СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЕФЕКТОВ ПОКРОВНЫХ ТКАНЕЙ
METHOD OF RECOVERY OF DEFECTS OF COVERING TISSUES

Изобретение относится к медицине, а именно к общей хирургии, комбустиологии, эстетической хирургии, косметологии и может найти применение при лечении дефектов покровных тканей различной этиологии, в том числе на фоне сахарного диабета.
Область техники
В современной реконструктивной и восстановительной хирургии получили развитие и широко применяются методы органоспецифического замещения поврежденных структур с помощью биосовместимых материалов.
Одной из ключевых и актуальных проблем является создание материалов с оптимальными биоинженерными свойствами (Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И., 2006; Василец В.Н. и др., 2010). Достижения в области молекулярной и клеточной биологии демонстрируют принципиальную возможность восстановления поврежденных тканей и органов с помощью материалов, способных имитировать свойства замещаемых биологических структур. Для производства биопластических материалов используются биодеградируемые полимеры: альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, фиброины шелка, полиэфиры бактериального происхождения - полиоксибутираты и их сополимеры. Отличительная особенность биоматериалов - их способность к биодеградации и включение в метаболизм клеток продуктов распада, которыми являются моносахара; молочная и гликолевые кислоты и др. (Севастьянов В.И., Кирпичников М.П., 2011).
При создании современных конструкций для реконструктивной и восстановительной хирургии разработчики используют гиалуроновую кислоту (ГК) - гликозаминогликан, естественный компонент внеклеточного матрикса тканей позвоночных. Благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам, таким как высокая гидрофильность и мультиполярность, молекула ГК способствует формированию оптимального внеклеточного матрикса для восстановления пораженных органов, предотвращая явления фиброза и формирование рубцовых тканей. В большинстве своем наноструктурированные материалы на основе ГК получают с помощью технологии химической модификации и биосинтеза дополнительных протеиновых компонентов (Хабаров В.Н., 2012). Высокая эффективность микро- и наноструктурированных биоматериалов на основе ГК подтверждена клиническими показателями, например, при лечении дефектов покровных тканей, вызванных повреждениями (механические травмы, ожоги) и заболеваниями сосудов (трофические язвы нижних конечностей) (Зиновьев Е.В., 2013; 2014).
К одному из перспективных направлений использования биопластических материалов многими исследователями относится разработка двух- и трехмерных матриксов для тканеинженерных конструкций и биоискусственных органов (Рахматуллин Р.Р., 2014).
Одним из перспективных направлений применения биопластических материалов в последнее время является их использование в качестве структурной основы для тканеинженерных конструкций (ТИК). Последние по сравнению с суспензионными клеточными трансплантатами повышают выживаемость клеток, обеспечивают их более активную пролиферацию за счет адгезии на матриксе. Материал ТИК выступает в роли объемообразующего агента, способствует активной индукции ангиогенеза и репаративной регенерации. Благодаря ряду специфических физико-химических свойств (гидрофильность, мультиполярность, иммунологическая толерантность) молекула ГК, используемая как основа для ТИК, способна формировать оптимальный внеклеточный матрикс (Хабаров В.Н., 2012).
Уровень техники
Известна технология регенеративной биопластики дефектов покровных тканей (Патент РФ №2547386, опубл. 10.04.2015), включающая подготовку раны и наложение пластины биопластического материала, в качестве биопластического материала используют гистоэквивалент-биопластический материал, в состав которого входит гидроколлоид нативной формы гиалуроновой кислоты и пептидный комплекс, при этом в перфорации гистоэквивалент-биопластического материала наносят жизнеспособные округлые лоскуты аутотканей и накрывают второй пластиной биоматериала.
Недостатком этого способа является низкая клиническая эффективность, так как для регенерации раны используются ткани самого пациента в качестве источника регенерации, помещаемые в лунки пластического материала. Взятые фрагменты тканей пациента («кусочки» кожи) вокруг хронически протекающего воспаления обладают низкой регенеративной способностью, часто лизируются, провоцируя развитие зон вторичного некроза, микробного воспаления.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей настоящего изобретения является преодоление недостатков уровня техники и, в частности, повышение эффективности регенерации покровных тканей в условиях бесперевязочного ведения раны. Задача решается тем, что в способе восстановления дефектов покровных тканей, включающем подготовку раны и наложение гистоэквивалент-биопластического материала, в перфорации которого наносят жизнеспособные округлые лоскуты аутотканей, жизнеспособные округлые лоскуты аутотканей предварительно помещают в культуральную среду на 72 часа с температурой 36-37°С, содержащую суммарно 0,01% массовой доли фермента коллагеназы и гиалуронидазы.
Техническим результатом способа восстановления дефектов покровных тканей согласно настоящему изобретению является сокращение сроков регенерации покровных тканей в условиях ведения раневого процесса для заживления раны без перевязок (восстановления покровных тканей).
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 изображена схема способа восстановления дефектов покровных тканей по изобретению, где 1 - раневой дефект, 2 - аутоклеточная суспензия, 3 - жизнеспособные округлые лоскуты аутотканей, 4 - гистоэквивалент-биопластический материал, 5 биоклеточная матрица.
На фиг. 2 изображены клетки кожи спустя 7 суток культивирования; окраска Н&Е (гематоксилином и эозином), об. ×20; где 6 - стратифицированный пласт кератиноцитов, 7 фибробласты, 8 - фибриновый гель, 9 - агрегаты кератиноцитов, 10 - CMComplex.
На фиг. 3 изображен гистологический срез биоматериала гиалуроновой кислоты с культурой клеток фибробластов и кератиноцитов, иммуногистохимия с антителами к виментину и панцитокератину, увеличение в 20 раз; где 11 - окраска кератиноцитов на панцитокератин, 12 - окраска фибробластов на виментин.
Осуществление изобретения
Предлагаемый способ восстановления дефектов покровных тканей реализуется следующим образом. Предварительно осуществляется тщательный туалет раны с использованием раствора мирамистина и 3% пероксида водорода, удаляются нежизнеспособные участки тканей, дно раны скальпелем освежается до появления т.н. «кровяной росы». Края раны иссекают, осуществляют забор округлых кусочков жизнеспособной ткани кожи размером 0,5 на 1 мм, которые затем помещают в культуральную среду для клеточного культивирования (100 мл) с температурой 36-37°С, содержащую суммарно 0,01% массовой доли ферментов коллагеназы и гиалуронидазы, сочетание которых позволяет достичь своеобразное «разрыхление» матрикса, что значительно облегчает затем проникновение в рану жизнеспособных клеток. Данную емкость затем размещают в боксе для клеточного культивирования на 72 часа.
2
Через 72 часа полученную аутоклеточную взвесь распределяют по лункам гистоэквивалент-биопластического материала, который предварительно был перфорирован (50 лунок диаметром 1 мм на площади 100 см) и размещен в культуральных чашках Петри, затем данные чашки Петри помещают на 24 часа в бокс для клеточного культивирования для распределения жизнеспособных клеток по всему объему гистоэквивалент-биопластического материала.
Через 24 часа гистоэквивалент-биопластический материал извлекают из чашек Петри и укладывают на раневую поверхность.
Дальнейшее ведение раны осуществляют посредством этапных перевязок, в ходе которых проводят контроль процесса заживления (эпителизации) язвы. В участках биодеградации материала выполняют дополнительную аппликацию биоматериала до полного замещения раневого дефекта.
Гистоэквивалент-биопластический материал, используемый в настоящем изобретении, известен из уровня техники, например из патентов РФ №2513838, опубл. 20.04.2014, и №2547386, опубл. 10.04.2015.
Предлагаемый способ восстановления дефектов покровных тканей был исследован в условиях клеточного культивирования in vitro. Исследования по совместному культивированию 1 л vitro фибробластов и кератиноцитов показали, что в структуре материала формируются клеточные ассоциации. Первичная культура кератиноцитов, полученная из кожи ферментативным способом, представляла собой гетерогенную суспензию клеток на разных стадиях дифференцировки. Кератиноциты слипались в отдельные агрегаты, которые формировали колонии; отдельные колонии разрастались и образовывали единый пласт. Одновременно с пролиферацией шли процессы дифференцировки и морфогенеза, которые приводили к стратификации - образованию многослойных пластов клеток (фиг. 2).
Констатировано, что фибробласты активно мигрируют в глубину матрикса, при этом наблюдается эффект трехмерного распределение клеток по всей его структуре, плотность клеток максимальна в ближайших слоях к поверхности и постепенно падала.
При совместном культивировании фибробластов и кератиноцитов последние формируют эпителиальный слой на поверхности матрикса (фиг. 3).
Таким образом, культуральные исследования предлагаемого способа восстановления дефектов покровных тканей демонстрируют его высокую эффективность.
Использование данного способа восстановления дефектов покровных тканей в условиях хронических ран при трофических язвах нижних конечностей осуществлялось в 14 клинических наблюдениях гранулирующих ран голеней, осложнивших течение варикозной болезни (стадия С6 согласно классификации СЕАР, хроническая венозная недостаточность 3-й степени). Трансплантация осуществлялась на чистую гранулирующую рану с отпечатком марли, без гнойного отделяемого, без фибрина, без воспалительных изменений окружающих тканей. При анализе полученных данных отмечено, что у всех пациентов после выполнения трансплантации обогащенной аутоклеточной суспензии на биопластический материал гиалуроновой кислоты, размещенный на ране, во всех клинических наблюдениях отмечена эпителизация 90-95% раневой поверхности, восстановление целостности кожного покрова в течение 15-25 суток после трансплантации.
Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ восстановления дефектов покровных тканей позволяет вести заживление раны без перевязок (восстановления покровных тканей) и сокращает сроки регенерации покровных тканей.