СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ КАРОТИНОВ, КСАНТОФИЛОВ И ХЛОРОФИЛЛОВ ЛИСТЬЕВ КРАПИВЫ ДВУДОМНОЙ
METHOD FOR SEPARATION OF CAROTHINES, XANTHOPHILES AND CHLOROPHYLLES OF LEAVES OF URTICA DIOICA

Изобретение относится к фармации, в частности к химико-фармацевтической отрасли, и касается способа разделения растительных пигментов листьев крапивы двудомной, что может быть использовано для получения индивидуальных каротиноидов.
Установлено, что крапива содержит около 9 веществ каротиноидной природы, доминирующим соединением среди них является лютеин, относящийся к группе кислородсодержащих каротиноидов - ксантофиллов. Наряду с лютеином крапива двудомная содержит неоксантин, виолаксантин, β-каротин, ликопин [Применение, химический состав и стандартизация сырья и препаратов Urtica (Обзор) / Я.Ф. Копытько, Е.С. Лапинская, Т.А. Сокольская // Хим-фармац. журн. 2011. - №45. С. 32-41].
Urtica dioica
Наиболее распространенным экстрагентом для получения суммы биологически активных веществ (БАВ) крапивы двудомной ( L.) является спирт этиловый 70%. Этот растворитель позволяет извлекать комплекс соединений, включающий суммы гидроксикоричных кислот и флавоноидов, каротиноидов и хлорофиллов.
Известны способы экстракции суммы БАВ крапивы двудомной, которые осуществляются дробно в течение 30 минут на каждой стадии, гидромодуль - 1:100, температурный режим - 100°C [Стандартизация листьев крапивы двудомной / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина, Н.Н. Сапронова // Фармация, 2011. №6. С. 22-24; Патент РФ на изобретение 2531940].
В литературе описано получение ацетонового извлечения из листьев крапивы двудомной, согласно которому экстракция осуществляется ацетоном в течение 20 минут при нагревании на водяной бане с обратным холодильником при соотношении сырье : экстрагент - 1,5:100. В результате анализа установлено, что полученная вытяжка преимущественно содержит хлорофиллы и каротины [Идентификация органических кислот методом ТСХ в извлечениях из растительных объектов / О.В. Тринеева, И.И. Сафонова, Е.Ф. Сафонова, А.И. Сливкин // Сорбционные и хроматографические процессы. 2013. Т. 13. Вып. 6. С. 896-901].
Ацетон позволяет экстрагировать из природного сырья одновременно и каротины, и ксантофиллы. Так как по результатам анализа полученных вытяжек в них установлено наличие лишь каротинов, можно предположить, что в результате кипячения в ходе экстракции происходит деструкция ксантофиллов, что является недостатком предложенного способа экстракции пигментов крапивы, в частности их каротиноидной фракции.
Известна также перспективность использования синтетических эфиров высших жирных кислот для экстракции БАВ листьев крапивы [Л.М. Федосеева, В.О. Кирьякова Изучение некоторых фенольных соединений крапивы коноплевой травы, произрастающей на территории Алтайского края // Химия растительного сырья. 2012. №2. С. 133-138]. Экстракция проводят методом мацерации с настаиванием в течение 2 часов при температуре 75°C. Очевидно, что липофильные экстрагенты позволяют получить фракции, содержащие сумму хлорофиллов и каротиноидов, однако использованный температурный режим настаивания является губительным для каротиноидов, кроме того, метод мацерации отличается минимальной эффективностью среди экстракционных методов.
Общим существенным недостатком всех описанных выше способов выделения растительных пигментов крапивы является кипячение в ходе экстракции, так как под действием температуры свыше 25°C молекулы каротиноидов способны к изомеризации, а в большинстве случаев к деструкции. Кроме того, реализация всех описанных выше способов предполагает получение суммарного экстракта, содержащего весь спектр липофильных веществ, в том числе каротиноидов и хлорофиллов.
Одним из перспективных направлений при изучении растительного сырья является совершенствование подходов и выбор условий разделения классов соединений, которые, как правило, сопутствуют друг другу. В частности, мало изучено разделение каротиноидов и хлорофиллов, а изолирование этих групп БАВ проводится лишь на стадии анализа, и, как правило, методами колоночной хроматографии или ТСХ [Выбор оптимальной системы для определения пигментов листьев крапивы двудомной методом ТСХ / О.В. Тринеева, С.В. Воропаева, А.И. Сливкин // Сорбционнные и хроматографические процессы. 2013. Т. 13. С. 213-219].
В контексте получения индивидуальных веществ природного происхождения для их применения в фармацевтической и медицинской практике представляет интерес решение задачи по разделению каротиноидов и хлорофиллов на этапе экстракции, что позволит одновременно получать очищенную вытяжку каротиноидов с разделением последней на фракции каротинов и ксантофиллов. Возможность получения изолированных фракций каротинов и ксантофиллов оптимизирует их разделение на индивидуальные соединения методами колоночной и тонкослойной хроматографии.
В литературе имеются сведения о возможности получить изолированные фракции хлорофиллов и каротиноидов, но только на уровне методической литературы для студентов и школьников [Физиология растений: лабораторный практикум для студентов биологического факультета [Электронный ресурс] / А.П. Кудряшов [и др.]. - Минск.: БГУ, 2011. - Режим доступа: http://www.elib.bsu.by]. Научной разработке это направление не подвергалось.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ разделения хлорофиллов и каротиноидов, описанный в [Сальников, А.И. Физиология и биохимия растений: практикум / А.И. Сальников, И.Л. Маслов, М-во с.-х. РФ, ФГБОУ ВПО Пермская ГСХА. - Пермь: Изд-во ФГБОУ ВПО Пермская ГСХА, 2014. - 300 с.], который принят за прототип.
Согласно прототипу в пробирку наливают 2-3 мл спиртового экстракта пигментов (хлорофиллов и каротиноидов), добавляют 3-4 мл бензина. Содержимое пробирки сильно встряхивают, предварительно закрыв ее пробкой, и оставляют отстояться. По мере расслоения эмульсии бензиновый слой будет окрашиваться в зеленый цвет из-за лучшей растворимости в нем хлорофиллов. В бензин переходит и каротин, но его окраска маскируется окраской хлорофилла. Ксантофиллы остаются в спиртовом слое и придают ему золотисто-желтую окраску. Если органические слои разделяются недостаточно четко, добавляют 3-4 капли воды и снова встряхивают.
Заявляемое изобретение ставит цель - предложить экстракционный способ разделения каротинов, ксантофиллов, хлорофиллов на примере листьев крапивы двудомной.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем. Липофильную вытяжку, содержащую хлорофиллы и каротиноиды, полученную с помощью любого подходящего экстрагента (спирта этилового, ацетона, хлороформа и др.) упаренную до объема 1-2 мл, переносят в делительную воронку и растворяют в 25 мл петролейного эфира (делительная воронка №1). Растворы встряхивали до полного растворения пигментов.
Далее к раствору пигментов в петролейном эфире прибавляют 25 мл спирта этилового 95%. Для четкого разделения органических слоев в систему добавляют 2,5 мл воды очищенной, систему встряхивают в течение 30 минут.
Через 30 минут и после полного разделения системы спиртовую фазу, содержащую ксантофиллы и хлорофиллы, отделяют от петролейного эфира и переносят в другую делительную воронку (делительная воронка №2). Процедуру повторяют до получения практически бесцветного спиртового слоя в делительной воронке №1. Спиртовые извлечения объединяют в делительной воронке №2.
Фаза петролейного эфира, оставшаяся в делительной воронке №1, содержит каротины и следы хлорофиллов.
Для отделения каротинов от следовых количеств хлорофиллов последние подвергают омылению. С этой целью в делительную воронку №1 добавляют 10 мл раствора натрия гидроксида 20% и 25 мл спирта этилового 95%, систему встряхивают в течение 30 минут. После расслоения системы спиртовую фазу, содержащую омыленные хлорофиллы сливают. Слой петролейного эфира окрашен в ярко желто-оранжевый цвет, спиртовая фаза, за счет содержания хлорофиллов, имеет зеленую окраску.
Объединенная спиртовая фракция включает ксантофиллы и частично хлорофиллы (делительная воронка №2). К спиртовому экстракту приливают 25 мл петролейного эфира, раствор встряхивают в течение 30 минут. Менее полярные хлорофиллы экстрагируются в петролейный эфир, ксантофиллы концентрируются в спиртовой фазе.
Контроль содержания каротинов и ксантофиллов проводят методом спектрофотометрии. Расчет количественного содержания каротинов проводят по стандартному образцу β-каротина (аналитическая длина волны - 450 нм), ксантофиллов - стандартному образцу лютеина (аналитическая длина волны - 445 нм) (табл. 1, 2).
Таким образом, отличительными признаками изобретения являются следующие особенности:
- способ позволяет использовать любые вытяжки, содержащие каротиноиды и хлорофиллы;
- в качестве экстрагентов используются два растворителя: петролейный эфир (менее полярный) и спирт этиловый 95% (более полярный);
- путем последовательной замены растворителей осуществляется разделение каротиноидов и хлорофиллов;
- способ позволяет проводить разделение каротинов и ксантофиллов;
- каротины последовательно концентрируются в петролейном эфире;
- ксантофиллы последовательно экстрагируются в спирт этиловый;
- для разделения каротинов и следовых количеств хлорофиллов последние подвергают омылению.
Предлагаемый способ позволяет проводить разделение фракций каротиноидов и хлорофиллов с одновременным фракционированием каротинов и ксантофиллов, при этом происходит очистка фракции каротинов от следовых количеств хлорофиллов. Способ может быть использован для получения и очитки каротиноидов, а также при изучении состава БАВ растительного сырья.
* - данные, представленные в таблице 1, получены для шести параллельных определений, обработанных статистически (р=0,95).
* - данные, представленные в таблице 2, получены для шести параллельных определений, обработанных статистически (р=0,95).