ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ IL-10 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ (SLE)
HUMANISED ANTI-IL-10 ANTIBODIES FOR TREATING SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS (SLE)

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к интерлейкину-10 (IL-10) и специфичным к IL-10 средствам. В частности, настоящее изобретение включает гуманизированные антитела к IL-10 и их применение. Изобретение также относится к способу лечения системной красной волчанки (SLE).
Уровень техники
Системную красную волчанку (SLE) рассматривают как аутоиммунное заболевание, при котором ключевую роль играют аномальная гиперактивность Β-лимфоцитов и обширная аномальная продукция аутоантител к иммуноглобулину гамма (IgG). Данный патологический процесс приводит к секвестрации и разрушению покрытых Ig клеток, фиксации и расщеплению белков комплемента, и высвобождению хемотаксинов, вазоактивных пептидов и разрушающих ферментов в тканях (Hahn BH. Systemic Lupus Erythematosus. In: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson, JL, editors. In: Harrison's Principles of Internal Medicine (16th edition). New York (US): McGraw-Hill; 2005. pp. 1960-1967).
SLE отличается разнообразными проявлениями. В течение заболевания в общем 95% пациентов испытывают скелетно-мышечные нарушения, 80% демонстрируют кожные повреждения, 85% - гематологические нарушения, 60% - неврологические нарушения, 60% - сердечно-легочные нарушения, от 30% до 50% - почечные нарушения, 40% - желудочно-кишечные нарушения, 15% - тромбоз, и 15% - офтальмологические нарушения. Подавляющее большинство пациентов (95%) также страдает системными симптомами, такими как утомляемость, тревога, лихорадка, анорексия и потеря веса, присутствующими большую часть времени. Большинство пациентов испытывает периоды обострения заболевания, чередующиеся с ремиссиями. Постоянная ремиссия (отсутствие симптомов в отсутствие лечения) является очень редкой. Более чем 50 лет назад большинство пациентов с диагнозом SLE жили менее чем 5 лет. В настоящее время более 90% проживают 10 лет, в основном благодаря ранней диагностике, симптоматическому противовоспалительному и иммуносупрессивному лечению. Общей причиной смерти является инфекция в результате иммуносупрессии (Hahn 2005).
Общепринято в лечении SLE применять противомалярийные, противовоспалительные и иммуносупрессивные лекарственные средства. Нестероидные противовоспалительные средства дополняют кортикостероидами, если симптомы становится трудно контролировать. Кроме того, активная SLE с вовлечением основных органов требует агрессивной терапии циклофосфамидом.
До настоящего времени не существовало этиологического лечения, доступного для лечения SLE и/или улучшения качества жизни пациентов на долговременной основе. Однако последние достижения в связанных с антителами технологиях и дальнейшая идентификация факторов, лежащих в основе данного аутоиммунного заболевания, открыли возможность использования моноклональных антител в качестве способа лечения. В частности, удобным подходом для лечения SLE будет специфическое лечение, воздействующее на патологический иммунный ответ, приводящий к обширной гиперпродукции поликлональных аутоантител, или корректирующее его. Поскольку патогенез SLE, главным образом, включает Β-клетки с нарушенной регуляцией, особый интерес представляют моноклональные антитела, способные воздействовать на B-клетки. Как отмечают Robak и Robak (Current Drug Targets, 2009, No, 10, pages 26-37), потенциальными мишенями среди B-клеточных поверхностных антигенов являются CD19, CD20, CD21 и CD22. Кроме того, IL-10, IL-1ra, IL-12 (Capper et al., Clin. Exp. Immunol. 2004 Nov; 138(2)':348-56) и IL-6 (Chun et al., J. Clin. Immunol, 2007 Sep; 27(5):461-6) представляют собой важные цитокины в регуляции иммунного ответа, и их уровень значительно повышается при обострениях у пациентов с SLE. Уровни IL-10 и аутоантител против двухцепочечной ДНК (дцДНК) в плазме часто отражают активность заболевания у пациентов с SLE. Повышенные уровни IL-10 коррелируют с активностью заболевания у пациентов с SLE (Park et al., Clin. Exp, Rheumatol, 1998 мая-Jun; 16(3):283-8). Однако IL-10 представляет собой цитокин с плейотропными эффектами относительно иммунной системы, а также известно, что он вовлечен в снижение провоспалительных ответов.
На пациентах с SLE проводили клинические испытания с применением моноклональных антител. В частности, несколько испытаний включали антитело ритуксимаб, химерное моноклональное антитело мыши против CD20, применяемое при лечении неходжкинской лимфомы. Как отмечают Robak и Robak (2009), результаты данных испытаний демонстрируют высокую активность этого антитела у пациентов с SLE, и разработано несколько новых антител, нацеленных на CD20: офатумумаб, IMMU-106 и GA-101. Дальнейшие клинические испытания, в которых сообщали об активности моноклональных антител при SLE, проводили с антителом против CD22, эпратузумабом, антителом против TNF-α, инфликсимабом, антителом против IL-10 B-N10 (Llorente et al., Arthritis Rheum. 2000 Aug; 43(8): 1790-800), антителами против CD40L, IDEC 131 и BG 9588, ингибитором BLYS, белимумабом, антителом против рецептора IL-6, токлимумабом, и антителом против C5, экулизумабом.
Задачей настоящего изобретения является предоставление дополнительных средств и, в частности, антител, обладающих применимостью в данной области.
Таким образом, настоящее изобретение относится к гуманизированному или химерному антителу или его фрагменту, способному связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент можно вводить субъекту в отсутствие неприемлемого повышения уровня провоспалительных цитокинов.
in vivo
in vitro
in vivo
Поскольку IL-10 представляет собой противовоспалительный цитокин, после блокирования можно ожидать значительного повышения уровня цитокинов. В случае антитела мыши против IL-10 B-N10 на нестимулированных культурах клеток (что отражает ситуацию  у здоровых индивидуумов) можно наблюдать повышение уровня провоспалительных цитокинов, таких как IL-6 или TNF-α. Однако авторы изобретения неожиданно обнаружили, что, если антитело по настоящему изобретению наносят на клетки  и вводят , высвобождение цитокина гораздо ниже. Это более низкое высвобождение цитокинов является предпочтительным, т.к. в результате индивидуумы, которым вводят антитело по настоящему изобретению, лучше его переносят.
Изобретение проиллюстрировано исключительно в качестве примеров следующими фигурами, среди которых:
На фиг.1A показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:2). Подчеркнуты гипервариабельные определяющие комплементарность области (CDR) (где LCDR1 является SEQ ID NO:4; LCDR2 является SEQ ID NO:5; и LCDR3 является SEQ ID NO:6).
На фиг.1B показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:3). Подчеркнуты гипервариабельные определяющие комплементарность области (CDR) (где HCDR1 является SEQ ID NO:7; HCDR2 является SEQ ID NO:8; и HCDR3 является SEQ ID NO:9).
На фиг.2A показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:10).
На фиг.2B показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:11).
На фиг.3 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой и тяжелой цепей антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:12 и 13 соответственно) вместе с последовательностями, взятыми из A17 (SEQ ID NO:14), JK1 (SEQ ID NO:15), 3-66+04 (SEQ ID NO:16) и JH4 (SEQ ID NO:17), и вариабельных областей hVL1-hVL12 (SEQ ID NO:18-29), и вариабельных областей hVH1-hVH29 (SEQ ID NO:30-58), полученных при гуманизации антитела B-N10 мыши.
На фиг.4 показано сравнение антигенсвязывающих свойств вариантов гуманизированного антитела и химерного антитела cB-N10 с применением ELISA с фиксированным антигеном hIL-10.
На фиг.5 показан результат определения антигенсвязывающих свойств трех гуманизированных вариантов, hVH20/hVL7, hVH20/hVL8 и hVH26/hVL7, по сравнению с химерным антителом B-N10 с использованием очищенных препаратов антитела.
На фиг.6A показан уровень высвобождения TNF-α из культур клеток цельной крови от здоровых добровольцев после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл).
На фиг.6B показан уровень высвобождения TNF-α из культур клеток цельной крови от пациентов с SLE после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл).
На фиг.7A показан уровень высвобождения IL-6 из культур клеток цельной крови от здоровых добровольцев после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл).
На фиг.7B показан уровень высвобождения IL-6 из культур клеток цельной крови от пациентов с SLE после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл).
На фиг.8A показан уровень высвобождения IL-1β из культур клеток цельной крови от здоровых добровольцев после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл).
На фиг.8B показан уровень высвобождения IL-1 β из культур клеток цельной крови от пациентов с SLE после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл).
На фиг.9A показан уровень высвобождения INF-γ из культур клеток цельной крови от здоровых добровольцев после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл).
На фиг.9B показан уровень высвобождения INF-γ из культур клеток цельной крови от пациентов с SLE после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл).
На фиг.10 показана общая структура Fab-фрагмента BT-063, связывающего IL-10. IL-10 и Fab-фрагмент представлены в виде ленточной модели.
На фиг.11 показан Fab-фрагмент BT-063, относящийся к тому же участку связывания на IL-10, что и рецептор IL-10. IL-10, IL-10R1 и Fab-фрагмент представлены в виде ленточной модели.
На фиг.12 показан график средней концентрации Cmax цитокинов в плазме после введения BT-063 здоровым добровольцам относительно дозы.
in vivo
На фиг.13 показан график средней концентрации IL-10 в плазме с течением времени после введения BT-063  здоровым добровольцам.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к гуманизированному или химерному антителу или его фрагменту, способному связываться с интерлейкином-10 (IL-10), и применению данного антитела или его фрагмента в лечении медицинских состояний, опосредуемых повышенным уровнем или активностью IL-10.
IL-10 человека представляет собой гомодимер с молекулярной массой 37 кДа. Каждый мономер состоит из 160 аминокислот и имеет молекулярную массу 18,5 кДа. Димер IL-10 взаимодействует с α-рецептором IL-10 (IL-10Rα или IL-10R1) и соответственно вовлекает β-рецептор IL-10 (IL-10Rβ или IL-10R2) в комплекс. Рецептор экспрессируется на множестве клеток, в частности иммунных клетках (Asadullah et al., Pharmacol. Rev. 2003 Jun; 55(2):241-69), включая большинство гематопоэтических клеток, таких как моноциты, макрофаги, и T- и B-лимфоциты, а также экспрессируется и на негематопоэтических клетках, таких как клетки эпидермиса или кератиноциты. Связывание IL-10 с α-рецептором IL-10 и вовлечение β-рецептора IL-10 приводит к передаче сигнала через тирозиновые киназы Jak1 и Tyk2 и затем к активации факторов транскрипции семейства STAT. Известны различные клеточные источники IL-10, такие как Τ-хелперные клетки, регуляторные Τ-клетки, моноциты, макрофаги, Β-клетки, эозинофилы, тучные клетки, кератиноциты, дендритные клетки и даже злокачественные клетки. Действие IL-10 на Β-клетки находится в диапазоне предотвращения апоптоза, усиления пролиферации, переключения класса иммуноглобулинов и дифференцировки в плазматические клетки (Asadullah et al., Pharmacol, Rev. 2003 Jun; 55(2):241-69).
Настоящее изобретение относится к гуманизированному или химерному антителу или его фрагменту, способному связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент можно вводить субъекту в отсутствие неприемлемого повышения уровня провоспалительных цитокинов.
В частности, известно, что введение терапевтических антител может приводить к неприемлемому повышению уровней провоспалительных цитокинов, приводящему к побочным эффектам у субъекта. В частности, неприемлемое повышение может вызывать покраснение кожи и лихорадку или гриппоподобные симптомы, включая повышение температуры тела. Таким образом, в предпочтительном аспекте изобретения антитело или фрагмент антитела является таким, которое можно вводить субъекту в отсутствие повышения температуры тела более чем на 2°C.
Кроме того, антитело или его фрагмент не вызывает существенного повышения количества провоспалительных цитокинов в плазме крови субъекта после введения. Уровни данных цитокинов, являющиеся неприемлемыми, как правило, в несколько раз больше, чем верхний предел цитокинов в норме (ULN), где ULN определяют как средний уровень цитокина (цитокинов), измеряемый в когорте индивидуумов+2 стандартных отклонения.
Таким образом, в предпочтительном аспекте изобретения антитело или его фрагмент можно вводить субъекту в отсутствие повышения провоспалительного цитокина, составляющего более чем 500%, более предпочтительно более чем 300% от верхнего предела в норме (ULN). Другими словами, антитело или его фрагмент вызывает повышение уровня провоспалительных цитокинов, составляющее менее чем 500%, более предпочтительно менее чем 300% от ULN для данного цитокина. Предпочтительно, чтобы провоспалительный цитокин представлял собой, по меньшей мере, один и, предпочтительно, все из TNF-α, INF-γ и IL-1β. Альтернативно, провоспалительный цитокин не является IL-6 или IL-8.
Кроме того, особенно предпочтительно, чтобы антитело или его фрагмент по настоящему изобретению могли стимулировать антагонист рецептора IL-1 (IL-1ra) у субъекта, приводя к противовоспалительному ответу.
in vitro
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения гуманизированное антитело или его фрагмент не вызывает более чем 500% повышение уровня провоспалительных цитокинов, особенно, TNF-α, IL-1β, IL-6, высвобождающихся из PBMC, более конкретно из иммунной клетки, при контакте с указанной клеткой .
in vitro
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что гуманизированное антитело или его фрагмент по изобретению вызывают меньшее повышение уровня провоспалительных цитокинов в анализах , чем антитело B-N10 мыши.
in vitro
Уровень высвобождения провоспалительного цитокина можно определить в исследованиях  с использованием культур клеток цельной крови человека, таких как исследования, описанные ниже в примере 5, или выделенных иммунных клетках. В частности, способы включают стадии: (a) инкубации культуры клеток с антителом или его фрагментом; и (b) определение уровня, по меньшей мере, одного провоспалительного цитокина.
Культуры клеток цельной крови человека можно получать от здоровых добровольцев или пациентов с заболеванием, таких как пациенты, страдающие SLE. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) могут представлять собой иммунные клетки и, в частности, выбранные из макрофагов, моноцитов, дендритных клеток, Τ-хелперных клеток и Β-клеток.
По меньшей мере, один провоспалительный цитокин может быть выбиран из интерлейкина-1β (IL-1β), IL-1α, IL-6 или фактора некроза опухоли (TNF-α) или Τ-хелперных цитокинов (интерферона гамма, INF-гамма, IL-4), макрофагальных цитокинов (IL-12), хемокинов (IL-8, MCP-1) соответственно. Уровни таких высвобождаемых цитокинов могут быть измерены в супернатанте культуры клеток с применением способов, как правило, известных в данной области.
in vitro
Более конкретно, данный способ  может включать стадии:
a) приведения 50 мкг/мл антитела или фрагмента в контакт с культурой клеток цельной крови человека;
b) инкубации указанного антитела или фрагмента с указанной культурой клеток цельной крови при 37°C в течение 48 часов;
c) определения количества одного или нескольких провоспалительных цитокинов в культуре.
В частности, способ параллельно осуществляют на культуре клеток цельной крови человека, не контактировавшей с антителом. Предпочтительно, при сравнении с данным контролем антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению вызывает менее чем 500% повышение уровня цитокина, более предпочтительно менее чем 300% повышение уровня цитокина. Предпочтительно, чтобы цитокин в данном способе не являлся IL-6 или IL-8.
Цитокины можно определить в культуре с помощью мультиплексных иммуноферментных анализов с применением бус (твердофазных анализов белков, проводимых на 96-луночных фильтрующих планшетах). Способ основан на применении бус, связанных, во-первых, с конкретным антителом конкретного цитокина и, во-вторых, проявляющих определенные спектральные характеристики. Это позволяет специфически определять бусы и, таким образом, относить их к известному связанному антителу. Связанный с бусами цитокин можно количественно определить посредством дополнительного связывания цитокинов антителом определения. Это позволяет определять одновременно до 10 цитокинов человека, включая GM-CSF, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, INF-γ и TNF-α. Для этой цели используют фильтрующие планшеты, в увлажненные лунки которых пипеткой наносят образцы, стандарты и раствор бус. После инкубации жидкость отсасывают вакуумным насосом, оставшиеся бусы промывают и добавляют смесь биотинилированных антител определения. Не связавшиеся антитела определения удаляют посредством отсасывания жидкости и промыванием оставшихся в лунке бус и затем добавляют конъюгированный со стрептавидином R-фикоэритрин (стрептавидин-RPE). Это позволяет распознавать биотинилированные антитела определения при инкубации, и после повторного промывания образовавшиеся иммунные комплексы можно анализировать с использованием системы Bio-Plex 200. В иммунологическом анализе используют устройство Bio-Plex 200. В нем используются две системы лазеров, во-первых, определяющие бусы на основе их спектральных характеристик и, во-вторых, определяющие количество связавшихся цитокинов посредством определения с применением вторичного антитела. Количественный анализ связавшегося антитела осуществляют посредством анализируемых параллельно стандартов с известными количествами цитокинов.
Настоящее изобретение также относится к гуманизированному или химерному антителу или его фрагменту, способному связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент способны повышать уровни IL-10 в плазме при введении субъекту.
Как показано в примере 8 ниже, в то время как антитело по настоящему изобретению можно вводить в отсутствие неприемлемого повышения уровня провоспалительных цитокинов, введение дозо-зависимым образом повышает количество IL-10, определяемого в образцах плазмы. Обнаружение того, что уровни IL-10 будут повышаться при введении нейтрализующего антитела, является неожиданным. Можно было бы ожидать, что введение нейтрализатора цитокина будет снижать уровень свободного цитокина (Strand et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2007, Vol, 6, pages 75-92). Не желая быть связанными теорией, полагают, что связывание IL-10 антителом предотвращает связывание IL-10 с рецептором IL-10 и запускает отрицательную обратную связь, заставляющую B-клетки продуцировать больше IL-10. Однако положительная регуляция не препятствует терапевтической применимости антитела по настоящему изобретению, т.к. антитело безопасно для введения на уровнях, достаточно высоких для нейтрализации всего IL-10, что также показано в примере 8.
В настоящем описании термин "химерное антитело" относится к антителам, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична последовательностям антител, полученным из конкретных видов или принадлежащим конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть антитела идентична последовательностям антител, полученным из других видов, класса или подкласса антител. Особенно предпочтительно, чтобы CDR химерного антитела имели одно происхождение, в то время как остальная часть антитела имела другое происхождение. В частности, в настоящем изобретении химерное антитело может являться гуманизированным антителом, в котором антигенсвязывающие последовательности/вариабельные домены не принадлежащего человеку антитела пересаживают на каркасные области антитела человека.
2
В настоящем описании термин "фрагмент" относится к фрагменту или производному антитела, сохраняющему желаемую биологическую активность. Как правило, фрагмент будет содержать антигенсвязывающую область антитела, в частности Fab, Fab', F(ab)', Fv и scFv фрагменты, а также производные поливалентных антител, в частности диател или тандемных диател. Предпочтительно, фрагмент содержит, по меньшей мере, 25, более предпочтительно 50 и еще более предпочтительно 200-500 аминокислот. Альтернативно, фрагменты могут быть определены как имеющие размер от 30 кДа до 150 кДа. Кроме того, фрагменты антител могут включать две или более пептидные/полипептидные цепи. Например, Fab фрагмент, содержащий две цепи от 200 до 300 аминокислот в каждой, или TandAbs (форматы тетравалентного биспецифического антитела), содержащий две цепи от 400 до 500 аминокислот в каждой.
Предпочтительным признаком изобретения является то, что антитело или его фрагмент получают из антитела B-N10 мыши или гуманизированного антитела BT-063 (вариант hVH26/hVL7), описанного в настоящем описании. В частности, такое антитело или его фрагмент будет содержать CDR, по меньшей мере, на 80% идентичные CDR из CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи B-N10/BT-063, и/или содержать аминокислотные последовательности, по меньшей мере, на 80% идентичные последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи B-N10/BT-063. Аминокислотная последовательность CDR мыши показана на фиг.1. Аминокислотная последовательность CDR BT-063 показана в примере 6. Более предпочтительно, последовательности будут, по меньшей мере, на 90% или, по меньшей мере, на 95% идентичны последовательностям CDR антитела B-N10/BT-063. Рентгено-кристаллографические исследования, описанные в примере 6 в настоящем описании, указывают на то, какие остатки в CDR важны для связывания IL-10.
Альтернативно, антитело или фрагмент по изобретению, все еще являясь производным антитела B-N10/BT-063, может содержать аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи B-N10/BT-063 и/или аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи B-N10/BT-063, необязательно, с вариацией в данных последовательностях, которая по существу не изменяет аффинности и/или специфичности антитела или его фрагмента. В частности, вариации в последовательности не снижают аффинности или специфичности антитела или фрагмента в отношении IL-10, по сравнению с аффинностью или специфичностью антитела или фрагмента, содержащих CDR антитела B-N10 мыши или антитела BT-063 (вариант hVH26/hVL7).
В конкретном варианте осуществления изобретение относится к гуманизированному или химерному антителу или его фрагменту, содержащему аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой и/или тяжелой цепей B-N10/BT-063. Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к гуманизированному или химерному антителу или его фрагменту, содержащему аминокислотные последовательности вариабельных доменов антитела B-N10 мыши, как показано на фиг.1. Наиболее предпочтительно, антитело или фрагмент содержит одну или обе аминокислотные последовательности вариабельных доменов BT-063 (SEQ ID NO:69 и SEQ ID NO:70).
Как правило, антитело по изобретению дополнительно содержит константную область (Fc) человека. Она может быть выбрана среди константных доменов любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любых изотипов, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Предпочтительные константные области выбирают среди константных доменов IgG, в частности IgG1.
Другие продукты
Настоящее изобретение дополнительно относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующим описанное выше антитело или фрагменты антител. Последовательности нуклеиновой кислоты могут представлять собой ДНК или РНК, но предпочтительно ДНК. Последовательности можно использовать в экспрессирующих кассетах или векторах и практически применять в производстве описываемых в настоящем описании антител и их фрагментов.
Изобретение дополнительно относится к клеткам-хозяевам, трансформированным данными полинуклеотидами, экспрессирующими кассетами или векторами. Подходящие клетки-хозяева могут являться прокариотическими и эукариотическими.
Альтернативно, клетка-хозяин может представлять собой гибридому, полученную слиянием клетки, продуцирующей антитело по настоящему изобретению, с миеломной клеткой.
Описанные выше клетки-хозяева можно применять в способе получения антитела или его фрагмента. В частности, такой способ может включать стадию культивирования клетки-хозяина в подходящей среде для культивирования в условиях, делающих возможной экспрессию антитела или его фрагмента и отделение антитела или фрагмента от среды для культивирования. Способы данного типа хорошо известны и описаны в данной области.
Медицинское применение
Описанные в настоящем описании антитела и их фрагменты обладают применимостью в лечении заболеваний или медицинских состояний, опосредуемых повышенным уровнем или активностью IL-10. В результате предоставлен способ лечения или предотвращения медицинского состояния у субъекта, где медицинское состояние опосредовано повышенным уровнем или активностью IL-10, включающий введение терапевтически эффективного количества описанного в настоящем описании антитела или его фрагмента.
В частности, медицинское состояние, опосредованное повышенным уровнем или активностью IL-10, представляет собой SLE. Таким образом, настоящее изобретение также относится к антителу или его фрагменту, как описано в настоящем описании, для применения в лечении SLE.
Дополнительные примеры представляют собой тромбоцитопеническую пурпуру, люпус-нефрит, ВИЧ, ЦМВ и гепатит C. Другой пример представляет собой лечение опухолевых клеток в зависимости от IL-10 посредством прямой поддержки пролиферации или супрессии иммунного ответа.
Дополнительным вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая описанное выше антитело или его фрагмент, фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В одном из вариантов осуществления композиция содержит липосомы, с которыми соединяют антитело или его фрагмент.
Такие композиции можно вводить пациенту парентерально, внутривенно или подкожно. Предпочтительно при лечении SLE антитело или его фрагмент вводят внутривенно или подкожно.
Антитела и их фрагменты практически применяют в лечении медицинского состояния, поскольку они не вызывают значимого повышения уровней провоспалительных цитокинов, они не требуют совместного введения с кортикостероидом для предотвращения "цитокиновой бури", неприемлемой для пациента.
Таким образом, конкретный аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения медицинского состояния у субъекта, где медицинское состояние опосредованно повышенным уровнем или активностью IL-10, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его фрагмента, как описано в настоящем описании, где субъекта не лечат одновременно или раздельно кортикостероидом, т.е. пациентом является пациент, которого не лечат одновременно кортикостероидом. В варианте осуществления данного предпочтительного аспекта медицинским состоянием, опосредованным повышенным уровнем или активностью IL-10, является SLE.
В настоящее время кортикостероиды применяют в лечении SLE у многих пациентов. Однако данный аспект изобретения обладает конкретной применимостью в лечении пациентов, когда дальнейшее введение кортикостероидов нежелательно.
Немедицинское применение
Кроме того, предоставлено меченое гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, включающее описанное в настоящем описании антитело или его фрагмент и метку. Метка может быть любого подходящего типа, известного в данной области для определения присутствия антитела в образце. В частности, метка может представлять собой флуоресцентную метку.
in vitro
Меченое или немеченое антитело, в частности меченое антитело, обладает конкретной применимостью в способе определения наличия IL-10  в образце. Способ может включать стадию приведения немеченого или меченого антитела или его фрагмента в контакт с образцом, промывания образца для удаления антитела и его фрагментов, не связавшихся с образцом (т.е. не связавшегося антитела или фрагментов антител), и определение наличия антитела (или фрагмента) в образце, например, посредством метки.
in vitro
Альтернативно, немеченое антитело или фрагмент может быть использовано в способе нейтрализации IL-10 в образце. Такой способ включает стадии приведения образца в контакт с антителом или его фрагментом для связывания антитела или его фрагмента с IL-10.
Теперь изобретение будет описано далее в отношении следующих конкретных вариантов осуществления.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1 - Характеристика антитела B-N10 мыши против IL-10
1.1. Выделение ДНК, кодирующей вариабельные домены антитела B-N10
7
Для идентификации вариабельных последовательностей B-N10 мыши применяли клеточные массы. Образцы (3×B-N10, пассаж 3, 1×10 клеток) хранили при -80°C до выделения мРНК из клеток, и после синтеза кДНК вариабельные последовательности B-N10 амплифицировали посредством ПЦР и затем клонировали.
Секвенировали в общем 14 клонов (SEQ Laboratories, Gottingen) и анализировали вариабельные области легкой цепи и вариабельные области тяжелой цепи. Однозначно определяли вариабельные последовательности B-N10. Отклонения присутствовали только в N-концевых областях праймеров (см. таблицу 1). В случае вариабельной области тяжелой цепи вариант последовательности QVQLKQ (SEQ ID NO:59) присутствовал в области праймеров девять раз, но другие варианты присутствовали только один или два раза. Данный вариант выбирали для субклонирования. В случае вариабельной области легкой цепи в равных пропорциях присутствовали два варианта. После сравнения последовательностей с последовательностями зародышевой линии мыши значительную гомологию с идентифицированной последовательностью VL проявляла последовательность cr1 только с 3 мутациями. Это означает, что последовательность DVLMTQ (SEQ ID NO:60) является наиболее вероятной правильной последовательностью. Последовательность DIVMTQ (SEQ ID NO:61) представляет собой типичную последовательность другого класса последовательностей зародышевой линии, и поэтому ее исключали.
<b>Таблица 1</b><b>Встречаемость секвенированных вариантов N-концевой последовательности вариабельной области легкой и тяжелой цепи B-N10</b>Выбранные последовательности выделены жирным шрифтом.
<b>Последовательность</b>
<b>Число раз</b>
Вариабельная область легкой цепи
DIVMTQ (SEQ ID No:61)
5
<b>DVLMTQ</b> (SEQ ID No:60)
<b>5</b>
DVLMTR (SEQ ID No:62)
1
DIVITQ (SEQ ID No:63)
1
DIVLTQ (SEQ ID No:64)
2
Вариабельная область тяжелой цепи
<b>QVQLKQ </b>(SEQ ID No:59)
<b>9</b>
QVQLKE (SEQ ID No:65)
2
EVQLQQ (SEQ ID No:66)
1
QVQLNQ (SEQ ID No:67)
1
QVQLTQ (SEQ ID No:68)
1
Белковые последовательности вариабельной области легкой цепи VL и вариабельной области тяжелой цепи VH представлены на фиг.1A и 1B соответственно. Подчеркнуты гипервариабельные определяющие комплементарность области (CDR). Соответствующие последовательности ДНК представлены на фиг.2A и 2B соответственно.
ПРИМЕР 2 - Получение химерного антитела B-N10
Идентифицированные вариабельные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела примера 1 клонировали в векторную систему для экспрессии рекомбинантных антител. Первой стадией являлось клонирование последовательностей в лидерную последовательность BS; с Ν-конца добавляли секреторный сигнал и с C-конца добавляли последовательность донорного сайта сплайсинга. Второй стадией являлось клонирование данных последовательностей в экспрессирующие векторы, содержащие константные области каппа-цепи человека и константные области гамма-1-цепи человека соответственно. Получали вектор для легкой цепи и вектор для тяжелой цепи и затем транзиторно котрансфицировали в клетки COS-7 осаждением фосфатом кальция или липофекцией. Супернатант культуры клеток собирали через 2 дня. После экспрессии химерного B-N10 в клетках COS-7 и определения титра антител в супернатанте (сэндвич-вариант ELISA) тестировали их связывающую способность на интерлейкине-10 человека (R&D Systems, кат. № 217-IL/CF, лот ET114021, хранящийся при -20°C) с применением ELISA.
Для сэндвич-варианта ELISA антитело мыши против каппа-цепи человека (Becton Dickinson) связывали с поверхностью планшета в качестве фиксирующего антитела, затем инкубировали с супернатантом культуры клеток и определяли присутствие химерного антитела с применением POD-конъюгированного антитела кролика против IgG человека (H+L) (Dianova). В качестве положительного контроля использовали химерное контрольное антитело в определенной концентрации (0,125-12 мкг/мл).
Для ELISA с фиксированным антигеном IL-10 человека связывали с поверхностью планшета в концентрации 0,5 и 5 мкг/мл. После инкубации с супернатантом культуры клеток (неразведенным и разведенным 1:5) определяли связывание химерного B-N10 с POD-конъюгированным антителом кролика против IgG человека (H+L) (Dianova). В качестве положительного контроля использовали B-N10 мыши. Антитело использовали в концентрациях 0,5 и 5 мкг/мл и определяли связывание с POD-конъюгированным антителом кролика против IgG/IgM мыши (Dako).
Результаты ELISA обсуждены в примере 3.
ПРИМЕР 3 - Гуманизация антител против IL-10
Исходные попытки снижать иммуногенность антител грызунов у людей включали получение химерных антител заменой константных доменов антитела грызунов доменами человека. Т.к. каркасные области грызунов в вариабельных доменах все равно могут индуцировать иммунный ответ, разработали усовершенствованный способ ремоделирования CDR, подразумевающий перенос антигенсвязывающих последовательностей (определяющих комплементарность областей, CDR) на каркасы антитела полностью человека (гуманизация). Как правило, для повышения возможности сохранения исходной антиген-специфичности и аффинности при гуманизации выбирают акцепторные каркасы человека, наиболее напоминающие донорное антитело мыши. Для улучшения способа можно применять или сочетать различные подходы с использованием последовательностей зародышевой линии антител человека, консенсусных последовательностей экспрессируемых антител, анализ структур петель CDR и рентгеновских структур комплексов антитело/антиген. Как правило, таким способом получали несколько вариантов гуманизированных антител и затем анализировали их биологические эффекты, которые могут отличаться у разных антител и у исходного антитела. В конечном итоге в соответствии с желаемой функцией антитела может быть выбрана подходящая константная область человека.
3.1. Сравнение вариабельных последовательностей B-N10 мыши и последовательностей человека и дизайн набора гуманизированных последовательностей VL (hVL) и VH (hVH)
Выбирали антитело мыши против IL-10 B-N10 (Llorente et al., Eur. Cytokine Netw. 1993 Nov-Dec; 4(6): 421-7; и Llorente et al., Arthritis Rheum, 2000 Aug; 43(8): 1790-80). Способ получения гуманизированных антител основан на способе ремоделирования CDR, где определяющие комплементарность области (CDR) объединяют с акцепторными областями человека.
Выбор акцепторных каркасов человека основан на комбинированном анализе трех наборов данных:
1) гомология последовательностей мыши с последовательностями зародышевой линии человека для минимизации риска соматических мутаций;
2) сравнение последовательностей мыши с консенсусными последовательностями человека для идентификации необычных аминокислотных остатков и
3) идентификация канонических классов структур последовательностей CDR для получения информации о важных структурных аминокислотных остатках каркаса.
Вариабельные области легкой цепи B-N10 мыши демонстрируют наибольшую гомологию с вариабельным сегментом 2-30*01 зародышевой линии человека (A17 (SEQ ID NO:14)) и соединительным пептидом JK1 (SEQ ID NO:15). Консенсусной последовательностью человека с наибольшей гомологией с B-N10 является HuKII. Определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области легкой цепи в случае L1 можно отнести к классу 4 и в случае L2 и L3 - к классу 1. Идентифицировали критические аминокислотные остатки.
При сравнении последовательностей генов CDR мыши и VL зародышевой линии человека с канонической структурой класса 4-1-1 выявляли наибольшую гомологию с 2-30*01 (наименьшее количество несовпадающих аминокислот).
Вариабельные области тяжелой цепи B-N10 мыши демонстрируют наибольшую гомологию с вариабельным сегментом VH3-33 зародышевой линии человека и с соединительным пептидом JH4 (SEQ ID NO:17). Консенсусной последовательностью человека с наибольшей гомологией с B-N10 является HuHIII. Определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области тяжелой цепи в случае H1 и H2 можно отнести к классу 1. Идентифицировали критические аминокислотные остатки. При сравнении последовательностей генов CDR мыши и VH зародышевой линии человека с канонической структурой класса 1-1 выявляли наибольшую гомологию с 3-66*04 (SEQ ID NO:16) (наименьшее количество несовпадающих аминокислот). Таким образом, также принимали во внимание последовательность зародышевой линии VH3-66.
Все полученные данные учитывали при дизайне набора различных вариабельных последовательностей гуманизированных вариабельной области легкой цепи (12 вариантов) и вариабельной области тяжелой цепи (29 вариантов).
3.2. Конструирование небольшой библиотеки и выбор гуманизированных hIL-10-связывающих фрагментов антител
Для того чтобы получить библиотеку потенциально связывающих hIL-10 фрагментов антител, для обеспечения оптимального антитела, связывающего IL-10 человека, последовательности кДНК, кодирующие 12 фрагментов hVL и 29 фрагментов hVH, как показано на фиг.3, получали с учетом применения кодонов в эукариотических клетках.
Затем полученные кДНК клонировали в клонирующие векторы и секвенировали в SEQ Laboratories (Gottingen, Germany). Библиотеку конструировали таким образом, чтобы каждая из 12 кДНК, кодирующих фрагменты hVL, комбинировалась с 29 кДНК, кодирующими фрагменты hVH, с получением 348 потенциально экспрессируемых фрагментов антител.
После бактериальной экспрессии и двух раундов селекции с IL-10 человека (R&D Systems, кат. № 217-IL/CF) фрагменты антител анализировали посредством ELISA на предмет связывания с hIL-10 (также как для селекции). Кратко, планшеты Maxisorb (Nunc, Germany) покрывали 1мкг/мл hIL-10 в PBS в течение ночи при 4°C. После блокирования и промывания планшетов добавляли супернатанты продуцирующих фрагменты антитела бактерий. Для определения связавшихся фрагментов гуманизированного антитела использовали POD-конъюгированное вторичное антитело.
Кодирующие последовательности с хорошими связывающими свойствами анализировали и указывали наличие идентифицированных hVL и hVH фрагментов (таблица 2).
<b>Таблица 2</b><b>Встречаемость фрагментов VL и VH, присутствующих во фрагментах антител, связывающихся с hIL-10</b>
<b>Встречаемость вариантов вариабельной области тяжелой цепи</b>
<b>Встречаемость вариантов вариабельной области легкой цепи</b>
hVH вариант
Встречаемость
hVL вариант
Встречаемость
<b>hVHl</b>
<b>1</b>
hVLl
2
hVH5
1
hVL2
1
hVH7
2
hVL3
1
<b>hVH9</b>
<b>2</b>
hVL5
1
hVH12
1
hVL6
3
<b>hVH13</b>
<b>2</b>
<b>hVL7</b>
<b>4</b>
hVH14
1
<b>hVL8</b>
<b>18</b>
(hVH16)
4
(hVL9)
4
<b>hVH18</b>
<b>4</b>
hVL10
1
<b>hVH20</b>
<b>4</b>
hVLll
1
hVH21
1
hVL12
2
hVH23
1
<b>hVH26</b>
<b>9</b>
hVH27
2
<b>hVH28</b>
<b>3</b>
hVH29
1
Последовательности, отмеченные жирным шрифтом, выбирали для субклонирования в соответствующих эукариотических экспрессирующих векторах для анализа связывающих свойств в отношении целого антитела. Последовательности, указанные в скобках, выбирали для субклонирования в экспрессирующих векторах, но получали только дефектные конструкции.
3.3. Получение экспрессирующих векторов для выбранных вариантов легкой и тяжелой цепи гуманизированного BT-063
На основе статистических данных, определенных скрининговым подходом, выбирали набор вариантов гуманизированной VL и гуманизированной VH BT-063 для клонирования в векторную систему. На первой стадии кДНК, кодирующую варианты гуманизированных VL и VH, переносили в соответствующий вектор для слияния последовательности, кодирующей 5'-секреторный сигнал, и последовательности донорного 3'-сайта сплайсинга с клонированной кДНК. Данные конструкции ДНК на второй и конечной стадии субклонирования переносили в экспрессирующие векторы, кодирующие константные домены каппа-цепи человека и константные домены гамма-1-цепи человека соответственно. Плазмиды экспрессирующих векторов, содержащих независимо полученные hVL и hVH, получали с применением не содержащего эндотоксин набора Qiagen Midi-prep (Qiagen, Germany),
3.4. Транзиторная экспрессия выбранных вариантов гуманизированного BT-063 в клетках COS-7 и сравнение связывания антител с hIL-10
Для транзиторной экспрессии вариантов гуманизированного антитела в клетках COS-7 каждый из выбранных вариантов гуманизированных VL (hVL7 и hVL8) комбинировали с каждым из выбранных вариантов гуманизированных VH (hVH1, hVH9, hVH13, hVH18, hVH20, hVH26, hVH28) с получением 14 различных гуманизированных антител.
Кратко, экспрессирующие векторы, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь, транзиторно котрансфицировали в клетки COS-7 осаждением фосфатом кальция в DMEM, содержащей 10% FCS, в 24-луночном формате. После трансфекции среду заменяли не содержащей сыворотку средой CHO-S-SFM II (Invitrogen, Germany) и собирали супернатанты клеток COS-7 через 2-3 дня после трансфекции. Титр гуманизированных антител, секретируемых в супернатанты трансфицированных клеток COS-7, анализировали сэндвич-вариантом ELISA. На основе определенных концентраций антитела супернатанты всех образцов использовали для анализа связывания с IL-10 человека в ELISA с фиксированным антигеном, при условии, что планшеты Maxisorb (Nunc, Germany) покрывали 2 мкг/мл hIL-10 в PBS.
Как показано на фиг.4, все проанализированные варианты связываются с hEL-10, однако с различными связывающими свойствами. Значимо наибольшие сигналы в ELISA с фиксированным антигеном получали с вариантами BT-063 hVH20/hVL7, hVH26/hVL7 и hVH20/hVL8, демонстрирующими интенсивность сигнала, сравнимую с полученной для химерного антитела B-N10. Для данных трех антител варианты интенсивности сигнала (самый сильный сигнал для hVH20/hVL8 и более низкие сигналы для hVH20/hVL7 и hVH26/hVL7) могут быть вызваны отличающимися концентрациями антител в результате количественного сэндвич-варианта ELISA (см. выше). Все другие исследованные варианты приводили к более слабым по сравнению с химерным антителом B-N10 сигналам.
3.5. Получение и аффинная очистка химерного и гуманизированного вариантов антител
Выбранные варианты гуманизированного BT-063 (hVH20/hVL7, hVH20/hVL8, hVH26/hVL7) и химерное cB-N10 (описанное в примере 2) получали в клетках COS-7.
Транзиторную экспрессию осуществляли, как описано в разделе 3.4., при условии, что использовали 10 см планшеты для культивирования. Не содержащие сыворотку супернатанты из приблизительно 0,5 л каждого варианта собирали через 5 дней после трансфекции.
Очистку антител осуществляли аффинной хроматографией с белком A из не содержащих сыворотку супернатантов. Супернатанты нагружали в присутствии 2M NaCl. Антитела элюировали 0,1M цитратным буфером с pH 4,0 и фракционировали в пробирки, содержащие 2M фосфатный буфер, pH 7,2. Замену буфера PBS, а также концентрирование отдельных образцов антител осуществляли посредством центрифугирования с использованием мембран с пределом 30 кДа. Качество очищенных материалов проверяли ELISA с фиксированным антигеном, электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях и измерениями УФ при 260 нм и 280 нм.
Связывание очищенных химерных и гуманизированных вариантов B-N10 с hIL-10 тестировали ELISA по описанному выше в примере 2 способу. Связывание hIL10 и антитела измеряли для вариантов cB-N10, BT-063-1 (hVH20/hVL7), BT-063-2 (hVH20/hVL8) и BT-063-3 (hVH26/hVL7). Результаты представлены на фиг.5.
Интенсивность сигналов была сравнима для химерного B-N10 и варианта hVH20/hVL7, в то время как интенсивность сигналов вариантов hVH20/hVL8 и hVH26/hVL7 была немного меньше
3.6. Определение аффинности IL-10 человека с использованием Biacore
.
Для измерения скорости ассоциации и диссоциации для связывания различных антител (мыши, химерного, 3 гуманизированных вариантов) с hIL-10 применяли анализ поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIACORE 2000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden). hIL-10 иммобилизировали на сенсорном чипе CM-5 согласно инструкциям производителя. hIL-10 иммобилизировали добавлением 50 мкл аликвоты 20 мкг/мл при скорости потока 5 мкл/минута, приводящей к плотности иммобилизации 320 RU. Поверхность с иммобилизованным hIL-10 восстанавливали в двухстадийном цикле с использованием 0,1M карбонатного буфера, pH 9,2, и 0,01M HCl/1M NaCl при скорости потоков 50 мкл/минута в течение одной минуты каждый. Каждый образец антитела анализировали, по меньшей мере, 4 раза в диапазонах концентрации антитела 20-0,15 мкг/млВычисления по сенсограммам осуществляли с применением программного обеспечения BIA evaluation version 3 (1999).
В таблице 3 приведены результаты всех измерений с использованием Biacore. Связывание всех вариантов с hlL-10 было сравнимым, однако определялись небольшие различия. В результате моноклональное антитело мыши B-N10, химерное антитело cB-N10, а также гуманизированный вариант BT-063-1 (hVH20/hVL7) связывались со сравнимыми аффинностями, в то время как два других гуманизированных варианта BT-063-2 (hVH20/hVL8) и BT-063-3 (hVH26/hVL7) демонстрировали сниженные аффинности (приблизительно в 3 раза по сравнению с B-N10 мыши). Также определялись небольшие различия в скоростях ассоциации и диссоциации.
<b>Таблица 3</b><b>Результаты измерений с применением Biacore</b>n=число отдельных измерений; ka=скорость ассоциации; kd=скорость диссоциации; KD=константа диссоциации
<b>Вариант антитела</b>
<b>n</b>
<b>ka [1/М с]</b>
<b>kd [1/с]</b>
<b>KD [M]±SD</b>
B-N10
6
4,43 E6
2,05 E-3
1,07 E-9±3,11 E-10
cB-N10
4
6,23 E5
8,48 E-4
1,37 E-9±2,42 E-10
BT-063-1
6
1,21 E6
1,03 E-3
1,22 E-9±1,44 E-10
BT-063-2
4
1,21 E6
1,64 E-3
2,81 E-9±1,03 E-9
BT-063-3
5
1,07 E6
2,66 E-3
2,91 E-9±8,07 E-10
IL-10 макака-крабоеда
Аффинность варианта 3 BT-63 (hVH26/hVL7) в отношении IL-10 макака-крабоеда анализировали в дополнительных экспериментах по поверхностному плазмонному резонансу с использованием Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala, Sweden).
BT-063 разводили в 10 мМ ацетата pH 5,5 до 5 мкг/мл и иммобилизировали с применением присоединения через аминогруппы для получения конечного уровня приблизительно 1000 RU. Восстановление поверхности сенсорного чипа осуществляли инъекцией 10 мМ глицин-HCl, pH 1,8, в течение 30 с. Образцы инъецировали в различных концентрациях в проточную кювету, а также в референсную кювету. Сигналы, полученные от референсной кюветы, вычитали из сигналов, полученных из детекторной проточной кюветы, и полученные профили связывания оценивали с применением 1:1 модели связывания Ленгмюра. Получали профили связывания в зависимости от концентрации и для IL-10 макака-крабоеда вычисляли среднюю KD 194 пМ. Анализировали rhIL-10 положительного контроля, получая KD 4,6 нМ. Результаты представлены в таблице 4.
<b>Таблица 4</b><b>Результаты измерений BT-063 с применением Biacore</b>rhIL-10: рекомбинантный IL-10 человека; rCIL-10: рекомбинантный IL-10 макака-крабоеда; ka=скорость ассоциации; kd=скорость диссоциации; KD=константа диссоциации
<b>Аналит</b>
<b>№ анализа</b>
<b>ka [1/М с]</b>
<b>kd [1/с]</b>
<b>KD [M]</b>
rhIL-10
1
6,0 E5
0,3 E-2
4,6 E-9
rCIL-10
1
6,2 E7
1,2 E-2
0,196 E-9
rCIL-10
2
8,6 E7
1,7 E-2
0,195 E-9
rCIL-10
3
9,7 E7
1,8 E-2
0,191 E-9
in vitro
ПРИМЕР 4 - Активность антитела против IL-10
Для подтверждения активности BT-063 исследовали блокирование высвобождения IL-6 в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC). Интерлейкин-6 (IL-6) высвобождался из PBMC после стимуляции липополисахаридом (LPS). Физиологической активностью интерлейкина-10 (IL-10) является ингибирование секреции цитокинов, например IL-6. Таким образом, добавление IL-10 к стимулированным LPS клеткам ингибирует секрецию IL-6, приводя к значимому снижению IL-6, присутствующего в среде культуры клеток. Однако в результате добавления BT-063 в культуру клеток IL-10 связывается, и, таким образом, он не способен связываться с рецептором на поверхности клетки. Компенсируют ингибирующий эффект IL-10 и восстанавливают секрецию IL-6 с получением IL-6 в среде.
6
PBMC выделяли из крови человека посредством градиента фиколла. Выделенные клетки высевали как 1×10 клеток/мл и стимулировали LPS для секреции IL-6, которую ингибировали добавлением IL-10. Ингибирующий эффект IL-10 нейтрализовывали добавлением BT-063, восстанавливая, таким образом, секрецию IL-6. В зависимости от цели (референсные или низко-, высококачественные контрольные образцы) добавления BT-063, использовали различные титровальные концентрации BT-063 с получением зависящей от концентрации секреции IL-6, которую определяли в супернатанте культуры клеток.
<b>Таблица 5</b><b>Средние значения уровней IL-6 при двукратном определении и восстановлении IL-6, соответственно, в зависимости от титрования референсного стандарта</b>
<b>S1: 40 мкг/мл</b>
<b>Концентрация BT-063 [мкг/мл]</b>
<b>Среднее значение уровня IL-6 [пг/мл]</b>
<b>Восстановление секреции IL-6 [%]</b>
40,000
<b>42546</b>
<b>72,8%</b>
20,000
<b>43134</b>
<b>73,8%</b>
13,333
<b>37910</b>
<b>64,9%</b>
8,889
<b>31107</b>
<b>53,2%</b>
5,926
<b>25602</b>
<b>43,8%</b>
3,951
<b>20793</b>
<b>35,6%</b>
1,975
<b>14200</b>
<b>24,3%</b>
0,988
<b>10227</b>
<b>17,5%</b>
Как показано в таблице 5, количество секретируемого IL-6 прямо коррелирует с концентрацией BT-063. Чем выше концентрация BT-063, тем больше IL-6 секретируется из PBMC и, таким образом, присутствует в супернатанте. Инкубация клеток с 40 мкг/мл BT-063 приводила к восстановлению секреции IL-6 до приблизительно 73%, в то время как для 0,988 мкг/мл BT-063 (последняя стадия титрования) в среде определяли только 17,5% от уровня IL-6 по сравнению с положительным контролем (стимулированные PBMC без инкубации с IL-10).
ПРИМЕР 5 - Различные эффекты B-N10 и BT-063 на синтез/уровень цитокинов в культурах клеток цельной крови человека
Иммунофармакологический профиль BT-063 (вариант hVH26/hVL7) оценивали по зависящей от лекарственного средства модуляции экспериментально индуцируемого синтеза цитокинов в культурах клеток цельной крови человека. В данном способе можно определить прямое и косвенное воздействие BT-063 на активности иммунных клеток. Активности BT-063 сравнивали с эффектами B-N10.
В анализах использовали культуры клеток цельной крови здоровых добровольцев и пациентов с SLE, которые анализировали на высвобождение цитокинов в присутствии BT-063 или B-N10. Высвобождение цитокинов иммунными клетками в культуре клеток цельной крови оценивали в состоянии покоя после инкубации с антителами B-N10 или BT-063 соответственно. Включали лейкоциты от здоровых добровольцев, а также клетки пациентов, страдающих системной красной волчанкой(SLE).
Описанные ниже клетки для экспериментов получали простым забором крови у здоровых добровольцев или пациентов с SLE и осуществляли их инкубацию с BT-063 или B-N10 соответственно в течение 2 дней на планшетах для микрокультивирования.
Медиаторы, измеренные в данных экспериментах, в основном представляли собой цитокины и хемокины, ассоциированные, например, с активацией Th1, Th2 или моноцитов/макрофагов, такие как интерферон гамма (INF-гамма), интерлейкин-1β (IL-1β), IL-12, IL-4, IL-8 или фактор некроза опухоли (TNF-α). Концентрацию каждого тестируемого параметра в супернатантах культур определяли с использованием мультипараметрической системы считывания на основе бус (технология на основе Luminex™, называемая мультианалитным профилированием, или MAP, тесты Rules-Based Medicine, RBM (Austin, Texas, USA)). Данные анализы проводили в EDI GmbH, Reutlingen, Germany. Технология Luminex™ работает по аналогии с сочетанием ELISA и проточной цитометрии, и с помощью нее считывают 100 бусин на аналит, таким образом, чтобы концентрации вычислялись из средней интенсивности флуоресценции в 100 отдельных измерениях.
Только при концентрации антитела 50 мкг/мл наблюдали индукцию высвобождения цитокинов.
Абсолютные уровни цитокинов, измеренные в культурах клеток от здоровых добровольцев и от пациентов с SLE, инкубированных с B-N10 или BT-063, приведены в таблицах 6 и 7 ниже.
<b>Таблица 6</b><b>Цитокины, дифференциально регулируемые B-N10 и BT-063 в культурах клеток цельной крови здоровых добровольцев.</b> Абсолютные значения цитокинов ±SD (в нг/мл для IL-1α, MMP-2, в пг/мл для всех остальных цитокинов), высвобождаемых после инкубации с антителом при концентрации 50 мкг/мл.
<b>Здоровые добровольцы</b>
Индуцированные в нестимулированных культурах при 50 пг/мл
<b>BT063</b>
<b>B-N10</b>
<b>Среднее</b>
<b><i>+/-SD</i></b>
<b>Среднее</b>
<b><i>+/-SD</i></b>
<b><u>Т-клеточные цитокины</u></b>
IFN-γ
<b>24</b>
<i>15</i>
<b>1757</b>
<i>1545</i>
<b>IL-2</b>
<b>0</b>
<i>0</i>
<b>19</b>
<i>12</i>
IL-17
<b>20</b>
<i>4</i>
<b>116</b>
<i>51</i>
IL-4
<b>22</b>
<i>4</i>
<b>96</b>
<i>4</i>
<b><u>Выживание Т-клеток</u></b>
IL-7
<b>103</b>
<i>15</i>
<b>319</b>
<i>31</i>
<b><u>Хемокины</u></b>
Mip1-β
<b>5453</b>
<i>852</i>
<b>316667</b>
<i>134656</i>
Mip1-α
<b>154</b>
<i>34</i>
<b>6227</b>
<i>5763</i>
MCP-1
<b>1852</b>
<i>1001</i>
<b>120933</b>
<i>30897</i>
IL-8
<b>2093</b>
<i>266</i>
<b>65967</b>
<i>26515</i>
<b><u>Провоспалительные цитокины</u></b>
IL-6
<b>20</b>
2
<b>20400</b>
<i>11557</i>
IL-1α
<b>0,133</b>
0,008
<b>0,356</b>
<i>0,142</i>
IL-1β
<b>44</b>
16
<b>3160</b>
<i>2936</i>
TNF-α
<b>24</b>
9
<b>1068</b>
<i>386</i>
<b><u>Противовоспалительные цитокины</u></b>
IL-10
3
<i>1</i>
146
<i>62</i>
<b>Таблица 7</b><b>Цитокины (абсолютные значения), дифференциально регулируемые B-N10 и BT-063 в культурах клеток цельной крови пациентов с SLE.</b>Абсолютные значения цитокинов ±SD (в нг/мл для IL-1α, MMP-2, в пг/мл для всех остальных цитокинов), высвобождаемых после инкубации с антителом при концентрации 50 мкг/мл.
<b>BT063</b>
<b>B-N10</b>
<b>Среднее</b>
<b>+/-</b>
<b>Среднее</b>
<b>+/-</b>
<b><u>Т-клеточные цитокины</u></b>
IFN-γ
1
<i>1</i>
323
<i>407</i>
IL-2
0
<i>0</i>
17
<i>5</i>
IL-4
28
<i>1</i>
118
<i>80</i>
IL-17
16
<i>13</i>
75
<i>91</i>
<b><u>Выживание Т-клеток</u></b>
IL-7
75
<i>11</i>
290
<i>166</i>
<b><u>Хемокины</u></b>
IL-8
8410
<i>9744</i>
121100
<i>145523</i>
Mip1-α
100
<i>9</i>
10235
<i>12961</i>
Mlp1-β
3695
<i>1407</i>
156350
<i>82944</i>
MCP-1
2580
<i>2560</i>
600500
<i>663973</i>
<b><u>Провоспалительные цитокины</u></b>
IL-6
227
<i>284</i>
23200
<i>17253</i>
IL1-β
69
<i>27</i>
1420
<i>438</i>
<b><u>Противовоспалительные цитокины</u></b>
IL-10
8410
<i>9744</i>
121100
<i>145523</i>
IL-1α
0,072
<i>0,048</i>
0,206
<i>0,013</i>
TNF-α
7
<i>0</i>
572
<i>200</i>
TNF-β
0
<i>0</i>
66
<i>42</i>
<b><u>Матрикс протеиназ</u></b>
MMP-2
27
<i>12</i>
365
203
На фиг.6A и Β, 7A и B, 8A и B, 9A и Β показана дифференциальная регуляция провоспалительных цитокинов в культурах клеток цельной крови человека от здоровых добровольцев и пациентов с SLE в нестимулирующих условиях. На фигурах показано, что культуры клеток цельной крови от здоровых добровольцев и пациентов с SLE демонстрируют более высокое высвобождение TNF-α, IL-6, IL-1β и INF-γ после инкубации с B-N10 по сравнению с BT-063 (при 50 мкг/мл). Следует отметить, что, помимо провоспалительной функции, дополнительно IL-6 действует в качестве фактора B-клеточной дифференцировки в плазматические клетки.
Наиболее четко это можно увидеть из данных о повышенной регуляции IL-10 и провоспалительных цитокинов в большей степени посредством B-N10 по сравнению с культурами, инкубированными с BT-063, от здоровых добровольцев и пациентов с SLE, позволяя предположить лучший профиль безопасности. Это нельзя считать результатом гуманизации.
ПРИМЕР 6 - Рентгеноструктурная кристаллография
Кристаллизация Fab-фрагмента BT-063 в комплексе с IL-10 человека
6.1.
E. coli.
Получали несколько конструкций IL-10 по опубликованным данным о структуре (Zdanov et al., Structure, Vol.3, 1995, pp.591) и клонировали стандартными способами в векторы для гетерологичной экспрессии в Тестирование экспрессии клонированных конструкций осуществляли стандартными способами и демонстрировали высокую гиперэкспрессию для IL-10, на что указывает повышение в полосе в ожидаемом диапазоне приблизительно 18 кДа.
Белок IL-10 экспрессировали в оптимизированных условиях, получая количества, пригодные для последующей очистки белка. После рефолдинга белок очищали аффинной хроматографией с иммобилизацией, эксклюзионной хроматографией и ионообменной хроматографией, с получением белка с 95% гомогенностью, оцененной с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии SDS с последующим окрашиванием Кумаси. Выход очищенного белка составлял приблизительно 0,3 мг на литр экспрессирующей культуры, что являлось достаточным для экспериментов с кристаллизацией.
Fab-фрагмент BT-063 (вариант hVH26/hVL7) отщепляли от интактного антитела с использованием протеазы папаин и очищали с использованием белка A. Затем Fab-фрагмент дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией.
Комплекс IL-10:Fab-фрагмент BT-063 получали смешиванием очищенных белков с молярным избытком IL-10 и дополнительной очисткой эксклюзионной хроматографией. Удерживаемый объем согласовался с размером комплекса.
Затем белок концентрировали до подходящих для кристаллизации концентраций.
Кристаллы комплекса IL-10:Fab-фрагмент BT-063 получали способом совместной кристаллизации.
6.2. Сбор и обработка данных
Кристаллы быстро замораживали и измеряли при температуре 100K. Данные о дифракции рентгеновских лучей собирали из сокристаллов IL-10 с Fab-фрагментом BT-063 в SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Switzerland) с использованием криогенных условий.
Кристаллы принадлежали к пространственной группе P6 с двумя комплексами в асимметричном блоке. Данные обрабатывали с применением программного обеспечения XDS и XSCALE. Обобщенные статистические данные приведены в таблице 8.
<b>Таблица 8</b><b>Сбор и обработка статистических данных</b>
<b>Комплекс</b>
<b>IL-10:BT-063</b>
Источник рентгеновского излучения
PX (SLS<sup>1</sup>)
Длина волны [Å]
1,0007
Детектор
PILATUS
Температура [K]
100
Пространственная группа
P6
Ячейка: a; b; c [Å]α; β; γ [°]
219,00; 219,00; 64,3690,0; 90,0; 120,0
Разрешение [Å]<sup>2</sup>
3,48 (3,72-3,48)
Уникальные отражения<sup>2</sup>
21124 (3817)
Кратность<sup>2</sup>
3,0 (2,9)
Завершенность [%]<sup>2</sup>
91,2 (92,3)
R<sub>sym</sub> [%]<sup>2,3</sup>
10,5 (44,0)
R<sub>meas</sub> [%]<sup>2,4</sup>
14,8 (62,2)
Ι/σΙ<sup>2</sup>
6,1(1,7)
Среднее(I)/сигма 2,5
7,0(1,7)
<sup>1</sup> SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Switzerland)
<sup>2</sup> Числа в скобках соответствуют наибольшему элементу разрешения
<sup>3</sup><img file="00000001.tif" he="25" wi="33" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>, </b>где<b></b><img file="00000002.tif" he="12" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>, </b>где <i>I</i><sub>h,i</sub> представляет собой значение интенсивности для <i>i</i>-го измерения<i> h</i><sup>4</sup><img file="00000003.tif" he="28" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>, </b>где<b></b><img file="00000004.tif" he="12" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>, </b>где <i>I</i><sub>h,i</sub> представляет собой значение интенсивности для <i>i</i>-го измерения<i> h</i><sup>5</sup> Вычисляли из независимых отражений
6.3. Моделирование и уточнение структуры
Решение фазовой проблемы, необходимое для определения и анализа структуры, получали молекулярной заменой. Опубликованные модели IL-10 и Fab-фрагмента использовали в качестве поисковой модели. Последующее построение и уточнение модели осуществляли стандартными способами с применением пакетов программ CCP4 и COOT. Для вычисления свободного R-фактора, меры достоверности правильности конечной модели, 4,2% измеряемых отражений исключали при уточнении структуры (см. таблицу 9).
Определение параметров нанотел осуществляли с применением программного обеспечения CHEMSKETCH. LIBCHECK (CCP4) использовали для получения соответствующих библиотечных файлов.
.
)
Водную модель строили с применением алгоритма "Find waters…" программного обеспечения COOT, помещая молекулы воды в пики Fo-Fc карты, смоделированной при 3,0 σ, с последующим уточнением с помощью REFMAC5 и проверки всей воды инструментом валидации COOT. Критериями для включения в список подозрительных молекул воды являлись: B-фактор выше 80, 2Fo-Fc карта менее чем 1,2 σ, расстояние до ближайшего контакта менее чем 2,3 Åили более 3,5 ÅПодозрительные молекулы воды и молекулы в активном центре (расстояние до ингибитора менее чем 10 Åпроверяли вручную. Удерживание боковых цепей, находящихся в отрицательных пиках на Fo-Fc карте (смоделированной при -3,0 σ), устанавливали на ноль и затем на 0,5, если после следующего цикла уточнения появлялся положительный пик.
На диаграмме Рамачандрана конечной модели показаны 80,8% всех остатков в наиболее предпочтительной области, 17,9% в дополнительно разрешенной области, 0,7% остатков в условно разрешенной области. Остатки Val86(A), His14(B), Asp86(B), Ser131(C), Val56(D) и Val56(F) обнаруживались в неразрешенной области диаграммы Рамачандрана (таблица 9). Их подтверждают картой электронной плотности или не включают в моделирование в другой восприимчивой конформации. Статистика конечной структуры и способа уточнения приведены в таблице 9.
<b>Таблица 9</b><b>Статистика уточнения структуры</b><sup>1</sup>
<b>Комплекс</b>
<b>IL-10:BT-063</b>
Разрешение [Å]
20,0-3,48
Число отражений (рабочих/тестовых)
20199/889
R<sub>cryst</sub> [%]
29,7
R<sub>free</sub> <sup>2</sup> [%]
35,5
Общее количество атомов:БелокВодаЛиганд
8870-
Отклонение от идеальной геометрии:<sup>3</sup>Длины связей [Å]Углы связей [°]Связанные B<sup>4</sup> [Å<sup>2</sup>]
0,0070,930,0
Диаграмма Рамачандрана:<sup>5</sup>Наиболее благоприятные областиДополнительные разрешенные областиУсловно разрешенные областиНеразрешенные области
80,817,90,70,6
<sup>1</sup> Значения, как указано в REFMAC5, без предела по сигме
<sup>2</sup> Набор тестов включает 4,2% измеряемых отражений
<sup>3</sup> Среднее квадратичное отклонение от геометрических целевых значений
<sup>4</sup> Вычисляли с применением программного обеспечения MOLEMAN
<sup>5</sup> Вычисляли с применением программного обеспечения PROCHECK
6.4. Рентгеноструктурный анализ
Структуру комплекса IL-10 человека, связанного с Fab-фрагментом антитела BT-063, анализировали при разрешении 3,48 Å и выявляли подробный способ связывания Fab-фрагмента антитела.
Полученная электронная плотность свидетельствует об определенном способе связывания Fab-фрагмента, включая ориентацию и конформацию Fab-фрагмента. Кристалл пространственной группы P6 содержит два комплекса в асимметричном блоке.
Структура IL-10 в комплексе с Fab-фрагментом представлена на фиг.6. Два Fab-фрагмента связываются своими петлями CDR с каждым гомодимером IL-10.
;
Следующие остатки IL-10 (молекулы A и B) можно найти вблизи от петель CDR на максимальном расстоянии 3,9 ÅArg27, Lys34, Gln38, Met39, Asp41, Gln42, Asp44, Leu46, Glu50, Leu53, Glu142, Asp144, Ile145, Asn148, Tyr149, Glu151 и Thr155.
:
Следующие остатки петель CDR можно найти вблизи от IL-10 на максимальном расстоянии 3,9 ÅPhe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32, Trp52, Arg53, Gly54, Ser56, Asn73, Ser74, Tyr100, Gly101, Tyr103 (молекулы C и E), Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37, Lys55 (молекулы D и F).
Участок связывания BT-063 совпадает с участком связывания рецептора IL-10 на поверхности IL-10, как показано при наложении структуры комплекса IL-10:BT-063 с опубликованной структурой комплекса IL-10:рецептор IL-10R1 (фиг.7).
Аминокислотные остатки BT-063 в участке контакта с IL-10 человека, идентифицированные рентгеноструктурным анализом, подчеркнуты на представленной ниже линейной аминокислотной последовательности вариабельных доменов антитела BT-063.
BT-063 VL:
BT-063 VH
:
Подчеркнуты области CDR (Honegger и Pliickthun (2001) J. Mol. Biol., 309, 657-670) (CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи представляют собой SEQ ID NO:71, 72 и 73 соответственно; CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи представляют собой SEQ ID NO:74, 75 и 76 соответственно). Остатки в участке контакта с IL-10 показаны жирным шрифтом.
В легкой цепи контактные остатки обнаруживаются в CDR1 и CDR2, но не в CDR3. Рассматриваемые остатки всех трех CDR тяжелой цепи вовлечены в связывание антигена. Два остатка FR3 (Asn73 и Ser74) также участвуют в связывании антигена.
Ser28 и Ala30 в начале CDR1 представляют собой часть последовательности предшественника VH мыши (B-N10) и не присутствуют в выбранном каркасе человека (3-66*04). Оба положения реже участвуют в связывании антигена, и их встраивали в качестве альтернативных аминокислот при гуманизации.
Остатки Asn73 и Ser74 обнаруживаются у мышей и часто в последовательностях каркаса антитела человека, но, как правило, они не участвуют в связывании антигена, (www.bioc.uzh.ch/antibody; Honegger и Pluckthun, 2001). Их участие в связывании антигена является неожиданным.
Аминокислотные остатки IL-10, вовлеченные в связывание BT-063, представлены ниже. Также указаны остатки IL-10, вовлеченные в связывание с высокоаффинной цепью рецептора IL-10 (IL-10R1) и низкоаффинной цепью рецептора (IL-10R2). Обе цепи рецептора участвуют в связывании гомодимера IL-10 и необходимы для передачи сигнала. В последовательности A остатки, контактирующие с BT-063, представлены жирным шрифтом. В последовательности B контактные остатки для IL-10R1 показаны жирным шрифтом, контактные остатки для IL-10R2 показаны курсивом и подчеркнуты, и контактные остатки и для IL-10R1, и для IL-10R2 выделены жирным шрифтом, курсивом и подчеркнуты (Pletnev et al. 2005).
A
Β
Можно видеть, что BT-063 связывается с прерывистым эпитопом IL-10, содержащим остатки спирали A (Arg27, Lys34, Gln38, Met39, Asp41), и N-концевую часть спирали Β (Glu50 и Leu53), включая последовательность соединительной петли (Glu42, Asp44, Leu46) одного мономера IL-10, а также остатки спирали F' (Glu142, Asp144, Ile145, Asn148, Tyr149, Glu151, Thr155) второго мономера IL-10.
in vivo
ПРИМЕР 7 - Исследование токсичности однократной дозы  на макаке-крабоеде
Исследование токсичности однократной, включая фармакологические параметры безопасности, осуществляли на макаках-крабоедах после однократной внутривенной инъекции BT-063 (вариант hVH26/hVL7). Животных распределяли по четырем группам (плацебо, 1 мг/кг, 7 мг/кг и 50 мг/кг) по 4 животных/пол/группа. BT-063 вводили внутривенно в день 1. Половину животных вскрывали после 5 дней, в то время как остальных животных умерщвляли на день 28.
Низкий уровень дозы 1 мг/кг в данном исследовании соответствует эквивалентной дозе для человека ~300 мкг/кг, приводя к общей дозе для человека 18 мг (масса тела 60 кг). Схожую дозу предшественника антитела BT-063 B-N10 вводили ежедневно в течение 21 дня в небольшом инициированном исследователями испытании (Llorente, 2000). Данное количество антитела демонстрировало фармакологические эффекты и клиническую эффективность. Таким образом, выбирали низкий уровень дозы. Высокую дозу выбирали как кратное (50 мкг) начальной дозы. Промежуточная доза представляет собой геометрическое среднее низкой и высокой доз.
В течение исследования не наблюдали токсикологически значимых или существенных изменений физиологических или гистопатологических параметров. Кроме того, изменения параметров клинической химии считали небольшими или токсикологически не значимыми.
in vivo
ПРИМЕР 8 - Исследование токсичности однократной дозы на здоровых добровольцах.
Исследование для контроля безопасности и переносимости BT-063 (вариант hVH26/hVL7) и эффектов введения BT-063 с применением повышающихся доз антитела проводили на здоровых добровольцах. Двадцати трем добровольцам однократно внутривенно вводили BT-063 в 8 группах дозирования. Группы дозирования являлись следующими: 0,175 мг, 0,75 мг, 3,5 мг, 7 мг, 15 мг, 30 мг, 60 мг и 100 мг. На группу приходилось три добровольца, за исключением группы дозы 100 мг, где было два добровольца.
Каждую дозу разводили 0,9% хлоридом натрия для инъекцией до общего объема 20 мл. Дозу вводили в виде однократного непрерывного внутривенного вливания в течение 2 часов.
Добровольцев оценивали в течение периода 85 дней после инъекции и забирали кровь в нескольких временных точках в течение данного периода.
Цитокины
Во взятой плазме проводили оценку уровней цитокинов INF-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 и TNF-α до и после вливания BT-063.
В таблице 10 представлен верхний предел нормальных значений IL-6, IL-8 и IL-10, вычисленный из значений перед введением дозы и скринингом.
<b>Таблица 10</b><b>Концентрация цитокинов у здоровых добровольцев</b>
<b>Цитокин (пг/мл)</b>
<b>IL-6</b>
<b>IL-8</b>
<b>IL-10</b>
Среднее
5,6
12,4
4,9
SD
10,6
11,5
9,3
ULN (Среднее + 2×SD)
26,7
35,3
23,5
Диапазон (от наименьших до наибольших значений)
0-44,5
0,0-45,1
0,0-40,2
Дополнительные результаты измерений цитокинов представлены на фиг.12 и 13.
Независящее от дозы временное повышение IL-6 и IL-8 присутствовало в течение 24 часов после вливания, возвращаясь к уровням до введения дозы через 3 дня. Полагают, что данный эффект больше связан с самим событием вливания, чем с антителом, поскольку не наблюдали зависимости от дозы, и эффект проявлялся уже после наименьшей дозы.
Неожиданно, учитывая, что IL-10 является важным регуляторным цитокином, не определялось повышение уровней INF-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5 и TNF-α, как показано на фиг.12. Отсутствие повышения уровней IL-4, IL-5 INF-γ, IL-2 также подтверждалось отсутствием активации T-хелперных клеток в результате введения BT-063. Кроме того, поскольку температура тела также является свидетельством обширного высвобождения провоспалительных цитокинов, этот параметр также измеряли у подвергнутых лечению добровольцев. Однако не определяли повышение температуры тела после введения.
in vitro
Как показано на фиг.13, введение BT-063 влияло только на концентрацию IL-10 в плазме с определенным снижением IL-10 в плазме при повышении дозы BT-063. Следует отметить, что в применяемом анализе определяется как свободный IL-10, так и IL-10, связавшийся с BT-063. Существуют два возможных объяснения повышения: (1) пролонгированное время полужизни IL-10 со связыванием IL-10 с BT-063, предотвращающим интернализацию IL-10, и сопутствующим отсутствием высвобождения IL-10 из крови (в норме существует быстрый кругооборот IL-10, где время полужизни IL-10 составляет приблизительно 2,3-3,5 часов (Huhn et al., Blood (1996) Jan 15: 87(2): 699-705)); и/или (2) индукция отрицательной обратной связи, где BT-063 блокирует связывание IL-10 с его рецептором, захват IL-10 клетками невозможен, стимулируя продукцию IL-10 B-клетками. Авторы полагают, что вариант (2) более вероятен, т.к. он подтвержден данными , взятыми из экспериментов с культурой клеток цельной крови с BT-063 и клетками мыши, нокаутированными по IL-10R (Mahnke et al., неопубликованные данные).
Фармакокинетика
Фармакокинетические данные показали, что Cmax, AUC и время полужизни BT-063 находятся в диапазоне ожидаемых теоретических значений. Конечное время полужизни BT-063 составляет от 15 до 30 дней. После введения доз 30 мг или выше BT-063 все еще определяем в плазме после 85 дней.
Не наблюдали антител человека против человека (HAHA) у здоровых добровольцев, несмотря на то, что ответы HAHA наблюдали с другими нейтрализующими цитокины антителами (например, адалимумабом, гуманизированным антителом против TNF-α).
Несмотря на повышение определенных количеств IL-10 после введения BT-063, следует отметить, что данное исследование демонстрирует безопасность и переносимость даже больших доз BT-063, и, таким образом, можно сделать вывод, что можно безопасно вводить значительные дозы BT-063 (в частности, без неприемлемого повышения уровня провоспалительных цитокинов) пациентам с SLE для противодействия эффектам избытка IL-10.