Детская присыпка на основе лактоферрина
LACTOFERRIN BASED BABY POWDER

Область техники.
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, гигиене и дерматологии. Предлагается детская присыпка, содержащая в своем составе лактоферрин, обладающий бактерицидным действием против широкого круга патогенных бактерий и грибков, включая антибиотикустойчивые формы. Присыпка позволяет безопасно использовать ее у новорожденных детей в качестве профилактического средства для снижения риска занесения инфекционной кожной патологии в условиях медицинского учреждения и последующем периоде ухода за грудным ребенком.
Предшествующий уровень техники.
Основной целью детских присыпок, в первую очередь, является защита нежной кожи новорожденного ребенка от опрелостей, обычно начинающихся в складочках кожи. Это достигается за счет обязательного присутствия в детских присыпках подсушивающих компонентов.
Детские присыпки для нормальной кожи ребенка различаются использованием при их изготовлении в качестве наполнителя различных сыпучих материалов. Классические присыпки являются смесью измельченных в мелкий порошок минеральных или растительных веществ. Как основной компонент многих присыпок обычно используют тальк или крахмал (рисовый, кукурузный, картофельный). Эти вещества обладают большой впитывающей способностью. Таким образом, они выполняют основную функцию детской присыпки. В качестве наполнителя присыпок можно также применять муку, сделанную из высушенных листьев гречихи, споры булавовидного плауна. Известны порошкообразные составы для обработки кожи, которые в качестве основных компонентов помимо талька, крахмала и окиси цинка, содержат, мел, монтмориллонитовые глины и антисептик (любое лекарственное вещество) (Войцеховская А.Л. Вольфензон И.И. Косметика сегодня. М. 1988). Для детской косметики используют и более тонкодисперсные составы, например, на основе тонкоизмельченной яичной скорлупы (Японии, заявка N 61-36806в, 1987). Недостатком данной присыпки являются очень узкий круг применения, слабый лечебный эффект при поражениях кожи.
В отечественных фармакологических руководствах состав традиционных детских присыпок описан уже более 40 лет назад. При этом указаны их различные составы. Например, 5 частей крахмала и 40 частей талька. Она была рекомендована для профилактики и лечения «опрелостей» кожи у детей до 1 года. В нее было добавлено 5 частей окиси цинка (М.Д. Машковский. Лекарственные средства. 1977, т. 1, стр. 297). Данная присыпка оказалась малоэффективной, и ее состав, вскоре был изменен за счет снижения количества талька до 15-и частей, но окиси цинка в ней осталось 5 частей (М.Д. Машковский. Лекарственные средства. 1977, т. 2, стр. 357).
Недостатками этих известных присыпок явилась ограниченная область применения. Кроме того, на месте кожных дефектов возникали корочки, под которыми нередко развивались нагноительные процессы, вызванные анаэробной флорой. Было показано, что окись цинка какими-либо специфическими бактерицидными свойствами не обладает, хотя в некоторых российских присыпках ее продолжают использовать. Например, в гигиеническом детском продукте «Мое солнышко. Присыпка-крем» в качестве мази под подгузники, что малоэффективно и небезопасно.
В настоящее время используются присыпки для детей разного состава и назначения, разных производителей. Среди наиболее популярных присыпки: Johnsons Baby; Bubchen; Наша мама; Sanosan; Babyline и другие.
Известна присыпка (патент RU №2194509) с тальком, окисью цинка и порошками метилурацила и метронидазола для лечении кожных заболеваний и инфекционных болезней например, при некрозе тканей при менинтококковой инфекции. Недостатком данного состава является наличие лекарственных компонентов, которые имеют противопоказания к применению, побочные эффекты и не могут применяться в качестве профилактического средства, особенно для новорожденных.
Известна присыпка (патент RU №2049462) с тальком, крахмалом, окисью цинка, бетулином, медными производными хлорофилла и натуральным хвойным комплекс для борьбы с опрелостями, трещинами зудом.
К недостаткам присыпки относится недостаточная эффективность применения: присыпка применяется только как средство ухода за кожей лица, в других областях применения она не эффективна, сложная технология и химический способ получения биодобавок в чистом виде, конечный продукт имеет неэстетичный вид (зеленый цвет). Клинические испытания присыпки указанного состава, как детской, закончились с отрицательным результатом. Присыпка в серию не пошла.
Известна присыпка (патент RU №2185808) с тальком, крахмалом, окисью цинка, спиртовой настойкой густого экстракта прополиса для борьбы с опрелостями, трещинами зудом. Присыпка обладает регенерирующей, противовоспалительной, дезодорирующей активностью. Недостатком покрытия являлось индивидуальная непереносимость отдельных компонентов. Изобретение отличается по составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Известна присыпка (патент RU №2482834) с тальком, окисью цинка, стеаратом цинка, карбонатом магния, борной кислотой, салициловой кислотой, камфорой и ментолом ухода для ухода за кожей ног и обувью для устранения неприятного запах, подсушивания и дезинфекции кожи на ногах, уменьшения потоотделения, повышения бактерицидного, дезинфицирующего и дезодорирующего эффекта. Изобретение отличается по сферам применения и составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Известна детская присыпка, выпускаемая АКО "СИНТЕЗ" Р.67.554.198, содержащая тальк, окись цинка и крахмал картофельный. Присыпка обладает антисептическим, вяжущим свойствами и является наружным средством, предназначенным для ухода за кожей тела, склонной к опрелостям. Изобретение отличается по составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Известно противогрибковое средство для стоп в виде присыпки (патент RU №2083224), обладающей противовоспалительным и антибактериальным свойствами при заболевании кожи стоп и ногтей пальцев ног, содержащее в качестве носителя природный цеолит шивыртуин-монториллитцеолит, содержащий туф с размером частиц 40-200 мкм и активное антигрибковое вещество, выбранное из группы, включающей серу, йод кристаллический, сернокислую медь, борную кислоту, перманганат калия с размером частиц 40-200 мкм, в количестве 1-5% от массы цеолита, в котором цеолит обеспечивает многомесячную пролонгацию активного действия средства. Недостатком покрытия являлось индивидуальная непереносимость отдельных компонентов. Изобретение отличается по сферам применения и составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Известна препаративная форма микстуры (Свидетельство на полезную модель N 11710), содержащая дозированное количество смеси сухих компонентов, подлежащих последующему растворению в воде и составляющих требуемую пропись, представляющую собой герметичный пакет, выполненный из многослойного влагонепроницаемого материала, разрешенного к использованию в пищевой промышленности, внутрь которого помещена разовая доза смеси сухих компонентов, составляющих пропись микстуры. Изобретение отличается по составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Известна детская присыпка в форме крема, в отличие от обычной присыпки, не скатывается на коже и обеспечивает более комфортное и безопасное применение, исключающее попадание порошкообразного талька в дыхательные пути новорожденного малыша. Содержит натуральный порошок кукурузы, витамин Е, уникальный компонент NHEB-05 (патент Кореи №10-2008-0032798), церамид, В-глюкан, а также экстракты лекарственных трав. Однако, в детские присыпки не рекомендуется добавлять ароматизирующие вещества и растительные добавки, из-за возможного появления аллергических сыпей на нежной и чувствительной коже ребенка. Изобретение отличается по составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Изобретение (патент RU №2709102) относится к созданию препарата в виде присыпки, ускоряющего заживление раневой поверхности, состоящая из: крахмала, пектина, глюкозамина, D-пантенола. Изобретение отличается по составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Известен патент RU №2221456, где биологически активным веществом является белковый гидролизат, полученный путем кислотного гидролиза и последующей нейтрализации пептидосодержащего животного сырья и может быть использован в составе и присыпки. Изобретение отличается по составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Известен способ лечения угрей в форме присыпки (патент RU №2416403). Используют прополисную присыпку в виде маски с 3% перекисью водорода в соотношении 2,0 г на 2 мл перекиси. Курс лечения составляет 10 ежедневных процедур. Способ обладает эффективностью, но имеет побочные эффекты.
Предложен препарат для лечения инфицированных вялотекущих ран и язв (патент RU №92015322) следующего состава, г: антибактериальное вещество 0,1-2,0, анестетик 2,0-4,0, стимулятор репарации 3,0-8,0, сахар 20-30, пектин - до 100. Препарат представляет собой тонкий порошок и применяется в виде присыпки. Недостатком покрытия является индивидуальная непереносимость отдельных компонентов. Изобретение отличается по сферам применения и составу от заявляемого и не содержит бактерицидного белка лактоферрина.
Близким решением к заявляемому изобретение (патент RU №2165769) о препаратах, которые содержат человеческий лактоферрин в качестве активного вещества и фармацевтически приемлемые добавки, предназначенный для изготовления лекарственных средств, и/или лекарственные средства, содержащие препарат и фармацевтически приемлемые носители: раствор для внутривенного введения, раствор для внутриполостного или внутрипузырного введения, раствор для перорального введения, раствор для обработки раневых поверхностей, раствор для интраназального применения или в форме глазных капель, мазь, болюсы для перорального применения, суппозитории для ректального или интравагинального применения, таблетки. Изобретение отличается по сферам применения и составу от заявляемого в виде детской присыпки.
Наиболее близким является изобретение (патент RU №2687969) для ингибирования и/или предотвращения роста микробиопленок, которое может быть использовано в качестве лекарственного или профилактического средства, в частности в стоматологии и в лечении и профилактике состояний слизистых оболочек. Предложено антимикробное средство на основе лактоферрина и моно[(2-диметиламино)этиловых] эфиров карбоновых кислот общей формулы R - О - (Et) - N(Me)2, где R-карбоновая кислота, выбранная из ряда: фумаровая, янтарная, малеиновая, а-кетоглутаровая, щавелевая, D,L-яблочная, пировиноградная, Et - этил и Me - метил, при этом соотношение (мас.) лактоферрин/эфиры карбоновых кислот составляет от 1/1 до 1/3. Лекарственная форма заявляемого антимикробного средства может быть выполнена в виде жидкого раствора, таблетки или пленки, для буккапьного применения, в виде жевательной резинки или в виде суппозитория для ректального или вагинального введения. Изобретение отличается по сферам применения и составу от заявляемого в виде детской присыпки.
Ни в одной из известных детских присыпок лактоферрин никогда не использовался и не предлагался по причине коммерческого отсутствия этого продукта.
Таким образом, технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, из уровня техники не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».
Термины и определения
Под термином «присыпка» подразумевается любой тип, традиционно используемый в рутинной косметической, медицинской и лечебно-профилактической практиках, выбранный из группы, не ограничивающей представленное изобретение: пудры и иные приемлемые сухие аппликативные формы для наружного применения.
Под термином базовый компонент подразумевается: тальк всех типов, или крахмал из различных источников (кукурузы, картофеля, риса или др,), или мука, или мел, или монтмориллонитовая глина, или тонкоизмельченная яичная скорлупа, или природный цеолит шивыртуин-монториллитцеолит, или пектин.
Под термином «лактоферрин» (Лф) подразумевается полноразмерный высокоочищенный белок лактоферрин, полученный из природного сырья (женское молоко, коровье молоко), либо «Неолактоферрин», выделенный из молока генно-инженерных коз. В последнем случае он представлен комплексом лактоферринов козы (10%) и биоаналога лактоферрина человека (90%).
Краткое описание фигур, чертежей.
Фигура 1. Эффективность антибактериальной активности 50 мкл различных разведений образцов присыпок, на основе лактоферрина.
Фигура 2. Антибактериальная активность образцов присыпок, на основе лактоферрина, в отношении антибиотикорезистентных клинических изолятов Streptococcus и Staphylococcus aureus, выделенных от пациентов с клиническими проявлениями недостаточности иммунной системы.
1-8 образцы присыпок, 9 - контроль
Фигура 3. Действие нистатина, амфотерицина и лактоферрина в отношении клинического изолята Candida alb. с устойчивостью к нистатину и амфотерицину.
1, 3 - на диски с наносили 50 мкл лактоферрина в концентрации 3 мг/мл; 2 -диск с нистатином, 4 - диск с амфотерицином; 5, 6, 7 - контроли.
Фигура 4. Кривая роста штамма - клинического изолята Staphylococcus aureus при использовании Лф по сравнению с контролем
Фигура 5. Кривая роста штамма клинического изолята Staphylococcus aureus при использовании бЛф и нЛф.
1 - нЛф, 2 - бЛф, К - контроль
Фигура 6. Кривая роста штамма клинического изолята Candida albicans при использовании бЛф и нЛф.
1 - нЛф, 2 - бЛф, К - контроль
Основание для осуществления изобретения.
Недостатками известных коммерческих присыпок явилась ограниченная область применения. Кроме того, на месте кожных дефектов возникают корочки, под которыми нередко развивается нагноительные процессы, вызванные анаэробной флорой. Было показано, что окись цинка какими-либо специфическими бактерицидными свойствами не обладает, хотя в некоторых российских присыпках ее продолжают использовать. Например, в гигиеническом детском продукте «Мое солнышко. Присыпка-крем» в качестве мази под подгузники, что малоэффективно и небезопасно.
С целью лечения бактериальных или грибковых инфекционных поражений кожи грудного ребенка предложены различные специальные присыпки. Так, например, если в местах опрелостей у грудного ребенка поселяются грибки, которые любят теплые и влажные места, то у детей появляется, так называемый «пеленочный кандидоз». Обычной присыпке с ним уже не справиться. Кандидозная инфекция у детей (молочница) вызывается грибками рода Candida albicans. Обычно они входят в нормальную микрофлору кишечника и кожных покровов. Однако любые неблагоприятные факторы, вызывающие ослабление иммунитета грудного ребенка, способствуют их чрезмерному размножению и появлению специфических симптомов заболевания. В таких случаях врачи часто назначают лечебную присыпку.
Основным действующим компонентом, например, препарата «Кандид» является клотримазол. Данное вещество относится к обширной группе средств, обладающих противогрибковым действием. Но только некоторые из них, в том числе, клотримазол, разрешены к применению в педиатрической практике. Однако, после применения «Кандида» иногда могут наблюдаться аллергические реакции, которые проявляются у грудных детей зудом кожи или крапивницей.
Новорожденные и дети до года входят в группу риска по развитию кандидозных инфекций. Это связано с несовершенством их иммунной системы, особенностями строения кожных покровов, недостаточностью местных факторов защиты. Кожа и слизистые маленького ребенка относительно тонкие, имеют рыхлую структуру, более высокие значения рН.
У кожи детей отмечается недостаточная секреторная функция и, соответственно, уменьшение защитного липидного слоя.
Поражение кожи и слизистых грибками рода Candida albicans - довольно частое явление среди новорожденных и детей грудного возраста. Оно диагностируется почти у 20% малышей, выписанных из родильного дома. Поэтому перед педиатрами и родителями стоит вопрос выбора эффективного и вместе с тем безопасного противогрибкового средства, применение которого целесообразно было бы начать с момента рождения ребенка в профилактических целях. В случае же появления грибкового заболевания кожи ребенка, оно должно обеспечить его быстрое и полное излечение, даже в тех случаях, когда вызывается антибиотикустойчивыми грибками, как следствие возможного распространения этой инфекции во внутрибольничной форме.
При отсутствии лечения кандидомикоза, возможно присоединение вторичной бактериальной инфекции. Тут уже необходимо применение антибиотиков, спектр которых для использования их у грудных детей, строго ограничен. А среди них таких, которые были бы биологически безвредными и помогали бы бороться с антибиотикустойчивой микрофлорой, нет.
Таким образом, безопасным противомикробным лечебным эффектом такие материалы не обладают.Между тем, наличие в присыпке средств с бактерицидным и противогрибковым действием, жизненно необходимой, как профилактическое и как лечебное средство. В связи с этим, возникла идея создания принципиально нового состава детских присыпок на основе бактерицидного белка лактоферрина.
Белок природного происхождения лактоферрин демонстрирует широкий спектр биологических активностей, наибольшую ценность из которых представляют его бактерицидные и противогрибковые свойства.
Лактоферрин человека представляет собой катионный гликозилированный белок, состоящий из 691 аминокислоты (Anderson et al., 1990), свернутый в две глобулярные доли (Vogel, 2012), которые связаны α-спиралью (Karav et al. al., 2017, Karav, 2018). Важным является то, что при наличии инфекций он работает даже при рН 3,5 и, тем самым ограничивает источник ионов железа для микробов (Ganz, 2018). Таким образом, ЛФ играет важную роль в регуляции уровня железа в организме.
Лактоферрин - это природный бактерицидный белок, наибольшее количество которого содержится в грудном молоке. Его физиологическая функция состоит в защите новорожденного ребенка от патогенной микрофлоры до тех пор, пока у него не сформируется собственная иммунная система. Помимо этого лактоферрин обладает еще целым рядом биологических активностей, которые необходимы человеку на протяжении всей его жизни. Среди них антиоксидантная, иммуномодулирующая, противовирусная, противогрибковая и противовоспалительная функции, способность стимулировать рост различных тканей.
Было установлено, что биоаналог лактоферрина человека способен поражать широкий спектр патогенных микроорганизмов, включая их антибиотикустойчивые формы. Он обладает уникальным свойством, препятствующим образованию биопленок на поверхности, и разрушающим имеющиеся. Кроме того, лактоферрин активирует иммунокомпетентные клетки и стимулирует естественный иммунитет (Черноусое А.Д. и др., 2013).
Источником природного лактоферрина может быть грудное молоко, молоко животных или полученный биотехнологическим путем биоаналог лактоферрина человека. Созданы технологии позволяющие производить этот белок из биологического сырья промышленным способом, что открывает возможность его широкого медицинского использования.
В нашей стране на лактоферрине, выделенном из грудного молока, в Московском онкологическом институте им. Герцена был выполнен ряд исследований его биологических активностей.
Лактоферрин, полученный из коровьего молока, промышленно выпускается в ряде стран. Однако, из-за разницы в структурах белков разного происхождения, он может применяться лишь для наружного использования.
В Институте биологии гена РАН, впервые в мировой практике была разработана биотехнология получения биоаналога лактоферрина человека (патенты RU №2491343, №2553515, №2554742), для которого была показана его идентичность природному белку человека и его биобезопасность. Известно, что лактоферрин способствует ангиогенезу и реэпитализации тканевого дефекта путем усиления пролиферации и миграции фибробластов и кератиноцитов. В последнее десятилетие представление о физиологической роли лактоферрина существенно пополнились, и его стали рассматривать не только как противомикробный агент, но и как многофункциональный фактор тканевой дифференцировки и активации клеток.
Предлагаемая в настоящей заявке детская присыпка, за счет биологической активности лактоферрина, стимулирует процессы ранозаживления и обеспечивает антибактериальный и противогрибковый эффекты.
Для придания других фармакологических свойств в состав присыпки дополнительно моут быть введены соответствующие биологически активные или лекарственные вещества, такие как: окисид цинка, метилурацил, метронидазол, бетулин, глюкокортикостероиды, эозин, сульфаниламиды, декспантенол, медные производные хлорофилла или натуральный хвойный комплекс, содержащее натриевые соли смоляных кислот, натриевые соли жирных кислот, воск, фитостерин, феофорбид, каротин, эфирное масло, борная кислота, метенамин, натрия тетроборат, лидокаин, хлоргексидинформальдегид, ацетат свинца, танина, гидрокарбоната натрия и др.
Описание изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка новой безопасной детской присыпки, обладающей бактерицидными свойствами.
В качестве основы для присыпки предлагается композиция, состоящая из вариантов базового компонента и лактоферрина, в эффективном количестве при следующем соотношении (масс. %): лактоферрин 1,0-10,0%, базовый компонент 90,0-99,0%. Данная присыпка может применяться для профилактики. Она позволит обеспечить защиту кожного покрова младенца от внешнего инфицирования. Содержащийся в ней лактоферрин будет препятствовать проникновению и развитию инфекционного процесса, способствовать стимуляции активности клеток иммунной системы и эпителизации при наличии раневого дефекта.
Детская присыпка обладает следующими основными свойствами:
• Сохраняет физико-химические параметры лактоферрина и его исходную биологическая активность.
• В сухом виде сохраняет активные биологические свойства не менее двух лет. При хранении в сухом виде в диапазоне температур 4-25°С
• Безопасна для кожного покрова ребенка. Технический результат заключается в том, что впервые получена безопасная, не вызывающая аллергии присыпка, которая обладает профилактическим и лечебным свойствами. Она удобна в практическом использовании, обеспечивает длительное хранение, не имеет противопоказаний.
Заявляемые признаки, предопределяющие получение вышеуказанного технического результата, явно не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретных исследований, которыми заявляемое изобретение проиллюстрировано, но не исчерпано.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Определение аллергезирующего действия активного компонента композиции
Обоснованием выбора тестируемых методов определения аллергизирующих свойств лактоферрина являются следующие критерии:
1. Информативность;
2. Экономичность;
3. Воспроизводимость;
4. Выявление разных типов аллергических реакций. Наиболее оптимальными выбраны следующие тесты:
1. Активная кожная анафилаксия;
2. Метод накожных аппликаций;
3. Коньюнктивальная проба.
Тест-система:
• Вид - морские свинки;
• Порода - беспородные, пятнистые и альбиносы;
• Масса тела в начале исследования -65-70 г.
• Возраст на начало исследования -1 месяца.
• Общее количество - 70;
• Источник - питомник «Андреевка» ГУ НЦ биомедицинских технологий РАМН»;
• Период акклиматизации - 14 суток. Тест-система:
• Вид - кролики;
• Порода - Шиншилла;
• Масса тела в начале исследования -0,5-0,7 кг.
• Возраст на начало исследования -1 месяца.
• Общее количество -18;
• Источник - питомник «Андреевка» ГУ НЦ биомедицинских технологий РАМН»;
Период акклиматизации - 14 суток.
Этические и правовые нормы исследования (регламентирующие стандарты) Исследования выполняют согласно утвержденному письменному протоколу и в соответствии со Стандартными операционными процедурами исследователя (СОП), разработанными в лаборатории (ЦНИЛ). Оценка безопасности исследуемого препарата Оценка безопасности исследуемого препарата лактоферрин осуществляется на основе сравнительных комплексных функциональных, патоморфологических исследований при интраназальном пути поступления препарата в эквитерапевтических дозах и дозах, значительно превышающих эквитерапевтические. Статистическая обработка результатов исследования осуществляется согласно Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М: Медицина, 2005. - 832 с.
Для всех количественных данных вычисляют групповое среднее арифметическое (М), стандартную ошибку среднего (m) либо среднеквадратичное отклонение (SD). Полученные результаты обрабатываются на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 5.5. Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием критерия ANOVA. Различия считают достоверными при уровне значимости р<0,05.
1. Активная кожная анафилаксия. На 14-21 дни на выстриженных участках спины неполовозрелым морским свинкам внутрикожно вводили раствор лактоферрина в двух дозах - 600 и 1500 мг/мл в объеме 0,05 мл (до появления «лимонной корочки»), а также 1% 2,4-динитрохлорбензол (ДНХБ). Контролем реактивности кожи служило введение тем же животным на другом выстриженном участке кожи стерильного изотонического раствора натрия хлорида в объеме 0,05 мл.
Через 20 мин морским свинкам вводили внутривенно по 0,5 мл 1% раствора синего Эванса. Через 30 мин изолировали участки кожи с введением веществ и определяли размеры синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения препарата.
Разрешающие инъекции препарата лактоферрина вводят также контрольным животным.
Группы животных (30 морских свинок):
1. Контроль 1 (2,4-динитрохлорбензол (ДНХБ)), n=10;
2. Лактоферрин 600 мг/мл, n=10;
3. Лактоферрин 1500 мг/мл, n=10;
Реакцию кожи определяют по размеру окрашенного пятна. Размер более 6 мм (положительная реакция) свидетельствует о наличии аллергизирующих свойств.
Как видно из таблицы 1, активная кожная анафилактическая реакция на лактоферрин отсутствовала, в сравнении с выраженной реакцией на ДНХБ 1%.
Результаты экспериментов свидетельствуют об отсутствии аллергических свойств у препарата лактоферрина.
2. Метод накожных аппликаций
На выстриженный участок спины неполовозрелым морским свинкам наносят по 3 капли раствора лактоферрина и эталонного аллергена 2,4-динитрохлорбензола (ДНХБ) 5 раз в неделю (всего 20 накожных аппликаций). Группы животных (30 морских свинок):
1. Контроль 1 (1% крахмальная взвесь), n=10;
2. Контроль 2 (2,4-динитрохлорбензол (ДНХБ)), n=10;
3. Лактоферрин, n=10;
Реакцию кожи определяют по шкале оценки кожных проб. Тяжесть кожных проявлений обозначают в баллах:
0 - отсутствие реакции;
1 - бледно-розовая эритема по всему участку или по его периферии;
2 - ярко-розовая эритема по всему участку или по его периферии;
3 - красная эритема по всему участку;
4 - инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы;
5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъявления (некроз), геморрагия.
Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, накожная аппликация исследуемых веществ не вызывает никакой заметной реакции в сравнении с эталонным препаратом.
Результаты экспериментов свидетельствуют об отсутствии аллергических свойств у лактоферрина.
3. Конъюнктивалъная проба
1 каплю раствора лактоферрина и эталонного аллергена 2,4-динитрохлорбензол (ДНХБ) вводят глазной пипеткой с вытянутым тонким концом под верхнее веко подопытным и контрольным кроликам. Контролем реактивности служит введение тем же животным во второй глаз 1 капли физиологического раствора. Закапывание производится при положении животного лежа головой вниз.
Группы животных (неполовозрелые 18 кроликов):
1. Контроль 1 (физиологический раствор), n=6;
2. Контроль 2 (2,4-динитрохлорбензол (ДНХБ)), n=6;
3. Лактоферрин, n=6; Реакции определяют через 15 мин (быстрая реакция), через 24 и 48 часов (гиперчувствительность замедленного типа) и оценивают по следующей шкале:
1 - легкое покраснение слезного протока;
2 - покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице;
3 - покраснение всей конъюнктивы и склеры.
При введении лактоферрина в глаз, не наблюдалось гиперемии, отека, блефароспазма. Выраженная конъюктивальная реакция наблюдалась при закапывании ДНХБ 1% в ацетоне.
Таким образом, при исследовании аллергизирующего действия в тестах кожных аппликаций, конъюктивальных проб не выявлено способности у лактоферрина вызывать аллергические реакции.
Пример 2. Оценка противомикробной и противогрибковой активности детской присыпки.
Для определения антибактериальной активности образцов присыпки на основе лактоферрина использовали диско-диффузионный метод. Для работы были использованы чашки с 15, а не 20 мл агара. Стандартизованный по Мак-Фарланду инокулят разводили на 20% разводящей жидкостью до 0,5. На диски наносили 50 мкл раствора исследуемого образца. Учет реакции проводили визуально через 18 часов инкубации. Учет реакции проводился измерением зон подавления. В качестве положительного контроля использовали природный лактоферрин коз. Образцы присыпок, на основе лактоферрина, разводили до концентрации 1,0 мг/мл. Далее 50 мкл различных разведений препаратов наносили на диски. Эксперименты с исследованием дозовой зависимости проводили на 3-х клинических изолятах №1, 7 и 9 Staphylococcus aureus. Полученные суммарные результаты представлены на Фиг. 1.
Из полученных данных следует, что образцы присыпок, на основе лактоферрина, обладают антибактериальной активностью, которая проявляется в концентрации - 1 мг/мл лактоферрина.
На Фиг. 2 представлены суммарные данные 3-х опытов, проведенных на антибиотикорезистентных клинических изолятах.
Как видно из Фиг. 2, все без исключения исследуемые образцы присыпок, на основе лактоферрина, обладали антибактериальной активностью. И, следовательно, механизм антибактериальной активности лактоферрина отличается от механизмов действия антибиотиков, к которым была выявлена резистентность.
Исследование способности подавлять рост Candida albicans, было проведено с образцами присыпок, на основе лактоферрина. Полученные данные представлены на Фиг. 3. Эти результаты были воспроизведены в 3-х независимых опытах. Как видно из Фиг. 3, лактоферрин обладает антигрибковой активностью, даже в случае антибиотикоустойчивости патогена.
Для более точной оценки противомикробной активности приведено исследование в отношении референтного штамма Staphylococcus aureus АТСС 25993. Выделение и культивирование штамма микроорганизма проводили в соответствии с использованием известного стандартного протокола (Царев В.Н., Давыдова М.М., Ипполитов Е.В., Николаева Е.Н., и др. // Микробиология, вирусология, иммунология полости рта. (2-е издание, переработанное и дополненное) - М.: 2019, ООО ГЭОТАР-Медиа - 720 с).
Исследуемые образцы, предоставленные «Трансгенбанком», которые разводили в 10 мл питательной среды, используемой в дальнейшем для культивирования микроорганизмов. В питательный бульон была добавлена бактериальная взвесь в концентрации 1,5×108КОЕ. Концентрация лактоферрина в образце составила 100 мг/мл.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы Biostat 9,0. Исследование динамики роста микроорганизмов проводили в шести параллелях, что отражалось на графиках кривых роста бактериальных популяций каждого вида в присутствии различных образцов лактоферрина. Оценка контроля роста соответствующего вида бактерий, отражалась в изменении параметров оптической плотности, на основании которых была построена кривая.
В исследовании больших концентраций лактоферрина (10 мг/мл и выше), проведенном в первые 1-3 суток после внесения образцов этого белка, роста бактерий не наблюдалось, или он сильно запаздывал по сравнению с контролем, Фиг. 4.
Дальнейшие исследования были выполнены с концентрацией 1 мг/мл. В этой концентрации сравнение кривых роста, полученных при использовании лактоферрин из коровьего молока (бЛф) и неолактоферрин (нЛф), были выявлены активности в отношении разных штаммов микроорганизмов и грибков.
Так, кривая роста штамма клинического изолята Staphylococcus aureus (Фиг. 5) отличалась короткой лаг-фазой с переходом в фазу логарифмического роста на 3-й час культивирования, причем переход к стационарной фазе происходил одинаково для сравниваемых видов лактоферринов (9-12 часов). Максимум роста в случае использования бЛф составил 1,0 OD, в то время, как для нЛф - 3,5 OD, что соответственно было в 6 и 1,7 раз меньше, чем в контроле без использования лактоферринов.
Очевидно, что кривые роста при воздействии бЛф и нЛф имели как общие закономерности, соответственно существующим фазам.
Аналогично результатам вышеописанного эксперимента, присыпки с лактоферрином также демонстрирует видимую ингибирующую активность (Фиг. 6).
Таким образом, микробиологический анализ подтвердил, что лактоферрин, присутствующий в качестве активного вещества в составе присыпки, оказывает заметный антибактериальный и противогрибковый эффект.
На заявляемый состав присыпки получен Декларация соответствия ТС N RU Д-RU.АГ92.В.00631, на основании чего присыпка на основе лактоферрина может быть рекомендована к практическому применению и промышленному серийному выпуску.
Таким образом, анализ конкретных примеров использования детской присыпки с лактоферрином по заявляемому техническому решению, а также сопоставление результатов тестов с таковыми у известных технических решений, позволяет утверждать, что состав присыпки безопасен и обладает высокими антисептическими свойствами в отношении бактерий, фунгицидными свойствами в отношении грибов, даже антибиотикоустойчивых форм, и обеспечивает эффективный антибактериальный и противогрибковый эффект за счет лактоферрина. Этот факт имеет принципиальное значение при профилактике и лечении сочетанной, бактериальной и грибковой патологии. Также заявляемая присыпка является достаточно доступной по экономическим соображениям. Она не аллергенна, что позволяет считать ее биологически безопасной для использования у детей и взрослых.
Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки:
1. Войцеховская А.Л. Вольфензон И.И. Косметика сегодня. М. 1988
2. Машковский М.Д.. Лекарственные средства. 1977, т.1, стр. 297
3. ANDERSON, В. F., BAKER, Н. М., NORRIS, G. Е., RUMBALL, S. V. & BAKER, Е. N. 1990. Apolactoferrin structure demonstrates ligand-induced conformational change in transferrins. Nature, 344,784-7.
4. VOGEL, H. J. 2012. Lactoferrin, a bird's eye view. Biochem Cell Biol, 90,233-44 Ward P. P. and Conneely O.M. (2004) Lactoferrin: role in iron homeostasis and host defense against microbial infection. Biometals 17: 203-208
5. KARAV, S. 2018. Selective deglycosylation of lactoferrin to understand glycans' contribution to antimicrobial activity of lactoferrin. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 64,52-57. KARAV, S., GERMAN, J. В., ROUQUI, C, LE PARC, A. & BARILE, D. 2017. Studying Lactoferrin N-Glycosylation. Int J Mol Sci, 18. GANZ, T. 2018. Iron and infection. Int J Hematol, 107,7-15.
6. ЧЕРНОУСОВ А.Д., НИКОНОВА М.Ф., ШАРОВА Н.И., МИТИН A.H., ЛИТВИНА M.M., САДЧИКОВ П.Е., ГОЛЬДМАН И.Л., ЯРИЛИН А.А., САДЧИКОВА Е.Р. Неолактоферрин как стимулятор врожденного и адаптивного иммунитета, Acta Naturae (русскоязычная версия). 2013. Т. 3. №18. С. 67.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М: Медицина, 2005.- 832 с.
8. ЦАРЕВ В.Н., ДАВЫДОВА М.М., ИППОЛИТОВ Е.В., НИКОЛАЕВА Е.Н., и др. // Микробиология, вирусология, иммунология полости рта. (2-е издание, переработанное и дополненное) - М.: 2019, ООО. ГЭОТАР-Медиа - 720 с.