СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ АМОРФНЫЙ КАРБОНАТ КАЛЬЦИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕД
STABILIZED AMORPHOUS CALCIUM CARBONATE FOR USE AS ADDITIVE FOR CELLULAR CULTURAL MEDIA

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Согласно настоящему изобретению предложен стабилизированный аморфный карбонат кальция для применения в качестве добавки для клеточных культуральных сред. В частности, АКК подходит для улучшения роста культур клеток in vitro. Согласно дополнительным аспектам настоящего изобретения предложены добавки для клеточных культуральных сред, содержащие стабилизированный АКК.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Методики культивирования клеток позволяют культивировать in vitro клетки животных, растений или насекомых, извлеченные из тканей, при условии обеспечения подходящих питательных веществ и условий. Методики культивирования клеток находят различное применение, в том числе при исследованиях клеточных процессов, оценке эффекта различных химических соединений или лекарственных средств на конкретные типы клеток, синтеза ценных биологических средств в производственных масштабах и получении размноженных клеток для целей трансплантации. Методики культивирования клеток применяют для оплодотворения in vitro, изучения стволовых клеток и получения вакцин.
[0003] Одним из наиболее важных вариантов применения методик культивирования клеток является массовое производство биологических средств, в том числе специфических белков, таких как моноклональные антитела. Число таких коммерчески ценных биологических средств быстро увеличивалось на протяжении последних десятилетий, что привело к существующему в настоящее время широкому интересу к технологии культивирования клеток млекопитающих.
[0004] Состав сред, применяемых для культивирования клеток, имеет большое значение ввиду влияния на выживание клеток, пролиферацию клеток и продуцирование ими представляющих интерес биологических средств. Было разработано множество разных клеточных культуральных сред с разной степенью специфичности в отношении культур клеток. Некоторые из указанных сред представляют собой базальные среды, которые могут содержать добавки, соответствующие требованиям для разных культур клеток, тогда как другие представляют собой более сложные среды. В клеточные культуральные среды могут быть добавлены сотни индивидуальных компонентов для обеспечения требуемого эффекта. Однако методология введения добавок в среды обычно ограничивается добавлением материалов, которые в целом способствуют стабилизации и поддержанию культуры клеток. К наиболее часто используемым добавкам относятся минеральные вещества, витамины, аминокислоты, гормоны и сыворотка, чаще всего фетальная бычья сыворотка, сыворотка лошади или сыворотка человека. Однако, поскольку применение сыворотки может быть во многих случаях нежелательным, используют ростовые среды с пониженным содержанием сыворотки или среды, не содержащие сыворотки.
[0005] Постоянно продолжаются исследования и разработка сред и в частности, добавок для сред, позволяющих осуществлять поддержание и пролиферацию культур клеток и тканей, в частности, обеспечивающих благоприятные условия культивирования для крупномасштабного производства.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Неожиданно было обнаружено, что клеточные культуральные среды с добавлением
стабилизированного аморфного карбоната кальция (АКК) обеспечивают улучшение роста различных клеток по сравнению с клетками, культивируемыми на средах с добавлением других источников кальция. В частности, наблюдалось обеспечиваемое стабилизированным АКК улучшение образования мышечных трубочек в клетках mdx, модели мышечной дистрофии Дюшенна. Кроме того, в средах, содержащих стабилизированный АКК,
2+
наблюдалось улучшенное развитие эмбрионов in vitro как в «одностадийной» среде для монокультур, так и в среде для «последовательного» культивирования (среде для дробления). Неожиданно было обнаружено, что эмбрионы, культивируемые на среде для дробления с добавлением стабилизированного АКК, демонстрировали быстрое дробление и более высокие показатели хетчинга. В других случаях нервные клетки, культивируемые на средах с добавлением АКК, демонстрировали улучшенную регенерацию нервных волокон, а стволовые клетки, культивируемые на средах с добавлением АКК, демонстрировали более быстрые экспансию и дифференцировку. Было также неожиданно обнаружено, что сперма, инкубированная в присутствии АКК, демонстрировала значительно более высокую подвижность после процедуры флотации, а концентрация сперматозоидов при инкубации с АКК в верхней фазе (подвижные сперматозоиды) достигала значений, 7-кратно превышающих концентрацию в необработанном образце. Кроме того, было показано, что АКК не оказывал двухфазного эффекта на подвижность спермы, наблюдаемого при добавлении ионов Са в образцы спермы. Все указанные наблюдения свидетельствуют о том, что стабилизированный АКК представляет собой добавку для улучшения клеточных культуральных сред, способствует росту клеток и обеспечивает лучшую функциональность.
[0007] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена клеточная культуральная среда, отличающаяся тем, что в указанную клеточную культуральную среду добавлен аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, и тем, что указанная клеточная культуральная среда подходит для роста биологической культуры. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда подходит для культивирования культуры клеток, культуры тканей, культуры органа или органов. В соответствии с другими вариантами реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать рост или способствовать росту, например, улучшать пролиферацию, созревание, размножение, регенерацию, развитие, сохранение, например, криоконсервацию и/или дифференцировку клеток, тканей и органов. В соответствии с одним вариантом реализации указанные клетки представляют собой клетки животных, растений или насекомых. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК подходит для роста и, необязательно, способна улучшать рост культуры клеток, культуры тканей, культуры органов, при этом указанные культуры представляют собой культуру клеток, тканей или органов животных, растений или насекомых. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК подходит для роста стволовых клеток, таких как эмбриональные, хорионические, амниотические, гематопоэтические, мезенхимальные, нервные, глиальные клетки, клетки слизистой оболочки обонятельной области носа (NOM), стволовых тканеспецифических клеток взрослых и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или для роста эмбрионов, таких как эмбрионы человека или не являющегося человеком млекопитающего. Согласно другим вариантам реализации такая клеточная культуральная среда способна улучшать пролиферацию, экспансию и/или дифференцировку стволовых клеток, способна улучшать созревание гамет или способна улучшать развитие эмбрионов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК подходит для роста и, необязательно, способна улучшать рост дрожжей или бактерий. Согласно некоторым вариантам реализации указанные бактерии представляют собой Е. coli или пробиотические бактерии, такие как бактерии родов Bifidobacterium и Lactobacillus. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению может представлять собой любую среду, подходящую для роста клеток, например, естественную среду, содержащую биологическую жидкость, или искусственную среду, такую как сбалансированный раствор солей, базальная среда или сложная среда. Клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению может содержать дополнительные добавки, как известно в данной области техники. В соответствии с настоящим изобретением в указанную клеточную культуральную среду добавлен АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. Указанный стабилизирующий агент может представлять собой любой агент, известный в данной области техники. Согласно конкретным вариантам реализации указанный стабилизатор выбран из полифосфата, такого как неорганический полифосфат, фосфорилированной аминокислоты, бисфосфоната, органической кислоты и любой их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой комбинацию указанных стабилизаторов, например, комбинацию неорганического полифосфата с органической кислотой, такой как лимонная кислота, или комбинацию фосфорилированной аминокислоты с органической кислотой.
[0008] В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК добавляют в среду при получении указанной среды. Согласно другому варианту реализации АКК добавляют в среду перед применением.
[0009] В соответствии с еще одним аспектом в настоящем изобретении предложена добавка для клеточной культуральной среды, содержащая аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. В соответствии с одним вариантом реализации указанной добавки для клеточной культуральной среды, содержащей стабилизированный АКК, указанный стабилизированный АКК добавляют в среду при получении указанной среды. Согласно другому варианту реализации указанную добавку добавляют в среду перед применением. Указанная добавка для клеточной культуральной среды может представлять собой твердую, жидкую или полужидкую добавку. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации АКК стабилизирован по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. Такая добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать рост, например, улучшать пролиферацию, созревание, размножение, регенерацию, развитие и/или дифференцировку клеток, тканей и органов.
[0010] В соответствии с дополнительным аспектом в настоящем изобретении предложен аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, в виде состава для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, отличающий тем, что указанный АКК стабилизирован по меньшей мере одним стабилизирующим агентом.
[0011] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ улучшения роста клеток биологической культуры, включающий воздействие на биологическую культуру АКК, стабилизированным по меньшей мере одним стабилизатором. Согласно некоторым вариантам реализации указанная биологическая культура выбрана из клеточной культуры, культуры клеток, культуры тканей, культуры органа и бактериальной культуры. Согласно одному варианту реализации указанный способ включает улучшение роста клеток и, в частности, улучшение образования мышечных трубочек, улучшение развития эмбриона, улучшение регенерации нервных клеток и улучшение созревания и/или сохранения гамет.[0012] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен набор, содержащий АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды согласно настоящему изобретению, или добавку для клеточной культуральной среды, содержащую стабилизированный АКК, и инструкции для применения указанного АКК или указанной добавки в комбинации с клеточной культуральной средой. В соответствии с определенными аспектами в настоящем изобретении предложен набор, содержащий аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, и инструкции для применения указанного АКК в комбинации с клеточной культуральной средой. В соответствии с одним вариантом реализации указанный АКК предназначена для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды. В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанный набор содержит добавку для клеточной культуральной среды, содержащую АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, и инструкцию для применения указанного АКК в комбинации с клеточной культуральной средой. Набор согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать любую известную среду, подходящую для роста клеток, тканей или органов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
2+
2
[0013] На фиг. 1 показан эффект разных источников кальция на спраутинг нейронов из культивированных срезов дорсальных корешковых ганглиев спинного мозга (СМ-ДКГ). Иммунофлуоресцентное окрашивание (антителом против нейрофиламентов) нервных волокон, выращенных из срезов СМ-ДКГ, на которые воздействовали следующими соединениями кальция (концентрация Са=2 мМ): (А) АКК-Этидроновая кислота; (В) АКК-фосфосерин; (С) гастролит; (D) кристаллический карбонат кальция (ККК); и (Е) раствор CaCl (контроль). Исходное увеличение - ×100.
2
2
[0014] На фиг. 2 показан эффект (А) АКК, стабилизированного этидроновой кислотой, и (В) раствора CaCl (контроль) на спраутинг нейронов из клеток головного мозга, культивированных на хитозановых микроносителях (ХМ). Представлено иммунофлуоресцентное окрашивание нервных волокон (антителом против нейрофиламентов), выращенных из агрегатов клеток головного мозга с хитозаном (ХМ), через 30 дней в культуре в присутствии 2 мМ либо АКК-этидроновой кислоты, либо CaCl.
2+
2
[0015] На фиг. 3 показан эффект АКК на формирование мышечных трубочек в культурах здоровых скелетных мышц. Исходное увеличение - ×40. На культуры скелетных мышц воздействовали следующими соединениями кальция (конечная концентрация Са=2 мМ): АКК-этидроновая кислота; АКК-АДФ; гастролит; кристаллический карбонат кальция (ККК); и раствор CaCl (контроль). Культуры фиксировали через 4 и 7 дней и окрашивали по Гимза. Для обработанных АКК клеток наблюдалось улучшение образования мышечных трубочек в культурах скелетных мышц.
2
[0016] На фиг. 4 показан эффект АКК в культуральной среде на раннее образование мышечных трубочек в культурах линии клеток mdx. Показано окрашивание по Гимза культур, на которые воздействовали средой, содержащей CaCl, АКК-ЭТ и АКК-фосфосерин (АКК-ФС). Исходное увеличение - ×100.
2
[0017] На фиг. 5 показаны уровни креатининкиназы (КК), измеренные в мышечных клетках линии mdx, на которые воздействовали двумя составами с АКК (АКК-ЭТ и АКК-ФС), в сравнении с CaCl.
2
[0018] На фиг. 6 показан эффект АКК (АКК-ФС, АКК-ПФ в сравнении с контролем (CaCl)) на образование мышечных трубочек в первичных культурах клеток мышей mdx (окрашивание по Гимза; исходное увеличение - ×50)
2
[0019] На фиг. 7 показан эффект АКК на формирование мышечных трубочек в первичных культурах клеток мышей mdx, продемонстрированный иммуноокрашиванием миозина; контроль (CaCl); АКК-ФС, АКК-полифосфат (АКК-ПФ). Исходное увеличение - ×100.
[0020] На фиг. 8 показан эффект стабилизированного АКК на развитие эмбрионов мышей in vitro.
2+
2+
2
[0021] На фиг. 9 показано окрашивание ализариновым красным остеобластов после 10 дней в культуре в зависимости от обработки различными средами. В среды добавляли дополнительные 1 мМ Са из: А - АКК, В - CaCl; или использовали С - контроль, без добавления Са.
2+
2+
2
[0022] На фиг. 10 показано окрашивание остеобластов на щелочную фосфатазу после 10 дней в культуре в зависимости от обработки различными средами. В среды добавляли дополнительные 1 мМ Са из: А - АКК, В - CaCl, или использовали С - контроль, без добавления Са.
2+
2+
2
[0023] На фиг. 11 показано окрашивание ализариновым красным (А-С) и окрашивание на щелочную фосфатазу (D-F) клеток линий mdx, культивированных на средах с добавлением разных источников дополнительного 1 мМ Са: А и D - АКК, В и Е - CaCl, или С и F -контроль (без дополнительной добавки с Са).
[0024] На фиг. 12 показано влияние стабилизированного АКК на культивируемые in vitro яичники (А), где зернистые клетки, окружающие ооциты, были интактными, в сравнении с контролем (В) (без АКК в среде), где наблюдались неинтактные зернистые клетки и ооцит на стадии зародышевого пузырька.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0025] Неожиданно было обнаружено, что добавление АКК в клеточную культуральную среду улучшает рост различных типов клеток. Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена клеточная культуральная среда с добавлением аморфного карбоната кальция (АКК), отличающаяся тем, что указанный АКК стабилизирован по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. В соответствии с другими аспектами в настоящем изобретении предложен стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды. Согласно определенным аспектам в настоящем изобретении предложена добавка для культур клеток, содержащая стабилизированный АКК.
[0026] Согласно любому аспекту настоящего изобретения, индивидуально и в совокупности применяют следующую терминологию и используют специфические показатели согласно определению ниже в настоящем документе:
[0027] Термины «клеточная культуральная среда», «ростовая среда» и «культуральная среда» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к среде, используемой, подходящей для поддержки или способной к поддержке роста биологической культуры, такой как клетки, ткани или органы, и обеспечения надлежащей среды для указанных клеток, ткани или органа. Разные клеточные культуральные среды могут иметь разные свойства и содержать разные компоненты, однако почти все среды представляют собой изотонические среды и обеспечивают осмотическое давление, подходящее для роста клеток. Соответственно, указанная клеточная культуральная среда представляет собой изотоническую клеточную культуральную среду. Термин «изотонический» в настоящем документе относится к клеточной культуральной среде, имеющей осмоляльность водного раствора при 37°С в диапазоне 270-300 мОсм/кг. Соответственно, согласно одному варианту реализации собственно воду или, более конкретно, деионизированную воду не считают клеточной культуральной средой. Согласно некоторым вариантам реализации культура ткани содержит хлорид натрия, хлорид калия и источник фосфора, такой как одноосновный или двуосновный фосфат натрия. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда подходит для культивирования культуры клеток, культуры тканей, культуры органа или органов. Указанные клетки могут быть эукариотическими или прокариотическими. В частности, клеточная культуральная среда относится к среде, подходящей для роста культуры клеток, культуры ткани или культуры органа эукариот. Согласно некоторым конкретным вариантам реализации указанная среда может представлять собой полную среду, базальную среду, базальную среду с добавлением добавки для клеточной культуральной среды, среду с различными количествами сыворотки или среду с химически определенным составом.
[0028] Термин «с добавлением» в настоящем документе относится к среде, в которую добавлен АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, соответственно, указанная среда включает АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором. Термин охватывает среду, в которую АКК добавляют при получении, и среду, в которую АКК добавляют перед применением.
[0029] Соответственно, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложена клеточная культуральная среда, отличающаяся тем, что в указанную клеточную культуральную среду добавлен аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, и тем, что указанная клеточная культуральная среда подходит для роста биологической культуры.
[0030] Термины «культура», «биологическая культура» и «культура клеток» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к культуре клеток, тканей, органов или органу, культивируемым in vitro в заранее определенных условиях. Согласно некоторым вариантам реализации указанная биологическая культура выбрана из культуры клеток животных, растений или насекомых; культуры тканей животных, растений или насекомых, культуры органов животных, растений или насекомых, культуры дрожжей и бактериальной культуры.
[0031] Термин «культура клеток» в настоящем документе относится к клеткам многоклеточных эукариот, которые поддерживают, культивируют или выращивают в искусственной среде in vitro. Указанная культура клеток может представлять собой суспензионную культуру, в которой клетки культивируют в жидкой среде при постоянном перемешивании, или на микроносителях, или в адгезивной или однослойной культуре.
[0032] Термин «культура тканей» в настоящем документе относится к ткани, поддерживаемой или культивируемой in vitro.
[0033] Термин «культура органа» в настоящем документе относится к части или частям органа или целому органу, культивируемым in vitro.
[0034] Термин «стволовые клетки» относится к клеткам, которые обладают способностью к пролиферации и дифференцировке в разные типы клеток.
[0035] Термины «аморфный карбонат кальция» и «АКК» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к некристаллической форме карбоната кальция, стабилизированной по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. АКК может быть получен из естественного источника или химически синтезирован. Указанные термины также включают естественным образом стабилизированный АКК, такой как АКК, полученный из гастролита.
[0036] Термин «естественный АКК» в настоящем документе относится к любому АКК, выделенному или происходящему из естественного источника. Неограничивающие примеры природных источников АКК включают гастролиты пресноводных ракообразных.
[0037] Термин «синтетический АКК» в настоящем документе относится к любому АКК, полученному и/или извлеченному человеком ex vivo.
[0038] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением подходит для роста биологической культуры. В соответствии с одним вариантом реализации указанная биологическая культура представляет собой культуру эукариотических или прокариотических клеток. Термин «рост» в настоящем документе охватывает что-либо из следующего: пролиферации, созревания, размножения, регенерации, поддержки, дифференцировки, развития, сохранения, криоконсервации и любой комбинации перечисленного; и может использоваться в разных значениях в соответствии с типом клеток. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для поддержки, для пролиферации или размножения клеток.
Согласно одному примеру варианта реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для пролиферации или размножения эукариотических клеток, например, одноклеточных организмов или клеток многоклеточного организма. В соответствии с другим примером варианта реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для пролиферации или размножения прокариотических клеток. В соответствии с другими вариантами реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для созревания и/или развития клеток, например, развития эмбрионов или созревания гамет. Термин «эмбрион» в настоящем документе относится к оплодотворенному ооциту млекопитающего, т.е. зиготе, и к многоклеточному организму, развивающемуся из указанной зиготы, на самых ранних этапах развития. Термины «гамета» или «клетки гамет» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к любой мужской или женской клетке зародышевой линии, которая способна инициировать образование нового диплоидного индивидуума. Примерами гамет являются сперматозоиды и ооциты. Термины «сперма» и «сперматозоиды» в настоящем документе используются взаимозаменяемо и относятся к мужским репродуктивным клеткам. Термин «образец спермы» относится к одному или более образцам, содержащим сперму. Указанный образец спермы может представлять собой семенную жидкость, полученную от субъекта, или обработанную семенную жидкость, сжиженную семенную жидкость, осажденную и, необязательно, ресуспендированную сперму, и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для регенерации клеток, например, регенерации нервных клеток. Термины «нейрональная регенерация» и «регенерация нервов» в настоящем документе могут применяться взаимозаменяемо и относятся к восстановлению функций пораженного нерва. В частности, они включают восстановление сигнализации через нерв за счет заживления пораженного участка, повторное разрастание аксональных и дендритных нейронных волокон периферической или центральной нервной системы. Согласно некоторым вариантам реализации регенерация нервов относится к спраутингу из пораженных нейронных волокон. Согласно некоторым вариантам реализации регенерация нервов относится к спраутингу из пораженных нейронных волокон. Соответственно, клеточная культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением способна содействовать глубокой регенерации нервных волокон. Согласно другому варианту реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для дифференцировки клеток, например, дифференцировки стволовых клеток, и, в частности, дифференцировки стволовых клеток в остеобласты. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для поддержания пролиферации культуры ткани и культуры органа. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для сохранения органа in vitro.
[0039] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК в соответствии с настоящим изобретением способна улучшать рост биологической культуры согласно определению выше в настоящем документе. Термин «улучшение» в настоящем документе относится к способствованию (облегчению), улучшению, преумножению, усовершенствованию и, как правило, к увеличению показателей роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения термины «способный к улучшения» и «улучшает» используются взаимозаменяемо. Улучшение может быть измерено относительно контрольного образца, культивируемого в идентичных условиях, но без АКК. Соответственно, согласно одному варианту реализации клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК в соответствии с настоящим изобретением способна улучшать пролиферацию, созревание, размножение, регенерацию, развитие, криоконсервацию и/или дифференцировку клеток, тканей или органов. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда способна улучшать дифференцировку стволовых клеток. Согласно другому варианту реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать пролиферацию клеток. В соответствии с еще одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать созревание клеток. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать развитие клеток или тканей. В соответствии с определенными вариантами реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать регенерацию клетки. Улучшение пролиферации, созревания, размножения, регенерации, развития и/или дифференцировки клеток, тканей или органов может быть определена как процент улучшения по сравнению с контролем согласно определению выше в настоящем документе. Соответственно, в соответствии с одним вариантом реализации клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать показатели роста приблизительно на 10% - приблизительно на 600%, приблизительно 20% - приблизительно на 500%, приблизительно на 30% - приблизительно на 400%, приблизительно на 40% - приблизительно на 300%, приблизительно на 50% - приблизительно на 200, приблизительно на 60% - приблизительно на 150%; или приблизительно на 70% - приблизительно на 100%. Улучшение на 100% означает, что указанный показатель, например, пролиферация, увеличивается в 2 раза; улучшение на 200% означает, что указанный показатель, например, развитие эмбриона, увеличивается в 3 раза, и так далее. Согласно некоторым вариантам реализации происходит улучшение указанных показателей роста приблизительно на 100% - приблизительно на 500%, приблизительно на 120% -приблизительно на 400%, приблизительно на 150% - приблизительно на 300%.
[0040] Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК подходит для роста и, необязательно, улучшения роста культуры эукариотических клеток, например, культуры клеток, тканей или органов эукариот. Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК предназначена для роста эукариотических клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура эукариотических клеток выбрана из культуры клеток животных, растений и насекомых.
[0041] В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура клеток, тканей или органов эукариот представляет собой культуру клеток, ткани или органа животного, стволовые клетки, эмбрионы и орган животного. Согласно некоторым вариантам реализации указанное животное представляет собой человека или не являющееся человеком млекопитающее. Соответственно, в соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК подходит для роста и, необязательно, улучшения роста культуры клеток, ткани или органа млекопитающего, стволовых клеток млекопитающего, эмбрионов млекопитающего или органа млекопитающего.
[0042] В соответствии с одним вариантом реализации указанное млекопитающее представляет собой человека, соответственно, в соответствии с одним вариантом реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста культуры клеток, ткани или органа человека, стволовых клеток, эмбрионов или органа человека.
[0043] В соответствии с другими вариантами реализации указанное млекопитающее представляет собой не являющееся человеком млекопитающее. В соответствии с одним вариантом реализации указанное не являющееся человеком млекопитающее представляет собой сельскохозяйственных животных, например, крупный рогатый скот, свиней, овец, коз, лошадей, мулов, ослов, буйволов или верблюдов. Согласно другому варианту реализации указанное не являющееся человеком млекопитающее представляет собой домашнее животное, например, кошку или собаку; грызуна, такого как мышь, крыса, морская свинка или хомяк; зайцеобразное, например, кролика; или примата, такого как обезьяна (например, макака) или человекообразная обезьяна (например, шимпанзе).
[0044] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда в соответствии с настоящим изобретением подходит для роста культуры клеток млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура клеток млекопитающего человека или культура клеток не являющегося человеком млекопитающего выбрана из культуры нервных, мышечных, эпителиальных, костных, жировых, стволовых клеток, гамет и клеток крови. В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура клеток представляет собой культуру мышечных клеток. Согласно другому варианту реализации указанная культура клеток представляет собой культуру нервных клеток. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная культура клеток представляет собой культуру костных клеток или остеоцитов. В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура клеток представляет собой культуру клеток костного мозга. Согласно другому варианту реализации указанная культура клеток представляет собой опухолевые или раковые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда с добавлением АКК в соответствии с настоящим изобретением способна улучшать рост указанной культуры клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура клеток представляет собой суспензионную или адгезивную культуру клеток.
[0045] Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура клеток представляет собой первичную культуру. Термин «первичная культура» в настоящем документе относится к клеткам, которые были выделены из ткани и пролиферированы в подходящих условиях.
[0046] Согласно другому варианту реализации указанная культура клеток представляет собой линию клеток. Термин «вторичная культура» и «линия клеток» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к субкультивированной первичной культуре, т.е. первичной культуре, перенесенной из одного культурального сосуда в другой культуральный сосуд. Согласно некоторым вариантам реализации указанная линия клеток представлена конечными линиями клеток, т.е. линиями клеток, которые имеют ограниченную продолжительность жизни и ограничены определенным числом поколений клеток. В соответствии с другими вариантами реализации указанная линия клеток представляет собой непрерывную линию клеток, т.е. бессмертную линию клеток, которая приобрела способность к бесконечному делению.
[0047] В соответствии с одним конкретным вариантом реализации указанная линия клеток выбрана из линии клеток FM3, HeLa, 293, А-549, ALC, СНО, НВ54, HL60, COS-7, HEK293, VERO, BHK, CVl, MDCK, 3Т3, С127 MRC-5, ВАЕ-1, SH-SY5Y, L-929, HEP G2, NSO, U937, NAMALWA, WEHI 231, YAC1 и U266B1. Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать рост указанной линии клеток.
[0048] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста культуры ткани млекопитающего. В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура ткани млекопитающего представляет собой культуру ткани человека. Согласно другому варианту реализации указанная культура ткани представляет собой культуру ткани не являющегося человеком млекопитающего. В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура ткани выбрана из культуры эпителиальной, соединительной, мышечной и нервной ткани. В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура ткани представляет собой культуру нервной ткани. Согласно другому варианту реализации указанная культура ткани представляет собой культуру мышечной ткани. В соответствии с еще одним вариантом реализации указанная культура ткани представляет собой культуру эпителиальной ткани, такой как обонятельная область слизистой оболочки носа. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная культура ткани представляет собой культуру костной ткани.
[0049] В соответствии с некоторыми более конкретными вариантами реализации указанная культура ткани выбрана из культуры почечной, печеночной, железистой ткани, ткани головного мозга, кости, глаз и мышц. В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура эпителиальной ткани выбрана из культуры ткани кожи, желудка и выстилки кишечника, почек и железистой ткани, указанная культура мышечной ткани выбрана из культуры ткани гладких, скелетных и сердечных мышц, указанная культура нервной ткани выбрана из ткани головного мозга, спинного мозга и нервов.
[0050] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать рост указанной культуры ткани. Согласно одному варианту реализации такая среда способна улучшать регенерацию культуры нервной ткани. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда способна улучшать регенерацию культуры нервов приблизительно на 10% - приблизительно на 200%, приблизительно 20% - приблизительно на 150%, приблизительно 30% - приблизительно на 120% или приблизительно 40% - приблизительно на 100%. Согласно другим вариантам реализации такая среда способна улучшать образование мышечных трубочек, и/или улучшать появление или способствовать появлению сократительной способности мышечных клеток, например, также уменьшая период времени до начала спонтанной сократительной активности мышечных трубочек. Согласно одному варианту реализации указанная среда способна улучшать образование мышечных трубочек приблизительно на 10% - приблизительно на 600%, приблизительно 20% - приблизительно на 500%, приблизительно 30% - приблизительно на 400%, приблизительно 40% - приблизительно на 300%, приблизительно 50 до приблизительно 200, приблизительно 60% - приблизительно на 150% или приблизительно 70% - приблизительно на 100%. Термин «образование мышечных трубочек» в настоящем документе относится к процессу, в ходе которого миобласты сливаются в многоядерные волокна, мышечные трубочки.
[0051] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста стволовых клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки человека. Согласно другому варианту реализации указанные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки не являющегося человеком млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации указанные стволовые клетки выбраны из эмбриональных, хорионических, амниотических, гематопоэтических, мезенхимальных, нервных, глиальных стволовых клеток, стволовых клеток взрослых и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В соответствии с одним вариантом реализации указанные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки. Согласно другому варианту реализации указанные стволовые клетки представляют собой гематопоэтические стволовые клетки. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанные стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки. В соответствии с еще одним вариантом реализации указанные стволовые клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации указанные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки взрослых, например, мезенхимальные стволовые клетки, эпидермальные стволовые клетки, эпителиальные стволовые клетки, гематопоэтические стволовые клетки или нервные стволовые клетки. В соответствии с одним вариантом реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для пролиферации, экспансии и/или дифференцировки стволовых клеток. Согласно другому варианту реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению способна улучшать пролиферацию и/или дифференцировку стволовых клеток. В соответствии с одним конкретным вариантом реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению способна улучшать дифференцировку стволовых клеток в остеобласт, т.е. улучшать остеобластическую дифференцировку.
[0052] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста эмбрионов. В соответствии с одним вариантом реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для развития эмбрионов. Согласно другому варианту реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению способна улучшать развитие эмбрионов. В соответствии с одним вариантом реализации указанная среда способна улучшать развитие эмбриона приблизительно на 10% - приблизительно на 300%, приблизительно на 20% - приблизительно на 250%, приблизительно на 30% - приблизительно на 200%, приблизительно на 40% - приблизительно на 150%, приблизительно на 60% - приблизительно на 100%; или приблизительно на 70% - приблизительно на 90%. Термины «эмбриогенез» и «развитие эмбриона» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к процессу, в ходе которого образуется и развивается эмбрион, начиная со стадии зиготы, превращаясь в эмбрион, как известно в данной области техники, и включает этапы достижения стадии дробления, компактизации, образования бластоцисты или хетчинга бластоцисты. Термины «дробление», «компактизация» бластоцисты и «хетчинг» в настоящем документе относятся к терминам, широко используемым в эмбриологии. Термин «дробление» относится к делению клеток в раннем эмбрионе, с получением кластера клеток того же размера, что и оригинальная зигота. Разные клетки, образующиеся в результате дробления, называют бластомерами. Термин «компактизация» в настоящем документе относится к стадии, на которой делящиеся клетки, происходящие из зиготы, максимизируют взаимные контакты за счет поляризации и адгезии, образуя компактную сферу, которая сохраняет целостность за счет плотных соединений. Термин «бластоциста» в настоящем документе относится к структуре, развивающейся после стадии компактизации и содержащей внутреннюю клеточную массу, которая затем образует эмбрион, внешний слой бластоцисты, который окружает внутреннюю клеточную массу, и наполненную жидкостью полость, называемую бластоцелем. Термин «хетчинг» в настоящем документе относится к стадии, на которой эмбрион выходит из своей внешней оболочки (zona pellucida, «блестящая оболочка»).
[0053] Термин «улучшение развития эмбриона» в настоящем документе относится к содействию, улучшения или повышению скорости и/или эффективности процесса развития, а также к доле успешно выросших и развившихся эмбрионов. Указанную улучшение измеряют относительно контрольного образца, подвергаемого той же процедуре, но без АКК в ростовой среде. В соответствии с одним вариантом реализации указанные эмбрионы представляют собой эмбрионы человека. Согласно другому варианту реализации указанные эмбрионы представляют собой эмбрионы не являющегося человеком млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации указанное не являющееся человеком млекопитающее выбрано из крупного рогатого скота, свиней, овец, коз, лошадей, мулов, осла, буйвола или верблюдов. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанное не являющееся человеком млекопитающее выбрано из кошки, собаки, мыши, крысы, морской свинки, хомяка, кролика, обезьяны или человекообразной обезьяны.
[0054] Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда способна улучшать или продлевать криоконсервацию эмбрионов или гамет, согласно описанию выше в тексте настоящего документа. В настоящем документе термин «криоконсервация» относится к хранению клеток, таких как гаметы, или эмбрионов, при сверхнизких температурах, как правило, в жидком азоте (-196°С).
[0055] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста клеток гамет. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК подходит для созревания и/или сохранения клеток гамет. В соответствии с одним вариантом реализации клетки гамет представляют собой ооциты. В соответствии с другими вариантами реализации клетки гамет представляют собой сперматозоиды. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации указанные клетки гамет представляют собой клетки гамет человека или не являющегося человеком млекопитающего. В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанное не являющееся человеком млекопитающее выбрано из группы, состоящей из сельскохозяйственного животного, домашних животных, грызунов, диких животных и приматов. Согласно одному варианту реализации указанные сельскохозяйственные животные выбраны из крупного рогатого скота, свиней, овец, коз, лошадей, мулов, ослов, буйволов и верблюдов. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанное домашнее животное представляет собой кошку или собаку, указанный грызун представляет собой крысу, мышь, морскую свинку или хомяка, указанное зайцеобразное представляет собой кролика, а указанный примат представляет собой обезьяну, такую как макаки, или эмбрион человекообразной обезьяны, такой как шимпанзе.
[0056] Согласно другому варианту реализации указанные клетки гамет представляют собой клетки гамет не являющегося млекопитающим животного. В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанное не являющееся млекопитающим животное выбрано из группы, состоящей из рыб, насекомых и птиц.
[0057] В соответствии с одним вариантом реализации указанные клетки гамет представляют собой сперматозоиды или ооциты человека.
[0058] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать созревание ооцитов или спермы. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать качество спермы. Термины «улучшение созревания спермы» и «улучшение качества спермы» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к улучшению качества спермы, например, улучшения подвижности спермы, улучшения поступательной подвижности сперматозоидов, увеличения численности сперматозоидов и любой комбинации перечисленного. Соответственно согласно одному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать подвижность спермы, улучшать поступательную подвижность сперматозоидов, увеличивать численность сперматозоидов, или обеспечивать любую комбинацию перечисленного. Термин «подвижность спермы» в настоящем документе относится к доле движущихся сперматозоидов от всех клеток спермы в определенном образце. Термин «поступательная подвижность» в настоящем документе относится к фракции сперматозоидов, движущихся в приблизительно постоянном направлении. Термины «улучшение подвижности спермы» и «улучшение поступательной подвижности сперматозоидов» в настоящем документе относятся к увеличению фракции подвижных сперматозоидов и сперматозоидов, обладающих поступательной подвижностью, соответственно. Соответственно, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ улучшения подвижности спермы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ улучшения поступательной подвижности сперматозоидов. Оценка подвижности спермы, поступательной подвижности сперматозоидов и этап созревания спермы может быть проведена любым известным в данной области техники способом. Например, оценка подвижности может быть проведена с применением метода компьютеризированного анализа спермы (CASA, «computer-assisted sperm analysis))) (Amann & Waberski, 2014, Theriogenology, 81: 5-17). Термин «образец спермы» относится к одному или более образцам, содержащим сперму. Указанный образец спермы может представлять собой семенную жидкость, полученную от субъекта, или обработанную семенную жидкость, сжиженную семенную жидкость, осажденную и, необязательно, ресуспендированную сперму, и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации увеличение численности сперматозоидов включает увеличение численности сперматозоидов при процедуре оценки подвижности или поступательной подвижности. В соответствии с одним из вариантов реализации указанная процедура оценки подвижности или поступательной подвижности представляет собой процедуру флотации.
[0059] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста ткани органа или органа. Согласно некоторым вариантам реализации указанная ткань органа или указанный орган выбран из яичника, роговицы, сердца, почки, поджелудочной железы, печени, селезенки, легкого, яичка, мочевого пузыря и везикул крови. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная ткань органа или орган представляет собой яичник. Соответственно, клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению способна улучшать сохранение или поддержание ткани органа или органа.
[0060] Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста клеток растений. Согласно некоторым вариантам реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста культуры клеток растения. Согласно другому варианту реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста культуры ткани растения. Термин «культура клеток растения» относится к клеткам растений, происходящим из тканей или клеток растений, которые затем культивируют в контейнере или в реципиенте. Термин «культура ткани растения» включает каллусные ткани (каллус), дифференцированные культивируемые ткани или культивируемую ткань органа. Термин «каллус» относится к массе неупорядоченных паренхиматозных клеток, происходящих из ткани растения (эксплантатам).
[0061] Согласно другому варианту реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста клеток насекомых. В соответствии с одним вариантом реализации указанные клетки насекомых представляют собой культуру клеток насекомых например, линии клеток насекомых. Типы клеток соответствуют описанным выше в тексте настоящего документа. Согласно одному конкретному варианту реализации указанные линии клеток выбраны из линий клеток Sf 9, Sf 21 и High-Five. Согласно другому варианту реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста культуры ткани насекомых. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанные клетки насекомых представляют собой культуру органа насекомых.
[0062] Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура клеток представляет собой суспензионную или адгезивную культуру клеток.
[0063] Согласно одному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать рост культуры клеток или тканей растений, или способна улучшать рост культуры клеток, тканей или органов растений.
[0064] В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению, подходящая для роста клеток животных, растений или насекомых, культур тканей или органов, может представлять собой естественную среду или искусственную среду, в которую добавлен АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда представляет собой естественную среду с добавлением АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. Согласно некоторым вариантам реализации указанная естественная среда включает биологическую жидкость, выбранную из плазмы, сыворотки, лимфы, сыворотки пуповинной крови человека и амниотической жидкости. Согласно другому варианту реализации указанная естественная среда включает экстракты тканей, такие как экстракт печени, селезенки, опухолей, лейкоцитов и костного мозга, экстракт бычьего эмбриона и эмбрионов курицы. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная естественная среда включает коагулянты или сгустки плазмы. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда представляет собой искусственную среду с добавлением АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. В соответствии с одним вариантом реализации указанная искусственная среда представляет собой сбалансированный раствор солей. Примерами сбалансированных растворов солей являются ФСБ, фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS), сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS), сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS), раствор Тироде Т6, среда Виттена (WM1), среда Пула Р1, среда Квина HTF и среда Гарднера G1. Согласно другому варианту реализации указанная искусственная среда представляет собой базальную среду. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда может содержать дополнительные добавки, как хорошо известно в данной области техники. В соответствии с одним вариантом реализации в указанную среду добавлена сыворотка, например, фетальная бычья сыворотка. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная искусственная среда представляет собой сложную среду.
[0065] Термин «базальная среда» в настоящем документе относится к питательной смеси неорганических солей, Сахаров, аминокислот, необязательно также содержащей витамины, органические кислоты и/или буферы. Базальные среды совместно с добавками обеспечивают питательные вещества, необходимые для поддержки жизни, роста и репродукции клеток. Выбранная для применения базальная среда должна подходить для культуры.
[0066] В соответствии с одним вариантом реализации указанная искусственная среда представляет собой бессывороточную среду. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная искусственная среда представляет собой среду с пониженным содержанием сыворотки. Согласно другому варианту реализации указанная искусственная среда представляет собой не содержащую белка среду.
[0067] Примерами клеточных сред, в которые может быть добавлен АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, для применения в соответствии с настоящим изобретением, являются модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), минимальная эссенциальная среда (ЕМЕМ), среда RPMI 1640 (разработанная в Мемориальном институте Розуэлл-Парк (Roswell Park Memorial Institute)) и базальная среда Игла (ВМЕ). Дополнительными примерами сред для применения в соответствии с настоящим изобретением являются питательные смеси Хэма, такие как среда Хэма F-10, среда Хэма F-12, DMEM/F-12 (DMEM и среда Хэма F-12). Другими примерами являются среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков (IMDM), Opti-MEM и среда MEM в модификации Глазго (GMEM). Примерами сред, подходящих для роста клеток насекомых, являются среда для клеток насекомых IPL-41, среда Шнайдера для клеток дрозофилы, среда для клеток насекомых Грейса, бессывороточная среда для клеток насекомых, Sf-900, ТС-10, среда для клеток насекомых Шейлдса и Санга М3, среда ТС-100 для клеток насекомых, среда TNM-FH для клеток насекомых; и IPL-10. Примерами сред, подходящих для роста эмбрионов, являются среды для монокультур, такие как SAGE 1-Step™, или среды для последовательного культивирования, такие как Quinns Advantage™ Sequential Media (ORIGIO). Примерами сред, подходящих для роста клеток растений, являются среды Мурасиге-Скуга (MS), В5, N6 и среда Нича.
[0068] Другими примерами сред являются модифицированная среда, среда NCTC, среда MegaCell, среда Клейкомба, среда Клика, среда L-15, среда 199, среда MCDB, среда Эймса, среда BGJb (модификация Фиттона-Джексона), среда Клика, среда CMRL-1066, модифицированная среда Маккоя 5А, среда NCTC, среда Свима S-77, среда Веймаута, среда Е Уильяма и среды для оплодотворения in vitro, такие как Global, GM501, SSM™, среда для дробления K-SICM, среда для бластоцист K-SIBM, среда для дробления Quinns Advantage, среда для бластоцист Quinns Advantage, среда для ЭКО FERTICULT™, среда FERTICULT™ G3, IVC-TWO™, IVC-THREE™, ЕСМ, MultiBlast, EmbryoAssist™, BlastAssist™, ISM1, ISM2, G-1™PLUS, G-2™PLUS, IVF™ и CCM™. Дополнительными примерами сред являются среды для разделения спермы, такие как ISolate, PureCeption™, универсальная рабочая среда Multipurpose Handling Medium (МНМ), среды для промывания спермы, такие как среда для промывания спермы Quinns™, Multipurpose Handling Medium (МНМ) или модифицированная среда HTF с гентамицином, среда для капацитации, такая как среда Бигера-Виттена-Виттингема (BWW), среда F10 Хэма и модифицированная среда Тироде (HSM); и среда для созревания, которая обеспечивает получение из культуры незрелых ооцитов полностью развившихся эмбрионов, подходящих для переноса. Согласно другим вариантам реализации указанная среда представляет собой среду для созревания ооцитов, такую как среда SAGE™ для созревания in vitro (IVM) и среда для созревания ооцитов BO-IVM, среду для оплодотворения, среду для развития эмбрионов, среды для манипуляций с гаметами, среду для предымплантационной генетической диагностики (ПГД) или среду для созревания, манипуляций и/или криоконсервации эмбрионов и/или гамет.Соответственно, согласно одному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда выбрана из DMEM, RPMI 1640, MEM, IMDM, среды L-15 (среды Лейбовица), среды MCDB, среды 199, Opti-MEM и DMEM/F-12, среды Шнайдера для клеток дрозофилы, среды для клеток насекомых Грейса, IPL-41, среды для клеток насекомых Sf-900, бессывороточной среды для клеток насекомых, среды для клеток насекомых Шейлдса и Санга М3, среды для клеток насекомых ТС-100, среды для клеток насекомых TNM-FH, Хэма F-12, Хэма F-10, GMEM, среды Эймса, базальной среды Игла (ВМЕ), среды Клейкомба, среды Клика, минимальной эссенциальной среды в модификации Глазго (GMEM), среды MegaCell, модифицированной среды Маккоя 5А, среды NCTC, среды Е Уильяма, среды Веймаута, ТС-10 и среды IPL-10. Согласно другому варианту реализации указанная клеточная культуральная среда выбрана из DMEM, RPMI 1640, MEM, IMDM, Opti-MEM, GMEM, среды Хэма F-12 и среды DMEM/F-12, среды Шнайдера для клеток дрозофилы, среды для клеток насекомых Грейса, Sf-900, ТС-10, среды IPL-10, сред для разделения, промывания или созревания спермы, таких как ISolate, PureCeption™, среды Multipurpose Handling Medium (МНМ), среды для промывания спермы Quinns™, Multipurpose Handling Medium (МНМ), среды Бигера-Виттена-Виттингема (BWW), среды Хэма-F10 и модифицированной среды Тироде (HSM); модифицированной среды HTF с гентамицином, среды для оплодотворения, среды для развития эмбриона и среды для созревания, манипуляций и/или криоконсервации эмбрионов и/или гамет.
[0069] Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК согласно настоящему изобретению подходит для роста одноклеточных эукариот. В соответствии с одним из вариантов реализации указанные одноклеточные эукариоты представляют собой дрожжи, такие как Saccharomyces, более конкретно - Saccharomyces cerevisiae. В соответствии с одним вариантом реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению, подходящая для роста одноклеточных эукариот, например, Saccharomyces cerevisiae, выбрана из дрожжевого экстракта с пептоном и декстрозой (среда YPD), дрожжевого экстракта с пептоном и глицерином (среда YPG) и экстракта дрожжей с пептоном и декстрозой (среда YPAD). Согласно одному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать рост дрожжей.
[0070] В соответствии с некоторыми вариантами реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста прокариот.Согласно частному варианту реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста микроорганизмов. Согласно некоторым вариантам реализации указанные микроорганизмы представляют собой микроорганизмы микробиома. Согласно некоторым вариантам реализации указанные микроорганизмы представляют собой бактерии. Соответственно, согласно частному варианту реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста бактерий. Согласно некоторым вариантам реализации указанные бактерии представлены Е. coli или пробиотическими бактериями, такими как бактерии родов Bifidobacterium и Lactobacillus. Дополнительные примеры штаммов видов пробиотических бактерий представлены Lactobacillus Paracasei, Bifidobacterium Longum, Lactobacillus Johnsonii, Lactobacillus Fermentum, Pediococcus Acidlacti, например: Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Rhamnosus GG, Lactobacillus Helveticus, Bifidobacterium Infantis, Bifidobacterium Lactis, Lactobacillus Bulgaricus, Lactobacillus Silivarius, Lactobacillus Plantarum, Lactobacillus Reuteri, Lactobacillus Casei, Bifidobacterum Bifidum, Saccharomyces Boulardii, Streptococcus Thermophilus, Bifidobacterum Breve, Bacillus Coagulans, Lactobacillus Brevis. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда, подходящая для роста бактерий, выбрана из LB и М9. Согласно одному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать рост бактерий.
[0071] В соответствии с некоторыми вариантами реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для роста архей. Согласно одному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать рост архей.
[0072] В соответствии с любыми аспектами и вариантами реализации настоящего изобретения АКК стабилизирован по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. Термины «стабилизирующий агент» и «стабилизатор» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к любому веществу, которое вносит вклад в сохранение карбоната кальция в аморфном состоянии при получении АКК, приготовлении составов с АКК, хранении и/или применении АКК. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой единственный агент. Согласно другим вариантам реализации предусмотрено применение нескольких стабилизирующих агентов. Термины «стабилизированный АКК» и «АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором» могут применяться, согласно некоторым вариантам реализации, взаимозаменяемо.
[0073] Указанный стабилизатор может содержать молекулу, содержащую одну или более функциональных групп, выбранных из гидроксильных, карбоксильных, сложноэфирных, аминных, фосфиновых, фосфоновых, фосфатных, сульфонильных, сульфатных или сульфиновых групп, но не ограничивающихся перечисленными группами. Несущие гидроксильные группы соединения в комбинации с гидроксидом необязательно также несут другие функциональные группы, такие как карбоксильные группы и т.п., однако гидроксил при этом не подвергается этерификации.
[0074] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор отличается низкой токсичностью или отсутствием токсичности для клеток или организма млекопитающих, и, в частности, для человека. В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанный стабилизатор подходит для пищевого, нутрицевтического или фармацевтического применения.
[0075] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий АКК агент представляет собой, независимым в каждом случае образом, органическую кислоту; фосфорилированное, фосфонированное, сульфатированное или сульфонированное органическое соединение; фосфорный или серный сложный эфир гидроксикарбоновой кислоты; органоаминное соединение; органическое соединение, содержащее гидроксил; фосфороорганическое соединение или его соль; фосфорилированные аминокислоты и их производные, бисфосфонат; фосфороорганическое соединение; органофосфонатное соединение; органический полифосфат, неорганический полифосфат, неорганическую фосфористую кислоту, органическое соединение, содержащее несколько функциональных групп согласно определению выше; неорганическое фосфатное и полифосфатное соединение; органическое соединение, содержащее полифосфатную цепь; органическое поверхностно-активное вещество; имеющий существенное биологическое значение неорганический ион; сахариды и их производные, белки, фосфорилированные белки, естественные и синтетические биополимеры и их производные, или любую их комбинацию. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор может обладать также фармацевтической активностью, как, например, бисфосфонат или АТФ.
[0076] Соответственно согласно одному варианту реализации указанный стабилизирующий агент выбран из группы, состоящей из полифосфата, такого как неорганический полифосфат, органических кислот, фосфорилированных, фосфонированных, сульфатированных или сульфонированных органических соединений, фосфорных или серных сложных эфиров гидроксикарбоновых кислот, фосфорилированных аминокислот, бисфосфоната, органического полифосфата, сахаридов и их производных, белков, пептидов, фосфорилированных белков, фосфорилированных пептидов и любых их комбинаций. Согласно другому варианту реализации указанный стабилизирующий агент выбран из группы, состоящей из фосфосерина, аденозинтрифосфата, аденозиндифосфата, фитиновой кислоты, лимонной кислоты, этидроновой кислоты, пирофосфата, полифосфата, трифосфата, этанола, гексаметафосфата, хитина; и любой их комбинации.
[0077] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор представляет собой органическую кислоту. В соответствии с определенными вариантами реализации указанная органическая кислота выбрана из аскорбиновой, лимонной, молочной или уксусной кислоты, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, глутаконовой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, молочной кислоты, глутаминовой кислоты, аконитовой кислоты, и, необязательно, включают соединения, содержащие по меньшей мере две карбоксильных группы, необязательно с молекулярной массой, не превышающей 250 г/моль, такие как лимонная кислота, винная кислота, яблочная кислота и т.п.В соответствии с одним конкретным вариантом реализации указанный стабилизатор представляет собой лимонную кислоту.
[0078] Согласно другому варианту реализации указанный фосфорный сложный эфир гидроксикарбоновых кислот представляет собой фосфоенолпируват.Согласно другому варианту реализации указанные фосфорные или серные сложные эфиры гидроксикарбоновых кислот содержат аминокислоты. Примерами таких сложных эфиров являются фосфосерин, фосфотреонин, сульфосерин, сульфотреонин и фосфокреатин.
[0079] Согласно другому варианту реализации указанный стабилизатор представляет собой сахарид. В соответствии с одним вариантом реализации указанные сахариды выбраны из моно-, ди-, три-, олиго- и полисахаридов, таких как сахароза, манноза, глюкоза, хитозан и хитин. Стабилизатор может представлять собой, согласно некоторым вариантам реализации, полиатомные спирты, такие как глицерин. Согласно другому варианту реализации указанный стабилизатор представляет собой аминокислоты, такие как серии или треонин. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[0080] Неограничивающими примерами естественных и синтетических биополимеров и производных являются полинуклеотиды и гликопротеины.
[0081] Некоторые специфические неограничивающие примеры таких стабилизаторов АКК, одобренных для употребления в пищу, обнаруживаемых в естественных пищевых продуктах или в организме человека, включают фитиновую кислоту, лимонную кислоту, двуосновный пирофосфат натрия, соль аденозин-5'-монофосфат (АМФ) натрия, соль аденозин-5'-дифосфат (АДФ) натрия и гидрат динатриевой соли аденозин-5'-трифосфата (АТФ), фосфосерин, фосфорилированные аминокислоты, поверхностно-активные вещества пищевого качества, стеароиллактилат натрия; и их комбинации.
[0082] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из фосфорных или серных сложных эфиров гидроксикарбоновых кислот, таких как фосфоенолпируват, фосфосерин, фосфотреонин, сульфосерин или сульфотреонин, и сахаридов, выбранных из моно-, ди-, три-, олиго- и полисахаридов, например, сахарозы, маннозы, глюкозы. Несущее гидроксил соединение может дополнительно содержать по меньшей мере один щелочной гидроксид, такой как гидроксид натрия, гидроксид калия и т.п. Фосфорилированные кислоты могут присутствовать в олигопептидах и полипептидах. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанный стабилизатор представляет собой органическую кислоту, выбранную из монокарбоновой кислоты или поликарбоновой кислоты, например, дикарбоновой кислоты или трикарбоновой кислоты. Каждая возможность соответствует отдельному варианту реализации настоящего изобретения. Указанная органическая кислота может соответствовать определению выше.
[0083] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный стабилизатор АКК выбран из фосфорилированных аминокислот, полиолов и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабильный АКК содержит в качестве стабилизатора фосфорилированное соединение, причем фосфорилирование осуществляют на гидроксильной группе органического соединения. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабильный АКК содержит стабилизатор, выбранный из группы, состоящей из лимонной кислоты, фосфосерина, фосфотреонина и их комбинаций. Неограничивающие примеры стабилизаторов, содержащих фосфатные, фосфитные, фосфонатные группы, и их соли или сложные эфиры, включают фитиновую кислоту, диметилфосфат, триметилфосфат, пирофосфат натрия, тетраэтилпирофосфат, рибулозобисфосфат, этидроновую кислоту и другие медицинские бисфосфонаты, соль 3-фосфоглицериновой кислоты, глицеральдегид-3-фосфат, соль 1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфат натрия, диэтилентриаминпентакис(метилфосфоновую кислоту), нитрилотри(метилфосфоновую кислоту), пентанатриевую соль 5-фосфо-D-рибозо-1-дифосфата, натриевую соль аденозин-5'-дифосфата, гидрат динатриевой соли аденозин-5'-трифосфата, α-D-галактозамин-1-фосфат, тринатриевую соль 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты, пентагидрат дикалиевой соли α-D-галактозо-1-фосфата, α-D-галактозамин-1-фосфат, О-фосфорилэтаноламин, гидрат динатриевой соли, пентанатриевую соль 2,3-дифосфо-D-глицериновой кислоты, гидрат мононатриевой соли фосфо(енол)пировиноградной кислоты, D-глицеральдегид-3-фосфат, литиевую соль sn-глицерин-3-фосфата, динатриевую соль D-(-)-3-фосфоглицериновой кислоты, натриевую соль D-глюкозо-6-фосфата, фосфатидную кислоту, соль ибандронат натрия, фосфоноуксусную кислоту, DL-2-амино-3-фосфонопропионовую кислоту; или их комбинации. Имеющие существенное биологические значение неорганические ионы могут включать, в том числе, Na, K, Mg, Zn, Fe, Р, S, N; P или S в фазе оксидов; или N в виде аммония или нитрогрупп.
[0084] Указанный стабилизатор может дополнительно включать фосфонатные соединения, такие как, не ограничиваясь перечисленными, бисфосфонаты, полифосфаты, например, не ограничиваясь перечисленными, пирофосфат или полифосфонаты; или органические полифосфаты, такие как, не ограничиваясь перечисленными, аденозиндифосфат (АДФ) или аденозинтрифосфат (АТФ).
[0085] Необязательно, АКК стабилизирован комбинацией фосфосерина и лимонной кислоты. Согласно другому варианту реализации АКК стабилизирован трифосфатом и лимонной кислотой.
[0086] Указанный АКК может быть стабилизирован более чем одним стабилизатором, например, двумя стабилизаторами. Указанный стабильный АКК могут содержать более чем два стабилизатора, при этом указанные один или более стабилизаторов добавляют в АКК при образовании и осаждении указанного АКК; таким образом, они представляют собой «внутренние» стабилизаторы, а другие один или более стабилизаторов добавляют на поверхность частиц АКК после их образования; таким образом, они представляют собой «внешние» стабилизаторы. Дополнительные примеры стабильных АКК и их состава можно найти в международных патентных заявках WO 2009/053967, WO 2014/024191 и WO 2016/193982.
[0087] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой белок. Согласно одному варианту реализации указанный белок представляет собой естественным образом полученный и очищенный белок. Согласно другому варианту реализации указанный белок представляет собой полученный синтетическим путем белок. Согласно некоторым вариантам реализации указанный белок выбран из белков GAP65, GAP22, GAP21 и GAP 12. Согласно другому варианту реализации указанные белки выбраны из CqCDAl, хотиназы 2, бета-N-ацетилглюкозаминидазы, ГАМФ-подобного, хитин-связывающего белка, CqCBP, САР10, GAP 18,2, GAP 02526, CqHc1, CqHc2, CqHc3, CqHc4, CqHc5, CqHc6, CqHc7, криптоцианина 1, циклофилина, цистатина 1, цистатина 2, LPS-BP, белка LEA и кристацианина; необязательно, указанные белки происходят из С.quadricarinatus. В соответствии с определенными вариантами реализации указанные белки представляют собой фосфорилированные белки.
[0088] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий агент выбран из полифосфата, фосфорилированных аминокислот, органических кислот, фосфорилированных, фосфонированных, сульфатированных или сульфонированных органических соединений, фосфорных или серных сложных эфиров гидроксикарбоновых кислот, бисфосфоната, сахаридов, их производных, белков, фосфорилированных белков, естественных и синтетических биополимеров, и их производных и любых их комбинаций. Согласно другим вариантам реализации указанный стабилизирующий агент выбран из фосфосерина, трифосфата, аденозинтрифосфата, аденозиндифосфата, фитиновой кислоты, лимонной кислоты, этидроновой кислоты, пирофосфата, этанола, гексаметафосфата, хитина и любой их комбинации.
[0089] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий агент выбран из органических кислот, фосфорилированных органических кислот, фосфорных или серных сложных эфиров гидроксикарбоновых кислот, фосфорилированных аминокислот, бисфосфоната, органического полифосфата, сахаридов, их производных, белков и любых их комбинаций.
[0090] Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один стабилизатор выбран из группы, состоящей из полифосфата, бисфосфоната, фосфорилированной аминокислоты, лимонной кислоты, и любой их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации добавляют более одного стабилизатора, например, 2, 3 или 4 стабилизатора.
4
[0091] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор представляет собой полифосфат или его фармацевтически приемлемые соли. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полифосфат представляет собой физиологически совместимую водорастворимую полифосфатную соль, выбранную из группы, состоящей из соли натрия, калия и любого другого имеющего существенное значение катиона полифосфата. Согласно одному варианту реализации указанный полифосфат представляет собой органический или неорганический полифосфат.Термин «полифосфат» в настоящем документе относится к полимерным сложным эфирам PO. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полифосфат представляет собой физиологически совместимую водорастворимую полифосфатную соль, выбранную из группы, состоящей из полифосфата натрия и калия. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полифосфат представляет собой неорганический полифосфат или его фармацевтически приемлемые соли. Неограничивающими примерами такой соли являются соли Na, K, Mg, Mn и Zn. Согласно некоторым вариантам реализации указанный неорганические фосфаты содержат от 2 до 10 фосфатных групп, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фосфатных групп.Согласно некоторым вариантам реализации указанный полифосфат выбран из пирофосфата, трифосфата и гексаметафосфата. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизатор представляет собой пирофосфат или его фармацевтически приемлемые соли, такие как пирофосфат натрия. Согласно другому варианту реализации указанный стабилизатор представляет собой трифосфат или его фармацевтически приемлемые соли, такие как трифосфат натрия. Термин «трифосфат» и «триполифосфат» используют в настоящем документе взаимозаменяемо. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанный стабилизатор представляет собой гексаметафосфат или его фармацевтически приемлемую соль, такую как гексаметафосфат натрия.
[0092] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор представляет собой бисфосфонат или его фармацевтически приемлемые соли. Неограничивающими примерами солей являются соли Na, K, Mg, Mn и Zn.
2
[0093] Термин «бисфосфонат» в настоящем документе относится к органическим соединениям, содержащим две фосфонатные (РО(ОН)) группы. Указанный термин также относится к соединениям, содержащим остов РО3-органический компонент-РО3. Наиболее типичные примеры представлены рядом бисфосфонатов, применяемых в качестве фармацевтических средств для лечения остеопороза. Согласно некоторым вариантам реализации указанный бисфосфонат выбран из группы, состоящей из этидроновой кислоты, золедроновой кислоты, медроновой кислоты, алендроновой кислоты и их фармацевтически приемлемой соли. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор представляет собой этидроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль. Согласно другому варианту реализации указанный стабилизатор представляет собой золедроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная стабилизатор представляет собой медроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль. В соответствии с определенными вариантами реализации указанный стабилизатор представляет собой алендроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль.
[0094] В соответствии с определенными вариантами реализации указанный стабилизатор представляет собой фосфорилированную аминокислоту. В соответствии с одним вариантом реализации указанная фосфорилированная аминокислота представляет собой фосфосерин. Согласно другому варианту реализации указанная фосфорилированная аминокислота представляет собой фосфотреонин.
[0095] Согласно некоторым вариантам реализации композиция с АКК содержит комбинацию стабилизаторов, описанных выше.
[0096] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор представляет собой полифосфат или бисфосфонат согласно определению выше в тексте настоящего документа, и молярное отношение атомов Р стабилизатора и атомов Са АКК (молярное отношение Р:Са) составляет от приблизительно 1:90 до 1:1. Согласно одному варианту реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:40 до приблизительно 1:1. Согласно дополнительному варианту реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:35 до приблизительно 1:2. Согласно некоторым вариантам реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:30 до приблизительно 1:3. Согласно некоторым вариантам реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:28 до приблизительно 1:3. Согласно другим вариантам реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:25 до приблизительно 1:4. Согласно дополнительному варианту реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:20 до приблизительно 1:5. Согласно другому варианту реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:20 до приблизительно 1:6. Согласно конкретному варианту реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:15 до приблизительно 1:5. Согласно другому конкретному варианту реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:25 до приблизительно 1:5. Согласно некоторым вариантам реализации такой полифосфат представляет собой пирофосфат, трифосфат, гексаметафосфат или его фармацевтически приемлемую соль. В соответствии с другими вариантами реализации указанный бисфосфонат представляет собой алендроновую кислоту, этидроновую кислоту, золедроновую кислоту или медроновую кислоту, а молярное отношение Р:Са соответствует определению выше в тексте настоящего документа.
[0097] Согласно некоторым вариантам реализации содержание кальция (содержание Са) в стабилизированном АКК, содержащем полифосфат или бисфосфонат, составляет от приблизительно 1% по массе до приблизительно 39% по массе, от приблизительно 5% по массе до приблизительно 39% по массе, от приблизительно 10% до приблизительно 39% по массе, от приблизительно 15% до приблизительно 39% по массе, от приблизительно 20% по массе до приблизительно 38% по массе, от приблизительно 25% по массе до приблизительно 38% по массе, или от приблизительно 30 до приблизительно 38. Термины «содержание Са» и «содержание кальция» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к содержанию кальция в АКК в итоговой композиции.
[0098] Согласно некоторым вариантам реализации указанное молярное отношение Р:Са составляет от приблизительно 1:40 до приблизительно 1:1, а содержание Са составляет от приблизительно 20% по массе до приблизительно 39% по массе. Согласно некоторым вариантам реализации указанное молярное отношение составляет от 1:28 до приблизительно 1:3, а содержание Са составляет приблизительно 30% по массе до приблизительно 38% по массе. Согласно другому варианту реализации указанное молярное отношение составляет от 1:25 до приблизительно 1:5, а содержание Са составляет от приблизительно 30% по массе до приблизительно 36% по массе.
[0099] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор выбран из группы, состоящей из полифосфата, фосфорилированной аминокислоты, бисфосфоната, лимонной кислоты, винной кислоты и любой их комбинации. В соответствии с одним из вариантов реализации указанный полифосфат выбран из группы, состоящей из трифосфата, пирофосфата и гексаметафосфата, указанная фосфорилированная аминокислота представляет собой фосфосерин или фосфотреонин, и указанный бисфосфонат выбран из группы, состоящей из алендроната, этидроновой кислоты, золедроновой кислоты и медроновой кислоты.
[0100] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК содержит менее чем 20% по массе, менее чем 15% по массе, менее чем 10% по массе, или менее чем 5% по массе указанного стабилизирующего агента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК содержит до 5% по массе указанного стабилизирующего агента.
[0101] В соответствии с одним вариантом реализации средний диаметр первичных частиц стабилизированного АКК составляет от приблизительно 10 нм до приблизительно 5 мкм. Согласно другому варианту реализации средний диаметр первичных частиц АКК составляет от приблизительно 30 нм до приблизительно 400 нм. В соответствии с еще одним вариантом реализации средний диаметр первичных частиц АКК составляет от приблизительно 30 нм до 350 нм. В соответствии с определенными вариантами реализации средний диаметр первичных частиц АКК составляет от приблизительно 35 нм до 300 нм, от 40 нм до приблизительно 250 нм, от приблизительно 45 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 150 нм или от приблизительно 60 нм до приблизительно 100 нм. В соответствии с еще одним вариантом реализации первичные частицы АКК агрегированы и средний диаметр указанных агрегатов составляет от 0,5 мкм до 300 мкм. В соответствии с одним дополнительным вариантом реализации диаметр агрегатов первичных частиц АКК составляет от приблизительно 1 до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкм или от приблизительно 20 до приблизительно 40 мкм. Согласно другому варианту реализации средний диаметр средний диаметр агрегатов первичных частиц АКК составляет от 1 мкм до 10 мкм.
[0102] В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточной культуральной среде составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 2 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 3 мМ до приблизительно 6 мМ или приблизительно 4 мМ до приблизительно 5 мМ. Согласно более конкретному варианту реализации стабилизированный АКК присутствует в концентрации, составляющей от 0,5 до приблизительно 4 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 3 мМ, от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5, или приблизительно 1, 1,5, 2 или 2,5 мМ. Согласно некоторым вариантам реализации концентрация стабилизированного АКК в клеточной культуральной среде составляет от приблизительно 0,0001% (масса/объем) до приблизительно 1% (масса/объем), от приблизительно 0,0005% (масса/объем) до приблизительно 0,5% (масса/объем), от приблизительно 0,001% (масса/объем) до приблизительно 0,1% (масса/объем), от приблизительно 0,005% (масса/объем) до приблизительно 0,05% (масса/объем), от приблизительно 0,01% (масса/объем) до приблизительно 0,03% (масса/объем).
[0103] В соответствии с некоторыми более специфическими вариантами реализации в настоящем изобретении предложена клеточная культуральная среда с добавлением АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, при этом указанный стабилизирующий агент выбран из полифосфата, такого как неорганический полифосфат, фосфорилированная аминокислота, бисфосфонат, органическая кислота и любая их комбинация; указанная клеточная культуральная среда подходит для роста (i) культуры мышечных, нервных или костных клеток или тканей, (ii) эмбрионов человека или не являющегося человеком млекопитающего, (iii) стволовых клеток, (iv) клеток гамет или (v) яичников. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой фосфосерин. Согласно другому варианту реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой трифосфат. В соответствии с еще одним вариантом реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой комбинацию фосфосерина с органической кислотой, такой как лимонная кислота. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой комбинацию трифосфата, такого как трифосфат натрия, с органической кислотой, такой как лимонная кислота. В соответствии с одним вариантом реализации такая клеточная культуральная среда подходит для роста культур мышечных, нервных или костных клеток или тканей. В соответствии с более конкретным вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда способна поддерживать и улучшать рост, например, пролиферацию, созревание, развитие или дифференцировку клеток. В соответствии с одним вариантом реализации указанные клетки представляют собой нервные клетки и, конкретнее, пораженные нервные клетки. Соответственно, согласно одному варианту реализации такая клеточная культуральная среда способна улучшать регенерацию пораженных нервных клеток. Согласно другому варианту реализации указанные клетки представляют собой мышечные клетки, в частности, дистрофические мышечные клетки, такие как клетки, пораженные мышечной дистрофией Дюшенна. Соответственно, в соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда способна улучшать образование мышечных трубочек и/или появление сократительной способности. Согласно другому варианту реализации такая клеточная культуральная среда подходит для роста эмбрионов человека или не являющегося человеком млекопитающего. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для роста эмбрионов человека. Согласно даже более конкретному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда способна улучшать развитие эмбрионов человека. Согласно другому варианту реализации такая клеточная культуральная среда подходит для роста клеток гамет человека или не являющегося человеком млекопитающего. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для созревания клеток гамет человека. Согласно еще более конкретному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда способна улучшать созревание клеток гамет человека. Согласно другому варианту реализации указанная клеточная культуральная среда способна обеспечивать созревание сперматозоидов человека, например, улучшение подвижности спермы, улучшение поступательной подвижности сперматозоидов, увеличение численности сперматозоидов и любую комбинацию перечисленного. В соответствии с дополнительным вариантом реализации такая клеточная культуральная среда подходит для роста стволовых клеток, и, в частности, стволовых клеток человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанные стволовые клетки выбраны из эмбриональных, хорионических, амниотических, гематопоэтических, мезенхимальных, нервных, глиальных стволовых клеток, стволовых клеток взрослых и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В соответствии с одним вариантом реализации такая клеточная культуральная среда подходит для пролиферации и/или дифференцировки стволовых клеток. В соответствии с одним конкретным вариантом реализации такая клеточная культуральная среда способна улучшать дифференцировку стволовых клеток, таких как МВА13, в остеобласты. В соответствии с некоторыми вариантами реализации конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточной культуральной среде составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, или от приблизительно 2 до приблизительно 4 мМ. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать показатели роста, например, пролиферацию, созревание, развитие или дифференцировку клеток приблизительно на 10% - приблизительно на 600%, приблизительно 20% - приблизительно на 500%, приблизительно 30% - приблизительно на 400%, приблизительно 40% - приблизительно на 300%, приблизительно 50 - приблизительно на 200, приблизительно 60% - приблизительно на 150% или приблизительно 70% - приблизительно на 100%. Согласно некоторым вариантам реализации улучшение указанных показателей роста составляет приблизительно 100% - приблизительно 500%, приблизительно 120% -приблизительно 400%, приблизительно 150% - приблизительно 300%.
[0104] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клеточная культуральная среда, такая как среда для дробления, среда для монокультур или последовательного культивирования с добавлением АКК, стабилизированным по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, при этом указанный агент представляет собой фосфосерин или трифосфат натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточной культуральной среде составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, или от приблизительно 2 до приблизительно 4 мМ, и указанная клеточная культуральная среда способна улучшать рост, например, развитие эмбрионов человека.
[0105] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клеточная культуральная среда, например, среды для разделения, промывания или созревания спермы, такие как ISolate, PureCeption™, Multipurpose Handling Medium (МНМ), среды для промывания спермы Quinns™, Multipurpose Handling Medium (МНМ) и модифицированная среда HTF с гентамицином, с добавлением АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, при этом указанный агент представляет собой фосфосерин или трифосфат натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточной культуральной среде составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, или от приблизительно 2 до приблизительно 4 мМ, и указанная клеточная культуральная среда способна улучшать созревание сперматозоидов, например, обеспечивать улучшение подвижности спермы, улучшение поступательной подвижности сперматозоидов, увеличение численности сперматозоидов и любую комбинацию перечисленного.
[0106] В соответствии с другими вариантами реализации в настоящем изобретении предложена клеточная культуральная среда с добавлением АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, при этом указанный агент представляет собой фосфосерин, этидроновую кислоту или трифосфат натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, и указанная клеточная культуральная среда способна улучшать регенерацию нервных клеток.
[0107] В соответствии с другими вариантами реализации в настоящем изобретении предложена клеточная культуральная среда, такая как DMEM/F12 или DMEM/F12, необязательно с добавлением сыворотки лошади (ЛС), L-глутамина, гентамицина и инсулина, отличающаяся тем, что в указанную среду дополнительно добавлен АКК, стабилизированный фосфосерином, этидроновой кислотой или трифосфатом натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, при этом конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточной культуральной среде составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, или от приблизительно 2 до приблизительно 4 мМ; и указанная клеточная культуральная среда способна улучшать образование мышечных трубочек и/или появление сократительной способности скелетной мышечной клетки, например, в случае мышечной дистрофии Дюшенна.
[0108] В соответствии с другими вариантами реализации в настоящем изобретении предложена клеточная культуральная среда с добавлением АКК, стабилизированного фосфосерином, этидроновой кислотой или трифосфатом натрия, необязательно, в комбинации с лимонной кислотой, и указанная клеточная культуральная среда способна улучшать дифференцировку стволовых клеток, в частности, дифференцировку МВА13 в остеобласты, при этом конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточной культуральной среде составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, или от приблизительно 2 до приблизительно 4 мМ.
[0109] В соответствии с другими вариантами реализации в настоящем изобретении предложена клеточная культуральная среда, такая как DMEM/F12 или DMEM/F12, с 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 2 мМ глутамином, 25 мкг/мл гентамицина и 0,3-0,5% геля NVR-Gel, отличающаяся тем, что в указанную среду дополнительно добавлен АКК, стабилизированный фосфосерином, этидроновой кислотой или трифосфатом натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, при этом конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточной культуральной среде составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, или от приблизительно 2 до приблизительно 4 мМ; и указанная клеточная культуральная среда способна улучшать сохранение яичников.
[0110] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды. Термины «добавка» и «добавка для клеточной культуральной среды» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к одному или нескольким компонентам для добавления в клеточные культуральные среды. Согласно одному конкретному варианту реализации термин относится к стабилизированному АКК, который был добавлен или предназначался для добавления в клеточную культуральную среду. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК добавляют в среду при получении указанной среды. Согласно другому варианту реализации АКК добавляют в среду перед применением.
[0111] В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для культивирования биологической культуры.
[0112] Согласно некоторым вариантам реализации стабилизированный АКК согласно настоящему изобретению при добавлении в клеточные культуральные среды улучшает рост клеток. Соответственно, согласно одному варианту реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать рост клеток. Согласно одному варианту реализации указанный стабилизированный АКК, используемый в качестве добавки для клеточной культуральной среды, улучшает пролиферацию, созревание, размножение, регенерацию, развитие и/или дифференцировку клеток, тканей и органов. В соответствии с одним вариантом реализации указанный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды согласно настоящему изобретению, способна улучшать дифференцировку стволовых клеток. Согласно другому варианту реализации такой АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать пролиферацию клеток. В соответствии с еще одним вариантом реализации АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать созревание, например, гамет, или улучшать развитие клеток, например, эмбрионов. В соответствии с определенными вариантами реализации АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать регенерацию клеток.
[0113] В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать показатели роста, например, пролиферацию, созревание, развитие или дифференцировку клеток, приблизительно на 10% - приблизительно на 600%, приблизительно 20% - приблизительно на 500%, приблизительно 30% - приблизительно на 400%, приблизительно 40% -приблизительно на 300%, приблизительно на 50 - приблизительно на 200, приблизительно на 60% - приблизительно на 150%; или приблизительно на 70% - приблизительно на 100%. Согласно некоторым вариантам реализации происходит улучшение указанных показателей роста приблизительно на 100% - приблизительно на 500%, приблизительно 120% -приблизительно на 400%, приблизительно 150% - приблизительно на 300%.
[0114] Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды может быть добавлена в любую известную клеточную культуральную среду. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда соответствует определению выше в тексте настоящего документа. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда выбрана из естественной среды и искусственной среды. В соответствии с одним вариантом реализации указанная среда подходит для роста любой биологической культуры, например, культуры клеток, культуры тканей, культуры органов, одноклеточных эукариот или микроорганизмов, таких как бактерии. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для роста культуры, выбранной из культуры клеток, тканей и/или органов животных, растений или насекомых. Согласно другому варианту реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для роста бактерий или дрожжей.
[0115] В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанная культура клеток животных выбрана из культуры клеток, культуры тканей, культуры органов, стволовых клеток, гамет, эмбрионов и органа человека или не являющегося человеком млекопитающего. В соответствии с другими вариантами реализации указанное млекопитающее представляет собой не являющееся человеком млекопитающее, например, сельскохозяйственное животное, такое как крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, лошади, мулы, ослы, буйволы или верблюды; домашнее животное, например, кошку или собаку; грызуна, такого как мышь, крыса, морская свинка или хомяк; зайцеобразных, таких как кролик; или примата, такого как обезьяна (например, макаки) или человекообразная обезьяна (например, шимпанзе). Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для культуры клеток, подходящей для роста первичной или вторичной культуры. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК способен улучшать рост указанной линии клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста культуры ткани млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста стволовых клеток. Согласно другому варианту реализации указанные стволовые клетки представляют собой стволовые клетки человека или не являющегося человеком млекопитающего.
[0116] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста эмбрионов. В соответствии с одним вариантом реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для созревания и развития эмбрионов. Согласно другому варианту реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать развитие эмбрионов. В соответствии с одним вариантом реализации указанные эмбрионы представляют собой эмбрионы человека. Согласно другому варианту реализации указанные эмбрионы представляют собой эмбрионы не являющегося человеком млекопитающего.
[0117] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста гамет. В соответствии с одним вариантом реализации клеточная культуральная среда согласно настоящему изобретению подходит для созревания или сохранения гаметы. Согласно другому варианту реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать созревание или сохранение гамет, например, созревание или сохранение спермы или ооцитов.
[0118] Согласно другому варианту реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать криоконсервацию эмбрионов или гамет, согласно описанию выше в тексте настоящего документа.
[0119] Согласно некоторым вариантам реализации улучшение созревания спермы выбрана из улучшения подвижности спермы, улучшения поступательная подвижности сперматозоидов, увеличения численности сперматозоидов, и любой их комбинации. В соответствии с одним вариантом реализации указанная сперма представляет собой сперму человека. Согласно другому варианту реализации указанная сперма представляет собой сперму не являющегося человеком млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста культуры органа или органа. Согласно некоторым вариантам реализации указанная ткань органа или указанный орган выбран из яичника, роговицы, сердца, почки, поджелудочной железы, печени, селезенки, легкого, яичка, мочевого пузыря и везикул крови. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная ткань органа или орган представляет собой яичник.
[0120] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста клеток растений или насекомых.
[0121] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста клеток животных, растений или насекомых, и представляющей собой естественную среду, выбранную из биологических жидкостей, экстрактов тканей и сгустков; или искусственную среду, выбранную из сбалансированного раствора солей, базальной среды и сложной среды.
[0122] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной среды, выбранной из DMEM, RPMI 1640, MEM, IMDM, среды L-15 (среды Лейбовица), среды MCDB, среды 199, Opti-MEM и DMEM/F-12, среды Шнайдера для клеток дрозофилы, среды для клеток насекомых Грейса, IPL-41, среды для клеток насекомых Sf-900, бессывороточной среды для клеток насекомых, среды для клеток насекомых Шейлдса и Санга МЗ, среды для клеток насекомых ТС-100, среды для клеток насекомых TNM-FH, Хэма F-12, Хэма F-10, GMEM, среды Эймса, базальной среды Игла (ВМЕ), среды Клейкомба, среды Клика, минимальной эссенциальной среды в модификации Глазго (GMEM), среды MegaCell, модифицированной среды Маккоя 5А, среды NCTC, среды Е Уильяма, среды Веймаута, ТС-10 и среды IPL-10. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной среды, выбранной из сред для монокультур, таких как одностадийная среда Quinn's Advantage™ (SAGE) 1-Step™, сред для последовательного культивирования, таких как Quinn's Advantage™, сред для последовательного культивирования (ORIGIO), MEDICULT, универсальной среды IVM, DMEM, RPMI 1640, MEM, IMDM, Opti-MEM, GMEM, среды Хэма F-, DMEM/F-12, среды Шнайдера для клеток дрозофилы, среды для клеток насекомых Грейса, Sf-900, ТС-10, IPL-10, В5, N6 и среды Нича. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной среды, выбранной из сред для спермы, сред для созревания спермы, таких как ISolate, PureCeption™, универсальной рабочей среды Multipurpose Handling Medium (МНМ), среды для промывания спермы Quinns™, Multipurpose Handling Medium (МНМ) и модифицированной среды HTF с гентамицином, среды для оплодотворения, среды для развития эмбриона и среды для созревания, манипуляций и/или криоконсервации эмбрионов и/или гамет.
[0123] В соответствии с указанными вариантами реализации АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать рост культуры клеток, культуры ткани или культуры органа при добавлении в клеточную культуральную среду.
[0124] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточных культуральных сред, подходящих для роста одноклеточных эукариот.В соответствии с одним из вариантов реализации указанные одноклеточные эукариоты представляют собой дрожжи, такие как Saccharomyces, более конкретно - Saccharomyces cerevisiae. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для среды YPD, YPG или YPAD.
[0125] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста прокариот, например, бактерий. Согласно некоторым вариантам реализации указанные бактерии представляют собой Е. coli или пробиотические бактерии, такие как бактерии родов Bifidobacterium и Lactobacillus. В соответствии с одним из вариантов реализации стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки в среды LB и М9.
[0126] В соответствии с указанными вариантами реализации АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать рост указанных дрожжей или указанных бактерий при добавлении в клеточную культуральную среду.
[0127] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК предназначен для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста архей.
[0128] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор выбран из группы, состоящей из полифосфата, такого как трифосфат, фосфорилированной аминокислоты, такой как фосфосерин, бисфосфоната, лимонной кислоты, и любой их комбинации, такой как комбинация трифосфата и лимонной кислоты, или комбинация фосфосерина и лимонной кислоты.
[0129] Согласно некоторым вариантам реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды остается стабильным в аморфной фазе в сухой форме на протяжении периода, составляющего по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, или по меньшей мере одного года. Согласно другим вариантам реализации указанный стабилизированный АКК остается стабильным в аморфной фазе при диспергировании в клеточной культуральной среде на протяжении по меньшей мере одного часа, на протяжении периода, составляющего по меньшей мере 4, 6, 8, 12 или 24 часов, по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере одного месяца.
[0130] В соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды может быть введен в состав твердой, жидкой или полужидкой формы. Согласно некоторым вариантам реализации стабилизированный АКК для применения согласно настоящему изобретению вводят в состав твердой формы, например порошка, таблеток, капсул или гранул. Согласно одному конкретному варианту реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки вводят в состав порошка. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки вводят в состав жидкой или полужидкой формы. В соответствии с одним вариантом реализации указанная жидкая форма представляет собой суспензию или эмульсию, а полужидкая форма представляет собой гель или вязкую суспензию, такую как коллоидные суспензии. Согласно одному специфическому варианту реализации указанный стабилизированный АКК вводят в состав суспензии. Соответственно, согласно одному варианту реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды добавляют в клеточную культуральную среду либо при получении клеточной культуральной среды, либо перед применением указанной среды, в виде порошка или суспензии. В соответствии с одним еще более конкретным вариантом реализации стабилизированный АКК добавляют в виде свежеприготовленной суспензии.
[0131] В соответствии с одним вариантом реализации средний диаметр первичных частиц стабилизированного АКК составляет от приблизительно 10 нм до приблизительно 5 мкм. Согласно другому варианту реализации средний диаметр первичных частиц АКК составляет от приблизительно 30 нм до приблизительно 400 нм. В соответствии с еще одним вариантом реализации средний диаметр первичных частиц АКК составляет от приблизительно 30 нм до 350 нм.
[0132] В соответствии с определенными вариантами реализации средний диаметр первичных частиц АКК составляет от приблизительно 35 нм до 300 нм, от 40 нм до приблизительно 250 нм, от приблизительно 45 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 150 нм; или от приблизительно 60 нм до приблизительно 100 нм. В соответствии с еще одним вариантом реализации первичные частицы АКК агрегированы, и средний диаметр указанных агрегатов составляет от 0,5 мкм до 300 мкм. В соответствии с одним дополнительным вариантом реализации диаметр агрегатов первичных частиц АКК составляет от приблизительно 1 до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкм; или от приблизительно 20 до приблизительно 40 мкм. Согласно другому варианту реализации средний диаметр агрегатов первичных частиц АКК составляет от 1 мкм до 10 мкм.
[0133] В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды добавляют в клеточную культуральную среду в конечной концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 2 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 3 мМ до приблизительно 6 мМ; или от приблизительно 4 мМ до приблизительно 5 мМ. Согласно более конкретному варианту реализации стабилизированный АКК присутствует в концентрации, составляющей от 0,5 до приблизительно 4 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 3 мМ, от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5; или приблизительно 1, 1,5, 2 или 2,5 мМ.
[0134] В соответствии с некоторыми более специфическими вариантами реализации в настоящем изобретении предложен АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, выбранным из полифосфата, такого как органический полифосфат, фосфорилированной аминокислоты, бисфосфоната, органической кислоты и любой их комбинации, для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, подходящей для роста (i) культур мышечных, нервных или костных клеток или тканей, (ii) эмбрионов человека или не являющегося человеком млекопитающего, (iii) стволовых клеток, (iv) гамет или (v) яичников. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой фосфосерин. Согласно другому варианту реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой трифосфат. В соответствии с еще одним вариантом реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой комбинацию фосфосерина с органической кислотой, такой как лимонная кислота. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой комбинацию трифосфата, такого как трифосфат натрия, с органической кислотой, такой как лимонная кислота. В соответствии с одним вариантом реализации такая клеточная культуральная среда подходит для роста культуры мышечных, нервных или костных клеток или тканей. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК для добавления в указанную клеточную культуральную среду способен улучшать рост, например, пролиферацию, развитие, созревание или дифференцировку клеток. В соответствии с одним вариантом реализации указанные клетки представляют собой нервные клетки и, более конкретно, пораженные нервные клетки. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать регенерацию пораженных нервных клеток. Согласно другому варианту реализации указанные клетки представляют собой мышечные клетки, в частности, дистрофические мышечные клетки, такие как клетки, пораженные мышечной дистрофией Дюшенна. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать образование мышечных трубочек и/или появление сократительной способности мышечных клеток. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать развитие эмбрионов человека. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать созревание или сохранение гаметы, и, в частности, сперматозоидов. Согласно другому варианту реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать криоконсервацию эмбрионов или гамет, согласно описанию выше в тексте настоящего документа. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды способен улучшать подвижность спермы, улучшать поступательную подвижность сперматозоидов, увеличивать численность сперматозоидов, и обеспечивать любую их комбинацию. В соответствии с дополнительным вариантом реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки способен улучшать рост, например, пролиферацию, экспансию и/или дифференцировку, стволовых клеток, и, в частности, стволовых клеток человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанные стволовые клетки выбраны из эмбриональных, хорионических, амниотических, гематопоэтических, мезенхимальных, нервных, глиальных стволовых клеток, стволовых клеток взрослых и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать показатели роста, например, пролиферацию, созревание, развитие или дифференцировку клеток приблизительно на 10% - приблизительно на 600%, приблизительно 20% - приблизительно на 500%, приблизительно на 30% -приблизительно на 400%, приблизительно на 40% - приблизительно на 300%, приблизительно на 50 - приблизительно на 200, приблизительно на 60% - приблизительно на 150%; или приблизительно на 70% - приблизительно на 100%. Согласно некоторым вариантам реализации происходит улучшение указанных показателей роста приблизительно на 100% -приблизительно на 500%, приблизительно на 120% - приблизительно на 400%, приблизительно на 150% - приблизительно на 300%.
[0135] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для среды для дробления, для монокультур или для последовательного культивирования, отличающийся тем, что стабилизирующий агент представляет собой фосфосерин или трифосфат натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, и тем, что указанный стабилизированный АКК способен улучшать развитие эмбрионов человека.
[0136] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, отличающийся тем, что указанный агент представляет собой фосфосерин, этидроновую кислоту или трифосфат натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, и тем, что указанный стабилизированный АКК способен улучшать регенерацию нервных клеток.
[0137] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для DMEM/F12 или DMEM/F12, необязательно с добавлением сыворотки лошади (ЛС), L-глутамина, гентамицина и инсулина, отличающийся тем, что стабилизирующий агент выбран из фосфосерина, этидроновой кислоты или трифосфата натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, и при этом указанный стабилизированный АКК способен улучшать образование мышечных трубочек и/или появление сократительной способности в скелетной мышечной клетке, например, в случае мышечной дистрофии Дюшенна.
[0138] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен АКК, стабилизированный фосфосерином, этидроновой кислотой или трифосфатом натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды, и таким образом способный улучшать дифференцировку стволовых клеток, в частности, дифференцировку МВА13 в остеобласты.
[0139] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен АКК, стабилизированный фосфосерином, этидроновой кислотой или трифосфатом натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, для применения в качестве добавки для сред для разделения, промывания или созревания спермы, таких как ISolate, PureCeption™, Multipurpose Handling Medium (МНМ), среды для промывания спермы Quinns™, универсальная рабочая среда Multipurpose Handling Medium (МНМ), модифицированная среда HTF с гентамицином; и таким образом способный улучшать созревание сперматозоидов, например, улучшение подвижности спермы, улучшение поступательной подвижности сперматозоидов, увеличение численности сперматозоидов и любую комбинацию перечисленного.
[0140] В настоящем изобретении предложен АКК, стабилизированный фосфосерином, этидроновой кислотой или трифосфатом натрия, необязательно в комбинации с лимонной кислотой, для применения в качестве добавки для среды, такой как DMEM/F12 или DMEM/F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 2 мМ глутамином, 25 мкг/мл гентамицина и 0,3-0,5% геля NVR-Gel, с улучшением, за счет этого, сохранения яичников.
[0141] Согласно некоторым вариантам реализации конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточных культуральных средах составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, или от приблизительно 2 до приблизительно 4 мМ.
[0142] В соответствии с еще одним аспектом в настоящем изобретении предложена добавка для клеточной культуральной среды, содержащая аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом.
[0143] В соответствии с одним вариантом реализации указанной содержащей стабилизированный АКК добавки для клеточной культуральной среды указанный стабилизированный АКК добавляют в среду при получении указанной среды. Согласно другому варианту реализации указанную добавку добавляют в среду перед применением.
[0144] Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды представляет собой твердую добавку. В соответствии с другими вариантами реализации указанная добавка представляет собой жидкую или полужидкую добавку.
[0145] В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации указанный АКК стабилизирован по меньшей мере одним стабилизирующим агентом согласно определению выше в тексте настоящего документа. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор выбран из группы, состоящей из полифосфата, такого как трифосфат, фосфорилированной аминокислоты, такой как фосфосерин, бисфосфоната, лимонной кислоты, и любой их комбинации, такой как комбинация трифосфата и лимонной кислоты, или комбинации фосфосерина и лимонной кислоты.
[0146] Добавка для клеточной культуральной среды согласно настоящему изобретению, содержащая стабилизированный АКК, может быть добавлена в любую клеточную культуральную среду, описанную выше в тексте настоящего документа. Согласно одному варианту реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды, содержащая стабилизированный АКК, может быть добавлена в клеточную культуральную среду, подходящую для культивирования биологической культуры, например, культуры клеток, культуры тканей, культуры органа; или органов. Указанные клетки могут быть эукариотическими или прокариотическими. В частности, клеточная культуральная среда относится к среде, подходящей для роста культуры эукариотических клеток, тканей или органа. Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура клеток представляет собой суспензионную или адгезивную культуру клеток. Согласно некоторым конкретным вариантам реализации указанная среда может представлять собой полную среду, базальную среду, базальную среду с добавками для клеточной культуральной среды, среду с различными количествами сыворотки или среду с химически определенным составом.
[0147] В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды, содержащая стабилизированный АКК, способна улучшать рост клеток или тканей. Соответственно, согласно одному варианту реализации добавка для клеточной культуральной среды, содержащая стабилизированный АКК, способна улучшать пролиферацию, созревание, размножение, регенерацию, развитие и/или дифференцировку клеток, тканей и органов. В соответствии с одним вариантом реализации указанная добавка способна улучшать дифференцировку стволовых клеток. Согласно другому варианту реализации указанная добавка способна улучшать пролиферацию культуры клеток. В соответствии с еще одним вариантом реализации добавка способна улучшать созревание и/или развитие клеток или тканей. В соответствии с определенными вариантами реализации указанная добавка способна улучшать регенерацию клетки. Согласно некоторым вариантам реализации указанные клетки представляют собой эукариотические клетки. В соответствии с одним из вариантов реализации указанные эукариотические клетки представляет собой клетки животных, растений и насекомых. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная культура клеток животных выбрана из культуры клеток, культуры тканей, культуры органов, стволовых клеток, гамет, эмбрионов и органа человека или не являющегося человеком млекопитающего. В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанное млекопитающее представляет собой человека, и культура клеток человека выбрана из культуры клеток, культуры тканей и культуры органа человека. В соответствии с другими вариантами реализации указанное млекопитающее представляет собой не являющееся человеком млекопитающее. Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура клеток, представляющая собой либо культуру клеток человека, либо культуру клеток не являющегося человеком млекопитающего, выбрана из культуры клеток нервных, мышечных, эпителиальных, костных, жировых, стволовых клеток, гамет и клеток крови. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать показатели роста, например, пролиферацию, созревание, развитие или дифференцировку клеток, приблизительно на 10% - приблизительно на 600%, приблизительно 20% - приблизительно на 500%, приблизительно 30% - приблизительно на 400%, приблизительно 40% - приблизительно на 300%, приблизительно на 50 - приблизительно на 200, приблизительно на 60% - приблизительно на 150%; или приблизительно на 70% - приблизительно на 100%. Согласно некоторым вариантам реализации происходит улучшение указанных показателей роста приблизительно на 100% - приблизительно на 500%, приблизительно 120% - приблизительно на 400%, приблизительно 150% - приблизительно на 300%.
[0148] Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды, содержащая стабилизированный АКК, может быть добавлена в клеточную культуральную среду, подходящую для роста дрожжей, и указанная клеточная культуральная среда выбрана из YPD, YPG и YPAD.
[0149] Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды, содержащая стабилизированный АКК, может быть добавлена в клеточную культуральную среду, подходящую для роста прокариот, причем указанная среда выбрана из LB и М9.
[0150] Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды, содержащая стабилизированный АКК, способна улучшать рост дрожжей и бактерий.
[0151] В соответствии с некоторыми более специфическими вариантами реализации в настоящем изобретении предложена добавка для клеточной культуральной среды, содержащая АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, отличающаяся тем, что указанный агент выбран из фосфорилированной аминокислоты, полифосфата, бисфосфоната, органической кислоты и любой их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанную добавку добавляют в клеточную культуральную среду, подходящую для роста (i) культур мышечных, нервных или костных клеток или тканей, (ii) эмбрионов человека или не являющегося человеком млекопитающего, (iii) стволовых клеток, (iv) гамет или (v) яичников. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой фосфосерин. Согласно другому варианту реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой трифосфат. В соответствии с еще одним вариантом реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой комбинацию фосфосерина с органической кислотой, такой как лимонная кислота. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанный стабилизирующий агент представляет собой комбинацию трифосфата, такого как трифосфат натрия, с органической кислотой, такой как лимонная кислота. В соответствии с более конкретным вариантом реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать рост, например, пролиферацию, дифференцировку, развитие или созревание клеток. В соответствии с одним вариантом реализации такая добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать регенерацию пораженных нервных клеток. Согласно другому варианту реализации такая добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать образование мышечных трубочек и/или содействовать появлению сократительной способности мышечных трубочек. В соответствии с дополнительным вариантом реализации такая добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать развитие эмбрионов, таких как эмбрионы человека. В соответствии с дополнительным вариантом реализации такая добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать созревание или сохранение гамет и в частности, сперматозоидов. В соответствии с одним конкретным вариантом реализации такая добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать криоконсервацию эмбрионов или гамет, согласно описанию выше в тексте настоящего документа. В соответствии с одним вариантом реализации такая клеточная культуральная среда подходит для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанные стволовые клетки выбраны из эмбриональных, гематопоэтических, мезенхимальных, нервных, глиальных стволовых клеток, стволовых клеток взрослых и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Согласно другому варианту реализации такая добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать дифференцировку стволовых клеток. В соответствии с одним конкретным вариантом реализации такая добавка для клеточной культуральной среды способна улучшать дифференцировку стволовых клеток, таких как МВА13, в остеобласты. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать показатели роста, например, пролиферацию, созревание, развитие или дифференцировку клеток, приблизительно на 10% - приблизительно на 600%, приблизительно на 20% - приблизительно на 500%, приблизительно на 30% -приблизительно на 400%, приблизительно на 40% - приблизительно на 300%, приблизительно на 50 - приблизительно на 200, приблизительно на 60% - приблизительно на 150%; или приблизительно на 70% - приблизительно на 100%. Согласно некоторым вариантам реализации происходит улучшение указанных показателей роста приблизительно на 100% -приблизительно на 500%, приблизительно на 120% - приблизительно на 400%, приблизительно 150% - приблизительно на 300%.
[0152] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена добавка для клеточной культуральной среды, содержащая АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, выбранным из фосфосерина, этидроновой кислоты или трифосфата натрия, необязательно, в комбинации с лимонной кислотой. В соответствии с одним вариантом реализации указанную добавку добавляют в среду для дробления, среду для монокультур или среду для последовательного культивирования, с улучшением, за счет этого, развития эмбрионов человека. В соответствии с одним вариантом реализации указанную добавку добавляют в среды для разделения, промывания или созревания спермы, такие как ISolate, PureCeption™, Multipurpose Handling Medium (МНМ), среды для промывания спермы Quinns™, Multipurpose Handling Medium (МНМ) или модифицированная среда HTF с гентамицином, с улучшением, за счет этого, созревания или сохранения гамет и в частности, сперматозоидов. Согласно другому варианту реализации такую добавку добавляют в клеточную культуральную среду, подходящую для роста нервных клеток, с улучшением, за счет этого, регенерации нервных клеток. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанную добавку добавляют в среду DMEM/F12 или среду DMEM/F12, в которую необязательно дополнительно добавлены сыворотка лошади (ЛС), L-глутамин, гентамицин и инсулин, с улучшением, за счет этого, образования мышечных трубочек в скелетной мышечной клетке, например, в случае мышечной дистрофии Дюшенна.
В соответствии с еще одним вариантом реализации указанную добавку добавляют в клеточную культуральную среду, подходящую для роста стволовых клеток, с улучшением, за счет этого, дифференцировки стволовых клеток, в частности, дифференцировки МВА13 в остеобласты. В соответствии с другими вариантами реализации указанную добавку добавляют в такую среду, как DMEM/F12 или DMEM/F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 2 мМ глутамином, 25 мкг/мл гентамицина и 0,3-0,5% геля NVR-Gel, с улучшением, за счет этого, сохранения яичников. Согласно некоторым вариантам реализации конечная концентрация стабилизированного АКК в клеточных культуральных средах составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мМ, или от приблизительно 2 до приблизительно 4 мМ.
[0153] В соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации термин «содержать» имеет значение «состоять из», соответственно, согласно такому варианту реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды состоит из АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизатором.
[0154] В соответствии с дополнительным аспектом в настоящем изобретении предложен аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, в виде состава для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды.
[0155] В соответствии с определенными аспектами в настоящем изобретении предложен способ улучшения роста биологической культуры, включающий воздействие на указанную культуру АКК, стабилизированным по меньшей мере одним стабилизатором. В соответствии с одним вариантом реализации указанная биологическая культура выбрана из клеток, ткани или органа эукариот и клеток прокариот.
[0156] В соответствии с другими вариантами реализации указанный способ включает улучшение роста, например, улучшение пролиферации, созревания, размножения, регенерации, дифференцировки и/или развития биологической культуры, такой как клетки, ткани и органы.
[0157] В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура клеток выбрана из культуры клеток животных, растений или насекомых. Согласно другому варианту реализации указанная культура ткани выбрана из культуры ткани животных, растений или насекомых. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная культура органа выбрана из культуры органа животных, растений или насекомых. Согласно некоторым вариантам реализации указанное животное представляет собой человека или не являющееся человеком млекопитающее. В соответствии с определенными вариантами реализации указанное не являющееся человеком млекопитающее выбрано из сельскохозяйственного животного, такого как крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, лошади, мулы, ослы, буйволы или верблюды; домашнего животного, например, кошки или собаки; грызуна, такого как мышь, крыса, морская свинка или хомяк; зайцеобразного, такого как кролик; и приматов, таких как обезьяна (например, макаки) или человекообразная обезьяна (например, шимпанзе).
[0158] Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура клеток млекопитающего, представляющая собой либо культуру клеток человека, либо культуру клеток не являющегося человеком млекопитающего, выбрана из культуры клеток нервных, мышечных, эпителиальных, костных, жировых, стволовых клеток, гамет и клеток крови. В соответствии с одним вариантом реализации указанная культура ткани выбрана из культуры эпителиальной, соединительной, мышечной и нервной ткани. В соответствии с некоторыми более конкретными вариантами реализации указанная культура ткани выбрана из культуры почечной, печеночной, железистой ткани, ткани головного мозга, кости, глаз и мышц. Согласно некоторым вариантам реализации указанная ткань органа или указанный орган выбраны из яичника, роговицы, сердца, почки, поджелудочной железы, печени, селезенки, легкого, яичка, мочевого пузыря и везикул крови. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная ткань органа или орган представляет собой яичник.
[0159] В соответствии с одним вариантом реализации в настоящем изобретении предложен способ улучшения роста мышечных клеток. В соответствии с другими вариантами реализации улучшение роста мышечных клеток включает улучшение образования мышечных трубочек. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает также уменьшение периода времени до начала спонтанной сократительной активности указанных мышечных трубочек. Период времени до начала спонтанной сократительной активности определен как время, необходимое миобластам для слияния и начала спонтанного сокращения. Согласно одному варианту реализации миоциты, образовавшиеся из указанных миобластов, выбраны из скелетных миоцитов или сердечных миоцитов. Согласно более конкретному варианту реализации миоциты представляют собой скелетные миоциты. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает улучшение образования мышечных трубочек и/или появления сократительной способности скелетной мышечной клетки, например, в случае мышечной дистрофии Дюшенна.
[0160] В соответствии с другими вариантами реализации указанный способ включает улучшение роста нервных клеток. Согласно одному варианту реализации улучшение роста нервных клеток включает улучшение и ускорение регенерации нервных клеток. Соответственно, согласно одному варианту реализации указанный способ включает улучшение повторного разрастания аксональных и дендритных нейронных волокон периферической и центральной нервной системы, и/или спраутинга из пораженных нейронных волокон.
[0161] Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает улучшение созревания или сохранения гаметы, например, улучшение in vitro созревания или сохранения сперматозоидов или ооцита. Согласно некоторым вариантам реализации указанная гамета выбрана из гаметы человека или гаметы не являющегося человеком млекопитающего. В соответствии с одним вариантом реализации указанная гамета представляет собой сперматозоид. Соответственно, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ улучшения созревания или улучшения качества спермы, включающий воздействие на указанную культуру АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизатором.
[0162] В соответствии с одним из вариантов реализации улучшение качества спермы выбрано из группы, состоящей из улучшения подвижности спермы, улучшения поступательной подвижности сперматозоидов, увеличения численности сперматозоидов и любой комбинации перечисленного.
[0163] Согласно некоторым вариантам реализации увеличение численности сперматозоидов включает увеличение численности сперматозоидов при процедуре оценки подвижности или поступательной подвижности. В соответствии с одним из вариантов реализации указанная процедура оценки подвижности или поступательной подвижности представляет собой процедуру флотации.
[0164] В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации сперма представляет собой сперму человека или не являющегося человеком млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации указанное не являющееся человеком млекопитающее выбрано из группы, состоящей из сельскохозяйственного животного, домашних животных, грызунов, диких животных и приматов.
[0165] Согласно одному варианту реализации указанное сельскохозяйственное животное выбрано из крупного рогатого скота, свиней, овец, коз, лошадей, мулов, ослов, буйволов и верблюдов. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанное домашнее животное представляет собой кошку или собаку, указанный грызун представляет собой крысу, мышь, морскую свинку или хомяка, указанное зайцеобразное представляет собой кролика, и указанный примат представляет собой обезьяну, такую как макаки, или эмбрион человекообразной обезьяны, такой как шимпанзе.
[0166] Согласно другому варианту реализации указанная сперма представляет собой сперму не являющегося млекопитающим животного. В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанное не являющееся млекопитающим животное выбрано из группы, состоящей из рыб, насекомых и птиц.
[0167] В соответствии с одним вариантом реализации указанная сперма представляет собой сперму человека. В соответствии с другими вариантами реализации указанный способ включает улучшение развития эмбриона in vitro.
[0168] Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает улучшение дифференцировки и/или пролиферации стволовых клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанные стволовые клетки выбраны из эмбриональных, хорионических, амниотических, гематопоэтических, мезенхимальных, нервных, глиальных стволовых клеток, стволовых клеток взрослых и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В соответствии с одним вариантом реализации указанный способ включает улучшение дифференцировки стволовых клеток, таких как МВА13, в остеобласты.
[0169] В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда с добавлением стабилизированного АКК способна улучшать показатели роста, например, пролиферацию, созревание, развитие или дифференцировку клеток, приблизительно на 10% - приблизительно на 600%, приблизительно на 20% - приблизительно на 500%, приблизительно на 30% - приблизительно на 400%, приблизительно на 40% - приблизительно на 300%, приблизительно на 50 - приблизительно на 200, приблизительно на 60% - приблизительно на 150%; или приблизительно на 70% - приблизительно на 100%. Согласно некоторым вариантам реализации происходит улучшение указанных показателей роста приблизительно на 100% - приблизительно на 500%, приблизительно на 120% - приблизительно на 400%, приблизительно на 150% - приблизительно на 300%.
[0170] Согласно некоторым вариантам реализации указанная культура клеток представляет собой культуру бактерий или дрожжей, соответственно, согласно таким вариантам реализации указанный способ включает улучшение роста дрожжей или бактерий. Согласно некоторым вариантам реализации указанные бактерии представлены Е. coli или пробиотическими бактериями, такими как бактерии родов Bifidobacterium и Lactobacillus.
[0171] В соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации воздействие на клетки АКК, стабилизированным по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, включает добавление указанного АКК в клеточную культуральную среду. Термины «воздействие на» и «приведение в контакт с» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к перемещению или переносу клеток в среду, содержащую представляющий интерес компонент, такой как стабилизированный АКК, или добавление указанного компонента, например, стабилизированного АКК, в среду, в которой выращивают или культивируют указанные клетки. Среды для клеток могут представлять собой любые известные в данной области техники среды. Согласно некоторым вариантам реализации указанные среды соответствуют определению выше в тексте настоящего документа. В соответствии с одним вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда выбрана из естественной среды и искусственной среды. Согласно некоторым вариантам реализации указанная естественная среда включает биологическую жидкость, выбранную из плазмы, сыворотки, лимфы, сыворотки пуповинной крови человека и амниотической жидкости. Согласно другому варианту реализации указанная естественная среда включает экстракты тканей, такие как экстракт печени, селезенки, опухолей, лейкоцитов и костного мозга, экстракт бычьего эмбриона и эмбрионов курицы. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная естественная среда включает коагулянты или сгустки плазмы. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда представляет собой искусственную среду с добавлением АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизирующим агентом. В соответствии с одним вариантом реализации указанная искусственная среда представляет собой сбалансированный раствор солей. Примерами сбалансированных растворов солей являются ФСБ, фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS), сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS), сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS), раствор Тироде Т6, среда Виттена (WM1), среда Пула Р1, среда Квина HTF и среда Гарднера G1. Согласно другому варианту реализации указанная искусственная среда представляет собой базальную среду. Согласно некоторым вариантам реализации указанная среда может содержать дополнительные добавки, как хорошо известно в данной области техники. В соответствии с одним вариантом реализации в указанную среду добавлена сыворотка, например, фетальная бычья сыворотка. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная искусственная среда представляет собой сложную среду. В соответствии с одним вариантом реализации указанная искусственная среда представляет собой бессывороточную среду. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная искусственная среда представляет собой среду с пониженным содержанием сыворотки. Согласно другому варианту реализации указанная искусственная среда представляет собой не содержащую белка среду.
[0172] В соответствии с одним вариантом реализации указанный способ включает добавление стабилизированного АКК в клеточную культуральную среду, выбранную из среды, DMEM, ЕМЕМ, RPMI 1640, базальной среды Игла (ВМЕ), среды Хэма F-10, среды Хэма F-12, DMEM/F-12, IMDM, Opti-MEM, GMEM, среды для клеток насекомых IPL-41, среды Шнайдера для клеток дрозофилы, среды для клеток насекомых Грейса, бессывороточной среды для клеток насекомых, Sf-900, ТС-10, среды для клеток насекомых Шейлдса и Санга МЗ, среды для клеток насекомых ТС-100, среды для клеток насекомых TNM-FH, IPL-10, сред для монокультур, таких как одностадийная среда Quinn's Advantage™ (SAGE) 1-Step™, или сред для последовательного культивирования, таких как среда для дробления Quinn's Advantage™, среды Мурасиге-Скуга (MS), В5, N6, среды Нича, среды NCTC, среды MegaCell, среды Клейкомба, среды Клика, среды L-15, среды 199, среды MCDB, среды Эймса, среды BGJb, среды Клика, среды CMRL-1066, модифицированной среды Маккоя 5А, среды NCTC, среды Свима S-77, среды Веймаута, среды Е Уильяма, сред для созревания in vitro, сред Менезо В2 и ВЗ, среды для бластоцист Бера, среды Гарднера G2, универсальной среды IVM (ORIGIO) и сред для последовательного культивирования для роста эмбрионов. В соответствии с одним вариантом реализации указанный способ включает добавление стабилизированного АКК в клеточную культуральную среду, выбранную из сред для разделения спермы, сред для промывания спермы и сред для созревания, таких как ISolate, PureCeption™, среды Multipurpose Handling Medium (МНМ), среды для промывания спермы Quinns™, Multipurpose Handling Medium (МНМ). модифицированной среды HTF с гентамицином. В соответствии с одним вариантом реализации указанный способ включает добавление стабилизированного АКК в клеточную культуральную среду, выбранную из среды для оплодотворения, среды для развития эмбриона или среды для созревания, манипуляций и/или криоконсервации эмбрионов и/или гамет.
[0173] Согласно некоторым вариантам реализации указанные клетки культивируют в виде стационарных или иммобилизированных культур на носителе, таком как цитодекс 1 или 3, цитопор 2, полистирол, желатин, декстран, полиакриламид или другие эквивалентные носители.
[0174] Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для роста одноклеточных эукариот. В соответствии с одним из вариантов реализации указанные одноклеточные эукариоты представляют собой дрожжи, такие как Saccharomyces, более конкретно - Saccharomyces cerevisiae. В соответствии с одним вариантом реализации указанный способ включает добавление стабилизированного АКК в клеточную культуральную среду, подходящую для роста одноклеточных эукариот, например, Saccharomyces cerevisiae, при этом указанная клеточная культуральная среда выбрана из дрожжевого экстракта с пептоном и декстрозой (YPD), дрожжевого экстракта с пептоном и глицерином (YPG) и экстракта дрожжей с пептоном и декстрозой (YPAD).
[0175] В соответствии с некоторыми вариантами реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для роста прокариот, например, бактерии Е. coli или пробиотических бактерий, таких как бактерии родов Bifidobacterium и Lactobacillus. В соответствии с одним вариантом реализации указанный способ включает добавление стабилизированного АКК в среду, которая подходит для роста бактерий, такую как LB или М9.
[0176] В соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации стабилизированный АКК добавляют в клеточную культуральную среду. В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации конечная концентрация составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 2 до приблизительно 8 мМ, от приблизительно 3 мМ до приблизительно 6 мМ; или от приблизительно 4 мМ до приблизительно 5 мМ. Согласно более конкретному варианту реализации стабилизированный АКК присутствует в концентрации, составляющей от 0,5 до приблизительно 4 мМ, от приблизительно 1 до приблизительно 3 мМ, от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5, или приблизительно 1, 1,5, 2 или 2,5 мМ.
[0177] В соответствии с одним вариантом реализации АКК вводят в состав твердой, жидкой или полужидкой формы. Согласно одному конкретному варианту реализации стабилизированный АКК добавляют в форме суспензии. Согласно еще одному варианту реализации указанная суспензия представляет собой свежеприготовленную суспензию.
[0178] В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации АКК стабилизирован по меньшей мере одним стабилизирующим агентом, описанным выше в тексте настоящего документа. Согласно некоторым вариантам реализации АКК стабилизирующий агент представляет собой, независимым образом в каждом случае, органическую кислоту; фосфорилированное, фосфонированное, сульфатированное или сульфонированное органическое соединение; фосфорный или серный сложный эфир гидроксикарбоновой кислоты; органоаминное соединение; органическое соединение, содержащее гидроксил; фосфороорганическое соединение или его соль; фосфорилированные аминокислоты и их производные, бисфосфонат; фосфороорганическое соединение; органофосфонатное соединение; органический полифосфат, неорганический полифосфат, неорганическую фосфористую кислоту, органическое соединение, содержащее несколько функциональных групп согласно определению выше; неорганическое фосфатное и полифосфатное соединение; органическое соединение, содержащее полифосфатную цепь; органическое поверхностно-активное вещество; имеющий существенное биологическое значение неорганический ион; сахариды и их производные, белки, фосфорилированные белки, естественные и синтетические биополимеры и их производные, или любую их комбинацию. Согласно другому варианту реализации указанный стабилизирующий агент выбран из группы, состоящей из фосфосерина, аденозинтрифосфата, аденозиндифосфата, фитиновой кислоты, лимонной кислоты, этидроновой кислоты, пирофосфата, полифосфата, трифосфата, этанола, гексаметафосфата, хитина и любой их комбинации. Указанное соединение соответствует определению выше в тексте настоящего документа. Согласно некоторым вариантам реализации АКК стабилизирован более чем одним стабилизирующим агентом, например, 2 или 3 стабилизирующими агентами.
[0179] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор выбран из группы, состоящей из полифосфата, такого как трифосфат, фосфорилированной аминокислоты, такой как фосфосерин, бисфосфоната, лимонной кислоты, и любой их комбинации, такой как комбинация трифосфата и лимонной кислоты или комбинация фосфосерина и лимонной кислоты.
[0180] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения клеточной культуральной среды, содержащей аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, включающий добавление стабилизированного АКК в клеточную культуральную среду.
[0181] В соответствии с определенными аспектами в настоящем изобретении предложен набор, содержащий аморфный карбонат кальция (АКК), стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, и инструкцию для применения указанного АКК в комбинации с клеточной культуральной средой. В соответствии с одним вариантом реализации указанный стабилизированный АКК представляет собой АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды. В соответствии с одним вариантом реализации в настоящем изобретении предложен набор, содержащий хлорид кальция, карбонат натрия, по меньшей мере один стабилизирующий агент и инструкцию для получения стабилизированного АКК из указанных хлорида кальция, карбоната натрия, по меньшей мере одного стабилизирующего агента, и инструкцию для применения указанного стабилизированного АКК в комбинации с клеточной культуральной средой. В соответствии с одним вариантом реализации хлорид кальция, карбонат натрия и/или по меньшей мере один стабилизирующий агент находятся в виде водного раствора.
[0182] Согласно другому варианту реализации указанный набор содержит добавку для клеточной культуральной среды, содержащую АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, и инструкции для применения указанной добавки в комбинации с клеточной культуральной средой. В соответствии с одним вариантом реализации указанная добавка для клеточной культуральной среды состоит из АКК, стабилизированного по меньшей мере одним стабилизатором.
[0183] В соответствии с любым из вышеперечисленных вариантов реализации указанный набор дополнительно содержит клеточную культуральную среду, согласно определению выше в тексте настоящего документа. Соответственно, согласно одному варианту реализации указанный набор содержит АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, клеточную культуральную среду и инструкции для применения. Согласно другим вариантам реализации указанный набор содержит добавку для культуральной среды, содержащую АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, среду и инструкции для применения.
[0184] АКК, стабилизированный по меньшей мере одним стабилизатором, и клеточная культуральная среда соответствуют описанию выше в тексте настоящего документа.
[0185] Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизатор выбран из группы, состоящей из полифосфата, такого как трифосфат, фосфорилированной аминокислоты, такой как фосфосерин, бисфосфоната, лимонной кислоты; и любой их комбинации, такой как комбинация трифосфата и лимонной кислоты или комбинация фосфосерина и лимонной кислоты.
[0186] Согласно некоторым вариантам реализации композиция с АКК содержит комбинацию стабилизаторов, описанных выше.
[0187] В соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации стабилизированный АКК может быть введен в твердый, жидкий или полужидкий состав. Соответственно, согласно одному варианту реализации указанный стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для клеточной культуральной среды введен в твердый, жидкий или полужидкий состав. Согласно некоторым вариантам реализации указанный стабилизированный АКК введен в состав твердой формы, такой как порошок, таблетки, капсулы или гранулы.
Соответственно, согласно одному конкретному варианту реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки для культуры клеток введен в состав порошка. В соответствии с другими вариантами реализации стабилизированный АКК для применения в качестве добавки введен в жидкий или полужидкий состав. В соответствии с одним вариантом реализации указанная жидкая форма представляет собой суспензию или эмульсию, а указанная полужидкая форма представляет собой гель или коллоид. Согласно одному специфическому варианту реализации указанный стабилизированный АКК введен в состав суспензии. Соответственно согласно одному варианту реализации указанный стабилизированный АКК, введенный в состав порошка или суспензии, добавляют в клеточную культуральную среду перед применением указанной среды. В соответствии с одним еще более специфическим вариантом реализации стабилизированный АКК добавляют в виде свежеприготовленной суспензии.
[0188] Набор согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать клеточную культуральную среду. Клеточные культуральные среды хорошо известны в данной области техники; может применяться любая среда. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для культивирования биологической культуры, при этом указанная культура выбрана из культуры клеток, культуры тканей, культуры органа; или органов. Культура клеток может представлять собой культуру эукариотических или прокариотических клеток. В частности, указанная клеточная культуральная среда относится к среде, подходящей для роста культуры эукариотических клеток, тканей или органов. Согласно некоторым конкретным вариантам реализации указанная среда может представлять собой полную среду, базальную среду, базальную среду с добавлением добавки для клеточной культуральной среды, среды с различными количествами сыворотки или среды с химически определенным составом.
[0189] Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда выбрана из DMEM, RPMI 1640, MEM, IMDM, среды L-15 (среды Лейбовица), среды MCDB, среды 199, Opti-MEM и DMEM/F-12, среды Шнайдера для клеток дрозофилы, среды для клеток насекомых Грейса, IPL-41, среды для клеток насекомых Sf-900, бессывороточной среды для клеток насекомых, среды для клеток насекомых Шейлдса и Санга М3, среды для клеток насекомых ТС-100, среды для клеток насекомых TNM-FH, Хэма F-12, Хэма F-10, GMEM, среды Эймса, базальной среды Игла (ВМЕ), среды Клейкомба, среды Клика, минимальной эссенциальной среды в модификации Глазго (GMEM), среды MegaCell, модифицированной среды Маккоя 5А, среды NCTC, среды Е Уильяма, среды Веймаута, ТС-10 и среды IPL-10.
Согласно одному конкретному варианту реализации указанная клеточная культуральная среда выбрана из сред для монокультур, таких как среда Quinn's Advantage™ (SAGE) 1-Step™, сред для последовательного культивирования, таких как среда для дробления Quinn's Advantage™, MEDICULT, универсальной среды IVM, DMEM, RPMI 1640, MEM, IMDM, Opti-MEM, GMEM, Хэма F-, DMEM/F-12, среды Шнайдера для клеток дрозофилы, среды для клеток насекомых Грейса, Sf-900, ТС-10, IPL-10, В5, N6 или среды Нича. Дополнительными примерами сред являются среды для разделения спермы, такие как ISolate, PureCeption™, Multipurpose Handling Medium (МНМ) и среды для промывания спермы, такие как среды для промывания спермы Quinns™, Multipurpose Handling Medium (МНМ) и модифицированная среда HTF с гентамицином - HEPES. Согласно другим вариантам реализации указанная среда представляет собой среду для созревания ооцитов, такую как среда для созревания in vitro SAGE™ (IVM) и среда для созревания ооцитов BO-IVM. В соответствии с дополнительным вариантом реализации указанная клеточная культуральная среда выбран из среды для оплодотворения, среды для развития эмбриона и среды для созревания, манипуляций и/или криоконсервации эмбрионов и/или гамет.
[0190] Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для роста дрожжей, и выбрана из YPD, YPG и YPAD.
[0191] Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточная культуральная среда подходит для роста прокариот, и выбрана из LB и М9.
[0192] В соответствии с одним вариантом реализации в настоящем изобретении предложен набор, содержащий хлорид кальция, карбонат натрия, по меньшей мере один стабилизирующий агент, инструкцию для получения стабилизированного АКК и инструкцию для применения указанного АКК в комбинации с клеточной культуральной средой. Согласно некоторым вариантам реализации хлорид кальция и карбонат натрия находятся в виде водных растворов. В соответствии с одним вариантом реализации по меньшей мере один стабилизирующий агент находится в виде одного или двух отдельных растворов. В соответствии с одним вариантом реализации указанные инструкции для получения АКК содержат инструкции для смешивания раствора, содержащего хлорид кальция и по меньшей мере один стабилизатор, с раствором карбоната натрия, и дальнейшего добавления раствора, содержащего по меньшей мере один стабилизирующий агент.
[0193] В соответствии с некоторыми вариантами реализации настоящего изобретения термины «способный к улучшения» и «улучшает», согласно некоторым вариантам реализации, используются взаимозаменяемо.
[0194] Согласно любому из вышеописанных вариантов реализации термин «содержащий» включает значение «состоящий из» и может быть им заменен.
[0195] Предполагается, что в настоящем документе термин «приблизительно» в отношении измеряемого значения, такого как количество, продолжительность периода времени и т.п., охватывает вариации, отклоняющиеся от указанного значения на +/-10%, или +/-5%, +/-1%, или даже +/-0,1%.
[0196] После ознакомления с представленным выше общим описанием настоящего изобретения, его лучшее понимание может быть достигнуто после обращения к представленным ниже примерам, приведенным для иллюстрации и не предназначенным для ограничения настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Эффекты АКК на совместные культуры СМ-ДКГ
[0197] Способы
[0198] Культуральная среда
[0199] Культуральная среда состояла из: 90% модифицированной по Дульбекко среды Игла / питательной смеси F-12 (DMEM-F12), истощенной по кальцию (среда без ионов кальция, (специальный состав), 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ глутамина, 25 мкг/мл гентамицина и 0,05 нг/мл инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) (все приобретены у Biological Industries, Израиль).
[0200] NVR-Gel в качестве субстрата для культивирования нейронов
6
[0201] Гель для реконструкции нервной и сосудистой ткани (NVR-Gel, разработка NVR Labs) состоит из двух основных компонентов: высокомолекулярная гиалуроновая кислота (ГК, 3×10 Да, BTG, Израиль) и ламинин (Sigma). Для культивирования нервных клеток 1% NVR-Gel разводили культуральной средой до конечной концентрации, составляющей 0,3-0,5%. Указанный гель имеет текстуру вязкой жидкости, обеспечивает легкую и успешную адгезию внедренных клеток или эксплантатов к пластиковой или стеклянной подложке, и трехмерное разрастание нервного волокна.
[0202] Получение культур нервной ткани
[0203] Все эксперименты были проведены и одобрены локальным этическим комитетом, признанным израильскими властями, для контроля экспериментов на животных. Стационарные органотипические культуры дорсальных корешковых ганглиев (ДКГ) и спинного мозга (СМ), а также культуры диссоциированных клеток головного мозга получали из плодов крысы (15 дней гестации, инбредные крысы линии Льюис, Harlan, Израиль). Непосредственно после препарирования получали небольшие фрагменты выделенных тканей на устройстве для получения срезов тканей Мак-Илвейна (толщиной 400 мкм). В указанных исследованиях использовали две стратегии культивирования тканей. Согласно первому способу срезы тканей высевали помещали непосредственно в 12-луночные культуральные планшеты, содержащие 1 мл культуральной среды, содержащей 0,3-0,5% геля NVR-Gel. Согласно второму способу срезы тканей дополнительно обрабатывали для диссоциации раствором трипсина-ЭДТК в течение 30 минут, и промывали культуральной средой. Затем диссоциированные клетки добавляли в суспензию порошка хитозана или порошка гастролита (микроносители, ХМ) и инкубировали в суспензии при 37°С в течение 4 дней. Затем образовавшиеся агрегаты флотирующих клеток с ХМ собирали и высевали в 12-луночные культуральные планшеты, содержащие 1 мл культуральной среды, содержащей 0,3-0,5% геля NVR-Gel.
2+
[0204] Источник дополнительного Са
2+
2
[0205] Источники Са (перечисленные ниже) в конечной концентрации, составляющей 1 или 2 мМ, однократно добавляли в гель на стадии посева, а затем добавляли в питательную среду при каждой следующей подкормке. Использовали следующие источники кальция: АКК-этидроновая кислота (АКК-ЭТ) (свежая суспензия); АКК-фосфосерин (АКК-ФС) (свежая суспензия); гастролит (растворенный в 0,1 М HCl, а затем нейтрализованный 1М NaOH); порошок гастролита; ККК - водная суспензия кристаллического карбоната кальция (коммерческий порошок наночастиц); и раствор CaCl - контроль.
[0206] Мониторинг культур осуществляли с применением фазово-контрастной микроскопии ежедневно, с момента через 24 часа после начала культивирования и далее.
[0207] Суспензии свежих составов с АКК состояли из частиц, образующих стабильную суспензию. Гастролит представляет собой естественный АКК, выделяемый из крабов, и может быть приобретен только в виде сухого порошка. В указанной форме другие его характерные компоненты (такие как ионы кальция и белки) недоступны для клеток. Для увеличения их биодоступности порошок гастролита растворяли в 0,1 М HCl (имитирующей кислотность, существующую в желудке), а затем нейтрализовали 1М NaOH.
[0208] Иммунофлуоресиентное окрашивание культур нейронов
[0209] После удаления культуральной среды культуры дорсальных корешковых ганглиев (ДКГ) промывали забуференным фосфатом солевым раствором (ФСБ) и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 минут, после чего повторно промывали ФСБ. Фиксированные клетки пермеабилизировали с применением 0,1% Triton Х-100 в ФСБ, а затем иммуноблокировали (чтобы избежать неспецифического окрашивания) 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в ФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем образцы инкубировали с антителами кролика против нейрофиламентов (NF, Novus Biologicals, 1:500) для визуализации разрастания нейритов. Первичные антитела разводили в 0,1% БСА и 0,05% Tween-20 в ФСБ (буфер для разведения) и инкубировали с образцами в течение ночи при 4°С. После промывания 0,05% Tween-20 в ФСБ (промывочный буфер) образцы ДКГ инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с конъюгированными с Alexa-Fluor-594 вторичными антителами осла против IgG кролика (Jackson ImmunoResearch, США, 1:800 в буфере для разведения). Наконец, указанные образцы повторно промывали промывочным буфером, и заливали заливочной средой (Immco Diagnostic, США). Все изображения наблюдали с применением микроскопа Olympus IX70.
[0210] Результаты
2
2
2+
[0211] Изучали эффект различных составов с кальцием на совместные культуры СМ-ДКГ. В целом, указанные культуры содержали срезы СМ толщиной 400 мкм с прикрепленными или отделенными срезами ДКГ. Можно сказать, что все изученные составы с АКК (АКК-ЭТ, АКК-ФС и гастролит) значимо улучшали регенерацию нейронных волокон по сравнению с ККК и CaCl. В таблице 1 представлена часть эксплантатов (из 6), которые демонстрировали спраутинг нервных волокон через 4 дня культивирования в присутствии различных составов с кальцием (концентрация Са=2 мМ) или в присутствии стабилизаторов по отдельности (стабилизатор (приготовленный из 5% стокового раствора) добавляли в концентрации 0,05% в каждую лунку). Видно, что наиболее интенсивный спраутинг наблюдался в культурах, на которые воздействовали АКК-ЭТ (100% эксплантатов), за ними следовали культуры, обработанные АКК-ФС и гастролитом (66,6% эксплантатов). ККК и CaCl индуцировали спраутинг нейронов только у 50% эксплантатов, а стабилизаторы по отдельности - даже у меньшего процента (0-33%). Во время стабилизации культур (после первой недели культивирования) регенерировавшие нервные волокна удлинялись, утолщались и разветвлялись вплоть до образования нейронных сетей, в основном в культурах, на которые воздействовали различными составами с АКК (фиг. 1).
[0212]
Пример 2. Эффекты АКК на культуры головного мозга
[0213] Исследовали эффект АКК на культуры агрегатов клеток головного мозга и ХМ, высаженных в гель через 4 дня в суспензии (см. часть примера 1, посвященную способам). Результаты представлены на фиг. 2 и показывают, что АКК улучшал регенерацию нервных волокон в значимо большей степени, чем хлорид кальция. Это заметно, в частности, при сравнении числа и длины нервных волокон при применении двух вариантов обработки.
Пример 3 - Эффекты составов АКК на здоровые клетки скелетных мышц
[0214] Способы
[0215] Получение культур скелетных мыши
5
[0216] Стационарные культуры скелетных мышц получали от здоровых новорожденных крыс возрастом 1 день (Спрег-Доули, Harlan, Израиль). Мышечную ткань вырезали из задних конечностей и тщательно измельчали. Проводили расщепление трипсином-ЭДТК, аккуратно перетирая. Через 30 минут собирали супернатант, содержащий диссоциированные клетки, и добавляли свежую смесь трипсин-ЭДТК. Указанную процедуру повторяли два или более раз. Затем все супернатанты объединяли, центрифугировали и ресуспендировали клеточный осадок в среде для пролиферации. Клетки высевали в покрытые желатином 12-луночные культуральные планшеты в количестве 1×10 клеток/лунку, каждая из которых содержала 1 мл среды для пролиферации. Через два дня среду заменяли на среду для слияния, которую затем заменяли два раза в неделю. Мониторинг культур осуществляли с применением фазово-контрастной микроскопии ежедневно, с момента через 24 часа после начала культивирования и далее. В заранее заданные дни культуры фиксировали в метаноле в течение 20 минут и затем окрашивали по Гимза для оценки числа мышечных трубочек, образовавшихся со временем в культурах.
[0217] Культуральные планшеты, покрытые желатином
[0218] Стоковый 1% раствор свиного желатина в воде стерилизовали автоклавированием. После охлаждения 500 мкл указанного раствора добавляли в каждую лунку 12-луночного культурального планшета. После инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре удаляли избыток раствора и высевали клетки.
[0219] Среда для пролиферации
2+
[0220] Для стадии пролиферации клетки культивировали в DMEM/F12 (содержащей 1 мМ Са) с 10% ФБС, 25 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глутамином.
[0221] Среда для слияния
[0222] Для стадии слияния среду для пролиферации заменяли на среду для слияния, которую получали следующим образом: DMEM/F12 (содержащую 1 мМ Са2+), 2% сыворотки лошади (ЛС), 2 мМ L-глутамин, 25 мкл/мл гентамицина и 4 единицы/100 мл инсулина (все приобретены у Biological Industries, Израиль).
[0223] Перечень протестированных составов с кальцием
2+
2+
[0224] Среду для слияния обогащали различными составами с кальцием, перечисленными в таблице 2, при концентрации Са, составляющей 1 мМ (поскольку указанная среда уже содержала 1 мМ ионы кальция, конечная концентрация Са составляла 2 мМ). Контрольные культуры культивировали без дополнительного добавления кальция, или использовали культуры, обогащенные свободным (растворимым) стабилизатором. Эксперимент маскировали путем маркировки различных составов с кальцием исключительно произвольными номерами.
[0225] Указанные компоненты добавляли одним из следующих способов: (i) использовали водные суспензии сухого материала; (ii) использовали водную суспензию свежего материала (до высушивания); или (iii) растворяли в HCl (для имитации кислотности, существующей в желудке. После завершения растворения полученные растворы нейтрализовали 1М NaOH).
[0226] Результаты
[0227] Эффект сухого АКК на здоровые скелетные мышиы
2+
2
2
[0228] На первой стадии использовали сухой порошок АКК. Указанный порошок (представленный в таблице 2 со стабилизаторами, используемыми при приготовлении) суспендировали в воде, а затем добавляли в культуральные среды в концентрации 1 мМ. Поскольку указанная среда уже содержала 1 мМ ионов кальция, конечная концентрация Са составляла 2 мМ. Результаты, некоторые из которых показаны на фиг. 3 (слева), показали, что в культурах, на которые воздействовали АКК, наблюдалось раннее образование множества мышечных трубочек уже в первые 4 дня культивирования, без значимых различий при применении разных составов АКК. В контрольных культурах, на которые воздействовали добавленным ККК или CaCl, образование мышечных трубочек наблюдалось позже. Через 7 дней в культурах, обработанных АКК, наблюдались многочисленные длинные утолщенные мышечные волокна, тогда как в культурах, обработанных ККК и CaCl, развивалось меньшее число более тонких и коротких мышечных волокон (фиг. 3; справа).
2
[0229] Также отмечено, что в культурах, на которые воздействовали составами с АКК, сокращения мышц наблюдались уже на 7 день после высевания, тогда как в культурах, на которые воздействовали добавленным ККК или CaCl, сокращения мышц возникали только через 10 дней или позже.
[0230] Из описанных выше полученных in vitro результатов было сделано заключение, что все составы с АКК улучшают образование мышечных трубочек и раннюю мышечную сократительную способность в культурах здоровых поперечнополосатых мышц.
Пример 4 - Оценка эффекта АКК на мышечные клетки линии с мышечной дистрофией Дюшенна - исследования in vitro
[02311 Способы
[0232] Получение клеток Mdx
[0233] Влияние разных составов с кальцием исследовали на клетках линии mdx (модель мышечной дистрофии Дюшенна), любезно предоставленных (почетным) профессором Научного института имени Вейцмана (Израиль) Давидом Яффе (David Yaffe).
4
2+
[0234] Клетки линии Mdx высевали в покрытый желатином 12-луночный культуральный планшет в количестве 3×10 клеток/лунку, каждая из которых содержала 1 мл среды для пролиферации. Через два дня (~66% конфлюэнтности) указанную среду заменяли на среду для слияния, которую заменяли два раза в неделю. Различные составы с кальцием по отдельности добавляли в указанную среду для слияния в соответствии с описанной в таблице 3 обработкой. Культуры обогащали различными составами с кальцием, при концентрации Са 1 мМ. Поскольку указанная среда уже содержала 1 мМ ионов кальция, конечная концентрация Са2+ составляла 2 мМ.
[0235] Мониторинг эффектов протестированных составов с кальцием на пролиферацию клеток, слияние с образованием мышечных трубочек и мышечные сокращения осуществляли ежедневно с применением фазово-контрастной микроскопии. В заранее заданные дни культуры фиксировали в метаноле в течение 20 минут и затем окрашивали по Гимза для оценки числа мышечных трубочек, образующихся со временем в культурах.
[0236] Анализ на креатинкиназу (КК) в культуре мышечной ткани
2+
[0237] В культурах мышечных клеток КК представляет собой индикатор образования мышечных трубочек, и увеличение уровня КК (в планшетах для культивирования тканей) прямо коррелирует с прогрессирующим образованием мышечных трубочек в культурах мышц. В заранее заданные дни клетки собирали из лунок с культурой (с применением резинового скребка) и держали в 1 мл ФСБ (без Са) при -70°С до анализа. Для измерения КК образцы клеток размораживали и физически лизировали с применением ультразвукового аппарата для высвобождения КК из мышечных трубочек в мышцах. Концентрацию КК определяли с применением набора для анализа активности креатинкиназы (набор с реагентом для определения креатинкиназы с N-ацетилцистеином (CK-NAC Reagent Set), Curtiss, Chem-Index Inc, Хайалиа, Флорида, США).
[0238] Результаты
2
[0239] Результаты описанных выше экспериментов представлены на фиг. 4 и 5. Как ясно видно, добавление АКК улучшало слияние клеток и образование мышечных трубочек лучше, чем добавление стандартного источника ионов кальция (CaCl). Указанный неожиданный результат был продемонстрирован как в биохимическом (активность КК), так и в морфологическом (микроскопическом) анализе (фиг. 4 и 5). Кроме того, в культурах, на которые воздействовали составами с АКК, сокращения мышц наблюдались уже на 7 день после высевания, тогда как в контроле они появлялись только через 10 дней или позже. Соответственно, было сделано заключение, что добавление АКК потенциально подходит для лечения пациентов с МДД.
Пример 5 - Эффект источников кальция на первичные клетки мышей mdx
[0240] Способы
[0241] Экстракция первичных клеток
[0242] Бедренные мышцы извлекали из задних конечностей новорожденных (возрастом 1 день) мышей mdx в стерильных условиях, и промывали в ФСБ для удаления избытка клеток крови. Мышцы измельчали с получением фрагментов небольшого размера. Для ферментативного расщепления фрагменты мышц помещали в мензурку, содержащую раствор трипсина-ЭДТК (0,25 мМ). Для обеспечения разделения клеток указанную смесь помещали на мешалку, работающую при комнатной температуре, и аккуратно перемешивали в течение 20 минут. Бульон собирали и центрифугировали при 300×g в течение 5 минут. Осадок ресуспендировали в DMEM, содержащем ФБС. Этапы трипсинизации повторяли в течение 3 или более циклов. Все супернатанты объединяли в одной пробирке. Разделение клеток определяли визуально (с применением фазово-контрастной микроскопии). Плотность клеток определяли с применением гемоцитометра.
5
2+
2+
[0243] Клетки высевали в 12-луночный планшет в концентрации 2×10 клеток/лунку. Использовали среду DMEM/F12 без Са с добавлением 15% ФБС, 2 мМ L-глутамином и гентамицином (25 мкг/мл). Кальций добавляли в среду отдельно в соответствии с описанной в таблице 4 обработкой. На 2 день (~ 66% конфлюэнтности) среду заменяли на среду для слияния (DMEM/F12 без Са с добавлением 10% ЛС, инсулина (4 единиц/100 мл) и гентамицина (25 мкг/мл)). Среду заменяли каждые 3 дня.
[0244] Качественный мониторинг пролиферации и слияния клеток проводили ежедневно. Культуры фиксировали на 2, 3, 4, 5 и 7 дни и окрашивали по Гимза, или с применением антитела к миозину.
[0245] Результаты
[0246] Результаты представлены на фиг. 6 и 7. Благоприятный эффект составов с АКК был продемонстрирован образованием мышечных трубочек, в частности, в ранние моменты времени, на 3 и 4 дни, по сравнению с контролем. Различия в образовании мышечных трубочек становились неразличимыми на 5 и 7 дни. Наблюдалась выраженная корреляция между окрашиванием по Гимза и окрашиванием на миозин.
Улучшение эмбрионального развития на средах с добавлением АКК
Пример 6.
[0247] Материалы и способы:
[0248] Самцов мышей СВА скрещивали с самками мышей BL С57. Мышей содержали в условиях 12-часового фотопериодического цикла с неограниченным доступом к воде и пищей. Приблизительно через 6-8 недель после получения потомства каждой самке мыши инъецировали в/б 5МЕ гонадотропина сыворотки жеребой кобылы (ГСЖК).
2
3
[0249] Через 48 часов каждой самке мыши инъецировали В/Б 5МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Затем проверенных на фертильность самцов размещали совместно с суперовулирующими самками. На следующее утро самок мышей исследовали на предмет наличия копулятивных пробок. Самок с копулятивными пробками умерщвляли через 24 часа (приблизительно через 36 часов после совокупления) и извлекали из маточных труб эмбрионы на стадии 2 клеток следующим образом: маточные трубы препарировали в среде для дробления Quinn's Advantage (SAGE, Origio, Дания) и эмбрионы переносили в капли объемом 20 мкл со средой для дробления Quinn's Advantage (SAGE, Origio, Дания), покрытые минеральным маслом, и культивировали при 37,0°С с 5% СО и атмосферным кислородом. Собранные эмбрионы продолжали расти, т.о., в культуре in vitro (IVC), до стадии бластоцисты/хетчинга. Для тестирования эффекта аморфного карбоната кальция в среду для дробления Quinn's Advantage («среда для дробления» здесь и далее в настоящем документе) добавляли разные добавки, т.е. аморфный карбонат кальция, стабилизированный полифосфатом (АКК-ПФ), кристаллическим карбонатом кальция (ККК), полифосфатом (ПФ), фосфосерином (ФС) или карбонатом натрия (NaCO). Все добавки добавляли в виде свежеприготовленной суспензии; добавки с АКК получали в асептических условиях. Необработанную среду для дробления (без каких-либо добавок) применяли в качестве контрольной (идентифицирована как Конт-Q). Эмбрионы оценивали ежедневно, проводя микроскопические наблюдения для детекции следующих этапов: 2 клетки, стадия компактизации, образование бластоцист и стадия хетчинга. Рассчитывали долю (в процентах) эмбрионов, достигающих каждой стадии (число эмбрионов на стадии 2 клеток принимали за 100%).
[0250] Результаты
[0251] Развитие эмбрионов на среде для дробления с добавлением 1,7 мМ аморфного карбоната кальция, стабилизированного ПФ (АКК-ПФ), сравнивали с контролем (Конт-Q - развитие в необработанной среде). Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (последнее значение приведено в круглых скобках) представлены в таблице 5.
Пример 7.
2
[0252] Развитие эмбриона в среде для дробления с добавлением 1,7 мМ либо АКК-ПФ, либо хлорида кальция (CaCl) тестировали в двух отдельных тестах (А и В). В тесте А эмбрионы культивировали до стадии бластоцисты, а в тесте В - до стадии хетчинга. Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (в круглых скобках) представлены в таблице 6 (тест А) или таблице 7 (тест В).
Пример 8.
2
[0253] Развитие эмбриона в среде для дробления с добавлением 1,7 мМ CaCl, 1,7 мМ АКК-ПФ или 0,85 мМ АКК-ПФ (среда с  первоначальной концентрации АКК-ПФ, идентифицирована как АКК-ПФ 0,85). Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (в круглых скобках) представлены в таблице 8.
Пример 9.
2
[0254] Развитие эмбрионов на среде для дробления с добавлением 1,7 мМ CaCl, 1,7 мМ или 0,85 мМ АКК-ПФ (АКК-ПФ 0,85) тестировали и сравнивали с развитием в необработанной среде. Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (в круглых скобках) представлены в таблице 9.
Пример 10
2
[0255] В указанном эксперименте умерщвляли 4 самки мышей возрастом 5 месяцев. Собирали эмбрионы каждой мыши согласно описанию в разделе «Материалы и способы», однако не объединяли; эмбрионы из каждой маточной трубы каждой мыши культивировали в среде для дробления с добавлением либо 1,7 мМ CaCl, либо или 1,7 мМ АКК-ПФ по отдельности. Таким способом авторы настоящего изобретения могли также оценить различия между мышами, поскольку эмбрионы каждой самки представляли собой сиблингов. Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (в круглых скобках) представлены в таблице 10.
Пример 11.
[0256] В указанном эксперименте умерщвляли 7 самок мышей возрастом 6 месяцев. Собирали эмбрионы от каждой мыши согласно описанию в разделе «Материалы и способы», однако эмбрионы мышей №1 и №2 не объединяли, а культивировали по отдельности, согласно примеру 5. Эмбрионы от мыши №1 культивировали либо в необработанной среде для дробления, либо в среде с добавлением 2,6 мМ АКК-ПФ (АКК-ПФ 2,6). Эмбрионы от мыши №2 культивировали в среде для дробления с добавлением 1,3 мМ или 0,6 мМ АКК-ПФ (идентифицирована как АКК-ПФ 1,3 и АКК-ПФ 0,6, соответственно). Все эмбрионы от мышей №№3-7 объединяли и культивировали с 1,6 мМ полифосфата (ПФ). Кроме того, вычисляли диаметры и объемы бластоцист. Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (в круглых скобках) представлены в таблице 11.
[0257] Было обнаружено, что диаметр прошедших хетчинг бластоцист, которые культивировали с 2,6 мМ АКК-ПФ, был на 28% больше, чем в контроле, а объем - в 2 раза больше, чем в контроле.
Пример 12.
[0258] В указанном эксперименте умерщвляли 7 самок мышей возрастом 6 месяцев. Собирали эмбрионы каждой мыши согласно описанию в разделе «Материалы и способы» (Пример 6). Эмбрионы объединяли и разделяли на 5 групп, которые культивировали в необработанной среде для дробления (Конт-Q), или в среде с добавлением 2,6 мМ, 1,3 мМ, 0,6 мМ АКК-ПФ (идентифицирована как АКК-ПФ 2,6, АКК-ПФ 1,3 и АКК-ПФ 0,6, соответственно), или в среде с добавлением 1,6 мМ полифосфата (ПФ). Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (в круглых скобках) представлены в таблице 12.
Пример 13.
[0259] В указанном эксперименте умерщвляли 6 самок мышей возрастом 6 месяцев. Собирали эмбрионы каждой мыши согласно описанию в разделе «Материалы и способы». Эмбрионы объединяли и разделяли на 3 группы: одна служила в качестве контроля (Конт-Q), а в двух других группах эмбрионы культивировали в среде для дробления с добавлением 3,3 мМ АКК-ПФ (АКК-ПФ 3,3) или с 3,3 мМ коммерчески доступного нанометрического кристаллического карбоната кальция (ККК). Все три среды получали в асептических условиях. Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (в круглых скобках) представлены в таблице 13.
Пример 14.
2
[0260] В указанном эксперименте умерщвляли 6 самок мышей возрастом 7 месяцев. Собирали эмбрионы от каждой мыши согласно описанию в разделе «Материалы и способы» (Пример 6). Эмбрионы объединяли и культивировали в среде для дробления с добавлением 1,7 мМ CaCl, 1,7 мМ АКК-ПФ, 0,8 мМ АКК-ПФ (АКК-ПФ 0,8) или 1,7 мМ фосфосерина (ФС). Число эмбрионов на каждой стадии развития и соответствующая им доля от первоначального числа эмбрионов (в круглых скобках) представлены в таблице 14.
[0261] Можно видеть, что в указанном конкретном эксперименте добавление хлорида кальция оказывало отрицательный эффект на эмбриональное развитие, приводя к более низким процентным значениям для бластоцист и прошедших хетчинг бластоцист.
Пример 15.
3
3
[0262] В указанном эксперименте умерщвляли 6 самок мышей возрастом 6 месяцев. Собирали эмбрионы каждой мыши согласно описанию в разделе «Материалы и способы» (Пример 6), однако эмбрионы от мыши №1 и 2 не объединяли, а культивировали по отдельности, как в эксперименте с сиблингами (см. пример 10). Эмбрионы от самки №1 культивировали в необработанной среде для дробления или в среде с добавлением 1,7 мМ нанометрического кристаллического карбоната кальция (ККК). Эмбрионы от мыши №2 культивировали в среде с добавлением 1,7 мМ АКК-ПФ или 1,7 мМ карбоната натрия (NaCO). Все эмбрионы от мышей №№3-6 объединяли и культивировали в необработанной среде или в среде с добавлением 1,7 мМ NaCO или 1,7 мМ АКК-ПФ. Кроме того, вычисляли диаметр и объем бластоцист (см. таблицу 15).
[0263] Можно видеть, что добавление карбоната натрия приводило к выраженно неудовлетворительному эмбриональному развитию по сравнению с контролем или средой с добавлением АКК-ПФ. Было также обнаружено, что диаметр прошедших хетчинг эмбрионов, которые культивировали в среде с добавлением 2,6 мМ АКК-ПФ, был на 28% больше, а объем - в 2 раза больше по сравнению с контролем.
Пример 16. Получение состава АКК с 10% ТФ и 1% лимонной кислоты (АКК, стабилизированного 10% трифосфата и 1% лимонной кислоты) для применения в качестве добавки к клеточной культуральной среде.
[0264] 36 мл 3% раствора хлорида кальция смешивали с 4 мл 0,27% раствора лимонной кислоты и с 10 мл 0,5406% раствора трифосфата. Затем добавляли 40 мл 1,9485% раствора карбоната натрия для осаждения АКК. 10 мл стабилизирующего раствора, содержащего 0,5406% трифосфата, добавляли в суспензию АКК с получением стабилизированной суспензии АКК. Полученную суспензию применяли в качестве добавки для среды Quinn's™ для дробления или для одностадийной среды Quinn's™. Указанную суспензию добавляли до достижения конечной концентрации АКК, равной 1,7 или 3,4 мМ. Как вариант, указанную суспензию фильтруют с применением воронки Бюхнера, осадок промывают водой и затем высушивают, например, в печи. Указанный порошок добавляют в среду для дробления до достижения конечной концентрации 1,7 или 3,4 мМ.
Пример 17
[0265] В указанном эксперименте умерщвляли 4 самки мышей возрастом 6-8 недель. Собирали эмбрионы каждой мыши согласно описанию в разделе «Материалы и способы». Стабилизированный АКК (АКК, стабилизированный 10% трифосфата и 1% лимонной кислоты) получали согласно описанию в примере 16. Эмбрионы от каждой самки разделяли и культивировали одну их часть в необработанной среде SAGE 1-Step™, в вторую часть в среде SAGE 1 -Step™ с добавлением 1,7 мМ АКК-ПФ или 3,4 мМ АКК-ПФ. Как можно видеть на фиг. 8, добавление стабилизированного АКК оказывало положительный эффект на эмбриональное развитие, приводя к более высоким процентным значениям для бластоцист и прошедших хетчинг бластоцист, в частности, при применении 3,4 мМ АКК. Неожиданно было обнаружено, что эмбрионы, культивируемые в среде для дробления с добавлением стабилизированного АКК, демонстрировали быстрое дробление и более высокие показатели хетчинга.
Пример 18. Получение составов с АКК для применения в качестве добавки к клеточной культуральной среде.
[0266] Получали композиции АКК, стабилизированного разными стабилизаторами (трифосфат (ТФ), гексаметафосфат (ГМФ), пирофосфат (Пир), фосфосерин (ФС), этидроновая кислота (ЭТ), золедроновая кислота (ЗК); или медроновая кислота (МК)). В ходе типичной процедуры растворы кальция (300 мл воды, 24 г хлорида кальция и стабилизатор) и раствор карбоната (200 мл воды и 17,3 г карбоната натрия) смешивали для осаждения АКК. Раствор стабилизатора (100 мл воды и стабилизатор; состав стабилизаторов в растворах кальция и стабилизатора приведен в таблице 16) добавляли в суспензию АКК с получением стабилизированной суспензии АКК. Указанная суспензия может применяться в качестве добавки. Затем АКК фильтровали с применением воронки Бюхнера, и осадок промывали водой. Суспензию высушивали с получением порошка. Указанный порошок может быть добавлен в качестве добавки для клеточной культуральной среды или ресуспендирован в водной среде и добавлен в виде суспензии.
[0267] Согласно другим примерам указанные композиции получали согласно описанию выше, с добавлением лимонной кислоты в растворы кальция для получения 1% лимонной кислоты в итоговой композиции. Указанную суспензию применяют непосредственно в качестве добавки для культуральной среды. Как вариант, указанную суспензию затем промывали водой и высушивали для получения порошка. Указанный порошок может быть добавлен к любой клеточной культуральной среде или ресуспендирован в водной среде.
Пример 19. Рост стволовых клеток МВА13 (Стромальные клетки костного мозга) с образованием остеобластов
[0268] Материал и способы
2+
2+
[0269] Через два дня после размораживания клетки MBA-13 (полученные от профессора Дова Ципори (Dov Zipori), Научный институт имени Вейцмана) ресуспендировали в растворе рекомбинантного трипсина и высевали в 96-луночный планшет (день «0») в концентрации 1×104 клеток/лунку, используя базальную среду для MCK Nutristem XF (Biological Industries, кат. №05-200-1А) с добавлением среды со смесью добавок для мезенхимальных стволовых клеток (MCK) (Biological Industries, кат. №05-201-06) в соотношении 50 мл : 300 мкл. Ряды А-Н колонок 1-4 96-луночного планшета предварительно покрывали раствором для прикрепления МСК, разведенным ФСБ (без Са, Mg), в соотношении 1:100, для высевания клеток. Ряды А-Н колонок 5-8 96-луночного планшета предварительно покрывали 0,1% желатином в течение 30 минут при комнатной температуре.
[0270] На 2 день, после достижения более 80% конфлюэнтности клеток (~48 ч), среду заменяли на остеогенную среду для быстрой дифференцировки MSCgo (кат. №05-442-1 В), содержащую факторы, способствующие остеобластической дифференцировке. После замены среды в ряды А-С добавляли дополнительно 1 мМ кальция (до общей концентрации кальция 2,488 мМ), происходящего из аморфного карбоната кальция (АКК), стабилизированного 10% трифосфата+1% лимонной кислоты; в ряды D-F добавляли дополнительно 1 мМ кальция (до общей концентрации кальция 2,488 мМ), происходящего из хлорида кальция; в ряд G планшета добавляли среду MSCgo (общая концентрация кальция 1,488 мМ). В ряд Н планшета добавляли питательную базальную среду для MCK NutriStem XF + смесь добавок (общая концентрация кальция 1,488 мМ).
[0271] На 4 день среду заменяли на свежие составы с АКК.
4
[0272] Параллельно в контрольный планшет также высевали клетки линий MDX, происходящие из пораженных мышц мышей MDX. Окрашивание указанных клеток использовали для задания фонового окрашивания внутреннего кальция клеток, а также для элиминации возможности окрашивания отложений кальция при обработке АКК. Перед посевом лунки покрывали желатином, который применяют в качестве стандартного субстрата для прикрепления клеток MDX. Клетки MDX высевали в 24-луночный планшет в концентрации 3x10 клеток/лунку. День посева определен как «0 день».
[0273] На 2 день среду в лунках заменяли следующим образом:
2
2
[0274] В колонки 1 и 2 добавляли среду для спинного мозга (СМ), которую готовили самостоятельно (указанная среда содержит 0,6% по массе D-глюкозы, 2 мМ L-глутамин, 25 мкг/мл гентамицина, В27, N, 0,1 мг/мл БСА, Hepes, 10% ФБС, DMEM/F12 и ИФР-I, 50 нг/мл) + 1 мМ кальция, происходящего из АКК (общая концентрация кальция 2 мМ); в колонки 3 и 4 добавляли среду для СМ + 1 мМ кальция, происходящего из CaCl; в колонки 5 и 6 добавляли среду для СМ. Оба типа клеток (МВА13 и MDX) культивировали до 10 дней.
[0275] Фиксацию (4% параформальдегидом в течение 20 минут) содержимого нескольких лунок каждого типа выполняли на 5, 7 и 10 дни после замены среды, т.е. на 7, 9 и 12 день исследования.
[0276] После фиксации клеток использовали два типа реагентов для окрашивания внеклеточного кальция или отложения в кости для оценки функциональности остеобластов: (i) ализариновый красный (Sigma А55333) и (ii) щелочную фосфатазу (субстратная система BCIP/NBT от DAKO, К0598), следующим образом:
[0277] Процедура окрашивания ализариновым красным - рН доводили до 4,2. Клетки двукратно промывали ФСБ и фиксировали холодным метанолом в течение 5 минут, а затем повторно промывали ФСБ. Раствор ализарина в концентрации, составляющей 2%, использовали в течение 15-20 минут. После инкубации с окрашиванием образцы промывали водой 2-3 раза для устранения неспецифического окрашивания.
[0278] Окрашивание на щелочную фосфатазу - клетки промывали ФСБ 1 или 2 раза и затем фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 минут. После этого промывали 3 раза ФСБ и, после удаления остатков ФСБ, использовали 3 капли раствора из набора BCIP/NBT для покрытия клеток, в том числе заполняя одну пустую лунку, не содержащую каких-либо клеток, в качестве контроля для количественной оценки анализа. Инкубацию с набором для анализа щелочной фосфатазы проводили в течение 1 часа, а затем промывали дистиллированной водой.
[0279] Результаты
[0280] Приведены результаты для клеток, которые культивировали в течение 10 дней и подвергали как окрашиванию ализарином, так и окрашиванию на щелочную фосфатазу. При наблюдениях, проведенных ранее чем через 10 дней, практически невозможно было детектировать какое-либо отложение кальция при применении обоих способов окрашивания.
[0281] За состоянием клеток наблюдали под световым микроскопом (без фиксации) в два момента времени, на 2 и 4 дни. Оба наблюдения показали, что состояние клеток, которые высевали на лунки, предварительно покрытые раствором для прикрепления МСК, не было хорошим; указанные клетки приобретали округлую форму. Напротив, состояние клеток, которые высевали на лунки, предварительно покрытые желатином, было хорошим. Тем не менее, было принято решение продолжить использование обоих типов предварительного покрытия. Представленные ниже результаты и процедуры окрашивания относятся к клеткам, культивируемым на желатине, который использовали в качестве субстрата для прикрепления.
[0282] При окрашивании ализариновым красным отложения кальция детектируют по оранжево-красному цвету.
2
[0283] При окрашивании ализариновым красным наблюдался очень сильный сигнал в образцах остеобластических клеток с добавлением АКК по сравнению с образцами с добавлением CaCl, в которых наблюдался только слабый сигнал (фиг. 9). Помимо указанного сигнала на указанной фигуре можно видеть окрашивание больших кальциевых бляшек, которые не наблюдаются при каком-либо из контрольных вариантов обработки.
2
[0284] При окрашивании ализариновым красным клеток, культивируемых в среде для быстрой дифференцировки MSCgo также наблюдалось некоторое окрашивание отложения кальция, однако размер отложений и их количество значимо ниже, а морфология напоминает морфологию и количество, наблюдаемые в клетках при добавлении CaCl. Отложение кальция не наблюдалось в клетках, культивируемых в среде с добавками для MCK NutriStem (добавки для МСК; данные не показаны). Среду с добавками для MCK NutriStem обычно используют, чтобы индуцировать пролиферацию клеток, а не дифференцировку. Действительно, наблюдалось значительное число клеток, но не отложение кальция.
[0285] Указанное наблюдение предполагает, что обработка АКК улучшает дифференцировку клеток МВА13 в остеобласты и увеличивает отложение кальция в клетках, т.е. улучшает их функциональность.
[0286] Другим независимым маркером остеобластической дифференцировки является щелочная фосфатаза. Максимальная экспрессия указанного фермента происходит в фазе созревания матрикса клеток. Окрашивание на щелочную фосфатазу применяли в качестве дополнительного способа детекции дифференцировки и функциональности остеобластов, с целью верификации результата, полученного при окрашивании ализарином.
[0287] Окрашивание на щелочную фосфатазу показано черным цветом; результаты представлены на фиг. 10. В клетках MBA13, обработанных АКК, наблюдался интенсивный сигнал по сравнению с другими вариантами обработки. Так, окрашивание на щелочную фосфатазу подтверждает, что дифференцировка остеобластов лучше проходит в культурах, обработанных АКК.
[0288] Окрашивание ализарином клеток MDX, обработанных обогащенной АКК средой, через 10 дней после посева продемонстрировало отсутствие значительных различий окрашивания при разных вариантах обработки (см. фиг. 11А-С). Указанные результаты подтверждают, что окрашивание остеобластов ализариновым красным обусловлено отложением кальция указанным остеобластом, а не отложением АКК, вызванным собственно обработкой (т.е. не является экспериментальным артефактом).
2
[0289] Окрашивание на щелочную фосфатазу в клетках линий MDX (фиг. 15D-E) продемонстрировало, что формирования кости не происходило. Интересно, что при окрашивании на щелочную фосфатазу в обработанных АКК клетках наблюдалась улучшение образования мышечных трубочек по сравнению с клетками, культивированными на среде с добавлением CaCl, или в контроле.
[0290] Выводы
[0291] Оба независимых вида окрашивания, окрашивание ализариновым красным и окрашивание на щелочную фосфатазу через 10 дней после посева на разную среду, показали существенно более выраженное окрашивание отложений в остеобластических клетках, которые культивировали в среде с добавлением АКК, по сравнению с использованными контролями.
2
[0292] Хотя при культивировании клеток в присутствии АКК наблюдались отложение больших кальциевых бляшек, такое отложение не наблюдалось в клетках, культивированных в среде с добавлением CaCl. Более сильный сигнал может указывать на большую функциональность, поскольку окрашивание продемонстрировало более выраженное отложение бляшек. Результат, полученный при окрашивании клеток MDX, предполагает, что указанные бляшки возникают не в результате добавления АКК, а являются непосредственным результатом функционирования остеобластов.
Пример 20 - АКК для улучшения подвижности сперматозоидов
[0293] Материалы и способы
[0294] Получение суспензии АКК
[0295] 36 мл 3% раствора хлорида кальция смешивали с 4 мл 0,3% раствора лимонной кислоты и с 10 мл 0,5% раствора трифосфата. Затем добавляли 40 мл 2% раствора карбоната натрия для осаждения АКК. В суспензию АКК добавляли 10 мл стабилизирующего раствора, содержащего 0,5% трифосфата, с получением стабилизированной суспензии АКК. Концентрация элементарного кальция в полученной суспензии составляла 75 мМ.
[0296] Взятие спермы
2
[0297] Сперму собирали 3 раза от одного барана (эксп.1) или дважды от 3 баранов (эксп.2 и 3), и оценивали концентрацию и подвижность при комнатной температуре. Сперму разводили до концентрации 50 млн сперматозоидов/мл в синтетической жидкости маточных труб (SOF), содержащей: 107,70 мМ NaCl, 7,16 мМ KCl, 1,19 мМ KH2PO4, 1,71 мМ CaCl, 0,49 мМ MgCl2, 25,07 мМ NaHCO3, 3,30 мМ лактат Na и 1,50 мМ глюкозу (10) в воде Milli-Q. Осмолярность должна составлять 270 мОсм, а рН - 7,55.
[0298] Затем оценивали подвижность спермы с применением CASA (Theriogenology, 2014, Volume 81, Issue 1, Pages 5-17) и охлаждали до 4°С со скоростью 1°С /мин.
[0299] Процедура флотации
[0300] Процедуру флотации выполняли при 38°С, сырую сперму (10 мкл) помещали во флакон Eppendorf объемом 1 мл и инкубировали в течение приблизительно 1 часа в среде SOF, которую вводили в трубочках объемом 0,25 мл (CBS, Франция). Через 40-60 минут сперму, которая проникла в трубочку, помещали на предметное стекло и оценивали с применением CASA.
[0301] Результаты
[0302] Подвижность свежесобранной спермы тестировали согласно описанию в разделе «Материалы и способы» при добавлении или без добавления аморфного карбоната кальция. Результаты представлены в таблице 17.
[0303] Можно видеть, что сперма с добавлением АКК обладала значительно более высокой поступательной подвижностью по сравнению с необработанной спермой.
Пример 21. Эффект АКК на подвижность сперматозоидов в эксперименте с флотацией
[0304] Для оценки эффекта АКК на подвижность сперматозоидов проводили стандартный эксперимент с флотацией в присутствии 17 мкл/мл и 34 мкл/мл суспензии АКК (1,3 и 2,6 мМ элементарного Са, соответственно). Жизнеспособные сперматозоиды подсчитывали через 1 час, результаты обобщены в таблице 18.
[0305] Ясно видно, что добавление АКК значимо увеличивало число жизнеспособных сперматозоидов во всех экспериментах. В образцах с добавлением АКК число жизнеспособных сперматозоидов было в 2-7 раз выше, чем в образцах из необработанной среды.
Пример 22. Эффект концентрации АКК на подвижность сперматозоидов в эксперименте с флотацией
[0306] Эффект концентрации АКК на подвижность спермы тестировали в эксперименте с флотацией, с применением 3 разных образцов для каждой концентрации АКК. Результаты обобщены в таблице 19.
[0307] Было отмечено, что добавление 17 мкл/мл суспензии АКК в раствор синтетической жидкости маточных труб (SOF) и инкубация при 38С в течение 1 часа увеличивали концентрацию подвижной спермы по меньшей мере в 3 раза. Интересно, что более высокая концентрация АКК не снижала концентрацию подвижной спермы после флотации. Было сделан вывод, что АКК улучшал концентрацию спермы после процедуры флотации и не оказывал какого-либо двухфазного эффекта в отношении ионного кальция. Любая концентрация АКК выше минимальной эффективной дозы увеличивает подвижность.
Пример 23. АКК сохраняет яичники in vitro
[0308] Материал и способы
[0309] У мышей (возрастом 6 недель) собирали яичники, разделенные на фрагменты размером 0,4 мм × 0,4 мм. Яичники культивировали в 12-луночных планшетах. Культуральная среда состояла из: 90% модифицированной до Дульбекко среды Игла - питательной смеси F-12 (DMEM-F12), истощенной по кальцию (среда без ионов кальция, специальный состав), 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 2 мМ глутамин, 25 мкг/мл гентамицина и 0,3-0,5% геля NVR-Gel с добавлением или без добавления стабилизированного 3,4 мМ АКК-ПФ. Через 48 ч культивирования добавляли в емкость для культивирования добавляли 5МЕ ГСЖК (гонадотропина сыворотки жеребой кобылы.
[0310] Результаты
[0311] На фиг. 12 можно видеть, что вторичные фолликулы развивались через 2 недели культивирования in vitro в присутствии стабилизированного АКК, и зернистые клетки, окружающие ооциты, были интактными. Напротив, во вторичных фолликулах в контрольной группе наблюдаются неинтактные зернистые клетки и ооцит на стадии зародышевого пузырька. В группе АКК наблюдалось значительно больше фолликулов, что указывает на то, что добавление АКК в культуральную среду обеспечивает лучший и более быстрый рост фолликулов, и лучшее сохранение яичников.
[0312] Хотя настоящее изобретение было описано в настоящем документе на предпочтительных вариантах его реализации, оно может быть модифицировано без отступления от существа и предмета заявленного изобретения, определяемых прилагаемой формулой изобретения.