Фактор роста эндотелия сосудов в опухолях и сыворотке больных раком молочной железы: связь с клинико-морфологическими факторами

Е. С. Герштейн, А. М. Щербаков, С. К. Алиева, О. А. Анурова, К. П. Лактионов,

Н. Е. Кушлинский

ФАКТОР РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ В ОПУХОЛЯХ И СЫВОРОТКЕ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: СВЯЗЬ С КЛИНИКОМОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ФАКТОРАМИ

НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Иммуноферментными методами исследовано содержание свободного и общего фактора роста эндотелия сосудов (УБОБ) в цитозоле опухолевых клеток и сыворотке 109 больных раком молочной железы. Изучена взаимосвязь этих показателей с клинико-морфологическими особенностями заболевания и рецепторным статусом опухолей. Показано, что цитозольная концентрация свободного УБОБ достоверно возрастает по мере увеличения размера опухоли. Кроме того, опухолевая и сывороточная концентрации свободного УБОБ повышены у больных старшего возраста, большинство из которых находятся в постменопаузе. Уровень общего УБОБ в сыворотке больных раком молочной железы не только не повышен по сравнению с нормой, но и не зависит от каких-либо клинико-морфологических факторов. Таким образом, для количественной оценки активности ангиогенеза при раке молочной железы целесообразно определять свободный УБОБ в опухолевой ткани.

Ключевые слова: фактор роста эндотелия сосудов, УБОБ, рак молочной железы, опухоль, сыворотка, иммуноферментный анализ.

Важную роль в лечении рака молочной железы (РМЖ) сейчас отводят различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли, такие, как способность к неконтролируемой пролиферации, инвазии, метастазированию и т. д. Именно они позволяют уточнить общий прогноз заболевания и подобрать наиболее эффективные схемы цитостатиче-ской или гормональной терапии.

В этой связи в последние годы активно изучаются механизмы и клинико-лабораторные критерии активности не-оангиогенеза — образования сети кровеносных сосудов, обеспечивающих снабжение опухолевых клеток кислородом и питательными веществами [11]. Изучение молекулярных механизмов этого процесса позволило перейти от микроскопической оценки плотности сосудов в опухолевой ткани к исследованию отдельных молекул, регулирующих образование и рост новых капиллярных отростков. Среди разнообразных специфических и неспецифических регуляторов ангиогенеза ведущая роль, безусловно, принадлежит фактору роста эндотелия сосудов (VEGF — vascular endothelial growth factor) [7].

Биологическая доступность VEGF определяется размером молекулы и регулируется на генетическом и эпигеномном уровне. Она также зависит от того, находится этот фактор в свободном или связанном состоянии. Единого мнения

о том, с какими именно белками или структурами связан VEGF, нет, однако известно, что в крови VEGF может депонироваться в тромбоцитах [5].

© Герштейн Е. С., Щербаков А. М., Алиева С. К., Анурова О. А., Лактионов К. П., Кушлинский Н. Е., 2005 УДК 618.19-006.6-07:611-018.74

Результаты ряда ретроспективных клинических исследований свидетельствуют о том, что экспрессия УБОБ при РМЖ влияет на общий прогноз заболевания и чувствительность опухоли к гормонотерапии и химиотерапии [1; 6; 9; 10; 15; 20]. Оценка активности УБОБ-зависимого ангиогенеза — основа для целенаправленного применения антиангиоген-ных препаратов. Однако, несмотря на весьма значительное количество публикаций по данному вопросу, единого мнения о преимуществах тех или иных методов и субстратов (опухоль, кровь) для определения УБОБ при РМЖ до настоящего времени нет [4; 15]. В частности, не установлено, в какой степени уровень УБОБ в крови отражает его продукцию и активность неоангиогенеза в опухоли, а также какова роль различных форм УБОБ [4; 5; 8; 14; 16; 18].

Ранее мы показали, что в сыворотке больных РМЖ повышена концентрация свободного, но не общего УБОБ и что только этот показатель коррелирует с концентрацией УБОБ в опухолевой ткани [2]. Цель данной работы — дальнейшее изучение взаимосвязи тканевого и сывороточного уровней свободного и общего УБОБ с клинико-морфологическими особенностями РМЖ.

Материал и методы

В исследование были включены 109 больных РМЖ I— 1У стадии, лечившихся в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН с октября 2000 г. по июль 2002 г. У 38 больных помимо опухоли исследована окружающая неизмененная ткань молочной железы. Возраст больных составил 28— 77 лет (медиана — 52 года). У 33 больных менструальная функция была сохранена, 17 больных находились в пери-менопаузе, у 59 — наблюдалась постменопауза длительностью от 2 до 38 лет.

Стадии РМЖ определяли в соответствии с классификацией злокачественных опухолей по системе TNM (1997 г.):

I стадия (T1N0M0) наблюдалась у 24 больных, 11а (T2N0M0, T1N1M0) — у 38, IIb (T2N1M0, T3N0M0) — у 22, 111а (T1N2M0, T2N2M0, T3N1—2M0) — у 6, IIIb (T4N0—3M0, T0—4N3M0) — у 16, IV (T1—4N0—2M1) — у 3.

Определение свободного VEGF в сыворотке и цитозоле проводили с помощью стандартных коммерческих наборов для прямого иммуноферментного анализа «CytElisa™ Human VEGF», определение общего VEGF в сыворотке — с помощью наборов для конкурентного иммуноферментного анализа «Accucyte Human VEGF» (оба набора производятся компанией «Cytimmune Science, Inc.», США) в соответствии с инструкциями производителя. Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX800 («Bio-Tek Instruments, Inc.», США). Концентрацию VEGF в цитозоле выражали в пикограммах на миллиграмм белка, определенного по методу Лоури.

Рецепторы стероидных гормонов в опухолях определяли стандартизованным радиолигандным методом по методике, описанной ранее [3].

Для сравнения показателей использовали непараметрические критерии Манна—Уитни и Краскела—Уоллиса, медианный тест, парный критерий Вилкоксона. Взаимосвязь непрерывных показателей оценивали с помощью теста корреляции рангов Спирмена (r). Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного пакета «Statistica» для «Windows» («StatSoft, Inc.», 1996, версия 6.0).

Результаты и обсуждение

Содержание свободного VEGF в цитозоле опухолевых клеток определено у 98 больных РМЖ. У 38 больных одновременно с опухолью исследовали неизмененную ткань молочной железы. Концентрация свободного VEGF в сыворотке измерена у 52 больных, общего — у 22. Мы не исследовали содержание общего VEGF в опухолях, поскольку, как продемонстрировано нами ранее [2], этот показатель практически одинаков у больных РМЖ и здоровых женщин. Кроме того, набор для определения общего VEGF, по-видимому, рассчитан именно на те белки и клетки, с которыми этот фактор роста связан в сыворотке, и может давать неадекватные результаты при исследовании экстрактов тканей с другим белковым составом.

Среднее и медиана содержания свободного VEGF в цитозоле опухолевых клеток были достоверно выше, чем в неизмененной ткани молочной железы (медианы 56,9 и 31,9 пг/мг белка соответственно; p<0,01, тест Вилкоксона). При попарном сравнении у 24 из 38 обследованных содержание VEGF в опухоли оказалось выше, чем в нормальной ткани (рис. 1). Степень повышения достоверно коррелировала с концентрацией VEGF в опухоли (r=0,76, р<0,0001), но не зависела от его содержания в неизмененной ткани молочной железы. При этом уровни VEGF в опухоли и неизмененной ткани молочной железы коррелировали между собой (r=0,54, p<0,001).

На следующем этапе мы проанализировали содержание свободного VEGF в цитозоле опухолевых клеток, а также концентрацию свободного и общего VEGF в сыворотке в зависимости от клинических, морфологических и рецепторных характеристик опухолей (табл. 1). Содержание VEGF в цитозоле опухолевых клеток достоверно повышено у больных старше 55 лет и у больных в постменопаузе. Кроме того, обнаружена слабая (r=0,33), но достоверная (p=0,012) прямая корреляционная зависимость между содержанием VEGF в цитозоле и возрастом больных. Аналогичная корреляцион-

Рисунок 1. Содержание свободного VEGF в опухоли и неизмененной ткани молочной железы у 38 больных РМЖ (различия достоверны по критерию Вилкоксона, p<0,01).

Темными столбиками обозначено содержание VEGF в опухоли, белыми — в неизмененной ткани молочной железы.

ная зависимость обнаружена и для свободного VEGF в сыворотке (r=0,35, р=0,015), уровень которого был также повышен у больных в постменопаузе. Эта зависимость отмечена и другими авторами [16] и может быть связана с характерной для большинства пожилых больных гипоксией. Интересно, что уровень общего VEGF в сыворотке не зависел от возраста и менструальной функции больных.

Ни один из исследованных показателей достоверно не зависел от стадии заболевания, хотя наблюдалась выраженная тенденция к увеличению тканевой концентрации VEGF по мере увеличения стадии. Эта тенденция была достоверной при сравнении стадий I и IIb (табл. 1). Отмечено также, что при РМЖ I стадии сывороточная концентрация свободного VEGF в 2—4 раза выше, чем при других стадиях.

Более детальное изучение зависимости тканевой и сывороточной концентрации VEGF от распространенности процесса показало, что сывороточная концентрация VEGF не зависит ни от одного из индексов системы TNM, а наиболее значимым для тканевого уровня VEGF является индекс Т, определяющий размер первичной опухоли: концентрация свободного VEGF в опухоли достоверно возрастает по мере увеличения ее размера (табл. 1). Это наблюдение согласуется с представлениями о том, что в крупных опухолях, в которых особенно велика потребность в кислороде и питательных веществах для предотвращения некроза, активность неоангио-генеза выше. Взаимосвязи между концентрацией VEGF в первичной опухоли и поражением лимфатических узлов, а также наличием отдаленных метастазов не обнаружено.

По гистологическому строению более половины исследованных опухолей представляли собой протоковый инвазивный рак. Удалось выделить еще три более или менее репрезентативные группы: дольковый инвазивный, смешанный и тубулярный рак (табл. 1). Содержание VEGF в цитозоле опухолевых клеток и сыворотке не зависело от гистологического строения опухоли. Повышение тканевой концентрации VEGF при тубулярном раке, а также тканевой и сывороточной концентрации свободного VEGF при смешанном раке не было статистически значимым.

Интересным и до сих пор окончательно неясным остается вопрос о гормональной регуляции неоангиогенеза при РМЖ. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что в разных клеточных линиях синтез VEGF может как индуцироваться [17; 19], так и подавлять-

Таблица 1

Сопоставление заключений дооперационного цитологического и послеоперационного гистологического исследований3

Свободный 7ЕвР Общий 7ЕвР в сыворотке

Характеристики в цитозоле в сыворотке

п пг/мг белка п пг/мл п нг/мл

Возраст, годы

до 40 8 45,2 (10,5—80,0) 3 4,2 (6,2—11,0) 1 13,4

Ю ип 1 0 4 47 42,8

старше 55 38 103,0

P <0,05б 0,017в НД

Менструальная функция сохранена 28 28,7

перименопауза 14 45,2

постменопауза 49 107,0

P <0,01г 0,05д НД

Стадии

I 24 26,7

На 38 48,4

МЬ 22 87,5

Ша 6 205,0 (46,4—348,0) 2 35,5 (9,9—61,0) 1 12,2

ШЬ 16 63,0 (5,9—392,0) 7 17,3 (4,8—76,0) 1 9,8

IV 3 51,1

P НД НД НД

Размер опухоли

Т1 31 28,9

Т2 44 78,9

Т3 5 63,0 (19,9—76,4) 3 9,9 (4,8—14,0) 1 15,2

Т4 10 120,0

P <0,05в НД НД

Метастазы в лимфатические узлы N0 49 48,4

N1 34 66,1

N2 7 71,8 (16,4—392,0) 6 12,1 (4,8—61,0) 1 12,2

P НД НД НД

Таблица 1 окончание

Гистологический тип

протоковый инвазивный рак 45 48,4

дольковый инвазивный рак 25 44,7

смешанный рак 11 69,2

тубулярный рак 5 94,7 (18,5—165,0) 0 — 0 —

р НД НД НД

Рецепторы эстрогенов

+ 48 67,6

- 56 44,0

p НД НД НД

Рецепторы прогестерона

+ 55 58,3

- 48 51,6

p НД НД НД

НД — различия недостоверны. а Из-за асимметричности распределения значений изучаемых показателей полученные данные представлены в виде медиан и диапазонов нижнего и верхнего квартилей, а оценка достоверности различий между группами проведена с помощью непараметрических тестов. б Медианный тест. в Корреляционная зависимость по тесту Спирмена (г=0,35). гТест Краскела—Уоллиса. д Тест Манна—Уитни при сравнении больных с сохраненной менструальной функцией и больных в постменопаузе. е Различия между I и IIa, I и ИЬ стадиями по тесту Манна —Уитни достоверны ф<0,05). ж Различия между I и ИЬ стадиями достоверны по медианному тесту ф<0,05).

ся [13] эстрогенами и прогестинами. В этой связи представлялось важным проанализировать зависимость содержания УЕвБ в опухолевых клетках и сыворотке от рецепторного статуса опухоли (табл. 1). По нашим данным, содержание УЕвБ в рецептороположительных и рецептороотрицательных опухолях (по рецепторам как эстрогенов, так и прогестерона), а также в сыворотке больных с соответствующими рецепторными характеристиками достоверно не отличается. Это наблюдение согласуется с представлениями некоторых авторов о том, что в злокачественных опухолях молочной железы утрачивается гормональный контроль неоангиогенеза, характерный для нормальной молочной железы [12; 16].

Таким образом, анализ взаимосвязи содержания УЕвБ в опухолевых клетках и сыворотке больных РМЖ с клиникоморфологическими особенностями заболевания показал, что цитозольная концентрация свободного УЕвБ достоверно возрастает по мере увеличения размера опухоли, опухолевая и сывороточная концентрации свободного УЕвБ повышены также у больных старшего возраста, большинство из

которых находятся в постменопаузе. Значимых взаимосвязей с другими традиционными прогностическими факторами не обнаружено. Уровень общего УБОБ в сыворотке больных РМЖ не только не повышен по сравнению с нормой, но и не зависит от каких-либо клинико-морфологических факторов.

Заключение

Результаты исследования свидетельствуют о том, что содержание свободного УБОБ в цитозоле опухолевых клеток взаимосвязано с распространенностью РМЖ, в первую очередь, с размером первичной опухоли. При этом характер выявленных закономерностей позволяет считать данный показатель значимой характеристикой активности внутриопу-холевого неоангиогенеза.

Несмотря на то что ранее нами продемонстрированы повышение уровня свободного УБОБ в сыворотке большинства больных РМЖ, а также его корреляция с содержанием этого фактора роста в первичной опухоли, значимой взаимосвязи между уровнем свободного УБОБ в сыворотке и распространенностью опухолевого процесса не обнаружено.

В целом можно сделать заключение, что для количественной оценки активности ангиогенеза при РМЖ целесообразно определять свободный VEGF, причем наиболее адекватным субстратом для таких исследований все-таки остается ткань опухоли.

ЛИТЕРА ТУРА

1. Герштейн Е. С., Кушлинский Н. Е. Роль фактора роста эндотелия сосудов при раке молочной железы // Бюлл. экспер. биол. мед. —

2002. — Т. 133, №6. — С. 604—612.

2. Герштейн Е. С., Щербаков А. М., Алиева С. К. и др. Фактор роста эндотелия сосудов в опухолях и сыворотке крови больных раком молочной железы // Бюлл. экспер. биол. мед. — 2003. — Т. 135, №1. — С. 99—102.

3. Кушлинский Н. Е., Герштейн Е. С. Биохимические критерии прогноза и гормоночувствительности рака молочной железы: сравнительный анализ клинического значения исследования рецепторов стероидных гормонов и рецепторов эпидермального фактора роста в опухолях// Маммология. — 1996. — №3. — С. 15—25.

4. Adams J., Carder P. J., Downey S. et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in breast cancer: comparison of plasma, serum, and tissue VEGF and microvessel density and effects of tamoxifen // Cancer Res. — 2000. — Vol. 60, N 11. — P. 2898—2905.

5. Benoy I., Salgado R., Colpaert C. et al. Serum interleukin 6, plasma VEGF, serum VEGF, and VEGF platelet load in breast cancer patients // Clin. Breast Cancer. — 2002. — Vol. 2, N 4. — P. 311—315.

6. Berns E. M., Klijn J. G., Look M. P. et al. Combined vascular endothelial growth factor and TP53 status predicts poor response to tamoxifen therapy in estrogen receptor-positive advanced breast cancer // Clin. Cancer Res. — 2003. — Vol. 9, N 4. — P. 1253—1258.

7. CallagyG., Dimitriadis E., Harmey J. et al. Immunohistochemical measurement of tumor vascular endothelial growth factor in breast cancer. A more reliable predictor of tumor stage than microvessel density or serum vascular endothelial growth factor // Appl. Immunohistochem. Molecul. Morphol. — 2000. — Vol. 8, N 2. — P. 104—109.

8. Coskun U., Gunel N., Toruner F. B. et al. Serum leptin, prolactin and vascular endothelial growth factor (VEGF) levels in patients with breast cancer // Neoplasma. — 2003. — Vol. 50, N 1. — P. 41—46.

9. De Paola F., Granato A. M., Scarpi E. et al. Vascular endothelial growth factor and prognosis in patients with node-negative breast cancer // Int. J. Cancer. — 2002. — Vol. 98, N 2. — P. 228—233.

10. Foekens J. A., Peters H. A., Grebenchtchikov N. et al. High tumor levels of vascular endothelial growth factor predict poor response to systemic therapy in advanced breast cancer // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61, N 14. — P. 5407—5414.

11. Gasparini G. Clinical significance of determination of surrogate markers of angiogenesis in breast cancer // Crit. Rev. Oncol. Hematol. — 2001. — Vol. 37, N 2. — P. 97—114.

12. Greb R. R., Maier I., Wallwiener D. et al. Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) mRNA expression levels decrease after menopause in normal breast tissue but not in breast cancer lesions // Br. J. Cancer. — 1999. — Vol. 81, N 2. — P. 225—231.

13. Hyder S. M., Stancel G. M. Inhibition of progesterone-induced VEGF production in human breast cancer cells by the pure antiestrogen ICI 182,780 // Cancer Lett. — 2002. — Vol. 181, N 1. — P. 47—53.

14. Lantzsch T., Hefler L., Krause U.The correlation between immunohis-tochemically-detected markers of angiogenesis and serum vascular endothelial growth factor in patients with breast cancer // Anticancer Res. — 2002. — Vol. 22, N 3. — P. 1925—1928.

15. Linderholm B., Grankvist K., Wilking N. et al. Correlation of vascular endothelial growth factor content with recurrences, survival, and first relapse site in primary node-positive breast carcinoma after adjuvant treatment // J. Clin. Oncol. — 2000. — Vol. 18, N 7. — P. 1423—1431.

16. Nishimura R., Nagao K., Miyayama H. et al. Higher plasma vascular endothelial growth factor levels correlate with menopause, overexpression of p53, and recurrence of breast cancer // Breast Cancer. —

2003. — Vol. 10, N 2. — P. 120—128.

17. Ruohola J. K., Valve E. M., Karkkainen M. J. et al. Vascular endothelial growth factors are differentially regulated by steroid hormones and antiestrogens in breast cancer cells // Mol. Cell. Endocrinol. — 1999. — Vol. 149, N 1—2. — P. 29—40.

18. Salven P., Perhoniemi V., Tykka H. et al. Serum VEGF levels in women with a benign breast tumor or breast cancer // Breast Cancer Res. Treat. — 1999. — Vol. 53, N 2. — P. 161 — 166.

19. TakeiH., LeeE. S., Jordan V. C. In vitro regulation of vascular endothelial growth factor by estrogens and antiestrogens in estrogen-receptor positive breast cancer// Breast Cancer. — 2002. — Vol. 9, N 1. — P. 39—42.

20. Wu Y., Saldana L., Chillar R. et al. Plasma vascular endothelial growth factor is useful in assessing progression of breast cancer post surgery and during adjuvant treatment// Int. J. Oncol. — 2002. — \bl. 20, N 3. — P. 509—516.

Поступила 08.07.2003

E. S. Gershtein, A. M. Scherbakov, S. K. Alieva, O. A. Anurova, K. P. Laktionov, N. E. Kushlinsky

VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR IN TUMORS AND SERUM OF BREAST CANCER PATIENTS: RELATION TO CLINICOMORPHOLOGICAL FACTORS

Institute of Clinical Oncology, N. N. Blokhin CRC RAMS, Moscow

Free and total vascular endothelial growth factor (VEGF) levels were measured by enzyme immunoassay in tumor cytosol and serum from 109 breast cancer patients. These parameters were studied in relation to clinicomorphological disease features and tumor receptor status. The study demonstrated free VEGF concentration in cytosol to increase with tumor size. Besides, free tumor and serum VEGF concentrations were elevated in patients of advanced age, most of whom were postmenopausal. In opposite, total serum VEGF was not increased against normal and not related to any clinical morphological factors. Free tumor VEGF should therefore be measured to quantify angiogenesis activity in breast cancer patients.

Key words: vascular endothelial growth factor, VEGF, breast cancer, tumor, serum, enzyme immunoassay.