СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ
METHOD OF PREPARING COW BLOOD PLASMA SAMPLE FOR DETERMINING COMPOSITION OF FREE AMINO ACIDS

Изобретение относится к биохимии, а именно к клинической лабораторной диагностике, к методам анализа свободных аминокислот в плазме крови с.-х. животных, и может быть использовано в диагностических и исследовательских целях.
Для количественного определения содержания аминокислот в крови первым шагом всегда является подготовка исследуемого материала, суть которого заключается в поэтапно качественной и максимально быстрой обработке крови и извлечении из нее аминокислот.
Известен способ приготовления пробы плазмы крови для определения свободных аминокислот (ВНИИЖ «Методы определения аминокислот в кормах животноводческой продукции и продуктах обмена», Рядчиков В.Г. и др., Дубровицы - 1967 г., стр.54). Способ заключается в следующем: 25 мл свежей крови помещают в 50-мл центрифужный стакан, стенки которого обработаны 5 мг гепарина. Центрифугируют в течение 10 минут, чтобы осадить клетки и другие вещества. Переносят фугат в другой центрифужный стакан с последующим центрифугированием в течение 10 минут. Затем 10 мл плазмы депротеинизируют 50мл 1% пикриновой кислоты. Образовавшуюся суспензию перемешивают и вновь центрифугируют 10 минут. Удаляют пикриновую кислоту и соли, пропуская центрифугат через колонку, заполненную смолой Дауэкс (2 X 8). Пропускают центрифугат до тех пор, пока вся жидкость не пройдет через колонку, после чего стенки колонки и смолу промывают пять раз по 3 мл 0,02н HCl. Вытекающий элюат собирают, а затем выпаривают под вакуумом до 2 мл. В случае если в концентрированном растворе имеются нерастворенные вещества, элюат следует профильтровать, промывая бумагу 1н HCl. Для лучшей фильтрации к раствору добавляют 4-5 мг диатома эфира.
Разбавляют раствор водой до 3 мл, а затем добавляют 1н NaOH и доводят рН до 7-8. Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 4 часов. После этого доводят рН образца до 2,0 добавлением 1н НО. Общий объем образца окончательно доводят до 5 мл, буфером с рН 2,2. Хранят в холодильнике при 4°C. В случае, если анализируемая проба не исследуется в течение 24 часов, ее хранят при -20°C.
К недостаткам данного способа относятся дополнительные затраты времени на удаление пикриновой кислоты и солей из образца, т.к. недостаточная очистка может привести к погрешностям результата анализа, а из-за высокой трудоемкости процесса в указанном аналоге возможность одновременной подготовки нескольких и более образцов затруднена. Указанный способ технически сложен и потребует использования специфического оборудования: колонки со смолой Дауэкс (2 X 8), роторного вакуумного испарителя.
Наиболее близким техническим решением является способ приготовления образца плазмы для выделения из нее свободных аминокислот, основанный на депротеинизации плазмы крови сульфосалициловой кислотой и введении в приготовленный образец внутреннего стандарта - норлейцина (Laboratory Instrumets division of INGOS Ltd.: User manual, Automatic amino acid analyser AAA-400, Prague, Apr 11 2006, 34 Deproteination by sulphosalicylic acid). Берут 25 мл свежей крови и помещают ее в центрифужный стаканчик, предварительно обработанный 5 мг гепарина. Полученную пробу центрифугируют в течение 10 минут, затем отбирают верхнюю надосадочную жидкость, т.е. плазму крови, для анализа. Далее осуществляют депротеинизацию (осаждение белков), для этого к полученной плазме прибавляют сульфосалициловую кислоту из расчета 30 мг на 1 мл плазмы, встряхивают и центрифугируют в течение 10 минут. Отбирают надосадочную жидкость и вносят стандартный раствор норлейцина из соотношения 0,2 мл на 4 мл плазмы крови.
Недостатком данного способа является недостаточная чистота пробы плазмы крови, т.к. вносимое в пробу малое количество сульфосалициловой кислоты и ее кратковременное встряхивание не позволяют полностью осадить белки плазмы крови крупного рогатого скота. Поэтому загрязненная белками крови проба считается некачественной и не может подвергаться дальнейшим исследованиям. При этом, если уровень белка в крови крупного рогатого скота снижен, количество сульфосалициловой кислоты в пробе будет повышено, что приведет к увеличению кислоты в пробе и негативно повлияет на результат анализа, т.к. некачественная проба может привести к сбою работы анализатора, а это в свою очередь ведет к неточности определения свободных аминокислот. Кроме того, дополнительное внесение компонента стандартного раствора норлейцина в исследуемый образец влияет на чистоту пробы плазмы крови.
Техническим результатом изобретения является повышение точности определения выделения свободных аминокислот из плазмы крови за счет обеспечения чистоты пробы плазмы крови, повышение надежности работы анализатора и снижение трудозатрат и времени.
Технический результат достигается тем, что в способе подготовки пробы плазмы крови крупного рогатого скота для определения состава свободных аминокислот, включающем приготовление пробы плазмы крови, путем забора крови в предварительно обработанную раствором коагулянта емкость и центрифугирование; отбор полученной плазмы крови, депротеинизацию сульфосалициловой кислотой, центрифугирование в течение 10 минут с последующим отбором надосадочной жидкости, определение состава свободных аминокислот путем ионообменной хроматографии, согласно предлагаемому изобретению в 1 мл плазмы крови крупного рогатого скота вносят 40-45 мг сульфосалициловой кислоты, перемешивают в течение 2-3 минут, после центрифугирования фильтруют надосадочную жидкость и в очищенный фильтрат вносят гидроксид лития в количестве 0,002-0,004 мг на 1 мл очищенного фильтрата и тщательно встряхивают до полного растворения.
Новизна заявленного предложения заключается в добавлении большего количества сульфосалициловой кислоты (40-45 мг), перемешивании пробы в течение 2-3 минут, дополнительном фильтровании и добавлении гидроксида лития.
Добавление к 1 мл плазмы крови сульфосалициловой кислоты в количестве 40-45 мг позволяет полностью осадить белки плазмы крови крупного рогатого скота, т.е. повысить качество выделения свободных аминокислот, за счет обеспечения чистоты пробы. Количество внесенной сульфосалициловой кислоты 40-45 мг обусловлено тем, что при количестве 40 мг и менее происходит неполное связывание белка, а при количестве 45 мг и более происходит полное связывание белков и появление избыточной кислоты, что загрязняет пробу и отрицательно влияет на работу анализатора.
Перемешивание пробы в течение 2-3 минут позволяет сульфасолициловой кислоте лучше связать белки плазмы и в более полном объеме провести их осаждение, что позволит повысить качество и надежность результатов. Перемешивание пробы менее 2-х минут не позволяет сульфосалициловой кислоте полностью связать белки и получить однородную массу, перемешивание пробы более 3-х минут не влияет на консистенцию и осаждение белка сульфосалициловой кислотой в пробе.
Дополнительная фильтрация обеспечивает чистоту самой пробы, за счет удаления из нее ненужных примесей и осадков (в виде осажденного белка), и положительно влияет на чистоту пробы и работу анализатора.
Добавление гидроксида лития обеспечивает нейтрализацию излишней кислоты в очищенной пробе, что повышает качество анализа свободных аминокислот в пробе и точность результатов. Рекомендуемая доза внесения гидроксида лития 0,002-0,004 мг обусловлена тем, что при количестве 0,002 мг и менее происходит неполная нейтрализация сульфосалициловой кислоты, а при количестве 0,004 мг и более происходит полная нейтрализация сульфосалициловой кислоты и появление избытка щелочи, что загрязняет пробу и отрицательно влияет на работу анализатора и точность результата анализа свободных аминокислот.
Технический результат достигается только при сочетании заявленных признаков, что позволяет повысить точность анализа свободных аминокислот за счет подготовки качественной пробы плазмы крови крупного рогатого скота, влияющей на работу анализатора.
По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружено аналогичное техническое решение, что позволяет судить об изобретательском уровне предложения.
Способ реализуют следующим образом.
В предварительно обработанную раствором коагулянта емкость отбирают пробу крови. Центрифугируют и отбирают полученную плазму крови. Затем производят депротеинизацию: в 1 мл плазмы крови крупного рогатого скота вносят 40-45 мг сульфосалициловой кислоты. После чего перемешивают в течение 2-3 минут до получения однородной массы. Повторно центрифугируют пробу не менее 10 минут. Полученную надосадочную жидкость фильтруют. В очищенный фильтрат вносят 0,002-0,004 мг гидроксида лития. Пробу тщательно встряхивают до полного растворения гидроксида лития. Исследуют полученный раствор по отношению к пробе со стандартной смесью аминокислот путем жидкостной ионообменной хроматографии с последующим определением свободных аминокислот плазмы крови.
Проведенные нами исследования показали, что использование пробы плазмы крови, подготовленной предложенным способом, обеспечило бесперебойную работу анализатора, что привело к сокращению затрат времени и качественному результату анализа пробы.
Пример осуществления заявляемого способа
Произвели забор крови в ЗАО «Победа» Брюховецкого района на МТФ №2 от клинически здоровой коровы канадской породы в возрасте 2-х лет, одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с гепарином (в соотношении 5 мг на 25 мл крови) для дальнейшей подготовки 3-х проб плазмы крови по стандартной методике (прототип) и 3-х проб плазмы крови по предлагаемому способу.
Согласно стандартной методике (прототипу) в пробирку, обработанную 5 мг гепарина, было помещено 25 мг крови. После чего ее центрифугировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем отбирали верхнюю надосадочную жидкость (плазму) отдельным наконечником (пастеровскими пипетками) в три стерильные пробирки в количестве 1 мл. К полученной плазме, разделенной на три пробирки, прибавляли сульфосалициловую кислоту в количестве 30 мг. Три пробирки встряхивали около одной минуты и повторно центрифугировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Отобрали надосадочную жидкость в количестве 0,5 мл отдельным наконечником (пастеровскими пипетками) в специальные пробирки эпиндорфи (Eppendorf). В каждую пробирку внесли стандартный раствор норлейцина из расчета 0,025 мл на 0,5 мл плазмы крови. Приготовленные пробы исследовали по отношению к пробе со стандартной смесью аминокислот путем жидкостной ионообменной хроматографии с последующим определением свободных аминокислот в пробе плазмы крови на аминокислотном анализаторе «ААА-400» (Чехия).
Согласно предлагаемому способу в пробирку, обработанную 5 мг гепарина, было помещено 25 мг крови. Затем закрыли крышкой и аккуратно переворачивали несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом. Плазму крови получали центрифугированием пробирок с кровью в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем отбирали плазму в количестве 1 мл отдельным наконечником (пастеровскими пипетками) в три стерильные пробирки. В полученные пробы внесли сульфосалициловую кислоту в количестве: пробирка №1 - 43 мг, пробирка №2 - 44 мг и пробирка №3 - 42 мг. Перемешали стеклянной палочкой в течение 3 минут с последующим повторным центрифугированием 3-х проб в течение 10 мин при комнатной температуре. Полученную надосадочную жидкость от каждой пробы отобрали в количестве 0,5 мл отдельным наконечником (пастеровскими пипетками) в специальные пробирки эпиндорфи (Eppendorf), предварительно профильтровав каждую пробу через стеклянный бактериологический фильтр. В очищенный фильтрат пробы №1 внесли 0,0035 мг гидроксида лития, №2 -0,0038 мг и в пробу №3 - 0,0028 мг. Тщательно встряхивали каждую пробирку до полного растворения гидроксида лития. Готовые пробы исследовали по отношению к пробе со стандартной смесью аминокислот путем жидкостной ионообменной хроматографии с последующим определением свободных аминокислот в пробе плазмы крови крупного рогатого скота на аминокислотном анализаторе «ААА-400» (Чехия).
Способ-прототип и рекомендованный нами способ оценивали по работе аминокислотного анализатора, т.е. частоты сбоев при анализе проб, а также точности анализа в виде выхода и расшифровки всех свободных аминокислот в исследуемой пробе (таблица 1).
Подготовка проб плазмы крови по способу согласно прототипу, увеличивает время (дополнительные 4 часа работы на устранение возникшей ошибки) и дополнительные затраты труда на исследуемые пробы, снижает надежность работы анализатора (в результате некачественной подготовки плазмы крови входной фильтр колонки забился недоосажденными белками плазмы, из-за чего работа анализатора нарушилась), а также точность определения выделения свободных аминокислот из плазмы (первые три аминокислоты в результате анализа были смазаны и не могли подвергнуться расшифровке).
Таблица 1
Анализ работы аминокислотного анализатора
Исследуемые пробы
Проба-стандарт (со стандартной смесью аминокислот)
Проба-прототип
Проба-стандарт (со стандартной смесью аминокислот)
Проба по заявленному способу
Время исследования
2 ч 40 мин
1 - проба
2 ч 40 мин
2 ч 40 мин
1 - проба
2 ч 40 мин
2 - проба
2 ч 40 мин
2 - проба
2 ч 40 мин
3 - проба
2 ч 40 мин
3 - проба
2 ч 40 мин
Сбои в работе, время, затрачиваемое на устранение возникших проблем
-
1 - проба
-
-
1 - проба
-
2 - проба
Остановка анализатора. Входной колоночный фильтр забился беками. Затрачиваемое время на устранение ошибки - 4 часа
2 - проба
-
3 - проба
-
3 - проба
-
Общее время анализа проб
2 ч 40 мин
Анализ 3 проб производился в течение 7 ч 20 мин + дополнительные 4 часа работы на устранение возникшей ошибки. Итого общее время на анализ 3 проб составило: 11 ч 20 мин
2 ч 40 мин
7 ч 20 мин
Точность анализа
100%
88% Первые три пики аминокислот смазаны, расшифровке не подлежат.
100%
100%
Подготовка пробы согласно разработанному способу оказывает положительный эффект на точность определения выделяемых свободных аминокислот из плазмы крови крупного рогатого скота (таблица 2), надежность работы анализатора, экономию затрат труда и времени на всех стадиях процесса.
Таблица 2
Качественный и количественный состав аминокислот плазмы крови крупного рогатого скота, мг %
Аминокислоты
мг %
Таурин
0,99
Аспарагин
0,31
Треонин
0,46
Серии
1,00
Глютаминовая кислота
1,28
Глютамин
1,87
Пролин
0,47
Глицин
3,06
Алании
1,36
Цитрулин
0,43
В алии
1,88
Цистеин
0,16
Метионин
0,27
Изолейцин
1,13
Лейцин
1,28
Тирозин
0,57
Фенил
0,73
Gama-Аминомасленная кислота
0,11
Аммиак
0,05
Орнитин
0,41
Лизин
0,98
Гистидин
0,80
1 - метилгистидин
0,13
3 - метилгистидин
0,16
Аргинин
2,19
Сумма аминокислот
22,08
Проведенные нами исследования показали, что использование пробы плазмы крови, подготовленной предложенным способом, обеспечило бесперебойную работу анализатора, что привело к сокращению затрат времени и качественному результату анализа пробы.
Предложенный способ позволяет повысить точность и качество определения выделения свободных аминокислот из пробы плазмы крови крупного рогатого скота, надежность работы анализатора, а также снизить затраты труда и времени на всех стадиях процесса.