Трансплантация модифицированных генами hgf и fgf4 звёздчатых клеток печени стимулирует дифференцировку гепатоцитов у крыс после частичной гепатэктомии

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНАМИ HGF И FGF4

ЗВЁЗДЧАТЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ СТИМУЛИРУЕТ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ

ГЕПАТОЦИТОВ У КРЫС ПОСЛЕ ЧАСТИЧНОЙ ГЕПАТЭКТОМИИ

А.А. Титова 1,Э.И. Шарипова 12, Г.О. Певнев12, М.О. Мавликеев12, А.К. Шафигуллина1, Г.Р. Бурганова 1, М.А. Титова1, А.А. Ризванов 1, А.А. Гумерова1, А.П. Киясов 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

Transplantation of hepatic stellate, genetically modified genes hgf and fgf4, stimulates differentiation of hepatocytes in rats after partial hepatectomy

А.А. Titova 1, E.I. Sharipova 12, GO. Pevnev12, M.O. Mavlikeev12, A.K. Shafigullina 1, G.R. Burganova 1, МА. Titova 1, АА. Rizvanov1, АА. Gumerova 1, A.P. Kiyasov1

1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

Хронические заболевания печени различной этиологии остаются проблемой современной медицины . В настоящее ведется активный поиск новых методов лечения этих заболеваний с применением стволовых клеток и методов генно-клеточной терапии . Один из видов клеток, рассматриваемый как возможные прогениторные клетки печени — звёздчатые клетки печени. Ранее в модели частичной гепатэктомии была показана возможность дифференцировки звёздчатых клеток печени в клетки с фенотипом гепатоцитов . В настоящей работе проведено изучение регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии после трансплантации звёздчатых клеток, трансдуцированных терапевтическими генами фактора роста гепатоцитов и фактора роста фибробластов 4 в сочетании с трейсерным геном красного флуоресцентного белка . Показано, что трансдукция звёздчатых клеток печени указанными генами повышает выживание клеток и их дифференцировку в гепатоцитарном направлении

Ключевые слова: звёздчатые клетки печени, частичная гепатэктомия, факторы роста, стволовые клетки, регенерация печени

Chronic liver diseases of different etiology are the problem of the modern medicine . Nowadays is held an active search for new methods of treatment for these diseases using stem cells and methods of gene-cell therapy . One of the cell types, thought to be progenitor cells of the liver, — hepatic stellate cells . Previously was shown the possibility of hepatic stellate cells to differentiate into the cells with hepatocytes phenotype after transplantation into the rats with partial hepatectomy . In this work we studied rat liver regeneration on the same model of liver damage after transplantation of the hepatic stellate cells, transduced with therapeutic genes of hepatocyte growth factor (HGF) and fibroblast growth factor 4 (FGF4) in combination with tracer gene of red fluorescent protein (RFP). The results of the survey demonstrated that transduction of the hepatic stellate cells with these genes facilitates engraftment of the transplanted cells and their further differentiation into hepatic direction, that was confirmed by a large number of hepatocytes, expressing tracer gene RFP, as well as a large number of a-fetoprotein positive hepatoblasts in compare to the animals, that had transplantation of cells, transduced only with tracer gene

Keywords: hepatic stellate cells, partial hepatectomy, growth factors, stem cells, liver regeneration

Введение

Хронические заболевания печени различной этиологии остаются проблемой современной медицины . Многие годы смертность от заболеваний печени входит в первую десятку среди всех причин смерти и лидирует по этому показателю в гастроэнтерологии [1]. В настоящее время ведется активный поиск новых методов лечения этих заболеваний с применением стволовых клеток и при помощи ген-но-клеточной терапии. Существует широкий спектр различных стволовых клеток, которые потенциально могут быть использованы для клеточной терапии заболеваний печени [2—4]. Одним из видов клеток, рассматриваемых в качестве прогениторных клеток печени, являются звёздчатые клетки печени (ЗКП) . Научной группой Кордеса эти клетки были отнесены к резидентным мезенхимным стволовым клеткам печени, которые вносят свой вклад в регенерацию и фиброгенез в органе [5]. Ранее в наших исследованиях было показано, что после трансплантации звёздчатых клеток печени крысам с различными повреждениями печени происходит их дифферен-цировка в клетки с фенотипом гепатоцитов [6—9]. Однако количество таких клеток было небольшим,

e-mail: anjerika@list . ru

что может оказаться недостаточным при необходимости быстрого восстановления функционального потенциала печени. В поисках решения этой проблемы большую актуальность приобретает разработка методов клеточной терапии с использованием генетической модификации стволовых клеток . Ген-но-клеточная терапия ориентирована на придание клеткам новых функций . Так, для генно-клеточной терапии заболеваний печени перспективным может стать использование таких ключевых для дифферен-цировки клеток печени факторов роста, как фактор роста гепатоцитов (Hepatocyte Growth Factor, HGF) и фактор роста фибробластов 4 (Fibroblast Growth Factor 4, FGF4) . HGF — это гликопротеин, являющийся сильным митогеном для гепатоцитов и участвующий в регенерации печени, он стимулирует пролиферацию некоторых типов эпителиоцитов, а также эндотелиальных клеток и меланоцитов [10]. Фактор роста фибробластов 4 стимулирует деление различных клеток мезенхимного происхождения [11]. Исходя из этого в настоящей работе было изучено влияние трансдукции ЗКП генами этих факторов на их регенераторный потенциал после трансплантации крысам, перенесшим частичную гепатэктомию (ЧГ).

100

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методы

Работа выполнена на модели частичной гепатэк-томии (ЧГ) по методике Хиггенса и Андерсона [12]. Удалением 68% массы печени достигалась стимуляция регенераторного ответа в сохранившихся долях. Метод поддается хорошей стандартизации и является классической моделью для изучения регенерации печени . В исследовании были использованы самцы крыс породы Вистар массой 250—300 г . Животные находились на стандартном рационе вивария и имели свободный доступ к воде . Экспериментальных животных разделили на 3 группы: 1 группа (контрольная) — крысы, перенесшие ЧГ с введением физиологического раствора; 2 группа — крысы, перенесшие ЧГ с трансплантацией ЗКП, трансдуци-рованных трейсерным геном красного флуоресцентного белка (Red Fluorescent Protein, RFP); 3 группа — крысы, перенесшие ЧГ с трансплантацией ЗКП, трансдуцированных генами rfp, hgf и fgf4.

Выделение ЗКП было проведено методом кол-лагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза [6]. Количество выделенных клеток и их жизнеспособность определяли путём подсчёта клеток в камере Горяева при разведении клеточной суспензии в трипановом синем в соотношении 1:10 . ЗКП трансдуцировали аденовирусным вектором, несущим гены rfp, hgf и fgf4, культивировали в инкубаторе в течение одного часа при температуре 37°С и 5% содержания СО2 во влажной атмосфере в питательной среде DMEM (Sigma, США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Sigma, США), 146 мг/мл L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США).

Трансплантацию ЗКП проводили интраопераци-онно путём введения суспензии клеток в воротную вену в дозе 3х10в кл ./животное . Животных выводили из эксперимента через 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 сут . после введения клеток, кусочки печени помещали в 10% нейтральный забуференный формалин на 0,2 М фосфатном буфере (pH = 7,4) на 24 ч для фиксации, далее заливали в парафин по стандартной методике . Срезы окрашивали иммуногистохимиче-ски с коммерческими поликлональными антителами к RFP (GenScript, США, 1:400), HGF (Abcam, Англия, 1:200), FGF4 (Abcam, Англия, 1:1000), маркёру ге-патобластов а-фетопротеину (а-ФП, Abcam, Англия, 1:200), маркёру стволовых и прогениторных клеток С-kit (рецептор к фактору стволовых клеток, Abcam,

Англия, 1:400) . Иммуногистохимическое окрашивание было проведено с использованием визуализа-ционных систем Novolink (Novocastra, Англия), CSA и Envision (Dako, Дания). Контроль специфичности иммуногистохимической реакции проводили путём замены первичных антител неиммунной сывороткой мыши или кролика, а также путём исключения из реакции первичных антител

Результаты и обсуждение

В первой группе (контроль) ни на одном из сроков не были обнаружены RFP-позитивные клетки . Экспрессия HGF и FGF4 была выражена слабо . На протяжении всего эксперимента в печени около сосудов были обнаружены единичные слабо позитивные по этим белкам округлые клетки . На вторые сутки после операции были обнаружены HGF позитивные ге-патоциты (рис . 1А) и на этом же сроке значительно увеличилось количество FGF4-позитивных клеток (рис . 1Б) . Начиная с третьих суток позитивное окрашивание наблюдали только в единичных округлых клетках около сосудов

Во второй группе уже через сутки после трансплантации свежевыделенных ЗКП, трансдуцированных трейсерным геном, в печени крыс появлялись RFP+ клетки, идентичные по размерам и форме гепатоцитам (рис. 1В) . Клетки располагались как изолированно, так и группами по 3—5—7 клеток . Расположение многих клеток группами может свидетельствовать о пролиферации клеток, дифференцирующихся из одной клетки предшественника . Экспрессии HGF и FGF4 не было обнаружено ни на одном экспериментальном сроке

В третьей группе уже через сутки после трансплантации ЗКП, трансдуцированных терапевтическими генами, крысам, перенесшим ЧГ, в печени крыс реципиентов появлялись многочисленные небольшие округлые RFP+ клетки в портальных трактах (в среднем 8—10 кл ./портальный тракт), а также довольно многочисленные гепатоциты, экспрессирующие этот белок (рис . 2А) . Последние располагались главным образом перипортально, по одному или группами по 2—3 клетки, а также тяжами вдоль оси ацинуса . Ещё через сутки число позитивных гепатоцитов возрастало до 20—25/портальный тракт (рис . 2Б), многие позитивные гепатоциты имели два ядра На сроке 3 сут . число RFP+ гепатоцитов немного снижалось, а к 5 суткам вновь возрастало и достигало максимума — одиночные и сгруппированные клетки,

Рис. 1. Печень крысы через двое суток (А, Б, 1 группа) и через одни сутки (В, 2 группа) после ЧГ: А — HGF+ гепатоциты, Б — FGF4+ клетки в синусоидах, В — RFP+ гепатоциты. Продукт иммуногистохимической реакции красного цвета, ядра докрашены гематоксилином. Ув.: А, Б х200; В х100

тяжи клеток преимущественно в портальных зонах . После 7 сут . число позитивных гепатоцитов постепенно снижалось, и на сроке 28 сут . можно было видеть только единичные (1—3 кл ./поле зрения) округлые клетки в паренхиме печени . На ранних сроках (1—2 сут . после операции) HGF экспрессировали лишь мелкие округлые клетки, с третьих суток появлялись также HGF+ гепатоциты, а через 28 сут . можно было видеть многочисленные гепатоциты, экспрессирующие HGF (рис . 2В). FGF4 появлялся через сутки в единичных мелких округлых клетках, через 2 сут . — в гепатоцитах (1—2 кл ./поле зрения), ещё через сутки число позитивных гепатоцитов возрастало до 4—5 в поле зрения (рис . 2Г), а затем снижалось, и до конца эксперимента FGF4 выявлялся в единичных округлых клетках и гепатоцитах

Таким образом, в 3 экспериментальной группе ре-популирующий эффект от трансплантации ЗКП оказался существенно выше и продолжительнее, чем в контроле (группа 1) и в группе 2 (ЧГ с трансплантацией ЗКП, трансдуцированных трейсерным геном), что подтверждает эффективность выбранных генов для ускорения восстановления гепатоцитов после повреждения и увеличения их количества

Изучение динамики количества дифференцирующихся гепатоцитов (а-ФП+ гепатобластов) также указывает на стимулирующий эффект на регенерацию печени трансплантации ЗКП, трансдуциро-ванных терапевтическими генами В первой группе окрашивание с антителами к а-ФП показало наличие дифференцирующихся а-ФП + гепатоцитов через 2 сут . эксперимента (рис . 3А), на более поздних сроках такие клетки отсутствовали, а затем появлялись вновь через 14 сут . после ЧГ . Этот факт позволяет предположить, что в ходе регенерации печени после ЧГ дифференцировка гепатоцитов происходит волнообразно: первая волна наблюдается в первые дни, а вторая начинается в конце второй недели после операции . Данный феномен установлен нами впервые и требует дополнительного изучения Анализ количества а-ФП + гепатобластов во второй группе показал, что в первые сутки после трансплантации

появляются единичные гепатобласты, экспрессиру-ющие а-ФП, с 3 по 7 сут . их число уменьшается, при этом на 5 сут . наблюдается максимальное количество синусоидных клеток, экспрессирующих а-ФП (рис . 3Б). На более поздних сроках, как и в начале эксперимента, можно было видеть только единичные а-ФП + гепатобласты . Таким образом, экспрессия а-ФП в этой группе была более выраженной и постоянной, чем в контроле Этот факт позволяет сделать вывод, что трансплантация клеток стимулирует дифференцировку прогениторных клеток печени в гепатоциты. Кроме того, учитывая появление в печени реципиентов RFP+ клеток, имеющих форму и размеры гепатоцитов, можно предположить, что введенные ЗКП также могут способствовать диффе-ренцировке в гепатоциты

В третьей группе окрашивание с антителами к а-ФП показало, что количество дифференцирующихся гепатоцитов (гепатобластов) в первые сутки было небольшим (единичные а-ФП-позитивные клетки), ещё через сутки оно значительно возрастало, множество а-ФП+ гепатобластов было диффуз-но распределено в паренхиме печени, затем число таких клеток несколько снижалось . Однако начиная с 14 сут и до конца эксперимента (28 сут ) мы наблюдали резкое возрастание числа а-ФП+ ге-патобластов, когда наряду с отдельными клетками появлялись группы и тяжи гепатобластов, экспрес-сирующих а-ФП (рис . 3В). Интересно, что в этой группе на тех же сроках значительная часть гепа-тоцитов экспрессировала маркёр стволовых клеток С-к^ (рис . 3Г) . Вероятно, и в этом случае мы наблюдали две волны регенерации гепатоцитов, как это было выявлено в контроле, однако в данном случае дифференцировка гепатобластов носила более массовый характер и была более продолжительной, что, по-видимому, отражает влияние терапевтических генов на данный процесс . Появление С-к^+ клеток указывает на активацию стволового компартмента и подтверждает полученные нами ранее данные об активации региональных стволовых клеток печени после ЧГ и их участии в регенерации [13, 14] .

ШТЯш

4»**« 4а

^ > у

¡Ша * € * • л

... «• $ ' 1 .

Рис. 2.

Печень крысы через одни (А), двое (Б) и трое (В, Г) суток после ЧГ и трансплантации RFP+/HGF+/FGF4+ ЗКП (3 группа): А, Б — RFP+ гепатоциты; В — HGF+ гепатоциты; Г — FGF4+ гепатоциты.

Продукт иммуногистохимической реакции красного цвета, ядра докрашены гематоксилином. Ув. х400

Рис. 3.

Печень крысы через одни (А), пять (Б), четырнадцать (Г), двадцать восемь (В) сут. после ЧГ:

А — 1 группа; Б — 2 группа; В — 3 группа, а-ФП+ гепатоциты и синусоидные клетки; Г — 3 группа, гепатоциты.

Продукт реакции красного цвета, ядра докрашены гематоксилином. Ув.: А, Б х400, В, Г х200

Полученные результаты показали, что трансплантация ЗКП повышает активность и скорость регенерации печени после ЧГ Также установлено, что введение в ЗКП ещё двух генов, HGF и FGF4, облегчает приживление клеток и их дифференцировку в гепа-тоцитарном направлении, что подтверждается большим числом гепатоцитов, экспрессирующих трей-серный ген RFP, а также большим числом а-ФП + гепатобластов по сравнению с экспериментальной группой, в которой животным водили ЗКП, транс-дуцированные только трейсерным геном GFP . Таким образом, представленная комбинация генов может рассматриваться как потенциально эффективная для стимуляции регенерации печени и восстановления популяции гепатоцитов и перспективная для разработки методов генно-клеточной терапии заболеваний печени

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 12-04-97088-р_поволжье_а «Изучение фундаментальных механизмов пластичности и направленной дифференцировки звёздчатых клеток печени для разработки клеточной биомедицинской технологии восстановления гепатоцитов».

Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Kuo Y . H ., Lu S . N ., Chen C . L . et al . Hepatocellular carcinoma surveillance and appropriate treatment options improve survival for patients with liver cirrhosis . Eur . J . Cancer 2010; 46(4): 744-51.

2 . Kaibori M ., Adachi Y ., Shimo T. et al . Stimulation of liver regeneration after hepatectomy in mice by injection of bone marrow mesenchymal stem cells via the portal vein . Transplant . Proc . 2012; 44(4): 1107-9 .

3 . Khuu D .N ., Nyabi O ., Maerckx C. et al . Adult human liver mesenchymal stem/progenitor cells participate in mouse liver regeneration after hepatectomy. Cell Transplant . 2013; 22(8): 1369-80 .

4 Seki T , Yokoyama Y , Nagasaki H et al Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation promotes hepatic regeneration after hepatic ischemia-reperfusion and subsequent hepatectomy in rats . J . Surg . Res . 2012; 178(1): 63-70 .

5 . Kordes C ., Sawitza I ., Müller-Marbach A. et al . CD133 + hepatic stellate cells are progenitor cells . Biochem . Biophys . Res . Commun . 2007; 52(2): 410-7 .

6 . Шафигуллина А . К ., Гумерова А. А. , Трондин А .А . и др . Трансплантированные звёздчатые клетки печени участвуют в регенерации органа после частичной гепатэктомии без риска развития фиброза печени . КТТИ 2012; 3: 169-72 .

7 . Шафигуллина А . К . , Трондин А .А ., Бурганова Г . Р . и др . Сравнение различных методов выделения, мечения и трансплантации звёздчатых клеток печени крыс . КТТИ 2013; 3: 147-51.

8 . Титова А .А ., Бурганова Г . Р ., Шарипова Э . И . и др . Звёздчатые клетки печени стимулируют регенерацию печени крыс после частичной гепатэктомии на фоне подавления пролиферации гепатоцитов . Гены и Клетки 2014; 9(3): 131-5 .

9 . Бурганова Г. Р ., Титова А.А., Шарипова Э . и др . Влияние трансплантации перисинусоидальных клеток печени на регенерацию печени крыс после повреждения четыреххлористым углеродом и 2-ацетиламинофлуореном . Гены и Клетки 2014; 9(3): 53-8 .

10 . Weidner К . M . , Arakaki N ., Hartmann G . et al . Evidence for the identity of human scatter factor and human hepatocyte growth factor . PNAS USA 1991; 88: 7001-5 .

11. Шафигуллина А . К . Влияние звёздчатых клеток печени на фенотип мезенхимных стволовых клеток крысы in vitro . Дисс . ... кандид . мед . наук . Казань: Казанский ГМУ, 2013 .

12 . Higgins G . M ., Anderson R . M . Experimental pathology of the liver: I . Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal . Arch . Pathol . 1931; 12: 186-202 .

13 . Газизов И . М ., Гумерова А. А. , Калигин М . С . и др . Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток C-kit в регенерирующей печени после частичной гепатэктомии Морфологические ведомости 2008; 1-2: 23-7 .

14 . Андреева Д . И ., Газизов И . М ., Йылмаз Т . С . и др . Возможные направления дифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс . КТТИ 2013; 8(3): 95-100 .

Поступила: 02.11.2015