ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/ИНДИАНА/11/72 (H3N2v) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ
STRAIN OF INFLUENZA VIRUS A/17/INDIANA/11/72 (H3N2v) FOR PRODUCTION OF LIQUID INFLUENZA INTRANASAL VACCINE FOR ADULTS AND FOR CHILDREN

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Индиана/11/72 (H3N2v).
В 2011 году в циркуляции среди людей в США появился новый вирус А/Индиана/10/2011 (H3N2v). Вирус представляет собой реассортант и содержит 7 генов от вируса гриппа свиней Северной Америки A(H3N2), а ген М - от пандемического штамма свиного происхождения A(H1N1)pdm09, который продолжает циркулировать среди людей. Доказаны факты передачи вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v) от человека к человеку, что вызывает обоснованные опасения об эпидемических (пандемических) потенциях реассортантного штамма. Известный вакцинный штамм вируса гриппа - А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1), созданный для профилактики заболеваемости гриппом, вызванной пандемическим вирусом А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm09 - прототип [Патент РФ №2413765 от 16.09.09 - опубл. БИ 2011 - №7. Ларионова Н.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г., Александрова Г.И. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей], не может служить средством профилактики заболеваемости, вызванной новым вирусом свиного происхождения антигенной формулы A (H3N2v).
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v). Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977 - №4. - С.387-395].
Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С.66-83].
Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно-актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного донора аттенуации.
Получение вакцинного штамма
Вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) получен методом генетической реассортации «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v) с донором аттенуирующих свойств А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены четырьмя последовательными клонированиями методом предельных разведений под прессом антисыворотки к донору при пониженной (26°C - два клонирования) и оптимальной (32°C - два клонирования) температурах инкубации. Чистые клоны проверены по фенотипическим характеристикам (ts-, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.
Антигенная характеристика вакцинного штамма
Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Индиана/10/2011 (H3N2v), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - идентичен вирусу А/Индиана/10/2011 (H3N2v) по данным метода микс-ПЦР.
Анализ состава генома
Для анализа состава генома полученных реассортантов на соответствие вакцинной формуле генома использовали Микс-ПЦР анализ ДНК копий генов, основанный на различиях в размерах пар амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации и «дикого» вируса и, соответственно, различий в их электрофоретической подвижности [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С.29-36].
Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), принадлежат «дикому» родительскому вирусу А/Индиана/10/2011 (H3N2v), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) представлены в табл.1.
Таблица 1
Состав генома реассортантного вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v), полученного на основе «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v), и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
Ген
Принадлежность гена одному из родительских вирусов
Донор аттенуации
«Дикий» вирус
Вакцинный штамм
РВ2
Лен 17<sup>1</sup>
Wt (H3N2v)<sup>2</sup>
Лен 17
РВ1
Лен 17
Wt (H3N2v)
Лен 17
PA
Лен 17
Wt (H3N2v)
Лен 17
НА
Лен 17
Wt (H3N2v)
Wt (H3N2v)
NP
Лен 17
Wt (H3N2v)
Лен 17
NA
Лен 17
Wt (H3N2v)
Wt (H3N2v)
M
Лен 17
Wt (H3N2v)
Лен 17
NS
Лен 17
Wt (H3N2v)
Лен 17
<sup>1</sup> Лен 17 ген принадлежит донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);
<sup>2</sup> (H3N2v) ген принадлежит «дикому» вирусу А/Индиана/10/2011 (H3N2v).
Фенотипическая характеристика вакцинного штамма в экспериментах in vitro
10
50
10
50
Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм является температурочувствительным (ts-фенотип - его инфекционная активность при повышении температуры инкубации до 40°C - составлял менее 1.7 log ЭИД/мл 40°C) и холодоадаптированным (са фенотип - его инфекционная активность при пониженной до 26°C температуре составляла 8.0 log ЭИД/мл), что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл.2). Фенотипические свойства вакцинного штамма не изменились после его пятикратного пассирования в куриных эмбрионах, что свидетельствует о его генетической стабильности (табл.2).
Таблица 2
Фенотипические свойства вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) до и после его пассирования в развивающихся куриных эмбрионах
Вирус
Пассаж
Титр, log<sub>10</sub> ЭИД<sub>50</sub>/мл
Фенотип
32°C
26°C
40°C
А/Индиана/10/2011 (H3N2v) («дикий» вирус)
8.2
2.7
5.7
non-ts, non-ca
А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (донор)
9.2
7.2
1.7
ts, са
А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) (вакцинный штамм)
до пассирования
9.6
8.0
<1.7
ts, са
5-й пассаж
9.8
8.1
<1.7
ts, са
Генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) изучали также сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после его пятикратного пассирования в куриных эмбрионах. Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов [Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J. Virol. Methods. - 1995. - Vol.52. - №1-2. - P.41-49], основанным на амплификации коротких участков РНК, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), продемонстрирована идентичность мутаций во всех внутренних генах донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) до и после его пятикратного пассирования, в том числе в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип (табл.3).
Таблица 3
Кодирующие мутации в геноме вакцинного щтамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) по сравнению с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и его диким предшественником, вирусом А/Ленинград/134/57 (H2N2)
Ген
Аминокислота
Мутации
Лен/wt<sup>1</sup>
Лен 17
А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v)
до пассирования
5 пассаж
РВ2
478
Val
Leu
Leu
Leu
РВ1
265
Lys
Asn
Asn
Asn
591
Val
Ile
Ile
Ile
РА
28
Leu
Pro
Pro
Pro
341
Val
Leu
Leu
Leu
NP
NP ген донора аттенуации не содержит мутаций
M1
15
Ile
Val
Val
Val
144
Phe
Leu
Leu
Leu
NS2
100
Met
Ile
Ile
Ile
<sup>1</sup>Наличие мутаций в геноме вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) определяли путем его сравнения с диким предшественником донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а именно с вирусом дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), с помощью стандартного метода RFLP. Обозначения: Лен - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); Лен/wt - вирус дикого типа А/Ленинград/134/57 (H2N2), предшественник донора аттенуации.
Безвредность для морских свинок
Доклинические исследования острой и подострой токсичности вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) проводили на морских свинках в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.: 2010. 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.20010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html].
50
Изучение острой токсичности вакцинного штамма А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) проводили в экспериментах на морских свинках обоего пола. Морским свинкам вводили однократно 5 мл вакцинного вируса подкожно в дозе 7.0 lg ЭИД/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.
Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении.
Изучение подострой токсичности изучали на морских свинках обоего пола. Морским свинкам вводили вирус интраназально по 100 мкл вируса в носовой ход, двукратно с 24-часовым интервалом. Животным контрольной группы интраназально вводили физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (14 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.
Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении (табл.4).
Данные физиологического исследования показали, что подкожное или интраназальное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.
Таблица 4
Результаты изучения безвредности вакцинного штамма в экспериментах на морских свинках
Животные
Пол
Препарат
Путь введения
Выжило к последнему дню наблюдения
Морские свинки (острая токсичность)
Самцы
ВШ
п/к
10/10
Самки
ВШ
п/к
10/10
Самцы
Плацебо
п/к
10/10
Самки
Плацебо
п/к
10/10
Морские свинки (подострая токсичность)
Самцы
ВШ
и/н
10/10
Самки
ВШ
и/н
10/10
Самцы
Плацебо
и/н
10/10
Самки
Плацебо
и/н
10/10
Обозначения: ВШ - вакцинный штамм A/17/Texac/2012/30 (H3N2); п/к - подкожное введение; и/н - интраназальное введение.
В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.
Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р №003224/01-270313) на Ультравак, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.
Полученный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) депонирован 04.07.2013 г. в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, Россия, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2739 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
50
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 48 часов - 9,6 lg ЭИД/мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:1024.
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.