НАПРАВЛЕННОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ МИКРОБОВ, ПЛАТФОРМА ДЛЯ РАЦИОНАЛЬНОГО УЛУЧШЕНИЯ ВИДОВ МИКРОБОВ ДЛЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

1. Способ направленного модифицирования микробов для рационального улучшения микробов, ассоциированных с растением, для осуществления функции полезной для растения, включающий
a. получение множества видов микробов, которые ассоциированы с целевым растением, представляющим интерес;
b. анализ множества видов микробов на: метрику образования колоний и возможность осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес;
c. выбор микробов кандидатов из множества анализируемых видов микробов;
d. введение одного или нескольких целевых внутриродовых генетических изменений в виды микробов кандидатов;
e. подтверждение встраивания внутриродового генетического изменения на целевом геномном локусе и отсутствия какой-либо трансгенной последовательности; и
f. повторение стадий d) и e) один или несколько раз, пока виды микробов кандидатов не приобретут улучшенную возможность осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес.
2. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия b) включает анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды.
3. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, включающий стадию сканирования геномов множества видов микробов, полученных на стадии a) и характеризацию одного или нескольких геномных путей или наборов генов, которые ассоциированы с функцией полезной для растения, представляющего интерес.
4. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия d) введения одного или нескольких целевых внутриродовых генетических изменений в виды микробов кандидатов включает
a. трансформацию видов микробов кандидатов с помощью плазмиды трансформации, содержащей (i) селективный маркер, (ii) противоселективный маркер, (iii) фрагмент ДНК, содержащий внутриродовое генетическое изменение для введения в виды микробов кандидатов на целевом геномном локусе в одном или нескольких геномных путях или в наборах генов, которые ассоциированы с функцией полезной для растения, представляющего интерес, и гомологичные руки для целевого геномного локуса, фланкирующие внутриродовое генетическое изменение; и (iv) основную цепь плазмиды;
b. выбор видов микробов кандидатов, которые подвергаются начальной гомологичной рекомбинации и содержат внутриродовое генетическое изменение, встроенное в целевой геномный локус, на основе присутствия селективного маркера в геноме; и
c. селекцию видов микробов кандидатов, которые содержат внутриродовое генетическое изменение, встроенное в целевой геномный локус, но подвергаются дополнительной гомологичной рекомбинации, которая выпетливает основную цепь плазмиды, на основе отсутствия противоселективного маркера;
5. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия e) подтверждения встраивания внутриродового генетического изменения на целевом геномном локусе и отсутствия какой-либо трансгенной последовательности включает секвенирование генома трансформированных видов микробов кандидатов.
6. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия e) включает подтверждение отсутствие какой-либо трансгенной последовательности из плазмиды трансформации.
7. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где функция полезная для растения, представляющего интерес, представляет собой фиксирование азота.
8. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где функция полезная для растения, представляющего интерес, представляет собой солюбилизацию фосфата.
9. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где функция полезная для растения, представляющего интерес, представляет собой образование колоний микробов.
10. Способ направленного модифицирования микробов по п. 3, где стадия секвенирования включает секвенирование полного генома.
11. Способ направленного модифицирования микробов по п. 3, включающий характеризацию пути фиксирования азота.
12. Способ направленного модифицирования микробов по п. 3, включающий характеризацию набора генов, выбранных из группы, состоящей из: nifA, nifL, ntrB, ntrC, полинуклеотида, кодирующего глутаминсинтетазу, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, полинуклеотида, кодирующего глутаминазу, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, гена, ассоциированного с биосинтезом фермента нитрогеназы, и их сочетаний.
13. Способ направленного модифицирования микробов по п. 3, включающий характеризацию одного или нескольких генов, вовлеченных в путь, выбранный группы, состоящей из: продуцирования экзополисахарида, продуцирования эндополигалатуроназы, продуцирования трегалозы и преобразования глутамина.
14. Способ направленного модифицирования микробов по п. 3, включающий характеризацию одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, и их сочетания.
15. Способ направленного модифицирования микробов по п. 3, включающий характеризацию одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из: nifA, nifL, ntrB, ntrC, полинуклеотида, кодирующего глутаминсинтетазу, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, полинуклеотида, кодирующего глутаминазу, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, гена, ассоциированного с биосинтезом фермента нитрогеназы, bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, и их сочетания.
16. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия b) включает анализ множества видов микробов на метрику образования колоний в условиях на основе теплицы или лаборатории.
17. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия b) включает анализ множества видов микробов на метрику образования колоний в полевых условиях.
18. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия b) включает анализ множества видов микробов на метрику образования колоний в условиях на основе теплицы или лаборатории, а также в полевых условиях.
19. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где метрика образования колоний, анализируемая на стадии b), включает, по меньшей мере, один из следующих параметров: пространственные структуры образования колоний, временную динамику образования колоний, плотность образования колоний или их сочетания.
20. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляют в условиях на основе теплицы или лаборатории.
21. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в условиях на основе теплицы или лаборатории и включает измерение транскриптомного профиля видов микробов.
22. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в условиях на основе теплицы или лаборатории и включает измерение транскриптомной активности генов, ассоциированных с возможностью у видов микробов для осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес.
23. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в условиях на основе теплицы или лаборатории и включает измерение транскриптомной активности регуляторных последовательностей генов.
24. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в условиях на основе теплицы или лаборатории и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей.
25. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в условиях на основе теплицы или лаборатории и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей в присутствии экзогенного азота.
26. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в условиях на основе теплицы или лаборатории и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей в присутствии экзогенного азота, когда указанная транскриптомная активность промоторных последовательностей измеряется посредством количественного определения экспрессирования регулируемого гена.
27. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в полевых условиях.
28. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в полевых условиях и включает измерение транскриптомного профиля видов микробов.
29. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в полевых условиях и включает измерение транскриптомной активности генов, ассоциированных с возможностью у видов микробов для осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес.
30. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в полевых условиях и включает измерение транскриптомной активности регуляторных последовательностей генов.
31. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в полевых условиях и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей.
32. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в полевых условиях и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей в присутствии экзогенного азота.
33. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется в полевых условиях и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей в присутствии экзогенного азота, когда указанная транскриптомная активность промоторных последовательностей измеряется посредством количественного определения экспрессирования регулируемого гена.
34. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется in vitro.
35. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется in vitro и включает измерение транскриптомного профиля видов микробов.
36. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется in vitro и включает измерение транскриптомной активности генов, ассоциированных с возможностью у видов микробов для осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес.
37. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется in vitro и включает измерение транскриптомной активности регуляторных последовательностей генов.
38. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется in vitro и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей.
39. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется in vitro и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей в условиях обеднения N и обогащения N.
40. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды осуществляется in vitro и включает измерение транскриптомной активности промоторных последовательностей в условиях обеднения N и обогащения N, когда указанная транскриптомная активность промоторных последовательностей измеряется посредством количественного определения экспрессирования регулируемого гена.
41. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где анализ множества видов микробов на метрику образования колоний включает выращивание указанного множества видов микробов в тесной ассоциации с целевым растением.
42. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где анализ множества видов микробов на метрику образования колоний включает выращивание указанного множества видов микробов в тесной ассоциации с целевым растением в условиях на основе теплицы или лаборатории.
43. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где анализ множества видов микробов на метрику образования колоний включает выращивание указанного множества видов микробов в тесной ассоциации с целевым растением в полевых условиях.
44. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды включает выращивание указанного множества видов микробов в тесной ассоциации с целевым растением.
45. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды включает выращивание указанного множества видов микробов в тесной ассоциации с целевым растением в условиях на основе теплицы или лаборатории.
46. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на транскрипционно активные гены при метаболически релевантных условиях окружающей среды включает выращивание указанного множества видов микробов в тесной ассоциации с целевым растением в полевых условиях.
47. Способ направленного модифицирования микробов по п. 2, где анализ множества видов микробов на метрику образования колоний и транскрипционно активных генов при метаболически релевантных условиях окружающей среды включает выращивание указанного множества видов микробов в тесной ассоциации с целевым растением в полевых условиях.
48. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия b) включает анализ множества видов микробов на возможность осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес, в условиях на основе теплицы или лаборатории.
49. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия b) включает анализ множества видов микробов на активность фиксирования азота.
50. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где стадия b) включает анализ множества видов микробов на активность фиксирования азота в анализе восстановления ацетилена или анализе выделения аммония.
51. Способ направленного модифицирования микробов по п. 1, где плазмида трансформации представляет собой суицидную плазмиду.
52. Способ направленного модифицирования микробов по п. 5, где секвенирование включает секвенирование полного генома.
53. Способ направленного модифицирования микробов для рационального улучшения микробов, ассоциированных с растением, для осуществления функции полезной для растения, включающий
a. получение множества видов микробов;
b. анализ множества видов микробов на: метрику образования колоний и возможность осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес;
c. выбор микробов кандидатов из множества анализируемых видов микробов;
d. введение одного или нескольких целевых внутриродовых генетических изменений в виды микробов кандидатов на целевом геномном локусе в одном или нескольких геномных путях или наборах генов, которые ассоциированы с функцией полезной для растения, представляющего интерес;
e. подтверждение встраивания внутриродового генетического изменения на целевом геномном локусе и отсутствия какой-либо трансгенной генетической последовательности; и
f. повторение стадий d)-e) один или несколько раз, пока виды микробов кандидатов не приобретут улучшенную возможность осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес.
54. Способ направленного модифицирования микробов по п. 53, где стадия b) включает анализ транскрипционно активных генов при метаболически релевантных условиях окружающей среды.
55. Способ направленного модифицирования микробов по п. 53, где на стадии d), указанные внутриродовые генетические изменения выбирают из группы, состоящей из: делеций генов целиком, частичных делеций генов, инсерций промоторов, изменений отдельных пар оснований и их сочетания.
56. Способ направленного модифицирования микробов по п. 53, где стадия e) включает секвенирование геномов видов микробов кандидатов.
57. Способ направленного модифицирования микробов для рационального улучшения микробов, ассоциированных с растением, для осуществления функции полезной для растения, включающий
a. получение множества видов микробов;
b. анализ множества видов микробов на: метрику образования колоний и возможность осуществления функции полезной для растения, представляющего интерес;
c. выбор микробов кандидатов из множества анализируемых видов микробов;
d. введение двух или более целевых внутриродовых генетических изменений в виды микробов кандидатов на двух или более целевых геномных локусах, в одном или нескольких геномных путях или наборах генов, которые ассоциированы с функцией полезной для растения, представляющего интерес; и
e. подтверждения введения внутриродовых генетических изменений на целевых геномных локусах и отсутствия какой-либо трансгенной генетической последовательности.
58. Способ направленного модифицирования микробов по п. 57, где стадия b) включает анализ транскрипционно активных генов при метаболически релевантных условиях окружающей среды.
59. Способ направленного модифицирования микробов по п. 57, где на стадии d), указанные внутриродовые генетические изменения выбирают из группы, состоящей из: делеций генов целиком, частичных делеций генов, инсерций промоторов, изменений отдельных пар оснований и их сочетания.
60. Способ направленного модифицирования микробов по п. 57, где стадия e) включает секвенирование геномов видов микробов кандидатов.
61. Способ компьютерного направленного модифицирования микробов для рационального улучшения микробов, ассоциированных с растением, для осуществления функции полезной для растения, включающий
a. оценку множества полных геномных последовательностей микробов;
b. идентификацию множества регуляторных последовательностей генов, которые активно регулируют транскрипцию гена при метаболически релевантных условиях окружающей среды;
c. идентификацию множества генов, ассоциированных с функцией полезной для растения;
d. выбор регуляторной последовательности генов и гена, ассоциированного с функцией полезной для растения, из указанных множеств; где стадии a)-d) осуществляются in silico; и
e. получение, in vivo, модифицированной микробной клетки, которая содержит выбранную регуляторную последовательность генов, функционально связанную с выбранным геном, ассоциированным с функцией полезной для растения, тем самым улучшая экспрессирование гена, ассоциированного с функцией полезной для растения.
62. Система компьютерного направленного модифицирования микробов для рационального улучшения микробов, ассоциированных с растением, для осуществления функции полезной для растения, включающий
a. один или несколько процессоров и
b. одно или несколько устройств памяти, оперативно связанных с одним или несколькими процессорами и имеющих инструкции, хранимые в них, которые при исполнении их одним или несколькими процессорами заставляют систему
i. оценивать множество полных геномных последовательностей микробов;
ii. идентифицировать множество регуляторных последовательностей генов, которые активно регулируют транскрипцию гена при метаболически релевантных условиях окружающей среды;
iii. идентифицировать множество генов, ассоциированных с функцией полезной для растения; и
iv. выбирать регуляторную последовательность генов и ген, ассоциированный с функцией полезной для растения, из указанного множества.
63. Способ компьютерного направленного модифицирования микробов для рационального улучшения микробов, ассоциированных с растением, для осуществления функции полезной для растения, включающий
a. активирование компьютерной системы, содержащей один или несколько процессоров и одно или несколько устройств памяти, оперативно связанных с одним или несколькими процессорами и имеющих инструкции, хранимые в них, тем самым заставляя один или несколько процессоров исполнять инструкции и заставляя систему
i. оценивать множество полных геномных последовательностей микробов;
ii. идентифицировать множество регуляторных последовательностей генов, которые активно регулируют транскрипцию гена при метаболически релевантных условиях окружающей среды;
iii. идентифицировать множество генов, ассоциированных с функцией полезной для растения;
iv. выбирать регуляторную последовательность генов и ген, ассоциированный с функцией полезной для растения, из указанного множества; и
b. получение, in vivo, модифицированных микробных клеток, которые содержат выбранную регуляторную последовательность генов, функционально связанную с выбранным геном, ассоциированным с функцией полезной для растения, тем самым улучшая экспрессирование гена, ассоциированного с функцией полезной для растения.