НОВЫЕ АНТИ-CD19-АНТИТЕЛА
NEW ANTI-CD19 ANTIBODIES

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение, в общем, относится к новым анти-CD19-антителам и их применению.
Уровень техники
[0002] CD19 (кластер дифференцировки 19) представляет структурно отличимый рецептор клеточной поверхности, экспрессируемый на поверхности В-клеток, включая, не ограничиваясь этим, все субтипы В-клеточной лимфомы, от индолентной до агрессивной формы, а также В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз и не-Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, пре-В-клетки, В-клетки в раннем периоде развития (т.е. незрелые В-клетки), зрелые В-клетки, перешедшие в результате терминальной дифференцировки в плазматические клетки, и злокачественные В-клетки. CD19 экспрессируется при большинстве пре-B-клеточных острых лимфобластных лейкозах (ALL), неходжкинских лимфомах, B-клеточных хронических лимфоцитарных лейкозах (CLL), пролимфоцитарных лейкозах, волосатоклеточных лейкозах, распространенных острых лимфоцитарных лейкозах и некоторых острых лимфобластных лейкозах с нулевым фенотипом (Nadler et al., J. Immunol., 131: 244-250 (1983), Loken et al., Blood, 70: 1316-1324 (1987), Uckun et al., Blood, 71: 13-29 (1988). Anderson et al., 1984. Blood, 63: 1424-1433 (1984), Scheuermann, Leuk. Lymphoma, 18: 385-397 (1995)). Экспрессия CD19 на плазматических клетках дополнительно предполагает, что он может экспрессироваться на дифференцированных В-клеточных опухолях, таких как множественная миелома, плазмоцитомы, опухоли при макроглобулинемии Вальденстрема (Grossbard et al., Br. J. Haematol., 102: 509-15 (1998); Treon et al., Semin. Oncol., 30: 248-52 (2003)). CD19 также был одним из многих предлагаемых мишеней для иммунотерапии. В отличие от CD20 (другой поверхностный рецептор B-клеток), считается, что CD19 экспрессируется на более высоких уровнях и интернализуется клетками при связывании с анти-CD19-антителом.
[0003] Остается необходимость в новых анти-CD19-антителах, в частности, тех, которые обладают благоприятной способностью к интернализации и высокой аффинностью связывания.
Сущность изобретения
[0004] По тексту настоящего раскрытия артикли «а», «an» и «the» используются здесь для обозначения одного или более чем одного (т. е., по меньшей мере, одного) грамматического объекта артикля. Например, «антитело» означает одно антитело или несколько антител.
[0005] Настоящее изобретение относится к новым моноклональным анти-CD19-антителам, их аминокислотным и нуклеотидным последовательностям и их применениям.
[0006] В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, содержащим одну или более (например, 1, 2 или 3) последовательностей определяющего комплементарность участка (CDR) тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 44, 45, 136, 140 и 141, и/или одну или более (например, 1, 2 или 3) последовательностей CDR легкой цепи каппа, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 40, 41, 42, 137, 138 и 139.
[0007] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат 1, 2 или 3 последовательности CDR тяжелой цепи, имеющие, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере, 85%, 88%, 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичность последовательности с последовательностями SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 43, 44, 45, 136, 140 или 141. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат 1, 2 или 3 последовательности CDR легкой цепи, имеющие, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичность последовательности с последовательностями SEQ ID NO: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 40, 41, 42, 137, 138 или 139.
[0008] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из:
а) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3;
b) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9;
c) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15;
d) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21;
e) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24;
f) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27;
g) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30;
h) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33;
i) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36;
j) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39;
k) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45;
l) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3;
m) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 9; и
n) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 и SEQ ID NO: 15.
[0009] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи каппа, выбранную из группы, состоящей из:
а) вариабельной области легкой цепи каппа, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
b) вариабельной области легкой цепи каппа, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12;
c) вариабельной области легкой цепи каппа, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и/или SEQ ID NO: 18;
d) вариабельной области легкой цепи каппа, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42; и
e) вариабельной области легкой цепи каппа, содержащей 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 и SEQ ID NO: 139.
[00010] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат:
а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12;
c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18;
d) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
e) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
f) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
g) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
h) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
j) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 42;
k) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6;
l) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 и SEQ ID NO: 139;
m) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 9; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; или
n) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 и SEQ ID NO: 15; и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую 1, 2 или 3 последовательности CDR, выбранные из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.
[00011] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат: последовательность CDR3 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 45.
[00012] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат:
a) последовательность CDR1 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 136;
b) последовательность CDR2 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141; и
c) последовательность CDR3 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 45.
[00013] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат:
а) последовательность CDR1 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 137;
b) последовательность CDR2 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 138; и
c) последовательность CDR3 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 139.
[00014] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат:
a) последовательность CDR1 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 , SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 136;
b) последовательность CDR2 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141;
c) последовательность CDR3 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 45;
d) последовательность CDR1 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 137;
e) последовательность CDR2 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 138; и
f) последовательность CDR3 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 139.
[00015] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты дополнительно содержат одну или более (например, 1, 2, 3 или 4) последовательностей каркасной области (FR) тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 70, 71, 72, 73, 86, 87, 88 и 89, и/или одну или более последовательностей каркасной области (FR) легкой цепи каппа (например, 1, 2, 3 или 4), выбранных из SEQ ID NO: 58, 59, 60, 61, 74, 75, 76, 77, 90, 91, 92 и 93.
[00016] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты дополнительно содержат последовательность FR1 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 54, 70 и 86; последовательность FR2 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 55, 71 и 87; последовательность FR3 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 56, 72 и 88; и/или последовательность FR4 тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 57, 73 и 89.
[00017] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты дополнительно содержат последовательность FR1 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 58, 74 и 90; последовательность FR2 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 59, 75 и 91; последовательность FR3 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 60, 76 и 92; и/или последовательность FR4 легкой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 61, 77 и 93.
[00018] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132 и их гомологичных последовательностей, имеющих, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичность последовательности.
[00019] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134 и их гомологичных последовательностей, имеющих, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичность последовательности.
[00020] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат всю или часть последовательности вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 94, 98, 102, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 122, 124, 128 и 132; и/или всю или часть последовательности вариабельной области легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 100, 104, 120, 126, 130 и 134. В одном варианте осуществления антитела или его антигенсвязывающие фрагменты представляют однодоменное антитело, которое состоит из всей или части вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 94, 98, 102, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 122, 124, 128 и 132.
[00021] В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат:
а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 94, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 96;
b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 98, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 100;
c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 102, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 104;
d) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 106, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 96;
e) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 108, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 96;
f) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 110, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 96;
g) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 112, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 96;
h) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 114, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 96;
i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 116, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 96;
j) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 118, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 120;
k) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 122, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 96;
l) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 124, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 126;
m) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 128, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 130; или
n) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 132, и вариабельную область легкой цепи каппа, содержащую SEQ ID NO: 134.
[00022] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат одну или более замен аминокислотных остатков, но сохраняют специфическую аффинность связывания с CD19.
[00023] В некоторых вариантах осуществления замена имеет место в одной или более последовательностях CDR и/или в одной или более последовательностях FR, в одной или обеих последовательностях вариабельной области и/или в Fc-области. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна (или все) замена(ы) в последовательностях CDR, последовательностях FR, последовательностях вариабельной области или Fc-области включает консервативную замену.
[00024] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен аминокислотных остатков в одной или более последовательностях CDR, выбранных из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 136, 137, 138 139, 140 и 141.
[00025] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен аминокислотных остатков в одной или более последовательностях FR, выбранных из SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 и 93. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат в общей сложности не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен в последовательностях CDR и/или последовательностях FR вариабельной области тяжелой цепи, выбранных из SEQ ID NO: 94, 98, 102, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 122, 124, 128 и 132. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен аминокислотных остатков во всех последовательностях FR вариабельной области легкой цепи, выбранных из SEQ ID NO: 96, 100, 104, 120, 126, 130 и 134.
[00026] В некоторых вариантах осуществления замена придает одно или более желательных свойств, выбранных из: а) повышения аффинности связывания с CD19, b) введения или удаления сайта гликозилирования, с) введения свободного остатка цистеина, d) усиления или снижения ADCC или CDC, e) увеличения периода полувыведения из сыворотки крови; и f) увеличения связывания с FcRn.
[00027] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат константную область иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат константную область IgG. В определенном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат константную область мышиного IgG1, мышиного IgG2a, мышиного IgG2b или человеческого IgG1.
[00028] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой «нечеловеческое» (например, мышиное антитело или антитело другого грызуна) антитело или гуманизированное антитело.
2
2
[00029] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют верблюжье однодоменное антитело, диатело, scFv, димер scFv, BsFv, dsFv, (dsFv), dsFv-dsFv', Fv-фрагмент, Fab, Fab', F(ab'), биспецифическое антитело, ds диатело, нанотело, доменное антитело или бивалентное доменное антитело.
[00030] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты являются биспецифическими.
[00031] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связаны с одним или более конъюгатами. В некоторых вариантах осуществления конъюгат включает химиотерапевтическое средство, токсин, радиоактивный изотоп, лантаноид, люминесцентную метку, флуоресцентную метку или фермент-субстратную метку. В некоторых вариантах осуществления конъюгат представляет токсин. В некоторых вариантах осуществления токсин представляет цитотоксин, алкилаторы ДНК, ингибитор топоизомеразы, тубулин-связывающие агенты или другие противоопухолевые средства. В определенных вариантах осуществления противоопухолевое лекарственное средство представляет собой цитотоксический агент майтанзиноид. В определенных вариантах осуществления токсином является DM1.
[00032] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться с CD19. В некоторых вариантах осуществления CD19 получены от мыши, крысы, обезьяны или человека.
D
-9
-9
-10
-10
-10
-10
-10
-10
-10
-10
-10
[00033] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты способны специфически связываться с человеческим CD19, экспрессированным на клетке, при значении K не более 5×10 М, не более 1×10 М, не более 9×10 М, не более 8×10 М, не более 7×10 М, не более 6×10 М, не более 5×10 М, не более 4×10 М, не более 3×10 М, не более 2×10 М, не более 1×10 М, как измерено методом проточной цитометрии.
50
[00034] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты способны специфически связываться с человеческим CD19, экспрессированным на клетке, с EC не более 0,04 нМ, не более 0,05 нМ, не более 0,1 нМ, не более 0,2 нМ, не более 0,3 нМ, не более 0,4 нМ, не более 0,5 нМ, не более 0,5 нМ, не более 0,6 нМ, не более 0,7 нМ, не более 0,8 нМ, не более 0,9 нМ или не более 1 нМ по данным метода проточной цитометрии.
50
[00035] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты способны специфически связываться с CD19 обезьян Cynomolgus, экспрессируемым на клетке, с EC не более 0,2 нМ, не более 0,5 нМ, не более 0,8 нМ, не более 1 нМ, не более 2 нМ или не более 3 нМ по данным метода проточной цитометрии.
50
[00036] В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты способны интернализироваться клеткой, экспрессирующей CD19, с EC не более 1 пМ, не более 2 пМ, не более 3 пМ, не более 4 пМ, не более 5 пМ, не более 6 пМ, не более 7 пМ, не более 8 пМ, не более 9 пМ, не более 10 пМ, не более 11 пМ, не более 12 пМ не более 13 пМ, не более 14 пМ, не более 15 пМ, не более 16 пМ, не более 17 пм, не более 18 пМ, не более 19 пМ, не более 20 пМ, не более 21 пМ, не более 22 пМ, не более 23 пМ, не более 24 пМ, не более 25 пМ, не более 30 пМ, не более 35 пМ, не более 40 пМ, не более 45 пМ или не более 50 мкМ по данным анализа Fab-Zap.
[00037] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые конкурируют за один и тот же эпитоп с W7011-4.155.8, W7011-4.202.9 или W7011-4.225.7.
[00038] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченные здесь, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит второй агент, который способен усиливать терапевтический эффект антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и/или способен ослаблять побочный эффект антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
[00039] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает выделенные полинуклеотиды, кодирующие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченные здесь. В некоторых вариантах осуществления выделенный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 95, 99, 103, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 123, 125, 129 и 133, и/или нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 97, 101, 105, 121, 127, 131 и 135, или ее гомологичной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичность последовательности, но кодирующей ту же белковую последовательность.
[00040] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает векторы, содержащие указанный выделенный полинуклеотид.
[00041] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает клетки-хозяева, содержащие указанный вектор.
[00042] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает способы экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, обеспеченные здесь, включающие культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, при которых указанный полинуклеотид экспрессируется.
[00043] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно относится к конъюгатам антитело-лекарственное средство, содержащим одну или более молекул лекарственного средства, ковалентно связанных с антителами или антигенсвязывающими фрагментами, обеспеченными здесь, прямо или через линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет гидразиновый линкер, дисульфидный линкер, бифункциональный линкер, дипептидный линкер, глюкуронидный линкер, тиоэфирный линкер. В определенных вариантах осуществления линкер представляет SMCC.
[00044] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна молекула лекарственного средства присоединена к специфическому сайту антител или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления специфический сайт представляет собой остаток цистеина. В некоторых вариантах осуществления молекулы лекарственного средства представляют собой токсин или радиоактивные изотопы. В некоторых вариантах осуществления молекулы лекарственного средства представляют собой токсин, необязательно цитотоксин, алкилаторы ДНК, ингибитор топоизомеразы, тубулин-связывающие агенты или другие противоопухолевые средства, необязательно цитотоксический агент майтанзиноид, необязательно токсин представляет собой DM1.
[00045] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, или конъюгаты антитело-лекарственное средство, обеспеченные здесь, и фармацевтически приемлемый носитель.
[00046] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает способы лечения связанного с CD19 заболевания или патологического состояния у субъекта, включающие введение терапевтически эффективного количества антител или их антигенсвязывающих фрагментов, обеспеченных здесь, конъюгатов антитело-лекарственное средство, обеспеченных здесь, или фармацевтической композиции, обеспеченной здесь, субъекту. В определенных вариантах осуществления субъект является человеком. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляется посредством перорального, интраназального, внутривенного, подкожного, сублингвального или внутримышечного введения. В определенных вариантах осуществления указанное заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления указанный рак представляет лимфому, рак легкого, рак печени, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак поджелудочной железы, меланому, глиобластому, рак предстательной железы, рак пищевода или рак желудка. В некоторых вариантах осуществления указанное заболевание или патологическое состояние представляет B-клеточную лимфому, необязательно лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому, где неходжкинская лимфома включает: диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, B-клеточную лимфому маргинальной зоны (MZL), лимфому лимфоидной ткани, ассоциированную со слизистой желудка (MALT), малую лимфоцитарную лимфому (хронический лимфолейкоз, CLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или макроглобулинемию Вальденстрема (WM).
[00047] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает способы модуляции активности CD19 в клетке, экспрессирующей CD19, включающие воздействие на клетку, экспрессирующую CD19, антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, обеспеченными здесь.
[00048] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает in vivo или in vitro способы индукции гибели клетки, экспрессирующей CD19, включающие контактирование клетки, экспрессирующей CD19, с конъюгатами антитело-лекарственное средство, обеспеченными здесь.
[00049] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает способ определения присутствия или количества CD19 в образце, включающий контактирование образца с антителами или его антигенсвязывающими фрагментами, обеспеченными здесь, и определение присутствия или количества CD19 в образце.
[00050] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает способы диагностики связанного с CD19 заболевания или патологического состояния у субъекта, включающие: а) получение образца от субъекта; b) контактирование образца с антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, обеспеченными здесь; в) определение присутствия или количества CD19 в образце; d) корреляцию присутствия или количества CD19 с заболеванием или патологическим состоянием у субъекта.
[00051] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает применение антител или их антигенсвязывающих фрагментов, обеспеченных здесь, в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или патологического состояния у субъекта, где лечение включает: введение терапевтически эффективного количества антител или их антигенсвязывающих фрагментов субъекту.
[00052] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает применение антител или их антигенсвязывающих фрагментов, обеспеченных здесь, в производстве диагностического реагента для выявления заболевания или патологического состояния, связанного с CD19.
[00053] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к химерным антигенным рецепторам (CAR), содержащим антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченный здесь, и фрагмент активации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления фрагмент активации Т-клеток содержит нативный фрагмент активации Т-клеточного рецептора (TCR). В некоторых вариантах осуществления фрагмент активации Т-клеток содержит трансмембранный домен TCR и внутриклеточный домен сигнальной трансдукции TCR. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv.
[00054] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим CAR, обеспеченный здесь. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты содержат первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую антигенсвязывающий фрагмент антител, обеспеченных здесь, функционально связанную со второй полинуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный домен TCR и внутриклеточный домен сигнальной трансдукции TCR.
[00055] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к векторам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, обеспеченную здесь.
[00056] В одном аспекте настоящее раскрытие обеспечивает выделенные Т-клетки, которые экспрессируют CAR, обеспеченный здесь.
[00057] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к способам стимуляции опосредованного Т-клетками иммунного ответа на мишень, экспрессирующую CD19, у субъекта, где способ включает введение субъекту эффективного количества Т-клеток, обеспеченных здесь.
Краткое описание фигур
[00058] На фиг.1 показан SDS-PAGE WBP701-BMK1 и WBP701-BMK2. М: белковый маркер; дорожка 1: BMK1, восстанавливающие условия; дорожка 2: BMK2, восстанавливающие условия; дорожка 3: BMK1, невосстанавливающие условия; дорожка 4: BMK4, невосстанавливающие условия.
[00059] На фиг.2 показан SDS-PAGE WBP701-BMK3. М: белковый маркер; дорожка 1: BMK3, восстанавливающие условия; дорожка 2: BMK3, невосстанавливающие условия.
[00060] На фиг. 3А приведены гистограммы проточной цитометрии для экспрессии CD19 в клеточной линии 293F, трансфектированной CD19 человека (WBP701.293F.hPro1.FL.A2). Пик слева представляет отрицательный контрольный сигнал. Смещенный вправо пик представляет экспрессию CD19 в анализированной клеточной линии.
[00061] На фиг. 3В приведены гистограммы проточной цитометрии для экспрессии CD19 в человеческой клеточной линии CHO-K1, трансфектированной CD19 (WBP701.CHO-K1.hPro1.FL.B4). Пик слева представляет отрицательный контрольный сигнал. Смещенный вправо пик представляет экспрессию CD19 в анализированной клеточной линии.
[00062] На фиг. 3C приведены гистограммы проточной цитометрии для экспрессии CD19 в клеточной линии 293, трансфектированной CD19 обезьяны Cynomolgus, (WBP701.293F.cpro1.FL.C1). Пик слева представляет отрицательный контрольный сигнал. Смещенный вправо пик представляет экспрессию CD19 в анализированной клеточной линии.
[00063] На фиг. 3D приведены гистограммы проточной цитометрии для экспрессии CD19 в клеточной линии CHO-K1, трансфектированной CD19 обезьяны Cynomolgus (WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9). Пик слева представляет отрицательный контрольный сигнал. Смещенный вправо пик представляет экспрессию CD19 в анализированной клеточной линии.
[00064] На фиг. 4A-4F показано связывание селектированных субклонов с клетками Ramos с помощью FACS.
[00065] На фиг. 5А-5С показано связывание селектированных субклонов с клетками, экспрессирующими CD19 обезьяны Cynomolgus (WBP701.CHO-K11.cynoPro1) с помощью FACS.
[00066] На фиг. 6А-6Е показан анализ Fab-Zap селектированных субклонов.
[00067] На фиг. 7A-7C показан биннинг антител-кандидатов против BMK1, BMK2 и BMK3 с помощью FACS.
[00068] На фиг. 8 показан анализ аффинности связывания Скэтчарда антитела WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k с клетками Ramos с помощью FACS.
[00069] На фиг. 9 показан анализ аффинности связывания Скэтчарда антитела WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S) с клетками Ramos с помощью FACS.
[00070] На фиг. 10 показан анализ аффинности связывания Скэтчарда антитела W7011-4.155.8-z1-uIgG1K с клетками Ramos с помощью FACS.
[00071] На фиг. 11 показан анализ цитотоксичности конъюгатов гуманизированное антитело-лекарственное средство W7011-4.155.8-z1-uIgG1K-DM1 и WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S)-DM1 на клетках Daudi.
[00072] На фиг. 12 показан анализ цитотоксичности конъюгата гуманизированное антитело-лекарственное средство WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S)-DM1 на клетках Nalm-6.
[00073] На фиг. 13 показан анализ цитотоксичности конъюгатов гуманизированное антитело-лекарственное средство W7011-4.155.8-z1-uIgG1K-DM1 и WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K(N-S)-DM1 на клетках WSU-DLCL2.
[00074] На фиг. 14 показана противоопухолевая эффективность референсного антитела (W7011-BMK1-DM1) и антитела (W7011-4.87.6-z1-uIgG1k(NS)-DM1), данные представляют объемы опухолей в группах с различной обработкой самок мышей CB17-SCID с опухолевыми ксенотрансплантатами лимфомы Nalm-6. Точки данных представлены в виде среднего значения ± SEM. Стрелка обозначает сутки, на которые проводили введение.
Подробное описание изобретения
[00075] Нижеследующее описание раскрытия предназначено только для иллюстрации различных вариантов осуществления изобретения. По существу, обсуждаемые конкретные модификации не должны рассматриваться в качестве ограничения объема раскрытия. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что различные эквиваленты, изменения и модификации могут быть сделаны, не отступая от объема изобретения, и следует понимать, что такие эквивалентные варианты осуществления включаются в данный документ. Все ссылки, цитируемые здесь, включая публикации, патенты и патентные заявки, включены здесь посредством ссылки во всей их полноте.
Определения
[00076]
L
K
L
K
[00077] Как здесь используется, термин «антитело» включает любой иммуноглобулин, моноклональное антитело, поликлональное антитело, мультивалентное антитело, бивалентное антитело, моновалентное антитело, полиспецифическое антитело или биспецифическое антитело, которое связывается со специфическим антигеном. Нативное интактное антитело содержит две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи. Тяжелые цепи млекопитающих классифицируются как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области (VH) и первой, второй и третьей константной области (CH1, CH2, CH3 соответственно); легкие цепи млекопитающих классифицируются как λ или κ, где каждая легкая цепь состоит из вариабельной области (V для легкой цепи λ или V для легкой цепи κ соответственно) и константной области (C для легкой цепи λ или C для легкой цепи κ соответственно). Антитело имеет «Y»-образную форму, где основание Y состоит из второй и третьей константных областей двух тяжелых цепей, связанных вместе посредством дисульфидной связи. Каждое плечо Y включает вариабельную область и первую константную область одной тяжелой цепи, связанную с вариабельной и константной областями одной легкой цепи. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей ответственны за связывание антигена. Вариабельные области в обеих цепях обычно содержат три гипервариабельные петли, называемых определяющими комплементарность участками (CDR) (CDR легкой цепи, включающие LCDR1, LCDR2 и LCDR3, CDR тяжелой цепи, включающие HCDR1, HCDR2, HCDR3). Границы CDR для антител и антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых здесь, могут быть определены или идентифицированы в соответствии с системами нумерации Kabat, IMGT, Chothia или Al-Lazikani (Al-Lazikani, B., Chothia C., Lesk A.M., J. Mol. Biol., 273 (4), 927 (1997); Chothia C. et al., J. Mol. Biol., Dec. 5; 186 (3): 651-63 (1985); Chothia C. и Lesk A.M., J.Mol.Biol., 196901 (1987); Chothia C. et al., Nature. 21-28; 342 (6252): 877-83 (1989); Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Три CDR находятся между фланкирующими участками, известными как каркасные области (FR), которые более консервативны, чем CDR, и образуют каркас для поддержания гипервариабельных петель. Константные области тяжелой и легкой цепей не участвуют в связывании антигена, но проявляют различные эффекторные функции. Антитела относят к классам на основе аминокислотной последовательности константной области их тяжелой цепи. Пятью основными классами или изотипами антител являются IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, которые характеризуются наличием тяжелых цепей альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Некоторые из основных классов антител подразделяются на подклассы, такие как IgG1 (тяжелая цепь гамма-1), IgG2 (тяжелая цепь гамма-2), IgG3 (тяжелая цепь гамма-3), IgG4 (тяжелая цепь гамма-4), IgA1 (тяжелая цепь α1) или IgA2 (тяжелая цепь α2).
[00078] Как здесь используется, термин «бивалентные» относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, имеющим два антигенсвязывающих сайта; термин «моновалентные» относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, имеющим только один единственный антигенсвязывающий сайт; и термин «мультивалентные» относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, имеющим множество антигенсвязывающих сайтов. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются бивалентными.
[00079] Как здесь используется, термин «биспецифическое» антитело относится к искусственному антителу, которое имеет фрагменты, полученные из двух разных моноклональных антител, и которое способно связываться с двумя разными эпитопами. Два эпитопа могут находиться на одном и том же антигене или могут находиться на двух разных антигенах.
2
2
[00080] Как здесь используется, термин «антигенсвязывающий участок» относится к участку антитела, образованному из части антитела, содержащей 1, 2 или 3 CDR, или любому другому участку антитела, который связывается с антигеном, но не содержит интактной нативной структуры антитела. Примеры антигенсвязывающего фрагмента включают, без ограничения, диатело, фрагменты Fab, Fab', F(ab'), Fv-фрагмент, стабилизированный дисульфидной связью фрагмент Fv(dsFv), (dsFv), биспецифический dsFv (dsFv-dsFv'), стабилизированное дисульфидной связью диатело (ds диатело), молекулу одноцепочечного антитела (scFv), димер scFv (бивалентное диатело), биспецифическое антитело, мультиспецифическое антитело, верблюжье однодоменное антитело, нанотело, доменное антитело и бивалентное доменное антитело. Антигенсвязывающий фрагмент способен связываться с тем же антигеном, с которым связывается родительское антитело.
[00081] «Fab» по отношению к антителу относится к той части антитела, состоящей из одной легкой цепи (как вариабельной, так и константной области), связанной с вариабельной областью и первой константной областью одной тяжелой цепи дисульфидной связью.
[00082] «Fab» относится к Fab-фрагменту, который включает часть шарнирной области.
2
[00083] «F(ab')» относится к димеру Fab’. «Fv» по отношению к антителу относится к наименьшему фрагменту антитела, который содержит полный антигенсвязывающий сайт. Fv-фрагмент состоит из вариабельной области одной легкой цепи, связанной с вариабельной областью одной тяжелой цепи.
2
H
L
[00084] «dsFv» относится к стабилизированному дисульфидной связью Fv-фрагменту, в котором связь между вариабельной областью одной легкой цепи и вариабельной областью одной тяжелой цепи представляет собой дисульфидную связь. В некоторых вариантах осуществления «(dsFv)» или «(dsFv-dsFv')» содержит три пептидные цепи: две V-группы, связанные пептидным линкером (например, длинным гибким линкером) и связанные с двумя V-группами соответственно, через дисульфидные мостики. В некоторых вариантах осуществления dsFv-dsFv' является биспецифическим, в котором каждая спаренная дисульфидной связью тяжелая и легкая цепь имеет различную антигенную специфичность.
[00085] «Одноцепочечное Fv-антитело» или «scFv» относится к сконструированному антителу, состоящему из вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, соединенных друг с другом прямо или через последовательность пептидного линкера (Huston J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879 (1988)).
[00086] Термин «Fc» по отношению к антителу относится к той части антитела, которая состоит из второй и третьей константных областей первой тяжелой цепи, связанных со второй и третьей константными областями второй тяжелой цепи посредством дисульфидной связи. Fc-область антитела отвечает за различные эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), но не функционирует в связывании антигена.
[00087] «Одноцепочечное Fv-Fc антитело» или «scFv-Fc» относится к сконструированному антителу, состоящему из scFv, соединенному с Fc-областью антитела.
[00088] Термин «верблюжье однодоменное антитело», «антитело из тяжелых цепей» или «HCAb» относится к антителу, которое содержит два домена VH и не содержит легких цепей (Riechmann L. and Muyldermans S., J. Immunol. Methods. Dec. 10; 231 (1-2): 25-38 (1999); Muyldermans S., J. Biotechnol. Jun.; 74 (4): 277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; патент США № 6005079). Антитела из тяжелых цепей первоначально были получены из организма представителей семейства Camelidae (верблюды, дромадеры и ламы). Несмотря на отсутствие легких цепей, верблюжьи антитела имеют аутентичный антигенсвязывающий репертуар (Hamers-Casterman C. et al., Nature. Jun 3;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. et al. “Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation,” Immunogenetics. Apr; 54(1):39-47 (2002); Nguyen V.K. et al. Immunology. May; 109(1):93-101 (2003)). Вариабельный домен антитела из тяжелых цепей (домен VHH) представляет собой наименьшую из известных антигенсвязывающих единиц, генерируемых адаптивными иммунными ответами (Koch-Nolte F. et al., FASEB J. Nov; 21 (13): 3490-8. Epub 2007 15 Gun. 2007 г.).
[00089] «Нанотело» относится к фрагменту антитела, который состоит из домена VHH антитела из тяжелых цепей и двух константных доменов, CH2 и CH3.
H
L
H
L
L
H
H
L
H
L
H
L
H1
L2
L1
H2
H1
L1
H2
L2
[00090] «Диатела» или «dAbs» включают небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, где фрагменты содержат область V, связанную с областью V в одной полипептидной цепи (V-V или V-V) (см. например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Jul 15; 90 (14): 6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161). Используя линкер, который является слишком коротким, чтобы обеспечить спаривание между двумя доменами в одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, создавая тем самым два антигенсвязывающих сайта. Антигенсвязывающие сайты могут быть нацелены на одни и те же или разные антигены (или эпитопы). В некоторых вариантах осуществления «биспецифическое ds диатело» представляет собой антитело, направленное на два разных антигена (или эпитопа). В некоторых вариантах осуществления «димер scFv» представляет бивалентное диатело или бивалентный scFv (BsFv), содержащие V-V (связанные пептидным линкером), димеризованное с другой группой V-V, так что V одной группы координирует с V другой группы и образуют два сайта связывания, которые могут быть нацелены на одни и те же антигены (или эпитопы) или разные антигены (или эпитопы). В еще одних вариантах осуществления «димер scFv» представляет биспецифическое диатело, содержащее V-V (связанный пептидным линкером), связанный с V-V (также связанным пептидным линкером), так что V и V и V и V координируют, и каждая координированная пара обладает различной антигенной специфичностью.
H
H
[00091] «Доменное антитело» относится к фрагменту антитела, содержащему только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В некоторых случаях два или более доменов V ковалентно соединяются пептидным линкером с образованием бивалентного или мультивалентного доменного антитела. Два V-домена бивалентного доменного антитела могут быть нацелены на один и тот же или разные антигены.
[00092] Как здесь используется, термин «химерный» означает антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеют часть тяжелой и/или легкой цепи, происходящую от одного вида, и остальную часть тяжелой и/или легкой цепи, происходящую от другого вида. В иллюстративном примере химерное антитело может содержать константную область, происходящую от человека, и вариабельную область от животного, отличного от человека, такого как мышь или крыса. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой млекопитающее, например мышь, крысу, кролика, козу, овцу, морскую свинку или хомяка.
[00093] Как здесь используется, термин «гуманизированный» означает, что антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR, полученные от животных, отличных от человека, FR-области, полученные от человека, и, когда это применимо, константные области, полученные от человека.
[00094] Как здесь используется, термин «CD19» относится к белку кластера дифференцировки 19, который является антигенной детерминантой, определяемой в лейкозных клетках-предшественниках. Аминокислотные и нуклеиновокислотные последовательности CD19 человека и мыши можно найти в общедоступной базе данных, такой как GenBank, UniProt и Swiss-Prot. Например, аминокислотную последовательность CD19 человека можно найти под инвентарным номером UniProt/Swiss-Prot P15391, и нуклеотидную последовательность, кодирующую CD19 человека, можно найти под инвентарным номером NM_001178098. Как здесь используется, термин CD19 включает белки, содержащие мутации, например, точечные мутации, фрагменты, инсерции, делеции и варианты сплайсинга полноразмерного CD19 дикого типа. CD19 экспрессируется в большинстве видов опухолей В-клеточной линии дифференцировки, включая, например, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз и неходжкинскую лимфому. Это также ранний маркер B-клеточных предшественников. Смотри, например, Nicholson et al. Mol.Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). В одном аспекте белок CD19 экспрессируется на опухолевой клетке.
D
D
off
on
D
-6
-7
-7
-7
-8
-8
-8
-9
-9
-9
-9
-9
[00095] Как здесь используется, термин «специфическое связывание» или «специфически связывается» относится к неслучайной реакции связывания между двумя молекулами, например, такими как антитело и антиген. В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, специфически связываются с человеческим CD19 с аффинностью связывания (K) ≤10 М (например, ≤5×10 М, ≤2×10 М, ≤10 M, ≤5×10 М, ≤2×10 М M, ≤10 M, ≤5×10 М, ≤4×10 М, ≤3×10 М, ≤2×10 М или ≤10 M. Как здесь используется, K относится к отношению скорости диссоциации к скорости ассоциации (k/k), которое можно определить с использованием любого обычного метода, известного в данной области техники, включая, не ограничиваясь этим, метод поверхностного плазмонного резонанса, метод микромасштабного термофореза, метод ВЭЖХ-МС и метод проточной цитометрии (такой как FACS). В некоторых вариантах осуществления значение K можно соответствующим образом определить с использованием метода проточной цитометрии.
[00096] Способность «блокировать связывание» или «конкурировать за один и тот же эпитоп», как здесь используется, относится к способности антитела или антигенсвязывающего фрагмента ингибировать взаимодействие связывания между двумя молекулами (например, человеческим CD19 и анти-CD19-антителом) в любой детектируемой степени. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые блокируют связывание между двумя молекулами, ингибируют связывающее взаимодействие между двумя молекулами, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85% или, по меньшей мере, на 90%. В некоторых вариантах осуществления это ингибирование может составлять более 60%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85% или более 90%.
[00097] Как здесь используется, термин «эпитоп» относится к конкретной группе атомов или аминокислот на антигене, с которыми связывается антитело. Два антитела могут связываться с одним и тем же или тесно связанным эпитопом внутри антигена, если они проявляют конкурентное связывание с антигеном. Например, если антитело или антигенсвязывающий фрагмент блокируют связывание референсного антитела с антигеном (например, CD19 человека/обезьяны) по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере на 75%, при можно считать, что по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 90%, то тогда антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно рассматривать в качестве связывающихся с одним и тем же/тесно связанным эпитопом, что и референсное антитело.
[00098] Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что без чрезмерного экспериментирвоания можно определить, связывается ли человеческое моноклональное антитело с тем же эпитопом, что и антитело по настоящему изобретению (например, мышиные моноклональные антитела WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, и гуманизированные антитела W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S), and W7011-4.155.8-z1-P15) определением того, насколько первое антитело препятствует связыванию второго антитела с полипептидом антигена CD19. Если тестируемое антитело конкурирует с антителом по настоящему изобретению, что показано снижением связывания антитела по настоящему изобретению с полипептидом антигена CD19, то эти два антитела связываются с одним или тесно связанным эпитопом. Или, если связывание тестируемого антитела с полипептидом антигена CD19 было ингибировано антителом по настоящему изобретению, то тогда два антитела связываются с одним или тесно связанным эпитопом.
[00099] Различные символы, используемые в названиях антител, обеспеченных здесь, имеют различное обозначение: «mIgG2» относится к антителу с константной областью мыши изотипа IgG2; «UIgG1» относится к антителу с константной областью человека изотипа IgG1; «K» или «L» относится к антителу с использованием легкой цепи каппа или лямбда.
[000100] «Консервативная замена» по отношению к аминокислотной последовательности относится к замене аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь со сходными физико-химическими свойствами. Например, консервативные замены могут быть сделаны среди аминокислотных остатков с гидрофобными боковыми цепями (например, Met, Ala, Val, Leu и Ile), среди остатков с нейтральными гидрофильными боковыми цепями (например, Cys, Ser, Thr, Asn и Gln), среди остатков с кислотными боковыми цепями (например, Asp, Glu), среди аминокислот с основными боковыми цепями (например, His, Lys и Arg) или среди остатков с ароматическими боковыми цепями (например, Trp, Tyr и Phe). Как известно в данной области, консервативная замена обычно не вызывает значительного изменения конформационной структуры белка и, следовательно, может сохранять биологическую активность белка.
[000101] Как здесь используется, термины «гомолог» и «гомологичный» являются взаимозаменяемыми и относятся к последовательностям нуклеиновой кислоты (или ее комплементарной цепи) или аминокислотным последовательностям, которые имеют идентичность последовательности, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) с другими последовательностями при оптимальном выравнивании.
[000102] «Процент (%) идентичности последовательности» по отношению к аминокислотной последовательности (или последовательности нуклеиновой кислоты) определяется как процент аминокислотных (или нуклеотидных) остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным (или нуклеотидным) остаткам в референсной последовательности, после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения гэпов, для достижения максимального числа идентичных аминокислот (или нуклеотидов). Консервативная замена аминокислотных остатков может рассматриваться или не рассматриваться как идентичные остатки. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной (или нуклеотидной) последовательности может быть проведено, например, с помощью общедоступных инструментов, таких как BLASTN, BLASTp (доступны на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации США (NCBI), см. также, Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (доступен на веб-сайте Европейского института биоинформатики, см. также, Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)), и с использованием программного обеспечения ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут использовать параметры по умолчанию, обеспеченные инструментом, или могут настроить параметры в соответствии с выравниванием, например, выбором подходящего алгоритма.
[000103] Как здесь используется, «эффекторные функции» относятся к биологическим активностям, ассоциированным со связыванием Fc-области антитела с его эффекторами, такими как комплекс С1 и Fc-рецептор. Типичные эффекторные функции включают: комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), индуцированную взаимодействием антител и C1q на комплексе C1; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), индуцированную связыванием Fc-области антитела с Fc-рецептором на эффекторной клетке; и фагоцитоз.
[000104] Как здесь используется, антитело, которое «интернализуется» или «способно к интернализации», представляет собой антитело, которое поглощается клеткой при связывании с ее антигеном на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления антитело и его фрагменты, обеспеченные здесь, могут быть интернализованы, по меньшей мере, до некоторой степени, клетками, которые экспрессируют CD19 на своих поверхностях. Например, в некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитело, обеспеченное здесь, может быть интернализировано клеткой В-клеточной лимфомы при связывании с CD19, экспрессированным на поверхности клетки. Интернализация может происходить in vitro или in vivo. Для терапевтического применения интернализация может происходить in vivo. Насколько интернализуется антитело при связывании с клеткой млекопитающего, можно определить с помощью различных анализов, в том числе описанных в примерах ниже (например, метод Fab-Zap). Методы определения того, интернализуется ли антитело клеткой, также описаны в патенте США № 7619068, который включен здесь посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, способные к интернализации, могут быть связаны или конъюгированы с противоопухолевыми агентами, такими как цитотоксические молекулы, которые индуцируют гибель клетки при интернализации. В зависимости от активности антитела или конъюгата антитела, в некоторых случаях поглощение одной молекулы антитела клеткой является достаточным для индукции гибели клетки-мишени, с которой связывается антитело. Например, некоторые токсины являются высокоэффективными в индукции гибели, так что интернализации одной молекулы токсина, конъюгированного с антителом, достаточна для уничтожения опухолевой клетки.
[000105] Как здесь используется, термины «проводить лечение» или «лечение» патологического состояния включают предупреждение или облегчение состояния, замедление наступления или скорости развития состояния, снижение риска развития состояния, предотвращение или задержку развития симптомов, связанных с состоянием, уменьшением или прекращением симптомов, связанных с состоянием, генерированием полной или частичной регрессии состояния, лечением состояния или некоторой их комбинацией.
[000106] «Выделенное» вещество было изменено рукой человека по сравнению с природным состоянием. Если «выделенная» композиция или вещество встречается в природе, то они были изменены или удалены из своей первоначальной среды, или подвергнуты обоим вариантам. Например, полинуклеотид или полипептид, естественно присутствующий в организме живого животного, не является «выделенным», но тот же полинуклеотид или полипептид является «выделенным», если он был достаточно отделен от сосуществующих веществ в его естественном состоянии, чтобы находиться по существу в чистом состоянии. Термины выделенная «нуклеиновая кислота» или «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к последовательности выделенной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления «выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент» относится к антителу или антигенсвязывающим фрагментам, имеющим чистоту, по меньшей мере, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, как определено электрофоретическими методами (такими как SDS-PAGE, изоэлектрическое фокусирование, капиллярный электрофорез) или хроматографическими методами (такими как ионообменная хроматография или обращенно-фазовая ВЭЖХ).
[000107] Как здесь используется, термин «вектор» относится к носителю, в который может быть операбельно встроен полинуклеотид, кодирующий белок, для обеспечения экспрессии этого белка. Вектор можно использовать для трансформации, трансдукции или трансфекции клетки-хозяина, в целях экспрессии генетического элемента, который он несет, в клетке-хозяине. Примеры векторов включают плазмиды, фагемиды, космиды, искусственные хромосомы, такие как дрожжевая искусственная хромосома (YAC), бактериальная искусственная хромосома (BAC) или искусственная хромосома с элементами плазмиды P1 (PAC), бактериофаги, такие как фаг лямбда или фаг M13, и вирусы животных. Группы вирусов животных, используемых в качестве векторов, включают ретровирус (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса (например, вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, вирус папилломы и паповавирус (например, SV40). Вектор может содержать множество элементов для контроля экспрессии, включая последовательности промотора, последовательности инициации транскрипции, последовательности энхансера, селектируемые элементы и репортерные гены. Кроме того, вектор может содержать ориджин репликации. Вектор может также включать вещества, способствующие его проникновению в клетку, включая, помимо прочего, вирусную частицу, липосому или белковую оболочку. Вектор может быть вектором экспрессии или вектором клонирования. Настоящее раскрытие обеспечивает векторы (например, векторы экспрессии), содержащие обеспеченную здесь последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по меньшей мере, один промотор (например, SV40, CMV, EF-1α), операбельно связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты и, по меньшей мере, один селектируемый маркер. Примеры векторов включают, не ограничиваясь этим, ретровирус (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус (например, вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, папилломавирус, паповавирус (например, SV40), фаг лямбда и фаг M13, плазмиды pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos и т. д.
[000108] Выражение «клетка-хозяин» в контексте настоящего описания относится к клетке, в которую был введен экзогенный полинуклеотид и/или вектор.
[000109] «Связанное с CD19 заболевание или патологическое состояние» в контексте настоящего описания относится к любому заболеванию или состоянию, вызванному, обострившемуся или иным образом связанному с повышенной или пониженной экспрессией или активностями CD19. В некоторых вариантах осуществления патологическое состояние, связанное с CD19, представляет собой В-клеточную лимфому, необязательно лимфому Ходжкина или неходжкинскую лимфому, где неходжкинская лимфома включает: диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, В-клеточную лимфому маргинальной зоны (MZL), лимфому лимфоидной ткани, ассоциированную со слизистой желудка (MALT), малую лимфоцитарную лимфому (хронический лимфолейкоз, CLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или макроглобулинемию Вальденстрема.
[000110] «Рак» в контексте настоящего описания относится к любому медицинскому состоянию, характеризующемуся ростом или новообразованием злокачественных клеток, аномальной пролиферацией, инфильтрацией или метастазированием, и включает как солидные опухоли, так и несолидные раковые заболевания (гематологические злокачественные новообразования), такие как лейкоз. Как здесь используется, термин «солидная опухоль» относится к твердой массе опухолевых и/или злокачественных клеток. Примеры рака включают, не ограничиваясь этим, немелкоклеточный рак легкого (плоскоклеточный/неплоскоклеточный), мелкоклеточный рак легкого, почечно-клеточный рак, колоректальный рак, рак толстой кишки, рак яичника, рак молочной железы (включая базальноклеточную карциному молочной железы, протоковую карциному и лобулярную карциному молочной железы), рак поджелудочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак пищевода, мезотелиому, меланому, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, саркому, рак предстательной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак вилочковой железы, меланому, миеломы, грибовидный микоз, опухоль из клеток Меркеля, гепатоцеллюлярную карциному (HCC), фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому и другие саркомы, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, лимфоидные новообразования, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовой железы, медуллярную карциному щитовидной железы, папиллярную карциному щитовидной железы, феохромоцитомы сальной железы, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, семиному, классическую лимфому Ходжкина (CHL), первичную B-крупноклеточную лимфому средостения, Т-клеточную/богатую гистиоцитами В-клеточную лимфому, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, истинную полицитемию, тучноклеточные опухоли, EBV-позитивные и EBV-негативные PTLD, диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, B-клеточную лимфому маргинальной зоны (MZL), лимфому лимфоидной ткани, ассоциированную со слизистой желудка (MALT), малую лимфоцитарную лимфому (хронический лимфоцитарный лейкоз, CLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), острый лимфобластный лейкоз (ALL), плазмабластическую лимфому, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому, назофарингеальную лимфому, HHV8-ассоциированную первичную эффузионную лимфому, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема (WM), болезнь тяжелых цепей, миелодиспластический синдром, волосатоклеточный лейкоз и миелодисплазию, первичную лимфому ЦНС, опухоль позвоночника, глиому ствола головного мозга, астроцитому, медуллобластому, краниофариогиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, акустическую нейрому, олигодендроглиому, менангиому, меланому, нейробластому и ретинобластому.
[000111] Термин «фармацевтически приемлемый» указывает, что указанный носитель, растворитель, разбавитель, эксципиент(ы) и/ или соль, как правило, химически и/или физически совместимы с другими ингредиентами, входящими в состав, и физиологически совместимы с его реципиентом.
[000112] Анти-CD19-антитела
[000113] Настоящее раскрытие обеспечивает анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) последовательностей CDR анти-CD19-антитела, выбранного из WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S), и W7011-4.155.8-z1-P15. В настоящем описании термин «WBP7011» в отношении названий антител используется взаимозаменяемо с «W7011». Например, антитело WBP7011-4.34.11 также упоминается как W7011-4.34.11, и такие названия относятся к одному и тому же антителу.
[000114] «WBP7011-4.34.11» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 94 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 96.
[000115] «WBP7011-4.87.6» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 98 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 100.
[000116] «WBP7011_4.155.8» в контексте настоящего описания относится к моноклональному антителу мыши, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 102 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 104.
[000117] «WBP7011_4.56.1» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 106 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 96.
[000118] «WBP7011-4.15.10» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 108 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 96.
[000119] «WBP7011-4.100.1» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 110 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 96.
[000120] «WBP7011-4.106.3» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 112 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 96.
[000121] «WBP7011_4.108.3» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 114 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 96.
[000122] «WBP7011_4.191.6» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 116 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 96.
[000123] «WBP7011_4.194.10» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 118 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 120.
[000124] «WBP7011_4.231.5» в контексте настоящего описания относится к мышиному моноклональному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 122 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 96.
[000125] «W7011-4.34.11-z1-m5» в контексте настоящего описания относится к гуманизированному антителу на основе WBP3311_2.166.48, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 124 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 126.
[000126] «W7011-4.87.6-z1 (NS)» в контексте настоящего описания относится к гуманизированному антителу на основе WBP3311_2.166.48, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO 128: и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 130.
[000127] «W7011-4.155.8-z1-P15» в контексте настоящего описания относится к гуманизированному антителу на основе WBP3311_2.166.48, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи с SEQ ID NO: 132 и вариабельную область легкой цепи каппа с SEQ ID NO: 134.
[000128] В таблице 1 приведены последовательности CDR данных 11 мышиных антител против CD19 и трех гуманизированных антител W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1 (NS) и W7011-4.155.8-z1-Р15. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи также представлены ниже.
[000129]
Таблица 1
CDR1
CDR2
CDR3
WBP7011-4.34.11
VH
SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2
SEQ ID NO: 3
GYTFTNYVIH
YFNPYNDGTEYNEKFKA
GPYYYGSSPFDY
WBP7011-4.34.11
VK
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
WBP7011-4.87.6
VH
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 9
GYAFSTYWMN
QIYPGDDDTKYNGKFKG
RYFRYDYWYSDV
WBP7011-4.87.6
VK
SEQ ID NO: 10
SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 12
RASQDISNYLN
YTSRLHS
HQGNTLPLT
WBP7011_4.155.8
VH
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 15
GYAFTSYNMY
YIDPYNGDTTYNQKFKG
TAYAMDY
WBP7011_4.155.8
VK
SEQ ID NO: 16
SEQ ID NO: 17
SEQ ID NO: 18
SASSTVNYMH
STSNLAS
HQWSSYPYT
WBP7011_4.56.1
VH
SEQ ID NO: 19
SEQ ID NO: 20
SEQ ID NO: 21
GYTFTNYVIH
YINPYNDGTEYNEKFKG
GPYYYGGSPFDY
WBP7011_4.56.1
VK
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
WBP7011-4.15.10
VH
SEQ ID NO: 22
SEQ ID NO: 23
SEQ ID NO: 24
GYTFTSYVMH
YINPYNDGTEYHEKFKG
GPYYYGGSPFDF
WBP7011-4.15.10
VK
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
WBP7011-4.100.1
VH
SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 26
SEQ ID NO: 27
GYTFTSYVIH
YINPYNDGAEYTEKFKG
GPYYYGGSPFDY
WBP7011-4.100.1
VK
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
WBP7011-4.106.3
VH
SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 30
GYTFSSYVIH
YINPYNDGAEYAEKFKG
GPYYYGGSPFDY
WBP7011-4.106.3
VK
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
WBP7011_4.108.3
VH
SEQ ID NO: 31
SEQ ID NO: 32
SEQ ID NO: 33
GYTFTSYVIH
YINPYNDGAEYNEKFKG
GPYYYGSSPFDY
WBP7011_4.108.3
VK
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
WBP7011_4.191.6
VH
SEQ ID NO: 34
SEQ ID NO: 35
SEQ ID NO: 36
GYTFTDYVIH
YINPYNDGSEYSEKFKG
GPYYYGGSPFDY
WBP7011_4.191.6
VK
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
WBP7011_4.194.10
VH
SEQ ID NO: 37
SEQ ID NO: 38
SEQ ID NO: 39
GYTFTSYVMH
YINPYNDGTKYNEKFKG
GPYYYGSSPFDY
WBP7011_4.194.10
VK
SEQ ID NO: 40
SEQ ID NO: 41
SEQ ID NO: 42
RSSQTLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
WBP7011_4.231.5
VH
SEQ ID NO: 43
SEQ ID NO: 44
SEQ ID NO: 45
GYTFTSYVMH
YINPYNDGTQYNEKFKG
GPYYYSPSPFDY
WBP7011_4.231.5
VK
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
W7011-4.34.11-z1-m5
VH
SEQ ID NO: 136
SEQ ID NO: 2
SEQ ID NO: 3
GYTFTDYVIH
YFNPYNDGTEYNEKFKA
GPYYYGSSPFDY
W7011-4.34.11-z1-m5
VK
SEQ ID NO: 137
SEQ ID NO: 138
SEQ ID NO: 139
RSSQSLENSNHNTYIN
RVSKRFS
HQVTHVPYT
W7011-4.87.6-z1(N-S)
VH
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 140
SEQ ID NO: 9
GYAFSTYWMN
QIYPGDDDTKYSGKFKG
RYFRYDYWYSDV
W7011-4.87.6-z1(N-S)
VK
SEQ ID NO: 10
SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 12
RASQDISNYLN
YTSRLHS
HQGNTLPLT
W7011-4.155.8-z1-P15
VH
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 141
SEQ ID NO: 15
GYAFTSYNMY
YIDPYNADTTYNQKFKG
TAYAMDY
W7011-4.155.8-z1-P15
VK
SEQ ID NO: 16
SEQ ID NO: 17
SEQ ID NO: 18
SASSTVNYMH
STSNLAS
HQWSSYPYT
[000130] Последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи каппа антител WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, или WBP7011_4.231.5, и гуманизированные W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S) и W7011-4.155.8-z1-P15 представлены ниже.
[000131] WBP7011-4.34.11-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 94):
GYTFTNYVIH
YFNPYNDGTEYNEKFKA
GPYYYGSSPFDY
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASWVKQKPGQGLEWIGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 95):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAACTATGTTATTCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATTTTAATCCTTACAATGATGGTACTGAATACAATGAGAAGTTCAAAGCCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAAAGGTCCCTACTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[000132] WBP7011-4.34.11-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 96):
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCFGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000133] WBP7011-4.87.6-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 98):
GYAFSTYWMN
QIYPGDDDTKYNGKFKG
RYFRYDYWYSDV
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASWVKQRPGQGLEWIGKASLTADKSSSTAYMQLISLTSEDSAVYFCARWGAGTTVTVTS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 99):
CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTACCTATTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGATGATACTAAGTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCTCACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACCGCCTACATGCAGCTCATCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAAGATACTTTAGGTACGACTACTGGTATTCCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCACCTCA
[000134] WBP7011-4.87.6-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 100):
RASQDISNYLN
YTSRLHS
HQGNTLPLT
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCWYQQKPDGTVKLLIYGVPARFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCFGAGTKLELK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 101):
GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCGGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCAGCAAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTACTCTCTCACCATTAGTAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCACCAGGGTAATACGCTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
[000135] WBP7011-4.155.8-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 102):
GYAFTSYNMY
YIDPYNGDTTYNQKFKG
TAYAMDY
EIQLQQSGPELVKPGASVKVSCKASWVKQSHGKSLEWIGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCLTWGQGTSVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 103):
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTATGCATTCACTAGCTACAACATGTACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTGATCCTTACAATGGTGATACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGCATCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTCTCACTACGGCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
[000136] WBP7011-4.155.8-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 104):
SASSTVNYMH
STSNLAS
HQWSSYPYT
QIVLTQSPAIMSASLGEEITLTCWYQQKSGTSPKLLIYGVPSRFSGSGSGTFYSLTIRSVEAEDAADYYCFGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 105):
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGGAGATCACCCTAACCTGCAGTGCCAGCTCGACTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACTTCTCCCAAACTCTTGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTTTTATTCTCTCACAATCAGAAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCGATTATTACTGCCATCAGTGGAGTAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000137] WBP7011_4.56.1-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 106):
GYTFTNYVIH
YINPYNDGTEYNEKFKG
GPYYYGGSPFDY
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASWVKQKPGQGLEWIGKATLTSDTSSSTAYMALSSLTSEDSAVYYCTRWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 107):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAACTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTGAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGGCGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[000138] WBP7011_4.56.1-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 96):
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYTF
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000139] WBP7011_4.15.10-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 108):
GYTFTSYVMH
YINPYNDGTEYHEKFKG
GPYYYGGSPFDF
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASWMKQKPGQGLEWIGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVFYCARWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 109):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGATGAAACAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTGAGTACCATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTTTTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACGGTCTCCTCA
[000140] WBP7011_4.15.10-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 96):
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYTF
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000141] WBP7011_4.100.1-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 110):
GYTFTSYVIH
YINPYNDGAEYTEKFKG
GPYYYGGSPFDY
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASWVKQKPGQGLEWIGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSTVYYCARWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 111):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTACACTGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTACTGCCTATATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTACGGTCTATTACTGTGCACGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[000142] WBP7011_4.100.1-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 96):
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYTF
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000143] WBP7011_4.106.3-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 112):
GYTFSSYVIH
YINPYNDGAEYAEKFKG
GPYYYGGSPFDY
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASWVKQKPGQGLEWIGKATLTSDKSSSSAYMELGSLTSEDSAVYYCARWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 113):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCAGTAGTTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTATGCTGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTTCTGCCTATATGGAGCTCGGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCACGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[000144] WBP7011_4.106.3-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 96):
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYTF
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000145] WBP7011_4.108.3-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 114):
GYTFTSYVIH
YINPYNDGAEYNEKFKG
GPYYYGSSPFDY
EVQLQQSGPELVKPGASVEMSCKASWLKQKPGQGLEWIGKATLTSDKSSSTAYMDLNSLTSEDSAVYYCARWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 115):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGGAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATTCACTGGTTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTGCTGAGTATAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTATATGGATCTCAACAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[000146] WBP7011_4.108.3-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 96):
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYTF
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000147] WBP7011_4.191.6-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 116):
GYTFTDYVIH
YINPYNDGSEYSEKFKG
GPYYYGGSPFDY
EVQLLQSGPELVKPGASVKMSCKASWVKQRPGQGLEWIGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 117):
GAGGTCCAGCTGCTGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTATGTTATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTTCTGAGTACAGTGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACGGTGGTAGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[000148] WBP7011_4.191.6-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 96):
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYTF
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000149] WBP7011_4.194.10-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 118):
GYTFTSYVMH
YINPYNDGTKYNEKFKG
GPYYYGSSPFDY
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASWVKQKPGQGLEWIGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 119):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACGGTAGTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[000150] WBP7011_4.194.10-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 120):
RSSQTLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYT
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCFGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 121):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGACCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTAGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGACTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGCCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000151] WBP7011_4.231.5-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 122):
GYTFTSYVMH
YINPYNDGTQYNEKFKG
GPYYYSPSPFDY
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASWVKQKPGQGLEWIGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARWGQGTTLTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 123):
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTCATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTACTCAGTACAATGAGAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGACCCTATTACTACAGTCCTAGCCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
[000152] WBP7011_4.231.5-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 96):
RSSQSLENSNGNTYLN
RVSNRFS
LQVTHVPYTF
DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCGGGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 97):
GATGCTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTTGAAAACAGTAATGGAAACACCTATTTGAACTGGTACCTCCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAGGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCTTGACAGGTTCAGTGGTAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTCTGTCTCCAAGTTACACATGTCCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
[000153] Известно, что CDR ответственны за связывание антигена, однако было обнаружено, что не все из 6 CDR являются необходимыми или неизменяемыми. Другими словами, можно заменять или изменять или модифицировать 1, 2 или 3 CDR в анти-CD19-антителах WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z, W7011-4.87.6-z или W7011-4.155.8-z1-P15, по-прежнему сохраняя специфическую аффинность связывания с CD19.
[000154] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, содержат последовательность CDR3 тяжелой цепи одного из анти-CD19-антител WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S) или W7011-4.155.8-z1-P15. В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, содержат последовательность CDR3 тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39 и 45. Участки CDR3 тяжелой цепи расположены в центре антигенсвязывающего сайта, и поэтому считается, что они в наибольшей степени контактируют с антигеном и обеспечивают наибольшую свободную энергию для обеспечения аффинности антитела к антигену. Также считается, что CDR3 тяжелой цепи является самым вариабельным CDR антигенсвязывающего сайта с точки зрения длины, аминокислотного состава и конформации за счет механизмов множественной диверсификации (Tonegawa S., Nature. 302: 575-81). Разнообразие в CDR3 тяжелой цепи является достаточным для получения большей части специфичностей антител (Xu J.L., Davis M.M. Immunity, 13: 37-45), а также желаемой антигенсвязывающей аффинности (Schier R. et al., J. Mol. Biol., 263: 551-67).
[000155] В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, содержат подходящие последовательности каркасной области (FR), при условии, что антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут специфически связываться с CD19. Последовательности CDR, представленные в таблице 1, получены из мышиных антител, но они могут быть привиты к любым подходящим последовательностям FR любых подходящих видов, таких как мышь, человек, крыса, кролик, среди прочих, с использованием подходящих способов, известных в данной области, таких как рекомбинантный методы.
[000156] В определенных вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, являются гуманизированными. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент желательны за счет своей низкой иммуногенности у человека. Гуманизированное антитело является химерным по своим вариабельным областям, поскольку «нечеловеческие» последовательности CDR привиты к человеческим или по существу человеческим последовательностям FR. Гуманизация антитела или антигенсвязывающего фрагмента может быть, частности, осуществлена заменой генов CDR «нечеловеческого» происхождения (таких как мышиные) на соответствующие гены CDR человека в гене человеческого иммуноглобулина (см., например, Jones et al. (1986) Nature, 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature, 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science, 239: 1534-1536).
[000157] Подходящие вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи человека могут быть выбраны для достижения данной цели с использованием способов, известных в данной области. В иллюстративном примере можно использовать подход «наилучшей подгонки», когда последовательность вариабельной области антитела человека (например, грызуна) подвергается скринингу или анализу BLAST против базы данных известных последовательностей вариабельной области человека, и идентифицируется последовательность человека, ближайшая к запрашиваемой последовательности, не относящейся к человеческой, и используется в качестве человеческого каркаса для прививки последовательностей CDR, отличных от человеческих (см., например, Sims et al. (1993) J. Immunol., 151: 2296; Chothia et al. (1987) J. Mot. Biol., 196: 901). Альтернативно, каркас, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител, может быть использован для прививки «нечеловеческих» CDR (см., например, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151: 2623).
[000158] В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, по существу состоят из всех последовательностей человека, за исключением последовательностей CDR, которые не являются человеческими. В некоторых вариантах осуществления FR вариабельной области и константные области, если они присутствуют, полностью или по существу являются последовательностями человеческого иммуноглобулина. Последовательности FR человека и последовательности константной области человека могут быть получены из различных генов иммуноглобулина человека, например, последовательности FR, полученные из одного антитела человека, и константные области из другого антитела человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую/легкую цепь FR1-4 человека.
[000159] В определенных вариантах осуществления гуманизированные антитела и их антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченные здесь, содержат одну или несколько последовательностей FR W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(NS) или W7011-4.155.8-z1-Р15. В приведенной ниже таблице 2 представлены последовательности FR W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S) или W7011-4.155.8-z1-P15. Соответствующие нативные мышиные последовательности FR также приведены в таблице 2. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи также представлены ниже.
[000160] W7011-4.34.11-z1-m5-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 124):
GYTFTDYVIH
YFNPYNDGTEYNEKFKA
GPYYYGSSPFDY
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASWVRQAPGQGLEWMGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGQGTTVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 125):
CAGGTGCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAAGTGAAGAAGCCAGGATCCTCCGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCGATTACGTGATCCACTGGGTCAGGCAGGCCCCTGGGCAAGGCTTGGAGTGGATGGGGTACTTTAACCCCTACAACGATGGGACTGAGTACAATGAGAAGTTTAAAGCACGGGTGACCATTACCGCCGACAAGAGCACAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTCCGCAGCGAGGATACAGCCGTCTACTACTGCGCCAGAGGCCCTTACTACTATGGGTCCAGCCCCTTCGACTATTGGGGCCAGGGGACTACAGTGACTGTCAGTTCA
[000161] W7011-4.34.11-z1-m5-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 126):
RSSQSLENSNHNTYIN
RVSKRFS
HQVTHVPYT
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCWYLQKPGQSPQLLIYGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFGQGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 127):
GATATCGTGATGACCCAGACTCCCCTGTCCCTTCCTGTGACCCCAGGAGAACCAGCTTCTATCAGCTGTAGGTCCTCACAGAGCCTGGAGAACTCCAACCACAACACCTACATAAACTGGTACCTCCAGAAGCCTGGGCAGTCTCCCCAGTTGCTGATCTACAGGGTCAGCAAACGCTTCTCCGGGGTGCCCGATCGGTTTAGTGGGAGCGGGAGCGGCACAGACTTTACACTCAAGATTTCCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTCGGCGTCTATTACTGCCACCAAGTGACACACGTGCCCTACACATTCGGCCAGGGCACTAAACTGGAGATTAAG
[000162] W7011-4.87.6-z1(N-S)-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 128):
GYAFSTYWMN
QIYPGDDDTKYSGKFKG
RYFRYDYWYSDV
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASWVRQAPGQGLEWMGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGQGTTVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 129):
CAGGTCCAGCTTGTCCAGTCTGGAGCAGAAGTGAAGAAGCCAGGGGCTTCAGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCTTCCGGATACGCCTTCTCCACTTACTGGATGAACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGGCAGGGCTTGGAGTGGATGGGCCAGATCTATCCCGGCGATGACGACACAAAATACAGCGGGAAGTTCAAGGGGCGGGTGACCATTACCGCCGATAAAAGCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTCAGTTCCCTGAGAAGCGAGGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGGAGGTACTTTCGGTACGACTACTGGTATAGCGACGTCTGGGGGCAAGGCACAACTGTCACAGTGAGCAGC
[000163] W7011-4.87.6-z1(N-S)-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 130):
RASQDISNYLN
YTSRLHS
HQGNTLPLT
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWYQQKPGKVPKLLIYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCFGQGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 131):
GACATCCAAATGACCCAGAGCCCTTCCTCCTTGTCCGCAAGTGTGGGAGATAGAGTGACCATCACCTGCAGGGCTTCTCAGGATATCTCCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGTGCCAAAGCTCCTTATTTACTACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTCCCATCTCGCTTCAGCGGGTCAGGCAGCGGCACTGACTTTACTCTGACAATTAGCAGCCTCCAGCCTGAAGACGTCGCCACTTACTACTGTCATCAGGGGAATACACTCCCCCTGACATTCGGGCAGGGGACAAAACTGGAGATTAAG
[000164] W7011-4.155.8-z1-P15-VH
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 132):
GYAFTSYNMY
YIDPYNADTTYNQKFKG
TAYAMDY
QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASWVRQARGQRLEWIGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCLTWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 133):
CAAATGCAGCTCGTCCAGTCTGGACCTGAAGTGAAGAAGCCCGGGACATCCGTCAAGGTCTCATGTAAGGCTAGCGGGTACGCATTCACTTCCTACAACATGTACTGGGTGCGCCAGGCCAGAGGACAGAGGTTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCATACAACGCCGATACTACCTACAATCAGAAGTTTAAAGGGCGGGTGACCATTACCCGGGATATGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCCTGACAACAGCCTATGCCATGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTTGTGACTGTGAGCAGT
[000165] W7011-4.155.8-z1-P15-VK
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 134):
SASSTVNYMH
STSNLAS
HQWSSYPYT
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCWYQQKPGKAPKLLIYGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCFGQGTKLEIK
Последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 135):
GACATCCAGCTCACCCAATCCCCTTCTTTCCTCTCCGCAAGTGTCGGAGATAGGGTGACTATCACCTGCTCAGCTTCTTCAACCGTGAACTACATGCATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGGAAAGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCACCTCCAATCTGGCCAGTGGAGTGCCAAGCCGGTTTAGCGGGAGCGGCTCCGGCACTGAATTCACTTTGACAATTAGCAGCCTTCAGCCTGAGGACTTTGCCACATATTACTGTCACCAGTGGTCCAGCTACCCCTACACATTCGGGCAGGGCACAAAGCTGGAGATTAAG.
[000166] Типичные гуманизированные анти-CD19-антитела W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1 (NS) или W7011-4.155.8-z1-P15 все сохраняли специфическую аффинность связывания с CD3-экспрессирующей клеткой (например, CD4 T-клеткой) и, по меньшей мере, были сопоставимы или даже лучше, чем родительские мышиные антитела в таком аспекте.
[000167] В некоторых вариантах осуществления области FR, полученные от человека, могут содержать ту же аминокислотную последовательность, что и иммуноглобулин человека, из которого она получена. В некоторых вариантах осуществления один или более аминокислотных остатков человеческой FR замещены соответствующими остатками из родительского «нечеловеческого» антитела. Это может быть желательно в определенных вариантах осуществления, чтобы гуманизированное антитело или его фрагмент близко приближались к структуре родительского антитела, отличного от человеческого. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченные здесь, содержат не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен аминокислотных остатков в каждой из последовательностей FR человека, или не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен аминокислотных остатков во всех FR вариабельной области тяжелой или легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления такое изменение в аминокислотном остатке может иметь место только в областях FR тяжелой цепи, только в областях FR легкой цепи или в обеих цепях.
[000168] В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132. В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134.
[000169] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, включают всю или часть вариабельной области тяжелой цепи и/или всю или часть вариабельной области легкой цепи. В одном варианте осуществления анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, представляют собой однодоменное антитело, которое состоит из всей или части вариабельной области тяжелой цепи, обеспеченной здесь. Больше информации о таком однодоменном антителе доступно в данной области (см., например, патент США № 6248516).
[000170] В определенных вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их фрагменты, обеспеченные здесь, дополнительно содержат константную область иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления константная область иммуноглобулина содержит константную область тяжелой цепи и/или легкой цепи. Константная область тяжелой цепи включает области CH1, шарнирную область и/или участки CH2-CH3. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи содержит Fc-область. В некоторых вариантах осуществления константная область легкой цепи содержит Cκ.
[000171] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты имеют константную область иммуноглобулина изотипа IgG1, IgG2a или IgG2b, которая обладает пониженной или истощенной эффекторной функцией, такой как ADCC или CDC, что можно оценить с помощью различных анализов, известных в данной области техники, например, анализом связывания с Fc-рецептором, анализом связывания с C1q и анализом лизиса клеток.
D
off
on
D
D
D
max
[000172] Аффинность связывания антитела и антигенсвязывающего фрагмента, обеспеченных здесь, может выражаться значением K, которое представляет отношение скорости диссоциации к скорости ассоциации (k/k), когда связывание между антигеном и антигенсвязывающей молекулой достигает равновесия. Антигенсвязывающую аффинность (например, K) можно соответствующим образом определить, используя подходящие способы, известные в данной области, включая, например, анализ с помощью проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления связывание антитела с антигеном в различных концентрациях можно определить с помощью проточной цитометрии, где определенная средняя интенсивность флуоресценции (MFI) может быть сначала нанесена на график зависимости от концентрации антитела, затем значение K можно рассчитать подгонкой зависимости интенсивности флуоресценции специфического связывания (Y) и концентрации антител (X) в уравнении насыщения одного сайта: Y=Bmax×X/(K+X) (анализ Скэтчарда) с использованием Prism версии 5 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния), где B относится к максимальному специфическому связыванию тестируемого антитела с антигеном.
[000173] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, способны специфически связываться с CD19 человека/обезьяны Cynomolgus, экспрессированным на поверхности клетки естественным или искусственным путем. Например, последовательность ДНК CD19 человека/обезьяны Cynomolgus можно клонировать в вектор экспрессии, и затем трансфектировать и экспрессировать в клетках 293F, так что белок CD19 человека/обезьяны Cynomolgus может экспрессироваться на поверхности трансфектированных клеток 293F.
D
-9
-9
-10
-10
-10
-10
-10
-10
-10
-10
-10
[000174] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, способны специфически связываться с человеческим CD19, экспрессированным на поверхности клеток с аффинностью связывания (K) не выше 5×10 M, не выше 1×10 M, не выше 9×10 M, не выше 8×10 M, не выше 7×10 M, не выше 6×10 M, не выше 5×10 M, не выше 4×10 M, не выше 3×10 M, не выше 2×10 M или не выше 1×10 M, как измерено методом проточной цитометрии.
[000175] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, перекрестно реагируют с CD19 обезьяны Cynomolgus, экспрессированным на клеточной поверхности.
50
50
50
[000176] Связывание антител с CD19, экспрессированным на клетке, также может быть представлено значением «половинной максимальной эффективной концентрацией» (ЕС), которое относится к концентрации антитела, при которой наблюдается 50% его максимального эффекта (например, связывания или ингибирования и т.д.). Значение ЕС можно определить методами, известными в данной области, например, сэндвич-анализом, таким как ELISA, вестерн-блот, анализ с помощью проточной цитометрии и другой анализ связывания. В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты, обеспеченные здесь, специфически связываются с человеческим CD19, экспрессированным на клетке с ЕС не более 0,01 нМ, не более 0,02 нМ, не более 0,03 нМ, не более 0,04 нМ, нет более 0,05 нМ, не более 0,1 нМ, не более 0,2 нМ, не более 0,3 нМ, не более 0,4 нМ, не более 0,5 нМ, не более 0,6 нМ, не более 0,7 нМ, не более 0,8 нМ, не более 0,9 нМ или не более 1 нМ согласно данным проточной цитометрии.
50
[000177] В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты связываются с CD19 обезьяны Cynomolgus с аффинностью связывания, сходной с аффинностью связывания с человеческим CD19. Например, связывание примерных антител WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP701.1014 WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.225.7 или WBP7011_4.231.5 с CD19 обезьяны Cynomolgus имеет сходную аффинность или значение EC со значением аффинности с человеческим CD19.
50
[000178] В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, специфически связываются с CD19 обезьяны Cynomolgus, экспрессированным на клетке, с EC не более 0,2 нМ, не более 0,5 нМ, не более 0,8 нМ, не более 1 нМ, не более 2 нМ или не более 3 нМ по данным проточной цитометрии.
50
[000179] В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты, обеспеченные здесь, интернализуются клеткой, экспрессирующей CD19, с ЕС не более 1 пМ, не более 2 пМ, не более 3 пМ, не более 4 пМ не более 5 пМ, не более 6 пМ, не более 7 пМ, не более 8 пМ, не более 9 пМ, не более 10 пМ, не более 11 пМ, не более 12 пМ, не более 13 пМ, не более 14 пМ, не более 15 пМ, не более 16 пМ, не более 17 пМ, не более 18 пМ, не более 19 пМ, не более 20 пМ, не более 21 пМ, не более 22 пМ, не более 23 пМ, не более 24 пМ, не более 25 пМ, не более 30 пМ, не более 35 пМ, не более 40 пМ, не более 45 пМ или не более 50 пМ по данным анализа Fab-Zap.
[000180] В определенных вариантах осуществления антитела и их фрагменты, обеспеченные здесь, обладают специфической аффинностью связывания с человеческим CD19, которая достаточна для обеспечения диагностического и/или терапевтического применения. В ряде терапевтических стратегий, основанных на нацеливании на В-клетки, клинически применяют моноклональные антитела против CD19 человека.
[000181] Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, могут представлять моноклональное антитело, поликлональное антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, рекомбинантное антитело, биспецифическое антитело, меченое антитело, бивалентное антитело или антиидиотипическое антитело. Рекомбинантное антитело представляет собой антитело, полученное in vitro с использованием рекомбинантных методов, а не на животных.
[000182] Варианты антител
[000183] Настоящее раскрытие также включает различные типы вариантов антител и их антигенсвязывающих фрагментов, обеспеченных здесь. В определенных вариантах осуществления настоящее раскрытие включает варианты примерного антитела, обеспеченного здесь, т. е. WBP7011-4.34.11, WBP7011-4.87.6, WBP7011_4.155.8, WBP7011_4.56.1, WBP7011-4.15.10, WBP7011-4.100.1, WBP7011-4.106.3, WBP7011_4.108.3, WBP7011_4.191.6, WBP7011_4.194.10, WBP7011_4.231.5, W7011-4.34.11-z1-m5, W7011-4.87.6-z1(N-S) или W7011-4.155.8-z1-P15.
[000184] В некоторых вариантах осуществления варианты антител включают одну или более модификаций или замен в 1, 2 или 3 последовательностях CDR, представленных в таблице 1, одну или более последовательностей FR, представленных в таблице 2, последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи, обеспеченные здесь, и/или константной области (например, Fc-области). Такие варианты антител сохраняют специфическую аффинность связывания с CD19 их родительских антител, но обладают одним или более желательными свойствами, обусловленными модификацией(ями) или заменой(ами). Например, варианты антител могут иметь повышенную антигенсвязывающую аффинность, улучшенный паттерн гликозилирования, сниженный риск гликозилирования, пониженное дезаминирование, пониженную или истощенную эффекторную функцию(и), улучшенное связывание с FcRn-рецептором, увеличенный фармакокинетический период полувыведения, чувствительность к pH и/или совместимость с конъюгацией (например, один или более введенных остатков цистеина).
[000185] Последовательность родительского антитела может быть подвергнута скринингу для идентификации подходящих или предпочтительных остатков, которые должны быть модифицированы или замещены, с использованием методов, известных в данной области техники, например «сканирующий аланиновый мутагенез» (см., например, Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085). Вкратце, целевые остатки (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) можно идентифицировать и заменить нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), и модифицированные антитела продуцируют и скринируют на представляющее интерес свойство. Если замена в определенном аминокислотном положении демонстрирует интересующее функциональное изменение, то положение может быть идентифицировано в качестве потенциального остатка для модификации или замещения. Потенциальные остатки можно дополнительно оценить посредством замены остатка другого типа (например, остатка цистеина, положительно заряженного остатка и т.д.).
[000186] Аффинный вариант
[000187] Аффинный вариант может содержать модификации или замены в одной или более последовательностях CDR, представленных в таблице 1, одной или более последовательностях FR, представленных в таблице 2, или последовательностях вариабельной области тяжелой или легкой цепи, обеспеченных здесь. Аффинные варианты сохраняют специфическую аффинность связывания с CD19 родительского антитела или даже имеют повышенную аффинность связывания с CD19 по сравнению с родительским антителом. В определенных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна (или все) замена(ы) в последовательностях CDR, FR-последовательностях или последовательностях вариабельных областей содержит консервативную замену.
[000188] Специалист в данной области понимает, что в последовательностях CDR и последовательностях FR, представленных в таблице 1 и таблице 2, один или более аминокислотных остатков могут быть замещены, но полученное антитело или антигенсвязывающий фрагмент все еще сохраняют аффинность связывания с CD19, или даже имеют повышенную аффинность связывания. Для достижения этой цели можно использовать различные способы, известные в данной области. Например, можно создать библиотеку вариантов антител (таких как варианты Fab или scFv) и экспрессировать с помощью технологии фагового дисплея, и затем подвергнуть скринингу на аффинность связывания с человеческим CD19. В еще одном примере компьютерное программное обеспечение можно использовать для виртуальной имитации связывания антител с CD19 человека и определения аминокислотных остатков в антителах, которые образуют поверхность связывания. Таких остатков можно либо избежать при замене, чтобы предотвратить снижение аффинности связывания, либо нацелить на замену, чтобы обеспечить более сильное связывание.
[000189] В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченные здесь, содержат одну или более замен аминокислотных остатков в одной или нескольких последовательностях CDR и/или одной или нескольких последовательностях FR. В некоторых вариантах осуществления аффинный вариант содержит не более 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен в последовательностях CDR и/ или последовательностях FR.
[000190] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты содержат 1, 2 или 3 последовательности CDR, имеющие, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичность последовательности с той (или теми) последовательностью, приведенной в таблице 1, и в то же время сохраняют аффинность связывания с CD19 на уровне, аналогичном или даже выше, чем его родительское антитело.
[000191] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты содержат одну или более последовательностей FR, имеющих, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичность последовательности с той (или теми), которые приведены в таблице 2, и в то же время сохраняют аффинность связывания с CD19 на уровне, аналогичном или даже выше, чем его родительское антитело.
[000192] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты содержат одну или более последовательностей вариабельных областей, имеющих, по меньшей мере, 80% (например, по меньшей мере, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичность последовательности с той (или теми), которые показаны в SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130 SEQ ID NO: 134, и в тоже время сохраняют аффинность связывания с CD19 на уровне, аналогичном или даже более высоком, чем у его исходного антитела. В некоторых вариантах осуществления в целом 1-10 аминокислот были замещены, вставлены или делецированы в последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130 и SEQ ID NO: 134. В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции имеют место в областях за пределами CDR (т. е. в FR).
[000193] Вариант по гликозилированию
[000194] Анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, также включают вариант по гликозилированию, который может быть получен для повышения или снижения степени гликозилирования антитела или антигенсвязывающего фрагмента.
[000195] Анти-CD19-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать один или более аминокислотных остатков с боковой цепью, к которой может быть присоединен углеводный фрагмент (например, олигосахаридная структура). Гликозилирование антител обычно является либо N-связанным, либо O-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина, например остатка аспарагина в трипептидной последовательности, такой как аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х представляет собой любую аминокислоту кроме пролина. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров: N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего к серину или треонину. Удаление нативного сайта гликозилирования можно удобно осуществить, например, изменением аминокислотной последовательности так, что одна из вышеуказанных трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования) или сериновые или треониновые остатки (для сайтов O-связанного гликозилирования), присутствующих в последовательности подвергаются замещению. Новый сайт гликозилирования может быть создан аналогичным образом введением такой трипептидной последовательности или остатка серина или треонина.
[000196] Вариант, сконструированный с введением цистеина
[000197] Анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, также включают вариант, сконструированный с введением цистеина, который содержит один или более введенных свободных аминокислотных остатков цистеина.
[000198] Свободный остаток цистеина представляет остаток, который не является частью дисульфидного мостика. Вариант, сконструированный с введением цистеина, пригоден для конъюгации, например, с цитотоксическим и/или визуализирующим агентом, меткой или радиоизоптипом среди прочего, в сайте введенного цистеина, например, через группу, такую как малеимид или галоацетил. Способы конструирования антител или антигенсвязывающих фрагментов с введением свободных остатков цистеина известны в данной области, см., например, WO 2006/034488.
[000199] Fc-вариант
[000200] Анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, также охватывают Fc-вариант, который включает одну или более модификаций или замен аминокислотных остатков в их Fc-области и/или шарнирной области.
[000201] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат одну или более аминокислотных замен, которые повышают рН-зависимое связывание с неонатальным Fc-рецептором (FcRn). Такой вариант может иметь увеличенный фармакокинетический период полувыведения, поскольку он связывается с FcRn при кислом pH, что позволяет ему избежать деградации в лизосоме, и затем транслоцироваться и высвобождаться из клетки. Способы конструирования антитела и его антигенсвязывающего фрагмента с целью улучшения аффинности связывания с FcRn хорошо известны в данной области, см., например, Vaughn, D. et al., Structure, 6(1): 63-73, 1998; Kontermann, R. et al., Antibody Engineering, Volume 1, Chapter 27: Engineering of the Fc region for improved PK, опубликованный Springer, 2010; Yeung, Y. et al., Cancer Research, 70: 3269-3277 (2010); и Hinton, P. et al., J. Immunology, 176:346-356 (2006).
[000202] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат одну или более аминокислотных замен, которые изменяют антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Определенные аминокислотные остатки в домене CH2 Fc-области могут быть заменены для обеспечения повышенной активности ADCC. Альтернативно или дополнительно, углеводные структуры антитела могут быть изменены для усиления активности ADCC. Способы изменения активности ADCC с помощью конструирования антител были описаны в данной области, см., например, Shields RL. et al., J Biol Chem. 2001. 276(9): 6591-604; Idusogie EE. et al., J Immunol., 2000.164(8):4178-84; Steurer W. et al., J Immunol., 1995, 155(3): 1165- 74; Idusogie EE. et al., J Immunol. 2001, 166(4): 2571-5; Lazar GA. et al., PNAS, 2006, 103(11): 4005-4010; Ryan MC. et al., Mol. Cancer Ther., 2007, 6: 3009-3018; Richards JO,. et al., Mol Cancer Ther. 2008, 7(8): 2517-27; Shields R. L. et al, J. Biol. Chem, 2002, 277: 26733-26740; Shinkawa T. et al, J. Biol. Chem, 2003, 278: 3466-3473.
[000203] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат одну или более аминокислотных замен, которые изменяют комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), например, посредством повышения или снижения связывания с C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (см., например, WO99/51642; Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821; и WO94/29351, касающиеся других примеров вариантов Fc-области.
[000204] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела или антигенсвязывающие фрагменты содержат одну или более аминокислотных замен на границе Fc-области для облегчения и/или стимуляции гетеродимеризации. Такие модификации включают введение выступа в первый полипептид Fc и полости во второй полипептид Fc, при этом выступ может располагаться в полости таким образом, чтобы способствовать взаимодействию первого и второго полипептидов Fc с образованием гетеродимера или комплекса. Способы получения антител с такими модификациями известны в данной области, например, как описано в патенте США № 5731168.
[000205] Антигенсвязывающие фрагменты
[000206] Также обеспечиваются антигенсвязывающие фрагменты против CD19. Различные типы антигенсвязывающих фрагментов известны в данной области, и их можно разработать на основе антител против CD19, обеспеченных здесь, включая, например, типичные антитела, последовательности CDR и FR которых показаны в таблицах 1 и 2, и их различные варианты (такие как аффинные варианты, варианты по гликозилированию, Fc-варианты, варианты, сконструированные с введением цистеина и так далее).
2
2
[000207] В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент против CD19, обеспеченный здесь, представляет собой верблюжье однодоменное антитело, диатело, одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), димер scFv, BsFv, dsFv, (dsFv), dsFv-dsFv', Fv-фрагмент, Fab, Fab, F(ab'), биспецифическое антитело, ds диатело, нанотело, доменное антитело, однодоменное антитело или бивалентное доменное антитело.
2
[000208] Для получения таких антигенсвязывающих фрагментов можно использовать различные методики. Иллюстративные методы включают ферментативное расщепление интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)), рекомбинантную экспрессию клеток-хозяев, таких как E.coli (например, для фрагментов Fab, Fv и scFv антител), скрининг библиотеки фагового дисплея, как обсуждалось выше (например, для scFv), и химическое связывание двух фрагментов Fab'-SH с образованием фрагментов F(ab') (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Другие методы получения фрагментов антител известны специалистам в данной области.
[000209] В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент представляет собой scFv. Получение scFv описано, например, в WO 93/16185; патентах США № 5571894 и 5587458. scFv может быть слит с эффекторным белком на амино- или карбоксиконце с обеспечением слитого белка (см., например, Antibody Engineering, ed. Borrebaeck).
[000210] Анти-CD19-антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, могут представлять моноклональное антитело, поликлональное антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, рекомбинантное антитело, биспецифическое антитело, меченое антитело, бивалентное антитело или антиидиотипическое антитело. Рекомбинантное антитело представляет антитело, полученное in vitro с использованием рекомбинантных методов, а не на животных.
[000211] В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно использовать в качестве основы для биспецифических или мультивалентных антител или конъюгатов антитело-лекарственное средство.
[000212] Биспецифические антитела, мультивалентные антитела
[000213] В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, являются бивалентными, четырехвалентными, шестивалентными или мультивалентными. В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, являются моноспецифическими или биспецифическими.
[000214] Как здесь используется, термин «валентность» относится к наличию определенного количества сайтов связывания антигена в данной молекуле. Как таковые, термины «бивалентная», «четырехвалентная» и «шестивалентная» молекула обозначают наличие двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания соответственно, в одной антигенсвязывающей молекуле. Бивалентная молекула может быть моноспецифической, если оба сайта связывания предназначены для специфического связывания одного и того же антигена или одного и того же эпитопа. Аналогично, трехвалентная молекула может быть биспецифической, например, когда два сайта связывания являются моноспецифическими для первого антигена (или эпитопа), и третий сайт связывания является специфичным для второго антигена (или эпитопа).
[000215] В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, могут быть моноспецифическими, но бивалентными, трехвалентными или четырехвалентными, по меньшей мере с двумя сайтами связывания, специфичными для одного и того же антигена или эпитопа. В некоторых вариантах это обеспечивает более сильное связывание с антигеном или эпитопом, чем моновалентный аналог. В некоторых вариантах осуществления в бивалентном антигенсвязывающем фрагменте первая валентность сайта связывания и вторая валентность сайта связывания структурно идентичны (т.е. имеют одинаковые последовательности) или структурно различны (т.е. имеют разные последовательности, хотя имеют одинаковую специфичность).
[000216] В некоторых вариантах осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, являются биспецифическими. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, имеют первую специфичность для CD19 и вторую специфичность. В некоторых вариантах осуществления вторая специфичность относится к CD19, но к различным эпитопам. В некоторых вариантах осуществления вторая специфичность относится ко второму антигену, отличному от CD19, и способна стимулировать или облегчать иммунный ответ на клетки-мишени, экспрессирующие CD19, когда они находятся в непосредственной близости. Например, биспецифическое антитело может обеспечивать клетки-мишени экспрессирующие CD19, в непосредственной близости к иммунной клетке, такой как Т-клетка или NK-клетка, тем самым способствуя распознаванию или элиминации такой клетки-мишени иммунной системой.
[000217] Биспецифические антитела и антигенсвязывающие фрагменты, обеспеченные здесь, можно получить любыми подходящими способами, известными в данной области. В традиционном подходе две пары тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, имеющие разные антигенные специфичности, могут совместно экспрессироваться в клетке-хозяине с получением биспецифических антител рекомбинантным способом (см., например, Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)) с последующей очисткой аффинной хроматографией.
[000218] Также можно использовать рекомбинантный подход, когда последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи антитела для двух специфичностей соответственно сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина с последующей вставкой в вектор экспрессии, который котрансфектируют с вектором экспрессии для последовательности легкой цепи в подходящей клетке-хозяине для рекомбинантной экспрессии биспецифического антитела (см., например, WO 94/04690; Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)). Аналогично, димеры scFv также можно рекомбинантно-конструировать и экспрессировать из клетки-хозяина (см., например, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).)
[000219] В еще одном способе пептиды «лейциновой молнии» из белков Fos и Jun могут быть связаны с Fab'-фрагментами двух разных антител посредством слияния генов. Связанные антитела восстанавливают в шарнирной области до четырех половинных антител (т.е. мономеров) и затем повторно окисляют с образованием гетеродимеров (Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)).
[000220] Два антигенсвязывающих домена также можно конъюгировать или «сшить» с образованием биспецифического антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Например, одно антитело может быть связано с биотином, в то время как другое антитело с авидином, и сильная ассоциация между биотином и авидином может связать два антитела вместе, образуя биспецифическое антитело (см., например, патент США № 4676980; WO 91/00360, WO 92/00373 и EP 03089). В еще одном примере два антитела или антигенсвязывающих фрагмента можно «сшить» обычными способами, известными в данной области, например, как описано в патенте США № 4676980.
[000221] Биспецифические антигенсвязывающие фрагменты можно получить из биспецифического антитела, например, протеолитическим расщеплением или химическим связыванием. Например, антигенсвязывающий фрагмент (например, Fab') антитела можно получить и превратить в Fab'-тиоловое производное, и затем смешать и подвергнуть взаимодействию с другим превращенным производным Fab', имеющим другую антигенную специфичность, с образованием биспецифического антигенсвязывающего фрагмента (см., например, Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)).
[000222] В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело или его антигенсвязывающие фрагменты можно сконструировать на границе раздела, так что может быть сформирована ассоциация «выступ-во-впадине», чтобы способствовать гетеродимеризации двух разных антигенсвязывающих сайтов. Как здесь используется, выражение «выступ-во-впадине» относится к взаимодействию между двумя полипептидами (такими как Fc), где один полипептид имеет выступ (т.е. «выпуклость») за счет присутствия аминокислотного остатка, имеющего объемную боковую цепь (например, тирозина или триптофана), и другой полипептид имеет полость (т.е. «впадину»), в которой находится небольшой аминокислотный остаток боковой цепи (например, аланин или треонин), и выступ располагается в полости таким образом, чтобы способствовать взаимодействию двух полипептидов с образованием гетеродимера или комплекса. Способы получения полипептидов с «выступами-во-впадинах» известны в данной области, например, как описано в патенте США № 5731168.
[000223] Конъюгаты
[000224] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты связаны с конъюгатом. Конъюгат представляет собой небелковый фрагмент, который можно присоединить к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту. Полагается, что различные конъюгаты могут быть связаны с антителами или антигенсвязывающими фрагментами, обеспеченными здесь (см., например, «Conjugate Vaccines», Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989)). Такие конъюгаты можно связать с антителами или антигенсвязывающими фрагментами посредством ковалентного связывания, аффинного связывания, интеркаляции, координационного связывания, комплексообразования, ассоциации, смешивания или добавления, среди прочих способов. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связаны с одним или несколькими конъюгатами через линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой гидразиновый линкер, дисульфидный линкер, бифункциональный линкер, дипептидный линкер, глюкуронидный линкер, тиоэфирный линкер.
[000225] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые здесь, можно сконструировать таким образом, чтобы они содержали специфические сайты вне эпитоп-связывающего участка, которые можно использовать для связывания с одним или несколькими конъюгатами. Например, такой сайт может включать один или более реакционноспособных аминокислотных остатков, таких как, например, остатки цистеина или гистидина, для облегчения образования ковалентной связи с конъюгатом.
[000226] Конъюгат может представлять терапевтический агент (например, химиотерапевтический агент), радиоактивный изотоп, детектируемую метку (например, лантаноид, люминесцентную метку, флуоресцентную метку или фермент-субстратную метку), модифицирующую фармакокинетику молекулу или очищающий агент (такой как магнитный шарик или наночастица).
[000227] Примеры детектируемой метки могут включать флуоресцентные метки (например, флуоресцеин, родамин, дансил, фикоэритрин или техасский красный), фермент-субстратные метки (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, люцерифераза, глюкоамилаза, лизоцим, сахаридоксидаза или β-D-галактозидаза), радиоизотопы, другие лантаноиды, люминесцентные метки, хромофорный фрагмент, дигоксигенин, биотин/авидин, молекулу ДНК или золото для детектирования.
123
124
125
131
35
3
111
112
14
64
67
86
88
90
177
211
186
188
153
212
32
[000228] Примеры радиоизотопов могут включать I, I, I, I, S, H, In, In, C, Cu, Cu, Y, Y, Y, Lu, At, Re, Re, Sm, Bi и P. Радиоизотопно-меченные антитела пригодны в экспериментах по визуализации, направленной на рецепторы.
[000229] В некоторых вариантах осуществления конъюгат может представлять собой модифицирующую фармакокинетику молекулу, такую как ПЭГ, которая способствует увеличению периода полувыведения антитела. Другие подходящие полимеры включают, например, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля и тому подобное.
[000230] В некоторых вариантах осуществления конъюгат может представлять собой очищающий агент, такой как магнитный шарик или наночастица.
[000231] Коньюгаты антитело-лекарственное средство
[000232] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC), содержащим любое из указанных выше анти-CD19-антител или антигенсвязывающих фрагментов, конъюгированных с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, лекарственное средство, агент, ингибирующий рост, токсин или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).
[000233] Конъюгаты антитело-лекарственное средство могут быть пригодными для локальной доставки цитотоксических агентов, например, в лечении рака. Это обеспечивает целенаправленную доставку цитотоксических агентов к опухолям и внутриклеточное накопление в них, что особенно выигрышно, когда системное введение этих неконъюгированных цитотоксических агентов может привести к неприемлемым уровням токсичности для нормальных клеток, а также к тем опухолевым клеткам, гибель которых необходимо вызвать (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review» in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; патент США № 4975278).
[000234] В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент может представлять собой любой агент, который токсичен для клеток или который может вызвать повреждение или гибель клетки. В определенных вариантах осуществления цитотоксический агент необязательно представляет цитотоксин, алкилаторы ДНК, ингибитор топоизомеразы, тубулин-связующие или другие противоопухолевые лекарственные средства.
[000235] Примеры ферментативно активного цитотоксина включают бактериальные токсины и растительные токсины, такие как, например, дифтерийный токсин, А-цепь экзотоксина (Pseudomonas aeruginosa), рицин, абрин, модецин, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PARI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены (см., например, WO 93/21232). Такой токсин с крупной молекулой может быть конъюгирован с антителами или антигенсвязывающими фрагментами, обеспеченными здесь, с использованием способов, известных в данной области, например, как описано в публикации Vitetta et al. (1987) Science, 238: 1098.
[000236] Цитотоксический агент также может представлять низкомолекулярные токсины и лекарственные средства, такие как гелданамицин (Mandler et al. (2000) Jour. Of Nat. Cancer Inst., 92 (19): 1573-1581; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem., 13: 786-791), майтанзиноиды (ЕР 1391213; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8618-8623), калихеамицин (Lode et al. (1998) Cancer Res., 58: 2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res., 53: 3336-3342), таксол, цитохалазин B, грамицидин D, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, виндезин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин и его аналоги, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-меркаптогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиоэпа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, диброманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлородиаминоплатина (II) (DDP), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (AMC)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин), калихеамицин, майтанзиноиды, доластатины, ауристатины, трихотецен и CC1065 и их производные, обладающие цитотоксической активностью.
211
131
125
90
186
153
212
32
212
[000237] Цитотоксический агент также может представлять высокорадиоактивный изотоп. Примеры включают At, I, I, Y, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Способы конъюгирования радиоизотопа с антителом известны в данной области, например, с помощью подходящего лигандного реагента (см., например, WO94/11026; Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)). Лигандный реагент имеет хелатирующий лиганд, который может связывать, хелатировать или иным образом образовывать комплекс с радиоактивным изотопом металла, и также имеет функциональную группу, которая реагирует с тиолом цистеина антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Типичные хелатирующие лиганды включают DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA и TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex.).
[000238] Конъюгаты, обеспеченные здесь, антител (или антигенсвязывающих фрагментов) и цитотоксических агентов можно получить с использованием различных бифункциональных связывающих белок агентов. Типичные бифункциональные связывающие реагенты включают, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидопроизводные (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазоний бензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и активные бис- производные фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).
[000239] В некоторых вариантах осуществления ADC, обеспеченный здесь, получают с линкерными реагентами, выбранными из группы, состоящей из: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPRH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB и SVSG (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат). Эти линкерные реагенты являются коммерчески доступными (например, производства Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A, см. страницы 467-498, 2003-2004 Applications Handbook и Catalog).
[000240] В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется в конкретной физиологической среде, тем самым способствуя высвобождению цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, линкер может представлять чувствительный к кислотам линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992); патент США № 5208020). В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать аминокислотные остатки, такие как дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид. Аминокислотные остатки в линкере могут быть природными или не встречающимися в природе аминокислотными остатками. Примеры таких линкеров включают валин-цитруллин (ve или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe), глицин-валин-цитруллин (gly-yal-cit), глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly), валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил («vc-PAB»). Аминокислотные линкерные компоненты можно сконструировать и оптимизировать по их селективности в отношении ферментативного расщепления под действием конкретных ферментов, например, ассоциированной с опухолью протеазой, катепсином В, С и D или протеазой плазмином.
[000241] В некоторых вариантах осуществления в ADC, обеспеченном здесь, антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) конъюгируют с одним или несколькими цитотоксическими агентами при соотношении антитело:агент примерно от 1 до примерно 20, примерно от 1 до примерно 6, примерно от 2 до 6, примерно от 3 до примерно 6, примерно от 2 до примерно 5, примерно от 2 до примерно 4 или примерно от 3 до примерно 4.
[000242] ADC, обеспеченный здесь, можно приготовить любыми подходящими способами, известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления нуклеофильную группу антитела (или антигенсвязывающего фрагмента) сначала подвергают взаимодействию с бифункциональным линкерным реагентом, и затем связывают с цитотоксическим агентом или наоборот, т.е. сначала нуклеофильная группа цитотоксического агента реагирует с бифункциональным линкером и затем происходит связывание с антителом.
[000243] В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент может содержать (или модифицирован для того, чтобы содержать) реактивную тиоловую функциональную группу, которая может реагировать с цистеинтиолом свободного цистеина антител или антигенсвязывающих фрагментов, обеспеченных здесь. Типичные реактивные тиоловые функциональные группы включают, например, малеимид, иодацетамид, пиридилдисульфид, галоацетил, сукцинимидиловый эфир (например, NHS, N-гидроксисукцинимид), изотиоцианат, сульфонилхлорид, 2,6-дихлортриазинил, пентафторфениловый эфир или фосфорамидит (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671).
[000244] Цитотоксический агент или антитело может вступать в реакцию со связующим реагентом перед его конъюгированием с образованием ADC. Например, N-гидроксисукцинимидный эфир (NHS) цитотоксического агента может быть предварительно образован, выделен, очищен и/или охарактеризован, или он может быть образован in situ и подвергнут взаимодействию с нуклеофильной группой антитела. Обычно карбоксильная форма конъюгата активируется посредством взаимодействия с некоторой комбинацией карбодиимидного реагента, например, дициклогексилкарбодиимида; диизопропилкарбодиимида или уронового реагента, например, TsTu (O-(N-сукцинимидил)-N, N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат, HBTU (O-бензотриазол-1-ил)-N, N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат) или HATU (O-(7-азабензотриазол-1-ил)- N, N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат), активатора, такого как 1-гидроксибензотриазол (HOBt) и N-гидроксисукцинимид, с получением эфира NHS. В некоторых случаях цитотоксический агент и антитело могут быть связаны активацией in situ и взаимодействием с образованием ADC в одну стадию. Другие активирующие и связывающие реагенты включают TBTU (2-(1H-бензотриазо-1-ил)-1-1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат), TFFH (N, N',N'',N'''-тетраметилурония 2-фтор-гексафторфосфат), РуВОР (бензотриазол-1-илокси-трис-пирролидино-фосфония гесафторфосфат), EEDQ (2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидро-хинолин), DCC (дициклогексилкарбодиимид); DIPCDI (диизопропилкарбодиимид), MSNT (1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1Н-1,2,4-триазол и арилсульфонилгалогениды, например триизопропилбензолсульфонилхлорид. В еще одном примере антитело или его антигенсвязывающие фрагменты могут быть конъюгированным с биотином, затем опосредованно конъюгированы со вторым конъюгатом, который конъюгирован с авидином.
[000245] Майтанзин и майтанзиноиды
[000246] В одном варианте осуществления любое из анти-CD19-антител или антигенсвязывающих фрагментов, обеспеченных здесь, конъюгировано с одной или несколькими молекулами майтанзиноидов. Майтанзиноиды являются ингибиторами митотического веретена, которые действуют посредством ингибирования полимеризации тубулина.
[000247] Соединения майтанзина (такие как майтанзинол и C-3 сложные эфиры майтанзинола), подходящие для применения в качестве молекул лекарственных средств из группы майтанзиноидов, хорошо известны в данной области и могут быть выделены из природных источников в соответствии с известными способами, полученными с использованием методов генной инженерии (см. Yu et al. (2002) PNAS 99: 7968-7973) майтанзинол или аналоги майтанзинола, полученные синтетическим путем в соответствии с известными способами (см., например, патенты США № 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663 и 4371533).
2
2
2
[000248] Подходящие майтанзиноиды раскрыты, например, в патенте США № 5208020 и в других патентах и непатентных публикациях, упомянутых здесь. Примерами майтанзиноидов являются майтанзинол и аналоги майтанзинола, модифицированные в ароматическом кольце или в других положениях молекулы майтанзинола, см., например, C-49-дехлор (патент США № 4256746); C-20-гидрокси (или C-20-деметил) +/- C-19-дехлор (патенты США № 4361650 и 4307016); C-20-деметокси,C-20-ацилокси (-OCOR), +/- дехлор (патент США № 4294757), C-9-SH (патент США № 4424219); C-14-алкоксиметил(деметокси/CHOR) (патент США № 4331598); C-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (CHOH или CHOAc) (патент США № 4450254); С-15-гидрокси/ацилокси (патент США № 4364866); С-15-метокси (патенты США № 4313946 и 4315929); C-18-N-деметил (патенты США № 4362663 и 4322348); и 4,5-дезокси (патент США № 4371533). В некоторых вариантах осуществления майтанзиноид, конъюгированный с антителами, обеспеченными здесь, представляет собой DM1 (N2'-деацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзин) или DM4 (N2'-деацетил-N2'-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-6-метилмайтанзин).
[000249] Конъюгаты анти-CD19-антитело-майтанзиноид можно получить посредством химического связывания антитела с молекулой майтанзиноида без значительного снижения биологической активности антитела или молекулы майтанзиноида. См., например, патент США № 5208020 (раскрытие которого включено здесь посредство ссылки). В некоторых вариантах осуществления в среднем 1-4, 2-4 или 3-4 молекулы майтанзиноида конъюгированы на молекулу антитела без отрицательного влияния на функцию или растворимость антитела.
[000250] Майтанзиноидная молекула может быть связана с антителом или антигенсвязывающим фрагментом через любые подходящие линкеры, известные в данной области, см., например, в патенте США № 5208020, 6441163 или в патенте ЕР 0425235 B1, Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992) и заявке на патент США 2005/0169933 A1, раскрытие которых включено здесь посредством ссылки. Линкеры в ADC, обеспеченных здесь, включают дисульфидные линкеры, тиоэфирные линкеры, чувствительные к кислотам линкеры, фотолабильные линкеры, чувствительные к пептидазам линкеры или чувствительные к эстеразам линкеры. В определенных вариантах осуществления линкер в ADC, обеспеченном здесь, представляет собой бифункциональный связывающий белки агент, такой как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидопроизводные (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазоний бензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и его активные фторсодержащие бис-производные (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).
[000251] Линкер может быть присоединен к молекуле майтанзиноида в различных положениях, в зависимости от типа связи. Например, сложноэфирная связь может быть образована взаимодействием с гидроксильной группой с использованием обычных методик сочетания. Реакция может иметь место в положении C-3, имеющем гидроксильную группу, положении C-14, модифицированном гидроксиметилом, положении C-15, модифицированном гидроксильной группой, и положении C-20, имеющем гидроксильную группу. В предпочтительном варианте осуществления связь образуется в положении С-3 майтанзинола или аналога майтанзинола.
[000252] Ауристатины и долостатины
[000253] В одном варианте осуществления любое из анти-CD19- антител или антигенсвязывающих фрагментов, обеспеченных здесь, конъюгировано с одним или несколькими долостатинами, пептидными аналогами и производными долостатина или ауристатинами (патенты США № 5635483; 5780588). Доластатины и ауристатины обладают противоопухолевой и противогрибковой активностью, предположительно за счет нарушения динамики микротрубочек, гидролиза GTP и деления ядра и клеток (см., например, патент США № 5663149; Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965; Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584).
[000254] Типичные ауристатины включают MMAE и MMAF. Молекулы лекарственного средства ауристатин/доластатин можно получить в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США 2005/0238649; патенте США № 5635483; патенте США № 5780588; публикациях Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc., 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design., 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans., 15:859-863; и Doronina (2003) Nat. Biotechnol., 21(7):778-784.
[000255] Лекарственный фрагмент доластатина или ауристатина может быть присоединен к антителу через N(амино)-конец или С(карбоксильный)-конец пептидного лекарственного фрагмента (WO 02/088172).
[000256] Композиция химерного антигенного рецептора (CAR)
[000257] Настоящее раскрытие также относится к химерным антигенным рецепторам (CAR), содержащим антигенсвязывающий фрагмент антитела, обеспеченный здесь, который специфически связывается с CD19 и фрагмент активации Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления фрагмент активации Т-клеток содержит нативный фрагмент активации Т-клеток TCR. В некоторых вариантах осуществления фрагмент активации Т-клеток содержит трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен TCR.
[000258] Антигенсвязывающий фрагмент
2
[000259] В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может представлять любой фрагмент, который связывается с CD19, включая, не ограничиваясь этим, антигенраспознающие домены, полученные из любого одного или нескольких антител, обеспеченных здесь. В некоторых вариантах осуществления выигрышно, чтобы антигенсвязывающий фрагмент происходил от тех же видов, в которых в конечном итоге будет использоваться CAR. Например, для применения у людей может быть полезным применение антигенсвязывающего фрагмента в CAR, полученного из человеческого антитела или гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент представляет одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может существовать во множестве других форм, включая, например, Fv, Fab и (Fab'), а также бифункциональные (т.е. би-специфические) фрагменты гибридного антитела (например, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)).
[000260] Трансмембранный домен
[000261] В отношении трансмембранного домена, то в различных вариантах осуществления CAR сконструирован для включения трансмембранного домена, который слит с внеклеточным доменом CAR. В одном варианте осуществления используется трансмембранный домен, который естественным образом связан с одним из доменов в CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован аминокислотной заменой, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами таких же или других поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать взаимодействия с другими членами рецепторного комплекса.
[000262] Трансмембранный домен можно получить из природного или из синтетического источника. Если источник является природным, то домен может быть получен из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные домены, которые можно использовать в данном изобретении, могут быть получены из (т. е. включают, по меньшей мере, трансмембранную область(и)) из альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. В некоторых случаях можно использовать различные шарнирные области человека, включая шарнирную область человеческого Ig (иммуноглобулина).
[000263] В одном варианте осуществления трансмембранный домен может быть синтетическим, и в этом случае он будет содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В одном аспекте триплет из фенилаланина, триптофана и валина будет находиться на каждом конце синтетического трансмембранного домена. Необязательно, короткий олиго- или полипептидный линкер длиной от 2 до 10 аминокислот может образовать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR. Глицин-сериновый дублет обеспечивает особенно подходящий линкер.
[000264] Домен сигнальной трансдукции
[000265] Домен сигнальной трансдукции CAR по настоящему изобретению отвечает за активацию, по меньшей мере, одной из нормальных эффекторных функций TCR T-клетки, в которую была помещен CAR. TCR эффекторная функция T-клетки, например, может представлять цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин «домен сигнальной трансдукции» относится к части белка, которая передает сигнал эффекторной функции TCR и направляет Т-клетку на выполнение специализированной функции. Несмотря на то, что обычно можно использовать весь внутриклеточный домен сигнальной трансдукции, во многих случаях отсутствует необходимость использовать полную цепь. В той степени, в которой используется усеченная часть внутриклеточного домена сигнальной трансдукции, такая усеченная часть может использоваться вместо интактной цепи до тех пор, пока она передает сигнал эффекторной функции. Термин «внутриклеточный сигнальный домен», таким образом, подразумевает включение любой усеченной части внутриклеточного домена сигнальной трансдукции, достаточной для передачи сигнала эффекторной функции TCR.
[000266] Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для использования в CAR по настоящему изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторов, которые действуют совместно, инициируя трансдукцию сигнала после включения антигенного рецептора, а также любое производное или вариант этих последовательностей и любую синтетическую последовательность, которая имеет аналогичные функциональные активности.
[000267] Известно, что сигналы, генерируемые только через TCR, недостаточны для полной активации Т-клетки и что также необходим вторичный или костимулирующий сигнал. Таким образом, можно сказать, что активация Т-клеток опосредуется двумя различными группами цитоплазматической сигнальной последовательности: теми, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и теми, которые функционируют антигеннезависимым образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности).
[000268] Первичные последовательности внутриклеточной сигнальной трансдукции регулируют первичную активацию комплекса TCR либо стимулирующим, либо ингибирующим образом. Первичные внутриклеточные сигнальные последовательности, которые функционируют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные мотивы активации на основе тирозина или ITAM.
[000269] Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые особенно применимы в изобретении, включают последовательности, полученные из TCR дзета, FcR гамма, FcR бета, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. Особенно предпочтительно, чтобы цитоплазматическая сигнальная молекула в CAR по изобретению содержала цитоплазматическую сигнальную последовательность, полученную из CD3 дзета.
[000270] В предпочтительном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен CAR сконструирован для включения CD3 дзета сигнального домена сам по себе или в комбинации с любым другим желаемым цитоплазматическим доменом(и), пригодными в контексте CAR по настоящему изобретению. Например, внутриклеточный сигнальный домен CAR может содержать участок дзета-цепи CD3 и костимулирующий сигнальный участок. Костимуляторная сигнальная область относится к части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, антиген-1, связанный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 и лиганд, который специфически связывается с CD83 и тому подобное. Часть дзета-цепи CD3 и костимулирующая сигнальная область могут быть связаны друг с другом в произвольном порядке или в определенном порядке. Необязательно, короткий олиго- или полипептидный линкер, например, длиной от 2 до 10 аминокислот, может образовывать связь. Глицин-сериновый дублет обеспечивает особенно подходящий линкер.
[000271] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CAR, обеспеченные здесь, включающие первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую антигенсвязывающий фрагмент антител, обеспеченных здесь, и, необязательно, вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен и внутриклеточный домен сигнальной трансдукции TCR. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая антигенсвязывающий фрагмент, операбельно связана с последовательностью, кодирующей трансмембранный домен и домен сигнальной трансдукции TCR. В некоторых вариантах осуществления система сигнальной трансдукции содержит костимулирующую сигнальную область и/или участок дзета-цепи CD3. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие желаемые молекулы, могут быть получены с использованием рекомбинантных методов, известных в данной области, например, таких как скрининг библиотек из клеток, экспрессирующих ген, получение гена из вектора, о котором известно, что он его включает, или выделение непосредственно из клеток и тканей, содержащих его, используя стандартные методики. Альтернативно, интересующий ген может быть получен синтетическим путем, а не клонирован.
[000272] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к векторам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, обеспеченную здесь. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет ретровирусную и лентивирусную векторную конструкцию, экспрессирующую CAR по настоящему изобретению, которая может быть непосредственно трансфектирована в клетку, или РНК-конструкцию, которая может быть непосредственно трансфектирована в клетку.
[000273] В одном аспекте настоящее раскрытие обеспечивает выделенные клетки-хозяева, которые экспрессируют CAR, обеспеченный здесь.
[000274] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает способы стимулирования Т-клеточного иммунного ответа на мишень, экспрессирующую CD19, у субъекта, где способ включает введение субъекту эффективного количества Т-клетки, экспрессирующей CAR, обеспеченный здесь.
[000275] Полинуклеотиды и рекомбинантные способы
[000276] Настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, которые кодируют анти-CD19-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления выделенные полинуклеотиды содержат одну или более нуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ IN NO: 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133 и/или 135, которые кодируют вариабельную область типичных антител. ДНК, кодирующую моноклональное антитело, легко выделить и секвенировать с использованием обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела). Кодирующая ДНК также может быть получена синтетическими методами.
[000277] Выделенный полинуклеотид, который кодирует анти-CD9-антитела и их антигенсвязывающие фрагменты (например, включая последовательности, показанные в SEQ IN NO: 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133 и/или 135) можно вставить в вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии с использованием рекомбинантных методик, известных в данной области. Многие векторы доступны. Компоненты вектора обычно включают, не ограничиваются этим, одно или более из следующего: сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промотор (например, SV40, CMV, EF-1α) и последовательность терминации транскрипции.
[000278] В некоторых вариантах осуществления векторная система включает системы млекопитающих, бактериальные, дрожжевые системы и т.д. и содержит плазмиды, такие как, не ограничиваясь этим, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMD18-T, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pex2, pTD, pRS и т.д., и другие лабораторные и коммерчески доступные векторы. Подходящие векторы могут включать плазмидные или вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы).
[000279] Векторы, содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент, могут быть введены в клетку-хозяин для клонирования или экспрессии гена. Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах по настоящему изобретению являются клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Подходящие прокариоты для этой цели включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные микроорганизмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, E.coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans и Shigella, а также Bacilli, такие как B. subtilis и B. licheniformis, Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces.
[000280] В дополнение к прокариотам, эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела против CD19. Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи, наиболее часто используются среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Однако ряд других родов, видов и штаммов являются общедоступными и применимыми здесь, например Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces хозяева, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), К. thermotolerans и К. marxianus; Yarrowia (ЕР 402226); Pichia pastoris (ЕР 183070); Candida; Trichoderma reesia (ЕР 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и нитчатые грибы, такие как Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, и хозяева Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.
[000281] Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированных антител или антигенсвязывающего фрагмента, обеспеченных здесь, получены из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие пермиссивные клетки-хозяева насекомых из таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (кукурузная листовая совка), Aedes aegypti (желтолихорадочный комар), Aedes albopictus (кровососущий комар), Drosophila melanogaster (дрозофила обыкновенная) и Bombyx mori. Разнообразные штаммы вирусов для трансфекции являются общедоступными, например, вариант L-1 Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы можно использовать в качестве вируса в соответствии с настоящим изобретением, в частности для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Культуры растительных клеток хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, томатов и табака также можно использовать в качестве хозяев.
[000282] Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало обычной процедурой. Примерами пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия CV1 почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия почки эмбриона человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки детенышей хомяков (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомяка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканских зеленых мартышек (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Hep G2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку 293F.
[000283] Клетки-хозяева трансформируют вышеописанными векторами экспрессии или клонирования для продуцирования анти-CD19-антител и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных подходящим образом, для индукции промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. В еще одном варианте осуществления антитело может быть получено гомологичной рекомбинацией, известной в данной области.
[000284] Клетки-хозяева, используемые для продукции антител или антигенсвязывающих фрагментов, обеспеченных здесь, можно культивировать в различных средах. Коммерчески доступные среды, такие как Ham's F10 (Sigma), минимальная эссенциальная среда (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла, модифицированная по методу Дульбекко (DMEM), Sigma), подходят для культивирования клеток-хозяев. Кроме того, любую среду, описанную в публикациях Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), патентах США № 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или патенте США Re 30985, можно использовать в качестве культуральной среды для клеток-хозяев. Любую из этих сред можно при необходимости дополнить гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как препарат GENTAMYCIN™), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки также можно включить в соответствующих концентрациях, которые известны специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное, являются такими, которые ранее использовались для клетки-хозяина, выбранной для экспрессии, и будут очевидны для специалиста в данной области техники.
[000285] Анти-CD19-антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, полученные из клеток, можно очистить с использованием, например, хроматографии на гидроксилапатите, гель-электрофореза, диализа, ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе, осаждения сульфатом аммония, высаливания и аффинной хроматографии, где аффинная хроматография является предпочтительным методом очистки.
[000286] В некоторых вариантах осуществления белок А, иммобилизованный на твердой фазе, используется для иммуноаффинной очистки антитела и его антигенсвязывающего фрагмента. Пригодность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа Fc-области любого иммуноглобулина, который присутствует в антителе. Белок А можно использовать для очистки антител, основанных на тяжелых цепях гамма-1, гамма-2 или гамма-4 человека (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1983)). Белок G рекомендуется для всех мышиных изотипов и для человеческого гамма-3 (Guss et al., EMBO J., 5: 1567 1575 (1986)). Матрица, к которой присоединен аффинный лиганд, чаще всего представляет агарозу, но доступны и другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемыми порами или полистиролдивинилбензол, обеспечивают более высокие скорости потока и более короткое время обработки, чем это может быть достигнуто с агарозой. Когда антитело содержит домен СН3, то смола Bakerbond ABX.TM. (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) пригодна для очистки. Другие методы очистки белков, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин-SEPHAROSE™ на анионообменной или катионообменной смоле (такой как колонка с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония также доступны в зависимости от антитела, которое требуется извлечь.
[000287] После любой стадии (стадий) предварительной очистки смесь, содержащую антитело, представляющее интерес, и загрязняющие вещества, может быть подвергнута хроматографии гидрофобного взаимодействия с низким рН с использованием элюирующего буфера при рН примерно 2,5-4,5, предпочтительно проводимого при низких концентрациях соли (например, примерно 0-0,25 М соли).
[000288] Фармацевтические композиции
[000289] Настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие анти-CD19-антитела или их антигенсвязывающие фрагменты или конъюгат антитело-лекарственное средство, обеспеченные здесь, и один или более фармацевтически приемлемых носителей.
[000290] Фармацевтически приемлемые носители для применения в фармацевтических композициях, раскрытых здесь, могут включать, например, фармацевтически приемлемые жидкие, гелевые или твердые носители, водные носители, неводные носители, антимикробные агенты, изотонические агенты, буферы, антиоксиданты, анестетики, суспендирующие/распределяющие агенты, изолирующие или хелатообразующие агенты, разбавители, адъюванты, эксципиенты или нетоксичные вспомогательные вещества, другие компоненты, известные в данной области техники, или их различные комбинации.
[000291] Подходящие компоненты могут включать, например, антиоксиданты, наполнители, связующие вещества, дезинтегранты, буферы, консерванты, смазывающие вещества, ароматизаторы, загустители, красители, эмульгаторы или стабилизаторы, такие как сахара и циклодекстрины. Подходящие антиоксиданты могут включать, например, метионин, аскорбиновую кислоту, ЭДТА, тиосульфат натрия, платину, каталазу, лимонную кислоту, цистеин, тиоглицерин, тиогликолевую кислоту, тиосорбит, бутилированный гидроксанизол, бутилированный гидрокситолуол и/или пропилгаллат. Как здесь раскрыто, включение одного или более антиоксидантов, таких как метионин, в композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент и конъюгаты, обеспеченные здесь, уменьшает окисление антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Такое снижение окисления предотвращает или уменьшает потерю аффинности связывания, тем самым улучшая стабильность антител и максимизируя срок годности. Следовательно, в определенных вариантах осуществления обеспечиваются композиции, которые содержат одно или более антител или антигенсвязывающих фрагментов, как здесь описано, и один или более антиоксидантов, таких как метионин. Кроме того, обеспечиваются способы предупреждения окисления, продления срока годности и/или повышения эффективности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, обеспеченных здесь, посредством смешивания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с одним или более антиоксидантами, такими как метионин.
[000292] Для дополнительной иллюстрации, фармацевтически приемлемые носители могут включать, например, водные носители, такие как раствор хлорида натрия для инъекций, инъекционный раствор Рингера, инъекционный изотонический раствор декстрозы, инъекционная стерильная вода или инъекционный раствор декстрозы и лактата Рингера, неводные носители, такие как нелетучие растительные масла, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло или арахисовое масло, антимикробные агенты в бактериостатических или фунгистатических концентрациях, изотонические агенты, такие как хлорид натрия или декстроза, буферы, такие как фосфатные или цитратные буферы, антиоксиданты, такие как бисульфат натрия, местные анестетики, такие как прокаина гидрохлорид, суспендирующие и диспергирующие агенты, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлоза или поливинилпирролидон, эмульгирующие агенты, такие как полисорбат 80 (твин-80), секвестрирующие или хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), ЭГТА (этиленгликольтетрауксусная кислота), этиловый спирт, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, гидроксид натрия, соляная кислота, лимонная кислота или молочная кислота. Антимикробные агенты, используемые в качестве носителей, могут быть добавлены к фармацевтическим композициям в контейнерах с множеством доз, которые включают фенолы или крезолы, ртутьсодержащие агенты, бензиловый спирт, хлорбутанол, сложные эфиры метил- и пропил-п-гидроксибензойной кислоты, тимеросал, бензалкония хлорид и бензетония хлорид. Подходящие наполнители могут включать, например, воду, физиологический раствор, декстрозу, глицерин или этанол. Подходящие нетоксичные вспомогательные вещества могут включать, например, смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферные агенты, стабилизаторы, агенты, повышающие растворимость, или агенты, такие как ацетат натрия, сорбитан монолаурат, олеат триэтаноламина или циклодекстрин.
[000293] Фармацевтические композиции могут представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, пилюлю, капсулу, таблетку, состав с замедленным высвобождением или порошок. Препараты для перорального введения могут включать стандартные носители, такие как фармацевтические классы маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, поливинилпирролидона, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д.
[000294] В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции формулированы в инъекционную композицию. Инъекционные фармацевтические композиции можно приготовить в любой обычной форме, например, такой как жидкий раствор, суспензия, эмульсия или твердые формы, подходящие для приготовления жидкого раствора, суспензии или эмульсии. Препараты для инъекций могут включать стерильные и/или непирогенные растворы, готовые для инъекции, стерильные сухие растворимые продукты, такие как лиофилизированные порошки, готовые к объединению с растворителем непосредственно перед применением, включая водорастворимые таблетки для подкожных инъекций, стерильные суспензии, готовые для инъекции, стерильные сухие нерастворимые продукты, готовые к объединению с носителем непосредственно перед применением, и стерильные и/или непирогенные эмульсии. Растворы могут быть водными или неводными.
[000295] В некоторых вариантах осуществления препараты для парентерального введения в виде единичных доз упаковывают в ампулу, флакон или шприц с иглой. Все препараты для парентерального введения должны быть стерильными, и непирогенными, как это известно и практикуется в данной области.
[000296] В определенных вариантах осуществления стерильный лиофилизированный порошок готовят растворением антитела или антигенсвязывающего фрагмента, раскрытых здесь, в подходящем растворителе. Растворитель может включать эксципиент, который повышает стабильность или другие фармакологические компоненты порошка или восстановленного раствора, приготовленного из порошка. Эксципиенты, которые можно использовать, включают, не ограничиваясь этим, воду, декстрозу, сорбит, фруктозу, кукурузный сироп, ксилит, глицерин, глюкозу, сахарозу или другой подходящий агент. Растворитель может включать буфер, такой как цитрат, фосфат натрия или калия, или другой такой буфер, известный специалистам в данной области, в одном варианте осуществления примерно с нейтральным pH. Последующая стерилизация фильтрованием раствора с последующей лиофилизацией в стандартных условиях, известных специалистам в данной области, дает желаемый состав. В одном варианте осуществления полученный раствор разливают во флаконы для лиофилизации. Каждый флакон может содержать одну дозу или несколько доз анти-CD19-антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, или их композиции. Переполнение флаконов небольшим количеством, превышающим необходимое для дозы или ряда доз (например, примерно на 10%), является приемлемым для обеспечения точного набора образца и точного дозирования. Лиофилизированный порошок можно хранить в подходящих условиях, например при температуре от 4°C до комнатной температуры.
[000297] Восстановление лиофилизированного порошка водой для инъекций обеспечивает состав для применения при парентеральном введении. В одном варианте осуществления для восстановления добавляют стерильную и/или непирогенную воду или другой жидкий подходящий носитель к лиофилизированному порошку. Точное количество зависит от выбранной терапии и может быть определено эмпирически.
[000298] Способы применения
[000299] Настоящее раскрытие также обеспечивает терапевтические способы, включающие: введение терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента, обеспеченных здесь, субъекту, нуждающемуся в этом, тем самым обеспечивая лечение или профилактику связанного с CD19 патологического состояния или расстройства. В некоторых вариантах осуществления связанное с CD19 патологическое состояние или расстройство представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления рак выбан из группы, состоящей из B-клеточной лимфомы, необязательно лимфомы Ходжкина или неходжкинской лимфомы, где неходжкинская лимфома включает: диффузную B-крупноклеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому, B-клеточную лимфому маргинальной зоны (MZL), лимфому лимфоидной ткани, ассоциированную со слизистой желудка (MALT), малую лимфоцитарную лимфому (хронический лимфоцитарный лейкоз, CLL), или лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), острый лимфобластный лейкоз (ALL) или макроглобулинемию Вальденстрема (WM). В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком.
[000300] В еще одном аспекте обеспечиваются способы лечения патологического состояния у субъекта, для которого полезна модуляция CD19 в иммунном ответе, включающие введение терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента, обеспеченных здесь, субъекту, нуждающемуся в этом.
[000301] Терапевтически эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, обеспеченных здесь, будет зависеть от различных факторов, известных в данной области, например, таких как масса тела, возраст, история болезни в прошлом, лекарственные средства, используемые в настоящее время, состояние здоровья субъекта и возможность проявления перекрестной реакции, аллергии, чувствительности и побочных эффектов, а также пути введения и стадии развития заболевания. Доза может быть пропорционально снижена или повышена специалистом с обычной квалификацией в данной области (например, врачом или ветеринаром), что диктуется указанными этими и другими обстоятельствами или требованиями.
[000302] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитело или антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченные здесь, можно вводить в терапевтически эффективной дозировке примерно от 0,01 до примерно 100 мг/кг (например, примерно 0,01 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 15 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 25 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно 35 мг/кг, примерно 40 мг/кг, примерно 45 мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 55 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 65 мг/кг, примерно 70 мг/кг, примерно 75 мг/кг, примерно 80 мг/кг, примерно 85 мг/кг, примерно 90 мг/кг, примерно 95 мг/кг или примерно 100 мг/кг). В некоторых из этих вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозировке примерно 50 мг/кг или ниже, и в некоторых из этих вариантов осуществления дозировка составляет 10 мг/кг или ниже, 5 мг/кг или ниже, 3 мг/кг или ниже, 1 мг/кг или ниже, 0,5 мг/кг или ниже, или 0,1 мг/кг или ниже. В некоторых вариантах осуществления вводимая доза может корректироваться в течение курса лечения. Например, в определенных вариантах осуществления начальная вводимая доза может быть выше, чем последующая вводимая доза. В некоторых вариантах осуществления вводимая доза может варьироваться в течение курса лечения в зависимости от реакции субъекта.
[000303] Режимы дозирования могут корректироваться для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может быть введена одна доза или несколько разделенных доз во времени.
[000304] Анти-CD19-антитела и антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые здесь, можно вводить любым способом, известным в данной области, например, таким как парентеральный (например, подкожный, внутрибрюшинный, внутривенный, включая внутривенную инфузию, внутримышечную или внутрикожную инъекцию) или непарентеральный (например, пероральный, интраназальный, внутриглазный, сублингвальный, ректальный или местный) пути.
[000305] В некоторых вариантах осуществления анти-CD19-антитела или антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые здесь, можно вводить самостоятельно или в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими средствами или агентами. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые здесь, можно вводить в комбинации с другим терапевтическим агентом, например, химиотерапевтическим агентом или противоопухолевым лекарственным средством.
th
th
[000306] В некоторых из этих вариантов осуществления анти-CD19-антитело или антигенсвязывающий фрагмент, раскрытые здесь, которые вводят в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, можно вводить одновременно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, и в некоторых из этих вариантов осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и дополнительный терапевтический агент(ы) можно вводить в виде части одной и той же фармацевтической композиции. Однако анти-CD19-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вводимые «в комбинации» с другим терапевтическим агентом, не должны вводиться одновременно или в одной композиции, что и агент. Полагается, что анти-CD19-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вводимые до или после другого агента, выражение «в комбинации» с этим агентом используется, даже если антитело или антигенсвязывающий фрагмент и второй агент вводят разными путями. Там, где это возможно, дополнительные терапевтические агенты, вводимые в комбинации с антителами или антигенсвязывающими фрагментами, раскрытыми здесь, вводят в соответствии со схемой, приведенной в информационном вкладыше о продукте для дополнительного терапевтического агента, или в соответствии с Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57 Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57 edition (November 2002)) или протоколами, хорошо известными в данной области.
[000307] Настоящее раскрытие дополнительно обеспечивает способы применения анти-CD19-антител или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к способам ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD19, in vivo или in vitro, включающим: контактирование клеток, экспрессирующих CD19, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, обеспеченными здесь. В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к способам модуляции активности CD19 в клетке, экспрессирующей CD19, включающим воздействие на клетку, экспрессирующую CD19, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, обеспеченными здесь.
[000308] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает способы детектирования присутствия или количества CD19 в образце, включающие контактирование образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и определение наличия или количества CD19 в образце.
[000309] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает способы диагностики заболевания или патологического состояния, связанного с CD19, у субъекта, включающие: а) получение образца от субъекта; b) контактирование образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, обеспеченными здесь; в) определение присутствия или количества CD19 в образце; и d) определение наличия заболевания или патологического состояния, связанного с CD19, у субъекта.
[000310] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает наборы, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обеспеченные здесь, необязательно конъюгированные с детектируемой молекулой. Наборы могут быть пригодны для детектирования CD19 или диагностики заболеваний, связанных с CD19.
[000311] В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие также обеспечивает применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, обеспеченных здесь, в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или патологического состояния, связанного с CD19, у субъекта, в производстве диагностического реагента для диагностики заболевания или состояния, связанного с CD3.
[000312] Следующие примеры приведены для лучшей иллюстрации заявленного изобретения и не должны интерпретироваться как ограничивающие объем изобретения. Все конкретные композиции, материалы и способы, описанные ниже, полностью или частично, входят в объем настоящего изобретения. Эти конкретные композиции, материалы и способы предназначены не для ограничения изобретения, а только для иллюстрации конкретных вариантов осуществления, попадающих в объем изобретения. Специалист в данной области может разработать эквивалентные композиции, материалы и способы без приложения изобретательских усилий и без отклонения от объема изобретения. Понятно, что в описанных здесь процедурах может быть сделано много изменений, при этом они все еще остаются в рамках настоящего изобретения. Заявители изобретения предполагают, что такие варианты включаются в объем изобретения.
Пример 1: получение материалов
[000313] 1.1 Получение референсного антитела
[000314] Ген вариабельной области референсных анти-CD19- антител (WBP701-BMK1 соответствует huB4 в заявке на патент США US20140072587A1; WBP701-BMK2 соответствует hBU12 в заявке на патент США US8242252B2; WBP701-BMK3 соответствует 21D4 в заявке на патент США US8097703B2) клонировали в экспрессионный вектор, содержащий ген человеческой Fc-области. Экспрессионные плазмиды трансфектировали в клетки Expi293 (Invitrogen-A14527) с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine293 (Invitrogen-A14524). Клетки культивировали в среде для экспрессии Expi293 (Invitrogen-A1435101) на орбитальном шейкере с платформой, вращающимся со скоростью 135 об/мин, в термостате при 37°С. Собранный супернатант очищали с использованием колонки с белком A (GE Healthcare 17543802).
[000315] Референсные антитела WBP701-BMK1, WBP701-BMK2 и WBP701-BMK3, полученные в соответствии с вышеуказанным способом, анализировали с использованием SDS-PAGE. На фиг. 1 и 2 показано, что все три полученных референсных антитела мигрировали соответственно кажущейся молекулярной массе 25 кДа и 55 кДа в SDS-PAGE в восстанавливающих условиях, которые соответствуют легкой цепи и тяжелой цепи. Основная полоса в невосстанавливающих условиях соответствует полному IgG с молекулярной массой 150 кДа. Чистота референсных антител выше 95% (см. фиг. 1 и 2).
[000316] 1.2 Получение клеточных линий человека или обезьяны Cynomolgus, экспрессирующих CD19
6
2
[000317] Ген полноразмерного CD19 человека или обезьяны Cynomolgus клонировали в вектор pcDNA3.3. Вкратце, клетки FreeStyle 293F в объеме 30 мл (ThermoFisher-R79007) с плотностью 1×10/мл трансфектировали 30 мкг ДНК с использованием реагента Plasfect (Bioline-46025). Трансфектированные клетки культивировали в термостате при 37°С, 8% СО и скорости встряхивания 100 об/мин. Через 24 ч после трансфекции использовали бластидин (Invitrogen-A1113902) в конечной концентрации 4-10 мкг/мл для получения стабильного пула. Селектированные клоны тестировали с помощью FACS с использованием анти-CD19-антитела. После двух-трех пассажей селекции клетки обогащали PE-конъюгированным анти-CD19-антителом и микрогранулами с антителами к PE (Miltenyi-013-048-801). Стабильные моноклеточные клоны выделяли лимитирующим разведением и скринировали с помощью FACS с использованием анти-CD19-антитела.
[000318] Ген полноразмерного CD19 человека или обезьяны Cynomolgus клонировали в вектор pcDNA3.3. Затем каждый экспрессионный вектор трансфектировали в клетки CHO-K1, соответственно, с использованием Lipofectamine 2000. Клетки культивировали в среде F12-K с 10% FBS. Бластидин добавляли через 24-48 ч после трансфекции. После двух-трех пассажей селекции клетки обогащали PE-конъюгированным анти-CD19-антителом и микрогранулами с антителами к PE (Miltenyi-013-048-801). Стабильные моноклеточные клоны выделяли лимитирующим разведением и скринировали с помощью FACS с использованием анти-CD19-антитела.
[000319] Экспрессию человеческого CD19 и CD19 обезьяны Cynomolgus в трансфектированных клеточных линиях определяли с использованием анти-CD19-антитела методом проточной цитометрии. Все трансфектированные клеточные линии WBP701.293F.hPro1.FL.A2, WBP701.CHO-K1.hPro1.FL.B4, WBP701.cPro1.293F.FL.C1 и WBP701.CHO-K1.cpro1.FL.C9 показали высокий уровень экспрессии CD19 человека или обезьяны (фиг.3А-3D).
Пример 2: получение антитела
[000320] 2.1 Иммунизация
6
[000321] Мышей Balb/c иммунизировали трансфектированными CD19 клетками 293F. Лизат клеточных мембран смешивали с адъювантом, включающим CpG-ODN и Adju-Phos или Titer-Max. Мышей иммунизировали дважды введением в подушечку лапы, подкожно или внутрибрюшинно с интервалом две недели. Мышам с высоким титром в сыворотке проводили конечное бустирование лизатом клеточных мембран из расчета 1×10 клеток/животное и 10 мкг белка ECD/животное в PBS.
[000322] 2.2 Определение титра в сыворотке крови
5
[000323] Титр в сыворотке крови определяли проточной цитометрией. Клетки CHO-K1, трансфектированные CD19, распределяли в 96-луночных планшетах с U-образным дном (BD) из расчета 1×10 клеток/лунку. Мышиную сыворотку разводили в соотношении 1:3, начиная с 100-кратного разведения, используя буфер для окрашивания (1X PBS/1% BSA). Образцы сыворотки инкубировали с клетками в течение 1 ч при 4°С. После промывания клеток буфером для окрашивания добавляли PE-конъюгированное козье антимышиное антитело к Fc IgG (Jackson) и инкубировали при 4°C в темноте в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали и ресуспендировали в 100 мкл буфера для окрашивания. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии (BD Canto II) и анализировали с помощью FlowJo.
[000324] У всех мышей был обнаружен CD19-специфический титр. Мышей с высоким титром сыворотки отбирали для получения гибридомы слиянием (таблица 3).
Таблица 3Титр в сыворотке
Мышь#
1
2
3
4
5
До отбора проб крови на клетках CHO-K1.CD19
<100
<100
<100
<100
<100
Титр на клетках CHO-K1.CD19
1968300
656100
218700
656100
72900
Титр на родительских клетках CHO-K1
2700
2700
900
300
2700
[000325] 2.3 Получение гибридомы
4
[000326] Клетки лимфатических узлов подвергали слиянию с клетками миеломы Sp2/0 посредством электрослияния в соответствии с общими процедурами электрослияния. После слияния клетки высевали в 96-луночные планшеты из расчета 1×10 лимфоцитов/лунку со средой DMEM с 20% FBS и 1% HAT. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 10-12 суток.
[000327] 2.4 Скрининг антител
[000328] 2.4.1 Связывание с человеческим CD19
5
[000329] Клетки CHO-K1, трансфектированные человеческим CD19, высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD) с плотностью 1×10 клеток/лунку. Супернатанты гибридом переносили на чашки и инкубировали с клетками в течение 1 ч при 4°С. Затем клетки дважды промывали буфером для окрашивания (BSA/1X PBS). Добавляли PE-конъюгированное козье антимышиное антитело к Fc IgG (Jackson 115-115-164) и инкубировали при 4°C в темноте в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали и ресуспендировали в 100 мкл буфера для окрашивания. Интенсивность флуоресценции измерялис помощью проточной цитометрии (BD Canto II) и анализировали с помощью FlowJo.
[000330] 2.4.2 Связывание с CD19 обезьяны Cynomolgus
5
[000331] Клетки CHO-K1, трансфектированные CD19 обезьяны Cynomolgus, высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD) с плотностью 1×10 клеток/лунку. Супернатанты гибридом переносили на чашки и инкубировали с клетками в течение 1 ч при 4°С. Затем клетки дважды промывали буфером для окрашивания (BSA/ 1X PBS). Добавляли PE-конъюгированное козье антимышиное антитело к Fc IgG (Jackson 115-115-164) и инкубировали при 4°C в темноте в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали и ресуспендировали в 100 мкл буфера для окрашивания. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии (BD Canto II) и анализировали с помощью FlowJo.
[000332] 2.4.3 Анализ интернализации
2
[000333] Fab-ZAP представляет химический конъюгат козьего моновалентного античеловеческого антитела и инактивирующего рибосому белка сапорина. Fab-ZAP используется для определения способности антител к интернализации. Концентрацию IgG в супернатантах гибридом определяли методом ELISA. Нормализованные гибридомные супернатанты и Fab-ZAP смешивали в молярном соотношении 1:3. Клетки Ramos (5000/лунку) инкубировали с различными концентрациями конъюгата в термостате при 37°С, 5% CO в течение 96 ч. Цитотоксичность для клеток определяли с помощью CellTiter Glo (Promega). Жизнеспособность клеток (%) рассчитывали следующим образом: жизнеспособность клеток (%) = RLU образца/RLU контроля × 100%, где RLU обозначает относительные световые единицы.
[000334] Результаты
[000335] Супернатант гибридом использовали для первичного скрининга. В первичном скрининге связывания было идентифицировано 116 гибридом, которые могут продуцировать антигенспецифические связывающие антитела. Затем подтверждали связывание антигенспецифических гибридом с трансфектированными CD19 клетками CHO-K1 и проводили контрольный скрининг на родительских клетках CHO-K1. Было подтверждено связывание 40 селектированных гибридомных линий на клетках Ramos. Положительные связывающие вещества затем подвергали скринингу в анализе Fab-Zap. Для субклонирования были отобраны 13 гибридомных линий на основе способности к связыванию и интернализации.
[000336] 2.5 Субклонирование гибридом
2
[000337] Гибридомные клетки каждой выбранной линии высевали в 96-луночные планшеты из расчета 1 клетка/лунку. Планшеты выдерживали во влажном термостате при 37°С, 6% СО в течение 10-12 суток. Одиночные клоны отбирали и анализировали FACS.
[000338] 2.6 Изотип
[000339] Изотип антитела идентифицировали с помощью ELISA. Планшеты (Nunc) покрывали козьим антимышиным IgG1, антимышиным IgG2a, антимышиным IgG2b, антимышиным IgG3, антимышиными антителами IgM в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при 4°С. После блокирования и промывания супернатанты гибридом переносили на покрытые планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты инкубировали с вторичным антителом козьим антимышиным каппа HRP или козьим антимышиным лямбда HRP (Southern Biotech) в течение 45 мин. После промывания добавляли субстрат TMB и реакцию останавливали 2 М HCl. Оптическую плотность при 450 нм определяли с использованием микропланшетного ридера (Molecular Device).
[000340] Результаты
[000341] Подтверждали связывание субклонов гибридом с клеточной линией CD19, и были также определены их изотипы (см. таблицу 4). Селектированные субклоны очищали и дополнительно оценивали в анализе связывания, анализе интернализации, анализе перекрестного связывания между семействами и анализе биннинга.
Таблица 4Изотип антител
Антитело
Изотип
WBP7011_4.34.11
мышиный IgG2a, каппа
WBP7011_4.87.6
мышиный IgG2a, каппа
WBP7011_4.100.1
мышиный IgG2a, каппа
WBP7011_4.106.3
мышиный IgG2a, каппа
WBP7011_4.155.8
мышиный IgG2a, каппа
WBP7011_4.15.10
мышиный IgG1, каппа
WBP7011_4.56.1
мышиный IgG2a, каппа
WBP7011_4.202.9
мышиный IgG2a, каппа
WBP7011_4.231.5
мышиный IgG2b, каппа
WBP7011_4.108.3
мышиный IgG2a, каппа
WBP7011_4.191.3
мышиный IgG1, каппа
WBP7011_4.194.10
мышиный IgG2b, каппа
WBP7011_4.225.7
мышиный IgG2a, каппа
Пример 3: характеристика антител-кандидатов
[000342] 3.1 Очистка антител
[000343] Собранные супернатанты гибридом загружали на колонку с белком A (MabSelect SuRe, GE) после доведения рН до 7,0. Антитела элюировали глицином с последующей немедленной нейтрализацией с использованием 1 М Трис-буфера. Концентрацию антител определяли Nano Drop (Thermal-Fisher). Чистоту белков оценивали с помощью SDS-PAGE (Invitrogen, NuPAGE 4%-12% бис-Трис-гель) и HPLC-SEC (Agilent).
[000344] 3.2 Аффинность с использованием FACS
4
D
[000345] Трансфектированные CD19 клетки CHO-K1 или клетки Ramos высевали в 96-луночные планшеты (BD) с плотностью 5×10 клеток/лунку. Готовили серийные разведения антител, подлежащих тестированию, в буфере для окрашивания (1X PBS/1% BSA) и инкубировали с клетками при 4°C в течение 1 ч. После удаления супернатантов добавляли PE-конъюгированное козье антимышиное антитело к Fc IgG (Jackson 115-1154-164) и инкубировали при 4°С в темноте в течение 30 мин. Клетки промывали один раз и ресуспендировали в 100 мкл буфера для окрашивания. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии (BD Canto II) и анализировали с помощью FlowJo. Концентрацию связанного IgG и свободного IgG рассчитывали на основе интенсивностей флуоресценции количественных гранул (набор для количественного определения флуоресценции PE, BD 340495). K рассчитывали с использованием анализа Скэтчарда.
[000346] Результаты
D
[000347] Аффинность селектированных антител-кандидатов тестировали на клетках CHO-K1, трансфектированных CD19, методом проточной цитометрии. Значения K суммированы в таблице 5. Все антитела-кандидаты демонстрировали аффинность связывания с человеческим CD19 на субнаномолярном уровне.
Таблица 5Аффинность антител-кандидатов
Антитело
K<sub>D</sub> (M)
W7011-4.34.11
1,81E-10
W7011-4.87.6
9,55E-11
W7011-4.100.1
2,13E-10
W7011-4.106.3
2,31E-10
W7011-4.155.8
9,49E-10
W7011-4.15.10
1,70E-10
W7011-4.56.1
1,18E-10
W7011-4.202.9
8,47E-10
W7011-4.231.5
1,70E-10
W7011-4.108.3
2,52E-10
W7011-4.191.3
1,14E-10
W7011-4.194.10
4,20E-10
W7011-4.225.7
7,35E-10
[000348] 3.3 Связывание с человеческим CD19
5
[000349] Клетки Ramos высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD) с плотностью 1×10 клеток/лунку. Готовили серийные разведения очищенного антитела в буфере для окрашивания (1X PBS/1% BSA) и инкубировали с клетками в течение 1 ч при 4°C. Затем клетки дважды промывали буфером для окрашивания (BSA/1XPBS). Добавляли PE-конъюгированное козье антимышиное антитело к Fc IgG (Jackson 115-115-164) и инкубировали при 4°C в темноте в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали и ресуспендировали в 100 мкл буфера для окрашивания. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии (BD Canto II) и анализировали с помощью FlowJo.
50
50
[000350] Связывающую активность селектированных субклонов анализировали на клетках Ramos с помощью проточной цитометрии (фиг. 4). Значения EC в связывании суммированы в таблице 6. Все антитела-кандидаты показали EC в анализе связывания на субнаномолярном уровне.
Таблица 6Связывающая активность селектированных субклонов
Клон#
EC<sub>50</sub> (нМ)
W7011-4.34.11
0,23
W7011-4.34.17
0,21
W7011-4.34.18
0,24
W7011-4.87.6
0,10
W7011-4.87.8
0,09
W7011-4.87.18
0,09
W7011-4.100.1
0,17
W7011-4.100.14
0,17
W7011-4.100.18
0,18
W7011-4.106.3
0,23
W7011-4.106.9
0,18
W7011-4.106.20
0,19
W7011-4.155.8
0,85
W7011-4.155.14
0,82
W7011-4.155.17
0,69
W7011-4.15.10
0,31
W7011-4.15.13
0,32
W7011-4.56.1
0,10
W7011-4.56.2
0,08
W7011-4.202.9
0,64
W7011-4.231.5
0,12
W7011-4.231.6
0,05
W7011-4.231.15
0,09
W7011-4.108.3
0,19
W7011-4.108.6
0,09
W7011-4.108.11
0,05
W7011-4.202.3
0,58
W7011-4.202.8
0,34
W7011-4.191.3
0,04
W7011-4.191.6
0,07
W7011-4.191.16
0,13
W7011-4.194.10
0,15
W7011-4.194.11
0,26
W7011-4.194.13
0,34
W7011-4.225.7
0,45
W7011-4.225.9
0,39
WBP701.BMK3
0,11
[000351] 3.4 Связывание с CD19 обезьяны Cynomogus
5
[000352] Клетки CHO-K1, трансфектированные CD19 обезьяны Cynomolgus, высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD) с плотностью 1×10 клеток/лунку. Готовили серийные разведения очищенного антитела в буфере для окрашивания (1X PBS/1% BSA) и инкубировали с клетками в течение 1 ч при 4°C. Затем клетки дважды промывали буфером для окрашивания (BSA/1XPBS). Добавляли PE-конъюгированное козье антимышиное антитело к Fc IgG (Jackson 115-115-164) и инкубировали при 4°C в темноте в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали и ресуспендировали в 100 мкл окрашивающего буфера. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии (BD Canto II) и анализировали с помощью FlowJo.
50
[000353] Активность связывания антител-кандидатов с CD19 обезьяны Cynomogus оценивали с использованием линии клеток CHO-K1, трансфектированных CD19 обезьяны Cynomolgus (фиг.5). Значения EC в связывании суммированы в таблице 7. Все селектированные клоны показали сильное связывание с клетками, экспрессирующими CD19 обезьяны Cynomolgus.
Таблица 7Связывающая активность с CD19 обезьяны Cynomolgus
Антитело
EC<sub>50</sub> (нМ)
W7011-4.34.11
0,4427
W7011-4.87.6
0,285
W7011-4.100.1
0,4384
W7011-4.106.3
0,4959
W7011-4.155.8
1,542
W7011-4.15.10
0,4598
W7011-4.56.1
0,4381
W7011-4.202.9
2,299
W7011-4.231.5
0,628
W7011-4.108.3
0,8634
W7011-4.191.3
0,5984
W7011-4.194.10
0,9959
W7011-4.225.7
1,77
WBP701-BMK1
0,4473
WBP701-BMK2
0,7407
WBP701-BMK3
0,1936
[000354] 3.5 Анализ интернализации
2
[000355] Fab-ZAP используется для определения способности антител к интернализации. Серийные разведения антител смешивалис Fab-Zap в молярном соотношении 1:3. Клетки Ramos (5000/лунку) инкубировали с различными концентрациями конъюгата в термостате с 37°С, 5% CO в течение 96 ч. Цитотоксичность для клеток определяли с помощью CellTiter Glo (Promega). Жизнеспособность клеток (%) рассчитывали следующим образом: жизнеспособность клеток (%) = RLU образца/RLU контроля × 100%.
50
50
[000356] Активность к интернализации селектированных субклонов тестировали на клетках Ramos с использованием анализа Fab-Zap (фиг.6). Значения EC жизнеспособности клеток суммированы в таблице 8. Все антитела-кандидаты могут интернализоваться в клетки Ramos и показали значения EC на пикомолярном уровне в анализе Fab-Zap.
Таблица 8Анализ Fab-Zap
Антитело
EC<sub>50</sub> (пМ)
W7011-4.34.11
7
W7011-4.34.17
8,9
W7011-4.34.18
8,9
W7011-4.87.6
8,5
W7011-4.87.8
5,8
W7011-4.87.18
7,2
W7011-4.100.1
14,8
W7011-4.100.14
11,5
W7011-4.100.18
11
W7011-4.106.3
13,6
W7011-4.106.9
12,7
W7011-4.106.20
16,2
W7011-4.155.8
27,6
W7011-4.155.14
44,9
W7011-4.155.17
30,2
W7011-4.15.10
13,9
W7011-4.15.13
11
W7011-4.56.1
8,4
W7011-4.56.2
5,2
W7011-4.61.10
23,1
W7011-4.61.12
21,1
W7011-4.61.16
19,4
W7011-4.231.5
8,5
W7011-4.231.6
14,8
W7011-4.231.15
14,7
W7011-4.108.3
20,6
W7011-4.108.6
15,7
W7011-4.108.11
18,7
W7011-4.202.3
28,3
W7011-4.202.8
35,4
W7011-4.202.9
23,6
W7011-4.191.3
18,4
W7011-4.191.6
19,1
W7011-4.191.16
18,2
W7011-4.194.10
11,7
W7011-4.194.11
11,8
W7011-4.194.13
12,8
W7011-4.225.7
15
W7011-4.225.9
15,8
[000357] 3.6 Эпитопное бинирование
5
[000358] CD19-трансфектированные клетки WBP701.CHO-K1.hPro1.B4 высевали в 96-луночные планшеты (BD) с плотностью 1×10 клеток/лунку. Готовили сенийные разведения аантител, подлежащих тестированию, и смешивали с референсными антителами. Смеси добавляли в планшет и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. После промывки добавляли PE-конъюгированное козье антимышиное антитело к Fc IgG (Jackson) и инкубировали при 4°C в темноте в течение 30 мин. Клетки дважды промывали и ресуспендировали в 100 мкл буфера для окрашивания (1X PBS/1% BSA). Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии (BD Canto II) и анализировали с помощью FlowJo.
[000359] Селектированные клоны-кандидаты тестировали на конкурентное связывание с референсными антителами BMK1, BMK2 и BMK3. Некоторые антитела-кандидаты могут блокировать связывание референсных антител с CD19. W7011-4.155.8, W7011-4.202.9 и W7011-4.225.7 не конкурируют с референсными антителами (фиг.7). На основании результатов конкурентного связывания антитела относятся к двум эпитопным бинам (таблица 9).
Таблица 9Эпитопный бин антител-кандидатов
Бин 1
Бин 2
WBP701-BMK1
W7011-4.155.8
WBP701-BMK2
W7011-4.202.9
WBP701-BMK3
W7011-4.225.7
W7011-4.34.11
W7011-4.87.6
W7011-4.100.1
W7011-4.106.3
W7011-4.15.10
W7011-4.56.1
W7011-4.231.5
W7011-4.108.3
W7011-4.191.3
W7011-4.194.10
[000360] После секвенирования клонов антител было установлено, что аминокислотная последовательность клонов антител W7011-4.155.8, W7011-4.202.9 и W7011-4.225.7 идентична. Аминокислотные и нуклеиновокислотные последовательности для клонов антител приведены в разделе «Подробное описание».
Пример 4: гуманизация антител и созревание аффинности
[000361] 4.1. Секвенирование гибридом
[000362] РНК выделяли из клеток гибридомы с использованием реагента Trizol (Invitrogen-15596018). кДНК амплифицировали с использованием набора 5'-RACE (Takara-28001488) с последующей амплификацией ПЦР с использованием 3'-вырожденных праймеров и 3'-адаптерных праймеров (ExTaq: Takara-RR001B). Фрагменты ПЦР вставляли в вектор pMD18-T (Takara-D101C) и отправляли для секвенирования (Shanghai Biosune).
[000363] Последовательности антител (мышиных) из гибридомы являются такими, как показано в SEQ ID NO: 94-123.
[000364] 4.2 Гуманизация
[000365] Подход «наилучшей подгонки» использовали для гуманизации легких и тяжелых цепей антител. Для легких цепей аминокислотные последовательности соответствующих V-генов подвергали разрушению против собственной базы данных V-геновзародышевой линии человека. Последовательность гуманизированного VL-гена получали заменой последовательностей CDR человека в лучших вариантах на последовательности CDR мыши с использованием определения CDR по Kabat. Для тяжелой цепи получали 4 гуманизированных последовательности, для легкой цепи была получена 1 гуманизированная последовательность в соответствии с методом, описанным выше, и 3 дополнительных последовательности получали посредством разрушения каркаса мыши против базы данных V-гена человеческой зародышевой линии. Каркасы определяли с использованием расширенного определения CDR, где CDR1 по Kabat был удлинен на 5 аминокислот на N-конце. Три лучших варианта использовали для получения последовательностей гуманизированных V-генов. Гуманизированные гены подвергали обратной трансляции, кодон-оптимизировали для экспрессии у млекопитающих и синтезировали с помощью GeneArt Costum Gene Synthesis (Life Technologies). Синтетические гены повторно клонировали в вектор экспрессии IgG, экспрессировали и очищали.
[000366] 4.3 Созревание аффинности
[000367] Каждая аминокислота из шести определяющих комплементарность участков (CDR) была индивидуально мутирована в 20 аминокислот с использованием метода гибридизационного мутагенеза (Kunkel, 1985). ДНК-праймеры, содержащие кодон NNS, кодирующий 20 аминокислот, использовали для введения мутации в каждое целевое положение CDR. Индивидуальные вырожденные праймеры использовали в реакциях гибридизационного мутагенеза. Продукты синтеза для CDR VH и VL объединяли соответственно. 200 нг объединенной библиотеки ДНК трансфектировали в BL21 для получения фрагментов scFv.
2
3
3
[000368] Мутанты сначала подвергали скринингу с помощью ELISA с захватом с использованием периплазматического экстракта бактерий. 96-луночный Maxisorp Immunoplate (Nunc) покрывали анти-c-myc-антителом в буфере для покрытия (200 мМ NaCO/NaHCO, pH 9,2) в течение ночи при 4°C. После блокирования казеином в течение 1 ч при комнатной температуре образцы периплазматического экстракта затем добавляли в планшет и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки добавляли биотинилированный белок ECD CD19 и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей инкубацией со стрепатавидином-HRP в течение 1 ч. После промывки добавляли субстрат TMB и реакцию останавливали 2 М HCl. Оптическую плотность при 450 нм определяли с использованием микропланшетного ридера (Molecular Device).
[000369] Клоны, демонстрирующие сигнал оптической плотности (OD) при 450 нм больше, чем родительский клон, отбирали для секвенирования. Уникальные клоны подтверждали FACS при нормализованной концентрации scFv для определения относительной аффинности связывания мутантного scFv и родительского антитела.
[000370] Точечные мутации в VH и VL, определенные как полезные для связывания с антигеном, дополнительно объединяли для получения дополнительной синергии связывания. Комбинаторные мутанты экспрессировали в виде scFv и подвергали скринингу с использованием ELISA с захватом. Клоны, демонстрирующие сигнал оптической плотности (OD) при 450 нм больше, чем родительский клон, секвенировали и дополнительно подтверждали связыванием FACS.
[000371] 4.4 Аффинность связывания сконструированных антител
[000372] 4.4.1 WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k
D
[000373] Антитело WBP7011-4.34.11 гуманизировали и подвергали аффинному созреванию. Аффинность сконструированного антитела WBP7011-4.34.11-z1-m5 определяли на клетках Ramos с помощью FACS (фиг.8). K рассчитывали с использованием анализа Скэтчарда. Аффинность WBP7011-4.34.11-z1-m5-IgG1k составляет 0,23 нМ.
[000374] 4.4.2 WBP7011-4.87.6-z1-IgG1k(N-S)
D
[000375] Антитело WBP7011-4.87.6 гуманизировали и подвергали аффинному созреванию. Аффинность сконструированного антитела WBP7011-4.87.6-z1-IgG1k (N-S) определяли на клетках Ramos с помощью FACS (фиг. 9). K рассчитывали с использованием анализа Скэтчарда. Аффинность WBP7011-4.87.6-z1-IgG1k(N-S) составляет 0,25 нМ.
[000376] 4.4.3 W7011-4.155.8-z1-uIgG1K
D
[000377] Антитело W7011-4.155.8 гуманизировали. Аффинность гуманизированного антитела W7011-4.155.8-z1-uIgG1K определяли на трансфектированных CD19 клетках CHO-K1 с помощью FACS (фиг. 10). K рассчитывали с использованием анализа Скэтчарда. Аффинность к W7011-4.155.8-z1-uIgG1K составляет 0,82 нМ.
[000378] 4.5. Последовательности сконструированных антител
[000379] Последовательности сконструированных антител являются такими, как показано в SEQ ID NO: 124-135.
Пример 5: получение конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC)
[000380] Антитела диализовали против буфера в буфере PBS (pH 7,4) и смешивали с DMA (Alfa Aesar). Затем добавляли DM1-SMCC (BrightGene) и смесь инкубировали при 22°С с легким вращением для конъюгации.
[000381] Для удаления свободного лекарственного средства продукт ADC диализовали против буфера в буфере для хранения ADC с использованием ультрафильтратора 30 кДа (Millipore). После 8-кратного буферного обмена продукт ADC фильтровали через мембранный фильтр 0,22 мкм для окончательной характеристики.
[000382] Концентрацию ADC определяли на UV/Vis спектрофотометре (NanoDrop). Значение DAR определяли UV/Vis спектрофотометрией и SEC-ВЭЖХ. Уровень агрегации и чистоту определяли методом SEC-HPLC. Свободный препарат определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ. Содержание эндотоксинов определяли турбидиметрическим кинетическим анализом.
[000383] Основные антитела конъюгировали с DM1. Концентрацию, чистоту, DAR, уровень агрегации и % свободного лекарственного средства оценивали после конъюгации (таблица 10).
Таблица 10Характеристика антитела, конъюгированного с DM1
Антитело
Конц. мг/мл
Чистота %
Свободное лекарственное средство %
Эндотоксины EU/мг
УФ-
SEC-DAR
Аггр. %
DAR
W7011-BMK1-DM1
14,2
95,45
0
0,039
3,57
3,57
4,54
W7011-4.87.6-z1-lgG1K(N-S)-DM1
9,71
97,7
1,06
2,36
3,38
2,95
2,31
W7011-4.34.11-z1-m5-lgG1K-DM1
6,45
96,38
0
следы
3,32
3,38
3,02
IgG1K изотипический контроль-DM1
5,85
98,47
0
0,086
2,86
2,69
1,53
Пример 6: анализ токсичности ADC для клеток
[000384] Клетки В-лимфомы (5000 на лунку) инкубировали с различными концентрациями DM1-конъюгированных антител при 37°С в течение 72 ч. Цитотоксичность для клеток определяли с помощью CellTiter Glo (Promega). Жизнеспособность клеток (%) рассчитывали следующим образом: жизнеспособность клеток (%) = RLU образца/RLU контроля × 100%.
50
[000385] Конъюгированные с DM1 антитела тестировали в анализе цитотоксичности на клетках Daudi, Nalm-6 и WSU-DLCL2 (фиг. 11, 12, 13). Значения EC обобщены в таблицах 11, 12 и 13. ADC WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K(N-S)-DM1 показал лучшую цитотоксическую активность, чем WBP701-BMK1-DM1, на всех тестированных опухолевых клетках. ADC WBP7011-4.34.11-z1-m5-uIgG1K-DM1 показал сравнимую цитотоксическую активность с WBP701-BMK1-DM1.
Таблица 11Анализ цитотоксичности на клетках Daudi
Антитело
EC<sub>50</sub> (нМ)
WBP7011-4.34.11-z1-m5-uIgG1K-DM1
27
WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S)-DM1
1,9
WBP701-BMK1-DM1
22
IgG1k изотипический контроль-DM1
отсутствует
Таблица 12Анализ цитотоксичности на клетках Nalm-6
Антитело
EC<sub>50</sub> (нМ)
WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S)-DM1
0,73
WBP701-BMK1-DM1
отсутствует
IgG1k изотипический контроль-DM1
отсутствует
Таблица 13Анализ цитотоксичности на клетках WSU-DLCL2
Антитело
EC<sub>50</sub> (нМ)
WBP7011-4.34.11-z1-m5-uIgG1K-DM1
10,1
WBP7011-4.87.6-z1-IgG1K (N-S)-DM1
1,4
WBP701-BMK1-DM1
9,0
Пример 7: анализ противоопухолевой активности ADC
[000386] Культивирование клеток
2
[000387] Опухолевые клетки Nalm-6 поддерживали in vitro в виде суспензионной культуры в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, при 37°C во влажной атмосфере (95% воздуха и 5% CO). Опухолевые клетки обычно субкультивировали дважды в неделю. Клетки в фазе экспоненциального роста собирали и подсчитывали для инокуляции опухолевых клеток.
[000388] 7.2. Инокуляция опухолевых клеток и распределение на группы
3
Каждой мыши подкожно имплантировали на правом боку опухолевые клетки Nalm-6 (10 млн + матригель) для развития опухоли. Обработку начинали, когда средний объем опухолей достигал 113 мм. Введение испытуемых продуктов и количество животных в каждой группе показано в следующей таблице.
Таблица 14Введение тестируемых ADC и количество животных в каждой группе
Группа
Обработка
n
Доза(мг/кг)
Объем дозы(мкл/г)
Путь введения
Схема
1
Изотипический контроль-DM1
6
10
10
в/в
два раза в неделю×3 недели
2
W7011-BMK1-DM1
6
1
10
в/в
два раза в неделю×3 недели
3
W7011-BMK1-DM1
6
10
10
в/в
два раза в неделю×3 недели
4
W7011-4.87.6-z1-ulgG1k (N-S)-DM1
6
1
10
в/в
два раза в неделю×3 недели
5
W7011-4.87.6-z1-ulgG1k (N-S)-DM1
6
3
10
в/в
два раза в неделю×3 недели
6
W7011-4.87.6-z1-ulgG1k (N-S)-DM1
6
10
10
в/в
два раза в неделю×3 недели
[000389] 7.3 Наблюдения
[000390] Протокол и любую поправку(и) или процедуры, касающиеся содержания и использования животных в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC) WuXi AppTec перед проведением эксперимента. В ходе исследования содержание и использование животных проводили в соответствии с положениями Ассоциации по оценке и аккредитации работы с лабораторными животными (AAALAC). После инокуляции животных ежедневно проверяли на проявление симптомов заболевания и смертность. Во время обычного мониторинга животных проверяли на любые эффекты развития опухолей и обработки на нормальное поведение, такие как подвижность, потребление корма и воды, повышение/снижение массы тела (массу тела измеряли каждый день), изменение состояния глаз/шерстного покрова и любой другой аномальный эффект. Падеж животных и наблюдаемые клинические признаки регистрировали на основе количества животных в каждой подгруппе.
[000391] 7.4 Измерения опухолей и конечные точки
3
2
i
0
i
0
0
0
[000392] Основной конечной точкой была задержка роста опухолей или излечение мышей. Размер опухолей измеряли два раза в неделю в двух измерениях, используя штангенциркуль, и объем выражали в мм, используя формулу: V=0,5 a × b, где a и b представляют длинный и короткий диаметры опухоли соответственно. Затем размер опухолей использовали для расчета значения T/C и TGI. Значение T/C (в процентах) является показателем противоопухолевой эффективности; T и C представляют средние объемы опухолей в обработанной и контрольной группах соответственно на сутки 21 и 28. TGI рассчитывали для каждой группы по формуле: TGI (%) = [1-(T-T)/(V- V)] × 100; где Ti представляет средний объем опухолей в группе обработки на сутки 21 и 28, T представляет средний объем опухолей в группе обработки на день начала лечения, Vi представляет средний объем опухолей в контрольной группе с носителем на сутки 21 и сутки 28, и V представляет средний объем опухолей в группе с носителем в день начала лечения.
[000393] Результаты по всем группам были сняты на сутки 28 согласно протоколу.
[000394] У всех животных отсутствовало негативное изменение массы тела в течение периода эксперимента.
[000395] 7.5 Исследование эффективности на модели опухолевого ксенотрансплантата лимфомы Nalm-6
[000396] В данном исследовании эффективность конъюгатов референсное антитело-лекарственное средство W7011-BMK1-DM1 и W7011-4.87.6-z1-uIgG1k(NS)-DM1 оценивали на опухолевом ксенотрансплантате лимфомы Nalm-6 у самок мышей CB17-SCID. Объемы опухолей во всех группах на разные временные точки показаны на фиг. 14.
3
3
3
3
3
3
[000397] На PG-D21 средний объем опухолей в группе, обработанной контрольным изотипом, достигал 840 мм. Обработка W7011-BMK1-DM1 в дозе 1 мг/кг (TV=364 мм, TGI=66%, p<0,01) и 10 мг/кг (TV=327 мм, TGI=71%, p<0,001) показала высокую противоопухолевую активность. ADC W7011-4.87.6-z1-uIgG1k(NS)-DM1 в дозах 1 мг/кг (TV=398 мм, TGI=61%, p <0,01), 3 мг/кг (TV=387 мм, TGI=62% , p<0,01) и 10 мг/кг (TV=332 мм, TGI=70%, p<0,001) - во всех случаях проявил высокую противоопухолевую активность.
3
3
3
3
3
3
[000398] После введения суспензии в течение 1 недели средний объем опухолей в группе, обработанной изотипическим контролем, достигал 1266 мм. Обработка W7011-BMK1-DM1 в дозе 1 мг/кг (TV=593 мм, TGI=58%, p<0,01) и 10 мг/кг (TV=499 мм, TGI=67%, p<0,001) показала высокую противоопухолевую активность. ADC W7011-4.87.6-z1-uIgG1k(NS)-DM1 в концентрации 1 мг/кг (TV=562 мм, TGI=61%, p<0,01), 3 мг/кг (TV=556 мм, TGI=62% , p<0,01) и 10 мг/кг (TV=502 мм, TGI=66%, p<0,001) - во всех случаях проявил высокую противоопухолевую активность.
[000399] У всех животных отсутствовало негативное изменение массы тела в течение периода эксперимента.
--->
Список последовательностей
<110>  WUXI BIOLOGICS (SHANGHAI) CO. LTD.
WUXI BIOLOGICS (CAYMAN) INC.
<120>  НОВЫЕ АНТИ-CD19-АНТИТЕЛА
<130>  053674-8013WO02
<160>  141
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  1
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Val Ile His
1               5                   10
<210>  2
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  2
Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ala
<210>  3
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  3
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  4
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  4
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
<210>  5
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  5
Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  6
Leu Gln Val Thr His Val Pro Tyr Thr
1               5
<210>  7
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  7
Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Tyr Trp Met Asn
1               5                   10
<210>  8
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  8
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  9
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  9
Arg Tyr Phe Arg Tyr Asp Tyr Trp Tyr Ser Asp Val
1               5                   10
<210>  10
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  10
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  11
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  11
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210>  12
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  12
His Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>  13
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  13
Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr Asn Met Tyr
1               5                   10
<210>  14
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  14
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  15
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  15
Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  16
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  16
Ser Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met His
1               5                   10
<210>  17
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  17
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  18
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  18
His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  19
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  19
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Val Ile His
1               5                   10
<210>  20
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  20
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  21
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  21
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  22
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  22
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His
1               5                   10
<210>  23
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  23
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr His Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  24
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  24
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Phe
1               5                   10
<210>  25
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  25
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Ile His
1               5                   10
<210>  26
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  26
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Thr Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  27
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  27
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  28
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  28
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Val Ile His
1               5                   10
<210>  29
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  29
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Ala Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  30
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  30
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  31
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  31
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Ile His
1               5                   10
<210>  32
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  32
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  33
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  33
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  34
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  34
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Ile His
1               5                   10
<210>  35
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  35
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Glu Tyr Ser Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  36
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  36
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  37
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  37
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His
1               5                   10
<210>  38
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  38
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  39
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  39
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  40
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  40
Arg Ser Ser Gln Thr Leu Glu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1               5                   10                  15
<210>  41
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  41
Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  42
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  42
Leu Gln Val Thr His Val Pro Tyr Thr
1               5
<210>  43
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  43
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His
1               5                   10
<210>  44
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  44
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  45
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  45
Gly Pro Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  46
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  46
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
20                  25
<210>  47
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  47
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>  48
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  48
Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
20                  25                  30
<210>  49
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  49
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  50
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  50
Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210>  51
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  51
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  52
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  52
Gly Val Leu Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  53
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  53
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  54
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20                  25
<210>  55
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  55
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>  56
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  56
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  57
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  57
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  58
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  58
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210>  59
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  59
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  60
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  61
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  61
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  62
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  62
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20                  25
<210>  63
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  63
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>  64
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  64
Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
1               5                   10                  15
Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  65
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  65
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Thr Ser
1               5                   10
<210>  66
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys
20
<210>  67
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  67
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  68
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  68
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  69
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  69
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1               5                   10
<210>  70
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20                  25
<210>  71
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  71
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>  72
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  72
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  73
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  73
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  74
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  75
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  75
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  76
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  76
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  77
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  77
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  78
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  78
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20                  25
<210>  79
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  79
Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>  80
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  80
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His
1               5                   10                  15
Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Thr
20                  25                  30
<210>  81
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  81
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  82
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  82
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys
20
<210>  83
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  83
Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  84
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  84
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Arg Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  85
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  85
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  86
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  86
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20                  25
<210>  87
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  87
Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>  88
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  88
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Thr
20                  25                  30
<210>  89
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  89
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  90
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  90
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  91
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  91
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  92
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  92
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  93
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  93
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  94
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  94
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  95
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  95
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact aactatgtta ttcactgggt gaagcagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat tttaatcctt acaatgatgg tactgaatac      180
aatgagaagt tcaaagccaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac      240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaaaggtccc      300
tactactacg gtagtagccc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  96
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  96
Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Leu
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val
85                  90                  95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  97
<211>  336
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  97
gatgctgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc       60
atctcttgca ggtctagtca gagccttgaa aacagtaatg gaaacaccta tttgaactgg      120
tacctccaga aaccaggcca gtctccacag ctcctgatct acagggtttc caaccgattt      180
tctggggtcc ttgacaggtt cagtggtagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc      240
agtagagtgg aggctgagga tttgggagtt tatttctgtc tccaagttac acatgtcccg      300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa                                336
<210>  98
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  98
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Tyr Phe Arg Tyr Asp Tyr Trp Tyr Ser Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Thr Ser
115                 120
<210>  99
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  99
caggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt       60
tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt acctattgga tgaactgggt gaagcagagg      120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatgatga tactaagtac      180
aatggaaagt tcaagggtaa agcctcactg actgcagaca aatcctccag caccgcctac      240
atgcagctca tcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagaagatac      300
tttaggtacg actactggta ttccgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtcacc      360
tca                                                                    363
<210>  100
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  101
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  101
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc       60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaaccg      120
gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagat tacactcagg agtcccagca      180
agattcagtg gcagtgggtc tggaacagat tactctctca ccattagtaa cctggaacaa      240
gaagatattg ccacttactt ttgccaccag ggtaatacgc ttccgctcac gttcggtgct      300
gggaccaagc tggagctgaa a                                                321
<210>  102
<211>  116
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  102
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Leu Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>  103
<211>  348
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  103
gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta       60
tcctgcaagg cttctggtta tgcattcact agctacaaca tgtactgggt gaagcagagc      120
catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaatggtga tactacctac      180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagcctac      240
atgcatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtct cactacggcc      300
tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctca                   348
<210>  104
<211>  106
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  104
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Arg Ser Val Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  105
<211>  318
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  105
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga ggagatcacc       60
ctaacctgca gtgccagctc gactgtaaat tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc      120
acttctccca aactcttgat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc      180
ttcagtggca gtgggtctgg gaccttttat tctctcacaa tcagaagtgt ggaggctgaa      240
gatgctgccg attattactg ccatcagtgg agtagttatc cgtacacgtt cggagggggg      300
accaagctgg aaataaaa                                                    318
<210>  106
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  106
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Ala Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  107
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  107
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact aactatgtta tacactgggt gaagcagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactgagtac      180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca catcctccag cacagcctac      240
atggcgctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtac aagaggaccc      300
tattactacg gtggtagccc cttcgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  108
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  108
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Val Met His Trp Met Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr His Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Phe Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  109
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  109
gaggtccagc tgcagcagtc tgggcctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactggat gaaacagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactgagtac      180
catgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac      240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct tttactgtgc aagaggaccc      300
tattactacg gtggtagccc ctttgacttc tggggccaag gcaccactct cacggtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  110
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  110
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Thr Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  111
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  111
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tacactgggt gaagcagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tgctgagtac      180
actgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag tactgcctat      240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctacggtct attactgtgc acgaggaccc      300
tattactacg gtggtagccc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  112
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  112
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Ala Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  113
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  113
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcagt agttatgtta tacactgggt gaagcagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tgctgagtat      180
gctgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag ttctgcctat      240
atggagctcg gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc acgaggaccc      300
tattactacg gtggtagtcc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  114
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  114
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Glu Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Val Ile His Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  115
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  115
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtggagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta ttcactggtt gaagcagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tgctgagtat      180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag tacagcctat      240
atggatctca acagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggaccc      300
tattactacg gtagtagccc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  116
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  116
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Val Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Glu Tyr Ser Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  117
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  117
gaggtccagc tgctgcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta tacactgggt gaagcagagg      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg ttctgagtac      180
agtgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac      240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggaccc      300
tattactacg gtggtagtcc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  118
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  118
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  119
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  119
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac      180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac      240
atggaactca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggaccc      300
tattactacg gtagtagccc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  120
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  120
Asp Ala Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Leu Glu Asn Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Leu
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val
85                  90                  95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  121
<211>  336
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  121
gatgctgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc       60
atctcttgca ggtctagtca gacccttgaa aacagtaatg gaaacaccta tttgaactgg      120
tacctccaga aaccaggcca gtctccacag ctcctgatct acagggtttc caaccgattt      180
tctggggtcc tagacaggtt cagtggtagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc      240
agcagagtgg agactgagga tttgggagtt tatttctgcc tccaagttac acatgtcccg      300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa                                336
<210>  122
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  122
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Ser Pro Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  123
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  123
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtca tgcactgggt gaagcagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactcagtac      180
aatgagaagt ttaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac      240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggaccc      300
tattactaca gtcctagccc ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  124
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ala Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  125
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  125
caggtgcagc ttgtgcagtc tggagctgaa gtgaagaagc caggatcctc cgtgaaggtc       60
tcctgtaagg cttctggcta caccttcacc gattacgtga tccactgggt caggcaggcc      120
cctgggcaag gcttggagtg gatggggtac tttaacccct acaacgatgg gactgagtac      180
aatgagaagt ttaaagcacg ggtgaccatt accgccgaca agagcacaag cacagcctac      240
atggagctgt ccagcctccg cagcgaggat acagccgtct actactgcgc cagaggccct      300
tactactatg ggtccagccc cttcgactat tggggccagg ggactacagt gactgtcagt      360
tca                                                                    363
<210>  126
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  126
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser
20                  25                  30
Asn His Asn Thr Tyr Ile Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Val
85                  90                  95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  127
<211>  336
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  127
gatatcgtga tgacccagac tcccctgtcc cttcctgtga ccccaggaga accagcttct       60
atcagctgta ggtcctcaca gagcctggag aactccaacc acaacaccta cataaactgg      120
tacctccaga agcctgggca gtctccccag ttgctgatct acagggtcag caaacgcttc      180
tccggggtgc ccgatcggtt tagtgggagc gggagcggca cagactttac actcaagatt      240
tccagagtgg aggccgagga cgtcggcgtc tattactgcc accaagtgac acacgtgccc      300
tacacattcg gccagggcac taaactggag attaag                                336
<210>  128
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  128
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Tyr Phe Arg Tyr Asp Tyr Trp Tyr Ser Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  129
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  129
caggtccagc ttgtccagtc tggagcagaa gtgaagaagc caggggcttc agtgaaggtg       60
tcttgcaagg cttccggata cgccttctcc acttactgga tgaactgggt gcgccaggcc      120
cctgggcagg gcttggagtg gatgggccag atctatcccg gcgatgacga cacaaaatac      180
agcgggaagt tcaaggggcg ggtgaccatt accgccgata aaagcacctc caccgcctac      240
atggagctca gttccctgag aagcgaggat acagccgtgt actactgtgc caggaggtac      300
tttcggtacg actactggta tagcgacgtc tgggggcaag gcacaactgt cacagtgagc      360
agc                                                                    363
<210>  130
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  130
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  131
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  131
gacatccaaa tgacccagag cccttcctcc ttgtccgcaa gtgtgggaga tagagtgacc       60
atcacctgca gggcttctca ggatatctcc aactacctga actggtatca gcagaagccc      120
ggcaaggtgc caaagctcct tatttactac acctcccggc tgcacagcgg agtcccatct      180
cgcttcagcg ggtcaggcag cggcactgac tttactctga caattagcag cctccagcct      240
gaagacgtcg ccacttacta ctgtcatcag gggaatacac tccccctgac attcgggcag      300
gggacaaaac tggagattaa g                                                321
<210>  132
<211>  116
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  132
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Leu Thr Thr Ala Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>  133
<211>  348
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  133
caaatgcagc tcgtccagtc tggacctgaa gtgaagaagc ccgggacatc cgtcaaggtc       60
tcatgtaagg ctagcgggta cgcattcact tcctacaaca tgtactgggt gcgccaggcc      120
agaggacaga ggttggagtg gatcggctac atcgacccat acaacgccga tactacctac      180
aatcagaagt ttaaagggcg ggtgaccatt acccgggata tgtccacctc caccgcctac      240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac acagccgtgt actactgcct gacaacagcc      300
tatgccatgg actattgggg ccagggcaca cttgtgactg tgagcagt                   348
<210>  134
<211>  106
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  134
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  135
<211>  318
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  135
gacatccagc tcacccaatc cccttctttc ctctccgcaa gtgtcggaga tagggtgact       60
atcacctgct cagcttcttc aaccgtgaac tacatgcatt ggtaccagca gaagcccggg      120
aaagccccaa agctgctgat ctacagcacc tccaatctgg ccagtggagt gccaagccgg      180
tttagcggga gcggctccgg cactgaattc actttgacaa ttagcagcct tcagcctgag      240
gactttgcca catattactg tcaccagtgg tccagctacc cctacacatt cgggcagggc      300
acaaagctgg agattaag                                                    318
<210>  136
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  136
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Ile His
1               5                   10
<210>  137
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  137
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn His Asn Thr Tyr Ile Asn
1               5                   10                  15
<210>  138
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  138
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1               5
<210>  139
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  139
His Gln Val Thr His Val Pro Tyr Thr
1               5
<210>  140
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  140
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  141
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  141
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<---