Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis для очистки нефтезагрязненных почв, водоемов и сточных вод от нефтяных углеводородов, в том числе для окисления полиароматических соединений
YEAST RHODOTORULA GLUTINIS FOR THE CLEANING OF OIL-POLLUTED SOILS, WATER AND WASTE WATER TO REMOVE OIL HYDROCARBONS, INCLUDING FOR THE OXIDATION OF POLYAROMATIC COMPOUNDS

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма дрожжей, эффективного для очистки нефтезагрязненных водоемов, сточных вод от нефтяных углеводородов, в том числе для окисления полиароматических соединений.
Известен консорциум дрожжей Candida maltosa ВКПМ У-2256 и У-2257, предназначенный для очистки воды, почвы и др. объектов от нефтезагрязнений [RU №97109191/13 С1, C12P 39/00, C12N 1/16, C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/16, C12R 1/72, опубл. 27.06.1998].
Известен штамм дрожжей Rhodotorula sp. 51-18-2 Р-Y-2993D, используемый для очистки почв, вод, сточных вод, шламов от нефти и нефтепродуктов [RU №2 526 496 C1, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, C12N 1/26, опубл. 20.8.2014].
В описании патентов отсутствуют данные по снижению полициклических ароматических нефтепродуктов.
Задача изобретения - получение штамма дрожжей, обеспечивающего биодеструкцию в водных средах нефтяных углеводородов, в том числе полиароматических соединений.
В этом состоит технический результат.
Для достижения технического результата в 2014 году из пробы нефтяного шламонакопителя Усинского района Республики Коми выделен штамм Rhodotorula glutinis, способный к нефтеокислению. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM Y-2998D.
3
2
4
4
2
Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 20 г, NaNO - 3,0 г; KHPO - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO×5HO - 0,5 г., 15-25°С, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма.
Колонии красные слизистые выпуклые блестящие гладкие, край ровный.
Клетки почкующиеся округлые, овальные, 2.5-6.0 × 4.0-8.5 мкм, с небольшой капсулой. Баллистоспоры и псевдомицелий отсутствуют.
Образование истинного мицелия и телиоспор не наблюдалось как в монокультуре, так и при скрещивании с типами спаривания Rhodosporidium babjevae Golubev, R. paludigenum Fell et Tallman и R. toruloides Banno.
Сахара не сбраживает.
Ассимилирует глюкозу, мальтозу, мелецитозу (слабо), L-арабинозу (слабо), рамнозу (медленно), сорбит, маннит, этанол. Не ассимилирует лактозу, эритрит, арабит, дульцит, инозит, глюкуронат.
Усваивает нитраты, нитриты (медленно), лизин, этиламин (слабо).
Крахмалоподобные вещества не образует.
При +37°С не растет.
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
3
2
4
4
2
Режим хранения штамма - длительноe хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 30 г, NaNO - 3,0 г; KHPO - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO×5HO - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0 г; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.
Способность штамма к биодеструкции нефти и нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах со сточной водой, загрязненной нефтью, результаты приведены в примерах ниже.
Пример 1. Разрушение углеводородов в воде
3
2
4
4
2
Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт в присутствии сырой нефти. На 1 л воды добавляли NaNO - 2,0 г; KHPO - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO×5HO - 0,5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл, стерилизовали их в течение часа в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, затем до температуры экспозиции в холодильнике, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной суспензией живой культуры Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D с титром живых клеток 10 млрд.клеток/1 мл в количестве 1 мл на колбу. Контрольную колбу микроорганизмами не заражали. Во все колбы добавляли по 0,5 г сырой нефти. Условия опыта: температура + 23°С, культивировали в течение 7 суток при 220 об/мин.
Массовую концентрацию нефтепродуктов в образцах определяли гравиметрическим методом, ПНД Ф 14.1:2.116-97 [Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах вод методом колоночной хроматографии с гравиметрическим окончанием. ПНД Ф 14.1:2.116-97]. Результаты анализа концентрации углеводородов приведены в таблице 1. Как видно из данных анализа, в присутствие штамма Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D происходит снижение концентрации растворенных в воде углеводородов на 46%.
Таблица 1
Массовая доля углеводородов после внесения штамма
Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D
Варианты опыта
Содержание нефтепродуктов, мг
Контроль (среда + 0.5 г нефти)
445,0±133,5
Среда + 0.5 г нефти + 5 мл штамма Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D
236,0±70,8
Пример 2. В течение опыта проводили оценку состава полиаренов. В основу определения полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в почве положена методика М 03-04-2002 - измерение массовой доли бенз[a]пирена в пробах почв, грунтов донных отложений и твердых отходов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием анализатора “Флюорат-02” в качестве флуориметрического детектора [Габов Д.Н., Безносиков В.А., Кондратенок Б.М., Яковлева Е.В. Закономерности формирования полициклических ароматических углеводородов в почвах Северной и Средней тайги // Почвоведение. 2008. № 11. С. 1334-1343].
Таблица 2
Массовая доля ПАУ после внесения штамма Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D
Контроль (среда + нефть)
Среда + нефть + штамм Rhodotorula glutinis
флуорен
828700
217500
фенантрен
114700
47070
антрацен
1900
2025
флуорантен
380
555
пирен
21500
9735
бенз[а]антрацен
4360
495
хризен
11550
16860
бенз[b]флуорантен
7550
3165
бенз[к]флуорантен
140
90
бенз[а]пирен
690
615
сумма ПАУ
991340
289110
Культура дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D быстро и эффективно трансформировала исключительно низкомолекулярные ПАУ, тогда как высокомолекулярные ПАУ окислялись слабо или же не окислялись совсем (табл. 2). Эксперимент показал, что за 7 дней микроорганизмы метаболизировали до 72% низкомолекулярных ПАУ (от флуорена до пирена), а также отмечен прирост высокомолекулярных ПАУ (от хризена до бенз[а]пирена) на 4%. В значительной степени за 7 суток произошло снижение доли отдельных ПАУ: флуорена, фенантрена, пирена и бенз[а]антрацена.