СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ ЦИТОСТАТИКАМИ У БОЛЬНЫХ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
METHOD FOR PREDICTING EFFICACY OF CYTOSTATIC CHEMOTHERAPY IN PATIENTS SUFFERING MALIGNANT NEW GROWTHS OF EPITHELIAL TISSUES

Предлагаемое изобретение относится к исследованию биологических жидкостей химическими и физическими методами и может быть использовано в онкологии, клинической лабораторной практике для оценки эффективности химиотерапии при лечении цитостатиками злокачественных новообразований эпителиальных тканей, а также мониторинга лечения данных онкологических заболеваний.
Принимая во внимание высокую токсичность противоопухолевых препаратов и их значительную стоимость, индивидуализация выбора тактики лечения при химиотерапии является чрезвычайно актуальной. На сегодняшний день существуют способы определения признаков чувствительности опухоли к химиопрепаратам:
- показана зависимость между низким уровнем экспрессии нуклеазы ERCC1 и ответом карцином на цисплатин, карбоплатин или оксалиплатин (Joshi M.B., Shirota Y., Danenberg K.D. et al. High gene expression of TS1, GSTP1, and ERCC1 are risk factors for survival in patients treated with trimodality therapy for esophageal cancer // Clin Cancer Res. - 2005. - Vol. 11, №6. - P. 2215-2221);
- взаимосвязь между повышенным содержанием тимидилатсинтазы и резистентностью новообразования к 5-фторурацилу (Aschele С., Lonardi S., Monfardini S. Thymidylate synthase expression as a predictor of clinical response to fluoropyrimidine-based chemotherapy in advanced colorectal cancer // Cancer Treat Rev. - 2002. - Vol. 28, №1. - P. 27-47).
Однако известные способы имеют ряд недостатков.
Так, показано различие экспрессии тимидилатсинтазы в первичной неоплазме и метастазах; может отмечаться увеличение ее активности в процессе лечения фторпиримидинами, а также зависимость от ряда клинических факторов (Libra M., Navolanic P.M., Talamini R. et al. Thymidylatesynthetase mRNA levels are increased in liver metastases of colorectal cancer patients resistant to fluoropyrimidine-based chemotherapy // BMC Cancer. - 2004. - Vol. 4, №1. - P. 11-17). Помимо вышеуказанного, общим недостатком перечисленных методов является возможность их использования для прогноза эффективности терапии только отдельно взятыми цитостатиками, что существенно ограничивает клиническое использование известных способов. Кроме того, предложенные молекулярные маркеры ответа опухоли на химиотерапию, в силу необходимости специального оборудования и реактивов, определяются далеко не в каждой клинической лаборатории.
За прототип изобретения выбран известный способ прогнозирования эффективности химиотерапии цитостатиками у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей, включающий исследование плазмы крови до и после лечения с количественным определением содержания меди, цинка и железа (Алясова А.В. Клинико-неврологические и клинико-иммунологические характеристики рака молочной железы: Автореф. … дис. д.м.н., Иваново, 2004, 43 с.).
Известный способ осуществляют следующим образом.
Для определения содержания микроэлементов в плазме крови больных применялся атомно-абсорбционный спектрофотометр С-115-М1. Градуировку прибора проводят путем предварительного измерения нескольких растворов с известной концентрацией определенного микроэлемента и построения калибровочных кривых. Для приготовления калибровочных растворов используют стандартные растворы №1; 2; 3 с известной концентрацией ионов цинка, меди, железа. В приборе устанавливают спектральные лампы с длиной волны 213,9 нм, 324,7 нм и 248,3 нм для определения концентраций цинка, меди, железа соответственно. Газ, используемый для работы, - ацетилен-воздух. Щель 0,1. Анализ каждой биологической пробы выполняют дважды. Для определения концентрации каждого микроэлемента требуется 1 мл пробы. По калибровочному графику высчитывают содержание заданных микроэлементов в биологических пробах. Все анализы выполняют в динамике, на каждом этапе лечения. У больных, вышедших в ремиссию заболевания, содержание меди в сыворотке крови было не менее чем в 1,3 раза, цинка не менее 1,4 раза ниже, чем у лиц, имевших рецидив заболевания или прогрессирование опухолевого процесса. Уровни железа достоверно не отличались.
Однако известный способ имеет ряд недостатков.
В качестве диагностического параметра в известном способе определяют изменения содержания микроэлементов только при лечении злокачественных заболеваний молочной железы, что может оказаться недостаточно специфично для других злокачественных новообразований или давать ложные результаты исследования при наличии некачественных реактивов, загрязнении образцов, технических сбоях в работе прибора. Недостатком является и то, что известный способ достаточно длителен по времени, так как проводится только после 6-го курса химиотерапии, что затрудняет прогнозирование течения заболевания в более ранние сроки.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей, повышающего прогностическую точность и специфичность, а также сокращающего время оценки прогноза заболевания.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе прогнозирования эффективности химиотерапии цитостатиками у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей, включающем исследование плазмы крови и определение концентрации микроэлементов цинка и железа до лечения, дополнительно определяют концентрацию лития в плазме крови и коэффициент степени эндогенной интоксикации после первого курса химиотерапии цитостатиками и при его увеличении более чем в 2,5 раза, увеличении содержания лития не менее чем в 2 раза, железа не менее чем в 1,5 раза и цинка не менее чем в 1,2 раза после первого курса полихимиотерапии оценивают проводимую цитостатическую терапию как эффективную, при этом коэффициент степени эндогенной интоксикации рассчитывают по формуле
КСЭИ=(МСМпл+МСМэр)/МСМмочи,
где
МСМпл - молекулы средней массы плазмы крови,
МСМэр - молекулы средней массы эритроцитов,
МСМмочи - молекулы средней массы мочи.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна», так как в процессе проведения патентно-информационного исследования не выявлены источники патентной и научно-технической информации, которые бы порочили новизну изобретения.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию «изобретательский уровень», так как не выявлено технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.
В настоящее время доказана роль микроэлементов (МЭ) в процессах роста, дифференцировки, репарации, регенерации, апоптоза, некроза, выживаемости клеток и в патогенезе различных хронических, воспалительных, дегенеративных и опухолевых заболеваний (Скальный А.В. Микроэлементозы человека (диагностика и лечение): Практическое руководство для врачей и студентов медицинских вузов. М., 1997).
Микроэлементы действуют в организме за счет их включения в той или иной форме и в незначительных количествах в структуру биологически активных веществ, главным образом, ферментов.
nd
th
Одним из эссенциальных МЭ, необходимых для нормального функционирования клетки, является цинк, который участвует в процессах синтеза и репарации ДНК, регенерации тканей, эмбриогенезе, репродукции, иммуногенезе, развитии мозга и поведенческих реакций, функционировании эндокринной системы, обонятельного, вкусового и зрительного анализаторов (De Silva J.J.R.F., Williams J.J.P. The biological chemistry of the elements, 2 Ed. - Oxford: Oxford University Press, 2001). Этот микроэлемент входит в структуру активного центра нескольких сотен металлоферментов (Hambidge К.М., Casey С.Е., Krebs N.F.Zinc // Mertz W. (ed) / Trace Elements in Human and Animal Nutrition, 5 Ed - New York: Academic Press, 1986, 2: 1-137). Он необходим для функционирования фермента ключевой реакции биосинтеза гема, который входит в состав гемоглобина, цитохромов дыхательной цепи митохондрий, цитохрома P-450, каталазы и миелопероксидазы. Цинк содержится в ферменте карбоангидразе, позволяющем освобождаться от избытка углекислого газа. Цинк входит в структуру ключевого антиоксидантного фермента Zn-Cu-суперосиддисмутазы и индуцирует биосинтез защитных белков клетки - металлотионеинов, в силу чего цинк является антиоксидантом репаративного действия. К ферментам, контролируемым цинком, относятся также алкогольдегидрогеназа, дегидропептидаза, щелочная фосфатаза, аденозидтрифосфатаза, тимидинкиназа, альдолаза, глутаматдегидрогеназа, аргиназа, кариозиназа, РНК-полимераза (Maret W., Jacob C., Vallee B.L., Fischer E.H. Inhibitor ysites in enzymes: zinc removal and reactivation by thionein // proc. Natl. Acad. Soc, 1999, 96 (3): 1936-1940).
Цинк играет важную роль в реализации гормональных функций в организме. Он непосредственно влияет на продукцию и функционирование инсулина, а тем самым на весь спектр инсулинзависимых процессов. Цинк увеличивает активность фосфатаз кишечной и костной, катализирующих гидролиз. У мужчин цинк участвует в формировании половых желез, в силу чего прослеживается обратная зависимость между уровнем цинка в организме и потенцией. Являясь ингибитором 5-альфа-редуктазы, цинк регулирует уровень метаболита тестостерона - дигидротестостерона, избыток которого обусловливает гиперплазию простаты. Цинк является важным ферментом и для женского организма, т.к. входит в структуру рецепторов для эстрогенов, регулируя, таким образом, все эстрогензависимые процессы. Тесная связь цинка с гормонами и ферментами объясняет его влияние на окислительно-восстановительные процессы, на синтетическую функцию печени. Известно, что цинк обладает липотропным эффектом, т.е. способствует распаду жиров, что проявляется уменьшением жира в печени. Цинк выступает в качестве регулятора действия кальция и меди в организме (Скальный А.В. Цинк и здоровье человека. - Оренбург: РИК ГОУ ОГУ, 2003: 80).
2+
+
+
+
2+
2+
Документирована роль цинка в потенцировании клеточного и гуморального иммунитета, направленного против бактерий, вирусов и опухолевых клеток (Takahaski К. Staphylococcal enterotoxin Н displays sunique MHC class II-binding properties // J. Immunol, 1999, 163 (2): 6686-6693). Цинк стимулирует внутритимусное развитие Т-ЛФ, дифференцировку В-ЛФ в иммуноглобулин-секретирующие клетки посредством Zn-зависимых фингер-белков (Hosea H.J., Rector Е.S., Taylor C.G. Zinc-deficient rats have fewer recent thymic emigrant (CD90) T lymphocytes in spleen and blood // J. Nutr., 2003, 133 (12): 4239-4242), созревание CD4 и CD8 лимфоцитов в культуре, экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости на макрофагах. Он дозозависимо регулирует антителогенез, повышает фагоцитоз (Fraker P.J., King L.Е. A distinct role for apoptosis in the changes in lymphopoiesis and myelopoiesis created by deficiencies of zinc // FASEB J, 2001, 15: 2572-2578), индуцирует синтез металлотионеинов в антиген-презентирующих клетках. Цинк стимулирует высвобождение интерлейкина-2, ФНО, y-интерферона, которые повышают активность противоопухолевых киллеров. Дефицит цинка вызывает подавление ЕК-активности (Mocchegiani Е., Muzzioli М., Santarelli L. etal.Zinc and metallothioneins on thymic and natural killer activites during liver regrneration in young and old mice // Metal Ions in Biology and Medicine / Ph. Collery, P. Bratter. et al. - Paris: John LibbeyEurotext, 1998, 5: 423-428). Цинк является конкурентным антагонистом ионов Са и Mg, по-видимому блокирует транскриптационные факторы Fas, c-myc и стимулирует ген bcl-2, способствует торможению эндонуклеаз и предупреждает апоптоз EKK. Цинк стимулирует экспрессию в EKK высокоаффинных рецепторов к интерлейкину-2 и трансферрину, лиганды которых являются дифференцировочными сигналами.
+
Цинк на нескольких уровнях участвует в регуляции апоптоза (Tsukamoto Н. Macrophage control of mycobacterial growth induced by picolinic acid is dependent on host cell apoptosis // J. Immunol, 2000, 164, 1: 389-397). Предполагается, что в качестве клеточного медиатора апоптоза он подавляет всасывание прооксидантных МЭ (железа и меди), является структурным металлом многочисленных транскриптационных факторов (p21, A20 и других), в качестве кофактора медь-, цинксодержащей супероксиддисмутазы и металлотионеинов защищает клетки от оксидантного стресса, блокирует активность кальций-, магний-эндонуклеазы. Данный МЭ не оказывает влияния на этапе "преапоптоза", но стимулирует CD95 опосредованный апоптоз (Sutherland L.C. Zinchasnoeffecton IL-3-mediatedapoptosisof BAR-3 cellsbutenhances CD95-mediated apoptosis of jurkat cells // J. Immunol. Methods, 2000, 234, 1-2: 43-50).
Цинк обеспечивает контроль экспрессии генов в процессе репликации и дифференцировки клеток. Он служит эссенциальной частью ДНК-связывающих белков, участвует в формировании рецепторных сигнальных путей и чувствительности к цитокинам, факторам роста, гормонам. Таким образом, цинк - один из наиболее многофункциональных микроэлементов не только в иммунной системе, но и в организме в целом.
Железо является важным МЭ, который входит в состав не только гемоглобина и миоглобина, но и цитохромов (белков-хромопротеидов), участвующих в процессах тканевого дыхания (цитохром P-450, цитохрром G5, цитохромы дыхательной цепи митохондрий). Данный микроэлемент важен не только для обеспечения организма кислородом, но и для функционирования дыхательной цепи и синтеза АТФ, процессов метаболизма и детоксикации эндогенных и экзогенных веществ, синтеза ДНК, инактивации токсичных перекисных соединений. Все эндогенные хелаторы железа тесно связаны с иммунной системой и ее основными медиаторами - цитокинами (Морщакова Е.Ф., Павлов А.Д. Регуляция гомеостаза железа // Гематология и трансфузиология, 2003, 1: 36-39). Лактоферрин блокирует синтез колониестимулирующего гранулоцитарно-макрофагального фактора, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли, но в определенных условиях усиливает экспрессию CD23 антигена и продукцию интерлейкина-1 макрофагами, а также играет роль в регуляции миелопоэза. Трансферрин (ТФ) - транспортный белок плазмы крови, который переносит железо из кишечника в места отложения и ретикулоэндотелиальные клетки, где используется большая часть этого элемента. Он также регулирует всасывание железа через мембраны серозных оболочек. Трансферрин является промотором клеточной пролиферации. Блокада рецепторов к ТФ на ТФ-зависимых клетках индуцирует в них апоптоз по типу "депривации факторов роста" (Prem P. Recent advances in cellular iron metabolism: Tes. 6 International Conference of the International Society for Trace Elements Research in Human (ISTERH) "Trace Element Research for a New Century" Quebec Cuty, Sept. 15-20, 2001 // J. Trace Elem. Exp. Med, 2001, 14 (3): 362-363). С ТФ тесно связан метаболизм и активность NK-клеток.
+
4
3
Литий оказывает множественные эффекты на жизнедеятельность клеток организма, опосредуя свое влияние путем регулирования систем вторичных посредников и через различные сигнальные пути (Karlović D., Buljan D. Apoptosis - the potential pathophysiological mechanism in mood disorders modifiable by lithium salts. Biochemia Medica 2008; 18 (3): 291-310). Литий влияет на ряд элементов систем мессенджеров: G-белки, протеинкиназы, аденилатциклазы, инозитолтрифосфат, 3β киназу гликогенсинтазы (Williams RSB, Harwood AJ. Lithium therapy and signal transduction // Trends Pharmacol Sci 2000; 21: 61-64). Известно влияние солей лития на Wnt/β катенин сигнальный путь и также через изменение активности активность 3β киназы гликоген синтазы на активность белков и невходящих в состав пути Wnt, например, опухолевого супрессорар53 (Watcharasit Р., Bijur G.N., Zmijewski J.W., Song L., Zmijewska A., Chen X., Johnson G.V., Jope R.S. Direct, activating interaction between glycogen synthase kinase-3beta and p53 after DNA damage. // Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99 (12): 7951-7955). В исследованиях Yan Lan с соавторами (Yan Lan, Xiufeng Liu, Rong Zhang Kai Wang, Yao Wang, Zi-Chun Hua. Lithium enhances TRAIL-induced apoptosis in human lung carcinoma A549 cells // Biometals: an international journal on the role of metal ions in biology, biochemistry, and medicine 2013; 26 (2): 241-54) была показана активация TRAIL-индуцированного апоптоза малигнизированных клеток под действием солей лития. Литий может модулировать активность ДНК-полимеразы (Suganthi М., Sangeetha G., Gayathri G., Ravi Sankar B. Biphasic Dose-Dependent Effect of Lithium Chloride on Survival of Human Hormone-Dependent Breast Cancer Cells (MCF-7) // Biol Trace Elem Res., 2012, (150): 477-486). Причем эффекты лития на клетки характеризуются двухфазным дозозависимым эффектом, то есть в зависимости от концентрации литий может оказывать как апоптотический, так и антиапоптотический эффект. Известна роль лития в снижении процессов перекисного окисления липидов за счет торможения синтеза ненасыщенных жирных кислот (Панченко Л.Ф., И.В. Маев, К.Г. Гуревич. Клиническая биохимия микроэлементов - М: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2004. - 368 с.). Литий регулирует концентрацию цитопротекторного белка bcl-2 в нейронах человека. Литий дозозависимо стимулирует продукцию ИЛ-6, гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующего фактора. Кроме того, литий активирует продукцию mPHK ФНО-а в условиях совместного добавления Li и ИЛ-2, причем оба последних агента оказывали в данном случае сильнейший противоопухолевый эффект, обусловленный уменьшением размеров опухолей и увеличением выживаемости опухоль-несущих животных. Таким образом, литий является потенциальным противоопухолевым иммуномодулятором. Литий также взаимодействует с рецепторами гормона щитовидной железы и ингибирует превращение T в T, что вызывает гипотиреоидизм у некоторых пациентов и снижает стабилизирующие эффекты. Литий также обладает инсулиноподобным эффектом на организм.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
Чрезвычайно важна роль МЭ в регуляции противоопухолевого иммунитета. Металлы - Mg, Zn - могут выступать ко-факторами онкобелков и продуктов опухоль-супрессорных генов, Fe, Pb - индукторы свободнорадикальных процессов, лежащих в основе повреждения опухоль-супрессорных генов. Многочисленные Mg, Zn - содержащие ферменты (каспазы) и фосфопротеины способствуют не только поддержанию экспансии, но и супрессии злокачественного роста (Ho L.H. Involvement of intracellular labile zinc in suppression of DEVD-caspase activity in human neuroblastomacells // Biochem. Biophys. Res. Commun, 2000, 268, 1: 148-154). Цинк является важнейшим кофактором ангиогенеза растущей опухоли (Vernhet L. Differential sensitivities of MRP1-over expressing lung tumor cells to cytotoxic metals // Toxicology, 2000, 142 (2): 127-134), необходимым компонентом многочисленных транскрипционных факторов в неопластических клетках. Одновременно он осуществляет поддержание синтеза тех рецепторных детерминант, которые участвуют в оптимизации NK-лизиса клеток бластомы (Александров А.В. Роль молекул адгезии и цитокинов в противоопухолевом иммунитете: Автореф. дис. … к.м.н. - М., 1993: 24) и усиливает активность NK через стимуляцию продукции цитокинов и факторов роста. Дисбаланс цинка в составе фингерных белков вызывает активацию экспрессии протоонкогенов c-jun, c-myc, c-fos и других. Железосвязывающий белок ТФ является селективным фактором роста клеток рака простаты и мелкоклеточного рака легкого (Rossi М.С., Zetter B.R. Selective stimulation of prostatic carcinoma cell proliferation by trancferrin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89. - P. 6197-6201). Метаболизм металлов в опухолевых клетках тесно связан с продукцией металлотионеинов (МТ) и MDR-белков, участвующих в формировании лекарственной резистентности опухолей (Lazo J.S., Pitt B.R. Metallothioneins and cell death by anticancer drugs // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol, 1995, 35: 635-653). Показаны выраженные противоопухолевые свойства лития, способствующего повышению LAK-активности и уменьшению размеров опухолей у мышей. Литий в культуре опухолевых клеток мыши способен стимулировать продукцию ФНО-a, который повышает апоптоз и некроз клеток. М. Kubera и соавторы (Kubera M, Bubak-Satora М, Holan V. et al. Modulation of cell-mediated immunity by lithium chloride // Z. Naturforsch, 1994, 49 (9-10): 679-683) отмечали, что иммуномодулирующие свойства лития зависят от типа клеточной популяции способа назначения микроэлемента. В опытах на мышах авторы продемонстрировали подавление под влиянием хлорида лития активности естественных киллеров к трансплантированным опухолям на 43% в первые 6 дней назначения с последующим возрастанием данной активности в 2,5 раза по сравнению с контролем к 21 дню лечения. Есть данные о стимуляции солями лития как противоопухолевого ответа, так и реакцией отторжения трансплантанта (Оберлис Д., Харланд Б., Скальный А. Биологическая роль макро- и микроэлементов у человека и животных / Под ред Скального - С.-Пб.: Наука, 2008: 452-458).
Однако авторы предлагаемого способа не обнаружили в научной медицинской литературе сведений об изменении концентраций цинка, железа и лития в процессе противоопухолевой химиотерапии цитостатиками в качестве факторов, позволяющих прогнозировать эффективность противоопухолевого лечения.
Эндогенная интоксикация - состояние, характеризующееся накоплением в тканях и биологических жидкостях продуктов нормального и аномального обмена веществ или клеточного реагирования, сложный многокомпонентный процесс, обусловленный нарушением биологической активности эндогенных метаболитов (Копытова Т.В. Механизмы эндогенной интоксикации и детоксикации организма в норме и при морфо-функциональных изменениях в коже: дисс. … докт. биол. наук: 03.00.04. Н. Новгород, 2007. 280 с.). В настоящее время сформулировано понятие субстрата эндогенной интоксикации (Малахова М.Я. Метод регистрации эндогенной интоксикации: Пособие для врачей. СПб.: МАПО, 1995. 33 с.), физиологически активных компонентов, по молекулярной массе занимающих промежуточное положение между пулом белков плазмы и аминокислотами - молекулы средней массы (МСМ). Это гетерогенная группа веществ разнообразной структуры с молекулярной массой от 300 до 5000 Да. МСМ обладают нейротоксической активностью, угнетают синтез белка, способствуют гемолизу эритроцитов, ингибируют эритропоэз и активность ряда ферментов, вызывают состояние вторичной иммуносупрессии (Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Синдром эндогенной интоксикации // Лабораторные методы диагностики неотложных состояний. - М.: Медицина, 2002. - С. 193-211). МСМ можно разделить на две большие группы: вещества низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) - соединения, в основном, небелковой природы (промежуточные продукты метаболизма, продукты нарушенного метаболизма, конечные продукты обмена в сверхвысоких концентрациях) и олигопептиды (ОП) - пептиды с молекулярной массой не более 10 кДа, к которым относят регуляторные (присутствующие в норме) и нерегуляторные (возникающие при аутолизе, протеолизе и т.д.) (Карпищенко, А.И. Медицинские лабораторные технологии / А.И. Карпищенко. СПб: Наука, 1999. - 656 с.).
Олигопептиды состоят из двух пулов: регуляторные (гормоны-нейротензины, нейрокинины, вазоактивный интестинальный пептид, соматостатин, соматомедин, вещество P, эндорфины, энкефалины и т.д.) и нерегуляторные - продукты протеолитической деградации плазменных и тканевых белков, поступившие в кровь в результате аутолиза, ишемии, гипоксии органов, процессов протеолиза.
ВНСММ представляют собой небелковые производные различной природы: мочевина, креатинин, мочевая кислота, глюкоза, органические кислоты, аминокислоты, жирные кислоты, холестерин, фосфолипиды, продукты свободнорадикального окисления, промежуточного метаболизма, нуклеопротеидного обмена, спирты, альдегиды, токсические компоненты полостных сред (фенол, скатол, индол, путресцин, кадаверин), продукты белкового обмена - аммиак, мочевина, мочевая кислота, креатинин, индикан, глутамин, и другие. Концентрация МСМ является интегральным показателем, необходимым для объективизации токсичности независимо от этиопатогенетических особенностей заболевания.
По современным представлениям (Добротина Н.А., Копытова Т.В. Эндоинтоксикация организма человека: методологические и методические аспекты: Учебное пособие. Н. Новгород, 2005. 64 с.) различают четыре фазы развития эндогенной интоксикации.
В первой (латентной) фазе наблюдается повышение МСМ в эритроцитах без значительного роста их концентрации в плазме. Происходит элиминация поступающих токсинов из очага интоксикации.
Во второй фазе эндогенной интоксикации концентрация МСМ в эритроцитах значительно возрастает при умеренном повышении их концентрации в плазме. Это фаза накопления токсических продуктов, при которой их образование превышает элиминацию.
В третьей фазе (полного насыщения) имеет место максимальная концентрация МСМ в эритроцитах; параллельно происходит повышение токсических веществ в плазме.
Четвертая фаза характеризуется нарастанием количества МСМ в плазме, причем в эритроцитах из-за нарушения проницаемости мембраны их концентрация снижается. Это фаза необратимой декомпенсации систем и органов детоксикации с присутствием синдрома эндогенной интоксикации, который характеризуется накоплением в тканях и биологических жидкостях эндогенных токсических субстанций - избытка нормального или патологического обмена веществ.
Синдром эндогенной интоксикации у онкологических больных обусловлен как опухолевым процессом, так и комплексом терапевтических воздействий, направленных на разрушение очагов злокачественного роста. Известно, что скорость формирования синдрома эндогенной интоксикаци и степень его тяжести существенно зависят от интенсивности деструктивных процессов (Сахно Л.А., Николаев В.Г. Сорбционные методы в онкологии // Онкология. 1999, 3: 165-176).
Предлагаемое изобретение обеспечивает при использовании следующий технический эффект:
- повышение эффективности проведения противоопухолевой химиотерапии за счет раннего выявления неэффективного использования препаратов и более ранней смены химиотерапевтического агента;
- увеличение точности, чувствительности и специфичности способа прогнозирования эффективности химиотерапии цитостатиками;
- возможность прогнозирования эффективности химиотерапии при использовании в лечении любых цитостатиков;
- снижение времени прогнозирования эффективности химиотерапии цитостатиками;
- снижение экономических затрат на неэффективное лечение больных.
Для подтверждения положительного эффекта исследованы и проанализированы образцы крови 14 больных с рецидивом рака эпителиальных тканей, подтвержденным гистологически, до лечения и после проведения первого курса химиотерапии. Первая группа включала пациентов с рецидивом рака толстого кишечника: 3 мужчин и 4 женщины в возрасте 57-62 лет. Все входящие в нее больные имели IV стадию заболевания. Вторая группа состояла из больных рецидивом рака мочевого пузыря: 5 мужчин и 2 женщин в возрасте 48-64 года. Все входящие в нее больные имели III стадию заболевания, установленную в соответствие с международной классификацией TNM.
Лечение при рецидиве рака толстого кишечника включало 8 курсов полихимиотерапии (ПХТ) по схеме FOLFIRI: иринотекан, фторурацил, лейковорин, при рецидиве рака мочевого пузыря - 6 курсов ПХТ по схеме CMV: карбоплатин, метотрексат, винбластин (Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний / Под ред. Н.И. Переводчиковой. - 2-е изд., доп. - М.: Практическая медицина, 2005. - 365 с.). Пациенты обеих групп наблюдались на протяжении года и в зависимости от отдаленных результатов лечения были разделены на две подгруппы: с достигнутым объективным эффектом (частичный ответ или стабилизация) или прогрессией заболевания. Оценку результатов лечения опухоли проводили с помощью компьютерной томографии с использованием критериев RESIST (версия 1.0), исследование выполнялась до начала лечения и через каждые 8 недель на протяжении терапии и последующего наблюдения. Оценку уровня эндогенной интоксикации проводили по уровню молекул средней массы эритроцитов, плазмы, мочи (Копытова Т.В. Механизмы эндогенной интоксикации и детоксикации организма в норме и при морфо-функциональных изменениях в коже: дисс. … докт. биол. наук: 03.00.04. Н. Новгород, 2007. 280 с.). Анализ уровня микроэлементов осуществляли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на спектрометре iCAP6300Duo (ThermoScientific, США). Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ MicrosoftExcel, Biostat 4.3.
В случаях последующего достижения объективного эффекта после проведения полихимиотерапии у больных, закончивших 1 курс лечения, мы наблюдали значительное увеличение МСМ плазмы крови: в 3 раза при рецидиве рака толстого кишечника и в 1,6 раза при рецидиве рака мочевого пузыря; МСМ эритроцитов: в 1,6 и 1,7 раза соответственно. МСМ мочи, напротив, при этом уменьшалось в 2 раза и 1,8 раза. Коэффициент степени эндогенной интоксикации (рассчитываемый по формуле КСЭИ=(МСМпл+МСМэр)/МСМмочи) возрастал в 4,24 и 2,95 раз. Все вышеперечисленное обусловило статистически значимое возрастание степени эндогенной интоксикации: с 1-й до 3-й стадии в этой подгруппе после 1 курса ПХТ
Данный факт также может быть объяснен попаданием продуктов незавершенного протеолиза разрушаемых под действием препаратов опухолевых клеток в системный кровоток, так как пул МСМ помимо всего прочего включает олигопептиды, образующиеся при протеолизе и аутолизе клеток, и промежуточные продукты метаболизма (Малахова, М.Я. Эндогенная интоксикация как отражение компенсаторной перестройки обменных процессов в организме // Эффер. терапия. - 2000. - Т. 6, №4. - С. 3-14).
Некоторые опухоли эпителиальных тканей накапливают металлы (Mir М.М., Dar N.А., Malik М.А. et al. Studies on association between Copper excess, Zinc deficienty and P53 mutations in esophageal squamous cell carcinoma from Kashmir valley, India - a high risk area // Intern. J. of Health Sciences. - Vol. 1, №1. - 2007. - P. 35-41; Richardson D.R., Kalinowski D.S., Lau S. et al. Cancer cell iron metabolism and the development of potent iron chelators as anti-tumor agents // BiochimBiophysActa. - 2009. - Vol. 1790, №7. - P. 702-717). Например, известно, что опухолевые клетки с помощью цитокиновой сети перестраивают метаболизм Fe так, что на фоне его дефицита в нормальных тканях возникает избыток металла в опухоли (Hoshino T., Misaki М. In vitro cytotoxicities and in vivo distribution of transferrin - platinum (II) complex // J. Pharm. Sci. - 1995. - Vol. 84. - №2. - P. 216-221). В связи с этим, при лизисе злокачественных клеток под действием химиотерапии, металлы, содержащиеся в малигнизированных клетках, попадают в кровь, обуславливая значимое повышение их содержания в кровотоке: цинка - не менее чем в 1,6 и в 2,2 раза; лития - не менее чем в 2,5 и 1,8 раза; железа - не менее чем в 3,1 и 2,5 раза соответственно в группах с положительной динамикой при рецидиве рака кишечника и мочевого пузыря (таблица 1).
Предлагаемый способ прогнозирования эффективности химиотерапии цитостатиками у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей осуществляют следующим образом.
Исследования проводят до лечения и после первого курса химиотерапии цитостатиками.
Анализ концентрации микроэлементов цинка, железа и лития в плазме крови осуществляют методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на спектрометре iCAP6300Duo (ThermoScientific, США). Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ MicrosoftExcel, Biostat 4.3.
Определение микроэлементов в плазме крови осуществляют следующим образом. 1 мл плазмы крови заливают 2 мл азотной кислоты (ос.ч.) и оставляют на 12 часов. Затем добавляют по 250 мкл пероксида водорода (36%). Далее пробирки автоклавируют с закрытыми крышками в герметичном автоклаве в соответствии с температурной программой: 160°C - 1 ч, 180°C - 1 ч, 200°C - 2 ч. После к 3 мл бидистиллированной воды добавляют раствор полученного минерализата и доводят объем бидистиллированной водой до 15 мл. Для определения спектра элементов используют атомно-эмиссионный спектрометр с индуктивно связанной плазмой АЭС и ИСП Модель i CAP6300 INTERTECH (США). Метод плазменной атомно-эмиссионной спектрометрии пригоден для одновременного определения нескольких микроэлементов. Его преимущества заключаются в относительно малых матричных эффектах, широком диапазоне измерений (1:10000), высокой производительности (Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. - М.: Издательский дом «ОНИКС 21 век»: Мир, 2004. - 272 с.).
Определение общего уровня молекул средней массы осуществляют методом Малаховой М.Я. в модификации Т.В. Копытовой (Копытова Т.В. Механизмы эндогенной интоксикации и детоксикации организма в норме и при морфо-функциональных изменениях в коже: дисс. … докт. биол. наук: 03.00.04. Н. Новгород, 2007. 280 с). Метод основан на осаждении крупномолекулярных белков 0,2 M раствором хлорной кислоты и спектрометрическом определении пула МСМ безбелкового супернатанта в ультрафиолетовой области спектра от 238 до 298 нм. Для исследования используют различные биологические среды организма - плазма, эритроциты и моча (табл. 2).
Расчет конечного результата проводят путем интегрального измерения площади фигуры, образованной полученными значениями экстинкции, путем умножения суммы полученных значений на шаг длины волны - 4 нм:
∑ВНСММ=(Е238+Е242+Е246+…+Е298)×4 (условные единицы)
Коэффициент степени эндогенной интоксикации рассчитывают по формуле
КСЭИ=(МСМпл+МСМэр)/МСМмочи,
где
МСМпл - молекулы средней массы плазмы крови,
МСМэр - молекулы средней массы эритроцитов,
МСМмочи - молекулы средней массы мочи.
При увеличении КСЭИ более чем в 2,5 раза, увеличении содержания лития не менее чем в 2 раза, железа не менее чем в 1,5 раза и цинка не менее чем в 1,2 раза после первого курса химиотерапии цитостатиками оценивают проводимую цитостатическую терапию как эффективную.
Пример конкретного исполнения дан в виде выписок из истории болезни.
Пример 1.
Пациентка Б., 60 лет, рецидив рака толстого кишечника (IV стадия заболевания, установленная в соответствии с международной классификацией TNM). Диагноз заболевания подтвержден гистологически. При определении стадии эндогенной интоксикации по уровню МСМ: МСМ плазмы крови=8,4 усл.ед; МСМ эритроцитов=22,3 усл.ед; МСМ мочи=45,8 усл.ед. На основании полученных данных был рассчитан коэффициент степени эндогенной интоксикации (КСЭИ)=0,67. Диагностирована 1-я стадия эндогенной интоксикации организма. Методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой были выявлены следующие уровни микроэлементов в плазме крови: Zn=0,88 мкг/мл плазмы; Fe=0,90 мкг/мл плазмы; Li=0,002 мкг/мл плазмы.
Лечение включало 8 курсов полихимиотерапии по схеме FOLFIRI: иринотекан, фторурацил, лейковорин. После первого курса полихимиотерапии произошло увеличение вышеприведенных показателей: МСМ плазмы крови=29,2 усл.ед; МСМ эритроцитов=36,5 усл.ед; МСМ мочи=13,3 усл.ед. На основании полученных данных был рассчитан КСЭИ=4,9. После проведения первого курса полихимиотерапии диагностирована 3-я стадия эндогенной интоксикации организма. Также выявлен рост содержания микроэлементов в плазме крови: Zn=1,2 мкг/мл плазмы; Fe=1,5 мкг/мл плазмы; Li=0,008 мкг/мл плазмы. Оценку результатов лечения опухоли проводили с помощью компьютерной томографии с использованием критериев RESIST (версия 1.0), исследование выполнялась до начала лечения и через каждые 8 недель на протяжении терапии и последующего наблюдения. Пациентка наблюдалась на протяжении года. По прошествии этого времени у пациентки выявлена частичная регрессия опухолевых очагов.
Пример 2.
Пациент Т. 57 лет, рецидив рака мочевого пузыря (III стадия заболевания, установленная в соответствии с международной классификацией TNM). Диагноз заболевания подтвержден гистологически. При определении стадии эндогенной интоксикации по уровню МСМ: МСМ плазмы крови=9,55 усл.ед; МСМ эритроцитов=21,76 усл.ед; МСМ мочи=25,50 усл.ед. На основании полученных данных был рассчитан КСЭИ=1,3. Диагностирована 1-я стадия эндогенной интоксикации организма. Методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой были выявлены следующие уровни микроэлементов в плазме крови: Zn=0,86 мкг/мл плазмы; Fe=2,50 мкг/мл плазмы; Li=0,012 мкг/мл плазмы. После первого курса полихимиотерапии не произошло увеличение степени эндогенной интоксикации: МСМ плазмы крови=8,30 усл.ед; МСМ эритроцитов=12,2 усл.ед; МСМ мочи=35,30 усл.ед. На основании полученных данных был рассчитан КСЭИ=0,58. После проведения первого курса полихимиотерапии диагностирована та же 1-я стадия эндогенной интоксикации организма. Также не выявлено увеличения содержания микроэлементов в плазме крови: Zn=0,80 мкг/мл плазмы; Fe=2,50 мкг/мл плазмы; Li=0,001 мкг/мл плазмы. Оценку результатов лечения опухоли проводили с помощью компьютерной томографии с использованием критериев RESIST (версия 1.0), исследование выполнялась до начала лечения и через каждые 8 недель на протяжении терапии и последующего наблюдения. Пациент наблюдался на протяжении года. По прошествии этого времени была выявлена прогрессия опухолевого процесса.