Способ ранней диагностики онкологического заболевания
METHOD FOR EARLY DIAGNOSIS OF CANCER

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано для ранней диагностики онкологического заболевания различных органов человека.
По данным ВОЗ по смертности онкологические заболевания занимают в настоящее время второе место в мире после сердечно-сосудистых заболеваний (https://www.rosbalt.ru/piter/2020/01/20/1823540.html). Основной причиной высокой смертности от онкологии является ее выявление на поздней стадии.
Ранняя диагностика основных заболеваний человека является одним из главных условий успешности их лечения. Это положение имеет особое значение для онкологии в отношении больных злокачественными новообразованиями.
Все методы диагностики подразделяются на инвазивные, сопровождающиеся нарушением целостности покровов тела, и неинвазивные.
Неинвазивные методы диагностики в свою очередь подразделяются на контактные, когда датчики прилегают к покровам тела, и бесконтактные.
Классические методы онкологической диагностики обязательно включают в себя рентгеновское томографическое исследование определенных органов и тканей пациента и основаны на различиях в проницаемости здоровой ткани и опухоли для рентгеновских лучей (RU 2119767 10.10.1998.) Применение magnetic resonance imaging (MRI), магнитно-резонансной томографии, сложно использовать для ранней диагностики заболеваний, и, к тому же, эта система достаточно дорогая.
Использование биопсийных методов сопровождается дискомфортом пациента и его эффективность зависит от того насколько корректно проведен анализ локализации злокачественного новообразования.
Наиболее приемлемыми, с точки зрения пациента, являются методы на основе анализа молекулярных биомаркеров, полученных из образцов крови пациента.
Известен способ диагностики онкологических заболеваний с молекулярным анализом крови пациента с помощью ИК-спектрометра. С этой целью берут 0,05 мл крови из вены пациента и применяют ее на призму множественного нарушенного полного внутреннего отражения и, используя обычный ИК-спектрофотометр, регистрирует ИК-спектр вышеуказанного отражения крови пациента. При наличии онкологического заболевания в спектре, в отличие от спектра крови, взятого из донора, дополнительная полоса поглощения находится в области частот 1500-3000 см.: При раке крови при 1625 см, раке молочной железы при 1735 см, раке печени 2864 см, а в случае лимфогранулематоза - при 1580 см. Способ изобретения повышает точность диагностики примерно в 230 раз и прост в отношении необходимого оборудования. Относительно небольшое количество крови, необходимое для анализа, позволяет диагностировать онкологические заболевания у детей (RU 2108577,кл. G01N21/35; G01N33/49, опубл.27.03.1997 г.)
Sci Rep
8
TUB
43
2018
2021
Среди серологических методов диагностики рака можно еще выделить методы на базе ИФА-методов с использованием маркеров CEA, CA 19-9, CA 242 [Gao, Y.; Wang, J.; Zhou, Y.; Sheng, S.; Qian, S. Y.; Huo, X. Evaluation of Serum CEA, CA19-9, CA72-4, CA125 and Ferritin as Diagnostic Markers and Factors of Clinical Parameters for Colorectal Cancer. ,  (1), 2732. https://doi.org/10.1038/s41598-018-21048-y. Björkman, K.; Mustonen, H.; Kaprio, T.; Kekki, H.; Pettersson, K.; Haglund, C.; Böckelman, C. CA125: A Superior Prognostic Biomarker for Colorectal Cancer Compared to CEA, CA19-9 or CA242. ,  (1), 57-70. https://doi.org/10.3233/TUB-200069.], однако эти маркеры не являются специфическими.
-13
Иммуноферментные и другие стандартные белковые способы на основе матриц для ранней диагностики рака ограничены невысокой концентрационной чувствительностью (не выше концентрации 10 моль/л). Кроме того, эти способы являются неспецифическими, а ПЦР способы не свободны от недостатков, связанных с амплификацией, что может приводить к ошибкам и ложноположительным результатам. Поэтому разработка новых способов выявления онкологических заболеваний на ранней стадии являются весьма актуальной задачей.
Так, способ иммуноферментного анализа (ИФА) для белковой диагностики онкологических заболеваний имеет длительность постановки анализа (2-24 часа), отсутствие жесткого контроля качества тест-систем, неспецифичность анализа, т.к. основан на детекции маркеров воспалительных процессов.
-12
Известен способ диагностики рака путем обнаружения микроРНК при помощи оптического биосенсора, который позволяет в реальном масштабе времени по мониторингу изменения коэффициента преломления проследить за кинетикой взаимодействия, рассчитать константу равновесия реакции лиганд/рецептор без использования меток и менее продолжителен по сроку выполнения анализа (до нескольких минут). Однако этот метод обладает пределом концентрационной чувствительности, не превышающей 10М, сложностью осуществления контроля вклада в сигнал оптического биосенсора от неспецифических взаимодействий компонентов биологической жидкости (Kodoyianni V. SPR principles //BioTechniques. - 2011. - Т. 50. - №. 1. - С. 32-40)
Имеющиеся к настоящему времени другие способы диагностики онкологических заболеваний также обладают сложностью в выполнении анализа и длительностью во времени.
Известен способ диагностики рака, основанный на определении онкомаркеров белковой природы в крови человека на биологическом микрочипе (патент RU 2 625 018 C2). Недостаток этого способа состоит в том, что используемые белковые маркеры могут быть неспецифичны для онкозаболевания, т.к. из литературных источников известно, что белковые маркеры являются маркерами воспалительного процесса.
Известен способ диагностики онкологического заболевания с помощью биологического микрочипа для обнаружения опухолевых экзосом (Патент RU 2 682 721 C2). Недостаток этого способа состоит в том, что детекция чипов производится с использованием меченых антител, которые могут давать ошибку в измерении за счет применения метки, т.е. это метод непрямой регистрации белка на поверхности опухолевой экзосомы из сыворотки крови. Кроме того, белковые маркеры, как правило, являются маркерами воспалений, а не прямыми маркерами онкологии.
-13
В настоящее время особый интерес представляют способы диагностики онкологических заболеваний на основе биосенсора нанопроводного чипа (НП-чип), которые относят к перспективному новому поколению диагностики, позволяющей регистрировать белковые маркеры в биологической жидкости при низких концентрациях (<10 М), когда патологический процесс находится на ранней стадии развития. Кроме высокой чувствительности, эта система позволяет проводить анализ в реальном времени без использования меток.
Одним из основных факторов, определяющих высокую чувствительность диагностических устройств этого поколения диагностики, является использование сенсорных элементов, размеры которых соизмеримы с размерами детектируемых белков, т.е. наноразмерных сенсоров. Теоретическая оценка предела детекции с помощью биосенсора НП-чипа показала, что сигнал может быть зарегистрирован от единичной биомолекулы, сорбированной на нанопроводоном сенсорном элементе НП-чипа (Elfström N. et al. Surface charge sensitivity of silicon nanowires: Size dependence //Nano Letters. - 2007. - Т. 7. - №. 9. - С. 2608-2612).
Очень близким к вышеописанным способам является способ ранней диагностики рака с помощью биосенсора нанопроволочного чипа, изложенный в статье [Tran D. P. et al. Toward intraoperative detection of disseminated tumor cells in lymph nodes with silicon nanowire field effect transistors //ACS nano. - 2016. - Т. 10. - №. 2. - С. 2357-2364.]. Однако этот способ дает возможность проводить диагностику заболеваний только по анализу циркулирующих раковых клеток. Недостатком этого способа является использование для диагностики уже сформированных метастазов, что исключает его применения на ранней стадии заболевания.
Как правило, для детекции с помощью биосенсора НП-чипа молекул, ассоциированных с развитием онкологических заболеваний, обычно используется микроРНК (миРНК) как ранний маркер развития заболевания.
Прототипом предлагаемого изобретения является способ диагностики онкологических заболеваний, на основе детекции с помощью биосенсора НП-чипа и молекул, ассоциированных с развитием онкологических заболеваний, включающий регистрацию миРНК в крови пациента, страдающего раком молочной железы. Регистрацию миРНК проводится с помощью биосенсора нанопроводного чипа (НП- чипа), поверхность которого ковалентно модифицируется ДНК-олигонуклеотидными зондами (о-ДНК), комплементарными миРНК, ассоциированной с раком молочной железы. Такой НП-чип инкубируют в образце с миРНК, выделенных из крови пациента. При этом образуются комплексы между о-ДНК зондами и специфичными для них миРНК. Образование комплексов сопровождается измерением электрического тока, пропускаемого через сенсорные элементы НП-чипа. (RU 2696114, кл. А61В 8/08, опубл. 31.07.2019 г.)
Однако недостаток данного способа использования только миРНК для диагностики рака заключается в том, что миРНК могут быть неспецифичными к конкретным онкологическим заболеваниям [Федянин Михаил Юрьевич, Игнатова Екатерина Олеговна, Тюляндин Сергей Алексеевич Роль микро-РНК при солидных опухолях // Злокачественные опухоли. 2013. №1 (5). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/rol-mikro-rnk-pri-solidnyh-opuholyah (дата обращения: 01.11.2021).].
Техническим результатом предлагаемого способа ранней диагностики онкологического заболевания является обеспечение надежности диагностики при быстродействии на уровне нескольких минут.
Для достижения заявленного технического результата предлагается способ ранней диагностики онкологического заболевания с использованием биосенсора нанопроводного чипа, включающий анализ и подбор последовательности о-ДНК-зондов, комплементарным к участкам малых ядрышковых РНК, ассоциированных с развитием онкологического заболевания, ковалентную иммобилизацию указанных зондов на поверхности НП-чипа на базе полевого нанотранзистора, и регистрацию ассоциированных с онкологическим заболеванием малых ядрышковых РНК , циркулирующих в крови пациентов, по изменению уровня тока, проходящего через сенсорный элемент НП-чипа, при образовании в процессе инкубации НП-чипа в образце крови диагностируемого пациента комплекса между последовательностями о-ДНК-зондов и комплементарными им участками малых ядрышковых РНК.
В отличие от прототипа в предлагаемом изобретении используются при инкубации НП-чипа в крови диагностируемого пациента образуемые в процессе инкубации комплексы между выбранной последовательностью о-ДНК и комплементарными ей участками малой ядрышковой РНК (snoРНК) , циркулирующей в крови диагностируемого пациента.
Порядок осуществления предлагаемого способа ранней диагностики онкологических заболеваний включает следующие стадии:
- анализ и выбор последовательности о-ДНК-зондов, выделенной из крови пациента , комплементарной к участкам snoРНК, ассоциированных с диагностируемым онкологическим заболеванием;
- ковалентная иммобилизация на поверхности НП-чипа выбранной последовательности о-ДНК-зондов;
- выделение из крови пациента snoРНК;
- инкубация образца НП-чипа в растворе крови диагностируемого пациента ,содержащего snoРНК с образованием комплексов между биоспецифическими диагностируемому раку участками snoРНК и иммобилизованными на поверхности НП-чипа молекулами выбранной последовательности о-ДНК - зонда;
- измерение сигнала тока, протекающего через нанопроволочные элементы НП-чипа при образовании комплексов между иммобилизованными на их поверхности молекулами о-ДНК - зондами и биоспецифичными участками snoРНК с построением кривых изменения уровня сигнала тока.
НП-чип к биосенсору содержит на своей поверхности нанопроволоки в виде массива полевых нанотранзисторов на базе структур Кремний на Изоляторе (далее называемый НП-чип), являющиеся чувствительными элементами. НП-чип был изготовлен с помощью КМОП - технологии. Биосенсор с таким чипом характеризуется чувствительностью на субфемтомолярном уровне, быстродействием - порядка нескольких минут.
Предлагаемый в настоящем изобретения способ ранней диагностики онкологических заболеваний осуществлялся следующим образом.
SNORA15
Для подготовки НП-чипа использовалась последовательность , циркулирующей в крови пациента с диагнозом диагностируемого онкологического заболевания.
SNORA15
ACA15
В молекулярной биологии ,  (также известный как ) является членом класса Н / АСА из малых ядрышковых РНК (snoРНК), которая направляет сайты модификации уридинов к псевдоуридин.
Далее для целей диагностики экспериментально выбирался участок в последовательности малой ядрышковой РНК (snoРНК), который представляет «мишень» диагностирующего онкологического заболевания для о-ДНК зонда, ковалентно иммобилизованного на поверхности НП-чипа
Выделение snoРНК из плазмы крови пациента осуществлялся с использованием набора ExtractRNA (Евроген). Реагент в составе набора представляет собой монофазный водный раствор фенола и гуанидин-изо-тиоцианата и служит для быстрого лизиса клеток. Однако это не исключает использование и другого способа безгуанидинового выделения snoРНК из крови пациента, например, на основе фенол-хлороформной или фенольной экстракции.
Для выбранного участка snoРНК из 15 нуклеотидов синтезировался в фирме ЕВРОГЕН комплементарный о-ДНК-зонд, включающий последовательность из 15 нуклеотидов и линкер для ковалентной иммобилизации к НП-чипу.
Ковалентная иммобилизация (функционализация НП-чипа) о-ДНК-зонда на поверхности НП-чипа за его аминогруппу осуществлялась с помощью бифункционального кросс-линкера на основе сукцинимидного эфира.
С этой целью в буферный раствор (7 мкл), содержащий snoРНК, выделенные из плазмы крови пациента, добавлялся в измерительную кювету, содержащую 100 мкл буферного раствора, дном которой являлась поверхность НП-чипа с иммобилизировым олигонуклеотидным зондом.
Электрические измерения проводились с помощью 10-ти канальной системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя. Во время измерений поверхность нанопровлочных структур НП-чипа была использована в качестве управляющего электрода (затвора полевого нанотранзистора). В предлагаемом способе использовались НП-чипы n-типа проводимости.
I
(t)
V
V
ds
g
ds
Временные зависимости тока  регистрировались принапряжении на затворе транзисторов= 50 В и напряжении исток-сток  = 0,1 В в режиме реального времени.
I
(t)
I
ds
ds
Полученные результаты представлялись в виде зависимостей , отражающих разностный сигнал между рабочим (с иммобилизованным о-ДНК зондом) и контрольным (не содержащим молекул-зондов) НП-чипа биосенсора (Δ ) представленные на рис.1, 2,3.
Для подтверждения точности и надежности предлагаемого способа ранней диагностики онкологических заболеваний была проверена функциональность НП-чипа. С этой целью на поверхность НП-чипа наносился раствор, содержащий при разных концентрациях комплементарные (о-ДНК) к иммобилизованным на поверхности чипа о-ДНК зондам.
-17
Была найдена экспериментально минимальная концентрация при которой биосенсор НП-чипа еще реагировал на добавку раствора о-ДНК в виде изменения сигнала тока. Эта концентрация была определена на минимальном уровне равным 10 моль/л.
В табл. 1, 2 и 3 представлены последовательности о-ДНК зондов , использованных для диагностирования колоректального рака , рака предстательной железы (простаты), глиомы (рака мозга).
На рис.1 приведены результаты применения предлагаемого способа ранней диагностики онкологического заболевания колоректальный рак, где кривая 3 показывает изменение сигнала тока, соответствующего сигналу c НП-чипа при добавке в измерительную кювету образца, полученного от пациента с диагнозом колоректальный рак, кривая 1 - изменение сигнала тока, соответствующего добавке образца, полученного от пациента с диагнозом гиперплазия предстательной железы , а кривая 2- соответствующая изменению сигнала тока, полученного при добавке образца здорового добровольца. Стрелкой указано добавление раствора образца и его замена на буферный раствор при отмывке кюветы.
На рис.2 кривая показывает изменение сигнала тока, соответствующего сигналу c НП-чипа при добавке в измерительную кювету образца, полученного от пациента с диагнозом рак предстательной железы. Стрелкой указано добавление раствора образца.
На рис. 3 кривая показывает изменение сигнала тока, соответствующего сигналу c НП-чипа при добавке в измерительную кювету образца, полученного от пациента с диагнозом рак предстательной железы. Стрелкой указано добавление раствора образца.
Новизна предлагаемого способа заключается в том, что в способе диагностики на основе нанопроводной (НП-биосенсорной) детекции впервые реализуется специально выделенный участок малой ядрышковой РНК (snoРНК), образующий в качестве онкомаркера в нанопроволочном устройстве биоспецифический комплекс с комплементарной этому участку, выбранному из крови пациента, последовательности о-ДНК
При анализе известных аналогов совокупность существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, включая порядок и условия проведения предлагаемого способа ранней диагностики онкологического заболевания явным образом не следует из уровня техники, что соответствует критерию «изобретательский уровень».
Предлагаемый в настоящем изобретении способ ранней диагностики онкологических заболевания путем выявления snoРНК, ассоциированного с развитием онкологического заболевания, позволяет достигать высокую фемтомолярную концентрационную чувствительность обнаружения циркулирующей в крови snoРНК (без амплификации), что соответствует ранней стадии развития онкопатологии в режиме реального времени в течении порядка десяти минут.
Таблица 1Последовательности биоспецифического о-ДНК зонда и участка малой ядрышковой РНК SNORA15 (5’ - 3’) для колоректального рака
snoРНК
Выбранный участок последовательности SNORA15
Количество нуклеотидов
SNORA15 (Хромосома7: 56,060,470-56,060,602)
UUCCCUUUAGAAUGA
<b>15 н</b>
Последовательность о-ДНК-зонда
5’-(NH2)-(T)<sub>10</sub> -TCATTCTAAAGGGAA
линкер-(<b>15 н</b>)
Таблица 2Последовательности биоспецифического о-ДНК зонда и участка малой ядрышковой РНК SNORA15 (5’ - 3’) для рака предстательной железы
snoРНК
Выбранный участок последовательности SNORA55
Количество нуклеотидов
SNORA55 (Хромосома1: (39,567,374- 39,567,510)
<b>G</b><b>CAGAGGAAAU</b><b>CCAG</b>
<b>15 н</b>
Последовательность о-ДНК-зонда
5’-(NH<sub>2</sub>)-(T)<sub>10</sub>-CTGGATTTCCTCTGC
линкер-(<b>15 н</b>)
Таблица 3Последовательности биоспецифического о-ДНК зонда и участка малой ядрышковой РНК SNORA33 (5’ - 3’) для глиомы.
snoРНКSNORA33
Выбранный участок последовательности SNORA33
Количество нуклеотидов
SNORA33(Хромосома 6:(132,817,219- 132,817,351)
CCA AUGAAUCUGC UU
<b>15 н</b>
Последовательность о-ДНК-зонда
5’-(NH<sub>2</sub>)-(T)<sub>10</sub>-AAGCAGATTCATTGG-3’
линкер-(<b>15 н</b>)