НОВЫЙ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ ХЛОРЭРЕМОМИЦИНА KIBDELOSPORANGIUM ARIDUM
NEW PRODUCER STRAIN OF CHLOREREMOMYCIN KYIBDELOSPORANGIUM ARIDUM

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и касается нового штамма-продуцента антибиотика хлорэремомицина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ.
Хлорэремомицин - гликопептидный антибиотик класса ванкомицинов, имеет в составе своей структуры три сахара, одну D-глюкозу и два L-4-эпи-ванкозамина, присоединенные к сшитому гептапептидному остову тремя гликозилтрансферазами, GtfA, -B и –C (Lu W, et al. Characterization of a regiospecific epivancosaminyl transferase GtfA and enzymatic reconstitution of the antibiotic chloroeremomycin// Proc Natl Acad Sci U S A.- 2004 Mar 30.-101(13):4390-5. Epub 2004 Mar 18).
Amycolatopsis orientalis
Хлорэремомицин является предшественником полусинтетического антибиотика оритаванцина (Wang, W.-Y. et al. Enhancement of A82846B yield and proportion by overexpressing the halogenase gene in  SIPI18099, Appl. Microbiol. Biotech.- 2018.- P.5635-5643).
Actinomycetales
Большинство используемых в медицине антимикробных препаратов разработаны на основе природных метаболитов бактерий и грибов. Актиномицеты, грамположительные мицелиальные бактерии порядка  являются продуцентами таких классов антибиотиков, как макролиды, антрациклины, полиэфирные антибиотики, циклополилактоны, аминогликозиды, стрептотрицины, актиномицины, хиноксалиновые пептиды, гликопептиды и др. Для поиска актиномицетов — продуцентов биологически активных соединений разрабатываются различные методы селективной изоляции новых штаммов (Синёва О.Н. Выделение актиномицетов редких родов — продуцентов антибиотиков из почв с применением сока Aloe arborescens// Антибиотики и Химиотерапия.- 2021.- 66(9-10):4-11).
Кibdelosporangium aridum
Известен штамм-продуцент  JH100-32B16B промежуточного продукта синтеза оритаванцина, депонированный в Общем центре сбора микробиологических культур Китая (CGMCC) под номером CGMCC №17931 (CN113493748, опубл. 12.10.2021).
Kibdelosporangium aridum,
Kibdelosporangium aridum
Известен рекомбинантный штаммпродуцирующий антибиотик A82846B, который является важным предшественником полусинтетического гликопептидного антибиотика оритаванцина (Тian et al., Enhancing A82846B production by artificial attB-assisted overexpression of orf10-orf11 genes in  SIPI-3927. AMB Express. - 2020 Mar 16. - 10(1):52). Указанный штамм рассматривался авторами настоящего изобретения в качестве близкого аналога.
Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления хлорэремомицина известные ранее штаммы.
Kibdelosporangium aridum
Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности нового штамма VKPM Ac-2184, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика хлорэремомицин, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма по настоящему изобретению к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Из образца дерново–подзолистой почвы (Мордовия) был выделен штамм дикого типа, продуцирующий антибиотик хлорэремомицин.
Для повышения секреции хлорэремомицина штамм дикого типа подвергался процессу индуцированного мутагенеза путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах.
Далее полученный высокопродуктивный штамм, который получил внутреннее наименование CLE 20-36, был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рРНК.
Kibdelosporangium aridum.
По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм CLE 20-36 оказался наиболее близок к виду
Kibdelosporangium aridum
Полученный новый штамм депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2184.
Kibdelosporangium aridum
Kibdelosporangium aridum
Kibdelosporangium aridum
Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент хлорэремомицина VKPM Ac-2184. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма VKPM Ac-2184 для получения антибиотика хлорэремомицина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения антибиотика хлорэремомицина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма VKPM Ac-2184 и выделение хлорэремомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой (Фиг.1).
ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.
Термин «антибиотик» включает в себя любую молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводит к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозировании, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е., непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.
Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.
Kibdelosporangium aridum
Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток VKPM Ac-2184, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).
Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты). Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика хлорэремомицина).
Kibdelosporangium aridum
Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика хлорэремомицина, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма VKPM Ac-2184 в условиях биореактора, выраженному в граммах хлорэремомицина на литр культуральной жидкости.
При использовании в описании термина «примерно», «приблизительно», «около» следует считать, что он характеризует плюс минус десять процентов от указанной величины.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1.
Kibdelosporangium aridum
На Фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма  VKPM Ac-2184 и наработки хлорэремомицина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Kibdelosporangium aridum
Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм продуцент хлорэремомицина - штамм  депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2184.
Культурально-морфологические признаки
: аэроб; окраска по Граму – положительная, при культивировании на плотной среде нижеуказанного состава типичные колонии имеют цвет от светло-бежевого до серо-бежевого, коническую форму, диаметр 3-5 мм, приподняты над агаром, поверхность неровная.
Физиолого-биохимические характеристики:
Хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, арабинозу, инозит, галактозу, манит, глюкозу; умеренно лактозу, рамнозу, ксилозу, не утилизирует рафинозу. Обладает протеолитической активностью. Восстанавливает нитраты до нитритов.
Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: растворимый крахмал –15.0-19.0; глюкоза – 8.0-10.0; дрожжевой экстракт – 3.0-4.0; ферментативный гидролизат казеина – 4.0-4.5; гидрофосфат калия – 0.3 - 0.5; агар-агар - 18.0-21.0; вода очищенная; рН среды 6.7±0.3.
Условия культивирования для выделения единичных колоний- 10-12 суток, при температуре 27-32°С.
ПРИМЕРЫ
Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.
Пример 1.
Способ селективного выделения из штамма - продуцента хлорэремомицина из образца почвы.
Объектами исследования были образцы дерново-подзолистой почвы. Образцы почвы были отобраны в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.
Для выделения штамма дикого типа - продуцента хлорэремомицина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду добавляли антибиотики широкого спектра для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.
Посевы инкубировали при температурах 20 - 30°С до появления видимых колоний. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.
Пример 2.
Получение высокопродуктивного штамма-продуцента хлорэремомицина.
Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского дикого штамма был получен новый высокопродуктивный штамм - продуцент хлорэремомицина CLE 20-36.
o
Для этого осуществляли воздействие УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток родительского штамма, размещенного на расстоянии 55 см от лампы в течение 20 минут при температуре 0C. Полученному штамму был присвоен внутренний номер CLE 20-36.
Пример 3.
Идентификация штамма CLE 20-36 до вида с помощью анализа 16s РНК.
Выделение ДНК штамма CLE 20-36 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15).
Для секвенирования использовали консервативные праймеры для наработки 16S rDNA:
8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:
о
1. 95С - 3мин.
2. 35 циклов
о
95С - 30 сек.
о
57С - 30 сек.
о
72С - 1 мин. 30 сек.
о
3. 72С - 5 мин.
Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.
Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.
Bacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Kibdelosporangium
Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: .
Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.
Обработку секвенированных последовательностей проводились при помощи биоинформатического программного обеспечения в открытом доступе - программы Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в т.ч. для определения степени филогенетической близости живых организмов.
Kibdelosporangium aridum.
По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм CLE 20-36 оказался наиболее близок к виду
Пример 4.
Методика культивирования.
Kibdelosporangium aridum
Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры VKPM Ac-2184 в чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культуры, и выдерживали в термостате от 5 до 12 суток, при температуре 25-34°С.
Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде в при 25-34°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.
Далее проводили наработку посевной культуры в ферментере объемом 5/15/100 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 110-170 часов.
Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика в среде процесс ферментации прекращали.
Пример 5.
Определение содержания хлорэремомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ.
Анализ содержания хлорэремомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты. Подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,1 мл/мин; длина волны детектирования – 254 нм.
Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании
Штамм
Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости ±0,2 г/л)
в ферментере объемом 5 литров
в ферментере объемом 15 литров
в ферментере объемом 100 литров
<i>Kibdelosporangium aridum </i>VKPMAc-2184
5,55,76,4
6,87,07,4
15,115,816,2
Kibdelosporangium aridum
Kibdelosporangium aridum
Kibdelosporangium aridum
Согласно литературным данным продуктивность известного штамма  составляла 1,45 г/л (CN113493748, опубл. 12.10.2021). А продуктивность генетически модифицированного штамма  достигала 2,52 г/л (Тian et al., Enhancing A82846B production by artificial attB-assisted overexpression of orf10-orf11 genes in  SIPI-3927. AMB Express. - 2020 Mar.- 16;10(1):52).
Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что штамм микроорганизма по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика хлорэремомицина.
Пример 6
. Методика выделения хлорэремомицина.
Kibdelosporangium aridum
После культивирования микроорганизма VKPM Ac-2184 проводили отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием.  Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию очистки, а отработанную биомассу утилизировали.
Очищенную от биомассы культуральную жидкость наносили на колонку с гидрофобным сорбентом НР-20. Вытесненный с колонки раствор утилизировали. Колонку промывали очищенной водой. Элюат собирали и переносили порционно в колбу ротационного испарителя. Удаляли растворитель в вакууме при температуре не выше 40 °С. Полученный концентрат снова наносили на колонку с сорбентом НР-20. Колонку промывали очищенной водой. Затем колонку элюировали 50 % водным этанолом с добавлением уксусной кислоты. Контроль осуществляли методом ВЭЖХ/УФ. Элюат фракционировали, отдельные фракции анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие хлорэремомицин с чистотой не менее 80 % объединяли. Менее чистые фракции утилизировали. Очищенный раствор хлорэремомицина депигментировали перемешиванием в течение 30 мин с 0.5 масс. % угля апирогенного. Уголь отделяли фильтрованием через слой силикагеля. Далее раствор хлорэремомицина концентрировали при помощи ротационного испарителя в вакууме до 1/3 от первоначального объема. Концентрат охлаждали, выпавший осадок отделяли фильтрованием.