БИОЦИДНЫЙ ПЕПТИД И ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ
BIOCIDAL PEPTIDE AND THE PREPARATION ON ITS BASIS

Изобретение относится к области медицины, а именно к новым пептидам, обладающим биоцидными, в частности, антибактериальными, противогрибковыми и противовирусными свойствами и препаратам на их основе.
В настоящее время наблюдается рост устойчивых к действию антимикробных препаратов возбудителей инфекционных заболеваний, что приводит к снижению эффективности лечения социально значимых инфекционных заболеваний. Кроме того, значимым патогенетическим фактором становится сочетанная бактериальная и вирусная инфекция. В этой связи актуальной задачей является поиск новых альтернативных подходов к их терапии.
Известно, что в процесс защиты высших эукариотов от инфекции организм включает секрецию эндогенных соединений пептидной природы, которые синтезируются в результате процессинга предшественников в виде активного защитного компонента, причем их образование происходит гораздо быстрее и требует меньше энергетических затрат, чем образование антител или специфических фагоцитарных клеток. [Mangoni, М.L. Host-defense peptides: from biology to therapeutic strategies // Cell. Mol. Life Sci. - 2011. - 68. - p. 2157-2159].
Создание лекарственных препаратов на основе таких эндогенных пептидных соединений является одним из возможных путей решения проблемы толерантности микроорганизмов к существующим антибиотикам. В настоящее время подобные лекарственные средства уже применяются в практической медицине или проходят клинические испытания [Brogden, N.K., and Brogden, K.А. Will new generations of modified antimicrobial peptides improve their potential as pharmaceuticals?// Int. J. Antimicrob. Agents. - 2011. - 38. - p. 217-225. Yeung, A.T.Y., Gellatly, S.L., and Hancock, R.E.W. Multifunctional cationic host defense peptides and their clinical applications // Cell. Mol. Life Sci.. - 2011. - 68. - p. 2161-2176].
Известны, в частности, ранее созданные авторами [RU 2183643, 2002] пептиды общей формулы
2
H-a-Lys-b-Trp-Lys-c-Pro-d-Lys-Pro-Trp-e-Arg-NH, где
а=-Ile- или -Lys-; b=-Pro - или -Lys-; с, d=-Lys- или -Trp-; e=Arg или Ala,
Недостатком этих пептидов является недостаточно высокая активность в отношении грибов и вирусов.
Наиболее близким по строению к заявляемому пептиду является пептид индолицидин [Selsted М.Е., Novotny M.J., et al/, Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neurophils. // J. Biol. Chemistry. - vol. 267. - №7. - 1992. - p. 4292-4295], имеющий структуру:
2
H-Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-NH.
Этот пептид обладает антимикробным действием по отношению к достаточно широкому кругу бактерий, однако малоэффективен против вирусных инфекций. Еще одним недостатком индолицидина является наличие высокой гемолитической активности.
Известно большое число лекарственных форм для наружного применения на основе пептидов, обладающих биоцидным действием. К ним относятся, в частности, «Пептид-актив» [http://tiu.ru/Gel-dlya-litsa-s-peptidami.html?no_redirect=1]; комплекс «Жизнь тела» [http://lifehappiness.narod.ru/screens/cosmetics/gels.htm]; производные гемина с аминокислотами и пептидами [RU 2415868, 2011].
Все вышеуказанные препараты состоят из активного начала пептидного происхождения и вспомогательных ингредиентов.
Недостатком этих препаратов является относительно невысокая биоцидная активность, использование смеси пептидов, как правило, природного происхождения, часто не имеющих конкретного состава ингредиентов.
Наиболее близким к заявляемому препарату является гель АЛЛОМЕДИН, содержащий в качестве активного начала пептид Аллостатин, а в качестве вспомогательных веществ - карбопол, воду, аллантоин, феноксиэтанол, этилгексилглицерин и натрия гидроксид. [www.stada.ru/press/…/allomedin-preparat-novogo-pokoleniya-protiv-gerpesa-0.html; http://www.biomedservice.ru/price/goods/62/2582].
Недостатком геля является ограниченная область применения (только вирусные инфекции кожных покровов).
Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящего изобретения, являлась разработка пептидов, обладающих более эффективным воздействием на различные группы микроорганизмов, и готовой лекарственной формы для наружного применения на его основе.
Было найдено, что поставленная выше задача решается путем создания аналогов индолицидина, особенностью которых является наличие в их составе аминокислотных остатков производных фенилаланина, содержащих в ароматическом кольце электроно-донорные и электроно-акцепторные заместители.
Заявляемые пептиды имеют общую формулу:
2
Y-Ile-Leu-Pro-X-Lys-X-Pro-X-X-Pro-X-Arg-Arg-NH, где
2
3
2
z
5
3
2
2
10
t
X = 4-нитрофенилаланин - Phe(NO) или 4-хлорфенилаланин - Phe(Cl), или 4-метоксифенилаланин - Phe(OCH), или D-фенилаланин - D-Phe, или 4-аминофенилаланин - (4-NH)Phe, или 4-аминобензоилфенилаланин - (4-NHB)Phe, или гомофенилаланин - homoPhe, или 4-третбутилфенилаланин - (4-Bu)Phe, или 2-метилфенилаланин - (2-Me)Phe, или 4-фторфенилаланин - (4-F)Phe, или пентафторфенилаланин - Phe(F), или 2-трифторметилфенилаланин - (2-CF)Phe, а Y=Н или - пальмитоил - Pal, или аминодеканоил - HN-(CH)-CO-.
Пептиды получают стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе [J.M. Steward and J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969] с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
В качестве промежуточной защиты α-аминогруппы аминокислот при твердофазном методе синтеза используют трет-бутилоксикарбонильную группу. Гуаногруппы аргинина блокировали мезитиленсульфонильной или нитрогруппой, ∈-аминогруппы лизина - 2-хлорбензилоксикарбонильной защитой. Наращивание пептидной цепи осуществляли с помощью 1-гидроксибензотриазоловых эфиров. Полноту протекания реакции контролировали нингидриновым тестом или бромфеноловым голубым (пролин). Отщепление пептидов от смолы и удаление защитных групп проводили фтористым водородом в присутствии скавенджеров. Очистку синтезированных пептидов проводили с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе. Чистота полученных препаратов была более 95%. Все они имели удовлетворительный аминокислотный анализ и корректные данные масс-спектроскопии.
Структуры синтезированных пептидов приведены в таблице 1.
Проведенные испытания показали, что полученные пептиды совмещают антибактериальную активность с биоцидной активностью в отношении плесневых грибов и дрожжей, а также в отношении вирусов.
Возможный механизм инактивации бактерий пептидами связан с формированием множественных микропопор в оболочке, приводящих к выравниванию осмотического давления, вытеканию содержимого и разрушению нуклеоида.
Лучшие результаты были получены при использовании пептидов 2, 6 и 11, структура которых приведена ниже:
2
2
10
2
(2) NH-(CH)-CO-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH
2
(6) H-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH
2
(11) H-Ile-Leu-Pro-(2-Me)Phe-Lys-(2-Me)Phe-Pro-(2-Me)Phe-(2-Me)Phe-Pro-(2-Me)Phe-Arg-Arg-NH.
3
На фоне высокой антибактериальной активности, которая проявлялась в интервале доз 1-5 мкг/мл, синтезированные пептиды не вызывали гемолиз в дозах, превышающих 200 мкг/мл. Кроме того, данные пептиды оказывали влияние на иммунокомпетентные клетки. Так, в интервале доз 2-10 мкг/мл они достоверно усиливали спонтанную пролиферацию спленоцитов и снижали включение Н-тимидина клетками селезенки. При стимуляции пролиферации спленоцитов липополисахаридом (ЛПС) пептиды в дозах 0,4-2,0 мкг/мл пептиды ингибировали действие ЛПС. В дозах 10-0,4 мкг/мл они ингибировали продукцию NO, стимулированную ЛПС, клетками макрофагальной линии RAW 264.7. Специфичность связывания пептидов с ЛПС подтверждалась также тем, что эффективность ингибирования продукции NO увеличивалась при уменьшении стимулирующей дозы ЛПС.
На основе разработанных пептидов был получен препарат для местного применения, обладающий биоцидной активностью. Препарат представляет собой прозрачный гомогенный гель для местного применения, свободный от посторонних частиц. Гель имеет следующий состав (% масс): активный ингредиент (пептид) - 0,001-0,1; вспомогательные добавки - 99,999-99,9. В качестве активного начала используются пептиды 2, 6 или 11. В качестве вспомогательных добавок могут быть растворители, например, вода или водно-спиртовые растворы, ароматизаторы, антиоксиданты, а также иные вещества, способствующие оптимизации использования пептида в качестве лекарственного средства биоцидной направленности. В частности, в качестве вспомогательных добавок в состав геля входит, по крайней мере, одно вещество из группы, включающей карбопол, аллантион, феноксиэтанол, этиленгексилглицерин, гидроксид натрия, гиалуронат натрия, лавандовое или касторовое масло, глицерин, кармелозу натрия, лимонную кислоту, альфа-токоферола ацетат, бензойную кислоту и т.п.
Получение лекарственного препарата осуществляли по стандартным технологиям создания "мягких" лекарственных форм фармпрепаратов, используя в качестве активного ингредиента фармацевтически подходящую соль пептида, не вызывающую нежелательных местных и системных побочных эффектов, а в качестве вспомогательных веществ - соответствующие добавки, обеспечивающие определенную структурную вязкость, обладающие псевдопластическими, пластическими и тиксотропными свойствами и оптимизирующие биодоступность активного ингредиента.
Практическая применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Синтез пептидов 1 и 3-14
В качестве защиты -функции аргинина использовали нитрогруппу, ε-аминогруппы лизина - хлоркарбобензокси-группу. Для синтеза пептида загружали в реакционный сосуд 0.2 г N-трет-бутилоксикарбонил--нитро-аргинилметилбензгидриламинополимера в 10 мл диметилформамида. Содержание аргинина - 1.0 ммол/г полимера. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в таблице 2.
При положительном нингидриновом тесте, повторяли конденсацию, начиная с п. 3.
По завершении синтеза пептидил-полимер в реакционном сосуде обрабатывали 5 мл 50% трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, промывали 5 мл хлористого метилена, фильтровали, извлекали из сосуда и переносили на фильтрующую воронку. Промывали на фильтре трижды по 5 мл изопропилового спирта и трижды по 5 мл абсолютного эфира. Высушивали полученный пептидил-полимер в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора, и 0.2 г продукта окончательно деблокировали по программе, приведенной в таблице 3.
Полученные грубые продукты подвергали очистке обращенно-фазовой высоко-эффективной хроматографией на колонке С18 Nova Pack, 19×300 мм, 300А° в градиенте 0-70% ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества - пептидов последовательности 1, 3-14 - по данным оптической плотности, составляло не менее 98%. Аминокислотный состав каждого пептида и его молекулярная масса соответствовали теоретическим. Суммарные аналитические характеристики полученных соединений приведены в таблице 4.
Пример 2. Синтез пептидов 2 и 15
В качестве защиты -функции аргинина использовали мезитиленсульфонильную группу. Для синтеза пептида загружали в реакционный сосуд 0.2 г N-трет-бутилоксикарбонил--мезитиленсульфонил-аргинил-метилбензгидрил аминополимера в 10 мл диметилформамида. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в таблице 2, присоединяя на последней стадии пальмитиновую кислоту (15) или Вос-11-аминодекановую кислоту (2).
Полученный пептидил-полимер обрабатывали безводным фтористым водородом и выделяли грубый продукт в соответствии с программой, приведенной в таблице 3. При ВЭЖХ очистке использовали градиент ацетонитрила 12-90% в 0,1% трифторуксусной кислоте. Аналитические характеристики пептидов 2 и 15 приведены в таблице 4.
Пример 3. Биоцидная активность синтезированных пептидов в отношении бактерий.
6
Для определения антимикробной активности использовали метод радиальной диффузии в агарозных гелях. При проведении эксперимента около 4×10 CFU в средне-логарифмической фазе роста диспергировали в 10 мл на слой геля (10 mM фосфата натрия, 0.3 мг порошка гидролизата соевого бульона на мл и 1% (вес/об) агарозы). Готовили серии разбавлений пептидов в 0,01% уксусной кислоте, содержащей 0.1% человеческий сывороточный альбумин. 8-μl образца пептида наносили на слой геля. Через 3 часа после нанесения пептидов наносили верхний слой (10 мл гидролизата соевого агара, 60 г/л). После ночи инкубации измеряли просветленные зоны с точностью до 0,1 мм. Активность пептидов выражали в относительных единицах 1 мм=10 U.
MIC определялась как значения отрезков на оси x линии регрессии значений диаметров зон, полученных при серийном разбавлении образцов пептидов. Все измерения осуществлялись в триплете. Результаты испытаний приведены в таблице 5.
Полученные результаты свидетельствуют, что при воздействии на бактериальные штаммы, включающая и антибиотикоустойчивые, все пептиды имели высокую биоцидную активность, которая в ряде случаев превышала эффективность пептида 1 (индол иди дина).
Лучшие результаты достигались при использовании пептидов 2, 6 и 11.
Пример 4. Биоцидная активность в отношении плесневых грибов и дрожжей
Противогрибковая активность была оценена по методике, аналогичной примеру 3, на штамме Candida albicans 820. Результаты приведены в таблице 6.
Показано, что в дозах 3-10 мкг/мл пептиды 2, 4 6, 8, 11 и 13 проявляют биоцидную активность в отношении плесневых грибов и дрожжей, существенно превышающую активность индолицидина.
Пример 5. Гемолитическая активность полученных пептидов.
2
При определении гемолитической активности эритроциты изолировали из гепаринизированной крови путем центрифугирования и трижды промывали веронал-мединальным буфером (0,15 М, рН 7,4). Затем разбавляли смесь фосфатным (PBS) буфером (0,015 М NaHPO4, 0,15 М NaCl, рН 7,4). Образцы пептидов определенной концентрации в PBS, помещали в ячейки 96-луночной планшеты и прибавляли суспензию эритроцитов в PBS. Концентрация эритроцитов - 1%. В качестве негативного контроля (отсутствие гемолиза) использовали PBS. В качестве положительного (100% гемолиз) - 0.1% triton Х-100 в PBS.
2
50
Планшеты инкубировали в течение 3 часов при 37°С в атмосфере 5% CO и центрифугировали. Супернатант переносили в чистую планшету. Интенсивность выделения гемоглобина из разрушенных эритроцитов определяли с помощью планшетного спектрофотометра "Victor-2" (Finland) при λ - 450 nm. MIH определяли как самую низкую концентрацию, при которой наступал 50% гемолиз. Все измерения осуществлялись в триплете. Результаты испытаний приведены в Таблице 7.
На фоне высокой антибактериальной активности, которая проявлялась в интервале доз 1-5 мкг/мл, пептиды 2, 6, 11 не вызывали гемолиз в дозах, превышающих 200 мкг/мл.
Пример 6. Противовирусная активность полученных пептидов
Для оценки действия пептидов использовались следующие штаммы: вирус гриппа H3N2 (ВГ, штамм A Pert/16); аденовирус 3-его серотипа (АВ, штамм 3/Воронеж/ 2174/82); вирус парагриппа 3 типа (ВП3, штамм Вок). Вирус гриппа получен из коллекции вирусов НИИ гриппа РАН; вирус парагриппа и аденовирус получены из Государственной коллекции музейных вирусов.
В работе использовали перевиваемые культуры клеток карциномы гортани человека Нер-2 и клетки почки собаки MDCK.
1 мг каждого препарата растворяли в 2 мл DMSO и вносили во флаконы с поддерживающей средой (2ИГЛА MEM и 199, взятые в равных соотношениях) в конечной концентрации 20,0 мкг/мл; 2,0 мкг/мл, 0,2 мкг/мл и 0,02 мкг/мл.
2
50
Монослой клеточных культур получали в культуральных матрасах полезной площадью 25 см. Перед заражением ростовую среду удаляли, монослой клеток однократно промывали раствором Хенкса. Перевиваемую культуру клеток Нер-2 заражали аденовирусом или вирусами парагриппа 3 типа; культуру клеток MDCK - вирусом гриппа, используя в каждом случае множественность инфицирования, равную 0,1-0,01 ТЦД / клетка.
Параллельно с инфицированными, в опыте использовали аналогичные культуральные матрасы с неинфицированными культурами клеток Нер-2 и MDCK, часть которых использовали как контроль клеток, а часть - для определения возможного токсического действия препаратов на клетки.
В матрасы с инфицированными культурами клеток добавляли поддерживающую среду (ПС), не содержащую изучаемые препараты, (контроль вируса) или содержащие изучаемые пептиды 2, 6, 11, показавшие наиболее высокую активность против бактерий и грибов, в дозах 20,0 мкг/мл; 2,0 мкг/мл, 0,2 мкг/мл и 0,02 мкг/мл. Аналогичную по составу ПС вносили в неинфицированные культуры клеток (контроль препарата). В другую часть неинфицированных клеточных культур добавляли ПС, не содержащую пептиды (контроль клеток).
Наблюдение проводили в течение 3-4 суток в зависимости от развития цитопатического действия вируса в контрольных матрасах (контроль вируса). Возможное токсическое действие препаратов на клетки оценивали ежедневной микроскопией не инфицированных клеточных культур с ПС содержащей или не содержащей пептиды (контроль препарата). По окончанию периода наблюдения образцы вируссодержащей культуральной жидкости (ВСЖ) титровали для определения инфекционной активности в опытных и контрольных пробах.
2
Для этого по 0,1 мл суспензии клеток Нер-2 или MDCK, приготовленной в посевной концентрации, помещали в лунки полистероловых планшетов, маркированных «для работы с культурой клеток». Через 24-48 часов формирования монослоя, в клетки вносили ВСЖ в разведении от 1:10 до 1:1000000 с коэффициентом 10 в ростовой среде и помещали по 0,1 мл каждого разведения в 4 лунки планшета. Шесть лунок оставляли в качестве контроля клеток, внося в них по 0,1 мл среды. Зараженные и контрольные клетки инкубировали в термостате с 5% CO в стационарном положении при 34,5±0,5°С. Учет результатов титрования проводили через 3 суток (вирус гриппа), или 4 суток (вирусы парагриппа, аденовирус) по наличию прямого цитопатогенного действия (ЦПД) вируса на клетки.
Активность вирусной репродукции оценивали по величине инфекционных титров, рассчитанных по методу Reed, Muench. Результаты изучения противовирусной активности препаратов представлены в таблице 8.
Показано, что в дозах 20 мкг/мл или 2,0 мкг/мл испытанные пептиды вызывали существенное (более чем в 100-1000 раз) снижение инфекционной активности вируса гриппа H3N2 (ВГ, штамм A Pert/16), аденовируса 3-его серотипа (АВ, штамм 3/Воронеж/ 2174/82) и вируса парагриппа 3 типа (ВП3, штамм Вок). Применение пептидов в дозе 0,2 мкг/мл в меньшей степени, но также достоверно (более чем в 10-100 раз) снижало инфекционную активность вируса гриппа и аденовируса.
Пример 7. Влияние пептидов на иммунокомпетентные клетки
6
Исследовали влияние пептидов на спонтанную и стимулированную митогеном пролиферацию клеток тимуса и селезенки мышей. Тимусы мышей забирали в асептических условиях, гомогенизировали, суспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma) и фильтровали через два слоя марли. Полученную взвесь клеток дважды отмывали средой RPMI-1640 (Sigma) и ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Концентрацию клеток доводили до 10×10/мл культуральной средой, содержащей 4% фетальной сыворотки (FCS) (Sigma).
6
Селезенки мышей забирали в асептических условиях, гомогенизировали в среде RPMI-1640 (Sigma) и фильтровали через два слоя стерильной марли. Полученный гомогенат центрифугировали и затем лизировали эритроциты, используя 0,83% раствор хлористого аммония. Спленоциты дважды отмывали средой RPMI-1640 (Sigma). Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Концентрацию клеток селезенки доводили до 5×10 в одном миллилитре среды RPMI-1640 (Sigma) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma), 80 мкг/мл гентамицина и 20% FCS.
2
3
3
Для стимуляции пролиферации клеток тимуса и селезенки использовали липополисахарид (Sigma) в конечной концентрации 0,2 и 0,02 мкг/мл. При исследовании in vitro влияния синтетических аналогов индолицидина на пролиферацию лимфоцитов, исследование проводили на фоне различных концентраций препаратов (диапазон концентраций от 10 до 0,016 мкг/мл). Для постановки теста использовали плоскодонные 96-луночные планшеты для культивирования (Costar). Культуру клеток инкубировали при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO в течение 72 часов. За 16 часов до окончания периода культивирования во все лунки планшета вносили Н-тимидин (Изотоп) в конечной концентрации 5 μCi/мл. По окончании культивирования культуры клеток с помощью харвестера переносили на фильтры, фильтры высушивали и измеряли количество включенного Н-тимидина, используя жидкостной сцинтилляционный счетчик (Rackbeta 1217). Результаты выражали количеством импульсов в минуту (имп/мин). Данные приведены в таблицах 9-12.
6
2
2
2
Клетки линии RAW-264.7 культивировали в течение 16 часов в лунках 48 луночного планшета для культивирования в концентрации 1×10/мл по 0,5 мл на лунку в культуральной среде DMEM/F-12 (Sigma) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma), 80 мкг/мл гентамицина и 10% FCS в CO-инкубаторе. По окончании времени инкубации во всех лунках планшета культуральную среду замещали 0,25 мл свежей среды. Исследуемые препараты в концентрациях 40, 8, 1,6 мкг/мл преинкубировали с ЛПС (0,8 и 0,16 мкг/мл) в течение двух часов в CO-инкубаторе. В качестве положительного контроля ингибиции действия ЛПС использовали полимиксин В (Calbiochem) (РМВ) в тех же концентрациях. Затем приготовленную смесь по 0,25 мл добавляли в лунки культурального планшета не менее чем в двух параллелях. В контрольные лунки добавляли смесь ЛПС с культуральной средой. Клетки культивировали в течение суток в CO-инкубаторе. Продукцию NO измеряли по суммарному уровню нитрита в культуральной среде с помощью реакции Грисса с использованием коммерческого реагента (Sigma) по инструкции изготовителя. Результаты приведены в таблицах 13-14.
3
Пептиды 2, 6, 11 оказывали влияние на иммунокомпетентные клетки. Так в интервале доз 2-10 мкг/мл они достоверно усиливали спонтанную пролиферацию спленоцитов и снижали включение Н-тимидина клетками селезенки. При стимуляции пролиферации спленоцитов липополисахаридом пептиды в дозах 0,4-2,0 мкг/мл ингибировали действие ЛПС. Кроме того, в дозах 10-0,4 мкг/мл они ингибировали продукцию NO, стимулированную ЛПС, клетками макрофагальной линии RAW 264.7 Специфичность связывания пептидов с ЛПС подтверждалась также тем, что эффективность ингибирования продукции NO увеличивалась при уменьшении стимулирующей дозы ЛПС.
Пример 8. Получение геля для профилактики и лечения заболеваний кожи и слизистых.
Для приготовления геля используют химический реактор с мешалкой. В смеситель загружают компоненты геля согласно рецептуре (мас. %): карбопол (1,5-2,0%), дистиллированную воду, раствор NaOH (1,5-2,0%), перемешивают, выдерживают в течение 30 мин. Затем титруют раствором лимонной кислоты до рН 6 и порционно при перемешивании вводят водный раствор пептида, содержащий консерванты, в качестве которых используют метилпарабен в количестве 0,01-0,2 мас. % и пропилпарабен в количестве 0,002-0,01 мас. %. В полученную смесь вводят глицерин в количестве 1,5-2,5 мас. %. Систему перемешивают в течение 10 мин и измеряют величину рН. Полученный однородный гель оставляют в покое для созревания на одни сутки. Затем гель вновь перемешивают и однородную массу фасуют в тару (тюбики).
В результате получают прозрачный гомогенный гель для наружного (местного) применения, свободный от посторонних частиц. Гель имеет следующий состав (% масс): пептид - 0,001-0,1; служебные добавки - 99,999-99,9. Характеристика полученных гелевых препаратов, содержащих пептиды, приведена в таблице 15.
Пример 9. Противовирусная активность препаратов на основе пептидов в отношении вируса простого герпеса человека 2 типа в опытах in vivo
Для проведения эксперимента были сформированы 3 группы животных по 15 особей каждая:
группа 1 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа с применением пептидных препаратов (опытная группа);
группа 2 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа с применением Ацикловира (контроль препарата)
группа 3 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа без применения фармпрепаратов (контроль вируса)
2
Экспериментальная герпесвирусная инфекция. В работе был использован вирус простого герпеса 2 типа штамм G (АТСС VR-734, США). Вирус культивировали в культуре клеток T-98G (глиобластома головного мозга человека), далее адаптировали к организму мышей двумя последовательными интрацеребральными пассажами у мышей разных групп. Для подготовки итогового инфицирующего материала животных интрацеребрально заражали гомогенатом мозговой ткани от второго пассажа, на 4 сутки после инфицирования мышей забивали, извлекали мозг, готовили гомогенат, инфицировали им клетки Vero и инкубировали 48 часов при 37°С и 5% CO, используя культуральную жидкость, в которой предварительно определяли инфекционный титр вируса, в качестве инфицирующего материала.
В качестве препарата сравнения использовали Зовиракс (Ацикловир в форме 5% мази, Glaxo Welcome).
6
50
Повреждение вагинального эпителия мышей осуществляли при помощи скарификатора для влагалищных мазков, после чего животных 1 и 2 групп инфицировали вирусом в дозе 10 TCID в объеме 30 мкл. Препараты наносили животным на рану по лечебной схеме: через 1, 2, 3, 4 и 5 суток после заражения один раз в день.
Наблюдение за животными осуществляли в течение 18 дней. Об окончании смертности судили по отсутствию в группах мышей с признаками герпетического вагинита (выделения из влагалища) и его осложнений (пареза задних конечностей). Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (отношение числа павших на момент контроля животных к общему числу зараженных животных в группе), индекс защиты (отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (СПЖ) на каждый день исследования.
Протективную активность пептидов оценивали по снижению специфической смертности и увеличению продолжительности жизни животных по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения. Данные по протективной активности пептидов приведены в таблице 16.
Лучшие результаты были получены при использовании препаратов 2с и 2б.
Проведенные исследования показали, что заявляемые пептиды проявляют биоцидные свойства по отношению к бактериям, включая споровые, плесневым грибам, а также вирусам. Лучшие результаты были получены при использовании пептидов 2, 6, 11. Гели на основе пептидов могут быть использованы для лечения, бактериальных, вирусных и сочетанных инфекционных заболеваний.