Способ борьбы с фузариозом зерновых культур и средство на основе цеолита для его осуществления
METHOD FOR COMBATING FUSARIUM OF GRAIN CROPS AND A ZEOLITE-BASED AGENT FOR ITS IMPLEMENTATION

Группа изобретений относится к сельскому хозяйству, в частности, к средству и способу борьбы с фузариозом зерновых культур, и может найти применение для борьбы с фузариозом при проведении предпосевной обработки семян.
Многие почвенные микромицеты, в том числе представители рода Fusarium, являются возбудителями различных инфекционных заболеваний растений, нанося существенный урон сельскохозяйственному производству, который может достигать 20-50%. Фузарии поражают более 200 видов растений разных семейств. Фузариоз вызывает один из фитопатогенов Fusarium graminearum, который поражает в основном пшеницу, рожь, тритикале и ячмень.
Заражая зерно, Fusarium graminearum вызывает разложение белковых веществ с выделением токсических соединений [Караджова Л.В. / Фузариозы полевых культур. // Кишинев: Штиинца. - 1989. - 255 с.]. Фузариозная корневая гниль вызывает гибель проростков, гниль корней, подземного междоузлия и основы стеблей, угнетение роста растений, гибель продуктивных стеблей, развитие неполноценного колоса с щуплым зерном, полегание [Иващенко В.Г., Шипилова И.П., Назаровская Л.А. / Фузариоз колоса хлебных злаков. // Санкт-Петербург. - 2004. - 164 с.; Кристенсен М.К. / Микрофлора ухудшение качества семян // В кн.: Жизнеспособность семян. М.: Колос, - 1978. - 415 с.]. Помимо потерь, непосредственно связанных со снижением количества и качества урожая, заражение растений возбудителями фузариоза приводит к накоплению в зерне и растительном материале микотоксинов - вторичных метаболитов грибов, представляющих большую угрозу для здоровья и жизни человека и сельскохозяйственных животных.
Различные представители рода Fusarium синтезируют более 100 токсических соединений, основными группами которых являются трихотецены, фумонизины, зеараленон, энниатины. Большинство микотоксинов отличается химической стабильностью и не разрушается в процессе термической обработки. Присутствующие в продуктах питания микотоксины могут вызывать острую интоксикацию, симптомы которой развиваются вскоре после употребления сильно контаминированных продуктов питания и даже могут привести к летальному исходу. Хроническое потребление микотоксинов с продуктами питания может оказывать долгосрочное негативное воздействие на здоровье, в частности, провоцируя онкологические заболевания и иммунодефицит. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной Организации Объединенных Наций (ФАО) четверть производимого в мире урожая зерновых культур загрязнено микотоксинами. На сегодняшний день подтверждением важности изучения и разработки методов борьбы с токсигенными возбудителями фузариоза злаковых являются разработанные Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA) и Комиссией Кодекс Алиментариус (нормативным межправительственным органом по пищевым стандартам) и принятые Европейским союзом правила, регулирующие методы отбора проб и анализов для обязательного контроля микотоксинов в продуктах питания и кормах [Commission regulation (EC) №856/2005 of 6-th June 2005].
Новыми направлениями для борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных растений являются селекционные способы создания растений с заданными характеристиками, включая устойчивость к различным заболеваниям, в том числе к фузариозу. Так, в [WO 2008/087208 А, 24.07.2008] предложены растения кукурузы и способ получения таких растений селекцией по маркерам, вводя в идиоплазму кукурузы набор аллелей, связанных с локусами количественных признаков (QTL), вносящими вклад в экспрессию ряда фенотипических признаков, представляющих экономический интерес. Признаки выбирают из урожайности по зерну, влажности зерна при сборе, раннего и позднего прикорневого полегания, стеблевого полегания, частоты головни обыкновенной, частоты вызванного Fusarium загнивания початков (фузариоза початков), устойчивости к Sulcotrione и строения метелки. Но многие ученые отмечают пластичность генома растений за счет мобильных генетических элементов [В.А. Кунах. Мобильные генетические элементы и пластичность генома растений / Я.Б. Блюм, А.П. Галкин // Цитология и генетика. - 2014. - Т. 48, №2. - С. 83-84]. Кроме того, пластичность проявляется в нестабильности генома на фенотипическом уровне [Анисимова И.Н., Туманова Л.Г., Гаврилова В.А., Дягилева А.В., Паша Л.И., Митин В.А., Тимофеева Г.И. Нестабильность генома межвидовых гибридов подсолнечника // Генетика. - 2009. - Т. 45. - №8. - С. 1067-1077].
8
Средства для профилактики и борьбы с фузариозом могут применяться как путем обработки сельскохозяйственных растений, так и путем протравливания их семян с целью освобождения от спор патогенных грибов. Получили широкое распространение биологические средства защиты сельскохозяйственных культур от фузариоза - живые культуры микроорганизмов, которые подавляют рост патогенных микроорганизмов и оказывают фунгицидное воздействие. На целевом рынке представлено значительное количество биопрепаратов фунгицидного действия, используемых при заболеваниях зерновых, в том числе пшеницы и ячменя фузариозом - Бактофит, СК (Bacillus subtilis, штамм ИПМ 215), производитель ООО ПО «Сиббиофарм», Ризоплан, Ж (Pseudomonas fluorescens, штамм АР-33) ООО «Биопестициды», Трихоцин, СП (Trichoderma harzianum, штамм Г 30 ВИЗР), ООО «АгроБиоТехнология», Фитоспорин-М, ПС (Bacillus subtilis, штамм 26 Д) ООО «БашИнком», Оргамика С (Bacillus amyloliquefaciens, штамм OPS-32), Псевдобактерин, Ж (Pseudomonas aureofaciens, штамм ВКМ В-2391Д). Ассортимент указанных средств неизменно расширяется, например, в [RU 2724464 C1, 23.06.2020] раскрыта группа изобретений - штаммы спорообразующих бактерий-антагонистов с антифузариозной активностью, биопрепарат, включающий комбинацию предложенных штаммов, содержащий не менее 10 КОЕ/г жизнеспособных бактерий-антагонистов, имеющий остаточную влажность не более 10%, способ его получения и способ биологической защиты сельскохозяйственных культур от фузариоза, который включает выделение грибов рода Fusarium из отобранных на полях образцов, отбор наиболее активно подавляющих штаммы грибов рода Fusarium штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов, приготовление биопрепарата и обработку биопрепаратом посевного материала.
Американским заявителем предложены группы изобретений [WO 2013/016361 A1, 31.01.2013], относящихся к биотехнологии и сельскому хозяйству, и эффективных в борьбе с фузариозом злаковых растений, таких как пшеница и ячмень: в [RU 2736382 C2, 16.11.2017] описан выделенный штамм вида Microbacterium NRRL В-50470, обладающий супрессорной активностью против фузариоза, в [RU 2736382 C2, 16.11.2020] - выделенный штамм вида Variovorax sp. NRRL В-50469, обладающий подавляющей активностью в отношении фузариоза, кроме того в указанных источниках раскрываются композиции и способы с использованием указанных штаммов. Способы предотвращения развития фузариоза включают выращивание соответствующего микробного штамма или его культуры в среде для роста или почве растения, а способы обработки против развития фузариоза включают нанесение на растение или на окружающую его среду эффективного количества соответствующего микробного штамма или его культуры. Также предложены композиции для подавления фузариоза, содержащие микробный штамм или его культуру, семя, резистентное к инфекции грибка Fusarium, покрытое составом для покрытия семян, содержащим композицию.
Использование микробного консорциума может привести к более длительному воздействию на полевые культуры, но его недостатки могут включать стресс для растений из-за высокой сложности взаимодействия растений и микробов [Plett J.M., Martin F.M. Know your enemy, embrace your friend: using omics to understand how plants respond differently to pathogenic and mutualistic microorganisms // The Plant Journal. - 2018. - 93(4): 729-746. https://doi.org/10.1111/tpj.13802].
Однако наиболее распространенным способом борьбы с фузариозом в сельском хозяйстве для профилактики и подавления болезней растений, вызванных этим патогеном, продолжает оставаться использование фунгицидов - химических соединений различного механизма действия, которые могут действовать на грибы непосредственно, вмешиваясь в биохимические реакции, происходящие в их клетках, либо блокируя ферменты, управляющие этими реакциями. В качестве фунгицидов могут быть использованы, во-первых, неорганические соединения, в том числе сера (в тонкодисперсном виде) и ее соединения (полиосульфиды кальция и бария), соли металлов (сульфаты, хлориды меди (например, бордоскаяжикость), цинка, алюминия), которые могут быть ядовиты и обладать различной степенью токсичности. Во-вторых, в качестве фунгицидов используются сложные органические соединения. Известно применение для обработки семян, пораженных фузариозом, препаратов, в состав которых входит тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД), класс дитиокарбаматы, например, ядохимикат Тирам (номер CAS137-26-8). Препараты на основе Тирама относятся для человека к 2 и 3 классам опасности. Описаны технические решения [RU 2042326 C1, 27.08.1995; RU 2475025 C1, 20.02.2013] для повышения устойчивости растений к поражению грибковыми заболеваниями на основе препарата фуролан (2-(1,3-диоксоланил-2) фуран). Известно, что фуролан положительно влияет на физиолого-биохимические процессы, увеличивает продуктивность растений пшеницы, повышает устойчивость к неблагоприятным условиям произрастания и поражению фитопатогенами, способствует получению более выровненного по размерам зерна в колосе и синхронизирует его созревание. В [RU 2475025 C1, 20.02.2013] заявлено средство для предпосевной обработки семян зерновых и зернобобовых культур, пораженных фузариозом, содержащее раствор действующего вещества фуролан и аминокислоту метионин при следующем соотношении компонентов, мас. %: фуролан 0,001-0,01; аминокислота метионин 0,005; вода остальное до 100%. Изобретение позволяет улучшить посевные качества семян зерновых и зернобобовых культур, пораженных фузариозом, повысить всхожесть семян на 22-40% и увеличить высоту проростков на 128,6-371,4% и длину корней на 223,5-552,9% в сравнении с контролем. Фуролан относится к третьему классу опасности для человека.
Для применения на колосовых широко распространены фунгициды на основе триазолов, которые ингибируют биосинтез стеролов, нарушая целостность клеточных стенок патогенов, действующими веществами которых являются Флутриафол, Тебуконазол, Тетраконазол, Пропиконазол. Например, известен препарат АМИСТАР ТРИО - трехкомпонентный фунгицид для применения на колосовых, включающий в себя ципроконазол, пропиконазол и азоксистробин. Он эффективен в борьбе с фузариозом колоса, уменьшает риски заражения зерна микотоксинами препарат ОсирисСтар, BASF (действующие вещества эпоксиконазол, метконазол). Согласно независимой оценке (www.ahdb.org.uk) различных действующих веществ в борьбе с фузариозом колоса в европейских странах максимальную эффективность против фузариоза колоса имеет комбинация тебуконазола с протиоконазолом (оба действующих вещества относятся к группе триазолов) [https://www.cropscience.bayer.ru/fusarium, дата обращения 15.10.2021]. Некоторые из них способны ингибировать спорообразование, ослабляя, таким образом, распространение болезни, но, если фитопатогены уже образуют споры на зараженных растениях, данные фунгициды неэффективны [Фунгициды - производные триазола. 24 октября 2011. http://www.agroxxi.ru/]. Триазолы в основном относятся к токсичным веществам. Эпоксиконазол в высоких дозах проявляет канцерогенные свойства. Флутриафол особенно опасен при поступлении через дыхательные пути, может вызвать раздражение кожи. Пенконазол, тебуконазол, ципроконазол, диниконазол, дифеноконазол считаются умеренно опасными или малоопасными для человека и не представляющими серьезной опасности для полезных организмов.
Органические фунгициды специально разработаны для эффективного действия на определенные болезни, механизм их действия на организм человека до конца не изучен, вследствие этого они могут быть гораздо опаснее, чем неорганические фунгициды. Отравление этими препаратами может проявиться впоследствии в виде онкологических или других многочисленных заболеваний, мутаций, поражения плода у беременных и др. Необходимо помнить, что после обработки растений все эти экологически небезопасные вещества, а также продукты их распада способны попасть в трофическую цепь почва - растения - сельскохозяйственные животные - продукция растительного и животного происхождения - человек.
Можно констатировать, что, несмотря на существенное продвижение в области разработок способов борьбы с фузариозом, уменьшение влияния этой губительной болезни на производство и качество зерна пока остается нерешенной проблемой. Следовательно, для повышения продуктивности производства и качества многих зерновых культур существует потребность в поиске новых средств и разработке новых способов борьбы с фузариозом.
Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является расширение арсенала средств, подавляющих рост Fusarium graminearum, являющихся при этом экологически безопасными.
Техническим результатом изобретения является создание неблагоприятных условий для роста Fusarium graminearum под действием щелочной среды, при этом не оказывающее негативного влияния на семена злаковых растений, что приводит к подавлению (ингибированию) роста гриба Fusarium graminearum и повышению качества посевного материала злаковых культур.
Известно, что патогенные бактерии и грибы способны существовать в относительно узком диапазоне рН, изменение концентрации водородных ионов приводит к нарушению метаболизма условно-патогенной микрофлоры и ее гибели [Rothschild L.J., Mancinelli R.L. / Life in extreme environments // Nature. - 2001. - P. 1092-1101; Lowe S.E., Mahendra K.J., Zeikus J.G. / Biology, ecology, and biotechnological application sofanaero bicbacteria adapted to environmental stresses in temperature, pH, salinity, orsubstrates // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 1993. - P. 451-509; Zijlstra H.JP. / Early diagenetic silica precipitation, inrel ationtoredoxbo undariesand bacterial metabolism, in Late Cretaceo us chalk of the Maastrichtian type locality // Geologieen Mijnbouw. - 1987. - P. 343-355; Cotter Pau lD., Colin Hill / Surviving the acid test: responses of gram-positive bacteria to low pH // Microbiology and molecular biology reviews. - 2003. - P. 429-453; Lee Y.J. Miyahara T., Noik T. / Effect of pH on microbial hydrogen fermentation // Journalof Chemical Technology & Biotechnology. - 2002. - P. 694-698]. Поскольку существенное значение на рост микроорганизмов оказывает концентрация водородных ионов, то для борьбы с патогенными грибами необходимо создавать условия для выхода из рН-диапазона, благоприятного для существования, что будет приводить к гибели условно-патогенной микрофлоры [Todar'sonlineTextbook…, 2002, электронный ресурс http://textbookofbacteriology.net].
Влияние различных уровней рН на жизнедеятельность гриба Fusarium была исследована группой ученых (MaitloS. etal. Влияние физиологических факторов на вегетативный рост и споруляцию Fusarium oxysporum f. sp. ciceris // PakJBot. - 2017. - Т. 49 -, С - 311-316). Исследования in vitro проводились в отношении сухого мицелия Fusarium oxysporum f. sp. ciceris по микро- и макроконидии. Данные свидетельствуют о прямой зависимости влияния физиологических факторов на вегетативный рост и споруляцию гриба Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, что значительно варьировал, а также на микро- и макроконидии Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. Результаты показывают, что чем выше рН среды, тем ниже показатели роста грибов рода анаморфных аскомицетовых Fusarium. Оптимальными условия рН для роста грибов Fusarium являются рН 6-8, условия при рН≤5 и рН≤9 являются неблагоприятными для его существования (жизнедеятельности). Таким образом, для подавления роста грибов рода Fusarium необходимо применять такие средства, рН среды которой превышает максимальное значение рН>9 или ниже рН<5.
Техническая проблема решается, и указанный технический результат достигается средством, представляющим собой водную суспензию с рН>9 активированного цеолита Татарско-Шатрашанского месторождения Республики Татарстан, ТУ 2163-001-27860096-2016, при соотношении вода : цеолит 1:1-470 с размером фракции 0,2 мм и при соотношении вода : цеолит 1:6-450 с размером фракции 0,2-0,8 мм.
Заявленное средство получают путем добавления в воду при перемешивании измельченного активированного цеолита Татарско-Шатрашанского месторождения (до значения рН среды более 9), которое достигается при массовом соотношении цеолит : вода не менее 1:1-470 для фракции цеолита с размером частиц 0,2 мм, и при массовом соотношении цеолит : вода не менее 1:6-450 для фракции цеолита с размером частиц 0,2-08 мм.
В качестве активированного цеолита применяют активированный цеолит производства компании «ZEOL», ТУ 2163-001-27860096-2016 активированный цеолит фракции 0,2 мм, и фракции 0,2-0,8 мм. Гранулы светло-серого цвета, белого цвета, без запаха. Производится на основе природных цеолитов породы Татарско-Шатрашанского месторождения и согласно сертификату аккредитации сырья, относится все к I классу применения, т.е. считается пригодным во всех возможных видах использования, нетоксичен, https://zeol.ru/ceolit-aktivirovannyy.
Активированный цеолит эффективный, безопасный, нетоксичный и недорогой материал. Известно, что активированный цеолит положительно влияет на физиолого-биохимические процессы, улучшает качество почв и увеличивает продуктивность растений, повышает устойчивость к поражению фитопатогенами, способствует получению более качественного зерна в колосе и синхронизирует его созревание.
Химический состав активированного цеолита приведен ниже:
Окиси,
Средние значения, % масс.
SiO<sub>2</sub> в т.ч.
65,88
TiO<sub>2</sub>
0,35
Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub>
6,19
Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub>общ.
2,65
MnO
<0,01
СаО
17,16
MgO
1,45
Na<sub>2</sub>O
0,16
К<sub>2</sub>О
1,43
Р<sub>2</sub>О<sub>5</sub>
0,13
Активация цеолита происходит в трехконтурном сушильном барабане при начальной температуре 400°С и конечной - 150-200°С согласно [Иванова Е.Н., и др. Термическая активация цеолитов типа Х // Успехи в химии и химической технологии, Т. XXVI, 2012, N8(137), с. 26-30]. При этом обжиг происходит в мягком режиме без разрушения структуры сырья, вследствие которого продукт приобретает новые качества с повышенными адсорбирующими, каталитическими и ионообменными, а также свойствами раскислителя (нейтрализатора) для повышения уровня pH.
Применение активированного цеолита обусловлено тем, что водная суспензия нативного цеолита при любом разведении не имеет необходимого для подавления роста гриба Fusarium значения рН среды и не превышает значения 9,00 [Чернов А.Н., Афордоаньи Д.М., Халилуллина Г.Р., Газизов Р.Р. / Микробный фон и концентрация водородных ионов нативного цеолита // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. - 2020. - Т 244, - №4. - С. 232-237].
При соотношении цеолит : вода 1:471 для фракции с размером частиц 0,2 мм значение pH по истечении 30 минут снижается до значения менее 9 (рН-8.98), и при соотношении цеолит : вода 1:451 для фракции с размером частиц 0,2-08 мм по истечении 30 минут значение pH суспензии достигает рН-8.97. Таким образом, в суспензиях, где количество воды превышает заявленное, значения рН среды не достигают нужного рН>9, необходимого для ингибирования и подавления роста возбудителя фузариоза зерновых культур.
Не смотря на то, что при соотношении цеолит : вода менее 1:1, например, 1:0,5 для фракции 0,2 мм цеолита, также получают суспензию со значением рН среды более >9 (рН-10,37), в этом случае вся вода впитывается в цеолит и полученное густое средство является непригодным для эффективной обработки зараженных зерен.
Данные, описанные в статьях [Чернов А.Н. и др. Определение оптимальной фракции активированного цеолита по концентрации водородных ионов для изменения реакции среды // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. НЭ Баумана. - 2020. - Т. 244. - №. 4; Чернов А.Н., Афордоаньи Д.М., Валидов Ш.З. Влияние концентрации и времени экспозиции цеолитного раствора на Staphyloccocus Aureus // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2020. - Т. 248. - С. 277-280], подтверждают, что водные растворы активированного цеолита фракции с размером частиц 0,2 мм различной концентрации (от 1:1 до 1:50) имеют значения рН среды больше 10 (рН>10). А также водные растворы с соотношением (от 1:6 до 1:10) активированного цеолита с водой для фракции с размером частиц 0,2-08 мм имеют значения рН среды больше 9 (рН>9). Все другие фракции показывают меньшее значение рН среды.
Дополнительные исследования по разведению суспензий цеолита показывают, что водные растворы активированного цеолита фракции с размером частиц 0,2 мм в воде при любых разведениях от 1:1 до 1:470, и фракции с размером частиц 0,2-0,8 мм в воде при разведениях от 1:6 до 1:450 имеют и значение рН среды больше 9 (рН>9).
Фракции активированного цеолита с размером частиц 0,04, 0,8-2,5 и 2,5-5,0 не позволяют достичь заявляемого технического результата, поскольку водные растворы данных фракций при любом разбавлении не достигают необходимого значения рН<9 [Чернов А.Н., Прищепенко Е.А., Халилуллина Г.Р., Афордоаньи Д.М. Определение оптимальной фракции активированного цеолита по концентрации водных ионов для измерения реакции среды // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Бауманна, 2020, Т. 244, №4, с. 238-242].
Заявляемое средство применяют для ингибирования гриба Fusarium graminearum.
Применение активированного цеолита позволяет эффективнее влиять на ингибирование (рост) гриба Fusarium graminearum за счет образования сильнощелочной среды.
Исследования ингибирующего действия заявляемого средства на Fusarium graminearum проводят по модифицированной методике [Sánchez, M.J., Mauricio, J.E., Paredes, A.R., Gamero, P. AndCortés, D., 2017. Antimicrobial properties of ZSM-5 type zeolite functionalized with silver. Materials Letters, 191, pp. 65-68], с использованием среды Сабуро [NCCLS. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. In Approved Standard-Second Edition. Wayne, Pennsylvania, USA, 2002; pp. 31]. Готовят твердую питательную среду Сабуро по методике [Medentsev A.G., Arinbasarova A.Y. Akimenko V.K. / Biosynthesis of naphthoquinone pigments by fungi of the genus Fusarium // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2005. - 41(5). - pp. 503-507].
Используют культуру Fusarium graminearum (Fusarium graminearum F-1668), выделенную из растений ржи (Secale cereale), взятую из Всероссийской коллекции микроорганизмов. В чашку Петри со штаммом Fusarium graminearum в среде Сабуро добавляют водный раствор заявляемого средства в разных концентрациях (Sabouraud R. Contribution a l'etude de la trichophytie humaine. Etude clinique, microscopiqueetbacterioloqique sur la pluralité des trichophytons de l'homme // Ann. Dermatol. Syphil. - 1892. - Т. 3. - С. 1061-1087). В качестве препарата сравнения используют Пропиконазол, который является триазольнымфунгицидом, применяемый в сельском хозяйстве в качестве системного фунгицида на сельскохозяйственных культурах против несовершенных грибов (базидомицетов, аскомицетов и дейтеромицетов) (https://www.pesticidy.ru/active_substance/propiconazole), а в качестве контроля - дистиллированную воду (Ойлрайт, компании OsmnicsInc, pH - 6,9). Чашки Петри с Fusarium graminearum на среде Сабуро выдерживают при 28°С в течение 7 суток.
На фигуре 1 приведены фотографии образцов: слева - контроль (культура Fusarium graminearum и дистиллированная вода), справа - опытный образец (культура Fusarium graminearum с заявляемым средством при соотношении цеолит : вода 1:10 (фракция цеолита 0,2 мм) с pH-10,25, время культивирования 7 суток при комнатной температуре. В отличие от прозрачного белого (контрольного образца (слева) в чашке с опытным образцом (справа) наблюдают изменение окраски до красно-розовой. На фигуре 2 представлены фотографии этих же образцов - слева контрольный, справа - опытный образцы. На левом фото (контроль) наблюдают характерную для Fusarium graminearum белую окраску гифы гриба. На снимке справа опытного образца гифа гриба практически полностью окрашена в красно-розовый цвет. Изменение окраски опытного образца на фигурах 1 и 2 свидетельствует о биосинтезе Fusarium graminearum окрашенного пигмента аурофузарина, что является основной реакцией грибов на стресс, наблюдаемой в условиях подавления или остановки роста [Medentsev, A.G., Arinbasarova, A.Y. and Akimenko, V.K. / Biosynthesis of naphthoquinonepig ments by fungi of the genus Fusarium // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2005. - 41(5). - pp. 503-507]. Фотографии образцов на фигуре 2 сделаны методом световой микроскопии (Ste REODiscovery V12., Carl Zeiss).
На фигуре 3 показано действие заявляемого средства в соотношении цеолит : вода 1:1 (фракция 0,2 мм) на Fusarium graminearum. Культура Fusarium graminearum выращена в чашке Петри на среде Сабуро в течение 7 дней) с последующим внесением заявляемого средства в соотношении цеолит : вода 1:1 (фракция 0,2 мм) и выдерживанием в течение 24 часов. Белая стрелка указывает на возникновение в чашке пигментации изменения окраски (красно-бордовой), что также подтверждает возникновение стресса у гриба Fusarium graminearum.
Заявляемое средствов соотношении цеолит : вода 1:1-470 (для фракции 0,2 мм) и 1:6-450 (для фракции 0,2-0.8 мм) проверяют на способность к подавлению роста гриба Fusarium graminearum. На фигуре 4 показано действие заявляемого средства (в соотношении цеолит : вода 1:1, 1:5, 1:10 (фракция 0,2 мм)) на Fusarium graminearum в сравнении с препаратом Пропиконазол (эксперимент описан в примере 7) и контролем (дистиллированная вода). Белой стрелкой указана разрастающаяся гифа гриба Fusarium graminearum в среде дистиллированной воды. Черными стрелками показан результат действия Пропиконазола (добавленного локально, без перемешивания), который полностью подавляет рост гриба Fusarium graminearum. Желтыми стрелками продемонстрированы результаты действия заявляемого средства при соотношениях цеолит : вода 1:1, 1:5, 1:10, тоже оказывающего ингибирующее действие на Fusarium graminearum: видно полное подавление роста Fusarium graminearum.
Таким образом, из представленных данных можно сделать заключение, что заявляемое средство - суспензия активированного цеолита ТУ 2163-001-27860096-2016 (фракция 0,2 мм) при концентрации цеолит : вода 1:1-470, и (фракция 0,2-0,8 мм) при концентрации цеолит : вода 1:6-450, с рН>9 ингибируют рост гриба Fusarium graminearum.
Техническая проблема решается, и указанный технический результат также достигается заявляемым способом борьбы с фузариозом зерновых культур, включающим предпосевную обработку семян зерновых культур водной суспензией активированного цеолита (фракция 0,2 мм и 0,2-0,8 мм) с рН средой больше 9, путем полного погружения семян в суспензию.
Полное погружение посадочного материала в суспензию является оптимальным, поскольку применение меньшего количества заявленного средства для предпосевной обработки не позволяет эффективно обработать все семена полностью.
Время обработки не имеет значения, обычно оптимальным и достаточным является 10-15 минут. При более длительном нахождении семян в заявляемом средстве увеличивается влажность посадочного материла, и в случае машинной посадки семян, потребуется значительное количество времени для их просушивания семян [Колесова Т. К. Приемы повышения посевных качеств семян пшеницы // Дисс. на соиск. уч. ст. канд. с-х. наук. Якутск. - 2003].
Предпосевную обработку семян зерновых культур заявляемым средством осуществляют непосредственно перед посадкой в землю при температуре окружающей среды не ниже 7°С.
Преимущественно заявляемое средство готовят непосредственно перед обработкой семян для посадки в землю.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
В качестве семян зерновых культур при реализации заявляемого способа используют семена ячменя и пшеницы, как культур, в наибольшей степени подверженных заражению фузариозом - семена ячменя сорта Раушан (создан в Татарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства - обособленного структурного подразделения Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Казанской научный центр Российской академии наук» (ТатНИИСХ - ОСП ФИЦ КазНЦ РАН), урожай 2015 год, г. Казань) и яровой мягкой пшеницы сорта Казанская 84 (создан в ТатНИИСХ - ОСП ФИЦ КазНЦ, урожай 2020 года, г. Казань).
Семена указанных культур стерилизуют и заражают фузариозом, стерилизацию и заражение осуществляют аналогично [M. Simons, A.J. van der Bij, I. Brand, L.A. de Weger, C.A. Wijffelman, B.J. Lugtenberg et al. / Gnotobiotic system for studying rhizosphere colonization by plant growth-promoting Pseudomonas bacteria // Mol Plant Microbe Interact. - 1996. - 9 (7): 600-7, Sh. Validov, F. Kamilova, B. Lugtenberg / Pseudomonas putida strain PCL1760 controls tomato foot and root rot in stonewool under industrial conditions in a certified greenhouse // Biological Control. - 2009. - Т 48. - №1. - Р. 6-11].
Часть зараженных семян обрабатывают (опыт) путем перемешивания семян с водной суспензией активированного цеолита с рН>9 (фракция 0,2-0,8 мм, при соотношении цеолит : вода 1:50) в течение -15 мин, при температуре не ниже 7°С, в качестве контроля используют дистиллированную воду (Ойлрайт, компании OsmnicsInc, pH - 6,9). Семена опытной и контрольной группы выращивают аналогично [Khan A. Z. et al. Influence of synthetic zeolite application on seed development profile of soybean grown on allophanic soil // Pak. J. Bot. - 2013. - Т. 45. - №. 3. - С. 1063-1068].
Для определения эффективности заявляемого способа проводят сравнительный анализ всхожести обработанных и необработанных семян, а также количественное определение Fusarium graminearum в проросших семенах контрольной и опытной групп методом ПЦР-РВ.
Сравнительный анализ всхожести семян показывает, что заявляемый способ предпосевной обработки семян зерновых культур заявляемым средством приводит к более равномерному и полному прорастанию семян, что особенно заметно в случае пшеницы. Энергия прорастания пшеницы на 7 сутки в контрольном варианте составила 95%, в варианте с активированным цеолитом - 98%. Всхожесть семян с применением заявляемого средства оказалась выше контрольного варианта на 2,04%. На фигуре 5 представлено изображение проросших (на 7 сутки) обработанных (сверху) и необработанных (снизу) зерен пшеницы.
ПЦР-анализ для количественного определения Fusarium graminearum в проросших семенах осуществляют на термоциклере CFX96 (Bio-Rad, США) по ДНК гена β-актина в качестве генетического маркера. Выделение ДНК проводят по методике, описанной в [Sambrook J., Russel D. // Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, USA, 2001]. Для этого проросшие семена ячменя сорта Раушан и яровой мягкой пшеницы сорта Казанская 84, не размораживая, перемалывают в жидком азоте, 100 мг (100 мкл) измельченной биомассы смешивают с 0,5 мл буфера 2% бромида гексадекатриметиламмониума (CTAB; ООО Компания Хеликон, Москва, РФ), 100 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1.4M NaCl и 20 мМ EDTA (ООО Компания Хеликон, Москва, РФ). Смесь инкубируют при 60°С в течение 20 минут и центрифугируют 5 мин при 14.500 об/мин. Супернатант отбирают в новый эппендорф и экстрагируют равным объемом хлороформа. Водную фазу переносят в новую пробирку и добавляют 0,6 объема изопропилового спирта. После тщательного перемешивания ДНК осаждают центрифугированием при комнатной температуре в режиме 5000 об/мин в течение 5 минут. Осадки растворяют в 100 мкл ТЕ с pH 8.0. РНКазу (Sigma-Aldrich ChemieBV), в концентрации 2 мкг/мл добавляют для удаления РНК из препаратов. Препараты ДНК инкубируют при 60°С в течение 30 мин и смешивают с пятью объемами PB буфера и наносят на колонки для очистки ПЦР (Набор Cleanup Standard, Евроген, https://evrogen.ru/kit-user-manuals/BC022.pdf). Дальнейшую обработку ДНК производят строго в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя набора «QIAGEN PCR purificationkit». ДНК была элюирована с колонок 50 мкл EB буфера.
Полученные количественные значения концентрации грибковой ДНК контрольных и опытных групп представлены в таблице, данные которой свидетельствуют, что заявляемый способ предпосевной обработки семян зерновых культур водной суспензией с рН>9 активированного цеолита приводит к снижению концентрации ДНК Fusarium graminearum на 76,0% для пшеницы (0,001075 и 0,000267 ng/μL для контроля и опыта соответственно) и 13,6% для ячменя (0,0051051 и 0,0044101 ng/μL для контроля и опыта соответственно), что свидетельствует об ингибировании и подавлении роста гриба Fusarium graminearum.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами реализации.
Пример 1.
В стакан с магнитной мешалкой засыпают 10 г активированного цеолита («ZEOL» ТУ 2163-001-27860096-2016) фракции 0,2 мм и приливают 100 мл дистиллированной воды (Ойлрайт, компании OsmnicsInc, pH - 6,9), тщательно перемешивают, помещают в прибор Ph-метр Hannaedge (Hanna Instruments) и определяют pH -10.37.
Пример 2.
Пример 2 осуществляют в условиях примера 1, однако используют 1 г цеолита и 470 мл воды. pH - 9.01.
Пример 3.
Пример 3 осуществляют в условиях примера 2, однако используют 471 мл воды. pH - 8,98.
Пример 4.
Пример 4 осуществляют в условиях примера 2, однако используют активированного цеолита («ZEOL» ТУ 2163-001-27860096-2016) фракции 0,2-0,8 мм и добавляют 450 мл воды 1 г. pH - 9,01.
Пример 5.
Пример 5 осуществляют в условиях примера 4, однако используют 451 мл воды. pH - 8,97.
Пример 6.
Зараженные семена пшеницы сорта Казанская 84 (ТатНИИСХ - ОСП ФИЦ КазНЦ, урожай 2020 года, 200 г) полностью погружают в заявляемое средство, полученное по примеру 1, и выдерживают 10-15 минут, достают, высушивают и высаживают в подготовленный грунт. В качестве контроля используют зараженные семена пшеницы сорта Казанская 84, которые погружают в дистиллированную воду на 10 минут, просушивают и высаживают. Энергия прорастания пшеницы на 7 сутки в контрольном варианте составила 95%, в варианте с заявляемым средством - 98%. Всхожесть семян с применением заявляемого средства оказалась выше контрольного варианта на 2,04%.
Таким образом, технический результат, который заключается в подавлении роста гриба Fusarium graminearum, достигается заявленной группой изобретений: эффективным, нетоксичным и экономически выгодным заявляемым средством и экологически безопасным способом, включающим предпосевную обработку семян зерновых культур указанным средством путем полного погружения семян в суспензию. Изобретения позволяют ингибировать рост гриба Fusarium graminearum, уменьшить его количество на 76,0% для пшеницы и на 13,6% для ячменя, повысить качества посевного материала злаковых культур.