Способ контроля антикоагулянтной терапии
METHOD OF CONTROLLING ANTICOAGULANT THERAPY

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области медицинской диагностики и мониторинга лекарственных средств, в частности к области измерения свертываемости крови у пациентов, принимающих фармацевтические препараты для антикоагулянтной терапии.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Свертывание крови - механизм, предотвращающий продолжающуюся потерю крови при повреждениях какой-либо части кровеносной системы. Он включает в себя формирование полутвердого кровяного сгустка, который служит для закупоривания места повреждения сосуда. Система включает ряд взаимодействующих компонентов в крови и в стенке сосуда, которые должны оставаться в равновесии; неактивная система вызывает риск тяжелых и смертельных кровотечений, в то время как чрезмерная активность системы свертывания крови вызывает риск образования кровяного сгустка (тромбоз и тромбоэмболию) в кровеносной системе, закупорки артерий с потенциально смертельными последствиями из-за некроза тканей (гибели клеток).
Антикоагулянты, или «препараты, разжижающие кровь», являются одними из наиболее часто вводимых препаратов, и в этом классе препаратов антагонисты витамина К (VKA, кумарины) до последнего времени были единственно доступными пероральными препаратами. В связи с хрупким балансом системы свертывания крови и большими колебаниями в чувствительности пациентов и восприимчивости к терапии дозы VKA должны тщательно подбираться и постоянно контролироваться, так как реакция пациента и подходящая доза часто меняются со временем. По оценкам, 800 миллионов анализов проводятся ежегодно по всему миру для контроля свертываемости крови у пациентов, принимающих VKA.
Система свертывания крови представляет собой сложную систему взаимосвязанных проферментов, ферментов и кофакторов, выполняющих свои роли на поверхности активированных тромбоцитов и эндотелиальных клеток и в разорванных сосудах в организме человека. При активации системы, обычно в месте повреждения сосуда, конечным результатом является формирование тромба, содержащего нерастворимое фибриновое волокно. В организме процесс свертывания тщательно контролируется на поверхности активированных тромбоцитов и эндотелиальных клеток, но в испытательной лаборатории поверхность тромбоцитов обычно заменяют подходящими фосфолипидами. Проферменты, ферменты и кофакторы традиционно называют факторами коагуляции (F), большая часть которых образуется в печени.
Витамин К-зависимые факторы свертывания крови и антагонисты витамина К: четыре фактора коагуляции, т.е. FII, FVII, FIX и FX, которые образуются в печени, неактивны, если не последующий синтез, в котором они затем становятся карбоксилированными посредством витамин К-зависимого ферментативного процесса в печени. У пациентов с недостатком витамина К или у пациентов, принимающих антагонист витамина К (VKA), количество карбоксилированных витамин К-зависимых (VKD) факторов снижено, как, следовательно, и свертываемость (коагулирующая способность) крови соответствующего пациента. Если воздействие VKA не контролируется, это может привести к тяжелому и даже смертельному внутреннему кровотечению. Однако путем контролируемого снижения уровней VKD факторов нарушение свертываемости крови внутри сосудов (тромбоз) может быть предотвращено при сведении к минимуму риска кровотечений. Поэтому крайне важно, чтобы воздействие VKA постоянно находилось под контролем путем проведения соответствующих проб на коагуляцию. На основе полученных результатов проб доза может быть скорректирована таким образом, чтобы антитромботический эффект был максимален, а риск аномального кровотечения из-за чрезмерного торможения свертывания в то же время минимален.
Контроль активности свертывания крови у пациентов, принимающих VKA, более 60 лет был основан на измерении протромбинового времени (РТ), либо как первоначальный тест по Квику (РТ) (Quick, A., J Вiо Chem 1935(109): с. 73-4), либо как его модификация, РТ Оурена (также известного как РР, Р&Р-тест или протромбиновая комплексная проба) (Owren and Aas. Scand J Clin Lab Invest, 1951. 3(3): с. 201-8.). Тест РТ измеряет свертывающую активность трех из четырех витамин К-зависимых факторов свертывания крови (т.е. FII, FVII и FX), а также фибриногена (фактор I) и фактора V в образце плазмы крови, лишенном кальция, путем добавления коагуляционного реагента (тромбопластина, тканевого фактора) и кальция и последующего измерения времени, которое требуется для свертывания крови. Последний из упомянутых тестов (Р&Р) является модификацией РТ, в котором адсорбированную плазму (полностью лишенную витамин К-зависимых факторов) смешивают с анализируемой плазмой, корректируя любой возможный недостаток фактора V или фибриногена и оставляя пробу Р&Р чувствительной только к факторам II, VII и X. Таким образом, тест РТ также чувствителен к недостатку фактора V и фибриногена, которые не являются витамин К-зависимыми, и их дефицит может исказить результаты тестов у пациентов, принимающих VKA. В обоих тестах, однако, измеряемое время свертывания в равной степени чувствительно к уменьшению любого из трех измеряемых витамин К-зависимых факторов, определяемых тестом, т.е. FII, FVII и FX. Коагулирующая активность FIX этими тестами не измеряется. Время свертывания крови, полученное при тестах РТ, как предполагается, на практике непосредственно отражает антитромботическое воздействие VKA у пациентов, исключая начальный период VKA терапии. Однако это может происходить не всегда.
Фактическое измеряемое время свертывания, измеренное у нормального индивидуума, будет колебаться в зависимости от применяемого метода, а также аналитической системы и конкретных используемых реагентов. Различные коагуляционные реагенты и даже разные партии произведенного тканевого фактора (тромбопластина) и используемых белков являются причиной изменчивости времени свертывания, измеренного тестами РТ или Р&Р. Поэтому был разработан протокол для калибровки методов. Каждый производитель присваивает значение ISI (Международный индекс чувствительности) поставляемому тканевому фактору. (См. Руководство ВОЗ по тромбопластинам и плазме, используемым для контроля антикоагуляционной терапии, TRS, №889, Приложение 3). Значение ISI показывает, насколько конкретная партия тканевого фактора сопоставима с образцом, соответствующим международным нормам. Значение ISI, как правило, составляет от 1,0 до 2,0. Значение «Международного нормализованного отношения» (INR) может быть, таким образом, вычислено и представляет собой отношение протромбинового времени пациента к среднему нормальному РТ населения, возведенное в степень значения ISI для используемой аналитической системы. Значение INR может быть, соответственно, описано уравнением:
ISI
INR=(PT/MNPT),
где MNPT - «среднее нормальное протромбиновое время». Для практического применения MNPT обычно получают в виде среднего значения протромбинового времени по меньшей мере для 20 свежих образцов от здоровых людей. Высокий уровень INR, такой как INR больше 5, показывает, что существует высокая вероятность кровотечения, тогда как, если INR составляет 1,3 или менее, нет защиты против тромбоэмболии. Нормальный диапазон INR для здорового человека составляет 0,8-1,3, а для людей, проходящих кумариновую терапию (например, терапию варфарином), чаще всего рекомендуемый терапевтический диапазон - 2,0-3,0. Целевое значение INR может быть установлено выше в определенных ситуациях, например, для людей с механическими клапанами искусственного сердца.
Модифицированные тесты для точной оценки свертываемости крови, которые могли бы исключить недостатки существующих методов и сделать возможными более точную корректировку дозы и предпочтительно менее частый контроль антикоагуляционной активности у пациентов, принимающих антикоагулянты, были бы весьма ценны.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новому способу контроля антикоагулянтной терапии и наборам для применения этого способа. Оно основано на экспериментах авторов изобретения, показывающих, что измерение активности только факторов II и Х (FII и FX) более точно отражает свертываемость, чем существующие традиционные способы (РТ, Р&Р), и, следовательно, возможно, что антитромботическое действие антикоагулянтов VKA у пациентов лучше определяется этим новым способом анализа. Изобретение основано на определении совместной активности только факторов свертывания крови II и Х и исключении влияния всех других факторов свертывания крови на результаты анализа. Способ включает смешивание анализируемой плазмы человека, подвергающегося исследованию, с плазмой, дефицитной только по факторам коагуляции II и X, но с нормальными уровнями других факторов (в дальнейшем называемой Fiix-дефицитной плазмой), с целью коррекции любого возможного дефицита других факторов свертывания крови, за исключением FII и FX, в пробе, которые иначе могли бы повлиять на результат анализа. При добавлении коагуляционного реагента и кальция может быть измерено образование тромбина или фибрина. Таким образом может быть точно оценена активность факторов II и Х и их совместная активность без искажающего влияния дефицита других факторов. Следовательно, изобретение обеспечивает оценку свертываемости крови, которая, как полагают изобретатели, более точно, по сравнению с существующими способами, отражает антитромботическое действие VKA антикоагулянтов, вводимых тестируемому субъекту.
Кроме того, изобретение предусматривает наборы, подходящие для осуществления разработанного способа, которые содержат коагуляционный реагент и плазму, дефицитную только по факторам II и X.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1. Протромбиновое время по Квику (РТ, панель А) или протромбиновое время Оурена (Р&Р, панель В) относительно селективного снижения активности отдельных витамин К-зависимых факторов.
Фигура 2. Параметры ROTEM относительно Р&Р в процентном выражении для 65 образцов от пациентов, проходящих антикоагулянтную терапию варфарином на постоянной основе.
Фигура 3. Параметры ROTEM (CT, MaxVel, MCF) относительно селективного снижения активности отдельных витамин К-зависимых факторов свертывания крови в обедненной тромбоцитами плазме.
Фигура 4. Fiix-протромбиновое время; время свертывания получено на анализируемых плазмах с совместной активностью факторов FII и FX от 1,6% до 100%. Кривые описывают результаты, полученные в различных экспериментальных условиях, то есть при разном соотношении анализируемой плазмы и Fiix-дефицитной плазмы, а также при различном предварительном разбавлении анализируемой плазмы. Репрезентативные эксперименты показывают соотношение анализируемой плазмы к общей плазме (объем анализируемой плазмы + объем Fiix плазмы):  0,09 (1+10);  0,17 (1+5);  0,25 (1+3);  0,28 (1+2,5);  0,31 (1+2,2);  0,40 (1+1,5).
Фигура 5. Корреляция Fiix-INR c INR (PP-INR) для 38 случайно выбранных образцов от пациентов, принимающих варфарин на постоянной основе.
Фигура 6. Последовательные измерения FII, FVII и FX у одного человека в начале терапии варфарином относительно INR (PP-INR, черная кривая) и Fiix-INR (красная кривая). Изменение времени свертывания (INR) относительно изменений в концентрациях VKD факторов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение включает новый способ и обеспечивает наборы, основанные на этом способе, для определения свертываемости крови в образцах плазмы человека, в частности для измерения активности антикоагулянтного препарата у пациентов, принимающих такие препараты. С помощью этого способа устраняется влияние других факторов свертывания крови, не FII и FX. Способ может улучшить, в частности, антикоагулянтную терапию кумаринами (антагонистами витамина К, VKA), такими как варфарин, которые снижают концентрацию активных (гамма-карбоксилированных) факторов свертывания крови II, VII, IX и X. Новый способ может также применяться для того, чтобы контролировать другие антикоагулянты, которые ингибируют FII или FX, или оба этих фактора.
Исходной базой нашего изобретения являются экспериментальные результаты, которые позволяют предположить, что включение влияния фактора свертывания крови FVII на время свертывания крови у пациентов, принимающих VKA, как это делается в традиционных методах анализа для определения свертываемости крови, основанных на протромбиновом времени, РТ (Квик) и Р&Р (Оурен), может вызывать флуктуацию в полученных результатах определения времени свертывания, которые могут быть терапевтически неприменимыми. Такие искажающие результаты анализа могут ввести врача в заблуждение при подборе дозы этих потенциально опасных лекарственных средств. Эта новая гипотеза привела к новому изобретению, которое основано на следующих соображениях и экспериментальных результатах:
I. В начале пероральной антикоагулянтной терапии (ОА) с VKA и при последующих изменениях дозы концентрация каждого из физиологически активных гамма-карбоксилированных витамин К-зависимых (VKD) факторов свертывания крови (F) изменяется в различной степени и с разной скоростью вследствие их значительно отличающихся периодов полужизни, то есть около 3,5 часов для FVII (проконвертина), 52 часов для FX (фактора Стюарта) и 72 часа для FII (протромбина) (Roberts, H.R., Escobar M.A., Other coagulation factor deficiencies. 3rd ed. Thrombosis and Hemorrhage, ed. S.A.I. Loscaizo J. Vol. 1. 2003, Philadelphia: Lippincott Williams & ns. 575-598). Соответственно, концентрация FVII изменяется быстрее, чем концентрация других факторов, и это может оказать основное влияние на измеряемые значения РТ/Р&Р, даже если концентрации FII и FX значительно не изменились.
II. Некоторые предшествующие исследования показали, что антитромботическое влияние FVII в процессе кумариновой терапии может быть менее важным, чем влияние протромбина (FII) или FX (Zivelin et al, J Clin Invest, 1993. 92 (5): с. 2131-40; Xi et al, Thromb Haemost, 1989. 62 (2): с. 788-91). XI и соавторы показали, что активность протромбиназы (образование тромбина) в антикоагулированных образцах от пациентов, принимающих кумариновые препараты, зависела от концентрации FX и, в частности, FII, но меньше зависела от активности FVII, который продемонстрировал пороговую взаимосвязь, в первую очередь заметную при очень низких концентрациях FVII. Zivelin и соавторы обнаружили, что антитромботическое воздействие VKD факторов у кроликов зависит от концентрации FX и, в частности, от концентрации FII, но не от концентрации FVII. Кроме того, в клинических исследованиях было показано, что контроль VKA путем измерения нативного протромбинового антигена (NPA) способом ИФА оказался более точным для предсказания неблагоприятных событий, чем контроль с помощью РТ, предполагая определенную погрешность измерений РТ (Furie et al., Blood, 1984. 64(2): с. 445-51; Furie et al., Blood, 1990. 75(2): с. 344-9; Kornberg et al., Circulation, 1993. 88(2): с. 454-60). Наконец, исследование Brummel и соавторов с использованием антикоагулированной плазмы от пациентов, принимающих варфарин, показало, что между временем свертывания, определенным на основе РТ (INR), и образованием тромбина в ответ на разбавленный тканевый фактор существует слабая зависимость (Brummel et al, Circulation, 2001. 104(19): с. 2311-7). Наши выводы, полученные при использовании ротационной тромбоэластометрии (ROTEM) и разбавленного тканевого фактора, подтверждают это наблюдение, показывая неточность способов контроля, основанных на РТ и Р&Р.
Термин «анализируемая плазма» или «анализируемый образец плазмы» относится в данном контексте к плазме от пациента или субъекта, которому требуется анализ на свертывание крови.
«Нормальная плазма» означает плазму, подходящую для использования в качестве контроля, от нормальных здоровых индивидуумов, предпочтительно и обычно объединенную от нескольких лиц, чтобы нормализовать любые межиндивидуальные вариации в концентрации соответствующих факторов.
«Коагуляционный реагент» означает реагент, который инициирует каскад коагуляции в образце крови или плазмы, что приводит к превращению протромбина в тромбин и фибриногена в фибрин.
Способ изобретения основан на измерении совместной активности обоих факторов свертывания крови II и Х и только их, а это означает, что эффект от других факторов, которые могут меняться в анализируемом образце (например, FI, FV, FVII и FIX), устраняется. «Совместная активность» в данном описании относится к измеренным эффектам вследствие активности как FII, так и FX, но эффект одного не дифференцируется от эффекта другого.
В способе изобретения анализируемый образец плазмы смешивают с Fiix-дефицитной плазмой, как упоминалось выше, подходящее соотношение анализируемой плазмы к дефицитной плазме находится в диапазоне от 1:1 до 1:20, предпочтительно в диапазоне от 1:4 до 1:10, например, в диапазоне от 1:5 до 1:8, таком как 1:5, 1:6, 1:7, 1:8 или 1:10, но не ограничивается этим. Используемое в данном описании обозначение 1:4 означает одну часть анализируемой плазмы против четырех частей дефицитной плазмы, то есть пять частей плазмы в целом (т.е. 20% анализируемой плазмы и 80% дефицитной плазмы).
Как правило, анализируемый образец плазмы обрабатывают как для обычных проб на коагуляцию, т.е. свежий образец крови, взятый у пациента, обрабатывают цитратом для удаления кальция, и эритроциты отделяются от плазмы центрифугированием. Подготовленный анализируемый образец плазмы затем может быть смешан с Fiix-дефицитной плазмой, предпочтительно непосредственно перед анализом.
Коагуляционный реагент и кальций добавляют в анализируемую плазму, чтобы инициировать коагуляцию. Коагуляционный реагент и кальций могут быть предварительно смешаны вместе, или их добавляют по отдельности в анализируемый образец плазмы. Альтернативно один или оба реагента могут быть предварительно смешаны с дефицитной плазмой. Соответственно, стадии заявленного способа, включающие смешивание анализируемого образца плазмы с дефицитной плазмой и добавление коагуляционного реагента и кальция, могут быть выполнены в один, два или три этапа.
Коагуляционный реагент может быть любым из обычно используемых в общепринятых тестах реагентов, что описаны выше, таким как без ограничения тромбопластин (включая рекомбинантный тканевый фактор), фосфолипиды, фактор IXa, фактор XIa, фактор ХIIа, калликреин, фактор VIIa, фактор VIIa и экзогенный активатор, такой как змеиный яд, который активирует фактор X.
Данный способ работает с активацией свертывания как через внутренний путь, так и через внешний путь. Коагуляционные реагенты тромбопластин и фактор VIIa активируют внешний путь, тогда как следующие коагуляционные реагенты активируют внутренний путь: фосфолипиды, фактор IXa, фактор XIa, фактор ХIIа, калликреин или комплекс факторов IXa и VIIIa.
В способе изобретения могут использоваться экзогенные активаторы, такие как змеиные яды. К ним относится яд гадюки Рассела (змеиный яд от Daboi russelil), который может быть получен из природных источников или рекомбинантным способом. Также могут быть использованы яды других змей, которые активируют фактор Х напрямую, через общий путь.
Тромбопластин представляет собой не чистый белок, а комплекс белка тканевого фактора и фосфолипидов. Тканевый фактор (также упоминается как тромбоцитарный тканевый фактор, фактор III, тромбокиназа или CD142) является интегральным трансмембранным белком, который является рецептором на клеточной поверхности для фактора VIIa, функционирующий в качестве кофактора, обязательного для протеолитической активности фактора VIIa по отношению к фактору X, превращающего фактор Х в активный протеазный фактор Ха. Тканевый фактор должен быть связан с коагуляционными фосфолипидами для полного проявления его кофакторной функции.
Тромбопластин, используемый в способе и наборах изобретения, может быть получен из животных источников, известных специалистам, включая без ограничения мозг кролика, плаценту человека, человеческий мозг, бычий мозг, легкие крупного рогатого скота или другие подходящие источники. Тромбопластин также может быть рекомбинантно полученным тромбопластином, предпочтительно рекомбинантным человеческим тромбопластином. Рекомбинантный Тромбопластин может быть получен путем экспрессии компонента тканевого фактора в соответствующих клеточных культурах, например, плацентарной культуре клеток мыши, клетках яичника хомяка (СНО клетки), клетках грибов, прокариотических организмах, например, в культурах E. coli, трансгенных растениях или другой подходящей экспрессионной среде, а затем тканевый фактор липоилируют in vitro.
В некоторых формах осуществления изобретения коагуляционный реагент содержит фосфолипиды, которые могут происходить из различных природных источников или быть синтезированы и/или модифицированы химическим путем. Фосфолипиды, используемые в коагуляционных тестах, также называют как частичный Тромбопластин, хотя обычно частичный Тромбопластин относится к экстрактам фосфолипидов, выделенным из различных тканей При использовании фосфолипидов в качестве коагуляционного реагента они могут предпочтительно иметь подходящий состав, обогащенный фосфолипидами, которые обладают хорошей прокоагулянтной активностью, такими как фосфатидилсерин, но не ограничиваясь им. Коагуляционный реагент в некоторых формах осуществления может быть использован с активатором, в частности, когда фосфолипиды используют как коагуляционный реагент.Такой активатор может быть соответствующим образом выбран без ограничения из частиц каолина, целита, частиц стекла, частиц кремнезема, который может быть или не быть микронизированным кремнеземом, или эллаговой кислоты. В этой форме осуществления способ соответствует тому, что называют тестом АРТТ (активированное частичное тромбопластиновое время), за исключением того, что в соответствии с изобретением добавляют Fiix-дефицитную плазму, заставляя результаты теста Fiix-APTT отражать активность только FII и/или FX. При использовании фосфолипидов без активатора в качестве реагента для анализа, тест можно сравнить с тем, что называют пробой РТТ, т.е. Fiix-PTT.
В некоторых формах осуществления изобретения используют комбинации двух и более коагуляционных реагентов, такие комбинации включают использование тромбопластина и фактора VIIa и комбинацию факторов IXa и VIIIa.
Источник кальция, как правило, но не обязательно, представляет собой хлорид кальция.
Количество/концентрация коагуляционного реагента в способе, как правило, сходно с теми, которые используют в современных способах измерения свертывания крови. При использовании тромбопластина результаты могут быть нормализованы на основе значения ISI, нормализацию можно проводить так же, как в тестах РТ по Квику и РТ Оурена.
Коагуляционный реагент и/или дефицитную плазму предпочтительно лиофилизируют и перед использованием в таком случае растворяют в воде или подходящем буфере.
Кальций используют в обычных концентрациях, например, в диапазоне 1,0-4,0 мМ, предпочтительно 2,5 мМ.
Определение конечной точки:
Определить конечную точку в способе настоящего изобретения можно любым обычно используемым в настоящее время способом, в том числе без ограничения ручным (визуальным) определением по процедуре наклонной пробирки, механическим обнаружением с использованием способов обнаружения сгустка, таких как «вращающийся шар» или методика вибрирующего зонда (обнаружение, когда зонд неподвижен из-за более высокой вязкости), оптические способы обнаружения с использованием оптического детектирования образования фибрина, а также хромогенные методики, основанные на использовании хромогенных субстратов, в том числе субстратов для тромбина (например, субстрат S2238 (Chromogenix-Instrumentation Laboratory SpA, Милан, Италия) и субстратов для FXa, таких как BIOPHEN CS-11(22) (Aniara, Масон, Огайо, США).
Другие формы осуществления включают в себя использование флуорогенных субстратов, которые непосредственно после расщепления амидолитическим ферментом (например, тромбином или фактором Ха) высвобождают флуорогенный маркер. Они включают без ограничения амиды пептид-4-метилкумарина (МСА), например, Pefafluor FXa (Pefa-5534) (Pentapharm Ltd., Базель, Швейцария), который является чувствительным субстратом для фактора Ха. В других формах осуществления используют люминогенные субстраты, в том числе субстрат S-2613 (трет-бутилоксикарбонил-изолейцил-глутамил-гамма-пиперидил-глицил-аргинил-изолюминол), для других субстратов см., например, Hemker H.C., Handbook of synthetic substrates for the coagulation and fibrinolytic system, Martinus Nijhoff Publishers, Бостон (1983).
Наборы изобретения:
В еще одном аспекте изобретение предусматривает наборы, которые подходят для осуществления способа изобретения в клинических лабораториях по всему миру. Соответственно, наборы составлены так, чтобы необходимые реагенты для выполнения анализов в соответствии изобретением были представлены в подходящем количестве и готовых к использованию контейнерах. Набор для анализа в соответствии с изобретением включает коагуляционный реагент, такой как один или более из вышеупомянутых в описании способа изобретения, и нормальную плазму, дефицитную только по фактору II и по фактору Х (Fiix-дефицитная плазма).
Дефицитная плазма - это плазма с недостатком только по фактору II и по фактору X, так что она еще содержит другие факторы свертывания крови, в том числе факторы VII и IX. Дефицитную плазму получают подходящим способом, как описано выше, то есть нормальную плазму, как определено выше, делают дефицитной по FII и FX, предпочтительно способами иммунодеплеции.
В некоторых формах осуществления наборы изобретения дополнительно содержат источник ионов кальция, который может находиться в своем собственном специальном контейнере или быть включенным в коагуляционный реагент или дефицитную плазму. В других формах осуществления кальций не предусмотрен как часть набора, так как во многих лабораториях и коагуляционных устройствах имеются подходящие источники кальциевого реагента.
Коагуляционный реагент и упомянутая дефицитная плазма могут в некоторых формах осуществления находиться в одном контейнере, который дополнительно может содержать, а может и не содержать, ионы кальция. В других формах осуществления коагуляционный реагент и дефицитную плазму поставляют в отдельных контейнерах.
Коагуляционный реагент и дефицитную плазму предпочтительно поставляют в форме лиофилизированного порошка вне зависимости от того, поставляют ли их отдельно или в одной и той же таре. Один или более контейнеров соответствующим образом изготовлен так, что лиофилизированный материал может быть растворен в исходном контейнере.
ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ - ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Мы были заинтересованы в изучении вклада каждого VKD фактора в коагуляцию при измерениях ротационной тромбоэластометрией (ROTEM). Результаты этих экспериментов привели нас к мысли, что FII и FX оказывали значительно большее влияние на формирование сгустка, чем FVII и FIX, в клинически значимых концентрациях- этих факторов. Тем не менее, мы не могли установить разницу между действием FII и FX. Это наблюдение привело к нашему новому изобретению, описанному ниже.
Нам неизвестны предшествующие исследования с использованием ROTEM, активированным сильно разбавленным тромбопластином, для систематической оценки вклада каждого из витамин К-зависимых факторов свертывания крови на формирование сгустка. ROTEM является общим анализом коагулирующей активности, обычно проводимом на цельной крови. Способ ROTEM, в дополнение к измерению времени инициирования полимеризации фибрина, т.е. времени свертывания (ROTEM СТ, фаза инициации), также измеряет последующие аспекты свертывания (Rand et al, Blood, 1996. 88(9): с. 3432-45), в том числе скорость последующей фазы распространения объемного образования сгустка (измеряется как угол альфа или максимальная скорость ROTEM, «MaxVel») и, наконец, максимальную плотность сгустка (MCF), что отражает заключительный этап стабилизации (Sorensen et al, J Thromb Haemost, 2003. 1(3): с. 551-8). Результаты ROTEM, полученные на цельной крови, зависят не только от факторов свертывания крови, но также и от функции тромбоцитов, протеаз, ингибиторов и фибринолитической системы. ROTEM, по мнению некоторых исследователей, лучше описывает образование сгустка, чем традиционные анализы коагуляции, сделанные на РРР, поскольку традиционные коагуляционные анализы измеряют только фазу инициации (Ganter et al., J Cardiothorac Vase Anesth, 2008. 22(5): с. 675-80). Так как мы не могли сделать эксперименты на цельной крови, мы сравнивали эксперименты, проведенные на РРР, с экспериментами с добавлением фосфолипидов тромбоцитов или тромбоцитов банка крови. В большинстве случаев результаты были сходными, если не указано иное. В наших экспериментах ROTEM мы использовали сильно разбавленный тромбопластин (1:17,000), что может более точно отражать физиологическую концентрацию тканевого фактора, по сравнению с высокой концентрацией тромбопластина, используемой в анализах РТ (Brummel et аl., см. выше).
Экспериментальные реагенты и условия:
Подготовка плазмы и тромбоцитов
Кровь брали у пациентов, проходящих антикоагуляционную терапию варфарином, для изготовления анализируемых образцов РРР. Также кровь была взята от двадцати здоровых доноров (10 мужчин, 10 женщин) для изготовления объединенной нормальной плазмы (PNP), для исследования коагуляции и анализа ROTEM. Используя методику минимального стаза, брали кровь через иглу 21 G в Vacuette пробирки (Greiner, Кремсмюнстер, Австрия) 1/10 об./об. с 3,2% (0,109 моль/л) буфером цитрата натрия. Обедненную тромбоцитами плазму (РРР) получали путем центрифугирования крови при 4°С в течение 15 минут при 2500 г, удаления супернатанта и повторного центрифугирования в течение 15 минут при 2500 г. PNP получали объединением рецентрифугированной нормальной плазмы, и конечный материал хранили в 0,5 мл аликвотах при -80°С. Иммуноистощенные дефицитные по факторам плазмы были получены из Haematologic Technologoies Inc. (Essex Junction, Вермонт, США). Иммуноистощенные плазмы были выборочно обеднены по факторам свертывания крови II, VII, IX или X, и в плазмах не было остаточной ингибирующей активности.
2
9
Подвергнутые замораживанию-оттаиванию (бурст) тромбоциты (фосфолипиды тромбоцитов) и промытые тромбоциты получали из концентрата тромбоцитов банка свежей крови в кислом цитратном растворе на основе декстрозы (ACD). В обоих случаях тромбоциты промывали следующим образом: обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) центрифугировали в течение 15 минут при 2500 г и затем повторно суспендировали 1:1 об./об. в буфере TBS (6,055 г основания Trizma (Sigma, Зельце, Германия), 8,766 г NaCl, pH 7,4, 1000 мл HO). После повторного суспендирования пробирки заполняли буфером TBS и повторно центрифугировали в течение 10 мин при 2500 г. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок повторно дважды суспендировали. Конечную суспензию автоматически определяли с помощью Sysmex 4000 (Sysmex Corp., Кобе, Япония), и конечный раствор доводили до уровня тромбоцитов 100×10/л. Конечный раствор либо замораживали при -80°С, снова размораживали, затем повторно разделяли на аликвоты в маленькие пробирки и замораживали снова, чтобы получить фосфолипиды тромбоцитов, либо промытые тромбоциты хранили при комнатной температуре и использовали в течение двух дней.
Реагенты
2
2
2
Дефицитные по факторам плазмы, используемые для анализа факторов свертывания крови, получали от Diagnostica Stago (Аньер, Франция). Буфер Hepes (20 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, с и без 200 мМ CaCl, рН 7,4) получали от Bie and Berntsen Inc. (Херлев, Дания). Рекомбинантный тромбопластин (TF) (Innovin) получали от Dade Behring (Марбург, Германия). Innovin растворяли и хранили в 100 мкл аликвотах при -80°С в пробирках фирмы Eppendorf. Для каждого эксперимента растворяли одну пробирку Innovin и смешивали 10 мкл Innovin с 990 мкл буфера Hepes CaCl, чтобы добиться разведения 1:100, которое затем разбавляли путем смешивания 100 мкл разведения 1:100 с 500 мкл буфера Hepes СаСl, чтобы получить рабочий раствор 1:600.
РРР, иммуноистощенную по факторам свертывания крови FII, или FVII, или FIX, или FX, или по обоим FII и FX, получали от Haemotologic Technologies Inc. (Essex Junction, Вермонт, США). Обедненную плазму смешивали с объединенной нормальной плазмой в различных пропорциях, как описано в каждом эксперименте ниже. Добавляли тромбопластин и кальций и измеряли время свертывания крови при постепенно увеличивающихся разведениях нормальной плазмы в буфере Оурена.
Эксперименты ROTEM
2
Профили динамического образования кровяного сгустка записывали на анализаторе тромбоэластометрической коагуляции ROTEM (Pentapharm, Мюнхен, Германия), подробно описанном в других местах [Sorensen, В., et al., J Thromb Haemost, 2003. 1(3): с. 551-8. Ingerslev, J., et al. Haemophilia, 2003. 9(4): с. 348-52. Fenger-Eriksen, С., et al. Br J Anaesth, 2005. 94(3): с. 324-9}, но с тем отличием, что вместо цельной крови использовали цитратную РРР. В краткой форме, реакционная смесь содержала 270 мкл цитратной плазмы +30 мкл буфера +20 мкл разбавленного TF и CaCl. Все показанные результаты являются средними по четырем экспериментам. Тромбоэластометрическое измерение (ROTEM) основано на активации коагуляции сильно разбавленным тромбопластином (конечное разведение реакционной смеси TF 1:17000). Оценка образования сгустка плазмы основана на стандартных параметрах тромбоэластометрии, таких как время свертывания (СТ), максимальная скорость (MaxVel) и максимальная плотность сгустка (MCF). СТ характеризует фазу инициации образования сгустка. MaxVel представляет фазу распространения свертывания, и MCF обозначает фазу стабилизации.
2
Эксперименты ROTEM проводили на разведениях PNP, сделанных с соответствующей плазмой, дефицитной по факторам (FII, FVII, FIX или FX), смешанных с постепенно увеличивающейся долей нормальной плазмы для того, чтобы получить окончательные концентрации факторов свертывания крови 1, 2, 4, 8, 16, 32 и 50%. Смеси разводили 1:600 в два этапа буфером HEPES CaCl Эксперименты проводили без добавления и с добавлением фосфолипидов тромбоцитов или промытых тромбоцитов банка крови. Экспериментальные кюветы помещали в алюминиевый штатив, который термостатировали при 37°С. Смесь 270 мкл каждого разведения плазмы и 30 мкл промытых тромбоцитов помещали в измерительные чашки. Измерение начинали при добавлении 20 мкл 1:600 разбавления рекомбинантного TF и размещении чашки на штифт диаметром 6 мм, который был присоединен к нижнему концу вертикальной оси. Каждый эксперимент проводили четыре раза.
Протромбиновое время
Как Протромбиновое время по Квику (РТ), так и Протромбиновое время Оурена (Протромбиновое проконвертиновое время, Р&Р-тест) измеряли на образцах крови пациентов. Использовали анализатор коагуляции STA-R (Diagnostika Stago, Аньер, Франция). РТ измеряли с использованием STA-Neoplastine CI plus в качестве коагуляционного реагента, со значением ISI 1,3, и Р&Р измеряли с использованием реагента STA-SPA 50 с ISI 1,01 (оба от Diagnostika Stago). Реагент Р&Р сходен с реагентом РТ, но также содержит добавленную абсорбированную бычью плазму в качестве источника фактора коагуляции V и фибриногена, следовательно, он чувствителен только к активности FII, FVII и FX. Р&Р в процентах рассчитывали по стандартной кривой, построенной на основе последовательно разбавляемой объединенной плазмы в буфере Оурена. INR рассчитывали, как описано выше.
Статистический анализ
Для построения графиков и статистических вычислений, в том числе линейного и нелинейного регрессионного анализа, использовали статистическое программное обеспечение GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc., Калифорния, США). Все данные представлены как среднее±1 стандартная ошибка среднего (SEM).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Пример 1: РТ и Р&Р относительно селективного уменьшения отдельных VKD факторов.
Связь между РТ и пониженной концентрацией выбранных VKD факторов свертывания крови FII, FVII, FIX или FX в РРР показана на Фигуре 1. Протромбиновое временя по Квику показано на панели А, а протромбиновое время Оурена (Р&Р) на панели В. Эксперименты проводили с постепенным насыщением полностью иммуноистощенной по одному фактору плазмы путем постепенного смешивания с нормальной плазмой. Как и ожидалось, оба типа измерений РТ (по Квику и Оурена) были одинаково чувствительны к концентрации FII, FVII и FX во всем диапазоне анализируемых концентраций, в то время как ни одно из них не было чувствительно к активности FIX.
Пример 2: Корреляция параметров ROTEM с РТ Оурена в образцах от пациентов, получающих варфарин
2
2
2
2
Параметры ROTEM и результаты Р&Р-теста сравнивали в образцах РРР, полученных от 65 последовательных пациентов, получающих варфарин, посещающих антикоагуляционную клинику (Фигура 2). Отмечена средняя корреляция между коагуляционной активностью Р&Р-теста в процентах и ROTEM СТ (R=0,27, р<0,0001) с выраженным отклонением ROTEM СТ при похожих значениях Р&Р в процентах. Отмечена слабая корреляции между Р&Р и ROTEM MaxVel (R=0,08, р<0,0001) и ROTEM MCF (R=0,11, р=0,0014). Аналогичные результаты можно увидеть, если INR представить в зависимости от параметров ROTEM (не показано). Параметры ROTEM также измеряли в адсорбированной РРР, одинаково обедненной по всем VKD факторам. Путем смешивания с постепенно повышающимися концентрациями объединенной нормальной РРР адсорбированная плазма постепенно насыщалась равными концентрациями VKD факторов. При одинаковом снижении концентраций всех VKD факторов наблюдалась хорошая корреляция, то есть R в нелинейной регрессии составил 0,79 для ROTEM СТ, 0,64 для ROTEM MaxVel и 0,77 для ROTEM MCF (кривые не показаны).
Пример 3: Параметры ROTEM относительно селективного уменьшения отдельных VKD факторов
Для того, чтобы отдельно оценить влияние каждого VKD фактора на параметры ROTEM, мы исследовали коагуляцию с помощью ROTEM в РРР, селективно иммуноистощенную по одному индивидуальному VKD фактору, а затем постепенно насыщали соответствующий дефицитный фактор путем смешения с нормальной плазмой. Данные, приведенные на Фигуре 3, относятся к экспериментам в РРР без добавления фосфолипидов тромбоцитов или промытых тромбоцитов. ROTEM ОТ (фаза инициации) (Фиг. 3а) было заметно продолжительнее при постепенном селективном уменьшении FII или FX при средних и умеренно низких уровнях (сходных с теми, что используют во время антикоагуляции), чем при аналогичных снижениях FVII или FIX. Аналогичные результаты были получены в РРР с добавленными фосфолипидами тромбоцитов и в РРР с добавлением промытых тромбоцитов (данные не показаны). ROTEM MaxVel (Фиг. 3В), представляющая фазу распространения образования сгустка ROTEM, также более зависима от концентрации FII и FX, чем от концентрации FVII или FIX в РРР, а также в РРР, обогащенной фосфолипидами тромбоцитов (данные не показаны), но возможно в большей степени зависима от концентрации II, чем от концентрации Х при добавлении промытых тромбоцитов (данные не показаны). Наконец, фаза стабилизации или ROTEM MCF в РРР (Фиг. 3С) была более зависимой от FII и FX, чем от FIX или FVII.
На основе этих экспериментов ROTEM заключаем, что FII или FX имеют большее влияние на образование фибрина, чем факторы FVII и FIX при средних и умеренно сниженных концентрациях факторов, аналогичных концентрациям, представленным и являющимся целевыми при терапии кумарином. FII и FX вносили больший вклад на всех фазах образования сгустка (инициирования, распространения и стабилизации), чем FVII и FIX. Слабая корреляция параметров ROTEM с РТ Оурена (INR), описанная выше для образцов плазмы пациентов, возможно, отражает это расхождение влияния между FVII с одной стороны и FII и FX с другой стороны, на образование сгустка в анализах РТ и ROTEM.
Мы также пришли к заключению, что совокупный эффект FII и FX может оказывать значительно большее влияние на образование сгустка, чем FVII или FIX при концентрациях факторов, имеющих место при антикоагулянтной терапии. Однако, так как FVII имеет намного короче время полужизни, чем FII и FX, флуктуации протромбинового времени (РТ и Р&Р) иногда могут быть связаны в основном с изменением концентрации FVII и не могут дать предсказание об истинном изменении в потенциале образования сгустка или в антитромботическом действии. Искажающее действие FVII, вызывающее флуктуацию РТ, потенциально может привести к ошибочным дозировкам VKA и излишне частым анализам для контроля. Таким образом, включение чувствительности FVII в современные контрольные пробы может уменьшить эффективность и безопасность и увеличить стоимость кумариновой терапии. Предполагается, что флуктуация в антикоагуляционном действии VKA может быть уменьшена путем устранения влияния FVII на контрольные пробы.
Пример 4: Fiix-способ, примененный на образце плазмы
Тест на основе Fiix-способа
Наше изобретение основано на идее, что при смешивании анализируемого образца плазмы с плазмой, дефицитной (полностью обедненной) по факторам FII и FX (здесь и далее называемой Fiix-дефицитной плазмой), проводимой таким образом корректировке дефицита всех других возможных факторов свертывания крови в образце и последующем измерении времени свертывания после активации свертывания коагуляционным реагентом, результаты анализа будут отражать только коагуляционную активность FII и FX.
Результаты анализа могут быть представлены как время свертывания, соотношение времен свертывания или любая другая конечная точка измерения образования тромбина или фибрина. Экспериментальные результаты, продемонстрированные в приведенных здесь примерах, основаны на измерении времени свертывания с тромбопластином (STA - Neoplastine Cl plus от Diagnostica Stago) в качестве коагуляционного реагента на приборе STA-R (Diagnostica Stago). Так как это вариант протромбинового времени, мы называем его «Fiix-протромбиновое время» или Fiix-PT.
В нашем новом способе, который мы называем Fiix-способ, анализируемый образец плазмы (плазма пациента) смешивают с нормальной плазмой, в которой имеется недостаток обоих факторов FII и FX (Fiix-дефицитная плазма). Используя такую смесь, при добавлении тромбопластина и кальция можно измерить вариант протромбинового времени, чувствительный только к FII и FX, т.е. Fiix-PT. В Fiix-PT соотношение анализируемой плазмы к Fiix-дефицитной плазме может находиться в диапазоне от 1:1 до 1:20 частей, предпочтительно в диапазоне от 1:2 до 1:10 (см. ниже).
Наглядные результаты наших экспериментов с использованием тромбопластина в качестве коагуляционного реагента (т.е. Fiix-PT) показаны на Фигуре 4. Результаты показывают время свертывания, полученное в зависимости от «процентного содержания Fiix», т.е. концентрации в процентах FII и FX, вместе взятых. Различные кривые представляют различные разведения нормальной плазмы, а также различные соотношения образца нормальной плазме и Fiix-дефицитной плазмы в смеси.
Соотношения анализируемой плазмы и Fiix-дефицитной плазмы в образцах, показанных на Фигуре 4, следующие:  0,09 (1+10);  0,17 (1+5);  0,25 (1+3);  0,28(1+2,5);  0,31 (1+2,2);  0,40 (1+1,5).
Использовали различные соотношения, но нашей целью было иметь возможность надежного измерения концентраций PII и FX<2 u/дл (u -эквивалентные единицы плазмы). Для того, чтобы точно измерить концентрации FII и FX до <2 u/дл, как показывают эксперименты, предпочтительное соотношение анализируемой плазмы к Fiix-дефицитной плазме должно находиться в диапазоне 1:2-1:10.
2
Основываясь на экспериментах, показанных на Фигуре 4, мы решили измерить Fiix-PT путем смешивания 80 мкл 1:7 разведения анализируемой плазмы с 25 мкл Fiix-дефицитной плазмы (т.е. конечная пропорция - 1 часть анализируемой плазмы к 2,2 частям Fiix-дефицитной плазмы). Затем измеряли «Fiix-PT» в образцах от 38 пациентов, принимающих варфарин на постоянной основе, и вычисляли международное нормализованное отношение («Fiix-INR»). Как показано на Фигуре 5, Fiix-INR хорошо коррелирует со значениями INR на основе РТ Оурена (PP-INR; R=0,87, р<0,0001). Соответствующие результаты были получены, когда Fiix-INR коррелировало с INR на основе РТ по Квику (PT-INR, данные не показаны).
На Фигуре 6 представлены последовательные измерения Fiix-INR, PP-INR, FII, FVII и FX в течение 49 дней у одного пациента, начавшего принимать варфарин. Количество факторов свертывания крови (в процентах) показано на левой Y-оси и значение INR - на правой Y-оси. Изменение INR по отношению к изменениям концентраций VKD факторов может быть получено из графика. Если кратко, PT-INR демонстрирует больше флуктуации, чем Fiix-INR, причем причина в том, что PT-INR реагирует на быстрые изменения, которые происходят в FVII, a Fiix-INR - нет. Тем не менее, на основе экспериментов, обсуждавшихся ранее, и нашей гипотезы на их основе, что концентрации FX и FII в основном ответственны за антитромботическое действие варфарина, мы утверждаем, что Fiix-INR более точно описывает антитромботическое действие, отмечаемое у пациента.
В частности, можно видеть, что значение PT-INR возрастает гораздо быстрее, чем Fiix-INR, в самые первые дни приема, что можно отнести к быстрому снижению FVII, которое оказывает влияние на измеряемое значение PT-INR, но не на значение Fiix-INR. Значение PT-INR показывает, что уже на 3 день пациент достиг приемлемого уровня концентрации антикоагулянта (серая зона), а падение после 4-го дня показывает, что доза варфарина, скорее всего, была уменьшена. Кривая Fiix, с другой стороны, показала, что пациент достигает приемлемого значения INR (приемлемого уровня антикоагуляции) на 5 день. Значение Fiix остается в приемлемой области INR в последующие 6 и 7 дни, в то время как значения PT-INR ошибочно указывают, что пациент получает слишком высокую дозу варфарина.