УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ПРИ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

Настоящая полезная модель относится к устройствам для получения, наблюдения, записи и реконструкции многоцветных флюоресцентных изображений, получаемых с помощью нескольких флюорохромов. Данные устройства могут быть использованы, например, при многоцветной иммуногистохимической диагностике лимфом и применены в области фундаментальной медицины, в том числе, в гематологии и онкологии.
Флюоресцентная микроскопия по сравнению с обычной микроскопией позволяет получить ряд новых возможностей для различных исследований: сочетание цветного изображения и сохранение контрастности объектов; изучение морфологии клеток микроорганизмов в питательных средах и тканях животных; исследование клеточных микроструктур, избирательно поглощающих различные флюорофоры; определение функционально-морфологических изменений клеток; использование флюорофоров при иммунологических реакциях и подсчете бактерий в образцах с невысоким их содержанием. В отличие от известных классических органических красителей особый интерес в качестве флюорофоров представляют собой так называемые фотолюминесцирующие квантовые точки (флюоресцентными наночастицы), в которых поглощение фотона рождает электрон-дырочные пары, а рекомбинация электронов и дырок вызывает флюоресценцию. Такие квантовые точки обладают узким и симметричным пиком флюоресценции, положение которого определяется их размером. Так, в зависимости от размера и состава, квантовые точки могут иметь флюоресценцию в УФ, видимой или ИК-области спектра.
В известных устройствах для получения флюоресцентных изображений возбуждающий свет от источника света - ртутной лампы направляется на исследуемый препарат, вызывая в нем свечение флюоресценции. Возникающая при этом на исследуемом препарате многоцветная картина визуально анализируется оператором, и он выбирает в ней те участки препарата, которые, на его взгляд, наиболее информативно описывают исследуемый в данном анализе процесс. После этого оператор осуществляет съемку выбранного фрагмента при помощи цветной камеры и анализирует получаемое изображение. (Lichtman, J.W. and Conchello, J.A. Fluorescence Microscopy. Nature Methods 2: 910-919 (2005).)
Недостатком таких устройств является невысокая точность проводимых исследований и их трудоемкость, обусловленная низкой чувствительностью самого устройства и малой чувствительностью цветового зрения оператора, который в данных условиях не в состоянии с нужной детальностью оценить степень информативности всех цветовых характеристик объекта.
Известно устройство для получения флюоресцентных изображений, содержащее источник света, набор возбуждающих и запирающих светофильтров, дихроическое зеркало, объектив, светоделительную пластину, окуляры и черно-белую цифровую камеру. В качестве флюоресцентных красителей используют только органические флюорохромы, что предъявляет очень жесткие требования к разделению каналов возбуждения и флуоресценции и значительно снижает выходной сигнал от каждого флюорохрома (сквозь светофильтр с очень узкой полосой пропускания проходит мало света). Это делает невозможным одновременное наблюдение более чем двух цветов. (N.Barteneva and I.Vorobjev. The development of multicolor panels with Quantum Dots-conjugated antibodies for diagnostics of Chronic Lymphoid Leukemia (CLL) by conventional flow cytometer. Nanotechnology 2009. Technical Proceedings, vol.2, pp.26-28.)
Кроме того, точность проводимых на описанных известных устройствах исследований невысока, в одних случаях из-за отсутствия полной картины свечения в силу низкой чувствительности цветной камеры, в других случаях - из-за невозможности оценить цветовые характеристики изображения, т.к. черно-белая камера не фиксирует цветовые различия. В то же время, глаз оператора хорошо видит общую цветовую картину препарата, что, как правило, достаточно для выбора наиболее информативного объекта съемки, но не видит целый ряд важных деталей этой картины, также в силу своей низкой цветовой чувствительности
Технической задачей настоящей полезной модели является устранение вышеуказанных противоречий, повышение точности проводимых исследований, что позволит, например, детектировать одновременно не менее 4-5 антигенов на гистологических препаратах биопсийного материала лимфом, а также получать раздельные и объединенные изображения в нескольких каналах флюоресценции.
Технический результат полезной модели состоит в повышение чувствительности проводимых исследований за счет возбуждения всех красителей с использованием всего одного возбуждающего светофильтра вместо целого набора, что позволяет получить более сильный по интенсивности сигнал сразу от нескольких красителей.
Такая конструкция также способствует упрощению и удешевлению устройства за счет исключения из него колеса с набором дорогостоящих узкополосных возбуждающих светофильтров.
Технический результат полезной модели достигается за счет того, что устройство для получения флюоресцентных изображений при иммуногистохимической диагностике, содержащее источник света, возбуждающие и запирающие светофильтры, дихроическое. зеркало, объектив, светоделительную пластину, окуляры и цифровую камеру, снабжено установленным между камерой и светоделительной пластиной колесом с укрепленными в нем запирающими светофильтрами, а в качестве возбуждающих светофильтров используют широкополосный светофильтр.
При этом, предпочтительно выполнять запирающие светофильтры узкополосными.
При этом, предпочтительно в качестве источника света использовать ртутно-кварцевую лампу.
При этом, предпочтительно использовать черно-белую цифровую камеру.
Схематично устройство показано на чертеже, фиг.1. Оно содержит источник света (ртутно-кварцевую лампу) 1, широкополосный светофильтр возбуждения 2, дихроическое зеркало 3, объектив 4, на чертеже показан исследуемый препарат 5, светоделительную пластину 6, окуляр 7, запирающие узкополосные светофильтры 8, укрепленные в колесе 9, цифровую камеру 10, компьютер 11. На чертеже показан также глаз оператора 12.
Устройство работает следующим образом. Исследуемый препарат 5, заранее обработанный несколькими флюорохромами, избирательно связывающимися с теми или иными структурами препарата, устанавливают под объективом 4. Затем включают ртутно-кварцевую лампу 1, свет от которой через широкополосный светофильтр возбуждения 2 и дихроическое зеркало 3, попадает на препарат 5, вызывая свечение связавшихся с препаратом флюорохромов. При этом на исследуемом препарате создается многоцветная картина. Эта цветное изображение, проходя через объектив 4, дихроическое зеркало 3, поступает на светоделительную пластину 6, которая разделяет его на два световых пучка. Один пучок через окуляр 7 попадает в глаз оператора 12, создавая в нем многоцветную картину флуоресцентного свечения исследуемого объекта, а второй через запирающие светофильтры 8 колеса 9 поступает в цифровую фотокамеру 10, которая осуществляет съемку монохромной картины объекта, каждый кадр которой характеризуется спектральной характеристикой данного запирающего светофильтра 8. Изображение визуально анализируется оператором, который перемещая препарат в поле зрения, находит то сочетание светящихся объектов, которое, на его взгляд, наиболее информативно характеризует данный препарат. Определив, таким образом, место съемки, оператор, последовательно перемещая запирающие светофильтры 8 путем ручного или автоматического вращения колеса 9, делает несколько монохромных снимков выбранного поля, фиксируя их на черно-белую камеру 10. Эти снимки, снятые в разных спектральных зонах флуоресценции подаются в компьютер 11 для анализа. Использование комплекта запирающих светофильтров 8 с различной шириной полосы пропускания позволяет также подобрать и условия минимального спектрального перекрытия (затекания). Кроме того, фиксируется и нередуцированное исходное изображение (суммирующее все цвета), подаваемое на камеру напрямую, без запирающих светофильтров 8. Все эти изображения поступают для анализа в компьютер 11. Там проводится их компенсация, и эти скомпенсированные изображения, виртуально накладываясь друг на друга, дают более детальную реконструкцию исходного цветного изображения фрагмента, которое подлежит дальнейшему визуальному и компьютерному анализу. Такое устройство позволяет использовать красители нового поколения - т.н. квантовые точки (флюоресцентные наночастицы), что сводит к минимуму «затекание» сигналов от разных красителей, возникающее в результате перекрывания их спектров эмиссии.
Предлагаемая полезная модель позволяет повысить чувствительность проводимых исследований и их точность, снизить их трудоемкость, а также способствует упрощению и удешевлению устройства.
Предлагаемое устройство дает возможность проведения дифференциальной диагностики всех основных форм лимфом в соответствии с классификацией ВОЗ с использованием стандартных гистологических срезов и срезов быстрозамороженной ткани; получать раздельные и объединенные изображения в нескольких каналах флюоресценции; обеспечивать регистрацию цветных изображений и возможность быстрого синтезирования цветных изображений на основе монохромных; дает возможность использования стандартных антител, употребляемых для диагностики лимфом, конъюгированных с флюоресцентными наночастицами, на замороженных и парафиновых срезах, а также на отпечатках ткани и, позволяет таким образом с успехом использовать его в дифференциальной диагностике лимфопролиферативных заболеваний.