Способ получения наночастиц кремния для инактивации коронавирусной инфекции
METHOD FOR PRODUCTION OF SILICON NANOPARTICLES FOR CORONAVIRUS INFECTION INACTIVATION

Область техники
Изобретение относится к области нанотехнологии, дезинфектологии и медицины, а именно, к способу получения наночастиц для инактивации коронавирусной инфекции, который заключается в изготовлении наночастиц кремния путем электрохимического приготовления слоев мезопористого кремния с последующим их механическим измельчением, селекцией по размерам и очисткой при помощи центрифугирования и диализа, что приводит к получению стабильных коллоидных растворов наночастиц кремния, предназначенных для безопасной очистки водных сред и биосистем от коронавирусной инфекции.
Уровень техники
Из уровня техники известен СПОСОБ ФУНГИЦИДНОЙ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ ОБРАБОТКИ ОБЪЕКТОВ (WO 2022055468 A1, дата публ. 17.03.2022), заключающийся в приготовлении водного раствора веществ, используя пероксодисульфата натрия в концентрации 0,50 масс. % и гидроксида натрия в концентрации 0,50 масс. %, остальное вода. После приготовления состава его наносят на объект обработки медицинского, бытового или промышленного характера, например, пол, стены, автомобильный транспорт и прочее. Осуществляют выдержку не менее 1 мин. Предложенный способ фунгицидной и противовирусной обработки обеспечивает полное уничтожение вирусов и грибов в течение 1 минуты, а компоненты, которые применяются в способе, являются неорганическими веществами и быстро теряют свою активность, что позволяет не оказывать загрязняющее действие на окружающую среду. Однако при попадании такого раствора на кожу, в глаза или другие открытые участки тела человека возможно токсическое и ожоговое поражение.
Также известен способ получения ВИРУЛИЦИДНЫХ МЕТАЛЛИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ (WO 2018015466 A1, дата публ. 25.01.2018). Изобретение относится к вирулицидным металлическим наночастицам, содержащим их вируцидным композициям и их применению в лечении и/или профилактике вирусных инфекций, для стерилизации и дезинфекции. Изобретение предлагает способ получения и применения вирулицидных металлических наночастиц на основе золота или оксида железа, содержащих множество алкилсульфонатных лигандов, которые обеспечивают рецептор присоединения для вирусов. Разработана серия наночастиц с высокой поверхностной плотностью длинных молекул, заканчивающихся сульфокислотой, для того, чтобы индуцировать их сильное мультивалентное связывание, приводящее к необратимым изменениям в вирусах человека, либо в их оболочке (например, респираторно-синцитиальный вируса, лентивируса, вируса Денге), Суть изобретения обеспечивает вирулицидную металлическую наночастицу, содержащую множество (несколько) алкилсульфонатных лигандов, которые обеспечивают рецептор присоединения для вирусов, и, при необходимости, множество (несколько) дополнительных алкильных лигандов. Недостатки предлагаемого подхода заключаются в том, что предлагаемые металлические наночастицы не являются биодеградируемыми, используемые алкилсульфонатные и алкильные лиганды могут вызывать нежелательные аллергические или токсические воздействия на организм человека, а вызываемый ими вирулицидный эффект состоит только в уменьшении числа активных вирусов вне биологических систем, таких как клетки или организм человека.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является УНИВЕРСАЛЬНЫЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ВОЗДУХА, ЖИДКИХ СРЕД И ПОВЕРХНОСТЕЙ ПРИ ПОМОЩИ БИОСОВМЕСТИМОГО МИКРОПОРИСТОГО КРЕМНИЯ ДЛЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ОБРАБОТКИ В БЫТУ, В МЕДИЦИНЕ И НА ПРОИЗВОДСТВЕ (RU 2499610 С2, опубл. 27.11.2013), в котором предлагается способ получения и применения водных суспензий наночастиц микропористого кремния для уменьшения концентрации вирусов человека, таких как вирус иммунодефицита человека ВИЧ-1/Bru и респираторно-синцитиальный вирус RS virus Long, начиная с концентрации наночастиц микропористого кремния в водной среде 0,1-0,2 мг/мл. Получаемые наночастицы микропористого кремния являются нетоксичными и биодеградируемыми, что исключает нежелательные аллергические или токсические воздействия при их попадании на открытые участки тела человека, а также внутрь человеческого организма. Однако, наночастицы, получаемые таким способом, состоят из очень мелких нанокристаллов с размерами 1-5 нм, которые нестабильны в водной среде ввиду их растворения в водных средах и биосистемах в течение нескольких часов, что затрудняет их применение для продолжительной противовирусной обработки водных сред и биосистем.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является создание способа получения наночастиц кремния с улучшенными свойствами стабильности и эффективности противовирусной обработки водных сред и биосистем.
Технический результат изобретения заключается в способе получения кремниевых наночастиц при помощи последовательности этапов приготовления, включающих электрохимическое травление пластин кристаллического кремния для получения мезопористых кремниевых слоев, их механическое измельчение в водной среде, центрифугирование полученных водных суспензий кремниевых наночастиц для выделения заданных размеров наночастиц с последующим диализом полученных коллоидных растворов наночастиц для их очистки от мелких наночастиц и растворенных веществ. Полученные предложенным способом наночастицы кремния обладают повышенной стабильностью в водных средах и высокой эффективностью инактивации коронавирусной инфекции.
Технический результат изобретения достигается следующим образом. На первом этапе проводится электрохимическое травление в растворе плавиковой кислоты и этилового спирта пластин кристаллического кремния проводимости с высокой концентрацией акцепторной примеси, обеспечивающей получение слоев мезопористого кремния высокой пористости более 50%, состоящих из кремниевых нанокристаллов с размерами порядка и более 10 нм. На втором этапе полученные мезопористые слои отделяют от подложки и подвергают механическому измельчению для получения водной суспензии кремниевых наночастиц. На третьем этапе полученную суспензию кремниевых наночастиц подвергают центрифугированию для осаждения крупных наночастиц кремния, удаляемых затем из суспензии. На четвертом этапе используют супернатант (надосадочную фракцию) суспензии центрифугированных наночастиц кремния, которую подвергают очистке от мелких наночастиц и растворенных веществ. В результате образуется стабильная водная суспензия кремниевых наночастиц со средними поперечными размерами вблизи 100 нм, состоящих из нанокристаллов кремния и пор меньшего размера. Такая структура наночастиц кремния обеспечивает их устойчивость в водных суспензиях в течение многих дней, а также обуславливает высокую степень инактивации коронавирусной инфекции вследствие эффективного связывания с вирусными частицами (вирионами). При этом получаемые данным способом наночастицы кремния состоят из химически чистого кремния, что обеспечивает их низкую цитотоксичность в процессе биодеградации.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 показано изображение в сканирующем электронном микроскопе единичной кремниевой наночастицы, полученной заявляемым описанным выше способом. Кремниевая наночастица имеет характерные размеры порядка 100 нм и состоит из кремниевых нанокристаллов с размерами 10-20 нм, разделенных порами. Такая морфология кремниевых наночастиц обеспечивает их эффективное электростатическое связывание с вирионами коронавирусной инфекции.
Фиг. 2 демонстрирует данные метода динамического светорассеяния, отражающие распределение по размерам (гидродинамическим диаметрам) наночастиц кремния, полученных заявляемым выше способом, для свежеприготовленных и хранившихся в течение 1 недели водных суспензиях, где кривая 1 соответствует свежеприготовленным наночастицам кремния, а кривая 2 - тем же наночастицам кремния, хранившимся в течение 1 недели в темноте при комнатной температуре. Данные Фиг. 1 показывают, что как свежеприготовленные, так и хранившиеся в течение 1 недели наночастицы кремния имеют в водных суспензиях гидродинамические диаметры в диапазоне от 50 до 150 нм с максимумом распределения вблизи 100 нм. Близость кривых распределения по размерам для свежеприготовленных и хранившихся в течение 1 недели наночастиц кремния свидетельствует о стабильности их свойств в водных суспензиях, что является их преимуществом по сравнению с известными ранее наночастицами микропористого кремния.
Таблица 1 показывает данные по противовирусным свойствам наночастиц кремния, полученных заявляемым способом, по результатам проведенных лабораторных исследований инфекционной активности коронавирусной инфекции на модельной клеточной культуре. По данным эксперимента определялись степень цитотоксическая доза наночастиц кремния СС50, соответствующая гибели 50% клеток, а также инактивирующая доза наночастиц кремния IC50, при которой 50% вирусных частиц теряют свою заражающую активность. Данные Таблицы 1, показывают, что наночастицы кремния обладают инактивирующим действием по отношению к коронавирусу, начиная с концентраций наночастиц в водной среде 0,38 мкг/мл, а 50% инактивирующая доза IC50 = 6,8 мкг/мл на порядок ниже значений концентраций наночастиц, для которых наблюдается 50% ингибирование клеточной пролиферации СС50 = 50 мкг/мл. Все вышесказанное свидетельствует о том, что кремниевые наночастицы, полученные предложенным способом, обладают высокой эффективностью при противовирусной обработке водных сред, а также могут быть использованы как основа безопасных противовирусных препаратов.
Осуществление изобретения
2
2
Получение наночастиц провидится в форме последовательности физико-химических нанотехнологических этапов. На первом этапе проводится электрохимическое травление пластин кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением от 1 до 50 мОм*см в растворе плавиковой кислоты с объемной концентрацией 40-50% и этилового спирта в соотношении от 1:1 до 1:5 по объему соответственно в течение промежутка времени от 10 до 60 минут с плотностью тока от 20 до 60 мА/см. В результате получаются слои мезопористого кремния толщиной от 10 до 100 мкм, диаметром пор от 2 до 10 нм, пористостью от 50 до 80%. Данные слои отделяются от подложки кратковременным увеличением силы тока до 500-600 мА/см либо механически снимаются с подложки, промывают в дистиллированной воде для удаления остатков электролита и высушиваются на воздухе в течение 1-2 часов. На втором этапе полученные слои мезопористого кремния подвергают механическому измельчению посредством помола в шаровой планетарной мельнице до получения водной суспензии кремниевых наночастиц. На третьем этапе полученную суспензию подвергают центрифугированию при центробежных ускорениях от 1000 до 2000 ускорений свободного падения в течение промежутка времени от 10 до 20 мин для осаждения крупных наночастиц кремния, удаляемых затем из суспензии. На четвертом этапе берут супернатант (надосадочную фракцию) суспензии центрифугированных наночастиц и подвергают ее диализу в течение 24 часов в диализных мешках с размером пор 40 кДа для очистки от самых мелких наночастиц и растворенных веществ. В результате образуется стабильная водная суспензия кремниевых наночастиц со средними поперечными размерами порядка 100 нм, обладающих наношероховатой структурой с размерами выступов, представляющих собой агрегаты нанокристаллов кремния с размерами 10-20 нм, которые существуют в форме устойчивых водных суспензий в течение нескольких недель и обладают высокой эффективностью связывания с коронавирусами в водных средах и биосистемах.
Пример получения наночастиц кремния
2
2
Проводится электрохимическое травление пластин кристаллического кремния дырочного типа проводимости с удельным сопротивлением 10 мОм*см в растворе плавиковой кислоты с объемной концентрацией 50% и этилового спирта в соотношении от 1:1 по объему в течение 60 минут с плотностью тока травления 50 мА/см. В результате получаются слои мезопористого кремния толщиной от 60 мкм, имеющие диаметр пор 2-5 нм и пористость 55-60%. Данные слои отделяются от подложки кратковременным увеличением силы тока 400-500 мА/см, затем механически снимаются с подложки, промывают в дистиллированной воде в течение 5 минут и высушиваются на воздухе в течение 1 часа. Полученные слои мезопористого кремния заливают дистиллированной водой в соотношении 1:10 по массе и подвергают механическому измельчению посредством помола в шаровой планетарной мельнице до получения водной суспензии кремниевых наночастиц с широким распределением по размерам от 2 до 1000 нм. Полученную суспензию подвергают центрифугированию при центробежных ускорениях 2000 ускорений свободного падения в течение 15 мин для осаждения крупных наночастиц кремния, удаляемых затем из суспензии. Далее используют супернатант (надосадочную фракцию) суспензии центрифугированных наночастиц, которую подвергают ее диализу в течение 24 часов в диализных мешках с размером пор 40 кДа для очистки от самых мелких наночастиц и растворенных веществ. В результате образуется стабильная водная суспензия кремниевых наночастиц со средними поперечными размерами порядка 100 нм, обладающих наношероховатой структурой с размерами выступов, представляющих собой разделенные порами группы нанокристаллов кремния с размерами 10-20 нм. Такие наночастицы кремния существуют в форме устойчивых водных суспензий в течение нескольких недель и обладают высокой эффективностью связывания с коронавирусами в водных средах и биосистемах.
Пример использования наночастиц кремния для инактивации коронавирусной инфекции
Противовирусная активность исследуемых препаратов исследовалась по степени повышения жизнеспособности клеток в результате ослабления коронавирусной инфекции на примере авторского штамма коронавируса на модели клеток Vero Е6. Выбор концентраций тестируемых препаратов наночастиц осуществляли на основе результатов исследования их цитотоксических свойств, которые показали отсутствие цитотоксичности при концентрации наночастиц не более 50 мг/мл.
Для проведения стандартного теста подсчета живых клеток (МТТ-теста) в лунки планшета с клетками добавляли по 20 мкл окрашивающего МТТ раствора (5 мг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 4 часов, далее данный раствор осторожно, не смывая клеток, удаляли из лунок и добавляли по 150 мкл диметилсульфоксида для растворения кристаллов формазана, концентрацию которого в растворе затем измеряли как величину оптической плотности раствора для длины волны света 570 нм относительно оптической плотности на длине волны 700 нм в микропланшетном устройстве измерения оптической плотности. Величину оптической плотности, зарегистрированную для неинфицированных клеток, принимали за 100%, что соответствовало отсутствию инфекции, а значение оптической плотности для инфицированных клеток, культивированных в отсутствие исследуемых препаратов, принимали за 0% (отсутствие противовирусного эффекта). Концентрацию препаратов, которая защищала клетки на 50% от инфекции (IC50), определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа.
Расчет степени защиты клеток от действия инфекции в % проводился с использованием формулы:
(ОП опыта - ОП контроля вируса) / (ОП контроля клеток - ОП контроля вируса) × 100%, где ОП - оптическая плотность.
Полученные результаты тестирования противовирусной активности полученных наночастиц представлены в Таблице 1, в которой также указаны найденные экспериментально величины цитотоксической дозы наночастиц кремния СС50 = 50 мкг/мл, и инактивирующая дозы наночастиц кремния IC50 = 6,8 мкг/мл. Противовирусное действие наночастиц кремния выражается в инактивации размножения коронавируса в используемой клеточной культуре, начиная с концентраций наночастиц 0,38 мкг/мл. Тот факт, что инактивирующая доза IC50 на порядок ниже значения СС50, дает возможность использовать нетоксичные концентрации наночастиц кремния для эффективной инактивации коронавирусной инфекции.