АНАЛИЗ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСНОГО ВЕКТОРА, КОДИРУЮЩЕГО ИЗОМЕРОГИДРОЛАЗЫ

1. Способ измерения активности изомерoгидролазы, включающий:
(a) приведение клеток, экспрессирующих лецитин:ретинол-ацилтрансферазу (LRAT), в контакт с аденоассоциированным вирусным (AAV) вектором, содержащим трансген, кодирующий белок изомерoгидролазу, в условиях, позволяющих трансдукцию клеток;
(b) инкубацию трансдуцированных клеток в условиях, позволяющих экспрессию кодированного белка изомерoгидролазы;
(c) сбор и лизис трансдуцированных клеток для получения экстракта, содержащего кодированный белок изомерoгидролазу;
(d) инкубацию указанного экстракта с субстратом в течение периода времени и в условиях, позволяющих превращение субстрата посредством белка изомерoгидролазы в продукт реакции;
(e) подвергание указанного продукта реакции колоночной хроматографии, таким образом, получая очищенный колоночной хроматографией продукт реакции; и
(f) подвергание указанного очищенного колоночной хроматографией продукта реакции масс-спектрометрии, таким образом, количественная оценка продукта реакции, где количество продукта реакции отражает активность изомерoгидролазы, таким образом, измерение активности изомерoгидролазы.
2. Способ по п.1, где белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок, 65-кДа (RPE65).
3. Способ по п.1, где белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок дикого типа, 65-кДа (RPE65).
4. Способ по п.1, где белок изомерoгидролаза содержит вариант или мутант специфического для пигментного эпителия сетчатки белка, 65-кДа (RPE65).
5. Способ по любому из пп. 1-4, где белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок млекопитающего, 65-кДа (RPE65).
6. Способ по любому из пп. 1-5, где белок изомерoгидролаза содержит специфический для пигментного эпителия сетчатки белок человека, 65-кДа (RPE65).
7. Способ по любому из пп. 1-6, где клетки содержат клетки млекопитающих.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где клетки содержат клетки человека.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где клетки содержат клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где клетки экспрессируют LRAT, стабильно или временно.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где субстрат содержит полностью-транс-ретиниловый сложный эфир.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где стадия (d) включает добавление предшественника субстрата в экстракт, где предшественник превращается в указанный субстрат посредством экспрессированной LRAT.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где стадия (d) включает добавление клеточного связывающего ретинальдегид белка (CRALBP) и предшественника субстрата в экстракт, где предшественник превращается в указанный субстрат посредством экспрессированной LRAT.
14. Способ по п.13, где количество добавленного CRALBP составляет между приблизительно 50 и приблизительно 500 мкг.
15. Способ по любому из пп. 1-12, где клетки также стабильно или временно экспрессируют клеточный связывающий ретинальдегид белок (CRALBP).
16. Способ по любому из пп. 12-15, где предшественник содержит полностью-транс-ретинол или состоит из него.
17. Способ по п.16, где полностью-транс-ретинол добавляют таким образом, что конечная концентрация составляет от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где продукт реакции содержит 11-цис-ретинол или состоит из него.
19. Способ по любому из пп. 1-17, где стадию (d), (e) и/или (f) проводят в темноте, при тусклом свете или при тусклом желтом свете.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где субстрат, предшественник или продукт реакции является нерадиоактивным.
21. Способ по любому из пп. 1-20, где период времени на стадии (d) составляет от приблизительно 30 минут до приблизительно 240 минут.
22. Способ по любому из пп. 1-21, где после стадии (d), но до стадии (e), реакцию останавливают или гасят.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где после стадии (d), но до стадии (e), добавляют спирт.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где стадия (d) дополнительно включает экстракцию указанного продукта реакции.
25. Способ по п.24 где указанный продукт реакции экстрагируют органическим растворителем.
26. Способ по п.24, где указанный продукт реакции экстрагируют гексаном.
27. Способ по любому из пп. 1-26, где любую из стадий (a)-(d) осуществляют, как указано в примере 1.
28. Способ по любому из пп. 1-26, где любую из стадий (e)-(f) осуществляют, как указано в примере 2.
29. Способ по любому из пп. 1-28, где аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор содержит белковую последовательность капсида или последовательность инвертированного концевого повтора, имеющие 70% или более идентичности последовательности с белковой последовательностью капсида или с последовательностью инвертированного концевого повтора любого серотипа, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и AAV10.
30. Способ по любому из пп. 1-28, где аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор содержит белок капсида или инвертированный концевой повтор из любого серотипа, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10.
31. Способ по любому из пп. 1-30, где (a) приведение клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 500 до приблизительно 5 миллионов частиц вектора AAV/клетку.
32. Способ по любому из пп. 1-30, где (a) приведение клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 1000 до приблизительно 1000000 частиц вектора AAV/клетку.
33. Способ по любому из пп. 1-30, где (a) приведение клеток в контакт проводят с количеством от приблизительно 2000 до приблизительно 500000 частиц вектора AAV/клетку.
34. Способ по любому из пп. 1-30, где (b) инкубация трансдуцированных клеток происходит в течение периода времени от приблизительно 6 часов до приблизительно 96 часов.
35. Способ по любому из пп. 1-30, где лизис трансдуцированных клеток из (c) проводят посредством замораживания-размораживания, обработки ультразвуком или их комбинации.
36. Способ по любому из пп. 1-30, где определяют общее количество клеточного белка, полученного после стадии (c).
37. Способ по любому из пп. 1-30, где общее количество клеточного белка, полученного после стадии (c), определяют посредством анализа Бредфорд.
38. Способ по любому из пп. 1-30, где предшественник смешивают с 10-100% раствором DMF.
39. Способ по любому из пп. 1-30, где после сбора клеток, но до лизиса (c), собранные клетки ресуспендируют в буфере.
40. Способ по любому из пп. 1-30, где после лизиса (c) трансдуцированных клеток для получения экстракта, экстракт разводят в буфере.
41. Способ по пп. 39 или 40, где буфер представляет собой солевой буфер.
42. Способ по пп. 39 или 40, где буфер представляет собой буфер NaCl.
43. Способ по любому из пп. 1-30, где указанный экстракт, полученный на стадии (c), включает от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2000 мкг общего клеточного белка, или его доводят до от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2000 мкг общего белка.
44. Способ по любому из пп. 1-30, где указанный экстракт, полученный на стадии (c), включает от приблизительно 50 мкг до приблизительно 750 мкг общего клеточного белка, или его доводят до от приблизительно 50 мкг до приблизительно 750 мкг общего белка.
45. Способ по любому из пп. 1-30, где указанная инкубация (d) происходит при температуре от приблизительно 30 до приблизительно 40°C.
46. Способ по любому из пп. 1-30, где колоночная хроматография отделяет 11-цис-ретинол от 9-цис-ретинола и/или отделяет 11-цис-ретинол от 13-цис-ретинола.
47. Способ по любому из пп. 1-30, где колоночная хроматография включает обращеннофазовую хроматографию.
48. Способ по любому из пп. 1-30, где колоночная хроматография включает обращеннофазовую стационарную фазу.
49. Способ по п.48, где стационарная фаза содержит цепь C18.
50. Способ по п.48, где стационарная фаза содержит гидрофильную группу.
51. Способ по п.48, где гидрофильная группа содержит карбаматную группу.
52. Способ по п.48, где стационарная фаза содержит гидрофильную карбаматную группу в цепи C18.
53. Способ по п.48, где стационарная фаза содержит силилкарбаматную группу.
4
6
54. Способ по любому из пп. 1-53, где способ является линейным от приблизительно 1×10 до приблизительно 2×10 геномов вектора AAV на клетку.
2
55. Способ по любому из пп. 1-54, где коэффициент детерминации (R) составляет более, чем приблизительно 0,85.