СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СОСТОЯНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ФАКТОРОМ, ИНДУЦИРУЕМЫМ ГИПОКСИЕЙ (HIF)
METHOD OF TREATING CONDITIONS ASSOCIATED WITH A FACTOR INDUCED BY HYPOXIA (HIF)

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам лечения состояний, связанных с фактором, индуцируемым гипоксией (HIF), и, в частности, способам лечения состояний, связанных с HIF, включающим введение композиции, содержащей трансферрины.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Защита клеток, в особенности нейронов, от повреждений, вызванных различными факторами, включая инсульт, нейродегенеративные заболевания, травматические повреждения и т.д., имеет важное значение для долгосрочного восстановления функции клеток или нейронов. Монотерапевтическое лечение поврежденных клеток или нейронов имеет определенные преимущества, но их часто недостаточно для мобилизации множества молекул, необходимой для полного восстановления функции.
Обычно считается, что физиологическая реакция защиты нейронов или других клеток от гипоксии или ишемических явлений, или от окисления опосредована экспрессией генов, стимулируемой посредством сигнального пути фактора, индуцируемого гипоксией (HIF), ключевого регуляторного пути, ответственного за клеточные повреждения. Считается, что стимуляция нейропротекторных молекул в головном мозге является важнейшим фактором защиты клеток от необратимого повреждения. Тем не менее, лишь некоторые из доступных препаратов в достаточной степени способны предотвращать, восстанавливать или уменьшать повреждения нейронов и других тканей. Кроме того, они часто являются токсичными и/или имеют короткий период полужизни. Например, в международной патентной заявке WO 2006/20727 предлагается применение дефероксамина в качестве нейропротекторного агента от вредного воздействия реперфузии, однако, при введении дефероксамина возникают проблемы из-за его ограниченного времени полужизни в плазме.
Трансферрины являются железосвязывающими гликопротеинами плазмы крови, контролирующими уровень свободного железа в биологических жидкостях. Трансферрины действуют как основные переносчики железа в кровотоке, где они присутствуют в форме апотрансферрина (ApoTf), не содержащего железа, моножелезистого трансферрина или двужелезистого голотрансферрина (HoloTf). Как правило, в кровотоке железо связано с 30% всех сайтов связывания трансферрина. Нейропротекторные функции ApoTf, но не HoloTf, описаны Chen-Roetling et al. (Chen-Roetling J., Chen L., and Regan R.F. Neuropharmacology, 2011; 60(2-3): 423-431), которые предполагают, что ApoTf может смягчить нейротоксичность гемоглобина после внутри мозгового кровоизлияния.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что можно усилить нейропротекторные свойства введения трансферрина у пациентов путем его комбинирования с другими железохелатирующими агентами или с другим железохелатирующим белком плазмы, например, аполактоферрином, который повышает уровень белка HIF-1α в некоторых тканях и оказывает влияние на уровень ЕРО в плазме (Zakharova E.T. et al. Biometals (2012) 25:1247-1259). Предполагается, что молекулы, способные к образованию хелатов с железом, являются активаторами пути HIF, блокирующими активность пролилгидроксилаз.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения состояний, связанных с фактором, индуцируемым гипоксией (HIF), включающему введение композиций, содержащих трансферрин. Настоящее изобретение также относится к способу лечения состояний, связанных с фактором, индуцируемым гипоксией (HIF), при этом вводимая композиция дополнительно содержит комбинацию трансферрина и хелатора железа.
В данном контексте, термин «трансферрин», в том числе во множественном числе, относится только к ApoTf или только к HoloTf, или к их смеси.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение дополнительно описано со ссылками на следующие чертежи, на которых:
На фигуре 1 показано, что композиции с преобладанием ApoTf и преобладанием HoloTf индуцируют белок HIF-1α в условиях нормоксии и гипоксии после 6-часовой обработки.
На фигуре 2 показано, что композиции с преобладанием ApoTf и преобладанием HoloTf индуцируют белок HIF-1α в условиях нормоксии после 24-часовой обработки.
На фигуре 3 показано, что смеси ApoTf и HoloTf индуцируют белок HIF-1α через 6 часов после обработки.
На фигуре 4А показаны уровни экспрессии мРНК Glut1 в условиях нормоксии и гипоксии в присутствии ЧСА, апотрансферрина или голотрансферрина.
На фигуре 4В показаны уровни экспрессии мРНК VEGF в условиях нормоксии и гипоксии в присутствии ЧСА, апотрансферрина или голотрансферрина.
На фигуре 5А показана токсичность композиций с преобладанием HoloTf или с преобладанием ApoTf in vitro или in vivo.
На фигуре 5В показаны модифицированный балльный показатель Бедерсона и общий поведенческий балльный показатель для крыс, внутривенно получавших препарат, преобладающей частью которого являлся ApoTf или HoloTf.
На фигуре 6А показан график разброса для объема инфаркта при лечении с применением ApoTf (385 мг/кг, в/в) или физиологического раствора на модели временной окклюзии средней мозговой артерии (СМАо) у крысы.
На фигуре 6В показаны фронтальные срезы типичных контрольных и обработанных ApoTf крыс, окрашенные хлоридом трифенилтетразолия (TTC).
На фигуре 7 показана защита нейронных клеток от токсического воздействия бета-амилоида (1-42) с применением смесей, в основном содержащих ApoTf и HoloTf.
На фигуре 8А показана обработка нейронных клеток SH-SY5Y с применением 4 мг/мл композиции с преобладанием ApoTf и комбинации с преобладанием ApoTf и DFO или IOX2.
На фигуре 8В показана обработка нейронных клеток SH-SY5Y с применением 4 мг/мл указанного белка и комбинации указанного белка и 10 мкМ М30.
На фигуре 8С показана обработка нейронных клеток SH-SY5Y с применением 4 мг/мл указанного белка и комбинации указанного белка и 200 мкМ DFO.
На фигуре 9А показаны уровни экспрессии мРНК Glut1 в ответ на комбинации с преобладанием апотрансферрина и DFO или IOX2.
На фигуре 9В показаны уровни экспрессии мРНК VEGF в ответ на комбинации с преобладанием комбинаций апотрансферрина и DFO или IOX2.
На фигуре 10А показаны уровни HIF-1α после обработки первичных клеток эпителия проксимальных канальцев почек человека (RPTEC) с применением композиций с преобладанием апотрансферрина, с преобладанием голотрансферрина в концентрации 4 мг/мл или различных смесей каждого из них в течение 6 ч при нормальном уровне кислорода.
На фигуре 10В показаны уровни HIF-1α после обработки первичных клеток эпителия коркового вещества (HRCE) с применением композиций с преобладанием апотрансферрина, с преобладанием голотрансферрина в концентрации 4 мг/мл или различных смесей каждого из них в течение 6 ч при нормальном уровне кислорода.
На фигуре 11А показана жизнеспособность первичных клеток эпителия проксимальных канальцев почек человека (RPTEC) или эпителия коркового вещества (HRCE) при обработке с применением композиции с преобладанием ApoTf или DFO в течение 48 часов.
На фигуре 11В показана жизнеспособность клеток RPTEC или HRCE при обработке в течение 72 ч с применением 4 мг/мл композиции с преобладанием ApoTf, HoloTf, смесей трансферринов.
На фигуре 12 показана активация каспазы 3/7 внутри первичных клеток почки человека в присутствии композиции с преобладанием ApoTf или DFO.
На фигуре 13А показаны уровни HIF-1α после обработки линии клеток легкого NCI-H1650 с применением композиций с преобладанием апотрансферрина, с преобладанием голотрансферрина или pd-трансферрина в концентрации 4 мг/мл в течение 6 ч при нормальном уровне кислорода.
На фигуре 13В показаны уровни HIF-1α после обработки первичных гепатоцитов с применением композиций с преобладанием апотрансферрина, с преобладанием голотрансферрина или pd-трансферрина в концентрации 4 мг/мл в течение 6 ч при нормальном уровне кислорода.
На фигуре 14А показана жизнеспособность линии клеток легкого человека NCI-H1650 при обработке в течение 72 ч с применением 4 мг/мл композиции с преобладанием ApoTf, с преобладанием HoloTf или pd-трансферринов.
На фигуре 14В показана жизнеспособность первичных гепатоцитов человека при обработке в течение 72 ч с применением 4 мг/мл композиции с преобладанием ApoTf, с преобладанием HoloTf или pd-трансферринов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения состояний, связанных с фактором, индуцируемым гипоксией (HIF), включающему введение композиций, содержащих трансферрин. Предпочтительно трансферрин является рекомбинантным, полученным из плазмы или химически синтезированным трансферрином.
Если трансферрин является рекомбинантным, его можно получить посредством любой методики, известной в области экспрессии, продукции и очистки белка. Например, нуклеотидную последовательность трансферрина можно включить в любой вектор, подходящий для экспрессии в выбранной клетке-хозяине, например, бактериальной (Escherichia coli, Bacilus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus), дрожжевой (роды Saccharomyces, Pichia или Kuyveromyces), клетке насекомого (Bombyx mori, Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni или Drosophila melanogaster) или клетке млекопитающего (клетки HeLa, клетки почки детеныша хомяка (BHK), клетки почки обезьяны (COS-1), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки, трансформированые аденовирусом человека 293, клетки мыши L-929, клетки линий хомяка HaK, клетки мыши 3Т3, полученные из мышей Swiss, Balb-c или NIH, клетки линии CV-1, линии клеток, полученные от in vitro культуры первичной ткани или первичных эксплантов).
Предполагается, что трансферрины, полученные из плазмы, выделены из подходящей фракции плазмы. В предпочтительном варианте воплощения изобретения трансферрин выделен из фракции IV и наиболее предпочтительно он выделен из фракции IV-I или фракции IV-IV при фракционировании по Кону. В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения трансферрин получают из фракции отходов при применении способа очистки ингибитора альфагпротеиназы (A1PI). Предпочтительно указанный способ очистки осуществляют путем:
(1) удаления части загрязняющих белков из водного раствора осаждением с целью получения очищенного раствора, содержащего A1PI;
(2) пропускания очищенного раствора через анионообменную смолу, так что A1PI связывается с анионообменной смолой;
(3) элюирования A1PI с анионообменной смолы с целью получения элюированного раствора, содержащего A1PI;
(4) пропускания элюированного раствора через катионообменную смолу;
(5) сбора раствора, содержащего A1PI, после его прохождения через катионообменную смолу; и
(6) приведения элюированного раствора этапа (в) или фильтрата этапа (д) в контакт с гидрофобным адсорбентом по меньшей мере одной среды HIC.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения изобретения вышеупомянутый водный раствор, используемый в способе очистки (A1PI), является кровью, плазмой или фракциями, полученными из плазмы.
В дополнительном варианте воплощения изобретения трансферрин содержит по меньшей мере одну посттрансляционную модификацию, предпочтительно - пэгилирование, гликозилирование, полисиалилирование или их комбинацию.
В одном варианте воплощения изобретения трансферрин, используемый в способе лечения согласно настоящему изобретению, является полноразмерным трансферрином с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1 (Human Transferrin, Sequence Reference: GENBANK ACCESSION AAB22049, АВТОРЫ: Hershberger, C.L., Larson, J.L., Arnold, В., Rosteck, P.R. Jr., Williams, P., DeHoff, B., Dunn, P., O'Neal, K.L., Riemen, M.W., Tice, P.A. et al. НАЗВАНИЕ: A cloned gene for human transferrin, ЖУРНАЛ: Ann. N.Y. Acad. Sci. 646, 140-154 (1991)). Дополнительные варианты воплощения изобретения охватывают применение в способе лечения согласно настоящему изобретению производных трансферрина, обладающих по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологией или сходством с SEQ ID NO: 1 при условии сохранения 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% железохелатирующей активности трансферрина дикого типа. Специалист в данной области техники должен понимать, что различия в гомологии между трансферрином и аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 могут быть обусловлены консервативными и/или неконсервативными аминокислотными заменами, не влияющими на железохелатирующую функцию.
В еще одном варианте воплощения изобретения рассматривается применение фрагмента трансферрина дикого типа (SEQ ID NO: 1) в способе лечения согласно настоящему изобретению. Специалист в данной области техники может легко выбрать подходящий фрагмент трансферрина дикого типа таким образом, чтобы он сохранял способность трансферрина дикого типа образовывать хелаты с железом.
В дополнительном варианте воплощения изобретения трансферрин модифицирован с целью повышения его сродства связывания с железом. Специалист в данной области техники должен учитывать, что подвергающиеся модификации остатки или области можно определить с помощью нескольких методик, известных в данной области техники, например, сайт-специфического мутагенеза, аланинового скрининга, кристаллографии или анализа делеций и/или инсерций.
Рассматривают вариант, в котором трансферрин, применяемый в способе лечения согласно настоящему изобретению, находится в форме белкового конъюгата или гибридного белка с целью, например, увеличения его времени полужизни в крови, при этом трансферрин конъюгирован или слит с любым другим белком, фрагментом белка, доменом белка или пептидом. В предпочтительном варианте воплощения изобретения трансферрин конъюгирован или слит с полноразмерным белком, фрагментом, доменом или пептидом сывороточных альбуминов (например, бычьего, кроличьего или человеческого), гемоцианином лимфы улитки, иммуноглобулиновыми молекулами (в том числе Fc-доменом иммуноглобулинов), тиреоглобулином, овальбумином, столбнячным анатоксином или анатоксинами других патогенных бактерий, например, возбудителей дифтерии, Е. coli, холеры или Н. pylori, или ослабленным производным токсина, цитокинами, хемокинами, глюкагон-подобным пептидом-1, эксендином-4 или XTEN.
Трансферрин, применяемый в способе согласно настоящему изобретению, может являться только Holo-Tf, только Apo-Tf или смесью ApoTf и HoloTf. В предпочтительном варианте воплощения изобретения трансферрин, применяемый в способе согласно настоящему изобретению, является смесью ApoTf и HoloTf, и, предпочтительно, указанная смесь характеризуется процентным соотношением между 99:1 и 70:30 (ApoTf : HoloTf); более предпочтительно указанная смесь характеризуется пропорцией или процентным соотношением, сопоставимым с фракцией, получаемой или выделяемой из биологических жидкостей. В наиболее предпочтительном варианте воплощения изобретения смесь ApoTf и HoloTf, применяемая в способе согласно настоящему изобретению, характеризуется пропорцией или процентным соотношением ApoTf и HoloTf, аналогичным пропорции или процентному соотношению ApoTf и HoloTf в крови или плазме человека.
В способе согласно настоящему изобретению композиция может дополнительно содержать хелатор железа. В предпочтительном варианте воплощения изобретения хелатор железа выбран из группы, содержащей М30, дефероксамин (DFO), деферазирокс, деферипрон, деферитрин, L1NA11, СР363, СР502, IOX2, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) или их комбинации. В наиболее предпочтительном варианте воплощения изобретения хелатор железа является дефероксамином (DFO).
В способе согласно настоящему изобретению лечение состояний, связанных с фактором, индуцируемым гипоксией (HIF), включает обработку органов с применением композиции, содержащей трансферрин, в рамках подготовки к трансплантации в организм человека. В предпочтительном варианте воплощения изобретения органы выбирают из группы, содержащей почку, печень, легкое и сердце.
Кроме того, в способе согласно настоящему изобретению лечение состояний, связанных с фактором, индуцируемым гипоксией (HIF), включает введение композиции, содержащей трансферрин, в трансплантат органа реципиента до или после трансплантации. В предпочтительном варианте воплощения изобретения способ согласно настоящему изобретению включает введение композиции, содержащей трансферрин, в трансплантат органа реципиента до или после трансплантации, причем трансплантаты органов ранее обрабатывали композицией, содержащей трансферрин, в рамках подготовки к трансплантации в организм человека.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения состояния, связанного с фактором, индуцируемым гипоксией (HIF), причем указанное состояние включает лечение ишемии у человека, включающее введение композиции, содержащей трансферрин, указанному человеку. В предпочтительном варианте воплощения изобретения указанная ишемия обусловлена остановкой сердца, тромботическими сгустками, травматическим повреждением или инсультом.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения состояния, связанного с фактором, индуцируемым гипоксией (HIF), причем указанное лечение является предоперационным введением пациенту-человеку в случаях, когда наблюдается или ожидается ишемия или кислородное голодание тканей/органов.
Хотя изобретение будет описано в следующих примерах в связи с некоторыми предпочтительными вариантами воплощения изобретения с целью лучшего понимания и оценки его аспектов, не следует считать, что изобретение ограничивается данными конкретными вариантами воплощения изобретения. Напротив, подразумевается, что изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в рамки изобретения, как определяется прилагаемой формулой изобретения. Таким образом, следующие примеры, включающие предпочтительные варианты воплощения изобретения, должны использоваться для иллюстрации практической реализации настоящего изобретения; следует понимать, что показанные подробности приведены лишь в качестве примера и для целей иллюстративного обсуждения предпочтительных вариантов воплощения настоящего изобретения и представлены как пример описания процедур составления, считающегося наиболее полезным и понятным, а также принципов и концептуальных аспектов настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Эксперименты, проводившиеся в следующих примерах, выполняли с применением трансферрина, содержавшего апо- или голо-формы. Тестировали различные смеси трансферрина; относительное процентное содержание ApoTf и HoloTf, включая смеси с преобладанием ApoTf, с преобладанием HoloTf, pdTf и конкретно определенные смеси трансферрина, представлено ниже в таблице 1.
Пример 1. Композиции с преобладанием ApoTf и преобладанием HoloTf индуцировали белок HIF-1α в условиях нормоксии и гипоксии после 6-часовой обработки.
Клетки линии нейробластомы человека SH-SY5Y, культивируемые в бессывороточных средах, обрабатывали ApoTf и HoloTf, полученными из плазмы (в обоих случаях в концентрации 1 мг/мл и 4 мг/мл), в течение 6 часов в условиях нормоксии (21% кислорода) и гипоксии (1% кислорода). В качестве контроля использовали необработанные клетки или клетки, обработанные человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) в концентрации 1 мг/мл или 4 мг/мл. Через 6 ч собирали внутриклеточные белки и анализировали уровень белка HIF-1α с помощью твердофазного ИФА.
Как показано на фигуре 1, в условиях как нормоксии, так и гипоксии для обеих протестированных концентраций ApoTf происходило существенное повышение уровня клеточного белка HIF-1α. Касательно HoloTf, существенное повышение уровня клеточного белка HIF-1α наблюдали в условиях как нормоксии, так и гипоксии при обработке клеток в концентрации 1 мг/мл и в условиях нормоксии при обработке клеток в концентрации 4 мг/мл. При обработке клеток HoloTf в концентрации 4 мг/мл наблюдали тенденцию к повышению уровня клеточного белка HIF-1α.
Пример 2. Композиции с преобладанием ApoTf и преобладанием HoloTf индуцировали белок HIF-1α в условиях нормоксии после 24-часовой обработки.
Эксперименты, проводившиеся в примере 1, повторили, но теперь выполняя обработку в течение 24 часов и только в условиях нормоксии. Через 24 ч собирали внутриклеточные белки и анализировали уровень белка HIF-1α с помощью твердофазного ИФА. На Фигуре 2 показаны результаты данного эксперимента. Как показано на указанной фигуре, ApoTf повышает уровень клеточного белка HIF-1α в обеих протестированных концентрациях. Для HoloTf наблюдали существенное повышение уровня клеточного белка HIF-1α при обработке концентрацией 4 мг/мл, а тенденцию к повышению уровня указанного белка наблюдали при концентрации 1 мг/мл.
Пример 3. Смеси ApoTf и HoloTf индуцировали белок HIF-1α после 6-часовой обработки.
Через 6 ч собирали внутриклеточные белки и анализировали уровень белка HIF-1α с помощью твердофазного ИФА. Как показано на фигуре 3, после 6-часовой обработки композицией с преобладанием ApoTf плазмы, композицией с преобладанием HoloTf плазмы или их смесями наблюдали повышение уровня клеточного белка HIF-1α в условиях нормоксии. Кроме того, как можно видеть на данной фигуре, все смеси ApoTf и HoloTf стимулировали экспрессию белка HIF-1α в нейронных клетках SH-SY5Y.
Пример 4. Уровни экспрессии мРНК Glut1 и VEGF в условиях нормоксии и гипоксии в присутствии ЧСА, апотрансферрина или голотрансферрина.
Стабилизация и повышение уровня белка HIF-1α обычно ведет к стимуляции генов, связанных с HIF (к усилению транскрипции генов-мишеней HIF), т.е. генов, области регуляции транскрипции которых имеют сайты связывания HIF. Два хорошо изученных гена, активируемых белком HIF-1α, представляют собой рецептор Glut1 и VEGF. Таким образом, с целью анализа изменений экспрессии мРНК каждого из генов-мишеней HIF клетки линии SH-SY5Y культивировали и обрабатывали композициями с преобладанием ApoTf или с преобладанием HoloTf в концентрации 1 мг/мл и 4 мг/мл в условиях нормоксии (21% кислорода) или гипоксии (1% кислорода) в течение 6 часов. В качестве отрицательного контроля клетки обрабатывали ЧСА (1 мг/мл или 4 мг/мл) или оставляли без обработки. Через 6 ч собирали внутриклеточную мРНК и анализировали уровень экспрессии Glut1 и VEGF посредством количественной ПЦР. Результаты экспрессии рассчитывали по отношению к экспрессии соответствующего транскрипта, наблюдаемой в необработанных клетках. На фигурах 4А и 4B показаны результаты экспрессии, полученные для рецептора Glut1 и VEGF, соответственно. Значения на фигурах показаны в виде относительной экспрессии генов, причем ген-мишень (Glut1 или VEGF) нормировали по экспрессии конститутивного гена (бета-актина). Как напрямую следует из указанных фигур, в условиях гипоксии экспрессия Glut1 (фиг. 4А) и VEGF (фиг. 4B) существенно усиливалась при обработке апотрансферрином по сравнению с контролем (ЧСА). Интересно, что в условиях нормоксии голотрансферрин, но не апотрансферрин, повышал экспрессию только Glut1.
Пример 5. Смеси ApoTf и HoloTf не проявляли токсического действия in vitro или in vivo.
Хотя сообщалось, что HoloTf является токсичным для клеток in vivo и in vitro, токсичность различных композиций с преобладанием ApoTf, с преобладанием HoloTf или смесей ApoTf + HoloTf тестировали в клетках SH-SY5Y. Клетки SH-SY5Y обрабатывали указанными концентрациями 4 мг/мл Tf (как показано на фигуре 5А), М30 или DFO в течение 72 часов. Через 72 часа клетки подвергали анализу жизнеспособности Cell Titer Glow. Контрольные необработанные клетки считали 100% жизнеспособными. Средняя жизнеспособность и стандартные отклонения показаны для каждого условия обработки. Токсического влияния не наблюдали при применении любой композиции с преобладанием ApoTf и, как ни странно, не наблюдали токсичности или вредоносного влияния композиций с преобладанием HoloTf.
Интересно, что ни композиции с преобладанием ApoTf, ни композиции с преобладанием HoloTf не демонстрировали существенного различия по указанным поведенческим критериям, что свидетельствует об отсутствии вредоносного влияния HoloTf in vivo. На фигуре 5В показаны модифицированный балльный показатель Бедерсона и общий поведенческий балльный показатель для крыс, внутривенно получавших препарат, преобладающей частью которого являлся ApoTf или HoloTf. Неврологические функции in vivo оценивали посредством модифицированного балльного показателя Бедерсона (Bederson et al., 1986b; Crumrine et al., 2011) с использованием следующих определений:
0 баллов: явные неврологические нарушения отсутствуют;
1 балл: присутствует перекручивание тела;
2 балла: перекручивание тела со слабостью правой стороны;
3 балла: перекручивание тела, слабость правой стороны и вращательное поведение; и
4 балла: судорожная активность.
Общие поведенческие балльные показатели крыс разработаны персоналом CALS с целью мониторинга восстановления животных после хирургических процедур (стандартный для CALS послеоперационный уход). Численное значение присваивалось при наблюдении заранее заданного поведения.
0 баллов: поведение согласуется с поведением здоровой наивной крысы (т.е. ипсилатеральные нарушения отсутствуют);
1 балл: оживленное/активное поведение/быстрая реакция; крыса спонтанно двигается и исследует свою клетку, реагирует на внешние раздражители, исследует верхнюю часть клетки;
2 балла: смирное/настороженное поведение/быстрая реакция; сдержанное поведение, однако реагирует на внешние раздражители, не стремится вставать на задние лапы или исследовать верхнюю часть клетки;
3 балла: подавленное поведение: не стремится двигаться, если не понукают, быстро возвращается в сонливое состояние, практически не интересуется внешними раздражителями;
4 балла: отсутствие реакции: остается в положении лежа даже при понукании; и
5 баллов: судорожная активность, требующая эвтаназии.
Пример 6. Трансферрин защищает клетки in vivo.
Модель инсульта головного мозга у крысы за счет МСАо (окклюзии средней мозговой артерии) использовали для оценки защиты клеток с помощью трансферрина. Инсульт хирургически вызывали у 16 крыс посредством методики МСАо. 8 крыс лечили с помощью инъекции физиологического раствора в головной мозг, а других 8 крыс лечили инъекцией ApoTf в головной мозг. На фигурах 6А и 6В показано, что у крыс, получавших смесь с преобладанием ApoTf, наблюдалось значительное снижение объема области, пораженной инфарктом, по сравнению с контрольными крысами (получавшими физиологический раствор). На фигуре 6А показан точечный график объема области, пораженной инфарктом, при лечении с применением ApoTf (385 мг/кг, в/в) или физиологического раствора при временной МСАо, а на фигуре 6В показаны фронтальные срезы типичных контрольных крыс и крыс, получавших ApoTf, окрашенные TTC.
Пример 7. ApoTf и HoloTf защищают SH-SY5Y от токсичности бета-амилоида 1-42.
Известно, что стимуляция пути HIF играет защитную роль при ряде нейродегенеративных заболеваний, в том числе патологий, приводящих к разрушению нервных клеток и нейронов. Поскольку обработка SH-SY5Y стимулирует HIF, обработка клеток апо- или голотрансферрином должна обеспечивать защитное действие для клеток, подвергавшихся действию веществ, заведомо вызывающих нейродегенерацию. На фигуре 7 представлены данные, позволяющие оценить, способны ли композиции с преобладанием апо- и голотрансферрина защитить клетки SH-SY5Y от токсического воздействия известного нейродегенеративного токсина - олигомеризованного пептида бета-амилоида 1-42 (фигура 7). Нейронные клетки SH-SY5Y, культивируемые в питательной среде, обрабатывали 4 мг/мл апотрансферрина или голотрансферрина в течение 24 часов при нормальном уровне кислорода. Через 24 часа клетки обрабатывали олигомеризованным пептидом бета-амилоида 1-42 в течение дополнительных 72 часов. После обработки с применением олигомеризованного бета-амилоида 1-42 клетки подвергали анализу активации каспазы 3/7 (ApoGlo). Контрольные необработанные клетки принимали за нормированное значение, равное 1. Средняя степень индукции каспазы по сравнению с контрольными клетками и стандартные отклонения показаны для каждого условия обработки. Интересно, что эти данные показывают, что композиции с преобладанием ApoTf и HoloTf защищают клетки SH-SY5Y от токсического действия бета-амилоида. Указанные данные также подтверждают отсутствие собственной токсичности у ApoTf или HoloTf.
Пример 8. Синергетический эффект низкомолекулярных активаторов HIF и смесей ApoTf/HoloTf.
2
Трансферрин может действовать синергически с другими низкомолекулярными активаторами HIF, например, другими хелаторами желаза или ингибиторами ферментов. Это может обеспечить возможность введения пониженного количества указанных низкомолекулярных соединений, что ослабляет побочные эффекты, сохраняя при этом высокий терапевтический уровень. Чтобы определить возможность усиления эффективности хелатора железа с помощью апотрансферрина, DFO и phd2-ингибитора IOX2, нейронные клетки SH-SY5Y, культивируемые в бессывороточной среде, обрабатывали с применением 4 мг/мл указанных белков в присутствии или в отсутствие низкомолекулярных лекарственных средств при нормальном уровне кислорода. Результаты этого эксперимента показаны на Фигурах 8А, 8В и 8С. Данные, показанные на фигуре 8А, относятся к обработке клеток с применением комбинации DFO или IOX2 в указанных концентрациях и 4 мг/мл белка. CoCl использовали в качестве экспериментального положительного контроля. Данные, показанные на фигуре 8В, относятся к обработке клеток с применением комбинации 10 мкМ М30 с или без 4 мг/мл белка. Данные, показанные на фигуре 8С, относятся к обработке клеток с применением комбинации 200 мкМ DFO с или без 4 мг/мл белка. Через 6 ч собирали внутриклеточные белки и анализировали уровень белка HIF-1α с помощью твердофазного ИФА. Данные приведены в пг/мл с указанием стандартного отклонения.
Пример 9. Уровни экспрессии мРНК Glut1 и VEGF в ответ на комбинации композиций с преобладанием апотрансферрина и DFO или IOX2.
В дополнение определили уровни экспрессии мРНК Glut1 и VEGF в ответ на комбинации композиций с преобладанием апотрансферрина и DFO или IOX2. Нейронные клетки SH-SY5Y, культивируемые в бессывороточной среде, обрабатывали 4 мг/мл человеческого сывороточного альбумина или композиции с преобладанием апотрансферрина при нормальном уровне кислорода. Где это указано, совместно с ЧСА и композицией с преобладанием апотрансферрина применяли 200 мкМ DFO или 1 мкМ IOX2. После 6-часовой обработки собирали внутриклеточную мРНК и анализировали уровень экспрессии Glut1 и VEGF посредством количественной ПЦР. Значения показаны в виде относительной экспрессии генов, причем ген-мишень (Glut1 или VEGF) нормировали по экспрессии конститутивного гена (бета-актина). Показаны стандартные отклонения. На фигурах 9А и 9В показано, что уровни мРНК Glut1 и VEGF повышались синергетически и аддитивно при добавлении апотрансферрина и низкомолекулярных активаторов пути HIF.
Пример 10. Композиции с преобладанием ApoTf и с преобладанием HoloTf индуцируют белок HIF-1α в первичных клетках почки человека.
В данной области техники общеизвестно, что многие низкомолекулярные соединения, применяемые для лечения состояний, связанных или вызываемых гипоксией, например, ДФО, являются токсичными и обладают многочисленными побочными эффектами. Одним из наиболее очевидных побочных эффектов указанных низкомолекулярных соединений является токсическое действие на почки. Таким образом, с целью оценки способности трансферрина и/или его смесей повышать уровень HIF-1α в первичных клетках почки получали первичные клетки почки человека, причем как первичные клетки эпителия проксимальных канальцев почки (RPTEC) человека, так и клетки эпителия коркового вещества (HRCE) человека. Первичные клетки эпителия проксимальных канальцев почки (RPTEC) человека или первичные клетки эпителия коркового вещества (HRCE) человека, культивируемые в бессывороточной среде, обрабатывали с применением 4 мг/мл композиции с преобладанием апотрансферрина, композиции с преобладанием голотрансферрина или различных смесей каждого их них в течение 6 часов при нормальном уровне кислорода. Через 6 ч собирали внутриклеточные белки и анализировали уровень белка HIF-1α с помощью твердофазного ИФА. На фигурах 10А и 10В показано, что уровень HIF-1α индуцировался трансферрином в виде смесей апотрансферрина и голотрансферрина в RPTEC и HRCE, соответственно.
Пример 11. Жизнеспособность первичных клеток почки человека в присутствии трансферринов или DFO, включая активацию каспазы 3/7 в первичных клетках почки человека в присутствии композиции с преобладанием ApoTf или DFO.
С учетом предполагаемого профиля безопасности белка плазмы человека, токсичность ДФО и трансферринов (композиций с преобладанием апотрансферрина, с преобладанием голотрансферрина и смесей) оценивали в первичных клетках почки человека. Клетки эпителия проксимальных канальцев почек (RPTEC) или эпителия коркового вещества (HRCE) обрабатывали указанной концентрацией композиций с преобладанием ApoTf или DFO в течение 48 часов (фигура 11А), а клетки RPTEC или HRCE обрабатывали в течение 72 ч с применением композиций с преобладанием ApoTf, с преобладанием HoloTf и смесей трансферрина в концентрации 4 мг/мл (фигура 11В). Через 48 или 72 часа клетки подвергали анализу жизнеспособности Cell Titer Glow. Контрольные необработанные клетки считали 100% жизнеспособными. Средняя жизнеспособность и стандартные отклонения показаны для каждого условия обработки. На фигурах 11А и 11В показано, что, несмотря на существенную токсичность DFO, ни одна из молекул трансферрина не демонстрировала никакого вредоносного влияния на указанные первичные клетки почки.
Для оценки активации каспазы 3/7 в первичных клетках почки человека в присутствии ApoTf или DFO клетки RPTE или HRC обрабатывали указанной концентрацией ApoTf или DFO в течение 48 часов. Через 48 часов клетки подвергали анализу активации каспазы 3/7 (ApoGlo). Контрольные необработанные клетки принимали за нормированное значение, равное 1. Средняя активность каспазы по сравнению с контрольными клетками и стандартные отклонения показаны на фигуре 12 для каждого условия обработки.
Пример 12. Стимуляции HIF не наблюдали в первичных гепатоцитах человека или линии клеток легкого NCI-H1650.
Как подробно описано выше, и апотрансферрин, и голотрансферрин плазмы повышали уровень HIF-1α в линии нейронных клеток человека SH-SY5Y. В дополнение к нейронным клеткам сигнальный путь HIF также может оказывать благоприятное действие на трансплантаты печени и легких. В связи с этим с целью оценки вышеуказанного определили влияние трансферринов на уровень HIF-1α в первичных гепатоцитах и линии клеток легкого (NCI-H1650). Линии клеток легкого NCI-H1650 или первичные гепатоциты, культивируемые в бессывороточной среде, обрабатывали с применением композиций с преобладанием апотрансферрина, с преобладанием голотрансферрина или pd-трансферрина в концентрации 4 мг/мл в течение 6 часов при нормальном уровне кислорода. Через 6 ч собирали внутриклеточные белки и анализировали уровень белка HIF-1α с помощью твердофазного ИФА. Данные, показанные на фигурах 13А и 13В, показывают, что уровень HIF-1α не индуцировался трансферрином или смесями апотрансферрина и голотрансферрина в клетках NCIH1650 или первичных гепатоцитах.
Пример 13. Жизнеспособность NCI-H1650 и первичных гепатоцитов человека в присутствии трансферринов.
С учетом предполагаемого профиля безопасности белка плазмы человека, токсичность трансферринов (композиций с преобладанием апотрансферрина, с преобладанием голотрансферрина и pd-трансферрина) оценивали в клетках NCI-H1650 и первичных гепатоцитах человека. Линии клеток легких человека NCI-H1650 и первичные гепатоциты человека обрабатывали в течение 72 ч с применением 4 мг/мл композиции с преобладанием ApoTf, с преобладанием HoloTf или pd-трансферрина. Через 72 часа клетки подвергали анализу жизнеспособности Cell Titer Glow. Контрольные необработанные клетки считали 100% жизнеспособными. Средняя жизнеспособность и стандартные отклонения показаны на фигурах 14А и 14В для каждого условия обработки. Данные показали, что композиции с преобладанием HoloTf или с преобладанием ApoTf не оказывали токсического действия на клетки легкого NCI-H1650 или первичные гепатоциты.
ВЫВОДЫ:
Эксперименты, выполненные на нейронных клетках человека линии SH-SY5Y, показали, что апотрансферрин и голотрансферрин, полученные из плазмы, повышают клеточный уровень HIF-1α. Повышение уровня HIF-1α происходило в условиях как нормоксии, так и гипоксии. Введение апотрансферрина в клетки при нормальном уровне кислорода повышало уровень HIF-1α аналогично уровню, наблюдаемому в клетках, подвергаемых гипоксии. Воздействие апотрансферрина на клетки SH-SY5Y в условиях нормоксии в течение длительного времени повышало уровень HIF-1α в большей степени, чем при краткосрочном воздействии. Отрицательный контроль (человеческий сывороточный альбумин) не оказывал влияния на уровень HIF-1α.
Различные смеси ApoTf и HoloTf стимулировали экспрессию белка HIF-1α в нейронных клетках SH-SY5Y и первичных клетках почки.
Стимуляции HIF-1α не наблюдали в первичных гепатоцитах человека или линии клеток легкого NCI-H1650.
Различные смеси ApoTf и HoloTf стимулировали гены-мишени HIF-1α в нейронных клетках SH-SY5Y.
Композиции с преобладанием HoloTf или с преобладанием ApoTf не оказывали токсического действия на клетки любого типа (нейронные клетки, клетки легкого, почек или гепатоциты) или in vivo.
Лечение крыс in vivo в модели неврологического стресса ишемии-реперфузии показало, что трансферрин (состоящий главным образом из ApoTf) защищает клетки крыс от инфаркта.
Смеси, содержавшие главным образом ApoTf или HoloTf, защищали нейронные клетки от токсического воздействия олигомера бета-амилоида (1-42).
Только смеси, состоявшие главным образом из ApoTf, оказывали синергетическое действие с М30 или DFO, и указанная синергетическая активность имела место только в нейронных клетках SH-SY5Y.