Влияние излучения He-Ne лазера на морфологию эритроцитов человека

МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА

Вестн. Ом. ун-та. 2008. № 4. С. 45-48.

УДК 612.111:577.344:57.086

Н.А. Давлеткильдеев, Г.С. Трутников

Омский государственный университет им. Ф. М. Достоевского

ВЛИЯНИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ HE-NE ЛАЗЕРА НА МОРФОЛОГИЮ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

The results of studying the effect of He-Ne laser radiation dose on morphologic parameters of the human erythrocytes are reported.

Ключевые слова: эритроциты, лазерное воздействие, атомно-силовая микроскопия, морфология.

Многолетний опыт использования низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) в клинической практике свидетельствует о наличии у лазерного излучения красного и ближнего инфракрасного диапазона отчетливого терапевтического эффекта. Однако внедрение НИЛИ в клиническую практику идет преимущественно эмпирическим путем. Одной из особенностей воздействия НИЛИ является резкая зависимость величины и даже знака эффекта от дозы облучения и функционального состояния биологического объекта. Позитивное, стимулирующее действие проявляется, как правило, в узком интервале доз облучения, а затем исчезает или даже сменяется угнетающим действием. До настоящего времени не объяснены механизмы терапевтического действия НИЛИ на организм человека и отсутствует научно обоснованный метод выбора доз облучения. Молекулярно-клеточные механизмы лечебного действия НИЛИ обсуждаются сейчас в литературе лишь на уровне гипотез.

Наибольшее распространение в клинической практике получил метод внутривенного облучения крови, при котором воздействию подвергаются компоненты плазмы и форменные элементы крови. Основная доля лазерного воздействия приходится на эритроциты, составляющие более 99 % всех форменных элементов и более 45 % объема крови.

На сегодняшний день установлено, что НИЛИ оказывает заметное влияние на метаболизм и функцию эритроцитов. Основные сведения в литературе о влиянии НИЛИ на красные клетки крови [1] можно резюмировать следующим образом:

1) НИЛИ активирует основные метаболические процессы в эритроцитах, что ведет к повышению содержания в них АТФ и 2, 3=ДФГ;

2) при воздействии малых доз НИЛИ в мембранах эритроцитов активируются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), накапливаются ацилгидроперекиси и малоновый диальдегид, ответственные за начальные этапы активации метаболизма эритроцитов;

3) параллельно с активацией процессов ПОЛ наблюдается стимуляция основных клеточных ферментов антиоксидантной защиты - ка-

© Н.А. Давлеткильдеев, Г.С. Трутников, 2008

талазы и супероксиддисмуттазы (СОД), ограничивающих степень окислительной альтерации мембраны эритроцитов;

4) под влиянием активных форм кислорода и продуктов ПОЛ возникают перестройки цитоплазматической мембраны эритроцита, приводящие к изменению её ионной проницаемости;

5) результатом фотовоздействия оказывается повышение эластичности и деформируемости мембраны эритроцитов за счет увеличения содержания в мембранах фосфолипидов;

6) повышается неспецифическая резистентность эритроцитов, что проявляется в повышении их устойчивости к разрушающему' действию различных гемолитических агентов и механических факторов.

Таким образом, основная доля информации об изменениях состояния эритроцитов под действием НИЛИ получена либо разными клиническими методами исследования, либо на основе биохимических экспериментов. Как правило, эта информация носит обобщенный характер по большому количеству клеток. Кроме того, практически отсутствует детальная картина морфологических изменений эритроцитов при воздействии НИЛИ.

Цель данной работы заключалась в изучении влияния дозы излучения Не-N6 лазера на морфологические параметры индивидуальных эритроцитов человека.

Методика эксперимента

Для приготовления образцов использовалась венозная гипаринезированная кровь практически здорового пациента. Облучение крови производилось в кварцевой кювете с длиной оптического пути 3 мм, излучением Не-Ие лазера с длиной волны 632,8 нм в течение времени, необходимого для набора определенной дозы. Плотность мощности лазерного излучения непосредственно перед слоем крови составляла 1 мВт/см2. Для равномерного облучения объема крови производилось ее периодическое перемешивание.

Для подготовки образцов использовался мазок крови, приготовленный на предметном стекле стандартным для клинической лаборатории методом. Фиксация клеток в мазке производилась в смеси Никифорова в течение 20 мин. Фиксированный мазок высушивался на воздухе.

Исследование морфологии эритроци

тов проводилось методом атомно-силовои микроскопии (ACM) на сканирующем зон-довом микроскопе SOLVER PRO (NT-MDT) в полуконтактном режиме на воздухе с использованием зонда марки NSG10.

Результаты и обсуждение

Представленные на рисунке 1 АСМ-изображения демонстрируют характерные изменения формы индивидуальных эритроцитов с ростом дозы облучения.

а)

б)

в)

Рис. 1. Типичные АСМ-изображения и профили сечения индивидуальных эритроцитов при различных дозах облучения О, (Вт с)/см : а) 0; б) 0,5; в) 2

На рисунке 2 представлена дозовая зависимость среднего объема эритроцитов, определенного на основе анализа АСМ-изображений. При малых дозах облучения (до 0,5 (Вт-с)/см2) наблюдается изменение формы эритроцита: характерная для эритроцита форма дискоцит переходит в сфероцит (рис. 1 б). При этом средний объем клеток практически не изменяется (рис. 2). Дальнейшее увеличение дозы облучения приводит к восстановлению характерной формы эритроцита (рис. 1 в) и увеличению среднего объема клеток. При последующем увеличении дозы вплоть до 7,5 (Вт-с)/см2 эритроцит сохраняет дискоидальную форму, однако глубина вогнутости в центре дискоцита

Влияние излучения Не-!Че лазера на морфологию эритроцитов человека

47

немонотонно изменяется с дозой облучения. При средней высоте клеток для всех доз порядка 600 нм глубина вогнутости варьируется от 100 до 500 нм, достигая максимального значения при дозе 7,5 (Вт-с)/см2.

О, (Вт с)/см

Рис. 2. Дозовая зависимость среднего объема эритроцитов

Изменение характерной формы эритроцита связано с морфофункциональной нестабильностью клеточной мембраны в результате активизации процессов ПОЛ. При накоплении в мембране продуктов ПОЛ происходит ее структурная реорганизация с образованием липидных кластеров, малоподвижных конгломератов липидов, ограничивающих подвижность встроенных в мембрану белковых молекул различного функционального назначения-

Следствием перестройки мембраны эритроцита являются избирательное увеличение ее проницаемости для ионов Н+ и/или ОН-, увеличение проницаемости для ионов Са2+ и 1У^2+, снижение электрической стабильности и изменение электрического потенциала мембраны. Увеличение объема эритроцитов с ростом дозы (рис. 2) может быть связано с увеличением ионной проницаемости мембраны вследствие активации фермент-насосов ]\/^2+-, Са2+-АТФазы [2; 3].

Восстановление формы эритроцита (рис. 1 в) происходит в результате включения механизма антиоксидантной защиты, компенсирующего процесс липидной пероксидации [1].

Характерные изменения параметров с увеличением дозы облучения наблюдаются и для внешней поверхности мембраны эритроцита. На АСМ-изображениях поверхности мембраны (рис. 3) видно, что при малых дозах облучения (до 0,5

і» да зи

Рис. 3. АСМ-изображения поверхности мембраны эритроцитов и графики плотности распределения высот поверхности при различных дозах О,

(Вт с)/см2: а) 0; 6)0,5; в) 2

На рисунке 4 представлена дозовая зависимость средней высоты рельефа поверхности мембраны эритроцита. Видно, что с увеличением дозы облучения происходит обратимое изменение шероховатости поверхности эритроцитов.

О, (Вт -с)/см2

Рис. 4. Дозовая зависимость средней высоты рельефа поверхности мембраны эритроцитов на площади 500x500 нм"

Наблюдаемое изменение рельефа мембраны эритроцита с ростом дозы облучения можно интерпретировать следующим образом. При малых дозах облучения мембрана становится более вязкой и жесткой вследствие формирования малоподвижных липидных кластеров при накоплении продуктов ПОЛ. При дальнейшем увеличении дозы стимулируется выработка клеточных ферментов антиокси-дантной защиты, ограничивающих степень окислительной альтерации мембраны эритроцита. Этот процесс приводит к увеличению содержания в мембранах фосфолипидов, уменьшающих ее вязкость и жесткость. Как следствие, поверхность мембраны становится более шероховатой, а сама мембрана - более эластичной.

Заключение

Таким образом, в результате воздействия излучением гелий-неонового лазера на кровь человека при дозах 0,5 7,5

(Вт-с)/см2 происходит изменение формы,

объема эритроцитов, а также шероховатости его мембраны в результате протекания двух конкурирующих процессов: перекисного окисления липидов и стимуляции клеточных ферментов антиокси-дантной защиты. При указанных дозах наблюдается необратимое изменение объема эритроцитов вследствие увеличения ионной проницаемости цитоплазматической мембраны.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Бриль Г.Е. Молекулярно-клеточные основы те-

рапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения. Саратов: Саратовский медицинский университет, 2000. 41 с.

[2] Клебанов Г.И. Мембранные механизмы фото-

биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения // Мебраны. 2000. № 6.

[3] Владимиров Ю.А. Три гипотезы о механизме действия красного (лазерного) света // Эфферентная медицина / ред. С.Я. Чикин. М.: НИИ физ.-хим. медицины, 1994. С. 23-35.