УСТРОЙСТВО ДЛЯ МИКРОИНКАПСУЛИРОВАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
VITALISED CELL AND TISSUE MICROENCAPSULATION DEVICE

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и биотехнологии и может быть использовано для подготовки клеточного материала к трансплантации.
Известно, что для защиты живых клеток, подготавливаемых к трансплантации, проводят их помещение в капсулы (Ляпустин А.В. Перспективы применения методов инкапсулирования в малотоннажной технологии получения биологических препаратов / Биотехнология, экология, медицина. Материалы III-IV Международных научных семинаров 2001-2002 гг. / под ред. А.Ф.Труфанова. - Москва-Киров: ЭКСПРЕСС. 2002, - С.42-45).
В качестве устройства для инкапсулирования клеток используют стерильный химический стакан, в который помещают взвесь жизнеспособных клеток и коллаген. При их механическом смешивании происходит обволакивание клеток коллагеном. После полимеризации коллагена отвердевшую макрогранулу покрывают раствором агарозы, окунают ее в минеральное масло (Канти Д., Рубин А.Л., С.Барри (US 95/00400 от 12.01.1995) Макрогранула с секреторными клетками, способ ее получения и способ лечения заболеваний, вызванных нарушением функционирования секреторных клеток).
К недостаткам известного технического решения следует отнести отсутствие возможности стандартизации размера и формы капсул. Получаемые макрокапсулы таких размеров, что их невозможно ввести через инъекционную иглу при трансплантации.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является устройство для инкапсулирования островковых клеток, содержащее емкость и воздушную камеру, соединенную с компрессором. На дистальном конце емкости выполнено калиброванное отверстие (Hardikar А.А., Risbud MV and Bhonde R.R. (1999), A simple microcapsule generator design for islet encapsulation, J. Biosci. 24 (3): p.101-106).
Известное устройство работает следующим образом. Клеточную взвесь, смешанную с капсулообразующим веществом - альгинатом натрия, помещают в емкость - шприц. Смесь продавливают через длинную иглу (14-16 см), размещенную внутри воздушной камеры - тефлонового цилиндра, через который продувают воздух. Аэрозольные капли отрываются с конца иглы и собираются в тефлоновом химическом стакане.
К недостаткам известного устройства следует отнести невозможность стандартизации получаемых микрокапсул по величине и форме. Так, из-за неравномерной подачи и, следовательно, неравномерного выхода из иглы клеточной взвеси с капсулообразующим веществом получаемые капсулы имеют разный размер, происходит их слипание в цепочки, а также их повреждение. Образованные из цепочек конгломераты не дают возможности трансплантации их через инъекционную иглу. Часть капсул имеет неровную поверхность, что способствует формированию раннего фиброза в зоне трансплантации.
Задачей заявляемого изобретения является разработка устройства для микроинкапсулирования жизнеспособных клеток и тканей.
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение микрокапсул заданного размера с ровной и гладкой поверхностью без повреждений и слипания капсул между собой с жизнеспособными клетками и тканями.
Технический результат достигается конструкцией предлагаемого устройства для микроинкапсулирования жизнеспособных клеток и тканей, состоящего из емкости, на дистальном конце которой выполнено калиброванное отверстие, и воздушной камеры, соединенной с компрессором.
Отличительные признаки заявляемого устройства заключаются в том, что оно оснащено вторым компрессором, и в том, что емкость соединена с компрессором через регулятор давления. Дистальный конец емкости размещен в воздушной камере и с 4-х сторон фиксирован винтами, установленными в дистальном отделе воздушной камеры. Воздушная камера выполнена в виде ресивера и соединена со вторым компрессором через регулятор давления и ротаметр.
Отличие заявляемого устройства также заключается и в том, что калиброванное отверстие емкости размещено в воздушной камере и напротив него в камере установлена форсунка так, что ось калиброванного отверстия емкости совмещена с осью отверстия форсунки.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемое устройство для микроинкапсулирования жизнеспособных клеток и тканей конструктивно отличается от известного и, следовательно, обладает критерием патентоспособности «новизна».
Соединение емкости с первым компрессором через регулятор давления (манометр) позволяет изменять скорость прохождения клеточной массы с капсулообразуемым веществом через калиброванное отверстие емкости и тем самым позволяет избежать критической скорости, приводящей к разрушению клеток и капсул.
Установка в дистальном отделе воздушной камеры 4-х крепежных элементов, выполненных в виде винтов, позволяет осуществить фиксацию дистального отдела емкости во время работы устройства и тем самым обеспечить совмещение осей калиброванного отверстия емкости и отверстия форсунки.
Выполнение воздушной камеры в виде ресивера обеспечивает возможность получения равномерного ламинарного потока на выходе из форсунки.
Соединение воздушной камеры со вторым компрессором через регулятор давления (манометр) и ротаметр дает возможность управлять проходящим через ресивер воздушным потоком.
Установка форсунки в воздушной камере напротив калиброванного отверстия емкости и совмещение их осей позволяет получать капсулы калиброванного размера с ровной и гладкой поверхностью.
Изменение размера выходного отверстия форсунки (0,2 мм; 0,4 мм; 0,6 мм) в сочетании с регулированием скоростей воздушного и жидкостного потоков обеспечивает возможность получения инкапсулированных жизнеспособных клеток заданного размера, который зависит от размера капсулируемых клеток и тканей. Так, при диаметре отверстия форсунки, равном 0,2 мм, получают 99 (99-100)% микроинкапсулированных жизнеспособных клеток размером 0,2 мм, при диаметре отверстия форсунки 0,4 мм - 98,7 (98-100)% микроинкапсулированных жизнеспособных клеток размером 0,4 мм; при диаметре отверстия форсунки 0,6 мм - 98 (97-100)% микроинкапсулированных жизнеспособных клеток диаметром 0,6 мм. Заданный размер микрокапсул дает возможность трансплантации капсул через инъекционную иглу.
Экспериментальными исследованиями авторов заявляемого изобретения установлено, что предлагаемое устройство обеспечивает микроинкапсулирование жизнеспособных клеток в капсулы одинакового размера без повреждений с ровной и гладкой поверхностью. Заданный размер капсул и отсутствие их слипания между собой обеспечивает возможность трансплантации микроинкапсулированного жизнеспособного клеточного материала через инъекционную иглу.
Авторами заявляемого технического решения экспериментальным путем установлено, что жизнеспособность получаемых с помощью заявляемого устройства клеток составляет 98 (97-99) %, при этом стандартизация по размеру получаемых капсул составляет 99%.
Заявляемое устройство обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата - получение микрокапсул заданного размера с ровной и гладкой поверхностью без повреждений и слипания капсул между собой с жизнеспособными клетками и тканями.
При анализе известных устройств для инкапсулирования жизнеспособных клеток было выявлено в них отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков заявляемого устройства на достижение технического результата.
Из изложенного следует, что заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Устройство, составляющее заявляемое изобретение, предназначено для использования в здравоохранении и биологии. Осуществление его возможностей подтверждено описанием заявки. Использование разработанного устройства позволяет достичь усматриваемый заявителем технический результат, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "промышленная применимость".
Сущность изобретения поясняется фиг.1, на которой приведена схема заявляемого устройства, где: 1 - воздушная камера, 2 - емкость, 3 - отверстие емкости, 4 - винты, 5 - регуляторы давления (манометры), 6 - ротаметр, 7 и 7а - компрессоры, 8 - форсунка, 9 - подводящие трубки, 10 - уловитель (см. Фиг.1).
Заявляемое устройство работает следующим образом:
В емкость 2, размещенную в воздушной камере 1, вводят капсулообразующее вещество и жизнеспособные клетки до уровня верхней кромки емкости 2. Выпускное отверстие 3 емкости 2 центрируют при помощи винтов 4. При этом ось калиброванного отверстия 3 совмещают с осью отверстия форсунки 8. В емкость 2 от первого компрессора 7 по приводящим трубкам 9 подают давление, величину которого регулируют манометром 5.
В воздушной камере 1 создают давление, обеспечивающее отрыв капель от калиброванного отверстия 3 емкости 2. Для этого от второго компрессора 7а по подводящим трубкам 9 через соответствующий регулятор давления - манометр 5 и ротаметр 6 подают воздух.
Проходящий воздушный поток обеспечивает отрыв капель, которые через калиброванное отверстие форсунки 8 собираются в стакане-уловителе 10.
Для оценки эффективности работы заявляемого устройства были проведены исследования 30-ти образцов клеточной взвеси островков Лангерганса, приготовленных из поджелудочных желез новорожденных суточных поросят.
Оценку целостности полученных капсул с клеточным материалом провели с помощью теста «на исключение красителя» (Warburton S. and James R. Hemocytometer cell counts and viability studies; in Cell and tissue culture: Laboratory procedures (eds) A. Doyle, J.B.Griffiths and D.G.Newell (New York: John Wiley, 1995) pp 4B: 1.1-1.5). Для этого в суспензию, содержащую микроинкапсулированные клетки, добавляли водный раствор красителя - трипановый синий и в камере Фукса-Розенталя подсчитывали число неокрашенных микрокапсул. При нарушении целостности капсулы и гибели клеток регистрируют окрашивание среды и клеток внутри капсулы.
Все образцы (n=30) были разделены на 3 группы. Первая группа - микроинкапсулированные клетки, полученные при помощи предложенного устройства, вторая группа - микроинкапсулированные клетки, полученные при помощи устройства-прототипа при скорости подачи клеточного материала менее 1 мл/мин, третья группа - микроинкапсулированные клетки, полученные по устройству-прототипу при скорости подачи клеточного материала 1 мл/мин.
Заявляемое устройство позволило получить микроинкапсулированные клетки заданного размера; размер получаемых микрокапсул соответствует размеру калиброванного отверстия емкости и диаметру отверстия форсунки. При световой микроскопии образцов группы 1 установлено: микрокапсулы не слипаются в цепочки, имеют сферическую форму с ровной и гладкой поверхностью 1 и жизнеспособными островками Лангерганса 2 внутри капсулы (см. Фиг.2). При окраске микроинкапсулированных клеток трипановым синим содержимое внутри капсул остается неокрашенным, что свидетельствует о целостности капсул (см. Фиг.3).
При использовании устройства-прототипа в режиме постоянного давления были получены следующие результаты: при скорости прохождения инкапсулируемой смеси менее 1 мл/мин получали капсулы большого размера (более 1 мм) и конгломераты в виде цепочек; при скорости прохождения, равной 1 мл/мин, получали микроинкапсулированные клетки различного диаметра от 0,1 мм и меньше до 1,4 мм и крупнее, с бугристой поверхностью 1, неправильной формы 1, с повреждением стенки капсул 3 и слипанием капсул 2 (см. фиг.4). Повреждение капсул подтверждает прокрашивание содержимого микрокапсул трипановым синим 4 (см. фиг.4). Жизнеспособность инкапсулированных клеток по устройству-прототипу, по данным авторов заявляемого технического решения составила не более 54 (50-58)%.
Таким образом, заявляемое устройство позволяет проводить микроинкапсулирование жизнеспособных клеток и тканей в капсулы заданного размера с ровной и гладкой поверхностью, без повреждений, без слипания капсул между собой, что обеспечивает возможность их трансплантации через инъекционную иглу.