Автономное устройство для анаэробного культивирования сульфаторедуцирующих микроорганизмов
SELF-CONTAINED ANAEROBIC CULTURE DEVICE FOR SULFATE-REDUCING MICROORGANISMS

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет предварительных заявок на патент США №62/039,638, поданной 20 апреля 2014 года, и 62/187,293, поданной 1 июля 2015 года, раскрытие которых включено во всей их полноте в данную заявку путем ссылки.
Уровень техники
Сульфатредуцирующие бактерии (SRB) повсеместно распространены в морской воде, поверхностных водах, содержащих разлагающиеся органические вещества, а также в отложениях, найденных в морской и пресноводной среде. SRB обычно обнаруживают в анаэробных средах, хотя сообщалось, что, по меньшей мере, некоторые SRB могут выдерживать и размножаться в средах, которые имеют, по меньшей мере, низкий уровень кислорода.
2
SRB получают энергию путем окисления органических соединений или молекулярного водорода. Они используют сульфат в качестве акцептора электронов для продуцирования сероводорода (HS). Продуцирование сероводорода может способствовать коррозии металлов (например, металлов, которые используются для производства труб). Эта коррозия может в результате привести к разрушению металла и, в конечном счете, к увеличению эксплуатационного обслуживания или повреждению металлических труб. Биогенный сульфид также может вызвать коррозию других материалов, таких как бетон.
Способы обнаружения и подсчета сульфатредуцирующих бактерий, как правило, включают получение анаэробной культуральной среды и/или инкубирование культуральной среды в анаэробной атмосфере. В последнее время для обнаружения SRB используют методы амплификации нуклеиновых кислот.
Несмотря на то, что были предприняты попытки разработать простой способ культивирования SRB, остается потребность в улучшенных способах для подсчета SRB.
Сущность изобретения
В общем, настоящее изобретение относится к обнаружению и, необязательно, подсчету сульфатредуцирующих микроорганизмов в образце. В частности, настоящее изобретение относится к устройству для культивирования SRB в аэробной атмосфере и способам использования устройства. Выращивание и обнаружение SRB могут быть проведены с использованием автономного образующего модифицированную среду устройства для культивирования. Создающее модифицированную среду устройство активируется с помощью предварительно определенного объема водной жидкости для получения анаэробной водной среды для выращивания, которая способствует росту SRB.
Устройство для культивирования и способы в соответствии с настоящим изобретением, раскрытые в данной заявке, обеспечивают выращивание, обнаружение и дифференциацию сульфатредуцирующих микроорганизмов даже при инкубировании микроорганизмов в содержащих кислород (например, нормальных атмосферных содержащих кислород) средах. Преимущественно, это исключает необходимость в специальном оборудовании для инкубирования и реагентах (например, анаэробных баночках, анаэробных саше одноразового использования, палладиевых катализаторах, анаэробных перчаточных боксах), которые, как правило, требуются для культивирования сульфатредуцирующих микроорганизмов.
В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает устройство для культивирования для подсчета колоний сульфатредуцирующих микроорганизмов. Устройство может содержать корпус, содержащий водонепроницаемое основание, водонепроницаемый покрывающий лист, прикрепленный к основанию, и отделение для выращивания, расположенное между основанием и покрывающим листом. Отделение для выращивания может иметь периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания. Часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением. Часть может включать >50% периметра. Устройство дополнительно может содержать сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, расположенный в отделении для выращивания, сухую культуральную среду, расположенную в отделении для выращивания, и сухой первый улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания. Сухая культуральная среда может быть выбрана таким образом, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующих бактерий. В любом варианте осуществления, устройство необязательно может содержать сухой индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующими бактериями, при этом индикаторный реагент расположен в отделении для выращивания.
В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает устройство для культивирования для подсчета колоний сульфатредуцирующих микроорганизмов. Устройство может содержать корпус, содержащий водонепроницаемое основание, водонепроницаемый покрывающий лист, прикрепленный к основанию, и отделение для выращивания, расположенное между основанием и покрывающим листом. Отделение для выращивания может иметь периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания. Часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением. Часть может включать >50% периметра. Устройство дополнительно может содержать сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, расположенный в отделении для выращивания, индикаторный реагент, расположенный в отделении для выращивания, и сухой первый улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания. Индикаторный реагент может обнаруживать продуцирование сероводорода сульфатредуцирующими бактериями. В любом варианте осуществления, устройство необязательно может содержать сухую культуральную среду, расположенную в отделении для выращивания, при этом индикаторный реагент расположен в отделении для выращивания, причем сухую культуральную среду выбирают таким образом, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующих бактерий.
В любом из приведенных выше вариантов осуществления, устройство дополнительно может содержать носитель, приклеенный к основанию или покрывающему листу, при этом часть носителя расположена в отделении для выращивания.
В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает устройство для культивирования для подсчета сульфатредуцирующих микроорганизмов. Устройство может содержать корпус, сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, сухую культуральную среду и сухой первый улавливающий кислород реагент. Корпус может содержать плоскую водонепроницаемую подложку. Подложка содержит периферийную кромку, первую основную поверхность, содержащую расположенные на расстоянии друг от друга первую и вторую секции, вторую основную поверхность, противоположную первой основной поверхности, и сгиб, который размещает первую секцию в перекрывающемся смежном положении по отношению ко второй секции. Первая секция и вторая секция определяют внутренние стенки отделения для выращивания, которое содержит периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания. Часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением. Часть включает >50% периметра. Растворимый в холодной воде гелеобразующий агент может быть приклеен к первой секции в отделении для выращивания. Сухая культуральная среда может быть расположена в отделении для выращивания и выбрана таким образом, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующих бактерий. Первый улавливающий кислород реагент может быть расположен в отделении для выращивания.
В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает устройство для культивирования для подсчета сульфатредуцирующих микроорганизмов. Устройство может содержать корпус, сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующими бактериями, и сухой первый улавливающий кислород реагент. Корпус может содержать плоскую водонепроницаемую подложку. Подложка содержит периферийную кромку, первую основную поверхность, содержащую расположенные на расстоянии друг от друга первую и вторую секции, вторую основную поверхность, противоположную первой основной поверхности, и сгиб, который размещает первую секцию в перекрывающемся смежном положении по отношению ко второй секции. Первая секция и вторая секция определяют внутренние стенки отделения для выращивания, которое содержит периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания. Часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением. Часть включает >50% периметра. Растворимый в холодной воде гелеобразующий агент может быть приклеен к первой секции в отделении для выращивания. Индикаторный реагент может быть расположен в отделении для выращивания. Первый улавливающий кислород реагент может быть расположен в отделении для выращивания.
В любом из приведенных выше вариантов осуществления, растворимый в холодной воде гелеобразующий агент может содержать гидроксипропилметилцеллюлозу. В любом из приведенных выше вариантов осуществления, первый улавливающий кислород реагент может быть выбран из группы, состоящей из сульфата железа(III)-аммония, хлорида трехвалентного железа, солей трехвалентного железа, сульфитных солей, бисульфитных солей.
В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения или подсчета сульфатредуцирующих микроорганизмов. Способ может включать стадии, на которых помещают образец в отделение для выращивания устройства, инкубируют устройство при температуре, которая способствует росту сульфатредуцирующего микроорганизма, и обнаруживают индикацию колонии сульфатредуцирующего микроорганизма в отделении для выращивания. Устройство может содержать корпус, содержащий отделение для выращивания, расположенное между водонепроницаемым основанием и водонепроницаемым покрывающим листом, прикрепленным к основанию, сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, приклеенный к основанию в отделении для выращивания, и сухой первый улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания. Отделение для выращивания может иметь периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания. Часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением, при этом часть включает >50% периметра.
В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения или подсчета сульфатредуцирующих микроорганизмов. Способ может включать стадии, на которых помещают образец в отделение для выращивания устройства, инкубируют устройство при температуре, которая способствует росту сульфатредуцирующего микроорганизма, и обнаруживают индикацию колонии сульфатредуцирующего микроорганизма в отделении для выращивания. Корпус может содержать плоскую водонепроницаемую подложку. Подложка содержит периферийную кромку, первую основную поверхность, содержащую расположенные на расстоянии друг от друга первую и вторую секции, вторую основную поверхность, противоположную первой основной поверхности, и сгиб, который размещает первую секцию в перекрывающемся смежном положении по отношению ко второй секции. Первая секция и вторая секция определяют внутренние стенки отделения для выращивания, которое содержит периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания. Часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением. Часть включает >50% периметра. Растворимый в холодной воде гелеобразующий агент может быть приклеен к первой секции в отделении для выращивания. Индикаторный реагент может быть расположен в отделении для выращивания. Первый улавливающий кислород реагент может быть расположен в отделении для выращивания.
В любом из приведенных выше вариантов осуществления способов, перед помещением образца в отделение для выращивания, отделение для выращивания может содержать сухую культуральную среду, при этом культуральная среда выбрана таким образом, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующей бактерии. В любом из приведенных выше вариантов осуществления способов, перед помещением образца в отделение для выращивания, отделение для выращивания может содержать индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующей бактерией. В любом из приведенных выше вариантов осуществления способов, помещение образца в отделение для выращивания дополнительно может включать помещение водной жидкости в отделение для выращивания. В любом из приведенных выше вариантов осуществления способов, способ дополнительно может включать стадию, на которой герметично скрепляют отверстие.
Слова «предпочтительный» и «предпочтительно» относятся к вариантам осуществления настоящего изобретения, которые при определенных обстоятельствах могут обеспечить определенные преимущества. Однако другие варианты осуществления могут также быть предпочтительными при тех же или других обстоятельствах. Кроме того, перечисление одного или более предпочтительных вариантов осуществления не означает, что другие варианты осуществления не являются полезными и не предназначается для исключения других вариантов осуществления из объема настоящего изобретения.
Термин «содержит» и его варианты не имеют ограничивающего значения, если эти термины присутствуют в описании и формуле изобретения.
Как используется в данной заявке, единственное число, «по меньшей мере, один» и «один или более» используются взаимозаменяемо. Таким образом, например, питательное вещество может быть истолковано для обозначения «одного или более» питательных веществ.
Термин «и/или» означает один или все из перечисленных элементов или комбинацию любых двух или более из перечисленных элементов.
Кроме того, в данной заявке, перечисления числовых диапазонов по конечным точкам включают все числа, включенные в пределах этого диапазона (например, от 1 до 5 включает 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, и т.д.).
Термин «микроорганизм» или «микроб», как используется в данной заявке, относится к любому микроскопическому организму, который может представлять собой единичную клетку или многоклеточный организм. Термин обычно используют для обозначения любого прокариотического или эукариотического микроскопического организма, способного к росту и размножению в приемлемой культуральной среде, включая, без ограничения, одну или более бактерий. Микроорганизмы, охватываемые объемом настоящего изобретения, включают прокариоты, а именно бактерии и археи; и различные формы эукариотов, включающие простейшие, грибы, дрожжи (например, анаэробные дрожжи), водоросли и т.д. Термин «целевой микроорганизм» относится к любому микроорганизму, который требуется обнаружить.
Термин «анаэробный микроорганизм» или «анаэроб», как используется в данной заявке, относится к микроорганизмам, которые чувствительны к кислороду и не будут расти в присутствии кислорода. Анаэробный микроорганизм или анаэроб представляет собой любой организм, который не нуждается в кислороде для роста. Анаэробные микроорганизмы включают как облигатные анаэробы, так и факультативные анаэробы. Облигатные анаэробы представляют собой те микроорганизмы, которые будут погибать при воздействии атмосферных уровней кислорода. Факультативный анаэроб представляет собой организм, который может осуществлять аэробное дыхание, если кислород присутствует, но способен переходить на ферментацию или анаэробное дыхание, если кислород отсутствует. Способы и системы в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для обогащения и обнаружения как облигатных анаэробов, так и факультативных анаэробов.
Термин «культивирование» или «выращивание» микроорганизмов, как используется в данной заявке, относится к способу увеличения количества микробных организмов, разрешая им размножаться в предварительно определенных культуральных средах в условиях, способствующих их росту. Более конкретно, это способ обеспечения приемлемой культуральной среды и условий для того, чтобы способствовать, по меньшей мере, одному клеточному делению микроорганизма. Культуральные среды представляют собой твердые, полутвердые или жидкие среды, содержащие все питательные вещества и необходимые физические параметры для выращивания, необходимые для роста микроорганизмов.
Термин «обогащение», как используется в данной заявке, относится к способу культивирования, который обеспечивает избирательное обогащение роста определенного микроорганизма путем обеспечения среды и условий с определенными и известными свойствами, которые благоприятствуют росту этого определенного микроорганизма. Обогащение среды для культивирования будет положительно влиять на рост выбранного микроорганизма и/или отрицательно влиять на рост других микроорганизмов.
«Улавливающий кислород реагент» и «улавливатель кислорода» будут широко использоваться в данной заявке для обозначения соединения, которое может потреблять, истощать или взаимодействовать с кислородом из данной среды. Предпочтительно, улавливающий кислород реагент не замедляет или не ингибирует рост анаэробных микроорганизмов.
h
Термин «восстанавливающий агент» относится к веществу, которое способно понижать E потенциал полутвердой культуральной среды, образованной гидратацией сухих компонентов в отделении для выращивания устройства в соответствии с настоящим изобретением.
Термин «источник углерода», как используется в данной заявке, относится к веществу, которое может метаболизироваться микроорганизмом, таким образом, что, по меньшей мере, часть атомов углерода в источнике углерода преобразуется микроорганизмом в биомассу.
Приведенное выше краткое описание настоящего изобретения не предназначено для описания каждого раскрытого варианта осуществления или каждой реализации настоящего изобретения. В описании, которое следует далее, более конкретно представлены иллюстративные варианты осуществления. В нескольких местах по всей заявке руководство обеспечивается через списки примеров, где примеры могут использоваться в различных комбинациях. В каждом случае указанный список служит только в качестве репрезентативной группы и не должен интерпретироваться как исключительный список.
Дополнительные подробности этих и других вариантов осуществления приведены на прилагаемых чертежах и в описании ниже. Другие признаки, объекты и преимущества станут очевидными из описания и чертежей, и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
ФИГ. 1А представляет собой вид сверху одного варианта осуществления устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением.
ФИГ. 1В представляет собой перспективный вид с пространственным разделением деталей в поперечном разрезе сбоку, вдоль линии 1В-1В, устройства для культивирования ФИГ. 1А.
ФИГ. 2А представляет собой вид сверху альтернативного варианта осуществления устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением.
ФИГ. 2В представляет собой перспективный вид с пространственным разделением деталей сбоку устройства для культивирования ФИГ. 2А.
ФИГ. 3 представляет собой вид сверху еще одного альтернативного варианта осуществления устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением.
ФИГ. 4А представляет собой вид сверху альтернативного варианта осуществления устройства для культивирования ФИГ. 3.
ФИГ. 4В представляет собой перспективный вид с пространственным разделением деталей сбоку устройства для культивирования ФИГ. 4А.
ФИГ. 5А представляет собой вид сверху еще одного альтернативного варианта осуществления устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением.
ФИГ. 5В представляет собой перспективный вид с пространственным разделением деталей сбоку устройства для культивирования ФИГ. 5А.
ФИГ. 6-9 представляют собой различные виды устройства для культивирования, содержащего единое основание в соответствии с настоящим изобретением.
ФИГ. 10 представляет собой схематический вид сверху одного варианта осуществления способа инокуляции устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением.
ФИГ. 11А-11Е представляют собой схематические виды сверху различных стадий одного варианта осуществления способа изготовления устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением.
Подробное описание изобретения
Прежде чем какие-либо варианты осуществления настоящего изобретения подробно объясняются, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено в его применении деталями конструкции и компоновкой компонентов, изложенными в нижеследующем описании или проиллюстрированными на следующих чертежах. Настоящее изобретение дает возможность других вариантов осуществления и может быть выполнено на практике или осуществлено различными способами. Кроме того, следует понимать, что фразеология и терминология, используемые в данной заявке, предназначены для описания и не должны рассматриваться как ограничивающие. Использование «включающий», «содержащий» или «имеющий» и их варианты в данной заявке предназначено для того, чтобы охватить перечисленные ниже пункты и их эквиваленты, а также дополнительные пункты. Если не оговорено или не ограничено иное, термины «соединенный» и «связанный» и их варианты широко используются и охватывают как непосредственные, так и опосредованные соединения и связывания. Кроме того, «соединенные» и «связанные» не ограничиваются физическими или механическими соединениями или связываниями. Следует понимать, что могут быть использованы другие варианты осуществления и могут быть сделаны структурные или логические изменения, не выходящие за пределы объема настоящего изобретения. Кроме того, такие термины, как «передний», «задний», «верхний», «нижний» и т.п., используются только для описания элементов, поскольку они относятся друг к другу, но ни в коем случае не предназначены для указания определенных положений устройства, для того, чтобы указывать или подразумевать необходимые или требуемые положения устройства, или чтобы определять, как описанное в данной заявке настоящее изобретение будет использоваться, устанавливаться, отображаться или располагаться при применении.
Настоящее изобретение в общем относится к обнаружению и, необязательно, подсчету сульфатредуцирующих микроорганизмов в образце. Например, в некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к выращиванию и обнаружению сульфатредуцирующих бактерий (SRB). Смешанная группа SRB, как правило, растет в анаэробных средах. В настоящее время известно, что выращивание и обнаружение облигатно-анаэробных сульфатредуцирующих микроорганизмов может проводиться с использованием автономного образующего среду с пониженным содержанием кислорода устройства для культивирования, которое устраняет необходимость инкубирования самого устройства в анаэробной среде. Преимущественно, в любом варианте осуществления, устройство в соответствии с настоящим изобретением отличает сульфатредуцирующие бактерии от бактерий, которые восстанавливают другие формы соединений окисленной серы (например, бисульфит).
В настоящее время известно, что могут быть изготовлены устройства для культивирования, генерирующие сухую регидратируемую автономную среду с пониженным содержанием кислорода. Устройство для культивирования содержит эффективное количество, по существу, сухого улавливающего кислород реагента, расположенного в отделении для выращивания устройства для культивирования и способного к регидратации в предварительно определенном объеме водного раствора, при этом, при регидратации, улавливающий кислород реагент способен принимать участие в реакции потребления кислорода. Кроме того, в настоящее время известно, что реакция потребления кислорода может потреблять достаточное количество кислорода для того, чтобы способствовать росту микроаэротолерантного микроорганизма, микроаэрофильного микроорганизма или облигатно-анаэробного сульфатредуцирующего микроорганизма. Кроме того, устройство для культивирования можно удерживать в аэробной среде во время инкубирования, при этом устройство для культивирования может поддерживать среду с пониженным содержанием кислорода в течение до приблизительно восьми дней для того, чтобы способствовать росту указанных выше микроорганизмов.
Интересующие виды бактерий могут быть проанализированы в тестовом образце, который может быть получен из любого источника, таком как образец, содержащий морскую воду, поверхностные воды (например, из прудов, озер или рек) или осадок из морских или пресноводных источников. Кроме того, тестовый образец может быть получен из нефтяных месторождений, нефтяных скважин, трубопроводов, используемых для транспортировки нефти, или резервуаров, используемых для хранения нефти.
Сульфатредуцирующие бактерии повсеместно распространены в природе. Данные бактерии могут быть облигатно-анаэробными или могут быть аэротолерантными. Неограничивающие примеры облигатно-анаэробных, сульфатредуцирующих бактерий включают Desulfovibrio spp. и Desulfotomaculum spp.
В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает устройство для культивирования для культивирования и обнаружения сульфатредуцирующего микроорганизма, который растет в средах с пониженным содержанием кислорода. Со ссылкой на ФИГ. 1А и 1В, устройство для культивирования 100 в соответствии с настоящим изобретением содержит корпус 5, который включает водонепроницаемое основание 10, водонепроницаемый покрывающий лист 20 и отделение для выращивания 30, расположенное между основанием 10 и покрывающим листом 20. Основание 10 имеет внутреннюю поверхность и внешнюю поверхность, противоположную внутренней поверхности. Покрывающий лист 20 имеет внутреннюю поверхность и внешнюю поверхность, противоположную внутренней поверхности. В любом варианте осуществления, внутренняя поверхность основания 10 расположена обращенной к внутренней поверхности покрывающего листа 20.
Отделение для выращивания 30 имеет периметр 32, который включает отверстие 34. Отверстие 34 обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания 30. Часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением 40. В любом варианте осуществления, часть включает >50% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥80% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥90% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥95% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥98% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥99% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления (например, во время использования после того, как устройство инокулировано), часть включает 100% периметра 32 отделения для выращивания 30.
Основание 10 предпочтительно представляет собой относительно жесткую водонепроницаемую пленку, изготовленную из материала (например, сложного полиэфира, полипропилена или полистирола), который не будет абсорбировать или иным образом не будет подвергаться отрицательному воздействию воды. Основание 10 предпочтительно изготовлено с использованием материала, который, по существу, является непроницаемым для газообразного кислорода. Неограничивающие примеры приемлемых материалов для основания 10 включают сложнополиэфирные пленки с толщиной от, по меньшей мере, приблизительно 15 мкм до, по меньшей мере, приблизительно 180 мкм, полипропиленовые пленки с толщиной от, по меньшей мере, приблизительно 100 мкм до, по меньшей мере, приблизительно 200 мкм и полистирольные пленки с толщиной от, по меньшей мере, приблизительно 300 мкм до приблизительно 380 мкм. Другие приемлемые основания включают пленки на основе сополимера этилена и винилового спирта, пленки на основе поливинилового спирта и поливинилиденхлоридные пленки. Основание 10 может быть непрозрачным, полупрозрачным или, если желательным является наблюдать колонии через основание 10, основание может быть прозрачным.
Покрывающий лист 20 прикреплен (например, адгезивно прикреплен) к основанию 10 с образованием отделения для выращивания 30 и; необязательно, если покрывающий лист является оптически пропускающим; отделение для выращивания просматривается во время транспортировки, хранения, инкубирования и/или подсчета колоний. Покрывающий лист 20 предпочтительно представляет собой относительно жесткую водонепроницаемую пленку, изготовленную из материала (например, сложного полиэфира, полипропилена или полистирола), который не будет абсорбировать или иным образом не будет подвергаться отрицательному воздействию воды. Покрывающие листы 20 предпочтительно являются прозрачными для того, чтобы способствовать подсчету колоний без открывания устройства для культивирования 100, и являются, по существу, непроницаемыми для микроорганизмов и водяного пара.
Как правило, покрывающие листы могут быть изготовлены из материалов, таких как материалы, используемые для изготовления основания 10. Покрывающий лист 20 предпочтительно изготовлен с использованием материала, который является, по существу, непроницаемым для газообразного кислорода. Неограничивающие примеры приемлемых материалов для основания 10 включают сложнополиэфирные пленки с толщиной от, по меньшей мере, приблизительно 15 мкм до, по меньшей мере, приблизительно 180 мкм, полипропиленовые пленки с толщиной от, по меньшей мере, приблизительно 100 мкм до, по меньшей мере, приблизительно 200 мкм и полистирольные пленки с толщиной от, по меньшей мере, приблизительно 300 мкм до приблизительно 380 мкм. Другие приемлемые основания включают пленки на основе сополимера этилена и винилового спирта, пленки на основе поливинилового спирта и поливинилиденхлоридные пленки. Как показано на ФИГ. 1, покрывающий лист 20 соединен с основанием 10 посредством водонепроницаемого герметичного скрепления 40, которое простирается вдоль части периметра 32 отделения для выращивания 30.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что пропускаемость газообразного кислорода через данный тип полимерной пленки может быть уменьшена путем увеличения толщины полимерной пленки. В любом варианте осуществления, основание и покрывающий лист в соответствии с настоящим изобретением представляют собой полимерные пленки, имеющие приемлемую толщину для того, чтобы быть, по существу, непроницаемыми для газообразного кислорода.
Отделение для выращивания 30 может находиться в любом доступном месте в устройстве для культивирования 100 между основанием 10 и покрывающим листом 20. Предпочтительно, периметр 32 отделения для выращивания 30, за исключением отверстия 34, расположен на расстоянии от периферийных кромок 80 устройства 100.
Устройство в соответствии с настоящим изобретением содержит сухой, растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, приклеенный к основанию 10 в отделении для выращивания 30. Предпочтительно, гелеобразующий агент приклеен, или непосредственно или опосредовано, к основанию 10. Необязательно, гелеобразующий агент приклеен непосредственно или опосредовано к покрывающему листу 20 устройства 100. В любом варианте осуществления, гелеобразующий агент может быть равномерно распределен на внутренней поверхности 10 основания 10 и/или внутренней поверхности покрывающего листа 20 в отделении для выращивания 30 устройства 100.
В любом варианте осуществления, гелеобразующий агент может быть обеспечен в устройстве в качестве первого сухого покрытия 14, приклеенного к основанию 10. В любом варианте осуществления, первое сухое покрытие 14 может быть приклеено к первому адгезивному слою 12, приклееному к основанию 10 в отделении для выращивания 30. Приемлемые гелеобразующие агенты для использования в первом сухом покрытии 14 включают растворимые в холодной воде природные и синтетические гелеобразующие агенты. Как правило, приемлемыми являются природные гелеобразующие агенты, такие как альгин, карбоксиметилцеллюлоза, камедь тары, гидроксиэтилцеллюлоза, гуаровая камедь, камедь бобов рожкового дерева, ксантановая камедь, и синтетические гелеобразующие агенты, такие как полиакриламид, полиуретан, полиэтиленоксиды и их смеси. Соответствующие гелеобразующие агенты могут быть выбраны в соответствии с описанием настоящего изобретения и раскрытиями патентов США №№4,565,783; 5,089,413; и 5,232,838. Другие предпочтительные гелеобразующие агенты включают гидроксипропилметилцеллюлозу; при этом данные гелеобразующие агенты используются индивидуально, или предпочтительно, в комбинации с другим гелеобразующий агентом, таким как один из указанных выше гелеобразующих агентов.
Таким образом, в любом варианте осуществления, устройство 100 в соответствии с настоящим изобретением необязательно может содержать первое сухое покрытие 14, приклеенное, по меньшей мере, к части или всей внутренней поверхности основания 10 в отделении для выращивания 30. Первое сухое покрытие 14, если присутствует, может содержать сухой, растворимый в холодной воде гелеобразующий агент. Необязательно, первый адгезивный слой 12 приклеен к основанию 10 и, по меньшей мере, часть первого сухого покрытия приклеена к первому адгезивному слою в отделении для выращивания 30.
Покрывающий лист 20 может быть свободен от какого-либо покрытия (не показано). Альтернативно, если устройство 100 не имеет первого сухого покрытия 14, приклеенного к внутренней поверхности 10 основания 10 в отделении для выращивания 30, или если устройство 100 имеет первое сухое покрытие 14, приклеенное к основанию 10, покрывающий лист 20 может содержать второе сухое покрытие 24, приклеенное к нему в отделении для выращивания. Второе сухое покрытие 24, если присутствует, может содержать сухой, растворимый в холодной воде гелеобразующий агент. Необязательно, второй адгезивный слой 22 прикреплен к покрывающему листу 20 и, по меньшей мере, часть второго сухого покрытия 24 прикреплена ко второму адгезивному слою в отделении для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть второго адгезивного слоя 22 может быть использована для формирования водонепроницаемого герметичного скрепления по периметру 32 отделения для выращивания 30.
4
2
4
Первое и/или второе сухое покрытие необязательно может содержать любое питательное вещество или питательную культуральную среду, которая является восстанавливаемой холодной водой, которая, по существу, не влияет на улавливающий кислород реагент (обсуждается ниже) или свойства гелеобразования в холодной воде гелеобразующего агента, и которая способствует росту сульфатредуцирующего микроорганизма. Определенные питательное вещество или культуральная среда, приемлемые для использования в устройстве для культивирования, могут зависеть от микроорганизма, подлежащего выращиванию в устройстве, и будут легко выбраны специалистом в данной области техники. Неограничивающий пример приемлемой питательной культуральной среды содержит бактотриптон, Amresco Soytone, бакто-дрожжевой экстрат, MgSO-7HO, лактат натрия, ацетат натрия, NaCl, NHCl, со значением рН приблизительно 7,3, как описано в примере 5 в данной заявке. Как правило, такие питательные вещества растворимы в холодной воде. Приемлемые питательные вещества для поддержания бактериального роста известны в данной области техники и включают без ограничения дрожжевой экстракт, пептон, сахара, приемлемые соли и тому подобное. В любом варианте осуществления, первое и/или второе сухое покрытие дополнительно может содержать селективный агент (например, питательное вещество, антибиотик и их комбинации), который способствует росту сульфатредуцирующего микроорганизма или группы сульфатредуцирующих микроорганизмов по сравнению с другим микроорганизмом или группой микроорганизмов, которые в противном случае могут расти в устройстве для культивирования. Специалистам в данной области техники будет понятно, что может быть использовано множество других составов и что они не приуменьшают объем настоящего изобретения.
Предпочтительно, когда первое сухое покрытие 14 состоит в основном из сухого порошка или сухого порошкового агломерата, первое покрытие 14 расположено на первом адгезивном слое 12, который расположен, по меньшей мере, на части внутренней поверхности основания 10. Первое сухое покрытие 14 может быть нанесено на основание 10 или на необязательный первый адгезивный слой 12 с использованием способов компаундирования, способов нанесения адгезивного покрытия и способов нанесения жидкого покрытия и/или способов нанесения сухого покрытия, описанных, например, в патентах США №№4,565,783; 5,089,413; и 5,232,838; все из которых включены в данную заявку путем ссылки во всей их полноте.
Предпочтительно, когда второе сухое покрытие 24 состоит в основном из сухого порошка или сухого порошкового агломерата, второе покрытие 24 расположено на втором адгезивном слое 22, который расположен, по меньшей мере, на части внутренней поверхности покрывающего листа 20. Второе сухое покрытие 24 может быть нанесено на покрывающий лист 20 или на необязательный второй адгезивный слой 22 с использованием способов компаундирования, способов нанесения адгезивного покрытия и способов нанесения жидкого покрытия и/или способов нанесения сухого покрытия, описанных, например, в патентах США №№4,565,783; 5,089,413; и 5,232,838; все из которых включены в данную заявку путем ссылки во всей их полноте.
Отделение для выращивания 30 определено, как объем, расположенный между внутренними поверхностями основания 10 и покрывающего листа 20, объем, охватывающий, по меньшей мере, часть первого сухого покрытия 14 и/или второго сухого покрытия 24. Таким образом, когда водная жидкость распределяется в отделении для выращивания, водная жидкость находится в жидкостном контакте, по меньшей мере, с частью первого сухого покрытия 14, если присутствует, и/или второго сухого покрытия 24, если присутствует. В любом варианте осуществления, толщина отделения для выращивания 30 неинокулированного устройства для культивирования может составлять от приблизительно 0,2 мм до приблизительно 3 мм. Толщина отделения для выращивания 30 инокулированного устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением может варьироваться в зависимости, например, от объема водной жидкости (не показана), помещенной в устройство для культивирования, и присутствия твердых веществ (например, суспендированных частиц и/или мембранного фильтра), связанных с образцом (не показано). В любом варианте осуществления, толщина отделения для выращивания инокулированного устройства для культивирования может составлять от приблизительно 1 мм до приблизительно 5 мм.
Устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат эффективное количество одного или более сухих улавливающих кислород реагентов. Один или более улавливающие кислород реагенты расположены в отделении для выращивания; необязательно, приклеены к адгезивному слою в отделении для выращивания, как обсуждается в данной заявке. «Сухой», как используется в данной заявке, означает, что реагент, по существу, свободен от воды. Фраза «по существу, свободен от воды» относится к реагенту, который имеет содержание воды не более, чем приблизительно содержание воды в материале (например, обеспеченном в виде порошка или в виде обезвоженного водного покрытия) после того, как он уравновесится с окружающей средой.
Необязательно, устройство для культивирования в соответствии с настоящим изобретением дополнительно может содержать другие сухие, регидратируемые в воде компоненты, такие как компонент буфера, восстанавливающий агент и/или индикаторный реагент.
По меньшей мере, два сухих компонента (например, гелеобразующий агент и один или более улавливающих кислород реагентов для поглощения кислорода, или восстанавливающий агент) гидратируются водной жидкостью до, во время или после введения (например, инокуляции) образца материала в отделение для выращивания устройства для культивирования, как описано в данной заявке. Как правило, образец материала и/или водную жидкость вводят в отделение для выращивания устройства для культивирования в условиях окружающей среды (т.е., в аэробной газовой среде). Таким образом, после инокуляции отделения для выращивания образцом в аэробных условиях, водная жидкость в отделении для выращивания устройства для культивирования содержит первую концентрацию растворенного кислорода. Один или более улавливающих кислород реагентов в устройстве для культивирования действует для снижения первой концентрации растворенного кислорода в водной жидкости в отделении для выращивания до второй концентрации растворенного кислорода, которая является, по существу, более низкой, чем первая концентрация растворенного кислорода. Данное снижение концентрации растворенного кислорода в отделении для выращивания инокулированного устройства для культивирования способствует росту облигатно-анаэробных или микроаэрофильных микроорганизмов в устройстве для культивирования.
В любом варианте осуществления, эффективное количество одного или более улавливающих кислород реагентов и их концентрацию выбирают таким образом, что снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода происходит в течение приблизительно 120 минут после приведения одного или более улавливающих кислород реагентов в жидкостной контакт с предварительно определенным объемом водной жидкости в отделении для выращивания устройства для культивирования. В любом варианте осуществления, эффективное количество одного или более улавливающих кислород реагентов и их концентрацию выбирают таким образом, что снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода происходит в течение приблизительно 60 минут после приведения улавливающего кислород реагента в жидкостной контакт с предварительно определенным объемом водной жидкости в отделении для выращивания устройства для культивирования. В любом варианте осуществления, эффективное количество одного или более улавливающих кислород реагентов и их концентрацию выбирают таким образом, что снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода происходит в течение приблизительно 30 минут после приведения улавливающего кислород реагента в жидкостной контакт с предварительно определенным объемом водной жидкости в отделении для выращивания устройства для культивирования.
В любом варианте осуществления, снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода происходит при температуре от температуры окружающей среды (например, приблизительно 16 градусов С) до приблизительно 80 градусов С, включительно. Таким образом, в любом варианте осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением, не требуется инкубировать устройство для культивирования при повышенной температуре (т.е., выше температуры окружающей среды) для того, чтобы снизить первую концентрацию растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода после приведения улавливающего кислород реагента в жидкостной контакт с предварительно определенным объемом водной жидкости в отделении для выращивания устройства для культивирования.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что количество кислорода, удаленного из отделения для выращивания устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением в течение периода времени, приемлемого для культивирования микроорганизмов, зависит, среди прочего, от количества одного или более улавливающих кислород реагентов в отделении для выращивания устройства для культивирования. Регулируя количество улавливающего кислород реагента в отделении для выращивания в соответствии с настоящим изобретением, устройство для культивирования может быть сконфигурировано для культивирования микроаэротолерантных микроорганизмов или для культивирования облигатно-анаэробных микроорганизмов.
2
2
Ряд улавливающих кислород реагентов являются известными, включая, например, аскорбиновую кислоту (например, L-аскорбиновую кислоту и ее соли), фермент, который катализирует реакцию потребления кислорода, соли двухвалентного железа, сульфитные, бисульфитные и метабисульфитные соли металлов. Приемлемый улавливающий кислород реагент в соответствии с настоящим изобретением потребляет достаточное количество кислорода для создания среды с низким содержанием кислорода или анаэробной локальной среды в устройстве для культивирования, и продуцирует количества и типы продуктов реакции, которые могут находиться в жидкостной связи с микроорганизмами, подлежащими культивированию в устройстве, по существу, без ингибирования роста этих микроорганизмов. В любом варианте осуществления, улавливающий кислород реагент расположен в отделении для выращивания в количестве от приблизительно 1 микромоль/10 см до приблизительно 15 микромоль/10 см.
Предпочтительно, в любом варианте осуществления, один или более улавливающих кислород реагентов обеспечены в виде сухого порошка. Более предпочтительно, в любом варианте осуществления, один или более улавливающих кислород реагентов обеспечены в виде сухого порошка, который измельчается и классифицируется, с образованием совокупности частиц с распределением по размерам, состоящей в значительной степени из частиц, имеющих диаметр 100 микрон или менее. Преимущественно, улавливающий кислород реагент, обеспеченный в частицах, имеющих диаметр 100 микрон или менее, может быть приклеен к основанию или покрывающему листу (например, приклеен к адгезивному слою, нанесенному на основание или покрывающий лист) в количестве, эффективном для создания и поддержания (например, до приблизительно 24 часов инкубирования, до приблизительно 48 часов инкубирования, до приблизительно 72 часов инкубирования, до 4 дней инкубирования, до 5 дней инкубирования, до 7 дней инкубирования, по меньшей мере, 24 часов инкубирования, по меньшей мере, 48 часов инкубирования, по меньшей мере, 72 часов инкубирования, по меньшей мере, 4 дней инкубирования, по меньшей мере, 5 дней инкубирования, по меньшей мере, 7 дней инкубирования) анаэробной среды в отделении для выращивания, когда устройство инокулируют предварительно определенным объемом водной жидкости и, необязательно, отверстие герметично скрепляют.
Адгезив, использованный в необязательном адгезивном слое 22, расположенном на покрывающем листе 20, может быть таким же или отличным от адгезива, использованного в необязательном адгезивном слое 12, расположенном на основании 10. Кроме того, второе сухое покрытие 24, расположенное на покрывающем листе 20, может быть таким же или отличным от первого сухого покрытия 14, расположенного на основании 10. Покрытия на покрывающем листе 20 могут покрывать всю поверхность, обращенную к основанию, но предпочтительно покрывают, по меньшей мере, часть внутренней поверхности, которая определяет, по меньшей мере, часть отделения для выращивания 30 устройства для культивирования 100.
В любом варианте осуществления, селективный агент может быть расположен в устройстве в сухом покрытии или, необязательно, растворен в адгезивном слое внутри отделения для выращивания.
Необязательно, устройство для культивирования в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит средство для индикации кислорода в устройстве для культивирования. Предпочтительно, средство способно указывать количество (например, или предварительно определенное пороговое количество или относительное количество) кислорода, присутствующего в устройстве. Преимущественно, средство может указывать на то, поглотит ли улавливающий кислород реагент подходящим образом кислород или когда улавливающий кислород реагент подходящим образом поглотит кислород в отделении для выращивания устройства для культивирования до концентрации, которая способствует росту микроаэрофильных, микроаэротолерантных или облигатно-анаэробных микроорганизмов. Средство для обнаружения кислорода в устройстве для культивирования известно в данной области техники и включают, например, окислительно-восстановительные красители (например, метиленовый синий) и кислород-гасящие флуоресцентные красители.
Средство может быть люминесцентным соединением, которое указывает на отсутствие кислорода внутри устройства. Приемлемые кислородные индикаторы раскрыты в патенте США №6,689,438 (Kennedy et al.), который включен в данную заявку путем ссылки во всей своей полноте. Люминесцентные соединения, подходящие в качестве индикаторов для устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением, будут отображать люминесценцию, которая гасится кислородом. Более точно, индикаторы будут люминесцировать под воздействием их частоты возбуждения с эмиссией, которая обратно пропорциональна концентрации кислорода. Индикатор может быть покрыт, ламинирован или экструдирован на другой слой или часть другого слоя внутри устройства. Такой слой может быть расположен в отделении для выращивания и, необязательно, отделен от отделения для выращивания одним или более другими проницаемыми для кислорода слоями. Приемлемые соединения для индикации кислорода включают металлопроизводные октаэтилпорфирина, тетрафенилпорфирина, тетрабензопорфирина, хлорины или бактериохлорины. Другие приемлемые соединения включают копропорфирин палладия (PdCPP), октаэтилпорфирин платины и палладия (PtOEP, PdOEP), тетрафенилпорфирин платины и палладия (PtTPP, PdTPP), камфорхинон (CQ) и красители ксантенового типа, такие как эритрозин В (ЕВ). Другие приемлемые соединения включают комплексы рутения, осмия и иридия с лигандами, такими как 2,2'-бипиридин, 1,10-фенантролин, 4,7-дифенил-1,10-фенантролин и тому подобное. Приемлемые примеры таких соединений включают, трис(4,7,-дифенил-1,10-фенантролин)рутения (II) перхлорат, трис(2,2'-бипиридин)рутения (II) перхлорат, трис(1,10-фенантролин)рутения (II) перхлорат и тому подобное.
Устройство для культивирования в соответствии с настоящим изобретением необязательно включает сухой буферный реагент, расположенный в отделении для выращивания, который, при гидратировании деионизированной водой, приводит воду к предварительно определенному значению рН, которое является приемлемым для культивирования культуры и, необязательно, селективно обогащающим определенные группы микроорганизмов. Например, в любом варианте осуществления, предварительно определенное значение рН может составлять от приблизительно 5,2 до приблизительно 7,8. В любом варианте осуществления, предварительно определенное значение рН может быть меньше или равно 6,35 (например, от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,35).
a
Буферные реагенты, использованные в устройстве в соответствии с настоящим изобретением, включают любой микробиологически-совместимый буфер, имеющий значение pK приблизительно 8,0 или менее. Кислотная и основная части буферного реагента присутствуют в устройстве для культивирования в таком соотношении, что, когда предварительно определенный объем деионизированной воды контактирует с буферным реагентом, значение рН в отделении для выращивания является приемлемым для выращивания и обнаружения определенного микроорганизма или группы микроорганизмов. Приемлемые буферные реагенты включают, например, фосфатные соли металла (например, фосфат натрия, фосфат калия, фосфат кальция), ацетатные соли металла (например, ацетат натрия, ацетат калия, ацетат кальция), 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту и натриевую соль 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты, и янтарную кислоту и сукцинат натрия. Специалисту в данной области техники будет понятно, что соотношение кислотных и основных буферных реагентов может регулироваться для того, чтобы достичь желаемое значение рН водной смеси, образованной, когда предварительно определенный объем водной жидкости (например, содержащей образец) помещают в отделение для выращивания, и устройство закрывают.
2
Устройство для культивирования в соответствии с настоящим изобретением необязательно включает индикаторный реагент. Приемлемые индикаторные реагенты (например, трифенилтетразолия хлорид (ТТС)) могут обнаружить, по существу, все микроорганизмы, присутствующие в устройстве для культивирования. Необязательно, индикаторный реагент может быть дифференциальным индикатором; то есть, индикаторный реагент отличает определенные микроорганизмы от других микроорганизмов. Приемлемые индикаторные реагенты включают, например, индикатор (например, соль Мора, флуоресцентные HS зонды) для обнаружения продуцирования сероводорода микроорганизмами, рН индикатор, хромогенный ферментный субстрат и флуорогенный ферментный субстрат для обнаружения присутствия микроорганизма. Индикатор не должен, по существу, мешать улавливающему кислород реагенту. В любом варианте осуществления, индикаторный реагент может быть расположен в устройстве в сухом покрытии или, необязательно, растворен в адгезивном слое внутри отделения для выращивания.
Устройство для культивирования в соответствии с настоящим изобретением необязательно включает восстанавливающий агент вместо или в дополнение к сухому улавливающему кислород реагенту. Приемлемые восстанавливающие реагенты полезны для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды для выращивания и, таким образом, способствуют росту анаэробных микроорганизмов. Приемлемые восстанавливающие агенты включают, например, тиогликолят натрия, L-цистеин, дитиотреитол, дитиоэритрит и их комбинации.
В любом варианте осуществления, отделение для выращивания может иметь размеры, чтобы быть гидратированным объемом водной жидкости в 1 миллилитр. Вода содержит приблизительно 0,54 мкмоля растворенного кислорода на миллилитр. Таким образом, первое сухое покрытие и/или второе сухое покрытие предпочтительно содержит, по меньшей мере, достаточное количество улавливающего кислород реагента, чтобы потреблять 0,54 мкмоля кислорода в течение периода 120 минут или менее при температуре от приблизительно 22 градуса С до приблизительно 42 градуса С. Более предпочтительно, первое сухое покрытие и/или второе сухое покрытие предпочтительно содержит, по меньшей мере, достаточное количество улавливающего кислород реагента, чтобы потреблять более, чем 0,54 мкмоля кислорода в течение периода 120 минут или менее при температуре от приблизительно 22 градуса С до приблизительно 42 градуса С. В любом варианте осуществления, отделение для выращивания может иметь размеры, чтобы получить и быть гидратированным объемом водной жидкости от приблизительно 2 до приблизительно 10 миллилитров. Специалисту в данной области техники будет понятно, какое дополнительное количество улавливающего кислород реагента, необходимого для потребления кислорода в водном образце в таких ситуациях.
В любом варианте осуществления, первое сухое покрытие и/или второе сухое покрытие может включать любое количество других компонентов, таких как красители (например, рН индикатор), поперечно-сшивающие агенты, реагенты (например, селективные реагенты или индикаторные реагенты, такие как хромогенные или флуорогенные ферментные субстраты) или комбинацию любых двух или более из вышеуказанных компонентов. Например, для некоторых применений желательным является включить индикатор роста микроорганизмов (например, индикатор для обнаружения продуцирования сероводорода, рН индикатор, хромогенный ферментный субстрат, окислительно-восстановительный краситель) в первое и/или второе сухое покрытие или в адгезив, к которому приклеено первое и/или второе сухое покрытие. Приемлемые красители включают красители, которые метаболизируются или иным образом взаимодействуют с растущими микроорганизмами, и при этом вызывая окрашивание или флуоресценцию колоний для облегчения визуализации. Такие красители включают трифенилтетразолия хлорид, п-толил тетразолия красный, тетразолий фиолетовый, вератрилтетразолий синий и родственные красители, и 5-бром-4-хлориндолилфосфата динатриевую соль. Другие приемлемые красители включают красители, чувствительные к изменениям рН во время роста микроорганизмов, такие как нейтральный красный.
По меньшей мере, одно сухое покрытие может необязательно включать реагенты, необходимые для проведения определенных микробиологических тестирований. Например, антибиотики могут быть включены для проведения тестирований относительно чувствительности к антибиотикам. Для идентификации микроорганизмов могут быть включены дифференциальные реагенты, которые подвергаются изменению цвета в присутствии определенного типа микроорганизма.
Устройство для культивирования в соответствии с настоящим изобретением может быть получено с использованием различных методов. Как правило, устройство может быть изготовлено вручную или с помощью обычного лабораторного оборудования, как описано, например, в данной заявке и в патентах США №№4,565,783; 5,089,413; и 5,232,838.
Неограничивающим примером приемлемого чувствительного к давлению адгезива, который может быть использован в первом адгезивном слое и/или втором адгезивном слое, является сополимер 2-метилбутилакрилата/акриловой кислоты в мольном соотношении 90/10. Другие предпочтительные чувствительные к давлению адгезивы, которые могут быть использованы, включают изооктилакрилат/акриловую кислоту в мольном соотношении 95/5 или 94/6 и силиконовый каучук. Адгезивы, которые становятся молочными (например, непрозрачными) при воздействии воды, являются менее предпочтительными, но могут быть использованы в сочетании с непрозрачным основанием или в ситуациях, когда визуализация колонии не требуется. Кроме того, известными являются активированные теплом адгезивы, имеющие более низкоплавкое вещество, нанесенное на более высокоплавкое вещество и/или активированные водой адгезивы, такие как клей, и их можно использовать в настоящем изобретении. При включении индикаторного реагента, как описано выше, для того, чтобы способствовать визуализации колоний, обычно предпочтительным является включать индикаторный реагент в адгезив или смесь покрытия питательной среды, а не в порошок.
Первый адгезивный слой или второй адгезивный слой наносят (например, используя ножевое устройство для нанесения покрытий) на верхнюю поверхность основания или покрывающего листа для того, чтобы сформировать адгезивный слой с такой толщиной, которая предпочтительно является меньшей, чем средний диаметр частиц сухого порошка или агломерированного порошка для того, чтобы приклеиться к адгезиву. Как правило, наносят достаточное количество адгезива для того, чтобы приклеить частицы к подложке (например, первому или покрывающему листу, описанному в данной заявке), но не настолько большое, чтобы частицы стали полностью погруженными в адгезив. Как правило, приемлемым является адгезивный слой с толщиной от приблизительно 5 мкм до приблизительно 12 мкм.
2
Предпочтительно, когда гелеобразующий агент включен в первое сухое покрытие и/или второе сухое покрытие, он включен в таком количестве, что предварительно определенное количество воды или водного образца, например, от 1 до 3 мл или более, размещенное в отделении для выращивания будет образовывать гидрогель. Например, от 0,025 г до 0,050 г порошкообразной гуаровой камеди, по существу, равномерно распределенной по площади поверхности 20,3 см, будет обеспечивать достаточно вязкую среду, когда она будет восстановлена с использованием от 1 до 3 мл водного образца. Размер частиц порошка может быть использован для контролирования массы покрытия на единицу площади.
В любом варианте осуществления, первое сухое покрытие или второе сухое покрытие может содержать одно или более питательных веществ и/или культуральную среду для того, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующих микроорганизмов. Когда покрытие состоит в значительной степени из порошков или порошковых агломератов, предпочтительное соотношение гелеобразующего агента и питательного вещества в приклеенной порошковой среде определяется конкретным микроорганизмом, подлежащим выращиванию в устройстве. Однако, для общих целей предпочтительным является соотношение от приблизительно 4 к 1 до приблизительно 5 к 1 (общее количество гелеобразующего агента к общему количеству питательного вещества в расчете на массу). Порошок в приклеенной порошковой среде может быть нанесен на адгезивный слой (например, первый адгезивный слой 12 и/или второй адгезивный слой 22) любыми способами, приемлемыми для нанесения, по существу, равномерного слоя. Примеры приемлемых средств нанесения слоя порошков включают использование устройства шейкерного типа или использование аппликатора для порошка.
Специалисту в данной области техники будут понятны приемлемые питательные вещества или культуральная среда для использования в устройстве в соответствии с настоящим изобретением для выращивания и обнаружения сульфатредуцирующих микроорганизмов. Неограничивающие примеры приемлемых питательных веществ включают источник пептона (например, мясной экстракт, мясной пептон), дрожжевой экстракт, ферментативный гидролизат казеина и углевод (например, молочную кислоту). В любом варианте осуществления, углевод может представлять собой неферментируемое питательное вещество, которое используется определенными сульфатредуцирующими микроорганизмами. Предпочтительно, углевод присутствует в устройстве в количестве, которое является достаточно высоким для того, чтобы способствовать росту (продуцированию биомассы) микроорганизмов.
При использовании устройства для культивирования в соответствии с настоящим изобретением, может быть желательным точный подсчет колоний присутствующих микроорганизмов. Таким образом, в любом варианте осуществления, устройство для культивирования в соответствии с настоящим изобретением может содержать узор в виде сетки на основании или, альтернативно, на покрывающем листе. Узор в виде сетки может содержать квадратный узор в виде сетки, такой как, например, квадратный узор в виде сетки, раскрытый в патенте США №4,565,783. Узор в виде сетки может быть получен на первом или покрывающем листе любым приемлемым способом, таким как, например, способы печати.
В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ изготовления автономного образующего анаэробную среду устройства для культивирования по любому из указанных выше вариантов осуществления. Способ включает стадию, на которой приклеивают растворимый в холодной воде гелеобразующий агент на часть основания. Гелеобразующий агент может быть сухим (например, в виде, по существу, свободных от воды частиц), когда он приклеен к основанию, или гелеобразующий агент может быть приклеен к основанию в виде жидкого покрытия (например, водного жидкого покрытия) и затем высушен до, по существу, свободного от воды состояния. Способ дополнительно включает стадию, на которой прикрепляют (например, посредством чувствительного к давлению адгезива) основание к покрывающему листу. Необязательно, прикрепление основания к покрывающему листу дополнительно включает формирование водонепроницаемого герметичного скрепления.
Основание расположено прилежащим к покрывающему листу таким образом, что, по меньшей мере, часть приклеенного гелеобразующего агента обращена к отделению для выращивания, расположенному между основанием и покрывающим листом. Необязательно, в любом варианте осуществления, первый адгезивный слой может быть нанесен (например, с использованием способов нанесения покрытия, известных в данной области техники) на основание, и растворимый в холодной воде гелеобразующий агент может быть приклеен к первому адгезивному слою.
В альтернативном варианте осуществления, растворимый в холодной воде гелеобразующий агент может быть приклеен к покрывающему листу любым из способов, описанных для приклеивания гелеобразующего агента к основанию. Высушивание приклеенного гелеобразующего агента, если гелеобразующий агент является покрытым жидкостью, может быть осуществлено с использованием ряда способов, известных в данной области техники. Покрытие может быть высушено в печи (например, гравитационной печи, конвекционной печи), например, в соответствии со способом, описанным в патенте США №5,601,998, который включен в данную заявку путем ссылки во всей своей полноте. Предпочтительно, приклеенный гелеобразующий агент высушивают до тех пор, пока он не станет, по существу, свободным от воды. Как используется в данной заявке, фразы «по существу, сухой», «по существу, свободный от воды» или подобные относятся к покрытию, которое имеет содержание воды не более, чем приблизительно содержание воды в обезвоженном покрытии, как только оно было уравновешено с окружающей средой.
Способ дополнительно включает стадию, на которой помещают один или более других сухих компонентов, выбранных из группы, состоящей из первого и/или второго улавливающего кислород реагента, буферного компонента, культуральной среды, восстанавливающего агента, индикаторного реагента и селективного агента. В любом варианте осуществления, любой или все из улавливающего кислород реагента и компонента буферной системы могут быть помещены в отделение для выращивания в виде сухого порошка. Необязательно, любой или все из улавливающего кислород реагента и буферной системы могут быть приклеены к адгезиву (например, первому адгезивному слою или второму адгезивному слою как описано в данной заявке) в отделении для выращивания. Другие необязательные компоненты (например, индикаторные реагенты, селективные агенты, питательные вещества) также могут быть помещены в отделение для выращивания, необязательно, приклеенными к адгезивному слою.
Расположение основания прилежащим к покрывающему листу, таким образом, что приклеенный гелеобразующий агент обращен к отделению для выращивания, расположенному между основанием и покрывающим листом, может быть выполнено множеством способов. Репрезентативный пример расположения основания и покрывающих листов, прилежащих друг к другу так, что часть гелеобразующего агента перекрывает отделение для выращивания, показан на ФИГ. 1-3. Можно увидеть, что перекрывающаяся конфигурация позволяет оператору помещать водную жидкость между основанием и покрывающим листом, тем самым размещая гелеобразующий агент, улавливающий кислород реагент и другие сухие компоненты, присутствующие в отделении для выращивания, в жидкостной связи.
В любом варианте осуществления, устройство для культивирования в соответствии с настоящим изобретением может содержать необязательные съемные перемычки, приклеенные с возможностью последующего снятия к адгезивному слою вблизи отверстия устройства для культивирования. ФИГ. 2А и 2В показывают один вариант осуществления устройства для культивирования 200, содержащего множество съемных перемычек (перемычки 50 и 51, соответственно), которые приклеены к первому адгезивному слою 12 и второму адгезивному слою 22, соответственно, прилежащими к отверстию 34 устройства. Съемные перемычки предотвращают склеивание друг с другом первого и второго адгезивных слоев (и тем самым герметичное скрепление отверстия) во время хранения и обработки до тех пор, пока устройство не будет инокулировано, и перемычки не будут удалены оператором.
Съемные перемычки 50 и 51 могут быть изготовлены из любого приемлемого материала (например, бумаги, полимерной пленки), на который может быть нанесено разделительное покрытие (например, низко-адгезивная основа) для предотвращения агрессивной адгезии между материалом перемычки и адгезивными слоями.
Отделение для выращивания устройства в соответствии с настоящим изобретением может иметь различные формы, такие как, например, отделение для выращивания прямоугольной формы ФИГ. 1А. Другие приемлемые формы включают, но не ограничиваются приведенным, круглую, овальную, многоугольную, звездообразную и неправильную форму отделений для выращивания. ФИГ. 3 показывает один вариант осуществления устройства для культивирования 300, имеющего многоугольное отделение для выращивания с отверстием 34, которое определяет менее, чем приблизительно 10% периметра отделения для выращивания 30.
ФИГ. 4А и 4В показывают различные виды устройства для культивирования 300 ФИГ. 3, при этом устройство 300 дополнительно содержит множество съемных перемычек (перемычки 50 и 51, соответственно).
В любом варианте осуществления, устройство в соответствии с настоящим изобретением может быть изготовлено за счет приклеивания, по меньшей мере, одного из сухих компонентов (например, гелеобразующего агента, одного или более улавливающих кислород реагентов, восстанавливающего агента) к носителю и, затем, приклеивания носителя к основанию или покрывающему листу в отделении для выращивания. ФИГ. 5А и 5В показывают один вариант осуществления устройства для культивирования 300, содержащий указанный носитель.
Устройство 300 содержит корпус 6, имеющий основание 10 и покрывающий лист 20, как описано в данной заявке выше. Приклеенным к основанию 10 является первый адгезивный слой 12, как описано в данной заявке выше. Приклеенным к покрывающему листу 20 является второй адгезивный слой 22, как описано в данной заявке выше. Приклеенным к первому адгезивному слою 12 является необязательный носитель 60. Приклеенным к носителю 60 посредством необязательного третьего адгезивного слоя 62 является первое сухое покрытие 14, как описано в данной заявке. Приклеенным ко второму адгезивному слою 22 является необязательный носитель 70. Приклеенным к носителю 70 посредством необязательного четвертого адгезивного слоя 72 является второе сухое покрытие 24, как описано в данной заявке выше. В любом варианте осуществления, устройство в соответствии с настоящим изобретением может содержать первый носитель 60 (и сухое покрытие на нем), второй носитель 70 (и сухое покрытие на нем) или как первый, так и второй носители и сухие покрытия на них.
Первый и второй носители могут быть изготовлены с использованием любого приемлемого материала, описанного в данной заявке для использования в качестве материала для основания или покрывающего листа. Третий адгезивный слой и четвертый адгезивный слой могут содержать любой приемлемый адгезив, описанный в данной заявке для использования в первом или втором адгезивных слоях.
В настоящее время известно, что устройство 300 ФИГ. 5А и 5В в соответствии с настоящим изобретением может быть легко покрыто и собрано с использованием тонкопленочных подложек для основания, покрывающего листа и носителей, и с использованием рулонных (roll-to-roll) процессов.
В настоящее время известно, что устройство в соответствии с настоящим изобретением альтернативно может быть сконструировано с использованием единой подложки для формирования как покрывающего листа, так и основания. В этих вариантах осуществления, покрытия наносятся на единую, по существу, плоскую подложку, которая впоследствии сгибают для того, чтобы создать водонепроницаемое герметичное скрепление и отделение для выращивания, расположенное между двумя частями единой подложки.
ФИГ. 6-9 показывают один вариант осуществления устройства 400 в соответствии с настоящим изобретением, при этом устройство сконструировано из единой подложки. Устройство 400 содержит корпус 8, который включает водонепроницаемую подложку 11. Водонепроницаемая подложка имеет первую основную поверхность 81 и вторую основную поверхность 87, противоположную первой основной поверхности. Первая основная поверхность 81 содержит первую секцию 82 и вторую секцию 84, расположенную на расстоянии от первой секции. Корпус 8 дополнительно содержит кромку 89 и сгиб 86, который размещает первую секцию 82 в перекрывающемся смежном положении по отношению ко второй секции 84.
Первая секция 82 и вторая секция 84 определяют внутренние стенки отделения для выращивания 30, которое содержит периметр 32 и отверстие 34, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания. Часть периметра 32 определяется водонепроницаемым герметичным скреплением 40, при этом часть включает >50% периметра. В любом варианте осуществления, часть включает >50% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥80% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥90% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥95% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥98% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления, часть включает ≥99% периметра 32 отделения для выращивания 30. В любом варианте осуществления (например, во время использования после того как устройство инокулировано, часть включает 100% периметра 32 отделения для выращивания 30).
Сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент приклеен, по меньшей мере, к одной из секций (например, первой секции или второй секции 84) отделения для выращивания 30. Гелеобразующий агент может быть обеспечен как часть первого покрытия 14, которое необязательно может быть приклеено к первому адгезивному слою 12, который приклеен к первой секции 82. Альтернативно, или дополнительно, гелеобразующий агент может быть обеспечен как часть второго покрытия 24, которое необязательно может быть приклеено ко второму адгезивному слою 22, который приклеен ко второй секции 84. В любом варианте осуществления, первый и второй адгезивные слои и первое и второе покрытия являются такими, описано в данной заявке выше.
В любом варианте осуществления, сухой улавливающий кислород реагент и/или индикаторный реагент (например, сухой индикаторный реагент) для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующей бактерией расположен в отделении для выращивания 30. В любом варианте осуществления, улавливающий кислород реагент и/или индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующей бактерией может быть расположен в отделении для выращивания 30 в виде сыпучего порошка или он может быть частью первого сухого покрытия 14, приклеенного к первой секции 82, и/или частью второго сухого покрытия 24, приклеенного ко второй секции 84.
В любом варианте осуществления, устройство 400 дополнительно может содержать сухой восстанавливающий агент, индикаторный реагент, питательное вещество или культуральную среду, и/или буферный реагент, как обсуждается в данной заявке выше.
В любом варианте осуществления, первое сухое покрытие 14 и/или второе сухое покрытие 24 устройства 400 могут быть приклеены к носителю (не показано), как описано в данной заявке выше.
После того, как устройство собрано, его могут инокулировать образцом. ФИГ. 10 показывает один вариант осуществления инокулированного устройства для культивирования 500. Устройство 500 устанавливается с отверстием 34 выше отделения для выращивания 30. Образец жидкости переносится через отверстие 34, например, с помощью пипетки. Необязательно, после того как образец переносят в отделение для выращивания, отверстие 34 герметично скрепляют, как описано в данной заявке, и устройство 500 инкубируют при температуре, которая способствует росту сульфатредуцирующего микроорганизма.
ФИГ. 11А-11Е иллюстрируют один вариант осуществления способа изготовления устройства в соответствии с настоящим изобретением. В любом варианте осуществления, по существу, плоское водонепроницаемое основание 10 имеет первый слой чувствительного к давлению адгезива 12, нанесенный на основную поверхность. Приемлемые основания и адгезивы описываются в данной заявке выше. Перед нанесением покрытия на первый адгезивный слой 12, листовидную маску 95 наносят (например, ламинируют) на первый адгезивный слой 12 на основании 10. Маска 95 имеет периферийную кромку, центральную открытую область и зазор, простирающийся от открытой области до периметра 32. При размещении на основании 10, отверстие и зазор маски 95 оставляют открытой часть первого адгезивного слоя 12. Хотя показано, что она имеет круглую форму, предполагается, что открытая область может иметь любую из ряда приемлемых форм (например, круглую, квадратную, овальную, продолговатую, прямоугольную, многоугольную или т.п.).
Маска 95 может быть изготовлена из множества материалов, включая, например, листы бумаги или пластиковую пленку. Предпочтительно, маска 95 покрыта низко-адгезивной основой на стороне, которая размещается напротив первого адгезивного слоя 12. Низко-адгезивная основа (не показана) способствует удалению маски с адгезива без нарушения связи между адгезивом и основанием. После того, как маска 95 нанесена на первый адгезивный слой 12, первое сухое покрытие 14 (например, покрытие из порошкообразного материала, такого как гелеобразующий агент, улавливающий кислород агент и/или другие сухие компоненты, как описано в данной заявке выше) наносят на оставленный открытым адгезив. ФИГ. 4с показывает, как первое сухое покрытие 14 приклеивается к частям адгезива, которые не покрыты маской 95.
После нанесения первого сухого покрытия 14 избыточный порошок необязательно может быть удален (например, путем вибрации), и маску 95 удаляют. Удаление маски 95 оставляет открытым оставшийся непокрытый первый адгезивный слой 12 на основании 10, как показано на ФИГ. 11D. Для завершения получения устройства в соответствии с настоящим изобретением покрывающий лист 20, рассчитанный по размерам для покрытия оставленного открытым первого адгезивного слоя 12, ламинируют (например, с помощью ролика, не показано) к адгезиву, как показано на ФИГ. 11Е. Устройство содержит отделение для выращивания 30, в которое образец жидкости (не показан) вводят через отверстие 34 вдоль кромки устройства.
В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения сульфатредуцирующего микроорганизма. Способ использует любой из вариантов осуществления устройства для культивирования, описанных в данной заявке.
В любом варианте осуществления, способ включает стадии, на которых помещают образец и предварительно определенный объем водной жидкости в отделение для выращивания через отверстие, необязательно герметично скрепляют отверстие, инкубируют устройство для культивирования в течение периода времени, достаточного для возможности образования колонии микроорганизмов в отделении для выращивания, и обнаруживают колонию микроорганизмов. Необязательно, образец может содержать или может быть суспендирован в предварительно определенном объеме водной жидкости. В любом варианте осуществления, помещение образца с предварительно определенным объемом водной жидкости в отделение для выращивания включает образование полутвердой культуральной среды микроорганизмов, закрытой (например, изолированной от внешней газообразной среды) в отделении для выращивания устройства для культивирования.
2
2
В любом варианте осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости, использованный для гидратирования и/или инокуляции устройства для культивирования, составляет от приблизительно 0,1 миллилитра до приблизительно 100 миллилитров. В любом варианте осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости, использованный для гидратирования и/или инокуляции устройства для культивирования, составляет от приблизительно 1 миллилитра до приблизительно 20 миллилитров. В любом варианте осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости, использованный для гидратирования и/или инокуляции устройства для культивирования, составляет приблизительно 1 миллилитр. В любом варианте осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости, использованный для гидратирования и/или инокуляции устройства для культивирования, составляет приблизительно 2 миллилитра. В любом варианте осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости, использованный для гидратирования и/или инокуляции устройства для культивирования, составляет приблизительно 3 миллилитра. В любом варианте осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости, использованный для гидратирования и/или инокуляции устройства для культивирования, составляет приблизительно 4 миллилитра. В любом варианте осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости, использованный для гидратирования и/или инокуляции устройства для культивирования, составляет приблизительно 5 миллилитров. В любом варианте осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости, использованный для гидратирования и/или инокуляции устройства для культивирования, составляет приблизительно 10 миллилитров. В любом варианте осуществления, водная жидкость, использованная для гидратирования участка для выращивания устройства для культивирования, распределяется по площади, что в результате приводит к от приблизительно одного миллилитра на 3,9 см участка для выращивания до приблизительно одного миллилитра жидкости на 20,3 см участка для выращивания.
В любом варианте осуществления способа, размещение предварительно определенного объема в отделении для выращивания включает одновременное размещение образца в отделении для выращивания. Например, образец может представлять собой жидкость (например, образец воды или напитка, подлежащий тестированию на микробное заражение) или образец может представлять собой твердый или полутвердый образец, суспендированный в жидком носителе или разбавителе.
Альтернативно, в любом варианте осуществления, размещение предварительно определенного объема в отделении для выращивания не включает одновременное размещение образца в отделении для выращивания. Например, образец может содержать жидкость, твердое вещество или полутвердое вещество, которые размещают в отделении для выращивания до или после того, как предварительно определенный объем (предпочтительно стерильный) жидкого носителя или разбавителя размещают в отделении для выращивания устройства для культивирования.
Преимущественно, устройство для культивирования может быть гидратировано и/или инокулировано в аэробной среде (т.е. на воздухе). Как правило, водная жидкость (которая может включать образец материала, подлежащий тестированию), используемая для того, чтобы гидратировать устройство, прикапывается из пипетки на отделение для выращивания между основанием и покрывающим листом. После того, как предварительно определенный объем водной жидкости помещают в отделение для выращивания, устройство для культивирования необязательно герметично скрепляют, например, удаляя одну или более съемных перемычек, если присутствуют, чтобы оставить открытым адгезивный слой, который может быть использован для того, чтобы герметично скрепить отверстие. Необязательно, плоский или вогнутый распределитель, аналогичный тому, который используется для инокуляции устройств для культивирования PETRIFILM, может быть использован для равномерного распределения водной жидкости по всему отделению для выращивания.
В любом варианте осуществления способа, размещение предварительно определенного объема в отделении для выращивания может включать одновременное размещение образца в отделении для выращивания. В данных вариантах осуществления, образец может содержать водную жидкость и/или образец может быть разбавленным в или суспендированным в водной жидкости (например, буфере или стерильной культуральной среде).
Альтернативно, в любом варианте осуществления, размещение предварительно определенного объема в отделении для выращивания не включает одновременное размещение образца в отделении для выращивания. В данных вариантах осуществления, предварительно определенный объем водной жидкости может быть размещен (например, прикапан из пипетки, как показано на ФИГ. 10) в отделении для выращивания до или после размещения образца в отделении для выращивания. Например, образец может быть захвачен на мембранном фильтре (не показано), который размещают в отделении для выращивания до или после того, как гелеобразующий агент гидратируется водной жидкостью.
В любом варианте осуществления способа, размещение образца в отделении для выращивания включает размещение одной или более добавок в отделении для выращивания. Одна или более добавок могут быть размещены в отделении для выращивания с образцом или отдельно. Одна или более добавок могут выполнять множество функций в способе. Например, в любом варианте осуществления, одна или более добавок могут содержать питательное вещество и/или культуральную среду для того, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующих микроорганизмов в устройстве. Такие питательные вещества и культуральные среды хорошо известны в данной области техники и могут быть выбраны, исходя из определенного микроорганизма, подлежащего культивированию. Питательное вещество и культуральная среда, по существу, не должны мешать улавливающему кислород реагенту. Это может быть легко протестировано, используя кислородный датчик, как описано в примерах 2-3 международной публикации № WO 2015/061213, которая включена в данную заявку путем ссылки во всей своей полноте.
Альтернативно или дополнительно, в любом варианте осуществления, добавка содержит один или более селективных агентов (например, антибиотик, соль) которые способствуют росту одного сульфатредуцирующего микроорганизма по сравнению с, по меньшей мере, одним другим микроорганизмом (например, несульфатредуцирующим микроорганизмом). Альтернативно или дополнительно, в любом варианте осуществления, добавка содержит индикаторный реагент (например, индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующей бактерией, рН индикатор, окислительно-восстановительный индикатор, хромогенный ферментный субстрат, флуорогенный ферментный субстрат) для обнаружения присутствия сульфатредуцирующего микроорганизма. Специалисту в данной области техники будут понятны селективные агенты и индикаторные реагенты, используемые для обнаружения сульфатредуцирующих микроорганизмов. Селективный агент и/или индикатор, по существу, не должны мешать улавливающему кислород реагенту. Это может быть легко протестировано, используя кислородный датчик, как описано выше.
При контакте с водной жидкостью в отделении для выращивания; сухие компоненты (например, улавливающий кислород реагент, буферный реагент, питательное вещество, индикаторный реагент, восстанавливающий агент и/или селективный агент) и водная жидкость образуют смесь, которая содержит первую концентрацию растворенного кислорода.
В любом варианте осуществления, первая концентрация растворенного кислорода в водной смеси в отделении для выращивания может представлять собой концентрацию, которая, по существу, ингибирует рост облигатно-анаэробного микроорганизма, микроаэрофильного микроорганизма и/или микроаэротолерантного микроорганизма. В данных вариантах осуществления, размещение компонентов в водной жидкостной связи инициирует реакцию улавливания кислорода, тем самым, снижая первую концентрацию растворенного кислорода в водной жидкости в отделении для выращивания до второй концентрации, которая является ниже, чем первая концентрация (например, по меньшей мере, приблизительно на 50% ниже, по меньшей мере, приблизительно на 60% ниже, по меньшей мере, приблизительно на 70% ниже, по меньшей мере, приблизительно на 80%, по меньшей мере, приблизительно на 90%, по меньшей мере, приблизительно на 95%, по меньшей мере, приблизительно на 98%, по меньшей мере, приблизительно на 99% ниже, или более, чем на 99% ниже, чем первая концентрация).
В любом варианте осуществления, снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода может включать снижение растворенного кислорода в водной смеси в отделении для выращивания до второй концентрации, которая является достаточно низкой для поддержания роста анаэробных микроорганизмов (например, аэротолерантных бактерий или облигатно-анаэробных бактерий).
В любом варианте осуществления, снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода включает снижение растворенного кислорода до второй концентрации в водной смеси в отделении для выращивания в течение времени меньшего, чем или равного приблизительно 120 минут после образования смеси. В любом варианте осуществления, снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода включает снижение растворенного кислорода до второй концентрации в водной смеси в отделении для выращивания в течение времени меньшего, чем или равного приблизительно 90 минут после образования смеси. В любом варианте осуществления, снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода включает снижение растворенного кислорода до второй концентрации в водной смеси в отделении для выращивания в течение времени меньшего, чем или равного приблизительно 60 минут после образования смеси. В любом варианте осуществления, снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода включает снижение растворенного кислорода до второй концентрации в водной смеси в отделении для выращивания в течение времени меньшего, чем или равного приблизительно 45 минут после образования смеси. В любом варианте осуществления, снижение первой концентрации растворенного кислорода до второй концентрации растворенного кислорода включает снижение растворенного кислорода до второй концентрации в водной смеси в отделении для выращивания в течение времени меньшего, чем или равного приблизительно 30 минут после образования смеси.
Если устройство для культивирования гидратируется до того, как образец материала размещают в устройстве, растворимому в холодной воде гелеобразующему агенту, необязательно, могут позволить гидратироваться и образовывать гель (например, при комнатной температуре) в течение от нескольких минут до приблизительно 30 минут или более, до того, как устройство повторно открывают, чтобы инокулировать материалом для культивирования. В течение периода, когда гелеобразующему агенту позволяют гидратироваться и образовывать гель, улавливающий кислород реагент снижает концентрацию растворенного кислорода в гидратированном гелеобразующем агенте от первой концентрации до второй концентрации, что способствует росту анаэробных, сульфатредуцирующих микроорганизмов, как обсуждается в данной заявке.
До или после того, как отделение для выращивания устройства для культивирования гидратируется, образец материала может контактировать с отделением для выращивания различными способами, которые известны в данной области техники. В любом варианте осуществления, образец материала контактирует с отделением для выращивания путем помещения образца материала в отделение для выращивания. Это может быть сделано, например, путем прикапывания из пипетки, путем контактирования отделения для выращивания с тампоном (например, через отверстие), который использовали для получения образца материала (например, путем тампонирования поверхности), путем контактирования отделения для выращивания с петлей или иголкой инокуляции (например, с использованием метода штриховой пластины) или путем размещения устройства захвата образца (например, тампона, спонжа или мембранного фильтра) непосредственно в отделении для выращивания. После того, как образец помещен и устройство для культивирования необязательно герметично скреплено (не обращая внимания на захват макроскопически видимых пузырьков воздуха в устройстве для культивирования), улавливающий кислород реагент истощает растворенный кислород в отделении для выращивания.
В любом варианте осуществления способа, после того, как образец размещен в отделении для выращивания и устройство для культивирования необязательно герметично скреплено, устройство для культивирования инкубируют в течение периода времени (например, предварительно определенного периода времени). Условия инкубирования (например, температура инкубирования) могут влиять на скорость роста микроорганизмов, как хорошо известно специалисту в данной области техники. Например, инкубирование при более низких температурах (например, ниже приблизительно 25°С) может позволить обнаружение психротрофных микроорганизмов. Инкубирование при более высоких температурах (например, приблизительно 30°С, приблизительно 32°С, приблизительно 35°С, приблизительно 37°С) может способствовать более быстрому росту определенных мезофильных микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления, после инокуляции, устройство для культивирования может быть инкубировано в течение, по меньшей мере, приблизительно 16 часов, по меньшей мере, приблизительно 18 часов, по меньшей мере, приблизительно 24 часов, или, по меньшей мере, приблизительно 48 часов. В некоторых вариантах осуществления, устройство для культивирования может быть инкубировано не более, чем приблизительно 24 часа, не более, чем приблизительно 48 часов, или не более, чем приблизительно 72 часа. В определенных предпочтительных вариантах осуществления, устройство для культивирования инкубируют от приблизительно 24 часов до приблизительно 48 часов. В любом варианте осуществления, устройство для культивирования может быть инкубировано, и выдержано в среде с пониженным содержанием кислорода, в течение приблизительно 72 часов, в течение приблизительно 96 часов, в течение приблизительно 120 часов, в течение приблизительно 7 дней, или в течение приблизительно 8 дней до обнаружения или подсчета колоний микроорганизмов, растущих в отделении для выращивания. В любом варианте осуществления, инкубирование устройства для культивирования в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить образование колонии микроорганизмов, включает инкубирование устройства для культивирования в течение периода времени в аэробной атмосфере (т.е. устройство для культивирования не помещают в контейнер с пониженным содержанием кислорода или перчаточный бокс для инкубирования).
После того, как инокулированное устройство для культивирования инкубировано, способ дополнительно включает стадию, на которой обнаруживают колонию микроорганизмов. Колонии микроорганизмов могут быть обнаружены в устройстве для культивирования с использованием различных методов, которые известны в данной области техники. После приемлемого периода инкубирования, отсутствие микроорганизма может быть обнаружено в устройстве для культивирования по отсутствию наблюдаемых колоний, отсутствию изменения у индикатора роста (например, рН индикатора, хромогенного ферментного субстрата, окислительно-восстановительного индикатора, такого как ТТС, флуорогенного ферментного субстрата) и отсутствию пузырьков газа, связанных с метаболизмом ферментируемого углевода в среде для выращивания.
Кислотная зона, связанная с колонией микроорганизмов, может быть обнаружена визуально и/или путем использования системы формирования изображений. Например, в способе, в котором культуральная среда содержит бромкрезол пурпурный, в качестве рН индикатора, культуральная среда будет иметь пурпурный или серый внешний вид при приблизительно нейтральном значении рН. По мере того, как микроорганизмы растут и ферментируют углевод (например, глюкозу) в культуральной среде, индикатор бромкрезол пурпурный будет становиться желтым вместе с ростом колоний бактерий. Например, в способе, в котором культуральная среда содержит хлорфенол красный, в качестве рН индикатора, культуральная среда будет иметь красный или фиолетовый внешний вид при приблизительно нейтральном значении рН. По мере того, как микроорганизмы растут и ферментируют углевод в культуральной среде, индикатор хлорфенол красный будет становиться желтым вместе с ростом колоний микроорганизмов.
Пузырьки газа, если они присутствуют в отделении для выращивания и связаны с колонией микроорганизмов (например, при прикосновении к колонии или в пределах расстояния приблизительно 1 мм или менее от колонии), могут быть обнаружены визуально и/или путем использования системы формирования изображений. Пузырьки газа могут быть связаны с видимой колонией и/или кислотной зоной, обнаруживаемой по изменению цвета рН индикатора в области, прилежащей к колонии микроорганизмов. Пузырьки газа могут содержать диоксид углерода, который образуется, например, путем анаэробной ферментации углевода.
В любом из приведенных выше вариантов осуществления, способ дополнительно может включать стадию, на которой получают изображения устройства для культивирования. В данных вариантах осуществления, обнаружение присутствия или отсутствия колонии сульфатредуцирующих микроорганизмов включает отображение, печать или анализ изображения устройства для культивирования. Система формирования изображений содержит устройство формирования изображений и может содержать процессор. В некоторых вариантах осуществления, устройство формирования изображений может содержать линейный сканер или сканер области (например, камеру). Устройство формирования изображений может включать монохроматический (например, черно-белый) или полихроматический (например, цветной) сканер. Преимущественно, монохроматические системы формирования изображений могут обеспечивать изображения с более высоким разрешением, которые могут улучшить точность результата и/или сократить время, необходимое для обнаружения присутствия микроорганизмов в устройстве для культивирования.
В некоторых вариантах осуществления, система формирования изображений дополнительно содержит систему освещения. Система освещения может включать, по меньшей мере, один источник видимого света с широким спектром (например, «белый» свет). В некоторых вариантах осуществления, система освещения может включать, по меньшей мере, один источник видимого света с узким спектром (например, светоизлучающий диод, который излучает относительно узкую полосу пропускания видимого света, такого как, например, красный, зеленый или синий свет). В определенных вариантах осуществления, система освещения может включать источник видимого света с узким спектром (например, светоизлучающий диод) с пиком излучения света на предварительно выбранной длине волны (например, приблизительно 525 нм).
Изображение может быть получено из света, отраженного компонентами (например, колониями микроорганизмов, средами для выращивания и индикаторами) в отделении для выращивания устройства для культивирования, или изображение может быть получено из света, пропускаемого через компоненты в отделении для выращивания устройства для культивирования. Приемлемые системы формирования изображений и соответствующие системы освещения описаны, например, в публикации международной заявки на патент № WO 2005/024047 и публикациях заявок на патент США №№ US 2004/0101954 и US 2004/0102903, каждая из которых включена в данную заявку путем ссылки во всей своей полноте. Неограничивающие примеры приемлемых систем формирования изображений включают планшетный считыватель PETRIFILM (PPR), доступный от 3М Company (St. Paul, MN), счетчик колоний PETRISCAN, доступный от Spiral Biotech (Norwood, MA), и планшетные сканеры PROTOCOL и ACOLYTE, доступные от Synbiosis (Cambridge, U.K.).
В некоторых вариантах осуществления, получение изображения включает получение изображения, смещенного по длине волны. Например, система формирования изображений может включать фильтр смещения, который смещает свет, собранный устройством формирования изображений. Фильтрующие элементы известны в данной области техники и включают как фильтры «отсечки» (т.е., фильтры, которые позволяют пропускать свет с длинами волн или выше, или ниже определенной конкретной длины волны), так и «полосовые» фильтры (т.е., фильтры, которые позволяют пропускать свет с длинами волн между определенными конкретными верхним и нижним пределами). Фильтр смещения может быть расположен между источником освещения и устройством для культивирования. Альтернативно или дополнительно, фильтр смещения может быть расположен между устройством для культивирования и устройством формирования изображений.
ИЛЛЮСТРАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Вариант осуществления А представляет собой устройство, содержащее:
корпус, содержащий водонепроницаемое основание, водонепроницаемый покрывающий лист, прикрепленный к основанию, и отделение для выращивания, расположенное между ними, при этом отделение для выращивания имеет периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания;
при этом часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением, причем часть включает >50% периметра;
сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, приклеенный к основанию в отделении для выращивания;
сухую культуральную среду, расположенную в отделении для выращивания, при этом культуральная среда выбрана таким образом, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующей бактерии; и
сухой первый улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания.
Вариант осуществления В представляет собой устройство по варианту осуществления А, при этом устройство содержит индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующей бактерией, при этом индикаторный реагент расположен в отделении для выращивания.
Вариант осуществления С представляет собой устройство, содержащее:
корпус, содержащий водонепроницаемое основание, водонепроницаемый покрывающий лист, прикрепленный к основанию, и отделение для выращивания, расположенное между ними, при этом отделение для выращивания имеет периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания;
при этом часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением, причем часть включает >50% периметра;
сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, приклеенный к основанию в отделении для выращивания;
индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующей бактерией, при этом индикаторный реагент расположен в отделении для выращивания; и
сухой первый улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания.
Вариант осуществления D представляет собой устройство для культивирования по варианту осуществления С, дополнительно содержащее сухую культуральную среду, расположенную в отделении для выращивания, при этом культуральная среда выбрана таким образом, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующей бактерии.
Вариант осуществления Е представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором корпус является, по существу, двухмерным.
Вариант осуществления F представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, дополнительно содержащее эффективное количество сухого восстанавливающего агента, расположенного в отделении для выращивания.
Вариант осуществления G представляет собой устройство по варианту осуществления F, в котором восстанавливающий агент приклеен к основанию.
Вариант осуществления Н представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором первый улавливающий кислород реагент приклеен к основанию.
Вариант осуществления I представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором культуральная среда содержит источник органического углерода.
Вариант осуществления J представляет собой устройство по варианту осуществления I, в котором источник органического углерода является неферментируемым.
Вариант осуществления K представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, дополнительно содержащее индикаторный реагент для обнаружения присутствия жизнеспособного микроорганизма, при этом индикаторный реагент расположен в отделении для выращивания.
Вариант осуществления L представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, дополнительно содержащее сухой второй улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания.
Вариант осуществления М представляет собой устройство по варианту осуществления L, в котором второй улавливающий кислород реагент приклеен к водонепроницаемому основанию.
Вариант осуществления N представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором индикаторный реагент представляет собой первый улавливающий кислород реагент или второй улавливающий кислород реагент.
Вариант осуществления О представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором первый сухой компонент, выбранный из группы, состоящей из первого улавливающего кислород реагента, второго улавливающего кислород реагента, восстанавливающего реагента, питательного вещества, индикаторного реагента и комбинации любых двух или более из указанных выше компонентов, приклеен к основанию.
Вариант осуществления Р представляет собой устройство по варианту осуществления О, в котором основание содержит первый адгезивный слой, расположенный на нем, по меньшей мере, в части отделения для выращивания, при этом первый сухой компонент приклеен к первому адгезивному слою в отделении для выращивания.
Вариант осуществления Q представляет собой устройство по варианту осуществления О, дополнительно содержащее первый носитель, при этом первый сухой компонент приклеен к первому носителю, причем первый носитель приклеен к первому адгезивному слою в отделении для выращивания.
Вариант осуществления R представляет собой устройство по варианту осуществления Q, в котором первый носитель содержит второй адгезивный слой, нанесенный на него, при этом первый сухой компонент приклеен ко второму адгезивному слою.
Вариант осуществления S представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором второй сухой компонент, выбранный из группы, состоящей из первого улавливающего кислород реагента, второго улавливающего кислород реагента, восстанавливающего реагента, питательного вещества, индикаторного реагента и комбинации любых двух или более из указанных выше компонентов, приклеен к покрывающему листу.
Вариант осуществления Т представляет собой устройство по варианту осуществления S:
в котором покрывающий лист содержит третий адгезивный слой, расположенный на нем, по меньшей мере, в части отделения для выращивания;
в котором второй сухой компонент приклеен к третьему адгезивному слою в отделении для выращивания.
Вариант осуществления U представляет собой устройство по варианту осуществления Т, дополнительно содержащее второй носитель, при этом второй сухой компонент приклеен ко второму носителю, причем второй носитель приклеен ко второму адгезивному слою в отделении для выращивания.
Вариант осуществления V представляет собой устройство по варианту осуществления U, в котором второй носитель содержит четвертый адгезивный слой, нанесенный на него, при этом второй сухой компонент приклеен к четвертому адгезивному слою.
Вариант осуществления W представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором основание дополнительно содержит первую перемычку вблизи отверстия.
Вариант осуществления X представляет собой устройство по варианту осуществления W, в котором первая перемычка содержит первый закрывающий адгезив, приклеенный к ней.
Вариант осуществления Y представляет собой устройство по варианту осуществления X, дополнительно содержащее первое защитное покрытие с возможностью последующего снятия, приклеенное к первому закрывающему адгезиву.
Вариант осуществления Z представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором покрывающий лист дополнительно содержит вторую перемычку вблизи отверстия.
Вариант осуществления АА представляет собой устройство по варианту осуществления Z, в котором вторая перемычка содержит второй закрывающий адгезив, приклеенный к ней.
Вариант осуществления АВ представляет собой устройство по варианту осуществления АА, дополнительно содержащее второе защитное покрытие с возможностью последующего снятия, приклеенное ко второму закрывающему адгезиву.
Вариант осуществления АС представляет собой устройство, содержащее:
корпус, содержащий плоскую водонепроницаемую подложку, содержащую:
периферийную кромку;
первую основную поверхность, содержащую расположенные на расстоянии друг от друга первую и вторую секции;
вторую основную поверхность, противоположную первой основной поверхности;
сгиб, который размещает первую секцию в перекрывающемся смежном положении по отношению ко второй секции;
при этом первая секция и вторая секция определяют внутренние стенки отделения для выращивания, которое содержит периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания;
при этом часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением, причем часть включает >50% периметра;
растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, приклеенный к первой секции в отделении для выращивания;
сухую культуральную среду, расположенную в отделении для выращивания, при этом культуральная среда выбрана таким образом, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующей бактерии; или индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующей бактерией, причем индикаторный реагент расположен в отделении для выращивания; и
сухой первый улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания.
Вариант осуществления AD представляет собой устройство по варианту осуществления АС, в котором корпус является, по существу, двухмерным.
Вариант осуществления АЕ представляет собой устройство по варианту осуществления АС или варианту осуществления AD, дополнительно содержащее сухой восстанавливающий агент, расположенный в отделении для выращивания.
Вариант осуществления AF представляет собой устройство по любому из вариантов осуществления АС-АЕ, в котором культуральная среда содержит источник органического углерода.
Вариант осуществления AG представляет собой устройство по варианту осуществления AF, в котором источник органического углерода является неферментируемым.
Вариант осуществления АН представляет собой устройство по любому из вариантов осуществления АС-AG, дополнительно содержащее сухой второй улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания.
Вариант осуществления AI представляет собой устройство по любому из вариантов осуществления АС-АН, при этом устройство содержит культуральную среду и индикаторный реагент, причем культуральная среда и индикаторный реагент оба расположены в отделении для выращивания.
Вариант осуществления AJ представляет собой устройство по любому из вариантов осуществления АС-AI, в котором первый сухой компонент, выбранный из группы, состоящей из первого улавливающего кислород реагента, второго улавливающего кислород реагента, восстанавливающего реагента, культуральной среды, индикаторного реагента и комбинации любых двух или более из указанных выше компонентов, приклеен к первой секции плоской водонепроницаемой подложки.
Вариант осуществления AK представляет собой устройство по варианту осуществления AJ, в котором плоская водонепроницаемая подложка содержит первый адгезивный слой, расположенный, по меньшей мере, на части первой секции, при этом первый сухой компонент приклеен к первому адгезивному слою в отделении для выращивания.
Вариант осуществления AL представляет собой устройство по варианту осуществления AJ, дополнительно содержащее первый носитель, при этом первый сухой компонент приклеен к первому носителю, причем первый носитель приклеен к первому адгезивному слою в отделении для выращивания.
Вариант осуществления AM представляет собой устройство по варианту осуществления AL, в котором первый носитель содержит второй адгезивный слой, нанесенный на него, при этом первый сухой компонент приклеен ко второму адгезивному слою.
Вариант осуществления AN представляет собой устройство по любому из вариантов осуществления АС-AM, в котором второй сухой компонент, выбранный из группы, состоящей из первого улавливающего кислород реагента, второго улавливающего кислород реагента, восстанавливающего реагента, культуральной среды, индикаторного реагента и комбинации любых двух или более из указанных выше компонентов, приклеен ко второй секции плоской водонепроницаемой подложки.
Вариант осуществления АО представляет собой устройство по варианту осуществления AN:
в котором водонепроницаемая подложка содержит третий адгезивный слой, расположенный, по меньшей мере, на части второй секции;
в котором второй сухой компонент приклеен к третьему адгезивному слою в отделении для выращивания.
Вариант осуществления АР представляет собой устройство по варианту осуществления AN, дополнительно содержащее второй носитель, при этом второй сухой компонент приклеен ко второму носителю, причем второй носитель приклеен ко второму адгезивному слою в отделении для выращивания.
Вариант осуществления AQ представляет собой устройство по варианту осуществления АР, в котором второй носитель содержит четвертый адгезивный слой, нанесенный на него, при этом второй сухой компонент приклеен к четвертому адгезивному слою.
Вариант осуществления AR представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, при этом часть включает, по меньшей мере, 80% периметра.
Вариант осуществления AS представляет собой устройство по варианту осуществления AR, при этом часть включает, по меньшей мере, 90% периметра.
Вариант осуществления AT представляет собой устройство по варианту осуществления AS, при этом часть включает, по меньшей мере, 95% периметра.
Вариант осуществления AU представляет собой устройство по варианту осуществления AT, при этом часть включает 100% периметра.
Вариант осуществления AV представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором растворимый в холодной воде гелеобразующий агент выбран из группы, состоящей из гидроксипропилметилцеллюлозы, ксантановой камеди, гуаровой камеди, камеди бобов рожкового дерева, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, альгина и их комбинаций.
Вариант осуществления AW представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором первый улавливающий кислород реагент является водорастворимым.
Вариант осуществления АХ представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором первый улавливающий кислород реагент выбран из группы, состоящей из сульфата железа(III)-аммония, хлорида трехвалентного железа, соли трехвалентного железа, сульфитной соли и бисульфитной соли.
Вариант осуществления AY представляет собой устройство по варианту осуществления L или варианту осуществления АН, в котором второй улавливающий кислород реагент является водорастворимым.
Вариант осуществления AZ представляет собой устройство по варианту осуществления AY, в котором второй улавливающий кислород реагент выбран из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты и ее солей, и фермента, способного катализировать реакцию, которая потребляет молекулярный кислород.
Вариант осуществления ВА представляет собой устройство по варианту осуществления F или варианту осуществления АЕ, в котором восстанавливающий агент выбран из группы, состоящей из дитиотреитола, дитиоэритрита, соли тиогликолевой кислоты и комбинации любых двух или более из указанных выше агентов.
Вариант осуществления ВВ представляет собой устройство по любому из предыдущих вариантов осуществления, в котором водонепроницаемое герметичное скрепление содержит адгезив.
Вариант осуществления ВС представляет собой устройство по варианту осуществления ВВ, в котором адгезив содержит чувствительный к давлению адгезив.
Вариант осуществления BD представляет собой способ, включающий стадии, на которых:
помещают образец в отделение для выращивания устройства, при этом устройство содержит:
корпус, содержащий отделение для выращивания, расположенное между водонепроницаемым основанием и водонепроницаемым покрывающим листом, прикрепленным к основанию, причем отделение для выращивания имеет периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания;
при этом часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением, причем часть включает >50% периметра;
сухой растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, приклеенный к основанию в отделении для выращивания; и
сухой первый улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания;
инкубируют устройство при температуре, которая способствует росту сульфатредуцирующего микроорганизма; и
обнаруживают индикацию колонии сульфатредуцирующего микроорганизма в отделении для выращивания.
Вариант осуществления BE представляет собой способ, включающий стадии, на которых:
помещают образец в отделение для выращивания устройства, при этом устройство содержит:
корпус, содержащий плоскую водонепроницаемую подложку, содержащую: периферийную кромку;
первую основную поверхность, содержащую расположенные на расстоянии друг от друга первую и вторую секции;
вторую основную поверхность, противоположную первой основной поверхности;
сгиб, который размещает первую секцию в перекрывающемся смежном положении по отношению ко второй секции;
при этом первая секция и вторая секция определяют внутренние стенки отделения для выращивания, которое содержит периметр и отверстие, которое обеспечивает доступ жидкости в отделение для выращивания;
при этом часть периметра определяется водонепроницаемым герметичным скреплением, причем часть включает >50% периметра;
растворимый в холодной воде гелеобразующий агент, приклеенный к первой секции в отделении для выращивания; и
сухой первый улавливающий кислород реагент, расположенный в отделении для выращивания, и
инкубируют устройство при температуре, которая способствует росту сульфатредуцирующего микроорганизма; и
обнаруживают индикацию колонии сульфатредуцирующего микроорганизма в отделении для выращивания.
Вариант осуществления BF представляет собой способ по варианту осуществления BD или варианту осуществления BE, в котором перед тем, как помещать образец в отделение для выращивания, отделение для выращивания содержит сухую культуральную среду, при этом культуральная среда выбрана таким образом, чтобы способствовать росту сульфатредуцирующей бактерии.
Вариант осуществления BG представляет собой способ по любому из вариантов осуществления ВС-BF, в котором перед тем, как помещать образец в отделение для выращивания, отделение для выращивания содержит индикаторный реагент для обнаружения продуцирования сероводорода сульфатредуцирующей бактерией.
Вариант осуществления ВН представляет собой способ по любому из вариантов осуществления ВС-BG, в котором помещение образца в отделение для выращивания дополнительно включает помещение водной жидкости в отделение для выращивания.
Вариант осуществления BI представляет собой способ по варианту осуществления ВН, в котором образец расположен в водной жидкости.
Вариант осуществления BJ представляет собой способ по варианту осуществления ВН или варианту осуществления BI, в котором помещение водной жидкости в отделение для выращивания включает помещение предварительно определенного объема водной жидкости.
Вариант осуществления BK представляет собой способ по варианту осуществления BJ, в котором помещение предварительно определенного объема включает помещение от приблизительно 0,1 мл до приблизительно 100 мл.
Вариант осуществления BL представляет собой способ по любому из вариантов осуществления ВС-BK, в котором способ дополнительно включает стадию, на которой герметично скрепляют отверстие.
Вариант осуществления ВМ представляет собой способ по любому из вариантов осуществления ВС-BL, в котором инкубирование устройства включает инкубирование устройства в течение периода 7 дней или менее.
Вариант осуществления BN представляет собой способ по варианту осуществления ВМ, в котором инкубирование устройства включает инкубирование устройства в течение периода 96 часов или менее.
Вариант осуществления ВО представляет собой способ по варианту осуществления BN, в котором инкубирование устройства включает инкубирование устройства в течение периода 72 часа или менее.
Вариант осуществления BP представляет собой способ по варианту осуществления ВО, в котором инкубирование устройства включает инкубирование устройства в течение периода 48 часов или менее.
Вариант осуществления BQ представляет собой способ по варианту осуществления BP, в котором инкубирование устройства включает инкубирование устройства в течение периода 24 часа или менее.
Объекты и преимущества настоящего изобретения далее иллюстрируются следующими примерами, но определенные вещества и их количества, приведенные в этих примерах, а также другие условия и детали, не должны истолковываться как чрезмерно ограничивающие настоящее изобретение.
ПРИМЕРЫ
Пример 1; Конструкция устройства (с нанесенным узором, односторонняя)
75 мкм (3,0 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) покрывали изооктилакрилатным/акриламидным чувствительным к давлению адгезивом (PSA), описанным в примере 1 патента США №5,409,838. Покрытое силиконом бумажное защитное покрытие (D №63 BL KFT Н/О 548440/000; Loprex GmbH, Stuttgart, Germany) с прямоугольником 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма), удаленным с середины, использовали для маскировки границы адгезива. Оставленный открытым адгезив покрывали порошком с различными смесями растворимых в холодной воде гелеобразующих агентов и улавливателей кислорода/восстанавливающих агентов (Таблица 1). Порошок наносили равномерно, и избыточный порошок удаляли с адгезивного слоя путем ручного встряхивания пленки с последующим удалением защитного покрытия. Полоска покрытого силиконом бумажного защитного покрытия была приклеена к адгезиву выше одной из 7,62 см (3 дюйма) сторон покрытой порошком части пленки. Кусок 125 мкм (5 мил) ПЭТ пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) затем ламинировали к остальному оставленному открытым адгезиву, образуя карман с защитным покрытием, предотвращая герметичное скрепление на одном конце.
Пример 2: Конструкция устройства (с нанесенным узором, двухсторонняя)
75 мкм (3,0 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) покрывали изооктилакрилатным/акриламидным чувствительным к давлению адгезивом (PSA), описанным в примере 1 патента США №5,409,838. Покрытое силиконом бумажное защитное покрытие с прямоугольником 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма), удаленным с середины, использовали для маскировки границы адгезива. Оставленный открытым адгезив покрывали порошком с различными смесями растворимых в холодной воде гелеобразующих агентов и улавливателей кислорода/восстанавливающих агентов (Таблица 1). Порошок наносили равномерно, и избыточный порошок удаляли с адгезивного слоя путем ручного встряхивания пленки с последующим удалением защитного покрытия. Полоска покрытого силиконом бумажного защитного покрытия была приклеена к адгезиву выше одной из 7,62 см (3 дюйма) сторон покрытой порошком части пленки. Две покрытые порошком пленки с приклеенными защитными покрытиями изготавливали таким образом и ламинировали вместе с покрытыми порошком частями, обращенными внутрь и перекрывающимися, и приклеенными защитными покрытиями, также перекрывающимися (смотрите фигуру 2).
Пример 3: Конструкция устройства (покрытая порошком подложка-носитель, односторонняя)
75 мкм (3,0 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) покрывали изооктилакрилатным/акриламидным чувствительным к давлению адгезивом (PSA), описанным в примере 1 патента США №5,409,838. Адгезив покрывали порошком с различными смесями растворимых в холодной воде гелеобразующих агентов и улавливателей кислорода/восстанавливающих агентов (Таблица 1). Порошок наносили равномерно, и избыточный порошок удаляли с адгезивного слоя путем ручного встряхивания пленки. Покрытую порошком пленку разрезали на прямоугольники 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма) и помещали в центр куска 10,16 см на 12,7 см (4 дюйма на 5 дюймов) покрытого адгезивом ПЭТ. Полоску покрытого силиконом бумажного защитного покрытия приклеивали к покрытой адгезивом пленке поверх одной из сторон 7,62 см (3 дюйма) покрытой порошком пленки-носителя. Кусок 125 мкм (5 мил) ПЭТ пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) затем ламинировали к остальному оставленному открытым адгезиву, образуя карман с защитным покрытием, предотвращая герметичное скрепление на одном конце.
Пример 4: Конструкция устройства (покрытая порошком подложка-носитель, двухсторонняя)
75 мкм (3,0 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) покрывали изооктилакрилатным/акриламидным чувствительным к давлению адгезивом (PSA), описанным в примере 1 патента США №5,409,838. Адгезив покрывали порошком с различными смесями растворимых в холодной воде гелеобразующих агентов и улавливателей кислорода/восстанавливающих агентов (Таблица 1). Порошок наносили равномерно, и избыточный порошок удаляли с адгезивного слоя путем ручного встряхивания пленки. Покрытую порошком пленку разрезали на прямоугольники 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма) и помещали в центр куска 10,16 см на 12,7 см (4 дюйма на 5 дюймов) покрытого адгезивом ПЭТ. Полоску покрытого силиконом бумажного защитного покрытия приклеивали к покрытой адгезивом пленке поверх одной из сторон 7,62 см (3 дюйма) покрытой порошком пленки-носителя. Две конструкции изготавливали таким образом и ламинировали вместе с покрытыми порошком пленками-носителями, обращенными внутрь и перекрывающимися, и приклеенными защитными покрытиями, также перекрывающимися (смотрите фигуру 5).
Пример 5: Конструкция устройства (покрытый одним порошком и одной питательной средой носитель, двухсторонняя)
Одну часть конструкции изготавливали путем покрытия 75 мкм (3,0 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) изооктилакрилатным/акриламидным чувствительным к давлению адгезивом (PSA), описанным в примере 1 патента США №5,409,838. Адгезив покрывали порошком с различными смесями растворимых в холодной воде гелеобразующих агентов и улавливателей кислорода/восстанавливающих агентов (Таблица 1). Порошок наносили равномерно, и избыточный порошок удаляли с адгезивного слоя путем ручного встряхивания пленки. Покрытую порошком пленку разрезали на прямоугольники 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма) и помещали в центр куска 10,16 см на 12,7 см (4 дюйма на 5 дюймов) покрытого адгезивом ПЭТ. Полоску покрытого силиконом бумажного защитного покрытия приклеивали к покрытой адгезивом пленке поверх одной из сторон 7,62 см (3 дюйма) покрытой порошком пленки-носителя.
4
2
4
Вторую часть конструкции изготавливали путем покрытия 75 мкм (3,0 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) средним составом (BD бактотриптон 10 г/л (Becton Dickinson Corp, New Franklin, NJ), Amresco Soytone 10 г/л (Amresco, Solon, OH), BD бакто-дрожжи 2 г/л (Becton Dickinson Corp, New Franklin, NJ), MgSO-7HO 4 г/л (EMD Millipore, Billerica, MA), 60% сироп лактата натрия 8 мл/л (Sigma Aldrich Co., St. Louis, МО), ацетат натрия 5 г/л (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO), NaCl 10 г/л (EMD Millipore, Billerica, MA), NHCl 0,2 г/л (JT Baker, Center Valley, PA), M150 ryap 8 г/л, значение рН до 7,3 с NaOH, смешивали при высоком сдвиге) при толщине 300 мкм (12,0 мил) с последующими 10 минутами при 180°С в печи с растворителем. Кусок 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма) покрытого питательной средой ПЭТ разрезали и помещали в центр куска 10,16 см на 12,7 см (4 дюйма на 5 дюймов) покрытого адгезивом ПЭТ. Полоску покрытого силиконом бумажного защитного покрытия приклеивали к покрытой адгезивом пленке поверх одной из сторон 7,62 см (3 дюйма) покрытой питательной средой пленки-носителя.
Первую часть и вторую часть конструкции ламинировали порошковым покрытием в покрытии питательной среды с приклеенными защитными покрытиями, также перекрывающимися (смотрите фигуру 5). Это в результате привело к созданию конструкции кармана с внутренним отделением для выращивания микроорганизмов с противоположными сторонами, покрытыми порошком и питательной средой, который остается открытым с одной стороны с помощью защитных покрытий.
Пример 6: Выращивание и поддержание исходных культур сульфатредуцирующих бактерий
4
2
4
2
4
Исходные культуры SRB Desulfovibrio desulfuricans (АТСС №29577; American Type Culture Collection, Manassas, VA) и Desulfovibrio vulgaris (ATCC №29579; American Type Culture Collection, Manassas, VA) выращивали и поддерживали в модифицированной лактатом натрия среде (Дрожжевой экстракт 1 г (Becton Dickinson Corp, New Franklin, NJ), MgSO-7HO 1 г (EMD Millipore, Billerica, MA), NHCl 0,4 г (JT Baker, Center Valley, PA), KHPO 0,01 г (MP Biochemicals LLC, Solon, OH), NaCl 5 г (EMD Millipore, Billerica, MA), аскорбат натрия 0,1 г (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO), лактат натрия (60%) 4 мл (Sigma Aldrich Co., St. Louis, МО), значение рН до 7,3 с NaOH (Sigma Aldrich Co., St. Louis, МО), разлитой в Balch пробирки непосредственно после автоклавирования в атмосфере 97% азота / 3% водорода, используя бутилкаучуковые пробки и алюминиевые обжимные колпачки. Культуры пересевали еженедельно путем обратного разбавления 1/100 в пробирке с модифицированной лактатом натрия средой, используя насыщенные газом 1 мл шприцы. Культуры инкубировали в течение 48 часов при 30°С и затем хранили при 4°С в течение дополнительных 5 дней. После 6-го пересева, культуры выбрасывали и инокулировали свежие из замороженных исходных культур.
Пример 7: Инокуляция устройств
Устройства примеров 1-5 инокулировали следующим образом. Образцы (или 5, или 10 мл) помещали в устройства либо путем непосредственного вливания их внутрь, либо с использованием 10 мл стерильной пипетки. Защитные покрытия удаляли и устройства перемещали между двумя параллельными пластинами из плексигласа, чтобы протолкнуть образец в верхнюю часть зоны выращивания и исключить воздух. Теперь оставленный открытым PSA в горловине устройства спрессовывали вместе, с образованием герметичного скрепления, и устройства укладывали горизонтально для инкубирования. Инкубирование проводили при 30°С в течение до 10 дней, давая время для роста бактерий. Колонии визуализировались в виде небольших черных пятен, формирующихся в результате образования нерастворимого осадка сульфида железа из комбинации бактериального продуцирования сероводорода и железа, присутствующего в среде.
Пример 8: Выращивание сульфатредуцирующих бактерий с использованием аскорбата в двухсторонней порошковой конструкции
-6
Устройства примера 4 конструировали с использованием смесей порошковых покрытий 1-9 из Таблицы 1. Исходные культуры Desulfovibrio desulfuricans (АТСС №29577) и Desulfovibrio vulgaris (АТСС №29579) из примера 6 серийно разбавляли в аэробной среде, описанной в Таблице 2. Количество 5 мл 10 разбавления инокулировали, и устройства инкубировали, как описано подробно в примере 7. Через 96 часов устройства исследовали на рост SRB, полученные результаты представлены в Таблице 3.
Пример 9: Выращивание сульфатредуцирующих бактерий с использованием двухвалентного железа в двухсторонней порошковой конструкции
-5
Устройства примера 4 конструировали с использованием смесей порошковых покрытий 1 и 10-12 из Таблицы 1. Исходные культуры Desulfovibrio vulgaris (АТСС №29579) из примера 6 серийно разбавляли в аэробной среде, описанной в Таблице 4. Количество 5 мл 10 разбавления инокулировали, и устройства инкубировали, как описано подробно в примере 7. Через 72 часа устройства исследовали на рост SRB, полученные результаты представлены в Таблице 3.
Пример 10: Конструкция устройства с альтернативной формой полотна-носителя.
Устройства в примере 3 конструировали с альтернативной формой полотна-носителя, показанной на фигуре 3.
Пример 11: Конструкция устройства с альтернативной формой полотна-носителя.
Устройства в примере 4 конструировали с альтернативной формой полотна-носителя, показанной на фигуре 3.
Пример 12: Конструкция устройства с альтернативной формой полотна-носителя.
Устройства в примере 5 конструировали с альтернативной формой полотна-носителя, показанной на фигуре 3.
Пример 13: Выращивание сульфатредуцирующих бактерий с использованием двухвалентного железа в двухсторонней конструкции с порошком / питательной средой.
-5
-6
-7
Устройства примера 5 конструировали с использованием смеси порошковых покрытий 11 из Таблицы 1. Исходные культуры Desulfovibrio vulgaris (АТСС №29579) из примера 6 серийно разбавляли в фосфатном забуференном растворе (Sigma). Количество 5 мл 10, 10 и 10 разбавлений инокулировали, и устройства инкубировали, как описано подробно в примере 7. Через 120 часов устройства исследовали на рост SRB, полученные результаты представлены в Таблице 3.
Пример 14: Выращивание сульфатредуцирующих бактерий с использованием гелей различной прочности
-7
Устройства примера 3 конструировали с использованием смеси порошковых покрытий 2 из Таблицы 1. Исходные культуры Desulfovibrio desulfuricans (АТСС №29577) и Desulfovibrio vulgaris (АТСС №29579) из примера 6 серийно разбавляли в аэробной среде, описанной в Таблице 2. Количество 2, 3, 4 или 5 мл 10 разбавления инокулировали, и устройства инкубировали, как описано подробно в примере 7. Через 72 часа устройства исследовали на рост SRB, полученные результаты представлены в Таблице 5.
Сравнительный пример 1: Конструкция тонкопленочного устройства для культивирования с общим подсчетом
75 мкм (3,0 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) покрывали изооктилакрилатным/акриламидным чувствительным к давлению адгезивом (PSA), описанным в примере 1 патента США №5,409,838. Адгезив покрывали порошком со смесью 2 из Таблицы 1. Порошок наносили равномерно, и избыточный порошок удаляли с адгезивного слоя путем ручного встряхивания пленки. Покрытую порошком пленку разрезали на прямоугольники 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма). Два прямоугольника соединяли вдоль одной стороны 7,62 см (3 дюйма), используя двухсторонние ленточные порошковые стороны, обращенные внутрь.
Сравнительный пример 2: Конструкция тонкопленочного устройства для культивирования со спейсером
75 мкм (3,0 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (Melanex 454, Tekra, New Berlin, WI) покрывали изооктилакрилатным/акриламидным чувствительным к давлению адгезивом (PSA), описанным в примере 1 патента США №5,409,838. Адгезив покрывали порошком со смесью 2 из Таблицы 1. Порошок наносили равномерно, и избыточный порошок удаляли с адгезивного слоя путем ручного встряхивания пленки. Покрытую порошком пленку разрезали на прямоугольники 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма).
100 мкм (4 мил) полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки (нижняя пленка LAB планшета) покрывали изооктилакрилатным/акриламидным чувствительным к давлению адгезивом (PSA), описанным в примере 1 патента США №5,409,838. Покрытое силиконом бумажное защитное покрытие с удаленным кругом диаметром 6 сантиметров использовали, чтобы маскировать адгезив. Оставленный открытым адгезив покрывали порошком со смесью 2 из Таблицы 1. Порошок наносили равномерно, и избыточный порошок удаляли с адгезивного слоя путем ручного встряхивания пленки с последующим удалением защитного покрытия. Пенный спейсер (полистирольная пена; 76 мм ширины на 102 мм длины на 0,57 мм толщины) с круглым отверстием 61 мм в диаметре адгезивно ламинировали к покрытой адгезивом стороне первого слоя. Покрытую порошком пленку с приклеенным спейсером разрезали на прямоугольники 7,62 см на 10,16 см (3 дюйма на 4 дюйма).
Две описанные выше пленки соединяли вдоль одной стороны 7,62 см (3 дюйма), используя двухсторонние ленточные порошковые стороны, обращенные внутрь.
Сравнительный пример 3: Выращивание SRB в тонкопленочных устройствах для культивирования
-5
-6
-7
2
2
Устройства сравнительного примера 1 конструировали, и исходные культуры Desulfovibrio desulfuricans (АТСС №29577) из примера 6 серийно разбавляли в аэробной среде, описанной в Таблице 2, к которой добавляли аскорбатоксидазу (Calzyme Laboratories, San Luis Obispo, CA) до конечной концентрации 4 Ед./мл. 3 мл 10, 10 и 10 разбавлений инокулировали путем поднятия верхней пленки, распределения образца в середине нижней пленки, и осторожного помещения верхней пленки назад. Планшеты инкубировали при 30°С или в атмосфере окружающей среды, или в анаэробной камере, продутой газом из 97% N и 3% Н. Через 72 часа устройства исследовали на рост SRB, полученные результаты представлены в Таблице 6.
Сравнительный пример 4: Выращивание SRB в тонкопленочных устройствах для культивирования
-5
-6
-7
2
2
Устройства сравнительного примера 2 конструировали, и исходные культуры Desulfovibrio desulfuricans (АТСС №29577) из примера 6 серийно разбавляли в аэробной среде, описанной в Таблице 2, к которой добавляли аскорбатоксидазу (Calzyme Laboratories, San Luis Obispo, CA) до конечной концентрации 4 Ед./мл. Количество 3 мл 10, 10 и 10 разбавлений инокулировали путем поднятия верхней пленки, распределения образца в середине нижней пленки, и осторожного помещения верхней пленки назад. Планшеты инкубировали при 30°С или в атмосфере окружающей среды, или в анаэробной камере, продутой газом из 97% N и 3% Н. Через 72 часа устройства исследовали на рост SRB, полученные результаты представлены в Таблице 6.
Пример 15: Конструкция и использование карманоподобных устройств для культивирования
4
2
4
4
2
2
4
2
4
4
4
2
-6
-7
Устройства примера 3 конструировали за исключением того, что наружная пленка представляла собой 48ga ПЭT/98ga WOPP/,00035'' Фольга/2 мил Barex (Technipaq, Crystal Lake, IL) вместо 75 мкм (3 мил) ПЭТ и следующую смесь порошкового покрытия; M150 гуар 5 г (DuPont Danisco, Copenhagen, Denmark), Fortefiber HB Ultra 89,3 г (Dow Chemical Company, Midland, MI), FeSO-7HO 3 г (JT Baker, Center Valley, PA), аскорбат натрия 0,60 r (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO), тиогликолят натрия: 1,5 г (Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO), CaSO: 0,60 г (JT Baker, Center Valley, PA). FeSO-7HO и аскорбат натрия измельчали, как в Таблице 1. Исходные культуры Desulfovibrio desulfuricans (АТСС №29577) и Desulfovibrio vulgaris (АТСС №29579) из примера 6 серийно разбавляли в аэробной среде; KHPO 0,56 г/л (MP Biochemicals LLC, Solon, ОН), KHPO 0,11 г/л (MP Biochemicals LLC, Solon, OH), NHC1 1,0 г/л (JT Baker, Center Valley, PA), MgSO-7HO 3,0 г/л (EMD Millipore, Billerica, MA), 60% лактата Na 4,0 мл/л (Sigma Aldrich Co., St. Louis, МО), бакто-дрожжевой екстракт 1,0 г/л (Becton Dickinson Corp, New Franklin, NJ), бактотриптон 1 г/л (Becton Dickinson Corp, New Franklin, NJ), резазурин: 1 мг/л (MP Biochemicals LLC, Solon, ОН), АТСС смесь витаминов 10 мл/л (American Type Culture Collection, Manassas, VA), АТСС смесь микроэлементов и минеральных веществ 10 мл/л. Значение рН регулировали до 7,3 гидроксидом натрия и стерилизовали посредством фильтрации. Количество 5 мл 10 и 10 разбавлений инокулировали, и устройства инкубировали, как описано подробно в примере 7. Через 96 часов устройства исследовали на рост SRB. Оба штамма росли хорошо, при этом отдельные колонии были легко подсчитаны на данное время.
6
7
6
4
2
Таблица 1. Составы порошковых покрытий. Все значения представлены в граммах. CHNaO (Sigma Aldrich Co., St. Louis, МО) и FeSO-7HO (JT Baker, Center Valley, PA) получали в кристаллической форме и измельчали до среднего размера частиц <100 мкм перед смешиванием и нанесением порошкового покрытия. ГПМЦ (гидроксипропилметилцеллюлоза; Fortefiber HB Ultra) получали от Dow Chemical Company (Midland, MI).
Таблица 2. Состав среды SRB. Значение рН регулировали до 7,3 гидроксидом натрия и стерилизовали посредством фильтрации.
+++ = Буйный рост по всему планшету, одиночные колонии легко подсчитываются.
++ = Рост присутствует с некоторым ингибированием вокруг кромок планшета, одиночные колонии подсчитываются.
+ = Рост присутствует с выраженным ингибированием вокруг кромок планшета, колонии трудно различаются.
- = Никакого черного осадка не наблюдается.
TNTC = Слишком много для подсчета.
ND = Не определялось.
Таблица 4. Состав SRB среды. Значение рН регулировали до 7,3 гидроксидом натрия и стерилизовали посредством фильтрации.
+++ = Буйный рост по всему планшету, одиночные колонии легко подсчитываются.
++ = Рост присутствует с некоторым ингибированием вокруг кромок планшета, одиночные колонии подсчитываются.
+ = Рост присутствует с выраженным ингибированием вокруг кромок планшета, колонии трудно различаются.
- = Никакого черного осадка не наблюдается
+++ = Буйный рост по всему планшету, одиночные колонии легко подсчитываются.
++ = Рост присутствует с некоторым ингибированием вокруг кромок планшета, одиночные колонии подсчитываются.
+ = Рост присутствует с выраженным ингибированием вокруг кромок планшета, колонии трудно различаются.
- = Никакого черного осадка не наблюдается.
Полное раскрытие всех патентов, заявок на патенты и публикаций, а также доступного в электронном виде материала, цитируемых в данной заявке, включено путем ссылки. В случае, если какое-либо противоречие существует между раскрытием представленной заявки и раскрытием(ями) какого-либо документа, включенного в данную заявку путем ссылки, раскрытие представленной заявки имеет преимущественную силу. Приведенное выше подробное описание и примеры представлены только для ясности понимания. Никаких ненужных ограничений не следует понимать из этого. Настоящее изобретение не ограничено точными деталями, показанными и описанными, поскольку варианты, очевидные для специалиста в данной области техники, будут включены в настоящее изобретение, определенное формулой изобретения.
Все заголовки предназначены для удобства читателя и не должны использоваться для ограничения значения текста, следующего за заголовком, если только это не указано.
Различные модификации могут быть сделаны без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Эти и другие варианты осуществления находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.