РЕГУЛЯТОР АКТИВАЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ
REGULATOR OF NEUTROPHIL ACTIVATION

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к регулятору активации нейтрофилов, содержащему тромбин-подобный фермент в качестве активного ингредиента, и к терапевтическому средству от заболеваний, вызванных активацией нейтрофилов, где терапевтическое средство содержит регулятор активации нейтрофилов.
Предпосылки создания изобретения
[0002] Кровь включает эритроциты, лейкоциты и тромбоциты в качестве клеточных компонентов. Из них, лейкоциты являются иммунокомпетентными клетками, вовлеченными в биозащиту, и они подразделяются на пять типов: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, лимфоциты и моноциты. Среди них, количество нейтрофилов является самым большим и составляет 50-70% от всех типов лейкоцитов. Нейтрофилы имеют функции, например, уничтожения чужеродных веществ, таких как бактерии и вирусы, которые попадают в живой организм извне.
Когда чужеродные вещества, такие как бактерии попадают в живой организм, макрофаги тотчас же взаимодействуют с ними и высвобождают цитокины, такие как интерлейкин-1 (IL-1). Такие цитокины вызывают воспалительное изменение в клетках в тканях. Ткани, имеющие воспалительное изменение, высвобождают множество цитокинов, представленных интерлейкином-8 (IL-8) и факторами, стимулирующими миграцию нейтрофилов.
Нейтрофилы, на поверхностном рецепторе, распознают факторы, стимулирующие миграцию нейтрофилов, и вещества, продуцируемые самими бактериями, и активируют миграционное движение. После миграции нейтрофилы вступают в контакт с, например, бактериями, затем распознают бактерии как чужеродные вещества через поверхностный рецептор и сцепляются и связываются с бактериями. Связанные бактерии поглощаются цитоплазматической мембраной нейтрофилов, включаются в нейтрофилы и фагоцитируются.
[0003] Бактерии, включенные в нейтрофилы, уничтожаются (фагоцитируются) тремя способами.
Первый способ уничтожения бактерий осуществляется реактивными формами кислорода, такими как пероксид водорода, генерируемый действием ферментной системы.
Второй способ уничтожения бактерий осуществляется бактерицидными белками и ферментами, такими как лизозим и дефензины, высвобождаемые из гранул в нейтрофилах.
Однако, если реактивные формы кислорода или бактерицидные белки и ферменты в избытке высвобождаются из нейтрофилов, ткань повреждается, и воспалительный симптом еще более усиливается.
Третий способ уничтожения бактерий осуществляется путем образования хроматинового сплетения, называемого NETs (нейтрофильные внеклеточные ловушки) через внеклеточное высвобождение хроматина в ядре активированными нейтрофилами (Непатентная литература 1). Происходящая в процессе этого клеточная гибель нейтрофилов играет важную роль в действии против бактерий. Поскольку это другой тип клеточной гибели, отличный от некроза и апоптоза, он называется НЕТозом.
Однако вещества, обладающие антибактериальным действием, такие как гистоны, миелопероксидаза и эластаза, которые являются составляющими компонентами NET, высвобождаются в кровь или ткань хозяина, эти вещества также служат повреждающими факторами ткани и клеток хозяина.
Следовательно, считается, что подавление NET, образованных активированным нейтрофилом, может подавлять чрезмерную воспалительную реакцию.
В связи с этим, были предприняты усилия для подавления воспалительной реакции путем регулирования активации нейтрофилов.
[0004] К настоящему времени было описано несколько веществ для регулирования активации нейтрофилов.
Например, сообщалось, что богатый гистидином гликопротеин, который синтезируется в печени, содержится в плазме и, как известно, участвует в регуляции системы коагуляции и фибринолиза и контроле ангиогенеза, является регулятором активации нейтрофилов (Патентная литература 1).
[0005] Кроме того, сообщалось, что 2-аденозин-N-пиразольные соединения и 2-аденозин-тиофеновые соединения полезны в качестве ингибиторов агрегации тромбоцитов или ингибиторов активации нейтрофилов (Патентная литература 2 и 3).
[0006] Кроме того, сообщалось, что производные бензоксазинона и производные азетидинона являются веществами, подавляющими инфильтрацию нейтрофилов, и обладают противовоспалительным действием (Патентная литература 4 и 5).
[0007] Кроме того, сообщалось о лактоферрин-содержащем ингибиторе образования внеклеточных лейкоцитарных ловушек и лактоферрин-содержащей композиции для лечения заболевания, связанного с образованием внеклеточных лейкоцитарных ловушек (Патентная литература 6).
Перечень цитируемых докумнетов
Патентная литература
[0008]
Патентная литература 1: Японский патент № 5807937
Патентная литература 2: Опубликованный японский перевод международной заявки PCT № 2003-506461
Патентная литература 3: Опубликованный японский перевод международной заявки PCT № 2003-502434
Патентная литература 4: Публикация японской патентной заявки № Hei 5-148249
Патентная литература 5: Публикация японской патентной заявки № Hei 7-242624
Патентная литература 6: Международная публикация № WO2014/168253
Непатентная литература
[0009]
Непатентная литература 1: Brinkmann V et al: Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303: 1532-1535, 2004
Сущность изобретения
Техническая задача
[0010] Однако, с точки зрения эффективности, безопасности и т.д., сохраняется потребность в новом регуляторе активации нейтрофилов и содержащем регулятор терапевтическом средстве от заболеваний, вызванных активацией нейтрофилов.
Решение задачи
[0011] Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для решения вышеописанных задач. В результате авторы изобретения обнаружили, что тромбин-подобный фермент регулирует активацию нейтрофилов (в частности, дегрануляцию, экспрессию Mac-1, образование NET, трансэндотелиальную миграцию и инфильтрацию ткани) и способен лечить заболевания, вызванные активацией нейтрофилов. Настоящее изобретение было создано на основе таких открытий.
[0012] В частности, настоящее изобретение относится к следующим [1] - [10].
[1] Регулятор активации нейтрофилов, включающий тромбин-подобный фермент в качестве активного ингредиента.
[2] Регулятор активации нейтрофилов в соответствии с пунктом [1], где тромбин-подобный фермент выбран из группы, состоящей из батроксобина, анкрода и кроталазы.
[3] Регулятор активации нейтрофилов в соответствии с пунктом [1], где тромбин-подобный фермент представляет собой батроксобин.
[4] Регулятор активации нейтрофилов в соответствии с пунктом [1], где активация нейтрофилов регулируется путем ингибирования дегрануляции нейтрофилов.
[5] Регулятор активации нейтрофилов в соответствии с пунктом [1], где активация нейтрофилов регулируется путем ингибирования экспрессии Mac-1 нейтрофилами.
[6] Регулятор активации нейтрофилов в соответствии с пунктом [1], где активация нейтрофилов регулируется путем ингибирования образования NETs нейтрофилами.
[7] Регулятор активации нейтрофилов в соответствии с пунктом [1], где активация нейтрофилов регулируется путем ингибирования трансэндотелиальной миграции нейтрофилов.
[8] Регулятор активации нейтрофилов в соответствии с пунктом [1], где активация нейтрофилов регулируется путем ингибирования инфильтрации ткани нейтрофилами.
[9] Терапевтическое средство против заболевания, вызванного активацией нейтрофилов, где терапевтическое средство включает регулятор активации нейтрофилов в соответствии с пунктом [1].
[10] Терапевтическое средство в соответствии с пунктом [9], где заболевание, вызванное активацией нейтрофилов, выбрано из группы, состоящей из сепсиса, острого респираторного дистресс-синдрома, острого панкреатита и острого легочного расстройства.
Полезные эффекты изобретения
[0013] Как описано ниже в Примерах, регулятор активации нейтрофилов по настоящему изобретению, содержащий тромбин-подобный фермент в качестве активного ингредиента, регулирует активацию нейтрофилов (в частности, дегрануляцию, экспрессию Mac-1, образование NETs, трансэндотелиальную миграцию и инфильтрацию ткани) и является полезным в качестве терапевтического средства от заболеваний, вызванных активацией нейтрофилов.
Краткое описание чертежей
[0014]
Фиг. 1 показывает результат проверки ингибирующего действия батроксобина на дегрануляцию нейтрофилов, вызываемую TNF-α.
Фиг. 2 показывает результат проверки ингибирующего действия батроксобина на экспрессию Mac-1 нейтрофилами, вызываемую TNF-α.
Фиг. 3 показывает результат проверки ингибирующего действия батроксобина на образование NETs нейтрофилами, вызываемое TNF-α.
Фиг. 4 показывает результат проверки ингибирующего действия батроксобина на трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов, вызываемую TNF-α.
Фиг. 5 показывает результат проверки, методом HE окрашивания, ингибирующего действия батроксобина на инфильтрацию ткани нейтрофилами в ишемической ткани мышц задней конечности.
Фиг. 6 показывает результат проверки, методом MPO окрашивания, ингибирующего действия батроксобина на инфильтрацию ткани нейтрофилами в ишемической ткани мышц задней конечности.
Описание вариантов осуществления
[0015]
Далее настоящее изобретение будет описано подробно.
Должно быть понятно, что термины, используемые в описании, если не указано иное, используются в том смысле, который обычно используется в данной области. Таким образом, если не указано иное, все технические термины и научные термины, используемые в описании, имеют значение, хорошо известное специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае противоречия, преимущество имеет описание изобретения, включая определения.
[0016] Настоящее изобретение относится к регулятору активации нейтрофилов, содержащему тромбин-подобный фермент в качестве активного ингредиента (далее также просто указан как "регулятор"), и к терапевтическому средству от заболеваний, вызванных активацией нейтрофилов, которое содержит регулятор (далее также просто указано как "терапевтическое средство").
[0017] Индикатор, указывающий на "активацию нейтрофилов", включает эффекты, демонстрируемые нейтрофилами при стимуляции нейтрофил-активирующими факторами, в частности дегрануляцию, экспрессию Mac-1, образование NET, трансэндотелиальную миграцию и инфильтрацию тканей и т.п.
"Дегрануляция" нейтрофилов относится к явлению, когда вещество в гранулах высвобождается из гранул наружу при контакте с инородным веществом или со стимулом цитокина.
"Экспрессия Mac-1" нейтрофилами относится к явлению, когда молекула клеточной адгезии (CD18/CD11b) экспрессируется на поверхности нейтрофилов.
"Образование NET" нейтрофилами относится к явлению, когда хроматин в ядре высвобождается во внеклеточное пространство с образованием хроматинового сплетения.
"Трансэндотелиальная миграция" нейтрофилов относится к явлению, когда нейтрофилы мигрируют отдельно от кровотока и попадают в ткань через разрыв сосудистой эндотелиальной клетки.
"Инфильтрация ткани" нейтрофилами относится к явлению, когда нейтрофилы проскальзывают через эндотелиальную клетку сосуда, мигрируют и остаются вокруг паренхиматозной клетки ткани.
[0018] "Заболевание, вызванное активацией нейтрофилов", относится к заболеванию, которое возникает в результате повреждения ткани или органа в результате образования NET, активных форм кислорода и бактерицидных белков и ферментов, избыточно продуцируемых из нейтрофилов (активированных нейтрофилов), что указывает на вышеописанный индикатор активации. Конкретные примеры заболевания включают сепсис, острый респираторный дистресс-синдром, острый панкреатит, острое легочное расстройство, полиорганную недостаточность, грипп-ассоциированную энцефалопатию, эпилепсию, вирусный энцефалит и т.п. Из этих заболеваний, настоящее изобретение можно подходящим образом использовать против сепсиса, острого респираторного дистресс-синдрома, острого панкреатита и острого легочного расстройства.
[0019] "Тромбин-подобный фермент", используемый в описании, относится к протеазе, отличной от тромбина, которая обладает свойством коагуляции фибриногена. Конкретные примеры тромбин-подобного фермента включают батроксобин, анкрод, кроталазу, флавоксобин, асперазу, акутин, ботропазу, клотазу, габоназу, вензим и т.п.
[0020] Тромбин-подобный фермент подразделяется на три категории на основании сайта в субстрате, фибриногене, который фермент атакует. В частности, классифицированы три категории: (1) протеаза (такая как батроксобин, анкрод, кроталаза), которая отделяет только фибринопептид А от фибриногена с образованием фибрина I, (2) протеаза (такая как габоназа), которая отделяет фибринопептид А и фибринопептид В от фибриногена с образованием фибрина II, который также называют фибрином, и (3) протеаза (такая как вензим), которая преимущественно отделяет фибринопептид В от фибриногена.
[0021] В настоящем описании термин "фибрин I" относится к мономеру, образующемуся, когда только фибринопептид А отделяется от фибриногена. Этот фибрин I также называется Des A фибрином.
2
Кроме того, термин "фибринопептид A" относится к пептиду, соответствующему 16 аминокислотам на NH-концевом участке Aα-цепи фибриногена.
2
Кроме того, термин "фибринопептид B" относится к пептиду, соответствующему 14 аминокислотам на NH-концевом участке цепи Bβ фибриногена.
Кроме того, в настоящем описании батроксобин, анкрод, кроталаза, флавоксобин, аспераза, акутин и т.п. указаны в качестве примера протеаз, которые генерируют фибрин I из фибриногена.
[0022] Предпочтительный тромбин-подобный фермент по настоящему изобретению содержит батроксобин, анкрод и кроталазу. Все это известные тромбин-подобные ферменты (Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and  fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p130-131; 1990).
Из батроксобина, анкрода и кроталазы наиболее предпочтительным является батроксобин в качестве активного ингредиента регулятора по настоящему изобретению.
[0023] Батроксобин представляет собой тромбин-подобный фермент, выделенный из яда Bothrops moojeni, и представляет собой гликопротеин, имеющий молекулярную массу приблизительно 36000 Да. Батроксобин отделяет только фибринопептид А от фибриногена и генерирует фибрин I (Aronson DL: Comparison of the actions of thrombin and the thrombin-like venom enzymes Ancrod and Batroxobin. Thrombos Haemostas (stuttg) 36: 9-13, 1976). Кроме того, первичная структура батроксобина уже определена, и батроксобин представляет собой одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 231 аминокислоты (Itoh N et al: Molecular cloning and sequence analysis of cDNA для batroxobin, a thrombin-like snake venom enzyme. J Biol Chem 262: 3132-3135, 1987).
[0024] Батроксобин и тромбин являются ферментам, аналогичными друг другу, поскольку имеют структуру гликопротеина. Тем не менее, батроксобин отделяет только фибринопептид А от фибриногена и генерирует фибрин I; между тем, тромбин отличается от батроксобина тем, что тромбин отделяет не только фибринопептид А, но и фибринопептид В от фибриногена и генерирует фибрин II (также называемый фибрином). Кроме того, они отличаются друг от друга тем, что батроксобин не действует на факторы свертывания крови, кроме фибриногена, в то время как тромбин действует на другие факторы свертывания крови.
[0025] Батроксобин является известным веществом и может быть получен в соответствии со способом, описанным в патенте США № 4137127. Кроме того, продукты батроксобина легко доступны от Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. (Токио, Япония) и Beijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. (Китай).
[0026] Анкрод представляет собой тромбин-подобный фермент, выделенный из яда Agkistrodon rhodostoma, и представляет собой гликопротеин, имеющий молекулярную массу приблизительно 35400 Да. Анкрод, подобно батроксобину, отделяет только фибринопептид A от фибриногена и генерирует фибрин I (Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p134-135; 1990).
[0027] Кроталаза представляет собой тромбин-подобный фермент, выделенный из яда Crotalus adamanteus, и представляет собой гликопротеин, имеющий молекулярную массу приблизительно 32700 Да. Кроталаза, подобно батроксобину, отделяет только фибринопептид А от фибриногена и генерирует фибриноген (Stocker KF: Snake venom proteins affecting hemostasis and fibrinolysis, in Medical Use of Snake Venom Proteins, Stocker KF, ed., CRC Press, Boston, p140-141; 1990).
[0028] Тромбин-подобные ферменты, такие как батроксобин, анкрод и кроталаза, в настоящем изобретении могут представлять собой природный продукт или продукт генетической рекомбинации.
[0029] Регулятор по настоящему изобретению может представлять собой тромбин-подобный фермент только (например, только батроксобин) или может содержать по меньшей мере один тромбин-подобный фермент.
Альтернативно, регулятор по настоящему изобретению может содержать тромбин-подобный фермент в комбинации с по меньшей мере одним активным веществом (например, стероидом, иммунодепрессантом или т.п.), отличным от фермента.
[0030] В качестве лекарственной формы регулятора по настоящему изобретению можно использовать лекарственные формы, описанные в General Rules for Preparations фармакопеи Японии, без конкретных ограничений. Примеры включают инъекции (включая суспензии и эмульсии), непосредственно вводимые в живой организм; препараты для наружного применения, такие как мази (в том числе маслянистые мази, эмульсионные мази (кремы), водорастворимые мази и т.п.), формы для ингаляции, жидкости (включая офтальмологические растворы, растворы для орошения полости носа и т.п.), суппозитории, пластыри, припарки и лосьоны; и препараты для внутреннего применения, такие как таблетки (включая таблетки с сахарным, пленочным, желатиновым покрытием), жидкости, капсулы, гранулы, порошки (включая мелкие гранулы), пилюли, сиропы и пастилки.
Эти препараты могут быть сформулированы способом, описанным в General Rules for Preparations фармакопеи Японии.
[0031] Кроме того, регулятор по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый твердый или жидкий носитель или основу для интервенционной терапии, в зависимости от лекарственной формы. Фармацевтически приемлемый твердый или жидкий носитель включает растворитель, стабилизатор, консервант, солюбилизирующий агент, эмульгатор, суспендирующий агент, буферный агент, изотонический агент, краситель, загуститель, эксципиент, смазывающее вещество, связующее, разрыхлитель, покрывающий агент, корригент и т.п.
[0032] Приведенные выше описания лекарственных форм, носителей и основы для интервенционной терапии применимы также к терапевтическому средству по настоящему изобретению.
[0033] Дозировка и количество введений регулятора по настоящему изобретению обычно изменяются в зависимости от типа тромбин-подобного фермента, массы тела пациента, а также природы и состояния заболевания.
Например, в случае, когда батроксобин вводят в виде тромбин-подобного фермента взрослому один раз в день, дозировка составляет от 0,1 до 50 единиц батроксобина (сокращенно BU). В качестве еще одной предпочтительной дозы батроксобина разовая доза для взрослого составляет от 1 до 20 BU, и введение осуществляют через день. В случае препаратов для наружного применения доза составляет от 0,01 до 500 мг на грамм препарата для наружного применения.
В данном случае, единица батроксобина представляет собой единицу измерения ферментативной активности батроксобина; 2 BU эквивалентно коагуляционной активности через 19,0 ± 0,2 секунды после добавления 0,1 мл раствора батроксобина к 0,3 мл стандартной цитратной плазмы человека при 37°C.
[0034] В случае, когда анкрод вводят в виде тромбин-подобного фермента взрослому человеку один раз в день, дозировка составляет от 0,01 до 10 МЕ/кг, и более предпочтительная дозировка составляет 0,5 МЕ/кг.
[0035] Регулятор по настоящему изобретению можно вводить субъекту путем разбавления тромбин-подобного фермента, когда это необходимо, с последующим: внутривенным капельным введением, внутривенным введением, внутриартериальным введением, внутримышечным введением, подкожным введением, внутрикожным введением, внутрисердечной инъекцией, интраперитонеальной инъекцией или субарахноидальной инъекцией; интраректальным введением, сублингвальным введением, введением через слизистую оболочку носа, трансдермальным введением или введением путем ингаляции; или местным введением в орган и/или ткань, пораженные в результате активации нейтрофилов. Предпочтительно тромбин-подобный фермент разбавляют при помощи 100 мл или более физиологического раствора и осуществляют внутривенное капельное введение в течение 1 часа или более.
[0036] Приведенные выше описания дозировок, количества введений и способов введения применимы также к терапевтическому средству по настоящему изобретению.
50
[0037] Острая токсичность (LD (BU/кг)) батроксобина для мыши, крысы, кролика и собаки показана в Таблице 1 ниже. Оценку острой токсичности осуществляли путем внутривенного введения батроксобина.
[0038]
Таблица 1Острая токсичность батроксобина (в/в)
Вид животного
LD<sub>50</sub> значение (BU/кг)
Мышь (ddy)
192 ~ 210
Крыса (Wistar)
105 ~ 110
Кролик (NW)
> 300
Собака (беспородная)
190 ~ 208
[0039] Регулятор и терапевтическое средство по настоящему изобретению можно применять для животных, имеющих нейтрофилы. Конкретные примеры животных включают человека, обезьяну, собаку, свинью, кошку, кролика, крысу и мышь. Из них предпочтительным является человек.
[0040] Далее настоящее изобретение будет описано более конкретно при помощи Примера получения и Примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается ими.
[0041]
[Пример получения 1] Получение Регулятора (Терапевтического средства)
Препарат батроксобина, имеющий следующий состав, был сформулирован для инъекции.
Название ингредиента
Смешиваемое количество
Батроксобин (активный ингредиент)
10 BU
Хлорбутанол (консервант)
3 мг
Гидролизованный желатин (стабилизатор)
1 мкл
Хлорид натрия (изотонический агент)
9 мг
Хлористоводородная кислота (регулятор pH)
подходящее количество
Дистиллированная вода для инъекций
до 1 мл
Общее количество
1 мл
[0042]
[Получение нейтрофилов]
1. Сбор крови
Здоровому взрослому добровольцу объясняли цель эксперимента, и было получено его согласие. Затем 15 мл периферийной венозной крови брали из срединной локтевой вены с использованием 20-мл гепаринизированного шприца.
2. Разделение и получение нейтрофилов
TM
В качестве раствора для разделения клеток крови использовали раствор с градиентом плотности Polymorphprep (изготовитель PROGEN Biotechnik GmbH). На 15 мл периферийной венозной крови наносили сверху равное количество раствора для разделения и центрифугировали в условиях 480 × g в течение 30 минут. После удаления путем аспирации мононуклеарных клеток в верхнем слое полинуклеарные гранулоциты в нижнем слое переносили в 10 мл буферного раствора Хэнкса и центрифугировали в условиях 400 × g в течение 20 минут. Затем клеточную массу суспендировали в 2 мл BD Pharm Lyse(изготовитель Becton Dickinson Sciences) и подвергали лизирующей обработке на ледяной бане в течение 5 минут. После лизирующей обработки клеточную суспензию центрифугировали в условиях 300 × g в течение 10 минут. Затем клеточную массу суспендировали снова с использованием PBS-2мМ EDTA буферного раствора и конечный объем доводили до 15 мл. Полученное вещество использовали в качестве человеческих нейтрофилов в следующих Примерах.
[0043]
Пример 1
Ингибирующее действие батроксобина на дегрануляцию нейтрофилов, вызываемую TNF-α
1. Экспериментальный метод
6
С использованием 1% FBS-RPMI 1640 среды получали клеточную суспензию нейтрофилов при 1 × 10 клеток/100 мкл и помещали на ледяную баню до инокуляции.
В качестве фактора, вызывающего дегрануляцию нейтрофилов, использовали воспалительный цитокин человеческий рекомбинантный TNF-α (hrTNF-α, изготовитель Peprotech, Inc.) при конечной концентрации 50 нг/мл.
К каждой 1% FBS-RPMI 1640 среде в 24-луночный планшет (изготовитель Greiner Bio One International GmbH) для клеточной суспензии добавляли в качестве испытываемых веществ батроксобин (DF-521, изготовитель Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd.) (конечная концентрация: 0,2 BU/мл) отдельно, человеческий фибриноген (hFbg, изготовитель Sigma-Aldrich Co.) (конечная концентрация: 2 мг/мл) отдельно или комбинацию батроксобина (конечная концентрация: 0,2 BU/мл) с человеческим фибриногеном (конечная концентрация: 2 мг/мл). Таким образом, получали кондиционированную среду (900 мкл/лунка).
В качестве положительного контроля использовали N-формилметионил-лейцил-фенилаланин (fMLP, изготовитель Sigma-Aldrich Co.) (конечная концентрация: 20 нМ).
Что касается лунок, в которые добавляли человеческий фибриноген, нужно отметить, что человеческий фибриноген добавляли в конце. После добавления человеческого фибриногена осуществляли предварительную инкубацию в условиях 37°C в течение 15 минут.
Что касается лунок, в которые добавляли батроксобин и человеческий фибриноген, когда было подтверждено образование Des A фибринового геля, 100 мкл суспензии нейтрофилов инокулировали в каждую кондиционированную среду (лунки) и снова культивировали в условиях 37°C в течение 60 минут.
TM
TM
Когда культивирование было завершено, гель удаляли с использованием 200-мкл пипетки. PerCP-Cy5.5-меченное мышиное античеловеческое CD66b антитело (изготовитель BioLegend, Inc.) добавляли к 400 мкл кондиционированной среды, содержащей культивированные нейтрофилы, и давали прореагировать друг с другом. Затем, используя FACSVerse проточную цитометрию (изготовитель Becton Dickinson Sciences), измеряли количество CD66b-положительных нейтрофилов как дегранулированных нейтрофилов. Данные анализировали с использованием программы FlowJo ver10.1 (изготовитель Tommy Digital Biology Co., Ltd.) и значения представляли как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI).
[0044]
2. Результат
Как показано на Фиг. 1, hrTNF-α вызывал дегрануляцию нейтрофилов.
fMLP как вещество, положительно действующее на активацию нейтрофилов, явно повышал дегрануляцию нейтрофилов, вызываемую hrTNF-α.
Добавление только батроксобина (DF-521) и добавление только человеческого фибриногена (hFbg) незначительно влияло на дегрануляцию нейтрофилов, вызываемую hrTNF-α.
С другой стороны, добавление батроксобина и человеческого фибриногена явно ингибировало дегрануляцию нейтрофилов, вызываемую hrTNF-α.
in vivo
При этом, фибриноген всегда присутствует вокруг нейтрофилов. Таким образом, батроксобин, вводимый в живой организм, способен регулировать дегрануляцию нейтрофилов, то есть активацию нейтрофилов, вызываемую воспалительным цитокином, когда возникает воспаление.
[0045]
Пример 2
Ингибирующее действие батроксобина на Экспрессию Mac-1 (CD18/CD11b) нейтрофилами, вызываемую TNF-α
1. Экспериментальный метод
Таким же способом, как в 1. Экспериментальном методе Примера 1, нейтрофилы совместно культивировали с каждым испытываемым веществом.
TM
TM
Когда культивирование было завершено, гель удаляли с использованием 200-мкл пипетки, APC-Cy-меченное мышиное античеловеческое CD11b антитело (изготовитель BioLegend, Inc.) и PE-меченное мышиное анти-CD18 антитело (изготовитель BioLegend, Inc.) добавляли в 400 мкл кондиционированной среды, содержащей культивированные нейтрофилы, и давали прореагировать друг с другом. Затем, используя проточную цитометрию FACSVerse (изготовитель Becton Dickinson Sciences), измеряли количество Mac-1-положительных нейтрофилов как активированных нейтрофилов. Данные анализировали с использованием программы FlowJo ver10.1 (изготовитель Tommy Digital Biology Co., Ltd.) и значения представляли как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI).
[0046]
2. Результат
Как показано на Фиг. 2, hrTNF-α вызывал экспрессию Mac-1 нейтрофилами.
fMLP как вещество, положительно действующее на активацию нейтрофилов, явно повышал экспрессию Mac-1 нейтрофилами, вызываемую hrTNF-α.
Добавление только батроксобина (DF-521) и добавление только человеческого фибриногена (hFbg) незначительно влияло на экспрессию Mac-1 нейтрофилами, вызываемую hrTNF-α.
С другой стороны, добавление батроксобина и человеческого фибриногена явно ингибировало экспрессию Mac-1 нейтрофилами, вызываемую hrTNF-α.
in vivo
При этом, фибриноген всегда присутствует вокруг нейтрофилов. Таким образом, батроксобин, вводимый в живой организм, способен регулировать экспрессию Mac-1 нейтрофилами, то есть активацию нейтрофилов, вызываемую воспалительным цитокином, когда возникает воспаление.
[0047]
Пример 3
Ингибирующее действие батроксобина на образование NETs нейтрофилами, вызываемое TNF-α
1. Экспериментальный метод
Покровное стекло помещали на дно каждой лунки 24-луночного планшета для клеточной суспензии и нейтрофилы совместно культивировали с каждым испытываемым веществом таким же способом, как в 1. Экспериментальном методе Примера 1, описанном выше.
Однако при этом была установлена конечная концентрация положительного контрольного вещества fMLP, равная 10 нМ.
После завершения культивирования полученное вещество промывали PBS и предварительно фиксировали в течение 2 часов буферным раствором 0,1 М фосфата натрия (pH 7,4), содержащим 2,5% глутаральдегида. После промывки три раза буферным раствором 0,1 М фосфата натрия (рН 7,4) в течение 10 минут использовали 1% осмиевую кислоту для фиксации в течение 30 минут.
Затем полученное вещество дегидратировали 50%, 70%, 80% и 90% этанолом каждый раз по 10 минут и затем дегидратировали безводным этанолом в течение 10 минут три раза. Осуществляли погружение полученного вещества в трет-бутиловый спирт и замещение им три раза и вещество лиофилизировали (JFD-310 изготовитель JEOL Ltd.) с использованием трет-бутилового спирта.
Покровные стекла вынимали из 24-луночного планшета и закрепляли на предметном столике сканирующего электронного микроскопа с использованием электропроводящей двухсторонней клейкой ленты. Пар осаждали, используя устройство для нанесения осмиевого покрытия плазменным напылением (Neoc-Pro, изготовитель Meiwafosis Co., Ltd.), и осуществляли наблюдение и визуализацию с использованием сканирующего электронного микроскопа (JSM-6510LV, изготовитель JEOL Ltd.) в условиях ускоряющего напряжения 15 кВ.
[0048]
2. Результат
Фиг. 3 показывает результат (стрелки указывают NETs).
hrTNF-α вызывал образование NETs нейтрофилами (вверху слева на Фиг. 3).
fMLP в качестве положительного контроля активации нейтрофилов явно вызывал образование NETs нейтрофилами (вверху справа на Фиг. 3).
Добавление только человеческого фибриногена явно повышало вызываемое hrTNF-α образование NETs нейтрофилами (внизу слева на Фиг. 3).
С другой стороны, добавление батроксобина и человеческого фибриногена явно ингибировало вызываемое hrTNF-α образование NETs нейтрофилами, (внизу справа на Фиг. 3).
При этом, фибриноген всегда присутствует вокруг нейтрофилов in vivo. Таким образом, батроксобин, вводимый в живой организм, способен регулировать образование NETs нейтрофилами, то есть активацию нейтрофилов, вызываемую воспалительным цитокином, когда возникает воспаление.
[0049]
Пример 4
Ингибирующее действие батроксобина на трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов, вызываемую TNF-α
В этом Примере ингибирующее действие батроксобина на трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов оценивали с использованием анализа hrTNF-α-вызываемой трансэндотелиальной миграции нейтрофилов.
1. Экспериментальный метод
4
Анализ трансэндотелиальной миграции нейтрофилов осуществляли в соответствии с методом Pliyev et al. (Boris K. Pliyev et al, Molecular Immunology, 48, 1168-1177, 2011). В качестве эндотелиальных клеток использовали эндотелиальные клетки пупочной вены (эндотелиальные клетки пупочной вены человека, HUVEC, изготовитель Lonza Group), предварительно культивированные в 5% FBS-EGM-2 среде для роста эндотелия (изготовитель Lonza Group). В покрытую фибронектином снабженную фильтром верхнюю камеру (диаметр фильтра: 6,5 мм, размер пор: 3 мкм, изготовитель Corning Incorporated) инокулировали 200 мкл клеточной суспензии, содержащей 7,0 × 10 HUVEC, которые были восстановлены с использованием 5% FBS-EGM-2 среды, тогда как 800 мкл 5% FBS-EGM-2 среды добавляли в 24-луночный планшет нижней камеры. После культивирования в течение 3 дней фильтр верхней камеры был заполнен HUVECs в монослойном состоянии.
7
В день эксперимента в лунки 24-луночного планшета (изготовитель Greiner Bio One International GmbH) для культивирования клеточной суспензии добавляли клеточную суспензию, которая была получена из человеческих нейтрофилов, выделенных и подготовленных в [Получении нейтрофилов], описанном выше, таким образом, чтобы конечная концентрация клеток была 1,0 × 10 клеток/лунка в 1% FBS-RPMI 1640 среде. Кроме того, в лунки добавляли растворы испытываемых веществ, полученные в 1% FBS-RPMI 1640 среде. Конечные концентрации испытываемых веществ были следующими: 0,2 BU/мл, когда батроксобин добавляли отдельно; 2,0 мг/мл, когда человеческий фибриноген добавляли отдельно; и 0,2 BU/мл для батроксобина и 2,0 мг/мл для человеческого фибриногена, когда батроксобин и человеческий фибриноген добавляли в комбинации. Нейтрофилы предварительно обрабатывали путем культивирования в течение 1 часа в условиях этих конечных концентраций, и конечный объем испытываемых систем составлял 1 мл.
7
Предварительно обработанные нейтрофилы собирали и промывали при помощи PBS. Затем получали суспензию предварительно обработанных нейтрофилов 1,0 × 10 клеток/мл в 1% FBS-RPMI 1640 среде.
Затем верхнюю камеру, в которой HUVECs были живыми, промывали 200 мкл 1% FBS-RPMI 1640 среды два раза.
7
После промывки в верхнюю камеру, в которой HUVECs были живыми, добавляли 100 мкл суспензии предварительно обработанных нейтрофилов 1,0 × 10 клеток/мл. В нижнюю камеру добавляли раствор hrTNF-α, полученный в конечной концентрации 50 нг/мл в 1% FBS-RPMI 1640 среде, и затем культивировали в течение 3 часов. Нейтрофилам давали мигрировать в нижнюю камеру.
Человеческие нейтрофилы, которые мигрировали в нижнюю камеру, собирали и их количество подсчитывали как трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов с использованием гемоцитометра.
[0050]
2. Результат
Как показано на Фиг. 4, hrTNF-α вызывал трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов.
Добавление только батроксобина (DF-521) оказывало незначительное влияние на трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов, вызываемую hrTNF-α.
Добавление только человеческого фибриногена (hFbg) явно повышало трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов, вызываемую hrTNF-α.
С другой стороны, добавление батроксобина и человеческого фибриногена явно ингибировало трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов, вызываемую hrTNF-α.
in vivo
При этом, фибриноген всегда присутствует вокруг нейтрофилов. Таким образом, батроксобин, вводимый в живой организм, способен регулировать трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов, то есть активацию нейтрофилов, вызываемую воспалительным цитокином, когда возникает воспаление.
[0051]
Пример 5
Ингибирующее действие батроксобина на инфильтрацию ткани нейтрофилами в мышечной ткани задней конечности с острой ишемией
1. Экспериментальный метод
(1) Получение моделей ишемии задней конечности у мышей DIO
В Charles River Laboratories Japan, Inc. самцам C57BL6/J мышей в возрасте 4 недели после рождения постоянно давали корм с высоким содержанием жира (5,25 ккал/г, D12492 изготовитель American Research Diet). Таким образом получали DIO (диета-индуцированное ожирение) мышей. 10-недельных DIO мышей закупали у Charles River Laboratories Japan, Inc., давали им корм с высоким содержанием жира и давали привыкнуть в течение 2 недель для использования в эксперименте.
Используя 12-недельных DIO мышей, получали модели односторонней ишемии задней конечности в соответствии с методом Tsukada et al. (Tsukada S. et al: Identification of mouse colony-forming endothelial progenitor cells for postnatal neovascularization: a novel insight highlighted by new mouse colony-forming assay. Stem Cell Res Ther., 4 (1): 20-33, 2013). Конкретно, каждую мышь анестезировали ингаляцией 1,5-2,0% изофлурана (изготовитель Baxter Limited) для разрезания кожи в области дистального конца паховой связки левой задней конечности. После лигирования проксимального конца бедренной артерии дистальный конец подкожной артерии лигировали, а все боковые ветви иссекали и вырезали. Затем разрез кожи закрывали хирургическим степлером.
После получения моделей ишемии задней конечности модельной группе интраперитонеально вводили физиологический раствор (Модельная группа) и 30 BU/кг батроксобина интраперитонеально вводили группе батроксобина (DF-521 группа). Затем мышей возвращали в клетки. Группу имитации операции подвергали только процедуре разрезания кожи.
TM
+
-
+
+
В день 1 (16 ч) или День 2 (36 ч) после получения модели ишемии задней конечности Сомнопентил(зарегистрированная торговая марка), разбавленный 140 мкл/мышь физиологического раствора при соотношении 1:1 (64,8 мг/100 мл, изготовитель Kyoritsu Seiyaku Corporation), вводили путем интраперитонеальной инъекции и цельную кровь собирали из сердца под анестезией. Цельную кровь лизировали с использованием лизирующего буфера BD Pharm Lyse (изготовитель BD Biosciences). После лизиса клетки окрашивали Ly6C-PE и Ly6G-PerCP Cy5.5 (изготовитель Biolegend, Inc.) с использованием кроличьего анти-мышиного антитела. Моноциты и нейтрофилы в 1 мл крови оценивали соответственно как Ly6CLy6G клеточную популяцию и Ly6CLy6G клеточную популяцию.
[0052]
(2) Гистологическое исследование
2
2
TM
После сбора крови под анестезией ишемические задние конечности мышей отрезали и фиксировали в течение ночи с использованием 4% раствора параформальдегида. Фиксированные ткани погружали в парафин для получения образцов для исследования патологии для: гистологического исследования, иммуногистохимического окрашивания на миелопероксидазу (MPO) и гематоксилин-эозинового (HE) окрашивания. Используя буфер для демаскировки pH 9,0 (изготовитель DAKO) и микроволновую печь, MPO антиген депарафинизированного образца восстанавливали в условиях 98°C в течение 15 минут. Для иммуногистохимического окрашивания на MPO использовали кроличье анти-MPO антитело (изготовитель Abcam plc.), 100-кратно разбавленное PBS, содержащим 10% нормальную козлиную сыворотку/0,25% казеин, в качестве первичного антитела. Образцы на предметных стеклах подвергали взаимодействию с первичным антителом при 4°C в течение ночи и затем их промывали PBS. Активность пероксидазы в тканях блокировали с использованием 3% HO-MeOH при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем HRP (пероксидаза хрена)-меченное вторичное антитело (Histofine(зарегистрированная торговая марка) SimpleStain Mouse MAX PO изготовитель Nichirei Biosciences Inc.) добавляли к образцам на предметных стеклах и давали им прореагировать при комнатной температуре в течение 1 часа. Образцы промывали PBS, подвергали взаимодействию с DAB (3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид, изготовитель DAKO) и окрашивали для визуализации MPO-положительных клеток. Затем образцы промывали PBS и ядра окрашивали гематоксилином. Окрашенные образцы скрепляли при помощи Marinol. Что касается отрицательного контроля, 500-кратно разбавленное кроличье IgG (изготовитель DAKO) использовали в качестве первичного антитела. Каждый образец наблюдали под оптическим микроскопом (DP73(зарегистрированная торговая марка) изготовитель Olympus Corporation). MPO-положительные клетки оценивали с использованием программы cellSense (зарегистрированная торговая марка) (изготовитель Olympus Corporation).
[0053]
(3) Статистический анализ
Все данные были представлены как средние значения или средние значения ± SD. В эксперименте in vivoоценкиишемии задней конечности использовали критерий Крускела-Уоллиса для проведения дисперсионного анализа между группами и группы сравнивали. P < 0,05 использовали в качестве уровня статистически значимой разницы.
[0054]
2. Результат
(1) Влияние батроксобина на количество нейтрофилов в крови
Таблица 2Влияние батроксобина на количество лейкоцитов в крови в DIO мышиных моделях ишемии задней конечности (средние значения ± SD × 10<sup>5</sup>/мл крови; n=2)
День 1 (16 ч)
Общее число лейкоцитов
Нейтрофилы
Моноциты
Модельная группа
13,5±3,3
9,59±1,81
0,57±0,28
Группа введения батроксобина
5,4±2,0
3,29±0,60
0,32±0,13
День 2 (36 ч)
Общее число лейкоцитов
Нейтрофилы
Моноциты
Модельная группа
10,7±5,4
6,07±2,96
0,51±0,22
Группа введения батроксобина
13,6±6,3
10,28±6,36
0,52±0,12
5
5
[0055] Как показано в Таблице 2, общее число лейкоцитов в день 1 (16 ч) после получения модели ишемии задней конечности было 5,4 × 10/мл в группе введения батроксобина, что было меньше чем 13,5 × 10/мл в модельной группе. В день 2 (36 ч) общее число лейкоцитов в группе введения батроксобина возвращалось к уровню модельной группы в день 1.
5
5
5
5
Подобным образом, количество нейтрофилов и количество моноцитов в день 1 (16 ч) после получения модели ишемии задней конечности было меньше в группе введения батроксобина, чем в модельной группе. Более конкретно, количество нейтрофилов уменьшалось от 9,59 × 10/мл до 3,29 × 10/мл, а количество моноцитов уменьшалось от 0,57 × 10/мл до 0,32 × 10/мл. В день 2 (36 ч) как количество нейтрофилов, так и количество моноцитов в группе введения батроксобина возвращалось к уровням модельной группы в день 1.
[0056]
(2) Ингибирующее действие батроксобина на инфильтрацию ткани нейтрофилами в ишемической ткани мышц задней конечности (HE окрашивание)
Фиг. 5 представляет снимки, показывающие HE-окрашивание ишемической ткани мышц задних конечностей.
Что касается модельной группы (Модельная группа), инфильтрация ткани нейтрофилами в ишемической ткани мышц задней конечности была больше в день 2, чем в день 1 после получения модели.
С другой стороны, инфильтрация ткани нейтрофилами в группе введения батроксобина (DF-521 групп) была меньше, чем в модельной группе. В частности, в день 2 после получения модели инфильтрация ткани нейтрофилами в группе введения батроксобина явно была меньше, чем в модельной группе.
Таким образом, батроксобин, вводимый в живой организм, способен регулировать инфильтрацию ткани нейтрофилами в ишемической ткани мышц задней конечности, то есть активацию нейтрофилов.
[0057]
(3) Ингибирующее действие батроксобина на инфильтрацию ткани нейтрофилами в ишемической ткани мышц задней конечности (окрашивание на MPO)
Количественное определение инфильтрации нейтрофилами, наблюдаемой в виде MPO иммуногистохимическое окрашивание-положительных клеток, осуществляли с использованием оптического микроскопа в поле зрения при большом увеличении ×40 (HPF). Фиг. 6 показывает результат.
Что касается модельной группы (Модельная группа), инфильтрация ткани нейтрофилами в день 2 после получения модели была явно больше, чем в день 1, и она была в 3,7 раза (93,8/25,3) больше, чем в день 1.
С другой стороны, что касается группы введения батроксобина (DF-521 группа), количество инфильтраций ткани нейтрофилами было явно меньше, чем в модельной группе. В день 1 это количество составляло 30,8% от количества в модельной группе; в день 2 количество составляло 25,8% от количества в модельной группе (P < 0,001).
Таким образом, батроксобин, вводимый в живой организм, способен регулировать инфильтрацию ткани нейтрофилами в ишемической ткани мышц задней конечности, то есть активацию нейтрофилов.
Промышленная применимость
[0058] Настоящее изобретение применимо в качестве регулятора активации нейтрофилов, а также в качестве терапевтического средства против различных заболеваний, вызванных активацией нейтрофилов.