ШТАММ МИКРООРГАНИЗМА BACILLUS SMITHII TBMI12 MSCL P737 И ПРИМЕНЕНИЕ ЕГО В КАЧЕСТВЕ ПИЩЕВОЙ ИЛИ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ, ИЛИ КОМПОНЕНТА ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ И ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
STRAIN OF MICROORGANISM BACILLUS SMITHII TBM112 MSCL P737 AND ITS APPLICATION AS FOOD OR FEED ADDITIVE, OR COMPONENT OF PROBIOTIC COMPOSITION, AND PROBIOTIC COMPOSITION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к области биотехнологии и пробиотическому бактериальному штамму, который может быть использован для предотвращения бактериальных инфекций желудочно-кишечного тракта позвоночных животных и стимулирования их иммунной системы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Идея использования антагонизма между бактериями и патогенами относится ко временам Листера и Флеминга. Применение живых микроорганизмов для колонизации желудочно-кишечного тракта с целью стимулирования иммунной системы или антибактериального воздействия является более новой идеей. Перорально вводимые живые микроорганизмы, положительно воздействующие на организм, называются пробиотиками (Martins, F.S. et al. (2005) Screening of yeast as probiotic based on capacities to colonize the gastrointestinal tract and to protect against enteropathogen challenge in mice. J. Gen. Appl. 25 Microbiol. 51:83-92). Обычно они происходят от рода Lactobacillus.
К сожалению, успешное применение этих лактобактерий в качестве пробиотиков затрудняется массовой гибелью микроорганизмов под воздействием желудочной кислоты и желчи (Spinosa, M.R. et 30 al. (2002) On the fate of ingested Bacillus spores. Res. Microbiol. 151:361-368). Однако если вместо вегетативных клеток используются споры, то их выживаемость является значительно более высокой. В то же самое время препараты, вводимые в форме спор, не являются менее эффективными, чем препараты, применяемые в вегетативной форме. Точнее, возможность сохранить споры в течение неограниченного периода времени является преимуществом, и таким образом применение спор стало альтернативой применению антибиотиков в сельском хозяйстве (Wolken, W.A.M. et al. 5 (2003) What can spores do for us? Trends in Biotechnology. 21:338-345). В профилактических и терапевтических целях чаще всего используются споры представителей рода Bacillus, таких как В. clausii, В. subtilis, В. pumilus и В. Cereus (Duc, L.H. 10 et al. (2004) Characterization of Bacillus probiotics available for human use. Appl. Environ Microbiol. 70:2161-2171).
У авторов настоящего изобретения вызвала интерес возможность использования эндоспор Bacillus sp. в комбинации с антибиотиками для борьбы с инфекцией. Это сочетание широко применяется в Восточной и Южной Азии, так как оно помогает снизить осложнения, связанные с лечением антибиотиками.
Как правило, используемые эндоспоры также резистентны к используемым антибиотикам. Недостатком этого метода является распространение генов резистнентности к антибиотикам.
Наиболее близкие к настоящему изобретению аналоги из уровня техники основаны на использовании спорогенной бактерии Bacillus coagulans, применяемой в виде пробиотической добавки к корму для животных (WO 93/14187, Adami A. et al., 1993), а также на комбинации пробиотических неспорогенных микроорганизмов Bacillus subtilis и/или Bacillus clausii и спор для использования в фармацевтике, диетологии и/или пищевой промышленности (ЕР 1405641 А2, Dondi G., 2004). Эксперименты, описанные в этих публикациях, обычно являются косвенными: пробиотический эффект исследуется в in vitro экспериментах (ЕР 1107772, Farmer, Sean. Probiotic, lactic acid-producing bacteria and uses thereof 1999) или путем простого измерения положительной прибавки в весе у животных, принимавших участие в эксперименте (Adami, A., et al. (1993) A bacterial strain of the species Bacillus coagulans: its use as a probiotic agent. PCT/EP 93/0030).
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Объектами настоящего изобретения являются штамм микроорганизма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 и его функциональные эквиваленты (эндоспоры, мутанты, результат размножения, производные), а также применение данного штамма в качестве пробиотического агента для антибактериального лечения, для колонизации желудочно-кишечного тракта и стимулирования иммунной системы; а также его использование в качестве пищевой добавки и пробиотической композиции.
Объект настоящего изобретения - Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 - был выделен из фекалий здорового взрослого мужчины. Полученный штамм был выделен в процессе описания микробиологического состава фекалий, в которых проверяли наличие термофильных видов Bacillus sp. Свежий образец фекалий был десятикратно разбавлен 0.9% NaCl раствором и суспендирован.
Полученную суспензию нагревали в течение 15 минут при температуре 85°С с целью выделения вегетативных клеток. Нагретую пробу культивировали в среде с композицией, указанной в Michelson, Т.; Kask, К.; Jõgi, E.; Talpsep, E.; Suitso, I.; Nurk, А. (2006). l(+)-Lactic acid producer Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 and its comparison with Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis DSM 20073. Enzyme and Microbial Tech. Чашки с уровнем инокуляции 100 мкл инкубировали при температуре 55°С в течение 24 часов. Из полученных колоний делали суспензию (0.2% Tween 80) различной концентрации, затем путем ее культивирования в вышеуказанной среде получали очищенную беспримесную культуру Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737.
Культура и морфологические характеристики
Колонии P737 штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL имеют ровные края, выпуклую поверхность и очень вязкую консистенцию. Диаметр бесцветных (без пигмента) колоний составляет около 5 мм. Грамположительные палочкообразные бактерии являются обычно неагрегированными, но в случае стрессорного воздействия также формируются в цепи. Клетки подвижны и формируют субтерминальные эндоспоры.
Физиологические и биохимические характеристики
Рост штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 регистрируется на моносахаридах, таких как глюкоза, галактоза, фруктоза, ксилоза и арабиноза; на дисахаридах, таких как сахароза, мальтоза, лактоза; и на полисахаридах, таких как крахмал. Что касается типа метаболизма, то данный штамм является аэротолерантной молочнокислой бактерией: она ферментирует углеводы в молочную кислоту без высвобождения углекислоты. Благодаря наличию каталазы она толерантна к кислороду.
Температура роста
Штамм Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 регистрируется при широком диапазоне температур, начиная с комнатной до 55°С. Нагревание в течение 40 минут при температуре 85°С не нанесло какого-либо вреда эндоспорам и не повлияло на их развитие.
Распознавание
Штамм Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 был распознан на основе 16S генной последовательности рРНК (GenBank Accession No EF010852). Наиболее близкими к нему были Bacillus smithii R-71170 с 99% соответствия. Bacillus smithii JCM9076 с 96% соответствия и Bacillus eolicus 4-1T с 95% соответствия.
С 19.10.2006 осуществляется депонирование штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 в Коллекции микробиологических штаммов Латвии (MSCL) под номером P737.
Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 предоставляет одну интересную возможность: благодаря типу метаболизма этот штамм резистентен к метронидазолу. Это делает возможным использование штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 без дополнительных маркеров резистентности в лечении инфекций желудочно-кишечного тракта, вызванных Clostridium difficile, так как вышеупомянутая Clostridium difficile является чувствительной к метронидазолу, и этот антибиотик обычно используется для лечения таких инфекций. Дополнительно помимо данного антибиотика вместе со штаммом Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 в принципе возможно использовать другие антибиотики.
Штамм согласно настоящему изобретению используется в следующих целях.
Колонизация желудочно-кишечного тракта с целью антибактериального воздействия.
Clostridium difficile, которая составляет часть нормальной микрофлоры человека, обычно является безвредной. Однако после лечения антибиотиками, которые нарушают баланс микрофлоры желудочно-кишечного тракта, она может вызвать псевдомембранозный колит. С целью избежать пролиферации Clostridium difficile и последующего заболевания следует профилактически колонизировать желудочно-кишечный тракт пробиотическими бактериями, такими как штамм Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, который может выжить в форме эндоспор при лечении антибиотиками.
Колонизация желудочно-кишечного тракта с целью обеспечения резистентности к заболеванию и профилактики бактериальных инфекций.
Инфицирование Salmonella обычно происходит в результате употребления определенной пищи. Бактерии, которые попали в желудочно-кишечный тракт, прикрепляются к стенке кишечника, проникают сквозь нее и с кровью разносятся по всему организму. В печени бактерии размножаются и после этого возвращаются в кишечник, где вызывают диарею. Заболевшие домашние животные и птицы могут заразить человека через яйца и мясо.
Несмотря на то что обычно это заболевание не является опасным для жизни человека (только 2% зараженных людей нуждаются в лечении антибиотиками), более целесообразно профилактически колонизировать желудочно-кишечный тракт человека, домашних животных и птиц штаммом Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, чем позволить им заболеть.
Использование с целью стимулирования иммунной системы.
Содержание животных в санитарных условиях снижает риск возникновения патогенных инфекций. К сожалению, такое содержание имеет негативный побочный эффект: иммунная система привыкает к стерильным условиям и даже случайный контакт с обычно непатогенным микроорганизмом может привести к болезни.
Для того чтобы этого избежать, иммунная система должна постоянно подвергаться воздействию иммуногенов.
Применение эндоспор пробиотических бактерий Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 позволяет поддерживать иммунную систему в постоянной готовности противостоять патогенам.
Использование в качестве пищевой добавки.
Штамм Bacillus smithii TBMI12 MSCL может быть использован в качестве пищевой добавки в форме как вегетативных клеток, так и эндоспор. Вегетативные клетки перед применением должны быть лиофилизированы. Применение штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL в форме эндоспор является предпочтительным, так как это позволяет достигнуть максимального пробиотического эффекта, и в то же самое время эндоспоры могут быть легко сохранены. Предпочтительным является использование эндоспор в форме сухих препаратов. В этом случае по существу нет каких-либо ограничений относительно формообразующего вещества препарата, так как клетки в неактивной форме, такие как эндоспоры, переносят экстремальные условия (высокую концентрацию сахара, низкий рН, долгосрочное хранение, консерванты).
Использование в качестве пробиотических композиций.
Вегетативные клетки или эндоспоры Bacillus smithii TBMI12 MSCL могут использоваться в качестве компонента пробиотических композиций. Формообразующие вещества призваны упростить производство, хранение и применение препарата, а также поддержать пробиотический эффект Bacillus smithii TBMI12 MSCL.
Наружное применение в качестве антибактериального средства.
Антагонизм между бактериями может быть использован с целью гигиенической обработки наружной поверхности организма хозяина от вредоносных бактерий. Следует отметить тот факт, что в отличие от химической или физической стерилизации, которая неизбирательно разрушает всю микрофлору, антагонизм между бактериями действует избирательно. Это означает, что существует возможность подавлять потенциальные патогены, не разрушая нормальную микрофлору.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
4
8
Фиг.1 Количество () Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 (n=5) со среднеквадратической погрешностью в фекалиях хомячков (КОЕ/г) после лечения антибиотиками (ампициллин, 3 мг на хомячка), инокуляция Clostridium difficile VPI 25 10463 (10клеток) и лечение пробиотическим штаммом Bacillus smithii TBMI12 MSCL Р737 (1×10 эндоспор; на 2-й, 3-й и 4-й день).
Фиг.2. Течение инфекционного заболевания, вызванного Salmonella, у мышей. Инфекционное заболевание, вызванное патогенной Salmonella Enteritidis wt у мышей, не подвергавшихся колонизации () и подвергавшихся колонизации () эндоспорами Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, определялось по образцам фекалий, тканям печени или селезенки, культивированным на XLD пластине в соответствии с показателем КОЕ.
8
Фиг.3. Медианные значения количества Clostridium difficile VPI 10463 со среднеквадратической погрешностью в фекалиях тестируемых животных (КОЕ/г). Мыши, получавшие комбинированное лечение метронидазолом и Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 (10) (n=5) (), и мыши, получавшие лечение только метронидазолом (). Значение р на 2-й и 4-й день указывает на статистическую значимость наблюдаемых различий.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Колонизация желудочно-кишечного тракта с целью антибактериального воздействия.
С целью демонстрации в эксперименте in vivo способности Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 успешно колонизировать желудочно-кишечный тракт позвоночных животных в качестве исследуемых животных использовали хомячков (Mesocritus auratus).
5
8
На микрофлору обычных хомячков негативно воздействовали 3 мг ампициллина, который вводили внутрижелудочно. Через 24 часа исследуемых животных инфицировали клетками (10) штамма Clostridium difficile VPI 10463. За два часа до инфицирования части хомячков ввели эндоспоры Bacillus smithii TBMI12 MSCL Р737 (10). Дополнительно та же доза бактерий вводилась той же группе хомячков через 24 и 48 часов. Хомячки, не получавшие штамм Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, а следовательно, не подвергавшиеся колонизации, погибли через 48 часов, тогда как колонизированные хомячки выжили. Колонии Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 все еще существовали в желудочно-кишечном тракте в течение месяца после введения (Фиг.1). Результаты данного эксперимента являются особенно значимыми, так как хомячки особенно подвержены воздействию токсина Clostridium difficile, и эта бактерия (Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737) не является частью их нормальной микрофлоры.
С помощью данного эксперимента мы продемонстрировали, что Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 способна колонизировать желудочно-кишечный тракт в течение длительного периода времени и таким образом предотвращать развитие у хомячков инфекции, вызываемой Clostridium difficile.
2. Колонизация желудочно-кишечного тракта с целью обеспечения резистентности к заболеванию и профилактики бактериальных инфекций.
8
6
Для обеспечения постоянной колонизации желудочно-кишечного тракта мышей (Mus musculus BALB/c) три дозы (10) эндоспор пробиотической бактерии Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 внутрижелудочно вводили каждые 24 часа. На третий день после введения последней дозы исследуемые животные были инокулированы клетками Salmonella Enteritidis wt (10). Через две недели было возможно культивировать клетки Salmonella Enteritidis из образцов тканей печени, селезенки и фекалий только 40% исследуемых животных. 60% исследуемых животных не были инфицированы Salmonella. Контрольная группа не была колонизирована штаммом Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, и ей вводили лишь клетки Salmonella Enteritidis wt. Все мыши этой группы были инфицированы. Течение заболевания было значительно замедлено: у инфицированных мышей, которые были колонизированы штаммом Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, инфицирование было зарегистрировано только на 10 день после инокуляции, тогда как в фекалиях неколонизированных мышей выделить клетки Salmonella Enteritidis можно было уже на первый день после инокуляции. Описанный выше эксперимент проиллюстрирован на Фиг.2. Благодаря более медленному развитию заболевания можно принять меры для борьбы с инфекцией и облегчения патологического состояния. На основе проведенных экспериментов можно сделать вывод, что применение штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 в качестве пробиотического агента позволяет предотвратить развитие инфекционного заболевания, вызываемого Salmonella, и замедлить течение болезни.
3. Использование с целью стимулирования иммунной системы.
8
6
6
С целью стимулирования иммунной системы мышей три дозы (10) эндоспор штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL Р737 внутрижелудочно вводили животным каждые 24 часа. Через четыре часа после введения последней дозы исследуемые животные были инфицированы клетками Salmonella Enteritidis wt (10). Благодаря проведенной ранее стимуляции иммунной системы исследуемые животные не были инфицированы Salmonella. Впервые было возможно обнаружить клетки Salmonella Enteritidis только лишь на 10 день после инокуляции и в фекалиях лишь 10% исследуемых животных. В общем, инфицирование Salmonella произошло лишь у 40% исследуемых животных, колонизированных эндоспорами Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737. Иммунная система животных контрольной группы не подвергалась стимулированию эндоспорами штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, и ей вводились лишь клетки Salmonella Enteritidis wt. (10). 100% этих мышей были инфицированы. Течение болезни также ускорилось: в фекалиях неколонизированных мышей выделить клетки Salmonella Enteritidis можно было уже на первый день после инокуляции.
Соответственно, многократное введение эндоспор пробиотической бактерии штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 эффективно стимулирует иммунную систему для обеспечения надежной защиты от инфекций, вызываемых Salmonella.
4. Использование в качестве пищевой и/или кормовой добавки. Мышей и хомячков кормили эндоспорами Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 в различных дозах и наблюдали их воздействие на животных. В результате эксперимента не было отмечено какого-либо негативного эффекта. В то же самое время положительное воздействие было очевидным: стало возможным восстановить баланс микрофлоры экспериментальных животных, который был нарушен в результате лечения антибиотиками, а исследуемые животные были значительно более резистентными к бактериальным инфекциям желудочно-кишечного тракта, так как эндоспоры Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 заранее стимулировали их иммунную систему.
Соответственно, пробиотическая бактерия штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 подходит для применения в качестве пищевой и/или кормовой добавки.
5. Использование в качестве компонента пробиотических композиций.
6
10
С целью введения эндоспор Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 мышам и хомячкам приготовили пробиотическую композицию из эндоспор Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 и воды, деионизированной в ходе обратного осмоса. В 1 мл раствора пробиотической композиции содержалось от 10 до 10 эндоспор. Это значительно упростило хранение и введение эндоспор.
Благодаря введению композиции, содержащей штамм Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, повысилась резистентность исследуемых животных к бактериальным инфекциям желудочно-кишечного тракта. Соответственно, пробиотическая бактерия штамма Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 подходит для применения в качестве компонента пробиотических композиций.
6. Наружное применение в качестве антибактериального средства.
С целью продемонстрировать антибиоз между Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 и другими бактериями были проведены эксперименты in vitro. В первом эксперименте клетки Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 выращивали в чашках PDA (Fluka) при температуре 55°С и затем радиально вокруг них культивировали бактерии различных видов. В эксперименте использовали Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila, Erwinia carotovora, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcesens, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Skaphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella Typhimurium и Salmonella Enteritidis. Затем чашки инкубировали при температуре 30°С. У 75% видов бактерий, использованных в эксперименте, наблюдалось подавление роста рядом с колонией Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737. Следует отметить, что среди использованных видов бактерий было несколько патогенов, таких как Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus. В то же самое время рост 25% бактерий не подавлялся Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737, включая виды, составляющие нормальную микрофлору, такие как Escherichia coli.
Соответственно, между Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 и другими бактериями имеет место антибиоз, позволяющий наружно применять Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 в антибактериальных целях.
7. Использование пробиотической композиции в сочетании с антибиотиками.
С целью демонстрации позитивного взаимодействия между эндоспорами Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 и антибиотиками авторы провели эксперимент in vivo с мышами (BALB/c).
8
Перед инфицированием токсичным штаммом Clostridum difficile VPI 10643 мышей следовало подвергать 5-дневному лечению цефокситином для того, чтобы ослабить их микрофлору. После инокуляции штаммом Clostridum difficile VPI 10643 мышей разделили на две группы. Первой группе мышей вводили метронидазол для лечения Clostridium difficile (через 24 часа после инокуляции, 15 мкг/кг), второй группе вводили метронидазол в сочетании с эндоспорами Bacillus smithii TBMI12 MSCL Р737 (10эндоспор на каждую дозу антибиотика (15 мкг/кг)).
Эксперимент показал, что в случае, если мыши получали комбинированное лечение (метронидазол + Bacillus smithii TBMI12 MSCL Р737), количество Clostridium difficile в фекалиях снизилось более чем в 10 раз (Фиг.3). Таким образом, введение эндоспор Bacillus smithii TBMI12 MSCL Р737 обладает потенциалом применения в лечении антибиотиками.
Варианты применения настоящего изобретения не ограничены описанными примерами; возможны и другие варианты выполнения изобретения.