КОМПОЗИЦИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ И СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТКИ ИЛИ ТКАНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОЙ КОМПОЗИЦИИ
COMPOSITION OF THE CULTURE MEDIUM AND METHOD OF CULTURING OF THE CELL OR TISSUE USING THE SPECIFIED COMPOSITION

Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции среды, содержащей структуру, способную суспендировать клетки или ткани, и к способу культивирования клеток или тканей с использованием этой композиции среды. Композицию среды и способ культивирования клеток с использованием этой среды по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать для культивирования клеток и/или тканей животных или растений, в частности, в суспендированном состоянии.
Уровень техники
В последние годы разработаны технологии пролиферации и поддержания различных органов, тканей и клеток in vitro, которые играют различные роли в организме животных и растений. Пролиферацию или поддержание органов и тканей in vitro называют культурой органов и культурой тканей, соответственно, и пролиферацию, дифференцировку или поддержание клеток, отделенных от органа или ткани in vitro, называют клеточной культурой. Клеточная культура представляет собой технологию пролиферации, дифференцировки или поддержания разделенных клеток in vitro в среде, и она является незаменимой для детального анализа функций и структуры различных органов, тканей и клеток in vivo. Кроме того, клетки и/или ткани, культивируемые по этой технологии, используют в различных областях для оценки эффективности и токсичности химических веществ, фармацевтических продуктов и т.п., крупномасштабной продукции полезных веществ, таких как ферменты, факторы роста клеток, антитела и т.п., в регенеративной медицине для замены органа, ткани и клетки, которые были утрачены вследствие заболевания и недостаточности, улучшения сорта растений, получения продуктов рекомбинактных генов и т.п.
Клетки животного происхождения ориентировочно подразделяют на не прикрепляющиеся клетки и прикрепляющиеся клетки, исходя из их свойств. Не прикрепляющиеся клетки представляют собой клетки, которые не требуют каркаса для роста и пролиферации, и прикрепляющиеся клетки представляют собой клетки, для роста и пролиферации которых требуется каркас. Большинство клеток, составляющих живой организм, являются последними из них прикрепляющимися клетками. В качестве способов культивирования прикрепляющихся клеток известны культура в монослое, дисперсионная культура, погруженная культура, культура в микроносителе, сферическая культура и т.п.
Культура в монослое представляет собой способ культивирования клеток в качестве единичного слоя с использованием, в качестве каркаса, контейнера для культивирования, изготовленного из стекла или синтетического полимерного материала, который подвергнут различным обработкам поверхности, или поддерживающих клеток, называемых фидерными клетками, и она наиболее распространена. Например, были разработаны способы культивирования с использованием контейнеров для культивирования с различной формой или свойствами, таких как полистироловый контейнер, подвергнутый различным поверхностным обработкам (обработка плазмой, коронная обработка и т.д.), который покрыт факторами адгезии клеток, такими как коллаген, фибронектин, полилизин и т.п. или на который заранее посеяны фидерные клетки и т.п. Однако культура в монослое является проблематичной в том, что клетки не могут сохранять конкретные функции, которые они имеют in vivo, в течение длительного времени, поскольку среда двумерной культуры полностью отличается от среды in vivo, клетки не могут восстанавливать ткань аналогично ткани in vivo, она не пригодна для массового культивирования клеток, поскольку количество клеток на постоянную площадь ограничено, и т.п. (патентный документ 1). Кроме того, способ культивирования рассматриваемой клетки на фидерных клетках иногда сталкивается с проблемой отделения рассматриваемых клеток от фидерных клеток (непатентный документ 1).
Дисперсионная культура представляет собой способ культивирования прикрепляющихся клеток в суспендированном состоянии, который включает посев клеток на среду и перемешивание культуральной среды в контейнере для культивирования, подвергнутом поверхностной обработке для ингибирования адгезии клеток, чтобы ингибировать прикрепление клеток к контейнеру для культивирования. Однако прикрепляющиеся клетки, культивируемые таким способом, не могут прикрепляться к каркасу, и, таким образом, способ нельзя применять к клетке, для которой обязательно требуется прикрепление к каркасу для пролиферации клеток. Кроме того, вследствие постоянного воздействия усилия сдвига, клетка не может проявлять присущую ей клеточную функцию, и, таким образом, функциональные клетки иногда нельзя культивировать в большом количестве (непатентный документ 2).
Погруженная культура представляет собой способ культивирования клеток путем погружения и фиксации клеток в твердом или полутвердом гелеобразном субстрате, таком как агар, метилцеллюлоза, коллаген, желатин, фибрин, агароза, альгинаты и т.п. Поскольку способ обеспечивает трехмерное культивирование клеток в состоянии, более близком к состоянию in vivo, и гелеобразный субстрат сам по себе иногда обеспечивает пролиферацию и дифференцировку клеток, клетки можно культивировать при высокой плотности с одновременным сохранением функции клеток, по сравнению с культурой единичных клеток и дисперсионной культурой (патентные документы 2, 3). Более того, также разработан способ культивирования клеток, включающий формирование микрокапсулы размером 100-300 мкм путем заключения клеток в гелеобразный субстрат и культивирование клеток в среде в виде водного раствора, в то время как микрокапсулы находятся в дисперсном состоянии (непатентный документ 3). Однако эти способы сталкиваются с проблемами, состоящими в том, что последующее наблюдение культивируемых клеток не является возможным, если видимый свет не проникает через гелеобразный субстрат, восстановление клеток из среды требует затрудненных действий, которые повреждают клетки, таких как обработка ферментом (например, обработка коллагеназой в случае коллагенового геля) и т.п., поскольку среда и микрокапсулы, содержащие гелеобразный субстрат, имеют высокую вязкость, замена среды, необходимая для длительного культивирования, является трудной и т.п. В последние годы были разработаны способы, обеспечивающие восстановление клеток из гелеобразного субстрата посредством обработки нагреванием, сдвиговых усилий и т.п. Однако нагревание, сдвиговые усилия и т.п. могут оказывать неблагоприятный эффект на функцию клеток, и безопасность гелеобразного субстрата для живого организма еще не была установлена (патентные документы 4, 5, непатентные документы 4, 5, 6, 7). Кроме того, в области подпитки разработана подпитка sol food для предотвращения преципитации и всплытия подпитки в форме частиц, такой как фрукты, овощи и т.п., нарезанные мелко, чтобы поддерживать однородность диспергированной и суспендированной подпитки. Однако подпитка sol food не обеспечивает извлечение диспергированной подпитки в форме частиц, и не исследовано, можно ли клетки и ткани подвергать суспензионной культуре (патентный документ 6).
2
Культура на микроносителе представляет собой способ культивирования клеток в суспендированном состоянии посредством пролиферации клеток в виде единичного слоя на поверхности тонких частиц, немного более тяжелых, чем вода (далее также обозначаемых как микроноситель) и перемешивания тонких частиц в контейнере для культивирования, таком как колба и т.п. Как правило, микроноситель, используемый в способе, представляет собой сферическую частицу, имеющую диаметр 100-300 мкм, площадь поверхности 3000-6000 см/г, удельный вес 1,03-1,05, и состоит из материала, такого как декстран, желатин, альгиновая кислота, полистирол и т.п. Также на поверхности микроносителя могут быть нанесены коллаген, желатин или заряженная группа, такая как диметиламикоэтил и т.п., чтобы облегчить прикрепление клетки. Этот способ применяют для массивного культивирования клеток, поскольку он может значительно увеличивать площадь культуры (патентные документы 7, 8). Однако трудно прикреплять рассматриваемые клетки практически единообразно ко всем микроносителям, и возникают проблемы, такие как открепление клеток от микроносителя вследствие сдвиговых усилий во время перемешивания, повреждения клеток и т.п. (непатентный документ 8).
Сферическая культура представляет собой способ культивирования, включающий формирование агрегата, состоящего из от нескольких дюжин до нескольких сотен рассматриваемых клеток (далее также обозначаемого как сфера), и культивирование агрегатов путем выдерживания или встряхивания в среде. Известно, что сфера имеет высокую плотность клеток, реконструирует взаимодействия клетка-клетка и клеточную структуру аналогично среде in vivo, и ее можно культивировать при сохранении клеточной функции в течение боле длительного периода времени по сравнению с культурой в монослое и способом дисперсионной культуры (непатентные документы 9, 10). Однако сферическая культура не может образовывать крупную сферу, поскольку предоставление питания внутрь сферы и отведение отходов затрудняются, когда размер сферы является слишком большим. Кроме того, поскольку образовавшуюся сферу необходимо культивировать в дисперсном состоянии на дне контейнера для культивирования, количество сфер на данный объем не может увеличиваться с легкостью, и она не пригодна для массивной культуры. Более того, в качестве способа формирования сферы известны культура с висячей каплей, культура на не адгезивной для клеток поверхности, культура внутри микролунки, вращающаяся культура, культура с использованием клеточного каркаса, коагуляции с помощью центробежной силы, ультразвуковой обработки, электрического поля или магнитного поля и т.п. Однако эти способы являются проблематичными в том, что их осуществление является затрудненным, выделение сфер является трудным, затруднены контроль размера и крупномасштабная продукция, неизвестно влияние на клетку, необходимы специальный особенный контейнер и устройство и т.п. (патентный документ 9).
С другой стороны, что касается растений, клетку, протопласт без клеточной стенки или орган, ткань, каллюс растения, как например, лист, стебель, корень, конус нарастания, семя, эмбрион, пыльца и т.п., также можно выращивать путем культивирования в асептических условиях. С использованием способа культивирования для таких тканей и клеток растений стало возможным улучшение сортов растений и продуцирование полезных веществ. В качестве способа пролиферации клеток и тканей в большом количестве в течение короткого периода времени, известен способ суспензионного культивирования клеток растений в жидкой среде (непатентный документ 11). Для обеспечения высокой пролиферации, являются важными предоставление достаточного количества кислорода, поддержание состояния однородного перемешивания, предупреждение повреждения клеток и т.п. Предоставление кислорода культуральной среде и суспендирование клеток и тканей можно проводить с  помощью комбинирования аэрации и механического перемешивания или с помощью только аэрации. Первое из них может приводить к дефектной пролиферации вследствие повреждения клеток и тканей посредством перемешивания, а последняя из них затруднена, поскольку, даже несмотря на то, что напряжение сдвига клеток и тканей является меньшим, и, поскольку состояние однородного перемешивания может быть трудно поддерживать в культуре высокой плотности, клетки и ткани образуют осадок, уменьшающий эффективность пролиферации и т.п.
Более того, для исследования и разработки лекарственного средства против злокачественной опухоли или выбора подходящего лекарственного средства против злокачественной опухоли при лечении злокачественной опухоли, активность лекарственного средства, направленную против злокачественной опухоли, оценивают культивированием злокачественных клеток in vitro в культуральной среде, содержащей являющееся кандидатом лекарственное средство или лекарственное средство против злокачественной опухоли. Однако существующие способы оценки активности, направленной против злокачественной опухоли, имеет проблемы, состоящие в различии между результатами оценки in vitro и истинными клиническими эффектами и т.п. Для решения проблем были разработаны способы оценки активности в условиях культивирования клеток, воспроизводящих условия in vivo настолько, насколько это возможно. Например, был разработан способ, включающий погружение злокачественных клеток в подложку, такую как мягкий агар, коллагеновый гель, гидрогель и т.п., чтобы обеспечить культивирование клеток в среде, ингибирующей адгезию к контейнеру для культивирования, и оценку лекарственного средства против злокачественной опухоли (патентный документ 10, непатентные документы 12, 13). Кроме того, был разработан способ, включающий ингибирование клеточной адгезии путем покрытия поверхности контейнера для культивирования материалом, ингибирующим клеточную адгезию, или с использованием специальной обработки поверхности, культивирование злокачественных клеток в коагулированном состоянии (сферическая культура) и оценку активности, направленной против злокачественной опухоли (патентные документы 11, 12).
Однако эти способы культивирования злокачественных клеток имеют различные проблемы, состоящие в том, что процесс изготовления контейнера для культивирования и осуществление культивирования клеток являются затрудненными, является затрудненным осуществление отделения клеток от подложки, такой как коллаген, и т.п. с последующей оценкой активности, направленной против злокачественной опухоли, предоставление подложки иногда ограничено, когда подложка представляет собой компонент животного происхождения, поскольку она является дорогостоящей, клеточные агрегаты (сферы) ассоциируют до избыточного размера, тем самым снижая уровень выживаемости клеток и воспроизводимость, и т.п. Более того, когда проводят скрининг лекарственного средства против злокачественной опухоли, является желательным способ культивирования злокачественных клеток, который является удобным, может осуществлять обработку большого количества единообразных образцов и имеет высокую воспроизводимость.
Кроме того, различные виды активности лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, и фармацевтического продукта, в отношении гепатоцитов оценивают путем культивирования гепатоцитов in vitro в культуральной среде, содержащей лекарственное средство, являющееся кандидатом для фармацевтического продукта, или фармацевтический продукт. Однако, поскольку функция, от природы выполняемая гепатоцитами in vivo, может утрачиваться вследствие культивирования гепатоцитов in vitro, существующие способы культивирования гепатоцитов имеют проблемы, состоящие в том, что точная оценка лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, и фармацевтического продукта не доступна, оценка множества образцов является затрудненной и т.п. Для преодоления таких проблем был разработан способ проведения оценки активности в условиях культивирования клеток, воспроизводящих условия in vivo настолько, насколько это возможно. Например, был разработан способ, включающий культивирование гепатоцитов на внеклеточном матриксе, таком как коллаген, ламинин, матригель (зарегистрированный торговый знак) и т.п., поддерживающем функцию гепатоцитов (патентный документ 13, непатентные документы 14, 15). Кроме того, был разработан способ, включающий формирование агрегата (сферы) из гепатоцитов путем обработки, например для ингибирования клеточной адгезии, посредством покрытия поверхности контейнера для культивирования материалом, ингибирующим адгезию клеток, или с использованием специальной обработки поверхности контейнера, встряхивания контейнера для культивирования и т.п., тем самым сохраняя функцию гепатоцитов (патентные документы 14, 15, непатентные документы 16, 17).
Однако эти способы культивирования гепатоцитов имеют различные проблемы, состоящие в том, что процесс изготовления контейнера для культивирования и осуществление культивирования клеток являются затрудненными, является затрудненным осуществление отделения клеток от подложки, такой как коллаген и т.п., и является затрудненной оценка функции гепатоцитов, предоставление подложки иногда ограничено, когда подложка представляет собой подложку животного происхождения, поскольку она является дорогостоящей, клеточные агрегаты (сферы) ассоциируют до избыточного размера, тем самым снижая уровень выживаемости клеток и воспроизводимость, и т.п. Более того, когда проводят скрининг лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, или фармацевтического продукта, является желательным способ культивирования гепатоцитов, который является удобным, может осуществлять обработку большого количества единообразных образцов и имеет высокую воспроизводимость.
Перечень патентных документов
[Патентный документ 1] JP-A-2001-128660.
[Патентный документ 2] JP-A-S62-171680.
[Патентный документ 3] JP-A-S63-209581.
[Патентный документ 4] JP-A-2009-29967.
[Патентный документ 5] JP-A-2005-60570.
[Патентный документ 6] JP-A-8-23893.
[Патентный документ 7] JP-A-2004-236553.
[Патентный документ 8] WO 2010/059775.
[Патентный документ 9] JP-A-2012-65555.
[Патентный документ 10] JP-A-2008-11797.
[Патентный документ 11] JP-A-2008-61609.
[Патентный документ 12] JP-A-2012-249547.
[Патентный документ 13] WO20005/028639.
[Патентный документ 14] WO2010/079602.
[Патентный документ 15] JP-A-2009-50194.
[Непатентные документы
[Непатентный документ 1] Klimanskaya et al., Lancet 2005, 365:1636-1641.
[Непатентный документ 2] King et al., Curr Opin Chem Biol. 2007, 11:394-398.
[Непатентный документ 3] Murua et al., J. of Controlled Release 2008, 132:76-83.
[Непатентный документ 4] Mendes, Chemical Society Reviews 2008, 37:2512-2529.
[Непатентный документ 5] Moon et al., Chemical Society Reviews 2012, 41:4860-4883.
[Непатентный документ 6] Рек et al., Nature Nanotechnol. 2008, 3:671-675.
[Непатентный документ 7] Liu et al., Soft Matter 2011, 7:5430-5436.
[Непатентный документ 8] Leung et al., Tissue Engineering 2011, 17:165-172.
[Непатентный документ 9] Stahl et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 2004, 322:684-692.
[Непатентный документ 10] Lin et al., Biotechnol J. 2008, 3:1172-1184.
[Непатентный документ 11] Weathers et al., Appl Microbiol Biotechnol 2010, 85:1339-1351.
[Непатентный документ 12] Takamura et al., Int. J. Cancer 2002, 98: 450-455.
[Непатентный документ 13] Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76: 3401-3405.
[Непатентный документ 14] Bissell et al., J. Clin. Invest. 1987, 79: 801-812.
[Непатентный документ 15] LeCluyse et al., Critical Reviews in Toxicology 2012, 42:501-548.
[Непатентный документ 16] Brophy et al., Hepatology 2009, 49:578-586.
[Непатентный документ 17] Franziska et al., World J Hepatol 2010, 2:1-7.
Сущность изобретения
Проблемы, решаемые с помощью изобретения
Задачей настоящего изобретения является решение упомянутых выше проблем уровня техники и предоставление композиции среды для культивирования клеток и/или тканей животного или растения, в частности, в трехмерном или в суспендированном состоянии, и способ культивирования клеток и/или тканей животных или растений с использованием композиции среды.
Также задачей настоящего изобретения является решение упомянутых выше проблем уровня техники и предоставление композиции среды для культивирования агрегата (сферы) злокачественных клеток в трехмерной окружающей среде и способа исследования злокачественных клеток с использованием композиции среды.
Альтернативно задачей настоящего изобретения является решение упомянутых выше проблем уровня техники и предоставление композиции среды для культивирования агрегата (сферы) гепатоцитов в трехмерной окружающей среде и способа исследования злокачественных клеток с использованием композиции среды.
Более того, задачей настоящего изобретения является предоставление добавки в среду, которая стимулирует пролиферацию злокачественных клеток при культивировании злокачественных клеток и добавки в среду, которая ингибирует уменьшение количества гепатоцитов при культивировании гепатоцитов.
Способы решения проблем
Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования различных соединений и эффекта суспендирования клеток и/или тканей в жидкой среде, содержащей их, и успешно нашли структуру, способную однородно диспергировать клетки и/или ткани в суспендированном состоянии, по существу не повышая вязкости жидкой среды. Они открыли, что клетки и/или ткани можно подвергать пролиферации, дифференцировке или поддержанию, одновременно сохраняя суспензионное состояние, с использованием композиции среды, содержащей по меньшей мере указанную структуру. Более того, они также открыли, что культивируемые клетки и/или ткани можно без труда выделять из среды, что обеспечивает осуществление настоящего изобретения.
Авторы настоящего изобретения также провели тщательные исследования эффекта различных соединений и жидких сред, содержащих их, на агрегат злокачественных клеток (сферу), и успешно выявили композицию среды, которая препятствует ассоциации сфер и обеспечивает однородное диспергирование. Они обнаружили, что с использованием композиции среды сферу можно культивировать с высоким уровнем выживаемости, и активность лекарственного средства, направленную против злокачественной клетки, можно оценивать эффективно и с высокой чувствительностью. Более того, они также выявили, что культивируемую сферу можно без труда выделять из среды и оценивать, что обеспечило осуществление настоящего изобретения.
Также авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования эффекта различных соединений и жидкой среды, содержащей их, на агрегат гепатоцитов (сферу), и успешно выявили композицию среды, которая препятствует ассоциации сфер и обеспечивает однородное диспергирование. Они обнаружили, что сферу можно культивировать с высоким уровнем выживаемости при - сохранении функции гепатоцитов, и с использованием композиции среды можно эффективно и с высокой чувствительностью оценивать эффект лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, или фармацевтического продукта на гепатоциты. Более того, они также обнаружили, что культивируемые сферы можно без труда выделять из среды и оценивать, что обеспечило осуществление настоящего изобретения.
Более того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что пролиферация злокачественных клеток может быть значительно ускорена добавлением деацилированной геллановой камеди или ее соли в среду, содержащую злокачественные клетки, что обеспечило осуществление настоящего изобретения.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что уменьшение количества гепатоцитов может ингибироваться путем добавления деацилированной геллановой камеди или ее соли в среду, содержащую гепатоциты, что обеспечило осуществление настоящего изобретения.
Таким образом, настоящее изобретение относится к следующему:
(1) Композиция среды, содержащая структуру, способную культивировать клетки или ткани путем суспендирования их.
(2) Композиция среды согласно (1), позволяющая обработку для замены композиции среды во время культивирования и выделение клеток или тканей после завершения культивирования.
(3) Композиция среды согласно (1), которая не требует никакого изменения температуры, химической обработки, ферментативной обработки и сдвигового усилия во время выделения клеток или тканей из среды.
(4) Композиция среды согласно (1), имеющая вязкость не более 8 мПа⋅с.
(5) Композиция среды согласно (1), где упомянутая выше структура имеет такой размер, что она проходит через фильтр, имеющий размер пор от 0,2 мкм до 200 мкм, когда ее пропускают через фильтр.
(6) Композиция среды согласно (1), где упомянутая выше структура содержит полимерное соединение.
(7) Композиция среды согласно (6), где упомянутое выше полимерное соединение включает полимерное соединение, имеющее анионную функциональную группу.
(8) Композиция среды согласно (6), где упомянутое выше полимерное соединение представляет собой полисахарид.
(9) Композиция среды согласно (7), где упомянутая выше анионная функциональная группа относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из карбоксигруппы, сульфогруппы и фосфатной группы.
(10) Композиция среды согласно (8), где упомянутый выше полисахарид относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, геллановой камеди, деацилированной геллановой камеди, рамсановой камеди, диутановой камеди, ксантановой смолы, каррагенана, фукоидана, пектина, пектовой кислоты, пектиновой кислоты, гепарансульфата, гепарина, гепаритинсульфата, кератосульфата, хондроитинсульфата, дерматансульфата, рамнансульфата и их соли.
(11) Композиция среды согласно (10), где упомянутый выше полисахарид относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, деацилированной геллановой камеди, диутановой камеди, ксантановой смолы, каррагенана и их соли.
(12) Композиция среды согласно (10) или (11), где упомянутый выше полисахарид представляет собой деацилированную геллановую камедь или ее соль.
(13) Композиция среды согласно (12), где конечная концентрация упомянутой выше деацилированной геллановой камеди или ее соли в композиции среды составляет 0,001-1,0% (масса/объем).
(14) Композиция среды согласно (13), дополнительно содержащая полисахарид, отличный от деацилированной геллановой камеди или ее соли.
(15) Композиция среды согласно (14), где упомянутый выше полисахарид относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из ксантановой смолы, альгинозой кислоты, харрагенана, диутановой камеди и их соли.
(16) Композиция среды согласно (14), где упомянутый выше полисахарид относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из метилцеллюлозы, смолы плодоворожкового дерева и их соли.
(17) Композиция среды согласно любому из (1)-(16), дополнительно содержащая ион металла.
(18) Композиция среды согласно (17), где упомянутый выше ион представляет собой ион двухвалентного металла.
(19) Композиция среды согласно (18), где упомянутый выше ион металла относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из иона кальция, иона магния, иона цинка, иона железа и иона меди.
(20) Композиция среды согласно (19), где упомянутый выше ион металла представляет собой ион кальция.
(21) Композиция среды согласно (20), дополнительно содержащая ион металла, отличный от иона кальция.
(22) Композиция среды согласно (21), где упомянутый выше ион металла относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из иона магния, иона натрия и иона кальция.
(23) Композиция среды согласно любому из (1)-(22), дополнительно содержащая молекулу внеклеточного матрикса и/или молекулу клеточной адгезии.
(24) Композиция среды согласно (23), где упомянутый выше внеклеточный матрикс относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из коллагена, гиалуроновой кислоты и протеогликана.
(25) Композиция среды согласно (23), где упомянутая выше молекула клеточной адгезии относится по меньшей мере к одному типу, выбранному из группы, состоящей из кадгерина, ламинина, фибронектина и витронектина.
(26) Композиция среды согласно любому из (1)-(25), которая предназначена для культивирования клеток.
(27) Композиция среды согласно (26), где упомянутая выше клетка представляет собой прикрепляющуюся клетку или не прикрепляющуюся клетку.
(28) Композиция среды согласно (27), где упомянутая выше прикрепляющаяся клетка прикреплена к микроносителю.
(29) Композиция среды согласно (27), где упомянутая выше прикрепляющаяся клетка погружена в носитель.
(30) Композиция среды согласно (27), где упомянутая выше прикрепляющаяся клетка представляет собой сферу.
(31) Композиция среды согласно (27), где упомянутая выше прикрепляющаяся клетка выбрана из группы, состоящей из плюрипотентной стволовой клетки, злокачественной клетки и гепатоцита.
(32) Культура клеток или ткани, содержащая композицию среды согласно любому из (1)-(31) и клетки или ткани.
(33) Способ культивирования клетки или ткани, включающий культивирование клетки или ткани в композиции среды согласно любому из (1)-(31).
(34) Способ культивирования согласно (33), где упомянутая выше клетка выбрана из группы, состоящей из плюрипотентной стволовой клетки, злокачественной клетки и гепатоцита.
(35) Способ выделения клетки или ткани, включающий извлечение клетки или ткани из культуры согласно (32).
(36) Способ выделения согласно (35), где упомянутое выше извлечение проводят путем фильтрации, центрифугирования или магнитного разделения.
(37) Способ получения сферы, включающий культивирование прикрепляющейся клетки в композиции среды согласно любому из (1)-(31).
(38) Способ скрининга лекарственного средства против злокачественной опухоли, включающий
(a) стадию культивирования злокачественной клетки в присутствии исследуемого вещества и в его отсутствие в композиции среды согласно любому из п. 1-31, и
(b) стадию анализа изменений пролиферации злокачественной клетки.
(39) Способ согласно (38), дополнительно включающий стадию отбора в качестве вещества-кандидата вещества, которое подавляет пролиферацию злокачественной клетки относительно пролиферации в отсутствие исследуемого вещества.
(40) Способ скрининга вещества, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, который действует на гепатоциты, включающий
(a) стадию культивирования гепатоцитов в присутствии исследуемого вещества и в его отсутствие в композиции среды согласно любому из п. 1-31, и
(b) стадию анализа изменений физиологической функции гепатоцитов.
(41) Способ согласно (40), дополнительно включающий стадию отбора в качестве вещества-кандидата вещества, которое подавляет или усиливает физиологическую функцию гепатоцитов относительно физиологической функции в отсутствие исследуемого вещества.
(42) Способ оценки эффективности или токсичности вещества, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, который действует на гепатоциты, включающий
(a) стадию культивирования гепатоцитов в присутствии исследуемого вещества и в отсутствие его в композиции среды согласно любому из пп. 1-31, и
(b) стадию анализа изменений физиологической функции гепатоцитов.
(43) Добавка в среду для получения композиции среды, в которой можно культивировать клетки или ткани путем их суспендирования, содержащая полимерное соединение, растворенное или диспергированное в растворителе.
(44) Добавка в среду согласно (43), которая находится в стерилизованном состоянии.
(45) Добавка в среду согласно (43) или (44), где упомянутое выше полимерное соединение представляет собой полимерное соединение, имеющее анионную функциональную группу.
(46) Добавка в среду согласно (43) или (44), где упомянутое выше полимерное соединение представляет собой деацилированую геллановую камедь или ее соль.
(47) Способ получения композиции среды, в которой могут культивироваться клетки или ткани путем суспендирования их, включающий смешение полимерного соединения и среды.
(48) Способ согласно (47), включающий смешение добавки в среду согласно любому из (43)-(46) и среды.
(49) Способ согласно (48), где упомянутую выше среду растворяют или диспергируют в растворителе.
(50) Способ согласно (47), где упомянутое выше полимерное соединение представляет собой полимерное соединение, имеющее анионную функциональную группу.
(51) Способ согласно (50), где упомянутое полимерное соединение представляет собой деацилированную геллановую камедь или ее соль.
(52) Способ согласно (47), где упомянутое выше полимерное соединение и среда смешаны с водой.
(53) Способ согласно (52), включающий нагревание при 80-130°С после смешения с водой.
(54) Способ согласно (53), включающий нагревание при 100-125°С.
(55) Способ согласно (47), включающий стерилизацию фильтрованием.
(56)Способ согласно (55), где упомянутая выше стерилизация фильтрованием включает пропускание через 0,1-0,5 - мкм фильтр.
(57) Добавка в среду для злокачественных клеток, содержащая деацилированную геллановую камедь или ее соль, или диутановую камедь или ее соль.
(58) Добавка согласно (57), которая ускоряет пролиферацию злокачественной клетки при культивировании злокачественной клетки.
(59) Добавка согласно (57), которую используют для оценки активности, направленной против злокачественной опухоли, у лекарственного средства против злокачественной опухоли.
(60) Композиция среды для злокачественных клеток, содержащая добавку согласно любому из (57)-(59).
(61) Способ культивирования злокачественной клетки, включающий культивирование злокачественной клетки в присутствии добавки согласно любому из (57)-(59), или в композиции среды согласно (60).
(62) Способ оценки активности лекарственного средства против злокачественной опухоли в отношении злокачественной клетки, включающий культивирование злокачественной клетки в присутствии добавки согласно любому из (57)-(59), или в композиции среды согласно (60).
(63) Способ согласно (61) или (62), где злокачественные клетки образуют клеточный агрегат в композиции среды для злокачественной клетки.
(64) Способ согласно (61) или (62), где контейнер для культивирования злокачественной клетки подавляет прикрепление злокачественной клетки.
(65) Добавка в среду для гепатоцитов, содержащая деацилированную геллановую камедь или ее соль, или диутановую камедь или ее соль.
(66) Добавка согласно (65), которая ингибирует снижение количества гепатоцитов при культивировании гепатоцитов.
(67) Добавка согласно (65), которую используют для оценки эффекта фармацевтического продукта и лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, на гепатоциты.
(68) Композиция среды для гепатоцитов, содержащая добавку согласно любому из (65)-(67).
(69) Способ оценки активности фармацевтического продукта и лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, в отношении гепатоцитов, включающий культивирование гепатоцитов в присутствии добавки согласно любому из (65)-(67), или в композиции среды согласно (68).
(70) Способ согласно (69), где гепатоциты образуют клеточный агрегат в композиции среды для гепатоцитов.
(71) Способ согласно (69), где контейнер для культивирования гепатоцитов ингибирует прикрепление гепатоцитов.
Эффекты изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции среды, содержащей структуру конкретного соединения (далее также называемую конкретным соединением), в частности полимерного соединения, имеющего анионную функциональную группу. С использованием композиции среды клетки и/или ткани можно культивировать в суспендированном состоянии без таких действий, как встряхивание, вращение и т.п., которые обладают риском возникновения повреждения и утраты функции клеток и тканей. Более того, при использовании композиции среды среду можно без труда заменять во время культивирования и культивируемые клетки и/или ткани также можно без труда выделять. Настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток и/или тканей, полученных из организма животного или организма растения, и оно может обеспечивать получение рассматриваемых клеток и/или тканей в большом количестве без нарушения их функций. Клетки и/или ткани, полученные способом культивирования, можно использовать для проведения оценки эффективности и токсичности химических веществ, фармацевтических продуктов и т.п., крупномасштабной продукции полезных веществ, таких как ферменты, факторы роста клеток, антитела и т.п., в регенеративной медицине для замены органа, ткани и клетки, которые были утрачены вследствие заболевания и недостаточности, и т.п. В частности, композиция среды, полученной с использованием деацилированной геллановой камеди, является улучшенной и имеет следующие характеристики. Поскольку концентрация для того, чтобы проявлялись свойства, является крайне низкой (на один порядок или около того ниже), влияние на компоненты среды может снижаться до минимума. Поскольку образование комка при растворении в воде затруднено, крупномасштабная продукция практически не является проблематичной. Более того, поскольку вязкость в диапазоне концентраций, в которой проявляется свойство, является низкой, функциональность, такая как выделение клеток и/или тканей и т.п., является чрезвычайно высокой.
Кроме того, с использованием композиции среды по настоящему изобретению может подавляться ассоциация агрегатов злокачественных клеток (сфер), и сферу можно культивировать в дисперсном состоянии, и, таким образом, может быть ускорена пролиферация злокачественных клеток. Более того, когда средство против злокачественной опухоли оценивают с использованием композиции среды, лекарственное средство против злокачественной опухоли можно без труда добавлять в среду и для оценки пролиферации клеток можно без труда добавлять реагент для обнаружения. Кроме того, поскольку культивируемые злокачественные клетки можно выделять, также можно без труда проводить оценку функции выделенных клеток. Настоящее изобретение предпочтительно можно использовать при проведении оценки эффективности и скрининга химического вещества, лекарственного средства против злокачественной опухоли и т.п. с помощью злокачественных клеток, полученных способом культивирования.
При культивировании в композиции среды по настоящему изобретению, поскольку влияние условий, не являющихся условиями in vivo, в двумерной культуре является небольшим и происходит только адгезия между клетками, чувствительность к HB-EGF (фактор роста, подобный гепаринсвязывающему эпидермальному фактору роста), который ускоряет озлокачествление, становится высокой в злокачественных клетках, и может повышаться чувствительность к ингибитору рецептора EGF на уровне ниже его. Более того, также может повышаться чувствительность к ингибиторам MEK и Akt, которые являются важными каскадами передачи сигнала для независимой от каркаса пролиферации злокачественных клеток.
Альтернативно с использованием композиции среды по настоящему изобретению, можно подавлять ассоциацию агрегатов гепатоцитов (сфер), и сферы можно культивировать в дисперсном состоянии. Таким образом, выживаемость и клеточную функцию гепатоцитов можно поддерживать in vitro. Более того, когда оценку лекарственного средства, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, проводят с использованием композиции среды, лекарственное средство, являющееся кандидатом для фармацевтического продукта, или фармацевтический продукт можно без труда добавлять в среду, и для оценки функции клеток можно без труда добавлять реагент для обнаружения. Поскольку культивируемые гепатоциты можно выделять, можно без труда проводить функциональную оценку выделенных клеток. Настоящее изобретение предпочтительно можно использовать при проведении оценки эффективности и токсичности и скрининга химического вещества, лекарственного средства против злокачественной" опухоли и т.п. с помощью гепатоцитов, полученных способом культивирования.
Более того, добавка в среду по настоящему изобретению, содержащая деацилированную геллановую камедь или ее соль, может значительно ускорять пролиферацию злокачественных клеток при культивировании злокачественных клеток.
Также добавка в среду по настоящему изобретению, содержащая деацилированную геллановую камедь или ее соль, может подавлять снижение количества гепатоцитов при культивировании гепатоцитов.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда сферы клеток HepG2 культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, сферы были единообразно диспергированы и могли культивироваться в суспендированном состоянии.
Фиг. 2 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда сферы клеток HeLa культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, сферы были единообразно диспергированы и могли культивироваться в суспендированном состоянии.
Фиг. 3 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда сферы клеток HeLa культивировали в композиции среды по настоящему изобретению и наблюдали через микроскоп, ассоциация сфер могла подавляться по сравнению с существующими средами.
Фиг. 4 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда плюрипотентные стволовые клетки культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, токсичность в отношении клеток не обнаруживалась.
Фиг. 5 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда сферы плюрипотентных стволовых клеток культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, сферы были однородно диспергированы и находились в суспендированном состоянии.
Фиг. 6 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда сферы плюрипотентных стволовых клеток культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, плюрипотентные стволовые клетки эффективно пролиферировали.
Фиг. 7 представляет собой фигуру, на которой показано, что плюрипотентные стволовые клетки, культивированные в композиции среды по настоящему изобретению, оставались недифференцированными.
Фиг. 8 представляет собой фигуру, на которой показано, что плюрипотентные стволовые клетки после суспензионного стационарного культивирования в композиции среды по настоящему изобретению сохраняли нормальный кариотип.
Фиг. 9 представляет собой фигуру, на которой показано, что плюрипотентные стволовые клетки, культивируемые в композиции среды по настоящему изобретению, оставались недифференцированными.
Фиг. 10 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда микроносители, к которым были прикреплены клетки HepG2, культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, клетки HepG2 могли пролиферировать на микроносителе.
Фиг. 11 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда сферы клеток HeLa добавляли к композиции среды по настоящему изобретению, сферы были единообразно диспергированы и находились в суспендированном состоянии.
Фиг. 12 представляет собой фигуру, на которой показано, что в композиции среды по настоящему изобретению могли образовываться сферы клеток HeLa.
Фиг. 13 представляет собой фигуру, на которой показана пленка, которая является одним вариантом осуществления структуры по настоящему изобретению, где концентрация деацилированной геллановой камеди в композиции среды составляла 0,02% (масса/объем).
Фиг. 14 представляет собой фигуру, на которой показано, что в композиции среды по настоящему изобретению могли образовываться сферы клеток HepG2.
Фиг. 15 представляет собой фигуру, на которой показано суспендированное состояние покрытого ламинином GEM, к которому прикреплены клетки HepG2, когда их культивировали в композиции среды по настоящему изобретению.
Фиг. 16 представляет собой фигуру, на которой показано суспендированное состояние клеток HepG2, заключенных в гранулы из альгиновой кислоты, когда их культивировали в композиции среды по настоящему изобретению.
Фиг. 17 представляет собой фигуру, на которой показано суспендированное состояние клеток HepG2, заключенных в гелеобразную капсулу из коллагена, когда их культивировали в композиции среды по настоящему изобретению.
Фиг. 18 представляет собой фигуру, на которой показано суспендированное состояние происходящего из риса каллюса, когда его культивировали композиции среды по настоящему изобретению.
Фиг. 19 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда сферы клеток HeLa культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, сферы были однородно диспергированы и могли культивироваться в суспендированном состоянии.
Фиг. 20 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда сферы клеток А549 и клеток НСТ116 культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, сферы были однородно диспергированы и могли культивироваться в суспендированном состоянии.
Фиг. 21 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда первичные гепатоциты человека культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, сферы образовывались и могли культивироваться.
Фиг. 22 представляет собой фигуру, на которой показано, что, когда первичные гепатоциты яванского макака культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, сферы образовывались и могли культивироваться.
Фиг. 23 представляет собой фигуру, на которой показаны агрегаты клеток MCF-7 после культивирования клеток MCF-7 в течение 5 суток в композиции среды по настоящему изобретению.
Фиг. 24 представляет собой фигуру, на которой показаны агрегаты после культивирования клеток А375 и клеток MNNG/HOS в течение 4 суток в композиции среды по настоящему изобретению.
Фиг. 25 представляет собой фигуру, на которой показаны агрегаты после культивирования клеток MIAPaCa-2 в течение 6 суток в композиции среды по настоящему изобретению.
Описание вариантов осуществления
Настоящее изобретение пояснено более подробно ниже.
Термины, используемые в настоящем описании, имеют следующие определения.
Клетка в рамках настоящего изобретения является самым основным элементом, составляющим животных и растения, который имеет, в качестве его элементов, цитоплазму и различные органеллы внутри клеточной мембраны. В этом случае ядро, инкапсулирующее ДНК, может находиться внутриклеточно или может не находиться внутриклеточно. Например, происходящие из животных клетки в рамках настоящего изобретения включают репродуктивные клетки, такие как сперматозоиды, ооциты и т.п., соматические клетки, составляющие живой организм, стволовые клетки (плюрипотентные стволовые клетки и т.д.), клетки-предшественники, злокачественные клетки, извлеченные из живого организма, клетки, извлеченные из живого организма, которые приобрели способность к иммортализации и стабильно поддерживаются in vitro (клеточная линия), клетки, извлеченные из живого организма и подвергнутые искусственной генетической модификации, клетки, извлеченные из живого организма, в которых ядро искусственным образом заменено, и т.п. Примеры соматических клеток, составляющих живой организм, включают, но не ограничиваются ими, фибробласты, клетки костного мозга, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, нейтрофилы, эритроциты, тромбоциты, макрофаги, моноциты, остеоциты, клетки костного мозга, перициты, дендритные клетки, кератиноциты, адипоциты, мезенхимные клетки, эпителиальные клетки, эпидермальные клетки, эндотелиальные клетки, сосудисто-эндотелиальные клетки, гепатоциты, хондроциты, кучевые клетки, нервные стволовые клетки, глиальные клетки, нейроны, олигодендроциты, микроглиальные клетки, астроциты, сердечные клетки, клетки пищевода, миоциты (например, гладкомышечные клетки или скелетные мышечные клетки), бета-клетки поджелудочной железы, меланоциты, гемопоэтические клетки-предшественники (например, происходящие из пуповинной крови CD34-положительные клетки), мононуклеарные клетки и т.п. Соматические клетки включают клетки, полученные из ткани, например, кожи, почки, селезенки, надпочечника, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, матки, желудка, ободочной кишки, тонкого кишечника, толстого кишечника, мочевого пузыря, предстательной железы, семенника, тимуса, мышцы, соединительной ткани, костей, суставов, ткани кровеносных сосудов, крови (включая пуповинную кровь), костного мозга, сердца, глаза, головного мозга, нервной ткани и т.п. Стволовые клетки представляют собой клетки, одновременно обладающие способностью реплицироваться и способностью дифференцироваться во множество других ростков. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, эмбриональные стволовые клетки (клетки ES), клетки эмбриональной опухоли, эмбриональные половые стволовые клетки, искусственные плюрипотентные стволовые клетки (клетки iPS), нейрональные стволовые клети, гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки, стволовые клетки печени, стволовые клетки поджелудочной железы, мышечные стволовые клетки, репродуктивные стволовые клетки, стволовые клетки кишечника, стволовые клетки злокачественной опухоли, стволовые клетки волосяных фолликулов и т.п. Примеры плюрипотентных стволовых клеток включают клетки ES, эмбриональные репродуктивные стволовые клетки и клетки iPS, среди упомянутых выше стволовых клеток. Клетки-предшественники представляют собой клетки, находящиеся на пути дифференцировки из упомянутой выше стволовой клетки в конкретную соматическую клетку или репродуктивную клетку. Злокачественные клетки представляют собой клетки, которые происходят из соматической клетки и обладают приобретенной способностью к неограниченной пролиферации. Клеточные линии представляют собой клетки, которые обладают приобретенной неограниченной способностью к пролиферации вследствие искусственного воздействия in vitro.
Примеры злокачественной ткани включают, но не ограничиваются ими, ткани рака желудка, рака пищевода, рака толстого кишечника, рака толстого кишечника, рака прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичника, рака предстательной железы, рака из плоских эпителиальных клеток, базально-клеточной карциномы, аденокарцикомы, рака костного мозга, почечноклеточного рака, рака мочевыводящих протоков, рака печени, холангиокарциномы, рака шейки матки, рака эндометрия, рака семенника, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, эпителиального рака, краниофарингиомы, рака гортани, рака языка, фибросаркомы, саркомы слизистых оболочек, липосаркомы, хондросаркомы, остеогенной саркомы, хондромы, саркомы кровеносных сосудов, лимфангиосаркомы, лимфангиоэндотелиальной саркомы, синовиальной саркомы, мезотелиомы, опухоли Юинга, лейомиосаркомы, рабдомиосаркомы, семиномы, опухоли Вилмса, глиомы, астроцитомы, саркомы костного мозга, менингиомы, меланомы, нейробластомы, медуллобластомы, ретинобластомы, злокачественной лимфомы и крови, взятой от пациентов со злокачественной опухолью, и т.п. Примеры линии злокачественных клеток включают, но не ограничиваются ими, НВС-4, BSY-1, BSY-2, MCF-7, MCF-7/ADR RES, HS578T, MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDA-N, ВТ-549, T47D в качестве клеточных линий рака молочной железы человека, HeLa в качестве клеточной линии карциномы шейки матки человека, А549, EKVX, НОР-62, НОР-92, NCI-H23, NCI-H226, NCI-Н322М, NCI-H460, NCI-H522, DMS273, DMS114 в качестве клеточных линий рака легкого человека, Сасо-2, COLO-205, НСС-2998, НСТ-15, НСТ-116, НТ-29, KM-12, SW-620, WiDr в качестве линий клеток рака толстого кишечника человека, DU-145, РС-3, LNCaP в качестве линий клеток рака предстательной железы, U251, SF-295, SF-539, SF-268, SNB-75, SNB-78, SNB-19 в качестве линий клеток злокачественной опухоли центральной нервной системы человека, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, SK-OV-3, IGROV-1 в качестве линий клеток рака яичника человека, RXF-631L, ACHN, UO-31, SN-12С, А498, CAKI-1, RXF-393L, 786-0, TK-10 в качестве линий клеток рака почки человека, MKN45, MKN28, St-4, MKN-1, MKN-7, MKN-74 в качестве линий клеток рака желудка человека, LOX-IMVI, LOX, MALME-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-5, SK-MEL-28, UACC-62, UACC-257, М14 в качестве линий клеток рака кожи, CCRF-CRM, K562, MOLT-4, HL-60TB, RPMI8226, SR, UT7/TPO, Jurkat в качестве линий клеток лейкоза, А431 в качестве клеточной линии клеток злокачественной опухоли, подобной эпителиальной злокачественной опухоли человека, А375 в качестве клеточной линии меланомы человека, MNNG/HOS в качестве клеточной линии остеосаркомы человека, MIAPaCa-2 в качестве клеточной линии рака поджелудочной железы человека и т.п. Примеры клеточной линии зключают, но не ограничиваются ими, HEK293 (клетки почки эмбриона человека), MDCK, MDBK, BHK, С-33А, АЕ-1, 3D9, Ns0/1, NIH3T3, РС12, S2, Sf9, Sf21, High Five (зарегистрированный торговый знак), Vero и т.п.
Примеры гепатоцитов в рамках настоящего изобретения включают первичные гепатоциты, взятые из ткани печени, линию гепатоцитов, полученную путем пассирования культуры в условиях, оптимизированных для культивирования in vitro, и гепатоциты, дифференцированные и индуцированные in vitro из клеток, происходящих из ткани, отличной от печени, плюрипотентных стволовых клеток, таких как клетки iPS, клетки ES и т.п., мезенхимных стволовых клеток, стволовых клеток, происходящих из периферической крови, миелоидных стволовых клеток, стволовых клеток жировой ткани, стволовых клеток печени, клеток-предшественников печени и т.п. Ткань печени представляет собой печень, извлеченную из человека, крысы, мыши, морской свинки, хомяка, кролика, свиньи, животного семейства бычьи, лошади, собаки, кошки, обезьяны и т.д., которая может представлять собой нормальную печень или озлокачествленную печень. Хотя первичные гепатоциты могут быть отделены и извлечены из такой печени перфузионным способом с использованием коллагеназы, их можно приобрести у изготавливающих реагенты компаний, таких как Primarycell, Japan Becton Dickinson and Company, Takara Bio Inc., Hokkaido System Science Co., Ltd., Lonza Japan, Veritas Ltd., Life Technologies Japan Corporation и т.п. Приобретенные гепатоциты могут находиться в замороженном состоянии или могут быть прикреплены к носителю, такому как коллаген, и т.п. Примеры клеточных линий гепатоцитов включают, но не ограничиваются ими, HepG2, Нер3В, HepaRG (зарегистрированный торговый знак), JHH7, HLF, HLE, PLC/PRF/5, WRL68, НВ611, SK-HEP-1, HuH-4, HuH-7 и т.п.
Хотя функция гепатоцитов в рамках настоящего изобретения конкретно не ограничена, она включает проявление активности цитохрома Р450 (также обозначаемого как CYP), такого как CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5 и т.п. и метаболизм фармацевтических продуктов и т.п. этими ферментами, конъюгацию фармацевтических продуктов и т.п. с глюкуроновой кислотой, глутатионом, серной кислотой, глицином и т.п., продуцирование полезных белков, таких как альбумин, аполипопротеины, тромбопоэтик и т.п., секрецию билирубина, синтез мочевины, синтез желчных кислот и жирных кислот, транспорт фармацевтических продуктов и т.п. переносчиками и т.п. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, гепатоциты предпочтительно сохраняют, среди упомянутых выше функций, активность цитохрома Р450, продуцирование альбумина и/или транспорт фармацевтических продуктов переносчиками (например, захват карбоксидихлорфлуоресцеина диацетата, бромида тетраэтиламмония, таурохолата, росвастатина и экскреция карбоксидихлорфлуоресцеина).
Фармацевтические продукты в рамках настоящего изобретения включают любое вещество, пригодное для медицинского применения. Лекарственное средство, являющееся кандидатом для фармацевтического продукта, представляет собой вещество, для которого проводили поиск или разработку и исследование в качестве кандидата для фармацевтического продукта, и оно включает синтетическое соединение, белок, нуклеиновую кислоту, сахариды, встречающееся в природе вещество и т.п.
Лекарственное средство против злокачественной опухоли в рамках настоящего изобретения включает лекарственные средства, которые прямо действуют на злокачественные клетки и подавляют пролиферацию и функцию злокачественной клетки, а также лекарственные средства, которые действуют не прямо на злокачественную клетку, а подавляют пролиферацию или функцию злокачественной клетки или уничтожают злокачественную клетку посредством совместного действия с иммуноцитами in vivo (или другими лекарственными средствами. Примеры лекарственного средства против злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, алкилирующее средство, производное платины, антагонист метаболизма, примером которого является лекарственное средство против злокачественной опухоли на основе 5-FU, ингибитор топоизомеразы, ингибитор микротрубочек, антибиотик против злокачественной опухоли, примером" которого является эпирубицин, лекарственное средство, направленное на молекулярную мишень, примером которого являются гефитиниб, трастузумаб, цетуксимаб, зрлотиниб, панитумумаб, лапатиниб, темсиролимус, эверолимус, ипилимумаб, вандетаниб, кризотиниб, руксолитиниб, траметиниб и т.п. Примеры молекулы-мишени для лекарственного средства направленного на молекулярную мишень, включают, но не ограничиваются ими, различные киназы, Her2, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста рецептор), PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназа), mTOR (белок-мишень млекопитающих для рапамицина), Akt, CDK (циклин-зависимая киназа), VEGFR (рецептор сосудисто-эндотелиального фактора пролиферации), PDGFR (рецептор тромбоцитарного фактора роста), FGFR (рецептор фибробластного фактора роста), c-Met, Raf, р38 MAPK, CTLA-4, ALK, JAK, MEK (MAPK/ERK-киназа), Hsp90, деацетилазу гистонов и т.п. Более того, также в лекарственное средство против злокачественной опухоли в рамках настоящего изобретения включены синтетические соединения, белки, нуклеиновые кислоты, сахариды, природные продукты, являющиеся кандидатами для лекарственных средств, имеющих такие эффекты.
Происходящая из растения клетка в рамках настоящего изобретения включает клетки, выделенные из любой ткани организма растения, а также протопласт, полученный путем искусственного удаления клеточной стенки из клетки.
Ткань в рамках настоящего изобретения представляет собой элемент структуры, который представляет собой определенный ансамбль клеток, имеющих некоторые типы различных свойств и функций, и примеры ткани животных включают эпителиальную ткань, соединительную ткань, мышечную ткань, нервную ткань и т.п. Примеры ткани растений включают меристему, ткань эпидермиса, ассимилирующую ткань, ткань мезофилла, проводящую ткань, механическую ткань, ткань паренхимы, дедифференцированный кластер клеток (каллюс) и т.п.
Когда клетки и/или ткани культивируют способом по настоящему изобретению, клетки и/или ткани, подлежащие культивированию, можно свободно выбирать из клеток и/или тканей, описанных выше, и культивировать. Клетки и/или ткани можно прямо извлекать из организма животного или растения. Клетки и/или ткани можно индуцировать, выращивать и трансформировать из организма животного или растения с использованием конкретной обработки, а затем собирать. В этом случае обработка может происходить in vivo или in vitro. Примеры животного включают насекомое, рыбу, земноводное, пресмыкающееся, птиц, животных группы Pancrustacea, шестиногих насекомых, млекопитающих и т.п. Примеры млекопитающего включают, но не ограничиваются ими, крысу, мышь, кролика, морскую свинку, белку, хомяка, полевку, утконоса, дельфина, кита, собаку, кошку, козу, животное семейства бычьи, лошадь, овцу, свинью, слона, обыкновенную игрунку, беличью обезьяну, Масаса mulatta, шимпанзе и человека. Растение конкретно не ограничено при условии, что полученные клетки и/или ткани можно использовать в жидкой культуре. Их примеры включают, но не ограничиваются ими, растения (например, женьшень, барвинок, белена, коптис, белладонна и т.д.), продуцирующие натуральные лекарственные средства (например, сапонин, алкалоиды, берберин, скополин, фитостерин и т.д.), растения (например, черника, подсолнечник, марена, шафран и т.д.), продуцирующие краситель или полисахарид (например, антоцианин, краситель из сафлора, краситель из марены, краситель из шафрана, флавоны и т.д.), являющиеся исходным материалом для косметических средств или продуктов питания, или растения, продуцирующие фармацевтическое лекарственное вещество, растения (рис, кукуруза, пшеница или ячмень и т.д.) являющиеся кормами или продуктами питания и т.д.
Суспендирование клеток и/или тканей в рамках настоящего изобретения относится к состоянию, когда клетки и/или ткани не прикреплены к контейнеру для культивирования (являются не прикрепляющимися). Более того, в рамках настоящего изобретения, когда клетки и/или ткани подвергают пролиферации, дифференцировке или поддержанию, состояние, когда клетки и/или ткани однородно диспергированы и суспендированы в жидкой композиции среды с отсутствие давления на или встряхивания жидкой композиции среды извне иди качающего, вращающего воздействия и т.п. на композицию, называют "стойкостью суспензии", и культивирование клеток и/или тканей в таких условиях называют "стойкой суспензионной культурой". В случае "стойкости суспензии" период суспендирования включает по меньшей мере 5-60 мин, 1 ч - 24 ч, 1 сутки - 21 суток, хотя этот период не ограничивается указанными периодами при условии, что сохраняется суспендированное состояние.
Композиция среды по настоящему изобретению представляет собой композицию, содержащую структуру, способную культивировать клетки или ткани в суспендированном состоянии (предпочтительно способную к стойкому суспензионному культивированию), и среду.
Композиция среды по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой композицию, позволяющую осуществление замены композиции среды во время культивирования, и выделение клеток или тканей из композиции среды после завершения культивирования. Более предпочтительно, она представляет собой композицию, которая не требует какого-либо изменения температуры, химической обработки, ферментативной обработки и сдвигового усилия во время выделения клеток или тканей из композиции среды.
Структура в рамках настоящего изобретения образована конкретным соединением, и она демонстрирует эффект однородного суспендирования клеток и/или тканей. Более конкретно, она включает сборку полимерных соединений через ион, трехмерную сеть, образованную полимерными соединениями, и т.п. Известно, что полисахариды образуют микрогель через ион металла (например, JP-A-2004-129596) и структура по настоящему изобретению также включает такой микрогель в качестве одного варианта осуществления.
Одним вариантом осуществления сборки полимерных соединений через ион является пленочная структура. Такая пленка в качестве примера представлена на фиг. 13.
Размер структуры в рамках настоящего изобретения предпочтительно представляет собой размер, при котором структура проходит через фильтр с размером пор от 0,2 мкм до 200 мкм, когда ее пропускают через фильтр. Нижний предел размера пор более предпочтительно составляет более 1 мкм и, для обеспечения стабильной суспензии клеток или тканей, он более предпочтительно превышает 5 мкм. Верхний предел размера пор более предпочтительно составляет менее 100 мкм и, учитывая размер клеток или тканей, более предпочтительно он составляет менее 70 мкм.
Конкретное соединение в рамках настоящего изобретения относится к соединению, которое при смешении с жидкой средой образует промежуточную структуру, которая однородном диспергируется в жидкости, поддерживает клетки и/или ткани по существу без увеличения вязкости жидкости и демонстрирует эффект предотвращения их осаждения. "По существу без увеличения вязкости жидкости" означает, что вязкость жидкости не превышает 8 мПа⋅с. В этом случае вязкость жидкости (т.е. вязкость композиции среды по настоящему изобретению) не превышает 8 мПа⋅с, предпочтительно не превышает 4 мПа⋅с, более предпочтительно не превышает 2 мПа⋅с. Более того, химическая структура, молекулярная масса, свойство и т.д. конкретного соединения не ограничиваются при условии, что оно образует структуру в жидкой среде и демонстрирует эффект однородного суспендирования (предпочтительно выдерживания суспензии) клеток и/или тканей, по существу без увеличения вязкости жидкости.
Вязкость жидкости, содержащей структуру, можно измерять, например, способом, описанным в упомянутых ниже примерах. В частности, ее можно измерять в условиях 37°С и с использованием измерителя вязкости Е-типа (изготавливаемый Toki Sangyo Co., Ltd., измеритель вязкости типа TV-22, модель: TVE-22L, конический ротор: стандартный ротор 1°34'×R24, количество оборотов 100 об/мин).
Примеры конкретного соединения для применения в рамках настоящего изобретения включают, но не ограничиваются ими, полимерные соединения, предпочтительно полимерное соединение, имеющее анионную функциональную группу.
В качестве анионной функциональной группы, могут быть упомянуты карбоксигруппа, сульфогруппа, фосфатная группа и их соль, причем предпочтительными являются карбоксигруппа или ее соль.
В качестве полимерного соединения для применения в рамках настоящего изобретения можно использовать соединение, имеющее один или нескольких типов из упомянутых выше анионных функциональных групп.
Предпочтительные конкретные примеры полимерного соединения для применения в рамках настоящего изобретения включают, но не ограничиваются ими, полисахариды, в которых полимеризовано не менее 10 отдельных сахаридов (например, триоза, тетроза, пентоза, гексоза, гептоза и т.д.), более предпочтительно, кислые полисахариды, имеющие анионную функциональную группу. Кислые полисахариды в рамках настоящего изобретения конкретно не ограничены при условии, что они имеют анионную функциональную группу в их структуре, и включают, например, полисахариды, имеющие уроновую кислоту (например, глюкуроновая кислота, идуроновая кислота, галактуроновая кислота, маннуроновая кислота), полисахариды, имеющие группу серной кислоты или фосфатную группу в части их структуры, и полисахариды, имеющие обе структуры, и включают не только полученные из природных источников полисахариды, но также и полисахариды, продуцируемые микроорганизмами, полисахариды, полученные способами генной инженерии, и полисахариды, искусственно синтезированные с использованием фермента. Более конкретно, их примеры включают полимерные соединения, состоящие из одного или нескольких типов, выбранных из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, геллановой камеди, деацилированной геллановой камеди (далее иногда обозначаемой как DAG), рамсановой камеди, диутановой камеди, ксантановой смолы, каррагенана, ксантановой смолы, гексуроновой кислоты, фукоидана, пектина, пектовой кислоты, пектиновой кислоты, гепарансульфата, гепарина, гепаритинсульфата, кератосульфата, хондроитинсульфата, дерматансульфата, рамнансульфата и их соли. Полисахариды предпочтительно представляют собой гиалуроновую кислоту, DAG, диутановую камедь, ксантановую смолу, каррагенан или их соли, наиболее предпочтительно DAG, поскольку его использование в низкой концентрации может суспендировать клетки или ткани и ввиду простоты выделения клеток или тканей.
Соль в рамках настоящего изобретения включает, например, соли щелочных металлов, таких как литий, натрий, калий, соли щелочноземельных металлов, таких как кальций, барий, магний, и соли алюминия, цинка, меди, железа, аммония, органических оснований и аминокислот, и подобные соли.
Средневзвешенная молекулярная масса этих полимерных соединений (полисахариды и т.д.) предпочтительно составляет от 10000 до 50000000, более предпочтительно от 100000 до 20000000, еще более предпочтительно от 1000000 до 10000000. Например, молекулярную массу можно измерять на основе пуллулана гель-фильтрацией (GPC).
Как описано в упомянутых ниже примерах, также можно использовать фосфорилированный DAG. Фосфорилирование можно проводить известным способом.
В рамках настоящего изобретения множество типов (предпочтительно два типа) упомянутых выше полисахаридов можно использовать в комбинации. Тип комбинации полисахаридов конкретно не ограничен при условии, что упомянутая выше структура образуется в жидкой среде, и клетки и/или ткани могут быть однородно суспендированы (предпочтительно в виде стойкой суспензии) по существу без увеличения вязкости жидкости. Предпочтительно, комбинация включает по меньшей мере DAG или его соль. Следовательно, предпочтительная комбинация полисахаридов содержит DAG или его соль, и полисахариды, отличные от DAG и его соли (например, ксантановая смола, альгиновая кислота, каррагенан, диутановая камедь, метилцеллюлоза, смола плодоворожкового дерева или их соль). Примеры конкретной комбинации полисахаридов включают, но не ограничиваются ими, DAG и рамсановую камедь, DAG и диутановую камедь, DAG и ксантановую смолу, DAG и каррагенан, DAG и ксантановую смолу, DAG и смолу плодоворожкового дерева, DAG и κ-каррагенан, DAG и альгинат натрия, DAG и метилцеллюлозу и т.п.
Более предпочтительные конкретные примеры конкретного соединения, подлежащего применению в рамках настоящего изобретения, включают гиалуроновую кислоту, деацилированную геллановую камедь, диутановую камедь, каррагенан и ксактановую смолу и их соль. Наиболее предпочтительные примеры включают деацилированную геллановую камедь и ее соль, поскольку можно обеспечить низкую вязкость композиции среды и клетки или ткани можно без труда выделить.
Деацилированная геллановая камедь в рамках настоящего изобретения представляет собой линейный полимерный полисахарид, содержащий 4 молекулы сахаров: 1-3-связанную глюкозу, 1-4-связанную глюкуроновую кислоту, 1-4-связанную глюкозу и 1-4-связанную рамнозу, в качестве составляющего элемента, и она представляет собой полисахарид следующей формулы (I), где каждый из R1, R2 представляет собой атом водорода и n представляет собой целое число, равное двум или более. R1 может содержать глицерильную группу, R2 может содержать ацетильную группу, и содержание ацетильной группы и глицерильной группы предпочтительно составляет не более 10%, более предпочтительно не более 1%.
Структура в рамках настоящего изобретения принимает различные формы в зависимости от конкретного соединения. В случае деацилированной геллановой камеди, она захватывает ион металла (например, ион кальция) в жидкой среде, когда она смешана с жидкой средой, образует промежуточную структуру через ион металла и суспендирует клетки и/или ткани. Вязкость композиции среды по настоящему изобретению, полученной из деацилированной геллановой камеди, составляет не более 8 мПа⋅с, предпочтительно не более 4 мПа⋅с, и более предпочтительно не более 2 мПа⋅с для простоты выделения клеток или тканей.
Конкретное соединение в рамках настоящего изобретения можно получать способом химического синтеза. Когда соединение представляет собой встречающееся в природе вещество, его предпочтительно получают из различных растений, различных животных, различных микроорганизмов, содержащих соединение, путем экстракции, разделения и очистки общепринятыми способами. В случае экстракции соединение можно эффективно экстрагировать с использованием воды и надкритического газа. Например, в качестве способа получения геллановой камеди, продуцирующий микроорганизм культивируют в ферментационной среде, слизистое вещество, продуцируемое наружу гриба, выделяют обычным способом очистки и после стадий высушивания, распыления и т.п., преобразуют в порошковую форму. Когда оно представляет собой деацилированную геллановую камедь, при выделении слизистого вещества используют обработку щелочью, проводят деацилирование и удаление глицерильной группы и ацетильной группы, связанных с 1-3-связанным остатком глюкозы. Примеры способа очистки включают экстрагирование жидкости жидкостью, фракционное осаждение, кристаллизацию, различные типы ионообменной хроматографии, гель-фильтрацию с использованием Sephadex LH-20 и т.п., адсорбционную хроматографию с использованием активированного угля, силикагель и т.п., адсорбционную и десорбционную обработку активного вещества с помощью тонкослойной хроматографии, высокоэффективную жидкостную хроматографию с использованием обращенно-фазовой колонки и т.п., и примеси можно удалять и соединение можно очищать с их использованием отдельно или в комбинации в любом порядке, или многократно: Примеры продуцирующего геллановую камедь микроорганизма включают, но не ограничиваются ими, Sphingomonas elodea и микроорганизм, полученный путем изменения гена Sphingomonas elodea.
Когда оно представляет собой деацилированную геллановую камедь, можно использовать коммерчески доступные продукты, например, "KELCOGEL (зарегистрированный торговый знак CP Kelco) CG-LA", производимый SANSHO Co., Ltd., "KELCOGEL (зарегистрированный торговый знак CP Kelco)", производимый San-Ei Gen F.F.I., Inc. и т.п. В качестве геллановой камеди, подобной природной, можно использовать "KELCOGEL (зарегистрированный торговый знак CP Kelco) НТ", производимый San-Ei Gen F.F.I., Inc. и т.п.
Концентрация конкретного соединении в среде зависит от типа конкретного соединения, и она может быть соответствующим образом установлена из диапазона, в котором конкретное соединение может образовывать упомянутую выше структуру в жидкой среде и может однородно суспендировать (предпочтительно в стойкую суспензию) клетки и/или ткани по существу без увеличения вязкости жидкости. Как правило, она составляет от 0,0005% до 1,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,001% до 0,4% (масса/объем), более предпочтительно от 0,005% до 0,1% (масса/объем), еще более предпочтительно от 0,005% до 0,05% (масса/объем). Например, в случае деацилированной геллановой камеди, ее добавляют в среду в количестве от 0,001% до 1,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,003% до 0,5% (масса/объем), более предпочтительно от 0,005% до 0,1% (масса/объем), более предпочтительно от 0,01% до 0,05% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,01% до 0,03% (масса/объем). В случае ксантановой смолы, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 5,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,01% до 1,0% (масса/объем), более предпочтительно от 0,05% до 0,5% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,1% до 0,2% (масса/объем). В случае смеси κ-каррагенана и смолы плодоворожкового дерева, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 5,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,005% до 1,0% (масса/объем), более предпочтительно от 0,01% до 0,1% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,03% до 0,05% (масса/объем). В случае геллановой камеди природного типа, ее добавляют в среду в концентрации от 0,05% до 1,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,05% до 0,1% (масса/объем).
Когда используют множество типов (предпочтительно два типа) упомянутых выше полисахаридов в комбинации, концентрация полисахаридов может формировать упомянутую выше структуру в жидкой среде, и они могут однородно суспендировать (предпочтительно с образованием стойкой суспензии) клетки и/или ткани по существу без увеличения вязкости жидкости. Например, когда используют комбинацию DAG или его соли и полисахарида, отличного от DAG и его соли, концентрация DAG или его соли составляет, например, 0,005-0,02% (масса/объем), предпочтительно 0,01-0,02% (масса/объем), и концентрация полисахарида, отличного от DAG и его соли, составляет, например, 0,005-0,4% (масса/объем), предпочтительно 0,1-0,4% (масса/объем).
Конкретные примеры комбинации диапазона концентраций включают следующие.
DAG или его соль: 0,005-0,02% (предпочтительно 0,01-0,02%) (масса/объем),
полисахарид, отличный от DAG,
ксантановая смола: 0,1-0,4% (масса/объем),
альгинат натрия: 0,1-0,4% (масса/объем),
смола плодоворожкового дерева: 0,1-0,4% (масса/объем),
метилцеллюлоза: 0,1-0,4% (масса/объем) (предпочтительно 0,2-0,4% (масса/объем)),
каррагенан: 0,05-0,1% (масса/объем),
диутановая камедь: 0,05-0,1% (масса/объем).
Концентрацию можно вычислять по следующей формуле.
Концентрация (%) = масса (г) конкретного соединения/объем (мл) композиции среды ×100.
Упомянутое выше соединение также можно далее конвертировать в отличающееся производное способом химического синтеза, и полученное таким образом производное также можно эффективно использовать в рамках настоящего изобретения. В частности, в случае деацилированной геллановой камеди, в рамках настоящего изобретения также можно использовать производное соединения, соответствующее формуле (I), где гидроксильная группа R1 и/или R2 замещена C1-3-алкоксигруппой, C1-3-алкилсульфонильной группой, моносахаридным остатком, таким как глюкоза, фруктоза и т.п., олигосахаридные остатком, таким как сахароза, лактоза и т.п., или аминокислотным остатком, таким как глицин, аргинин и т.п. Кроме того, соединение также можно сшивать с использованием сшивающего агента, такого как 1-этил-3-(3-диметиламикопропил)карбодиимид (EDC) и т.п.
Конкретное соединение или его соль, подлежащие применению в рамках настоящего изобретения, могут присутствовать в любой кристаллической форме в зависимости от условий получения, и они могут присутствовать в качестве любого гидрата. Такая кристаллическая форма, гидрат и их смеси также охватываются объемом настоящего изобретения. Кроме того, они могут присутствовать в качестве сольвата, содержащего органический растворитель, такой как ацетон, этанол, тетрагидрофуран и т.п. Такие формы охватываются объемом настоящего изобретения.
Конкретное соединение, подлежащее применению в рамках настоящего изобретения, может присутствовать в форме таутомера, образовавшегося в результате изомеризации в кольце или вне кольца, геометрического изомера или таутомера, или смеси геометрических изомеров, или их смесей. Когда соединение по настоящему изобретению имеет асимметричный центр, независимо от того, образовано ли соединение путем изомеризации, оно может присутствовать в форме отделенного оптического изомера или смеси, содержащей его в любом соотношении.
Композиция среды по настоящему изобретению может содержать ион металла, например, ион двухвалентного металла (ион кальция, ион магния, ион цинка, ион железа, ион меди и т.д.), и предпочтительно содержит ион кальция. Можно использовать два или более типов ионов металлов в комбинации, например, ион кальция и ион магния, ион кальция и ион цинка, ион кальция и ион железа, и ион кальция и ион меди. Специалисты в данной области могут определить комбинацию соответствующим образом. В одном варианте осуществления, поскольку композиция среды содержит ион металла, полимерные соединения объединяются через ион металла и образуют трехмерную сеть (например, полисахариды образуют микрогель через ион металла), посредством чего может образовываться структура по настоящему изобретению. Концентрацию ионов металла можно соответствующим образом установить из диапазона, в котором конкретное соединение может образовывать упомянутую выше структуру в жидкой среде и может однородно суспендировать (предпочтительно с образованием стойкой суспензии) клетки и/или ткани по существу без увеличения вязкости жидкой среды. Концентрация соли составляет, но не ограничивается этим, 0,1 мМ - 300 мМ, предпочтительно 0,5 мМ - 100 мМ. Ион металла можно смешивать со средой или солевой раствор получать отдельно и добавлять в среду. Композиция среды по настоящему изобретению может содержать упомянутый ниже внеклеточный матрикс, молекулу адгезии и т.п.
Настоящее изобретение также относится к способу культивирования для пролиферации клеток или тканей с использованием композиции среды, к способу выделения полученных клеток или тканей, например, путем фильтрации, центрифугирования или магнитного разделения, и к способу получения сферы с использованием композиции среды.
Когда клетки и/или ткани культивируют in vitro, структура, состоящая из конкретного соединения, подлежащего применению в рамках настоящего изобретения, демонстрирует эффект суспендирования (предпочтительно эффект стойкости суспензии) клеток и/или тканей в жидкости, содержащей структуру конкретного соединения. Посредством эффекта суспендирования, можно культивировать увеличенное количество клеток и/или тканей на данный объем по сравнению с культурой монослоя. Когда общепринятый способ плавающей культуры сопровождается вращением или встряхиванием, уровень пролиферации и уровень выделения клеток и/или тканей могут снижаться, или функция клетки может быть нарушена, поскольку сдвиговое усилие действует на клетки и/или ткани. Использование композиции среды по настоящему изобретению, которая содержит структуру конкретного соединения, может обеспечить однородное диспергирование клеток и/или тканей без такого действия, как встряхивание и т.п., и может обеспечить получение рассматриваемых клеток и/или тканей без труда в большом количестве без утраты клеточной функции. Кроме того, когда клетки и/или ткани культивируют в качестве суспензии в общепринятой среде, содержащей гелеобразный субстрат, наблюдение и выделение клеток и/или тканей иногда затруднено, и их функция иногда нарушается во время выделения. Однако с использованием композиции среды, содержащей структуру конкретного соединения по настоящему изобретению, клетки и/или ткани можно подвергать суспензионной культуре, наблюдать без нарушения их функции и можно выделять. Кроме того, общепринятая среда, содержащая гелеобразный субстрат, иногда демонстрирует высокую вязкость, которая затрудняет замену среды. Однако, поскольку композиция среды, содержащей структуру конкретного соединения по настоящему изобретению, имеет низкую вязкость, ее можно без труда заменять пипеткой, насосом и т.п.
Происходящие из человека клетки и/или ткани, культивируемые способом по настоящему изобретению, можно трансплантировать для лечения пациентов, имеющих заболевание или нарушение. В этом случае, подвергаемое лечению заболевание, тип нарушения, способ предварительной обработки и способ трансплантации клеток соответствующим образом выбирают специалисты в данной области. Приживление трансплантированных клеток реципиенту, выздоровление от заболевания или нарушения, присутствие или отсутствие побочных эффектов, ассоциированных с трансплантацией, и эффект лечения исследуют соответствующим образом и оценивают общими способами трансплантационной терапии.
Более того, поскольку клетки и/или ткани эффективно пролиферируют при использовании способа по настоящему изобретению, композицию среды, содержащую конкретное соединение и его структуру по настоящему изобретению, можно использовать в качестве реагента для исследования клеток. Например, когда устанавливают фактор, контролирующий дифференцировку и пролиферацию клеток и тканей, клетки и рассматриваемый фактор сокультивируют, и анализируют число и тип клеток и изменения маркеров дифференцировки на клеточной поверхности и экспрессируемых генов. В этом случае, с использованием композиции среды по настоящему изобретению, количество анализируемых клеток-мишеней можно эффективно увеличивать в количестве, а также эффективно выделять. Когда устанавливают рассматриваемый фактор, условия культивирования, устройство для культивирования, тип среды, тип соединения по настоящему изобретению, содержание конкретного соединения, тип добавки, содержание добавки, период культивирования, температуру культивирования и т.п. может соответствующим образом выбирать специалист в данной области из диапазона, описанного в настоящем описании. Клетку, которая пролиагерировала или появилась путем культивирования, можно наблюдать с использованием стандартного микроскопа в соответствующей области. В этом случае культивируемые клетки можно окрашивать специфическим антителом. Экспрессированный ген, который изменился из-за рассматриваемого фактора, можно выявлять путем экстракции ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота) из культивируемых клеток и обнаружения с помощью саузерн-блоттинга, нозерн-блоттинга, ОТ-ПЦР и т.п. Кроме того, выявляют маркер дифференцировки на клеточной поверхности с помощью ELISA и проточной цитометрии с использованием специфического антитела, и можно наблюдать эффект рассматриваемого фактора на дифференцировку и пролиферацию.
Когда клетки и/или ткани культивируют способом культивирования по настоящему изобретению, для культивирования можно использовать инструменты для культивирования, обычно используемые для культивирования клеток, такие как миска, колба, пластиковый мешок, мешок из Teflon (зарегистрированный торговый знак), чашка, миска, чашка для культивирования тканей, чашка с множеством отделений, микропланшет, микролуночный планшет, мультипланшет, многолуночный планшет, предметное стекло с камерами, колба для культивирования клеток, колба для вращающейся культуры, пробирка, лоток, мешок для культивирования, вращающаяся бутылка и т.п. Хотя материалы для этих инструментов для культивирования конкретно не ограничены, могут быть упомянуты, например, стекло, пластмасса, такая как поливинилхлорид, целлюлозные полимеры, такие как этилцеллюлоза, ацетилцеллюлоза и т.п., полистирол, полиметилметакрилат, поликарбонат, полисульфон, полиуретан, полиэфир, полиамид, полистирол, полипропилен, полиэтилен, (полибутадиен, сополимер полиэтилена и винилацетата, сополимер бутадиена и стирола, сополимер бутадиена и акрилонитрила, сополимер этилена и этилакрилата, сополимер этилена и метакрилата, полихлоропрен, стироловая смола, хлорсульфонатный полиэтилен, этиленвинилацетат, акриловый блок-сополимер и т.д. Эти пластмассы являются лучшими не только вследствие проницаемости для газов кислорода, диоксида углерода и т.п., но также они являются лучшими с точки зрения промышленной способности к формованию, могут выдерживать различную обработку стерилизацией и предпочтительно являются прозрачными материалами, позволяющими наблюдение внутри инструментов для культивирования. В рамках настоящего изобретения способ стерилизационной обработки конкретно не ограничен и, например, могут быть упомянуты радиационная стерилизация, стерилизация газообразной окисью этилена, стерилизация автоклавированием и т.п. Более того, можно использовать эти пластмассы с различной обработкой поверхности (например, обработка плазмой, коронная обработка и т.п.). Более того, эти инструменты для культивирования можно заранее покрывать внеклеточным матриксом, молекулой клеточной адгезии и т.п. Примеры материала покрытия включают коллаген с I по XIX, желатин, фибронектин, витронектин, ламинин с 1 по 12, нитоген, тенасцин, тромбоспондин, фактор Виллебранда, остеопонтин, фибриноген, различные эластины, различные протеогликаны, различные кадгерины, десмоколин, десмоглеин, различные интегрины, Е-селектин, Р-селектин, L-селектин, иммуноглобулин, гиалуроновую кислоту, суперсемейство, матригель, поли-D-лизин, поли-L-лизин, хитин, хитозан, сефарозу, гель из альгиновой кислоты, гидрогель, их фрагменты расщепления и т.п. Также можно использовать эти материалы покрытия, имеющие аминокислотную последовательность, искусственно измененную способами рекомбинации генов. Также можно использовать материал покрытия для ингибирования адгезии клеток и/или тканей к инструментам для культивирования. Примеры материала покрытия включают, но не ограничиваются ими, кремний, поли(2-гидроксиметилметакрилат), поли(2-метоксиметилакрилат), поли(2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолин), поли-N-изопропилакриламид, гель Mebiol (зарегистрированный торговый знак) и т.п.
Клетки и/или ткани также можно культивировать путем автоматического проведения посева клеток, замены среды, получения изображения клеток и выделения культивируемых клеток под механическим контролем и в закрытой окружающей среде с контролем рН, температуры, концентрации кислорода и т.п. и с использованием биореактора и автоматического инкубатора, способного к культивированию с высокой плотностью. В качестве способа предоставления новой среды и предоставления требуемых веществ клеткам и/или тканям во время культивирования с использованием такого устройства, доступны периодическая культура с подпиткой, непрерывная культура и перфузионная культура, и все эти способы можно использовать в качестве способа культивирования по настоящему изобретению. Контейнеры для культивирования, используемые для биореакторов и автоматических инкубаторов, включают открытые контейнеры для культивирования, которые просто открывать-закрывать и которые имеют большую площадь контакта с внешней средой (например, контейнеры для культивирования, имеющие крышку), и закрытые контейнеры для культивирования, которые трудно открывать-закрывать и которые имеют небольшую площадь контакта с внешней средой (например, контейнеры для культивирования тканей в виде кассет). Оба типа контейнеров для культивирования можно использовать для способа по настоящему изобретению.
Когда клетки и/или ткани культивируют с использованием конкретного соединения по настоящему изобретению, композицию среды можно получать путем смешения среды, используемой для культивирования клеток и/или тканей, и конкретного соединения. В соответствии с классификацией такой композиции среды, могут быть упомянуты природная среда, полусинтетическая среда и синтетическая среда. В соответствии с классификацией по форме, могут быть упомянуты полутвердая среда, жидкая среда, порошковая среда (далее иногда обозначаемая как порошковая среда) и т.п. Когда клетки и/или ткани происходят из животного, можно использовать любую среду, используемую для культивирования клеток животных. Примеры среды включают модифицированную способом Дульбекко среду Игла (DMEM), среду hamF12 (смесь питательных вещества Хэма F12), среду DMEM/F12, среду Мак-коя 5А, среду Игла MEM (минимальная эссенциальная среда Игла; ЕМЕМ), среду αМЕМ (модифицированная минимальная эссенциальная среда Игла альфа; αМЕМ), среду MEM (минимальная эссенциальная среда), среду RPMI1640, модифицированную по способу Исков среду Дульбекко (IMDM), среду MCDB131, среду Уильяма Е, среду IPL41, среду Фишера, StemPro34 (изготавливаемая Invitrogen), X-VIVO 10 (изготавливаемая Cambrex Corporation), X-VIVO 15 (изготавливаемая Cambrex Corporation), HPGM (изготавливаемая Cambrex Corporation), StemSpan H3000 (изготавливаемая STEMCELL Technologies), StemSpanSFEM (изготавливаемая STEMCELL Technologies), Stemlinell (изготавливаемая Sigma Aldrich), QBSF-60 (изготавливаемая Qualitybiological), StemPro hESC SFM (изготавливаемая Invitrogen), среду Essential8 (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая Gibco), среду mTeSR1 или 2 (изготавливаемая STEMCELL Technologies), ReproFF или ReproFF2 (изготавливаемая ReproCELL), среду PSGro hESC/iPSC (изготавливаемая System Biosciences), среду NutriStem (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая Biological Industries), среду CSTI-7 (изготавливаемая Cell Science & Technology Institute, Inc.), среду MesenPRO RS (изготавливаемая Gibco), среду для пролиферации мезенхимных стволовых клеток MF-medium (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая TOYOBO CO., LTD.), Sf-900II (изготавливаемая Invitrogen), Opti-Pro (изготавливаемая Invitrogen) и т.п.
Среда, подлежащая применению для культивирования злокачественных клеток, может представлять собой упомянутую выше среду, в которую добавляют фактор клеточной адгезии, и ее примеры включают матригель, коллагеновый гель, желатин, поли-L-лизин, поли-D-лизин, ламинин и фибронектин. Является возможным добавление двух или более типов этих факторов адгезии в комбинации. Более того, среду, подлежащую применению для культивирования сферы злокачественных клеток, можно далее смешивать с загустителем, таким как гуаровая камедь, тамариндовая камедь, альгиновая кислота, пропиленгликоль, смола плодоворожкового дереза, гуммиарабик, камедь тары, тамариндовая камедь, метилцеллюлоза и т.п.
Примеры среды для применения для культивирования гепатоцитов включают, в дополнение к упомянутым выше средам, HepatoZYME-SFM (изготавливаемая Life Technologies), среду для культивирования гепатоцитов НСМ (зарегистрированный торговый знак), Bullet Kit (зарегистрированный торговый знак, изготавливаемая Lonza), базовую среду для гепатоцитов НВМ (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая Lonza), поддерживающую среду для гепатоцитов НММ (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая Lonza), модифицированную среду Лэнфорда (изготавливаемая NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), среду ISOM, среду для пролиферации клеток печени (изготавливаемая Takara Bio Inc.), поддерживающую среду для гепатоцитов (изготавливаемая Takara Bio Inc.), базовую среду для гепатоцитов (изготавливаемая Takara Bio Inc.), поддерживающая активность среду Super medium (изготавливаемая In Vitro ADMET Laboratories) и т.п. Эти среды могут содержать фактор адгезии клеток, и их примеры включают матригель, коллагеновый гель, желатин, поли-L-лизин, поли-D-лизин, ламинин и фибронектин. Также можно добавлять два или более из этих факторов клеточной адгезии в комбинации. Более того, среду, подлежащую применению для культивирования сферы злокачественных клеток или гепатоцитов, можно далее смешивать с загустителем, таким как гуаровая камедь, тамариндовая камедь, альгиновая кислота, пропиленгликоль, смола плодоворожкового дерева, гуммиарабик, камедь тары, тамариндовая камедь, метилцеллюлоза и т.п.
Когда клетки и/или ткани происходят из растения, в качестве среды может быть упомянута среда, полученная добавлением ауксинов и, когда это необходимо, вещества для контроля роста растений (гормон растений), такого как цитокины и т.п., в подходящей концентрации в базовую среду, такую как среда Murashige Skoog (MS), среда Linsmaier Skoog (LS), среда White, среда Gamborg B5, среда niche, среда hela, среда Morel и т.п., обычно используемые для культивирования тканей растений, или модифицированную среду, где эти компоненты модифицированы до оптимальной концентрации (например, азот аммиака с половинкой концентрации и т.д.). Эти среды могут быть дополнительно дополнены, когда это необходимо, деградирующим казеин ферментом, жидким кукурузным экстрактом, витаминами и т.п. Примеры ауксинов включают, но не ограничиваются ими, 3-индолуксусную кислоту (IAA), 3-индолмасляную кислоту (IBA), 1-нафталинуксусную кислоту (NAA), 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-D) и т.п. Например, ауксины можно добавлять в среду в концентрации приблизительно 0,1 - приблизительно 10 м.д. Примеры цитокинов включают, но не ограничиваются ими, кинетин, бензиладенин (ВА), зеатин и т.п. Например, цитокины можно добавлять в среду в концентрации приблизительно 0,1 - приблизительно 10 м.д.
Специалисты в данной области могут свободно добавить в упомянутую выше среду, в зависимости от задачи, натрий, калий, кальций, магний, фосфор, хлор, различные аминокислоты, различные витамины, антибиотик, сыворотку, жирную кислоту, сахар и т.п. Для культивирования происходящих из животных клеток и/или тканей специалисты в данной области также могут добавлять, в зависимости от задачи, один или несколько типов других химических компонентов и биогенных веществ в комбинации.
Примеры компонентов, подлежащих добавлению в среду для клеток и/или тканей животного происхождения, включают эмбриональную телячью сыворотку, сыворотку человека, сыворотку лошади, инсулин, трансферрин, лактоферрин, холестерин, этаноламин, селенит натрия, монотиоглицерин, 2-меркаптоэтанол, бычий сывороточный альбумин, пируват натрия, полиэтиленгликоль, различные витамины, различные аминокислоты, агар, агарозу, коллаген, метилцеллюлозу, различные цитокины, различные гормоны, различные факторы пролиферации, различные внеклеточные матриксы, различные молекулы адгезии и т.п. Примеры цитокина для добавления в среду включают, но не ограничиваются ими, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), интерлейкин-13 (IL-13), интерлейкин-14 (IL-14), интерлейкин-15 (IL-15), интерлейкин-18 (IL-18), интерлейкин-21 (IL-21), интерферон-α (IFN-α), интерферон-β (IFN-β), интерферон-у (IFN-γ), гракулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), моноцитарный колониестимулирующий фактор (М-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор стволовых клеток (SCF), лиганд flk2/flt3 (FL), ингибиторный фактор клеток лейкоза (LIF), онкостатин М (ОМ), эритропоэтин (ЕРО), тромбопоэтин (ТРО) и т.п.
Примеры гормона для добавления в среду включают, но не ограничиваются ими, мелатонин, серотонин, тироксин, трийодтиронин, адреналин, норадреналин, дофамин, антимюллеров гормон, адипонектин, адренокортикотропный гормон, ангиотензиноген и ангиотензин, антидиуретический гормон, предсердный натрийуретический пептид, кальцитонин, холицистокинин, рилизинг-фактор кортикотропина, эритропоэтин, фолликулостимулирующий гормон, гастрин, грелин, глюкагон, релизинг-фактор гонадотропина, рилизинг-фактор гормона роста, хорионический гонадотропин человека, лактоген плаценты человека, гормон роста, ингибин, инсулин, инсулиноподобный фактор роста, лептин, лютеинизирующий гормон, стимулирующий меланоциты гормон, окситоцин, паратиреоидный гормон, пролактин, рилизинг-фактор гастрина, соматостатин, тромбопоэтин, гормон стимуляции щитовидной железы, рилизинг-фактор тиреотропина, кортизол, андростендион, тестостерон, дегидроэпиандростерон, андростендион, дигидротестостерон, эстрадиол, эстрон, эстриол, прогестерон, кальцитриол, кальцидиол, простагландин, лейкотриен, простациклин, тромбоксан, рилизинг-фактор пролактина, липотропин, натрийуретический пептид головного мозга, нейропептид Y, гистамин, эндотелии, полипептид поджелудочной железы, ренин и энкефалин.
Примеры фактора роста, подлежащего добавлению в среду, включают, но не ограничиваются ими, трансформирующий фактор роста-α (TGF-α), трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), воспалительный белок макрофагов-1α (MIP-1α), фактор роста эпителиальных клеток (EGF), фибробластный фактор роста-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), фактор роста нервных клеток (NGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), ингибирующий лейкоз фактор (LIF), протеазу нексин I, протеазу кексин II, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), холиновый вазоактивный фактор дифференцировки (CDF), хемокин, Notch-лиганд (Deltal и т.п.), белок Wnt, ангиопоэтин-подобный белок 2, 3, 5 или 7 (Angpt2, 3, 5, 7), иксулиноподобный фактор роста (IGF), связывающий инсулиноподобный фактор роста белок-1 (IGFBP), плейотрофин и т.п.
Кроме того, также можно добавлять эти цитокины и факторы роста, имеющие аминокислотные последовательности, искусственно измененные способами рекомбинации генов. Их примеры включают комплекс IL-6/растворимый рецептор IL-6, Hyper IL-6 (слитый белок IL-6 и растворимый рецептор IL-6) и т.п.
Примеры различных внеклеточных матриксов и различных молекул клеточной адгезии включают коллаген с I по XIX, фибронектин, витронектин, ламинин с 1 по 12, нитоген, тенасцин, тромбоспондин, фактор Виллебранда, остеопонтин, фибриноген, различные эластины, различные протеогликаны, различные кадгерины, десмоколин, десмоглеин, различные интегрины, Е-селектин, Р-селектин, L-селектин, суперсемейство иммуноглобулинов, матригель, поли-D-лизин, поли-L-лизин, хитин, хитозан, сефарозу, гиалуроновую кислоту, альгинатный гель, различные гидрогели, их фрагменты расщепления и т.п.
Примеры антибиотика, подлежащего добавлению в среду, включают сульфонамиды и их препараты, пенициллин, фенетициллин, метициллин, оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин, флуклоксициллин, нафциллин, ампициллин, пенициллин, амоксициллин, циклациллин, карбенициллин, тикарциллин, пиперациллин, азлоциллин, мезлоциллин, мециллинам, андиноциллин, цефалоспорин и его производное, оксолиновую кислоту, амифлоксацин, темафлоксацин, налидиксовую кислоту, пиромидовую кислоту, ципрофлоксацин, циноксацин, норфлоксацин, перфлоксацин, розаксацин, офлоксацин, эноксацин, пипемидовую кислоту, сульбактам, клазулановую кислоту, β-бромпенисиллановую кислоту, β-хлорпенисиллановую кислоту, 6-ацетилметиленпенисиллановую кислоту, сефоксазол, сультампициллин, адиноширин и сложный эфир формальдегида гидрата сульбактам, тазобактам, азтреонам, сульфазетен, изосульфазетин, норкардицин, м-карбоксифенил, фекилацетамидофосфоновую кислоту-метил, хлортетрациклик, окситетрациклин, тетрациклин, демеклоциклин, доксицилин, метациклин и миноциклин.
Когда конкретное соединение по настоящему изобретению добавляют в упомянутую выше среду, конкретное соединение растворяют или диспергируют в подходящем растворителе, когда его используют (когда его используют в качестве добавки в среду). После этого в среду можно добавлять добавки, так чтобы концентрация конкретного соединения в среде представляла собой, как подробно описано выше, концентрацию, при которой клетки и/или ткани могут быть однородно суспендированы (предпочтительно при выдерживании суспензии) по существу без увеличения вязкости жидкой среды, например, от 0,0005% до 1,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,001% до 0,4% (масса/объем), более предпочтительно от 0,005% до 0,1% (масса/объем), более предпочтительно от 0,005% до 0,05% (масса/объем). Например, в случае деацилированной геллановой камеди, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 1,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,003% до 0,5% (масса/объем), более предпочтительно от 0,005% до 0,1% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,01% до 0,03% (масса/объем). В другом аспекте в случае деацилированной геллановой камеди, ее добавляют в среду в концентрации от 0,0005% до 1,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,001% до 0,5% (масса/объем), более предпочтительно от 0,003% до 0,1% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,005% до 0,03% (масса/объем). В случае ксантановой смолы, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 5,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,01% до 1,0% (масса/объем), более предпочтительно от 0,05% до 0,5% (масса/объем) наиболее предпочтительно от 0,1% до 0,2% (масса/объем). В случае смеси κ-каррагенана и смолы плодоворожкового дерева, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 5,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,005% до 1,0% (масса/объем), более предпочтительно от 0,01% до 0,1%, наиболее предпочтительно от 0,03% до 0,05% (масса/объем). В случае смеси деацилированной геллановой камеди и диутановой камеди, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 1,0% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,005% до 0,01% (масса/объем). В случае смеси деацилированной геллановой камеди и метилцеллюлозы, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 1,0% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,005% до 0,2% (масса/объем). В случае смеси деацилированной геллановой камеди и смолы плодоворожкового дерева, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 1,0% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,01% до 0,1% (масса/объем). В случае смеси деацилированной геллановой камеди и альгината натрия, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 1,0% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,01% до 0,1% (масса/объем). В случае смеси деацилированной геллановой камеди и ксантановой смолы, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 1,0% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,01% до 0,1% (масса/объем). В случае смеси деацилированой геллановой камеди и κ-каррагенана, ее добавляют в среду в концентрации от 0,001% до 1,0% (масса/объем), наиболее предпочтительно от 0,01% до 0,1% (масса/объем). Концентрацию можно вычислять по следующей формуле.
Концентрация (%) = масса (г) конкретного соединения/объем (мл) композиции среды ×100.
В рамках настоящего изобретения, примеры подходящего растворителя, используемого для добавки в среду, включают, но не ограничиваются ими, водные растворители, такие как вода, диметилсульфоксид (DMSO), различные спирты (например, метанол, этанол, бутанол, пропанол, глицерин, пропиленгликоль, бутиленгликоль и т.п.) и т.п. В этом случае концентрация конкретного соединения составляет от 0,001% до 5,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,01% до 1,0% (масса/объем), более предпочтительно от 0,1% до 0,6% (масса/объем). Также возможно дополнительно добавлять добавку для увеличения эффекта конкретного соединения или для снижения используемой концентрации. В качестве примера такой добавки можно смешивать один или несколько типов гуаровой камеди, тамариндовой камеди, сложного эфира пропиленгликоля и альгиновой кислоты, смолы плодоворожкового дерева, гуммиарабика, камеди тары, тамариндовой камеди, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, агарозы, камеди семян тамаринда, полисахариды, такие как пуллулан и т.п. Также является возможной иммобилизация конкретного соединения на поверхности носителя или предоставление конкретного соединения внутри носителя во время культивирования. Конкретное соединение может иметь любую форму во время предоставления или хранения. Конкретное соединение может быть в форме составленного твердого вещества, такого как таблетка, пилюля, капсула, гранула, или жидкого вещества, такого как раствор, полученный растворением в соответствующем растворителе с использованием солюбилизатора или суспензии, или оно может быть связано с субстратом или единичным веществом. Примеры добавки, используемой для составления, включают консерванты, такие как сложные эфиры п-оксибензойной кислоты; эксципиенты, такие как лактоза, глюкоза, сахароза, маннит и т.п.; смазывающие вещества, такие как стеарат магния, тальк и т.п.; связующие вещества, такие как поливиниловый спирт, гидроксипропилцеллюлоза, желатин и т.п.; поверхностно-активные вещества, такие как сложные эфиры жирных кислот и т.п.; пластификаторы, такие как глицерин и т.п.; и т.п. Эти добавки не ограничиваются добавками, упомянутыми выше, и их можно свободно выбирать при условии, что они применимы для специалистов в данной области. При необходимости конкретное соединение по настоящему изобретению можно стерилизовать. Способ стерилизации конкретно не ограничен, и могут быть упомянуты, например, радиационная стерилизация, стерилизация газообразной окисью этилена, стерилизация автоклавированием, стерилизация фильтрованием и т.п. Когда намереваются проводить фильтрационную стерилизацию (далее иногда называемую стерилизацию фильтрованием), материал фильтрующей части конкретно не ограничен и, например, могут быть упомянуты стекловолокно, нейлон, PES (полиэфирсульфон), гидрофильный PVDF (поливинилиденфторид), смешанный с целлюлозой сложный эфир, целлюлозаацетат, политетрафторэтилен и т.п. Когда размер пор в фильтре конкретно не ограничен, предпочтительно он составляет от 0-1 мкм до 10 пм, более предпочтительно от 0,1 пм до 1 пм, наиболее предпочтительно от 0,1 пм до 0,5 пм. Обработку стерилизацией можно применять, когда конкретное соединение находится в твердом состоянии или в состоянии раствора.
Композицию среды по настоящему изобретению можно получать путем формирования упомянутой выше структуры в жидкой среде посредством добавления в жидкую среду раствора или дисперсии конкретного соединения, полученного, как описано выше. Поскольку среда, как правило, содержит достаточную концентрацию ионов металлов для сборки полимерных соединений через ионы или формирования трехмерной сети полимерных соединений, композицию среды по настоящему изобретению можно получать, просто добавляя раствор или дисперсию конкретного соединения по настоящему изобретению в жидкую среду. Альтернативно среду можно добавлять к добавке в среду (раствор или дисперсия конкретного соединения). Более того, композицию среды по настоящему изобретению также можно получать путем смешения конкретного соединения и компонента среды в водном растворителе (например, вода, включающая ионообменную воду, сверхчистую воду и т.п.). Примеры вариантов осуществления смешения включают, но не ограничиваются ими, (1) смешение жидкой среды и добавки в среду (раствор), (2) смешение жидкой среды и упомянутого выше полимерного соединения (твердое вещество, такое как порошок и т.д.), (3) смешение добавки в среду (раствор) и порошковой среды, (4) смешение порошковой среды и упомянутого выше полимерного соединения (твердое вещество, такое как порошок и т.д.) с водным растворителем, и т.п. Для предотвращения неоднородного распределения конкретного соединения в композиции среды по настоящему изобретению предпочтительным является вариант осуществления согласно (1) или (4), или (1), или (3).
Когда конкретное соединение растворяют в растворителе (например, водный растворитель, такой как вода, жидкая среда) или конкретное соединение и порошковую среду растворяют в растворителе, смесь предпочтительно нагревают для обеспечения растворения. Температура нагревания составляет, например, 80°С-130°С, предпочтительно 100°С-125°С (например, 121°С), при которой проводят стерилизацию нагреванием.
После нагревания полученный раствор конкретного соединения охлаждают до комнатной температуры. Упомянутую зыше структуру, состоящую из конкретного соединения, можно формировать путем добавления упомянутого выше иона металла в раствор (например, путем добавления раствора в жидкую среду). Альтернативно, упомянутую выше структуру, состоящую из конкретного соединения, также можно формировать путем нагревания (например, 80°С-130°С, предпочтительно 100°С-125°С (например, 121°С)) конкретного соединения, когда оно растворено в растворителе (например, водном растворителе, таком как вода и жидкая среда), содержащем упомянутый выше ион металла, и охлаждения полученного раствора до комнатной температуры.
Примеры способа получения композиции среды по настоящему изобретению представлены ниже, и их не следует истолковывать как ограничивающие. Конкретное соединение добавляют в ионообменную воду или сверхчистую воду. Затем смесь перемешивают при нагревании при температуре, при которой конкретное соединение может растворяться (например, не менее 60°С, не менее 80°С, не менее 90°С), чтобы обеспечить растворение до прозрачного состояния.
После растворения смеси позволяют остыть при перемешивании и стерилизуют (например, стерилизация автоклавированием при 121°С в течение 20 мин). После охлаждения до комнатной температуры в данную среду, подлежащую применению для стационарного культивирования, добавляют упомянутый выше стерилизованный водный раствор при перемешивании (например, смеситель-гомогенизатор и т.д.) для однорогого смешения раствора со средой. Способ смешения водного раствора и среды конкретно не ограничен, и он может представлять собой смешение вручную, такое как пипетирование и т.д., или смешение с помощью устройства, такого как магнитная мешалка, механическая мешалка, смеситель-гомогенизатор и гомогенизатор. Более того, после смешения композицию среды по настоящему изобретению можно фильтровать через фильтр. Размер поры фильтра для фильтрационной обработки составляет от 5 мкм до 100 мкм, предпочтительно от 5 мкм до 70 мкм, более предпочтительно от 10 мкм до 70 мкм.
Альтернативно порошковую среду и упомянутое выше полимерное соединение (твердое вещество, такое как порошок и т.д.) смешивают с водным растворителем, и смесь нагревают при упомянутой выше температуре с получением композиции среды по настоящему изобретению.
Например, когда получают деацилированную геллановую камедь, деацилированную геллановую камедь добавляют к ионообменной воде или сверхчистой воде до концентрации от 0,1% до 1% (масса/объем), предпочтительно от 0,2% до 0,5% (масса/объем), более предпочтительно от 0,3% до 0,4% (масса/объем). Более того, в другом аспекте, когда получают деацилированную геллановую камедь, деацилированную геллановую камедь добавляют в ионообменную воду или сверхчистую воду до концентрации от 0,1% до 1% (масса/объем), предпочтительно от 0,2% до 0,8% (масса/объем), более предпочтительно от 0,3% до 0,6% (масса/объем).
Затем упомянутую выше деацилированную геллановую камедь растворяют до прозрачного состояния путем перемешивания при нагревании до любой температуры при условии, что растворение является возможным, которая может составлять не менее 60°С, предпочтительно не менее 80°С, более предпочтительно не менее 90°С (например, 80-130°С). После растворения смеси позволяют остыть при перемешивании и стерилизуют автоклавированием при, например, 121°С в течение 20 мин. После охлаждения до комнатной температуры водный раствор добавляют, например, в среду DMEM/F-12, при перемешивании с помощью гомогенизатора и т.п.до желаемой конечной концентрации (например, когда конечная концентрация составляет 0,015%, соотношение 0,3% водный раствор:среда составляет 1:19), и смесь перемешивают до однородного состояния.
Способ смешения водного раствора и среды конкретно не ограничен, и он может представлять собой смешение вручную, такое как пипетирозание и т.д., или смешение с помощью устройства, такого как магнитная мешалка, механическая мешалка, смеситель-гомогенизатор и гомогенизатор. Более того, после смешения композицию среды по настоящему изобретению можно фильтровать через фильтр. Размер пор фильтра для применения для фильтрационной обработки составляет от 5 мкм до 100 мкм, предпочтительно от 5 мкм до 70 мкм, более предпочтительно от 10 мкм до 7 0 мкм.
Более того, после получения композиции среды по настоящему изобретению структуру можно осаждать обработкой центрифугированием.
Специалисты в данной области могут без труда выбрать форму и состояние клеток и/или тканей, подлежащих культивированию способом по настоящему изобретению. Их предпочтительные конкретные примеры включают, но конкретно не ограничиваются этим, состояние, в котором клетки и/или ткани по отдельности диспергированы в композиции среды, состояние, в котором клетки и/или ткани связаны с поверхностью носителя, состояние, в котором клетки и/или ткани заключены в носитель, состояние, в котором множество клеток объединены и формируют клеточные агрегаты (сферы), или состояние, в котором два или более типов клеток объединены и формируют клеточные агрегаты (сферы) и т.п. Более предпочтительными являются состояние, в котором клетки и/или ткани связаны с поверхностью носителя, состояние, в котором клетки и/или ткани заключены в носитель, состояние, в котором множество клеток объединены и формируют клеточные агрегаты (сферы), и состояние, в котором два или более типов клеток объединены и формируют клеточные агрегаты (сферы). Кроме того, предпочтительными являются состояние, в котором клетки и/или ткани связаны с поверхностью носителя, состояние, в котором множество клеток объединены и формируют клеточные агрегаты (сферы), и состояние, в котором два или более типов клеток объединены и формируют клеточные агрегаты (сферы). Среди этих состояний состояние с формированием клеточных агрегатов (сфер) может быть упомянуто в качестве наиболее предпочтительного состояния для культивирования способом по настоящему изобретению, поскольку воспроизводятся межклеточные взаимодействия и клеточные структуры, сходные со средой in vivo, можно проводить длительное культивирование с сохранением клеточной функции, и также выделение клеток является относительно простым.
В качестве носителя, являющегося подложкой для клеток и/или тканей на поверхности микроносителя и стеклянных гранул, состоящих из различных полимеров, могут быть упомянуты керамические гранулы, полистироловые гранулы, декстрановые гранулы и т.п. В качестве примеров полимеров можно использовать виниловую смолу, уретановую смолу, эпоксисмолу, полистирол, полиметилметакрилатный полиэфир, полиамид, полиимид, кремнийорганическую смолу, фенольную смолу, меламиновую смолу, смолу на основе мочевины, анилиновую смолу, иономерную смолу, поликарбонат, коллаген, декстран, желатин, целлюлозу, альгинаты, их смеси и т.п. Носитель можно покрывать соединением, которое усиливает клеточную адгезию или высвобождение вещества из клеток. В качестве примеров таких материалов покрытия могут быть упомянуты сополимеры моностеароилглицеридов и янтарной кислоты, сополимер D,L-лактида и гликолида, гиалуронат натрия, н-изопропилакриламид, коллаген с I по XIX, фибронектин, витронектин, ламинин с 1 по 12, нитоген, тенасцин, тромбоспондин, фактор Виллебранда, остеопонтин, фибриноген, различные эластины, различные протеогликаны, различные кадгерины, десмоколин, десмоглеин, различные интегрины, Е-селектин, Р-селектин, L-селектин, суперсемейство иммуноглобулинов, матригель, поли-D-лизин, поли-L-лизин, хитин, хитозан, сфеароза, гель на основе альгиновой кислоты, различные гидрогели, кроме того, фрагменты их расщепления и т.п. В рамках настоящего изобретения можно комбинировать два или более типов материалов покрытия. Более того, один или несколько типов полисахаридов, таких как гуаровая камедь, тамариндовая камедь, смола плодоворожкового дерева, гуммиарабик, камедь тары, тамариндовая камедь, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, агароза, камедь семян тамаринда, пуллулан и т.п. также можно смешивать со средой для применения для культивирозания носителя, поверхность которого является подложкой для клеток и/или тканей. Носитель также может содержать магнитный материал, например, феррит. Диаметр носителя составляет от нескольких десятков микрометров до нескольких сотен микрометров, более предпочтительно от 100 мкм до 200 мкм, и его удельная плотность предпочтительно близка к 1, более предпочтительно 0,9-1,2, в частности предпочтительно приблизительно 1,0. Примеры носителя включают, но не ограничиваются ими, Cytodex 1 (зарегистрированный торговый знак), Cytodex 3 (зарегистрированный торговый знак), Cytoline 1 (зарегистрированный торговый знак), Cytoline 2 (зарегистрированный торговый знак), Cytopore 1 (зарегистрированный торговый знак)-, Cytopore 2 (зарегистрированный торговый знак) (выше, GE Healthcare Life Sciences), Biosilon (зарегистрированный торговый знак) (NUNC), Cultispher-G (зарегистрированный торговый знак), Cultispher-S (зарегистрированный торговый знак) (выше, Thermo SCIENTIFIC), HILLEXCT (зарегистрированный торговый знак), ProNectinF-COATED (зарегистрированный торговый знак), и HILLEXII (зарегистрированный торговый знак) (Solo Hill Engineering), GEM (зарегистрированный торговый знак) (Global Eucariotic Microcarrier) и т.п. Носитель при необходимости можно стерилизовать. Способ стерилизации конкретно не ограничен и, например, могут быть упомянуты радиационная стерилизация, стерилизация газообразной окисью этилена, стерилизация автоклавированием, стерилизация сухим жаром и т.п. Способ культивирования клеток животных с использованием носителя конкретно не ограничен, и можно использовать способ культивирования с использованием обычной проточной многослойной культуральной емкости или заполняемой многослойной культуральной емкости и т.п. В данном случае, носитель, которого является подложкой для клеток и/или тканей и использование композиции среды, содержащей структуру конкретного соединения по настоящему изобретению, позволяет единообразное распределение даже без проведения встряхивания и т.п. В результате, рассматриваемые клетки и/или ткани можно культивировать без утраты клеточной функции.
Клетки и/или ткани, культивируемые этим способом, можно собирать путем проведения обработки центрифугированием и фильтрацией, пока клетки и/или ткани находятся на носителе, после культивирования. В этом случае, обработку
центрифугированием и фильтрацией можно проводить после добавления используемой жидкой среды. Например, но не ограничиваясь этим, гравитационное ускорение (G) при центрифугировании составляет от 50G до 1000G, более предпочтительно от 100G до 500G, и размер пор фильтра, используемого для фильтрационной обработки, составляет от 10 мкм до 100 мкм. Более того, культивируемые носители можно выделять с помощью магнитной силы путем инкапсулирования в носитель материала, обладающего магнетизмом, такого как феррит.Клетки и/или ткани, культивируемые этим способом, можно собирать путем высвобождения носителя с использованием различных хелатирующих агентов, обработки нагреванием или фермента.
Когда клетки и/или ткани заключены в носитель, в качестве носителя можно выбирать материалы, состоящие из различных полимеров. В качестве примеров таких полимеров могут быть упомянуты коллаген, желатин, альгинаты, хитозан, агароза, полигликолевая кислота, полимолочная кислота, фибриновый адгезив, сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, протеогликан, гликозаминогликан, губка, такая как полиуретановая пена, DseA-3D (зарегистрированный торговый знак), поли-N-замещенное акриламидное производное, поли-N-замещенное метакриламидное производное и их сополимеры, поливинилметиловый эфир, окись полипропилена, окись полиэтилена, чувствительные к температуре полимеры, такие как частично окисленный поливиниловый спирт, полиакриламид, поливиниловый спирт, метилцеллюлоза, нитроцеллюлоза, бутират целлюлозы, окись полиэтилена и гидрогели, такие как поли(2-гидроксиэтилметакрилат)/поликапролактон и т.п. Кроме того, можно получить носитель для заключения в него клеток с использованием двух или более типов из этих полимеров. Более того, помимо этих полимеров, носитель может иметь физиологически актизное вещество. В качестве примеров физиологически активного вещества могут быть упомянуты факторы роста клеток, индуцирующие дифференцировку факторы, факторы клеточной адгезии, антитела, ферменты, цитокины, гормоны, лектины, внеклеточные матриксы и т.п., а также может содержаться их множество. Примеры фактора клеточной адгезии включают сополимер моностеароилглицеридов и янтарной кислоты, сополимер D,L-лактида и гликолида, гиалуронат натрия, н-изопропилакриламид, коллаген с I по XIX, желатин, фибронектин, витронектин, ламинин с 1 по 12, нитоген, тенасцин, тромбоспондин, фактор Виллебранда, остеопонтин, фибриноген, различные эластины, различные протеогликаны, различные кадгерины, десмоколин, десмоглеин, различные интегрины, Е-селектин, Р-селектин, L-селектин, суперсемейство
иммуноглобулинов, матригель, поли-D-лизин, поли-L-лизин, хитин, хитозан, сефарозу, гель на основе альгиновой кислоты, различные гидрогели, кроме того, фрагменты их расщепления и т.п. В этом случае, можно комбинировать два или более типов факторов клеточной адгезии. Более того, также со средой, используемой для культивирования носителя, в который заключены клетки и/или ткани, можно смешивать один или несколько типов загустителей, таких как гуаровая камедь, тамариндовая камедь, альгиновая кислота, пропиленгликоль, смола плодоворожкового дерева, гуммиарабик, камедь тары, тамариндовая камедь, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, агароза, камедь семян тамаринда, пуллулан и т.п.
Способ заключения клеток и/или тканей в эти носители конкретно не ограничен и, например, можно использовать способ, включающий аспирирование смеси клеток и упомянутых выше полимеров с помощью шприца и капельное добавление их в среду через иглу для инъекций, размером 25G - 19G, или капельное добавление в среду с использованием микропипетки и т.п.
Размер подобного гранулам носителя, формирующегося в этом случае, определяется формой кончика инструмента, используемого для капельного добавления смеси клеток и упомянутых выше полимероз, и он предпочтительно составляет от нескольких десятков микрометров до нескольких тысяч микрометров, более предпочтительно от 100 мкм до 2000 мкм. Количество клеток, которые можно культивировать в подобном гранулам носителе, конкретно не ограничено, и его можно без ограничений выбирать в зависимости от размера гранул. Например, 5 миллионов клеток можно заключать в подобный гранулам носитель диаметром 2000 мкм. Клетки могут по отдельности диспергироваться в носителе или множество клеток могут объединяться с образованием клеточного агрегата. В данном случае, носитель, в котором заключены клетки и/или ткани, и использование композиции среды, содержащей структуру конкретного соединения по настоящему изобретению, позволяют однородно диспергирование даже без проведения перемешивания и т.п. В результате, рассматриваемые клетки и/или ткани можно культивировать без утраты функции клеток. Клетки и/или ткани, культивируемые этим способом, можно собирать путем проведения обработки центрифугированием и фильтрации, когда клетки и/или ткани заключены в носитель, после культивирования. В этом случае, обработку центрифугированием и фильтрацией можно проводить после добавления используемой жидкой среды. Например, но не ограничиваясь этим, гравитационное ускорение (G) при центрифугировании составляет от 50G до 1000G, более предпочтительно от 100G до 500G, и размер пор фильтра, используемого для обработки фильтрованием, составляет от 10 мкм до 100 мкм. Клетки и/или ткани, культивируемые этим способом, можно собирать путем диспергирования их посредством разрушения носителя обработкой с использованием различных хелатирующих агентов, нагревания, фермента и т.п.
Способ формирования клеточного агрегата (сферы) конкретно не ограничен, и его могут соответствующим образом выбирать специалисты в данной области. Их примеры включают способ с использованием контейнера, имеющего не адгезивную для клеток поверхность, способ висячей капли, способ вращающейся культуры, способ с трехмерным каркасом, способ центрифугирования, способ с использованием коагуляции с помощью электрического поля или магнитного поля и т.п. Например, с использованием способа, в котором используется контейнер, имеющей не адгезивную для клеток поверхность, рассматриваемые клетки культивируют в контейнере для культивирования, таком как миска и т.п., к которому применена поверхностная обработка для ингибирования клеточной адгезии, посредством чего может образовываться сфера. При использовании такого не адгезивного для клеток контейнера для культивирования, рассматриваемые клетки сначала собирают, получают их суспензию и высевают их в контейнер для проведения культивирования. Когда культивирование продолжается в течение приблизительно 1 недели, клетки самопроизвольно формируют сферу. В качестве не адгезивной для клеток поверхности, используемой в данном случае, можно использовать поверхность обычно используемого контейнера для культивирования, такого как миска и т.п., который покрыт веществом, ингибирующим адгезию клеток и т.п. Примеры такого вещества включают агарозу, агар, сополимер НЕМА (поли-(2-гидроксиэтилметакрилат)-2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолин) и другого мономера (например, бутилметакрилат и т.д.), поли(2-метоксиметилакрилат), поли-N-изопропилакриламид, гель Mebiol (зарегистрированный торговый знак) и т.п. Вещество не ограничивается ими, если отсутствует цитотоксичность.
В качестве способа формирования клеточного агрегата (сферы), также можно использовать способы, описанные в NATURE BIOTECHNOLOGY, VOL. 28, NO. 4, APRIL 2010, 361-366, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 689-700, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 572-579, Stem Cell Research, 7, 2011, 97-111, Stem Cell Rev and Rep, 6, 2010, 248-259 и т.п.
Кроме того, среда, используемая для культивирвоания сферы, также может содержать компонент, который стимулирует образование сферы или обеспечивает ее поддержание. Примеры компонента, имеющего такой эффект, включают диметилсульфоксид,
супероксиддисмутазу, церулоплазмин, каталазу, пероксидазу, L-аскорбиновую кислоту, фосфатный эфир L-аскорбиновой кислоты, токоферол, флавоноид, мочевую кислоту, билирубин, селенсодержащее соединение, трансферрин, ненасыщенную жирную кислоту, альбумин, теофиллин, форсколин, глюкагон, дибутирил сАМР и т.п. В качестве селенсодержащего соединения могут быть упомянуты ингибиторы ROCK,. такие как селенит натрия, селенат натрия, диметилселенид, селеноводород, селенометионин, Se-метилселеноцистеин, селеноцисатионин, селеноцистеин, селеногомоцистеин, аденозин-5'-трифосфорная кислота, Se-аденозилселенометионин, Y27632, фасудил (HA1077), Н-1152, Wf-536 и т.п. Для получения агрегатов рассматриваемых клеток, имеющих единообразный размер, также в не адгезивный для клеток контейнер для культивирования можно вносить множество углублений, имеющих такой же диаметр, как и агрегат рассматриваемых клеток. Когда эти углубления контактируют друг с другом или находятся в пределах диапазона диаметра рассматриваемого клеточного агрегата, и клетки высевают, посеянные клетки не образуют агрегаты между углублениями, а обязательно формируют клеточный агрегат размера, соответствующего объему углубления, таким образом, обеспечивая совокупность клеточных агрегатов, имеющих единообразный размер. Предпочтительной формой углубления в этом случае является полусфера или конус.
Альтернативно сфера также может образовываться на основе подложки, демонстрирующей клеточную адгезивность. Примеры такой подложки включают коллаген, полиротаксан, полимолочную кислоту (PLA), сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA), гидрогель и т.п.
Кроме того, сферу также можно формировать путем сокультивирования с фидерными клетками. В качестве фидерных клеток для обеспечения образования сферы можно использовать любые адгезивные клетки. Предпочтительно, является желательной фидерная клетка для конкретного типа клеток. Не ограничиваясь этим, например, когда образуется сфера из клеток, происходящих из печени или хряща, примеры фидерных клеток включают клетки COS-1 и сосудисто-эндотелиальные клетки в качестве предпочтительных типов клеток.
Более того, сферу также можно формировать с использованием композиции для культивирования, содержащей структуру из конкретного соединения по настоящему изобретению. В этом случае, конкретное соединение можно добавлять в среду, используемую для формирования сферы, так чтобы концентрация конкретного соединения представляла собой, как подробно описано выше, концентрацию, при которой клетки и/или ткани могут быть однородно суспендирозаны (предпочтительно с образованием стойкой суспензии) по существу без увеличения вязкости жидкой среды, например, от 0,0005% до 1,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,001% до 0,3% (масса/объем), более предпочтительно от 0,005% до 0,1% (масса/объем), более предпочтительно от 0,01% до 0,05% (масса/объем). В другом аспекте конкретное соединение можно добавлять в среду, используемую для формирования сферы, так чтобы концентрация конкретного соединения представляла собой, как подробно описано выше, концентрацию, при которой клетки и/или ткани могут быть однородно суспендированы (предпочтительно с образованием стойкой суспензии) по существу без увеличения вязкости жидкой среды, например, от 0,0005% до 1,0% (масса/объем), предпочтительно от 0,001% до 0,3% (масса/объем), более предпочтительно от 0,003% до 0,1% (масса/объем), более предпочтительно от 0,005% до 0,05% (масса/объем).
Сферу получают путем однородного диспергирования рассматриваемых клеток в среде, содержащей структуру из конкретного соединения, и культивированиях их путем выдерживания неподвижно в течение от 3 суток до 10 суток. Полученную сферу можно выделять обработкой центрифугированием и фильтрацией. Например, но не ограничиваясь этим, гравитационное ускорение (G) при центрифугировании составляет от 50G до 1000G, более предпочтительно от 100G до 500G, и размер пор фильтра, используемого для фильтрационной обработки, составляет от 10 мкм до 100 мкм. Кроме того, с использованием магнитных мелких частиц, поверхность которых покрыта антителом, которое специфически связывается с рассматриваемой клеткой, культивируемую сферу можно выделять с помощью магнитной силы. Примеры таких магнитных мелких частиц включают Dynabeads (изготавливаемые Veritas Ltd.), микрогранулы MACS (изготавливаемые Miltenyi Biotec), BioMag (изготавливаемые Techno Chemicals Corporation) и т.п.
Размер сферы варьирует в зависимости от типа клеток и периода культивирования и конкретно не ограничен. Когда сфера имеет сферическую форму или эллиптическую форму, ее диаметр составляет от 20 мкм до 1000 мкм, предпочтительно от 40 мкм до 500 мкм, более предпочтительно от 50 мкм до 300 мкм, наиболее предпочтительно от 8 0 мкм до 200 мкм.
Такая сфера может сохранять пролиферативную способность в течение не менее чем 10 суток, предпочтительно не менее чем 13 суток, более предпочтительно не менее чем 30 суток, путем продолжения выдерживания культуры. Кроме того, путем регулярного проведения во время выдерживания культуры механического разделения или обработки для формирования единичных клеток и коагуляции, пролиферативную способность можно поддерживать по существу бесконечно.
Контейнер для культивирования сферы конкретно не ограничен при условии, что он в общем позволяет культивирование клеток животных. Например, могут быть упомянуты колба, чашка, миска, чашка для культивирования тканей, чашка с множеством отделений, микропланшет, микролуночный планшет, мультипланшет, многолуночный планшет, предметное стекло с камерами, колба для культивирования клеток, колба для вращающейся культуры, миска, пробирка, лоток, мешок для культивирования, вращающаяся бутылка EZ SPHERE (изготавливаемые ASAHI GLASS CO., LTD.), планшет для плотного культивирования клеток Sumilon (изготавливаемый SUMITOMO BAKELITE) и т.п.
Среди этих контейнеров для культивирования, когда проводят оценку множества лекарственных средств против злокачественной опухоли, соединений, являющихся кандидатами для фармацевтического продукта, или фармацевтических продуктов, предпочтительно используют микропланшет, микролуночный планшет и мультипланшет и многолуночный планшет.Хотя форма дна лунок этих планшетов конкретно не ограничена, можно использовать лунки с плоским дном, U-образным дном и V-образным дном, и предпочтительно используют лунки с U-образным дном. Хотя материалы для этих инструментов для культивирования конкретно не ограничены, могут быть упомянуты, например, стекло, пластмассы, такие как пслизинилхлорид, полимеры целлюлозы, полистирол, полиметилметакрилат, поликарбонат, полисульфон, полиуретан, полиэфир, полиамид, полистирол, полипропилен и т.п.
Среда для применения для стойкого культивирования сфер может содержать фактор клеточной адгезии, и его примеры включают матригель, коллагеновый гель, желатин, поли-L-лизин, поли-D-лизин, ламинин и фибронектин. Также можно добавлять два или более типов этих факторов клеточной адгезии. Более того, среду для применения для культивирования сфер можно смешивать с загустителем, таким как гуаровая камедь, тамариндовая камедь, альгиновая кислота пропиленгликоль, смола плодоворожкового дерева, гуммиарабик, камедь тары, тамариндовая камедь, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, агароза, камедь семян тамаринда, пуллулан и т.п.
С использованием композиции среды, содержащей структуру конкретного соединения по настоящему изобретению, однородную дисперсию в среде можно получать даже без проведения встряхивания и т.п. В результате рассматриваемые клетки и/или ткани можно культивировать в качестве сферы без утраты клеточной функции.
Сферы после выдерживания, культивированные этим способом, можно собирать путем проведения центрифугирования и фильтрационной обработки после культивирования. В этом случае, обработку центрифугированием и фильтрацией можно проводить после добавления используемой жидкой среды. Например, но не ограничиваясь этим, гравитационное ускорение (G) при центрифугировании составляет от 50G до 1000G, более предпочтительно от 100G до 500G, и размер пор фильтра, используемого для фильтрационной обработки, составляет от 10 мкм до 100 мкм. Кроме того, с использованием магнитных мелких частиц, поверхность которых покрыта антителом, которое специфично связывается с рассматриваемой клеткой, культивируемую сферу можно выделять с помощью магнитной силы. Примеры таких магнитных мелких частиц включают Dynabeads (изготавливаемые Veritas Ltd.), микрогранулы MACS (изготавливаемые Miltenyi Biotec), BioMag (изготавливаемые Techno Chemicals Corporation) и т.п. Выделенную сферу можно диспергировать до единичных клеток с помощью дальнейшего разрушения обработкой различными хелатируюшими агентами, нагреванием, с помощью фильтра, фермента и т.п. Выделение клеток и замену композиции среды также можно осуществлять путем проведения центрифугирования, фильтрационной обработки или обработки для выделения с помощью магнетизма с использованием биореактора и автоматического инкубатора, способного проводить культивирование под механическим контролем и в закрытых условиях. В качестве способа выдерживания культуры происходящих из растений клеток и/или тканей, можно культивировать каллюс, который представляет собой агрегат недифференцированных клеток растений. Каллюс можно индуцировать способом, известным для каждого используемого вида растений. Например, поверхность части ткани дифференцированного растительного организма (например, корень, стебель, сегмент листа, семя, конус нарастаний, зародыш, пыльцу) стерилизуют, когда это необходимо, 70% спиртом, 1% раствором гипохлорита натрия и т.п., срез ткани подходящего размера (например, срез размером приблизительном 1 - приблизительно 5 квадратных мм) вырезают с помощью ножа и т.п. при необходимости, срез ткани высевают на индуцирующую каллюс среду, заранее стерилизованную путем асептического воздействия с использованием чистого рабочего места и т.п., и асептически культивируют в подходящих условиях. Каллюс, индуцированный таким образом, можно подвергать культивированию в жидкой культуре для массивной пролиферации, или его также можно поддерживать в качестве исходного штамма путем пассирования в среде для пассирования. Культивирование для пассирования можно проводить с использованием любой из жидкой среды и твердой среды.
Количество агрегата клеток растений, инокулируемого в начале стойкого культивирования с использованием композиции среды по настоящему изобретению, варьирует в зависимости от скорости пролиферации рассматриваемой клетки, способа культивирования (периодическая культура, периодическая культура с подпиткой, непрерывная культура и т.д.), периода культивирования и т.п. Например, когда культивируют агрегат клеток растений, такой как каллюс и т.п., его инокулируют в композицию среды по настоящему изобретению так, чтобы масса клеточного агрегата во злажном состоянии относительно композиции среды по настоящему изобретению составляла 4-8 (масса/объем (масс./об.))%, предпочтительно 5-7 (масс./об.)%. Размер частиц агрегата клеток растений во время культивирования составляет от 1 мм до 4 0 мм, предпочтительно от 3 мм до 2 0 мм, более предпочтительно от 5 мм до 15 мм. Как используют в рамках изобретения, "размер частиц" означает диаметр, когда, например, агрегат клеток растений имеет сферическую форму, длинный диаметр, когда он имеет эллиптическую форму, и максимальную возможную длину, когда он имеет другую форму.
2
Температура при культивировании клеток и/или тканей, как правило, составляет от 25 до 39°С, предпочтительно от 33 до 39°С, для клеток животных. Концентрация СО в атмосфере культуры обычно составляет от 4 до 10% по объему, и предпочтительной является концентрация от 4 до 6% по объему. Период культивирования обычно составляет от 3 до 35 суток, и он может быть без ограничений задан в зависимости от цели культивирования. Температура культуры для клеток растения обычно составляет от 20 до 30°С и, когда необходим свет, их можно культивировать в условиях освещения с освещенностью 2000-8000 люкс.
Хотя период культивирования обычно составляет от 3 до 70 суток, его можно без ограничений задавать в зависимости от задачи культивирования.
Когда клетки и/или ткани культивируют способом по настоящему изобретению, клетки и/или ткани, полученные по отдельности, добавляют в композицию для культивирования по настоящему изобретению и смешивают до однородной дисперсии. В этом случае способ смешения конкретно не ограничен и, например, могут быть упомянуты смешение вручную с использованием пипетирования и т.п., смешение с использованием устройства, такого как мешалка, встряхивающего смесителя, смесителя для микропланшетов, качающего устройства и т.п. После смешения культуральную среду можно выдерживать неподвижно или культуральную среду можно вращать, встряхивать или перемешивать при необходимости. Количество и частоту вращений можно соответствующим образом задавать в зависимости от задачи, поставленной специалистом в данной области. Когда композицию среды необходимо заменить во время периода стойкого культивирования, клетки и/или ткани и композицию среды отделяют центрифугированием или фильтрационной обработкой и к клеткам и/или тканям можно добавлять новую композицию среды. Альтернативно клетки и/или ткани соответствующим образом концентрируют центрифугированием или фильтрационной обработкой, и в концентрированную жидкость можно добавлять новую композицию среды.
Например, но не ограничиваясь этим, гравитационное ускорение (G) при центрифугировании составляет от 50G до 1000G, более предпочтительно от 100G до 500G, и размер пор фильтра, используемого для фильтрационной обработки, составляет от 10 мкм до 100 мкм. Кроме того, с использованием магнитных мелких частиц, поверхность которых покрыта антителом, которое специфически связывается с рассматриваемой клеткой, культивируемые клетки и/или ткани можно отделять с помощью магнитной силы. Примеры таких магнитных мелких частиц включают Dynabeads (изготавливаемые Veritas Ltd.), микрогранулы MACS (изготавливаемые Miltenyi Biotec), BioMag (изготавливаемые Techno Chemicals Corporation), магнитные микросферы (изготавливаемые Polysciences Inc.) и т.п. Замену композиции среды также можно проводить с использованием биореактора и автоматического инкубатора, способного осуществлять
культивирование под механическим контролем и в закрытых условиях.
Поскольку злокачественная клетка может эффективно пролиферировать при использовании способа по настоящему изобретению, композицию среды, содержащую конкретное соединение по настоящему изобретению, можно использовать для оценки действия лекарственного средства против злокачественной опухоли на злокачественную клетку. Например, когда выявляют лекарственное средство против злокачественной опухоли, которое ингибирует пролиферацию злокачественных клеток, злокачественную клетку и лекарственное средство против злокачественной опухоли сокультизируют и анализируют количество и тип клеток и изменения маркеров дифференцировки на клеточной поверхности и экспрессированных генов. В этом случае, с использованием композиции среды по настоящему изобретению количество клеток-мишеней, подлежащих анализу, можно эффективно увеличивать, а также их можно эффективно выделять. В рамках настоящего изобретения, в частности, добавку в среду для злокачественных клеток, которая содержит деацилированную геллановую камедь или ее соль, и композицию среды для злокачественных клеток, содержащую добавку, можно использовать для оценки пролиферации злокачественных клеток или активности против злокачественной опухоли и т.п. В этом случае концентрация деацилированной геллановой камеди или ее соли является такой, как упоминалось выше.
Хотя злокачественные клетки также пролиферируют при использовании диутановой камеди, более предпочтительной является деацилированная геллановая камедь, в частности, поскольку эффект на пролиферацию злокачественных клеток является более высоким, и ее можно использовать в низкой концентрации (упомянутая выше предпочтительная концентрация), которая в свою очередь препятствует образованию пузырей в культуральной среде и облегчает выделение злокачественных клеток.
Более конкретный способ скрининга лекарственного средства против злокачественной опухоли включает, например, способ, включающий (а) стадию культивирования злокачественной клетки в композиции среды по настоящему изобретению в присутствии исследуемого вещества и в его отсутствие, и (b) стадию анализа изменений пролиферации злокачественных клеток. Кроме того, способ может включать стадию выбора вещества, которое подавляет пролиферацию злокачественных клеток по сравнению с отсутствием исследуемого вещества, и/или стадию выделения злокачественных клеток. Изменения означают увеличение или снижение пролиферации злокачественных клеток. Для анализа можно проводить упомянутый выше способ, однако способ не ограничивается этим.
Когда оценивают активность лекарственного средства против злокачественной опухоли, условия культивирования, инструменты для культивирования, устройство для культивирования, тип среды, тип конкретного соединения, содержание конкретного соединения, тип добавки, содержание добавки, период культивирования, температуру культивирования, тип лекарственного средства против злокачественной опухоли, содержание лекарственного средства против злокачественной опухоли могут соответствующим образом выбирать специалисты в данной области из диапазона, описанного в настоящем описании. Клетку, которая пролиферировала или появилась путем культивирования, можно наблюдать с использованием стандартного микроскопа в соответствующей области. Когда измеряют количество клеток, можно использовать способ образования колоний, способ с кристаллическим фиолетовым, способ захвата тимидина, способ окрашивания трипановым синим, способ измерения АТР (аденозин-3-фосфорной кислоты), способ окрашивания бромидом 3-(4,5-диметилтиал-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ), способ окрашивания WST-1 (зарегистрированный торговый знак), способ окрашивания WST-8 (зарегистрированный торговый знак), проточную цитометрию, способ с использованием автоматического устройства для измерения количества клеток и т.п. Среди них наиболее предпочтительно используют способ окрашивания WST-8 (зарегистрированный торговый знак). Когда оценивают цитотоксичность, можно использовать способ измерения активности лактатдегидрогеназы (LDH), способ CytoTox-ONE (зарегистрированный торговый знак) и т.п. Альтернативно культивируемые клетки окрашивают специфическим антителом, маркер дифференцировки на клеточной поверхности выявляют с помощью ELISA или проточной цитометрии, и можно наблюдать эффект лекарственного средства против злокачественной опухоли на пролиферацию и апоптоз. Более того, ген, который демонстрирует отличающуюся экспрессию вследствие борьбы со злокачественной опухолью, можно выявлять путем экстракции ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота) из культивируемых клеток и обнаружения с использованием саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинга, ОТ-ПЦР и т.п.
Поскольку способ по настоящему изобретению поддерживает выживаемость и функцию гепатоцитов, композицию среды, содержащую конкретное соединение по настоящему изобретению, можно использовать для оценки различных эффектов фармацевтического продукта или вещества, являющегося кандидатом для лекарственного средства, на гепатоциты. Например, когда оценивают эффект, токсичности вещества, являющегося кандидатом для лекарственного средства, гепатоциты и оцениваемое исследуемое вещество сокультивируют и анализируют количество и тип клеток, и изменение маркера дифференцировки на клеточной поверхности и экспрессируемого гена. В этом случае, с использованием композиции среды по настоящему изобретению можно поддерживать выживаемость и функцию анализируемых гепатоцитов-мишеней, а также можно эффективно выделять гепатоциты.
В качестве способа скрининга вещества, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, который действует на гепатоциты, может быть упомянут способ, включающий (а) стадию культивирования гепатоцитов в присутствии исследуемого вещества и в его отсутствие в композиции среды по настоящему изобретению, и (b) стадию анализа изменений физиологической функции гепатоцитов.
В качестве способа оценки эффективности или токсичности вещества, являющегося кандидатом для фармацевтического продукта, который действует на гепатоциты, могут быть упомянуты способ, включающий (а) стадию культивирования гепатоцитов в присутствии исследуемого вещества и в его отсутствие в композиции среды по настоящему изобретению, и (b) стадию анализа изменений физиологической функции гепатоцитов. Кроме того, эти способы могут включать стадию выбора вещества, которое подавляет или увеличивает физиологическую функцию гепатоцитов, по сравнению с функцией гепатоцитов в отсутствие исследуемого вещества и/или стадию выделения гепатоцитов. Изменения относятся к увеличению или уменьшению физиологической функции гепатоцитов (например, пролиферации клеток печени, активности фермента цитохрома Р450 и т.п.). Увеличение физиологической функции гепатоцитов можно оценивать, чтобы показать низкую эффективность или токсичность, и снижение физиологической функции гепатоцитов можно оценивать, чтобы показать высокую эффективность или токсичность, и т.п.
Когда оценивают активность вещества, являющегося кандидатом для лекарственного средства, 'специалисты в данной области могут соответствующим образом выбирать условия культивирования, инструменты для культивирования, устройство для культизирования, тип среды, тип конкретного соединения, содержание конкретного соединения, тип добавки, содержание добавки, период культивирования, температуру культивирования, тип и содержание фармацевтического продукта или вещества, являющегося кандидатом для лекарственного средства, и т.п. из диапазона, описанного в настоящем описании. Клетку, которую поддерживали или которая появилась путем культивирования, можно наблюдать с использованием стандартного микроскопа в данной области. Когда измеряют количество клеток, можно использовать способ образования колоний, способ с кристаллическим фиолетовым, способ с захватом тимидина, способ окрашивания трипановым синим, способ измерения с АТР (аденозин-3-фосфорная кислота), способ окрашивания бромидом 3-(4,5-диметилтиал-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ), способ окрашивания WST-1 (зарегистрированный торговый знак), способ окрашивания WST-8 (зарегистрированный торговый знак), проточную цитометрию, способ с использованием автоматического устройства для измерения количества клеток и т.п. Среди них, наиболее предпочтительно можно использовать способ окрашивания WST-8 (зарегистрированный торговый знак). Когда оценивают цитотоксичность, можно использовать способ измерения активности лактатдегидрогеназы (LDH), способ CytoTox-ONE (зарегистрированный торговый знак) и т.п. Альтернативно культивируемую клетку окрашивают специфическим антителом, маркер дифференцировки на клеточной поверхности выявляют с помощью ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или проточной цитометрии, и можно наблюдать эффект фармацевтического продукта или вещества, являющегося кандидатом для лекарственного средства, на пролиферацию и апоптоз. Более того, ген, который продемонстрировал отличающуюся экспрессию благодаря фармацевтическому продукту или веществу, являющемуся кандидатом для лекарственного средства, может быть обнаружен путем экстракции ДНК (дезоксирибснуклеиковая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота) из культивируемых клеток и выявления с помощью саузерн-блоттинга, нозерн-блоттинга, ОТ-ПЦР и т.п. Более того, белок, который продемонстрировал отличающуюся экспрессию из-за фармацевтического продукта или вещества, являющегося кандидатом для лекарственного средства, можно обнаруживать с помощью ELISA, вестерн-блоттинга, проточной цитометрии и т.п. Более того, ферментативную активность цитохрома Р450 можно выявлять путем измерения активности фермента в отношении конвертирования структуры субстрата способом радиоактивных изотопов, способом высокоэффективной жидкостной хроматографии, люминесцентным способом, способом развития окраски и т.п.
Примеры
Настоящее изобретение более подробно пояснено ниже посредством конкретного описания примеров анализа и экспериментальных примеров для композиции среды по настоящему изобретению в качестве примеров; однако настоящее изобретение не ограничивается ими.
Пример анализа 1: измерение вязкости и исследование суспендирования клеток для среды, содержащей деацилированную геллановую камедь
Получение и измерение вязкости среды, содержащей деацилированную геллановую камедь
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в чистой воде до 0,4% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этому водному раствору позволяли остыть до комнатной температуры при перемешивании и стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. 2-кратную концентрацию среды DMEM/F-12 (изготавливаемая Aldrich, 50 мл) и воду для стерилизации (47,5 мл) помещали в 300-мл высокий стакан при перемешивании с помощью смесителя-гомогенизатора (3000 об/мин) при комнатной температуре, добавляли водный раствор деацилированной геллановой камеди (2,5 мл) и смесь непрерывно перемешизали в течение 1 мин с получением композиции среды с деацилированной геллановой камедью в конечной концентрации 0,01%. Аналогичным образом получали композиции среды, в которые добавлен водный раствор деацилированной геллановой камеди до конечных концентраций 0,02, 0,03 и 0,05% (масс./об.). Вязкость композиций среды измеряли с использованием вискозиметра Е-типа (изготавливаемый Toki Sangyo Co., Ltd., вискозиметр TVE-22L, стандартный ротор 1°34'×R24) в условиях 37°С при 100 об/мин в течение 5 мин.
Исследование суспендирования клеток для среды, содержащей с деацилированную геллановую камедь
2
2
Клетки линии клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) суспендировали в среде ЕМЕМ, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), в количестве 250000 клеток/мл, суспензию (10 мл) высевали на EZ SPHERE (изготавливаемые ASAHI GLASS CO., LTD.) и культивировали в инкубаторе с СО (5% СО) в течение 3 суток. Полученную суспензию (10 мл) сфер (диаметр 100-200 мкм) центрифугировали (200G, 5 мин) чтобы обеспечить осаждение сфер, и супернатант извлекали с получением суспензии сфер (1,0 мл). Затем среду, содержащую деацилированную геллановую камедь, полученную, как описано выше, помещали в 1,5 мл Eppendorf по 1,0 мл, а затем добавляли суспензию сфер с клетками HeLa (10 мкл). Клеточный агрегат диспергировали постукиванием, инкубировали при 37°С, а затем через 1 час визуально наблюдали диспергированное состояние клеток.
Сравнительный пример. Получение среды, содержащей метилцеллюлозу и коллаген
Получение среды, содержащей метилцеллюлозу
Среду DMEM/F-12 (изготавливаемая Aldrich, 100 мл) помещали в 200-мл грушевидную колбу и добавляли метилцеллюлозу (М0387, изготавливаемая Aldrich, 0,1 г). Смесь перемешивали при охлаждении на ледяной бане для растворения метилцеллюлозы. С использованием этого раствора получали композиции среды, в которые был добавлен водный раствор метилцеллюлозы в конечной концентрации 0,1, 0,3, 0,6 или 1,0% (масс./об.).
Получение содержащей коллаген среды
10-кратную концентрацию среды DMEM/F-12 (изготавливаемая Aldrich, 1 мл), буфер для разбавления (изготавливаемый Nitta Gelatin Inc., 1 мл) и чистую воду (1,5 мл) добавляли к 0,3% клеточному матриксу типа I-A (изготавливаемая Nitta Gelatin Inc., 6,5 мл), и смесь перемешивали на льду с получением 0,2% содержащей коллаген среды. Аналогично получали композиции среды, в которые добавлен коллаген в конечной концентрации 0,01, 0,05, 0,1 или 0,2% (масс./об.).
Композиции среды, полученные, как описано выше, подвергали испытанию суспендирования сфер клеток HeLa и измерению вязкости аналогично тому, как и в случае среды, содержащей деацилированную геллановую камедь. Вязкость 1,0% (масс./об.) метилцеллюлозы измеряли при 50 об./мин. вследствие диапазона измерения устройства.
Экспериментальные примеры
2
2
2
Несмотря на то, что применимость композиции среды по настоящему изобретению для культивирования клеток конкретно пояснена в следующих ниже экспериментальных примерах, настоящее изобретение не ограничивается только ими. Концентрация CO (%) в инкубаторе с CO показана в качестве % от объема CO в атмосфере. PBS означает фосфатно-солевой буфер (изготавливаемый Sigma Aldrich Japan), и FBS означает эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая Biological Industries). Кроме того (масс./об.) означает массу на объем.
Экспериментальный пример 1: исследование пролиферации клеток посредством диспергирования единичных клеток
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду IMDM (изготавливаемая Gibco), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку и 10 нг/мл тромбопоэтина (изготавливаемый WAKO). Затем, клеточную линию лейкоза человека UT7/TPO высевали на композицию среды, в которую была добавлена упомянутая выше деацилированная геллановая камедь, в количестве 20000 клеток/мл, и распределяли в микропланшет с 6 ячейками с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated) в количестве 5 мл/ячейка. Аналогично, линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) высевали в количестве 20000 клеток/мл на композицию среды, полученную путем добавления 0,015% (масс./об.) деацилированной геллановой камеди (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) в среду ЕМЕМ, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и композицию распределяли в микропланшет с 6 ячейками с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated) в количестве 5 мл/ячейка. Суспензии клеток культивировали при неподвижном выдерживании в инкубаторе с СО (5% СО) в течение 3 суток. После этого, часть культуральной среды извлекали, добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation), и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью цитометра для клеток крови (изготавливаемый ERMA INC.).
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению, клетки UT7/TP0 и клетки HeLa могут однородно культивироваться в суспендированном состоянии и эффективно пролиферировать в композиции среды. Количества клеток UT7/TPO и клеток HeLa после статической суспензионной культуры в течение 3 суток представлены в таблице 4.
Экспериментальный пример 2: испытание пролиферации клеток путем культивирования сферы, сформированной из клеточной линии
2
2
2
2
Линию клеток рака печени человека HepG2 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) суспендировали в среде DMEM, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO) в количестве 250000 клеток/мл, и эту суспензию (10 мл) высевали на EZ SPHERE (изготавливаемые ASAHI GLASS CO., LTD.) и культивировали в течение 7 суток в инкубаторе с СО (5% СО). Аналогично, линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемые DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) суспендировали в среде ЕМЕМ, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAK0) в количестве 250000 клеток/мл, и эту суспензию (10 мл) высевали на EZ SPHERE (изготавливаемые ASAHI GLASS CO., LTD.) и культивировали в течение 7 суток в инкубаторе с CO (5% CO). Суспензию (2,5 мл) сфер (диаметр 100-200 мкм) каждой клеточной линии, полученную в этом эксперименте, центрифугировали (200G, 5 мин), чтобы обеспечить осаждение сфер, и супернатант удаляли. Затем к сферам (приблизительно 800 сфер) добавляли упомянутую выше среду (10 мл), чтобы суспендировать их, и суспензию переносили в пробирку с плоским дном (изготавливаемая ВМ Equipment Co., Ltd.). Аналогично, с использованием композиции среды, полученной добавлением 0,015% (масс./об.) деацилированной геллановой камеди (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) в упомянутую выше среду, получали суспензию сфер и переносили ее в пробирку с плоским дном (изготавливаемая ВМ Equipment Co., Ltd.). Композицию среды, в которую была добавлена 0,015% (масс./об.) деацилированная геллановая камедь, приготавливали, сначала путем суспендирования деацилированной геллановой камеди (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс/об.), растворения ее перемешиванием при нагревании до 90°С, стерилизацией этого водного раствора при 121°С в течение 20 мин в автоклаве, и добавления раствора в разведении 1/20 в среду DMEM, содержащую,10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку.
2
2
После статического культивирования упомянутой выше суспензии сфер в инкубаторе с CO (5% CO) при 37°С в течение 3 суток добавляли двукратный объем среды. Смесь центрифугировали (200G, 5 мин), чтобы обеспечить осаждение сфер, и супернатант удаляли. В этот момент часть сфер извлекали и их форму наблюдали с помощью оптического микроскопа (изготавливаемый OLMPUS, CK30-F100). Затем выделенные сферы промывали один раз PBS (10 мл), добавляли 1 мл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAKO) и смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Добавляли упомянутую выше среду (9 мл) и клетки собирали центрифугированием (200G, 5 мин). К части полученной суспензии клеток (2 мл) добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation), и количество жизнеспособных клеток и погибших клеток определяли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.).
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению сферы клеток HepG2 и клеток HeLa могли культивироваться в суспендированном состоянии, и клетки эффективно пролиферировали в композиции среды. Более того, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению демонстрирует небольшой уровень погибших клеток по сравнению с существующей средой, когда клетки подвергали пролиферации, и имеет лучший эффект стимуляции пролиферации клеток. Сферы, культивированные в существующей среде, оседали на дно культурального контейнера. Более того, форму культивируемых сфер наблюдали с помощью оптического микроскопа. В результате композиция среды по настоящему изобретению не продемонстрировала ассоциации сфер, в то время как в существующей среде наблюдали ассоциацию сфер.
Относительное количество клеток HepG2 и клеток HeLa представлено в таблице 5, где количество клеток, культивируемых в среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, составляет 1. Кроме того, относительный уровень погибших клеток представлен в таблице 6, где уровень погибших, клеток, культивируемых в среде, свободной от деацилированной геллановой камеди (количество погибших клеток/количество жизнеспособных клеток), составляет 0. Суспендированное состояние сфер клеток HepG2 и клеток HeLa, культивированных в композиции среды по настоящему изобретению, показано на фиг. 1 и фиг. 2, соответственно. Более того, форма сферы культивируемых клеток HeLa представлена на фиг. 3.
Экспериментальный пример 3: испытание пролиферации клеток для плюрипотентных стволовых клеток человека в прикрепляющейся культуре люрипотентные стволовые клетки человека (hPSC) обычно подвергают пролиферации и поддерживают на фидерном слое или культуральной чашке, покрытой матригелем, в условиях культивирования на плоскости, позволяющих прикрепление. Для оценки токсичности деацилированной геллановой камеди в отношении hPSC, деацилированную геллановую камедь добавляли в концентрации от 0,000% до 0,020% (масс./об.) в среду mTeSR (изготавливаемая STEM CELL Technologies) в условиях культивирования на плоскости с использованием матригеля (изготавливаемый Becton, Dickinson and Company), и исследовали влияние на пролиферацию hPSC. В этом случае, штамм Kyoto University 253G1 культивировали в качестве клеток iPS человека и штамм Kyoto University KhES-1 культивировали в качестве клеточной линии ES человека. Композицию среды, в которую была добавлена упомянутая выше концентрация деацилированной геллановой камеди, приготавливали, сначала путем суспендирования деацилированной геллановой камеди (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), растворения ее путем перемешивания при 90°С, стерилизации водного раствора при 121°С в течение 20 мин в автоклаве, и добавления раствора в среду mTeSR в данной концентрации.
В результате, количество клеток на том же уровне, что и в обычной среде mTeSR, может быть получено как для клеток iPS человека, так и для клеток ES человека, с использованием среды, в которую добавлена деацилированная геллановая камедь, и токсичность деацилированной геллановой камеди не была выявлена. Результаты представлены на фиг.4. Количество клеток после культивирования, как показано на фиг. 4 представляет собой относительную величину количества клеток, которое было получено путем посева hPSC в покрытую матригелем культуральную чашку и культивирования клеток в среде mTeSR, содержащей деацилированную геллановую камедь, в течение 5 суток, к количеству клеток в среде mTeSR, свободной от деацилированной геллановой камеди, принятому за 1.
2
2
2
2
Экспериментальный пример 4: испытание деацилированной геллановой камеди в отношении ингибирования осаждения в культуре сфер плюрипотентных стволовых клеток человека hPSC формируют сферу на культуральной чашке с низкой способностью к адгезии, такой как культуральная чашка Петри и т.п. Например, сферу можно получать любыми способами, описанными в NATURE BIOTECHNOLOGY, VOL. 28, NO. 4, APRIL 2010, 361-366, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 689-700, NATURE PROTOCOLS VOL. 6, NO. 5, 2011, 572-579, Stem Cell Research, 7, 2011, 97-111, Stem Cell Rev and Rep, 6, 2010, 248-259. Штамм hPSC (штамм Kyoto University 253G1 или штамм Kyoto University KhES-1), поддерживаемый на фидерных, клетках (фибробласты плода мыши) выделяли, фидерные клетки извлекали путем естественного оседания, и hPSC ресуспендировали в среде mTeSR, в которую был добавлен ингибитор киназы Rho Y-27 632 (10 мкМ). Затем колонию hPSC, имеющую данный размер, инокулировали в культуральную чашку Петри (изготавливаемую BD Falcon) и культивировали в инкубаторе с CO (5% CO) при 37°С для формирования сферы. Среду заменяли свободной от Y-27632 средой mTeSR на 1 сутки и 3 сутки после пассирования, и клетки пассировали в содержащей Y-27632 среде mTeSR каждые 5 суток. Полученные таким образом сферы с hPSC (4 сутки культивирования) суспендировали в композиции среды, полученной добавлением деацилированной геллановой камеди в среду mTeSR (полученную аналогично тому, как в примере 3) до концентрации от 0,000% до 0,020% (масс./об.) и переносили в кювету. Кювету оставляли стоять в инкубаторе с СО (5% CO) при 37°С в течение ночи и исследовали эффект деацилированной геллановой камеди в отношении ингибирования оседания. Результаты представлены на фиг. 5. Как показано на фиг. 5, трехмерное суспендированное состояние сфер можно было поддерживать в среде путем добавления деацилированной геллановой камеди при всех диапазонах концентраций. С другой стороны, было обнаружено, что в существующей среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, сферы оседали на нижней поверхности контейнера для культивирования и не могли поддерживаться в суспендированном состоянии. Кроме того, эффекты деацилированной геллановой камеди были общими для клеток iPS человека и клеток ES человека. Описанные выше результаты демонстрируют, что деацилированная геллановая камедь может поддерживать сферы hPSC в суспендированном состоянии.
Экспериментальный пример 5: испытание пролиферации клеток в культуре сфер плюрипотентных стволовых клеток человека
2
Проводили исследование того, могут ли hPSC культивироваться в пробирке в состоянии трехмерной суспензии. Сферы hPSC (от 600 до 800/3 мл), полученные и пассированные аналогично тому, как описано в экспериментальном примере 4, высевали на среду mTeSR, содержащую деацилированную геллановую камедь в концентрации 0,000%, ,0,015% или 0,020% (масс./об.), в 5-мл полистироловых пробирках (изготавливаемые BD Falcon), так чтобы все пробирки имели одинаковое количество сфер, и культивировали в инкубаторе с С02 (5% CO) при 37°С в течение 5 суток. Среду заменяли на 1 сутки и 3 сутки после пассирования путем добавления 3-кратного объема среды DMEM/F-12 (изготавливаемая Sigma Ltd.) в культуральную среду, осаждения сфер центрифугированием (100G, 3 мин) и добавления к сферам новой среды. На 5 сутки добавляли равное количество среды DMEM/F-12 (изготавливаемая Sigma Ltd.), все сферы выделяли центрифугированием (100G, 3 мин) и диссоциировали на единичные клетки раствором трипсин-EDTA (изготавливаемый Invitrogen), и количество клеток определяли с помощью NucleoCounter (изготавливаемый Chemometec). В результате, в среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, сферы оседали на дне пробирки, образуя крупный клеточный агрегат, и не демонстрировали пролиферации. Однако в среде, содержащей деацилированную геллановую камедь в количестве 0,015% или 0,020% (масс./об.), размер сферы увеличивался в трехмерном суспендированном состоянии, и была выявлена пролиферация клеток, о чем свидетельствовало приблизительно в 10 раз большее количество клеток, полученное на 5 сутки, относительно посеянного количества клеток, принятого за 1. Результаты представлены на фиг. 6. На фиг. 6 сравнительно представлено количество клеток на 5 сутки относительно посеянного количества клеток, принятого за 1. В случае клеток человека ES, в полистироловой пробирке можно было фактически получить 3000000 клеток на 3 мл на 5 сутки культивирования (что соответствует приблизительно 1000000000 клеток в 1000 мл среды).
Экспериментальный пример 6: испытание для подтверждения поддержания недифференцированного состояния в культуре сфер плюрипотентных стволовых клеток человека
В клетках сфер с hPSC, подвергнутых суспензионной статической культуре в среде mTeSR, содержащей деацилированную геллановую камедь в концентрации 0,015% или 0,020% (масс./об.), исследовали поддержание недифференцированного состояние с помощью проточного анализа.- В полистироловой пробирке в сферическом состоянии клетки ES человека (KhES-1) пассировали 3 раза, клетки iPS человека (253G1) пассировали 4 раза. Клетки выделяли, окрашивали антителом SSEA4 (#МАВ4304, изготавливаемое Millipore) и антителом TRA-1-60 (#МАВ4360, изготавливаемое Millipore), которые являются маркерами клеточной поверхности, демонстрирующими недифференцированное состояние hPSC, и уровень положительного окрашивания клеток антителом оценивали с использованием FACSCantoII (изготавливаемый Becton, Dickinson and Company). Результаты представлены на фиг. 7. Как показано на фиг. 7, как на А: клетки iPS человека (253G1), так и на В: клетки ES человека (KhES-1), не менее 90% клеток, подвергнутых суспензионному статическому культивированию в среде с добавкой, содержащей деацилированную геллановую камедь, экспрессировали маркер плюрипотентных стволовых клеток, подобно клеткам, поддерживаемым на матригеле. В качестве отрицательного контроля проводили окрашивание только вторичным антителом. Из вышесказанного, было установлено, что как в клетках iPS человека, так и в клетках ES человека, сферы hPSC, подвергнутые суспензионному статическому культивированию в среде с добавкой, содержащей деацилированную геллановую камедь, сохраняют недифференцированное состояние.
Экспериментальный пример 7: анализ свойств сфер, культивируемых с плюрипотентными стволовыми клетками - 1
С использованием среды mTeSR (изготавливаемая STEM Cell Technologies), содержащей 0,020% (масс./об.) деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.), полученной способом, сходным со способом, описанным в экспериментальном примере 3, сферы клеток iPS человека (253G1) или клеток ES человека (KhES-1) культивировали для пассирования всего 9 раз согласно способу, описанному в экспериментальном примере 4, сферы на 1 сутки пассирования каждого типа клеток высевали на фибробласты эмбриона мыши. На следующие сутки их обрабатывали 300 мкг/мл тимидина (изготавливаемый Sigma Aldrich) в течение ночи. Затем их обрабатывали 100 нг/мл колцемида (изготавливаемый Nacalai Tesque), диссоциировали на отдельные клетки с помощью раствора трипсин-EDTA и подвергали гипотонической обработке 0,075 М KCl. После этого клетки фиксировали фиксажом Сагпоу (метанол : уксусная кислота = 3:1).
Кариотип фиксированных клеток анализировали способом Q-бэндинга (эксперименты, проведенные в Chromosome Science Labo. Ltd.). В результате, было подтверждено, что как клетки iPS человека, так и клетки ES человека, подвергнутые суспензионной статической культуре в композиции среды по настоящему изобретению, сохраняли нормальный кариотип. Результаты представлены на фиг. 8.
Экспериментальный пример 8: анализ свойств культивируемых сфер плюрипотентных стволовых клеток человека - 2
С использованием среды mTeSR (изготавливаемая STEM Cell Technologies), содержащей 0,020% (масс./об.) деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.), полученной способом, сходным со способом, описанным в экспериментальном примере 3, сферы клеток iPS человека (253G1) культивировали для пассирования всего 21-22 раз каждые 5 суток, согласно способу, описанному в экспериментальном примере 4, и сферы после культивирования фиксировали с помощью 4% (масс./об.) параформальдегида (изготавливаемый Nacalai Tesque). Их погружали в PBS, содержащий 20% сахарозу1 (масс./об.) и заключали в средство для заливки для замораживания (соединение О.С.Т, изготавливаемое Japanese cherry Fihetek Japan Co., Ltd.). Срезы толщиной 12 мкм получали в криостате (изготавливаемый Thermo Scientific) и окрашивали антителами NANOG (#4903, изготавливаемое Cell Signaling) и ОСТ3/4 (#sc-5279, изготавливаемое Santa Cruz) и SSEA4 (#МАВ4304, изготавливаемое Millipore), демонстрирующими недифференцированное состояние hPSC. В результате, было установлено, что клетки, подвергнутые суспензионному статическому культивированию в композиции среды, содержащей деацилированную геллановую камедь, экспрессировали маркер недифференцированного состояния плюрипотентных стволовых клеток. Как упоминалось выше, было установлено, что сферы клеток iPS человека, подвергнутые суспензионному статическому культивированию в течение не менее чем 100 суток в композиции среды, содержащей деацилированную геллановую камедь, сохраняли недифференцированное состояние. Результаты представлены на фиг.9.
Экспериментальный пример 9: испытание пролиферации клеток путем культивирования клеточной линии, прикрепленной к микроносителю
Микроноситель Cytodex (зарегистрированный торговый знак) 1 (изготавливаемый GE Healthcare Life Sciences) суспендировали в PBS в концентрации 0,02 г/мл, и суспензию выдерживали в течение ночи. Супернатант отбрасывали и микроноситель промывали два раза свежим PBS. После этого, его вновь суспендировали в PBS в концентрации 0,02 г/мл, и стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. Затем этот микроноситель промывали два раза 70% этанолом и три раза PBS, и суспендировали в среде DMEM, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAK0) в концентрации 0,02 г/мл. С использованием этой суспензии микроносителя получали среду DMEM (содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, 20 мл), содержащую 120 мг Cytodex (зарегистрированный торговый знак) 1 и 4000000 клеток HepG2, и суспензию клеток культивировали в стакане, заранее обработанном средством для нанесения кремнийорганического покрытия (изготавливаемое AGC TECHNO GLASS Co., Ltd.) при перемешивании (100 об/мин) мешалкой при 37°С в течение 6 ч. В этот момент времени адгезию клеток HepG2 на микроноситель подтверждали с помощью микроскопа. Затем микроноситель с прикрепленными к нему клетками промывали два раза средой DMEM, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и суспендировали в той же среде (3 мл).
Упомянутую выше суспензию микроносителя (300 мкл) добавляли в каждую из среды DMEM (20 мл), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и композиции среды, полученной добавлением к этой среде 0,015% (масс./об.) деацилированной геллановой камеди (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.), и смеси культивировали при 37°С в течение 3 суток. В случае культуральной среды, свободной от деацилированной геллановой камеди, смеси культивировали при перемешивании (100 об/мин) мешалкой. После культивирования состояние прикрепления клеток к микроносителю подтверждали с помощью микроскопа и микроноситель осаждали центрифугированием (200G, 5 мин). Этот микроноситель промывали PBS (10 мл), добавляли 1 мл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAKO) и смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Более того, добавляли среду DMEM (9 мл), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и микроноситель извлекали с помощью сита для клеток (изготавливаемое BD Falcon, размер ячейки 7 0 мкм). Клетки выделяли из полученного фильтрата центрифугированием (200G, 5 мин). Клетки суспендировали в среде (500 мкл), к их части добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation), и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.). В результате культуральная среда, свободная от деацилированной геллановой камеди, содержала 123000 клеток, а культуральная среда, содержащая деацилированную геллановую камедь, содержала 1320000 клеток. Как упоминалось выше, было подтверждено, что среда, содержащая структуру конкретного соединения по настоящему изобретению, является лучшей с точки зрения эффекта стимуляции пролиферации клеток по сравнению с существующей средой, даже когда клетки культивируют с использованием микроносителя. Состояние прикрепления клеток HepG2 после культивирования в течение 3 суток на микроносителе с использованием композиции среды, содержащей структуру конкретного соединения по настоящему изобретению, показано на фиг. 10.
Экспериментальный пример 10: испытание суспензии клеток с использованием сфер, происходящих из клеточной линии
Ксантановую смолу (KELTROL CG, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до концентрации 1% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. С использованием этого водного раствора получали композиции среды DMEM/F-12, имеющие конечную концентрацию ксантановой смолы, составляющую 0,1, 0,15 или 0,2% (масс./об.). Кроме того, получали водный раствор, содержащий 0,2% (масс./об.) κ-каррагенан (GENUGEL WR-80-J, изготавливаемый SANSHO Co., Ltd.) и 0,2% (масс./об.) смолу плодоворожкового дерева (GENUGUM RL-200-J, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) путем нагревания при 90°С. С использованием этого водного раствора получали композиции среды DMEM/F-12 (изготавливаемая Sigma Ltd.), содержащие 0,03, 0,04. или 0,05% (масс./об.) κ-каррагенана и смолы плодоворожкового дерева.
Аналогично экспериментальному примеру 2, формировали сферы клеток HeLa и несколько десятков сфер добавляли в каждую среду (1 мл), полученную, как описано выше, смесь выдерживали неподвижно при 37°С в течение 1 часа и суспендированное состояние клеток сфер визуально исследовали. В результате, было подтверждено, что сферы клеток HeLa сохраняли суспензионное состояние в любой из упомянутых выше композиций среды. Более того, было подтверждено, что добавление равного количества среды в суспензию клеток и их центрифугирование (от 300 до 400G, 5 мин) обеспечивает осаждение и выделение сфер клеток HeLa. Суспензионное состояние сфер клеток HeLa, культивированных в композиции среды по настоящему изобретению, в каждом случае представлено на фиг. 11. Кроме того, вязкость, измеренная аналогично тому, как в примере анализа 1, представлена в таблицах 7 и 8.
Экспериментальный пример 11: испытание суспензии клеток с использованием композиции среды, отфильтрованной через фильтр
Композицию среды DMEM/F-12, содержащую 0,015%
деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготовленная SANSHO Co., Ltd.) приготавливали в том же буфере, что и в экспериментальном примере 2. Затем эту композицию среды (1 мл) фильтровали через 70-мкм фильтр и 40-мкм фильтр (изготавливаемый BD Falcon), 30-мкм фильтр и 20-мкм фильтр (изготавливаемый AS ONE Corporation), 10-мкм фильтр (изготавливаемый Partec) и 5-мкм фильтр, 1,2-мкм фильтр, 0,45-мкм фильтр и 0,2-мкм фильтр (изготавливаемые Sartorius Stedim Japan). В упомянутые выше фильтраты добавляли сферы клеток HepG2, полученные аналогично тому, как описано в экспериментальном примере 2, в количестве приблизительно несколько десятков сфер и выдерживали при 37°С в течение 1 часа, и суспендированное состояние клеток сфер визуально исследовали. В результате было подтверждено, что сферы клеток HepG2 поддерживались в суспендированном состоянии в композиции среды, прошедшей через фильтр с размером пор не менее чем 10 мкм, но оседали в композиции среды, прошедшей через фильтр с размером пор менее 5 мкм. Более того, было подтверждено, что центрифугирование при комнатной температуре, 300G, 5 мин, или добавление равного количества среды и центрифугирование при комнатной температуре, 200G, 5 мин, сфер клеток HepG2 в суспендированном состоянии обеспечивает осаждение и выделение сфер.
Экспериментальный пример 12: испытание формирования сфер
Аналогично тому, как и в экспериментальном примере 2, получали композицию среды ЕМЕМ (изготавливаемая WAKO), содержащую 0,01% деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) и 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку. Затем добавляли клетки HeLa до количества 1000 клеток/мл и распределяли в 24-луночный планшет (изготавливаемый Corning Incorporated). Этот планшет подвергали суспензионному культивированию путем неподвижного выдерживания при 37°С в течение 9 суток, и формирование сфер подтверждали с помощью микроскопа. Более того, формировали осадок сфер клеток обработкой центрифугированием (300G, 5 мин) и промывали один раз PBS (5 мл). Добавляли 100 мкл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAKO) и смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. После этого к полученной суспензии клеток (100 мкл) добавляли среду ЕМЕМ (100 мкл), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, к части клеточной суспензии добавляли раствор трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation) в том же количестве, и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (manufactured by ERMA INC.). В результате, было подтверждено, что количество клеток HeLa увеличилось до 170000 клеток/мл. Сфера клеток HeLa, образованная в композиции среды по настоящему изобретению, представлена на фиг. 12.
Экспериментальный пример 13: наблюдение структуры под оптическим микроскопом
Деацилированную геллановую камедь. (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в чистой воде до 0,4% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Среду DMEM/F-12 (изготавливаемая Aldrich, 95 мл) в 2-кратной концентрации помещали в 300-мл высокий стакан, добавляли водный раствор деацилированной геллановой камеди (5 мл) при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре, и смесь перемешивали как есть в течение 5 мин с получением композиции среды, содержащей деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,02%. Более того, композицию среды перемешивали с помощью смесителя-гомогенизатора (3000 об/мин) в течение 5 мин. Полученную композицию среды наблюдали с помощью оптического микроскопа (KEYENCE Corporation, BIOREVO BZ-9000). Наблюдаемая структура представлена на фиг.13.
Экспериментальный пример 14: получение путем смешения и нагревания порошковой среды и DAG
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd., 20 мг) и среду DMEM/F-12 (изготавливаемая Life Technologies, 1,58 г) помещали в 200-мл колбу Эрленмейера, и в нее наливали чистую воду (100 мл). Смесь стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве с получением композиции среды DMEM/F-12 с концентрацией деацилированной геллановой камеди 0,02%. К полученной среде добавляли декстрановые гранулы Cytodex 1 (размер 200 мкм, изготавливаемые GE Healthcare Life Sciences), и диспергированное состояние гранул подтверждали путем визуального наблюдения. Для оценки суспендированное состояние представляет собой о, частичное оседание/диспергированное состояние представляет собой Δ, и осажденное состояние представляет собой х. Результаты представлены в таблице 9.
Экспериментальный пример 15: получение композиции среды, содержащей полисахариды
Ксантановую смолу (KELTROL CG, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в чистой воде до концентрации 0,5% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Аналогично приготавливали 0,5% (масс./об.) водные растворы альгината натрия (Duck alginic acid NSPM7 изготавливаемая FOOD CHEMIFA Co., Ltd.), смолы плодоворожкового дерева (GENUGUM RL-200-J, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.), к-каррагенана (GENUGEL WR-80-J, изготавливаемый SANSHO Co., Ltd.) и диутановой камеди (KELCO CRETE DG-F, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.).
Этот водный раствор и 0,2 или 0,1% (масс./об.) раствор деацилированной геллановой камеди и среду DMEM/F-12 в 10-кратной концентрации смешивали и смесь нагревали при 8 0°С в течение 30 мин, позволяли ей остыть до комнатной температуры и добавляли 7,5% водный раствор гидрокарбоната натрия с получением композиций среды DMEM/F-12, содержащих деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,01, 0,02% (масс./об.) и другой полисахарид в конечной концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,4% (масс./об.). Кроме того, среду, содержащую деацилированную геллановую камедь, приготавливали, как упоминалось выше, и добавляли порошок метилцеллюлозы (сР4 00, изготавливаемый WAKO). Смесь перемешивали на ледяной бане для растворения метилцеллюлозы с получением композиций среды DMEM/F-12, содержащих деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,01, 0,02% (масс./об.) и другую метилцеллюлозу в конечной концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,4% (масс./об.).
Полистироловые гранулы (размер 500-600 мкм, изготавливаемые Polysciences Inc.) добавляли в среду, полученную, как описано выше, и диспергированное состояние гранул подтверждали путем визуального наблюдения. Для оценки суспендированное состояние представляет собой о, частичное оседание/диспергированное состояние представляет собой Δ, и осажденное состояние представляет собой х. Результаты представлены в таблице 10.
Экспериментальный пример 16: измерение вязкости композиции среды, содержащей полисахариды
Способом, сходным со способом для смеси полисахаридов согласно экспериментальному примеру 15, получали среды DMEM/F-12, содержащие деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,005, 0,01% (масс./об.) и другой полисахарид. Конечная концентрация полисахарида составляла 0,1% (масс./об.) для ксантановой смолы, альгината натрия, смолы плодоворожкового дерева, 0,2% (масс./об.) для метилцеллюлозы и 0,05% (масс./об.) для κ-каррагенана и диутановой камеди. Состояние каждой композиции среды и вязкость, измеренная аналогично тому, как измеряли в примере анализа 1, представлены в таблицах 11-16.
Экспериментальный пример 17: Получение композиции среды с измененной концентрацией иона двух валентного металла
С использованием DMEM/F-12 (D9785, изготавливаемая Aldrich), свободной от хлорида кальция, сульфата магния и хлорида магния и аналогично тому, как в способе согласно экспериментальному примеру 14, получали композицию среды DMEM/F-12, содержащую 0,02% (масс./об.) деацилированную геллановую камедь. Получали композицию среды DMEM/F-12, в которую добавлены хлорид кальция или сульфат магния и хлорид магния так, чтобы конечная концентрация находилась на определенном уровне в среде DMEM/F-12. Ввиду определенного состава среды DMEM/F-1, конечная концентрация в каждом случае составляла 0,116 г/л для хлорида кальция, 0,049 г/л для сульфата магния и 0,061 г/л для хлорида магния. К полученной композиции среды добавляли декстрановые гранулы Cytodex 1 (изготавливаемые GE Healthcare Life Sciences) и дисперсное состояние гранул подтверждали через 2 суток путем визуального наблюдения. Для оценки суспендированное состояние представляет собой о, состояние частичного оседания/дисперсии представляет собой Δ, и состояние оседание представляет собой х. Результаты представлены в таблице 17.
Экспериментальный пример 18: получение композиции среды, в которую позднее добавляют ион двухвалентного металла
Солевой раствор получали путем растворения 0,1% (масс./об.) раствора деацилированной геллановой камеди, 5-кратной концентрации среды DMEM/F-12 (не содержащая хлорида кальция, сульфата магния и хлорида магния, D9785, изготавливаемая Aldrich), хлорида кальция (1167 мг), сульфата магния (489 мг) и хлорида магния (287 мг) в чистой воде (300 мл). Водный раствор деацилированной геллановой камеди и чистую воду помещали в 200-мл высокий стакан и раствор перемешивали при 200 об/мин с использованием перемешивающей лопасти якорного типа. Добавляли раствор А, который представляет собой смесь раствора среды и воды, и смесь прямо перемешивали в течение 10 мин. Затем добавляли солевой раствор, и далее добавляли 7,5% водный раствор гидрокарбоната натрия (1,6 мл) с получением композиций среды DMEM/F-12, содержащих деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,02%. Смешиваемое количество каждого раствора представлено в таблице. Через 4 ч после приготовления 6 композиций среды подвергали оценке дисперсии полистироловых гранул и Cytodex1. Результаты представлены в таблицах 18, 19.
Экспериментальный пример 19: получение различных композиций среды
Приготавливали 0,1% (масс./об.) раствор деацилированной геллановой камеди и раствор среды, имеющий высокую концентрацию. В качестве раствора среды, имеющего высокую концентрацию, приготавливали MEM, имеющую 10-кратную концентрацию (М02 68, изготавливаемая Aldrich), RPMI-164 0, имеющую 10-кратную концентрацию (R6504, изготавливаемая Aldrich) и DMEM, имеющую 5-кратную концентрацию (среда, соответствующая среде, стерилизованной путем стерилизации высокого давления, изготавливаемая Nissui). 0,1% (масс./об.) раствор деацилированной геллановой камеди, каждую среду с высокой концентрацией и чистую воду для доведения концентрации смешивали и смесь нагревали при 80°С в течение 30 мин. Смеси позволяли охладиться до комнатной температуры и добавляли 7,5% водный раствор гидрокарбоната натрия с получением композиций среды, содержащих деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,01, 0,02, 0,03% (масс./об.).
9 приготовленных композиций среды оценивали в отношении суспензионного и дисперсного состояния полистироловых гранул и декстрановых гранул Cytodex1, где суспендированное состояние представляет собой о, частично осажденное/диспергированное состояние представляет собой Δ, и осажденное состояние представляет собой х. Результаты представлены в таблицах 20, 21.
Экспериментальный пример 20: измерение распределения размера частиц в композиции среды, содержащей деацилированную геллановую камедь
В соответствии с примером анализа 1, приготавливали композицию среды DMEM/F-12, содержащую 0,038% (масс./об.) деацилированную геллановую камедь. Среду получали путем перемешивания при 3000 об/мин и 6000 об/мин в течение 1 мин с помощью смесителя-гомогенизатора. Распределение размера частиц в композиции среды определяли с помощью Beckman Instruments Coulter, Inc. Multisizer 4 (устройство для точного определения размера частиц от Coulter principle) и определяли срединный размер (d50) для стандартного распределения размера частиц по объему. Результаты представлены в таблице 22.
Экспериментальный пример 21: фосфорилирование деацилированной геллановой камеди
-1
-1
-1
Деацилгеллановую камедь (1 г) и чистую воду (40 мл) смешивали в 100-мл стеклянной пробирке, и смесь нагревали при 100°С в течение 30 мин с получением суспензии. К этой суспензии добавляли водный раствор фосфорной кислоты (85%, 1 г) и смесь нагревали при температуре кипячения с обратным холодильником в течение 5 ч. После этого ей позволяли остыть до комнатной температуры при перемешивании в течение 12 ч, и полученную белую суспензию выливали в 99% этанол (500 мл). Полученное плавающее белое твердое вещество собирали фильтрацией и сушили с получением светло-коричневого твердого вещества (0,4 г) в качестве фосфорилированного вещества деацилгеллановой камеди. Внесение фосфатной группы подтверждали с помощью инфракрасного спектроскопического анализа с преобразованием Фурье (устройство, изготавливаемое SHIMADZU CORPORATION, IR-Prestage 21) (1700 см; Р-ОН, 1296 см, 1265 см; Р=0). Светло-коричневое твердое вещество разлагали с помощью устройства для расщепления с помощью микроволнового нагревания (ETHOS ТС, изготавливаемое Milestone General) и содержание атома фосфора измеряли с помощью эмиссионного спектроскопического анализатора с индуктивно-связанной плазмой (ICP-OES) (SPS5520, изготавливаемый SII NanoTechnology). Результат составлял 3,5 масс. % (n-2).
Экспериментальный пример 22: получение композиции среды, содержащей фосфорилированную деацилированную геллановую камедь
Произвольное количество фосфорилированной деацилированной геллановой камеди (30 мг) и среду DMEM/F-12 (изготавливаемая Life Technologies, 1,56 г) помещали в 200-мл колбу Эрленмейера и в нее выливали чистую воду (100 мл). Смесь стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве с получением композиции среды DMEM/F-12, имеющей концентрацию деацилированной геллановой камеди 0,03%. К полученной среде добавляли декстрановые гранулы Cytodex1 (изготавливаемые GE Healthcare Life Sciences) и дисперсное состояние гранул подтверждали путем визуального наблюдения. Дисперсное состояние гранул было выявлено при концентрации фосфорилированной деацилированной геллановой камеди 0,03% (масс./об.).
Экспериментальный пример 2 3: получение композиции среды, содержащей деацилированную геллановую камедь
Водный раствор деацилированной геллановой камеди и раствор среды смешивали в количествах, представленных в нижеследующей таблице, с получением композиции среды DMEM/F-12, имеющей концентрацию деацилированной геллановой камеди 0,02%, и оценивали дисперсное состояние полистироловых гранул (размер 500-600 мкм, изготавливаемые Polysciences Inc.). Результаты представлены в таблицах 23 и 24. При выдерживании в течение 1 суток или более стироловые гранулы были диспергированы во всех условиях.
"Порошковую среду DMEM/F12/чистую воду" добавляли к "деацилированной геллановой камеди/чистой воде".
"Деацилированную геллановую камедь/чистую воду добавляли к "порошковой среде DMEM/F12/чистой воде".
Экспериментальный пример 24: получение композиции среды с использованием фильтра
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до конечной концентрации 0,02 или 0,04% (масс./об.), и растворяли путем нагревания при 90°С в течение 30 мин или при 121°С в течение 20 мин. Более того, этот водный раствор (100 мл) фильтровали с помощью фильтра с мембраной из полиэфирсульфона, имеющего размер пор 0,22 мкм (изготавливаемый Corning Incorporated). Затем этот фильтрат смешивали с от 2- до 4-кратной концентрацией среды DMEM/F-12 (изготавливаемая Sigma Aldrich) и смесь встряхивали с помощью мягкого смесителя (SI-24, изготавливаемый TAITEC Co., Ltd.) в течение-1 часа с получением композиций среды, содержащих деацилированную геллановую камедь в конечных концентрациях 0,01 или 0,015% (масс./об.) (например, 25 мл каждого из 0,02% (масс./об.) водного раствора деацилированной геллановой камеди и среды DMEM/F-12, имеющей 2-кратную концентрацию, смешивали для получения 0,01% (масс./об.) композиции среды с деацилированной геллановой камедью (50 мл)). Способом, сходным со способом, описанном в экспериментальном примере 2, формировали сферы клеток HepG2 и несколько десятков сфер добавляли в среду (1 мл), полученную, как описано выше, выдерживали при 37°С, и суспендированное состояние клеток сфер визуально исследовали через 1 ч и одну ночь. В результате, было подтверждено, что сферы клеток HepG2 сохранялись в суспендированном состоянии во всей упомянутой выше композиции среды. Более того, добавляли двукратный объем среды и суспензию клеток центрифугировали (500G, 5 мин). Было подтверждено, что сферы клеток HepG2 оседали, и клетки можно было выделить из всех композиций среды. Дисперсное состояние сфер после одной ночи подтверждали путем визуального наблюдения и оценивали, где суспензионное и дисперсное состояние представляют собой о, частично осажденное/диспергированное состояние представляет собой Δ, и осажденное состояние представляет собой х. Результаты оценки представлены в таблице 25.
Экспериментальный пример 25: испытание пролиферации клеток путем культивирования происходящих из клеточной линии сфер
2
2
Клетки линии клеток почки эмбриона человека HEK293 (изготавливаемые DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) суспендировали в среде ЕМЕМ, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO) в количестве 250000 клеток/мл, и эту суспензию (10 мл) высевали на EZ SPHERE (изготавливаемые ASAHI GLASS CO., LTD.) и культивировали в течение 2 суток в инкубаторе с CO (5% CO). Суспензию (10 мл) сфер (диаметр 100-2 00 мкм) из клеток HEK293, полученную таким образом, центрифугировали (200G, 5 мин), чтобы обеспечить осаждение сфер, супернатант удаляли и сферы суспендировали в 1 мл. Затем к суспензии сфер (200 мкл, количество клеток приблизительно 200000) добавляли среду (10 мл), чтобы суспендировать их, и суспензию переносили в пробирку с плоским дном (изготавливаемая ВМ Equipment Co., Ltd.). Аналогично, с использованием композиции среды, полученной добавлением 0,015% (масс./об.) деацилированной геллановой камеди (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) в упомянутую выше среду, получали суспензию сфер и переносили ее в пробирку с плоским дном, (изготавливаемая ВМ Equipment Co., Ltd.). Приготавливали композицию среды, в которую была добавлена 0,015% (масс./об.) деацилированная геллановая камедь, сначала путем суспендирования деацилированной геллановой камеди (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об), растворения ее путем перемешивания при нагревании до 90°С, стерилизации этого водного раствора при 121°С в течение 20 мин в автоклаве, и добавления этого раствора в разведении 1/20 в среду ЕМЕМ, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку.
2
2
После статического культ.ивирования упомянутой выше суспензии сфер в инкубаторе с CO (5% CO) при 37°С в течение 5 суток добавляли двукратный объем среды. Смесь центрифугировали (500G, 5 мин), чтобы обеспечить осаждение сфер, и супернатант удаляли. Затем выделенные сферы промывали один раз PBS (10 мл), добавляли 1 мл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAKO), и смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Добавляли упомянутую выше среду (9 мл) и клетки собирали центрифугированием (200G, 5 мин). К части полученной суспензии клеток (2 мл) добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation), и количество жизнеспособных клеток и погибших клеток определяли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.). В качестве контроля получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, и проводили сходный эксперимент.
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению сферы клеток HEK293 могут культивироваться в суспендированном состоянии, и клетки могут эффективно пролиферировать в композиции среды. Более того, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению демонстрирует небольшой уровень погибших клеток по сравнению с композицией среды, свободной от деацилированной геллановой камеди, когда клетки подвергают пролиферации, и имеет лучший эффект стимуляции пролиферации клеток. Сферы, культивируемые в существующей среде, оседали на дне контейнера для культивирования.
Относительное количество клеток HEK293 представлено в таблице 26, где количество клеток, культивируемых в среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, равно 1. Кроме того, относительный уровень погибших клеток представлен в таблице 27, где уровень погибших клеток, культивируемых в среде, свободной от деацилированной геллановой камеди (количество погибших клеток/количество жизнеспособных клеток), составляет 1.
Экспериментальный пример 2 6: испытание пролиферации клеток путем культивирования клеток насекомых
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) к среде Sf-900 (зарегистрированный торговый знак) III SFM (изготавливаемая Gibco). Затем происходящие из Spodoptera frugiperda клетки Sf9 (изготавливаемые Gibco) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 100000 клеток/мл, и распределяли в лунки 24-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated) в количестве 1 мл/лунка. Суспензии клеток культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе при 25°С в течение 5 суток. После этого часть культуральной среды извлекали, добавляли то же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation) и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA. INC.). В качестве контроля получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, и подвергали ее сходному эксперименту.
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению клетки Sf9 могут однородно культивироваться в суспендированном состоянии, и могут пролиферировать в композиции среды. Более того, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению является лучшей с точки зрения эффекта стимуляции пролиферации клеток, когда клетки подвергают пролиферации, по сравнению с композицией среды, свободной от деацилированной геллановой камеди. Количество клеток Sf9 после суспензионного статического культивирования в течение 5 суток представлено в таблице 28.
Экспериментальный пример 27: испытание пролиферации клеток путем культивирования CD34-положительных клеток
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс/об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при (121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс/об.), 20 нг/мл тромбопоэтина (изготавливаемый WAKO) и 100 нг/мл фактора стволовых клеток (SCF, изготавливаемый WAKO) в среду StemSpan SFEM (изготавливаемая StemCell Technologies). Затем происходящие из пуповинной крови человека CD34-положительные клетки (изготавливаемые Lonza) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, до 10000 клеток/мл, и распределяли в лунки 24-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated) в количестве 1 мл/лунка. Клеточные суспензии подвергали статическому культивированию при 37°С в течение 7 суток в инкубаторе с СО (5% СО). После этого часть культуральной среды извлекали, добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation) и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.). В культуральную среду добавляли 3-кратный объем среды и смесь центрифугировали (500G, 5 мин), чтобы обеспечить осаждение всех клеток. В качестве контроля получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, и подвергали сходному эксперименту.
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению, CD34-положительные клетки могут однородно культивироваться в суспендированном состоянии и могут пролиферировать в композиции среды. Более того, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению демонстрирует эффект стимуляции пролиферации клеток на уровне, равном или превышающем уровень для существующих сред без деацилированной геллановой камеди. Кроме того, было подтверждено, что центрифугирование приводит к осаждению клеток и клетки могут быть выделены. Относительное количество клеток, пролиферированных из CD34-положительных клеток после суспензионной статической культуры в течение 7 суток, когда количество клеток, культивируемых в среде, свободной от деацилированной геллановой камеди равно 1, представлено в таблице 29.
Экспериментальный пример 28: испытание образования сфер
Аналогично тому, как в экспериментальном примере 2, приготавливали композицию среды DMEM (изготавливаемая WAKO), содержащую 0,015% деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) и 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку. Затем добавляли клетки HepG2 до концентрации 15000 клеток/мл и распределяли по 1 мл в 24-луночный планшет (изготавливаемый Corning Incorporated). Этот планшет подвергали суспензионному культивированию путем неподвижного выдерживания при 37°С в течение 7 суток и образование сфер подтверждали с помощью микроскопа. Более того, формировали осадок клеток сферы путем обработки центрифугированием (400G, 5 мин) и промывали один раз посредством PBS (5 мл). Добавляли 100 мкл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAKO) и смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. После этого к полученной суспензии клеток (100 мкл) добавляли среду DMEM (100 мкл), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, к части суспензии клеток добавляли раствор трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation) в том же количестве, и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.). В результате, было подтверждено, что клетки HepG2 формировали сферу в композиции среды по настоящему изобретению, и их количество возросло до 80800 клеток/мл. Сферы клеток HepG2, образовавшиеся в композиции среды по настоящему изобретению, представлены на фиг.14.
Экспериментальный пример 29: испытание суспензии клеток с использованием происходящих из клеточной линии сфер
Диутановую камедь (KELKO-CRETE DG, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до концентрации 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.С использованием этого водного раствора приготавливали композиции среды DMEM/F-12, имеющей конечную концентрацию диутановой камеди 0,1% (масс./об.). Кроме того, приготавливали водный раствор, содержащий 0,5% (масс./об.) геллановую камедь природного типа (KELCO gel НТ, изготавливаемая San-Ei Gen F.F.I., Inc.) путем нагревания при 90°С. С использованием водного раствора получали композиции среды DMEM/F-12 (изготавливаемая Sigma Ltd.), содержащие 0,05 или 0,1% (масс./об.) геллановой камеди природного типа.
Аналогично тому, как и в экспериментальном примере 2, получали сферы клеток HeLa и в каждую из сред (1 мл), полученных, как описано выше, добавляли несколько десятков сфер, смесь выдерживали неподвижно при 37°С в течение 1 часа, и суспендированное состояние клеток сфер визуально исследовали. В результате, было подтверждено, что сферы клеток HeLa сохраняли суспендированное состояние в любой из упомянутых выше композиций среды. Более того, было подтверждено, что центрифугирование (200G, 5 мин) суспензии клеток, содержащей 0,1% (масс./об.) диутановую камедь, обеспечивает осаждение и выделение сфер клеток HeLa.
Экспериментальный пример 30: испытание суспензии клеток с использованием магнитных гранул, обладающих способностью к клеточной адгезии - 1
2
2
Суспензию GEM (зарегистрированный торговый знак, Global Эукариотический Microcarrier, изготавливаемые GL Sciences Inc.), покрытых ламинином или фибронектином, распределяли по 500 мкл в микропробирки объемом 1,5 мл (изготавливаемые Eppendorf), GEM собирали из упомянутой выше суспензии GEM с использованием магнитного стенда (ТА4 8 99N12, изготавливаемый TAMAGAWA SEIKI CO., LTD.) и растворитель удаляли. Более того, GEM промывали два раза средой DMEM (изготавливаемая WAKO, 500 мкл), содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и суспендировали в той же среде (500 мкл). Эту суспензию распределяли в планшет для плотного культивирования клеток Sumilon 24F (изготавливаемый SUMITOMO BAKELITE), который представляет.собой планшет с низкой адгезией клеток, в количестве 50 мкл на 1 лунку. Затем добавляли клетки HepG2, приготовленные отдельно, в количестве 250000 клеток/мл, и конечный объем доводили той же средой до 500 мкл. Суспензию клеток перемешивали вручную и планшет выдерживали в течение ночи в инкубаторе с CO (5% CO). После подтверждения адгезии клеток на GEM с помощью микроскопа, суспензию клеток переносили в 1,5-мл микропробирку (изготавливаемая Eppendorf), GEM со связанными с ними клетками собирали с помощью упомянутого выше магнитного стенда и супернатант удаляли.
2
2
Способом, сходным со способом, описанным в экспериментальном примере 2, получали композицию среды DMEM (изготавливаемая WAKO), содержащую 0,015% деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) и 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку. Каждую из этой композиции среды или описанной выше среды, свободной от деацилированной геллановой камеди добавляли по 1 мл к GEM (покрытые ламинином или фибронектином) со связанными с ними клетками HepG2, полученные, как описано выше, суспендировали и переносили в планшет для плотного культивирования клеток Sumilon 2 4F. Затем, этот планшет выдерживали в течение 6 суток в инкубаторе с CO (5% CO), и среду для культивирования клеток переносили в 1,5-мл микропробирку (изготавливаемая Eppendorf), GEM со связанными с ними клетками собирали путем осторожного пипетирования на упомянутом выше магнитном стенде и супернатант удаляли. GEM промывали один раз PBS (1 мл), добавляли 200 мкл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAKO) и смесь инкубировали при 37°С в течение 10 мин. К 200 мкл суспензии клеток, полученной таким образом, добавляли 800 мкл среды DMEM, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, к части клеточной суспензии добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation) и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.).
В результате было подтверждено, что с использованием композиции среды по настоящему изобретению, GEM, к которым прикреплены клетки HepG2, могут культивироваться в суспендированном состоянии и эффективно пролиферируют в композиции среды. Более того, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению демонстрирует лучший эффект стимуляции пролиферации относительно существующей среды, свободной от деацилированной геллановой камеди. Кроме того, было подтверждено, что с использованием магнитной силы GEM со связанными с ними клетками HepG2 можно собирать из композиции среды по настоящему изобретению, и, кроме того, из этих GEM можно выделять клетки HepG2. Количество клеток HepG2 при культивировании в течение 6 суток на GEM в среде, содержащей деацилированную геллановую камедь или свободной от нее, представлено в таблице 30. Кроме того, суспензионное состояние покрытых ламинином GEM с прикрепленными к ним клетками HepG2 при культивировании в композиции среды по настоящему изобретению представлено на фиг.14.
Экспериментальный пример 31: испытание суспензии клеток с использованием магнитных гранул, обладающих способностью к адгезии клеток - 2
Аналогично экспериментальному примеру 30, покрытые фибронектином GEM (зарегистрированный торговый знак, Global Eucariotic Microcarrier, изготавливаемые GL Sciences Inc.) суспендировали в среде для пролиферации мезенхимных стволовых клеток MF-Medium (зарегистрированный торговый знак)
2
2
(изготавливаемая TOYOBO CO., LTD.). Эту суспензию распределяли в планшет для плотного культивирования клеток Sumilon 24F (изготавливаемый SUMITOMO BAKELI-TE), который представляет собой планшет с низкой адгезией клеток, в количестве 50 мкл на 1 лунку. Затем добавляли отдельно полученные происходящие из костного мозга человека мезенхимные стволовые клетки (изготавливаемые Cell Applications) в количестве 250000 клеток/мл и, аналогично экспериментальному примеру 30, этот планшет выдерживали в течение ночи в инкубаторе с CO (5% CO) для получения GEM, на которые прикреплены мезенхимные стволовые клетки.
2
2
Способом, сходным со способом, описанным в экспериментальном примере 2, получали композицию среды для пролиферации мезенхимных стволовых клеток MF-Medium (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая TOYOBO CO., LTD.), содержащую 0,015% деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.). Каждую из этой композиции среды или описанной выше среды, свободной от деацилированной геллановой камеди, добавляли в количестве 1 мл к GEM со связанными с ними мезенхимными стволовыми клетками (покрытые фибронектином), полученным, как описано выше, суспендировали и переносили в планшет для плотного культивирования клеток Sumilon 24F. Затем этот планшет выдерживали в течение 4 суток в инкубаторе с CO (5% CO), среду для культивирования клеток переносили в 1,5-мл микропробирку (изготавливаемая Eppendorf), GEM со связанными с ними клетками собирали путем осторожного пипетирования на упомянутом выше магнитном стенде и супернатант удаляли. GEM промывали один раз PBS (1 мл), добавляли 200 мкл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAK0), и смесь инкубировали при 37°С в течение 10 мин. К 200 мкл суспензии клеток, полученной таким, образом, добавляли 800 мкл среды DMEM, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, к части суспензии клеток добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation), и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцйтометра (изготавливаемый ERMA INC.).
В результате было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению, GEM с прикрепленными к ним мезенхимными стволовыми клетками могут культивироваться в суспендированном состоянии и эффективно пролиферируют в композиции среды. Более того, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению демонстрирует лучший эффект стимуляции пролиферации клеток, чем существующая среда без деацилированной геллановой камеди. Кроме того, было подтверждено, что с использованием магнитной силы GEM со связанными с ними мезенхимными стволовыми клетками можно собирать из композиции среды по настоящему изобретению, и далее мезенхимные стволовые клетки можно выделять из этих GEM. Количество мезенхимных стволовых клеток при культивировании в течение 4 суток на GEM в среде, содержащей деацилированную геллановую камедь или свободной от нее среде,- представлено в таблице 31.
Экспериментальный пример 32: испытание суспензии клеток с использованием гранул с альгиновой кислотой
2
2
Следующее испытание проводили в соответствии со способом с использованием набора для трехмерной культуры с альгиновой кислотой, изготавливаемого PG Research. Полученные по отдельности клетки HepG2 добавляли в раствор альгината натрия (изготавливаемый PG research, 2,5 мл) в количестве 400000 клеток/мл, а затем добавляли рекомбинантный ламинин человека 511 (изготавливаемый Veritas Ltd.) в количестве 5 пг/мл для получения суспензии клеток. Суспензию клеток выделяли с помощью 5-мл шприца (изготавливаемый TEROMO CORPORATION), имеющего иглу для зондового питания, и на этот шприц устанавливали иглу для инъекций 22G (изготавливаемая TERUMO CORPORATION). " Затем суспензию клеток добавляли по 10 капель в каждую лунку 24-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый PG research), в который было добавлено 2 мл каждого из водного раствора хлорида кальция (изготавливаемый PG research). Смесь выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре, подтверждали образование альгиновой кислоты, удаляли раствор хлорида кальция, добавляли PBS (2 мл) и смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин. Более того, PBS удаляли, добавляли среду DMEM (изготавливаемая WAKO, 2 мл), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин. Среду удаляли, в каждую лунку добавляли композицию среды DMEM (изготавливаемая WAKO), содержащую 0,03% деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) и 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, которая была получена аналогично тому, как в экспериментальном примере 2, или описанную выше среду, свободную от деацилированной геллановой камеди, по 1 мл, и смесь подвергали статическому культивированию в течение 8 суток в инкубаторе с СО (5% CO). Среду заменяли на 4 сутки культивирования.
Культивируемые гранулы из альгиновой кислоты переносили в 1,5-мл микропробирку (изготавливаемая Eppendorf) с
использованием 1-мл наконечника, в каждую пробирку добавляли раствор цитрата натрия (1 мл, изготавливаемый PG research) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин для растворения гранул из альгиновой кислоты. Затем клетки осаждали центрифугированием при 300G в течение 3 мин и супернатант удаляли. К клеткам добавляли 200 мкл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)
(изготавливаемый WAKO), и смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. К полученной суспензии клеток (2 00 мкл) добавляли 800 мкл среды DMEM, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и к части суспензии клеток добавляли такое же количество раствора трипакового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen - Corporation), и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.).
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению, гранулы из альгиновой кислоты с заключенными в них клетками HepG2, могут культивироваться в суспендированном состоянии и эффективно пролиферируют в композиции среды. Более того, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению демонстрирует лучший эффект стимуляции пролиферации клеток, чем существующие среды без деацилированной геллановой камеди.
Количество клеток HepG2 при культивировании в гранулах из альгиновой кислоты в среде, содержащей деацилированную геллановую камедь, или свободной от нее, в течение 8 суток, представлено в таблице 32. Кроме того, суспензионное состояние, когда гранулы из альгиновой кислоты с заключенными в них клетками HepG2 культивировали в композиции среды по настоящему изобретению, представлено на фиг. 16.
Экспериментальный пример 33: испытание суспензии клеток с использованием капсулы из коллагенового геля
2
2
А: коллагеновый матрикс для культивирования тканей Cell matrix (зарегистрированный торговый знак) типа I-A (клеточный матрикс, изготавливаемый Nitta Gelatin Inc.), В: 10-кратная концентрация среды DMEM/F-12 (изготавливаемая Aldrich), С: буфер для разбавления (полученный добавлением гидрокарбоната натрия (2,2 г), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)) (4,77 г) к 0,5 н. раствору гидроксида натрия (100 мл) и стерилизации смеси фильтрованием) смешивали в соотношении А:В:С-8:1:1 при охлаждении на льду. Более того, добавляли рекомбинантный ламинин человека 511 (изготавливаемый Veritas Ltd.) в количестве 5 мкг/мл с получением раствора со смешанным с ним коллагеном. (500 мкл). К смешанному раствору добавляли полученные отдельно клетки HepG2 в количестве 200000 клеток/мл, и все количество извлекали с использованием 1,5-мл шприца (изготавливаемый TERUMO CORPORATION) с иглой для инъекций 25G (изготавливаемая TERUMO CORPORATION). Затем суспензию клеток по каплям добавляли по одной капле в пробирку с плоским дном (изготавливаемая ВМ Equipment Co., Ltd.), содержащую среду DMEM (изготавливаемая WAKO) (10 мл), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и предварительно инкубировали при 37°С с использованием упомянутого выше шприца. Смесь инкубировали на водяной бане при 37°С в течение 10 мин и подтверждали образование промежуточной капсулы из коллагенового геля диаметром приблизительно 2 мм, добавляли деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) в конечной концентрации 0,04% способом, сходным со способом в экспериментальном примере 2, и упомянутые выше капсулы суспендировали путем осторожного перемешивания. Затем пробирку подвергали статическому культивированию в инкубаторе с CO (5% CO) в течение 5 суток.
В культуральную среду, содержащую капсулы из коллагенового геля, добавляли PBS (25 мл), и капсулы из коллагенового геля осаждали центрифугированием при 400G в течение 5 мин и супернатант удаляли. Вновь добавляли PBS (25 мл), смесь центрифугировали и супернатант удаляли, чтобы получить количество оставшейся части, составляющее 5 мл. К этому раствору добавляли 1% (масс./об.) коллагеназу L (изготавливаемая Nitta Gelatin Inc., 20 мкл) и смесь встряхивали при 37°С в течение 2 ч. После подтверждения растворения коллагенового геля добавляли PBS (10 мл), и клетки осаждали центрифугированием при 400G в течение 5 мин, и супернатант удаляли. К клеткам добавляли 1 мл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAKO), и смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. К полученной клеточной суспензии добавляли 4 мМ среды DMEM, содержащей 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и клетки осаждали центрифугированием при 400G в течение 5 мин, и супернатант удаляли. Полученные клетки суспендировали в 2 мл той же среды, которая описана выше, и к их части добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation), и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.).
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению, капсулы из коллагенового геля, в которые заключены клетки HepG2, могут культивироваться в суспендированном состоянии, и клетки могут эффективно пролиферировать в композиции среды. Более того, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению демонстрирует лучший эффект пролиферации клеток, чем существующие среды без деацилированной геллановой камеди.
Количество клеток HepG2 при культивировании в капсулах из коллагенового геля в среде, содержащей деацилированную геллановую камедь и свободной от нее, в течение 5 суток представлено в таблице 33. Кроме того, суспензионное состояние, когда капсулы с заключенными в них клетками HepG2, культиврировали в композиции среды по настоящему изобретению, представлено на фиг. 17.
Экспериментальный пример 34: испытание по выделению сфер с использованием фильтра
Композицию среды DMEM (изготавливаемая WAKO), содержащую 0,015% деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) и 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, приготавливали способом, сходным со способом, описанным в экспериментальном примере 2. Кроме того, в качестве контроля получали такую же среду, но свободную от деацилированной геллановой камеди. Сферы клеток HepG2 формировали способом, сходным со способом, описанным в экспериментальном примере 2, и добавляли в среду (1 мл), полученную, как описано выше, в количестве 8 6000 клеток, смесь выдерживали при 37°С в течение 1 часа, и суспензию сфер с клетками визуально наблюдали. Более того, суспензию клеток добавляли на клеточные сита (изготавливаемые Becton, Dickinson and Company), имеющие размер ячеек 40 мкм, для улавливания сфер на фильтре. Затем PBS (10 мл) пропускали сбоку фильтра для выделения сфер в 15-мл пробирку, сферы осаждали центрифугированием при 300G в течение 5 мин. Супернатант удаляли, к сферам добавляли 500 мкл раствора трипсин-EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (изготавливаемый WAKO) и смесь инкубировали при 37°С в течение 5 мин. К полученной суспензии клеток добавляли среду DMEM (1 мл), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, к ее части добавляли такое же количество раствора трипанового синего для окрашивания (изготавливаемый Invitrogen Corporation), и количество жизнеспособных клеток измеряли с помощью гемоцитометра (изготавливаемый ERMA INC.). В результате было подтверждено, что сферы с клетками HepG2 поддерживают суспендированное состояние в упомянутой выше композиции среды. Более того, было подтверждено, что с помощью обработки фильтрованием суспензии сфер, содержащей 0,015% деацилированную геллановую камедь, клетки из сфер с клетками HepG2 можно выделять на уровне, эквивалентном уровню в случае среды, свободной деацилированной геллановой камеди. Относительное количество, выделенное из среды, содержащей деацилированную геллановую камедь, представлено в таблице 34, где количество клеток HepG2, выделенных с помощью фильтра и с использованием среды, свободной от деацилированной геллановой камеди, составляет 1.
Экспериментальный пример 35: испытание суспензии клеток для сфер с использованием комбинированного средства из различных полисахаридов
Композицию среды DMEM/F-12, содержащую комбинацию ксантановой смолы (KELTROL CG, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.), альгината натрия (Duck alginic acid NSPM, изготавливаемый FOOD CHEMIFA Co., Ltd.), смолы плодоворожкового дерева (GENUGUM RL-200-J, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.), метилцеллюлозы (cP400, изготавливаемая WAKO), к-каррагенана (GENUGEL WR-80-J, изготавливаемый SANSHO Co., Ltd.), пектина (GENU pectin LM-102AS, изготавливаемый SANSHO Co., Ltd.) или диутановой камеди (KELCO CRETE DG-F, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.), и деацилированной геллановой камеди (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) приготавливали способом, аналогичным способу, описанному в экспериментальном примере 15. Аналогично экспериментальному примеру 2, получали сферы клеток HepG2 и в каждую среду добавляли несколько десятков сфер (1 мл), полученных, как описано выше, смесь выдерживали неподвижно при 37°С в течение 1 часа или одной ночи, и суспендированное состояние клеток сфер визуально исследовали. В результате, было подтверждено, что сферы клеток HepG2 сохраняли суспендированное состояние в любой из упомянутых выше композиций среды. Более того, было подтверждено, что во всех композициях сред добавление 2-кратного количества среды и центрифугирование (5'00G, 5 мин) суспензии клеток приводит к осаждению и выделению сфер клеток HepG2. Дисперсное состояние сфер после одной ночи подтверждали путем визуального наблюдения, где суспензионное и дисперсное состояние представляет собой о, частично осажденное/диспергированное состояние представляет собой Δ, и осажденное состояние представляет собой х. Результаты оценки представлены в таблице 35 и в таблице 36. В таблице "-" означает "не проводили".
Сравнение способности гранул и клеток к диспергированию - 1
Дисперсное состояние декстрановых гранул Cytodex (зарегистрированный торговый знак) 1 (изготовленные GE Healthcare Life Sciences) и сфер клеток HeLa сравнивали между средой, содержащей деацилгеллановую камедь, полученной, как описано выше (сравнительный пример), и средой, содержащей метилцеллюлозу. Результаты представлены в таблице. Поскольку дисперсное состояние Cytodex1 и сфер клеток HeLa хорошо коррелирует, Cytodex1 можно использовать в качестве модели сфер клеток.
Сравнение способности гранул и клеток к диспергированию - 2
Дисперсное состояние полистироловых гранул (размер 500-600 мкм, изготавливаемые Polysciences Inc.) и сфер клеток HepG2 сравнивали между средой, содержащей полисахарид, полученный в экспериментальном примере 15, и средой, содержащей деацилгеллановую камедь. При оценке суспензионное и дисперсное состояние представляет собой о, частично осажденное/диспергированное состояние представляет собой Δ, и осажденное состояние представляет собой х. Результаты представлены в таблице. Поскольку дисперсное состояние полистироловых гранул и сфер клеток HepG2 хорошо коррелирует, полистироловые гранулы можно использовать в качестве модели сфер клеток.
Экспериментальный пример 36: испытание плавающей культуры происходящего из риса каллюса растений
Пятьдесят семян риса полной зрелости Nipponbare, отобранных с помощью солевого раствора (приобретенный от Koto agricultural cooperatives) переносили в 50-мл полистироловую пробирку (изготавливаемая BD Falcon), промывали стерилизованной водой (50 мл) и перемешивали в 70% этанолом в воде (30 мл) в течение 1 мин. Этанол в воде удаляли, добавляли Kitchen Haiter (изготавливаемый Као Corporation, 30 мл) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Kitchen Haiter удаляли и проводили промывание 4 раза стерилизованной водой (50 мл). Стерилизованные семена культивировали на базальной среде Murashige Skoog (М9274, изготавливаемая Sigma Aldrich), содержащей 2 пг/мл 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (изготавливаемая Sigma Aldrich) и агар в количестве 1,5 мл/лунка (24-луночный микропланшет с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated)). Их культивировали в условиях 30°С, 16 ч в темном месте/8 ч в темном месте в течение 3 недель, и каллюсы кремового цвета (1-2 мм), выращенные на бластоцистах семян, собирали.
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,03% (масс./об.) в базальную среду Murashige Skoog (М9274, изготавливаемую Sigma Aldrich), содержащую 2 мкг/мл 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (изготавливаемая Sigma Aldrich). К этой композиции среды в 10-мл пробирке с плоским дном (изготавливаемая ВМ Equipment Co., Ltd.) добавляли 15 каллюсов, полученных, как описано выше, и культивировали при встряхивании при 25°С в течение 7 суток. В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению происходящий из риса каллюс может культивироваться в суспендированном состоянии и каллюсы поддерживались в композиции среды. Суспензионное состояние, когда происходящий из риса каллюс культивировали композиции среды по настоящему изобретению, представлено на фиг. 18.
Экспериментальный пример 37: испытание пролиферации клеток путем диспергирования клеток НеLа
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO-Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистое воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) или 0,030% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO). Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля клетки HeLa суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% СО) в течение 8 суток. После культивирования в течение 3 и 8 суток в культуральную среду добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Поглощение при 4 50 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190) и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды. Культуральную среду, содержащую клетки после культивирования в течение 8 суток, перемешивали с помощью пипетки и полученный перемешиваемый раствор (20 мкл) смешивали с 0,4% красителем трипановым синим (изготавливаемый Invitrogen, 20 мкл) и плотность клеток измеряли под микроскопом.
В результате было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению клетки HeLa могут культивироваться в однородно диспергированном состоянии без формирования клеточного агрегата, имеющего чрезмерный размер, и эффективно пролиферируют в композиции среды. Результаты микроскопического наблюдения агрегата клеток HeLa после культивирования в течение 8 суток представлены на фиг.19. Кроме того, поглощение при 450 нм (соответствующее количеству клеток HeLa) после статического культивирования в течение 3 и 8 суток представлено в таблице 40. Плотность клеток HeLa после культивирования в течение 8 суток представлена в таблице 41.
Экспериментальный пример 38: испытание пролиферации клеток путем диспергирования клеток А549 и клеток НСТ116
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO) или среду Мак-Коя 5а (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.). Затем клеточную линию рака легкого человека А549 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) или клеточную линию рака ободочной и прямой кишки человека НСТ116 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемая Corning Incorporated, #3474) в количестве 200 мкл. В качестве отрицательного контроля клетки А549 и клетки НСТ116 суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 7 суток. После культивирования в течение 3, 5 и 7 суток в культуральную среду добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190) и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения среды отдельно.
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению клетки А549 и клетки НСТ116 могут культивироваться в однородно диспергированном состоянии без формирования агрегата клеток, имеющего чрезмерный размер, и могут эффективно пролиферировать в композиции среды. Результаты микроскопического наблюдения агрегата клеток А549 и клеток НСТ116 после культивирования в течение 5 суток представлены на фиг. 20. Кроме того, поглощение при 450 нм (соответствующее количеству клеток А549) после статического культивирования в течение 3, 5, 7 суток представлено в таблице 42 и поглощение при 450 нм (соответствующее количеству клеток НСТ116) после статического культивирования в течение 3, 5, 7 суток представлено в таблице 43.
Экспериментальный пример 39: испытание пролиферации клеток с использованием планшета с U-образным дном с поверхностью с низкой адгезией
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С."Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO). Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с U-образным дном с поверхностью с низкой адгезией (изготавливаемый SUMITOMO BAKELITE, #MS-9096U) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля клетки HeLa суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% СО) в течение 7 суток. В культуральную среду после культивирования в течение 2, 5 и 7 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Поглощение при 4 50 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате была подтверждена эффективная пролиферация также в другом планшете с низкой адгезией с использованием композиции среды по настоящему изобретению. Поглощение при 450 нм (соответствующее количеству клеток HeLa) после статического культивирования в течение 2, 5, 7 суток представлено в таблице 44.
Экспериментальный пример 40: испытание пролиферации клеток с использованием планшета с поверхностью с низкой адгезией, изготавливаемого другой компанией
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,005% и 0,030% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO). Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью с низкой адгезией (изготавливаемый IWAKI, #Ez-BindShut) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля клетки HeLa суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем
2
2
неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 7 суток. В культуральную среду после культивирования в течение 3 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190) и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате, была подтверждена эффективная пролиферация также в другом планшете с низкой адгезией с использованием композиции среды по настоящему изобретению. Поглощение при 450 нм (соответствующее количеству клеток HeLa) после статического культивирования в течение 3 суток представлено в таблице 45.
Экспериментальный пример 41: испытание по сравнению пролиферации клеток со средой Happy Ce11 ASM
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора приготавливали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO). Среду Happy Ce11 ASM (изготавливаемая biocroi) предварительно доводили с помощью среды DMEM (изготавливаемая WAKO) до заданной концентрации (смешивали в соотношении 1:1). Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) или линию клеток рака легкого человека А549 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, или композицию среды Happy Ce11 ASM в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью с низкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля клетки HeLa и клетки AS49 суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 5 суток. В культуральную среду после культивирования в течение 3 и 5 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл) и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Поглощение при 4 50 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190) и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению, клетки эффективно пролиферировали в композиции среды по сравнению с Happy Cell ASM. Поглощение при 4 50 нм (соответствующее количеству клеток HeLa) после статического культивирования в течение 3 и 5 суток представлено в таблице 4 6 и поглощение при 4 50 нм (соответствующее количеству клеток А549) представлено в таблице 47.
Экспериментальный пример 42: испытание пролиферации клеток с использованием других полисахаридов
2
2
Диутановую камедь (KELCO CRETE DG-F, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 1,5% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления диутановой камеди в конечных концентрациях 0,2% и 0,3% (масс./об.) в среду DMEM (изготавливаемая NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку. Затем клеточную линию рака легкого человека А549 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена диутановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля клетки А549 суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от диутановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% CO) в течение 3 суток. В культуральную среду после культивирования в течение 3 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате была подтверждена эффективная пролиферация в композиции среды по настоящему изобретению, содержащей другие полисахариды. Поглощение при 450 нм (соответствующее числу клеток А549) после статического культивирования в течение 3 суток представлено в таблице 48.
Экспериментальный пример 43: испытание пролиферации клеток с использованием различных лекарственных средств против злокачественной опухоли
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,030% (масс./об.) и различных лекарственных средств против злокачественной опухоли в конечных концентрациях 0,001, 0,01, 0,1, 1 мкМ в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO). Используемое лекарственное средство против злокачественной опухоли представляло собой адриамицин (изготавливаемый WAKO), паклитаксел (изготавливаемый WAKO) или митомицин С (изготавливаемый WAKO). Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 200 мкл/лунка. Что касается ситуации без добавления, клетки HeLa суспендировали в упомянутой выше среде, содержащей только деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,030% (масс./об.), и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% СО) в течение 7 суток. После культивирования в течение 3, 5, 7 суток, в культуральную среду добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190), и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды. Культуральную среду, содержащую клетки, после культивирования в течение 5 суток, перемешивали с помощью пипетки, и полученный перемешиваемый раствор (20 мкл) смешивали с 0,4% красителем трипановым синим (изготавливаемый Invitrogen, 20 мкл), и плотность клеток измеряли под микроскопом.
В результате было подтверждено, что лекарственные средства против злокачественной опухоли можно эффективно оценивать с помощью способа испытания пролиферации клеток с использованием композиции среды по настоящему изобретению. Кроме того, поглощение при 4 50 нм (соответствующее количеству клеток HeLa) после статического культивирования в течение 3, 5, 7 суток представлено в таблице 49. Плотность клеток HeLa через 5 суток представлена в таблице 50.
Экспериментальный пример 44: испытание поддержания и функции первичных гепатоцитов человека
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной" геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% или 0,030% (масс./об.) в среду НВМ (изготавливаемая Lonza Japan), в которую были добавлены добавки (НСМ single Quots (зарегистрированный торговый знак), BSA без жирных кислот, EGF, аскорбиновая кислота, трансферрин, инсулин, GA-1000, гидрокортизон 21 гемисукцинат; Lonza Japan). Затем замороженные первичные гепатоциты (изготавливаемые Xenotech) инокулировали в упомянутую выше композицию, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 250000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с U-образным дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый SUMITOMO BAKELITE, PrimeSurface, MS-9096U) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля первичные гепатоциты человека суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 3 суток.
1. Измерение количества жизнеспособных клеток
В культуральную среду после культивирования в течение 4 ч, 8 ч, 1 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл) и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Для измерения количества жизнеспособных клеток измеряли поглощение при 450 нм с помощью спектрометра (изготавливаемы: Molecular Devices, SPECTRA MAX 190).
2. Анализ уровня секреции альбумина
После культивирования в течение 3 суток культуральну] среду, содержащую гепатоциты, извлекали, и культуральньп супернатант удаляли центрифугированием (400g, 3 мин) Концентрацию альбумина человека в среде измеряли с использованием набора Albumin ELISA Quantitatior
(изготавливаемый Bethyl Laboratories).
3. Анализ экспрессии мРНК способом ПЦР в реальном времени Культуральную среду, содержащую гепатоциты после
культивирования в течение 8 ч, извлекали, и клетки выделяла центрифугированием (400g, 3 мин). Тотальную РНК экстрагировала из клеток с использованием набора RNeasy Mini (изготавливаемый QIAGEN). С использованием тотальной РНК и смеси RT Master Mix PrimeScript (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая Takara Bio Inc.), проводили реакцию обратной транскрипции с использованием системы GeneAmp PCR System 9700 (изготавливаемая Applied Biosystems) для синтеза кДНК. Каждый образец кДНК, используемый для реакции ПЦР, получали путем распределения и разбавления до 1/10 стерилизованной водой. Кроме того, в качестве используемого образца для применения для калибровочной кривой кДНК распределяли и смешивали, и использовали в количественном диапазоне разведений от 1/3 до 1/243 при 3-кратном общем соотношении. Реакцию ПЦР проводили с использованием каждого образца кДНК, калибровочного образца, Premix Ex Taq (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемый Takara Bio Inc.) и различных зондов Taqman (изготавливаемые Applied Biosystems), и системы 7500 Real-time PCR System (изготавливаемая Applied Biosystems). Специфичность вычисляли с использованием мРНК GAPDH в качестве эндогенного контроля, в экспрессию каждой мРНК вносили поправку на величину GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), и отрицательный контроль принимали за 100%.
Ниже представлен каждый использованный зонд (изготавливаемые Applied Biosystems).
GAPDH: HS99999905.
Альбумин: HS99999922.
Cyp3A4: HS00604506.
Сур2С9: HS02383631.
PXR (рецептор прегнана X): HS01114267.
ApoA1 (Аполипопротеин A1): HS00163641.
В результате было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению обладает эффектом поддержания первичных гепатоцитов человека в дисперсном состоянии и ингибирования снижения числа жизнеспособных клеток вследствие защиты. Также было подтверждено, что композиция среды демонстрирует более высокую способность продуцирования альбумина и более высокую способность экспрессии группы мРНК, связанные с фармакокинетикой, относительно отрицательного контроля. Поглощение при 450 нм (соответствующее числу первичных гепатоцитов) после статического культивирования в течение 4 ч, 8 ч, 1 суток представлено в таблице 51. Уровень альбумина в культуральном супернатанте после статического культивирования в течение 3 суток представлен в таблице 52. Кроме того, уровень экспрессии каждой мРНК, на основе отрицательного контроля после статического культивирования в течение 8 ч в качестве 100%, представлен в таблице 53. Состояние клеток, когда первичные гепатоциты человека культивировали в течение 4 ч, представлено на фиг. 21.
Экспериментальный пример 45: испытание поддержания и функции первичных гепатоцитов яванского макака
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% или 0,030% (масс./об.) в среду НВМ (изготавливаемая Lonza Japan), в которую были добавлены добавки (НСМ single Quots (зарегистрированный торговый знак), BSA без жирных кислот, EGF, аскорбиновая кислота, трансферрин, инсулин, GA-1000, гидрокортизон 21 гемисукцинат; Lonza Japan). Затем замороженные первичные гепатоциты яванского макака (изготавливаемые Ina Research) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 250000 клеток/мл, и распределяли в лунки 9 6-луночного микропланшета с U-образным дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый SUMITOMO BAKELITE, PrimeSurface, MS-9096U) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля первичные гепатоциты яванского макака суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% CO) в течение 3 суток.
1. Измерение количества жизнеспособных клеток
В культуральную среду после культивирования в течение 4 ч, 8 ч, 1 и 3 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смеси инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Для измерения количества жизнеспособных клеток измеряли поглощение при 450 нм с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190).
2. Анализ уровня секреции альбумина
После культивирования в течение 3 суток культуральную среду, содержащую гепатоциты, извлекали, и культуральный супернатант удаляли центрифугированием (400g, 3 мин). Концентрацию альбумина человека в среде измеряли с использованием набора Albumin ELISA Quantitation (изготавливаемый Bethyl Laboratories).
3. Анализ экспрессии мРНК способом ПЦР в реальном времени Культуральную среду, содержащую гепатоциты после культивирования в течение 1, 2, 3 суток, извлекали, и клетки выделяли центрифугированием (400g, 3 мин). Тотальную РНК экстрагировали из клеток с использованием набора RNeasy Mini kit (изготавливаемый QIAGEN). С использованием тотальной РНК и смеси RT Master Mix PrimeScript {зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая Takara Bio Inc.) проводили реакцию обратной транскрипции с использованием системы GeneAmp PCR System 9700 (изготавливаемая Applied Biosystems) для синтеза кДНК. Каждый образец кДНК, используемый для реакции ПЦР, получали путем распределения и разбавления до 1/10 стерилизованной водой. Кроме того, в качестве используемого образца для применения для калибровочной кривой, кДНК распределяли и смешивали, и использовали в количественном диапазоне разведений от 1/3 до 1/243 при 3-кратном общем соотношении. Реакцию ПЦР проводили с использованием каждого образца кДНК, калибровочного образца, Premix Ex Taq (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемый Takara Bio Inc.) и различных зондов Tagman (изготавливаемые Applied Biosystems), и системы 7500 Real-time PCR System (изготавливаемая Applied Biosystems). Специфичность вычисляли с использованием мРНК GAPDH в качестве эндогенного контроля, в экспрессию каждой мРНК вносили поправку на величину GAPDH.
Ниже представлен каждый использованный зонд (изготавливаемые Applied Biosystems).
GAPDH: Rh02621745.
Альбумин: Rh02789672.
ApoA1 (Аполипопротеин A1): Rh02794272.
В результате было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению обеспечивает эффект ингибирования снижения количества жизнеспособных клеток путем защиты первичных гепатоцитов яванского макака. Также было подтверждено, что гепатоциты, культивируемые в композиции среды, демонстрируют более высокую способность продуцировать альбумин и более высокую способность экспрессировать группу мРНК альбумина и ApoA1, чем отрицательный контроль. Поглощение при 450 нм (соответствующее числу первичных гепатоцитов яванского макака) после статического культивирования в течение 4 ч, 8 ч, 1 суток, 3 суток представлено в таблице 54. Уровень альбумина в культуральном супернатанте после статического культивирования в течение 3 суток представлен в таблице 55. Кроме того, уровень экспрессии мРНК альбумина после статического культивирования в течение 2, 3 суток на основе отрицательного контроля в качестве 100%, представлен в таблице 56, и уровень экспрессии мРНК ApoA1 представлен в таблице 57. Состояние клеток, когда первичные гепатоциты яванского макака культивировали в течение 4 ч, представлено на фиг. 22.
Экспериментальный пример 46: испытание поддержания и функции гепатоцитов в покрытом коллагене микропланшете
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% или 0,030% (масс./об.) в среду НВМ (изготавливаемая Lonza Japan), в которую были добавлены добавки (НСМ single Quots (зарегистрированный торговый знак), BSA без жирных кислот, EGF, аскорбиновая кислота, трансферрин, инсулин, GA-1000, гидрокортизон 21 гемисукцинат; Lonza Japan). Затем замороженные первичные гепатоциты яванского макака (изготавливаемые Ina Research) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 100000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного покрытого коллагеном микропланшета (изготавливаемый IWAKI, 4860-010) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля первичные гепатоциты яванского макака суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% СО) в течение 3 суток.
1. Измерение количества жизнеспособных клеток
В культуральную среду после культивирования в течение 1 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смеси инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Для измерения количества жизнеспособных клеток измеряли поглощение при 450 нм с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190).
2. Анализ уровня секреции альбумина
После культивирования в течение 3 суток культуральную среду, содержащую гепатоциты, извлекали, и культуральный супернатант удаляли центрифугированием (400g, 3 мин). Концентрацию альбумина человека в среде измеряли с использованием набора Albumin ELISA Quantitation (изготавливаемый Bethyl Laboratories).
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению защита первичных гепатоцитов в композиции среды обеспечивает ингибирование снижения числа жизнеспособных клеток, даже когда используют покрытый коллагеном планшет. Также было подтверждено, что композиция среды демонстрирует более высокую способность продуцировать альбумин, чем отрицательный контроль. Поглощение при 450 нм (соответствующее количеству первичных гепатоцитов яванского макака) после статического культивирования в течение 1 суток представлено в таблице 58. Кроме того, уровень альбумина в культуральном супернатанте после статического культивирования в течение 3 суток представлен в таблице 59.
Экспериментальный пример 47: сравнение со средой Happy Cell ASM
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем смешения среды НВМ (изготавливаемая Lonza Japan)с добавками (НСМ single Quots (зарегистрированный торговый знак), BSA без жирных кислот, EGF, аскорбиновая кислота, трансферрин, инсулин, GA-1000, гидрокортизон 21 гемисукцинат; Lonza Japan) со средой DMEM (изготавливаемая WAKO) в соотношения 1:1 и добавления деацилированной геллановой камеди в конечной концентрации 0,015% (масс./об.). Среду Happy Cell ASM (изготавливаемая biocroi) предварительно смешивали со средой DMEM до заданной концентрации (смесь 1:1). Затем замороженные первичные гепатоциты человека (изготавливаемые Xenotech) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, или в композицию среды Happy Cell ASM в количестве 250000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с U-образным дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый SUMITOMO BAKELITE) в количестве 200 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля первичные гепатоциты человека суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% CO) в течение 6 суток.
1. Измерение количества жизнеспособных клеток В культуральную среду после культивирования в течение 2 ч, 4 ч, 8 ч, 1 суток, 4 суток и 6 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 20 мкл), и смеси инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Для измерения количества жизнеспособных клеток измеряли поглощение при 450 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190).
В результате, было подтверждено, что композиция среды по настоящему изобретению является лучшей с точки зрения эффекта ингибирования снижения числа жизнеспособных клеток вследствие защиты первичных гепатоцитов, по сравнению с Happy Cell ASM. Поглощение при 450 нм (соответствующее количеству первичных гепатоцитов человека) после статического культивирования в течение 2 ч, 4 ч, 8 ч, 1 суток, 4 суток, 6 суток, представлено в таблице 60.
Экспериментальный пример 48: испытание токсичности соединения в отношении гепатоцитов
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С другой стороны, клетки HepG2 смешивали со средой DMEM (изготавливаемая WAKO) в количестве 100000 клеток/мл, и суспензию клеток распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 100 мкл/лунка. В упомянутый выше водный раствор деацилированной геллановой камеди добавляли троглитазон (изготавливаемый WAKO, #717 50) в каждой концентрации, и этот раствор (10 мкл) добавляли в упомянутую выше суспензию клеток (100 мкл). С помощью упомянутых выше обработок получали суспензию клеток, имеющую концентрацию DMSO 0,18% (об./об.), концентрацию троглитазона 20,0, 4 0,0, 60,0, 100 (мкмоль/л), и концентрацию деацилированной геллановой камеди 0,015% (масс./об.). Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 1 суток.
1. Измерение количества жизнеспособных клеток
Культуральную среду (50 мкл) после культивирования в течение 1 суток распределяли в 96-луночный планшет для титрования (изготавливаемый Corning Incorporated), в эту культуральную среду добавляли реагент Cell Titer-Glo (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемый Promega, 50 мкл), и смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Интенсивность люминесценции измеряли с помощью устройства для считывания множества планшетов (изготавливаемое Molecular Devices, FlexStation3) для измерения количества жизнеспособных клеток.
2. Измерение активности лактатдегидрогеназы (LDH) В культуральную среду (100 мкл) после культивирования в течение 1 суток добавляли среду DMEM (изготавливаемая WAKO, 100 мкл), и планшет центрифугировали при 440G в течение 15 мин. Супернатант (100 мкл) распределяли в 96-луночный планшет для титрования (изготавливаемый Corning Incorporated), добавляли реакционную смесь (100 мкл) из набора для выявления цитотоксичности (изготавливаемый Roche Applied Science), и смесь выдерживали при затемнении при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем, в соответствии с протоколом упомянутого выше набора, измеряли поглощение при 490 нм (эталон; 600 нм) с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190), посредством чего измеряли уровень поврежденных клеток, т.е. уровень нарушения клеток (%).
В результате было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению троглитазон обладает цитотоксичностью в отношении гепатоцитов. Относительное количество клеток и уровень нарушения клеток (%) представлены в таблице 61, когда условия без добавления после культивирования в течение 1 суток соответствуют 1.
Экспериментальный пример 49: испытание пролиферации клеток с использованием клеток А549 способом количественного определения АТР
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,005% (масс./об.), 0,015% (масс./об.) или 0,030% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO). Затем клеточную линию рака легкого человека А549 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 100000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 100 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля клетки А549 суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 5 суток. В культуральную среду после культивирования в течение 1, 3 и 5 суток добавляли реагент АТР (100 мкл) (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величина RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготовленный Molecular Devices), и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции среды отдельно. Для измерения WST-8 к клеткам после культивирования в течение 3 суток добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DQJINDO Laboratories, 10 мкл) и смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин. Поглощение при 4 50 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190), и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате, способом измерения АТР также было подтверждено, что клетки А54 9 эффективно пролиферируют, когда используют композицию среды по настоящему изобретению. Величина RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) после статического культивирования в течение 1, 3 и 5 суток представлена в таблице 62. Поглощение при 450 нм (WST-8) и величина RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) после культивирования в течение 3 суток, представлены в таблице 63.
Экспериментальный пример 50: сравнение со способом культивирования в монослое в испытании пролиферации клеток с использованием лекарственного средства против злокачественной опухоли
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.) и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном со сверхнизкой адгезионной способностью (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое, линию клеток рака шейки матки человека HeLa инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл/лунка. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% СО). На 1 сутки культивирования, добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию различных лекарственных средств против злокачественной опухоли до конечной концентрации от 0,001 до 1 мкм, и деацилированную геллановую камедь (группа добавления деацилированной геллановой камеди) в конечной концентрации 0,015% (масс./об.), и композиции среды, содержащие только 10-кратную концентрацию различных лекарственных средств против злокачественной опухоли (группа культивирования в монослое), каждая по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 3 суток. Использованное лекарственное средство против злокачественной опухоли представляло собой адриамицин (изготавливаемый WAKO), паклитаксел (изготавливаемый WAKO) или митомицин С (изготавливаемый WAKO). В культуральную среду на 4 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды. Для измерения WST-8 добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 15 мкл), смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин, поглощение при 450 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190) и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате, было обнаружено, что способ испытания пролиферации клеток с использованием композиции среды по настоящему изобретению убедительно показал эффективность митомицина С по сравнению с со способом культивирования в монослое. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 4 сутки статического культивирования, представлен в таблице 64. % от контрольной величины для поглощения при 450 нм (измерение WST-8) на 4 сутки статического культивирования представлен в таблице 65.
Экспериментальный пример 51: сравнение со способом культивирования в монослое в испытании пролиферации клеток с использованием средства для индукции апоптоза
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс/об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С, Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток рака шейки матки человека HeLa инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготовленный Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл/лунка. Каждый планшет культивировали путем выдерживания неподвижно в инкубаторе с СО (37°С, 5% СО). На 1 сутки культивирования, добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию различных средств для индукции апоптоза до конечной концентрации 0,2-10 мкм и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), и композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию различных средств для индукции апоптоза (культура монослоя) по отдельности, каждую по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 3 суток. Использованное средство для индукции апоптоза представляло собой набор Apoptosis Inducer set (изготавливаемый Merck Millipore, APT800: актиномицин D, камптотецин, циклогексимид, дексаметазон, этопозид). В культуральную среду на 4 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды. Для измерения WST-8 добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 15 мкл), смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин, поглощение при 450 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190) и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате, было обнаружено, что способ испытания пролиферации клеток с использованием композиции среды по настоящему изобретению убедительно продемонстрировал эффективность камптотецина и этопозида по сравнению со способом культивирования в монослое. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 4 сутки статического культивирования представлен в таблице 66. % от контрольной величины для поглощения при 4 50 нм (измерение WST-8) на 4 сутки статического культивирования представлен в таблице 67.
Экспериментальный пример 52: сравнение со способом культивирования в монослое в испытании пролиферации клеток HeLa с использованием траметиниба и MK-2206
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток рака шейки матки человека HeLa инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 7400 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию различных лекарственных средств против злокачественной опухоли до конечной концентрации от 0,001 до 30 мкМ и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), и композиции среды, содержащие только 10-кратную концентрацию различных лекарственных средств против злокачественной опухоли (группа культивирования в монослое), каждую по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 5 суток. Используемые лекарственные средства против злокачественной опухоли представляли собой траметиниб (изготавливаемый Santa Cruz, ингибитор МЕК) и МК-2206 (изготавливаемый Santa Cruz, ингибитор Akt). В культуральную среду на 6 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды.
В результате было обнаружено, что способ испытания пролиферации клеток с использованием композиции среды по настоящему изобретению убедительно продемонстрировал эффективность MK-2206 и траметиниба по сравнению со способом культивирования в монослое. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 4 сутки статического культивирования, представлен в таблице 68.
Экспериментальный пример 53: сравнение со способом культивирования в монослое в испытании пролиферации клеток А549 с использованием траметиниба и MK-2206
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.); и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака легкого человека А549 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 14800 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток рака легкого человека А54 9 инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 14800 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию различных лекарственных средств против злокачественной опухоли до конечной концентрации от 0,001 до 30 мкМ и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), и композиции среды, содержащие только 10-кратную концентрацию различных лекарственных средств против злокачественной опухоли (группа культивирования в монослое), каждую по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 5 суток. Используемые лекарственные средства против злокачественной опухоли представляли собой траметиниб (изготавливаемый Santa Cruz, ингибитор MEK) и MK-2206 (изготавливаемый Santa Cruz, ингибитор Akt). В культуральную среду на 6 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды.
В результате, было обнаружено, что способ пролиферации клеток с использованием композиции среды по настоящему изобретению убедительно продемонстрировал эффективность MK-2206 по сравнению с со способом культивирования в монослое. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 4 сутки статического культивирования представлен в таблице 69.
Экспериментальный пример 54: сравнение пролиферации клеток HeLa, стимулированных HB-EGF человека, со способом культивирования в монослое
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс/об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток рака шейки матки человека HeLa инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) до конечной концентрации от 10, 30 и 100 нг/мл и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), и композиции среды, содержащие только 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) (группа культивирования в монослое), каждую по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 7 суток. В культуральную среду на 6 и 8 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды.
В результате, было обнаружено, что способ испытания пролиферации клеток HeLa с использованием композиции среды по настоящему изобретению убедительно продемонстрировал эффект стимуляции пролиферации клеток HB-EGF человека по сравнению со способом культивирования в монослое. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 6 сутки статического культивирования представлен в таблице 70. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 8 сутки статического культивирования представлен в таблице 71.
Экспериментальный пример 55: сравнение пролиферации клеток А549, стимулированных HB-EGF человека, со способом культивирования в монослое
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 2 0 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака 'легкого человека А54 9 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 14800 клеток/мл, и распределяли, в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток рака легкого человека А549 инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 14800 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) до конечной концентрации от 10, 30 и 100 нг/мл и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), и композиции среды, содержащие только 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) (группа культивирования в монослое) каждую по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 7 суток. В культуральную среду на 6 и 8 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды.
В результате, было обнаружено, что способ испытания пролиферации клеток А549 с использованием композиции среды по настоящему изобретению убедительно продемонстрировал эффект стимуляции пролиферации клеток HB-EGF человека по сравнению со способом культивирования в монослое. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 6 сутки статического культивирования представлен в таблице 72. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 8 сутки статического культивирования представлен в таблице 73.
Экспериментальный пример 56: сравнение пролиферации клеток А431, стимулированных HB-EGF человека, со способом культивирования в монослое
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С.Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду ЕМЕМ (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток плоскоклеточной карциномы человека А431 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток плоскоклеточной карциномы человека А431 инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) до конечной концентрации от 10, 30 и 100 нг/мл и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), и композиции среды, содержащие только 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) (группа культивирования в монослое) по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 7 суток. В культуральную среду на 6 и 8 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды.
В результате, было обнаружено, что способ испытания пролиферации клеток А431 с использованием композиции среды по настоящему изобретению убедительно продемонстрировал эффект стимуляции пролиферации клеток HB-EGF человека по сравнению со способом культивирования в монослое. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 6 сутки статического культивирования представлен в таблице 74. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 8 сутки статического культивирования представлен в таблице 75.
Экспериментальный пример 5 7: сравнение пролиферации клеток SKOV3, стимулированных HB-EGF человека, со способом культивирования в монослое
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду Мак-Коя 5а (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.), содержащую 15% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку, и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака яичника человека SKOV3 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток рака яичника человека SKOV3 инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) до конечной концентрации от 10, 30 и 100 нг/мл и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), и композиции среды, содержащие только 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) (группа культивирования в монослое), каждую по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 8 суток. В культуральную среду на 6 и 9 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды.
В результате, было обнаружено, что способ испытания пролиферации клеток SKOV3 с использованием композиции среды по настоящему изобретению убедительно продемонстрировал эффект стимуляции пролиферации клеток HB-EGF человека по сравнению со способом культивирования в монослое. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 6 сутки статического культивирования представлен в таблице 76. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 9 сутки статического культивирования представлен в таблице 77.
Экспериментальный пример 58: сравнение экспрессии мРНК VEGF в клетках HeLa, стимулированных HB-EGF человека, со способом культивирования в монослое
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака шейки матки человека HeLa (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток рака шейки матки человека HeLa инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) до конечной концентрации от 10, 30 и 100 нг/мл и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), и композиции среды, содержащие только 10-кратную концентрацию HB-EGF человека (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста, изготавливаемый PEPROTECH) (группа культивирования в монослое), каждую по 15 мкл, а затем клетки культивировали в течение 6 суток. Культуральную среду, содержащую злокачественные клетки, извлекали на 7 сутки, и выделяли клетки центрифугированием (400д, 3 мин). Тотальную РНК экстрагировали из клеток с использованием набора RNeasy Mini (изготавливаемый QIAGEN). С использованием тотальной РНК и смеси RT Master Mix PrimeScript (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемая Takara Bio Inc.), проводили реакцию обратной транскрипции с использованием системы GeneAmp PCR System 9700 (изготавливаемая Applied Biosystems) для синтеза кДНК. Каждый образец кДНК, используемый для реакции ПЦР, получали путем распределения и разбавления 1/10 стерилизованной воды. Кроме того, в качестве используемого образца для применения для калибровочной кривой, кДНК распределяли и смешивали, и использовали в количественном диапазоне разведений от 1/3 до 1/243 при 3-кратном общем соотношении. Реакцию ПЦР проводили с использованием каждого образца кДНК, калибровочного образца, Premix Ex Taq (зарегистрированный торговый знак) (изготавливаемый Takara Bio Inc.) и различных зондов Taqman (изготавливаемые Applied Biosystems), и системы 7500 Real-time PCR System (изготавливаемая Applied Biosystems). Специфичность вычисляли с использованием мРНК GAPDH в качестве эндогенного контроля для внесения поправки в экспрессию мРНК VEGF (сосудисто-эндотелиальный фактор роста) поправку на величину GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), и принимая отрицательный контроль за 100%. Ниже представлен каждый использованный зонд (изготавливаемые Applied Biosystems).
GAPDH: HS99999905.
VEGF: HS00173626.
В результате было обнаружено, что клетки HeLa, культивируемые с использованием композиции среды по настоящему изобретению, убедительно продемонстрировали эффект усиления экспрессии мРНК VEGF посредством HB-EGF по сравнению со способом культивирования в монослое. Кроме того, уровень экспрессии мРНК VEGF, когда отрицательный контроль на 7 сутки статического культивирования принимали за 100%, представлен в таблице 78.
Экспериментальный пример 59: эффект гефитиниба на пролиферацию клеток А549, стимулированных HB-EGF человека
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток рака легкого человека А549 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 14 800 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток рака легкого человека А549 инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 14800 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию каждого из лекарственного средства против злокачественной опухоли, HB-EGF человека (изготавливаемый PEPROTECH) и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления
деацилированной геллановой камеди), каждую по 15 мкл, для доведения конечной концентрации лекарственного средства против злокачественной опухоли до от 0,1 до 30 мкМ и концентрации HB-EGF человека до конечной концентрации 0 нг/мл или 100 нг/мл, затем клетки культивировали в течение 7 суток. Используемое лекарственное средство против злокачественной опухоли представляло собой гефитиниб (изготавливаемый Santa Cruz, ингибитор рецептора EGF). В культуральную среду на 6 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo
(зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды.
В результате, в соответствии со способом испытания пролиферации клеток А549 с использованием композиции среды по настоящему изобретению и HB-EGF человека, условия культивирования с добавлением HB-EGF продемонстрировали более выраженный супрессивный эффект гефитиниба. % от контрольной величины для величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 6 сутки статического культивирования представлен в таблице 79.
Экспериментальный пример 60: эффект гефитиниба, эрлотиниба пролиферацию и рост клеток А431, стимулированных HB-EGF
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс. /об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,015% (масс./об.) в среду ЕМЕМ, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), и получали композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди. Затем линию клеток плоскоклеточного рака человека А431 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с. поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 135 мкл/лунка. В способе культивирования в монослое линию клеток плоскоклеточного рака человека А431 инокулировали в упомянутую выше композицию среды, свободную от деацилированной геллановой камеди, в количестве 37000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном (изготавливаемый Corning Incorporated, #3585) в количестве 135 мкл. Каждый планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с СО (37°С, 5% CO). На 1 сутки культивирования добавляли композиции среды, содержащие 10-кратную концентрацию каждого лекарственного средства против злокачественной опухоли, HB-EGF человека (изготавливаемый PEPROTECH) и деацилированную геллановую камедь в конечной концентрации 0,015% (масс./об.) (группа добавления деацилированной геллановой камеди), каждую по 15 мкл, для доведения конечной концентрации каждого лекарственного средства против злокачественной опухоли до от 0,1 до 30 мкм и доведения концентрации HB-EGF человека до конечной концентрации 0 нг/мл или 100 нг/мл, затем клетки культивировали в течение 7 суток. Используемые лекарственные средства против злокачественной опухоли представляли собой гефитиниб (изготавливаемый Santa Cruz, ингибитор рецептора EGF) и эрлотиниб (изготавливаемый Santa Cruz, ингибитор рецептора EGF). В культуральную среду на 4, 6 и 8 сутки добавляли реагент АТР (150 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды.
В результате способом культивирования, в котором комбинировали композицию среды по настоящему изобретению и HB-EGF человека, наблюдали пролиферацию клеток А431 в условиях культивирования с низкой адгезией. Более того, способом испытания пролиферации клеток А431, в котором комбинировали композицию среды по настоящему изобретению и HB-EGF человека, можно было оценить супрессивные эффекты гефитиниба и эрлотиниба на индуцируемую HB-EGF пролиферацию клеток. Что касается действия стимуляции роста посредством HB-EGF, величина RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 4 сутки, 6 сутки, 8 сутки статического культивирования представлена в таблице 80. Более того, что касается действия каждого лекарственного средства против злокачественной опухоли в отношении стимуляции пролиферации посредством HB-EGF, % от контрольной величины RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) на 4 сутки, 8 сутки представлен в таблице 81.
Экспериментальный пример 61: испытание пролиферации клеток путем диспергирования клеток MCF-7
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,005% (масс./об.) или 0,015% (масс./об.) в среду ЕМЕМ (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.), содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку. Затем линию клеток рака молочной железы человека MCF-7 (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 100 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля, клетки MCF-7 суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 5 суток. В культуральную среду после культивирования в течение 2 и 5 суток добавляли реагент АТР (100 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды. Для измерения с WST-8, раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 10 мкл) добавляли к клеткам после культивирования в течение 2 и 5 суток, смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин, поглощение при 4 50 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190), и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению клетки MCF-7 эффективно пролиферируют согласно способу измерения с АТР и способу измерения с WST-8. Величина RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) после статического культивирования в течение 2, 5 суток представлена в таблице 82. Поглощение при 450 нм (WST-8) после статического культивирования в течение 2, 5 суток представлено в таблице 83. Результаты микроскопического наблюдения агрегата клеток MCF-7 после культивирования в течение 5 суток представлены на фиг. 23.
Экспериментальный пример 62: испытание пролиферации клеток, когда клетки A375 и клетки MNNG/HOS диспергированы
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 2 0 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,005% (масс./об.) или 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку изготавливаемая WAKO) или в среду ЕМЕМ (изготавливаемая DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.). Затем каждую из линии меланомы человека А375 (изготавливаемая АТСС) и линии злокачественных клеток остеосаркомы человека MNNG/HOS (изготавливаемая АТСС) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 100 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля, клетки А375 и клетки MNNG/HOS суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 5 суток. В культуральную среду после культивирования в течение 4 суток добавляли реагент АТР (100 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины люминесценции только среды. После культивирования в течение 4 суток в культуральную среду добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 10 мкл), смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин, поглощение при 450 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190), и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению клетки А375 и клетки MNNG/HOS могут культивироваться в однородном диспергированном состоянии без формирования клеточного агрегата, имеющего избыточный размер, и эффективно пролиферируют в композиции среды. Результаты микроскопического наблюдения агрегатов клеток А375 и клеток MNNG/HOS после культивирования в течение 4 суток представлены на фиг.24. Кроме того, в клетках А375 поглощение при 450 нм (WST-8) и величина RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) после статического культивирования в течение 4 суток представлены в таблице 84. В клетках MNNG/HOS поглощение при 450 нм (WST-8) и величина RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) после статического культивирования в течение 4 суток представлены в таблице 85.
Экспериментальный пример 63: испытание пролиферации клеток посредством диспергирования клеток MIAPaCa-2
2
2
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.) суспендировали в сверхчистой воде (вода Milli-Q) до 0,3% (масс./об.), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. Этот водный раствор стерилизовали при 121°С в течение 20 мин в автоклаве. С использованием этого раствора получали композицию среды путем добавления деацилированной геллановой камеди до конечной концентрации 0,005% (масс./об.) или 0,015% (масс./об.) в среду DMEM, содержащую 10% (об./об.) эмбриональную телячью сыворотку изготавливаемая WAKO). Затем линию клеток карциномы поджелудочной железы человека MIAPaCa-2 (изготавливаемая АТСС) инокулировали в упомянутую выше композицию среды, в которую была добавлена деацилированная геллановая камедь, в количестве 50000 клеток/мл, и распределяли в лунки 96-луночного микропланшета с плоским дном с поверхностью со сверхнизкой адгезией (изготавливаемый Corning Incorporated, #3474) в количестве 100 мкл/лунка. В качестве отрицательного контроля, клетки MIAPaCa-2 суспендировали в упомянутой выше среде, свободной от деацилированной геллановой камеди, и суспензию распределяли. Затем этот планшет культивировали путем неподвижного выдерживания в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение 6 суток. В культуральную среду после культивирования в течение 6 суток добавляли реагент АТР (100 мкл (набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo
(зарегистрированный торговый знак), изготавливаемый Promega) с получением суспензии, которую выдерживали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, и интенсивность люминесценции (величину RLU) измеряли с помощью FlexStation3 (изготавливаемый Molecular Devices), и количество жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания величины. люминесценции только среды. После культивирования в течение 6 суток в культуральную среду добавляли раствор WST-8 (изготавливаемый DOJINDO Laboratories, 10 мкл), смесь инкубировали при 37°С в течение 100 мин, поглощение при 4 50 нм измеряли с помощью спектрометра поглощения (изготавливаемый Molecular Devices, SPECTRA MAX 190), и число жизнеспособных клеток измеряли путем вычитания поглощения только среды.
В результате, было подтверждено, что при использовании композиции среды по настоящему изобретению клетки MIAPaCa-2 могут культивироваться в однородном диспергированном состоянии без формирования клеточного агрегата, имеющего чрезмерный размер, и эффективно пролиферируют в композиции среды. Результаты микроскопического наблюдения агрегата клеток MIAPaCa-2 после культивирования в течение 6 суток представлены на фиг. 25. Кроме того, поглощение при 450 нм (WST-8) и величина RLU (измерение АТР, интенсивность люминесценции) в клетках MIAPaCa-2 после статического культивирования в течение 4 суток представлены в таблице 86.
Экспериментальный пример 64: концентрирование и разбавление среды, содержащей деацилированную геллановую камедь
Среду DMEM (изготавливаемая WAKO), содержащую 0,015% (масс./об.) деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd.), полученную аналогично тому, как в экспериментальном примере 2, распределяли в 15-мл центрифужную пробирку (изготавливаемая VIOLAMO) по 10 мл, и деацилированную геллановую камедь осаждали центрифугированием (700G, 5 мин) в поворотном роторе LC-200 (изготавливаемый ТОМУ SEIKO Co., Ltd.). Супернатант (8 мл) извлекали с помощью аспиратора, посредством чего среду, содержащую деацилированную геллановую камедь, концентрировали. Более того, к этой концентрированной среде добавляли среду DMEM (изготавливаемая WAKO), свободную от деацилированной геллановой камеди и перемешивали путем пипетирования с получением среды, имеющей произвольную концентрацию.
2
2
С другой стороны, клетки рака печени человека HepG2 (изготавливаемые DS PHARMA BIOMEDICAL CO., LTD.) суспендировали в среде DMEM, содержащей 10% (об. /об.) эмбриональную телячью сыворотку (изготавливаемая WAKO), в количестве 500000 клеток/мл, эту суспензию (10 мл) инокулировали в EZ SPHERE (изготавливаемые ASAHI GLASS CO., LTD.) и клетки культивировали в инкубаторе с CO при 37°С, (5% СО) в течение 7 суток. После этого суспензию (10 мл) полученных сфер (диаметр 100-200 мкм) центрифугировали (200G, 5 мин), чтобы обеспечить осаждение, и супернатант удаляли, получая суспензию сфер (1,0 мл). К среде, полученной в упомянутой выше произвольной концентрации, добавляли эту суспензию сфер по 100 мкл, сферы распределяли путем пипетирования и инкубировали при 37°С, и дисперсное состояние сфер визуально исследовали через 1 ч. Результаты представлены в таблице 87.
Как показано в таблице 87, деацилированную геллановую камедь можно концентрировать и разбавлять до произвольной концентрации, после приготовления в качестве композиции среды. Было подтверждено, что композиция среды, концентрированная и разбавленная таким образом, имеет эффект суспендирования на сферы.
Экспериментальный пример 65: получение среды DMEM/Ham F12, содержащей деацилгеллановую камедь
Деацилированную геллановую камедь (KELCOGEL-CG-LA, изготавливаемая SANSHO Co., Ltd., 120 мг) суспендировали в чистой воде (72 мл), и растворяли путем перемешивания при нагревании до 90°С. К ней добавляли чистую воду для получения 0,017% (масс./об.) раствора (720 мл) деацилгеллановой камеди, и раствор стерилизовали с использованием фильтра для стерилизации (размер пор 0,22 мкм). С другой стороны, чистую воду, соответствующую 1/10 количества, рекомендованного для приготовления среды, добавляли в среду, содержащую смешанную порошковую среду из равных количеств DMEM/Ham F12 (Life Technologies Corporation), и гидрокарбонат натрия с получением 80 мл водного раствора в 10-кратной концентрации, и раствор стерилизовали с использованием фильтра для стерилизации (размер пор 0,22 мкм). Его смешивали путем перемешивания при 25°С в условиях стерилизации с получением заданной среды (800 мл), имеющей концентрацию деацилгеллановой камеди концентрация 0,015% (масс./об.).
Промышленная применимость
Композиция среды по настоящему изобретению демонстрирует улучшенный эффект суспендирования клеток и/или тканей и является в высокой степени полезной для крупномасштабного культивирования клеток и/или тканей, происходящих из животных и растений, с сохранением их функции. Кроме того, клетки и/или ткани, культивируемые способом по настоящему изобретению, являются в высокой степени пригодными для оценки эффективности и токсичности химических веществ, фармацевтических продуктов и т.п., крупномасштабной продукции полезных веществ, таких как ферменты, факторы роста клеток, антитела и т.п., и в области регенеративной медицины для замены органа, ткани и клетки, утраченных вследствие заболевания и дефицита, и т.п.
Настоящая заявка основана на патентных заявках №2012-164227 (дата подачи: 24 июля 2012 года), 2012-263801 (дата подачи: 30 ноября 2012 года), 2013-017836 (дата подачи: 31 января 2013 года), поданных в Японии, содержание которых включено в настоящее описание в полном объеме.