КАРБОРАНОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 4,4-ДИФТОР-4-БОРА-3а,4а-ДИАЗА-s-ИНДАЦЕНА, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ
CARBORANE DERIVATIVES OF 4,4-DIFLUORO-4-BORA-3α,4α-DIASE-s-INDACENE SHOWING ANTI-TUMOR ACTIVITY

Изобретение относится к новым соединениям, а именно к производным 4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена общей формулы I, в частности к их карборановым производным, проявляющим противоопухолевую активность:
,
где
Указанные соединения наиболее эффективно могут быть использованы в качестве фото/радиосенсибилизаторов в фотодинамической терапии (ФДТ) и борнейтронозахватной терапии (БНЗТ) онкологических заболеваний.
Указанные соединения формулы I, их свойства и способ получения в литературе не описаны.
ФДТ является разновидностью химиотерапии и заключается в локальной активации фотосенсибилизатора (ФС), введенного в опухоль, видимым красным светом, что в присутствии кислорода тканей приводит к развитию фотохимической реакции, разрушающей опухолевые клетки. ФДТ позволяет избежать системного (общего) воздействия на организм, характерного для обычной химиотерапии.
Фотодинамическая терапия известна с 1975 г. [Dougherty, T.G.; Grindey, G.B.; Fiel, R. J. Natl. Cancer Inst., 1975, 55, 115-121], и в последующие годы получила широкое распространение в США, Европе, Китае и Японии. В Российской Федерации ФДТ применяют с 1996 г.
Успешное применение метода ФДТ для лечения злокачественных новообразований стимулирует поиск новых фотосенсибилизаторов с улучшенными свойствами.
Известно, что некоторые производные 4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена позволяют существенно увеличивать генерацию активных форм кислорода с более высокими квантовыми выходами и временем жизни активных частиц, по сравнению с производными порфиринов и хлоринов, в настоящее время использующихся в клинике для ФДТ [A. Kamkaew, S. Η. Lim, Η. Β. Lee, L. V. Kiew, L. Y. Chung, K. Burgess. Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 77-88]. Известно, что некоторые производные 4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена позволяют существенно увеличивать генерацию активных форм кислорода с более высокими квантовыми выходами и временем жизни активных частиц, по сравнению с производными порфиринов и хлоринов, в настоящее время использующихся в клинике для ФДТ [A. Kamkaew, S. Η. Lim, Η. Β. Lee, L. V. Kiew, L. Y. Chung, K. Burgess. Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 77-88]. Далее в настоящей заявке иногда используется общепринятое техническое название 4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена - BODIPY [Tram K.; Yan Η.; Jenkins Η. Α.; Vassiliev S.; Bruce D. Dyes and Pigments, 2009, 82, 392-395]. Опубликованные к настоящему времени исследования in vivo показывают, что ряд производных BODIPY обладают повышенной способностью избирательно подавлять рост опухоли без значительного повреждения здоровых тканей [М. L. Agazzi, Μ. В. Ballatorea, Α. Μ. Durantini, Ε. Ν. Durantini,  J. Photochem. Photobiol. C: Photochem. Rev., 2019, 40,21-48].
10
7
7
-1
БНЗТ - перспективный метод терапевтического лечения злокачественных опухолей путем накопления в них стабильного изотопа бора-10 и последующего облучения тепловыми нейтронами. Генерируемые при реакции Β(n,α) Li высокоэнергетические α-частицы и ядра отдачи Li (200 и 350 кэВ мкм, соответственно) с длиной пробега, сравнимой с диаметром клетки, вызывают летальные повреждения опухолевых клеток, накопивших достаточное количество борсодержащего вещества. Повреждение окружающих неопухолевых клеток при этом минимально. Для успешной реализации в клинической практике уникальных возможностей БНЗТ необходимо решить комплекс сложных химических, биологических, медицинских и технических проблем, прежде всего требуется создать борсодержащие соединения, способные избирательно доставлять терапевтическое количество бора в злокачественные опухоли (20 мкг/г опухоли) с градиентом концентраций 3:1 (опухоль к нормальной ткани) или выше, обеспечивая его оптимальное микрораспределение и способность оставаться в опухоли в течение времени, необходимого для облучения [R. F. Barth, Μ. G. Η. Vicente, О. K. Harling, W.S. Kiger III, K. J. Riley, P. J. Binns, F. M. Wagner, M. Suzuki, T. Aihara, I. Kato, S. Kawabata. Radiat. Oncol, 2012, 7, 146].
В настоящее время стандартным терапевтическим препаратом, используемым при БНЗТ, является L-боронфенилаланин (ВРА) [R. F. Barth, P. Mi, W. Yang, Cancer Commun., 2018, 38, 35]. Существенным недостатком L-BPA является низкое содержание бора, поэтому особый.интерес представляют собой карбораны, которые содержат 75% бора и активно используются для модификации биомолекул, обеспечивающих доставку бора в опухоль [J. F. Valliant, K. J. Guenther, A. S. King, P. Morel, P. Schaffer, О. О. Sogbein, K. A. Stephenson, Coord. Chem. Rev., 2002, 232, 173-230].
Известно, что введение фтора в молекулы субстанций лекарственных средств в ряде случаев может повышать их устойчивость к метаболизму, биодоступность, показатели связывания с белками и обеспечивать оптимальные липофильные характеристики конечных продуктов [S. Purser, P. R. Moore, S. Swallow, V. Gouvemeur. Chem. Soc. Rev., 2008, 37, 320-330], и таким образом, синтез соединений, модифицированных атомами фтора может привести к созданию перспективных препаратов для ФДТ и БНЗТ.
Известно соединение формулы II, структура которого близка к структуре заявляемых соединений [J. Н. Gibbs, Η. Wang, Ν. V. S. D. K. Bhupathiraju, F. R. Fronczek, K.M. Smith, M. G. H. Vicente. J. Organomet. Chem., 2015, 798, 209-213].
50
В соединении II в качестве карборановой компоненты используется орто-карборан, который связан с фрагментом BODIPY через фенильный спейсер по атому углерода карборанового полиэдра. Данное соединение обладает низкой темновой цитотоксичностью и низкой фотоиндуцированной цитотоксичностью (IС>100 мкМ) на опухолевых клетках, что существенно ограничивает его применение в ФДТ.
Задачей настоящего изобретения является создание производных BODIPY с высоким содержанием бора, применимых в фотодинамической терапии (ФДТ) и борнейтронозахватной терапии (БНЗТ) онкологических заболеваний.
Технический результат - получение новых карборансодержащих производных 4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена, проявляющих противоопухолевую активность, расширение арсенала агентов для ФДТ и БНЗТ.
Поставленная задача решается заявляемыми соединениями Ia-Ie, проявляющими противоопухолевые свойства.
,
где
Соединения I содержат уникальную совокупность фармакофорных групп, таких как индаценовый фрагмент, тетрафторфенильная группа и карборановый полиэдр, причем BODIPY связан с карборановым полиэдром через фторфенильный спейсер и атом серы. Указанная совокупность фармакофорных элементов в новых соединениях может обеспечить цитотоксическое действие в отношении раковых клеток.
50
Оказалось, что конъюгация орто- и мета-меркаптокарборанов с пентафторфенильными производными 4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена через атом бора карборанового полиэдра или введение водорастворимого 1-меркапто-1-карба-клозо-додекабората цезия в такую молекулу, а также наличие в подобных структурах фторфенильного заместителя существенно повышает как темновую цитотоксичность так и фотоиндуцированную цитотоксичность таких соединений (IC<50 мкМ).
Таким образом, заявленные соединения могут быть применены в качестве химиотерапевтических агентов, агентов для ФДТ, а повышенное содержание атомов бора в молекуле (>20%) может позволить использовать подобные структуры в качестве агентов для БНЗТ.
Исходные BODIPY (8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацен и 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-1,3,5,7-тетраметил-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацен) получают по известным методикам [Н. R. A. Golf, Н.-U. Reissig, A. Wiehe. Org. Lett., 2015, 77, 982-985; G. Vives, С.Giansante, R. Bofinger, G. Raffy, A. Del Guerzo, B. Kauffmann, P. Batat, GJonusauskas, N. D. McClenaghan. Chem. Commun., 2011, 47, 10425-10427].
Соединения Ia-Ir получают взаимодействием 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена или 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-1,3,5,7-тетраметил-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена с 9-меркапто-мета-карбораном или 9-меркапто-орто-карбораном в диметилформамиде в присутствии ацетата натрия и последующей стандартной очисткой.
Соединения Iд и Ie получают взаимодействием 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена или 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-1,3,5,7-тетраметил-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена с 1-меркапто-1-карба-клозо-додекаборатом цезием в диметилформамиде в присутствии карбоната калия и последующей стандартной очисткой (Схема 1).
Соединения формулы I по настоящему изобретению являются доступными веществами: их получают с высокими выходами из доступных реагентов, используя одностадийный и технологичный способ синтеза.
Все полученные производные представляют собой микрокристаллы темно-красного цвета, хорошо растворимые в хлороформе (соединения Ia-Iг), ацетоне, этилацетате, диметилсульфоксиде, диметилформамиде, воде (соединения Iд-Ie).
Изобретение иллюстрируется конкретными примерами его осуществления и результатами испытаний цитотоксичности заявляемых соединений Ia-Ie, приведенными ниже.
Общая методика получения карборановых производных BODIPY Ia-Iг
К раствору 0.2 ммоль 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена или 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-1,3,5,7-тетраметил-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена в диметилформамиде прибавляют 1.0 ммоль 9-меркапто-мета-карборана или 9-меркапто-орто-карборана и 0.2 ммоль безводного ацетата натрия. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона в течении 60 минут при комнатной температуре в темноте. Реакционную смесь выливают в 200 мл воды, экстрагируют 100 мл этилацетата, этилацетат промывают водой 3 раза по 100 мл. Растворитель упаривают в вакууме, продукт помещают на колонку с силикагелем, хроматографируют на силикагеле 40X60, элюент - гексан - этилацетат (7:3).
Пример 1
+
-1
-3
1
11
19
17
17
11
2
6
2
3
2
max
3
3
2
3
2
8-[4-(м-карборан-9-илтио)-2,3,5,6-тетрафторфенил]-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацен (Ia). Выход 68 мг.(66.1%). MS (MALDI): m/z [Μ] для CHBNFS вычислено 514.211; найдено 514.215. Ик-спектр (KBr), ν, см: 3069 (СН карборана), 2616 (ВН карборана), 1567, 1471 (С=С, C=N), 1190, 1254 (BF). Электронный спектр ((СН)СО), λ, нм, (ε 10): 513 (42.8). H-ЯМР спектр (400 МГц, CDC1) δ, м.д.: 7.99 (с, 2Н, Η пиррола), 6.84 (д, J=3.81 Гц, 2Н, Η пиррола), 6.59 (д, J=3.81 Гц, 2Н, Η пиррола). 3.05 (уш.с, 2Н, СН карборана). В-ЯМР спектр (128 МГц, CDCl) δ, м.д.: 0.21 (т, J=28,39 Гц, 1B, BF,), -1.19 (уш.с,1IB), -6.25 (д, J=158,5 Гц, 2B), -9.54 (d, J=156,1 Гц, 1B)-12.34 - -14.28 (м, 5B), -17.36 (д, 1B, J=182,1 Гц). F-ЯМР (376 МГц, CDC1); δ, м.д.: -129.71 (дд, J=24.42, 9.16 Гц, 2F, opmo-F), -137.48 (дд, J=21.36, 9.16 Гц, 2F, мета-F), -144.83 (дд, J=57.98, 30.52 Гц, 2F, BF).
Пример 2
+
-3
-1
1
11
19
21
25
11
2
6
3
2
max
2
3
3
3
3
2
3
2
8-[4-(м-карборан-9-илтио)-2,3,5,6-тетрафторфенил]-1,3,5,7-тетраметил-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацен (Iб). Выход 78 мг (68.4%). MS (MALDI): m/z [Μ] для CHBNFS вычислено 570.274; найдено 570.271. Электронный спектр ((СН)СО) λ нм (ε 10): 513 (46.3). ИК-спектр (KBr), ν, см 3063 (СН карборана), 2612 (ВН карборана), 1551, 1471 (С=С, C=N), 1190 (BF). Н-ЯМР спектр (400 МГц, CDC1) δ, м.д.: 6.06 (с, 2Н, Η пиррола), 3.01 (уш.с, 2Н, СН карборана), 2.59 (с, 6Н, СН), 1.64. (с, 6Н, СН). В-ЯМР спектр (128 МГц, CDCl) δ, м.д.: 0.268 (т, J=30,75 Гц, 1B, BF), -1.23 (уш.с, 1B), -6.11 (д, J=170,3 Гц, 2B), -9.71 (д, J- 151,4 Гц, 1B), -12.43 - -14.35 (м, 5В), -17.46 (д, J=184,5 Гц, 1В). F-ЯМР спектр (376 МГц, CDCl); δ, м.д.: -129.93 (дд, J=24.09, 11.48 Гц, 2F, opmo-F), -140.07 (дд, J=25.24, 12.63 Гц, 2F, мета-F), -146.09 (дд, J=64.25, 32.13 Гц, 2F, BF).
Пример 3
+
-1
-3
1
11
19
17
17
11
2
6
карборана
карборана
2
3
2
max
3
3
2
3
2
8-[4-(о-карборан-9-илтио)-2,3,5,6-тетрафторфенил1-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацен (Iв). Выход 62 мг, (60.3%). MS (MALDI): m/z [М] для CHBNFS вычислено 514.211; найдено 514.212. ИК-спектр (KBr), ν, см: 3090 (СН), 2605 (ВН), 1577, 1473 (C=С, C=N), 1228 (BF). Электронный спектр ((СН)СО) λ нм (ε 10): 513 (41.1). Н-ЯМР спектр (400 МГц, CDC1) δ, м.д.: 7.99 (с, 2Н, Η пиррола), 6.84 (д, J=3.50 Гц, 2Н, Η пиррола), 6.59 (d, J=3.81 Гц, 2Н, Η пиррола). 3.67 (уш.с, 1Н, СН карборана), 3.55 (уш.с, 1Н, СН карборана). В-ЯМР спектр (128 МГц, CDC1) δ, м.д.: 5.42 (уш.с, 1В), 0.21 (т, 1B, J=28,4 Гц, BF), -2.10 (д, J=144,3 Гц, 1В), -8.59 (д, J=153,7 Гц, 2В), -13.63 --16.06 (м, 6В). F-ЯМР спектр (376 МГц, CDC1); δ, м.д.: -129.83 (дд, J=24.41, 9.15 Гц, 2F, opmo-F), -137.82 (дд, J=24.41, 9.15 Гц, 2F, мета-F), -144.83 (дд, J=57.98, 27.47 Гц, 2F, BF).
Пример 4
+
-1
-3
1
11
19
21
25
11
2
6
2
3
2
max
3
3
3
3
2
3
2
8-[4-(о-карборан-9-илтио)-2,3,5,6-тетрафторфенил]-1,3,5,7-тетраметил-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацен (Iг). Выход 73 мг, (64.0%). MS (MALDI): m/z [Μ] для CHBNFS вычислено 570.274; найдено 570.277. ИК-спектр (KBr), ν, см: 3073 (СН карборана), 2617 (ВН карборана), 1550, 1513, 1467 (С=С, C=N), 1190 (BF). Электронный спектр ((СН)СО) λ нм (ε 10): 513 (49.9). Н-ЯМР спектр (400 МГц, CDC1) δ, м.д.: 6.06 (с, 2Н, Η пиррола), 3.64 (уш.с, 1H, СН карборана), 3.53 (уш.с, 1H, СН карборана), 2.59 (с, 6Н, СН), 1.64. (с, 6Н, СН). В-ЯМР спектр (128 МГц, CDC1) δ, м.д.: 5.35 (уш.с, 1В), 0.68 (т, J=30,8 Гц, 1B, BF), -2.04 (д, J=151,4 Гц, 1В), -8.68 (д, J=153,7 Гц, 2В), -13.76 - -15.97 (м, 6В). F-ЯМР спектр (376 МГц, CDC1); δ, м.д.: -129.95 (дд, J=24.75, 11.00 Гц, 2F, opmo-F), -140.16 (дд, J=24.75, 11.00 Гц, 2F, мета-F), -146.07 (дд, J=63.23, 30.24 Гц, 2F, BF).
Общая методика получения карборановых производных BODIPY Iд-Ie
2
3
К раствору 0.2 ммоль 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена или 8-(2,3,4,5,6-пентафторфенил)-1,3,5,7-тетраметил-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацена в диметилформамиде прибавляют 1.0 ммоль 1-меркапто-1-карба-клозо-додекабората цезия и 0.2 ммоль безводного KCO. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона в течение 8 часов при комнатной температуре в темноте. Реакционную смесь выливают в 200 мл воды, экстрагируют 100 мл этилацетата, этилацетат промывают водой 3 раза по 100 мл. Растворитель упаривают в вакууме, продукт помещают на колонку с силикагелем, хроматографируют на силикагеле 40X60, элюент - хлороформ - ацетон (2: 1).
Пример 5
+
-1
-3
1
11
19
16
17
12
2
6
2
3
2
max
3
2
3
2
2
3
2
2
8-[4-(1-карба-клозо-додекаборан-1 -илтио)-2,3,5,6-тетрафторфенил]-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацен} цезий (Iд). Выход 108 мг, (83.6%). MS (MALDI): м/z [Μ] для CHBNFSCs вычислено 646.126; найдено 646.129. ИК-спектр (KBr), ν, см: 2540 (ВН карборана), 1576, 1470 (С=С, C=N), 1259 (BF). Электронный спектр ((СН)СО) λ нм (ε 10): 513 (37.2). Η-ЯМР спектр (400 МГц, (CD)CO) δ, м.д.: 8.16 (с, 2Н, Η пиррола), 7.18 (д, J=3.67 Гц, 2Н, Η пиррола), 6.75 (д, J=4.11 Гц, 2Н, Η пиррола). В-ЯМР спектр (128 МГц, (CD)CO) δ, м.д.: 0.23 (т, J=28,39 Гц, 1B, BF), -8.68 (d, J=135 Гц, 1B), -12.64 (d, J=142 Гц, 10 В). F-ЯМР спектр (376 МГц, (CD)CO); δ, м.д.: -129.14 (дд, J=24.75, 11.00 Гц, 2F, opmo-F), -140.52 (дд, J=24.75, 11.00 Гц, 2F, мета-F), -144.38 (дд, J=57.74, 30.24 Гц, 2F, BF).
Пример 6
+
-1
-3
1
11
19
20
25
12
2
6
2
3
2
max
3
2
3
3
3
2
2
3
2
2
8-[4-(1-карба-клозо-додекаборан-1-илтио)-2,3,5,6-тетрафторфенил]-1,3,5,7-тетраметил-4,4-дифтор-4-бора-3α,4α-диаза-s-индацен} цезий (Ie). Выход 102 мг (72.6%). MS (MALDI): м/z [М] для CHBNFSCs вычислено 702.189; найдено 702.185. ИК-спектр (KBr), ν, см: 2536 (ВН карборана), 1553, 1512, 1469 (С=С, C=N), 1190, 1193 (BF). Электронный спектр ((СН)СО) λ нм (ε 10): 513 (51.9). Н-ЯМР спектр (400 МГц, (CD)CO) δ, м.д.: 6.28 (с, 2Н, Η пиррола), 2.55. (с, 6Н, СН), 1.72. (с, 6Н, СН). В-ЯМР спектр (128 МГц, (CD)CO) δ, м.д.: 0.63 (т, J=33,12 Гц, 1B, BF), -8.66 (d, J=134,8 Гц, 1B), -12.73 (d, J=141.9 Гц, 10 В). F-ЯМР спектр (376 МГц, (CD)CO); δ, м.д.: -128.32 (дд, J=24.75, 11.00 Гц, 2F, opmo-F), -142.77 (дд, J=24.75, 11.00 Гц, 2F, мета-F), -145.58 (дд, J=63.23, 32.99 Гц, 2F, BF).
Ниже представлены результаты серии испытаний цитотоксичности в условиях темнового эксперимента и эксперимента с фотовозбуждением представителей заявляемых соединений Ia-Ie.
Результаты испытаний показали, что соединения Ia-Ie проявляют значительную активность на культивируемых злокачественных клетках (темновая и фотоиндуцированная в терапевтических концентрациях), что позволяет считать их перспективными «drug candidates) для дальнейших исследований как противоопухолевых агентов.
Результаты исследования темновой и фототоксичности соединений на культуре опухолевых клеток
Препараты для исследований
Для исследований получены соединения Ia-Ie. Соединения растворяли в ДМСО до концентрации стокового раствора 10 мМ.
Культивируемая клеточная линия
2
Для экспериментов использована линия НСТ116 (карцинома толстой кишки человека). Клетки НСТ116 культивировали в среде DMEM с добавлением следующих компонентов до конечных концентраций: 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), инкубация проводилась при 37°С, 5% CO в увлажненной атмосфере. В экспериментах использованы клетки в логарифмической фазе роста.
ΜТТ-тест для исследования цитотоксичности
50
Цитотоксическое действие соединений исследовали в МТТ-тесте (по восстановлению желтой соли 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола в темно-синий кристаллический формазан митохондриями живых клеток). По результатам исследования цитотоксичности построены кривые выживаемости и определены значения концентрации, необходимые для гибели 50% клеток -IC.
2
Клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета (NUNC, США) (5000 клеток в 190 мкл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37°С, 5% CO, в увлажненной атмосфере. Вносили по 10 мкл раствора исследуемых веществ в культуральной среде, приготовленных серийными разведениями из исходного раствора, до 10 конечных концентраций.
Контролем в эксперименте служили клетки без препарата (интактные).
Исследование темновой цитотоксичности
2
2
50
Клетки с препаратами инкубировали 72 ч при 37°С, 5% CO, в увлажненной атмосфере. За 1 ч до окончания инкубации в лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия) и инкубировали при 37°С, 5% CO, в увлажненной атмосфере 1,5 ч. После окончания инкубации культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 570 нм. Процент клеток, выживших при действии каждой дозы соединения, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в лунках после инкубации с данной дозой к средней оптической плотности контрольных лунок (значения последних приняты за 100%). По результатам построены кривые выживаемости и определены показатели IC.
Исследование фотоиндуцированной цитотоксичности
2
Клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета (NUNC, США) (5000 клеток в 190 мкл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37°С, 5% CO, в увлажненной атмосфере. Вносили по 5-10 мкл раствора исследуемых веществ в культуральной среде, приготовленных серийными разведениями из исходного раствора, до 10 конечных концентраций).
2
2
50
2
Клетки с препаратами инкубировали при 37°С, 5% CO в течение 72 часов. Затем освещали диодным источником на 530 нм (АФС, Полироник, Россия) с плотностью дозы 30 Дж/см. После окончания освещения в лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия) и инкубировали при 37°С, 5% CO, в увлажненной атмосфере 1,5 ч. После окончания инкубации культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 570 нм. Процент клеток, выживших при действии каждой дозы соединения, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в лунках после инкубации с данной дозой к средней оптической плотности контрольных лунок (значения последних приняты за 100%). По результатам построены кривые выживаемости и определены показатели IC.