Применение ускоренных микробиологических методов для определения патогенных листерий в мясе

Применение ускоренных микробиологических методов

для определения патогенных листерий в мясе

БАТАЕВА Д.С., канд.техн.наук

ВНИИ мясной промышленности НЕЧАЕВ А.Ю., канд.вет.наук

Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Проблема выявления возбудителей пищевых зоонозов, в том числе и L.monocytogenes, в сырье и готовой продукции в практике производственного контроля по-прежнему остается актуальной.

Статистика болезней пищевого происхождения, приведенная ВОЗ, регистрирует значительное увеличение в Европе заболеваний, обусловленных потреблением продуктов питания, контаминированных Listeria monocytogenes [3].

Возникновение пищевого листериоза связано с употреблении продуктов питания (мясо и мясные продукты, молоко и молочные продукты, рыба, яйца) выработанных с нарушением режимов тепловой обработки или обсеменением патогенными листериями в процессе производства и хранения. Ведущее положение в появлении пищевого листериоза занимают мясо и мясные продукты.

В странах Европейского Союза, а также в США, Канаде и Японии требования к контролю мяса и мясных продуктов на наличие L. monocytogenes строго регламентированы, и исследование пищевых продуктов является обязательным

В Российской Федерации с 2002 г. в СаНПиН 2.3.2.1078-01 определен перечень пищевых продуктов, которые контролируются на наличие L. monocytogenes.

Разработаны ГОСТ Р 51921-2002 и МУК 4.2.1122-02, в соответствии с которыми должны проводиться исследования пищевой продукции на L. monocytogenes.

Скрининг исследуемой продукции на наличие L. monocytogenes предусматривает четыре этапа: предобогащение, обогащение, выявление и подтверждение.

Выявление L. monocytogenes в пищевых продуктах имеет ряд особенностей. Одна из них состоит в том, что в пищевых продуктах микроорганизмы рода Listeria находятся в смешанной форме с другими микроорганизмами и для их выявления необходимо применение специальных селективных сред обогащения.

Другая особенность скрининга - сопутствующее выделение непатогенных для человека видов листерий, обладающих сходными с L. monocytogenes культурально-морфологически-ми свойствами. Например, L. innocua является наиболее часто сопутствующим микроорганизмом L. monocytogenes в мясе и мясных продуктах [1,2]. В связи с этим необходимо использовать строго специфические среды и методы для выявления и идентификации патогенного для человека вида листерий.

Целью данной работы является сравнительная оценка эффективности ускоренных методов, таких как метод кон-дуктометрического определения, иммуноферментного анализа и фенотипический метод дифференцирования микроорганизмов рода листерий, выделенных из мяса, исходя из их факторов патогенности.

В качестве материала исследований использовали 62 образца охлажденного мяса (свинины). Отбор и подготовку проб пищевых продуктов проводили согласно ГОСТ 26668

и ГОСТ 26669 и в соответствии с требованиями других действующих ГОСТ и нормативной документации на конкретные виды продуктов.

Выделение и идентификацию L. monocytogenes проводили согласно ГОСТ Р 51921-02 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes» и МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах».

На этапе выделения применяли ускоренный метод кон-дуктометрического определения в микробиологическом анализаторе «БакТрак 4300». Длительность анализа составляла около 24 ч.

Одновременно листерии определялись в исследуемых образцах иммуноферментным методом на анализаторе miniVIDAS с использованием теста VIDAS Listeria monocytogenes II (LM02). Перед проведением исследования на miniVIDAS первичное и вторичное селективные обогащения проб проводили с использованием бульона Фразер. Продолжительность анализа составляла около 70 мин, а общая продолжительность исследования - 3 дня.

Согласно ГОСТ Р 51921-2002 положительные результаты теста VIDAS Listeria monocytogenes II (LM02) не являются окончательными и требуют подтверждения классическими методами с использованием сахаров или биохимических тест-панелей.

Для подтверждения выделенной культуры к патогенному виду L. monocytogenes были использованы биохимические панели системы API Listeria (фирмы BioMerieux).

Для оценки факторов патогенности выделенных листерий производился посев на кровяной агар и хромогенный ALOA-агар по Ottaviani Agosti. Характерная реакция на среде ALOA позволяла дифференцировать L. monocytogenes от непатогенных видов листерий.

Результаты исследований показали следующее. На первом этапе скрининга с помощью микробиологического анализатора «БакТрак 4300» из 62 исследованных образцов свинины микроорганизмы рода листерий были определены в 8 пробах.

В ходе биохимической идентификации микроорганизмов рода листерий, проведенной с помощью стрипов API Listeria, установлено, что из выделенных 8 культур в трех случаях определяются L. monocytogenes, а в 5 - L. innocua. Дифференциальным тестом культур L. monocytogenes отL. innocua в тест-панели API-Listeria является DIM-тест. Отрицательный DIM-тест свидетельствует о принадлежности выделенной культуры к L. monocytogenes, положительный - к L. innocua.

ВСЕ О МЯСЕ, 3-2007.

27

№ образца Кондуктометрический метод (БакТрак 4300) определения микроорганизмов рода Listeria Иммуноферментный метод (mini VIDAS) определение L. monocytogenes Фенотипические методы определения факторов патогенности

Отрицательный DIM - тест API-Listeri'a в-гемолиз

i + - - - -

L2 + + + + + зона просветления

L3 + - - - -

4 + - - - -

L5 + + + + + зона просветления

L6 + - - - -

7 + - - - -

L8 + - - - -

Изменения, характерные для L. monocytogenes при посеве на кровяной агар, как наличие р-гемолиза, и на хромо-генном ALOA-агаре по Ottaviani Agosti как рост сине-зеленых колоний с зоной просветления, были обнаружены только у 2 из 8 выделенных культур микроорганизмов рода Listeria.

Такие же результаты были получены на анализаторе miniVIDAS при исследовании аликвот из сред обогащения 62 образцов. Только в двух пробах с помощью miniVIDAS были выявлены L. monocytogenes, которые входили в число проб определенные как микроорганизмы рода листерия на приборе «БакТрак 4300» и как L. monocytogenes с помощью API Listeria.

Результаты исследований 8 культур микроорганизмов рода Listeria представлены в таблице.

Согласно данным, представленным в таблице, результаты теста VIDAS L. monocytogenes II (LM02) четко совпадали с фе-нотипическими проявлениями патогенности: р-гемолизом на кровяном агаре и фосфолипазной реакцией на хромогенном ALOA-агаре по Ottaviani Agosti. Только в двух образцах было обнаружено присутствие микроорганизмов вида L. monocytogenes. Остальные 6 выделенных микроорганизмов рода листерий, не обладавшие факторами патогенности, то есть не проявлявшие гемолитических свойств на кровяном агаре, не способные к расщеплению фосфолипазы С на хромогенном ALOA-arape и имевшие сходство по максимальному количеству феноти-пических и метаболических тестов с L. innocua, были признаны в итоге представителями данного непатогенного вида.

В ходе исследования имела место полная корреляция положительных результатов теста VIDAS LM02 и фенотипи-ческих проявлений патогенности. Все положительные результаты этого теста подтвердились наличием характерных колоний на хромогенном ALOA-arape.

Результаты работы показали, что для подтверждения принадлежности выделенной культуры к патогенному виду L. monocytogenes необходимо проведение комплекса исследований.

Очевидна целесообразность использования для определения патогенных листерий хромогенного ALOA-агара по Ottaviani Agosti, выявляющего наличие вирулентного фактора L. monocytogenes - фермента фосфотидилинозит-специфичной фосфолипазы С.

Использование комбинации ускоренных методов с высокоспецифичными тестами патогенности позволит повысить эффективность производственного контроля пищевой продукции на наличие возбудителя листериоза.

Учитывая вышеизложенное, следует признать, что выяснение реальной контаминации микроорганизмами вида L. monocytogenes мясного сырья, пищевых продуктов и объектов производства, принятие действенных мер профилактики и предупреждение необоснованных забраковок продукции связано с необходимостью совершенствования методологических подходов к выделению и идентификации этого возбудителя. Одним из решений этой проблемы является разработка эффективных ускоренных способов скрининга и идентификации L. monocytogenes в пищевых продуктах. Внедрение в практику ветеринарно-санитарной экспертизы ускоренных, высокочувствительных и специфичных тестов является одной из мер, обеспечивающий выпуск качественной и безопасной продукции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ерофеева Ю. К., Янковский К. С., Костенко Ю. Г. Обнаружение листерий в мясном сырье и его санитарная оценка//Все о мясе. 2003. № 3. С. 31-32

2. Костенко Ю. Г., Шагова Т. С., Янковский К. С. Листе-рии - критерий безопасности мясных продуктов//Мясная индустрия. 1997. № 3. С. 23-24

3. Программа ВОЗ по наблюдению и контролю за пищевыми инфекциями и интоксикациями в Европе//Вестник ВОЗ. 2004. № 80

: Птицеводы республики Татарстан планируют ежегодно | производить по 3000 т мяса индеек. Первую партию мяса ин-| деек планируют поставить в торговую сеть в августе текущего

года птицеводы крестьянско-фермерских хозяйств (КФХ) : «Марс», являющегося структурным подразделением ОАО : «Татптицепром». Об этом сообщил генеральный директор : «Татптицепрома» Марс Алиев. До этого года выращиванием : индеек целенаправленно занимались лишь работники КФХ : «Хайрутдинов» Лениногорского района. В этом году произ-| водством мяса индеек занялись и птицеводы КФХ «Марс»

Зеленодольского района. На сегодняшний день в этом

хозяйстве насчитывается 25 тыс. голов индеек. В целом : до конца этого года в хозяйстве планируют произвести 500 т

диетического мяса, поскольку этот продукт содержит 23 % : белка и лишь 4 % жира.

На будущий год птицеводы «Марса» намерены увеличить : производственные мощности своего предприятия. В экс- | плуатацию будет введено еще одно помещение для со-  держания птиц. Поголовье индеек увеличится до 100 тыс. ; голов, что позволит ежегодно производить не менее 3000 т : мяса. Выращивать индеек очень выгодно. За 102 дня масса : самок достигает 10-12 кг, самцов (за 140 дней) - 15-18 кг. : При этом среднесуточные привесы на откорме молодняка составляют 70-80 г.

http://meatinfo.ru/news/region \

28

ВСЕ О МЯСЕ, 3-2007