Клеточная селекция зерновых растений на устойчивость к микотоксинам грибов рода Fusarium

2. Завалин А.А., Пасынков А.В., Пономарев М.И. Роль бобовых культур в земледелии Кировской области // Агрохимия. - 2002. - № 6. - С. 66-71.

3. Лошаков В.Г. Пожнивная сидерация и плодородие дерново-подзолистых почв // Земледелие. - 2007. - № 1. - С. 11-13.

4. Постников П.А. Промежуточные культуры // Аграрная наука. - 2002. - № 10. - С. 18-20.

УДК 57.083.18 (4,5) А.Г. Савицкая, Ю.А. Литовка,

Т.В. Рязанова, Н.В. Зобова КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ЗЕРНОВЫХ РАСТЕНИЙ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К МИКОТОКСИНАМ ГРИБОВ РОДА FUSARIUM*

Исследование влияния метаболитов фитопатогенных штаммов грибов рода Fusaiium, выделенных на территории Сибири, на каллусные культуры сортов мягкой яровой пшеницы показало, что внесение их в питательную среду в концентрации 20% приводит к снижению пролиферации жизнеспособных каллусных культур в среднем на 27% и образованию на их основе небольшого количества регенерантов. Выделен образец, наиболее пригодный для использования в клеточной селекции при получении форм пшеницы, устойчивых к фузариозу.

Ключевые слова: fusaiium, фузариотоксины, культура in vitro, каллусогенез, мягкая яровая пшеница.

A.G. Savitskaya, Yu. A. Litovka, T.V. Ryazanova, N.V.Zobova CELL SELECTION OF GRAIN CROPS ON RESISTANCE TO FUNGI MYCOTOXINS OF FUSARIUM GENUS

The influence research of phyto-pathogenic fungi strain metabolites of the genus Fusaiium, isolated in Siberia, on callus cultures of soft spring wheat sorts showed that their introduction into the nutrient environment at 20% concentration leads to the decrease in viable callus proliferation by 27% on average and the formation of regenerant small amount on their base. The sample most suitable for use in cell selection for receiving forms of wheat resistant to fusarium diseases is determined.

Key words: fusarium, fusarium toxins, culture in vitro, callus formation, soft spring wheat.

Введение. Фитопатогенные грибы рода Fusarium наносят значительный ущерб урожаю зерновых культур, в том числе яровой мягкой пшеницы, а также загрязняют зерно фузариотоксинами, опасными для человека и животных. Одним из наиболее экологичных способов борьбы с этой инфекцией является создание иммунных сортов с использованием культуры in vitro [2-4]. Все сибирские штаммы грибов рода Fusarium, выделенные из различного материала на территории агроценозов Красноярского края, обладают фитопатогенными свойствами и вызывают некротические поражения растений злаковых культур различной степени выраженности [1]. В то же время эти грибы представляют практический интерес для современной биотехнологии как продуценты биологически активных веществ - селективных факторов отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых культур [2-4].

* Работа поддержана за счёт средств, предоставленных путём выделения целевого финансирования краевым государственным автономным учреждением «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно - технической деятельности» в рамках конкурса РФФИ «Сибирь».

Во многих странах мира ведется работа по созданию фузариозоустойчивых сортов злаковых растений, однако основным ограничивающим фактором применения на практике форм, выведенных зарубежными селекционерами, является их неприспособленность к смене климатических условий [4-5].

Цель работы. Создание фузариозоустойчивых сортов яровой мягкой пшеницы с использованием биотехнологических методов и форм злаковых растений сибирской селекции.

Материалы и методы исследования. Для клеточной селекции в качестве продуцента биологически активных веществ использовали штаммы Z 12-2 Fusarium verticillioides и Z 3-06 Fusarium sporotrichioides из коллекции чистых культур кафедры химической технологии древесины и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета. Эти штаммы выделены из семян пшеницы и, согласно ранее проведенным исследованиям, характеризуются выраженной фитотоксической активностью в отношении зерновых культур [6].

Для получения раствора биологически активных веществ использовали жидкую токсигенную среду Myro, на которой практически полностью подавляется споруляция и идет интенсивный биосинтез токсинов. Поверхностное культивирование проводили в течение 42 суток при температуре 23±1 оС в темноте, после чего культуральную жидкость (КЖ) фильтровали (Puradisc 30К, Whatman), удаляя живые клетки гриба. Для исключения заражения каллусных культур стерильность фильтрата контролировали путем его высева на агаризованную среду Чапека.

Отбор форм пшеницы, устойчивых к микотоксинам, проводили в культуре изолированных тканей растений среди сортов Таежная Нива, Минуса, Новосибирская 15, Кантегирская 89 и линии КС-1607, выращенных в условиях светокультуры.

Для индукции каллусов изолированные незрелые зародыши пшеницы высевали на питательную среду с основой по прописи Мурасиге-Скуга, содержащую 2,4Д - 1мг/л и ИУК - 2 мг/л, а пролиферацию каллус-ных культур проводили на среде той же основы с 2,4Д - 0,5 мг/л и различной концентрацией КЖ в среде: 0 (контроль), 20 и 40 %, - добавление которой проводили после стерилизации питательных сред. Каллусы культивировали при 12-часовом фотопериоде в течение 30 суток, отмечали уровень пролиферации, а затем каллусы переносили на среду регенерации с кинетином (1 мг/л), не содержащую токсины, и культивировали их на свету в течение 30 суток. Жизнеспособные регенеранты высаживали в керамзит для получения семенного потомства [1-3].

Результаты. Оценка возможности получения растений-регенерантов, устойчивых к действию метаболитов грибов рода Fusarium, выявила, что биологически активные вещества, содержащиеся в культуральной жидкости, оказывают ингибирующее действие на уровень пролиферации каллусов и образования реге-нерантов у всех исследуемых образцов. При введении в среду Мурасиге-Скуга метаболитов в концентрации 20 % пролиферация каллусов снижалась в среднем в 1,5 раза по сравнению с контролем; при использовании концентрации 40 % происходило полное угнетение пролиферации каллусов у большинства изученных сортов за исключением линии КС-1607 и сорта Таежная Нива, которые были отобраны для дальнейшего исследования (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика регенерационных процессов на средах с метаболитами штамма 1 12-2 F. vertidШoides

в культуре незрелых зародышей пшеницы

Сорт, линия Введено зародышей, шт. Индукция каллусогенеза, % Пролиферация, %

концентрация КЖ

- 20 % 40 %

КС 1607 51 78,9 67,8 47,7 30,2

Минуса 20 75,0 80,0 60,0 0

Новосибирская 15 12 83,3 89,1 75,0 0

Кантегирская 89 15 86,6 97,0 40,4 0

Таежная Нива 35 85,5 98,8 72,4 29,1

Среднее £=133 81,9 86,5 59,1 11,9

Среднее, % от контроля 100 68 14

НСР0,05 56,7

Образцы (Таежная Нива и линия КС-1607), каллусы которых проявили устойчивость к метаболитам штамма Z 12-2 Г. verticillioides, использованы для проведения исследований со штаммом Z 3-06 Г. ьрогоМсЬШеь, обладающим выраженной фитотоксичностью и являющимся представителем широко распространенного вида в Сибирском регионе [6].

На втором этапе оценивали выживаемость каллусных культур и возможность получения регенерантов на средах с различной концентрацией метаболитов штамма Z 3-06 грибов рода Г. sporotrichioides. Использование метаболитов в концентрации 20 % приводило к ограничению пролиферации каллусов у линии КС-1607 и сорта Таежная Нива в среднем на 37 % по сравнению с контролем; метаболиты в концентрации 30 % ингибировали каллусогенез на 45 %; а в концентрации 40 % - на 77 % (табл. 2, рис. 1). При этом значительных отличий между реакцией образцов на токсины не отмечалось. Из результатов пролиферации этих двух образцов на средах с КЖ (табл. 1 и 2) можно отметить, что штамм Z 3-06 более агрессивен, чем Z 12-2.

Таблица 2

Пролиферация каллусов в культуре незрелых зародышей пшеницы на средах с метаболитами грибов рода Fusarium

Сорт, линия Введено зародышей, шт. Индукция кал-лусогенеза, % Пролиферация каллусов, %

Контр. концентрация КЖ штамма Z°3-06

20% 30% 40%

КС 1607 51 55 65,7 43,2 38,5 18,1

Таежная Нива 193 87 95,3 65,8 56,3 21,7

Среднее £244 71 86,5 54,5 47,4 19,9

Среднее, % от контроля 100 63 55 23

НСР0,05 46,7

Рис. 1. Влияние присутствия метаболитов штамма 13-06 F. sporotrichioides в питательной среде на рост каллусных культур пшеницы: А - контроль (без метаболитов); Б - содержание метаболитов

в среде 20 %; В - 30 %; Г - 40 %

Получение регенерантов после пролиферации каллусов проводили на среде регенерации без добавления метаболитов гриба. Образование регенерантов для линии КС-1607 и сорта Таежная Нива в контроле составило 56,7 и 72,2 %; в опытном варианте (при пролиферации каллусов на среде с 20 % метаболитов) -5,7 и 1,2 % соответственно. От показателей регенерации в контрольных условиях это составило всего 10 и 1,7%. Таким образом, регенерационные процессы ингибировались токсинами десятикратно и больше угнетались на каллусах, полученных от линии КС-1607.

При микроскопировании каллусных клеток существенных морфологических различий в опытных и контрольных вариантах не выявлено (рис. 2). Однако большая доля (по сравнению с контролем) сильно прокрашенных фрагментов на каллусах, прокультивированных с метаболитами, может означать присутствие в них поврежденных нежизнеспособных клеток.

контроль 40 % метаболитов

Рис. 2.. Каллусные клетки (окрашенные метиленовым синим) после роста на среде с метаболитами

штамма Z 3-06 (40 %) и в контроле

Заключение. Исследование влияния культурарной жидкости штаммов грибов рода Fusarium на каллусные культуры, индуцированные на незрелых зародышах сортов мягкой яровой пшеницы, выявило, что внесение в питательную среду метаболитов в концентрации 20 % вызывает снижение пролиферации жизнеспособных каллусных культур. Увеличение концентрации КЖ до 40 % сопровождается более яркой дифференциацией сортов по устойчивости к метаболитам. Однако если в первом случае регенерация растений сохраняется, хотя и на низком уровне, то получение регенерантов во втором случае практически отсутствует. Каллусные культуры и регенеранты, полученные от линии КС-1607 и сорта Таежная Нива, по сравнению с остальными образцами более устойчивы к действию биологически активных веществ обоих исследованных штаммов грибов рода F. sporotrichioides в культуре in vitro. Эти формы, с предпочтением сорта Таежная Нива, можно использовать в клеточной селекции как источник для получения регенерантов пшеницы, устойчивых к фузариозу.

Литература

1. Сорокатая Е.И. Биотехнологические методы в селекции ярового ячменя на устойчивость к корневым гнилям. - Красноярск: Изд-во КрасГАУ, 2003. - 70 с.

2. Получение регенерантов ярового ячменя, устойчивых к токсинам возбудителей корневых гнилей в условиях Восточной Сибири I Н.А. Сурин [и др.] II Микология и фитопатология. - 2002. - Т. 36, №2. -С. 67-71.

3. Необходимость повышения устойчивости к корневым гнилям сортов ярового ячменя в Красноярском крае I Н.А. Сурин [и др.] //Доклады РАСХН. -2001. - №3. - С. 16-18.

4. Тырышкин Л.Г. Генетическое разнообразие пшеницы и ячменя по эффективной устойчивости к болезням и возможности его расширения: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - СПб., 2007. - 40 с.

5. Шаяхметов И.Ф. Биологическая активность метаболитов из культурального фильтрата Cochliobolus sativus и Г^эпит oxysporum в связи с клеточной селекцией злаковых на устойчивость к фитопатогенам // Микология и фитопатология. - 2001. - Т. 35. - Вып. 6. - С. 66-71.

6. Биологический контроль сибирских штаммов грибов рода Fusarium в лабораторных и полевых условиях / А.Г. Савицкая [и др.] // Вестник КрасГАУ. - 2011. - № 11. - С. 97-102.

УДК 633.14: 631.52 А.В. Сумина, В.И. Полонский

ПОКАЗАТЕЛЬ СОДЕРЖАНИЯ ВОДЫ В ЗЕРНЕ И ЕГО ЗАВИСИМОСТЬ ОТ УСЛОВИЙ ВЫРАЩИВАНИЯ

И ГЕНОТИПА ЯЧМЕНЯ

На 24 образцах ярового пленчатого ячменя сибирской селекции, выращенных в трех географических районах, изучали влияние агроклиматических условий вегетационного периода и генотипа на содержание воды в зерне.

Ключевые слова: зерно, ячмень, содержание воды, бета-глюканы, генотип, географические условия.

A.V. Sumina, V.I. Polonskiy GRAIN WATER CONTENT INDEX AND ITS DEPENDENCE ON CULTIVATION CONDITIONS AND BARLEY GENOTYPE

On 24 samples of the Siberian selection spring scarious barley grown in three geographical areas, the influence of the vegetative period agroclimatic conditions and genotype on the content of water in grain is studied.

Key words: grain, barley, water content, genotype, beta-glucans, genotype, geographical conditions.

На сегодняшний день зерно ячменя используется главным образом в качестве корма для животных и как материал для производства пива и виски. К сожалению, незначительна роль этой культуры как пищевого продукта для человека. А вместе с тем известно, что его зерно содержит незаменимые аминокислоты, витамины, минералы и растворимые волокна, такие как бета-глюканы. Употребление последних в пищу улучшает работу кишечника и снижает риск сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и гипертонии [1-3].

Одним из основных показателей качества при использовании ячменя в пищевых целях является содержание воды в зерне. В зависимости от стойкости зерна при хранении и возможности его переработки в государственных стандартах на зерно установлены четыре состояния по влажности. Для пшеницы, ржи и ячменя они характеризуются следующим содержанием влаги: до 14% (включительно) - сухое, от 14 до 15,5 % - средней сухости, от 15,5 до 17% - влажное, более 17% - сырое [4]. Узкие пределы градации этих состояний вытекают из форм связи влаги с зерном. Вода в сухом зерне прочно связана с гидрофильными коллоидами, лишена подвижности и не принимает участия в обмене веществ. В связи с этим все процессы жизнедеятельности в зерне снижены, нет условий и для развития микроорганизмов.

Прежде всего, показатель воды в зерне интересен с точки зрения ценности зерна. А именно, что в этом продукте человек ценит сухое вещество, а не воду. Кроме влияния на пищевое достоинство зерна, содержание влаги определяет возможность его сохранности и переработки. Так, при влажности 16% и более зерно плющится и увеличивается расход энергии на его помол.

Оптимальное содержание влаги в зерне достигается в процессе сушки. Вместе с тем высокая температура этого процесса может повлиять на физические, химические и функциональные свойства зерна. В экспериментах, выполненных бразильскими учеными по изучению влияния температуры сушки на качество зерна овса [5], было установлено, что оптимальная температура этого процесса не должна превышать 25оС.