УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭКОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Полезная модель относится к экспериментальной микробиологии и может быть использована для изучения экологии микроорганизмов в экосистемах, максимально приближенных к условиям окружающей среды (почва, вода).
В настоящее время накоплено достаточное количество фактов, свидетельствующих о самостоятельном существовании в водных и почвенных экосистемах многих бактериальных патогенов, но биологические особенности такого сапрофитического существования мало изучены и по-прежнему остаются дискуссионными. Экспериментальное изучение сапрофитической фазы обитания патогенных микроорганизмов необходимо для расшифровки механизмов циркуляции возбудителей инфекционных заболеваний в окружающей среде, что, в конечном итоге, способствует усовершенствованию эпидемиологического надзора и открывает новые направления для оздоровления природных очагов инфекций. Поэтому актуальной задачей остается разработка устройств, позволяющих изучать микроорганизмы в условиях, максимально приближенных к естественным.
Наиболее близким к предлагаемому является устройство, состоящее из камеры, имеющей отверстие для забора проб, фланцев с прокладками и целлюлозных фильтров (Родзиковский А.В. Методические рекомендации по применению диффузионной камеры для проведения экологических исследований по биологии возбудителя сибирской язвы в почве / А.В.Родзиковский, Ю.И.Соркин, Л.И.Вязьмин // Иркутский ордена Трудового Красного Знамени противочумный НИИ Сибири и Дальнего Востока. Утверждены ГУКИ МЗ СССР 9 июня 1988 г. - Иркутск, 1988. - 6 с.). Камера представляет собой полый цилиндр из полихлорвинила с резьбовыми соединениями объемом 5 мл. Фланцы имеют отверстия и резьбовые соединения, соответствующие таковым на торцах камеры.
Целлюлозные мембранные фильтры "Synpor" или «Владипор» с размером пор 0,3-0,7 мкм и диаметром 35 мм (в соответствии с диаметром торцов камеры) при сборке устройства крепятся к торцам камеры при помощи фланцев с прокладками. Отверстие для забора проб на боковой стенке камеры плотно завинчивается болтом и служит для введения или отбора проб изучаемого объекта.
Однако данное устройство не обеспечивает изоляцию чистой культуры исследуемого микроорганизма, что затрудняет исследование динамики численности и изменения его биологических свойств. Определенные виды почвенной биоты разрушают целлюлозу (Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы / Д.Г. Звягинцев. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987. - 256 с.), из которой изготовлены мембранные фильтры, в результате чего в устройство проникают почвенные микроорганизмы. Микроорганизмы, способные подвергать биодеградации матрицу мембраны, могут образовывать колонии на ее внешней стороне и изменять характеристики проницаемости настолько, что она перестает функционировать должным образом. Поэтому целлюлозные мембранные фильтры непригодны для длительных экспериментов по экологии микроорганизмов. Кроме того, данное устройство недостаточно удобно в работе, так как целлюлозные фильтры плохо выдерживают стандартную стерилизацию автоклавированием и кипячением (Брок Т. Мембранная фильтрация / Т. Брок. - Пер. с англ. - М.: Мир, 1987. - 464 с).
Целью является - повышение изоляционных свойств устройства и удобства работы.
Поставленная цель достигается тем, что устройство состоит из камеры с открытыми торцами, имеющей отверстие для забора проб, фланцев с прокладками и фторопластовых фильтров.
Оптимальным для решения поставленной задачи является применение в качестве фильтров микрофильтрационных фторопластовых гидрофильных мембран производства ЗАО НТЦ «Владипор» с размером
пор мембраны 0,15 мкм, что обеспечивает изоляцию в устройстве большинства микроорганизмов. Исключением являются микоплазмы (размер 0,01-0,1 мкм), вирусы и фаги, которые не оказывают влияния на проведение бактериологических исследований. Фторопластовые фильтры отличаются высокой прочностью, выдерживают действие агрессивных жидкостей, большой диапазон температуры и рН, стерилизацию автоклавированием и не разрушаются микроорганизмами. Гидрофильность фильтров обеспечивает наиболее быстрое установление равновесия растворенных веществ.
Надежность устройства, исключающая выход исследуемого микроорганизма за его пределы, обеспечивает соблюдение правил биологической безопасности при длительных экспериментах с микроорганизмами I-II группы патогенности. Технические характеристики фторопластовых фильтров позволяют помещать устройство в объекты окружающей среды, содержащие большое количество посторонней микрофлоры, а также в агрессивные среды с наличием химических веществ, спиртов, углеводородов, масел, кислот, щелочей, органических растворителей (кроме кетонов, сложных и простых эфиров, амидных растворителей). Данное устройство может применяться в экспериментальных исследованиях по экологии микроорганизмов как в естественных средах (почва, вода), так и в отходах химических, нефтеперерабатывающих, металлургических и других предприятий.
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».
Устройство для изучения экологии микроорганизмов состоит из камеры 1 с открытыми торцами (см. приложение к описанию, фиг.1), имеющей отверстие для забора проб 2, фильтров 3, представляющих собой микрофильтрационные фторопластовые гидрофильные мембраны с размером пор 0,15 мкм и общей пористостью 80-85%, фланцев с прокладками 4.
Устройство используют следующим образом. При сборке фторо-пластовые фильтры крепятся с помощью клея БФ-2 к открытым торцам камеры. Фланцы с прокладками обеспечивают дополнительную фиксацию фторопластовых фильтров, а также устойчивость устройства при помещении его, например, в почвенную суспензию. Перед применением устройство стерилизуют автоклавированием. Через отверстие для забора проб, предварительно обработанное 70% спиртом, стерильным шприцем в устройство вводят исследуемый микроорганизм и производят забор проб через необходимые для эксперимента интервалы времени. После каждой манипуляции отверстие герметизируют и одновременно дезинфицируют медицинским клеем БФ-6.
Для изучения экологических закономерностей существования микроорганизмов в почве сухую нестерильную почву заливают стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:1. Через сутки в полученную почвенную суспензию погружают устройство так, чтобы отверстие для забора проб находилось над ее поверхностью. Через поры мембранных фильтров осуществляется диффузионный обмен между жидкостью внутри устройства с находящимся в ней исследуемым микроорганизмом и почвенной суспензией.
4
5
Пример. Предлагаемое устройство, торцы камеры которого были закрыты микрофильтрационными фторопластовыми гидрофильными мембранами с размером пор 0,15 мкм, было использовано для изучения экологических особенностей Yersinia pestis в экспериментальной почвенной экосистеме при двух температурных режимах 4 и 22°С. Температурный фактор оказывает влияние на динамику численности популяций и выживание чумного микроба в почве. При 22°С быстро снижается численность микробов, и срок выживания ограничивается 3,5 месяцами. При 4°С численность популяций стабилизируется на уровне 10-10 м.к./мл, и возбудитель сохраняется 5 месяцев (срок наблюдения). В ходе эксперимента из устройств выделялась чистая культура
возбудителя чумы, что позволило проследить динамику численности и направления изменчивости биологических свойств исследуемого микроорганизма в почве.
Таким образом, использование предлагаемого устройства позволило повысить эффективность эксперимента за счет исключения самого сложного этапа выделения чистой культуры Yersinia pestis из почвы, содержащей в 1 г миллионы различных микроорганизмов. Высокие изоляционные свойства фторопластовых фильтров в течение длительного промежутка времени обеспечили изучение свойств чумного микроба, выделение которого из нативных образцов почвы маловероятно из-за его низкой конкурентоспособности по сравнению с представителями почвенной микрофлоры. Кроме того, герметизация отверстия для забора проб медицинским клеем БФ-6 повышает удобство работы, так как упрощает процедуры инокуляции исследуемого микроорганизма и забора проб и вместе с обработкой 70% спиртом обеспечивает стерильность манипуляций.
Предлагаемое устройство было использовано в длительных экспериментах по изучению экологических закономерностей существования микроорганизмов и подтвердило свою надежность. При условии соблюдения стерильности манипуляций - обработка поверхности устройства вокруг отверстия для забора проб и самого отверстия 70% спиртом до и клеем БФ-6 после инокуляции исследуемого микроорганизма и каждого забора проб, - устройство обеспечивает изоляцию в нем исследуемого микроорганизма и исключает проникновение посторонних бактерий.
Кроме того, устройство для изучения экологии микроорганизмов удобно и просто в эксплуатации, и может быть рекомендовано для изучения экологических особенностей большинства известных микроорганизмов в объектах окружающей среды, содержащих большое количество посторонней микрофлоры.