СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
METHOD FOR SEPARATION OF LIPOPOLYSACCHARIDES OF GRAM-NEGATIVE BACTERIA

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано, в частности, для создания биологически активных веществ, предназначенных для повышения естественной резистентности организма.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Основным полисахаридным антигеном грамотрицательных бактерий является расположенный на наружной поверхности внешней мембраны клеточной стенки липополисахарид (ЛПС), представляющий собой семейство структурно родственных амфифильных макромолекул. Полисахаридный фрагмент ЛПС представлен О-специфическим полисахаридом (ОПС), построенным из олигосахаридных повторяющихся звеньев (ПЗ), количество которых может составлять от 1 до нескольких десятков. ОПС присоединяется к олигосахариду кора, который, в свою очередь, связан с липидным компонентом - липидом А. Липид А служит «якорем», удерживающим молекулу ЛПС в мембране микробной клетки, а полисахаридный фрагмент направлен вовне в сторону окружающей среды. ЛПС, в состав которого входят все три структурные элемента - ОПС, кор и липид А, называется S-ЛПС.
У некоторых бактерий, в том числе у многих патогенных бактерий, ОПС в составе ЛПС отсутствует. Эти микроорганизмы продуцируют низкокомолекулярный ЛПС, в котором присутствует только олигосахарид кора, присоединенный к липиду А и который называют липоолигосахаридом (ЛОС) или R-ЛПС.
В настоящее время можно считать доказанным, что структура ОПС уникальна для каждого микроорганизма, причем во многих случаях специфические антитела к ОПС, индуцируемые иммунной системой организма хозяина в ответ на появление ЛПС, играют ключевую роль в защите от гомологичной бактериальной инфекции. Иммунизация бактериальным ЛПС обеспечивает индукцию как циркулирующих сывороточных, так и секреторных анти-ЛПС антител. Таким образом, вакцина на основе ЛПС должна обладать высоким протективным потенциалом. Однако хорошо известно, что помимо способности к активации адаптивного иммунитета ЛПС даже в минимальных дозах является мощным эндотоксином, а в ответ на появление больших количеств ЛПС в макроорганизме может возникнуть состояние септического шока.
В последние годы интенсивно исследуется вопрос о том, какую роль на разных стадиях инфицирования макроорганизма играют популяции молекул ЛПС, отличающиеся по молекулярной массе (ММ). Существует экспериментальные доказательства того, что, по крайней мере в случае некоторых энтеробактерий (Сальмонелла Шигелла), количество ЛПС с короткоцепным ОПС (до 5-7 ПЗ) на внешней поверхности клеточной мембраны резко возрастает при внедрении микроорганизма в слизистые организма хозяина, тогда как после инвазии для защиты от воздействия иммунной системы бактериальная клетка синтезирует в основном ЛПС с длинными полисахаридными цепями (20-50 ПЗ)[1]. Одним из путей более глубокого анализа этого вопроса является выделение фракций ЛПС с различной ММ и исследование их с помощью моделей in vivo.
Одним из наиболее распространенных способов препаративного фракционирования ЛПС по ММ является колоночная гель-хроматография в буфере, содержащем ионный детергент - дезоксихолат натрия (ДОХ), использование которого позволяет обеспечить полную диссоциацию мицелл, образующихся в водных растворах ЛПС [2]. Практически единственным, но очень существенным недостатком данного подхода является отсутствие надежных методов удаления остаточных минорных количеств детергента, что чрезвычайно важно для корректной интерпретации результатов иммунобиологических экспериментов.
Другим действенным методом фракционирования ЛПС является колоночная хроматография на гидрофобной фазе - ок-тил-сефарозе [3]. При использовании этого метода необходимо принимать во внимание, что фракционирование в этом случае происходит не только по ММ. Различная скорость элюции молекул ЛПС при гидрофобной хроматографии зависит от первичной структуры липида А, а также, в известной степени, и от наличия гидрофобных моносахаридных остатков в О-специфической цепи ЛПС.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническим результатом данного изобретения является разработка улучшенного метода фракционирования ЛПС грамотрицательных бактерий по молекулярной массе, который, в отличие от описанных ранее методов, позволяет получать фракции ЛПС, не содержащие (по данным ЯМР-спектроскопии) компонентов хроматографического буфера, с желаемым молекулярно-массовым распределением, которое зависит от типа используемого носителя для гель-хроматографии.
Предлагается способ фракционирования ЛПС грамотрицательных бактерий по ММ с помощью препаративной колоночной хроматографии с использованием гелей типа Сефадекс и водных буферов, содержащих н-пропанол, а также одну из перечисленных ниже солей: карбонат, формиат или ацетат аммониия, триметил- и триэтиламмония или пиридиния для поддержания рН в области от 3,0 до 8,0.
Использование гелей типа Сефадекс (G-10,G-15,G-25,G-50,G-100,G-150, G-200) позволяет получать фракции ЛПС с желаемым молекулярно-массовым распределением. В некоторых случаях удается выделить фракции, содержащие в основном R-ЛПС. Введением н-пропанола в хроматографический буфер достигается демицеллирование ЛПС, что обеспечивает достаточно эффективное фракционирование ЛПС. На степень демицеллирования ЛПС существенное влияние оказывает также ионная сила и значение рН хроматографического буфера. При фракционировании конкретного ЛПС необходимо поддержание определенного значения рН, так как ОПС, входящий в состав ЛПС, может быть нейтральным или содержать кислотные фрагменты (остатки уроновых кислот, фосфат), аминосодержащие компоненты (остатки аминосахаров, фосфоэтаноламин), а также иметь цвиттер-ионный характер, т.е. может нести, например, чередующиеся карбоксильные и аминогруппы. Введение низших третичных органических аминов, помимо растворимости в воде, обусловлено наличием у них, в частности у триэтиламина, ярко выраженных хаотропных свойств, что способствует более полному демицеллированию ЛПС. Использование в составе хроматографического буфера низших спирта, амина и углеродсодержащей кислоты обеспечивает возможность эффективного и полного удаления этих компонентов хроматографического буфера после хроматографии с помощью одного из перечисленных ниже методов: диализ, высаживание в этанол, упаривание, лиофилизация или комбинация этих методов.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для эффективного хроматографического разделения ЛПС содержание н-пропанола обычно составляет не менее 10%, так как при более низких значениях концентраций полнота демицеллирования может быть не достигнута. Более высокое, чем 15%, содержание н-пропанола не сказывается на степени демицеллирования, но иногда приводит к частичной потере растворимости ЛПС. Повышение концентраций амина и кислоты выше О,2М также не сказывается на качестве разделения. Выбор несущих заряд компонентов хроматографического буфера и их концентрации, а также качество разделения в большой степени зависят от содержания гидрофобных компонентов в ОПС (N-ацетиламино-, дезокси-, дидезоксисахаров, O-ацетильных групп и т.п., а также от заряженности ОПС, так как именно эти факторы (помимо строения липидного фрагмента) сказываются на склонности ЛПС к мицеллированию. Эффективное разделение достигается обычно, если соотношение веса наносимого на колонку ЛПС и объема содержащегося в колонке геля не превышает 0,5-1,0 мг /мл.
Следующие примеры, приведенные в целях детализации и иллюстрации изобретения, не имеют цели ограничения притязаний настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
13
Хроматографическую колонку (2,5x60 см), заполненную гелем G-200, уравновешивают 0,05М триэтиаммоний-ацетатным буфером рН 4,7, содержащим 10% (v/v) н-пропанола. Раствор 100 мг ЛПС Shigella flexneri 2a в 15 мл хроматографического буфера наносят на колонку, и колонку элюируют со скоростью 5 мл/час, собирая одночасовые фракции и используя проточный УФ-детектор с фильтром 226 нм. Фракции, соответствующие наблюдаемым пикам 1, 2 и 3(фракции 9-13, фракции 15-29 и фракции 33-55 соответственно), объединяют, упаривают до объема 10-15 мл и диализуют против дистиллированной воды (4-5 смен по 3-4 литра). После лиофилизации получают вещества, соответствующие пикам 1, 2 и 3,в количестве 7, 25 и 59 мг соответственно, которые анализируют с помощью гель-электрофореза (ГЭФ) в додецил-сульфате натрия (ДСН). Вещество пика 1 не визуализируется при ГЭФ, а по данным ЯМР представляет собой (1-3)глюкан. Анализ веществ пиков 2 и 3 с помощью ГЭФ показывает, что они представляют собой высокомолекулярную и низкомолекулярную фракции ЛПС S.flexneri 2a соответственно, что подтверждается также данными С-ЯМР спектров.
ПРИМЕР 2
13
На хроматографическую колонку, описанную в примере 1, наносят раствор 80 мг ЛПС Shigella sonnei фаза 1 в 8 мл хроматографического буфера. В результате хроматографии в условиях, приведенных в примере 1, последующего диализа и лиофилизации получают два вещества (фракции 13-25 и фракции 27-48) в количестве 33 и 29 мг соответственно. По данным ГЭЭФ в ДСН и С-ЯМР-спектроскопии вещество, элюирующееся первым, представляет собой S-ЛПС, ОПС которого содержит от 7 до 25 ПЗ, тогда как более медленно элюирующееся вещество представляет собой смесь R-ЛПС с ЛПС, содержащим от 1 до 5 ПЗ. Выделенные фракции ЛПС по данным ЯМР-спектроскопии не содержат компонентов хроматографического буфера.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Optimization of Virulence Functions Through Glu- cosylation of Shigella LPS. Nicholas P. West, Philippe Sansonetti, Joelle Mounier, Rachel M. Exley, Claude Parsot, Stephanie Guadagnini, Marie-Christine Prevost, Ada Prochnicka-Chalufour, Muriel Delepierre, Myriam Tanguy, Christoph M. Tang. Science, 2005, vol 307, 1313-1317.
2. High-molecular Weight Components in Lipopolysac-charides of Salmonella typhimurium, Salmonella minesota, and Escherichia coli. Peterson, A.A., and E.J.Mcgroarty.J. Bacteriology, 1985, 162:738-745.
3. Purification and fractionation of lipopolysac-charide from Gram-negative bacteria by hydrophobic interaction chromatography. Werner Fisher. Eur. J. Biochem. 194, 655-661 (1990).