Эффект Канглайта для инъекций на клеточный цикл опухолевых клеток

44 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ

EFFECT OF KANGLAITE INJECTION ON THE CELL CYCLE OF TUMOR Yang Hua, Wang Xianping, Yu Linlin, Zheng Shu Cancer Research Institute, Zhejiang Medical University ABSTRACT This study was conducted to investigate the effect of Kanglaite (KLT) on the tumor cell cycle. The results reveal that the blank emulsion has a slight inhibiting action on tumor cells: the inhibition rate of 1:20 diluted emulsion (corresponding to 50 |xl/ml) for KB cells being 10%.The IC 50 values for KB cell and K562 cell being 22,65 |il/ml and 38,57 ¡il/ml KLT respectively. The mechanism by which KLT blocks the growth of tumor cells as showed by the flow cytometry is the inhibition of the multiplication of cancer cells, characterized by a decrease in the number of S-period cells and an increase in the G2+M period cells with a dose-dependent relationship, thus resulting in the apoptosis of tumor cells. ЭФФЕКТ КАНГЛАЙТА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Ян Ху а, Ванг Ксянпин, Ю Линлин, Зенг Шу Онкологический Научный Институт, Шейангский Медицинский Университет, КНР РЕЗЮМЕ Целью исследования явилось изучение влияния препарата «Канглайт для инъекций» (KJIT) на клеточный цикл в опухолевых клетках. Результаты показали, что инкубация клеток линии КВ с контрольной ультраэмульсией, разведенной 1:20, что соответствует концентрации препарата KJIT 50 мкл/мл, привела к ингибиции 10 % клеток. IC50 для клеток линии КВ и К562 был 22,65 мкл/мл и 38,57 мкл/мл препарата KJ1T соответственно. Методом проточной цитофлюорометрии показали, что KJIT дозо-зависимым образом блокирует рост опухолевых клеток. KJTT снижает количество клеток в S фазе клеточного роста, повышает количество клеток в G2+M фазе и индуцирует апоптоз. Введение. «Канглайт для инъекций» (KJIT) являет- ческой плоскоклеточной карциномы полости рта по-ся ультраэмульсией для инъекционного применения, по- лучена из Шанхайского Института Биологии Китайс-лученной с помощью современной технологии из ак- кой Академии Наук; линия клеток К562 эритробласт-тивной части экстракта семян Coix. В эксперименталь- ного лейкоза человека предоставлена Исследователь-ных и клинических исследованиях было показано, что ским Институтом Иммунологии Кильского Универси-KJIT имеет выраженную противоопухолевую актив- тета (Германия). ность для многих типов опухолевых клеток, а также 3. Оборудование. Проточный цитофлюориметр повышает иммунную реактивность организма. Изуче- (FACScan) фирмы Becton Dickinson (США). ние цитотоксического действия KJIT на опухолевые 4. МТТmecm. МТТ тест выполнен по стандартной клетки дало возможность использовать его лечения методике [1]. В опытах использовали клетки на следу-больных злокачественными заболеваниями. ющий день после пассажа. В каждую лунку 96-луноч- Целью настоящей работы являлось изучение влия- ной платы помещали по 200 мкл клеток в логарифми-ния KJIT на клеточный цикл опухолевых клеток. ческой фазе роста (2x105/ мл). В опыте были следующие группы: 1) контроль - инкубация клеток с физиоло- Материалы и методы гическим раствором; 2) экспериментальные группы - 1. Реактивы и реагенты. 10 % раствор KJIT и чис- клетки с различными концентрациями KJIT и 3) полотая контрольная ультраэмульсия предоставлены жительный контроль -клетки инкубированные смито-Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical Co., Ltd. (3-(4,5 ди- мицином С. В каждой группе было по 6 дублирован-метил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н тетразолий броми- ных лунок. Клетки с препаратами инкубировали при стый (МТТ); среда RPMI-1640, пропидиум иодид (PI) 37С° в 5% СО, в течение 72 ч, затем добавляли МТТ производства Merck, Sigma и Gibco company; митоми- (рабочий раствор 5 мг/мл) по 10 мкл в каждую лунку цин С (ММС), произведен Kyowa Co., Ltd. за 4 часа до конца эксперимента. После чего определя- 2. Клеточные культуры. Линия клеток КВ челове- ли оптическую плотность (ОП) на спектрофотометре,

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ №4/том1/2002

—

при длине волны 570 нм. Коэффициент ингибирования роста опухолевых клеток рассчитывался по формуле:

средняя ОП экспериментальной группы

Коэффициент =1- _______________________________4100%

ингибирования (%) средняя ОП контрольной группы

50% ингибирующую концентрацию (IC50) лекарственного препарата рассчитывали логарифмическим графическим методом.

5. Определение фаз клеточного цикла. Фазы клеточного цикла определяли методом проточной цитоф-люорометрии как описано ранее [2]. Клетки фиксировали в абсолютном спирте, обрабатывали РНК-азой, окрашивали PI в течение 30 минут. С помощью проточного цитофлюориметра определяли содержание ДНК, а процент клеток в разных периодах клеточного цикла вычисляли с помощью компьютерной программы Multicycle (Phoenix flow system, США, 1994).

Результаты и обсуждение

1. Угнетение роста опухолевых клеток с помощью КЛТ. KJIT существенным образом тормозил рост клеток линий КВ и К562 при инкубации в течение 72 часов. Уровень 50% ингибирующей концентрации для клеток линий КВ и К562 составил 22,6 мкл/мл и 38,5 мкл/мл КЛТ соответственно. Контрольная ультраэмульсия, разведенная 1:20, соответствующая 50 мкл/ мл КЛТ, показала 10 % угнетение роста клеток линии КВ. Уровень 50% ингибирующей концентрации для клеток КВ в позитивном контроле группы с митомици-ном С составил 0,54 мкл/мл.

2. Влияние КЛТ на клеточный цикл опухолевых клеток. Влияние КЛТ на фазы клеточного цикла опухолевых клеток показано в таблице 1. После обработки клеток КЛТ в дозе 1мкл/мл процент клеток в S-фазе и G2+M периоде заметно увеличился. В то время как доза КЛТ в 5 мкл/мл снижала количество клеток в S-фазе. Когда дозу КЛТ увеличили до 10 мкл/мл, процент клеток в S-фазе снизился на 11,6 % по сравнению С контрольной группой, а процент клеток в G2+M-ne-риоде увеличился в 12 раз. При дозе КЛТ 50 мкл/мл, апоптоз наблюдался в 100% опухолевых клеток.

Выше описанные результаты показывают, что КЛТ имеет значимый дозо-зависимый ингибирующий эффект на клетки линии К562. Механизм, лежащий в основе апоптоза опухолевых клеток, является результатом препятствия перехода клеток из С2+М-фазы в G0-и 0,-фазу. Таким образом, процент клеток в S-периоде

Таблица 1

Действие КЛТ на клеточный цикл клеток К562

Группы Концентра- ция препарата Клетки в Gi фазе

Интакт-

ный - 42,4 51,6 6,0

контроль

Контроль- 1 мкл/мл 42 47,4 5,4

ная 5 мкл/мл 45,3 52,7 2,0

эмульсия 10 мкл/мл 41 48,3 10,6

1 мкл/мл 26,2 58,1 15,7

КЛТ 5 мкл/мл 27,2 24,1 48,8

10 мкл/мл 50 мкл/мл 26,4 Апоптоз 6,1 67,5

снижается и митоз опухолевых клеток сокращается, ингибируется деление клеток, и, в конечном счете, индуцируется апоптоз. Результаты в контрольной группе с чистой эмульсией показали, что доза ниже 10 мкл/мл не оказывает никакого эффекта на клеточный цикл клеток К562. КЛТ в этих дозах оказывал видимый эффект на клеточный цикл опухолевых клеток.

Японские ученые сообщили о двух активных компонентах, извлеченных из семян Coix, которые оказывают ингибирующее действие на рост мышиной карциномы Эрлиха. Один из эффективных компонентов вызывал дегенерацию протоплазмы, а другой компонент останавливал клеточное деление на уровне метафазы [3, 4]. Наши результаты подтверждают, что КЛТ может ингибировать деление опухолевых клеток, путем препятствия делению ядра в опухолевых клетках [5, 6].

ЛИТЕРАТУРА

1. Camplin B.G., Рут Baker Н.М. et al. Chemosensitivity testing of small cell lung cancer using MTT assay.// Br J Cancer, 1991, P. 63-75.

2. Dosik Gm„ Barligie B., Smith T.L. et al. Pretreatment flow Cytometry of DNA content acute leukemia.// Blood, 1980, P. 55-74.

3. Nakayama Muneharu H The Journal of Japanese Surgery, 1960, 61, №2, P. 234.

4. Nakayama Tsuneaki II The Journal of Japanese Engineer Association, 1959,42, № 2, P. 945

5. Li Fengyun // The Journal of Practical Oncology, 1994, № 3, P. 59

6. Liu Jiaxiang, Liao Meilin, Yan Dejun. Kanglaite Injection in the Treatment of Primary Lung Cancer - A Clinical Summary. Zhejiang Anticancer Drug Information, Aug. 1995

№4/tom1/2002

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ