Способ обследования детей с подозрением на синдром Алажилля
METHOD FOR EXAMINING CHILDREN WITH SUSPECTED ALAGILLE SYNDROME

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии при диагностике врожденных заболеваний, и может быть использовано для ранней диагностики синдрома Алажилля у детей.
Синдром Алажилля (артериопеченочная дисплазия) - генетически детерминированное, мультисистемное аустосомно доминантное заболевание, связанное с мутациями, в большей степени, в гене JAG1 (более 90%) и NOTCH2 (1%), характеризующееся патологией печени, сердца, глаз, почек, центральной нервной системы, уха и имеющее характерные фенотипические особенности.
Распространенность синдрома Алажилля от 1:70000 живорожденных детей с учетом наличия у ребенка явной патологии печени до 1:100000 живорожденных, однако имеются случаи рождения в семье детей, с преобладанием кардиальных и костных проявлений без явной патологии печени.
Классическая диагностика синдрома Алажилля основана на сочетании так называемых «больших критериев», которым относятся: патология печени, особенности фенотипа, патология сердца, изменения скелета, патология глазного аппарата и другие, к которым можно отнести патологию почек, поджелудочной железы.
Патология печени при синдроме Алажилля характеризуется проявлениями неонатального холестаза с гипербилирубинемией преимущественно за счет прямой его фракции, ахолией/гипохолией стула вследствие билиарной недостаточности и значительным снижением количества поступающей в кишечник желчи из-за гипоплазии внутрипеченочных желчных протоков. Патология печени при этом заболевании встречается более чем в 95% случаев. Высокая концентрация желчных кислот в гепатоцитах приводит к их гибели, а повышенное содержание компонентов желчи в плазме крови, с последующим накоплением в коже, способствует возникновению мучительного кожного зуда.
Проявление таких клинических симптомов как желтуха и кожный зуд наблюдаются на первом году жизни. В биохимических анализах крови, кроме гипербилирубинемии с преобладанием прямой его фракции, отмечается повышение цитолитической активности, повышение уровня гаммаглютамилтранспептидазы (ГГТ), вырабатываемой эпителием внутрипеченочных желчных протоков в ответ на раздражающее действие желчных кислот, щелочной фосфатазы (ЩФ), холестерина. В возрасте первых трех месяцев жизни может повышаться уровень α-фетопротеина (АФП), являющегося маркером пролиферации желчных протоков. При морфологическом исследовании ткани печени детей раннего возраста определяется малочисленность внутрипеченочных желчных протоков и их пролиферация, которая может быть расценена как следствие портального воспаления, что и приводит, зачастую, к неправильной диагностике билиарной атрезии и последующему проведению операции по Касаи (что является прогностически неблагоприятным при синдроме Алажилля). Всем детям, которым была проведена портоэнтеростомия, в конечном итоге осуществлялась трансплантация печени. Частота необходимости проведения трансплантации печени была выше (100% против 20,0%) и смертность (60,0% против 10,0%) были значительно выше в тех случаях, где была проведена операция по Касаи в младенческом возрасте вследствие ложной информативности морфологического исследования ткани печени по сравнению с теми случаями, где оперативное вмешательство не проводилось. Исследование по изучению частоты встречаемости дуктопении у детей разного возраста показало, что в первые 6 месяцев жизни она выявляется в 60% случаев, а в возрасте старше 6 месяцев - в 95% случаев, что свидетельствует о более низкой информативности морфологического исследования ткани печени с целью диагностики синдрома Алажилля в неонатальном периоде, чем у детей более старшего возраста. Исходом заболевания является формирование вторичного билиарного цирроза печени и необходимость проведения ее трансплантации, однако это наблюдается в 15% случаев.
Известен способ диагностики наследственных нарушений обмена, приводящих к развитию неонатальной гипербилирубинемии. Предлагается тест-система, представленная набором олигонуклеотидов, позволяющих выявлять точковые мутации в генах FAN SERPINA1, которые вызывают соответственно тирозинемию 1 типа и недостаточность альфа-1-антитрипсина. Описан способ детекции указанных точковых мутаций, предусматривающий проведение двухраундной мультиплексной ПЦР с использованием соответствующих наборов специфических праймеров и гибридизацию полученных ПЦР-продуктов с биочипом, содержащим тест-систему (Патент РФ №2458131).
Как правило, исследования, проводимые с целью установления диагноза, проходят в несколько этапов - пошаговая диагностика.
Известен способ пошаговой диагностики и дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний у детей [Бегайдарова Р.Х., Стариков Ю.Г., Алшынбекова Г.К., Балтынова Р.З., Дюсембаева А.Е. Диагностика и дифференциальная диагностика инфекционных заболеваний у детей. Учебное пособие. - 2014. - Гэотар-Медиа. - 140 с.] Недостатком способа является применение его при инфекционных заболеваниях у детей, а не с целью диагностики генетически детерминированных заболеваний у детей.
Известен способ пошаговой диагностики вторичных лицевых болей (заявка №2012106346 от 22.02.2012 г.) на патент на изобретение Российской Федерации), заключающийся в детальном стоматологическом и неврологическом клиническом обследовании пациента, изучении биоэлектрической активности жевательных мышц, функционального состояния височно-нижнечелюстного сустава, окклюзионных взаимоотношений зубов, биоэлектрической активности сердца с последующим анализом вариабельности сердечного ритма, что позволяет выявить этиологический фактор возникновения вторичных лицевых болей, провести дифференциальную диагностику и выявить сочетанные патологии.
Недостатком способа является использование его при лицевых болях у взрослых пациентов, а не при генетически детерминированных заболеваниях у детей.
Известна пошаговая диагностика анемий, помогающая врачу быстро определиться с направлением обследования пациента и тактикой его ведения на основании оценки параметров, получаемых с помощью современных гематологических анализаторов. Шаг первый - взятие крови с определением среднего объема эритроцитов в кубических микрометрах и среднего содержания гемоглобина в одном эритроците, шаг второй - оценка гематокрита, шаг третий - оценка количества гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, шаг четвертый: оценка эритроцитарных индексов (Селиванов Е.В., Звягинцев Е.Н. Диагностика анемий по результатам анализов, выполненных на современных гематологических анализаторах // Вестник «Лаборатории ДНК-диагностики». – 2010. - №2. - С. 9-12).
Этот способ пошаговой диагностики анемии выбран нами в качестве прототипа.
Задачей изобретения является разработка способа пошаговой диагностики синдрома Алажилля у детей с помощью многофакторного статистического анализа клинико-диагностических показателей.
Техническим решением поставленной задачи является разработка алгоритма ранней диагностики синдрома Алажилля у детей для своевременного назначения специфической терапии с целью предупреждения развития цирроза печени.
Сущность способа заключается в том, что 1-м шагом в алгоритме диагностики является обнаружение клинической симптоматики у детей в возрасте первых трех-пяти месяцев жизни - сочетание низкой массы тела при рождении и длительного, более 2-х недель, желтушного периода, а у детей в возрасте старше 6-ти месяцев наличие дополнительно таких симптомов, как кожный зуд, гепато/гепатоспленомегалия. ахолия/гипохолия стула, таким детям проводят биохимический анализ крови для определения признаков холестаза, таких как прямая гипербилирубинемия, умеренная цитолитическая активность, повышение уровня холестерина, что определяют как 2-й шаг в диагностике синдрома Алажилля; при выявлении признаков холестаза проводят ультразвуковое исследование органов брюшной полости, что определяют как 3-й шаг в алгоритме диагностики синдрома Алажилля, и при обнаружении таких изменений органов брюшной полости как неоднородность печеночной паренхимы и утолщение стенок внутрипеченочных желчных протоков, для исключения врожденных пороков развития сердечно-сосудистой системы, почек и скелета проводят ультразвуковое исследование сердца и рентгенографию грудопоясничного отдела позвоночника, что определяют как 4-й шаг диагностики синдрома Алажилля, а, при выявлении изменений со стороны сердечно-сосудистой системы, скелета и почек проводят молекулярно-генетическое исследование, что определяют как 5-й шаг в алгоритме диагностики синдрома Алажилля.
За период с 2006 года по 2015 гг. под наблюдением находились 17 детей (10 мальчиков и 11 девочек) с синдромом Алажилля - сплошное исследование пациентов, поступивших в гастроэнтерологическое отделение с гепатологической группой ФГАУ «Научный центр здоровья детей» Минздрава России (ФГАУ НЦЗД МЗ РФ), зав. отделением - д.м.н., проф. А.С. Потапов.
Диагноз был установлен на основании клинико-лабораторных и инструментальных данных и подтвержден результатами молекулярно-генетического исследования.
Проводилось изучение анамнеза жизни и анамнез болезни пациентов, оценивались результаты клинико-лабораторных исследований в дебюте заболевания по месту жительства, при первичной госпитализации в ФГАУ НЦЗД МЗ и в динамике.
При первой госпитализации проводилась оценка показателей биохимического анализа крови. Для оценки степени нарушения функции печени оценивались показатели: уровень аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), коэффициента де Ритиса, билирубина, глюкозы, альбумина, холестерина, лактата, аммиака, мочевины, трансферрина, церулоплазмина, протромбина по Квику, фибриногена, характеризующих роль печени в обмене белков, жиров и углеводов; [патент №2473904 от 27.01.2013], гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП), щелочной фосфатазы (ЩФ).
Статистическая обработка данных была проведена в операционной среде Windows ХР с использованием компьютерных программ Microsoft Excel 2010 и пакета статистического анализа данных SPSS Statistic (version 20) и StatSoftStatistica (версия 6,0). Количественные переменные описывались числом пациентов (n), средним арифметическим значением (М), m - стандартная ошибка среднего. Использовались непараметрические методы статистики. При анализе выборок, не подчиняющихся закону нормального распределения, использовали непараметрический метод-критерий Манна-Уитни. Различия между величинами считали статистически значимыми при p<0,05.
Анализ диагностической значимости клинико-лабораторных показателей в дебюте заболевания в зависимости от возраста при оптимальном сочетании чувствительности и специфичности осуществляли методом многофакторного статистического анализа и построения ROC-кривых. Количественная интерпретация ROC-анализа оценивалась по показателю AUC (area under curve) - численное значение клинической значимости диагностического теста. По экспертной шкале для значений AUC показатель в пределах 0,5-0,6 свидетельствует о неудовлетворительном качестве диагностического теста, в пределах 0,6-0,7 - о среднем качестве диагностического теста, в пределах 0,7-0,8 - о хорошем качестве диагностического теста, в пределах 0,8-0,9 - очень хорошем, 0,9-1,0 - отличном качестве диагностического теста. Информативность показателя оценивалась по величине площади под кривой и считалась достоверной при AUC>0,6.
Возраст на момент обследования в клинике составлял 44,2±13,2 мес (от 31 до 57,4 мес = 2,5-5 лет). При этом дебют заболевания приходился на первые 3 месяца жизни, а в последующем у половины детей проводились оперативные вмешательства, обусловленные подозрением на атрезию желчных протоков.
Многофакторный статистический анализ показал, что задержка внутриутробного развития - низкий вес при рождении при нормальном гестационном сроке - отмечалась у 70,0% детей с синдромом Алажилля. В дебюте заболевания в 91,5% случаев у детей первых 3-х месяцев жизни отмечалась желтуха (с чувствительностью 87,5% и специфичностью 100%, <0,0001). Диагностическая значимость затянувшейся желтухи в диагностике синдрома Алажилля у детей в возрасте первых трех месяцев жизни представлена на Фиг. 1.
Гепато- или гепатоспленомегалия у детей первых 3-х месяцев жизни при синдроме Алажилля обнаруживалась лишь в 9,5% случаев, что не позволяет считать этот клинический признак специфическим для дебюта данного заболевания. В возрасте первых 3-х месяцев жизни характерные для синдрома Алажилля признаки дизморфизма - гипертелоризм, острый подбородок, широкая переносица - обнаруживались лишь в 9,5% случаев, что также не позволяет считать их значимыми для данного возраста. Ссылок на кожный зуд в первые 3 месяца жизни нет, однако в 9,5% случаев имелись указания на беспокойство ребенка во сне. Незначительная частота встречаемости этого клинического признака в возрасте первых трех месяцев жизни не позволяет считать его значимым в дебюте заболевания. Клинически значимые проявления кожного зуда определялись у детей старше 6 месяцев жизни (чувствительность 100%, специфичность 75%, р=0,0027), Диагностическая значимость зуда в диагностике синдрома Алажилля у детей в возрасте 6 месяцев и старше представлена на Фиг. 2.
В 19% случаев имел место эпизодически появляющийся ахоличный стул в возрасте первых трех месяцев жизни (специфичность 100%, чувствительность 80%, р=0,0001),
Диагностическая значимость ахолии стула в диагностике синдрома Алажилля в возрасте первых трех месяцев жизни представлена на Фиг. 3.
Явления гепатомегалии были диагностически значимыми у детей старше 6 мес.
При анализе показателей биохимических анализов крови обнаруживаются признаки холестаза, характеризующиеся повышением уровня холестерина до 6,62±0,5 ЕД/л, ГГТП до 139±24 ЕД/л, щелочной фосфатазы до 385±41 ЕД/л ЕД/л, общего билирубина до 86±30,4 мкмоль/л и прямой его фракции до 47,3±16 мкмоль/л (>50%). Отмечалось повышение цитолитической активности с преобладанием ACT над АЛТ: уровень АЛТ повышался до 128±20,6 ЕД/л, ACT - до 210±64 ЕД/л.
При проведении УЗИ органов брюшной полости выявлялось повышение эхогенности паренхимы печени и неоднородность ее эхоструктуры (специфичность 50,0%, чувствительность 78,9%). В 95,2% случаев диагностировался врожденный порок сердца, верифицированный при эхокардиографии.
При поступлении в гастроэнтерологическое отделение с гепатологической группой в возрасте 44,2±13,2 месяцев жизни у всех детей выявлялось отставание физического развития. У 5 из 21 ребенка (24%) имела место желтушность кожи (специфичность 93,7%, чувствительность 40,0%), а у 4 пациентов (19%) - иктеричность слизистых оболочек, и у 12 детей (57,0%) отмечался кожный зуд (специфичность 22%, чувствительность 91%). У 5-х пациентов (24,0%) отмечался осветленный стул (специфичность 40%, чувствительность 93,7%). Функция печени была снижена на 20,9±2,1%.
При проведении УЗИ печени и билиарной системы наиболее выраженные изменения у детей проявлялись в виде повышения эхогенности паренхимы (чувствительность 78,95%, специфичность 50%) и утолщение стенок внутрипеченочных желчных протоков (чувствительность 94,7%, специфичность 50,0%).
Диагностическая значимость изменений гепатобилиарной системы при ультразвуковом исследовании у детей с синдромом Алажилля представлена на Фиг. 4.
При биохимическом исследовании крови отмечалось незначительное повышение цитолитической активности (до 3-4 верхних границ нормы), имелись признаки холестаза, характеризующиеся повышение уровня холестерина до 6,6±0,5 ммоль/л, ГГТП - до 149,3±28,1 Ед/л. Общий билирубин был повышен до 56,7±17,9 мкмоль/л, при этом отмечалось повышение уровня прямого билирубина до 31,6±11,4 мкмоль/л, а в 9 случаях 0(42,8%) прямая фракция билирубина преобладала над непрямой. По результатам коореляционного анализа получена корреляция, значимая на уровне 0,01 между ГГТ и ЩФ, что указывает на повышение уровня ЩФ за счет холестатического компонента, нежели за счет проявлений дефицита витамина Д на фоне мальабсорбции.
Способ осуществляется следующим образом: у детей в возрасте первых трех месяцев жизни, сочетание низкой массы при рождении и длительным (более 2-х недель) желтушным периодом, а у детей в возрасте старше 6-ти месяцев - присоединение таких симптомов как кожный зуд, гепато/гепатоспленомегалия, ахолия/гипохолия стула, - могут быть дебютом синдрома Алажилля, расцениваются как первый шаг в алгоритме диагностики этого заболевания и служат показанием для проведения второго шага - биохимического анализа крови, в котором определяются признаки холестаза: преимущественно прямая гипербилирубинемия, умеренная цитолитическая активность, повышение уровня холестерина. Характерные черты фенотипа начинают проявляться по мере созревания костей лицевого скелета, поэтому рассматривать их как диагностические целесообразно в более старшем возрасте.
При выявлении в биохимическом анализе крови вышеуказанных изменений требуется проведение третьего шага в алгоритме дигностики синдрома Алажилля - ультразвукового исследования органов брюшной полости. При синдроме Алажилля по данным УЗИ отмечается неоднородность печеночной паренхимы и утолщение стенок внутрипеченочных желчных протоков. Обнаруженные при УЗИ изменения органов брюшной полости обусловливают необходимость проведения 4-го шага в алгоритме диагностики синдрома Алажилля - исключение врожденных пороков развития сердечно-сосудистой системы, почек и скелета. Для этого проводится УЗИ сердца и рентгенография грудо-поясничного отдела позвоночника для исключения характерных костных изменений. При выявлении сочетания данных симптомов проводится проведение пятого шага в диагностике синдрома Алажилля - проведение молекулярно-генетического исследования.
Алгоритм пошаговой диагностики синдрома Алажилля у детей представлен на Фиг. 5.
Пример клинического осуществления способа
Пример 1. Мальчик А., 1 год. Родился на нормальном сроке гестации с весом 2000 г. С рождения затяжная желтуха, гипохоличный стул. В 2 мес эпизод кровотечения из мест инъекция, стул ахоличный. В возрасте 4 мес ребенок беспокойно спал. При внешнем осмотре обращала н себя внимание желтушность кожных покровов, широко посаженные глаза, треугольное лица. Данные клинические проявления расценены как 1-й шаг в алгоритме диагностики и обусловили необходимость проведения 2-го шага - лабораторные исследования - клинический анализ крови и биохимический анализ крови. Было выявлено повышение уровня общего билирубина до 90,4 мкмоль/л, прямого билирубина до 45 мкмоль/л, уровень АЛТ был повышен до 150 ед/л, ACT - до 180 ед/л.
Учитывая выявленные клинико-лабораторные изменения, ребенку были проведены исследования, относящиеся к 3-му шагу алгоритма диагностики: УЗИ органов брюшной полости, по результатам которого выявлены признаки утолщения внутрипеченочных желчных протоков. По данным УЗИ сердца обнаружен дефект межжелудочковой перегородлки.
Учитывая вышеуказанные изменения был выполнен 5-й шаг в алгоритме диагностики - проведение молекулярно-генетического исследования, при котором обнаружена мутация в гене JAG1 в гомозиготном состоянии, что подтвердило наличие синдрома Алажилля. Был установлен диагноз: синдром Алажилля.
Способ позволяет начать диагностическое обследование детей на ранний стадиях заболевания, уже на 1 уровне оказания медицинской помощи в условиях первичного звена здравоохранения. Своевременная диагностика синдрома Алажилля и раннее начало специфической терапии позволяют профилактировать инвалидность и смертность вследствие синдрома Алажилля у детей.
Способ позволяет проводить отбор пациентов для дорогостоящих молекулярно-генетических исследований, что максимально уменьшает материальные затраты при проведении диагностики, а с учетом редкой частоты встречаемости заболевания позволит не проводить эти исследования пациентам, не нуждающимся в них.