Цитогенетический анализ гибридов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L. ) с пшеницей Тимофеева (Triticum timopheevii Zhuk. )

УДК 633.11: 575.222.73

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГИБРИДОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ

Е.П. УХИНОВА, В.В. ПЫЛЬНЕВ, В.С. РУБЕЦ

Проведен анализ мейоза и фертильности пыльцы у гибридов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) с пшеницей Тимофеева (Triticum timopheeviiZhuk.).Обнаружены нарушения в микроспорогенезе и фертильности пыльцы у межвидовых гибридов. Описан характер этих нарушений и частота их возникновения у различных гибридных комбинаций. Сделан вывод, что количество нормальных пыльцевых зерен у изучаемых образцов достаточно для протекания нормального опыления и оплодотворения.

Ключевые слова: отдаленные гибриды, микроспорогенез, фертильность пыльцы, пшеница Тимофеева.

Использование сравнительно небольшого числа сортов мягкой пшеницы при создании новых сортов привело к резкому сужению генофонда культуры. Это, в частности, может существенно сказаться на устойчивости современных сортов пшеницы к различным заболеваниям, увеличивает опасность возникновения и степень проявления вредоносности эпифитотий. Генетический материал мягкой пшеницы по таким признакам, как иммунитет к различным болезням, устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды и продуктивность, практически исчерпан [11]. Проблему обогащения генофонда мягкой пшеницы можно решить за счет использования генофонда ее дикорастущих сородичей. Одним из видов пшеницы, используемых в селекции в этих целях, является Triticum timopheevii , который обладает многими генами устойчивости к различным заболеваниям. Однако геномный состав

обусловливают трудную скрещиваемость его с мягкой пшеницей (ААББКК; 2п=42), а также стерильность гибридов Еі . Данное затруднение преодоля-ется путем возвратного скрещивания гибридов соответствующим исходным сортом.

Успех в решении проблем отдал ен-ной гибридизации, связанных с несовместимостью геномов исходных видов, во многом зависит от знания особенностей протекания мейоза у гибридов. В процессе мейоза у них происходят рекомбинация, хромосомные и геномные перестройки и формирование функциональных гамет различного хромосомного состава, определяющие генетическое разнообразие и цитогенетическую стабильность следующих поколений гибридов [4]. В связи с этим у отдаленных гибридов со сложными межгеномными взаимодействиями необходимо исследование цитогенетических особенностей мейотических процессов.

В данной работе представлены результаты цитогенетического анализа

микроспорогенеза и фертильности пыльцы у гибридов, полученных от скрещивания Triticum aestivum Li с Triticum timopheevii Zhuk.

Материалы и методы

В исследованиях использовалось 30 линий F7-F8 мягкой яровой пшеницы и пшеницы Тимофеева: 11 линий (Л-25-1 — Л-25-11) от скрещивания (Новосибирская 67 Triticum timopheevii) X Новосибирская 67; 19 линий (Л-6-1 — Л-6-19) от скрещивания (Жница X Triticum timopheevii) X Жница; сорта яровой мягкой пшеницы Новосибирская 67 и Жница; линия Triticum timopheevii К-47793.

Цитологический анализ фертильности пыльцы и мейоза проводили на окрашенных ацетокармином давленых препаратах пыльников [8]. Колосья фиксировали по Карнуа (3:1). При анализе мейоза подсчитывали и описывали характер аномалий у 10 растений каждой линии и родительского сорта. За исходный критерий генетической стабильности принят мейоз в родительских сортах. При исследовании фер-

тильности пыльцы определяли процент стерильных пыльцевых зерен. В каждой линии анализировали по 5000 пыльцевых зерен.

Результаты и их обсуждение

Во всех изученных гибридных комбинациях Е7— Ев и в родительских сортах мейоз характеризуется отклонениями от нормального течения, хотя частота встречаемости таких отклонений различна. На стадии метафаза I наиболее характерным было невключение части унивалентных хромосом (от 0,4 до 10,5%) в метафазную пластинку (рис. 1 а). В анафазе I мейоза отмечали неравномерное расхождение хромосом к полюсам, реже встречались хромосомные и хроматидные мосты.

Характер деления хромосом зависит от полярной ориентации их центромер [12, 14]. При делении и расхождении клеточных центров в начале мейоза унивалентная хромосома получает биполярный тип ориентации центромеры и способность к эквационно-му делению на хроматиды. В процессе спаривания и синапсиса возникает пре-

Рис. 1. Нарушения в мейозе: а — отдельно лежащие хромосомы в М-I; б — преждевременное расхождение хромосом в А-I; в — отставание хромосом в A-II; г- преждевременное расхождение хромосом в А-II; д -отставание хромосом в А-II; е — асинхронное расхождение в А-II; ж — клетки, находящиеся в стадиях от М-I до тетрад в одном пыльнике; з — триада

пятствие для образования биполярной ориентации центромер. В результате у хромосом в составе бивалентов и де-синаптических псевдоунивалентов сохраняется униполярная центромерная ориентация, и они расходятся к полюсам без деления на хроматиды (редукционное деление). Соотношение типов деления хромосом в А1 зависит от участия генетических систем контроля уровня конъюгации и степени синапсиса исходных видов и их взаимодействия у гибридов различных комбинаций скрещивания.

Возможно, что у изученных гибридов процесс гомеологичной конъюгации препятствовал возникновению у части гомеологов биполярной ориентации центромер. Унивалентные хромосомы, случайным образом разбросанные по периферии клетки в М1, в А1 оказывались вблизи формирующихся клеточных центров или активно сдвигались в эти области, сегрегируя по типу редукционного деления ранее хромосом бивалентных ассоциаций («забегания») (рис. 1 б). Включенные в метафазную пластинку унивалентные хромосомы в А1 делились эквационно и сегрегировали позже («отставания») основной массы хромосом (рис. 1 в). При этом трудно точно определить, к какому полюсу отойдут отставшие хро-

мосомы. Возможно, что отставшие хромосомы правильно разойдутся по «своим» полюсам и общее число хромосом в клетках диад нарушено не будет. Частота клеток с нарушениями в А1 была достаточно высокой и колебалась от 2,4 до 34,6% (табл. 1, 2).

Во втором делении наблюдали отставания и забегания хромосом, мосты (рис. 1 г, д). Часто в пределах одного пыльника встречались клетки, находящиеся в стадиях от диакинеза до тетрад, наблюдалась асинхронность деления (рис. 1 е, ж). Все это, в конце концов, приводит к возникновению дефектных тетрад (рис. 1 з), а также к частичному формированию стерильной пыльцы.

Частоты встречаемости клеток с нарушениями на различных этапах мейоза для всех изучаемых форм приведены в таблицах 1 и 2.

Все изучавшиеся формы по числу тетрад с нарушениями практически не отличаются друг от друга. Мейотичес-кий индекс колеблется от 99,6 до 100%. А, как известно, при мейотическом индексе выше 90% растение считается цитологически стабильным, т.е. оно воспроизводит в потомстве стабильное число хромосом [8].

Таким образом, нарушения, отмеченные нами на других этапах мейо-

Т а б л и ц а 1

Анализ мейоза и фертильности пыльцы гибридов, полученных от скрещивания

Сорт/ Линия Нарушения, % Стерильная пыльца, %

метафаза I анафаза I анафаза II тетрады

Л-25-1 6,3±0,60 4,2±0,02 10,4±1,40 3,0±0,20

Л-25-2 2,4±0,30 11,1±0,60 7,7±0,90 — 5,1 ±0,10

Л-25-3 1,9±0,70 13,7±3,10 19,0±5,60 0,1 ±0,04 0,6±0,10

Л-25-4 3,2±0,30 29,1±8,40 29,4±9,10 0,1±0,06 0,8±0,04

Л-25-5 2,2±0,20 6,3±1,50 9,2±3,40 — 5,2±0,10

Л-25-6 2,5±0,80 11,5±0,20 10,1±1,30 _ 2,9±0,02

Л-25-7 2,7±0,20 2,5±1,10 7,0±0,80 — 1, 8±0,09

Л-25-8 10,5±0,10 20,3±4,50 17,6±4,60 0,1±0,06 4,2±0,10

Л-25-9 8,5±1,20 11,4±3,90 12,6±4,00 0,4±0,04 2,3±0,09

Л-25-10 8,4±1,00 27,1±9,50 20,7±5,60 — 2,5±0,20

Л-25-11 1,4±0,09 10,1±1,10 13,1 ±2,90 0,1 ±0,02 2,9±0,20

Новосибирская 67 2,5±0,80 2,4±0,20 10,2±0,50 — 1,2±0,30

Таблица 2

Анализ мейоза и фертильности пыльцы гибридов, полученных от скрещивания

Сорт/ Линия Нарушения, % Стерильная пыльца, %

метафаза I анафаза I анафаза II тетрады

Л-6-1 2,8±0,50 34,6±12,20 31,1 ±12,40 3,9±0,02

Л-6-2 3,7±0,60 32,0±9,70 29,7±9,50 — 4,8±0,07

Л-6-3 1,5±0,50 26,1 ±9,80 11,2±2,70 — 4,2±0,04

Л-6-4 2,6±0,30 12,5±1,40 22,0±6,80 0,1 ±0,04 3,4±0,60

Л-6-5 5,0±1,00 23,1 ±2,20 25,8±8,80 — 5,0±0,02

Л-6-6 10,4±0,80 13,2±3,50 14,0±5,70 0,05±0,02 18,4±1,50

Л-6-7 1,8±0,20 20,2±4,90 25,4±10,10 — 1,0±0,09

Л-6-8 2,8±0,40 5,0±1,60 6,9±1,00 0,2±0,10 5,1 ±0,30

Л-6-9 2,2±0,80 23,2±6,40 12,7±2,80 0,2±0,04 4,1 ±0,09

Л-6-10 1,4±0,10 16,9±1,70 28,8±8,60 0,1 ±0,07 3,0±0,50

Л-6-11 8,6±0,80 8,5±2,20 13,9±4,70 — 6,5±0,30

Л-6-12 4,5±0,40 7,6±1,20 13,0±4,70 0,1 ±0,04 3,7±0,40

Л-6-13 7,2±0,40 20,3±2,60 21,8±6,90 — 7,2±0,09

Л-6-14 0,4±0,10 21,7±4,30 11,5±3,20 0,2±0,07 8,8±0,02

Л-6-15 8,9±0,02 9,2±2,20 7,6±2,50 — 15,6±0,80

Л-6-16 2,0±0,20 12,0±3,50 5,2±0,30 — 7,1 ±0,40

Л-6-17 2,6±0,60 9,3±0,30 12,5±1,70 — 5,9±0,10

Л-6-18 2,1 ±0,50 12,3±1,40 7,1 ±0,20 — 5,5±0,70

Л-6-19 2,0±0,40 14,0±4,50 15,1 ±4,60 — 21,0±0,40

Жница 4,1 ±0,50 11,4±3,50 12,3±3,10 — 1,1 ±0,20

за, не повлияли на частоту видимых нарушений на стадии тетрад.

Нарушения в правильности течения мейоза у гибридов и родительских форм отражаются и на их спермиогенезе. Одной из основных причин стерильности отдаленных гибридов является их цитогенетическая нестабильность [11]. Нарушения мейоза могут стать причиной снижения частоты функционально способных гамет [б]. Еще в 1926 г. Г. Тиш-лер, изучая цитологические причины стерильности, сделал вывод, что различные нарушения в распределении хромосом во время мейоза приводят к частичной или полной стерильности гамет [15]. В других случаях фертильная пыльца формируется, но ее количество не обеспечивает растрескивание пыльников [3, 5]. Ряд авторов считают, что на растрескивание пыльников оказывают влияние условия во время микроспорогенеза и в период цветения [3, 5, 10].

Однако не только низкая фертильность пыльцы и нерастрескиваемость

пыльников являются причинами низкой плодовитости отдаленных гибридов [2, 3]. Предполагается, что причиной низкой завязываемости является нарушение функционирования завязей, семяпочек и зародышевых мешков [7].

Исследования фертильности — стерильности пыльцы в момент цветения колоса показали наличие в пыльниках пыльцевых зерен следующих типов (рис. 2): 1 — фертильные: пыльцевые зерна с двумя спермиями и вегетативным ядром (А); 2 — стерильные: пыльцевые зерна с двумя ядрами (Б, В); пыльцевые зерна с одним ядром (Е); пыльцевые зерна без содержимого (пустые) (Г).

Из всех вышеназванных типов чаще всего наблюдались пыльцевые зерна первого типа, на втором месте — четвертого типа. Кроме того, нередко наблюдались пыльцевые зерна, в которых происходили процессы плазмолиза цитоплазмы (рис. 2 Б), а также пыльцевые зерна с недоразвитыми

и

и

"Щ %

-'* щ

Рис. 2. Типы пыльцевых зерен: А — с двумя спермиями и вегетативным ядром;

Б, В — с двумя ядрами; Г — без содержимого (пустые); Д — с недоразвитыми спермиями;

Е — с одним ядром

спермиями (рис. 2 Д). Наряду с хорошо выполненными пыльцевыми зернами встречались более или менее слабо выполненные. Дегенерация пыльцевых зерен происходит на всех фазах развития, особенно же часто на одно-и двухъядерной стадиях. Стерилизация пыльцы выражается в резком нарушении процесса вакуолизации в пыльцевых зернах, дегенерации и плазмолизе цитоплазмы и ядра, остановке митоза на двухъядерной стадии.

Процесс «стерилизации» гипотетически может зависеть от нарушений процессов как мейоза, так и микро-спорогенеза на любой стадии развития микроспор и пыльцевых зерен. Дегенерация пыльцы начинается после распада тетрад микроспор, что может объясняться нарушениями в питании пыльцевых зерен за счет недоразвития сосудистой системы тычиночных нитей [13].

Процент фертильной пыльцы у всех гибридов довольно высок (91,2-99,4%).

Большинство гибридов показывают фертильность на уровне родительских форм (95,6-98,9%). Относительно высокая фертильность у гибридов, по-видимому, связана с элиминацией дефектных клеток на разных этапах мейоза. В итоге можно предположить, что причиной аномалий мейоза является недостаточная гомологичность хромосом исходных форм [9].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что уровень фертильности Т. tгmopheevii (95,6%) ниже, чем у сортов мягкой пшеницы (98,8%), что также ранее было отмечено Н.И. Вавиловым [1]. Наблюдалось изменение процентного содержания фертильных пыльцевых зерен у ТгШсит НшорНее-гт по годам. В 2007 г. оно составляло 92,1, а в 2008 г. — 99,2% (табл. 3).

Линии Л-6-6 (81,6%), Л-6-15 (84,4%) и Л-6-19 (79,0%), полученные от скрещивания (Жница х ТгШсит Нторкее-vii) х Жница отмечаются пониженным содержанием фертильных пыльцевых

Таблица 3

Процентное содержание фертильных и стерильных пыльцевых зерен в родительских сортах

Линия, сорт 2007 г. 2008 г. В среднем за 2007-2008 гг.

пыльца

фертильная стерильная фертильная стерильная фертильная стерильная

количе- ство % коли- чество % коли- чество % коли- чество % коли- чество % количе- ство %

Жница 4925 98,5 75 1,5 4963 99,3 37 0,7 4944 98,9 56 1,1

Новосибирская 67 4907 98,1 93 1,9 4975 99,5 25 0,5 4941 98,8 59 1,2

ТМторЬее^іі 4605 92,1 395 7,9 4960 99,2 40 0,8 4782 95,6 218 4,4

зерен. Причем эта закономерность наблюдается в оба года исследований.

Линии, полученные от скрещивания (Новосибирская 67 х ТгШсит timopheevn) х Новосибирская 67, характеризуются стабильностью и показывают высокий уровень фертильности (94,8-99,4%). Данный показатель внутри комбинации варьирует незначительно.

Анализ данных показал, что процент фертильной пыльцы у линий, полученных от скрещивания (Новосибирская 67 х ТгШсит Нторкееип) х Новосибирская 67 выше, чем у линий от скрещивания (Жница х ТгШсит ИторНееуіі) х Жница.

Линия Л-25-10, полученная от скрещивания (Новосибирская 67 х

ТгШсит ИторНееьИ) х Новосибирская 67, хотя и содержит высокое число зерен в колосе (30), характеризуется низкой массой зерна (36,1 г). Остальные линии в данной комбинации находятся на одном уровне или превосходят родительский сорт по всем элементам структуры урожая (табл.4).

Линии Л-6-6 и Л-6-15, полученные от скрещивания (Жница х ТгШсит ИторНееоп) х Жница, которые отличались пониженной фертильностью по таким показателям, как число продуктивных колосков в колосе и число зерен в колосе, уступают родительскому сорту, но по массе 1000 зерен значительно превосходят его (табл. 5).

При сравнении двух изучаемых комбинаций между собой можно заметить,

Таблица 4

Структурный анализ гибридов, полученных от скрещивания (Новосибирская 67 х ТгШсит йторИееуН) х Новосибирская 67

Сорт/линия Высота растений, см Длина колоса, см Число продуктивных колосков в колосе Число зерен в колосе Вес 1000 зерен

Л-25-1 75,0 7,0 13 29 38,5

Л-25-2 76,5 7,0 13 29 37,3

Л-25-3 76,5 7,0 14 28 39,1

Л-25-4 76,5 7,5 13 31 39,1

Л-25-5 77,5 7,5 13 30 40,0

Л-25-6 78,5 7,0 12 24 37,7

Л-25-7 79,5 7,0 12 27 38,4

Л-25-8 80,5 7,0 11 24 36,6

Л-25-9 77,0 7,0 13 25 37,2

Л-25-10 76,0 7,0 12 30 36,1

Л-25-11 73,5 7,0 12 27 39,1

Новосибирская 67 79,5 6,5 13 24 36,5

Структурный анализ гибридов, полученных от скрещивания

Сорт/линия Высота растений, см Длина колоса, см Число продуктивных колосков в колосе Число зерен в колосе Масса 1000 зерен, г

Л-6-1 81,0 7,5 13 30 40,2

Л-6-2 79,5 8,0 12 26 40,3

Л-6-3 74,0 8,5 12 29 44,0

Л-6-4 79,0 8,0 12 31 42,7

Л-6-5 73,0 8,0 13 30 41,0

Л-6-6 79,0 8,5 11 23 45,8

Л-6-7 80,0 9,0 13 33 43,0

Л-6-8 76,0 8,5 13 33 41,9

Л-6-9 74,5 7,5 12 26 44,6

Л-6-10 83,5 8,5 12 27 41,7

Л-6-11 83,0 8,5 12 28 40,3

Л-6-12 77,5 8,5 13 32 41,9

Л-6-13 83,0 8,0 12 28 40,0

Л-6-14 77,0 7,5 11 25 42,5

Л-6-15 69,5 7,5 11 22 43,9

Л-6-16 75,5 9,0 13 28 41,5

Л-6-17 78,5 8,5 12 25 43,1

Л-6-18 71,5 8,0 13 31 39,8

Л-6-19 73,0 8,0 12 26 40,9

Жница 75,0 7,0 12 25 40,5

что линии, полученные от скрещивания (Новосибирская 67 х ТгШсит timopheevii) х Новосибирская 67, по числу зерен в колосе (25) и массе 1000 зерен (38,1 г) уступают линиям, полученным от скрещивания (Жница х ТпЫсит timopheevii) х Жница (28 и 42,1 г соответственно).

На основании данного исследования мы пришли к заключению, что хотя у изученных гибридов обнаружены нарушения в правильности течения микроспорогенеза и спермиогенеза,

процент нормальных микроспор и пыльцевых зерен у них достаточно высок для протекания нормального опыления и оплодотворения. Таким образом, уровень плодовитости отдаленных гибридов определяется не нарушениями микроспорогенеза, а другими факторами. Возможно, частичная стерильность гаметофитов, нестабильность процесса оплодотворения и аномалии в эндоспермогенезе вызваны межгеномной и ядерно-цитоплазматической несбалансированностью.

Библиографический список

1. Вавилов Н.И. Сб. Теоретические основы селекции растений, 1935. Т.2 . С. 107.

2 Колев Д., Камышов Н. Цитологические исследования пшенично-ржаных амфи-диплоидов // Цитология и генетика, 1970. №1. С. 3-10.

3. Любимова В.Ф. Механизм включения отдельных геномов пырея в геномный комплекс твердой пшеницы // Генетика, 1991. №6. С. 1020-1033.

4. Люсиков О.М., Белька Н.Б., Щетъко И.С., Гордей И.А. Создание ржано-пшеничных амфидиплоидов с цитоплазмой ржи — секалотритикум (КИЛАВВ, 2п =42): особенности мейоза у ржано-тритикальных гибридов Е1 (ККАЛВИ, 5х=35) // Генетика, 2005. №7. С. 902-909.

5. Мустафаев И.Д., Пиралов Г.Р. Биологические особенности пшенично-эгилопс-ных и пшенично-ржаных гибридов / / Сельскохозяйственная биология, 1977. №2. С. 194-196.

6. Першина Л.А.,Шумный В.К. -Белова Л.И., Нумерова О.М. Ячменно-ржаные гибриды и их потомство от первого возвратного скрещивания с рожью / / Цитология и генетика, 1986. №2. С. 125-130.

7. Поддубная-Арнолъди В.А. Микроспорогенез и спермиогенез у ржано-пырей-ных гибридов//Отдаленная гибридизация растений. Зерновые и зернобобовые культуры. М., 1970. С. 259-267.

8. Пухалъский В.А.,Соловъев А.А.Бадаева Е.Д., Юрцев В.Н. Практикум по цитологии и цитогенетике растений. М.: КолосС, 2007.

9. Серюкова Е.Г., Шаманин В.П., Леонтьев С.И., Серюков Г.М. Изучение особенностей мейоза у яровых пшенично-пырейных гибридов / / Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур, 2003. С. 61-62.

10. Шив Чаран Шарма. Совместимость геномов некоторых видов тетраплоидной и гексаплоидной пшеницы с цитоплазмой Triticum timopheevii: Автореф. канд. дисс. биол. наук. М., 1970.

11. Ячевская ГЛ., Наумов А.А. Использование метода отдаленной гибридизации в селекции пшеницы. М., 1990.

12. Aragon-Alkaide L, Reader S., Miller T, Moore G. Centromeric behaviour in wheat with high and low homoeologous chromosomal pairing // Chromosoma, 1997. V/106/ P. 327-333.

13. Joppa L.R, Mc Neal F.H., Welsh J.R.. Pollen and anthens development in cytoplasmic male sterile wheat T.aestivum L. // Crop Sci., 1966. V.6. P. 296-297.

14. Vega J.M., Feldman M. Effect of the Pairing Gene Ph1 on centromere misdivision in common wheat // Genetics, 1998. V. 148. P. 1285-1294.

15. Tischler G. Investigation concerning the Causation of gametic sterility // Memoirs of the Horticultural Soc. of New-York 3, 1927.

Рецензент — д. б. н. А.А. Соловьев

SUMMARY

Both Meiosis and pollen fertility analyses have been carried out in hybrids of soft whet (Triticum aestivum L.) and Timopheev wheat (Triticum timopheevii Zhuk.). Abnormalities in microsporogenesis and pollen fertility in interspecific hybrids are found. The type of these abnormalities and frequency of their emergence in various hybrid combinations have been described. It has been inferred from this that the quantity of normal pollen grains in test saples is sufficient for the mormal process of pollimation and ferilizarion.

Key words: remote hybrids, microsporogenesis, pollen fertility, Timopheev wheat.