Изменчивость биологических свойств Listeria monocytogenes под влиянием абиотических факторов

С 2009 по 2011 гг. было заготовлено 163 дозы плазмы методом дискретного афереза, 250 доз методом автоматического афереза на аппарате Autopheresis-C фирмы Baxter.

Анализируя данные методы заготовки тромбоцитов, мы отдаем предпочтение аппаратному методу по следующим причинам:

1. Получения максимально эффективной дозы клеток от одного донора;

2. Эффективной лейкоредукции (снижению примеси лейкоцитов в клеточном концентрате ниже минимальной дозы, вызывающей у реципиента появление антилейкоцитарных антител).

Используя разные методы заготовки плазмы, наиболее предпочтительным является аппаратный метод заготовки, применение которого, соответствует современным клиническим потребностям:

- получение максимально эффективной дозы (до 800 мл) от одного донора;

- максимальное исключение возможности клеточной и микробной контаминации продукта;

- одноигольный доступ, обеспечивающий максимальную безопасность и комфортность донора при проведении процедуры ПЦФ;

- низкая концентрация антикоагулянта, для снижения вероятности "цитратных" реакций.

Выводы и предложения:

В настоящее время в распоряжении специалистов трансфузионной медицины имеется значительное количество различных аппаратов для разделения крови на фракции. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки и «идеальный» фракциона-тор, конечно, еще не создан. Однако следует отме-

тить значительный прогресс развития этой области медицинских знаний и медицинских технологий.

Оснащение же учреждений трансфузиологической службы современным оборудованием такого типа является одной из важнейших задач здравоохранения и залогом успешного развития таких отраслей медицины как трансплантология, гематология и онкология.

Новой формой донорства является мультикомпо-нентное донорство, сочетающее в себе ряд преимуществ, существенных как для донора компонентов крови, так и для их реципиента. Внедрение методов мультикомпонентного донорства в таких подразделениях позволит получать достаточное количество высококачественных компонентов крови от минимального количества доноров, повысит эффективность и безопасность лечения.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Руководство по военной трансфузиологии. -М.: Наука, 2005. 269 с.

2. Техническое руководство 12-ое издание. Американская ассоциация банков крови: Пер. с англ. -М.: Наука, 2000. 667 с.

3. Руководство по общей и клинической трансфузиологии: Под ред. Ю.Л.Шевченко. - СПб. 2003. 289 с.

4. Практическая трансфузиология: Под ред. Г.И. Козинца - М.: 2005. 296 с.

5. Методические рекомендации по применению мембранного плазмафереза с плазмофильтром ПФМ-01-ТТ ”РОСА". - М.: 2004. 126 с.

6. Очерки по производственной и клинической трансфузиологии, - М.: 2006. 226 с.

Truschenko A.M., Avdashova L.P., Pushkareva IN. Preparation of blood components by plazmacytoferez. FGI

”1477 Naval Fleet Hospital”, Vladivostok.

Keywords: storage of blood components, plazmacytoferez.

Сведения об авторах:

Авдашева Людмила Павловна, заведующая станцией переливания ФБУ «1477 ВМКГ флота», тел.: 221-65-71: (автор-корреспондент);

Трущенко Алла Мисаковна, заведующая отделением заготовки крови, с. тел.: 294-66-51; р. тел.: 221-65-71;

Пушкарева Ирина Николаевна, заведующая отделением заготовки компонентов крови, с. тел.: 8(951)002-55-47, р. тел.: 221-65-71.

© Н.Б. Цветкова, 2012 УДК 616.9-036.21

Цветкова Н.Б.

изменчивость биологических свойств listeria monocytogenes под влиянием абиотических факторов

ФБУ «1477 Военно-морской клинический госпиталь» флота, филиал №1, Приморский край, Фокино

В работе показана изменчивость биологических свойств L. monocytogenes под влиянием некоторых абиотических факторов при обитании на пищевых продуктах. Установлено, что проявление факторов патогенности у L. monocytogenes зависит от вида пищевого продукта, температуры культивирования и условий

вакуумной упаковки. Культивирование в условиях вакуумной упаковки и низкой температуры (+6С), независимо от питательного субстрата, сформировало субпопуляции микроорганизмов устойчивые к некоторым антибактериальным препаратам из группы пенициллинов (бензилпенициллину, ампициллину). Установлено, что хранение контаминированных листериями продуктов в вакуумных упаковках способствует формированию капсулы у возбудителя.

Ключевые слова: L. monocytogenes, изменчивость, биологические свойства, абиотические свойства.

Листериоз - тяжелое инфекционное заболевание людей и животных, возбудителем которого является Listeria monocytogenes. За последние сто лет из типичного зооноза, с весьма ограниченным ареалом распространения, листериоз трансформировался в одну из значимых пищевых инфекций в мире и вошел в пятерку наиболее опасных бактериальных инфекций [12]. В настоящее время не вызывает сомнение, что основными факторами передачи патогенных листерий является готовая продукция пищевой индустрии [2, 4, 14].

Известно, что L. monocytogenes свойственна изменчивость морфологических, культуральных, биохимических свойств. Это находит отражение в лабораторной диагностике листериоза [6, 7, 11]. Вместе с тем, наличие у микроба адаптивных способностей для размножения на различных пищевых продуктах, выступающих в качестве факторов передачи возбудителя инфекции, имеет и эпидемиологическое значение, поскольку эти особенности L. monocytogenes могут быть определяющими для количественных показателей заболеваемости населения. Широкий спектр пищевых продуктов, являющихся возможными факторами передачи листериозной инфекции, предполагает необходимость их оценки в качестве субстрата для размножения листерий, изучения изменчивости биологических свойств и вирулентности микроба в процессе роста.

Учитывая, что на сегодняшний день именно бактериологическое подтверждение диагноза остается единственно достоверным [1], становится весьма актуальным разработка новых подходов для изоляции, типирования и идентификации вирулентных штаммов листерий с целью выявления наиболее значимых из них в инфекционной патологии человека.

Цель исследования: изменчивость биологических свойств L. monocytogenes под влиянием некоторых абиотических факторов при обитании на пищевых продуктах.

Материалы и методы. В работе использованы типовые штаммы бактерий L. monocytogenes (серова-риантов 1/2а, 4b), полученные из коллекции лаборатории экологии патогенных бактерий НИИ ЭМ СО РАМН (г. Владивосток), типичные по своим морфологическим, биохимическим, культуральным и антигенным свойствам, подтвержденным генетически.

Для экспериментальных исследований использовались пищевые продукты, приобретенные в торговой сети г. Владивосток, наиболее эпидемически

значимые при листериозе [12]: рыба холодного копчения (горбуша); креветка вареная; сыр «Ламбер»; творог «Домашний»; молоко пастеризованное; сыр плавленый «Янтарь»; сыр «Камамбер» (вакуумная упаковка); сосиска «Молочная»; сосиска «Свиная» (вакуумная упаковка).

Исследование морфологических, культуральных и биохимических свойств листерий проводили согласно методов и сред, рекомендованных МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выделения бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах» [9] и ГОСТом Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выделения и определения бактерий Listeria monocytogenes» [5].

Для ускоренной идентификации листерий по биохимическим признакам использовали стриповый диагностикум «API Listeria» фирмы ВioMёrieux (Франция) с использованием однорядного планшета по методу, предложенному фирмой изготовителем. Для приготовления суспензии (по стандарту мутности, эквивалентной 1ЕД по шкале МакФарланда) выделяли изолированные колонии листерий, выращенные на Оксфордском агаре.

Антигенные свойства культур листерий определяли в линейной реакции агглютинации на стекле с поливалентной листериозной сывороткой Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (НИИВВиМ, г. Покров).

В качестве дополнительного метода исследовали наличие капсулы у листерий, которую определяли методом «сухого» окрашивания мазка черной тушью с последующей фиксацией абсолютным метанолом и докрашиванием карболовым раствором фуксина в течение 5-10 мин [3]. Количество кап-сулированных форм выражали в процентном соотношении.

Для выяснения влияния вакуумного хранения пищевых продуктов на биологические свойства L. monocytogenes были заражены сосиски «Свиные» и сыр «Камамбер». В вакуумные упаковки (площадь поверхности упаковки 100 см2) под парафин стерильным шприцем в асептических условиях вводили суспензию листерий, распределяя по поверхности продуктов в концентрации 107 КОЕ/мл, в расчете

0,1 мл на 1 см2 площади поверхности продукта. В качестве контроля служили штаммы листерий, культивируемые на питательном агаре с 0,1% глюкозы. Культивирование проводили при температурах +6С и +22°С в течение 30 суток.

Идентификацию листерий проводили по наиболее важным классификационным признакам: морфологическим и культуральным свойствам, особенностям метаболизма: окраска по Граму, выявление каталазной активности и определение подвижности культуры при +22С и +37С, биохимическим свойствам листерий (ферментацию маннита, ксилозы и рамнозы), способности к Р-гемолизу (агар с 5% крови барана), лецитиназной активности на средах с активированным углем (добавляемым для связывания и удаления ауторепрессора) и без него.

Антибиотикорезистентность штаммов листерий изучали методом диско-диффузии в агар согласно МУК 4.2.1890-04. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» [10]. Интерпретация полученных результатов проводилась согласно таблицам чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, входящих в набор для определения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам.

Результаты и обсуждение. В соответствии с указанными тестами, L. monocytogenes обладает следующими диагностическими признаками: неспорообразующие короткие палочки, окрашивающиеся в мазках в фиолетовый цвет, располагающиеся одиночно, парами или в коротких цепочках в виде цифры V; каталазоположительные; подвижны при +22С и не подвижные при +37С; ферментируют различные сахара с образованием кислоты без газа (ферментация рамнозы, маннозы и отсутствие ферментации ксилозы и маннита); обладают Р-гемолитической активностью; продуцируют ле-цитиназу и дают плотную зону помутнения в присутствии активированного угля вокруг колоний на среде ГРМ №1 и не дают ее при отсутствии угля [5]. Указанные свойства L. monocytogenes довольно типичны, однако возможны их изменения, связанные с обитанием листерий на определенных пищевых продуктах, а так же под влиянием условий их хранения, что было показано при экспериментальных исследованиях.

Известно, что температура является одним из важнейших факторов окружающей среды влияю-

щим на скорость ферментативных процессов, характер метаболизма бактерий и изменение биологических свойств листерий [3, 6, 11]. Большинство пищевых продуктов во избежание порчи хранятся в холодильниках (+6С). Однако, современные технологии, делающие возможным хранение продуктов при комнатной температуре (+22С), а так же нарушение условий хранения, могут привести к изменениям биологических свойств возбудителя.

Изучение биохимических свойств листерий, обсеменяющих мясные, молочные и морепродукты, показало изменение способности к ферментации некоторых субстратов, используемых при диагностике L. monocytogеnеs.

Наибольшие изменения в отношении расширения спектра ферментов разлагающих субстрат наблюдали у штаммов листерий, контаминирующих сыры при +22С. При этом листерии, в отличие от контроля, приобрели способность дополнительно ферментировать 7 субстратов: L-сорбозу, D-сахарозу, инулин, D-мелезидозу, D-раффинозу, амидон, гликоген. Культуры листерий, обсеменяющие мясные продукты, приобрели дополнительную способность ферментировать L-сорбозу и D-сахарозу. Хранение зараженных морепродуктов при +6С в течение 14 суток, привело к появлению у листерий способности ферментировать D-раффинозу и отсутствию разложения К-рамнозы (в отличие от контроля).

Известно, что бактерии L. monocytogenes обладают подвижностью при +22С, обеспечиваемой фла-геллярным аппаратом. Как показали результаты наших исследований, хранение пищевых продуктов в течение 7 суток при +22С (независимо от пищевого продукта) приводило к утрате подвижности листерий, что не наблюдалось при +6°С.

Нарушение температурных условий хранения пищевых продуктов (при +22С), а так же хранение морепродуктов и молочной продукции при +6С, может привести к изменению патогенных свойств листерий, а именно утрате гемолитической активности и снижению продуцирования лецитиназы, что играет важную роль при дифференциации L. monocytogenes от других непатогенных видов листерий (табл. 1).

Таблица 1

Изменение биологических свойств L. monocytogenes, при культивировании на пищевых продуктах

при разных температурах хранения

Пищевые ^''''^^ продукты Тест Контроль (рост листерий на редах) Мясные продукты Молочные продукты (сыры) Море-продукты

+6"С +22°С +6"С +22°С +6"С +22°С +6"С +22°С

Подвижность +37"С - - - - - - - -

+22"С + + + - - - - -

Лецитиназа + + + - - - - -

Гемолиз + + + - - - - -

Таким образом, культивирование L. monocytogenes на пищевых продуктах при разных температурах приводило к изменению биологических свойств, что необходимо учитывать при диагностике листерий.

Одним из известных способов, обеспечивающих длительное хранение пищевых продуктов, является вакуумная упаковка. В результате проведенных исследований установлено, что хранение мясных и молочных пищевых продуктов, контаминированных листериями, в условиях вакуумной упаковки при +6С в течение 30 суток, может приводить к изменению морфологии бактериальных клеток. Поэтому, обнаружение в мазках, приготовленных из инфицированного материала или жидкой среды кокковых форм, которые могут быть ошибочно приняты за стрептококки, необходимо учитывать при выделении и идентификации листерий.

Культивирование L. monocytogenes на мясных и

В связи с изучением причин недостаточно высокой эффективности ряда антибиотиков в терапии листериоза, внимание исследователей часто направлено на оценку резистентности возбудителя к применяемым препаратам.

Изучение антибиотикорезистентности исследуемых штаммов L. monocytogenes показало, что культивирование в условиях вакуумной упаковки и низкой температуры (+6С), независимо от питательного субстрата, сформировало субпопуляции микроорганизмов устойчивые к некоторым антибактериальным препаратам из группы пенициллинов (бензилпени-циллину, ампициллину). При этом сохранялась чувствительность к тетрациклинам (доксициклину, тетрациклину), аминогликозидам (стрептомицин, гентамицин), эритромицину и рифампицину.

Объяснение этому может быть следующее. В результате проведенных наблюдений нами была обнаружена способность к формированию капсулы у штаммов L. monocytogenes, культивируемых на сыре в условиях вакуумной упаковки при +6С, что не происходило при +22С. При этом у контрольных штаммов листерий лишь 0,7 % (р<0,001) бактериальных клеток обладали капсулой, а после пребывания в условиях ва-

молочных пищевых продуктах в условиях вакуумной упаковки и комнатной температуры (14 суток) приводило к утрате подвижности при +22С (на 5-е сутки) (табл. 2). Хранение контаминированных продуктов при +6С в течение 14 суток способствовало сохранению подвижности при +22С у всех исследуемых штаммов листерий.

Согласно литературным источникам, инкубация L. monocytogenes на пищевых продуктах при температурах +4 - +20°С значительно сокращает продуцирование листериолизина О, вплоть до полного его прекращения [13], что не совпадало с полученными нами результатами. Было установлено, что штаммы листерий, культивируемые на пищевых продуктах в условиях вакуумной упаковки при +22С не лизировали эритроциты и не продуцировали лецитиназу, но не утрачивали эту способность при +6°С (табл. 2).

куумной упаковки наблюдалось 72-75% (р<0,001) кап-сулированных клеток. Доказано, что капсула играет значительную роль в формировании резистентности бактерий к антимикробным препаратам, блокируя проникновение в клетку гидрофобных антибиотиков и не препятствуя поступлению гидрофильных препаратов [8]. Полученные результаты могут быть использованы в антибитикотерапии при листериозных инфекциях.

Таким образом, была создана экспериментальная модель, позволяющая изучить влияние вакуумной упаковки и температуры хранения на биологические и патогенные свойства L. monocytogenes, контамини-рующих пищевые продукты. Установлено, что сочетанное действие вакуумной упаковки и низкой температуры хранения явилось сигналом к перестройке метаболических процессов, изменению морфологии бактериальных клеток и усилению патогенных свойств листерий. Такие условия культивирования стимулировали у L. monocytogenes процесс капсу-лообразования, что являлось одним из механизмом адаптивной изменчивости.

Необходимо отметить, что все изменения, полученные в ходе исследований, носили фенотипический характер. Так, пятикратное пассирование куль-

Таблица 2

Изменение биологических свойств L. monocytogenes при культивировании на пищевых продуктах в условиях вакуумной упаковки при

разных температурах

Примечание: (-*) и (+*) - подвижность на 5-е сутки.

тур L. monocytogenes на дрожжевом агаре с 0,1% глюкозы приводило к реверсии их первоначальных свойств, что необходимо учитывать при выделении и идентификации листерий из пищевых продуктов.

Заключение. В настоящее время является общепризнанным положение о том, что условия культивирования микроорганизмов открывают решающее влияние на их физиологию. Это особо относится к составу питательных сред, степени их аэрации, концентрации водородных ионов, температуре культивирования и другим условиям. В силу исключительного разнообразия метаболических процессов в микробных клетках наиболее перспективными являются исследования, направленные на изучение экологии патогенных бактерий, а именно L. monocytogenes, их биологических свойств, определяющих эпидемиологические особенности вызываемых ими болезней. Так, принимая во внимание всю совокупность полученных данных, можно заключить, что, сочетанное действие низкой температуры, вакуумной упаковки и определенного пищевого продукта приводит к формированию соответствующих субпопуляций листерий, наиболее адекватных к обитанию в данных условиях. Все это диктует особый подход к выделению и идентификации штаммов возбудителя, для чего необходимо совершенствовать лабораторную диагностику, в том числе и методы экспресс-контроля листерий в продуктах, пищевом сырье, объектах производства и клинических образцах, позволяющие выявить эпидемиологически опасные штаммы L. monocytogenes.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Алиева Е.В., Ковальчук И.В. Современное состояние изученности и лабораторной диагностики возбудителя листериоза: Обзор литературы / Став-роп. н.-и. противочум. ин-т, Ставрополь. 2006. -№24. - 63 с.

2. Бакулов И.А. Бактериологический контроль пищевых продуктов на наличие листерий, / Изд-во Ульяновской гос. сельхоз. Академии, 1999. - С. 37-38.

3. Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды: автореф.

дис. .. .д-ра. биол. наук, Владивосток, 2001. - С. 16-18.

4. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов: СанПин 2.3.2.1078-01; Введ.01.09.02г. - М., 2001. -186 с.

5. ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выделения и определения бактерий Listeria monocytogenes» - Минздрав России, Москва, 2002. - 23 с.

6. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Изменение уровня экспрессии факторов вирулентности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2000. - №1. - С. 17-19.

7. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Микробиологическая характеристика Listeria monocytogenes, изолированных из различных источников в Приморском крае // Журн. микробиол. 2006. - №2. - С. 3-6.

8. Медицинская микробиология / Под ред. Покровского В.И., Поздеева ОК. - М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 1200 с.

9. Методические указания МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах» - М.: Минздрав России. -2002. - 21 с.

10. Методические указания МУК 4.2.1890-04. «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» - М.: Минздрав России, 2004. - 147 с.

11. Сомов Г.П., Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды / Владивосток: ОАО Примполиграфком-бинат, 2004. - 167 с.

12. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика / М.: Медицина для всех, 2002. - 200 с.

13. Datta A.R., Kothary M.H. Effects of glucose, growth temperature, and pH on listeriolisine O production in Listeria monocytogenes // J. Appl. Environ. Microbiol. - 1993. -Vol. 59. - P. 3495-3497.

14. Farber J.M., Peterkin Р.1. Listeria moпocytogeпes. а food-borne pathogen // Microbiol. Rev. - 1991. - Vol. 55. - Р. 476-511.

N.B. Tsvetkova. The variability of the biological properties of Listeria monocytogenes under the influence of abiotic factors. FBU ”1477 Naval clinical hospital”, the branch N1, Primorsky Krai, Fokino

The paper shows the variability of the biological properties of L. monocytogenes under the influence of some abiotic factors in the habitat on the food. Found that the expression of pathogenicity factors in L. mopocytogepes depends on the type of food, cultivation temperature and conditions of vacuum packing. Cultivation in vacuum packaging and low temperature (+6°C), regardless of the nutrient substrate, formed a sub-population of microorganisms resistant to some antibiotics of the penicillin group (benzylpenicillin, ampicillin). It is established that the storage of contaminated food Listeria in vacuum-packaging promotes capsule with the pathogen.

Keywords: variability, biological properties, L. monocytogenes, abiotic factors.

Сведения об авторе:

Цветкова Наталья Борисовна, кандидат биологических наук, зав. бактериологической лабораторией лабораторного отделения, филиала №1 ФБУ «1477 ВМКГфлота», Тел. 8 (914) 723 82 76; E-mail: nat19101976@mail.ru