СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ГИПОФОСФАТАЗИИ (ГФФ) У ВЗРОСЛЫХ И ПОДРОСТКОВ
METHODS FOR TREATMENT OF HYPOPHOSPHATASIA (HPP) IN ADULTS AND ADOLESCENTS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
В раскрытии предложены способы лечения гипофосфатазии (ГФФ).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Гипофосфатазия (ГФФ - HPP - hypophosphatasia) - это редкое наследственное заболевание скелета с частотой 1 случай на 100000 новорожденных для наиболее тяжелых форм заболевания. Расстройство возникает в результате мутаций, приводящих к потере функциональности, в гене, кодирующем неспецифическую для ткани щелочную фосфатазу (ТНЩФ - TNLAP - tissue nonspecific alkaline phosphatase). ГФФ характеризуется значительным спектром симптомов и тяжести, от рахита до почти полного отсутствия минерализации костей в утробе матери.
Проявление ГФФ варьирует среди пациентов и варьирует в зависимости от возраста пациента. У большинства пациентов с ГФФ наблюдаются изменения скелета, низкий рост, хроническая боль, боль в нижних конечностях, нарушение походки и преждевременная атравматическая потеря зубов. Например, общие симптомы у взрослых с ГФФ могут включать остеомаляцию, плохо минерализованные кости, повышенный уровень неорганического пирофосфата (нПФ - PPi inorganic pyrophosphate) в крови и/или моче, пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф - PLP pyridoxal 5'-phosphate) или фосфоэтаноламина (ФЭА - PEA - phosphoethanolamine), гипоминерализацию, гиперкальциурию, низкий рост, скелетную деформацию, переваливающуюся походку, боль в костях, переломы костей, отложение кристаллов дигидрата пирофосфата кальция, артрит и пирофосфатную артропатию. Общие симптомы у подростков с ГФФ могут включать повышенные уровни нПФ, ФЭА или П5Ф в крови или моче, остеомаляцию, скелетную деформацию, гипотонию, мышечную слабость, ревматоидные осложнения, артрит, псевдоподагру, переваливающуюся походку, трудности при ходьбе, боль в костях, боль, раннюю потерю зубов, гипоминерализацию, легочную гипоплазию, дыхательную недостаточность, судороги, гиперкальциурию, низкий рост и задержку роста.
Из-за физических нарушений, связанных с ГФФ, у взрослых пациентов, страдающих от ГФФ, часто наблюдается снижение способности ходить по сравнению со здоровыми субъектами (Weinstein RS, Whyte MP, Arch Intern Med. 1981;141(6): 727-731). Взрослые пациенты с ГФФ могут страдать от болезни отложения пирофосфата кальция (CPPD), псевдоподагры, хондрокальциноза, кальцифицированного периартрита, переломов позвоночника, подвертельных переломов, переломов плюсневой кости и/или псевдо-переломов (Coe JD, et al., J Bone Joint Surg Am. 1986;68(7):981-990; Sutton, RAL, et al., J Bone Miner Res. 2012; 27(5): 987-994). Другие симптомы, такие как рахит, рахитические ребра, тяжелая гипоминерализация, задержка развития, задержка моторного развития, недостаточный набор веса, легочная гипоплазия, дыхательная недостаточность, нарушение дыхания, краниосиностоз (включая осложнения краниосиностоза) и судороги, возникают у маленьких детей или у детей с ГФФ, но не у взрослых с ГФФ.
Примечательно, что эффективность и безопасность лечения ГФФ, в частности, специфических физиологических и физических нарушений и снижения способности к ходьбе, связанных с формами ГФФ взрослых и подростков, с использованием терапевтических средств в течение длительного периода времени, неизвестны. Таким образом, существует потребность в способах, которые можно использовать для лечения и мониторинга ГФФ у взрослых и подростков в течение продолжительных периодов времени, чтобы эти пациенты могли жить с облегченными физическими и физиологическими нарушениями и могли восстанавливать соответствующие уровни способности ходить.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Раскрыты (1) способы идентификации взрослых, имеющих ГФФ (например, взрослых, имеющих ГФФ в возрасте около 18 лет или старше, таких как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) и/или подростков, имеющих ГФФ (например, подростков, имеющих ГФФ в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) для лечения с помощью растворимой щелочной фосфатазы (рЩФ - sALP - soluble alkaline phosphatase; например, SEQ ID NO: 1) и (2) лечение таких пациентов с помощью рЩФ. Симптомы взрослой формы ГФФ, как определено в данном документе, включают, например, повышенный уровень фосфоэтаноламина (ФЭА) в крови и/или моче, гипоминерализацию, гиперкальциурию, скелетную деформацию, переваливающуюся походку, костную боль, перелом кости, отложение кристаллов пирофосфата кальция дигидрата, артрит, пирофосфатную артропатию, хондрокальциноз, кальцифицирующий периартрит, и псевдоперелом. Симптомы подростковой формы ГФФ, как определено в данном документе, включают, например, повышенные уровни нПФ, ФЭА или П5Ф в крови или моче, остеомаляцию, одну или более деформацию скелета, гипотонию, мышечную слабость, ревматоидные осложнения, артрит, псевдоподагру, переваливающуюся походку, трудности при ходьбе, боль в костях, боль, раннюю потерю зубов, гипоминерализацию, легочную гипоплазию, дыхательную недостаточность, судороги, гиперкальциурию, низкий рост и задержку роста.
Типовые метрики, полезные для оценки необходимости или эффективности лечения с использованием рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) включают (1) концентрации нПФ и П5Ф в плазме, (2) тест 6-минутной ходьбы (6MWT), (3) тест Брюинкса-Озерецкого на Оценку Моторики 2-е издание (BOT-2), (4) Динамометрию с использованием Портативных устройств (HHD), (5) Шкалу Функций Нижних Конечностей (LEFS) и (6) Краткий Опросник Оценки Боли (BPI-SF). Дополнительные тесты и метрики могут включать Тест Тинетти - Оценку Мобильности, Ориентированной на Результативность (POMA; при необходимости, модифицированный) и программное и аппаратное обеспечение для анализа пространственно-временных характеристик походки, такое как GAITRITE (Clinical Image Retrieval System Inc.). Способы дополнительно включают использование одного или более из описанных показателей (например, BOT-2, 6MWT, концентрации нПФ и П5Ф в плазме, HHD, LEFS или BPI-SF) по отдельности или в комбинации для оценки эффективности лечения с использованием рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) для пациента с ГФФ, у которого улучшения относительно определенного показателя или значения демонстрируют, что рЩФ эффективен для лечения ГФФ. Кроме того, уровень активности ЩФ в образце (например, образце плазмы) пациента, имеющего ГФФ, также можно использовать отдельно или в комбинации с одним или каждым из этих показателей для оценки эффективности лечения рЩФ (например, SEQ ID). NO: 1) пациента. Кроме того, способы дополнительно включают изменение дозировки и/или частоты рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) введение для определения эффективного количества рЩФ для назначения взрослому человеку, имеющему ГФФ (например, взрослому, имеющему ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подростку, имеющему ГФФ.
В первом аспекте описан способ лечения ГФФ у пациента с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, в возрасте около 18 лет или старше (например, у человека), характеризующийся наличием симптомов ГФФ взрослой формы, который включает введение рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) пациенту в режиме лечения, обеспечивающем от около 1 мг/кг/неделя до около 9 мг/кг/неделя, предпочтительно 6 мг/кг/неделя, рЩФ в течение периода лечения, по меньшей мере, двух недель (например, по меньшей мере, трех недель, по меньшей мере, четырех недель, по меньшей мере, пяти недель, по меньшей мере, шести недель, по меньшей мере, семи недель, по меньшей мере, восьми недель, по меньшей мере, девяти недель, по меньшей мере, десяти недель, по меньшей мере, трех месяцев, по меньшей мере, четырех месяцев, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шести месяцев, по меньшей мере, семи месяцев, по меньшей мере, восьми месяцев, по меньшей мере, девяти месяцев, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, в по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет или, по меньшей мере, десяти лет или в течение жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель). Предпочтительно, взрослый пациент является таковым, который не проходил лечение (т.е. не проходивший лечение) в отношении лечения с помощью рЩФ. В частности, рЩФ содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1 (например, асфотаза альфа). Введение рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) приводит к одному или более из следующего: (i) статистически значимому снижению концентрации нПФ в образце плазмы пациента, по меньшей мере, на около 1 мкМ по отношению к концентрации нПФ в образце плазмы субъекта с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходившего лечение в возрасте около 18 лет или старше; (ii) статистически значимому снижению концентрации П5Ф в образце плазмы пациента, по меньшей мере, на около 100 нг/мл относительно концентрации П5Ф в образце плазмы субъекта с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходившего лечение в возрасте около 18 лет или старше; и (iii) статистически значимому увеличению дистанции ходьбы пациента, по меньшей мере, на 50 метров, согласно оценке 6MWT, относительно расстояния ходьбы за 6 минут у пациента, которому не проводили введение. Кроме того, может быть увеличение активности ЩФ в образце (например, образце плазмы) после введения рЩФ (например, SEQ ID NO: 1).
В результате применения этих способов, поддерживается снижение концентрации нПФ в образце плазмы пациента (например, пациента с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходившего лечение, в возрасте около 18 лет или старше), снижение концентрации П5Ф в образце плазмы пациента, и/или увеличение расстояния ходьбы пациента в течение периода лечения, по меньшей мере, двух недель (например, по меньшей мере, трех недель, по меньшей мере, четырех недель, по меньшей мере, пяти недель, по меньшей мере, шести недель, по меньшей мере, семи недель, по меньшей мере, восьми недель, по меньшей мере, девяти недель, по меньшей мере, десяти недель, по меньшей мере, трех месяцев, по меньшей мере, четырех месяцев, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шести месяцев, по меньшей мере, семи месяцев, по меньшей мере, восьми месяцев, по меньшей мере, девяти месяцев, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет или, по меньшей мере, десяти лет или в течение жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель).
Перед введением рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) пациент (например, пациент с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходивший лечение, в возрасте около 18 лет или старше) может характеризоваться как имеющий концентрацию нПФ в плазме до около 6 мкМ (например, около 3,5 мкМ, около 4 мкМ около 4,5 мкМ, около 5 мкМ или около 5,5 мкМ или концентрацию нПФ в плазме в диапазоне от около 3,5 мкМ до около 6 мкМ), концентрацию П5Ф в плазме до 1300 нг/мл (например, концентрацию П5Ф в плазме около 200 нг/мл, 300 нг/мл, 400 нг/мл, 500 нг/мл, 600 нг/мл, 700 нг/мл, 800 нг/мл, 900 нг/мл, 1000 нг/мл, 1100 нг/мл, 1200 нг/мл или 1300 нг/мл или концентрацию П5Ф в плазме в диапазоне от около 200 нг/мл до около 1300 нг/мл) и/или расстояние ходьбы в течение шести минут около 350 м или менее (например, расстояние ходьбы в течение шести минут около 50 метров, 75 метров, 100 метров, 125 метров, 150 метров, 175 метров, 200 метров, 225 метров, 250 метров, 275 метров или 350 метров или расстояние ходьбы в течение шести минут в пределах от около 50 метров до около 350 метров). После введения рЩФ в течение периода лечения снижение концентрации нПФ в образце плазмы от пациента может составлять, по меньшей мере, около 2 мкМ (например, у пациента обнаруживается концентрация нПФ в плазме в диапазоне от около 2 мкМ до около 5 мкМ после введения рЩФ), снижение концентрации П5Ф в образце пациента составляет, по меньшей мере, около 200 нг/мл (например, у пациента обнаруживается концентрация П5Ф в плазме в диапазоне от около 2 нг/мл до около 150 нг/мл после введения рЩФ), и/или проявляется увеличение расстояния ходьбы в течение шести минут, по меньшей мере, на 100 метров или более (например, у пациент демонстрирует расстояние ходьбы в течение шести минут около 420 метров или более после введения рЩФ). У пациента также может проявляться снижение зависимости от вспомогательного устройства для мобильности (например, ходунки, инвалидное кресло, ортодонтические скобы, костыли и ортопедические приспособления) и/или снижение частоты переломов (например, перелом позвоночника, субтрохантерный перелом или перелом плюсневой кости) после введения рЩФ (SEQ ID NO: 1). Лечение пациентов с помощью рЩФ может быть исключено для пациентов в случае, например, уровней кальция в сыворотке ниже диапазона здорового субъекта (например, от около 8,5 до около 10,2 мг/дл), уровней фосфата в сыворотке ниже диапазона здорового субъекта (например, от около 2,5 до около 4,5 мг/дл), уровней витамина D в сыворотке ниже диапазона здорового субъекта (например, около 20 нг/мл), креатинина в сыворотке выше диапазона здорового субъекта (например, около 0,6 мг/дл до 1,2 мг/дл) и/или уровней гормона околощитовидной железы выше диапазона здорового субъекта (например, от около 10 до около 65 пг/мл).
Второй аспект относится к способу лечения ГФФ у пациента в возрасте около 13 лет или старше (например, у человека), который включает введение рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) пациенту в режиме лечения, обеспечивающем от около 1 мг/кг/ неделю до около 9 мг/кг/неделя, предпочтительно 6 мг/кг/неделя, рЩФ в течение периода лечения, по меньшей мере, двух недель (например, по меньшей мере, трех недель, по меньшей мере, четырех недель, по меньшей мере, пяти недель, по меньшей мере, шести недель, по меньшей мере, семи недель, по меньшей мере, восьми недель, по меньшей мере, девяти недель, по меньшей мере, десяти недель, по меньшей мере, трех месяцев, по меньшей мере, четырех месяцев, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шести месяцев, по меньшей мере, семи месяцев, по меньшей мере, восьми месяцев, по меньшей мере, девяти месяцев, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, в по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет или, по меньшей мере, десяти лет или в течение жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель). Пациент может представлять собой такового, который не проходил лечение, в отношении лечения с помощью рЩФ. В частности, рЩФ содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1 (например, асфотаза альфа). Введение рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) приводит к одному или более из следующего: (i) изменению процента (%) прогнозируемой оценки HHD у пациента на около 5% или более (например, на около 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% или более) по отношению к прогнозируемой оценке HHD % у пациента до лечения с помощью рЩФ; (ii) изменению показателя LEFS пациента на около 3 или более (например, на около 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более) относительно показателя LEFS пациента до лечения с помощью рЩФ; и (iii) изменению показателя BPI-SF у пациента на около - 2 или более (например, на около - 2, около - 3, около - 4, около - 5, около - 6 или около - 7 или более) относительно показателя BPI-SF у пациента до лечения с помощью рЩФ.
В первом или втором аспекте рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) может быть введена один или более раз в день, неделю, месяц или год (например, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю или семь раз в неделю). В частности, рЩФ может быть введена в виде нескольких доз два дня в неделю, три дня в неделю, четыре дня в неделю, пять дней в неделю, шесть дней в неделю или семь дней в неделю. Например, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) вводят в начальной дозе от около 2,1 мг/кг/неделя до около 3,5 мг/кг/неделя (например, начальная дозировка от около 0,3 мг/кг/день до около 0,5 мг/кг/день рЩФ) и впоследствии увеличивают до дозы около 6 мг/кг/неделя или более (например, 9 мг/кг/неделя). В частности, начальная доза может быть увеличена после периода лечения, составляющего по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года или по меньшей мере, четыре года или более (например, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет, по меньшей мере, десять лет или более десяти лет, например, на протяжении всей жизни пациента). Кроме того, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) может быть введена в дозировке около 1,3 мг/кг/неделя, около 2,7 мг/кг/неделя или около 6 мг/кг/неделя или более (например, около 9 мг/кг/неделя), например рЩФ вводят в дозировке около 2 мг/кг три раза в неделю, около 3 мг/кг два раза в неделю, около 3 мг/кг три раза в неделю или около 1 мг/кг шесть раз в неделю. Кроме того, рЩФ может быть введена один раз в день подряд или через день. Кроме того, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) может быть введена в количестве, которое является терапевтически эффективным для лечения по меньшей мере, одного симптома взрослой формы ГФФ (например, одного или более из повышенных уровней фосфоэтаноламина (ФЭА) в крови и/или моче, гипоминерализации, гиперкальциурии, скелетной деформации, переваливающейся походки, боли в костях, перелома костей (например, перелома позвоночника, субтрохантерного перелома или перелома плюсневой кости), отложения кристаллов дигидрата пирофосфата кальция, артрита, пирофосфатной артропатии, хондрокальциноза, кальцифицированного периартрита и псевдоперелома).
В первом или втором аспекте рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) вводят в композиции, содержащей, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент, такой как физиологический раствор или хлорид натрия и фосфат натрия. Например, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент содержит 150 мМ хлорида натрия и 25 мМ фосфата натрия. Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить подкожно, внутримышечно, внутривенно, перорально, назально, сублингвально, интратекально или внутрикожно. В частности, фармацевтическая композиция вводится подкожно.
Третий аспект относится к рЩФ, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (например, асфотаза альфа) для лечения гипофосфатазии (ГФФ) у пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходивших лечение, в возрасте около 18 лет или старше (например, у человека). В частности, рЩФ приготовлена для введения пациенту в режиме лечения, обеспечивающем от около 1 мг/кг/неделя до около 9 мг/кг/неделя, предпочтительно 6 мг/кг/неделя, рЩФ в течение периода лечения, по меньшей мере, двух недель (например, по меньшей мере, трех недель, по меньшей мере, четырех недель, по меньшей мере, пяти недель, по меньшей мере, шести недель, по меньшей мере, семи недель, по меньшей мере, восьми недель, по меньшей мере, девяти недель, по меньшей мере, десяти недель, по меньшей мере, трех месяцев, по меньшей мере, четырех месяцев, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шести месяцев, по меньшей мере, семи месяцев, по меньшей мере, восьми месяцев, по меньшей мере, девяти месяцев, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, в по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет или, по меньшей мере, десяти лет или в течение жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель). рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) характеризуется тем, что введение рЩФ пациенту приводит к одному или более из следующего: (i) статистически значимому снижению концентрации нПФ в образце плазмы пациента, по меньшей мере, на около 1 мкМ по отношению к концентрации нПФ в образце плазмы субъекта с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходившего лечение, в возрасте около 18 лет или старше; (ii) статистически значимому снижению концентрации П5Ф в образце плазмы пациента, по меньшей мере, на около 100 нг/мл относительно концентрации П5Ф в образце плазмы субъекта с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходившего лечение в возрасте около 18 лет или старше; и (iii) статистически значимому увеличению дистанции ходьбы пациента, по меньшей мере, на 50 метров, согласно оценке 6MWT, относительно расстояния ходьбы за 6 минут у пациента, которому не проводили введение.
В третьем аспекте рЩФ может характеризоваться снижением концентрации нПФ в образце плазмы пациента (например, пациента с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходившего лечение, в возрасте около 18 лет или старше), снижение концентрации П5Ф в образце плазмы пациента, и/или увеличение расстояния ходьбы пациента в течение периода лечения, по меньшей мере, двух недель (например, по меньшей мере, трех недель, по меньшей мере, четырех недель, по меньшей мере, пяти недель, по меньшей мере, шести недель, по меньшей мере, семи недель, по меньшей мере, восьми недель, по меньшей мере, девяти недель, по меньшей мере, десяти недель, по меньшей мере, трех месяцев, по меньшей мере, четырех месяцев, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шести месяцев, по меньшей мере, семи месяцев, по меньшей мере, восьми месяцев, по меньшей мере, девяти месяцев, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет или, по меньшей мере, десяти лет или в течение жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель).
В третьем аспекте, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) может характеризоваться тем, что перед введением рЩФ пациент (например, пациент с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходивший лечения, в возрасте около 18 лет или старше) имеет концентрацию нПФ в плазме около 6 мкМ, концентрацию П5Ф в плазме до 1300 нг/мл и/или пешее расстояние в течение шести минут около 350 метров или меньше. В частности, рЩФ характеризуется тем, что снижение концентрации нПФ в образце плазмы пациента составляет, по меньшей мере, около 2 мкМ (например, у пациента наблюдается концентрация нПФ в плазме от около 2 мкМ до около 5 мкМ после введения рЩФ), снижение концентрации П5Ф в образце пациента составляет, по меньшей мере, около 200 нг/мл (например, у пациента наблюдается концентрация П5Ф в плазме от около 2 нг/мл до около 150 нг/мл после введения рЩФ), и/или введение рЩФ в течение периода лечения, составляющего, по меньшей мере, один год, приводит к увеличению расстояния ходьбы за шесть минут, по меньшей мере, на 100 метров или более (например, пациент демонстрирует расстояние ходьбы за шесть минут, составляющее около 420 метров или более после введения рЩФ). У пациента также может проявляться снижение зависимости от вспомогательного устройства для мобильности (например, ходунки, инвалидное кресло, ортодонтические скобы, костыли и ортопедические приспособления) и/или снижение частоты переломов (например, перелом позвоночника, субтрохантерный перелом или перелом плюсневой кости) после введения рЩФ (например, SEQ ID NO:). 1).
В третьем аспекте, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) может быть приготовлена для введения один или более раз в день, неделю, месяц или год (например, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю или семь раз в неделю). В частности, рЩФ может быть приготовлена для введения в виде нескольких доз два дня в неделю, три дня в неделю, четыре дня в неделю, пять дней в неделю, шесть дней в неделю или семь дней в неделю. Например, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) приготовлена для введения в начальной дозе от около 2,1 мг/кг/неделя до около 3,5 мг/кг/неделя (например, начальная дозировка от около 0,3 мг/кг/день до около 0,5 мг/кг/день рЩФ) и впоследствии увеличивают до дозы около 6 мг/кг/неделя или более (например, 9 мг/кг/неделя). В частности, начальная доза может быть увеличена после периода лечения, составляющего по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года или по меньшей мере, четыре года или более (например, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет, по меньшей мере, десять лет или более десяти лет, например, на протяжении всей жизни пациента). Кроме того, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) может быть приготовлена для введения в дозировке около 1,3 мг/кг/неделя, около 2,7 мг/кг/неделя или около 6 мг/кг/неделя или более (например, около 9 мг/кг/неделя), например рЩФ приготовлена для введения в дозировке около 2 мг/кг три раза в неделю, около 3 мг/кг два раза в неделю, около 3 мг/кг три раза в неделю или около 1 мг/кг шесть раз в неделю. Кроме того, рЩФ может быть приготовлена для введения один раз в день подряд или через день. Кроме того, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) может быть приготовлена для введения в количестве, которое является терапевтически эффективным для лечения по меньшей мере, одного симптома взрослой формы ГФФ (например, одного или более из повышенных уровней фосфоэтаноламина (ФЭА) в крови и/или моче, гипоминерализации, гиперкальциурии, скелетной деформации, переваливающейся походки, боли в костях, перелома костей (например, перелома позвоночника, субтрохантерного перелома или перелома плюсневой кости), отложения кристаллов дигидрата пирофосфата кальция, артрита, пирофосфатной артропатии, хондрокальциноза, кальцифицированного периартрита и псевдоперелома).
В третьем аспекте, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) может быть приготовлена для введения в композиции, содержащей, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент, такой как физиологический раствор или хлорид натрия и фосфат натрия. Например, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент содержит 150 мМ хлорида натрия и 25 мМ фосфата натрия. Кроме того, фармацевтическая композиция может быть приготовлена для подкожного, внутримышечного, внутривенного, перорального, назального, сублингвального, интратекального или внутрикожного введения. В частности, фармацевтическая композиция приготовлена для подкожного введения.
В любом из вышеперечисленных аспектов пациент (например, пациент с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходивший лечение, в возрасте около 18 лет или старше) может представлять собой пациента, который не был диагностирован на основании наличия симптомов перинатальной, младенческой или ювенильной ГФФ, таких как рахит, рахитические ребра, тяжелая гипоминерализация, задержка развития, задержка моторного развития, недостаточный набор веса, легочная гипоплазия, дыхательная недостаточность, нарушение дыхания, краниосиностоз (включая осложнения краниосиностоза) и судороги
В любом из перечисленных выше аспектов пациент представляет собой человека. Пациент (например, пациент с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходивший лечение, в возрасте около 18 лет и старше) может не иметь эктопической кальцификации после введения рЩФ (например, SEQ ID NO: 1). Например, пациент не проявляет эктопическую кальцификацию после введения рЩФ в течение, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет или, по меньшей мере, десяти лет или более, например, на протяжении всей жизни пациента. Кроме того, пациент (например, пациент с ГФФ в возрасте около 13 лет или старше, например, пациент с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, не проходивший лечение, в возрасте около 18 лет и старше) может проявлять переносимость введения рЩФ (например, SEQ ID NO: 1), такую как отсутствие или снижение частоты нежелательных явлений, выбранных из группы, состоящей из эритемы в месте инъекции, снижения уровня гемоглобина, гипертермии, пневмонии, инфекции верхних дыхательных путей, среднего отита, рвоты, запора, диареи, выпадения зубов, назофарингита, сыпи, зубного кариеса и раздражимости.
В любом из вышеуказанных аспектов рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Например, рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) физиологически активна в отношении ФЭА, нПФ и П5Ф, каталитически компетентна для улучшения скелетной минерализации в костях и/или представляет собой растворимый внеклеточный домен щелочной фосфатазы.
посл
посл
беск
беск
1/2
В любом из вышеперечисленных аспектов введение рЩФ может привести к статистически значимому изменению предела среднего от исходного уровня концентраций нПФ и/или П5Ф в образце плазмы пациента. Введение рЩФ может привести к AUC от около 2000 U × день/л до около 7000 U × день/л, где AUC равен площади под кривой концентрация-время от нуля до времени последней наблюдаемой концентрации в интервале дозирования. Введение рЩФ может привести к AUC от около 4000 U × день/л до около 10000 U × день/л, причем AUC равен площади под кривой концентрация-время от нуля до бесконечности. Введение рЩФ может привести к t от около 3 дней до около 8 дней.
Определения
При использовании в контексте данного документа использование существительных в одиночном числе означает «по меньшей мере, один» или «один или более», если не указано иное. Кроме того, формы единственного числа включают множественные формы, если из контекста явно не следует иное.
При использовании в контексте данного документа термин «около» относится к количеству, которое составляет ± 10% от приведенного значения и, предпочтительно, составляет ±5% от приведенного значения или, более предпочтительно, ±2% от приведенного значения.
При использовании в контексте данного документа термин «по меньшей мере» относится к количеству, которое составляет ≤10% от приведенного значения и, предпочтительно, составляет ≤ 5% от приведенного значения или, более предпочтительно, ≤2% от приведенного значения.
1
10
Под «асфотазой альфа» подразумевается человеческий слитый белок ТНЩФ (чТНЩФ), приготовленный для лечения ГФФ. Асфотаза альфа (STRENSIQ, Alexion Pharmaceuticals, Inc.) представляет собой гибридный белок, включающий растворимый гликопротеин двух идентичных полипептидных цепей, в котором каждая полипептидная цепь включает аминокислотные остатки 1-726 SEQ ID NO: 1. Структура каждой полипептидной цепи включает каталитический домен чТНЩФ, человеческий Fc-домен иммуноглобулина G и дека-аспартатный пептид, используемый в качестве домена, ориентированного на костную ткань (структура чТНЩФ - Fc-D). Две полипептидные цепи ковалентно связаны двумя дисульфидными связями. Асфотаза альфа была одобрена во всем мире под торговой маркой STRENSIQ, в том числе в США, Европе, Японии, Канаде, Израиле, Австралии и Корее.
Используемый в данном документе термин «среднее» относится к числовому значению, выражающему среднее значение или медиану набора данных. Среднее значение совокупности данных рассчитывается путем деления суммы значений в совокупности на их число. Медиана набора данных рассчитывается путем определения среднего значения в списке нечетных чисел или путем определения среднего из двух значений данных в середине в списке четных чисел.
-6
-15
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-14
-15
Используемый в данном документе термин «ориентированный на костную ткань компонент» относится к аминокислотной последовательности длиной от 1 до 50 аминокислотных остатков, обладающей достаточным сродством к костному матриксу, так что ориентированный на костную ткань компонент, в частности, имеет сродство связывания in vivo с костным матриксом, которое составляет от около 10 М до около 10 М (например, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M или 10 М).
Термины «Краткий Опросник Оценки Боли» и «BPI-SF», используемые здесь взаимозаменяемо, относятся к способу измерения боли пациентов, в частности, пациентов с ГФФ (например, пациентов в возрасте около 13 лет или старше). BPI-SF представляет собой самооценку боли, описанную в Cleeland & Ryan (Ann Acad Med Singapore, 23(2), 129-138; 1994), включенную в данный документ в полном объеме посредством ссылки. BPI-SF представляет собой опросник, предназначенный для оценки тяжести боли и ее влияния на повседневные функции. BPI-SF состоит из 11 пунктов, которые используют числовую оценочную шкалу для оценки выраженности боли (4 единицы) и болевого вмешательства (7 единиц) за 24 часа до предоставления опросного листа. Опросный лист BPI-SF предоставляет информацию об интенсивности боли и степени, в которой боль влияет на ежедневные функции пациента (например, пациента с ГФФ в возрасте около 13 лет или старше) по числовой шкале от 0 (без боли) до 10 (сильная боль или значительное вмешательство, вызванное болью); более низкие оценки указывают на улучшение качества жизни и уменьшение боли. Например, оценки BPI-SF у подростков и взрослых с ГФФ представляют собой комплекс из 11 оценок боли.
Используемые в данном документе термины «Тест Брюинкса-Озерецкого на Оценку Моторики 2-е издание» или «BOT-2» относятся ко второму изданию стандартизированного теста крупной и мелкой моторики у пациентов, например, у взрослых, имеющих ГФФ, таких как у взрослых, имеющих ГФФ, начавшуюся в детском возрасте. См. Bruininks, R. H. (2005). Bruininks-Oseretsky Test of Motor Proficiency, (BOT-2). Minneapolis, MN: Pearson Assessment, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки. BOT-2 назначается индивидуально для оценки навыков крупной и мелкой моторики у ряда пациентов. BOT-2, например, может использоваться для оценки физических нарушений и ограничений подвижности у пациентов, имеющих ГФФ (например, у взрослых, имеющих ГФФ, таких как у взрослых, имеющих ГФФ, начавшуюся в детском возрасте). BOT-2 обеспечивает составные оценки BOT-2 в следующих типовых областях: сила, скорость бега и маневренность, четкость мелкой моторики, целостность мелкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, баланс и координация верхних конечностей. Например, общую оценку силы согласно BOT-2 можно определить, если пациент выполняет приседания, подъем прямых ног в положении лежа, прыжки в длину с места, приседания с опорой и отжимания. Общая оценка скорости бега и маневренность может быть определена путем того, чтобы пациент перепрыгнул через гимнастическое бревно или выполнил челночный бег, боковой прыжок на двух ногах или боковой прыжок на одной ноге. Как общая сила согласно BOT-2, так и общая скорость бега согласно BOT-2 и суммарные оценки маневренности варьируют от 0 до 25, при этом оценка от 10 до 25 считается репрезентативной для здоровых субъектов. Нормативные показатели силы, скорости бега и маневренности составляют 15±5. Оценки у взрослых не нормируются (не используют шкалу оценок), и, следовательно, более высокие значения представляют лучшую производительность. Могут использоваться либо средние значения, либо медиана оценок, причем медиана оценок предпочтительнее для меньших размеров выборки или меньших наборов данных.
Используемый в данном документе термин «каталитически компетентный» относится к рЩФ, который гидролизует ингибитор минерализации костей неорганического пирофосфата (нПФ) с образованием неорганического фосфата (Ф), тем самым уменьшая внеклеточные концентрации нПФ. Таким образом, каталитически компетентный рЩФ улучшает скелетную минерализацию в кости, регулируя концентрацию нПФ.
Под «внеклеточным доменом» подразумевается любая функциональная внеклеточная часть нативного белка, например, щелочной фосфатазы. В частности, во внеклеточном домене отсутствует сигнальный пептид.
Под «Fc» подразумевается фрагмент кристаллизуемой области иммуноглобулина, например, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-3 или IgG-4, включая домены СН2 и СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина. Fc также может включать любую часть шарнирной области, соединяющей области Fab и Fc. Fc может быть любого млекопитающего, включая человека, и может быть пост-трансляционно модифицированным (например, путем гликозилирования). В неограничивающем примере Fc может представлять собой фрагмент кристаллизуемой области человеческого IgG-1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
Под «фрагментом» подразумевается часть молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты, которая содержит, предпочтительно, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более от всей длины эталонной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Фрагмент может содержать, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130 , 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 400, 500, 600, 700 или более аминокислотных остатков, вплоть до полной длины полипептида. Типовые фрагменты рЩФ имеют аминокислотные остатки 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18-505, 18-506, 18-507, 18-508 18-509, 18-510, 18-511 или 18-512 ALP (например, SEQ ID NO: 2-6) и могут включать в себя дополнительные С-концевые и/или N-концевые части.
Термины «Динамометрия с использованием Портативных устройств» и «HHD», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к способу измерения силы захвата и мышечной силы у субъектов, в частности, у пациентов имеющих ГФФ в возрасте около 13 лет или старше. Динамометр может быть использован для оценки силы захвата, сгибания колена, разгибания колена, сгибания бедра, разгибания бедра и отведения бедра у субъекта с ГФФ. Например, сгибание и разгибание колена, а также сгибание, разгибание и разведение в стороны бедра у субъекта, имеющего ГФФ возрасте около 13 лет или старше, может быть измерено с использованием, например, Динамометра MICROFET2TM, в то время как сила захвата субъекта может быть измерена с использованием например, Ручного Динамометра JAMAR. В частности, администратор держит динамометр в неподвижном состоянии, а субъект прилагает максимальную силу к динамометру. Данные пиковой силы собираются в фунтах, а затем преобразуются в Ньютоны (Н, N). Значения крутящего момента затем рассчитываются с использованием длины конечности в Ньютон-метрах. Затем значение крутящего момента можно сравнить со значением, например, нормального субъекта примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста, и выразить в виде процентного значения, чтобы получить оценку HHD субъекта.
Термины «гипофосфатазия» или «ГФФ», используемые в данном документе, относятся к редкому наследственному нарушению скелета, вызванному, например, одной или несколькими мутациями с потерей функции в гене ALPL (щелочная фосфатаза, печень/кость/почка), который кодирует неспецифическую для ткани щелочную фосфатазу (ТНЩФ). ГФФ может быть дополнительно охарактеризована как инфантильная форма ГФФ, ГФФ, начинающаяся в детском возрасте, перинатальная форма ГФФ (например, доброкачественная перинатальная форма ГФФ или летальная перинатальная форма ГФФ), форма ГФФ, поражающая зубы, подростковая форма ГФФ или взрослая форма ГФФ. Например, «взрослая форма ГФФ» описывает пациента, имеющего ГФФ, в возрасте 18 лет или старше. «Подростковая форма ГФФ» описывает пациента, имеющего ГФФ, в возрасте от около13 до около 17 лет. Термин «взрослая форма ГФФ», используемый в контексте данного документа, относится к состоянию или фенотипу, характеризующемуся наличием одного или более из следующих симптомов: повышенные уровни неорганического пирофосфата (нПФ) в крови и/или моче, фосфоэтаноламина (ФЭА) или пиридоксаль-5''-фосфата (П5Ф), гипоминерализации, гиперкальциурии, скелетной деформации, переваливающейся походки, боли в костях, перелома костей (например, перелома позвоночника, субтрохантерного перелома или перелома плюсневой кости), отложения кристаллов дигидрата пирофосфата кальция, артрита, пирофосфатной артропатии, хондрокальциноза, кальцифицированного периартрита и псевдоперелома). Термин «подростковая форма ГФФ», используемый в контексте данного документа, относится к состоянию или фенотипу, характеризующемуся наличием одного или более из следующих симптомов: повышенные уровни нПФ, ФЭА или П5Ф в крови или моче, остеомаляция, одна или более деформаций скелета, гипотония, мышечная слабость, ревматоидные осложнения, артрит, псевдоподагра, переваливающуяся походка, трудности при ходьбе, боль в костях, боль, ранняя потеря зубов, гипоминерализация, легочная гипоплазия, дыхательная недостаточность, судороги, гиперкальциурия, низкий рост и задержку роста.
Термины «функциональная шкала нижней конечности» и «LEFS», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к способу измерения нарушения функции нижних конечностей пациентов, в частности, пациентов с ГФФ (например, пациентов в возрасте около 13 лет или старше). LEFS представляет собой шкалу для самостоятельного оценивания, описанную в Binkley et al. (Phys Ther. 79:371-83, 1999), полностью включенной в данное описание посредством ссылки. Суммарные баллы LEFS варьируют от 0 до 80, причем более высокие баллы указывают на лучшее функционирование нижней конечности. Изменение балла LEFS на 9 баллов считается клинически значимым изменением. Лицензированный физиотерапевт может назначать оценивание LEFS пациентам с ГФФ (например, пациентам с ГФФ в возрасте около 13 лет и старше) в формате интервью. Более высокие баллы LEFS указывают на улучшение функционирования нижней конечности, включая переходные движения (например, подъем из ванны или переворачивание в кровати), локомоцию (например, ходьба или бег по неровной поверхности), подъем по лестнице и приседание. LEFS может быть использована для оценки функциональных нарушений одной или обеих нижних конечностей пациента с ГФФ, включая возможность наблюдать пациента с течением времени и оценивать эффективность лечения с помощью асфотазы альфа.
Под «пациентом, не проходившим лечение» или «субъектом, не проходившим лечение» подразумевается пациент или субъект, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, который ранее не проходил лечение с помощью щелочной фосфатазы, или полипептида, обладающего активностью щелочной фосфатазы, такой как рЩФ (например, ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).
Термины «форма гипофосфатазии, начавшаяся в детском возрасте» и «ГФФ, начинающаяся в детском возрасте» относятся к появлению у субъекта симптомов ГФФ в возрасте до 18 лет.
Термины «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к любой цепи из двух или более природных или не встречающихся в природе аминокислотных остатков, независимо от посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования), составляющих весь или часть естественного встречающегося или не встречающегося в природе полипептида или пептида, как описано в данном документе.
Под «фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом» подразумевается носитель, разбавитель или наполнитель, соответственно, которые являются физиологически приемлемыми для субъекта (например, человека) при сохранении терапевтических свойств фармацевтической композиции, с которой они вводятся. Один типовой фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент представляют собой физиологический раствор. Например, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент может содержать хлорид натрия (например, 150 мМ хлорида натрия) и фосфат натрия (например, 25 мМ фосфата натрия). Другие физиологически приемлемые носители, разбавители или эксципиенты и их приготовления известны специалисту в данной области техники.
Под «фармацевтической композицией» подразумевается композиция, содержащая полипептид (например, композиции, содержащие рЩФ, такую как асфотаза альфа), как описано в данном документе, составленная по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом. Фармацевтическая композиция может быть изготовлена или продана с разрешения государственного регулирующего органа как часть терапевтического режима для лечения или профилактики заболевания или осложнения у пациента. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены, например, для подкожного введения, внутривенного введения (например, в виде стерильного раствора, не содержащего частиц, способных вызвать закупорку кровеносных сосудов и в системе растворителей, подходящих для внутривенного применения), для перорального введения (например, таблетки, капсулы, каплеты, желатиновые капсулы или сироп), или любой другой препарат, описанный в данном документе, например, в единичной лекарственной форме.
Используемый в данном документе термин «физические нарушения» относится к физиологическому состоянию, такому как хрупкость костей и мышечная слабость, связанному с ГФФ, которое может ограничивать или приводить к утрате, например, способности ходить, функциональной выносливости и способности выполнять элементарные действия по самообслуживанию (ADL) у пациента (например, взрослого, имеющего ГФФ, такого как взрослого, имеющего ГФФ, начавшуюся в детском возрасте). В частности, физические нарушения могут ограничивать или приводить к утрате способности пациента выполнять ADL, которые являются рутинными действиями, которые здоровые субъекты выполняют ежедневно, не требуя помощи, такие как функциональная подвижность или передвижение (например, ходьба), купание и принятие душа, одевание, самостоятельное принятие пищи, личная гигиена и уход. Как описано в данном документе, терапевтические композиции (например, композиции, включающие рЩФ, такие как асфотаза альфа), могут быть введены пациенту (например, взрослому, имеющему ГФФ, например, взрослому, имеющему ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), чтобы уменьшить степень тяжести и/или частоту физических нарушений, связанных с фенотипом ГФФ и/или для увеличения способности пациента ходить (например, способности ходить, определенной по расстоянию, пройденному пациентом в течение шести минут).
Используемый в данном документе термин «физиологически активная» относится к рЩФ (например, SEQ ID NO: 1) которая гидролизует фосфоэтаноламин (ФЭА), неорганический пирофосфат (нПФ) и пиридоксаль 5'-фосфат (П5Ф) с образованием Ф, тем самым снижая внеклеточные концентрации ФЭА, нПФ и П5Ф.
Термины «рШФ», «растворимая щелочная фосфатаза» и «внеклеточный домен щелочной фосфатазы» используются взаимозаменяемо и относятся к растворимой, не мембраносвязанной щелочной фосфатазе или домену, биологически активному фрагменту или его биологически активному варианту. рЩФ включают, например, щелочную фосфатазу, в которой отсутствует C-концевой гликолипидный якорь (сигнальная последовательность GPI, например полипептиды, включающие или состоящие из аминокислотных остатков 18-502 человеческого ТНЩФ (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 или 6)). В частности, ТНЩФ может включать, например, полипептид, включающий или состоящий из аминокислотных остатков 1-485 SEQ ID NO: 1, такой как асфотаза альфа или полипептидный вариант, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с аминокислотными остатками 1-485 SEQ ID NO: 1. Кроме того, рЩФ включают, например, ортологи ТНЩФ человека, такие как ТНЩФ макак-резусов (SEQ ID NO: 7), ТНЩФ крысы (SEQ ID NO: 8), ТНЩФ собаки (SEQ ID NO: 9), ТНЩФ свиньи (SEQ ID NO: 10), ТНЩФ мыши (SEQ ID NO: 11), ТНЩФ быка (SEQ ID NO: 12-14) или ТНЩФ кошки (SEQ ID NO: 15). рЩФ также включают растворимые, не связанные с мембраной формы человеческого ПЩФ (например, полипептиды, включающие или состоящие из аминокислотных остатков 18-502 SEQ ID NO: 16 или 17), ЗЩФ (например, полипептиды, включающие или состоящие из аминокислотных остатков 18-502 SEQ ID NO: 18), КЩФ (например, полипептиды, включающие или состоящие из аминокислотных остатков 18-502 SEQ ID NO: 19) и его дополнительные варианты и аналоги, которые сохраняют активность щелочной фосфатазы, например способность гидролизовать нПФ. В частности, в рЩФ отсутствует N-концевой сигнальный пептид (например, АА 1-17 SEQ ID NO: 2-6, 8, 11-13 или 15 или АА 1-25 SEQ ID NO: 7).
Под «полипептидом рЩФ» подразумевается полипептид, имеющий структуру A-рЩФ-B, где рЩФ является такой, как определено в данном документе, и каждый из A и B отсутствует или представляет собой аминокислотную последовательность по меньшей мере, одной аминокислоты (например, любой слитый рЩФ полипептид, описанный в данном документе (например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).
Под «сигнальным пептидом» подразумевается короткий пептид (длиной 5-30 аминокислот) на N-конце полипептида, который направляет полипептид к секреторному пути (например, во внеклеточное пространство). Сигнальный пептид обычно расщепляется во время секреции полипептида. Сигнальная последовательность может направлять полипептид во внутриклеточный компартмент или органеллу, например, аппарат Гольджи. Сигнальная последовательность может быть идентифицирована по гомологии или биологической активности в сравнении с пептидом с известной функцией таргитирования полипептидом конкретной области клетки. Специалист в данной области может идентифицировать сигнальный пептид с помощью легкодоступного программного обеспечения (например, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, или PILEUP/PRETTYBOX программы). Сигнальный пептид может быть таким, который, например, по существу является идентичным аминокислотным остаткам 1-17 SEQ ID NO: 2-6 или аминокислотным остаткам 1-25 SEQ ID NO: 7.
Как используется в данном документе, когда последовательность полипептида или нуклеиновой кислоты упоминается как имеющая « по меньшей мере, X% идентичности последовательности» с контрольной последовательностью, где «X» представляет собой действительное число, это означает, что, по меньшей мере, X процентов остатков аминокислоты или нуклеотидов в полипептиде или нуклеиновой кислоте идентичны таковым в контрольной последовательности, когда последовательности оптимально выровнены. Оптимальное выравнивание последовательностей может быть определено различными способами, которые известны специалисту в данной области, например, алгоритмом выравнивания Смита Уотермана (Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195-7, 1981) и BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990). Эти и другие алгоритмы выравнивания доступны с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как «Best Fit» (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489, 1981), которое включено в GeneMatcher Plus (Schwarz and Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, M.O., Ed. Pp. 353-358, 1979), BLAST, BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, Megalign (DNASTAR), или другого программного/аппаратного обеспечение для выравнивания. Кроме того, специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения оптимального выравнивания по длине сравниваемых последовательностей.
Термины «пациент» или «субъект» относятся к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь этим, человека или млекопитающего, не являющегося человеком, такого как бык, лошадь, собака, овца или кошка. Особый интерес представляют пациенты-люди.
«Парентеральное введение», «вводимый парентерально» и другие грамматически эквивалентные фразы, используемые в данном документе, относятся к способам введения, отличным от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают, без ограничения, подкожную, внутрикожную, внутривенную, интраназальную, внутриглазную, легочную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрилегочную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, внутриспинальную, эпидуральную, интрацеребральную, интракраниальную, внутрикаротидную и интрастернальную инъекцию и инфузию.
Используемый в данном документе термин «Тест 6-Минутной Ходьбы» и «6MWT» относится к стандартизированному тесту для оценки способности пациента к ходьбе (например, взрослого человека с ГФФ, такого как взрослого с ГФФ, начавшейся в детском возрасте), в частности, способности пациента поднимать и опускать каждую ногу по очереди. См. заявление Американского Торакального Общества: рекомендации для теста шестиминутной ходьбы (American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 166(1):111-7, 2002), включенное в данный документ в полном объеме посредством ссылки. 6MWT определяется по расстоянию (например, в метрах), по которому пациент ходит по плоской твердой поверхности в течение шести минут. Расстояние 6MWT затем можно сравнить с расстоянием 6MWT пациента на исходном уровне, расстоянием 6MWT субъекта, не проходившего лечение (например, субъекта примерно того же возраста, роста и/или пола, не проходившего лечение) или расстоянием 6MWT здорового субъекта (например, здорового субъекта примерно того же возраста, роста и/или пола) и выразить в процентах для определения значения 6MWT.
Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается количество полипептида (например, рЩФ, такого как SEQ ID NO: 1) или молекулы нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе, которая достаточна для существенного улучшения, лечения, предотвращения, задержки, подавления или прекращения по меньшей мере, одного симптома ГФФ у взрослых (например, повышенных уровней нПФ, П5Ф и ФЭА в крови и/или моче, гипоминерализации, гиперкальциурии, скелетной деформации, переваливающейся походки, боли в костях, перелома кости, отложения кристаллов пирофосфата кальция дигидрата, артрита, пирофосфатной артропатии, хондрокальциноза, кальцифицирующего периартрита и псевдоперелома). Терапевтически эффективное количество композиции, описанной в данном документе, может зависеть от тяжести нарушения, которое лечат, а также от патологического состояния, веса и общего состояния пациента, и может быть определено специалистом в данной области с учетом таких факторов. Терапевтически эффективное количество композиции, описанной в данном документе, может быть введено пациенту в однократной дозе или в множественных дозах, вводимых в течение периода времени.
Под «подвергать воздействию», «лечение» или «терапия» подразумевается медицинское ведение пациента с намерением вылечить, улучшить, стабилизировать, снизить вероятность или предотвратить взрослую форму ГФФ и/или лечение пациента, проявляющего или вероятно имеющего взрослую форму ГФФ, например, путем введения фармацевтической композиции (например, рЩФ, такой как SEQ ID NO: 1). Этот термин включает активное лечение, то есть лечение, направленное конкретно на улучшение или связанное с лечением заболевания, патологического состояния, нарушения или осложнения, и также включает этиотропную терапию, то есть терапию, направленную на устранение причины сопутствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или осложнения. Кроме того, этот термин включает паллиативное лечение, то есть лечение, предназначенное для облегчения или улучшения, по меньшей мере, одного симптома, а не для лечения заболевания, патологического состояния, нарушения или осложнения; симптоматическое лечение, то есть лечение, направленное на конституциональные симптомы связанные с заболеванием, патологическим состоянием, нарушением или осложнением; профилактическое лечение, то есть лечение, направленное на минимизацию или частичное или полное ингибирование развития сопутствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или осложнения, например, у пациента, который еще не болен, но который восприимчив к, или иным образом находится под угрозой, конкретному заболеванию, патологическому состоянию, нарушению или осложнению; и поддерживающее лечение, то есть лечение, применяемое для дополнения другой специфической терапии, направленной на улучшение сопутствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или осложнения.
Другие особенности и преимущества представленного раскрытия станут очевидными из следующего подробного описания, графических материалов и формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
a
На Фиг. 1A-1B изображены графики, показывающие изменения медианы концентраций неорганического пирофосфата (нПФ; Фиг. 1A) и пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф; Фиг. 1B) в образцах плазмы у взрослых пациентов с формой гипофосфатазии (ГФФ), начавшейся в детском возрасте, по сравнению с исходным уровнем до шести месяцев лечения асфотазой альфа. Данные представлены в виде медианы (минимум, максимум).  Значение P сравнивает объединенную группу, получавшую альфа-асфотазу (взрослые пациенты с ГФФ, получающие дозы 0,3/кг/день и 0,5 мг/кг/день альфа-асфотазы) с нелеченой контрольной группой. Представлено количество (n) подвергнутых лечению пациентов и нелеченых контрольных субъектов, оцененных по концентрации нПФ и П5Ф в плазме.
a
Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий среднюю концентрацию нПФ в образцах плазмы у взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, которым вводили асфотазу альфа в течение 6 лет периода лечения. Показаны верхний предел нормы и нижний предел нормы концентрации нПФ для здоровых субъектов старше 18 лет. Контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы с комбинированным лечением. Показан период лечения, в течение которого дозировка альфа-асфотазы была увеличена до 6 мг/кг/неделя посредством изменения протокола. P < 0.0001 для изменения медианной концентрации нПФ в плазме от исходного уровня через шесть месяцев.
a
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий медианную концентрацию П5Ф в образцах плазмы у взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, которым вводили асфотазу альфа в течение 6 лечения. Показаны верхний предел нормы и нижний предел нормы концентрации П5Ф для здоровых субъектов старше 18 лет. Контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы с комбинированным лечением. Показан период лечения, в течение которого альфа-асфотаза была увеличена до дозировки 6 мг/кг/неделя посредством изменения протокола. P  < 0.0001 для изменения медианной концентрации нПФ в плазме от исходного уровня через шесть месяцев.
а
Фиг. 4 представляет собой график, изображающий прогнозируемое в процентах медианное расстояние Теста шестиминутной ходьбы (6MWT) взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, которым вводили альфа-асфотазу в течение 6 лет периода лечения. Медиана, минимум, максимум и значения n показаны для каждого временного интервала (исходный уровень, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет и 6 лет). Серая область представляет нормальный диапазон расстояния 6MWT для здоровых субъектов того же возраста и роста. Контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы с комбинированным лечением. Показан период лечения, в течение которого дозировка альфа-асфотазы была увеличена до 6 мг/кг/неделя посредством изменения протокола. Пациенты с ГФФ, получавшие 0,3 мг/кг/день и 0,5 мг/кг/день асфотазы альфа до изменения протокола до 6 мг/кг/неделя, были объединены в течение всего периода лечения.
На Фиг. 5 изображен график, демонстрирующий медиану оценок скорости бега и теста ловкости согласно тесту на моторную способность согласно Брюинкса-Озерецкого, 2-е издание (BOT-2) , для взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, которым вводили асфотазу альфа в течение периода лечения 6 лет. Медиана, минимум, максимум и значения n показаны для каждого временного интервала (исходный уровень, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет и 6 лет). Контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы с комбинированным лечением. В начальный период, пациенты с ГФФ, получавшие 0,3 мг/кг/день и 0,5 мг/кг/день асфотазы альфа до изменения протокола до 6 мг/кг/неделя, были объединены в течение всего периода лечения.
На Фиг. 6 изображен график, демонстрирующий медиану оценок силы BOT-2 для взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, которым вводили асфотазу альфа в течение периода лечения 6 лет. Медиана, минимум, максимум и значения n показаны для каждого временного интервала (исходный уровень, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет и 6 лет). Контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы с комбинированным лечением. В начальный период, пациенты с ГФФ, получавшие 0,3 мг/кг/день и 0,5 мг/кг/день асфотазы альфа до изменения протокола до 6 мг/кг/неделя, были объединены в течение всего периода лечения.
a
b
На Фиг. 7 изображена схема, показывающая план исследования для введения асфотазы альфа подросткам и взрослым, имеющим ГФФ, в течение пятилетнего периода, включая начальную фазу лечения асфотазой альфа (от начальной точки времени) до шести месяцев и фазу пролонгации лечения с помощью асфотазы альфа (от шести месяцев лечения до пяти и более лет лечения).  Доза асфотазы альфа корректировалась каждые 3 месяца при изменении веса; максимальная доза составляла 80 мг асфотазы альфа, если только после консультации с медицинским наблюдателем исследователь не утвердил дозу, превышающую 80 мг.  Доза асфотазы альфа была увеличена путем изменения протокола у всех пациентов. Во время фазы пролонгации все пациенты первоначально получали суточные дозы асфотазы альфа 0,5 мг/кг/неделя в течение от около 6 месяцев до 1 года, которая впоследствии была изменена на 1 мг/кг в течение 6 дней/неделя.
На Фиг. 8 изображена схема, демонстрирующая количество подростков и взрослых пациентов с ГФФ на разных этапах исследования (скрининг, рандомизация, период первичного лечения от начальной точки времени до шести месяцев лечения асфотазой альфа, период пролонгации открытого исследования от шести месяцев до одного года лечения асфотазой, и период, в течение которого доза асфотазы альфа была увеличена до 1 мг/кг/день, вводили 6 дней/неделю до пятого года исследования).
a
На Фиг. 9A-B изображены графики, показывающие изменения медианы концентраций пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф; Фиг. 9A) и неорганического пирофосфата (нПФ; Фиг. 9B) в образцах плазмы подростков и взрослых пациентов с ГФФ от начальной точки времени до шести месяцев лечения асфотазой альфа. Данные представлены в виде медианы (минимум, максимум).  Значение P сравнивает объединенную группу, получавшую альфа-асфотазу (взрослые пациенты и подростки с ГФФ, получающие дозы 0,3/кг/день и 0,5 мг/кг/день альфа-асфотазы) с контрольной группой, не проходившей лечение. Представлено количество (n) подвергнутых лечению пациентов и нелеченых контрольных субъектов, оцененных по концентрации нПФ и П5Ф в плазме.
На Фиг. 10А-10В изображены графики, показывающие медиану концентрации П5Ф (Фиг. 10A) и нПФ (Ф иг.10B) в образцах плазмы подростков и взрослых пациентов с ГФФ, которым вводили асфотазу альфа в течение периода лечения, составляющего пять лет. Также показаны верхний предел нормы и нижний предел нормы концентрации нПФ и П5Ф здоровых субъектов. Контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы с комбинированным лечением. Показан период лечения, в течение которого дозировка асфотазы альфа была увеличена до 6 мг/кг/неделя посредством изменения протокола.
На Фиг. 11А-11В изображены графики, показывающие медиану дистанции ходьбы при тесте 6MWT (Фиг. 11A) и процентное прогнозируемое медианное расстояние при тесте 6MWT (Фиг. 11B) подростков и взрослых пациентов с ГФФ, которым вводили асфотазу альфа в течение периода лечения, составляющего 5 лет. Медиана, минимум, максимум и значения n показаны для каждого временного интервала (исходный уровень, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года и 5 лет). Серая область представляет нормальный диапазон расстояния 6MWT для здоровых субъектов того же возраста и роста. Контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы с комбинированным лечением. Показан период лечения, в течение которого дозировка асфотазы альфа была увеличена до 6 мг/кг/неделя посредством изменения протокола.
На Фиг. 12А-12В изображены графики, показывающие корреляцию между пройденным расстоянием в течение 6MWT при скрининге и начальной точки времени у подростков с ГФФ (Фиг. 12А) и взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, (Фиг. 12В).
На Фиг. 13 изображен график, показывающий изменение медианы общих оценок BOT-2 по сравнению с начальной точкой времени во время тестов скорости бега и ловкости BOT-2 у подростков и взрослых пациентов с ГФФ, которым вводили асфотазу альфа в течение периода лечения 5 лет. Медиана, минимум, максимум и значения n показаны для каждого временного интервала (исходный уровень, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года и 5 лет). Контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы с комбинированным лечением. В начальный период, пациенты с ГФФ, получавшие 0,3 мг/кг/день и 0,5 мг/кг/день асфотазы альфа до изменения протокола до 6 мг/кг/неделя, были объединены в течение всего периода лечения.
На Фиг. 14 изображена схематическая диаграмма, показывающая схему приема препаратов пациентами, получающими асфотазу альфа в различных концентрациях во время фазы 2а клинических испытаний.
На Фиг. 15 изображен график, показывающий значимые различия, наблюдаемые между средними значениями, полученными способом наименьших квадратов (LSM) в изменениях нПФ от исходного уровня до времени перед дозой 3 Недели 9 во время фазы 2а клинических испытаний.
На Фиг. 16 изображен график, показывающий значимые различия, наблюдаемые между изменениями LSM в П5Ф от исходного уровня до времени перед дозой 3 Недели 9 во время фазы 2а клинических испытаний.
На Фиг. 17А-17В изображены схематические диаграммы, показывающие схему приема препарата каждой когорты дозировок (Фиг. 17А) и график фармакокинетических, фармакодинамических и иммуногенных оценок (Фиг. 17В).
На Фиг. 18А-18В изображены графики, показывающие индивидуальные ФК-профили активности асфотазы альфа (Ед/л) в каждой когорте дозировок (0,5 мг/кг 3×/неделя, 2 мг/кг 3 ×/неделя и 2 мг/кг 3 ×/неделя) каждый день после начальной дозы в день 1 (Фиг. 18A) и после многократного приема препарата в день 61 (Фиг. 18B).
На Фиг. 19A-19C изображены графики, показывающие среднее ± SD профилей ФК активности асфотазы альфа (Ед/л) в каждой когорте дозировок каждый день после начальной дозы в 1-й день (Фиг. 20A), после многократного приема препарата между днями 15-61 (Фиг. 19B) и после многократного приема препарата в день 61 (Фиг. 19C).
На Фиг. 20A-20B изображены графики, показывающие средняя ± SD, нормированная по дозе активность асфотазы альфа (Ед/л) в каждой когорте дозировок каждый день после начальной дозы в день 1 (Фиг. 20А) и после многократного приема препарата в день 61 (Фиг. 20B).
ср, сс
На Фиг. 21 изображен график, показывающий отличие показателей Дня 61 от базового значения (CBL) нПФ в зависимости от квартилей воздействия Сасфотазы альфа. Медианные значения нПФ CBL обозначены линией в центре прямоугольников. Прямоугольниками отмечен межквартильный диапазон (IQR). Доверительные интервалы соответствуют 1,5 * IQR. Вылетающие значения отмечены за пределами доверительных интервалов с помощью закрашенных кружков.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Мы обнаружили, что асфотаза альфа (SEQ ID NO: 1, STRENSIQ, Alexion Pharmaceuticals, Inc.) может эффективно использоваться для лечения гипофосфатазии (ГФФ), ее симптомов и физических нарушений, связанных с ними, у взрослых, имеющих ГФФ (например, у взрослых, имеющих ГПП, в возрасте около 18 лет и старше, таких как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подростки, имеющие ГФФ (например, подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13 до около 17 лет) в течение продолжительного периода времени (например, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, не менее семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет, по меньшей мере, десяти лет или более десяти лет, например, на протяжении всей жизни пациента). В частности, асфотазу альфа (SEQ ID NO: 1) можно вводить для лечения взрослых или подростков с ГФФ, у которых проявляются физические нарушения (например, слабость костей или мышц), снижение способности к ходьбе по сравнению со здоровым субъектом (например, субъект без ГФФ примерно того же возраста, пола и/или роста), снижение уровня щелочной фосфатазы (ЩФ) в образце (например, в образце плазмы) относительно здорового субъекта (например, субъекта без ГФФ примерно того же возраста, того же пола и/или роста), снижение хватательной и мышечной силы относительно здорового субъекта (например, субъекта без ГФФ примерно того же возраста, того же пола и/или роста), снижение функциональной способности в нижних конечностях по сравнению со здоровым субъектом (например, субъект без ГФФ примерно того же возраста, того же пола и/или роста) или усиленная боль по сравнению со здоровым субъектом (например, субъект без ГФФ примерно того же возраста, того же пола и/или роста). Кроме того, взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может представлять собой пациента, не проходившего лечение, который ранее не проходил лечение с помощью асфотазы альфа (SEQ ID NO: 1).
Описаны способы введения асфотазы альфа (SEQ ID NO: 1) взрослому человеку, имеющему ГФФ (например, взрослому, имеющему ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, например взрослому, имеющему ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростку, имеющему ГФФ (например, подростки, имеющие ГФФ в возрасте от около 13 до около 17 лет), которые демонстрируют повышенные концентрации неорганического пирофосфата (нПФ) или пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф) в образце плазмы взрослого или подростка, имеющего ГФФ, относительно концентраций нПФ или П5Ф в образце плазмы взрослого или подростка, имеющих ГФФ и не проходивших лечение. До введения рЩФ пациент с ГФФ может характеризоваться как имеющий концентрацию нПФ в плазме до около 6 мкМ и/или концентрацию П5Ф до 1300 нг/мл. Кроме того, описаны способы введения асфотазы альфа (SEQ ID NO: 1) взрослому, имеющему ГФФ (например, взрослому, имеющему ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подростку, имеющему ГФФ (например, подросткам, имеющим ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), что приводит к улучшению способности ходить у взрослого человека, имеющего ГФФ. Например, асфотазу альфа (SEQ ID NO: 1) можно вводить взрослому или подростку с ГФФ с пониженной способностью ходить, такой, что перед введением рЩФ пациент характеризуется как таковой, который имеет дистанцию ходьбы в течение шести минут около 350 метров или менее. Например, у взрослого, имеющего ГФФ, после введения рЩФ снижается зависимость от вспомогательного устройства для мобильности, такого как ходунки, инвалидная коляска, ортопедические скобы, костыли и ортопедические устройства.
Также описаны способы введения асфотазы альфа (SEQ ID NO: 1) взрослому с ГФФ (например, взрослому с ГФФ, начавшейся в детском возрасте) или подростку с ГФФ (например, подросткам с ГФФ в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), имеющим оценки общего теста скорости бега и ловкости согласно Брюинкса-Озерецкого, 2-го издания (BOT-2) или теста на силу, указывающие на физические нарушения (например, оценка BOT-2 менее чем около 7 в одном или более показателей BOT-2 относительно силы, скорости бега и ловкости, точности мелкой моторики, целостности мелкой моторики, ловкости рук, двусторонней координации, баланса и координации верхней конечности). Например, асфотазу альфа (SEQ ID NO: 1) можно вводить взрослому, имеющему ГФФ, с показателями скорости бега и ловкости BOT-2 менее чем около 6. Кроме того, асфотазу альфа (SEQ ID NO: 1) можно вводить взрослому, имеющему ГФФ, с показателем силы BOT-2 менее чем около 12.
Также описаны способы введения асфотазы альфа (SEQ ID NO: 1) взрослому с ГФФ (например, взрослому, имеющему ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростку с ГФФ (например, подросткам с ГФФ в возрасте от около 13 до около 17 лет) с показателем Динамометрии с использованием Портативных устройств (HHD), указывающим на снижение хватательной и мышечной силы (например, показатель HHD менее чем около 50, например, около 10, 20, 30, 40 или 50), показателем Шкалы Функций Нижних Конечностей (LEFS), указывающим на снижение функциональной способности в нижних конечностях (например, балл LEFS менее чем около 40, такой как около 10, 20, 30 или 40), и/или показателем Краткого Опросника Оценки Боли (BPI-SF), указывающим на наличие боли (например, балл более чем около 10, например, около 10, около 15, около 20, около 25 или около 30 или более).
В любом из этих способов асфотазу альфа (SEQ ID NO: 1) можно вводить взрослому с ГФФ (например, взрослому с ГФФ, начавшейся в детском возрасте) или подростку с ГФФ в течение продолжительного периода времени, например, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет, по меньшей мере, десяти лет или более чем десяти лет, например, в течение всей жизни пациента). Кроме того, учитывая результаты, описанные в данном документе с использованием асфотазы альфа, другие рЩФ (такие как вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1) могут быть использованы для лечения взрослого человека с ГФФ (например, взрослого человека, имеющего ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) в течение продолжительного периода времени, например, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет, по меньшей мере, десяти лет или более чем десяти лет, например, в течение всей жизни пациента).
Способы Лечения
В данном документе представлены способы лечения взрослого человека, имеющего ГФФ (например, взрослого человека, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый человек, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подростка, имеющего ГФФ (например, подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 до около 17 лет). Взрослые, имеющие ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подростки, имеющие ГФФ (например, подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13 лет до коло 17 лет), могут проходить лечение с помощью введения рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ, такой как слитый полипептид рЩФ с последовательностью SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) в диапазоне возрастов, например, от около 18 до около 20 лет, от около 20 до около 25 лет, от около 25 до около 30 лет, от около 30 до около 35 лет, от около 35 до около 40 лет, от около 40 до около 45 лет, от около 45 до около 50 лет, от около 50 до около 55 лет, от около 60 до около 65 лет, от около 20 до около 30 лет, от около 30 до около 40 лет, от около 40 до около 50 лет, от около 50 до около 60 лет, от около 60 до около 70 лет, от около 20 до около 65 лет, от около 30 до около 65 лет или старше 65 лет.
Взрослые (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростки (например, подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), могут быть диагностированы как имеющие ГФФ до введения рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитого полипептида рЩФ, такого как слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Взрослый, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подросток, имеющий ГФФ, могут проявлять, например, физические нарушения и нарушение способности к ходьбе по сравнению со взрослым человеком без ГФФ.
Кроме того, взрослый, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подросток, имеющий ГФФ (например, подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может представлять собой пациента, не проходившего лечение, который ранее не проходил лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитого полипептида рЩФ, такого как слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Способ включает введение рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитого полипептида рЩФ, такого как слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) взрослому, имеющему ГФФ, или подростку, имеющему ГФФ, например, введение рЩФ в течение периода лечения, по меньшей мере, одного года (например, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет, по меньшей мере, десяти лет или более десяти лет, например, на протяжении всей жизни пациента).
В частности, рЩФ, такую как асфотаза альфа, можно вводить в течение периода лечения взрослому, имеющему ГФФ (например, взрослому, имеющему ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, например взрослому, имеющему ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростку с ГФФ (например, подростку с ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), у которых ранее были определены концентрация нПФ в плазме до около 6 мкМ (например, около 3,5 мкМ, около 4 мкМ, около 4,5 мкМ, около 5 мкМ или около 5,5 мкМ), концентрация П5Ф в плазме до 1300 нг/мл (например, концентрация П5Ф в плазме около 200 нг/мл, 300 нг/мл, 400 нг/мл, 500 нг/мл, 600 нг/мл, 700 нг/мл, 800 нг/мл, 900 нг/мл, 1000 нг/мл, 1100 нг/мл, 1200 нг/мл или 1300 нг/мл), расстояние ходьбы в течение шести минут около 350 метров или менее (например, расстояние ходьбы в течение шести минут около 50 метров, 75 метров, 100 метров, 125 метров, 150 метров, 175 метров, 200 метров, 225 метров, 250 метров, 275 метров или 350 метров), показатели скорость бега и ловкости, согласно общей оценке BOT-2, менее чем около 6,0, показатель силы, согласно общей оценке BOT-2, менее чем около 12, показатель HHD менее чем около 80% от прогнозируемого показателя HHD (например, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 65%, около 70% или около 75% от прогнозируемой оценки HHD), показатель LEFS менее около 40 (например, показатель LEFS менее около 10, около 20, около 30 или около 40) и/или показатель BPI-SF менее, чем около 12 (например, показатель BPI-SF менее чем около 0, около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10). Кроме того, концентрацию нПФ в плазме, концентрацию П5Ф в плазме, расстояние ходьбы в течение шести минут, показатель силы BOT-2, показатель скорости бега и показатель ловкости BOT-2, показатель HHD, показатель LEFS и показатель BPI-SF у взрослого или подростка с ГФФ можно сравнить с концентрацией нПФ в плазме, концентрацией П5Ф в плазме, расстоянием ходьбы в течение шести минут, показателями силы BOT-2, показателями скорости бега и ловкости BOT-2, показателем HHD, показателем LEFS и показателем BPI-SF, соответственно, пациента в начальной точке времени для оценки эффекта у взрослого или подростка после лечения с помощью рЩФ.
Кроме того, концентрацию нПФ в плазме, концентрацию П5Ф в плазме, расстояние ходьбы в течение шести минут, показатель силы BOT-2, показатель скорости бега и показатель ловкости BOT-2, показатель HHD, показатель LEFS и показатель BPI-SF у взрослого, имеющего ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подростка, имеющего ГФФ (например, подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), можно сравнить с концентрацией нПФ в плазме, концентрацией П5Ф в плазме, расстоянием ходьбы в течение шести минут, показателем силы BOT-2, показателем скорости бега и показателем ловкости BOT-2, показателем HHD, показателем LEFS и показателем BPI-SF у здорового пациента для определения эффекта лечения у взрослых или подростков, которым вводили рЩФ (например, асфотазу альфа). В частности, рЩФ можно вводить в течение периода лечения, по меньшей мере, одного года (например, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет, по меньшей мере, десяти лет или более десяти лет, например, на протяжении всей жизни пациента). Альтернативно, способы могут включать определение концентрации нПФ в плазме, концентрации П5Ф в плазме, расстояния ходьбы в течение шести минут, показателя силы BOT-2, показателя скорости бега и ловкости BOT-2, показателя HHD, показателя LEFS и показателя BPI-SF до введение рЩФ, такой как асфотаза альфа, как описано в данном документе, для оценки эффекта лечения с помощью рЩФ у взрослого или подростка.
Кроме того, каждый из описанных показателей (например, концентрация нПФ в плазме, концентрация П5Ф в плазме, расстояние ходьбы в течение шести минут, показатель силы BOT-2, показатель скорости бега и ловкости BOT-2, показатель HHD, показатель LEFS и показатель BPI-SF) можно использовать отдельно или в любой комбинации для оценки эффективности лечения с использованием рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитого полипептида рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) у взрослого, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего HPP, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или у подростка, имеющего ГФФ (например, у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), при этом улучшения, относящиеся к определенному значению или оценке показателя, могут быть использованы для демонстрации эффекта лечения у пациента с ГФФ с использованием рЩФ.
Гипофосфатазия у Взрослых и Подростков
Взрослых пациентов, имеющих ГФФ (например, взрослых, имеющих ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, таких как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростков, имеющих ГФФ (например, подростков, имеющих ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) можно лечить с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например слитый полипептид рЩФ с последовательностью SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель). В частности, асфотазу альфа (STRENSIQ) можно вводить, как описано в данном документе, для лечения ГФФ, начавшейся в детском возрасте, у взрослого пациента (например, пациента, не проходившего лечение). Соответственно, способы полезны для ослабления одного или более, или всех симптомов ГФФ, описанных в данном документе, особенно когда рЩФ (такая как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) вводят в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет). В частности, период лечения составляет, по меньшей мере, шесть недель.
Например, способы полезны для лечения симптомов взрослой формы ГФФ, включая, но не ограничиваясь этим повышенный уровень фосфоэтаноламина (ФЭА) в крови и/или моче, гипоминерализацию, гиперкальциурию, скелетную деформацию, переваливающуюся походку, костную боль, перелом кости (например, перелома позвоночника, субтрохантерный перелом или перелом плюсневой кости), отложение кристаллов пирофосфата кальция дигидрата, артрит, пирофосфатную артропатию, хондрокальциноз, кальцифицирующий периартрит, и псевдоперелом. Эти способы также полезны для лечения симптомов ГФФ у подростков, включая, но не ограничиваясь этим, повышенные уровни нПФ, ФЭА или П5Ф в крови или моче, остеомаляцию, одну или более деформацию скелета, гипотонию, мышечную слабость, ревматоидные осложнения, артрит, псевдоподагру, переваливающуюся походку, трудности при ходьбе, боль в костях, боль, раннюю потерю зубов, гипоминерализацию, легочную гипоплазию, дыхательную недостаточность, судороги, гиперкальциурию, низкий рост и задержку роста.
Типовые метрики, полезные для оценки необходимости или эффективности лечения с использованием рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазы альфа) включают (1) концентрации нПФ и/или П5Ф в плазме, (2) тест 6-минутной ходьбы (6MWT), (3) тест Брюинкса-Озерецкого на Оценку Моторики 2-е издание (BOT-2), (4) Динамометрию с использованием Портативных устройств (HHD), (5) Шкалу Функций Нижних Конечностей (LEFS) и (6) Краткий Опросник Оценки Боли (BPI-SF), которые более подробно описаны ниже.
Концентрации в плазме неорганического пирофосфата (нПФ) и пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф)
Пациенты, имеющие ГФФ (например, взрослые, имеющие ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такие как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте или подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) могут быть определены как подлежащие лечению с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например слитый полипептид рЩФ с последовательностью SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), путем определения концентраций нПФ и или П5Ф в образце, таком как образец плазмы или мочи пациента. Любой способ, известный специалистам в данной области техники, можно использовать для количественного определения концентраций нПФ и П5Ф в образце плазмы или, альтернативно, в образце мочи, как подробно описано в Whyte et al., 1995 (J. Clin. Invest. 95(4): 1440-1445),полностью включенной в данное описание посредством ссылки. Способы количественной оценки концентрации нПФ в образце плазмы или мочи также описаны в Cheung et al., 1977 (Anal. Biochem. 83: 61-63), Cook et al., 1978 (Anal. Biochem. 91: 557-565), и Johnson et al, 1968 (Anal. Biochem. 26: 137-145), каждая из которых полностью включена в данное описание посредством ссылки. В частности, концентрации нПФ и П5Ф в образце плазмы можно использовать для оценки активности ЩФ у пациента (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет).
По сравнению со здоровыми субъектами (например, здоровыми субъектами примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста), у пациентов с ГФФ обычно наблюдаются повышенные концентрации нПФ и П5Ф в плазме, например, концентрация нПФ до около 6 мкМ (например, около 3,5 мкМ, около 4 мкМ, около 4,5 мкМ, около 5 мкМ или около 5,5 мкМ) и/или концентрация П5Ф до около 1300 нг/мл (например, концентрация П5Ф в плазме около 200 нг/мл, 300 нг/мл, 400 нг/мл, 500 нг/мл, 600 нг/мл, 700 нг/мл, 800 нг/мл, 900 нг/мл, 1000 нг/мл, 1100 нг/мл, 1200 нг/мл или 1300 нг/мл). Нижний предел нормы концентрации нПФ в плазме здоровых взрослых составляет около 1 мкМ, а верхний предел нормы составляет около 5,9 мкМ. Нижний предел нормы для концентраций П5Ф в плазме здоровых взрослых составляет менее около 10 нг/мл, тогда как верхний предел нормы составляет около 60 нг/мл. Нижний предел нормы для концентраций нПФ в плазме здоровых подростков составляет менее около 0,75 мкМ, тогда как верхний предел нормы составляет около 4,78 мкМ. Нижний предел нормы для концентраций П5Ф в плазме здоровых подростков составляет менее чем около 5,74 нг/мл, тогда как верхний предел нормы составляет около 61,15 нг/мл.
Пациенты с ГФФ (например, взрослые, имеющие ГФФ, в возрасте около 18 лет и старше, такие как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13лет до около 17 лет) с повышенными концентрациями нПФ и/или PLP в плазме могут проходить лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ с последовательностью SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как введение рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель). Например, пациент, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) с концентрацией нПФ до около 6 мкМ можно лечить с помощью рЩФ в течение периода лечения. Аналогично, пациент, имеющий ГФФ, с концентрацией П5Ф до около 1300 нг/мл может проходить лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения.
Способы приводят к статистически значимому снижению концентрации нПФ и/или П5Ф в образце (например, образце плазмы) пациента. Например, лечение с помощью рЩФ приводит к снижению концентрации нПФ в образце (например, образце плазмы) пациента на около 1 мкМ, около 1,5 мкМ, около 2 мкМ, около 2,5 мкМ или около 3 мкМ или на 25% или более (например, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или более 60%) относительно концентраций нПФ в образце (например, образце плазмы) пациента с ГФФ, не проходившего лечение (например, субъекта с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, в возрасте около 18 лет или старше). Таким образом, у пациента наблюдается концентрация нПФ в плазме, например, от около 2 мкМ до около 5 мкМ, от около 3 мкМ до около 5 мкМ, от около 2 мкМ до около 4 мкМ или от около 2 мкМ до около 3 мкМ после введения рЩФ.
Аналогично, лечение с помощью рЩФ приводит к снижению концентрации П5Ф в образце (например, образце плазмы) пациента на около 100 нг/мл, 125 нг/мл, 150 нг/мл, 175 нг/мл, 200 нг/мл, 225 нг/мл или 250 нг/мл или на 50% или более (например, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более чем 95%) относительно концентраций П5Ф в образце (например, образце плазмы) пациента с ГФФ, не проходившего лечение (например, субъекта с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, в возрасте около 18 лет или старше). Таким образом, у пациента наблюдается концентрация П5Ф в плазме, например, от около 2 нг/мл до около 150 нг/мл, от около 4 нг/мл до около 100 нг/мл, от около 10 нг/мл до около 75 нг/мл или от около 1 нг/мл до около 50 нг/мл после введения рЩФ.
Снижение концентраций нПФ и/или П5Ф в плазме пациента с ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как у взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может поддерживаться в течение всего периода введения рЩФ. Например, концентрация нПФ в плазме снижается на около 25% и остается на уровне ± 10% от сниженной концентрации нПФ в плазме при лечении с помощью рЩФ и/или концентрация П5Ф в плазме снижается на около 50% и остается на уровне ± 10% от сниженной концентрации П5Ф в плазме при лечении с помощью рЩФ.
Альтернативно, когда введение рЩФ не приводит к снижению концентраций нПФ в образце плазмы пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) на около 25% или более, дозу и/или частоту введения рЩФ можно изменить, чтобы определить эффективное количество рЩФ для пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте). Аналогичным образом, когда введение рЩФ не приводит к снижению концентраций П5Ф в образце плазмы пациента на около 50% или более, дозу и/или частоту введения рЩФ можно изменить, чтобы определить эффективное количество рЩФ для пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 дет до около 17 лет). Например, доза рЩФ может быть увеличена, например, с около 2,1 мг/кг/неделя или около до 3,5 мг/кг/неделя до около 6 мг/кг/неделя или около 9 мг/кг/неделя.
Тест 6-минутной ходьбы (6MWT)
Взрослые, имеющие ГФФ (например, взрослые, имеющие ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такие как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте или подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) могут быть определены как подлежащие лечению с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например слитый полипептид рЩФ с последовательностью SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) с использованием 6MWT. В частности, 6MWT можно использовать для оценки способности к ходьбе у взрослого, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или у подростка, имеющего ГФФ (например, подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) для получения значения 6MWT для взрослого или подростка.
6MWT можно выполнять в помещении или на открытом воздухе, используя плоский, прямой, закрытый коридор (например, длиной около 30 метров) с твердой поверхностью. Секундомер или другой таймер можно использовать для отслеживания времени, а механический счетчик или другое устройство можно использовать для определения расстояния (например, в метрах) ходьбы у пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ (например, подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Например, длина коридора может быть отмечена каждые три метра, чтобы определить количество метров, пройденных пациентом, имеющим ГФФ, с точкой поворота на 30 метрах и также отмеченной начальной линией. Расстояние, пройденное пациентом за шесть минут, можно затем сравнить с прогнозируемым количеством пройденных метров, например, у субъекта, не проходившего лечение, примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста, и выразить в виде процентного значения для получения значения 6MWT пациента. Значение 6MWT пациента (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13лет до около 17 лет) можно сравнить со значением 6MWT пациента в начальной точке времени. Кроме того, значение 6MWT у взрослого или подростка, имеющего ГФФ, можно сравнить со значением 6MWT у здорового пациента.
Пациенты с ГФФ (например, взрослые, имеющие ГФФ, в возрасте около 18 лет и старше, такие как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) с показателями 6MWT менее чем около 80% относительно прогнозируемого показателя 6MWT могут проходить лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ с последовательностью SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как введение рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель). Например, пациент, имеющий ГФФ, с 6MWT менее чем около 80% от прогнозируемой величины 6MWT (например, около 50%, около 55%, около 60%, около 65%, около 70% или около 75% от прогнозируемого показателя 6MWT) может проходить лечение с помощью рЩФ (такого как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель).
Способы могут привести к улучшению значения 6MWT у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющего ГФФ, начавшуюся в детском возрастеимеющего ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Например, лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель), может привести к увеличению значения 6MWT до около 80% или более относительно прогнозируемого значения 6MWT пациента (например, около 82%, около 84%, около 86%, около 88%, около 90%, около 92%, около 94%, около 96%, около 98% или более относительно прогнозируемого значения 6MWT).
Увеличение значения 6MWT у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как у взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может поддерживаться в течение всего периода введения рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), например, в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель). Например, значение 6MWT увеличивается до более чем около 80% относительно прогнозируемого значения 6MWT у пациента и остается на уровне ± 10% относительно увеличенного значения 6MWT во время лечения с помощью рЩФ (например, асфотазы альфа).
Аналогичным образом, увеличение способности к ходьбе у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может поддерживаться в течение всего периода введения рЩФ, например, в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель). Например, пациент, имеющий ГФФ, проявляет меньшую зависимость от вспомогательного устройства для мобильности, такого как ходунки, инвалидная коляска, ортопедические скобы, костыли или ортопедические устройства, во время лечения с помощью рЩФ.
Альтернативно, если введение рЩФ не приводит к увеличению значения 6MWT до значения, превышающего 80% относительно прогнозируемого значения 6MWT (например, субъекта, имеющего ГФФ, не проходившего лечение, примерно того же возраста, того же пола и/или роста) дозировку и/или частоту введения рЩФ можно изменить, чтобы определить эффективное количество рЩФ для пациента с ГФФ (например, для взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Например, дозировка рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть увеличена, например, от около 2,1 мг/кг/неделя или около 3,5 мг/кг/неделя до около 6 мг/кг/неделя или около 9 мг/кг/неделя.
Тест Брюинкса-Озерецкого для Оценки Моторики, 2-е издание (BOT-2)
Взрослые, имеющие ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростки, имеющие ГФФ (например, подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) могут быть идентифицированы для лечения с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитого полипептида рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) с использованием тестов скорости бега и ловкости BOT-2 и тестом силы BOT-2. В частности, тесты скорости и ловкости BOT-2 и тесты силы BOT-2 могут использоваться для оценки физических нарушений и ограничений подвижности у взрослого, имеющего ГФФ, для получения общего показателя скорости и ловкости BOT-2 и/или общего показателя силы BOT-2 для взрослого.
BOT-2 включает ряд тестов для оценки физических нарушений у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), которые могут быть выполнены, например, с помощью набора, включающего тесты. BOT-2 обеспечивает составные оценки BOT-2 в следующих областях: сила, скорость бега и ловкость, точность мелкой моторики, целостность мелкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, баланс и координация верхних конечностей. Например, взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может выполнять приседания, подъем прямых ног в положении лежа, прыжки в длину с места, приседание с опорой и/или отжимания, чтобы определить показатель силы BOT-2; взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может делать проходку по гимнастическому бревну и/или выполнить челночный бег, боковые прыжки на двух ногах и/или боковые прыжки на одной ноге для определения скорости бега и показателя ловкости BOT-2; взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может вырезать круг и/или соединять точки, чтобы определить показатель точности мелкой моторики BOT-2; взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может скопировать звездочку и/или скопировать квадрат, чтобы определить показатель целостности мелкой моторики BOT-2; взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может передавать монетки, сортировать карточки и/или струнные блоки, чтобы определить показатель ловкости рук; взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может постукивать ногой и пальцем и/или выполнять прыжки с разведением ног в стороны, чтобы определить показатель двусторонней координации BOT-2; взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может идти вперед по линии и/или стоять на одной ноге на балансире для определения показателя баланса BOT-2; и взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может бросать мяч в цель и/или ловить брошенный мяч, чтобы определить показатель координации верхних конечностей BOT-2. Показатель BOT-2 представляет собой совокупную сумму каждой оцененной области. Кроме того, показатель BOT-2, используемый для оценки физической подготовленности пациента, может представлять собой исходную суммарную оценку или нормативную оценку.
Взрослый, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подросток, имеющий ГФФ (например, подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может выполнять тесты в одной или более описанных областях (сила, скорость бега и ловкость, тонкая моторика, целостность тонкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, баланс и координация верхних конечностей) для получения показателя BOT-2, указывающего на физические нарушения у взрослого или подростка. В пределах каждой области BOT-2 (сила, скорость бега и ловкость, тонкая моторика, целостность тонкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, баланс и координация верхних конечностей) взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может проходить один или более тестов для определения показателя BOT-2 для взрослого или подростка, например, взрослый или подросток может выполнять одно или более из приседаний, подъема прямых ног в положении лежа, прыжка в длину с места, приседаний с опорой для определения показателя силы BOT-2. Если необходимо, может быть проведен только один тест (например, один тест, выбранный из группы, состоящей из приседаний, подъема прямых ног в положении лежа, прыжков в длину с места, приседаний с опорой и отжиманий), чтобы определить показатель BOT-2 (например, показатель силы BOT-2) взрослого или подростка, имеющего ГФФ.
Каждый из показателей BOT-2 (сила, скорость бега и ловкость, точность мелкой моторики, целостность мелкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, баланс и координация верхних конечностей) пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет и старше, например, взрослого, имеющего ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), можно сравнить с показателем BOT-2 пациентов без ГФФ (например, взрослого, не имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет и старше или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), например, для определения стандартного отклонения показателя BOT-2. Каждый из показателей BOT-2 (например, сила, скорость бега и ловкость, точность мелкой моторики, целостность мелкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, баланс и координация верхних конечностей) пациента, имеющего ГФФ, можно сравнить с показателем BOT-2 других пациентов, имеющий ГФФ (например, пациентов, имеющий ГФФ, примерно того же возраста, роста и/или пола), например, для определения показателя BOT-2 для пациента, имеющего ГФФ.
Показатели BOT-2 (например, показатели силы, скорости бега и ловкости, мелкой моторики, целостности мелкой моторики, ловкости рук, двусторонней координации, баланса и координации верхней конечности) находятся в диапазоне от 0 до около 25, или менее, при этом показатель более чем около 10 считается соответствующим здоровым субъектам (например, пациенты, не имеющие ГФФ). Пациенты с показателем BOT-2 (например, показателями силы, скорости бега и ловкости, мелкой моторики, целостности мелкой моторики, ловкости рук, двусторонней координации, баланса и координации верхних конечностей) составляющим менее 10 могут проходить лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как введение рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель).
Например, пациент, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) и показатель скорости бега и ловкости BOT-2 менее 10 (например, около 0, около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10) может проходить лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель). Таким же образом пациент, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) с показателем силы BOT-2 менее 12 (например, около 0, около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13 или около 14) затем могут проходить лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель).
Способы приводят к улучшению показателя BOT-2 (например, силы, скорости бега и ловкости, мелкой моторики, целостности мелкой моторики, ловкости рук, двусторонней координации, баланса и/или показателя координации верхних конечностей) у пациента с ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Например, лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель), может привести к увеличению показателя силы BOT-2 до около 10, до около 20 или более (например, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24 или около 25). Кроме того, лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель), может привести к увеличению показателя скорости бега и ловкости BOT-2 до около 9, до около 20 или более (например, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24 или около 25).
Увеличение показателя BOT-2 (например, показатель силы, скорости бега и ловкости, точность мелкой моторики, целостности мелкой моторики, ловкости рук, двусторонней координации, баланса и/или координации верхних конечностей) может поддерживаться в течение всего периода введения рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), например, в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель). Аналогично, ослабление физических нарушений может поддерживаться в течение всего периода введения рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитого полипептида рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), например, в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель).
Показатели BOT-2 (сила, скорость бега и ловкость, точность мелкой моторики, целостность мелкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, баланс и координация верхних конечностей) у пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющего ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), могут использоваться отдельно или в комбинации для оценки эффективности лечения с использованием рЩФ (такой как в качестве ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), при этом улучшения по сравнению с определенной оценкой теста показывают, что рЩФ эффективна для лечения физических нарушений, связанных с ГФФ. Например, введение рЩФ пациенту, имеющему ГФФ (например, взрослому, имеющему ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такому как, взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростку, имеющему ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) приводит к увеличению показателя скорости бега и ловкости BOT-2 до около 9 или выше, при котором у пациента ранее был показатель скорости бега и ловкости BOT-2 менее чем около 7, таким образом рЩФ считается эффективной при, например, лечении физических нарушений, связанных с ГФФ. Альтернативно, увеличение по меньшей мере, на два или более баллов (например, на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 баллов) по сравнению с показателями скорости бега и ловкости BOT-2 до лечения указывает на эффективность (например, в сочетании с устойчивым высоким баллом в течение более 1 года лечения).
Кроме того, в каждой области BOT-2 (сила, скорость бега и ловкость, точность мелкой моторики, целостность мелкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, баланс и координация верхних конечностей) пациент, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как, взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет), может выполнить один или более тестов для определения показателя BOT-2 пациента. Например, взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может выполнить одно или более из приседаний, подъема прямых ног в положении лежа, прыжков в длину с места, приседаний с опорой и отжиманий для определения показателя силы BOT-2 и оценки эффективности лечения с помощью введения рЩФ. Взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может выполнить одно или более из прохождения по гимнастическому бревну, челночного бега, боковых прыжков на двух ногах и/или боковых прыжков на одной ноге для определения показателя скорости бега и ловкости BOT-2 и оценки эффективности лечения с помощью введения рЩФ. Взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может вырезать кружок и/или соединять точки для определения показателя точности мелкой моторики BOT-2 и оценки эффективности лечения с помощью введения рЩФ. Взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может скопировать звездочку и/или скопировать квадрат для определения показателя целостности мелкой моторики BOT-2 и оценки эффективности лечения с помощью введения рЩФ. Взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может выполнять одно или более из передачи монеток, сортировки карточек и струнных блоков для определения показателя ловкости рук BOT-2 и оценки эффективности лечения с помощью введения рЩФ. Взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может постукивать его или ее ногой и пальцем и/или выполнять прыжки для определения показателя двусторонней координации BOT-2 и оценки эффективности лечения с помощью введения рЩФ. Взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может идти вперед по линии и/или стоять на одной ноге на гимнастическом бревне для определения показателя баланса BOT-2 и и оценки эффективности лечения с помощью введения рЩФ. Взрослый или подросток, имеющий ГФФ, может бросать мяч в цель и/или ловить брошенный мяч для определения показателя координации верхних конечностей BOT-2 и оценки эффективности лечения с помощью введения рЩФ.
Альтернативно, если введение рЩФ не приводит к увеличению показателя скорости бега и ловкости BOT-2 до более чем около 9 (например, увеличение по меньшей мере, от 2 до 10 баллов (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 баллов) по сравнению с показателем скорости бега и ловкости BOT-2 до лечения с помощью рЩФ), дозировку и/или частоту введения рЩФ можно изменить для определения эффективного количества рЩФ для пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около1 3 лет до около 17 лет). Например, дозировка рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть увеличена, например, с около 2,1 мг/кг/неделя или около 3,5 мг/кг/неделя до около 6 мг/кг/неделя или до около 9 мг/кг/неделя.
Динамометрия с использованием Портативных устройств (HHD)
™
Хватательная и мышечная сила пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может быть оценена с помощью динамометрии с использованием портативных устройств (HHD). Например, сгибание и разгибание колена, а также сгибание, разгибание и отведение в сторону бедра пациента, имеющего ГФФ, могут быть измерены с использованием, например, динамометра MICROFET2, в то время как хватательная сила пациента, имеющего ГФФ, может быть измерена с использованием, например, динамометра с захватом JAMAR. В частности, администратор держит динамометр в неподвижном состоянии, а пациент прилагает максимальную силу к динамометру. Данные пиковой силы собираются в фунтах, а затем преобразуются в Ньютоны (Н, N). Значения крутящего момента затем рассчитываются с использованием длины конечности в Ньютон-метрах. Затем значение крутящего момента можно сравнить со значением крутящего момента, например, нормального субъекта примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста, и выразить в виде процентного значения, чтобы получить оценку HHD субъекта.
Пациент, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) с показателем HHD менее чем около 80% относительно прогнозируемого показателя HHD (например, относительно нормального субъекта примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста) может проходить лечение с помощью рЩФ (такой как, ТНЩФ, например слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Например, пациент, имеющий ГФФ, с HHD менее чем около 80% относительно прогнозируемого показателя HHD может проходить лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель).
Способы могут привести к улучшению показателя HDD у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Например, лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель), может привести к увеличению показателя HDD на около 5% или более относительно прогнозируемого показателя HDD пациента (например, увеличение на около 5%, около 10%, около 15%, около 20%, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45% или около 50%).
Увеличение показателя HDD у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как у взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может поддерживаться в течение всего периода введения рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), например, в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента, имеющего ГФФ; в частности, по меньшей мере, шесть недель). Например, показатель HHD увеличивается на около 5% или более относительно прогнозируемого показателя HHD и остается на уровне ±10% относительно увеличенного показателя HHD во время лечения с помощью рЩФ. Альтернативно, если введение рЩФ не приводит к увеличению показателя HHD на около 5% или более относительно прогнозируемого показателя HHD (например, у пациента, имеющего ГФФ, примерно того же возраста, того же пола и/или роста), дозировку и/или частоту введения рЩФ можно изменить для определения эффективного количества рЩФ для пациента, имеющего ГФФ. Например, доза рЩФ может быть увеличена, например, с около 2,1 мг/кг/неделя или около до 3,5 мг/кг/неделя до около 6 мг/кг/неделя или около 9 мг/кг/неделя.
Шкала Функций Нижних Конечностей (LEFS)
Снижение функциональной способности в нижних конечностях у пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может быть оценена с помощью шкалы функций нижних конечностей (LEFS). LEFS может быть использована для оценки функциональных нарушений одной или обеих нижних конечностей пациента с ГФФ, включая возможность наблюдать пациента с течением времени и оценивать эффективность лечения с помощью асфотазы альфа. Лицензированный физиотерапевт может назначить LEFS пациенту, имеющему ГФФ (например, пациенту, имеющему ГФФ, в возрасте около 13 лет или старше) в формате интервью.
Пациент, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) с показателем LEFS менее чем около 40 (например, показатель LEFS около 10, около 15, около 20, около 25, около 30, около 35 или около 40) может проходить лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Например, пациент, имеющий ГФФ, с показателем LEFS менее чем около 40 (например, показателем LEFS около 10, около 15, около 20, около 25, около 30, около 35 или около 40) может проходить лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения, по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель).
Способы могут привести к улучшению показателя LEFS у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Например, лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель), может привести к увеличению показателя LEFS на около 3 или более (например, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10).
Увеличение показателя LEFS у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как у взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может поддерживаться в течение всего периода введения рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), например, в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента, имеющего ГФФ; в частности, по меньшей мере, шесть недель). Например, показатель LEFS может увеличиться на около 3 или более (например, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10) и остается на уровне ±10% относительно увеличенного показателя LEFS во время лечения с помощью рЩФ. Альтернативно, когда введение рЩФ не приводит к увеличению показателя LEFS на около 3 или более (например, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10) дозировка и/или частота введения рЩФ могут быть изменены для определения эффективного количества рЩФ для пациента, имеющего ГФФ. Например, доза рЩФ может быть увеличена, например, с около 2,1 мг/кг/неделя или около до 3,5 мг/кг/неделя до около 6 мг/кг/неделя или около 9 мг/кг/неделя.
Краткий Опросник Оценки Боли (BPI-SF)
Уровень боли пациента, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может быть оценен с помощью Краткого Опросника Оценки Боли (BPI-SF). BPI-SF представляет собой опросник, предназначенный для оценки тяжести боли и ее влияния на повседневные функции. BPI-SF состоит из 11 пунктов, которые используют числовую оценочную шкалу для оценки выраженности боли (4 единицы) и болевого вмешательства (7 единиц) за 24 часа до предоставления опросного листа. Опросный лист BPI-SF предоставляет информацию об интенсивности боли и степени, в которой боль влияет на ежедневные функции пациента, имеющего ГФФ (например, пациента, имеющего ГФФ, в возрасте около 13 лет или старше) по числовой шкале от 0 (без боли) до 10 (сильная боль или значительное вмешательство, вызванное болью); более низкие оценки указывают на улучшение качества жизни и уменьшение боли. Например, оценки BPI-SF у подростков и взрослых с ГФФ представляют собой комплекс из 11 оценок боли.
Пациент, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) с показателем BPI-SF более чем около 10 (например, показатель BPI-SF около 10, около 15, около 20, около 25, или около 30 или более) может проходить лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Например, пациент, имеющий ГФФ, с показателем BPI-SF более чем около 10 (например, показателем BPI-SF около 10, около 15, около 20, около 25, или около 30 или более) может проходить лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения, по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель).
Способы могут привести к улучшению показателя BPI-SF у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Например, лечение с помощью рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), такое как лечение с помощью рЩФ в течение периода лечения по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шести недель), может привести к снижению показателя BPI-SF на около - 2 или более (например, на около - 2, около - 3, около - 4, около - 5, около - 6 или около - 7 или более).
Снижение показателя BPI-SF у пациента, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как у взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) может поддерживаться в течение всего периода введения рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), например, в течение периода времени по меньшей мере, две недели (например, по меньшей мере, три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере, восемь недель, по меньшей мере, девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере, три месяца, по меньшей мере, четыре месяца, по меньшей мере, пяти месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере, два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере, четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере, шесть лет, по меньшей мере, семь лет, по меньшей мере, восемь лет, по меньшей мере, девять лет или, по меньшей мере, десять лет, или в течение продолжительности жизни пациента, имеющего ГФФ; в частности, по меньшей мере, шесть недель). Например, показатель BPI-SF уменьшается на около - 2 или более (например, на около - 2, около - 3, около - 4, около - 5, около - 6 или около - 7 или более) и остается на уровне ±10% относительно сниженного показателя BPI-SF во время лечения с помощью рЩФ.
Альтернативно, если введение рЩФ (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), не приводит к снижению показателя BPI-SF на около - 2 или более (например, на около - 2, около - 3, около - 4, около - 5, около - 6 или около - 7 или более), дозировку и/или частоту рЩФ можно изменить, чтобы определить эффективное количество рЩФ для пациента, имеющего ГФФ. Например, доза рЩФ может быть увеличена, например, с около 2,1 мг/кг/неделя или около до 3,5 мг/кг/неделя до около 6 мг/кг/неделя или около 9 мг/кг/неделя.
Щелочная Фосфатаза
Асфотаза альфа представляет собой слитый полипептид ТНЩФ человека (чТНЩФ; SEQ ID NO: 1), приготовленный для лечения ГФФ. В частности, асфотазу альфа (SEQ ID NO: 1) можно эффективно использовать для лечения гипофосфатазии (ГФФ), ее симптомов и физических нарушений, связанных с ней, у взрослого человека, имеющего ГФФ (например, у взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, или у подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) в течение продолжительного периода времени (например, по меньшей мере, шести месяцев, по меньшей мере, одного года, по меньшей мере, двух лет, по меньшей мере, трех лет, по меньшей мере, четырех лет, по меньшей мере, пяти лет, по меньшей мере, шести лет, по меньшей мере, семи лет, по меньшей мере, восьми лет, по меньшей мере, девяти лет, по меньшей мере, десяти лет или больше десяти лет, например, в течение всей жизни пациента).
Учитывая результаты, описанные в данном документе, способы лечения не ограничиваются введением конкретной щелочной фосфатазы (ЩФ) или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ЩФ. Щелочные фосфатазы охватывают группу ферментов, которые катализируют расщепление фосфатной части (например, гидролиз пирофосфата, нПФ). Существует четыре известных изофермента щелочной фосфатазы (ЩФ) млекопитающих: тканевая неспецифическая щелочная фосфатаза (ТНЩФ; подробно описанная ниже), плацентарная щелочная фосфатаза (ПЩФ) (например, регистрационные номера P05187, NP_112603 и NP_001623), щелочная фосфатаза зародышевых клеток (ЗЩФ) (например, регистрационный номер P10696) и кишечная щелочная фосфатаза (КЩФ) (например, регистрационные номера P09923 и NP_001622). В дополнение к типовым ЩФ, описанным выше, любой полипептид, имеющий идентичную или сходную структуру каталитического сайта и/или ферментативную активность ЩФ, может быть использован (например, в качестве рЩФ или слитого полипептида рЩФ, как определено в данном документе) для лечения пациентов, имеющих ГФФ, таких как взрослые, имеющие ГФФ (например, взрослые, имеющие ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такие как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростки, имеющие ГФФ (например, подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Конъюгаты для доставки в костную ткань, содержащие рЩФ, дополнительно описаны в международных публикациях №: WO 2005/103263 и WO 2008/138131.
ТНЩФ, которые можно использовать в соответствии со способами, описанными в данном документе, включают, например, человеческую ТНЩФ (регистрационные номера NP_000469, AAI10910, AAH90861, AAH66116, AAH21289 и AAI26166); ТНЩФ резуса (регистрационный номер XP_01109717); ТНЩФ крысы (регистрационный номер NP_037191); ТНЩФ собаки (регистрационный номер AAF64516); ТНЩФ свиньи (регистрационный номер AAN64273), мыши (регистрационный номер NP_031457), ТНЩФ коровы (регистрационные номера NP_789828, NP_776412, AAM 8209 и AAC33858) и ТНЩФ кошки (регистрационный номер NP_001036028). В частности, ТНЩФ может представлять собой рекомбинантную человеческую ТНЩФ (например, SEQ ID NO: 1, асфотаза альфа; см. патенты США № 7,763,712 и 7,960,529, которые полностью включены в данное описание посредством ссылки), используемую для лечения пациентов, имеющих ГФФ, таких взрослые, имеющие ГФФ (например, взрослые, имеющие ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такие как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростки, имеющие ГФФ (например, подростки, имеющие ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). ТНЩФ также может представлять собой таковую, которая имеет по меньшей мере, около 95% идентичности последовательности относительно полипептида или последовательности нуклеиновой кислоты вышеуказанных ТНЩФ.
Растворимые Щелочные Фосфатазы
ЩФ, которые можно использовать в способах, описанных в данном документе, включают растворимые (например, внеклеточные или не связанные с мембраной) формы любой из щелочных фосфатаз, описанных в данном документе. рЩФ может представлять собой, например, растворимую форму неспецифической для ткани щелочной фосфатазы человека (ТНЩФ человека (чТНЩФ)). Способы не ограничиваются конкретной рЩФ и могут включать любую рЩФ, которая является физиологически активной в отношении, например, фосфоэтаноламина (ФЭА), неорганического пирофосфата (нПФ) и пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф). В частности, рЩФ является каталитически компетентной для усиления скелетной минерализации костей. Способы дополнительно включают нуклеиновые кислоты, кодирующие рЩФ, описанные в данном документе, которые можно использовать для лечения состояний, описанных в данном документе, например, ГФФ, например, взрослых, имеющих ГФФ (например, взрослых, имеющих ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, таких как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подростков, имеющих ГФФ (например, подростков, имеющих ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет).
ТНЩФ представляет собой связанный с мембраной белок, закрепленный с помощью гликолипидного фрагмента на С-конце (Swiss-Prot, P05186). Этот гликолипидный якорь (GPI) добавляется посттрансляционно после удаления гидрофобного C-терминального конца, который служит как в качестве временного мембранного якоря, так и в качестве сигнала для добавления GPI. Хотя GPI якорь находится в клеточной мембране, оставшиеся части ТНЩФ являются внеклеточными. В частности, ТНЩФ (например, ТНЩФ человека (чТНЩФ)) может быть модифицирована для замены первой аминокислоты гидрофобной С-концевой последовательности (аланина) на стоп-кодон, тем самым продуцируя модифицированную чТНЩФ, которая содержит все аминокислотные остатки нативной формы прикрепленной ТНЩФ и не имеет мембранного якоря GPI. Специалист в данной области техники поймет, что положение мембранного якоря GPI будет варьировать в разных ЩФ и может включать, например, последние 10, 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50 или более аминокислотных остатков на С-конце полипептида. Рекомбинантная рЩФ может включать, например, аминокислоты от 1 до 502 (от 18 до 502 при секреции), аминокислоты от 1 до 501 (от 18 до 501 при секреции), аминокислоты от 1 до 504 (от 18 до 504 при секреции), аминокислоты от 1 до 505 (18-505 при секреции) или аминокислоты от 1 до 502. Таким образом, С-конец нативной ЩФ может быть укорочен на несколько аминокислот, не влияя на активность ЩФ.
В дополнение к C-концевому GPI якорю ТНЩФ также имеет N-концевую сигнальную пептидную последовательность. N-концевой сигнальный пептид присутствует в синтезированном белке, когда он синтезируется, но отщепляется от ТНЩФ после транслокации в ЭР. рЩФ включают как секретируемые (т.е. не имеющие N-концевого сигнала), так и не секретируемые (т.е. имеющие N-концевой сигнал) их формы. Специалист в данной области техники поймет, что положение N-концевого сигнального пептида будет варьировать в разных щелочных фосфатазах и может включать, например, первые 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30 или более аминокислотных остатков на N-конце полипептида. Специалист в данной области техники может предсказать положение сайта отщепления сигнальной последовательности, например, с помощью соответствующего компьютерного алгоритма, такого как описанный в Bendtsen et al. (J. Mol. Biol. 340(4):783-795, 2004) и доступен в сети Интернет по адресу www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/.
Способы также могут быть реализованы с использованием консенсусных последовательностей рЩФ, полученных из внеклеточного домена изозимов ЩФ (например, ТНЩФ, ПЩФ, ЗЩФ, КЩФ и т.д.). Таким образом, подобно рТНЩФ, обсужденной выше, в данном раскрытии также предложены другие растворимые изозимы ЩФ человека, т.е. без пептидного сигнала, предпочтительно содержащие внеклеточный домен ЩФ. рЩФ также включают полипептидные последовательности, удовлетворяющие консенсусной последовательности, полученной из внеклеточного домена ЩФ изозимов ЩФ человека и ортологов ТНЩФ млекопитающих (человека, мыши, крысы, коровы, кошки и собаки) или консенсусной последовательности, полученной из внеклеточного домена ЩФ лишь ортологов ТНЩФ млекопитающих (человека, мыши, крысы, коровы, кошки и собаки). рЩФ также включают те, которые удовлетворяют подобным консенсусным последовательностям, полученным из различных комбинаций этих ортологов ТНЩФ или изозимов ЩФ человека. Такие консенсусные последовательности приведены, например, в WO 2008/138131.
рЩФ согласно данным способам могут включать не только последовательность рЩФ дикого типа, описанную выше, но и любой полипептид, имеющий, по меньшей мере, 50% (например, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичности последовательности относительно данных щелочных фосфатаз (например, SEQ ID NO: 1-24; например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Примеры мутаций, которые могут быть введены в последовательность ЩФ, описаны в публикации США № 2013/0323244, которая полностью включена в данное описание посредством ссылки. рЩФ может быть необязательно гликозилирована по любому подходящему одному или более аминокислотным остаткам. Кроме того, рЩФ может иметь, по меньшей мере, 50% (например, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичности последовательности относительно любой из описанных рЩФ в данном документе (такой как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). рЩФ может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более инсерций, делеций или замен относительно любой из рЩФ, описанных в данном документе (таких как ТНЩФ, например, слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).
Слитные Полипептиды рЩФ
Любой из рЩФ и линкеров, описанных в данном документе, могут быть объединены в полипептид рЩФ, например, в полипептид рЩФ A-рЩФ-B, где каждый из A и B отсутствует или представляет собой аминокислотную последовательность из, по меньшей мере, одной аминокислоты (такой как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Если присутствует, A и/или B могут представлять собой любой линкер, описанный в данном документе. В некоторых полипептидах рЩФ A отсутствует, B отсутствует или A и B отсутствуют. Полипептиды рЩФ согласно изобретению могут необязательно содержать область Fc для получения слитого полипептида рЩФ, как описано в данном документе. Полипептид рЩФ может необязательно содержать таргетирующий кости фрагмент, как описано в данном документе. В некоторых полипептидах рЩФ линкер, например, гибкий линкер, может быть вставлен между фрагментом, таргетирующим кости, и рЩФ, например, в виде дипептидной последовательности (например, лейцин-лизин или аспарагиновая кислота-изолейцин). Другие примеры областей Fc, линкеров и фрагментов, таргетирующих кости, описаны ниже.
n
n
n
n
n
n
n
Любые из рЩФ, линкеров и Fc-областей, описанных в данном документе, могут быть объединены в слитый полипептид, например, рекомбинантный слитый полипептид, который содержит структуру Z-рЩФ-Y-спейсер-X-W-V, Z-W-X-спейсер-Y-рЩФ-V, Z-рЩФ-Y-W-X-спейсер-V, и Z-W-X-рЩФ-Y-спейсер-V (такой как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). В частности, структура может представлять собой Z-рЩФ-Y-спейсер-X-W-V или Z-W-X-spacer-Y-рЩФ-V. рЩФ может представлять собой полноразмерные или функциональные фрагменты ЩФ, такие как растворимый внеклеточный домен ЩФ, как описано в данном документе (например, ТНЩФ, ПЩФ, ЗЩФ и КЩФ). Любой из X, Y, Z и V и/или спейсер может отсутствовать или иметь аминокислотную последовательность, по меньшей мере, из одной аминокислоты. W может представлять собой таргетирующий кости фрагмент, например, имеющий серию последовательных остатков Asp или Glu, где n=от 1 до 50, например, n=3-30, например, 5-15, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, или 50. Таргетирующий кости фрагмент, если он присутствует, может быть расположен в любом месте слитого полипептида, например, на N-конце или возле N-конца или на C-конце и/или в области линкера. Например, таргетирующий кости фрагмент находится на С-терминальном конце. Полипептиды рЩФ и слитые полипептиды также могут не содержать таргетирующий кости фрагмент.
10
Слитые полипептиды рЩФ согласно данному изобретению могут иметь структуру чТНЩФ-Fc-D. В частности, слитые полипептиды рЩФ могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа.
n
Подходящие спейсеры включают, но не ограничиваются этим, полипептиды, содержащие Fc, и гидрофильные и гибкие полипептиды, способные ослаблять силы отталкивания, вызванные присутствием терминального сильно отрицательно заряженного пептида (например, W). Например, рЩФ может представлять собой слитый полипептид, содержащий область Fc иммуноглобулина на N-концевом или С-концевом домене. Молекула иммуноглобулина имеет структуру, которая хорошо известна в данной области техники. Она содержит две легкие цепи (~23 кДа каждая) и две тяжелые цепи (~50-70 кДа каждая), соединенные межцепочечными дисульфидными связями. Иммуноглобулины легко расщепляются протеолитически (например, расщеплением папаином) в Fab (содержащий легкую цепь и домены VH и CH1 тяжелой цепи) и Fc (содержащий домены CH2 и CH3 тяжелой цепи вместе с примыкающими последовательностями). Подходящие фрагменты Fc, как описано в данном документе, включают фрагмент Fc любой молекулы иммуноглобулина, включая IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, и их различные подклассы (например, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1, IgA-2) от любого млекопитающего (например, человека). Например, фрагмент Fc представляет собой человеческий IgG-1. Фрагменты Fc согласно изобретению могут содержать, например, домены СН2 и СН3 тяжелой цепи и любую часть шарнирной области. Область Fc может быть необязательно гликозилирована в любом подходящем одном или более аминокислотных остатках, известных специалистам в данной области техники. В частности, фрагмент Fc слитого полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, или имеет по меньшей мере, 50% (например, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичности последовательности относительно SEQ ID NO: 20. Модифицированные, например, не встречающиеся в природе, области Fc могут быть использованы в способах согласно изобретению, например, как описано в публикации международной патентной заявки № WO2005/007809, которая включена в данное описание посредством ссылки. Описанный в данном документе фрагмент Fc может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или более инсерций, делеций или замен относительно любого из фрагментов Fc, описанных в данном документе.
Слитые полипептиды рЩФ, описанные в данном документе (такие как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может содержать область пептидного линкера между фрагментом Fc. Кроме того, область пептидного линкера может быть вставлена между фрагментом Fc и необязательным фрагментом, таргетирующим кости. Линкерная область может иметь любую последовательность и длину, что позволяет рЩФ оставаться биологически активной, например, не подвергаться пространственным осложнениям. Типовые длины линкера составляют от 1 до 200 аминокислотных остатков, например, 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-110, 111-120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190 или 191-200 аминокислотных остатков. Например, линкеры содержат или состоят из гибких частей, например областей без значительной фиксированной вторичной или третичной структуры. Типовые гибкие линкеры представляют собой глицин-богатые линкеры, например, содержащие по меньшей мере, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или даже 100% глициновых остатков. Линкеры также могут содержать, например, сериновые остатки. В некоторых случаях аминокислотная последовательность линкеров состоит только из остатков глицина и серина. Линкер может быть необязательно гликозилирован по любому подходящему одному или более аминокислотным остаткам. Кроме того, линкер, как описано в данном документе, может содержать любую другую последовательность или фрагмент, присоединенный ковалентно или нековалентно. Линкер также может отсутствовать, при этом фрагмент Fc и рЩФ слиты вместе напрямую, без промежуточных остатков. Некоторые слитые полипептиды Fc-рЩФ или рЩФ-Fc могут рассматриваться, согласно данному раскрытию, либо как 1) не имеющие линкера, либо как 2) имеющие линкер, который соответствует части рЩФ. Например, Fc, слитый непосредственно с чрТНЩФ (1-502), можно рассматривать, например, как не имеющий линкера, при этом чрТНЩФ представляет собой аминокислоты 1-502, или как имеющий линкер из 17 аминокислот, при этом чрТНЩФ (18-502).
Дополнительные аминокислотные остатки могут быть введены в полипептид в соответствии со стратегией клонирования, используемой для получения слитых полипептидов. Например, дополнительные аминокислотные остатки не обеспечивают дополнительный сигнал прикрепления GPI, чтобы поддерживать полипептид в растворимой форме. Кроме того, любые такие дополнительные аминокислотные остатки при включении в полипептид согласно изобретению не формируют сайт расщепления для эндопротеаз клетки-хозяина. Вероятность того, что сконструированная последовательность будет расщеплена эндопротеазами клетки-хозяина, может быть предсказана, как описано, например, Ikezawa (Biol. Pharm. Bull. 25:409-417, 2002).
рЩФ и слитые полипептиды рЩФ согласно изобретению (такие как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут быть ассоциированы в димеры или тетрамеры. Например, два мономера рЩФ-Fc могут быть ковалентно связаны с помощью двух дисульфидных связей, расположенных в шарнирных областях фрагментов Fc. Кроме того, полипептид или слитый полипептид согласно изобретению (например, полипептид рЩФ или слитый полипептид) может быть гликозилированным или пегилированным.
Продуцирование Нуклеиновых Кислот и Полипептидов
Нуклеиновые кислоты, кодирующие рЩФ и слитые полипептиды рЩФ (такие как ТНЩФ, например слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть получены любым способом, известным в данной области техники. Обычно, нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый слитый полипептид, получают с использованием способов молекулярного клонирования и, обычно, помещают в вектор, такой как плазмида или вирус. Вектор используется для трансформации нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, подходящую для экспрессии слитого полипептида. Репрезентативные способы раскрыты, например, в Maniatis et al. (Cold Springs Harbor Laboratory, 1989). Многие типы клеток могут быть использованы в качестве подходящих клеток-хозяев, но клетки млекопитающих являются предпочтительными, поскольку они способны обеспечивать соответствующие посттрансляционные модификации. Клетки-хозяева могут включать, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО), клетку L, клетку C127, клетку 3T3, клетку BHK, клетку COS-7 или любую другую подходящую клетку-хозяина, известную в данной области техники. Например, клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО) (например, клетку СНО-DG44).
рЩФ и слитые полипептиды рЩФ (такие как ТНЩФ, например слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть получена в любых условиях, подходящих для осуществления экспрессии полипептида рЩФ в клетке-хозяине. Такие условия включают соответствующий выбор среды, приготовленной с такими компонентами, как буфер, бикарбонат и/или HEPES, ионы, такие как хлорид, фосфат, кальций, натрий, калий, магний, железо, источники углерода, такие как простые сахара, аминокислоты, потенциально липиды, нуклеотиды, витамины и факторы роста, такие как инсулин; обычные коммерчески доступные среды, такие как альфа-MEM, DMEM, Ham's-F12 и IMDM, с добавлением 2-4 мМ L-глутамина и 5% фетальной бычьей сыворотки; обычные коммерчески доступные среды, не содержащие животных белков, такие как Hyclone™ SFM4CHO, Sigma CHO DHFR-, Cambrex POWER™ CHO CD с добавлением 2-4 мМ L-глютамина. Эти среды желательно готовить без тимидина, гипоксантина и L-глицина для поддержания селективного давления, обеспечивающего стабильную экспрессию белкового продукта.
Фармацевтические композиции и составы
Композиция, которая может быть использована в описанных в данном документе способах (например, включая рЩФ и слитый полипептид рЩФ, такой как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть введена различными способами, известными в данной области техники. Как будет понятно специалисту в данной области техники, путь введения и/или способ введения будут варьировать в зависимости от желаемых результатов. Путь введения может зависеть от множества факторов, таких как окружающая среда и терапевтические цели. В частности, полипептиды и слитые полипептиды, описанные в данном документе, могут быть введены любым путем, известным в данной области техники, например, подкожно (например, с помощью подкожной инъекции), внутривенно, перорально, назально, внутримышечно, сублингвально, интратекально или внутрикожно. Например, фармацевтические композиции, которые можно использовать в описанных в данном документе способах, могут быть в форме жидкости, раствора, суспензии, пилюли, капсулы, таблетки, желатиновой капсулы, порошка, геля, мази, крема, спрея, тумана, пара, аэрозолья или фитосомы.
Дозировка
Любое количество фармацевтической композиции (например, включая рЩФ или слитый полипептид рЩФ, такой как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) можно вводить взрослым, имеющим ГФФ (например, взрослым, имеющим ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, например, взрослым, имеющим ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подросткам, имеющим ГФФ (например, подросткам, имеющим ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Дозировки будут зависеть от многих факторов, включая способ введения и возраст пациента. Например, полипептиды рЩФ (такие как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), описанные в данном документе, могут быть введены пациенту, имеющему ГФФ, такому как взрослый, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подросток, имеющий ГФФ (например, подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) в виде индивидуальных дох, например, от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг пациента (например, от 0,05 мг/кг до 500 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, от 5 мг/кг до 500 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг, от 10 мг/кг до 100 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 50 мг/кг, от 0,5 мг/кг до 25 мг/кг, от 1,0 мг/кг до 10 мг/кг, от 1,5 мг/кг до 5 мг/кг или от 2,0 мг/кг до 3,0 мг/кг) или от 1 мкг/кг до 1000 мкг/кг (например, от 5 мкг/кг до 1000 мкг/кг, от 1 мкг/кг до 750 мкг/кг, от 5 мкг/кг до 750 мкг/кг) кг, от 10 мкг/кг до 750 мкг/кг, от 1 мкг/кг до 500 мкг/кг, от 5 мкг/кг до 500 мкг/кг, от 10 мкг/кг до 500 мкг/кг, от 1 мкг/кг до 100 мкг/кг, от 5 мкг/кг до 100 мкг/кг, от 10 мкг/кг до 100 мкг/кг, от 1 мкг/кг до 50 мкг/кг, от 5 мкг/кг до 50 мкг/кг или от 10 мкг/кг до 50 мкг/кг пациента).
Типовые дозы рЩФ включают, например, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250 или 500 мг/кг; или 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 900 или 1000 мкг/кг. В частности, композиции (например, содержащие рЩФ (такую как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа)) в соответствии с данным раскрытием может быть введена пациентам в дозах, варьирующимся от около 0,001 мг/кг/сутки до около 500 мг/кг/сутки, от около 0,01 мг/кг/сутки до около 100 мг/кг/день или от около 0,01 мг/кг/день до около 20 мг/кг/день. Например, композиции рЩФ (такой как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть введены пациентам в еженедельной дозе, например, от около 0,5 мг/кг/неделя до около 140 мг/кг/неделя, например, от около 0,8 мг/кг/неделя до около 50 мг/кг/неделя или от около 1 мг/кг/неделя до около 10 мг/кг/неделя (например, около 6 или около 9 мг/кг/неделя). В частности, рЩФ (такая как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть введена в дозировке 2 мг кг три раза в неделю (общая доза 6 мг/кг/неделя), 1 мг/кг шесть раз в неделю (общая доза 6 мг/кг/неделя), 3 мг/кг три раза в неделю (общая доза 9 мг/кг/неделя), 0,5 мг/кг три раза в неделю (общая доза 1,5 мг/кг/неделя) или 9,3 мг/кг три раза в неделю (общая доза 28 мг/кг/неделя). Дозировка будет адаптирована лечащим врачом в соответствии с общепринятыми факторами, такими как степень заболевания и другие параметры пациента, имеющего ГФФ, такого как взрослый, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, например, взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подросток, имеющий ГФФ (например, подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет).
Дозировки композиций, содержащих рЩФ и слитые полипептиды рЩФ (такие как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть реализованы в схемах однократного или многократного приема препарата. Дозы могут вводиться, например, каждый час, раз в два часа, раз в день, дважды в день, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, раз в два месяца или раз в год. Альтернативно, дозы можно вводить, например, два, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, 10 раз, 11 раз или 12 раз в день. В частности, схема приема препарата представляет собой прием препарата один раз в неделю. Продолжительность схемы приема препарата может составлять, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней, недель, месяцев или даже оставшуюся длительность жизни пациента, имеющего ГФФ, например взрослого, имеющего ГФФ (например, взрослого, имеющего ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такого как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подростка, имеющего ГФФ (например, подростка, имеющего ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет). Количество, частота и продолжительность дозировки будут адаптированы лечащим врачом в соответствии с общепринятыми факторами, такими как степень заболевания и другие параметры пациента, имеющего ГФФ, такого как взрослый, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, например, взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте) или подросток, имеющий ГФФ (например, подросток, имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет).
Например, рЩФ или слитый полипептид рЩФ (такой как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть Приготовлен в виде раствора для инъекций, который представляет собой прозрачный водный раствор от бесцветного до слегка желтого цвета, рН 7,4. рЩФ или полипептид рЩФ (такой как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть приготовлен в концентрации 12 мг/0,3 мл, 18 мг/0,45 мл, 28 м /0,7 мл, 40 мг/1 мл или 80 мг/0,8 мл. В частности, композиция может быть приготовлена в виде раствора 40 мг/мл для инъекций, при этом каждый мл раствора содержит 40 мг рЩФ или полипептида рЩФ (например, каждый флакон содержит 0,3 мл раствора и 12 мг рЩФ (40 мг/мл), каждый флакон содержит 0,45 мл раствора и 18 мг рЩФ (40 мг/мл), каждый флакон содержит 0,7 мл раствора и 28 мг рЩФ (40 мг/мл), или каждый флакон содержит 1,0 мл раствора и 40 мг асфотазы альфа (40 мг/мл)). рЩФ или полипептид рЩФ (такой как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть приготовлен в виде раствора для инъекций в концентрации 100 мг/мл, при этом каждый 1 мл раствора содержит 100 мг рЩФ или полипептида рЩФ (например, каждый флакон содержит 0,8 мл раствора и 80 мг асфотазы альфа (100 мг/мл)). Объем инъекции рЩФ, вводимой пациенту, может составлять, например, 0,15 мл, 0,18 мл, 0,20 мл, 0,23 мл, 0,25 мл, 0,28 мл, 0,30 мл, 0,33 мл, 0,35 мл, 0,38 мл, 0,40 мл, 0,43 мл, 0,45 мл, 0,48 мл, 0,50 мл, 0,63 мл, 0,75 мл, 0,88 мл или 1,00 мл.
Например, рекомендуемая дозировка рЩФ или слитого полипептида рЩФ ((такого как, ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), составляет 2 мг/кг массы тела, вводимая подкожно три раза в неделю, или схема приема препарата 1 мг/кг массы тела, вводимого подкожно шесть раз в неделю. Дополнительная информация о дозировке представлена ниже (Таблица 1). В частности, пациент весом 40 кг, которому вводили дозу 6 мг/кг/неделя, получал бы инъекцию 80 мг рЩФ в 0,8 мл три раза в неделю или 40 мг рЩФ в 1,00 мл шесть раз в неделю, в то время как пациент весом 50 кг, которому вводили дозу 6 мг/кг/неделя, получал бы инъекцию 50 мг рЩФ в 0,05 мл шесть раз в неделю.
Таблица 1. ДОЗИРОВКА АСФОТАЗЫ АЛЬФА
Вес тела (кг)
При инъекциях 3 раза в неделю
При инъекциях 6 раз в неделю
Вводимая доза
Вводимый объем
Тип сосуда, используемый для инъекции
Вводимая доза
Вводимый объем
Тип сосуда, используемый для инъекции
3
6 мг
0,15 мл
0,3 мл
4
8 мг
0,20 мл
0,3 мл
5
10 мг
0,25 мл
0,3 мл
6
12 мг
0,30 мл
0,3 мл
6 мг
0,15 мл
0,3 мл
7
14 мг
0,35 мл
0,45 мл
7 мг
0,18 мл
0,3 мл
8
16 мг
0,40 мл
0,45 мл
8 мг
0,20 мл
0,3 мл
9
18 мг
0,45 мл
0,45 мл
9 мг
0,23 мл
0,3 мл
10
20 мг
0,50 мл
0,7 мл
10 мг
0,25 мл
0,3 мл
11
22 мг
0,55 мл
0,7 мл
11 мг
0,28 мл
0,3 мл
12
24 мг
0,60 мл
0,7 мл
12 мг
0,30 мл
0,3 мл
13
26 мг
0,65 мл
0,7 мл
13 мг
0,33 мл
0,45 мл
14
28 мг
0,70 мл
0,7 мл
14 мг
0,35 мл
0,45 мл
15
30 мг
0,75 мл
1 мл
15 мг
0,38 мл
0,45 мл
16
32 мг
0,80 мл
1 мл
16 мг
0,40 мл
0,45 мл
17
34 мг
0,85 мл
1 мл
17 мг
0,43 мл
0,45 мл
18
36 мг
0,90 мл
1 мл
18 мг
0,45 мл
0,45 мл
19
38 мг
0,95 мл
1 мл
19 мг
0,48 мл
0,7 мл
20
40 мг
1,00 мл
1 мл
20 мг
0,50 мл
0,7 мл
25
50 мг
0,50 мл
0,8 мл
25 мг
0,63 мл
0,7 мл
30
60 мг
0,60 мл
0,8 мл
30 мг
0,75 мл
1 мл
35
70 мг
0,70 мл
0,8 мл
35 мг
0,88 мл
1 мл
40
80 мг
0,80 мл
0,8 мл
40 мг
1,00 мл
1 мл
50
50 мг
0,50 мл
0,8 мл
60
60 мг
0,60 мл
0,8 мл
70
70 мг
0,70 мл
0,8 мл
80
80 мг
0,80 мл
0,8 мл
90
90 мг
0,90 мг
0,8 мл (x2)
100
100 мг
1,00 мл
0,8 мл (x2)
Препараты
th
th
rd
Композиции, содержащие рЩФ и слитые полипептиды рЩФ (такие как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть приготовлены в соответствии со стандартными способами. Фармацевтическая композиция хорошо известна в данной области техники и дополнительно описана, например, в Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20 Edition, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel et al. (1999) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7 Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); и Kibbe (2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3 Edition (ISBN: 091733096X). Например, композиция рЩФ (такая как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может быть приготовлена, например, в виде буферного раствора в подходящей концентрации и пригодного для хранения при температуре 2-8°С (например, 4°С). Композиция также может быть приготовлена для хранения при температуре ниже 0°C (например, - 20°C или - 80°C). Композиция может быть дополнительно приготовлена для хранения до 2 лет (например, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, семь месяцев, восемь месяцев, девять месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 1 год, 1½ года или 2 года) при температуре 2-8°C (например, 4°C). Таким образом, композиции, описанные в данном документе, могут быть стабильными при хранении в течение по меньшей мере, 1 года при температуре 2-8°C (например, 4°C).
Композиции, содержащие рЩФ и слитые полипептиды рЩФ (такие как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могуть быть представлены в различных формах. Эти формы включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит частично от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.
Например, композиции, предназначенные для системной или локальной доставки, могут быть представлены в форме инъекционных или инфузионных растворов. Соответственно, композиции (такие как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть приготовлены для введения парентеральным способом (например, с помощью подкожной, внутривенной, внутрибрюшинной или внутримышечной инъекции).
Композиции, содержащие рЩФ и слитые полипептиды рЩФ (такие как ТНЩФ, например слитый полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть приготовлены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для стабильного хранения при высокой концентрации. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем внесения описанной в данном документе композиции в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией на фильтре. Обычно дисперсии готовят путем внесения композиции, описанной в данном документе, в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций способы приготовления включают вакуумную сушку и сушку вымораживанием, которые что позволяет получить порошок композиции, описанной в данном документе, плюс любой дополнительный желаемый ингредиент (см. ниже) из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора. Подходящая текучесть раствора может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Длительная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута включением в композицию реагента, который задерживает абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.
Композиции, описанные в данном документе, также могут быть приготовлены в виде иммунолипосомных композиций. Такие препараты могут быть получены способами, известными в данной области техники, такими как, например, способы, описанные в Epstein et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:4030; и патентах США № 4,485,045 и 4,544,545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции раскрыты, например, в патенте США № 5,013,556.
Композиции, содержащие рЩФ и слитые полипептиды рЩФ (такие как ТНЩФ, например, полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), также могут быть приготовлены с носителем, который будет защищать композицию (например, полипептид рЩФ или слитый полипептид рЩФ) от быстрого высвобождения, например в виде препарата с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких препаратов известны в данной области техники. См., например, JR Robinson (1978) Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York.
Когда композиции должны использоваться в комбинации со вторым активным агентом, композиции могут быть приготовлены совместно со вторым агентом, или композиции могут быть приготовлены отдельно от препарата второго агента. Например, соответствующие фармацевтические композиции могут быть смешаны, например, непосредственно перед введением, и вводиться вместе, или могут вводиться отдельно, например, в одно и то же или в разное время.
Носители/наполнители
Препараты, содержащие рЩФ или слитый полипептид рЩФ (такой как ТНЩФ, например полипептид рЩФ SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере, 95% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть предоставлены пациентам, имеющим ГФФ, таким как взрослый, имеющий ГФФ (например, взрослый, имеющий ГФФ, в возрасте около 18 лет или старше, такой как взрослый, имеющий ГФФ, начавшуюся в детском возрасте), или подросток, имеющий ГФФ (например, подросток имеющий ГФФ, в возрасте от около 13 лет до около 17 лет) в сочетании с фармацевтически приемлемыми стерильными водными или неводными растворителями, суспензиями или эмульсиями. Примеры неводных растворителей представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, рыбий жир и инъецируемые органические сложные эфиры. Водные носители включают воду, водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферные медицинские парентеральные носители, включая раствор хлорида натрия, декстрозный раствор Рингера, раствор декстрозы плюс хлорид натрия, раствор Рингера, содержащий лактозу, или нелетучие масла. Например, фармацевтически приемлемый носитель может содержать хлорид натрия и/или фосфат натрия, при этом композиция содержит, например, около 150 мМ хлорида натрия и/или около 25 мМ фосфата натрия, рН 7,4.
Внутривенные носители могут содержать пополнители жидкости и питательных веществ, пополнители электролитов, такие как основанные на декстрозе Рингера, и тому подобное. Также могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и тому подобное; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и тому подобное. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферизующее вещество для поддержания рН и тому подобное. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Следующие примеры предназначены для иллюстративных целей, и не должны рассматриваться как ограничивающие данное раскрытие. Эти исследования описывают введение асфотазы альфа (SEQ ID NO: 1) взрослым, имеющим ГФФ, таким как взрослые, имеющие ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, в возрасте около 18 лет или старше, или подростки, имеющие ГФФ, анализ симптомов ГФФ у этих пациентов после введения асфотазы альфа и связанных с этим физических нарушений в течение длительного периода времени.
Пример 1. Лечение Пациентов с Гипофосфатазией (ГФФ), начавшейся в детском возрасте, с помощью асфотазы альфа
Подростки и взрослые с гипофосфатазией (ГФФ) в возрасте от около 12 до около 66 лет участвовали в исследовании, чтобы определить эффективность, безопасность и переносимость лечения с помощью растворимой щелочной фосфатазы (рЩФ) (асфотаза альфа; SEQ ID NO: 1). Был проведен субпопуляционный анализ 12 взрослых с формой гипофосфатазии (ГФФ), начавшейся в детском возрасте, в возрасте от около 18 до около 66 лет для изучения биохимических и функциональных улучшений в результате лечения альфа-асфотазой. На начальном этапе исследования в течение 6 месяцев 9 взрослых с ГФФ проходили лечение асфотазой альфа (группа лечения), а 3 взрослых с ГФФ не проходили лечение асфотазой альфа (контрольная группа). Средний возраст появления симптомов ГФФ в контрольной группе составлял 3 года, минимальный возраст 0,8 года и максимальный возраст 4 года, тогда как средний возраст появления симптомов ГФФ в группе лечения составлял 2 года, с минимальным возрастом 0,1 года и максимальным возрастом 4 года (Таблица 2, группы дозировок (2,1 мг/кг/неделя и 3,5 мг/кг/неделя) были объединены для всех результатов). Данные представлены в виде медианы (мин, макс), если не указано иначе. 2 взрослых, не проходивших лечение, были женщинами (67%), и 7 взрослых, проходивших лечение, были женщинами (78%).
Таблица 2. Исходные показатели пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, до начала лечения с помощью асфотазы альфа
Показатель
Начальное распределение на группы
Всего(N=12) 5
Контроль(n=3)
Комбинированное лечение(n=9)
Возраст при включении, лет
21 (13, 58)
55 (14, 66)
53 (13, 66)
Возраст при включении, лет
54 (26, 58)
56 (45, 66)
55 (26, 66)
Возрастная категория при включении, n (%) Взрослые (возраст ≥18 лет)
3 (100)
9 (100)
12 (100)
Возраст появления симптомов, лет (мин, макс)
3 (0,8, 4)
2 (0,1, 13)
2,5 (0,1, 13(10))
Возрастная категория в начале появления симптомов, n (%) <18 лет
3 (100)
9 (100)
12 (100)
Женщины, n (%)
2 (67)
7 (78)
9 (75)
Пациенты с ГФФ, отобранные для лечения с помощью асфотазы альфа, имели уровень ЩФ в сыворотке ниже нормального диапазона, скорректированного по возрасту, концентрации пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф) в плазме, по меньшей мере, в два раза превышающие верхний предел нормы, и признаки остеопении или остеомаляции на рентгенограммах скелета и/или биопсиях кости. Пациенты были исключены из исследования при определения уровня кальция или фосфата в сыворотке ниже нормального уровня, уровня витамина D в сыворотке менее 20 нг/мл, уровня креатинина в сыворотке или гормона околощитовидной железы выше верхнего предела нормы, или состояния здоровья или других смягчающих обстоятельств, которые могут значительно повлиять на соблюдение пациентом протокола исследования.
На начальном этапе лечения асфотазой альфа в течение 6 месяцев 4 взрослых получали асфотазу альфа в дозировке 0,3 мг/кг/день (2,1 мг/кг/неделя), и 5 взрослых получали асфотазу альфа в дозировке 0,5 мг/кг/день (3,5 мг/кг/неделя) путем подкожного введения. 3 пациента в начальной контрольной группе не получали лечение асфотазой альфа. После начального этапа исследования пациенты как в группе лечения, так и в контрольной группе (всего 12 пациентов) получали лечение асфотазой альфа. Асфотазу альфа вводили подкожно в начальной дозе 0,5 мг/кг/день (3,5 мг/кг/неделя), которая увеличивалась через 1 год до 1 мг/кг/день, подкожно, один раз в день в течение 6 дней (6 мг/кг/неделя). Дозировка асфотазы альфа поддерживалась на уровне 6 мг/кг/неделя в течение оставшейся фазы пролонгации лечения.
Показатели, использованные во время фазы пролонгации лечения для оценки лечения взрослых пациентов, имеющих ГФФ, с помощью асфотазы альфа, включали: 1) изменения концентрации неорганического пирофосфата (нПФ) и пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф) в образцах плазмы пациента для оценки активности ЩФ; 2) 6-минутный тест ходьбы (6MWT) для оценки способности к ходьбе; и 3) баллы теста Брюинкса-Озерецкого на Оценку Моторики, 2-е издание (BOT-2), для оценки физических способностей.
Пример 2. Статистически значимое снижение медианы концентрации неорганического пирофосфата (нПФ) и пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф) в плазме после введения асфотазы альфа
Активность ЩФ в образцах плазмы, взятых у взрослых, имеющих ГФФ, оценивали путем количественного определения концентраций субстратов ЩФ нПФ и П5Ф, как описано в Whyte et al., 1995 (J. Clin. Invest. 95(4): 1440-1445), полностью включенной в данный документ посредством ссылки. Медиана концентрации нПФ и П5Ф в образцах плазмы взрослых контрольной группы и взрослых, получавших асфотазу альфа, была на исходном уровне выше нормального диапазона (Таблица 3). Аналогично, значения активности ЩФ были относительно низкими для контрольной группы (21,0 Ед/л) и для группы лечения (18,0 Ед/л) по сравнению с нижним пределом нормы (НПН) значений активности ЩФ с поправкой на возраст и пол (31 Ед/л в возрасте от 18 до менее 50 лет или 35 Ед/л в возрасте от 50 до менее 70 лет).
a
b
Таблица 3. Измерения активности щелочной фосфатазы (ЩФ) и концентрации неорганического пирофосфата (нПФ) и пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф) в плазме крови у взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, до начала лечения с помощью асфотазы альфа. Все данные представлены в виде медианы (минимум, максимум), если не указано иначе.  Первоначальные группы лечения объединяются для анализа.  Взрослые контрольной группы и группы лечения объединены, поскольку все взрослые получают лечение в фазе пролонгации лечения. НПН, нижний предел нормы.
Показатель
Начальное распределение на группы
Всего(N=12)<sup>b</sup>
Контроль без лечения(n=3)
Комбинированное лечение(n=9)<sup>a</sup>
ЩФ, Ед/лНПН (с учетом возраста и пола)От 18 до <50 лет: 31 (M), 31 (Ж) ≥50 до <70 лет: 35 (M), 35 (Ж)
21.0(18.0, 26.0)
18.0(18.0, 35.0)
18.0(18.0, 35.0)
НПФ, мкМНормальный диапазон 13-18 лет: <0,75-4,78 >18 лет: 1,00-5,82
5,9(5,2, 6,6)
5,5(2,2, 8,2)
5,7(2,2, 8,2)
П5Ф, нг/мл Нормальный диапазон: 5-18 лет: 5,7-61,2 >18 лет: 2,8-26,7
199,0(196,0, 474,0)
267,0(28,8, 1270,0)
233,0(28,8, 1270,0)
Медиана концентрации нПФ в плазме составляла 5,9 мкМ (минимальная концентрация нПФ в плазме 5,2 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 6,6 мкМ) для контрольной группы на исходном уровне и 5,5 мкМ (минимальная концентрация нПФ в плазме 2,2 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 8,2 мкМ) для группы лечения на исходном уровне (Таблица 3). Концентрация нПФ в плазме снизилась после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа, о чем свидетельствует статистически значимое изменение медианы по сравнению с исходным значением, составляющее - 3,0 для пациентов, получавших асфотазу альфа, по сравнению с изменением - 0,3 для контрольной группы, не проходившей лечение (Фиг. 1А). Значение P для изменения медианы концентрации нПФ по сравнению с исходным уровнем составило 0,0364 на основе точного U-критерия Манна-Уитни, при сравнении группы лечения с контрольной группой. Анализ концентрации нПФ в плазме после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа для двух разных групп дозировки показал, что изменение медианы по сравнению с исходным уровнем составляет - 2,870 для пациентов, проходивших лечение с помощью 0,3 мг/кг/день асфотазы альфа, и - 2,990 для пациентов, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа 0,5 мг/кг/день (Таблица 4, значение P на основе точного U-критерия Манна-Уитни, при сравнении каждой группу лечения с контрольной группой; оценка и точный доверительный интервал получены способом Ходжеса-Леманна-Сена для сдвига положения в распределении между группой лечения и контрольной группой).
Таблица 4. Статистический анализ концентрации нПФ у взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, после лечения с помощью асфотазы альфа в течение 6 месяцев
Статистические показатели
Контрольная Группа (n=3)
Асфотаза Альфа 0,3 мг/кг/день (n=4)
Асфотаза Альфа 0,5 мг/кг/день (n=5)
Асфотаза Альфа Комбинированная (n=9)
n
3
4
5
9
Среднее (СО)
-0,060 (1,0193)
-2,790 (1,4903)
-2,258 (1,4739)
-2,494 (1,4134)
95% ДИ
(-2,592, 2,472)
(-5,161, -0,419)
(-4,088, -0,428)
(-3,581, -1,408)
Медиана
-0.340
-2,870
-2,990
-2,990
Мин, Макс
-0,91, 1,07
-4,40, -1,02
-3,18, 0,32
-4,40, 0,32
Значение Р
0,0571
0,1429
0,0364
Оценка
-2,925
-2,270
-2,640
95% ДИ<sup>b</sup>
(НО, НО)
(-4,250, 1,230)
(-4,250, -0,110)
Медиана концентрации П5Ф в плазме составляла 199,0 нг/мл (минимальная концентрация П5Ф в плазме 196,0 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 474,0 нг/мл) для контрольной группы на исходном уровне и 267,0 нг/мл (минимальная концентрация П5Ф в плазме 28,8 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 1270,0 нг/мл) для группы лечения на исходном уровне (Таблица 3). Концентрация П5Ф в плазме снизилась после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа, о чем свидетельствует статистически значимое изменение медианы по сравнению с исходным значением, составляющее -254,5 для пациентов, получавших асфотазу альфа, по сравнению с изменением 140,0 для контрольной группы (Фиг. 1В). Значение P для изменения медианы концентрации П5Ф по сравнению с исходным уровнем составило 0,0364 на основе точного U-критерия Манна-Уитни, при сравнении группы лечения с контрольной группой. Анализ концентрации П5Ф в плазме после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа для двух разных групп дозировки показал, что изменение медианы по сравнению с исходным уровнем составляет - 298,60 для пациентов, проходивших лечение с помощью 0,3 мг/кг/день асфотазы альфа, и - 254,50 для пациентов, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа 0,5 мг/кг/день (Таблица 5, значение P на основе точного U-критерия Манна-Уитни, при сравнении каждой группу лечения с контрольной группой; оценка и точный доверительный интервал получены способом Ходжеса-Леманна-Сена для сдвига положения в распределении между группой лечения и контрольной группой).
Таблица 5. Статистический анализ концентрации П5Ф у взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, после лечения с помощью асфотазы альфа в течение 6 месяцев
Статистические показатели
Контрольная Группа (N=3)
Асфотаза Альфа 0,3 мг/кг/день (N=4)
Асфотаза Альфа 0,5 мг/кг/день (N=5)
Асфотаза Альфа Комбинированная (N=9)
n
3
4
5
9
Среднее (СО)
123,60 (231,037)
-301,30 (186,482)
-383,72 (492,195)
-347,09 (368,857)
95% ДИ
(-450,33, 697,53)
(-598,03, -4,57)
(-994,86, 227,42)
(-630,62, -63,56)
Медиана
140,00
-298,60
-254,50
-254,50
Мин, Макс
-115,2, 346,0
-486,4, -121,6
-1236,2, -17,2
-1236,2, -17,2
Значение Р
0,0571
0,1429
0,0364
Оценка
-419,40
-394,50
-394,50
95% ДИ
(НО, НО)
(-1582,20, 98,00)
(-1121,00, -6,40)
a
b
Значение P на основе точного U-критерия Манна-Уитни, при сравнении каждой группу лечения с контрольной группой;  оценка и точный доверительный интервал получены способом Ходжеса-Леманна-Сена для сдвига положения в распределении между группой лечения и контрольной группой.
Для всех последующих измерений концентрации нПФ и П5Ф в плазме были объединены для группы лечения и контрольной группы в каждый соответствующий момент времени (6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет и 6 лет лечения асфотазой альфа), поскольку контрольная группа получала лечение асфотазой альфа после начальной фазы 6 месяцев. Снижение концентрации нПФ в плазме поддерживалось на протяжении всей фазы пролонгации лечения асфотазой альфа (Фиг. 2). Медиана концентрации нПФ в плазме снизилась с 5,53 мкМ (минимальная концентрация нПФ в плазме 2,15 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 8,20 мкМ) до 3,30 мкМ (минимальная концентрация нПФ в плазме 0,75 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 5,02 мкМ) после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа. Медиана концентрации нПФ составляла 3,74 мкМ через 1 год (минимальная концентрация нПФ в плазме 1,62 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 5,40 мкМ); медиана концентрации нПФ составляла 2,49 мкМ через 2 года (минимальная концентрация нПФ в плазме 1,32 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 10,90 мкМ); медиана концентрации нПФ составляла 2,09 мкМ через 3 года (минимальная концентрация нПФ в плазме 1,24 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 2,94 мкМ); медиана концентрации нПФ составляла 2,49 мкМ через 4 года (минимальная концентрация нПФ в плазме 1,09 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 4,52 мкМ); медиана концентрации нПФ составляла 2,2 мкМ через 5 лет (минимальная концентрация нПФ в плазме 0,92 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 5,36 мкМ); и медиана концентрации нПФ составляла 2,60 мкМ через 5 лет (минимальная концентрация нПФ в плазме 1,95 мкМ; максимальная концентрация нПФ в плазме 4,84 мкМ). Размер выборки составлял 9 взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, для 6 месяцев, 12 взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, для от 1 года до 5 лет и 3 взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, для 6 лет.
Аналогичным образом, снижение концентрации П5Ф в плазме поддерживалось на протяжении всей фазы пролонгации лечения асфотазой альфа (Фиг. 3). Медиана концентрации П5Ф в плазме снизилась с 267,0 нг/мл (минимальная концентрация П5Ф в плазме 28,8 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 1270,0 нг/мл) до 21,6 нг/мл (минимальная концентрация П5Ф в плазме 2,5 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 141,0 нг/мл) после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа. Медиана концентрации П5Ф составляла 65,1 нг/мл через 1 год (минимальная концентрация П5Ф в плазме 15,9 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 367,0 нг/мл); медиана концентрации П5Ф составляла 20,1 нг/мл через 2 года (минимальная концентрация П5Ф в плазме 2,7 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 45,7 нг/мл); медиана концентрации П5Ф составляла 14,0 нг/мл через 3 года (минимальная концентрация П5Ф в плазме 2,5 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 36,2 нг/мл); медиана концентрации П5Ф составляла 12,0 нг/мл через 4 года (минимальная концентрация П5Ф в плазме 2,5 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 38,4 нг/мл); медиана концентрации П5Ф составляла 7,8 нг/мл через 5 лет (минимальная концентрация П5Ф в плазме 2,5 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 29,5 нг/мл); и медиана концентрации П5Ф составляла 6,0 нг/мл через 6 лет (минимальная концентрация П5Ф в плазме 4,7 нг/мл; максимальная концентрация П5Ф в плазме 15,1 нг/мл). Размер выборки составлял 9 взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, для 6 месяцев и 1 года, 12 взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, для от 2 лет до 5 лет и 3 взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, для шести лет.
Пример 3. Улучшение Физической Способности и Способности к Ходьбе у Взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, с помощью Теста Ходьбы в Течение 6 Минут (6MWT)
Физическая способность и способность к ходьбе у пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, были оценены с помощью теста ходьбы в течение 6 минут (6MWT). Пациенты, проходившие лечение с помощью асфотазы альфа, улучшили показатель среднего расстояния ходьбы с 315,0 метров за 6 минут на исходном уровне (минимальное расстояние 223,0, максимальное расстояние 540,0) до среднего расстояния ходьбы 421,5 метров в течение 6 минут после 1 года лечения с помощью асфотазы альфа (минимальное расстояние 204,0, максимальное расстояние 640,0). В отличие от этого, контрольная группа, не получавшая лечения, не проявила улучшения результатов от среднего расстояния ходьбы 401,0 метра в течение 6 минут на исходном уровне (минимальное расстояние 6,0, максимальное расстояние 440,0) до среднего расстояния ходьбы 355,0 метра в течение 6 минут после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа (минимальное расстояние 13,0, максимальное расстояние 420,0).
Среднее изменение по сравнению с исходным уровнем после 1 года лечения с помощью асфотазы альфа составило 88,0 метров расстояния, пройденных в течение 6 минут, в то время как среднее изменение от исходного уровня в контрольной группе составило - 20,0 метров, пройденных в течение 6 минут после 6 месяцев без лечения (Таблица 6). Это изменение также охватывает 3 пациентов в контрольной группе, которые не могли ходить в течение 6 минут в начале исследования. Среднее изменение по сравнению с исходным уровнем в тесте 6MWT для группы, проходившей лечение, составило 17,6% с увеличением от 62,8% прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 42,4%, максимальное прогнозируемое значение 6MWT 101,3%) в начале исследования до 85,0% прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 31,1%, максимальное прогнозируемое значение 6MWT 121,3%) после 1 года лечения с помощью асфотазы альфа. Напротив, среднее изменение по сравнению с исходным уровнем в тесте 6MWT для контрольной группы, не проходившей лечение, составило - 6,2 с уменьшением от 85,8% прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 79,1%, максимальное прогнозируемое значение 6MWT 92,4%) в начале исследования до 79,6% прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 70,4%, максимальное прогнозируемое значение 6MWT 88,7%) после 1 года лечения с помощью асфотазы альфа. Кроме того, изменение по сравнению с исходным уровнем прогнозируемого процентного значения 6MWT через 6 месяцев между контрольной группой и пациентами с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, проходившими лечение с помощью асфотазы альфа, было статистически значимым (р=0,04). Таким образом, у пациентов с ГФФ после 1 года лечения с помощью асфотазы наблюдалось статистически значимое улучшение способности к ходьбе, в то время как способность к ходьбе у пациентов контрольной группы ухудшалась или не улучшалась.
Таблица 6. Расстояние, пройденное в течение шести минут у взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, после лечения с помощью асфотазы альфа в течение 6 месяцев
Контроль без лечения
Комбинированное лечение
Метры(n=3)
%, Предсказано (n=2)
Метры<sup>a</sup> (n=9)
%, Предсказано<sup>b</sup> (n=8)
Исходный уровень
401,0(6,0, 440,0)
85,8(79,1, 92,4)
315,0(223,0, 540,0)
62,8(42,4, 101,3)
Последующее наблюдение (контроль: 6 месяцев; лечение: 1 год)
355,0(13,0, 420,0)
79,6(70,4, 88,7)
421,5(204,0, 640,0)
85,0(31,1, 121,3)
Среднее изменение относительно исходного уровня
-20,0(-46,0, 7,0)
-6,2(-8,7, -3,7)
88,0(-123,0, 197,0)
17,6(-23,1, 29,8)
a
b
n=12 для данных для года 1; n=10 для данных для года 1 и n=9 для данных об изменении относительно исходного уровня.
Для значений 6MWT после исходного уровня, значения 6MWT были объединены для группы лечения и контрольной группы в каждый соответствующий момент времени (1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет и 6 лет лечения асфотазой альфа), поскольку контрольная группа получала лечение асфотазой альфа после начальной фазы 6 месяцев. Изменение 6MWT представляет собой увеличение с 62,9% прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 42,4%, максимальное прогнозируемое значение 6MWT 101,3%; n=8) в начале исследования до 80,8% прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 46,0%, максимальное прогнозируемое значение 6MWT 109,0%; n=8) после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа (Фиг. 4). Увеличение значения 6MWT поддерживалось на протяжении всего лечения с помощью асфотазы альфа на уровне 85% относительно прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 31,1%; максимальное прогнозируемое значение 6MWT 121,3%; n=10) через 1 год; 91,8% относительно прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 63,3%; максимальное прогнозируемое значение 6MWT 120,8%; n=9) через 2 года; 93,5% относительно прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 64,7%; максимальное прогнозируемое значение 6MWT 121,6%; n=8) через 3 года; 91,7% относительно прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 59,0%; максимальное прогнозируемое значение 6MWT 133,4%; n=8) через 4 года; и 85,1% относительно прогнозируемого значения 6MWT (минимальное прогнозируемое значение 6MWT 61,5%; максимальное прогнозируемое значение 6MWT 137,4%; n=8) через 5 лет. Таким образом, значение 6MWT у пациентов, имеющих ГФФ, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа, улучшилось с 76% относительно прогнозируемого значения 6MWT на исходном уровне до 80,8% относительно прогнозируемого значения 6MWT, что находится в пределах нормального диапазона здоровых субъектов того же возраста и роста в течение 6 месяцев. Улучшение значения 6MWT сохранялось в течение 4 лет лечения с помощью асфотазы альфа.
Пример 4. Улучшение Физической Способности Взрослых Пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, при Оценке с помощью теста Моторики Брюинкса-Озерецкого, 2-е издание (BOT-2)
Физическая способность и нарушения у пациентов с ГФФ были оценены с помощью теста моторики Брюинкса-Озерецкого на скорость бега, ловкость и силу, 2-е издание (BOT-2). Тесты BOT-2 для оценки скорости бега и ловкости пациентов с ГФФ включали челночный бег на 50 футов, боковые шаги через гимнастическое бревно и боковые прыжки на одной или двух ногах. Тесты BOT-2 для оценки силы пациентов с ГФФ включали приседания, подъем прямых ног в положении лежа, прыжки в длину с места, приседания с опорой и отжимания. Затем были определены общие показатели скорости и ловкости BOT-2 и общие показатели силы BOT-2 из суммы баллов, полученных за тесты BOT-2 за каждый временной интервал (исходный уровень, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года 5 лет и 6 лет). Для показателей BOT-2 после исходного уровня, показатели BOT-2 были объединены для группы лечения и контрольной группы в каждый соответствующий момент времени (6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет и 6 лет лечения асфотазой альфа), поскольку контрольная группа получала лечение асфотазой альфа после начальной фазы 6 месяцев.
Общие показатели BOT-2 скорости бега и ловкости улучшились после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа по сравнению с медианой общего показателя скорости бега и ловкости BOT-2 (минимальный показатель BOT-2 0; максимальный показатель BOT-2 27; n=9) в начале исследования до 10,5 (минимальный показатель BOT-2 5; максимальный показатель BOT-2 27; n=8) через 6 месяцев (Фиг. 5). Улучшение медианы общего показателя скорости бега и ловкости BOT-2 сохранялось на протяжении всей фазы пролонгации лечения с помощью асфотазы альфа, при этом медиана общего показателя скорости бега и ловкости BOT-2 составила 9,0 (минимальный показатель BOT-2 4; максимальный показатель 35; n=11) через 1 год; медиана общего показателя скорости бега и ловкости BOT-2 составила 10,0 (минимальный показатель BOT-2 3; максимальный показатель 33; n=11) через 2 года; медиана общего показателя скорости бега и ловкости BOT-2 составила 10,0 (минимальный показатель BOT-2 4; максимальный показатель 30; n=10) через 3 года; медиана общего показателя скорости бега и ловкости BOT-2 составила 9 (минимальный показатель BOT-2 4; максимальный показатель 31; n=11) через 4 года; и медиана общего показателя скорости бега и ловкости BOT-2 составила 8,0 (минимальный показатель BOT-2 0; максимальный показатель 35; n=9) через 5 лет. Общие показатели силы BOT-2 улучшились после 6 месяцев лечения с помощью асфотазы альфа относительно медианы общего показателя силы BOT-2, составляющей 12 (минимальный показатель BOT-2 2; максимальный показатель 30; n=5) в начале исследования до 14 (минимальный показатель BOT-2 8; максимальный показатель 35; n=5) через 6 месяцев (Фиг. 6).
Пример 5. Улучшение Минерализации Костей у Взрослых Пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, после Введения Асфотазы Альфа
Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (DXA) была выполнена на шейке бедра, поясничном отделе позвоночника и на всем теле в начале исследования и через 6 месяцев для пациентов контрольной группы, не проходившей лечение, и в начале исследования и через 1 год для пациентов, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа. У взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, проходивших лечение, наблюдалось увеличение по сравнению с исходным уровнем минеральной плотности костной ткани (МПК) поясничного отдела позвоночника после 6 месяцев введения асфотазы альфа. Статистически значимое увеличение МПК в поясничном отделе позвоночника наблюдалось после шести месяцев лечения с помощью асфотазы альфа (Таблица 7).
Таблица 7. Минеральная Плотность Костей Поясничного Отдела Позвоночника у взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, в начале исследования и после лечения с помощью асфотазы альфа в течение 12 месяцев
Контроль, без лечения (n=3)
Комбинированное лечение (n=9)
Минеральная Плотность Костей Поясничного Отдела Позвоночника (г/см<sup>2</sup>)
Исходный уровень
1,0947 (0,39910)
1,1853 (0,22806)
Последующее наблюдение (6 месяцев)
1,1127 (0,37064)
1,2128 (0,21789)
Среднее изменение относительно исходного уровня
0,0180 (0,02858)
0,0262 (0,01861)
Доверительный интервал 95% для среднего изменения относительно исходного уровня
(-0,053, 0,089)
(0,011, 0,042)
Биопсия костной ткани также проводилась в начале исследования и через 6 месяцев для пациентов контрольной группы, не проходившей лечение, а также в начале исследования и через 1 год для пациентов, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа, для определения объема и толщины остеоида (Таблица 8) и времени задержки минерализации (Таблица 9). Статистически значимое уменьшение объема остеоида/объема кости (%) и толщины остеоида (мкм) наблюдалось после одного года лечения с помощью асфотазы альфа. Это тестирование было значительно более инвазивным, чем тестирование DXA.
Таблица 8. Объем остеоида/объем кости и толщина остеоида у взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, в начале исследования и после лечения с помощью асфотазы альфа в течение 12 месяцев
Контроль, без лечения (n=3)
Комбинированное лечение (n=9)
Объем остеоида/объем кости (%)
Исходный уровень
9,2 (4,1)
7,6 (4,2)
Последующее наблюдение (контроль: 6 месяцев; лечение: 1 год)
9,4 (3,9)
5,4 (4,5)
Среднее изменение относительно исходного уровня
0,2 (3,2)
-3,8 (-0,5)
Доверительный интервал 95% для среднего изменения относительно исходного уровня
(-7,7, 8,1)
(-3,8, -0,5)
Толщина остеоида (мкм)
Исходный уровень
11,2 (0,6)
10,2 (5,1)
Последующее наблюдение (контроль: 6 месяцев; лечение: 1 год)
9,0 (1,4)
8,3 (4,8)
Среднее изменение относительно исходного уровня
-2,2 (2,0)
-1,8 (1,9)
Доверительный интервал 95% для среднего изменения относительно исходного уровня
(-7,1, 2,8)
(-3,3, -0,4)
В начале исследования время задержки минерализации было увеличено для всех пациентов с ГФФ, хотя оно включало большую степень изменчивости между пациентами. Такая изменчивость является ожидаемой для этого типа гистоморфометрических измерений и исследований. После лечения с помощью асфотазы альфа в течение 1 года время задержки минерализации было сокращено в группе, проходившей лечение, со средним изменением относительно исходного уровня составляющим -696 дней в сравнении с контрольной группой, не проходившей лечение, со средним изменением относительно исходного уровня составляющим 65 дней через 6 месяцев. Эти результаты показывают, что введение асфотазы альфа взрослым пациентам с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, способствует минерализации костей.
Таблица 9. Время задержки минерализации у взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, в начале исследования и после лечения с помощью асфотазы альфа в течение 12 месяцев
Контроль, без лечения (n=3)
Комбинированное лечение(n=9)
Время задержки минерализации (дни)
Исходный уровень
456 (261), 2
964 (1212), 6
Последующее наблюдение (контроль: 6 месяцев; лечение: 1 год)
369 (264), 3
436 (486), 7
Среднее изменение относительно исходного уровня
65 (270), 2
-696 (1069), 6
Доверительный интервал 95% для среднего изменения относительно исходного уровня
(-1506,1460)
(-1818, 426)
Пример 6. Схема Исследования Лечения Подростков и Взрослых с ГФФ с помощью Асфотазы Альфа
Подростки и взрослые с HPP в возрасте от около 13 лет до около 65 лет участвовали в исследовании для определения эффективностм, безопасностм и переносимостм лечения с помощью рЩФ (асфотаза альфа; Фиг. 7). На начальном этапе лечения с помощью асфотазы альфа в течение 6 месяцев в общей сложности 19 пациентов были рандомизированы для получения альфа асфотазы в дозировке 0,3 мг/кг/день (2,1 мг/кг/неделя; n=7) путем подкожного введения, 0,5 мг/кг/день (3,5 мг/кг/неделя; n=6) путем подкожного введения или без лечения (n=6) в контрольной группе (Фиг. 8). После начального этапа исследования в течение 6 месяцев пациенты как в группе, проходившей лечение, так и в контрольной группе проходили лечение с помощью асфотазы альфа в дозировке 0,5 мг/кг/день (3,5 мг/кг/неделя) путем подкожного введения. После первых 6 месяцев фазы пролонгации лечения доза была увеличена до 1 мг/кг/день, вводимой 6 дней/неделю (6 мг/кг/неделя) для всех пациентов согласно поправке к протоколу. Критерии включения в исследование и исключения описаны в Таблице 10. Демографические данные пациентов и исходные характеристики для подростков и взрослых с ГФФ, включая историю болезни, связанную с ГФФ, представлены в Таблице 11.
Таблица 10. Основные критерии включения и исключения для исследования подростков и взрослых с ГФФ, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа
Основные критерии включения
Основные критерии исключения
возраст ≥13 и ≤65 летПредварительно установленный клинический диагноз ГФФ с началом в любом возрасте на основании:Низкого уровня сывороточной щелочной фосфатазы, с учетом возраста пациентаВысокий уровень пиридоксаль-5''-фосфата П5Ф (≥2 × верхний предел нормы)<sup>a</sup>Проявление остеопении или остеомаляции на рентгенограмме скелета<sup>b</sup>Остеомаляция при биопсии кости (Z-показатель времени задержки минерализации ≥+2)<sup>c</sup>
Низкий уровень кальция или фосфата в сывороткеНизкий уровень витамина D в сыворотке 25 (ОН) (<20 нг/мл)<sup>d</sup>Высокий уровень креатинина или паратиреоидного гормона (ПТГ) в сыворотке или лечение с помощью ПТГ в течение 6 месяцевИспользование бисфосфонатов в течение 2 лет после начала исследования (в течение любого периода времени) или в течение >2 лет в любой период времени<sup>e</sup>
a
6
Без введения витамина B за ≥1 неделю до определения уровня П5Ф;
b
Остеомаляция подтверждена путем биопсии кости;
c
Лечение не было приостановлено до проведения биопсии, но у всех пациентов было подтверждено наличие остеомаляции с помощью биопсии;
d
Пациенты, не прошедшие скрининг из-за низкого уровня, могут быть повторно обследованы после приема добавок по усмотрению исследователя;
e
У пациентов с разрешенным предварительным использованием бисфосфоната должны иметь уровни С-телопептида в сыворотке и N-телопептида в моче или дезоксипиридинолина в пределах нормального или повышенного уровня.
Таблица 11. Демографические и исходные характеристики подростков и взрослых с ГФФ, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа
Всего<sup>a</sup>(N=19)
Основной период лечения, распределение на группы
Контрольная группа(n=6)
Группа, проходившая лечение с помощью асфотазы альфа<sup>b</sup>(n=13)
Демографические данные
Возраст при включении, лет, медиана (мин, макс)
53 (13, 66)
21 (13, 58)
55 (14, 66)
Возрастная категория при включенииПодростки (возраст 13 - <18 лет)Взрослые (возраст ≥18 лет)
6 (32)13 (68)
3 (50)3 (50)
3 (23)10 (77)
Возраст появления симптомов, лет, медиана (мин, макс)
2.0 (0, 36)
0,9 (0,2, 4)
2.0 (0, 36)
Возрастная категория появления симптомов, n (%)<18 лет≥18 лет
18 (95)1 (5)<sup>c</sup>
6 (100)0 (0)
12 (92)1 (8)<sup>c</sup>
Женщины, n (%)
12 (63)
2 (33)
10 (77)
Европеоиды
18 (95)
5 (83)
13 (100)
История болезни, относящаяся к ГФФ
Пациенты с переломами, n (%)Количество переломов, медиана (мин, макс)
18 (95)6.0 (1, 30)
6 (100)5.0 (1, 8)
12 (92)9,5 (1, 30)
Тяжесть боли в костях, n (%)Ограничение активностиТребуются обезболивающие препараты
18 (95)16 (84)
5 (83)5 (83)
13 (100)11 (85)
Мышечные проявления, n (%)СлабостьБоль
17 (90)14 (74)
5 (83)4 (67)
12 (92)10 (77)
Суставные проявления, n (%)БольПрипухлость
17 (90)7 (37)
5 (83)2 (33)
12 (92)5 (39)
Ненормальная походка, n (%)
15 (79)
4 (67)
11 (85)
Вспомогательные устройства для передвижения, n (%)
5 (26)
2 (33)
3 (23)
Краниосиностоз, n (%)
3 (16)
0
3 (23)
Преждевременная потеря молочных зубов, n (%)
16 (84)
5 (83)
11 (85)
Потеря коренных зубов, n (%)Оставшиеся коренные зубы, средние (мин, макс)
8 (42)24 (0, 30)
1 (17)26 (0, 28)
7 (54)23 (0, 30)
Гиперкальциемия, n (%)
6 (32)
3 (50)
3 (23)
Гиперфосфатемия, n (%)
6 (32)
2 (33)
4 (31)
Подагра, n (%)
5 (26)
2 (33)
3 (23)
Камни в почках, n (%)
4 (21)
2 (33)
2 (15)
a
Объединено, поскольку все пациенты проходили лечение в фазе пролонгации лечени.;
b
Группы, проходившие лечение с помощью азотазы альфа объединены для анализа;
c
Один пациент, который изначально был отнесен к категории имеющих взрослую форму ГФФ, впоследствии был определен, как имеющий признаки и симптомы ГФФ, начавшейся в детском возрасте.
ЩФ=щелочная фосфатаза; ГФФ=гипофосфатазия.
Метрики, использованные во время фазы пролонгации лечения для оценки лечения подростков и взрослых, имеющих ГФФ, с помощью асфотазы альфа, включали: 1) изменения концентрации неорганического пирофосфата (нПФ) и пиридоксаль-5'-фосфата (П5Ф) в образцах плазмы пациента для оценки активности ЩФ; 2) показатели теста ходьбы в течение 6 минут (6MWT) для оценки способности к ходьбе; (3) показатели теста Брюинкса-Озерецкого для Оценки Моторики, 2-е издание (BOT-2), для оценки физических способностей; 4) Динамометрию с использованием Портативных устройств (HHD) для оценки силы; 5) Шкалу Функций Нижних Конечностей (LEFS) для оценки нарушений; и 6) Краткий Опросник Оценки Боли (BPI-SF) для оценки уровня боли.
Анализы эффективности были выполнены на полном наборе анализируемой выборки, которая включала всех рандомизированных пациентов; все пациенты проходили лечение, к которому они были отнесены при рандомизации. Групповые сравнения были выполнены между объединенной группой, проходившей лечение с помощью асфотазы альфа и контрольной группой в начальный период лечения. Также проводились анализы по продолжительности воздействия асфотазы альфа до 5 лет; для пациентов в контрольной группе лечение асфотазой альфа началось через 6 месяцев в начале фазы пролонгации лечения. Что касается результатов изменения концентрации нПФ и П5Ф в плазме с исходного уровня до 6-го месяца, сравнения между объединенной группой, проходившей лечение с помощью асфотазы альфа, и контрольной группой проводились с использованием точного U-критерий Манна-Уитни для каждого параметра с использованием двухстороннего альфа 0,05; пропущенные значения были рассчитаны с использованием последнего проведенного наблюдения. Для 6MWT процентное (%) прогнозируемое значение, определяемое как процент от нормального прогнозируемого пройденного расстояния на основе возраста, пола и роста, было рассчитано, если пациент ходил полные 6 минут в начале исследования.
Пример 7. Снижение Медианы Концентраций нПФ и П5Ф после Введения Асфотазы Альфа Взрослым и Подросткам с ГФФ
Активность ЩФ в образцах плазмы, взятых у взрослых и подростков, имеющих ГФФ, оценивали путем количественного определения концентраций субстратов ЩФ нПФ и П5Ф, как описано в Whyte et al., 1995 (J. Clin. Invest. 95(4): 1440-1445). После 6 месяцев наблюдалось большее изменение в концентрациях как нПФ (-2,2 мкм), так и П5Ф (-254,5 нг/мл) в плазме у подростков и взрослых с ГФФ, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа, относительно контрольной группы (Фиг. 9A и 9B соответственно). Разница между группами была статистически значимой для изменений П5Ф в плазме (P=0,0285), но не для изменений нПФ в плазме (P=0,0715). Post-hoc анализы чувствительности, которые исключили одного пациента из контрольной группы с высокой концентрацией нПФ на начальном уровне (12,1 мкМ), показали статистически значимое снижение концентрации нПФ в плазме на 6-м месяце в группе, проходившей лечение с помощью асфотазы альфа, по сравнению с контрольной группой (P=0,0044). Снижения медианы концентрации нПФ и П5Ф в плазме у подростков и взрослых пациентов с ГФФ сохранялись в течение пяти лет лечения с помощью асфотазы альфа (Фиг. 10A и 10B, соответственно).
Пример 8. Улучшение Физической Способности и Способности к Ходьбе у Взрослых Пациентов и Подростков с ГФФ с помощью Теста Ходьбы в Течение 6 Минут (6MWT)
Физическая способность и способность к ходьбе у взрослых и подростков с ГФФ были оценены с помощью теста ходьбы в течение 6 минут (6MWT). Для значений 6MWT после исходного уровня, значения 6MWT были объединены для группы, проходившей лечение, и контрольной группы в каждый соответствующий момент времени (1 год, 2 года, 3 года, 4 года и 5 лет лечения с помощью асфотазы альфа), поскольку контрольная группа была переориентирована и начала проходить лечение с помощью асфотазы альфа после начальной фазы длительностью 6 месяцев. Изначальная контрольная группа начала лечение асфотазой альфа через шесть месяцев после группы, проходившей лечение. Исходным показателем для всех анализов был последний показатель перед тем, как пациенты получали первую дозу асфотазы альфа. Прогнозируемое значение 6MWT рассчитывалось только в том случае, если пациент ходил в течение всех шести минут. Три пациента, первоначально отнесенные к контрольной группе, не были включены в анализ прогнозируемого процентного значения, поскольку эти пациенты не могли ходить в течение 6 минут в начале исследования из-за физических и/или когнитивных нарушений. При измерении на начальном уровне 5 из 19 пациентов использовали вспомогательные устройства для мобильности (n=3, группа, группа лечения асфотазой альфа; n=2, контрольная группа).
Подростки и взрослые пациенты с ГФФ, проходившие лечение с помощью асфотазы альфа, улучшили свои показатели с 355 метров (минимальное расстояние 10 метров; максимальное расстояние 620 метров) в начале лечения до 450 метров (минимальное расстояние 280 метров; максимальное расстояние 707 метров) после шести месяцев лечения с помощью асфотазы альфа (Фиг. 11А). Аналогичным образом, медиана прогнозируемого процента пройденного расстояния 6MWT увеличилась с 76%, прогнозируемых на исходном уровне (минимум 42%, максимум 101%), до 85% (минимум 29%, максимум 109%) после шести месяцев лечения с помощью асфотазы альфа (Фиг. 11B). Увеличение пройденного расстояния при 6MWT и прогнозируемого % пройденного расстояния при 6MWT сохранялись в течение пяти лет лечения с помощью асфотазы альфа. После двух лет лечения с помощью асфотазы альфа все пять пациентов, использующих вспомогательные устройства для мобильности, улучшили свои показатели: один перешел от инвалидной коляски к костылям, один - от ходунка до трости, один - от ходунка на колесиках до самостоятельного передвижения и два - от трости до независимого передвижения.
Также был проведен анализ post hoc для оценки результатов 6MWT для пациентов-подростков с ГФФ (n=4) и взрослых, имеющих ГФФ, начавшуюся в детском возрасте, (n=9) до и после лечения с помощью асфотазы альфа. Надежность 6MWT при повторном испытании оценивали путем вычисления коэффициента корреляции Пирсона (r) между расстояниями 6MWT, пройденными в моменты времени скрининга относительно исходного значения, и рассчитывали двусторонние значения P (точная нулевая гипотеза теста: r=0). Надежность анализа изучалась отдельно для подростков от около 13 до около 17 лет и взрослых старше около 18 лет. Коэффициенты корреляции Пирсона (r) между пройденным расстоянием в моменты времени скрининга относительно исходного уровня составляли 0,81 (P=0,1250) для пациентов-подростков с ГФФ (Фиг. 12A) и 0,94 (P=0,0001) для взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, (Фиг. 12B). Минимальное клинически значимое различие (МКЗР) для 6MWT пациентов-подростков с ГФФ (n=4) и взрослых, имеющих ГФФ, начавшуюся в детском возрасте (n=9), было рассчитано с использованием способов на основе распределения, примененных к данным 6MWT в моменты скрининга и данным исходного уровня. В текущем анализе post hoc для оценки МКЗР использовались способы, основанные на стандартной ошибке измерения (СОИ) и 1/3 стандартного отклонения (СО) распределения. Наиболее консервативные оценки МКЗР составляли 43 метра для подростков (способ СОИ; n=4) и 31 метр для взрослых (способ СО; n=9) с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, которые завершили 6MWT в моменты скрининга и для которых были получены исходные данные.
Пример 9. Улучшение Физической Способности Подростков и Взрослых Пациентов с ГФФ, при Оценке с помощью теста Моторики Брюинкса-Озерецкого, 2-е издание (BOT-2)
Физическая способность и нарушения у подростков и взрослых с ГФФ были оценены с помощью теста моторики Брюинкса-Озерецкого на скорость бега, ловкость и силу, 2-е издание (BOT-2). Тесты BOT-2 для оценки скорости бега и ловкости пациентов с ГФФ включали челночный бег на 50 футов, боковые шаги через гимнастическое бревно и боковые прыжки на одной или двух ногах. Тесты BOT-2 для оценки силы пациентов с ГФФ включали приседания, подъем прямых ног в положении лежа, прыжки в длину с места, приседания с опорой и отжимания. Затем были определены общие показатели скорости и ловкости BOT-2 и общие показатели силы BOT-2 из суммы баллов, полученных за тесты BOT-2 за каждый временной интервал (исходный уровень, 6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года и 5 лет). Для показателей BOT-2 после исходного уровня, показатели BOT-2 были объединены для группы лечения и контрольной группы в каждый соответствующий момент времени (6 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, и 5 лет лечения с помощью асфотазы альфа), поскольку контрольная группа получала лечение асфотазой альфа после начальной фазы длительностью 6 месяцев. Медиана общего показателя скорости бега и ловкости BOT–2 для взрослых и подростков с ГФФ составляла 6,5 (минимум 0, максимум 39) на исходном уровне и увеличилась на 4,0 (минимум - 5, максимум 18) после 5 лет лечения с помощью асфотазы альфа (Фиг. 13). Медиана общего показателя силы BOT-2 составила 13,5 (минимум 0, максимум 33) в начале лечения и увеличилась на 3,5 (минимум - 9, максимум 9) после пяти лет лечения с помощью асфотазы альфа (Фиг. 13).
Пример 10. Увеличение Хватательной и Мышечной Силы у Подростков и Взрослых пациентов с ГФФ, при Оценке с Помощью Динамометрии с Использованием Портативных Устройств (HHD)
Хватательную и мышечную силу у подростков и взрослых с ГФФ оценивали с помощью Динамометрии с использованием Портативных устройств (HHD). Следующие двусторонние группы мышц были проверены путем проведения HHD: хватательная группа, сгибатели колена, разгибатели колена, сгибатели бедра, разгибатели бедра и группа мышц, отводящих бедро. Сила была представлена в фунтах. Измерения были проведены в фунтах (сила), пересчитаны в ньютоны (N), а крутящий момент был рассчитан в ньютон-метрах (NM) с учетом длины конечности. Крутящий момент использовался для определения % прогнозируемых показателей HHD на основе возраста, пола и веса у пациентов младше 16 лет, а сила использовалась для сравнения % прогнозируемых показателей HHD у взрослых.
Значения медианы для % прогнозируемого показателя HHD мышц, отводящих бедро, для подростков и взрослых пациентов с ГФФ (n=13), составили 45,60% в начале исследования (минимум 9,1%, максимум 126,2%). Увеличение силы в проксимальных мышцах бедра наблюдалось у пациентов с ГФФ, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа, после 24 недель лечения с помощью асфотазы альфа. Изменение медианы % прогнозируемого значения (доминантная сторона) от исходного уровня до 24-й недели составило 11,10% (минимум - 25,7%, максимум 20,4%) в группе комбинированного лечения с помощью асфотазы альфа по сравнению с 6,70% (минимум - 7,1%, максимум 12,0%) в контрольной группе, в случае отведения бедра. Изменение медианы % прогнозируемого значения (доминантная сторона) от исходного уровня до 24-й недели составило 7,95% (минимум 12,6%, максимум 19,5%) в группе комбинированного лечения с помощью асфотазы альфа по сравнению с 1,90% (минимум 15,0%, максимум 11,2%) в контрольной группе, в случае разгибания бедра.
Подростки и взрослые пациенты с ГФФ, проходившие лечение с помощью асфотазы альфа, проявили улучшение показателей отведения бедра после лечения с помощью асфотазы альфа через 48 недель (изменение медианы - 11,00% прогнозируемого значения (минимум - 15,0, максимум - 30,5%)), 96 недель (изменение медианы - 11,95% прогнозируемого значения (минимум - 14,0%, максимум 47,2%)), 144 недели (изменение медианы 17,05% прогнозируемого значения (минимум - 6,7%, максимум 55,5%)), 192 недели (изменение медианы 19,45% прогнозируемого значения (минимум - 24,2%, максимум 94,7%)) и 240 недель (изменение медианы 9,80% прогнозируемого значения (минимум - 7,2%, максимум 155,2%)). Подростки и взрослые пациенты с ГФФ, проходившие лечение с помощью асфотазы альфа, проявили улучшение показателей разгибания бедра после лечения с помощью асфотазы альфа через 24 недели (изменение медианы - 6,20% прогнозируемого значения (минимум - 12,6, максимум 19,5%)), 48 недель (изменение медианы - 4,90% прогнозируемого значения (минимум 1,7, максимум - 27,7%)), 96 недель (изменение медианы 6,75% прогнозируемого значения (минимум - 24,1%, максимум 31,2%)), 144 недели (изменение медианы 15,40% прогнозируемого значения (минимум - 15,6%, максимум 45,2%)), 192 недели (изменение медианы 17,10% прогнозируемого значения (минимум - 3,2%, максимум 50,2%)) и 240 недель (изменение медианы 12,40% прогнозируемого значения (минимум - 9,2%, максимум 45,1%)). Подростки и взрослые пациенты с ГФФ, проходившие лечение с помощью асфотазы альфа, проявили улучшение в отведении бедра после 240 недель лечения с помощью асфотазы альфа. Подростки и взрослые пациенты с ГФФ имели изменение медианы показателей разгибания колена 16,05% прогнозируемого значения (минимум 7,1%, максимум 40,7%) и сгибания колена 14,30% прогнозируемого значения (минимум 2,1%, максимум 68,0%)).
Пример 11. Улучшения в Функциональных Нарушениях в Нижних Конечностях у Подростков и Взрослых Пациентов с ГФФ, при Оценке с помощью Шкалы Функций Нижних Конечностей (LEFS)
Функциональное нарушение в нижних конечностях у подростков и взрослых с ГФФ оценивали с использованием Шкалы Функций Нижних Конечностей (LEFS). Лицензированный физиотерапевт проводил оценку LEFS у пациентов с ГФФ в формате интервью. Суммарные баллы LEFS варьируют от 0 до 80, причем более высокие баллы указывают на лучшее функционирование нижней конечности. Исходные данные медианы и среднего показателей LEFS были намного ниже в контрольной группе, чем в комбинированной группе, проходящей лечение с помощью асфотазы альфа. Наблюдалось улучшение показателя LEFS в комбинированной группе, проходящей лечение с помощью асфотазы альфа, у подростков и взрослых пациентов с ГФФ по сравнению с контрольной группой, не проходившей лечение (Таблица 12). Клинически значимое улучшение (увеличение ≥ 9 баллов) относительно исходного уровня до 24-й недели наблюдалось у 1 из 5 пациентов (20,0%) в контрольной группе по сравнению с 4 из 13 (30,8%) пациентов с ГФФ, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа.
Таблица 12. Улучшение показателей функциональных нарушений согласно Шкале Функций Нижних Конечностей (LEFS) пациентов с ГФФ относительно исходного уровня до 24 недели лечения с помощью асфотазы альфа
Визит
Параметр
Контрольная Группа (N=6)
Асфотаза Альфа 0,3 мг/кг (N=7)
Асфотаза Альфа 0,5 мг/кг (N=6)
Асфотаза Альфа Комбинированная (N=13/19(20))
Исходный уровень
n
5
7
6
13
Среднее (СО)
35,8 (4,66)
40,0 (25,04)
41,7 (15,62)
40,8 (20,39)
Медиана
35,0
28,0
36,0
35,0
Мин, Макс
30, 41
17, 78
29, 70
17, 78
Неделя 24
n
4
7
6
13
Среднее (СО)
42,0 (12,73)
52,3 (21,05)
44,8 (21,07)
48,8 (20,53)
Медиана
37,5
58,0
47,5
53,0
Мин, Макс
33, 60
22, 78
22, 77
22, 78
Изменение относительно исходного уровня до Недели 24
n
4
7
6
13
Среднее (СО)
5,5 (13,70)
12,3 (17,13)
3,2 (13,09)
8,1 (15,51)
Медиана
2,0
5,0
5,5
5,0
Мин, Макс
-7, 25
-2, 40
-15, 23
-15, 40
Значение р*
-
-
-
0,7248
*Значение р на основе точного U-критерия Манна-Уитни, при сравнении группы, проходившей лечение, с контрольной группой.
Во время лечения с помощью асфотазы альфа у 14 из 18 пациентов (77,8%) с исходными данными показателей LEFS наблюдалось увеличение (улучшение) общего показателя LEFS от исходного уровня до пяти лет лечения с помощью асфотазы альфа. Кроме того, 8 из 18 пациентов (44,4%) продемонстрировали клинически значимое улучшение (≥ 9 баллов) показателя LEFS при их окончательной оценке по сравнению с исходным показателем LEFS. Среднее изменение от исходного уровня для всех 18 пациентов до последнего общего воздействия асфотазы альфа составило 7,5 (стандартное отклонение 13,33).
Пример 12. Боль у Подростков и Взрослых Пациентов с ГФФ, при Оценке с Помощью Краткого Опросника Оценки Боли (BPI-SF)
Боль у подростков и взрослых с ГФФ оценивалась с использованием Краткого Опросника Оценки Боли (BPI-SF). Оценки BPI-SF у подростков и взрослых с ГФФ представляют собой комплекс из 11 оценок боли. Не было увеличения среднего от исходного уровня до 24-й недели в комбинированном показателе BPI-SF у подростков и взрослых с ГФФ (Таблица 13). Изменения среднего и медианы от исходного уровня до 24-й недели показателей BPI-SF были одинаковыми у подростков и взрослых с ГФФ, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа, и в контрольной группе.
Таблица 13. Отсутствие Изменений Показателей Краткого Опросника Оценки Боли (BPI-SF) у Пациентов с ГФФ от Исходного Уровня до 24-й Недели Лечения с Помощью Асфотазы Альфа
Визит
Параметр
Контрольная Группа (N=6)
Асфотаза Альфа 0,3 мг/кг (N=7)
Асфотаза Альфа 0,5 мг/кг (N=6)
Асфотаза Альфа Комбинированная (N=13/19)
Исходный уровень
n
6
7
6
13
Среднее (СО)
12,3 (7,17)
10,3 (10,78)
17,8 (8,18)
13,8 (10,07)
Медиана
12,0
8,0
20,0
15,0
Мин, Макс
5, 25
0, 30
3, 25
0, 30
Неделя 24
n
4
7
6
13
Среднее (СО)
10,3 (6,60)
6,0 (7,16)
15,2 (8,82)
10,2 (8,98)
Медиана
10,0
3,0
16,0
7,0
Мин, Макс
3, 18
0, 21
4, 26
0, 26
Изменение относительно исходного уровня до Недели 24
n
4
7
6
13
Среднее (СО)
-4,0 (6,00)
-4,3 (7,04)
-2,7 (6,38)
-3,5 (6,51)
Медиана
-3,0
-3,0
-0,5
-2,0
Мин, Макс
-11, 1
-17, 3
-11, 4
-17, 4
Значение р*
-
-
-
0,7315
*Значение р на основе точного U-критерия Манна-Уитни, при сравнении группы, проходившей лечение, с контрольной группой.
Во время лечения с помощью асфотазы альфа в течение пяти лет показатели BPISF у подростков и взрослых с ГФФ соответствовали показателям, наблюдаемым в течение начального 24-недельного периода лечения. К 96 неделям (N=19) и 144 неделям (N=17) лечения с помощью асфотазы альфа изменение медианы составило - 4,0 (диапазон: - 13, 11) и - 4,0 (диапазон: - 24, 9) для подростков и взрослых с ГФФ, проходивших лечение с помощью асфотазы альфа, и контрольных пациентов, соответственно. К 192 неделям (N=15) и 240 неделям (N=16) лечения с помощью асфотазы альфа изменение медианы составило - 3,0 (диапазон: - 20, 8) и - 3,5 (диапазон: - 20, 5) для подростков и взрослых с ГФФ и контрольных пациентов, соответственно. Таким образом, подростки и взрослые с ГФФ не проявили усиления боли после лечения с помощью асфотазы альфа в течение около 5 лет.
Пример 13. Переносимость Долгосрочного Лечения с Помощью Асфотазы Альфа
Как правило, лечение с помощью асфотазы альфа хорошо переносилось у подростков и взрослых, имеющих HPP, при этом большинство нежелательных явлений (НЯ) состояло из реакций в месте инъекции (РМИ) и артралгии. Оценки безопасности включали постоянный мониторинг побочных эффектов (НЯ), включая РМИ и реакции, связанные с инъекцией (РСИ). РМИ были локализованы в месте введения и происходили в любой момент времени после начала лечения с помощью асфотазы альфа. РСИ включали системные признаки, симптомы или проявления (например, генерализованную крапивницу или зуд, гипотензию или респираторный дистресс), которые возникли в течение 3 часов после введения асфотазы альфа.
Смертей не происходило во время лечения с помощью асфотазы альфа. Только один пациент прекратил участие из-за гиперчувствительности в месте инъекции и анафилактоидной реакции (по 1 эпизоду). Все пациенты испытывали по меньшей мере, одно нежелательное явление, возникающее при лечении (НЯВЛ) во время исследования; большинство НЯВЛ были легкой (864/1145 (75%)) или средней (229/1145 (20%)) интенсивности. НЯВЛ, представляющие собой артралгию, эритему в месте инъекции, боль в конечности, боль в спине, гематому в месте инъекции, боль в костях, изменение цвета в месте инъекции, офтальмологические кальцификации, скелетно-мышечную боль, периферические отеки, головокружение, перелом стопы, реакцию в месте инъекции, отек сустава, инфекции верхних дыхательных путей, головную боль, боль в месте инъекции, ринофарингит, кашель, слабость, атрофию в месте инъекции, зуд в месте инъекции, боль во время процедуры, синусит, усталость, отек в месте инъекции, гипертрофию в месте инъекции, тошноту, боль в ротоглотке, остеоартрит, парестезию и посттравматические боли были зарегистрированы более чем у трех пациентов с ГФФ (Таблица 14).
Таблица 14. Нежелательные явления, возникающие при лечении (НЯВЛ), возникшие у более чем трех пациентов с ГФФ во время лечения с помощью асфотазы альфа
НЯВЛ (предпочтительный термин)
Пациенты, n (%)N=19
Артралгия
13 (68)
Эритема в месте инъекции
13 (68)
Боль в конечности
12 (63)
Боль в спине
10 (53)
Гематома в месте инъекции
10 (53)
Боль в костях
9 (47)
Изменение цвета в месте инъекции
9 (47)
Офтальмологические кальцификации<sup>a</sup>
9 (47)
Скелетно-мышечная боль
8 (42)
Периферический отек
8 (42)
Головокружение
7 (37)
Перелом стопы
7 (37)
Реакция в месте инъекции
7 (37)
Отек сустава
7 (37)
Инфекция верхних дыхательных путей
7 (37)
Головная боль
6 (32)
Боль в месте инъекции
6 (32)
Назофарингит
6 (32)
Кашель
5 (26)
Слабость
5 (26)
Атрофия в месте инъекции
5 (26)
Зуд в месте инъекции
5 (26)
Боль во время процедуры
5 (26)
Синусит
5 (26)
Усталость
4 (21)
Отек места инъекции
4 (21)
Гипертрофия места инъекции
4 (21)
Тошнота
4 (21)
Боль в ротоглотке
4 (21)
Остеоартрит
4 (21)
Парестезия
4 (21)
Посттравматическая боль
4 (21)
a
НЯВЛ включает предпочтительные термины «глазные отложения» и «конъюнктивальные отложения».
Наиболее распространенные НЯВЛ представляли собой РМИ (385/1145 (34%)), которые встречались у всех пациентов; наиболее распространенные РМИ (≥5% РМИ) представляли собой эритему (121/385 (31%)), изменение цвета (66/385 (17%)), РМИ без дополнительных уточнений (56/385 (15%)), гематому (33/385 (9%)), боль (26/385 (7%)) и зуд (20/385 (5%)). В общей сложности два пациента испытали НЯВЛ, которые были классифицированы как РСИ, представляющие гиперчувствительность (оральная гипестезия и озноб у одного пациента; анафилактоидная реакция у одного пациента), которые считались умеренными по интенсивности. В общей сложности 29 серьезных возникающих при лечении НЯ (СНЯ) были зарегистрированы у 9 пациентов, и 8 СНЯ, зарегистрированных у двух пациентов, были оценены исследователем как связанные с введением асфотазы альфа (пероральная гипестезия, озноб, боль в конечностях и головная боль у одного пациента и реакция гиперчувствительности и анафилактоидная реакция у одного пациента). В целом, введение асфотазы альфа хорошо переносилось подростками и взрослыми с ГФФ.
Пример 14. Фармакодинамические Результаты Фазы 2а, Рандомизированное, Многоцентровое, Открытое Исследование по Подбору Дозы Асфотазы Альфа у Взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте
В исследованиях у пациентов в возрасте 6-12 лет, а также у подростков и взрослых с ГФФ, асфотаза альфа снижала уровни циркулирующих нПФ и П5Ф и улучшала функциональные результаты. Асфотаза альфа была одобрена в Соединенных Штатах, Европе и Японии для лечения ГФФ у пациентов всех возрастов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, в рекомендуемой дозе 2,0 мг/кг 3 раза в неделю или 1,0 мг/кг 6 раз в неделю. В Соединенных Штатах эта доза может быть увеличена до 3,0 мг/кг 3 раза в неделю, если лечащий врач считает, что эффективность недостаточна.
Фармакодинамику, фармакокинетику и безопасность/переносимость асфотазы альфа оценивали у взрослых с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, при 3 дозах в 6-кратном диапазоне относительно рекомендуемой в настоящее время дозы 2,0 мг/кг 3 раза в неделю. Фармакодинамика и безопасность/переносимость были измерены.
В число отвечающих критериям пациентов входили мужчины и небеременные женщины в возрасте ≥18 лет с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, и диагнозом ГФФ, о чем свидетельствует документированный анамнез скелетных аномалий, связанных с ГФФ, и одно или более из следующего: документированная мутация (мутации) гена ТНЩФ (ALPL), активность сывороточной щелочной фосфатазы ниже скорректированного по возрасту нормального диапазона и П5Ф выше верхнего предела нормы при скрининге (исторические результаты для П5Ф могут использоваться для определения пригодности пациента; критерий П5Ф в плазме не применим для пациентов, проходивших лечение пиридоксином), нПФ в плазме ≥3,9 мкМ при скрининге и отсутствие лечения асфотазой альфа в течение 3 лет после начала исследования.
Схема исследования и лечение представляли собой 13-недельное многоцентровое рандомизированное открытое исследование зависимости доза-эффект фазы 2а. После скрининга, в начальном подготовительном периоде допускался отбор проб для анализа субстрата. Затем пациентов рандомизировали 1:1:1 для однократного дозирования асфотазы альфа (0,5, 2,0 или 3,0 мг/кг), вводимой подкожно (пк) в течение Недели 1. Пациенты не получали асфотазу альфа в течение Недели 2. Асфотазу альфа затем вводили с 3 по 9 Неделю в дозе 0,5, 2,0 или 3,0 мг/кг пк 3 раза в неделю (эквивалентно 1,5, 6,0 или 9,0 мг/кг/неделя) (Фиг. 14).
Фармакодинамические результирующие измерения представляли собой изменения нПФ в плазме (первичный) и П5Ф (вторичный) от исходного уровня до времени перед дозой 3 (остаточный уровень) на Неделе 9, при этом исходный уровень был определен как среднее значение всех оценок до первой пк инъекции с асфотазой альфа. Образцы крови для измерения нПФ и П5Ф в плазме были отобраны во время скрининга, на подготовительном этапе, в Неделю 1, Неделю 9 и Неделю 13 в клинических условиях. Образцы крови в течение Недель 2-8 и Недель 10-12 можно было отбирать в клинических условиях или дома. Другие вторичные результирующие измерения включают безопасность/переносимость и фармакокинетические параметры. Представлены результаты фармакодинамики и безопасности/переносимости.
Первичные гипотезы проверяли, отличаются ли различия в изменении нПФ плазмы между когортами от нуля при измерении до введения дозы 3 Недели 9. Для контроля повторяемости использовалась процедура тестирования с фиксированной последовательностью, чтобы сначала определить разницу между когортами 3,0 и 0,5 мг/кг и, только если она была статистически значимой, затем была определена разница между когортами 2,0 и 0,5 мг/кг. При проведении теста значимости использовалась двусторонняя 5% ошибка первого рода (P <0,05). Первичный критерий эффективности был достигнут, если нулевая гипотеза была отклонена для обоих сравнений при уровне значимости тестирования 0,05 (P <0,05 для обоих сравнений). Первичный анализ был выполнен с использованием смешанной модели повторных измерений на основе способа ограниченного максимального правдоподобия (REML) для оценки изменения от базового уровня до недели 9 (до момента времени перед введением 3-й дозы; день 61). В этой модели использовались результаты, полученные из образцов до введения дозы, полученных на Неделе 4 (день 22), Неделе 5 (день 29), Неделе 7 (день 43), Неделе 8 (день 50), Неделе 9 (день 57) и Неделе 9 (День 61). Момент времени до введения дозы Недели 3 (день 15) не был включен, так как он был получен после 2-недельного периода выведения препарата после однократного приема, и ожидалось, что в этот момент будут получены значения, аналогичные значениям на исходном уровне. Следуя протоколу, фармакодинамические оценки не были получены на 6 Неделе. Анализ включал коварианты для фиксированного, категориального эффекта посещения, когорты лечения, исходного уповня нПФ, пола, исходной весовой группы (≥ медиана относительно <медиана) и назначения партии исследуемого препарата. Неструктурированная ковариационная структура использовалась для моделирования интраиндивидуальных ошибок, а аппроксимация Кенварда-Роджера использовалась для оценки степеней свободы знаменателя.
Из 35 обследованных пациентов 27 были включены в исследование и завершили исследование. Демографические и исходные характеристики заболевания приведены в Таблице 15. Среди трех дозовых когорт средний возраст составлял 45,0 года (диапазон: 18-77), и большинство пациентов были эвропеоидами (96%) и женщинами (59%).
Таблица 15. Демографические и Исходные Характеристики ГФФ
Когорта AA 0,5 мг/кг (n=8)
Когорта AA 2,0 мг/кг (n=10)
Когорта AA 3,0 мг/кг (n=9)
Всего АА (N=27)
Возраст при включении, лет, медиана (диапазон)
44,5 (18-64)
42,5 (24-77)
55,0 (24-69)
45,0 (18-77)
Пол, n (%)
3 (38)
4 (40)
4 (44)
11 (41)
Мужчины
5 (63)
6 (60)
5 (56)
16 (59)
Раса, n (%)
Европеоиды
7 (88)
10 (100)
9 (100)
26 (96)
Смешанная
1 (13)
0
0
1 (4)
Рост, см, среднее (СО)
161 (14)
163 (7)
163 (9)
163 (10)
Вес, кг, среднее (СО)
89 (24)
73 (13)
85 (19)
82 (20)
Форма ГФФ, n (%)<sup>a</sup>
Перинатальная или младенческая
0
1 (10)
1 (11)
2 (7)
Детская
3 (38)
5 (50)
4 (44)
12 (44)
Перинатальная, младенческая или детская
5 (63)
4 (40)
4 (44)
13 (48)
Мутация последовательности гена ALPL, n(%)<sup>b</sup>
7 (88)
9 (90)
9 (100)
25 (93)
Категория мутации гена, n (%)
Гомозиготная
0
1 (10)
0
1 (4)
Гетерозиготная
2 (25)
3 (30)
4 (44)
9 (33)
Сложная гетерозиготная
5 (63)
5 (50)
5 (56)
15 (56)
Не определено
1 (13)
1 (10)
0
2 (7)
Высокий уровень П5Ф в анамнезе, использованный для диагностирования ГФФ при скрининге, n (%)
7 (88)
9 (90)
8 (89)
24 (89)
Исходный уровень нПФ, мкМ, среднее (СО)<sup>c</sup>
5,4 (1,6)
5,3 (1,2)
5,0 (0,9)
5,2 (1,2)
Исходный уровень П5Ф, нг/мл, среднее (СО)<sup>d</sup>
309,5 (349,2)
382,1 (385,9)
229,5 (321,4)
309,7 (347,0)
Исходный уровень ЩФ, Ед/л, среднее (СО)<sup>e</sup>
20,1 (4,2)
20,4 (6,6)
25,6 (20,5)
22,0 (12,5)
a
На основании категориального отбора на основании возраста при первых признаках/симптомах;
b
Анализ мутаций генов был проведен в рамках исследования в центральной лаборатории;
c
Нормальный диапазон уровня нПФ: 0,75-4,78 мкМ для пациентов в возрасте 13-18 лет и 1,00-5,82 для пациентов в возрасте >18 лет;
d
Нормальный диапазон уровня П5Ф: 5,74-61,15 нг/мл для пациентов в возрасте 6-18 лет и 2,81-26,70 нг/мл для пациентов в возрасте >18 лет;
e
Нормальный диапазон уровня ЩФ: 60-270 Ед/л для пациентов мужского пола в возрасте 16-19 лет, 40-120 Ед/л для пациентов мужского пола в возрасте >19 лет и 40-120 Ед/л для пациентов женского пола в возрасте >15 лет. Для анализа, значения ниже НПКО 18 Ед/л были установлены равными 18 Ед/л.
АА=асфотаза альфа; ЩФ=щелочная фосфатаза; ГФФ= гипофосфатазия; ТНЩФ=тканенеспецифическая щелочная фосфатаза; П5Ф=пиридоксаль 5'-фосфат; нПФ=неорганический пирофосфат; СО=стандартное отклонение.
Значимые отличия наблюдались между изменениями предела среднего (LSM) нПФ от исходного уровня до точки времени перед 3-й дозой на Неделе 9 (Таблица 16 и Фиг. 15). Значимые отличия также наблюдались между изменениями LSM П5Фот исходного уровня до точки времени перед 3-й дозой на Неделе 9 (Таблица 16 и Фиг. 16).
Таблица 16. Среднее изменение нПФ и П5Ф от исходного уровня до 3-й дозы на Неделе 9
Когорта AA 0,5 мг/кг (n=8)<sup>a</sup>
Когорта AA 2,0 мг/кг (n=10)<sup>a</sup>
Когорта AA 3,0 мг/кг (n=9)<sup>a</sup>
нПФ, мкМ
Исходный уровень, среднее (СО)
5,4 (1,6)
5,3 (1,2)
5,0 (0,9)
Перед 3-й дозой Недели 9, среднее (СО)<sup>b</sup>
3,1 (0,7)
1,9 (0,6)
1,1 (0,3)<sup>c</sup>
LSM, изменение относительно исходного уровня (ОС)<sup>d</sup>
-2,6 (0,2)
-3,8 (0,2)
-4,5 (0,2)
П5Ф, н/мл
Исходный уровень, среднее (СО)
309,5 (349,2)
382,1 (385,9)
229,5 (321,4)
Перед 3-й дозой Недели 9, среднее (СО)<sup>b</sup>
40,7 (45,8)
13,0 (9,5)
4,8 (4,4)
LSM, изменение относительно исходного уровня (ОС)<sup>d</sup>
-304,0 (0,4)
-333,4 (8,1)
-338,0 (8,5)
а
Дозы вводятся 3 раза в неделю в течение периода многократного дозирования;
b
Перед введением 3-й дозы Недели 9 образец отбирали в День 61;
c
Для одного пациента не было результата;
d
Первичный анализ с использованием смешанной модели повторных измерений на основе способа ограниченного максимального правдоподобия.
АА=асфотаза альфа; ДИ=доверительный интервал; LSM=предел среднего; П5Ф=пиридоксаль 5'-фосфат; нПФ=неорганический пирофосфат; СО=стандартное отклонение; ОС=ошибка среднего.
Что касается безопасности и переносимости, нежелательные явления, возникающие при лечении (НЯВЛ), наблюдаемые у ≥5 пациентов в целом, представлены в Таблице 17. Например, реакции в месте инъекции (137 случаев у 21 пациента) были более частыми в когортах 2,0 и 3,0 мг/кг. Наблюдалась липодистрофия (2 случая у 1 пациента в когорте 2,0 мг/кг). Эктопические кальцификации (4 случая у 4 пациентов; по 2 в когортах 2,0 и 3,0 мг/кг) наблюдались в почках (2 пациента; по 1 в когортах 2,0 и 3,0 мг/кг), в глазах (1 пациент в когорте 2,0 мг/кг когорты) и печени (1 пациент в когорте 3,0 мг/кг). Также наблюдались реакции гиперчувствительности (4 события у 1 пациента в когорте 2,0 мг/кг). В общем, 99% (480/485) НЯВЛ были легкой или средней степени тяжести. О серьезных НЯВЛ не сообщалось, и ни один пациент не был исключен из исследования из-за НЯВЛ.
Таблица 17. Нежелательные Явления, Возникающие при Лечении у ≥5 Пациентов
Когорта AA 0,5 мг/кг (n=8)<sup>a</sup>
Когорта AA 2,0 мг/кг (n=10)<sup>a</sup>
Когорта AA 3,0 мг/кг (n=9)<sup>a</sup>
Всего (N=27)
НЯВЛ
Явления, n
Пациенты, n (%)
Явления, n
Пациенты, n (%)
Явления, n
Пациенты, n (%)
Явления, n
Пациенты, n (%)
Боль в конечности
17
4 (50)
11
5 (50)
10
4 (44)
38
13 (48)
Артралгия
13
2 (25)
12
4 (40)
15
5 (56)
40
11 (41)
Головная боль
10
3 (38)
9
3 (30)
7
5 (56)
26
11 (41)
Усталость
9
3 (38)
11
4 (40)
5
3 (33)
25
10 (37)
Эритема в месте инъекции
4
2 (25)
4
3 (30)
4
4 (44)
12
9 (33)
Реакция в месте инъекции
4
1 (13)
21
3 (30)
68
4 (44)
93
8 (30)
Боль в спине
13
4 (50)
4
1 (10)
2
2 (22)
19
7 (26)
Боль в костях
3
2 (25)
3
3 (30)
3
2 (22)
9
7 (26)
Эритема
4
2 (25)
7
3 (30)
2
1 (11)
13
6 (22)
Боль в месте инъекции
2
2 (25)
2
1 (10)
4
3 (33)
8
6 (22)
Тошнота
3
2 (25)
2
1 (10)
2
2 (22)
7
5 (19)
Инфекция верхних дыхательных путей
1
1 (13)
3
3 (30)
1
1 (11)
5
5 (19)
а
Дозы вводятся 3 раза в неделю в течение периода многократного дозирования.
АА=Асфотаза Альфа.
Взрослые пациенты с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, проходившие лечение с помощью асфотазы альфа в рекомендованной дозе или выше (2,0 или 3,0 мг/кг), имели статистически значимое снижение по сравнению с исходным уровнем значений нПФ и П5Ф, полученных до введения 3-й дозы Недели 9 по сравнению с пациентами, получавшими более низкие, чем рекомендуемая доза, дозы (0,5 мг/кг). Реакции в месте инъекции были более частыми при увеличении дозы. В остальном, асфотаза альфа хорошо переносилась при любых дозах.
Пример 15. Популяционный Фармакокинетический и Фармакокинетически-Фармакодинамический Анализ Асфотазы Альфа у Взрослых Пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, в Исследовании AA-HPP-208
Мы рассчитали параметры фармакокинетики (ФК) асфотазы альфа, используя некомпартментный анализ (NCA), чтобы описать ФК асфотазы альфа у взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте. Мы оценили популяционные параметры ФК, включая типичные значения и случайные межиндивидуальные и остаточные вариации, и определили индивидуально-специфические ковариантные факторы (например, вес), которые предсказывают необъяснимую случайную изменчивость в популяционном анализе ФК. Мы описали популяционную фармакокинетически-фармакодинамическую (ФКФД) взаимосвязь между воздействием асфотазы альфа и реакцией нПФ. Кроме того, мы оценили популяционные параметры ФК-нПФ, включая типичные значения и случайные межиндивидуальные и остаточные вариации. Кроме того, мы смоделировали взаимосвязь между воздействием и реакцией (ER) между ФК-нПФ у взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, проходивших лечение асфотазой альфа, для обоснования рекомендуемой дозы 6 мг/кг/неделя. Наконец, мы описали популяционную связь ФКФД между воздействием асфотазы альфа и пиридоксаль-50-фосфатным ответом (П5Ф) у пациентов, которые не получали добавок, содержащих витамин B6. Это включает описание ФК-П5Ф дозы или ER и оценку типичных значений и случайных межиндивидуальных и остаточных вариаций.
Фаза 2а исследования (протокол AA-HPP-208) представляла собой рандомизированную параллельную групповую схему трех режимов повышения многократного дозирования асфотазы альфа у 27 пациентов с ГФФ в течение около 13 недель (Фиг. 17A-17B). Исследование состояло из периода скрининга, периода однократного дозирования (3 недели) и периода лечения с помощью многократного дозирования (10 недель). Исследование состояло из однократной дозы 0,5, 2,0 или 3,0 мг/кг асфотазы альфа с последующими многократными дозами одинаковых количеств 3 раза в неделю, начиная спустя 2 недели. Двадцать семь субъектов (около 9 на когорту) были включены в исследование, и обширный отбор проб ФК, нПФ и П5Ф была выполнен после однократного и многократного дозирования с выборочным отбором образцов во время фазы накопления.
Индивидуальные и средние профили ФК были получены для всех трех когорт. Отдельные профили ФК указывали на накопление асфотазы альфа после однократного введения дозы в 1-й день (Фиг. 18А) до последующих нескольких событий дозирования в день 61 (Фиг. 18B). Профили ФК (среднее ± СО) как однократного, так и многократного дозирования показали, что асфотаза альфа проявляет линейный профиль ФК с повышенным воздействием в тестируемом диапазоне доз от 0,5 до 3 мг/кг (Фиг. 19A и 19C). Устойчивое состояние было достигнуто на около 29 день (или после 4 недель многократного дозирования), когда концентрация асфотазы альфа постоянно достигала плато при всех трех схемах дозирования (Фиг. 19B). Профили нормализованных по дозе профилей ФК (среднее ± СО) показали, что ФК асфотазы альфа увеличивалась приблизительно пропорционально дозе (или в 2 раза относительно диапазона пропорциональности) с 0,5 мг/кг до 3,0 мг/кг (Фиг. 20A-20B).
Популяционные данные ФК, включая наблюдения за концентрацией, историю дозирования, время событий и ковариантные факторы (возраст, рост, вес, пол и раса) были получены и отформатированы для анализа. Значения параметров ФК были оценены с использованием модуля NCA в PhoenixWinNonlin v 7.0 (Certara, Принстон, Нью-Джерси, США). Набор данных для NCA был получен из набора популяционных данных ФКФД NONMEM. Параметры ФК, полученные из результатов концентрации, были использованы для оценки пропорциональности дозы асфотазы альфа. Популяционный анализ ФКФД для конечных точек повторных измерений проводился с помощью нелинейного моделирования смешанных эффектов с помощью квалифицированной установки программного обеспечения для нелинейного моделирования смешанных эффектов (NONMEM), версия 7.3 (ICON Development Solutions, Ганновер, Мэриленд).
2
3
a
В предыдущих работах по моделированию было выдвинуто предположение, что асфотаза альфа имеет многокомпартментное распределение, поэтому первоначальное моделирование проводилось с использованием двухкомпартментной модели с абсорбцией первого порядка, параметризованной с точки зрения клиренса (CL), центрального объема распределения (V), периферийного объема распределение (V), межкомпартментного клиренса (Q), абсолютной биодоступности (F), константы скорости абсорбции (k) и времени задержки подкожной абсорбции (ALAG) (ADVAN13) с соответствующими случайными распределениями эффектов. Выбор модели основывался на различных критериях соответствия, включая диагностические корреляционные диаграммы, сходство по меньшей мере, 2 значащих цифр, достоверность оценок параметров, точность оценок параметров, корреляцию между ошибками оценки параметров модели
<0,95, и AIC, учитывая минимальное значение целевой функции и количество оцениваемых параметров. Окончательные оценки параметров модели были представлены с мерой неопределенности оценки, включая асимптотические стандартные ошибки (полученные из этапа NONMEM$COVARIANCE).
ср, сс
Предварительное моделирование асфотазы альфа также руководствовалось ковариантным моделированием. Полная модель была построена с осторожностью, чтобы избежать корреляции или коллинеарности в предикторах. Параметры модели были оценены, и оценка любых оставшихся трендов была проведена путем графического контроля всех ковариантных эффектов. Выводы о клинической значимости параметров были основаны на полученных оценках параметров полной модели и показателях точности оценки. Индивидуальные параметры ФК также были оценены, и была рассчитана средняя концентрация в течение интервала дозирования в стационарном состоянии (С). Этап оценки модели прогностической проверки был выполнен для оценки качества окончательной модели и параметров.
ср, сс
ср, сс
Для анализа данных ФК-нПФ был составлен график ответа нПФ в плазме с точки зрения изменения относительно исходного уровня и суммирован по квартилям воздействия. Частоты концентраций нПФ до введения дозы Дня 61 исследования ниже нижнего предела нормальных значений нПФ (1,33 мкМ) (НПН) были представлены таблице по межквартильному диапазону С и когортам лечения. Индивидуальные значения С асфотазы альфа в диапазоне от 253 до 6800 Ед/л были рассчитаны и использованы для графической и количественной оценки этого отношения ER.
Набор данных ФКФД асфотазы альфа был составлен из данных 27 пациентов, что в общей сложности составило 1140 концентраций асфотазы альфа в сыворотке крови и 1293 концентраций нПФ в плазме за весь период исследования. Было 198 наблюдений ниже предела количественного определения, что составило более 17% от общего числа наблюдений сывороточной асфотазы альфа. Исследуемая популяция состояла из 11 мужчин и 16 женщин в возрасте от 18 до 77 лет и весов от 48,2 до 121,3 кг. Большинство пациентов были эвропеоидами (96,3%). Рост, пол, возраст и раса были включены в набор данных и суммированы в табличном формате для полноты исследования, но не рассматривались как потенциальные коварианты в популяционных моделях. Информация о партии лекарственного средства, использованная в анализах, включала активность партии, общее содержание сиаловой кислоты (TSAC) и размер партии.
макс
посл
беск
беск
z
1/2
z
1/2
макс
макс
беск
посл
-1
Анализ NCA показал, что относительно длительный период полураспада и частота дозирования приводят к заметному накоплению при всех уровнях дозы. Обширная индивидуальная изменчивость наблюдалась в профилях концентрации в зависимости от времени в каждой когорте, хотя все профили, по-видимому, демонстрировали моноэкспоненциальное снижение при наблюдении на полулогарифмическом графике. Показатели содержания в сыворотке (максимальная концентрация в интервале дозирования (C), площадь под кривой концентрация-время от нуля до времени последней наблюдаемой концентрации в интервале дозирования (AUC) и площадь под кривой концентрация-время от времени ноль до бесконечности (AUC)) увеличивались с увеличением дозы и между введением одной и нескольких доз. Из-за ограниченных концентраций выше нижнего предела обнаружения в когорте 0,5 мг/кг, AUC, наблюдаемый клиренс после подкожного введения (CL/F), наблюдаемый объем распределения после подкожного введения (V/F ) и конечный период полураспада (t) не были оценены. Средние геометрические оценки CL/F и V/F составляли 18,8 л/день и 99,1 л для когорты 2,0 мг/кг, 22,1 л/день и 150 л для когорты 3,0 мг/кг соответственно. Оценки t имели средние геометрические значения в диапазоне от 3,66 до 5,54 день. Медиана времени максимальной концентрации в оценках интервала дозирования (T) варьировала от 1,91 до 3,0 и от 0,747 до 1,16 дня в когортах с одиночным и множественным дозированием, соответственно. Пропорциональность дозы в ФК асфотаза альфа была оценена с использованием логарифмической формы модели степени, подходящей для значений C для однократного и многократного дозирования и для значений AUC и AUC для однократного дозирования.
макс
макс
Результаты были неоднозначными для всех случаев, кроме C однократного дозирования, где была обнаружена непропорциональность. Для параметра C однократного дозирования отношение пороговой дозы к отклонению пропорциональности составляло 7,85. Максимальные пропорциональные соотношения доз для этих параметров варьировались от 1,37 до 1,69 по сравнению с максимальным соотношением дозы 18,2 в наборе данных.
2
3
a
2
3
-1
В нашей предыдущей работе по моделированию было выдвинуто предположение, что асфотаза альфа имеет многокомпартментное распределение, поэтому первоначальное моделирование проводилось с использованием двухкомпартментной модели с абсорбцией первого порядка с соответствующими распределениями случайных эффектов. Полная ковариантная модель из предыдущего анализа включала заранее определенные эффекты аллометрически взвешенного веса, TSAC и антител, нейтрализующих лекарственные средства (NAb), на CL; аллометрически взвешенный вес для V, V, и Q, а также размер производственной партии в качестве коварианта для F и k, так как были включены несколько размеров партии. Производственные партии для текущего анализа включали только размер партии 20К, поэтому наблюдаемая активность лекарственного вещества для каждой партии была также включена в модель как прямой фактор дозы, но это не было оцениваемым ковариантным эффектом. Типичные оценки (95% ДИ) параметров модели ФК для референтных ковариантных эффектов (70 кг, 1,7 моль/моль, отсутствие антител против лекарственного средства, размер партии 20K) составляли 17,9 (13,7, 23,4) л/день, 36,6 (0,876, 1530) л, 95,7 (18,5, 496) л, 3490 (6,47, 1,88e+06) л/день и 1,10 (0,603, 2,02) день, для CL/F, наблюдаемого (подкожного) центрального объема распределения (V/F ), наблюдаемого (подкожного) периферического объема распределения (V/F), наблюдаемого (подкожного) межкомпартментного клиренса (Q/F) и константы скорости поглощения однократной дозы (kaSD), соответственно. Эти результаты соответствовали результатам NCA и в определенной степени соответствовали результатам предыдущих анализов.
2
3
ср, сс
ср, сс
Влияние ковариантных факторов на ФК асфотазы альфа также были исследованы. Ожидаемое влияние ковариантов на CL/F, V/F, V/F и Q/F было проиллюстрировано путем расчета С при значениях, соответствующих каждому предиктору, который отличался от нулевого эффекта. Между экстремальными значениями массы тела (48,2 и 121,3 кг), TSAC (1,4 и 1,6 моль/моль) и в присутствием или отсутствием антител против лекарственного средства, прогнозируемое значение медианы С находилось в диапазоне от 1750 Ед/л до 2769 Ед/л, когда нормализованное значение для TSAC составляло 1,7. Необъяснимая случайная изменчивость (% КВ) была снижена для CL/F (коэффициент вариации 43,9% (КВ%)) в окончательной модели по сравнению с оценкой дисперсии базовой модели CL/F (48,8 КВ%). Клиническая значимость этого открытия заключается в том, что коррекция дозы для известных ковариантов не приведет к значительному снижению вариабельности ответа.
Конечная популяционная ФК модель обеспечило хорошее описание данных ФК. Критерии пригодности показали, что окончательная модель согласуется с наблюдаемыми данными и что не обнаружилось систематической ошибки. Результаты оценки модели предоставили доказательства того, что как компоненты с фиксированными, так и случайными эффектами конечной модели также отражали наблюдаемые данные.
ср, сс
ср, сс
Реакция нПФ в плазме, как правило, была выше при увеличении содержания асфотазы альфа в сыворотке, хотя в квартилях воздействия наблюдалось значительное наложение ответов. Частота этого ответа нПФ оказалась на плато до 66,7% при концентрациях выше медианы Сасфотазы альфа 2030 Ед/л, что указывает на то, что увеличение медианы Сболее 2030 Ед/л, по-видимому, не имеет дальнейшего влияния на увеличение частоты ответа нПФ.
беск
z
1/2
Параметры ФК асфотаза альфа были рассчитаны с использованием NCA и приведены в Таблице 18. Относительно длительный период полувыведения и частота дозирования приводили к заметному накоплению при всех уровнях дозы, однако AUC, CL/F, V/F , и t не были оценены в когорте 0,5 мг/кг из-за малого количества концентраций выше нижнего предела обнаружения.
Таблица 18. Сводная таблица параметров ФК NCA
Параметр
Асфотаза Альфа 0,5 мг/кг (N=8)
Асфотаза Альфа 2,0 мг/кг (N=10)
Асфотаза Альфа 3,0 мг/кг (N=9)
День 1
День 61
День 1
День 61
День 1
День 61
Cмакс (Ед/л)
218 (24,1)
743 (63,6)
617 (51,8)
1900 (53,6)
915 (35,3)
3600 (43,7)
Tмакс (день)
1,91 (0,485, 3,00)
0,747 (0,00, 2,46)
2,34 (1,49, 5,04)
1,16 (0,00, 2,49)
3,00 (1,50, 6,04)
0,990 (0,254, 1,33)
AUCпосл (Ед × день/л)
588 (77,0)
НО
3310 (60,6)
НО
5620 (63,3)
НО
AUCбеск (Ед × день/л)
НО
НО
5350 (45,6)
НО
9030 (40,3)
НО
t1/2 (день)
НО
5,12 (10,2)
3,66 (16,4)
4,62 (28,0)
4,69 (17,9)
5,54 (18,3)
λz (день-1)
НО
0,135 (10,2)
0,189 (16,4)
0,150 (28,0)
0,148 (17,9)
0,125 (18,3)
CL/F (Ед/л)
НО
НО
18,8 (37,2)
НО
22,1 (41,2)
НО
Vz/F (л)
НО
НО
99,1 (25,9)
НО
150 (36,2)
НО
C-R
НО
4,15 (35,3)
НО
3,14 (65,5)
НО
4,68 (33,6)
макс
Среднее геометрическое и геометрическое КВ% были получены для всех параметров, кроме t, где были указаны медиана и диапазон.
z
беск
посл
макс
1/2
макс
z
λ=концевая константа скорости выведения; AUC=площадь под кривой концентрация–время от нуля до бесконечности; AUC=площадь под кривой концентрация–время от времени ноль до времени последней наблюдаемой концентрации в интервале дозирования; CL/F=видимый клиренс после подкожного введения; C=максимальная концентрация в интервале дозирования; C-R=отношение концентрации через 48 часов после первой дозы к концентрации до введения дозы на 61 день после многократного дозирования; НО=не оценивается; t=конечный период полувыведения; t=время максимальной концентрации в интервале дозирования; V/F=видимый объем распределения после подкожного дозирования.
Графики накопления и графики средней концентрации асфотазы альфа в сыворотке в зависимости от времени продемонстрировали увеличение содержания в сыворотке при увеличении доз, хотя большая часть концентраций в когорте 0,5 мг/кг имела данные, которые были ниже предела количественного определения (BLQ) после введения дозы в 1-й День. Обширная индивидуальная изменчивость наблюдалась в профилях концентрации в зависимости от времени в каждой когорте, хотя все профили, по-видимому, демонстрировали моноэкспоненциальное снижение при наблюдении на полулогарифмическом графике.
макс
посл
беск
беск
z
½
z
½
макс
Показатели содержания в сыворотке (C, AUC, и AUC) увеличивались с увеличением дозы и между введением одной и нескольких доз. Из–за недостаточного количества концентраций выше нижнего предела обнаружения в когорте 0,5 мг/кг AUC, CL/F, V/F, и t не были оценены. Средние геометрические оценки CL/F и V/F составляли 18,8 л/день и 99,1 л для когорты 2,0 мг/кг, 22,1 л/день и 150 л для когорты 3,0 мг/кг соответственно. Показатели t имели средние геометрические значения в диапазоне от 3,66 до 5,54 дней. Показатели медианы t варьировались от 1,91 до 3,0 дней и от 0,747 до 1,16 дней в когортах с однократным и многократным дозированием соответственно.
Учитывая нерегулярное время между последовательными дозами (т.е. дозирование 3 раза в неделю приводит к 2 интервалам по 2 дня и 1 интервалу 3 дня в течение 7 дней), скорость накопления не может быть напрямую оценена стандартными способами. Аппроксимацию накопления при дозировании 3 раза в неделю оценивали путем расчета отношения концентрации через 48 часов после введения первой дозы к концентрации перед введением дозы в день 61 после многократного дозирования. Средние геометрические значения этих соотношений варьировались от 3,14 до 4,68 в 3 когортах. Полная популяционная модель ФК представлена в Таблице 19.
Таблица 19. Полная Модель: Популяционная Модель ФК 30502
Параметр ФК (Ед)
Параметр NONMEM
Показатель
95% ДИ
CL/F (л/день)
exp(θ1)
17,9
(13,7, 23,4)
V2/F (л)
exp(θ2)
36,6
(0,876, 1530)
V3/F (л)
exp(θ3)
95,7
(18,5, 496)
Q/F (л/день)
exp(θ4)
3490
(6,47, 1.88e+06)
kaСО (день-1)
exp(θ5)
1,10
(0,603, 2,02)
ALAG (день)
exp(θ6)
0,0771
(0/00939, 0,634)
kaмед (день-1)
exp(θ7)
2,09
(1,14, 3,82)
CL/F ~ Аллометрическая Экспонента
θ8
0,776 FIX
CL/F~ADA+/Nab-
exp(θ9)
1,11 FIX
CL/F~TSAC
θ10
-1,08 FIX
IIVvarCL/F (ω2CL/F)
Ω1,1(η1)
0,176 (%КВ=43.9)
(0,00, 0,472)
IIVcovCL/F, V2/F (ωCL/F, ωV2/F)
Ω2,1
0,0253
(-0,126, 0,176)
IIVvarV2/F (ω2V2/F)
Ω2,2(η2)
0,108 (%КВ=33.7)
(0,00, 1,13)
IIVcovCL/F, V3/F (ωCL/F, ωV3/F)
Ω3,1
0,229
(-0,00757, 0,465)
IIVcovV2/F, V3/F (ωV2/F, ωV3/F)
Ω3,2
-0,0295
(-0,502, 0,443)
IIVvarV3/F (ω3V3/F )
Ω3,3(η3)
0,405 (%КВ=70.6)
(0,00, 1,07)
IIVcovCL/F, ka (ωCL/F,ωka)
Ω4,1
0,101
(-0,118, 0,320)
IIVcovV2/F, ka (ωV2/F,ωka )
Ω4,2
0,175
(-0,527, 0,876)
IIVcovV3/F, ka (ωV3/F,ωka )
Ω4,3
0,104
(-0,136, 0,344)
IIVvar ka (ω4ka)
Ω4,4(η4)
0,372 (%КВ=67.1)
(0,00, 0,891)
Σ1.1,additive (ε1)
Σ1.1,additive (ε1)
0,0488 (СО=0,2221)
(0,0435, 0,0541)
95% ДИ, полученный из показателей стандартных ошибок, полученных на этапе NONMEM $COVARIANCE;
IIV=межиндивидуальная изменчивость, КВ=коэффициент вариации, СО=стандартное отклонение
-1
2
3
со
z
Популяционная ФК асфотазы альфа была описана у взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, с помощью двухкомпартментой модели с абсорбцией первого порядка со временем задержки абсорбции. Типичные показатели популяционных параметров (95% ДИ) 17,9 (13,7, 23,4) л/час, 36,6 (0,876, 1530) л, 95,7 (18,5, 496) л, 3490 (6,47, 1,88e+06) л/день и 1,10 (0,603, 2,02) день были оценены для CL/F, V/F, V/F, Q/F и ka соответственно. Показатели CL/F и V/F были согласованы между NCA и популяционным анализом.
2
3
a
Индивидуальные ковариантные факторы, которые предсказывали необъяснимую случайную изменчивость в популяции, включали эффекты аллометрически измеренного веса на CL/F, V/F, V/F и Q/F, а также влияние статуса антител и TSAC на CL/F. Эффект однократного введениря дозы относительно многократного введения дозы также учитывался для k.
ср, сс
Отношение популяционной ФКФД между содержанием асфотазы альфа в сыворотке и ответом нПФ было представлено в таблице квантилями предсказанных С и исследовано графически. Ответ нПФ в плазме, как правило, был выше при увеличении дозы и содержания асфотазы альфа в сыворотке, хотя в квартилях воздействия наблюдалось значительное наложение ответов (Фиг. 21 и Таблица 20).
ср, сс
Таблица 20. Ответ ФК-нПФ: Содержание в Сыворотке С (Ед/л) Относительно Изменения Ответа нПФ (мкМ) от Исходного Уровня в День Исследования 61
C<sub>сркв</sub> (Ед/л)
N
Среднее
Медиана
Мин
Макс
[253,935]
7
-2,44
-2,94
-5,64
0,192
(9,35, 2,03e+03]
7
-2,89
-2,35
-4,99
-0,938
(2,03e+03, 2,63e+03]
6
-4,14
-4,62
-5,46
-1,85
(2,63e+03, 6,8e+03]
7
-3,83
-3,64
-5,03
-2,87
ср, сс
ср, сс
N=количество пациентов, Cсркв=межквартильный интервал С в пределах которого были суммированы все изменения по сравнению с исходными данными нПФ, С=средняя концентрация асфотазы альфа в стационарном состоянии, рассчитанная с использованием индивидуальных эмпирических байесовских оценок CL=F и с учетом последних доз (единицы активности), вводимых каждому пациенту, которые вводили 3 раза в течение 7-дневного интервала дозирования.
ср, сс
Частота ответа нПФ находилась на плато до 66,7% при концентрациях выше медианы Сасфотазы альфа 2030 Ед/л (Таблица 21).
ср, сс
Таблица 21. нПФ <НПН по квартилям С: Частота нПФ < Нижнего Предела Нормы (1,33 мкМ) в День Исследования 61, по Квартилям Экспозиции
C<sub>сркв</sub> (Ед/л)
N
Частота (%)
[253,935]
7
0,0
(9,35, 2,03e+03]
7
14,3
(2,03e+03, 2,63e+03]
6
66,7
(2,63e+03, 6,8e+03]
7
66,7
ср, сс
ср, сс
N=количество пациентов, Cсркв=межквартильный интервал С в пределах которого были суммированы все изменения по сравнению с исходными данными нПФ, С=средняя концентрация асфотазы альфа в стационарном состоянии, рассчитанная с использованием индивидуальных эмпирических байесовских оценок CL=F и с учетом последних доз (единицы активности), вводимых каждому пациенту, которые вводили 3 раза в течение 7-дневного интервала дозирования. Частота, рассчитанная с использованием концентрации нПФ перед введением дозы в День Исследования 61.
ср, сс
Медиана прогнозируемого значения С для лечения 2 мг/кг × 3 дня/неделя у взрослых пациентов AA-HPP-208 (1810 Ед/л) приближается к этой пороговой концентрации, тогда как частота пациентов, достигших ответа нПФ (20%) согласуется с предыдущими прогнозами для группы взрослых (17,6%) при этой дозе. В совокупности эти результаты подтверждают схему дозирования 2 мг/кг × 3 дня в неделю у взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте.
Эти данные, полученные от взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, подтверждают эффективность схемы дозирования 2 мг/кг × 3 дня в неделю у пациентов подросткового возраста с ГФФ. Новые доступные данные о диапазоне доз и ФК/ФД из исследования AA-HPP-208 показывают эффективную дозировку у взрослых пациентов с ГФФ ≥ 18 лет, ранее неисследованной группы пациентов, и подтверждают, что взрослые пациенты с ГФФ, начавшейся в детском возрасте, получают пользу от лечения с помощью асфотазы альфа.
Кроме того, существуют значительные различия в способности подтверждать терапевтическую эффективность асфотазы альфа у пациентов детского возраста по сравнению со взрослыми пациентами с ГФФ, начавшейся в детском возрасте. Например, у пациентов детского возраста эффективность асфотазы альфа может быть определена с использованием рентгенографической шкалы изменений (RGI-C) для оценки скелетных изменений у пациентов детского возраста. Шкала RGI-C ограничена для применения при ГФФ, потому что ее можно применять для оценки только тех людей, у кого есть открытые пластинки роста костей (например, пациентов детского возраста). Следовательно, шкала RGI-C не может быть использована для оценки эффективности у взрослых пациентов с ГФФ, начавшейся в детском возрасте. Тем не менее результаты ФК/ФД/эффективности из исследования AA-HPP-208 подтверждают терапевтическую эффективность асфотазы альфа у этих взрослых пациентов.
Наконец, до исследования AA-HPP-208 не было данных о том, будет ли лечение асфотазой альфа хорошо переноситься взрослыми пациентами с ГФФ, начавшейся в детском возрасте. Эти данные подтверждают, что, хотя побочные эффекты лечения с помощью асфотазы альфа у детей отличаются от подростковой и взрослой группы пациентов, лечение с помощью асфотазы альфа хорошо переносится обеими группами с минимальными побочными эффектами.
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в вышеприведенном описании, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки в полном объеме. Различные модификации и вариации описанных способов, фармацевтических композиций и наборов согласно изобретению будут очевидны для специалистов в данной области техники, не выходя за пределы объема и сущности заявленного изобретения. Хотя раскрытие было описано в связи с конкретными вариантами реализации изобретения, следует понимать, что в него могут быть внесены дальнейшие модификации и что заявленное изобретение не должно ограничиваться такими конкретными вариантами реализации изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Alexion Pharmaceuticals, Inc.
<120>  СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ГИПОФОСФАТАЗИИ (ГФФ) У ВЗРОСЛЫХ И
ПОДРОСТКОВ
<130>  50694-069WO4
<150>  США 62/643,953
<151>  2018-03-16
<150>  США 62/502,255
<151>  2017-05-05
<150>  США 62/480,213
<151>  2017-03-31
<160>  20
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  726
<212>  Белок
<213>  Искусственная Последовательность
<220>
<223>  Синтетическая Конструкция
<400>  1
Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala
1               5                   10                  15
Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr Asn
20                  25                  30
Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser
35                  40                  45
Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro
50                  55                  60
Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala Leu
65                  70                  75                  80
Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr
85                  90                  95
Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val Gly
100                 105                 110
Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly Asn
115                 120                 125
Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser Val
130                 135                 140
Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala Ala
145                 150                 155                 160
Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met Pro
165                 170                 175
Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Met
180                 185                 190
His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys Tyr
195                 200                 205
Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu Lys
210                 215                 220
Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp Lys
225                 230                 235                 240
Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg Thr
245                 250                 255
Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly Leu
260                 265                 270
Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val Thr
275                 280                 285
Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu Arg
290                 295                 300
Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp
305                 310                 315                 320
His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala Val
325                 330                 335
Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser Glu
340                 345                 350
Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr Phe
355                 360                 365
Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Met
370                 375                 380
Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly Asn
385                 390                 395                 400
Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser Met
405                 410                 415
Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro Leu
420                 425                 430
Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys Gly
435                 440                 445
Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val Pro
450                 455                 460
His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His Cys
465                 470                 475                 480
Ala Pro Ala Ser Ser Leu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
485                 490                 495
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
500                 505                 510
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
515                 520                 525
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
530                 535                 540
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
545                 550                 555                 560
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
565                 570                 575
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
580                 585                 590
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
595                 600                 605
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
610                 615                 620
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
625                 630                 635                 640
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
645                 650                 655
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
660                 665                 670
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
675                 680                 685
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
690                 695                 700
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Ile Asp Asp Asp Asp
705                 710                 715                 720
Asp Asp Asp Asp Asp Asp
725
<210>  2
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20                  25                  30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu
305                 310                 315                 320
Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser
355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His
485                 490                 495
Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu
500                 505                 510
Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe
515                 520
<210>  3
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20                  25                  30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu
305                 310                 315                 320
Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser
355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His
485                 490                 495
Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu
500                 505                 510
Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe
515                 520
<210>  4
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20                  25                  30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu
305                 310                 315                 320
Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser
355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His
485                 490                 495
Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu
500                 505                 510
Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe
515                 520
<210>  5
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20                  25                  30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu
305                 310                 315                 320
Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser
355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His
485                 490                 495
Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu
500                 505                 510
Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe
515                 520
<210>  6
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20                  25                  30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu
305                 310                 315                 320
Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser
355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His
485                 490                 495
Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu
500                 505                 510
Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe
515                 520
<210>  7
<211>  652
<212>  Белок
<213>  Macaca mulatta
<400>  7
Met Pro Thr Val Lys Thr Lys Gln Glu Ser His Ala Gly Ser Gly Ser
1               5                   10                  15
Gly Pro Arg Leu Ala Glu Arg Lys Gly Arg Val Gly Ala Ala Arg Arg
20                  25                  30
Gln Ser Pro Arg Ala Pro Gly Gly Gly Leu Pro Gly Pro Arg Ser Gly
35                  40                  45
Pro Ala Ala Ala Phe Ile Arg Arg Arg Gly Arg Trp Pro Gly Pro Arg
50                  55                  60
Cys Ala Pro Ala Thr Pro Arg Pro Arg Ser Arg Leu Cys Ala Pro Thr
65                  70                  75                  80
Arg Leu Cys Leu Asp Glu Pro Ser Ser Val Leu Cys Ala Gly Leu Glu
85                  90                  95
His Gln Leu Thr Ser Asp His Cys Gln Pro Thr Pro Ser His Pro Arg
100                 105                 110
Arg Ser His Leu Trp Ala Ser Gly Ile Lys Gln Val Leu Gly Cys Thr
115                 120                 125
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
130                 135                 140
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
145                 150                 155                 160
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr
165                 170                 175
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
180                 185                 190
Ser Thr Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
195                 200                 205
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
210                 215                 220
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
225                 230                 235                 240
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
245                 250                 255
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
260                 265                 270
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
275                 280                 285
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
290                 295                 300
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
305                 310                 315                 320
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
325                 330                 335
Val His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
340                 345                 350
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ile Asp Glu
355                 360                 365
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asn Ile Trp
370                 375                 380
Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg
385                 390                 395                 400
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly
405                 410                 415
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Glu Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
420                 425                 430
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu
435                 440                 445
Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
450                 455                 460
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
465                 470                 475                 480
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Met Thr Ser Leu
485                 490                 495
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
500                 505                 510
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
515                 520                 525
Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
530                 535                 540
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
545                 550                 555                 560
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
565                 570                 575
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys
580                 585                 590
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile
595                 600                 605
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His
610                 615                 620
Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu
625                 630                 635                 640
Leu Pro Leu Ala Leu Phe Pro Leu Ser Ile Leu Phe
645                 650
<210>  8
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Rattus norvegicus
<400>  8
Met Ile Leu Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Pro Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Phe Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Ser Tyr Trp Arg Gln Gln
20                  25                  30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Asn Ala Leu Lys Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Ile Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Thr Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Thr Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Arg Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Lys Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Ile Ser Ile Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Ala Leu Asp Pro Ser Arg Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Leu
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Val Ala Leu Arg Ile Leu
305                 310                 315                 320
Thr Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Glu Ala Ile Gly Lys Ala Gly Thr Met Thr Ser Gln
355                 360                 365
Lys Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Asp Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ser Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His
485                 490                 495
Cys Ala Trp Ala Ser Ser Ala Ser Ser Pro Ser Pro Gly Ala Leu Leu
500                 505                 510
Leu Pro Leu Ala Leu Phe Pro Leu Arg Thr Leu Phe
515                 520
<210>  9
<211>  502
<212>  Белок
<213>  Canis lupus familiaris
<400>  9
Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala Gln Gln Thr Leu Lys
1               5                   10                  15
Tyr Ala Leu Arg Leu Gln Asn Leu Asn Thr Asn Val Ala Lys Asn Val
20                  25                  30
Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Thr
35                  40                  45
Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro Gly Glu Glu Thr Arg
50                  55                  60
Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala Thr Ala Tyr Leu
85                  90                  95
Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val Gly Val Ser Ala Ala Thr
100                 105                 110
Gln Arg Thr His Cys Asn Thr Thr Gln Gly Asn Glu Val Thr Ser Ile
115                 120                 125
Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser Val Gly Ile Val Thr Thr
130                 135                 140
Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala Ala Tyr Ala His Ser Ala
145                 150                 155                 160
Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met Pro Pro Glu Ala Leu Ser
165                 170                 175
Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Met His Asn Val Lys Asp
180                 185                 190
Ile Glu Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe Pro Lys Asn
195                 200                 205
Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Met Asp Glu Lys Ser Thr Gly Ala Arg
210                 215                 220
Leu Asp Gly Leu Asn Leu Ile Asp Ile Trp Lys Asn Phe Lys Pro Arg
225                 230                 235                 240
His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Leu Ala Leu
245                 250                 255
Asp Pro Tyr Thr Val Asp Tyr Leu Leu Gly Leu Phe Asp Pro Gly Asp
260                 265                 270
Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val Thr Asp Pro Ser Leu Ser
275                 280                 285
Glu Met Val Glu Ile Ala Ile Lys Ile Leu Ser Lys Lys Pro Arg Gly
290                 295                 300
Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His Glu
305                 310                 315                 320
Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala Val Glu Met Asp Arg Ala
325                 330                 335
Ile Gly Lys Ala Gly Val Met Thr Ser Leu Glu Asp Thr Leu Thr Val
340                 345                 350
Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr Phe Gly Gly Tyr Thr Pro
355                 360                 365
Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Met Val Ser Asp Thr Asp
370                 375                 380
Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser Met Val Asp Tyr Ala His
405                 410                 415
Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro Leu Arg His Glu Thr His
420                 425                 430
Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys Gly Pro Met Ala His Leu
435                 440                 445
Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile Pro His Val Met Ala Tyr
450                 455                 460
Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Gln Asp His Cys Ala Ser Ala Ser Ser
465                 470                 475                 480
Ala Gly Gly Pro Ser Pro Gly Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu
485                 490                 495
Pro Val Gly Ile Leu Phe
500
<210>  10
<211>  252
<212>  Белок
<213>  Sus scrofa
<400>  10
Ala Glu Leu Leu Ala Leu Asp Pro His Thr Val Asp Tyr Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
20                  25                  30
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Met Ala Ile Arg Ile Leu
35                  40                  45
Ile Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
50                  55                  60
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
65                  70                  75                  80
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Glu Gln Ala Gly Ser Met Thr Ser Val
85                  90                  95
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
100                 105                 110
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
115                 120                 125
Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
130                 135                 140
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
145                 150                 155                 160
Met Val Asp Tyr Ala His Asp Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
165                 170                 175
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Ile Phe Ala Arg
180                 185                 190
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile
195                 200                 205
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Val Gly Ala Asn Arg Asp His
210                 215                 220
Cys Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ser Pro Ser Pro Gly Pro Leu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Gly Ile Leu Phe
245                 250
<210>  11
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<400>  11
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Phe Val Pro Glu Lys Glu Arg Asp Pro Ser Tyr Trp Arg Gln Gln
20                  25                  30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Asn Ala Leu Lys Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Thr Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Thr Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Lys Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Ile Ser Ile Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Ala Leu Asp Pro Ser Arg Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Leu
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Val Ala Leu Arg Ile Leu
305                 310                 315                 320
Thr Lys Asn Leu Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Gln Ala Ile Gly Lys Ala Gly Ala Met Thr Ser Gln
355                 360                 365
Lys Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Asp Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ser Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His
485                 490                 495
Cys Ala Trp Ala Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ser Pro Gly Ala Leu Leu
500                 505                 510
Leu Pro Leu Ala Val Leu Ser Leu Arg Thr Leu Phe
515                 520
<210>  12
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Bos taurus
<400>  12
Met Ile Ser Pro Phe Leu Leu Leu Ala Ile Gly Thr Cys Phe Ala Ser
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20                  25                  30
Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn Ala Leu Arg Leu Gln Thr Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Ser
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Lys Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Tyr Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Gln Arg Ser Gln Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ser Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Lys Asp Ile Glu Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Phe Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asn Leu Ile Asp Ile Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Lys His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Asp Leu Leu Ala Leu Asp Pro His Ser Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Ala
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Met Ala Ile Arg Ile Leu
305                 310                 315                 320
Asn Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Gln Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ala Met Thr Ser Val
355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Arg Asp His
485                 490                 495
Cys Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ser Pro Ser Pro Gly Pro Leu Leu
500                 505                 510
Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Gly Ser Leu Phe
515                 520
<210>  13
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Bos taurus
<400>  13
Met Ile Ser Pro Phe Leu Leu Leu Ala Ile Gly Thr Cys Phe Ala Ser
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20                  25                  30
Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn Ala Leu Arg Leu Gln Thr Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Ser
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Lys Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Tyr Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Gln Arg Ser Gln Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ser Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Ile Lys Asp Ile Glu Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Phe Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asn Leu Ile Asp Ile Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Lys His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Asp Leu Leu Ala Leu Asp Pro His Ser Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Ala
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Met Ala Ile Arg Ile Leu
305                 310                 315                 320
Asn Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Gln Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ala Met Thr Ser Val
355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Arg Asp His
485                 490                 495
Cys Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ser Pro Ser Pro Gly Pro Leu Leu
500                 505                 510
Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Gly Ser Leu Phe
515                 520
<210>  14
<211>  124
<212>  Белок
<213>  Bos taurus
<400>  14
Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn Ala
1               5                   10                  15
Leu Gly Leu Gln Lys Leu Asn Thr Lys Val Ala Lys Asn Val Ile Leu
20                  25                  30
Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile
35                  40                  45
Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu
50                  55                  60
Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn
65                  70                  75                  80
Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala Pro His Pro Val Arg Val
85                  90                  95
Lys Ala Met Arg Ala Pro Trp Gly Glu Pro His Gln Arg Gln Cys Asn
100                 105                 110
Thr Arg Arg Ala Thr Ser Thr His Leu Leu Ala Gly
115                 120
<210>  15
<211>  524
<212>  Белок
<213>  Felis catus
<400>  15
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20                  25                  30
Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn Ala Leu Arg Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35                  40                  45
Asn Val Val Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50                  55                  60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65                  70                  75                  80
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Tyr Val Ala
85                  90                  95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100                 105                 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115                 120                 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Gln Arg Thr Gln Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130                 135                 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ser Gly Lys Ser
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165                 170                 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180                 185                 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195                 200                 205
Met His Asn Val Arg Asp Ile Glu Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Phe Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Met Asp Glu
225                 230                 235                 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asn Leu Val Asp Ile Trp
245                 250                 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro Tyr Gly Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275                 280                 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Ser Thr
290                 295                 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Ile Ala Ile Lys Ile Leu
305                 310                 315                 320
Ser Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325                 330                 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340                 345                 350
Val Glu Met Asp Gln Ala Ile Gly Arg Ala Gly Ala Met Thr Ser Val
355                 360                 365
Glu Asp Thr Leu Thr Ile Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370                 375                 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385                 390                 395                 400
Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ser Ile Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420                 425                 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys
450                 455                 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile
465                 470                 475                 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His
485                 490                 495
Cys Ala Ser Ala Ser Ser Ala Gly Gly Pro Ser Pro Gly Pro Leu Phe
500                 505                 510
Leu Leu Leu Ala Leu Pro Ser Leu Gly Ile Leu Phe
515                 520
<210>  16
<211>  532
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn
20                  25                  30
Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala
35                  40                  45
Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly
50                  55                  60
Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp
65                  70                  75                  80
Lys Leu Gly Pro Glu Thr Phe Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val
85                  90                  95
Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Ser Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly
100                 105                 110
Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr
115                 120                 125
Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg
130                 135                 140
Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala
165                 170                 175
Gly Ala Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp
180                 185                 190
Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln
195                 200                 205
Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr
225                 230                 235                 240
Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp
245                 250                 255
Leu Ala Lys His Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu
260                 265                 270
Leu Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe
275                 280                 285
Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp
290                 295                 300
Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ser Arg
305                 310                 315                 320
Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His
325                 330                 335
Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met
340                 345                 350
Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp
355                 360                 365
Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly
370                 375                 380
Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys
385                 390                 395                 400
Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro
405                 410                 415
Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu
420                 425                 430
Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Gly
435                 440                 445
Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln
450                 455                 460
Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val
465                 470                 475                 480
Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala
485                 490                 495
Pro Arg Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Pro Ser Val Val
500                 505                 510
Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Thr
515                 520                 525
Ala Thr Ala Pro
530
<210>  17
<211>  535
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Met Leu Gly Pro Cys Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg
1               5                   10                  15
Leu Gln Leu Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp
20                  25                  30
Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu
35                  40                  45
Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp
50                  55                  60
Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln
65                  70                  75                  80
Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe
85                  90                  95
Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro
100                 105                 110
Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn
115                 120                 125
Phe Gln Thr Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn
130                 135                 140
Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Lys Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala
165                 170                 175
Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser
180                 185                 190
Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile
195                 200                 205
Ala Thr Gln Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly
210                 215                 220
Gly Arg Lys Tyr Met Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro
225                 230                 235                 240
Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val
245                 250                 255
Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg
260                 265                 270
Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met
275                 280                 285
Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser
290                 295                 300
Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu
305                 310                 315                 320
Leu Ser Arg Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg
325                 330                 335
Ile Asp His Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu
340                 345                 350
Thr Ile Met Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser
355                 360                 365
Glu Glu Asp Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe
370                 375                 380
Ser Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala
385                 390                 395                 400
Pro Gly Lys Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly
405                 410                 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr
420                 425                 430
Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro
435                 440                 445
Leu Asp Glu Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg
450                 455                 460
Gly Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile
465                 470                 475                 480
Ala His Val Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys
485                 490                 495
Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Arg
500                 505                 510
Ser Val Val Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu
515                 520                 525
Leu Glu Thr Ala Thr Ala Pro
530                 535
<210>  18
<211>  532
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn
20                  25                  30
Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala
35                  40                  45
Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly
50                  55                  60
Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp
65                  70                  75                  80
Lys Leu Gly Pro Glu Thr Phe Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val
85                  90                  95
Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Ser Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly
100                 105                 110
Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr
115                 120                 125
Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg
130                 135                 140
Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala
165                 170                 175
Gly Ala Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp
180                 185                 190
Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln
195                 200                 205
Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr
225                 230                 235                 240
Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp
245                 250                 255
Leu Ala Lys His Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu
260                 265                 270
Leu Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe
275                 280                 285
Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp
290                 295                 300
Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ser Arg
305                 310                 315                 320
Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His
325                 330                 335
Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met
340                 345                 350
Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp
355                 360                 365
Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly
370                 375                 380
Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys
385                 390                 395                 400
Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro
405                 410                 415
Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu
420                 425                 430
Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Gly
435                 440                 445
Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln
450                 455                 460
Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val
465                 470                 475                 480
Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala
485                 490                 495
Pro Arg Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Pro Ser Val Val
500                 505                 510
Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Thr
515                 520                 525
Ala Thr Ala Pro
530
<210>  19
<211>  528
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu
1               5                   10                  15
Ser Leu Gly Val Ile Pro Ala Glu Glu Glu Asn Pro Ala Phe Trp Asn
20                  25                  30
Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile
35                  40                  45
Gln Lys Val Ala Lys Asn Leu Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Leu Gly
50                  55                  60
Val Pro Thr Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Asn Gly
65                  70                  75                  80
Lys Leu Gly Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Leu
85                  90                  95
Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp Ser Ala
100                 105                 110
Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Phe Gln Thr
115                 120                 125
Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg
130                 135                 140
Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Gln Ala Gly Lys
145                 150                 155                 160
Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala
165                 170                 175
Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp
180                 185                 190
Met Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln
195                 200                 205
Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys
210                 215                 220
Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Ala Asp Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gln Asn Gly Ile Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp
245                 250                 255
Leu Ala Lys His Gln Gly Ala Trp Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu
260                 265                 270
Met Gln Ala Ser Leu Asp Gln Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe
275                 280                 285
Glu Pro Gly Asp Thr Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Pro Thr Leu Asp
290                 295                 300
Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg
305                 310                 315                 320
Asn Pro Arg Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His
325                 330                 335
Gly His His Glu Gly Val Ala Tyr Gln Ala Leu Thr Glu Ala Val Met
340                 345                 350
Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp
355                 360                 365
Thr Leu Thr Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly
370                 375                 380
Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Ser Lys
385                 390                 395                 400
Ala Gln Asp Ser Lys Ala Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro
405                 410                 415
Gly Tyr Val Phe Asn Ser Gly Val Arg Pro Asp Val Asn Glu Ser Glu
420                 425                 430
Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Gln Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ser Ser
435                 440                 445
Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln
450                 455                 460
Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Ser Phe Val Ala His Val
465                 470                 475                 480
Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala
485                 490                 495
Pro Pro Ala Cys Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Val Ala Ala Ser Leu
500                 505                 510
Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ser Ala Ala Pro
515                 520                 525
<210>  20
<211>  227
<212>  Белок
<213>  Искусственная Последовательность
<220>
<223>  Синтетическая Конструкция
<400>  20
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210                 215                 220
Pro Gly Lys
225
<---