Способ забора дентинной жидкости зуба
METHOD FOR TOOTH DENTIN FLUID EXTRACTION

Изобретение относится к медицине, а именно стоматологии, и может быть использовано для забора дентинной жидкости зуба с целью изучения ее биохимического состава в диагностических целях, а также для дальнейших научных исследований в экспериментальной медицине.
Диагностика и лечение заболеваний пульпы остается одной из ведущих проблем в стоматологии, что определяется высокой распространенностью данной патологии среди населения. Воспаление пульпы зуба в структуре стоматологических заболеваний у взрослого населения России составляет от 18 до 30% и занимает первое место среди всех осложнений кариеса (Боровский Е.В., Леонтьев В.К., 2001; Максимовский Ю.М., Митронин А.В., 2014; Янушевич О.О., с соавт., 2016; Ricucci D., 2014). Согласно классификации МКБ-10 (1997), выделяют обратимые (начальный пульпит или гиперемия) и необратимые (острый, гнойный и хронические формы) формы пульпита (Дмитриева Л.А., с соавт., 2015; Kohen S., 2007; Rucucci D., 2015). Установлено, что на начальной стадии воспаления пульпы существует возможность сохранения ее жизнеспособности и функций (Островская И.Г., 2018; Cohenca N., 2013; AlShwaimi Е., 2016). Несмотря на высокое развитие цифровых методов медицинской диагностики, определение обратимости воспалительного процесса в пульпе по-прежнему остается актуальной проблемой при проведении пульпосохраняющей терапии. Низкий процент успеха при лечении начального пульпита говорит о несостоятельности существующих современных диагностических инструментов, которые так или иначе искажают достоверную картину физиологического состояния пульпы и не позволяют точно определить стадию воспалительного процесса, что препятствует постановке правильного диагноза. Достоверная диагностика состояния пульпы является ключевым фактором успешного лечения начального пульпита. Однако, на сегодняшний день представляется невозможным с помощью существующих методов обследования клинически оценить истинное гистологическое состояние пульпы (Seltzer S, Bender I, Ziontz M. The dynamics of pulp inflammation: correlations between diagnostic data and actual histologic findings in the pulp. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1963; 16:969-77). Следовательно, диагноз обратимый или необратимый пульпит зачастую выражает намерение врача-стоматолога сохранить пульпу жизнеспособной или провести ее экстирпацию на основе полученных недостоверных клинических данных основными и дополнительными методами обследования.
В настоящее время наиболее часто используемыми методами диагностики витальности пульпы зуба являются анализ субъективных признаков заболевания, термодиагностика, электроодонтометрия, рентгенография. Существуют и другие диагностические методы, которые оказались менее популярными вследствие их высокой стоимости, необходимости дополнительного профессионального оборудования, низкой эффективности и/или достоверности. Таковыми являются реодонтография сосудов пульпы зуба, фотоплетизмография сосудистой системы пульпы, ультразвуковая допплерография пульпы зуба, лазерная допплеровская флоуметрия микроциркуляции пульпы зуба и другие. Следует отметить, что исследования по внедрению данных диагностических методов малочисленны, носят фрагментарный характер и опираются на ограниченное количество наблюдений.
Очевидно, что необходим поиск новых методов исследования, которые позволят достоверно оценить активность воспалительного процесса в пульпе зуба с целью дифференциальной диагностики обратимой и необратимой стадии пульпита, что позволит назначить адекватное лечение.
Для диагностики состояния пульпы более предпочтительными являются неинвазивные или малоинвазивные методы обследования, которые позволяют диагностировать ранние проявления заболевания, осуществлять контроль эффективности лечения и мониторинг статуса витальности пульпы без ее повреждения.
Одним из таких методов является исследование дентинной жидкости зуба, поскольку это позволяет без специальной подготовки пациента к исследованию и с минимальным риском для здоровья оценить активность воспалительного процесса в пульпе зуба. Дентинная жидкость является транссудатом периферических сосудов пульпы (Быков В.Л., 1998), поэтому может содержать те же клетки иммунного ответа, что и пульпа, в том числе маркеры воспаления, которые служат достоверным источником информации о степени воспаления внутри пульпарной полости. В процессе развития воспалительного процесса в пульпе зуба участвует множество сигнальных молекул, концентрация которых меняется в зависимости от стадии воспаления. Следовательно, требуется более глубокий и детальный анализ маркеров воспаления в норме и при патологии с целью разработки и усовершенствования уже имеющихся неинвазивных методов диагностики обратимых форм пульпита на основе полученных данных.
Известен способ забора дентинной жидкости - [G. Bergenholtz, М. Jontell, A. Tuttle, G. Knutson. Inhibition of serum albumin flux across exposed dentine following conditioning with GLUMA primer, glutaraldehyde or potassium oxalates. J. Dent. 1993; 21:220-227]. Для определения сывороточного альбумина в дентинной жидкости зуба препарировали полость определенного размера 15-20 μl, оставляя 1-1,5 мм твердых тканей до пульпарной камеры. Сформированную полость промывали фосфатным буфером, протравливали с помощью 6% ортофосфорной кислоты в течение 1 минуты. Затем полость заполняли фосфатным буфером определенного объема и оставляли на 15-30 минут. Забор жидкости осуществляли с помощью микропипетки; далее проводили иммуноферментный анализ полученного диагностического материала.
Данный способ имеет ряд недостатков - требует формирования полости определенной формы с сохранением четырех стенок зуба (I класс по Блэку) для возможности временного удержания жидкости в полости зуба; данный метод не универсален, поскольку не применим при лечении зубов верхней челюсти, а так же при лечении зубов с кариозной полостью по II-V классу по Блэку. Данный метод так же требует много времени для исполнения и недостаточно точен и объективен, поскольку исходный объем жидкости не соответствует полученному объему жидкости через установленный интервал времени, что может быть связано с неполной адсорбцией биологического материала с помощью микропипетки.
Известен способ забора дентинной жидкости, который предполагает использование PVDF мембраны (Durapore, 0.45 mm, 13-mm diameter; Millipore, Bedford, MA), которая в сложенном виде помещается в полость зуба на 2 минуты с целью адсорбции дентинной жидкости [Matthias Zehnder, Florian J. Wegehaupt, Thomas Attin. A First Study on the Usefulness of Matrix Metalloproteinase 9 from Dentinal Fluid to Indicate Pulp Inflammation. J Endod 2011; 37:17-20]. Данная методика позволяет проводить измерение фермента матриксной металлопротеиназы-9 в дентинной жидкости методом иммуноферментной хроматографии (ELISA). Недостатками данного способа являются малый объем выхода дентинной жидкости на поверхность дентина сформированной полости, а также низкая адсорбционная способность используемых мембран.
Известен способ забора дентинной жидкости с помощью целлюлозной мембраны (1288, Sartorius Stedim Biotech GmbH, Gottingen, Germany) или бумажных пинов (Paper Points, Sirona Dentsply Endodontics, Ballaigues Switzerland), которые вносят на дно сформированной полости зуба без предварительного удаления смазанного слоя на 30 или 60 секунд соответственно. [Zehnder М, et al. Comparison of vehicles to collect dentinal fluid for molecular analysis. Journal of Dentistry (2014); Ballal, Vasudev; Rao, Sheetal; Bagheri, Azadeh; Bhat, Vinutha; Zehnder, Matthias; Attin, Thomas (2017). MMP-9 in dentinal fluid correlates with caries lesion depth. Caries Research, 51(5):460-465]. По вышеописанной методике проводится определение активности фермента матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9) в зависимости от глубины кариозного поражения с помощью иммуноферментного анализа. Данный способ выбран за прототип. Недостатками способа является то, что удаление смазанного слоя после препарирования дентина не проводится, что затрудняет выход дентинной жидкости на его поверхность; объем адсорбированной на поверхности мембраны дентинной жидкости очень мал, что не позволяет изучить состав полученного диагностического материала более технически сложными методами исследования; данный метод ограничен определением только двух маркеров воспаления, возможны погрешности в интерпретации результатов.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка универсального метода забора дентинной жидкости зуба, который позволит получить достаточное количество биологического материала для последующего проведения высокотехнологичных исследований в рамках протеомно-метаболомного анализа.
Авторы предлагают способ, характеризующийся простотой, малыми временными затратами и высокой результативностью.
Указанный способ осуществляется следующим образом. После проведения местной анестезии и изоляции рабочего поля с помощью системы раббердам, препарируют кариозную полость зуба с целью удаления некротизированных тканей. В области глубоких слоев дентина твердые ткани зуба препарируют с помощью новых, стерильных, острых боров и под обильным водо-воздушным охлаждением. Дентин дна и стенок полости зуба до эмалевой-дентинной границы протравливают 37% ортофосфорной кислотой в течение 10 секунд, затем полость промывают дистиллированной водой из пустера. В полость зуба вносят ватный шарик, обильно смоченный в гиперосмотическом растворе и оставляют на 2 минуты. Затем в полость вносят целлюлозную мембрану размером 0,7×1,5 см, оставляют на 2 минуты. В заранее подготовленную пробирку Эппендорфа с 0,5 физиологическим раствором переносят используемую мембрану с образцами биологического материала и замораживают при температуре -200С до проведения последующего исследования.
Техническим результатом заявленного изобретения является хорошая воспроизводимость результатов получения достаточного объема дентинной жидкости зуба при сохранении его витальности для последующего проведения высокотехнологичного протеомного анализа, повышение точности диагностики, упрощение процесса исследования при отсутствии необходимости использования опасных химических реагентов.
Это достигается за счет дополнительной стимуляции скорости тока дентинной жидкости в направлении кнаружи в область свежесрезанного дентина после его препарирования, что увеличивает объем полученного образца и сокращает время, необходимое для забора материала. Забор материала осуществляется путем внесения целлюлозной мембраны определенного размера в полость зуба на стандартизированное время, затем мембрану помещают в пробирку Эппендорфа с 0,5 мл физиологического раствора, замораживают при температуре -200 С; полученные образцы направляют на исследование.
Благодаря уникальному строению дентинно-пульпарного комплекса зуба, дентин может считаться живой тканью, которая способна отвечать на действие раздражителей. Основой структурной единицей дентина является дентинная трубочка, внутри которой располагается отросток одонтобласта и дентинная жидкость. Свободная жидкость внутри дентинных трубочек занимает около 22% общего объема дентина. Она является ультрафильтратом крови капилляров пульпы и по составу во многом напоминает плазму. Соответственно, при наличии воспалительного процесса в пульпе зуба компоненты иммунного ответа (в т.ч. ферменты, маркеры воспаления, сигнальные молекулы, нейропептиды и другие белковые фракции) через капилляры пульпы фильтруются в дентинную жидкость. Таким образом, биохимический анализ белкового спектра дентинной жидкости является одним из достоверных методов витальной диагностики зуба с целью определения стадии воспалительного процесса.
Особенности движения жидкости в дентинных канальцах были описаны многочисленными исследованиями. Жидкость движется из центральной части пульпы к кнаружи между одонтобластами, попадая в дентинные трубочки, и затем выходит через мелкие поры в эмали. Было показано, что давление в тканях пульпы составляет примерно 30 мм рт.ст. Следовательно, между пульпой и полостью рта имеется градиент давления, отвечающий за ток жидкости в направлении кнаружи. Сообщалось, что обнажение трубочек при переломе зуба или во время препарирования, высушивание поверхности дентина холодным сжатым воздухом полости часто приводит к движению жидкости в область открытой поверхности дентина, где она появляется в виде мельчайших капель. Однако, одной из основных проблем данного метода диагностики является чрезвычайно малый объем выхода дентинной жидкости на поверхность обнаженного дентина витальных зубов. Количество экссудата дентинных канальцев, который можно собрать после препарирования дентина, не достаточен для проведения всестороннего молекулярного анализа сигнальных молекул воспаления.
Для решения данной проблемы был предложен метод стимуляции движения жидкости кнаружи в область обнаженного дентина, который базируется на фундаментальных принципах осмолярности. Осмотическое давление обусловлено понижением химического потенциала растворителя в присутствии растворенного вещества. Тенденция системы выравнивать химические потенциалы во всех частях своего объема и перейти в состояние с более низким уровнем свободной энергии вызывает осмотический перенос вещества. Благодаря осмотическому давлению, которое мы искусственно создаем за счет внесения в полость зуба гиперосмотического раствора, растворитель стремится к понижению концентрации более концентрированного раствора вследствие встречной диффузии молекул растворенного вещества и растворителя. В данной системе в качестве растворителя выступает дентинная жидкость, а концентрированной жидкостью является гиперосмотический раствор. Величина осмотического давления зависит от концентрации осмотически активных веществ (электролитов, неэлектролитов, белков) в растворе. Таким образом, чем выше концентрация подлежащего опреснению раствора, тем выше градиент концентрации и перепад осмотических давлений, и тем активнее диффузия. Поскольку дентинная жидкость богата белковыми структурами, это дополнительно создает коллоидно-осмотическое давление. С учетом градиента осмотической концентрации и ионной заряженности раствора, для стимуляции тока дентинной жидкости кнаружи в область свежесрезанного дентина в качестве гиперосмотического раствора был выбран Декстран - 10% коллоидный раствор со средней молекулярной массой 35000-45000 Da, который вызывает ускорение восходящего потока жидкости, обусловленного капиллярным поднятием. Это увеличивает скорость выхода необходимого объема дентинной жидкости на поверхность дна сформированной полости в 2 раза за единицу времени. Таким образом, движение дентинного ликвора достигается за счет сочетанного действия капиллярности транспортных структур, коллоидно-осмотического и тканевого (внутрипульпарного) давления.
Кроме того, что в ходе проведения исследования была выявлена необходимость предварительного протравливания поверхности дентина 37% ортофосфорной кислотой в течение 5 секунд перед стимуляцией. Данная процедура позволяет очистить дентинные трубочки от дебриса и смазанного слоя после препарирования, что дополнительно открывает отверстия дентинных трубочек, усиливает эффект стимуляции и выход дентинной жидкости на поверхность обнаженного дентина.
Следует отметить, что оценка стадии воспалительного процесса на молекулярном уровне является относительно новым подходом, который позволит усовершенствовать диагностику и лечение начальных форм пульпита. Для качественного исследования протеома дентинной жидкости на разных стадиях воспаления предполагается использование метода масс-спектрометрии. Для масс-спектрометрического анализа необходимо не менее 50 мкг белка в исследуемом образце, что фактически неосуществимо при естественных условиях сбора дентинной жидкости. Это объясняет необходимость проведения стимуляции тока дентинного ликвора с целью получения требуемого объема биологического материала для последующего исследования.
С тем, чтобы подтвердить правильность наших рассуждений, было проведено лечение 30 пациентов обоего пола в возрасте от 18 до 35 лет, обратившихся в терапевтическое отделение центра клинической стоматологии г. Москвы. Исследование проводилось на основании письменного добровольного информированного согласия.
Был проведен сравнительный анализ полученных объемов дентинной жидкости зубов до стимуляции, после стимуляции и после удаления смазанного слоя дентина с последующей стимуляцией при лечении глубокого кариеса зубов. У всех пациентов был определен объем полученной дентинной жидкости на 3 этапах лечения с помощью взвешивания адсорбирующей целлюлозной мембраны до и после внесения в полость зуба. Взвешивание проводилось с помощью лабораторных электронных аналитических весов Adventurer RV214 (210 г/0,1 мг) фирмы «OHAUS Europe», Швейцария (государственный реестр средств измерений под №15565-02). Эксперименты, проведенные в рамках данного исследования, подтверждены в 100% случаев.
Клинический пример №1.
Пациентка С., 1996 года рождения, обратилась с жалобами на боль в области зуба 4.6 при приеме холодной и сладкой пищи. По данным осмотра была выявлена глубокая кариозная полость в 4.6 зубе, заполненная размягченным дентином. При проведении холодовой пробы болевая реакция продолжалась в течение 30 секунд после устранения раздражителя. Показатели ЭОД были равны 15 мкА. На прицельной внутриротовой рентгенограмме 4.6 зуба была выявлена глубокая кариозная полость, не сообщающаяся с полость зуба; периапикальные изменения отсутствовали. Был поставлен диагноз К04.00 Начальный пульпит (гиперемия пульпы) 4.6 зуба. После изоляции рабочего поля с помощь системы раббердам и проведения некрэктомии, сформированную полость зуба промывали дистиллированной водой, высушивали с помощью сухого ватного шарика. Затем с целью адсорбции дентинной жидкости в сформированную полость зуба вносили целлюлозную мембрану стандартного размера 0,7×1,5 см на 2 минуты, которая была предварительно взвешена на аналитических весах Adventurer (OHAUS) и имела массу 0,0090 г. После 2-х минутной экспозиции мембрана была повторно взвешена; они имела вес 0,0092 г. Далее было проведено протравливание дентина дна полости зуба 4.6 с помощью 37% ортофосфорной кислоты в течение 5 секунд, и в полость зуба был внесен обильно смоченный в гиперосмотическом растворе ватный шарик на 2 минуты для стимуляции тока дентинной жидкости на поверхность свежесрезанного дентина. Затем вновь вносили в полость зуба целлюлозную мембрану стандартного размера на 2 минуты. После 2-х минутной экспозиции мембрана была повторно взвешена; они имела вес 0,011 г.
Клинический пример №2.
Пациент К., 1989 года рождения, обратился с жалобами на перелом коронки зуба 2.1 в результате дорожно-транспортного происшествия и на боль от холодового раздражителя. Пациент обратился к врачу-стоматологу через 24 часа после получения травмы. По данным осмотра был выявлен откол дистального угла коронки зуба 2.1 без вскрытия полости зуба. При проведении холодовой пробы болевая реакция продолжалась в течение 40 секунд после устранения раздражителя. Показатели ЭОД были равны 20 мкА. На прицельной внутриротовой рентгенограмме 2.1 зуба в области периапикальных тканей изменения отсутствовали. Был поставлен диагноз К04.00 Начальный пульпит (гиперемия пульпы) 2.1 зуба. После изоляции рабочего поля с помощь системы раббердам и препарирования твердых тканей зуба, с целью адсорбции дентинной жидкости в сформированную полость зуба вносили целлюлозную мембрану стандартного размера 0,7×1,5 см по стандартной методике, дополнительно удерживая мембрану в помощью ручного инструмента. После 2-х минутной экспозиции мембрана была повторно взвешена; они имела вес 0,0092 г. Далее было проведено протравливание дентина дна коронки зуба 2.1 с помощью 37% ортофосфорной кислоты в течение 5 секунд, и к обнаженному дентину был приложен обильно смоченный в гиперосмотическом растворе ватный шарик на 2 минуты для стимуляции тока дентинной жидкости на поверхность свежесрезанного дентина. Затем вновь дентинную жидкость адсорбировали с помощью целлюлозной мембраны стандартного размера в течение 2-х минут. После 2-х минутной экспозиции мембрана была повторно взвешена; они имела вес 0,01 г.
Клинический пример №3.
Пациентка З., 2000 года рождения, обратилась с целью профилактического осмотра. По данным осмотра была выявлена несостоятельность старой реставрации на окклюзионной и контактной поверхностях 1.4 зуба, нарушение краевого прилегания и рецидив кариеса. При проведении холодовой пробы была отмечена быстропроходящая болевая реакция. Показатели ЭОД были равны 8 мкА. На прицельной внутриротовой рентгенограмме 1.4 зуба была выявлена глубокая кариозная полость под пломбой; периапикальные изменения отсутствовали. Был поставлен диагноз К04.00 Начальный пульпит (гиперемия пульпы) 1.4 зуба. Рабочее поле было изолировано с помощь системы раббердам. После удаления старой реставрации и проведения некрэктомии, сформированную полость зуба промывали дистиллированной водой, высушивали с помощью сухого ватного шарика. Затем с целью адсорбции дентинной жидкости в сформированную полость зуба вносили целлюлозную мембрану стандартного размера 0,7×1,5 см на 2 минуты, которая была предварительно взвешена на аналитических весах Adventurer (OHAUS) и имела массу 0,0090 г. После 2-х минутной экспозиции мембрана была повторно взвешена; они имела вес 0,0092 г. Далее было проведено протравливание дентина дна полости зуба 1.4 с помощью 37% ортофосфорной кислоты в течение 5 секунд, и в полость зуба был внесен обильно смоченный в гиперосмотическом растворе ватный шарик на 2 минуты для стимуляции тока дентинной жидкости на поверхность свежесрезанного дентина. Затем вновь вносили в полость зуба целлюлозную мембрану стандартного размера на 2 минуты. После 2-х минутной экспозиции мембрана была повторно взвешена; они имела вес 0,0098 г.
Предложенный способ забора дентинной жидкости позволяет получать необходимый для высокотехнологичного анализа объем дентинной жидкости в короткий срок, а так же он прост в исполнении, поэтому быть использован как в практическом здравоохранении, так и при проведении научно-практических исследований.