Генетическая индукция репрограммирования ядра соматической клетки установленными факторами

ИМИ!

Новости клеточных технологий

состоянии. Н90 влияет на обе функции этой молекулы, как нарушая как хоуминг, так и приводя к дифференцировке лейкемических бластов и их последующей гибели. Эти ре зультаты позволяют предположить возможность появления совершенно новой линии терапии, исключающей примене ние препаратов, воздействующих на делящиеся клетки - тем более, что малигнизированные миелоидные клетки часто оказываются к ним устойчивы.

Н90 блокирует хоуминг примитивных С034^С038~ кле ток как в костный мозг, так и в селезёнку, а также препят ствует трансмиграции лейкемических клеток через стенки капилляров. Пока неясно, может ли применение Н90 стиму лировать быструю дифференцировку уже начавших диффе ренцироваться злокачественных клеток. Может оказаться, что механизмы, справедливые для лейкозов, могут быть за действованы и в солидных опухолях, содержащих неболь шую популяцию стволовых клеток, обеспечивающих рост опухолевой массы [4]. Также для клеток солидных опухолей

важны контакты с их микроокружением, которое в основ ном составляют стромальные фибробласты. Задействова ны ли в этих процессах специфические изоформы CD44, ещё предстоит выяснить. Тем не менее, недавно было показано, что инициирующие клетки рака груди также экспрессируют молекулу CD44 [9].

Таким образом, результаты, полученные группой Dick et al„ открывают большие перспективы терапии, воздействую щей непосредственно на стволовые клетки опухоли - то есть, фактически, на её первопричину, а не на следствие. В дополнение к этому авторы продемонстрировали, насколько важно для РСК их микроокружение, без которого они не мо гут сохранять свои «стволовые» характеристики. Конечно, кроме CD44 существует и ряд других поверхностных и внут риклеточных сигнальных молекул [10], отвечающих за регу ляцию функций раковых и нормальных взрослых стволовых клеток, которые могут стать потенциальной мишенью для со здания противораковых препаратов нового поколения.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Wang J.C., Dick J.E. Cancer stem cells: lessons from leukemia. Trends Cell Biol. 2005; 15: 494 501.

2. Hope K., Jin ,L, Dick J.E. Acute myeloid leukemia originates from a hierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self renewal capacity. Nat. Immunol. 2004; 5: 738 43.

3. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 1997; 3: 730 7.

4. Clarke M.F., Dick J.E., Dirks P.B. et al. Cancer Stem Cells perspectives on current status and future directions: AACR workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 2006; 66: 9339 44.

5. Tallman M.S. New stratefies for the treatment of acute myeloid leukemia including anbtibodies and other novel agents. Hem. Am. Soc. Hematol. Educ.

Program 2005; 143 50.

6. Krause D.S., Lazarides K., von Andrian U.H. et al. Requirement for CD44 in homing and engraftment of BCR ABL expressing leukemic stem cells. Nat. Med. 2006; 12(10): 1175 80.

7. Ponta H., Sherman L., Herrlich P.A. CD44: from adhesion molecules to signaling regulators. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003; 4: 33 45.

8. Bendall L.J., Bradstock K.F., Gottlieb D.J. Expression of CD44 variant exons in acute myeloid leukemia is more common and more complex than that observed in normal blood, bone marrow or CD34t cells. Leukemia 2000; 14: 1239 46.

9. Al Hajj M., Wicha M., Morrison S.J. et al. Prospective indentification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 10O: 3983 8.

10. Yilmaz O.H., Valdez R., Theisen B.K. et al. Pten dependence distinguishes haematopoietic stem cells from leukaemia initiating cells. Nature 2006; 441(7092): 475 82.

Подготовила А,С, Григорян По материалам Nat, Med, 2006; 12(10): 1167-74

Генетическая индукция репрограммирования ядра соматической клетки установленными факторами

Феномен репрограммирования ядра взрослой соматичес кой клетки интенсивно изучается в последнее время в связи с возможными перспективами получения «пациент специфич ных» плюрипотентных клеток, подобных эмбриональным ство ловым (ЭСК). При реализации этого феномена, под влиянием неизвестных факторов в ядре соматической клетки происхо дит активация генов раннего эмбриогенеза и ингибирование генов, ответственных за дифференцировку и специализацию. При полном репрограммировании «стирается» как специали зированная генетическая, так и эпигенетическая информация, и клетка приобретает свойство плюрипотентности.

Полное репрограммирование соматической клетки про исходит при переносе ядра в энуклеированную неоплодот ворённую яйцеклетку (технология клонирования) [1] и при слиянии взрослой специализированной клетки с ЭСК [2, 3]. Эти эксперименты доказали возможность полного репрог раммирования ядра терминально дифференцированной клетки. Остаются неизученными механизмы и факторы, обус ловливающие реализацию этого биологического феномена. Лаборатория Austin Smith показала, что одним из ключевых факторов репрограммирования ядра взрослой клетки может быть ген Nanog [4]. Недавно исследовательская группа Shinya

Yamanaka из Kyoto University описала новый эксперимен тальный подход к репрограммированию ядра соматической клетки и изучению факторов, обусловливающих этот феномен. Результаты исследования опубликованы в журнале Cell.

Авторы предположили, что искусственно индуцированная избыточная экспрессия «генов плюрипотентности», описан ных как факторы поддержания «стволовости» в ЭСК, может стимулировать процесс репрограммирования взрослой клетки до эмбриональной. Для проверки гипотезы авторы проводили трансфекцию изолированными генами кандида тами 2 типов клеток - эмбриональных и взрослых фиброб ластов мыши. Всего было выбрано 24 гена кандидата, среди них гены самообновления, а также гены активные в опухо левых клетках и ЭСК, описанных в некоторых работах и из библиотеки in silico (Oct3/4, Sox2, Nanog, С myc и др.).

Одновременное введение всех 24 генов приводило к ак тивации промотера, активного только в ЭСК (Fbx15) и появле нию антибиотик селективных колоний. Введение каждого гена по отдельности не приводило к росту ЭСК подобных колоний. Последовательными экспериментами авторы «су зили» окно искомых генов сначала до 10 (iPSMEF10 клетки), а потом до 4 (iPS MEF4) 0ct3/4, Sox2, с Мус и Klf4.

111111

III

Новости клеточных технологий

Общая схема подходов к изучению феномена репрограммирования ядра соматической клетки: А - эксперимент ЭЫпуа Уатапака; Б - перенос ядра [1], слияние [2, 3] и генетическая индукция Заимствовано с модификацией [8]

I I I I I I

I I I

Новости клеточных технологий

Все эти факторы описаны и известны как определяющие и поддерживающие самообновление и «стволовость» ЭСК [5 7]. IPS MEF4 клетки, полученные из эмбриональных фиб робластов, обладали типичными свойствами ЭСК - имели подобную морфологию и рост в культуре с формированием эмбриоидных телец, образовывали тератомы в классическом in vivo тесте, были способны к мульти дифференцировке. Другим важным доказательством эффективности метода репрограммирования стал эксперимент по получению ЭСК подобных колоний из взрослых фибробластов индукцией 4 вышеуказанных генов (iPSTTF4) и демонстрация их плюри потентности формированием тератом in vivo, а также химери зация эмбриона при их инъекции в бластоцисту.

Интересно, что эффективность формирования ЭСК подобных колоний не зависела от введения гена Nanog -первого и значительного (по мнению группы Austin Smith) фактора кандидата, обусловливающего феномен репрог раммирования (4). В комментарии к статье Kevin Eggan и Kit Rodolfa из Harvard Stem Cell Institute указывают, что полу ченные клетки нельзя назвать абсолютно идентичными ЭСК, а репрограммирование полным. На это указывают факты отсутствия постнатальной химеризации животных после инъекции в бластоцисту, увеличение разницы в карте ген ной экспрессии на микрочипах при пассировании клонов по сравнению с контрольными ЭСК (например, отсутствие

экспрессии Еса11), различный уровень метилирования 0с13/4 промотера, говорящий о неполном эпигенетичес ком репрограммировании. Поэтому, по сравнению с други ми методами, уровень репрограммирования фибробластов в работе остаётся неполным, и, возможно, !РЭ клетки более похожи на клетки эмбриональной карциномы (ЕСС), но не идентичны ЭСК (8).

Тем не менее, эксперименты Уатапака чётко указыва ют на перспективность такого методического подхода для тестирования возможных факторов репрограммирования в эксперименте. Авторы впервые показали, что метод приме ним для индукции репрограммирования взрослой дифферен цированной соматической клетки (на примере взрослого фибробласта мыши) и выявили 4 новых фактора, обуслов ливающих этот феномен. Остаётся неизвестным значение в репрограммировании каждого фактора в отдельности, их ансамбль и взаимодействие. Приведёт ли к полному реп рограммированию взрослой терминально дифференциро ванной клетки добавление ещё одного двух каких либо факторов и каких? Будет ли этот метод работать на других типах соматических клеток и у человека? Ответы на эти воп росы позволят понять биологические механизмы феномена репрограммирования и значительно продвинуть клинические перспективы метода создания пациент специфичных плю рипотентных клеток в регенеративной медицине.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Wilmut I., Schnieke А.Е., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385(6619): 810 3.

2. Tada М., Takahama Y., Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr. Biol. 2001; 11: 1553 8.

3. Cowan C.A., Atienza J., Melton D.A, Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science 2005; 309: 1369 73.

4. Silva J., Chambers I., Pollard S., Smith A. Nanog promotes transfer of pluripotency after cell fusion. Nature 2006; 441 (7096): 997 1000.

5. Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 2005; 122(6): 947 56.

6. Cartwright P., McLean C., Sheppard A. et al. LIF/STAT3 controls ES cell self renewal and pluripotency by a Myc dependent mechanism. Dev. 2005; 132(5): 885 96.

7. Li Y., McClintick J., Zhong L. et al. Murine embryonic stem cell differentiation is promoted by SOCS 3 and inhibited by the zinc finger transcription factor Klf4. Blood 2005; 105(2): 635 7.

8. Rodolfa K.T., Eggan K. A transcriptional logic for nuclear reprogramming. Cell 2006; 126(4): 652 5.

Подготовил A.B. Берсенев По материалам Cell 2006; 126: 663-76

КЛОНИРОВАНИЕ

Зависимость эффективности клонирования от степени дифференцировки клетки - донора ядра

За последние 10 лет экспериментов по переносу ядра соматической клетки в энуклеированный овоцит с целью кло нирования организмов или создания линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) было установлено, что успех процеду ры зависит от степени дифференцировки клетки - донора ядра. Так было постулировано, что при использовании ядра ЭСК ве роятность рождения жизнеспособных клонов повышается в 5 10 раз [1]. Это привело к рождению гипотезы использова ния ядра «взрослой» стволовой клетки для улучшения резуль тативности процедуры клонирования (2). Логично предполо жить, что «полностью репрограммировать» ядро стволовой или прогениторной клетки теоретически легче, чем терминально

дифференцированной. Справедливость такого подхода совсем недавно была показана в эксперименте, использующем в ка честве донора ядра нейральную стволовую клетку (2). Кроме того, попытки клонирования мыши из постмитотического обо нятельного нейрона (3) и зрелых Т, В лимфоцитов (4) ока зывались удачными только при применении двух шагового протокола путём химеризации бластоцисты или тетраплоид ного эмбриона клонированными ЭСК (3, 4].

Международная группа исследователей из нескольких уни верситетов США и Японии недавно завершила интересное исследование, показывающее зависимость эффективности клонирования мыши от степени дифференцировки клетки -