ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ
NUTRITIVE MEDIUM FOR YEAST CULTIVATION

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области микробиологической диагностики, а в частности к культивированию и идентификации клинически релевантных дрожжей, а более конкретно, дрожжей различных видов, принадлежащих к роду Candida.
Предшествующий уровень техники
В патенте США № 4144133 описано использование желчи быка, очищенного сапонина и субстрата для детектирования фермента фенолоксидазы, которые облегчают идентификацию патогенных грибов, а в частности Candida albicans и Cryptococcus neoformans. Однако этот метод не позволяет культивировать, идентифицировать и дифференцировать все клинически или экологически релевантные виды Candida.
В патенте Японии JP2003310298, Komatsu Osamu, описан метод дифференциации Candida albicans и Candida tropicalis от других грибов с использованием субстрата X-glc (Х-галактозидазы). Специфичность этого субстрата не дает гарантии надежной дифференциации всех клинически или экологически релевантных видов Candida.
В патенте 4030980, Beckford, O. A. и сотрудниками был описан аппарат для выделения и идентификации дрожжей клинического происхождения с использованием нескольких биохимических тестов и культуральных сред для идентификации видов Candida среди других микроорганизмов. Этот аппарат и способ его применения имеют следующие основные недостатки, а именно сложность изготовления такого устройства, сложность посева этих микроорганизмов на каждую чашку и необходимость выделения колоний, а также другие недостатки. Наиболее серьезным недостатком является то, что чашки для биохимических тестов не содержат достаточного количества соответствующих питательных веществ для роста микроорганизмов Candida, тогда как идентификацию осуществляют путем наблюдения множества биохимических реакций, а поэтому атипическая реакция в одной из таких чашек может приводить к ошибочной идентификации.
В патенте Великобритании GB 730763 описана культуральная среда для выделения и идентификации микроорганизмов рода Candida, рецептура которой включает неорганическую соль висмута и сульфит натрия в комбинации с отверждающим агентом. Эта среда включает растворимый углевод, пируват натрия, глицин, органический фосфат и дрожжевой экстракт. Такая культуральная среда имеет ряд технологических недостатков, а именно:
- она не обеспечивает снабжение микроорганизмов всеми питательными веществами, необходимыми для обильного и быстрого роста всех релевантных видов Candida, поскольку она содержит всего лишь один источник витаминов, а в частности дрожжевой экстракт, в котором содержание минералов, а в частности магния, является недостаточным для эффективной активации сложной ферментной системы этих микроорганизмов;
- кроме того, эта среда содержит лишь один источник энергии, а именно пируват натрия, который является недостаточным для обеспечения равномерного, быстрого и обильного роста различных микроорганизмов Candida;
- эта среда не позволяет дифференцировать различные виды микроорганизмов Candida друг от друга;
- присутствие одного лишь глицина не позволяет обеспечить доставку достаточного количества азота, необходимого для синтеза аминокислот, белков и ферментов, требуемых для быстрого и обильного роста микроорганизмов вида Candida.
Jesús Ruiz-Aragón и сотрудниками (Assessment of a new CHROMOagar Candida medium for presumptive identification of yeasts; Revista de Diagnystico Biolуgico. V.52(1), 2003) было проведено сравнение новой среды CHROM M со средами CHROM OR и CHROM R (Beckton Dickinson). В таблице 1 указанной публикации показано, что среда CHROM OR не позволяет дифференцировать релевантные виды Candida друг от друга. В случае среды CHROM R не все релевантные виды могут быть в достаточной степени дифференцированы, а в среде CHROM M микроорганизмы нескольких видов обнаруживали одинаковую или похожую окраску. Авторы данной публикации указывают, что результаты могут быть более надежными только после 48-часового инкубирования. Кроме того, они пришли к выводу, что среда CHROM M не является достаточно эффективной для идентификации дрожжей различных видов, поскольку она является менее чувствительной, требует большего времени инкубирования для образования колоний и не позволяет осуществлять дифференциацию некоторых клинически релевантных видов, таких как Candida tropicalis и Candida parapsilosis.
В патенте Соединенных Штатов № 5449612 описан метод идентификации штаммов Candida albicans и Torupsis glabrata с использованием хромогенных субстратов, состоящих из моноаминокислот или пептидов, без выделения идентифицируемого штамма. В состав такой среды входит циклогексимид, ингибирующий рост некоторых видов Candida, кроме Candida albicans, то есть компонент, который ограничивает диагностические возможности этого варианта среды. Добавление антибактериальных веществ, таких как гентамицин, снижает стабильность среды после ее приготовления, а поэтому такая среда не может храниться в течение длительного периода времени. Кроме того, развитию хромогенных реакций также препятствует хлорамфеникол.
Кроме того, питательная основа, используемая в настоящем изобретении в качестве источников азота (азотистые основания дрожжей, неопептон, протеозо-пептон, бакто-пептон и дрожжевой экстракт), взятые отдельно или в комбинации друг с другом, не могут обеспечивать поступления достаточного количества витаминов и минералов, макро- и микроэлементов, необходимых для начального роста Candida.
В патенте Соединенных Штатов № 5534415 описана селективная дифференциальная культуральная среда для роста и детектирования Candida albicans. Главным элементом культуральной среды является питательная основа, подвергающаяся метаболизму дрожжами, то есть хромогенный или флуорогенный субстрат, который может гидролизоваться ферментом гексозаминидазой, присутствующей в Candida albicans, и, по меньшей мере, одно соединение, содержащее гексозаминидазу, которое активирует этот фермент. Компонентами, действующими как источник азота для данной среды, являются пептоны, содержащиеся в количестве от 0,01 до 40 г/л, такие как, например, мясной пептон, соевый пептон и пептонные смеси, а также дрожжевой экстракт, содержащийся в количестве от 0,01 до 40 г/л. Эти азотные соединения, сами по себе, не обеспечивают поступление всех питательных элементов и витаминов, необходимых для обильного начального роста микроорганизмов Candida; и, кроме того, они не гарантируют развитие явно выраженных хромогенных реакций с интенсивным окрашиванием в первые часы роста микроорганизмов Candida.
Включение в препарат источников углерода в концентрациях, указанных авторами, например, таких как глюкоза, ацетат, лактат, аминобутират и т.п. или их смесей, может быть осуществлено только в комбинации с хромогенным субстратом конкретного типа, поскольку он должен конкурировать с ферментативной активностью Candida и в свою очередь должен ограничивать возможность включения других хромогенных или флуорогенных субстратов, используемых для идентификации или дифференциации других видов Candida. Таким источником углерода является глюкоза, которая должна подавлять или ослаблять глюкозидазную активность. В состав данной среды входят такие буферы, как фосфаты, трис, HEPES и цитраты в количестве, достаточном для доведения рН до значения, близкого к 7, что благоприятствует идентификации только микроорганизмов вида Candida albicans, но не других видов Candida, представляющих интерес с точки зрения санитарии и экологии.
В среду могут быть добавлены и другие активаторы, такие как соли магния, марганца и/или кальция в количествах, варьирующихся в пределах от 0 до 10 ммоль/л.
В состав среды входят усилители клеточной проницаемости, такие как соли желчных кислот, дезоксихолат натрия, полиоксиэтиленгликоль, эфиры алкилфенола, сложные эфиры сорбитана или жирных кислот в концентрации, составляющей от 0 до 5 г/л. Некоторые из этих веществ, например соли желчных кислот, в высокой степени ингибируют рост микроорганизмов вида Candida, даже Candida albicans.
В данную среду были также добавлены ингибиторы грамположительных и грамотрицательных бактерий, такие как гентамицин, пенициллин и т.п. Большинство из этих веществ не обладают термостабильностью и должны быть быстро приготовлены и использованы. Кроме того, приготовленные среды, готовые для использования в чашках Петри, должны храниться в холодильнике, но не слишком долго, например в течение 2-30 дней.
В соответствии с представленным описанием можно использовать теллурит, молибдат или их смеси, которые также в высокой степени ингибируют рост микроорганизмов Candida.
Тем не менее, следует отметить, что другими явными недостатками различных сред, описанных в вышеупомянутом изобретении, являются те, что даже после 24-часового инкубирования не все колонии Candida albicans обнаруживают яркую окраску. Для развития интенсивной окраски большинству колоний Candida albicans требуется более 48 часов, а другие виды Candida вообще не дают окраску (таблицы II и III оригинала).
Некоторые авторы сообщали об использовании растительных экстрактов в различных целях для повышения роста или улучшения дифференциации микроорганизмов вида Candida.
Zia U. Khan и сотрудниками (Tobacco Agar, a New Medium for Differentiating Candida dubliniensis from Candida albicans, J. Clin. Microb., v. 42(10):4796-4798, 2004) был использован агар из семян подсолнечника для культивирования Candida dubliniensis. Этими авторами также было описано использование в культуральной среде экстракта из листьев табака и никотина. Но ни один из используемых экстрактов не может обеспечить поступления достаточного количества соответствующих витаминов и сахаров для роста релевантных микроорганизмов вида Candida.
Ни одна из вышеуказанных сред не позволят осуществлять соответствующую дифференциацию всех видов. И наконец, такие дифференциация и идентификация основаны не только на различии в окраске, но также и на морфолигических свойствах этих колоний, а именно на образовании хламидоспор, а поэтому средний специалист в данной области нуждается в интерпретации полученных результатов.
Dostál и сотрудниками, 2003, было описано использование культуральной среды, содержащей коровий гемоглобин, дрожжевой экстракт и бромфеноловый синий для детектирования протеолитической активности Candida. (Dostál J., Hamal P., Pavlicková L., Soucek M., Ruml T., Pichova I., Huskova-H O. Simple Method for Screening Candida Species Isolates for the Presence of Secreted Proteinases: A Tool for the Prediction of Successful Inhibitory Treatment. J. Clin. Microbiol. 2003, Feb., 41 (2):712-716.) Основным недостатком такой среды является то, что гемоглобин позволяет обнаруживать только аспарто-протеазную активность, наблюдающуюся у всех видов, а поэтому он не может быть использован для дифференциации микроорганизмов друг от друга. Кроме того, гемоглобин нуждается в фильтрации, и добавлять его следует в асептических условиях, что затрудняет проведение данной процедуры. К другим недостатками можно отнести необходимость растворения индикатора в этаноле; крайне низкий pH среды (4-4,5), который не является оптимальным для стимуляции роста дрожжей; необходимость инкубирования при температуре 30°С (также не являющейся оптимальной) и продолжительность детектирования протеолитической активности, которая может занимать от 5 до 7 дней.
Bramono K. и сотрудниками, 2006, были проведены исследования различных ферментативных активностей микроорганизмов Candida, а в частности протеиназной, липазной и α-глюкозидазной активности в минимальных средах, дефицитных по питательным элементам. (Bramono K., Yamazaki M., Tsuboi R. and Ogawa H. Comparison of Proteinase, Lipase and α-Glucosidase Activities from the Clinical Isolates of Candida Species. Jpn. J. Infect. Dis., v. 59, 73-76, 2006.) Этими авторами была обнаружена значительная внеклеточная протеиназная активность в Candida albicans, Candida parapsilosis и Candida tropicalis. Однако такая активность была связана с гидролизом белка бычьей сыворотки (альбумина), который является источником азота, необходимого для роста микроорганизмов, и не играет какой-либо роли как средство для идентификации и дифференциации, поскольку эта активность также присутствует и у других видов, хотя и в меньшей степени. Добавление альбумина в качестве маркера протеолитической активности приводит к снижению стабильности среды. Липолитическая активность была индуцирована с использованием Tween 80, который является единственным источником углерода, используемым в этой среде. Такая активность была значительно выше у Candida tropicalis, Candida albicans и Candida parapsilosis.
α-Глюкозидазная активность была протестирована путем добавления 0,6% мальтозы в минимальную среду и использования п-нитрофенил-α-D-глюкопиранозида. Оптическую плотность считывали на спекрофотометре. Полученные результаты подтвердили, что Candida tropicalis, Candida albicans и Candida parapsilosis обладают наивысшей ферментативной активностью в жидкой минимальной среде. Такую реакцию невозможно обнаружить невооруженным глазом, и для считывания и интерпретации результатов необходимо использовать лабораторное оборудование.
Целью вышеупомянутой работы было проведение базовых исследований ферментативной активности Candida в условиях низкого содержания питательных элементов, но при этом не преследовалось каких-либо целей идентификации или дифференциации видов микроорганизмов.
Asmaa Al Mosaid и сотрудниками (Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on Staib Agar and Caffeic Citrate Agar, J. Clin. Microb., v. 39(1), 323-327, 2001) была описана идентификация патогенных Candida dubliniensis в двух культуральных средах. В одной из этих сред использовали водный экстракт семян Guizotia abyssinica с добавлением глюкозы и креатинина. В другой среде использовали дрожжевой экстракт, глюкозу, сульфат аммония, цитрат железа(III) и кофеиновую кислоту. Ни одна из вышеупомянутых сред не может обеспечивать начальный рост Candida, что обусловлено, главным образом, тем фактом, что эти среды не содержат достаточного количества витаминов, азотсодержащих веществ и углеводов, необходимых для стимуляции быстрого и обильного роста микроорганизмов всех видов Candida.
Тот же автор, в своей работе “Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on Pal's Agar” (J. Clin. Microb., v. 41(10): 4787-4789, 2003) проводил сравнение среды, в которой использовался агар Пэлса (Pal's), полученный из обессоленного экстракта семян подсолнечника, с агаром Стайба (Staib). В обоих случаях идентификация и дифференциация Candida были достигнуты после инкубирования в течение 48-72 часов. Эта работа позволяет сделать выводы, аналогичные выводам, сделанным ранее в отношении недостатков сравниваемых сред.
Venitia M. C. и сотрудниками (New Chromogenic Agar Medium for the Identification of Candida spp. J. of Virology, v.68(7): 3622-3627, 2002) была описана новая культуральная среда для идентификации видов Candida с использованием декстрозного агара Сабуро, в который был добавлен хромогенный субстрат для детектирования глюкозаминидазной активности Candida albicans и Candida dubliniensis. Эту среду сравнивали со средой, содержащей агар «Agar Candida ID» (BioMérieux) и агар «CHROMagar Candida» (CHROMOagar Company Ltd.). Результаты такого сравнения показали, что агар «Candida ID Agar» не позволяет дифференцировать штаммы Candida tropicalis от штаммов Candida kefyr. Этот агар также не позволяет дифферецировать Candida guilliermondii от первых двух видов. Хромогенная агаровая среда позволяла идентифицировать только Candida albicans.
Эта новая среда является дефицитной по витаминам и микроэлементам, необходимым для обильного роста микроорганизмов видов Candida. Глюкоза является единственным источником углеводов и энергии в данной среде; а грибной пептон, сам по себе, не обеспечивает поступление других питательных элементов, необходимых для культивирования большинства видов.
Аналогичным образом, культуральная среда CLED, питательный агар, агар LAB Lemco, агар для подсчета колоний в стандартных чашках и дрожжевой экстракт с агаром не дают удовлетворительных результатов по причинам, указанным выше.
Основным недостатком всех культуральных сред, исследуемых в вышеупомянутой работе, включая новую среду, является низкая стабильность их готовых форм в чашках Петри, которая сохраняется только в течение максимум 6 недель, что обусловлено, главным образом, лабильной природой некоторых используемых субстратов и реагентов. В этой связи, наибольший интерес представляет агар Candida ID Agar, который необходимо инкубировать в темноте в соответствии с инструкциями производителя.
И наконец, следует отметить, что все агары, а именно CDA Agar, Candida ID Agar и Candida CHROMOagar, не позволяют эффективно дифференцировать штаммы и/или виды Candida друг от друга. В частности, виды Candida albicans варьируются по своей окраске, от зеленого до пурпурно-синего и бирюзово-синего, что вызывает затруднения в идентификации Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaneae, Candida parapsilosis, Candida pelliculosa, Candida rugosa и Candida tropicalis. В агаровой среде Candida ID Agar, некоторые виды Candida трудно отличить от других видов дрожжей из-за их окраски.
Введение нового хромогенного субстрата в агар из кукурузной муки, в картофельный агар с декстрозой и в рисовый агар не облегчало идентификацию или дифференциацию видов Candida. Это позволяет сделать вывод, что ни один из источников растительного происхождения, традиционно используемых в этих средах, не стимулирует вступление метаболитов в различные метаболические циклы тестируемых видов Candida и что ни одна из хромогенных или флуорогенных реакций, используемых в настоящее время в комбинации с такими питательными элементами, не облегчает выделение, дифференциацию или идентификацию микроорганизмов любых клинически и экологически релевантных видов Candida.
Описание сущности изобретения
Объектом настоящего изобретения является композиция культуральной среды, подходящая для селективного выделения, дифференциации и одновременной идентификации грибов различных видов, а в частности рода Candida.
Новизна настоящего изобретения состоит в том, что состав (композиция) питательной среды включает смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта в количестве, составляющем от 20 до 30 г/л. Указанная смесь на 50-67% состоит из экстракта сладкого картофеля и на 33-50% - из дрожжевого экстракта или на 33-50% из томатного экстракта.
В настоящее время отсутствуют какие-либо сообщения об использовании экстракта сладкого картофеля в культурах микроорганизмов видов Candida, который, как было неожиданно обнаружено, дает благоприятный эффект при его включении в культуральную среду в качестве питательной основы.
В другом своем новом аспекте настоящее изобретение включает: объединение смеси экстракта сладкого картофеля и дрожжевого или томатного экстракта с другими источниками азота, а предпочтительно, с глицином в количестве 0 до 3 г/л, с бактериальным пептоном в количестве от 0 до 5 г/л и с продуктом ферментативного гидролиза казеина в количестве от 0 до 5 г/л, где общее количество этих источников азота в питательной среде составляет в пределах от 0 до 13 г/л; и получение новой комбинации источников азота, ранее не описанной в научной литературе.
Комбинация вышеуказанных питательных элементов с ингибиторами грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, присутствующими в питательной среде, отличается от всех других комбинаций, описанных в литературе, относящейся к культивированию микроорганизмов Candida. Указанные ингибиторы, описанные в прототипе и являющиеся составной частью объекта настоящего изобретения, представлены в количествах от 0 до 10 г/л и, предпочтительно, выбраны из налидиксовой кислоты, взятой количестве от 0 до 0,05 г/л, экстракта чайной розы в количестве от 0 до 0,05 г/л, дезоксихолата натрия в количестве от 0 до 0,5 г/л, сульфита натрия в количестве от 0 до 3 г/л, цитрата аммоний-висмута в количестве от 0 до 5 г/л и хлорида тетрафенилтетразолия в количестве от 0 до 0,05 г/л.
Эта комбинация также является новой, так как стимуляторы микробного роста, выделенные из сладкого картофеля, никогда ранее не использовались в комбинации с вышеупомянутыми ингибиторами, и такое ингибирование ранее не могло быть достигнуто без использования лабильных веществ, затрудняющих рост Candida.
В этой композиции, впервые в культуральную среду, в которой присутствуют микроорганизмы Candida, добавляют налидиксовую кислоту в количестве от 0 до 0,05 г/л в целях ингибирования роста грамотрицательных бактерий. Ранее это не могло быть осуществлено из-за того, что указанный антибиотик оказывает ингибирующее действие на грибы этого вида. Однако такое добавление стало возможным благодаря его использованию в комбинации с магниевой солью (сульфатом магния), которая, как было неожиданно обнаружено, подавляет ингибирующее действие налидиксовой кислоты на Candida.
Другим новым аспектом настоящего изобретения является комбинация веществ, позволяющая осуществлять идентификацию различных видов Candida по изменению их окраски и/или интенсивности флуоресцении, появлению зон и морфологии колоний, а также по изменению свойств среды, содержащей питательные элементы, поступающие из экстракта сладкого картофеля.
Эти вещества, объединяемые со смесью экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта, выбирают из хромогенных и флуорогенных субстратов, используемых для детектирования ферментативной активности.
Впервые была получена комбинация, состоящая из группы хромогенных и/или флуорогенных субстратов и маркеров протеолитической активности, предназначенных для детектирования ферментативной активности микроорганизмов рода Candida, проводимого одновременно с селективным выделением этих микроорганизмов из клинических образцов или образцов окружающей среды, в присутствии активаторов этих реакций, об использовании которых в этих целях ранее не сообщалось, например, таких как трегалоза или мальтоза в количествах от 0 до 10 г/л.
Впервые детектирование α-глюкозидазной активности в данной композиции агаровой культуральной среды осуществляли по хромогенным или флуорогенным реакциям в целях дифференциации или идентификации видов Candida, а в частности Candida albicans, Candida tropicalis и Candida parapsilosis. Для этой цели был введен метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозид в количестве до 0,1 г/л.
Аналогичным образом, в предшествующих работах не сообщалось о включении в среду для культивирования дрожжей, а в частности дрожжей рода Candida, хромогенных и/или флуорогенных субстратов, используемых в целях идентификации фосфолипазной активности таких видов, как Candida albicans, Candida tropicalis и Candida parapsilosis. В случае настоящего изобретения аммониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата была включена в количествах, составляющих до 0,1 г/л.
Впервые в результате такого объединения группы субстратов была достигнута неожиданно высокая эффективность дифференциации всех клинически релевантных видов Candida. В частности, Candida albicans идентифицировали по его активностям, а именно по фосфолипазной активности (определенной с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата), α-глюкозидазной активности (определенной с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида), гексозаминидазной активности (определенной с использованием метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактопиранозида и 5-бром-4-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкозаминида) и L-пролин-аминопептидазной активности (определенной с использованием гидробромида L-пролин-7-амидо-4-метил-кумарина и пара-нитроанилина L-пролина); Candida tropicalis идентифицировали по его фосфолипазной активности (определенной с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата) и α- и β-глюкозидазной активности (определенной с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида, 5-бром-4-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида и 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида); Candida kefyr идентифицировали по его β-глюкозидазной активности (определенной с использованием 5-бром-4-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида и 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида), а также по его протеолитической активности; Candida parapsilosis идентифицировали по его фосфолипазной активности (определенной с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата), α-глюкозидазной активности (определенной с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида) и L-пролин-аминопептидазной активности (определенной с использованием гидробромида L-пролин-7-амидо-4-метил-кумарина и L-пролин-паранитроанилина); Candida krusei и Candida glabrata идентифицировали по их белой окраске (мутной и блестящей соответственно), появляющейся в результате отсутствия в микроорганизмах этих двух видов ферментативной активности.
Другим новым элементом настоящего изобретения является включение маркера протеолитической активности, которая наблюдается только в Candida kefyr. В этом случае неожиданно было обнаружено, что казеин сухого сепарированного молока в количестве до 10 г/л гидролизуется только этим микроорганизмом, но не микроорганизмами других видов.
Неожиданно было обнаружено, что включение в данную композицию мальтозы или трегалозы в присутствии других источников углерода приводит к заметному увеличению интенсивности хромогенной реакции (появлению окраски) колоний. Этот эффект противоречит общепринятой практике промышленного продуцирования колоний, обычно осуществляемого с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов в среде, в которую, по существу, не добавляют сахара или других источников углерода, аналогичных, по своей природе, субстратам, во избежание резкого снижения рН, а значит, и снижения интенсивности хромогенной реакции, или во избежание снижения интенсивности окраски колоний, вызываемого другими конкурирующими механизмами, посредством которых эти микроорганизмы потребляют сахар в наиболее доступной форме, а поэтому в меньшей степени подвергают метаболизму хромогенный субстрат.
Аналогичным образом, уникальной является комбинация группы хромогенных и/или флуорогенных субстратов с другими индикаторами или красителями, источниками углерода и органическими и неорганическими солями, присутствующими в питательной среде в количестве от 0 до 26 г/л, такими как глицерин в количестве от 0 до 25 мл/л, бромкрезоловый пурпурный в количестве от 0 до 0,04 г/л, бромтимоловый синий в количестве от 0 до 0,08 г/л и сульфат магния в количестве от 0 до 0,5 г/л.
Комбинация pH-регулирующих веществ в количестве от 0 до 5 г/л, при котором некоторые из них действуют как активаторы ферментов, например, такие как фосфаты, а предпочтительно, монофосфат калия (от 0 до 1 г/л) и дифосфат калия (от 0 до 4 г/л), при рН среды, регулируемым путем добавления буферов, предпочтительно, 3-морфолинопропансульфоновой кислоты (3-морфолин-пропансульфоновой кислоты), также известной, как MOPS (от 0 до 0,5 г/л), становится уникальной в результате комбинированного действия этих компонентов вместе с микро- и макроэлементами, присутствующими в экстракте сладкого картофеля, которые, как было неожиданно обнаружено, функционируют как буферы и поддерживают рН в пределах, благоприятных для всех видов Candida.
Таким образом, неожиданно было обнаружено, что при использовании композиции, описанной в настоящем изобретении, наблюдается усиление стимуляции роста всех видов Candida (в среднем на 113%), по сравнению с традиционными средами, даже если такие среды приготавливают без использования каких-либо ингибиторов, например декстрозный агар Сабуро, который представляет собой превосходную среду, обычно используемую для стимуляции роста грибов.
Такое открытие не является очевидным и не может быть сделано, исходя из предшествующих работ, в которых утверждается, что ингибиторы бактерий, вообще говоря, ингибируют до некоторой степени рост релевантных видов микробов. Таким образом, в общих чертах, при вычислении коэффициентов восстановления микроорганизмов на селективных средах и сравнении таких коэффициентов с коэффициентами, полученными на специальных средах в отсутствие ингибиторов, было обнаружено, что с использованием указанных селективных сред число колоний снижается и их морфология ухудшается.
Питательная среда также включает агар в количестве от 13 до 15 г/л, используемый для обеспечения развития морфологических свойств, которые являются типичными для колоний различных видов Candida, а также для наблюдения хромогенных или биохимических реакций в среде, таких как образование прозрачных зон.
Такая уникальная питательная среда также состоит из дистиллированной или деионизованной воды, в которой растворены другие твердые или жидкие компоненты в количествах от 35 до 50 г/л. pH корректируют до значений в предалах от 6,0 до 6,8.
Впервые с помощью такой питательной среды клинически или экологически релевантные виды Candida могут быть одновременно и селективно выделены, идентифицированы и дифференцированы за такое короткое время, как 24-48 часов.
При этом следует подчеркнуть, что питательная среда с добавлением указанных субстратов позволяет легко создать новую комбинацию морофлогических и биохимических средств для идентификации видов Candida.
Главным признаком новизны и главным преимуществом этой композиции для выделения и дифференциации видов грибов является то, что она позволяет одновременно выделять и идентифицировать значительно большее число видов Candida, чем это сообщалось в предшествующих работах, а в частности, впервые может быть идентифицировано 94% клинически релевантных видов Candida, а именно Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr и Candida parapsilosis, помимо Candida krusei.
Новая питательная среда имеет следующие преимущества:
- эта питательная среда обеспечивает обильный рост различных клинически или экологически релевантных видов Candida, поскольку она содержит питательные вещества широкого ряда, поступающие из экстракта сладкого картофеля и из объединенного с ним дрожжевого экстракта или томатного экстракта. Такой обильный рост может наблюдаться даже после инкубирования в течение лишь 24 часов, при этом для наблюдения характерных морфологических свойств этих колоний нет необходимости ждать более чем 48 или 76 часов;
- комбинация экстракта сладкого картофеля с дрожжевым экстрактом или с томатным экстрактом обеспечивает присутствие подходящих уровней макро- и микроэлементов, витаминов, а в частности, комплекса С и В, а также других водорастворимых экстрагируемых веществ, активирующих метаболические пути различных видов Candida и их специфической ферментативной активности, которая в свою очередь стимулирует стандартные хромогенные и флуорогенные реакции и реакции разложения субстрата в течение максимум 24-36 часов. Такая активация позволяет включать несколько биохимических маркеров в конечную композицию среды в целях осуществления одновременной идентификации различных видов Candida, проводимой в одну стадию;
- особым преимуществом настоящего изобретения является восстановление релевантных видов Candida, в среднем, более чем на 110%, по сравнению с культуральными средами, не содержащими ингибиторов и специально разработанными для культивирования грибов;
- эта питательная среда может быть легко приготовлена, не требует проведения сложных процедур добавления и применения специальной техники инокуляции;
- идентификацию различных видов и штаммов Candida осуществляют визуально с учетом различий в окраске колоний и культуральной среды, образования прозрачных зон вокруг этих колоний и, наконец, основных морфологический признаков колоний (края и поверхность). Для получения такой культуральной среды и интерпретации результатов не требуется специально обученного или квалифицированного персонала;
- поступление питательных веществ из смеси экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта приводит к образованию питательной среды, которая позволяет выделять, восстанавливать, дифференцировать и идентифицировать колонии Candida за одну стадию, не прибегая к применению методов и средств, обычно используемых для выделения колоний;
- аналитическая чувствительность и чистота культуральной среды обусловлены тем фактом, что осуществляемая на ней идентификация не зависит от группы биохимических индикаторов или маркеров, а зависит лишь от ферментативных реакций, которые являются типичными для различных видов, а также от очень хорошо определенных морфологических свойств, которые не допускают получения неоднозначных или вариабельных результатов при выявлении различных штаммов какого-либо определенного вида;
- с использованием хромогенных компонентов новой композиции и их комбинаций с сепарированным молоком были получены новые формы такой среды, позволяющие проводить дифференциацию или идентификацию релевантных видов Candida в присутствии более чем одного ферментного маркера, который в свою очередь значительно повышает чуствительность и точность диагностики по сравнению с ранее используемыми методами;
- комбинация экстракта сладкого картофеля с дрожжевым экстрактом или томатным экстрактом обеспечивает поступление в новую культуральную среду значительного количества витаминов, а в частности витаминов A, B1, B5, B6, B12 и C, доставляемых такими экстрактами, которые являются метаболитами, благоприятствующими обильному росту различных видов Candida;
- введение экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта, кроме того, обеспечивает присутствие различных углеводов, которые могут удовлетворять все потребности микроорганизмов различных видов. Поэтому для обеспечения необходимых условий культивирования микроорганизмов различных видов необязательно вводить другие углеводы. Это также облегчает идентификацию и дифференциацию различных видов микроорганизмов, исходя их способности разлагать субстраты, состоящие из углеводов или содержащие группы, имитирующие эти углеводы;
- в этой питательной среде, помимо других микроэлементов, поставляемых источниками, из которых приготовлена данная смесь экстрактов, а в частности сладкого картофеля, обеспечивается нужное содержание железа, кальция, фосфора, магния, калия и т.п. Поэтому, в данном случае, для выделения или идентификации видов Candida не требуется введения других солей, используемых в качестве питательных добавок. Кроме того, также не требуется введения питательных добавок, используемых для активации ферментативных реакций, позволяющих дифференцировать виды Candida с помощью биохимических и/или хромогенных и флуорогенных тестов. Добавление веществ этого типа в новую питательную среду требуется только в том случае, когда такие дополнительные добавки необходимы для продуцирования очень быстрых реакций от скудного посевного материала или при очень низких концентрациях дрожжей в образцах;
- интенсивность хромогенной и/или флуорогенной реакций для идентификации различных видов микроорганизмов в данной среде значительно выше, чем интенсивность таких реакций в других культуральных средах, описанных в предшествующих работах, что обусловлено эффектом усиления, достигаемого путем добавления в данную композицию трегалозы или мальтозы в ранее указанных количествах;
- комбинация смеси экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта вместе с другими источниками азота, такими как глицин, ферментативный гидролизат казеина или бактериальный пептон, обсуждаемые выше, обеспечивает доступность различных форм азота (в виде амина, аминокислоты, пептида, полипептида и белка), которые могут удовлетворять различным потребностям культивируемых микроорганизмов различных видов на ранних стадиях клеточного развития, а поэтому такие колонии могут достигать полного развития за меньший период времени. С другой стороны, такие вспомогательные добавки обеспечивают сохранение колоний в чашках Петри в течение еще более длительного периода времени;
- питательная среда не содержит веществ, которые, по своей природе, могут затруднять прохождение биохимических, хромогенных или флуорогенных реакций, а в данном случае такими веществами являются циклогексимид, хлорамфеникол, гентамицин или родамин, либо вещества, которые могут препятствовать прохождению каскада метаболических реакций при специфическом взаимодействии “фермент-субстрат”, либо вещества, которые окрашивают колонии, что затрудняет детектирование развития окраски или появления флуоресценции;
- композиция культуральной среды не включает термолабильные антибактериальные вещества, ингибирующие рост грамотрицательных или грамположительных микроорганизмов, либо дрожжей или плесени других типов, но может включать комбинации более стабильных веществ, таких как налидиксовая кислота, дезоксихолат натрия, сульфит натрия, цитрат аммония и/или экстракт чайной розы, которые, в конечном счете, повышают стабильность полученной питательной среды, готовой для ее использования в чашках Петри;
- с другой стороны, питательная среда не требует включения ингибиторов, улучшающих восстановление тех же самых видов Candida, на развитие которых влияют такие вещества, как теллурит, которые, даже в умеренных концентрациях, ингибируют или снижают рост таких микроорганизмов;
- добавление налидиксовой кислоты, по сравнению с предшествующими средами, приводит к более эффективному ингибированию грамотрицательных бактерий, а поэтому такая композиция становится более устойчивой к высокой температуре и сохраняется в течение более длительного времени;
- впервые использование налидиксовой кислоты в качестве ингибитора в композиции для идентификации видов Candida позволяет включить в данную среду маркеры ферментативных хромогенных или флуорогенных реакций для детекции фосфолипазной или α-глюкозидазной активности, поскольку другие обычно используемые ингибиторы дают различные хроматические реакции в колониях видов Candida;
8
- появилась возможность селективного и прямого выделения видов Candida из клинических образцов или проб окружающей среды, благодаря ингибированию сопутствующей бактериальной флоры, которая может присутствовать даже в высоких концентрациях (3-5×10 КОЕ/мл), при этом восстановление микроорганизмов вида Candida составляет, в среднем, 113%, по сравнению с обычно используемой культуральной средой, не содержащей ингибиторов (декстрозный агар Сабуро). Этот эффект достигается благодаря новой комбинации ингибиторов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов с питательными веществами и солями магния;
- аналогичным образом, в настоящем изобретении не используются вещества, которые являются светочувствительными настолько, что инкубирование культуральной среды должно осуществляться в отсутствие света;
2
4
2
4
4
- комбинация экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта с добавлением в данную композицию различных солей (KHPO, KHPO, MgSO) в указанных концентрациях обеспечивает возможность корректировать буферную емкость среды в широком интервале величин рН (от 6,0 до 6,8), подходящих для детектирования различных видов микроорганизмов, и в то же время предотвращает ингибирование роста, вызываемое повышенной кислотностью, обусловленной аккумуляцией метаболитов в культуральной среде;
- смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта позволяет проводить идентификацию в режиме реального времени по биохимическим, хромогенным или флуорогенным реакциям, активируемым макро- и микроэлементами и витаминами, без использования веществ, которые, при высоких концентрациях, действуют как усилители клеточной проницаемости, например, такие как соли желчных кислот, ингибирующие некоторые микроорганизмы вида Candida;
- включение мальтозы или трегалозы не только усиливает хромогенную реакцию в колониях, но также стимулирует более интенсивный рост и образование колоний, размер которых превышает размер, достигаемый с использованием культуральной среды, описанной в предшествующих работах;
- присутствие агара в количестве от 13 до 15 г/л в комбинации с другими твердыми компонентами и водой, добавляемой при приготовлении питательной среды, дает надежную гарантию того, что в такой комбинированной среде колонии Candida будут проявлять свою дифференциальную окраску и морфологические признаки и что все тестируемые виды будут выделены или восстановлены и одновременно идентифицированы и/или дифференцированы друг от друга без применения какого-либо сложного метода инокуляции или специального обучения персонала;
- агар и другие твердые и жидкие компоненты, а также вода в соответствующих концентрациях позволяют детектировать хромогенные или флуорогенные реакции, биохимические реакции, свойства колоний или их морфологические признаки, а также обнаруживать высвобождение метаболита или появление зон на поверхности и/или в глубине культуральной среды, а поэтому любая реакция может быть визуализирована не только в верхней части чашки, но также и на ее дне;
- концентрация питательной среды в воде варьируется от 35 до 50 г/л, при этом концентрация экстракта сладкого картофеля в конечной питательной среде всегда составляет от 10 до 20 г/л.
Подробное описание настоящего изобретения включает получение смеси порошкообразного экстракта сладкого картофеля с дрожжевым экстрактом, где количество экстракта сладкого картофеля составляет от 50 до 67% по массе всей смеси. Экстракт сладкого картофеля может быть также смешан с томатным экстрактом, где количество экстракта сладкого картофеля составляет от 50 до 67% по массе всей смеси. Смесь экстракта сладкого картофеля с дрожжевым экстрактом или томатным экстрактом добавляют в питательную среду в количестве от 20 до 30 г/л.
Такая смесь может быть также получена из экстрактов в жидкой форме. В этом случае калькуляцию смеси осуществляют в расчете на твердые компоненты в смешиваемых экстрактах двух типов. Если смесь получают из любых жидких ингредиентов, то количество смеси жидких экстрактов также вычисляют из расчета содержания всех твердых веществ в смеси, а остальное количество по массе вычитают из объема воды, используемой для получения данной питательной среды.
Полученную смесь добавляют к 1 литру дистиллированной или деионизованной воды с рН от 5 до 7 (при этом предварительно вычитают содержание влаги, как указывалось ранее при смешивании одного или обоих экстрактов в жидкой форме).
Остальные вещества, являющиеся источниками азота, добавляют в количестве от 0 до 13 г/л. Эти вещества конкретно выбирают, среди прочих, из глицина в концентрации от 0 до 3 г/л, бактериального пептона в концентрации от 0 до 5 г/л и ферментативного гидролизата казеина в концентрации от 0 до 5 г/л.
Ингибиторы вводят в количестве от 0 до 10 г/л. Эти ингибиторы выбирают, среди прочих, предпочтительно, из налидиксовой кислоты в количестве от 0 до 0,05 г/л, экстракта чайной розы в количестве от 0 до 0,05 г/л, дезоксихолата натрия в количестве от 0 до 0,5 г/л, сульфита натрия в количестве от 0 до 3 г/л, цитрата аммония-висмута в количестве от 0 до 5 г/л и хлорида тетрафенилтетразолия в количестве от 0 до 0,05 г/л.
Были также добавлены вещества, облегчающие идентификацию различных микроорганизмов вида Candida. Эти вещества выбирают, среди прочих, из хромогенных и флуорогенных субстратов, индикаторов или красителей, присутствующих в питательной среде в количестве от 0 до 26 г/л, а предпочтительно, из аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-фосфата в количестве от 0 до 0,1 г/л, метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида в количестве от 0 до 0,1 г/л, 5-бром-4-хлор-3-индоксил-β-D-глюкозаминидина в количестве от 0 до 0,1 г/л, 5-бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкопиранозида в количестве от 0 до 0,1 г/л, 4-метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминида в количестве от 0 до 0,15 г/л, 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида в количестве от 0 до 0,1 г/л, глицерина от 0 до 25 мл/л, бромкрезолового пурпурного в количестве от 0 до 0,04 г/л, бромтимолового синего в количестве от 0 до 0,08 г/л, гидробромида L-пролин-7-амидо-4-метилкумарина от 0 до 0,1 г/л, пара-нитроанилида L-пролина в количестве от 0 до 0,2 г/л.
Добавляют также соединения, используемые для активации и усиления хромогенных и флуорогенных реакций, и такие соединения выбирают, среди прочих, из глицерина в количестве от 0 до 25 мл/л, мальтозы в количестве от 0 до 10 г/л, трегалозы в количестве от 0 до 10 г/л и сульфата магния в количестве от 0 до 0,5 г/л.
Сухое сепарированное молоко вводят в концентрации от 0 до 10 г/л.
Кроме того, добавляют другие рН-корректирующие вещества в количестве от 0 до 5 г/л, а предпочтительно, монофосфат калия в количестве от 0 до 1 г/л, дифосфат калия в количестве от 0 до 4 г/л и 3-морфолино-пропансульфоновую кислоту (3-морфолин-пропансульфоновую кислоту), также известную как MOPS, в количестве от 0 до 0,5 г/л.
Агар добавляют в количестве от 13 до 15 г/л, а pH питательной среды корректируют в пределах от 6,0 до 6,8.
Полученную культуральную среду расплавляют с применением любых хорошо известных методов.
Ниже представлены некоторые примеры применения новой питательной среды согласно изобретению.
Пример 1
Тест для оценки питательной ценности смеси из экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта или томатного экстракта в препарате культуральной среды с использованием некоторых хромогенных и/или флуорогенных субстратов.
Две композиции питательной среды (среды 1 и 2) тестировали по сравнению с культуральной средой, в которой был использован солодовый экстракт (RI) в качестве источника питательных элементов.
<b>Таблица 1</b><b>Состав культуральной среды</b>
Компоненты
г/л
1
2
RI
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
Томатный экстракт
10,0
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
Солодовый экстракт (эталон)
20,0
X
Монофосфат калия
1,0
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
5-Бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкопиранозид
0,04
X
X
X
4-Метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминид
0,04
X
X
X
Aгар
15,0
X
X
X
рН культуральной среды доводили до 6,5. После стерилизации рН доводили до значения 6,0 в варианте 1 и до значения 6,4 в варианте 2. В эталонной среде RI, рН поддерживался при 6,3.
Композиция среды 2 аналогична среде 1, но в ней вместо томатного экстракта использовали дрожжевой экстракт в той же самой концентрации 10 г/л.
Эталонную среду (RI) получали с использованием солодового экстракта (Merck) в концентрации 20 г/л.
Тестируемыми микроорганизмами (выделенными штаммами, полученными на Биологическом факультете Гаванского университета) были следующие микроорганизмы: Candida albicans (2 штамма), Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida kefyr и Candida krusei.
Чашки инкубировали при 30°С в течение 24 и 48 часов. Колонии оценивали визуально и интерпретировали следующим образом:
- синие колонии являются типичными для видов, содержащих фермент β-D-глюкозидазу, а именно Candida tropicalis и Candida kefyr;
- колонии, флуоресцирующие в синем диапазоне спектра, характерны для видов, содержащих фермент N-ацетил-β-D-галактозаминидазу, а именно Candida albicans и штаммы Candida tropicalis;
- белые колонии соответствуют штаммам, не содержащим ферменты β-D-глюкозидазу и N-ацетил-β-D-галактозаминидазу. Эти виды были идентифицированы по их морфологическим свойствам, а именно такие виды, как Candida krusei, Candida glabrata и Candida parapsilosis.
Результаты тестов представлены в таблице 2. Виды Candida могут быть идентифицированы в соответствии с культуральными свойствами этих колоний.
Было неожиданно обнаружено, что характерные признаки роста и основные признаки колоний Candida albicans и Candida tropicalis в культуральной среде наблюдались после инкубирования всего лишь в течение 24 часов.
Эти колонии имели характерный размер, хорошо развивались и хорошо снабжались питательными элементами, поступаемыми из экстракта сладкого картофеля, используемого в комбинации с дрожжевым экстрактом или томатным экстрактом.
Даже через 48 часов наблюдался обильный рост колоний, и эти колонии еще сохраняли свою морфологию.
Было выявлено, что культуральные среды 1 и 2, полученные с использованием смеси экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта, облегчали дифференциацию видов Candida по комбинации их окраски и флуоресценции, тогда как использование солодового экстракта (RI) в качестве эталона давало характерную синюю окраску только у Candida kefyr.
При использовании комбинации экстракта сладкого картофеля и томатного экстракта, концентрация хромогенного субстрата была недостаточной. А поэтому было принято решение увеличить такую концентрацию в последующих экспериментах.
Аналогичным образом было установлено, что присутствие углеводов в экстракте сладкого картофеля и в его смеси с дрожжевым экстрактом не только давало благоприятный эффект в отношении усиления роста тестируемых видов, но также не оказывало негативного влияния на прохождение хромогенных и/или флуорогенных реакций введенного субстрата, и даже благоприятствовало развитию таких реакций, что подтверждало полную совместимость вышеупомянутых экстрактов с субстратами.
Такой эффект не наблюдался в случае солодового экстракта, который ингибировал развитие флуорогенных реакций для Candida tropicalis через 48 часов, и хромогенных реакций для большинства микроорганизмов, за исключением Candida kefyr.
И наконец, было замечено, что агар имел нужную концентрацию. Действительно, наблюдаемые колонии имели характерные достаточно четко выраженные свойства, питательная среда не имела на своей поверхности царапин или разрывов, а цветные реакции хорошо наблюдались на поверхности колоний и в глубине культуральной среды. Такая флуорогенная реакция также очень хорошо наблюдалась в культуральной среде.
<b>Таблица 2</b><b>Идентификация выбранных видов Candida в тестируемых культуральных средах</b>
Микроорганизм
Культуральная среда
Цвет колоний
Флуоресценция
Морфология
Синий
Белый
1
X
X
-
C. albicans
2
X
X
-
RI
X
X
-
1
X (бледный)
X
-
C. tropicalis
2
X
X
-
RI
X
-
-
1
X
-
Набухшие, блестящие, с ровными краями
C. glabrata
2
X
-
RI
X
-
1
X (яркий)
-
-
C. kefyr
2
X (яркий)
-
-
RI
X (яркий)
-
-
1
X
-
Уплощенные, мутные, с неровными краями
C. krusei
2
X
-
RI
X
-
1
X
-
С шероховатой поверхностью и с ровными краями
C. parapsilosis
2
X
-
RI
X
-
Пример 2
Смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта объединяли с хромогенными и флуорогенными субстратами (5-бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкопиранозид, 4-метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминид; пара-нитроанилид L-пролина добавляли в более высоких концентрациях), а в качестве бактериостатического агента использовали дезоксихолат натрия (таблица 3).
Штаммы высевали методом глубинного посева до истощения инокулята. Культуральные среды инкубировали при 30°С в течение 36 часов.
На обоих средах наблюдался обильный рост даже через 36 часов. Хромогенные и/или флуорогенные реакции, а также морфологические свойства подтверждали дифференциацию видов Candida (таблица 4).
<b>Таблица 3</b><b>Состав культуральных сред 3 и 4</b>
Компоненты
г/л
3
4
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
Монофосфат калия
1,0
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
5-Бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкопиранозид
0,1
X
4-Метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминид
0,15
X
Пара-нитроанилид L-пролина
0,05
X
Агар
15,0
X
X
Глицин
1,0
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
Аналогичным образом было установлено, что экстракты, составляющие питательную среду, являются совместимыми с хромогенными и/или флуорогенными субстратами, которые могут быть визуализированы внутри клетки и диффундируют внутрь среды. Реакции разложения этих субстратов стимулируются присутствием экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта.
<b>Таблица 4</b><b>Идентификация тестируемых видов Candida в средах 3 и 4</b>
Микроорганизм
Культуральная среда
Цвет колоний
Флуоресценция
Морфология
Синий
Желтый
Белый
C. albicans
3
X
X
4
X
C. tropicalis
3
X (бледный)
4
X
C. glabrata
3
X
Набухшие Х, блестящие, с ровными краями
4
X
C. kefyr
3
X (яркий)
4
X
C. parapsilosis
3
X
С шероховатой поверхностью и с ровными краями
4
X
Пример 3
Питательную среду (среду 5) получали в лаборатории, и набор ингредиентов этой среды представлен в таблице 5. Полученную среду распределяли по чашкам Петри и инокулировали.
Посев осуществляли путем разведения до тех пор, пока отдельные колонии не достигали от 30 до 300 КОЕ/чашку.
Инкубирование осуществляли при 30°С в течение 36-48 часов.
Эта питательная среда (таблица 6) стимулировала рост микроорганизмов всех тестируемых видов. Была подтверждена совместимость экстракта сладкого картофеля или его смеси с дрожжевым экстрактом с более высокими концентрациями хромогенных и флуорогенных субстратов.
Неожиданно было обнаружено, что обильный рост наблюдался при высоких разведениях (при низкой концентрации инокулята). Это подтверждало высокую аналитическую чувствительность питательной среды и поступление из этой среды, главным образом, из экстракта сладкого картофеля и его комбинации с дрожжевым экстрактом, питательных веществ, необходимых для восстановления микроорганизмов вида Candida.
<b>Таблица 5</b><b>Состав питательной среды с более высокими концентрациями хромогенных и флуорогенных субстратов</b>
Компонент
г/л
Среда 5
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
Монофосфат калия
1,0
X
Сульфат магния
0,5
X
5-Бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкозид
0,1
X
4-Метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминид
0,15
X
Агар
15,0
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
<b>Таблица 6</b><b>Результаты культивирования видов Candida в питательной среде при разведении 10</b><sup>-4</sup>
Микроорганизм
Культуральная среда
Цвет колоний
Флуоресценция
Морфология
Синий
Белый
C. albicans
5
X
X
C. tropicalis
5
X (бледный, с темным центром)
C. glabrata
5
X
Набухшие, блестящие, с ровными краями
C. kefyr
5
X (яркий)
C. parapsilosis
5
X
С шероховатой поверхностью и с ровными краями
C. krusei
5
X
Уплощенные, мутные, с неровными краями
Пример 4
Для оценки совместимости экстракта сладкого картофеля в его смеси с дрожжевым экстрактом и с веществами, ингибирующими грамположительные микроорганизмы, питательную среду (6) получали с добавлением дезоксихолата натрия (таблица 7).
Данную композицию не стерилизовали в автоклаве. Ее кипятили и распределяли по чашкам.
Посев осуществляли путем серийных разведений стандартизированного инокулята.
<b>Таблица 7</b>
Компонент
г/л
Экстракт сладкого картофеля
10,0
Дрожжевой экстракт
10,0
Монофосфат калия
1,0
Сульфат магния
0,5
Агар
15,0
Дезоксихолат натрия
0,5
<b>Таблица 8</b><b>Рост микроорганизмов вида Candida на питательной среде, содержащей дезоксихолат натрия</b>
Микроорганизм
Цвет
Морфология
C. albicans
Белый
Гладкие, набухшие, круглые
C. tropicalis
Белый
Гладкие, набухшие, круглые
C. glabrata
Белый
Набухшие, блестящие, с ровными краями
C. kefyr
Белый
Наполовину уплощенные, круглые
C. parapsilosis
Белый
С шероховатой поверхностью и с ровными краями
C. krusei
Белый
Уплощенные, непрозрачные, с неровными краями
-4
Присутствие дезоксихолата ускоряло рост тестируемых дрожжей (таблица 8), даже при высоких разведениях (10), при этом какого-либо ингибирования не наблюдалось. Это подтверждает ростстимулирующую способность экстракта сладкого картофеля в его комбинации с дрожжевым экстрактом, которые благоприятствуют образованию типичных колоний в присутствии усилителя проницаемости клеточной стенки.
С другой стороны, сульфат магния действует как стимулятор проявления морфологических свойств различных штаммов Candida, поскольку наблюдаемые колонии имели более блестящую и более яркую белую окраску и четко обозначенные края.
Пример 5
Для подтверждения ростстимулирующей способности культуральной среды на ранней стадии культивирования и для оценки совместимости экстракта сладкого картофеля с другими биохимическими субстратами, которые могут быть использованы для дифференциации различных видов Candida, в эту среду были включены глицерин и бромтимоловый синий (среды 7 и 8) (таблица 9).
<b>Таблица 9</b><b>Состав сред 7 и 8</b>
Компоненты
г/л
7
8
Эстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
Монофосфат калия
1,0
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
Агар
15,0
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
Глицерин
10 (мл)
X
Бромтимоловый синий
0,08
X
X
Интенсивный рост Candida albicans и Candida tropicalis наблюдался только после 24-часового инкубирования.
С другой стороны, для оценки стабильности идентифицирующих реакций и сохранения питательных свойств данной питательной среды, считывание результатов проводили после 76-часового инкубирования.
Рост микроорганизмов указанных видов продолжался. Кроме того, идентифицирующие реакции сохраняли свою стабильность на протяжении всего процесса инкубирования (таблица 10).
<b>Таблица 10</b><b>Результаты роста микробов после 76-часового инкубирования в культуральных средах 7 и 8</b>
Микроорганизм
Культуральная среда
Цвет колоний
Морфология
Желтый
Белый
C. albicans
7
X
8
X
C. tropicalis
7
X
8
X
C. glabrata
7
X
Набухшие, блестящие, с ровными краями
8
X
C. kefyr
7
X
8
X
C. krusei
7
X
Уплощенные, мутные, с неровными краями
8
X
C. parapsilosis
7
X
С шероховатой поверхностью и с ровными краями
8
X
Пример 6
Оценка эффективности использования хромогенного субстрата 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида как компонента питательной среды 9 для дифференциации некоторых микроорганизмов вида Candida (таблица 11)
<b>Таблица 11</b><b>Состав питательной среды 9</b>
Компоненты
г/л
Экстракт сладкого картофеля
10,0
Дрожжевой экстракт
10,0
Mонофосфат калия
1,0
Сульфат магния
0,5
Aгар
15,0
Дезоксихолат натрия
0,5
6-Хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозид (Rose-glu)
0,1
-4
-5
Культуральную среду инокулировали путем поверхностного инкубирования до достижения высоких разведений (10-10).
Чашки инкубировали в течение 48 часов. В это время колонии Candida tropicalis и Candida kefyr приобретали розовую окраску, причем у Candida kefyr она была более интенсивной. Было подтверждено, что даже при более высоких разведениях, чем разведения, протестированные ранее, можно не только восстанавливать микроорганизмы этих видов Candida, но также продуцировать характерные хромогенные реакции, поскольку у обоих этих видов наблюдалась розовая окраска.
Высокая питательная ценность экстракта сладкого картофеля и его смеси с дрожжевым экстрактом как источников азота и как поставщиков витаминов и макро- и микроэлементов стала очевидной только после того, как эти две питательные основы были использованы лишь в качестве источников питания при приготовлении культуральной среды.
И снова было подтверждено, что оба эти экстракта, взятые в комбинации друг с другом, не только не препятствуют прохождению хромогенных реакций, но даже стимулируют развитие этих хромогенных реакций при очень низких концентрациях инокулята.
-4
-5
Было установлено, что эта питательная среда имеет высокую восстанавливающую способность, поскольку при разведении 10 невозможно осуществлять пересчет колоний Candida glabrata и Candida krusei в чашках, так как они присутствуют в бесчисленном количестве, и такой пересчет можно осуществлять только при разведении 10, как показано в таблице 12.
<b>Таблица 12</b><b>Рост микроорганизмов различных видов Candida в питательной среде 9</b>
Микроорганизм
КОЕ/на чашку, при разведении
Цвет колоний
Морфология
10<sup>-4</sup>
10<sup>-5</sup>
Розовый
Белый
C. albicans
45
5
X
C. tropicalis
47
5
X
C. glabrata
INC
36
X
Набухшие, блестящие, с ровными краями
C. kefyr
51
11
X
C. krusei
INC
50
X
Уплощенные, мутные, с неровными краями
C. parapsilosis
48
6
X
С шероховатой поверхностью и с ровными краями
INC - бесчисленное количество
Пример 7
Была проведена оценка питательной ценности нескольких компонентов, обогащенных азотом белкового происхождения (пославляемым ферментативным гидролизатом казеина и бактериальным пептоном) в присутствии и в отсутствие дезоксихолата натрия.
Были протестированы экспериментальные варианты питательной среды (от 10 до 15) (таблица 13). При этом добавляли различные источники азота и дезоксихолат натрия и сравнивали с эталонной средой (R2), а именно с декстрозным агаром Сабуро (BioCen).
<b>Таблица 13</b><b>Композиция экспериментальных вариантов питательной среды и эталонной среды</b>
Компоненты
г/л
10
11
12
R2
13
14
15
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
X
-
X
X
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
X
-
X
X
X
Mонофосфат калия
1,0
X
X
X
-
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
-
X
X
X
Продукт ферментативного гидролиза казеина
5,0
-
X
-
X
-
X
-
Бактериальный пептон
5,0
-
-
X
X
-
-
X
Декстроза
40,0
-
-
-
X
-
-
-
Aгар
15,0
X
X
X
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
-
-
-
-
X
X
X
Культуральные среды 10, 11, 12 и R2 были стерилизованы в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. Культуральные среды 13, 14 и 15 расплавляли и кипятили в течение 2-3 минут.
Во всех случаях pH экспериментальных вариантов культуральной среды составлял 6,8. pH среды R2 составлял 5,6.
Проводили глубинную инокуляцию до полного истощения инокулята.
При наблюдении роста и морфологии колоний Candida был сделан вывод, что, хотя добавление ферментативного гидролизата казеина и бактериального пептона не приводило к значительному усилению роста, однако, оно не оказывало какого-либо негативного влияния на такой рост.
При сравнении со средой R2, различия между средой R2 и вариантами питательной среды для C. albicans, C. parapsilosis и C. tropicalis не наблюдалось, даже при использовании в данных вариантах дезоксихолата натрия в качестве ингибитора.
Было подтверждено, что даже при ослаблении роста C. glabrata и C. krusei и интенсивности окраски колоний, обусловленном добавлением дезоксихолата натрия и отсутствием альтернативных источников углеводов, эти виды были детектированы и восстановлены без каких-либо затруднений.
В отличие от среды R2, которая не содержала ингибиторов и имела высокий уровень сахара (декстрозы), варианты питательной среды отвечали нужным требованиям. Такой неожиданный эффект позволяет сделать вывод, что смесь экстракта сладкого картофеля с дрожжевым экстрактом обеспечивает питательную среду достаточным количеством азота, необходимым для роста микроорганизмов различных видов Candida, хотя в культуральную среду может быть введена добавка в целях ее снабжения источниками азота белкового происхождения для сохранения этого микроорганизма в течение более длительных периодов времени без истощения источников питательных веществ, поступающих из обоих экстрактов.
Другим важным аспектом является то, что во всех вариантах питательной среды поддерживается стабильный рН 6,8, что, наряду с присутствием вышеупомянутых питательных элементов, обеспечивает соответствующий рост микроорганизмов вида Candida даже в менее благоприятных условиях, чем условия, существующие в контрольном варианте (R2). Это имеет решающее значение для достижения проявления характерных морфологических свойств колоний и хорошего их восстановления.
Пример 8
Для оценки влияния добавления экстракта сладкого картофеля в качестве источника питательных веществ всех типов (углеводов, азота, витаминов и макро- и микроэлементов) и добавления глицерина в качестве возможного маркера ферментативной реакции для последующей дифференциации микроорганизмов вида Candida были получены новые варианты питательной среды (16-19) (таблица 14), и эти варианты сравнивали с эталонной средой (R2).
Различные микроорганизмы вида Candida высевали глубинным методом до истощения инокулята.
pH среды R2 составлял 5,6, а рН экспериментальных вариантов составлял 6,8. Затем снова была проведена оценка свойств этого индикатора, который был протестирован в предыдущем примере.
Во всех тестируемых вариантах уже в течение первых 24 часов наблюдался рост всех протестированных видов дрожжей.
Было подтверждено, что добавление глицерина благоприятствовало росту микроорганизмов всех тестируемых видов, на что указывал значительно лучший рост колоний. Исходя из этого, очевидно, что глицерин не оказывает негативного влияния на рост микроорганизмов.
<b>Таблица 14</b><b>Состав питательной среды</b>
Компоненты
г/л
16
R2
17
18
19
Экстракт сладкого картофеля
10,0
20 (двойная концентрация)
-
X
X
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
-
X
X
X
Mонофосфат калия
1,0
X
-
-
X
X
Сульфат магния
0,5
X
-
-
X
X
Продукт ферментативного гидролиза казеина
5,0
-
X
-
-
-
Бактериальный пептон
5,0
-
X
-
-
-
Декстроза
40,0
-
X
-
-
-
Aгар
15,0
X
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
-
X
X
X
Глицерин
10 мл
-
-
-
-
X
Аналогичным образом, увеличение количества экстракта сладкого картофеля оказывает благоприятное действие на питательную среду, поскольку, несмотря на присутствие дезоксихолата натрия, наблюдался хороший рост релевантных видов микроорганизмов.
Отсутствие монофосфата калия и сульфата магния в варианте 17 не приводило к прекращению роста, но приводило к небольшому снижению интенсивности роста микроорганизмов C. glabrata и C. krusei в течение 24 часов. В результате было подтверждено, что экстракт сладкого картофеля в комбинации с дрожжевым экстрактом является достаточным для удовлетворения минимальных потребностей в макро- и микроэлементах, необходимых для стимуляции роста микроорганизмов вида Candida.
Пример 9
Этот эксперимент осуществляли в целях тестирования эффективности введения в питательную среду глицерина с индикатором рН для дифференциации микроорганизмов вида Candida, а также для сравнения продуцируемой реакции с реакцией, достигаемой при добавлении декстрозы, то есть углевода, используемого для стимуляции роста этих дрожжей в большинстве методов, описанных в предшествующих работах.
Два хромогенных и флуорогенных субстрата были включены одновременно для оценки возможного влияния добавленных источников углерода на развитие хромогенных и флуорогенных реакций.
Композиции питательной среды (20-22) представлены в таблице 15, где проиллюстрировано их сравнение с эталонной средой R3, полученной на основе композиции R2 с добавлением хромогенных и флуорогенных субстратов, индикатора рН и дезоксихолата натрия. pH всех культуральных сред доводили до 6,8.
Штаммы различных микроорганизмов вида Candida и других микроорганизмов были инокулированы глубинным методом на поверхность культуральной среды. Указанную среду инкубировали в течение 24-48 часов.
Были засеяны микроорганизмы вида Candida и другие микроорганизмы, такие как Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis и Staphylococcus aureus.
В таблице 16 описаны реакции, полученные с использованием тестируемых вариантов питательной среды, содержащей различные микроорганизмы.
<b>Таблица 15</b><b>Состав экспериментальных вариантов описанных сред и эталонной среды</b>
Компоненты
г/л
Культуральная среда
20
21
22
R3
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
X
-
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
X
-
Mонофосфат калия
1,0
X
X
X
-
Сульфат магния
0,5
X
X
X
-
Агар
15,0
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
X
Глицерин
10 мл
-
-
X
-
Продукт ферментативного гидролиза казеина
5,0
-
-
-
X
Бактериальный пептон
5,0
-
-
-
X
Декстроза
20,0
-
X
-
40 (двойная концентрация)
Бромтимоловый синий
0,08
X
X
X
X
5-Бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкозид
0,1
X
X
X
X
4-Метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминид
0,15
X
X
X
X
<b>Таблица 16</b><b>Ответ тестируемых микроорганизмов на различные варианты культуральной среды</b>
Микроорганизм
Среда
Цвет колоний
Цвет среды
Флуоресценция
Морфология
C. albicans
20
Белый-желтый
Синий
Да
1 мм, гладкие, круглые
21
Желтый
Желтый
Нет
1 мм, гладкие, круглые
22
Белый-желтый
Синий
Да
1 мм, гладкие, круглые
R3
Желтый
Желтый
Нет
1 мм, гладкие, круглые
C. tropicalis
20
От беловато-серого до голубого
Зеленый
Слабая
2 мм, гладкие, круглые
21
Беловато-серый
Зеленый
Нет
2 мм, гладкие, круглые
22
От беловато-серого до синего
Зеленый
Слабая
2 мм, гладкие, круглые
R3
Беловато-серый
Зеленый
Нет
2 мм, гладкие, круглые
C. glabrata
20
Белый
Синий
Нет
0,5 мм, гладкие, круглые
21
Желтый-оранжевый
Желтый
Нет
1,5 мм, гладкие, круглые
22
Желтый
Желтый
Нет
1 мм, гладкие, круглые
R3
Желтый
Желтый
Нет
1 мм, гладкие, круглые
C. kefyr
20
Синий
Зеленый
Нет
0,5 мм, гладкие, круглые
21
Зеленый
Желтый
Нет
0,5 мм, гладкие, круглые
22
Синий
Зеленый
Нет
0,5 мм, гладкие, круглые
R3
NG
NG
-
-
C. parapsilosis
20
Белый
Синий
Нет
1 мм, неправильной формы, круглые
21
Белый-желтый
Зеленый
Нет
1 мм, неправильной формы, круглые
22
Белый-желтый
Зеленый
Нет
1 мм, неправильной формы, круглые
R3
Желтый
Желтый
Нет
1 мм, неправильной формы, круглые
C. krusei
20
Прозрачный
Синий
Нет
0,5 мм, уплощенные
21
Желтый
Зеленый
Нет
1,5 мм, уплощенные
22
Белый-желтый
Зеленовато-желтый-
Нет
1 мм, уплощенные
R3
Желтый
Желтый
Нет
1,5 мм, уплощенные
E. aerogenes
20
Зеленый-синий с ярко окрашенным зеленым центром
Синий
Нет
2-4 мм, круглые
21
Желтый-оранжевый
Желтый
Нет
1 мм, круглые
22
Зеленый
Зеленый
Нет
2-4 мм, круглые
R3
Желтый, прозрачная зона
Желтый
Нет
2 мм, круглые
S. typhimurium
20
Ярко-зеленый
Зеленый-синий
Нет
1 мм, круглые
21
Желтый
Желтый
Нет
1-2 мм, с неровными краями, уплощенные
22
Ярко-зеленый
Зеленый-синий
Нет
1 мм, круглые
R3
Желтый
Желтый
Нет
1 мм, круглые
P. aeruginosa
20
Прозрачный
Синий
Нет
Неправильной формы, в виде слизи
21
Желтый
Желтый
Нет
Неправильной формы, в виде слизи
22
Желтый
Зеленый
Нет
Неправильной формы, в виде слизи
R3
Желтый
Желтый
Нет
Неправильной формы, в виде слизи
E. faecalis
20
NG
NG
-
-
21
NG
NG
-
-
22
NG
NG
-
-
R3
NG
NG
-
-
S. aureus
20
NG
NG
-
-
21
NG
NG
-
-
22
NG
NG
-
-
R3
NG
NG
-
-
NG - рост не наблюдался.
Для вариантов 21 и R3, в которые была включена декстроза, результаты дифференциации микроорганизмов тестируемых видов не были удовлетворительными, поскольку гидролиз этого сахара, осуществляемый несколькими микроорганизмами вида Candida и другими микроорганизмами, давал почти один и тот же цвет, и приводил к продуцированию высокого уровня кислоты, сопровождаемому снижением рН, на что указывало значение рН в конечной точке, и к ингибированию хромогенных реакций, вызываемому снижением pH. Такой эффект наблюдается в случае Enterobacter, Salmonella и Pseudomonas и почти для всех видов Candida, за исключением Candida tropicalis, Candida krusei и Candida parapsilosis в варианте 21.
Поэтому введение указанного сахара не рекомендуется.
Добавление глицерина в вариант питательной среды 22 в указанном количестве не только не препятствовало росту релевантных микроорганизмов в течение 24 часов, а в частности Candida krusei и Candida glabrata, но также, в комбинации с хромогенными и флуорогенными субстратами, позволяло проводить соответствующую дифференциацию различных микроорганизмов вида Candida и даже других грамотрицательных микроорганизмов, которые могут расти на этих средах и негативно влиять, по меньшей мере, теоретически, на результаты идентификации релевантных дрожжей.
Дифференциация Candida albicans может быть, в частности, осуществлена по белому цвету колоний и по флуоресценции в синем диапазоне спектра; Candida tropicalis - по синему цвету всей массы колоний и по флуоресценции в синем диапозоне спектра; Candida kefyr - по синему цвету без флуоресценции; Candida glabrata - по желтому цвету колоний; Candida krusei - по желтовато-белому цвету колоний, но их морфология отличается наличием мутных уплощенных колоний с неровными, но закругленными краями; а Candida parapsilosis может быть дифференцирована по тому же цвету, но с неровной поверхностью. Грамотрицательные микроорганизмы окрашивали культуральную среду в зеленый цвет и образовывали зеленые колонии, за исключением микроорганизма Pseudomonas aeruginosa, который образовывал желтые и слизевидные колонии.
8
Присутствие дезоксихолата натрия способствовало ингибированию засеянных грамположительных микроорганизмов даже при высоких концентрациях (10 КОЕ/мл).
Пример 10
Для оценки влияния pH на микробиологический ответ, pH изменяли в пределах от 6,1 до 6,8 путем добавления различных буферов (культуральные среды 23-25) (таблица 17).
<b>Таблица 17</b><b>Состав культуральной среды при pH 6,1</b>
Компоненты
г/л
Культуральная среда
23
24
25
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
X
Mонофосфат калия
1,0
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
5-Бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкозид
0,1
X
X
X
4-Метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминид
0,15
X
X
X
Агар
15,0
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
3-(N-морфолин)пропансульфоновая кислота (MOPS)
0,5
-
X
-
Дифосфат калия
4,0
-
-
X
Культуральные среды 26, 27 и 28 были получены на основе тех же самых композиций, которые были использованы для приготовления трех сред, указанных в таблице 17, за исключением того, что рН этих сред был доведен до 6,8.
Вообще говоря, совершенно очевидно, что реакция в вариантах питательных сред с pH 6,1 протекала в течение более длительного времени в присутствии субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкозида для Candida kefyr. Однако следует отметить, что микроорганизмы Candida albicans, Candida glabrata и Candida krusei при этом рН обнаруживали лучший рост, чем при pH 6,8.
Включение MOPS не оказывало негативного влияния на развитие тестируемых микроорганизмов и не оказывало влияния на реакцию, по которой проводили идентификацию.
Кроме того, добавление дифосфата калия не ингибировало такую реакцию, но приводило к появлению небольшой мутности, которая не препятствовала идентификации или дифференциации микробов.
Этот эксперимент со всей очевидностью показал, что при обоих pH 6,1 и 6,8 рост микроорганизмов вида Candida усиливался и облегчалась их дифференциация; но тем не менее pH должен быть скорректирован в зависимости от конкретного вида культивируемых или идентифицируемых релевантных микроорганизмов.
Пример 11
В данную композицию варианта культуральной среды был включен хлорамфеникол для оценки влияния добавления дезоксихолата натрия на рост и идентификацию Candida, которую проводили по сравнению с известной средой, содержащей антибиотики, ингибирующие рост грамотрицательных микроорганизмов.
Культуральные среды 26 и 27, описанные в таблице 18, сравнивали с хромогенной средой CHROMagar Candida (R4) (CHROMagar) и с агаровой декстрозной средой Сабуро (R2) (Biocen).
Несколько штаммов различных микроорганизмов вида Candida высевали глубинным методом до истощения инокулята.
Были засеяны четыре выделенных штамма Candida albicans, а именно два штамма, взятые из ATCC (10231 и 17111), и один штамм, принадлежащий к другому виду дрожжей. Результаты представлены в таблице 19.
<b>Таблица 18</b><b>Состав питательной среды с различными ингибиторами</b>
Компоненты
г/л
26
27
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
Mонофосфат калия
1,0
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
Агар
15,0
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
-
Хлорамфеникол
0,5
-
X
5-Бром-4-хлор-3-индолил-N-ацетил-β-D-глюкозид
0,1
X
X
4-Метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминид
0,15
X
X
<b>Таблица 19</b><b>Рост микроорганизмов вида Candida в питательной среде и в среде CHROMagar для Candida</b>
Микроорганизм
Культуральная среда
Цвет колоний
Флуоресценция
Морфология
Размер колоний, мм/интенсивность роста
C. albicans
26
Белый
В синем диапазоне
Гладкие, круглые, набухшие
1-1,5, хорошая
27
Белый
В синем диапазоне
Гладкие, круглые, набухшие
1-1,5, хорошая
R2
Белый
-
Гладкие, круглые, набухшие
1, хорошая
R4
Светло-зеленый
-
Гладкие, круглые, набухшие
1, хорошая
C. tropicalis
26
Бледно-синий
Очень слабая
Гладкие, круглые, набухшие
1,5-2, хорошая-превосходная
27
Белый с синеватым оттенком
Очень слабая
Гладкие, круглые, набухшие
1,5-2, хорошая-превосходная
R2
Белый
-
Гладкие, круглые, набухшие
1,5, хорошая-превосходная
R4
Синий-серый
-
Гладкие, круглые, набухшие
1, хорошая
C. glabrata
26
Белый
Нет
Гладкие, круглые
0,5, хорошая
27
Белый
Нет
Гладкие, круглые
0,5, хорошая
R2
Белый
-
Гладкие, круглые
1-1,5, хорошая
R4
Фиолетовый
-
Гладкие, круглые
1, хорошая
C. kefyr
26
Ярко-синий
Нет
Гладкие, круглые
1, хорошая
27
Ярко-синий
Нет
Гладкие, круглые
1, хорошая
R2
Белый
-
Гладкие, круглые
1 хорошая
R4
Белый
-
Гладкие, круглые
1 хорошая
C. krusei
26
Белый, полупрозрачный
Нет
Мутные, уплощенные, пушистые на вид
0,5, хорошая
27
Белый, полупрозрачный
Нет
Мутные, уплощенные, пушистые на вид
0,5, хорошая
R2
Белый, полупрозрачный
-
Мутные, уплощенные, пушистые на вид
0,5, хорошая
R4
Бледно-розовый
-
Мутные, уплощенные, пушистые на вид
1, хорошая
Как можно видеть, включение хлоранфеникола усложняет и затрудняет дифференциацию видов микроорганизмов, а в частности, препятствует прохождению хромогенных реакций, например, в случае Candida tropicalis.
Кроме того, использование хлорамфеникола не обеспечивает постоянную стабильность готовой среды, в основном при комнатной температуре.
Среду CHROMagar Candida не использовали (не хранили или не инкубировали) на свету, поскольку такое использование не рекомендуется производителем. Кроме того, полученная среда может быть использована только в течение одного дня, поскольку по истечении этого времени она разрушается.
Питательная среда согласно изобретению, полученная как описано для композиции варианта 26, может сохраняться даже при температуре окружающей среды без какого-либо негативного изменения ее ростстимулирующих свойств или прохождения детектирующих реакций.
С использованием такого варианта композиции можно получить колонии Candida albicans и Candida tropicalis (два вида микроорганизмов, представляющих наибольший интерес), размер которых будет превышать размер колоний, полученных с использованием эталонной среды.
Пример 12
В нижеследующем эксперименте тестировали влияние содержания глицерина в присутствии двух индикаторов рН.
В таблице 20 представлены композиции первых пяти вариантов (28-32). Что касается следующих пяти вариантов (33-37), то ингридиенты брали в указанной концентрации, за исключением того, что бромкрезоловый пурпурный заменяли бромтимоловым синим.
Все композиции стерилизовали в автоклаве, а pH доводили до 6,8.
Все штаммы высевали на поверхность среды глубинным методом.
<b>Таблица 20</b><b>Основные ингредиенты экспериментальной среды в различных композициях</b>
Компоненты
г/л
28
29
30
31
32
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
X
X
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
X
X
X
Mонофосфат калия
1,0
X
X
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
X
X
Бромкрезоловый пурпурный
0,04
X
X
X
X
X
Агар
13,0
X
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
X
X
Глицерин
Варьировался (мл)
-
1
5
10
12,5
В случае Candida albicans, при увеличении концентрации глицерина, ростингибирующий эффект не детектировался. Такой микроорганизм не использовал глицерин в качестве субстрата.
Среда не изменяла свой цвет, а поэтому характерная ферментативная активность не детектировалась, как это должно было наблюдаться само по себе при изменении pH среды.
Кроме того, в случае Candida tropicalis и Candida parapsilosis, при увеличении концентрации глицерина, ингибирования роста не наблюдалось.
По наблюдаемому в результате росту Candida kefyr было установлено, что увеличение концентрации глицерина благоприятно влияет на развитие окраски, размер и яркость колоний. Аналогичным образом, этот микроорганизм не разлагает глицерин в качестве субстрата.
Увеличение концентрации глицерина облегчает идентификацию изменения цвета колоний Candida glabrata (преобладание желтого оттенка) и культуральной среды (желтый); и, кроме того, улучшает морфологические свойства колоний, то есть эти колонии становятся более набухшими, более крупными и приобретают более яркую окраску. Что касается этого микроорганизма, то добавление бромкрезолового пурпурного улучшает ответ этого микроорганизма на изменение pH. Изменение цвета также становится заметным на дне чашки, поскольку эта реакция распространяется вглубь, образуя желтую зону вокруг колоний.
В случае Candida krusei увеличение содержания глицерина облегчало наблюдение изменения цвета культуральной среды (желтый). Кроме того, по мере образования более крупных колоний размером 1-3 мм, морфологические свойства улучшались и колонии приобретали более выраженную белую окраску. Что касается этого микроорганизма, то бромтимоловый синий облегчал детектирование изменения окраски (придавал желтую окраску) в культуральной среде с повышенной концентрацией субстрата.
Вообще говоря, добавление агара в концентрации 13 г/л приводило к увеличению размера колоний, хотя считается, что на этом уровне поверхность культуральной среды может разрушаться в процессе глубинного культивирования.
Пример 13
Было протестировано несколько ингибиторов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов (таблица 21) для того, чтобы определить, которые из них должны быть использованы в композиции культуральной среды согласно изобретению, а также для сравнения полученных результатов с результатами, полученными с использованием других добавляемых ранее ингибиторов и сообщаемыми различными авторами, а также описанными в литературе.
8
Для оценки ингибирования высевали шесть видов Candida и шесть штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов (инокулят высевали на поверхность глубинным методом при разведении 10 КОЕ/мл), включая Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecalis и Staphylococcus aureus.
Чашки с культуральной средой инкубировали при 30°С в течение 48 часов.
С использованием вариантов культуральных сред 38 и 39 достигалось полное ингибирование тестируемых грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Микроорганизмы вида Candida обнаруживали хороший рост. Цвет микроорганизмов различных видов был темно-коричневым, за исключением Candida glabrata, который имел белый цвет.
Вариант 40 ингибировал все грамположительные микроорганизмы и Proteus vulgaris. Все штаммы Candida обнаруживали обильный рост и имели характерную морфологию и розовую окраску.
Питательная среда 41 ингибировала Candida krusei и Candida parapsilosis, однако полное ингибирование грамотрицательных микроорганизмов не достигалось.
Варианты 42 и 43 обнаруживали слишком сильное ингибирование микроорганизмов, даже тех микроорганизмов Candida, которые не могли расти в этой среде.
Аналогичным образом, в варианты сред 44-48 полностью ингибировали микроорганизмы вида Candida.
Результаты этих тестов неожиданно показали, что только сульфит натрия, цитрат аммония-висмута и экстракт чайной розы, взятые в комбинации с экстрактом сладкого картофеля и с его смесью с дрожжевым экстрактом, стимулируют рост микроорганизмов вида Candida, облегчая их дифференциацию, и способны ингибировать конкурирующие микроорганизмы, предотвращая, тем самым, продуцирование тех же самых идентифицирующих реакций грамотрицательными микроорганизмами до полного их ингибирования, а также предотвращая рост грамположительных бактерий в вариантах культуральной среды, содержащих такие ингредиенты.
<b>Таблица 21</b><b>Состав культуральных сред, содержащих различные ингибиторы</b>
Компоненты
г/л
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Mонофосфат калия
1,0
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Агар
15,0
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
Сульфит натрия
3,0
X
X
Цитрат аммония-висмута
5,0
X
X
Глицин
3,0
X
Экстракт чайной розы
0,05
X
2% раствор теллурита калия
18 мл
X
X
X
Хлорид лития
5,0
X
Цетримид
варьировалась
0,3
1,0
Борная кислота
варьировалась
1,0
3,0
5,0
Пример 14
Этот эксперимент осуществляли для оценки влияния сепарированного молока как питательного вещества, обеспечивающего поступление белков и сахаров (лактозы).
В таблице 22 представлена экспериментальная композиция для сравнения различных питательных композиций с двумя концентрациями сухого сепарированного молока. Результаты сравнивали с результатами, полученными с использованием основной композиции согласно изобретению, не содержащей молока (вариант 49 в таблице 22), и двух композиций (варианта 49 и варианта 50), которые не были заявлены в описанном здесь способе, поскольку они включают только экстракт сладкого картофеля.
<b>Таблица 22</b><b>Ингредиенты экспериментальной среды</b>
Компоненты
г/л
49
50
51
52
Экстракт сладкого картофеля
10,0
X
X
Смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта
20,0
X
X
Сепарированное молоко
варьировалась
5
10
5
Монофосфат калия
1,0
X
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
X
Глицерин
10 (мл)
X
X
X
X
Агар
15,0
X
X
X
X
Рабочий pH составлял 6,8.
Все варианты тестируемой композиции нагревали до кипения в течение 2 или 3 минут после достижения температуры плавления агара. Стерилизацию этих вариантов в автоклаве не проводили.
Было засеяно несколько видов микроорганизмов рода Candida, таких как Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida kefyr, Candida parapsilosis, Candida glabrata и Saccharomyces cerevisiae.
Чашки инкубировали в течение 48 часов при температуре 25°С. Результаты считывания показали, что варианты 49 и 50 не давали удовлетворительного роста микроорганизмов видов Candida glabrata, Candida krusei и Candida parapsilosis. Это может быть обусловлено недостатком таких основных элементов, как витамины и факторы роста, присутствующие в дрожжевом экстракте.
Варианты 51 и 52 показывали удовлетворительный рост всех тестируемых микроорганизмов, однако, следует подчеркнуть, что в варианте 49 колонии Candida kefyr неожиданно обнаруживали прозрачную зону, что было обусловлено протеолитическим действием на казеин. Другие виды не обнаруживали какой-либо протеолитической активности. Таким образом, можно сделать вывод, что сухое сепарированное молоко может быть использовано в качестве нового маркера протеолитической активности для микроорганизма Candida kefyr в целях его идентификации или дифференциации от остальных видов.
Пример 15
Для группы грамотрицательных и грамположительных бактерий и дрожжей рода Candida проводили тест на антибактериальное действие налидиксовой кислоты в комбинации с дезоксихолатом натрия.
Этот эксперимент проводили путем введения налидиксовой кислоты в концентрациях от 0,01 до 0,05 г. В таблице 23 представлена оценка композиций на их способность ингибировать рост бактерий и стимулировать рост грибов различных видов.
Культуральные среды не стерилизовали в автоклаве, а лишь подвергали плавлению в течение 2-3 минут до полного растворения агара. Затем их распределяли по стерильным чашкам.
Конечный pH полученной культуральной среды составлял 6,8.
Как показано в таблице 23, были культивированы следующие микроорганизмы: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr, Isachenkia orientalis (Candida krusei), Candida glabrata и Candida parapsilosis.
Инкубирование проводили, начиная с использования стандартизированного инокулята при коэффиценте прозрачности 50% методом истощения инокулята на поверхности агаризованной культуральной среды для выделения колоний.
Чашки инкубировали в течение 48 часов при температуре 28±2°С.
Результаты теста показали, что налидиксовая кислота при всех трех тестируемых концентрациях ингибировала все грамотрицательные бактерии, за исключением Pseudomonas aeruginosa. Что касается дрожжей рода Candida, то было неожиданно обнаружено, что налидиксовая кислота, вместо ингибирования роста этих микроорганизмов, способствовала развитию колоний микроорганизмов таких видов, как Candida krusei и Candida glabrata, а также способствовала росту других видов микроорганизмов этого рода, хотя и в меньшей степени.
<b>Таблица 23</b><b>Композиции, приготовленные для проведения тестов на влияние налидиксовой кислоты и дезоксихолата натрия как ингибиторов бактерий</b>
Компоненты
г/л
53
54
55
Смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта
20,0
X
X
X
Монофосфат калия
1,0
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
Глицерин
10 (мл)
X
X
X
Налидиксовая кислота
варьировалась
0,01 г
0,03 г
0,05 г
Агар
15,0
X
X
X
Результат оказался неожиданным. При более тщательном рассмотрении всех возможных случаев можно сделать вывод, что добавление ионов магния в определенном количестве (0,5 г/л в виде сульфата магния) приводило к повышению резистентности Candida к действию налидиксовой кислоты.
Обнаружение отсутствия ингибирования Pseudomonas aeruginosa является интересным фактом, поскольку этот микроорганизм ранее не рассматривался как нежелательный конкурент при диагностике Candida, и его совместная идентификация с Candida представляет особый интерес. Так, например, многие специалисты считают, что отомикоз представляет собой инфекцию грибковой этиологии, тогда как в действительности эта инфекция является бактериальной и ответственна за большинство случаев развития наружного отита, и лишь в незначительном числе случаев это заболевание вызывается грибками. Было установлено, что из всех индивидуумов, обращающихся к отоларингологу за консультацией, наружный отит диагностируется у 5-20% индивидуумов, и большинство из этих случаев имеют бактериальную этиологию. Наружный отит вызывается, главным образом, Pseudomonas, и только в 15-20% из всех случаев этого заболевания причиной его возникновения считают грибковую инфекцию.
Пример 16
Группу экспериментальных вариантов тестировали при двух концентрациях налидиксовой кислоты в комбинации с дезоксихолатом натрия, используемым в качестве ингибитора грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также в комбинации с глицерином и Tween 80 для определения их влияния на рост грибов различных видов.
В таблице 24 представлены композиции, используемые в данном эксперименте.
<b>Таблица 24</b><b>Композиции для тестирования двух концентраций налидиксовой кислоты в комбинации с глицерином и Tween 80</b>
Компоненты
г/л
56
57
58
59
60
61
62
63
64
Смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта
20,0
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Монофосфат калия
1,0
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Налидиксовая кислота
Варьируется
0,03
0,05
-
0,03
0,05
-
0,03
0,05
-
Агар
15,0
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Глицерин
10 (мл)
-
-
-
X
X
X
-
-
-
Tween 80
10 (мл)
-
-
-
-
-
-
X
X
X
pH доводили до 6,8. Эти варианты нагревали до кипения для полной гомогенизации продукта. Стерилизацию в автоклаве не проводили.
Композиции тестировали методом глубинной инокуляции до истощения инокулята, полученного от видов: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida glabrata, Isachenkia orientalis (Candida krusei) и Candida parapsilosis.
Чашки инкубировали в течение 48 часов при температуре 28±2°С.
Результаты теста показали, что действие глицерина как добавки в культуральную среду (варианты 59, 60 и 61), в отличие от действия Tween 80, также используемого в качестве добавки, стимулировало рост колоний всех тестируемых видов. Полученные результаты наблюдались только через 24 часа.
Результаты, полученные для вариантов, содержащих налидиксовую кислоту в обеих концентрациях (0,03 и 0,05 г/л) в комбинации с глицерином, показали, что рост и развитие колоний микроорганизмов вида Candida не только не ингибировались, а даже стимулировались. Результат, полученный с использованием Tween 80, был менее эффектным.
Пример 17
Было протестировано несколько хромогенных и флуорогенных субстратов с использованием различных хромогенных и/или флуорогенных групп для глюкозидазных ферментов (гексозаминидазы и β-глюкозидазы), присутствующих в некоторых микроорганизмах рода Candida. Протокол экспериментов представлен в таблице 25.
<b>Таблица 25</b>
Компоненты
г/л
65
66
67
68
Смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта
20,0
X
X
X
X
Монофосфат калия
1,0
X
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
X
Глицерин
10 (мл)
X
X
X
X
Агар
15,0
X
X
X
X
4-MU-β-D-галактозаминид
0,1
X
-
-
-
X-β-D-галактозаминид
0,1
-
X
-
-
X-β-D-глюкозаминид
0,1
-
-
X
-
X-β-D-glc
0,1
X
-
-
-
Salmon<sup>TM</sup>-β-D-glc
0,1
-
X
-
-
Примечания:
4-MU-β-D-галактозаминид
4-метил-умбеллиферил-N-ацетил-β-D-галактозаминид
X-β-D-галактозаминид
5-бром-4-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-галактозаминид
X-β-D-глюкозаминид
5-бром-4-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид
X-β-D-glc
5-бром-4-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкопиранозид
Salmon<sup>TM</sup>-β-D-glc
6-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкопиранозид
рН композиций доводили до 6,8, и композиции расплавляли в течение 2-3 минут до полного растворения агара. Эти композиции не стерилизовали в автоклаве.
Были засеяны микроорганизмы следующих видов: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida glabrata, Isachenkia orientalis (Candida krusei) и Candida parapsilosis.
Посев микроорганизмов этих видов осуществляли методом серийных разведений для детектирования морфологических и культуральных свойств выделенных колоний на различных субстратах.
Чашки инкубировали при 30°С в течение 48 часов.
В таблице 26 проиллюстрировано благоприятное влияние глицерина, используемого в качестве питательного вещества, на развитие тестируемых микроорганизмов вида Candida.
<b>Таблица 26</b><b>Рост микроорганизмов различных видов Candida в хромогенных и/или флуорогенных композициях</b>
Микроорганизм
Вариант
КОЕ/чашку при разведении 10<sup>-5</sup>
Характеризация колоний
Цвет
Флуоресценция
Морфология
синий
розовый
белый
C. albicans
65
4
-
-
X
X
Круглые, гладкие, набухшие, блестящие, ⌀≈1 мм
66
10
-
-
X
-
67
3
X
-
-
-
68
8
-
-
X
-
C. tropicalis
65
9
X
-
-
-
Круглые, гладкие, набухшие, блестящие, ⌀≈1,2 мм
66
4
-
X
-
-
67
2
-
-
X
-
68
4
-
-
X
-
C. glabrata
65
7
-
-
X
-
Круглые, гладкие, набухшие, блестящие,⌀≤1 мм
66
9
-
-
X
-
67
3
-
-
X
-
68
9
-
-
X
-
C. kefyr
65
3
X
-
-
-
Круглые, гладкие, набухшие, блестящие, ⌀≈1 мм
66
5
-
X
-
-
67
1
-
-
X
-
68
6
-
-
X
-
C. krusei
65
8
-
-
X
-
Уплощенные, мутные с неровными краями, ⌀ варьируется в пределах ≈2-4 мм
66
6
-
-
X
-
67
6
-
-
X
-
68
8
-
-
X
-
C. parapsilosis
65
11
-
-
X
-
С шероховатой поверхностью и ровными краями
66
13
-
-
X
-
67
10
-
-
X
-
68
9
-
-
X
-
Все теструемые варианты обладали явно выраженными хроматическими и флуоресцентными свойствами. Особенно примечательно то, что микроорганизм Candida albicans обладал способностью использовать галактозаминидные и глюкозаминидные субстраты, а Candida tropicalis был способен использовать хромогенные субстраты глюкопиранозидного типа.
Действие фермента галактозаминидазы, присутствующего в Candida albicans, было более очевидным в варианте 65, где колонии идентифицировали по их флуоресценции при освещении УФ-лампой. Однако использование хромогенного субстрата для детектирования, который обладал почти такой же ферментативной активностью (вариант 66), не дало положительных результатов, поскольку эти колонии не продуцировали какую-либо окраску. Такой неожиданно полученный отрицательный результат является отличительным признаком этой конкретной композиции, заявленной в настоящем изобретении.
В варианте 67 выделенные колонии Candida albicans приобретали синюю окраску, что обусловлено использованием хромогенного субстрата, а именно 5-бром-4-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкозаминида.
Колонии Candida tropicalis и Candida kefyr приобретали синюю и розовую окраску в вариантах 65 и 66 соответственно в зависимости от включения компонента X или Pink в гликозид, последний из которых использовался обоими видами.
Другие тестируемые виды, такие как Candida parapsilosis, Candida krusei и Candida glabrata, не реагировали на введение каких-либо субстратов, а поэтому они должны быть идентифицированы по их морфологическим свойствам.
Пример 18
В целях идентификации и дифференциации микроорганизмов вида Candida было проведено тестирование композиции с использованием антибактериальных агентов широкого спектра и специфических хромогенных субстратов.
Этот тест проводили для препарата, описанного в таблице 27. В качестве эталонной среды использовали среду Chromagar Candida (Chromagar, France).
Композицию получали путем взвешивания всех ингредиентов и использования деионизованной воды. рН доводили до 6,8. Композицию нагревали до кипения в течение 2-3 минут до полного растворения агара.
Эталонную среду с конечным рН 5,9 получали в соответствии с инструкциями производителя, напечатанными на этикетке.
Для оценки ингибирующей и ростстимулирующей способности экспериментальной композиции была протестирована группа грибов и бактерий, включая: Candida albicans ATCC 102321, Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida krusei (Isachenkia orientalis), Candida glabrata (Torulopsis), Candida parapsilosis, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Saccharomyces uvarum ATCC 9080, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 13315, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Shigella flexneri ATCC 12022, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Enterococcus faecalis ATCC 19433 и Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Результаты были вполне удовлетворительными. Все грамположительные и грамотрицательные бактерии, засеянные в культуральную среду, ингибировались, за исключением Pseudomonas aeruginosa. Дифференциацию видов Candida albicans, Candida tropicalis и Candida kefyr можно было проводить по цвету выделенных колоний. Кроме того, с использованием композиций согласно изобретению, микроорганизмы Candida krusei и Candida parapsilosis могут быть также идентифицированы по их белой окраске, причем один из них - по матовой, а другой - по блестящей окраске соответственно и по морфологии их колоний.
Эталонная среда, Chromagar Candida, облегчала идентификацию только видов Candida albicans, Candida tropicalis и Candida krusei и полностью ингибировала все указанные протестированные бактерии.
<b>Таблица 27</b><b>Состав хромогенной среды согласно изобретению</b>
Компоненты
г/л
69
Смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта
20,0
X
Монофосфат калия
1,0
X
Сульфат магния
0,5
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
Агар
15,0
X
Глицерин
10 мл
X
Налидиксовая кислота
0,03
X
X-β-D-глюкозаминид
0,1
X
Salmon<sup>TM</sup>-β-D-glc
0,1
X
Примечания:
X-β-D-глюкозаминид:
5-бром-4-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D- глюкозаминид
Salmon<sup>TM</sup>-β-D-glc:
6-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкопиранозид
Пример 19
Для детекции других ферментативных активностей в микроорганизмах рода Candida проводили эксперимент для того, чтобы определить, какой из тестируемых субстратов может быть использован для идентификации наибольшего числа релевантных видов грибов. Этот эксперимент был совершенно необходим, поскольку неясно (пример 17), будут ли, в композиции согласно изобретению, другие субстраты с той же активностью давать те же самые ответы, так как для некоторых видов были получены отрицательные и противоречивые ответы.
Варианты, указанные в таблице 28, включают нижеследующие хромогенные и флуорогенные субстраты в концентрации 0,1 г/л. Ингридиенты были включены в основную композицию, соответствующую варианту 69 в таблице 25, в соответствии с протоколом, проиллюстрированным в таблице 28.
<b>Таблица 28</b><b>Оценка других хромогенных субстратов для детектирования эстеразной, фосфолипазной и глюкозидазной активностей</b>
Препарат
г/л
70
71
72
73
74
75
76
77
78
Композиция варианта 20, таблица 4
37,3
Каприлат Magenta
0,1
X
-
-
-
-
-
-
-
-
X-нонаноат
0,1
-
X
-
-
-
-
-
-
-
X-фосфоинозит
0,1
-
-
X
-
-
-
-
-
-
4-MU-β-D-xyl
0,1
-
-
-
X
-
-
-
-
-
X-α-D-манозид
0,1
-
-
-
-
X
-
-
-
-
X-α-D-gal
0,1
-
-
-
-
-
X
-
-
-
X-β-D-glcUA·Na
0,1
-
-
-
-
-
-
X
-
-
Salmon<sup>TM</sup>-β-D-glc
варьировалась
-
-
-
-
-
-
-
0,1
0,5
Примечание:
Каприлат Magenta:
5-бром-6-хлор-3-индоксил-каприлат
X-нонаноат:
5-бром-4-хлор-3-индоксил-нонаноат
X-фосфоинозит:
аммониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозит-1-фосфата
4-MU-β-D-xyl:
4-метил-умбеллиферил-β-D-ксилопиранозид
X-α-D-манозид:
5-бром-4-хлор-3-индоксил-α-маннопиранозид
X-α-D-gal:
5-бром-4-хлор-3-индоксил-α-галактозид
X-β-D-glcUA·Na:
циклогексиламмониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индоксил-β-D-глюкуроновой кислоты
Salmon<sup>TM</sup>-β-D-glc:
6-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкопиранозид
рН композиций доводили до 6,8±0,1, и эти композиции стерилизовали путем кипячения в течение 2-3 минут до полного растворения агара. Затем они были подвергнуты глубинной инокуляции до истощения инокулята. Для посева были использованы нижеследующие виды: четыре выделенных штамма Candida albicans, Candida albicans ATCC 10231 и Candida albicans ATCC 17111, Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida krusei, Isachenkia orientalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Saccharomyces uvarum ATCC 9080 и Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Чашки инкубировали при 30°С в течение 48 часов.
Вообще говоря, можно установить, какие из хромогенных или флуорогенных субстратов разлагались микроорганизмами различных видов Candida.
Candida albicans идентифицировали по его фосфолипазной активности (с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозитфосфата) и β-глюкозидазной активности, но только при очень высокой концентрации субстрата (6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида).
Candida tropicalis идентифицировали по его фосфолипазной активности (с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозитфосфата), β-глюкозидазазной активности (с использованием 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида) и маннозидазной активности (с использованием 5-бром-4-хлор-3-индоксил-α-D-маннопиранозида).
Candida kefyr идентифицировали по его β-глюкозидазной активности (с использованием 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида).
Candida parapsilosis идентифицировали по его фосфолипазной активности (с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозитфосфата) и ксилозидазной активности (с использованием метил-умбеллиферил-β-D-ксилопиранозида).
Candida krusei, Isachenkia orientalis и Candida glabrata идентифицировали по их белой окраске (мутной или блестящей соответственно), образуемой из-за отсутствия вышеупомянутых ферментативных активностей.
Saccharomyces uvarum ATCC 9080 идентифицировали по его фосфолипазной активности. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 не реагировал ни на один из используемых субстратов, хотя его колонии давали зеленоватое флуоресцентное свечение при их облучении УФ-лампой.
Пример 20
Композицию, обозначенную вариант 68 в таблице 25, смешивали с хромогенными и флуорогенными субстратами, описанными в таблице 29.
Каждый вариант тестировали при 3 различных значениях pH: 6,0, 6,4 и 6,8.
Были получены следующие результаты: Candida albicans был идентифицирован по его L-пролинаминопептидазной активности (с использованием гидробромида L-пролин-7-амидо-4-метил-кумарина) и α-глюкозидазной активности (с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида); Candida tropicalis и Candida parapsilosis были идентифицированы по их α-глюкозидазной активности (с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида). Candida parapsilosis, кроме того, реагировал с субстратом для L-пролин аминопептидазы (гидробромид L-пролин-7-амидо-4-метил-кумарина).
<b>Таблица 29</b><b>Оценка других хромогенных субстратов для детектирования аминопептидазной активности, глюкозидазной активности и активности щелочной фосфатазы</b>
Препарат
г/л
79
80
81
82
83
84
Композиция варианта 20 в таблице 4
37,3
X
X
X
X
X
X
H-Pro-AMC-HBr
0,1
X
-
-
-
-
-
PNP-β-D-галактозаминид
0,1
-
X
-
-
-
-
PNP-β-D-глюкозаминид
0,1
-
-
X
-
-
-
4-MU-α-D-glc
0,1
-
-
-
X
-
-
Y-phos.diNa
0,1
-
-
-
-
X
-
Фосфат 3-индоксилхолина
0,1
-
-
-
-
-
X
Примечания:
H-Pro-AMC-HBr:
гидробромид L-пролин-7-амидо-4-метил-кумарина
PNP-β-D-галактозаминид:
4-нитрофенил-N-ацетил-β-D-галактозаминидин
PNP-β-D-глюкозаминид:
4-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминидин
4-MU-α-D-glc:
4-метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозид
Y-phos.diNa:
натриевая соль 3-индоксил-фосфата
Candida albicans не давал удовлетворительных результатов в композиции согласно изобретению в присутствии тестируемых гексозаминидазных субстратов (PNP-β-D-галактозаминида и PNP-β-D-глюкозаминида), поскольку оба из них диффундировали в среду, и хромогенная реакция не могла быть ассоциирована с определенной колонией.
Остальные виды Candida не разлагали ни один из тестируемых субстратов.
Композиции с pH 6,4 и 6,8 лучше всего стимулировали наблюдаемое развитие колоний (характерного размера и морфологии) и продуцирование более яркой окраски.
Пример 21
Целью данного эксперимента является оценка влияния добавления трегалозы или глицерина на рост и дифференциацию микроорганизмов вида Candida по хромогенной или флуорогенной реакции. Тестируемая композиция и ее варианты представлены в таблице 30.
<b>Таблица 30</b><b>Состав питательной среды для тестирования различных компонентов</b>
Компоненты
г/л
85
86
87
88
Смесь экстракта сладкого картофеля и дрожжевого экстракта
20,0
X
X
X
X
Монофосфат калия
1,0
X
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
X
Глицерин
10 (мл)
X
X
Трегалоза
10,0
X
X
Налидиксовая кислота
0,03
X
X
X
X
Агар
15,0
X
X
X
X
X-β-D-глюкозаминид
0,1
X
X
X
X
Salmon<sup>TM</sup>-β-D-glc
0,1
X
X
X
X
X-фосфоинозит
0,1
X
X
4-MU-α-D-glc
0,1
X
X
В таблице 31 представлены результаты этих экспериментов.
Присутствие глицерина благоприятствовало росту некоторых тестируемых видов (Candida albicans, Candida krusei).
Трегалоза, для некоторых видов, в отсутствие глицерина не только не стимулировала рост, но даже подавляла его (например, в случае Candida krusei).
Добавление трегалозы приводило к значительному ускорению хромогенной реакции для Candida albicans и Candida tropicalis. Установление этого факта было неожиданным, и о нем нигде ранее не сообщалось, хотя трегалоза широко используется в культуральных средах для стимуляции роста и для идентификации Candida glabrata.
Candida albicans идентифицировали по его гексозаминидазной активности (с использованием 5-бром-4-хлор-3-индоксил-N-ацетил-β-D-глюкозаминида), α-глюкозидазной активности (с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида) и фосфолипазной активности (с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозитфосфата); Candida tropicalis идентифицировали по его α- и β-глюкозидазазным активностям (с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида и 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида) и фосфолипазной активности (с использованием аммониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индоксил-мио-инозитфосфата); Candida kefyr идентифицировали по его β-глюкозидазной активности (с использованием 6-хлор-3-индоксил-β-D-глюкопиранозида); Candida parapsilosis идентифицировали по его α-глюкозидазной активности (с использованием метил-умбеллиферил-α-D-глюкопиранозида). Candida krusei и Candida glabrata идентифицировали по их белой окраске (мутной или блестящей, соответственно), образуемой из-за отсутствия вышеупомянутых ферментативных активностей.
<b>Таблица 31</b><b>Характеризация различных видов Candida в хромогенных и/или флуорогенных композициях</b>
Микроорганизм
Вариант
Характеризация колоний
Цвет
Флуоресценция
Морфология
Синий
Фиолетовый
Розовый
Белый
C. albicans
85
X+
-
-
-
-
Круглые, гладкие, набухшие, блестящие, ⌀≈2 мм
86
X+
-
-
-
X
87
X
-
-
-
-
88
X
-
-
-
X
C. tropicalis
85
-
X+
-
-
-
Круглые, гладкие, набухшие, блестящие, ⌀≈1-2 мм
86
-
X
-
-
X
87
-
X
-
-
-
88
-
X
-
-
X
C. glabrata
85
-
-
-
X
-
Круглые, гладкие, набухшие, блестящие, ⌀≤1 мм
86
-
-
-
X
-
87
-
-
-
X
-
88
-
-
-
X
-
C. kefyr
85
-
-
X
-
-
Круглые, гладкие, набухшие, блестящие, ⌀≈1 мм
86
-
-
X
-
-
87
-
-
X
-
-
88
-
-
X
-
-
C. krusei
85
-
-
-
X
-
Уплощенные, мутные, с неровными краями, ⌀ варьируется в пределах ≈2-4 мм
86
-
-
-
X
-
87
-
-
-
X+
-
88
-
-
-
X+
-
C. parapsilosis
85
-
-
-
X
-
С шероховатой поверхностью и ровными краями
86
-
-
-
X
X
87
-
-
-
X
-
88
-
-
-
X
X
Примечания:
X+: Яркая окраска
Пример 22
Композиция для культивирования грибов различных видов представлена в таблице 32.
pH композиции доводили до 6,6.
В результате этих тестов была проведена весьма четкая дифференциация грибов, представляющих клинический интерес. В частности, в случае вариантов 90 и 93 интенсивность хроматических реакций была гораздо выше интенсивности, которая наблюдалась в известных хромогенных культуральных средах, описанных ранее.
<b>Таблица 32</b><b>Питательная среда для анализа эффекта добавления мальтозы и трегалозы в присутствии глицерина</b>
Компоненты
г/л
89
90
91
92
93
Экстракт сладкого картофеля
Варьируется
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
Дрожжевой экстракт
10,0
X
X
X
X
X
Монофосфат калия
1,0
X
X
X
X
X
Сульфат магния
0,5
X
X
X
X
X
Дезоксихолат натрия
0,5
X
X
X
X
X
Глицерин
10 (мл)
X
X
X
X
X
Трегалоза
10,0
X
Мальтоза
10,0
X
Налидиксовая кислота
0,03
X
X
X
X
X
Агар
15,0
X
X
X
X
X
X-β-D-глюкозаминид
0,1
X
X
X
X
X
Salmon<sup>TM</sup>-β-D-glc
0,1
X
X
X
X
X
X-фосфоинозит
0,1
X
В частности, микроорганизм Candida albicans, который в присутствии трегалозы или мальтозы, объединенными с глицерином, неожиданно обнаруживал зеленовато-синию или зеленую окраску (в случае варианта 90), был очень хорошо дифференцирован от остальных видов; Candida tropicalis приобретал яркую пурпурно-синюю окраску, однако в случае вариантов 91 и 92 его колонии были голубовато-розовыми. Candida kefyr во всех вариантах продуцировал розовую окраску, тогда как Candida parapsilosis в вариантах 89, 90 и 91 имел белую окраску, а в варианте 92 он приобретал бледно-синюю окраску. Микроорганизмы Candida krusei и Candida glabrata, которые имели белую окраску, могли быть идентифицированы по их мутности или яркости соответственно, как было описано в вышеприведенных примерах.
В случае Candida albicans и Candida tropicalis удвоение концентрации экстракта сладкого картофеля приводило к повышению интенсивности хромогенной реакции. В общих чертах, это приводило к улучшению морфологии (увеличению размера) колоний микроорганизмов всех видов.