Изучение способности моноцитов, выделенных из периферической крови, образовывать внеклеточные ловушки спонтанно и после активации

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012

man leukocyte antigen-G expression in extravillous trophoblasts is associated with preeclampsia // Mol. Hum. Reproduct. - 2000. - Vol. 6, N 1. - P. 88-95.

17. Gomez-LopezN., GuilbertL., OlsonD. M. Invasion of leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy // J. Leukocyte Biol. - 2010. - Vol. 88, N 4. - P. 625-633.

18. Hunt J. S., PetroffM. G., McIntire R. H. et al. HLA-G and immune tolerance in pregnancy // FASEB J. - 2005. - Vol. 9. - P. 681-693.

19. Issekutz A. C., Issekutz T. B. Quantitation and kinetics of blood monocyte migration to acute inflammatory reactions, and IL-1 alpha, tumor necrosis factor-alpha, and IFN-gamma // J. Immunol. - 1993. - Vol. 151, N 4. - P. 2105-2115.

20. Sacks G. P., Studena K., Sargent I. L. et al. Normal pregnancy and preeclampsia both produce inflammatory changes in periph-

eral blood leukocytes akin to those of sepsis // Am. J. Obstetr. Gynecol. - 1998. - Vol. 179. - P. 80-86.

21. Sumagin R., Sarelius I. H. TNFa activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2006. - Vol. 291. - P. H2116-H2125.

22. Tsuda H., SakaiM., Michimata T. et al. Characterization of NKT cells in human peripheral blood and decidual lymphocytes // Am. J. Reproduct. Immunol. - 2001. - Vol. 45, N 5. - P. 295-302.

23. Wilczynski J. R., Tchorzewski H., BanasikM. et al. Lymphocyte subset distribution and cytokine secretion in third trimester decidua in normal pregnancy and preeclampsia // Eur. J. Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol. - 2002. - Vol. 109. - P. 8-15.

Поступила 17.03.12

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616-092:612.112.95.017.1

И. И. Долгушин, О. Б. Прокопьева, Т. Г. Смирнова, Е. А. Мезенцева, О. Л. Колесников,

А. Ю. Савочкина, К. В. Никушкина

изучение способности моноцитов, выделенных из периферической крови, образовывать внеклеточные ловушки спонтанно и после активации

ГБОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России, НИИ иммунологии

Целью исследования стало изучение способности моноцитов крови образовывать внеклеточные ловушки при действии на них различных микробных и немикробных факторов. Был разработан метод двухступенчатого выделения моноцитов из периферической крови, который позволяет получить клеточную суспензию, которая состоит на 2/3 из моноцитов, находящихся в неактивированном состоянии. В ходе работы выявлено, что активация моноцитов пи-рогеналом, взвесью Candida albicans при температуре 37C в течение 30 мин и форбол-12-миристат-13-ацетатом при 37C в течение 60 мин приводит к образованию ими внеклеточных ловушек. При 50C происходит спонтанная тотальная активация моноцитов, стимулирующая их к выбросу экстрацеллюлярных сетей. Результаты данной работы представляют интерес для клинической иммунологии и открывают перспективы для дальнейшего изучения способности моноцитов к образованию внеклеточных ловушек.

Ключевые слова: моноциты, выделение моноцитов, внеклеточные моноцитарные ловушки

I.I. Dolgushin, O.B. Prokopyeva, T.G. Smirnova, E.A. Mezentseva, O.L. Kolesnikov, A.U. Savochkina, K.V Nikushkina

THE STUDY OF THE ABILITY OF THE MONOCYTES EXTRACTED FROM PERIPHERAL BLOOD TO FORM EXTRACELLULAR TRAPS SPONTANEOUSLY AND AFTER ACTIVATION

The aim of the research is the study of the ability of the monocytes extracted from peripheral blood to form extracellular traps after their activation by microbal and non-microbal factors. The method of two-step extraction of monocytes from peripheral blood was developed. Due to this method it is possible to get cell suspension containing two thirds of monocytes in nonactivated state. The activation of monocytes by pyrogenal and C. аlbicans cell suspension under + 37оС during 30 minutes and FMA under + 37оС during 60 minutes leads to the formation of extracellular traps. The temperature of + 50оС provocates spontaneous total activation of monocytes followed by the secret of extracellular traps. The results of this research are of interest for clinical immunology and stimulate further study of monocytes ability to form extracellular traps.

Key words: monocytes, monocytes extraction, monocyte extracellular traps

Введение. На сегодняшний день существует огромное количество заболеваний, в патогенезе которых дефект моноцитарно-макрофагального звена играет существенную роль и выступает как маркер тяжести их течения [3, 5]. Это и бактериальные инфекции - сифилис, бруцеллез, сепсис, туберкулез [11, 16], и инфекции вирусной этиологии - инфекционный мононуклеоз, грипп, ВИЧ [6]. Кроме того, функция

Долгушин Илья Ильич - д-р мед. наук, проф., член-корр. РАМН, зав. каф. микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, ректор Челябинской гос. мед. академии, тел. 8(912) 891-26-95, e-mail: obp74@rambler.ru

моноцитов и макрофагов страдает при некоторых заболеваниях неинфекционной природы, к которым можно отнести злокачественные солидные опухоли, лейкозы, миелопроли-феративные заболевания, гемолитические анемии [17]. Некоторым аутоиммунным заболеваниям (АИТ, СКВ, рассеянный склероз) также присущи специфические дефекты моноцитов и макрофагов [4]. В связи с этим изучение моноцитов и их функций остается актуальным направлением в иммунологии и представляет интерес как для диагностики, так и для прогнозирования течения заболевания и выбора возможных способов лечения в практической медицине.

Функции моноцитов/макрофагов разнообразны и оказывают значительное влияние на иммунную реактивность ор-

- 240 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

ганизма в целом [7]. Впервые на их защитную роль указал И. И. Мечников, открывший явление фагоцитоза. В настоящее время широко изучены и другие фундаментальные функции этих клеток: антигенпрезентирующая и секреторная. В 2004 г новой вехой в изучении фагоцитирующих клеток стало открытие способности нейтрофилов к образованию экстрацеллюлярных сетеподобных структур, состоящих из нуклеиновых кислот и ферментов, названных внеклеточными ловушками и являющихся еще одним антимикробным механизмом помимо фагоцитоза [8]. При этом указывалось, что образование внеклеточных ловушек характерно только для нейтрофилов, а мононуклеарные клетки периферической крови не способны высвобождать свою ДНК [12]. Однако в 2009 г. немецкие ученые опубликовали данные о том, что внеклеточные ловушки, которые захватывают и уничтожают патогены, способны образовывать и моноциты/макрофаги в ответ на воздействие различных агентов [10, 14, 18].

Материалы и методы. Для выделения моноцитов использовали периферическую венозную кровь. Взятие материала для анализа производили у доноров с применением системы «Vacuette» («Greiner Boi-One») с гепарином. Кольцо моно-нуклеаров (лимфоциты и моноциты) выделяли на градиенте фиколла-урографина плотностью 1,077 г/мл. Дважды отмывали полученную взвесь мононуклеаров фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Для обогащения клеточной взвеси моноцитами проводили наслаивание кольца на градиент 63% перколла, центрифугировали и аккуратно собирали вновь полученное кольцо на границе между подушкой перколла и биологической жидкостью. Клеточную взвесь дважды отмывали ФСБ, подсчитывали количество моноцитов в полученной взвеси в камере Горяева и определяли их жизнеспособность с помощью окраски 1% раствором трипанового синего. С тем чтобы избежать ошибок при определении количества моноцитов в полученной клеточной взвеси на основании только их морфологической структуры, использовали моноклональные антитела к специфическому моноцитарному рецептору CD14+ и панлейкоцитарному рецептору CD45+. Учет проводили с помощью проточного цитофлюо-риметра Cytomics FC 500 фирмы «Beckman Coulter» (США).

Для подтверждения неактивного функционального состояния клеток на данном этапе оценивали внутриклеточный кислородзависимый метаболизм моноцитов с помощью спонтанного теста с нитросиним тетразолем (НСТ) с 0,2% его раствором.

Следуя стандартной методике обнаружения внеклеточных нейтрофильных ловушек [1, 9], мы попытались применить ее и к моноцитам. Подсчитывали количество спонтанно образованных моноцитарных внеклеточных ловушек в форсированном и нативном препарате (при окрашивании акридиновым оранжевым) в люминесцентном микроскопе.

Для стимуляции выброса моноцитами внеклеточных ловушек использовали активаторы микробной (взвесь Candida albicans и пирогенал в концентрации, соответствующей терапевтической дозе) и немикробной (форбол-12-миристат-13-ацетат - ФМА, который является неспецифическим активатором функциональной активности клеток и вызывает ряд после дова-тельных внутриклеточных реакций, приводя к мощному окислительному взрыву и выбросу свободнорадикальных форм кислорода) природы. Инкубацию проводили при различных температурных режимах (37° и 50°C) в течение 30 и 60 мин. Подсчитывали количество внеклеточных моноцитарных ловушек при окрашивании акридиновым оранжевым в препарате «раздавленная капля» в люминесцентном микроскопе.

Результаты. Донорами были мужчины в возрасте от 18 до 22 лет, в анамнезе которых отсутствовали хронические заболевания и острые инфекционные заболевания не менее чем за 30 дней до исследования. С момента взятия крови до первого этапа исследования проходило не более 30 мин.

Одним из самых распространенных и доступных методов получения моноцитов из периферической крови сегодня является выделение кольца мононуклеаров на градиенте плот-

ности фиколла-урографина 1,077 г/мл [7]. Но его существенным недостатком для нашего исследования является низкий процент выхода моноцитов в получаемой клеточной взвеси, что затрудняет подсчет моноцитов и их сетей в препарате. Поэтому мы использовали двухступенчатое выделение моно-цитарной взвеси: первый этап - выделение кольца монону-клеаров на градиенте плотности фиколла-урографина 1,077 г/мл, второй - обогащение фракции моноцитов путем центрифугирования клеточной взвеси мононуклеаров на слое перколла.

Гепаринизированную кровь разводили физиологическим раствором 1:1 и осторожно наслаивали на градиент фиколла-урографина плотностью 1,077 г/мл в соотношении 1:3. Центрифугировали 40 мин при скорости 1500 об/мин и температуре 20°C. Снимали кольцо мононуклеаров, подсчитывали процент моноцитов в клеточной взвеси, их количество составило 20,8%. Следующим этапом готовили 63% раствор перколла. Для этого сначала из гиперосмолярного раствора готовили 100% перколл путем смешивания 9 частей перколла и 1 части 10-кратно разведенного ФСБ. Затем готовили 63% перколл из нормосмолярного с помощью 0,01 М ФСБ. На 63% перколл наслаивали взвесь мононуклеаров в соотношении 1:3. Центрифугировали при температуре 4°C со скоростью 1800 об/мин в течение 30 мин. Обязательное условие центрифугирования - отключенный тормоз ротора, что позволяет максимально избежать потери клеток. По данным литературы, низкий температурный режим и невысокие скорости центрифугирования препятствуют активации клеток при трении [13, 15].

В полученной взвеси определили 7,5 • 106/мл лейкоцитов. При этом жизнеспособность клеток составила 98%. Качественный состав клеточной взвеси изучали методом проточной цитофлюориметрии. Для этого клеточную взвесь инкубировали с моноклональными антителами к CD45+ и CD14+, меченными флюорохромом, в течение 30 мин при комнатной температуре. Результаты проведенного анализа показали, что 63% лейкоцитов в полученной взвеси клеток представлено моноцитами. Кроме того, для визуальной оценки по морфологической структуре готовили нативный препарат и исследовали в люминесцентном микроскопе. При выборе полей зрения количество моноцитов составило 71% (рис. 1).

Известно, что для образования внеклеточных ловушек в клетке требуются реактивные формы кислорода, которые генерируются активированной НАДФ-оксидазой [1]. Поэтому далее определяли наличие в моноцитах активных форм кислорода с помощью НСТ-теста [2]. Активность НСТ-теста в нашем опыте составила 2%, а интенсивность - 0,02 усл. ед. Данный результат свидетельствует о покоящемся состоянии клеток.

Следующим этапом нашего исследования стало изучение воздействия на моноциты активаторов, способных запустить в них процессы, которые приводят к образованию внеклеточных моноцитарных ловушек. В качестве активаторов использовали пирогенал в концентрации 0,02 мкг/мл, что соответствует разовой терапевтической дозе; взвесь C. albicans и ФМА в концентрации 7,5 мкМ. Клеточную взвесь с активатором инкубировали в термостате (37 и 50°C), время активации составило 30 мин. Для контроля использовали взвесь моноцитов, инкубируемых в тех же условиях, но без активаторов. После инкубации готовили препарат «раздавленная капля» и подсчитывали количество образованных внеклеточных моноцитарных ловушек на 100 клеток (исключая лимфоциты) в контроле и с тремя активаторами. Параллельно из этих же взвесей клеток готовили мазки, фиксированные этанолом, и также окрашивали их акридиновым оранжевым. Оценку проводили в люминесцентном микроскопе. Как видно на рис. 2, через 30 мин при 37°C количество ловушек, образованных моноцитами, которые активированы C. albicans, составило 46% по сравнению с 12% в контроле. При активации пирогеналом это различие оказалось не столь выражено, а при использовании активатора ФМА процент ловушек и вовсе был ниже показателя в кон-

- 241 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012

Рис. 2. Количество (в %) внеклеточных ловушек, образованных моноцитами в зависимости от активаторов и времени инкубации при 37°C.

1 - контроль; 2 - C. ablicans; 3 - ФМА; 4 - пирогенал.

троле. При температуре 50°C получили тотальную активацию моноцитов в контроле, что не позволило оценить действие активаторов на клетки (рис. 3). В фиксированных мазках подсчет моноцитарных ловушек был затруднен из-за невозможности дифференцировки различных клеточных форм. Это связано с особенностями морфологического строения моноцитов и их способностью распластываться на стекле. Мы увеличили время инкубации клеточной взвеси с активаторами при 37°C до 1 ч. При этом (см. рис. 2) активация моноцитов ФМА и пирогеналом привела к значительно большему образованию внеклеточных ловушек по сравнению с контролем, тогда как действие C. albicans на клетки отличалось от такового других активаторов не столь значимо.

Обсуждение. В данной работе изучали способность моноцитов образовывать внеклеточные ловушки спонтанно и под воздействием агентов бактериальной (пирогенал, C. albicans) и небактериальной (ФМА) природы. Для эффективного осуществления данной задачи на первом этапе был разработан метод двухступенчатого выделения моноцитов из периферической крови: сначала на градиенте фиколла-урографина плотностью 1,077 г/мл, а затем на подушке 63% перколла. В результате мы получили клеточную суспензию, которая состояла на 2/3 из моноцитов, находящихся в неактивированном состоянии, что было подтверждено проведенным НСТ-тестом. При этом мы убедились в том, что все клетки полученной взвеси жизнеспособны. Данная методика проста в исполнении и доступна для любой лаборатории. Изучение функций моноцитов не в кольце мононуклеаров, где их количество составляет 20,8%, а в обогащенной до 70% фракции дает следующие преимущества: снижение ошибки до минимума при подсчете в микроскопе на основании морфологической структуры клеток; уменьшение времени исследования при подсчете нативных мазков; значительное снижение возможности влияния лимфоцитарного окружения на активационные способности моноцитов.

Следующим этапом работы были проведение активации моноцитов пирогеналом, взвесью C. albicans и ФМА и изучение влияния этих активаторов на образование внеклеточных моноцитарных ловушек при различном времени экспозиции и температурных режимах. Выявили, что оптимальной является температура 37°C, а при 50°C происходит тотальная активация моноцитов, стимулирующая их к выбросу экстрацеллю-лярных сетей. Учитывая, что 37°C - температура тела, можно предположить, что изучение функций моноцитов при данном режиме in vitro моделирует их поведение в организме. На рис. 2 видно, что C. albicans является активатором, время реагирования на который у моноцитов минимальное. На втором ме-

сте по этому показателю находится пирогенал. В то же время на активацию ФМА моноциты реагируют только при увеличении времени активации до 1 ч. Принимая во внимание тот факт, что пирогенал - это липополисахарид клеточной стенки бактерий, полагаем, что включение антимикробного механизма, связанного с образованием моноцитарных внеклеточных ловушек, происходит в зависимости от вида активирующего агента через разные промежутки времени. Эта функция в первую очередь включается на бактериальные стимуляторы, причем на растворимые или мелкодисперсные позже, чем на клеточные. Активация немикробными агентами отсрочена, но при этом не менее выражена. Результаты данной работы представляют интерес для клинической иммунологии и позволяют определить направления дальнейшего изучения способности моноцитов к образованию внеклеточных ловушек.

ЛИТЕРАТУРА

1. Долгушин И. И., Андреева Ю. С., Савочкина А. Ю. Нейтро-фильные внеклеточные ловушки и методы оценки нейтро-фильного статуса нейтрофилов. - М., 2009.

2. Маянский А. Н. НАДФН-оксидаза нейтрофилов: активация и регуляция // Цитокины и воспаление. - 2007. - Т. 6, № 3. - С. 3-13.

3. Маянский А.Н., Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск, 1989.

4. Молоствов Г. С., Данилова Л. И. Иммунные аспекты патогенеза аутоиммунного тиреоидита // Мед. новости. - 1997. - № 4. - С. 3-10.

5. Новицкий В. В., СтрелисА. К., Уразова О. И. и др. Макро- и микроэлементы мононуклеаров крови у больных лекарственночувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких // Бюл. сиб. мед. - 2007. - № 2. - С. 31-36.

6. Плехова Н. Г., Сомова Л. М. Роль моноцитов/макрофагов в патогенезе вирусных инфекций // Тихоокеан. мед. журн. -2010. - № 3. - С. 5-9.

7. Тотолян А. А., Фрейдлин И. С. Клетки иммунной системы. -СПб., 2000. - Т 2.

8. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C. et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria // Science. - 2004. - Vol. 303. - P. 1532-1535.

9. Brinkmann V., Laube B., Ulrike Abu Abed et al. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them // J. Visualiz. Exp. - 2010. - Vol. 36. - P. 1724-1734.

10. Chow O., Kockritz-BlickwedeM., Bright T. et al. Statins enhance formation of fhagocyte extracellular traps // Cell Host Microbe.

- 2010. - Vol. 8. - P. 445-454.

11. Jonsson B. Epidemiological and immunological studies of environmental mycobacteria with focus on Mycobacterium abscessus: thesis doctor of midicine. - 2009. - P. 78.

12. Fuches T. A., Abed U., Goosmann C. et al. Novell cell death program leads to neutrophil extracellular traps // J. Cell Biol. -2007. - Vol. 176, N 2. - P. 231-241.

13. de Almeida M. C., Silva A. C., Barral A., Netto M. B. A simple method fo human peripheral blood monocyte isolation // Short Commun. - 2000. - Vol. 95, N 2. - P. 221-223.

14. Matthias B., Heidrun A., Gabriele Z., Groll J. Phagocytosis independent extracellular nanoparticle clearance by human immune cells // Nano Lett. - 2010. - Vol. 10. - P. 59-63.

15. Botran R. F. Methods in Cellular Immunology. - Boca Raton, Florida, 2001.

16. Webster S. J., Daigneault M., Bewley M. A. et al. Distinct cell death programs in monocytes regulate innat responses following challenge with common causes of invasive bacterial disease // J. Immunol. - 2010. - Vol. 185, N 5. - P. 2968-2979.

17. Nares S., Wahl S. M. Monocytes and macrophages // Measuring Immunity / Eds M. T. Lotze, A. W. Thomson, 2005. - Chapt. 25.

- P. 299-311.

18. Webster J., Daigneault M., Bewley M. et al. Distinct cell death programs in monocytes regulate innate responses causes of invasive bacterial disease following challenge with common // J. Immunol. - 2010. - Vol. 185. - P. 2968-2979.

Поступила 13.02.12

- 242 -

К ст. И. И. Долгушина и соавт.

Рис. 1. Нативный препарат обогащенной фракции моноцитов. Лю- Рис. 3. Активация моноцитов при температуре 50°С в мазке (окра-минесцентная микроскопия (окрашивание акридиновым оранже- шивание акридиновым оранжевым; ув. 1000).

вым; ув. 1000). --------------------------------------------------------------

1 - моноцит; 2 - лимфоцит.

К ст. И. И. Долгушина и соавт.

Рис. 1. Фиксированный мазок чистой фракции нейтрофилов, активированных прогестероном в концентрации 50 нг/мл. Люминесцентная микроскопия (окрашивание акридиновым оранжевым; ув. 1000).

Морфологические формы нейтрофилов: 1 - нейтрофил с сегментированным ядром; 2 - нейтрофил с недифференцированным ядром; 3 - нейтрофильная внеклеточная ловушка.

Рис. 2. Оценка внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови с помощью индуцированного НСТ-теста. Световая микроскопия (окрашивание 0,1% раствором сафранина; ув. 1000).