ГИДРОЛИЗОВАННЫЕ ЯИЧНЫЕ БЕЛКИ
HYDROLYSED EGG PROTEINS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу снижения аллергенности яичных белков.
Уровень техники
Пищевые аллергии, из которых наиболее часто встречающейся является аллергия к коровьему молоку, вызываются в большинстве случаев реакцией на содержащиеся в пище белки. В первые годы жизни иммунная система еще находится в состоянии развития и может оказываться не в состоянии распознавать и проявлять толерантность к таким пищевым белкам. Результатом оказывается то, что ребенок или молодое животное относится к пищевому белку как чужеродному веществу и вырабатывает к нему аллергическую реакцию. Пищевые аллергии могут поражать не только людей, но также и других млекопитающих, таких как собаки и кошки.
Обычно пищевая аллергия появляется только после того, как восприимчивый младенец, ребенок или детеныш животного впервые сталкивается с новой пищей. Первые пищевые белки, с которыми, как правило, сталкиваются человеческие младенцы, являются по меньшей мере белками коровьего молока и, как отмечено выше, аллергия на коровье молоко - наиболее часто встречающаяся пищевая аллергия. Общепризнано, что младенцы с установившейся аллергией к коровьему молоку имеют увеличенный риск развития аллергий к другим пищевым белкам, таким как яичные и зерновые белки, но даже у младенцев с успешно развившейся оральной толерантностью к белкам коровьего молока впоследствии могут развиться аллергии к другим пищевым белкам, таким как яичные и зерновые белки, при их введении в рацион в ходе отлучения от груди.
С диетической точки зрения существуют два способа лечения развившейся аллергии: необходимо либо полностью избегать пищевых продуктов, содержащих аллерген, либо пищевые продукты нужно обрабатывать для исключения их аллергенного потенциала, например, подвергать гидролизу. Для этой последней цели производятся смеси для детского питания, содержащие сильно гидролизованные белки коровьего молока (пептиды, состоящие из не более чем пяти аминокислот).
Были предложены и рецептуры смесей для детского питания, содержащие менее сильно гидролизованные белки коровьего молока, - для содействия снижению риска развития аллергии к коровьему молоку, в особенности у детей, которые считаются подверженными такому риску (например, если у ребенка есть по меньшей мере один страдающий от аллергии член семьи). Такие продукты часто характеризуются как гипоаллергенные, термином, определенным в Европейской директиве 96/4/ЕС применительно к молоку как содержащему гидролизованные белки, аллергенность которых по меньшей мере в 100 раз ниже аллергенности негидролизованных белков. Один способ производства гипоаллергенных белков коровьего молока описан в патенте US №5039532.
Было предложено много других способов снижения аллергенности белков коровьего молока, по в сравнению с которыми другим пищевым белкам, часто вызывающим аллергические реакции, таким как яичные белки, было уделено относительно небольшое внимание. Яйца являются превосходным источником белков высокого качества, которые обычно составляют около 12 масс.% съедобной части яйца. Яйца могут употребляться не только в их исходном состоянии, например, в вареном виде или в виде яиц-пашот, либо, например, в омлетах, но они также часто используются как ингредиенты в других продуктах питания как для питательных, так и для функциональных целей. Например, яйца могут использоваться как красители и связующие вещества в таких блюдах, как макаронные изделия, и в качестве загустителей и желирующих веществ в таких блюдах, как пудинги, пироги с заварным кремом и соусы.
Однако овальбумин яичного белка особенно тесно связывается с развитием аллергии. На самом деле, с учетом того, что аллергия к белкам коровьего молока обычно исчезает самопроизвольно в возрасте между двумя и пятью годами, тогда как аллергия к белкам яиц исчезает, как правило, медленнее и может даже сохраняться на протяжении всей жизни, необходимость в снижении аллергенности яичных белков может быть даже более высокой, чем в снижении аллергенности белков коровьего молока. Поэтому задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения гипоаллергенных яичных белков, а также новых пищевых продуктов, содержащих гидролизованные яичные белки.
Раскрытие изобретения
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ производства гидролизованных яичных белков ферментативным способом, включащий первый этап гидролиза, на котором нативные яичные белки подвергают ферментативному гидролизу первой протеазой, промежуточный этап подогрева, на котором продукт первого гидролиза нагревают до температуры, не превышающей 75°С, второй гидролитический этап, на котором продукт этапа промежуточного подогрева подвергают ферментативному гидролизу второй протеазой, и этап инактивации, на котором продукт второго гидролиза нагревают до температуры между 85 и 90°С и выдерживают при этой температуре по меньшей мере в течение 30 минут.
Настоящее изобретение дополнительно распространяется на продукт из яичных макаронных изделий, содержащий гидролизованные яичные белки. Например, продукт может содержать от 50 до 80% муки, от 5 до 15% гидролизованного цельного яйца и 10% воды.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 показывает остаточную OVA-специфическую антигенность яичных гидролизатов.
Фигура 2 показывает снижение аллергенности в функциональном исследовании стимуляции тучных клеток.
Осуществление изобретения
2
2
В данном описании следующие термины имеют следующие значения: «степень гидролиза» или «DH» белка означает количество азота в несвязанных NH-группах, деленное на общее количество азота (NH- и NН-группы), выраженное в процентном виде;
«гидролизованное цельное яйцо» означает цельное яйцо, в котором яичные белки являются частично гидролизованными;
«гипоаллергенное гидролизованное цельное яйцо» означает гидролизованное цельное яйцо, в котором гидролизованные яичные белки имеют аллергенность, которая по меньшей мере в 100 раз ниже аллергенности негидролизованных яичных белков;
«гипоаллергенные яичные белки» означают гидролизованные яичные белки, аллергенность которых по меньшей мере в 100 раз ниже аллергенности негидролизованных яичных белков.
Все указания на проценты, если не оговаривается иного, представлены массовыми процентными долями.
Первая протеаза может быть выбрана из группы, содержащей бактериальные протеазы Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus licheniformis и их смеси, трипсин и панкреатин.
Вторая протеаза может быть выбрана из группы, содержащей бактериальные протеазы Bacillus licheniformis, грибковые протеазы Aspergillus oryzae, трипсин и панкреатин.
Примером бактериальной протеазы Bacillus amyloliquefaciens является фермент, предлагаемый в продаже под торговой маркой Neutrase (нейтраза). Бактериальную протеазу Bacillus licheniformis называют субтилизином, а пример этого фермента предлагается в продаже под торговой маркой Alcalase (алкалаза). Примером смеси бактериальных протеаз Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus licheniformis является ферментная смесь, предлагаемая в продаже под торговой маркой Protamex (протамекс). Примером грибковой протеазы Aspergillus oryzae является фермент, предлагаемый в продаже под торговой маркой Flavourzyme (флавоэнзим). Как известно специалистам в данной области, панкреатин является смесью трипсина и химотрипсина, которая может быть получена из поджелудочной железы свиньи, а сам трипсин может быть получен inter alia из панкреатина.
Особенно предпочтительной комбинацией первой и второй протеаз являются бактериальные протеазы Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus licheniformis в качестве первой протеазы и грибковая протеаза Aspergillus oryzae в качестве второй протеазы. В качестве варианта субтилизин может использоваться и как первая, и как вторая протеаза.
Исходным материалом для способа изобретения являются нативные (интактные) яичные белки в любой удобной жидкой форме. Примером подходящего исходного материала является пастеризованная масса из цельных яиц. Способ изобретения может включить дополнительный этап предварительного подогрева перед первым этапом гидролиза. Подогревание может выполняться при температуре, не превышающей 65°С, и с продолжительностью от 2 до 15 минут.
Температура, при которой выполняются первый и второй этапы гидролиза, продолжительность этих этапов, а также используемые количества первой и второй протеазы выбираются специалистом в данной области, исходя из желательной степени гидролиза готового продукта и известных в данной области свойств выбранных протеаз. Однако общее правило состоит в том, что чем более высокая степень гидролиза требуется, тем более сильная протеаза(-ы) используется, тем длительнее продолжительность гидролиза и тем выше концентрация используемой протеазы. Например, для получения гидролизата с величиной DH между 20 и 25% возможно применение от 2 до 10% фермента (по отношению к массе исходного, предназначаемого для гидролиза материала) на каждом этапе гидролиза, а каждый этап гидролиза будет длиться около двух часов. Конкретные комбинации ферментов могут включать следующие (с использованием исключительно в целях краткости торговых наименований, примененных в качестве примеров ферментов бактериального и грибкового происхождения):
Первая протеаза
Вторая протеаза
Протамекс 5%
Флавоэнзим 5%
Протамекс 2%
Флавоэнзим 2%
Алкалаза 10%
Алкалаза 10%
Алкалаза 5%
Алкалаза 5%
Алкалаза 5-10%
Протамекс 5%
Алкалаза 5-10%
Флавоэнзим 5%
Нейтраза 5-10%
Протамекс 5%
Нейтраза 5-10%
Флавоэнзим 5%
Трипсин 1-5%
Протамекс 5%
Трипсин 1-5%
Флавоэнзим 5%
Панкреатин 1-5%
Протамекс 5%
Панкреатин 1-5%
Флавоэнзим 5%
Аналогично, температура, при которой выполняются этапы гидролиза, выбирается с учетом используемых протеаз, поскольку оптимальная для ферментативной активности температура является фермент-специфической. Компетентные указания по этому вопросу представляются производителем фермента.
В случае некоторых белковых гидролизатов может возникать проблема горького вкуса, и авторы изобретения нашли, что некоторые протеазы и комбинации протеаз дают очень хорошие в этом отношении результаты. Именно по этой причине комбинация бактериальных протеаз Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus licheniformis в качестве первой протеазы и грибковая протеаза Aspergillus oryzae в качестве второй протеазы являются особенно предпочтительными. Кроме того, было найдено, что при использовании этих двух ферментов раздельным добавлением второй протеазы, когда между 10 и 60% второй протеазы прибавляется во время этапа промежуточного подогрева, а остаток прибавляется после завершения этапа промежуточного подогрева, может быть получен гидролизат с особенно хорошим сочетанием органолептических свойств и сниженной аллергенности.
Согласно оценке с помощью методики, описанной Fritsché и др. (Int. Arch. Aller and Appl I mm, 93, 289-293, 1990), обнаружено, что гидролизованные яичные белки, полученные способом настоящего изобретения, имеют аллергенность, сниженную по сравнению с нативными белками яиц по меньшей мере в 100 раз. Таким образом, эти гидролизованные яичные белки и содержащее их гидролизованное цельное яйцо могут быть описаны как гипоаллергенные.
Гипоаллергенное гидролизованное цельное яйцо, полученное в соответствии со способом настоящего изобретения, находится в виде гомогенной жидкости. Оно может использоваться, как таковое или может быть высушено известным в данной области способом, таким как вальцовая сушка, распылительная сушка или лиофилизация, для получения однородного порошка, который является стойким в хранении и может сохраняться до момента требования. Когда порошок восстанавливается с водой, он снова образует гомогенную жидкость.
Гидролизованное цельное яйцо может использоваться вместо цельного яйца в любом пищевом продукте, в который традиционно включаются цельные яйца. Например, гидролизованное цельное яйцо в порошкообразной или жидкой форме может использоваться вместо цельного яйца в таких рецептах, как десерты из запеченного английского крема, пироги с заварным кремом, крем-карамель, бисквиты и пудинги, такие как рисовый пудинг. В качестве варианта гидролизованное цельное яйцо может использоваться для приготовления таких блюд, как омлеты и яичница-болтунья, после восстановления при необходимости в воде. Гипоаллергенное гидролизованное цельное яйцо является особенно подходящим ингредиентом для пищевых продуктов, предназначаемых для младенцев и маленьких детей, в частности, для пищевых продуктов, пригодных для использования на ранних стадиях отлучения ребенка от груди. Кроме того, гидролизованное цельное яйцо может применяться вместо цельного яйца, традиционно используемого для приготовления таких продуктов.
Как отмечалось выше, аллергии к пищевым белкам не ограничиваются людьми, и получаемое с помощью способа настоящего изобретения гидролизованное яйцо может также применяться в производстве продуктов питания для животных, в частности, для животных-компаньонов, таких как собаки и кошки. Поэтому гидролизованное яйцо может также использоваться для замены цельного яйца в пищевых продуктах, предназначенных, например, для недавно переставших получать грудное вскармливание щенков и котят.
Изобретение дополнительно распространяется на продукт из яичных макаронных изделий, содержащий гидролизованные яичные белки. Например, продукт может содержать от 50 до 85% муки, от 5 до 15% гидролизованного цельного яйца и 10-40% воды. Предпочтительно мука является манной мукой из пшеницы твердых сортов. Гидролизованное цельное яйцо может быть получено любым подходящим способом, включая, но не ограничиваясь, способом, описанным выше.
Продукт в виде макаронных изделий может быть приготовлен смешиванием с водой гидролизованного цельного яйца в форме порошка, затем смешиванием с яйцом и водой муки и экструдированием полученной смеси в желательной форме, такой как макароны, лапша, ракушки, спагетти и т.д.
Экструдированные формы могут бланшироваться, покрываться маслом, подвергаться быстрой заморозке, заполняться в подходящие контейнеры и сохраняться в морозильнике при, например, -25°С до момента требования. Типичная композиция замороженных макаронных изделий согласно изобретению может быть представлена на 56,5% манной мукой из пшеницы твердых сортов, на 6,2% гидролизованным цельным яйцом, на 34,6% водой и на 2,7% подсолнечным маслом.
В качестве варианта экструдированные формы могут бланшироваться, покрываться маслом, заполняться в подходящие контейнеры и охлаждаться, например, до температур от 5 до 7°С. Типичная композиция охлажденных макаронных изделий согласно изобретению может быть представлена на 53,7% манной мукой из пшеницы твердых сортов, на 8,9% гидролизованным цельным яйцом, на 34,8% водой и на 2,7% подсолнечным маслом.
В качестве еще одного варианта, экструдированные формы могут высушиваться с использованием известных в данной области технологий, заполняться в подходящие контейнеры и сохраняться при температуре окружающей среды до момента требования. Типичная композиция высушенных макаронных изделий согласно изобретению может быть представлена на 80,4% манной мукой из пшеницы твердых сортов, на 7,6% гидролизованным цельным яйцом, на 12,0% водой и на 2,75% подсолнечным маслом.
Далее изобретение иллюстрируется на основании нижеследующих примеров.
Приготовление яичных гидролизатов
Исходным материалом являлась пастеризованная яичная масса из цельного яйца FT/OVO/0105 R, ABCD S.A., Avicole Bretonne Cecab Distribution (Ploermel, Франция).
Пример 1
30 кг яичной массы из цельного яйца нагревалось при 65°С в течение 10 минут при перемешивании со скоростью 250 об/мин. После охлаждения до 55°С было добавлено 2% ферментов Protamex (партия PW2A1006, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Дания) и смесь выдерживалась при 55°С в течение 2 часов. После этого первого этапа гидролиза было добавлено 1% фермента Flavourzyme 1000 L (партия 400904, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Дания) и смесь нагревалась в течение 10 мин при 75°С. Затем смесь охлаждалась до 55°С, добавлялись следующие 1% ферментов Flavourzyme и смесь выдерживалась при 55°С в течение 2 часов. После этого второго этапа гидролиза смесь нагревалась в течение 30 минут при 90°С и затем высушивалась распылительной сушкой для получения гидролизованного яичного порошка, который сохранялся в поддерживающем свежее состояние продукта алюминиевом пакете.
Пример 2
35 кг яичной массы из цельного яйца нагревалось при 65°С в течение 10 минут при перемешивании со скоростью 250 об/мин. После охлаждения до 55°С было добавлено 5% ферментов Protamex (партия PW2A1006, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Дания) и смесь выдерживалась при 55°С в течение 2 часов. После этого первого этапа гидролиза было добавлено 1% фермента Flavourzyme 1000 L (партия 400904, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Дания) и смесь нагревалась в течение 10 мин при 75°С. Затем смесь охлаждалась до 55°С, добавлялись следующие 4% ферментов Flavourzyme и смесь выдерживалась при 55°С в течение 2 часов. После этого второго этапа гидролиза смесь нагревалась в течение 30 минут при 90°С и затем высушивалась распылительной сушкой для получения гидролизованного яичного порошка, который сохранялся в поддерживающем свежее состояние продукта алюминиевом пакете.
Пример 3
30 кг яичной массы из цельного яйца нагревалось при 65°С в течение 10 минут при перемешивании со скоростью 250 об/мин. После охлаждения до 55°С было добавлено 10% ферментов Alcalase 2.4L (партия 500357, NOVOZYMES A/S Bagsvaerd, Дания) и смесь выдерживалась при 55°С в течение 2 часов. После этого первого этапа гидролиза смесь нагревалась в течение 10 мин при 75°С. Затем смесь охлаждалась до 55°С, после чего было добавлено еще 10% ферментов Alcalase и смесь выдерживалась при 55°С в течение 2 часов. После этого второго этапа гидролиза смесь нагревалась в течение 30 минут при 90°С и затем высушивалась распылительной сушкой для получения гидролизованного яичного порошка, который сохранялся в поддерживающем свежее состояние продукта алюминиевом пакете.
Общий азот в гидролизатах определялся по методике Дюма (способ Карло Эрба). Степень гидролиза измерялась способом TNBS согласно Adler-Nissen (J. Agric. Food. Chem. 1979 27: 1256-1262). Было найдено, что гидролизат из Примера 1 имеет величину DH в 20%, гидролизат из Примера 2 - DH в 23% и гидролизат из Примера 3 - DH в 25%.
Продукты, содержащие гидролизованное цельное яйцо
Пример 4
Пример ингредиентов для сладкого яичного пудинга, содержащего гидролизованное яйцо, состоит в следующем:
Ингредиент %
Цельное молоко (жирность 3,5%)
62,0
Вода
24,3
Сахар
5,5
Гипоаллергенный яичный порошок
2,5
Кукурузный крахмал
3,0
Маниоковый крахмал
2,0
Ванильный ароматизатор
0,7
Такой пудинг может быть приготовлен любым известным в данной области подходящим способом.
Пример 5
Пример ингредиентов для пикантного яичного пудинга, содержащего гидролизованное яйцо, состоит в следующем:
Ингредиент %
Цельное молоко (жирность 3,5%)
62,0
Вода
21,5
Замороженная морковь кубиками
10,0
Гипоаллергенный яичный порошок
1,5
Кукурузный крахмал
3,0
Маниоковый крахмал
2,0
Такой пудинг может быть приготовлен любым известным в данной области подходящим способом.
Пример 6
Пример ингредиентов для яичных макаронных изделий, содержащих гидролизованное яйцо, состоит в следующем:
Ингредиент %
Крупчатка из пшеницы твердых сортов
72
Вода
22
Гипоаллергенный яичный порошок
6
Такие макаронные изделия могут быть приготовлены любым известным в данной области подходящим способом.
Остаточная антигенность яичных гидролизатов
Остаточная антигенность альбумина яичного белка (OVA) в гидролизатах Примеров 1, 2 и 3 определялась ингибированием с поликлональной кроличьей антисывороткой с антителами к белку OVA с помощью иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Лунки пластин для микротитрования покрывались 100 мкл раствора OVA концентрацией 50 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере и выдерживались 24 часа при 4°С. Пластины четырежды промывались в PBS-Tween-буфере и их незанятые участки закупоривались добавлением в каждую такую лунку по 200 мкл рыбного желатина (0,5% в PBS-Tween). Пластины выдерживались 1 час при комнатной температуре (RT) и снова 4 раза промывались в PBS-Tween.
В отдельных пробирках в течение 1 часа при комнатной температуре инкубировались 1 часть стандартного препарата OVA или образца для испытаний с 1 частью кроличьих антител к белку OVA (разведение 1:20000). После инкубирования 100 мкл этой ингибирующей смеси прибавлялось к вышеупомянутым покрытым и закупоренным лункам и выдерживалось в течение 2 часов при комнатной температуре. Пластины четырежды промывались в PBS-Tween. Затем прибавлялся козий антикроличий меченный пероксидазой конъюгат (0,1 мл раствора с разведением 1:2000), пластины выдерживались в течение 1 часа при комнатной температуре и промывались 4 раза в PBS-Tween. Добавлялся хромогенный субстрат (0,1 мл о-фенилендиамин). После инкубации в течение 15 минут с помощью ИФА-спектрофотометра для прочтения планшетов определялась оптическая плотность при 492 нм.
Результаты представлены на Фигуре 1, из которой видно, что OVA-специфическая антигенность гидролизатов из Примеров 1-3 по сравнению с интактным белком яиц была снижена более чем в 10000 раз.
Остаточная аллергенность яичных гидролизатов
5
3
5
3
Для определения IgE-зависимой аллергенности антигенной молекулы (OVA) было проведено in vitro функциональное исследование выделения меченного тритием серотонина из сенсибилизированных тучных клеток крысы согласно ранее описанному в литературе (Fritsché и др. J. Allergy Clin. Immunol, №2, том 100, стр.266-273). Вкратце, тучные клетки были получены от нормальных крыс линии Спраг-Доули перитонеальными промывками в модифицированной Дульбекко среде Игла, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку. Клетки промывались в этой среде и выдерживались в течение ночи при 4°С. После двух промывок в фосфатно-HEPES-рыбно-желатиновом буфере (PHG) с рН 7,0 клетки повторно суспендировались в том же самом буфере в концентрации 5×10 клеток в 1 мл и разбавлялись одним объемом богатой IgE-антителами к OVA крысиной сыворотки, содержащей 5 мкКи/мл Н-серотонина. После инкубации в течение 2 часов при 37°С клетки далее трижды промывались в PHG и повторно суспендировались в PHG при концентрации 2,5×10 клеток в 1 мл. Сенсибилизированные тучные клетки распределялись по пластинам микротитратора (по 0,1 мл в каждой лунке) и смешивались с 0,05 мл последовательных разведений гидролизованного яичного белка, полученного согласно Примеру 2 (1/10 начиная от 10 мг/мл). Смесь выдерживалась 60 минут при 37°С и центрифугировалась. Аликвота (0,05 мл) супернатанта смешивалась с 2 мл сцинтилляционной жидкости и с помощью счетчика β-излучения фирмы Packard измерялось испускание H.
Результаты показаны на Фигуре 2, из которой видно, что гидролизованное яйцо имело сильно сниженную аллергенность (25 мкг OVA/г белковых эквивалентов) и что эта низкая величина сохранялась при включении гидролизованного яйца в десерт типа пирога с фруктами.