Виды специфического свечения в реакции иммунофлюоресценции (риф)

© Ю.Д. Алексеев, Е.Н. Савенкова, 2013 УДК 340.6

Ю.Д. Алексеев, Е.Н. Савенкова

ВИДЫ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЕЧЕНИЯ В РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

Кафедра судебной медицины им. М.И. Райского (зав. кафедрой - доц. А.А. Ефимов) ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского»

Микроскопическое исследование биологических объектов является ответственным и заключительным этапом иммунофлюоресцентного анализа. Наряду с методикой приготовления и окраской препаратов, условия микроскопии во многом определяют достоверность и воспроизводимость получаемых результатов.

Подавляющее большинство исследователей рекомендует изучать люминесценцию объектов при микроскопии в падающем свете люминесцентного микроскопа, так как при этом наблюдается наибольшая яркость и контрастность изображения в силу того, что объектив, выполняя роль конденсора, концентрирует весь световой поток на малой площади препарата. Чем больше апертура применяемого объектива, тем выше яркость освещения объекта в падающем свете. Поэтому при изучении люминесценции клеток используются иммерсионные объективы, имеющие большую апертуру и увеличение.

На результаты микроскопического анализа могут влиять и некоторые особенности подготовки препаратов. Одни исследователи микроскопировали препараты в капле фосфатного буфера с рН 8,0, другие - в капле дистиллированной воды или глицерина под покровными стеклами. Однако никто из авторов не проводил сравнительной оценки яркости люминесценции обработанных ФИТЦ-глобулинами объектов, в частности изолированных клеточных элементов органов и тканей, в зависимости от использованных при микроскопии заключающих реагентов.

Для выбора оптимальных условий микроскопии, при которых наблюдается наибольшая яркость и контрастность люминесценции клеток, мы провели специальные исследования. В качестве объектов использовали клетки буккального эпителия и печени человека для выявления в них, с помощью прямой и непрямой реакции иммуно-флюоресценции (РИФ), видоспецифические белки.

Препараты исследовали в падающем свете люминесцентного микроскопа Альтами Люм - 1 (сила тока питания лампы ДРШ - 250 - 4Ф, возбуждающий фильтр ФС - 1 - 2, запирающий - ЖС - 18 + ЖЗС - 19, с объективами масляной 90х и водной иммерсии 40х, окулярами 7х). В качестве иммерсионной среды использовали фосфатный буфер с рН 7,2-7,4, глицерин, дистиллированную воду, нелюминесцирующее иммерсионное масло, вазелиновое масло, диметилфталат.

Установлено, что наибольшая яркость и четкость изображения клеток наблюдалась при микроскопии препаратов в капле фосфатного буфера с рН 7,2 - 7,4, независимо от примененного объектива. При использовании объектива водной иммерсии микроскопическая картина была одинаковой, как с покровным стеклом, так и без него, когда фосфатный буфер служил одновременно и заключающей средой и иммерсионной жидкостью. Наименьшая яркость свечения клеток отмечена при микроскопии с объективом 90х без покровного стекла независимо от используемых иммерсионных сред. В случаях микроскопии препаратов с объективом 40х без покровного стекла, применение в качестве иммерсионной среды глицерина и его растворов, не обеспечивало удовлетворительной резкости изображения, что связано с различиями коэффициентов преломления глицерина (1,4343) и воды (1,3330), на

использование которой в качестве иммерсионной среды рассчитаны объективы водной иммерсии.

Противоречивым, по сведениям литературы, является вопрос о числе клеток, обладающих специфическим свечением в препарате при положительном результате РИФ. Одни авторы считают РИФ положительной при обнаружении в препарате единичных светящихся клеток, другие - при выявлении в мазке свыше 10 таких клеток, или не менее 10% клеток, обладающих специфическим свечением.

Необходимо отметить, что в опытах были выявляли антигены, не свойственные клеткам, а образовавшиеся или попавшие в них вследствие какого-либо инфекционного процесса, то есть регистрировали специфическое свечение лишь небольшой пораженной части клеток. При установлении видовой принадлежности клеток определяются не гетерогенные, а свойственные каждой клетке антигены, образование которых генетически детерминировано. Поэтому при положительных результатах РИФ должно регистрироваться свечение практически каждой клетки в препарате или в поле зрения. Отмеченное положение полностью подтвердилось в наших опытах.

Все клетки в препаратах при обработке их гомологичными антителами обладали специфическим свечением. Однако, интенсивность люминесценции была различной, что могло быть связано как с распределением антигенов, так и с возможным повреждением клеток в процессе приготовления препаратов.

В литературе нет и единого мнения о характере ви-доспецифического или группоспецифического свечения клеток при положительных результатах РИФ. Затронуты понятия о, так называемом, феномене «светящегося ободка» или "яркого ореола" по периферии клетки, что объясняется количественным распределением люминесцирую-щих антител на ее поверхности. Если на участке клеточной поверхности отсутствуют антигенные группировки, то «светящийся ободок» может быть прерывистым.

Так же описаны три типа специфического свечения цитоплазмы, ядра или всей поверхности клетки: мембра-нозный, гранулярный и комковатый.

При положительных результатах РИФ видоспецифи-ческая люминесценция наблюдается как в ядрах, так и в цитоплазме клеток. При этом, в ядрах преобладает гомогенное свечение, в цитоплазме - крупно или мелкозернистое, в виде ободка по периферии клеточной мембраны.

В связи с отмеченными противоречиями, мы проанализировали особенности свечения клеток буккального эпителия и гепатоцитов, окрашенных прямым методом РИФ с использованием античеловеческой, антикроличьей и антибараньей ЛС. Перед обработкой мазков ЛС, изучали собственную люминесценцию клеток. При наличии таковой, клетки имели тусклое, неяркое, серовато-зеленое свечение, без четких границ (рис.1). Подобная картина наблюдалась и в случаях обработки препаратов гетероло-гичными ЛС (рис.2).

При анализе окрашенных препаратов оценивались характер, цвет и уровень яркости специфической люминесценции. При фокусировке изображения обращали внимание на наличие различных артефактов в мазке (слизь, детрит, пузырьки воздуха под покровным стеклом,

/TrFb

iУ-, :•. •..

r j

.. .

Рис. 1. Собственная люминесценция гепатоцита. Об. 40х, гомал 5х.

- * -.' 1 г -f ; « Jkt

- * * rfrr fe.ï"1^ : ' '

Рис. 2. Отрицательный результат РИФ

гепатоцита с антикроличьей ЛС. Прямое окрашивание. Об 40х, гомал 5х.

Рис. 3. Гомогенно-диффузный тип свечения гепатоцита при положительном результате РИФ. Прямое окрашивание. Об 40х, гомал 5х.

Рис. 4. Контурный тип свечения клеток буккального эпителия при положительной РИФ. Прямое окрашивание. Об. 40х, гомал 5х

Рис. 5. Гомогенно-диффузный тип свечения клетки буккального эпителия. Положительный результат РИФ. Прямое окрашивание. Об. 40х, гомал 5х.

Рис. 6. Гранулярный тип свечения клетки буккального эпителия. Положительный результат РИФ. Прямое окрашивание. Об. 40х, гомал 5х.

отдельные элементы разрушенных клеток и др.), которые наслаивались на клетки и могли имитировать специфическое свечение.

Исследования показали, что при положительном результате РИФ клеткам печени свойственна лишь диффузная ярко зеленая люминесценция всей поверхности, на фоне которой ядро не различается (рис.3). У большинства клеток буккального эпителия наблюдалась ярко-зеленая люминесценция по контуру мембран в виде сверкающего непрерывного или прерывистого ободка и свечение цитоплазмы серовато-зеленого цвета, незначительно превосходящее по интенсивности уровень аутолюминес-ценции (рис.4). Однако, даже в одном и том же препарате или в поле зрения, отмечались клетки с более или менее выраженной гомогенной люминесценцией всей поверхности (рис.5) и свечением в виде множественных гранул на фоне тусклой цитоплазмы (рис.6).

Учитывая особенности люминесценции клеток, мы сочли возможным выделить 3 типа их специфического свечения: контурный, гранулярный и гомогенно-диффузный. Различия в свечении клеток зависят, по-видимому, от неравномерного распределения в них видоспецифи-ческих антигенов, которые собраны в глыбки различных размеров и формы.

Таким образом, наибольшая яркость свечения клеток, обработанных гомологичными люминесцирующими сыворотками, наблюдалась при микроскопии препаратов в фосфатном буфере с рН 8,0. При положительных результатах РИФ клетки буккального эпителия обладали тремя типами свечения: контурным, гранулярным и гомогенно-диффузным, а гепатоциты - лишь гомогенно-диффузным.

© Н.Н. Михайлова, 2013 УДК 340.6

Н.Н. Михайлова

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИБОРА «SERA QUANT» ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПЕРМЫ В СЛЕДАХ НА ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ

ГБУЗ ТО «Областное бюро судебно-медицинской экспертизы»

Практически все доказательные методы, с помощью которых решается вопрос о присутствии крови в пятнах на предметах-носителях, основаны на выявлении гемоглобина и его производных [3]. Наиболее распространенным методом определения крови является метод тонкослойной хроматографии, который требует проведения второго этапа - установления вида найденной крови, что требует дополнительных затрат и времени.

К тому же, при исследовании микроследов этим методом не всегда достаточно количества материала для проведения дальнейших этапов исследования [1], а при необходимости и проведения повторной экспертизы.

Методы, позволяющие устанавливать наличие спермы в объектах, основаны на обнаружении сперматозоидов. Однако в ряде случаев резко снижается возможность обнаружения сперматозоидов на предметах-носителях,