УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ БИОРАЗЛОГАЕМЫМИ ОРГАНИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ

Техническое решение относится к области экологии, а именно, к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использовано для определения степени загрязнения воды биоразлагаемыми органическими веществами (биохимической потребности в кислороде) в образцах воды различного происхождения.
Для оценки степени загрязненности воды биоразлагаемыми органическими соединениями в настоящее время применяется параметр, обозначаемый как «биохимическая потребность в кислороде» (БПК). Существующий способ определения БПК основан на тестах, минимальная продолжительность которых составляет 5 суток [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М.: 1997. 25 с.]. В настоящее время все предприятия, санитарные службы и водоочистные сооружения РФ используют для повседневного анализа сточных вод стандартный способ. Отсутствие оперативности существенно снижает ценность традиционного способа. По указанной причине возникают экологически опасные ситуации, при которых остается незамеченной поступление на водоочистные сооружения аварийно загрязненных вод или наоборот, недоочистка их в процессе регенерации.
Для оперативного анализа могут быть использованы способы оценки БПК, основанные на использовании биосенсорных анализаторов. В БПК-биосенсорах в качестве распознающих элементов использованы микроорганизмы, способные окислять широкий спектр органических соединений.
Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип является устройство для экспресс-определения БПК, описанное в работе [Пономарева О.Н. Арляпов В.А., Каманин С.С., Юдина Н.Ю., Решетилов А.Н. Биосенсор для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода на основе дрожжевых микроорганизмов родов Candida и Debaryomyces. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А.Овчинникова. Т 6. №3. 2010. с.5-12.]
3
Измерительная система состояла из кислородного электрода с иммобилизованными микроорганизмами, измерительной кюветой и магнитной мешалки. В качестве микроорганизмов были использованы дрожжи Candida maltosa BKM Y-2359, Candida blankii BKM Y-2675 и Debaryomyces hansenii BKM Y-2482. Иммобилизация микроорганизмов проводилась адсорбцией на стекловолоконном фильтре Whatman GF/A. Измерения выполнялись при постоянном перемешивании в открытой кювете с рабочим объемом 5 мл. Биосенсор на основе дрожжей Debaryamyces hansenii обладал лучшими характеристиками и позволял определять БПК5 в диапазоне 2,2-177 мг/дм (без разбавления пробы), время стабильной работы биосенсора составляло более 30 суток.
3
Задачей предлагаемого технического решения является повышение производительности и качества анализа, за счет того, что предложенное устройство позволит проводить определение биохимического потребления кислорода после n-дней инкубации в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах с высокой точностью в диапазоне 0,5-200 мг/дм (без разбавления пробы) за время 10 мин.
Сущность технического решения заключается в том, что устройство для определения степени загрязнения воды биоразлагаемыми органическими веществами, содержащее измерительную кювету, магнитную мешалку и биосенсорную систему, включающую выполненный с возможностью подключения к регистрирующему прибору и к компьютеру кислородный электрод с укрепленным на нем носителем, на котором размещены иммобилизованные микроорганизмы, в биосенсорной системе использован кислородный электрод с укрепленным на нем носителе с размещенной на нем ассоциацией дрожжей Pichia angusta BKM Y-2559, Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 и Arxula adeninovorans BKM Y-2676 в массовом соотношении 1:1:1.
На фиг.1 показано устройство для определения степени загрязнения воды биоразлагаемыми органическими веществами представляющее собой кислородный электрод с иммобилизованными микроорганизмами, сопряженный с измерительной кюветой и магнитной мешалкой.
На фиг 2 показана диаграмма субстратной специфичности (чувствительности) используемой биосенсорной системы.
В табл.1 показаны характеристики предложенного технического решения и прототипа.
Предлагаемое устройство состоит из следующих элементов: биосенсора, состоящего из преобразователя - кислородного электрода 1, на котором размещен биорецептор 2, представляющий собой иммобилизованную на носителе ассоциацию микроорганизмов Pichia angusta BKM Y-2559, Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 и Arxula adeninovorans BKM Y-2676 в массовом соотношении 1:1:1. Кислородный электрод 1 с биорецептором 2 помещены в измерительную кювету 3 объемом 4 мл. Перемешивание раствора в измерительной кювете 3 осуществляется с помощью магнитной мешалки 4 с якорем 5.
Для регистрации сигнала биосенсорной системы используют прибор, определяющий зависимость тока от времени - Electrochemical testing system IPC2000, подключаемый к кислородному электроду и компьютеру.
3
3
3
3
3
3
3
3
4
2
4
4
2
4
2
2
4
2
2
4
2
2
4
6
7
24
2
2
2
4
2
Для формирования рецепторного элемента микробного биосенсора используют дрожжевые штаммы Pichia angusta BKM Y-2559, Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 и Arxula adeninovorans BKM Y-2676, принадлежащие Всероссийской коллекции микроорганизмов (BKM) УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина (г.Пущино, Московская обл.). Для получения биомассы микроорганизмы Pichia angusta выращивали в жидкой среде следующего состава (г/дм): (NH)SO - 2,5; MgSO·7H20 - 0,4; КНРO·3НО - 0,9; NaHPO·2HO·2НО - 3,9; дрожжевой экстракт - 0,5; глицерин - 10; MnSO - 0,0012; СоСl·6НО - 0,0003; (NH)MoO·4HO - 0,0002; СаСl·2НО - 0,0015; FeSO·7HO - 0,01; ЭДТА - 0,001. Среду для выращивания дрожжей стерилизовали автоклавированием при давлении 1,1 атмосфера в течение 45 мин. Клетки выращивали аэробно 36 часов в качалочных колбах объемом 750 см при температуре 28°С. Микроорганизмы Debaryomyces hansenii выращивали на богатой минеральной среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда). Состав жидкой среды: глюкоза - 10 г/дм, пептон - 5 г/дм, дрожжевой экстракт - 0,5 г/дм, дистиллированная вода - 200 см. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1,1 атмосферу в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см при температуре 29°С. Микроорганизмы Arxula adeninovorans культивировали в водной среде следующего состава: 0,3% пептон, 0,3% мясной экстракт, 0,3% дрожжевой экстракт и 1,0% глюкоза. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1,1 атмосферу в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 24 часа в качалочных колбах объемом 750 смпри температуре 37°С.
Принцип работы устройства для определения степени загрязнения воды биоразлогаемыми органическими веществами заключается в следующем:
Кислородный электрод 1 с размещенным на нем биорецептором 2, содержащим иммобилизованную ассоциацию микроорганизмов Pichia angusta BKM Y-2559, Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 и Arxula adeninovorans BKM Y-2676 в массовом соотношении 1:1:1, погружают в измерительную кювету 3 объемом 4 мл с 30 мМ фосфатным буфером (рН 6,8) и регистрируют силу тока, отражающего содержание кислорода в среде (фоновое). Затем вносят пробу, содержащую биоразложимые органические вещества (100 мкл). Измерения проводят при непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки 4 с якорем 5 при комнатной температуре.
3
3
После регистрации сигнала биосенсорной системы (зависимость силы тока от времени) кювету промывают буферным раствором. Рассчитывают величину максимальной скорости потребления кислорода (ответ сенсора, dI/dt, нА/с) и определяют значение БПК5 по предварительно построенной калибровочной кривой. Калибровочная зависимость строится по раствору глюкозо-глутаматной смеси (ГГС) приготовленному согласно ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. В соответствии с указанным нормативным документом принимали, что БПК5, равное 205 мг/дм, соответствует раствору, содержащему суммарно 300 мг/дмглюкозы и глутаминовой кислоты.
Ассоциация микроорганизмов Pichia angusta BKM Y-2559, Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 и Arxula adeninovorans BKM Y-2676 способны окислять очень широкий спектр органических веществ, что дает возможность получить высокую степень корреляции между показаниями биосенсорной системы и стандартным методом.
В таблице 1 представлены характеристики предлагаемого устройства для определения степени загрязнения воды биоразлагаемыми органическими веществами и прототипа.
3
Линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от БПК5 лежит в диапазоне 0,5-200 мг/дм (без разбавления пробы). Длительность единичного измерения не превышает 10 минут. Долговременная стабильность сенсора более 60 суток (падение активности микроорганизмов на протяжении этого времени составило 25%).
3
Таким образом, предлагаемое устройство для определения степени загрязнения воды биоразлагаемыми органическими веществами обеспечивает возможность экспресс-определения индекса БПК за время не более 10 минут в диапазоне 0,5-200 мг/дм (без разбавления пробы) без использования сложного дорогостоящего оборудования.