Особенности доклинических исследований биотехнологических лекарственных препаратов

иммунология № 5, 2015

ОБЗОРЫ

© коллектив авторов, 2015 удк 615.37.07

Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Солдатов А.А., Бондарев В.П., Бунятян Н.Д., Меркулов В.А., Медуницын Н.В., Мосягин В.Д.

особенности доклинических исследований биотехнологических лекарственных препаратов

ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России (ФГБУ "НЦ ЭСМП" Минздрава России), 127051, Москва, Россия

Обзор посвящен вопросам доклинических исследований биотехнологических лекарственных препаратов, включающих препараты системы цитокинов, растворимых рецепторов и их антагонистов, моноклональных антител, ин-терферонов, факторов свертывания крови, филграстима, эритропоэтина и др., активным веществом которых являются белки и их производные, полученные с использованием методов рекомбинантной ДНК. Приведены общие принципы проведения доклинических исследований указанных групп биотехнологических препаратов, требования к оценке их качества на этапах разработки и последующих исследований, включающих характеристику физико-химических свойств, специфической биологической активности, фармакокинетики, фармакодинамики, токсичности, иммуногенности. Решение о проведении дальнейших клинических исследований базируется на результатах, полученных при доклинических исследованиях препарата.

Ключевые слова: биотехнологические лекарственные препараты; доклинические исследования; рекомбинант-ные белки; оценка безопасности; специфическая активность.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36 (5): 306-312. Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Soldatov A.A., Bondarev V.P., Bunyatyan N.D.,Merkulov V.A., Medunitsin N.V., Mosyagin V.D.

FEATURES OF PRECLINICAL STUDIES OF BIOTECHNOLOGICAL MEDICINES «SCIENTIFIC CENTER OF EXPERTISE OF MEDICAL APPLICATION» OF RMPH, 127051, MOSCOW, RUSSIA

The review is devoted to questions of preclinical researches of biotechnological medicines which active agent are the proteins and their derivatives received with use of the methods of recombinant DNA including medicines system of cytokines, soluble receptors and their antagonists, monoclonal antibodies, interferon, blood coagulation factors, filgrastim, erythropoietin, etc. The general principles of carrying out preclinical researches of the specified groups of biotechnological medicines, requirements to an assessment of their quality are given in development stages and the subsequent researches including the characteristic of physical and chemical properties, specific biological activity, pharmacokinetics, pharmacodynamics, toxicity, and immunogenicity. The decision on carrying out further clinical trials is based on the results received at preclinical researches of a medicine.

Keywords: biotechnological medicines; preclinical researches; recombinant proteins; safety assessment; specific activity.

citation: Immunologiya. 2015; 36 (5): 306-312.

К биотехнологическим относят лекарственные препараты, производство которых осуществляют с использованием биотехнологических процессов и методов, в том числе ДНК-рекомбинантной технологии, технологии контролируемой экспрессии генов, кодирующих биологически активные белки в прокариотах и эукариотах, включая измененные клетки млекопитающих, гибридомного метода и метода монокло-нальных антител.

В данную группу препаратов включены препараты реком-бинантных цитокинов, растворимых рецепторов и их антагонистов, интерфероны, эритропоэтины, рекомбинантные факторы свертывания крови, моноклональные антитела (МкАТ), препараты модифицированных МкАТ, вакцины на основе рекомбинантных белков (HBsAg, белки вируса папилломы и др.), филграстим, факторы роста, гормоны, фьюжен белки (белки слияния) и др.

Генно-инженерные лекарственные препараты предназна-

Для корреспонденции: Авдеева Жанна Ильдаровна, avd-cytok@yandex. ru

For correspondence: Avdeeva Zhanna D'darovna, avd-cytok@ yandex.ru

чены для лечения, профилактики и диагностики различных заболеваний, характеризующихся длительным прогрессирующим течением - ревматических, онкологических, инфекционных, аллергических, сердечно-сосудистых заболеваний, а также для профилактики отторжения трансплантата.

На современном фармацевтическом рынке с каждым годом увеличивается количество биологических лекарственных препаратов, полученных с помощью генно-инженерных технологий. Указанные препараты значительно отличаются от препаратов, получаемых путем химического синтеза, более сложной по строению молекулой действующего вещества, которое представляет собой активное вещество белковой природы, синтезируемое модифицированными клетками, используемыми в качестве систем экспрессии. Белок в таких препаратах имеет сложное пространственное строение и во много раз превосходит молекулу, получаемую методом химического синтеза, как по массе, так и по размерам. Так, молекулярная масса молекулы аспирина составляет 135 Да, кальцитонина (синтетического гормона щитовидной железы) - 3455 Да, тогда как молекулы филграстима (гранулоцитар-ного колониеобразующего фактора) - 18 800 Да, молекулы МкАТ - 150 000 Да. Препарат кальцитонин содержит 32 аминокислоты, филграстим - 175, МкАТ - 1300 аминокислот.

Для получения указанных препаратов используют слож-

ный многоэтапный биотехнологический процесс, требующий тщательного контроля на каждом из этапов. Известно, что качество биотехнологических препаратов (БТП) обеспечивается условиями их производства. Несмотря на то, что данное положение касается всех биологических лекарственных препаратов, в первую очередь, оно относится к генно-инженерным препаратам.

Процесс производства БТП включает этапы аффинной, ионообменной и гельпроникающей хроматографии и другие способы очистки с целью получения высокоочищенного белкового продукта. При этом должна быть обеспечена полнота удаления или инактивации потенциальных инфекционных агентов, примесей, связанных с процессом производства (белки клеток-хозяина и ДНК штамма-продуцента, реагенты, используемые при очистке, например, белок А, антибиотики, компоненты среды культивирования клеток и др.). Профили чистоты (содержание родственных соединений и посторонних примесей) должны быть оценены как качественно, так и количественно с помощью взаимодополняющих аналитических методик. Все этапы процесса, включая стадии ферментации, очистки, методы фрагментации, конъюгации и др., должны быть валидированы для обеспечения стабильности и воспроизводимости производства. Поскольку процесс производства генно-инженерных препаратов базируется на использовании системы банков клеток (главный и рабочий банки клеток), в регистрационное досье на препарат должны быть включены сведения о банках клеток, стабильности экс-прессирующей конструкции, генетических и фенотипиче-ских характеристиках системы хозяин/вектор.

Одной из важнейших стадий разработки нового лекарственного препарата является проведение доклинических исследований, основная цель которых заключается в оценке безопасности, специфической биологической активности, эффективности препарата для решения вопроса о возможности проведения клинических исследований с целью последующей регистрации препарата. Заключение о возможности проведения исследований с участием добровольцев (здоровых лиц или пациентов) должно основываться на оценке соотношения безопасности и эффективности препарата при его доклиническом исследовании.

На первом этапе доклинических исследований проводится оценка физико-химических параметров действующего вещества, включая вторичную и третичную структуру белка, иммунохимических свойств и биологических свойств как активного компонента, так и готовой лекарственной формы препарата. Известно, что химическая и конформационная структура белка действующего вещества во многом определяют специфические биологические свойства БТП.

Оценка физико-химических показателей и специфической активности должна проводиться с использованием широкого диапазона методов, включая физико-химические, иммунохимические и иммунологические методы, базирующиеся на разных принципах для получения взаимодополняющей информации по оцениваемому показателю. Объем исследований и оцениваемые показатели зависят от природы и свойств лекарственных препаратов, относящихся к конкретной группе БТП.

На этапе доклинических исследований проводят определение безопасных и эффективных доз и схемы введения препарата, которые могут быть рекомендованы для последующих исследований с участием человека; определение потенциальных органов-мишеней побочного действия препарата и исследование обратимости выявленных токсических эффектов. Определение параметров безопасности, показателей возможного побочного действия важно в плане последующих наблюдений на этапе клинических исследований препарата.

В программу доклинических исследований БТП включают изучение токсичности, фармакокинетики и фармако-динамики, иммунологической безопасности, в том числе потенциальной иммуногенности и иммунотоксичности. Обязательность изучения влияния на репродуктивную функцию и эмбриогенез, а также мутагенности и канцерогенности

зависит от свойств конкретного препарата, предполагаемой популяции пациентов, показаний к клиническому применению.

При разработке программы доклинических исследований БТП и требований к оценке их качества, вносимых в нормативную документацию, необходимо руководствоваться принципами, изложенными в отечественных и международных документах [1-9].

Для установления фармакологических и токсикологических эффектов разрабатываемого БТП проводят экспериментальные исследования как in vitro, так и in vivo.

Традиционные подходы к изучению фармакодинамики (ФД), безопасности и токсикологических характеристик, рекомендованные для химических лекарственных средств, имеют ограниченное значение для БТП, получаемых с использованием метода рекомбинантной ДНК. Это обусловлено тем, что указанные препараты обладают уникальными особенностями, включая многообразие молекулярного строения, разнообразные биологические свойства, видоспецифичность, иммуногенность и непредсказуемое плейотропное действие.

Определение эффективности, т. е. характеристику специфического проявления действия препарата проводят с целью выяснения механизмов его терапевтического эффекта. Для этого должен быть использован широкий спектр методик, основывающихся на разных принципах, для выяснения различных механизмов действия лекарственного препарата и выбора наиболее информативного метода оценки биологической активности для включения в нормативную документацию и рутинного контроля выпускаемых серий при промышленном производстве препарата. Выбор методик и подходы к изучению специфической биологической активности зависят от свойств исследуемого препарата.

Оценку биологической активности проводят, используя тесты in vitro и in vivo, результаты этих исследований позволяют установить, какие свойства лекарственного препарата могут быть соотнесены с терапевтическими эффектами, проявляющимися при его клиническом применении. При проведении исследований in vitro могут быть использованы клеточные линии и/или первичные клеточные культуры для оценки непосредственного воздействия препарата на фенотип клеток, их пролиферацию или проявления функциональной активности используемых клеток.

Для каждой группы препаратов, включая препараты системы цитокинов, ростовых факторов, МкАТ, а также отдельных БТП используют индивидуальные методы оценки специфической активности. Выбранная методика должна быть адекватной и обладать достаточной чувствительностью и специфичностью для оценки качества препарата по оцениваемому показателю.

При определении активности препарата, по возможности, используют соответствующие стандартные образцы (международные стандартные/референтные образцы, при их отсутствии - стандартные образцы производителя), калиброванные в единицах биологической активности. Специфичную активность исследуемого препарата также оценивают в единицах активности относительно массы активного компонента препарата.

Одной из подгрупп БТП являются препараты МкАТ, которые наиболее широко применяются при лечении онкологических и системных воспалительных аутоиммунных заболеваний [10-21]. От общего объема рынка всех лекарственных препаратов МкАТ 50% составляют противоопухолевые препараты, 37% - препараты для лечения аутоиммунных заболеваний, 11% - заболеваний органов дыхания, 2% - сердечнососудистых заболеваний.

Для лечения онкологических больных используют МкАТ, направленные к клеточным рецепторам, экспрессированным на опухолевых клетках - рецептору HER-2 (трастузумаб), CD20 на опухолевых В-клетках (ритуксимаб, офатумумаб), рецептору CD52 на нормальных и малигнизированных В- и Т-Лф (алемтузумаб); МкАТ, блокирующие воздействие ростовых факторов - антитела к рецептору эпидермального

фактора роста - ЭФР (цетуксимаб, панитумумаб), фактору роста эндотелия сосудов - ФРЭС (бевацизумаб) и др.

Препараты неконъюгированных МкАТ, используемые для лечения онкологических больных, оказывают непосредственное воздействие на клетки-мишени, факторы роста или их рецепторы, вызывая гибель опухолевых клеток или подавляя стимулирующее воздействия ростовых факторов. Препараты конъюгированных МкАТ осуществляют адресную доставку к опухолевым клеткам лекарственных препаратов, токсинов, изотопов, воздействующих на рост и пролиферацию указанных клеток. На рис. 1 на 2-й пол. обложки отображены основные механизмы реализации действия противоопухолевых препаратов МкАТ.

Ниже перечислены основные механизмы цитотоксиче-ского действия МкАТ, обусловленные их специфическим взаимодействием с антигенными рецепторами, экспрессиро-ванными на опухолевых клетках:

- активация компонентов комплемента;

- индукция антителозависимой цитотоксичности;

- индукция апоптоза;

- блокада рецепторов и прерывание внутриклеточных сигнальных цепей;

- блокада биоактивных молекул, важных для реализации злокачественного фенотипа клеток;

- индукция идиотип-антиидиотипического ответа;

- торможение роста опухоли за счет подавления образования в ней новых сосудов и другие.

При доклинических исследованиях препаратов МкАТ, направленных к антигенам, экспрессированным на опухолевых клетках, вызывающих их лизис за счет активация компонентов комплемента или индукции антителозависимой цитоток-сичности, для оценки специфической активности могут быть использованы методы иммуноопосредованной цитотоксич-ности. В случае комплемент-зависимой цитотоксичности происходит активация комплемента, обусловленная реакцией антиген-антитело, которая приводит к повреждению клеточной мембраны и гибели опухолевой клетки; при антите-лозависимой цитотоксичности разрушение клеток-мишеней происходит под воздействием эффекторных клеток в присутствии специфических антител (рис. 2 на 2-й пол. обложки).

Другие противоопухолевые препараты МкАТ могут блокировать рост опухоли за счет воздействия на факторы роста или его рецепторы, экспрессированные на опухолевых клетках. На рис. 3 на 3-й пол. обложки представлены этапы злокачественной трансформации опухолей при взаимодействии эпидермального фактора роста (EGF) с соответствующим рецептором (EGFR) и активации сигнального каскада.

Взаимодействие МкАТ с ростовыми факторами или их рецепторами блокирует механизмы защиты опухолевых клеток от апоптоза, подавляет процессы их пролиферации, миграции, подавляет формирование новых сосудов, способствует восстановлению способности клеток к дифференци-ровке и др.

При аутоиммунной патологии успешно применяют препараты на основе МкАТ, ингибирующие активность важнейших провоспалительных цитокинов - ФНОа (инфликсимаб, адалимумаб, этанерцепт), ИЛ-1 (анакинра), ИЛ-6 (тоцилизу-маб), а также гиперактивацию Т- и В-Лф (ритуксимаб, аба-тасепт) и др. Механизмы действия МкАТ, используемых в терапии системных воспалительных заболеваний:

- блокада биологических эффектов провоспалительных цитокинов, путем воздействия на цитокин, его рецепторы или другие функционально связанные с ним цитокины;

- подавление взаимодействия иммунокомпетентных клеток и их активации;

- частичная элиминация отдельных субпопуляций клеток, участвующих в развитии воспаления за счет иммуноопосре-дованной (антитело- и комплемент-зависимой) цитотоксич-ности и др.

Указанные эффекты лекарственных препаратов МкАТ позволяют ограничить гиперактивацию функций иммунной системы и существенно подавить развитие острого и хрони-

ческого воспаления при указанных заболеваниях. На рис. 4 на 3-й пол. обложки представлен механизм действия провос-палительного цитокина ИЛ-6.

Известно, что провоспалительные цитокины (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6) играют существенную роль в патогенезе системных воспалительных заболеваниях аутоиммунной природы, таких как ревматоидный артрит, псориаз и псориати-ческий артрит, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона и др.

На рис. 5 на 3-й пол. обложки представлен механизм действия препарата абатацепт (димерная молекула из внеклеточного домена CTLA-4 (CD152) и модифицированного Fc фрагмента IgG1 человека), который показан для применения при ревматоидном артрите, болезни Крона, системной красной волчанке, псориатическом артрите.

Абатацепт модулирует ко-стимулирующие сигналы путем связывания CTLA-4 с CD80/CD86, экспрессированных на антигенпрезентирующих клетках, предупреждая связывание CD80/CD86 с CD28 Т-клеток, что приводит к подавлению активации Т-клеток.

В зависимости от механизма действия БТП при проведении доклинических исследований используют индивидуальные методы оценки их специфической активности. На соответствующих линиях клеток могут быть использованы тесты in vitro, например, реакция нейтрализации цитолитического действия цитокинов в присутствии специфических нейтрализующих антител (ФНО-а на культуре клеток L-929 или WEHI 164 и др.); прямое цитолитическое действие МкАТ на клетки-мишени, экспрессирующие соответствующие рецепторы (антителозависимая или комплемент-зависимая клеточная цитотоксичность); оценка активности препаратов по влиянию на синтез цитокинов путем выявления их в над-осадочной жидкости культивируемых клеток с помощью ИФА или по интенсивности пролиферации цитокин-зависимых клеточных линий; оценка цитокинов, секретируемых индивидуальными клетками, путем определения количественного содержания клеток, секретирующих исследуемый цитокин. Специфическая активность отдельных биотехнологических препаратов может быть определена в реакции пролиферации путем оценки стимуляции или ингибиции пролиферации соответствующих клеток, обусловленных взаимодействием исследуемого препарата со специфическим рецептором на мембране этих клеток; либо путем оценки ко-стимулирующей активности цитокинов, т. е. усиления пролиферации клеток, изначально стимулированных субоптимальными дозами ми-тогенов (ФГА, КонА и др.).

Для определения специфической активности БТП кроме тестов in vitro для ряда препаратов используют методы in vivo, например, для эритропоэтина, филграстима и др. Активность препарата может быть оценена, например, по снижению числа клеток, экспрессирующих соответствующие рецепторы, после введения исследуемого препарата экспериментальным животным релевантного вида; по степени стимуляции эри-тропоэза у мышей соответствующих линий после введения препаратов эритропоэтина; по уровню гемостимулирующей активности препаратов филграстима на модели цитостатиче-ской миелосупрессии у иммунодефицитных животных.

Рекомендуется оценивать корреляцию между результатами, полученными при определении активности препарата с помощью различных методов, включая биологические и физико-химических методы анализа. Результаты проведенных исследований позволяют установить, какие свойства лекарственного препарата могут быть соотнесены с терапевтическими эффектами, проявляющимися при его клиническом применении.

Изучение токсичности - учитывая видовую специфичность многих лекарственных препаратов, полученных с использованием метода рекомбинантной ДНК, существенное значение при оценке их безопасности имеет выбор соответствующего/релевантного вида животных.

Соответствующим является такой вид животного, при проведении исследования на котором изучаемый материал

является фармакологически активным за счет экспрессии рецептора (или эпитопа, в случае моноклональных антител). Помимо экспрессии рецептора, важным фактором при выборе соответствующего вида животного является распределение рецепторов в клетках/тканях.

Для обоснования выбора соответствующих видов животных могут быть использованы разные методы (например, иммунохимические или функциональные тесты). Результаты исследований in vitro на клеточных линиях, полученных из клеток млекопитающих, могут быть использованы для прогнозирования специфической активности в экспериментах in vivo, а также для количественной оценки относительной чувствительности различных видов животных, а также человека к БТП.

Целью подобных исследований может являться определение, например, специфичности и аффинности связывания с рецептором и/или фармакологических эффектов, результаты которых помогают при выборе релевантного вида животных для последующих фармакологических и токсикологических исследований in vivo. Сведения о распределении рецепторов/ эпитопов позволяют более адекватно оценить потенциальную токсичность препарата, оцениваемую в условиях in vivo. Доказательством функциональной активности препарата, которое может служить обоснованием использования в исследованиях данного вида животных, является изменение оцениваемых биологических или фармакодинамических показателей.

При отсутствии соответствующего вида животных используют трансгенных животных, клетки тканей которых экспрессируют человеческий рецептор. Возможно использование гомологичных белков, т. е. белков того вида животных, на клетках тканей которых экспрессируются антигены-мишени исследуемого белкового препарата. Гомологичный белок - белок животного происхождения (например, мышей, крыс, собак, кроликов или нечеловекообразных приматов), который распознает антигены-мишени у соответствующего вида животных с той же эффективностью, с какой препарат, предназначенный для клинических исследований, распознает соответствующую мишень (мишени) у человека. Однако необходимо учитывать, что производственный процесс, диапазон примесей, фармакокинетика (ФК) и точные фармакологические механизмы действия гомологичной формы белка и препарата, предназначенного для клинического использования, могут различаться.

В тех случаях, когда использование трансгенных моделей или гомологичных белков невозможно, все же целесообразно оценить некоторые аспекты токсичности препарата в рамках ограниченных исследований на одном виде животных. Например, проводят исследование токсичности при многократном введении препарата продолжительностью < 14 суток, которое включает оценку важных функциональных показателей (например, состояние сердечно-сосудистой или дыхательной системы).

Часто нечеловекообразные приматы (NHPs) являются единственным релевантным видом животных, который подходит для использования в токсикологических и фармакологических исследованиях. Однако другие виды животных должны быть включены в исследования для определения их чувствительности в отношении соответствующей биологической активности изучаемого лекарственного препарата.

Исследования фармакологической безопасности проводят с целью оценки влияния лекарственного препарата на жизненные функции основных физиологических систем организма (в том числе, на сердечно-сосудистую, центральную нервную, респираторную системы). Данные функциональные показатели можно изучить в отдельных исследованиях или включить в дизайн изучения токсичности, а также продолжить изучение и на этапе проведения клинических исследований.

Исследования фармакокинетики (ФК) однократной и многократной дозы, исследования токсикокинетики (TK) и распределения препарата в тканях целесообразно проводить на релевантных видах животных. Стандартные исследова-

ния, направленные на оценку баланса масс введенного и элиминированного продукта, малоинформативны.

Единые принципы проведения фармакокинетических исследований для лекарственных препаратов, полученных с использованием метода рекомбинантной ДНК, установить сложно. Изменения профиля ФК могут быть обусловлены механизмами иммуноопосредованной элиминации лекарственного препарата, что может затруднить интерпретацию данных о его токсичности. Некоторым лекарственным препаратам присущи значительные задержки в проявлении фармакодинамических эффектов относительно фармакоки-нетических характеристик (например, у цитокинов), или возможно пролонгирование фармакодинамических эффектов по сравнению с содержанием действующего вещества в плазме крови.

Оценка ФК- и ТК-показателей может быть включена в общее исследование токсичности препарата.

Для понимания фармакодинамического эффекта БТП необходимо учитывать особенности проявления активности препарата в биологической среде (например, в плазме, сыворотке, спинномозговой жидкости) и возможные последствия связывания компонентов препарата с белками на фармакоди-намический эффект.

Распределение препаратов, полученных с использованием метода рекомбинантной ДНК, вследствие их б0льшей молекулярной массы, отличается от синтетических химических препаратов. Для последних свойственно более быстрое распределение по сравнению с БТП. После внутривенного введения указанные препараты первоначально поступают в кровоток сосудистой системы, однако спустя некоторое время препарат может распространяться во внесосудистое пространство.

Концентрацию радиоактивности в тканях и/или данные радиоаутографии при использовании белков с радиоактивной меткой бывает сложно оценить ввиду быстрого метаболизма белка in vivo или нестабильности связи радиоактивной метки с белком. Следует учитывать возможность высвобождения радиоактивной метки, встроенной в специфические аминокислоты, и включение ее в аминокислоты, которые участвуют в синтезе белков, не имеющих отношения к исследуемому препарату.

Следствием метаболизма БТП, полученных с использованием метода рекомбинантной ДНК, является их деградация до небольших пептидов и отдельных аминокислот. В целом пути метаболизма таких препаратов изучены, в связи с чем отсутствует необходимость в проведении классических исследований биотрансформации БТП в том виде, в котором они проводятся для фармацевтических препаратов.

Количество экспериментальные животных по этическим соображениям желательно минимизировать путем соблюдения принципа «трех "R"» («reduction, refinement and replacement», т. е. сокращение, замена и оптимизация), кроме того, необходимо рассмотреть возможность проведения исследований по оценке безопасности с использованием альтернативных методов in vitro. Ограничения, связанные с недостатком выборки, которые часто наблюдаются в случае исследований на NHPs, могут быть частично компенсированы повышением частоты и продолжительности мониторинга за их состоянием.

Способ и частота введений лекарственного препарата экспериментальным животным должны быть максимально приближены к предполагаемым для клинического использования.

Диапазон доз подбирают таким образом, чтобы обеспечить получение информации о зависимости «доза-эффект», токсической дозе и максимальной дозе, не вызывающей развитие видимых нежелательных реакций (NOAEL). Полученные данные могут быть использованы для оценки максимальной рекомендуемой начальной дозы, назначаемой в первоначальных клинических исследованиях.

Помимо этого, выбору безопасной начальной дозы препарата для первых клинических исследований на человеке,

должно предшествовать определение дозы, вызывающей минимальный уровень предполагаемого биологического эффекта (MABEL).

Токсичность большинства биотехнологических препаратов связана с их механизмом действия, поэтому введение относительно высоких доз может вызывать нежелательные явления как следствие чрезмерного фармакологического действия. Для некоторых классов препаратов с низкой или отсутствующей токсичностью, установление специфичной максимальной дозы может оказаться невозможным. В таких случаях необходимо представить научное обоснование правильности выбора дозы и планируемого многократного воздействия на организм человека.

При обосновании выбора высокой дозы препарата необходимо учитывать ожидаемые фармакологические/физиологические эффекты от введения исследуемого препарата и планируемое клиническое его использование. Когда лекарственный препарат проявляет низкую активность при тестировании на клетках выбранного вида животных или более низкую аффинность по отношению к соответствующему рецептору, по сравнению с клетками человека, может потребоваться испытание более высоких доз.

Степень превышения дозы по сравнению с дозой, которая будет использоваться у человека, необходима для определения диапазона безопасного воздействия препарата на человека. Для каждого класса лекарственных препаратов, получаемых с использованием метода рекомбинантной ДНК, и в зависимости от показаний к применению степень превышения может отличаться. Необходимо обосновать выбор дозы, принимая во внимание характеристики зависимости «доза-эффект». Подходы, используемые в ФК и ФД (например, простая причинно-следственная зависимость -«воздействие-ответ» или более сложные методы моделирования и имитационные подходы), могут помочь при выборе высоких доз. При этом учитывают дозу, которая обеспечивает максимальный желаемый фармакологический эффект у выбранного вида животных, и дозу, которая обеспечивает приблизительно 10-кратное увеличение воздействия по сравнению с уровнем максимального воздействия, которое предполагают достичь при клиническом применении препарата.

Наиболее высокая из этих двух доз должна быть выбрана для группы животных, которой вводится высокая доза препарата во время доклинических исследований токсичности, если не обосновано использование более низкой дозы (например, максимально допустимой дозы).

Исследование токсичности однократной дозы (острая токсичность), как правило, проводится в тех случаях, когда ожидается значительная токсичность исследуемого препарата и когда необходимо установить дозу для использования в исследованиях токсичности при приеме многократных доз (хроническая токсичность). В дизайн данных исследований включают оценку фармакологических параметров безопасности лекарственного препарата.

Исследование токсичности многократных доз проводят с учетом предполагаемой длительности клинического применения и показаний, связанных с заболеванием. Для большинства БТП длительность введения животным, как правило, составляет 1-3 мес. Для препаратов, предназначенных для кратковременного использования (например, не более 7 дней), а также для лечения острых, опасных для жизни состояний, достаточным считают проведение исследований в течение 2-х недель.

Для препаратов, предназначенных для лечения хронических заболеваний, длительность исследования, как правило, составляет 6 мес, однако в некоторых случаях возможно проведение более коротких или более длительных исследований.

Исследования генотоксичности, традиционно применяемые в отношении фармацевтических препаратов, для БТП, получаемых с использованием метода рекомбинантной ДНК, не требуются, поскольку действующее вещество, по-видимому, не взаимодействует напрямую с ДНК или другим хромосомным материалом.

Если препарат вызывает опасения (например, ввиду присутствия органической молекулы-линкера в препарате на основе конъюгированного белка), необходимо проведение исследований с использованием соответствующих методик.

Канцерогенность - способность препарата повышать риск развития новых злокачественных новообразований. При оценке канцерогенности необходимо также учитывать способность лекарственного препарата активировать процессы пролиферации опухолевых клеток и прогрессирования существующих опухолей. Необходимость в оценке канцерогенного потенциала исследуемого препарата определяют с учетом популяции с предполагаемой патологией и продолжительности его клинического использования.

Механизм действия некоторых БТП может свидетельствовать о возможном канцерогенном потенциале (например, иммунодепрессанты или факторы роста), в таком случае, информация, касающаяся потенциального риска препарата, должна быть отражена в маркировке препарата и предусмотрена в плане управления рисками после его регистрации.

Изучение влияния на репродуктивный потенциал и онтогенетической токсичности (отдаленных эффектов токсичности на развитие потомства) зависит от свойств лекарственного препарата, клинических показаний для его использования и предполагаемой популяции пациентов.

Оценку иммуногенности лекарственного препарата на животных проводят для обеспечения правильности интерпретации результатов доклинических исследований [22-25]. Как правило, результаты доклинических исследований на животных не имеют значения в плане прогнозирования потенциальной иммуногенности рекомбинантных белков у человека [26]. Определение концентрации антител, вырабатываемых к БТП у животных, необходимо проводить в следующих случаях:

- при наличии доказательства об изменении фармакоди-намической активности;

- при получении данных о неожиданном изменении экспозиции/воздействия препарата при отсутствии фармакоди-намического маркера;

- выявление иммуноопосредованных реакций в ответ на введение препарата (реакции, обусловленные формированием иммунных комплексов, васкулиты, анафилактические реакции и т. д.).

Если в ходе исследования обнаружены антитела к лекарственному препарату, потребуется оценка их влияния на интерпретацию результатов других исследований. В частности, необходимо учитывать влияние образования антител на фар-макокинетические/фармакодинамические параметры препарата, частоту развития и/или тяжесть побочных эффектов, активацию комплемента или появление новых токсических эффектов. Также следует обратить внимание на возможность развития патологических изменений, связанных с образованием и осаждением иммунных комплексов. Необходимо подробно проанализировать интенсивность развития иммунного ответа и охарактеризовать свойства сформировавшихся антител по следующим параметрам - титр антител; количество животных, у которых обнаружены антитела; нейтрализующая или ненейтрализующая активность антител.

Следует отметить, что у человека не всегда формируются антитела к рекомбинантному белку. Однако даже в случае формирования антител, терапевтический эффект препарата у пациентов может сохраняться. Развитие тяжелых анафилактических реакций на рекомбинантные белки у человека наблюдается редко.

Исследования иммунотоксического действия препаратов проводят потому, что многие биотехнологические препараты предназначены для стимуляции или подавления иммунной системы и, следовательно, могут оказывать влияние как на гуморальный, так и на клеточный иммунный ответ. Кроме того, возможно изменение экспрессии антигенов на мембране клеток-мишеней, что может иметь значение для развития аутоиммунного ответа.

Следующие механизмы действия БТП могут потребовать особого внимания:

- участие мишени, связанной с множественными сигнальными путями, что приводит к различным физиологическим эффектам, или мишени, экспрессируемой на различных типах клеток (например, клетках иммунной системы);

- каскад биологических реакций и высвобождение цито-кинов, в том числе механизм действия, ведущий к усилению биологического эффекта, который не может в достаточной степени контролироваться физиологическим механизмом за счет обратной связи. Особого внимания требует оценка возможности развития синдрома так называемого «цитокино-вого шторма» (CRS), который характеризуется неконтролируемым высвобождением ряда цитокинов (ИЛ-6, ФНОа, ИФ гамма и др.) в ответ на введение препарата [27].

Исследования перекрестной реактивности с тканями проводят в тестах in vitro, используя иммуногистохимические методики, которые позволяют охарактеризовать связывание препаратов МкАТ и препаратов модифицированных антител с антигенными детерминантами в тканях; также могут быть использованы другие аналитические технологии, которые позволяют изучить распределение сайт-связывающих мишеней/антигенных детерминант в тканях.

Угрозы для безопасности применения БТП могут быть вызваны присутствием в них остаточного содержания примесей или контаминантов. Тем не менее для решения этих проблем рекомендуется полагаться на совершенствование процессов производства и внутрипроизводственного контроля с целью максимально возможного удаления примесей и контаминантов, а не разрабатывать программы доклинических исследований для их идентификации.

Таким образом, доклинические исследования БТП проводят с целью получения информации о том, обладают ли новые лекарственные препараты требуемой фармакодинамической (специфической биологической) активностью и потенциальной способностью вызывать непредвиденные и нежелательные реакции. Одним из наиболее значимых разделов доклинических исследований является оценка специфической активности препарата. Результаты этих исследований, наряду с оценкой физико-химических, иммунохимических свойств, потенциальной токсичности, иммуногенности и иммунологической безопасности, являются основанием для решения вопроса о возможности проведения дальнейших клинических исследований лекарственного препарата с целью его государственной регистрации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. М.: Гриф и К; 2013.

2. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том III. М.: ПОЛИГРАФ-ПЛЮС; 2014.

3. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том IV. М.: ПОЛИГРАФ-ПЛЮС; 2014.

10. Насонов Е.Л. ред. Анти-В-клеточная терапия в ревматологии: фокус на ритуксимаб. Монография. М.: ИМА-ПРЕСС; 2012.

11. Насонов Е.Л., Каратеев А.Е., Клюквина Н.Г. Фармакотерапия. В кн.: Насонов Е.Л., Насонова В.А., ред. Ревматология: национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2008: 178251.

12. Сигидин Я.А., Лукина Г.В. Биологическая терапия в ревматологии. М.: Практическая медицина; 2009.

13. Бекетова Т.В., Александрова Е.Н., Новоселова Т.М., Сажина Е.Г., Николаева Е.В., Смирнов А.В. и др. Российский опыт применения моноклональных антител к В-лимфоцитам (ритуксимаб) при системных васкулитах, ассоциированных с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами. Научно-практическая ревматология. 2014; 2 (52): 147-58.

14. Моисеенко В.М. Возможности моноклональных антител в лечении злокачественных опухолей. Практическая онкология. 2002; 3 (4): 253-61.

17. Барышников А.Ю., Оборотов Н.А. Иммунолипосомы - новое средство доставки лекарственных препаратов. Современная онкология. 2001; 3 (2): 3-7.

20. Авдеева Ж.И.,. Алпатова Н.А, Волкова Р.А., Лаптева Л.К. Лекарственные препараты на основе генно-инженерных моно-клональных антител. Биопрепараты. 2011; 42 (2): 14-9.

21. Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Волкова Р.А., Медуницын Н.В., Борисевич И.В. Требования к производству и контролю препаратов на основе моноклональных антител, применяемых для лечения. Биопрепараты. 2010; 40 (4): 11-4.

25. Алпатова Н.А., Авдеева Ж.И., Солдатов А.А, Медуницын Н.В., Бондарев В.П., Миронов А.Н. и др. Проблемы, связанные с проявлением иммуногенности лекарственных препаратов моноклональных антител при клиническом использовании. Иммунология. 2014; 1: 28-32.

Поступила 15.06.15

REFERENCES

1. Guidelines for the examination of drugs. Vol. I. Moscow: Grief and K; 2013.

2. Guidelines for the examination of drugs. Vol. III. Moscow: POLIGRAF-PLYuS; 2014.

3. Guidelines for the examination of drugs. Vol. IV. Moscow: POLIGRAF-PLYuS; 2014.

4. Guideline on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins (EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006). London: European Medicines Agency; 2008.

5. Guideline on immunogenicity assessment of monoclonal antibodies intended for in vivo clinical use (EMA/CHMP/ BMWP/86289/2010). London: European Medicines Agency; 2012.

6. Guideline on development, production, characterization and specifications for monoclonal antibodies and related products. London: European Medicines Agency; 2008.

7. Guidelines on the quality, safety, and efficacy of biotherapeutic protein products prepared by recombinant DNA technology. Replacement of Annex 3 of WHO Technical Report Series, No. 814. World Health Organization October. 2013.

8. ICH S6 (R1) guideline. Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals. Geneva, International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. 2011.

9. Handbook: good laboratory practice (GLP): quality practices for regulated non-clinical research and development, 2nd ed. Geneva, UNDP/World Bank/WHO, Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. 2009.

10. Nasonov E.L., ed. Anti-B-cell therapy in rheumatology: a focus on rituximab. Monograph. Moscow: IMA-PRESS; 2012.

11. Nasonov E.L., Karateev A.E., Klyukvina N.G. Pharmacotherapy. In: Nasonov E.L., Nasonova V.A. eds. Rheumatology: national leadership. Moscow: GEOTAR-Media; 2008: 178-251

12. Sigidin Ya.A., Lukina G.V. Biological therapy in rheumatology. Moscow: Practical Meditsine; 2009.

13. Beketova T.V., Aleksandrova E.N., Novoselova T.M., Sazhina E.G., Nikolaeva E.V., Smirnov A.V. et al. Russian experience with using monoclonal antibodies to B-lymphocytes

14. Moiseenko V.M. Features of monoclonal antibodies in the treatment of malignant tumors. Practical oncology. 2002; 3

15. Buch M.H., Bingham S.J., Bejanaro V. Bryer D., White J., Reece R. et al. Therapy of patients with rheumatoid arthritis. Outcome of infliximab failures switched to etanercept. Arthr. Care Res. 2007; 57: 448-53.

16. van Vollenhoven R.F., Emery P., Bingham C.O., Keystone E.C., Fleischmann R.M., Furst D.E. et al. Long-term safety of ritux-imab in rheumatoid arthritis: 9.5-year follow-up of the global clinical trial programme with a focus on adverse events of interest in RA patients. Ann. Rheum. Dis. 2013; 72 (9): 1496-502.

17. Baryshnikov A.Yu., Oborotov N.A. Immunoliposomes - new

means of drug delivery. Modern oncology. 2001; 3

18. Gutheil J. The Promise of Monoclonal Antibodies for the Therapy of Cancer. Critical Rev. Oncol. Hematology. 2001; 38: 1-2.

19. Elliott M.J., Maini R.N., Feldmann M., Long-Fox A., Charles P., Katsikis P. et al. Treatment of rheumatoid arthritis with chimeric monoclonal antibodies to tumor necrosis factor alpha. Arthritis Rheum. 1993; 36 (12): 1681-90.

20. Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Volkova R.A., Lapteva L.K. Pharmaceutical preparations based on genetic engineering of monoclonal antibodies. Biologicals. 2011; 42

21. Avdeeva Zh.I, Alpatova N.A., Volkova R.A., Medunitsyn N.V., Borisevich I.V. The requirements for the production and control of drugs based on monoclonal antibodies used to treat. Biologicals. 2010: 40

22. van Meer P., Kooljman M., Brinks V, Gispen-de Wied Ch., SilvaLima B., Moors E. et al. Immunogenicity of mAbs in non-human primates during nonclinical safety assessment. MAbs. 2013; 5: 810-6.

23. Swanson S.J., Bussiere J. Immunogenicity assessment in nonclinical studies. Curr. Opin. Microbiol. 2012; 15: 337-47.

24. Baker M.P., Reynolds H.M., Lumicisi B., Bryson C.J. Immunogenicity of protein therapeutics: The key causes, consequences and challenges. Self Nonself. 2010; 1: 314-22.

25. Alpatova N.A., Avdeeva Zh.I., Soldatov A.A, Medunitsyn N.V., Bondarev V.P., Mironov A.N. et al. Problems associated with the manifestation of the immunogenicity monoclonal antibodies in clinical use. Immunology. 2014; 1: 28-32.

26. Bugelski P. J., Treacy G. Predictive power of preclinical studies in animals for the immunogenicity of recombinant therapeutic proteins in humans. Curr. Op. Mol. Therapeutics. 2004; 6: 10-6.

27. Suntharalingam G., Perry M.R., Ward S., Brett S.J., Castello-Cortes A., Brunner M.D. et al. Cytokine Storm in a Phase 1 Trial of the Anti-CD28 Monoclonal Antibody TGN1412. N. Engl. J. Med. 2006; 355: 1018-28.

Received 15.06.15

© потапнев м.п., 2015 удк 616-002-092:612.017.1

Потапнев М.П.

иммунные механизмы стерильного воспаления

Белорусский государственный медицинский университет Минздрава Республики Беларусь, 220116, Минск

В обзоре литературы рассмотрены основные типы острого и хронического воспаления. Показано, что участие цитокинов, нейтрофилов и макрофагов в развитии острого инфекционного и стерильного воспаления является их общими характеристиками. Обсуждены различия инфекционного и стерильного дисметаболического и аутоиммунного хронического воспаления. Приведены данные об участии DAMPs/damage-associated molecular patterns/ в формировании метаболических нарушений, клеточного стресса, клеточной смерти, а также в поддержании инфекционного и различного типа стерильного воспаления. Сделано заключение о важной роли клеточного стресса, продуктов клеточной смерти в инициации воспалительных процессов в организме человека, формировании острых и хронических патологических состояний.

Ключевые слова: стерильное воспаление; DAMPs; клеточная смерть; заболевания человека.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36 (5): 312-318.

Potapnev M.P.

IMMUNE MECHANISMS OF STERILE INFLAMMATION

Belarusian State Medica University, Ministry of Public Health, 220116, Minsk, Belarus

The review of literature explored the main types of acute and chronic inflammation. The common feature for acute infectious and sterile inflammation is participation of cytokines, neutrophils and macrophages. Distinguished characters were found between chronic infectious and sterile types of inflammation , between dismetabolic chronic sterile inflammation, related to metabolic disorder, and autoimmune chronic inflammation, related to autoimmune diseases. The leading role of damage-associated molecular patterns/ DAMPs in acute and chronic sterile inflammation was underlined. The contribution of DAMPs to infectious inflammation was shown. Discrepancy between dismetabolic and autoimmune sterile inflammation was shown as linked to imballance of types of cell death such as autophagy, apoptosis and necrosis. Conclusion summarize the role of metabolism disorder and autophagy in sensing cellular stress, and extracellular DAMPs circulation in induction sterile inflammation and human immunopathology.

Keywords: sterile inflammation; infectious inflammation; DAMPs; metabolic disorder; autophagy; human pathology.

citation: Immunologiya. 2015; 36 (5): 312-318.

Воспаление является реакцией организма на повреждающие воздействия. Впервые его описали более 2700 лет до н. э., а классическое описание признаков воспаления, включающих покраснение, повышение температуры, припухлость, боль дано Cornelius Celsus около 2000 лет на-

Для корреспонденции: Потапнев Михаил Петрович,

mpotapnev@yandex.by

For correspondence: Potapnev Michael Petrovich, mpotapnev@ yandex.by

зад [1]. При воспалении микробного происхождения оно играет ограничительную роль и вызывает гибель инфекционного агента. При «стерильном» воспалении, когда отсутствует внешний инфекционный агент, происходит ускорение очищения организма от отмирающих тканей и заживления раны [2, 3]. Воспалительная реакция обычно протекает остро, эффективно устраняя причину [1, 4]. За последние десять лет воспаление стали рассматривать как проявление реакций врожденного иммунитета, включающего этапы распознавания, выброса цитокинов, фагоцитоза лейкоцитами, с последующим заживлением [1, 2, 5-7].