СПОСОБ ОЦЕНКИ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГИПЕРГЛИКЕМИИ
METHOD FOR ASSESSING LONG-TERM HYPERGLYCEMIA

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для изучения хронических осложнений сахарного диабета, формирующихся вследствие длительной гипергликемии и гликозилирования белков, а также коррекции этих изменений при разработке новых методов лечения. Изобретение также может быть использовано в клинической диагностике в качестве недорогого скринирующего метода исследования для выявления гипергликемии, продолжающейся в течение длительного периода времени.
Широкое распространение сахарного диабета, приобретающее характер эпидемии среди населения развитых стран, определяет необходимость своевременного выявления и лечения лиц, относящихся к группам риска, а также поиск новых методов коррекции вызванных заболеванием хронических осложнений [1, 4, 6]. Причинами длительной гипергликемии, кроме инсулинзависимого и инсулиннезависимого сахарного диабета, могут быть такие эндокринные нарушения, как гипертиреоз, повышенная функция коры надпочечников, феохромацитома, а также состояние хронического стресса, сопровождающееся выделением контринсулярных гормонов. Стресс, острый и хронический, рассматривают не только как фактор, отягощающий течение, но также являющийся в некоторых случаях причиной возникновения сахарного диабета [9]. Гормоны, участвующие в адаптации к стрессу (адреналин, глюкагон, глюкокортикоиды), являются контринсулярными и вызывают повышение уровня глюкозы в крови, что способствует усиленной секреции инсулина и, как следствие, инсулинорезистентности у некоторых лиц [1, 7, 9].
Основным и доступным способом оценки гипергликемии в настоящее время является определение содержания глюкозы в цельной крови или в плазме, сыворотке крови ферментативным глюкозоксидазным методом. Поскольку содержание глюкозы в крови, даже измеренное натощак, подвержено значительным изменениям в течение нескольких недель, для выявления гипергликемии, сохраняющейся на протяжении длительного времени, используют методы определения гликозилированного гемоглобина (HbA1c) и фруктозамина. Для установления инсулинорезистентности используют тест толерантности к глюкозе.
Гликозилирование белков происходит в результате неферментативной реакции свободных аминогрупп аминокислотных остатков и альдегидной группы глюкозы. На первой, обратимой стадии реакции образуется лабильный альдимин или нестабильное основание Шиффа. На второй, медленной и необратимой стадии происходит перегруппировка Амадори (изомеризация остатка глюкозы в остаток фруктозы) с образованием стабильного кетамина [4, 8]. Гемоглобин, содержащий кетамин, традиционно называют гликозилированным гемоглобином, а альбумин крови, соединенный с кетамином, принято называть фруктозамином.
В клинической диагностике по количеству HbA1c судят о средней концентрации глюкозы за последние два-три месяца, так как период полураспада гемоглобина составляет 60 дней, а количество фруктозамина свидетельствует о средней концентрации глюкозы за последние 2-3 недели, поскольку период полураспада альбумина - 40 дней [8].
Существует 6 способов определения продуктов гликозилирования, основанных на различных принципах анализа: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), микроколоночные ионообменная и аффинная хроматография, электрофорез, спектрофотометрический и иммунохимический методы.
Для ВЭЖХ и электрофореза необходимо специальное, часто дорогостоящее оборудование, например для эффективного разделения фракций гемоглобина методом электрофореза требуются реактивы фирмы «Beckman» и хороший денситометр типа Apprise (США). Микроколоночные хроматографические методы в значительной степени зависят от температурных условий. Температура оказывает меньшее влияние на определение методом аффинной хроматографии, но определение вместе с подготовкой и промыванием колонок занимает 3 часа и позволяет исследовать одновременно не более 5 образцов крови. Спектрофотометрический и иммунохимический методы выполняются быстро, но спектрофотометрическое определение также зависит от температуры, а для иммунохимического анализа необходимы импортные реактивы фирмы «Bayer» и «Roche», биохимический анализатор и специальное и программное обеспечение [8]. Результат определения может быть заниженным в случае потери крови, анемии у пациента из-за меньшей продолжительности существования эритроцитов. Гемоглобин (в случае гемолиза), аскорбиновая кислота и церулоплазмин тормозят образование фруктозамина. Снижение результатов определения фруктозамина наблюдается при гипопротеинемии, протеинурии, потере альбумина. В этом случае необходимо дополнительно определять содержание общего белка и альбумина в плазме крови. У пациентов после удаления селезенки или с полицитемией могут обнаруживаться завышенные результаты. Кроме того, в ряде методов на точность анализа HbA1c оказывают влияние другие гликозилированные фракции гемоглобина, удаление которых не всегда предусмотрено. В эритроцитах крови человека кроме основных фракций гемоглобина (HbA - 93%) содержится незначительное количество других фракций, которые также могут подвергаться гликозилированию (HbA1a, HbA1b, HbA1c, HbA2, HbF). В норме у человека гликозилированный гемоглобин (HbA1) находится в пределах от 5 до 8% от общего гемоглобина, фракция гликозилированного гемоглобина - HbA1c составляет 4-6,5%.
Гликозилированный гемоглобин образуется неферментативным путем, когда глюкоза свободно проникает через мембрану эритроцита на протяжении всей жизни эритроцита. Глюкоза, присоединенная к белкам посредством прочной ковалентной связи, вызывает изменение их строения, функций и аутоиммунные реакции. Процесс гликозилирования белков обуславливает развитие микро- и макрососудистых осложнений у больных сахарным диабетом [1, 4]. Гликозилированию подвержены не только гемоглобин и белки плазмы крови, но также белки мембран форменных элементов крови, в том числе белки эритроцитарных мембран. Согласно проведенным ранее исследованиям при аллоксановом диабете увеличение количества гликозилированного гемоглобина, являющееся показателем гликозилирования других белков организма, сопровождается стабилизацией мембран эритроцитов, и эта стабилизация не зависит от содержания холестерина в эритроцитарной мембране [2, 3]. Следовательно, устойчивость мембраны эритроцитов может быть обусловлена ее гликозилированием и увеличением слоя гликокаликса на поверхности эритроцитов.
При утолщении гликокаликса проницаемость эритроцитарной мембраны становится недостаточной для глюкозы, являющейся единственным энергетическим субстратом для эритроцитов. Уменьшение поступления глюкозы в эритроциты напрямую не связано с выработкой инсулина, так как в мембране эритроцитов отсутствует рецептор, встраивающийся в мембраны клеток после взаимодействия инсулина с инсулиновым рецептором и активации цепочки посредников гормона. Однако гипоинсулинемия и инсулинорезистентность являются причиной нарушения активного транспорта глюкозы в клетки инсулинзависимых тканей, обладающих подобными рецепторами [4]. Глюкоза, оставшаяся невостребованной, а также образовавшаяся в результате глюконеогенеза, накапливается в крови и вступает в реакции гликозилирования.
Эритроциты здорового человека или животного in vitro быстро потребляют глюкозу из плазмы крови, поэтому определение глюкозы проводят в цельной крови или в сыворотке/плазме, отделенной от форменных элементов, непосредственно после взятия крови. Увеличение времени от забора крови до определения показателя приводит к получению заниженного результата. В то же время снижение проницаемости эритроцитарной мембраны должно способствовать меньшей скорости потребления эритроцитами глюкозы из плазмы крови.
Целью предлагаемого изобретения является снижение времени оценки длительной гипергликемии с повышением достоверности результата, также и возможность обследования максимального количества людей в минимальное время для выявления группы риска.
Технический результат достигается за счет оптимизации способа оценки и, как следствие, снижения трудо- и материальных затрат.
Для решения поставленной задачи предлагается способ оценки длительной гипергликемии, основанный на определении содержания глюкозы в плазме крови, отличающийся тем, что содержание глюкозы определяют дважды: сразу после взятия крови и через 24 часа после хранения плазмы крови над слоем форменных элементов, затем подсчитывают уменьшение содержания глюкозы в процентах от исходного уровня, по которому дают оценку длительной гипергликемии, причем хранение плазмы крови производят при t=4,0±0,5°C.
Материалы и методы
Эксперимент был проведен на 35 беспородных крысах обоего пола массой 180-250 г, которых содержали на обычном рационе вивария. Условия содержания и обращение с используемыми в эксперименте животными соответствовали Директиве Совета ЕС 2010/63/EU. Животных разделили на группы: 1 - интактные крысы, 2 - моделирование субкомпенсированного сахарного диабета 1 типа (введение аллоксана в количестве 17 мг/100 г массы), 3 - моделирование декомпенсированного аллоксанового диабета 1 типа (введение аллоксана в количестве 30 мг/100 г массы). Моделирование сахарного диабета проводили в соответствии с авторской методикой (заявка №2013125897). Через месяц после первого введения аллоксана развивался аллоксановый диабет, сопровождавшийся полидипсией, полиурией, повышением уровня глюкозы, гликозилированного гемоглобина и снижением инсулина в крови - основных показателей и критериев сахарного диабета 1 типа. Отклонение от нормы исследованных показателей было более выражено у животных в группе 3, чем в группе 2.
Содержание глюкозы определяли с использованием стандартного набора реактивов фирмы «Витал Диагностикс» (СПб). Определение проводили дважды: в плазме крови сразу после ее забора и в той же плазме, хранившейся над слоем форменных элементов при 4°C в течение 24 часов. В цельной крови определяли содержание гликозилированного гемоглобина методом аффинной гель-хроматографии по набору реактивов «Диабет-тест» фирмы ФОСФОСОРБ. Проницаемость эритроцитарных мембран (ПЭМ) определяли методом Колмакова В.Н., Радченко В.Г. [5]. Степень гемолиза выражали в % гемолизированных эритроцитов по отношению к эталону. Проницаемость мембран оценивали по гемолизу эритроцитов в смесях растворов мочевины и хлорида натрия с возрастающей концентрацией мочевины.
Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре DU-800 фирмы «Beckman» (США). Статистический анализ материала проводили с помощью программ Statistica 6.0 (Stat. Soft.Inc.) и программы Microsoft Exel 2003. При проверке статистических гипотез использовался уровень значимости 5% (P<0,05).
Результаты наблюдений и выводы
Как видно из таблицы 1, у животных с моделью субкомпенсированной и компенсированной форм сахарного диабета содержание глюкозы прогрессивно возрастает по сравнению с показателем в группе интактных животных. Чем выше первоначально измеренный уровень глюкозы, тем меньше снижение этого показателя, выраженного в процентах от исходного количества, через 24 часа после первого измерения.
Таблица 1
Содержание глюкозы и HbA1c, % в крови опытных и интактных животных
Показатели
Группы
Интактные n=10
Аллоксановый диабет, субкомпенсированная форма n=15
Аллоксановый диабет, декомпенсированная форма n=10
Глюкоза, ммоль/л
Первое измерение
5,1±0,7
10,9±1,7
33,9±1,7
*
* **
Второе измерение
3,3±0,4
9,8±1,7
33,9±1,6
*
* **
Снижение содержания глюкозы, %
34,8±5,9
9,9±2,3
1,8±0,6
*
* **
HbA1c, %
2,9±0,1
5,0±0,3
9,1±0,4
*
* **
Примечание: * - различие с группой интактных животных достоверно при P<0,05; ** - различие с группой 2 достоверно при P<0,05.
У здоровых животных наблюдается значительное уменьшение показателя через сутки после первого измерения - на 30-40%, уровень глюкозы становится ниже нормы или приближается к нижней границе нормы. У животных с аллоксановым диабетом снижение содержания глюкозы за сутки незначительно: на 10% у крыс с субкомпенсированной формой диабета и почти не изменяется у животных с декомпенсированной формой. Содержание гликозилированного гемоглобина также увеличено в обеих опытных группах относительно контроля - интактных крыс.
При подсчете коэффициента парной линейной корреляции между снижением содержания глюкозы, выраженным в процентах от исходного уровня, и содержанием гликозилированного гемоглобина в эритроцитах получено значение -0,77, то есть наблюдается обратная корреляция: чем больше гликозилированного гемоглобина, тем меньше потребление эритроцитами глюкозы из плазмы крови.
Таблица 2
Проницаемость эритроцитарных мембран (ПЭМ) по мочевинному гемолизу при возрастающей концентрации мочевины (в % гемолизированных эритроцитов)
Объемное соотношение мочевина : хлорид натрия
Группы
Интактные n=10
Аллоксановый диабет, субкомпенсированная форма n=15
Аллоксановый диабет, декомпенсированная форма n=10
40:60
7,3±1,3
7,1±0,7
7,0±0,9
50:50
19,3±2,6
28,6±5,6
13,7±3,2
55:45
45,7±3,6
63,6±7,2
25,4±5,6
* **
60:35
91,4±1,6
86,7±2,7
67,3±7,3
* **
Примечание: * - различие с группой интактных животных достоверно при P<0,05; ** - различие с группой 2 достоверно при P<0,05.
В таблице 2 представлены данные измерения проницаемости эритроцитарных мембран у интактных и опытных животных. В группе крыс с субкомпенсированной формой сахарного диабета ПЭМ достоверно не отличается от показателя интактных животных, измеренного при всех четырех соотношениях растворов мочевины и хлорида натрия. В то же время у крыс с декомпенсированной формой патологии обнаруживается более выраженная устойчивость эритроцитов к гемолизу при повышенном содержании мочевины в гемолизирующем растворе. Возрастание устойчивости мембран эритроцитов или снижение их проницаемости может быть причиной уменьшения потребления эритроцитами глюкозы из плазмы крови при хранении цельной крови.
Таким образом, снижение содержания глюкозы в плазме крови, выраженное в процентах к первоначальному количеству, через 24 часа после забора крови может служить показателем для оценки длительной гипергликемии.
Предлагаемый способ насколько прост, настолько и эффективен, поэтому, а также в силу своей дешевизны и доступности может найти широкое применение в лечебных учреждениях: районных поликлиниках, небольших больницах и особенно в медучреждениях сельской местности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Кремлинская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений (руководство для врачей). - М.: Медицина. 2005 г. - 512 с.
2. Гетте И.Ф., Данилова И.Г., Кротов В.К. Зависимость резистентности эритроцитарных мембран от возраста крыс и развития аллоксанового сахарного диабета // Вестник Уральской медицинской академической науки. - №3(26). - 2009. - С.22-24.
3. Данилова И.Г., Медведева С.Ю., Абидов М.Т., Юшков Б.Г., Кисельникова Л.П., Гетте И.Ф., Госьков И.А., Чиши М.А. Особенности регенераторных процессов различных тканей в условиях модулирования макрофагальной активности // Институт стоматологии. 2005. 2. С.67-69.
4. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Патохимия. - СПб: ЭЛБИ-СПБ, 2007. - 768 с.
5. Колмаков В.Н., Радченко В.Г. Значение определения проницаемости эритроцитарных мембран (ПЭМ) в диагностике хронических заболеваний печени // Терапевтический архив. №5. 1982. С.59-62. Колмаков В.Н., Радченко В.Г. Значение определения проницаемости эритроцитарных мембран (ПЭМ) в диагностике хронических заболеваний печени // Терапевтический архив. №5. 1982. С.59-62.
6. Питер Дж. Уоткинс. Сахарный диабет. - М.: Издательство «Бином». 2006 г. - 135 с.
7. Титов В.Н. Лабораторные и инструментальные исследования в диагностике. Справочник. - М.: Издательство «ГЭОТАР-МЕД». 2004. 958 с.
8. Эммануэль В.Л., Карягина И.Ю., Эммануэль Ю.В. Сравнение методов определения гликозилированного гемоглобина // Лабораторная медицина. 2002. 5. С.99-104.
9. Surwit R., Schneider М., Feinglos М. Stress and Diabetes Mellitus // Diabetes Care 1992. vol.15. №.10. P.1413-1422