СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ
METHOD FOR ESTIMATING CLINICAL EFFECTIVENESS IN PATIENTS WITH CHRONIC GLOMERULONEPHRITIS

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения циклофосфамидом у больных хроническим гломерулонефритом.
В ряду паренхиматозных заболеваний почек хронический гломерулонефрит занимает доминирующее место. Среди нефрологических заболеваний хронический гломерулонефрит (ХГН) составляет более 35% [1]. Очевидно, что это самый частый вид патологического процесса в почках, который является одной из распространенных причин хронической почечной недостаточности, для лечения которой необходимы гемодиализ и пересадка почки [2]. Распространенность и заболеваемость терминальными стадиями хронической болезни почек неуклонно увеличивается в разных регионах мира [3, 4]. Если в США в конце XX века более 340000 человек были включены в программы диализа или трансплантации почки, то уже к 2010 году число таких пациентов увеличилось и достигает 560000 человек [5].
Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии ХГН играют хемокины [6, 7]. Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХГН, в России немногочисленны и затрагивают в основном спектр генов вазоактивных гормонов [8], факторов некроза опухолей [9, 10, 11], интегральных мембранных белков и некоторых интерлейкинов [12, 13]. Исследования роли полиморфных маркеров ряда генов хемокинов в отношении ХГН до сих пор не проведены. Тогда как хемокины, являясь хемоаттрактантами, играют важную роль в развитии воспалительных реакций в организме [14] и, в том числе, иммуновоспалительных процессов при хроническом гломерулонефрите [15].
Известен способ по патенту РФ №2256182, 19.08.2003., где предложен способ прогнозирования эффективности лечения хронического гломерулонефрита у детей. Сущность изобретения состоит в том, что производят отбор венозной крови и в сыворотке крови определяют содержание трийодтиронина и при его уровне 2,73-3,98 нмоль/л прогнозируют эффективность лечения препаратами группы иммунодепрессантов преднизолоном или циклоспорином A. Техническим результатом является прогнозирование эффективности лечения до начала его проведения.
Недостаток заключается в том, что этот способ предназначен только для прогнозирования эффективности лечения хронического гломерулонефрита у детей, кроме того, концентрация в крови гормона щитовидной железы трийодтиронина может изменяться в течение жизни у одного пациента, в связи с чем эффект от терапии преднизолоном или циклоспорином A, может быть недостаточным. Более надежным можно считать способ, основанный на определении генетического профиля пациентов по ряду молекулярно-генетических маркеров.
Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ оценки эффективности терапии циклофосфамидом у больных хроническим гломерулонефритом на основе данных о полиморфизме гена макрофагального воспалительного протеина-1β (MIP-1β).
Циклофосфамид - цитостатический препарат алкилирующего типа, производное бис-β-хлорэтиламина. Обладает широким спектром противоопухолевой активности. Обладает также выраженным иммуносупрессивным действием, но имеет ряд противопоказаний и побочных действий (http://ru.wikipedia.org/wiki).
Задачей изобретения является разработка способа оценки эффективности терапии циклофосфамидом у больных хроническим гломерулонефритом на основе оценки полиморфизма гена MIP-1β (rs1719153).
Технический результат использования изобретения - прогнозирование эффективности лечения до начала его проведения благодаря возможности выявить пациентов, которым не рекомендуется проведение терапии циклофосфамидом, и пациентов, которым терапия циклофосфамидом показана, несмотря на ряд возможных побочных эффектов препарата.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ оценки эффективности терапии у больных хроническим гломерулонефритом на основе анализа полиморфизма гена хемокина макрофагального воспалительного протеина 1β, заключающийся в выделении ДНК из периферической венозной крови, выявлении носительства аллелей локуса +1931 А/Т MIP-1β (rs1719153), прогнозировании эффективности монотерапии циклофосфамидом при выявлении аллеля +1931 T MIP-1β, а в случае выявления аллеля +1931 А MIP-1β проведение монотерапии циклофосфамидом неэффективно.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность определения эффективности терапии хронического гломерулонефрита по наличию аллелей и генотипов гена хемокина макрофагального воспалительного протеина 1β (rs1719153).
Способ осуществляют следующим образом.
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (рН=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции.
Анализ полиморфизма +1931 А/Т MIP-1β проводят методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров и специфических зондов (табл.1) с последующим генотипированием методом дискриминации аллелей.
Таблица 1
Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования полиморфного локуса гена макрофагального воспалительного протеина MIP-1β
Ген
Полиморфизми его локализацияв гене
Структура праймеров и зондов
Литература
MIP-1β(rs1719153)
+1931А/Т
F - 5'-CAA GGG TTT TAA С CAC CCT TAT GAA С-3'R - 5'-CCA AGC AGG CCT ACA AGC TT-3'
William S., 2006 г.
FAM:5'-TTT CCT TAA CTG TGA AAC T-RTQ1-3'5'-TTT CCT TAA CAG TGA AAC T BHQ2-3'
2
Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (рН=8,8), 2,5 мМ MgCl, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 95°C) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров - 1 мин при 49°C; денатурация - 15 сек при 95°C.
При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (амплификатор IQ5) генотипирование осуществляют методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда (фиг.1). Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю T, зонд с красителем FAM - аллелю A.
Предлагаемое изобретение характеризуется следующими графическими материалами:
Фиг.1. Дискриминация аллелей по локусу +1931 А/Т MIP-1β (где • - гомозиготы +1931 AA,  - гомозиготы +1931 TT,  - гетерозиготы +1931AT, ⋄ - отрицательный контроль).
Фиг.2. Частота аллеля +1931 T MIP-1β среди больных ХГН, получавших монотерапию циклофосфамидом, с различной эффективностью терапии.
В качестве конкретного примера приведен анализ результатов наблюдений 49 больных хроническим гломерулонефритом. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. Обследование проводилось на базе отделения нефрологии Белгородской областной клинической больницы.
Проведено изучение эффективности терапии препаратом циклофосфамидом - каждому пациенту была назначена суточная доза препарата 2-3 мг/кг веса.
Эффективность иммуносупрессивной терапии оценивали через 6 месяцев после начала лечения по следующим критериям:
- для больных с нефротическим синдромом - исчезновение и уменьшение признаков нефротического синдрома с полным восстановлением функции почек;
- для больных с активным хроническим гломерулонефритом без нефротического синдрома - снижение уровня протеинурии не менее чем на 50%.
В исследуемой выборке положительный эффект при монотерапии циклофосфамидом наблюдался у 37 пациентов (75,51%). Отсутствие эффекта от лечения зарегистрировано у 12 человек (24,49%).
2
cor
Из табл.2 видно, что у больных с отсутствием положительного эффекта от терапии циклофосфамидом частота генотипа +1931 AA MIP-1β была наибольшей и составила 83,33% в сравнении с индивидуумами, имеющими положительный ответ на лечение циклофосфамидом, где данный показатель был в 2 раза меньше и равнялся 40,54% (χ=5,04, p=0,025). Следует отметить, что при введении поправки Бонферони (поправка введена с целью минимизации ошибок 1-го рода, связанных с получением ложноположительных результатов [16]), показатель значимости полученных результатов не достигает статистически достоверного уровня (p=0,075).
Таблица 2
Эффекты терапии циклофосфамидом у больных хроническим гломерулонефритом в зависимости от генетического полиморфизма +1931 А/Т MIP-1β
Эффективность терапии
Генотипы
n
%
есть эффект
нет эффекта
χ<sup>2</sup>(p)
OR 95% CI
n
%
n
%
+1931 AA
25
51,02
15
40,54
10
83,33
5,04 (p=0,025)
0,14 (0,02-0,82)
+1931 AT
20
40,82
18
48,65
2
16,67
2,63 (p=0,11)
4,74 (0,79-36,33)
+1931 TT
4
8,16
4
10,81
0
0
0,34 (р=0,56)
0,20 (0,19-0,21)
Итог
49
100
37
100
12
100
Различия по частотам аллелей локуса +1931 А/Т MIP-1β между сравниваемыми группами больных видны на фиг.2.
2
Среди индивидуумов с отрицательным эффектом от проведенной монотерапии циклофосфамидом распространенность аллеля +1931 T MIP-1β составила 8,33%, что более чем в 4 раза меньше аналогичного показателя у больных с положительным результатом от лечения циклофосфамидом - 35,14%, (χ=5,13, p=0,02).
Таким образом, можно заключить, что поставленная задача решена. Генетический полиморфизм гена +1931 А/Т макрофагального воспалительного протеина 1β имеет важное значение для прогнозирования эффективности монотерапии циклофосфамидом у больных хроническим гломерулонефритом. Молекулярно-генетический маркер +1931 T MIP-1β ассоциирован с положительным ответом на проводимую монотерапию циклофосфамидом, а в случае выявления аллеля +1931 A MIP-1β проведение монотерапии циклофосфамидом неэффективно.
Литература
1. Кутырина И.М. Применение ингибитора ангиотензин-превращающего фермента при первичных поражениях почек и диабетической нефропатии // Consilium Medicum. - 2002. - т.7, №4. - С.331-333.
2. Мухин Н.И., Тареева И.Е., Шилов Г.Л. Диагностика и лечение болезней почек. - М.: ТЕОТАР-МЕД, 2002. - 383 с.
3. Nickolas T.L. Awareness of kidney disease in the US population: findings from the National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) 1999 to 2000. Am. J. Kidney Dis. - 2004. - Vol.44. - P.185-197.
4. Петросян Э.К., Цыгин A.H., Ильенко Л.И. и др. Полиморфный маркер R229Q гена подоцина у детей с нефротическим синдромом // Нефрология и диализ. - 2006. т.5, №12. С.589-592.
5. Verhave J.С. et al. An elevated urinary albumin excretion predicts de novo development of renal function impairment in the general population. Kidney Int. - 2004. - Vol.66. - P.18-21.
6. Syrjanen J., Hurme M., Lehtimaki T. et al. Polymorphisms genes cytokine and IgA-nephropatie // Nephron Int. - 2002. - Vol.57. - 487-498.
7. Вашурина Т.В., Сергеева Т.В. Цитокины и адгезивные молекулы в патогенезе хронического гломерулонефрита // Нефрология и диализ. - 2002. - №4. - С.232-239.
8. Камышова Е.С. Клиническое значение полиморфных маркеров гена ангеотензинпревращающего фермента, гена синтетазы альдостерона и гена эндотелиальной синтетазы оксида азота при хроническом гломерулонефрите. Автореферат дисс. к.м.н. - 2004. - 35 с.
9. Quasney М., Bronstein D., at al. Increased Frequency of Alleles Associated with Elevated Tumor Necrosis Factor-α Levels in Children with Kawasaki Disease // Pediatric Research. - 2001. - V.49. - P.686-690.
10. Sugiura Y., Niimi Т., at al. Transforming growth factor β1 gene polymorphism in rheumatoid arthritis // Annals of the Rheumatic Diseases. - 2002. - V.61. - P.826-828.
11. Некипелова Е.В., Калмыкова Е.В., Чурносов М.И. Клиническое и молекулярно-генетическое исследование больных с хроническим гломерулонефритом // Вестник новых медицинских технологий - 2006. - Т.13, №6. - С.170-173.
12. Шестаков А.Е. Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом // Автореферат дисс. к.м.н. - М., 2006. - 25 с.
13. Калмыкова Е.В. Исследование ассоциаций полиморфных маркеров генов интерлейкинов с хроническим гломерулонефритом // Автореферат дисс … к.б.н. - М., 2009. - 18 с.
14. William S. Modi, James Lautenberger, Ping An, Kevin Scott, James J. Goedert, Gregory D. Kirk, Susan Buchbinder, John Phair, Sharyne Donfield, Stephen J. O'Brien, and Cheryl Winkler. Genetic Variation in the CCL18-CCL3-CCL4 Chemokine Gene Cluster Influences HIV Type 1 Transmission and AIDS Disease Progression // Am J Hum Genet. - 2006. vol.79(1). P.120-128.
15. Anders H.J., Sayyed S.A., Vielhaver V. Questions about chemokine and chemokine receptor antagonism in renal inflammation // Nephron Exp. Nephrol. - 2010. - vol.114, №2. - P.33-38.
16. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: МедиаСфера. - 2002. - 312 с.