционного фактора NFΚB; ген sAP помещают под контроль промотора, индуцируемого NFΚB. Этот ген-репортер позволяет отслеживать клеточную сигнализацию, опосредуемую TLRs: высвобождение sAP, индуцируемое ES0 и измеренное при помощи колориметрического теста, позволяет определять активность этого активного ингредиента в качестве агониста TLR2, TLR4 или TLR5.
Исследование проводили на следующих линиях эмбриональных клеток почки человека (human embryonic kidney, HEK293):
- клетки HEK-Blue™-2 для TLR2,
- клетки HEK-Blue™-4 для TLR4,
- клетки НЕК-Blue™-5 для TLR5.
Эти клеточные линии содержали в культуральной среде HEK-Blue™ Selection 10% FCS и затем помещали в 96-луночные планшеты в среде HEK-Blue™ Detection в присутствии ES0 на 18 часов. Считывали показания с планшетов при помощи калориметрии при 620 нм.
3.2.1 Активация TLR2
Экстракт ES0 вызывал активацию TLR2, обладая дозозависимым эффектом с максимальной активностью при 100 нг/мл (Фигура 6).
3.2.2 Активация TLR4
Экстракт ES0 вызывал активацию TLR4 с максимальной активностью при 10 нг/мл (Фигура 7).
3.2.3 Активация TLR5
Экстракт ES0 вызывал активацию TLR5, обладая дозозависимым эффектом. Данная активность подавлялась в присутствии антитела к TLR5, что показывало специфичность активирующего действия ES0 в отношении TLR5 (Фигура 8).
3.3 Ингибирование PAR2
Ингибирование активируемых протеазами рецепторов под воздействием экстракта ES0 оценивали при помощи кератиноцитов человека клеточной линии (НаСаТ) путем измерения притока внутриклеточного кальция, индуцированного после специфической стимуляции PAR2 трипсином рогового слоя (stratum corneum tryptic enzyme, SCTE). Использовали флуоресцентный зонд Fluo-4/АМ: его эстерифицированная форма облегчает его проникновение внутрь клеток путем пассивной диффузии; только деэстерифицированная форма, связанная с ионами кальция, способна возбуждаться при 485 нм с испусканием флуоресценции при 535 нм.

Флуоресцентный зонд внедрялся в клетки, раскапанные по 96-луночным планшетам, в течение 30 минут, после чего проводили инкубацию с экстрактом ES0 в течение 30 минут. Приток кальция регистрировали в каждой лунке по отдельности в реальном времени кинетическим методом до и после инъекции SCTE. Считывали показания планшетов при помощи считывающего устройства Mithras LB940™ (Berthold Technologies).
Экстракт ES0 ингибировал дозозависимым образом активацию PAR2, индуцированную SCTE человека (Фигура 9).
Пример 4: Применение экстракта ES0 для лечения периодонтита
Заболевания периодонта представляют собой хронические воспалительные заболевания, которые могут привести к разрушению периодонта. Происходят изменения бактериальной флоры, включающие патогенные анаэробные штаммы, такие как Porphyromonas gingivalis (Pg). Эти штаммы чувствительны к противомикробным пептидам, которые, по меньшей мере в случае hBD-3, обнаруживаются в зубодесневой жидкости лиц, страдающих заболеваниями периодонта, в пониженном количестве (Brancatisano FL etal. (2011) Reduced human Beta defensin 3 in individuals with periodontal disease. J Dent Res. 90:241-245). В данном эксперименте авторы изобретения продемонстрировали, что экстракт ES0 способен индуцировать экспрессию противомикробных пептидов в кератиноцитах полости рта.
Первичные кератиноциты полости рта стимулировали в течение 48 часов при помощи 10 мкг/мл ES0, в присутствии или отсутствии 1 м кг/мл антитела, специфически блокирующего каждый TLR: TLR2 (aTLR2), TLR4 (aTLR4) или TLR5 (aTLR5). Экспрессию мРНК различных противомикробных пептидов (Таблица 7, ниже) количественно оценивали при помощи ПЦР в реальном времени.
Таблица 7
Ген
Белок
DEFB103
hBD-3
DEFB4
hBD-2
S100A7
Псориазин
RNase 7
РНКаза 7
После 48 часов стимуляции клетки лизировали и выделяли общую РНК, а затем проводили измерение при помощи спектрофотометра NanoDrop N1000 (Thermo Fisher Scientific). Комплементарную ДНК синтезировали из 1 мкг РНК. Амплификацию в ходе количественной ПЦР проводили с использованием SYBR Green (SYBR Green PCR Core Reagents kit, Applied Biosystems) в 96-луночных планшетах. Последовательности ДНК использованных праймеров представлены ниже в Таблице 8.
Таблица 8
H-DEFB103A-U
5'-TGGGGTGAAGCCTAGCAGCTATG-3'
SEQ ID NO.3
H-DEFB103A-L
5'-ATGATTCCTCCATGACCTGGAACA-3'
SEQ ID NO.4
H-DEFB4-U
5'-CCATCAGCCATGAGGGTCTTGTAT-3'
SEQ ID NO.5
H-DEFB4-L
5'-CGCCTATACCACCAAAAACACCTG-3'
SEQ ID NO.6
H-S100A7-19U
5'-CACTCATCCTTCTACTCGTGACGC-3'
SEQ ID NO.7
H-S100A7-142L
5'-GGCTTGGCTTCTCAATCTTGTCAT-3'
SEQ ID NO.8
H-RNASE7-U
5'-GAGTCACAGCACGAAGACCAAGC-3'
SEQ ID NO.9
H-RNASE7-L
5'-AGCAGCAGAAGGGGGCAGAA-3'
SEQ ID NO.10
(целевого гена)
(референсного гена)
Значения порогового цикла реакции (cycle threshold, Ct) нормализовали по отношению к референсным генам (GAPDH: глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа; PPIA: пептидилпролил изомераза A; YWHAZ: тирозин 3/триптофан5-монооксигеназа; RPLPO: рибосомальный белок РО). Уровень экспрессии целевого гена затем выражали в виде ΔCt: ΔCt=Ct-Ct. Относительное количество (relative quantity, RQ) матричной РНК для каждого целевого гена рассчитывали по отношению к соответствующим необработанным контрольным клеткам:
(-ΔΔCt)
(обработанные клетки)
(контрольные клетки)
RQ=2, Где ΔΔCt=ΔCt-ΔCl.
Экспрессию целевого гена считали измененной при RQ≥2 (индукция) или RQ≤0,5 (ингибирование).
Концентрацию hBD-2 в культуральных супернатантах определяли при помощи ELISA с применением готовых наборов согласно рекомендациям производителя (PeproTech). Результаты выражены как среднее арифметическое ±стандартное отклонение, а выраженное в процентах ингибирование продукции, при ее существенном снижении, указано жирным синим (оценивали по отношению к продукции, индуцированной в отсутствие антитела "без а/т").
Результаты свидетельствуют, что ES0 является мощным индуктором экспрессии всех исследованных противомикробных пептидов (Фигура 11, "без а/т"). Сверхэкспрессия гена DEFB4 коррелирует со значительным повышением секреции белка hBD-2 (Фигура 12).
После преинкубации клеток с антителом к TLR2 или к TLR4 уровень экспрессии пептида не менялся. С другой стороны, в присутствии антитела к TLR5 экспрессия DEFB103, DEFB4, S100A7 и РНКазы 7 значительно подавлялась: 71%, 94%, 99% и 82%, соответственно (Фигура 11). Аналогично, секреция hBD-2 резко снижалась на 82% только в присутствии антитела к TLR5 (Фигура 12).
Таким образом, ES0 является мощным активатором экспрессии и секреции противомикробного пептида. Этот эффект связан с активацией TLR5. В настоящее время единственным известным лигандом TLR5 является флагеллин. Следовательно, вероятно, что флагеллин LMB64, содержащийся в ES0, отвечает за активацию TLR5 и продукцию противомикробных пептидов.
Пример 5: Применение экстракта ES0 для лечения хронического воспалительного заболевания кишечника (ВЗК)
Оценивали эффект ES0 на воспалительный ответ при экспериментальном колите. Модель острого колита, индуцированного у крыс TNBS (2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой), приблизительно соответствует болезни Крона. ES0 вводили ректально во избежание его деградации при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Здесь показано, что ES0 способен подавлять воспаление путем ингибирования миелопероксидазы (МПО).
Кроме того, также оценивали эффект живых бактерий LMB64 при введении оральным путем в качестве превентивной меры при ВЗК: эффект штамма LMB64 оценивали на модели острого колита у крыс, индуцированного TNBS. Живой штамм LMB64 вводили оральным путем.
5.1 Экстракт ES0
Оценивали эффект ES0 на воспалительный ответ при экспериментальном колите. Модель острого колита у крыс, индуцированного TNBS (2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой), приблизительно соответствует болезни Крона. ES0 вводили ректально во избежание его деградации при прохождении через желудочно-кишечный тракт.
Группы по 10 крыс линии Wistar получали по 30 мг TNBS ректально в день 0 (D0). Различные дозы ES0 (7,5, 0,75 и 0,075 мг белка/кг) вводили ежедневно с DO по D6. Животных умерщвляли на день 7 (D7) для изучения местной воспалительной реакции путем определения фермента миелопероксидазы (МПО), присутствующей в нейтрофилах. Вкратце, фрагмент кишечника гомогенизировали и в супернатанте количественно определяли активность МПО при помощи спектрофотометрического анализа.
Результаты выражали как среднее арифметическое±стандартное отклонение.
Статистический анализ данных проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Бонферрони.
Введение TNBS вызывало значительное повышение активности по сравнению с нелеченой контрольной группой. У крыс, получавших ES0 в дозах 0,75 мг/кг или 0,075 мг/кг, но не в максимальной дозе, наблюдалось значительное ингибирование активности МПО по сравнению с группой положительного контроля, получавшей TNBS. Эффект ES0 был выраженным, поскольку активность МПО возвращалась к норме, т.е. была схожей с активностью в группе отрицательного контроля, не получавшей TNBS (Фигура 13).
5.2 Бактерия LMB64 в качестве превентивной меры при воспалительном заболевании кишечника
Оценивали эффект штамма LMB64 на модели острого колита у крыс, индуцированного TNBS. Культуру LMB64 центрифугировали и отмывали физиологическим раствором. Бактерии ресуспендировали в физиологическом растворе 0,9% NaCl. Раствор с определенным титром бактерий LMB64 вводили животным оральным путем.
8
9
Группы по 10 крыс линии Wistar получали по 30 мг TNBS ректально в день 0 (D0). Различные дозы LMB64 (10 или 10 живых бактерий) вводили ежедневно с D0 no D6. Кроме того, была включена группа крыс, получавших в соответствии с тем же протоколом по 3 мг/кг преднизолона, применявшегося в качестве референсной молекулы. Животных умерщвляли на D7.
Макроскопические поражения оценивали и выражали в виде индекса, основываясь на показателях, представленных ниже в Таблице 9.
Таблица 9
Показатель
Индекс
Нормальный вид
0
Местное кровотечение, отсутствие язв
1
Изъязвление без кровотечения или утолщение стенки кишечника
2
Изъязвление с участком воспаления
3
Изъязвление с двумя или более участками воспаления
4
Местную воспалительную реакцию оценивали при помощи определения МПО, как описано выше.
Результаты выражали как среднее арифметическое ± стандартное отклонение. Статистический анализ данных проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом Бонферрони.
9
Результаты свидетельствуют, что LMB64 неожиданно ингибирует воспалительную реакцию, что отражается по активности МПО (Фигура 14Б). Этот эффект является дозозависимым, максимальную активность обеспечивают 10бактерий LMB64.
9
В этой дозе штамм LMB64 является более эффективным, чем референсная молекула, преднизолон. LMB64 также способен резко снижать индекс, по которому оценивали поражения, но только при дозе бактерий LMB64 равной 10 (Фигура 14А). И вновь, штамм оказывается более эффективным, чем референсная молекула, преднизолон.