СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИНА
METHOD FOR PREPARING PHOSPHATIDYL SERINE

Настоящее изобретение относится к способу получения фосфолипида. В частности, данное изобретение относится к способу получения фосфатидилсерина с помощью фосфолипазы D из моркови.
Фосфатидилсерин представляет собой фосфолипид, являющийся питательным веществом; он присутствует в рыбе, зеленых листовых овощах, соевых бобах и рисе. Это вещество важно для нормального функционирования мембран нервных клеток. При апоптозе фосфатидилсерин переносится в наружный слой плазматической мембраны, что входит в механизм представления клетки для фагоцитоза. Фосфатидилсерин используется для замедления прогрессирования слабоумия при рано начавшейся болезни Альцгеймера. Это вещество имеется в продаже как диетическая добавка для лиц, нуждающихся в дополнительном его потреблении.
Фосфатидилсериновую диетическую добавку первоначально получали из мозга крупного рогатого скота. Однако из-за того, что в 1990-е годы было немало случаев заболевания, вызываемого прионами, этот способ получения оказался вне закона, и был предложен альтернативный способ получения фосфатидилсерина из сои. В настоящее время в продажу поступает фосфатидилсерин, получаемый из растений, а не из животных. Так, для желающих улучшить свои умственные способности продается напиток под названием «Фанкшн Брейник» («Function Brainiac»), содержащий эмульсию соевого фосфатидилсерина.
Методы получения и очистки фосфатидилсерина, как правило, включают ферментативное превращение фосфатидилхолина в фосфатидилсерин путем реакции переэтерификации (называемой также трансфосфатидилированием), катализируемой ферментом фосфолипазой D, с последующей очисткой, достигаемой главным образом путем экстракции фосфатидилсерина органическими растворителями.
Обычно для синтеза фосфатидилсерина путем ферментативного превращения используют либо двухфазные системы, содержащие воду и органический растворитель, либо водную среду; процесс идет в присутствии фосфолипазы D, получаемой из ферментационного бульона штаммов микроорганизмов, продуцирующих внеклеточную фосфолипазу D.
Например, в ЕР-А-1048738 описан способ получения фосфатидилсерина путем взаимодействия фосфолипида с серином в водной дисперсной системе в присутствии фосфолипазы D и солей кальция.
Перечисление или обсуждение ранее опубликованных работ в данном описании не следует непременно считать признанием того, что таковые работы входят в существующий уровень данной области техники или же общеизвестны.
Реакция трансфосфатидилирования, в ходе которой фосфатидилхолин превращается в фосфатидилсерин, конкурентна с гидролизом фосфатидилхолина, в ходе которого образуется фосфатидная кислота. Поэтому используются такие штаммы микроорганизмов, которым свойственна более высокая активность трансфосфатидилирования нежели гидролиза.
На сегодняшний день все еще есть потребность в экономичном и эффективном способе получения фосфатидилсерина с помощью фосфолипазы D.
Обнаружено, что фосфолипаза D, полученная из моркови, может быть использована для эффективного производства продукта переэтерификации - фосфатидилсерина.
Согласно первому объекту данного изобретения предлагается способ получения фосфатидилсерина, включающий взаимодействие фосфолипида с серином в присутствии воды, фосфолипазы D из моркови и, по меньшей мере, одного поверхностно-активного вещества. Таким образом, данный способ включает ферментативное превращение фосфолипида в фосфатидилсерин путем реакции переэтерификации, катализируемой ферментом фосфолипазой D, полученной из моркови.
Во втором объекте данного изобретения предлагается способ получения фосфатидной кислоты, включающий гидролиз фосфолипида в присутствии воды и фосфолипазы D из моркови.
Фосфолипид, пригодный для использования в способах по данному изобретению, может быть синтетическим или же природным. Типичные примеры пригодных фосфолипидов включают фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол, сфингомиелин и их смеси. Предпочтительным фосфолипидом для использования в способах по данному изобретению является фосфатидилхолин.
Фосфолипид получают предпочтительно из животных или растительных источников, и он может включать такие природные вещества, как лецитин, цефалин и сфингомиелин. Особенно предпочтителен лецитин.
Лецитин содержит смесь гликолипидов, триглицеридов и фосфолипидов, а именно фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол, и может быть получен из природных либо синтетических источников. Предпочтительно лецитин для использования в способах по данному изобретению получают из таких природных источников, как соевые бобы или рапсовое семя при помощи обычных методов. Альтернативно лецитин может быть получен из животных источников, таких как яичные желтки. Содержание фосфолипидов в лецитине для использования в способах по данному изобретению предпочтительно выше 15 мас.%, более предпочтительно выше 25 мас.%, например, более 30 мас.%. Например, содержание фосфолипидов в лецитине может быть в диапазоне от 25 до 60 мас.%, например от 30 до 40 мас.%. Из имеющихся в продаже препаратов лецитина для использования в данном изобретении пригоден мембранол-35 (Membranol-35).
В предпочтительном воплощении данного изобретения фосфолипид представлен эмульсией типа «масло в воде», содержащей лецитин.
Начальная концентрация фосфолипида в общем реакционном объеме составляет предпочтительно от 0,5 до 25 мас.%, например от 1 до 20 мас.% или от 2 до 15 мас.%, более предпочтительно от 3 до 15 мас.%. Предпочтительно, чтобы более 15 мас.% фосфолипида составлял фосфатидилхолин, например от 20 до 80 мас.%, от 25 до 60 мас.% или от 25 до 40 мас.%.
В способе согласно второму объекту данного изобретения фосфолипид гидролизуется предпочтительно в присутствии, по меньшей мере, одного поверхностно-активного вещества.
В способах по данному изобретению могут использоваться ионогенные или неионогенные поверхностно-активные вещества, предпочтительно ионогенные. Пригодные поверхностно-активные вещества включают анионогенные, например соли карбоновых кислот, в частности холиевой кислоты. Пригодные соли включают, например, соли пищевой категории, в частности натрия. Предпочтительным поверхностно-активным веществом является холат натрия.
Начальная концентрация поверхностно-активных веществ в общем реакционном объеме составляет предпочтительно от 0,5 до 15 мас.%, например от 1 до 10 мас.%, более предпочтительно от 1,5 до 8 мас.%.
В способе согласно первому объекту данного изобретения используется серии в форме D- либо L-энантиомера или же рацемической смеси. Предпочтителен L-серин.
Начальное массовое соотношение серина и фосфолипида в общем объеме реакционной смеси составляет предпочтительно от 10:1 до 1:1, например от 7:1 до 3:1.
Начальная концентрация серина в общей реакционной смеси составляет предпочтительно от 5 до 70 мас.%, например от 10 до 60 мас.%, более предпочтительно от 20 до 50 мас.%, например от 25 до 40 мас.%.
В способах по данному изобретению используется фосфолипаза D из моркови. Как правило, фосфолипаза D присутствует в общей реакционной смеси в количестве более 0,0005 мас.%, наиболее предпочтительно более 0,001 мас.% или более 0,002 мас.%.
Способы по данному изобретению осуществляются предпочтительно при рН выше 7, наиболее предпочтительно в интервале рН от 7 до 10, например от 7 до 9. Желаемый рН может быть достигнут известными в данной области техники методами, например добавлением какого-либо подходящего основания (например, гидроокиси аммония).
Способы по данному изобретению могут осуществляться при любой подходящей температуре, например при температуре от 25 до 60°С, скажем от 25 до 45°С. Как правило, способы по данному изобретению осуществляются при комнатной температуре, а именно при температуре от 21 до 25°С.
Фосфолипид перед смешиванием с другими компонентами реакционной смеси предпочтительно диспергируют в водной среде. Это может быть достигнуто просто путем механического перемешивания фосфолипида в воде в течение подходящего периода времени.
Чтобы способствовать диспергированию фосфолипида в водной среде, способы по данному изобретению предпочтительно содержат стадию приготовления водной смеси фосфолипида и поверхностно-активного вещества. Так, в способе по первому объекту данного изобретения водную смесь фосфолипида и поверхностно-активного вещества готовят перед взаимодействием с серином. В способе по второму объекту данного изобретения водную смесь фосфолипида и поверхностно-активного вещества готовят предпочтительно перед гидролизом фосфолипида. Водная смесь предпочтительно должна быть гомогенной.
Водная смесь фосфолипида и поверхностно-активного вещества содержит предпочтительно от 2 до 50 мас.% фосфолипида, например от 5 до 40 мас.% или от 5 до 30 мас.%, более предпочтительно от 10 до 20 мас.%. Количество поверхностно-активного вещества в водной смеси составляет предпочтительно от 0,1 до 25 мас.%, например от 3 до 20 мас.%, более предпочтительно от 4 до 15 мас.%, например от 5 до 12 мас.%
Исходно фосфолипаза D берется предпочтительно в водной среде, содержащей, как правило, от 5 до 25 мас.% фосфолипазы D, наиболее предпочтительно от 10 до 20 мас.%.
2+
В способе согласно первому объекту данного изобретения взаимодействие фосфолипида с серином осуществляется предпочтительно в присутствии ионов одного или более металлов. Аналогично, в способе согласно второму объекту данного изобретения гидролиз фосфолипида осуществляется предпочтительно в присутствии ионов одного или более металлов. Это обычно одно- или двухвалентные ионы, например ионы кальция, калия, натрия, магния и их смеси. Например, в реакционную смесь могут быть добавлены галоидные соли подходящих металлов. Особенно предпочтительны соли Са, предпочтительно в форме хлорида кальция. Концентрация ионов металлов составляет предпочтительно от 0,05 до 0,5 М.
В способе согласно первому объекту данного изобретения серии используется предпочтительно в форме водного раствора, который смешивают с другими компонентами реакционной смеси. Содержание серина в водном растворе составляет обычно от 50 до 80 мас.%, например от 55 до 75 мас.%, более предпочтительно от 60 до 70 мас.%. Предпочтительно, чтобы водный раствор серина имел рН выше 7, например от 7 до 9. Это может быть достигнуто известными в данной области техники методами, например добавлением какого-либо подходящего основания (например, гидроокиси аммония).
В способах по данному изобретению компоненты реакционной смеси можно смешивать в любом порядке.
В предпочтительном воплощении способ согласно первому объекту данного изобретения содержит следующие стадии:
(i) смешивание водной смеси фосфолипида и поверхностно-активного вещества с серином; и
(ii) добавление фосфолипаза D к реакционной смеси, полученной по пункту (i).
Предпочтительно, чтобы реакционная смесь, полученная на стадии (i), перемешивалась (механически) перед добавлением в нее фосфолипазы D на стадии (ii). Обычно реакционную смесь, полученную на стадии (ii), перемешивают и оставляют стоять некоторое время, например, по меньшей мере, 1 час (или, по меньшей мере, 5 часов, или, по меньшей мере, 10 часов, или, по меньшей мере, 20 часов).
В альтернативном воплощении способа согласно первому объекту данного изобретения фосфолипазу D прибавляют в водную смесь фосфолипида и одного или более поверхностно-активных веществ, прежде чем в реакционную смесь добавляют серин.
Способы по данному изобретению осуществляются предпочтительно в полное или значительное отсутствие каких бы то ни было добавок органических растворителей (включая спирты, содержащие 1-12 атомов углерода, например метанол, этанол, н-пропанол и изопропанол; кетоны, содержащие 3-8 углерода, и алканы, содержащие 1-12 атомов углерода, например толуол, гексан и бензол); и апротонные растворители, например диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид, ацетонитрил и N-метилпирролидон).
В способе получения фосфатидилсерина количество образующегося фосфатидилсерина по отношению к массе фосфатидилхолина в исходном фосфолипиде предпочтительно выше 10%, например больше 12% или 15%, наиболее предпочтительно больше 18% или 20%.
В способе получения фосфатидной кислоты количество образующейся фосфатидной кислоты по отношению к массе фосфатидилхолина в исходном фосфолипиде составляет предпочтительно от 20 до 50%, например от 25 до 45%.
Фосфатидилсерин может быть выделен из реакционной смеси путем фильтрования. Фильтрат промывают (необязательно) для удаления серина и ионов металлов. Затем фосфатидилсерин может быть, если требуется, забуферен (необязательно).
Фосфолипаза D
Фосфолипаза D может быть выделена из моркови при помощи известных в данной области техники методов.
Особенно предпочтительный способ выделения фосфолипазы D из моркови включает следующие стадии:
(а) получение жидкого экстракта из моркови;
(б) соединение жидкого экстракта с осаждающим агентом, содержащим фосфолипиды, моно-, ди- или триглицериды или их смесь с добавлением по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества для получения суспензии, содержащей супернатант и осадок; и
(в) отделение и сбор осадка из суспензии, полученной по пункту (б).
Жидкий экстракт моркови - это предпочтительно сок или подобный жидкий материал. Жидкий экстракт может быть не совсем жидким и содержать некоторое количество твердого материала. Как правило, морковь охлаждают до температуры ниже комнатной (т.е. ниже 25°С, например до температуры от 1 до 10°С или от 2 до 7°С), моют и режут на мелкие кусочки. Из измельченного материала выжимают сок известными в данной области техники методами, например при помощи пресс-фильтра или бытовой соковыжималки.
В некоторых случаях часть содержащейся в моркови фосфолипазы D остается в твердой фазе (выжимках) после первого отделения сока. Из этого нерастворимого материала можно (необязательно) извлечь фосфолипазу D, добавив воду и повторив соковыжимающую обработку. Специалисты в данной области техники оценят по достоинству тот факт, что порции жидкого экстракта, полученные при последовательных соковыжимающих обработках, можно объединить и вместе использовать как исходный материал для стадии (а).
Описанный выше способ получения жидкого экстракта для стадии (а) осуществляется предпочтительно при температуре ниже комнатной (т.е. ниже 25°С), например от 1 до 10°С или от 2 до 7°С. Полученный в итоге супернатант собирают и, если его нужно сохранить впрок, замораживают предпочтительно в жидком азоте и хранят при температуре около - 70°С.
Для того чтобы контролировать эффективность вышеописанного способа экстракции фосфолипазы D из моркови и убедиться в получении адекватных ее количеств, могут быть использованы обычные методы определения ферментативной активности фосфолипазы D.
Применяя вышеописанный способ экстракции, можно получить жидкий экстракт из моркови с высоким выходом. Например, из 1 кг сырой моркови можно получить 0,6-0,67 л жидкого экстракта.
Жидкий экстракт, полученный описанным выше способом, может содержать остаточные частицы твердой фазы. Например, неочищенный морковный экстракт может содержать плавающие на поверхности липиды, насыщенные каротином. Поэтому в предпочтительном воплощении данного изобретения жидкий экстракт перед стадией (б) подвергают процедуре осветления для получения осветленного жидкого экстракта. Таким образом, предпочтительно, чтобы жидкий экстракт был осветленным.
Способ осветления обычно содержит контактирование жидкого экстракта с осветляющим агентом, содержащим ионы одного или более металлов, для получения суспензии, содержащей осветленный жидкий экстракт и осадок. Полученный в итоге осветленный жидкий экстракт затем отделяют и собирают из суспензии.
Таким образом, в предпочтительном воплощении данного изобретения способ выделения фосфолипазы D из моркови включает следующие стадии, предшествующие стадии (б):
А. Контактирование жидкого экстракта, полученного на стадии (а), с осветляющим агентом, содержащим ионы одного или более металлов, для получения суспензии, содержащей осветленный жидкий экстракт и осадок; и
Б. Отделение и сбор осветленного жидкого экстракта из суспензии, полученной на стадии (А).
Как правило, ионы одного или более металлов в осветляющем агенте являются одно- или двухвалентными, например ионы кальция, натрия, калия, магния и их смеси. Например, можно использовать, как описано выше, галоидную соль подходящего ионообразующего металла. Предпочтительны ионы кальция, обычно в составе хлорида кальция.
Концентрация ионов одного или более металлов на стадии (А) составляет предпочтительно от 20 до 60 мМ, например от 30 до 50 мМ или от 35 до 45 мМ.
Контактирование жидкого экстракта, полученного на стадии (а), с осветляющим агентом на стадии (А) осуществляется предпочтительно при температуре ниже комнатной (т.е. ниже 25°С), например при температуре от 1 до 20°С, более предпочтительно от 1 до 15°С, например от 2 до 10°С или от 2 до 7°С. После контактирования с осветляющим агентом смесь тщательно перемешивают (механически).
Стадия (А) осуществляется предпочтительно при рН от 4 до 9. Наиболее предпочтительно, чтобы рН был выше 7, например от 7 до 9 или от 7 до 8. Желаемый рН достигается путем известных в данной области техники методов, например добавлением какого-либо подходящего основания (гидроокиси натрия или гидроокиси аммония).
В предпочтительном воплощении стадии (А) после того, как полученный на стадии (а) жидкий экстракт контактировал с осветляющим агентом и рН был доведен до желаемого, смесь предпочтительно остужают до температуры около 0°С и оставляют на некоторое время (например, около 20 мин), достаточное для формирования осадка.
Осветленный жидкий экстракт, полученный на стадии (А), можно отделить от осадка путем известных в данной области техники методов, например центрифугированием или фильтрованием. Например, на стадии (Б) суспензию можно профильтровать и фильтрат центрифугировать при 9000 об/мин в течение 15 мин.
В ходе стадии (Б) температуру поддерживают предпочтительно ниже комнатной (т.е. ниже 25°С), например от 1 до 20°С, более предпочтительно от 1 до 15°С, например от 2 до 10°С или от 2 до 7°С.
Как правило, на стадиях (А) и (Б) содержание фосфолипазы D в осветленном жидком экстракте незначительно уменьшается по сравнению с неосветленным жидким экстрактом. Например, в результате осветления содержание фосфолипазы D в осветленном жидком экстракте по сравнению с неосветленным может стать меньше на 10 мас.%.
Осаждающий агент предпочтителен в форме водной эмульсии. Предпочтительно осаждающий агент содержит фосфолипиды. Эти фосфолипиды могут быть синтетические или природные. Типичные примеры фосфолипидов, которые могут присутствовать во втором осаждающем агенте, включают: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол, сфингомиелин и их смеси. Предпочтительным фосфолипидом является фосфатидилхолин.
Осаждающий агент, используемый в способе выделения фосфолипазы D из моркови, может иметь природное происхождение, т.е. быть производным веществ из животных или растительных источников - лецитина, цефалина и сфингомиелина. Предпочтителен осаждающий агент из лецитина.
Лецитин содержит смесь гликолипидов, триглицеридов и фосфолипидов (а именно, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол) и может иметь природное происхождении или быть полученным из синтетических источников. Предпочтительно, чтобы лецитин, используемый для получения осаждающего агента, был получен из животных или растительных источников, например соевых бобов, яичных желтков или рапсового семени; для его получения применяют обычные методы переработки. Из числа имеющихся в продаже препаратов лецитина пригоден, например, мембранол-35 (Membranol-35, Lipid Nutrition B.V., Wormerveer, the Netherlands).
Содержание фосфолипидов в лецитине, используемом для получения осаждающего агента, предпочтительно выше 15 мас.%, более предпочтительно выше 25 мас.%, например выше 30 мас.% или 50 мас.%.
В предпочтительном воплощении данного изобретения содержание фосфолипидов в осаждающем агенте оставляет от 0,1 до 7 мас.%, например от 0,5 до 4 мас.%, более предпочтительно от 0,8 до 3 мас.% или от 0,8 до 2 мас.%.
Содержание фосфолипидов на стадии (б) в общем реакционном объеме составляет предпочтительно от 0,05 до 1 мас.%, более предпочтительно от 0,1 до 0,5 мас.%, например от 0,1 до 0,3 мас.%.
Содержание фосфатидилхолина относительно массы фосфолипидов в осаждающем агенте составляет предпочтительно более 15 мас.%. Например, содержание фосфатидилхолина может составлять от 20 до 100 мас.%, скажем от 20 до 80 мас.%, от 25 до 60 мас.% или от 25 до 40 мас.%.
2+
Осаждающий агент содержит также (необязательно) ионы одного или более металлов, которые являются предпочтительно одно- или двухвалентными, например ионы натрия, калия, кальция, магния и их смеси. Например, осаждающий агент может содержать водный раствор галоидной соли подходящего металла, предпочтительно ионы кальция (Са), предпочтительно в составе хлорида кальция.
Концентрация ионов одного или более металлов на стадии (б) составляет предпочтительно от 20 до 60 мМ, например от 30 до 50 мМ или от 35 до 45 мМ.
В предпочтительном воплощении данного изобретения, в котором жидкий экстракт подвергается осветлению (стадии (А) и (Б)), ценно то, что ионы одного или более металлов уже присутствуют в осветленном жидком экстракте и, следовательно, не является необходимым, чтобы их содержал осаждающий агент. Однако из-за того, что на стадии (Б) некоторое количество ионов кальция может быть связано в осадке, в предпочтительном воплощении данного изобретения осаждающий агент содержит ионы одного или более металлов, предпочтительно в таком количестве, чтобы концентрация ионов металлов на стадии (б) оказывалась в пределах предпочтительных диапазонов концентраций, приведенных выше.
4
24
Осаждающий агент, кроме того, содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество. Во втором осаждающем агенте присутствуют предпочтительно ионогенные или неионогенные поверхностно-активные вещества, причем ионогенные поверхностно-активные вещества особо предпочтительны. Пригодные ионогенные поверхностно-активные вещества включают анионогенные поверхностно-активные вещества, например соли карбоновых кислот (холиевой и т.п.), соли неразветвленных алкилсульфатов С-С (например, додецилсульфат натрия) или их смеси. Пригодные соли холиевой кислоты включают, например, соли натрия и другие соли пищевой категории. Предпочтительным поверхностно-активным веществом является додецилсульфат натрия.
Содержание поверхностно-активного вещества в осаждающем агенте составляет предпочтительно от 0,05 до 5 мас.%, более предпочтительно от 0,1 до 3 мас.% или от 0,2 до 1,5 мас.%.
Содержание поверхностно-активного вещества на стадии (б) в общем реакционном объеме составляет предпочтительно от 0,01 до 3 мас.%, более предпочтительно от 0,05 до 1,0 мас.%, наиболее предпочтительно от 0,08 до 0,16 мас.%.
В предпочтительном воплощении данного изобретения осаждающий агент получают в виде водной эмульсии. Предпочтительно, чтобы осаждающий агент получали в виде гомогенной смеси. Это может быть достигнуто, например, просто механическим перемешиванием осаждающего агента в водной среде в течение подходящего периода времени. Присутствие поверхностно-активного вещества может способствовать диспергированию компонентов осаждающего агента в водной среде.
рН осаждающего агена составляет предпочтительно более 7, предпочтительно от 7 до 9, например от 7 до 8,5 или от 7,2 до 8. Желаемый рН достигается с помощью известных в данной области техники способами, например добавлением какого-либо подходящего основания (гидроокиси натрия, гидроокиси аммония).
Стадия (б) способа по данному изобретению осуществляется предпочтительно при температуре ниже комнатной, т.е. ниже 25°С. Наиболее предпочтительно, чтобы стадия (б) осуществлялась при температуре от 0 до 15°С, например от 1 до 10°С или от 1 до 5°С. Как правило, рН смеси на стадии (б) выше 7 (например, в интервале от 7 до 9, наиболее предпочтительно в интервале от 7 до 7,5).
Не вдаваясь в теорию, можно считать, что в ходе стадии (б) фосфолипаза D в жидком экстракте адсорбирована, образует комплекс или иначе связана с осадком, образовавшимся из ионов одного или более металлов и поверхностно-активного вещества. Например, считается, что когда жидкий экстракт приходит в соприкосновение с осаждающим агентом, содержащим додецилсульфат натрия (SDS), в присутствии хлорида кальция, фосфолипаза D адсорбируется на образующемся осадке кальций/SDS.
Стадия (б) осуществляется предпочтительно до того момента, когда по меньшей мере 30 мас.% или по меньшей мере 40 мас.% фосфолипазы D, присутствовавшей в жидком экстракте, окажется в осадке; более предпочтительно, если по меньшей мере 50 мас.%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60 мас.% или по меньшей мере 66 мас.% фосфолипазы D обнаруживается в осадке.
Хотя скорость образования осадка или перехода фосфолипазы D в осадок могут варьировать в зависимости от температуры и других переменных способа, стадия (б) осуществляется предпочтительно в течение, по меньшей мере, 5 мин, более предпочтительно долее 30 мин или 1 ч. Наиболее предпочтительно стадия (б) осуществляется в течение периода от 30 мин до 30 ч, например от 1 до 24 ч, от 1 до 10 ч, от 1 до 5 ч или от 1,5 до 2,5 ч.
Осадок, образовавшийся на стадии (б), может быть отделен от супернатанта путем известных в данной области техники методов, например центрифугированием и/или фильтрованием. Например, на стадии (в) суспензию можно центрифугировать при 6000 об/мин в течение около 15 мин.
В ходе стадии (в) температура поддерживается предпочтительно ниже комнатной, например в интервале от 1 до 20°С; более предпочтительно от 1 до 15°С, например от 2 до 10°С или от 2 до 7°С.
Как правило, собранный осадок затем высушивают. Высушивание осадка осуществляется путем известных в данной области техники методов. В предпочтительном воплощении данного изобретения осадок суспендируют в воде, замораживают (например, в жидком азоте) и лиофилизируют.
Чтобы увеличить срок хранения или сохранить активность фосфолипазы D, ее препарат предпочтительно лиофилизируют в присутствии хлорида калия, гистидин-НСl, хлорида кальция, ацетата натрия или их смесей, обычно при рН от 5 до 7. Наиболее предпочтительно, фосфолипазу D, полученную по данному изобретению, лиофилизируют в присутствии хлорида калия и ацетата натрия, предпочтительно при рН от 5 до 6.
Количество полученной фосфолипазы D относительно общего объема жидкого экстракта предпочтительно более 0,2 мас.%, например более 0,3 мас.% или более 0,5 мас.%, наиболее предпочтительно более 0,7 мас.%.
Следующие примеры иллюстрируют, но никоим образом не ограничивают данное изобретение. В этих примерах и описаниях все проценты, доли и отношения даются в мас.%, если не указано иного.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение фосфатидилсерина
Фосфатидилсерин (PS) синтезировали из мембранола-35 ((Membranol-35, Lipid Nutrition B.V., Wormerveer, the Netherlands) и серина; катализатором служила фосфолипаза D (PLD), полученная из моркови (см. примеры 2 и 3 ниже).
Готовили следующие растворы:
A. Получение эмульсии мембранол-холат
Смешивали 15 мл 10%-ного холата натрия с 2,5 мл воды и 7,5 г мембранола и встряхивали в течение около 1 ч до тех пор, пока не образовывалась гомогенная смесь.
Б. Получение суспензии серина
4
Смещивали 200 мг сухого порошка серина с 260 мкл воды и 40 мкл концентрированного NHOH.
B. Получение суспензии PLD
Смешивали 32 мг лиофилизированной PLD, полученной, как описано в Примере 2 ниже, с 200 мкл воды.
Реакция переэтерификации
2
Прибавляли 200 мкл суспензии Б к 250 мг препарата А. Смесь хорошо взбалтывали и встряхивали, после чего добавляли в нее 20 мкл ферментативного препарата В и смесь хорошо перемешивали. Затем прибавляли 20 мкл 6 М раствора СаСl. Реакционную смесь тщательно перемешивали, после чего оставляли без перемешивания при комнатной температуре на 22 ч.
Анализ реакционной смеси
1) Реакционную смесь быстро экстрагировали, встряхивая с 1 мл смеси метанол/хлороформ (1:2 объем/объем). Разделяли фазы путем непродолжительного центрифугирования; органические (нижние) фазы разбавляли в 10 раз смесью метанол/хлороформ (1:2 объем/объем). Аликвоты (5 мкл) органических экстрактов и контрольный раствор PS наносили на сдвоенные пластины для тонкослойной хроматографии в силикагеле на одном большом листе.
2) Хроматографировали смесью хлороформ/метанол/вода (100:50:3).
4
3
4
4
3
4
3) После высушивания хроматографический лист разделяли на две части (пластины). Одну окрашивали 1%-ным раствором нингидрина в ацетоне и затем нагревали при около 50°С в течение 10 мин, пока не появлялись фиолетовые пятна в местах присутствия PS. Другую часть окрашивали CuSO-HPO (погружали в водный раствор 0,63 М CuSO/0,85 М НРО) и затем нагревали при 110°С в течение 30 мин, пока не появлялись темно-серые пятна в местах присутствия липидов.
Количественное определение фосфолипидов и фосфатидшсерина(РS)
Применяли метод, описанный Vaskovsky et al., "A universal reagent for phospholipid analysis" J.Chromat. (1975), vol.114, N1, pages 129-141.
Содержание в мас.% фосфолипидов в реакционной смеси (относительно массы фосфатидилхолина (PC) в мембраноле-35) было следующим: PS около 20-25%, PC около 40-45%, фосфатидная кислота (РА) около 35%.
Пример 2
Получение PLD из моркови осаждением при помощи Ca-SDS-Membranol-35
Сырую морковь (3,9 кг) сначала охлаждали до 4°С, мыли и измельчали. Получали сок с помощью соковыжималки Braun МР80 при 4°С. Ту PLD, которая оставалась в морковных выжимках, извлекали путем повторной обработки выжимок в соковыжималке. В совокупности было получено 2400 мл морковного сока и 1500 г выжимок. Сок фильтровали через 4 слоя марли. Профильтрованный сок центрифугировали при 9000 об/мин (центрифуга Beckman J-21, ротор JA-14) в течение 15 мин при 4°С. После центрифугирования полученный супернатант (2300 мл) ярко-желтого цвета замораживали в жидком азоте и хранили при - 70°С.
2
4
Морковный сок быстро размораживали теплой водой, после чего помещали в водоледяную баню. К 300 мл размороженного сока медленно, постоянно перемешивая, прибавляли 14 мл 1 М раствора СаСl до конечной концентрации 40 мМ. Осторожно доводили рН смеси до 7,4, добавляя 1 М раствор NHOH, после чего оставляли на 20 мин при 0°С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 6000 об/мин (центрифуга Beckman J-21, ротор JA-14) в течение 15 мин при 4°С и собирали супернатант (осветленный сок).
2
4
К 160 мл осветленного сока добавляли 16 мл эмульсии SDS-Membranol-35 (см. получение эмульсии в примере 3) и смесь хорошо перемешивали. Затем прибавляли небольшими порциями (по 1 мл) 8 мл 1 М раствора СаСl. После этого при перемешивании по каплям прибавляли 5 мл 1 н. раствора NHOH до рН около 7,15. Всю смесь выдерживали в ледяной бане в течение приблизительно 2 ч. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 6000 об/мин (центрифуга Beckman J-21, ротор JA-14) в течение 15 мин при 4°С. Осадок суспендировали в около 5 мл воды, замораживали в жидком азоте и лиофилизировали.
После лиофилизации было получено 1,29 г лиофилизованного препарата. Из 1 мл морковного сока получалось приблизительно 8 мг порошка - чистого порошка ферментного препарата.
Пример 3
Получение эмульсии SDS-Membranol-35
К 1,2 мл мембранола-35 ((Membranol-35, Lipid Nutrition B.V.,Wormerveer, the Netherlands) при перемешивании прибавляли 0,15 мл 1 н. раствора NaOH и 2,4 мл 10%-ного водного раствора додецилсульфата натрия (SDS). Затем добавляли воду небольшими порциями (5 раз по 1 мл) при энергичном перемешивании до тех пор, пока не образовывалась гомогенная смесь. Добавляли еще воду до общего количества 40 мл и смесь перемешивали около 30 мин на встряхивателе.