Способ получения мышиной модели для изучения синдрома Леша-Нихена путем внесения делеции p.Val8del в ген hprt1
METHOD FOR OBTAINING A MOUSE MODEL FOR STUDYING LESCH-NYHAN SYNDROME BY INTRODUCING A DELETION OF P.Val8del INTO THE Hprtl GENE

Область техники
Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается мышиной модели, содержащей делецию p.Val8del в гене mhprt1. Изобретение может быть использовано для детального изучения патогенеза и разработки терапии синдрома Леша-Нихена.
Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019.
Уровень техники
Синдром Леша-Нихена (СЛН) - орфанное заболевание, причина которого - недостаточная активность фермента гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HPRT1), который катализирует реутилизацию гуанина и гипоксантина. При такой недостаточности в клетках организма происходит накопление мочевины. Как правило, к снижению активности фермента приводят мутации в гене HPRT1, расположенном на Х-хромосоме.
СЛН встречается у одного из 380000 новорожденных и может проявляться состояниями разной степени тяжести. Из-за нарушения метаболизма развивается гиперурикемия, накопление в тканях организма мочевой кислоты. Она может становиться причиной нефролитиаза. Кроме метаболических нарушений, наблюдаются неврологические, психические и когнитивные. Характерным симптомом СЛН является самотравмирующее поведение (кусание пальцев, губ, внутренней поверхности щек). При неблагоприятном течении заболевания летальный исход наступает на первом или втором десятилетии жизни. Для разработки терапевтических подходов и доклинических исследований перспективных препаратов необходимы адекватные животные модели.
Известны трансгенные мыши (Hooper et al., 1987) и крысы (Isotani et al., 2016) с нокаутом гена mhprt1. Однако у них наблюдаются менее выраженные, чем у людей, биохимические изменения и не обнаруживаются поведенческие черты, свойственные СЛН (Finger et al., 1988). Было выдвинуто предположение (Keebaugh et al., 2011), что фенотип СЛН вызван не отсутствием белка HPRT, а заметной на фоне его отсутствия аномальной активностью его паралога PRTFDC1. У мышей данный паралог представляет собой инактивированный псевдоген. В данном изобретении реализована мутация, приводящая не к нокауту гена, а к делеции одной аминокислоты, однако вызвавшая тяжелое течение СЛН у человека. Существует вероятность, что мыши с мутантной формой белка HPRT будут демонстрировать фенотип заболевания, отсутствующий у мышей с нокаутом гена.
Краткое описание изобретения
В Научно-исследовательский клинический институт педиатрии имени академика Ю.Е. Вельтищева ФГАОУ ВО РНИМУ поступил пациент с клинической картиной СЛН. У него была обнаружена мутация c.23_25delTCG, p.Val8del в гене hprt1. Для внесения аналогичной делеции в геном мыши мы использовали систему CRISPR/Cas9, состоящую из белка spCas9 и сгРНК, ПАМ-сайт которой расположен в 4-х нуклеотидах от 5’-цонца делеции.
Задачей заявляемого изобретения является создание мышиной модели синдрома Леша-Нихена путем внесения в геном мыши делеции p.Val8del в гене hprt1.
Задача решается тем, что с использованием системы CRISPR/Cas9 получена новая линия генетически модифицированных мышей, содержащих в геноме делецию p.Val8del в гене hprt, для чего:
1. Была получена плазмидная конструкция px330+HPRTsg SEQ ID NO: 1, содержащая сгРНК SEQ ID NO: 2 против соответствующего участка гена hprt, под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора.
2. Был разработан способ получения конструкции px330+HPRTsg, характеризующийся следующими стадиями:
а) биоинформатический анализ последовательности гена hprt и подбор сгРНК в непосредственной близости от места целевой мутации,
б) клонирование соответствующей последовательности сгРНК в вектор px330.
3. Способ получения линии мышей, содержащих делецию p.Val8del в гене mHprt1,, характеризующийся следующими стадиями:
1
а) микроинъекция конструкции px330+HPRTsg из п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F(CBA×C57BL/6);
б) выявление жизнеспособных зигот;
в) пересадка выживших зигот из пункта (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;
г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (в);
д) проведение анализа наличия мутации через 8-14 дней после рождения мышей (г), путем амплификации целевого участка гена hprt с праймерами SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 с последующим секвенированием фрагмента;
е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;
ж) проведение скрещивания мышей из пункта (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию;
з) проведение скрещивания мышей из пункта (ж) для получения итоговой линии мышей, несущих мутацию p.Val8del.
Технический результат изобретения: разработан способ получения линии трансгенных мышей c мутацией p.Val8del в гене hprt1 и выведена соответствующая линия мышей.
Изобретение иллюстрируется фигурами 1 и 2 и перечнем использованных последовательностей.
Краткое описание рисунков
На Фигуре 1 представлена схема задействованной в данной работе части hprt1 локуса. Указаны 3 делетируемых нуклеотида, сгРНК, ПАМ-сайт, праймеры для генотипирования, 1-й экзон и его кодирующая белок часть.
На Фигуре 2 представлен двоящийся сиквенс, соответствующий мозаичному трансгену F0.
Осуществление изобретения
Способ осуществляется следующим образом.
Пример 1. Получение генетических конструкций. Для введения выбранной нами делеции мы подобрали с помощью онлайн инструмента: http://crispor.tefor.net/ сгРНК, ПАМ-сайт которой находится на расстоянии 4-х нуклеотидов от места делеции (Фиг. 1). Выбранная сгРНК имела последовательность CCCTTGGCTCACCACGACGC-TGG. Поскольку место разрезания белка spCas9 находится в непосредственной близости от вводимой делеции, мы выдвинули предположение, что целевая делеция может произойти без гомологической рекомбинации, а только за счет негомологического соединения концов. Выбранную сгРНК мы заклонировали в плазмидный вектор px330, предназначенный для одновременной экспрессии белка spCas9 и сгРНК. Последовательность сгРНК была синтезирована с использованием двух олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.
Разрезание вектора производили с использованием рестриктазы BbsI-HF (New England Biolabs), затем дефосфорилировали вектор с помощью фермента FastAP (Thermofisher Scientific), и очищали в агарозном геле и последующим выделением с помощью набора Monarch DNA Gel Extraction Kit. Олигонуклеотиды для последовательности сгРНК были заказаны с таким расчетом, чтобы их некомплиментарные концы образовали липкие концы для клонирования в вектор px330. Олигонуклеотиды фосфорилировали с использованием фермента PNK kinase (Thermofisher Scientific), отжигали друг с другом и лигировали с приготовленным ранее вектором и использованием фермента T4 DNA ligase (Thermofisher Scientific). Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки штамма XL1blue (Евроген). Скрининг колоний осуществляли с использованием пцр-наборов компании Изоген и праймеров к U6 промотору (SEQ ID NO: 5) и обратного праймера для синтеза сгРНК (SEQ ID NO: 4). По две колонии, содержащие сгРНК, наращивали в ночной культуре и выделяли с помощью набора Monarch Plasmid Miniprep Kit. Анализ полученных плазмид проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Сиквенс полученных плазмид осуществляли с использованием праймера SEQ ID NO: 5 в компании Евроген. Анализ сиквенсов проводили с использованием программного обеспечения SnapGene.
Проверенную конструкцию разводили до концентрации используемой при микроинъекциях – 1 нг/мкл.
1
1
Пример 2. Получение яйцеклеток мышей. Яйцеклетки для микроинъекции получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F(CBA×C57BL/6) весом 12-13 г внутрибрюшинно вводили 8 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 48 час - 8 ед. хорионического гонадотропина человека (ХгЧ). После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F(CBA×C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки.
Схема индукции суперовуляции: 12:00 - ГСЖК, через 48 часов - ХгЧ. В 17:00 этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:00. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00.
Отобранных самок-доноров умерщвляли, извлекали яйцеводы, затем вымывали яйцеклетки в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы. Процедуру проводили под бинокуляром (Zeiss Stemi DV4) с увеличением в 32 раза. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония).
2
3. Микроинъекции. Полученные зиготы культивировали в течение двух часов при t=37°C и 5% СОв капле среды KSOM под минеральным маслом (Sigma, США), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200М при увеличении в 400-600 раз, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Со Р-97 (США), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900.
После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных эмбрионов.
1
4. Получение самок-реципиентов. Самок-реципиентов яйцеклеток получали следующим образом: половозрелых самок F(CBA×C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Через 18 часов псевдобеременных реципиентов отбирали по наличию копулятивных пробок. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в яйцеводы псевдобеременной самки. Одной псевдобеременной самке пересаживали 6-10 эмбрионов. Операцию проводили под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно).
5. Операция вазэктомирования. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля.
6. Получение новорожденных мышей. На 19 день после пересадки микроинъецированных эмбрионов реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 8-14 дней после рождения у мышат брали образец ткани, выделяли ДНК и анализировали наличие трансгена методом ПЦР.
7. Анализ наличия трансгена в геноме мышей производили методом секвенирования ПЦР-фрагмента. ДНК для ПЦР выделяли из тканей по стандартному протоколу. Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью набора GenPak™ PCR Core (Isogene) в присутствии 10 пМ праймеров HPRT-f (SEQ ID NO:6) и HPRT-r (SEQ ID NO:7) в следующих режимах: денатурация 95°С - 3 мин; далее следовало 35 циклов: 95°С - 40 сек, 58°С - 40 сек; 72°С - 40 сек; и последний синтез 72°С - 2 мин. После прохождения реакции ПЦР-смесь очищали в 1,5% агарозном геле, полученный продукт выделяли набором Monarch DNA Gel Extraction Kit и секвенировали в компании Евроген и использованием праймера SEQ ID NO:6. Полученные сиквенсы можно подразделить на три категории: сиквенсы дикого типа, последовательность в которых соответствует дикому типу, двоящиеся сиквенсы (Фиг. 2), соответствующие мозаичным животным F0 или гетерозиготным самкам следующих поколений, и сиквенсы, на которых присутствует только мутантны вариант ДНК, соответствующие трансгенным самцам и гомозиготным трансгенным самкам.
Источники информации
Finger S, Heavens RP, Sirinathsinghji DJ, Kuehn MR, Dunnett SB. Behavioral and neurochemical evaluation of a transgenic mouse model of Lesch-Nyhan syndrome. J Neurol Sci. 1988 Sep; 86(2-3).
Hooper M, Hardy K, Handyside A et al, HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells, Nature, 1987 Mar 19-25; 326(6110): 292-5.
Isotani, A., Yamagata, K., Okabe, M. et al. Generation of Hprt-disrupted rat through mouse←rat ES chimeras. Sci Rep 2016, 6, 24215.
Keebaugh AC, Mitchell HA, Gaval-Cruz M, Freeman KG, Edwards GL, Weinshenker D, Thomas JW. PRTFDC1 is a genetic modifier of HPRT-deficiency in the mouse. PLoS One. 2011; 6(7): e22381.