НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК КОРОНАВИРУСА
SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTING CORONAVIRUS RNA

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к выявлению РНК коронавируса SARS-CoV-2 в образцах биологического материала человека и животных, а также в образцах объектов окружающей среды.
Коронавирус SARS-CoV-2 является причиной заболевания COVID-2019, вызвавшей пандемию в 2020 году. С целью выявления SARS-CoV-2 Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) предложено выделение РНК возбудителя с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance).
Согласно рекомендациям экспертной группы ВОЗ генетические варианты (или, иначе, варианты) SARS-CoV-2, вызывающие озабоченность (variant of concern, VOC, ВВО) как имеющие значение для глобального общественного здравоохранения (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20210225_weekly_epi_update_voc-special-edition.pdf?sfvrsn=leacfa47_7&download=true), маркируются следующими буквами греческого алфавита (https://www.who.int/ru/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/tracking-SARS-CoV-2-variants):
- маркировка ВО3-Альфа (вариант альфа), наиболее ранние образцы задокументированы в Соединенном Королевстве, линия Pango В. 1.1.7;
- маркировка ВО3-Бета (вариант бета), наиболее ранние образцы задокументированы в Южной Африке, линия Pango В. 1.351;
- маркировка ВО3-Гамма (вариант гамма), наиболее ранние образцы задокументированы в Бразилии, линия Pango Р.1;
- маркировка ВО3-Дельта (вариант дельта), наиболее ранние образцы задокументированы в Индии, линия Pango В. 1.617.2;
- маркировка - Дельта плюс (вариант дельта плюс), наиболее ранние образцы задокументированы в Индии, варианты линии Pango В.1.617.2 (AY.1 - В.1.617.2.1, AY.2 - В. 1.617.2.2) (https://www.pib.gov.in/PressReleseDetail.aspx7PRID-1729467; https://www.gisaid.org/hcovl9-variants/; https://cov-lineages.org/lineages/lineage_AY.1.html;
https://cov-lineages.org/lineages/lineage_AY.2.html).
Уровень техники
Известные протоколы исследования направлены на выявление специфичных нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках SARS-CoV-2:
- ORFlab, N (http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html);
- RdRP, Е, N (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618 с_2);
- ORFlb-nsp14, N (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1 -20.pdf?sfvrsn=afl aac73_4);
- S, N (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7);
- N (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4);
- N (https://www.fda.gov/media/134922/download, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2);
- RdRP (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=:3662fcb6_2).
С учетом частоты мутаций SARS-CoV-2, числа уже имеющихся его генетических вариантов особенно перспективными для практического использования являются наборы для мультиплексной ОТ-ПЦР (Zhen W., Berry G.J. Development of a new multiplex real-time RT-PCR assay for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) detection. The Journal of molecular diagnostics, 2020, vol. 22, no. 12, pp. 1367-1372. DOI: 10.1016/j.jmoldx.2020.09.004; Bland J., Kavanaugh A., Hong L.K., Perez O., Kadkol S.S. A multiplex one-step RT-qPCR protocol to detect SARS-CoV-2 in NP/OP swabs and saliva. Current protocols, 2021, vol. 1(5), article e145. DOI: 10.1002/cpzl.145).
Однако представленные протоколы исследований, а также доступные на рынке диагностические наборы на основе ОТ-ПЦР не позволяют идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность (https://www.who.int/ru/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/tracking-SARS-CoV-2-variants;
https://www.pib.gov.in/PressReleseDetail.aspx7PRID-l729467), генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие рецептор-связывающий домен (receptor-binding domain, PvBD).
Известен способ выявления генетического варианта SARS-CoV-2, имеющего делецию 382 нуклеотидов в открытой рамке считывания 8, ассоциированной с легкой формой течения COVID-19 в связи с низкой степенью его репликации (Effects of а major deletion in the SARS-CoV-2 genome on the severity of infection and the inflammatory response: an observational cohort study. The Lancet, 2020, vol. 396, issue 10251, p. 603-611. DOI: https://doi.org/10.1016/SO140-6736(20)31757-8).
Недостатком известного аналога является невозможность выявления SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Известен способ выявления генетического варианта SARS-CoV-2, имеющего замену D614G в S-белке коронавируса, увеличивающей инфективность SARS-CoV-2 (Tracking changes in SARS-CoV-2 spike: Evidence that D614G increases infectivity of the COVID-19 virus. Cell, 2020, vol. 182, issue 4, p.794-795. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.043).
Недостатком известного аналога является невозможность выявления SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Известен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 С1, 12.05.2020), включающий в себя пару праймеров, выбранную из ряда: 5'-GGTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-CTTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-GTAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TTGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TAAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TGTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AAGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-GTAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-AGAGTCATTTTGCTATTGGCC-3' и 5'-TAAAGTTGCCACATTCCTACG-3'; 5'-TGAGTGAAATGGTCATGTGTGG-3' и 5'-AGACCTTGAGATGCATAAGTGC-3'. Из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид может иметь флуоресцентную метку. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 может дополнительно содержать флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 по прототипу устраняет риск получения ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР при наличии мутаций в области амплифицируемого участка генома SARS-CoV-2. Кроме того аналог позволяет проводить выявление генетических вариантов SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР посредством анализа кривых плавления продуктов реакции.
Недостатком аналога является невозможность выявления SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Известен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 включает в себя пары праймеров: 5'-CCGGGTGTTCTTTATCAGGA-3' и 5'-GAGGGAAAACTTCTTGGGTG-3'; 5'-ACGTCTATCAGTTACGTGCC-3' и 5'-ССССААААТСAGCGААATGC-3' (RU 2750564 С1, 29.06.2021). Из пары выбранных праймеров один олигонуклеотид может иметь флуоресцентную метку. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 может дополнительно содержать флуоресцентно меченный олигонуклеотидный зонд, комплементарный или частично комплементарный нуклеотидной последовательности, фланкированной выбранной парой праймеров. Технический результат изобретения заключается в выявлении SARS-CoV-2 на основе мультиплексной ОТ-ПЦР, позволяющей оценивать в сочетании участки вирусного генома, определяющие инфективность и степень репликации SARS-CoV-2.
Недостатком аналога является невозможность выявления SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Наиболее близким аналогом заявленного технического решения - прототипом -являются наборы праймеров, фланкирующих делецию 9 нуклеотидов в гене ORFla в аминокислотных положениях 3675-3677 (ORF1a Δ3675-3677), которая произошла у вариантов SARS-CoV-2 В. 1.1.7, В. 1.351 и Р.1 (согласно маркировке ВОЗ вариант альфа, вариант бета и вариант гамма, соответственно), праймеров для выявления делеции в гене шипа в аминокислотных положениях 69-70 (А69-70) и праймеров CDC N1 (гена нуклеокапсида) для контрольного выявления вирусов дикого типа и вариантов вирусов (Vogels C.B.F., Breban M.I., Ott I.M., Alpert Т., Petrone M.E., Watkins A.E., Kalinich C.C., Earnest R., Rothman J.E., Goes de Jesus J., Claro I.M., Ferreira G.M., Crispim M.A.E., Singh L., Tegally H., Anyaneji U.J., Hodcroft E.B., Mason C.E., Khullar G., Metti J., Dudley J.T., MacKay M.J., Nash M., Wang J., Liu C., Hui P., Murphy S., Neal C., Laszlo E., Landry M.L., Muyombwe A., Downing R., Razeq J., de Oliveira Т., Faria N.R., Sabino E.C., Neher R.A., Fauver J.R., Grubaugh N.D. Multiplex qPCR discriminates variants of concern to enhance global surveillance of SARS-CoV-2. PLoS biology, 2021, vol. 19, no. 5, article e3001236. DOI: 10.1371/journal.pbio.3001236). Наборы праймеров используются для мультиплексной RT-qPCR. Согласно прототипу предложены следующие праймеры:
-для ORF1a Δ3675-3677 - Fwd праймер TGCCTGCTAGTTGGGTGATG, Rev праймер TGCTGTCATAAGGATTAGTAACACT;
-для шипа Δ69-70 - Fwd праймер TCAACTCAGGACTTGTTCTTACCT, Rev праймер TGGTAGGACAGGGTTАТСАААС;
-для гена нуклеокапсида (CDC N1) - Fwd праймер GACCCCAAAATCAGCGAAAT, Rev праймер TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG.
Недостатком прототипа является невозможность выявления SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Решаемой технической проблемой в настоящем изобретении является выявление SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Раскрытие сущности изобретения
Достигаемым техническим результатом является выявление SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Достижение указанного технического результата обусловлено следующей совокупностью существенных признаков - комбинацией синтетических олигонуклеотидов - праймеров, которые специфически отжигаются на участках кДНК, комплементарных мутантным участкам вирусного генома, кодирующим S-белок важных генетических вариантов SARS-CoV-2, в том числе кодирующим распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD, при ОТ-ПЦР.
Синтетический олигонуклеотид Wul-fw: 5'-CTTGATTCGAAGGTTGGTGG-3' способен специфически отжигаться как универсальный прямой праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для всех генетических вариантов SARS-CoV-2. E484K-fw: 5'-CGCACCGTGTAATGGTGTTA-3' способен специфически отжигаться как прямой праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для мутации Е484К, характерной для варианта альфа с мутацией Е484К (https://www.gov.uk/government/publications/covid-19-variants-genomically-confirmed-case-numbers/variants-distribution-of-cases-data; https://assets.publishing.service,gov.uygoveirmient/uploads/system/uploads/attachmentdata/file/959426/Variant_of_Concern_VOC_202012 01_Technical_Briefing_5pdf), для варианта бета и для варианта гамма SARS-CoV-2. Синтетический олигонуклеотид K417N-fw: 5'-СТССAGGGCAAACTGGAААТ-3' способен специфически отжигаться как прямой праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для мутации K417N, характерной для варианта бета и для варианта дельта плюс.Синтетический олигонуклеотид K417T-fw: 5'-ATTCCAGGGCAAACTGGAAC-3' способен специфически отжигаться как прямой праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для мутации К417Т, характерной для варианта гамма SARS-CoV-2. Синтетический олигонуклеотид T478K-fw: 5'-АТСТАТСAGGCCGGTAGCАА-3' способен специфически отжигаться как прямой праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для мутации Т478К, характерной для варианта дельта и для варианта дельта плюс.Синтетический олигонуклеотид Wul-rv: 5'-CAAGTGTTTGTGGATCACGG-3' способен специфически отжигаться как универсальный обратный праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для всех генетических вариантов SARS-CoV-2. Синтетический олигонуклеотид N501Y-rv: 5'-AACCGGCAACCAACACCATA-3' способен специфически отжигаться как обратный праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для мутации N501Y, характерной для варианта альфа, для варианта бета и для варианта гамма SARS-CoV-2. Синтетический олигонуклеотид P681H-rv: 5'-TATATTACGTGCCCGCCGAT-3' способен специфически отжигаться как обратный праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для мутации Р681Н, характерной для варианта альфа. Синтетический олигонуклеотид P681R-rv: 5'-TATATTATGTGCCCGCCGAC-3' способен специфически отжигаться как обратный праймер на участке кДНК, комплементарном участку генома SARS-CoV-2, специфичном для мутации P681R, характерной для варианта дельта и для варианта дельта плюс.
Заявленные синтетические олигонуклеотиды - праймеры подобраны в виде парных праймеров - paired primers (общеупотребляемый в молекулярной генетике термин, например: US 7320857 В2, 22.01.2008; US 7709188 В2, 04.05.2010) таким образом, что их пары позволяют идентифицировать, в том числе в мультиплексных и/или моноплексных реакциях, пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: Wul-fw и Wul-rv, -способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок участку генома SARS-CoV-2, универсальному для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 426 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: Wul-fw и N501Y-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта альфа, для варианта бета и для варианта гамма SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 200 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: Wul-fw и P681H-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта альфа SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 740 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: Wul-fw и P681R-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта дельта и для варианта дельта плюс SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 740 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов -праймеров: E484K-fw и Wul-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта альфа с мутацией Е484К, варианта бета и варианта гамма SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 316 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: E484K-fw и N501Y-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта альфа с мутацией Е484К, варианта бета и варианта гамма SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 90 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: E484K-fw и P681H-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта альфа с мутацией Е484К SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 630 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: K417N-fw и Wul-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта бета и варианта дельта плюс SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 515 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов -праймеров: K417N-fw и N501Y-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта бета SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 289 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов -праймеров: K417T-fw и Wul-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта гамма SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 516 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов -праймеров: K417T-fw и N501Y-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта гамма SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 290 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов -праймеров: T478K-fw и Wul-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта дельта и для варианта дельта плюс SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 333 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: T478K-fw и P681R-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта дельта и для варианта дельта плюс SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 647 пар нуклеотидов. Пара синтетических олигонуклеотидов - праймеров: K417N-fw и P681R-rv, - способна специфически отжигаться на участке кДНК, комплементарном кодирующему S-белок мутантному участку генома SARS-CoV-2, характерному для варианта дельта плюс SARS-CoV-2, с образованием продукта реакции ОТ-ПЦР около 829 пар нуклеотидов.
Для упрощения проведения ПЦР-исследований можно использовать одну композицию, содержащую описанные праймеры без флюоресцентных меток. Также можно использовать до четырнадцати композиций, содержащих описанные праймеры, с учетом получения описанных выше пар праймеров, то есть с подбором описанных синтетических олигонуклеотидов в виде парных праймеров.
При применении праймеров с флюоресцентными метками можно использовать две следующие композиции для проведения мультиплексных ОТ-ПЦР с флуоресцентной детекцией. Одна (первая) композиция может содержать праймеры Wu1-fw без флуоресцентной метки, E484K-fw с флуоресцентной меткой, K417N-fw с флуоресцентной меткой, Wu1-rv с флуоресцентной меткой, N501Y-rv с флуоресцентной меткой и P681H-rv с флуоресцентной меткой. Другая (вторая) композиция может содержать праймеры Wu1-fw без флуоресцентной метки, E484K-fw с флуоресцентной меткой, K417N-fw с флуоресцентной меткой, K417T-fw с флуоресцентной меткой, Wu1-rv без флуоресцентной метки, N501Y-rv без флуоресцентной метки, T478K-fw с флуоресцентной меткой и P681R-rv с флуоресцентной меткой.
В качестве флюоресцентных меток можно использовать известные флюоресцентные метки, обеспечивающие проведение реакций амплификации с заявленными олигонуклеотидами, например, выбранные из перечней BioCat GmbH (Германия) (https://www.biocat.com/genomics/real-time-pcr-dyes) и ООО «Научно-производственная фирма «СИНТОЛ» (Россия) (https://www.syntol.ru/catalog/zondy-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/zondy-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni.html).
Из патентно-технической литературы и практики лабораторной диагностики COVID-19 неизвестно о наборе синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК, генетического типирования и выявления мутантных участков генома коронавируса SARS-CoV-2, который был бы идентичен заявленному.
Отсюда правомерен вывод о соответствия заявленного решения критерию «новизна».
Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для достижения технического результата - выявления SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.
Предлагаемый набор может быть получен многократно, а, значит, заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость». Осуществление изобретения
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих получение набора, обеспечивающего выявление SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта, дельта плюс), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD. При этом приведенные примеры набора показывают конкретную реализацию заявленного изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявленного изобретения.
Пример 1. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК, генетического типирования и выявления мутантных участков генома коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя одну композицию следующих праймеров, при мультиплексной реакции фланкирующих с обеих сторон нуклеотидные последовательности, специфичные для вызывающих озабоченность генетических вариантов SARS-CoV-2: Wul-fw, E484K-fw, K417N-fw, K417T-fw, T478K-fw, Wul-rv, N501Y-rv, P681H-rv и P681R-rv. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, которая была подтверждена при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 С1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием композиции праймеров полученного набора, термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля (в качестве положительного контроля в данном и других примерах использовался препарат целевых нуклеотидных последовательностей, соответствующих амплифицируемым нуклеотидным последовательностям вариантов альфа, бета, гамма, дельта и дельта плюс коронавируса SARS-CoV-2) и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили мультиплексную ПЦР в реальном времени с использованием композиции праймеров полученного набора, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.
В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР с парами праймеров Wul-fw и Wul-rv, Wul-fw и N501Y-rv, Wul-fw и P681H-rv, E484K-fw и Wul-rv, E484K-fw и N501Y-rv и E484K-fw и P681H-rv. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР были получены шесть нуклеотидных последовательностей, которые подтвердили специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал наличие в геноме коронавируса SARS-CoV-2, полученного из биологического материала, мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта альфа с мутацией Е484К SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2. Выявление мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта альфа с мутацией Е484К SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2, в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная вариантом альфа с мутацией Е484К SARS-CoV-2.
Пример 2. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК, генетического типирования и выявления мутантных участков генома коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя две композиции праймеров, фланкирующих с обеих сторон нуклеотидные последовательности, специфичные для вызывающих озабоченность генетических вариантов SARS-CoV-2, при этом одна (первая) из композиций содержала праймеры: Wul-fw, E484K-fw, K417N-fw, Wul-rv, N501Y-rv и P681H-rv, - а другая (вторая) композиция содержала праймеры: Wul-fw, E484K-fw, K417N-fw, K417T-fw, Wul-rv, N501Y-rv, T478K-fw и P681R-rv. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, которая была подтверждена при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 С1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием композиций праймеров полученного набора, термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили мультиплексные ПЦР в реальном времени с использованием композиций праймеров полученного набора, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.
В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР с парами праймеров Wul-fw и Wul-rv, Wul-fw и P681R-rv, T478K-fw и Wul-rv и T478K-fw и P681R-rv. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР были получены четыре нуклеотидных последовательности, которые подтвердили специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал наличие в геноме коронавируса SARS-CoV-2, полученного из биологического материала, мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта дельта SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2. Выявление мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта дельта SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2, в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная вариантом дельта SARS-CoV-2.
Пример 3. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК, генетического типирования и выявления мутантных участков генома коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя четырнадцать композиции праймеров, фланкирующих с обеих сторон нуклеотидные последовательности, специфичные для вызывающих озабоченность генетических вариантов SARS-CoV-2, при этом первая из композиций содержала праймеры Wul-fw и Wul-rv, вторая композиция содержала праймеры Wul-fw и N501Y-rv, третья композиция содержала праймеры Wul-fw и P681H-rv, четвертая композиция содержала праймеры Wul-fw и P681R-rv, пятая композиция содержала праймеры E484K-fw и Wul-rv, шестая композиция содержала праймеры E484K-fw и N501 Y-rv, седьмая композиция содержала праймеры E484K-fw и P681H-rv, восьмая композиция содержала праймеры K417N-fw и Wul-rv, девятая композиция содержала праймеры K417N-fw и N501 Y-rv, десятая композиция содержала праймеры K417T-fw и Wul-rv, одиннадцатая композиция содержала праймеры K417T-fw и N501 Y-rv, двенадцатая композиция содержала праймеры Т478К-fw и Wul-rv, тринадцатая композиция содержала праймеры T478K-fw и P681R-rv и четырнадцатая композиция содержала праймеры K417N-fw и P681R-rv. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, которая была подтверждена при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 С1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием композиций праймеров полученного набора, термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили моноплексные ПЦР в реальном времени с использованием композиций праймеров полученного набора, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.
В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР с парами праймеров Wul-fw и Wul-rv, Wul-fw и N501Y-rv, E484K-fw и Wul-rv, E484K-fw и N501Y-rv, K417N-fw и Wul-rv, а также K417N-fw и N501 Y-rv. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР были получены шесть нуклеотидных последовательностей, которые подтвердили специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал наличие в геноме коронавируса SARS-CoV-2, полученного из биологического материала, мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта бета SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2. Выявление мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта бета SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2, в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная вариантом бета SARS-CoV-2.
Пример 4. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК, генетического типирования и выявления мутантных участков генома коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя три композиции праймеров, фланкирующих с обеих сторон нуклеотидные последовательности, специфичные для вызывающих озабоченность генетических вариантов SARS-CoV-2, при этом первая из композиций содержала праймеры: Wul-fw, E484K-fw, K417N-fw, T478K-fw, Wul-rv, N501 Y-rv, P681H-rv и P681R-rv. Вторая композиция содержала праймеры: K417T-fw и Wul-rv. Третья композиция содержала праймеры: K417T-fw и N501 Y-rv. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, которая была подтверждена при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 С1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием композиций праймеров полученного набора, термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили мультиплексную и моноплексные ПЦР в реальном времени с использованием композиций праймеров полученного набора, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.
В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР с парами праймеров Wul-fw и Wul-rv, Wul-fw и N501 Y-rv, E484K-fw и Wul-rv, E484K-fw и N501 Y-rv, K417T-fw и Wul-rv, а также K417T-fw и N501Y-rv. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР были получены шесть нуклеотидных последовательностей, которые подтвердили специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал наличие в геноме коронавируса SARS-CoV-2, полученного из биологического материала, мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта гамма SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2. Выявление мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта гамма SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2, в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная вариантом гамма SARS-CoV-2.
Пример 5. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК, генетического типирования и выявления мутантных участков генома коронавируса SARS-CoV-2, включающий в себя две композиции праймеров, фланкирующих с обеих сторон нуклеотидные последовательности, специфичные для вызывающих озабоченность генетических вариантов SARS-CoV-2. Одна композиция содержала праймеры Wul-fw без флуоресцентной метки, E484K-fw с флуоресцентной меткой, K417N-fw с флуоресцентной меткой, Wul-rv с флуоресцентной меткой, N501 Y-rv с флуоресцентной меткой и P681H-rv с флуоресцентной меткой. Другая композиция содержала праймеры Wul-fw без флуоресцентной метки, E484K-fw с флуоресцентной меткой, K417N-fw с флуоресцентной меткой, K417T-fw с флуоресцентной меткой, Wul-rv без флуоресцентной метки, N501 Y-rv без флуоресцентной метки, T478K-fw с флуоресцентной меткой и P681R-rv с флуоресцентной меткой. Данный набор был использован для исследования образца РНК, полученного из биологического материала от больного с подозрением на инфекцию COVID-19, которая была подтверждена при использовании известного набора синтетических олигонуклеотидов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 (RU 2720713 С1, 12.05.2020). Проводили обратную транскрипцию с использованием композиций праймеров полученного набора, термостабильной ревертазы, ингибитора РНКаз, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля и отрицательного контроля. Затем с использованием полученной кДНК проводили мультиплексные ПЦР в реальном времени с использованием композиций праймеров полученного набора, термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции и кривых плавления продуктов амплификации, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования.
В результате проведенного исследования графиков кривых нарастания флуоресценции и анализа продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза была установлена положительная ОТ-ПЦР с парами праймеров Wul-fw и Wul-rv, Wul-fw и P681R-rv, T478K-fw и Wul-rv, T478K-fw и P681R-rv, а также K417N-fw и Wul-rv и K417N-fw и N501 Y-rv. В результате секвенирования ампликонов ОТ-ПЦР были получены шесть нуклеотидных последовательностей, которые подтвердили специфичность ОТ-ПЦР. Анализ результатов как горизонтального гель-электрофореза, так и графиков кривых плавления показал наличие в геноме коронавируса SARS-CoV-2, полученного из биологического материала, мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта дельта плюс SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2. Выявление мутантных участков генома SARS-CoV-2, характерных для варианта дельта плюс SARS-CoV-2, а также участка генома SARS-CoV-2, универсального для всех важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2, в результате ОТ-ПЦР с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов было подтверждено секвенированием нуклеотидных последовательностей.
На основании результатов ОТ-ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная вариантом дельта плюс SARS-CoV-2.
Таким образом, приведенные примеры использования предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов доказывают возможность выявления SARS-CoV-2 на основе ОТ-ПЦР, позволяющей идентифицировать пять важных, то есть вызывающих озабоченность, генетических вариантов SARS-CoV-2 (а именно: варианты альфа, бета, гамма, дельта), при выявлении в сочетании эпидемиологически и клинически значимых мутантных участков вирусного генома, кодирующих S-белок, в том числе кодирующих распознаваемые антителами эпитопы S-белка, включающие RBD.