СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛНОСТЬЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ БИСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ С ПРИМЕНЕНИЕМ ОБЩЕЙ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ

1. Способ получения биспецифического антигенсвязывающего белка, включающий:
получение двух различных генных последовательностей вариабельных участков тяжелой цепи человека, полученных от различных В-клеток, выделенных из одной и той же или отдельной мыши, которая экспрессирует единственный вариабельный домен легкой цепи человека и множество вариабельных доменов тяжелой цепи человека, и
получение биспецифического антигенсвязывающего белка, имеющего две тяжелые цепи человека, содержащие аминокислотные последовательности, кодируемые указанными двумя генными последовательностями вариабельных участков тяжелой цепи человека, и легкую цепь человека, содержащую указанный вариабельный домен легкой цепи человека.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что единственный вариабельный домен легкой цепи человека, экспрессируемый в одной и той же или отдельной мыши, кодируется нуклеотидной последовательностью, полученной от единственного перестроенного сегмента V зародышевой линии человека и единственного перестроенного сегмента J зародышевой линии человека.
3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что единственный перестроенный сегмент V зародышевой линии человека представляет собой перестроенный генный сегмент Vκ1-39 человека или перестроенный генный сегмент Vκ3-20 человека.
4. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что единственный перестроенный сегмент J зародышевой линии человека представляет собой перестроенный генный сегмент Jκ5 человека или перестроенный генный сегмент Jκ1 человека.
H
H
H
5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что одна и та же мышь или отличная мышь содержит локус тяжелой цепи, включающий один или несколько неперестроенных генных сегментов V человека, один или несколько неперестроенных генных сегментов D человека и один или несколько неперестроенных генных сегментов J человека, функционально связанных с одним или несколькими не являющимися человеческими генами константного участка тяжелой цепи.
H
H
H
6. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что локус тяжелой цепи содержит 80 неперестроенных генных сегментов V человека, 27 неперестроенных генных сегментов D человека и шесть неперестроенных генных сегментов J человека, функционально связанных с одним или несколькими генами константного участка тяжелой цепи мыши.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
7. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что один или несколько генных сегментов V содержат V1-2, V1-8, V1-24, V1-69, V2-5, V3-7, V3-9, V3-11, V3-13, V3-15, V3-20, V3-23, V3-30, V3-33, V3-48, V3-53, V4-31, V4-39, V4-59, V5-51, V6-1 человека или их комбинацию.
8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что одна и та же или отдельная мышь не содержит эндогенный генный сегмент вариабельного участка легкой цепи, который способен к реаражнировке с образованием гена, кодирующего вариабельный домен легкой цепи.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
9. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что каждая из двух генных последовательностей вариабельного участка тяжелой цепи человека содержит последовательность, полученную от одного и того же или различных сегментов V, при этом сегмент V выбирают из V1-2, V1-8, V1-24, V1-69, V2-5, V3-7, V3-9, V3-11, V3-13, V3-15, V3-20, V3-23, V3-30, V3-33, V3-48, V3-53, V4-31, V4-39, V4-59, V5-51 и V6-1.
10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что две тяжелые цепи человека связывают:
два различных антигена или
два различных эпитопа одного антигена.
11. Способ получения биспецифического антигенсвязывающего белка, включающий:
воздействие на первую мышь, которая экспрессирует единственный вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, полученной из единственной перестроенной генной последовательности вариабельного участка, и множество вариабельных доменов тяжелой цепи человека, первым представляющим интерес антигеном, который содержит первый эпитоп,
воздействие на вторую мышь, которая экспрессирует единственный вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, кодируемый последовательностью нуклеиновой кислоты, полученной из единственной перестроенной генной последовательности вариабельного участка, и множество вариабельных доменов тяжелой цепи человека, вторым представляющим интерес антигеном, который содержит второй эпитоп,
предоставление возможности каждой из первой и второй мыши дать иммунные ответы на представляющие интерес антигены,
определение у первой мыши вариабельного участка первой тяжелой цепи человека, который связывает первый эпитоп представляющего интерес первого антигена,
определение у второй мыши вариабельного участка второй тяжелой цепи человека, который связывает второй эпитоп представляющего интерес второго антигена,
получение гена первой полностью человеческой тяжелой цепи, который кодирует первую тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен первой тяжелой цепи человека, и гена второй полностью человеческой тяжелой цепи, который кодирует вторую тяжелую цепь, содержащую вариабельный домен второй тяжелой цепи человека,
введение генов первой и второй тяжелых цепей в клетку, которая содержит ген единственной полностью человеческой легкой цепи, содержащий единственную перестроенную генную последовательность вариабельного участка человека,
экспрессию первой и второй полностью человеческих тяжелых цепей, кодируемых генами полностью человеческих тяжелых цепей, и полностью человеческой легкой цепи, кодируемой единственным геном полностью человеческой легкой цепи, в клетке с образованием биспецифического антигенсвязывающего белка, и
выделение биспецифического антигенсвязывающего белка из указанной клетки.
12. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что единственная перестроенная генная последовательность вариабельного участка человека содержит перестроенный генный сегмент Vκ1-39 или Vκ3-20 человека.
13. Способ по п. 12, характеризующийся тем, что единственная перестроенная генная последовательность вариабельного участка человека дополнительно содержит перестроенный генный сегмент Jκ1 или Jκ5 человека.
14. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что:
первый антиген и второй антиген не являются идентичными; или
первый антиген и второй антиген являются идентичными, а первый эпитоп и второй эпитоп не являются идентичными.
15. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что полностью человеческая легкая цепь при образовании пары с первой полностью человеческой тяжелой цепью специфично связывает первый эпитоп первого антигена, а полностью человеческая легкая цепь при образовании пары со второй полностью человеческой тяжелой цепью специфично связывает второй эпитоп второго антигена.
16. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что первая или вторая полностью человеческая тяжелая цепь, но не обе, несет аминокислотную модификацию, которая уменьшает ее аффинность к белку А.
17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что модификацию выбирают из 95R (EUR 435R), 96F (EUR 436F) и их комбинации.
18. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что единственная перестроенная генная последовательность вариабельного участка человека представляет собой последовательность зародышевой линии.
H
H
H
19. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что множество вариабельных доменов тяжелой цепи человека у первой и второй мыши кодируются локусом тяжелой цепи, включающим один или несколько неперестроенных генных сегментов V человека, один или несколько неперестроенных генных сегментов D человека и один или несколько неперестроенных генных сегментов J человека, функционально связанных с одним или несколькими генами константных участков тяжелой цепи, не являющимися человеческими.
H
H
H
20. Способ по п. 19, характеризующийся тем, что локус тяжелой цепи у первой или второй мыши содержит 80 неперестроенных генных сегментов V человека, 27 неперестроенных генных сегментов D человека и шесть неперестроенных генных сегментов J человека, функционально связанных с одним или несколькими генами константного участка тяжелой цепи мыши.
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
21. Способ по п. 19, характеризующийся тем, что один или несколько генных сегментов V включают V1-2, V1-8, V1-24, V1-69, V2-5, V3-7, V3-9, V3-11, V3-13, V3-15, V3-20, V3-23, V3-30, V3-33, V3-48, V3-53, V4-31, V4-39, V4-59, V5-51, V6-1 человека или их комбинацию.
22. Способ отбора двух вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина человека для применения в биспецифическом антигенсвязывающем белке, включающий:
иммунизацию первой мыши первым представляющим интерес антигеном с получением вариабельного домена первой тяжелой цепи иммуноглобулина человека, который связывается с первым антигеном, причем первая мышь экспрессирует единственный вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, полученный с единственной перестроенной генной последовательности вариабельного участка человека, и множество вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина человека; и
иммунизацию второй мыши вторым представляющим интерес антигеном с получением вариабельного домена второй тяжелой цепи иммуноглобулина человека, который связывается со вторым антигеном, причем вторая мышь экспрессирует единственный вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, полученный с единственной перестроенной генной последовательности вариабельного участка человека, и множество вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина человека.
23. Способ по п. 22, характеризующийся тем, что единственная перестроенная генная последовательность вариабельного участка человека содержит перестроенный генный сегмент Vκ1-39 или Vκ3-20 человека.
24. Способ по п. 23, характеризующийся тем, что единственная перестроенная генная последовательность вариабельного участка человека дополнительно содержит перестроенный генный сегмент Jκ1 или Jκ5 человека.
25. Способ по п. 22, характеризующийся тем, что первая и вторая мышь не содержат эндогенный генный сегмент вариабельного участка легкой цепи, который способен к реаранжировке с образованием легкой цепи иммуноглобулина.
26. Способ по п. 22, характеризующийся тем, что первый и второй антигены являются:
различными; или
идентичными, и вариабельные домены первой и второй тяжелой цепи связывают различные эпитопы.
27. Клетка-хозяин, содержащая:
(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первую тяжелую цепь иммуноглобулина человека, которая связывает первый антиген, причем первая тяжелая цепь человека содержит последовательность вариабельного домена первой тяжелой цепи человека, и последовательность вариабельного домена первой тяжелой цепи человека кодируется нуклеотидной последовательностью, полученной из первой мыши, иммунизированной первым антигеном;
(b) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вторую тяжелую цепь иммуноглобулина человека, которая связывает второй антиген, причем вторая тяжелая цепь человека содержит последовательность вариабельного домена второй тяжелой цепи человека, и последовательность вариабельного домена второй тяжелой цепи человека кодируется нуклеотидной последовательностью, полученной из второй мыши, иммунизированной вторым антигеном;
причем каждая из первой и второй мыши экспрессирует единственный вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека, который кодируется единственной перестроенной генной последовательностью вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина человека, и множество вариабельных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина человека; и
(с) третью последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую единственную перестроенную генную последовательность вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина человека, причем третья нуклеиновая кислота кодирует легкую цепь иммуноглобулина человека;
причем первая, вторая и третья последовательности нуклеиновой кислоты экспрессируются с образованием антигенсвязывающего белка, который связывает первый и второй антиген.
28. Клетка-хозяин по п. 27, причем единственная перестроенная генная последовательность вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина человека содержит перестроенный генный сегмент Vκ1-39 или Vκ3-20 человека.
29. Клетка-хозяин по п. 28, причем единственная перестроенная генная последовательность вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина человека дополнительно содержит перестроенный генный сегмент Vκ1-39 или Vκ35 человека.