ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ IL-10 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ (SLE)
HUMANISED ANTI-IL-10 ANTIBODIES FOR TREATING SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS (SLE)

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к интерлейкину-10 (IL-10) и специфичным к IL-10 средствам. В частности, настоящее изобретение включает гуманизированные антитела к IL-10 и их применение. Изобретение дополнительно предусматривает способ лечения системной красной волчанки (SLE).
Уровень техники
Системную красную волчанку (SLE) рассматривают как аутоиммунное заболевание, при котором ключевую роль играют аномальная гиперактивность Β-лимфоцитов и обширная аномальная продукция аутоантител к иммуноглобулину гамма (IgG). Данный патологический процесс приводит к секвестрации и разрушению покрытых Ig клеток, фиксации и расщеплению белков комплемента и высвобождению хемотаксинов, вазоактивных пептидов и разрушающих ферментов в ткани (Hahn BH. Systemic Lupus Erythematosus. In: Kasper DL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL, Longo DL, Jameson, JL, editors. In: Harrison's Principles of Internal Medicine (16th edition). New York (US): McGraw-Hill; 2005. pp. 1960-1967).
SLE характеризуется разнообразными проявлениями. В течение заболевания в общей сложности 95% пациентов испытывают скелетно-мышечные нарушения, 80% демонстрируют кожные повреждения, 85% - гематологические нарушения, 60% - неврологические нарушения, 60% - сердечно-легочные нарушения, 30%-50% - почечные нарушения, 40% - желудочно-кишечные нарушения, 15% - тромбоз и 15% - офтальмологические нарушения. Подавляющее большинство пациентов (95%) также страдает системными симптомами, такими как утомляемость, недомогание, лихорадка, анорексия и потеря веса, присутствующими большую часть времени. Большинство пациентов испытывает периоды обострения заболевания, чередующиеся с периодами ремиссии. Постоянная ремиссия (отсутствие симптомов при отсутствии лечения) является очень редкой. Более 50 лет назад большинство пациентов с диагнозом SLE жили менее 5 лет. В настоящее время, более 90% проживают 10 лет, в основном благодаря ранней диагностике, симптоматическому противовоспалительному и иммуносупрессорному лечению. Общей причиной смерти является инфекция в результате иммуносупрессии (Hahn 2005).
Общепринято в лечении SLE применение противомалярийных, противовоспалительных и иммуносупрессивных лекарственных средств. Нестероидные противовоспалительные средства дополняют кортикостероидами, если симптомы становится трудно контролировать. Кроме того, активная SLE со значительным вовлечением органов требует агрессивной терапии циклофосфамидом.
До настоящего времени не существовало этиологического лечения, доступного для лечения SLE и/или для улучшения качества жизни пациентов на долговременной основе. Однако последние достижения в связанных с антителами технологиях и дальнейшая идентификация факторов, лежащих в основе данного аутоиммунного заболевания, открыли возможность использования моноклональных антител в качестве способа лечения. В частности, удобным подходом для лечения SLE будет специфическое лечение, воздействующее на патологический иммунный ответ, приводящий к обширной гиперпродукции поликлональных аутоантител, или корректирующее его. Поскольку патогенез SLE главным образом включает Β-клетки с нарушенной регуляцией, особый интерес представляют моноклональные антитела, способные воздействовать на B-клетки. Как отмечают Robak и Robak (Current Drug Targets, 2009, No. 10, pages 26-37) потенциальными мишенями среди B-клеточных поверхностных антигенов являются CD19, CD20, CD21 и CD22. Кроме того, IL-10, IL-1ra, IL-12 (Capper et al., Clin. Exp. Immunol. 2004 Nov; 138(2):348-56) и IL-6 (Chun et al., J. Clin. Immunol. 2007 Sep; 27(5):461-6) являются важными цитокинами в регуляции иммунного ответа, и их уровень значительно повышается при обострениях у пациентов SLE. Уровни IL-10 и аутоантител против двухцепочечной ДНК (дцДНК) в плазме часто отражают активность заболевания у пациентов с SLE. Повышенные уровни IL-10 коррелируют с активностью заболевания у пациентов с SLE (Park et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1998 May-Jun; 16(3):283-8). Однако IL-10 представляет собой цитокин с плейотропными эффектами относительно иммунной системы, а также известно, что он вовлечен в снижение провоспалительных ответов.
На пациентах с SLE проводили клинические испытания с применением моноклональных антител. В частности, несколько испытаний включали антитело ритуксимаб, химерное моноклональное антитело мыши против CD20, применяемое для лечения неходжкинской лимфомы. Как отмечают Robak и Robak (2009), результаты данных испытаний демонстрируют высокую активность этого антитела у пациентов с SLE, и разработано несколько новых антител, нацеленных на CD20; офатумумаб, IMMU-106 и GA-101. Дальнейшие клинические испытания, в которых сообщали об активности моноклональных антител при SLE, проводили с антителом против CD22, эпратузумабом, антителом против TNF-α, инфликсимабом, антителом против IL-10, B-N10 (Llorente et al., Arthritis Rheum. 2000 Aug; 43(8): 1790-800), антителами против CD40L, IDEC 131 и BG 9588, ингибитором BLYS, белимумабом, антителом против рецептора IL-6, токлимумабом, и антителом против C5, экулизумабом.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение дополнительных средств, и, в частности, антител, обладающих применимостью в этой области.
В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, способное связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент: (i) связывается с той же областью IL-10, что и α-рецептор IL-10 (IL-10Rα) и не способно связываться с IL-10, если IL-10 связан с рецептором IL-10; и (ii) связывается с IL-10 в гомодимерной форме посредством связывания с прерывистым эпитопом, содержащим остатки обоих мономеров.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитела по настоящему изобретению обладают особенно выгодным способом связывания, так что они пригодны для лечения медицинских состояний, которые опосредованы повышенным уровнем или активностью IL-10, и, в частности, аутоиммунных заболеваний. В частности, антитела и их фрагменты по настоящему изобретению не могут запускать ADCC или CDC ответ, так как они не могут связываться с IL-10, если он связан с IL-l0Rα. Это представляет собой особенно выгодный вид связывания, потому что в результате, антитела по настоящему изобретению не могут связываться с клетками, на которых IL-10 связан с рецептором, и вследствие этого не могут индуцировать ADCC или CDC ответ. Таким путем регулируется влияние антитела на другие части иммунной системы. Кроме того, антитела и их фрагменты по настоящему изобретению могут связываться с IL-10 гомодимером с гораздо большей аффинностью, чем с IL-10 мономером. Как таковое антитело связывается предпочтительно с функционально активной формой IL-10, в большей степени, чем с мономером или продуктами деградации. Это особенно выгодно, потому что снижается количество антитела к IL-10, требуемое для получения нейтрализующего эффекта, и снижается риск побочных эффектов посредством неспецифического связывания с неактивными молекулами.
Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, способное связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент связывается с той же областью IL-10, что и рецептор IL-10 (IL-10Rα) и не способно связываться с IL-10, если IL-10 связан с рецептором IL-10.
В третьем аспекте настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, которое способно связываться с интерлейкином-10 (IL-10) в гомодимерной форме, где указанное антитело или его фрагмент связывается с прерывистым эпитопом, содержащим остатки обоих мономеров.
В четвертом аспекте настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент по первому аспекту, где антитело или его фрагмент содержит аминокислотные последовательности, по меньшей мере, на 80% идентичные аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела B-N10 мыши и/или содержат аминокислотные последовательности, по меньшей мере, на 80% идентичные аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела B-N10 мыши.
В пятом аспекте настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, способное связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент не индуцирует антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность и/или комплемент-зависимую цитотоксичность.
В шестом аспекте настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, способное связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент способно предотвращать опосредованную IL-10 передачу сигнала через α-рецептор IL-10.
В седьмом аспекте настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, способное связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент не способно связываться с экспрессирующими IL-10R клетками.
Изобретение проиллюстрировано исключительно в качестве примеров следующими чертежами, среди которых:
На фиг.1A показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:2). Подчеркнуты гипервариабельные определяющие комплементарность области (CDR3) (где LCDR1 является SEQ ID NO:4; LCDR2 является SEQ ID NO:5, и LCDR3 является SEQ ID NO:6).
На фиг.1B показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:3). Подчеркнуты гипервариабельные определяющие комплементарность области (CDR3) (где HCDR1 является SEQ ID NO:7; HCDR2 является SEQ ID NO:8; и HCDR3 является SEQ ID NO:9).
На фиг.2A показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:10).
На фиг.2B показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:11).
На фиг.3 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой и тяжелой цепей антитела B-N10 мыши (SEQ ID NO:12 и 13, соответственно) вместе с последовательностями, взятыми из A17 (SEQ ID NO:14), JK1 (SEQ ID NO:15), 3-66+04 (SEQ ID NO:16) и JH4 (SEQ ID NO:17), и вариабельных областей hVL1-hVL12 (SEQ ID NO:18-29) и вариабельных областей hVL1-hVH29 (SEQ ID NO:30-58), полученных при гуманизации антитела B-N10 мыши.
На фиг.4 показано сравнение антигенсвязывающих свойств вариантов гуманизированного антитела и химерного антитела cB-N10 с применением ELISA с фиксированным антигеном hIL-10.
На фиг.5 показан результат определения связывающих свойств трех гуманизированных вариантов, hVH20/hVL7, hVH20/hVL8 и hVH26/hVL7, по сравнению с химерным антителом B-N10 с применением очищенных препаратов антитела.
На фиг.6 показано окрашивание лимфоцитов с применением меченых BT061 и BT-063.
На фиг.7 показана эксклюзионная хроматография BT-063 Fab (верхний ряд), мономера и димера IL-10 (средний ряд) и комплекса димера IL-10 и Fab BT-063 (нижний ряд).
На фиг.8 показана общая структура Fab фрагмента BT-063, связывающего IL-10. IL-10 и Fab-фрагмент представлены в виде ленточной модели.
На фиг.9 показан Fab-фрагмент BT-063, относящийся к тому же участку связывания на IL-10, что и рецептор IL-10. IL-10, IL-10R1 и Fab-фрагмент представлены в виде ленточной модели.
На фиг.10 показана теоретически рассчитанная зависимость дозы IL-10, связанного возрастающими общими дозами BT-063, после внутривенной инъекции здоровым добровольцам.
На фиг.11 показано теоретическое влияние различных концентраций IL-10 на кривую доза-ответ, изображенную на фиг.10. Изображены кривые для концентраций в 1000 раз выше и ниже, чем установленная в качестве стандартной (15 пг/мл). Можно отметить только незначительные различия между кривыми.
На фиг.12 показано теоретическое влияние различной аффинности BT-063 в отношении IL-10 на кривую доза-ответ, изображенную на фиг.10. Изображены кривые аффинности в 10 раз выше и ниже, как это определено с помощью BT-063 (3 нМ). Кривая доза-ответ в значительной степени зависит от аффинности BT-063 в отношении IL-10.
На фиг.13 показан график средней концентрации Cmax цитокинов в плазме после введения BT-063 здоровым добровольцам относительно дозы.
in vivo
На фиг.14 показан график средней концентрации IL-10 в плазме в зависимости от времени после введения BT-063  здоровым добровольцам.
Подробное описание изобретения
Как указано выше, настоящее изобретение относится к гуманизированному или химерному антителу или его фрагменту, способному связываться с интерлейкином-10 (IL-10), и применению этого антитела или его фрагмента в лечении медицинских состояний, опосредуемых повышенным уровнем или активностью IL-10. IL-10 человека представляет собой гомодимер с молекулярной массой 37 кДа. Каждый мономер состоит из 160 аминокислот и имеет молекулярную массу 18,5 кДа. Димер IL-10 взаимодействует с α-рецептором IL-10 (IL-10Rα или IL-10R1) и затем вовлекает в комплекс β-рецептор IL-10 (IL-10Rβ или IL-10R2). Рецептор экспрессируется на множестве клеток, в частности, иммунных клетках (Asadullah et al., Pharmacol. Rev. 2003 Jun; 55(2):241-69), включая большинство гемопоэтических клеток, таких как моноциты, макрофаги и T- и В-лимфоциты, а также экспрессируется в негемопоэтических клетках, таких как клетки эпидермиса или кератиноциты. Связывание IL-10 с α-рецептором IL-10 и вовлечение β-рецептора IL-10 приводит к передаче сигнала через тирозиновые киназы Jak1 и Tyk2 и затем к активации факторов транскрипции семейства STAT. Известны различные клеточные источники IL-10, такие как T-хелперные клетки, регуляторные T-клетки, моноциты, макрофаги, В-клетки, эозинофилы, тучные клетки, кератиноциты, дендритные клетки и даже злокачественные клетки. Действие IL-10 на Β-клетки находится в диапазоне предотвращения апоптоза, усиления пролиферации, переключения класса иммуноглобулинов и дифференцировки в плазматические клетки (Asadullah et al., Pharmacol. Rev. 2003 Jun; 55(2):241-69) и ингибирования воспаления.
α
В первом и втором аспектах настоящего изобретения и в предпочтительных вариантах осуществления других аспектов изобретения антитело или его фрагмент связывается с той же областью IL-10, что и α-рецептор IL-10(IL-10R), и не может связываться с IL-10, когда IL-10 связан с рецептором IL-10, т.е. когда IL-10 связан с антителом или фрагментом, он не может связываться с IL-10Rα.
Как описано выше, функционально активный димер IL-10 взаимодействует с IL-10Rα и затем вовлекает в комплекс IL-10Rβ, что приводит к передаче сигнала. Однако предполагают, что будут иметь место некоторые неоптимальные события передачи сигнала во время первоначального связывания IL-10 с IL-10Rα.
Антитела способные к нейтрализации эффектов IL-10 могут функционировать в соответствии с рядом механизмов. Они могут связываться с IL-10 и предотвращать связывание IL-10 с IL-10Rα посредством пространственного препятствия. В частности, так как функционально активный IL-10 представляет собой гомодимер, две молекулы антитела могут связываться с одним и тем же димером IL-10. Альтернативно, возможно, что нейтрализующее антитело связывает область IL-10, не перекрываясь с участком связывания IL-10Rα, и противодействует связыванию IL-10Rα посредством конформационно индуцированных изменений в IL-10 (Josephson et al. Structure (2002) 10; 981-987).
Альтернативно, антитела могут связываться с областью IL-10, что предотвращает взаимодействие между IL-10 и IL-10Rβ. Дополнительно, также возможно, что антитело связывается с участком IL-10, который все еще остается экспонированным после связывания цитокина с цепью рецептора с высокой аффинностью и индуцирует конформационное изменение, которое препятствует вовлечению второй цепи рецептора, необходимому для передачи сигнала.
В отличие от этого, антитела или их фрагменты по настоящему изобретению ингибируют взаимодействие IL-10 с IL-10Rα посредством связывания с той же областью IL-10, что и IL-10Rα. Соответственно, антитела по настоящему изобретению предотвращают любое связывание между IL-10 и IL-10Rα. По существу, даже неоптимальная передача сигнала, указанная выше, должна быть исключена. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, способное связываться с интерлейкином-10 (IL-10), где указанное антитело или его фрагмент способно предотвращать опосредованную IL-10 передачу сигнала через α-рецептор IL-10.
Выражение "связывается с той же областью" в используемом в данном описании значении относится к способности антитела или его фрагмента конкурировать с IL-10Rα за связывание IL-10. По эффекту антитело или его фрагмент по настоящему изобретению действует как конкурентный ингибитор. Известно, что IL-10Rα связывается с остатками от 19 до 42 и от 138 до 158 в димере IL-10. Соответственно, антитело или фрагмент по настоящему изобретению также способно связываться, по меньшей мере, с одним остатком внутри обеих этих областей, таким образом, IL-10Rα связывание эффективно блокируется.
Кроме того, выражение "когда IL-10 связан с рецептором IL-10" относится к ситуации, когда IL-10 связан с рецептором IL-10 обеими сторонами, т.е. через оба мономера.
В предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент не связываются с той же областью IL-10, что и β-рецептор IL-10 (IL-10Rβ).
Этот аспект и варианты осуществления по настоящему изобретению могут альтернативно быть определены как антитело или его фрагмент, способные предотвращать опосредованную IL-10 передачу сигнала через α-рецептор IL-10 или как не способные связываться с клетками, экспрессирующими IL-10R (т.е. через связанный IL-10).
В первом и третьем аспектах настоящего изобретения и в предпочтительных вариантах осуществления других аспектов изобретения антитело или его фрагмент связывается с прерывистым эпитопом, содержащим остатки одного из мономеров гомодимера IL-10 и остатки второго мономера гомодимера IL-10, т.е. антитело или его фрагмент связывается с прерывистым эпитопом, содержащим остатки первого мономера и остатки второго мономера, где первый мономер и второй мономер составляют гомодимер.
Термин "гомодимерная форма" относится к функционально активному IL-10, представленному симметричным гомодимером, составленным из двух альфа спиральных доменов (домен A и домен B), расположенных под углом 90 градусов по отношению друг к другу. Структурная целостность каждого домена зависит от переплетения альфа спиралей каждой пептидной цепи, так что первые четыре спирали одной цепи ассоциируются с последними двумя спиралями другой цепи. Одиночный IL-10 мономер не может связывать рецептор IL-10, так как для построения поверхности взаимодействия требуются части обеих цепей.
Антитела и их фрагменты по настоящему изобретению проявляют конкомитантное взаимодействие с обоими мономерами димера IL-10 дикого типа. По существу, они связываются с "прерывистым эпитопом", т.е. эпитопом, в котором аминокислоты находятся в непосредственной близости в уложенном белке, но находятся в отдалении в неуложенном белке. В частности, эпитоп представлен аминокислотами, присутствующими в обеих цепях димера IL-10.
В результате этого вида связывания антитела и их фрагменты связываются с функционально активным IL-10 с гораздо большей аффинностью, чем с мономерами IL-10, в которых присутствует только часть прерывистого эпитопа.
В предпочтительном варианте осуществления по настоящему изобретению антитело или его фрагмент связывается с прерывистым эпитопом, содержащим остатки спирали A одного мономера IL-10 (т.е. первого мономера) и остатки спирали F другого мономера IL-10 (т.е. второго мономера).
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент связывается с прерывистым эпитопом, представленным первыми 55 аминокислотами одного мономера IL-10, более предпочтительно аминокислотами 20-55, и последними 20 аминокислотами второго мономера, и наоборот.
Из литературы известны искусственные мутантные формы IL-10 комбинированных спиралей A-D и спиралей E-F одного мономера в форме, распознаваемой IL-10R1 или BT-063.
В настоящем описании под IL-10 подразумевается IL-10 человека, аминокислотная последовательность которого может быть представлена следующим образом:
Может быть определено имеют ли антитела против IL-10 целевую активность с помощью известных технологий пептидного сканирования или с помощью эксклюзионной хроматографии.
E.coli
Технологии пептидного скрининга могут состоять из скрининга возможно связывающихся с IL-10 веществ, которые полностью или фрагменты которых могут быть иммобилизованы на мембране или на подходящей поверхности. В частности, IL-10 или фрагмент IL-10 может быть синтезирован синтетически, или кодирующая нуклеотидная последовательность может быть сверхэкспрессирована в подходящем хозяине, таком как, например,  или клетки насекомых. В частности, могут быть использованы области IL-10, идентифицируемые в данном описании как образующие эпитоп для антитела по настоящему изобретению.
Антитела против IL-10 могут быть идентифицированы с использованием, например, технологии фагового или рибосомного дисплея (или дисплея мРНК, полисомального дисплея, дрожжевого дисплея). С этими технологиями также можно идентифицировать связывающие вещества, распознающие прерывистые эпитопы. Как белок, так и лиганд (т.е. антитело, которое будет отобрано) могут быть иммобилизованы и инкубированы с потенциальным партнером по связыванию. Несвязанные белки удаляют, и связанные лиганды элюируют. Осуществляют несколько стадий для идентификации связывающих с высокой аффинностью веществ.
В настоящем описании термин "химерное антитело" относится к антителам, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична последовательностям антител, полученным из конкретных видов или принадлежащим конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть антитела идентична последовательностям антител, полученным из других видов, класса или подкласса антител. Особенно предпочтительно, чтобы CDR химерного антитела имели одно происхождение, в то время как остальная часть антитела имела другое происхождение. В частности, в настоящем изобретении химерное антитело может быть гуманизированным антителом, в котором антигенсвязывающие последовательности/вариабельные домены не принадлежащего человеку антитела трансплантируют в каркасные области антитела человека.
2
В настоящем описании термин "фрагмент" относится к фрагменту или производному антитела, сохраняющему желаемую биологическую активность. Как правило, фрагмент будет содержать антигенсвязывающую область антитела и, в частности, Fab, Fab', F(ab)', Fv- и scFv-фрагменты, а также производные поливалентных антител, в частности, диател или тандемных диател. Предпочтительно, фрагмент содержит, по меньшей мере, 25, более предпочтительно 50 и еще более предпочтительно 200-500 аминокислот. Альтернативно, фрагменты можно определять как обладающие размером от 30 кДа до 150 кДа. Дополнительно, фрагменты антитела могут включать две или более пептидных/полипептидных цепей. Кроме того, фрагменты антител могут включать две или более пептидных/полипептидных цепей. Например, Fab-фрагмент, содержащий две цепи от 200 до 300 аминокислот в каждой, или TandAbs (форматы тетравалентного биспецифического антитела), содержащий две цепи от 400 до 500 аминокислот в каждой.
В четвертом аспекте настоящего изобретения и в предпочтительных вариантах осуществления других аспектов изобретения антитело или его фрагмент получают из антитела B-N10 мыши или из BT-063 (вариант hVH26/hVL7). В частности, такое антитело или его фрагмент содержит CDR, по меньшей мере, на 80% идентичные последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи B-N10 или BT-063 и/или содержат аминокислотные последовательности, по меньшей мере, на 80% идентичные аминокислотным последовательностям CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи B-N10 или BT-063. Аминокислотная последовательность CDR мыши показана на фиг.1. Вариабельные последовательности варианта BT-063 показаны в примере 6. Более предпочтительно последовательности будут, по меньшей мере, на 90% или, по меньшей мере, на 95% идентичны последовательностям CDR антитела B-N10 или BT-063.
Альтернативно, антитело или фрагмент по изобретению, все еще являясь производным антитела B-N10/BT-063, может содержать аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи B-N10/BT-063 и/или аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи B-N10/BT-063, необязательно с вариацией в данных последовательностях, которая по существу не изменяет аффинности и/или специфичности антитела или его фрагмента. В частности, вариации в последовательности не снижают аффинности или специфичности антитела или фрагмента к IL-10 по сравнению с аффинностью или специфичностью антитела или фрагмента, содержащих CDR антитело B-N10 мыши или антитело BT-063 (вариант WH26/HVL7).
В конкретном варианте осуществления гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент содержит аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепей антитела B-N10 мыши или легкой и/или тяжелой цепей варианта BT-063. Более предпочтительно, настоящее изобретение предоставляет гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, содержащее аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100% идентичность последовательности вариабельных доменов антитела B-N10 мыши, как показано на фиг.1, или вариабельных доменов антитела BT-063, как показано в примере 6.
Кроме того, в результате рентгеноструктурных анализов, выполненных авторами настоящего изобретения, антитело или его фрагмент по настоящему изобретению может также быть определено как гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, способное связываться с IL-10, где указанное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область, содержащую CDR1 и CDR2 легкой цепи BT-063 и/или вариабельную область, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи BT-063, необязательно, с аминокислотными заменами в последовательностях CDR, при условии, что:
(i) CDR1 легкой цепи содержит: Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37,
(ii) CDR2 легкой цепи содержит: Lys55,
(iii) CDR2 тяжелой цепи содержит: Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32,
(iv) CDR2 тяжелой цепи содержит: Trp52, Arg53, Gly54, Ser56,
(v) CDR3 тяжелой цепи содержит: Tyr100, Gly101, Tyr103.
Более предпочтительно вариабельная область тяжелой цепи дополнительно содержит Asn73 и Ser74. Особенно предпочтительно, чтобы с заменами в CDR их последовательность была, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% идентична последовательности CDR в BT-063.
Использование типа остатка и номера было осуществлено с целью определенного идентифицирования аминокислотного остатка CDR BT-063, к которому это относится. Однако необходимо понимать, что не подразумевается, что номер остатка ограничивает нахождение остатка в этом положении в вероятном антителе или фрагменте, которые подвергаются отбору в способе. Например, в антителе этого варианта осуществления Ser32 может быть в положении 31 внутри CDR1 легкой цепи, если был удален несущественный аминокислотный остаток из участка 1-30 легкой цепи.
Последовательности тяжелой и легкой цепей BT-063 и положения CDR показаны в примере 6 ниже.
В пятом аспекте настоящего изобретения и в предпочтительных вариантах осуществления остальных аспектов изобретения гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, способное связываться с интерлейкином-10 (IL-10), не индуцирует антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).
Как указано выше, антитело или его фрагмент не способно связываться с IL-10, если IL-10 связан с α-рецептором IL-10. Соответственно, антитело или его фрагмент может связываться только с растворимым IL-10 и не способно связываться с экспрессирующими IL-10R клетками (через IL-10). В результате, антитело или его фрагмент по настоящему изобретению не способно индуцировать ADCC или CDC, по меньшей мере, отчасти из-за свойства связывать только растворимый IL-10, а не связанный с клеткой IL-10.
Для тестирования того, индуцирует ли антитело CDC, клетки, несущие представляющий интерес антиген, могут быть инкубированы с дозами антитела в присутствии комплемента (или сыворотки, которая содержит активный комплемент, такой как C1q). В качестве параметра, описывающего количество индуцированной CDC, может быть измерена степень клеточного лизиса.
Для тестирования того, индуцирует ли антитело ADCC, клетки, несущие представляющий интерес антиген, (клетки-мишени) могут быть инкубированы с возрастающими дозами антитела в присутствии индуцирующих ADCC клеток (например, естественные киллерные клетки, эффекторные клетки). В качестве параметра, описывающего количество индуцированной ADCC, на клетках-мишенях может быть измерена степень клеточного лизиса.
in vitro
Кроме того, в дополнительном аспекте настоящего изобретения и в предпочтительных вариантах осуществления остальных аспектов изобретения гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент способно связываться с интерлейкином-10 (IL-10), таким образом, что при введении пациенту, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 75% IL-10 в плазме пациента связано в комплекс с антителом или его фрагментом. В этом смысле термин “связанный в комплекс с антителом или его фрагментом” относится к удерживанию IL-10 антителом или его фрагментом после того, как оно было введено пациенту. Емкость удерживания IL-10 антитела или фрагмента может быть определена  на основании объема крови 3,5 л, и с известной константой диссоциации между антителом или фрагментом и IL-10, и дополнительно, с использованием предположений и способов, представленных в примере 8 ниже.
Как правило, антитело по изобретению дополнительно содержит константную область (Fc) человека. Ее можно выбирать среди константных доменов любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любых изотипов, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Предпочтительные константные области выбирают среди константных доменов IgG, в частности, IgG1.
Другие продукты
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие описанное выше антитело или фрагменты антитела. Последовательности нуклеиновой кислоты могут представлять собой ДНК или РНК, но предпочтительно ДНК. Последовательности можно использовать в экспрессирующих кассетах или векторах, и они особенно применимы в производстве описываемых в настоящем описании антител и их фрагментов.
Изобретение дополнительно предусматривает клетки-хозяева, трансформированные данными полинуклеотидами, экспрессирующими кассетами или векторами. Подходящие клетки-хозяева могут быть как прокариотическими, так и эукариотическими.
Альтернативно, клетка-хозяин может представлять собой гибридому, получаемую слиянием клетки, продуцирующей антитело по настоящему изобретению, с миеломной клеткой.
Описанные выше клетки-хозяева можно использовать в способе получения антитела или его фрагмента. В частности, такой способ может включать стадию культивирования клетки-хозяина в подходящей среде для культивирования в условиях, делающих возможной экспрессию антитела или его фрагмента, и отделение антитела или фрагмента от среды для культивирования. Способы данного типа хорошо известны и описаны в данной области.
Настоящее изобретение также предоставляет выделенный пептид, содержащий менее 50 аминокислот, содержащих один или оба набора аминокислот 27-53 и аминокислот 142-155 IL-10 человека. Такие пептиды особенно полезны в описанных ниже способах скрининга.
Медицинские применения
Описываемые в настоящем описании антитела и их фрагменты обладают применимостью в лечении заболеваний или медицинских состояний, опосредуемых повышенным уровнем или активностью IL-10. Таким образом, предоставлен способ лечения или предотвращения медицинского состояния у субъекта, где медицинское состояние опосредовано повышенным уровнем или активностью IL-10, включающий введение терапевтически эффективного количества описываемого в настоящем описании антитела или его фрагмента.
В частности, медицинское состояние, которое опосредовано повышенным уровнем или активностью IL-10, представляет собой SLE. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет антитело или его фрагмент, как описано в настоящем описании, для применения в лечении SLE.
Дополнительные примеры представляют собой тромбоцитопеническую пурпуру, люпус-нефрит, ВИЧ, ЦМВ и гепатит C. Другой пример представляет собой лечение опухолевых клеток, зависящих от IL-10, посредством прямой поддержки пролиферации или супрессии иммунного ответа.
Дополнительный вариант осуществления изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую описанное выше антитело или его фрагмент, фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В одном из вариантов осуществления композиция содержит липосомы, с которыми связано антитело или его фрагмент.
Такие композиции можно вводить пациенту парентерально, внутривенно или подкожно. Предпочтительно, при лечении SLE антитело или его фрагмент вводят внутривенно или подкожно.
in vitro
Кроме того, антитела и их фрагменты, описанные в данном описании, могут быть применены при диагностировании медицинских состояний, которые опосредованы повышенным уровнем или активностью IL-10. В частности, антитела и их фрагменты могут быть использованы в анализах для определения наличия аномального уровня IL-10 в образцах, взятых у индивидуума. Такие способы диагностирования могут включать: (a) получение или обеспечение образцов, взятых у индивидуума; (b) приведение образца в контакт с антителом против IL-10 или его фрагментом, как описано в данном описании, и (c) определение присутствия IL-10 (например, определением присутствия антитела или его фрагмента). В частности, стадия (c) может включать определение количества IL-10, присутствующего в образце. Кроме того, способ может дополнительно содержать стадию (d) сравнения количества присутствующего IL-10 с одним или более заранее определенных значений для того, чтобы получить оценку в отношении пациента и медицинского состояния. Заранее определенные значения могут представлять эталонное значение количества IL-10, присутствующего в эквивалентном образце, взятом у здорового индивидуума.
Предпочтительно образец представляет собой образец плазмы, полученной посредством взятия крови у индивидуума. В частности, способ диагностирования может быть использован, если медицинское состояние представляет собой SLE.
Немедицинское применение
Кроме того, предоставлено меченое гуманизированное или химерное антитело или его фрагмент, включающее описываемое в настоящем описании антитело или его фрагмент и метку. Метка может быть любого подходящего типа, известного в данной области для определения наличия антитела в образце. В частности, метка может представлять собой флуоресцентную метку.
in vitro
Антитело или его фрагмент по настоящему изобретению и, в частности, меченое антитело, обладает конкретной применимостью в способе определения наличия IL-10  в образце. Способ может включать стадию приведения немеченого или меченого антитела или его фрагмента в контакт с образцом, промывания образца для удаления антитела и его фрагментов, не связавшихся с образцом (т.е. не связавшегося антитела или фрагментов антител), и определения присутствия антитела (или фрагмента) в образце, например, посредством метки.
in vitro
Альтернативно, немеченое антитело или фрагмент может быть использовано для способа нейтрализации IL-10 в образце. Такой способ включает стадии приведения образца в контакт с антителом или его фрагментом для связывания антитела или его фрагмента с IL-10.
Дополнительно, настоящее изобретение также предоставляет способ скрининга одной или более молекул, способных к связыванию с той же областью IL-10, что и α-рецептор IL-10 (IL-10Rα), включающий:
a) приведение одной или более молекул в контакт с пептидом, содержащим одну или более следующих областей человеческого IL-10: аминокислоты 27-53 и аминокислоты 142-155; и
b) определение того, связывается ли одна или более молекул с одной или более областями пептида.
В частности, одна или более молекул предпочтительно представляют собой пептиды и наиболее предпочтительно представляют собой антитела или фрагменты антител. Скрининг может быть выполнен посредством известных в данной области способов, таких как получение и скрининг библиотеки фагового дисплея.
Более того, настоящее изобретение предоставляет способ скрининга антитела или фрагмента антитела, способного к связыванию с той же областью IL-10, что и α-рецептор IL-10 (IL-10Rα), включающий:
(a) приведение одного или более антител или фрагментов антител в контакт с IL-10;
(b) оценку способности антитела или фрагмента антитела ингибировать взаимодействие между IL-10 и α-рецептором IL-10 (IL-10Rα);
(с) идентификацию антитела или фрагмента антитела, которые способны связываться с той же областью IL-10, что и α-рецептор IL-10 (IL-10Rα),
где антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область, содержащую CDR1 и CDR2 легкой цепи BT-063, и/или вариабельную область, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи BT-063, необязательно с аминокислотными заменами в последовательности CDR, при условии, что:
(i) CDR1 легкой цепи содержит: Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37,
(i) CDR2 легкой цепи содержит: Lys55,
(iii) CDR2 тяжелой цепи содержит: Phe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32,
(iv) CDR2 тяжелой цепи содержит: Trp52, Arg53, Gly54, Ser56,
(v) CDR3 тяжелой цепи содержит: Tyr100, Gly101, Tyr103.
В этом аспекте работа авторов настоящего изобретения предоставляет подробную информацию, согласно которой молекулы, вероятно, обладают способностью связываться с IL-10, и, соответственно, возможен способ скрининга с использованием конкретной представляющей интерес молекулы. Представляющая интерес молекула может быть получена посредством направленного мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельные области антитела BT-063.
Теперь изобретение будет описано далее в отношении следующих конкретных вариантов осуществления.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1 - Характеристика антитела B-N10 мыши против IL-10
1.1. Выделение ДНК, кодирующей вариабельные домены антитела B-N10
7
Для идентификации вариабельных последовательностей B-N10 мыши использовали клеточные массы. Образцы (3×B-N10, пассаж 3,1×10 клеток) хранили при -80°C до выделения мРНК из клеток, и после синтеза кДНК вариабельные последовательности B-N10 амплифицировали посредством ПЦР и затем клонировали.
Секвенировали в общем 14 клонов (SEQ Laboratories, Gottingen) и анализировали вариабельные области легкой цепи и вариабельные области тяжелой цепи. Однозначно определяли вариабельные последовательности B-N10. Отклонения присутствовали только в N-концевых областях праймеров (таблица 1). В случае вариабельной области тяжелой цепи вариант последовательности QVQLKQ (SEQ ID NO:59) присутствовал в области праймеров девять раз, и другие варианты присутствовали только один или два раза. Данный вариант выбирали для субклонирования. В случае вариабельной области легкой цепи в равных пропорциях присутствовали два варианта. После сравнения последовательностей с последовательностями зародышевой линии мыши значительную гомологию с идентифицированной последовательностью VL проявляла последовательность cr1 только с 3 мутациями. Это означает, что последовательность DVLMTQ (SEQ ID NO:60) представляет собой наиболее вероятную правильную последовательность. Последовательность DIVMTQ (SEQ ID NO:61) представляет собой типичную последовательность другого класса последовательностей зародышевой линии, и поэтому ее исключали.
<b>Таблица 1</b><b>Встречаемость секвенированных вариантов N-концевой последовательности вариабельной области легкой и тяжелой цепи B-N10</b>Выбранные последовательности выделены жирным шрифтом.
<b>Последовательность</b>
<b>Число раз</b>
Вариабельная область легкой цепи
DIVMTQ (SEQ ID No:61)
5
<b>DVLMTQ</b> (SEQ ID No:60)
<b>5</b>
DVLMTR (SEQ ID No:62)
1
DIVITQ (SEQ ID No:63)
1
DIVLTQ (SEQ ID No:64)
2
Вариабельная область тяжелой цепи
<b>QVQLKQ </b>(SEQ ID No:59)
<b>9</b>
QVQLKE (SEQ ID No:65)
2
EVQLQQ (SEQ ID No:66)
1
QVQLNQ (SEQ ID No:67)
1
QVQLTQ (SEQ ID No:68)
1
Белковые последовательности вариабельной области легкой цепи VL и вариабельной области тяжелой цепи VH представлены на фиг.1A и 1B, соответственно. Подчеркнуты гипервариабельные определяющие комплементарность области (CDR). Соответствующие последовательности ДНК представлены на фиг.2A и 2B, соответственно.
Пример 2 - Получение химерного антитела B-N10
Идентифицированные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела примера 1 клонировали в векторную систему для экспрессии рекомбинантных антител. Первой стадией являлось клонирование последовательностей в лидерную последовательность BS; с Ν-конца подавали секреторный сигнал и с C-конца добавляли последовательность донорного сайта сплайсинга. Второй стадией являлось клонирование данных последовательностей в экспрессирующие векторы, содержащие константные области каппа-цепи человека и константные области гамма-1-цепи человека, соответственно. Получали вектор для легкой цепи и вектор для тяжелой цепи и затем транзиторно котрансфицировали в клетки COS-7 осаждением фосфатом кальция или липофекцией. Супернатант культуры клеток собирали через 2 дня. После экспрессии химерного B-N10 в клетках COS-7 и определения титра антител в супернатанте (сэндвич-вариант ELISA), тестировали их связывающую способность на интерлейкине-10 человека (R&D Systems, кат. № 217-IL/CF, лот ET114021, хранящийся при -20°C) с применением ELISA.
Для сэндвич-варианта ELISA антитело мыши против каппа-цепи человека (Becton Dickinson) связывали с поверхностью планшета в качестве фиксирующего антитела, затем инкубировали с супернатантом культуры клеток и определяли встречаемость химерного антитела с применением POD-конъюгированного антитела кролика против IgG человека (H+L) (Dianova). В качестве положительного контроля использовали химерное контрольное антитело в определенных концентрациях (0,125-12 мкг/мл).
Для ELISA с фиксированным антигеном IL-10 человека связывали с поверхностью планшета в концентрации 0,5 и 5 мкг/мл. После инкубации с супернатантом культуры клеток (неразведенным и разведенным 1:5) определяли связывание химерного B-N10 с POD-конъюгированным антителом кролика против IgG человека (H+L) (Dianova). В качестве положительного контроля использовали B-N10 мыши. Антитело использовали в концентрациях 0,5 и 5 мкг/мл и определяли связывание с POD-конъюгированным антителом кролика против IgG/IgM мыши (Dako).
Результаты ELISA обсуждены в примере 3.
ПРИМЕР 3 - Гуманизация антител против IL-10
Исходные попытки снижения иммуногенности антител грызунов у людей включали получение химерных антител заменой константных доменов антитела грызунов доменами человека. Поскольку каркасные области грызунов в вариабельных доменах все равно могут индуцировать иммунный ответ, разработали усовершенствованный способ ремоделирования CDR, подразумевающий перенос антигенсвязывающих последовательностей (определяющих комплементарность областей, CDR) на полностью человеческие каркасы антитела (гуманизация). Как правило, для повышения возможности сохранения исходной антиген-специфичности и аффинности при гуманизации выбирают акцепторные каркасы человека, наиболее напоминающие донорное антитело мыши. Для улучшения процесса можно применять или сочетать различные подходы с использованием последовательностей зародышевой линии антител человека, консенсусных последовательностей экспрессируемых антител, анализа структур петель CDR и рентгеновских структур комплексов антитело/антиген. Как правило, таким образом, получали несколько вариантов гуманизированных антител и затем анализировали их биологические эффекты, которые могут отличаться у разных антител и у исходного антитела. В конечном итоге, в соответствии с желаемой функцией антитела можно выбирать подходящую константную область человека.
3.1 Сравнение вариабельных последовательностей B-N10 мыши и последовательностей человека, и дизайн набора гуманизированных последовательностей VL (hVL) и VH (hVH)
Выбирали антитело мыши против IL-10 B-N10 (Llorente et al., Eur. Cytokine Netw. 1993 Nov-Dec; 4(6): 421-7; и Llorente et al, Arthritis Rheum, 2000 Aug; 43(8): 1790-80). Способ получения гуманизированных антител основан на способе CDR-трансплантации, где определяющие комплементарность области (CDR) объединяют с акцепторными областями человека.
Выбор акцепторных каркасов человека основан на комбинированном анализе трех наборов данных:
1. гомология последовательностей мыши с последовательностями зародышевой линии человека для минимизации риска соматических мутаций;
2. сравнение последовательностей мыши с консенсусными последовательностями человека для идентификации необычных аминокислотных остатков и
3. идентификация канонических классов структур последовательностей CDR для получения информации о важных структурных аминокислотных остатках каркаса.
Вариабельные области легкой цепи B-N10 мыши демонстрируют наибольшую гомологию с вариабельным сегментом 2-30*01 зародышевой линии человека (A17 (SEQ ID NO:14)) и соединительным сегментом JK1 (SEQ ID NO:15). Консенсусной последовательностью человека с наибольшей гомологией с B-N10 является HuKII. Определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области легкой цепи в случае L1 можно относить к классу 4, и в случае L2 и L3 - к классу 1. Идентифицировали критические аминокислотные остатки.
При сравнении последовательностей генов CDR мыши и VL зародышевой линии человека с канонической структурой класса 4-1-1 выявляли наибольшую гомологию с 2-30*01 (наименьшее количество несовпадающих аминокислот).
Вариабельные области тяжелой цепи B-N10 мыши демонстрируют наибольшую гомологию с вариабельным сегментом VH3-33 зародышевой линии человека и с соединительным сегментом JH4 (SEQ ID NO:17). Консенсусной последовательностью человека с наибольшей гомологией с B-N10 является HuHIII. Определяющие комплементарность области (CDR) вариабельной области тяжелой цепи в случае H1 и H2 можно отнести к классу 1. Идентифицировали критические аминокислотные остатки. При сравнении последовательностей генов CDR мыши и VH зародышевой линии человека с канонической структурой класса 1-1 выявляли наибольшую гомологию с 3-66*04 (SEQ ID NO:16) (наименьшее количество несовпадающих аминокислот). Таким образом, также принимали во внимание последовательность зародышевой линии VH3-66.
Все полученные данные учитывали при дизайне набора различных вариабельных последовательностей гуманизированной вариабельной области легкой цепи (12 вариантов) и гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи (29 вариантов).
3.2 Конструирование небольшой библиотеки и выбор гуманизированных hIL-10-связывающих фрагментов антител
Для того, чтобы получить библиотеку потенциально связывающих hIL-10 фрагментов антител, для обеспечения оптимального антитела, связывающего IL-10 человека, с учетом использования кодонов в эукариотических клетках получали последовательности кДНК, кодирующие 12 фрагментов hVL и 29 фрагментов hVH, как показано на фиг.3.
Затем полученные кДНК клонировали в клонирующие векторы и секвенировали в SEQ Laboratories (Gottingen, Germany). Библиотеку конструировали таким образом, чтобы каждая из 12 кДНК, кодирующих фрагменты hVL, комбинировалась с 29 кДНК, кодирующими фрагменты hVH, с получением 348 потенциально экспрессируемых фрагментов антител.
После бактериальной экспрессии и двух раундов селекции с IL-10 человека (R&D Systems, кат. № 217-IL/CF), фрагменты антител анализировали ELISA на предмет связывания с hIL-10 (также, как для селекции). Кратко, планшеты Maxisorb (Nunc, Germany) покрывали 1 мкг/мл hIL-10 в PBS в течение ночи при 4°C. После блокирования и промывания планшетов, добавляли супернатанты продуцирующих фрагменты антитела бактерий. Для определения связавшихся фрагментов гуманизированного антитела применяли POD-конъюгированное вторичное антитело.
Кодирующие последовательности с хорошими связывающими свойствами анализировали и перечисляли встречаемость идентифицированных hVL и hVH фрагментов (таблица 2).
<b>Таблица 2</b><b>Встречаемость фрагментов VL и VH, присутствующих во фрагментах антител, связывающихся с hIL-10</b>
<b>Встречаемость вариантов вариабельной области тяжелой цепи</b>
<b>Встречаемость вариантов вариабельной области легкой цепи</b>
hVH вариант
Встречаемость
hVL вариант
Встречаемость
<b>hVHl</b>
<b>1</b>
hVLl
2
hVH5
1
hVL2
1
hVH7
2
hVL3
1
<b>hVH9</b>
<b>2</b>
hVL5
1
hVH12
1
hVL6
3
<b>hVH13</b>
<b>2</b>
<b>hVL7</b>
<b>4</b>
hVH14
1
<b>hVL8</b>
<b>18</b>
(hVH16)
4
(hVL9)
4
<b>hVH18</b>
<b>4</b>
hVL10
1
<b>hVH20</b>
<b>4</b>
hVLll
1
hVH21
1
hVL12
2
hVH23
1
<b>hVH26</b>
<b>9</b>
hVH27
2
<b>hVH28</b>
<b>3</b>
hVH29
1
Последовательности, отмеченные жирным шрифтом, выбирали для субклонирования в соответствующих эукариотических экспрессирующих векторах для анализа связывающих свойств в отношении целого антитела. Последовательности, указанные в скобках, выбирали для субклонирования в экспрессирующих векторах, но в результате получали только дефектные конструкции.
3.3. Получение экспрессирующих векторов для выбранных вариантов легкой и тяжелой цепи гуманизированного BT-063
На основе статистических данных, определенных скрининговым подходом, выбирали набор вариантов гуманизированной VL и гуманизированной VH BT-063 для клонирования в векторную систему. На первой стадии кДНК, кодирующую варианты гуманизированных VL и VH, переносили в соответствующий вектор для слияния последовательности, кодирующей 5'-секреторный сигнал, и последовательности донорного 3'-сайта сплайсинга с клонированной кДНК. Данные конструкции ДНК на второй и конечной стадии субклонирования переносили в экспрессирующие векторы, кодирующие константные домены каппа-цепи человека и константные домены гамма-1-цепи человека, соответственно. Плазмиды экспрессирующих векторов, содержащих независимо полученные hVL и hVH, получали с использованием не содержащего эндотоксин набора Qiagen Midi-prep (Qiagen, Germany).
3.4. Транзиторная экспрессия выбранных вариантов гуманизированного BT-063 в клетках COS-7 и сравнение связывания антител с hIL-10
Для транзиторной экспрессии вариантов гуманизированного антитела в клетках COS-7 каждый из выбранных вариантов гуманизированных VL (hVL7 и hVL8) комбинировали с каждым из выбранных вариантов гуманизированных VH (hVH1, hVH9, hVH13, hVH18, hVH20, hVH26, hVH28), с получением 14 различных гуманизированных антител.
Кратко, экспрессирующие векторы, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь транзиторно котрансфицировали в клетки COS-7 осаждением фосфатом кальция в DMEM, содержащей 10% FCS, в 24-луночном формате. После трансфекции среду заменяли не содержащей сыворотку средой CHO-S-SFM II (Invitrogen, Germany) и собирали супернатанты клеток COS-7 через 2-3 дня после трансфекции. Титр гуманизированных антител, секретируемых в супернатанты трансфицированных клеток COS-7, анализировали сэндвич-вариантом ELISA. На основе определенных концентраций антитела супернатанты всех образцов использовали для анализа связывания с IL-10 человека в ELISA с фиксированным антигеном, при этом планшеты Maxisorb (Nunc, Germany) покрывали 2 мкг/мл hIL-10 в PBS.
Как показано на фиг.4, все проанализированные варианты связываются с hIL-10, однако, с различными связывающими свойствами. Значимо наибольшие сигналы в ELISA с фиксированным антигеном получали с вариантами BT-063 hVH20/hVL7, hVH26/hVL7 и hVH20/hVL8, демонстрирующими интенсивность сигнала, сравнимую с полученной для химерного антитела B-N10. Для данных трех антител варианты интенсивности сигнала (самый сильный сигнал для hVH20/hVL8 и более низкие сигналы для hVH20/hVL7 и hVH26/hVL7) могут быть вызваны отличающимися концентрациями антител в результате количественного сэндвич-варианта ELISA (см. выше). Все другие исследованные варианты приводили в результате к более слабым по сравнению с химерным антителом B-N10 сигналам.
3.5. Получение и аффинная очистка химерного и гуманизированного вариантов антител
Выбранные варианты гуманизированного BT-063 (hVH20/hVL7, hVH20/hVL8, hVH26/hVL7) и химерное cB-N10 (описанное в примере 2) получали в клетках COS-7.
Транзиторную экспрессию осуществляли, как описано в разделе 3.4., при условии, что использовали 10 см планшеты для культивирования. Не содержащие сыворотку супернатанты приблизительно из 0,5 л каждого варианта собирали через 5 дней после трансфекции.
Очистку антител осуществляли аффинной хроматографией с белком A из не содержащих сыворотку супернатантов. Супернатанты нагружали в присутствие 2M NaCl. Антитела элюировали 0,1M цитратным буфером с pH 4,0 и фракционировали в пробирки, содержащие 2M фосфатный буфер, pH 7,2. Замену буфера PBS, а также концентрирование отдельных образцов антител осуществляли центрифугированием с применением мембран с пределом 30 кДа. Качество очищенных материалов проверяли ELISA с фиксированным антигеном, электрофорезом в ПААГ в присутствии SDS в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях и измерениями УФ при 260 нм и 280 нм.
Связывание очищенных химерных и гуманизированных вариантов B-N10 с hIL-10 тестировали ELISA по описанному выше в примере 2 способу. Связывали hIL10, и измеряли связывание антител для вариантов cB-N10, BT-063-1 (hVH20/hVL7), BT-063-2 (hVH20/hVL8) и BT-063-3 (hVH26/hVL7). Результаты представлены на фиг.5.
Интенсивность сигналов была сравнима для химерного B-N10 и варианта hVH20/hVL7, в то время как интенсивность сигналов вариантов hVH20/hVL8 и hVH26/hVL7 была немного меньше.
3.6. Определение аффинности IL-10 человека с использованием Biacore
.
Для измерения скорости ассоциации и диссоциации для связывания различных антител (мыши, химерного, 3 гуманизированных варианта) с hIL-10 применяли анализ поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIACORE 2000 (Biacore AB, Uppsala, Sweden). hIL-10 иммобилизировали на сенсорном чипе CM-5 в соответствии с инструкциями производителя. hIL-10 иммобилизировали добавлением 50 мкл аликвоты 20 мкг/мл при скорости потока 5 мкл/минута, приводящей к плотности иммобилизации 320 RU. Поверхность с иммобилизованным hIL-10 восстанавливали в двухстадийном цикле с использованием 0,1M карбонатного буфера, pH 9,2, и 0,01M HCl/1M NaCl при скорости потоков 50 мкл/минута в течение одной минуты каждый. Каждый образец антитела анализировали, по меньшей мере, 4 раза в диапазонах концентрации антитела 20-0,15 мкг/млВычисления по сенсограммам осуществляли с применением программного обеспечения BIA evaluation version 3 (1999).
В таблице 3 приведены результаты всех измерений с использованием Biacore. Связывание всех вариантов с hIL-10 было сравнимым. Однако определялись небольшие различия. В результате моноклональное антитело мыши B-N10, химерное антитело cB-N10, а также гуманизированный вариант BT-063-1 (hVH20/hVL7) связывались со сравнимой аффинностью, в то время как два других гуманизированных варианта BT-063-2 (hVH20/hVL8) и BT-063-3 (hVH26/hVL7) демонстрировали сниженные аффинности (приблизительно в 3 раза по сравнению с B-N10 мыши). Также определялись небольшие различия в скоростях ассоциации и диссоциации.
<b>Таблица 3</b><b>Результаты измерений с применением Biacore</b>n=число отдельных измерений; ka=скорость ассоциации; kd=скорость диссоциации; KD=константа диссоциации
<b>Вариант антитела</b>
<b>n</b>
<b>ka [1/М с]</b>
<b>kd [1/с]</b>
<b>KD [M]±SD</b>
B-N10
6
4,43 E6
2,05 E-3
1,07 E-9±3,11 E-10
cB-N10
4
6,23 E5
8,48 E-4
1,37 E-9±2,42 E-10
BT-063-1
6
1,21 E6
1,03 E-3
1,22 E-9±1,44 E-10
BT-063-2
4
1,21 E6
1,64 E-3
2,81 E-9±1,03 E-9
BT-063-3
5
1,07 E6
2,66 E-3
2,91 E-9±8,07 E-10
IL-10 макака-крабоеда
Аффинность варианта 3 BT-63 (hVH26/hVL7) в отношении IL-10 макака-крабоеда анализировали в дополнительных экспериментах по поверхностному плазмонному резонансу с использованием Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala, Sweden).
BT-063 разводили в 10 мМ ацетате с pH 5,5 до 5 мкг/мл и иммобилизировали с применением присоединения через аминогруппы, с получением конечного уровня приблизительно 1000 RU. Восстановление поверхности сенсорного чипа осуществляли инъекцией 10 мМ глицин-HCl, pH 1,8, в течение 30 с. Образцы инъецировали в различных концентрациях в проточную кювету, а также в референсную кювету. Сигналы, полученные от референсной кюветы, вычитали из сигналов, полученных из детекторной проточной кюветы, и полученные профили связывания оценивали с применением 1:1 модели связывания Ленгмюра. Получали профили связывания в зависимости от концентрации и для IL-10 макака-крабоеда вычисляли среднюю KD 194 пМ. Анализировали rhIL-10 в качестве положительного контроля, получая KD 4,6 нМ. Результаты представлены в таблице 4.
<b>Таблица 4</b><b>Результаты измерений BT-063 с использованием</b><b>Biacore</b>rhIL-10: рекомбинантный IL-10 человека; rCIL-10: рекомбинантный IL-10 макака-крабоеда; ka=скорость ассоциации; kd=скорость диссоциации; KD=константа диссоциации
<b>Аналит</b>
<b>№ анализа</b>
<b>ka [1/М с]</b>
<b>kd [1/с]</b>
<b>KD [M]</b>
rhIL-10
1
6,0 E5
0,3 E-2
4,6 E-9
rCIL-10
1
6,2 E7
1,2 E-2
0,196 E-9
rCIL-10
2
8,6 E7
1,7 E-2
0,195 E-9
rCIL-10
3
9,7 E7
1,8 E-2
0,191 E-9
in vitro
ПРИМЕР 4 - Активность антитела против IL-10
Для подтверждения активности BT-063 исследовали блокирование высвобождения IL-6 в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC). Интерлейкин-6 (IL-6) высвобождался из PBMC после стимуляции липополисахаридом (LPS). Физиологическая активность интерлейкина-10 (IL-10) представляет собой ингибирование секреции цитокинов, например, IL-6. Таким образом, добавление IL-10 к стимулированным LPS клеткам ингибирует секрецию IL-6, приводя к значимому снижению IL-6, присутствующего в среде культуры клеток. Однако в результате добавления BT-063 в культуру клеток IL-10 становится связанным, и, таким образом, он не способен связываться с рецептором на поверхности клетки. Это компенсирует ингибирующий эффект IL-10 и восстанавливает секрецию IL-6, что приводит к присутствию IL-6 в среде.
6
PBMC выделяли из крови человека посредством градиента фиколла. Выделенные клетки высевали при 1×10 клеток/мл и стимулировали LPS для секреции IL-6, которую ингибировали добавлением IL-10. Ингибирующий эффект IL-10 нейтрализовали добавлением BT-063, восстанавливая, таким образом, секрецию IL-6. В зависимости от цели (референсные или низко-, высококачественные контрольные образцы) добавления BT-063 использовали различные титровальные концентрации BT-063, с получением зависящей от концентрации секреции IL-6, которую определяли в супернатанте культуры клеток.
<b>Таблица 5</b><b>Средние значения уровней IL-6 при двукратном определении и восстановлении IL-6 соответственно в зависимости от титрования референсного стандарта</b>
<b>S1: 40 мкг/мл</b>
<b>Концентрация BT-063 [мкг/мл]</b>
<b>Среднее значение уровня IL-6 [пг/мл]</b>
<b>Восстановление секреции IL-6 [%]</b>
40,000
<b>42546</b>
<b>72,8%</b>
20,000
<b>43134</b>
<b>73,8%</b>
13,333
<b>37910</b>
<b>64,9%</b>
8,889
<b>31107</b>
<b>53,2%</b>
5,926
<b>25602</b>
<b>43,8%</b>
3,951
<b>20793</b>
<b>35,6%</b>
1,975
<b>14200</b>
<b>24,3%</b>
0,988
<b>10227</b>
<b>17,5%</b>
Как показано в таблице 5, количество секретируемого IL-6 прямо коррелирует с концентрацией BT-063. Чем выше концентрация BT-063, тем больше IL-6 секретируется из PBMC и, таким образом, присутствует в супернатанте. Инкубация клеток с 40 мкг/мл BT-063 приводила к восстановлению секреции IL-6 до приблизительно 73%, в то время как для 0,988 мкг/мл BT-063 (последняя стадия титрования) в среде определяли только 17,5% от уровня IL-6 по сравнению с положительным контролем (стимулированные PBMC без инкубации с IL-10).
ПРИМЕР 5 - Связывание антитела с PBMC человека
Готовили свежие мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека, полученные у различных здоровых добровольцев, с использованием центрифугирования в градиенте концентрации. С этой целью образцы крови разводили 1:1 буферным раствором Хенкса, и 20 мл полученного раствора медленно покрывали 20 мл фиколла в стерильной 50 мл пробирке. Пробирки центрифугировали при комнатной температуре в течение 25 минут при 1200×g без перерыва. После центрифугирования непрозрачную поверхность раздела или лейкоцитарную пленку переносили в 50 мл пробирку, промывали PBS и центрифугировали еще раз в течение 10 минут при 260g. Осажденные эритроциты лизировали с использованием BD Pharm Lyse™ по протоколу производителя. Выделенные PBMC ресуспендировали в RPMI (10% FCS).
Связывание BT-063 (вариант hVH26/hVL7) на PBMC человека определяли анализом FACS с использованием набора для мечения Zenon (Invitrogen). Антитела метили с использованием набора AlexaFluor488-Zenon против IgG человека в соответствии с инструкцией производителя. Метили BT-063 реагентами из набора посредством связывания флуоресцентно меченых Fab-фрагментов без воздействия на его свойства распознавания антигена. В качестве положительного контроля использовали IgG1 человека против антитела CD4 (BT061, Biotest), меченного параллельно набором Zenon.
Флуоресцирующие Fab-фрагменты инкубировали в избытке с антителами и связывали с Fc частью mAb. Оставшиеся свободными Fab-фрагменты блокировали во второй реакции с нерелевантными IgG для ингибирования ложно-положительного связывания. Затем смесь, включая флуоресцентно меченое BT-063 или BT061, использовали в экспериментах с окрашиванием. В качестве отрицательного контроля реакцию выполняли без антитела.
1 мкг первичного антитела (BT-063, α-CD4 или PBS в качестве отрицательного контроля) метили 5 мкл реагента Zenon-AF488 (AF-488 метили Fab фрагменты против IgG человека) в течение 5 минут в общем объеме 6 мкл. Затем инкубировали с 5 мкл реагента для блокировки (нерелевантный человеческий IgG) в течение 20 минут. Всю смесь разводили в PBS для достижения подходящей концентрации антитела и сразу же выполняли окрашивание клеток.
Результаты примера показаны на фиг.6. Меченое BT-063 использовали в концентрации 25, 2,5, 0,25 и 0,025 мкг/мл без проявления связывания на человеческой PBMC. С антителом против CD4 определяли ожидаемое связывание на человеческой PBMC, тогда как BT-063 не демонстрировал связывания на лимфоцитах или моноцитах вплоть до концентрации 25 мкг/мл. Благодаря чему можно сделать вывод, что BT-063 не проявляет обнаруживаемой перекрестной реакционной способности в отношении мононуклеарных клеток периферической крови человеческого происхождения.
Результаты демонстрируют, что антитело BT-063 не связывается с PBMC, и таким образом, BT-063 связывается только с растворимым IL-10.
ПРИМЕР 6 - Рентгеноструктурная кристаллография
Кристаллизация Fab-фрагмента BT-063 в комплексе с IL-10 человека
6.1.
E. coli.
Получали несколько конструкций IL-10 по опубликованным данным о структуре (Zdanov et al., Structure, Vol.3, 1995, pp.591) и клонировали стандартными способами в векторы для гетерологичной экспрессии в Тестирование экспрессии клонированных конструкций осуществляли стандартными способами, и оно показало высокую гиперэкспрессию для IL-10, на что указывает повышение в полосе в ожидаемом диапазоне приблизительно 18 кДа.
Белок IL-10 экспрессировали в оптимизированных условиях, с получением количества, пригодного для последующей очистки белка. После рефолдинга белок очищали аффинной хроматографией с иммобилизацией, эксклюзионной хроматографией и ионообменной хроматографией, с получением белка с 95% гомогенностью, оцененной с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии SDS, с последующим окрашиванием Кумаси. Выход очищенного белка составлял приблизительно 0,3 мг на литр экспрессирующей культуры, что являлось достаточным для экспериментов с кристаллизацией.
Fab-фрагмент BT-063 (вариант hVH26/hVL7) отщепляли от интактного антитела с использованием протеазы папаин и очищали с использованием белка A. Затем Fab-фрагмент дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией.
Комплекс IL-10:Fab-фрагмент BT-063 получали смешиванием очищенных белков с молярным избытком IL-10 и дополнительной очисткой эксклюзионной хроматографией. Удерживаемый объем согласовывался с размером комплекса. Затем белок концентрировали до подходящих для кристаллизации концентраций.
Кристаллы комплекса IL-10:Fab-фрагмент BT-063 получали способом совместной кристаллизации.
6.2. Сбор и обработка данных
Кристаллы быстро замораживали и измеряли при температуре 100°K. Данные о дифракции рентгеновских лучей получали из сокристаллов IL-10 с Fab-фрагментом BT-063 в SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Switzerland), используя криогенные условия.
Кристаллы принадлежали к пространственной группе P6 с двумя комплексами в асимметричном блоке. Данные обрабатывали с применением программного обеспечения XDS и XSCALE. Обобщенные статистические данные приведены в таблице 6.
<b>Таблица 6</b><b>Сбор и обработка статистических данных</b>
<b>Комплекс</b>
<b>IL-10:BT-063</b>
Источник рентгеновского излучения
PX (SLS<sup>1</sup>)
Длина волны [Å]
1,0007
Детектор
PILATUS
Температура [K]
100
Пространственная группа
P6
Ячейка: a; b; c [Å]α; β; γ [°]
219,00; 219,00; 64,3690,0; 90,0; 120,0
Разрешение [Å]<sup>2</sup>
3,48 (3,72-3,48)
Уникальные отражения<sup>2</sup>
21124 (3817)
Кратность<sup>2</sup>
3,0 (2,9)
Завершенность [%]<sup>2</sup>
91,2 (92,3)
R<sub>sym</sub> [%]<sup>2,3</sup>
10,5 (44,0)
R<sub>meas</sub> [%]<sup>2,4</sup>
14,8 (62,2)
Ι/σΙ<sup>2</sup>
6,1(1,7)
Среднее(I)/сигма 2,5
7,0(1,7)
<sup>1</sup> SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villigen, Switzerland)
<sup>2</sup> Числа в скобках соответствуют наибольшему элементу разрешения
<sup>3</sup><img file="00000002.tif" he="25" wi="33" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>, где </b><img file="00000003.tif" he="12" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>, </b>где <i>I</i><sub>h,i</sub> представляет собой значение интенсивности для <i>i</i>-го измерения<i> h</i>
<sup>4</sup><img file="00000004.tif" he="28" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>, где </b><img file="00000005.tif" he="12" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" /><b>, </b>где <i>I</i><sub>h,i</sub> представляет собой значение интенсивности для <i>i</i>-го измерения<i> h</i><sup>5</sup> Вычисляли из независимых отражений
Моделирование
6.3.  и уточнение структуры
Решение фазовой проблемы, необходимое для определения и анализа структуры, получали молекулярной заменой. Опубликованные модели IL-10 и Fab-фрагмента использовали в качестве поисковой модели. Последующее построение и уточнение модели осуществляли стандартными способами с применением пакетов программ CCP4 и COOT. Для вычисления свободного R-фактора, меры достоверности правильности конечной модели, 4,2% измеряемых отражений исключали при уточнении структуры (таблица 7).
Определение параметров нанотел осуществляли с применением программного обеспечения CHEMSKETCH. LIBCHECK (CCP4) использовали для получения соответствующих библиотечных файлов.
.
)
Водную модель строили с применением алгоритма "Find waters…" программного обеспечения COOT, помещая молекулы воды в пики Fo-Fc карты, смоделированной при 3,0 σ, с последующим уточнением с помощью REFMAC5 и проверкой всей воды инструментом валидации COOT. Критериями для включения в список подозрительных молекул воды являлись: B-фактор выше 80, 2Fo-Fc карта менее чем 1,2 σ, расстояние до ближайшего контакта менее чем 2,3 Åили более 3,5 Å Подозрительные молекулы воды и молекулы воды в активном центре (расстояние до ингибитора менее 10 Åпроверяли вручную. Удерживание боковых цепей, находящихся в отрицательных пиках на Fo-Fc карте (смоделированной при -3,0 σ), устанавливали на ноль и затем на 0,5, если после следующего цикла уточнения появлялся положительный пик.
На диаграмме Рамачандрана конечной модели показано 80,8% всех остатков в наиболее предпочтительной области, 17,9% в дополнительно разрешенной области, 0,7% остатков в условно разрешенной области. Остатки Val86(A), His14(B), Asp86(B), Ser131(C), Val56(D) и Val56(F) обнаруживали в неразрешенной области диаграммы Рамачандрана (таблица 7). Их подтверждали картой электронной плотности или не включали в моделирование в другой восприимчивой конформации. Статистика конечной структуры и способа уточнения приведены в таблице 7.
<b>Таблица 7</b><b>Статистика уточнения структуры</b><sup>1</sup>
<b>Комплекс</b>
<b>IL-10:BT-063</b>
Разрешение [Å]
20,0-3,48
Число отражений (рабочих/тестовых)
20199/889
R<sub>cryst</sub> [%]
29,7
R<sub>free</sub> <sup>2</sup> [%]
35,5
Общее количество атомов:БелокВодаЛиганд
8870-
Отклонение от идеальной геометрии:<sup>3</sup>Длины связей [Å]Углы связей [°]Связанные B<sup>4</sup> [Å<sup>2</sup>]
0,0070,930,0
Диаграмма Рамачандрана:<sup>5</sup>Наиболее благоприятные областиДополнительные разрешенные областиУсловно разрешенные областиНеразрешенные области
80,817,90,70,6
<sup>1</sup> Значения, как указано в REFMAC5, без предела по сигме
<sup>2</sup> Набор тестов включает 4,2% измеряемых отражений
<sup>3</sup> Среднее квадратичное отклонение от геометрических целевых значений
<sup>4</sup> Вычисляли с применением программного обеспечения MOLEMAN
<sup>5</sup> Вычисляли с применением программного обеспечения PROCHECK
Рентгеноструктурный
6.4.  анализ
Структуру комплекса IL-10 человека, связанного с Fab-фрагментом антитела BT-063, анализировали при разрешении 3,48 Å и выявляли подробный вид связывания Fab-фрагмента антитела.
Полученная электронная плотность свидетельствует об однозначном способе связывания Fab-фрагмента, включая ориентацию и конформацию Fab-фрагмента. Кристалл пространственной группы P6 содержит два комплекса в ассиметричном блоке.
Структура IL-10 в комплексе с Fab-фрагментом представлена на фиг.7. Два Fab-фрагмента связываются своими петлями CDR с каждым гомодимером IL-10.
:
Следующие остатки IL-10 (молекулы A и B) можно найти вблизи от петель CDR на максимальном расстоянии 3,9 ÅArg27, Lys34, Gln38, Met39, Asp41, Gln42, Asp44, Leu46, Glu50, Leu53, Glu142, Asp144, Ile145, Asn148, Tyr149, Glu151 и Thr155.
:
Следующие остатки петель CDR можно найти вблизи от IL-10 на максимальном расстоянии 3,9 ÅPhe27, Ser28, Ala30, Thr31, Tyr32, Trp52, Arg53, Gly54, Ser56, Asn73, Ser74, Tyr100, Gly101, Tyr103 (молекулы C и E), Ser32, Asn33, Asn35, Tyr37, Lys55 (молекулы D и F).
Участок связывания BT-063 совпадает с участком связывания рецептора IL-10 на поверхности IL-10, как показано при совмещении структуры комплекса IL-10:BT-063 с опубликованной структурой комплекса IL-10:рецептор IL-10R1 (фиг.8).
Аминокислотные остатки BT-063 в участке контакта с IL-10 человека, идентифицированные рентгеноструктурным анализом, подчеркнуты на представленной ниже линейной аминокислотной последовательности вариабельных областей антитела BT-063.
BT-063 VL:
BT-063 VH:
Подчеркнуты области CDR (Honegger и Pliickthun (2001) J. Mol. Biol., 309, 657-670) (CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи представлены SEQ ID NO:71, 72 и 73, соответственно; CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи представлены SEQ ID NO:74, 75 и 76, соответственно). Остатки в участке контакта с IL-10 выделены жирным шрифтом.
В легкой цепи контактные остатки обнаружены в CDR1 и CDR2, но не в CDR3. Рассматриваемые остатки всех трех CDR тяжелой цепи вовлечены в связывание антигена. Два остатка FR3 (Asn73 и Ser74) также участвуют в связывании антигена.
Ser28 и Ala30 в начале CDR1 представляют собой часть последовательности предшественника VH мыши (B-N10) и не присутствуют в выбранном каркасе человека (3-66*04). Оба положения реже участвуют в связывании антигена, и их встраивали в качестве альтернативных аминокислот при гуманизации.
Остатки Asn73 и Ser74 обнаруживают у мышей и часто в последовательностях каркаса антитела человека, но, как правило, они не участвуют в связывании антигена, (www.bioc.uzh.ch/antibody; Honegger и Pluckthun, 2001). Их участие в связывании антигена является неожиданным.
Аминокислотные остатки IL-10, вовлеченные в связывание BT-063, представлены ниже. Также указаны остатки IL-10, вовлеченные в связывание с высокоаффинной цепью рецептора IL-10 (IL-10R1) и низкоаффинной цепью рецептора (IL-10R2). Обе цепи рецептора участвуют в связывании гомодимера IL-10 и необходимы для передачи сигнала. В последовательности A остатки, контактирующие с BT-063, показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. В последовательности B контактные остатки для IL-10R1 показаны жирным шрифтом, контактные остатки для IL-10R2 показаны курсивом и подчеркнуты, и контактные остатки и общие для IL-10R1 и для IL-10R2 выделены жирным шрифтом, курсивом и подчеркнуты (Pletnev et al 2005).
A
Β
Можно видеть, что BT-063 связывается с прерывистым эпитопом IL-10, содержащим остатки спирали A (Arg27, Lys34, Gln38, Met39, Asp41) и N-концевую часть спирали Β (Glu50 и Leu53), включая последовательность соединительной петли (Glu42, Asp44, Leu46) одного мономера IL-10, а также остатки спирали F' (Glu142, Asp144, Ile145, Asn148, Tyr149, Glu151, Thr155) второго мономера IL-10.
Соответственно, можно видеть, что BT-063 блокирует участок связывания высокоаффинной цепи рецептора IL-10R1.
in vivo
ПРИМЕР 7 - Исследование токсичности однократной дозы  на макаке-крабоеде
Исследование токсичности однократной дозы, включая фармакологические параметры безопасности, осуществляли на макаках-крабоедах после однократной внутривенной инъекции BT-063 (вариант hVH26/hVL7). Животных распределяли по четырем группам (плацебо, 1 мг/кг, 7 мг/кг и 50 мг/кг) по 4 животных/пол/группа. BT-063 вводили внутривенно в день 1. Половину животных вскрывали после 5 дней, в то время как остальных животных умерщвляли на день 28.
Низкий уровень дозы 1 мг/кг в данном исследовании соответствует эквивалентной дозе для человека ~300 мкг/кг, приводя к общей дозе для человека 18 мг (масса тела 60 кг). Схожую дозу предшественника антитела BT-063 B-N10 вводили ежедневно в течение 21 дня в небольшом инициированном исследователями испытании (Llorente, 2000). Данное количество антитела демонстрировало фармакологическое действие и клиническую эффективность. Таким образом, выбирали низкий уровень дозы. Высокую дозу выбирали как кратное (50 мкг) начальной дозы. Промежуточная доза представляет собой геометрическое среднее низкой и высокой доз.
В течение исследования не наблюдали токсикологически значимых или существенных изменений физиологических или гистопатологических параметров. Кроме того, изменения параметров клинической химии считали небольшими или токсикологически незначимыми.
ПРИМЕР 8 - Установленное удерживание мишени специфичным к IL-10 антителом BT-063 после внутривенного введения
Для установления нейтрализации IL-10 у здоровых добровольцев после одиночной внутривенной инъекции mAb BT-063 у здоровых добровольцев было установлено удерживание мишени IL-10 BT-063 (вариант hVH26/hVL7) на основании константы диссоциации комплекса BT-063-IL-10 и стандартных параметров для объемов крови человека и допущения, что BT-063 распределяется исключительно внутри кровотока.
8.1
Способ
Программное обеспечение Microsoft-Excel использовали для подсчета и демонстрации зависимого от дозы удерживания мишени IL-10 BT063.
Условия для расчетов:
объем крови (сыворотка): 3,5 л;
средняя концентрация IL-10 в сыворотке здоровых добровольцев: 15 пг/мл;
D
k (константа диассоциации, BT063<->IL-10): 3 нМ (получена из исследований Biacore);
молекулярная масса димера IL-10: 37 000 г/моль;
молекулярная масса BT063: 150 000 г/моль.
С использованием закона действия масс рассчитывали удерживание мишени IL-10 при различных дозах антитела BT063. Для теоретических расчетов свободного и связанного в комплекс IL-10 предположили, что одна молекула антитело против IL-10 связывается с одним димером IL-10. Использовали следующее уравнение равновесия:
Закон действия масс: BT063+IL10<->комплекс BT063/IL-10
Итоговую константу диссоциации определяли по равновесным концентрациям BT063 ([BT063]), IL-10 ([IL-10]) и комплекса BT063-IL-10 ([комплекс]):
<b><i>k</i></b><sub>D</sub>
<b>=</b>
<b>[BT063]*[IL-10]</b>
<b>[комплекс]</b>
0
0
Равновесные концентрации не известны непосредственно, но могут быть рассчитаны, исходя из начальных концентраций [ВТ063] и [IL-10] и равновесной концентрации комплекса ([комплекс]):
[BT063]=[BT063
]-[комплекс]
0
[IL-10]=[IL-10
]-[комплекс]
0
Для расчета удерживания IL-10 BT063 после внутривенной инъекции mAb, принимали следующие условия:
BT063 распределяется равномерно и исключительно в крови непосредственно после инъекции;
молекулы BT063 не покидают объем крови;
IL-10 распределяется исключительно в крови и отсутствуют другие источники IL-10;
молекулы IL-10 или комплексы BT063-IL-10 не покидают кровоток и не выводятся из кровообращения опосредованным Fc-рецептором или другими механизмами;
равновесие достигается быстро.
Эти условия выбирали искусственно, и они не отражают возможную биологическую ситуацию in vivo. Можно предположить, что объем распределения BT063 больше, чем установленный, так как BT063, наиболее вероятно, распределяется дополнительно в экстравазальные компартменты тела, приводя к быстро уменьшающимся концентрациям mAb в кровообращении. Более того, можно предположить, что существуют экстравазальные источники для IL-10, и количество IL-10, представленное в организме, выше, чем установленное.
in vivo
in vivo
В конечном счете, выполненные в данном описании расчеты завышают процент связанного в комплекс IL-10 . Установленное комплексообразование IL-10, таким образом, не будет достигнуто , и для рассчитанных значений существует резерв безопасности.
В качестве основы для вычисления использовали следующие константы:
молекулярная масса (BT063): 150000 г/моль;
молекулярная масса (димер IL-10): 37000 г/моль;
средняя концентрация IL-10 в сыворотке здорового добровольца: 15 пг/мл;
объем сыворотки крови: 3,5 л.
На этом основании можно рассчитать дозозависимый процент IL-10, который связан в комплекс BT063 при равновесных концентрациях. В таблице 8 и на фиг.10 показана дозозависимость блокировки IL-10 BT063 после внутривенной инъекции mAb.
<b>Таблица 8</b><b>Вычисление удерживания IL-10 BT-063 с возрастающей общей дозой BT-063, введенной внутривенно</b><b>(* Дозы, которые должны быть применены в клинических анализах на здоровых добровольцах)</b>
<b>Общая доза BT063 (мкг)</b>
%<b> IL-10, связанного в комплекс BT063</b>
1,75
0,1
5,25
0,3
16
1,0
47
2,9
142
8,3
175*
10,0
425
21,3
750*
32,3
1276
44,7
3827
70,8
3500*
69,0
7500*
82,6
11482
87,9
15000*
90,5
30000*
95,0
34445
95,6
60000*
97,4
100000*
98,5
103336
98,5
310007
99,5
930022
99,8
2790065
99,9
Для теоретической оценки влияния различных концентраций IL-10 или различной аффинности (константа диссоциации) BT-063 в отношении IL-10, соответствующие кривые сравнивали с исходной зависимостью между дозой и ответом, изображенной на фиг.10.
На фиг.11 показано, что процент связанного в комплекс IL-10 не зависит от уровня IL-10 в крови. Даже 1000-кратные изменения уровня IL-10 только незначительно влияют на кривую доза-ответ. Вследствие этого, колебания концентрации IL-10 в процентном выражении не изменяют удерживание IL-10 BT-063.
Несмотря на то, что аффинность BT-063 в отношении IL-10 человека известна из исследований Biacore, другие способы могут привести к несколько различным константам диссоциации для комплекса (Waibler et al., J Allergy Clin Immunol., 2008 Nov; 122(5): 890-2, Epub 2008, Sep 20). Поэтому, анализировали, до какой степени различная аффинность будет изменять дозозависимость удерживания IL-10.
В отличие от этого, для измененных уровней IL-10 различная аффинность BT-063 в отношении IL-10 сдвигает кривые в сторону большего удерживания BT-063 в случае повышенной аффинности (в 10 раз больше) или, наоборот, для более низкой аффинности (фиг.12).
Из этих данных можно сделать вывод, что 175 мкг BT-063 (предполагаемая для использования начальная доза для первого клинического анализа здоровых добровольцах) способна нейтрализовать приблизительно 10% всего присутствующего в крови здорового добровольца IL-10. Вплоть до дозы 10 мг BT-063 существует прямопропорциональная зависимость между дозой BT-063 и процентом связанного в комплекс IL-10. При 10 мг BT-063 приблизительно 85% всего IL-10 будет нейтрализовано.
Вид рассчитанной кривой в целом не зависит от концентрации в крови IL-10, что означает, что на нейтрализующую способность BT-063 (в процентном выражении) различные уровни IL-10 будут влиять только в незначительной степени.
Вследствие этого, можно допустить, что кривая, представленная для здоровых добровольцев, дополнительно может быть использована для больных системной красной волчанкой (SLE), у которых повышен уровень IL-10 в крови. Из этих данных можно сделать вывод, что дозы выше 175 мкг общей дозы BT-063 в организме здоровых добровольцев будут нейтрализовать более 10% цитокина. Выше этой дозы и вплоть до 10 мг общей дозы связывание IL-10 в комплекс mAb будет приводить к прямопропорциональной зависимости вплоть до 85%. При более 10 мг BT-063 кривая проходит при уровнях насыщения. Около 100% нейтрализации достигается при общей дозе 100 мг.
in vivo
ПРИМЕР 8 - Исследование токсичности однократной дозы на здоровых добровольцах
Исследование для контроля безопасности и переносимости BT-063 (вариант hVH26/hVL7) и эффектов введения BT-063 с применением повышающихся доз антитела проводили на здоровых добровольцах. Двадцати трем добровольцам однократно внутривенно вводили BT-063 в 8 группах дозирования. Группы дозирования являлись следующими: 0,175 мг, 0,75 мг, 3,5 мг, 7 мг, 15 мг, 30 мг, 60 мг и 100 мг. На группу приходилось три добровольца, за исключением группы дозы 100 мг, где было два добровольца.
Каждую дозу разбавляли 0,9% хлоридом натрия для инъекцией до общего объема 20 мл. Дозу вводили в виде однократного непрерывного внутривенного вливания в течение 2 часов.
Добровольцев оценивали в течение периода 85 дней после инъекции и забирали кровь в нескольких временных точках в течение данного периода.
Во взятой крови проводили оценку уровня цитокинов IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10 и TNF-α.
Результаты
Не зависящее от дозы временное повышение IL-6 и IL-8 присутствовало в течение 24 часов после вливания, возвращаясь к уровням до введения дозы через 3 дня. Считают, что данный эффект больше связан с самим событием вливания, чем с антителом, поскольку не наблюдали зависимости от дозы, и эффект проявлялся даже после наименьшей дозы.
Неожиданно, учитывая, что IL-10 представляет собой важный регуляторный цитокин, не обнаруживали повышения уровней IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5 и TNF-α, как показано на фиг.13. Отсутствие повышения уровней IL-4, IL-5 IFN-γ, IL-2 также подтверждали отсутствием активации T-хелперных клеток в результате введения BT-063. Кроме того, т.к. температура тела также является свидетельством обширного высвобождения провоспалительных цитокинов, этот параметр также измеряли у подвергнутых лечению добровольцев. Однако не определяли повышение температуры тела после введения.
in vitro
Как показано на фиг.14, введение BT-063 влияло только на концентрацию IL-10 в плазме с определяемым повышением IL-10 в плазме при повышении дозы BT-063. Следует отметить, что в применяемом анализе определяется как свободный IL-10, так и IL-10, связавшийся с BT-063. Существует два возможных объяснения повышения: (1) пролонгированное время полужизни IL-10 при связывании IL-10 с BT-063, предотвращающем интернализацию IL-10, и сопутствующее отсутствие выведения IL-10 из крови (в норме существует быстрый кругооборот IL-10, где время полужизни IL-10 составляет приблизительно 2,3-3,5 часа (Huhn et al., Blood (1996) Jan 15: 87(2): 699-705)); и/или (2) индукция отрицательной обратной связи, где BT-063 блокирует связывание IL-10 с его рецептором, захват IL-10 клетками невозможен, что стимулирует продукцию IL-10 B-клетками. Авторы полагают, что вариант (2) более вероятен, т.к. он подтвержден данными , взятыми из экспериментов с культурой клеток цельной крови с BT-063 и клетками мыши, нокаутированными по IL-10R (Mahnke et al., неопубликованные данные).
Фармакокинетика
Фармакокинетические данные показали, что Cmax, AUC и время полужизни BT-063 находятся в диапазоне ожидаемых теоретических значений. Конечное время полужизни BT-063 составляет от 15 до 30 дней. После введения доз 30 мг или выше BT-063 все еще определяем в плазме после 85 дней.
Не наблюдали антитела человека против человека (HAHA) у здоровых добровольцев, несмотря на то, что ответы HAHA наблюдали с другими нейтрализующими цитокины антителами (например, адалимумабом, гуманизированным антителом против TNF-α).
Несмотря на повышение определяемых количеств IL-10 после введения BT-063, следует отметить, что данное исследование демонстрирует безопасность и переносимость даже больших доз BT-063, и, таким образом, можно сделать вывод, что можно безопасно вводить значительные дозы BT-063 пациентам с SLE для противодействия эффектам избытка IL-10.