Полиморфизм микросателлитных локусов у сортов черной смородины ( Ribes nigrum L. ) из коллекции ВНИИСПК

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, № 1, с. 46-54

УДК 634.723.1:575.174.015.3:577.21 doi: 10.15389/agrobiology.2015.1.46rus

ПОЛИМОРФИЗМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ У СОРТОВ ЧЕРНОЙ СМОРОДИНЫ (Ribes nigrum L.) ИЗ КОЛЛЕКЦИИ

ВНИИСПК*

А.В. ПИКУНОВА1, С.Д. КНЯЗЕВ1, А.Ю. БАХОТСКАЯ1, А.А. КОЧУМОВА2

Черная смородина — ведущая ягодная культура в России. Необходимость совершенствования сортимента по целому ряду направлений требует привлечения новых эффективных методов в селекцию. Один из современных подходов при работе с генетическими ресурсами — применение ДНК-маркеров. Впервые в России мы использовали микросателлитные ДНК-маркеры для изучения черной смородины. В настоящей работе проведено генотипирование 27 сортообразцов этой культуры из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур (ВНИИСПК) (в том числе 16 сортов селекции ВНИИСПК) по 14 микросателлитным локусам. Для анализа полиморфизма микросателлитных локусов использовали электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов в 6 % денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием нитратом серебра. Все локусы, кроме MS06g03, оказались полиморфными (в среднем было ам-плифицировано 4,9 аллеля на локус). С ДНК некоторых сортообразцов в одном локусе амплифи-цировалось три фрагмента, что, вероятно, связано с дупликацией этих микросателлитных локусов. Из 68 амплифицированных фрагментов 45 (66 %) были редкими аллелями с частотой й 0,2. Обнаружено восемь уникальных фрагментов, амплифицированных только на ДНК одного из протестированных сортообразцов. Наблюдаемая гетерозиготность варьировала от 0,259 для локуса g2-H21 до 1 для локуса e4-D03 (в среднем составила 0,608). По сочетанию аллелей в локусе можно было различить от 3 (g2-H21, e1-O21) до 15 (g2-G12) генотипов. Минимальный набор из четырех локусов (e4-D03, g1-M07, g1-E03, g2-B20) позволил дифференцировать все протестированные сортообразцы, то есть для каждого образца был получен уникальный мультилокусный профиль. Коэффициенты попарного генетического сходства варьировали от 0,110 (между сортами Оджебин и Шаровидная) до 0,950 (между сортами Говтва и Ртищевская) и в среднем составили 0,346. Проведен кластерный анализ генетического сходства сортообразцов и построена дендрограмма, в которой выделились несколько кластеров с высокой бутстреп-поддержкой. Изучение потока аллелей через родословные проанализированных сортов показало, что в большинстве случаев распределение аллелей между родственными сортами не противоречило родословным, но были обнаружены и случаи расхождения сведений родословных и SSR-анализа. Так, у сорта Очарование (получен в скрещивании сеянец № 1168 х сорт Экзотика) в трех локусах (e4-D03, g1-E03, g2-B20) не было общих аллелей с сортом Экзотика. Возможно, что в действительности произошло опыление другой пыльцой, нельзя также исключить ошибку при размножении и пересадке или мутации в указанных локусах. Сорта Оджебин и Бинар (выведен при скрещивании сортов Оджебин х Нарядная) тоже не имели общих аллелей в двух локусах (g1-M07, g1-E03). Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения протестированных маркеров для оценки генетического разнообразия отечественного генофонда черной смородины, а также для разработки методов идентификации и паспортизации ее сортов.

Ключевые слова: черная смородина, ДНК-маркеры, микросателлиты, полиморфизм, идентификация, генофонд, Ribes nigrum L.

На долю черной смородины в России приходится половина площадей, занятых под ягодниками (1). На 2013 год в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию, вошло 170 сортов этой важнейшей ягодной культуры (2). Совершенствованием ее сортимента в России занимается около 20 научных учреждений. Селекционные исследования направлены на улучшение биохимического состава ягод, создание продуктивных стабильно плодоносящих сортов, устойчивых к болезням и вредителям, пригодных к механизированной уборке урожая и др. (1). Во Всероссийском НИИ селекции плодовых культур (ВНИИСПК) к настоящему времени в государственное сортоиспытание переданы 26 сортов, из них 12 включены в Государственный реестр сортов, до-

* Работа выполнена при поддержке РНФ (№ проекта 14-1600127) и Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (соглашение № 8820).

46

пущенных к использованию. Собрана обширная коллекция сортообразцов, включающая более 100 интродуцированных сортов и более 700 форм собственной селекции.

Успех селекционных исследований во многом зависит от изучения, подбора и систематизации исходного материала (3). Черная смородина имеет диплоидный набор хромосом (п = 7), что в определенной степени облегчает изучение ее генома по сравнению с геномами полиплоидных видов. Пионерами в использовании ДНК-маркеров для анализа генетического полиморфизма при работе с генетическими ресурсами черной смородины и других представителей рода Ribes L. стали ученые из Шотландского института селекции сельскохозяйственных культур (Scottish Crop Research Institute, Invergowrie, Dundee, Scotland, Великобритания), применившие RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism), ISSR (inter-simple sequence repeat), SNP (single nucleotide polymorphism) и другие маркеры (4, 5). В результате на основании микросателлитных, SNP- и AFLP-маркеров впервые построена генетическая карта черной смородины (6), разработан и применяется метод маркер-опосредованного отбора генотипов, имеющих ген устойчивости к почковому клещу Се (7). В России ДНК-маркирование для оценки генетической коллекции представителей рода Ribes используется сравнительно недавно (8).

В настоящее время наблюдается тенденция к применению высоковоспроизводимых кодоминантных SSR- и SNP-маркеров. SSR (микро-сателлитные) маркеры используются как в фундаментальных исследованиях для оценки генетического полиморфизма, изучения филогенетических отношений, построения генетических карт для групп сцепления, так и в прикладных целях — для проверки родословных, при разработке систем идентификации и паспортизации, поиске маркеров, ассоциированных с хозяйственно полезными признаками, при маркер-опосредованном отборе интересующих генотипов на ранних стадиях развития растений (9). SSR-маркеры применялись для оценки разнообразия генетических коллекций Ribes в Италии и Северной Европе (10, 11).

Мы впервые использовали микросателлитные маркеры для оценки межсортового полиморфизма, определения генетического сходства между сортообразцами, проверки родословных у форм черной смородины из российской коллекции ВНИИСПК, что позволило обсуждать перспективы применения полиморфизма микросателлитных локусов в работе с генетическими ресурсами этой ягодной культуры.

Цель представляемой работы заключалась в изучении полиморфизма микросателлитных локусов у сортов черной смородины из коллекции ВНИИСПК.

Методика. Объектом исследования были 27 сортов черной смородины из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур, в том числе 16 сортов селекции ВНИИСПК — Ажурная, Грация, Гамма, Дачница, Орловский вальс, Монисто, Орловия, Искушение, Чудное мгновение, Очарование, Сластена, Черная вуаль, Экзотика, Блакестон, Зуша, Кипиа-на, а также сорта других оригинаторов — Оджебин, Титания, Шаровидная, Селеченская, Минай Шмырев, Ртищевская, Консорт, Бинар, Говтва, Канахама, Ядреная. Кроме того, сорта Лентяй и Орловская серенада были проанализированы не по всем использованным локусам. Результаты, полученные по этим сортам, учитывались только при анализе соответствия распределения аллелей между родственными сортами и данных по родословным (распределение аллелей между родственными сортами сверяли по

47

всем полиморфным локусам, для которых имелись такие данные).

ДНК выделяли из молодых листьев СТАВ-методом (12).

Всего нами были проанализированы 14 микросателлитных локусов (http://www.fruitbreeding.co.uk/RibesGenomicsSSRs.asp) — e1-O01, e1-O21, e3-B02, e4-D03, g1-B02, g1-E03, g1-K04, g1-M07, g2-B20, g2-H21, g2-J08, g2-L17, g2-G12, MS06g03 (13). ПЦР-анализ проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 1* ПЦР буфер, 200 мкМ нуклеотидов, 2 мкМ прямого праймера, 2 мкМ обратного праймера, 0,3 ед. Taq ДНК-полимеразы и 10 нг ДНК, в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). Реакцию амплификации осуществляли в следующем режиме: предварительная денатурация — 5 мин при 94 °С; денатурация — 30 с при 94 °С, отжиг праймера (при температуре, подобранной для каждого маркера, см. раздел «Результаты»), синтез ДНК — 30 с при 72 °С (всего 35 циклов); завершающая элонгация — 10 мин при 72 °С.

При анализе полиморфизма микросателлитных локусов использовали электрофоретическое разделение амплификатов в 6 % денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) в камере Sequi-Gen GT System (38*50 см) («Bio-Rad», США) с последующим окрашиванием нитратом серебра (14). Размеры фрагментов определяли, сравнивая с маркером молекулярных масс 10 bp DNA Ladder («Invitrogen™», США).

Частоту аллеля рассчитывали как сумму частот гомозиготного генотипа и полусумму частот гетерозиготных генотипов, содержащих этот аллель (15). Ожидаемую гетерозиготность вычисляли как He = 1 - pi2, где pi — частота /-го аллеля. Для оценки наблюдаемой гетерозиготности (Ho) в соответствующем локусе число гетерозиготных образцов делили на общее число образцов. Редким считали аллель с частотой 0,2 и менее. При определении частоты аллеля, вероятности идентичности в соответствии с законом Харди-Вайберга HW P(ID) и вероятности идентичности при анализе сибсов Sib P(ID) использовали программу GENECAP (16). Частоту ноль-аллеля (r) вычисляли по формуле r = (He - HH.)/(1 + HQ). Расчет коэффициентов сходства Жаккара (Jaccard similarity coefficient) (17) и построение дендрограммы осуществляли с помощью программы PAST (18). Дендрограмму строили методом кластерного анализа UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) (19) с использованием коэффициента Жаккара, число репликаций — 1000.

Результаты. При анализе 14 микросателлитных локусов (табл. 1) у 27 сортообразцов смородины были выявлены имеющие от 1 (MS06g03) до 8 (e4-D03) аллелей, что в среднем составило 4,9 аллеля на локус. При этом все локусы, кроме MS06g03, оказались полиморфными.

Для всех локусов, кроме MS06g03, у черной смородины известно расположение на генетической карте групп сцепления (в частности, локусы, включенные в анализ, расположены в семи различных группах сцепления) (6). Праймеры для локуса MS06g03 были первоначально разработаны на основании сиквенса ДНК яблони и картированы в 10-й группе сцепления в семье от скрещивания сортов Фиеста * Дискавери, MS06g03 рассматривается как мультилокусный маркер — у яблони при его амплификации образуются фрагменты ДНК размером 154-190 п.н. (13), а у смородины у всех сортообразцов наблюдается фрагмент длиной 140 п.н. Вероятно, локус находится в весьма консервативной части генома смородины черной.

В большинстве случаев у каждого генотипа для конкретного локуса было выявлено не более двух фрагментов, но в некоторых локусах у ряда образцов амплифицировались три фрагмента (у сорта Ядреная — в локусе

48

g2-B20, Селеченская — e1-O01, у сортообразцов Гамма, Грация, Орловия, Черная вуаль, Шаровидная, Зуша, Кипиана — в e3-B02). В литературе есть сообщения об амплификации более чем двух аллелей в некоторых микро-сателлигных локусах у диплоидных форм, что связано с дупликацией мик-росателлитных локусов на одной и той же или на разных хромосомах (20).

1. Обозначения и режимы амплификации микросателлитных локусов, по которым были проанализированы сортообразцы черной смородины (Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур

Локус

Группа

сцепления

а

Прямой праймер

Обратный праймер

e1-O01

e1-O21

e3-B02

e4-D03

g1-B02

g1-E03

g1-K04

g1-M07

g2-B20

g2-H21

g2-J08

g2-L17

g2-G12

MS06g03

6 CCT TTC CAG AGA AAA CTC AAA CA AAG TAT GGG AAC AAC GGC AG

4 TCT CTC CAA CTG AGA AGG AAA A GAT TTG TTC TTG TGC AGC GA

5 AAG ACG AAG ACG ACG ACG AT

3 CCC AAA AGC AAA TTT AGG GT

2 CGA CTT CAT CGC TCT CCT CT

1 TAA CTG CGG GGT TCC TAC AG 1 TGT TCC CTG TTT CCT TCA AAA

1 TCC CGT TAC TGG AGT GGT GT

3 CTC CAT CAA ATC CCT CGT TT

4 TGC CCT TTT TGG TCA TTT TC

2 CGC CGA GCT CTA ATC ACT GT

4 TTT GGA AAA CCT CCC CTT TT

7 GTG ACC CAC CTA AAC CGT CC

6 CGG AGG GTG TGC CGA AG

CTG ATC TTT GCC GAA TGG TT GTG AGG CAT GGA ACC ACT TT CCA TTG ATT TGG TGA GGG T CCA CCG CTA CCA ATA ACC AT GGA CGT GGA CGA TGA GAG TT CCA TGG TTT TCC GAT TTG TT TCT TGC TTC CCA AAC AGT ATC A CAA TCG TCG ATG AAG GTC TG ATA GCC CAT GCC CAT ATT CA GAG CTG TTG CTG TTG CCA TA GGA GTG GAG GGT TGG AAA AT GCC CAG CCC ATA TCT GCT

Г, °C

52

50

52

56

50

56

52

52

52

50

54

50

52

52

Примечание. Г — температура отжига; а — на генетической карте Ribes nigrum (6), б — локус у чер-

ной смородины не картирован.

На основе микросателлитных профилей у 27 сортообразцов мы проанализировали распределение аллелей для 13 из использованных полиморфных локусов (табл. 2).

2. Характеристика 13 полиморфных микросателлитных локусов, выявленных у 27 сортообразцов черной смородины (Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур

Локус | n 1 Размер аллеля :, п.н. (частота) Не | Но 1 r 1 А, Б

e1-O01 6 138а 140аб 142 145а 147 149а 0,737 0,769 -0,019 0,402,

(0,093) (0,023) (0,419) (0,163) (0,209) (0,093) 0,101

e1-O21 3 28 8аб 292 294 0,423 0,407 0,011 0,639,

(0,029) (0,714) (0,257) 0,402

e3-B02 4 188 191 193а 194а 0,655 0,800 -0,088 0,467,

(0,486) (0,257) (0,200) (0,057) 0,177

e4-D03 8 197а 201а 205а 207аб 210а 212а 217а 224а 0,840 1,000 -0,087 0,342,

(0,180) (0,100) (0,160) (0,020) (0,200) (0,200) (0,100) (0,040) 0,046

g1-B02 3 203 205 207 0,610 0,590 0,016 0,495,

(0,231) (0,513) (0,256) 0,216

g1-E03 7 232аб 235 237 239а 245а 249аб 270а 0,726 0,593 0,077 0,416,

(0,025) (0,400) (0,275) (0,175) (0,075) (0,025) (0,025) 0,118

g1-K04 4 285аб 290 295 298а 0,560 0,556 0,003 0,530,

(0,026) (0,605) (0,237) (0,132) 0,250

g1-M07 7 200а 204а 207а 209 212а 217а 222аб 0,739 0,704 0,020 0,405,

(0,140) (0,140) (0,047) (0,442) (0,140) (0,070) (0,023) 0,097

g2-B20 5 147а 168а 178 181а 185а 0,720 0,556 0,096 0,420,

0,189 0,135 0,432 0,189 0,054 0,119

g2-H21 3 265а 267 273а 0,361 0,259 0,075 0,680,

(0,156) (0,781) (0,063) 0,443

g2-J08 4 158а 160 162а 164а 0,514 0,444 0,046 0,562,

0,083 0,667 0,167 0,083 0,274

g2-L17 6 150а 152а 154а 161 168а 171а 0,580 0,296 0,180 0,510,

(0,063) (0,063) (0,094) (0,625) (0,094) (0,063) 0,200

g2-G12 7 190аб 195а 203а 207а 209а 212 215 0,997 0,926 0,035 0,355,

(0,022) (0,178) (0,089) (0,089) (0,156) (0,244) (0,222) 0,058

Среднее 0,652 0,608 0,192,

_______________________________________________________________________ 0,479

Примечание. А — Sib P(ID) (вероятность идентичности при анализе сибсов), Б — HW P(ID) (вероятность идентичности в соответствии с законом Харди-Вайберга); n — число аллелей, а — редкие аллели, б — уникальные аллели, амплифицируемые у одного сортообразца из 27 изученных.

Ожидаемая гетерозиготность варьировала от 0,361 в локусе g2-H21

49

до 0,997 в локусе g2-G12 (в среднем 0,652), в то время как наблюдаемая гетерозиготность — от 0,259 в локусе g2-H21 до 1 в локусе e4-D03 (в среднем 0,608). Таким образом, средние значения для наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности не сильно различались, что обусловлено природой изучаемого объекта. Как известно, перекрестноопыляемые растения, к которым относится черная смородина, характеризуются большей гетерози-готностью по сравнению с самоопыляемыми (15). К тому же вегетативное размножение плодово-ягодных культур позволяет закрепить гетерозиготное состояние генотипа независимо от того, насколько стабильным будет проявление признаков в первом поколении. Поэтому к отличительным особенностям таких культур относится высокая гетерозиготность, которую только усиливает использование метода отдаленной гибридизации и привлечение различных видов в селекцию.

3. Сортоспецифичные фрагменты, амплифи-цируемые в микросателлитных локусах у черной смородины (Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур

Сортообразец I Локус/размер фрагмента

Орловия g1-K04/285 п.н., g1-E03/232 п.н.

Оджебин g1-M07/222 п.н.

Монисто e4-D03/207 п.н.

Минай Шмырев e1-O21/288 п.н.

Бинар e 1-O01/140 п.н.

Титания g1-E03/249 п.н.

Шаровидная g2-G12/190 п.н.

В трех локусах (e1-O01, e3-B02 и e4-D03) наблюдаемая гетерозиготность превысила ожидаемую. В остальных девяти локусах, наоборот, ожидаемая гетерозиготность была выше наблюдаемой, что указывает на наличие гомозиготных генотипов или присутствие неампли-фицируемого ноль-аллеля. Теоретическая частота ноль-аллеля оказалась положительным значением для всех локусов, кроме e1-O01, e3-B02, e4-D03, и варьировала от -0,088 до 0,180.

Вероятность идентичности двух генотипов HW P(ID) варьировала от 0,046 по локусу e4-D03 до 0,443 по локусу g2-H21 (в среднем 0,203), вероятность идентичности двух сибсов Sib P(ID) — от 0,342 по локусу e4-D03 до 0,680 по локусу g2-H21 (в среднем 0,489).

Из 68 фрагментов, амплифицированных в 14 локусах, 45 (66 %) соответствовали редким аллелями с частотой, равной или менее 0,2. Также были обнаружены восемь уникальных фрагментов, амплифицированных только на ДНК одного из протестированных сортообразцов (табл. 3).

По сочетанию аллелей в локусе можно было различить от 3 (g2-H21, e1-O21) до 15 (g2-G12) генотипов. Например, в локусе g1-K04, в котором амплифицируется 4 аллеля, наблюдались пять сочетаний аллелей (генотипов), при этом сорт Орловия имел уникальный аллель размером приблизительно 285 п.н. (рис. 1).

Минимальный набор из четырех локусов (e4-D03, g1-M07, g1-E03, g2-B20) позволил различить все протестированные сортообразцы, то есть для каждого образца был получен уникальный мультилокусный профиль.

На основе SSR-спектров мы построили дендрограмму сходства для 27 сортообразцов черной смородины (рис. 2). Полученные коэффициенты попарного генетического сходства варьировали от 0,11 (между сортами Оджебин и Шаровидная) до 0,95 (между сортами Говтва и Ртищевская) и в среднем составили 0,346.

В дендрограмме выделились несколько кластеров с высокой бутст-реп-поддержкой (БП). На близком генетическом расстоянии вместе кластеризовались сорта Говтва и Ртищевская (БП 100 %) на несколько большем генетическом расстоянии объединились сорта Чудное мгновение и Экзотика (БП 60 %), у которых материнские формы — это сеянцы из од-

50

ной семьи; к ним примкнул сорт Кипиана (БП 90 %), для которого отцовской формой служил сорт Экзотика. Сорта Гамма и Грация, полученные отбором из той же гибридной семьи, что и сорт Кипиана, кластеризовались отдельно от сортов Экзотика и Кипиана. По данным RAPD-анализа, также наблюдалась кластеризация сортов Гамма и Грация с высоким значением БП, в то время как сорт Кипиана в этот кластер не вошел (8). Вероятно, подобное свидетельствует о том, что сорта Гамма и Грация генетически более сходны друг с другом, чем с сортами Кипиана и Экзотика. Отдельный кластер также сформировали выведенные в Швеции сорта Ти-тания и Оджебин (БП 66 %), имеющие в родословной скандинавский подвид смородины черной.

Рис. 1. Электрофореграмма фрагментов амплификации микросателлитного локуса g1-K04 у 27 изученных сортообразцов черной смородины (Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур: 1-5 — условные генотипы по локусу; M — маркер молекулярных масс (10 bp DNA Ladder, «Invitrogen™», США; справа указаны размеры фрагментов).

Анализ потока аллелей через родословные родственных проанализированных сортов показал, что в большинстве случаев распределение аллелей между ними не противоречило родословным. Так, родительский сорт Лентяй и его производные в первом поколении (сорта Ажурная, Орловский вальс, Сластена) имели хотя бы один общий аллель по всем протестированным микросателлитным локусам. То же происходило с сортом Минай Шмырев и с сортами, полученными от него в первом поколении (Зуша, Лентяй, Орловская серенада), а также с сортом Экзотика и потомками этого сорта в первом поколении (сорта Кипиана, Гамма, Грация). Однако у сорта Очарование, для которого по родословной сорт Экзотика служил отцовской формой, в трех локусах (e4-D03, g1-E03, g2-B20) не было общих с ним аллелей. Возможно, что в действительности произошло опыление другой пыльцой, нельзя исключить и ошибку при размножении и пересадке, а также мутации в этих локусах. Сорта Оджебин и Бинар (получен от скрещивания сортов Оджебин х Нарядная) не имели общих аллелей в двух микросателлитных локусах (g1-M07, g1-E03).

При генотипировании микросателлитных локусов у коллекционных сортов черной смородины из Северной Европы в ряде случаев не удалось подтвердить генетическую идентичность одноименных образцов из разных коллекций, например один из 10 сортообразцов сорта Оджебин оказался не идентичен остальным (11). В работе S. Reim с соавт. 11 микросателлитных локусов были использованы при уточнении происхождения у сортов, выведенных в Dresden-Pillnitz (21). В результате в ряде случаев вы-

51

яснили, какой именно сорт участвовал в гибридизации при опылении смесью пыльцы разных сортов, а для некоторых сортов установлена недостоверность родословных как по материнской, так и по отцовской форме.

.о

)

-Титан и н Оджебин Говтта JVhj це искан 'Сластена Орловия Черная вуаль  Ажурная Дачница Минай Шмырев Зуша -Ядреная Г рация Тамма

‘Чудное мшонение Экзотика Кициана Орловский нал1>с Бипар Консорт Очароваште Монисте) Блакестон Канахама Искушение Сслсчспская Шаровидная

Рис. 2. Дендрограмма сходства 27 сортообразцов черной смородины (Ribes nigrum L.) из коллекции Всероссийского НИИ селекции плодовых культур, построенная на основании анализа полиморфизма 13 микросателлитных локусов (приведены значения бутстреп-поддержки).

Итак, нами впервые в России проведено генотипирование микросателлитных локусов у черной смородины (Ribes nigrum L.). Установлен высокий полиморфизм микросателлитных локусов, выявлены редкие и уникальные аллели, что позволило получить уникальный мультилокусный профиль для каждого протестированного образца. Показана возможность проверки родства образцов на основе анализа распределения микросателлитных аллелей. Полученные данные свидетельствуют о перспективности применения протестированных маркеров при оценке генетического разнообразия отечественного генофонда черной смородины, а также при разработке методов идентификации и паспортизации сортов, что может быть использовано для защиты авторских прав селекционеров.

ЛИТЕРАТУРА

1. Князев С.Д., Огольцова Т.П. Селекция смородины черной на современном этапе. Орел, 2004.

2. Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. Т. 1. Сорта растений. М., 2013.

3. Вавилов Н.И. Теоретические основы селекции. М., 1987.

52

4. Lanham P., Brennan R.M., Hackett C., McNicol R.J. RAPD fingerprinting of blackcurrant (Ribes nigrum L.) cultivars. Theoretical and Applied genetics, 1995, 90: 166-172 (doi: 10.1007/BF00222198).

5. Brennan R., Jorgensen L., Woodhead M., Russell J. Future perspectives in blackcurrant breeding. Acta Horticulture, 2002, 585: 39-45.

6. Brennan R., Jorgensen L., Hackett C., Woodhead M., Gordon S.L., Russell J. The development of a genetic linkage map of blackcurrant (Ribes nigrum L.) and the identification of regions associated with key fruit quality and agronomic traits. Euphytica, 2008, 161: 19-34 (doi: 10.1007/s10681-007-9412-8).

7. Brennan R., Jorgensen L., Gordon S.L., Loades K., Hackett C., Russell J. The development of a PCR-based marker linked to resistance to the blackcurrant gall mite (Cecidophyopsis ribis Acari: Eriophyidae). Theor. Appl. Genet., 2009, 118: 205-211 (doi: 10.1007/s00122-008-0889-x).

8. Пикунова A.B., Мартиросян E.B., Князев С.Д., Рыжова Н.Н. Применение RAPD-анализа для изучения генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Ribes L. Экологическая генетика, 2011, IX(2): 34-44.

9. Kalia R.K., Rai M.K., Kalia S., Singh R., Dhawan A.K. Microsatellite markers: an overview of the recent progress in plants. Euphytica, 2011, 177(3): 309-334 (doi: 10.1007/s10681-010-0286-9).

10. Cavanna M., Marinoni D.T., Beccaro G.L., Bounous G. Microsatellite-based evaluation of Ribes spp. germplasm. Genome, 2009, 52: 839-848 (doi: 10.1139/G09-057).

11. Antonius K., Karhu S., Kaldm H., Lacis G., Rugenius R., Baniulis D., Sasnauskas A., Schulte E., Kuras A., Korbin M., Gunnarsson A., Wer-lemark G., Ryliskis T.-A.T., Kokk L., Jarve K. Development of the Northern European Ribes core collection based on a microsatellite (SSR) marker diversity analysis. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 2012, 10: 70-73 (doi: 10.1017/S1479262111000980).

12. Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 1990, 12: 13-15.

13. Liebhard R., G i a n f r a n c e s c h i L., Koller B., Ryder C.D., Tarchini R., Van de Weg E., Gessler C. Development and characterization of 140 new microsatellites in apple (Malus x domestica Borkh.). Mol. Breed., 2012, 10: 217-241.

14. Маниатис T., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.

15. Гаевский H.A. Знакомство с эволюционной генетикой. Красноярск, 2002.

16. Wilberg M.J., Dreher B.P. Genecap: a program for analysis of multilocus genotype data for non-invasive sampling and capture-recapture population estimation. Molecular Ecology Notes, 2004, 4(4): 783-785.

17. Jaccard P. Distribution de la flore alpine dans le Bassin des Dranses et dans quelques regions voisines. Bull. Soc. Vaudoise sci. Natur., 1901, 37(140): 241-272.

18. Hammer I., Harper D.A.T., Ryan P.D. PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia Electronica, 2001, 4(1): 9 (http://palaeo-electronica.org/2001_1/past/issue1_01.htm).

19. Sneath P.H.A., Sokal R.R. Numerical taxonomy: theprinciples and practice of numerical classification. San Francisco, 1973.

20. Galli Z., Hal a sz G., Kiss E., Heszky L., Dobr a nszki J. Molecular identification of commercial apple cultivars with microsatellite markers. Horticult. Sci., 2005, 40: 1974-1977.

21. Reim S., Flachowsky H., Hanke M.V., Peil A. Verifying the parents of the Pill-nitzer apple cultivars. Acta Horticulture, 2009, 814: 319-323.

1Всероссийский НИИ селекции плодовых культур Россельхозакадемии,

302530 Россия, Орловская обл., Орловский р-н, п/о Жилина, e-mail: pikuanna84@mail.ru;

2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН,

119991 Россия, г. Москва, ул. Губкина, 3, e-mail: iogen@vigg.ru

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2015, V. 50, № 1, pp. 46-54

Поступила в редакцию 1 июля 2013 года

MICROSATELLITE LOCI POLYMORPHISM IN RUSSIAN BLACK CURRANT (Ribes nigrum L.) VARIETIES FROM COLLECTION OF ALL-RUSSIAN RESEARCH INSTITUTE OF BREEDING FRUIT CROPS

A.V. Pikunova1, S.D. Knyazev1, A.Yu. Bakhotskaya1, A.A. Kochumova2

1All-Russian Research Institute of Breeding Fruit Crops, Russian Academy of Agricultural Sciences, p/o Zhilina, Orel Region, Orel Province, 302530 Russia, e-mail pikuanna84@mail.ru;

53

2N.I. Vavilov Institute of Genetics, Russian Academy of Sciences, 3, ul. Gubkina, Moscow, 119991 Russia, e-mail iogen@vigg.ru

Supported by Russian Science Foundation

Received July 1, 2013 doi: 10.15389/agrobiology.2015.1.46eng

Abstract

Black currant is the main berry crop in Russia. The need to improve its assortment requires new effective methods to be involved in breeding. Application of DNA markers as a modern approach in dealing with germplazm is intensively used abroad in works on black currant plants. We are the first in Russia who used SSR DNA markers in studying black currant gene pool. In this paper we report genotyping 27 black currant accessions from the collection of the All-Russian Research Institute of Breeding Fruit Crops, including 16 varieties originated from this institute, on 14 microsatellite loci. Electrophoresis in 6 % denaturing PAAG followed by staining with silver nitrate was used for separation of PCR products. All tested SSR loci, except MS06g03, have been found to be polymorphic. On average 4.9 alleles were amplified per locus. Three fragments have been amplified on DNA of some accessions at one SSR locus that is probably due to the duplication of these microsatellite loci in genome of these accessions. A total of 66 % of all amplified fragments were rare alleles with a frequency of occurrence equal to or less than 0.2. Eight unique alleles have been found. The observed heterozygosity ranged from 0.259 (g2-H21) to 1 (e4-D03) and averaged 0.608. Combinations of alleles at one locus allowed to distinguish from 3 (g2-H21, e1-O21) to 15 (g2-G12) genotypes. The minimum set of four loci (e4-D03, g1-M07, g1-E03, g2-B20) allowed to distinguish all the tested accessions, i.e. unique multilocus profile has been found for each sample. Pairwise genetic similarity coefficients ranged from 0.11 (between Odzhebin and Sharovidnaya varieties) to 0.95 (between Govtva and Rtishchevskaya varieties) and averaged 0.346. Cluster analysis of genetic similarity has been done. The dendrogram shows a few clusters with high bootstrap support. Distribution of alleles between related varieties was consistent with the pedigrees in the most cases, but discrepancies between pedigrees and SSR data also were found. Thus, the varieties Ocharovanie (№ 1168 x Ekzo-tika variety) and Ekzotika had no common alleles in three loci (e4-D03, g1-E03, g2-B20). It probably is due to pollination by other pollen or error in reproduction and transplantation or mutations in these loci. The varieties Odzhebin and Binar (Odzhebin x Naryadnaya) had no common alleles in two loci (g1-M07, g1-E03). Our results allow to recommend SSR markers for evaluation of domestic gene pool of black currant on genetic diversity, and to develop methods for the identification and certification of varieties of black currant.

Keywords: black currant, DNA markers, microsatellites, polymorphism, identification, gene pool, Ribes nigrum L.

Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология» выполняет рассылку электронных оттисков опубликованных статей

Для получения электронного оттиска Вам необходимо:

❖ отослать точное описание заказа (авторы и название статьи, год, номер журнала, страницы) по адресу felami@mail.ru, указав Ваши фамилию, имя, отчество (полностью), город, где проживаете, контактные e-mail и телефон;

❖ получить из редакции по своему e-mail подтверждение заказа (с присвоенным ему номером);

❖ оплатить услугу, указав в платежном документе в графе «Назначение платежа» присвоенный заказу номер и Ваши фамилию, имя, отчество.

Оттиски высылаются на Ваш контактный e-mail после зачисления оплаты на счет редакции.

Банковские реквизиты редакции:

Получатель: Банк получателя:

ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйст- Сбербанк России ОАО г. Москва, венная биология», Марьинорощинское ОСБ 7981, БИК 044525225,

г. Москва, р/с 40703810638050100603 к/с 30101810400000000225

В назначении платежа укажите номер заказа, Ваши фамилию, имя, отчество.

Стоимость услуги:

❖ один оттиск — 120 руб.,

❖ не более шести оттисков (абонемент) — 360 руб.,

❖ не более двенадцати оттисков (абонемент) — 700 руб.

НДС не облагается. Абонементное обслуживание предполагает предоставление указанного числа оттисков за период не более каждого текущего года по предоплате.

E-mail для заказа электронных оттисков — felami@mail.ru

© Электронные оттиски являются интеллектуальной собственностью редакции журнала «Сельскохозяйт-венная биология». Внесение в них каких бы то ни было изменений и дополнений не допускается. Перепечатка, тиражирование, размещение в средствах информации, в том числе электронных и сети Интернет, а также коммерческое распространение возможны только с разрешения редакции.

54