УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ РЕФОЛДИНГА ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ

1. Способ извлечения подвергнутого рефолдингу ранибизумаба, при этом способ включает этапы:
a) выделения легкой цепи и/или тяжелой цепи ранибизумаба из бактериальной клетки-хозяина;
b) солюбилизации указанной легкой цепи и/или тяжелой цепи ранибизумаба в первом буферном растворе, содержащем хаотропное средство и/или восстановитель, при подходящем pH;
c) рефолдинга солюбилизированной легкой цепи и/или тяжелой цепи ранибизумаба во втором буферном растворе в подходящих условиях pH и температуры до окончания первого периода инкубирования, а затем сдвига pH и температуры первого периода инкубирования до низкого pH и высокой температуры до окончания второго периода инкубирования, где сдвиг pH и температуры осуществляют между первым и вторым периодами инкубирования, с получением подвергнутого рефолдингу ранибизумаба; и
d) извлечения указанного подвергнутого рефолдингу ранибизумаба.
2. Способ по п.1, где второй буферный раствор из этапа (c) поддерживают при pH от приблизительно 10 до приблизительно 11 в течение первого периода инкубирования.
3. Способ по п.2, где второй буферный раствор из этапа (c) поддерживают при pH 10 в течение первого периода инкубирования.
4. Способ по п.1, где второй буферный раствор из этапа (c) поддерживают при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 12°C в течение первого периода инкубирования.
5. Способ по п.4, где второй буферный раствор из этапа (c) поддерживают при температуре от приблизительно 5°C до приблизительно 10°C.
6. Способ по п.1, где первый период инкубирования составляет от приблизительно 1 до приблизительно 25 часов.
7. Способ по п.6, где первый период инкубирования составляет 4 часа.
8. Способ по п.1, где второй буферный раствор из этапа (c) поддерживают при pH от приблизительно 8 до приблизительно 9 в течение второго периода инкубирования.
9. Способ по п.8, где второй буферный раствор из этапа (c) поддерживают при pH 9.
10. Способ по п.1, где второй буферный раствор из этапа (c) поддерживают при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C в течение второго периода инкубирования.
11. Способ по п.10, где второй буферный раствор из этапа (c) поддерживают при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 25°C.
12. Способ по п.1, где второй период инкубирования составляет от приблизительно 1 до приблизительно 25 часов.
13. Способ по п.12, где второй период инкубирования составляет 14 часов.
14. Способ по п.1, где второй буфер выбран из Tris, аргинина, сорбита, цистина, окисленного глутатиона (GSSG), сульфата меди, дегидроаскорбата и тиосульфата натрия.
1. Способ по п.1, где второй буфер выбран из Tris, аргинина, сорбита и цистина.
16. Способ по п.1, где первый буферный раствор из этапа (b) выбран из Tris-Cl и мочевины.
17. Способ по п.16, где первый буферный раствор из этапа (b) поддерживают при pH от приблизительно 8,5 до приблизительно 10.
18. Способ по п.17, где первый буферный раствор из этапа (b) поддерживают при pH 9.
19. Способ по п.1, где хаотропные средства выбраны из гидрохлорида гуанидина, мочевины и гидроксида натрия или калия.
20. Способ по п.1, где восстановитель выбран из дитиотреитола (DTT), дитиоэритрита (DTE), бета-меркаптоэтанола (BME), цистеина, цистеамина, тиогликолята, глутатиона и борогидрида натрия.
21. Способ извлечения подвергнутого рефолдингу ранибизумаба по любому из предыдущих пунктов, включающий этапы:
a) выделения легкой цепи и/или тяжелой цепи ранибизумаба из бактериальной клетки-хозяина;
b) солюбилизации указанной легкой цепи и/или тяжелой цепи ранибизумаба в первом буферном растворе, содержащем хаотропное средство и/или восстановитель, при pH, составляющем приблизительно 9;
c) рефолдинга указанной солюбилизированной легкой цепи и тяжелой цепи ранибизумаба во втором буферном растворе в подходящих условиях при pH, составляющем приблизительно 10, температуре, составляющей по меньшей мере приблизительно 5 - 10°C, в течение первого периода инкубирования, составляющего по меньшей мере приблизительно 4 часа;
d) осуществления сдвига подходящих условий из этапа (c), предусматривающего pH, составляющий приблизительно 9, температуру, составляющую по меньшей мере приблизительно 20 - 25°C, в течение второго периода инкубирования, составляющего приблизительно 14 часов, с получением подвергнутого рефолдингу ранибизумаба; и
e) извлечения указанного подвергнутого рефолдингу ранибизумаба.
22. Способ по п.1, где извлеченный подвергнутый рефолдингу ранибизумаб дополнительно очищают с помощью по меньшей мере одного способа очистки, выбранного из фильтрации и анионной или катионной хроматографии.