СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ ПРОТЕАЗЫ, ОБРАЗУЕМОЙ МИКРОМИЦЕТАМИ Aspergillus ochraceus
METHOD FOR OBTAINING ALKALINE FIBRINOLYTIC PROTEASE PRODUCED BY MICROMYCETES ASPERGILLUS OCHRACEUS

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, ветеринарии, косметологии, дерматологии, биохимии и пищевой промышленности, а также в исследовательских целях.
Микромицеты Aspergillus ochraceus являются продуцентами секретируемой щелочной протеазы, обладающей фибринолитической и активаторной по отношению к протеину С плазмы крови активностями [1-7].
Известны способы получения неочищенных препаратов секретируемой щелочной фибринолитической протеазы из культуральной жидкости микромицетов A. ochraceus при глубинном [8] и твердофазном [9] культивировании штамма-продуцента. Существенным недостатком этих способов является наличие в получаемых ферментных препаратах большого количества примесей, которые представляют собой остатки питательной среды и разнообразные продукты метаболизма самих продуцентов.
Наиболее близким является способ получения очищенного ферментного препарата, заключающийся в комбинации фракционирования культуральной жидкости продуцента сульфатом аммония и гидрофобной, ионообменной и гель-проникающей хроматографии [10]. Недостатком данного способа является относительно низкий выход целевого фермента (до 10 мг очищенной протеазы с 1 литра культуры).
.
Техническая задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в увеличении выхода целевого фермента за счет его рекомбинантной экспрессии, ренатурации и хроматографической очистки на металл-хелатном сорбенте. Технический результат, полученный при реализации предлагаемого технического решения, позволяет получать до 250 мг очищенной протеазы с 1 литра культуры. Задачей настоящего изобретения является расширение спектра имеющихся способов получения щелочной фибринолитической протеазы, образуемой микромицетами A ochraceus.
.
2
2
2
2
Поставленная задача достигается способом получения щелочной фибринолитической протеазы, образуемой микромицетами A ochraceus, заключающимся в том, что из мицелия продуцента A. ochraceus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК методом обратной транскрипции. Затем на матрице полученной кДНК амплифицируют фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и клонируют его в экспрессионный вектор с последующей трансформацией компетентных клеток продуцирующего микроорганизма. После этого проводят экспрессию целевого фермента в нерастворимой форме и выделяют из полученной биомассы фракцию тел включения путем гомогенизации и осаждения. Полученные тела включения промывают путем суспендирования в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 2 М мочевина в соотношении 1 л буфера на 100 г тел включения и переосаждения. После промывания солюбилизируют осадок в 50 мМ ацетатном буфере, рН 4,0, 8 М мочевина в соотношении 2 л буфера на 100 г осадка, осаждают нерастворимую фракцию, затем доводят рН полученного солюбилизата до величины 8,5 добавлением сухого Трис. Далее проводят ренатурацию полученного солюбилизата путем его плавного десятикратного разбавления в 25 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,5, 1 М сахароза, 1 мМ CaCl в течение 100 минут при температуре +4°С и инкубируют ренатурат в течение 24 ч при температуре +4°С. Полученный ренатурат наносят на металл-хелатный хроматографический сорбент, после чего промывают сорбент 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ CaCl, в соотношении 5 л буфера на 1 л сорбента при линейной скорости потока 50 см/ч. Далее промывают сорбент 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 1 мМ CaCl, в соотношении 10 л буфера на 1 л сорбента при линейной скорости потока 50 см/ч. Элюцию целевых ферментов проводят 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 200 мМ имидазол, 1 мМ CaCl. К элюату добавляют охлажденный этанол до конечной объемной концентрации 75%, затем осаждают целевой фермент, промывают осадок путем суспендирования в 75%-ном этаноле и переосаждения, после чего лиофилизируют. В результате получают высокоочищенный ферментный препарат в форме порошка белого либо кремового цвета с выходом до 250 мг с 1 л экспрессионной культуры.
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 включает в себя пропептидный домен целевого фермента SEQ ID NO: 2, протеазный домен целевого фермента SEQ ID NO: 3 и полигистидиновую последовательность SEQ ID NO: 4.
Пропептидный домен SEQ ID NO: 2 обеспечивает правильное сворачивание протеазного домена целевого фермента SEQ ID NO: 3 в процессе экспрессии и рефолдинга, после чего автокаталически расщепляется. Специалисту в области понятно, что удаление последовательности пропептидного домена SEQ ID NO: 2 на этапе клонирования может привести к снижению выхода активного фермента.
Полигистидиновая последовательность SEQ ID NO: 4 необходима для выделения целевого фермента при помощи металл-хелатной хроматографии. В предпочтительном варианте, однако без ограничения, она содержит шесть аминокислотных остатков гистидина. Специалисту в области очевидно, что для увеличения сродства к металл-хелатному сорбенту число остатков гистидина в полигистидиновой последовательности SEQ ID NO: 4 может быть увеличено. Специалисту в области понятно, что между последовательностями протеазного домена SEQ ID NO: 3 и полигистидиновой последовательности SEQ ID NO: 4 может быть дополнительно введен линкерный участок, служащий для отщепления полигистидиновой последовательности SEQ ID NO: 4 после очистки фермента.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, для получения ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, применяют методы обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, используя в качестве матрицы тотальную РНК, выделенную из микромицета A. ochraceus. Специалисту в области очевидно, что ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, может быть получена любым другим известным из уровня техники способом, например, методом химического синтеза генов.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, в качестве экспрессионного вектора, в который химико-ферментативным путем клонирована ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, используют коммерчески доступную плазмиду pET-23d. Специалисту в области очевидно, что в качестве экспрессионного вектора может быть использована другая коммерчески доступная плазмида.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, в качестве трансформируемого продуцирующего микроорганизма используют коммерчески доступный штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Специалисту в области понятно, что в качестве продуцирующего микроорганизма может выступать другая бактерия (например, Bacillus subtilis) либо дрожжи (например, Pichia pastoris). Для проведения трансформации могут использоваться любые методы, известные из уровня техники, например, кальций-хлоридный метод, метод электропорации. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод выполнения трансформации.
Для получения биомассы созданного штамма-продуцента осуществляют его культивирование, после чего доступными из уровня техники методами отделяют фракцию, содержащую целевой белок.
Специалисту понятно, что культивирование может осуществляться на орбитальном шейкере в колбах Эрленмейера, в ферментерах различного объема или любыми другими известными из уровня техники в настоящее время или созданными впоследствии способами.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, отделение культуральной жидкости от клеток осуществляют центрифугированием.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, дезинтеграцию клеток осуществляют при помощи ультразвукового дезинтегратора.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, осаждение нерастворимых фракций осуществляют центрифугированием.
В предпочтительном варианте целевой фермент экспрессируют в форме нерастворимых тел включения. Специалисту в области понятно, что экспрессия целевого фермента в растворимой форме может привести к снижению его выхода из-за автопротеолитической деградации.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, в качестве металл-хелатного хроматографического сорбента используют коммерчески доступную Ni-NTA-агарозу. Специалисту в области очевидно, что в качестве металл-хелатного хроматографического сорбента может быть использован другой коммерчески доступный носитель, например, Ni-IDA-агароза.
2
2
Последовательное промывание хроматографического сорбента с линейной скоростью потока 50 см/ч буферами 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ CaCl, в соотношении 5 л буфера на 1 л сорбента, и 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 1 мМ CaCl, в соотношении 10 л буфера на 1 л сорбента обеспечивает расщепление и отделение пропептидного домена, в результате чего целевой фермент приобретает свою активность. Специалисту в области понятно, что изменение линейной скорости потока, а также объемного соотношения используемых буферов и хроматографического сорбента, может снизить удельную активность целевого фермента.
Определения и термины
Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Пример осуществления изобретения
Приведенный далее пример предоставлен посредством объяснения изобретения и не может являться ограничением изобретения. Фактически, специалистам в данной области техники будет понятно, что в изобретение могут быть внесены различные модификации и изменения без отступления от объема или сущности изобретения. Специалисту в данной области техники следует понимать, что настоящее исполнение представляет собой описание только приведенного в качестве примера варианта осуществления и не предполагается в качестве ограничения более широких аспектов настоящего изобретения.
1. Из 100 мг мицелия микромицета A. ochraceus ВКМ-F4104D выделяют тотальную РНК, на матрице которой синтезируют первую цепь кДНК методом обратной транскрипции. Далее на матрице полученной первой цепи кДНК при помощи ПЦР проводят амплификацию нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, после чего клонируют амплификат в плазмиду pET-23d (Novagen, США) по рестриктным сайтам NcoI и XhoI. Трансформируют полученной молекулярно-генетической конструкцией экспрессионный штамм E. coli BL21 (DE3). Для выделения РНК, проведения обратной транскрипции, ПЦР-амплификации, клонирования и трансформации используют известные протоколы [11].
2. Свежетрансформированные клетки культивируют при температуре +37°С в биореакторе в 20 литрах питательной среды LB (состав среды в г/л: триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10), содержащей 100 мкг/мл ампициллина, до достижения оптической плотности культуры при длине волны 600 нм, равной 0,6 оптических единиц.
3. Добавляют индуктор белкового синтеза IPTG (изопропил-β-D-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч при температуре +37°С для проведения экспрессии целевого фермента в нерастворимой форме.
4. Осаждают биомассу продуцирующих клеток путем центрифугирования в течение 15 мин при ускорении 4000 g, после чего гомогенизируют полученный осадок в 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,0, 200 мМ NaCl и повторно центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g для получения осадка тел включения. В результате из бактериальной культуры объемом 20 л получают осадок тел включения с массой около 150 г.
5. Полученный осадок тел включения промывают суспендированием в 1,5 л 50 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 2 М мочевина, после чего центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g, супернатант отбрасывают.
6. Осадок тел включения после промывания солюбилизируют в 3 л 50 мМ ацетатном буфере, рН 4,0, 8 М мочевина, по мере солюбилизации доводят значение рН раствора до величины 4,0 добавлением соляной кислоты, после чего центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g, осадок отбрасывают. Доводят значение рН полученного супернатанта до величины 8,5 добавлением сухого Трис.
2
7. Для получения ренатурата при температуре +4°С и перемешивании добавляют полученный на предыдущей стадии солюбилизат со скоростью 30 мл/мин (общее время добавления - 100 мин) к 27 л 25 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,5, 1 М сахароза, 1 мМ CaCl. Инкубируют полученный ренатурат в течение 24 ч при температуре +4°С.
8. После инкубации наносят полученный на предыдущей стадии ренатурат на 1 л хроматографического сорбента WorkBeads 40 Ni-IDA (BioWorks, Швеция).
2
9. Промывают сорбент 5 л 20 мМ Трис-HCl буфера рН 8,0, 200 мМ NaCl, 1 мМ CaCl при линейной скорости потока 50 см/ч.
2
10. Промывают сорбент 10 л 20 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 1 мМ CaCl при линейной скорости потока 50 см/ч.
2
11. Проводят элюцию целевого фермента 20 мМ Трис-HCl буфером, рН 8,0, 200 мМ NaCl, 200 мМ имидазол, 1 мМ CaCl, затем добавляют к элюату охлажденный этанол до конечной объемной концентрации 75%, центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g, супернатант отбрасывают.
12. Полученный на предыдущей стадии осадок промывают суспендированием в 1 л 75%-ного этанола, центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 10000 g, супернатант отбрасывают. Полученный осадок лиофилизируют. В результате получают ферментный препарат массой до 5 г с удельной активностью по отношению к казеину до 5000 Ед./мг.
Определение протеолитической активности ферментного препарата:
Для измерения протеолитической активности полученного ферментного препарата используют метод Ансона-Хагихары [12, 13], заключающийся в определении количества тирозина в неосаждаемых трихлоруксусной кислотой (ТХУ) продуктах протеолиза после десятиминутного гидролиза 1%-ного раствора казеина в 100 мМ Трис-HCl буфере рН 8,2 при температуре +37°С. К 200 мкл раствора навески анализируемого ферментного препарата добавляют 400 мкл раствора казеина, инкубируют в течение 10 мин при температуре +37°С, после чего останавливают реакцию добавлением 600 мкл 10%-ного раствора ТХУ. Для формирования осадка пробирки после проведения реакции выдерживают в течение 30 мин при температуре +4°С, после чего центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 10000 g и определяют оптическое поглощение супернатанта при 275 нм. За единицу активности (Ед.) принимают количество фермента, которое за 1 мин в условиях определения высвобождает 1 нмоль тирозина, для расчетов строят калибровочную кривую.
Литература
1. Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Кураков А.В., Баранова Н.А., Егоров Н.С. Микромицеты Aspergillus ochraceus - продуценты внеклеточных протеиназ - активаторов протеина С плазмы крови // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. 48, 5, 537-542.
2. Осмоловский А.А., Звонарева Е.С., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. Воздействие внеклеточных протеаз микромицетов рода Aspergillus на белки системы гемостаза // Биоорганическая химия. 2014. 40, 6, 688-694.
3. Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Кураков А.В., Егоров Н.С. Свойства внеклеточной протеиназы - активатора протеина С плазмы крови, образуемой микромицетом Aspergillus ochraceus // Прикладная биохимия и микробиология. 2015. 51, 1, 86-92.
4. Пат. РФ 2460772. Штамм Aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы-активатора  протеина С плазмы крови / Осмоловский А.А., Кураков А.В., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108671/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 10.09.2012, Бюл. № 25.
5. Пат. РФ 2461614. Штамм Aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы-активатора  протеина С плазмы крови / Осмоловский А.А., Кураков А.В., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108668/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 20.09.2012, Бюл. № 26.
6. Пат. РФ 2461615. Штамм Aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы-активатора  протеина С плазмы крови / Кураков А.В., Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108669/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 20.09.2012, Бюл. № 26.
7. Пат. РФ 2461616. Штамм Aspergillus ochraceus - продуцент протеиназы-активатора  протеина С плазмы крови / Кураков А.В., Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108669/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 20.09.2012, Бюл. № 26.
8. Пат. РФ 2468081. Способ получения протеиназы-активатора протеина С плазмы крови / Осмоловский А.А., Кураков А.В., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2011108672/10, заявл. 09.03.2011, опубл. 27.11.2012, Бюл. № 33.
9. Пат. РФ 2535872. Способ твердофазного культивирования Aspergillus ochraceus для получения протеиназы-активатора протеина С плазмы крови / Осмоловский А.А., Кураков А.В., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н.С. № 2013113997/10, заявл. 29.03.2013, опубл. 20.12.2014, Бюл. № 35.
10. Комаревцев С.К., Попова Е.А., Крейер В.Г., Мирошников К.А., Осмоловский А.А. Очистка протеазы-активатора протеина С плазмы крови человека, продуцируемой микромицетом Aspergillus ochraceus ВКМ-F4104D // Прикладная биохимия и микробиология. 2020. 56, 1, 39-44.
11. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. XXV, 2209 p.
12. Anson M.L. Crystalline carboxypolypeptidase // Science. 1935. 81, 2106, 467-468.
13. Hagihara B., Matsubara H., Nakai M., Okunuki K. Crystalline bacterial proteinase. I. Preparation of crystalline proteinase of Bacillus subtilis // J. Biochem. 1958. 45, 185-194.
--->
Перечень последовательностей
SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность
гибридного предшественника рекомбинантной щелочной
фибринолитической протеазы, образуемой микромицетами A. ochraceus
MPVENTRRASEKIAGKYIVTFKNGIDTAKIEQHTTWATNIHKRNLARRDGSDDSDLPVGIEKKFKIKDFAAYFGS
FDDSTIEEIRKSADVAHIEEDQVWHLDALTTQTGATWGLGSISHKGESSTSYVYDSSAGEGTYGYVVDTGINVDH
SEFGGRASLAYNAVGGQHVDSVGHGTHVAGTIGGKTYGVSKKANLLSVKVFQGESSSTSIILDGYNWAANDIVSK
SRTGKAAINLSLGGGYSYAFNQAVENAFDEGVLTVVAAGNENSDAGNTSPASAPNALTVTASTNRNARASFSNYG
SVVDVFAPGQDIKSAWIGGSSATNTISGTSMATPHIVGLAIYLQALEGLTSPAAVTKRIKELATSGVVTDVKGSP
NLLAYNGAAHHHHHH
SEQ ID NO: 2. Аминокислотная последовательность пропептидного
домена щелочной фибринолитической протеазы, образуемой
микромицетами A. ochraceus
PVENTRRASEKIAGKYIVTFKNGIDTAKIEQHTTWATNIHKRNLARRDGSDDSDLPVGIEKKFKIKDFAAYFGSF
DDSTIEEIRKSADVAHIEEDQVWHLD
SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность протеазного
домена щелочной фибринолитической протеазы, образуемой
микромицетами A. ochraceus
ALTTQTGATWGLGSISHKGESSTSYVYDSSAGEGTYGYVVDTGINVDHSEFGGRASLAYNAVGGQHVDSVGHGTH
VAGTIGGKTYGVSKKANLLSVKVFQGESSSTSIILDGYNWAANDIVSKSRTGKAAINLSLGGGYSYAFNQAVENA
FDEGVLTVVAAGNENSDAGNTSPASAPNALTVTASTNRNARASFSNYGSVVDVFAPGQDIKSAWIGGSSATNTIS
GTSMATPHIVGLAIYLQALEGLTSPAAVTKRIKELATSGVVTDVKGSPNLLAYNGAA
SEQ ID NO: 4. Полигистидиновая последовательность
HHHHHH
SEQ ID NO: 5. Нуклеотидная последовательность гибридного
предшественника рекомбинантной щелочной фибринолитической протеазы,
образуемой микромицетом A. ochraceus ВКМ-F4104D
ATGCCCGTCGAGAACACCCGCCGGGCTTCCGAGAAGATCGCTGGAAAGTACATTGTCACTTTCAAGAACGGCATC
GACACCGCCAAGATCGAGCAGCACACCACCTGGGCTACCAACATCCACAAGCGCAACCTTGCCCGCCGTGATGGT
TCCGACGATTCTGACCTCCCCGTCGGTATCGAGAAGAAATTCAAGATCAAGGACTTCGCCGCCTACTTCGGTTCC
TTCGATGACTCCACCATCGAGGAGATCCGCAAGAGCGCCGATGTTGCTCACATCGAGGAGGACCAGGTCTGGCAC
CTCGATGCTCTGACCACCCAGACCGGTGCTACCTGGGGCCTGGGTTCCATCTCGCACAAGGGTGAATCCAGCACC
AGCTACGTCTACGACTCCAGCGCCGGCGAGGGCACCTACGGCTACGTCGTTGACACCGGTATCAACGTCGACCAC
AGCGAGTTCGGCGGCCGTGCGAGCCTCGCCTACAACGCTGTTGGCGGCCAGCACGTTGACAGCGTCGGCCACGGA
ACTCACGTTGCCGGCACCATTGGTGGCAAGACCTACGGTGTCTCCAAGAAGGCCAACCTCCTCTCCGTCAAGGTC
TTCCAGGGCGAATCTTCTTCTACCTCCATCATTCTTGACGGATACAACTGGGCCGCCAACGACATCGTGAGCAAG
TCCCGTACCGGAAAGGCCGCCATCAACCTGTCTCTCGGTGGTGGATACTCCTATGCCTTCAACCAGGCTGTCGAG
AACGCCTTCGATGAGGGTGTCCTGACCGTCGTCGCCGCCGGTAACGAGAACTCCGATGCTGGCAACACCAGCCCT
GCCTCTGCCCCCAACGCCTTGACCGTCGCTGCCAGCACCAACCGCAACGCCCGTGCCTCTTTCTCCAACTACGGC
TCCGTCGTTGATGTCTTCGCTCCCGGTCAGGACATCAAGTCTGCCTGGATCGGCGGCAGCTCTGCCACCAACACC
ATCTCCGGTACCTCCATGGCTACTCCCCACATCGTTGGTCTGGCCATCTACCTGCAGGCTCTTGAGGGTCTCACC
AGCCCCGCCGCCGTCACCAAGCGCATCAAGGAGCTCGCCACCTCCGGCGTTGTCACCGATGTCAAGGGCAGCCCC
AACCTCCTTGCCTACAACGGCGCTGCTCACCACCACCACCACCAC
<---