Композиции и способы для улучшения молочной продуктивности и репродуктивного здоровья млекопитающих, основанные на применении IL-8
COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING MILK PRODUCTIVITY AND REPRODUCTIVE HEALTH OF MAMMALS BASED ON USE OF IL-8

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет по заявке на патент США №62/099,643, поданной 5 января 2015 года, раскрытие которой включено в данный документ путем ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится, в общем, к улучшению молочной продуктивности и репродуктивного здоровья млекопитающих за счет введения интерлейкина-8 (IL-8).
Уровень техники
По мере роста населения мира и, что более важно, по мере увеличения паритета покупательной способности на душу населения, спрос на животный белок (молоко, мясо и яйца) будет неуклонно и неизбежно расти; для того, чтобы избежать инфляционных давлений, поставки продуктов на основе животного белка должны значительно и устойчиво расти с минимальным расширением использования сельскохозяйственных земель. Кроме того, сообщалось, что эффективность использования кормов является единственным наибольшим фактором, способствующим изменениям в фактических выбросах в пересчете на углекислый газ, и что повышение эффективности конверсии корма может снизить выбросы парниковых газов как за счет сокращения количества метана в кишечнике, так и выхода навоза. Послеродовые заболевания матки, такие как метрит, эндометрит и задержка отделения плаценты, важны по причинам соответствия требованиям содержания животных, способствуя дискомфорту у коров и выведению из стада; в сочетании с глубоко затронутым репродуктивным потенциалом, сниженным выходом молока и затратами на лечение. Метрит и эндометрит обычно ассоциируются со смешанной бактериальной инфекцией матки, которая включает Е. coli, Т. pyogenes и F. necrophorum (Bicalho et al., 2012). Сопутствующим фактором, повышающим восприимчивость к заболеваниям матки, является иммуносупрессия, с которой сталкиваются коровы во время околородового периода (Drackley, 1999; Cai et al., 1994; Kimura et al., 1999; Hammon et al., 2006; Galvao et al., 2010). Существует постоянная и неудовлетворенная потребность в улучшенных подходах, направленных на профилактику и лечение послеродовых заболеваний, а также в улучшении репродуктивного потенциала и молочной продуктивности. Настоящее изобретение относится к этим и другим потребностям.
Сущность изобретения
В одном аспекте, настоящее изобретение включает применение рекомбинантного IL-8 для улучшения молочной продуктивности самками млекопитающих. Введение IL-8 также применяется для профилактики и/или лечения одного или нескольких заболеваний матки и для профилактики или лечения гиперкетонемии у самок млекопитающих.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения здоровья самки млекопитающего, и/или увеличения молочной продуктивности и/или содержания жира в молоке, вырабатываемом млекопитающим. Способ включает стадию, на которой вводят самке млекопитающего IL-8, таким образом, что, по меньшей мере, улучшается здоровье самки млекопитающего, и/или у млекопитающего увеличивается количество молока, и/или увеличивается содержание жира в молоке.
В одном варианте осуществления, IL-8 вводят беременной самке млекопитающего, или самке млекопитающего после родов, например, 12 месяцев после родов. В одном варианте осуществления, введение IL-8 сопровождается профилактикой или лечением метрита или задержки отделения плаценты, или ингибированием гиперкетонемии у млекопитающего, или их комбинацией. В вариантах осуществления, введение IL-8 является пероральным, парентеральным, подкожным, внутрислизистым или внутрибрюшинным. Парентеральные введения включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутривагинальное, внутриматочное и подкожное введение. В одном варианте осуществления, введение IL-8 представляет собой внутриматочное введение.
В различных аспектах, настоящее изобретение обеспечивает улучшение здоровья млекопитающего за счет ингибирования развития послеродового метрита, или за счет ингибирования задержки отделения плаценты, или за счет увеличения молочной продуктивности у млекопитающего, включая, но не ограничиваясь приведенным, увеличение энергетически скорректированной молочной продуктивности, или за счет увеличения содержания жира в молоке, вырабатываемом самкой млекопитающего, или комбинации изложенного выше.
В вариантах осуществления, самка млекопитающего представляет собой крупный рогатый скот, такой как молочная корова. В вариантах осуществления, самка млекопитающего является членом популяции самок млекопитающих одного и того же вида, и введение IL-8 предоставляется другим членам популяции.
В другом аспекте, настоящее изобретение включает молоко, вырабатываемое самкой млекопитающего, которой был введен IL-8, а также молочные продукты, полученные с использованием такого молока.
В другом аспекте, настоящее изобретение включает набор для i) улучшения здоровья самки млекопитающего, и/или ii) увеличения молочной продуктивности и/или содержания жира в молоке, вырабатываемом млекопитающим, при этом набор содержит IL-8 в одном или более герметичных контейнерах, устройство доставки и инструкции по введению IL-8 самке млекопитающего для того, чтобы получить i) или ii). Устройство доставки может быть приемлемо для введения IL-8 в матку нечеловекообразного млекопитающего.
В другом аспекте, настоящее изобретение включает готовое изделие, содержащее IL-8 в герметичном контейнере, упаковку и печатную информацию, при этом печатная информация определяет IL-8 как содержимое упаковки и обеспечивает указание на то, что IL-8 следует применять для улучшения здоровья самки млекопитающего, и/или ii) увеличения молочной продуктивности и/или содержания жира в молоке, вырабатываемом млекопитающим.
Краткое описание чертежей
Фигура 1: Молочная продуктивность (кг/сутки) за неделю лактации для первородящих и многородящих коров. Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения. Общая молочная продуктивность была выше для коров с L-IL8 и H-IL8 по сравнению с контрольными коровами (Р-значение < 0,01). Взаимосвязь между лечением и неделей лактации была незначимой (Р-значение = 0,06). Звездочка (*) указывает на то, что еженедельные значения отличаются (Р-значение < 0,05).
Фигура 2: Скорректированная по жиру молочная продуктивность (кг/сутки) в течение первых двух месяцев лактации. Общая скорректированная по жиру молочная продуктивность была выше для коров с L-IL8 и H-IL8, чем для контрольных коров (Р-значение = 0,02). Взаимосвязь между лечением и месяцем лактации была незначимой (Р-значение = 0,89). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 3: Энергетически скорректированная молочная продуктивность (кг/сутки) в течение первых двух месяцев лактации. Общая энергетически скорректированная молочная продуктивность была выше для коров с L-IL8 и H-IL8 по сравнению с контрольными аналогами (Р-значение = 0,02). Взаимосвязь между лечением и месяцем лактации была незначимой (Р-значение = 0,56). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 4: Линейная оценка количества соматических клеток в течение первых двух месяцев лактации. Общая линейная оценка количества соматических клеток не зависела от лечения (Р-значение = 0,02). Взаимосвязь между лечением и месяцем лактации была незначимой (Р-значение = 0,09). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 5: Влияние лечения на диагностированный на ферме уровень заболеваемости послеродовым метритом у первородящих и многородящих коров.
Фигура 6: Влияние лечения на уровень заболеваемости клиническим эндометритом у первородящих и многородящих коров.
Фигура 7: Концентрация бета-гидроксибутирата (ВНВА) в крови по DIM. Общая концентрация ВНВА в крови составляла 0,77 мкмоль/л (95% CI=0,65-0,90), 0,62 мкмоль/л (95% CI=0,50-0,74) и 70 мкмоль/л (95% CI=0,58-0,82) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,22). Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,66). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 8: Концентрация IL-8 в крови по DIM. Общая концентрация IL-8 в крови не увеличивалась при внутриматочной инфузии IL-8 (Р-значение = 0,17). Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,16). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 9: Ректальная температура по DIM. Общая ректальная температура не отличалась между группами лечения (Р-значение = 0,47). Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,13). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 10: Уровни гаптоглобина в крови по DIM. Общий уровень гаптоглобина в крови не увеличивался при внутриматочной инфузии IL-8 (Р-значение = 0,96). Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,48). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 11: Снижение упитанности в баллах со дня родов до 35 DIM не зависела от лечения (Р-значение = 0,99).
Фигура 12: Уровни IGF-1 в крови по DIM. Общий уровень IGF-1 в крови не увеличивался при внутриматочной инфузии IL-8 (Р-значение = 0,18). Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,25). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 13: Концентрация глюкозы в сыворотке по DIM. Общая концентрация глюкозы в сыворотке не увеличивалась при внутриматочной инфузии IL-8 (Р-значение = 0,10). Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,55). Величины ошибок означают стандартную ошибку среднего значения.
Фигура 14: Влияние лечения на уровень заболеваемости субклиническим кетозом.
Фигура 15: Репрезентативные выравнивания аминокислотных последовательностей IL-8 от отдельных видов животных. Последовательности показаны от N- до С-конца. Последовательность для каждого вида и консенсусная последовательность является смежной по всем рядам. Последовательность Bos taums представляет собой SEQ ID NO: 1. Последовательность Bubalus bubalus представляет собой SEQ ID NO: 4. Последовательность Cervus elephus представляет собой SEQ ID NO: 5. Последовательность Ovis aries представляет собой SEQ ID NO: 6. Последовательность Equus caballus представляет собой SEQ ID NO: 7. Последовательность Homo sapiens представляет собой SEQ ID NO: 8. Последовательность Canis lupus familiaris представляет собой SEQ ID NO: 9. Последовательность Felus catus представляет собой SEQ ID NO: 10. Консенсусная из конкретных последовательностей млекопитающего, показанная в нижнем ряду, представляет собой SEQ ID NO: 11.
Фигура 16: Влияние различных внутриматочных доз лечения IL-8 на процентное содержание молочного жира в первый и второй месяцы лактации. Столбцы показаны для первого месяца и второго месяца слева направо как контроль, низкий IL-8, средний IL-8 и высокий IL-8.
Фигура 17: Влияние различных внутриматочных доз лечения IL-8 на суточную молочную продуктивность.
Фигура 18: Влияние различных внутриматочных доз лечения IL-8 на еженедельную молочную продуктивность.
Фигура 19: Влияние различных внутриматочных доз лечения IL-8 на скорректированное по жиру 3,5% молоко. Столбцы показаны слева направо как контроль, IL8-ВЫСОКИЙ, IL8-СРЕДНИЙ и IL8-НИЗКИЙ.
Фигура 20: Влияние различных внутриматочных доз лечения IL-8 на энергетически скорректированное молоко. Столбцы показаны слева направо как контроль, IL8-ВЫСОКИЙ, IL8-СРЕДНИЙ и IL8-НИЗКИЙ.
Фигура 21: Графическое представление данных, показывающее, что внутривлагалищное введение IL-8 значительно увеличивает молочную продуктивность. IL-8 вводили в день 0.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится, в общем, к введению эффективного количества IL-8 самкам млекопитающих с целью улучшения здоровья самок млекопитающих, которое может включать профилактику и/или лечение одного или нескольких заболеваний матки и/или гиперкетонемии, и увеличения молочной продуктивности и/или содержания жира в молоке, и их комбинации. Настоящее изобретение, таким образом, охватывает введение эффективного количества IL-8 млекопитающему, таким образом, что молочная продуктивность млекопитающим увеличивается, и/или содержание жира в молоке, вырабатываемом млекопитающим, увеличивается, и/или у млекопитающего уменьшается заболевание матки и/или уменьшается гиперкетонемия. В вариантах осуществления, количество молока, вырабатываемого млекопитающим, увеличивается и собирается. В вариантах осуществления, уменьшенное заболевание матки включает, но необязательно ограничивается уменьшенным эндометритом и/или послеродовым метритом, и/или уменьшенной задержкой отделения плаценты.
Что касается заболеваний матки, как известно в данной области техники, метрит, в общем, включает воспаление стенки матки, в то время как эндометрит, в общем, включает воспаление эндометрия. В этом отношении, открытие в соответствии с настоящим изобретением, что экзогенно введенный IL-8 оказывает полезное влияние на здоровье матки, было непредвиденным, поскольку среди известных функций IL-8 является его связь с воспалением. Кроме того, случайное открытие благоприятного влияния IL-8 на содержание молочного жира и молочную продуктивность, как далее описано ниже, было неожиданным. Принимая во внимание данные результаты, способы в соответствии с настоящим изобретением в результате приводят к увеличению здоровья самки млекопитающего, о чем свидетельствует, например, увеличение молочной продуктивности, увеличение скорректированной по жиру молочной продуктивности, увеличение энергетически скорректированной молочной продуктивности, уменьшение уровня заболеваемости задержкой отделения плаценты, уменьшение уровня заболеваемости или тяжести метрита, или клинического эндометрита, или послеродового метрита, или улучшение упитанности в баллах млекопитающего при родах, или уменьшение кетоз, включая, но необязательно ограничиваясь приведенным, уменьшение гиперкетонемии, или уменьшение ректальной температуры, или их комбинации. Таким образом, настоящее изобретение включает множество путей, с помощью которых можно улучшить общее состояние здоровья и репродуктивную функцию самок млекопитающих.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что энергетически скорректированное молоко (ЕСМ) представляет собой количество энергии в молоке на основе молока, жира и белка и доведенное до 3,5% жира и 3,2% белка. Обычная формула ЕСМ представляет собой ЕСМ = (0,327 × молоко фунт) + (12,95 × жир фунт) + (7,65 × белок фунт).
Ожидается, что способы в соответствии с настоящим изобретением будут применимы к любой самке млекопитающего. В вариантах осуществления, настоящее изобретение направлено на ветеринарные подходы, и, таким образом, в данном аспекте относится к нечеловекообразным млекопитающим. В вариантах осуществления, самка нечеловекообразного млекопитающего, которой вводят IL-8, представляет собой жвачное животное, включая, но необязательно ограничиваясь приведенным, крупный рогатый скот, овец, антилоп, оленей, жирафов и их родственников, и, кроме того, может включать псевдожвачных животных, таких как верблюды. В вариантах осуществления, жвачное животное представляет собой самку крупного рогатого скота, которое является членом рода Bos, таким как волы, коровы и буйволы. В одном варианте осуществления, жвачное животное представляет собой молочную корову. В вариантах осуществления, молочная корова представляет собой первородящую или многородящую корову. В вариантах осуществления, самка млекопитающего является копытным животным.
В одном варианте осуществления, настоящее изобретение включает введение IL-8 члену рода Sus, и, следовательно, охватывает практическое применение настоящего изобретения к любой свинье, примеры которой не ограничиваются домашней свиньей (то есть, Sus domesticus), также обычно называемой свиньей или домашней свиньей.
Настоящее изобретение также включает введение IL-8 млекопитающим, которые не относятся к крупному рогатому скоту и жвачным животным, включая, но необязательно ограничиваясь приведенным, лошадиных, собачих и кошачих. В вариантах осуществления, настоящее изобретение включает введение IL-8 водным млекопитающим, таким как китообразные млекопитающие, примеры которых необязательно ограничиваются китами, дельфинами и морскими свиньями. Таким образом, настоящее изобретение в определенных аспектах относится к животным-компаньонам, а также к животным, содержащимся в условиях сохранения, например, в зоопарках или аквариумах.
Кроме того, предполагается, что способы, описанные в данной заявке, являются приемлемыми для использования людьми, например, путем введения IL-8 женщине с целью увеличения молочной продуктивности или увеличения пищевой ценности молока за счет увеличения содержания жира в нем.
Конкретные реализации настоящего изобретения могут также исключать введение IL-8 при определенных обстоятельствах. Например, в определенных подходах введение IL-8 не предоставляется млекопитающему, молоко которого не получают после введения IL-8. В определенных вариантах осуществления, молоко, полученное после введения IL-8, например, молочной корове, является приемлемым для потребления человеком. Таким образом, в определенных вариантах осуществления введение IL-8 происходит нечеловекообразному млекопитающему, молоко которого, как предполагается, будут получать и/или получают, при этом молоко предназначено для потребления человеком и/или потребляется людьми. В определенных аспектах, настоящее изобретение может исключать введение IL-8 конкретным типам млекопитающих. В одном примере, IL-8 не вводится грызуну. Настоящее изобретение может, таким образом, включать введение IL-8 всем типам млекопитающих, за исключением грызунов, конкретные примеры которых включают, но не ограничиваются приведенным, мышей, крыс и морских свинок. В другом примере, приматы, включая или один из, или как человекообразных, так и нечеловекообразных приматов, могут быть исключены из группы млекопитающих, которым вводят IL-8. В одном примере, млекопитающее, которому вводят IL-8, не имеет тромбоза, включая, но не ограничиваясь приведенным, тромбоз глубоких вен. В определенных вариантах осуществления, настоящее изобретение может исключать введение IL-8 во время определенных периодов времени, например, в определенных вариантах осуществления настоящее изобретение может исключать введение IL-8 во время беременности с целью содействия оплодотворению, имплантации или для того, чтобы вызвать сократительную деятельность матки. В определенных аспектах, IL-8 не вводят видам млекопитающих, у которых острое воспаление после коитуса является существенным и/или способствует зачатию. В определенных вариантах осуществления, IL-8 не вводят путем прямой инфузии в молочную ткань или сосок, и, таким образом, в вариантах осуществления введение IL-8 не вызывает или не способствует маститу.
IL-8 хорошо известен в данной области техники как хемокин, продуцируемый рядом различных типов клеток, включая макрофаги. Он также упоминается как CXCL8 и связывается со специфичностью с рецепторами CXCR1 и CXCR2. Он продуцируется в виде белка-предшественника, который обычно составляет от 99 аминокислот (для человеческого IL-8) и вплоть до 103 аминокислот для других видов, и подвергается расщеплению для продуцирования активных изоформ. Расщепленная версия человеческого IL-8, которая наиболее часто секретируется человеческими макрофагами, составляет 72 аминокислоты в длину. В связи с этим, хотя в настоящем изобретении представлены определенные репрезентативные примеры влияния введения рекомбинантного IL-8 крупного рогатого скота молочным коровам, ожидается, что любой IL-8, экспрессируемый любым животным, может быть использован в способах в соответствии с настоящим изобретением. В неограничивающих вариантах осуществления, IL-8 является рекомбинантно продуцированным Bos taunts IL-8, который включает следующую последовательность или фрагмент:
MTSKLAVALL AAFLLSAALC EAAVLSRMST ELRCQCIKTH STPFHPKFIK ELRVIESGPH CENSEIIVKL TNGNEVCLNP KEKWVQKVVQ VFVKRAEKQD Р (SEQ ID NO: 1).
В вариантах осуществления, IL-8 представляет собой процессированную форму и, таким образом, является короче, чем последовательность предшественника IL-8. В вариантах осуществления, IL-8 составляет, по меньшей мере, 70 аминокислот в длину. В вариантах осуществления, IL-8, используемый в способах в соответствии с настоящим изобретением, имеет, по меньшей мере, 70 смежных аминокислот IL-8, причем, по меньшей мере, 70 аминокислот имеют, по меньшей мере, 70,0% гомологию с последовательностью крупного рогатого скота, представленной выше, и/или консенсусной последовательностью, представленной на фигуре 15 (нижний ряд выравнивания). В вариантах осуществления, IL-8 содержит или состоит из последовательности, которая является на 70-100% идентичной последовательности Bos Taunts по 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80, или более, ее смежным аминокислотам. В вариантах осуществления, такие идентичность и длина последовательности относятся к аминокислотной последовательности, начинающейся с N-конца, или начинающейся с любой аминокислоты от N-конца через аминокислотное положение 2-25, включительно, и включая каждое аминокислотное положение между ними. В вариантах осуществления, IL-8 содержит или состоит из последовательности или фрагмента любой аминокислотной последовательности, представленной на фигуре 15. В одном варианте осуществления, IL-8 содержит изменение ELR до AAR в последовательности Bos Тайга, показанной на фигуре 15 (SEQ ID NO: 1).
IL-8, использованный в способах в соответствии с настоящим изобретением, может быть получен из любого приемлемого источника. В одном варианте осуществления, IL-8 коммерчески получают от поставщика. Например, человеческий IL-8, экспрессированный в E.coli и представленный в виде лиофилизированного порошка, может быть получен от Sigma Aldrich. IL-8 крупного рогатого скота может быть получен от Kingfisher Biotech, Inc., Saint Paul, MN. Альтернативно, IL-8 может быть получен рекомбинантно с использованием методов, хорошо известных специалисту в данной области техники, например, с использованием системы экспрессии белка.
В неограничивающем и иллюстративном варианте осуществления, IL-8 получают рекомбинантно с использованием следующего подхода или его модификаций, которые будут очевидны для специалиста в данной области техники, учитывая преимущества настоящего изобретения. Конструирование плазмиды. рЕТ28-His-L-EK-IL8 конструировали путем субклонирования из Trc-His-L-EK-IL8 в рЕТ28А (NOVAGEN, Darmstadt, Germany) с использованием сайтов рестрикции Nhel и Xhol. Исходную Trc-плазмиду конструировали путем ПЦР-амплификации кДНК IL-8 ΔSS крупного рогатого скота, оптимизированной в отношении кодонов, с использованием следующих нуклеотидов; 5' - С GGCGCC GTG CTG ТСТ CGT ATG ТСС АСС GAA С (SEQ ID NO:2) и 5' - G CTCGAG ТСА CGG АТС TTG ТТТ ТТС TGC ACG (SEQ ID NO:3). Продукт ПЦР был ТА клонированным в вектор pGEM Т (PROMEGA, Madison, WI) и был секвенирован после скрининга на белые/синие колонии. Затем корректный клон расщепляли с использованием рестрикционных ферментов SfoI и XhoI и лигировали в вектор pTrcHis В (Invitrogen, Carlsbad, СА). Для того, чтобы сохранить нативную версию IL-8 при расщеплении энтерокиназой, вектор Trc получали путем расщепления с использованием BamHI с последующим расщеплением с использованием нуклеазы золотистой фасоли для того, чтобы удалить 5'-выступающий конец и создать тупой конец для лигирования, затем вектор расщепляли с использованием XhoI. Конечный конструкт был подтвержден секвенированием.
Экспрессия рекомбинантного IL-8. Для того, чтобы определить предпочтительные условия экспрессии E.coli BL21 для полной версии IL-8 и усеченной формы (без сигнального пептида), кодирующие последовательности клонировали в векторе рЕТ, пилотный эксперимент по исследованию зависимости от времени выполняли следующим образом. Все стадии роста инкубировали при 37°С при 200 об./мин. в бульоне LB или планшетах, содержащих 300 мкг/мл канамицина, в колбах Эрленмейера на 125 мл или чашках Петри. Замороженные исходные культуры (-80°С) реактивировали в течение ночи в 20 мл среды. На следующий день 0,4 мл растущей культуры переносили в 40 мл свежей среды и добавляли 1 мМ IPTG, когда O.D. достиг 600 нм, аликвоту 1 мл удаляли перед индуцированием IPTG и с интервалами в один час в течение 4 часов. Каждый образец центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин и осадки повторно суспендировали в лизирующем буфере (10 мМ Tris-HCL; 1 мМ ЭДТА; 0,1 н NaOH; 0,5% SDS). Затем нерастворимые белки и клеточный дебрис осаждали в течение 10 минут при 13000 g при 4°С. Супернатант кипятили с буфетом Лэммли (63 мМ Tris-HCL рН 6,8; 10% глицерина; 2% SDS (квалификация «для электрофореза»), 0,1% β-меркаптоэтанола и 0,0005% бромфенолового синего) в течение 5 минут для загрузки в 12% SDS-полиакриламидный гель. Электрофорез выполняли при 80 В в течение 90 минут.Гель окрашивали красящим раствором в течение 30 минут и обесцвечивали обесцвечивающим раствором (Bio-Rad) в течение 2 часов при интенсивном встряхивании. Мы экспрессировали (pET28-His-LEK-IL8) IL8 в E.coli. Экспрессированный pET28-His-LEK-IL8 является частично растворимым и подходящим для очистки.
Композиции, содержащие IL-8, для использования в способах в соответствии с настоящим изобретением, могут быть представлены в различных формах и доставлены различными путями. Композиции для использования у людей или нечеловекообразных млекопитающих могут быть получены путем смешивания IL-8 с любыми подходящими фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами и/или стабилизаторами. Некоторые примеры композиций, подходящих для смешивания с IL-8, могут быть найдены в: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins. В определенных аспектах, IL-8 может быть добавлен к корму млекопитающего, и, таким образом, потребляется в качестве пищевой добавки для поддержки репродуктивного здоровья и/или молочной продуктивности.
Композиции, содержащие IL-8, могут быть введены млекопитающему с использованием любого доступного способа и пути, включая пероральное, парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутривагинальное, внутриматочное и подкожное введение. Композиция может быть введена путем внутрислизистого подхода. Введение IL-8 может быть выполнено до или после родов и может быть выполнено во время беременности.
В определенных вариантах осуществления, с учетом определенных положений, как дополнительно описывается в данной заявке, композиции, содержащие IL-8, вводят беременному млекопитающему и, таким образом, используют предродовое введение. В определенных подходах, предродовое введение выполняется во время периода маммогенеза, который варьируется от вида к виду, но находится в последней трети периода беременности. В качестве неограничивающей иллюстрации, в одном варианте осуществления, период беременности коровы голштинской породы составляет 280 дней. Таким образом, считают, не намереваясь быть связанными теорией, что введение IL-8 после приблизительно 180 дней периода беременности, помогает развитию молочной железы, что приводит к увеличению молочной продуктивности в послеродовом периоде.
В одном варианте осуществления, предродовое введение включает внутривагинальное введение композиции, содержащей IL-8. В одном неограничивающем примере, внутривлагалищное введение композиции, содержащей IL-8, проводят беременному млекопитающему, такому как молочная корова.
В определенных вариантах осуществления, композиции, содержащие IL-8, вводят млекопитающему, которое недавно родило, и, таким образом, используется послеродовое введение. В вариантах осуществления, используется послеродовое внутриматочное введение. В одном неограничивающем примере, послеродовое внутриматочное введение композиции, содержащей IL-8, проводится млекопитающему, такому как молочная корова, в пределах 72 часов после родов (родоразрешения). Введение в пределах более короткого или более длительного времени после родов также охватывается настоящим изобретением. В определенных неограничивающих примерах, композиция, содержащая IL-8, вводится непосредственно после родов, и вплоть до 20 недель после родов. В определенных подходах, настоящее изобретение, таким образом, включает введение в тот же день, что и роды, или в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, ПО, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 дней, включительно, и включая все диапазоны целых чисел между ними.
В определенных подходах, настоящее изобретение включает в качестве альтернативы введению экзогенного IL-8, стимулирование продуцирования эндогенного IL-8, таким образом, что получают один или более эффектов, описанных в данной заявке. В неограничивающих примерах, стимулирование продуцирования экзогенного IL-8 включает введение млекопитающему одного или более стимулирующих IL-8 соединений и/или композиций, включая, но необязательно ограничиваясь приведенным, фактор некроза опухолей альфа (TNF-α), липополисахарид (LPS), интерлейкин-1 (IL-1), фактор активации тромбоцитов (PAF), и/или другие вещества, которые могут быть использованы в вариантах осуществления настоящего изобретения, с учетом полезного эффекта настоящего изобретения.
В определенных вариантах осуществления, настоящее изобретение включает введение композиции, содержащей IL-8, одному или более млекопитающим, неограничивающим примером которого является молочная корова(ы), таким образом, что достигается любое одно или любая комбинация из следующего: i) увеличение молочной продуктивности; ii) увеличение энергетически скорректированной молочной продуктивности; iii) увеличение содержания жира в молоке, вырабатываемом млекопитающим; iv) уменьшение развития послеродового метрита и/или уменьшение уровня заболеваемости послеродовым метритом, когда проводится введение IL-8 множеству млекопитающих; v) уменьшение развития клинического эндометрита и/или уменьшение уровня заболеваемости клиническим эндометритом, когда проводится введение IL-8 множеству млекопитающих; vi) уменьшение гиперкетонемии, такое как уменьшение субклинического кетоза и/или уровня заболеваемости субклиническим кетозом, когда проводится введение IL-8 множеству млекопитающих, и vii) ингибирование задержки отделения плаценты. В вариантах осуществления, указанные выше эффекты введения IL-8 достигаются путем использования внутриматочного введения композиции, содержащей IL-8, но считается, что также могут использоваться другие пути введения.
Будет признано, что любой из перечисленных выше результатов, полученных в результате введения IL-8, можно сравнить с референтным значением для оценки эффекта введения IL-8. Может быть использовано любое приемлемое референтное значение, и специалист в данной области техники определит приемлемые референтные значения, учитывая полезный эффект настоящего изобретения. В вариантах осуществления, референтное значение может представлять собой одно значение или диапазон значений. Например, референтное значение может представлять собой стандартизированную кривую или область на графике. Референтное значение может включать положительный или отрицательный контроль. В вариантах осуществления, референтное значение включает измерение, сделанное из образца, полученного от млекопитающего, которому не вводили IL-8, или вводили другое количество IL-8, или использовали другую схему дозирования IL-8. В различных аспектах, измерение результата можно сравнить с референтным значением для обеспечения качественного или количественного определения результата, который может положительно или отрицательно коррелироваться с введением IL-8. В определенных вариантах осуществления, сравнение с референтным значением может быть выполнено специалистом в области обработки или исследования животных. Например, задержка отделения плаценты и метрит могут быть диагностированы обученным персоналом фермы в соответствии с конкретными протоколами, известными в данной области техники, и определенные измерения по сравнению с состоянием без отсутствия задержки отделения плаценты или без метрита могут быть сделаны данными специалистами, независимо от того, делают ли непосредственное сравнение или нет с приемлемым референтным значением. Например, в определенных вариантах осуществления, изменение маточных выделений, такое как появление зловонных, водянистых, красно-коричневых маточных выделений, сопровождающихся лихорадкой, может быть использовано для диагностики послеродового метрита, тогда как коровы после родов, которые не продуцируют маточные выделения с такими характеристиками, как установлено, не имеют послеродового метрита.
Настоящее изобретение включает введение IL-8 любому одному или более, чем одному млекопитающему, например, множеству или популяции млекопитающих. В одном варианте осуществления, множество млекопитающих включает группу молочных коров, которые могут присутствовать, например, на молочной ферме любого масштаба, который находится в диапазоне от нескольких молочных коров до коммерческой молочной фермы, на которой могут находиться тысячи молочных коров.
Как будет видно из результатов, представленных в примерах и на фигурах настоящего изобретения, репрезентативные, но неограничивающие эксперименты, демонстрируют указанные выше перечисленные эффекты с использованием внутриматочных и внутривлагалищных инфузий, включающих диапазон количеств IL-8. В конкретных и неограничивающих примерах демонстрируются аспекты настоящего изобретения с использованием 9,5 мг, 1,125 мг, 0,095 мг, 0,0095 мг и 11,25 мкг рекомбинантного IL-8. Таким образом, настоящее изобретение демонстрирует, что широкий диапазон количеств IL-8 может вызывать некоторые или все из этих эффектов, и с учетом полезного эффекта настоящего изобретения специалисту в данной области техники будет понятно, как модифицировать дозу IL-8 для получения желаемого результата у любого конкретного млекопитающего. Кроме того, настоящее изобретение включает демонстрацию того, что дозы IL-8, которые находятся в диапазоне от 9,5 мг до всего лишь 0,0095 мг, приводят к статистически значимому увеличению процентного содержания молочного жира. Соответственно, настоящее изобретение включает введение эффективного количества IL-8, при этом эффективное количество IL-8 представляет собой количество, которое в результате приводит к желаемому результату. В одном варианте осуществления, количество IL-8 составляет от 0,001 мкг до 10 мг, включая все целые числа и количества между ними до 0,001 мкг единицы, и все диапазоны мкг и мг между ними. В вариантах осуществления, млекопитающему вводят, по меньшей мере, 11,25 мкг IL-8. В связи с этим, форма и характер конкретного режима дозирования IL-8 будет определяться путем введения и другими известными переменными с учетом таких факторов, как размер, здоровье, возраст, тип видов млекопитающих, количество предыдущих родов (если таковые имеются), предыдущая история матки или других связанных состояний и факторы риска, связанные с состоянием матки и молочной продуктивностью. В одном варианте осуществления, млекопитающему необходимо введение IL-8 из-за, например, наличия риска или иной предрасположенности к маточному состоянию или из-за плохой молочной продуктивности. В вариантах осуществления, введение IL-8 является профилактическим или терапевтическим, или и тем, и другим.
Композиции IL-8 в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены один раз или серией доз, и могут вводиться одновременно или последовательно с любым другим соединением или композицией, предназначенными для улучшения общего состояния здоровья млекопитающего, или для конкретной цели способствования или усиления вызванных IL-8 эффектов, описанных в данной заявке. В вариантах осуществления, введение IL-8 используют в сочетании с антибиотиком, гормоном или фактором роста. В определенных подходах, IL-8 вводится только один раз, но при этом оказывает долговременное влияние на любой один или комбинацию результатов касательно здоровья и/или молочной продуктивности, как описано в данной заявке.
Введение композиции IL-8 может в результате приводить к увеличению молочной продуктивности и/или молока с увеличенным содержанием жира, в течение различных периодов времени после введения. Желаемое содержание молочного жира может быть определено с использованием любого приемлемого способа, некоторые из которых известны в данной области техники. Например, содержание молочного жира может быть определено с помощью, так называемого теста Бэбкока или метода Гербера. В вариантах осуществления, содержание жира в молоке увеличивается. Настоящее изобретение предусматривает демонстрацию увеличения молочного жира в молоке, полученном от молочных коров после внутриматочных и внутривлагалищных инфузий рекомбинантного IL-8. Таким образом, в определенных подходах, настоящее изобретение включает способы стимулирования молочной продуктивности с повышенным содержанием жира, и включает молоко, вырабатываемое такими способами.
В определенных аспектах, настоящее изобретение включает повышение молочного жира в молоке, вырабатываемом молочной коровой, относительно контроля, например, количества молочного жира в молоке, вырабатываемом молочной коровой, которая не получала введение IL-8. В определенных подходах, увеличенный молочный жир включает увеличение молочного жира (относительно контроля), составляющее, по Меньшей мере, от 0,01% до 0,5%, включительно, и включающее все числа до второго после запятой в десятичном числе между ними, и все диапазоны таких чисел. В определенных подходах, молоко, полученное в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, содержит, по меньшей мере, 3,4% молочного жира, и может содержать от 3,4% до 4,4% молочного жира, включая все числа до второго после запятой в десятичном числе между ними, и все диапазоны таких чисел. В определенных подходах, молоко содержит такие количества молочного жира, когда впервые получено от млекопитающего. Таким образом, указанные количества могут присутствовать в непереработанном молоке.
Практическое осуществление способов в соответствии с настоящим изобретением оказывает в определенных вариантах осуществления один или более эффектов на млекопитающее, которые являются долгосрочными в течение периода времени. Например, мы продемонстрировали увеличение молочной продуктивности и скорректированного по жиру и энергетически скорректированного молока в течение 11 месяцев после однократного введения IL-8. В определенных вариантах осуществления, введение IL-8 в результате приводит к увеличенной молочной продуктивности или увеличенной скорректированной по жиру и/или энергетически скорректированной молочной продуктивности, и/или увеличению содержания жира в молоке, в течение периода времени, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 месяцев после введения IL-8. Более продолжительные периоды времени также охватываются. В определенных подходах, введение IL-8 оказывает долговременное влияние на молочную продуктивность, который длится в течение одного периода лактации, то есть всего периода лактации, непосредственно после или во время которого вводят IL-8. В одном примере, период лактации заканчивается следующей беременностью. Настоящее изобретение включает в одном неограничивающем подходе введение IL-8 в однократной дозе, таким образом, что один или более эффектов на содержание молока и/или молочную продуктивность, как описано в данной заявке, сохраняются в течение периода времени, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 месяцев, или всего периода лактации, после или во время которого проводят однократное введение IL-8. В определенных вариантах осуществления, один или более эффектов IL-8 начинается в пределах периода времени 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней после введения IL-8 и могут сохраняться после этого в соответствии с любым из периодов времени, описанных в данной заявке.
В определенных аспектах, настоящее изобретение включает увеличение количества молока, вырабатываемого млекопитающим, таким как молочная корова. В определенных аспектах, увеличение молочной продуктивности включает увеличение, по меньшей мере, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 фунтов молока в день. Увеличение молочной продуктивности может оцениваться по отношению к контролю, такому как молочная корова, которой не вводится IL-8. Специалисту в данной области техники будет понятно, что значение любого вызванного IL-8 изменения, описанного в данной заявке, может быть принято, как, например, среднее значение, определенное из группы млекопитающих в течение периода времени.
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение включает получение молока, и включает само молоко, от млекопитающего, обработанного IL-8, как описано выше. Данный аспект включает введение IL-8 самке млекопитающего и сбор молока, вырабатываемого после введения. В одном варианте осуществления, молоко, вырабатываемое согласно данному способу, отличается от других типов молока тем, что оно имеет увеличенное содержание жира, такое как содержание молочного жира, как описано выше. В вариантах осуществления, обеспечены контейнеры, содержащие молоко, полученное от млекопитающего, обработанного IL-8. Контейнеры могут представлять собой любой контейнер, такой как контейнер, ориентированный на потребителя, например, молочную коробку, или более крупные контейнеры, такие как чаны, или контейнеры, приемлемые для транспортировки морским путем или другой транспортировки больших количеств молока. В вариантах осуществления, обеспечены продукты, изготовленные с использованием молока, полученного согласно описанного в данной заявке способа. Неограничивающие примеры таких продуктов включают сыр, йогурт, кремы на основе молока и сливки, мороженое, начинки на основе молочных продуктов и любой другой молочный продукт, изготовленный с помощью указанного молока. Таким образом, в вариантах осуществления, молочный продукт может содержать производное молока, такое как один или более отделенных компонентов молока, включая, но не ограничиваясь приведенным, молочный жир. Соответственно, молоко может обрабатываться для разделения компонентов молока для включения в различные молочные продукты. Настоящее изобретение включает изготовление таких продуктов с использованием обычных подходов, но путем замены ранее доступного молока на молоко в соответствии с настоящим изобретением.
В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает готовые изделия, такие как набор. Набор может включать фармацевтическую композицию, содержащую IL-8 в одном или нескольких герметичных контейнерах, то есть, стеклянных или пластиковых флаконах. Набор может включать шприц, катетер или другое устройство доставки. Например, в случае катетера это может быть катетер для искусственного осеменения (A.I.), такой как катетер Gilt A.I. или эквиваленты. Набор может также содержать пакет, такой как пакет, который является приемлемым для содержания раствора и адаптирован для использования с катетером для введения раствора млекопитающему, например, путем внутривлагалищной или внутриматочной доставки. Набор может необязательно включать инструкции по использованию его содержимого, написанные или на бумаге, или в машиночитаемом формате. Набор также может содержать IL-8, который должен быть смешан с носителем, такой как IL-8 в лиофилизированной форме, и в этом случае набор может дополнительно включать инструкции по восстановлению лиофилизированного IL-8 в носителе/растворе для введения млекопитающему. Например, носитель может представлять собой стерильную воду, физиологический раствор или фосфатный буференый солевой раствор. Носитель может быть обеспечен в одном или нескольких отдельных флаконах.
В другом аспекте, настоящее изобретение включает готовое изделие. Готовое изделие содержит IL-8, обеспеченный в упаковке. Упаковка может включать контейнер, или сама по себе может быть контейнером. Может быть использован любой приемлемый контейнер, такой как пластиковый или стеклянный контейнер, включая, но не ограничиваясь приведенным, пластиковые или стеклянные флаконы. В различных вариантах осуществления, готовое изделие включает печатный материал. Печатный материал может быть частью упаковки или может быть обеспечен на этикетке или в виде бумажного вкладыша или другого письменного материала, включенного в упаковку. Печатный материал предоставляет информацию, определяющую IL-8 как содержимое упаковки, и инструктирует потребителя, как применять IL-8, чтобы получить любой один или любую комбинацию эффектов на млекопитающих, как описано в данной заявке.
Принимая во внимание изложенное выше, и не намереваясь быть связанным какой-либо конкретной теорией, настоящее изобретение частично относится к наблюдению того, что фактором, способствующим повышению восприимчивости к заболеваниям матки, является иммуносупрессия, с которой сталкиваются коровы во время околородового периода (Drackley, 1999; Cai et al., 1994; Kimura et al., 1999; Hammon et al, 2006; Galvao et al, 2010). Нейтрофилы являются основным лейкоцитарным типом, участвующим в отделении плаценты (Kimura et al., 2002), и в бактериальном клиренсе после инфекции матки (Hussain, 1989) и молочной железы (Рааре et al., 2002). Функция нейтрофилов крови начинает снижаться до родов, достигает крайнего упадка вскоре после родов и медленно возвращается к предродовым уровням приблизительно через 4 недели после родов (Kehrli и Goff, 1989; Goff и Horst, 1997). Некоторые факторы могут объяснить потерю функции нейтрофилов, например, увеличение концентраций эстрадиола и кортизола в крови накануне отела, и дефицит питательных веществ и минералов, таких как витамины А и Е, кальций и селен (Goff и Horst, 1997; Kimura et al., 2002; Hammon et al., 2006). Кроме того, нейтрофилы у коров с задержкой отделения плаценты (RP) также обладали сниженной миграционной способностью и уменьшенной активностью миелопероксидазы (Kimura et al., 2002). Коровы с наибольшим притоком нейтрофилов в матку имеют сниженный риск бактериальной инфекции и уменьшенный уровень заболеваемости эндометритом (Gilbert et al., 2007). Считается также, что миграция нейтрофилов в молочную железу играет роль в клиренсе возбудителей мастита (Рааре et al., 2002). IL-8 представляет собой хемоаттрактант для нейтрофилов; связывание IL-8 с его рецепторами (CXCR1 и CXCR2) в нейтрофиле вызывает активацию нейтрофилов, стимулирует хемотаксис и увеличивает способность к фагоцитозу и уничтожению (Mitchell et al., 2003). Поскольку нейтрофилы играют роль в поддержании здоровья эндометрия, считается, что необходимым является соответствующий стимул для избирательного привлечения нейтрофилов в матку. Тем не менее, продолжение воспаления в результате приводит к развитию хронического заболевания матки, что ухудшает способность к размножению и снижает рентабельность молочных продуктов (Dubuc et al., 2011; Lima et al., 2013). Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает парадоксальный подход, в одном аспекте которого обеспечивает лечение и/или профилактику состояний матки, которые, как известно, положительно коррелируют с воспалением, за счет введения IL-8, который также, как известно, способствует воспалению. В этом отношении и не намереваясь ограничиваться теорией, мы разработали настоящее изобретение, исследуя, может ли введение IL-8, несмотря на его провоспалительные свойства, все же привлечь и активировать нейтрофилы в матке, что в результате приводит к раннему притоку нейтрофилов в полость матки, раннему отслоению плаценты, раннему клиренсу бактериального заражения и, в конечном итоге, конечному положительному результату в виде более здоровых более способных к размножению молочных коров. Как видно из следующих примеров, введение IL-8 в результате приводит к более здоровым и более способным к размножению молочным коровам и неожиданно улучшает продуцирование их молочную продуктивность и содержание жира в молоке.
Следующие примеры иллюстрируют конкретные варианты осуществления настоящего изобретения и не предназначены для его ограничения.
ПРИМЕР 1
Данный пример представляет описание материала и способов, используемых для получения данных, описанных в примере 2.
Ферма и управление
Исследование проводили в крупной коммерческой молочной ферме, расположенной в округе Каюга недалеко от Итаки, штат Нью-Йорк (NY). Ферма доила 3300 коров Гольштейна 3 раза в сутки в двойной параллельной доильной комнате с 52 стойлами. Коровы были размещены в сараях со стойлами открытого типа, с бетонными стойлами, покрытыми матрасами и подстилкой с навозными твердыми веществами. Всем коровам была предложена TMR, состоящая из приблизительно 55% грубого корма (кукурузный силос, сенаж и пшеничная солома) и 45% концентрата (кукурузная мука, соевая мука, рапс, хлопковое семя и цитрусовый жом) на основе DM. Рацион был составлен так, чтобы соответствовать или превышать требования к питательным веществам NRC для лактирующих коров Гольштейна весом 650 кг и вырабатывающих 45 кг 3,5% FCM (NRC, 2001). Репродуктивное управление фермой использовало комбинацию Presynch, Ovsynch, Resynch и обнаружения эструса, с от 25 до 30% коров, выращенных с помощью согласованного по времени AI, и оставшаяся часть выращивалась после обнаружения эструса исключительно с помощью контролирования активности (Alpro; DeLaval, Kansas City, МО).
План исследования, лечение и сбор образцов
Всего в исследовании было зарегистрировано 217 свежих коров. Коровы были группированы по количеству родов и случайным образом распределены в одну из трех групп лечения: контроль, IL-8 с низкой дозой (L-IL8) и IL-8 с высокой дозой (H-IL8). Коровы, распределенные в H-IL8 и L-IL8, получали внутриматочную инфузию 250 мл солевого раствора, содержащего 1,125 и 11,25 мкг рекомбинантного IL-8, соответственно. IL-8 был получен с использованием описанного выше pET28-His-LEK-IL8 и состоял из последовательности SEQ ID NO:l.
Контрольные коровы получали внутриматочную инфузию 250 мл солевого раствора в качестве плацебо. Все свежие коровы, которые были доступны в течение периода регистрации, были включены в исследование. Распределение случайным образом было завершено в Excel (Microsoft, Redmond, WA) с использованием функции случайных чисел и импортировано в программу фермы Dairy Comp 305 (Valley Agricultural Software, Tulare, CA).
Лечение проводилось не дольше, чем 14 часов после родов исследовательской группой следующим образом: коров ограничивали в свободе, и область промежности очищали и дезинфицировали 70% этанолом. Затем стерильный катетер «Gilt» A.I. (Livestock concepts, Hawarden), прикрепленный к 250 мл пакету с солевым раствором, вводили краниально во влагалище. Катетер был введен в матку, и наконечник воздействовал на полость матки, и лечение прокачивали внутрь матки. Проба и использованием тампона была собрана с кончика катетера; она была аэробно культивирована на CHROMagar-E.coli (CHROMagar, Paris, France) при 37°C.
Образцы молока и крови собирали у 60 коров (20 коров на группу лечения) в течение первых четырех дней лактации. Для получения образцов сыворотки кровь собирали из копчиковой вены/артерии, используя пробирку Vacutainer без антикоагулянта и иглу Vacutainer 62,54 см калибра 20 (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Все образцы крови переносили в лабораторию на льду и центрифугировали при 2000xg в течение 15 мин при 4°С; сыворотку собирали и замораживали при -80°С.
Выявление заболевания
Задержку отделения плаценты и метрит диагностировал и лечил обученный персонал фермы в соответствии с конкретными протоколами, разработанными Ambulatory and Production Medicine Clinic при Cornell University. После родов коров держали в одном загоне до 20 DIM. Данный загон контролировался работниками фермы, и коровы были отправлены на полный медицинский осмотр, если они демонстрировали признаки вялости и депрессии; у коров со зловонными, водянистыми, красно-коричневыми маточными выделениями, сопровождающимися лихорадкой, диагностировали послеродовой метрит и их лечили работники фермы. Персонал фермы проводил лечение вслепую. Задержка отделения плаценты определялась как состояние, при котором коровы были не способными отделять свои эмбриональные мембраны в течение 24 ч после отела.
Оценка клинического эндометрита проводилась исследователями на 35±3 DIM и определялась как наличие гнойных или слизисто-гнойных выделений, путем извлечения влагалищной слизи с использованием устройства Metricheck (Metricheck, SimcroTech, Hamilton, New Zealand). Влагалищные выделения оценивали с использованием модифицированной шкалы от 0 до 5 (0 = не извлечен секреторный материал, 1 = прозрачная слизь, 2 = пятна гноя во влагалищных выделениях, 3 = <50% гноя во влагалищных выделениях, 4 = >50% гноя во влагалищных выделениях, 5 = водянистые, фетидные влагалищные выделения). У коров, у которых была оценка ≥ 3, считался клинический эндометрит.
Ректальную температуру измеряли при регистрации, 3, 6 и 9 DIM с использованием цифрового термометра (GLA М750, GLA Agriculture Electronics, СА), оборудованного угловым зондом (11,5 см, 42о). Оценки упитанности в баллах регистрировались при регистрации и на 35 день лактации (DIM) одним исследователем с использованием 5-балльной шкалы с четверть-бальной системой, как описано ранее (Edmonson et al, 1989). Снижение упитанности в баллах определялось как разница между упитанностью в баллах (BCS) при регистрации и на 35 DIM.
Данные о теленке (самка, самец, двойня и мертворождение), помощь при родах, день беременности на момент родов, молочная продуктивность и количество соматических клеток были извлечены из базы данных фермы DairyComp 305 (Valley Agricultural Software, Tulare, CA).
Параметры крови и молока
Концентрации IL-8 в образцах сыворотки и молока определяли с использованием набора для ИФА человеческого IL-8 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), который был утвержден для использования у крупного рогатого скота. Образцы сыворотки также тестировали на концентрации бета-гидроксибутирата (ВНВА) с использованием электронной измерительной системы ВНВА (Precision Xtra, Abbott, Abingdon, UK), уже утвержденной для использования у животных. Считалось, что коровы, которых тестировали с более, чем 1,2 мкмоль/л ВНВА, по меньшей мере, в один из первых четырех дней лактации, имели субклинический кетоз. Уровни глюкозы в сыворотке измеряли с использованием портативного глюкометра (Accu-Check Active, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Уровни IGF-1 в сыворотке определяли с использованием набора для ИФА человеческого IGF-1 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN).
Концентрацию гаптоглобина в сыворотке определяли с использованием колориметрической методики, которая измеряет комплекс гаптоглобина/гемоглобина путем оценки различий в активности пероксидазы. Коротко говоря, 5 мкл плазмы или дистиллированной воды (для определения холостой пробы) добавляли к 7,5 мл раствора О-дианизидина (0,6 г/л О-дианизидина, 0,5 г/л ЭДТА и 13,8 г/л одноосновного фосфата натрия в дистиллированной воде; рН регулировали до 4,1) в боросиликатной пробирке. Двадцать пять микролитров раствора гемоглобина (0,3 г/л гемоглобина крупного рогатого скота в дистиллированной воде) сразу добавляли в каждую пробирку. Все пробирки инкубировали на водяной бане, установленной при 37°С в течение 45 мин. После инкубирования, в каждую пробирку добавляли 100 мкл свежеприготовленного раствора перекиси водорода с рабочей концентрацией 156 мМ. Все пробирки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубирования, 200 мкл из каждой пробирки переносили в одну лунку в 96-луночном полистирольном микропланшете с плоским дном, и оптическую плотность (OD) сразу считывали при 450 нм в считывателе для микропланшетов (BioTek Instruments, Model EL 340, Winooski, VT). OD холостого образца вычитали из OD всех образцов, содержащих плазму. Результаты были представлены как считывания оптической плотности при длине волны 450 нм, учитывая, что способ, который использовался, не содержит стандартной кривой.
Статистический анализ

Анализ описательной статистики проводился в JMPPRO 10, используя функции ANOVA и распределения хи-квадрат для непрерывных и категориальных данных, соответственно. Десять смешанных общих линейных моделей были установлены по данным с использованием процедуры MIXED SAS (SAS Institute). Зависимые переменные, которые оценивали в данном исследовании, представляли собой: среднюю суточную молочную продуктивность (кг/сутки), среднюю скорректированную по жиру молочную продуктивность (кг/сутки), среднее суточное энергетически скорректированное молоко (кг/сутки), линейную оценку SCC, концентрацию ВНВА в крови (мкмоль/л), концентрацию IL-8 в крови (пг/мл), гаптоглобин в крови, концентрацию IGF-1 в крови (нг/мл), концентрацию глюкозы в сыворотке (мг/дл) и ректальную температуру (°С). Данные включали серию повторяющихся измерений по каждой зависимой переменной в течение первых восьми недель лактации для средней суточной молочной продуктивности; первых двух месяцев лактации для средней скорректированной по жиру молочной продуктивности, средней суточной энергетически скорректированной молочной продуктивности и линейной оценки SCC; первых четырех дней лактации для концентрации ВНВА в крови, концентрации IL-8 в крови, гаптоглобина в крови, IGF-1 в крови и концентрации глюкозы в сыворотке; и на 3, 6 и 9 дни после родов для ректальной температуры. Для того, чтобы надлежащим образом оценить корреляцию внутри коров, величина погрешности была смоделирована путем наложения авторегрессивной ковариационной структуры первого порядка для всех статистических моделей (что предполагало корреляцию между повторяющимися измерениями внутри коров). Независимые переменные, предложенные для моделей, представляли собой: лечение, количество родов, наличие плаценты при регистрации, результат по внутриматочной культуре Е. coli, помощь при родах, теленок, оценка упитанности в баллах при родах, день беременности на момент родов, температура при регистрации и время сбора данных. Моделям были предложены биологически правдоподобные двухсторонние и трехсторонние взаимосвязи. Кроме того, переменные и их соответствующие эффекты взаимосвязи во всех моделях сохранялись в модели при Р-значении <0,10. Переменная «лечение» была вынужденной во всех моделях.
Для того, чтобы оценить влияние лечения на вероятность послеродового метрита, клинического эндометрита и субклинического кетоза, три смешанные логистические регрессии были установлены для данных с использованием процедуры GLIMMIX SAS. Модели включали фиксированные влияния лечения, количество родов, наличие плаценты при регистрации, результат по внутриматочной культуре Е. coli, помощь при родах, теленка, оценку упитанности в баллах при родах, день беременности на момент родов и температуру при регистрации. Моделям были предложены биологически правдоподобные двухсторонние и трехсторонние взаимосвязи. Более того, переменные и их соответствующие влияния взаимосвязи во всех моделях сохранялись в модели при Р-значении <0,10. Переменные «лечение», «количество родов» и эффект взаимосвязи между количеством родов и лечением были вынуждеными во всех моделях. Для того, чтобы получить параметры соотношения вероятности к конкретным группам для разных концентраций влияния взаимосвязи между количеством родов и лечением, было использовано среднеквадратичное среднее значение процедуры GLIMMIX (бинарное распределение). Р-значения были скорректированы для нескольких сравнений с использованием теста HSD Tukey. Для оценки доли коров, которые имели обнаруживаемые уровни IL-8 в образцах молока, и уровней заболеваемости послеродовым метритом, клиническим эндометритом и субклиническим кетозом, была использована функция распределения хи-квадрат в JMPPRO 10.
ПРИМЕР 2
Данный пример представляет результаты, полученные с использованием материалов и способов, описанных в примере 1.
В таблице 1 представлены описательные статистические данные о количестве зарегистрированных многородящих и первородящих животных, количестве зарегистрированных животных, которые были положительными для внутриматочной культуры Е. coli, количестве зарегистрированных животных с плацентой, присутствующей при регистрации, количестве зарегистрированных животных, которым оказывалась помощь при родах, количестве зарегистрированных животных, которые родили самку, самца, двойню или мертворожденных телят, среднем количестве дней беременности на момент родов, средней оценке упитанности в баллах при родах и средней ректальной температуре при регистрации.
Влияние лечения на молочную продуктивность за неделю лактации для первородящих и многородящих коров представлено на фигуре 1. Общая молочная продуктивность была больше у коров, которых лечили IL-8; 33,1 кг/сутки (95% CI=32,0-34,2), 35,6 кг/сутки (95% CI=34,5-36,7) и 35,9 кг/сутки (95% CI=34,9-37,0) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение < 0,01). Переменные «количество родов», «теленок», «среднее количество дней беременности на момент родов», «ректальная температура при регистрации» и «неделя лактации» сохранялись в модели. Взаимосвязь между лечением и неделей лактации была незначимой (Р-значение = 0,06).
Влияние лечения на скорректированную по жиру молочную продуктивность в течение первых двух месяцев лактации представлено на фигуре 2. Общая скорректированная по жиру молочная продуктивность была более высокой для коров, которых лечили IL-8; 34,2 кг/сутки (95% CI=32,6-35,7), 37,1 кг/сутки (95% CI=35,7-38,5) и 36,6 кг/сутки (95% CI=35,0-38,1) для контрольных коров, коров с L-IL8 и Н-IL8, соответственно (Р-значение=0,02). Переменные «количество родов», «оценка упитанности в баллах при родах», «среднее количество дней беременности на момент родов», «ректальная температура при регистрации» и «месяц лактации» сохранялись в модели. Взаимосвязь между лечением и месяцем лактации была незначимой (Р-значение = 0,89).
Влияние лечения на энергетически скорректированную молочную продуктивность в течение первых двух месяцев лактации представлено на фигуре 3. Общая энергетически скорректированная молочная продуктивность была более высокой для коров, которых лечили IL-8; 32,8 кг/сутки (95% CI=30,9-34,6), 35,7 кг/сутки (95% CI=34,0-37,3) и 36,2 кг/сутки (95% CI=34,3-38,1) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,02). Переменные «количество родов», «оценка упитанности в баллах при родах», «среднее количество дней беременности на момент родов» и «месяц лактации» сохранялись в модели. Взаимосвязь между лечением и месяцем лактации была незначимой (Р-значение = 0,56).
Влияние лечения на линейную оценку SCC в течение первых двух месяцев лактации представлено на фигуре 4. Общая линейная оценка количества соматических клеток не отличалась между группами лечения; 2,46 (95% CI=1,64-3,28), 2,44 (95% CI=1,66-3,23) и 2,48 (95% CI=1,65-3,31) для контрольных коров, коров с L-IL8 и Н-IL8, соответственно (Р-значение = 0,99). Переменные «помощь при родах» и «месяц лактации» сохранялись в модели. Взаимосвязь между лечением и месяцем лактации была незначимой (Р-значение = 0,09).
Влияние лечения на диагностированный на ферме уровень заболеваемости послеродовым метритом зависело от количества родов, и представлено на фигуре 5; взаимосвязь между лечением и количеством родов была значительной (Р-значение < 0,01). Для первородящих животных, коровы с H-IL8 имели 7,43 более высокие вероятности наличия послеродового метрита по сравнению с контрольными коровами (Р-значение = 0,03), тогда как вероятности наличия послеродового метрита для коров с L-IL8 и контрольных коров не отличались (Р-значение = 0,27). С другой стороны, для многородящих животных, внутриматочное лечение IL-8 имело защитный эффект от послеродового метрита; контрольные коровы имели 7,14 (Р-значение = 0,02) и 5,88 (Р-значение = 0,02) увеличенные вероятности наличия послеродового метрита, чем коровы с L-IL8 и H-IL8, соответственно. В одном неограничивающем варианте осуществления, настоящее изобретение относится к профилактике послеродового метрита у многородящих животных. Влияние лечения на уровень заболеваемости клиническим эндометритом представлено на фигуре 6. Внутриматочная инфузия IL-8 не давала защиту от клинического эндометрита. (Р-значение = 0,73).
Общая концентрация ВНВА в крови составляла 0,77 мкмоль/л (95% CI=0,65-0,90), 0,62 мкмоль/л (95% CI=0,50-0,74) и 70 мкмоль/л (95% CI=0,58-0,82) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,22). Кроме того, взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,66, фигура 7).
Общая концентрация IL-8 в крови составляла 235,0 пг/мл (95% CI=193,9-276,0), 275,5 пг/мл (95% CI=233,7-317,4) и 287,5 пг/мл (95% CI=246,0-329,0) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,17, фигура
8). Переменные «ректальная температура при регистрации» и «DIM» сохранялись в модели. Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,16).
Большинство образцов молока, тестируемых на концентрацию IL-8, имели уровни ниже предела обнаружения используемого анализа (1,5 пг/мл). Из всех протестированных 182 образцов только 13,7% (25 образцов) имели концентрацию IL-8 выше предела обнаружения. Поэтому очень несущественный вывод может быть сделан относительно влияния внутриматочной инфузии IL-8 на концентрацию данного цитокина в молоке. Доля образцов, собранных до лечения, которые имели концентрации IL-8 выше предела обнаружения, составляла 40,0%, 43,0% и 23,5% для контроля, L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,10). Доля образцов, собранных после лечения с уровнями IL-8 выше предела обнаружения анализа, составляла 2,2%, 20,0% и 0,0% для контроля, L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение < 0,01).
Общая ректальная температура составляла 38,8°С (95% CI=38,7-38,9), 38,8°С (95% CI=38,8-38,9) и 38,8°С (95% CI=38,8-38,9) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,47, фигура 9). Переменные «плацента при регистрации», «оценка упитанности в баллах при родах», «дни беременности на момент родов» и «DIM» сохранялись в модели. Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,13). На 6 DIM, контрольные коровы имели более низкую ректальную температуру по сравнению с коровами с H-IL8 (Р-значение = 0,02).
Уровни гаптоглобина в течение первых четырех дней после родов не были подвержены влиянию путем лечения (фигура 10); общий уровень гаптоглобина составлял 0,13 (95% CI=0,11-0,16), 0,13 (95% CI=0,11-0,16) и 0,13 (95% CI=0,11-0,15) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,96). Переменные «количество родов», «теленок» и «DIM» сохранялись в модели. Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,48).
Лечение не имело влияния на снижение упитанности в баллах со дня родов до 35 DIM (фигура 11). Среднее снижение упитанности в баллах составляло 0,23 (95% CI=0,15-0,30), 0,23 (95% CI=0,16-0,30) и 0,23 (95% CI=0,16-0,31) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,99). Переменная «количество родов» сохранялась в модели.
Общие уровни IGF-1 в сыворотке составляли 149,9 нг/мл (95% CI=133,2-166,5), 172,0 нг/мл (95% CI=153,6-190,4) и 153,9 нг/мл (95% CI=136,5-171,4) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,18, фигура 12). Переменная «DIM» сохранялась в модели. Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,25). Однако, коровы с L-IL8 имели или способны иметь более высокие уровни IGF-1 в крови на день 1 (Р-значение = 0,09), 2 (Р-значение = 0,01) и 3 (Р-значение = 0,08) после родов.
Общая концентрация глюкозы в сыворотке составляла 218,5 мг/дл (95% CI=195,2-241,8), 220,5 мг/дл (95% CI=196,7-244,3) и 241,6 мг/дл (95% CI=218,6-264,5) для контрольных коров, коров с L-IL8 и H-IL8, соответственно (Р-значение = 0,11, фигура 13). Переменные «количество родов», «теленок» и «DIM» сохранялись в модели. Взаимосвязь между лечением и DIM была незначимой (Р-значение = 0,53).
Влияние лечения на уровень заболеваемости субклиническим кетозом представлено на фигуре 14. Лечение L-IL8 оказывало защитный эффект от субклинического кетоза; у контрольных коров были 8,04 увеличенные вероятности наличия субклинического кетоза, чем у коров с L-IL8 (Р-значение = 0,02). Однако, уровень заболеваемости субклиническим кетозом не отличался между контрольными коровами и коровами с H-IL8 (Р-значение = 0,30).
ПРИМЕР 3
Данный пример воспроизводит подход, описанный в примерах 1 и 2 выше, и дополнительно демонстрирует, что более широкий диапазон дозировки rIL-8 является эффективным для улучшения молочной продуктивности и содержания молока. Исследование также проводилось на коммерческой молочной ферме, расположенной в Каюге, штат Нью-Йорк (Cayuga, NY). Всего в исследовании были зарегистрированы 341 свежая корова за 116 дней. В течение 12 часов после родов коровы были случайным образом распределены для того, чтобы получать внутриматочные инфузии с 9,5 мг rIL-8 (высокий IL-8, n=86), 0,095 мг rIL-8 (средний IL-8, n=82), 0,0095 мг rIL8 (низкий IL-8; n=88) или не получали никакого лечения (контроль; n=85). Послеродовых коров лечили в течение 12 часов после родов. Коров удерживали на станциях с фиксатором для головы, и их зону промежности дезинфицировали этанолом (70% об./об.). Стерильный Gilt катетер для искусственного осеменения (Livestock Concepts Inc., Hawarden, IA), прикрепленный к 250 мл пакету с солевым раствором, который содержал соответствующую дозу rIL8, вводили в краниальную часть влагалища, манипулировали через шейку матки, и лечение вводили инфузионно в полость матки. Молочную продуктивность регистрировали ежедневно, и ежемесячно образцы молока предоставляли в лабораторию (DairyOne, Ithaca, NY) для оценки компонентов молока (белка и молочного жира). Рассчитывали энергетически скорректированное и скорректированное по жиру 3,5% молоко и сообщали в данной заявке.
Лечение rIL8 увеличивало процентное содержание молочного жира независимо от дозы лечения (фигура 16). Лечение rIL8 также увеличивало суточный выход молока (фигура 17), недельный выход молока (фигура 18), скорректированное по жиру 3,5% молоко (фигура 19) и энергетически скорректированное молоко (фигура 20). Результаты согласуются с результатами, полученными в экспериментах, описанных в примерах 1 и 2, и показывают, что коровы, которых лечили rIL8, вырабатывали в среднем на 10 фунтов больше молока в день по сравнению с контрольными.
ПРИМЕР 4
Данный пример демонстрирует внутривлагалищное введение IL-8. Для того, чтобы получить данные, приведенные на фигуре 21, в общей сложности 60 коров были случайным образом распределены для того, чтобы получать лечение плацебо (стерильный солевой раствор; n=30) или 1,125 мг rIL-8 (n=30). Лечения и плацебо вводили внутривлагалищно. Зарегистрированные коровы были через 30-80 дней после родов (поздняя лактация). Как можно увидеть из фигуры 21, внутривлагалищное лечение IL-8 значительно увеличивало молочную продуктивность.
Хотя изобретение описано в конкретных вариантах осуществления, обычные модификации будут очевидны для специалиста в данной области техники, и такие модификации предназначены, чтобы входить в объем настоящего изобретения.
Источники
Cai, Т.Q., P.G. Weston, L.A. Lund, В. Brodie, D.J. McKenna and W.С. Wagner. 1994. Association between neutrophil functions and periparturient disorders in cows. Am. J. Vet. Res. 55:934-943.
Drackley, J.K. 1999. ADSA foundation scholar award, biology of dairy cows during the transition period: The final frontier? J. Dairy Sci. 82:2259-2273.
Dubuc, J., T.F. Duffield, К.E. Leslie, J.S. Walton and S.J. Leblanc. 2011. Randomized clinical trial of antibiotic and prostaglandin treatments for uterine health and reproductive performance in dairy cows. J. Dairy Sci. 94:1325-1338.
Edmonson, A.J., I.J. Lean, L.D. Weaver, T. Farver, and G. Webster. 1989. A body condition scoring chart of Holstein dairy cows. J. Dairy Sci. 72:68-78.
Galvao, K.N., M.J. Flaminio, S.B. Brittin, R. Sper, M. Fraga, L. Caixeta, A. Ricci, C.L. Guard, W.R. Butler and R.O. Gilbert. 2010. Association between uterine disease and indicators of neutrophil and systemic energy status in lactating holstein cows. J. Dairy Sci. 93:2926-2937.
Gilbert, R.O., S.T. Shin, C.L. Guard, H.N. Erb and M. Frajblat. 2005. Prevalence of endometritis and its effects on reproductive performance of dairy cows. Theriogenology. 64:1879-1888.
Goff, J.P. and R.L. Horst. 1997. Physiological changes at parturition and their relationship to metabolic disorders. J. Dairy Sci. 80:1260-1268.
Hammon, D.S., I.M. Evjen, T.R. Dhiman, J.P. Goff and J.L. Walters. 2006. Neutrophil function and energy status in holstein cows with uterine health disorders. Vet. Immunol. Immunopathol. 113:21-29.
Hussain, A.M. 1989. Bovine uterine defense mechanisms: A review. Zentralbl. Veterinarmed. B. 36:641-651.
Kehrli, M.E., J.r and J.P. Goff. 1989. Periparturient hypocalcemia in cows: Effects on peripheral blood neutrophil and lymphocyte function. J. Dairy Sci. 72:1188-1196.
Kimura, K., J.P. Goff and M.E. Kehrli Jr. 1999. Effects of the presence of the mammary gland on expression of neutrophil adhesion molecules and myeloperoxidase activity in periparturient dairy cows. J. Dairy Sci. 82:2385-2392.
Kimura, K., J.P. Goff, M.E. Kehrli Jr and T.A. Reinhardt. 2002. Decreased neutrophil function as a cause of retained placenta in dairy cattle. J. Dairy Sci. 85:544-550.
Ley, K., J.B. Baker, M.I. Cybulsky, M.A. Gimbrone Jr and F.W. Luscinskas. 1993. Intravenous interleukin-8 inhibits granulocyte emigration from rabbit mesenteric venules without altering L-selectin expression or leukocyte rolling. J. Immunol. 151:6347-6357.
Lima, F.S., R.S. Bisinotto, E.S. Ribeiro, L.F. Greco, H. Ayres, M.G. Favoreto, M.R. Carvalho, K.N. Galvao and J.E. Santos. 2013. Effects of 1 or 2 treatments with prostaglandin F(2)alpha on subclinical endometritis and fertility in lactating dairy cows inseminated by timed artificial insemination. J. Dairy Sci. 96:6480-6488.
Mitchell, G.В., В.N. Albright and J.L. Caswell. 2003. Effect of interleukin-8 and granulocyte colony-stimulating factor on priming and activation of bovine neutrophils. Infect. Immun. 71:1643-1649.
NRC. 2001. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. (7th rev. ed.) Natl. Academy Press, Washington, D.C.
Paape, M., J. Mehrzad, X. Zhao, J. Detilleux and C. Burvenich. 2002. Defense of the bovine mammary gland by polymorphonuclear neutrophil leukocytes. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 7:109-121.
Watanabe, A., J. Hirota, S. Shimizu, S. Inumaru and K. Kimura. 2012. Single intramammary infusion of recombinant bovine interleukin-8 at dry-off induces the prolonged secretion of leukocyte elastase, inflammatory lactoferrin-derived peptides, and interleukin-8 in dairy cows. Vet. Med. Int. 2012:172072.