Морфофункциональные изменения в печени крыс при введении алкалоидов чистотела

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ АЛКАЛОИДОВ ЧИСТОТЕЛА

ЗВЕРИНСКИЙ И.В.*, МЕЛЬНИЧЕНКО Н.Г.*, ПОПЛАВСКИЙ В.П.*, ТЕЛЕГИН П.Г.*, ЛИС Р.Е.**

ГУ НПЦ «Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси», Центральная научно-исследовательская лаборатория Гродненского государственного медицинского университета**

Резюме. Исследовали влияние алкалоидов чистотела, выделенных из корневой части растения на структуру и функцию печени крыс. Установлено, что введение алкалоидов чистотела в дозах 5, 10 и 20 мг/кг, внутрибрюшинно, в течение 10 дней приводило к активации цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени и увеличению образования тимол-альбумин-липидного комплекса в сыворотке крови (тимоловая проба). При введении алкалоидов в дозе 20 мг/кг, наблюдалось снижение активности холинэстеразы в крови и выявлены признаки гепатита: диффузный лимфоцитоз; нейтрофилез и

образование лимфогранулем.

Ключевые слова: печень, алкалоиды чистотела, цитохром Р450,

мезенхимально-воспалительный синдром.

Abstract. It was studied the effect of alkaloids celandine isolated from root part of plant on structure and function of rat liver. Administration of celandine alkaloids for 10 days at doses 5, 10 and 20 mg/kg, intraperitoneal invoked activation of cytochrome P450-dependent monooxygenases of liver and increasing of thymol probe in blood serum. Following injection celandine alkaloids at dose 20 mg/kg was found reduction activity of cholinesterase in blood serum and signs of hepatitis: diffuse lymphocytosis, neutrocytosis and formation of lymphogranuloma.

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, 230030, г. Гродно, БЛК-50, ГУ НПЦ «Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси», лаборатория биохимической токсикологии и наркологии, тел. 80152-436511, факс 8 0152 434121. -

Зверинский И.В.

Принято считать, что применение лекарственных трав или препаратов на их основе в терапии не оказывает токсического действия на печень. Однако анализ литературы показывает, что использование растительных препаратов в лечении может спровоцировать острую печеночную недостаточность [1].

В народной медицине Западноевропейских стран и Китая экстракты чистотела использовали в качестве противовоспалительных, противомикробных, противоопухолевых и противовирусных средств. В настоящее время чистотел применяют в основном при заболеваниях печени, желчного пузыря и как болеутоляющее средство при язвенной болезни [2] .

В последнее время в научной литературе, описаны ряд случаев, острого поражения печени после назначения экстракта чистотела. Отмена лекарственного средства чистотела приводила к нормализации функции печени. Природа этого феномена неизвестна [3].

Фармакологическая активность большинства средств из чистотела обусловлена, прежде всего, наличием в нем алкалоидов, имеющих разную фармакологическую активность [4]. Состав алкалоидов чистотела неоднозначен и по структуре может быть отнесен к разным типам изохинолиновых производных: подгруппа протоберберина - берберин, коптизин, стилопин; подгруппа протопина - протопин, аллокриптопин; подгруппа бензофенонтридина - хелидонин, хелеритрин, хелирубин, сангвинарин [4]. Чешскими исследователями был изучен алкалоидный состав корней чистотела. Среди выделенных алкалоидов свыше 63% от суммарного состава приходилось на хелидонин, затем шел протопин - порядка 20%, аллокриптопин ~ 10.5% и гомохелидонин ~ 2%. Чуть менее 2% пришлось на долю вместе взятых сангвинарина, хелеритрина, хелирубина, хелилютина. Коризамин, берберин и коптизин вместе составили около 1%; стилопин, хеламин и хеламидин ~ 0.1, 0.2 и 0.3%, соответственно [5].

Целью настоящего исследования было изучение действия суммы алкалоидов чистотела, выделенных из корневой части растения на структуру и функцию печени крыс.

Методы

Опыты проведены на 40 крысах-самцах породы ’^Б1аг массой 180-220 г. Крысы содержались на стандартном рационе вивария, при естественном освещении и температуре 23-25°С. Животные были разбиты на три экспериментальные группы (п=10). Первой группе животных вводили алкалоиды чистотела в дозе 5 мг/кг, второй - 10 мг/кг и третьей - 20 мг/кг. Алкалоиды вводили внутрибрюшинно, на протяжении 10 дней. Раствор суммы алкалоидов чистотела готовили непосредственно перед инъекцией. Для растворения алкалоидов использовали 0.05 М трис-НС1 буфер рН 6.5. Контрольным животным вводили физиологический раствор в объеме 0.4 мл/100 г веса, внутрибрюшинно. Процентное содержание основных представителей изохинолиновых подгрупп во вводимой алкалоидной фракции было следующим: хелидонин - 43.5%; сангвинарин - 0.6%; хелеритрин - 1.1%; протопин - 28.9%; коптизин - 18.3% и берберин - 4.7%. Алкалоиды чистотела

для исследований были любезно предоставлены Nowicky Pharma (Вена. Австрия).

Через 24 часа после последнего введения животных декапитировали. Производили забор крови. Вскрывали брюшную полость. отрезали часть печени для морфологического анализа. а оставшуюся печень промывали 1.15% раствором KCl. Методом дифференциального центрифугирования выделяли микросомальную фракцию печени. Микросомальный осадок ресуспендировали в 0.05 М трис-буфер содержащий 1мМ ЭДТА и 20% глицерина. Все процедуры производились при температуре +4°С. Микросомы замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С до последующих биохимических исследований.

В сыворотке крови определяли содержание среднемолекулярных пептидов. триглицеридов. тимол-липидного комплекса (тимоловая проба). активность АлАТ. АсАТ. щелочной и кислой фосфатаз. холинэстеразы с использованием коммерческих аналитических наборов Анализ-Х (Беларусь). Cormay (Польша). Lachema (Чехия) согласно прилагаемых инструкций.

Содержание цитохрома Ь5 в микросомальной фракции печени определяли по изменению разницы поглощения окисленной и восстановленной форм гемопротеина. а цитохрома Р450 - по изменению величины поглощения комплекса восстановленного цитохрома Р450 с окисью углерода при Х=450 нм. В качестве восстановителя гемопротеинов использовали дитионит.

Концентрацию цитохрома Ь5 рассчитывали по коэффициенту экстинкции 164^ 103 М-1 см-1. а цитохрома P450 - 91 • 103 M-1 см-1.

Каталитическую активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени оценивали путем измерения скорости деметилирования этилморфина (цитохром Р450 ЗА-зависимая реакция) [6]. аминопирина (цитохром Р450 2С11 и 3А2-зависимая реакция) [7] и метанола (цитохром Р450 2Е1-зависимая реакция) [8] по образованию формальдегида. Реакции деалкилирования этилморфина (2 мМ). аминопирина (2 мМ) и метанола (3 мМ) проводили в 100 мМ tris-HCl буфера (рН 7.4). содержащего 16 мМ MgCl2. 2 мМ NADPH. в течение 10 мин при 37°С. Образующийся формальдегид определяли по реакции Наша [9].

Содержание цитохромов и их каталитическую активность рассчитывали на 1 мг микросомального белка. определяемого по методу Лоури [10].

Гистологические препараты печени готовили по стандартным методикам. Кусочки печени фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина с последующей проводкой через спирты. заключали в парафин. изготавливали серийные срезы толщиной 5-7 мкм. которые после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином. Для получения микрофотографий использовалась установка с цифровой камерой Canon EOS 300D. Для определения площади ядер гепатоцитов применяли программу «Морфометрия-4» (РФ).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Установлено, что при введении суммы алкалоидов чистотела в дозах 5, 10 и 20 мг/кг/день, внутрибрюшинно, в течение 10 суток увеличивается активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени крыс. Так активность этилморфин К-деметилазы (цитохром Р450 3А-зависимая реакция) после введения алкалоидов чистотела в дозе 10 и 20 мг/кг возрастает в сравнении с контрольной группой на 34 и 26%% (р<0.05) соответственно. Активность аминопирин К-деметилазы увеличивается во всех трех экспериментальных группах на 48, 64 и 39%% (р<0.05). Каталитическая активность метанол О-деметилазы (цитохром Р450 2Е1-зависимая реакция) возрастает только в I и III группах на 28 и 60%% (р<0.05) в сравнении с контрольной группой (таблица).

Таблица

Некоторые биохимические показатели крови и печени крыс после 10дневного введения суммы алкалоидов чистотела в дозе 5, 10 и 20

мг/кг/день, внутрибрюшинно

Показатель Контроль I группа

АлАТ, МЕ/л 41.73±3.66 49.25±3.45 45.76±5.74 41.96±5.26

АсАТ. МЕ/л 61.93±1.63 62.73±3.18 65.12±4.25 62.55±6.44

Щелочная фосфатаза. мккат/л 1.49±0.14 1.78±0.21 1.25±0.14 1.91±0.24

Кислая фосфатаза. нкат/л 579.7±87.2 365.0±68.9 426.7±54.6 416.9±99.3

Холинэстераза. мкКат/л 4.25±0.40 3.84±0.36 3.90±0.43 2.65±0.25*

Триглицериды. ммоль/л 0.67±0.11 0.41±0.12 0.47±0.11 1.04±0.32

Молекулы средней массы. г/л 1.34±0.08 1.10±0.10 1.38±0.12 1.48±0.12

Тимоловая проба. ед Б-И 5.27±0.39 8.79±1.37* 8.88±1.12* 9.31±1.04*

Цитохром Р450. нмоль/мг белка 0.52±0.04 0.62±0.08 0.47±0.04 0.41±0.06

Цитохром Ь5. нмоль/мг белка 0.37±0.03 0.41±0.04 0.37±0.03 0.45±0.05

Этилморфин N деметилаза. нмоль ИСИО/мин/мг белка 5. 18±0.41 5.50±0.57 6.94±0.53* 6.53±1.09

Аминопирин N деметилаза. нмоль ИСИО/мин/мг белка 2.88±0.16 4.27±0.28* 4.74±0.09* 3.95±0.69*

Метанол О-деметилаза нмоль ИСИО/мин/мг белка 2.27±0.15 2.91±0.25* 2.62±0.09 3.62±0.78*

Примечание: * - р<0.05 к контролю.

Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы являются суперсемейством ферментов, отвечающих за защиту организма от ксенобиотиков. В большинстве случаев при введении лекарственных препаратов или других ксенобиотиков наблюдается увеличение активности цитохрома Р450, как следствие адаптационной реакции организма к чужеродному веществу. Хорошо известно, что многие субстраты цитохрома Р450 обладают индуцирующим эффектом на гемопротеин. Анализ литературы показывает, что в метаболизме протопина участвуют изоформы Р450 2Б1, 2С11, 3А4 и 1А2 [11], а берберина 2Б6, 2С9 [12]. С другой стороны сангвинарин взаимодействует с активным центром цитохрома Р450 1А1 без дальнейшей метаболической трансформации [13]. Мы предполагаем, что при введении алкалоидов чистотела происходит активация цитохромов Р450 3А1, 2С11 и 2Е1.

Введение суммарной фракции алкалоидов чистотела в дозе 20 мг/кг на протяжении 10 дней вызывает снижение активности холинэстеразы в сыворотке крови на 38% (р<0.05) (таблица). Синтез холинэстеразы, как и альбумина происходит в гепатоцитах. Поэтому исследования активности холинэстеразы рассматривается, как важный лабораторно-диагностический тест, отражающий, прежде всего синтетическую функцию печени. Степень снижения активности фермента в крови соответствует тяжести и распространенности поражения печеночных клеток. Острые гепатиты, а так же хронические заболевания печени характеризуются падением активности фермента [14]. В связи с тем, что снижение активности холинэстеразы при патологиях печени часто сопровождается увеличением активности АлАТ и АсАТ и тем фактом, что время полужизни фермента составляет 12-14 суток, мы полагаем, что падение активности холинэстеразы при введении алкалоидов чистотела связано в меньшей степени с деструктивным действием алкалоидов на паренхиму печени, и в большей степени с непосредственным прямым ингибированием фермента, что было ранее показано в ряде работ [15, 16].

Во всех трех экспериментальных группах статистически достоверно увеличены показатели тимоловой пробы на 66, 69 и 77%% соответственно, которая относится к основным маркерным реакциям при мезенхимальновоспалительном синдроме печени. В основе развития данного синдрома лежат аутоиммунные процессы.

Анализ гистологических препаратов контрольной и опытных групп не выявил нарушений в архетиктонике печени. Отчетливо просматривается дольковое строение, гепатоциты располагаются в виде балок, расходящихся радиально от центральной дольковой вены. Между балками находятся синусоиды. Долька окружена по периферии невыраженными прослойками междольковой соединительной ткани, содержащими печеночные триады. Внутридольковые синусоиды выстланы плоскими эндотелиальными клетками, между которыми расположены Купферовские клетки. Так же не выявлено статистически достоверных различий в средней площади ядер гепатоцитов между контрольной и опытными группами (рис.1).

контроль I группа II группа III группа

Рис. 1. Площадь ядер гепатоцитов после введения алкалоидов чистотела в дозах 5 (I группа). 10 (II группа) и 20 (III группа) мг/кг/день. внутри брюшинно.

в течение 10 дней.

в

•

Я.'Л #* ♦

• V ' * ’

I *

*42

УШ

кш;'у!

VI

А

* )

. •: : Шл I

Ж 4

Рис. 2. Структура печеночной ткани после введения алкалоидов чистотела в дозе 20 мг/кг. в/б. в течение 10 дней. Окраска гемотоксилин-эозин.

а. б. в - (х 100) и г - (х 400).

Однако на многих гистологических препаратах в III группе обнаружены признаки гепатита: диффузный лимфоцитоз; нейтрофилез и образование лимфогранулем (рис. 2 а. б. в). На одном препарате наблюдается выраженный гепатит. с перипортальным ступенчатым некрозом и очаговыми некрозами паренхимы (рис. 2 г).

Заключение

На основании полученных результатов. мы предполагаем. что алкалоиды чистотела относятся к факультативным гепатотоксинам и способны инициировать мезенхимально-воспалительный синдром печени. В пользу этого предположения свидетельствуют следующие факты: отсутствие какого-либо дозозависимого эффекта; увеличение тимоловой пробы и печеночная лейкоцитарная инфильтрация портальных трактов.

При включении чистотела или лекарственных средств на его основе в комплексную терапию необходимо учитывать активирующий эффект алкалоидов чистотела на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы. а при наличии препаратов с узким терапевтическим диапазоном целесообразно исключать чистотел из терапии с целью предупреждения возможных нежелательных межлекарственных взаимодействий.

Литература

1. Oral aloe vera-induced hepatitis / M. M. Bottenberg [et al.] // Ann. Pharmacother. - 2007. - Vol. 41. N 10. - P. 1740-1743

2. The greater celandine (Chelidonium majus L.)-review of present knowledge/ E. Taborska [et al.] // Ceska Slov Farm. - 1995. - Vol. 44. N 2. - P. 7175.

3. Acute hepatitis after use of a herbal preparation with greater celandine (Chelidonium majus) / A. P. Crijns [et al.] // Ned. Tijdschr. Geneeskd. - 2002. - Vol. 146. N 3. - P. 124-128.

4. Pharmacological activities of Chelidonium majus L. (Papaveraceae) / M. L. Colombo [et al.] // Pharmacol. Res. - 1996. - Vol. 33. N 2. - P. 127-134.

5. Alkaloide der Mohngewachse (Papaveraceae) XXX. Uber wettere alkaloide aus derWarzel von Chelidonium majus L. / J. Slavik [et al.] // Coll. - 1965. - Vol. 30. N 11. - P. 3697-3704.

6. Ethylmorphine N-demethylase activity as a marker for cytochrome P450 3A activity in rat hepatic microsomes / D. E. Amacher [et al.] // Toxicology Letters. -1998. - Vol. 94. - P. 115-125.

7. Aminopyrine metabolism by multiple forms of cytochromes P-450 from rat liver microsomes: Simultaneous quantitation of four amonipyrine metabolites by high-performance liquid chromatography / S. Imaoka [et al.] // Arch. Biochem. Biophys. - 1988. - Vol. 265. N 1. - P. 159-170.

8. Cytochrome P450IIE1: roles in nitrosamine metabolism and mechanism of regulations / C. S. Yang [et al.] // Drug Metabolism Reviews. - 1990. - Vol. 22. N 2/3. - P. 147-159.

9. Nash. T. The colometric estimation of formaldehyde by means of the hantzsch reaction / T. Nash // Biochem. J. - 1953. - Vol. 55. - P. 416-421.

10. Protein measurment with the folin phenol reagent / O. N. Lowry [et al.] // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

11. Cytochrome P450 isoenzymes involved in rat liver microsomal metabolism of californine and protopine / L. D. Paul [et al.] // Eur. J. Pharmacol. -2004. - Vol. 485. N 1/3. - P. 69-79.

12. Human cytochrome p450 inhibition and metabolic-intermediate complex formation by goldenseal extract and its methylenedioxyphenyl components / P. Chatterjee [et al.] // Drug Metab. Dispos. - 2003. - Vol. 31. N 11. - P. 1391-1397.

13. Involvement of cytochrome P450 1A in sanguinarine detoxication / J. Vrba [et al.] // Toxicol. Lett. - 2004. - Vol. 151. - P. 375-387.

14. Williams. F. M. Clinical significance of esterases in man / F. M. Williams // Clin. Pharmacokinet. - 1985. - Vol. 10. N 5. - P. 392-403.

15. Acetylcholinesterase inhibitors from the aerial parts of Corydalis speciosa / D. K. Kim [et al.] // Arch. Pharm. Res. - 2004. - Vol. 27. N 11. - P. 11271131.

16. Protopine from Corydalis ternata has anticholinesterase and antiamnesic activities / S. R. Kim [et al.] // Planta Med. - 1999. - Vol. 65. N 3. - P. 218-212.