Биодеградация глинистых минералов под влиянием цианобактериально-актиномицетных ассоциаций

УДК 631.46

БИОДЕГРАДАЦИЯ ГЛИНИСТЫХ МИНЕРАЛОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-АКТИНОМИЦЕТНЫХ АССОЦИАЦИЙ1

Е.А. Иванова, Н.П. Чижикова, Г.М. Зенова, Е.О. Омарова, А.С. Манучаров

Показана способность экспериментальных ассоциаций цианобактерий и актиномицетов изменять структурные параметры глинистых минералов (каолинит, вермикулит, слюда и монтмориллонит). В первую очередь под влиянием ассоциации претерпевают преобразование вермикулит и биотит, наиболее легко выветривающиеся из всех слагающих породу минералов. Скорость процесса трансформации слюд в смешанослойное образование зависит от их строения — триоктаэдрические слюды (биотит, входящий в состав вермикулита) проходят этот путь значительно быстрее, чем диоктаэдрические (слюда, являющаяся компонентом каолина). Во всех слоистых силикатах отмечены преобразования их кристаллической решетки (разупоря-дочивание, разукрупнение, трансформация).

Ключевые слова: глинистые минералы, экспериментальные цианобактериально-актиноми-цетные ассоциации, диоктаэдрические и триоктаэдрические слюды.

Введение

Цианобактерии наряду с актиномицетами являются обязательным компонентом сообществ почвенных микроорганизмов в местах первичного почвообразования, пятнах «цветения» почвы, гидротермах лагун [1, 10]. Принимая участие во многих биохимических процессах (накопление органического вещества, разрушение минеральных субстратов, распределение и аккумуляция различных элементов), альго-циано-бактериальные сообщества обусловливают изменение среды, ведущее к формированию почвы [9].

В местах первичного почвообразования на осадочных карбонатных породах обнаружены альго-актино-мицетные ассоциации (актинолишайник), в которых мицелиальные бактерии составляют доминирующий компонент прокариотного комплекса [10]. Компонентом ассоциативного комплекса микроорганизмов в саговниковых растениях, где доминантными микросимбионтами являются цианобактерии, выступают актиномицеты [5]. Почвообразующую деятельность современных цианобактериальных сообществ, проявляющуюся в формировании наскальных обрастаний и преобразовании минеральной части почвообразую-щей породы, отмечали многие исследователи [2, 13, 14, 16]. Однако потенциал функциональных проявлений цианобактериально-актиномицетных ассоциаций в природных сообществах полностью не изучен.

Цель настоящей работы — анализ изменения структурного состояния минералов пород под влиянием экспериментальных ассоциаций, состоящих из цианобактерий и актиномицетов.

Объекты и методы исследований

Объекты исследования — глинистые породы, предоставленные музеем кафедры физики и мелиорации

почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова: каолин с доминирующим минералом каолинитом — Al4(OH)8[Si4O10]; вермикулит, на 56% состоящий из вермикулита (Са, Mg,...)(Mg, Fe)3(OH)2[(Si, Al)4O10]-4H2O; гумбрин — из монтмориллонита (Са, Mg,..), (Al, Fe3+, Mg)2(OH)2[(Si, Al^O^^O.

Экспериментальные двухкомпонентные ассоциации состояли из следующих культур: свободножи-вущая аскеничная цианобактерия Anabaena variabilis АТСС 29413 (из музея кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ); актино-мицеты Streptomyces pluricolorescens штамм p1 и Strep-tomyces cyaneofuscatus штамм c1, изолированные из апогеотропных корней оранжерейных саговниковых растений Cycas micholitziii и Stangeria eriopus (Государственный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН, г. Москва). Филогенетическое положение актиномицетов определяли на основании секвенирования гена 16S рРНК. Выделение ДНК из актиномицетов осуществляли по методу [3]. Для проведения полимераз-ной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК была использована система универсальных праймеров [17]. Проведение предварительного BLAST-анализа секвенированного фрагмента гена 16S рРНК штаммов р1 и c1 (1397 нук-леотидов), соответствующего (E. coli) позициям с 36 по 1450, подтвердило, что исследуемые штаммы принадлежат роду Streptomyces актиномицетной линии грамположительных бактерий. Наиболее близкими, в том числе и по фенотипическим признакам [15], к полученной последовательности штамма р1 были аналогичные последовательности типового штамма S. pluricolorescens, а штамма с1 — типового штамма S. cyaneofuscatus.

Стрептомицеты культивировали на среде минеральный агар-1 следующего состава (г/л): крахмал растворимый — 20,0; ^HPO4 — 0,5; MgSO4 — 0,5;

1 Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 08-04-90201-Монг.а), а также при частичном финансировании

грантом Президента для поддержки ведущих научных школ РФ № НШ—8797.2006.4.

KNO3 - 1,0; NaCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; агар - 20,0 [6]. Поддержание культуры цианобактерии A. variabilis проводили в люминостате на среде BG-11 следующего состава (г/л): NaNO3 — 1,5; K2PO4 — 0,04; MgSO4 • 7H2O - 0,075; CaCl2 • 2H2O - 0,036; лимонная кислота - 0,006; железо аммиачное лимоннокислое - 0,006; ЭДТА - 0,0011; Na2CO3 - 0,02; смесь микроэлементов (1 мл). Монокультуры цианобакте-рий пересевали один раз в месяц (объем инокулята цианобактерии составлял ~ 10% от объема свежей среды). Для получения смешанных культур цианобак-терии культивировали на жидкой питательной среде BG-11 в люминостате (780 лк, t 24±1°).

Экспериментальную цианобактериально-актино-мицетную ассоциацию формировали, используя ино-кулюмы монокультуры стрептомицета, выращенного в погруженной культуре на среде Г1 в течение 7 сут., и цианобактерии, выращенной в течение трех недель на среде BG-11 при круглосуточном освещении (780 лк, t 24±1°). Компоненты перемешивали (начальное соотношение биомасс 1:1) и культивировали в модифицированной жидкой среде BG-11 в стационарном состоянии в люминостате в течение 7—10 сут. Модификация среды BG-11 заключалась в отсутствии в ней микроэлементов. Использование питательной среды, традиционной для культивирования цианобактерий, но лишенной микроэлементов, обусловлено положением о том, что успешное формирование экспериментальных ассоциаций осуществляется в условиях, обеспечивающих рост, но не оптимальных для роста составляющих ассоциации компонентов.

Опыты проводили в стеклянных стаканах-фильтрах с впаянной пористой мембраной; на нее накладывали фильтровальную бумагу и помещали слой (~5 мм) минеральной основы, на которой культивировалась ассоциация. Для поддержания роста ее прокапывали модифицированной питательной средой BG-11 (1 раз в 2—3 дня) в течение двух месяцев. Питательная среда не только обеспечивала рост ассоциации, но и вымывала продукты метаболизма в слои минеральной фракции.

Минералогический состав пород определяли рентген-дифрактометрическим методом с помощью универсального рентген-дифрактометра XZG фирмы Carl Zeiss Yena (Германия) [7]. Режим работы аппарата в процессе исследований выдерживали постоянным (30 kv, 40 mA). Использовано медное излучение, фильтрованное никелем. Рентген-дифрактограммы получены для воздушно-сухих, для насыщенных эти-ленгликолем и для прокаленных при температуре 550° в течение 2 ч образцов. Диагностику минералов проводили по общепринятым руководствам [4, 8, 11, 12].

Результаты и обсуждение

По данным рентгеноструктурного анализа, исходный образец породы каолина состоит из каолинита с примесью слюд, а также гиббсита, кварца и полевых

шпатов (ортоклаз). Диагностика каолинита основана на наличии рефлексов в области d001 = 7,22 А и d002 = 3,58 А образцов в воздушно-сухом состоянии (рис. 1 — I, a). После сольватации образцов эти-ленгликолем отражения рефлексов этого минерала остались без изменения (рис. 1 — I, б). Прокаливание образца при 550° в течение 2 ч разрушило каолинит (рис. 1 — I, в).

Слюда в исходном образце определяется по целочисленной серии отражений, кратных d001 = 10,0 А, а именно d002 = 5,01 А, d003 = 3,34 А (рис. 1 — I, а). После сольватации образца этиленгликолем и после его прокаливания отражения рефлексов не изменились (рис. 1 — I, б, в). Отношение интенсивностей отражений 001 и 003 к таковому 002 свидетельствует о наличии диоктаэдрической разности слюд, поскольку интенсивность порядка составляет 1/3 интенсивности первого базального рефлекса.

Рис. 1. Рентген-дифрактограмма глинистых минералов в породе каолина: I - исходный образец; II - образец после выращивания ассоциации цианобактерии Anabaena variabilis и стрептомицета Streptomyces cyaneofuscatus. Условные обозначения здесь и на рисунках 2 и 3: а - образец в воздушно-сухом состоянии; б - образец после сольватации этиленгликолем; в - образец после прокаливания при 550° в течение 2 ч

Присутствие кварца в породе доказано наличием рефлексов d = 4,28 и d = 3,34 А. Рефлекс в области d = 3,22 А принадлежит полевому шпату, а наличие рефлекса d = 4,85 А свидетельствует о присутствии гиббсита.

При культивировании ассоциации, состоящей из актиномицета S. cyaneofuscatus и цианобактерии А. variabШs, произошли следующие изменения минералов породы. Существенным образом снизилась интенсивность рефлексов слоистых силикатов, в первую очередь слюд (рис. 1 — II, а). Одновременно возросла интенсивность рефлексов кварца — d = 4,28 А и 3,34 А и гиббсита — d = 4,85 А (рис. 1 — II, а). Можно предположить, что под влиянием роста ассоциации снизилась степень совершенства структуры слоистых силикатов, произошло их разупорядочивание.

Поскольку оба компонента (слюда и каолинит) обладают жесткой структурой, в данном эксперименте трансформационных преобразований структуры не зафиксировано.

Рис. 2. Рентген-дифрактограмма глинистых минералов в породе вермикулита: I — исходный образец; II — образец после выращивания культуры ассоциации цианобактерии Anabaena variabilis и стрептомицета Streptomyces cyaneofuscatus

Аналогичный опыт был проведен на породе, состоящей главным образом из двух компонентов — вермикулита и биотита. Диагностика вермикулита основана на наличии интенсивного отражения 1-го порядка, соответствующего межплоскостному расстоянию 14,4 А, и серии базальных рефлексов с наиболее сильными рефлексами 4-го и 5-го порядков соответственно 3,64 и 2,88 А (рис. 2 — I, а). Насыщение образцов этиленгликолем не изменяет величин базальных межплоскостных расстояний (рис. 2 — I, б). Прокаливание при 550° в данном случае не привело к полному сжатию до 10,0 А решетки минерала, сохранился остаточный продукт, отличающийся значительным снижением интенсивности первого рефлекса (рис. 2 — I, в).

Биотит диагностирован по наличию целочисленной серии отражений кратных 10,2 А, а именно d002 = 5,07 А, d003 = 3,38 А (рис. 2 — I, а). Эти отражения при прокаливании образца при 550° в течение 2 ч (рис. 2 — I, в) и насыщении его этиленгликолем (рис. 2 — I, б) не изменяются.

Выращивание ассоциации, состоящей из актиномицета S. cyaneofuscatus и цианобактерии A. variabilis, привело к преобразованиям минералов, выраженным в уменьшении интенсивности рефлексов как вермикулита, так и биотита. Снижение интенсивности базальных отражений в области d001, d004 и d005 в три раза свидетельствует о процессе разрушения этого компонента породы (рис. 2 — II, a). Интенсивность рефлексов биотита по сравнению с вермикулитом изменилась в меньшей степени. Однако здесь отмечается образование набухающей фазы — продукта трансформации биотита в смешанослойное слюда-смектитовое образование, что диагностируется по наличию рефлексов 12,7 и 24,4 А (рис. 2 — II, а).

Сравнение результатов, полученных в экспериментах с каолином и вермикулитом, свидетельствует о различии в процессах преобразования глинистых минералов под влиянием продуктов жизнедеятельности ассоциации, компонентами которой являются S. cyaneofuscatus и A. variabilis, что связано с кристаллохимией минералов и их устойчивостью к процессам выветривания. По сравнению с каолином процесс преобразования вермикулита произошел более интенсивно. Значительно сократилось количество вермикулита (уменьшилась интенсивность основных рефлексов).

Выявлено, что скорость процесса трансформации слюд в смешанослойное образование зависит от их строения — триоктаэдрические слюды (биотит, входящий в состав вермикулита) трансформируются значительно быстрее, чем диоктаэдрические (слюда, входящая в состав каолина).

Рентгенографирование ориентированных препаратов породы гумбрин свидетельствует о том, что она мономинеральна и состоит из минерала группы смектитов, а именно из монтмориллонита. В исходном воздушно-сухом состоянии он дает отражения

Рис. 3. Рентген-дифрактограмма глинистых минералов в породе гумбрина: I — исходный образец; II — после выращивания культуры ассоциации цианобактерии Anabaena variabilis и стрептомицета Streptomyces pluricolorescens; III — после выращивания культуры ассоциации цианобактерии Anabaena variabilis и стрептомицета Streptomyces cyaneofuscatus

с межплоскостным расстоянием 14 Â. Этот рефлекс всегда интенсивен, последующая целочисленная серия рефлексов имеет незначительную интенсивность (рис. 3 — I, a). Сольватация образца этиленгликолем привела к увеличению межплоскостного расстояния с 14 до 16,9 Â, здесь отмечается новая целочисленная серия отражений, четко диагностируется рефлекс в

области 8,6 Â (рис. 3 — I, б). Прокаливание образца при 550° привело к сокращению межплоскостного расстояния до 10,0 Â. Наличие рефлекса при 4,07 Â свидетельствует о примеси кристобалита, 3,35 Â — о примеси кварца.

Исследование влияния жизнедеятельности микробных ассоциаций на минералы породы гумбрина проводили с использованием ассоциации A. variabilis и S. pluricolorescens и ассоциации A. variabilis и S. cyaneofuscatus. Применение в качестве мицелиального компонента S. pluricolorescens привело к существенному снижению интенсивности основного (14 Â) рефлекса минерала (рис. 3 — II, а). Одновременно в образце резко увеличилась интенсивность рефлексов 4,4; 4,07; 3,35 Â. Можно предположить, что произошло разупорядочивание структуры минералов, снижение ориентации кристаллов по оси с за счет агрегирования минералов с продуктами жизнедеятельности микробных сообществ. В пользу этого довода говорит увеличивающаяся интенсивность общего рефлекса 4,4 Â. Относительное снижение количества монтмориллонита также подтверждается увеличением в образце кварца и кристобалита (рис. 3 — II, a). Сольватация образца этиленгликолем приводит к расширению, а прокаливание при 550° — к сжатию указанного выше межплоскостного расстояния до значений 17,24 и 10,00 Â соответственно (рис. 3 — II, бу в).

Цианобактериально-актиномицетная ассоциация, в которой в качестве мицелиального компонента использовался также S. cyaneofuscatus, оказала влияние на структурное состояние минеральной составляющей, что выразилось в уменьшении интенсивности и большей четкости рефлекса монтмориллонита — d001 = 15,2 Â (рис. 3 — III, а). Результаты, полученные при сольватации и прокаливании образца, аналогичны описанным в предыдущем варианте.

Таким образом, показана способность экспериментальных ассоциаций цианобактерий с актиноми-цетами изменять структурные параметры глинистых минералов (каолинита, вермикулита, биотита, монтмориллонита).

Преобразования глинистых минералов происходят и в современных почвах. Взаимодействие с ними почвенных организмов приводит к разупорядочива-нию структуры минералов, совершаются трансформационные преобразования деградационного типа и освобождение минеральных элементов, которые становятся достоянием микробных сообществ почв.

Можно предположить, что процессы преобразования породы могли происходить и в докембрии, когда начался гидроземный процесс почвообразования — первый этап единого почвообразовательного процесса на Земле, так как возраст альго-бактериальных сообществ, сохранившихся в виде литифицированных строматолитов, — 3,5 млрд лет. В результате этих процессов на сформированных субстратах поселялись более высокоорганизованные организмы, растения, ускоряющие процесс почвообразования.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андреюк Е.И., Коптева Ж.П., Занина В.В. Цианобак-терии. Киев, 1990.

2. Аристовская Т.В. Микробиология процессов почвообразования. Л., 1980.

3. Булыгина Е.С. Выделение ДНК из бактерий // Микробиология. 2002. Т. 71, № 4. С. 500-508.

4. Браун Т. Рентгеновские методы изучения и структура глинистых минералов. М., 1965.

5. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург, 2007.

6. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А. и др. Определитель актиномицетов. М., 1983.

7. Горбунов Н.И. Высокодисперсные минералы и методы их изучения. М., 1963.

8. Градусов Б.П. Смешанослойные минералы в почве. М., 1976.

9. Домрачева Л.И. «Цветение» почвы и закономерности его развития. Сыктывкар, 2005.

10. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. М., 2001.

11. Костов И. Минералогия. М., 1971.

12. Соколова Т.А., Дронова Т.Я., Толпешта И.И. Глинистые материалы в почвах. Тула, 2005.

13. Сушкина Н.Н., Цюрупа И.Г. Микрофлора и первичное почвообразование. М., 1973.

14. Чижикова Н.П., Зенова Г.М., Манучаров А.С. и др. Изменения в структуре глинистых минералов под влиянием альгобактериальных сообществ // Почвоведение. 2005. № 8. С 1012-1015.

15. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 4 / Ed. S.T. Williams, M. Sharpe, J.A. Holt. Baltomore ets. 9th ed. 1989.

16. Budel B., Weber B., Kuhl M. et al. Reshaping of sandstone surfaces by cryptoendolithic cyanobacteria bioalkalization causes chemical weathering in arid landscapes // Geobiology. 2004. Vol. 2(4). P. 261-268.

17. Edwards U., Rogall T., Bloeker H. et al. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucl. Acids res. 1989. Vol. 17. P. 7843-7853.

Поступила в редакцию 11.06.08

BIODEGRADATION OF CLAY MINERALS BY THE INFLUENCE OF CYANOBACTERIAL-ACTINOMYCETAL ASSOCIATIONS

E.A. Ivanova, N.P. Chizhikova, G.M. Zenova, E.O. Omarova, A.S. Manucharov

It was revealed ability of changing the parametrs of clay minerals (kaolin, vermiculite, mica and montmorillonite) of experimental associations of cyanobacteria and actinomycete. The firsts were changed vermiculite and biotite by influence of association. It was showed threeoctaedric mica (biotite) was chenged quickly that twooctaedric (mica). It was marked, that crystallic grating of all stratus silicates was changed by the influence of cyanobacterial-actinomycetal associations silicates was changed. Key words: clay mineral, biodegradation, association of cyanobacteria and actinomycete.

Сведения об авторах

Иванова Е.А., студентка каф. биологии почв. Чижикова Н.П., докт. геол.-минерал. наук, ведущий науч. сотр. Почвенного ин-та им. В.В. Докучаева РАСХН. Зенова Г.М., докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв. Омарова Е.О., аспирант каф. биологии почв. Манучаров А.С., канд. биол. наук, доцент каф. физики и мелиорации почв. Тел.: 8(495) 939-44-46 каф. биол. почв.