СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕЛЕОБРАЗУЮЩИХ ФОСФАТОВ ДЕКСТРАНА
METHOD FOR PRODUCING GEL-FORMING DEXTRANE PHOSPHATES

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и фармацевтической промышленности, касается способа получения гидрогелей на основе фосфатов декстрана, которые могут найти применение при получении пролонгированных препаратов для лечения различных заболеваний, включая онкологические, инфекционные заболевания, расстройства иммунной системы.
Гидрогели - сшитые гидрофильные полимеры, способные к равновесному и обратимому набуханию в воде или других растворителях (до 2 кг на 1 г сухого полимера). Гидрогели обладают уникальной биосовместимостью, что объясняется схожестью их структуры с тканями человеческого организма и высоким равновесным водосодержанием. Они находят широкое применение практически во всех сферах медицинской практики: в офтальмологии для создания контактных глазных линз, в эндопротезировании, ожоговой терапии, для контролированного выделения лекарственных веществ, в биосенсорах и т.д. Низкие значения свободной поверхностной энергии гидрогелей при контакте их с тканями организма обуславливает низкую адгезию к поверхности протеинов и клеток. Кроме того, вязкоупругие свойства гидрогелей вызывают минимальное раздражение тканей организма [1].
Известно, что для применения гидрогелей в медицине необходимо, чтобы они обладали не только биосовместимостью, но и способностью биодеградировать в тканях организма, и при этом ни они сами, ни продукты биодеградации не должны проявлять токсичных свойств. Природа продуктов деградации гидрогелей определяется как природой самого полимера, так и природой сшивающего агента.
Для приготовления гидрогелей медицинского назначения используются натуральные (коллаген, альгинат, крахмал, хитозан, др.) и синтетические полимеры (полиэтиленгликоль. поливиниловый спирт, полигидроксиэтилметакрилат).
Известно [1, 2], что в последние десятилетия декстран считается одним из наиболее перспективных полимеров для получения гидрогелей, используемых в качестве носителей биологически активных веществ. Декстран состоит из молекул, содержащих остатки D-глюкозы, связанных преимущественно α-1.6-D-глюкозидной связью, в значительно меньшей степени, α-1.2 и α-1,3 связями.
Декстран растворим в воде, обладает высокой биосовместимостью с тканями живого организма, не оказывает влияния на жизнедеятельность клеток, используется в медицине как плазмозаменитель благодаря своей фармакологической активности и отсутствию побочного действия. Реологические свойства декстрана и его производных послужили основанием исследования возможности применения его в качестве носителя лекарственных средств, включая антибиотики, цитостатики, пептиды и энзимы [1-3].
Известно, что гидрогели на основе декстрана и его производных получают путем химической и физической сшивки макромолекул [1].
Известно [1], что гидрогели на основе декстрана и его производных (метакрилат декстрана (MA-dex), гидроксиэтилметакрилат (HEMA-dex), олиголактаты декстрана и др.), имеющие в своем составе карбоксильные, или альдегидные, или амидные, или сульфатные и др. функциональные группы, биодеградируют в организме без образования токсичных веществ и находят применение для получения пролонгированных форм фармацевтически активных протеинов, белков, генов.
Известно [4-7], что фосфорилирование декстрана является одним из методов сообщения ему не только дополнительных медико-биологических, но катионообменных и гелеобразующих свойств при отсутствии токсичности модифицированных образцов.
Известно [5], что введение фосфорнокислых групп в состав декстрана путем этерификации ортофосфорной кислотой, полифосфорными кислотами, оксидом фосфора (V) и другими реагентами обеспечивает получение частично замещенных фосфорнокислых эфиров декстрана, которые растворимы в воде. Известно, что водорастворимые фосфаты декстрана, полученные путем этерификации полифосфорной кислотой в среде формамида или фосфатным буфером, обладают иммуномодулирующей активностью.
Известно [4], что гидрогели на основе фосфатов декстрана могут быть получены путем этерификации хлорокисью фосфора в среде слабого основания (пиридин или бензол). Проведение реакции в среде токсичного органического растворителя и деструкция полисахарида ограничивают возможности практического применения этого способа получения гидрогелей. В результате реакции этерификации получаются, в основном, дизамещенные фосфорнокислые эфиры декстрана, медико-биологические свойства которых не исследованы.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения гидрогелей целлюлозы [8, 9] путем этерификации смесью ортофосфорная кислота - оксид фосфора (V) в среде гексанола или диметилформамида и триэтилфосфата в течение 24-72 часов при температуре 30-70°С. После завершения реакции этерификации гидрогель последовательно отмывают водно-спиртовой смесью на аппарате Сокслета и диализом в дистиллированную воду с последующим лиофильным высушиванием и обработкой 0,05 моль/л раствором хлорида кальция.
Однако известный метод приготовления гидрогелей на основе фосфата целлюлозы не позволяет получать гидрогели на основе фосфата декстрана. В указанных условиях образуются неустойчивые при хранении или малонабухающие в воде производные фосфата декстрана. К недостаткам известного метода приготовления фосфорилированных полисахаридов для медицинского применения можно отнести следующее.
1. Использование в реакции этерификации алифатического спирта с высокой температурой кипения (160°С), способного связываться с матрицей полисахарида за счет водородных связей, усложняет отмывку целевого продукта, что приводит к увеличению энергозатрат и объема отходов.
2. Присутствие катионов кальция в составе гидрогелей фосфатов целлюлозы [9] ухудшает его катионообменные и комплексообразующие свойства и, как следствие, его поглощающую способность по отношению к лекарственным средствам.
3. Использование гидрогелей полисахаридов в Н-форме [8] приводит к автогидролизу и невозможности использования в качестве полимера-носителя при местном использовании из-за низкого значения рН.
4. Гидрогели на основе фосфата целлюлозы не могут использоваться в качестве полимера-носителя противоопухолевых веществ из-за длительности процесса биодеградации в организме, что при имплантации может вызвать отрицательную реакцию на длительное присутствие инородного объекта.
Задачей изобретения является получение биодеградируемого гидрогеля на основе фосфата декстрана, который обладает противоопухолевой активностью, катионообменными свойствами и может быть использован в фармацевтической промышленности в качестве полимера-носителя для получения пролонгированных форм лекарственных веществ.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения гидрогелей фосфатов полисахаридов, включающем обработку исходного полисахарида смесью ортофосфорная кислота - оксид фосфора (V) в среде органического растворителя в присутствии триалкилфосфата при температуре 30-70°С в течение 24-72 часов с последующей промывкой полученных продуктов, сушкой и обработкой водным раствором минерального соединения, процесс этерификации декстрана проводят в среде неполярного органического растворителя с низкой температурой кипения из числа углеводородов и их производных и обработкой полученного продукта 0,005-0,5 М водным растворами карбоната натрия, или гидрокарбоната натрия, или гидроксида натрия, или их смесями до значения рН 3.0-8,0 с последующим высаждением в этиловый спирт и сушкой при температуре 20-50°С.
В качестве исходного материала для получения заявляемых соединений используют декстран с молекулярной массой в интервале 40-1000 кДа.
При осуществлении заявляемого способа могут быть использованы различные растворители, например хлороформ, четыреххлористый углерод, гексан и др., а также различные алкилфосфаты (триэтил-, трибутил-, трифенилфосфат) и их смеси.
Процесс получения гидрогелей преимущественно на основе монозамещенных фосфатов декстрана по предлагаемому способу проводят путем последовательного осуществления следующих стадий:
- приготовление суспензии декстрана в неполярном органическом растворителе;
- приготовление смеси оксид фосфора (V) - ортофосфорная кислота в присутствии триалкилфосфата (триэтил-, трибутил-, трифенилфосфата);
- смешение суспензии декстрана в органическом растворителе с фосфорилирующей смесью;
- проведение реакции фосфорилирования при температуре 30-70°С в течение 24-72 часов;
- промывка водно-спиртовой смесью на аппарате Сокслета и сушка;
- обработка полученного продукта 0,005-0,5 М водными растворами карбоната натрия, или гидрокарбоната натрия, или гидроксида натрия, или их смесями до значения рН 3,0-8,0;
- высаждение полученного продукта в этиловый спирт и сушка.
р
В заявляемых гидрогелях определяют наличие фосфорнокислых групп методом ИК-спектроскопии, содержание фосфора (С) методом элементного анализа (спектрофотометрический с применением молибденованадиевого реактива), степень замещения по фосфорнокислым группам (СЗ), степень набухания (Q).
Изобретение иллюстрируют примеры.
w
P
Пример 1. 5 г декстрана (M=- 60 кДа) помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 25 мл хлороформа и выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре. Фосфорилирующую смесь готовят следующим образом: к 43,8 г оксида фосфора (V) прибавляют 36,8 мл трибутилфосфата и далее, малыми порциями, избегая сильного разогревания, 36,8 мл ортофосфорной кислоты (85%-ной). Этерифицирующую смесь вносят в суспензию полисахарида в хлороформе: реакцию проводят в течение 48 часов при температуре 30°С. Продукт этерификации промывают 70%-ным раствором этанола в аппарате Сокслета, сушат и обрабатывают 170 мл 0.1 М водным раствором гидроксида натрия в течение 2 часов при постоянном перемешивании, затем фосфат декстрана высаждают в 200 мл спирта этилового и сушат при температуре 50°С. Выход фосфата декстрана количественный. Выход гель-фракции составляет 91.5%. СЗ-0,71.
w
P
Пример 2. 5 г декстрана (M=40 кДа) помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 25 мл гексана и выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре. Фосфорилирующую смесь готовят следующим образом: к 43,8 г оксида фосфора (V) прибавляют 36,8 мл триэтилфосфата и далее, малыми порциями, избегая сильного разогревания, 36,8 мл ортофосфорной кислоты (85%-ной). Этерифицирующую смесь вносят в суспензию полисахарида в гексаноле, реакцию проводят в течение 48 часов при температуре 30°С. Продукт этерификации промывают 70%-ным раствором этанола в аппарате Сокслета, сушат и обрабатывают 100 мл 0.1 М водным раствором натрия карбоната в течение 2 часов при постоянном перемешивании, затем фосфат декстрана высаждают в 200 мл спирта этилового и сушат при температуре 50°С. Выход фосфата декстрана количественный. Выход гель-фракции составляет 89,0%. СЗ=0,97.
w
P
Пример 3. 5 г декстрана (M=1000 кДа) помещают в колбу с притертой пробкой, заливают 25 мл тетрахлористого углерода и выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре. Фосфорилирующую смесь готовят как описано в примере 1. Этерифицирующую смесь вносят в суспензию полисахарида; реакцию проводят в течение 72 часов при температуре 70°С. Продукт этерификации промывают 70%-ным раствором этанола в аппарате Сокслета, сушат и обрабатывают смесью, состоящей из 100 мл 0.1 М водного раствора натрия гидрокарбоната и 100 мл 0.1 М водного раствора натрия гидрокарбоната в течение 2 часов при постоянном перемешивании, затем фосфат декстрана высаждают в 200 мл спирта этилового и сушат при температуре 50°С. Выход фосфата декстрана количественный. Выход гель-фракции составляет 76,0%. СЗ=2,86.
Примеры 4-9. Осуществляют аналогично примеру 1 при различных параметрах процесса. Условия осуществления всех примеров и результаты химического анализа приведены в табл.1.
Физико-химические свойства полученных по предлагаемому способу гелеробразующих фосфатов декстрана, представляющих собой неагрегированные частицы белого или кремового цвета, представлены в таблице 2.
Степень набухания. Степень набухания (Q) гидрогелей определяют гравиметрическим методом в соответствии с формулой;
где Q - степень набухания, г/г,
1
m - масса набухшего образца, г;
2
m - масса образца, высушенного до постоянной массы, г.
Гидрогели фосфатов декстрана отделяют от избытка воды центрифугированием на стеклянном фильтре с размером пор 160 мкм при центробежной силе 2400 g. Высушивание до постоянной массы осуществляют в присутствии оксида фосфора (V) при температуре 50°С и остаточном давлении 0,1 атм.
Значения степени набухания гидрогелей фосфатов декстрана с разной степенью замещения приведены в таблице 2.
Таблица 2
Зависимость степени набухания от содержания фосфора в этерифицированном декстране
№
СЗ<sub>P</sub>
Q, г/г
1
0,62
86,0
2
0,76
48,3
3
0,85
40,7
4
1,35
41,0
Из таблицы 2 видно, что увеличение в составе декстрана фосфорнокислых групп приводит к уменьшению степени набухания.
Оценка острой токсичности гидрогелей на основе фосфатов дeкcтpaнa проведена на белых беспородных крысах (каждая серия по 4 крысы весом 200-250 г). Животным вводилось по 10 г 50% и 70%-ных гидрогелей внутрибрюшинно. Результаты медико-биологических исследований позволили сделать заключение, что фосфаты декстрана с разной степенью замещения относятся к классу малотоксичных веществ. Его токсические дозы составляют более 5 г/кг.
исх
50
Эффективность противоопухолевого действия фосфата декстрана была проверена in vitro на монослойной культуре опухолевых клеток HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека, клон М). Критериями оценки цитотоксического эффекта гидрогелей являлись: разница между числом (N-N) опухолевых клеток в контроле и опыте, а также показатель эффективности ИК, численно равный концентрации фюсфатов декстрана, вызывающей ингибирование 50% клеток.
Таблица 3
Влияние исходного и фосфорилированного декстранов на рост культуры опухолевых клеток HeLa
Полисахарид
СЗ<sub>P</sub>
Концентрация, мг /мл
Число клеток (·10<sup>3</sup>)
Прирост в % к контролю
ИК<sub>50</sub>, мг/мл
N<sub>исх</sub>
N
N-N<sub>исх</sub>
контроль
180±60
805±45
625
100
-
исходный декстран
-
1
720±35
540
86
>2,0
2
550±55
370
59
фосфат декстрана
0,52
1
570±65
390
62
1,7
2
460±20
280
45
0,79
1
520±20
340
54
1,2
2
408±20
228
36
50
Из таблицы следует, что при увеличении в составе декстрана фосфорнокислых групп способность гидрогелей ингибировать опухолевые клетки увеличивается: ИК гидрогелей декстрана со СЗ=0,79 почти в 2 раза больше аналогичного показателя исходного декстрана и на 30% декстрана со СЗ=0,52, т.е. в условиях in vitro противоопухолевый эффект фосфатов декстрана по сравнению с исходным декстраном повышается.
Релиз противоопухолевых веществ из гидрогелей фосфата декстрана.
Релиз противоопухолевых веществ из гидрогеля на основе фосфата декстрана (пример 1) был исследован на примере цитарабина методом диализа через полупроницемую мембрану в физиологический раствор. Исследование релиза проводили при температуре 37°С в двухкамерной ячейке с использованием мембраны из целлофана, проницаемой только для хлорида натрия и цитостатика. Соотношение цитарабин/фосфат декстрана 1/9. Концентрацию цитарабина во внешнем растворе через определенные промежутки времени определяли спектрофотометрическим методом.
Таблица 4
Релиз цитарабина из фазы гидрогеля фосфата декстрана
Цитостатик
Релиз, %
без гидрогеля
4.5% гидрогеля
t<sub>50%</sub>, мин<sup>1)</sup>
t<sub>90%</sub>, мин<sup>2)</sup>
t<sub>50%</sub>, мин <sup>1)</sup>
t<sub>90%</sub>, мин<sup>2)</sup>
Цитарабин
34
145
56
360
<sup>1)</sup> Время релиза 50% цитостатика из фазы гидрогеля во внешний раствор
<sup>2)</sup> Время релиза 90% цитостатика из фазы гидрогеля во внешний раствор
Из представленных в таблице 4 результатов видно, что в условиях модели в сравнительно короткий интервал времени во внешний раствор поступает достаточное количество цитостатика, позволяющее создать ударную концентрацию вблизи пораженного органа при локальном использовании и поддерживать ее в течение более длительного времени по сравнению с контролем.
Таким образом, полученные по предлагаемому способу гидрофильные гели, являются малотоксичными веществами, обладают противоопухолевым действием, катионообменными свойствами и могут быть использованы для получения пролонгированных лекарственных средств с контролированной скоростью их высвобождения.
Источники информации
1. Tomme S.R.V., Hennik W.E. Biodegradable dextran hydrogels for protein delivery applications. Expert Review of Medical Devices. 2007. Vol.4, p.147-164.
2. Tomme S.R.V., Steenbergen M.J., Smedt S.C.D., Nostrum C.F. Hennik W.E. Biomaterials. 2005. Vol.26, p.2129 - 2135.
3. Хомяков К.П., Вирник А.Д., Ушаков С.Н., Роговин З.А. Синтез полимерных лекарственных соединений на основе производных декстрана // Высокомолекулярные соединения. 1965. №6. С.1035-1040.
4. Kirci В., Kaplan H., Rzaev Z.M., Guner A. Preparation conditions and swelling equilibria of dextran hydrogels prepared by some crosslinking agents. Polymer. 2004. Vol.45. P.6431-6435. 7.
5. US Pat. 20060154896, МКИ А61К 31/721, 2006.
6. US Pat. 2970141. МКИ С12Р 19/08, С12Р 19/00, 1961.
7. Suzuki M.. Mikami Т., Malsumoto Т., Suzuki S. Preparation and antitumor activity of o-palmitoyldextran phosphate, o-palmitoyldextrans and dextran phosphate. Carbohydrate Reseach. 1977. Vol.53. P.223-229.
8. Granja P.L., Pouysegu L., Petraud M., De Jeso В., Baquey C., Barbosa M.A. Cellulose phosphates as biomaterials. Synthesis and characterization of highly phosphorylated cellulose gels // Journal of Applied Polymer Science 2001. V.82. P.3341-3353.
9. Granja P.L., Pouysegu L., Deffieux D. De Jeso В., Labrugere C., Baquey C., Barbosa M. A. Cellulose phosphate as biomaterials. II. Surface chemical modification of regenerated cellulose hydrogel // Journal of Applied Polymer Science. 2001. Vol.82. p.3354-3365.