СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА
METHOD OF OBTAINING PREPARATION BASED ON VACCINE STRAIN OF PLAGUE MICROBE

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения бактерийных препаратов на основе вакцинных штаммов чумного микроба, и может быть использовано для приготовления медицинских иммунобиологических препаратов.
В настоящее время в России единственным препаратом, используемым для специфической профилактики чумы, является вакцина чумная живая сухая, разработанная в 1937…1939 гг. на основе вакцинного штамма EV линии НИИЭГ [Файбич М.М., Карнеев Р.В., 1947 г.]. Длительное применение вакцины чумной живой сухой показало ее высокую эффективность при накожном, внутрикожном, подкожном и ингаляционном способах иммунизации.
Однако проблема сохранения высокоиммуногенных свойств вакцины во многом определяется стабильностью биологических свойств вакцинного штамма чумного микроба, входящего в ее состав, не только в процессе длительного хранения, но и на технологических стадиях производства препарата. Выпускаемые серии вакцины, как показывает практика, могут различаться между собой по физико-химическим свойствам, содержанию живых микробных клеток, термостабильности, остаточной влажности, иммуногенности и другим показателям. Поэтому поиск новых способов получения чумных вакцин, улучшающих их качественные характеристики, является актуальной задачей на современном этапе.
Известен способ получения вакцины чумной живой сухой на основе штамма EV линии НИИЭГ, применяемый в НИПЧИ г. Ставрополя [Промышленный регламент. Регистрационный номер ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича ПР №2334-09]. Способ заключается в последовательном приготовлении из производственной лиофилизированной культуры вакцинного штамма EV посевных культур I…III генерации: I генерации - выращиванием в пробирках на скошенном агаре Хоттингера, II генерации - в матрацах (бутылях) с бульоном Хоттингера или бульоном на основе ферментативного гидролизата казеина (ФГК), III генерации - культивированием в жидкой питательной среде (ЖПС) в бутылях, выращивании нативной культуры на плотной питательной среде (ППС) в АКМ-Ш (реакторе), приготовлении вакцинной взвеси и сухого препарата.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения вакцины чумной живой сухой на основе вакцинного штамма EV, применяемого в 48 ЦНИИ Минобороны России [Промышленный регламент на производство вакцины чумной живой лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, ингаляций и накожного скарификационного нанесения. ПР 08461522-07-08. Утвержден 03.06.2009 г. Регистрационный номер ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича ПР №2120-09]. Способ заключается в последовательном приготовлении из производственной культуры вакцинного штамма EV посевных культур I…III генерации: I генерации - выращиванием микробов в пробирках на скошенной ППС на основе ферментативного гидролизата мяса крупного рогатого скота (ФГМ), II генерации - ЖПС на основе ФГМ во флаконах, III генерации - культивированием в ЖПС на основе ФГМ в бутылях, выращивании нативной культуры в ЖПС, в аппаратах - культиваторах (реакторах), концентрировании микробной взвеси, приготовлении вакцинной взвеси с использованием защитной среды высушивания следующего состава:
лактоза, г·л<sup>-1</sup>
300
декстрин, г·л<sup>-1</sup>
30
тиомочевина, г·л<sup>-1</sup>
30
аскорбиновая кислота, г·л<sup>-1</sup>
30
вода дистиллированная, л
до расчетного объема,
лиофилизации вакцинной взвеси по следующему технологическому режиму:
температура конденсатора - минус (50…70)°C;
температура замораживания материала - минус 30°C;
разрежение в сушильной камере - не более 300 мкм рт.ст;
-1
скорость сушки - 2°С·ч;
время досушивания -10 ч.
Общим с заявляемым способом является аналогичность получения посевной культуры методом выращивания в ЖПС на основе ФГМ в бутылях и концентрирование микробной взвеси.
Основными недостатками способа-прототипа является следующее.
1. Получение традиционного посевного материала, включающее в себя ряд последовательных пересевов на плотных и в жидких питательных средах (посевные культуры I, II, III генераций), не гарантирующих стабильности основных биологических свойств и значительно снижающих резистентность вакцинного штамма чумного микроба к действию внешних факторов на последующих этапах приготовления концентрированной суспензии, вакцинной взвеси и сухой формы готового препарата.
2. Применение в качестве компонента защитной среды высушивания декстрина, который вследствие процессов коагуляции и дальнейшей седиментации, спровоцированной воздействием высокой температуры при автоклавировании, приводит к искусственному увеличению оптической плотности по сравнению с исходной. Это в дальнейшем способствует неадекватности оценки действительной концентрации, возрастанию оптической концентрации микробных клеток непосредственно в вакцинном препарате. Вышеуказанные обстоятельства ведут к нежелательному снижению одного из важнейших показателей качества вакцины чумной живой - процента живых микробных клеток.
3. Использование традиционного режима высушивания вакцинной взвеси с высокой гибелью микробов в условиях лиофильного стресса.
Все вышеперечисленные недостатки требовали серьезного поиска оптимальной схемы приготовления посевного материала, обеспечивающей стабилизацию основных биологических свойств микробов на ранних стадиях производства вакцины, оптимизации компонентного состава среды высушивания для полной протекции микробных клеток перед лиофилизацией и исключения возможных технических ошибок в определении концентрации микробных клеток на стадии приготовления вакцинной взвеси, отработки режимов лиофилизации, позволяющих снизить повреждающее воздействие низких температур и обезвоживания на микробные клетки в процессе сушки.
Задача изобретения заключается в сокращении продолжительности процесса получения вакцинного препарата с одновременным повышением его специфической активности.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом способе получения вакцины разработаны и оптимизированы (таблица 1):
1. Схема получения посевной культуры штамма чумного микроба, предусматривающая культивирование пассированной стабилизированной стартовой культуры (ПССК) в ЖПС в бутылях.
Для приготовления ПССК ампулу с эталонной культурой штамма чумного микроба ресуспендируют до первоначального объема в дистиллированной воде, а затем проводят последовательные трехкратные тестикулярные пассажи микробной культуры через организм восприимчивых животных (морских свинок). Пассированную микробную культуру стерильно выделяют из организма животных и смешивают в соотношении 2:1 со стабилизирующей жидкостью (глицерин, лактоза и полиглюкин). Приготовленную ПССК, предназначенную для получения посевной культуры в бутылях, разливают во флаконы по 60…80 мл и хранят в замороженном состоянии при температуре минус 18…22°C.
-1
Культивирование микробов в ЖПС в бутылях проводят в течение 48 ч при температуре 26…28°C и непрерывной аэрации не менее 10 л·мин. По окончании выращивания проводят биологический контроль культуры и передают ее в реактор для приготовления нативной культуры.
Сравнительная характеристика нативных культур вакцинного штамма чумного микроба, приготовленных по заявляемой схеме и схеме-прототипу, представлены в таблице 2.
-1
-1
-1
-1
2. Компонентный состав защитной среды высушивания: лактоза, г·л - 300,0; тиомочевина, г·л - 30,0; аскорбиновая кислота, г·л - 30,0; полиглюкин, г·л - 30,0; дистиллированная вода, л - до расчетного объема, водородный показатель среды в пределах 7,4…7,8 ед. pH (таблица 3).
3
Полиглюкин (полисахарид-структурообразователь)-отечественный декстран, полученный методом направленного синтеза. Молекулярный вес полиглюкина составляет (50…70)·10 ед. Являясь продуктом частичного гидролиза декстрина, он обладает идентичными свойствами, но значительно уступает в молекулярной массе. Полиглюкин химически инертен, практически не вступает в соединение с другими веществами. Безвредность, нетоксичность и апирогенность полиглюкина доказаны длительным и успешным применением его в области гемотрансфузиологии. Отсутствие побочного влияния на организм человека допускает его применение в качестве компонентов среды высушивания для вакцин.
В основе его действия на микробные клетки лежит процесс стабилизации конформационного состояния белковых молекул за счет восстановления внутримолекулярных водородных связей. Использование полиглюкина в качестве криопротектора позволяет значительно снизить деструкцию микробных клеток при замораживании и обезвоживании в процессе лиофилизации.
-1
3. Технологический режим лиофильного высушивания по основным параметрам: температура конденсатора минус 60°C, температура замораживания материала минус 40°C, разрежение в сушильной камере (глубина вакуума) не более 100 мкм рт.ст., скорость сушки 3°C·ч, время досушивания 6 ч (таблица 3, рисунки 1-3).
Сокращение продолжительности процесса получения вакцины, стабилизация биологических свойств чумного микроба на стадиях приготовления вакцинных полуфабрикатов и улучшение качественных характеристик сухой формы препарата обусловлено:
1) схемой получения посевной культуры вакцинного штамма чумного микроба, предусматривающей культивирование ПССК в ЖПС в бутылях;
2) применением оптимизированной по компонентному составу защитной среды высушивания;
3) оптимизированным по основным технологическим параметрам режимом лиофилизации.
Причинно-следственная связь между совокупностями существенных признаков заявляемого объекта и достигнутых результатов представлена в таблице 4.
Изобретение позволяет приготовить вакцину, соответствующую предъявляемым требованиям и обладающую стабильными биологическими свойствами на протяжении всего допустимого срока хранения.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примером.
-1
Для приготовления посевной культуры чумного микроба хранившуюся при отрицательных температурах ПССК вносят в ЖПС на основе ФГМ в бутылях. Выращивание проводят в течение 48 ч при температуре 26…28°C и непрерывной аэрации не менее 10 л·мин. По окончании выращивания культуры в бутылях проводят ее биологический контроль и передают в реакторы для приготовления нативной культуры. Выращивание микробной взвеси в реакторе проводят методом глубинного культивирования в соответствии с требованиями [Промышленный регламент. Регистрационный номер ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича ПР №2120-09].
Для приготовления среды высушивания навеску полиглюкина предварительно заливают 100…200 мл теплой 40…50°C дистиллированной воды и выдерживают 10…12 ч при температуре 18…24°C. Полученный гомогенный раствор фильтруют в стерильную посуду через марлевый фильтр.
Навеску лактозы заливают 500 мл дистиллированной воды и подогревают до 80…90°C при постоянном перемешивании до полного растворения. После этого полученный раствор разделяют на две части. В одной части растворяют аскорбиновую кислоту, а в другой - тиомочевину; растворение тиомочевины проводят при температуре 70…80°C. Раствор аскорбиновой кислоты нейтрализуют 40% раствором NaOH до величины 7,3…7,5 ед. pH. Приготовленные растворы тиомочевины и аскорбиновой кислоты фильтруют через марлевый фильтр и смешивают с раствором полиглюкина. Величина pH полученной смеси должна находиться в пределах 7,2…7,6 ед. pH. Корректировку величины pH производят 10% раствором NaOH.
Для корректировки оптической плотности при приготовлении вакцинной взвеси готовят также дополнительный раствор среды высушивания с содержанием компонентов в 10 раз меньшим, чем их содержание в основном растворе среды высушивания. Полученную среду высушивания стерилизуют в автоклаве (текучим паром - 40 мин; при 120°C - 20 мин или фильтрацией на фильтрующих установках типа "Sartorius" SM 16277 или "Сартокон-мини").
В бутыль с концентрированной взвесью чумного микроба при помощи вакуума добавляют среду высушивания из расчета 2:1 (2 части концентрированной взвеси, 1 часть среды высушивания). Содержимое бутыли тщательно перемешивают встряхиванием. После этого отбирают пробу вакцинной взвеси в количестве 200…300 мл для оценки ее биологических свойств. Вакцинную взвесь можно хранить при температуре 2…6°C не более 4 ч.
Вакцинную взвесь разливают в стерильные пенициллиновые флаконы по 2,0 мл в каждый с помощью автоматического дозатора над пламенем спиртовки.
-1
-1
Сублимационное высушивание проводят в установке TG-16. Для этого за 3 ч до загрузки охлаждают полки камеры до температуры минус 40°C, конденсатор до температуры минус 60°C. Кюветы с флаконами устанавливают на 1-5 полки сублиматора. В один из флаконов на полках №1, 3, 5 вставляют датчик температуры. Замораживание вакцинной взвеси проводят до температуры минус 40°C. После достижения указанной температуры вакцинной взвеси делают выдержку в течение 2 ч. Включают вакуумный насос и создают разрежение в установке не более 100 мкм рт.ст. Через 1 ч после создания заданной величины разрежения включают подогрев полок. Далее проводят постепенное повышение температуры до 0°C. Скорость сушки в этот период составляет 3°C·ч. При достижении температуры в материале 0°C с помощью подогрева полок за 6 ч доводят ее до температуры 25…30°C. Скорость сушки в этот период составляет 5…6°C·ч и досушивание проводят при этой температуре в течение 6 ч.
Сравнительные характеристики экспериментально-производственных серий вакцины чумной живой сухой, наработанных по заявляемому способу и способу-прототипу, а также в процессе длительного хранения представлены в таблицах 5 и 6.
Таблица 2
Сравнительная характеристика нативных культур вакцинного штамма чумного микроба (<maths num="1"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>X</mi><mo>¯</mo></mover><mo>±</mo><msub><mi>I</mi><mrow><mn>95</mn></mrow></msub></mrow></math><img file="00000002.tif" he="7" wi="14" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
, n=5)
Схема получения посевных культур
Концентрация микробов, N·10<sup>9</sup> м. кл.·мл<sup>-1</sup>, определенная…
Процент живых микробных клеток
Концентрация водородных ионов, ед. pH
по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича
Чашечным методом
Заявляемая
24,0±2,0
12,1+1,3
50,4
7,7
Прототип
22,0+3,0
10,9±1,1
49,5
7,8
Таблица 3
Сравнительная характеристика стадий технологического процесса получения чумной вакцины
Наименование стадии технологического процесса
Описание стадии технологического процесса
прототип (Промышленныйрегламент ПР №2120-09)
заявляемый объект
ТП - 14
Состав стабилизатора:
Состав стабилизатора:
Приготовление вакцинной взвеси
лактоза, г·л<sup>-1</sup> - 300;
лактоза, г·л<sup>-1</sup> - 300;
декстрин, г·л<sup>-1</sup> - 30;
полиглюкин, г·л<sup>-1</sup> - 30;
Операция BP-14-5
тиомочевина, г·л<sup>-1</sup> - 30;
тиомочевина, г·л<sup>-1</sup> - 30;
Приготовление стабилизатора
аскорбиновая кислота, г·л<sup>-1</sup> - 30;
аскорбиновая кислота, г·л<sup>-1</sup> - 30;
вода дистиллированная, л - до расчетного объема.
вода дистиллированная, л - до расчетного объема.
ТП-15. Розлив вакцинной взвеси и сублимационное высушивание
Технологический режим сублимационного высушивания по основным параметрам: температура конденсатора - минус 60°C;
Технологический режим сублимационного высушивания по основным параметрам: температура конденсатора - минус 60°C;
Операция ТП-15-8 Сублимационное высушивание
температура замораживания материала - минус 30°C; разрежение в сушильной камере (глубина вакуума) - не более 300 мкм рт.ст; скорость сушки 2°C·ч<sup>-1</sup>; время досушивания 10 ч
температура замораживания материала минус - 40°C; разрежение в сушильной камере (глубина вакуума) - не более 100 мкм рт.ст; скорость сушки 3°C·ч<sup>-1</sup>; время досушивания 6 ч.
Таблица 4
Причинно-следственная связь между совокупностями существенных признаков заявляемого объекта и достигнутых результатов
Виды технического результата и их размерность
Показатели фактические и расчетные
Подробное описание, за счет чего стало возможным улучшение показателей предложенного объекта по сравнению с прототипом
прототип
заявляемый объект
Концентрация микробных клеток,
Использование оптимизированного компонента состава защитной среды высушивания и оптимизированного технологического режима лиофильного высушивания
млрд·мл<sup>-1</sup>: общая (по ОСО мутности ГИСК)
90
75
живых (чашечным методом)
24,5
26,1
Процент живых микробных клеток
27,2
34,8
Иммуногенность ЕД<sub>50</sub>, ж.м.кл., для:
Использование пассивированной стабилизированной стартовой культуры
белых мышей
11350
9053
морских свинок
7360
5225
Сокращение продолжительности процесса получения вакцины, ч
491
337
Использование пассивированной стабилизированной стартовой культуры и оптимизированного технологического режима лиофильного высушивания
Таблица 5
Сравнительная характеристика биологических показателей вакцины чумной живой сухой в процессе длительного хранения(<maths num="2"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>X</mi><mo>¯</mo></mover><mo>±</mo><msub><mi>I</mi><mrow><mn>95</mn></mrow></msub></mrow></math><img file="00000002.tif" he="7" wi="14" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
, n=5)
Исследуемая серия вакцины
Концентрация микробов, N·10<sup>9</sup> м. кл.·мл<sup>-1</sup>, определенная…
Процент живых микробных клеток
Схема получения посевных культур
по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича
Чашечным методом
Свежеприготовленная
75,0±4,0
26,1±2,3
34,8
Заявляемая
Хранившаяся в течение… лет
1
75,0±3,0
25,7±1,9
34,2
2
75,0±2,0
25,4+2,6
33,8
3
75,0±2,0
23,3±2,0
31,1
Свежеприготовленная
90,0±2,0
24,5+1,3
27,2
Прототип
Хранившаяся в течение… лет
1
90,0±2,0
23,8+1,5
26,4
2
90,0±2,0
23,2±1,5
25,7
3
90,0±2,0
22,5±1,8
25,0
Таблица 6
Характеристика иммунобиологических свойств экспериментально-производственной серии вакцины чумной живой сухой
Показатель качества
Единица измерения
Требования НД (Промышленный регламент ПР №2120-09)
Результаты исследований серий препарата, полученных с использованием…способа
заявляемого
прототипа
Концентрация микробных клеток в 1 мл:
по ОСО мутности ГИСК
млрд
От 50 до 100
75
90
живых
млрд
-
26,1
24,5
Процент живых микробных клеток
процент
25,0, не менее
34,8
27,2
Препарат должен
Специфическая безвредность
-
быть безвредным при подкожном введении морской свинке массой (275±25)г 15×10<sup>9</sup> микробных клеток (м.кл.) в 1 мл по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича
Препарат безвреден при подкожном введении морской свинке массой (275±25) г 15×10<sup>9</sup> микробных клеток (м.кл.) в 1 мл по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича
Иммуногенность (ЕД<sub>50</sub>):
40000, не более
9053
11350
для белых мышей
ж.м.кл.
для морских свинок
10000, не более
5225
7360