НОВЫЙ ПЕПТИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
NEW PEPTIDE AND APPLICATION THEREOF

Область техники
[1] Настоящее изобретение относится к новому пептиду и, более конкретно, к новому пептиду и его применению.
Уровень техники
[2] Лимфоцитарная инфильтрация панкреатического островка называется инсулитом. Инсулит, в конечном счете, разрушает панкреатические β-клетки, которые секретируют инсулин, что приводит к диабету 1 типа (T1D) {Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event". Immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53 и т. д.}. Кроме того, сообщалось о том, что диабет 1 типа можно облегчить путем защиты поджелудочной железы от инсулита {Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. "Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice". Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669 и т. д.}.
[3] Известно, что различные цитокины, такие как IFN-γ (гамма-интерферон), TNF-α (фактор некроза опухолей альфа) и TGF-β1 (трансформирующий ростовой фактор бета 1) участвуют в развитии и супрессии инсулита. Известно, что инсулит вызывается IFN-γ {von Herrath MG, Oldstone MB. "Interferon-γ is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus". J. Exp Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9 и т. д.}, а также известно, что вызывается TNF-α {Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hi deo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. "IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death". J. Immunol April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489 и т. д.}. В то же время сообщалось о том, что повышенная экспрессия TGF-β1 защищает диабетических мышей, не страдающих ожирением (NOD), от инсулита {Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. "TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice" J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6 и т. д.}.
[4] Следовательно, необходимо разработать материал, который характеризуется эффектом в отношении инсулита.
[5] [Перечень ссылок]
[6] [Непатентная литература]
[7] (Непатентный документ 1) Lennon GP, Bettini M, Burton AR, Vincent E, Arnold PY, Santamaria P, Vignali DA. "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event". Immunity. 2009 Oct 16;31(4):643-53.
[8] (Непатентный документ 2) Norman Ende, Ruifeng Chen, Alluru S. Reddi. "Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice". Biochemical and Biophysical Research Communications 325 (2004) 665-669.
[9] (Непатентный документ 3) von Herrath MG, Oldstone MB. "Interferon-γ is Essential for Destruction of β Cells and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus". J. Exp. Med. 1997 Feb 3;185(3):531-9.
[10] (Непатентный документ 4) Kyoungho Suk, Sunshin Kim, Yun-Hee Kim, Kyoung-Ah Kim, Inik Chang, Hi deo Yagita, Minho Shong, Myung-Shik Lee. "IFN-γ/TNF-α Synergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes: A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in Pancreatic β Cell Death". J. Immunol. April 1, 2001, 166 (7) 4481-4489.
[11] (Непатентный документ 5) Piccirillo CA, Chang Y, Prud'homme GJ. "TGF-β1 Somatic Gene Therapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice" J. Immunol. 1998 Oct 15;161(8):3950-6.
Раскрытие изобретения
Техническая задача
[12] Целью настоящего изобретения является обеспечение нового пептида.
[13] Другой целью настоящего изобретения является обеспечение нового применения пептида по настоящему изобретению.
[14] Цели настоящего изобретения не ограничиваются вышеуказанным, а другие цели, не упомянутые в данном документе, будут более четко понятны специалистам в данной области техники из приведенного ниже описания.
Решение задачи
[15] В настоящем изобретении предусмотрен пептид, состоящий из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:1 (YGAGAGAGY), или его фармацевтически приемлемая соль.
[16] В аминокислотной последовательности Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).
[17] Аминокислоты, которые входят в состав пептида, включают L-, D- и DL-формы, все из которых включены в аминокислоты пептида по настоящему изобретению. Также будет понятно, что Y можно интерпретировать как имеющий значение, включающее 4-гидроксифенилаланин, а также тирозин, в качестве аминокислоты.
[18] Пептид включает его варианты, в которых часть структуры пептида в соответствии с настоящим изобретением варьирует из-за спонтанной мутации или искусственной мутации без изменения его основной активности.
[19] Примеры фармацевтически приемлемой соли могут включать гидрохлорид, сульфат, фосфат, ацетат, цитрат, тартрат, сукцинат, лактат, малеат, фумарат, оксалат, метан сульфонат и пара-толуолсульфонат, натриевую соль, калиевую соль, кальциевую соль и т. п.
[20] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и предпочтительно его применение для лечения или предупреждения инсулита. При этом под термином «лечение» в полном объеме подразумевают снижение интенсивности или облегчение симптомов, а термин «предупреждение» применяют во всеобъемлющем значении, включая подавление прогрессирования заболевания от бессимптомной стадии до выражения симптомов.
[21] Лечение и предупреждение может быть обусловлено по меньшей мере одним из подавления экспрессии IFN-γ (гамма-интерферона), подавления экспрессии TNF-α (фактора некроза опухоли альфа) и индукции экспрессии TGF-β1 (трансформирующего ростового фактора бета 1).
[22] Подавление экспрессии IFN-γ может представлять собой подавление экспрессии мРНК IFN-γ.
[23] Подавление экспрессии TNF-α может представлять собой подавление экспрессии мРНК TNF-α.
[24] Индукция экспрессии TGF-β1 может представлять собой индукцию экспрессии мРНК TGF-β1.
[25] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и предпочтительно его применение для лечения или предупреждения диабета 1 типа (T1D).
[26] Диабет 1 типа может быть вызван инсулитом.
[27] Лечение или предупреждение может быть обусловлено по меньшей мере одним из подавления развития инсулита и уменьшения его развития.
[28] Лечение или предупреждение может быть обусловлено снижением уровня глюкозы в крови.
[29] Снижение уровня глюкозы в крови может быть обусловлено по меньшей мере одним из числа подавления развития инсулита и уменьшения его развития.
[30] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена композиция для лечения или предупреждения инсулита, содержащая пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрена композиция для лечения или предупреждения диабета 1 типа, содержащая пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением. Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию.
[31] Композиция может содержать в качестве действующего вещества пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением.
[32] Композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемую добавку и может состоять из пептида или фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемой добавки.
[33] Пептид по настоящему изобретению можно получать с помощью способов, которые обычно применяют в области химии пептидов. Например, пептид можно получать со ссылкой на литературу, широко известную из уровня техники, или с помощью способа, такого как жидкофазный синтез или твердофазный синтез.
[34] Примеры способов образования пептидной связи могут включать ацилазидный способ, ацилгалогенидный способ, ацилимидазольный способ, карбодиимидный способ, способ с применением фосфония, ангидридный способ, смешанный ангидридный способ, окислительно-восстановительный способ и применение K-реагента Вудворда.
[35] Перед проведением реакции конденсации карбоксильную группу, аминогруппу или т. п., которые не участвуют в реакции, можно защитить, и карбоксильную группу, которая участвует в реакции конденсации, можно активировать с помощью способов, известных из уровня техники.
[36] Примеры функциональных групп для защиты карбоксильной группы могут включать группы, образующие сложный эфир, например, метил, трет-бутил, арил, пентафторфенил, бензил, параметоксибензил и метоксиэтоксиметил.
[37] Примеры функциональных групп для защиты аминогруппы могут включать тритилкарбонил, арилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, трихлорэтилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил и/или 9-флуоренилметилоксикарбонил.
[38] Примеры активных форм карбоксильной группы могут включать смешанный ангидрид, азид, ацилхлорид и активный сложный эфир [сложный эфир со спиртом (например, пентахлорфенол, 2,4-динитрофенол, цианометиловый спирт, п-нитрофенол, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимид, N-гидроксисукцинимид, N-гидроксифталамид или 1-гидроксибензотриазол)].
[39] Растворители, применяемые в реакции конденсации для образования пептидной связи, включают бензол, толуол, гексан, ацетон, нитрометан, циклогексан, эфир, хлороформ, дихлорметан, этилацетат, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин, диоксан, тетрагидрофуран, воду, метанол и этанол, которые можно применять отдельно или в комбинации.
[40] Температура реакции может колебаться в диапазоне от приблизительно -70°C до 100°C, который обычно применяют в реакции, и предпочтительно колеблется в диапазоне от -30°C до 30°C.
[41] Реакцию снятия защиты для удаления защитной группы пептида можно осуществлять с применением кислотного соединения, основного соединения или переходного металла, способного удалять защитную группу не воздействуя на пептидную связь, в зависимости от вида защитной группы.
[42] Реакцию снятия защиты можно выполнять посредством кислотной обработки с применением, например, хлороводорода, бромоводорода, фторводорода, уксусной кислоты, метансульфоновой кислоты, трифторметансульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты, триметилхлорсилана или их смесей.
[43] При осуществлении реакции снятия защиты посредством кислотной обработки, ее можно стимулировать путем добавления вспомогательного вещества, такого как анизол, фенол или тиоанизол.
[44] В качестве альтернативы, реакцию снятия защиты можно выполнять посредством основной обработки с применением, например, аммиака, диэтиламина, гидразина, морфолина, N-метилпирролидина, пиперидина, карбоната натрия или их смесей.
[45] В качестве альтернативы, реакцию снятия защиты можно выполнять посредством обработки переходным металлом с применением, например, цинка, ртути, палладия/водорода и т. д.
[46] После завершения реакции пептид можно очищать с применением традиционного способа очистки пептида, такого как экстрагирование, разделение слоев, осаждение твердых частиц, рекристаллизация или колоночная хроматография.
[47] Кроме того, пептид в соответствии с настоящим изобретением можно превратить в его вариант или его фармацевтически приемлемую соль с применением традиционного способа.
[48] Пептид в соответствии с настоящим изобретением можно синтезировать с применением автоматического синтезатора пептидов или можно получить с помощью манипуляции с генами. Например, слитый ген, кодирующий слитый белок, содержащий партнера по слиянию и пептид в соответствии с настоящим изобретением, изготавливают с помощью манипуляции с генами, а затем применяют для трансформации микроорганизма-хозяина и слитый белок экспрессируется в микроорганизме-хозяине, после чего пептид в соответствии с настоящим изобретением расщепляется или отделяется от слитого белка с применением протеолитического фермента или соединения, с получением таким образом требуемого пептида.
[49] Пептид или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением вводят парентерально в количестве от 24,3 мг/день до 4860 мг/день и предпочтительно от 48,6 мг/день до 2430 мг/день. При пероральном введении его количество превышает в от 5 до 10 раз количество при парентеральном введении. Введение можно проводить один раз в день или несколько раз в день и его количество может зависеть от взрослого (с весом 60 кг), но может варьировать в зависимости от веса, состояния тела и т. п. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением можно в основном вводить посредством парентеральных путей, например, внутривенной инъекции, подкожной инъекции, интраспинального введения, трансдермального введения, трансназального введения или ректального введения. В некоторых случаях возможно пероральное введение.
[50] Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, или композиция в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены вместе с фармацевтически приемлемой добавкой в форме инъекции, суппозитория, порошка, назальных капель, гранулы, таблетки или трансдермального пластыря.
[51] Фармацевтически приемлемую добавку можно применять в зависимости от различных факторов, хорошо известных специалистам в данной области техники, включая, например, определенный биоактивный материал, его концентрацию, стабильность и предполагаемую биодоступность; нарушения и заболевания, подлежащие лечению, или состояния, ассоциированные с ними; индивидуумы, подлежащие лечению, их возраст, размер и общее состояние здоровья; и пути введения композиции, например, назальный, пероральный, глазной, местный, трансдермальный и внутримышечный пути, однако, настоящее изобретение не ограничивается ими. Фармацевтически приемлемая добавка, которую применяют для введения биоактивного материала, в дополнение к пероральному пути введения, может включать водный раствор, включающий D5W (5% глюкозы в воде), декстрозу и физиологическую соль в количестве, находящемся в пределах 5% от ее объема. В случае местной инъекции, вводимой внутрь пораженных тканей, для усиления терапевтических эффектов и увеличения их продолжительности могут применяться любые инъецируемые гидрогели. Также фармацевтически приемлемая добавка может содержать дополнительные компоненты для улучшения стабильности эффективных компонентов, такие как консерванты и антиоксиданты. Пептид или его фармацевтически приемлемая соль, или композиция в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены с помощью подходящих способов в смежной области и предпочтительно составлены как подходящие для каждого заболевания или компонента по ссылке на широко известную литературу, относящуюся к способам составления в области техники.
[52] Пептид по настоящему изобретению может храниться в солевом растворе или может лиофилизироваться в ампуле после добавления маннита или сорбита и его можно вводить после растворения в солевом растворе.
[53] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения или предупреждения инсулита, в том числе введения пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением млекопитающему, в том числе человеку, нуждающемуся во введении. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения или предупреждения диабета 1 типа, в том числе введения пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением млекопитающему, в том числе человеку, нуждающемуся во введении. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения инсулита. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрено применение пептида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения диабета 1 типа. Введенные пептид или его фармацевтически приемлемая соль могут представлять собой пептид или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве.
[54] Если не указано иное, вещества, описанные в связи с пептидом или его фармацевтически приемлемой солью, а также применение, композиция и способ в соответствии с настоящим изобретением, применяются в равной степени друг к другу в том же объеме, если они не противоречат друг другу.
Полезные эффекты изобретения
[55] В соответствии с настоящим изобретением инсулит можно эффективно лечить или предупреждать. Более того, в соответствии с настоящим изобретением диабет 1 типа можно эффективно лечить или предупреждать.
Краткое описание графических материалов
[56] На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления или снижения развития инсулита.
[57] На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови.
[58] На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α.
[59] На фиг. 4 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении индукции экспрессии TGF-β1.
[60] На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептидов из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α.
[61] на фиг. 6 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептидов из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2, в отношении индукции экспрессии TGF-β1.
Вариант изобретения
[62] Лучшее понимание настоящего изобретения осуществляется с помощью следующих примеров, сравнительных примеров и примеров получения, в которых примеры и примеры получения изложены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие объем настоящего изобретения.
[63] Реагенты, применяемые в следующих примерах и т. п., являются коммерчески доступными и высококачественными продуктами, приобретенными у Sigma-Aldrich, если не указано иное.
[64] <Пример 1> Получение пептида
[65] Пептид, показанный в таблице 1 ниже, получали с применением твердофазного способа синтеза пептида. В частности, пептид синтезировали с применением твердофазного способа с применением химических свойств Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонила).
[66] Более конкретно, 0,55 ммоль/г твердой смолы (смолы Wang; Sigma-Aldrich), 5 мл диметилформамида (DMF), 1,1 ммоль Fmoc-Tyr(tBu)-OH и 0,55 ммоль О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилуроний-гексафторофосфата (HBTU) помещали в хорошо высушенный реактор и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, таким образом, синтезируя Fmoc-Tyr(tBu)-смолу, после чего синтезированную смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. В промытую смолу добавляли 8 мл 20% раствора пиперидина (растворенного в диметилформамиде) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин., таким образом синтезируя Fmoc (защитная группа флуоренилметилоксикарбонил)-незащищенную Tyr(tBu)-смолу. Синтезированную Tyr(tBu)-смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида.
[67] В промытую Tyr(tBu)-смолу добавляли к 5 мл диметилформамида, 1,1 ммоль Fmoc-Gly-OH и 0,55 ммоль О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилуроний-гексафторофосфата (HBTU) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч., таким образом синтезируя Fmoc-Gly-Tyr(tBu)-смолу, после чего синтезированную смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. В промытую смолу добавляли 8 мл 20% раствора пиперидина (растворенного в диметилформамиде) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин., таким образом синтезируя Fmoc-незащищенную Gly-Tyr(tBu)-смолу. Синтезированную Gly-Tyr(tBu)-смолу фильтровали и затем промывали с помощью диметилформамида. С помощью этих процедур пептидная связь образовывалась между глицином и тирозином.
[68] После этого Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH и Fmoc-Tyr(tBu)-OH последовательно применяли и повторяли такие же процедуры, как и для образования пептидной связи между глицином и тирозином, тем самым получая соединение пептид-смола, содержащее аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1 ниже.
[69] После этого в соединение добавляли 10 мл смешанного раствора трифторуксусной кислоты и воды в соотношении 95:5 (об./об.), перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. и затем фильтровали, после чего в полученный фильтрат добавляли диэтиловый эфир, чтобы таким образом кристаллизировать твердое вещество. Полученное таким образом твердое вещество фильтровали, промывали диэтиловым эфиром и затем сушили, таким образом синтезируя неочищенное соединение пептида, содержащее аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1 ниже.
[70] Неочищенное соединение пептида очищали посредством обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) с применением колонки Shimadzu 5 мм Shim-pack ODS C18 (20 х 250 мм) и лиофилизировали, таким образом получая пептид из примера 1 в форме белого твердого вещества.
[71] Очищенный пептид идентифицировали с помощью аналитической RP-HPLC с применением колонки Shimpak 5 мкм ODS C18 (4,6 x 250 мм) и молекулярный вес пептида измеряли с применением масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) (Axima CFR, Kratos Analytical, Манчестер, Великобритания).
[72] [Таблица 1]
Аминокислотная последовательность
SEQ ID NO:
Пример 1
YGAGAGAGY
1
[73] В таблице 1 Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).
[74] <Пример 2> Оценка эффектов пептида
[75] 2-1. Оценка эффекта подавления или уменьшения развития инсулита
[76] Эффект пептида из примера 1 в отношении подавления или уменьшения развития инсулита был экспериментально подтвержден.
[77] Экспериментальные животные представляли собой самок NOD/ShiLtJ (Jackson Lab) в возрасте 8 недель. Мыши NOD (диабетические, не страдающие ожирением) представляют собой животные модели инсулита и диабета 1 типа. Известно, что у этих животных диабет 1 типа возникает в среднем в возрасте 18 недель и 90% случаев возникает к возрасту 30 недель. Всех животных содержали в условиях барьера SPF. Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Osong Medical Innovation Foundation Laboratory Animal Center (Kbio-IACUC-2018-066). Период акклиматизации составлял 1 неделю и цикл дня и ночи составлял 12 ч. (08:00 свет выключен - 20:00 свет включен). Температура составляла 20±2°C и относительная влажность составляла от 60% до 80%. Поскольку распространение диабета можно подавлять с помощью кишечных микроорганизмов, воду, pH которой регулируется до 2,8-3,2 с применением HCl, подавали экспериментальным животным.
[78] Конец хвоста экспериментальных животных, полученных выше, кололи один раз в неделю, и в капле крови из укола измеряли уровни глюкозы в крови с применением глюкометра (Roche, Accu-CHEK Performa). Когда измеренные уровни глюкозы в крови составляли 250 мг/дл или более и уровни глюкозы в крови, повторно измеренные на третий день после этого, составляли также 250 мг/дл или более, считалось, что диабет 1 типа возник и проводили эксперимент.
-ый
[79] Два экспериментальных животных с диабетом 1 типа были выбраны в качестве группы обработки из примера 1 и им подкожно (SC) вводили 100 мкл пептида из примера 1 (5 мг/кг). Введение проводили каждое утро и вечер в течение 14 дней и уровни глюкозы в крови измеряли с применением глюкометра. Введение прекращали, когда уровень глюкозы в крови снижался до 250 мг/дл или менее. Кроме того, два экспериментальных животных с диабетом 1 типа были выбраны в качестве группы отрицательного контроля, и их обрабатывали таким же образом, как и группу обработки из примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) вводили вместо пептида из примера 1. На 14 день одно экспериментальное животное, измеренные уровни глюкозы в крови которого составляли менее чем 250 мг/дл, было выбрано в качестве нормальной группы и его применяли для сравнения показателей инсулита экспериментальных животных с диабетом 1 типа и экспериментальных животных без диабета 1 типа.
-ый
[80] После измерений уровней глюкозы в крови на 14 день поджелудочную железу удаляли у экспериментальных животных и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (10% NBF, Sigma, HT5011) для изготовления парафинового блока. Фиксированную ткань поджелудочной железы нарезали, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и исследовали с применением оптического микроскопа для подтверждения развития инсулита. Инсулит был поделен на 4 стадии в зависимости от его степени: стадия 0, при которой инсулит не наблюдается, стадия 1, при которой инсулит наблюдается вокруг панкреатических островков, стадия 2, при которой инсулит составляет 75%, и стадия 3, при которой инсулит составляет 75% или более. Для группы обработки примера 1 измеряли количество островков у двух животных, отдельные островки классифицировали в зависимости от стадии инсулита, таким образом определяя показатель инсулита, и количество островков, соответствующих каждой стадии инсулита, среди общего количества островков представляли в процентах. Для группы отрицательного контроля и нормальной группы показатели инсулита определяли как и для группы обработки примера 1, после чего количество островков, соответствующих стадии инсулита, среди общего количества островков представляли в процентах. Результаты показаны на фиг. 1.
[81] На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления или снижения развития инсулита. На фиг. 1 ось х представляет собой каждую группу, а ось у представляет собой показатель инсулита {инсулит (% островков)}. На фиг. 1 показатель 0 означает стадию 0, показатель 1 означает стадию 1, показатель 2 означает стадию 2 и показатель 3 означает стадию 3.
[82] Как показано на фиг. 1, в группе обработки примера 1 процент в стадии 3, которая представляет собой самую тяжелую стадию, был снижен и проценты в стадиях 0-2, при которых может секретироваться инсулин, были повышены по сравнению с группой отрицательного контроля. В частности, в группе обработки примера 1 процент в стадии 0, при которой не возникает инсулит, был примерно удвоен по сравнению с группой отрицательного контроля. На основании приведенных выше результатов можно обнаружить, что пептид из примера 1 являлся эффективным в лечении инсулита путем подавления развития инсулита и облегчения проявлений инсулита. Кроме того, процент в стадии 0 был выше в группе обработки примера 1, чем у нормальной группы. Следовательно, пептид из примера 1 способен подавлять развитие инсулита, что указывает на то, что пептид из примера 1 являлся эффективным как в лечении, так и в предупреждении инсулита.
[83] В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид по настоящему изобретению характеризуется терапевтическим и/или профилактическим эффектом в отношении инсулита.
[84] 2-2. Оценка эффекта снижения уровней глюкозы в крови
[85] Для оценки эффекта пептида из примера 1 в отношении диабета 1 типа (T1D) эффект пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови у экспериментальных животных с диабетом 1 типа был экспериментально подтвержден.
[86] В частности, уровни глюкозы в крови группы обработки примера 1 и группы отрицательного контроля среди экспериментальных животных примера 2-1 анализировали и, таким образом, оценивали эффект пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови. Результаты показаны на фиг. 2.
[87] На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении снижения уровней глюкозы в крови. В данном случае ось х представляет собой время после обработки (d), а ось y представляет собой уровни глюкозы в крови (мг/дл).
[88] Как показано на фиг. 2, уровни глюкозы в крови двух животных в группе обработки примера 1 (примера 1-1 и пример 1-2) снижались в значительной степени и затем оставались в диапазоне нормальных значений, но уровни глюкозы в крови двух животных в группе отрицательного контроля (группа отрицательного контроля 1 и группа отрицательного контроля 2) непрерывно повышались.
[89] На основании приведенных выше результатов можно подтвердить, что пептид по настоящему изобретению являлся эффективным в отношении снижения уровней глюкозы в крови. Поскольку пептид по настоящему изобретению являлся эффективным в отношении снижения уровней глюкозы в крови мышей с диабетом 1 типа и в отношении поддержания нормальных уровней глюкозы в крови, пептид по настоящему изобретению, как представляется, способен лечить или предупреждать диабет 1 типа путем снижения уровней глюкозы в крови. Кроме того, как подтверждено выше, поскольку пептид по настоящему изобретению способен подавлять и уменьшать развитие инсулита, он может проявлять терапевтический и/или профилактический эффект в отношении диабета 1 типа путем его действия и, можно считать, характеризуется эффектом снижения уровней глюкозы в крови.
[90] В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид по настоящему изобретению осуществляет лечение и/или предупреждение диабета 1 типа.
[91] 2-3. Оценка эффекта подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1.
[92] Оценивали эффект пептида из примера 1 в отношении цитокина {IFN-γ (гамма-интерферона), TNF-α (фактора некроза опухоли альфа) и TGF-β1 (трансформирующего ростового фактора бета 1)}, ассоциированных с инсулитом. Известно, что инсулит вызван экспрессией IFN-γ и TNF-α, и известно, что повышенная экспрессия TGF-β1 защищает поджелудочную железу от инсулита. Таким образом, путем определения того, подавляет ли пептид из примера 1 экспрессию IFN-γ и TNF-α и индуцирует ли экспрессию TGF-β1, оценивали его эффект в отношении инсулита.
7
2
[93] Конец хвоста экспериментальных животных, полученных как в примере 2-1, кололи один раз в неделю, и в капле крови из укола измеряли уровни глюкозы в крови с применением глюкометра (Roche, Accu-CHEK Performa). Было подтверждено, что уровни глюкозы в крови являлись «высокими» (600 мг/дл или более), мыши подвергались цервикальной дислокации и из них извлекали селезенку. Клеточное сито (BD, 352350) помещали в пробирку объемом 50 мл, и ткань извлеченной селезенки пропускали через клеточное сито с применением наконечника шприца, после чего в пробирку, содержащую клеточное сито, добавляли HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса) таким образом, что клетки промывали водой с последующим центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта. Клетки суспендировали в 1 мл HBSS с добавлением 10 мл 1x лизирующего буфера RBC (Ebioscience, 00-4333-57), смешивали при легком перемешивании, оставляли во льду в течение 5 мин и затем центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта. К полученным клеткам снова добавляли 10 мл лизирующего буфера RBC, оставляли во льду в течение 5 мин, дополнительно центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин) для удаления супернатанта и затем промывали два раза с помощью 10 мл HBSS. После окончательного центрифугирования (1000 об/мин, 5 мин) клетки суспендировали в 1 мл HBSS, 50 мкл клеток разбавляли раствором трипанового синего 1:1 и количество клеток подсчитывали с применением гемоцитометра. Извлеченные спленоциты помещали в количестве 1x10 клеток на лунку в 6-луночный планшет в 2 мл среды RPMI-1640 (Welgene, LM011-01), содержащей 10% FBS (эмбриональную бычью сыворотку, Corning, 35-015-CV), и добавляли к ней 2 нг/мл антител к CD28 мыши (Ebioscience, 16-0281-82) для индукции активности Т-клеток. Одновременно клетки обрабатывали 100 ммоль пептида из примера 1 в 5% CO инкубаторе при 37°C в течение 3 ч. для оценки изменений экспрессии IFN-γ и TNF-α и в течение 72 ч. для оценки изменений экспрессии TGF-β1.
[94] После этого клетки центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин.) для удаления супернатанта, лизировали посредством пипетирования 5 мл TRIzol (Invitrogen, 15596-018) и оставляли при комнатной температуре в течение 5 мин. К клеткам добавляли 100 мкл хлороформа, смешивали при энергичном перемешивании и затем оставляли при комнатной температуре в течение 2 мин. После этого проводили центрифугирование (12000 об/мин, 15 мин.) и только супернатант осторожно переносили на новую е-пробирку объемом 1,5 мл с добавлением 300 мкл изопропанола, смешивали при легком перемешивании и затем оставляли при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем проводили центрифугирование (12000 об/мин, 15 мин.) для удаления супернатанта с промыванием в 500 мкл 70% этанола, разбавленного в обработанной DEPC (диэтилпирокарбонатом) воде (раствор LPS, CBW004), и центрифугирование (12000 об/мин, 10 мин.) для удаления супернатанта, после чего оставшийся этанол выпаривали в непокрытом состоянии. РНК элюировали путем добавления 30 мкл обработанной DEPC воды и количественно определяли.
[95] cDNA синтезировали посредством методики эксперимента для набора для синтеза cDNA (ELPISbio, EBT-1512) с применением 1 мг количественно определенной РНК. Затем в соответствии с методикой для набора для ПЦР (полимеразной цепной реакции) (Solgent, SEF01-M50H) амплифицировали cDNA каждого цитокина (IFN-γ, TNF-α, TGF-β1) и конститутивный ген GAPDH для количественного определения изменений экспрессии цитокинов. Затем продукты ПЦР подвергались электрофорезу на 2% агарозном геле, чтобы таким образом подтвердить связи ДНК, которые затем количественно определяли с применением программы Image J, и количественно определенные значения рассчитывали как процентное отношение к GAPDH. Контрольную группу обрабатывали таким же образом, как и группу обработки примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) применяли вместо пептида из примера 1 и антитела к CD28 мыши, и группу отрицательного контроля обрабатывали таким же образом, как и группу обработки примера 1, за исключением того, что PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Welgene) применяли вместо пептида из примера 1. Результаты показаны на фиг. 3 и 4. Последовательности праймера для ПЦР каждого цитокина показаны в таблице 2 ниже.
[96] [Таблица 2]
Цитокин
Последовательность оснований
SEQ ID NO:
IFN-γ
прямая
actggcaaaaggatggtgac
2
обратная
tgagctcattgaatgcttgg
3
TNF-α
прямая
agcccccagtctgtatcctt
4
обратная
ctccctttgcagaactcagg
5
TGF-β1
прямая
gcttcagctccacagag
6
обратная
ggttgtagagggcaagg
7
GAPDH
прямая
tcatgaccacagtccatgcc
8
обратная
tccaccaccctgttgctgta
9
[97] В таблице 2 t представляет собой тимин, а представляет собой аденин, с представляет собой цитозин и g представляет собой гуанин.
[98] На фиг. 3 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α, и на фиг. 4 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффекта пептида из примера 1 в отношении индукции экспрессии TGF-β1. На фиг. 3 и 4 ось х представляет собой контрольную группу {(-)}, группу отрицательного контроля (антитело к CD28) и группу обработки примера 1 (антитело к CD28 + пример 1), и на фиг. 3 и 4 ось у представляет собой уровень экспрессии мРНК в процентном отношении к GAPDH {цитокины/GAPDH (%)}.
[99] Как показано на фиг. 3, на основании результатов оценки уровней экспрессии IFN-γ и TNF-α, которые, как известно, вызывают инсулит, каждый уровень экспрессии был снижен по сравнению с группой отрицательного контроля. Следовательно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 подавлял экспрессию IFN-γ и TNF-α, что указывает на то, что развитие инсулита было подавлено, таким образом эффективно осуществляя лечение и/или предупреждение инсулита.
[100] Как показано на фиг. 4, на основании результатов оценки уровня экспрессии TGF-β1, который, как известно, поражает защиту поджелудочной железы от инсулита, уровень экспрессии был повышен по сравнению с группой отрицательного контроля. Следовательно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 индуцирует экспрессию TGF-β1, тем самым защищая поджелудочную железу от инсулита, таким образом эффективно лечит и/или предупреждает инсулит.
[101] Соответственно, можно подтвердить, что пептид из примера 1 является эффективным в лечении и/или предупреждении инсулита путем подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и/или индукции экспрессии TGF-β1.
[102] В заключение, пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением способны проявлять терапевтический и/или профилактический эффект в отношении инсулита путем подавления экспрессии IFN-γ, подавления экспрессии TNF-α и/или индукции экспрессии TGF-β1. В конечном счете, можно сделать вывод, что пептид или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с настоящим изобретением способны лечить и/или предупреждать диабет 1 типа.
[103] <Сравнительный пример 1 и сравнительный пример 2> Получение пептида
[104] Для оценки того, проявляет ли активность часть пептида из примера 1, получали пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие части аминокислотной последовательности пептида из примера 1. Пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2 представляли собой пептид (GAGAGY), состоящий из 6 аминокислот последовательно от С-конца аминокислотной последовательности (YGAGAGAGY) пептида из примера 1, и пептид (YGAGAG), состоящий из 6 аминокислот последовательно от его N-конца соответственно. Пептид из сравнительного примера 1 и пептид из сравнительного примера 2 изготавливали таким же образом, что и пептид из примера 1, на основании аминокислотной последовательности, показанной в таблице 3 ниже.
[105] [Таблица 3]
Аминокислотная последовательность
SEQ ID NO:
Сравнительный пример 1
GAGAGY
10
Сравнительный пример 2
YGAGAG
11
[106] В таблице 3 Y представляет собой тирозин (Tyr), G представляет собой глицин (Gly) и A представляет собой аланин (Ala).
[107] <Сравнительный пример> Оценка эффектов пептида из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2
[108] Для оценки того, являются ли эффективными пептиды из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1, как пептид из примера 1, проводили следующий эксперимент.
[109] Настоящий эксперимент проводили таким же образом, что и в примере 2-3, за исключением того, что пептид из сравнительного примера 1 или пептид из сравнительного примера 2 применяли вместо пептида из примера 1. Результаты показаны на фиг. 5 и 6.
[110] На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффектов пептидов из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α, и на фиг. 6 представлен график, демонстрирующий результаты анализа эффектов пептидов из сравнительных примеров 1 и 2 в отношении индукции экспрессии TGF-β1. На фиг. 5 и 6 ось х представляет собой контрольную группу {(-)}, группу отрицательного контроля (антитело к CD28) и группу обработки сравнительного примера 1 (антитело к CD28 + сравнительный пример 1) и группу обработки сравнительного примера 2 (антитело к CD28 + сравнительный пример 2) и на фиг. 5 и 6 ось у представляет собой уровень экспрессии мРНК в процентном отношении {цитокины/GAPDH (%)} к GAPDH.
[111] Как показано на фиг. 5, на основании результатов оценки уровней экспрессии IFN-γ и TNF-α, которые, как известно, вызывают инсулит, уровень их экспрессии в каждой из группы обработки сравнительного примера 1 и группы обработки сравнительного примера 2 не изменялся значительно по сравнению с группой отрицательного контроля, и вместо этого было обнаружено, что в группе обработки сравнительного примера 2 повышался уровень экспрессии TNF-α. Кроме того, как представлено на фиг. 6, на основании результатов оценки уровней экспрессии TGF-β1, которые, как известно, поражают защиту поджелудочной железы от инсулита, уровень его экспрессии в каждой из группы обработки сравнительного примера 1 и группы обработки сравнительного примера 2 не изменялся значительно по сравнению с группой отрицательного контроля. Из этих результатов можно увидеть, что пептиды из сравнительного примера 1 и сравнительного примера 2 не проявляли эффектов в отношении подавления экспрессии IFN-γ, подавления экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1, в отличие от пептида из примера 1.
[112] На основании приведенных выше результатов можно сделать вывод, что целый пептид из примера 1, а не его часть, является эффективным в отношении подавления экспрессии IFN-γ и экспрессии TNF-α и индукции экспрессии TGF-β1 и характеризуется эффектом в отношении инсулита и диабета 1 типа.
[113] <Пример получения 1> Получение инъекционного раствора
[114] Для получения 1 мл раствора 10 мг пептида, полученного таким же образом, что и в примере 1, растворяли в PBS. Этот раствор загружали в ампулу для инъекции для получения инъекционного раствора.
Промышленная применимость
[115] Настоящее изобретение является эффективным в лечении или предупреждения инсулита. Кроме того, настоящее изобретение является эффективным в лечении или предупреждения диабета 1 типа. Следовательно, настоящее изобретение является промышленно применимым.
--->
<110>    Инсол Байосайенсиз, инк.
<120>    НОВЫЙ ПЕПТИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130>    GP19010PCT
<160>    11
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    9
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    пептид
<400>    1
Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr
1               5
<210>    2
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    прямой праймер для IFN-гамма
<400>    2
actggcaaaa ggatggtgac                                                     20
<210>    3
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    обратный праймер IFN-гамма
<400>    3
tgagctcatt gaatgcttgg                                                     20
<210>    4
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    прямой праймер для TNF-альфа
<400>    4
agcccccagt ctgtatcctt                                                     20
<210>    5
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>   обратный праймер для TNF-альфа
<400>    5
ctccctttgc agaactcagg                                                     20
<210>    6
<211>    17
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    прямой праймер для TGF-бета1
<400>    6
gcttcagctc cacagag                                                        17
<210>    7
<211>    17
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    обратный праймер для TGF-бета1
<400>    7
ggttgtagag ggcaagg                                                        17
<210>    8
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    прямой праймер для GAPDH
<400>    8
tcatgaccac agtccatgcc                                                     20
<210>    9
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    обратный праймер для GAPDH
<400>    9
tccaccaccc tgttgctgta                                                     20
<210>    10
<211>    6
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    пептид
<400>    10
Gly Ala Gly Ala Gly Tyr
1               5
<210>    11
<211>    6
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    пептид
<400>    11
Tyr Gly Ala Gly Ala Gly
1               5
<---