ROC-анализ результатов выявления антигенов возбудителей мелиоидоза и сапа твердофазным иммуноферментным методом

УДК 616.993

А.А.Будченко, И.Ю.Мазурова, В.И.Илюхин, Н.П.Храпова

roc-анализ результатов выявления антигенов возбудителей мелиоидоза и сапа твердофазным иммуноферментным методом

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт», Волгоград,

Российская Федерация

Анализ ROC-кривых, построенных по результатам тестирования бинарных классификаторов, используется для сравнительной оценки эффективности сравниваемых методов лабораторной диагностики инфекции и идентификации возбудителя. В работе проведен анализ ROC-кривых вариантов твердофазного иммунофермент-ного анализа (ТИФА) с иммунными сыворотками для выявления наиболее эффективных при идентификации B. pseudomallei и B. mallei. Показано, что среди вариантов ТИФА с иммунными сыворотками к клеточным антигенам наиболее эффективным был ТИФА с сыворотками к гомологичным антигенам. Среди вариантов ТИФА с иммунными сыворотками к ЭЦА наиболее эффективным был ТИФА с сыворотками к ЭЦА штаммов B. mallei и B. pseudomallei. Выявлена перспектива эффективного применения ТИФА с иммунными сыворотками к перекрестным антигенам штаммов B. thailandensis и B. cepacia для идентификации и типирования возбудителей сапа и мелиоидоза. Показана целесообразность применения для сравнительной оценки эффективности разрабатываемых методов идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза построения ROC-кривых и их анализа.

Ключевые слова: ROC-анализ, буркхольдерии, твердофазный иммуноферментный анализ, клеточные и экс-трацеллюлярные антигены, сыворотка, Burkholderia pseudomallei, B. mallei.

A.A.Budchenko, I.Yu.Mazurova, V.LIlyukhin, N.P.Khrapova

ROC-Analysis of the Results as regards B. pseudomallei and B. mallei Agents Detection Using Solid-Phase ELISA

Volgograd Research Anti-Plague Institute, Volgograd, Russian Federation

Analyzed are operational characteristic curves (ROC-curves) of solid-phase ELISA variants with immune sera to cellular and extracellular Burkholderia antigens with the aim to determine the most effective ones for B. pseudomallei and B. mallei antigen detection. It is shown that among solid-phase ELISA variants with immune sera to cellular and extracellular antigens, those with sera to homologous antigens are the most effective. Demonstrated is the possibility of application of solid-phase ELISA variants with immune sera to antigens of B. thailandensis and B. cepacia strains for identification and typing of glanders and melioidosis agents. Assessed are prospects of extracellular antigen application for differentiation between closely related species of “pseudomallei” group.

Key words: ROC-analysis, Burkholderia, enzyme-linked immunosorbent assay, cellular and extracellular antigens, serum, Burkholderia pseudomallei, B. mallei.

Современным удобным средством оценки эффективности (полезности) диагностических тест-систем является метод, основанный на анализе операционной характеристической кривой (ROC Receiver Operating Characteristic curve), широко известный в научных кругах [4]. ROC-кривая показывает зависимость количества верно классифицированных тест-системой положительных проб от количества неверно классифицированных отрицательных проб при выбранной точке отсечения (cut-off value). Для построения ROC-кривой для каждого значения точки отсечения, которое меняется от 0 до 1, с определенным шагом рассчитываются значения чувствительности (Se) и специфичности (Sp) теста и строится график их зависимости. Анализ классификаций с применением ROC-кривых называется ROC-анализом [4]. Анализ ROC-кривых успешно применялся для оценки эффективности методов диагностики бурк-хольдерий [9, 10]. В эндемичных по мелиоидозу районах в практической медицине при выявлении

антигенов B. pseudomallei и антител к ним серологические методы являются основными [7]. Однако их чувствительность и специфичность не достаточны при диагностике различных форм мелиоидоза у людей [12, 13]. Продолжается поиск антигенов, применение которых в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА) и реакции пассивной гемагглюти-нации обеспечило бы тест-системам высокие значения чувствительности и специфичности [5, 6]. Так, M.Kunakom и соавт., используя анализ ROC-кривых, оценили эффективность выявления антител в сыворотках больных мелиоидозом в Таиланде вариантами ТИФА с 5 антигенами разного молекулярного веса, выделенными из клеток B. pseudomallei [9]. Ранее мы сообщали об использовании полученных иммунных кроличьих сывороток к клеточным и экстрацеллю-лярным антигенам (ЭЦА) штаммов B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia, B. thailandensis для выявления различий составов ЭЦА буркхольдерий группы «pseudomallei» и B. cepacia в реакции иммунодиффу-

зии (РИД) и иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) [1].

Цель работы - сравнить с помощью ROC-анализа прогностическую способность вариантов ТИФА с иммунными кроличьими сыворотками к клеточным антигенам и к ЭЦА буркхольдерий при выявлении антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза.

Материалы и методы

В работе использовали 21 штамм буркхольдерий (Burkholderia pseudomallei - 9, B. mallei - 4, B. cepacia - 6, B. thailandensis - 2) и 6 штаммов псевдомонад (Pseudomonas alcaligenes 4138, P fragi 898, P. fluore-scens В1602, P aeruginosa 4000 и PAO, P stutzeri 903) из коллекционного центра Волгоградского НИПЧИ. Бактерии выращивали на F-агаре «Difco» (США). Клеточные антигены получали из высушенных в ацетоне клеток, обработанных ультразвуком [2]. ЭЦА выделяли по методике P.Liu [11]. Иммунные кроличьи сыворотки получали к клеточным антигенам и ЭЦА типичных штаммов буркхольдерий: B. mallei 10230, B. pseudomallei С141, B. cepacia 25416, B. thailandensis 264. Кроликов иммунизировали внутрикожно антигенами (концентрация 2 мг/мл) с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 дозой 2 мл за три цикла [3]. Одно введение состояло из инъекций 0,2 мл антигенной смеси в 10 точек животному вдоль позвоночника. Интервалы между введениями составляли 7 сут, между циклами - 30. Кровь отбирали при титре антител в РИД не менее 1:32. При постановке ТИФА использовали 96-луночные планшеты для иммунологических реакций «Dynatech» (Швейцария), сенсибилизированные клеточными антигенами исследуемых штаммов, (концентрация 10 мкг/мл). Свободные сайты блокировали 1 % раствором бычьего сывороточного альбумина. Затем в лунки последовательно вносили анализируемые сыворотки в разведении от 10-1 до 10-7 и меченные пероксидазой антитела против кроличьих иммуноглобулинов (Медгамал, Россия) в разведении 1:8000. В качестве субстрата применяли тетраме-тилбензидин. Реакцию учитывали на приборе «Stat Fax 2100» (Awareness Technology, США) при длине волны 450 нм. Положительным считали результат, при котором значения оптической плотности исследуемых образцов превышают в 2 раза и более значение критической оптической плотности контроля конъюгата (0,2). При анализе ROC-кривых, построенных для вариантов ТИФА с сыворотками против антигенов типичных штаммов буркхольдерий, был использован расчет по правилу трапеций площадей под кривыми AUC (Area Under Curve) [14].

Результаты и обсуждение

В данной работе был проведен ROC-анализ вариантов ТИФА на определение наиболее эффективных из них при выявлении антигенов B. pseudomallei и B. mallei: ТИФА с сыворотками к клеточным анти-

генам и ЭЦА B. pseudomallei С141 и B. thailandensis 264; ТИФА с сыворотками к ЭЦА четырех типичных штаммов буркхольдерий. Для этого варианты ТИФА тестировались антигенами известных штаммов буркхольдерий и псевдомонад, распределенных на 5 групп: 1-я - B. pseudomallei

7

? 6 ¥ 5

8. 4

О

ш

О о

о 3

Q.

S 2 I-

1

О

• • • •

0 1 2 3 4 5

В. pseudomallei В. mallei В. thailandensis В. cepacia псевдомонады

• •

.... •

• • • • •

• • . .1 . 1 1 • • • • • •

0 1 2 3 4 5

В. pseudomallei В. mallei В. thailandensis В. cepacia псевдомонады

Рис. 1. Скаттерграммы титров в ТИФА иммунных кроличьих сывороток к клеточным антигенам B. pseudomallei С141 (А) и к ЭЦА B. pseudomallei С141 (Б) при выявлении антигенов б групп штаммов B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. cepacia, псевдомонады:

------------ линия отсечения

позволил составить матрицы сопряженности с вычисленными значениями чувствительности (Se -доля истинно положительных проб) и специфичности (Sp - доля истинно отрицательных проб) в точках отсечения, взятых через интервал в один десятичный логарифм [4]. По данным матриц, были построены ROC-кривые рассматриваемых вариантов ТИФА при выявлении антигенов штаммов B. pseudomallei и B. mallei (рис. 2). Анализ ROC-кривых проводили, учитывая, что ROC-кривая «идеального классификатора» проходит через верхний левый угол графика, где доля истинно положительных проб составляет 100 % (идеальная чувствительность), а доля ложноположительных проб равна нулю (специфичность равна 100 %) и поэтому чем ближе кривая к верхнему левому углу, тем выше прогностическая способность тест-системы, а значит выше ее эффективность; диагональная пунктирная линия соответствует «бесполезному» классификатору, то есть, полной неразличимости двух классов проб - неэффективности тест-системы [15].

Построенная ROC-кривая варианта ТИФА с сывороткой к клеточным антигенам B. pseudomallei С141 - f1(x) оказалась ближе к углу (0 %, 100 %), а значит и более эффективной в обнаружении антигенов штаммов B. pseudomallei, чем вариант ТИФА с сывороткой к внеклеточным антигенам, ее кривая - f2(x) расположена ближе к диагонали (рис. 2, А). Визуальный анализ ROC-кривых вариантов ТИФА с сыворотками к клеточным антигенам и ЭЦА B. thailandensis 264 при идентификации антигенов B. pseudomallei не дал явного ответа, какой из вариантов более эффективен. Поэтому был применен количественный метод сравнения ROC-кривых - вычисление и оценка AUC. Анализ AUC проводили, учитывая, что теоретически AUC изменяется от 0 до 1; так как диагностическая модель всегда характеризуются кривой, расположенной выше диагонали, то реально AUC изменяется от 0,5 («бесполезный» классификатор) до 1 («идеальная» модель), а значит, чем больше AUC приближается к 1, тем эффективнее тест-система [14]. В нашем случае AUC вариан-

та ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. thailandensis 264 равна 0,78, а AUC варианта ТИФА с сывороткой к клеточным антигенам B. thailandensis 264 равна 0,75. Так как AUC первого варианта больше AUC второго, то из этого следует, что этот вариант ТИФА более эффективен при выявлении антигенов штаммов B. pseudomallei, чем второй. Эти варианты ТИФА с AUC от 0,7 до 0,8 по экспертной шкале относятся к моделям хорошего качества [14].

Визуальный анализ ROC-кривых этих же вариантов ТИФА при выявлении антигенов штаммов B. mallei показал, что более эффективными оказались варианты с сыворотками к клеточным антигенам B. pseudomallei С141 и B. thailandensis 264 (ROC-кривые f1(x) и f3(x) соответственно), так как их кривые на графике располагались ближе к углу с параметрами 0 %, 100 % (рис. 2, В). При этом вариант ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. thailandensis 264 для выявления антигенов оказался совсем непригодным, так как его ROC-кривая (f4(x)) расположилась ниже диагонали. Как отмечалось выше, эти классификаторы относятся к «бесполезным». Такие результаты связаны с тем, что в качестве отрицательных проб были взяты антигены штаммов B. pseudomallei, вида близкородственного B. mallei, которые выявляются этим вариантом ТИФА как положительные пробы. Это значительно снизило специфичность варианта ТИФА. Значения чувствительности вариантов ТИФА с сыворотками к клеточным антигенам B. pseudomallei С141 и B. thailandensis 264 при обнаружении антигенов B. mallei составили 100 %, а значения специфичности - 58,3 и 31,6 % соответственно. Чувствительность при выявлении антигенов B. mallei вариантом ТИФА с сыворотками к ЭЦА B. pseudomallei С141 составила 100 %, а вариантом ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. thailandensis 264 -25 %. Значения специфичности были соответственно 83,3 и 52,7 %. Низкое значение чувствительности варианта ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. thailandensis 264 указывает на значимые различия в составе ЭЦА B. thailandensis 264 и B. mallei 10230, ранее выявленные нами в ИЭФ [1].

Рис. 2. Сравнение ROC-кривых выявления антигенов штаммов B. pseudomallei, B. mallei вариантами ТИФА с сыворотками к клеточным антигенам и ЭЦА B. pseudomallei С141 и B. thailandensis 264:

ROC-кривые выявления антигенов штаммов B. pseudomallei ТИФА с сывороткой к клеточным антигенам (f1(x)) и к ЭЦА (f2(x)) B. pseudomallei С141 (А); ROC-кривые выявления антигенов штаммов B. pseudomallei ТИФА с сывороткой к клеточным антигенам: (f1(x)) и к ЭЦА (f2(x'))B. thailandensis 264 ( Б); ROC-кривые выявления антигенов штаммов B. mallei ТИФА с сыворотками: к клеточным антигенам (f1(x)) и к ЭЦА (f2(x))B. pseudomallei С141: к клеточным антигенам (f3(x)) и к ЭЦА (f4(x)) B. thailandensis 264(B). Sp - значение специфичности

Рис. 3. Сравнение ROC-кривых выявления антигенов штаммов B. pseudomallei (А), B. mallei (Б) вариантами ТИФА с иммунными сыворотками к ЭЦА:

f1(x) -B. pseudomalleiС141; f2(x) —B. mallei 10230; f3(x) -B. thailandensis 264; f4(x) — B. cepacia 25416. Sp - значение специфичности

Был проведен сравнительный анализ ROC-кривых вариантов ТИФА с сыворотками к ЭЦА 4 видов буркхольдерий при выявлении антигенов B. pseudomallei и B. mallei. При обнаружении антигенов B. pseudomallei более эффективным оказался ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. thailandensis 264, так как его ROC-кривая располагалась ближе остальных к углу графика с параметрами 0 %, 100 % (рис. З, А). Наименее эффективным оказался вариант ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. cepacia 25416, так как его ROC-кривая располагалась ближе других кривых к диагонали (рис. З, А). Это объясняется значительными различиями составов ЭЦА B. pseudomallei и B. cepacia [1]. При обнаружении антигенов B. mallei наиболее эффективным оказался вариант ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. mallei, так как его ROC-кривая на графике ближе других расположилась к углу с координатами 0 %, 10О %. Анализ определил бесполезным вариант для выявления антигенов штаммов B. mallei ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. thailandensis 264, о чем говорилось выше (рис. З, Б). Интересным явился тот факт, что при выявлении антигенов штаммов B. mallei эффективность варианта ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. cepacia 25416 оказалась выше, чем ТИФА с сывороткой к ЭЦА B. thailandensis 264, что коррелирует с данными по различиям составов ЭЦА

B. thailandensis 264 и ЭЦА B. cepacia 25416 [1].

Таким образом, проведенные исследования показали, что ROC-анализ применим для оценки прогностической способности вариантов ТИФА с сыворотками к разным антигенам буркхольдерий при выявлении антигенов B. pseudomallei, B. mallei. Анализ ROC-кривых позволил сделать вывод, что более эффективными при выявлении антигенов патогенных буркхольдерий являются варианты ТИФА с сыворотками к гомологичным клеточным антигенам. Изучение ROC-кривых вариантов ТИФА с сыворотками к ЭЦА четырех штаммов буркхольдерий выявило различия в эффективности их при идентификации антигенов патогенных буркхольдерий, связанные с различиями составов ЭЦА анализируемых видов. Эти факты определили перспективность дальнейшего изучения состава ЭЦА штаммов анализируемых видов с целью выявления индивидуальных и перекрестных антигенов, которые будучи выделенными, могли быть использованы в создании эффек-

тивных тест-систем идентификации B. pseudomallei,

B. mallei.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. БудченкоА.А., Мазурова И.Ю., Илюхин В.И. Исследование внеклеточных антигенов иммунодиффузионными методами в дифференциации патогенных буркхольдерий. Журн. микроби-ол., эпидемиол. и иммунобиол. 2012; 1:54-60.

2. Пивень Н.Н., Авророва И.В., Жукова С.И., Алексеев В.В., Храпова Н.П., Корсакова И.И., Ломова Л.В., Напалкова Г.М., Дрефс И.Т., Прошина О.Б. Иммуногенность поверхностных и капсульных антигенов Burkholderia mallei. Журн. микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол. 2007; 1:47-52.

3. Пивень Н.Н., Смирнова В.И., Каплиев В.И., Подзолкова Г.Г., Храпова Н.П. Роль поверхностных антигенов Pseudomonas pseudomallei в патогенезе мелиоидоза. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991; 10:8-12.

4. Файнзильберг Л.С., Жук Т.Н. Гарантированная оценка эффективности диагностических тестов на основе усиленного ROC-анализа. Управляющие системы и машины. 2009; 5:3-13.

5. Allwood E.M., Logue C.-A., Hafner G.J., Ketheesan N., Norton R.E., Peak I.R., Beacham I.R. Evaluation of recombinant antigens for diagnosis of melioidosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008; 54:144-53.

6. Ashdown L.R., Johnson R.W., Koehler J.M., Cooney C.A. Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of clinical and subclinical melioidosis. J. Infect. Dis. 1989; 160(2):253-60.

7. Chantratita N., Wuthiekanun V., Thanwisai A., Limmathurotsakul D., Cheng A.C., Chierakul W., Day N.P., Peacock S.J. Accuracy of enzyme-linked immunosorbent assay using crude and purified antigens for serodiagnosis of melioidosis. Clin. Vaccine Immunol. 2007; 14(1):110-13.

8. Chenthamarakshan V., Kumutha M.V., Vadivelu J., Puthucheary S.D. Distribution of immunoglobulin classes and IgG subclasses against a culture filtrate antigen of Burkholderia pseudomallei in melioidosis patients. J. Med. Microbiol. 2001; 50:55-61.

9. Kunakorn M., Boonma P., Khupulsup K., Petchclai B. Enzyme-linked immunosorbent assey for immunoglobulin M specific antibody for the diagnosis of melioidosis. J. Clin. Microbiol. 1990; 28(6):1249-53.

10. Limmathurotsakul D., Chantratita N., Teerawattanasook N., Piriyagitpaiboon K., Thanwisai A., Wuthiekanun V., Day N.P.J., Cooper B., Peacock S.J. Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of melioidosis: better than we thought. Clin. Infect. Dis. 2011; 52(8):1024-28.

11. Liu P. Identification of pathogenic Pseudomonas by extracellular antigens. J. Bacteriol. 1961; 81(7):28-35.

12. OBrien M., Freeman K., Lum G., Cheng A.C., Jacups S.P., Currie B.J. Further evaluation of a rapid diagnostic test for melioidosis in an area of endemicity. J. Clin. Microbiol. 2004; 42:2239-40.

13. Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Anuntagool N. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis. J. Trop. Med. Hyg. 2000; 63:146-9.

14. Van den Hout W.B. The area under an ROC curve with limited information. Med. Decis. Making. 2003; 23(2):160-66.

15. ZweigM.H., Campbell G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin. Chem. 1993; 39(4):551-77.

References

1. Budchenko A.A., Mazurova I.Yu., Ilyukhin V.I. [Investigations of extracellular antigens using immune-diffusion methods for differentiation between pathogenic Burkholderia]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol.

2012; 1:54-60.

2. Piven’N.N., Avrorova I.V, Zhukova S.I., Alekseev V.V, Khrapova N.P., Korsakova I.I., Lomova L.V., Napalkova G.M., Drefs I.T., Proshina O.B. [Immunogenicity of the surface and capsular Burkholderia mallei antigens]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2007; 1:47-52.

3. Piven’N.N., Smirnova V.I., Kapliev VI., Podzolkova G.G., Khrapova N.P. [Function of the surface Pseudomonas pseudomallei antigens in melioidosis pathogenesis]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1991; 10:8-12.

4. Fainzil’berg L.S., Zhuk T.N. [Assured assessment of the efficacy as regards diagnostic assays on the basis of amplified ROC-analysis]. Upravl. Sistemy i Machiny. 2009; 5:З-1З.

5. AllwoodE.M., Logue C.-A., Hafner G.J., Ketheesan N., Norton R.E., Peak I.R., Beacham I.R. Evaluation of recombinant antigens for diagnosis of melioidosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008; 54:144-5З.

6. Ashdown L.R., Johnson R.W., Koehler J.M., Cooney C.A. Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of clinical and subclinical melioidosis. J. Infect. Dis. 1989; 160(2):25З-60.

7. Chantratita N., Wuthiekanun V, Thanwisai A., Limmathurotsakul D., ChengA.C., Chierakul W., Day N.P., Peacock SJ. Accuracy of enzyme-linked immunosorbent assay using crude and purified antigens for serodiagnosis of melioidosis. Clin. Vaccine Immunol. 2007; 14(1):110-1З.

8. Chenthamarakshan V., KumuthaM.V, Vadivelu J., PuthuchearyS.D. Distribution of immunoglobulin classes and IgG subclasses against a culture filtrate antigen of Burkholderia pseudomallei in melioidosis patients. J. Med. Microbiol. 2001; 50:55-61.

9. Kunakorn M., Boonma P., Khupulsup K., Petchclai B. Enzyme-linked immunosorbent assey for immunoglobulin M specific antibody for the diagnosis of melioidosis. J. Clin. Microbiol. 1990; 28(6):1249-5З.

10. Limmathurotsakul D., Chantratita N., Teerawattanasook N., Piriyagitpaiboon K., Thanwisai A., Wuthiekanun V, Day N.PJ., Cooper B., Peacock S.J. Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of me-

lioidosis: better than we thought. Clin. Infect. Dis. 2011; 52(8):1024-28.

11. Liu P. Identification of pathogenic Pseudomonas by extracellular antigens. J. Bacteriol. 1961; 81(7):28-35.

12. O’BrienM., FreemanK., Lum G., ChengA.C., Jacups S.P., Currie BJ. Further evaluation of a rapid diagnostic test for melioidosis in an area of endemicity. J. Clin. Microbiol. 2004; 42:2239^0.

13. SermswanR.W., WongratanacheewinS.,AnuntagoolN. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis. J. Trop. Med. Hyg. 2000; 63:146-9.

14. Van denHout W.B. The area under an ROC curve with limited information. Med. Decis. Making. 2003; 23(2):160-66.

15. ZweigM.H., Campbell G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin. Chem. 1993; 39(4):551-77.

Authors:

Budchenko A.A., Mazurova I.Yu., Ilyukhin V.I., Khrapova N.P. Volgograd Research Anti-Plague Institute. 7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131, Russian Federation. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru

Об авторах:

Будченко А.А., Мазурова И.Ю., Илюхин В.И., Храпова Н.П. Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 4001З1, Волгоград, ул. Голубинская, 7. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru

Поступила 16.07.12.