СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РИСКА ФОРМИРОВАНИЯ ДЕФИЦИТА ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR RISK OF ANTITUMOR IMMUNE PROTECTION DEFICIENCY

Изобретение относится к онкологии, иммунологии и предназначено для диагностики риска формирования онкологического процесса. Прогнозирование онкологического заболевания и диагностика его на ранних стадиях болезни обеспечивают оптимальную профилактику и лечение. Иммунная система способна обнаруживать и уничтожать атипичные и опухолевые клетки; противоопухолевый иммунитет включает реакции врожденного и адаптивного иммунитета с участием цитокинов и активизацией иммунокомпетентных клеток. Наиболее рано развивается реакция протективного воспаления с выработкой IL-1 активированными макрофагами, кератиноцитами и фибробластами. IL-1β в отличие от IL-1α оказывает влияние не только внутриклеточно, но и системно, активируя Т-лимфоциты. Данный цитокин индуцирует экспрессию и продукцию хемокинов (CXCL12, MIP-1, RANTES, МСР-3) и молекул адгезии (VCAM-1, E-selectin, ICAM-1), что в свою очередь, активирует выход клеток из сосудистого русла. Синтез IL-1β инициируют активизация системы комплемента, свертывание крови и гипоксия. Гипоксия обусловливает усиление анаэробного метаболизма, характерного для опухолевого процесса, и ассоциируется с активизацией экспрессии CD71 на Т-лимфоцитах [Добродеева Л.К., Самодова А.В., Зубаткина И.С., Ставинская О.А., Карякина О.Е. Участие рецепторов к трансферрину в метаболических процессах // Российский аллергологический журнал. - 2013. - №2(2). - С. 84-85]. Т-лимфоциты обеспечивают развитие клеточноопосредованных защитных реакций, имеют основное значение в противоопухолевом иммунитете. Вариантами активизации Т-лимфоцитов при гипоксии является экспрессия на мембране рецепторов к трансферрину (CD71) и IL-2 (CD25), при наличии чужеродных и опухолевых антигенов - HLADR+, при пролиферации малодифференцированных клеток - маркера CD10. Нарушение процессов пролиферации лежит в основе опухолевого роста, поэтому перечисленные показатели являются наиболее точными критериями для диагностики риска развития опухолевого процесса.
Известны способы лечения, профилактики и прогнозирования рака. Рассмотрены вопросы патогенеза и этиологии заболевания, охарактеризована клиническая картина канцерогенеза, методы выявления групп онкологического риска [Сейц И.Ф., Князев П.Г. Молекулярная онкология. М.: Медицина, 1986. 352 с.; Онкология / Под ред. Глыбочко П.В. М.: Изд-во Академия, 2008. 400 с.; Чиссов В.И., Дарьялова С.Л. Клинические рекомендации. Онкология. Издательство: Гэотар-Медиа, 2006. 655 с.]. Однако способы диагностики риска развития онкологического процесса представлены недостаточно четко.
Так, известен способ диагностики злокачественности нейроэпителиальных опухолей III желудочка по данным электроэнцефалографических исследований [Патент РФ №2473304, опубл. 27.01.2013]. Оценивают мощность дельта-диапазона в теменных областях и при одновременно повышенных мощностях - левой выше 80 мкВ2 и правой выше 85 мкВ2, диагностируют злокачественную форму роста нейроэпителиальной опухоли III желудочка. Указанный способ нацелен на выявление злокачественных опухолей головного мозга, предложенное изобретение не ограничивается конкретной локализацией и может быть использовано для диагностики новообразований различного гистогенеза.
Известен способ диагностики мультиформной глиобластомы методом магнитно-резонансной томографии [Патент РФ №2530762, опубл. 10.10.2014]. Исследование проводится до и после внутривенного введения магнитных наночастиц, стабилизированных биосовместимым полимером и конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов. Для реализации способа применяются современные и точные методы исследования, однако достаточно долговременные по выполнению. Только для получения магнитных наночастиц затрачивается более 40 часов лабораторного времени без учета проведения многочисленных рутинных процедур и анализов. Предложенное изобретение можно осуществить в течение 6 часов рабочего времени одного лаборанта-исследователя, что экономит производственные ресурсы диагностических медицинских учреждений, а также позволяет диагностировать риск формирования опухоли любой локализации.
2
Известен способ диагностики рака молочной железы [Патент РФ №2566214, опубл. 20.10.2015]. Производится сканирование молочной железы с помощью инфракрасной камеры. Полученные термограммы разбивают на квадратные ячейки 1 см, в которых для каждого пикселя рассчитывают мультифрактальные спектры флуктуаций температуры во времени. Рассчитывают долю ячеек со значением ширины спектра менее 0,06 и формулируют заключение о наличии злокачественной опухоли молочной железы при обнаружении не менее 25% ячеек с обозначенной шириной спектра. Данный способ достаточно точно диагностирует онкологический процесс, однако его применение возможно лишь для женщин от 23 до 83 лет. Предложенное изобретение расширяет контингент обследуемых лиц, включает не только женщин, но и мужчин, решает вопросы прогнозирования и профилактики, т.к. выявляет дефицит защитных реакций против трансформации клеток в опухолевые.
Прототипом является способ диагностики опухоли мозга у пациента [Патент РФ №2535000, опубл. 10.12.2014], характеризующийся тем, что в забранной крови определяют процентное содержание CD25-лимфоцитов, и при его значении 13,7% от общего содержания лимфоцитов устанавливают отсутствие опухоли мозга, а при его значении меньше 13,7 диагностируют наличие опухоли мозга у пациента. Однако общее содержание лимфоцитов подвержено значительным колебаниям, зависящим от циркадного и сезонного ритмов. Предложенное нами изобретение увеличивает количество исследуемых параметров оценки активизации Т-клеток с учетом молодых клеток, гипоксии, толерантности к собственным антигенам, тем самым дается более точный и информативный прогноз.
Поставленная цель достигается тем, что в крови практически здоровых людей определяют концентрацию IL-1β и содержание активированных лимфоцитов CD71+, CD25+, CD10+, HLADR+. На основании полученных данных рассчитывают диагностический индекс (ДИ): ДИ=1L-1β/Σ (CD25+CD10+CD71+HLADR+). При величине ДИ, равной 20,04 и более, диагностируется риск дефицита противоопухолевой иммунной защиты.
Заявленный способ осуществляется стандартно следующим образом. Кровь для исследования берут из локтевой вены в объеме 10 мл в 9-10 часов утра натощак в пробирку Vacutainer без наполнителя, сыворотку отделяют от эритроцитов центрифугированием. Содержание фенотипов лимфоцитов определяют с помощью непрямой иммуннопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли». Для количественного определения IL-1β в сыворотке крови обследуемых лиц используется метод иммуноферментного анализа с оценкой результатов на спектрофотометре Multiscan с длиной волны 620 нм.
Заявленным способом были обследованы 84 больных со злокачественными новообразованиями, диагноз поставлен в областном онкологическом диспансере г. Архангельска. В качестве группы сравнения были взяты 77 практически здоровых людей, жителей г. Архангельска. Исследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера Европейской территории России. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Mann-Whitney. Статистическая достоверность присваивалась при значении р<0,05.
Нами установлено, что диагностический индекс значительно отличается у здоровых людей и онкологических больных. Соотношение уровня содержания цитокина IL-1β в сыворотке крови к сумме абсолютных концентраций активированных лимфоцитов (CD25+, CD71+, CD10+, HLADR+) у практически здоровых людей составляет в среднем 0,91±0,10, а при наличии опухолевого процесса данный показатель повышается до 73,97±9,46. Максимальное значение диагностического индекса у практически здоровых - 4,87. Минимальный уровень данного показателя у больных - 12,24, а максимальный в 58,4 раза выше, чем у практически здоровых. Так как повышение уровня IL-1β наблюдается и при воспалительных заболеваниях, для сравнения диагностический индекс был определен у пациентов с острым воспалением (фурункулез); в данной группе обследуемых лиц ДИ в среднем составил 20,04±2,39, минимальное значение - 6,25, максимальное - 37,64. Таким образом, значения ДИ для здоровых людей являются наименьшими, при воспалительных процессах индекс повышается, но во всех случаях у пациентов с онкологией предлагаемый ДИ является максимальным и выше 3,7 раза. Фактически увеличение ДИ выше 20,04 отражает наличие системного влияния IL-1β, а в сочетании с активизацией лимфопролиферации свидетельствует о нарушении.
Таким образом, риск формирования опухолевого процесса ассоциируется с активизацией лимфопролиферации и высокими концентрациями IL-1β.
Частные примеры использования способа
9
1. Пациент А., 35 лет. При лабораторном исследовании крови выявлено, что сумма абсолютного содержания активированных лимфоцитов CD71+, CD25+, CD10+, HLADR+ составляет 0,81×10 кл/л. Концентрация сывороточного IL-1β равняется 0,54 пг/мл. На основании полученных данных диагностический индекс составляет 0,67. Сделан вывод о нормальном уровне защитных иммунных реакций. Контроль всех известных опухолевых маркеров отрицательный. Подозрения на опухоль желудка сняты. При диспансерном наблюдении в течение 2-х лет пациент здоров.
9
2. Пациент С., 36 лет. При лабораторном исследовании крови выявлено, что сумма абсолютного содержания активированных лимфоцитов CD71+, CD25+, CD10+, HLADR+ составляет 1,87×10 кл/л. Концентрация сывороточного IL-1β равняется 74,22 пг/мл. На основании полученных данных диагностический индекс равняется 39,69. Сделан вывод о риске формирования опухолевого процесса. При обследовании у пациента выявлен рак почки, способ верен.
9
3. Пациент С., 34 года. При лабораторном исследовании крови выявлено, что сумма абсолютного содержания активированных лимфоцитов CD71+, CD25+, CD10+, HLADR+ составляет 0,88×10 кл/л. Концентрация сывороточного IL-1β равняется 189,32 пг/мл. На основании полученных данных диагностический индекс равняется 134,28. Сделан вывод о риске формирования опухолевого процесса. При клиническом обследовании у пациента выявлена лимфосаркома, способ верен.