Способ очистки рекомбинантного аденовируса 26 серотипа (Ad26)
METHOD FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT ADENOVIRUS 26 SEROTYPE (Ad26)

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу очистки рекомбинантного аденовируса 26 серотипа (Ad26) от компонентов среды. Изобретение может быть применено в прикладной вирусологии, производстве вакцин, биотехнологии и других областях науки и техники.
Предшествующий уровень техники
Известно решение по патенту US 7125706, в котором  раскрыт способ очистки аденовируса. Способ  включает в себя следующие стадии:
2
• Лизис (20 mMTris pH 7.5, 0.25M NaCl, 1mM MgCl, 1% Tween-20);
• Глубиннаяфильтрация;
• Фильтрация (0.8/0.22 мкр);
• Концентрирование ультрафильтрацией (через мембрану 300 кДа);
• Обработкаферментами (бензоназа);
• Анионообменнаяхроматография;
• Формулирование;
• Стерильнаяфильтрация (0.2 мкр).
2
2
2
2
2
В данном изобретении выращенный в клетках HEK 293 аденовирус лизировали в буфере 20 mMTrispH 7.5, 0.25MNaCl, 1mMMgCl, Tween-20 1%. Полученный лизат осветляли с помощью глубинной фильтрации, затем фильтровали через фильтры 0,8/0,22 мкр. Фильтрат концентрировали в 10 раз с помощью ультрафильтрации через мембрану 300 кДа и промывали 4-мя объемами 0.5 MTrispH 8.0, 1mMMgCl. В полученный раствор добавляли 100 U/mlBenzonase и оставляли инкубироваться на ночь при комнатной температуре. После инкубации проводили анионообменную хроматографию. В качестве сорбента использовали Source 15Q, колонку уравновешивали буфером 20 mMTrispH 8, 0.25MNaCl, 1mMMgCl. Аденовирус элюировали градиентом соли в 40 объемах колонки буфером 20 mMTrispH 8.0, 2 MNaCl, 1mMMgCl. Продукт промывали равным объемом буфера 20 мMTrispH 9.0, 1mMMgCl, 1MNaCl, 10% глицерина 8-10 раз с помощью ультрафильтрации через мембрану 300 кДа. На завершающей стадии очистки проводили стерильную фильтрацию через фильтр с порами 0.2 мкр.
Недостатками способа является:
Отсутствие условий разделения по физико-химическим свойствам примесей и аденовируса 26 серотипа, что не позволяет разделить целевой продукт от примесей, поскольку примеси имеют одинаковый заряд с аденовирусом 26 серотипа.
При фильтрации происходят потери целевого продукта. При этом, чем меньше объем полупродукта, тем выше потери при фильтрации.
Известно также решение по патенту  РФ 2465327, в котором представлен способ очистки рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса с модифицированным капсидным белком pIX, несущим полисахарид-связывающий домен. Способ включает следующую последовательность операций:
• Создание рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса;
• Осаждениекапсид-модифицированногоаденовируса;
• Промывкакапсид-модифицированногоаденовируса;
• Разделения рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса от целлюлозного носителя;
• Удаление нуклеиновых и белковых примесей;
• Получение чистого рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса.
В качестве носителя для очистки рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса использовали целлюлозные носители: аморфную целлюлозу; носители, содержащие остатки целлюлозы, привитые к субстрату другой (не полисахаридной) химической природы; модифицированные формы целлюлозы (метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза). Эти носители смешивали с приготовленной вируссодержащей суспензией в соотношении: 1 г целлюлозного носителя + 9 мл вируссодержащей суспензии. Смесь инкубировали в течение 16 часов при постоянном покачивании при температуре +4°C. Затем целлюлозный носитель с адсорбированным на нем рекомбинантным капсид-модифицированным аденовирусом осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант удаляли. Сначала осадок целлюлозного носителя с рекомбинантным капсид-модифицированным аденовирусом промывали нейтральным трис-фосфатным буфером рН=7,2 в объеме 10 мл, а затем снова осаждали центрифугированием 4000 об/мин в течение 5 минут с последующим удалением супернатанта. Промывку повторяли 2 раза. Для элюирования рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса с целлюлозного носителя добавляли кислый элюирующийтрис-фосфатный буфер (рН 3,0) в объеме 3,5 мл и инкубировали в течение 30 минут при постоянном покачивании. Для разделения целлюлозного носителя и рекомбинантного капсид-модифицированного аденовируса суспензию центрифугировали, а затем отбирали вируссодержащий супернатант. Так как в отобранном вируссодержащем супернатанте рН=3,0, рекомбинантный капсид-модифицированный аденовирус не может сохраняться длительное время, раствор нейтрализовали путем добавления карбонатного буфера (рН=9,2) в объеме 3,5 мл для выравнивания рН до значения 7,2. Носитель с аденовирусом для освобождения от нуклеиновых и белковых примесей промывали путем добавления 12 мл буфера 50 мМ Трис, рН=8; 150 мМ NaCl; 5% глицерин и последующего осаждения носителя с аденовирусом и удаления супернатанта. Такую процедуру проводили 5 раз. Аденовирус элюировали добавлением 500 мкл буфера 50 мМ Трис, рН=8; 150 мМ NaCl; 5% глицерин и 5 мМ биотина при аккуратном встряхивании в течение ночи при +4°С. Элюированный с носителя капсид-модифицированный аденовирус отбирали в супернатанте после осаждения (путем центрифугирования) носителя.
Недостатком данного способа является необходимость использования капсид-модифицированного аденовируса.
Известно также решение по патенту  РФ 2443779. Для очистки аденовирусов по патенту используют способ, состоящий из следующих этапов:
• Разрушение зараженных аденовирусом клеток путем 3-кратного перемораживания;
• Осаждение клеточногодебриса низкоскоростным центрифугированием;
• Концентрирование вирионов, осаждая их ультрацентрифугированием на поверхность раствора CsCl, плотность которого равна 1,375 г/см3, с последующей очисткой двукратным ультрацентрифугированием в равновесном градиенте плотности;
Водную фракцию, полученную после экстракции клеток, зараженных аденовирусом, аккуратно наносили на ступенчатый градиент хлорида цезия (раствор с плотностью 1,45г/мл и 1,3г/мл), растворенного в 5 мМ Tris-HCl, 1mM ЭДТА, pH 7.8, и откручивали 2 часа при 90000g. Бенды, сконцентрированные на интерфазе, отбирали и разбавляли буфером 5 мМ Tris-HCl, 1mM ЭДТА, pH 7.8 в 1,5 раза. Полученный полупродукт повторно откручивали на ступенчатом градиенте хлорида цезия (плотностью 1,45г/мл и 1,3г/мл) 18 часов при 100000g, и отбирали бенды, сконцентрированные на интерфазе.
Недостатком способа является токсическое действие на организм человека и/или животного хлористого цезия.
Техническое решение по патенту US 7326555 включает в себя следующие операции для очистки аденовирусов:
• Лизис (0,1% Triton x-100; 0,05% Polysorbate-80);
• Селективное осаждение загрязняющих нуклеиновых кислот (0,04% домифена бромид);
• Глубинная фильтрация для удаления клеточного дебриса и осадка нуклеиновых кислот;
• Концентрированиеультрафильтрацией;
• Ферментативная обработка нуклеазой для расщепления оставшихся нуклеиновых кислот;
• Анионообменнаяхроматография;
• Формулированиедлястабилизациипрепарата;
• Стерильнаяфильтрация.
2
2
2
2
о
К выращенному в клетках HEK 293 аденовирусу добавляли Tritonx-100 и Polysorbate-80 до финальной концентрации 0,1% и 0,05% соответственно и оставляли на ночь при комнатной температуре. После инкубации добавляли домифена бромид до концентрации 0,04% и оставляли при перемешивании до образования осадка. После осаждения проводили глубинную фильтрацию полученного лизата, для чего использовали последовательно два картриджа CE20 и CE-50. Осветленный лизат отбирали и концентрировали в 20 раз на мембране 500кДа. Для расщепления нуклеиновых кислот использовали ферментативную обработку бензоназой (концентрация 15 U/ml) в течение 2 часов при комнатной температуре. Полученный концентрат промывали буфером 50 mMHEPES, 2 mMMgCl, 1 MNaCl, pH 7.5 пять раз равным объемом и оставляли на хранение при +4С на ночь. Препарат разбавляли до проводимости 38 мСм / см, используя 50 мМ HEPES, 2 мМ MgCl, 0,1% PS-80, pH 7,5, для проведения анионообменной хроматографии. Препарат наносили на колонку с сорбентом Source 15Q. Промывали колонку 5-ю объемами колонки буфером 50 мМ HEPES, 2 мМ MgCl, 0,39 М NaCl, 0,1% PS-80, рН 7,5, затем элюировали градиентом соли NaCl до 0,47М в 4 объемах колонки. Буфер полученного полупродукта заменяли с помощью ультрафильтрации на формулирующий буфер, содержаший 5 mMTris, 75 mMNaCl, 1 mMMgCl, 5% sucrose, 0.005% PS-80, pH 8.0 с помощью ультрафильтрации. На завершающей стадии очистки проводили стерильную фильтрацию.
Недостатками способа являются:
Отсутствие условий разделения по физико-химическим свойствам примесей и аденовируса 26 серотипа, что не позволяет разделить целевой продукт от примесей, поскольку примеси имеют одинаковый заряд с аденовирусом 26 серотипа.
При фильтрации происходят потери целевого продукта. При этом, чем меньше объем полупродукта, тем выше потери при фильтрации.
В заявке США US 20100279385 раскрыт способ очистки аденовируса, который включает в себя обработку вирусного препарата анионообменной хроматографией с последующей эксклюзионной хроматографией:
• Лизис с помощью Microfluidiser при 1000 фунтов на квадратный дюйм;
• Обработка ферментами (бензоназой в расчете 2500 единиц бензоназы на 10 клеток в течении часа при комнатной температуре);
• Удаление клеточного дебриса с помощью стекловаты, без вакуума;
• Фильтрация через мембрану из ацетата целлюлозы с порами 0,8 мкр);
• Анионообменнаяхроматография;
• Эксклюзионнаяхроматография.
2
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
Клетки, зараженные аденовирусом, лизировали с помощью Microfluidiser при 1000 фунтов на квадратный дюйм. Полученныйлизат инкубировали с бензоназой (в расчете 2500 единиц бензоназы на 10 клеток) в течение часа при комнатной температуре. Для удаления клеточного дебриса использовали стекловату без вакуума и фильтрацию через ацетат целлюлозы с диаметром пор 0,8 мкр. Колонку DEAEMemSep уравновешивали буфером 1,5 мМ KHPO, 150 мМ NaCl, 5 мМ NaHPO, pH 7,5, 10% глицерина, 0,05% Tween-80 и 50 мкМ ZnCl. Осветленныйлизат наносили на колонку и промывали ее 10 mMNaHPO, 100 mM. NaCl, 100 mMKCl. Элюцию проводили градиентом от 100 mM до 1 M соли NaCl, растворенной в буфере 10 mMNaHPOpH 7.5, 10% глицерин, 0.05% Tween-80, 50 мкMZnCl, одним объемом. Собранный пик наносили на колонку с сорбентом SuperdexR200, уравновешенную буфером PBS, 10% глицерин, 2 mMMgCl, 50 uMZnCl, 0.05% Tween-80.
Недостатками способа является:
Отсутствие условий разделения по физико-химическим свойствам примесей и аденовируса 26 серотипа, что не позволяет разделить целевой продукт от примесей, поскольку примеси имеют одинаковый заряд с аденовирусом 26 серотипа.
При фильтрации происходят потери целевого продукта. При этом, чем меньше объем полупродукта, тем выше потери при фильтрации.
Патент США US 7445930 раскрывает способ очистки аденовируса, который включает в себя следующие последовательные стадии:
2
• Лизис (20 mMTris pH 7.5, 0.25M NaCl, 1mM MgCl, 1% Tween-20);
• Глубиннаяфильтрация;
• Фильтрация (0.8/0.22 мкр);
• Концентрирование ультрафильтрацией через мембрану 300 кДа;
• Обработкаферментами (бензоназа);
• Анионообменнаяхроматография;
• Ультрафильтрациячерезмембрану 300 кДа;
• Стерильнаяфильтрация (0.2 мкр).
2
2
2
2
2
Выращенный в клетках HEK 293 аденовирус лизировали в буфере 20 mMTrispH 7.5, 0.25MNaCl, 1mMMgCl, Tween-20 1%. Полученный лизат осветляли с помощью глубинной фильтрации и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,8/0,22 мкр. Затем проводили концентрирование в 10 раз с помощью ультрафильтрации через мембрану 300 кДа. Концентрат промыли 4 объемами 0.5 MTrispH 9.0, 1mMMgCl. Далее добавляли 100 U/mlBenzonase и оставляли на ночь при комнатной температуре. Затем проводили анионообменную хроматографию, используя колонку с сорбентом SuperQ 650M. Аденовирус наносили на колонку, уравновешенную буфером 20 mMTrispH 9.00, 0.25MNaCl, 1mMMgCl, и элюировали градиентом соли буфером 20 mMTrispH 9.00, 2 MNaCl, 1mMMgClв 40 объемах колонки. Полученный пик промывали 8-10 раз 20 мMTrispH 9.0, 1mMMgCl, 1MNaCl, 10% глицерина с помощью ультрафильтрации через мембрану 300 кДа. В качестве завершающей стадии очистки использовали стерильную фильтрацию.
Недостатками способа является:
Отсутствие условий разделения по физико-химическим свойствам примесей и аденовируса 26 серотипа, что не позволяет разделить целевой продукт от примесей, поскольку примеси имеют одинаковый заряд с аденовирусом 26 серотипа.
При фильтрации происходят потери целевого продукта. При этом, чем меньше объем полупродукта, тем выше потери при фильтрации.
Другой способ очистки аденовирусов, патент US 6989264, включает следующие основные последовательности операций:
• Лизис;
• Фильтрация;
• Обработкаферментами (бензоназа);
• Анионообменнаяхроматография.
2
2
Клетки, зараженные аденовирусом, растворяли в буфере 50 mMTris, pH 8.0, 5 mMMgCl, 1 mMEDTA, 5% глицерин и лизировали путем кавитации с помощью микрофлюидной технологии при 3000 фунтов на квадратный дюйм. Полученныйлизат последовательно фильтровали через мембраны с диаметром пор 5 и 0,45 мкр и наносили на колонку с сорбентом POROSTM 50 PI. Колонку промывали 10-ю объемами буфером 50 mMTris, pH 8.0, 5 mMMgCl, 1 mMEDTA, 5% глицерин, 900 mMNaCl. Аденовирус элюировали градиентом соли NaCl с 900 mM до 1300 mM.
Недостатками способа является:
Отсутствие условий разделения по физико-химическим свойствам примесей и аденовируса 26 серотипа, что не позволяет разделить целевой продукт от примесей, поскольку примеси имеют одинаковый заряд с аденовирусом 26 серотипа.
При фильтрации происходят потери целевого продукта. При этом, чем меньше объем полупродукта, тем выше потери при фильтрации.
Еще один способ очистки аденовирусов, патент US 6586226, включает следующие основные последовательности:
• Лизис;
• Фильтрация;
• Обработкаферментами (бензоназа);
• Анионообменнаяхроматография.
2
Клетки, зараженные аденовирусом, концентрировали центрифугированием. Полученный осадок ресуспендировали в буфере 25 mMTris, pH 7.8, 75 mMNaCl, 10 mMMgCl. Лизис клеток проводили с помощью микрофлюидной технологии. Осветление лизата осуществляли путем фильтрации.  Для избавления от нуклеиновых кислот использовали Benzonase в концентрации рекомендуемой производителем. Осветленный и обработанный ферментом клеточный лизат наносили на колонку POROS 50D, уравновешенную буфером с концентрацией соли 360 mMNaCl, и элюировали ступенчато растворами, содержащими хлорид натрия в концентрациях 360, 450 и 1000 mM.
Недостатками способа является:
Отсутствие условий разделения по физико-химическим свойствам примесей и аденовируса 26 серотипа, что не позволяет разделить целевой продукт от примесей, поскольку примеси имеют одинаковый заряд с аденовирусом 26 серотипа.
При фильтрации происходят потери целевого продукта. При этом, чем меньше объем полупродукта, тем выше потери при фильтрации.
Также, существует способ очистки аденовирусов (Патент US 8124106), который состоит из следующих этапов:
• Обработка нуклеазами для расщепления примесей нуклеиновых кислот;
• Лизис (Triton Х-100);
• Глубинная фильтрация для осветления лизата;
• Фильтрация (0.45 мкр);
• Концентрирование вирусных частиц с помощью ультрафильтрации;
• Диафильтрация для освобождения от низкомолекулярных примесей;
• Анионообменнаяхроматография;
• Эксклюзионнаяхроматография;
• Фильтрация (0.45 мкр);
• Концентрирование вирусных частиц с помощью ультрафильтрации;
• Формулирование;
• Стерильнаяфильтрация.
2
В суспензию клеток, содержащую аденовирус, добавляли бензоназу (50 U/ml) и MgCl (2 mM) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 1% TritonX-100 и инкубировали 50 мин при комнатной температуре. Затем концентрировали в 5 раз, используя мембрану 0,05 мкр. Полученный концентрат промывали через мембрану 0,45 мкр в десяти кратном объеме буфера 0,1М NaCl, 0.05% PS 80, 50mMTrispH 7.5. На следующем этапе проводили анионообменную хроматографию с использованием сорбента QSepharoseXL. Для нанесения использовали буфер 0,1М NaCl, 0.05% PS80, 50mMTrispH 7.5, элюировали продукт градиентом соли NaCl от 0 до 1 М. В полученном растворе концентрацию NaCl и Tween-20 доводили до 2,5 М и 1% соответственно. Используя полученный полупродукт, проводили эксклюзионную хроматографии. В качестве фазы для уравновешивания колонки использовали 2.5М NaCl, 1% Tween-20, 50mMTrispH 7.5. Полученную пробу фильтровали через фильтр с порами диаметром 0,45 мкр, концентрировали с помощью мембраны 500кDa и переводили в формулирующий буфер 25 мМ NaCl, 20mMTrispH 8.0, 2,5% глицерина. Завершающей стадией очистки проводили стерильную фильтрацию.
Несмотря на отсутствие в данном способе токсичных веществ, способ  имеет ряд недостатков. Во-первых, на стадиях фильтрации наблюдается высокий процент потерь препарата. Во-вторых, применение способа ограничено для некоторых серотипов аденовирусов, в частности, способ не учитывает физико-химические особенности аденовируса 26 серотипа, который невозможно эффективно отделить от примесей нуклеиновых кислот из-за схожего заряда аденовируса и нуклеиновых кислот, которые образуются при лизисе клеток – продуцентов аденовируса при использовании анионообменной хроматографии.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа очистки рекомбинантных аденовирусов 26 серотипа, позволяющего получать биологически активный, хроматографически чистый и концентрированный препарат аденовирусов 26 серотипа с минимальным процентом потерь.
Технический результат достигается за счет использования последовательности выполнения стадий: лизис зараженных клеток, ферментативная обработка лизата, осветление клеточного лизата, очистка вируса посредством трех этапов хроматографии, а именно: эксклюзионной хроматографии, хроматографии с гибридным сорбентом и анионообменной хроматографии с получением чистого и концентрированного образца, затем формулирование препарата и стерильная фильтрация. А также за счет использования химического лизиса с помощью солевого раствора.
Техническая задача решена путем создания способа очистки рекомбинантного аденовируса 26 серотипа (Ad26), заключающегося в последовательном выполнении стадий: лизис зараженных клеток, ферментативная обработка лизата, осветление клеточного лизата, очистка вируса посредством трех этапов хроматографии, а именно: эксклюзионной хроматографии, хроматографии с гибридным сорбентом и анионообменной хроматографии с получением чистого и концентрированного образца, затем формулирование препарата и стерильная фильтрация.При этом лизис клеток проходит в 1М NaCl, а на стадии хроматографии с гибридным сорбентом используют гибридный сорбент, эффективно отделяющий аденовирус 26 серотипа от примесей нуклеиновых кислот, образующихся при лизисе клеток, продуцентов аденовируса, за счет формы в виде сферы с полостями в разрезе и имеющим заряженное ядро, незаряженную внешнюю оболочку, а также поры с фиксированным диаметром на внешней оболочке. Аденовирус 26 серотипа стерильно фильтруется на последней стадии.
Краткое описание фигур
На фигуре 1
представлены технологические стадии очистки рекомбинантного аденовируса 26 серотипа.
На фигуре 2
представлен принцип действия гибридного сорбента в хроматографии при очистке аденовируса 26 серотипа.
1 - боковые стенки колонки в разрезе.
2 - гибридный сорбент  в виде сферы  с полостями в разрезе.
3 - заряженное ядро гибридного сорбента.
4 - незаряженная внешняя оболочка гибридного сорбента.
5 - поры гибридного сорбента с фиксированным диаметром.
6 – примеси, схематично изображены в виде овала.
7 - аденовирус 26 серотипа, изображен как шестигранник с лучами из вершин.
Принцип работы: полупродукт с аденовирусом 26 серотипа наносили на колонку, и благодаря тому, что сорбент имеет определенный размер пор, который меньше размера аденовируса 26 серотипа, примеси проникают вовнутрь сорбента, в полость, где присутствует заряженное ядро, сорбирующее примеси. Аденовирус 26 серотипа не способен проникнуть в поры сорбента, поэтому не может сорбироваться на колонке и выходит в проскоке.
На фигуре 3
представленахроматограмма очистки препарата методом эксклюзионной хроматографии, в результате которой компоненты смеси разделяют по массе.
По оси абсцисс: оптическая плотность подвижной фазы при длине волны 280 нм, в оптических единицах.
По оси ординат: объем подвижной фазы, прошедшей через колонку, в мл.
1 - целевой пик (целевой продукт).
2 – пик примесей.
На фигуре 4
представленахроматограмма очистки препарата способом гибридной хроматографии, в результате которой аденовирусные частицы Аd26 отделяют от примесей, имеющих заряд, равный заряду аденовирусных частиц Аd26.
По оси абсцисс: оптическая плотность подвижной фазы при длине волны 280 нм, в оптических единицах.
По оси ординат: объем подвижной фазы, прошедшей через колонку, в мл.
1 - проскок (на данной стадии проскок является целевой фракцией).
Аденовирус 26 серотипа присутствует в проскоке.
На фигуре 5
представлена хроматограмма очистки препарата методом анионообменной хроматографии, в результате которой происходит дополнительная очистка аденовирусных частиц Аd26 и их концентрирование.
По оси абсцисс: оптическая плотность подвижной фазы при длине волны 280 нм, в оптических единицах.
По оси ординат: объем подвижной фазы, прошедшей через колонку, в мл.
1 - целевой пик.
2 - нанесение и промывка (перед целевым пиком).
Реализация изобретения
Рекомбинантные аденовирусы (rAd) обладают целым рядом преимуществ, как векторы для разработки вакцинных препаратов. Множество клинических и доклинических испытаний показали, что rAd являются безопасными, поскольку они репликативно-дефектны и не способны вызывать заболевания (VanKampen K.R. etal.Safety and immunogenicity of adenovirus-vectorednasal and epicutaneousinfluenzavaccines in humans, Vaccine, 2005, № 23, 1029–1036), а вакцины на их основе могут быть легко получены и накоплены в суспензионных клетках при сравнительно небольших затратах (Kovesdi I., S.J. Hedley, Adenoviralproducercells, Viruses, 2010, № 2(8), 1681-703).
Вакцина на основе rAd может сохранять активность не менее одного года в лиофилизированной или жидкой форме (Croyle M. etal.Development of formulations that enhance physical stability of viral vector for gene therapy, Gene Therapy, 2001, № 8, 1281-1290).
Векторные аденовирусные вакцины не требуют классических адъювантов, которые могут привести к непредсказуемым побочным эффектам (LewisD.J. etal.Transientfacialnerveparalysis (Bell'spalsy) followingintranasaldeliveryofageneticallydetoxifiedmutantofEscherichiacoliheatlabiletoxin, PloSOne, 2009, № 4, e6999), поскольку поверхностный белок - гексон аденовируса сам является мощным адъювантом для активации врожденного иммунитета (Molinier-FrenkelV. Adenovirushexonproteinisapotentadjuvantforactivationofacellularimmuneresponse, JournalofVirology, 2002, № 76, 127-135). rAd могут инфицировать широкий диапазон клеток и тканей, следовательно, препараты на основе rAd можно вводить с помощью интраназальной, внутримышечной вакцинации или с использованием аэрозоля (RoyC.J. etal. Aerosolized adenovirus-vectored vaccine as an alternative vaccine delivery method, Respiratory Research, 2011, № 12, 153; Lambe T., et al. Immunity against heterosubtypic influenza virus induced by adenovirus and MVA expressing nucleoprotein and matrix protein-1, Scientific Reports, 2013, № 3, 1443).
На сегодняшний момент разработаны быстрые и гибкие технологии получения rAd, позволяющие реализацию масштабного производства различных кандидатных вакцин на их основе, на одной технологической линии без ее переоборудования и изменения регламента.
Вакцины на основе аденовируса 26 серотипа (Ad26) в качестве вектора, вызывают устойчивый гуморальный и клеточный иммунные ответы в доклинических исследованиях (Liu J. etal.Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Journal of Virology, 2008, № 82(10), 4844-4852; Radosevic K. The Th1 immune response to Plasmodium falciparum circumsporozoite protein is boosted by adenovirus vectors 35 and 26 with a homologous insert. Clinical and VaccineImmunology, 2010, № 17(11), 1687-1694). Также, международное сероэпидемиологическое исследование сообщило о выборе Ad26 в качестве потенциального альтернативного аденовирусного вектора для разработки вакцин против ВИЧ (Barouch D.H. etal.International seroepidemiology of adenovirus serotypes 5, 26, 35, and 48 in pediatric and adult populations, Vaccine, 2011, № 29(32), 5203-5209).
Для получения качественного препарата Ad26 необходима успешная процедура очистки аденовируса 26 серотипа от компонентов культуральной среды и клеточного дебриса. Наиболее эффективным методом для очистки препарата является хроматография, которая позволяет получить чистый продукт из сложных многокомпонентных смесей с минимальными потерями. Существуют несколько способов проведения хроматографической очистки аденовирусов, основанных на использовании их физико-химических свойств.
Эксклюзионная хроматография основывается на разделении компонентов сложной смеси по размеру и форме молекул. Для такого метода очистки используют гели на основе декстрана (сефадекс) или агарозы (сефароза) (A.Kamen, O. HenryDevelopmentandoptimizationofanadenovirusproductprocess.// JGeneMed, 2004, v.6, 184-192).
Однако для разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ необходимо было подобрать сорбент, который способен работать в диапазоне близком к размерам аденовирусных частиц Ад26 (молекулярная масса составляет около 170 МДа). В качестве такого сорбента может быть использован, например, сорбент Sepharose 4 FastFlow, состоящий из сферических частиц с диаметром около 90 мкм (L.L.Bondoc, S. FitzpatrickSizedistributionanalysisofrecombinantadenovirususingdiscCentrifugation.// JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology, 1998, v.20, 317-322).
Анионообменная хроматография основывается на электростатическом взаимодействии заряда вирусного капсида и ионогенных групп сорбента (F.BlanchAnimprovedanion-exchangeHPLCmethodfordetectionandpurificationofadenovirusparticles. // GeneTherapy, 2000, v.7, 1055-1062). Так как изоэлектрическая точка аденовирусных частиц Аd26 лежит в области низких значений рН, капсид аденовируса Аd26 при нейтральном значении рН приобретает отрицательный поверхностный заряд. Гранулы сорбента имеют на поверхности ковалентно связанные ионогенные группы, что позволяет им связывать вирусные частицы, пропуская белки, нуклеиновые кислоты клеток хозяина, белковые агрегаты (Е.К. Курбанова и др. ФАРМА-2020: Технологические аспекты производства некоторых ЖНВЛП и стратегических лекарственных средств (обзор). // Биофармацевтический журнал, 2012, т.4(3), с. 21-45).
Доказано, что Ad26 имеет ряд свойств, благодаря которым данный серотип является потенциальной платформой для создания вакцин.
Для получения чистого препарата Ad26 необходим способ очистки аденовируса, подобранный с учетом физико-химических свойств данного серотипа.
В связи с этим, авторы разработали способ очистки аденовируса,включающий следующие последовательности (см. фиг.1.):
Лизис клеток.
Ферментативная обработка.
Осветление клеточноголизата.
Эксклюзионная хроматография.
Хроматография с гибридным сорбентом.
Анионообменная хроматография.
Формулирование препарата.
Стерильная фильтрация.
Примеры реализации изобретения.
Пример 1.
Культивирование.
Клеточную линию НЕК-293, зараженную вирусом Ad26, высеивали на культуральные чашки с конфлюэнтностьюмонослоя 90% в дозе 20 инфекционных вирусных частиц на клетку. На вторые сутки после заражения наблюдали цитопатическое действие (ЦПД) вируса у 100% клеток.
Пример 2.
Очистка аденовируса 26 серотипа
Лизис клеток.
После анализа ЦПД клетки собирали в центрифужные банки (V=200 мл) и осаждали при 1500 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли, а осадок с клетками ресуспендировали в 10 мл приготовленного раствора (Tris-HCl pH-8.0, 1 mMMgCl, 0.075 M NaCl, Tween-80, Сахароза 5%).
Лизис клеток проводили в 1М NaCl при перемешивании в течение часа.
Получили лизат клеток.
Ферментативная обработка.
Лизат подвергали ферментативной обработке бензоназой Benzonase в концентрации 300 U/ml на водяной бане при температуре 37 °C в течение 40 минут при перемешивании.
Осветление клеточноголизата.
Осветление клеточного лизата проводили с помощью центрифугирования при 9000g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Получен супернатант для использования в эксклюзионной хроматографии.
Эксклюзионная хроматография.
о
2
Для проведения эксклюзионнойхроматоргафии использовали хроматограф AktaExplorer 10, AktaExplorer 100 или AktaAvant 150 (GE, Швеция) при постоянной температуре 4С. Препарат наносили на колонку системы ХК-26 с упакованным эксклюзионнымсорбентом Sepharose 4 FastFlow объемом 80 мл при потоке 2,5 – 3,5 мл/мин при разнице давлении надколонкой к подколонкой ниже 1 бар. Объем препарата должен составлять менее 10 – 15% от объема колонки. Раствор для элюции продукта представлен буфером, в состав которого входят следующие компоненты: Tris-HCl с pH-7.5 для поддержания кислотности среды, 5% сахароза как криопротектант, MgCl2 мМ, и 0,5 М NaCl для десорбции продукта и примесей с колонки, а также Tween-80 0,1% в качестве детергента. Концентрация соли подобрана таким образом, что вирусные частицы выходит раньше, чем другие компоненты смеси (осадочные компоненты питательной среды, детергент, нуклеазы, генетический материал клеток и 98% белков клеток). Целевой продукт (первый пик хроматограммы) собирали для дальнейших манипуляций. По полученной хроматограмме определяли кондуктивность раствора с препаратом и объем фракции продукта. Хроматограммапродемонстрирована на фигуре 3.
Хроматография с гибридным сорбентом.
На стадии хроматографии с гибридным сорбентом использовали гибридный сорбент, имеющий форму в виде сферы с полостями в разрезе, имеющими заряженное ядро, а также незаряженную внешнюю оболочку с порами, при этом сорбент имеет размер пор, который меньше размера аденовируса 26 серотипа, с обеспечением проникновения примесей вовнутрь сорбента, где присутствует заряженное ядро, причем аденовирус 26 серотипа не способен проникать в поры сорбента, и выходит в проскоке с обеспечением эффективного отделения аденовируса 26 серотипа от примесей нуклеиновых кислот, образующихся при лизисе клеток продуцентов аденовируса (см. фиг.2).
2
Для проведения хроматографии с гибридным сорбентом полученный продукт разбавляли фазой для разбавления (Tris-HCl pH-7.5, Твин-80 0,1%, MgCl 2 мМ, 5% сахароза) до концентрации NaCl равной 0,15M или кондуктивности равной 17. Препарат наносили на колонку системы ХК-26 с упакованным гибридным сорбентом CaptoCore 700 объемом 25 мл при потоке 2,5 – 3,5 мл/мин при разнице давлении над колонкой и под колонкой ниже 1 бар.
В качестве гибридного сорбента может быть использован не только гибридный сорбент CaptoCore 700, но также CaptoCore 400 и другие гибридные сорбенты с аналогичными свойствами.
Такие сорбенты представлены в статье: «LagoutteP. etal. Scalable chromatography-based purification of virus-like particle carrier for epitope based influenza A vaccine produced in Escherichia coli», Journal of virological methods,  2016, Т. 232, С. 8-11.
Гибридный сорбент позволил свободным вирусным частицам Ad26 проходить сквозь колонку, тогда как примеси раствора, а именно нуклеиновые кислоты, задерживались в порах сорбента, имеющих заряженный центр. Очищенный препарат Аd26 в виде проскока собирали для дальнейших манипуляций. Хроматограммапродемонстрирована на фигуре 4.
Анионообменная хроматография.
2
Для проведения анионообменной хроматографии использовали две фазы. Фаза для нанесения (Tris-HCl pH-7.5, Tween-80 0,1%, MgCl2 2 мМ, 5% сахароза, 0,15 М NaCl) и фаза для элюции (Tris-HCl с pH-7.5, 5% сахароза, MgCl2 мМ, 0,5 М NaCl и Tween-80 0,1%). Препарат наносили на колонку системы ХК-26 с упакованным анионообменным сорбентом QSepharoseFastFlow объемом 25 мл при потоке 2,5 – 3,5 мл/мин при разнице давлении над колонкой к под колонкой ниже 1 бар. При нанесении Ad26 вирусные частицы задерживаются на сорбенте, поэтому после нанесения, чтобы избавиться от оставшихся примесей, колонку промывали фазой для нанесения объемом 1-1,5 CV и снимали препарат с чистым Ad26 фазой для элюции. Проведение анионообменной хроматографии позволяет не только дополнительно очистить целевой продукт, но и сконцентрировать его.
Хроматограммапродемонстрирована на фигуре 5.
Формулирование препарата.
Полученный препарат с чистым Ad26 формулировали, добавляя этанол до концентрации 0,5%, ЭДТА до концентрации 0,1 мМ и NaCl до концентрации 0,5 М.
Стерильная фильтрация.
Сформулированный препарат фильтровали через фильтр 0,22 мкр и лиофильно высушивали. Получили готовый сформулированный препарат с чистым Ad26, подготовленным для хранения.
Пример 3.
Подбор концентрации соли в лизирующем буфере для Ad26 на этапе лизиса клеток.
Вирусные частицы Аd 26 имеют внутриклеточную локализацию, поэтому чтобы получить нужный материал, необходимо разрушить клетки.
Условия лизиса должны быть достаточно жёсткими, чтобы разрушить клетки, и в тоже время достаточно мягкими, чтобы исключить повреждение вирусных частиц Аd 26. В связи со сложностью масштабирования большинства физических методов лизиса, а также из-за возможности загрязнения конечной вирусной суспензии детергентами, авторы использовали химический лизис с помощью солевого раствора.
Для этого было изучено влияние ионной силы лизирующего буфера на эффективность лизиса. Ионную силу изменяли раствором NaCl до определенной концентрации с 0.075 М до 1М с шагом 0.25 М.
Таблица 2. Содержание вирусных частиц в клеточном лизате при разной ионной силе лизирующего буфера.
Опыт №
Концентрация натрия хлорида в лизирующем буфере
Содержание инфекционных вирусных частиц в клеточном лизате
1
2.4·10<sup>8</sup>
2
6.25·10<sup>8</sup>
3
5.25·10<sup>8</sup>
4
1.15·10<sup>9</sup>
5
1М
1.12·10<sup>9</sup>
По данным определения специфической активности видно, что с повышением ионной силы буфера увеличивается выход вирусных частиц (таблица 2). Оптимальная концентрация соли может варьироваться в пределах 0.75 – 1 М.
Пример 4.
Анализ качества полученного препарата аденовируса Ad26 после стерильной фильтрации.
Определение остаточной ДНК культуры клеток HEK293.
Определение остаточной ДНК клеток–продуцентов проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Содержание остаточной ДНК клеток-продуцентов должно быть не более 10,0 нг/дозу.
Из 100 мкл препаратов Ad26 выделяли тотальную ДНК на колонках «К-Сорб» (Синтол, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Количество остаточной ДНК определяли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора «resDNASEQQuantitative Human DNA Kit» (AppliedBiosystems, США) согласно протоколу производителя. Реакцию проводили на амплификаторе CFX96™ Real-Time PCR DetectionSystem (Bio-Rad, США).
Результаты анализировали автоматически с использованием программного обеспечения для ПЦР амплификатора. Строили калибровочный график зависимости порогового цикла от концентрации геномной ДНК в пробах. Содержание геномной ДНК (С, пг/мл) в исследуемом препарате определяли по следующей формуле:
С = Са х 80,
где,
Са – средняя концентрация геномной ДНК в испытуемом образце (пг/реакцию);
80 – разведение выделенного образца для пересчета на мл концентрата.
Производили проверку пригодности системы. Система считается пригодной, если: коэффициент корреляции не меньше 0,90; эффективность больше 80%. Система являлась пригодной, поскольку коэффициент корреляции составил 0,983, а эффективность 118%.
В результате, количество остаточной ДНК клеток-продуцентов составило 0,22±0,04 нг/мл.
Определение количества геномов Ad26
Определение количества геномов Ad26 в препарате после хроматографической очистки проводили методом ПЦР в режиме реального времени.
Из 100 мкл препарата Ad26 выделяли ДНК с использованием набора для выделения тотальной ДНК WizardGenomic DNA Purification Kit (Promega, США) согласно инструкции производителя.
Для приготовления стандартной калибровочной кривой использовали плазмиду, содержащую полный геном Ad26. Количество копий составляло от 102 до 108 геномов Ad26 на реакцию.
Количество геномов Ad26 определяли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора qPCRmix-HS (ЗАО «Евроген», Россия) согласно протоколу производителя. Для анализа были разработаны праймеры на ген гексона Ad26:
HexF 5’ ccc-tcg-gct-cgg-gtt-tcg-acc-c, HexR 5’ gtc-gtt-gcc-ggg-cca-gct-gac-c
и зонда
Hex-probe (R6G)-tac-tcg-ggc-tcc-atc-ccc-tac-ctc-ga-(BHQ-2),
которые синтезировали в компании ЗАО «Евроген» (Россия). Реакцию проводили на амплификаторе CFX96™ Real-Time PCR DetectionSystem (Bio-Rad, США) с использование канала Hex. Для начальной стадии ПЦР необходима инкубация реакционной смеси при температуре 95°С в течение 5 мин для предварительной денатурации. Количество циклов – 32. Каждый цикл включает 3 этапа: 95°С в течение 15 с (этап денатурации), 61°С в течение 40 с (этап отжига совмещенный с элонгацией и с детекцией сигнала).
Результаты анализировали автоматически с использованием программного обеспечения для ПЦР амплификатора. Строили калибровочный график зависимости порогового цикла от количества геномов в пробах Ad26. Число геномов (N, молекул/мл) в исследуемом препарате определяли по следующей формуле:
N = Nа х 120,
где,
Nа – среднее число геномов в испытуемом образце (молекул/реакцию);
120 – разведение выделенного образца для пересчета на мл концентрата.
11
Производили проверку пригодности системы. Система считается пригодной, если: коэффициент корреляции не меньше 0,90; эффективность больше 80%. Система являлась пригодной, поскольку коэффициент корреляции составил 0,982, а эффективность 87,6%. В результате количество геномов Ad26 составило 1,57х10 геномов/мл.
Определение количества физических и инфекционных частиц Ad26.
В очищенном препарате Ad26 определяли количество физических и инфекционных частиц.
Количество физических частиц Ad26 оценивали спектрофотометрически по величине оптической плотности раствора Ad26 при измерении поглощения при 260 нм, принимая, что 1 ОЕ соответствует 1012 вирусных частиц на 1 мл раствора при длине оптического пути 1 см (Maizel J.V.J, et al., 1968, Virology, 36-115). Выход очищенного Ad26 составляет 1,8 ОЕ/мл.
8
Количество инфекционных частиц определяли титрованием на культуре клеток по методу Рида и Менча в единицах ТЦД50 (тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя) на мл, которое составило 3,16х10 TCID50/мл. Соотношение инфекционных частиц и вирусных геномов составило 1:497.
Определение количества общего и остаточного белка.
В очищенном препарате содержание остаточного белка клеток продуцента не должно превышать 0,1 % от концентрации общего белка. Содержание общего белка определяли по методу Лоури без предварительного осаждения белка (ОФС.1.7.2.0023.15 Определение белка колориметрическим методом (метод Лоури) в иммунобиологических лекарственных препаратах) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве образца сравнения. Для оценки концентрации остаточного белка продуцента использовали набор ImmunoenzymetricAssay Kit for the Measurement of Human EmbryonicKidney 293 Host Cell Proteins (CygnusTechnologies, США). Данные по содержанию белка представлены в Таблице 3.
Таблица 3. Данные по концентрации общего белка и остаточного белка клеток продуцента
Концентрация общего белка, мкг/мл
Концентрация остаточного белка продуцента, мкг/мл
Отношение остаточного белка продуцента к общему белку, %
197,6 ±25,5
0,182031±0,02
Представленные данные свидетельствуют об эффективности разработанного метода очистки и безопасности продукта, полученного с его помощью.
Заявленный способ, по сравнению с прототипом, является эффективным в отношении аденовируса 26 серотипа и имеет преимущество в виде уменьшения потерь препарата на стадиях очистки аденовирусов.
Таким образом, задача изобретения, а именно разработка метода очистки рекомбинантного аденовируса 26 серотипа, позволяющего получать биологически активный, хроматографически чистый и концентрированный препарат аденовирусов 26 серотипа с минимальным процентом потерь, реализована в заявленном изобретении, что подтверждается примерами.
Поставленная задача решена за счет использования гибридного сорбента, позволяющего осуществлять отделение целевого продукта от примесей с использованием как анионообменного механизма, так и гель-фильтрации в рамках одной хроматографической операции, что привело к увеличению выхода целевого продукта.
Увеличение выхода целевого продукта также происходило за счет использования химического лизиса клеток, что видно по данным определения специфической активности, при этом, с повышением ионной силы буфера увеличивается выход вирусных частиц.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают промышленную применимость данного способа с применением гибридного сорбента.