Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в биореакторе с диффузором

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2015. Вып. 4. С. 294-302 Биология

УДК 579.2:579.66:579.695:577.2

Культивирование дрожжей Басскатотусев cerevisiae в биореакторе с диффузором

Н. В. Ширшиков, Ю. В. Редикульцев, А. Н. Сизов, Д. А. Шевелев, В. В. Безручко, А. Б. Гаврилов

Аннотация. Обсуждаются вопросы асептического культивирования микроорганизмов в биореакторе с направленным потоком культуральной жидкости, который достигается применением диффузора и турбинной мешалки. Применение данного типа перемешивания обеспечивает стабильность массопереноса по кислороду, достаточного для получения высокого выхода по биомассе, а также удержание пены без применения пеногасителя, что является важным при получении субстанции клеток, используемых для производства препарата пищевого назначения. Обсуждается использование комплексных сред, исключающих химические реагенты. Рассматриваются также вопросы общей организации системы культивирования, дозирования компонентов и измерения ряда физиологических параметров.

Ключевые слова: биореактор, культивирование дрожжей, направленный поток жидкости, аэрация, комплексные среды.

Введение

В производстве пищевых добавок достаточно широко используются разные микроорганизмы и в том числе дрожжи. На этом основании проблемы процессов культивирования дрожжей достаточно актуальны.

Однако, как правило, использование типовых питательных сред или сред с минеральными компонентами, требует дополнительных технологических стадий для получения чистых «отмытых» клеток, которые далее как субстанции применяются для пищевых целей. В данной работе продемонстрировано использование комплексных сред на основе пшеничного солода и соевой муки для обеспечения выхода по биомассе дрожжей с титром около 109 клеток/мл в ущерб некоторой оптимальности, поскольку сочетание минеральных и комплексных компонентов в питательных средах дает возможность получать более плотные культуры. Другой аспект, который рассматривался в работе, это отсутствие пеногасителей, как органических типа софэксила, так и пищевых масел, например, подсолнечного. Решение этой задачи по-

требовало использование реактора со специальной вставкой - диффузором и турбинной мешалкой. Режимы культивирования и частично конструкции аппаратов данного типа описаны в работах [1-3]. Основной принцип, заложенный в систему аэрации, это уход от турбулентного, хаотического движения жидкости в биореакторе и реализация направленного, циклического потока. Циклический поток культуральной жидкости с границы раздела фаз «газ - жидкость» при продувке воздухом наджидкостной полости забирает в поток «слой» жидкости, максимально насыщенный кислородом аэрирующего воздуха. Циклический поток гомогенно распределяет насыщенный «слой» культуральной жидкости по всему объему, производя тем самым аэрацию и перемешивание всего объема.

Таким образом, чтобы управлять насыщением кислородом воздуха куль-туральной жидкости в широких пределах, необходимо контролировать два параметра: обороты мешалки и расход входящего в наджидкостную полость аэрируещего воздуха.

Материалы и методы

Использовали ферментер фирмы «Биотек» (Швеция) объемом 10 л и рабочим объемом 6 л, снабженный узлом перемешивания с диффузором, модифицированным электроприводом от DC-мотора мощностью 0.2 кВт и регулятором оборотов с ручной уставкой числа оборотов. Парогенератор оригинальной конструкции объемом 20 л электрической мощностью 4 кВт с блоком терморегулирования на основе температурного контроллера ОМ-РОН (Япония) и ручной дозаправкой воды. Измерительную ячейку с насосом, снабженную стерилизуемым рН электродом запаянной конструкции ЭС-71-11 [4] и элемент термометрический платиновый ЭЧП 001 (100 Pt) [5]. Паростерилизуемые разъемы установлены по линиям подачи воздуха, инокулята, загрузки питательной среды, выхода продукта и слива. Входной фильтр воздуха стеклянный, набитый нетканым материалом. Систему выходной фильтрации, состоящую из емкости с входной трубкой и выходной трубки с фильтром (вся конструкция стерилизуется в автоклаве). Блок дозаторов d1, d2 (рис. 1) для обеспечения работы смешивающей камеры и измерения оптической плотности культуральной жидкости, а также для дозирования в биореактор через дозатор d2 из емкости S дополнительных добавок и элементов питательной среды.

Использовали клапанную систему, состоящую из пережимных клапанов и приводных 3/2 электропневмопреобразователей фирмы SMC (Япония), двухуровневую систему управления, состоящую из контроллера и РС. Контролер реализован на базе микрочипа ATmega128 (США), который обеспечивает работу всего «железа» на уровне датчиков и исполнительных элементов. Контроллер имеет 2 модуля измерения температуры по 2 канала на модуль, модуль измерения кислотности рН, растворенного кислорода рО2, и 48 оптоизолированных каналов вывода (320 ма, 60 в, DC) для обеспечения

Рис. 1. Схема ферментационной установки. 1-11 - управляющие клапаны, 12 - биореактор, 13 — диффузор, 14 — измерительная ячейка, 15 - термостат, 16-21 - паростерилизуемые разъемы, 22-24 - воздушные фильтры, 25 - емкость в линии выходящего воздуха, - дозатор объемом 1 мл, ё2 - дозатор объемом 30 мл, 8 - емкость субстрата подпитки, М - смеситель

работы клапанной системы. Контроллер сопряжен с персональным компьютером (РС) по каналу RS232. На уровне РС реализована одна из последних к моменту этой публикации версия программной системы ИБП РАН [6]. Даная программная система реализована на Visual C и функционирует под всеми версиями Windows, имеет минимальные требования к системным ресурсам и конфигурации компьютера. Система реализует удобные элементы пользовательского интерфейса, управление исполнительными элементами, параметризацией процесса и визуализацией состояния ферментации, архивацию данных. Существует диалект технологического языка для написания и интерпретации процедур управления по алгоритмам пользователя, набор данных процедур отображается в меню программы и составляет ядро системы управления ферментационным процессом. В качестве инокулятора использовали микроферментер объемом 250 мл, снабженный фильтрами, барботером и посевной трубкой. Для исследований использовался изолят дрожжей Saccharomyces cerevisiae из лабораторного музея отдела «Биотех-

нологии» Института биологического приборостроения Российской Академии Наук (ИБП РАН).

Стерилизация установки и модулей. Стерилизация ферментера, измерительной ячейки, системы дозирования, коммуникационных трубопроводов, инокулятора и паростерилизуемых разъемов осуществлялась проточным паром от локального парогенератора. Стерилизация внешнего входного фильтра аэрации, емкости и фильтра отходящего газа, емкости с питательной средой и др. проводилась в режиме автоклавирования.

Питательная среда. Основой питательной среды является пшеничный солод и соевое зерно. Солод был приготовлен по стандартной методике, представленной в работе [7]. Из данных компонентов приготовлен грубый размол солода и сои по 200 г каждого компонента. 400 г размола заваривали кипящей профильтрованной водопроводной водой в 3-литровой емкости и оставляли на 2 ч, таким образом осуществлялся частичный гидролиз крахмалистых и белковых компонентов сырья ферментами солода. Затем развар перенесли в 10-литровую бутыль и довели паром от парогенератора температуру раствора до кипения и парили 30 мин. Полученную таким образом суспензию профильтровали через сетчатый фильтр в 20-литровую бутыль. Содержимое фильтра несколько раз промывали кипящей водой в ту же бутыль, доведя общий объем среды до 15 л. Бутыль оснастили типовой арматурой с подающими трубками и фильтром и стерилизовали в автоклаве 45 мин при 117°С, рН до стерилизации 7.2.

Выращивание посевного материала. Выращивание инокулюма осуществляли в микроферментере объемом 250 мл, на питательной среде основного состава объемом 200 мл. Смыв с косяка культуры БассНагошусев сегеугвгае осуществляли под пламенем горелки в боксе, затем смыв пипеткой перемещали в инокулятор через посевную трубку. Аэрацию инокулятора осуществляли барботированием от мембранного микрокомпрессора с расходом 0.1 л/ мин, при температуре 25 °С, рН среды 7.2. Время культивирования 36 ч. Финальный титр 10 9 клеток/мл.

Посев и культивирования в биореакторе. В биореактор загрузили питательную среду объемом 6 л; данный объем среды является оптимальным для требуемого режима перемешивания, когда турбинная мешалка полностью захватывает поток жидкости, обеспечивая тем самым максимальный массообмен через поверхность газ - жидкость.

Инокуляцию осуществили путем перетока КЖ из инокулятора в биореактор, при этом загрузки среды и инокулюма осуществлялись через паростери-лизуемый разъем, расположенный в крышке биореактора. Стартовый титр в биореакторе при посеве составил 105 клеток/мл; рН - на уровне 7.0; расход воздуха 10 %, что при максимальной шкале ротаметра 4.2 л/мин составило 0.42 л/мин. После отбора пробы через 10 часов роста титр составил 10 7 клеток/мл, что позволило судить о начале ранней экспоненциальной фазы роста культуры, расход увеличили до 30 % на протяжение всей активной ростовой фазы, которая продолжалась 12 ч. В конце активной стадии титр достиг

значения 10 9 клеток/мл и больше не увеличивался, несмотря на увеличение интенсивности аэрации и внесение дробных добавок энергетического субстрата, что позволяет сделать вывод, что с большой вероятностью культура утилизировала основные компоненты среды: азот, фосфор, углеводы.

Дозирование субстрата. Подготовили емкость с концентрированным питательным раствором, содержащим сахаразу в концентрации 373 г/ли сернокислый магний в концентрации 2.6 г/л, общий объем раствора 750 мл. Емкость стерилизовали в автоклаве 40 мин при 110 °C. Данный компонент питательной среды использовался для обеспечения подпитки в режиме дробного внесения субстрата. Дозирование осуществлялось программной процедурой управления с помощью дозатора d2 объемом 30 мл. Концентрация компонентов в дозе подпитки 30 мл составляла 11.2 г/л и 0.04 г соответственно для сахарозы и сернокислого магния. Таким образом, с единичной дозой в биореактор с объемом культуральной жидкости 6 л поступало по 1.86 г сахарозы и 8 мг сернокислого магния. Манипуляция дозированием осуществлялась после достижения культурой стационарной фазы роста на 23 ч, 25 и 32 ч роста. Соответственно, за две процедуры подпитки внесено 2 дозы субстрата и в третьей процедуре - 5 доз субстрата.

Функционально данная система культивирования позволяет реализовать не только операторский режим внесения доз субстрата, но и режимы типа fed-batch по изменению параметров культуры, объемно-доливной режим и хемостат.

Результаты и обсуждение

На рис. 2 представлены экспериментальные данные процессов культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Кривая роста построена на основании титров клеток, полученных из проб в первые 30 ч роста. Следует отметить, что процесс культивирования сопровождался достаточно «длинным» лагом, около шести часов. Вероятно, это связано с температурной адаптацией культуры, поскольку посевной материал предварительно хранился в холодильнике. Тем не менее, анализ кривой роста показывает, что активная фаза продолжалась фактически 18-19 ч, что очень мало для этой культуры. Столь быстрый рост данной культуры сахаромицетов (расчетная по кривой роста удельная скорость роста составила 0.29 1/ч) наблюдается впервые именно в биореакторе с диффузором на представленной в этой работе комплексной среде. Причинами быстрого роста могут быть как «попадание» в состав среды, так и обнаружение в процессе эксперимента факторов оптимальности аэрации и перемешивания, что дает основание говорить об управлении лимитированием по кислороду. Лимитирование по кислороду как фактор ограничения скорости роста наблюдается практически в каждом процессе. В классических биореакторах с лопастной мешалкой и турбулентным (хаотическим) характером движения жидкости трудно параметризовать процессы аэрации и перемешивания (использование критериев подобия типа

Рейнольдса, Пекле и др. мало информативно и всегда затруднено методически) [8, с. 133]. Как следствие хаотического движения для классических биреакторов, зависимость числа оборотов от вкладываемой мощности имеет весьма короткий участок «регулирования», т.е. мощность вкладывается больше, а аэрация увеличивается слабо. В биоректоре с диффузором мы имеем возможность управления аэрацией и перемешиванием в широких пределах как за счет манипулирования расходом (в том числе и изменением давления в наджидкостной полости), так и за счет манипулирования оборотами турбиной мешалки (вводимой мощности). Положительным эффектом циклически направленного движения жидкости в биореакторе с диффузором является снижение уровня пены. Если в турбулентных реакторах пена накапливается без ограничений за счет естественных ПАВов питательной среды и как дисперсная среда пена не участвует в движении жидкости или, скорее, слабо участвует, то в биореакторе с диффузором пена вовлекается в поток жидкости и достигает в нем динамического равновесия, т.е. сколько пены создается, столько и разрушается в циклическом потоке жидкости.

Рис. 2. Динамика параметров культивирования дрожжей

Анализ других параметров процесса показывает, что рН в течение всего процесса культивирования менялся слабо, что свидетельствует о явной «забуференности» комплексной питательной среды, расход воздуха на аэрацию в активной фазе роста культуры в наджидкостную полость составлял 30% от верхнего предела шкалы ротаметра, или 1.25 л/мин. Тем не менее, этот сравнительно малый расход обеспечил высокий титр. Процесс культивирования происходил при комнатной температуре в режиме отсутствия термостатирования, поскольку температурный оптимум культуры находится вблизи 22 °С. В результате малоинерционный датчик температуры отслежи-

вал аэробную энергетику процесса роста дрожжей на фоне процесса перемешивания и продувки дисперсной среды КЖ воздухом (возможно дисперсность и продувка воздухом сыграли роль аутостабилизации температуры в процессе; по крайней мере, температура КЖ не росла, а снижалась к уровню своего оптимального значения во время всей активной фазы роста). Побочным положительным эффектом этих рассуждений может стать то, что в терморегуляторах для исследовательских биореакторов кроме, собственно фиксации значения температуры должно фиксироваться также количества тепла и хладагента; фиксироваться и выдаваться как параметры процесса. Это в равной степени может относиться и к измерению рН. После достижения максимального уровня по биомассе процесс культивирования перешел в стационарную фазу роста, которая продолжалась еще 30 ч до остановки процесса и слива КЖ. В этой фазе были произведены попытки реализовать отъемно-доливной режим культивирования; для этого осуществили подпитку раствором сахарозы с сернокислым магнием в дозах, приведенных в материалах и методах. Следует полагать, что культура дрожжей почти полностью потребила основные компоненты питательной среды (углеводы, фосфор, азот), поэтому рН не изменился при внесении субстрата, а на кривой температуры были зафиксированы слабые пики, характерные, скорее, для процессов биосинтеза или трансформации, но эти явления и процессы находятся вне основных целей эксперимента.

Выводы

Таким образом, в данном процессе культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae в биореакторе с диффузором осуществили поставленные цели: разработку и применение комплексной среды без применения минеральных компонентов с достижением высокой плотности культуры с титром 109, при этом процесс культивирования провели без пеногасителя. Процесс культивирования демонстрирует тот факт, что, используя биореактор с диффузором, возможно получать клеточную субстанцию для производства препаратов пищевого назначения с высокими потребительскими качествами.

Список литературы

1. Борман Е.А., Редикульцев Ю.В., Кощеенко К.А. Трансформация ситостерина в 9а-оксиандростендион культурой Mycobacterium sp. 207 в присутствии адсорбционной смолы // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т 28. Вып. 4. С. 551-556.

2. Способ выращивания микроорганизмов. А.с. 13008624. Опубл. 07.05.1987. Бюл.№17.

3. Установка для производства биопродукта. Пат. №2123525. Опубл. 20.12.1998. Бюл.№35.

4. Официальный сайт завода-изготовителя: http://zipgomel.by/ES-71-11

5. Официальный сайт завода-изготовителя: http://www.vladetalon.ru/Download/ katalog-tsp.pdf

6. Официальный сайт Института биологического приборостроения Российской Академии Наук (ИБП РАН http://www.ibp-ran.ru/units/nauchno-issledovatelskie _podrazdeleniya/otdel_razrabotki_eksperimentalnoy_apparatury_i_programmn-ogo_obespecheniya/

7. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов: справочник. М.: Агропромиздат, 1990. 240 с.

8. Виэстур У.Э., Кузнецов А.М., Савинков В.В. Системы ферментации. Рига: Зинатне, 1986. 368 с.

Ширшиков Николай Васильевич (nshirshikov@gmail.com), ведущий биотехнолог, отдел биотехнологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН, Пущино.

Редикульцев Юрий Васильевич, руководитель группы, отдел биотехнологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН, Пущино.

Сизов Алексей Николаевич, руководитель отдела, отдел разработки экспериментальной аппаратуры и программного обеспечения, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН, Пущино.

Шевелев Дмитрий Александрович (dmitri@alditech.ru), ведущий программист, отдел разработки экспериментальной аппаратуры и программного обеспечения, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН, Пущино.

Безручко Владислав Валерьевич, ведущий инженер-электронщик, отдел биотехнологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН, Пущино.

Гаврилов Анатолий Брониславович, руководитель отдела, отдел биотехнологии, Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН, Пущино.

Cultivation of the yeast Saccharomyces cerevisiae in a bioreactor with a diffuser

N.V. Shirshikov, Yu.V. Redikultsev, A.N. Sizov, D.A. Shevelev, V. V. Bezruchko, A. B. Gavrilov

Abstract. The article discusses the aseptic culturing microorganisms in a bioreactor with directional flow of the culture fluid, which is achieved by using a diffuser, and a turbine agitator. The use of this type of mixing provides stability to oxygen mass transfer sufficient to obtain high yields of biomass and retention

foam without defoamer, which is an important substance in the preparation of cells used for the production of edible product. We discuss the use of complex mediums, excluding chemicals. We also consider issues of general organization of the system of cultivation, dispensing components and measure a number of physiological parameters.

Keywords: bioreactor, cultivation of yeast, direction of fluid flow, aeration, complex mediums.

Shirshikov Nikolas (nshirshikov@gmail.com), leading biotechnologist, department of biotechnology, Institute for Biological Instrumentation of RAS, Pushchino.

Redikultsev Yuri, head of group, department of biotechnology, Institute for Biological Instrumentation of RAS, Pushchino.

Sizov Alexei, head of department, department of software systems, Institute for Biological Instrumentation of RAS, Pushchino.

Shevelev Dmitri (dmitri@alditech.ru), leading programmer, department of software systems, Institute for Biological Instrumentation of RAS, Pushchino.

Bezruchko Vladislav, leading engineer-electronic, department of biotechnology, Institute for Biological Instrumentation of RAS, Pushchino.

Gavrilov Anatoly, head of department, department of biotechnology, Institute for Biological Instrumentation of RAS, Pushchino.

Поступила 18.06.2015