Тест-система для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку
TEST SYSTEM FOR DETERMINING BACTERIAL FERMENTATIVE ACTIVITY BY AMMONIA

Изобретение относится к медицине, в частности, к тест-системам для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку, а именно ферментативной активности бактерий, вызывающих заболевания пародонта, желудка, мочеполовой системы человека и животных.
Ферментативная активность бактерий широко используется в медицине, как показатель инфицированности различными бактериями. Примером служит обнаружение H.pylori в желудке человека по уреазной активности. Есть литературные сведения, что в зависимости от исследуемого биоматериала можно обнаружить и другие бактерии, обладающие ферментами, которые катализируют реакцию расщепления субстрата с выделением аммиака. Так, в микробном ротовой полости может входить множество микроорганизмов, обладающих уреазной активностью и способных вызвать воспалительный процесс, например, Streptococcus sanguis, Bacteroides melaninogenicus, Prevotella melaninogenica, Actinomyces viscosus. Кроме этого, в последние годы рассматривается существенная роль локальных инфекций уреазопродуцирующими микроорганизмами (Proteus mirabilis, Corynebacterium urealyticum, Ureaplasma urealyticum и др.) в возникновении аммоний- и кальций-фосфатных камней («инфекционный уролитиаз»). Инвазивные и цитотоксические свойства патогенных штаммов бактерий приводят к повреждению слизистых поверхностей мочевыводящих путей, а продукция уреазы способствует защелачиванию мочи и образованию струвитных конкрементов. Кроме образования камней в почках Ureaplasma urealyticum может быть причиной воспалительных заболеваний репродуктивной системы, обнаружить ее по уреазной активности можно с помощью дифференциально-диагностических сред. Похожим способом можно обнаружить другую бактерию, передающуюся половым путем - Mycoplasma. В случае данного микроорганизма определение происходит благодаря комплексу ферментов, разлагающих аргинин до аммиака.
Известен способ определения уреазной активности («Урология и нефрология», 1997, №4, с. 13-14), заключающийся в том, что в две пробирки помещают по 2 мл исследуемой мочи. В пробирку №1 добавляют 0,4 мл 10% хлористого кальция, перемешивают, измеряют экстинкцию (оптическую плотность) относительно воды при 691 нм на КФК-3. В пробирку №2 добавляют 0,4 мл дистиллированной воды. Обе пробирки термостатируют при 37°С в течение часа. Проводят измерение пробирок №1 и №2 сразу после термостатирования при тех же условиях. Полученный после расчетов показатель уреазной активности сравнивают с показателем нормы (0-50 ммоль/л). При его превышении говорят о присутствии уреазообразующей микрофлоры, создающей благоприятные условия для кристаллообразования и способствующие росту камней, что может привести к мочекаменной болезни.
Известно использование микропланшетов для подготовки проб исследуемой биологической жидкости (патент RU 2521201 «Способ раннего выявления инфекции мочевыводящих путей у детей 3-7 лет», МПК G01N 33/52, опубл. 27.06.2014). При реализации способа подготавливают пробы мочи в лунках микропланшета, содержимое лунок микропланшета перемешивают, затем измеряют значения оптических плотностей фотометрическим методом при длине волны 620 нм на микропланшетном ридере, микропланшет заклеивают пленкой и содержимое лунок термостатируют в течение 1 ч при температуре 37°С, после чего содержимое лунок снова перемешивают и измеряют оптическую плотность проб мочи, далее строят калибровочную кривую и вычисляют уреазную активность мочи в Е/л по формуле
УА(Е/л)=ΔD*11655, где
УА (Е/л) - уреазная активность в (Е/л);
ΔD - разница оптической плотности опытной пробы и контрольной пробы после термостатирования, 11655 - коэффициент перевода в уреазную активность. При значении уреазной активности мочи выше 1621,73 Е/л относят конкретного ребенка к группе риска формирования инфекции мочевыводящих путей.
В способе по патенту RU 2597777 («Способ определения уреазной активности, ротовой жидкости для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой», МПК G01N 33/50, G01N 33/52, опубл. 20.06.2016) также используют микропланшеты для подготовки исследуемой биологической жидкости. Для этого проводили определение уреазной активности следующим образом: в одну из лунок микропланшета вносили водный раствор мочевины с фосфатным буфером, в две другие вносили водные растворы мочевины с фосфатным буфером, содержащие уреазу с известной концентрацией 5 и 10 Е/л соответственно, а в остальные лунки вносили водный раствор мочевины с фосфатным буфером и образцами ротовой жидкости, затем во все лунки вносили фенол/нитропруссидный реагент и гипохлорит, после чего измеряли оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 546 нм и рассчитывали концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Е/л. При значении уреазной активности выше 15,85±2,11 Ед/л регистрировали обсемененность полости рта уреазопозитивной микробиотой. Результат позволяет выявить необходимость противомикробной терапии для профилактики образования твердых зубных отложений и воспалительных заболеваний пародонта.
Известен набор для лабораторной диагностики инфекций (патент RU 2553548 «Набор для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum», МПК C12Q 1/02, опубл.20.06.2015), который может быть использован для культивирования и идентификации урогенитальных микоплазм, в частности Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum для лабораторной диагностики урогенитальных микоплазмозов путем выявления микоплазм в клиническом материале, для полуколичественного определения титра возбудителя, а также для определения их антибиотикочувствительности.
Такой набор содержит лиофилизированную транспортную среду для хранения исследуемого биологического материала, лиофилизированную питательную среду для выявления Mycoplasma hominis и/или Ureaplasma urealyticum и стрипы для идентификации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, для полуколичественного определения титра возбудителя и для определения чувствительности Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum к антибиотикам, который содержит три вида стрипов, первый из которых предназначен для идентификации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum и для полуколичественного определения их титра, причем часть лунок первого вида стрипов, которые предназначены для выявления и определения титра Mycoplasma hominis, содержат аргинин, бриллиантовый синий и кларитромицин, другая часть лунок этого стрипа, которые предназначены для выявления и определения титра Ureaplasma urealyticum, содержат мочевину и линкомицин, второй вид стрипов предназначен для определения антибиотикочувствительности Mycoplasma hominis, содержит специфические реагенты для выявления Mycoplasma hominis - аргинин, бриллиантовый синий и кларитромицин, а также восемь антибиотиков - доксициклин, джозамицин, мидекамицин, офлоксацин, ципрофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин, клиндамицин, сорбированных в лунки стрипов в одной концентрации, третий вид стрипов предназначен для определения антибиотикочувствительности Ureaplasma urealyticum, содержит специфические реагенты для выявления Ureaplasma urealyticum - мочевина и линкомицин, а также восемь антибиотиков - доксициклин, джозамицин, кларитромицин, эритромицин, рокситромицин, азитромицин, офлоксацин и спарфлоксацин, сорбированных в лунки стрипов в одной концентрации. Использование набора позволяет одновременно выявлять Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, оценивать их титр и определять чувствительность к различному спектру антибиотиков, причем для Mycoplasma hominis и для Ureaplasma urealyticum используют разные антибиотики.
Представленные выше тест-системы для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку используются в лабораторных условиях, предполагают применение дополнительных аппаратурных средств (фотоколориметр, термостат), что влечет за собой привлечение квалифицированного персонала.
Известны тест-системы для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку для выявления бактерии Helicobacter pylori (например, WO 2011112106, МПК C12Q 1/58, опубл. 15.09.2011; US 2010028937, МПК С12М 1/00; C12Q 1/02, опубл.04.02.2010; WO 9319200, МПК C12Q 1/00; C12Q 1/04, опубл.30.09.1993), которые представляют собой многослойное многоэлементное тестовое устройство, в основном состоящее из субстратного элемента, содержащего мочевину для определения уреазной активности исследуемого биологического материала, диффузионный элемент для предотвращения ложных реакций и пропускания аммиака к индикаторному элементу, изменение цвета которого позволяет оценить результат.
Однако такие тест-системы основаны на конструктивных решениях, позволяющих исследовать биологический материал, содержащий незначительное количество жидкой фазы (биоптат). Наличие диффузного элемента снижает чувствительность таких тест-систем и не позволяет определять уреазную активность иных бактерий.
Наиболее близким к заявляемому является техническое решение, представленное в патенте ЕР 3009519 («Test device, reactive element and arrangement for urease activity» МПК BO1L 3/00, C12Q 1/58, G01N 33/487, опубл. 14.10.2014), которое содержит подложку с, по меньшей мере, одной лункой, в которой размещен реактивный элемент, состоящий из двух слоев, индикаторного и чувствительного, последний для размещения исследуемого биологического материала, а индикаторный размещен на дне лунки со смотровым окном.
Для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку исследуемый биологический материал помещают на чувствительный слой реактивного элемента, далее происходит реакция расщепления мочевины чувствительного слоя. Через смотровое окно наблюдают окончательное изменение цвета индикаторного слоя, по которому судят о наличии уреазной активности бактерии, например Helicobacter pylori.
Конструктивное решение такой тест-системы позволяет исследовать биологический материал, содержащий незначительное количество жидкой фазы (например, биоптат), так как жидкий исследуемый материал проникнет к индикаторному слою, что приведет к недостоверности результата. Это ограничивает область применения тест-системы.
Кроме того, такая тест-система характеризуется значительной длительностью реакции из-за того, что слои реактивного элемента свободно размещены в лунке. Это приводит к потере выделяемого аммиака, в свою очередь увеличивая время определения ферментативной активности бактерий.
Задачей заявляемого изобретения является создание тест-системы для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку, позволяющих достигать технический результат, заключающийся в сокращении времени определения активности ферментативных реакций и в расширении области применения за счет расширения типов исследуемых образцов.
Сущность изобретения заключается в том, что в тест-системе для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку, содержащей подложку с окном для просмотра результатов, на которой размещен реактивный элемент, состоящий из индикаторного слоя, перекрывающего окно для просмотра результатов и чувствительного слоя, содержащего субстрат для обнаружения ферментативной активности, дополнительно на подложке расположен фиксирующий лист с отверстием для размещения на чувствительном слое реактивного элемента исследуемого биологического материала, размеры которого обеспечивают фиксацию чувствительного слоя, на фиксирующем листе размещен покровный лист, покрытый повторно закрываемым прикрепляющим покрытием со стороны, обращенной к фиксирующему листу, при этом поверхности подложки и фиксирующего листа, обращенные друг к другу, соединены клеевым слоем, а реактивный элемент организован таким образом, что площадь чувствительного слоя, представляющего собой полупроницаемую гидрофобную мембрану больше площади непрозрачного индикаторного слоя, при этом подложка, фиксирующий и покровный листы выполнены из непроницаемого гидрофобного материала, а их толщина, а также толщина каждого из слоев реактивного элемента находятся в диапазоне от 50 до 300 мкм.
Индикаторный слой реактивного элемента может быть выполнен из гидрофильного полимерного материала, содержащего индикатор, чувствительный к аммиаку.
Гидрофильный полимерный материал выбирают из ряда: бумага, полиэфирные волокна, пленка поливинилового спирта.
Индикатор, чувствительный к аммиаку, выбирают из ряда: рН индикаторы, реактив Несслера, хлорид хрома(II).
Непроницаемый гидрофобный материал, из которого выполнены подложка, фиксирующий и покровный листы выбирают из ряда: полипропилен, поливинилхлорид, полиэфир.
Чувствительный слой реактивного элемента, представляющий собой полупроницаемую гидрофобную мембрану, выполняют либо из полиэтилена, либо из политетрафторэтилена, либо полипропилена.
Субстрат для обнаружения ферментативной активности чувствительного слоя реактивного элемента выбирают из ряда: мочевина, аргинин, орнитин.
Повторно закрываемое прикрепляющие покрытие выполнено из однокомпонентного клея, который выбирают из ряда: полиуретан, ацетофенон, поливинилацетат, полиизобутилен.
Клеевой слой, которым соединены поверхности подложки и фиксирующего листа, обращенные друг к другу выполнен из однокомпонентного клея, который выбирают из ряда полиуретан, поливинилацетат, изоборнил акрилат, полиизобутилен.
Покровный лист может быть выполнен с дугообразным передним краем в виде язычка с одной из сторон.
Покровный лист со стороны, противоположной дугообразному переднему краю, может быть прикреплен слоем термоклея.
Покровный лист может быть выполнен либо прозрачным, либо имеющим прозрачную зону, соответствующую размерам отверстия фиксирующего листа.
Основным отличием заявляемой тест-системы является то, что фиксирующий лист и подложка жестко скрепленные между собой клеевым слоем и размещенный между ними реактивный элемент позволяет образовать камеру для аммиака, который выделяется в ходе целевых реакций, включающих в себя реакцию расщепления субстрата чувствительного слоя (мочевина, аргинин, орнитин- в зависимости от определяемой бактерии) и взаимодействия аммиака с индикатором. При этом благодаря малой толщине фиксирующего листа, подложки и слоев реактивного элемента, составляющей от 50 до 300 мкм, размер камеры является минимально достаточным, для быстрого взаимодействия аммиака с индикатором в этой камере, что позволяет сократить время реакции до 5 минут, в то время как у аналогов - от 15 минут. Диапазон толщин фиксирующего листа, подложки и слоев реактивного элемента обусловлен тем, что материал толщиной до 50 мкм характеризуется недостаточной прочностью, а более 300 мкм будет образовывать слишком большую камеру и замедлять реакцию между аммиаком и индикатором. Заявляемая тест-система обеспечивает возможность - анализировать как полутвердые (биоптат), так и жидкие исследуемые биологические материалы (моча, слюна), что также обеспечивается конструкцией тест-системы. Защиту индикаторного слоя реактивного элемента от попадания анализируемой жидкости обеспечивают: гидрофобность материала, из которого изготовлен чувствительный слой реактивного элемента; а также то, что площадь чувствительного слоя должна быть больше площади индикаторного слоя. Благодаря этому индикаторный слой, помещенный на лист подложки, сверху укрывается чувствительным слоем, что обеспечивает защиту от контакта с анализируемой жидкостью. Гидрофобный непроницаемый материал, из которого изготовлен фиксирующий лист помогает отводить излишки жидкости с поверхности и не давать протекать ей внутрь реактивного элемента. Наличие в тест системе покровного листа, обеспечивает герметичность тест-системы и кроме того исключает высыхание исследуемого биологического материала в ходе исследования. Заявляемая тест-система не требует дополнительных приготовлений перед исследованием за счет того, что все необходимо достаточные вещества (индикатор, субстрат) герметично заключены в тест-системе.
Изобретение поясняют следующие графические изображения.
Фиг. 1 Поперечный разрез тест-системы.
Фиг. 2 Упрощенный вид в разобранном состоянии тест-системы (аксонометрия).
Фиг. 3 Тест-система в собранном состоянии (аксонометрия).
Тест-система (фиг. 1) представляет собой подложку 1, с окном для просмотра результатов 2. На подложке 1 размещен двухслойный реактивный элемент, индикаторный слой реактивного элемента 3, которого перекрывает окно для просмотра результатов 2. Чувствительный слой реактивного элемента 4 размещен на индикаторном слое реактивного элемента 3, при этом площадь чувствительного слоя реактивного элемента 4 больше площади индикаторного слоя реактивного элемента 3. На подложке 1 с реактивным элементом фиксирующий лист 6 закреплен клеевым слоем 5 с отверстием для размещения на чувствительном слое реактивного элемента исследуемого биологического материала 8, размеры которого обеспечивают фиксацию чувствительного слоя реактивного элемента 4. На фиксирующем листе 6 посредством повторно закрываемого прикрепляющего покрытия 7 закреплен покровный лист 9 с прозрачной зоной 10. Покровный лист 9 с одной из сторон закреплен слоем термоклея 11, а с другой имеет язычок 12 для захвата при открывании и закрывании покровного листа 9.
Организацию тест-системы послойно иллюстрирует Фиг. 2, на которой в аксонометрическом виде представлены слои тест-системы без клеевого слоя и повторно закрываемого прикрепляющего покрытия. В собранном состоянии тест-система представлена на Фиг. 3.
Для определения ферментативной активности бактерий по аммиаку открывают покрывной лист 9, используя язычок 12, и размещают образец исследуемого биологического материала в окне 8 фиксирующего листа 6 на чувствительном слое реактивного элемента 4. Далее размещенный образец исследуемого биологического материала плотно закрывают покрывным
листом 9 и переворачивают тест-систему для возможности наблюдения за реакцией в окне для просмотра результатов 2. Ожидают 5 минут и оценивают изменение окраски индикаторного листа реактивного элемента 3 в окне для просмотра результатов 2.
Ферментативную активность бактерий, вызывающих заболевания пародонта, определяют по изменению цвета индикаторного слоя реактивного элемента при размещении на нем исследуемых образцов смешанной ротовой жидкости. При наличии в исследуемых образцах уреазоположительных бактерий в течение 5 минут на поверхности индикаторного слоя реактивного элемента появляется красное или малиновое пятно.
Ферментативную активность бактерий, вызывающих такое заболевание, как мочекаменная болезнь, определяют по изменению цвета индикаторного слоя реактивного элемента при размещении на нем исследуемых образцов мочи. При наличии в исследуемых образцах бактерий Proteus mirabilis и Corynebacterium urealyticum на поверхности индикаторного слоя реактивного элемента появляется красное или малиновое пятно.
Ферментативную активность бактерий, вызывающих гинекологические или урологические заболевания, определяют следующим образом: при наличии в исследуемых образцах бактерий Mycoplasma и Ureaplasma на поверхности индикаторного слоя реактивного элемента в течение 5 минут появляется красное или малиновое пятно. Образцами для исследования могут служить:
• для мужчин - мазок из уретры;
• для женщин - влагалищные выделения или эндоцервикальная слизь.
Примером конкретной реализации заявляемой тест-системы может служить следующая конструкция тест системы для определения ферментативной активности Mycoplasma по аммиаку в образце исследуемого биологического материала - эндоцервикальная слизь. Подложка, фиксирующий лист, покровный лист выполнены в виде квадратов размером 25×25 мм из полипропилена, толщина которого составляет 250 мкм.
Индикаторный слой реактивного элемента изготовлен из фильтровальной бумаги WHATMAN ТИП 1, пропитанной рН индикатором феноловым красным, в виде квадрата 5×5 мм толщиной 100 мкм.
Чувствительный слой реактивного элемента реализован в виде мембраны из полиэтилентерефталата, на которую нанесен аргинин, который является субстратом определяемой активности комплекса ферментов, которые расщепляют аргинин до аммиака, и изготовлен в виде квадрата 10×10 мм толщиной 150 мкм.
Фиксирующий лист имеет отверстие диаметром 5 мм для размещения на чувствительном слое реактивного элемента исследуемого биологического материала - эндоцервикальная слизь.
Клеевой слой, которым соединены поверхности подложки и фиксирующего листа, обращенные друг к другу выполнен из однокомпонентного клея на основе поливинилацетата KIWOTHERM D 123.
Покровный лист прикреплен к фиксирующему листу клеем LOCTITE DURO - TAK 4003 и имеет прозрачную зону, соответствующую по размерам отверстию фиксирующего листа 5 мм.
Окно для просмотра результатов подложки выполнено в виде квадрата размером 5×5 мм.
Покровный лист снабжен язычком с одной стороны для удобства открывания тест-системы и с другой стороны прикреплен слоем термоклея LUNAMELT HS-3500 для надежной фиксации этого листа.
При сохранении всех конструктивных размеров или изменении их в допустимых пределах замена субстрата с аргинина на мочевину или орнитин позволяет исследовать другие бактерии, например, Proteus mirabilis, Corynebacterium urealyticum, Helicobacter pylori, Ureaplasma urealyticum и др., используя разные типы исследуемых образцов: жидкие, полутвердые и твердые.
Таким образом, заявляемая тест-система позволяет расширить область применения за счет расширения типов исследуемых образцов и сократить время определения активности ферментативных реакций.