КОМПАКТНАЯ АНАЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА В АНАЛИЗИРУЕМОЙ ЖИДКОСТИ

Область техники
Настоящая полезная модель относится к медицинской технике и биотехнологиям, а более конкретно - к устройствам для определения в анализируемых пробах веществ или соединений, проявляющих круговой дихроизм (далее КД), в том числе, реализующим биосенсорные технологии определения биологически активных веществ (далее БАВ), и может быть использовано в медицинской и клинической биохимии, а также в молекулярной фармакологии, в пищевой, фармацевтической и биотехнологической промышленности и экологии, и наиболее эффективно - в клинической биохимии.
Предшествующий уровень техники
Известны различные устройства, реализующие биосенсорные технологии, основанные на регистрации оптических сигналов биологически активных веществ, проявляющих аномальный круговой дихроизм в анализируемых жидкостях.
-7
Известен спектрополяриметр фирмы Jasco Corporation, Япония (Jasco J-710/720 Spectropolarimeter, Instruction Manual), содержащий источник светового излучения, селектор, поляризатор, модулятор поляризации, ячейку с исследуемой пробой, фотодетектор, синхронный усилитель, усилитель постоянного тока, компьютер, в котором регистрируют величину кругового дихроизма (далее КД), пропорциональную концентрации БАВ в пробе. Однако отсутствие режима накопления сигнала, а значит, недостаточная чувствительность определения БАВ (10 моля), большие вес, габариты и энергопотребление, высокая стоимость прибора, отсутствие мобильности приводят к ограничению области применения указанного спектрополяриметра.
Известны устройство для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости (RU, 2107280, С1) и две его технические реализации в виде полезной модели (DE, 10035709, С2) и портативного дихрометра СКД-2 (Успехи физических наук, 2004, т.174, №6, с.686-690), содержащие установленные последовательно источник светового излучения, селектор, поляризатор, модулятор поляризации, ячейку для размещения исследуемой пробы, содержащей биодатчик на основе холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК (далее ХЖКД ДНК) в контакте с анализируемой жидкостью, фотодетектор, синхронный усилитель, средство обработки сигнала, блок управления.
При прохождении через исследуемую пробу, биодатчик в которой проявляет свойства аномального кругового дихроизма, световой поток становится модулированным по интенсивности, благодаря чему на выходе фотодетектора возникает электрический сигнал, переменная составляющая которого на частоте модуляции поляризации излучения пропорциональна величине сигнала КД. Затем сигнал поступает на вход цифровой системы регистрации и после усиления, фильтрации и преобразования в цифровой код поступает в компьютер. Интерфейсная плата на основе микроконтроллера осуществляет необходимое взаимодействие всех узлов прибора, сбор и предварительную обработку сигнала КД, передачу данных в компьютер, а также тестирование параметров всех систем дихрометра.
Управление работой дихрометра СКД-2 осуществляется с помощью программного комплекса, осуществляющего различные режимы работы дихрометра и поддерживающего библиотеку методик для определения различных БАВ, благодаря чему пользователь имеет возможность выбрать из меню то вещество, определение концентрации которого требуется в данный момент, после чего программа в режиме диалога «ведет» исследователя через все действия, предписанные методикой, и выдает результат в виде значения концентрации определяемого соединения в исследуемом образце.
Однако к недостаткам вышеупомянутых устройств можно отнести:
- неоптимальную конструкцию лампового источника светового излучения, приводящую к образованию озона внутри спектрального блока в диапазоне УФ излучения вблизи 200 нм;
- недостаточно надежный и сложный в изготовлении и настройке электродинамический привод (позиционного типа) поворота дифракционной решетки селектора;
- недостаточную стабильность характеристик и недостаточную устойчивость к внешним воздействиям фотоэластического модулятора поляризации, а также
- влияние электронной схемы возбуждения модулятора на другие системы устройства, что понижает чувствительность регистрации КД, и, соответственно, измерения концентрации БАВ.
Наличие паразитного сигнала КД из-за напряжений в окнах оптической кюветы с исследуемой пробой и несовершенства узла фиксации ячейки, а также избыточные шумы в канале регистрации КД приводят к недостаточной надежности и стабильности результатов измерений сигнала КД.
Усиление результирующего сигнала КД по постоянному току в тракте синхронного усилителя приводит к температурному дрейфу сигнала, при этом наличие в синхронном усилителе аналогового фильтра низких частот существенно снижает возможности дальнейшей обработки полезного сигнала из-за ограниченного набора постоянных времени фильтра.
Наличие селектора длины волны в виде монохроматора и отдельного блока термостатирования ячейки с пробой приводит к излишней громоздкости дихрометра.
Перечисленные выше недостатки устройств для определения БАВ устранены в дихрометре для определения биологически активного вещества в жидкостях, гелях и пленках (RU, 92959, U1) и в дихрометре для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости (RU, 92960, U1). В указанных дихрометрах для достижения более высокой точности определения концентраций определяемых компонентов в любых анализируемых пробах, в том числе, в жидкостях, гелях, пленках, предложены усовершенствованная конструкция лампового источника светового излучения, резко уменьшающая уровень образующегося озона в диапазоне УФ излучения вблизи и ниже 200 нм, технологичный шаговый двигатель поворота дифракционной решетки, усовершенствована конструкция устройства для размещения анализируемой пробы, обеспечивающая возможность скользящего перемещения кюветы с пробой относительно корпуса устройства без появления напряжений в материале стенок кюветы, конструктивное выполнение фотоэластического модулятора поляризации в сочетании со стабилизацией его рабочего тока, обеспечившее высокую стабильность характеристик модулятора и устойчивость его к внешним механическим воздействиям.
Кроме этого, в предложенных устройствах для определения БАВ реализован принцип модульности, при котором функциональные модули устройства для определения БАВ содержат микроконтроллеры, обеспечивающие управление функциональными модулями в согласованных режимах и взаимодействие их между собой с помощью стандартного интерфейса типа I2C. Управление работой аналитического устройства осуществляется с помощью внешнего или встроенного компьютера, при этом микроконтроллер модуля цифровой системы регистрации обеспечивает выполнение необходимых операций микроконтроллерами других функциональных модулей, первичную обработку сигнала, передачу его по интерфейсу USB в указанный компьютер, прием и передачу команд компьютера другим функциональным модулям.
Указанные технические решения позволили несколько уменьшить габариты предложенных аналитических устройств за счет включения блока термостатирования ячейки с пробой в состав оптического (спектрального) блока.
Кроме того, стало возможным применение биодатчиков на основе молекулярных конструкций ДНК, сохраняющих свою аномальную оптическую активность в течение длительного времени.
Использование предложенных аналитических устройств позволяет точнее и с лучшей воспроизводимостью определять величину КД, а значит, и концентрацию в жидкости различных БАВ, при этом достигается более высокая чувствительность их определения (до 10-9 М/л) и появляется возможность значительно расширить класс определяемых БАВ.
В то же время имеется множество аналитических задач, для решения которых не требуются полифункциональные широкодиапазонные дихрометры и которые можно было бы решить с помощью еще более простых и дешевых специализированных приборов, использующих для определения одного БАВ или однотипных БАВ конкретный специфический биодатчик, нацеленный на определение только этих БАВ. В этом случае можно было бы отказаться от таких достаточно громоздких элементов конструкции полифункциональных дихрометров, как мощный ламповый источник излучения, требующийся для обеспечения широкого диапазона длин волн его работы, селектор длины волны излучения в виде монохроматора и высокочувствительный детектор излучения на основе фотоэлектронного умножителя.
Такая возможность появилась с созданием биодатчиков, содержащих в своем составе частицы молекулярных конструкций ДНК (МК ДНК) (Жидкокристаллические дисперсии и наноконструкции ДНК (под редакцией Ю.М.Евдокимова) - М., Радиотехника, 2008). Для МК ДНК характерна не только аномальная оптическая активность, проявляемая в виде интенсивной полосы в спектре КД в области поглощения азотистых оснований ДНК на длине волны ~270 нм, но и дополнительная аномальная оптическая активность в области поглощения чувствительных элементов биодатчика, например, наномостиков, «сшивающих» МК ДНК, например, наномостиков, содержащих в качестве структурных элементов хромофоры антибиотика на длине волны ~ 520 нм. Величина аномальной оптической активности биодатчиков на основе МК ДНК в этой полосе остается неизменной в течение длительного времени и может уменьшаться (вплоть до полного исчезновения) под действием БАВ, «мишенью» которых являются структурные элементы наномостиков, являющиеся, по сути, наносенсорами. Наличие и концентрацию БАВ в анализируемой жидкости определяют по величине регистрируемого изменения под действием БАВ (в результате его взаимодействия с МК ДНК) сигнала КД биодатчика только в одной, указанной выше полосе в видимом диапазоне спектра, при помощи предварительно записанного калибровочного графика.
Раскрытие полезной модели
-9
В основу предлагаемой полезной модели была положена задача создания компактной специализированной биосенсорной аналитической системы для определения в анализируемых жидких пробах БАВ, «мишенью» которых являются реакционноспособные, чувствительные к определяемому БАВ, структурные элементы МК ДНК, обладающие аномальной оптической активностью в видимом диапазоне спектра, без какой-либо потери чувствительности регистрации сигнала КД, с высокой точностью определения концентрации определяемых БАВ, в том числе ультранизкой концентрации (до ~10 моля), в любых анализируемых пробах, в том числе, в жидкостях, гелях, пленках, в том числе в биологических жидкостях, таких, как плазма крови, цельная кровь и других.
Поставленная задача решена созданием аналитической системы для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости по величине регистрируемого изменения оптического сигнала кругового дихроизма биодатчика под действием вещества, подлежащего определению, содержащая размещенные последовательно:
- источник светового излучения;
- селектор, приспособленный для формирования светового потока с длиной волны, соответствующей области оптической активности биодатчика, проявляемой в спектре его кругового дихроизма;
- поляризатор, приспособленный для формирования линейно поляризованного светового потока;
- спектральную щель, приспособленную для выделения линейно поляризованного светового потока с определенным направлением вектора поляризации;
- модулятор поляризации, приспособленный для преобразования указанного линейно поляризованного светового потока в циркулярно поляризованный световой поток с периодически изменяющимся направлением вращения вектора поляризации;
- устройство для размещения пробы, содержащей биодатчик или анализируемую жидкость в контакте с биодатчиком, в оптически проницаемой кювете, содержащее узел термостатирования указанной кюветы;
- фотодетектор, приспособленный для регистрации оптических сигналов кругового дихроизма биодатчика и преобразования их в пропорциональный электрический сигнал;
- цифровую систему регистрации, приспособленную для выделения и усиления указанного электрического сигнала и преобразования его в цифровую форму;
- средство обработки полученного электрического сигнала и вычисления концентрации биологически активного вещества в жидкости, отличающейся тем, что система:
- приспособлена для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости по величине регистрируемого изменения оптического сигнала кругового дихроизма биодатчика на основе молекулярных конструкций ДНК, содержащих чувствительный элемент, проявляющий круговой дихроизм в видимой области спектра;
- в качестве источника светового излучения содержит узкополосный источник света видимого диапазона, излучающий на длине волны, соответствующей максимуму оптической активности чувствительного элемента биодатчика, проявляемой им в видимой области спектра кругового дихроизма, и снабженный коллимирующей линзой, размещенной в пучке света источника излучения,
- в качестве селектора длин волн содержит узкополосный интерференционный фильтр, размещенный в пучке света источника излучения после коллимирующей линзы;
- средство обработки приспособлено для вычисления концентрации биологически активного вещества на основе результатов измерений разности величин сигналов кругового дихроизма чувствительного элемента биодатчика, выполненных до контакта биодатчика с анализируемой жидкостью и через заданный промежуток времени контакта биодатчика с анализируемой жидкостью.
При этом, согласно полезной модели, целесообразно, чтобы в указанной аналитической системе источник светового излучения содержал два дополнительных узкополосных источника излучения, приспособленных для работы попеременно с первым источником и излучающих на длинах волн, на которых сигнал кругового дихроизма чувствительного элемента биодатчика исследуемой пробы минимален по отношению к оптическому сигналу кругового дихроизма чувствительного элемента биодатчика на длине волны первого источника излучения, при этом один из указанных дополнительных источников был приспособлен для излучения света на более короткой, а другой из указанных дополнительных источников был приспособлен для излучения света на большей длине волны по отношению к длине волны первого источника излучения, причем каждый из указанных дополнительных источников излучения был бы снабжен коллимирующей линзой, размещенной в пучке света соответствующего дополнительного источника излучения, а селектор длин волн содержал два дополнительных интерференционных фильтра, размещенных в пучке света каждого из указанных дополнительных источников излучения после соответствующей коллимирующей линзы, и чтобы система содержала средство для направления коллимированных потоков излучений дополнительных источников по пути потока излучения первого источника.
Поставленная задача была также решена созданием оптического диффузометра для анализа механизмов транспорта биологически активных веществ и определения их коэффициентов диффузии в биодатчик на основе молекулярных конструкций ДНК, содержащих чувствительный элемент, проявляющий свойства кругового дихроизма при облучении световым потоком в видимой области спектра, содержащего охарактеризованную выше аналитическую систему согласно полезной модели для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости.
Краткое описание чертежей
В дальнейшем аналитическая система для определения биологически активного вещества в анализируемой жидкости согласно полезной модели поясняется примерами ее конструктивного выполнения и применения и прилагаемыми чертежами, на которых:
Фиг.1 - оптическая схема аналитической системы согласно полезной модели, вариант выполнения;
Фиг.2 - оптическая схема аналитической системы согласно полезной модели, вариант выполнения;
Фиг.3 - Спектр КД биодатчика на основе МК ДНК, "сшитых" наномостиками DAU-Cu;
max
Фиг.4 - Зависимости величины относительного изменения сигнала кругового дихроизма ΔА/ΔA биодатчика на основе МК ДНК, генерируемого им на длине волны ~ 515 нм, от времени его обработки гипорамином, характеризующие динамику разрушения биодатчика МК ДНК под действием гипорамина;
max
Фиг.5 - Калибровочная зависимость величины ΔА/ΔA от концентрации гипорамина, соответствующая 10-минутной обработке гипорамином биодатчика на основе МК ДНК.
Однако представленные примеры выполнения и применения аналитической системы согласно полезной модели не ограничивают другие возможности его выполнения и применения, не выходящие за рамки формулы полезной модели.
Наилучший вариант осуществления полезной модели
На Фиг.1 и Фиг.2 показаны структурные схемы двух вариантов выполнения аналитической системы согласно полезной модели для определения биологически активного вещества (БАВ) в анализируемой жидкости с помощью биодатчика, содержащего чувствительный элемент, проявляющий круговой дихроизм в видимой области спектра циркулярно поляризованного светового потока, по величине регистрируемого изменения оптического сигнала биодатчика под действием вещества, подлежащего определению.
Аналитическая система согласно полезной модели, выполненная по первому варианту (Фиг.1), содержит один узкополосный источник 1 излучения видимого диапазона длин волн, коллимирующую линзу 2, размещенную в пучке света источника 1 излучения, и селектор, выполненный в виде узкополосного интерференционного фильтра 3, размещенного в пучке света, поступающего из коллимирующей линзы 2.
При этом источник 1 излучения должен быть приспособлен для излучения на длине волны в области оптической активности чувствительного элемента биодатчика, проявляющего круговой дихроизм в узкой видимой области спектра. В качестве узкополосного источника 1 излучения целесообразно использовать миниатюрный и дешевый светоизлучающий диод с высокой яркостью излучения, например, диод S12LG2C-B.
Возможность использования для измерений только видимого диапазона длин волн расширяет выбор таких источников, которых имеется много в этом диапазоне, в том числе лазерных, а также исключает проблемы, связанные с использованием УФ излучения (поглощение в воздухе, образование озона).
Узкополосный диодный источник 1 излучения заменяет собой традиционно используемые в полифункциональных дихрометрах широкополосный (обычно ламповый) источник излучения и селектор длины волны на основе монохроматора с их сложными и габаритными конструкцией и элементами и позволяет тем самым кардинально упростить, миниатюризировать и удешевить аналитическую систему для определения БАВ в анализируемой жидкости.
Для проведения более точных измерений величины изменения под действием БАВ оптического сигнала чувствительного элемента биодатчика на длине волны максимума интенсивной (аномальной) полосы в видимой области спектра КД целесообразно использовать аналитическую систему, содержащую в дополнение к излучающему в указанной области спектра узкополосному источнику 1 излучения еще два узкополосных источника, работающих попеременно с первым источником 1 излучения и излучающих на длинах волн, где сигнал КД биодатчика по абсолютной величине минимален: один источник - на более короткой длине волны, другой источник - на большей длине волны по отношению к положению максимума указанной полосы в спектре КД чувствительного элемента биодатчика.
Введение двух дополнительных миниатюрных источников излучения незначительно усложняет конструкцию аналитической системы, но позволяет учесть вклад фоновых сигналов в измеряемый сигнал КД и, соответственно, существенно повысить точность измерения изменений оптических свойств биодатчика при его взаимодействии с БАВ, а также наличия и концентрации БАВ в анализируемой жидкости.
В этом случае в пучке света каждого дополнительного узкополосного источника света могут быть установлены коллимирующие линзы и интерференционные фильтры, а для последующей поляризации, преобразования поляризации и просвечивания исследуемой пробы целесообразно осуществить совмещение и направление потоков коллимированного узкополосного излучения двух дополнительных источников света по пути потока излучения первого (рабочего) источника 1.
Аналитическая система согласно полезной модели, выполненная по второму варианту (Фиг.2), содержит три узкополосных источника 1, 1a, 1б излучения видимого диапазона длин волн, соответствующие им коллимирующие линзы 2, 2а, 2б, размещенные в пучке света соответствующих источников 1, 1а и 1б излучения, и, соответственно, три узкополосных интерференционных фильтра 3, 3а и 3б селектора, размещенные в пучках света, поступающего, соответственно, из коллимирующих линз 2, 2а и 2б. Кроме того, аналитическая система (Фиг.2) содержит два полупрозрачных плоскопараллельных зеркала А и Б, выполненных, например, из кварца, для направления потоков коллимированного узкополосного излучения источников 1а и 1б по пути потока излучения источника 1.
При этом источники 1, 1a и 1б излучения приспособлены для излучения на разных длинах волн:
- источник 1 излучения - на рабочей длине волны, соответствующей максимуму оптического сигнала КД чувствительного элемента биодатчика в видимой области спектра КД;
- источник 1а излучения - на более короткой по отношению к рабочей длине волны источника 1, на которой оптический сигнал КД чувствительного элемента биодатчика имеет минимум;
- источник 1б излучения - на длине волны, большей по отношению к рабочей длине волны источника 1, на которой оптический сигнал КД чувствительного элемента биодатчика также имеет минимум.
В качестве источников 1, 1a и 1б излучения могут быть использованы, например, светодиоды типа S12LB2C-B, S12LG2C-B, NCSU033A и NCSU034A.
Желательно, чтобы одна из плоскопараллельных поверхностей зеркал А и Б для исключения наложения на коллимированное излучение интерференционных эффектов имела антиотражающее покрытие, а другая максимально отражала излучение соответствующего этим зеркалам источника излучения и была прозрачна для излучения остальных узкополосных источников света.
Вместо полупрозрачных зеркал можно использовать полностью отражающие зеркала, которые, в соответствии с алгоритмом измерения изменений сигнала КД пробы и следующим этому алгоритму порядком последовательного включения каждого из источников излучения, вводились бы в световой поток поочередно, соответственно включаемым поочередно дополнительным источникам излучения.
Для решения задач, связанных только с определением наличия БАВ или грубой оценкой концентрации БАВ в исследуемой жидкости (например, тестирование биоцидов или определение пригодности жидкости для использования), и при использовании заведомо качественных биодатчиков введение в состав аналитической системы дополнительных к источнику, излучающему на рабочей длине волны, источников излучения и других элементов не требуется, и система остается наиболее простой и компактной.
При использовании узкополосного источника (1, 1a, 1б) излучения наиболее эффективно в качестве селектора длины волны его излучения для еще большего сужения полосы излучения, если она недостаточно узка, использовать узкополосный интерференционный фильтр (3, 3а, 3б) с многослойным диэлектрическим покрытием, но возможно использование и других типов спектральных фильтров.
Коллимирующие линзы 2, 2а, 2б используются для компенсации расходимости излучения узкополосного источника света и могут быть выполнены любым известным специалисту образом.
При этом аналитические системы согласно полезной модели (Фиг.1, Фиг.2) также содержат:
- поляризатор 4, формирующий из указанного излучения линейно поляризованный световой поток;
- спектральную щель 5, выделяющую «обыкновенный» луч;
- модулятор 6 поляризации, преобразующий линейно поляризованный световой поток в поляризованный по кругу с периодически меняющимся направлением вращения вектора поляризации;
- устройство 7 для размещения анализируемой пробы, содержащей биодатчик в анализируемой жидкости или биодатчик;
- фотодетектор 8, преобразующий изменения аномального оптического сигнала КД чувствительного элемента биодатчика под действием БАВ в пропорциональный ему электрический сигнал;
- цифровую систему 9 регистрации;
- средство 10 обработки полученного электрического сигнала и вычисления концентрации БАВ в анализируемой жидкости или определения оптических свойств биодатчика;
- источник 11 питания фотодетектора 8.
Поляризатор 4 (Фиг.1, Фиг.2) приспособлен для формирования линейно поляризованного светового потока и может быть призменным (например, из нелинейного кристалла дигидрофосфата калия), пленочным (например, типа NPF-S), жидкокристаллическим (например, на основе сегнетоэлектрических жидких кристаллов СЖК-582) или изготовлен любым другим, известным специалисту в этой области, образом.
При использовании призменного или пленочного поляризатора 4 преобразование линейно поляризованного светового потока в поляризованный по кругу с периодически меняющимся направлением вращения вектора поляризации целесообразно осуществлять в электрооптическом модуляторе 6 круговой поляризации фотоэластического типа.
Вместо модулятора 6 фотоэластического типа могут быть использованы и другие типы электрооптических модуляторов, например, комбинация модулятора на основе жидких кристаллов, обеспечивающего попеременное (периодическое) получение на выходе двух взаимно ортогональных линейных поляризаций, и четвертьволновой пластинки (λ/4) из кристаллического кварца, преобразующей линейно поляризованный световой поток в поляризованный по кругу с периодически меняющимся направлением вращения вектора поляризации.
Для лучшего разделения ортогональных поляризаций в случае использования призменного поляризатора, изготовленного из нелинейного кристаллического материала, может быть использована спектральная щель 5, которая располагается непосредственно после призменного поляризатора 4 (Фиг.1) или после электрооптического модулятора 6 круговой поляризации (Фиг.2).
В качестве устройства 7 для размещения пробы целесообразно использовать оптически проницаемую термостатируемую, например, с помощью терморегулятора 7а на основе элементов Пельтье и датчиков температуры, кювету или лунки термостатируемой стандартной микроплаты с минимальным остаточным дихроизмом прозрачного материала, соответственно, стенок кюветы или дна лунок, приспособленные для размещения в них биодатчика или пробы, содержащей анализируемую жидкость в контакте с биодатчиком.
Благодаря высокой яркости излучения светодиодов, используемых в качестве источников 1, 1a, 1б излучения, в качестве фотодетектора 8, приспособленного для регистрации оптических сигналов кругового дихроизма биодатчика и преобразования их в пропорциональный электрический сигнал, вместо дорогих фотоэлектронных умножителей (например, HAMAMATSU R1464 или R7400U-04) могут быть использованы миниатюрные стандартные фотодиоды, например, ФД-24.
Целесообразно, чтобы в цепи фотодетектора 8, преобразующего изменения сигнала КД под действием БАС в электрический сигнал, имелась электрическая обратная связь с целью регулирования его чувствительности, устроенная таким образом, что при любом изменении интенсивности поляризованного по кругу светового излучения, облучающего исследуемую пробу, постоянная составляющая электрического напряжения на выходе фотодетектора оставалась неизменной, при этом переменная составляющая электрического напряжения будет пропорциональна величине кругового дихроизма исследуемой пробы. Благодаря такому подходу удается понизить уровень помех, связанных с изменениями интенсивности излучения, и повысить чувствительность системы регистрации и аналитической системы в целом.
Желательно для получения устойчивого режима работы фотодетектора 8 использовать стабильный регулируемый источник 11 питания, и конструкцию фотодетектора 8, обеспечивающую надежное экранирование фотодетектора 8 от внешних электромагнитных полей и паразитной световой засветки.
Управление функциональными устройствами аналитической системы согласно полезной модели производится, например, с помощью компактного персонального компьютера (ноутбука), встроенного микрокомпьютера или иного аналогичного средства с соответствующим программным обеспечением.
Целесообразно, чтобы в предлагаемой аналитической системе был реализован принцип модульности, выполнение необходимых операций вышеописанными функциональными модулями системы производилось с помощью микроконтроллеров, а схемотехнические решения предоставляли возможность использования для управления прибором как внешнего, так и встроенного компьютера. Компьютер средства 10 обработки производит включение и управляет работой источников 1, 1a, 1б излучения, модулятором 6 круговой поляризации, терморегулятором 7а температуры кюветы 7, источником 11 питания фотодетектора 8, цифровой системой 9 регистрации.
Программное обеспечение осуществляет управление режимами работы аналитической системы согласно полезной модели, визуальное отображение результатов измерения на экране персонального компьютера, сохранение и документирование результатов измерений, выполнение различных действий по обработке экспериментальных результатов (сглаживание, накопление, сравнение с другими результатами), калибровку аппаратной части прибора, вычисление неизвестной концентрации БАВ в жидкости с помощью предварительно построенных калибровочных графиков. Прием и передача команд от средства 10 обработки микроконтроллерам функциональных устройств производится через микроконтроллер цифровой системы 9 регистрации. Связь между модулями осуществляется посредством стандартного цифрового интерфейса типа I2C. Схемотехническое решение предоставляет возможность использования для управления системой как внешнего, так и встроенного компьютера по интерфейсу USB.
Таким образом, предлагаемая полезная модель, благодаря использованию биодатчиков на основе молекулярных конструкций ДНК и новых технических решений, позволяет сделать аналитическое устройство для определения БАВ в жидкости, без ущерба для его чувствительности, более простым, более компактным и более мобильным, с возможностью экспрессного проведения анализа содержащих БАВ жидкостей.
Выполнение аналитической системы согласно полезной модели позволяет выполнять ее в компактном исполнении в едином корпусе, обеспечить простоту обслуживания и мобильность в различных условиях эксплуатации.
Применение аналитической системы согласно полезной модели может быть проиллюстрировано на примере определения наличия и концентрации БАВ в анализируемой жидкости и измерения скорости диффузии БАВ в биоматериале.
2+
Работа аналитической системы согласно полезной модели, выполненной по второму варианту (Фиг.2), показана на примере определения в анализируемой жидкости (крови человека) наличия и концентрации гипорамина с использованием биодатчика на основе МК ДНК, выполненного в виде интегрального микрочипа, представляющего собой частицу ХЖКД ДНК, в которой соседние молекулы нуклеиновой кислоты «сшиты» наномостиками, состоящими из чередующихся ионов Cu и молекул антибиотика дауномицина, образующих между собой полимерные хелатные сшивки (RU, 2139933, С1).
2+
2+
Применение указанных частиц ХЖКД ДНК в качестве интегрального биодатчика обусловлено тем, что молекулы многих химических и биологически активных соединений образуют комплексные соединения с ионами Cu "вытаскивая" эти ионы из структуры хелатного комплекса с 4 атомами кислорода в составе двух последующих молекул антрациклинового соединения. Такой процесс сопровождается не только нарушением целостности всей полимерной "сшивки", но и соответствующим уменьшением аномальной оптической активности биодатчика (Фиг.3). Величина уменьшения аномальной оптической активности связана с величиной концентрации химического или биологически активного соединения, присутствующего в анализируемой жидкости и разрушающего полимерную хелатную "сшивку". Поэтому аномальный оптический сигнал можно использовать в качестве аналитического критерия, позволяющего определять аналиты, «мишенью» которых являются «строительные блоки» микрочипа, в частности, структурные элементы наномостиков, в частности, ионы Cu и молекулы антибиотика. При этом чувствительным элементом биодатчика является молекула антибиотика, проявляющая различный по величине круговой дихроизм до и после нарушения целостности указанной «сшивки» - наномостика при облучении в видимой области спектра в полосе поглощения дауномицина на длине волны ~515 нм.
Для указанных исследований использовали аналитическую систему (Фиг.2), содержащую три источника излучения:
- источник 1, излучающий на длине волны ~515 нм, соответствующей максимуму интенсивной отрицательной полосы в спектре КД чувствительного элемента биодатчика - дауномицина,
- источник 1а, излучающий на длине волны ~450 нм, меньшей длины волны указанного максимума;
- источник 1б, излучающий на длине волны ~700 нм, большей длины волны указанного максимума.
В качестве источников 1, 1a и 1б излучения, содержащих коллимирующие линзы 2, 2а и 26, были использованы светодиоды типа S12LG2C-B, S12LB2C-B, и NCSU034A.
При этом аналитическая система также содержала:
- три узкополосных интерференционных фильтра 3, 3а, 3б, сужающие полосу излучения от источников 1, 1a, 1б; полупрозрачные плоскопараллельные пластины А и Б, при этом одна из плоскопараллельных поверхностей зеркал А и Б имела многослойное антиотражающее покрытие, а другая максимально отражала излучение, соответственно, источников 1а или 1б и была прозрачна для излучения остальных узкополосных источников, например, в зеркале Б - прозрачна для излучения источников 1 и 1а;
- поляризатор 4, выполненный в виде призмы из нелинейного кристаллического материала;
- спектральную щель 5;
- модулятор 6 круговой поляризации фотоэластического типа, установленный за спектральной щелью 5;
- устройство 7 для размещения исследуемой пробы, выполненное в виде термостатируемой с помощью узла 7а стандартной микроплаты с минимальным остаточным дихроизмом прозрачного материала дна лунок, приспособленных для размещения в них биодатчика или пробы, содержащей анализируемую жидкость в контакте с биодатчиком;
- фотодетектор 8;
- цифровую систему 9 регистрации электрического сигнала;
- средство 10 обработки электрического сигнала, вычисления концентрации определяемого БАВ или определения оптических свойств биодатчика и для управления функциональными модулями предлагаемой аналитической системы, выполненное в виде встроенного микрокомпьютера;
- источник 11 питания фотодетектора 8.
Фотодетектор 8 имеет два выхода 12 и 13; выход 13 соединен с входом источника 11 питания фотодетектора 8, а выход источника 11 питания соединен в свою очередь с входом фотодетектора 8 для организации электрической обратной связи с целью регулирования его чувствительности. Выход 12 фотодетектора 17 подключен к первому входу 14 цифровой системы 9 регистрации, выход 15 которой соединен с входом компьютера средства 10 обработки. Для управления системой выходы компьютера средства 10 обработки соединены с источниками 1, 1а, 1б излучения, для управления поочередной работой трех источников, с терморегулятором 7а температуры кюветы 7, с входом модулятора 6 круговой поляризации для управления параметрами модуляции и током стабилизации, а выход модулятора 6 соединен в свою очередь со входом цифровой системы 9 регистрации для синхронизации частоты и фазы модуляции и усиления.
При этом аналитическая система согласно полезной модели (Фиг.2) работает следующим образом.
Источники 1, 1а и 1б излучения работают поочередно:
- источник 1 светового излучения генерирует в течение заданного времени узкополосный световой поток в области максимума отрицательной полосы в спектре КД чувствительного элемента биодатчика - дауномицина на длине волны около 515 нм, этот поток коллимировали линзой 2 и, после вырезания интерференционным фильтром 3 еще более узкой полосы в спектре излучения на длине волны 515 нм, направляли через полупрозрачные пластины А и Б в поляризатор 4;
- источник 1а светового излучения генерирует в течение заданного времени узкополосный световой поток на более короткой длине волны, на которой сигнал КД чувствительного элемента биодатчика - дауномицина минимален, например, на длине волны 450 нм, его световой поток коллимируется линзой 2а, затем, после вырезания интерференционным фильтром 3а еще более узкой полосы в спектре излучения, отражается от полупрозрачной пластины А и поступает, пройдя полупрозрачную пластину Б, в поляризатор 4 по пути излучения от источника 1;
- источник 1б светового излучения генерирует в течение заданного времени узкополосный световой поток на длине волны, на которой сигнал КД чувствительного элемента биодатчика - дауномицина минимален со стороны более длинных волн, например, 700 нм, его световой поток коллимируется линзой 2б и, после вырезания интерференционным фильтром 3б еще более узкой полосы в спектре излучения, отражается от полупрозрачной пластины Б и поступает в поляризатор 4 по пути излучения источников 1 и 1а.
Поочередное включение всех трех источников 1, 1a, 1б излучения на заданные промежутки времени осуществляет компьютер средства 10 обработки. Полное время облучения (экспозиции) исследуемой жидкости подбирается таким, чтобы могли проявиться изменения величины аномального сигнала КД биодатчика под действием содержащегося в жидкости БАВ.
После прохождения через поляризатор 4 световой поток становится линейно поляризованным. Спектральная щель 5 выделяет из потока линейно поляризованного излучения только составляющую, соответствующую вышедшему из поляризатора 4 «обыкновенному» лучу. Прошедшее спектральную щель 5 излучение попадает в модулятор 6 поляризации, пройдя который, оно становится циркулярно поляризованным с периодически меняющимся направлением вращения вектора поляризации. Пройдя устройство 7 с размещенной в нем пробой, содержащей биодатчик, обладающий аномальным круговым дихроизмом, световой поток становится модулированным по интенсивности.
R
L
R
L
R
L
Под действием света на выходах фотодетектора 8 возникает электрический сигнал, причем на первом выходе 12 регистрируется переменная составляющая, пропорциональная величине ΔА сигнала, обусловленного аномальной оптической активностью биодатчика (ΔA=A-A, где A и A, соответственно, поглощение в веществе излучения с правой и левой циркулярной поляризацией), а на втором выходе 13 - постоянная составляющая, пропорциональная величине сигнала, характеризующего поглощение биоматериала пробы (A≈A≈A), при этом частота переменной составляющей равна частоте модуляции круговой поляризации излучения.
В указанной аналитической системе постоянная составляющая поддерживается на постоянном уровне путем регулирования напряжения питания фотодетектора 8, для чего сигнал постоянной составляющей с выхода 13 фото детектора 8 вводится на вход источника 11 питания фотодетектора, то есть осуществляется режим стабилизации постоянной составляющей с помощью отрицательной обратной связи по постоянной составляющей с одновременным измерением переменной составляющей, что эквивалентно измерению их отношения (ΔА/А), а значит, измерению сигнала кругового дихроизма исходной пробы поочередно на каждой из трех длин волн (515, 450 и 700 нм).
МК
С выхода 12 фотодетектора 8 соответствующий величине КД электрический сигнал поступает на первый вход 14 цифровой системы 9 регистрации, на второй вход 15 которой подается опорный сигнал с частотой модуляции круговой поляризации. Система 9 регистрации усиливает сигналы, преобразует их в постоянный ток и подает в компьютер средства 10 обработки для обработки по определенному алгоритму. Результирующий сигнал КД исходной пробы КД на длине волны 515 нм, рассчитанный с учетом фоновых сигналов КД на длинах волн 450 и 750 нм, сохраняется в памяти средства 10 обработки.
Определение концентрации БАВ гипорамина осуществляли следующим образом.
ост
ост
Вначале измеряли остаточный круговой дихроизм КД прозрачного материала дна лунок для размещения исследуемых проб микроплаты устройства 7 на длине волны, соответствующей максимуму интенсивной отрицательной полосы в спектре КД чувствительного элемента биодатчика - дауномицина на длине волны ~515 нм, учитывая при этом фоновые сигналы КД на длинах волн ~450 нм и ~700 нм.
max
Затем определяли исходные характеристики биодатчика. Для этого из некоторого количества биоматериала, содержащего чувствительные элементы биодатчика, готовили исходные пробы биодатчика путем закладки в лунки одинаковых порций биоматериала и измеряли на той же длине волны ~515 нм присущий каждой исходной пробе с биодатчиком аномальный сигнал кругового дихроизма, скорректировав его значение на измеренную величину остаточного кругового дихроизма материала дна лунок. Для всех проб результирующие сигналы КД (ΔA) рассчитанные с учетом фоновых сигналов КД на длинах волн ~450 нм и ~700 нм, были высокими и сравнительно одинаковыми, что говорило о высоком качестве используемых биодатчиков.
ДНК
ПЭГ
ДАУ
Cu
max
Гипорамин
Гипорамин
L
R
-6
-5
-2
+
-6
На Фиг.3 показан спектр КД в видимой области использованного биодатчика на основе молекулярных конструкций ДНК, в которых в частицах жидкокристаллической лиотропной дисперсии молекулы ДНК «сшиты» наномостиками, содержащими дауномицин и медь (DAU-Cu) (С ~ 5,6 мкг/мл; С=170 мг/мл, мол. масса ПЭГ=4000 Да; С ~ 27,18·10 М; C ~ 1·10 М; 0,3 М NaCl+10 М Na-фосфатный буфер).. Результирующие сигналы КД всех исходных проб биодатчика (ΔA) сохраняли в памяти компьютера средства 10 обработки: спектры КД молекулярных конструкций ДНК до (кривая 1, С=0) и после (кривая 2, С=4,0 мкг/мл) обработки гипорамином; спектр КД ХЖКД комплексов ДНК-ДАУ (Кривая 3. ΔА=(A-A)·10 оптич. ед.; L=1 см; Т=22°С).
t
t
max
t
max
ДНК
бис-ММ
ДАУ
2
2
Cu
Гипорамин
Гипорамин
Гипорамин
Гипорамин
Гипорамин
6
-6
-6
-2
+
-6
Затем готовили серию калибровочных проб путем обработки заложенных в лунки указанных выше исходных проб биодатчика жидкостью, содержащей определяемое БАВ в различных заданных концентрациях, и измеряли через заданные промежутки времени Δt, меньшие времени полной диффузии БАВ в биодатчик, сигналы кругового дихроизма ΔAкаждой исследуемой пробы на длине волны ~515 нм, учитывая при этом фоновые сигналы на длинах волн ~450 нм и ~750 нм. Величины результирующих сигналов ΔA на длине волны ~515 нм для заданных одинаковых промежутков времени и для каждой из исследуемых проб с разной концентрацией гипорамина, рассчитанные с учетом фоновых сигналов на длинах волн ~450 нм и ~700 нм, сохраняли в памяти компьютера средства 10 обработки, где они затем соотносились с величинами результирующих сигналов КД всех исходных проб биодатчика ΔA. В результате были получены зависимости величины относительного изменения сигнала кругового дихроизма (ΔA/ΔA), генерируемого биодатчиками на основе МК ДНК (ДНК из тимуса крупного рогатого скота («Sigma», США); мол. масса ДНК ~ (0,3-0,7)·10 Да; С=19,92 мкг/мл; С=170 мг/мл; мол. масса бис-макромономера ПЭГ=6000 Да; ДАУ («Sigma», США); С=25,764×10 М; CuClx·2HO («Aldrich», США); C=9,901 x·10 М; 0,3 М NaCl+10 М Na- фосфатный буфер; рН ~ 7,0. размеры гидрогеля ~ 6×1×20 мм; температура - 22°С) на длине волны ~ 515 нм, от времени их обработки гипорамином при разных его концентрациях (Фиг.4), характеризующие динамику разрушения МК ДНК биодатчика под действием гомоцистеина: кривая 1 - С=0,5 мкг/мл; кривая 2 - С=1,0 мкг/мл; кривая 3 - С=2,0 мкг/мл; кривая 4 - С=3,0 мкг/мл; кривая 5 - С=4,0 мкг/мл; ΔА×10 - круговой дихроизм (оптич. ед.).
max
max
Используя полученные через определенный заданный промежуток времени ΔТ значения величин относительного изменения сигнала кругового дихроизма (ΔА/ΔA), генерируемого биодатчиками на основе МК ДНК на длине волны ~ 515 нм (аналогично описанным выше), обработанными жидкостью, содержащей определяемый БАВ в различных заданных концентрациях, строили калибровочный график зависимости изменения на временном промежутке ΔТ сигнала (ΔА/ΔA) от концентрации гипорамина (Фиг.5), соответствующий 10-минутной обработке биодатчика на основе МК ДНК гипорамином, которую сохраняли в памяти компьютера средства 10 обработки.
ост
max
Для определения в анализируемой жидкой пробе неизвестной концентрации определяемого БАВ вначале, в соответствии с описанной выше процедурой, готовили пробу биоматериала с биодатчиком, для чего в лунку с известным значением КД материала ее дна помещали такое же, как для указанных выше исходных проб с биодатчиком, количество биоматериала, содержащего биодатчик, и проводили с помощью аналитической системы (Фиг.2) измерение его сигнала кругового дихроизма (ΔA) при облучении проб циркулярно поляризованным светом на рабочей длине волны ~520 нм, с учетом фоновых сигналов на длинах волн ~450 и ~700 нм, в соответствии с вышеизложенным алгоритмом.
Затем подготовленную пробу биоматериала с биодатчиком подвергали обработке анализируемой жидкостью, предположительно содержащей гипорамин в неизвестной концентрации, и через время экспозиции ΔТ измеряли величину изменения сигнала кругового дихроизма биодатчика (ΔА) на временном промежутке ΔТ при облучении циркулярно поляризованным светом на рабочей длине волны ~515 нм и двух дополнительных длинах волн (~450 и ~700 нм).
max
Измеренное значение относительного изменения под действием гипорамина за время ΔТ сигнала кругового дихроизма (ΔА/ΔA), генерируемого гелевым биодатчикам на основе МК ДНК на длине волны ~ 515 нм, компьютер сравнивал с калибровочной кривой (Фиг.5) и выводил на монитор соответствующее ему значение концентрации гипорамина в содержащей его анализируемой жидкости.
max
Результат измерения наличия и концентрации БАВ в жидкости может быть представлен в виде бланка, содержащего информацию о времени и месте проведения анализа, а также типе определяемого вещества и его содержании в анализируемой жидкости. Кроме того, на бланке приводится калибровочная кривая, на которой "жирной" точкой указано экспериментально измеренное и использованное для определения концентрации БАВ в анализируемой жидкости значение результирующего сигнала КД, равного отношению (ΔА/ΔA) за время экспозиции ΔТ.
Как видно из Фиг.4, время определения концентрации БАВ в анализируемой жидкости можно существенно сократить, если измерения величины КД твердотельных биодатчиков, обработанных содержащей БАВ анализируемой жидкостью, производить, не дожидаясь осуществления полной диффузии БАВ в биоматериале, через небольшие одинаковые промежутки времени ΔТ, достаточные для проявления характерной зависимости изменения аномального сигнала КД биодатчика во времени при взаимодействии содержащей БАВ жидкости с чувствительными элементами такого биодатчика. В этом случае калибровочные кривые, используемые для определения неизвестной концентрации БАВ в анализируемой жидкости, должны быть записаны точно в соответствии с вышеприведенной процедурой измерения сигналов КД, то есть через такие же определенные одинаковые промежутки времени ΔТ.
диф
Вычисление скорости диффузии БАВ, содержащегося в анализируемой жидкости в определенной низкой концентрации, в биодатчик производится тем же компьютером средства 10 обработки также на основании результатов, полученных в соответствии с описанной выше процедурой измерения величины изменений сигнала КД, регистрируемого до и после обработки твердотельного биодатчика указанной жидкостью, то есть, измеряя ΔА исходной пробы после полного проникновения БАВ в биодатчик (ΔТ=Т) или через определенные промежутки времени ΔТ (время экспозиции) после начала обработки жидкостью. Такие возможности аналитической системы согласно полезной модели позволяют использовать ее в оптическом диффузометре для определения динамики транспорта БАВ в молекулярные конструкции ДНК.
Компьютер средства 10 обработки осуществляет также необходимое взаимодействие всех элементов устройства, реализует требуемый алгоритм управления и обработки, вырабатывает управляющие сигналы для включения поочередно источников излучения 1, 1a, 1б, вырабатывает напряжение с частотой модуляции для работы модулятора 6 поляризации, формирует опорный сигнал на частоте модуляции для системы 9 регистрации, осуществляет управление терморегулятором 7а температуры устройства 7 для размещения пробы.
Таким образом, аналитическая система согласно полезной модели, благодаря использованию биодатчиков на основе молекулярных конструкций ДНК и новых технических решений, позволяет быстро, точно и с высокой чувствительностью определять в различных жидкостях, в том числе, в биологических жидкостях, например, в крови пациентов, наличие и концентрацию различных биологически активных веществ (противоопухолевые препараты, антибиотики, белки и т.д.), и поможет спасти здоровье и жизнь пациентов в тех случаях, когда другие способы неприменимы или не дают надлежащего эффекта.
Кроме того, настоящая полезная модель, предназначенная для определения наличия и концентрации практически важных классов БАВ, которые тем или иным способом нарушают целостность структуры молекулярных конструкций ДНК биодатчика, позволяет сделать аналитическую систему для определения БАВ в жидкости более простой, более компактной, более мобильной и более простой в обслуживании без ущерба для ее чувствительности.
Аналитическую систему согласно полезной модели возможно использовать в качестве компактной аналитической системы для определения наличия и концентрации БАВ в жидкости и в качестве оптического диффузометра при анализе механизмов транспорта БАВ, разрушающих биодатчик, и определении их коэффициентов диффузии.
Промышленная применимость
Настоящая полезная модель может быть использована в медицинской и клинической биохимии, а также в молекулярной фармакологии, при исследовании фармако-кинетики значимых биологически активных соединений, в фармацевтической промышленности и экологии. Наиболее эффективно его использование в клинической биохимии.
Настоящее полезная модель позволяет во многих случаях заменить сложное и дорогостоящее оборудование, исключив при этом использование высококвалифицированного персонала, и может быть применено в медицинской и клинической биохимии, в практике онкологии, хирургии, гинекологии, при медико-биологическом скрининге, а также в молекулярной фармакологии при исследовании фармако-кинетики значимых биологически активных соединений, в фармацевтической промышленности и экологии. Наиболее эффективно его использование в клинической медицине и биохимии.