СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АКТИВНОСТИ АСПАРАГИНАЗЫ В РАСТВОРЕ
METHOD FOR ENHANCEMENT OF ACTIVITY OF ASPARAGINASE IN SOLUTION

Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу снижения содержания аспарагина, являющегося предшественником акриламида, в пищевом продукте. Более точно, настоящее изобретение относится к повышению устойчивости фермента аспарагиназа в растворе.
Описание известного уровня техники
Как указано в патенте US 7037540, в подвергнутых тепловой обработке пищевых продуктах, содержащих аспарагин, содержится акриламид. Количество акриламида, образующегося в некоторых пищевых продуктах, можно уменьшить путем добавления фермента аспарагиназа в пищевой продукт до его кулинарной обработки.
Добавление снижающих содержание акриламида ферментов, таких как аспарагиназа, в пищевые продукты в промышленном масштабе в отличие от периодической технологии создает ряд серьезных сложностей. Например, фермент аспарагиназа должен контактировать со свободным аспарагином, чтобы способствовать гидролизу аспарагина. Поскольку фермент обычно используется в относительно концентрированном виде, в идеале фермент разбавляют водным раствором до того, как пищевой продукт войдет в контакт с раствором фермента. Например, контакт пищевого продукта с раствором фермента может представлять собой образование теста и добавление раствора фермента в тесто.
Известным способом представления активности фермента в количественной форме является ее определение в единицах активности. Одну единицу активности фермента определяют как количество фермента, необходимое для катализа преобразования одного микромоля субстрата за одну минуту. Таким образом, если известна относительная концентрация субстрата или соединения, такого как аспарагин, в пищевом продукте и количество пищевого продукта, можно вычислить, сколько единиц фермента, такого как аспарагиназа, необходимо для преобразования желаемого химического соединения, в данном случае аспарагина в отличающееся химическое соединение.
По не известным ранее причинам даже при использовании в пищевом продукте, таком как картофельное пюре или кукурузное тесто, избыточных доз (то есть больше математически рассчитанного количества, необходимого для преобразования всего аспарагина в пищевом продукте) фермента аспарагиназа, в тесте все же часто сохранялось высокое содержание аспарагина. С учетом необходимости снижать содержание акриламида, образующегося при тепловой обработке некоторых пищевых продуктов, было бы желательно создать систему и способ доведения до максимума эффективности фермента, используемого для снижения содержания предшественников акриламида в пищевых продуктах, производимых в промышленном масштабе.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно одной из особенностей настоящего изобретения предложен способ получения устойчивого раствора аспарагиназы в питьевой воде путем удаления хлора из воды. Согласно одной из особенностей хлор удаляют с использованием ионного обмена, обратного осмоса, активированного угля и/или аэрации. Согласно одной из особенностей для очистки питьевой воды используют добавки, такие как восстановители и поглотители хлора. Согласно одной из особенностей очищенную воду затем смешивают с аспарагиназой, чтобы получить раствор аспарагиназы. Упомянутые, а также дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения станут ясны из следующего далее подробного описания.
Краткое описание чертежей
В прилагаемой формуле изобретения содержатся элементы новизны, считающиеся характеризующими изобретение. Вместе с тем само изобретение, а также предпочтительный способ его применения, его дополнительные задачи и преимущества будут лучше всего поняты при рассмотрении следующего далее подробного описания наглядных вариантов осуществления в сочетании с сопровождающими чертежами, на которых:
на фиг.1а графически представлена остаточная активность фермента после различных операций очистки питьевой воды и
на фиг.1б графически представлена остаточная активность фермента в различных смесях воды и солей.
Подробное описание
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен раствор на водной основе, повышающий устойчивость аспарагиназы и сохраняющий активность аспарагиназы. Повышенная активность аспарагиназы может выражаться в более эффективном снижении содержания акриламида в пищевых продуктах, поскольку аспарагин является предшественником акриламида. Используемый в настоящей заявке термин "активность фермента" выражается в единицах. Каждая единица аспарагиназы способна гидролизировать один микромоль аспарагина за одну минуту.
В одном из вариантов осуществления пищевой продукт, в котором желательно снизить содержание акриламида, образующегося при тепловой обработке, получают из теста. Термин "готовый закусочный продукт из полуфабриката" означает закусочный продукт, в котором используется исходный ингредиент, отличающийся от основного и неизмененного исходного крахмалистого вещества. Например, готовые закусочные продукты из полуфабриката включают готовые картофельные чипсы из полуфабриката, в которых в качестве исходного вещества используется дегидратированный картофельный продукт, и кукурузные чипсы, в которых в качестве исходного вещества используется кукурузная мука. Следует отметить, что дегидратированным картофельным продуктом может являться картофельная мука, картофельные хлопья, картофельные гранулы или дегидратированный картофель в других существующих формах. Подразумевается, что при использовании любого из этих терминов в настоящей заявке в них включены все эти варианты. Лишь в качестве примера и без ограничения "готовые пищевые продукты из полуфабриката", в которые может добавляться раствор аспарагиназы, включают чипсы тортилья, кукурузные чипсы, картофельные чипсы из картофельных хлопьев и/или свежего картофельного пюре, чипсы из смешанной муки, воздушную кукурузу, воздушную пшеницу, воздушный рис, крекер, хлебные изделия (из ржаной, пшеничной, овсяной, картофельной, муки высшего сорта, муки из цельного зерна и смешанной муки), мягкие и твердые крендели, кондитерские изделия, печенье, гренки, кукурузные тортильи, мучные тортильи, лаваш, круассаны, пироги, маффины, шоколадные кексы, пирожные, бублики, пончики, сухие завтраки, прессованные закусочные продукты, продукты из гранолы, продукты из муки, продукты из кукурузной муки, продукты из кукурузного теста, картофельные хлопья, поленту, взбитые белковые смеси для панировки и тестовые заготовки, охлажденное и замороженное тесто, восстановленные пищевые продукты, подвергнутые обработке и замороженные пищевые продукты, панированные изделия из мяса и овощей, картофельные оладьи, картофельное пюре, тонкие блинчики, блины, вафли, основу для пиццы, арахисовое масло, пищевые продукты, содержащие измельченные и подвергнутые обработке орехи, желе, начинки, плодовые пюре, овощные пюре, алкогольные напитки, такие как пиво и эль, какао, какао-порошок, шоколад, горячий шоколад, сыр, корма для животных, такие как гранулированный корм для собак и кошек, и любые другие пищевые продукты для людей или корма для животных, которые раскатывают или прессуют или которые изготовлены из теста или смешанных ингредиентов.
Используемый в заявке термин "готовые пищевые продукты из полуфабриката" включает готовые закусочные продукты из полуфабриката согласно вышеприведенному определению. Используемый в заявке термин "пищевые продукты" включает все готовые закусочные продукты из полуфабриката и готовые пищевые продукты из полуфабриката согласно вышеприведенному определению.
Как указано в настоящей заявке, подвергнутые тепловой обработке пищевые продукты, которые могут быть обработаны раствором аспарагиназы, в качестве примера и без ограничения включают все пищевые продукты, ранее перечисленные в качестве примеров готовых закусочных продуктов из полуфабриката и готовых пищевых продуктов из полуфабриката, а также картофель фри, нарезанный ломтиками картофель, сладкий картофель фри, другие клубнеплоды или корнеплоды, подвергнутые кулинарной обработке овощи, включая подвергнутую кулинарной обработке спаржу, лук и томаты, кофейные бобы, бобы какао, подвергнутое кулинарной обработке мясо, дегидратированные плоды и овощи, подвергнутый тепловой обработке корм для животных, табак, чай, жареные или подвергнутые кулинарной обработке орехи, соевые бобы, патоку, соусы, такие как соус для барбекю, банановые чипсы, яблочные чипсы, жареные бананы и другие подвергнутые кулинарной обработке плоды.
В некоторых таких вариантах осуществления желаемые ингредиенты для получения теста смешивают с водой, с которой также смешивают желаемое количество аспарагиназы, чтобы получить раствор аспарагиназы. Затем раствор аспарагиназы может быть добавлен в тесто. В одном из вариантов осуществления раствор аспарагиназы смешивают непосредственно с желаемыми ингредиентами для получения теста. Затем из теста может быть изготовлен подвергнутый тепловой обработке пищевой продукт.
Для получения теста и раствора аспарагиназы на промышленном предприятии используют воду, которая легкодоступна на предприятии и которой обычно является питьевая вода, получаемая конечным пользователем из системы местного городского бытового водоснабжения. Используемый в заявке термин "питьевая вода" означает воду, подаваемую из системы бытового водоснабжения, и включает без ограничения воду из системы городского водоснабжения. Почти во всех системах городского водоснабжения в США в питьевую воду добавляют достаточное количество хлора, в результате чего в питьевой воде, которую получает потребитель, содержится остаточный хлор. На многих районных водохозяйственных предприятиях в питьевую воду добавляют хлорамин, поскольку он является более устойчивым, чем хлор. Используемый в заявке термин хлор означает окисляющие формы хлора и включает без ограничения хлорамин и гипохлориты. Таким образом, под это определение не подпадают неокисляющие формы хлорных ионов, как, например, формы, образуемые соляной кислотой (HCl) и хлоридом натрия (NaCl).
Авторами настоящего изобретения обнаружено, что некоторые характеристики питьевой воды, например, присутствие хлора, являются причиной снижения активности фермента аспарагиназа до такой степени, что он становится неприменимым в промышленных условиях для производства пищевых продуктов. Используемый в заявке термин "остаточная активность фермента" (выраженная в %) означает активность контрольного фермента, деленную на активность пробного фермента, и является относительным показателем активности фермента в различных условиях испытаний. Авторами настоящего изобретения также предложены способы и системы ослабления влияния питьевой воды на активность фермента и сохранения остаточной активности фермента аспарагиназа на таком уровне, чтобы он был применим в промышленных условиях. Следующие далее примеры приведены в качестве иллюстрации вышесказанного.
Пример 1
Из аликвотных частей получили четыре раствора, при этом каждая аликвотная часть имела одинаковую исходную активность добавленной аспарагиназы (Novozymes A/S) и каждая аликвотная часть была разбавлена дистиллированной или питьевой водой таким образом, чтобы общий объем каждого раствора составлял около 50 мл. В растворах №3 и 4 использовали питьевую воду, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса. Далее в Таблице 1а описаны типы воды, использованной в каждом растворе.
Таблица 1а
Типы воды, использованной для получения раствора аспарагиназы
Раствор №
Тип воды
1
Дистиллированная вода
2
Дистиллированная вода
3
Питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса
4
Питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса, с добавлением 0,1 N соляной кислоты для доведения рН до 6
Каждый из растворов №2-4 нагрели примерно до 35°С и выдерживали в течение около 40 минут, после чего измерили активность фермента и рН для сравнения остаточной активности фермента с раствором №1, использованным в качестве контроля. Раствор №1 охладили до температуры около 10°С и выдерживали в течение около 40 минут. Далее в Таблице 1б приведены полученные результаты.
Таблица 1б
Остаточная активность фермента в дистиллированной воде и питьевой воде
Раствор №
рН раствора
Относительная активность
1
6,93
100%
2
7,00
103%
3
8,22
38%
4
7,35
52%
Следует отметить, что данные активности фермента и остаточной активности фермента были получены путем проведения испытаний методом, который описан в конце настоящего описания. Активность фермента в растворе №2 не снизилась по сравнению с раствором №1 (контрольным). Активность фермента аспарагиназа в растворе №3, который имел незначительную щелочность (рН около 8,22), снизилась примерно на 62% примерно через 40 минут выдерживания при температуре около 35°С. После добавления разбавленной соляной кислоты в питьевую воду (раствор №4) уровень рН снизился примерно до 7,55, при этом активность аспарагиназы уменьшилась примерно на 48% примерно через 40 минут выдерживания при температуре около 35°С. Таким образом, ясно, что причиной некоторого снижения активности фермента является щелочность раствора №3. В целом считается, что рН влияет на активность аспарагиназы, при этом аспарагиназа имеет более высокую активность при рН от около 4 до около 7.
Пример 2
Из аликвотных частей получили четыре раствора, при этом каждая аликвотная часть имела одинаковую исходную активность добавленной аспарагиназы (Novozymes A/S) и каждая аликвотная часть была разбавлена дистиллированной или питьевой водой таким образом, чтобы общий объем каждого раствора составлял около 50 мл. Далее в Таблице 2а описаны типы воды, использованной в каждом растворе.
Таблица 2а
Растворы аспарагиназы, полученные с использование воды из различных источников
Раствор №
Тип воды
1
Деионизированная вода (контроль)
2
Питьевая вода, которой снабжается г.Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса
3
Питьевая вода, которой снабжается г. Данканвиль (штат Техас, США)
4
Вода, используемая на предприятии пищевой промышленности в Мехикали, Мексика
Каждый из растворов №2-4 нагрели примерно до 35°С и выдерживали в течение около 40 минут, после чего измерили уровень содержания хлора, жесткость воды, рН и активность фермента. Контрольный образец не нагревали. Далее в Таблице 2б приведены полученные результаты.
Таблица 2б
Остаточная активность фермента и химический состав воды в трех различный растворах на основе питьевой воды
Раствор №
Свободный хлор (мг/л)
Общее содержание хлора (мг/л)
Общая жесткость (мг/л)
рН
Активность
1
0
0
0
6,89
100%
2
1,0
1,0
232
7,47
9%
3
0,02
0,02
90
7,87
85%
4
0,02
0,06
28
8,00
89%
Эти данные ясно доказывают отрицательное влияние хлора на остаточную активность фермента. Например, раствор №1 (контрольный) не содержал хлор и имел наиболее высокую остаточную активность фермента. Раствор №2 имел наиболее низкую остаточную активности фермента и наиболее высокое содержание свободного хлора и общую жесткость.
Раствор №3 имел относительно низкую концентрацию свободного хлора, умеренную жесткость и остаточную активность свыше 80%. Раствор №4 имел концентрацию свободного хлора, сходную с его концентрацией в растворе №3, более низкую жесткость и немного более высокую остаточную активность. Из Таблицы 2б следует, что остаточная активность фермента аспарагиназа обратно пропорциональна содержанию хлора.
Пример 3
Из аликвотных частей получили четыре раствора, при этом каждая аликвотная часть имела одинаковую исходную активность добавленной аспарагиназы (Novozymes A/S) и каждая аликвотная часть была разбавлена дистиллированной или питьевой водой таким образом, чтобы общий объем каждого раствора составлял около 50 мл. Далее в Таблице 3а приведены типы воды для каждого образца.
Таблица 3а
Типы хлорированной воды, использованной для получения раствора аспарагиназы
Раствор №
Тип воды
1
Деионизированная вода (контроль)
2
Деионизированная вода + гипохлорит в количестве, достаточном для получения воды с содержанием 12 ч./млн, хлора
3
Питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса
4
Питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса, подвергнутая троекратной фильтрации через фильтр BRITA
Каждый из растворов №2-4 нагрели примерно до 35°С и выдерживали в течение около 40 минут, после чего измерили содержание свободного хлора, общую жесткость, рН и остаточную активность фермента. Далее в Таблице 3б приведены полученные результаты.
Таблица 3б
Остаточная активность фермента в растворах с различными уровнями содержания хлора
Раствор №
Свободный хлор(мг/л)
Общая жесткость(мг/л)
pH
Активность
1
0
-
4,81
100%
2
Не измерялся
-
5,87
4%
3
Не измерялся
228
7,10
21%
4
0
20
4,99
102%
Как показано выше в Таблице 3б, в результате добавления хлора в деионизированную воду, как в случае раствора 2, или присутствия хлора в питьевой воде, как в случае раствора 3, остаточная активность фермента аспарагиназа заметно снижается. Кроме того, в результате удаления хлора или при отсутствии хлора активность фермента заметно повышается, что доказывается уровнем остаточной активности фермента в деионизированной воде из раствора 1 и остаточной активности фермента в воде из раствора 4, фильтрованной с помощью фильтра BRITA. Содержание хлора в растворе 2 не измерялось, поскольку в раствор добавляли хлор в виде гипохлорита натрия. Кроме того, поскольку использовалась питьевая вода, относительное содержание хлора в растворе 3 соответствовало известным уровням его содержания в питьевой воде.
Пример 4
Задача этого испытания состояла в изучении влияния хлора на активность фермента при добавлении определенного количества хлора, содержащегося в питьевой воде, в деионизированную воду, не содержащую хлор, чтобы выяснить влияние хлора на активность аспарагиназы.
Из аликвотных частей получили четыре раствора, при этом каждая аликвотная часть имела одинаковую исходную активность добавленной аспарагиназы (Novozymes A/S) и каждая аликвотная часть была разбавлена дистиллированной или питьевой водой таким образом, чтобы общий объем каждого раствора составлял около 50 мл. Далее в Таблице 4а приведены типы воды для каждого образца.
Таблица 4а
Типы хлорированной воды, использованной для получения раствора аспарагиназы
Раствор №
Тип воды
1 (Контроль)
Деионизированная вода
2
Подкисленная деионизированная вода с добавлением гипохлорита натрия в количестве, достаточном для получения воды с содержанием 1,2 ч./млн хлора, и добавлением соляной кислоты в количестве, достаточном для доведения рН до кислотного уровня
3
Подкисленная деионизированная вода с добавлением гипохлорита натрия в количестве, достаточном для получения воды с содержанием 0,2 ч./млн хлора, и добавлением соляной кислоты в количестве, достаточном для доведения рН до кислотного уровня
4
Питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса
Каждый из растворов №2-4 нагрели примерно до 35°С и выдерживали в течение около 40 минут, после чего измерили содержание хлора, рН и остаточную активность фермента. Раствор 1 не нагревали. Далее в Таблице 4б приведены полученные результаты.
Таблица 4б
Остаточная активность фермента в растворах с различными уровнями содержания хлора
Раствор №
Свободный хлор (мг/л)
Общее содержание хлора (мг/л)
рН
Активность
1
-
-
4,85
100
2
1,2
1,2
4,69
3
3
0,1
0,2
4,62
108
4
0,8
1,1
6,84
14
Приведенные в Таблице 4б данные доказывают, что остаточная активность аспарагиназы значительно снижается при добавлении в воду только хлора. Тем не менее, при относительном низких уровнях содержания хлора он в меньшей степени влияет на остаточную активность фермента.
Пример 5
Получили пять растворов, чтобы выяснить потенциальное влияние изменений состава питьевой воды на остаточную активность аспарагиназы. Каждый раствор получили из аликвотных частей, при этом каждая аликвотная часть имела одинаковую исходную активность добавленной аспарагиназы (Novozymes A/S) и каждая аликвотная часть была разбавлена дистиллированной или питьевой водой таким образом, чтобы общий объем каждого раствора составлял около 50 мл. Для придания растворам незначительной кислотности в них добавили лимонную кислоту. В следующей далее Таблице 5а описаны типы воды, использованной в каждом растворе.
Таблица 5а
Изменения состава питьевой воды
Раствор №
Тип воды
1
Деионизированная вода
2
Питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса
3
Подкисленная питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса с добавлением лимонной кислоты в количестве, достаточном для получения воды с содержанием 100 ч./млн лимонной кислоты
4
Подкисленная питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса с добавлением лимонной кислоты в количестве, достаточном для получения воды с содержанием 100 ч./млн лимонной кислоты и 950 ч./млн EDTA
5
Подкисленная питьевая вода, которой снабжается г.Плане (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса с добавлением лимонной кислоты в количестве, достаточном для получения воды с содержанием 100 ч./млн лимонной кислоты, и добавлением тиосульфата в количестве, достаточном для получения воды с содержанием 10 ч./млн тиосульфата натрия
Каждый из растворов №2-5 нагрели примерно до 35°С и выдерживали в течение около 40 минут, после чего измерили содержание свободного хлора, общее содержание хлора, рН и остаточную активность фермента. Раствор 1 не нагревали. Далее в Таблице 5б приведены полученные результаты.
Таблица 5б
Остаточная активность фермента в различных растворах на основе очищенной питьевой воды
Раствор №
Свободный хлор(ч./млн)
Общее содержание хлора (ч./млн)
pH
Остаточная активность
1
0
0
-
100%
2
0,2
1,2
7,53
12%
3
0,4
0,8
5,81
32%
4
1,0
1,0
6,45
100%
5
0,1
0,4
5,65
86%
На фиг.1а в графической форме представлена остаточная активность фермента после различных операций очистки питьевой воды. Активность фермента представлена в виде столбцов столбчатой диаграммы, а общее содержание хлора представлено в виде линии 150. Как доказывают данные, в результате добавления тиосульфата (в количестве, примерно в 5 раз превышающем содержание хлора в питьевой воде) содержание хлора снизилось, и на 86% повысилась активность фермента (140). Питьевая вода с общим содержанием хлора 1,2 ч./млн имела относительно низкую остаточную активность фермента, составлявшую лишь около 12% (110). При добавлении лимонной кислоты содержание хлора в питьевой воде снизилось, и на 32% повысилась активность фермента (120).
Активность фермента (130) в питьевой воде с добавлением EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) была такой же, как и активность фермента в деионизированной воде (100), но при добавлении EDTA лишь незначительно снизилось общее содержание хлора. Не будучи связанными какой-либо теорией, заявители полагают, что EDTA может покрывать фермент оболочкой и тем самым защищать его от хлора или что EDTA может связывать хлор. Например, при испытаниях по-прежнему обнаруживается хлор, но обратимая реакция EDTA и хлора может препятствовать окислению хлора или иной реакции хлора с аспарагиназой. Таким образом, EDTA, по-видимому, инактивирует хлор. В связи с этим в одном из вариантов осуществления могут использоваться добавки, которые подавляют способность хлора снижать активность аспарагиназы и/или инактивируют хлор.
Пример 6
Получили пять растворов, чтобы выяснить потенциальное влияние придающих жесткость составляющих, обычно содержащихся в питьевой воде. Каждый раствор получили из аликвотных частей, при этом каждая аликвотная часть имела одинаковую исходную активность добавленной аспарагиназы (Novozymes A/S) и каждая аликвотная часть была разбавлена дистиллированной или питьевой водой таким образом, чтобы общий объем каждого раствора составлял около 50 мл. В каждый раствор добавили соль, чтобы довести содержание соли до 5 мМ (5 миллимолей), что приблизительно вдвое превышает содержание карбоната кальция в питьевой воде из г. Плано (штат Техас, США). Например, как указано выше в Таблице 3б, общая жесткость раствора №3 (питьевая вода из г.Плане) составляет 228 мг/л, что соответствует около 2,28 мМ. В следующей далее Таблице 6а описаны соли различных типов, использованные в каждом растворе.
Таблица 6а
Соли, добавленные в деионизированную воду
Раствор №
Тип воды
1
Деионизированная вода
2
Деионизированная вода + хлорид натрия
3
Деионизированная вода + хлорид кальция
4
Деионизированная вода + нитрат магния
5
Деионизированная вода + бикарбонат натрия
Каждый из растворов №2-5 нагрели примерно до 35°С и выдерживали в течение около 40 минут, после чего измерили остаточную активность фермента. Далее в Таблице 6б приведены полученные результаты.
Таблица 6б
Остаточная активность фермента в различных смесях воды и солей
Раствор №
Активность
1
100%
2
99%
3
101%
4
96%
5
102%
На фиг.1б в графической форме представлена остаточная активность фермента в различных смесях воды и солей и данные из приведенной выше Таблицы 6б. Добавление соли не оказывало видимого влияния на устойчивость фермента. Следовательно, предполагается, что основной причиной снижения активности аспарагиназы является хлор.
Пример 7
Две аликвотные части с исходной одинаковой активностью аспарагиназы разбавили одинаковым количеством деионизированной воды (кювета 1) и водопроводной воды (кювета 2), чтобы получить первый раствор аспарагиназы и второй раствор аспарагиназы. Каждый раствор в течение 30 минут выдерживали при комнатной температуре, а затем добавили каждый раствор аспарагиназы в кукурузное тесто. Через 5 и 10 минут после добавления фермента в тесто измерили содержание аспарагина в тесте. Далее в Таблице 7 приведены полученные результаты.
Таблица 7
Содержание аспарагина в кукурузном тесте с использованием фермента, смешанного с питьевой водой и деионизированной водой
Тип воды, использованной для разбавления фермента
Образец теста
Аспарагин (част/млн.)
Деионизированная вода
Через 5 минут после добавления первого раствора аспарагиназы
3,6
Деионизированная вода
Через 10 минут после добавления первого раствора аспарагиназы
2,9
Питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса
Через 5 минут после добавления второго раствора аспарагиназы
37,2
Питьевая вода, которой снабжается г. Плано (штат Техас, США) из районного водохозяйственного предприятия Северного Техаса
Через 10 минут после добавления второго раствора аспарагиназы
24,2
Приведенные выше в Таблице 7 показатели содержания аспарагина в кукурузном тесте доказывают, что конечное содержание аспарагина в значительной степени зависит от используемого разбавленного раствора аспарагиназы. В проиллюстрированном выше варианте осуществления различие в содержании аспарагина в кукурузном тесте после очистки деионизированной воды составляло около одного порядка величины по сравнению с использованием питьевой воды.
Приведенные выше данные ясно доказывают, что с целью доведения до максимума остаточной активности аспарагиназы должно быть снижено содержание активного хлора. Поскольку деионизированная вода и дистиллированная вода являются дорогостоящими, в настоящем изобретении предложен способ доведения до максимума остаточной активности фермента путем избирательного удаления и/или инактивирования хлора, содержащегося в питьевой воде или воде из иного источника.
Может использоваться любой известный способ, позволяющий снижать содержание в пищевой воде компонентов, снижающих активность фермента, включая без ограничения очистку питьевой воды с целью снижения содержания компонента, снижающего активность фермента, путем фильтрации питьевой воды через активированный уголь, аэратор (чтобы улетучился хлор), системы обратного осмоса и/или ионообменные смолы. Питьевая вода также может быть очищена путем ее смешивания с деионизированной водой или дистиллированной водой в количествах, достаточных для снижения содержания снижающих активность компонентов и получения устойчивого раствора фермента.
Используемый в заявке термин "поглотитель" означает любую добавку, которая сохраняет активность фермента путем вступления в реакцию с хлором. Таким образом, в питьевую воду могут добавляться поглотители компонентов, снижающих активность фермента. Например, в одном из вариантов осуществления в питьевую воду добавляют тиосульфат, являющийся поглотителем хлора. Кроме того, чтобы инактивировать хлор, могут использоваться другие добавки. Например, поскольку хлор является сильным окислителем, в питьевую воду также могут добавляться восстановители, вступающие в реакцию с хлором. Как известно из химии окисления-восстановления, восстановители представляют собой соединения, являющиеся донорами электронов, а окислители являются акцепторами электронов. Таким образом, в одном из вариантов осуществления в источник питьевой воды может быть добавлен один или несколько восстановителей (например, донор электронов), чтобы инактивировать или нейтрализовать хлор. Примеры восстановителей включают без ограничения дигидрат дихлорида олова, сульфит натрия, метабисульфит натрия, аскорбиновую кислоту, производные аскорбиновой кислоты, изоаскорбиновую кислоту (эриторбовую кислоту), производные солей аскорбиновой кислоты, железо, цинк, ионы железа и их сочетания.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения общее содержание хлора снижают до уровня от около 0 до менее около 0,5 ч./млн, предпочтительно от около 0 до около 0,1 ч./млн.
Затем в одном из вариантов осуществления аспарагиназа может быть смешана с очищенной водой, чтобы получить устойчивый раствор аспарагиназы, который затем может быть смешан с пищевым продуктом. В одном из вариантов осуществления питьевую воду подвергают достаточной очистке, при этом раствор фермента или раствор аспарагиназы является устойчивым, если остаточная активность фермента составляет по меньшей мере около 80%, более предпочтительно по меньшей мере около 90% на протяжении по меньшей мере 30 минут, более предпочтительно по меньшей мере около 4 часов после того, как фермент добавили в очищенную питьевую воду. В одном из вариантов осуществления остаточная активность фермента составляет по меньшей мере около 90% на протяжении времени, необходимого для добавления раствора аспарагиназы в тесто.
Специалист в данной области техники, ознакомившийся с настоящим описанием, сможет определить и получить необходимые составы воды, обеспечивающие желаемую остаточную активность фермента.
Пищевые продукты, в которые может быть добавлен раствор аспарагиназы, включают без ограничения различные виды теста, пастообразных смесей и любые другие пищевые продукты, в которых желательно снизить содержание акриламида. Например, в одном из вариантов осуществления раствор аспарагиназы добавляют в картофельную пасту, полученную из картофельных хлопьев. В одном из вариантов осуществления картофельную пасту получают путем добавления раствора аспарагиназы в картофельные хлопья. В одном из вариантов осуществления раствор аспарагиназы используют в качестве добавляемой воды и добавляют его в муку для получения теста. В одном из вариантов осуществления раствор аспарагиназы добавляют в кукурузное тесто.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложена система для получения устойчивого раствора аспарагиназы, который может добавляться в пищевой ингредиент, содержащий аспарагин. В одном из вариантов осуществления система представляет собой систему очистки воды. Система очистки позволяет удалять компоненты, такие как хлор, с помощью активированного угля или другими способами удаления, перечисленными выше, и/или вносить добавки, включая без ограничения восстановители, поглотители хлора или EDTA, которые повышают активность аспарагиназы до более высокого уровня, чем без использования добавки. Затем очищенная вода может направляться в смесительную емкость, в которой аспарагиназа может быть разбавлена с целью получения устойчивого раствора аспарагиназы. Затем раствор аспарагиназы может быть путем дозирования или иным способом добавлен в тесто, которое используют для получения готового пищевого продукта из полуфабриката, или подвергнут тепловой обработке, описанной выше. Затем тесто подвергают дополнительной обработке (например, формуют путем экструзии и раскатывания и подвергают тепловой обработке), хорошо известной из техники. Специалист в данной области техники, ознакомившийся с настоящим описанием, поймет, что настоящее изобретение может применяться во всех случаях, когда желательно, чтобы раствор аспарагиназы снижал содержание акриламида в пищевом продукте.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложена система, содержащая источник питьевой воды и источник аспарагиназы, систему очистки, позволяющую повышать активность аспарагиназы в очищенной воде до более высокого уровня, чем без осуществления очистки, и систему доставки, позволяющую смешивать очищенную питьевую воду и аспарагиназу. В одном из вариантов осуществления система доставки представляет собой смесительную емкость, в которую поступает очищенная вода из системы очистки и аспарагиназа.
Далее описан способ испытаний, использованный в примерах настоящего изобретения для определения активности аспарагиназы.
I. Подготовка
Для определения активности аспарагиназы методом SIGMA использовали трис-буфер с рН 8,6 (Sigma A4887). С учетом низкой активности аспарагиназы пищевой марки при рН 8,6, условия испытания изменили и довели рН до 7,0 с помощью MOPS (3-морфолинпропансульфоновой кислоты).
II. Принцип
III. Условия
436
Т=37°С, рН=7,0, А, путь световых лучей=1 см
IV. Метод
Спектрофотометрическое определение частоты остановок
V. Реактивы
а. 100 мМ натриевой соли MOPS (3-морфолинпропансульфоновой кислоты). Отвесить 2,09 г MOPS (Sigma M5162). Растворить примерно в 60 мл деионизированной воды комнатной температуры. Добавить гидроксид натрия, чтобы довести рН до 7,0. Долить деионизированной воды до 100 мл. Когда не используется, хранить в холодильнике.
b. 189 мМ раствора L-аспарагина. Отвесить 0,25 г безводного L-аспарагина и растворить в 10 мл деионизированной воды. Когда не используется, хранить в холодильнике. После охлаждения диспергировать с помощью ультразвука, чтобы растворить кристаллы аспарагина перед использованием.
4
2
4
с. 6 мМ эталонного раствора сульфата аммония ((NH)SO). Отвесить 0,079 г сульфата аммония на аналитических весах с точностью до 0.0001 г. Растворить и долить деионизированной воды до 100 мл. Когда не используется, хранить в холодильнике.
d. 1,5 М трихлоруксусной кислоты (ТСА). Отвесить 2,45 г трихлоруксусной кислоты. Растворить и долить деионизированной воды до 10 мл.
е. Цветной реактив на основе аммиака: испытательный комплект для определения высоких концентраций аммиачного азота методом определения остаточного азота с помощью реактива Несслера, LaMotte 3642-SC, VWR Cat. No. 34186-914. Реактив №2 содержит ртуть.
f. Раствор фермента аспарагиназа: непосредственно перед использованием приготовить раствор, содержащий 2,0-4,0 единиц/мл аспарагиназы в деионизированной воде комнатной температуры. Если фермент заморожен, полностью оттаять в слегка теплой воде перед тем, как использовать аликвотную часть для разбавления. Для фермента с типичной концентрацией 0,1 мл раствора фермента можно разбавить до объема 50 мл.
VI. Процедура
а. Установить температуру нагревательного элемента для пробирок на уровне 37°С.
b. Использовать регулируемую микропипетку для переливания в пипетки следующих реактивов (мл):
Реактив
Испытание
Контрольный фермент
Эталон 1
Эталон 2
Эталон 3
Контрольный реактив
А (Буфер)
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
В (L-ASN)
0,10
0,10
-
-
-
-
С (эталонный аммоний)
-
-
0,25
0,50
1,00
-
Деионизированная вода
0,90
0,90
0,85
0,60
0,10
1,10
F (Раствор фермента)
0,10
-
-
-
-
-
с. Закупорить пробирки и поместить в нагревательный элемент, нагретый до температуры 37°С. Начать взбалтывание нагревательного элемента.
d. Через 30 минут извлечь пробирки из нагревательного элемента. Раскупорить пробирки, немедленно добавить реактив ТСА и смешать. Затем добавить реактив F (раствор фермента) в контрольный фермент. Для испытываемых растворов фермента промежуток времени между извлечением пробирок из нагревательного элемента и добавлением ТСА должен быть максимально коротким. После добавления ТСА промежуток времени до измерения содержания аммиака не имеет решающего значения. Для контрольных и эталонных образцов промежуток времени между извлечением из нагревательного элемента и добавлением ТСА не имеет решающего значения.
Реактив
Испытание
Контрольный фермент
Эталон 1
Эталон 2
Эталон 3
Контрольный реактив
D (ТСА)
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
F (Раствор фермента)
-
0,10
-
-
-
-
е. С помощью пипетки влить 0,20 мл каждого раствора в пробирки. Добавить 4,30 мл деионизированной воды, 4 капли реактива LaMotte №1 и 0,50 мл реактива LaMotte №2. Смешать растворы и оставить при комнатной температуре на 10-20 минут, после чего измерить оптическую плотность на частоте 436 нм в 1-см кювете. Очистить спектрофотометр деоинизированной водой.
VII. Подсчет результатов
f. Активность фермента вычисляется на основании калибровочной кривой для аммиака (µмоль/0,2 мл).
g. Описание вычислительных шагов
i Вычисление концентрации эталонного раствора сульфата аммония:
3
4
4
мМ=(0,0809 г)·(1000 мМ/М)·(2NH/NHSO)/((132,14 г/моль)(0,1 л))=12,24 мМ = ммоль/L=µмоль/мл
при этом 0,0809 г означает эталонный вес сульфата аммония.
3
ii. Вычисление µмолей NH в 2,2 мл эталонов:
3
3
µмоль NH в 2,2 мл = (NH µмоль/мл эталонного раствора)·(мл эталона)
3
iii. Вычисление µмолей NH/0,2 мл:
3
3
µмоль NH/0,2 мл = (µмоль NH в 2,2 мл)·(0,2 мл)/(2,2 мл)
iv. Вычисление кривой регрессии при
х=А436
3
у=NH µмоль/0,2 мл
3
v. На основании калибровочной кривой вычисляют µмоль NH/0,2 мл:
3
µмоль NH/0,2 мл = (крутизна)·(А436) + отсекаемый отрезок
vi. Активность разбавленного раствора фермента вычисляют согласно следующей формуле:
3
Единицы/мл фермента = (µмоль высвобожденного NH)·(2,20)/(0,2·30·0,1), при этом:
2.20 мл = объем после шага 1 (шаг 1 - анализ раствора фермента)
0,2 мл = объем на шаге 1, использованный на шаге 2 (шаг 2 - формирование цвета)
30 минут = время анализа в минутах
0,1 мл = объем использованного фермента
vii. Коэффициент разбавления составляет 50 мл, деленные на объем концентрированного фермента, разбавленного до 50 мл.
viii. Концентрация раствора фермента до разбавления = (единицы/мл разбавленного раствора)·(коэффициент разбавления).
Хотя изобретение конкретно рассмотрено и описано со ссылкой на несколько вариантов осуществления, специалисты в данной области техники поймут, что могут применяться различные иные решения задачи сохранения остаточной активности аспарагиназы в раствор, не выходящие за пределы сущности и объема настоящего изобретения.