МНОГОЭФФЕКТОРНЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ CRISPR

1. Система обнаружения нуклеиновой кислоты, содержащая:
a) систему обнаружения CRISPR, содержащую:
i. эффекторный белок,
ii. одну или более направляющих РНК, предназначенных для связывания с соответствующими молекулами-мишенями, и
iii. один или более эффекторных белков амплификации сигнала CRISPR; и
b) одну или более маскирующих конструкций на основе РНК.
2. Система обнаружения полипептидов, содержащая:
a) систему обнаружения CRISPR, содержащую:
i. эффекторный белок,
ii. одну или более направляющих РНК, предназначенных для связывания с триггерной РНК, и
iii. один или более эффекторных белков амплификации сигнала CRISPR;
b) одну или более маскирующих конструкций на основе РНК и
c) один или более аптамеров обнаружения, содержащих сайт связывания промотора маскированной РНК-полимеразы или сайт связывания маскированного праймера.
3. Система по п. 1 или 2, в которой один или более эффекторных белков амплификации сигнала CRISPR включают в себя белок CRISPR типа IIIа.
4. Система по п. 3, в которой белок CRISPR типа III представляет собой белок Csm6.
5. Система по п. 4, в которой белок Csm6 выбран из EiCsm6 и LsCsm6.
6. Система по п. 3, в которой один или более эффекторных белков амплификации сигнала CRISPR включают в себя Csx28 или Csx27.
7. Система по п. 3, в которой один или более эффекторных белков амплификации сигнала CRISPR включают в себя один или более из Csm6, Csx28, Csx27 или любую их комбинацию.
8. Система по п. 3, дополнительно содержащая реагенты для амплификации нуклеиновых кислот.
9. Система по п. 1, в которой молекула-мишень представляет собой ДНК-мишень, и система дополнительно содержит праймер, который связывает ДНК-мишень и содержит промотор РНК-полимеразы.
10. Система по п. 1, в которой эффекторный белок системы CRISPR представляет собой нацеленный на РНК эффекторный белок.
11. Система по п. 10, в которой нацеленный на РНК эффекторный белок содержит один или более доменов HEPN.
12. Система по п. 11, в которой один или более доменов HEPN содержат последовательность мотива RxxxxH.
1
2
3
13. Система по п. 12, в которой мотив RxxxH содержит последовательность R{N/H/K]XXXH.
1
2
3
14. Система по п. 13, в которой X представляет собой R, S, D, Е, Q, N, G или Y, и Х независимо представляет собой I, S, Т, V или L, и Х независимо представляет собой L, F, N, Y, V, I, S, D, Е или А.
15. Система по п. 10, в которой нацеленный на РНК эффекторный белок CRISPR представляет собой С2с2.
16. Система по п. 15, в которой С2с2 находится в пределах 20 т.п.н. от гена Cas 1.
17. Система по п. 16, в которой эффекторный белок С2с2 происходит из организма рода, выбранного из группы, состоящей из Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter и Lachnospira.
18. Система по п. 17, в которой эффекторный белок С2с2 или Cas13b происходит из организма, выбранного из группы, состоящей из Leptotrichia shahii; Leptotrichia wadei (Lw2); Listeria seeligeri; Lachnospiraceae bacterium MA2020; Lachnospiraceae bacterium NK4A179; [Clostridium] aminophilum DSM 10710; Carnobacterium gallinarum DSM 4847; Carnobacterium gallinarum DSM 4847 (второй локус CRISPR); Paludibacter propionicigenes WB4; Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317; Listeriaceae bacterium FSL M6-0635; Leptotrichia wadei F0279; Rhodobacter capsulatus SB 1003; Rhodobacter capsulatus R121; Rhodobacter capsulatus DE442; Leptotrichia buccalis C-1013-b; Herbinix hemicellulosilytica; [Eubacterium] rectale; Eubacteriaceae bacterium CHKCI004; Blautia sp.Marseille-P2398; Leptotrichia sp.oral taxon 879 str. F0557; Lachnospiraceae bacterium NK4A144; Chloroflexus aggregans; Demequina aurantiaca; Thalassospira sp.TSL5-1; Pseudobutyrivibrio sp. OR37; Butyrivibrio sp.YAB3001; Blautia sp.Marseille-P2398; Leptotrichia sp.Mar seille-P3007; Bacteroides ihuae; Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA; Listeria riparia и Insolitispirillum peregrinum.
19. Система по п. 18, в которой эффекторный белок С2с2 представляет собой эффекторный белок С2с2 L. wadei F0279 или L. wadei F0279 (Lw2).
20. Система по п. 3, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК подавляют производство обнаруживаемого положительного сигнала.
21. Система по п. 20, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК подавляют производство обнаруживаемого положительного сигнала путем маскирования обнаруживаемого положительного сигнала или производства вместо этого обнаруживаемого отрицательного сигнала.
22. Система по п. 20, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК содержат молчащую РНК, которая подавляет образование генного продукта, кодируемого сообщающей конструкцией, причем генный продукт производит обнаруживаемый положительный сигнал при экспрессии.
23. Система по п. 20, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК представляет собой рибозим, который производит отрицательный обнаруживаемый сигнал, и причем положительный обнаруживаемый сигнал производится, когда рибозим деактивируется.
24. Система по п. 23, в которой рибозим преобразует субстрат в первый цвет, и причем субстрат преобразуется во второй цвет, когда рибозим деактивирован.
25. Система по п. 20, в которой маскирующее средство на основе РНК представляет собой РНК-аптамер и/или содержит РНК-связанный ингибитор.
26. Система по п. 25, в которой аптамер или РНК-связанный ингибитор изолирует фермент, причем фермент производит обнаруживаемый сигнал при высвобождении из аптамера или РНК-связанного ингибитора, воздействуя на субстрат.
27. Система по п. 25, в которой аптамер представляет собой ингибирующий аптамер, который ингибирует фермент и препятствует тому, чтобы фермент катализировал производство обнаруживаемого сигнала из субстрата, или причем РНК-связанный ингибитор ингибирует фермент и препятствует тому, чтобы фермент катализировал производство обнаруживаемого сигнала из субстрата.
28. Система по п. 27, в которой фермент представляет собой тромбин, белок С, нейтрофильную эластазу, субтилизин, пероксидазу хрена, бета-галактозидазу или щелочную фосфатазу теленка.
29. Система по п. 28, в которой фермент представляет собой тромбин, а субстрат представляет собой пара-нитроанилид, ковалентно связанный с пептидным субстратом для тромбина, или 7-амино-4-метилкумарин, ковалентно связанный с пептидным субстратом для тромбина.
30. Система по п. 25, в которой аптамер изолирует пару средств, которые при высвобождении из аптамеров объединяются для производства обнаруживаемого сигнала.
31. Система по п. 20, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК содержат олигонуклеотид РНК, к которому присоединены обнаруживаемый лиганд и маскирующий компонент.
32. Система по п. 20, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК содержат наночастицу, удерживаемую в совокупности с помощью мостиковых молекул, причем по меньшей мере часть мостиковых молекул содержит РНК, и причем раствор претерпевает сдвиг цвета, когда наночастица распределяется в растворе.
33. Система по п. 32, в которой наночастица представляет собой коллоидный металл.
34. Система по п. 33, в которой коллоидный металл представляет собой коллоидное золото.
35. Система по п. 20, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК содержат квантовую точку, связанную с одной или более молекулами-гасителями связывающей молекулой, причем по меньшей мере часть связывающей молекулы содержит РНК.
36. Система по п. 20, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК содержат РНК в комплексе с интеркалирующим средством, причем интеркалирующее средство изменяет абсорбцию при расщеплении РНК.
37. Система по п. 36, в которой интеркалирующее средство представляет собой пиронин-Y или метиленовый синий.
38. Система по п. 31, в которой обнаруживаемый лиганд представляет собой флуорофор, а маскирующий компонент представляет собой молекулу-гаситель.
39. Система по п. 3, в которой одну или более маскирующих конструкций на основе РНК можно расщеплять с помощью нацеленного на РНК эффекторного белка CRISPR и белка CRISPR типа IIIа.
40. Система по п. 39, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК содержат маскирующую конструкцию на основе РНК, которая может расщепляться нацеленным на РНК эффекторным белком CRISPR.
41. Система по п. 40, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК содержат маскирующую конструкцию на основе РНК, которая может расщепляться белком CRISPR типа IIIа.
42. Система по п. 40, в которой одна или более маскирующих конструкций на основе РНК содержат одну маскирующую конструкцию на основе РНК, которая может расщепляться нацеленным на РНК эффекторным белком CRISPR, и одну маскирующую конструкцию на основе РНК, которая может расщепляться белком CRISPR типа IIIа.
43. Система по п. 42, в которой маскирующая конструкция на основе РНК, которая может расщепляться белком CRISPR типа IIIа, содержит гомополимерную А или С-РНК.
44. Система по п. 3, в которой одна или более направляющих РНК, разработанных для связывания с соответствующими молекулами-мишенями, содержат (синтетическое) несоответствие.
45. Система по п. 44, в которой указанное несоответствие находится выше против хода транскрипции или ниже по ходу транскрипции от SNP или другого однонуклеотидного варианта в указанной молекуле-мишени.
46. Система по п. 3, в которой одна или более направляющих РНК разработаны для выявления однонуклеотидного полиморфизма в РНК-мишени или ДНК-мишени или варианта сплайсинга транскрипта РНК.
47. Система по п. 1, в которой одна или более направляющих РНК разработаны для обнаружения молекулы-мишени или триггерной РНК, которая производит гексаденилаты, содержащие 2'3'-циклический фосфат на конце, при расщеплении нацеленным на РНК эффекторным белком CRISPR.
48. Система по п. 1, в которой одна или более направляющих РНК разработаны для обнаружения молекулы-мишени или триггерной РНК, которая содержит участок поли А.
49. Система по п. 3, в которой одна или более направляющих РНК разработаны для связывания с одной или более молекулами-мишенями, которые являются диагностическими для патологического состояния.
50. Система по п. 49, причем патологическое состояние представляет собой рак.
51. Система по п. 49, причем патологическое состояние представляет собой аутоиммунное заболевание.
52. Система по п. 49, причем патологическое состояние представляет собой инфекцию.
53. Система по п. 52, причем инфекция вызвана вирусом, бактерией, грибом, простейшим или паразитом.
54. Система по п. 53, причем инфекция представляет собой вирусную инфекцию.
55. Система по п. 54, причем вирусная инфекция вызвана ДНК-вирусом.
56. Система по п. 55, причем ДНК-вирус представляет собой Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae (включая в себя вирус герпеса человека и вирус Varicella Zoster), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfarviridae (включая в себя вирус африканской лихорадки свиней), Baculoviridae, Cicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, Polydnaviruses, Polyomaviridae (включая в себя обезьяний вирус 40, JC вирус, вирус ВК), Poxviridae (включая в себя вирус коровьей оспы и натуральной оспы), Sphaerolipoviridae, Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus, Rhizidovirus.
57. Система по п. 54, причем вирусная инфекция вызвана двухцепочечным РНК-вирусом, РНК-вирусом с положительно-полярной нитью, РНК-вирусом с отрицательно-полярной нитью, ретровирусом или их комбинацией.
58. Система по п. 57, причем вирусная инфекция вызывается вирусом Coronaviridae, вирусом Picornaviridae, вирусом Caliciviridae, вирусом Flaviviridae, вирусом Togaviridae, Bornaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Pneumoviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Orthomyxoviridae или Deltavirus.
59. Система по п. 58, причем вирусная инфекция вызывается коронавирусом, SARS, полиовирусом, риновирусом, вирусом гепатита А, вирусом Норуолка, вирусом желтой лихорадки, вирусом Западного Нила, вирусом гепатита С, вирусом лихорадки денге, вирусом Зика, вирусом краснухи, вирусом Росс-ривер, вирусом Синдбис, вирусом чикунгуньи, вирусом болезни Борна, вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом кори, вирусом эпидемического паротита, вирусом Нипах, вирусом Хендра, вирусом ньюкаслской болезни, респираторно-синцитиальным вирусом человека, вирусом бешенства, вирусом Ласса, хантавирусом, вирусом конго-крымской геморрагической лихорадки, вирусом гриппа или вирусом гепатита D.
60. Система по п. 53, причем инфекция представляет собой бактериальную инфекцию.
61. Система по п. 60, причем бактерией, вызывающей бактериальную инфекцию, является вид Acinetobacter, вид Actinobacillus, вид Actinomycetes, вид Actinomyces, вид Aerococcus, вид Aeromonas, вид Anaplasma, вид Alcaligenes, вид Bacillus, вид Bacteriodes, вид Bartonella, вид Bifidobacterium, вид Bordetella, вид Borrelia, вид Brucella, вид Burkholderia, вид Campylobacter, вид Capnocytophaga, вид Chlamydia, вид Citrobacter, вид Coxiella, вид Corynbacterium, вид Clostridium, вид Eikenella, вид Enterobacter, вид Escherichia, вид Enterococcus, вид Ehlichia, вид Epidermophyton, вид Erysipelothrix, вид Eubacterium, вид Francisella, вид Fusobacterium, вид Gardnerella, вид Gemella, вид Haemophilus, вид Helicobacter, вид Kingella, вид Klebsiella, вид Lactobacillus, вид Lactococcus, вид Listeria, вид Leptospira, вид Legionella, вид Leptospira, виды Leuconostoc, вид Mannheimia, вид Microsporum, вид Micrococcus, вид Moraxella, вид Morganell, вид Mobiluncus, вид Micrococcus, виды Mycobacterium, вид Mycoplasm, вид Nocardia, вид Neisseria, вид Pasteurelaa, вид Pediococcus, вид Peptostreptococcus, вид Pityrosporum, вид Plesiomonas, вид Prevotella, вид Porphyromonas, вид Proteus, вид Providencia, вид Pseudomonas, вид Propionibacteriums, вид Rhodococcus, вид Rickettsia, вид Rhodococcus, вид Serratia, вид Stenotrophomonas, вид Salmonella, вид Serratia, вид Shigella, вид Staphylococcus, вид Streptococcus, вид Spirillum, вид Streptobacillus, вид Treponema, вид Tropheryma, вид Trichophyton, вид Ureaplasma, вид Veillonella, вид Vibrio, вид Yersinia, вид Xanthomonas или их комбинация.
62. Система по п. 53, причем инфекция вызвана грибом.
63. Система по п. 62, причем гриб представляет собой Aspergillus, Blastomyces, Candidiasis, Coccidiodomycosis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gatti, sp. Histoplasma sp. (например, Histoplasma capsulatum), Pneumocystis sp. (например, Pneumocystis jirovecii), Stachybotrys (например, Stachybotrys chartarum), Mucroymcosis, Sporothrix, грибковые инфекции глазной стригущий лишай, Exserohilum, Cladosporium, Geotrichum, Saccharomyces, вид Hansenula, вид Candida, вид Kluycesomy, вид Kluyomy, вид Penicillium, вид Cladosporium, вид Byssochlamys или их комбинации.
64. Система по п. 53, причем инфекция вызвана простейшим.
65. Система по п. 64, причем простейшее представляет собой Euglenozoa, Heterolobosea, Diplomonadida, Amoebozoa, Blastocystic, Apicomplexa или их комбинацию.
66. Система по п. 53, причем инфекция вызвана паразитом.
67. Система по п. 66, причем паразит представляет собой Trypanosoma cruzi (Chagas disease), Т. brucei gambiense, Т. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L. infantum, L. mexicana, L. major, L. tropica, L. donovani, Naegleria fowleri, Giardia intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis), canthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica, Blastocystic hominis, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae и Toxoplasma gondii или их комбинации.
68. Система по любому из пп. 1-67, в которой реагенты для амплификации молекул-мишеней РНК включают в себя амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA), опосредованную образованием петель изотермическую амплификацию (LAMP), амплификацию с замещением нити (SDA), геликаза-зависимую амплификацию (HDA) или реакцию амплификации с помощью никующего фермента (NEAR), ПЦР, амплификацию с множественным замещением (MDA), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), лигазную цепную реакцию (LCR) или способ амплификации ветвлением (RAM).
69. Система по любому из пп. 1-68, дополнительно включающая в себя систему обогащения CRISPR, причем система обогащения CRISPR разработана для связывания соответствующих молекул-мишеней до обнаружения системой обнаружения CRISPR.
70. Система по п. 69, в которой система обогащения CRISPR содержит каталитически неактивный эффекторный белок CRISPR.
71. Система по п. 70, в которой каталитически неактивный эффекторный белок CRISPR представляет собой каталитически неактивный С2с2.
72. Система по любому из пп. 69-71, в которой эффекторный белок обогащения CRISPR дополнительно содержит метку, причем метка используется для отделения эффекторной системы обогащения CRISPR или для связывания системы обогащения CRISPR с твердым субстратом.
73. Система по п. 72, в которой твердым субстратом является проточная ячейка.
74. Диагностическое устройство, содержащее один или более отдельных дискретных объемов, причем каждый отдельный дискретный объем содержит систему CRISPR по любому из пп. 1-73.
75. Диагностическое устройство по п. 74, в котором каждый отдельный дискретный объем дополнительно содержит один или более аптамеров обнаружения, содержащих сайт связывания маскированного промотора РНК-полимеразы или сайт связывания маскированного праймера.
76. Устройство по п. 74 или 75, в котором каждый отдельный дискретный объем дополнительно содержит реагенты для амплификации нуклеиновых кислот.
77. Устройство по п. 74, в котором молекула-мишень представляет собой ДНК-мишень, а отдельные дискретные объемы дополнительно содержат праймер, который связывает ДНК-мишень и содержит промотор РНК-полимеразы.
78. Устройство по любому из пп. 74-77, в котором отдельные дискретные объемы представляют собой капли.
79. Устройство по любому из пп. 74-78, в котором отдельные дискретные объемы определены на твердом субстрате.
80. Устройство по п. 79, в котором отдельные дискретные объемы представляют собой микролунки.
81. Диагностическое устройство по любому из пп. 74-78, в котором отдельные дискретные объемы представляют собой пятна, определенные на субстрате.
82. Устройство по п. 81, в котором субстрат представляет собой субстрат из гибких материалов.
83. Устройство по п. 82, в котором субстрат из гибких материалов представляет собой бумажный субстрат или субстрат на основе гибкого полимера.
84. Способ обнаружения нуклеиновых кислот-мишеней в образцах, предусматривающий:
распределение образца или набора образцов в один или более отдельных дискретных объемов, причем отдельные дискретные объемы составляют систему CRISPR по любому из пп. 1 или 3-73;
инкубацию образца или набора образцов в условиях, достаточных для связывания одной или более направляющих РНК с одной или более молекулами-мишенями;
активацию эффекторного белка CRISPR посредством связывания одной или более направляющих РНК с одной или более молекулами-мишенями, причем активация эффекторного белка CRISPR приводит к модификации маскирующей конструкции на основе РНК, так что производится обнаруживаемый положительный сигнал; и
обнаружение обнаруживаемого положительного сигнала, причем обнаружение обнаруживаемого положительного сигнала указывает на присутствие одной или более молекул-мишеней в образце.
85. Способ обнаружения полипептидов в образцах, предусматривающий:
распределение образца или набора образцов в наборе отдельных дискретных объемов, причем отдельные дискретные объемы содержат аптамеры для обнаружения пептидов, систему CRISPR по любому из пп. 2-73;
инкубацию образца или набора образцов в условиях, достаточных для связывания аптамеров для обнаружения пептидов с одной или более молекулами-мишенями, причем связывание аптамера с соответствующей молекулой-мишенью обнажает сайт связывания РНК-полимеразы или сайт связывания праймера, что приводит к образованию триггерной РНК;
активацию эффекторного белка РНК посредством связывания одной или более направляющих РНК с триггерной РНК, причем активация эффекторного белка РНК приводит к модификации маскирующей конструкции на основе РНК, так что производится обнаруживаемый положительный сигнал; и
обнаружение обнаруживаемого положительного сигнала, причем обнаружение обнаруживаемого положительного сигнала указывает на присутствие одной или более молекул-мишеней в образце.
86. Способ по п. 84, при котором молекула-мишень представляет собой ДНК-мишень, и способ дополнительно предусматривает связывание ДНК-мишени с праймером, содержащим сайт РНК-полимеразы.
87. Способ по любому из пп. 84-86, дополнительно предусматривающий амплификацию образца РНК или триггерной РНК.
88. Способ по п. 87, при котором амплификация РНК предусматривает амплификацию с помощью NASBA.
89. Способ по п. 87, при котором амплификация РНК предусматривает амплификацию с помощью RPA.
90. Способ по любому из пп. 84-89, при котором образец представляет собой биологический образец или образец окружающей среды.
91. Способ по п. 90, при котором биологический образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, мочу, стул, мокроту, слизистую, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, желчь, асцит, плевральный выпот, серому, слюну, спинномозговую жидкость, водянистую влагу или стекловидное тело или любой секрет тела, транссудат, экссудат (например, жидкость, полученную из абсцесса или любого другого места инфекции или воспаления), или жидкость, полученную из сустава (например, нормальный сустав или сустав, пораженный заболеванием, таким как ревматоидный артрит, остеоартрит подагра или септический артрит), или мазок кожи или поверхности слизистой оболочки.
92. Способ по п. 90, при котором образец окружающей среды получают из образца пищи, поверхности бумаги, ткани, поверхности металла, поверхности дерева, пластмассы, образца почвы, образца пресной воды, образца сточных вод, образца соленой воды или их комбинации.
93. Способ по любому из пп. 84 или 86-92, при котором одна или более направляющих РНК разработаны для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в РНК-мишени или ДНК-мишени или в варианте сплайсинга транскрипта РНК.
94. Способ по любому из пп. 84-93, при котором одна или более направляющих РНК разработаны для связывания с одной или более молекулами-мишенями, которые являются диагностическими для патологического состояния.
95. Способ по любому из пп. 85-94, при котором одна или более направляющих РНК разработаны для связывания с бесклеточными нуклеиновыми кислотами.
96. Способ по п. 94, при котором патологическое состояние представляет собой инфекцию, заболевание органов, заболевание крови, заболевание иммунной системы, рак, заболевание головного мозга и нервной системы, эндокринное заболевание, заболевание, связанное с беременностью или родами, наследственное заболевание или приобретенное благодаря окружающей среде заболевание.
97. Система по п. 49, причем указанное патологическое состояние характеризуется наличием или отсутствием гена устойчивости или чувствительности к антибиотику или лекарственному средству, а также транскрипта или полипептида, предпочтительно в патогене или клетке.
98. Система по п. 49, причем указанная молекула-мишень представляет собой ген, транскрипт или полипептид устойчивости или чувствительности к антибиотику или лекарственному средству.
99. Система по п. 45, в которой синтетическое несоответствие в указанной направляющей РНК находится в положении 3, 4, 5 или 6 спейсера, предпочтительно в положении 3.
100. Система по п. 44 или 45, в которой указанное несоответствие в указанной направляющей РНК находится в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 спейсера, предпочтительно в положении 5.
101. Система по п. 45 или 100, в которой указанное несоответствие находится на 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов выше против хода транскрипции или ниже по ходу транскрипции, предпочтительно на 2 нуклеотида, предпочтительно ниже по ходу транскрипции от указанного SNP или другой однонуклеотидной вариации в указанной направляющей РНК.
102. Система по любому из пп. 1-73 или 97-101, в которой указанная направляющая РНК содержит спейсер, который усечен относительно спейсера дикого типа.
103. Система по любому из пп. 1-73 или 97-102, в которой указанная направляющая РНК содержит спейсер, который содержит менее чем 28 нуклеотидов, предпочтительно и включительно от 20 до 27 нуклеотидов.
104. Система по любому из пп. 1-73 или 97-103, в которой указанная направляющая РНК содержит спейсер, который состоит из 20-25 нуклеотидов или 20-23 нуклеотидов, например, предпочтительно из 20 или 23 нуклеотидов.
105. Система по любому из пп. 1-73 или 97-104, в которой указанная маскирующая конструкция содержит олигонуклеотид РНК, разработанный для связывания последовательности, образующей G-квадруплекс, причем структура G-квадруплекса образована последовательностью, образующей G-квадруплекс при расщеплении маскирующей конструкции, и причем структура G-квадруплекса производит обнаруживаемый положительный сигнал.
106. Способ по любому из пп. 85-96, дополнительно предусматривающий сравнение обнаруживаемого положительного сигнала с (синтетическим) стандартным сигналом.
107. Способ обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени в образце, предусматривающий:
контактирование образца с системой обнаружения нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-73 и
применение указанного контактирующего образца к иммунохроматографическому анализу.
108. Способ по п. 107, при котором указанная система обнаружения нуклеиновой кислоты содержит маскирующую конструкцию на основе РНК, содержащую первую и вторую молекулу, и при котором указанный иммунохроматографический анализ предусматривает обнаружение указанной первой и второй молекулы, предпочтительно в дискретных местах обнаружения на тест-полоске.
109. Способ по п. 108, при котором указанную первую молекулу и указанную вторую молекулу обнаруживают путем связывания с антителом, распознающим указанную первую или вторую молекулу, и обнаруживания указанной связанной молекулы предпочтительно с помощью сэндвич-антител.
110. Способ по п. 108 или 109, при котором указанная тест-полоска иммунохроматографического анализа содержит расположенное раньше первое антитело, направленное против указанной первой молекулы, и расположенное далее второе антитело, направленное против указанной второй молекулы, и причем нерасщепленная маскирующая конструкция на основе РНК связывается указанным первым антителом, если нуклеиновая кислота-мишень не присутствует в указанном образце, и причем расщепленная маскирующая конструкция на основе РНК связывается как указанным первым антителом, так и указанным вторым антителом, если нуклеиновая кислота-мишень присутствует в указанном образце.