Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синтазы в генезе наследственного синдрома слабости синусового узла

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© НИКУЛИНА С. Ю., ШУЛЬМАН В. А., ЧЕРНОВА А. А., НИКУЛИН Д.

A., КУСКАЕВ А. П., КУКУШКИНА Т. С., ВОЕВОДА М. И., МАКСИМОВ

B. Н.

УДК 616.125.4-056.7:616

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ Ш-СИНТАЗЫ В ГЕНЕЗЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО СИНДРОМА СЛАБОСТИ СИНУСОВОГО УЗЛА

С. Ю. Никулина, В. А. Шульман, А. А. Чернова, Д. А. Никулин, А. П. Кус-каев, Т. С. Кукушкина, М. И. Воевода, В. Н. Максимов Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И. П. Артюхов, НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск, директор - д.м.н., проф. М. И. Воевода.

Резюме. В настоящей работе впервые на клинико-генетическом материале выявлена ассоциация наследственного синдрома слабости синусового узла с полиморфизмом гена эндотелиальной ИО-синтазы (вИОБ).

Ключевые слова: синдром слабости синусового узла, полиморфизм, ген эндотелиальной ИО-синтазы.

Никулина Светлана Юрьевна - проректор по учебной работе, д.м.н., проф. кафедры внутренних болезней № 1 КрасГМУ; тел 8(391)2640979.

Шульман Владимир Абрамович - д.м.н., проф., зав. каф. внутренних болезней № 1 КрасГМУ; тел 8(391)2640979.

Чернова Анна Александровна - ассистент каф. внутренних болезней № 1 КрасГМУ; тел 8(391)2640979.

Заболевания сердечно-сосудистой системы являются наиболее частой причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Постоянное накопление информации о патогенезе заболеваний сердечно-сосудистой системы привело к пониманию того, насколько значительную роль в их развитии играют генетические факторы. Сегодня практически не осталось болезней, в формировании которых не было бы установлено наследственной компоненты.

Синдром слабости синусового узла (СССУ) - это сочетание клинических, электрокардиографических и электрофизиологических признаков, отражающих структурные повреждения синусового узла, его неспособность нормально выполнять функцию водителя ритма сердца и обеспечивать регулярное проведение автоматических импульсов к предсердиям. Наследственный СССУ возникает из-за уменьшения числа специализированных клеток в синусовом узле, пролиферации соединительной ткани из-за различных генетических мутаций.

СССУ, обусловленный мутациями в генах, регулирующих функционирование клеток синусового узла и сино-атриального проведения, практически не изучен. В 2003 году D.W. Benson с соавт. представили мутантные гены СССУ. Это патология гена натриевого сердечного канала (SCN5A) с выявленными 3 видами мутаций: 4 миссенс - мутации (T2201, P1298L, G1408R, R1632H), внутрирамочная делеция (del F1617), нонсенс - мутация (R1623X), и патология гена HCN4, локализованного на 15 хромосоме при наследственном СССУ [3]. Исследования E. Schulz - Bahr с соавт. в этом же году подтвердили, что СССУ может возникать при патологии того же гена и выявили, что нарушение работы ионных каналов СУ приводит к замедлению скорости спонтанной деполяризации и уменьшению частоты синусового ритма [11].

R. Milanezi с соавт. в 2006 году скринировали 52 случая брадикардии на мутацию в области пейсмеккерного канала гена HCN4 (Ser672Arg) [8].

F. Kyndt с соавт. описали GLY1408ARG мутацию в гене SCN5A в большой французской семье с СССУ и синдромом Бругада, передающимися ау-тосомно-доминантно [6].

Одним из генов-кандидатов СССУ является ген еКОБ. Этот ген регулирует кальциевые Ь-каналы, обеспечивающие нормальный синусовый ритм и сокращение кардиомиоцитов. еКОБ находят в нервных волокнах, иннервирующих сино-атриальный и атриовентрикулярный узлы. Уменьшение N0 приводит к возникновению номотопных аритмий в результате увеличения кальциевого потока. Влияние N0 на ритм сердца обусловлено так же его центральными эффектами. Помимо этого, N0 угнетает пролиферацию гладкомышечных клеток и может выступать в роли антиростового фактора, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток стенки сосудов и клеток синусового узла [5].

Эндотелиальная КО-синтаза является одним из наиболее значимых источников физиологической связи КО и кардиоваскулярной системы. Эта изоформа присутствует в эндотелиальных клетках сосудов и ответственна за вызываемую N0 - вазодилатацию, ингибирование атеросклероза и предупреждение тромбоза, а также внезапную сердечную смерть [7].

Ген, кодирующий eN0S, находится на хромосоме 7q35-36, состоит из 26 экзонов и кодирует белок с молекулярной массой 135 кД, состоящий из 1203 аминокислот. Промотор гена eN0S содержит несколько доменов, то есть может регулироваться рядом факторов транскрипции. Наиболее мощным регулятором экспрессии eN0S является напряжение сдвига, связанное с воздействием потока крови на поверхность эндотелиальных клеток [12].

Наиболее значимые 4 полиморфных маркера гена eN0S: интрон 18 локус А27С; интрон 23 локус 010Т; интрон 4 eN0S 4а/Ь полиморфизм и аксон 7 01и298Лвр полиморфизм (структурный) [9, 13].

Показаны достоверно более высокое содержание аллеля 4а и частота генотипа 4а/4а среди японцев, страдающих гипертензией и перенесших инфаркт миокарда [10]. При анализе частот аллелей в группах больных гипертонической болезнью и здоровых людей достоверных различий не обнаружено [9]. Однако при выделении группы больных с артериальной гипертензией и ги-

пертрофией левого желудочка частота встречаемости аллеля 4а была достоверно выше, чем в группе здоровых людей [14].

Так как в доступной нам литературе мы не нашли работ по изучению данного полиморфизма с синдромом слабости синусового узла, представляется интересным изучение частот аллелей гена eN0S у больных с СССУ, их здоровых родственников в сравнении с контрольной группой.

Материалы и методы

Настоящее исследование было проспективным. Из базы данных кафедры терапии №1 Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого были отобраны 29 семей, имеющих наследственный СССУ. Среди пробандов было 20 женщин и 9 мужчин, средний возраст составил 58 ± 0,15 лет. Среди родственников I, II и III степени родства было 65 мужчин и 68 женщин, средний возраст - 39 ± 0,13 лет.

Всем пробандам и их родственникам I, II, III степени родства было проведено клинико-инструментальное исследование: клинический осмотр, электрокардиография, велоэргометрия, холтеровское мониторирование ЭКГ, атропиновая проба, электрофизиологическое исследование (чреспищеводная стимуляция левого предсердия до и после медикаментозной вегетативной блокады), эхокар-диоскопия, кардиоритмография.

Молекулярно-генетическое исследование больных СССУ и их родственников I, II и III степени родства проводилось в лаборатории медицинской генетики НИИ терапии СО РАМН города Новосибирска, были взяты образцы крови 239 человек, из которых 68 - больные с диагнозом СССУ, подтвержденным с помощью чреспищеводной стимуляции левого предсердия, 41 их здоровый родственник I, II, III степени родства и 130 человек контрольной группы.

Экстракция ДНК из крови осуществлялась методом фенол-хлороформной экстракции [2].

Генотипирование делеционного полиморфизма гена eN0S проводили через амплификацию соответствующего локуса гена и анализ длины ПЦР про-

дуктов. Для детекции VNTR гена eN0S использовали фланкирующие праймеры 5- лаассстлтаатлатасстт-3' (прямой) и 5-

ТСТСТТЛОТОСТОТООТСЛС-3 (обратный). В случае Ь аллеля амплифици-руется ПЦР продукт длиной 420 нуклеотидных пар, в случае а аллеля - ПЦР продукт длиной 393 нуклеотидных пар [15].

Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере типа "ГОМ РС" с использованием пакета программ '^айБйеа 7.0". Первым этапом определяли частоты аллелей и генотипов изучаемых генов-кандидатов. Соответствие распределения аллелей и генотипов равновесию Харди-Вайнберга, сравнительный анализ частот генотипов вышеперечисленных генов с контрольной группой выполнялось с использованием критерия X , двустороннего точного критерия Фишера. Описательная статистика представлена в виде процентных долей (Р±т).

Результаты и обсуждение

По полиморфизму 4а/4Ь гена eN0S было прогенотипировано 68 больных с СССУ, 41 - их здоровых родственников I, II и III степени родства и 130 - лиц контрольной группы.

По результатам полимеразной цепной реакции выявлены 3 вида генотипов eN0S у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы: 4а/4а - гомозиготный дикий, 4а/4Ь - гетерозиготный, 4Ь/4Ь - гомозиготный мутантный.

0-СССУ

Рис. 1. Частота встречаемости генотипов гена еИОБ у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы.

Установлено (рис.1) достоверное преобладание гетерозиготного генотипа 4а/4Ь у больных СССУ (41,18±6 %) по сравнению с лицами контрольной группы (25,39±3,8 %). В то же время группой украинских ученых были исследованы дети с брадиаритмиями. Были выявлены достоверные отличия по полиморфизму Т786С промотора гена еКОБ. Частота патологического аллеля С среди детей встречалась у 34,5% гетерозигот и 15,8% гомозигот по сравнению с 45,8% и 7,14% в контрольной группе. При этом количество патологических гомозигот в группе детей с аритмиями в 2,2 раза превышало таковое в контрольной группе [1].

Однако, в европейской популяции аллель 4Ь гена еКОБ встречается значительно чаще, чем аллель с 4 повторами. Распределение частот аллелей в популяции составляет соответственно 4Ь/4Ь - 0,41, 4Ь/4а - 0,46 и 4а/4а - 0,13. У австралийских европеоидов и японцев, гомозиготных по аллелю еКОБ4а, уровень нитратов и нитритов в крови, напрямую связанный со скоростью выработки N0 эндотелием сосудов, достоверно выше, чем у лиц с генотипом

4b/4b, что свидетельствует о потенциальной роли генотипа 4a/4a как фактора риска развития заболеваний, сопровождающихся нарушением нормальной выработки окиси азота [14].

Мы предполагаем, что полиморфизм промотора гена влияет на транскрипцию мРНК, в то время как полиморфизм экзона определяет белковую структуру и активность фермента. В настоящее время остается не до конца ясной роль полиморфизма интрона в регуляции синтеза различных ферментов, так как эта часть гена не кодирует белок (вырезается при формировании «спелой» РНК). Учитывая, что анализируемый однонуклеотидный полиморфный маркер расположен в некодирующей части гена, наблюдаемая ассоциация может являться как результатом собственного влияния данного полиморфизма на экспрессию гена, так и его сцеплением с влияющими на этот процесс аллелями других вариабельных участков гена.

Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о перспективности дальнейшего поиска генетических факторов, определяющих индивидуальные особенности возникновения СССУ и в частности изучения его связи с полиморфизмом гена eNOS.

GENE POLYMORPHISM OF ENDOTHELIAL NITRATE-NITROGEN SYNTHASE IN THE GENESIS OF HEREDITARY SICK SINUS SYNDROME

S.Yu. Nikulina, V.A. Shulman, A.A. Chernova, D.A. Nikulin, A.P. Kuskaev, T.S.

Kukushkina, M.I. Voevoda, V.N. Maksimov Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Abstract. The paper describes clinical and genetic data on association of hereditary sick sinus syndrome with polymorphism of endothelial nitrate-nitrogen synthase gene (eNOS).

Key words: sick sinus syndrome, polymorphism, gene of endothelial NOsynthase.

Литература

1. Досенко В.Є., Загорій В.Ю., Мойбенко О.О., Пархоменко О.М. Патофізіологічні аспекти генетичного поліморфізму ендотеліальноЇ NO-синтази // Фізіол. журн. - 2002. - Т. 48. - № 6. - С. 86-102.

2. Смит К., Калко С., Кантор Ч. Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК //Анализ генома / под ред. К. Дейвиса, пер. с англ. - М: Мир. - 1990. - С. 58-94.

3. Benson D.W. Genetics of atrioventricular conduction disease in humans // Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. - 2004. - Vol. 280, №2. - Р. 934-939.

4. Ichihara S., Yamada Y., Fujimura T. et al. Association of a polymorphism of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with myocardial infarction in the Japanese population // Am. J. Cardiol. - 1998. -Vol. 81. - P. 83-86.

5. Janssens S. P., Shimouchi A., Quetermous T. et al. Cloning and expression of cDNA encoding human endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide synthase // J. Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267. - P. 1451914522.

6. Kyndt F., Probst V., Potet F. et al. Brugada syndrome and familial sick sinus syndrome // Heart. - 2005. Vol. 91. - P.805.

7. Marsden P. A., Schappert K. T., Chen H. S. et al. Molecular cloning and characterization of human endothelial nitric oxide synthase // FEBS Lett. - 1992. - Vol. 307. - P. 287-293.

8. Milanesi R., Baruscotti M., Gnecchi-Ruscone T. et al. Familial sinus bradycardia associated with a mutation in the cardiac pacemaker channel // J. Med. - 2006. -Vol. 354. - P. 151-157.

9. Miyahara K., Kawamoto T., Sase K. et al. Cloning and structural characterization of the human endothelial nitric-oxide-synthase gene // Eur. J. Biochem. - 1994. - Vol. 223. - P. 719-726.

10.Nakayama T., Soma M., Takahashi Y. et al. Association analysis of CA repeat polymorphysm of the endothelial nitric oxide synthase gene with essential hypertension in Japanese // Clin. Genet. -1997. -Vol. 51. - P. 2630.

11.Schulze-Bahr E., Neu A., Friederich P. et al. Pacemaker channel dysfunction in a patient with sinus node disease // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol. 111. - P.1537-1545.

12.Tsukada T., Yokoyama K., Arai T. et al. Evidence of association of the eNOS gene polymorphism with plasma NO metabolite levels in humans // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998. - Vol. 245. - P. 190-193.

13.Wang X. L., Wang J. Endothelial nitric oxide synthase gene sequence variations and vascular disease // Molec. Gen. and Metab. - 2000. - Vol.

70. - P. 241-251.

14.Yoshimura M., Yasue H., Nakayama M. et al. A missense Glu298Asp variant in the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with coronary spasm in the Japanese // Hum. Genet. -1998. - Vol. 103. - P. 65-69.

15.Zhang R., Min W., Sessa W.C. Functional analysis of the human endothelial nitric oxide synthase promoter. Sp1 and GATA factors are necessary for basal transcription in endothelial cells // J. Biol. Chem. - 1995. -Vol. 270. - P. 15320-15326.