Прогресс ДНК-технологий в коневодстве

Следствием чего является увеличение с возрастом живой массы и привыкание животного к отдаче спермы.

Литература

1. Решетникова Н.М. Национальная технология замораживания и использования спермы быков-производителей. -М., 2008. - 160с.

2. Шляпина М.В., Виноградова Н.Д. Характеристика хозяйственно-полезных признаков быков-производителей в ОАО «Невское» // Научное обеспечение развития АПК в условиях реформирования. -Ч.1:Сб. тр. межд. научн,- прак. конф./СПбГАУ. - СПб, 2014. - С. 251 - 254.

УДК 636.1: 575 Доктор с.-х. наук Л.А. ХРАБРОВА

(ВНИИК, khrabrova(S)yandex.ru) Канд. с.-х. наук Е.И. АЛЕКСЕЕВА

ПРОГРЕСС ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ В КОНЕВОДСТВЕ

Генетические маркеры, ДНК-технологии, лошади, маркерная селекция

Очевидные успехи в развитии молекулярно-генетических и информационных технологий в течение последних десятилетий дали мощный старт для изучения геномов сельскохозяйственных животных, что позволило использовать на практике многие достижения маркер-вспомогательной и приступить к геномной селекции.

Генетический прогресс в селекции животных в значительной мере был обусловлен разработкой технологии полногеномного анализа, позволяющей выявлять локализацию генов, детерминирующих качественные и количественные признаки, а затем изучать их влияние на селекционную оценку животных на примере референтных популяций. Молекулярно-генетические технологии позволяют успешно решать задачу повышения эффективности генотипической оценки животных на основе изучения их наследственных задатков и генетико-биохимических механизмов формирования высокой продуктивности. Сегодня ученые ведут исследования, направленные на выявление генов, детерминирующих выраженность селекционируемых признаков. Генетический метод контроля происхождения лошадей уже давно стал обязательным элементом племенной работы, обеспечивающим высокую достоверность родословных племенных животных. Типирование лошадей по локусам микросателлитов ДНК позволяет повысить эффективность генетический экспертизы происхождения практически до 100%, одновременно с этим изучать генетическую структуру и филогенетические связи пород, а также проводить мониторинг гетерогенности популяций [1,2].

Не менее важной задачей является генетическая экспертиза племенной продукции на наличие дефектных генов, обуславливающих наследственные заболевания и снижение жизнеспособности. Сегодня у лошадей уже известны десятки генов, детерминирующих наследственные дефекты и заболевания, и разработаны молекулярно-генетические методы их диагностики. Выявлены ассоциации определенных генов с такими важными показателями работоспособности, как дистанционность и устойчивость рысистого аллюра.

Теоретические основы использования генетических маркеров (""сигналей) в селекции животных были разработаны русским генетиком A.C. Серебровским еще в 30 - 40-х годах прошлого века. Им были сформулированы основные требования, предъявляемые к генетическим маркерам, -альтернативность, конкретная локализация на хромосомах и определенное влияние на изучаемый признак. Современные молекулярно-генетические технологии (включая полногеномное сканирование с использованием чипов разной плотности) позволяют выполнить все эти условия. С их помощью выявлены гены, достоверно влияющие на работоспособность и жизнеспособность лошадей, и у селекционеров уже имеется возможность применять геномную оценку лошадей [3, 4].

Связь между аллельными генами и селекционируемыми признаками животных теоретически возможна через ряд генетических механизмов. Ген, контролирующий образование белка или фермента, в силу своего плейотропного действия может одновременно влиять и на формирование полезного признака. Плейотропное действие гена может проявляться и как результат вторичного

влияния выработанного под его контролем белка на отдельные биохимические и физиологические процессы в организме животного. Ввиду постоянства такой связи плейотропный эффект представляет большую ценность для практической селекции. Маркерные гены могут непосредственно детерминировать синтез белка (гормона, фермента), определяющего продуктивные качества, или находиться в одной группе сцепления с генами, определяющими хозяйственно-ценные признаки. В настоящее время исследователями активно ведется поиск генов-кандидатов, сцепленных с количественными признаками (()ЬТ). Например, полиморфизм в локусе миостатина (М8Т1Ч) ассоциирован с дистанционностью лошадей чистокровной верховой породы [5], а ген БМЯТЗ определяет склонность лошади двигаться иноходью или рысью [3].

При помощи модельного анализа было установлено, что отбор животных по генетическим маркерам эффективен даже при отсутствии плейотропии и сцепления. Последующие исследования подтвердили, что такие корреляции могут быть постоянными в ряде поколений, если они поддерживаются отбором, подбором и закрепляются инбридингом. В любом случае даже временные связи маркерных генов с хозяйственно- полезными признаками могут быть использованы в племенной работе с конкретными популяциями животных.

Благодаря быстрому внедрению ДНК-технологий и успешной работе по изучению генома лошади, общее число определяемых у лошадей маркерных генов уже превысило несколько сотен, что позволяет надежно контролировать значительную часть ее генома. Более того, систематическое тестирование всего поголовья лошадей основных заводских пород создает реальную основу для внедрения генетического мониторинга и других методов маркерной селекции в практику коневодства [6,7,8].

На основании обобщения результатов собственных исследований и анализа многочисленных публикаций по изучению и использованию полиморфизма структурных генов и участков ДНК (8ТЯ. 8ЫР) лошадей, а также общей стратегии использования генетических маркеров в животноводстве были сформулированы основные направления использования маркерной селекции в коневодстве:

1. Изучение генетической структуры и филогенеза пород и популяций лошадей, включая оценку степени разнообразия и определение генетического сходства.

2. Проведение генетического мониторинга в породах лошадей, сохранение оригинальности и гетерогенности аллелофонда малочисленных пород.

3. Совершенствование метода линейного разведения, включая генетическую оценку степени дифференциации генеалогической структуры породы, определение генетического сходства с родоначальником.

4. Контроль применения родственного разведения, включая мониторинг за нарастанием гомозиготности и оценку результатов инбридинга.

5. Селекция по маркерам, ассоциированным с хозяйственно-полезными признаками.

6. Диагностика наследственных дефектов и заболеваний, в том числе 8СГО, СА, НУРР, 1ЕВ. ОВЕБ, ОЬ\¥8 и другие.

7. Геномная селекция.

В отличие от ряда других отраслей животноводства, в которых широко практикуется крупномасштабная селекция, при племенной работе в коннозаводстве традиционно применяется индивидуальная система отбора и подбора, что является важной предпосылкой для внедрения методов маркер-вспомогательной селекции в повседневную коневодческую практику.

Генетические маркеры оказались незаменимым материалом для выявления диапазона популяционной и видовой изменчивости, изучения филогенеза, степени генетического сходства и последующей микроэволюции пород лошадей. Благодаря многолетней работе лаборатории генетики ВНИИ коневодства по генетической сертификации лошадей, проведена паспортизация всех отечественных конских пород по системам крови и микросателлитной ДНК. Среди всех изученных популяций своей генетической обособленностью как структурных генов, так и микросателлитной ДНК заметно выделялась орловская рысистая порода, представленная на дендрограмме (рис. 1) центральной ветвью. Популяционный анализ подтвердил генетическую самобытность большинства конских пород и филогенетические связи между ними.

Изучение особенностей ядерной и митохондриальной ДНК лошадей разных пород и стран, а также найденных останков древних лошадей, позволили прояснить многие важные вопросы эволюции эквидов. В частности, была выявлена высокая вариабельность митохондриальной ДНК,

свидетельствующая о наличии у домашних лошадей нескольких диких предков и существовании разных регионов одомашнения, одним из которых является территория Западной Сибири между Уральскими горами и рекой Обь.

Чистокровная арабская Ахалтекинская Чистокровная верховая Тракененская Русская рысистая Стандартбредная Французская рысистая Орловская рысистая Хакасская лошадь Забайкальская Алтайская Вятская Бу рятская Мезенская Тувинская

0,0

0,2 0,3 0,4 0,5

0,6 0,7

0.1

0.8

Рис. 1. Дендрограмма генетических дистанций между породами лошадей по локусам микросателлитов

ДНК

Изучение генетических особенностей лошадей заводских и локальных пород лошадей стало основой для разработки методов генетического мониторинга в коневодстве. Мониторинг дает возможность дополнить традиционную селекцию новыми технологиями и позволяет вести отбор и подбор не только на фенотипическом, но и на генотипическом уровне. Одна из основных задач генетического мониторинга - это поддержание в породах генетического разнообразия, что является необходимым условием для творческой селекционной работы. Проведенный генетический мониторинг аллелофонда заводских пород лошадей показал, что за два десятилетия в большинстве пород наблюдалась тенденция снижения генетического разнообразия, что подтверждает динамика средних показателей уровня полиморфности и степени гетерозиготности полиморфных систем крови [8]. Проведенный анализ показал, что низкий уровень генетической изменчивости ассоциируется с пониженными показателями плодовитости кобыл, поэтому потеря части аллелофонда в последующем может иметь непредсказуемые и негативные последствия для селекции.

Основным методом совершенствования пород лошадей является разведение по линиям, при этом традиционные зоотехнические методы оценки дифференциации сложившейся генеалогической структуры могут быть дополнены полученной генетической информацией. Изучение генетической структуры основных заводских пород лошадей по структурным генам показало наличие четко выраженных межлинейных различий по наличию и частоте встречаемости отдельных аллелей исследуемых локусов [1]. Использование полиморфных локусов систем крови и микросателлитов ДНК при изучении генетических особенностей внутрипородных структур дает селекционерам дополнительную и весьма ценную информацию о степени генетического различия (или сходства) мужских и женских линий и позволяет наполнить родословную конкретной генетической информацией, которая может быть творчески использована при подборе и отборе.

Необходимо отметить, что разведение по линиям пока еще сводится к разведению по родословным. Как указывал Д.А. Кисловский (1965), большее или меньшее насыщение родословной кличками определенных животных не всегда соответствует их фактическому влиянию на пробанда, то есть обязательно необходимо принимать во внимание вероятностный характер коэффициентов, характеризующих степень генетического сходства на основании степени родства. Генетические маркеры являются именно тем критерием, который позволяет решать две важнейшие проблемы инбридинга: проводить оценку результатов родственного разведения по фактическому

генотипическому сходству с инбридируемым предком и контролировать уровень гомозиготности у инбредных животных. При изучении влияния родственного разведения на гомозиготность орловских рысаков было установлено, что увеличение степени инбридинга не всегда сопровождается увеличением гомозиготности инбредных лошадей по полиморфным системам крови [8]. Тенденция нарастания гомозиготности была отмечена только при близкородственном спаривании при коэффициенте инбридинга 5,0% и выше, фактически на границе проявления инбредной депрессии (рис. 2).

—♦— Жеребцы —Ш- - Матки

•- - молодняк

- порода

40%

38%

36%

£ 34%

о

S

2

Л 32%

v

а

> 30% 28% 26%

> ! • « »

As / \ Ц ч. /./ v-N

* / \ ts-S . - V / / V t

V > ♦ î.

•

О 0,1-1,0 1,1-2 2,1-3,0 3,1-4,0 4,1-5,0 5,1-6,0 6,1-7,0 7,1 иболее

уровень инбридинга

Рис. 2. Степень гомозиготности лошадей орловской рысистой породы с разным уровнем инбридинга

Несомненным достижением современной генетики является разработка методов ДНК-типирования десятков наследственных заболеваний лошадей, таких как тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID), мозжечковая атаксия (СА), несовершенный эпителиогенез (JEB), гиперкалимический паралич (HYPP) и другие, как правило, вызванные различными дефектами нормальных генов [9, 10].

По имеющимся сведениям, практически у всех видов сельскохозяйственных животных 1-2% новорожденных имеют наследственные аномалии, и при отсутствии генетического контроля и селекции животных этот показатель будет иметь тенденцию к увеличению. По расчетам ученых в популяциях должно присутствовать до 600-700 скрытых летальных генов, генетическая природа большинства из которых еще не выявлена. В коневодстве заметный урон воспроизводству наносят ранняя эмбриональная смертность и аборты, а также крипторхизм жеребцов, наследственную обусловленность которых подтверждают факты их более частой встречаемости при инбридинге.

Получены данные, что многие локусы, обеспечивающие поддержание гомеостаза и работу иммунной системы, характеризуются наличием нескольких аллелей, различающихся по своему генетическому коду и функциям. Уже выявлены гены, ассоциированные со многими заболеваниями лошадей, такими как навикулярная болезнь, остеохондроз, респираторный синдром, лимфоденома и другие [5, 10].

Благодаря появлению технологии полногеномного сканирования и чипов высокой плотности (Illumina 50К, 54К. 70К SNP) ученым удалось выявить локализацию генов, определяющих многие селекционируемые признаки, включающие скаковую и спортивную работоспособность лошадей [4,

Таблица 1. Список однолокусных дефектов и болезней лошадей, тестируемых в лабораториях

№ п/п Название Клинические признаки заболевания Тип наследования

1 Тяжелый комбинированный иммуноде-фицит (SCID) Гибель жеребят в возрасте 2-4 месяцев от любой инфекции в результате потери защитных свойств лейкоцитов Аутосомный рецессивный

2 Церебральная абиотрофия (CA) Нарушение координации движений у жеребят, начиная с 3-4 недель после рождения Аутосомный рецессивный

3 Лавандовый синдром жеребят (LFS) Розовый оттенок волоса новорожденных жеребят, припадки, аномальные движения, повышенный тонус головы, шеи и спины Аутосомный рецессивный

4 Переодический паралич (HYPP) Слабость мускулатуры, периодические спазмы и параличи Аутосомный доминантный

5 Гиперэластичная кутикула, синдром Эларса-Данлоса (HERDA) Растягивающийся и легко рвущийся с образованием ран и язв кожный покров Аутосомный рецессивный

6 Дефицит гликоген-ветвящегося фермента (GBED) Аборты, рождение мертвых и слабых жеребят, гипотермия, аномальное функционирование мышц и органов, гипогликемия Аутосомный рецессивный

7 Несовершенный эпителиогенез (JEB) Врожденное отсутствие кожи на некоторых участках тела, воспаление слизистых оболочек Аутосомный рецессивный

8 Летальная белая масть (OL WS) Гибель белых и пегих жеребят в первые 48 часов от интоксикации Аутосомный рецессивный

9 Рабдомиолиз (RER) Дезинтеграция поперечно-полосатых мышц с выделением миоглобина в мочу Аутосомный рецессивный

10 Полисахаридная миопатия (PS SM) Слабость и атрофия мышц, аномальные движения при нагрузке после нескольких дней отдыха Аутосомный доминантный

Как показали исследования, одним из генов, влияющих на скаковую работоспособность лошадей, является ген миостатина (MSTN), локализованный в 18-й хромосоме. Этот ген является регулятором клеточного роста и дифференциации тканей и действует как супрессор. Поэтому отдельные мутации в локусе MSTN обусловили усиленное формирование мышц у мясных пород крупного рогатого скота, овец, свиней и бойцовских собак. У лошадей было выявлено три замещающие однонуклеотидные мутации этого гена, среди которых наиболее значимой оказалась С/Т замена в экзоне 1, ассоциированная с дистанционными способностями у представителей чистокровной верховой и многих других пород. Лошади с генотипом С/С хорошо скакали на короткие дистанции, тогда как скакуны с генотипом Т/Т демонстрировали хорошие стайерские способности. Коневладельцы получили реальную возможность генотипировать своих лошадей по гену MSTN и оптимизировать программы тренинга и участия в призах с учетом их дистанционного потенциала.

Шведскими исследователями (Andersen L.S. et al., 2012) был идентифицирован локус, детерминирующий способность лошади двигаться иноходью. Оказалось, что тип трехопорного аллюра зависит от мутации в гене DMRT3, локализованной в хромосоме 23. Данная рецессивная мутация выявлена у лошадей всех пород, где встречаются иноходцы, включая американскую рысистую, исландскую, перуанского naco и других. На основании этих исследований разработан тест для определения предрасположенности и устойчивости рысаков к движению на рыси или иноходи. Возможность детекции этой мутации представляет интерес для селекции лошадей многих пород, где особо ценятся иноходцы, более удобные для всадника при верховой езде.

Немецким исследователям из Ганновера удалось выявить локализацию генов, определяющих спортивную работоспособность лошадей. Оказалось, что конкурные качества лошадей статистически значимо зависят от генов, локализованных в хромосомах 1, 8, 14, 16, 17 и 23, тогда как способность к выездке определяют гены 1, 3, 5, 16 и 17 хромосом.

К поиску генов, ассоциированных со спортивными способностями лошадей, подключились и французские генетикии S. Brand и А. Ricard (2013), которыми было проведено полногеномное тестирование 1010 спортивных лошадей 4 разных пород. Детальный генетико-математический анализ позволил идентифицировать «конкурный» ген RYR2, локализованный в хромосоме 1, и показал, что тестирование лошадей модели по этому локусу дает определенный селекционный эффект. С использованием ассоциативного анализа было доказано, что гены, расположенные на хромосомах 11 и 16, ассоциированы с конкурными качествами лошадей, но при этом прослеживалось и определенное влияние породных особенностей.

Успешное развитие технологий генной диагностики и биоинформатики обусловило развитие новой технологии, которая получило название геномная селекция. Геномная селекция - это метод, основанный на использовании полиморфизма нуклеотидов как маркеров для определения генотипической ценности животного. Только в начале XXI века, когда были созданы генетические анализаторы с массовым параллельным синтезом и SNP-чиповые технологии, удалось реализовать на практике весь потенциал ДНК-маркеров. Сегодня этот метод, включающий полногеномное тестирование животных по нескольким тысячам нуклеотидов с помощью специально разработанных чипов и последующее сопоставление полученных результатов с данными референтной популяцией, уже широко практикуется для оценки генетической ценности быков-производителей во многих странах с развитым молочным скотоводством.

Первая попытка использования геномной селекции в коневодстве была предпринята немецкими исследователями Haeerland A.M. et al. (2012) на примере лошадей спортивных пород. Известно, что селекционные программы пород лошадей характеризуются длинными интервалами смены поколений и недостаточно оптимальной селекционной интенсивностью вследствие недостатка селекционных критериев для молодых лошадей. Оценка селекционной ценности (EBVs), включающая информацию о работоспособности самой лошади и качестве ее потомства, в лучшем случае возможна, когда она достигнет возраста 8-12 лет. Это свидетельствует о перспективности внедрения метода геномной селекции в коневодстве, тем более что уже разработаны SNP- чипы малой и высокой плотности (ЗК, 9К, 17К, 35К, 50К, 54К, Equine SNP70K). Геномное тестирование лошадей становится практически доступным для заводчиков при стоимости 139 € (Dr. Van Harrigen Mark laboratorium b.v).

На результативность геномной селекции влияет ряд факторов и, прежде всего, точность племенной оценки (BV), размер референтной популяции, количество маркеров, ассоциированных с локусами количественных признаков (QTR), характер наследования и генная архитектура признаков. При этом маркеры должны находиться в неравновесии по сцеплению с локусами количественных признаков, а число используемых маркеров должно значительно превышать число особей в контрольной выборке. В настоящее время наиболее используемая на практике математическая модель -это геномный наилучший линейный несмещенный прогноз (G-BLUP).

По общему мнению многих исследователей (Haeerland A.M. et al., 2012; Mickelson J.R. et al., 2012; Ricard A et al., 2012; Signer-Hasler H. tt al., 2012; Mark T., 2013), дополнительная генетическая информация значительно увеличивает точность селекционной ценности молодых не испытанных лошадей, а также взрослых лошадей, не имеющих оцененного потомства. Поэтому геномная селекция дает возможность проводить отбор в раннем возрасте, сократить интервал смены поколений и ускорить генетический прогресс при совершенствовании спортивных пород лошадей.

Литература

1. Храброва JI.A. Теоретические и практические аспекты генетического мониторинга в коневодстве: Автореф. дис ... доктора с.-х. наук. - Дивово, 2011. - 38 с.

2. Эрнст, JI.K., Зиновьева H.A. Биологические проблемы животноводства в XXI веке.: М., 2008. - 508 с.

3. Andersson L.S. , Larhammar L.S., F. Memic F. et al. Mutations in DMRT3 affect locomotion in horses and circuit function in mice // Nature. 2012. - N 488. - P. 642- 646.

4. Haberland A.M., Konig von Borstel U., Simianer H., Konig S. Integration of genomic information into sport horse breeding programs for optimization of accuracy of selection // Animal. - 2012. - Vol.6. - N 9. - P.1369-1376.

5. Hill E.W., Gu J., McGivney B.A. et al. Targets of selection in the Thoroughbred genome contain exercise-relevant gene SNPs associated with elite racecourse performance // Animal Genetics. - 2010. - Vol. 41, Suppl. 2. - P.56-63.

6. Калашников, В.В., Храброва JI.A., Зайцев А.М. и др. Изучение полиморфизма сателлитной ДНК лошадей заводских и местных пород // Доклады РАСХН. - 2010. - № 6. - С. 48-50.

7. Храброва JI.A. Мониторинг генетической структуры пород в коневодстве // Доклады РАСХН. - 2008. -№3. - С.42-44.

8. Храброва JI.A., Блохина Н.В., Устьянцева АВ. Инбридинг и степень гомозиготности микросателлитных локусов у лошадей орловской рысистой породы // Сельскохозяйственная биология. -2014.-№4.-С.35-41. '

9. Храброва JI.A. Стратегия использования генетических маркеров и геномной селекции в коневодстве. -Дивово, 2015.-81 с.

10. Nicolas F.W., Hobbs М. Mutation discovery for Mendelian traits in non-laboratory animals: a review of achievements up to 2012 / F.W Nicolas., // Animal Genetics. - 2014. - Vol. 45. - N 2. -P.157-170.

УДК 636.393.9 Канд. биол. наук В.Б. ЛЕЙБОВА

МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ У КОЗ ЗААНЕНСКОЙ ПОРОДЫ В ПЕРВУЮ ТРЕТЬ СУКОЗНОСТИ

Козы, первая треть беременности, критический период, адаптация

Отраслевая целевая программа «Развитие овцеводства и козоводства в Российской Федерации на плановый период до 2020 года» предполагает увеличение поголовья коз до 2,6 млн. гол. Из них молочных - до 1,4 млн. гол. Для реализации намеченной цели необходима разработка современных технологий воспроизводства коз на основе знаний биологии, в частности, особенностей биохимических процессов, сопровождающих внутриутробное развитие у коз.

Известно, что одной из актуальных проблем высокопродуктивного молочного скотоводства является способность адаптироваться к изменениям, происходящим в организме животных во время беременности [1,2]. Все этапы репродуктивной функции обусловлены как генетически наследуемыми причинами, так и влиянием внешней среды, и обеспечивают для каждого периода свой уровень обменных процессов. Однако адаптационные процессы, позволяющие поддерживать состояние метаболического гомеостаза в организме высокопродуктивных коз зааненской породы в период сукозности, изучены недостаточно, что вызывает затруднения при анализе причин, приводящих к эмбриональной смертности, абортам и появлению нежизнеспособного потомства. По данным исследований, проводимых в течение 8 лет ветеринарными диагностическими лабораториями Калифорнии [3], инфекционное начало как причина абортов у коз было обнаружено в 37% случаев, ещё у 4% абортированных животных предполагалось присутствие бактериального агента. Нарушение минерального обмена и аномалии развития плода составляли 4% и 6% соответственно, в 49% случаев аборта причина не была установлена. Всё это дает основания полагать, что изменение состояния обмена веществ у высокоудойных коз может быть фактором, негативно влияющим на поддержание беременности. В этой связи определялись биохимические показатели крови, которыми обычно пользуются в хозяйствах для контроля кормления и состояния здоровья животных. Динамика этих показателей позволяет судить о течении обменных процессов в период беременности и выявить критические моменты, при которых стрессовые ситуации любой этиологии могут спровоцировать функциональные срывы, проявляющиеся различными видами акушерской патологии.

Исследования проводили в ЗАО ПЗ «Приневское» Ленинградской области в зимний период. Объектом исследования служили козы в возрасте 2-5 лет со среднегодовой продуктивностью 780 кг за 305 дней лактации. Кровь отбирали однократно через 10-56 дней после осеменения и спустя 3-4 часа после кормления. В пробах сыворотки крови определяли содержание белка и его фракций (альбумина и глобулина), глюкозы, мочевины, креатинина, холестерина, активность ферментов аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ). гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ) и креатинкиназы (КК), а также концентрацию прогестерона.

Биохимические показатели крови исследовали на автоматическом анализаторе RX Daytona при