Протективное действие аутокринных факторов цитотоксических T-лимфоцитов в условиях химической гипоксии

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

as a novel placenta-derived hormone in humans. J. Clin. Endocrinol. 2003; ...(2): 914-9.

20. Muir A.I., Chamberlain L., Elshourbagy N.A. et al. AXOR12, a novel human G protein-coupled receptor, activated by the peptide KiSS-1. J. Biol. Chem. 2001; 276: 28969-75.

21. Selvaraj R.J., Sbarra A.J., Thomas G.B. et al. A microtechnique for studying chemiluminescence response of phago-

cytes using whole blood and its application to the evaluation of phagocytes in pregnancy. J. Reticuloendothel. Soc. 1982; 31: 3-16.

22. Stafford L.J., Xia C., Ma W. et al. Identification and characterization of mouse metastasis-suppressor KiSS1 and its G-protein-coupled receptor. Cancer Res. 2002; ...(19): 5399-404.

Поступила 11.03.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616-008.921-008.64-07:616.155.32

Г.В. Луценко, М.В. Гречихина, Л.Г. Дьячкова, А.М. Сапожников

протективное действие аутокринных факторов цитотоксических t-лимфоцитов в условиях химической гипоксии

ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, г Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10

Исследовали влияние аутокринных факторов клеток цитотоксической линии CTLL-2 на их жизнеспособность и энергетический метаболизм в условиях химической интоксикации, создаваемой с использованием азида натрия (NaN3) или хлорида кобальта (CoCl2). Показано, что аутокринные факторы, содержащиеся в 50% кондиционированной среде клеток CTLL-2, способны восстанавливать уровень АТФ в этих клетках, сниженный в условиях химической гипоксии, которая получена при их инкубации в течение 3 ч в присутствии 10 мМ NaN3 или 200 мкМ CoCl2. Результаты цитометрического анализа количества клеток CTLL-2, проведенного после 20 ч культивирования в условиях химической гипоксии (200 мкМ CoCl2), показали, что более 90% клеток подвергаются гибели по пути апоптоза или некроза. Добавление к клеткам 50% кондиционированной среды, богатой аутокринными факторами, снижало уровень погибших клеток до 10%. Сделан вывод о том, что аутокринные факторы цитотоксических клеток CTLL-2 в условиях химической гипоксии способны оказывать протективное действие на клетки за счет переключения энергетического метаболизма на анаэробный гликолиз.

Ключевые слова: аутокринные факторы, цитотоксические Т-лимфоциты, химическая гипоксия, апоптоз, некроз, проточная цитометрия

G.V Lutsenko, M.V Grechikhina, L.G. Diachkova, A.M. Sapozhnikov

PROTECTIVE ACTION OF AUTOCRINE FACTORS OF CYTOTOxIC T LYMPHOCYTES UNDER CHEMICAL hypoxia CONDITIONS

Federal State Budgetary Institution of Science “Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry”, Russian Academy of Sciences, 117997, Moscow, Russian Federation

The influence of autocrine factors of CTLL-2 cytotoxic cell line on cell viability and energy metabolism under chemical hypoxia conditions was investigated with using of sodium azide (NaN3) and cobalt chloride (CoCl2). Autocrine factors containing in 50% condition medium of CTLL-2 cells have been shown to restore ATP content in the cells depressed under chemical hypoxia conditions which were made by 3 hour incubation in the presence of 10 mM NaN3 or 200 mcM CoCl2. Flow cytometric analysis of CTLL-2 cells cultivated with CoCl2 for 20 hrs showed that more than 90% of the cells were dead (apoptotic or necrotic type of the cell death). The addition of 50% condition medium to the cell cultures decreased the percentage of dead cells after cultivation under chemical hypoxia conditions up to 10%. The conclusion was made that autocrine factors of CTLL-2 cytotoxic cells are able to protect the cells from hypoxia induced cell death by means of augmentation the rate of anaerobic glycolysis.

Key words: autocrine factors, cytotoxic T lymphocytes, chemical hypoxia, apoptosis, necrosis, flow cytometry

В многоклеточном организме выживание и энергетический метаболизм клеток находятся под контролем множества цитокинов и факторов роста. Так, известно, что интерлейкин (ИЛ)-3 может влиять на рост клеток и их выживание через свое действие на метаболизм глюкозы [1]. Наряду с пара-кринными факторами, которые клетка получает от клеток других типов, в контроле энергетического метаболизма и выживания клеток могут принимать участие аутокринные факторы, которые клетка секретирует сама и получает от клеток того же типа [2]. Ранее мы показали, что аутокринные факторы осуществляют контроль выживания Т-лимфоцитов через регуляцию уровня внутриклеточного АТФ [3].

Клетки иммунной системы при их миграции из кровяного русла в ткани организма переходят из области относительно высокого содержания кислорода (нормоксия) в область его

низкого содержания (гипоксия). Показано, что содержание кислорода в лимфоидных органах мыши составляет 0,54,5% при его содержании в атмосферном воздухе на уровне 20% [4]. В ряде патологических состояний наблюдается усиление гипоксии. Состояние повышенной гипоксии выявляют в злокачественных опухолях [5, 6], ранах кожных покровов [7], атероматозных бляшках [8], областях перелома кости [9], при низком артериальном давлении [10], в суставах при ревматоидном артрите [11]. Таким образом, активированные Т-лимфоциты при патологических состояниях организма часто функционируют в условиях повышенной гипоксии.

Механизмы поддержания энергетического метаболизма и сохранения жизнеспособности активированных Т-лим-фоцитов в условиях гипоксии представляют большой интерес. Данная работа посвящена исследованию протектив-

- 251 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013

ного действия аутокринных факторов на цитотоксические Т-клетки, культивируемые в условиях химической гипоксии. В качестве клеточной модели активированного цитотоксического Т-лимфоцита использовали клетки ИЛ-2-зависимой линии cTLL-2. Показано, что аутокринные факторы повышают уровень АТФ в клетках cTLL-2, сниженный при химической гипоксии, до нормальных значений и тем самым препятствуют их гибели по пути апоптоза и некроза.

Материалы и методы. Клетки ИЛ-2-зависимой линии cTLL-2 выращивали в среде RPMI-1640 (Sigma, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hy-clone, США), 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (Serva, Германия), 50 мкг/мл гентамицина и 50-100 ед/мл рекомбинантного ИЛ-2 («Биотех», Санкт-Петербург). Клетки культивировали в 1 мл среды в 24-луночных планшетах (Costar, США) при 37°С в атмосфере с 5% CO2. При проведении экспериментов использовали среду на основе среды RPMI-1640 с добавлением 1% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,5 мг/мл b-циклодекстрина (Sigma, США) [12], 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина и 100 ед/мл ИЛ-2.

Состояние химической гипоксии создавали с помощью внесения в среду для опытов 10 мМ азида натрия (NaN3) или 200 мкМ хлорида кобальта (CoCl2). Инкубацию клеток в условиях химической гипоксии проводили или в 96-луночных плоскодонных планшетах (Costar, США) в количестве 2,5-104 клеток/лунку в объеме 100 мкл или в 24-луночных планшетах (Costar, США) в количестве 1,5-105 клеток/лунку в объеме 1 мл.

В ряде экспериментов вместо свежей среды с клетками вносили кондиционированную среду из культур высокой плотности, обогащенную аутокринными факторами. Кондиционированную среду получали в виде надосадочной жидкости культур клеток CTLL-2 (1-106 клеток/мл), культивируемых в течение 24 ч в среде для экспериментов.

Содержание АТФ в клетках определяли люциферин-люциферазным методом с использованием стандартного набора для определения уровня АТФ (Sigma, США) на биолю-минометре «Triathler» (Hidex, Финляндия).

Регистрацию апоптоза и некроза проводили с использованием двойного окрашивания клеток аннексином V-ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат) и йодидом пропидия [13]. После отмывки в фосфатном буфере 1,5-105 клеток ресуспендировали в 100 мкл буфера (10 мМ HEPES/ NaOH pH 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2) и добавляли 2,3 мкг/мл аннексина V-ФИТЦ (Sigma, США) и 10 мкг/мл йодида пропидия (Sigma, США). Затем клетки инкубировали 15 мин при комнатной температуре, а по истечении этого времени добавляли к суспензии 400 мкл указанного выше буфера и проводили измерение на проточном цитофлюориметре «FACScan» (Becton Dickinson, США). В каждом образце анализировали не менее 10 000 клеток.

Для каждой экспериментальной точки сделали не менее трех повторов. Все опыты повторили не менее 3 раз. На всех рисунках указаны средние значения и стандартные ошибки. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали с помощью /-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Для исследования роли аутокринных факторов в процессе выживания Т-лимфоцитов в условиях химической гипоксии мы использовали среду с минимально возможным содержанием сыворотки, так как высокий уровень сывороточных факторов может маскировать действие аутокринных факторов. Таким минимально возможным содержанием сыворотки является 1%, эта концентрация сыворотки обеспечивает не только выживание клеток в культуре, но и их пролиферацию, однако только при условии добавления к среде RPMI-1640 в-циклодекстрина [12]. Это вещество связывает гидрофобные продукты метаболизма клеток, накапливающиеся при их культивировании, и, таким образом, выполняет одну из функций сыворотки. Среду с добавлением 1% эмбриональной сыворотки и в-циклодекстрина использовали во всех экспериментах данной работы.

а

40 -20 -

0 -1-1--1----1----г

0 12 3

б

Рис. 1. Уровень АТФ в клетках CTLL-2, которые инкубированы в условиях химической гипоксии, индуцированной с использованием 10 мМ NaN3 (а) или 200 мкМ CoCl2 (б).

По оси абсцисс - время (в ч) инкубации клеток; по оси ординат - уровень (в %)) АТФ в клетках. Кривая 1 - клетки инкубировали в свежей среде; кривая 2 - клетки инкубировали в 50% кондиционированной среде; кривая 3 (контроль) - клетки инкубировали в свежей среде без добавления NaN3.

Различия между данными кривых 1 и 2: * -p < 0,05; ** -p < 0,02; *** -

p < 0,0001.

В первой серии экспериментов мы провели оценку влияния, которое оказывает химическая гипоксия на энергетическое состояние клеток, и попытались выявить тот вклад, который ау-токринные факторы вносят в энергетический метаболизм. Для этого мы создавали состояние химической гипоксии, внося в культуру 10 мМ NaN3 [14], и определяли уровень АТФ в клетках CTLL-2 в результате ингибирования в них митохондриального дыхания. Известно, что NaN3 блокирует зависимые от кислорода шаги в энергетическом метаболизме клетки путем ингибирования цитохромоксидазы [15]. Инкубация клеток CTLL-2 в присутствии 10 мМ NaN3 приводила к значительному снижению уровня внутриклеточного АТФ, так что после 2 ч он составлял около 60% исходного уровня (рис. 1, а, кривая 1). Такое снижение связано с тем, что химическая гипоксия приводит к исключению окислительного фосфорилирования из энергетического метаболизма клеток, в результате чего единственным источником АТФ остается анаэробный гликолиз. Внесение в культуру 50% кондиционированной среды, богатой аутокринными факторами, восстанавливало уровень АТФ в клетках, который даже несколько превышал его исходное значение (рис. 1, а, кривая 2). Инкубация клеток в отсутствие NaN3 показала, что клетки в используемой среде сохраняют уровень внутриклеточного АТФ в течение всего времени эксперимента (рис. 1, а, кривая 3). Полученные данные указывают на то, что аутокринные факторы интенсифицируют гликолиз, что способствует сохранению нормального уровня АТФ в клетках CTLL-2 в условиях, исключающих дыхание клетки.

- 252 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Рис. 2. Двухпараметрические цитограммы флюоресценции клеток CTLL-2 в координатах аннексин v-ФИТЦ и йодид пропидия после их культивирования в отсутствие CoCl2 (а, б - контроль) или его присутствии (в, г), свежей среде (а, в) или 50% кондиционированной среде (б, г).

По оси абсцисс - флюоресценция (в отн. ед.) аннексина V-ФИТЦ; по оси ординат - флюоресценция (в отн. ед.) йодида пропидия. Контроль: клетки CTLL-2 культивировали в течение 20 ч в отсутствие CoCl2 в свежей среде (а) или 50% кондиционированной среде (б). Опыт: клетки CTLL-2 культивировали в течение 20 ч в присутствии 200 мкМ CoCl2 свежей среде (в) или 50% кондиционированной среде (г). Приведены данные одного из трех репрезентативных экспериментов.

Химическая гипоксия, получаемая с использованием NaN3, не может служить однозначной моделью гипоксии, хотя и способна отражать некоторые стороны этого состояния. Более адекватной моделью, имитирующей процессы, которые происходят при гипоксии, является химическая гипоксия, получаемая с использованием CoCl2. В присутствии иона Co2+ так же, как и при гипоксии, в клетке происходит активация транскрипционного фактора HIF-1 (hypoxia-inducible factor), которая сопровождается транскрипцией ряда генов, характерных для состояния гипоксии. Распознавание состояния гипоксии включает участие флавопротеина, содержащего ион железа в составе гема. Предполагается, что ионы кобальта и никеля замещают ион железа, который содержится в сенсорной молекуле флавопротеина, что запускает сигнальный каскад, приводящий к активации HIF-1 [16, 17].

При индукции химической гипоксии с использованием CoCl2 уровень АТФ в клетках CTLL-2 в первые часы снижался не так значительно, как в случае NaN3. К 3-му часу инкубации клеток в присутствии 200 мкМ CoCl2 уровень АТФ составлял 74,4% исходного значения. Однако по истечении 12 ч инкубации этот уровень снижался до 14% (рис. 1, б, кривая 1), что свидетельствует об исчерпании клетками основных запасов энергии. Внесение в культуру, содержащую CoCl2, 50% кондиционированной среды, как и в опытах с NaN3, приводило к восстановлению уровня АТФ в клетках CTLL-2 до нормальных значений (рис. 1, б, кривая 2). Таким образом, в обеих моделях химической гипоксии аутокринные факторы, присутствующие в кондиционированной среде, способствовали полному восстановлению сниженного уровня АТФ в клетках.

Известно, что пониженный уровень АТФ в клетках способен приводить к их гибели, причем показано, что концен-

трация АТФ является ключевым параметром при выборе пути гибели - апоптозе или некрозе [18]. В заключительной части данной работы мы провели оценку характера гибели клеток CTLL-2 при их культивировании в условиях химической гипоксии, индуцируемой в присутствии CoCl2, а также исследовали степень влияния аутокринных факторов на жизнеспособность клеток.

Главной особенностью некроза является потеря клетками целостности плазматической мембраны, в то время как для ранней стадии апоптоза характерна транслокация фос-фатидилсерина из внутреннего липидного слоя плазматической мембраны в ее внешний слой без разрушения мембраны [19]. Использование двойного окрашивания клеток посредством аннексина V-ФИТЦ (для обнаружения фосфа-тидилсерина на внешней стороне клеточной мембраны) и йодидом пропидия (для регистрации целостности клеток) позволяет с помощью проточной цитометрии отличить апоптоз исследуемых клеток от их некроза [13]. На двухпараметрической цитограмме аннексин V-ФИТЦ - йодид пропидия (рис. 2) зона апоптоза соответствует окрашиванию только аннексином V-ФИТЦ без окрашивания йодидом пропидия (4-й квадрант), а зона некроза - двойному окрашиванию (2-й квадрант).

Характер гибели клеток CTLL-2 в условиях химической гипоксии мы тестировали после их культивирования в течение 20 ч в присутствии 200 мкМ CoCl2 при начальной плотности культуры 1,5-105 клеток/мл. В качестве контроля использовали клетки, которые культивировали в отсутствие CoCl2 либо в свежей среде (рис. 2, а), либо в 50% кондиционированной среде (рис. 2, б). Доля живых клеток в 1-м контроле составила 85,4%, доля апоптозных и некрозных клеток - 9,7 и 4,8% соответственно. Повышенный уровень мертвых клеток в этом случае объясняется, по-видимому, тем, что в среде с 1% сыворотки содержится недостаточно факторов, необходимых для роста и выживания клеток. Добавление аутокринных факторов в составе 50% кондиционированной среды (2-й контроль) повышало долю живых клеток в культуре до 92,9% (рис. 2, б), снижая уровень мертвых клеток до приемлемых значений.

Культивирование клеток CTLL-2 в свежей среде в присутствии 200 мкМ CoCl2 в течение 20 ч приводило к значительному снижению (до 6,1%) доли живых клеток относительно контрольного уровня и возрастанию доли мертвых клеток: апоптозных - до 55,9%, а некрозных - до 37,8% (рис. 2, в). По-видимому, некроз, наблюдаемый в этом эксперименте, относится к вторичному типу, который следует за апоптозом в том случае, когда последний не способен завершиться вследствие недостатка энергии. В этом случае вторичный некроз наступает как заключительная неуправляемая стадия клеточной гибели [20].

Аутокринные факторы, вносимые вместе с 50% кондиционированной средой в культуру, оказывали очень значительное протективное действие на клетки CTLL-2, подвергнутые химической гипоксии, восстанавливая их жизнеспособность практически до 90% и снижая уровень мертвых клеток до 10,5% (рис. 2, г). Таким образом, аутокринные факторы цитотоксических клеток CTLL-2 в условиях химической гипоксии способны оказывать протективное действие на эти клетки за счет переключения энергетического метаболизма на анаэробный гликолиз, компенсируя тем самым дефицит внутриклеточного АТФ, образовавшийся при гипоксии и приводящий к гибели клеток по пути апоптоза и некроза.

Работа выполнена при финансовой поддержке программ «Молекулярная и клеточная биология» и «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов» президиума РАН.

ЛИТЕРАТУРА

3. Луценко Г.В., Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г. Регуляция уровня АТФ в нормальных и трансформированных Т-клетках ау-

токринными факторами. Иммунология. 2005; 26(2): 91-5.

- 253 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013

REFERENCES

1. Vander Heiden M.G., Plas D.R., Rathmell J.C. et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 5899-912.

2. Ishizaki Y., Burne J.F., Raff M.C. Autocrine signals enable chondrocytes to survive in culture. J. cell Biol. 1994; 126(4): 1069-77.

3. Lutsenko G.V., Grechikhina M.V., Diachkova L.G. ATP level regulation in normal and transformed T cells by autocrine factors. Immunologiya. 2005; 26(2): 91-5 (in Russian).

4. Caldwell C.C., Kojima H., Lukashev D. et al. Differential effects of physiologically relevant hypoxic conditions on T lymphocyte development and effector functions. J. Immunol. 2001; 167: 6140-9.

5. Vaupel P., Schlenger K., Knoop C. et al. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Res. 1991; 51: 3316-22.

6. Brown J.M., Giaccia A.J. Tumour hypoxia: the picture has changed in the 1990s. Int. J. Radiat. Biol. 1994; 65: 95-102.

7. Arnold F., West D., Kumar S. Wound healing: the effect of macrophage and tumour derived angiogenesis factors on skin graft vascularization. Br. J. Exp. Pathol. 1987; 68: 569-74.

8. Simanonok J.P. Non-ischemic hypoxia of the arterial wall is a primary cause of atherosclerosis. Med. Hypothes. 1996; 46: 155-61.

9. Ayala A., Ertel W., Chaudry I.H. Trauma-induced suppression of antigen presentation and expression of major histocompatibility class II antigen complex in leukocytes. Shock. 1996; 5: 79-90.

10. Ertel W., Singh G., Morrison M.H. et al. Chemically induced hypotension increases PGE2 release and depresses macrophage antigen presentation. Am. J. Physiol. 1993; 264: R655-60.

11. Mapp P.I., GrootveldM.C., Blake D.R. Hypoxia, oxidative stress and rheumatoid arthritis. Br. Med. Bull. 1995; 51: 419-36.

12. Ohmori H., Yamamoto I. beta-Cyclodextrin as a substitute for fetal calf serum in the primary antibody response in vitro. Eur. J. Immunol. 1987; 17: 79-83.

13. Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H. et al. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled an-nexin V J. Immunol. Meth. 1995; 184: 39-51.

14. Rose C.R., Waxman S.G., Ransom B.R. Effects of glucose deprivation, chemical hypoxia, and simulated ischemia on Na+ homeostasis in rat spinal cord astrocytes. J. Neurosci. 1998; 18(10): 3554-62.

15. De Vrij W., AzziA., Konings W.N. Structural and functional properties of cytochrome c oxidase from Bacillus subtilis W23. Eur. J. Biochem. 1983; 131: 97-103.

16. Zhu H., Bunn H.F. Oxygen sensing and signaling: impact on the regulation of physiologically important genes. Respir. Physiol. 1999; 115: 239-47.

17. SalnikowK., Su W., BlagosklonnyM.V. et al. Carcinogenic metals induce hypoxia-inducible factor-stimulated transcription by reactive oxygen species-independent mechanism. Cancer Res. 2000; 60: 3375-8.

18. Leist M., Single B., Casroldi A.F. et al. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J. Exp. Med. 1997; 185: 1481-6.

19. Martin S. J., Reutelingsperger C. P. M., McGahon A. J. et al. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J. Exp. Med. 1995; 182: 1545-56.

20. Darzynkiewicz Z., Juan G., LiX. et al. Cytometry in cell necrobi-ology: analysis of apoptosis and accidental cell death (necrosis). Cytometry. 1997; 27: 1-20.

Поступила 16.04.13

ИММУНОФАРМАКОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.2/.3.03:616.858-008.6].015.4

А.В. Таллерова, Е.А. Иванова, И.Г. Капица, Л.П. Коваленко, Е.А. Вальдман, Т.А. Воронина ВЛИЯНИЕ ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ГИМАНТАН НА УРОВЕНЬ

цитокинов в эксперименте

ФГБУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, 125315, г Москва

Известно, что воспаление способно провоцировать и усугублять развитие нейродегенеративных заболеваний. В посмертных образцах мозга пациентов с болезнью Паркинсона обнаруживают повышенный уровень провоспалительных цитокинов. При моделировании паркинсонического синдрома (ПС) у грызунов установлено, что введение токсинов, вирусных и бактериальных агентов в кору, гиппокамп, стриатум и черную субстанцию вызывает активацию микроглии, плотность которой в несколько раз больше в дофаминергических структурах мозга, что приводит к снижению концентрации дофамина в стриатуме и гибели дофаминергических нейронов. Данная работа посвящена изучению выраженности системной воспалительной реакции у крыс с двумя типами экспериментальной патологии - 6-гидроксидофамининдуцированным и липополисахаридиндуцированным ПС - и оценке влияния на нее нового противопаркинсонического препарата гимантан, а также исследованию действия препарата на острую воспалительную реакцию на модели конканавалин А-индуцированного отека у мышей.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, гимантан, воспаление, цитокины

Таллерова Анна Вадимовна (Tallerova Anna Vadimovna); Иванова Елена Анатольевна (Ivanova Elena Anatol’evna), iwanowaea@ yandex.ru; Капица Инга Геннадиевна (Kapitsa Inga Gennadievna); Коваленко Лариса Петровна (Kovalenko Larisa Petrovna); Вальдман Елена артуровна (Val’dman Elena Arturovna); воронина Татьяна александровна (Voronina Tatyana Aleksandrovna).

- 254 -