СПОСОБ КОНТРОЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДАМИ, И НЕЙТРАЛИЗАЦИИ УГЛЕВОДОРОДНЫХ ШЛАМОВ ПОСРЕДСТВОМ АНАЛИЗА АКТИВНОСТИ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
METHOD OF MONITORING CLEANING OF SOIL CONTAMINATED WITH HYDROCARBONS AND NEUTRALISATION OF HYDROCARBON SLUDGE THROUGH ANALYSIS OF DEHYDROGENASE ACTIVITY

Изобретение относится к охране окружающей среды и может быть использовано при контроле очистки почв, загрязненных углеводородами (нефтью, нефтепродуктами, газовым конденсатом и продуктами его переработки), и нейтрализации (обезвреживании) углеводородных шламов, которые осуществляются с помощью биологического средства, содержащего в своем составе углеводородокисляющие микроорганизмы, приводящие к полному разложению углеводородов путем каталитического воздействия продуцируемого ими фермента дегидрогеназы.
Наиболее близким к заявленному способу является способ контроля очистки почв от углеводородов (нефти и нефтепродуктов) хроматографическим методом, включающим отбор проб чистой и загрязненной почвы, самого биологического средства и шламов, а также загрязненной почвы и шламов с добавлением биологического средства, стадии экстракции углеводородов нефти и нефтепродуктов, концентрирования и хроматографической очистки экстрактов (К.Г.Панкратова, В.И.Щелоков, Ю.Г.Сазонов. Оценка загрязнения почв нефтепродуктами с использованием диффузной отражательной ИК-спектроскопии // Агрохимия. 2004. №12. С.51-58).
Недостатком этого способа является сложность и трудоемкость стадии экстракции углеводородов нефти и нефтепродуктов с помощью токсических и легковоспламеняющихся реактивов (циклогексан, н-пентан, хлороформ, хлористый метилен, петролейный эфир, тетрагидрофуран, спирто-бензол, толуол, метанол, четыреххлористый углерод), а также концентрирования и хроматографической очистки экстрактов. Кроме того, в процессе отгонки реактивов происходит потеря летучих фракций углеводородов, что искажает результаты анализа. Известный способ в связи с использованием токсичных и легковоспламеняющихся реактивов также требует специально оборудованных помещений и предъявляет жесткие требования к квалификации персонала. В результате отмеченные недостатки не позволяют использовать данный способ для экспрессных и массовых анализов как в условиях оперативной оценки последствий аварийных разливов углеводородов, так и очистки загрязненных почв и нейтрализации углеводородных шламов.
При создании предлагаемого изобретения решались технические задачи снижения сложности и трудоемкости контроля очистки почв, загрязненных углеводородами, и нейтрализации углеводородных шламов, производимых с помощью биологического средства.
Данные технические задачи решались тем, что способ контроля очистки почвы, загрязненной углеводородами, и нейтрализации углеводородных шламов, производимых с помощью биологического средства, характеризуется тем, что отбирают пробы из чистой почвы - проба №1, из биологического средства - проба №2, из почвы, загрязненной углеводородами, - проба №3 или углеводородных шламов - проба №4, из почвы, загрязненной углеводородами, но с добавлением биологического средства - проба №3а или из углеводородных шламов, но с добавлением биологического средства - проба №4а. В качестве метода анализа используют экспрессное определение (в течение не более одних суток) активности фермента - дегидрогеназы отобранных проб с применением не токсичных реактивов, а именно карбоната кальция, водных растворов глюкозы, 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида, насыщенного щелочного раствора пирогаллола и этилового спирта.
При этом о начале очистки почвы, загрязненной углеводородами, и нейтрализации углеводородных шламов с помощью биологического средства судят по повышению активности дегидрогеназы проб №3а или №4а относительно активности фермента проб №3 или №4 соответственно. Об окончании очистки и нейтрализации судят по выравниванию активности дегидрогеназы проб №3а или №4а с активностью фермента проб №1 или №2 соответственно.
Способ осуществляют следующим образом. Отбирают несколько вариантов проб, а именно: из чистой почвы (проба №1), биологического средства (проба №2), почвы, загрязненной углеводородами (проба №3) или углеводородных шламов (проба №4) - контрольные варианты, а также из почвы, загрязненной углеводородами, но с добавлением биологического средства (проба №3а) или из углеводородных шламов, но с добавлением биологического средства (проба №4а) - рабочие варианты. Пробы для биохимического анализа отбирают в 6-ти кратной повторности, в которых экспрессно (за время не более чем одни сутки) определяется активность дегидрогеназы с использованием не токсичных реактивов.
Активность дегидрогеназы проб анализируется с помощью модифицированной колбы Эрленмейера (1) с коленчатым отростком (2), изображенной на чертеже.
С целью анализа активности дегидрогеназы 1 г пробы отдельно из каждого вышеназванного варианта помещается в модифицированную колбу Эрленмейера (1), в которую затем последовательно добавляются 0.1 г тонко измельченного карбоната кальция, по 1 мл 1% водных растворов глюкозы и 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида, и все это перемешивается. Далее в коленчатый отросток (2) с помощью шприца вводится насыщенный щелочной раствор пирогаллола. Колба герметизируется и ставится на инкубирование в термостат при 30°С на одни сутки.
После завершения инкубирования проб производится экстракция образующегося в них 2,3,5-трифенилформазана (вещество красного цвета) с помощью этилового спирта - 5 раз по 4 мл. Экстракты каждой пробы объединяют до объема 25 мл и измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 490 нм и рассчитывают количество 2,3,5-трифенилформазана (ТФФ) по калибровочному графику (выражаемое в единицах мкг или мг ТФФ/г/сут) и различающееся в контрольных и рабочих вариантах, что в результате позволяет судить о процессе очистки почвы от углеводородов или нейтрализации углеводородных шламов.
В результате многочисленных экспериментов обнаружено, что очистка почвы, загрязненной углеводородами (проба №3а) и нейтрализация углеводородных шламов (проба №4а) с помощью биологического средства начинается при повышении активности дегидрогеназы данных проб относительно активности фермента проб №3 или №4 соответственно, а окончательная очистка или нейтрализация наступает при выравнивании активности дегидрогеназы с активностью фермента чистой почвы (проба №1) или с активностью самого биологического средства (проба №2).
2
Так, при внесении биологического средства - биокомпоста «Пикса» в почву, загрязненную газовым конденсатом, активность дегидрогеназы возрастала в среднем в 6-9 раз по сравнению с вариантом без внесения этого ремедиирующего средства, при этом наиболее резко - при дозе, равной 8 кг/м (табл.1).
Нейтрализация шлама газового конденсата с помощью биологического средства - биокомпоста «Пикса» показала, что активность дегидрогеназы смеси биокомпоста со шламом после 42 суток инкубирования имела максимальное значение при соотношениях этих компонентов 1:1 и 2:1, что свидетельствует о нейтрализующей способности данного средства (табл.2).
Таблица 1.
Активность дегидрогеназы при внесении в почву биологического средства - биокомпоста «Пикса». Полевой опыт продолжительностью 42 сут.
Вариант
Активность, мкг ТФФ*/г/сут
Контроль
53.4 а**
Биокомпост «Пикса», 4 кг/м
305.8 б
То же, 8 кг/м
469.1 б
-“-, 12 кг/м<sup>2</sup>
460.1 б
-“-, 16 кг/м<sup>2</sup>
472.7 б
* 2,3,5-трифенилформазан; ** существенные различия между вариантами (при P<sub>1</sub>=0.05) указаны посредством различных букв.
Таблица 2.
Активность дегидрогеназы смеси биологического средства - биокомпоста «Пикса» со шламом газового конденсата в различных соотношениях. Инкубирование смеси в полевых условиях в течение 42 сут.
Соотношения биокомпост «Пикса»: шлам газового конденсата
Активность, мг ТФФ*/г/сут
1: 1
11.0 а**
2: 1
10.8 а
4: 1
9.5 6
8:1
6.7 в
* 2,3,5-трифенилформазан; ** существенные различия между вариантами (при P<sub>1</sub>=0.05) указаны посредством различных букв.