СПОСОБЫ СКРИНИНГА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОДИНОЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ВАРИАЦИЙ

1. Способ выявления нуклеотидной вариации внутри представляющей интерес нуклеиновой кислоты, включающий:
(a) стадию, включающую генерирование набора продуктов удлинения из первой нуклеиновой кислоты и обеспечение присутствия модифицированных нуклеотидов в продуктах удлинения, где модифицированные нуклеотиды содержат один тип основания;
(b) стадию, включающую гибридизацию продуктов удлинения со второй нуклеиновой кислотой;
(c) стадию, включающую приведение гибридизирующейся нуклеиновой кислоты в контакт с одним или несколькими агентами, которые совместно удаляют модифицированные нуклеотиды;
(d) стадию, включающую приведение гибридизирующейся нуклеиновой кислоты в контакт с первым ферментом, который удлиняет продукты удлинения в присутствии трех типов устойчивых к нуклеазе нуклеотидов, но не в присутствии нуклеотидов, которые содержат тот же тип основания, что и модифицированные нуклеотиды, где каждый из трех типов устойчивых к нуклеазе нуклеотидов содержит другой тип основания;
(e) стадию, включающую приведение гибридизирующейся нуклеиновой кислоты в контакт со вторым ферментом, который удаляет нуклеотиды с 3'-конца продуктов удлинения, где второй фермент не удаляет устойчивые к нуклеазе нуклеотиды;
(f) стадию, включающую приведение гибридизирующейся нуклеиновой кислоты в контакт с третьим ферментом, который удлиняет продукты удлинения в присутствии нуклеотидов;
(g) стадию, включающую различение тех продуктов удлинения, которые содержат устойчивые к нуклеазе нуклеотиды, и тех продуктов удлинения, которые не содержат устойчивые к нуклеазе нуклеотиды, где первая нуклеиновая кислота является эталонной нуклеиновой кислотой, а вторая нуклеиновая кислота является представляющей интерес нуклеиновой кислотой, или где первая нуклеиновая кислота является представляющей интерес нуклеиновой кислотой, а вторая нуклеиновая кислота является эталонной нуклеиновой кислотой, посредством чего выявляют нуклеотидную вариацию в представляющей интерес нуклеиновой кислоте.
2. Способ по п.1, где эталонная нуклеиновая кислота содержит последовательность дикого типа.
3. Способ по п.2, где представляющая интерес нуклеиновая кислота содержит последовательность, которая соответствует последовательности дикого типа эталонной нуклеиновой кислоты.
4. Способ по любому из пп.1-3, где на стадии (g) по существу нет продуктов удлинения, не содержащих устойчивый к нуклеазе нуклеотид, где различение тех продуктов удлинения, которые содержат устойчивый к нуклеазе нуклеотид, и тех продуктов удлинения, которые не содержат устойчивый к нуклеазе нуклеотид, включает выявление присутствия продуктов удлинения.
5. Способ по п.1, где продукты удлинения присутствуют на стадии (g), только если устойчивый к нуклеазе нуклеотид был включен в продукт удлинения на стадии (d).
6. Способ по п.1, где устойчивый к нуклеазе нуклеотид включен в продукт удлинения на стадии (d), только если нуклеотидная вариация присутствовала в представляющей интерес нуклеиновой кислоте.
7. Способ по п.1, где устойчивый к нуклеазе нуклеотид включен в продукт удлинения на стадии (d), по существу только если нуклеотидная вариация присутствовала в представляющей интерес нуклеиновой кислоте.
8. Способ по п.1, где нуклеотидная вариация присутствовала в представляющей интерес нуклеиновой кислоте в месте, соответствующем положению модифицированного нуклеотида в продуктах удлинения.
9. Способ по п.1, где нуклеотиды с 5'-стороны устойчивого к нуклеазе нуклеотида в продуктах удлинения защищены от удаления вторым ферментом.
10. Способ по п.1, где продукты удлинения, в которых не присутствует устойчивый к нуклеазе нуклеотид, перевариваются вторым ферментом.
11. Способ по п.1, где первая нуклеиновая кислота содержит последовательность праймера, где по меньшей мере некоторые из продуктов удлинения, в которых присутствует устойчивый к нуклеазе нуклеотид, удлиняются на стадии (f) по меньшей мере до последовательности праймера в первой нуклеиновой кислоте.
1
12. Способ по п.1, где модифицированный нуклеотид представляет собой 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-оксогуанин), 8-оксоаденин, фапи-гуанин, мети-фапи-гуанин, фапи-аденин, афлатоксин B-фапи-гуанин, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиурацил, аддукты N-7 гуанина с открытым кольцом (7-метилгуанин), рибозу, урацил или их комбинацию.
13. Способ по п.1, где стадии (с) и (d) выполняют одновременно.
14. Способ по п.1, где один или более агентов удаляют основание из модифицированных нуклеотидов.
15. Способ по п.1, где один или более агентов содержат эндонуклеазу.
16. Способ по п.1, где один или более агентов содержат эндонуклеазу IV.
17. Способ по п.1, где один или более агентов содержат формамидопиримидин-ДНК-гликозилазу (FPG).
18. Способ по п.1, где первый фермент заменяет модифицированный нуклеотид меченым нуклеотидом.
19. Способ по п.1, где первый фермент содержит полимеразу.
20. Способ по п.1, где первый фермент представляет собой ДНК-полимеразу.
21. Способ по п.1, где первый фермент представляет собой термоустойчивую полимеразу.
22. Способ по п.1, где устойчивые к нуклеазе нуклеотиды содержат тио-модифицированные дезоксинуклеотиды.
23. Способ по п.1, где устойчивые к нуклеазе нуклеотиды содержат борано-модифицированные нуклеотиды.
24. Способ по п.1, где второй фермент содержит экзонуклеазу.
25. Способ по п.1, где второй фермент содержит экзонуклеазу III.
26. Способ по п.1, где продукты удлинения различаются ПЦР в реальном времени (rtPCR).
27. Способ по п.26, где ПЦР опосредуется двумя или более праймерами, где один или более праймеров содержат флуоресцентную метку.
28. Способ по п.27, где один или более праймеров содержат праймер изменения флуоресценции.
29. Способ по п.1, где удлинение продуктов удлинения на стадии (f) включает один или более меченых нуклеотидов в продукты удлинения.
30. Способ по п.29, где один или более меченых нуклеотидов содержат биотин.
31. Способ по п.30, где продукты удлинения различают путем выявления меченых нуклеотидов.
32. Способ по п.1, где продукты удлинения различают посредством гибридизации зонда, удлинения праймера или их комбинации.
33. Способ по п.1, где продукты удлинения различают посредством ассоциации продуктов удлинения с твердой подложкой.
34. Способ по п.1, дополнительно включающий выполнение стадий (а)-(g) один или более дополнительных раз, каждый раз с использованием другого типа модифицированного нуклеотида, содержащего другой тип основания.
35. Способ по п.1, где стадии (а)-(g) выполняют по меньшей мере однократно с использованием каждого из четырех различных модифицированных нуклеотидов, где каждый из четырех различных модифицированных нуклеотидов содержит другой один из четырех типов основания.
36. Способ по п.1, дополнительно включающий секвенирование продуктов удлинения с нуклеотидной вариацией и сравнение этой последовательности с эталонной последовательностью, посредством чего специфически идентифицируют нуклеотидную вариацию в первой нуклеиновой кислоте.
37. Способ по п.1, где нуклеотидная вариация представляет собой одиночную нуклеотидную вариацию.
38. Способ по п.1, где выявленная нуклеотидная вариация представляет собой вариацию в одном нуклеотиде.
39. Способ по п.1, где продукты удлинения мечены обнаруживаемой меткой, и стадия различения (g) включает выполнение гель-электрофореза реакционной смеси со стадии (f), где электрофорез имеет достаточное разрешение для различения меченого продукта удлинения, который дополнительно не удлинен, и нуклеиновой кислоты полной длины.
40. Способ по п.1, где присутствие модифицированных нуклеотидов в продуктах удлинения вызвано генерированием продуктов удлинения в присутствии модифицированных нуклеотидов, содержащих один тип основания, где продукты удлинения включают модифицированные нуклеотиды.
41. Способ по п.1, где присутствие модифицированных нуклеотидов в продуктах удлинения вызвано модификацией нуклеотидов в продуктах удлинения для получения модифицированных нуклеотидов.
42. Способ по п.41, где нуклеотиды модифицируют в продуктах удлинения селективно.
43. Способ по п.41, где нуклеотиды модифицируют в продуктах удлинения ограниченным образом.
44. Способ по п.41, где нуклеотиды модифицируют в продуктах удлинения посредством химической модификации.
45. Способ по п.41, где нуклеотиды модифицируют в продуктах удлинения посредством ферментативной модификации.
46. Способ выявления нуклеотидной вариации внутри первой нуклеиновой кислоты, включающий:
(a) стадию, включающую генерирование набора продуктов удлинения из эталонной нуклеиновой кислоты в присутствии модифицированных нуклеотидов, содержащих один тип основания, где продукты удлинения включают модифицированные нуклеотиды;
(b) стадию, включающую гибридизацию продуктов удлинения с первой нуклеиновой кислотой;
(c) стадию, включающую приведение гибридизирующейся нуклеиновой кислоты в контакт с одним или более агентами, которые совместно удаляют модифицированные нуклеотиды;
(d) стадию, включающую приведение гибридизирующейся нуклеиновой кислоты в контакт с первым ферментом, который удлиняет продукты удлинения в присутствии трех типов меченых нуклеотидов, но не в присутствии нуклеотидов, которые содержат тот же тип основания, что и модифицированные нуклеотиды, где каждый из трех типов меченых нуклеотидов содержит другой тип основания;
(е) стадию, включающую различение тех продуктов удлинения, которые содержат меченый нуклеотид, и тех продуктов удлинения, которые не содержат меченый нуклеотид, посредством чего выявляют нуклеотидную вариацию в первой нуклеиновой кислоте.