СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ АМИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА
METHOD OF PRODUCING IMMOBILISED BIOCATALYST AND METHOD OF PRODUCING AQUEOUS AMIDE SOLUTIONS WITH USING THIS BIOCATALYST

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения иммобилизованного биокатализатора на основе клеток микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью, а также способа получения концентрированных водных растворов амидов, в частности акриламида и никотинамида, путем гидратации нитрилов карбоновых кислот с использованием иммобилизованного биокатализатора.
В настоящее время амидосоединения находят применение во всех отраслях промышленности. В частности, акриламид широко используется как мономер для синтеза полимеров и сополимеров различного назначения. Наиболее перспективными для получения водных растворов амидов, в частности акриламида, являются биотехнологические способы гидратации нитрилов карбоновых кислот с применением в качестве биокатализатора микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной активностью. Биотехнологические процессы получения амидов в отличие от химического способа обладают рядом важных преимуществ: гидратация нитрила проходит при нормальных значениях температуры и давления, характеризуется высоким выходом целевого продукта (99,9%), низкой энергоемкостью и малоотходностью производства.
Известны штаммы микроорганизмов, продуцирующих фермент нитрилгидратазу, трансформирующие нитрилы в соответствующие амиды: Rhodococcus erythropolis E84 (патент RU №2196822, приоритет от 25.07.2001), Rhodococcus ruber GT (патент RU №2223316, приоритет от 06.12.2001) и др.
Известны способы получения водных растворов акриламида и других амидов в реакторах емкостного типа с применением суспензии микроорганизмов (бактерий), обладающих нитрилгидратазной активностью [1-3]. Недостатками этих способов является то, что биокатализатор вносится в виде суспензии, используется однократно, после проведения синтеза требуются трудоемкие процедуры отделения шлама биокатализатора. Известен также способ получения водных растворов амидов с применением клеток бактерий, обладающих нитрилгидратазной активностью, иммобилизованных путем включения в гель полиакриламида [4, 5]. Недостатками данных способов является снижение каталитической активности включенных в гель бактерий и скорости синтеза амидов, обусловленное:
- неизбежным повреждением (ковалентной модификацией) молекул фермента нитрилгидратазы и клеток в процессе полимеризации полиакриламида;
- значительным снижением скорости массопереноса субстрата (нитрила) к клеткам бактерий, содержащих нитрилгидратазу, и оттока продукта (амида) от них за счет диффузионных ограничений в гранулах геля полиакриламида;
- возможностью набухания и размывания геля полиакриламида.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому решению аналогом является способ промышленного получения концентрированных растворов акриламида [3], принятый за прототип. Способ осуществляется путем гидратации акрилонитрила в водном растворе с помощью штамма микроорганизмов Rhodococcus rhodochrous М33, применяемого в виде суспензии в концентрации 0,64-4,1 г/л водопроводной или дистиллированной воды при температуре 13-22°С и рН 6,8-7,8 в течение 4-6 часов с внесением акрилонитрила до концентрации, не превышающей 0,1%. Недостатками данного способа являются однократное использование и высокий расход биокатализатора, наличие в получаемом растворе суспензии шлама биокатализатора после проведения синтеза и необходимость очистки от него, ограничение концентрации субстрата - акрилонитрила (до 0,1%).
Технической задачей настоящего изобретения является повышение выхода конечного продукта в процессе синтеза амидов, осуществляемом путем гидратации нитрилов, и возможность проводить синтез как в периодическом, так и в проточном режиме в реакторах известных конструкций. Задача осуществляется за счет иммобилизации каталитически активной биомассы бактерий, легкости отделения основной массы биокатализатора от раствора синтезированного амида, а также многоцикловой работы биокатализатора или работы в проточном режиме.
3
Решение поставленной задачи достигается тем, что бактерии, обладающие нитрилгидратазной активностью, иммобилизуют путем адсорбции из клеточной суспензии на пористом углеродном носителе. В качестве носителя применяются активные угли с параметрами пористой структуры - суммарным объемом пор 0,4-1,8 см/г.
Для получения биокатализатора используют штаммы микроорганизмов, обладающие нитрилгидратазной активностью, например Rhodococcus ruber GT (Патент RU №2223316), Rhodococcus erythropolis E84 (Патент RU №2196822).
Иммобилизацию бактерий - продуцентов нитрилгидратазы осуществляют путем адсорбции на углеродных носителях (сорбентах), в частности активных углях из растительного и полимерного сырья, что позволяет получить биокатализатор для синтеза амидосоединений как в емкостных реакторах периодического действия путем многоциклового использования, так и в непрерывном режиме в реакторах колоночного или емкостного типа. После проведения каждого цикла синтеза в емкостных реакторах биокатализатор легко отделяется от жидкой фазы - раствора амида путем слива жидкой фазы, фильтрации или низкоскоростного центробежного разделения (центрифугирование или сепарация при угловой скорости до 3000 об/мин). Получение амидов предложенным способом может проводиться в проточных реакторах колоночного, мембранного, половолоконного типа или любой другой известной конструкции, при этом не требуется стадии фильтрации или сепарации. Получаемый раствор амида на выходе из реактора не содержит иммобилизованного биокатализатора.
Активные угли достаточно прочно связывают клетки Rhodococcus, что предотвращает возможность их десорбции в процессе синтеза и выхода в раствор, содержащий продукт реакции. Указанные сорбенты оказывают защитное и стабилизирующее действие на биокатализатор, выражающееся в уменьшении подавления нитрилами нитрилгидратазной активности клеток Rhodococcus и повышении термостабильности биокатализатора, что позволяет добавлять субстрат (акрилонитрил или другой нитрил) до концентрации 20% и проводить до 7-10 повторных циклов синтеза. Все перечисленные преимущества позволяют решить поставленную задачу, а именно повысить выход конечного продукта в процессе синтеза амидов.
Преимуществом является также тот факт, что используемые углеродные носители производятся в промышленном масштабе и имеют невысокую стоимость.
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
2
2
Клетки Rhodococcus (R.ruber GT или R.erythropolis E84) выращивают на среде следующего состава (г/л): глюкоза - 1-5; NHCl (либо мочевина) - 0,3-1; KHPO - 1,0; КHPO×3НO - 1,6; NaCl - 0,5; MgSO×7HO - 0,5; FeSO×7HO - 0,002; CoCl×6HO - 0,01; рН 7,4 в течение 30-45 ч до достижения плотности суспензии 4-10 г/100 мл. Биомассу отделяют от среды центрифугированием, центробежной сепарацией, фильтрованием либо любым другим известным способом и суспендируют в дистиллированной или водопроводной воде либо в буферном растворе до концентрации 1-30 г/л.
Иммобилизацию бактерий проводят путем инкубации носителей (активных углей) с суспендированными клетками Rhodococcus в течение 15-35 мин, либо путем пропускания (прокачивания) суспензии с линейной скоростью до 0,03 м/с через объем реактора, заполненного сорбентом (активным углем), либо посредством совместного центрифугирования клеточной суспензии и сорбента. После этого биокатализатор промывают водой или буферным раствором. В качестве носителей для иммобилизации используют, например, активные угли: березовый уголь-сырец; БАУ; СКТ-3; ФТД (свойства углей приведены в табл.1).
Процесс получения амида проводят в водном растворе при рН 6,5-8,3 в периодическом режиме - при отношении количества иммобилизованной на носителе биомассы к общему объему реакционной среды 0,1-10 г/л (по сухому весу) либо в проточном режиме. Акрилонитрил (или другой алифатический нитрил) вносится в среду до концентрации, не превышающей 20%. Время реакции 1-5 ч. По окончании синтеза получают раствор акриламида или другого алифатического амида с концентрацией 7-55%.
240
Ферментативную активность биомассы бактерий определяют по изменению концентраций субстратов - нитрилов карбоновых кислот и продуктов реакции - амидов. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимают количество нитрилгидратазы, содержащейся в 1 мг сухого веса клеток, катализирующей образование 1 мкмоль амида в минуту (мкмоль амида/мг сухого веса/мин). Концентрацию акриламида измеряют спектрофотометрически по величине оптической плотности (ОП) или методом газожидкостной хроматографии.
Способ поясняется следующими примерами:
Пример 1. Получение клеток бактерий, иммобилизованных на углеродных носителях.
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
2
2
Клетки Rhodococcus (например, R.ruber GT или R.erythropolis E84) выращивают на синтетической среде состава (г/л): глюкоза - 1-5; NHCl (либо мочевина) - 0,3-1; KHPO - 1,0; КHPO×3НO - 1,6; NaCl - 0,5; MgSO×7HO - 0,5; FeSO×7HO - 0,002; CoCl×6НО - 0,01; рН 7,4 в течение 30-45 ч до достижения плотности суспензии 4-10 г/100 мл и нитрилгидратазной активности не менее 100 ед.
Выращенные клетки отделяют от культуральной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин. Полученную биомассу разводят в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 6,5-8,3, дистиллированной или водопроводной воде до концентрации 1-30 г/л.
Иммобилизацию бактерий проводят одним из 2-х способов:
(1) Углеродным сорбентом в объемно-насыпном состоянии заполняют на 4/5 объема проточный реактор с соотношением высоты и диаметра 4:1-10:1, выходное отверстие которого закрыто фильтрующим материалом с глубиной фильтрации 10-200 мкм, и пропускают через него суспензию клеток Rhodococcus равноменным потоком с линейной скоростью внутри реактора до 0,03 м/с в течение 10-25 мин. После этого производят слив жидкой фазы и промывание биокатализатора дистиллированной, умягченной или водопроводной водой с линейной скоростью внутри реактора до 0,03 м/с в течение 10-25 мин. Полученным биокатализатор выгружается из реактора либо заполненный им проточный реактор может непосредственно использоваться для синтеза амидов.
(2) Суспензию клеток Rhodococcus центрифугируют 5-7 раз с сорбентами при 3000-8500 об/мин - 10-20 мин, последовательно отделяя надосадочную жидкость и добавляя суспезию клеток. Биомассу с сорбентами ресуспендируют в дистиллированной или водопроводной воде либо в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 6,5-8,3, при соотношении осадка к жидкости 1:2, выдерживают в течение 1-35 мин на вращающейся платформе (качалке) со скоростью перемешивания до 100 об/мин. Носитель с иммобилизованными клетками отделяют от водной среды фильтрацией через бумажный, капроновый, асбестовый или керамический фильтр либо через капроновую или металлическую сетку и промывают водной фазой.
540
Количество сорбированных клеток определяют по разности оптической плотности (ОП) культуральной среды до и после сорбции. Сорбционную емкость по отношению к клеткам выражают в мг сухого веса клеток на г сорбента.
В данных условиях прочно адсорбируется от 10 до 16 мг клеток (по сухому весу)/г носителя (табл.1). При иммобилизации путем совместного центрифугирования прочно адсорбируется до 78 мг сух. веса кл./г носителя. Сорбент с иммобилизованными клетками отделяют от культуральной среды фильтрацией через бумажный, капроновый, асбестовый или керамический фильтр либо через капроновую или металлическую сетку.
Для определения термостабильности биокатализатора иммобилизованные клетки и клетки в суспензии инкубируют при температурах 50, 60 и 70°С в течение 10, 30, 60 и 180 минут, после чего измеряют нитрилгидратазную активность. Нитрилгидратазная активность иммобилизованных клеток штамма R.ruber GT в сравнении с активностью клеток в суспензии представлена в табл.2.
Пример 2. Трансформация акрилонитрила в акриламид иммобилизованными клетками Rhodococcus.
Трансформацию акрилонитрила с использованием иммобилизованной биомассы Rhodococcus проводят в водной среде (дистиллированная или водопроводная вода) либо калий-фосфатном буфере, рН 6,5-8,3. Акрилонитрил вносят до концентрации 0,5-20%. По мере полной трансформации в амид добавляют новую порцию акрилонитрила.
Активность нитрилгидратазы клеток после иммобилизации оценивают следующим образом: клетки в количестве 0,5-4,5 мг по сухой биомассе, иммобилизованные на углеродном носителе по примеру 1, инкубируют в 10 мл 10 мМ натрий-фосфатного буфера или воды, рН 6,5-8,3, с акрилонитрилом в концентрации до 20% в течение 1-10 минут, а затем реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 6 н. HCl. Носитель с клетками отделяют от реакционной среды фильтрованием через бумажный фильтр, отфильтрованный раствор центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин.
Концентрацию акриламида в надосадочной жидкости анализируют методом газожидкостной хроматографии. Сохранение нитрилгидратазной активности у иммобилизованных клеток оценивают при сравнении с нитрилгидратазной активностью клеток в суспензии.
В результате получают раствор акриламида с концентрацией 40-55%.
Пример 3. Использование иммобилизованных клеток Rhodococcus для трансформации 3-цианопиридина в никотинамид или других нитрилов в соответствующие амиды.
Бактерии Rhodococcus, обладающие высокой нитрилгидратазной активностью, иммобилизуют и готовят к трансформации по примеру 1. Трансформацию никотинамида с использованием иммобилизованной биомассы Rhodococcus проводят в водной среде (дистиллированная или умягченная вода) при соотношении объема иммобилизованного биокатализатора и водной фазы 1:7-1:20. Скорость перемешивания или протока устанавливается таким образом, чтобы линейная скорость движения жидкости не превышала 0,03 м/с. В качестве субстрата добавляют 3-цианопиридин либо другой нитрил до концентрации 10 г/л. Концентрации остаточного 3-цианопиридина и никотинамида определяют методом жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ). По мере полного превращения 3-цианопиридина в никотинамид добавляют новые порции субстрата (или другого нитрила в соответствующий амид).
В результате получают раствор никотинамида в концентрации 20-23% или раствор другого амида в копцсшрсщиц не менее 20%.
Пример 4. Многоцикловое использование иммобилизованных клеток штамма Rhodococcus при конверсии акрилонитрила в акриламид.
3
Каждый цикл конверсии акрилонитрила в акриламид проводят в реакторах объемом от 0,001 до 10 м. Реакция катализируется иммобилизованными на углеродных носителях клетками активностью 100-460 мкмоль/мг/мин, взятыми в количестве 0,1-2,5 г/л, в пересчете на сухой вес. Оценивают сохранение нитрилгидратазной активности при последовательном проведении полной конверсии акрилонитрила, вносимого в каждом цикле до концентрации 10% в дистиллированной или водопроводной воде либо в калий-фосфатном буфере рН 6,5-8,3. Пробы на определение активности отбирают через 10 мин от начала реакции. Полный цикл конверсии проводят в течение 20 мин, после чего сорбенты с иммобилизованными клетками отмывают водой. Операционную стабильность иммобилизованных клеток сравнивают с операционной стабильностью клеток в суспензии при прочих равных условиях.
В данных условиях иммобилизованные клетки не теряют нитрилгидратазной активности после 6-7 циклов синтеза, в то время как бактерии в суспензии ко второму циклу сохраняют лишь половину активности. Результаты представлены в табл.3. Показанная стабилизация активности при иммобилизации на углеродном носителе позволяет использовать биокатализатор многократно.
В аналогичных условиях, поддерживая концентрацию акрилонитрила в реакторе 0,5-10%, получают концентрированные растворы акриламида (40-55%). Выход акриламида составляет 1600-5400 г акриламида на 1 г клеток (по сухому весу). В то же время при синтезе акриламида, катализируемом суспензией клеток Rhodococcus, выход акриламида составляет 180-1640 г акриламида на 1 г клеток (по сухому весу).
Пример 5. Синтез амида в проточном режиме.
Проточный реактор, представляющий собой герметично закрываемый разборный цилиндр из нержавеющей стали с соотношением диаметра к высоте 1/4-1/12 и высотой не менее 0,5 м, снабженный патрубками для ввода и вывода раствора и фильтрами в виде капроновой или металлической сетки, расположенными на торцах, либо реактор другой известной конструкции заполняется иммобилизованным биокатализатором, приготовленным как в примере 1. Через реактор прокачивается раствор акрилонитрила с концентрацией не более 20% и линейной скоростью потока внутри реактора 0,002-0,005 м/с. В таких условиях на выходе получается раствор акриламида с концентрацией до 20%. Для синтеза концентрированных растворов акриламида применяют следующие подходы: (1) применение реакторов длиною более 1,2 м; (2) каскадное соединение 3-6 реакторов с добавлением акрилонитрила в реакционную среду перед каждым последующим реактором; (3) циклическое многократное пропускание раствора акрилонитрила через реактор с добавлением новых порций акрилонитрила по мере его трансформации либо комбинацию этих подходов. При циклическом многократном прокачивании раствора скорость потока может быть увеличена, но не более чем до 0,04 м/с. В этих условиях за 0,3-5 ч трансформации получают раствор акриламида с концентрацией 38-55%. Выход акриламида при получении концентрированных растворов составляет более 2200 г акриламида на 1 г клеток (по сухому весу).
Таким образом, заявленный способ дает следующие преимущества перед известными способами получения амидов: увеличивается выход целевого продукта за счет стабилизации каталитической активности клеток, иммобилизованных на углеродных носителях, синтез амидосоединений может проводиться как в периодическом режиме, так и в проточном режиме во всех известных типах реакторов, биокатализатор легко отделяется от продукта синтеза и используется многократно, что решает проблему отделения шлама и повышает чистоту продукта.
Таблица 1Характеристика углеродных носителей, количество иммобилизуемых на них клеток Rhodococcus и адсорбция акриламида
Свойство
Углеродный носитель
Березовый уголь-сырец
БАУ
СКТ-3
ФТД
Исходное сырье
древесина березы
березовый древесный уголь
торф
фенолформальдегидная смола
Насыпная плотность, г/дм<sup>3</sup>
280±5
220±20
530±29
480±20
Суммарный объем макропор, см<sup>3</sup>/г
0,95-1,15
1,35-1,8
0,38-0,43
0,08-0,1
Объемная доля макропор, %
91-92
85-86
47-51 (45-80)
7-12
Сорбционная емкость по отношению к клеткам, мг/г
13,8±2,3
14,6±1,4
13,2±1,7
12,4±2,3
Сорбционная емкость по отношению к акрилонитрилу, мг/г
187,3±17,3
350,0±6,5
273,5±1,5
217,4±1,1
Сорбционная емкость сорбента с клетками по отношению к акриламиду, мг/г
0,1±0,1
6,6±2,9
7,5±0,8
9,5±0,9
Таблица 2Сохранение нитрилгидратазной активности клеток штамма R.ruber GT при воздействии повышенной температуры
Температура,°С
Время воздействия, мин
Нитрилгидратазная активность, %
Суспензия клеток R.ruber GT
Иммобилизованные клетки R.ruber GT
50
10
182
183
30
124
160
60
100
120
180
36
59
60
10
29
56
30
9
25
60
4
14
180
0,8
3
70
10
2
14
30
2
14
60
2
14
180
-
-
100% - активность нитрилгидратазы клеток при температуре 20°С
Таблица 3Сравнение стабильности биокатализатора - иммобилизованных клеток штамма R.ruber GT и клеток в суспензии при многоцикловом использовании
Циклы конверсии
Сохранение нитрилгидратазной активности, %
Суспензия клеток R.ruber GT
Иммобилизованные клетки R.ruber GT
1
100
100
2
53
100
3
39
100
4
18
100
5
13
100
6
6
100
7
3
71
8
0
53
9
0
17
10
0
12
Используемые источники
1. Патент US 4343900. Process for the production of acrylamide using microorganism.
2. Патент ДСП SU 1811698. Дебабов В.Г., Воронин С.П., Козулин С.В, Синолицкий М.К., Моисеева Т.Н., Полянский А.Б., Яненко А.С., Хоркин А.А., Байбурдов Т.А., Луйксаар И.В., Решетников Л.В., Герасимова Т.В. Биотехнологический способ получения акриламида.
3. Патент RU 2077588. Дебабов В.Г., Воронин С.П., Козулин С. В., Синолицкий М.К., Козулина Т.Н., Полянский А.Б., Синтин А.А., Яненко А.С., Байбурдов Т.А., Хоркин А.А., Луйксаар И.В., Решетникова Л.В., Федченко Н.Н. Способ получения акриламида.
4. Патент US 6043061. Process for producing amide compound.
5. Патент RU 2196825. Биотехнологический способ получения водных растворов акриламида.