БЕЛКОВЫЕ КАРКАСНЫЕ СТРУКТУРЫ

1. Рекомбинантная полипептидная каркасная структура, включающая:
I. домены, построенные из семи β-цепей, обозначенных как А, В, С, D, Е, F и G,
II. указанные цепи связаны шестью петлями, при этом каждая петля соединяет между собой две смежные β-цепи, и указанные петли обозначены как петли АВ, ВС, CD, DE, EF и FG,
III. где по меньшей мере одна из петлевых областей является неприродным вариантом исходной петли из любой последовательности SEQ ID №:1-32 или 68-88, и
IV. где гомология по меньшей мере одного домена, построенного из β-цепей, с исходным доменом, построенным из β-цепей, в любой последовательности SEQ ID №:1-32 или 68-88, составляет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%.
2. Каркасная структура по п.1, где указанные домены, построенные из β-цепей, включают полипептидную последовательность, кодируемую любой последовательностью SEQ ID №:1-32 или 68-88.
3. Каркасная структура по п.1, где указанные домены, построенные из β-цепей, включают:
а. аминокислотные последовательности β-цепи A (SEQ ID №228), β-цепи В (SEQ ID №229), β-цепи С (SEQ ID №230), β-цепи D (SEQ ID №231), β-цепи Е (SEQ ID №232), β-цепи F (SEQ ID №233) и β-цепи G (SEQ ID №234), или
б. аминокислотные последовательности β-цепи A (SEQ ID №235), β-цепи В (SEQ ID №229), β-цепи С (SEQ ID №230), β-цепи D (SEQ ID №236), β-цепи Е (SEQ ID №232), β-цепи F (SEQ ID №237) и β-цепи G (SEQ ID №234).
4. Каркасная структура по п.3, где указанная петля ВС включает 9 аминокислотных остатков и содержит последовательность S-X-a-X-b-X-X-X-G, где X обозначает остаток любой аминокислоты, причем (а) обозначает остаток пролина или аланина, и где (b) обозначает остаток аланина или глицина.
5. Каркасная структура по п.3, где указанная петля ВС включает 11 аминокислотных остатков и содержит последовательность S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G, где Х обозначает остаток любой аминокислоты, причем (с) обозначает остаток пролина, серина или глицина.
6. Каркасная структура по п.3, где указанная петля ВС включает 12 аминокислотных остатков и содержит последовательность A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G, где Х обозначает остаток любой аминокислоты, причем (d) обозначает остаток пролина, глутамина или лизина, (е) обозначает остаток аспарагина или глицина, a (f) обозначает остаток серина или глицина.
7. Каркасная структура по п.3, где указанная петля FG включает 9 аминокислотных остатков и содержит последовательность X-a-X-X-G-X-X-X-S, где Х обозначает остаток любой аминокислоты, причем (а) обозначает остаток аспарагина, треонина или лизина.
8. Каркасная структура по п.3, где указанная петля FG включает 10 аминокислотных остатков и содержит последовательность Х-а-Х-Х-Х-Х-b-N-P-А, где Х обозначает остаток любой аминокислоты, причем (а) обозначает остаток аспарагина, треонина или лизина, а (b) обозначает остаток серина или глицина.
9. Каркасная структура по п.3, где указанная петля FG включает 11 аминокислотных остатков и содержит последовательность X-a-X-X-G-X-X-S-N-Р-А, где Х обозначает остаток любой аминокислоты, причем (а) обозначает остаток аспарагина, треонина или лизина.
10. Каркасная структура по п.3, где указанная петля DE включает 6 аминокислотных остатков и содержит последовательность Х-Х-Х-Х-Х-Х, где Х обозначает остаток любой аминокислоты.
11. Каркасная структура по п.3, где указанная петля АВ включает 7 аминокислотных остатков и содержит последовательность K-Х-Х-Х-Х-Х-а, где Х обозначает остаток аспарагина, аспарагиновой кислоты, гистидина, тирозина, изолейцина, валина, лейцина, фенилаланина, треонина, аланина, пролина или серина, причем (а) обозначает остаток серина, треонина, аланина или глицина.
12. Каркасная структура по п.3, где указанная петля АВ включает 9 аминокислотных остатков и содержит последовательность К-Х-Х-Х-Х-Х-Х-Х-а, где Х обозначает остаток аспарагина, аспарагиновой кислоты, гистидина, тирозина, изолейцина, валина, лейцина, фенилаланина, треонина, аланина, пролина или серина, причем (а) обозначает остаток серина, треонина, аланина или глицина.
13. Каркасная структура по п.3, где указанная петля CD включает 7, 8 или 9 аминокислотных остатков, при этом каждый остаток в составе петли CD расположен в случайном порядке, причем каждый остаток может обозначать остаток аспарагина, аспарагиновой кислоты, гистидина, тирозина, изолейцина, валина, лейцина, фенилаланина, треонина, аланина, пролина или серина.
14. Каркасная структура по п.3, где указанная петля EF включает 8 аминокислотных остатков и содержит последовательность X-b-L-X-P-X-c-X, где Х обозначает остаток аспарагина, аспарагиновой кислоты, гистидина, тирозина, изолейцина, валина, лейцина, фенилаланина, треонина, аланина, пролина или серина, причем (b) обозначает остаток аспарагина, лизина, аргинина, аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты или глицина, а (с) обозначает остаток изолейцина, треонина, серина, валина, аланина или глицина.
15. Каркасная структура по п.1, которая дополнительно включает по меньшей мере одну дисульфидную связь, связывающую любые две из указанных семи β-цепей доменов.
16. Каркасная структура по п.15, где указанная дисульфидная связь образуется между:
а. β-цепью А и β-цепью В,
б. β-цепью D и β-цепью Е,
в. β-цепью F и β-цепью G или
г. β-цепью С и β-цепью F.
17. Каркасная структура по п.15, которая дополнительно включает по меньшей мере две дисульфидные связи, связывающие любые цепи из указанных семи цепей доменов.
18. Каркасная структура по п.17, где первая из указанных дисульфидных связей образуется между β-цепью F и β-цепью G, а вторая между β-цепью С и β-цепью F.
19. Каркасная структура по п.1, которая дополнительно включает по меньшей мере одну дисульфидную связь в составе петли.
SS1
SS2
SS3
SS4
20. Каркасная структура по п.15, которая включает последовательность, соответствующую Tn3 (SEQ ID №64), Tn3 (SEQ ID №210), Tn3 (SEQ ID №65) или Tn3 (SEQ ID №66).
SS3+4
21. Каркасная структура по п.17, которая включает последовательность, соответствующую Tn3 (SEQ ID №67).
22. Каркасная структура по п.1 или 15, которая связывается с мишенью.
23. Каркасная структура по п.22, для которой указанной мишенью является поверхностный антиген клетки, растворимый антиген, иммобилизованный антиген, не иммуногенный антиген, внутриклеточный антиген, внутриядерный антиген, аутоантиген, чужеродный антиген, раковый антиген, бактериальный антиген или вирусный антиген.
пл.
24. Каркасная структура по п.1 или 15, температура плавления (Т) которой составляет по меньшей мере 40°С по данным метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).
25. Каркасная структура по п.15, которая характеризуется повышенной стабильностью и характеризуется:
пл.
а. повышенной величиной С по меньшей мере на 10% по данным денатурации в мочевине,
пл.
б. повышенной величиной С по меньшей мере на 10% по данным денатурации в гуанидине или
в. повышенной устойчивостью к действию протеаз по меньшей мере на 10% по сравнению с аналогичной каркасной структурой (до ее модификации за счет образования дисульфидной связи) в аналогичных условиях.
26. Каркасная структура по п.1, которая коньюгирована с гетерологичным агентом, причем указанный агент выбран из группы, включающей другую каркасную структуру, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сывороточный альбумин человека (чСА), Fc-фрагмент антитела, молекулу IgG, связывающий пептид, цитотоксическое лекарственное средство, радиоактивную метку, визуализирующий агент, His-Tag, биотин, Flag-tag, нуклеиновую кислоту или цитокин.
27. Мультимерная каркасная структура, включающая по меньшей мере две каркасные структуры по п.1.
28. Мультимерная каркасная структура по п.27, которая дополнительно включает домен, связывающийся с эпитопом.
29. Мультимерная каркасная структура по п.27, где указанный домен, связывающийся с эпитопом, специфичен в отношении другой мишени, в отличие от указанной каркасной структуры.
30. Мультимерная каркасная структура по п.27, где указанный домен, связывающийся с эпитопом, специфичен в отношении той же самой мишени, что и указанная каркасная структура.
31. Мультимерная каркасная структура по п.27, где указанные каркасные структуры связаны через другую каркасную структуру, молекулу IgG или ее фрагмент, Fc-фрагмент, домен димеризации, химический линкер, дисульфидную связь или аминокислотный линкер.
32. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая каркасную структуру по п.1.
33. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая каркасную структуру по п.27.
34. Вектор экспрессии, функционально связанный с нуклеиновой кислотой по п.32.
35. Вектор экспрессии, функционально связанный с нуклеиновой кислотой по п.33.
36. Клетка хозяина, включающая вектор по п.34.
37. Клетка хозяина, включающая вектор по п.35.
38. Библиотека полипептидов, включающая каркасную структуру по п.1.
39. Библиотека по п.38, где указанная каркасная структура включает по меньшей мере две области петли, которые изменены за счет делеции, замены или вставки по меньшей мере одной аминокислоты в соответствующих последовательностях петли, присутствующих в природном белке.
40. Библиотека по п.39, где указанные две петлевые области выбраны из группы, включающей петли BC/DE, BC/FG, DE/FG, AB/CD, AB/EF и CD/ED.
41. Библиотека по п.38, где указанная каркасная структура включает по меньшей мере три петли, которые изменены за счет делеции, замены или вставки по меньшей мере одной аминокислоты в соответствующих петлевых последовательностях, присутствующих в природном белке.
42. Библиотека по п.38, где указанные последовательности петли включают любые три петли, выбранные из группы, включающей петли АВ, ВС, CD, DE, EF и FG.
43. Библиотека полипептидов по п.38, где указанная каркасная структура презентирована на поверхности рибосомы, бактериофага, вируса, бактерии или дрожжей.
6
44. Библиотека по п.38, включающая множество последовательностей по меньшей мере 10.
45. Коллекция выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды из библиотеки по п.38.
46. Вектор экспрессии, функционально связанный с нуклеиновыми кислотами по п.45.
47. Способ получения полипептидной каркасной структуры, которая связывается с мишенью, при этом указанный способ заключается (а) в контактировании лиганда мишени с полипептидами из библиотеки по п.38 в условиях, пригодных для образования комплекса каркасная структура/лиганд-мишень, и (б) выделении из комплекса каркасной структуры, которая связывается с лигандом-мишенью.
48. Способ по п.47, который дополнительно включает рандомизацию по меньшей мере одной петли в составе указанной белковой каркасной структуры, полученной на стадии (б), с целью получения дополнительной рандомизированной каркасной структуры, а также повторение стадий (а) и (б) с использованием указанной дополнительной рандомизированной каркасной структуры.
49. Способ по п.48, который включает по меньшей мере две петли.
50. Способ по п.48, который включает по меньшей мере три петли.
51. Способ по п.47, который дополнительно включает рандомизацию по меньшей мере одной петли в составе указанной каркасной структуры, полученной на стадии (б), с целью получения дополнительной рандомизированной каркасной структуры, а также повторение стадий (а) и (б) с использованием указанной дополнительной рандомизированной каркасной структуры, причем указанное повторение стадий (а) и (б) дополнительно включает контактирование мишени, отличающейся от мишени, использованной при первом проведении стадий (а) и (б).
52. Способ по п.47, который дополнительно включает рандомизацию по меньшей мере одной петли в составе указанной белковой каркасной структуры, полученной на стадии (б), где указанная петля не рандомизирована в указанной библиотеке, для получения дополнительной рандомизированной каркасной структуры, а также повторение стадий (а) и (б) с использованием указанной дополнительной рандомизированной каркасной структуры.
53. Способ по п.47, который дополнительно включает рандомизацию по меньшей мере одной петли в составе указанной каркасной белковой структуры, полученной на стадии (б), где указанная петля не рандомизирована в указанной библиотеке, для получения дополнительной рандомизированной каркасной структуры, а также повторение стадий (а) и (б) с использованием указанной дополнительной рандомизированной каркасной структуры, причем указанное повторение стадий (а) и (б) дополнительно включает контактирование мишени, отличающейся от мишени, использованной при первом проведении стадий (а) и (б).
54. Способ по п.53, включающий первую рандомизированную петлю, выбранную из группы, включающей петли ВС, DE и FG, и вторую петлю, нерандомизированную в указанной библиотеке, выбранную из группы, включающей петли АВ, CD и EF.
55. Способ по п.53, включающий первую рандомизированную петлю, выбранную из группы, включающей петли АВ, CD, EF, и вторую петлю, нерандомизированную в указанной библиотеке, выбранную из группы, включающей петли ВС, DE и FG.
56. Способ по п.53, который дополнительно включает рандомизацию по меньшей мере одной β-цепи в составе указанной каркасной белковой структуры, полученной на стадии (б), с целью получения дополнительной рандомизированной каркасной структуры, а также повторение стадий (а) и (б) с использованием указанной дополнительной рандомизированной каркасной структуры.
57. Способ по п.56, который дополнительно включает рандомизацию по меньшей мере двух, трех, четырех, пяти, шести или семи β-цепей в составе указанной каркасной белковой структуры, полученной на стадии (б), с целью получения дополнительной рандомизированной каркасной структуры, а также повторение стадий (а) и (б) с использованием указанной дополнительной рандомизированной каркасной структуры.
58. Способ получения по меньшей мере двух каркасных структур, связывающихся с мишенью, при этом указанный способ заключается (а) в контактировании лиганда-мишени с каркасной структурой из библиотеки по варианту 38 в условиях, пригодных для образования комплекса каркасная структура/лиганд-мишень, (б) в сшивке указанных каркасных структур с использованием сшивающего агента, при этом указанные сшитые каркасные структуры обеспечивают детектируемую ответную реакцию, и (в) в выделении указанных каркасных структур, связывающихся с мишенью, из комплекса.
59. Способ по п.58, где указанные каркасные структуры распознают один и тот же эпитоп.
60. Способ по п.58, где указанные каркасные структуры распознают различные эпитопы.
61. Способ по п.58, где указанный сшивающий агент выбран из группы, включающей антитело, фрагмент антитела, димеризованный мотив, химический сшивающий агент, связывающий пептид или эпитоп tag.
62. Способ детектирования соединения в образце, при этом указанный способ заключается в контактировании указанного образца с каркасной структурой по п.1 в условиях, пригодных для образования комплекса соединение/каркасная структура, и в детектировании указанного комплекса, таким образом, детектируется наличие указанного соединения в указанном образце.
63. Способ связывания соединения в образце, при этом указанный способ заключается в контактировании указанного образца с иммобилизованной каркасной структурой по п.1 в условиях, пригодных для образования комплекса соединение/каркасная структура, и в удалении указанной иммобилизованной каркасной структуры, таким образом, осуществляется связывание указанного соединения в указанном образце.
64. Стерильная апирогенная композиция, включающая каркасную структуру по п.1.
65. Фармацевтическая композиция, включающая каркасную структуру по п.1.
66. Способ профилактики, лечения, контроля или уменьшения интенсивности симптомов заболевания у пациента, нуждающегося в этом, который заключается в том, что указанному пациенту вводят эффективное количество композиции по п.64 или 65.
67. Способ диагностики или визуализации признаков заболевания у пациента, нуждающегося в этом, который заключается в том, что пациенту вводят композицию по п.64 или 65.
68. Способ по п.66, который включает дополнительный способ лечения, при этом указанное лечение включает иммунотерапию, биотерапию, химиотерапию, лучевую терапию или лечение с использованием низкомолекулярных лекарственных средств.
69. Способ по п.68, где указанным заболеванием является аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание, пролиферативное заболевание, инфекционное заболевание, респираторное заболевание, заболевание желудочно-кишечного тракта, диабет, волчанка или ожирение.
70. Способ очистки каркасной структуры по любому из пп.1 или 15, который заключается:
а. в нагревании композиции, включающей указанную каркасную структуру, при 70°С в течение по меньшей мере 15 мин, или
б. в доведении рН композиции, включающей указанную каркасную структуру, до рН 3,0, или рН 3,5, или рН 4,0, или рН 4,5, или рН 5,0, в нагревании полученной композиции при 50°С, или при 55°С, или при 60°С, или при 65°С, или при 70°С в течение 1-30 мин,
и в последующем удалении агрегатов соединений центрифугированием.
71. Масштабируемый способ, характеризующийся производительностью продуцирования каркасной структуры по любому из пп.1 или 15 на уровне по меньшей мере 1 г/л.
72. Способ по п.71, в котором каркасную структуру очищают из культуральной среды, используемой в указанном способе.
73. Способ продуцирования каркасной структуры по любому из пп.1 или 15, в котором продуцируемая указанная каркасная структура секретируется в культуральную среду.
74. Способ по п.73, включающий применение вектора экспрессии, включающего сигнальный пептид oppA (SEQ ID №227).
75. Способ анализа или детектирования связывания каркасной структуры с мишенью с использованием материала, не содержащего клетки, полученного способом по п.73.
76. Способ очистки каркасной структуры, полученной способом по п.74.
77. Каркасная структура по любому из пп.1 или 15, которая специфически связывается с TRAIL-R2.
78. Каркасная структура по п.77, где указанный TRAIL-R2 является TRAIL-R2 человека.
79. Каркасная структура по п.77, которая дополнительно включает по меньшей мере одну дисульфидную связь, связывающую любые две из указанных семи β-цепей доменов.
80. Каркасная структура по п.77, которая является мультимерной каркасной структурой, включающей по меньшей мере два домена.
81. Каркасная структура по п.80, в которой указанные по меньшей мере два домена каркасной структуры связываются с одним и тем же эпитопом в составе TRAIL-R2.
82. Каркасная структура по п.80, в которой указанные по меньшей мере два домена каркасной структуры связываются с различными эпитопами в составе TRAIL-R2.
83. Каркасная структура по п.80, где указанный по меньшей мере один домен каркасной структуры функционально связан:
а. с Fc-фрагментом молекулы IgG,
б. с фрагментом СН1 молекулы IgG,
в. с фрагментом СН2 молекулы IgG,
г. с шарнирным фрагментом молекулы IgG или
κ
λ
д. с С- или С-участком молекулы IgG.
84. Каркасная структура по п.80, в которой по меньшей мере одним из указанным доменом каркасной структуры является 2D3 или 1C12.
85. Каркасная структура по п.84, которая включает 1С12, который функционально связан:
а. с Fc-фрагментом молекулы IgG,
б. с фрагментом СН1 молекулы IgG,
в. с фрагментом СН2 молекулы IgG,
г. с шарнирным фрагментом молекулы IgG или
κ
λ
д. с С- или С-участком молекулы IgG.
86. Каркасная структура по п.84, которая включает 2D3, который функционально связан:
а. с Fc-фрагментом молекулы IgG,
б. с фрагментом СН1 молекулы IgG,
в. с фрагментом СН2 молекулы IgG,
г. с шарнирным фрагментом молекулы IgG или
κ
λ
д. с С- или С-участком молекулы IgG.
87. Каркасная структура по п.77, которая включает петлю ВС, выбранную из группы, включающей последовательности SEQ ID №126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195 и 198.
88. Каркасная структура по п.77, которая включает петлю DE, выбранную из группы, включающей последовательности SEQ ID №145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196 и 199.
89. Каркасная структура по п.77, которая включает петлю FG, выбранную из группы, включающей последовательности 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197 и 200.
90. Каркасная структура по п.77, которая включает последовательность каркасных структур, связывающихся с TRAIL-R2, выбранных из 2F4, 5В10, 10D9, 6F11, 8В3, 5Е5, 2Н6, 7G11, 6С7, 1Е03, 2В04, 1С12, 1А03, 1С10, 1В12, 2G03, 2D3, 1C06, 2F08, 1В04, 3В11, 1D8, 2A12, 1E05, 2F02, 1H05, 2A11 или 1G11.
91. Каркасная структура по п.77, которая связывается с рецептором TRAIL-R2 и:
а. проявляет агонистическую активность в отношении рецептора TRAIL-R2,
б. является миметиком связывания TRAIL с рецептором TRAIL-R2,
в. приводит к димеризации или олигомеризации рецептора TRAIL-R2,
г. индуцирует апоптоз или
д. снижает или подавляет жизнеспособность клеток.
92. Стерильная апирогенная композиция, включающая каркасную структуру по п.77.
93. Фармацевтическая композиция, включающая каркасную структуру по п.77.
94. Способ применения каркасной структуры по п.77 для связывания TRAIL-R2 и:
а. ингибирования рецептора TRAIL-R2,
б. имитации связывания TRAIL с рецептором TRAIL-R2,
в. стимулирования димеризации или олигомеризации рецептора TRAIL-R2,
г. индуцирования апоптоза или
д. снижения или подавления жизнеспособности клеток.
95. Способ профилактики, лечения, снижения интенсивности симптомов или контроля рака у пациента, нуждающегося в таком лечении, и указанный способ заключается в том, что пациенту вводят эффективное количество композиции по п.92 или 93.
96. Способ по п.95, где указанный рак выбран из плоскоклеточного рака, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ), лимфомы не-Ходжкина, бластомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака почек, рака яичников, рака печени, рака желудка, рака мочевого пузыря, гепатомы, рака молочной железы, рака ободочной кишки, колоректального рака, рака поджелудочной железы, эндометриального рака, карциномы слюнной железы, рака почки, рака печени, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, карциномы печени, рака головы и шеи, рака легких, аденокарциномы, почечно-клеточной карциномы или гепатоцеллюлярного рака.