СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ С ПОМОЩЬЮ АМПЛИФИКАЦИИ ПО ТИПУ КАТЯЩЕГОСЯ КОЛЬЦА
METHOD FOR OBTAINING PRODUCTS BY MEANS OF AMPLIFICATION ACCORDING TO ROLLING RING TYPE

Перекрестная ссылка
Эта заявка претендует на приоритет предварительной заявки с серийным номером 62/413,762, поданной 27 октября 2016 г., и эта заявка полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.
Уровень техники
Несколько диагностических тестов на основе нуклеиновых кислот могут быть реализованы путем гибридизации зондов с образцом нуклеиновой кислоты, циркуляризации зондов, которые гибридизуются с целевой последовательностью, амплифицируют циркуляризованные зонды с использованием амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и количественного определения количества продуктов RCA.
В таких способах продукты RCA могут быть количественно определены различными способами. Например, продукты RCA теоретически могут быть количественно оценены путем маркировки продуктов RCA, размещения образца на поверхности предметного стекла и подсчета количества меченых продуктов на предметном стекле. Однако простое размещение раствора, содержащего продукты с маркировкой RCA, на предметном стекле позволяя продуктам с маркировкой RCA диффундировать на поверхности и затем подсчитывание количества продуктов с маркировкой RCA, прикрепленных к предметному стеклу, занимает несколько часов и не все маркированные RCA продукты достигают слайда и подсчитываются. Эти проблемы могут быть в значительной степени решены путем фильтрования продуктов RCA через фильтр и подсчета количества меченых продуктов RCA, которые были захвачены фильтром. Тем не менее, реализация такого способа может быть сложной в некоторых случаях надежным путем, потому что многие флуоресцентные маркеры могут быстро разрушаться, когда они контактируют с воздухом. Кроме того, продукты RCA могут перемещаться, если фильтр влажный. Эти проблемы могут затруднить реализацию таких способов с высокой пропускной способностью, особенно когда образец должен быть физически перемещен (например, перевернут или повернут), анализ не всегда может быть выполнен немедленно или образец должен быть повторно проанализирован.
Считается, что это описание обеспечивает решение указанных проблем.
Краткое описание сущности изобретения
Данное описание предоставляет, среди прочего, способ обработки мембраны, содержащей продукты амплификации по типу катящегося кольца (RCA). В некоторых вариантах реализации этот способ может включать: (а) получение пористой капиллярной мембраны, которая содержит флуоресцентно меченые продукты RCA, которые находятся в или на мембране; (b) нанесение отверждаемого полимера на мембрану; и (c) отверждение полимера для инкапсуляции продуктов RCA в твердом веществе. В некоторых вариантах реализации отверждаемый полимер может представлять собой силикон и может быть прозрачным в твердой форме. Набор для реализации способа и композиция, полученная этим способом, также предоставляются.
Считается, что инкапсуляция продуктов RCA в твердом веществе (в отличие от использования жидкости или без жидкости) «фиксирует» продукты RCA, т.е. удерживает продукты RCA на месте, на фильтре и предотвращает окисление флуоресцентно-меченных продуктов RCA (то есть разрушение) наружным воздухом. Таким образом, инкапсулируя продукты RCA в твердом веществе, фильтр, содержащий меченые продукты RCA, можно быстро перемещать в нескольких направлениях (например, переворачивать, вращать или транспортировать) и/или хранить в течение длительного периода времени (например, в течение недель, месяцев или лет). Следовательно, настоящий способ может облегчить анализ продуктов RCA в рабочем процессе, который включает быстрое разнонаправленное движение фильтра перед анализом (например, роботом), или в рабочем процессе, в котором продукты RCA не всегда могут быть количественно определены сразу. Кроме того, настоящий способ может использоваться в рабочем процессе, в котором фильтру может потребоваться повторный анализ через длительный период времени.
Эти и другие потенциальные особенности и преимущества могут стать очевидными с учетом следующего описания.
Краткое описание графических материалов
Специалист в данной области поймет, что графические материалы, описанные ниже, предназначены только для иллюстрации. Графические материал никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Фиг. 1 схематически иллюстрирует некоторые стадии настоящего способа.
Фиг. 2 представляет собой гистограмму, показывающую некоторые результаты экспериментов, описанных в Примере 1.
Фиг. 3 представляет собой график соотношений между счетами для двух каналов относительно композиции смеси клеточных линий.
Подробное описание сущности изобретения
Прежде чем описывать различные варианты реализации, следует понимать, что идеи этого описания не ограничены конкретными описанными вариантами реализации и, как таковые, могут, конечно, варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие предмет, описанный каким-либо образом. Хотя настоящие идеи описаны в связи с различными вариантами реализации, не предполагается, что настоящие идеи ограничены такими вариантами реализации. Напротив, настоящие идеи охватывают различные альтернативы, модификации и эквиваленты, что будет понятно специалистам в данной области техники.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится это описание. Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, также могут использоваться при практическом применении или тестировании настоящих идей, некоторые примерные способы и материалы описаны ниже.
Ссылка на любую публикацию предназначена для ее описания до даты ее подачи и не должна рассматриваться как признание того, что настоящая формула изобретения не имеет права предшествовать такой публикации в силу предшествующего изобретения. Кроме того, даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут быть подтверждены независимо.
Как будет очевидно специалистам в данной области техники после прочтения этого описания, каждый из отдельных вариантов реализации, описанных и проиллюстрированных в данном документе, имеет отдельные компоненты и признаки, которые могут быть легко отделены или объединены с признаками любого из других нескольких вариантов реализации без отступления от объема или сути настоящей идеи. Любой изложенный метод может быть выполнен в порядке перечисленных событий или в любом другом порядке, который логически возможен.
Все патенты и публикации, включая все последовательности, описанные в таких патентах и публикациях, упомянутых в настоящем документе, прямо включены в качестве ссылки.
Прежде чем описывать примерные варианты реализации более подробно, следующие значения приведены для иллюстрации значения и объема терминов, используемых в описании.
Следует отметить, что используемые в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественные ссылки, если контекст явно не предписывает иное. Например, термин «праймер» относится к одному или нескольким праймерам, т.е. одному праймеру и множеству праймеров. Кроме того, следует отметить, что формула изобретения может быть составлена таким образом, чтобы исключить любой необязательный элемент. Как таковое, это утверждение предназначено для использования в качестве предшествующей основы для использования такой исключительной терминологии, как «лишь», «только» и тому подобное, в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использованием «отрицательного» ограничения.
Используемый в данном документе термин «фильтрация» относится к перемещению жидкости, которая содержит аналиты (например, продукты амплификации по типу катящегося кольца), через фильтр, так что некоторые аналиты удерживаются фильтром. При фильтрации, по меньшей мере, некоторая часть жидкости переносится с одной стороны фильтра на другую.
Используемый в данном документе термин «амплификация по типу катящегося кольца» или «RCA» относится к изотермической амплификации, которая генерирует линейные конкатемеризованные копии кольцевой матрицы нуклеиновой кислоты с использованием вытесняющей цепь полимеразы. RCA хорошо известна в области молекулярной биологии и описана во многих публикациях, включая, но не ограничиваясь, Lizardi et al. (Nat. Genet. 1998 19:225-232), Schweitzer et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 2000 97:10113-10119), Wiltshire et al (Clin. Chem. 2000 46:1990-1993) and Schweitzer et al (Curr. Opin. Biotech 2001 12:21-27), которые включены в данный документ посредством ссылки.
Используемый в данном документе термин «продукты амплификации по типу катящегося кольца» относится к конкатамеризованным продуктам реакции амплификации по типу катящегося кольца. Используемый в настоящем документе термин «флуоресцентно меченые продукты амплификации по типу катящегося кольца» относится к продуктам амплификации по типу катящегося кольца, которые были флуоресцентно мечены, например, путем гибридизации флуоресцентно меченного олигонуклеотида с продуктами амплификации по типу катящегося кольца или другими средствами (например, путем включения флуоресцентного нуклеотидного полимера в продукт во время амплификации).
Используемый в данном документе термин «пористая капиллярная мембрана» относится к мембране, которая имеет относительно плотно упакованные отдельные капилляры, которые охватывают толщину мембраны, т.е. которые проходят от одной стороны мембраны к другой, тем самым обеспечивая возможность прохождения жидкости, но не частицы, от одной стороны мембраны к другой. Примеры пористых капиллярных мембран включают, но не ограничиваются ими, например, мембраны из анодного оксида алюминия (см. ниже), стеклянные мембраны из наноканалов, трековые травленные мембраны и политетрафторэтилен. Стеклянные мембраны из наноканалов изготовлены из стекла и имеют высокую плотность однородных каналов диаметром от 15 микрон до 15 нанометров (см., например, Tonucci et al., Advances in Nanophotonics II, AIP Conference Proceedings, 2007 959: 59-71; Pearson et al., Science 1995 270: 68-70 и Tonucci et al., Science 1992 258: 783-785, а также патенты США 5,306,661; 5,332,681; 5,976,444; 6,087,274; 6,376,096; 6,483,640 и 6,599,616, которые включены посредством ссылки). Трековые мембраны, изготовленные из прозрачного полимера (например, поликарбонат, полиэтилентерефталат или полиимид и т.п.), содержащие поры, имеющие диаметр в диапазоне от 0,01 мкм до 30 мкм, которые были сделаны с помощью комбинации бомбардировок заряженными частицами (или облучения) и химического травления. Другие представляющие интерес пористые мембраны включают, но не ограничиваются ими, аморфные фторполимеры, такие как NAFION™, TEFLON AF™, FEFLON FEIP™ и CYTOP™ (DuPont Fluoroproducts, Fayetteville, NC). Как будет признано, пористая капиллярная мембрана может иметь поверхность (например, покрытие или химически модифицированные поверхности), которая отличается от материала, из которого изготовлена мембрана. Например, поверхность пористой капиллярной мембраны может иметь измененные характеристики заряда или измененные гидрофобные или гидрофильные характеристики. В некоторых вариантах реализации поверхность может быть покрыта аминосиланом, полилизином или другим соединением для обеспечения положительного заряда, который помогает удерживать продукты RCA на поверхности. В качестве альтернативы или в дополнение, поверхность может иметь нанесенный на нее тонкий слой металла (например, титана, золота), который может быть связан с другими агентами, которые модифицируют поверхностные свойства фильтра.
Используемый в данном документе термин «анодная мембрана из оксида алюминия» относится к регулярной, самоорганизующейся нанопористой мембранной структуре, которая образуется при анодировании Al в определенных кислотных средах. Внутренний диаметр пор в мембране, расстояние между центрами соседних пор в мембране и расстояние между краями соседних пор в мембране можно контролировать напряжением осаждения, типом кислоты и другими параметрами. Мембрана из анодного оксида алюминия практически прозрачна во влажном состоянии. Анодная мембрана из оксида алюминия, ее свойства и способы получения таких мембран подробно рассмотрены в различных публикациях, включая, но не ограничиваясь ими: Li et al. (Chem. Mater 1998 10: 2470-2480), Santos et al. (Trends on Analytical Chemistry 2013 44: 25-38), Ingham et al. (Biotechnology Advances 30 2012 1089-1099) и Poinern et al. (Materials 2011 4: 487-526), которые включены в данный документ посредством ссылки для этих идей. Мембраны из анодного оксида алюминия коммерчески доступны под торговым названием ANOPORE™ от, например, SPI Supplies (West Chester, PA) и от других поставщиков, таких как Sykera Technologies Inc. (Longmont, CO) и Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) и могут быть приобретены с опорным кольцом.
Используемый в данном документе термин «область» в контексте области мембраны или области изображения относится к непрерывной или несмежной области. Например, если способ включает определение количества меченых продуктов RCA в области, например, подсчет количества меченых продуктов RCA в области, область, в которой количественно определяются продукты RCA, может представлять собой одно непрерывное пространство или несколько смежные пространства.
Используемый в данном документе термин «изображение» относится к процессу, посредством которого оптические сигналы с поверхности объекта обнаруживаются и сохраняются как данные в связи с местоположением (то есть «пикселем»). Цифровое изображение объекта может быть восстановлено по этим данным. Область мембраны может быть отображена с использованием одного изображения или одного или нескольких изображений.
Используемый в данном документе термин «индивидуально меченые продукты RCA» относится к отдельным молекулам RCA, которые мечены.
Используемый в данном документе термин «определение количества» относится к способу, в котором подсчитываются индивидуально разрешенные продукты RCA, а также к способам, которые включают измерение совокупного сигнала от нескольких продуктов RCA. В способах, которые включают измерение интенсивности совокупного сигнала, отдельные продукты RCA не должны быть разрешены. Количество продуктов RCA может быть выражено с использованием любой подходящей единицы. В некоторых случаях количество продуктов RCA может быть выражено как количество индивидуально разрешенных продуктов RCA, которые были подсчитаны.
Используемый в данном документе термин «подсчет» относится к определению количества отдельных объектов в большей группе. В некоторых вариантах реализации «подсчет» требует обнаружения отдельных сигналов от отдельных объектов во множестве (а не группового сигнала от множества объектов) и затем определения количества объектов в множестве путем подсчета отдельных сигналов. В контексте настоящих способов «подсчет» может быть выполнен путем определения количества отдельных сигналов в массиве сигналов.
Используемый в данном документе термин «прозрачный» относится к состоянию, в котором объект оптически прозрачен на используемой длине волны. Для флуоресцентной микроскопии «прозрачный» означает, что объект будет прозрачным для одного или обоих спектров возбуждения и излучения флуорофора. Как будет более подробно описано ниже, некоторые мембраны являются прозрачными, только когда они были увлажнены. Такие мембраны считаются прозрачными, хотя сухая форма этих мембран может быть непрозрачной.
Используемый в данном документе термин «отверждаемый» в контексте отверждаемого полимера относится к жидкому полимеру, который можно сделать твердым (т.е. «отвержденным») посредством реакции сшивания. В некоторых случаях отверждаемый полимер можно сделать твердым путем добавления отвердителя (например, второго соединения, которое вызывает или катализирует сшивание полимера). В некоторых случаях лечение может быть инициировано внешним раздражителем (например, нагреванием, влажностью или ультрафиолетовым излучением).
Используемый в данном документе термин «твердый» относится к твердой форме отверждаемого полимера. Твердое вещество может быть в форме полутвердого вещества, такого как гель или резина.
Другие значения этих и других терминов могут встречаться в описании.
Прежде чем описывать настоящий способ более подробно, следует признать, что настоящий способ может быть реализован с использованием любого типа поддержки захвата, которая может выступать в качестве фильтра для продуктов RCA. Такие поддержки захвата должны иметь низкий фоновый сигнал на длинах волн, используемых при анализе, и размер пор, достаточный для обеспечения быстрого протекания жидкости и захвата продуктов RCA. Подходящие поддержки захвата могут быть изготовлены из пористых органических или неорганических материалов, в том числе твердых веществ, таких, как пористые металлические, керамические, гомогенные пленки (например, полимеры) и гетерогенные твердые вещества (полимерные смеси, смешанные стекла). Пористые керамические мембраны могут быть изготовлены из неорганических материалов (таких как оксид алюминия, диоксид титана, оксиды циркония, перекристаллизованный карбида кремния). См., например, PamChip, продаваемый Pamgene (Нидерланды), Wu et al., Nucleic Acids Res. 2004 32: e123 и Anthony et al. Biotechniques. (2003) 34:1082-6, 1088-9. Типичные пористые полимерные мембраны могут быть изготовлены из ацетата целлюлозы, нитроцеллюлозы, сложных эфиров целлюлозы (CA, CN и CE), полисульфона (PS), полиэфирсульфона (PES), полиакрилонитрила (PAN), полиамида, полиимида, полиэтилена и полипропилена (PE и PP), политетрафторэтилена (PTFE), поливинилиденфторида (PVDF) и поливинилхлорида (PVC). Ниже следующее описание иллюстрирует реализацию, в которой используется пористая капиллярная мембрана. Пористые капиллярные мембраны являются примером захвата поддержки, которые могут быть использованы. Следующее описание иллюстрирует настоящий способ на примере.
Как изложено выше, это описание обеспечивает способ обработки мембраны, содержащей продукты амплификации по типу катящегося кольца (RCA). В некоторых вариантах реализации этот способ может включать: (а) получение пористой капиллярной мембраны, которая содержит флуоресцентно меченные продукты RCA, которые находятся в или на мембране; (b) нанесение отверждаемого полимера на мембрану; и (c) отверждение отверждаемого полимера для капсулирования продуктов RCA в твердом веществе.
В некоторых случаях твердое вещество, полученное в (с), является прозрачным. В этих вариантах реализации твердая форма смачивающего агента может иметь показатель преломления, который совместим с мембраной. Например, если используется мембрана из анодного оксида алюминия (которая имеет показатель преломления приблизительно 1,72), то твердая форма смачивающего агента может иметь показатель преломления в диапазоне от 1,2 до 1,8, например, от 1,30 до 1,6. Силиконы обычно имеют показатель преломления около 1,4 и совместимы с мембранами из анодного оксида алюминия. В некоторых вариантах реализации отверждаемый полимер не должен давать усадки при его отверждении.
Отверждаемые полимеры включают силиконы, эпоксидные смолы, а также множество других пластиков, многие из которых являются прозрачными. Отверждаемый полимер может быть образован различными способами. Например, в некоторых вариантах реализации отверждаемый полимер может содержать отвердитель, например катализатор для сшивания полимера или другое соединение, которое вызывает сшивание полимера. В некоторых вариантах реализации отверждаемый полимер также может содержать разбавитель. В этих вариантах реализации разбавитель может снижать вязкость отверждаемого полимера, тем самым позволяя ему протекать через мембрану для получения слоя толщиной, например, от 1 мм до 1 см, например, от 1 мм до 5 мм. В идеале, отверждаемый полимер может иметь вязкость в диапазоне от 500 до 1200 мПа, хотя в некоторых случаях могут использоваться полимеры, имеющие вязкость вне этого диапазона. В некоторых случаях отверждаемый вязкостью полимер может быть отрегулирован таким образом, чтобы отверждаемый полимер в жидкой форме находился сверху и/или попадал в поры фильтра, но действительно сливался через поры фильтра. В некоторых случаях стадия отверждения может быть инициирован внешним раздражителем, например, нагреванием, влажностью или светом (например, ультрафиолетовым светом), который вызывает сшивание полимера и его затвердевание. Отверждение отверждаемого полимера инкапсулирует RCA в твердом веществе на одной стороне мембраны.
В некоторых вариантах реализации мембрана представляет собой анодную мембрану из оксида алюминия. В этих вариантах реализации твердое вещество (с) может действовать как смачивающий агент, который делает мембрану прозрачной. В этих вариантах реализации смачивающие свойства твердого вещества могут быть обеспечены самим сшитым полимером или разбавителем, например маслом или растворителем, который захвачен или сшит в твердом теле. Если используется разбавитель (например, масло), то со временем он может просочиться через мембрану, что может помешать визуализации и/или автофокусировке после хранения образца. Как таковые, разбавители менее подходят для некоторых применений. В этих вариантах реализации отверждаемый полимер может представлять собой силикон. Силикон может быть быстро отвержден без усадки и без выделения веществ, которые могут повлиять на продукты RCA или флуоресценцию.
Силикон можно отверждать различными способами. В некоторых вариантах силикон может быть отвержден в реакции, катализируемой платиной, в которой группы Si-H сшивающего агента реагируют с винильными группами полимера с образованием трехмерной сетки. В другом варианте реализации силикон может быть отвержден пероксидным отверждением. При повышенных температурах пероксиды разлагаются с образованием высокореактивных радикалов, которые химически сшивают полимерные цепи. В других вариантах реализации силикон также может отверждаться конденсационным отверждением, в котором терминальные гидроксильные группы полимера взаимодействуют с силоксановым отвердителем, выделяя небольшие летучие соединения, такие как спирт, уксусная кислота и амин. Силикон также можно отверждать с использованием оловянного катализатора. Другие способы отверждения силикона известны. В этих вариантах реализации отверждаемый полимер, нанесенный на мембрану, может содержать силикон и отвердитель (например, платиновый или оловянный катализатор, пероксид или силоксан) и необязательный разбавитель (например, силиконовое масло). В некоторых вариантах реализации способ может включать смешивание отверждаемого полимера (например, силикона) с отвердителем (например, платиновым или оловянным катализатором, пероксидом или силоксаном) и, необязательно, разбавителем перед нанесением отверждаемого полимера на мембрану.
В некоторых вариантах реализации твердая композиция может быть выполнена из одного или двух компонентов силикона «RTV» (то есть вулканизация силикона при комнатной температуре), который сделан из химически активных на масляной основе полимеров в комбинации с упрочняющими минеральными наполнителями. Существует два типа вулканизируемых при комнатной температуре силиконов: RTV-1 (однокомпонентная система) отверждается под действием атмосферной влажности, катализатора и ацетоксисилана. Ацетоксисилан, при воздействии влажных условий, будут образовывать уксусную кислоту. Процесс отверждения начинается на внешней поверхности и продолжается до ее сердцевины. Продукт упакован в воздухонепроницаемые картриджи и находится в жидкой или пастообразной форме. Силикон RTV-1 имеет хорошие характеристики адгезии, эластичности и долговечности. Твердость по Шору может варьироваться от 18 до 60. Удлинение при разрыве может варьироваться от 150% до 700%. Они имеют отличную устойчивость к старению благодаря превосходной устойчивости к ультрафиолетовому излучению и атмосферным воздействиям. RTV-2 представляет собой двухкомпонентный продукт, который при смешивании отверждается при комнатной температуре до твердого эластомера, геля или гибкой пены. RTV-2 остается гибким от -80°C до +250°C. Разрушение происходит при температуре выше 350°C, оставляя инертный осадок кремнезема, который не воспламеняется и не взрывается. RTV силиконы могут быть вулканизированы с катализатором, состоящим из платины или олова, соединением, таким как дибутилоловодилауринат.

SILGEL 612 A/B и ELASTOSILRT 601 A/B (Wacker, Munich, GE) являются примерами отверждаемых полимеров, которые можно использовать в этом способе. SILGEL 612 A/B представляет собой заливочную силиконовую резину RTV-2 с добавочным отверждением, которая вулканизируется при комнатной температуре до очень мягкого силиконового геля. ELASTOSIL RT 601 A/B представляет собой заливочную силиконовую резину RTV-2 с добавочным отверждением. Если используется продукт ELASTOSIL, он может быть разбавлен (например, 50:50, об:об) в силиконовом масле, например кремниевой жидкостью AK 35, которая представляет собой линейный нереакционноспособный полидиметилсилоксан с вязкостью около 35 мм²/с. Этот разбавитель может снизить вязкость отверждаемого полимера. Оба эти соединения, как и многие другие, являются прозрачными, когда они отверждаются, и способны смачивать анодные алюминиевые мембраны, тем самым делая их прозрачными.
Способ может быть реализован различными способами, одна из реализаций которого схематически показана на фиг. 1. Со ссылкой на фиг. 1, некоторые варианты реализации способа могут включать фильтрование жидкого образца 2, содержащего флуоресцентно меченые продукты 4 амплификации по типу катящегося кольца (RCA), через пористую капиллярную мембрану 6 (например, мембрану из анодного оксида алюминия). Стадия фильтрации концентрирует результаты RCA в продуктах RCA 8, которые находятся на или на мембране. После любых необязательных стадий промывки, раствор, содержащий отверждаемый полимер 10, наносится на пористую капиллярную мембрану, и отверждается.
Полимер отверждается в твердом виде для инкапсулирования продуктов RCA в твердое вещество 12. В проиллюстрированном варианте реализации следующая стадия включает обнаружение продуктов RCA, пока они находятся на мембране. В некоторых вариантах реализации эта стадия может создавать изображение 14 продуктов RCA. Как очевидно, обнаружение может быть выполнено с использованием любого подходящего флуоресцентного детектора, например флуоресцентного микроскопа, сканера, с использованием CMOS-детектора с высоким разрешением или CCD-детектора или с использованием PMT или тому подобного. Наконец, количество меченых продуктов RCA в области мембраны определяется, например, путем подсчета индивидуально разрешенных продуктов RCA или путем измерения совокупного сигнала и т.д. Это определение дает оценку количества меченых продуктов RCA 4 в образец 2. Продукты RCA могут быть мечены до или после стадии фильтрации.
Как очевидно, в любом варианте реализации поры капиллярной мембраны должны быть достаточного размера, чтобы продукты RCA не проходили через поры. Например, в вариантах реализации диаметр пор капиллярной мембраны может составлять не более 50% от среднего диаметра продуктов RCA, тогда как в некоторых вариантах реализации он может составлять не более 20% от среднего диаметра продуктов RCA, и в некоторых вариантах реализации не более 10% от среднего диаметра продуктов RCA. Таким образом, при фильтрации образца с использованием пористой капиллярной мембраны продукты RCA должны оставаться поверх мембраны и не должны полностью входить или проходить через поры.
В некоторых вариантах реализации образец может содержать по меньшей мере первую популяцию продуктов RCA и вторую популяцию продуктов RCA, где первая и вторая популяции меченых продуктов RCA помечены различимо. В этих вариантах реализации способ может включать определение количества первой меченой популяции продуктов RCA и количества второй меченой популяции продуктов RCA в области мембраны.
2
В некоторых вариантах реализации, образец, содержащий флуоресцентно меченые продукты RCA помещают в контейнер, например, в камеру, содержащую мембрану, например, в качестве нижней поверхности. Образец концентрируют, как описано выше, путем приложения давления, которое притягивает жидкую фазу образца через мембрану. Это может быть активной силой (например, центробежная сила, отрицательное давление или положительное давление) или пассивной силой (например, с помощью капиллярного действия (с использованием промокательной бумаги, например) или испарения). Продукты RCA удерживаются на поверхности мембраны в виде матрицы с плотностью, например, по меньшей мере 10, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 500, по меньшей мере 1000 по меньшей мере, 5000 или, по меньшей мере, 10000/мм, затем отверждаемый полимер добавляется к мембране и отверждается. Как было отмечено выше, отверждаемый полимер может смачивать мембрану, чтобы сделать ее прозрачной, тем самым позволяя продуктам RCA быть обнаруженным, например, изображенными, транспортированными и/или хранимыми таким образом, они могут быть повторно считаны, если положительный результат получен. В некоторых вариантах реализации матрицу можно анализировать с любой стороны мембраны, например, через мембрану. Очевидно, что если мембрана считывается «сверху», то есть с той же стороны, что и продукты RCA, мембрана должна быть прозрачной. Анализируемая область может содержать, по меньшей мере, 10, например, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 5000, по меньшей мере, 10000, по меньшей мере, 20000, по меньшей мере, 50000, по меньшей мере, 100000 или, по меньшей мере, 200000 или более продуктов RCA.
При желании продукты RCA могут быть помечены, когда они связаны с мембраной, и в некоторых вариантах реализации мембрана может быть промыта, например, водой или водным буфером, который содержит соль, после того как произведена матрица меченых продуктов RCA и до анализа. Эта стадия промывания может уменьшить фон, потому что потенциальные источники фона (например, меченые нуклеотиды или меченые олигонуклеотиды, которые не гибридизуются с продуктом RCA) могут быть вымыты через фильтр и не связаны с фильтром во время анализа фильтра. Если необходимо, другие реагенты, например средства, препятствующие выгоранию флуоресценции или реагенты, которые усиливают флуоресценцию или тому подобное, могут быть добавлены к мембране перед нанесением отверждаемого полимера для уменьшения фона или увеличения сигнала или тому подобного. Аналогичным образом, при необходимости, меченые продукты RCA могут быть связаны (ковалентно или нековалентно) с поверхностью мембраны перед нанесением отверждаемого полимера, если необходимо. Химические композиции для связывания биомолекул с поверхностью хорошо известны, и в некоторых случаях продукты RCA могут быть получены с использованием модифицированного нуклеотида или праймера, который имеет группу, которая специфически реагирует с поверхностью мембраны, обеспечивая таким образом только продукты RCA прикрепляемые к поверхности.
Используемая мембрана, может быть любой соответствующей толщины, например, в диапазоне от 20 м до 500 м или от 50 м до 200 м, по желанию, и, как уже отмечалось выше, может содержать один или несколько вспомогательных структур (например, опорное кольцо) для того, чтобы сохранить целостность мембраны при использовании.
Как отмечено выше, настоящий способ может использоваться в методиках, которые требуют точного количественного определения количества продуктов RCA в образце, в частности в образце, который имеет переменную концентрацию продуктов RCA (например, от 10 до 10М, что может быть при относительно низкая концентрации, например, от 5000 до 1M продуктов RCA в объеме от 50 л до 200 л или более) и статистическое разрешение, необходимое для идентификации различий может быть достигнуто только лишь путем подсчета, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 5000, по меньшей мере, 10000, по меньшей мере, 50000, по меньшей мере, 100000 или, по меньшей мере, 200000 или более продуктов RCA. Как будет более подробно описано ниже, способ имеет конкретное применение в анализе количества копий и в неинвазивных применениях для пренатального тестирования.
Композиция
2
Композиция также предлагается. В некоторых вариантах реализации композиция может содержать: (а) пористую капиллярную мембрану (например, пористую анодную мембрану из оксида алюминия); (b) множество флуоресцентно меченых продуктов RCA на мембране (например, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 5000, по меньшей мере, 10000, по меньшей мере, 20000, по меньшей мере, 50000, по меньшей мере, 100000, по меньшей мере, 500000 или, по меньшей мере, 1М меченых продуктов RCA; и (c) слой твердого вещества (например, отвержденного силикона), который инкапсулирует флуоресцентно меченные продукты RCA. Этот слой твердого вещества может быть прозрачным в некоторых вариантах реализации и, как отмечено выше, может увлажнять мембрану, чтобы сделать ее прозрачной. Меченые продукты RCA могут быть распределены по поверхности мембраны в случайном порядке, при плотности, например, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 50, по меньшей мере, 100, по меньшей мере, 500, по меньшей мере, 1000, по меньшей мере, 5000 или не менее 10000/мм. В некоторых вариантах реализации твердое вещество может проникать через, по меньшей мере, вход в поры мембраны. В некоторых вариантах реализации композиция может включать, по меньшей мере, две популяции флуоресцентно меченых продуктов RCA на поверхности мембраны, где различные популяции флуоресцентно меченых продуктов RCA являются различимо мечеными. Дополнительные подробности и варианты этой композиции могут быть найдены в разделе способах данного описания.
Наборы
В этом описании также предусмотрены наборы для практического осуществления способов, описанных выше. В некоторых вариантах реализации набор может содержать, по меньшей мере: (а) реагенты для производства флуоресцентно меченых продуктов RCA (то есть реагенты для качения выбранных фрагментов последовательным образом и последующего выполнения амплификации по типу катящегося кольца, например, один или больше рестрикционных ферментов, лигаза и один или несколько олигонуклеотидов, которые могут действовать как шина для качения продуктов, вытесняющая цепь полимеразы для амплификации катящихся продуктов с помощью RCA, один или несколько меченых олигонуклеотидов для мечения продуктов RCA и т.д.); (b) пористую капиллярную мембрану, например, пористая анодная мембрана из оксида алюминия; и (с) отверждаемый полимер, например силикон. Набор может дополнительно содержать отвердитель в отдельной емкости для отверждаемого смачивающего агента. В некоторых вариантах реализации отверждаемый полимер и отвердитель могут присутствовать в разных цилиндрах шприца с двумя цилиндрами, который имеет наконечник для смешивания. В некоторых вариантах реализации набор также может содержать разбавитель, например силиконовое масло.
Различные компоненты набора могут присутствовать в отдельных контейнерах или некоторые совместимые компоненты могут быть предварительно объединены в один контейнер, если это желательно. Дополнительные подробности и варианты компонентов этого набора могут быть найдены в разделе «Способы» данного описания.
В дополнение к вышеупомянутым компонентам предметные наборы могут дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора для практического применения предметных методов, то есть инструкции для анализа образцов.
Примеры
Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное описание того, как создать и использовать настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели считают своим изобретением, ни они предназначены для представления того, что приведенные ниже эксперименты являются всеми или единственными проведенными экспериментами.
Пример 1
Мультиплексные способы обнаружения
Материалы и способы
Устройства: мембраны из оксида алюминия с порами 20 нм были связаны с 96-луночными суперструктурированными планшетами, которые были изготовлены на заказ.
В этом мультиплексном эксперименте в качестве генетического исходного материала использовались смеси ДНК из двух клеточных линий. ДНК клеточной линии содержала либо 2 копии хромосомы 21 (нормальный генетический состав), либо 3 копии хромосомы 21 (трисомия 21). ДНК, выделенную из клеточных линий, смешивали в следующих пропорциях 100:0, 95:5, 90:10, 0:100. Каждую смесь ДНК сначала расщепляли с использованием рестрикционных ферментов, гибридизовали и лигировали с набором зондов и затем ферментативно амплифицировали с помощью RCA, как описано ранее (см. WO2015083001 и WO2015083002). Два специфичных для хромосомы олигонуклеотида обнаружения (Atto 550 для хромосомы 18, Atto 647 для хромосомы 21) добавляли к каждому образцу и давали возможность гибридизоваться, таким образом, флуоресцентно помечая специфичные для хромосомы продукты RCA в каждом образце.
После мечения 100 мкл образцов добавляли в чашки с мембранным дном и затем планшеты помещали в вакуумный коллектор (Supleco часть №66879-U). Образцы прошли через оксид алюминия за около 90 секунд. Нижнюю мембранную пластину дважды промывали 400 мкл 0,5X SSC, затем давали высохнуть. Затем в каждую лунку наносили триста микролитров фиксатора Wacker silgel 612, чтобы сделать их прозрачными и зафиксировать продукты RCA на мембране.
Съемка производилась на микроскопе Olympus X81 с объективом 20Х и камерой Hamamatsu Orca 4.0lt. Получение изображений осуществлялось с помощью мозаичных изображений 10х10, чтобы покрыть все дно каждой лунки. Изображения были проанализированы и продукты RCA подсчитаны с использованием собственного программного обеспечения.
Результаты
Результаты приведены на фиг. 2. Средние показатели на изображении для всех 91 образцов, включенных в эксперимент, варьировались от 3000 до чуть более 5000 импульсов на изображение. Гистограммы ясно показывают разницу в пропорциях между 550 и 647 каналами в смеси с соотношением 0:100 (последние 22 повторения), однако, по одной только фигуре сложнее различить пропорции в 0, 5 & 10% образцов. Фиг. 3 представляет собой график зависимости соотношения между двумя каналами от состава смеси клеточных линий. На этом графике наглядно представлена тенденция, иллюстрирующая изменение относительного соотношения в числах, которое следует за долей образцов ДНК входной клеточной линии.
Данные показывают, что осаждение на мембране из оксида алюминия приводит к примерно в 4 раза большему числу импульсов, чем при осаждении на стеклянную пластину за тот же 90-секундный интервал времени. Если мы увеличим время инкубации до 16 часов для стеклянной пластины, результатом будет увеличение продуктов RCA, обнаруживаемых на стеклянной пластине, но все же в 2,5 раза меньше, чем наблюдается за 90 секунд на оксиде алюминия.
Варианты реализации
Вариант реализации 1. Способ обработки мембраны, включающий амплификацию продуктов по типу катящегося кольца (RCA), включающий:
(а) получение пористой капиллярной мембраны, которая содержит флуоресцентно меченые продукты RCA, которые находятся в или на мембране;
(b) нанесение отверждаемого полимера на мембрану; и
(c) отверждение отверждаемого полимера для инкапсуляции продуктов RCA в твердом веществе.
Вариант реализации 2. Способ по варианту реализации 1, в котором твердое вещество, полученное на стадии (с), является прозрачным.
Вариант реализации 3. Способ по любому предшествующему варианту реализации, в котором отверждаемый полимер стадии (b) содержит отвердитель.
Вариант реализации 4. Способ по любому предшествующему варианту реализации, в котором отверждаемый полимер стадии (b) содержит разбавитель для снижения вязкости.
Вариант реализации 5. Способ по любому предшествующему варианту реализации, в котором мембрана представляет собой мембрану из анодного оксида алюминия и где твердое вещество (с) имеет свойство смачивания, которое делает мембрану прозрачной.
Вариант реализации 6. Способ по варианту реализации 5, в котором отверждаемый полимер представляет собой силикон.
Вариант реализации 7. Способ по варианту реализации 6, в котором силикон смешивают с отвердителем и, необязательно, силиконовым масляным разбавителем.
Вариант реализации 8. Способ по любому предшествующему варианту реализации, в котором стадия отверждения (с) инициируется внешним стимулятором.
Вариант реализации 9. Способ по варианту реализации 8, в котором внешним стимулятором является тепло, влага или свет.
Вариант реализации 10. Способ по любому предшествующему варианту реализации, где флуоресцентно меченые продукты RCA получают путем:
фильтрования продуктов RCA через мембрану для получения продуктов RCA, которые находятся внутри или на мембране; и
флуоресцентной маркировки продуктов RCA до или после фильтрации.
Вариант реализации 11. Способ по любому предшествующему варианту реализации, где способ дополнительно содержит
(d) количественное определение количества отдельных меченых продуктов RCA в области мембраны, обеспечивая тем самым оценку количества меченых продуктов RCA в образце.
Вариант реализации 12. Набор, содержащий:
(а) реагенты для получения флуоресцентно меченых продуктов RCA;
(b) пористую капиллярную мембрану; и
(c) отверждаемый полимер.
Вариант реализации 13. Набор по варианту реализации 12, в котором набор дополнительно содержит отвердитель, причем отвердитель находится в том же контейнере, что и отверждаемый полимер.
Вариант реализации 14. Набор по варианту реализации 12, где набор дополнительно содержит отвердитель, причем отвердитель и отверждаемый полимер находятся в разных контейнерах.
Вариант реализации 15. Набор по любому из вариантов реализации 12-14, где отверждаемый полимер представляет собой силикон.
Вариант реализации 16. Набор по любому из вариантов реализации 12-15, в котором пористая капиллярная мембрана представляет собой фильтр из анодного оксида алюминия.
Вариант реализации 17. Композиция, содержащая:
(а) пористую капиллярную мембрану;
(b) множество флуоресцентно меченых продуктов RCA на мембране;
(c) слой твердого вещества, которое инкапсулирует флуоресцентно меченые продукты RCA.
Вариант реализации 18. Композиция по варианту реализации 17, в которой твердый смачивающий агент проникает через поры фильтра.
Вариант реализации 19. Композиция по варианту реализации 17 или 18, в которой фильтр представляет собой фильтр из оксида алюминия.
Вариант реализации 20. Композиция по любому из вариантов реализации 17-19, где твердый смачивающий агент представляет собой поперечно сшитый силикон.