Драгоценный протез

Искусственные сердечные клапаны из коллагена можно насытить наноалмазами — и тогда они прослужат дольше и не будут подвержены микробным атакам.

Нарушение целостности или структуры любого из четырех клапанов человеческого сердца приводит к большому количеству серьезных заболеваний, которые значительно сокращают продолжительность жизни. Ежегодно пороки сердечных клапанов диагностируются у 100 млн человек по всему миру. Механизмы сбоев в их работе можно разделить на два типа: стенозы и различные недостаточности, связанные с износом тканей.

Причины стенозов — сужение аорты и пропорциональное повышение перепада давлений между камерами сердечной мышцы. Такие нарушения в сердце лечатся с помощью трансплантации протезов сердечных клапанов разной конструкции и состава, которые вошли в клиническую практику в середине 1960-х годов. Сейчас существует два типа вживляемых пациентам клапанов: механические и биологические, первые полностью синтетические, вторые же состоят из синтезированной основы и живой ткани.

Механические или биологические

Из 280 тыс. пациентов, ежегодно попадающих на операционный стол для пересадки сердечного клапана, большинство отдает предпочтение механическим перегородкам. В состав таких клапанов чаще всего входят металлические, углеродные или полимерные компоненты, поэтому протезы долговечны и достаточно прочны. Но их вживление влечет необходимость принимать антикоагулянты до конца жизни — а это далеко не всегда полезно, особенно людям старшего возраста.

За прошедшие 60 лет эры протезирования сердечных клапанов заметно выросло и продолжает расти доверие пациентов к протезам биологического типа, хотя они пока не отличаются продолжительным сроком службы. Эти импланты более дружелюбно принимаются организмом и не требуют постоянного медикаментозного сопровождения. Для протезов биологического типа ткани для трансплантации можно взять у донора, наиболее подходящего по показателям гистосовместимости, или у самого пациента (например, часть его легочного клапана может быть пересажена в сердечный аортальный клапан; такие операции чаще проводятся для самых маленьких больных).

Также используются ксенографты — конструкции, основой которых служит металлический или полимерный каркас (чаще дакрон или политетрафторэтилен), на который методами тканевой инженерии пришивается слой предварительно обработанной клапанной ткани свиней или коров. Выбор организма-донора клеток осуществляется в зависимости от их доступности, конкретного клапана и иногда от технологии изготовления протеза в целом.

Однако со временем синтетическая часть биопротезов подвергается химической модификации, что ведет к ее деградации и износу. В 20% случаев протезы со стентом становятся причиной остаточного стеноза. Поэтому множество исследовательских групп по всему миру пытается создать трансплантаты без синтетической или металлической основы — каркаса.

Убить все живое

Вне зависимости от будущей конструкции протезируемого клапана биологического типа, перед трансплантацией человеку ткани млекопитающего другого вида ее обрабатывают для удаления клеток (так называемая девитализация), после чего в ткани остается только ее межклеточный матрикс для нового органа. Здесь работает принцип «чем чище — тем лучше». Такая подготовка ткани необходима как для улучшения ее механических свойств, так и для предотвращения агрессивного иммунного ответа, который может вызвать отторжение организмом пациента донорской ткани.

Девитализацию можно осуществлять множеством физических, химических и биологических методов, но наиболее часто используется обработка водорастворимыми детергентами — поверхностно-активными средствами. Самое простое и доступное подходящее для этого вещество — додецилсульфат натрия, повсеместно используемый в косметической и фармакологической промышленности для создания очищающих средств. Использование этого соединения, имеющего ионную структуру, хотя и эффективно, но может спровоцировать разрушение всех клеток ткани клапана без разбора. Поэтому на сегодня наиболее перспективными считаются неионные детергенты, которые лишь нарушают взаимодействие ДНК с белками, белков с липидами и липидов с липидами, одновременно сохраняя пространственную структуру белков.

Важен и выбор среды, в которой ткань будет обрабатываться: ионные детергенты прекрасно работают в полярных средах, например, воде и этаноле, но не могут быть применены в неполярных органических жидкостях. Менее агрессивные средства, для работы которых не нужна диссоциация, могут быть нанесены из неполярных органических растворителей.

Подходящая ткань

Коллектив ученых центра сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева предложил уникальную технологию очищения тканей бычьей яремной вены для последующей интеграции их в ксенографтовые протезы с использованием углекислого газа, переведенного в состояние сверхкритического флюида для девитализации.

Сверхкритический флюид — это состояние вещества, в котором оно обладает промежуточными свойствами между газом и жидкостью: растворительная способность чрезвычайно высока из-за слабого межмолекулярного взаимодействия, которое отражается малым значением коэффициента диффузии, плотность заметно больше газовой, хоть и вязкость относительно высока.

Удобны такие растворители прежде всего тем, что изменением внешних физических параметров можно влиять на их полярность, то есть на способность растворять различные вещества. Флюидное состояние наблюдается при достижении критической точки — совпадения давления и температуры таким образом, что стирается грань между газовой и жидкой фазой существования химической системы.

Вообще-то достижение критической точки затруднительно и энергозатратно, но только не в случае углекислого газа. Он может быть переведен в сверхкритический флюид при комнатной температуре и лишь относительно высоком давлении. При 31оС и давлении в 73 атмосферы живым тканям не будет нанесено значительных повреждений. На регенерацию им потребуются не дни, как при классических способах, а несколько часов.

СО2 в качестве растворителя также обладает значительными преимуществами относительно привычных химических сред: он нетоксичен для человека, не горюч и химически устойчив. При обработке таким веществом ткани не останется следов — избыточное количество углекислого газа просто улетучится при обычных комнатных условиях.

Исследования российских ученых были направлены на поиск не только способа подготовки поверхности ткани, но и на улучшение ее механических свойств без нарушения внутренней структуры. Для этого в сверхкритический флюидный СО2 вводили небольшое количество этанола и наблюдали прекрасный эффект для венозных фрагментов.

Но бычья яремная вена и более плотные ткани оказались сложнее в обработке, поэтому потребовалось придумать ступенчатую схему их обработки. На первом этапе ткань подвергают непродолжительной обработке водным раствором додецилсульфата натрия, затем выдерживают в среде сверхкритического флюида из СО2 и этанола с добавлением неионного детергента и в результате получают ткань, по своим механическим свойствам и клеточной структуре походящую на сердечный клапан человека.

Протезы в алмазах

Но походящую не значит равную. Для дополнительного его укрепления ученые предложили использовать ковалентное сшивание фрагментов межклеточного каркаса с помощью глутарового альдегида, введение которого снижает и иммунный ответ организма пациента на чужеродную ткань. Однако не весь альдегид полностью химически связывается с коллагеновой основой искусственного органа. Потому необходимо помещать ткань в кожух, химически нейтрализующий отрицательный заряд, возникающий на поверхности протеза. Компенсирующим заряд веществом в композитном материале является хитозан — полисахарид, обладающий свободной аминогруппой, заряженной положительно. (Его много в панцирях ракообразных.) Нанесение полимерного покрытия является распространенным приемом для придания искусственным органам необходимых свойств.

Сотрудникам центра сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева, Института элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН и химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова удалось добиться больших успехов в проектировании искусственных сердечных клапанов путем допирования донорной ткани инертными компонентами малого размера. Небольшие частицы позволяют значительно упрочнить ткань, не нарушая ее эластичности. Химики МГУ и медики центра сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева предложили добавлять в них наноалмазы.

Детонационные наноалмазы — форма углерода, которую получают при взрыве в замкнутом объеме смесей взрывчатых веществ с отрицательным кислородным балансом в инертной среде. Наноалмазы химически инертны в объеме, но свойства их поверхности можно изменить обычными химическими методами. Поверхность наноалмазов легко модифицируются с помощью манипуляций вроде вымачивания в кислоте, отжигом в водородной или кислородной атмосфере. Диапазон приобретаемых с помощью этих и других способов химических свойств наночастиц очень широк. Наноалмазы можно назвать материалом с «программируемыми» свойствами, поэтому они находят применение в медицине и биологии, например, в биоимиджинге и стоматологии. Материал, в который добавлены наноалмазы, приобретает дополнительную прочность, поэтому они могут быть использованы и в первозданном виде.

Радиохимики МГУ и ученые центра сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева сначала попробовали добавить к протезу сердечного клапана наноалмазы и убедились, что механические их свойства действительно улучшаются и при этом сохраняется эластичность коллагеновой основы. Такой эффект наблюдается для наноалмазов, заряженных как положительно, так и отрицательно, причем вторые устойчивы в большем интервале кислотности среды — заряд поверхности наноалмазу можно придать на стадии его синтеза и предварительной обработки. Количество добавляемых отрицательных частиц и вдвое большее положительных одинаково влияет на прочность ткани. Отслеживание количества сорбируемых тканью наноалмазов и их распределения осуществлялось с помощью радиоактивной метки. В углеродную структуру вводили тритий. Регистрируя бета-частицы, образующиеся при распаде этого нуклида, можно определять локализацию метки с минимальным влиянием на сигнал матричных веществ.

Как посадить антибиотики

Есть еще одна проблема. Все без исключения биологические протезы обладают значительным недостатком — их коллагеновая основа подвержена кальцинозу. Избыточное накопление ионов кальция на поверхности тканей приводит к ухудшению механических свойств протеза. Аккумулирование кальция из лимфы и крови с последующим образованием твердых наростов вызывает повышенное давление на клапан, в результате чего он хуже сокращается и быстрее изнашивается. Поэтому на биопротезы наносят антиминерализационное покрытие.

Меченные тритием наноалмазы использовали в экспериментах на лабораторных животных для определения устойчивости покрытия, а также изучения кальциноза биоткани. Под кожу мыши вживляли трансплантат и создавали специальные условия, моделирующие кальцификацию. Например, мышей избыточно кормили витамином D, который способствует усвоению кальция. По прошествии четырех месяцев ткань извлекалась из животного и растворялась в азотной кислоте с получением осадка и раствора. Осадок необходим для определения количества наноалмазов, устойчиво закрепившихся в ткани, а раствор позволяет оценить накопление кальция.

«Использование меченных тритием наноалмазов и разработанные методики анализа позволяют определить и сохранность покрытия, и кальциноз материала в одном эксперименте, что сокращает количество используемых животных»,— говорит доцент кафедры радиохимии химического факультета МГУ, доктор химических наук Мария Чернышева.

Любой биологический протез — уязвимое для микробных заболеваний место организма. Для защиты сердечных клапанов от интервенции бактерий группа химиков и исследователей-медиков предложила модифицировать поверхность нанесенных на ткань наноалмазов антибиотиками, закрепляемыми на наноалмазах. Нанесение противомикробных веществ на поверхность биологического протеза клапана намного более эффективно противостоит заражению, чем обычное пероральное или инъекционное принятие медикаментов, потому что колонии микроорганизмов формируют пленку поверх пересаживаемых тканей, что значительно снижает действенность традиционных методов лечения.

Если сама площадка посадки бактерий является для них ядовитой, то формирование пленок становится невозможно. Поместить лекарственное средство на поверхность можно двумя способами — «пришить» химически или просто адсорбировать за счет менее слабых взаимодействий. Второй способ предпочтительней, поскольку в любом случае антибиотик окажется именно на поверхности и легко будет с нее высвобождаться. К тому же химическое пришивание требует использования токсичных растворителей, которые сложно удалить после реакции.

Для таких испытаний были выбраны левофлоксацин и амикацин, которые сорбировались на поверхность наноалмазов из водного раствора. Левофлоксацин — представитель противомикробных средств широкого диапазона класса фторхинолонов, используемый в клинической практике для лечения заболеваний дыхательных и мочеполовых путей. Амикацин применяется для лечения тех же болезней, а также сепсиса, гнойных инфекций и перитонита.

Именно эта пара антибиотиков была выбрана по нескольким причинам: во-первых, из-за относительной химической схожести, во-вторых, из-за разного заряда концевых групп этих молекул. Электростатические свойства могут повлиять на введение молекул на наноалмазную поверхность и на сохранение ими бактерицидных свойств.

«Есть антибиотики, которые прекрасны как лекарства в растворе, но при сорбции на какую-либо поверхность свою антимикробность они теряют,— поясняет Мария Чернышева.— Выбранные нами вещества, к счастью, работоспособны и в сорбированном состоянии, что наверняка связано с механизмом их сорбции».

Для оценки количества антимикробных веществ на поверхности наноалмазов снова использовалась тритиевая метка, но уже в составе антибиотиков. Оказалось, что оба антибиотика хорошо сорбируются на наноалмазах, но амикацин образует более стабильные комплексы и не реагирует на белковые раздражители и повышенную соленость среды.

Создание композитного биологического протеза с наноалмазами, которые могут быть модифицированы, является очень перспективным полем для экспериментов. Стабильные, безопасные и долгоживущие клапаны на основе тканей коров, проверенные на лабораторных тканях, могут стать подспорьем для сочетания всех преимуществ механических и биологических протезов и войти в клиническую практику.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда №22–23–00019.