НЕЙРОТОКСИНЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ СОКРАЩЕННУЮ БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
NEUROTOXINS THAT DISPLAY REDUCED BIOLOGICAL ACTIVITY

Настоящее изобретение относится к фармацевтической области. В частности настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид нейротоксин, обладающий сокращенной продолжительностью биологического эффекта, оказываемого на субъект, где указанный полипептид содержит по меньшей мере один сигнал деградации в легкой цепи, а также к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим указанный полинуклеотид, полипептидам, закодированным им, и антителам, специфически связывающимся с полипептидами. Более того, настоящее изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим указанные полинуклеотиды и полипептиды, а также к их специфическим терапевтическим применениям. Более того, настоящее изобретение относится к способам получения полипептидов и лекарственных средств.
Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют высокоактивные нейротоксины, то есть ботулинический токсин (BoNTs) и столбнячный токсин (ТеМТ), соответственно. Эти клостридиальные нейротоксины (CNT) специфически связываются с нервными клетками и нарушают высвобождение нейротрансмиттера. Каждый токсин синтезируется в виде неактивного необработанного одноцепочечного белка, массой около 150кДа. Посттрансляционная обработка включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (одноцепочечный разрыв) бактериальной протеазой (протеазами). Активный нейротоксин состоит из двух цепей, а именно N-терминальной легкой цепи, массой около 50 кДа, и тяжелой цепи, массой около 100 кДа, связанных дисульфидной связью. CNT состоят из трех доменов, то есть каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, заключающей транслокационный домен (N-терминальная половина), и домена, связывающего рецептор (С-терминальная половина), смотрите Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Ботулинические нейротоксины синтезируются в виде молекулярных комплексов, содержащих белок нейротоксин массой 150 кДа и связанные нетоксичные комплексообразующие белки. Размеры комплекса различаются в зависимости от клостридиального штамма и различных серотипов нейротоксина в интервале от 300 кДа до 900 кДа. Комплексообразующие белки в этих комплексах стабилизируют нейротоксин и защищают его от разложения, смотрите Chen 1998, Infect Immun 66(6): 2420-2425.
2+
Clostridium botulinum секретирует семь антигенно различных серотипа, обозначаемых А - G, ботулинического нейротоксина (ВоМТ). Все серотипы вместе с родственным столбнячным нейротоксином (TeNT), секретируемым Clostridium tetani, представляют собой Zn-эндопротеазы, которые блокируют синаптический экзоцитоз посредством расщепления белков SNARE, смотрите Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. CNT вызывают периферический паралич мышц, наблюдаемый при ботулизме, смотрите Fischer2007, PNAS 104, 10447.
Несмотря на их токсические эффекты, ботулинические токсины применялись в качестве терапевтических агентов для большого числа заболеваний или нарушений. Ботулинический токсин серотипа был одобрен для применения на человеке в Соединенных Штатах Америки в 1989 для лечения косоглазия, тонического блефароспазма и других нарушений. Он является коммерчески доступным в виде белкового комплекса ботулинического токсина А, например, под торговым названием ВОТОХ (Allergan Inc) или под торговым названием DYSPORT (Ipsen Ltd). Для терапевтических применений комплекс вводится непосредственно в мышцу, которая подлежит обработке. При физиологическом рН токсин высвобождается из белкового комплекса и происходит желательный фармакологический эффект. Улучшенный, свободный от белковых комплексов, препарат на основе полипептида нейротоксина А доступен под торговым наименованием XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). Эффект ботулинического токсина является лишь временным, что является причиной того, что может потребоваться повторное введение ботулинического токсина для поддержания терапевтического эффекта.
Клостридиальные нейротоксины уменьшают силу произвольного сокращения мышц и представляют собой эффективные терапевтические средства для лечения косоглазия, фокусной дистонии, включая затылочную дистонию, и доброкачественного эссенциального тонического блефароспазма. Кроме того, они были показаны для облегчения гемифациального спазма и фокальной мышечной спастичности, и, более того, являются эффективными при широком диапазоне других показаний, таких как желудочно-кишечные нарушения, гипергидроз и косметическая коррекция морщин, смотрите Jost 2007, Drugs 67, 669.
Однако уменьшение мышечной силы и сокращения также желательно при медицинских состояниях или заболеваниях, как например, для заживления ран, иммобилизации костей и лечения разрыва сухожилия, для пост-хирургической иммобилизации, в частности, в связи с хирургическим удалением геморроя, для введения зубных имплантатов или замены тазобедренного сустава (эндопротез), для восстановления движений в коленном суставе, офтальмологического хирургического вмешательства, лечения угрей или лечения заболеваний, связанных с раздражением кишечника. Нейротоксины, как правило, проявляют свой биологический эффект в течение периода времени, который превышает действительно необходимый для эффективного лечения указанных заболеваний и состояний. Продолжительный мышечный паралич, однако, является вредным или по меньшей мере менее предпочтительным в ходе лечения указанных медицинских состояний или заболеваний. Однако нейротоксины, проявляющие свой биологический эффект только в течение желательного периода времени, все еще не доступны.
Соответственно, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении средств и способов удовлетворения вышеуказанных требований. Указанная задача решается с помощью вариантов выполнения изобретения, охарактеризованных в приведенном далее описании изобретения и в формуле изобретения.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид нейротоксин, проявляющий сокращенную продолжительность биологического эффекта, оказываемого на субъект, где указанный полипептид содержит по меньшей мере один сигнал деградации в легкой цепи.
Термин "полинуклеотид", как применяется в настоящем изобретении, относится к одноцепочечным или двухцепочечным молекулам ДНК, а также к молекулам РНК. Указанный термин охватывает геномную ДНК, кДНК, гяРНК, мРНК, а также все полученные естественным путем или путем искусственной модификации производные таких молекулярных видов. Полипептид может находиться в виде линейной или кольцевой молекулы. Кроме того, в добавление к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим вышеупомянутый полипептид нейротоксин, полинуклеотид согласно настоящему изобретению может содержать дополнительные последовательности, необходимые для надлежащей транскрипции или трансляции, такие как 5'или 3'UTR последовательности. Полинуклеотид согласно настоящему изобретению кодирует модифицированный полипептид нейротоксин, полученный из одного из антигенно отличных серотипов ботулинических нейротоксинов, то есть BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, или столбнячного нейротоксина (TeNT). Согласно настоящему изобретению указанный полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, как показано SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 15 (TeNT). Корме того, в одном варианте выполнения настоящее изобретение охватывает полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, как показано любой из SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 16 (TeNT). Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения указанный полинуклеотид представляет собой вариант вышеуказанных полинуклеотидов, содержащий одно или более нуклеотидных замещений, делеций и/или добавлений, которые, в еще одном варианте выполнения настоящего изобретения, могут приводить к получению закодированной аминокислоты, имеющей одно или более аминокислотных замещений, делеций и/или добавлений. Более того, вариантный полинуклеотид согласно настоящему изобретению, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, может содержать вариант последовательности нуклеиновой кислоты, на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичный последовательности нуклеиновой кислоты, как показано любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15, или вариант последовательности нуклеиновой кислоты, который кодирует аминокислотную последовательность на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную аминокислотной последовательности, как показано любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16. Термин "идентичная", как применяется в описании настоящего изобретения, относится к идентичности последовательностей, охарактеризованной с помощью определения числа идентичных аминокислот между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислотными последовательностями, причем последовательности выравниваются таким образом, чтобы достичь совпадения наивысшего порядка. Идентичность можно вычислить, применяя опубликованные методики и способы, кодифицированные в виде компьютерных программ, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). В одном варианте выполнения настоящего изобретения значения процента идентичности вычисляются для всей аминокислотной последовательности. Ряд программ на основе различных алгоритмов доступен специалистам в данной области техники для сравнения различных последовательностей. В этом контексте, алгоритм Нидельмана-Вунша или алгоритм Смита-Ватермана приводят к получению особенно достоверных результатов. Для осуществления выравнивания последовательностей может применяться программа PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) или программы Gap и BestFit (Needleman-1970, J Mol Biol 48; 443;
Smith 1981, AdvAppI Math 2, 482), которые является частью программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Значения идентичности последовательностей, приведенные выше в процентах (%), в другом варианте выполнения изобретения могут быть определены, применяя программу GAP для области всей последовательности при следующих параметрах: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 и Average Mismatch: 0.000, которые, если иного не указано, должны всегда применяться в качестве стандартных параметров для выравнивания последовательностей.
Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения каждый из вышеупомянутых вариантных полинуклеотидов кодирует полипептид, сохраняющий одно или более и, согласно другому варианту выполнения изобретения, все биологические свойства соответствующего полипептида нейротоксина, то есть BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G или столбнячного нейротоксина (TeNT). Для специалиста в данной области техники должно быть очевидно, что полная биологическая активность включается только после протеолитической активации, даже несмотря на то, что существует вероятность проявления необработанным предшественником некоторых биологических функций или того, что он будет частично активным. Термин "биологические свойства", как применяется в описании настоящего изобретения, относится к (а) связыванию рецептора, (b) интернализации, (с) транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или (d) эндопротеолитическому расщеплению белков, участвующих в слиянии мембраны синаптической везикулы. In vivo анализы для оценки биологической активности, включая исследование LD50 на мышах, и ех vivo исследование правого или левого купола диафрагмы мышей описываются автором Реаrсе и его соавторами (Реаrсе 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77), а также автором Dressier и его соавторами (Dressier 2005, Mov Disord 20:1617-1619, Keller2006, Neuroscience 139: 629-637). Биологическая активность, в общем, выражается в мышиных единицах (MU). Как применяется в настоящем изобретении, 1 MU представляет собой количество компонента нейротоксина, которое убивает 50% конкретной мышиной популяции после интраперитонеальной инъекции, то есть LD50 для мышей при интраперитонеальной инъекции. В другом варианте выполнения настоящего изобретения вариантные полинуклеотиды могут кодировать нейротоксины, имеющие улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать сайты расщепления, которые улучшены с точки зрения распознавания ферментами, или могут быть улучшены в отношение связывания рецептора или любого из других вышеперечисленных свойств. Кроме того, настоящее изобретение охватывает слитые полипептиды, дополнительно содержащие детектируемые маркерные пептиды или метки. В одном варианте выполнения настоящего изобретения подходящими метками являются метки FLAG, метки Мус или метки His, которые также обеспечивают более эффективную очистку помеченных полипептидов. Обнаруживаемые маркерные пептиды, в варианте выполнения настоящего изобретения, включают флуоресцентные белки, такие как GFP, BFP и тому подобное. В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения вариантные полинуклеотиды кодируют слитые полипептиды нейротоксина, содержащие часть из по меньшей мере двух полипептидов нейротоксина различных серотипов, например, слитый нейротоксин, содержащий тяжелую цепь BoNT/A и легкую цепь ВоМТ/Е.
Полипептид нейротоксин, закодированный полинуклеотидом по изобретению, кроме того, содержит по меньшей мере один сигнал деградации в его легкой цепи. В варианте выполнения настоящего изобретения указанную легкую цепь полипептида нейротоксина, закодированного полинуклеотидом по изобретению, получают путем модификации из легкой цепи, закодированной полинуклеотидом, содержащим одну из вышеупомянутых конкретных последовательностей нуклеиновых кисло или их вариантов, описанных выше. Легкие цепи полипептидов нейротоксинов образуются при протеолитическом расщеплении полипептида-предшественника (одноцепочечный полипептид). Легкой цепью является N-терминальная часть полипептида предшественника, которую получают в результате протеолитического расщепления. Аминокислотные последовательности легких цепей полипептидов нейротоксинов, упомянутых выше, могут быть выведены, в варианте выполнения настоящего изобретения, из сайтов расщепления, приведенных в следующей таблице.
Нейротоксин (Бактериальный штамм)
Номер доступа
Сайт расщепления
Последовательность, включающая сайты расщепления (выделены жирным шрифтом)
BoNT/A (HalV62A)
ABD65472
К428Л429 К448/А449
KLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALN....DLCIKV (SEQIDNO: 17)
BoNT/B(Okra)
BAE48264
К441/А442
IQMCKSVKAPG..............ICIDV (SEQIDNO: 18)
BoNT/Cl (C-6814)
BAA 89713
R444/S445 К449/Т450
TKFCHKAIDGRSL....YNKTL......DCRELLV (SEQIDNO: 19)
BoNT/D
BAA
K442/N443
TKVCLRLTK.........NSRD......DSTCIKV
90661
R445/D446
(SEQ ID NO: 20)
BoNT/E (Beluga)
CAA 43999
K419/G420 R422/K423
IRFCKNIVSVKG......IRK........SICIEI (SEQ ID NO: 21)
BoNT/F (NCTC 10281)
CAA73972
R435/K436 К439/А440
VKFCKSVIPRKG......TKAP......PRLCIRV (SEQ ID NO: 22)
BoNT/G
CAA52275
IAMCKPVMYKNT......GKS........EQCIIV(SEQ ID NO: 23)
TeNT
P 04958
R449 (R455)
IGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKI (SEQ ID NO: 24)
Термин "сигнал деградации", как применяется в описании настоящего изобретения, относится к модификациям легкой цепи полипептида нейротоксина, которые приводят к усиленной деградации полипептида посредством эндогенных путей деградации, присутствующих в организме, к которому применяется нейротоксин. В варианте выполнения настоящего изобретения, путем деградации будет путь протеасомальной деградации или путь лизосомальной деградации. В другом варианте выполнения настоящего изобретения путь деградации может приводить только к частичному разложению полипептида нейротоксина, например, посредством одной или более стадий протеолитического расщепления. Указанный сигнал деградации может вводиться в легкую цепь (то есть быть локализован (внутренне) внутри легкой цепи) или может быть связан с ней либо N-терминально, либо С-терминально. Специалисту в данной области известны подходящие сигналы деградации и известно, как нужно их вводить в легкую цепь полипептида нейротоксина или связывать с ней. Корме того, специалист в данной области техники может получить полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды нейротоксины, с по меньшей мере одним сигналом деградации, путем применения рекомбинантных молекулярно-биологических методик или химических модификаций. Например, сайт-направленный мутагенез может применяться для введения сигналов деградации, как упоминается далее. Альтернативно, последовательность нуклеиновой кислоты для полинуклеотида, содержащего кодирующие последовательности для полипептида нейротоксина и предусмотренный сигнал деградации, может быть сконструирована, и полный полинуклеотид может быть впоследствии синтезирован химическим путем.
В варианте выполнения настоящего изобретения указанный сигнал деградации выбирается из группы, состоящей из:
a) по меньшей мере одного внутренне или терминально введенного мотива PEST,
b) по меньшей мере одного внутренне или терминально введенного мотива распознавания лигазой Е3,
c) N-терминальный олиго-лизиновый остаток,
d) N-терминально связанный убиквитин,
e) замещения N-терминального пролина основной аминокислотой,
f) замещений, находящихся на поверхности аминокислотных остатков остатками лизина, и
д) замещения N-терминального пролина основной аминокислотой в комбинации с замещениями находящихся на поверхности аминокислотных остатков остатками лизина.
В варианте выполнения настоящего изобретения мотив распознавания лигазой Е3 имеет консенсусную последовательность, как показано в следующей таблице (где "X" может представлять собой любую из аминокислот природного происхождения):
Е3 убиквитин лигаза
Мотив распознавания (консенсусная последовательность)
VBCCul2
ALAPYIP (SEQ ID NO: 25)
MNM2
RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 26) FXXXLWXXL (SEQ ID NO: 27)
Smurf2
ELESPPPPYSRYPM (SEQ ID NO: 28)
RN181
KVGFFKR (SEQ ID No: 29)
E3alpha
LLVRGRTLW (SEQ ID NO 30
SCF
DRHDSGLDSM (SEQ ID NO: 31)
Siah
PXAXVXP (SEQ ID NO: 32)
Itch
PPXYXXM (SEQ ID NO: 33)
Nedd4-2
PPXY (SEQ ID No: 34)
PEST мотивы хорошо известны в данной области техники в качестве сигналов деградации (Rogers 1986, Science 234: 364-368, Rechsteiner 1996, TIBS 21: 267-271, Belizario 2008, Science 9: 210-220). В одном варианте выполнения настоящего изобретения мотив PEST имеет последовательность, раскрытую в Rechsteiner 1996, TIBS 21: 267-271, таблица 1 (включена в настоящий документ посредством ссылки), для любого из следующих белков: GCN4, IκВá, Fos, орнитин-декарбоксилаза, Cactus, CLN2, CLN 3 или NIMA.
Модифицированный полипептид нейротоксин, закодированный полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, будет при введении обладать сокращенной продолжительностью биологического эффекта, оказываемого на субъект, по сравнению с немодифицированным полипептидом нейротоксином. В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный биологический эффект, наблюдаемый у субъекта, вызывает мышечный паралич, то есть (обратимую) инактивацию мышечной способности к сокращению. В одном варианте выполнения настоящего изобретения эффекты могут быть протестированы с помощью так называемого анализа мышиного бега (Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). Биологические эффекты могут быть определены специалистом в данной области техники без дополнительных сложностей. Сокращенная продолжительность биологического эффекта, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, относится к статистически значимой сокращенной продолжительности. Является ли продолжительность эффекта статистически значимой сокращенной продолжительностью, может быть определено специалистами в данной области техники посредством применения стандартных статистических тестов, как например, определение интервалов доверия, определение р-значения, тест Стьюдента, тест Манна-Уитни и т.д. Предпочтительными интервалами доверия являются по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. р-значения предпочтительно составляют 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 или 0.0001. Предпочтительно, вероятность, предусмотренная настоящим изобретением, означает, что диагноз будет корректным для по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90% субъектов данной когорты или популяции. В варианте выполнения настоящего изобретения указанная сокращенная активность составляет менее 75%, менее 70%, менее 65%, менее 60%, менее 55%, менее 50%, менее 45%, менее 40%, менее 30% или менее 20% от нормальной продолжительности, то есть продолжительности, наблюдаемой для немодифицированного полипептида нейротоксина. Согласно настоящему изобретению нормальная продолжительность составляет около 4 месяцев в случае ВоМТ/А, 2 месяца в случае ВоМТ/В, около 3 - 4 месяцев в случае BoNT/C или около 4 недель в случае BoNT/E (Foran, J Biol. Chem. 278(2): 1363-1371, Eleopra 1998, Neurosci Lett. 13, 256(3): 135-138, Eleopra 1997, Neurosci Lett. 14,224(2): 91-94, Sloop 1997, Neurology 49(1): 189-194, Washbourne 1998, J Physiol Paris 92(2): 135-139). Необходимо понимать, что продолжительность эффекта зависит от индивидуальных характеристик субъекта, таких как генетическая среда, возраст, стиль жизни и т.д. Поэтому приблизительная продолжительность в контексте настоящего изобретения относится к продолжительности, как указано выше, для соответствующих полипептидов нейротоксинов (например, 4 месяца для BoNT/A или 4 недели для BoNT/E) со стандартным отклонением 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, или 5% или менее.
Предпочтительно согласно настоящему изобретению было обнаружено, что полипептид нейротоксин может быть модифицирован с тем чтобы оказывать сокращенное по продолжительности биологическое действие на субъект при введении. На самом деле, этого можно достичь путем введения сигнала деградации в легкую цепь указанного полипептида нейротоксина или связывания с ней, так как было обнаружено, что стойкость легкой цепи коррелирует с продолжительностью биологического эффекта. Сокращенная продолжительность биологического эффекта, оказываемого полипептидами нейротоксинами, предпочтительна для различных медицинских применений, которые требуют инактивации деятельности нервов, то есть паралича мышц, для облегчения заживления ран.
Настоящее изобретение охватывает вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению.
Термин "вектор" предпочтительно охватывает вектора на основе фагов, плазмид, вирусов и ретровирусов, а также искусственные хромосомы, такие как искусственные хромосомы бактерий или дрожжей. Более того, этот термин также относится к нацеливающим конструкциям, которые обеспечивают случайное или сайт-направленное введение целевой конструкции в геномную ДНК. Такие целевые конструкции предпочтительно содержат ДНК достаточной длины для гомологической, либо гетерологической рекомбинации, как подробно описывается ниже. Вектор, включающий полинуклеотиды по настоящему изобретению, в варианте выполнения настоящего изобретения, дополнительно содержит селектируемые маркеры для размножения и/или отбора в хозяине. Вектор может быть включен в клетку-хозяина путем различных методик, хорошо известных в данной области техники. Например, плазмидный вектор может вводиться в осадок, такой как осадок фосфата кальция или осадок хлорида рубидия, или в комплекс с заряженным липидом или в кластеры на основе углерода, как например, фуллерены. Альтернативно, плазмидный вектор может вводиться посредством методик на основе теплового шока или электропорации. Если вектором является вирус, он может быть упакован in vitro перед введением в клетку-хозяина, применяя соответствующую упаковывающую клеточную линию. Вектора на основе ретровирусов могут быть дееспособными в отношении репликации или дефектными в отношении репликации. В последнем случае, размножение вируса, в общем, будет происходить только в комплементирующем хозяине/клетках. Более того, в варианте выполнения настоящего изобретения, полинуклеотид оперативно связывается с последовательностями, контролирующими экспрессию, обеспечивающими экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, или с их выделенными фракциями в указанном векторе. Экспрессия поли-нуклеотида включает транскрипцию полинуклеотида в транслируемую мРНК. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в клетках-хозяевах, хорошо известны в данной области техники. В варианте выполнения настоящего изобретения они содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие инициацию транскрипции, и/или поли-А-сигналы, обеспечивающие терминацию транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут содержать энхансеры транскрипции, а также энхансеры трансляции. Возможные ре-гуляторные элементы, обеспечивающие возможность экспрессии в прока-риотических клетках-хозяевах, содержат, например, промотор lac, промотор trp или промотор tac в Е. coli, и примерами регуляторных элементов, обеспечивающих возможность экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, являются промотор АОХ1 или промотор GAL1 в дрожжах, или промотор CMV, промотор SV40, промотор RSV (вирус саркомы Роуз), CMV-энхансер, SV40-энхансер или интрон глобина в клетках млекопитающих и других животных клетках. Более того, индуцируемые последовательности, контролирующие экспрессию, могут применяться в экспрессионном векторе по настоящему изобретению. Такие индуцируемые вектора могут содержать tet или lac операторные последовательности или последовательности, индуцируемые тепловым шоком или другими факторами окружающей среды. Подходящие последовательности, контролирующие экспрессию, хорошо известны в данной области техники. Помимо элементов, которые отвечают за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы могут также содержать сигналы терминации транскрипции, такие как сайт SV40-поли-А или сайт tk-поли-А, по ходу транскрипции поли-нуклеотида. В этом контексте, подходящие экспрессионные вектора известны в данной области техники, как например, Okayama-Веrg кДНК экспрессионный вектор pcDV1 (Pharmacia), pBluescript (Stratagene), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) или pSPORT1 (Invitrogen). Предпочтительно указанным вектором является экспрессионный вектор и генный трансфер или нацеливающий вектор. Экспрессионные вектора, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус вакцины, аденоассоцииро-ванный вирус, вирус герпеса или вирус папилломы крупного рогатого скота, могут применяться для доставки полинуклеотидов или вектора по изобретению в целевую клеточную популяцию. Способы, известные специалистам в данной области техники, могут применяться для конструирования рекомбинантных вирусных векторов; смотрите, например, методики, описанные в Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994).
Более того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид или вектор по настоящему изобретению.
Термин "клетка-хозяин", как применяется в настоящем изобретении, охватывает прокариотические и эукариотические клетки-хозяева. В одном варианте выполнения настоящего изобретения клеткой-хозяином является бактериальная клетка, и в другом варианте выполнения настоящего изобретения клеткой-хозяином является бактериальная клетка бактерий, относящихся к отделу Firmicutes. В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанной бактериальной клеткой является клетка-хозяин e.coli. В другом варианте выполнения настоящего изобретения бактериальной клеткой является клетка-хозяин бактерий рода Clostridium. В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанной клеткой-хозяином бактерий рода Clostridium является клетка-хозяин Clostridium botulinum, в еще одном варианте выполнения настоящего изобретения, клеткой-хозяином является клетка одного из вышеупомянутых семи различных серотипов Clostridium botulinum. В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения бактериальной клеткой-хозяином является клетка-хозяин Clostridium tetani. В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения клеткой-хозяином является клетка-хозяин бактерий рода Bacillus, в конкретном варианте выполнения настоящего изобретения клеткой-хозяином является клетка-хозяин Bacillus megaterium. Эукариотической клеткой-хозяином в варианте выполнения настоящего изобретения является клетка животной клеточной линии, подходящей для получения токсичных белков, или грибковая клетка-хозяин, как например, дрожжевая клетка-хозяин.
Настоящее изобретение также охватывает полипептид, кодируемый полинуклеотидом согласно настоящему изобретению.
Термин "полипептид", как применяется в настоящем изобретении, охватывает выделенные или по существу очищенные полипептиды, по существу свободные от других полипептидов, включая комплексообразующие белки НА70, НА17, НА33 или NTNH (NBP) клетки-хозяина, или полипептидные препараты, содержащие в дополнение другие белки. Более того, этот термин включает химически модифицированные полипептиды. Такими модификациями могут быть искусственные модификации или модификации природного происхождения. Как упоминается выше, полипептид по настоящему изобретению будет обладать биологическими свойствами полипептидов нейротоксинов, упомянутых выше. Более того, он будет обладать сокращенной продолжительностью биологического эффекта, оказываемого на субъект при введении. Полипептид по изобретению, в варианте выполнения настоящего изобретения, может быть получен с помощью способа получения полипептида, как более подробно описано в описании настоящего изобретения. В варианте выполнения настоящего изобретения также раскрывается полипептидный препарат, который содержит комплекс полипептида и его комплексообразующих белков.
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с полипептидом по настоящему изобретению.
Антитела против полипептида по изобретению могут быть получены хорошо известными способами, применяя очищенный полипептид по изобретению или подходящий фрагмент, полученный из него, в качестве антигена. Фрагмент, который подходит в качестве антигена, может быть идентифицирован с помощью алгоритмов определения антигенности, хорошо известных в данной области техники. Такие фрагменты могут быть получены либо из полипептида по изобретению путем протеолитического расщепления или могут представлять собой синтетический пептид. В варианте выполнения настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, поликлональное антитело, одноцепочечное антитело, антитело человека или гуманизированное антитело, или приматизированное антитело, химеризованное антитело или их фрагмент. Также к антителам по настоящему изобретению относятся биспецифическое антитело, синтетическое антитело, фрагмент антитела, как например, фрагмент Fab, Fv или scFv и т.д., или химически модифицированная производная любого из них. Антитело по настоящему изобретению будет специфически связываться (то есть, не будет вступать в перекрестные реакции с другими полипептидами или пептидами) с полипептидом по изобретению. В частности, антитело также не должно вступать в перекрестную реакцию с немодифицированным полипептидом нейротоксином. Специфическое связывание может быть протестировано с помощью различных известных методик. Антитела или их фрагменты могут быть получены с применением способов, которые описываются, например, в Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью методик, первоначально описанных Köhler и его соавторами. (Köhler 1975, Nature 256 (1975), 495) или Galfré (Galfré 1981, Meth. Enzymol. 73 (1981)), которые содержат слияние мышиных миеломных клеток с клетками селезенки, полученными у млекопитающих, которые были иммунизированы антигеном, то есть полипептидом по изобретению или его иммуногенным фрагментом. Антитела могут применяться, например, для иммунопреципитации или иммунолокализации полипептидов по изобретению, а также для контроля присутствия указанных полипептидов, например, в рекомбинантных организмах, и для идентификации соединений, взаимодействующих с белками по изобретению. Например, поверхностный плазменный резонанс, как применяется в системе BIAcore, может применяться для повышения эффективности фаговых антител, которые связываются с эпитопом белка согласно настоящему изобретению (Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97-105; Malmborg 1995, J. Immunol. Methods 183, 7-13).
Полинуклеотид или полипептид по настоящему изобретению, в общем, могут применяться в качестве лекарственного средства.
Термин "лекарственное средство", как применяется в настоящем изобретении, в одном варианте выполнения настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей биологически активный полипептид нейротоксин или полинуклеотид, кодирующий его, в качестве фармацевтически активного соединения. Указанное лекарственное средство может применяться в терапевтически эффективной дозе для лечения человека или животных при различных заболеваниях или нарушениях. Лекарственное средство может быть получено с помощью различных методик в зависимости от желательных целей применения. Различные варианты выполнения лекарственного средства по настоящему изобретению рассматриваются далее.
Согласно варианту выполнения настоящего изобретения лекарственное средство содержит биологически активный полипептид нейротоксин по настоящему изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей в виде фармацевтической композиции. Фармацевтически приемлемый носитель (носители) должен быть приемлемым с точки зрения совместимости с другими ингредиентами композиции и отсутствия вредности для реципиента. Применяемый фармацевтический носитель может быть твердым, гелеобразным или жидким. Примерами твердых носителей являются лактоза, каолин, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, акация, стеарат магния, стеариновая кислота и тому подобное. Примерами жидких носителей являются глицерин, фосфатно-буферизированный соляной раствор, вода, эмульсии, различные типы смачивающих веществ и тому подобное. Подходящие носители содержат упомянутые выше и другие хорошо известные в данной области техники носителе, смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Истон, Пенсильвания. Необходимо понимать, что носителем может также быть вирус или ретровирус, подходящие для генной терапии, в частности, если активным ингредиентом лекарственного средства является полинуклеотид по изобретению.
Лекарственное средство, в варианте выполнения настоящего изобретения, будет растворяться в разбавителе перед введением. Разбавитель выбирается таким образом, чтобы он не оказывал воздействия на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода или физиологический раствор. Кроме того, фармацевтическая композиция или препарат могут также включать другие носители или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и тому подобное. Таким образом, полипептид нейротоксин по изобретению, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, может быть представлен в жидкой или лиофилизированной форме. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения он может присутствовать вместе с глицерином, белковыми стабилизаторами (HSA) или небелковыми стабилизаторами, такими как поливинилпирролидон (ПВП), гиалуроновая кислота или свободные аминокислоты. В варианте выполнения настоящего изобретения подходящие стабилизаторы, не являющиеся белковоподобными, представляют собой те, которые описываются в WO 2005/007185 или WO 2006/020208.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения лекарственное средство получают в виде раствора, содержащего полипептид нейротоксин. Кроме того, раствор может содержать носители или стабилизаторы, также упомянутые выше. Стабильная жидкая композиция полипептида нейротоксина может быть получена, как описывается в патенте США US 7,211,261.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция вводится местно. Как правило, лекарственное средство вводится внутримышечно или подкожно (около гланд), в зависимости от медицинского показания. Однако в зависимости от природы и образа действия соединения фармацевтическая композиция также может вводиться другими путями.
50
50
50
50
Терапевтически эффективная доза относится к количеству полипептида нейротоксина или полинуклеотида по изобретению, которое предотвращает, уменьшает или лечит симптомы, характерные для состояния или заболевания, упомянутых в описании настоящего изобретения. Терапевтическая эффективность или токсичность соединения может быть определена с помощью стандартных фармацевтических процедур, проводимых на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, может быть определена ED (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции) и LD (летальная доза для 50% популяции). Отношение доз терапевтического и токсического эффектов представляет собой терапевтический индекс, и может быть выражено как отношение LD/ED. Лекарственное средство по настоящему изобретению, в варианте выполнения настоящего изобретения, будет содержать рекомендации в отношении применяемых доз в предписаниях или инструкциях для пользователя, чтобы избежать корректировки дозы согласно индивидуальному желанию реципиента.
Лекарственное средство, раскрытое в настоящей заявке, разрабатывается для введения по меньшей мере один раз в целях лечения, или улучшения, или профилактики заболевания или состояния, перечисленных в описании настоящего изобретения. Однако указанное лекарственное средство может вводиться более одного раза.
Лекарственное средство согласно настоящему изобретению, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, может содержать лекарственные вещества в дополнение к биологически активному полипептиду нейротоксину, которые добавляются в фармацевтическую композицию в ходе ее получения.
Более того, настоящее изобретение относится к применению полинуклеотида или полипептида по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для заживления ран, иммобилизации костей и лечения разрыва сухожилия, для пост-хирургической иммобилизации, в частности, в связи с хирургическим удалением геморроя, для введения зубных имплантатов или замены тазобедренного сустава (эндопротез), для восстановления движений в коленном суставе, офтальмологического хирургического вмешательства, лечения угрей или лечения заболеваний, связанных с раздражением кишечника.
Симптомы, связанные с вышеупомянутыми медицинскими состояниями или заболеваниями, хорошо известны специалисту в данной области техники и описываются в стандартных учебниках по медицине, таких как Sled-man или Pschyrembl.
Корме того, настоящее изобретение также относится к применению полинуклеотида или полипептида по настоящему изобретению для получения диагностического лекарственного средства для определения отвечает ли субъект на терапию на основе нейротоксина.
Диагностическое лекарственное средство, как упоминается выше, представляет собой лекарственное средство на основе полипептида нейротоксина, как упоминается выше. Однако такое лекарственное средство должно применяться в течение времени и согласно схеме приема, которые позволяют только определить реагирует ли субъект вообще на полипептид нейротоксин или определить подходящую схему приема. Так как вышеуказанный полипептид нейротоксин, хотя и обладает также терапевтическим потенциалом, главным образом скорее применяется в целях диагностики, чем для лечения или улучшения, лекарственное средство, содержащее его, называется "диагностическим лекарственным средством". Таким образом, такой ограниченный по времени предварительный анализ с применением модифицированных полипептидов нейротоксинов согласно настоящему изобретению будет способствовать отбору субъектов, отвечающих на терапию с применением немодифицированного нейротоксина, а также определению подходящей дозы. Возможные побочные эффекты терапии на основе немодифицированного нейротоксина, который, как правило, действует в течение более долгого времени, могут быть уменьшены благодаря сокращенной продолжительности биологического эффекта, оказываемого полипептидом нейротоксином по изобретению.
Настоящее изобретение охватывает способ получения полипептида нейротоксина, кодируемого полинуклеотидом по изобретению, содержащий стадии:
a) культивации клетки-хозяина по изобретению в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида нейротоксина, кодируемого полинуклеотидом по изобретению, и
b) получения полипептида нейротоксина, кодируемого полинуклеотидом по изобретению, из культуры клетки-хозяина а).
В варианте выполнения настоящего изобретения полипептид может быть получен из культуры посредством всех обычных методик очищения, включая аффинную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), и методик осаждения, включая осаждение антителами. Кроме того, согласно варианту выполнения настоящего изобретения полипептид нейротоксин, полученный способом по настоящему изобретению, может быть свободен от комплексообразующих белков. В другом варианте выполнения изобретения полипептид нейротоксин может быть получен в виде комплекса, содержащего комплексообразующие белки в дополнение к полипептиду нейротоксину. Более того, получение, как применяется в настоящем изобретении, в варианте выполнения настоящего изобретения включает активацию полипептида нейротоксина. Активация может быть достигнута посредством протеолитического расщепления (одноцепочечного) предшественника полипептида нейротоксина, либо внутриклеточно путем эндогенной или экзогенной (например, рекомбинантно экспрессируемой) протеазы, либо с внешней стороны клетки путем контакта полипептида нейротоксина с протеазой, например, перед, в ходе или после вышеупомянутого очищения, в условиях, обеспечивающих расщепление.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения лекарственного средства, причем указанный способ содержит стадии вышеупомянутого способа по изобретению и дополнительную стадию получения полипептида нейротоксина, кодируемого полинуклеотидом по изобретению, в виде лекарственного средства.
Должно быть понятно, что такой способ получения лекарственного средства осуществляется в соответствии со стандартами GMP для лекарственных средств, в целях гарантии качества, фармацевтической безопасности и эффективности лекарственного средства. Подходящие композиции лекарственного средства описываются в описании настоящего изобретения. Специалисту в данной области техники будет очевидно, каким образом могут быть получены такие композиции.
Настоящее изобретение также охватывает способ получения косметической композиции, содержащий стадии способа по изобретению и дополнительную стадию получения полипептида нейротоксина в виде косметической композиции.
"Косметическая композиция", как применяется в настоящем изобретении, может быть составлена, как описано для фармацевтических композиций выше. Для косметических композиций, подобным образом, предусмотрено, что соединение по настоящему изобретению, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, применяется в по существу чистой форме. Примеси, однако, в данном случае играют менее критичную роль, чем в случае лекарственного средства. Косметические композиции, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, вводятся внутримышечно. В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения, косметические композиции, содержащие нейротоксин, могут быть получены в форме средств против морщин.
Настоящее изобретение также относится к такой косметической композиции и к применению полинуклеотида или полипептида по настоящему изобретению для получения косметической композиции, применяемой в качестве средства против морщин.
Все документы, упомянутые в описании настоящего изобретения, включены в настоящий документ посредством ссылки как в части полного их содержания, так и в части, специфически упомянутой в настоящей заявке.