Серопрофилактика синегнойного сепсиса в эксперименте

ОСО вакцины сибиреязвенной живой сухой внесен в Реестр отраслевых стандартных образцов, допущенных к применению в системе Министерства здравоохранения и социального развития РФ и предприятиях других ведомств, выпускающих медицинские иммунобиологические препараты, и предназначен для стандартизации и оценки качества препарата для профилактики сибирской язвы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.СП 3.3.2.128-03 Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов. - 2. Пименов Е.В., Кожухов В.В., Строчков Ю.И. // Фармвести. -2002. -№ 4. - С. 27-29. - 3. Черкасский Б. Л. Сибирская язва как биологическое оружие. - М., 2002. - 40 с. - 4. Ясинский A.A., Котова Е.А., Перевощикова А.Л. и др.//Эпиде-миол. и вакцинопрофилакт. - 2005. - № 2. - С. 6-14. -

5. Принципы приготовления, характеристики и утверждения международных и других стандартов и эталонных реагентов для биологических препаратов // Сер. техн. докл. ВОЗ. - 1992. -Т. 800. - С. 171-203. - 6. Петухов В.Г. // Биопрепараты.

Профилактика. Диагностика. Лечение. - 2004. - № 1 (13). -С. 19-23.

I.V.Kasina, L.V.Sayapina, V.G.Petukhov, T.I.Anisimova, A.N.Shevtsov, A.A.Byvalov

Elaboration and studying of a novel branch-wise standard specimen of dry live anthrax vaccine

LA.Tarasevich Slate Institute of Standardization and Control;

Microbiology Research Institute, RF MD, Kirov

A new branch-wise standard specimen (BSS) of dry live anthrax vaccine was elaborated and considered to satisfy the requirements, set forth for BSS, after its properties had been studied as recommended: total spore concentration, percentage of living spores, presence of foreign microflora, mean mass contained in an ampoule, weight loss after drying, stability and homogeneity, immunity index, specific safety.

Key words', anthrax vaccine, branch-wise standard specimen, immunity index, total spore concentration, stability.

Поступила 30.06.05.

УДК 616.94:001.5

М.А.Ободова, Н.П.Храпова, Е.А.Снатенков, Л.В.Ломова, Н.И.Нарбутович СЕРОПРОФИЛАКТИКА СИНЕГНОЙНОГО СЕПСИСА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Проведена оценка протективных свойств моноклональных антител (МКА) против различных антигенов Pseudomonas aeruginosa при их парентеральном введении в организм инфицированных биопробных животных в режимах серопрофилактики и серотерапии на модели мышиного синегнойного сепсиса. Эффективность защиты биомоделей от инфекции в результате введения МКА оценена по показателю средней продолжительности жизни (СПЖ). Помимо основной схемы, применяли сочетание МКА и антибиотика (гентамицина) как в офици-нальной, так и в липосомальной формах. Использование МКА в качестве средств защиты приводило к удлинению сроков СПЖ животных на 35-50 % в отдельных экспериментальных группах, а также к появлению в них выживших особей. Сочетанное применение МКА и антибиотика также оказалось эффективным - в данных экспериментальных группах отмечалось удлинение СПЖ животных на 40 %.

Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, моноклональные антитела, протективный эффект.

филактических и иммунотерапевтических средств. За рубежом исследования по оценке протективных свойств моноклональных антител (МКА) к различным антигенам P. aeruginosa проводят с середины 80-х годов. Протективная активность выявлена у ряда мышиных МКА к белку F наружной мембраны P. aeruginosa [4] и человеческих МКА к липополи-сахариду (ЛПС) и экзотоксину А P. aeruginosa [3]. Хотя моделирование на животных может лишь частично воспроизвести ситуацию клинического заболевания, настоящие эксперименты дают возможность уверенно говорить о целесообразности применения МКА в качестве дополнительного терапевтического средства у иммунокомпрометированных пациентов с риском инфицирования P. aeruginosa [7].

В нашей стране подобные исследования не проводят ввиду отсутствия отечественных коллекций гибридом-продуцентов МКА против антигенов P. aeruginosa. В настоящее время в Волгоградском НИПЧИ создан набор гибридных клонов, продуци-

Госпитальные инфекции остаются одной из наиболее сложных проблем в стационарах во всех странах мира, несмотря на проведение регламентированных санитарно-эпидемиологических мероприятий и успехи в антимикробной терапии.

Синегнойная палочка - одна из основных причин госпитальной инфекции с высоким уровнем заболеваемости и смертности среди пациентов с нарушениями иммунного статуса на фоне болезни, стресса или иммуносупрессивной терапии. У вышеперечисленных категорий больных антибактериальная терапия чаще всего недостаточно эффективна вследствие увеличения числа антибиотикорезистентных штаммов P. aeruginosa, что делает очевидной необходимость изменения тактики борьбы с синегнойной инфекцией и разработки новых средств профилактики и лечения [6].

В связи с этим в последнее время обсуждается вопрос целесообразности возврата к идее применения специфических антител в качестве иммунопро-

рующих мышиные МКА к водорастворимым антигенам клеток и ЛПС P. aeruginosa, и начата работа по получению МКА к экзотоксину А.

Цель данной работы заключалась в оценке про-тективно'сти моноклональных антител против антигенов P. aeruginosa на модели синегнойного сепсиса в ¡эксперименте, оптимизации режимов парентерального введения моноклональных антител для профилактики и лечения экспериментальной синегнойной инфекции.

Материалы и методы

Культивирование P. aeruginosa. Использовали штамм P. aeruginosa 103Р, продуцирующий экзотоксин А. Данный штамм был получен из коллекционного центра Волгоградского НИПЧИ. Культуру P. aeruginosa выращивали на МПА с 5 % глицерина, pH 6,8 при 37 °С в течение одних суток. Взвесь микроорганизмов 109 м.к./мл готовили на основе стерильного 0,15 М раствора NaCl по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц и использовали в экспериментах.

Получение препаратов МКА. Для накопления препаративных количеств моноклональных иммуноглобулинов использовали линии мышиных перевиваемых гибридных клеток, продуцирующих МКА против антигенов P. aeruginosa, из коллекции лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии Волгоградского НИПЧИ. Присутствие МКА в среде выращивания гибридом-продуцентов иммуноглобулинов против различных антигенов P. aeruginosa и специфическую активность асцитических жидкостей контролировали с помощью непрямого варианта твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ). Для приготовления препаративных количеств МКА клетки гибридом, стабильно продуцирующих специфические иммуноглобулины, тиражировали in vitro. Затем клетки гибридом вводили внутрибрюшинно мышам BALB/c, предварительно праймированным пристаном. Накопление асцитической жидкости (АЖ) наблюдали через 10 и более суток. Индивидуальные образцы АЖ тестировали в ТИФМ. МКА из мышиных АЖ выделяли методом трехкратного переосаждения белка сульфатом аммония [5]. Образцы испытуемых МКА охарактеризованы по показателям концентрации белка, специфической активности в ТИФМ, эпитопной направленности, изотипу, антиферментной активности в отношении ферментов фосфолипазы С и протеаз (про-теолитического комплекса) P. aeruginosa. Все испытуемые образцы МКА стерилизовали методом мембранной фильтрации с использованием фильтров с величиной пор 0,45 ц, сохраняли при -20 - 70 °С. Концентрацию белка в растворе МКА определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Моделирование инфекции. Моделирование экспериментальной синегнойной инфекции осуществляли на белых мышах [как ин- (линия BALB/C), так и аутбредных], культуру P. aeruginosa вводили внутрибрюшинно в расчетной дозе равной 10-50 LD50.

Оценка протективности. В настоящей работе использовали 9 типов МКА различной эпитопной направленности: 2 - против эпитопов полисахарида, входящего в состав ЛПС P. aeruginosa, 4 - против

эпитопов белков наружной мембраны P. aeruginosa, 3 - против эпитопов липополисахарида; смеси МКА (имитация поликлональных антител - ПКА). При изотипировании МКА установлено, что МКА 5D8, 5D10, 4Е11, 4G5, 2А2, 7G4 (и их субклоны) являются IgG2b, МКА 1В7 (и его субклоны) - IgG3, МКА Н-2, 4G4 (и их субклоны) - IgGl. С целью оптимизации режимов парентерального применения МКА последние вводили в различные сроки относительно момента заражения P. aeruginosa, в различных дозировках и различными способами (подкожно, внутрибрюшинно).

Срок наблюдения за экспериментальными животными составил 30 сут с момента заражения. День постановки опыта считали нулевым. Продолжительность жизни индивидуального животного -число полных суток с момента заражения. По истечении 30 сут производили расчет показателя средней продолжительности жизни и доверительных интервалов для каждой группы мышей [1].

Результаты и обсуждение

В результате проведенных экспериментов установлено, что подкожный путь введения МКА и введение менее 2 мг белка в растворе МКА на одно животное неэффективны. Увеличение дозировки МКА более 2 мг на одно животное сопровождалось повышением токсичности препарата - в этих группах отмечался падеж животных без введения культуры P. aeruginosa. В последующих опытах отдельные МКА и их смеси вводили внутрибрюшинно в дозировке 2 мг белка на одно животное; варьировались сроки введения, сочетания МКА с антибиотиком гентамицином как в липосомальной, так и в официнальной формах.

Протективная активность МКА изучена при введении за 24 ч (режим ранней серопрофилактики) и за 2 ч до заражения (режим экстренной серопрофилактики) животных P. aeruginosa 103Р, а также при введении МКА через 24 ч после заражения (режим серотерапии).

При введении смесей МКА (имитация ПКА) антитела вводили внутрибрюшинно в те же сроки, доза смеси составляла суммарно 2 мг белка на одно животное. При сочетанном введении МКА и гента-мицина оптимальной формой оказалась липосо-мальная, а оптимальной дозировкой - 1,5 мг гента-мицина на одно животное. При введении офици-нального гентамицина в этой же дозе отмечалась высокая токсичность препарата. Антибиотик вводили через 2 ч и повторно через 24 ч после заражения, дозировка гентамицина была одна и та же.

Выработана следующая схема введения препаратов: за 24 ч до заражения - МКА (или смеси МКА) 2 мг на одно животное внутрибрюшинно; за 2 ч до заражения - МКА (или смеси МКА) 2 мг на одно животное внутрибрюшинно; заражение животных культурой P. aeruginosa 103Р 10-50 LD50 внутрибрюшинно; через 2 ч после заражения - ли-посомальный гентамицин 1,5 мг на одно животное внутрибрюшинно; через 24 ч после заражения -МКА (или смеси МКА) 2 мг на одно животное внутрибрюшинно; через 24 ч после заражения - ли-посомальный гентамицин 1,5 мг на одно животное

Сводные данные по результатам исследований

Наименование МКА, смесей МКА Специфическая активность в отношении эпитопов Угнетение активности ферментов Р. aeruginosa, % Изотип антител3 Протективная активность (процент увеличения показателя СПЖ) при введении МКА относительно заражения4

протеазы фосфолипазы С

за 24 ч за 2 ч через 24 ч

1В7' ПС, входящий в состав ЛПС 25,0 0 IgGj 33

2А21 То же 41,7 51,5 IgGzb 33-50

Н-21 Белки наружной мембраны 8,3 51,5 IgG, 17

4Е1 Iі Тоже 50,0 39,4 IgGjb 17

4G4'. " 0 45,4 IgG, 17

4G5' " 25,0 40,0 IgG2b 33

5D81 ЛПС 41,7 82,0 IgG» . 50

5D101 " 25,0 42,4 IgG2b 17

7G4 и 20,0 32,0 IgG2b 33

H-2+5D8+4G5 ЛПС 2 - - 33

1B7+7G4+2A2 ПС, ЛПС - - - 0

5D8+1B7 ЛПС, ПС - ' - - 83

5D8+2A2 ЛПС, ПС - - - 33

5D8+4G5 ЛПС, белки - - - 17

НМИг - - - - 17

Примечания: 'МКА и их субклоны. Исследования не проводили. 3Изотипирование проводили с помощью изотипирующей панели для мышиных иммуноглобулинов производства «ВЮ-RAD», США. 4Данные вне скобок приведены для мышей линии BALB/C, в скобках - для аут-бредных мышей.

внутрибрюшинно (возможно одновременное введение с МКА).

Результаты опытов подтвердили данные G.R.Barclay et al. [2] об отсутствии отчетливой взаимосвязи между протективностью МКА и их титрами в ТИФМ, изотипом антител, их концентрацией. Также не найдено прямой зависимости между антифер-ментной активностью МКА в отношении протеазы и фосфолипазы С Р. aeruginosa. Однако в настоящих исследованиях установлено, что МКА с наибольшей антипротеазной активностью (4Е11/А10 - к эпитопам белка наружной мембраны) не обладает протек-тивными свойствами в отношении Р. aeruginosa 103Р, а МКА 5D8/A12 (к ЛПС), с наибольшей анти-фосфолипазной активностью обладает наилучшим протективным потенциалом. В то же время МКА со специфической антифосфолипазной активностью (4G4/F5 - к белку наружной мембраны) и МКА со специфической антипротеазной активностью (1B7/G5/H2 - к полисахаридному компоненту ЛПС) обеспечивали лишь некоторую степень защиты биомоделей при малых заражающих дозах.

Обнаружено, что оптимальным режимом вве-

дения МКА является режим ранней серопрофилактики, наибольшей протективной активностью обладают МКА к ЛПС Р. aeruginosa и его полисахаридному компоненту, у МКА к белкам наружной мембраны протективные свойства выражены в меньшей степени (таблица, рис. 1). При введении МКА экспериментальным животным в режиме экстренной серопрофилактики наибольшей протективностью обладали опять же МКА к ЛПС и его полисахаридному компоненту (таблица, рис. 2). При введении МКА в режиме серотерапии практически все МКА проявляли слабый протективный эффект (таблица, рис. 3). При введении смесей МКА (имитация ПКА) протективной активностью обладали смеси, содержащие МКА к ЛПС и его полисахаридному компоненту, и только в режиме ранней серопрофилактики (таблица). Введение сочетания МКА и антибиотика приводило к увеличению СПЖ животных в отдельных группах (в ряде случаев протективный эффект превосходил таковой при введении только МКА), при этом наиболее эффективной формой гентами-цина была липосомальная, дозой - 1,5 мг гентами-цина на одно животное.

Во всех опытах нормальный мышиный иммуноглобулин - НМИг - (контроль антител) обладал слабой протективностью, введение НМИг живот-

Показатель вариабелен для различных субклонов

I

ИІІІПІІ

I

? * s s * * f *

Jr & & &

* -і»"

Рис. 1. Протективная активность (процент увеличения показателя средней продолжительности жизни) при введении моноклональных антител (МКА) за 24 ч до заражения

Рис. 2. Протективная активность (процент увеличения показателя средней продолжительности жизни) при введении моноклональных антител (МКА) за 2 ч до заражения

Показатель вариабелен для различных субклонов

OJ

I

* * s * * f V//// **

# ,оГ & ¿г „<?

МКА

Рис. 3. Протективная активность (процент увеличения ' показателя средней продолжительности жизни) при введении моноклональных антител (МКА) через 24 ч после заражения

ным не влияло на показатель СПЖ. Не выявлено существенных различий показателя СПЖ при введении МКА как инбредным мышам (линии BALB/C), так и аутбредным (таблица).

Таким образом, наибольшей протективной активностью, по данным настоящего исследования, обладают МКА к ЛПС P. aeruginosa и его полисахаридному компоненту; у МКА к белкам наружной мембраны протективные свойства выражены в меньшей степени. Статистически достоверных отличий показателя СПЖ между группами- животных, получавших МКА различной эпитопной направленности, не выявлено, но отмечена тенденция к увеличению СПЖ на 33-67 % по сравнению с контролем и повышению процента выживших особей в группах животных, получавших МКА к ЛПС P. aeruginosa и его полисахаридному компоненту до 33-50 %.

Учитывая то, что использованный в работе штамм P. aeruginosa 103Р является токсинпродуци-рующим, перспективным представляется исследование протективных свойств МКА к экзотоксину А P. aeruginosa (данные МКА находятся в стадии тестирования в ТИФМ, накопления их препаративных количеств). Интересно дальнейшее исследование антиферментной активности МКА с возможным установлением корреляции между антиферментной

активностью и протективным эффектом МКА. Принимая во внимание более высокую эффективность липосомальной формы гентамицина по сравнению с официнальной, планируется конструирование липо-сомальных форм МКА с последующей оценкой их протективного потенциала.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л., 1962. -180с. - 2. Barclay G.R., Yap Р.L., McClelland D.В.L. et al. // J. Med. Microbiol. - 1986. - Vol. 21. - P. 87-90. -

3. Bruderer U., Deusinger M., Schurch U., Lang A.B.// Res. Immunol. - 1993. - Vol. 144, N9. - P. 659-665. -

4. Hancock R.E.W., Mutharia L.M., Mouat E.C.A. // Eur. J. Clin. Microbiol. - 1985. - N 4. - P. 224-227. - 5.0’ Berry P.A. // Am. J. Vet. Res. - 1964. - Vol.25. -P. 1669-1672. -

6.VanDelden C., Iglewski B.H. // Emerg. Infect. Dis. -1998. - Vol. 4, N 4. - P. 551-560. - 7. Zweerink H. J., Gammon M.C., Hutchinson C.F. et al. II Inf. Immun. - 1988. -Vol. 56, N8.-P. 1873-1879.

M.A.Obodova, N.P.Khrapova, E.A.Snatenkov, L.V.Lomova, N.I.Narbutovich

Serologie Prophylaxis of Biue-Pus Bacillary Sepsis under Experimental Conditions

Volgograd Anti-Plague Research Institute

Protective characteristics of monoclonal antibodies (MCA) was assessed against different antigens of Pseudomonas aeruginosa parenterally inoculated into infected biotest animals under operation modes of serologic prophylaxis and serologic therapy. Protection efficacy of the biomodels against the infection after MCA injection was estimated according to the average lifetime index (ALT). Beside the main plan, a combination of MCA and an antibiotic (gentamycin) was used both in the officinal and liposomal forms. Application of MCA as a protection means resulted in 35-50% prolongation of the animals' ALT as well as the appearance of survivors in individual experimental groups. The combination of MCA and the antibiotic also appeared effective: 40% increase in ALT of some animals was observed in these test groups.

Key words’. Pseudomonas aeruginosa, monoclonal antibodies, protective effect.

Поступила 14.05.05.

УДК 616.981.42:615.371/.372

Б.А.Шабалин1, В.Ю.Охапкина1, Л.Б.Гаврилова1, Л.В.Саяпина2

) ЛЕЧЕБНАЯ БРУЦЕЛЛЕЗНАЯ ВАКЦИНА - ЭФФЕКТИВНОЕ СРЕДСТВО ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ БРУЦЕЛЛЕЗА

'Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ, Киров;

2Государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича, Москва

Предложен новый компонентный состав, усовершенствован способ приготовления и контроля вакцины бруцеллезной лечебной жидкой. Освоен выпуск препарата и разработана нормативная документация.

. Ключевые слова: бруцеллез, лечебная вакцина, освоение производства, иммунологическая эффективность.

Анализ данных литературы показывает, что ле- по бруцеллезу, эта инфекция распространена прак-

чение больных бруцеллезом людей до настоящего тически во всем мире. В странах СНГ она встреча-

времени остается актуальной проблемой. По дан- ется повсеместно, главным образом в Казахстане,

ным Объединенного Комитета экспертов ФАО/ВОЗ Средней Азии, Северном Кавказе, Закавказье, а