Разработка метода идентификации и генотипирования бактерий Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica на основе полимеразной цепной реакции и филогенетический анализ культур бактерий, выделенных от крупного рогатого скота

MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS OF ALLELE VARIANTS OF MICROSATELLITE

LOCI DU281, DU215, AND DU323 IN THE PARTHENOGENETIC LIZARDS DAREVSKIA ROSTOMBEKOVI

F. A. Osipov12, A. A. Vergun12, A. E. Girnyk1, N. M. Kutuzova2, A. P. Ryskov1

1 Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow,

Russia; 2 Moscow State Pedagogical University, Ministry of Education and Science of the Russian Federation, Moscow, Russia

One of the main questions in the study of the unisexual (partheno-genetic) species of vertebrates is the determination of their genetic diversity. Nuclear and mitochondrial genetic markers can be used for this purpose. One of the most effective genetic markers is the microsatellite DNA, which mutates at a high rate. Development and characteristics of such markers are necessary in studies of par-thenogenetic species. In this work, the analysis of the allele polymorphism of three microsatellite loci was performed for the first time via locus-specific PCR in the populations of parthenogenetic species Darevskia rostombekovi (n = 42) and bisexual parental species D. raddei (n = 6) and D. portschinskii (n = 6). All examined individuals of the parthenogenetic D. rostombekovi were heterozygous. Two to five alleles, depending on the locus, were found in the studied populations of the parthenogenetic species. It was shown that the differences were due to the varying structure of the mi-

crosatellite cluster and to single nucleotide substitutions at fixed distances in the DNA regions adjacent to the cluster. The allele structure variations form haplotype markers specific for each allele and inherited from the parental bisexual species. It was determined which alleles of the parthenogenetic species were inherited from the maternal species and which from the paternal species. Characteristics of distribution, frequency of occurrence, and combination of alleles of microsatellite loci, which determine the distinctive features of each D. rostombekovi population were obtained. The data can be used in the future to determine the clonal diversity and possible ways of its formation in the populations of the parthenogenetic species D. rostombekovi.

Key words: parthenogenesis, unisexual and bisexual lizards of genus Darevskia, microsatellite loci, allele polymorphism, haplotype markers

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-58-62

Acknowledgments. Equipment provided by the Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, was used. The authors are grateful to F. D. Danielyan and coworkers for the help in preparation of biological samples used to form a collection of DNA of Darevskia lizards.

Funding. This work was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 14-14-00832).

Conflicts of interest. The authors declare that there is no conflict of interest.

@С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.843.95.083.1

Нефедченко А.В 1, Шиков А.Н. 2, Глотов А.Г.1, Глотова Т.И. 1, Терновой В.А.2, Агафонов А.П. 2,

Сергеев А.Н. 2, Донченко Н.А.1

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ PASTEURELLA MULTOCIDA И MANNHEIMIA HAEMOLYTICA НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

'Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока», 630501, Новосибирск, Российская Федерация; 2Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», 630559, Новосибирск, Российская Федерация.

В статье представлены результаты разработки метода выявления и генотипирования бактерий Pasteurella multocida 5 капсульных групп и Mannheimia haemolytica А1 на основе мультиплексной по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией. Диагностическая чувствительность разработанного метода составила 103 КОЕ/мл при исследовании чистых культур и 105 КОЕ/г при исследовании биологического материала. При исследовании 260 проб биоматериала от больных животных выявили Pasteurella multocida в 50%, а Mannheimia haemolytica в 11,2% исследованных проб. Нами не установлена циркуляция среди восприимчивого поголовья животных капсульных групп Pasteurella multocida В и Е. В большинстве исследованных проб были выявлены группа А, реже D, в одном случае К На основе филогенетического анализа выявлена циркуляция двух генетических типов бактерии Pasteurella тиНоШа капсульной группы А. Ключевые слова: Pasteurella тиНо^а; Mannheimia haemolytica; полимеразная цепная реакция; гены; капсульная группа; филогенетический анализ.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-62-66

Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота (КРС) причиняют значительный экономический ущерб животноводству. В этиологии этих болезней значительная роль принадлежит бактериям семейства Pasteurellaceae — Мап^ета haemolytica и

Для корреспонденции: Нефедченко Алексей Васильевич, nav-vet@ mail.ru

Pasteurella тиНосЫа [1]. Оба возбудителя вызывают, как правило, вторичные инфекции, возникающие при неблагоприятных воздействиях внешней среды или вирусной инфекции. Эти болезни распространены повсеместно, приводят к гибели, снижению скорости роста, привесов и молочной продуктивности животных [2—5].

М. haemolytica вызывает вспышки респираторных болезней, характеризующихся острым проявлением и тяжелым течением, а Р. multocida — подострые и хронические пневмонии, обладает меньшей вирулентностью [6, 7].

У Pasteurella тиНоШа выявлено 5 капсульных групп (А, В, D, Е и F), имеющих различное эпизоотологическое значение для животных. Штаммы бактерии капсульных групп А и D участвуют в возникновении респираторных болезней телят и взрослых животных, В и Е — геморрагической септицемии КРС и буйволов; F — редко выделяли при септических и респираторных болезнях телят [8, 9]. У Mannheimia haemolytica выявлено 12 серологических типов, из которых только один (А1) вызывает респираторные болезни КРС [10].

Идентификация бактерий, основанная на изучении их культурально-морфологических, биохимических свойств, является очень трудоемким и длительным процессом. Методы молекулярной биологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют быстро обнаружить и идентифицировать микроорганизмы непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах [11].

Расшифровка нуклеотидной последовательности второго региона локуса синтеза капсулы Р. т^^^а позволила иден-

тифицировать уникальные для каждой капсульной группы гены, кодирующие белки, вовлеченные в синтез группоспе-цифичных капсульных полисахаридов. Ген hyaD отвечает за синтез гиалуроновой кислоты и уникален для штаммов группы А, fcbD — синтез хондроитинсинтазы у F, dcbF — синтез гликозида гепарана у D. Гены bcbD и ecbJ кодируют гликозилтрансферазу у штаммов капсульных групп В и Е, соответственно. Также был идентифицирован высоко консервативный и уникальный для P. multocida ген белка клеточной стенки kmt1 [12].

Ген sodA, кодирующий фермент супероксиддисмутазу, высоко консервативен для Mannheimia haemolytica [13].

Ряд авторов приводят данные о гетерогенности гена протеина наружной мембраны Н (ompH) у различных серовариантов Pasteurella multocida и возможности использования его для ти-пирования культур [14, 15].

Цель работы — разработка метода идентификации и геноти-пирования бактерий Pasteurella multocida капсульных групп A, B, D, Е, F и Mannheimia haemolytica A1, основанного на мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией, и проведение филогенетического анализа выделенных культур бактерий.

Материалы и методы

Бактерии. Референтные штаммы P. multocida «1231», «681», «Т80», а также M. haemolytica «16» были получены из коллекции культур микроорганизмов ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (Москва). Другие штаммы были выделены нами от больных телят (табл. 1).

Выделение ДНК. ДНК из бактериальных культур и проб внутренних органов животных выделяли при помощи коммерческого набора «Рибо-преп» (ЦНИИ эпидемиологии, Россия).

Постановка ПЦР. ПЦР проводили с праймерами, представленными в табл. 2, в реакционной смеси объемом 30 мкл следующего состава: 5 мкл ДНК; ^Taq буфер без Mg2 + (ООО «Лаборатория Медиген», Россия), 3,3 мМ MgCl2, 0,4 мМ dNTP, 0,15 мкМ каждого праймера, 1,5 е.а. SmartTaq ДНК-полимераза, вода — до 30 мкл, амплификацию проводили при следующем режиме: 1 цикл 95°С — 5 мин; 45 циклов 95°С — 20 с, 57°С — 30 с, 72°С — 40 с; 1 цикл 72°С — 7 мин. Амплифицированные фрагменты разделяли в 2% агарозном геле.

Получение положительных контрольных образцов. Положительные контрольные образцы (ПКО) были получены методом молекулярной трансформации E. coli штамма Top 10 плаз-мидами pCR 2.1 («Invitrogen», США), содержащими специфические ДНК вставки генов: sodA Mannheimia haemolytica, kmt1, hyaD, bcbD и dcbF Pasteurella multocida, полученными с помощью праймеров, представленных в табл. 2. Концентрацию плаз-мидной ДНК определяли с использованием набора реагентов Quant-iT dsDNA, HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).

Определение аналитической и диагностической чувствительности. Аналитическую чувствительность метода определяли отдельно для каждого анализа, в качестве образцов использовали 10-кратные разведения ПКО.

Диагностическую чувствительность метода устанавливали с использованием 10-кратных разведений культур Pasteurella multocida (СР-57, 681, МСК-13) и Mannheimia haemolytica (16), концентрация которых была предварительно определена стандартными бактериологическими методами.

Чувствительность ПЦР устанавливали при исследовании тканевого материала. Для этого к 900 мкл 10% суспензии легкого или лимфатического узла добавляли 100 мкл разведения культуры бактерий, перемешивали, отстаивали и исследовали верхнюю водную фазу. Концентрацию бактерий пересчитывали в колониеобразующие единицы (КОЕ) на 1 г ткани. Выделение ДНК из образцов проводили, как описано выше.

Анализ проб биологического материала. Исследовали 260 проб биоматериала (легкие, средостенные и бронхиальные лимфатические узлы, селезенка), полученных от павших телят в возрасте от 4 дней до 6 мес с признаками респираторных болезней. Из проб органов готовили 10% суспензию. Выделение ДНК из образцов проводили, как описано выше.

Определение нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ. Для секвенирования генов Pasteurel-

la multocida и Mannheimia haemolytica использовали праймеры, представленные в табл. 2. Секвенирующую реакцию проводили с использованием набора реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits («Applied Biosystems», США). Продукты секвенирующей реакции анализировали методом капиллярного электрофореза в автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130xl («Applied Biosystems», США). Выравнивание последовательностей, филогенетический анализ проводили методом присоединения соседей в программах MEGA 5 и Lasergene 7. Статистическую достоверность топологии филогенетических деревьев устанавливали с помощью бутстреп-теста.

Результаты и обсуждение Разработка методики выявления и генотипирования бактерий Pasteurella multocida и M. haemolytica

Для детекции генов Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica подбирали праймеры в программе Vector NTI 9.0.0 (InforMax) с использованием последовательностей генов, депонированных в международной базе данных NCBI GeneBank. На первом этапе работы были рассчитаны и синтезированы несколько пар олигонуклеотидных праймеров для каждого гена, которые проверяли на специфичность по отдельности и в смеси

Таблица 1

Бактериальные культуры, использованные в работе, и результаты генотипирования

Вид бактерий

Штамм

Источник

Результаты тестирования в ПЦР

выявление

генотипи-рование

M. haemolytica То же

P. multocida То же

16 НК-42

НВ-53 1231

681 Т-80 T-14

МСК-13 Sib-13 Омск-13 УК-59 СР-57 АОМ/2013 ОВ-58

Коллекция ВИЭВ

Коллекция лаборатории

То же

Коллекция ВИЭВ

То же

Коллекция лаборатории

То же

Streptococcus pneumoniae

Clostridium perfringens

Klebsiella pneumoniae

Salmonella typhimurium

Salmonella paratyphimurium

Escherichia coli

M.h. M.h.

M.h. P.m.

P.m. P.m. P.m.

P.m. P.m. P.m. P.m. P.m. P.m. P.m.

А

В В А

D

А А А А А А

F-50

Коллекция ВИЭВ

Примечание: штаммы бактерий из коллекции лаборатории были выделены из легких телят с респираторной патологией; — отрицательный результат ПЦР

Таблица 2

Последовательности праймеров для выявления и секвенирования генов Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica

Позиция в рефе- Референтная Размер

Ген Праймеры Последовательность праймеров рентной последова- последователь- амплико-

тельности ность на, пн

Происхождение

sodA

M.h.-F M.h.-R

kmtl Kmt1-F

Kmt1-R hyaD P.m.A-F

P.m.A-R dcbF P.m.D-F

P.m.D-R bcbD P.m.B-F

P.m.B-R ecbJ P.m.E-F

P.m.E-R fcbD P.m.F-F

P.m.F-R ompH* F

R

Примечание: *

Mannheimia haemolytica

5-GACTACTCGTGTTGGTTCAGGCT-3 312—334

5-CGGATAGCCTGAAACGCCT-3 438—420 Pasteurella multocida

5-TAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATA-3 266—292

5-GAGTGGGCTTGTCGGTAGTCTT-3 456—477

5-CGATAGTCCGTTAGATATTGCAAC-3 9267—9288

5-CATAATGGATTTGGCGCCAT-3 9803—9824

5-ATCGCATCCAGAATAGCAAACTC-3 3306—3328

5-TCCGATGCTTTGGTTGTGC-3 3661—3643

5-GCGTGTATAACCTACATCTTCCCA-3 12541—12564

5-CGTCCATCAACACCTTTACTGC-3 12708—12687

5-TGGGCACATGCTCGCTTA-3 4539—4556

5-CTGCTTGATTTTGTCTTTCTCCTAA-3 4896—4872

5-CGGAGAACGCAGAAATCAGAA-3 2885—2905

5-CAACAACGACTTCAAATGGGTAG-3 3142—3120

5'-GCGTTTCATTCAAAGCATCTC-3' 1—20

5'-ATGACCGCGTAACGACTTTC-3' 975—996 - использовали только для секвенирования.

AY702512

FJ986389

AF067175

AF302465

AF169324

AF302466

AF302467

126 Эта работа

211

564

355

167

357

257

AY606823 996

То же

[16]

с другими праймерами. Выбранные нами праймеры представлены в табл. 2.

С целью повышения чувствительности, специфичности и скорости анализа были оптимизированы следующие параметры ПЦР: концентрации dNTP, ионов Mg и праймеров, количество вносимого раствора ДНК, температурно-временной режим реакции, а также определены оптимальные смеси праймеров.

В окончательном варианте исследование каждой пробы проводили в двух мультиплексных реакциях.

В первой реакции использовали видоспецифичные праймеры для выявления Pasteurella multocida (Kmt1-F, Kmt1-R) с размером фрагмента 211 п.н. и Mannheimia haemolytica (M.h.-F, M.h.-R) — 126 п.н., а также группоспецифичные праймеры P.m. A-F — P.m. A-R (564 п.н.) для генотипирования группы А и P.m. D-F — P.m. D-R (355 п.н.) для группы D.

Во второй реакции проводили генотипирование капсульных групп В (P.m. В-F — P.m. В-R) размер фрагмента 167 п.н., Е (P.m. Е-F, P.m. Е-R) — 357 п.н. и F (P.m. F-F, P.m. F-R) — 257 п.н.

При отработке параметров постановки ПЦР использовали культуры бактерий, представленные в табл.1. Никаких неспецифических реакций мы не наблюдали. Результаты капсульного генотипирования культур совпадали с данными, полученными в ранее проведенных исследованиях [17] (рис. 1).

Определение аналитической и диагностической чувствительности

За аналитическую чувствительность принимали последнее разведение ПКО, с которым результат ПЦР-анализа интерпретировали как положительный. Аналитическая чувствительность метода составила от 1,6  10 до 5,9  102 ГЭ/реакцию.

Подобранные нами праймеры с одинаковой эффективностью выявляли и позволяли генотипировать культуры Pasteurella multocida капсульных групп А, В, D и M. haemolytica. Диагностическая чувствительность тест-системы при исследовании бактериальной суспензии составила 103 КОЕ/мл, а в тканевом материале - 105 КОЕ/1 г ткани.

Анализ проб биологического материала

Разработанный протокол постановки ПЦР был применен для анализа проб биологического материала от больных животных. Результаты, представленные в табл. 3, показали, что ДНК

M. haemolytica была выявлена в 14,3% проб легких, 11,1% лимфатических узлов. ДНК P. Multocida, помимо легких (63,3%) и лимфатических узлов (42,6%), также обнаружена в 8,8% проб селезенки. При генотипировании в 82,6% положительных проб выявили P. multocida капсульной группы А, а в 11,5% — D. У одного животного во всех исследованных пробах была выявлена ДНК P. multocida капсульной группы F.

Рис. 1. Результаты электрофореза продуктов амплификации геномов бактерий P. multocida и M. haemolytica в первой (а) и второй (б) реакции.

1 и 18 — маркер молекулярной массы 100 п.н. (цифрами обозначены длины ампликонов), 2 — M. haemolytica 16, 3—11 — культуры P. multocida

1231, 681, Т-80, Т-14, Sib-13, Омск-13, УК-59, МСК-13, СР-57, 12 — культура M. haemolytica НК-42, 13 — S. pneumoniae, 14 — Cl. perfringens, 15 — K. pneumonia, 16 — S. typhimurium, 17 — смесь ПКО.

20

60

35

44

93

50

69

- gi |AY225341.1 |Pm serovar B2

gi|DQ233648.1|Pm isolate IVI13 £Pm681 66 £PmT-80

ÄPmOmsk-13 gi|AE004439.1|Pm str. Pm70 £PmT-14 -£Pm. MCK-13 ]5

_i £Pm1231

ral gi|CP001409|Pm str. 3480 gi|CP003313.1|Pm str. HN06 gi|EU873317.1|Pasteurella sp. Kmt1 gene gi|AY225313.1|Pm serovar D

— gi|FJ986389.1 |Pm Kmt1 gene

99 i-

gi|AY225344.1|Pm serovar A4

40

gi|DQ233649.1|Pm isolate M14

ÍTPmSib-13

gi|CP008918.11 Pm str. ATCC 43137 fcPm OB-58 üPmAGM-2013 irPm CP-57

gi|CP003022.1|Pm str. 36950 gi|CP003328.1|Pm str. HB03

gi|DQ871028.1|Pm from sheep

99 I gi|DQ871029.1|Pm from poultry

Рис. 2. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей участка гена kmt1

Pasteurella multocida. Здесь и на рис. 3, 4: звездами выделены штаммы бактерий, приведенные в табл. 1.

Таблица 3

Выявление и генотипирование патогенов при исследовании органов животных

Вид биоматериала Количество исследован-нык нроб Результат исследования

выявление* капсульная группа**

Mannheimia haemolytica Pasteurella multocida А D F

Легкие I6I 23/I4,3 I02/63,3 89/88,2 I2/I0,8 I/0,9

Лимфатические 54 6/II,I 24/42,6 20/8б,9 3/I3,0 I/4,3

узлы

Селезенка 45 О 4/8,8 3/75,0 О I/25,0

Всего.

2б0

29/II.2

Примечание:* — количество положительныx/процент от количества исследованньк нроб, ** — количество положительныx/процент от количества нроб, в который выявлена ДНК P. multocida.

Определение нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ

Для подтверждения специфичности типирования бактериальных культур и генотипирования капсульных групп в пробах биологического материала определили нуклеотидную последовательность полученных в ПЦР ампликонов и сравнили их с гомологичными последовательностями в NCBI BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/). Амплифицированные фрагменты генов исследованных нами культур Pasteurella multocida hyaD, dcbF, bcbD, а также фрагмент гена fcbD, выявленный в пробе биомате-

риала, имели I00% идентичность с гомологичными последовательностями генов Pasteurella multocida, депонированный в базе данный GenBank.

Последовательности гена kmt1 раз-нык штаммов имели 97—100% сродства, поэтому был проведен филогенетический анализ по этому гену, разделивший все штаммы на несколько клад, объеди-няющик культуры одной капсульной группы (рис. 2). При этом выделенные нами штаммы капсульной группы А были объединены в 2 клады (клады I и 2) и генетически отличались от референтного штамма I23I (клада 3).

По результатам филогенетического анализа по гену ompH исследованные штаммы с высокой степенью достоверности были сгруппированы в те же клады (рис. 3, см. 2-ю пол. обл.).

Культуры M. haemolytica по участку гена sodA были гомологичны опубликованным последовательностям M. haemo-lytica. В то же время сродство с аналогичными последовательностями M. glucosi-da, M. varigena и M. ruminalis составило 83—95% (рис. 4, см. 2-ю пол. обл.).

Таким образом, нами разработан метод выявления и генотипирования бактерий P. multocida капсульнык групп А, В, D, Е, F и M. haemolytica на основе ПЦР с электрофоретической детекцией результатов. Он обладает высокой специфичностью и чувствительностью при тестировании бактериальным культур и проб биологического материала от больным животным. Бактерию Pasteurella multocida выявляли в органаx от животным с респираторной патологией чаще, чем M. haemolytica. Выявление P. multocida капсульной группы А в большем количестве проб свидетельствует о том, что она играла более важную роль в развитии эпизоотической ситуации в обследованный нами xозяйстваx, чем P. multocida капсульной группы D. В одном случае генотипировали бактерию капсульной группы F. Нами выявлена циркуляция на территории Сибири двуx генетически типов по генам kmtl и ompH штаммов P. multocida капсульной группы А.

Разработанный протокол постановки ПЦР может быть использован в ве-теринарнык лабораторияx как простой, доступный и легко воспроизводимый аналог серологического типирования, позволяющий выявлять и генотипиро-вать P. multocida и M. haemolytica на всеx этапаx бактериологически исследований и, следовательно, сократить время на постановку диагноза, что позволит оптимизировать противоэпизоотические мероприятия, в частности выбор вакцин и разработку программы иммунизации животным.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

I. Frank G.H. Bacteria as etiologic agents in bovine respiratory disease. In: Bovine Respiratory Disease / Ed. R.W. Loan. College Station (TX): Texas A & M University Press; I984: 342—б2.

I30/50,0 II2/86,2 I5/II,5 3/2,I

б5

2. Griffin D., Chengappa M.M., Kuszak J., McVey D.S. Bacterial pathogens of the bovine respiratory disease complex. Vet. Clin. N. Am.: FoodAnim. Pract. 2010; 26: 381—94.

3. Шегидевич Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота: Дисс. Москва; 1993.

4. Глотов А.Г., Петрова О.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Татарчук А.Т., Котенева С.В. и др. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота. Ветеринария. 2002; (3): 17—21.

5. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В., Котенева С.В., Будулов Н.Р., Кунгурцева О.В. Этиологическая структура массовых респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота в хозяйствах, занимающихся производством молока. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2008; (3): 72—8.

6. Griffin D. Bovine pasteurellosis and other bacterial infections of the respiratory tract. Vet. Clin. N. Am.: Food Anim. Pract. 2010; 26: 57—71.

7. Dabo S.M., Taylor J.D., Confer A.W. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease. Anim. Hlth Res. Rev. 2007; 8: 129—50.

8. Hemorrhagic septicemia. Chapter 2.4.12. In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (Mammals, Birds and Bees). 6 Ed. 2012; Vol. 1: 732—45.

9. Wilkie I.W., Harper M., Boyce J.D., Adler B. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2012; 361: 1—22.

10. Katsuda K., Kamiyama M., Kohmoto M., Kawashima K., Tsunemitsu H., Eguchi M. Serotyping of Mannheimia haemolytica isolates from bovine pneumonia: 1987—2006. Vet. J. 2012; 178: 146—8.

11. Терентьева Т.Е., Глотова Т.И., Глотов А.Г., Донченко Н.А. Сравнительная эффективность различных методов диагностики болезней крупного рогатого скота, вызываемых бактерией Pasteurella multocida. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2014; (3): 90—5.

12. Townsend K.M., Boyce J.D., Chung J.Y., Frost A.J., Adler B. Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 924—9.

13. Guenther S., Schierack P., Grobbel M., Lübke-Becker A., Wieler L.H., Ewers C. Real-time PCR assay for the detection of species of the genus Mannheimia. J. Microbiol. Meth. 2008; 75: 75—80.

14. Luo Y., Zeng Q., Glisson J.R., Jackwood M.W., Cheng I.H., Wang C. Sequence analysis of Pasteurella multocida major outer membrane protein (OmpH) and application of synthetic peptides in vaccination of chickens against homologous strain challenge. Vaccine. 1999; 17: 821—31.

15. Singh R., Tewari K., Packiriswamy N., Marla S., Rao Ingh V.D. P., Tewari R., K. Molecular characterization and computational analysis of the major outer membrane protein (ompH) gene of Pasteurella multocida P52. Vet. Arh. 2011; 81: 211—22.

16. Antony P.X., Nair G.K., Jayaprakasan V., Mini M., Aravindakshan T. Nucleic acid based differentiation of Pasteurella multocida serotypes. Internet J. Vet. Med. 2007; 2: 85—9.

17. Глотов А.Г., Терентьева Т.Е., Нефедченко А.В., Глотова Т.И., Ши-ков А.Н., Агафонов А.П. Гетерогенность пастерелл, выделенных от крупного рогатого скота на молочных комплексах. Ветеринария. 2014; (12): 23—6.

Поступила 16.03.15

REFERENCES

1. Frank G.H. Bacteria as etiologic agents in bovine respiratory disease. In: Bovine Respiratory Disease / Ed. R.W. Loan. College Station (TX): Texas A & M University Press; 1984: 342—62.

2. Griffin D., Chengappa M.M., Kuszak J., McVey D.S. Bacterial pathogens of the bovine respiratory disease complex. Vet. Clin. N. Am: Food Anim. Pract. 2010; 26: 381—94.

3. Shegidevich E.A. Role of Pasteurella in respiratory disease of sheep and cattle: Diss. Moscow; 1993. (in Russian).

4. Glotov A.G., Petrova O.G., Glotova T.I., Nefedchenko A.V., Tatarchuk A.T., Koteneva S.V. et al. The spread of viral respiratory disease of cattle. Veterinariya. 2002;

5. Glotov A.G., Glotova T.I., Nefedchenko A.V., Koteneva S.V., Budulov N.R., Kungurtseva O.V. The etiological structure of mass respiratory disease calves in farms producing milk. Sibirskiy vestnik sel 'sko-khozyayst-vennoy nauki. 2008;

6. Griffin D. Bovine pasteurellosis and other bacterial infections of the respiratory tract. Vet. Clin. N. Am.: Food Anim. Pract. 2010; 26: 57—71.

7. Dabo S.M., Taylor J.D., Confer A.W. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease. Anim. Hlth Res. Rev. 2007; 8: 129—50.

8. Hemorrhagic septicemia. Chapter 2.4.12. In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (Mammals, Birds and Bees). 6 Ed. 2012; Vol. 1: 732—45.

9. Wilkie I.W., Harper M., Boyce J.D., Adler B. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2012; 361: 1—22.

10. Katsuda K., Kamiyama M., Kohmoto M., Kawashima K., Tsunemitsu H., Eguchi M. Serotyping of Mannheimia haemolytica isolates from bovine pneumonia: 1987—2006. Vet. J. 2012; 178: 146—8.

11. Terent'yeva T.E., Glotova T.I., Glotov A.G., Donchenko N.A. Comparative efficacy of different methods of diagnosis of disease of cattle caused by the bacterium Pasteurella multocida. Sibirskiy vestnik sel 'skokhozyaystvennoy nauki. 2014;

12. Townsend K.M., Boyce J.D., Chung J.Y., Frost A.J., Adler B. Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 924—9.

13. Guenther S., Schierack P., Grobbel M., Lübke-Becker A., Wieler L.H., Ewers C. Real-time PCR assay for the detection of species of the genus Mannheimia. J. Microbiol. Meth. 2008; 75: 75—80.

14. Luo Y., Zeng Q., Glisson J.R., Jackwood M.W., Cheng I.H., Wang C. Sequence analysis of Pasteurella multocida major outer membrane protein (OmpH) and application of synthetic peptides in vaccination of chickens against homologous strain challenge. Vaccine. 1999; 17: 821—31.

15. Singh R., Tewari K., Packiriswamy N., Marla S., Rao Ingh V.D. P., Tewari R., K. Molecular characterization and computational analysis of the major outer membrane protein (ompH) gene of Pasteurella multocida P52. Vet. Arh. 2011; 81: 211—22.

16. Antony P.X., Nair G.K., Jayaprakasan V., Mini M., Aravindakshan T. Nucleic acid based differentiation of Pasteurella multocida serotypes. Internet J. Vet. Med. 2007; 2: 85—9.

17. Glotov A.G., Terent'yeva T.E., Nefedchenko A.V. Glotovа T.I., Shikov A.N., Agafonov A.P. Heterogeneity of Pasteurella isolates from cattle dairy complex. Veterinariya. 2014;

DEVELOPMENT OF THE METHOD FOR IDENTIFICATION AND GENOTYPING OF THE BACTERIA PASTEURELLA MULTOCIDA AND MANNHEIMIA HAEMOLYTICA ON THE BASIS OF THE PCR AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF BACTERIAL CULTURES ISOLATED FROM CATTLE

A. V. Nefedchenko1, A. N. Shikov2, A. G. Glotov', T. I. Glotova', V. A. Ternovoy2, A. P. Agafonov2, A. N. Sergeev2, N. A. Donchenko'

1 Institute of Experimental Veterinary of Siberia and the Far East, Novosibirsk, Russia; 2 State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Novosibirsk, Russia

The results of development of a method for detection and genotyping of the bacteria Pasteurella multocida capsular five groups and Mannheimia haemolytica A1 based on the multiplex polymerase chain reaction (PCR) with electrophoretic detection are submitted. Diagnostic sensitivity of the developed method was 103 CFU/ml in the study of the pure cultures and 105 CFU/g in the study of biological material. A study of 260 samples of biological material from infected animals revealed Pasteurella multocida in 50.0%, and Mannheimia haemo-lytica in 11.2% of the investigated samples. Circulation among the tested livestock of capsular groups В and E of Pasteurella multocida was not revealed. The majority of the tested samples contained group A, in some cases, group D, and, in one case, group F. On the basis of the phylogenetic analysis circulation of two different genetic types of Pasteurella multocida of the capsular group A was revealed. Key words: Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, PCR, genes, capsule group, phylogenetic analysis

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-62-66

Funding. The study was not supported by sponsors.

Conflicts of interest. The authors declare that there is no conflict of

interest.