СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ТРАВЫ МОНАРДЫ ДУДЧАТОЙ, ОБЛАДАЮЩЕЕ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ШТАММА BURKHOLDERIA ПРИ МУКОВИСЦИДОЗЕ
AGENT BASED ON WILD BERGAMOT HERB, HAVING ACTIVITY ON BURKHOLDERIA STRAIN IN CYSTIC FIBROSIS

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к производству лекарственных средств из лекарственного растительного сырья, и касается получения средства из травы монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.), обладающей активностью в отношении штаммов муковисцидоза.
Лекарственные растительные препараты широко применяются для лечения различных заболеваний, что объясняется широтой их фармакологической активности и высокой безопасностью. Поэтому очень важен поиск новых перспективных источников растительного сырья, из которых можно производить высокоэффективные лекарственные препараты (1).
Трава монарды дудчатой известна своей антибактериальной активностью за счет содержащихся в растении эфирного масла и флавоноидов и, на наш взгляд, является одним из перспективных источников биологически активных соединений для лечения бактериальных инфекций, в том числе муковисцидоза.
Муковисцидоз или кистозный фиброз - это системное наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена. Он характеризуется поражением желез внешней секреции, тяжелыми нарушениями функций органов дыхания и желудочно-кишечного тракта.
Пациенты с диагнозом муковисцидоз имеют хроническую бактериальную инфекцию дыхательных путей и придаточных пазух носа. В связи с тем, что штаммы бактерий Burkholderia, сопровождающих это заболевание, являются генетически устойчивыми ко многим антибактериальным препаратам, поиск лекарственных препаратов для лечения муковисцидоза является актуальной проблемой (2, 3, 4, 5).
Известен масляный экстракт на основе травы монарды дудчатой, который в концентрации 30 мг/мл проявляет бактерицидное действие в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Enterobacter cloacae, Proteus vulgaris и Klebsiella pneumoniae и бактериостатическое действие в отношении Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Candida albicans. Масляный экстракт получают экстракцией растительным маслом при соотношении 1:10 при нагревании в течение 5 часов на водяной бане с температурой 60-70°С (6). Действующие вещества травы монарды дудчатой извлекаются растительным маслом не полностью, что приводит к их низкому выходу.
Известна настойка на спирте этиловом 70%, полученная методом мацерации и перколяции из травы монарды дудчатой, проявляющая антимикробное действие в отношении Staphylococcus aureus и Escherichia coli в концентрации 400 мкг/мл. Содержание суммы флавоноидов в полученной настойке составляет 0,55% (7).
Однако полученная настойка не лишена недостатков. Недостатком данного метода является низкий выход целевых веществ - флавоноидов - около 70%, и как следствие - низкое содержание суммы флавоноидов в препарате (0,55%), что снижает его эффективность. Кроме того, ни для масляного экстракта, ни для настойки монарды не описана активность в отношении штаммов Burkholderia, которыми инфицируются пациенты с муковисцидозом.
В качестве прототипа нами выбрана настойка травы монарды дудчатой на 70% спирте этиловом, полученная методом перколяции.
Таким образом, целью изобретения является получение средства из травы монарды дудчатой, обладающего активностью в отношении клинических штаммов, выделенных от пациентов с муковисцидозом, с более высоким содержанием суммы флавоноидов и выходом действующих веществ.
Технический результат достигается тем, что траву монарды дудчатой настаивают на 70% этиловом спирте в соотношении «сырье - экстрагент» 1:8 в условиях дробной экстракции - дважды при комнатной температуре в течение 24 часов и получением двух извлечений, а затем при нагревании на кипящей водяной бане и получением третьего извлечения, которое объединяют с двумя первыми.
Средство получают следующим образом.
В первый день в три экстрактора помещают по 1 части травы монарды дудчатой. В первый экстрактор заливают 8 объемов по отношению к сырью 70% спирта этилового (3 объема для замачивания и 5 объемов экстрагента для экстракции сырья), во второй экстрактор - 3 объема спирта этилового 70% на замачивание в течение суток.
Во второй день из первого экстрактора сливают полученное извлечение во второй экстрактор и оставляют на 24 ч при комнатной температуре. В первый экстрактор добавляют 5 объемов чистого экстрагента - спирта этилового 70%. В третьей экстрактор добавляли 3 объема спирта этилового 70% на замачивание. Экстракторы оставляют на сутки при комнатной температуре.
В третий день извлечение из второго экстрактора переливают в третьей экстрактор, а извлечение из первого экстрактора - во второй. В первый экстрактор добавляют 5 объемов чистого экстрагента и оставляют на 24 часа при комнатной температуре.
На четвертый день извлечение из третьего экстрактора собирают в приемник, извлечение из второго экстрактора переносят в третьей экстрактор. В первом экстракторе осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин, после чего остужают и переносят полученное извлечение во второй экстрактор. Второй и третий экстракторы оставляют на 24 часа при комнатной температуре. Сырье из первого экстрактора является отработанным.
В пятый день извлечение из третьего экстрактора собирают в приемник. Содержимое второго экстрактора нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут, после чего остужают и переносят полученное извлечение в третий экстрактор и оставляют на сутки при комнатной температуре. Сырье из второго экстрактора является отработанным.
В шестой день содержимое третьего экстрактора нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут, после чего остужают и переносят полученное извлечение в приемник. Сырье из третьего экстрактора является отработанным. Извлечения объединяют.
Полученное суммарное извлечение (готовый продукт) перемешивают и оставляют на 2-3 дня при температуре не выше 10°С. Выпавший осадок отфильтровывают, полученное извлечение фасуют во флаконы темного стекла.
Получение средства на основе травы монарды дудчатой в условиях дробной эктракции, а также использование 70% этилового спирта в качестве экстрагента приводит к увеличению выхода целевых веществ, который составляет 92,0% от теоретического содержания (содержание суммы флавоноидов в траве монарды дудчатой составляет 4,31%) и к увеличению содержания суммы флавоноидов (целевые вещества) в средстве из травы монарды дудчатой, что составляет 0,78%.
Исследование запредельных параметров технологического процесса дает следующие результаты. Использование концентрации спирта ниже 70%, в частности, 60% этилового спирта, на стадии экстракции приводит к существенному снижению выхода целевых веществ (75,0% от теоретического содержания суммы флавоноидов в сырье) и, следовательно, к снижению содержания флавоноидов в настойке травы монарды дудчатой (0,62%).
Использование концентрации 80% этилового спирта также приводит еще к большему снижению выхода целевых веществ (70,0% от теоретического содержания суммы флавоноидов в сырье) и, соответственно, к снижению содержания флавоноидов в настойке травы монарды дудчатой (0,47%) (Приложение 1, таблица 1).
Полученное средство исследовали на наличие активности в отношении штаммов Burkholderia cenocepacia ST 208 и Burkholderia multivorans, полученных от пациентов с муковисцидозом. Определение минимальной ингибирующей концентрации проводили методом двойных серийных разведений в бульоне в соответствии с МУ 4.2.1890-04 (8). Учет результатов микробиологического анализа осуществлялся через 48-72 часа после инкубации при температуре 37°С. При этом проводили визуальную оценку задержки роста. Из лунок с видимой задержкой роста осуществлялся высев на питательные среды (5% кровяной агар-агар), через 24 часа отсутствие роста оценивалось как бактерицидный эффект, а появление видимого роста, но с его задержкой - как бактериостатический.
Результаты исследования показали наличие активности средства на основе травы монарды дудчатой в отношении штаммов Burkholderia, выделенных от пациентов с муковисцидозом. Вплоть до разведения 1:32 включительно наблюдается бактериостатическое действие в отношении Burkholderia cenocepacia ST 208 и Burkholderia multivorans при дальнейшем разведении рост культуры возобновляется.
Таким образом, разработанное средство, полученное описанным способом, дает следующие преимущества по сравнению с протатипом:
1. Использование в заявляемом средстве этилового спирта в концентрации 70% в соотношении «сырье-экстрагент» 1:8 в режиме модифицированной дробной экстракции позволяет повысить выход действующих веществ (флавоноиды) из травы монарды дудчатой с 70% до 92%, а также повысить содержание действующих веществ с 0,55% до 0,78%, т.е. в 1,4 раза.
2. Заявляемое средство, полученное способом модифицированной дробной мацерации, обладает активностью в отношении штаммов Burkholderia при муковисцидозе, что расширяет спектр фармакологической активности целевого продукта и создает условия для замены дорогостоящих зарубежных аналогов.
Разработанное средство может применяться в химико-фармацевтической промышленности для получения субстанций для производства лекарственных препаратов активных в отношении штаммов Burkholderia, выделенных от пациентов с муковисцидозом.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
1. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармац. вузов - Изд. 3-е, перераб. и доп./ В.А. Куркин. - Самара: ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с.
2. Кондратенко О.В. Особенности биологических свойств и факторов патогенности неферментирующих грамотрицательных бактерий, выделенных от пациентов // Аспирантский вестник Поволжья. 2012. - №1-2. - С. 251-253.
3. Леншин А.В., Ильин А.В., Карапетян Е.И., Мальцева Т.А., Кочегарова Е.Ю. Муковисцидоз взрослых (клинико-рентгенологические особенности). В сборнике: Материалы VII съезда врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока (с международным участием) 2017. - С. 50-54.
4. Минько О.В., Казакова М.А., Рыжов В.М., Лямин А.В., Кондратенко О.В. Изучение противомикробный активности извлечений из листьев мяты перечной в отношении штаммов муковисцидоза: Сборник научных статей по материалам X Международного симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 14-19 мая 2018 г. / отв. ред. Н.В. Загоскина - М.: ИФР РАН, - 2018. - С. 449-452.
5. Эседов Э.М., Гаджимирзаев Г.А., Ахмедова Ф.Д., Мурадова В.Р., Гаджимирзаева Р.Г., Меджидова Р.А., Абасова А.С.Муковисцидоз - актуальная проблема медицины // Вестник оториноларингологии. - 2016. - Т. 81, №5 - С. 15-18.
6. Патент РФ №2003105076/15, 20.02.2003. Способ получения масляного экстракта из монарды дудчатой, обладающего антимикробной активностью // Патент Российской Федерации №2244552. 2003. / Высочина Г.И., Волхонская Т.А., Якимова Ю.Л.
7. Мащенко З.Е. Фитохимическое исследование и стандартизация тимолсодержащих растений семейства Яснотковых: дис. канд. фармац. наук. Пермь, 2004. - 119 с.
8. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2.1890-04 // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2004. - Т. 6, №4. - С. 306-359.