ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К АЛЬФА-ЭНОЛАЗЕ, И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ
HUMANIZED ANTIBODIES SPECIFIC TO ALPHA-ENOLASE AND METHODS FOR USE IN ANTITUMOR THERAPY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способам получения гуманизированных антител, которые специфично связываются с человеческим белком альфа-энолазы (ENO1). Настоящее изобретение также относится к способам разработки клеточной линии, продуцирующей гуманизированные антитела к альфа-энолазе, и к способам подавления опухолевого роста и метастазирования с использованием гуманизированного антитела для связывания белков альфа-энолазы (ENO1) в опухолевых клетках.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Опухоли являются результатом аберрантной, неограниченной пролиферации одной клетки, генерирующей клон трансформированных клеток. Злокачественное новообразование характеризуется автономным ростом опухолевых клеток и способностью метастазировать в отдаленные участки.
Опухолевые клетки могут экспрессировать уникальные антигены, которые могут распознаваться иммунной системой. Опухолеспецифические антигены включают, но не ограничиваются ими, мутированные онкогены, мутированные нормальные клеточные белки, аберрантно экспрессированные клеточные белки, аномальные белки клеточной поверхности и онкогенные вирусные белки. Иммунная система рассматривает эти опухолеспецифические антигены как чужеродные и может продуцировать антитела для уничтожения этих чужеродных антиген-несущих опухолевых клеток, сохраняя при этом здоровые клетки. Поэтому идентификация иммуногенных опухолеспецифических антигенов может быть использована в качестве мишеней для клинических прогностических или терапевтических применений при лечении злокачественного новообразования.
Некоторые злокачественные новообразования могут быть идентифицированы с помощью плеврального выпота, который представляет собой избыточную жидкость в пространстве между легким и стенкой грудной клетки. Легочная карцинома, карцинома молочной железы и лимфома вызывают примерно 75% всех злокачественных плевральных выпотов. Злокачественный плевральный выпот может быть обогащен лимфоцитарными инфильтратами и опухолевыми клетками. Опухолеспецифические иммунные комплексы или аутоантитела, такие как антитела к р53, антиядерные и антитела к с-Myc, были обнаружены в эффузионных жидкостях и ассоциированы с плохим прогнозом. Некоторые легочные опухолеспецифические антигены также были идентифицированы в злокачественном выпоте, включая фрагменты цитокератина 19, нейрон-специфическую энолазу (ENO2), антиген плоскоклеточной карциномы и растворимый HLA-I и т.д..
Альфа-энолаза (энолаза-1, ENO1) представляет собой многофункциональный белок, который впервые был обнаружен в качестве ключевого фермента путей гликолиза. В нормальных условиях ENO1 экспрессируется в цитозоле. Однако также было обнаружено, что ENO1 экспрессируется на клеточных поверхностях многих опухолевых клеток в виде рецептора плазминогена и на активированных гемопоэтических клетках, таких как нейтрофилы, лимфоциты и моноциты. Известно, что положительная регуляция белков рецептора плазминогена может индуцировать каскадный ответ урокиназной системы активации плазминогена (uPAS).
Урокиназная система активатора плазминогена (uPAS) состоит из урокиназного активатора плазминогена (uPA), его родственного рецептора (uPAR) и двух специфических ингибиторов, ингибитора 1 активатора плазминогена (PAI-1) и ингибитора 2 активатора плазминогена (PAI-2). Урокиназый активатор плазминогена превращает профермент плазминогена в активную сериновую протеазу, плазмин. Плазмин вовлечен в ряд процессов тканевого ремоделирования, таких как ремоделирование базальной мембраны (BM) и внеклеточного матрикса (ECM), что необходимо для прогрессии опухоли и метастазирования. Кроме того, было показано, что uPAS может участвовать в неопластической эволюции, влияя на ангиогенез опухоли, пролиферацию злокачественных клеток, адгезию и миграцию, интраваскуляризацию и рост на метастатическом участке.
В частности, активация плазминогена может привести к деградации внеклеточного матрикса, что, в свою очередь, может привести к увеличению метастазирования опухолевых клеток и инфильтрации иммунных клеток. Другими словами, экспрессия ENO1 на поверхностях опухолевых клеток в качестве рецептора плазминогена может увеличить инвазивные активности опухолевых клеток. Таким образом, ENO1 является потенциальной мишенью для противоопухолевой терапии.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Воплощения изобретения относятся к агентам направленного связывания (например, антителам или их связывающим фрагментам), которые специфично связываются с человеческим ENO1, тем самым ингибируя связывание лиганда (например, плазминогена) с ENO1. Путем ингибирования связывания плазминогена с ENO1 агенты направленного связывания по изобретению могут ингибировать активацию плазминогена, что приводит к снижению деградации внеклеточного матрикса, что, в свою очередь, предотвращает или уменьшает диссоциацию опухолевых клеток из внеклеточного матрикса. Таким образом, агенты направленного связывания в соответствии с воплощениями изобретения могут быть использованы для ингибирования роста опухоли и метастазирования. Механизмы, посредством которых это может быть достигнуто, могут включать, но не ограничиваясь этим, ингибирование связывания лиганда (такого как плазминоген) с его рецептором ENO1, или аннулирование внутренних реакций между рецептором ENO1 и его лигандами, тем самым снижая эффективную концентрация ENO1.
Согласно одному из воплощений изобретения агентом направленного связывания является гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим ENO1, предотвращая его связывание с лигандами (например, с плазминогеном) ENO1. Предотвращение связывания плазминогена с рецептором может предотвратить активацию плазминогена. Это приводит к ингибированию урокиназной системы активации плазминогена (uPAS) во внеклеточном матриксе опухолевых клеток.
Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело может связываться с ENO1 с высокой аффинностью, как например, с Kd менее чем 0,3 нМ. Такие жестко связывающие агенты могут ингибировать ENO1 с высокой эффективностью.
Согласно некоторым воплощениям изобретения агентом направленного связывания является гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим ENO1 и ингибировать индуцированную активность плазмина на опухолевых клетках с высокой эффективностью, как например, 40%, 50%, 60%, 705,80%, 90% или 100%-ингибирование. Анализы ингибирования могут быть осуществлены путем индуцирования экспрессии ENO1 (следовательно, активации плазминогена) в опухолевой клетке (такой как клетки лимфомы человека U937) путем обработки индуктором, таким как липополисахарид (LPS) (например, 10 мкг/мл, в течение 5 часов). Ингибирование такой индуцированной активности плазмина можно оценить с использованием антитела подходящей концентрации. Используя антитело по изобретению, такое ингибирование можно детектировать при настолько низких концентрациях антитела, как 20 мкг/мл или менее.
Согласно некоторым воплощениям изобретения агентом направленного связывания является антитело, которое может связываться с человеческим ENO1. Такое антитело может быть использовано для ингибирования инвазивной активности опухолевой клетки. Например, антитела по изобретению могут ингибировать более 40%, 50%, 60% или 70% инвазивной активности клеток лимфомы человека U937 при настолько низких концентрациях антител, как 50 мкг/мл или менее.
Согласно некоторым воплощениям изобретения агентом направленного связывания является антитело, которое может связываться с человеческим ENO1, ингибируя деградацию внеклеточного матрикса, тем самым ингибируя диссоциацию опухолевых клеток из внеклеточного матрикса. Например, антитело по изобретению может ингибировать более чем 40%, 50% или 60% опосредованной плазминогеном диссоциации клеток CL1-5 из коллагена или фибронектина при настолько низких концентрациях антител, как 50 мкг/мл или менее.
Согласно воплощениям изобретения агент направленного связывания (т.е. гуманизированное антитело) может содержать аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, 10 или 11.
Согласно воплощению изобретения агент направленного связывания (т.е. гуманизированное антитело) может содержать аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2 или 9.
Согласно воплощению изобретения агент направленного связывания (т.е. антитело) может содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую область определяющую комплементарность (CDR), содержащую одну из CDR-последовательностей, включенных в последовательности 1, 10 или 11. Следует отметить, что специалисты в данной области техники могут легко определить CDR. См., например, Kabat et al., «Sequences of Proteins of Immunological Interest», Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3.
Согласно некоторым воплощениям изобретения агент направленного связывания (т.е. антитело) может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую область, определяющую комплементарность (CDR), содержащую одну из CDR-последовательностей, включенных в последовательность 2 или 9 (ФИГ. 6В ).
Согласно некоторым воплощениям изобретения агентом направленного связывания является гуманизированное антитело или его связывающий фрагмент, где антитело может быть моноклональным антителом.
Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую любую из последовательностей LCDR1, LCDR2 или LCDR3, включенных в SEQ ID NO: 9 (ФИГ. 6B).
Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую любые две из последовательностей LCDR1, LCDR2 или LCDR3, включенных в последовательность 2 или 9 (то есть LCDR1 и LCDR2, LCDR1 И LCDR3 или LCDR2 и LCDR3).
Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотные последовательности легкой цепи, которые содержат последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, включенные в последовательность 2 или 9 (ФИГ. 6B). Согласно некоторым воплощениям изобретения антитело может быть гуманизированным антителом или полностью человеческим моноклональным антителом.
Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую любую из последовательностей HCDR1, HCDR2 или HCDR3, включенных в последовательности 1, 10 или 11 (ФИГ. 6А и ФИГ. 6В).
Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая включает любые две из последовательностей HCDR1, HCDR2 или HCDR3, включенные в n последовательность 1, 10 или 11 (ФИГ. 6A и ФИГ. 6В). (то есть HCDR1 и HCDR2, HCDR1 и HCDR3 или HCDR2 и HCDR3).
Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, включенные в последовательность 1, 10 или 11 (ФИГ. 6A и ФИГ. 6B),
Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотную последовательность легкой цепи, содержащую CDR, содержащую одну из CDR-последовательностей, включенных в последовательность 2 или 9 (ФИГ. 6B). Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело может связываться с человеческим белком ENO1 и содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, содержащую CDR, содержащую одну из последовательностей, представленных в последовательностях 1, 10 или 11. Согласно некоторым воплощениям изобретения гуманизированное антитело, которое может связываться с человеческим белком ENO1, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую одну из CDR-последовательностей, включенных в последовательность 1, 10 или 11, и аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую одну из последовательностей CDR, включенных в последовательность 2 или 9.
Согласно некоторым воплощениям изобретения агент направленного связывания (т.е. антитело) может конкурировать за связывание плазминогена с человеческим белком ENO1. Согласно некоторым воплощениям изобретения указанный агент направленного связывания содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере одну из CDR-последовательностей, включенных в последовательность 1, 10 или 11, и аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую по меньшей мере одну из CDR-последовательностей, включенных в последовательность 2 или 9.
Некоторые воплощения изобретения относятся к способам анализа уровня человеческого белка ENO1 у пациента или в образце пациента. Способ по изобретению включает контактирование гуманизированного антитела к ENO1 с биологическим образцом пациента и детектирование уровня связывания между указанным антителом и человеческим белком ENO1 в указанном образце. В более конкретных воплощениях биологический образец представляет собой кровь или плазму.
Другие воплощения изобретения относятся к композициям, содержащим агент направленного связывания, который может включать гуманизированное антитело или его функциональный фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.
Другие воплощения изобретения относятся к способам эффективного лечения объекта (например, человека или животного), страдающего болезнью или расстройством, связанными с ENO1. Способ может включать в себя отбор объекта, нуждающегося в лечении неопластического или не неопластического заболевания, и введение объекту терапевтически эффективной дозы антитела (которое может быть гуманизированным или полностью человеческим моноклональным антителом), которое специфично связывается с белком ENO1.
Гуманизированное антитело по изобретению может быть использовано для лечения заболевания или расстройства, связанного с человеческим белком ENO1. Заболевание или расстройство, связанное с человеческим белком ENO1, может быть любым состоянием, возникающим в результате аберрантной активации или экспрессии человеческого белка ENO1. Примеры таких заболеваний включают в себя такие, где человеческий белок ENO1 аберрантно взаимодействует со своими лигандами, тем самым изменяя свойства клеточной адгезии или передачи клеточных сигналов. Это изменение свойств клеточной адгезии или передачи клеточных сигналов может привести к неопластическим заболеваниям или к некоторым иммунным заболеваниям.
Например, заболевание, связанное с человеческим белком ENO1, может представлять собой неопластическое заболевание, такое как рак легких, молочной железы, поджелудочной железы, печени, колоректальный рак и рак предстательной железы.
Дополнительные воплощения изобретения относятся к способам ингибирования ENO1-индуцированной диссоциации клеток из внеклеточного матрикса злокачественных новообразований объекта. Эти способы могут включать в себя отбор объекта (например, человека или животного), нуждающегося в лечении ENO1-индуцированной диссоциации клеток, и введение указанному объекту терапевтически эффективной дозы антитела, где указанное антитело специфично связывается с ENO1. Антитело представляет собой гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.
Другие воплощения изобретения относятся к применениям гуманизированного антитела при получении лекарственного средства для лечения ENO1-связанного заболевания или расстройства у объекта (например, человека или животного), где указанное антитело специфично связывается с ENO1. Антитело представляет собой гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.
Согласно некоторым воплощениям изобретения, агенты направленного связывания, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для получения лекарственного средства для лечения индуцированной белком ENO1 диссоциации клеток из внеклеточного матрикса у животного, где указанное антитело специфично связывается с ENO1. Антитело представляет собой гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.
Некоторые воплощения изобретения, описанные в настоящем документе, относятся к моноклональным антителам, которые связываются с человеческим ENO1 и влияют на функции человеческого ENO1. Другие воплощения изобретения относятся к препаратам антител к ENO1 с целевыми свойствами для применения в терапии. Такие свойства могут включать аффинность высокого связывания для ENO1, способность нейтрализовать активность ENO1 in vitro и in vivo и способность ингибировать ENO1-индуцированную диссоциацию клеток, рост и метастазирование опухолей.
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
В некоторых воплощениях, изобретение относится к гуманизированному антителу, которое может связываться с человеческим ENO1 с очень высокой аффинностью (то есть с низкой Kd). Например, гуманизированное антитело, которое способно связываться с ENO1 с Kd менее чем примерно 10, 10, 10, 10, 10, 10 или примерно 10 М или с Kd в любом диапазоне или со значением между ними. Измерения аффинности и/или авидности могут быть выполнены с использованием ИФА и/или BIACORE, как описано в настоящем документе, или в соответствии с методами, известными в данной области.
2
Понятно, что воплощения изобретения не ограничены какой-либо конкретной формой антитела или способом получения или производства. Например, антитело к ENO1 может представлять собой полноразмерное антитело (например, содержащее человеческую интактную область Fc) или фрагмент антитела (например, Fab, Fab' или F(ab'), FV или Dab (Dab представляют собой наименьшие функциональные связывающие единицы человеческих антител). Кроме того, антитело может быть получено из рекомбинантно продуцируемой клетки, которая была трансформирована или трансфецирована геном или генами, кодирующими гуманизированное антитело.
Другие воплощения изобретения относятся к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые из описанных в настоящем документе гуманизированных антител, к векторам, содержащим выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие гуманизированное антитело к ENO1, или к клетке-хозяину, трансформированной любой из таких молекул нуклеиновой кислоты.
Кроме того, некоторые воплощения изобретения относятся к способу получения гуманизированного антитела к ENO1 путем культивирования клеток-хозяев в условиях, в которых молекула нуклеиновой кислоты экспрессируется с продуцированием антитела с последующим извлечением антитела. Следует понимать, что воплощения изобретения могут также включать любую молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует гуманизированное антитело или фрагмент гуманизированного антитела по изобретению, включая последовательности нуклеиновых кислот, оптимизированные для увеличения выхода антител или их фрагментов при трансфекции в клетки-хозяева для продуцирования антитела.
Другие воплощения относятся к генерации и идентификации выделенных гуманизированных антител, которые могут специфично связываться с человеческим ENO1. Ингибирование биологической активности ENO1 может быть осуществлено этими антителами для предотвращения ENO1-индуцированной диссоциации клеток, инвазии и других целевых эффектов злокачественных новообразований.
Другие воплощения изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим эффективное количество гуманизированного антитела к ENO1. Композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В других воплощениях антитело к ENO1 или его фрагмент конъюгированы с терапевтическим агентом. Терапевтический агент может представлять собой, например, токсин или радиоизотоп.
Другие воплощения изобретения относятся к способам лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией ENO1 у пациента. Способы могут включать введение пациенту эффективного количества гуманизированного антитела к ENO1. Гуманизированное антитело к ENO1 можно вводить индивидуально или его можно вводить в комбинации с дополнительными антителами или химиотерапевтическим лекарственным средством или вместе с лучевой терапией. Например, смесь моноклональных, олигоклональных или поликлональных антител к ENO1, которые блокируют диссоциацию клеток, можно вводить в комбинации с лекарственным средством, которое, как показано, непосредственно ингибирует пролиферацию опухолевых клеток. Способ может быть осуществлен in vivo, и пациент предпочтительно является человеком. В предпочтительном воплощении способ относится к лечению заболевания или расстройства, связанного с ENO1, включая, но не ограничиваясь ими, неопластические заболевания, такие как рак легкого, молочной железы, поджелудочной железы, печени, колоректальный рак, рак предстательной железы и/или солидные опухоли.
Некоторые воплощения изобретения относятся к способу мониторинга развития злокачественного новообразования. Способ может включать определение содержания белков альфа-энолазны (ENO1) в образце (например, в опухолевых клетках), где повышенный уровень ENO1 коррелирует с тяжестью злокачественного новообразования. Согласно воплощениям изобретения представленность может быть определена путем измерения связывания антитела, специфичного к ENO1, с белками ENO1.
Некоторые воплощения изобретения относятся к способу детектирования злокачественного новообразования. Такой способ может включать определение представленности ENO1-специфичных антител в образцах сыворотки, где низкий уровень ENO1-специфичных антител указывает на наличие злокачественной опухоли.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На ФИГ. 1 представлены результаты ИФА связывания ENO1 с mAb EN10, выделенных из ацитов гибридомы. Очистку сульфатом аммония, очистку на колонке с протеином A и очистку SDS-PAGE проводили, как описано в Примере 1. Эти данные демонстрируют Kd антитела mAb EN10 к человеческому ENO1.
На ФИГ. 2 представлены результаты фибринолитического анализа U937 mAb EN10. Индукцию экспрессии ENO1 с помощью LPS в клеточной линии лимфомы человека U937 и анализ активности плазмина проводили, как описано в Примере 2. Эти результаты демонстрируют, что mAb EN10 ослабляет активность рецептора плазминогена индуцируемого белка ENO1.
На ФИГ. 3 представлены результаты инвазивной активности клеток U937, обработанных различными концентрациями mAb EN10, выделенного из гибридомы, после того как экспрессия поверхностного ENO1 клетками была индуцирована LPS. Подробные процедуры выполняли, как описано в Примере 3. Эти данные демонстрируют, что mAb EN10 ингибирует инвазивную активность клеток U937 дозозависимым образом.
На ФИГ. 4 представлено, что mAb EN10 распознает ENO1 клеточной поверхности на клетках U937, обработанных LPS. Подробные процедуры выполняли, как описано в примере 4. На гистограмме изображено, что ENO1 экспрессируется на высоком уровне на поверхности U937 после того, как клетки вводили вместе с LPS.
На ФИГ. 5А изображена аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи mAb EN10 (SEQ ID NO: 1). Изображены каркасные области (FR1, FR2, FR3 и FR4) и CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3). Клонирование mAb EN10 осуществляли, как описано в Примере 5.
На ФИГ. 5В изображена аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи mAb EN10 (SEQ ID NO: 2). Указаны каркасные области (FR1, FR2, FR3 и FR4) и CDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3). Клонирование mAb EN10 осуществляли, как описано в Примере 5.
На ФИГ. 6А представлен анализ последовательности, выполненный для гуманизации последовательностей VL (последовательность ID NO: 9) и VH (последовательности ID NO: 11) hum ENO10mAb IMGT. В первой строке, показанной с нумерацией остатков в соответствии с схемой Kabat, рамка изображена с помощью подчеркивания, и CDR по Kabat показаны подчеркиванием. Определение каркасных последовательностей VL и VH humEN10 mAb IMGT выполняли, как описано в Примере 6.
На ФИГ. 7А изображен экспрессирующий вектор для генерации химеры мышь-человек и гуманизированных вариантов mAb EN10. Подробное описание процедуры для очистки различных вариантов антител mAb EN10 описаны в Примере 7.
На ФИГ. 7В представлены результаты использования химеры EN10, hum mAb EN10 4D5 и humEN10 mAb IMGT антител для определения аффинности связывания и кинетических констант mAb EN10. Подробные процедуры экспрессии химерного антитела, очистки и анализ Kd проводили, как описано в Примере 7. Результат Kd hum mAb EN10 IMGT не является значимым по сравнению с результатом Kd химерного антитела мышь-человек EN10mAb.
На ФИГ. 8А и ФИГ. 8В представлены результаты фибринолитического анализа U937 антител humEN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT. Индукцию экспрессии ENO1 с помощью LPS в клеточной линии лимфомы человека U937 и анализ активности плазмина проводили, как описано в Примере 2. Данные демонстрируют, что так же, как mAb EN10, оба, hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT ослабляют активность рецептора плазминогена индуцируемого белка ENO1.
На ФИГ. 9А и 9В представлены результаты инвазивной активности клеток U937, обработанных различными концентрациями антител mAb 4D5 humEN10 mAb и IMGT humEN10 mAb, соответственно, после того, как экспрессия клетками поверхностного ENO1 была индуцирована LPS. Подробные процедуры были выполнены, как описано в Примере 9. Эти данные демонстрируют, что после гуманизации антитела humEN10 mAb 4D5 и humEN10 mAb IMGT обладают активностью ингибирования инвазивной активности клеток U937 дозозависимым образом.
На ФИГ. 10А изображена активность адгезии клеток карциномы легкого CL1-5 к матриксным белкам. Анализ адгезии проводили, как описано в Примере 10. Эти данные демонстрируют, что клетки CL1-5 обладают более высокой активностью адгезии к коллагену и фибронектину.
На ФИГ. 10В представлены результаты ингибирования диссоциации клеток CL1-5 из фибронектина, обработанного humEN10 mAb 4D5. Анализ клеточно-ассоциированной адгезии проводили, как описано в Примере 10. Эти данные демонстрируют, что humEN10 mAb 4D5 ингибирует активность диссоциации клеток CL1-5 от фибронектина дозозависимым образом.
На ФИГ. 10C представлены результаты ингибирования диссоциации клеток CL1-5 из коллагена, обработанного humEN10 mAb 4D5. Анализ клеточно-ассоциированной адгезии проводили, как описано в Примере 10. Эти данные демонстрируют, что humEN10 mAb 4D5 ингибирует активность диссоциации клеток CL1-5 от коллагена дозозависимым образом.
На ФИГ. 11А и ФИГ. 11В изображены эффекты антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности антител humEN10 mAb 4D5 и humEN10 mAb IMGT. Введение гуманизированных антител и эффекты клеточного лизиса клеток клеточной линии рака легкого CL1-5 проводили, как описано в Примере 11. Данные демонстрируют, что оба гуманизированных антитела EN10 создают новые активности ADCC.
На ФИГ. 12 изображены ингибирующие эффекты антител humEN10 mAb 4D5 и humEN10 mAb IMGT. Введение humEN10 mAb 4D5 и humEN10 mAb IMGT и замедление роста опухоли путем обработки антителами проводили, как описано в Примере 12. Данные демонстрируют, что введение обоих гуманизированных mAb EN10 дважды в неделю имеет эффективность в мышиной модели ксенотрансплантата CL1-5.
На ФИГ. 13А изображен анализ последовательности, проведенный для оптимизации кодонов последовательностей VL (последовательность ID NO: 9) и VH (последовательности ID NO: 10) humEN10 mAb IMGT, экспрессированного в клеточной линии CHOS. Подробные процедуры были выполнены, как описано в Примере 13.
На ФИГ. 13B изображен экспрессирующий вектор для генерации гуманизированного антитела hum EN10 IMGT в стабильной клеточной линии CHOS. Подробные процедуры были выполнены, как описано в Примере 13.
На ФИГ. 13C изображена продуктивность лучших 6 стабильных клонов CHOS, которые экспрессировали антитело hum EN10 IMGT mAb. Подробные процедуры были выполнены, как описано в Примере 13. Наши данные демонстрируют, что после оптимизации кодонов и отбора одиночной колонии степень продуктивности этих 6 лучших клонов близка к 1 г/л/15дней.
На ФИГ. 13D изображены титры антител из 15 лучших стабильных клонов, которые экспрессировали антитело hum mAb EN10 IMGT. Подробные процедуры были выполнены, как описано в Примере 13.
На ФИГ. 13Е изображены титры лучших 6 стабильных клонов, которые экспрессировали антитело humEN10 mAb IMGT. Подробные процедуры были выполнены, как описано в Примере 13.
На ФИГ. 13F изображен SDS PAGE антител, выделенных из 6 лучших стабильных клонов, которые экспрессировали антитело humEN10 mAb IMGT. Подробные процедуры были выполнены, как описано в Примере 13. Наши данные демонстрируют, что все эти клоны экспрессируют интактное антитело hum mAb EN10 IMGT.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если не указано иное, научные и технические термины, используемые в настоящем документе, будут иметь значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число. Как правило, номенклатура, используемая в связи с этим, и методы клеточной и тканевой культур, молекулярной биологии и белковой и олиго- или полинуклеотидной химии, и гибридизации, описанные в настоящем документе, хорошо известны и широко используются в данной области.
Используют стандартные методы для получения рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов и ведения тканевых клеточных культур и трансформации (например, электропорации, липофекции). Ферментативные реакции и методы очистки осуществляют согласно инструкциям производителя или так, как обычно выполняются в данной области техники или как описано в настоящем документе. Вышеупомянутые способы и процедуры обычно выполняются в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании. См., например, публикацию Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)), которая включена сюда посредством ссылки. Используемая в связи с этим номенклатура и лабораторные процедуры и методы аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии хорошо известны и обычно используются в данной области. Стандартные методы используются для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов, состава и доставки, а также для лечения пациентов.
Используемые в соответствии с настоящим раскрытием следующие термины, если не указано иное, понимают как имеющие следующие значения: Термин «и/или», используемый в настоящем документе, следует рассматривать как конкретное раскрытие каждого из двух указанных признаков или компоненты вместе с другим или без него. Например, «A и/или B» следует рассматривать как конкретное раскрытие каждого из (i) A, (ii) B и (iii) A и B, точно так же, как если бы каждый из них был представлен в данном документе индивидуально.
Антагонист может представлять собой полипептид, нуклеиновую кислоту, углевод, липид, низкомолекулярное соединение, олигонуклеотид, олигопептид, интерферирующую РНК (РНКи), антисмысловую РНК, рекомбинантный белок, антитело или конъюгаты или их слитые белки. Для обзора РНКи см. Milhavet O, Gary DS, Mattson M. P. (Pharmacol Rev. 2003 December; 55(4):629-48. Review.), а для обзора подхода с использованием антисмысловой РНК см. Opalinska JB, Gewirtz A M. (Sci STKE. 2003 Oct. 28; 2003 (206): pe47).
Связанная с заболеванием аберрантная активация или экспрессия «ENO1» может представлять собой любую аномальную, нежелательную или патологическую клеточную адгезию, например, связанную с опухолью клеточную адгезию. Заболевания, связанные с клеточной адгезией, включают, но не ограничиваются ими, несолидные опухоли, такие как лейкоз или лимфома, а также солидные опухоли, такие как меланома, немелкоклеточный рак легкого, гепатоцеллюлярная (печеночная) карцинома, рак желудка, головы и шеи, печеночной системы, желудка, груди, яичника, легкого, легкого, матки, вульвы, колоректальный рак и рак поджелудочной железы.
Термин ENO1 относится к молекуле гетеродимера энолазы, состоящей из ENO1 и ENO2 или ENO3.
Используемый в настоящем документе термин «антитело» относится в общем и целом к иммуноглобулинам, аутоантителам, моноклональным антителам и поликлональным антителам, а также к их активным фрагментам. Фрагмент может быть активным в том, что он связывается с родственным антигеном, или может быть активным в том, что он является биологически функциональным. Антитела по изобретению могут быть химерными, гуманизированными или человеческими с использованием методов, известных в данной области.
Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» относится к антителам, которые являются химически и иммунологически гомогенными, обычно продуцируемыми гибридомами. См. A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
Используемый в настоящем документе термин «поликлональное антитело» относится к антителам, которые продуцируются более чем одним клоном плазматических клеток (В-лимфоцитов), синтезирующих антитела, в ответ на тот же самый антиген. Они, как правило, продуцируются животным после его иммунизации антигеном.
Используемый в настоящем документе термин «химерное антитело» относится к антителам, которые содержат последовательности из более чем одного источника. Например, такие антитела могут содержать последовательности из животных источников, но не из человека, которые затем модифицируют путем введения человеческих последовательностей.
Используемый в настоящем документе термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, в котором минимальные части животных, но не человеческих, антител вводят в другое человеческое антитело.
Используемый в настоящем документе термин «человеческое антитело» относится к антителу, в котором по существу каждая часть белка по существу не иммуногенна для людей, и которое имеет незначительные изменения или вариации последовательности.
Используемый в настоящем документе термин «антитело, специфичное к альфа-энолазе», относится к антителу, которое обладает высокой специфичностью к ENO1 млекопитающих, но не к ENO2 или ENO3.
Используемый в настоящем документе термин «антитело, специфичное к ENO1», относится к антителу, которое связывается с белком альфа-энолазы.
Термин «нейтрализация», когда речь идет об агенте направленного связывания, таком как антитело, относится к способности указанного агента направленного связывания устранять или значительно уменьшать активность антигена-мишени. Соответственно, «нейтрализующее» антитело к ENO1 способно устранять или значительно уменьшать активность ENO1. Нейтрализующее антитело к ENO1 может, например, действовать, блокируя связывание ENO1 с плазминогеном. Блокируя это связывание, диссоциация клеток, опосредуемая плазминогеном, значительно или полностью устраняется. В идеальном случае нейтрализующее антитело против ENO1 усиливает клеточную адгезию.
Используемый в настоящем документе термин «выделенный полинуклеотид» означает полинуклеотид, который был выделен из его естественной среды. Такие полинуклеотиды могут быть геномными, кДНК или синтетическими. Выделенные полинуклеотиды предпочтительно не ассоциированы со всеми или с частью полинуклеотидов, с которыми они ассоциированы в природе. Выделенные полинуклеотиды могут быть функционально связаны с другим полинуклеотидом, с которым они не связаны в естественной среде. Кроме того, выделенные полинуклеотиды предпочтительно не встречаются в природе в виде части более крупной последовательности.
Термин «выделенный белок», на который ссылаются в настоящем документе, означает белок, который был выделен из его естественной среды. Такие белки могут быть получены из геномной ДНК, кДНК, рекомбинантной ДНК, рекомбинантной РНК, или могут иметь синтетическое происхождение или являются их комбинацией, где в силу своего происхождения или источника получения «выделенный белок» (1) не ассоциирован с белками, встречающимися в природе (2) не содержит других белков из того же источника, например, свободен от мышиных белков, (3) экспрессируется клеткой другого вида или (4) не встречается в природе.
Термин «полипептид» используется в настоящем документе как общий термин для обозначения нативного белка, фрагментов или аналогов полипептидной последовательности. Следовательно, нативный белок, фрагменты и аналоги представляют собой виды полипептидного происхождения. Предпочтительные полипептиды согласно изобретению содержат молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина человека и молекулы легкой цепи каппа иммуноглобулина человека, а также молекулы антител, образованные комбинациями, включающими молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина с молекулами легкой цепи иммуноглобулина, такими как молекулы легкой цепи каппа или лямбда иммуноглобулина и наоборот, а также их фрагменты и аналоги. Предпочтительные полипептиды согласно изобретению могут также содержать исключительно молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина человека или их фрагменты.
Термин «природный», используемый в настоящем документе при применении к объекту, относится к тому факту, что объект встречается в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории или иным образом, является природной.
Используемый в настоящем документе термин «функционально связанный» относится к положениям описанных компонентов, которые находятся в связи, позволяющей им функционировать предназначенным образом. Например, контрольная последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, связана таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с контрольными последовательностями.
Используемый в настоящем документе термин «полинуклеотид» означает полимерную форму нуклеотидов, состоящих, по меньшей мере, из 10 оснований в длину, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, либо модифицированных форм нуклеотидов любого типа или гетеродуплексов РНК-ДНК. Термин включает одно- и двухцепочечные формы ДНК.
Используемый в настоящем документе термин «олигонуклеотид» включает встречающиеся в природе и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом природными и искусственными связями. Олигонуклеотиды представляют собой подгруппу полинуклеотидов, имеющих, как правило, длину 200 оснований или менее. Предпочтительно, олигонуклеотиды имеют длину от 10 до 60 оснований и наиболее предпочтительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 оснований. Олигонуклеотиды обычно являются одноцепочечными, например, для зондов; хотя олигонуклеотиды могут быть двухцепочечными, например, для использования при конструировании генного мутанта. Олигонуклеотиды могут быть либо смысловыми, либо антисмысловыми олигонуклеотидами.
Используемый в настоящем документе термин «природные нуклеотиды» включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Используемый в настоящем документе термин «модифицированные нуклеотиды» включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахара и тому подобное. Используемый в настоящем документе термин «олигонуклеотидные связи» включает олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфороселеноатные, фосфородиселеноатные, фосфоранилинотиоатные, фосфораниладатные, фосфорамидатные и тому подобное. См., например, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., U.S. Pat. No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), раскрытие которых включено в настоящее описание с помощью ссылки. Олигонуклеотид может включать метку для детектирования, если это желательно.
Термин «область CDR» или «CDR» предназначен для обозначения гипервариабельных областей тяжелых или легких цепей иммуноглобулина, как определено Kabat et al., 1991 (Kabat, EA et al., (1991)). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), и более поздние издания. Антитело, как правило, содержит 3 CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термин CDR или CDRs используют в настоящем документе для указания соответственно случаю одной из этих областей или нескольких или даже всех полностью, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинное связывание антитела с антигеном или эпитопом, который оно распознает.
Среди шести коротких CDR-последовательностей третья CDR тяжелой цепи (HCDR3) имеет большую вариабельность по размеру (большее разнообразие по существу связано с механизмами расположения генов, которые приводят к ее возникновению). Она может быть настолько короткой, как 2 аминокислоты, хотя самый длинный известный размер составляет 26. Длина CDR также может варьироваться в зависимости от длины, которая может быть установлена конкретной каркасной структурой. Функционально HCDR3 играет роль в определении специфичности антитела (Segal et al., PNAS, 71: 4298-4302, 1974, Amit et al., Science, 233: 747-753, 1986, Chothia et Al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987, Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989, Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990, Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991).
Используемый в настоящем документе термин «набор CDR» включает CDR1, CDR2 и CDR3. Таким образом, набор HCDR относится к HCDR1, HCDR2 и HCDR3 (HCDR относится к CDR вариабельной области тяжелой цепи), а набор LCDR относится к LCDR1, LCDR2 и LCDR3 (LCDR относится к CDR вариабельной области легкой цепи). Если не указано иное, «набор CDR» включает в себя HCDR и LCDR.
Две аминокислотные последовательности являются «гомологичными», если имеется частичная или полная идентичность между их последовательностями. Например, 85%-ная гомология означает, что 85% аминокислот идентичны, когда две последовательности выровнены для максимального соответствия. Пропуски (в любой из двух согласованных последовательностей) допускаются при максимизации соответствия; длина пропуска 5 или менее предпочтительна, причем 2 или менее является более предпочтительной. Альтернативно и предпочтительно, две белковые последовательности (или полипептидные последовательности, полученные из них, длиной по меньшей мере примерно 30 аминокислот) являются гомологичными, поскольку этот термин используется в настоящем документе, если они имеют показатель выравнивания более чем 5 (в единицах стандартного отклонения) с использованием программы ALIGN с матрицей данных мутаций и штрафом за пропуск 6 или выше. См. Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10. Две последовательности или их части более предпочтительно гомологичны, если их аминокислоты идентичны на 50% или более при оптимальном выравнивании с использованием программы ALIGN. Следует принимать во внимание, что в двух ортологичных последовательностях могут быть разные области гомологии. Например, функциональные сайты ортологов мыши и человека могут иметь более высокую степень гомологии, чем нефункциональные области.
Термин «соответствует» используется в настоящем документе для обозначения того, что полинуклеотидная последовательность является гомологичной (то есть идентична, а не строго эволюционно связана) всей или части эталонной полинуклеотидной последовательности, или что полипептидная последовательность идентична эталонной полипептидной последовательности.
В противоположность этому термин «комплементарный» используется в настоящем документе для обозначения того, что комплементарная последовательность гомологична всей или части эталонной полинуклеотидной последовательности. Для иллюстрации, нуклеотидная последовательность «TATAC» соответствует эталонной последовательности «TATAC» и комплементарна эталонной последовательности «GTATA».
Термин «идентичность последовательности» означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности идентичны (то есть на основе нуклеотид с нуклеотидом или остаток с остатком) в окне сравнения. Термин «процент идентичности последовательности» вычисляют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, определения количества положений, при которых присутствуют идентичные основания нуклеиновой кислоты (например, A, T, C, G, U или I) или аминокислотные остатки в обеих последовательностях, с получением количества совпадающих положений, путем деления количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения (то есть размер окна) и умножения результата на 100, с получением процента идентичности последовательности.
Используемые в настоящем документе термины «существенная идентичность» или «по существу идентичные» означают характеристику полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, где полинуклеотид или аминокислота содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 85 процентов идентичности последовательности, предпочтительно, по меньшей мере, 90-95 процентов идентичность последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью в окне сравнения, составляющей, по меньшей мере, 18 нуклеотидных (6 аминокислотных) положений, в окне, составляющем, по меньшей мере, 24-48 нуклеотидов (8-16 аминокислот), где процент идентичности последовательности вычисляют путем сравнения эталонной последовательности с последовательностью, которая может включать делеции или добавления, которые составляют суммарно 20 процентов или менее от эталонной последовательности в окне сравнения. Эталонная последовательность может представлять собой часть более крупной последовательности.
При использовании в настоящем документе, двадцать стандартных аминокислот и их аббревиатуры представлены согласно традиционному использованию. См. публикацию Immunology--A Synthesis (2.sup.nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), которая включена в настоящий документ с помощью ссылки. Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати стандартных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нестандартные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами для полипептидов настоящего изобретения. Примеры нестандартных аминокислот включают: 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемом в настоящем документе обозначении полипептидов левое направление представляет собой аминоконцевое направление, а правое направление представляет собой карбокси-концевое направление в соответствии со стандартным использованием и соглашением.
Аналогично, если не указано иное, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей представляет собой 5'-конец; левое направление двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей обозначается как 5'-направление. Направление 5' к 3' добавления зарождающихся РНК-транскриптов называется направлением транскрипции; области последовательности на цепи ДНК, имеющие ту же последовательность, что и РНК, и которые являются 5' по отношению к 5'-концу РНК-транскрипта, обозначаются «последовательностями, расположенными в 5'-области»; области последовательности на цепи ДНК, имеющие такую же последовательность, что и РНК, и которые являются 3' по отношению к 3'-концу РНК-транскрипта, обозначаются «последовательностями, расположенными в 3'-области».
В применении к полипептидам термин «существенная идентичность» означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, как например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием штрафа за пропуск, имеют, по меньшей мере, 80 процентов идентичности последовательности, предпочтительно, по меньшей мере, 90 процентов идентичности последовательностей, более предпочтительно, по меньшей мере, 95% идентичности последовательности и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99% идентичности последовательности. Предпочтительно, положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Консервативные аминокислотные замены относятся к взаимозаменяемости остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, представляет собой глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих алифатически-гидроксильные боковые цепи, представляет собой серин и треонин; группа аминокислот, содержащих амидосодержащие боковые цепи, представляет собой аспарагин и глутамин; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, представляет собой фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, имеющих основные боковые цепи, представляет собой лизин, аргинин и гистидин; и группа аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, представляет собой цистеин и метионин. Предпочтительные консервативные аминокислотные группы замещения представляют собой: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамино-аспарагиновый и аспарагин-глутамин.
Как обсуждалось в настоящем документе, небольшие вариации в аминокислотных последовательностях антител или молекул иммуноглобулина рассматриваются как охваченные настоящим изобретением, при условии, что изменения в аминокислотной последовательности сохраняют, по меньшей мере, примерно 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, 90%, 95% и наиболее предпочтительно примерно 99% идентичности последовательности с антителами или молекулами иммуноглобулина, описанными в настоящем документе. В частности, предполагаются консервативные замены аминокислот. Консервативные замены - это те, которые происходят внутри семейства аминокислот, имеющих родственные боковые цепи. Генетически кодированные аминокислоты обычно делятся на семейства: (1) кислотные=аспартат, глутамат; (2) основные=лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные=аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные=глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Более предпочтительные семейства представляют собой: серин и треонин являются алифатически-гидроксисодержащим семейством; аспарагин и глутамин являются амидосодержащим семейством; аланин, валин, лейцин и изолейцин являются алифатическим семейством; и фенилаланин, триптофан и тирозин являются ароматическим семейством. Например, целесообразно ожидать, что изолированная замена лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаматом, треонина серином или аналогичная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не будет иметь сильного влияние на функцию связывания или свойства полученной молекулы, особенно если замена не включает аминокислоту внутри каркасного сайта.
Приводит ли замена аминокислоты к получению функционального пептида, можно легко определить, анализируя специфическую активность производного полипептида. Анализы подробно описаны в настоящем документе. Фрагменты или аналоги антител или молекул иммуноглобулинов могут быть легко получены специалистами в данной области. Предпочтительные амино- и карбокси-концевые фрагменты или аналоги находятся вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы путем сравнения данных нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с общедоступными или частными базами последовательностей. Предпочтительно, компьютеризированные методы сравнения используются для идентификации последовательностей мотивов или предполагаемых конформационных доменов белка, которые встречаются в других белках известной структуры и/или функции. Методы идентификации белковых последовательностей, которые складываются в известную трехмерную структуру, известны. Bowie et al., (1991) Science 253:164. Таким образом, приведенные выше примеры демонстрируют, что специалисты в данной области могут распознавать последовательности мотивов и структурные конформации, которые могут быть использованы для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с описанными в настоящем документе антителами.
Следующий аспект изобретения представляет собой агент направленного связывания или молекулу антитела, содержащую домен VH, который имеет, по меньшей мере, примерно 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с доменом VH любого из антител, представленных в последовательностях 1, в прилагаемом списке последовательностей, антитела, описанного в настоящем документе, или с HCDR (например, HCDR1, HCDR2 или HCDR3), представленном в последовательностях 1. Агент направленного связывания или молекула антитела необязательно также может содержать домен VL, который имеет, по меньшей мере, примерно 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с доменом VL любого из антител, представленных в последовательностях 2, в прилагаемом списке последовательностей, антитела, описанного в настоящем документе, или с LCDR (например, LCDR1, LCDR2 или LCDR3), представленном в последовательностях 2. Алгоритмы, которые можно использовать для вычисления % идентичности двух аминокислотных последовательностей, включают, например, BLAST (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448) или алгоритм Смита-Уотермана (Smith and Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197), например, используя параметры по умолчанию. В некоторых воплощениях, агент направленного связывания или антитело, которое имеет идентичность аминокислотной последовательности, как описано выше, проявляет по существу ту же активность, что и указанные антитела. Например, по существу, одна и та же активность включает, по меньшей мере, одну активность, которая отличается от активности эталонных антител не более чем примерно на 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1% или менее.
Антигенсвязывающий сайт обычно образован вариабельным доменом тяжелой цепи (VH) и вариабельным доменом легкой цепи (VL) иммуноглобулина с антигенсвязывающей областью контакта, образованной шестью поверхностными полипептидными петлями, называемыми областями определения комплементарности (CDR). Есть три CDR в каждой VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и в каждой VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), вместе с каркасными областями (FR).
Как правило, домен VH спарен с VL-доменом, чтобы обеспечить антиген-связывающий сайт антигена, хотя индивидуально домен VH или VL можно использовать для связывания антигена. Домен VH (например, из последовательностей 1) может быть спарен с доменом VL (например, из последовательностей 2), так что образуется антигенсвязывающий сайт антитела, содержащий как домен VH, так и VL. Аналогичные воплощения предусмотрены для других доменов VH и VL, описанных в настоящем документе. В других воплощениях, цепи VH в последовательностях 1 спарены с гетерологичным доменом VL. В данной области хорошо известна разнородность легкой цепи. Опять же, аналогичные воплощения предусмотрены изобретением для других доменов VH и VL, описанных в настоящем документе. Таким образом, VH родительской или любой из цепей антител на последовательностях 2 может быть спарена с VL родительской или любого из антител на последовательностях 1 и 2, или другого антитела.
Антигенсвязывающий сайт может содержать набор H и/или L CDR родительского антитела или любого из антител в последовательностях 1 и 2, содержащими настолько много аминокислотных добавлений, замен, делеций и/или вставок, как двадцать, шестнадцать, десять, девять или менее, например одну, две, три, четыре или пять внутри описанного набора H и/или L CDR. Такие модификации могут быть потенциально сделаны на любом остатке в наборе CDR.
Предпочтительными аминокислотными заменами являются те, которые: (1) снижают восприимчивость к протеолизу, (2) снижают восприимчивость к окислению, (3) изменяют аффинность связывания для образования белковых комплексов, (4) изменяют аффинности связывания и (4) придают или модифицируют другие Физико-химические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать различные мутантные белки с последовательностями, отличными от природной пептидной последовательности. Например, одиночные или множественные замены аминокислот (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны в природной последовательности (предпочтительно в части полипептида вне домена(ов), образующего межмолекулярные контакты. Консервативная аминокислотная замена не должна существенно изменять структурные характеристики родительской последовательности (например, аминокислотная замена не должна иметь тенденцию нарушать спираль, которая возникает в родительской последовательности, или нарушать другие типы вторичной структуры, которая отличает родительскую последовательность). Примеры известных в данной области полипептидных вторичных и третичных структур описаны в публикациях Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); и Thornton et at. Nature 354: 105 (1991), которые включены в настоящее описание с помощью ссылки.
Следующий аспект изобретения представляет собой молекулу антитела, содержащую домен VH, который имеет, по меньшей мере, примерно 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с доменом VH любого из антител, перечисленных в последовательностях 1, в прилагаемом списке последовательностей или описанных в настоящем документе, или с HCDR (например, HCDR1, HCDR2 или HCDR3), представленном в последовательностях 1. Молекула антитела необязательно также может содержать домен VL, который имеет, по меньшей мере, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности аминокислотной последовательности с доменом VL любого из антител, представленных в последовательностях 2, в прилагаемом списке последовательностей, или описанных в настоящем документе, или с LCDR (например, LCDR1, LCDR2 или LCDR3), представленным в последовательностях 2. Алгоритмы, которые можно использовать для расчета % идентичности двух аминокислотных последовательностей, включают, например, BLAST (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448) или алгоритм Смита-Уотермана (Smith and Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197), например, используя параметры по умолчанию.
Следующий аспект изобретения представляет собой молекулу антитела, содержащую домен VH, который имеет, по меньшей мере, примерно 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с доменом VH любого из антител, перечисленных в последовательностях 1, или с HCDR (например, HCDR1, HCDR2 или HCDR3), представленном в последовательностях 1. Молекула антитела необязательно также может содержать домен VL, который имеет, по меньшей мере, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности аминокислотной последовательности с доменом VL любого из антител, представленных в последовательностях 2, в прилагаемом списке последовательностей, или описанных в настоящем документе, или с LCDR (например, LCDR1, LCDR2 или LCDR3), представленным в последовательностях 2.
Варианты доменов VH и VL и CDR по настоящему изобретению, включая те, для которых аминокислотные последовательности приведены в настоящем документе и которые могут применяться в агентах направленного воздействия и антителах человеческого белка ENO1, могут быть получены с помощью способов изменения последовательности или мутации и скрининга для нацеливания на антиген с желаемыми характеристиками. Примеры желаемых характеристик включают, но не ограничиваются ими: увеличенную аффинность связывания с антигеном по отношению к известным антителам, которые являются специфичными для антигена; повышенная нейтрализация активности антигена по отношению к известным антителам, которые являются специфичными для антигена, если активность известна; определенную конкурентную способность с известным антителом или лигандом к антигену при определенном молярном отношении; способность к иммунопреципитации комплекса; способность связываться с определенным эпитопом; линейный эпитоп, например, пептидная последовательность, идентифицированная с использованием пептидсвязывающего сканирования, как описано в настоящем документе, например, с использованием пептидов, скринированных в линейной и/или ограниченной конформации; конформационный эпитоп, образованный расположенными отдельно остатками; способность модулировать новую биологическую активность человеческого белка ENO1 или молекулы нижних сигнальных путей. Такие способы также представлены в настоящем документе.
Следующий аспект настоящего изобретения относится к агенту направленного связывания (т.е. к антителу), включая те, для которых аминокислотные последовательности, которые связываются с эпитопным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, примерно 60, 70, 80, 85, 90, или примерно 92% идентичности аминокислотной последовательности, с последовательностями, приведенными в последовательностях 9 или 10 человеческого белка ENO1, и могут быть использованы для лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с человеческим белком ENO1. Заболевание или расстройство, связанное с человеческим ENO1, может быть любым состоянием, возникающим из-за аберрантной активации или экспрессии человеческого белка ENO1. В одном примере заболевание, связанное с человеческим белком ENO1, представляет собой неопластическое заболевание, такое как немелкоклеточный рак легкого, гепатоцеллюлярная (печеночная) карцинома, рак желудка (желудка), рак молочной железы, аденокарцинома поджелудочной железы.
Варианты молекул антител, описанных в настоящем документе, могут быть получены и использованы в настоящем изобретении. Следуя примеру вычислительной химии при применении методов анализа многомерных данных в отношении структуры/свойства-активности ((Wold, et al., Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics - Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984) количественные отношения активности и свойств антител могут быть получены с использованием известных математических методов, таких как статистическая регрессия, распознавание и классификация образов (Norman et al., Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995); Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (Oct. 11, 1999); Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002); Ghose, Amp K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery). Свойства антител могут быть получены на основе эмпирических и теоретических моделей (например, анализ вероятных контактных остатков или расчетного физико-химического свойства) последовательности антител, функциональных и трехмерных структур, и эти свойства можно рассматривать отдельно и в комбинации.
Антигенсвязывающий сайт антитела, состоящий из домена VH и домена VL, обычно образован шестью петлями полипептида: три из вариабельного домена легкой цепи (VL) и три из вариабельного домена тяжелой цепи (VH). Анализ антител известной атомной структуры выявил взаимосвязи между последовательностью и трехмерной структурой сайтов, объединяющих антитела. Из этой взаимосвязи следует, что, за исключением третьей области (петля) в доменах VH, петли сайтов связывания имеют одну из небольшого числа конформаций главной цепи: канонические структуры. Было показано, что каноническая структура, сформированная в конкретной петле, определяется ее размером и наличием определенных остатков на ключевых участках как в петле, так и в каркасных областях.
Это исследование взаимосвязи последовательности-структуры может быть использовано для предсказания этих остатков в антителе известной последовательности, но неизвестной трехмерной структуры, которая важна для поддержания трехмерной структуры его CDR-петель и, следовательно, сохранения специфичности связывания, Эти прогнозы могут быть подкреплены путем сравнения прогнозов с результатами экспериментов по оптимизации. В структурном подходе может быть создана модель молекулы антитела с использованием любого свободно доступного или коммерческого пакета программ, такого как WAM. Затем программный пакет для визуализации и анализа белков, такой как Insight II (Accelrys, Inc.) или Deep View, может использоваться для оценки возможных замен в каждом положении в CDR. Затем эта информация может использоваться для того, чтобы сделать замены с минимальным или полезным влиянием на активность.
Методы, необходимые для создания замен в аминокислотных последовательностях CDR, доменах VH или VL антител и/или агентов связывания, в общем случае доступны в данной области. Могут быть созданы варианты последовательностей, причем замены, которые, как можно или нельзя спрогнозировать, оказывают минимальное или полезное влияние на активность, и могут быть протестированы на способность связывать и/или нейтрализовать и/или на любое другое целевое свойство.
Варианты аминокислотной последовательности вариабельного домена любого из доменов VH и VL, последовательности которых конкретно раскрыты в настоящем документе, могут быть использованы, как обсуждалось, согласно настоящему изобретению.
Используемый в настоящем документе термин «полипептидный фрагмент» относится к полипептиду, который имеет аминоконцевую и/или карбокси-концевую делецию, но где оставшаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям в природной последовательности, выведенной, например, из полноразмерной последовательности кДНК. Фрагменты обычно имеют длину, составляющую, по меньшей мере, примерно 5, 6, 8 или 10 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 14 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 20 аминокислот в длину, обычно, по меньшей мере, примерно 50 аминокислот в длину и еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 70 аминокислот. Используемый в настоящем документе термин «аналог» относится к полипептидам, которые состоят из сегмента, составляющего, по меньшей мере, примерно 25 аминокислот, который имеет существенную идентичность с частью выведенной аминокислотной последовательности, и который имеет, по меньшей мере, одно из следующих свойств: (1) специфичное связывание с человеческим белком ENO1 в подходящих условиях связывания, (2) способность блокировать связывание соответствующего лиганда/белка ENO1 или (3) способность ингибировать активность белка ENO1. Как правило, полипептидные аналоги содержат консервативную аминокислотную замену (или добавление или делецию) по отношению к природной последовательности. Аналоги, как правило, имеют длину, составляющую, по меньшей мере, 20 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 50 аминокислот в длину или более, и часто могут быть иметь длину, соответствующую полноразмерному природному полипептиду.
Используемый в настоящем документе термин «антитело» относится к полипептиду или группе полипептидов, которые состоят из, по меньшей мере, одного домена связывания, который образуется в результате сворачивания полипептидных цепей, имеющих трехмерные связывающие пространства с внутренними поверхностными формами и распределениями заряда, дополняющими особенности антигенной детерминанты антигена. Антитело, как правило, имеет тетрамерную форму, содержащую две идентичные пары полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну «легкую» и одну «тяжелую» цепь. Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют сайт связывания антитела.
При использовании в настоящем документе «агент направленного связывания» представляет собой агент, например антитело, или его связывающий фрагмент, который предпочтительно связывается с сайтом-мишенью. В одном воплощении, агент направленного связывания является специфичным только для одного сайта-мишени. В других воплощениях агент направленного связывания специфичен для более чем одного сайта-мишени. В одном воплощении, агент направленного связывания может представлять собой моноклональное антитело, и сайт-мишень может быть эпитопом. Как описано ниже, агент направленного связывания может содержать, по меньшей мере, один антигенсвязывающий домен антитела, где указанный домен слит или содержится в гетерологичном белке.
2
«Связывающие фрагменты» антитела получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab'), Fv и одноцепочечные антитела. Под антителом, отличным от «биспецифического» или «бифункционального» антитела, понимают, что каждый из его сайтов связывания идентичен. Антитело по существу ингибирует адгезию рецептора с контррецептором, когда избыток антитела уменьшает количество рецептора, связанного с контррецептором, по меньшей мере, на 20, 40, 60 или 80% и, чаще, более чем примерно на 85% (как измерено в анализе конкурентного связывания in vitro).
Антитело может быть олигоклональным, поликлональным антителом, моноклональным антителом, химерным антителом, CDR-привитым антителом, мультиспецифическим антителом, биспецифическим антителом, каталитическим антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом, полностью человеческим антителом, антиидиотипическим антителом и антителом, которое может быть помечено в растворимой или связанной форме, а также их фрагментами, вариантами или их производными либо индивидуально, либо в комбинации с другими аминокислотными последовательностями, которые обеспечиваются известными способами. Антитело может быть из любого вида. Термин антитело также включает связывающие фрагменты антител по изобретению; примерные фрагменты включают Fv, Fab, Fab', одноцепочечное антитело (svFC), димерную вариабельную область (Диатело) и дисульфидную стабилизированную вариабельную область (dsFv).
2
Было показано, что фрагменты цельного антитела могут выполнять антиген-связывающую функцию. Примерами связывающих фрагментов являются (Ward, ES et al., (1989) Nature 341, 544-546) Fab-фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного антитела; (iv) фрагмент dAb (Ward, ES et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490], который состоит из домена VH или VL, (v) выделенные области CDR, (vi) фрагменты F(ab'), двухвалентный фрагмент, содержащий два связанных Fab-фрагмента (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), где домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, который позволяет двум доменам связываться с образованием антигенсвязывающего сайта (Bird et al., (1988) Science, 242, 423- 426, Huston et al., (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) биспецифичные одноцепочечные Fv-димеры (PCT/US92/09965) и (ix) «диатела», многовалентные или мультиспецифические фрагменты, сконструированные слиянием генов (WO94/13804, Holliger, P. (1993) и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448). Молекулы Fv, scFv или диател могут быть стабилизированы путем введения дисульфидных мостиков, связывающих домены VH и VL (Reiter, Y. et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Минитела (Minibodies), содержащие scFv, присоединенные к СН3-домену, также могут быть получены (Hu, S. et al., (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061). Другими примерами связывающих фрагментов являются Fab', который отличается от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH1 тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела, и Fab'-SH, который представляет собой фрагмент Fab', в котором остаток(остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу.
Термин «эпитоп» включает любую детерминанту белка, способную к специфичному связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. Детерминанты эпитопов обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахара, и могут, но не всегда, иметь специфические трехмерные структурные характеристики, а также характеристики удельного заряда. Говорят, что антитело специфично связывается с антигеном, когда константа диссоциации составляет ≤ 1 мкМ, предпочтительно ≤ 100 нМ и наиболее предпочтительно ≤ 10 нМ.
Термин «агент» используется в настоящем документе для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов.
«Активный» или «активность» в отношении полипептида ENO1 относится к части полипептида ENO1, которая обладает биологической или иммунологической активностью нативного полипептида ENO1. «Биологический» при использовании в настоящем документе относится к биологической функции, которая возникает в результате активности нативного полипептида ENO1. Предпочтительная биологическая активность ENO1 включает, например, ENO1-индуцированную активность плазминогена.
«Млекопитающее» при использовании в настоящем документе относится к любому животному, которое считается млекопитающим. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.
2
2
Гидролиз антител ферментом папаин приводит к получению двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, известных также как фрагмент «Fab», и фрагмент «Fc», не имеющий антигенсвязывающей активности, но обладающий способностью к кристаллизации. Гидролиз антител ферментом пепсин приводит к получению фрагмента F(ab'), в котором два плеча молекулы антитела остаются связанными и содержат два антиген-связывающих сайта. Фрагмент F(ab') обладает способностью сшивать антиген.
Используемый в настоящем документе «Fv» относится к минимальному фрагменту антитела, который сохраняет как антигенраспознающие, так и антигенсвязывающие сайты. Используемый в настоящем документе «Fab» относится к фрагменту антитела, который содержит константный домен легкой цепи и домен CH1 тяжелой цепи. Термин «mAb» относится к моноклональному антителу.
Используемый в настоящем документе термин «фармацевтический агент или лекарственное средство» относится к химическому соединению или композиции, способным индуцировать целевой терапевтический эффект при соответствующем введении пациенту. Другие химические термины используются в настоящем документе в соответствии с их обычным использованием в данной области техники, примером которой является The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), (включенный в настоящий документ ссылкой).
Используемый в настоящем документе термин «по существу чистый» означает, что вид объекта является преобладающим видом из присутствующих (то есть на молярной основе он является более представленным, чем любые другие индивидуальные виды в композиции), и предпочтительно по существу очищенная фракция представляет собой композицию, где вид объекта составляет, по меньшей мере, примерно 50% (по молярной основе) всех присутствующих видов макромолекул. Как правило, по существу чистая композиция будет содержать более чем примерно 80% всех видов макромолекул, присутствующих в композиции, более предпочтительно более чем примерно 85%, 90%, 95% и 99%. Наиболее предпочтительно, чтобы вид объекта был очищен до существенной гомогенности (виды загрязняющих веществ не могут детектироваться в композиции обычными методами детектирования), где композиция состоит по существу из одного вида макромолекул.
Термин «пациент» включает человека и ветеринарные объекты.
Используемый в настоящем документе термин «мониторинг» относится к процессу детектирования и/или наблюдения за развитием злокачественного новообразования путем определения представленности белка ENO1 в опухолевых клетках.
Методы определения представленности ENO1 включают, но не ограничиваются ими, измерение связывания белков ENO1 и ENO1-специфичных антител, Вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, иммуногистохимию (IHC), ОТ-ПЦР и/или анализ микрочипов.
ПРИМЕРЫ
На практике в настоящем изобретении могут применяться технологии, включающие стандартные методы клеточной биологии, клеточной культуры, технологии антител и генной инженерии, которые находятся в пределах обычных навыков в данной области. Такие методы полностью объяснены в литературе.
Следующие примеры иллюстрируют разработку и применение ENO1-специфичных антител для подавления роста опухоли путем индукции иммунного ответа против ENO1.
Пример 1
ИФА связывания ENO1 с антителом mAb EN10
6
Для оценки аффинности связывания ENO1 с антителом mAb EN10 к человеческому ENO1 гибридомы выращивали в RPMI, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Через одну неделю культивирования собирали 1×10 клеток, промывали PBS, ресуспендировали в 200 мкл среды RPMI и вводили мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) путем инъекции IP. Через три недели ациты мышей собирали и разбавляли до 15 мл. Антитело дополнительно очищали 40% сульфатом аммония и на колонке с Протеином А (набор для очистки антител Montage antibody purification kit Millipore). Очищенное антитело концентрировали с помощью центрифужного фильтрующего устройства Amicon Ultra-15 в соответствии с протоколами, предоставленными производителем (Millpore). Чистоту антител анализировали с помощью 12% SDS PAGE.
-12
-8
Четыреста (400) нг человеческого белка ENO1 наносили в виде покрытия на 96-луночный ИФА-планшет, и планшет дополнительно промывали PBS. Серийные разведения от 1×10 до 1×10 М антитела mAb EN10 добавляли на планшет, и планшет инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Добавляли козьи антимышиные IgG, конъюгированные с гипоксантин фосфорибозилтрансферазой (HPRT). Через 1 час добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB) и считывали OD405. Каждое исследование повторяли три раза. Данные были представлены как среднее ± SD (СКО). Показания OD и концентрации антител использовали для создания диаграммы рассеяния множества данных с использованием Sigmaplot. Значения Kd были спрогнозированы с помощью 4-параметрической логистической регрессии.
-10
-10
Результаты этого эксперимента представлены на ФИГ. 1. Антитела mAb EN10 имели продуктивность от 20,4 до 4,6 мг на мышей. Значение Kd антитела mAb EN10 составило 2,03 ± 0,12×10 М (N=3). Этот результат указывает на то, что антитело mAb EN10 может распознавать человеческий белок ENO1 и имеет благоприятную аффинность со значением Kd примерно 2,03 ± 0,12×10 М (N=3).
Пример 2
6
Для оценки способности mAb EN10 ингибировать активность рецептора плазминогена ENO1 в опухолевых клетках, клеточную линию лимфомы U937 человека выращивали в RPMI, содержащей 10% FCS. Клетки обрабатывали 10 мкг/мл LPS в течение 6 часов, для индукции экспрессии белка ENO1 на поверхности клетки.1,5×10 клеток/мл в PBS затем пре-инкубировали с 1 мкг/мл человеческого Lys-плазминогена и 10 мкг/мл mAb EN10 в течение одного часа, соответственно. Образцы дважды промывали PBS и добавляли 3 нМ тканеспецифического активатора плазминогена и 0,5 ммоль хромогенного субстрата S-2251. После 1 ч инкубации при 37°С считывали при OD405. Каждое исследование повторяли три раза и анализировали антагонистическую активность. Данные были представлены как среднее ± SD. Для сравнения каждой группы использовали Т-тест. Значения P <0,05 считались статистически значимыми.
Результаты этого эксперимента показаны на ФИГ. 2. mAb EN10 обладает высокой антагонистической активностью в отношении рецептора плазминогена ENO1 и может достигать 100% ингибирования индуцированной LPS специфической активности ENO1. Следовательно, mAb EN10 будет иметь хороший потенциал для ингибирования трансмиграции опухолевых клеток в органы-мишени.
Пример 3
Результат примера 2 предполагает, что mAb EN10 может ингибировать активность рецептора плазминогена ENO1. Ингибирование активности рецептора плазминогена ENO1 может приводить к ингибированию активации плазминогена и активности трансмиграции в LPS-стимулированной клеточной линии лимфомы человека U937.
4
Чтобы оценить, приводит ли компрометация активности рецептора плазминогена ENO1 к ослаблению инвазивной активности опухолевых клеток, клеточную линию лимфомы U937 человека выращивали в RPMI, содержащей 10% FCS. Клетки обрабатывали 10 мкг/мл LPS в течение 6 часов для индукции экспрессии белка ENO1 на поверхности клетки. После смешивания с 5-50 мкг/мл ЕN10 mAb в верхнюю камеру двухкамерной аналитической системы, содержащей 15 микромолей Lys-плазминогена, высевали 2×10 клеток и инкубировали в течение 24 часов со средами, содержащими 10% FBS и 10 нМ MCP-1 в нижней камере. В качестве отрицательной контрольной группы использовали IgG против мышиного белка. Две камеры разделяли микропористым фильтром (с размером пор 8 микрометров), покрытым матригелем. После периода инкубации клетки в нижней камере подсчитывали с помощью гемоцитометра под микроскопом. Каждое исследование повторяли три раза. Данные представлены как среднее ± SD. Для сравнения каждой группы использовали Т-тест. Значения P <0,05 считали статистически значимыми.
Результаты представлены на ФИГ. 3. Когда обработанные LPS клетки U937 обрабатывали 5-50 мкг/мл mAb EN10, инвазивная активность U937 составила от 90,2 ± 2% до 49,1 ± 1% (N=3) контрольного IgG. Эти результаты демонстрируют, что mAb EN10 может ослабить инвазивную способность активированных U937, компрометируя активность рецептора плазминогена ENO1 дозозависимым образом. Направляя белок ENO1 на поверхность лимфомы, можно ингибировать клетки, попадая на пораженные участки с использованием mAb EN10.
Пример 4
EN10 mAb распознает поверхностный ENO1 клеток клеточной линии лимфомы U937, стимулированных LPS
Человеческие клетки лимфомы U937 выращивали в RPMI, содержащей 10% FCS. Клетки обрабатывали 10 мкг/мл LPS в течение 6 часов для индукции экспрессии белка ENO1 на поверхности клетки. Для анализа проточной цитометрии интактные цельные клетки окрашивали вместе или без mAb EN10 (разведение 1:300), визуализировали с помощью FITC-конъюгированной козьей антисыворотки (Jackson Lab) и анализировали с помощью проточного цитометра FACScan (Becton Dickinson). Экспрессию ENO1 измеряли с помощью полученной интенсивности флуоресценции.
Результаты этих экспериментов представлены на ФИГ. 4. Инкубация U937 вместе с LPS и mAb EN10 сдвигает гистограмму вправо по сравнению с инкубацией клеток без LPS, но вместе с EN10 mAb. Этот результат указывает на то, что клетки U937 увеличивают экспрессию ENO1 на поверхности клеток, когда клетки обрабатываются LPS. Эти данные подтверждают, что mAb EN10 распознает LSP-индуцированный поверхностный ENO1 на клетках лимфомы.
Пример 5
Клонирование гена, кодирующего антитело mAb EN10, проводили в соответствии со способами, описанными ниже.
(1) Получение и клонирование кДНК генов антител.
6
Гибридому культивировали в среде RPMI (производства Gibco), содержащей 10% FCS. После того, как количество клеток достигло примерно 10×10/мл, клетки собирали центрифугированием и затем добавляли TRIzol (производства Invitrogen) для извлечения суммарной РНК в соответствии с инструкцией производителя. Клонирование кДНК вариабельной области антитела осуществляли с использованием набора праймеров Ig мыши (производства Novagen) в соответствии с прилагаемой инструкцией производителя.
(a) Синтез кДНК 1-й цепи проводили в соответствии с инструкцией производителя SuperStream First Strand Synthesis System (производства Invitrogen).
2
1-ую цепь кДНК получали с использованием 5 мкг суммарной РНК в качестве матрицы. Смешивали пять микрограмм суммарной гибридомной РНК, 1 микролитр 50 мкг/мкл случайных праймеров и 1 мкл 10 мМ dNTP, и DEPC-обработанную воду добавляли к 10 мкл в ПЦР-пробирке на 200 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 65°С в течение 5 мин и затем помещали на лед в течение по меньшей мере 1 минуты. Добавляли 10 мкл смеси для синтеза кДНК, содержащей 2 мкл 10хRT-буфера, 4 мкл 25 мМ MgCl, 2 мкл DTT, 1 мкл 4 ед. RNaseOUT и 1 мкл 200 единиц SuperScript III RT, и собирали путем кратковременного центрифугирования. Реакционную пробирку инкубировали в течение 10 мин при 25°С и затем 50 мин при 50°С. Реакцию прекращали при 85°С в течение 5 мин и охлаждали на льду. Пробирку кратковременно центрифугировали для сбора реакционной смеси и добавляли 1 мкл РНКазы Н и инкубировали в течение 20 мин при 37°С.
(b) Амплификация генов тяжелой цепи и генов легкой цепи с помощью ПЦР
Реакционный раствор, содержащий состав из 5 мкл кДНК, 5 мкл 10хреакционного буфера, 1 мкл 10 мМ смеси dNTP, 1 мкл 2,5 ед. полимеразы Taq и 1 мкл прямого праймера 1 и 1 мкл обратного праймера 2, которые обеспечиваются набором праймеров, готовили в конечном объеме 50 мкл с дважды дистиллированной водой и подвергали ПЦР.
Для амплификации легкой цепи и тяжелой цепи антитела использовали цикл 94°С в течение 10 минут, затем цикл 94°С в течение одной минуты, 52°С в течение одной минуты и 72°С в течение 1 минуты повторяли 35 раз, и реакционную смесь инкубировали при 72°C в течение еще 10 минут. Реакционный раствор подвергали электрофорезу в 2%-ном агарозном геле для анализа продуктов реакции. Продукты с корректной молекулярной массой, примерно 463 п.о. для тяжелой цепи и 451 п.о. для легкой цепи, лигировали с вектором pCR 2.1-TOPO (производства Invitrogen) для субклонирования в соответствии с прилагаемой инструкцией производителя. Затем использовали праймеры M13 прямой (5'-GTAAACAACGACGGCGAG-3'(SEQ ID NO: 12) и M13 обратный (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEQ ID NO: 13)) для определения нуклеотидной последовательности. На основании информации о последовательности, последовательности антител были транслированы в последовательности белков с помощью инструмента трансляции ExPASY-Translation Tool. Результирующие последовательности mAb EN10 содержат аминокислотную последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи, имеющую области определения комплементарности (CDR), которые были определены методом, опубликованным Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3.
На ФИГ. 5А изображена аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи mAb EN10 (SEQ ID NO: 1). Показаны каркасные области (FR1, FR2, FR3 и FR4) и CDR (HCDR1 (SEQ ID NO: 3), HCDR2 (SEQ ID NO: 4) и HCDR3 (SEQ ID NO: 5)).
На ФИГ. 5В изображены аминокислотные последовательности вариабельной области/домен легкой цепи mAb EN10 (SEQ ID NO: 2). Показаны каркасные области (FR1, FR2, FR3 и FR4) и CDR (LCDR1 (SEQ ID NO: 6), LCDR2 (SEQ ID NO: 7) и LCDR3 (SEQ ID NO: 8)).
Пример 6
Гуманизация EN10 mAb
Отбор человеческих каркасных последовательностей V области:
Использование мышиного моноклонального антитела mAb EN10 в качестве родительского антитела, последовательности CDR mAb EN10 в соответствии с определениями Kabat были описаны на ФИГ. 5A и 5B (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2).
Для гуманизированного EN10 (сокращенно: hum EN10) mAb 4D5 акцепторный каркас человека выбирали из базы данных или использовали каркас, который была утвержден в клинических испытаниях. Человеческие каркасные последовательности тяжелой и легкой цепи в VH подгруппы III, IGHV3-66*04 (SEQ ID NO: 10 и VL κ подгруппы I, IGKV1-39*01 (SEQ ID NO: 9) (фиг. 6A) были утверждены в клинических испытаний и были успешно использованы во многих гуманизированных антителах.
Для hum mAb EN10 IMGT, человеческие зародышевые последовательности VL и VH с наивысшей степенью гомологии с каркасными областями mAb EN10 идентифицировали из базы данных IMGT (Международная иммуногенетическая информационная система). Поиск гомологии может выполняться с помощью BLAST или аналогичных методов. Последовательности вариабельной области EN10 mAb, используемые в качестве последовательностей запроса, доступны из литературы, такой как патентная заявка США №14/142186.
Человеческие каркасные последовательности тяжелой цепи в VH подгруппы III (VH3) успешно используют во многих гуманизированных антителах, а также каркасные последовательности легкой цепи человека VL подгруппы II (Vκ2) также, как было показано, являются хорошими кандидатами. Поэтому каркасные последовательности VHIII и Vκ2 подгрупп были выбраны для поиска структур VH и VL, соответственно. Эти поиски идентифицировали IGHV3-72*01 и IGKV2D-29*02, соответственно, как последовательности VH и VL, наиболее гомологичные соответствующим последовательностям каркасной последовательности тяжелой цепи и легкой цепи в mAb EN10.
Как показано на ФИГ. 6B, последовательности человеческих каркасных областей тяжелой цепи IGHV1-18*01 отличаются от таковых в mAb EN10 на 19 аминокислот (подчеркнутые остатки), что соответствует вариации 24,69% (20/81 суммарное количество остатков в каркасных областях). Человеческие каркасные последовательности легкой цепи (каппа I подтипа), как показано на ФИГ. 6В, отличаются от последовательностей в IGKV12-44*01 mAb EN10 на 15 аминокислот (подчеркнутые остатки), что соответствует вариации 19,73% (15/76 суммарных остатков в каркасных областях).
-11
Даже с этими степенями вариаций в каркасных областях фрагменты scFv, полученные путем прививки CDR-последовательностей из mAb EN10 в идентифицированные человеческие каркасные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, имеют относительно хорошую аффинность для ENO1 (KD=примерно 10 М) (см. Таблицу I ниже). Эти результаты предполагают, что каркасные области могут переносить относительно высокую степень вариаций, не влияя на конформации области CDR.
ТАБЛИЦА I: ИФА связывания ENO1 химеры EN10 и Hum EN10 IMGT
Мышиная химера
Hum EN10 IMGT
KD (M)
3,33E-11
3,65E-11
Эти две пары последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи (hum 4D5 и hum IMGT) будут использоваться в качестве примеров для конструкции гуманизированных антител против человеческого ENO1.
Пример 7
Анализ аффинности связывания гуманизированных антител
6
Для подтверждения изменения аффинности после того, как мышиные антитела были гуманизированы, вариабельные области гуманизированной легкой цепи и гуманизированной тяжелой цепи вариантов IMGT и 4D5 непосредственно получали методом нуклеотидного синтеза, соответственно. Экспрессирующий вектор pTCAE8-ENO1, содержащий мышиную вариабельную область, гуманизированный вариант вариабельных областей IMGT и 4D5, и химерное антитело с человеческим Fc, как показано на ФИГ. 7А, вводили в клетки-хозяева для получения клеток, экспрессирующих рекомбинантные антитела. В качестве клеток-хозяев для экспрессии использовали клетки FreeStyle293 (производства Invitrogen). Вектор вводили в клетки-хозяева посредством липофектамина 2000 в соответствии с прилагаемой инструкцией производителя (производства Invitrogen). Примерно 2,5 мкг вектора, экспрессирующего антитело, линеаризировали рестрикционными ферментами, ген вводили в 4×10 клеток, и клетки инокулировали в 6-ти луночный культуральный планшет. Добавляли агент, соответствующий маркеру селекции экспрессирующего вектора, и клетки непрерывно культивировали с образованием стабильного пула.
Супернатант культуры, содержащий человеческое IgG-антитело, получали с помощью способа, описанному ниже. Клетки, продуцирующие антитела, были акклиматизированы в среде Expression Medium FreeTM 293 (GIBCO). Клетки культивировали в культуральном матрасе для тканевой культуры, и супернатант культуры собирали, когда степень жизнеспособных клеток составляла 90%. Собранный супернатант фильтровали через фильтры 10 микрометров и 0,2 микрометра (производства Millpore) для удаления загрязняющих веществ. Супернатант культуры, содержащий антитело, аффинно очищали с использованием протеина A (производства Millipore), PBS в качестве абсорбционного буфера и 20 мМ буфера цитрата натрия (рН 3) в качестве элюирующего буфера. Фракции элюирования доводили до рН около 6 путем добавления 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7). Полученный раствор антитела заменяли PBS с использованием диализной мембраны (срез по 10000 MW, производства Spectrum Laboratories) и стерилизовали фильтрованием через мембранный фильтр (производства Millpore), имеющий размер пор 0,22 мкм с получением очищенного антитела. Концентрацию очищенного антитела определяли путем измерения поглощения при 280 нм и преобразования измеренного значения на основе значения 1,45 оптимальной плотности равного 1 мг/мл.
Чтобы узнать разницу кинетики связывания среди индивидуальных антител, использовали измерение поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с помощью BIAcore 2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), как описано ранее (Karlsson & Falt, (1997) J. Immunol Methods 200: 121-133). Карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (CM5, BIAcore Inc.) активировали с помощью N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Химеру mAb EN10 разбавляли 10 мМ ацетатом натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл перед инъекцией со скоростью потока 20 микролитров в минуту до достижения приблизительно 100 единиц ответа (RU) связанного белка с последующей инъекцией 1М этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики двухкратные серийные разведения ENO1 (от 0,3125нМ до 40 нМ) инъецировали в рабочий буфер HBS-P Biacore, предоставленный производителем (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C при скорости потока 25 мкл/мин, и ответы связывания mAb EN10 корректировали путем вычитания ответов на пустую проточную ячейку. Скорости ассоциации (kon или ka) и скорости диссоциации (koff или kd) рассчитывали с использованием простой модели связывания Ленгмюра один к одному с отдельными апроксимациями kon и koff. (BIAcore. TM. Evaluation Software version 3.2).
5
-5
-10
5
-5
-10
5
-5
-10
Результаты представлены на ФИГ. 7В и в Таблице II. кon и koff связывания химеры mAb EN10 с ENO1 составляют 3,57×10 и 8,271×10, соответственно, а Kd составляет 2,313×10 моль/л. кon и кoff связывания hum mAb EN10 IMGT с ENO1 составляют соответственно 5,31×10 и 1,162×10, а Kd составляет 2,188×10 моль/л. Для гуманизированного варианта 4D5, kon и koff составляют 3,511×10 и 1,755×10, соответственно, а Kd - 4,997×10 моль/л
-10
-10
На основе ФИГ. 7B и Таблицы II результаты предполагают, что все гуманизированные антитела EN10 могут распознавать человеческий белок ENO1, и после гуманизации аффинность варианта IMGT аналогична аффинности мышиного химерного антитела, и имеет предпочтительную аффинность с величиной Kd примерно 2,188 ± 0,12×10 М (N=3). Hum U10 mAb 4D5 также имеет сходную аффинность, 4,997×10 M.
Пример 8
Антитела hum mAb EN10 4D5 и hum EN10 mAb IMGT ингибируют активность рецептора плазминогена, индуцированную LPS U937
6
Для оценки способности hum mAb EN10 4D5 mAb и hum mAb EN10 IMGT ингибировать активность рецептора плазминогена ENO1 опухолевых клеток, клеточную линию лимфомы U937 человека растили в RPMI, содержащей 10% FCS. Клетки обрабатывали 10 мкг/мл LPS в течение 6 часов для индукции экспрессии белка ENO1 на поверхности клетки. 1,5×10 клеток/мл в PBS затем инкубировали с 1 мкг/мл человеческого Lys-плазминогена и различными концентрациями hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT в течение одного часа, соответственно. Образцы дважды промывали PBS и добавляли 3 нМ тканеспецифического активатора плазминогена и 0,5 ммоль хромогенного субстрата S-2251. После 1 ч инкубации при 37°С считывали OD405. Каждое исследование повторяли три раза и анализировали антагонистическую активность. Данные были представлены как среднее ± SD. Для сравнения каждой группы использовали Т-тест. Значения P <0,05 считали статистически значимыми.
Результаты этого эксперимента представлены на ФИГ. 8А и ФИГ. 8В. Также как и родительское антитело EN10 mAb, 50 мкг как hum mAb EN10 4D5, так и hum mAb EN10 IMGT обладали высокой антагонистической активностью рецептора плазминогена ENO1 и могли достигать 50 и 56% ингибирования индуцированной LPS специфической активности ENO1, и процент ингибирования являлся дозозависимым. Следовательно, оба гуманизированных антитела имели бы хороший потенциал в ингибировании трансмиграции опухолевых клеток в органы-мишени.
Пример 9
Антитела Hum mAb EN10 4D5 и hum EN10 mAb. IMGT ингибируют инвазивную активность U937
В качестве результатов примера 8 антитела humEN10 mAb 45D и mAb EN10 IMGT ослабляют индуцируемую активность рецептора плазминогена ENO1 U937. Это может привести, как у антитела пациента, к ингибированию инвазивной активности опухолевых клеток.
6
4
Для оценки антитрансмиграционной активности hum mAb EN10 4D5 и mAb EN10 IMGT 3×10 мышиных эндотелиальных клеток мозга bEnd.3 предварительно наносили в виде покрытия с использованием матричного геля на верхние камеры набора CytoselectTM 24 Well Cell Migration and Invasion Assay в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки в течение 24 ч. Верхние камеры дважды промывали PBS. В верхнюю и нижнюю камеры добавляли среду RPMI, содержащую 2% и 10% фетальной бычьей сыворотки, соответственно. После смешивания с 10, 50 и 100 мкг/мл humEN10 mAb 4D5 и hum mAb EN10 IMGT, соответственно, 2×10 клеток U937 высевали в верхнюю камеру двухкамерной аналитической системы и инкубировали в течение 24 часов. IgG к белку человека использовали в качестве отрицательного контроля. Две камеры разделяли микропористым фильтром (размер пор 8 мкм), покрытым матригелем. После периода инкубации клетки в нижней камере подсчитывали с помощью гемоцитометра под микроскопом. Каждое исследование повторяли три раза. Данные были представлены как среднее ± SD. Т-тест использовали для сравнения активности между каждой группой. Значения P <0,05 считали статистически значимыми.
Результаты представлены на ФИГ. 9А и 9В. Как и в исследовании Wang, et al, tPA стимулировал фоновую инвазию U937 (ФИГ. 8А и 8В). Инвазивная активность U937 ингибировалась примерно на 41,8 ± 11% (N=3) и 33 ± 11% (N=3), когда клеткам вводили 50 мкг/мл антител hum mAb EN10 45D и mAb EN10 IMGT, соответственно (ФИГ. 9А и 9В). Эти результаты аналогичны результатам Примера 4. Оба гуманизированных антитела обладают способностью ингибировать миграционную активность клеток U937.
Пример 10
Гуманизированное ЕN10 mAb ингибирует диссоциацию клеток CL1-5 от коллагена и фибронектина
4
Для оценки пути сигнальной трансдукции между рецептором плазминогена ENO1-плазмином и внеклеточными субстратами на необработанный ИФА-планшет наносили в виде покрытия 1 мг/мл желатина, 100 мкг/мл фибриногена, 10 мкг/мл коллагена и 10 мкг/мл фибронектина, соответственно, в течение ночи. Клетки CL1-5 (4×10 клеток) высевали на планшет, и 50 мкг/мл hum mAb EN10 4D5 добавляли к 200 мкл DMEM, содержащей 10% FCS. Клетки инкубировали при 37°С в течение 24 часов и затем дважды промывали PBS. Добавляли 10% WST и реакционные смеси инкубировали при 37°C в течение 4 часов. Относительные количества клеток в планшете оценивали по считыванию OD450. Каждое исследование повторяли три раза. Данные представлены как среднее ± SD. Т-тест использовали для сравнения активности между каждой группой. Значения P <0,05 считали статистически значимыми.
4
Результаты этих экспериментов представлены на ФИГ. 10A. Эти данные показывают, что показания OD450 на планшетах с фибронектиновым и коллагеновым покрытием составляют 2,45 ± 0,37 (N=3) и 1,83 ± 0,44 (N=3). Показания намного выше, чем показания на планшетах с желатиновым и фибриногеновым покрытием, которые незначительно отличались от показаний фона. Между группой обработки hum mAb EN10 4D5 и необработанной группой не было существенной разницы. Эти результаты предполагают, что клетки CL1-5 способствуют связыванию с фибронектином и коллагеном, и hum mAb EN10 4D5 не участвует в пути ассоциации клеток, когда клетки инкубируются в среде без протеаз нижних сигнальных путей, например плазминогена и tPA. Данные на ФИГ. 10А предполагают, что активность рецептора плазминогена ENO1 не участвует в пути ассоциации клеток во внеклеточном матриксе. Мы дополнительно тестировали, участвует ли ENO1 в пути диссоциации клеток во внеклеточном матриксе. Один микрограмм/мл фибронектина и 10 мкг/мл коллагена, соответственно, наносили в виде покрытия на необработанной ИФА-планшет в течение ночи. Клетки CL1-5 (4×10 клеток) высевали на планшет, и 0, 6,25, 12,5, 25 и 50 мкг/мл hum mAb EN10 4D5, соответственно, добавляли к 200 мкл DMEM, содержащей 10% FCS. Кроме того, добавляли 10 мкг/мл Glu-плазминогена и 2 нМ tPA. Клетки инкубировали при 37°С в течение 24 часов и дважды промывали PBS. Затем добавляли 10% WST и реакционные смеси инкубировали при 37°C в течение 4 часов. Относительные количества клеток в планшете оценивали с помощью показаний OD450. Каждое исследование повторяли три раза. Данные представлены как среднее ± SD. Т-тест использовали для сравнения активности между каждой группой. Значения P <0,05 считали статистически значимыми.
Результаты этих экспериментов представлены на ФИГ. 10В и ФИГ. 10С. Данные демонстрируют, что количества клеток прямо пропорциональны концентрациям обработки hum mAb EN10 4D5 в обоих внеклеточных матриксах, когда среда содержит протеазы нижних сигнальных путей рецептора ENO1, плазминоген и tPA. Существует значительная разница между группой обработки 50 мкг hum mAb EN10 4D5 и контрольной группой IgG (Р <0,05) в исследованиях внеклеточного матрикса. Эти результаты предполагают, что ENO1 участвует в пути диссоциации клеток CL1-5 из внеклеточного матрикса, возможно, путем усиления активности плазмина и протеазы tPA. Hum mAb EN10 4D5, функционирующий как антагонист ENO1, блокирует рецепторную активность ENO1, что приводит к ингибированию активации плазмина и tPA и, следовательно, ингибирует активность диссоциации клеток CL1-5 из внеклеточного матрикса и инвазии.
Пример 11
Гуманизированные антитела ENO-1 демонстрируют влияние ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) на клеточную линию рака легкого. Известно, что в дополнение к ингибированию антиростовых факторов, ADCC Герцептина очень важна для его противоопухолевого эффекта. Поскольку антитела hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT содержат один и тот же Fc-фрагмент Герцептина, мы обосновали, что оба антитела обладают активностью ADCC.
4
7
Чтобы протестировать эффект ADCC антител hum mAb EN10 4D5 и Hum mAb EN10 IMGT против опухолевых клеток, 2×10 клеток рака легкого CL1-5 человека выращивали на 96 ИФА-планшетах. После инкубации в течение ночи добавляли различные концентрации hum mAb EN10 4D5, hum mAb EN10 IMGT и контрольные IgG1-антитела. Свежие образцы крови от 5 добровольцев собирали, следуя руководству IRB Guide DCB. PBMC (мононуклеары периферической крови) готовили с помощью раствора кровь:PBS:фиколл=1:1:1 при центрифугировании при 3000 об/мин в течение 30 минут. Полученные РВМС собирали и дважды промывали PBS. РВМС суспендировали в среде RPMI1640, содержащей 5% FBS, и разбавляли до концентрации 2,5×10 клеток/мл. Затем к ИФА-планшетам, содержащим CL1-5, добавляли 50 мкл PBMC. Клетки центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут и инкубировали при 37°С в течение 4 часов. Образцы дважды промывали PBS и добавляли набор для детектирования ADCC с соблюдением протокола, предоставленного производителем, и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Процент лизиса клеток на планшете оценивали по показаниям OD530/590. Каждое исследование повторяли три раза. Данные представлены как среднее ± SD.
-9
-6
-8
-6
-9
-8
Результаты этих экспериментов представлены на ФИГ. 11А и 11В. Процент лизиса клеток не показал значительного увеличения, когда клетки вводили с различными концентрациями контрольного человеческого IgG-антитела в соотношении эффектор/мишень 40:1 и 1:15. В исследовании с соотношением эффектор/мишень 40:1 при обработке клеток с использованием 1×10 М антитела hum mAb EN10 4D5 начали замечать значительную разницу лизиса по сравнению с клетками, обработанными той же концентрацией человеческого IgG. Оба антитела, hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT, продемонстрировали максимальную активность лизиса, составляющую примерно 42%, когда клеткам вводили с 10 М антител. В исследовании с низким соотношением эффектор/мишень (15:1) в обеих группах, как с использованием антител hum mAb EN10 4D5, так и hum mAb EN10 IMGT, начали наблюдать значительный лизис при 1×10 М, и максимального лизиса достигали при 10 М. ADCC EC50 антител hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT оценивали примерно как 8×10M и 1×10M, соответственно. Оба гуманизированных антитела EN10 обладают активностью ADCC. Наши результаты предполагают, что в дополнение к антимиграционной активности антитела hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT могут обеспечить активность ADCC в качестве противоопухолевого агента.
Пример 12
Ингибирующий эффект гуманизированных антител EN10 в отношении роста опухоли.
-10
6
Гуманизированное антитело EN10 имеет хорошую аффинность с Kd примерно 2,311 ± 0,003×10 моль/л и потенциал для дальнейшего развития. Для оценки терапевтического эффекта гуманизированных антител EN10 была выполнена модель ксенотрансплантата мыши CL1-5. Клетки аденокарциномы легкого CL1-5F4 (1×10 клеток/мышь, 5 клеток/группа) подкожно инокулировали в день 0. Терапевтическую процедуру проводили через 2 дня после инокуляции опухоли путем введения 10 мкг (мг/кг) изотипического контроля (CTL) в виде антитела hum mAb EN10 4D5 или hum mAb EN10 IMGT два раза в неделю. Объем опухоли и массу каждой мыши измеряли еженедельно. Данные представлены как среднее ± SD для отдельных групп.
3
3
3
Результаты представлены на ФИГ. 12. Через 2 дня не было значительных различий в размерах опухоли среди контрольных, hum mAb EN10 и hum mAb EN10 IMGT групп. После 23-го дня опухоль мышей в контрольной группе начинает расти экспоненциально, и не было значительного роста опухоли у мышей, обработанных hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT. После 30-го дня средний размер опухоли мышей контрольной группы составляет 1600 ± 200 мм (N=5), а для мышей, обработанных 10 мг/кг hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT, средний размер опухоли составляет 505 ± 24 мм ( N=5) и 330 ± 11 мм (N=5), соответственно. Средние размеры опухолей групп обработки как hum mAb EN10 4D5, так и hum mAb EN10 IMGT, были значительно меньше, чем у контрольной группы с величиной Р 0,004 и 0,003, соответственно. Не существует существенной разницы в размерах опухоли между группами обработки hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT. Этот результат показывает, что hum mAb EN10 4D5 и hum mAb EN10 IMGT обладают активностью ингибирования роста опухоли, показанной на клетках CL1-5 в мышиной модели ксенотрансплантата, и mAb EN10 имеет хорошую эффективность в качестве реагента для противоопухолевой терапии.
Пример 13
Оптимизация кодонов для клеток CHO
Из приведенных выше примеров мы предполагаем, что моноклональное антитело ENO1 имеет потенциал для развития в качестве терапевтического антитела.
Для массового продуцирования гуманизированного терапевтического антитела в клеточной линии СНО проводили оптимизацию кодонов с помощью программного обеспечения GeneOptimizer. (Http://www.lifetechnologies.com/tw/zt/home/life -science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html). Вариабельную область hum mAb EN10 IMGT подвергали анализу с получением оптимизированных кодонов. Параметры включают в себя качественное распределение кодонов (качественное значение наиболее часто используемого кодона для желаемой экспрессирующей системы) и содержание GC (оптимизирует кодон так, что содержание GC находится в желательном диапазоне). Оптимизированная по кодонам вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи для клеточной линии СНО представлены на ФИГ. 13А и ФИГ. 13В (SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 16), соответственно.
R
6
а
Оптимизированные по кодонам для клеток CHO вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи hum mAb EN10 IMGT были непосредственно получены методом нуклеотидного синтеза, соответственно. Затем вектор pCHO-ENO1, экспрессирующий вариабельные области hum mAb EN10 IMGT и человеческое Fc-антитело Herceptin, как показано на ФИГ. 13А, вводили в клетки-хозяева для получения клеток, экспрессирующих рекомбинантные антитела. В качестве клеток-хозяев для экспрессии использовали CHOS-клетки (Life-Technology Inc.). Вектор вводили в клетки-хозяева посредством липофектамина 2000 в соответствии с прилагаемой инструкцией производителя (производства Invitrogen). Примерно 2,5 мкг вектора, экспрессирующего антитела, линеаризировали рестрикционными ферментами, ген вводили в 4×10 клеток, и клетки инокулировали в 6-луночный культуральный планшет. Для отбора с низкой концентрацией, полученные клеточные пулы выращивали в селекционной среде, содержащей 10 мкг/мл пуромицина и 100 нМ метотрексат или 20 мкг/мл пуромицина и 200 нМ метотрексата. Для дальнейшего отбора осуществляли следующую стадию отбора с высокой концентрацией. Пулы первичного отбора дополнительно выращивали в среде, содержащей 30 мкг/мл пуромицина и 500 нМ метотрексата или в среде, содержащей 50 мкг/мл пуромицина и 1000 нМ метотрексатов. Для получения конечной клеточной линии, продуцирующей антитело, 96000 клеток из пулов второй стадии инокулировали в полутвердую среду, и 768 клеток с высоким уровнем экспрессии антитела определяли и выделяли с помощью интенсивности флуоресценции с помощью ClonePix2 в соответствии с протоколом производителя (производства Molecular Device Inc.). 10 лучших лидирующих клеточных линий отбирали с использованием параметров, включая темпы роста, степень продуцирования для 5-дневного периодического процесса и степень продуцирования для 14-дневного процесса с простой подпиткой. После 60-ти генераций тестов на стабильность определяли кандидатную продуцирующую клеточную линию.
Результаты представлены на ФИГ. 13А. Когда нуклеиновую кислоту hum mAb EN10 IMGT, кодоны которой были оптимизированы для экспрессирующей системы CHO с помощью пакета программ GeneOptimizer, выравнивали с исходным человеческим антителом, гомологии вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи между двумя вариантами составили 74,5% и 84%, соответственно. Этот результат показывает, что предпочтение кодонов между клетками человека и клетками СНО различно, даже если кодируемое антитело имеет такую же белковую последовательность. Когда оба варианта генов антитела были сконструированы для pCHO1,0 и транзиторно экспрессированы в клетках CHO, то степень продуцирования антител с вариантом кодонов клеток CHO соответствовала примерно 3,1-кратному значению от исходного человеческого (данные не показаны). Наш результат демонстрирует, что оптимизация кодонов очень важна для высокопродуктивного продуцирования антител. Клеточные пулы CHO оптимизированного hum ENO10 mAb IMGT дополнительно отбирали в среде ForiCHO (Life Technology Inc.), а клеточные линии, продуцирующие антитело на высоком уровне, пикировали с использованием ClonePix2. Когда проанализировали степень продуцирования лучших 15 клонов в дни 5 и 14, результаты показаны на ФИГ. 13В. Степень продуцирования колеблется от 155мг/литр до 91,3 мг/л в день 5 и от 358,7 мг/литр до 247,5 мг/л в день 14. Все эти клоны обладают хорошей жизнеспособностью и скоростью роста в простой среде. Эти результаты предполагают, что все клоны могут улучшить свою способность продуцирования антител после оптимизации среды. Для дальнейшего изучения эффективности продуцирования антител этими клонами были исследованы различные комбинации глюкозы и питательной среды, и степень продуцирования антител анализировали в 6 лучших клонах на 15-й день. Результат представлен на ФИГ. 13С. Максимальная степень продуцирования лучших 6 клонов колеблется от 0,7 г/л до 0,81 грамм на литр после 15 дней инкубации. Все клоны обладают хорошей стабильностью после анализа 60 генераций и продуцируют интактное антитело, когда антитела анализировали с помощью SDS PAGE (ФИГ. 13D). Наше исследование предполагает, что эти клоны обладают хорошим потенциалом в качестве клеточных линий, продуцирующих терапевтические антитела ENO1.
Суммируя, также как антитело EN10 mAb, гуманизированное mAb EN10 4D5 и гуманизированное mAb EN10 IMGT используют их антагонистические активности рецептора плазминогена ENO1, чтобы ингибировать активацию плазминогена, тем самым индуцируя отрицательную регуляцию активности протеазы на поверхности клетки, что, в свою очередь, приводит к ингибированию диссоциации опухолевых клеток из внеклеточного матрикса. В результате антитела против ENO1 могут ингибировать инвазивную способность опухолевых клеток. Эти данные показывают, что антитела ENO1 (например, mAb EN10) обладают предпочтительной аффинностью, эффективностью и потенциалом в качестве терапевтического антитела для лечения злокачественных новообразований.
Хотя изобретение было описано в отношении ограниченного числа воплощений, специалисты в данной области техники, пользуясь этим раскрытием, поймут, что могут быть разработаны другие воплощения, которые не отходят от объема изобретения, раскрытого в настоящем документе. Соответственно, объем изобретения должен ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Центр разработок по биотехнологии
<120>  ГУМАНИЗОВАННЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К АЛЬФА-ЭНОЛАЗЕ, И СПОСОБЫ
ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ
<130>  17787/021WO1
<160>  17
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  119
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<400>  1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Cys
20                  25                  30
Val Met Asn Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Phe Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  2
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Mus muculus
<400>  2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg
100                 105
<210>  3
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Mus muculus
<400>  3
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Cys Val Met Asn
1               5                   10
<210>  4
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Mus muculus
<400>  4
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  5
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Mus muculus
<400>  5
Glu Gly Phe Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Asn
1               5                   10
<210>  6
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Mus muculus
<400>  6
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Thr
1               5                   10
<210>  7
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Mus muculus
<400>  7
Asn Ala Lys Thr Leu Pro Glu
1               5
<210>  8
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Mus muculus
<400>  8
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  9
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  10
<211>  119
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Cys
20                  25                  30
Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Phe Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  11
<211>  119
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Cys
20                  25                  30
Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Phe Tyr Tyr Gly Asn Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  12
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  12
gtaaacaacg acggcgag                                                     18
<210>  13
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  13
caggaaacag ctatgac                                                      17
<210>  14
<211>  300
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  14
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc       60
atcacctgtc gggcctccga gaacatctac tcctacctga cctggtatca gcagaagccc      120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaac gccaagaccc tgcccgaggg cgtgccctct      180
agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcagccc      240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcac cactacggca ccccctacac ctttggccag      300
<210>  15
<211>  323
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  15
gatatccaga tgacccagtc ccccagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc       60
atcacctgcc gagcaagtga gaatatttac agttatttaa catggtatca acagaaacca      120
ggaaaagctc cgaaactact gatttacaat gcaaaaacct taccagaagg agtcccttct      180
cgcttctctg gttccggctc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg      240
gaagacttcg caacttatta cagtcaacat cattatggta ctccgtacac gttcggacag      300
ggtaccaagg tggagatcaa acg                                              323
<210>  16
<211>  356
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  16
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg       60
tcctgcaagg cctccggcta cacctttacc agctgcgtga tgaactgggt gcgacaggct      120
cctggacagg gcctggaatg gatgggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac      180
aacgagaagt tcaagggcag agtgaccatg accaccgaca cctccaccag caccgcctac      240
atggaactgc ggtccctgag atccgacgac accgccgtgt actactgcgc cagagagggc      300
ttctactacg gcaacttcga caactggggc cagggcaccc tcgtgaccgt gtcatc          356
<210>  17
<211>  356
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  17
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctgtgtta tgaactgggt gcgacaggcc      120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac      180
aatgagaagt tcaaaggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac      240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagagggg      300
ttttactacg gtaactttga caattggggc caagggaccc tggtcaccgt ctcctc          356
<---