Субстратная специфичность мембранных фракций бактерий Gluconobacter oxydans при включении в полиэлектролиты

УДК 57.033+543.9

СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS ПРИ ВКЛЮЧЕНИИ В

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТЫ

А.Г. Быков, Ю.В. Плеханова, А.Л. Ким, А.В. Дубровский, С.А. Тихоненко,

А.Н. Решетилов

Изучена субстратная специфичность мембранных фракций (МФ) бактерий Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280, полученных ультразвуковой дезинтеграцией. МФ рассматривали как альтернативу целым клеткам G. oxydans по использованию в качестве рецепторного элемента биосенсора. Оценку ферментативной активности МФ в отношении субстратов глюкоза, лактат натрия, изопропиловый спирт, этиловый спирт, метиловый спирт проводили до и после включения в состав полиэлектролитных капсул (ПЭК) по изменению их дыхательной активности. Показали снижение каталитической активности после включения МФ в полиэлектролиты. Предположительно снижение связано с химической модификацией, а также с влиянием полиэлектролитов и их комплексов на активность ферментов при включении их в состав ПЭК.

Ключевые слова: Мембранные фракции, полиэлектролиты, субстратная специфичность, кислородный электрод.

Введение

Ранее было показано, что микробные клетки, иммобилизованные в гидрогелевую матрицу более устойчивы к негативным условиям окружающей среды и их изменениям, таким как pH, температура, органические растворители и токсины [1]. Полиэлектролитные гидрогели, представляющие собой полимеры, содержащие звенья с электрически заряженными боковыми функциональными группами, широко используются для иммобилизации ферментов [2]. Включение ферментов в состав капсул из таких полимеров (ПЭК) способствует сохранению их активности в течение длительного времени в сравнении с неиммобилизованными ферментами [3].

В тоже время в процессе включения в полиэлектролитные капсулы (ПЭК) может происходить химическая модификация фермента, сопровождающаяся изменением его каталитическую активность. Так, в работе [4] было показано, что инкубация алкогольдегидрогеназы (АДГ) в раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) приводит к инактивации фермента. Это связано с потерей ионов Zn2+ белковой молекулой за счет образования комплекса между ЭДТА и ионами цинка. При формировании полиэлектролитных капсул одной из стадий является растворение карбонатного компонента ядра ПЭК в растворе ЭДТА, что также может привести к инактивации фермента. Подбор условий при

формировании ПЭК позволяет исключить негативные воздействия на фермент и предотвратить его химическую модификацию [5, 6].

Альтернативой отдельным ферментам могут служить мембранные фракции (МФ) бактерий, представляющие собой ферменты клеточных мембран, локализованные в липидном окружении и находящиеся в более защищенном состоянии по сравнению со свободными ферментами. Известно, что PQQ-зависимые дегидрогеназы (ДГГ), в том числе АДГ, содержатся в составе клеточных мембран бактерий рода Gluconobacter [7]. Поскольку ранее отмечено, что ПЭК способствуют продлению срока активности фермента, представлялось важным выполнить оценку влияния включения МФ в ПЭК на активность ферментов, входящих в состав МФ и защищённых липидным окружением. Продление срока активности МФ может найти применение в биотехнологии, в частности в биотопливных элементах и биосенсорах как более дешевый аналог чистых ферментов.

Целью данной работы являлось изучение субстратной специфичности мембранных фракций бактерий Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280 при включении их в ПЭК. Для этого произведено сравнение субстратной специфичности МФ, иммобилизованных сорбцией на нейтральном носителе (хроматографической бумаге GF/A), и субстратной специфичности МФ, включенных в ПЭК и иммобилизованных сорбцией на нейтральном носителе (GF/A).

Материалы и методы

В работе использованы хроматографическая стеклобумага (тип GF/A, Whatman, Великобритания), кислородный электрод типа Кларка («Кронос», Россия), магнитная мешалка MAGNETIC STIRRER MS01 (Россия), ультразвуковой диспергатор УЗД11-0.1/22 (Россия), центрифуга Eppendorf (Германия). Использованы реагенты Д-сорбит (ООО Диаэм, Россия), дрожжевой экстракт (ООО Диаэм), гидроокись натрия (ООО Диаэм), KH2PO4 (Panreac, Испания), сульфит натрия (ООО Диаэм), D+ глюкоза (Panreac, Испания), лактат натрия 60 % (Реахим, Россия), этиловый спирт гидролизный (Медхимпром, Россия), метиловый спирт (МХК, Россия), изопропиловый спирт (ООО Диаэм), полистиролсульфонат натрия (ПСС, 70 кДа) и полиаллиламингидрохлорид (ПАА, 70 кДа) (Aldrich, Germany); этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (Sigma, Germany); хлорид кальция (Реахим, Россия), карбонат натрия (Реахим, Россия), хлорид натрия (Реахим, Россия).

Культивирование штамма бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius ВКМ B-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов, ИБФМ РАН) описано в работе [8], получение МФ представлено в работе

Получение ПЭК с включенными мембранными фракциями. Составные микросферолиты СаС03-МФ готовили по реакции ионного обмена, смешивая растворы СаС12 и №2СО3 в присутствии МФ. Полиэлектролитные микрокапсулы получали из полианиона ПСС и поликатиона ПАА путем поочередной их адсорбции на поверхность составных микросферолитов СаС03- МФ в растворах полиэлектролитов с концентрацией 2 мг/мл, содержащих 0,5 М №С1. После нанесения необходимого числа слоев карбонатный компонент составного ядра растворяли в 0,2 М растворе ЭДТА в течение 1 ч. Полученные капсулы трижды отмывали бидистиллированной водой для удаления продуктов распада составного ядра СаСОз-белок. Все стадии получения микрокапсул с МФ проводили при 20°С. Полученные капсулы хранили в бидистиллированной воде при +4°С.

Для иммобилизации МФ бактерий О. oxydans B-1280 на кислородном электроде биомассу МФ или МФ в ПЭК взвешивали и ресуспендировали в калий фосфатном буферном растворе (25 мМ, рН 6,5) до конечной концентрации 25 мг сырой массы МФ/мл. Далее 10 мкл полученной суспензии наносили на хроматографическую стеклобумагу размером 3x3 мм2. На рецептор, таким образом, наносилось МФ в количестве 0,25 мг по сырой массе.

Рецепторный элемент оставляли в термостатируемом помещении при 4°С до полного высыхания. Подготовленный таким образом рецепторный элемент размещали на поверхности кислородного электрода типа Кларка (ООО Эконикс-Эксперт) и фиксировали с помощью нейлоновой сетки.

В работе использовали два варианта биосенсоров: а) на основе МФ иммобилизованных сорбцией на нейтральном носителе GF/A, и б) МФ включенных в ПЭК и иммобилизованных сорбцией на нейтральном носителе GF/A.

Измерения проводили в кювете объемом 2 мл в калий фосфатном буферном растворе (25 мМ, рН 6,5) при постоянном перемешивании (200 об/мин), при температуре 20°С. Измеряемым параметром являлась максимальная скорость изменения концентрации кислорода при добавлении субстратов (нА/с).

Результаты и обсуждение

Было изучено влияние иммобилизации МФ в ПЭК на субстратную специфичность биосенсора на их основе, которую оценивали по изменению каталитической активности ферментов МФ.

Для определения активности МФ в измерительную ячейку биосенсора в одинаковой концентрации подавали субстраты, утилизируемые ферментами, входящими в состав МФ. Использовали

субстраты из различных классов химических соединений: сахара, спирты, карбоновые кислоты. Результаты представлены в таблице.

Сигналы биосенсоров на введение различных субстратов

Субстрат Показания биосенсора, а ± s,

МФ МФ в ПЭК

Глюкоза 0,198±0,015 0,013±0,001

Лактат 0,068±0,003 0,015±0,001

Изопропиловый спирт 0,143±0,004 0,010±0,001

Этиловый спирт 0,761±0,010 0,018±0,001

Метиловый спирт 0,017±0,001 0,009±0,002

Примечание: а - средний результат (п = 3-5), s - стандартное отклонение

Для МФ, иммобилизованных сорбцией на GF/A, максимальный сигнал биосенсора был получен на этиловый спирт. Сигнал на введение глюкозы составлял 26 % от сигнала этиловый спирт. Минимальный сигнал был получен на введение метилового спирта и составлял 2 % от сигнала биосенсора на этиловый спирт. В целом величина сигналов биосенсора уменьшалась в ряду субстратов следующим образом: этиловый спирт -глюкоза - изопропиловый спирт - лактат - метиловый спирт.

При иммобилизации МФ в ПЭК наблюдали резкое уменьшение сигналов биосенсора на введение всех исследуемых субстратов. Тем не менее максимальный сигнал биосенсора был получен также на этиловый спирт, но он составлял 2,4 % от подобного сигнала биосенсора на основе МФ, иммобилизованных сорбцией.

Было изучено влияние количества биомассы в составе рецепторного элемента на сигналы биосенсора. В качестве субстрата использовали этиловый спирт, так как на него были получены максимальные сигналы биосенсоров при обоих типах иммобилизации МФ. Как видно из рисунка сигнал биосенсора с МФ в составе ПЭК соответствует сигналу биосенсора с МФ, иммобилизованными сорбцией, в случае, когда концентрация МФ в составе ПЭК в двадцать раз выше.

Заключение

Проведено сравнение субстратной специфичности ферментов МФ, иммобилизованных сорбцией на GF/A, и ферментов МФ, включенных в ПЭК и иммобилизованных сорбцией на GF/A.

Показано, что включение МФ в ПЭК значительно снижает сигнал биосенсора на их основе на введение всех изученных субстратов. Таким образом, показано снижение каталитической активности ряда ферментов МФ (лактатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, глюкозодегидро-

геназы) при иммобилизации их в полиэлектролитные капсулы. В силу характера наблюдаемого ингибирования ферментативной активности исследовать эффект сохранения долговременной стабильности иммобилизованного биоматериала представляется преждевременным.

-38

<

I -39 -

ra

с

о

0 1 -40 -

CD

О

n -41 -

S

Ю

1—

a)

m i— -42 -

О

-43 -

80 100 120 140 160 180 200 Время, с

Виды ответов биосенсоров на введение субстрата (10 мМ этанола) при иммобилизации на рецепторе МФ в концентрации (мг сырого веса на рецепторе): А - 0.25, Б - 0.0125, и МФ, включенных в ПЭК (В), в количестве 0.25 мг сырого веса на рецепторе

Последующие эксперименты будут связаны с выяснением механизма отрицательного влияния ПЭК на активность ферментов в составе клеточных мембран.

Список литературы

1. Park J.K., Chang H.N. Microencapsulation of microbial cells. // Biotechnology Advances. 2000. № 18. P. 303-319.

2. McShane M.J. Enzyme immobilization in polyelectrolyte microcapsules. // Methods Mol. Biol. 2011. № 679. P. 147-154.

3. A technique for incorporating enzymes into polyelectrolyte microcapsules. / S.A. Tikhonenko [et al.]. // Glass Physics and Chemistry. 2007. V. 33. № 3. P. 287.

4. Importance of the structural zinc atom for the stability of yeast alcoholdehydrogenase. / E. Magonet [et al.]. // Biochem J. 1992. № 287. P. 361365.

5. Etsuo K. Polyelectrolyte-coated microcapsules and their potential applications to biotechnology. // Bioseparation. 1998. № 7. P. 241-252.

6. Protein-filled polyelectrolyte microcapsules in the design of enzymic microdiagnostics. / B.I. Sukhorukov [et al.]. // Biophysics. 2007. № 52. P. 575581.

7. Prust C. Complete genome sequence of the acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans. // Nature biotechnology. 2005. V. 23. № 2. P. 195-200.

8. Влияние глутарового альдегида на субстратную специфичность бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ В-1280 / Каманин С.С. [и др.] // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2015. Т.11. № 1. С. 10-19.

9. Buchert. J. A xylose-oxidizing membrane-bound aldose dehydrogenase of Gluconobacter oxydans ATCC 621 // Journal of Biotechnology. 1991. V. 18. № 1-2. P. 103-113.

Быков Александр Геннадьевич, мл. науч. сотр., agbykov(@rambler.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,

Плеханова Юлия Викторовна, канд. биол. наук, науч. сотр., plekhanova(@,ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,

Ким Александр Леонидович, мл. науч. сотр., аспирант, kimerzentaigmail.com, Россия, Пущино, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Москва Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

Тихоненко Сергей Алексеевич, канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник, tikhonenkosaaigmail. com, Россия, Пущино, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

Дубровский Алексей Владимирович, канд. биол. наук, старший научный сотрудник, Dav198@mail. ru, Россия, Пущино, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

Решетилов Анатолий Николаевич, д-р хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatolaiibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

SUBSTRACT SPECIFICITY OF THE MEMBRANE FRACTIONS OF GLUCONOBACTER OXYDANS BACTERIA ON INCLUSION IN

POLYELECTROLITES

A.G. Bykov, Yu. V. Plekhanova, A.L. Kim, S.A.Tikhonenko, A. V. Dubrovsky, A.N.

Reshetilov

The substrate specificity of the membrane fractions (MF) of the bacteria Gluconobacter oxydans VKM B-1280 obtained by ultrasonic disintegration was studied. MF was considered as an alternative to whole cells of G. oxydans for use as a receptor element of a biosensor. Evaluation of the enzymatic activity of MP for the substrates glucose, sodium lactate, isopropyl alcohol, ethyl alcohol, methyl alcohol was carried out before and after inclusion in the composition of polyelectrolyte capsules (PEC) by changing their respiratory activity. The decrease in catalytic activity after MF incorporation into polyelectrolytes was shown. Presumably, the decrease is due to the chemical modification, as well as to the effect of polyelec-

trolytes and their complexes on the activity of enzymes when they are incorporated into the PEC.

Key words: Membrane fractions, polyelectrolytes, substrate specificity, oxygen electrode.

Bykov Aleksandr Gennadievich, junior research scientist, agbykovairambler.ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of Russian Academy of Sciences,

Plekhanova Yuliya Viktorovna, candidate of biological sciences, research scientist, plekhanovaaiibpm.piishchino.ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of Russian Academy of Sciences,

Kim Alexander Leonidovich, graduate student, kimerzentaigmail. com, Russia, Moscow, Moscow State University M. V. Lomonosov, Pushchino, Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of Russian Academy of Sciences,

Tikhonenko Sergey Alekseevich, candidate of biological sciences, Sector Manager, tikhonenkosaaigmail. com, Russia, Pushchino, Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of Russian Academy of Sciences,

Dubrovsky Alexey Vladimirovich, candidate of biological sciences, Research Associate, I)avl98ai mail. ru, Russia, Pushchino, Institute for Theoretical and Experimental Biophysics of Russian Academy of Sciences,

Reshetilov Anatoliy Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, head of laboratory, anatolai ibpm.piishchino. ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganismso j Russian Academy of Sciences