Анализ спектральных зависимостей тушения флуоресценции макромолекул гуминовых кислот и их модельных молекул

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2012, том 55, №10_

ФИЗИКА

УДК 535.373.4:547.992.2

Н.У.Муллоев*, Н.Л.Лаврик, Б.Н.Нарзиев*

АНАЛИЗ СПЕКТРАЛЬНЫХ ЗАВИСИМОСТЕЙ ТУШЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ

МОДЕЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ

Институт химической кинетики и горения им.В.В.Воеводского Сибирского отделения РАН,

Таджикский национальный университет

При монохроматическом возбуждении (Хвозб=337.1 нм) изучена спектральная зависимость эффективности тушения флуоресценции а% стандартных образцов гуминовых кислот (ГК) (ПтВЗ) и производных салициловой кислоты ионом Си2+. Для образца ГК установлена немонотонная зависимость ах, в то время как для модельных молекул наблюдается слабая линейная зависимость. Полученные данные рассматриваются как спектроскопический аргумент проявления у макромолекул ГК свойства полидисперсности, обусловленного различием химической природы и пространственной доступности сайтов, содержащих флуорофоры.

Ключевые слова: тушение флуоресценции - константа Штерна-Фольмера - ионы Си2+ - гуминовые кислоты - производные салициловой кислоты.

Гуминовые вещества (ГВ) и, в частности, гуминовые кислоты (ГК) играют большую роль в функционировании экосистем Земли, оказывая физиологическое воздействие на растения и микроорганизмы. ГК выполняют ряд важнейших функций: сохраняют и накапливают элементы питания живых организмов, свяжывают в малоподвижные соединения токсичные и радиоактивные элементы, регулируя почвенные процессы и сохраняя почвенную биоту и растительный покров в неблагоприятных условиях [1,2].

Согласно общепринятым моделям структура ГК состоит из ядра (ароматический углеродный скелет) и периферии (полисахаридно-полипептидные цепи) [1,2], которые соединены химическими связями. Носителями специфических свойств гуминовых кислот являются конденсированные ароматические ядра, соединённые между собой через цепи, имеющие достаточное сопряжение углерод-углеродных и других связей. Периферические нерегулярные структурные элементы (периферические цепи) являются переменными компонентами. В связи с этим характерной особенностью макромолекул гуминовых кислот является их полидисперсность.

Для оценки степени полидисперсности образцов ГК применяются различные физико-химические методы [1-4], в частности флуоресцентный метод [5-9]. В [10] нами был предложен способ, позволяющий оценить степень полидисперсности образца ГК флуоресцентным методом в условиях возбуждения спектра флуоресценции монохроматическим возбуждением. Суть метода заключа-

Адрес для корреспонденции: Муллоев Нурулло Урунбойевич. 734025, Республика Таджикистан, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17, Таджикский национальный университет. E-mail: voruch@eml.ru

лась в наблюдении спектральной зависимости эффективности тушения флуоресценции. Возможность такого подхода была продемонстрирована на примере стандартного образца ГК, для которого получена немонотонная спектральная зависимость констант Штерн-Фольмера (ШФ) и сделано заключение о наличии как минимум трёх спектральных компонентов. Однако в [10] не были исследованы простые молекулы, не обладающие свойством полидисперсности.

Целью настоящей работы явился анализ спектральных зависимостей эффективностей тушения стандартного образца ГК и модельных соединений, предположительно входящих в состав макромолекулы ГК [5].

Экспериментальная часть

В качестве образца ГК был использован стандартный образец (Humic Add Standard IHSS Elliot soil 1S102H). В качестве модельных молекул использованы производные салициловой кислоты: салицилат натрия I (> 99.5%, «Fluka») и 5-сульфосалициловая кислота II (> 99.4%, «Fluka»). В работе использовали щелочные растворы ГК (NaOH, «Fluka»). В качестве тушителя флуоресценции ГК использовали ион двухвалентной меди, CuSO4*5H2O («ЧДА») - как один из самых распространённых поллютантов.

Метод регистрации спектров. Исходные растворы ГК готовили растворением 2 мг образца в 20 мл щелочного раствора. Растворы меньшей концентрации готовили последующим разбавлением этого же раствора. Растворы производных салициловой кислоты готовились на деионизованной воде. Величины рН измеряли с помощью рН-метра «Redelkis». Все эксперименты проводились при комнатной температуре (22 ± 1)°С.

Спектры поглощения были получены на спектрометре Hewlett Packard 6041. Использовались кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Спектры флуоресценции были получены на N2-лазерном импульсном флуориметре ( Я =337.1 шп. частота импульсов света составляла 25 гц, средняя мощность 80 мкВт) [11]. Луч лазера проходил через кювету сверху параллельно входной щели флуориметра. Диаметр лазерного луча - 3 мм. Расстояние от центра лазерного луча до стенки рабочей кюветы, через которую регистрировалась флуоресценция, составляло 0.5 см. Кювета заполнялась раствором таким образом, чтобы мениск отсутствовал. Контроль стабильности интенсивности возбуждающего света проводился периодическим снятием интенсивности Раман линии ОН колебания в деионизованной воде.

Обработка экспериментальных данных. Эффективность тушения флуоресценции на определенной длине волны X определялась величиной константы тушения Штерна-Фольмера Кщф [12] из соотношения

1 л

где 1{)1 и Iх — корректированные интегральные интенсивности флуоресценции ГК или производных салициловой кислоты при [Cu2 ]=0 и [Cu2+]^0, соответственно. Значения корректированной интегральной интенсивности IЛ определялись из соотношения

12

1Л = [1 -КГ2*» ]' \{1экс,раство^) - 1экс,растеоритт

Л

где 1жс.растаорй) и 1 жс.растаоришшО*)" экспериментально наблюдаемые интенсивности флуоресценции растворов и растворителя на длине волны флуоресценции X соответственно; /.)„7 и 1)ст л - величины оптической плотности на длине волны возбуждения X = 337.1 нм и на длине волны флуоресценции в спектральном диапазоне 350 - 650 нм соответственно. Сомножители (1 —10°33' ) 1 и 10 / являются корректирующими поправками на эффект внутреннего фильтра при возбуждении и испускании флуоресценции соответственно. Интегрирование корректированного контура спектра флуоресценции проводилось в спектральном диапазоне 350-650 нм для образцов ГК и 350-550 нм для образцов I и II.

В [13] было показано, что величину Кщф не всегда удаётся получить из экспериментальных

данных и в связи с этим было предложено использовать параметр осх = —— , который характеризует

изменение формы контура флуоресценции при добавлении тушителя и является достаточно универсальным. Из выражения Кщф — (ссу — 1)/[0/2' ] следует, что любое проявление немонотонности в спектральной зависимости проявится и в спектральной зависимости параметра сс 1 . Дополни-

тельное достоинство параметра сс л заключается и в том, что при анализе спектральной зависимости эффективности тушения можно не учитывать поправочный коэффициент (1 — Ю°337 ) 1 . Тем не менее определение величины КШФ с поправками по (1) принципиально важно, поскольку с её помощью можно оценить константу скорости тушения флуоресценции К , что позволяет делать заключение о статическом или диффузионном механизме тушения флуоресценции [12].

Константу скорости тушения флуоресценции К [12] определяли из соотношения

т^ Л ШФ к'

где Гц - время жизни флуоресценции исследуемой молекулы в отсутствие тушителя. Величина т0~ 3 не для образца ГК была взята из [8].

Результаты и обсуждение

На рис.1(а-в) и 2(а-в) приведены спектры поглощения и флуоресценции исследованных систем. Во вставках показаны зависимости величин 0337 и констант ШФ (с учётом поправок, приведённых в формуле (1)) от концентрации образцов. Из приведенных зависимостей видно, что они имеют линейный характер.

Рис.1 Экспериментально наблюдаемые спектры по-

Рис.2. Экспериментально наблюдаемые спектры

глощения: а - ГК при [Си2+] =0 (1); 2.5.10-4 М (2); 7.10" флуоресценции: а - ГК при [Си2+] = 0 (1); 2.5.10-4М (2);

4 М (3); 1.1.10-3 М (4), б-1 при [Си] = 0 (1); 1.25*10-3М (2); 2.5*10-3М (3); 3.75.10-3М(4), в - II при [Си2+] = 0 (1); 3.75*10-3М (2); 5.10-3М (3). На вставке: зависимости величин ОБ337 от концентрации Си2+.

I при [Си] = 0 (1); 10-

5.10-4 М (3); 1.1.10-3 М (4), б

3М (2); 1.б5*10-3М (3); 3.3.10-3М (4), в - II при [Си2+] = 0 (1); 10-3М (2); 1.б5.10-3М (3); 3.3.10-3М (4),. На вставке: зависимости коэффицента Штерна -Фольмера, построенного по уравнению (1).

Оценка констант ШФ даёт величины (4300 ± 250)М-1, (1830 ± 100)М-1, (285 ± 15)М-1 для ГК и образцов I и II, соответственно. Значения констант скорости тушения ШФ К составили

1.4*1012М-1с1, б.тОПМ^с1, 9.5*1010М"1с"1, для образцов ГК, I и II, соответственно. Эти величины, как минимум, на порядок превышают диффузионные, которые для водных растворов составляют ~ ЮЮМ^с-1 [13]. Превышение наблюдаемых констант скорости тушения над диффузионными означает статический механизм тушения и это указывает на то, что в изученных растворах имеет место образование комплексов.

На рис.З(а-в) представлены спектральные зависимости аА для изученных образцов. Из рисунка видно, что эти зависимости принципиально различаются: для модельных молекул имеет место монотонный характер (рис.3б, в), а для образца IHSS эта зависимость немонотонная (рис.3а). Полученные результаты показывают, что образец ГК содержит несколько спектральных компонент (несколько типов флуорофоров, принадлежащих разным сайтам макромолекулы ГК), которые претерпевают разное тушение, а образцы производных салициловой кислоты имеют только одну спектральную компоненту (один вид флуорофоров). Слабый монотонный рост аА в длинноволновой части

спектра флуоресценции образцов I и II объясняется слабым сдвигом линии флуоресценции в красную область благодаря комплексообразованию.

8

О I I I I I I I

40 0 42 0 4 4 0 480 480 5 00

А., нм

Рис. 3. Спектральные зависимости параметра а а - ГК для [Cu2+] = 1.1*10-3M; б - I для [Cu2+] = 3.3Л0-3М; в - II для [Cu2+] = 3.3Л0-3М.

Таким образом, в результате проведённых экспериментов по наблюдению спектральной зависимости эффективности тушения можно сделать заключение о наличии нескольких независимых флуорофорных групп в макромолекуле ГК, которые принадлежат различным сайтам макромолекулы ГК. Напротив, для модельных молекул наблюдается только один единственный тип флуорофоров, что априори и следовало ожидать.

Поступило 06.09.2012 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Stevenson F.J. Humus Chemistry. Genesis, Composition, Reactions; 2nd ed; John Wiley and Sons, Inc.: New York, 1994, 386 p.

2. Visser S.A. - J.Soil Sci., 1964, v. 15, pp. 202-210.

3. Ghosh K., Mukherjee S.K. - J.Appl.Polym.Sci., 1971, v.15, pp. 2073-2081.

4. Khan S.U. - Soil Science, 1971, v.112, pp. 410-416.

5. Senesi N., Miano T.M., Provinziano M.R., Brunetti G. - Soil Science, 1991, v.152, №4, pp. 259-271.

6. Лаврик Н.Л. - Химия в интересах устойчивого развития, 2003, т.11, № 5, с. 751-755.

7. Лаврик Н.Л., Муллоев Н.У. - Химия в интересах устойчивого развития, 2006, т.14, № 4, с.379-390.

8. Lochmuller C.H., Saavedra S.S. - Anal. Chem., 1986, v. 58, pp. 1978-1981.

9. Лаврик Н.Л., Муллоев Н.У. - ЖПС, 2011, т.78, №5, с. 757-763.

10. Лаврик Н.Л., Муллоев Н.У. - ЖПС, 2010, т. 77, № 4, с. 627-632.

11. Лаврик Н.Л., Августинович И.А. - Журн. физ. хим., 1986, т. 54, с.1216-1218.

12. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. - М. Мир, 1986, 496с.

13. Лаврик Н.Л., Муллоев Н.У. - Оптика атмосферы и океана, 2012, т.25, № 9, с.833-839.

Н.У.Муллоев*, Н.Л.Лаврик, Б.Н.Нарзиев*

ТА^ЛИЛИ ВОБАСТАГИ^ОИ ТАЙФИИ ХОМУШШАВИИ ФЛУОРЕССЕНСИЯИ МАКРОМОЛЕКУЛАМИ ТУРШИИ ГУМИНЙ ВА

МОЛЕКУЛА^ОИ МОДЕЛИИ ОЩО

Институти кинетикаи химияви ва оташангезии ба номи В.В.Воеводский шуъбаи Сибирии Академияи илмхои Россия, *Донишго%и миллии Тоцикистон

Хднгоми ангезиши монохромати 0.мк = 337.1 нм), вобастагии тайфии самаранокии хо-мушшавии флуорессенсияи и, барои туршии гуминии стандарти (IHSS) ва туршии салисилати, бо ионхои мис (Cu2+) омухта шуда аст. Барои намунаи гумини (IHSS) вобастагии гайримоното-нии и, ва барои молекулах,ои модели вобастагии хатии суст мушохдда карда шуд. Натичах,ои х,осилшуда, хамчун аргументи тайфии зохиршавии хосияти полидисперси дар макромолекулами гуминй мебошад, ки гуногунии табиати химиявй ва дастрасии фазогии сайтхои флуорофорхо дошта, ба вучуд овардааст.

Калима^ои калиди: хомушшавии флуорессенси - доимии Штерн-Фолмер - иощои мис (Cu2+) -туршщои гуминй - уосилауои туршиуои салисилати.

N.U.Mulloev*, N.L.Lavrik, B.N.Narziev*

THE ANALYSIS OF SPECTRAL DEPENDENCES OF FLUORESCENCE QUENCHING OF MACROMOLECULES HUMIC ACID AND THEIR MODELING

MOLECULES

V.V.VoevodskyInstitute of Chemical Kinetics and Combustion, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, *Tajik National University

Under monochromatic excitation (kexc= 337.1 nm) is studied the spectral dependence of efficiency of fluorescence quenching a, the standard sample humic acids HA (IHSS) and derivatives of salicylic acid by ion Cu2+ . For sample HA non monotonic dependence a, while for modeling molecules weak linear dependence has been observed. The obtaining data are considered as spectroscopic argument of display at macro-molecules HA of property of polydispersion caused by distinction of the chemical nature and spatial availability of the sites containing fluorophores.

Key words: fluorescence quenching - Stern-Volmer constant - ions Cu2+- humic acid - derivatives of salicylic acid.