Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу Cre
ESCHERICHIA coli BL21(DE3)/ pET32 v 11-Cre CELL STRAIN PRODUCING SITE-SPECIFIC Cre RECOMBINASE

Область техники настоящего изобретения
Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной биологии и представляет собой способ получения штамма генномодифицированного организма, продуцирующего каталитически активную рекомбиназу Cre.
Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения №075-15-2019-1661 от 31.10.2019.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
E.coli
E.coli
Система сайт-специфической рекомбинации Cre-LoxP из бактериофага P1, инфицирующего клетки , получила широкое распространение для геномной инженерии и генетического анализа модельных организмов, позволяя исследовать функции отдельных генов или регуляторных элементов в контексте организма (Branda and Dymecki, 2004; McLellan et al., 2017; Sauer, 1998). Система Cre-LoxP состоит из тирозиновой рекомбиназы Cre и сайтов рекомбинации длиной 34 п.н., называемых LoxP (Sternberg and Hamilton, 1981). Сайт LoxP дикого типа, ATAACTTCGTATAatgtatgcTATACGAAGTTAT, имеет сходную архитектуру с сайтом FRT и состоит из двух инвертированных повторов длиной 13 п.н. (показаны заглавным шрифтом), разделенных ассиметричным спейсером длиной 8 п.н. (показан строчным шрифтом). Нуклеотидная последовательность спейсера определяет ориентацию сайта LoxP в геноме или генетических конструкциях. В природе функция системы Cre-LoxP заключается в циркуляризации генома фага P1 в плазмиду, разделении физически сцепленных кольцевых плазмид и поддержании копийности таких плазмид в клетках  (Austin et al., 1981;  et al., 2004). В модельных системах, в зависимости от взаимной ориентации LoxP сайтов в геноме, в результате действия Cre может происходит вырезание, интеграция, инверсия или транслокация фрагментов ДНК.
in vivo
Для манипуляций с геном клеток млекопитающих  систему Cre-LoxP впервые использовали на модели клеток в культуре (Sauer and Henderson, 1988), и впоследствии на модели трансгенных мышей (Lakso et al., 1992; Orban et al., 1992). К 2017 году было опубликовано более 3000 работ с использованием системы Cre-LoxP (McLellan et al., 2017). Система Cre-LoxP часто используется для создания мышиных моделей кондиционного нокаута генов. В этом случае получают линию трансгенных мышей у которых один или несколько критически важных экзонов гена фланкированы сайтам LoxP (так называемые «floxed» линии мышей). Для индукции нокаута гена такую линию животных скрещивают с «драйверными» линиями трансгенных животных, которые экспрессируют рекомбиназу Cre под контролем убиквитарных, тканеспецифичных или индуцибельных промоторов. В результате действия Cre удаляется фланкированный LoxP сайтами фрагмент генома, что приводит к инактивации целевого гена (McLellan et al., 2017).
К настоящему времени получены и охарактеризованы более двух тысяч «драйверных» линий трансгенных мышей и множество «floxed» линий животных (McLellan et al., 2017). Кроме того, получены репортерные линии мышей, позволяющие оценить эффективность действия Cre по мониторингу экспрессии репортерных генов, таких как β-галактозидаза или Egfp. Многие из этих линий животных доступны для исследователей и депонированы в питомники, например, лабораторию Jackson, а информация о таких линиях мышей может быть найдена на веб-сайте https://mice.jax.org. Таким образом, вот уже почти 30 лет с момента первого применения на модели трансгенных мышей в 1992 году система Cre-LoxP остается крайне востребованной и актуальной для генетического анализа модельных животных, и прежде всего домовой мыши.
Система Cre-LoxP также используется в методе геномной инженерии RMCE (Recombinase Mediated Cassette Exchange, опосредованный-рекомбиназой обмен кассет), который изначально был разработан на основе системы сайт-специфической рекомбинации Flp-FRT (Schlake and Bode, 1994). Практическая возможность использования Cre-LoxP при RMCE основана на идентификации сайтов LoxP с мутированными спейсерными последовательностями, которые могут рекомбинировать только между собой, но не с сайтами LoxP c другими спейсерными последовательностями (Siegel et al., 2001). Как и в случае системы Flp-FRT, использование двух LoxP сайтов с различающимися спейсерами позволяет строго сохранять ориентацию фрагмента ДНК после рекомбинации, и тем самым осуществлять точную замену последовательности ДНК в геноме, фланкированной двумя сайтами LoxP с различными спейсерами, на внесенную в клетку последовательность ДНК, фланкированную такими же сайтами LoxP (Turan et al., 2011; Turan et al., 2013).
ROSA26
Кроме того, на основе системы Cre-LoxP была разработана технология, названная FLEX, применение которой базируется на инверсии фрагментов ДНК. В системе FLEX два репортерных гена фланкированы парами сайтов LoxP с различающимися спейсерами и ориентированы так, что один ген находится под контролем промотора и экспрессируется, а второй ген расположен в обратной ориентации ( et al.). В результате инверсии с использованием одной пары сайтов LoxP прекращается экспрессия первого гена и активируется экспрессия второго гена, после чего с использованием второй пары сайтов LoxP удаляется небольшой фрагмент экспрессионной кассеты. Такая система позволяет осуществлять эффективный мониторинг активности Cre на уровне единичных клеток ( et al.). Технология FLEX находит применение для анализа трансгенных животных. Например, получена линия мышей, несущая в локусе  кассету FLEX с Egfp и субъединицей А дифтерийного токсина, которая позволяет за счет Cre-опосредованной рекомбинации активировать экспрессию токсина и тем самым элиминировать определенные популяции клеток в организме мыши (Plummer et al., 2017). Технология Cre-опосредованной рекомбинации с использованием стохастических комбинаций инверсии и удаления фрагментов ДНК была элегантным образом реализована в системе Brainbow для мечения нейронов головного мозга с помощью комбинаций флуоресцентных белков (Cai et al., 2013; Livet et al., 2007).
Появление технологии геномного редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9 позволило существенно упростить и ускорить процесс получения трансгенных животных (Low et al., 2016; Singh et al., 2015), что позволяет эффективно получать как новые «драйверные» линии мышей с заданной тканеспецифичностью экспрессии рекомбиназы Cre, так и продуцировать линии животных, несущие в геноме сайты LoxP, для создания кондиционного нокаута гена или проведения RMCE. Это определяет важность пересмотра и оптимизации методов генетического анализа с использованием сайт-специфической рекомбинации. В настоящий момент, все более широкое применение находят технологии редактирования генома без использования ДНК (DNA free genome editing), что, прежде всего, подразумевает доставку в клетки систем редактирования генома в виде рибонуклеопротеинового комплекса белка Cas9 и гидовой РНК (РНП), а не в виде экспрессионных плазмид. Использование РНП более эффективно, снижает риск модификации нецелевых локусов генома и элиминирует возможность случайной интеграции плазмидной ДНК, кодирующей Cas9 и гидовые РНК, в нецелевой сайт генома (Metje-Sprink et al., 2019). Все эти преимущества присущи и использованию сайт-специфических рекомбиназ в виде белков. В частности, первое сообщение о применение рекомбинантного белка Cre для индукции сайт-специфической рекомбинации датируется 1993 годом (Baubonis and Sauer, 1993). Альтернативные способы доставки Cre в клетки млекопитающих подразумевают использование плазмид или мРНК, однако плазмидная ДНК может интегрировать в случайное место генома, что требует дополнительной проверки клеточной линии или модельного организма на предмет интеграции плазмиды. Использование мРНК сайт-специфических рекомбиназ достаточно эффективно (de Wit et al., 1998; Ponsaerts et al., 2004), однако при внесении мРНК требуется время для транскрипции и трансляции белка, что снижает эффективность рекомбинации и, в случае микроинъекций мРНК в зиготы, может способствовать формированию мозаицизма. Кроме того, для экспрессии Cre в соматических клетках организма можно использовать аденовирусы (Akagi et al., 1997). Однако, введение вируса экспериментальным животным может вызвать иммунный ответ, что неприемлемо при исследовании функции генов иммунной системы.
Кроме того, стандартная схема получения животных с кондиционным нокаутом подразумевает скрещивание линии животных, экспрессирующих рекомбиназу Cre, с линией животных, несущих фланкированный LoxP сайтами локус генома (McLellan et al., 2017). Это имеет ряд недостатков. Во-первых, многие линии животных, экспрессирующие Cre, были получены с помощью рандомного трансгенеза, и далеко не все такие линии были охарактеризованы на предмет идентификации сайтов интеграции трансгена и его копийности. Следовательно, в таком случае геном двойных трансгенов с кондиционным нокаутом целевого гена будет нести в одной из хромосом рандомно интегрированные фрагменты ДНК с экспрессионной кассетой для Cre, что может нарушать функции каких-либо генов или некодирующих РНК в месте интеграции трансгена. Помимо этого, имеется достаточно много свидетельств токсичности экспрессии Cre для клеток (McLellan et al., 2017). При получении двойных трансгенных животных в организме таких животных будет экспрессироваться Cre, конститутивно или определенных тканях и органах, что может вызвать токсический эффект, влияя на пролиферацию клеток или внутриклеточные сигнальные пути или за счет неспецифической модификации генома в местах криптических LoxP сайтов.
Drosophila melanogaster
Таким образом, использование системы сайт-специфической рекомбинации Cre-LoxP является одним из важных экспериментальных подходов функциональной геномики как у млекопитающих, так и других модельных организмов, таких как (Gurumurthy et al., 2019; McLellan et al., 2017; Sauer, 1998). Учитывая широкое распространение систем сайт-специфической рекомбинации, в том числе Cre-LoxP, для манипуляций с геномами модельных организмов или клеточных линий, актуальным представляется разработка и применение подходов, основанных на использовании рекомбинантного белка Cre. Это позволит повысить эффективность геномной инженерии, расширить арсенал используемых методов, элиминировать риск нецелевой интеграции генетических конструкций для экспрессии Cre в геном клетки-реципиента и минимизировать Cre-ассоциированную токсичность.
Очистка белка Cre
E.coli
E.coli
Бактериальные системы экспрессии рекомбинантных белков являются наиболее доступными и эффективными. В природе рекомбиназа Cre кодируется геномом бактериофага P1, инфицирующего клетки . Это свойство позволяет эффективно продуцировать рекомбинантный белок Cre в клетках  в каталитически активной форме без необходимости в оптимизации кодонного состава (Van Duyne, 2015).
Основные подходы к очистке рекомбинантного белка Cre из бактериальных систем экспрессии можно разделить на методы очистки Cre в нативном виде; методы аффинной очистки Cre, несущей соответствующие эпитопы; методы, комбинирующие аффинную очистку и хроматографические методы очистки нативного белка.
E.coli BL21
После открытия системы Cre-LoxP был разработан эффективный протокол очистки нативного рекомбинантного белка Cre из бактериальной системы экспрессии (Abremski and Hoess, 1984). В частности, Cre очищали с помощью хроматографии на фосфоцеллюлозной колонке (часто применявшуюся для очистки ДНК-модифицирующих ферментов (Lu and Erickson, 1997)) и гель-фильтрации на носителе Sephadex G-75, что позволяло получить белок с чистотой 98% (Abremski and Hoess, 1984). Данный протокол использовали и в последующих работах (Mack et al., 1992), однако, в этом случае Cre экспрессировали под контролем T7 промотора в штамме  (DE3), который широко применяется для продукции рекомбинантных белков в настоящее время и был использован в данном изобретении.
Дальнейшая модификация методов очистки нативного белка Cre была описана в работе (Ghosh and Van Duyne, 2002). Cre очищали с помощью комбинации двухстадийной катионообменной хроматографии на колонках SP и Mono S и последующей гидроксиапатитной хроматографии (Ghosh and Van Duyne, 2002). В другой работе нативный белок Cre для последующей кристаллизации очищали с использованием трехстадийной хроматографии на фосфоцеллюлозной колонке P11, катионообменной колонке Mono S и гель-фильтрации на носителе Superdex 200 (Ennifar et al., 2003).
Альтернативные методы очистки Cre основаны на использовании различных аффинных эпитопов. Например, Cre экспрессировали в виде слитого белка с MBP (Maltose binding protein), что позволяло проводить очистку рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии на амилозной колонке (Kolb and Siddell, 1996). В этой работе Cre модифицировали, добавляя NLS, эпитоп MBP отщепляли с помощью протеазы фактор Xa, а отщепленный белок MBP удаляли с помощью ионообменной хроматографии на колонке с Q-сефарозой. Важно отметить, что N-концевой MBP-эпитоп не влиял на каталитическую активность Cre (Kolb and Siddell, 1996). Данный метод очистки Cre впоследствии использовали для получения рекомбинантного белка, пригодного для микроинъекций в ооциты мыши (Luckow et al., 2009; Shmerling et al., 2005) или слитого с пептидами, обеспечивающими проникновение в клетки млекопитающих (Jo et al., 2001).
Saccharomyces cerevisiae
Sce
Bacillus circulans
Еще один вариант аффинной очистки Cre был основан на использовании белковых элементов интеинов, которые способны обеспечить посттрансляционное отщепление эпитопов от целевого белка без использования протеаз. Cre экспрессировали под контролем T7 промотора в виде слитого белка с интеином из (VMA интеин) и хитин-связывающим доменом из , который обеспечивал аффинную очистку рекомбинантного белка с помощью хитиновой колонки (Cantor and Chong, 2001). Для активации интеин-зависимого отщепления Cre колонку со связанным белком обрабатывали дитиотреитолом (ДТТ). Данный метод позволял получить белок Cre без каких-либо эпитопов используя лишь одностадийную аффинную хроматографию.
E.coli
Широкое применение для очистки Cre из клеток  нашла металл-хелатная аффинная хроматография в силу своей относительной простоты и эффективности (Block et al., 2009). Для получения рекомбинантного белка Cre c помощью металл-хелатной аффинной хроматографии часто использовали систему экспрессии компании Novagen, плазмидные векторы серии pET или pTriEx и соответствующие бактериальные штаммы, несущие лизоген DE3 (D'Astolfo et al., 2015; Jo et al., 2001; Martin et al., 2002; Peitz et al., 2002). В другом варианте белок Cre c 6-ти гистидиновым эпитопом очищали, используя систему QIAexpressionist (Qiagen) (Santoro and Schultz, 2002).
Кроме того, в качестве аффинного эпитопа для очистки Cre использовали глутатион-S-трансферазу (GST) из организма Schistosoma japonicum, проводя очистку на глутатионовой сефарозе. В частности, получали GST-Cre с последующим протеолитическим отщеплением GST эпитопа с помощью тромбина (Will et al., 2002) или использовали белок без отщепления GST (Jo et al., 2001). Полученный таким образом белок эффективно проникал в клетки млекопитающих в культуре и вызвал сайт-специфическую рекомбинацию. В другой работе Cre продуцировали в бактериальной системе экспрессии в виде слитого с GST белка, что не влияло на способность Cre связываться с LoxP сайтами (Kalinichenko et al., 2017) и позволяло осуществлять специфическую очистку фрагментов ДНК, содержащих LoxP сайты.
Как было отмечено выше, в ряде работ использовали комбинацию аффинной очистки и хроматографических методов очистки нативного белка. Например, Cre с N-концевым 6-гистидиновым эпитопом экспрессировали в векторе pET28b (Novagen) и очищали с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии и последующей катионообменной хроматографии. Полученный таким образом белок кристаллизовали в комплексе с олигонуклеотидными субстратами (Martin et al., 2002).
E.coli
Актуальность получения каталитически активной формы Cre из бактериальной системы экспрессии иллюстрируется коммерческим использованием таких белков. Например, полученный из  рекомбинантный белок Cre, слитый с Tat-пептидом вируса ВИЧ, и способный проникать в клетки без использования специальных реагентов для трансфекции белков, в настоящий момент коммерчески доступен от компаний Merck (https://www.merckmillipore.com/RU/ru/product/TAT-CRE-Recombinase,MM_NF-SCR508?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F) и Excellgen (https://www.excellgen.com/stem-cell-reagents-c-13/cre-recombinase-tatcre-tatnlscre-htnc-htncre-p-52931.html).
in vitro
Учитывая опубликованные ранее данные, получение рекомбинантного белка Cre в бактериальной системе экспрессии представляется наиболее оптимальным подходом. Описанный в данном изобретении белок Cre несет NLS и продуцируется слитым с N-концевыми 6-гистидиновым и S-эпитопами, которые при необходимости могут быть отщеплены с использованием TEV протеазы. Как показано на Фиг.6, рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, несущий N-концевые эпитопы, активен , что соответствует данными из работы (Kolb and Siddell, 1996) об отсутствии влияние N-концевых эпитопов на активность Cre. Использованный в данном изобретении метод очистки Cre основан на комбинации металл-хелатной аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе и катионообменной хроматографии на колонке Mono S.
In vitro
анализ активности рекомбиназы Cre
in vitro
E.coli
2
2
Рекомбиназа Cre способна катализировать реакцию сайт-специфической рекомбинации . Тест на рекомбинацию с использованием в качестве субстрата кольцевой формы плазмидной ДНК, несущей сайты LoxP, впервые был реализован с использованием клеточного лизата , содержащего белок Cre (Abremski et al., 1983), а затем и с использованием очищенного рекомбинантного белка Cre (Abremski and Hoess, 1984). В качестве субстрата в реакции рекомбинации можно использовать кольцевую суперскрученную плазмидную ДНК, линейные фрагменты ДНК или кольцевые молекулы с никами (Abremski et al., 1983). Основные принципы проведения теста на рекомбинацию были описаны в работе Abremski и коллег (Abremski and Hoess, 1984). В частности, реакционный буфер для Cre включал 50 мМ Трис pH=7.5, 33 мМ NaCl, 5 мМ спермидин и 500 мкг/мл БСА, при этом спермидин в реакционном буфере может быть замен на 10 мМ MgCl. Для прохождения реакции не требуется источников энергии, достаточно лишь солевого буфера и 10 мМ MgCl В качестве субстрата используется кольцевая плазмида, из которой в результате действия Cre формируются два кольцевых продукта реакции, которые для удобства детекции линеаризуются с помощью эндонуклеаз рестрикции и анализируются с помощью электрофореза в агарозном геле. Для терминации реакции смесь нагревают до +70°С для инактивации Cre.
in vitro
2
Начиная с 1984 года  тест для оценки активности рекомбинантного белка Cre применялся во множестве работ в разных форматах с некоторыми модификациями, наиболее часто протокол и состав реакционного буфера основывался на работе Abremski и коллег (Abremski and Hoess, 1984). Как правило, варьировали формат субстрата для реакции, используя кольцевые плазмиды, линеаризованные плазмиды, короткие синтетические двухцепочечные молекулы ДНК. Для количественной оценки реакции в некоторых случаях проводили радиоактивное мечение субстрата. В работе Kolb и коллег использовали два типа реакций: вырезание из кольцевой плазмиды фрагмента ДНК, фланкированного LoxP сайтами, и слияние двух кольцевых плазмид, несущих по одному LoxP сайту. Реакционный буфер включал 10 мМ Трис pH=7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl и 1 мМ ДТТ (Kolb and Siddell, 1996).
2
2
in vitro
В других работах в качестве субстрата использовали линеаризованную плазмиду, из которой под действием Cre вырезается фрагмент ДНК, и формируются укороченный линейный фрагмент и кольцевая молекула ДНК (Cantor and Chong, 2001; Ghosh and Van Duyne, 2002; Santoro and Schultz, 2002). Реакционная смесь содержала 20 мМ Трис pH=7.5, 300 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0.1% β-меркаптоэтанол и 0.5 нМ субстрата и 1000 нМ Cre (Santoro and Schultz, 2002). В других работах использовали 50 мМ Трис pH=7.5, 33 мМ NaCl, 10 мМ MgCl (Cantor and Chong, 2001); 50 мМ Трис, pH=7.5, 50 мМ NaCl, 5 мМ спермина гидрохлорида, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ и 100 мкг/мл БСА или 50 мМ Трис pH 7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl и 1 мМ ДТТ (Ghosh and Van Duyne, 2002). В другом варианте линейный субстрат для реакции  получают с помощью ПЦР (Zhang et al., 2015).
in vitro
Интересная модификация  теста основана использование коротких двуцепочечных олигонуклеотидов, несущих LoxP сайты, в которых отсутствует одна фосфодиэфирная связь на разрезаемой цепи ДНК на 3'-стороне от отрезаемого фосфатного остатка (Ghosh and Van Duyne, 2002). В этом случае в результате действия Cre образуется стабильный комплекс Cre и субстрата.
in vitro
Помимо этого, LoxP-Cre рекомбинация  может быть эффективно использована для манипуляций с рекомбинантной ДНК: для манипуляций с геномом вируса простого герпеса (Gage et al., 1992), для получения рекомбинантных бакуловирусов (Peakman et al., 1992), для инверсии открытых рамок считывания в плазмидах системы рекомбинации FLEX, являясь эффективной альтернативой молекулярному клонированию (Xu and Zhu, 2018).
2
in vitro
Рекомбинантный белок Cre коммерчески доступен от компании NEB под каталожным номером M0298 (https://international.neb.com/products/m0298-cre-recombinase#Product%20Information), а рекомендуемый реакционный буфер 50 мМ Трис-HCl pH=7.5, 33 мМ NaCl, 10 мМ MgCl соответствует таковому из работы (Abremski and Hoess, 1984) и был использован в одной из недавних работ (Xu and Zhu, 2018). В данном изобретении для проведения реакции  был использован реакционный буфер, в соответствии с данными из работы Abremski и коллег и рекомендациями компании NEB.
Использование белка Cre для геномной инженерии
in vitro
Рекомбиназа Cre в виде белка применяется для геномной инженерии достаточно давно, что возможно благодаря достаточно простой и эффективной очистке рекомбинантного белка Cre (Ghosh and Van Duyne, 2002). Вначале было показано, что при липофекции белка Cre в клеточную линию млекопитающих происходит эффективная рекомбинация (интеграция или вырезания фрагмента ДНК) (Baubonis and Sauer, 1993). Оказалось что слитый белок MBP-Cre обладает такой же каталитической активностью  как и нативный белок Cre, и способен эффективно индуцировать рекомбинацию при электропорации в клеточную линию млекопитающих (Kolb and Siddell, 1996).
В работе Araki и коллег была показана принципиальная возможность осуществления эффективной Cre-опосредованной рекомбинации в ооцитах мыши после микроинъекций кольцевой плазмидной ДНК, экспрессирующей Cre (Araki et al., 1995). Данный подход был эффективен и при микроинъекции мРНК Cre в ооциты мыши (de Wit et al., 1998). Несмотря на то, что авторы не обнаружили интеграции в геном плазмиды для экспрессии Cre (Araki et al., 1995), существует высокая вероятность интеграции даже плазмид в кольцевой форме. Поэтому для манипуляций с геномом зигот предпочтительно использовать мРНК или белок Cre. В частности, была показана Cre-опосредованная рекомбинация при реализации схемы RMCE при коинъекции кассеты для экспрессии Egfp и рекомбинантного белка MBP-Cre в ооциты, несущие «floxed» кассеты в локусе гена β-актина (Shmerling et al., 2005). Более, того инъецированные зиготы подсаживали псевдобеременным самкам получая потомков, несущих аллели с корректной заменой экспрессионных кассет. Однако в таких экспериментах эффективность замены кассет с помощью RMCE была достаточно низкая, порядка 0.3% (Shmerling et al., 2005). Важно отметить, что, в отличие от плазмид, длительно персистирующих в клетках, белок Cre находится в клетках транзиторно, что способствует сдвигу равновесия процесса RMCE в сторону интеграции кассет в геном, но не их вырезания. В другом примере микроинъекции белка MBP-Cre в ооциты мыши использовали для удаления маркерных генов устойчивости к антибиотикам, интегрированных в геном эмбриональных стволовых клеток в составе кассет для получения мышей с нокаутом генов CCR2 и CCR5 (Luckow et al., 2009).
ROSA26
Еще один вариант использования рекомбинантного белка Cre заключается в получении так называемых «клеточно-пермеабельных» вариантов Cre, которые проникают в клетки млекопитающих без использования реагентов для трансфекции или электропорации. Это достигается за счет слияния Cre c определенными аминокислотными последовательностями, опосредующими эффективное проникновение белка в клетку. Такие последовательности называют membrane translocation sequence, MTS; protein translocation sequence, PTS; protein transduction domain, PTD; cell-penetrating peptide, CPP. Впервые такой подход был описан с использованием рекомбинантного белка Cre с N-концевыми 6His эпитопом и NLS и C-концевой последовательностью MTS из белка FGF-4 (Jo et al., 2001). Белок 6His-NLS-Cre-MTS эффективно индуцировал рекомбинацию в модельных клеточных линиях. Более того, интраперитонеальное введение рекомбинантного белка 6His-NLS-Cre-MTS трансгенным мышам, несущим в локусе  инактивированный репортерный ген β-галактозидазы, вызывало сайт-специфическую рекомбинацию и активировало экспрессию репортерного гена во всех тканях животного (Jo et al., 2001).
В работе Will и коллег использовали Cre, слитую с Tat-пептидом ВИЧ и PreS2-пептидом вируса HBV. Такие белки вызывали эффективную рекомбинацию в клеточной линии, несущей репортерную конструкцию в геноме (Will et al., 2002). Однако, как оказалось, белок Cre, слитый лишь с NLS из большого Т-антигена вируса SV40, а также нативный белок Cre тоже обладают способностью проникать в клетки и индуцировать рекомбинацию (Lin et al., 2004; Will et al., 2002). На клеточных культурах фибробластов и эмбриональных стволовых клетках мыши была подтверждена эффективность использования белка 6His-Tat-NLS-Cre, а также показана рекомбинация при использовании NLS-Cre, и обнаружено, что последовательность MTS из белка FGF-4 не является необходимой для проникновения Cre в клетку (Peitz et al., 2002). Данная технология находит применение для получения трансгенных свиней, свободных от маркерных генов, используемых для селекции корректно модифицированных фетальных фибробластов для последующего переноса ядер из соматических клеток (SCNT) (Kang et al., 2018). В этом случае использовали белок Cre, слитый с различными CPP/PTD (Tat пептид, R9 и CPP5), среди которых пептид CPP5 был наиболее эффективен (Kang et al., 2018).
Приведенные выше примеры иллюстрируют различные варианты использования рекомбинантного белка Cre для геномной инженерии в клеточных линиях, ооцитах мыши и взрослых трансгенных мышах. В совокупности, это указывает на целесообразность и важность получения рекомбинантного белка Cre, а также указывают на возможные варианты его применения.
Краткое описание изобретения
in vitro
Данное изобретение решает задачу получения бактериального штамма, позволяющего эффективно продуцировать рекомбинантный белок Cre, слитый с 6-гистидиновым и S-эпитопами и последовательностью ядерной локализации из большого Т-антигена вируса SV40 (6His-S-NLS-Cre). Описан способ очистки белка 6His-S-NLS-Cre с помощью комбинации металл-хелатной аффинной и катионообменной хроматографии, позволяющий получить каталитически активную рекомбиназу Cre с выходом около 17 мкг с 1 мл культуры. Белок Cre может быть использован для геномной инженерии в модельных организмах и клеточных линиях, а также для манипуляций с рекомбинантной ДНК . В клетки млекопитающих возможна доставка Cre с помощью микроинъекций, электропорации или с использованием коммерчески доступных реагентов для трансфекции белков. Более того, возможно получение вариантов белка Cre, активно проникающих в клетки. Микроинъекции рекомбинантного белка Cre в эмбрионы модельных организмов, несущих в геноме сайты LoxP, можно использовать для интеграции фрагментов ДНК в целевое место генома, для удаления геномных последовательностей и получения кондиционного нокаута гена, для проведения RMCE. Доставку белка Cre можно рассматривать как альтернативу скрещиванию с «драйверными» линиями животных, экспрессирующими Cre. Применение белка Cre может повысить эффективность геномной инженерии, расширить арсенал используемых методов, элиминировать риск нецелевой интеграции генетических конструкций для экспрессии Cre в геном клетки-реципиента.
Осуществление/Раскрытие настоящего изобретения
Изобретение решает задачу получения бактериального штамма, эффективно продуцирующего рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, представляющий собой сайт-специфическую рекомбиназу Cre, модифицированную путем добавления N-концевых 6-гистидинового и S-эпитопов, которые могут быть использованной для аффинной очистки рекомбинантного белка (Block et al., 2009; Raines et al., 2000). Продуцируемый в бактериальной системе рекомбинантный белок очищается с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии и катионообменной хроматографии. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка содержит сайты расщепления для протеаз тромбина, энтеропептидазы (энтерокиназы) и TEV (протеаза вируса табачной мозаики). При необходимости, с помощью протеолитического расщепления удаляются 6-гистидиновый и S-эпитопы и получается белок Cre, несущий на N-конце лишь последовательность ядерной локализации (NLS) из большого Т-антигена вируса SV40 (Kalderon et al., 1984). Присутствие NLS важно для транслокации белка Cre в ядро и одновременно повышает сродство белка Cre к катионообменным носителям, что делает очистку данного белка более эффективной (более 90% чистоты, Фиг. 3). В другом техническом варианте очищают рекомбинантный белок без проведения протеолитического отщепления 6-гистидинового и S-эпитопов, что не влияет на функциональную активность рекомбиназы Cre.
Плазмидный вектор pET32v11-Cre получают с помощью методов генной инженерии путем амплификации кДНК рекомбиназы Cre и последующего клонирования в вектор pET32v11, таким образом, чтобы кДНК Cre с N-концевой NLS находилась в одной рамке считывания с 6-гистидиновым и S-эпитопами и аминокислотными последовательностями сайтов расщепления тромбина, энтерокиназы и протеазы TEV.
Escherichia coli
Escherichia coli
Штамм  BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующий рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, получают путем трансформации компетентных клеток штамма  BL21(DE3) плазмидным вектором pET32v11-Cre. Штамм культивируют на селективной среде, содержащей антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, и хранят при -80°С в среде LB, содержащей 15% глицерина.
E.coli
2
Для получения рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre клетки штамма-продуцента BL21(DE3)/pET32v11-Cre культивируют в богатой среде TB, индукцию синтеза рекомбинантного белка осуществляют в течение 16 часов при температуре +18°С путем внесения в среду индуктора ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 0.8 мМ. Суспензию клеток  разрушают в буфере 30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl, 10 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 5% глицерин, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1х кратный коктейль ингибиторов протеаз VII (Calbiochem) и очищают рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии на носителе Ni-NTA (Qiagen). Фракции с максимальной концентрацией Cre объединяют и очищают с помощью катионообменной хроматографии на носителе Mono S 5/50 (GE Healthcare). Очищенный белок диализуют против буфера (20 мМ ацетат натрия pH=5.0, 40 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ) и хранят в аликвотах при -80°С. В других воплощениях метода рекомбинантный белок очищают с помощью метал-хелатной аффинной хроматографии, проводят протеолитическое отщепление N-концевых эпитопов с помощью протеазы TEV и далее очищают белок с помощью катионообменной хроматографии.
Идентичность очищенного белка подтверждают с помощью ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга.
in vitro
Специфическую активность очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre проверяют с помощью  теста на рекомбинацию, используя в качестве субстрата кольцевую плазмидную ДНК, несущую сайты LoxP.
Escherichia coli
Штамм клеток  BL21(DE3)/pET32v11-Cre депонирован в Биоресурсный Центр Всероссийской коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИГенетика под номером В-13908.
Краткое описание чертежей
E.coli
На Фиг. 1 показана генетическая карта плазмидной конструкции pET32v11-Cre, кодирующей рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre. Показаны основные элементы плазмиды: Ampicillin resistance gene (bla) - ген устойчивости к ампициллину (β-лактамаза); lacI - ген lac репрессора из ; ColE1/pBR322 origin - точка начала репликации; f1 origin - точка начала репликации из бактериофага f1; 6His-S-NLS-Cre - кодирующая последовательность рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre; lac operator - lac оператор; T7 promoter - T7 промотор; T7 terminator - T7 терминатор; His tag и S-tag - 6-ти гистидиновый и S-эпитопы; thrombin, enterokinase, TEV cleavage site - сайты расщепления соответствующими протеазами. Кроме того, показан ряд уникальных сайтов рестрикции (EcoRI, SalI, XhoI, PstI и т.д.).
На Фиг. 2 показаны результаты анализа с помощью ДСН-ПААГ в 12%-ом акриламидном геле фракций, элюированных с катионообменной колонки Mono S при очистке рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre. Номера фракций указаны сверху. Часть исходного клеточного лизата диализовали перед нанесением на колонку Mono S. Элюированные фракции для такого образца отмечены сверху «d». Дорожка «w» - образец объединенных фракций промывки и прошедшего через колонку лизата. Дорожка «inp» содержит образец из объединенных фракций клеточного лизата с белком Cre после металл-хелатной хроматографии перед проведением диализа. Mw - маркер молекулярного веса белков: PageRuler™ Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa (ThermoFisher Scientific). Молекулярный вес полос маркера указан слева от рисунка. Полоса, соответствующая белку 6His-S-NLS-Cre, показана стрелкой.
E.coli
На Фиг. 3 показаны результаты анализа в 10%-ом акриламидном геле с помощью ДСН-ПААГ очищенного рекомбинантного белка 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») и образцов лизатов клеток штамма  BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «0 ч») и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор синтеза белка ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С (дорожка «3 ч»). Справа указано положение полос маркера молекулярного веса белков Precision Plus Dual Color Protein Standard, (#161-0374 Bio-Rad). Полоса, соответствующая белку 6His-S-NLS-Cre, показана стрелкой.
E.coli
На Фиг. 4 показаны результаты Вестерн-блот анализа очищенного рекомбинантного белка 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») и образцов лизатов клеток штамма  BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «0 ч») и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С (дорожка «3 ч»). Для Вестерн-блот анализа использовали мышиные моноклональные антитела к 6-гистидиновому эпитопу (Sigma, #H1029, разведение 1:2000). Справа указано положение полос маркера молекулярного веса белков Precision Plus Dual Color Protein Standard, (#161-0374 Bio-Rad).
vitro
На Фиг. 5 показана схема проведения  теста на рекомбинацию с использованием модельной плазмиды pBl-Lox-PSMC-Lox-F3. В результате действия Cre из кольцевой плазмиды длиной 4743 п.н. (S) вырезается фрагмент ДНК, фланкированный двумя однонаправленными сайтами LoxP. В результате рекомбинации образуются два кольцевых продукта рекомбинации длиной 3183 (R1) и 1560 (R2) п.н. Под схемой приведены размеры линейный фрагментов ДНК, образующихся после обработки субстрата и продуктов реакции эндонуклеазой рестрикции EcoRI.
in vitro
На Фиг. 6 показаны результаты  теста на рекомбинацию с использованием модельной плазмиды pBl-Lox-PSMC-Lox-F3. Продукты реакции рекомбинации анализировали 1%-ом TAE-агарозном геле. Дорожка «Cre-» - субстрат инкубировали без добавления 6His-S-NLS-Cre; дорожка «Cre+» - субстрат инкубировали в присутствии 1 мкМ 6His-S-NLS-Cre. S - фрагменты ДНК, образующиеся при гидролизе субстрата эндонуклеазой рестрикции EcoRI. R1 и R2 - фрагменты ДНК, образующиеся при гидролизе продуктов реакции эндонуклеазой рестрикции EcoRI. Размеры продуктов реакции указаны слева. Размеры фрагментов маркера молекулярного веса ДНК (O'GeneRuler 1kb DNA Ladder, ThermoFisher Scientific), показаны справа.
Примеры осуществления настоящего изобретения
Пример 1.
Получение рекомбинантной плазмиды, кодирующей кДНК белка Cre, слитую с 6-гистидиновым и S-эпитопами
gaattc
gtcgac
Для продукции белка Cre в бактериальной системе экспрессии с помощью методов генной инженерии получают рекомбинантную плазмидную конструкцию. Для этого кДНК рекомбиназы Cre амплифицируют с помощью ПЦР на матрице плазмиды pBluescriptSK II(+)-TERT-Surv-Cre-3DNMT1 (Bezborodova et al., 2018) с олигонуклеотидными праймерами 5-agagctccccaagaagaagaggaag-3 и 5-actaatcgccatcttccag-3, содержащими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и SalI, соответственно (выделены жирным шрифтом). Продукт амплификации анализируют с помощью электрофореза в 1%-ом агарозном геле, очищают из агарозного геля с помощью набора реагентов QiaexII (Qiagen) и клонируют в вектор pJET1 (ThermoFisher Scientific) получая вектор pJET1-Cre. Далее определяют полную нуклеотидную последовательность амплифицированного фрагмента с помощью секвенирования по Сэнгеру.
ccatgg
ggatcc
Далее, на основе вектора pET-32a(+) (Merck) получают модифицированный вектор pET32v11. Для этого, из вектора pGEX-6P1 (GE Healthcare) клонируют фрагмент NotI-XhoI, содержащий стоп-кодоны, в вектор pET-32a(+) по сайтам NotI-XhoI. В полученный вектор по сайтам NcoI-BamHI (выделены жирным шрифтом) клонируют фрагмент ДНК (5-gcagatctgaaaacctgtactttcagagc-3), содержащий сайт расщепления протеазой TEV. Далее, из полученного вектора удаляют NdeI-NdeI фрагмент, несущий кодирующую последовательность тиоредоксина, и получают вектор pET32v11 (SEQ ID NO 1).
В векторе pET32v11 сайт расщепления для протеазы TEV расположен таким образом, чтобы после очистки рекомбинантного белка с помощью металл-аффинной хроматографии используя протеазу TEV, при необходимости можно было отщепить N-концевой фрагмент очищенного белка, включающий 6-гистидиновый и S-эпитопы.
Далее EcoRI-SalI фрагмент, содержащий кДНК Cre, клонируют из вектора pJET1-Cre в плазмидный вектор pET32v11 по сайтам EcoRI-SalI таким образом, чтобы кДНК Cre находилась в одной рамке считывания с N-концевым 6-гистидиновым эпитопом. Полученную рекомбинантную плазмиду называют pET32v11-Cre.
Полученная плазмидная конструкция имеет размер 6648 п.н., (SEQ ID NO 2). Генетическая карта плазмиды pET32v11-Cre представлена на Фиг. 1. Слитый рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, кодируемый данной плазмидой, имеет расчетный молекулярный вес 46.2 кДа и состоит из 411 аминокислотных остатков (SEQ ID NO 3).
Пример 2.
Процедура получения штамма бактерий
E.coli
BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующего рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre
E.coli
E.coli
Плазмидный вектор pET32v11-Cre трансформируют в штамм  BL21 (DE3)с помощью стандартной методики трансформации бактерий (Titus, 1991) и высевают на LB агар (0.171 M NaCl, 1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1.5% агар), содержащий селективный антибиотик ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и растят в течение 16 часов при температуре +37°С. Единичные колонии бактерий, выросших на селективной среде, пересевают штрихом на свежую селективную чашку, и растят в течение 16 часов при температуре +37°С. С чашки Петри бактериальной петлей берут единичную колонию бактерий и инокулируют 5 мл жидкой ростовой среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и растят в течение 16 часов при температуре +37°С и постоянном перемешивании. 200 мкл ночной культуры переносят в 2 мл среды LB содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и растят в течение 2 часов при температуре +37°С. Клетки  осаждают центрифугированием, удаляют супернатант, осадок ресуспендируют в 500 мкл среды для заморозки (жидкая среда LB, содержащая 15% глицерина). Полученный штамм-продуцент хранят при температуре -80°С.
Пример 3.
Процедура получения рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre в бактериальной системе экспрессии
E.coli
2
4
2
4
4
Клетки штамма  BL21(DE3) трансформируют плазмидой pET32v11-Cre и высевают на чашку Петри с LB агаром, содержащим 0.5% глюкозу и 50 мкг/мл ампициллина. С чашки Петри смывают несколько колоний бактерий и ресуспендируют их в прогретой до +37°С среде Terrific Broth (TB; 17 мМ KHPO, 72 мМ KHPO, 5 мМ MgSO, 1.2% триптон, 2.4% дрожжевой экстракт, 0.5% глицерин) и инокулируют две 2-х литровые колбы, содержащие по 500 мл жидкой среды TB и ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Бактерии растят при постоянном перемешивании и температуре +37°С в течение 3-5 часов до достижения оптической плотности 0.4 при длине волны 600 нм. Далее колбы охлаждают до +18°С и индуцируют экспрессию рекомбинантного белка путем добавления ИПТГ до конечной концентрации 0.8 мМ, добавляют ампициллин до концентрации 50 мкг/мл и растят бактерии при температуре +18°С в течение 16 часов при постоянном перемешивании (220 оборотов/мин).
Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре +4°С в течение 20 минут, супернатант удаляют, а осадок промывают с использованием 50 мл фосфатно-солевого буфера (0.01 М натрия фосфат, 0.138 М NaCl, 0.0027 M KCl, pH=7.4), предварительно охлажденного до +4°С, и затем клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре +4°С в течение 20 минут. Супернатант удаляют, клеточную массу замораживают в жидком азоте и хранят при -80°С до стадии очистки белка.
2
Суспензию бактериальных клеток медленно оттаивают на льду, ресуспендируют в 30 мл буфера для лизиса (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl, 10 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 5% глицерин, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1х кратный коктейль ингибиторов протеаз VII (Calbiochem) и разрушают с помощью гомогенизатора LV1 (Microfluidics).
Полученный лизат бактериальных клеток центрифугируют при 15000 об/мин и температуре +4°С в течение 60 минут, собирают осветленный лизат. Очистку белка проводят на хроматографе среднего давления Acta Pure (GE Healthcare). Осветленный лизат наносят на хроматографическую колонку, наполненную металл-хелатным аффинным носителем Ni-NTA agarose (Qiagen) объемом 5 мл, уравновешенную буфером для лизиса. Колонку промывают буфером (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 30 мМ имидазол, 0.1% NP-40, 1 мМ β-меркаптоэтанол). Связавшиеся с колонкой белки элюируют с помощью буфера (30 мМ HEPES pH=7.4, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазол, 1 мМ β-меркаптоэтанол). Собирают фракции с максимальным пиком поглощения при длине волны 280 нм.
4
4
4
4
in vitro
Элюированные с Ni-NTA колонки фракции объединяют, разводят в два раза буфером (10 мМ NaKPO pH=6.8, 10 мМ β-меркаптоэтанол) и наносят на катионообменную колонку Mono S 5/50 (GE Healthcare), уравновешенную буфером (10 мМ NaKPO pH=6.8, 250 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол). Колонку промывают буфером (10 мМ NaKPO pH=6.8, 250 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол). Связавшиеся с колонкой белки элюируют с помощью градиента соли от 500 мМ NaCl до 850 мМ NaCl в буфере 10 мМ NaKPO pH=6.8, 10 мМ β-меркаптоэтанол. Собирают фракции объемом 1 мл. Фракции с максимальным пиком поглощения при длине волны 280 нм анализируют с помощью ДСН-ПААГ в 12%-ом акриламидном геле (Фиг. 2), как описано (Laemmli, 1970). Рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre эффективно элюируется с колонки при 700 мМ NaCl. Результат анализа фракций, собранных в процессе очистки рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre, приведен на Фиг. 2. Видно, что с Mono S колонки элюируется белок с молекулярным весом около 45 кДа, что соответствует ожидаемому. Фракции, сошедшие с колонки Mono S, и содержащие максимально чистый рекомбинантный белок 6His-S-NLS-Cre, диализуют против буфера 20 мМ ацетат натрия pH=5.0, 40 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ. Замораживают в жидком азоте в аликвотах и хранят при -80°С. Для проверки активности белка 6His-S-NLS-Cre размораживают аликвоту, проводят функциональный тест на рекомбинацию  (Фиг. 5 и 6) и анализируют образец рекомбинантного белка с помощью ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга (Фиг. 3 и 4).
Пример 4
.
Процедура определения идентичности и концентрации очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre
Концентрацию очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre определяют спектрофотометрически, измеряя поглощение образца белка при длине волны 280 нм по сравнению с буфером для диализа на спектрофотометре NanoDrop ND-8000 (ThermoFisher Scientific). Для расчета концентрации белка используют коэффициент молярной экстинкции для белка 6His-S-NLS-Cre, рассчитанный по его аминокислотной последовательности, и составляющий 50550. При этом 1 единица оптической плотности при длине волны 280 нм соответствует концентрации белка в 0.91 мг/мл.
E.coli
Идентичность очищенного рекомбинантного белка 6His-S-NLS-Cre определяют с помощью ДСН-ПААГ в 10% акриламидном геле и Вестерн-блоттинга. Готовят образцы лизатов бактериальных клеток штамма  BL21 (DE3)/pET32v11-Cre до индукции синтеза рекомбинантного белка (0ч) и после культивации клеток штамма в среде, содержащий индуктор ИПТГ в концентрации 1 мМ в течение 3 часов при +37°С. Готовят образцы, содержащие 0.85 и 1.7 мкг очищенного белка 6His-S-NLS-Cre. Проводят электрофорез белков в 10%-ом акриламидном геле и окрашивают гель красителем Кумасси. На Фиг. 3 показано, что очищенный рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») мигрирует в геле на уровне между полосами маркера молекулярного веса 37 и 50 кДа, что близко к ожидаемому молекулярному весу белка 6His-S-NLS-Cre в 46.2 кДа. Чистота очищенного белка (дорожки «0.85 мкг» и «1.7 мкг») составляет более 90%. Детектируемое в геле количество белка 6-His-S-NLS-Cre и отсутствие в геле интенсивных полос низкого молекулярного веса, которые могли бы указывать на деградацию белка 6-His-S-NLS-Cre, указывают на стабильность полученного рекомбинантного белка при повторном замораживании и оттаивании.
E.coli
lacUV5
E.coli
E.coli
Для подтверждения идентичности очищенного белка проводят Вестерн-блот анализ. Проводят электрофоретическое разделение описанных выше образцов в 10%-ом акриламидном геле, переносят белки из геля на PVDF мембрану (Millipore) c помощью прибора для электропереноса SV20-SDB (Sigma). Мембрану блокируют в буфере TBS-T (50 мМ Трис-HCl pH=8.0, 138 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 0.05% Tween-20), содержащем 5% сухое обезжиренное молоко (TBS-T5%). Далее инкубируют мембрану в течение 16 часов при +4°С в буфере TBS-T5% с мышиными моноклональными антителами к 6-ти гистидиновому эпитопу (Sigma, #H1029) в разведении 1:2000. Мембрану три раза промывают в буфере TBS-T и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными антителами против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (GE Healthcare, #NA931V), в разведении 1:5000. Мембрану три раза промывают в буфере TBS-T, детектируют связавшиеся антитела с помощью набора реагентов Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore). Хемилюминесценцию детектируют с помощью системы гель-документации ChemiDoc XRS (Bio-Rad). На Фиг. 4 показан результат Вестерн-блот анализа. Видно, что с помощью антител к 6-ти гистидиновому эпитопу детектируются полосы с молекулярным весом немного ниже 50 кДа (дорожки «3 ч», «0.85 мкг» и «1.7 мкг»), что соответствует ожидаемому молекулярному весу белка 6His-S-NLS-Cre в 46.2 кДа. Важно отметить, что интенсивная иммунореактивная полоса ожидаемого молекулярного веса присутствует лишь в образце лизата клеток штамма  BL21 (DE3)/pET32v11-Cre после индукции синтеза рекомбинантного белка (дорожка «3 ч»), но не в неидуцированном клеточном лизате (дорожка «0 ч»), в котором детектируется лишь слабая иммунореактивная полоса, которая отражает синтез белка в отсутствии индукции экспрессии за счет «подтекания» промотора  в геноме , контролирующего экспрессию T7 РНК-полимеразы. Эти результаты подтверждают идентичность очищенного рекомбинантного белка. В дорожках «0.85 мкг» и «1.7 мкг» детектируются полосы с молекулярным весом менее 37 кДа, которые представляют собой либо продукты деградации очищенного белка, либо продукты преждевременной терминации синтеза белка в клетках . Интенсивность окрашивания этих полос обусловлена высокой концентрацией белка в анализированных образцах. Как видно, из Фиг. 3, интенсивность низкомолекулярных полос существенно слабее полосы в геле, соответствующей очищенному белку Cre, что указывает на стабильность белка 6His-S-NLS-Cre.
Пример 5.
In vitro
тест на сайт-специфическую рекомбинацию
in vitro
PSMC5
in vitro
Для проведения реакции рекомбинации  в качестве субстрата используют плазмиду pBl-Lox-PSMC-Lox-F3 размером 4347 п.н. (SEQ ID NO 4), в которой нуклеотидная последовательность терминатора транскрипции из гена  человека, фланкирована двумя однонаправленными сайтами LoxP. В результате действия рекомбиназы Cre из кольцевого плазмидного субстрата вырезается фрагмент ДНК с образованием двух кольцевых продуктов рекомбинации размером 3183 п.н. и 1560 п.н. (Фиг. 5). Продукты реакции и субстрат линеаризуют, используя эндонуклеазу рестрикции EcoRI и анализируют с помощью электрофореза в 1%-ом агарозном геле. При гидролизе субстрата эндонуклеазой рестрикции EcoRI образуются фрагменты ДНК длиной 4298, 313, 114 и 18 п.н., обозначены S на Фиг. 6, за исключением фрагмента длиной 18 п.н., который не детектируется в геле; при гидролизе продуктов реакции образуются фрагменты длиной 3051, 114 и 18 п.н. (R1) и 1560 п.н. (R2). Схема проведения  теста на сайт-специфическую рекомбинацию показана на Фиг. 5.
2
Для проведения реакции рекомбинации готовят смесь объемом 40 мкл, содержащую 50 мМ Трис-HCl pH=7.5, 10 мМ MgCl, 30 мМ NaCl, 1 мкг плазмидной ДНК, 1 мкМ 6-His-S-NLS-Cre. Реакцию инкубируют при +37°С в течение 30 минут. Далее, для инактивации рекомбиназы Cre реакцию инкубируют 10 мин при +70°С. После этого к реакции добавляют 5 мкл 10-ти кратного буфера “Orange” «ThermoFisher Scientific», 4 мкл воды и 1 мкл (10 ед. активности) эндонуклеазы рестрикции EcoRI «ThermoFisher Scientific»). Инкубируют реакцию при +37°С в течение 1 часа. Добавляют 1 мкл протеиназы K (20 мкг/мкл, «Sigma-Aldrich») и инкубируют реакцию 10 минут при +56°С для протеолиза Cre и высвобождения продуктов реакции. Анализируют продукты реакции в 1%-ом агарозном геле.
На Фиг. 6 показан результат теста на сайт-специфическую рекомбинацию. При инкубации плазмидной ДНК pBl-Lox-PSMC-Lox-F3 с рекомбинантным белком 6-His-S-NLS-Cre (образец Cre+) при +37°С образуются продукты реакции (R1 и R2) ожидаемого размера. При инкубации плазмиды без добавления белка детектируется лишь фрагменты исходного субстрата (S) длиной 4298, 313 и 114 п.н.. Так как фрагменты длиной 313 и 114 п.н. образуются при гидролизе, как субстрата, так и продуктов реакции, то именно появление продуктов реакции длиной 3051 п.н. (R1) и 1560 п.н. (R2) указывает на прохождение Cre-опосредованной рекомбинации.
Основные характеристики клеток (по данным паспорта штамма)
Escherichia coli
1. Родовое и видовое название штамма-хозяина (реципиента):
BL21(DE3)/pET32v11-Cre
2. Номер или наименование штамма:
3. Способ получения штамма: получен трансформацией.
6His-S-NLS-Cre
4. Область применения штамма: получение рекомбинантного белка
6His-S-NLS-Cre
5. Продукт, синтезируемый штаммом: белок
6. Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели: 17 мкг белка на 1 мл среды
in vitro
7. Способ определения активности штамма с указанием метода:  тест на рекомбинацию
8. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: среда LB + 15% глицерина в ампулах на -80°С
9. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: среда LB, содержащая 50 мкг/мл ампициллина
10. Группа уровня риска штамма: I
11. Генетические особенности штамма:
-
-
-
+
S
ompT
gal
dcm
lon
hsdS
r
m
lacI
lacUV5
T7p07
ind1
sam7
nin5
malB
B
B
B
K-12
а. Генотип штамма хозяина (мутации, делеции, инверсии, наличие плазмид или профагов, устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д., прочие генетические особенности): генотип штамма генотип штамма BL21 (DE3): F() λ(DE3 [-]) [](λ)
б. Описание рекомбинантной плазмиды
pET32v11-Cre
Название плазмиды:
pET32v11-Cre
Размер плазмиды : 6648 пар нуклеотидов
Полная нуклеотидная последовательность плазмиды: SEQ ID NO: 2.
в. Сведения о векторе, на основе которого сконструирована плазмида:
Название вектора; pET-32a(+)
Происхождение вектора и его основных генетических элементов;
Вектор pET-32a(+) содержит:
- ген устойчивости к ампициллину (β-лактамаза)
lac
lacI
E.coli
- ген  репрессора () из
E.coli
- точку начала репликации из плазмид ColE1/pBR322 из .
- точку начала репликации из бактериофага f1
rop
E.coli
- ген  из , кодирующий белок, регулирующий копийность плазмиды
trxA
E.coli
- кодирующую последовательность гена тиоредоксина  из
г. Сведения о клонированной ДНК
Escherichia virus P1
Видовая принадлежность донорного организма:
Общие сведения о клонированном фрагменте, размер и включенные в его состав гены; плазмида содержит кДНК гена Cre длиной 1026 п.н., кодируемого геномом бактериофага P1 (Genebank Acc.: NC_005856.1)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
J Biol Chem
Abremski, K., and R. Hoess. 1984. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. . 259:1509-1514.
Cell
Abremski, K., R. Hoess, and N. Sternberg. 1983. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: evidence for topologically unlinked products following recombination. . 32:1301-1311.
Nucleic Acids Res
Akagi, K., V. Sandig, M. Vooijs, M. Van der Valk, M. Giovannini, M. Strauss, and A. Berns. 1997. Cre-mediated somatic site-specific recombination in mice. . 25:1766-1773.
Proc Natl Acad Sci USA
Araki, K., M. Araki, J. Miyazaki, and P. Vassalli. 1995. Site-specific recombination of a transgene in fertilized eggs by transient expression of Cre recombinase. . 92:160-164.
Cell
Austin, S., M. Ziese, and N. Sternberg. 1981. A novel role for site-specific recombination in maintenance of bacterial replicons. . 25:729-736.
Nucleic Acids Res
Baubonis, W., and B. Sauer. 1993. Genomic targeting with purified Cre recombinase. . 21:2025-2029.
Dokl Biochem Biophys
Bezborodova, O.A., I.V. Alekseenko, E.R. Nemtsova, A.A. Pankratov, O.B. Filyukova, R.I. Yakubovskaya, M.B. Kostina, V.K. Potapov, and E.D. Sverdlov. 2018. The Antitumor Efficacy of a Complex Based on Two-Vector System for Coexpression of the Suicide Gene Fcu1 and Cre Recombinase. . 483:326-328.
Methods Enzymol
Block, H., B. Maertens, A. Spriestersbach, N. Brinker, J. Kubicek, R. Fabis, J. Labahn, and F. . 2009. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. . 463:439-473.
Dev Cell
Branda, C.S., and S.M. Dymecki. 2004. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. . 6:7-28.
Nat Methods
Cai, D., K.B. Cohen, T. Luo, J.W. Lichtman, and J.R. Sanes. 2013. Improved tools for the Brainbow toolbox. . 10:540-547.
Protein Expr Purif
Cantor, E.J., and S. Chong. 2001. Intein-mediated rapid purification of Cre recombinase. . 22:135-140.
Cell
D'Astolfo, D.S., R.J. Pagliero, A. Pras, W.R. Karthaus, H. Clevers, V. Prasad, R.J. Lebbink, H. Rehmann, and N. Geijsen. 2015. Efficient intracellular delivery of native proteins. . 161:674-690.
Nucleic Acids Res
de Wit, T., D. Drabek, and F. Grosveld. 1998. Microinjection of cre recombinase RNA induces site-specific recombination of a transgene in mouse oocytes. . 26:676-678.
Nucleic Acids Res
Ennifar, E., J.E. Meyer, F. Buchholz, A.F. Stewart, and D. Suck. 2003. Crystal structure of a wild-type Cre recombinase-loxP synapse reveals a novel spacer conformation suggesting an alternative mechanism for DNA cleavage activation. . 31:5449-5460.
J Virol
Gage, P.J., B. Sauer, M. Levine, and J.C. Glorioso. 1992. A cell-free recombination system for site-specific integration of multigenic shuttle plasmids into the herpes simplex virus type 1 genome. . 66:5509-5515.
Methods
Ghosh, K., and G.D. Van Duyne. 2002. Cre-loxP biochemistry. . 28:374-383.
Genome Biol
Gurumurthy, C.B., A.R. O'Brien, R.M. Quadros, J. Adams, Jr., P. Alcaide, S. Ayabe, J. Ballard, S.K. Batra, M.C. Beauchamp, K.A. Becker, G. Bernas, D. Brough, F. Carrillo-Salinas, W. Chan, H. Chen, R. Dawson, V. DeMambro, J. D'Hont, K.M. Dibb, J.D. Eudy, L. Gan, J. Gao, A. Gonzales, A.R. Guntur, H. Guo, D.W. Harms, A. Harrington, K.E. Hentges, N. Humphreys, S. Imai, H. Ishii, M. Iwama, E. Jonasch, M. Karolak, B. Keavney, N.C. Khin, M. Konno, Y. Kotani, Y. Kunihiro, I. Lakshmanan, C. Larochelle, C.B. Lawrence, L. Li, V. Lindner, X.D. Liu, G. Lopez-Castejon, A. Loudon, J. Lowe, L.A. Jerome-Majewska, T. Matsusaka, H. Miura, Y. Miyasaka, B. Morpurgo, K. Motyl, Y.I. Nabeshima, K. Nakade, T. Nakashiba, K. Nakashima, Y. Obata, S. Ogiwara, M. Ouellet, L. Oxburgh, S. Piltz, I. Pinz, M.P. Ponnusamy, D. Ray, R.J. Redder, C.J. Rosen, N. Ross, M.T. Ruhe, L. Ryzhova, A.M. Salvador, S.S. Alam, R. Sedlacek, K. Sharma, C. Smith, K. Staes, L. Starrs, F. Sugiyama, S. Takahashi, T. Tanaka, A.W. Trafford, Y. Uno, L. Vanhoutte, F. Vanrockeghem, B.J. Willis, C.S. Wright, Y. Yamauchi, X. Yi, K. Yoshimi, X. Zhang, Y. Zhang, M. Ohtsuka, S. Das, D.J. Garry, T. Hochepied, P. Thomas, J. Parker-Thornburg, A.D. Adamson, A. Yoshiki, et al. 2019. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. . 20:019-1776.
Nat Biotechnol
Jo, D., A. Nashabi, C. Doxsee, Q. Lin, D. Unutmaz, J. Chen, and H.E. Ruley. 2001. Epigenetic regulation of gene structure and function with a cell-permeable Cre recombinase. . 19:929-933.
Cell
Kalderon, D., B.L. Roberts, W.D. Richardson, and A.E. Smith. 1984. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. . 39:499-509.
Anal Biochem
Kalinichenko, S.V., M.V. Shepelev, and I.V. Korobko. 2017. A gel-less isolation of untagged plasmid DNA insert from vector backbone in homogeneous format. . 521:28-30.
PLoS One
Kang, Q., Z. Sun, Z. Zou, M. Wang, Q. Li, X. Hu, and N. Li. 2018. Cell-penetrating peptide-driven Cre recombination in porcine primary cells and generation of marker-free pigs. . 13.
Gene
Kolb, A.F., and S.G. Siddell. 1996. Genomic targeting with an MBP-Cre fusion protein. . 183:53-60.
Nature
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. . 227:680-685.
Proc Natl Acad Sci USA
Lakso, M., B. Sauer, B. Mosinger, Jr., E.J. Lee, R.W. Manning, S.H. Yu, K.L. Mulder, and H. Westphal. 1992. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. . 89:6232-6236.
BMC Biotechnol
Lin, Q., D. Jo, K.D. Gebre-Amlak, and H.E. Ruley. 2004. Enhanced cell-permeant Cre protein for site-specific recombination in cultured cells. . 4:1472-6750.
Nature
Livet, J., T.A. Weissman, H. Kang, R.W. Draft, J. Lu, R.A. Bennis, J.R. Sanes, and J.W. Lichtman. 2007. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. . 450:56-62.
J Bacteriol
, M.B., D.J. Rose, G. Plunkett, 3rd, M. Rusin, A. Samojedny, H. Lehnherr, M.B. Yarmolinsky, and F.R. Blattner. 2004. Genome of bacteriophage P1. . 186:7032-7068.
Methods Mol Biol
Low, B.E., P.M. Kutny, and M.V. Wiles. 2016. Simple, Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing in Mice: Strategies and Methods. :3661-3668_3662.
Protein Expr Purif
Lu, C., and H.P. Erickson. 1997. Expression in Escherichia coli of the thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. . 11:179-184.
Genesis
Luckow, B., A. Hanggli, H. Maier, S. Chilla, R.P. Loewe, S. Dehmel, D. Schlondorff, P. Loetscher, H.G. Zerwes, and M. Muller. 2009. Microinjection of Cre recombinase protein into zygotes enables specific deletion of two eukaryotic selection cassettes and enhances the expression of a DsRed2 reporter gene in Ccr2/Ccr5 double-deficient mice. . 47:545-558.
Nucleic Acids Res
Mack, A., B. Sauer, K. Abremski, and R. Hoess. 1992. Stoichiometry of the Cre recombinase bound to the lox recombining site. . 20:4451-4455.
J Mol Biol
Martin, S.S., E. Pulido, V.C. Chu, T.S. Lechner, and E.P. Baldwin. 2002. The order of strand exchanges in Cre-LoxP recombination and its basis suggested by the crystal structure of a Cre-LoxP Holliday junction complex. . 319:107-127.
Curr Protoc Mouse Biol
McLellan, M.A., N.A. Rosenthal, and A.R. Pinto. 2017. Cre-loxP-Mediated Recombination: General Principles and Experimental Considerations. . 7:1-12.
Front Plant Sci
Metje-Sprink, J., J. Menz, D. Modrzejewski, and T. Sprink. 2019. DNA-Free Genome Editing: Past, Present and Future. . 9.
Proc Natl Acad Sci USA
Orban, P.C., D. Chui, and J.D. Marth. 1992. Tissue- and site-specific DNA recombination in transgenic mice. . 89:6861-6865.
Nucleic Acids Res
Peakman, T.C., R.A. Harris, and D.R. Gewert. 1992. Highly efficient generation of recombinant baculoviruses by enzymatically medicated site-specific in vitro recombination. . 20:495-500.
Proc Natl Acad Sci USA
Peitz, M., K. Pfannkuche, K. Rajewsky, and F. Edenhofer. 2002. Ability of the hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cellular uptake of recombinant Cre recombinase: a tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes. . 99:4489-4494.
Genesis
Plummer, N.W., E.K. Ungewitter, K.G. Smith, H.H. Yao, and P. Jensen. 2017. A new mouse line for cell ablation by diphtheria toxin subunit A controlled by a Cre-dependent FLEx switch. . 55:19.
Gene Ther
Ponsaerts, P., J.P. Brown, D. Van den Plas, L. Van den Eeden, D.R. Van Bockstaele, P.G. Jorens, V.F. Van Tendeloo, J. Merregaert, P.B. Singh, and Z.N. Berneman. 2004. Messenger RNA electroporation is highly efficient in mouse embryonic stem cells: successful FLPe- and Cre-mediated recombination. . 11:1606-1610.
Methods Enzymol
Raines, R.T., M. McCormick, T.R. Van Oosbree, and R.C. Mierendorf. 2000. The S.Tag fusion system for protein purification. . 326:362-376.
Proc Natl Acad Sci USA
Santoro, S.W., and P.G. Schultz. 2002. Directed evolution of the site specificity of Cre recombinase. . 99:4185-4190.
Methods
Sauer, B. 1998. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. . 14:381-392.
Proc Natl Acad Sci USA
Sauer, B., and N. Henderson. 1988. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. . 85:5166-5170.
Biochemistry
Schlake, T., and J. Bode. 1994. Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. . 33:12746-12751.
, F., N. Doerflinger, C. , O. Wendling, P. Chambon, and N.B. Ghyselinck. A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse.
Genesis
Shmerling, D., C.P. Danzer, X. Mao, J. Boisclair, M. Haffner, M. Lemaistre, V. Schuler, E. Kaeslin, R. Korn, K. , B. Ledermann, B. Kinzel, and M. . 2005. Strong and ubiquitous expression of transgenes targeted into the beta-actin locus by Cre/lox cassette replacement. . 42:229-235.
FEBS Lett
Siegel, R.W., R. Jain, and A. Bradbury. 2001. Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences. . 505:467-473.
Genetics
Singh, P., J.C. Schimenti, and E. Bolcun-Filas. 2015. A mouse geneticist's practical guide to CRISPR applications. . 199:1-15.
J Mol Biol
Sternberg, N., and D. Hamilton. 1981. Bacteriophage P1 site-specific recombination. I. Recombination between loxP sites. . 150:467-486.
In
Titus, D.E. 1991. Cloning of DNA inserts.  Promega Protocols and Applications Guide. D.E. Titus, editor, USA. 52-53.
J Mol Biol
Turan, S., M. Galla, E. Ernst, J. Qiao, C. Voelkel, B. Schiedlmeier, C. Zehe, and J. Bode. 2011. Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE): traditional concepts and current challenges. . 407:193-221.
Gene
Turan, S., C. Zehe, J. Kuehle, J. Qiao, and J. Bode. 2013. Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) - a rapidly-expanding toolbox for targeted genomic modifications. . 515:1-27.
Microbiol Spectr
Van Duyne, G.D. 2015. Cre Recombinase. . 3:0014-2014.
Nucleic Acids Res
Will, E., H. Klump, N. Heffner, M. Schwieger, B. Schiedlmeier, W. Ostertag, C. Baum, and C. Stocking. 2002. Unmodified Cre recombinase crosses the membrane. . 30.
BMC Biotechnol
Xu, J., and Y. Zhu. 2018. A rapid in vitro method to flip back the double-floxed inverted open reading frame in a plasmid. . 18:018-0462.
Nucleic Acids Res
Zhang, C., C.A. Myers, Z. Qi, R.D. Mitra, J.C. Corbo, and J.J. Havranek. 2015. Redesign of the monomer-monomer interface of Cre recombinase yields an obligate heterotetrameric complex. . 43:9076-9085.
--->
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биологии гена Российской академии наук (Institute of Gene Biology Russian
Academy of Sciences)
<120> Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих
сайт-специфическую рекомбиназу Cre
<160> 4
<210> 1
<211> 5596
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pET32v11
<400> 1
gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct        60
ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc        120
attcttctgg tctggtgcca cgcggttctg gtatgaaaga aaccgctgct gctaaattcg        180
aacgccagca catggacagc ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gccatgggca        240
gatctgaaaa cctgtacttt cagagcggat ccccggaatt cccgggtcga ctcgatcgag        300
cggccgcatc gtgactgact gacgatctcg agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg        360
ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag        420
cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta        480
tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt        540
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt        600
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct        660
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg        720
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga        780
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc        840
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga        900
gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttcagg        960
tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc        1020
aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag        1080
gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg        1140
ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt        1200
gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt        1260
tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt        1320
attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa        1380
tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag        1440
agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac        1500
aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac        1560
tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac        1620
cacgatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac        1680
tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact        1740
tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg        1800
tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt        1860
tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat        1920
aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta        1980
gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa        2040
tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga        2100
aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac        2160
aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt        2220
tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc        2280
gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat        2340
cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag        2400
acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc        2460
cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag        2520
cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac        2580
aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg        2640
gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct        2700
atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc        2760
tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga        2820
gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga        2880
agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg        2940
catatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtataca        3000
ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg        3060
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct        3120
ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc        3180
ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt        3240
ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta atgtctggct tctgataaag cgggccatgt        3300
taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg atgcctccgt gtaaggggga tttctgttca        3360
tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg        3420
aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg        3480
accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc        3540
cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg        3600
acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc        3660
aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat        3720
tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga        3780
tcatgcgcac ccgtggggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt        3840
tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa        3900
gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga        3960
gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga        4020
cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca        4080
tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac        4140
tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg        4200
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg        4260
ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg        4320
ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat        4380
gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatgt ccgcaccaac gcgcagcccg        4440
gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca        4500
gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc        4560
cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag        4620
ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc        4680
tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa        4740
ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg        4800
caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca        4860
ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt        4920
tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg        4980
acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac        5040
tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc        5100
gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa        5160
acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca        5220
ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg        5280
cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa        5340
gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgcaa        5400
ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca        5460
agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt cggcgatata        5520
ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag        5580
gatcgagatc gatctc            5596
<210> 2
<211> 6648
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pET32v11-Cre:
gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct        60
ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcaccat catcatcatc        120
attcttctgg tctggtgcca cgcggttctg gtatgaaaga aaccgctgct gctaaattcg        180
aacgccagca catggacagc ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gccatgggca        240
gatctgaaaa cctgtacttt cagagcggat ccccggaatt cgagctcccc aagaagaaga        300
ggaaggtgtc caatttactg accgtacacc aaaatttgcc tgcattaccg gtcgatgcaa        360
cgagtgatga ggttcgcaag aacctgatgg acatgttcag ggatcgccag gcgttttctg        420
agcatacctg gaaaatgcta ctgtccgttt gccggtcgtg ggcggcatgg tgcaagttga        480
ataaccggaa atggtttccc gcagaacctg aagatgttcg cgattatctt ctatatcttc        540
aggcgcgcgg tctggcagta aaaactatcc agcaacattt gggccagcta aacatgcttc        600
atcgtcggtc cgggctgcca cgaccaagtg acagcaatgc tgtttcactg gttatgcggc        660
ggatccgaaa agaaaacgtt gatgccggtg aacgtgcaaa acaggctcta gcgttcgaac        720
gcactgattt cgaccaggtt cgttcactca tggaaaatag cgatcgctgc caggatatac        780
gtaatctggc atttctgggg attgcttata acaccctgtt acgtatagcc gaaattgcca        840
ggatcagggt taaagatatc tcacgtactg acggtgggag aatgttaatc catattggca        900
gaacgaaaac gctggttagc accgcaggtg tagagaaggc acttagcctg ggggtaacta        960
aactggtcga gcgatggatt tccgtctctg gtgtagctga tgatccgaat aactacctgt        1020
tttgccgggt cagaaaaaat ggtgttgccg cgccatctgc caccagccag ctatcaactc        1080
gcgccctgga agggattttt gaagcaactc atcgattgat ttacggcgct aaggatgact        1140
ctggtcagag atacctggcc tggtctggac acagtgcccg tgtcggagcc gcgcgagata        1200
tggcccgcgc tggagtttca ataccggaga tcatgcaagc tggtggctgg accaatgtaa        1260
atattgtcat gaactatatc cgtaacctgg atagtgaaac aggggcaatg gtgcgcctgc        1320
tggaagatgg cgattaggtc gactcgatcg agcggccgca tcgtgactga ctgacgatct        1380
cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga        1440
gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt        1500
cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga ttggcgaatg ggacgcgccc        1560
tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt        1620
gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc        1680
ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta        1740
cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc        1800
tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg        1860
ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt        1920
ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat        1980
tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga        2040
acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa        2100
ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt        2160
gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg        2220
ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg        2280
gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg        2340
agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag        2400
caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca        2460
gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg        2520
agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc        2580
gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg        2640
aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgcagcaat ggcaacaacg        2700
ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac        2760
tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg        2820
tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg        2880
gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact        2940
atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa        3000
ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt        3060
aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag        3120
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct        3180
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt        3240
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg        3300
cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct        3360
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc        3420
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg        3480
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa        3540
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg        3600
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg        3660
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga        3720
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt        3780
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct        3840
gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga        3900
acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt        3960
ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg gtgcactctc agtacaatct        4020
gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat        4080
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc        4140
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc        4200
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag        4260
cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt        4320
taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac        4380
tgatgcctcc gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta atgataccga tgaaacgaga        4440
gaggatgctc acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga        4500
gggtaaacaa ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg        4560
ccagcgcttc gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc atcctgcgat        4620
gcagatccgg aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac tttacgaaac        4680
acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc agcagcagtc        4740
gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc aaccccgcca        4800
gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcgc acccgtgggg ccgccatgcc        4860
ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga cgaaggcttg        4920
agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg tcgcgctcca        4980
gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc ctacgagttg        5040
catgataaag aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg cccaccggaa        5100
ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt        5160
gagctaactt acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc        5220
gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg        5280
ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct        5340
ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct        5400
gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca        5460
ctaccgagat gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca        5520
gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt        5580
gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct        5640
gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag        5700
aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca        5760
cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag        5820
agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct        5880
ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca        5940
ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac        6000
ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca        6060
gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc        6120
ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag        6180
aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact        6240
ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg        6300
ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga        6360
cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt gaggccgttg        6420
agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag tcccccggcc        6480
acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc        6540
cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc tgtggcgccg        6600
gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatcgaga tcgatctc         6648
<210> 3
<211> 411
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Белок 6-His-S-NLS-Cre
<400> 3
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser     16
1                 5                   10                  15
Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp     32
20                   25                   30
Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Gly Arg Ser     48
35                   40                    45
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser Pro Glu Phe Glu Leu Pro Lys     64
50                     55                  60
Lys Lys Arg Lys Val Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro     80
65                    70                   75                     80
Ala Leu Pro Val Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met     96
85                   90                   95
Asp Met Phe Arg Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met     112
100                   105                  110
Leu Leu Ser Val Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn     128
115                  120                  125
Arg Lys Trp Phe Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu     144
130                   135                 140
Tyr Leu Gln Ala Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu     160
145                  150                    155                    160
Gly Gln Leu Asn Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser     176
165                   170                  175
Asp Ser Asn Ala Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn     192
180                  185                  190
Val Asp Ala Gly Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr     208
195                   200                   205
Asp Phe Asp Gln Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln     224
210                  215                   220
Asp Ile Arg Asn Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu     240
225                   230                  235                    240
Arg Ile Ala Glu Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr     256
245                  250                  255
Asp Gly Gly Arg Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val     272
260                    265                 270
Ser Thr Ala Gly Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu     288
275                   280                  285
Val Glu Arg Trp Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn     304
290                   295                  300
Tyr Leu Phe Cys Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala     320
305                  310                   315                    320
Thr Ser Gln Leu Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr     336
325                    330                 335
His Arg Leu Ile Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu     352
340                  345                   350
Ala Trp Ser Gly His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala     368
355                   360                   365
Arg Ala Gly Val Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr     384
370                  375                    380
Asn Val Asn Ile Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr     400
385                  390                   395                    400
Gly Ala Met Val Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp          411
405                    410
<210> 4
<211> 4743
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pBl-Lox-PSMC-Lox-F3
<440> 4
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc        60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga        120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc        180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc        240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag        300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa        360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac        420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg        480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg        540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg        600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtacccc        660
acccgggtgg aaaatcgatg ggcccgcggc cgctctagaa gtactctcga gtaaactcct        720
cttcagacct aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatattaa gggttattga        780
atattatcgg gaattaattc tttggatcca ctagtgtcga ggtcaacggc cgcatgtatg        840
ccctgcgaga acggcgagtc catgtcactc aggaggactt tgagatggca gtagccaagg        900
tataggcctc catctttgtg cctttgccag tggtggctct ggggcagtgg gctagggcat        960
gtgtgtgttc gtaacttaat gttcattctc tctcccaccc ctaggtcatg cagaaggaca        1020
gtgagaaaaa catgtccatc aagaaattat ggaagtgagt ggacagcctt tgtgtgtatc        1080
tctccaataa agctctgtgg gccaagtcct ctaggactcc agtctgttaa tgagggctgt        1140
gctgttcaag gaccaggtcc aggcaccacc aatagacaaa aggatttatt tggaaatttc        1200
caaacctgcc agatgtggca ctcgccaagc cctaggccca ccctcctcac caagctccaa        1260
agggcaacac cagtcctccc agcctcccca ttcaccttac cctggcctcc acatgcacat        1320
accccatacc tcaggccatg ctagagaact ggagtgtccc ctccccggcc caagccgctg        1380
gagaggcagc cctctggcat cccaggagat gatggcggcc agagccgctt gcatagattg        1440
aggaaagaaa agaaggaggc acctaacagg ctccctgaaa acccccaact tacccctgta        1500
caaaaaaagt ggctcccaca tagaaaactt gctcccaaaa tagtgcaaat acccaaagga        1560
aaggaaaaaa ccagcagcaa ggctgggctt gtaggaatgg caaagaactt tggtttagaa        1620
aggctaggaa gagtctgggc tgcacctcct cttcctagcc cagctcccca gagccagctc        1680
tgaccctcgc cccaggggga gtctgtaaac atgcaaaccc agcagccttt ggttcggaaa        1740
tgtcttacaa tgtcaaagca cagcctccag cagtcctact tgggcctgcc tgcagggggg        1800
cagaggaggc atctgctgaa cccaattaaa gccaatgcaa aaagtataag gctttgggga        1860
ccaagcaaca aggaatccta tcactacatt tataagacta aagctggaga gtagagggtg        1920
acagcagaca ctcctcaccc cagcctacgt gtctgcggcc ccagcaagga cccagagggt        1980
ggtctccctc caggctccag ggctgggaag aaagatccct gagcagttag gtcaggcgaa        2040
ttcccagcac ctgttccagt tcctgccttc gctgctgcac ctggagaagg gagaaaccaa        2100
gtggctcagg cctttgctac tcacggccaa aggagggaaa acagggcaga gcctcacctt        2160
ggcaaagatg tgcctgccta ctgcttcctg ggcccagggc tggtggtaga aagcagctcg        2220
tctctccggc cgttgacggt atcgataagc ttgatctaga actagtggat ctaaactcct        2280
cttcagacct aataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatattaa gggttattga        2340
atattatcgg gaattcgata tcaagcttat cgataccgtc gacggtatcg ataagcttga        2400
agttcctata ctatttgaag aataggaact tcggaatagg aacttcaaga tccccctggc        2460
gaaggaattc ctgcagccca tcgaattcct gcagcccggg ggatccacta gttctagagc        2520
ggccgccacc gcggtggagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct        2580
tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac        2640
acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac        2700
tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc        2760
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg        2820
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc        2880
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt        2940
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc        3000
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa        3060
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc        3120
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg        3180
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc        3240
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc        3300
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca        3360
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact        3420
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg        3480
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt        3540
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct        3600
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga        3660
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa        3720
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac        3780
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga        3840
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc        3900
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca        3960
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta        4020
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg        4080
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc        4140
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg        4200
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt        4260
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt        4320
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata        4380
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc        4440
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac        4500
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa        4560
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct        4620
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat        4680
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc        4740
cac             4743
Свободный текст перечня последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии
гена Российской академии наук (Institute of Gene Biology Russian Academy of
Sciences)
<120> Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих
сайт-специфическую рекомбиназу Cre
<160> 4
<210> 1
<211> 5596
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pET32v11:
102-311 п.н. -> прямая цепь, 210 п.н.; рамка считывания, кодирующая химерный
белок, включающий 6-ти гистидиновый эпитоп, сайт расщепления тромбином, S-эпитоп,
сайты расщепления энтерокиназой и TEV протеазой.
1088-1945 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину
(β-лактамаза) 4140-5219 нт -> обратная цепь, 1080 п.н.; ген lac репрессора
(lacI) из E.coli 3137-3328 п.н. -> обратная цепь, 192 п.н.; ген rop из E.coli,
кодирующий белок,
регулирующий копийность плазмиды
<210> 2
<211> 648
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pET32v11-Cre:
102-1334 п.н. -> прямая цепь, 1233 п.н.; рамка считывания, кодирующая
рекомбинантный белок 6-His-S-NLS-Cre
2140-2997 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину
(β-лактамаза)
5192-6271 п.н. -> обратная цепь, 1080 п.н.; ген lac репрессора (lacI) из
E.coli
4189-4380 п.н. -> обратная цепь, 192 п.н.; ген rop из E.coli, кодирующий
белок, регулирующий копийность плазмиды
<210> 3
<211> 411
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Белок 6-His-S-NLS-Cre:
2-7:  6-гистидиновый эпитоп (HHHHHH)
11-16:  Сайт расщепления тромбином (LVPRGS)
19-33:  S-эпитоп из панкреатической РНКазы А (KETAAAKFERQHMDS)
39-43:  Сайт расщепления энтерокиназы (DDDDK)
49-55:  Сайт расщепления TEV протеазы (ENLYFQS)
63-69:  Сигнал ядерной локализации из большого Т антигена вируса SV40, NLS
(PKKKRKV)
70-411: аминокислотная последовательность белка Cre без стартового метионина
(2-343 а.о.)
<210> 4
<211> 4743
<212> ДНК
<213> artificial sequence
<220>
<223> Плазмидная конструкция pBl-Lox-PSMC-Lox-F3:
3755-4612 п.н. -> прямая цепь, 858 п.н.; ген устойчивости к ампициллину
(β-лактамаза)
<---