Факторы врожденного иммунитета в патогенезе красного плоского лишая

дерматология

Факторы врожденного иммунитета в патогенезе красного плоского лишая

Л.В.Ганковская1, А.А.Шахнович2, О.А.Ганковская3, Л.В.Ковальчук1, Д.Д.Карташов1, А.Г.Пашинян2

1Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра иммунологии медико-биологического факультета, Москва (зав. кафедрой - проф. Л.В.Ковальчук);

2Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова,

кафедра дерматовенерологии лечебного факультета, Москва

(зав. кафедрой - акад. РАМН, проф. А.А.Кубанова);

3НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, Москва

Цель исследования - изучение факторов врожденного иммунитета в клетках кожи у больных красным плоским лишаем. Показано, что уровень экспрессии гена TLR2 в клетках патологического очага повышен при всех формах красного плоского лишая, при этом статистически значимые различия выявлены у больных с острым и подострым течением заболевания. Экспрессия гена HBD-2 в коже при остром и подостром течении снижена, при хроническом - практически не отличается от нормальных значений. Концентрация нейтрофильных дефенсинов HNP-1-3 в сыворотке крови при остром и подостром течении болезни значительно повышена, при хроническом - снижена. Полученные данные позволяют по-новому взглянуть на патогенез красного плоского лишая, выделив гиперэкспрессию распознающего рецептора TLR2 в качестве одного из пусковых механизмов патологического процесса в коже при данном заболевании. Ключевые слова: красный плоский лишай, а-дефенсины, b-дефенсины, Toll-подобные рецепторы

Factors of innate immunity in the pathogenesis of lichen ruber planus

L.V.Gankovskaya1, A.A.Shakhnovich2, O.A.Gankovskaya3, L.V.Kovalchuk1, D.D.Kartashov1, A.G.Pashinyan2

1N.I.Pirogov National Research Medical University,

Department of Immunology of Medical-Biological Faculty, Moscow

(Head of the Department - Prof. L.V.Kovalchuk);

2N.I.Pirogov National Research Medical University,

Department of Dermatology and Venerology of Medical Faculty, Moscow

(Head of the Department - Acad. of RAMS, Prof. AA.Kubanova);

3I.I.Mechnikov Researsh Institute of Vaccines and Sera of RAMS, Moscow

The purpose of the investigation was to study the factors of innate immunity in the skin cells in patients with lichen ruber planus. It was shown that the level of TLR2 gene expression in cells of abnormality was increased in all forms of lichen ruber planus, while statistically significant differences were detected in acute and sub-acute periods of the disease. HBD-2 gene expression was decreased in acute and sub-acute processes, but there were no statistical differences in chronic cases from the normal values. HNP-1-3 concentration in serum was significantly increased in acute and sub-acute processes, but it was reduced in long-lasting chronic cases. The data obtained allow a new perspective on the pathogenesis of the lichen ruber planus, highlighting the overexpression of recognizing receptor TLR2 as one of the triggers of the pathological process in affected skin. Key words: lichen ruber planus, а-defensins, b-defensins, Toll-like receptors

Красный плоский лишай (КПЛ) - полиэтиологическое хроническое воспалительное заболевание кожи, при котором в патологический процесс могут вовлекаться сли-

Для корреспонденции:

Шахнович Анна Александровна, аспирант кафедры дерматовенерологии

лечебного факультета Российского национального исследовательского

медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 119071, Москва, Ленинский пр-т, 17

Телефон: (499) 248-4348

E-mail: shakhnovichaa@mail.ru

Статья поступила 06.06.2011 г., принята к печати 14.12.2011 г.

зистые оболочки и ногти. Распространенность КПЛ в структуре дерматологических болезней составляет до 2,4% [1]. Этиология и патогенез данного заболевания на сегодняшний день еще недостаточно изучены. Наиболее частые причины развития дерматоза - психоэмоциональные стрессы, инфекционные заболевания, воздействие собственных метаболитов организма, образующихся при висцеропати-ях, прием некоторых лекарственных препаратов и влияние химических веществ [1, 2]. M.Kofoed предположил наличие генетической предрасположенности у некоторых больных

с отягощенным семейным анамнезом по данному заболеванию [3].

Согласно современным представлениям об иммунных механизмах развития КПЛ, в основе патогенеза лежит иммунопатологическая реакция гиперчувствительности замедленного типа. При этом активированные Т-лимфоциты привлекаются в дермо-эпидермальное соединение и индуцируют апоптоз базальных кератиноцитов. В инфильтрате при КПЛ обнаруживаются CD4- и CD8-субпопуляции Т-лимфо-цитов. Взаимодействие между базальными кератиноцитами и Т-лимфоцитами усиливается из-за повышенной экспрессии межклеточных молекул адгезии ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) базальными кератиноцитами [4]. Межклеточные молекулы адгезии ICAM, экспрессируемые на поверхности кератиноцитов, являются цитокин-индуци-руемыми молекулами.

Повышение активности клеточного звена иммунитета при КПЛ приводит кератиноциты к апоптозу, при этом лимфоцитами и кератиноцитами увеличивается продукция таких ци-токинов, как интерферон-гамма (IFN-y), фактор некроза опухоли-альфа (TNF-a), фактор транскрипции NF-kB, интерферон-альфа (IFN-a), интерлейкин-6 и -8 (IL-6, IL-8), молекулы клеточной гибели Fas. Перечисленные цитокины дополнительно привлекают лимфоциты в патологический очаг. Описываемый процесс называют лихеноидной тканевой реакцией [5].

Существует мнение, что при КПЛ эпителиальные клетки могут быть активированы химическими или микробными агентами, которые взаимодействуют с распознающими рецепторами врожденного иммунитета - Toll-подобными рецепторами (TLR). Стимуляция эпителиальных TLR патогенными или эндогенными лигандами вызывает продукцию хемокинов, экспрессию молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и способствует привлечению в очаг лимфоцитов с последующей продукцией цитокинов [6]. Установлено, что при КПЛ с поражением слизистой оболочки установлено снижение уровней экспрессии TLR2 и TLR4 в клетках слюны и слизистой оболочки полости рта [7]. При этом в литературе нет сведений об уровне экспрессии данных Toll-подобных рецепторов в патологически измененных участках кожи при КПЛ.

Активация TLR приводит не только к экспрессии молекул адгезии и цитокинов, но и индуцирует выработку противоми-кробных пептидов - р-дефенсинов. Человеческие р-дефен-сины (HBD) продуцируются многими типами эпителиальных клеток для защиты от различных вирусов, бактерий и грибов.

Механизмы врожденного иммунитета в патогенезе КПЛ практически не изучены. Однако именно эти механизмы определяют распознавание и элиминацию патогенов и эндогенных лигандов в первые минуты после их действия, а также индуцируют развитие адаптивного иммунного ответа. В связи с этим использование новых технологий оценки компонентов врожденного иммунитета (определение экспрессии генов TLR и противомикробных пептидов) в диагностике, прогнозе и лечении КПЛ представляет актуальную задачу.

Цель работы - изучение экспрессии генов TLR2 и HBD-2 в очагах патологического кожного процесса и оценка концентрации нейтрофильных противомикробных пептидов в сыворотке крови у больных красным плоским лишаем.

Пациенты и методы

Под наблюдением находились 17 пациентов с диагностированным по основным клиническим критериям КПЛ в возрасте от 37 до 60 лет. У 1 пациента было отмечено острое течение процесса, у 9 - подострое (более 2-х мес без стойкой ремиссии), у 7 пациентов диагностировано хроническое заболевание (волнообразное течение с периодами обострений и ремиссий при длительности заболевания более года) в стадии обострения патологического процесса. Контрольную группу составили 10 здоровых доноров.

Уровень экспрессии генов HBD-2 и TLR2 в пробах из патологического очага КПЛ определяли c помощью методов: выделения РНК из клеток, реакции обратной транскрипции на матрице мРНК генов TLR2 или HBD2, определения числа копий с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени [8]. Данные представлены в виде отношения десятичного логарифма количества копий исследуемого гена к десятичному логарифму 1 млн копий гена актина.

Содержание нейтрофильных дефенсинов HNP-1-3 (Human Neutrophil Peptides) в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного анализа с использованием тест-системы.

Статистическая обработка результатов проведена с помощью стандартных программ StatGraf и BMDP, используемых при обработке биологических и медицинских данных. Сравнение малых выборок проводили с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [9].

Результаты исследования и их обсуждение

В очагах высыпаний при КПЛ отмечена тенденция к повышению экспрессии гена распознающего рецептора TLR2 вне зависимости от стадии заболевания. Достоверно значимые (p < 0,01) различия были выявлены у больных с острым и подострым течением заболевания: уровень экспрессии соответствовал 4,123 ± 0,086 при норме 3,352 ± 0,587. У пациентов с хроническим течением КПЛ увеличение уровня экспрессии гена TLR2 было не столь значительным; величина экспрессии составила 3,665 ± 0,269 (рис. 1).

4,5 г

ос Я

4

3,5

— S СО t

S « 3

I- СО

1 2 2,5

0

° § 2 СО §

I 5 1

0,5 0

1

2

3

Рис. 1. Уровень экспрессии гена ТLR2 в клетках кожи в норме и при красном плоском лишае. 1 - контрольная группа; 2 - острое и подострое течение заболевания; 3 - хроническое течение заболевания. *р < 0,01 по сравнению с нормой.

Факторы врожденного иммунитета в патогенезе красного плоского лишая

i 3

S2

СО

(О 2,5

X '

CD

1 2 Ü1.5

с

s

0,5 0

1

2

3

Рис. 2. Уровень экспрессии гена HBD-2 в клетках кожи в норме и при красном плоском лишае. 1 - контрольная группа; 2 - острое и подострое течение заболевания; 3 - хроническое течение заболевания. *р < 0,01 по сравнению с нормой.

2500 —

7 2000

01

^ 1500

СЕ S

СО

£1000

ф

X

2 500

0

1

2

3

Рис. 3. Концентрация HNP-1-3 в сыворотке крови у здоровых лиц и больных красным плоским лишаем. 1 - контрольная группа; 2 - острое и подострое течение заболевания; 3 - хроническое течение заболевания. *р < 0,01 по сравнению с нормой.

Уровень экспрессии гена противомикробного пептида HBD-2 в клетках кожи пациентов с острым и подострым течением КПЛ был достоверно снижен по сравнению с керати-ноцитами здоровых доноров (2,091 ± 0,18 при норме 3,146 ± 0,417). При хроническом течении уровень экспрессии гена HBD-2 в клетках кожи достоверно не отличался от нормальных значений и составлял 3,192 ± 0,522 (рис. 2).

Таким образом, можно предположить, что повышенная экспрессия гена рецептора врожденного иммунитета в патологически измененных очагах кожи при КПЛ индуцирует выработку провоспалительных цитокинов, таких как IFN-Y, TNF-a, ^-6, ^-8, которые дополнительно привлекают лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы в патологический очаг, а также вызывают апоптоз кератиноцитов [7]. Одновременно происходит снижение экспрессии гена HBD-2 в патологически измененных кератиноцитах, что приводит к нарушению локальной противомикробной защиты и иммунорегуляторных механизмов. Не исключено, что эти процессы индуцируют развитие патологической реакции гиперчувствительности замедленного типа, лежащей в основе патогенеза КПЛ.

Известно, что нейтрофильные дефенсины HNP-1-3 -одни из основных противомикробных молекул, секретируе-мых нейтрофилами и эозинофилами. Некоторые дефенсины вызывают дегрануляцию тучных клеток с высвобождением хемокинов и обладают прямой хемотаксической активностью. Таким образом, противомикробные пептиды могут привлекать лейкоциты в очаг воспаления при КПЛ [10].

Исследование содержания дефенсинов HNP-1-3 в сыворотке крови больных КПЛ с острым и подострым течением заболевания выявило достоверно значимое увеличение их концентрации более чем в 4 раза (2086,85 ± 787,89 пг/мл) по сравнению со здоровыми донорами (480,45 ± 158,77 пг/мл). У больных КПЛ с хроническим течением заболевания наблюдали достоверное снижение концентрации нейтрофиль-ных пептидов. Содержание HNP-1-3 было ниже нормы в 1,8 раза (261,64 ± 112,17 пг/мл) (рис. 3). Полученные данные согласуются с результатами А.КЫте и соавт. об увеличении концентрации HNP-1 в слюне пациентов с КПЛ полости рта [11]. Соответственно, изменение концентрации нейтро-фильных противомикробных пептидов можно рассматривать как биомаркер течения красного плоского лишая.

Выводы

При изучении факторов врожденного иммунитета в сыворотке крови больных КПЛ обнаружено снижение концентрации нейтрофильных противомикробных пептидов при хроническом течении заболевания и значительное ее повышение при остром и подостром процессе.

Исследование образцов кожи с очагов КПЛ показало, что экспрессия гена HBD-2 при остром и подостром течении болезни была снижена, при хроническом - практически не отличалась от нормальных значений. При этом уровень экспрессии гена TLR2 был повышен при всех формах КПЛ, но особенно выраженным это повышение было при остром и подостром течении заболевания.

Полученные данные позволяют по-новому взглянуть на патогенез КПЛ, выделив гиперэкспрессию распознающего рецептора TLR2 в качестве одного из пусковых механизмов патологического процесса в клетках кожи при КПЛ.

Активация TLR2 при воздействии патогенов, эндогенных лигандов, химических соединений может приводить к повышенной выработке хемокинов, провоспалительных цитокинов, увеличивать экспрессию адгезивных молекул [12, 13]. Это вызывает инфильтрацию кератиноцитов лимфоцитами, нейтрофилами, макрофагами. Увеличение выработки TNF-a и IFN индуцирует апоптоз в кератиноцитах. Таким образом, изменение компонентов врожденного иммунитета инициирует патологическую реакцию гиперчувствительности замедленного типа, в результате которой и развивается хронический воспалительный процесс в клетках кожи при красном плоском лишае.

Исследование выполнено в рамках приоритетного направления развития «Персонализированная медицина» Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова.

Литература

1. Кубанова А.А., Кисина В.И. Рациональная фармакотерапия заболеваний

кожи и инфекций, передаваемых половым путем. М.: Литтерра, 2005.

С.301-307.

2. Manolsche L., Seceleanu-Petrescu D., Benea V., Manolache D.V. Lichen planus patients and stressful events // J Eur Acad Dermatol Venereol. 2008. V.22. P. 437-441.

3. Kofoed M., Wantzin G. Familial lichen planus. More frequent than previously suggested? // J. Am. Acad. Dermatol. 2009. V.13. №1. P.50-54.

4. Lehman Julia S., Tollefson Megha M., Gibson Lewrence E. Lichen planus // Int. J. Dermatol. 2009. V.48. P.682-694.

5. Meller S., Gilliet M., Homey B. Chemokines in the pathogenesis of lichenoid tissue reactions // J. Invest. Dermatol. 2009. V.129. P.315-319.

6. Yamamoto T., Nakane T., Osaki T. The mechanism of mononuclear cell infiltration in oral lichen planus: the role of cytokines released from keratinocytes // J. Clin. Immunol. 2000. V.20. P.294-305.

7. Srinivasan M., Kodumudi K.N., Zunt S.L. Soluble CD14 and toll-like receptor-2 are potential salivary biomarkers for oral lichen planus and burning mouth syndrome // Clin Immunol. 2008. V.126. №1. P.31-37.

8. Ганковская Л.В., Богомильский М.Р., Рахманова И.В., Ганковский В.А. Экспрессия противомикробных пептидов слизистой оболочки носа при гипертрофии аденоидных вегетаций // Вестн. Урал. АН. 2010. №2. С.108-109.

9. Крамер Г. Математические методы статистики. М.: Мир, 1975. С.55-67.

10. Gomes Pde S., Fernandes M.H. Defensins in the oral cavity: distribution and biological role // J. Oral Pathol. Med. 2010. V.39. №1. P.1-9.

11. Khine A. et al. Human neutrophil peptides induce interleukin-8 production through the P2Y6signalling pathway // Blood. 2006. V.107. P.29-36.

12. Kikkert R., Laine M.L., Aarden L.A., van Winkelhoff A.J. Activation of Toll-like receptors 2 and 4 by Gram-negative periodontal bacteria // Oral Microbiol. Immunol. 2007. V.22. P.145-151.

13. Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д., Ройт А. Иммунология. М.: Логосфера, 2007. С.143-144.

Информация об авторах:

Ганковская Людмила Викторовна, доктор медицинских наук, профессор кафедры иммунологии медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-9000 E-mail: lvgan@yandex.ru

Ганковская Оксана Анатольевна, доктор медицинских наук,

заведующая лабораторией молекулярной иммунологии НИИ вакцин

и сывороток им. И.И.Мечникова

Адрес: 105064, Москва, Малый Казенный пер., 5а

Телефон: (495) 674-5501

E-mail: oksgan@yandex.ru

Ковальчук Леонид Васильевич, доктор медицинских наук,

профессор, заведующий кафедрой иммунологии медико-биологического

факультета Российского национального исследовательского

медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-8047

Карташов Дмитирий Дмитриевич, кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры иммунологии медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-5467

Пашинян Альбина Гургеновна, доктор медицинских наук,

профессор кафедры дерматовенерологии лечебного факультета

Российского национального исследовательского медицинского

университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 119071, Москва, Ленинский пр-т, 17

Телефон: (495) 954-53-97

E-mail: stso@rambler.ru

из жизни университета

Учебники и монографии

Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии: Учебник. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. 640 с.

Ковальчук Леонид Васильевич - доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, заведующий кафедрой иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова, заслуженный деятель науки РФ.

Ганковская Людмила Викторовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова.

Мешкова Раиса Яковлевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой клинической иммунологии и аллергологии Смоленской государственной медицинской академии. Руководитель областного центра аллергологии-иммунологии. Заслуженный врач РФ.

В основу учебника положен многолетний опыт преподавания современной общей и клинической иммунологии на кафедре иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова и на кафедре клинической иммунологии и аллергологии Смоленской медицинской академии. Методология изложения материала построена на современных представлениях о том, что предмет клинической иммунологии - иммунная система организма, ее структурные и функциональные особенности в норме и при патологии. В связи с этим основное внимание уделяется изложению ключевых вопросов общей иммунологии, дающих знания об иммунной системе человека и ее врожденном и приобретенном компонентах, а также наиболее важных тем клинической иммунологии, включая иммунопатологию, оценку иммунного статуса человека, генетически опосредованные и приобретенные иммунодефициты, аллергические заболевания, иммунотерапию и иммунопрофилактику. Учебник предназначен для студентов медицинских вузов, клинических ординаторов, аспирантов, аллергологов-иммунологов.