Инновационный метод окрашивания клеток новыми фотоактивируемыми флуоресцентными красителями

ЛИТЕРАТУРА: 1. Абдуллаев М.А., Рузикулов Р.Ф. Иммунность организма сельскохозяйственных животных против условно-патогенных микроорганизмов. Журнал «Известия» Армянской сельскохозяйственной академии, 2004, № 4, С. 60-61; 2. Железникова Г.Ф. Инфекция и иммунитет: стратегии обоих сторон //Иммунология.- Москва, 2006. - № 6. -С.597 - 614; 3. Румянцев С.Н. Конституциональный иммунитет и его молекулярно-экологическое основы. Л: Наука, 1983. - С.209-210.

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКТИВНОСТЬ КАРАКУЛЬСКИХ ОВЕЦ РАЗНОЙ КОНСТИТУЦИИ

Хаитов Р.Х., Рузикулов Р.Ф., Рузикулова У.Х.

Резюме

Иммунобиологическая реактивность каракульских овец характеризовалась вариабельностью показателей гуморальных и клеточных факторов иммунитета в зависимости от крепкой, грубой или нежной конституции.

THE IMMUNOBIOLOGY REACTION OF THE KARAKUL SHEEPS WITH THE DIFFERENT CONSTITUTIONS

Haitov R.H., Ruzikulov R.F., Ruzikulova I.H.

Summary

The immunobiology reaction of the karakul sheeps have variability of the gumoral and cytological factors in the correlation with type constitutions.

УДК 611-018.1:547.633.6.004.13

ИННОВАЦИОННЫЙ МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ КЛЕТОК НОВЫМИ ФОТОАКТИВИРУЕМЫМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ

КРАСИТЕЛЯМИ

Шапошников М.Н., Бартов М.С., Зайцев С.Ю.

Московская государственная академия ветеринарной медицины и

биотехнологии

Ключевые слова: инновационный метод, красители, клетки.

Key words: innovative method, dyes, cells.

Введение. Одним из перспективных и активно развиваемых направлений современной инструментальной биологии является разработка и применение фотоактивируемых флуоресцентных красителей (ФФК), обладающих селективными свойствами окрашивания тканей, клеток и субклеточных органелл прокариотических и эукариотических форм живых организмов. Актуальным подходом к решению указанных задач является введение в молекулы родаминов новых компактных фоточувствительных групп, а именно тиоамидных и А-нитрозотиоамидных. Это дает возможность синтезировать ФФК вначале в так называемой «закрытой» (или «спиросочлененной») бесцветной форме и способствует повышению их мембранной проницаемости [1-3]. Облучение светом с длиной волны > 375 нм вызывает раскрытие пятичленного цикла и регенерирует окрашенную флуоресцентную форму. Изменяя мощность облучающего света и его локализацию, можно легко варьировать число и пространственное расположение вновь образовавшихся флуоресцентных «зондов» и далее следить за их движением, определять форму и взаимное расположение клеточных и субклеточных объектов, помеченных этими (поначалу «замаскированными») красителями [1-3].

Целью данной работы являлось исследование новых фотоактивируемых флуоресцентных красителей (ФФК) - производных родамина, проникающих через клеточную мембрану и обеспечивающих возможность окрашивания клеток.

Экспериментальная часть. Различные соединения типа ФФК были синтезированы под руководством В.Н. Белова и сотрудниками [4]. В данной работе представлен только один из новых фотоактивируемых флуоресцентных красителей - ФФК-813, все детали синтеза и характеристика которого уже опубликованы [4].

Отработку метода окрашивания проводили на линии клеток кератиноцитов человека (НаСаТ), предварительно выращенных в ячейках планшета на покровных стеклах.

Кристаллический ФФК-813 растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и помещали на 1 час в ультразвуковую ванну. Это необходимо для разрушения агрегатов красителя. Полученный раствор (2 мг/мл) разводили в воде до концентрации 200 мкг/мл, и затем добавляли в ячейку. Конечная концентрация, с учетом питательной среды в ячейке, составила 2,5 мкг/мл. Планшеты с клетками поместили в инкубатор с заданным режимом работы (Т=37оС, ф(С02) = 4,5%) на 15 мин.

По истечении времени инкубации, добавили ядерный краситель «Хёхст», после чего также инкубировали 15 минут. Затем в ячейку добавили 1 мл 4%-го (до 1 %) раствора формальдегида, для фиксирования клеток, инкубировали 15 минут. Далее, полученный раствор декантировали и промывали ячейку два раза 3 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в течение 5 минут (оставили ФСБ после второй промывки в ячейке).

На предметное стекло, нанесли каплю мовиола (полимеризующий агент). После этого, вытащили с помощью иглы и пинцета из лунки покровное стекло, и положили на предметное стекло таким образом, чтобы монослой клеток был между стеклами, склеенный мовиолом. Надавливая сверху иглой, фиксировали плотней покровное стекло, чтобы между стеклами не было пузырьков с воздухом.

Результаты и обсуждения. На конфокальном инвертированном микроскопе «Eclipse TE2000» фирмы Nikon микроскопировали полученный препарат монослоя клеток. Была изучена клеточная линия кератиноцитов человека HaCaT.

1. Клетки окрашены ФФК-813, конц. 2,5 мкг/мл, увеличение 1000* (слева) и увеличение 3000* (справа).

Выбрано оптимальное соединение и изучено связывание ФФК с клетками. При использовании раствора ФФК-813 в концентрации 2,5 мкг/мл наблюдается окрашивание внутриклеточных структур клеток НаСаТ (рис. 1, красные «диффузные» области) в сравнении с традиционным красителем «Хёхст», окрашивающим ядра клеток (рис. 1, синие

окружности).

Как видно из рисунка 1, краситель ФФК-813 в концентрации 2,5 мкг/мл достаточно хорошо окрашивает монослой клеток. Интенсивная флуоресценция на увеличенном фрагменте справа указывает на верно подобранную концентрацию красителя.

Для расшифровки процесса связывания ФФК с клетками и его транспорта через клеточную мембрану, начаты работы по компьютерному моделированию связывания ФФК-813 с липидными компонентами клеточных мембран методом молекулярной динамики.

Получены данные по моделированию структуры ФФК-813,

фосфолипидов и их бислоев для моделирования биомембран. Работа проводится на базе операционной среды UNIX, с помощью программ «Maestro» (Schrodinger), «VMD», и «GROMACS» [5,б].

В ходе работы было построено несколько небольших моделей липидных бислоев индивидуального и смешанного состава, содержащих от 32 до 40 молекул фосфолипидов (рис. 2). Использовались структуры ДОФX (диолеоилфосфохолин), ДОФС-Na (натриевая соль

диолеоилфосфосерина), ПОФЭ (1-пальмитоил-2-олеоил-фосфоэтаноламин), ПОФX (1-пальмитоил-2-олеоилфосфохолин), ДМФX

(димиристоилфосфохолин), ДМФС-Na (натриевая соль

димиристоилфосфосерина). Так, были построены следующие бислои в

водном окружении: ДОФX, ДОФС-Na, ДОФX/ДОФС-Na (3:5),

ПОФX/ПОФЭ (2:1), ДМФX/ДМФС-Na (1:1).

На рисунке 2 представлена модель липидного бислоя на основе ДОФX/ДОФС-Na. Система в целом электронейтральна и содержит 12 молекулы ДОФX, 20 молекул ДОФС, 20 ионов Na+ и 942 молекулы воды.

2. Бислой ДОФX/ДОФС-Na через 10 нс.

Динамика проводилась в течение 10 нс, при нагревании до 300К и семиизотропном давлении.

Уровень энергии установлен на постоянном уровне, что свидетельствует о стабилизации системы.

Красно-белым цветом показаны диполи воды, зеленым - «хвосты» молекул липидов ДОФХ и ДОФС, синим цветом - катионы №+, связанные с отрицательно заряженным остатком серина ДОФС.

В настоящее время проводится оптимизация параметров запуска молекулярной динамики в «GROMACS» для исследуемых ФФК, встраивание ФФК-813 в модельный бислой ПОФХ, а также анализ взаимодействия его функциональных групп с фосфолипидом и изменений, вызываемых в мембране в результате связывания.

Таким образом, отработан метод окрашивания клеток на линии клеток кератиноцитов человека (HaCaT). Подобрана оптимальная концентрация красителя ФФК-813 для равномерного окрашивания монослоя клеток (2,5 мкг/мл). Изучено связывание ФФК-813 с клетками и внутриклеточными структурами на линии клеток кератиноцитов человека (HaCaT). Получены данные по моделированию биомембран, которые позволят выяснить механизмы взаимодействия ФФК-813 с плазматической мембраной.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Paul, P.H. Imaging of Pressure- and

Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. / P.H. Paul, M.G. Garguilo, D.J. Rakestraw // Anal. Chem. - 1998. - V. 70. P. 2459-2467. 2. Molho, J.I. Optimization of Turn Geometries for Microchip Electrophoresis. / J.I. Molho, A.E. Herr, B.P. Mosier, J.G. Santiago, T.W. Kenny, R.A. Brennen, G. Gordon, B. Mohammadi // Anal. Chem. - 2001. - V. 73. P. 1350-1360. 3. Willis, R.C. Portraits of Life: One Molecule at a Time. / R.C. Willis // Anal. Chem. - 2007. - V. 79. P. 1785-1788. 4. Boyarskiy V.P. Photostable, Amino Reactive and Water-Soluble Fluorescent Labels Based on Sulfonated Rhodamine with a Rigidized Xanthene Fragment / V.P. Boyarskiy, V.N. Belov, R. Medda, B. Hein, M. Bossi, S.W. Hell // Chem. Eur. J. 2008, 14,1784 - 1792. 5. Lindahl E., Hess B., van der Spoel D. 2001. GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod., 7, 306-317. 6. Berendsen H. J. C., van der Spoel D., van Drunen R. 1995. A message-passing parallel molecular dynamics implementation. Comp. Phys. Comm., 91, 43-56.

ИННОВАЦИОННЫЙ МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ КЛЕТОК НОВЫМИ

ФОТОАКТИВИРУЕМЫМИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ

Шапошников М.Н., Бартов М.С., Зайцев С.Ю.

Резюме

Методом флуоресцентной микроскопии показано окрашивание внутриклеточных структур клеток кератиноцитов человека линии НаСаТ

новым фотоактивируемым флуоресцентным красителем - ФФК813. Получены предварительные данные по компьютерному моделированию структуры и динамики биоорганических молекул и их слоев для моделирования биомембран.

INNOVATIVE METHODS OF CELL STAINING NEW PHOTOACTIVATABLE

FLUORESCENT DYES

Shaposhnikov, M.N., Barto M.S., Zaitsev S.Y.

Summary

Using fluorescence microscopy the staining of intracellular structures of human keratinocytes (cell line НаСаТ) by new photoactive fluorescent dye PFD-813 was demonstrated. Preliminary data on computer modeling of the structure and dynamics of bioorganic molecules and their segments for modeling biomembranes were obtained.

УДК б1б:б19 - б3б.4

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ НЕКОТОРЫХ ОРГАНОВ У СВИНЕЙ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ

СЕЛЕБЕН

Яппаров И.А., Ежков В.О.

ГУ «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Российской академии сельскохозяйственных наук» г. Казань

Ключевые слова: морфология, органы, кормовые добавки, селебен.

Key words: morphology, organs, feed additives, selebi.

До недавнего времени селен в качестве нормируемого компонента рационов сельскохозяйственных животных почти не учитывался. Сдерживающим фактором в этом направлении были: слабая изученность и отсутствие справочных данных содержания селена в кормах разных регионов страны, отсутствие научно обоснованных и безопасных норм и способов скармливания селена животным с учетом вида, пола, возраста, уровня продуктивности и физиологического состояния [1].

В последние годы отечественными учеными разрабатываются и успешно внедряются в производство препараты органически связанного селена, такие как ДАФС-25, селплекс, селенопиран, селеноприл и другие, и кормовые добавки, разработанные на их основе, такие как селебен, селевер, селецел и др. [2, 3].