Обзор аналитических работ по физикохимической биологии шунгитовой породы

УДК 616.157

ОБЗОР АНАЛИТИЧЕСКИХ РАБОТ ПО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ ШУНГИТОВОЙ ПОРОДЫ

Н.В.СЕРЕГИНА, Т.В. ЧЕСТНОВА, Д.В. ПРОКОПЧЕНКОВ,

В. А. ХРОМУШИН*

Интенсивная деятельность человека на современном этапе развития науки и технологии требует изучения веществ биосферы, находящихся в земных недрах, а также большого числа индивидуальных химических соединений, выделенных из природных источников. Шунгитовая порода (ШП) представляет собой природный композит, богатый высокометаморфизированным органическим веществом и кремнеземом. Вопрос о происхождении ШП до настоящего времени вызывает много дискуссий. Основными являются две гипотезы о генезисе органической массы ШП (ОМШП): биогенная и абиогенная. Биогенная гипотеза считается наиболее ранней и научно обоснованной. Однако не все сторонники ее едины в определении типа исходного органического вещества: большинство из них считают его сапропелевым, другие - гумусовым. В 1996-2000 гг. М.М. Филипповым, А.Е. Ромашкиным и другими авторами предложена современная диапировая модель формирования ШП. Данная модель успешно объясняет расположение практически всех известных месторождений ШП заонежской свиты, как проявление полидиапирового процесса, что нашло подтверждение в [5].

Биологические свойства шунгита связывают со сложным органоминеральным комплексом, то есть единой смесью органических и минеральных веществ и наличием фуллереновых структур. Авторами предлагается классический для химии и фармакологии подход - разделение смеси на индивидуальные вещества, определение их химического строения, изучение их биологических свойств, выделение «действующего начала» и определение механизмов действия на биообъекты. Изучив строение ОМШП и детализировав химический состав экстрактов, определили цель работы - изучение воздействия отдельных компонентов, полученных путем экстракции ОМШП, на бактерии [6].

Определяли длительность обработки бактериальной суспензии экстрактами ОМШП; концентрации экстрактов, при которых проявляется бактерицидный и бактериостатический эффект; изучали взаимосвязи между химсоставом экстрактов и механизмами их действия на бактериальные культуры.

Результаты. Бактерицидное действие на культуры Listeria monocytogenes, Corynebacterium diphteriae tox+, Streptococcus pyogenes оказывают ацетоновый и хлороформный экстракты в концентрациях 1% и 3% с экспозицией 24 часа. 1% ацетоновый экстракт бактериостатически действует на Staphylococcus aureus при экспозиции 24 часа. При действии 1% хлороформного экстракта на Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella enteritidis, при той же экспозиции бактериостатическо-го и бактерицидного эффекта не наблюдалось. Наиболее выраженный бактериостатический и бактерицидный эффект действия ацетонового экстракта обусловлен наличием в своем составе производных фурана (3-ацетамидофурана, 5-нитрофуран-2-

карбоновой кислоты). Фуран содержит в молекуле в качестве гетероатома кислород. Сам фуран не обладает физиологической активностью, но его производные высокоактивны и широко применяются в медицине. Они подавляют рост грамположительных и грамотрицательных бактерий в довольно низких концентрациях. По механизму действия производные фурана относятся к ингибиторам синтеза нуклеиновых кислот, а именно подавляют репликацию и функции ДНК [6].

Природа биоактивности толуольного экстракта ОМШП изложена в статье [7]. Биоактивность экстракта ШП заложена в его химической структуре. На определение связи «структура-активность» были нацелены данные исследования. В качестве тест-объектов выбраны бактерии: синегнойная палочка и дифтерийная палочка. Они являются представителями различных семейств и родов, с разным строением клеточной оболочки.

В эксперименте было установлено, что толуольный экстракт органической массы ШП в концентрации 1% и 3% не оказывают бактериостатического и бактерицидного действия на культуру синегнойной палочки при экспозиции 24 часа; в кон-

центрации 1% и 3% оказывает бактерицидное действие на культуру токсигенной дифтерии при экспозиции 24 часа.

Данными химических исследований толуольного экстракта ОМШП с помощью метода хромато-масс-спектрометрии (ХМС), установлено, что экстракт - это многокомпонентная смесь органических веществ алифатической, гидроароматической, ароматической и гетероциклической природы. Здесь идентифицирован ряд активных веществ: алканы, изопреноидные алканы, алкены, производные аренов, циклические спирты, производные карбоновых кислот, альдегидов, дикетонов, производные нафталина, серосодержащие соединения, производные пиперидина. Все компоненты толуольного экстракта ОМШП в разной степени обладают биоактивностью, то есть способностью воздействовать на объекты живой материи-бактерии. Биохимические основы устойчивости синегнойной палочки и чувствительности палочки токсигенной дифтерии к действию толуольного экстракта заключаются в специфике организации структурных компонентов их клеточных оболочек [7].

В статье [4] приведены результаты исследования биологической активности препаратов на основе ШП по отношению к бактериальной микрофлоре с применением алгебраической модели конструктивной логики (АМКЛ), позволяющие установить взаимосвязи между химическим составом экстрактов ОМШП и определенными типами их биоактивности. Анализ моделей [4] позволяет констатировать, что наиболее эффективным бактерицидным и бактериостатическим действием обладают 3% растворы экстрактов ОМШП в разведении -3 при экспозиции 24 часа. Все изученные экстракты ОМШП бактерицидны по отношению к культурам грамположительных бактерий (патогенных листерий, токсигенной дифтерии, патогенного стафилококка и р-гемолитического стрептококка) и по отношению к культурам грамотрицательных бактерий (кишечной и синегнойной палочек).

В отношении культур грамотрицательных бактерий наиболее эффективным бактериостатическим действием обладают 3% растворы экстрактов ОМШП в разведении 3 при экспозиции 3 часа. По уменьшению бактерицидного действия растворов экстрактов ОМШП на культуры грамположительных бактерий экстракты можно расположить в следующий ряд: ацетоновый > хлороформный > толуольный > фракция 1 этанольного > органическая составляющая уксусно-кислотного > фракция 2 этаноль-ного > фракция 3 этанольного. Среди изученных растворов экстрактов ОМШП наибольшее бактерицидное действие по отношению к культурам грамотрицательных бактерий проявляют растворы ее ацетонового и, в несколько меньшей степени - хлороформного экстрактов. Растворы других полученных экстрактов ОМШП обладают в лучшем случае лишь бактериостатическим действием на культуры данных патогенных микроорганизмов. Для растворов фракций 1-3 этанольного и органической составляющей уксусно-кислотного экстрактов ОМШП, наблюдается не бактериостатическое, а, наоборот, бактериостимулирующее воздействие этих растворов на ряд бактериальных культур. Анализ полученных моделей 1-3 позволил установить группы органических соединений, которые ответственны за бактерицидное и бактериостатическое действие экстрактов ОМШП по отношению к культурам патогенных микроорганизмов. На культуры патогенных листерий бактерицидно действуют алифатические предельные дикарбоновые кислоты, серосодержащие производные алифатических непредельных одноатомных спиртов, гетероциклические соединения: производные хинолина и изохинолина; на культуры токсигенной дифтерии - алифатические непредельные карбоновые кислоты, алифатические предельные и ароматические дикарбоновые кислоты, гетероциклические соединения: производные хинолина, изохинолина, индола, пиперидина и пирроли-дина; на культуры патогенного стафилококка - алифатические непредельные карбоновые кислоты; на культуры р-гемолитического стрептококка - алифатические предельные дикарбоновые кислоты, гетероциклические соединения: производные пирролидина; на культуры кишечной и синегнойной палочек - алифатические предельные дикарбоновые кислоты.

На культуры патогенных листерий бактериостатически действуют гетероциклические соединения: производные индола; на культуры токсигенной дифтерий - гетероциклические соединения: производные бензотиазола; на культуры патогенного стафилококка - ароматические дикарбоновые кислоты, серосодержащие производные алифатических непредельных одноатомных

спиртов, алифатические предельные дикарбоновые кислоты, гетероциклические соединения: производные пиперидина и индола; на культуры р-гемолитического стрептококка - гетероциклические соединения: производные пиперидина и бензотиазола; на культуры кишечной палочки - серосодержащие производные алифатических непредельных одноатомных спиртов, фенолы, гетероциклические соединения: производные бензотиазола и пиперидина; на культуры синегнойной палочки - алифатические предельные дикарбоновые кислоты, серосодержащие производные алифатических непредельных одноатомных спиртов, гетероциклические соединения: производные пиперидина и пирролиди-на; на культуры дизентерийной палочки - алифатические предельные дикарбоновые кислоты, галогензамещенные алифатические предельные карбоновые кислоты, гетероциклические соединения: производные пирролидина и индола; на культуры сальмонелл - алифатические предельные дикарбоновые кислоты, гетероциклические соединения: производные хинолина, изохинолина, пирролидина и индола. Рост и размножение культур дизентерийной палочки, сальмонелл и других бактерий под влиянием ряда растворов экстрактов ОМШП связано с возможным развитием резистентности данных бактерий к соединениям, содержащихся в их составе. По модели 3 это может объясняться отсутствием в данных экстрактах соединений, обладающих бактерицидным и бактериостатическим действием на эти микроорганизмы. Наблюдающийся в отдельных случаях усиленный рост и размножение бактерий могут быть также связаны с тем, что в ряде экстрактов ОМШП содержатся вещества (в фракциях 1-3 этанольно-го и органической составляющей уксусно-кислотного), которые могут использоваться бактериями в качестве питательных субстратов, для построения клеточной стенки и т.д. (а-

аминоуксусная кислота, производные тиазола и моносахариды).

С помощью АМКЛ впервые были установлены структурные группы органических соединений, ответственных за различные типы биологической активности ОМШП, а их селективное накопление в полученных экстрактах делает препараты на основе ШП высоко активными в плане подавления ряда патогенных микроорганизмов [4]. Наиболее полно результаты системного анализа химического состава ШП, как основы ее биоактивности представлены в работе [10]. Для изучения качественного и количественного химсостава исходной ШП использовались методы технического (ТА), элементного (ЭА), термогравиметрического, рентгенофазового, рентгено-флуоресцентного, эмиссионноспектрального, элементного масс-спектрального и атомно-

эмиссионного анализов, атомно-абсорбционной спектроскопии.

Для увеличения содержания ОМШП в исходной ШП она подвергалась обогащению путем обработки ее водным раствором фтороводородной кислоты, вызывающей растворение значительной части минеральной составляющей исходной ШП. Содержание ОМШП увеличилось с 30,21 до 82,00 мас.%. Изучение химсостава полимерной матрицы (неподвижной фазы) обогащенной ШП велось методами окислительной деструкции ОМШП с применением различных окисляющих реагентов (водного щелочного раствора пероксодисульфата аммония - (NH4)2S2O8/NaOH, водного раствора азотной кислоты и водного щелочного раствора перманганата калия). Все полученные продукты были исследованы ЭА, криоскопией, ИК-Фурье спектроскопией и ХМС.

Для изучения химсостава низкомолекулярной составляющей (подвижной фазы), обогащенной ШП, извлекаемой органическими растворителями, использовалась последовательная исчерпывающая экстракция набором органических растворителей с возрастающей полярностью (толуол, хлороформ, ацетон, этанол, уксусная кислота). Полнота экстракции устанавливалась рефрактометрией. Все продукты были исследованы ЭА, криоскопией, ИК-Фурье спектроскопией и ХМС. Для удобства хроматографирования соединений, содержащих фенольные и карбоксильные группы, в методе ХМС применяли предварительное метилирование полученных продуктов эфирным раствором диазометана.

Биоактивность экстрактов ОМШП по отношению к ряду культур патогенных микроорганизмов исследовалась по следующей методике: из воздушно-сухих экстрактов ОМШП готовились их 1 и 3% водные растворы. После приготовления рабочих растворов для них через 3 и 24 часа дважды определялись значения рН. Высев бактериальных культур производили на соответствующие элективные питательные среды: для Shigella Sonne -эндо агар, для Corynebacterium diphtheriae tox.+ - кровяно-

телуритовый агар, для Streptococcus pyogenes - 5% кровяной агар. Для остальных культур использовали «голодные» питательные среды. Подготовка культур для целевого изучения, разведения и контроля их ростовых свойств и питательных сред осуществлялась согласно общепринятым методикам. Растворы для изучения бактерицидной и бактериостатической активности полученных экстрактов ОМШП готовились путем сливания и перемешивания равных объемов растворов экстрактов и бактериальных взвесей в разведениях -1 и -3. С целью сравнительного изучения роста испытуемых бактериальных культур после их посевов на среды с добавлением изучаемых экстрактов ОМШП, в качестве контрольной группы использовались те же культуры, высеянные на идентичные среды (но без добавления экстрактов ОМШП), имеющие значения рН, аналогичные таковым для экспериментов с участием экстрактов ОМШП. Посевы испытуемого материала производились общепринятыми бактериологическими методами. Посевная доза составляла 0,1 мл (1 капля) на соответствующую питательную среду и растиралась шпателем по поверхности агара. Посевы для каждой культуры проводили трижды: сразу после приготовления рабочего раствора, затем - через 3 и через 24 часа.

Для оценки бактерицидного, бактериостатического действия экстрактов ОМШП на ряд культур применена АМКЛ:

1.Изучена полимерная матрица (неподвижная фаза) ШП с применением окислительной деструкции различными окисляющими реагентами. Каждый из окислителей вызывает образование продуктов достаточно сложного состава, среди которых доминируют карбоновые кислоты, спирты, фенолы, значительное число кислород-, серо- и азотсодержащих гетероциклических структур, а также металлорганические соединения. Они являются соизвле-ченными из сетчатой матрицы макромолекулы шунгита, отражающей биохимический состав древних одноклеточных водорослей, являвшихся биопродуцентами исходного ОВ. Гетероциклические фрагменты ОМШП являются вероятной причиной ее высокой биологической активности.

2.Изучена биоактивность экстрактов ОМШП по отношению к культурам ряда патогенных микроорганизмов, в результате чего установлено, что наибольшим бактерицидным и бактериостати-ческим действием на культуры грамположительных и грамотри-цательных бактерий обладают 3% растворы ацетонового и хлороформного экстрактов ОМШП в максимальном бактериальном разведении -3 при наибольшем времени экспозиции, равном 24 ч.

3.С помощью АМКЛ установлены взаимосвязи между химсоставом и типами биологической активности изученных экстрактов ОМШП, в результате чего определены группы органических соединений ответственных за бактерицидное и бактериоста-тическое действие экстрактов ОМШП.

В [1] приведены результаты исследований адгезии клинических штаммов klebsiella pneumoniae / pneumoniae к эукариотическим клеткам и влияния на нее экстрактов шунгита. У Klebsiella pneumoniae / pneumoniaе выявлен ряд факторов вирулентности, способствующих адгезии к эпителию, повреждению эукариотических клеток. За адгезию ответственны фимбрии, которые помогают на первых этапах инфекционного процесса реализовывать болезнетворность. Из внебольничных инфекций клебсиелла чаще всего вызывает инфекции мочевыводящих путей, дыхательных путей, кожи и мягких тканей. При госпитальных инфекциях Klebsiella pneumoniae / pneumoniaе актуальна как возбудитель раневых интраабдоминальных инфекций. Цель этой работы - оценка влияния экстрактов шунгита на адгезивность клинических штаммов Klebsiella pneumoniae / pneumoniaе. В работе использовалась клиническая методология исследования, включающая микроскопические, бактериологические и математические методы. Для определения адгезивной активности в работе использованы представители семейства Enterobacteriaceae-20 клинических штаммов Klebsiella pneumoniae / pneumoniaе.

Схема исследования адгезивности включала два способа: экспресс-метод и развернутый. Контрольные штаммы в обычных условиях, без какого-либо воздействия дают высокий показатель адгезии и высокий индекс адгезии, поэтому испытуемые клебси-еллы можно считать высокоадгезивными. На основании экспериментальных данных, представляется возможным сделать следующий вывод: Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae при воздействии 1% раствора ацетонового экстракта, 1% и 3% растворами этанольного экстракта проявляет низкую адгезивность. При воздействии 3% раствора ацетонового экстракта Klebsiella pneumo-niae/ pneumoniae проявляет среднюю адгезивность. Принимая во

внимание ИАМ, констатируем, что при действии всех экстрактов ОМШП, у Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae снижается адгезив-ность, она становится среднеадгезивной культурой. В связи с этим ингибирование микробной адгезии, в т. ч. и экстрактами шунгита, является необходимым условием блокирования инфекционного процесса на ранних этапах развития и может учитываться при разработке профилактических препаратов [1].

В статье [2] приведены результаты исследований экстракта шунгита как способа воздействия на адгезию streptococcus pyogenes к эритроцитам человека. Целью этой работы является изучение адгезии Streptococcus pyogenes на эритроцитах человека O (I) Rh (+) и возможности воздействия на этот процесс экстрактов шунгита. Объектами являлись клинические штаммы Streptococcus pyogenes, выделенные от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями. Для изучения адгезивного процесса бактерий были использованы методические рекомендации N28-6/7 «Выявление гемолитических, адгезивных и энтеротоксигенных свойств энтеробактерий» и доступная, более информативная методика В. И. Брилиса, Т. А. Брилене, Х. П. Ленцнера. На основании экспериментальных данных и количественных характеристик, можно сделать вывод: при воздействии на Streptococcus pyogenes 1% и 3% этанольного экстрактов культура проявляет низкую адгезив-ность. 1% и 3% растворы ацетонового экстракта делают Streptococcus pyogenes среднеадгезивным. Учитывая значения ИАМ, отметим, что при действии 1% и 3% раствора ацетонового экстракта, 1% раствор этанольного экстракта Streptococcus pyogenes является среднеадгезивным и низкоадгезивным при воздействии 3% этанольного экстракта шунгита [2].

В [3] приведено изменение протеолитических и сахароли-тических ферментов pseudomonas aeruginosa под действием экстракта шунгита. Целью этого исследования является изучение протеазной активности и сахаролитических свойств Pseudomonas aeruginosa, определение влияния ацетонового экстракта ОМШП на ферментативные свойства бактерии. Протеолитические и са-харолитические ферменты играют важную роль в патогенезе синегнойной инфекции. Расщепляя белковые молекулы и сахара на низкомолекулярные продукты, эти ферменты обеспечивают микробным клеткам питательные вещества, необходимые для роста и размножения. Ферменты, не обладающие высокой токсической активностью, вызывают лишь местные поражения в тканях, однако именно эти поражения способствуют проникновению Pseudomonas aeruginosa в макроорганизм, его колонизации и развитию инфекционного процесса. В работе использован классический метод определения желатиназы - разжижение желатина. Производили посев уколом в столбик застывшего при комнатной температуре 10% желатина в пептонной воде. Инкубация шла при температуре 20-22 С в течение ряда дней. Для изучения сахаролитических свойств мы использовали набор ID 32 GN, предназначенный для автоматической идентификации грамотри-цательных палочек. В состав одного из микротестов входил гликоген (дегидрированный субстрат). Чтение стрипа велось автоматически через 24 часа на приборе ATB Expression bio Merieux фотометрическим методом.

В ходе эксперимента было установлено, что все испытуемые бактерии обладают высокой протеолитической активностью. Все штаммы Pseudomonas aeruginosa в течение 2 суток при температуре 20-22 С разжижают желатин in vitro. При добавлении к питательной среде с желатином 0,5 мл 1 и 3% ацетонового экстракта, протеолитические свойства существенно меняются. Заслуживает внимание тот факт, что при добавлении 1% ацетонового экстракта ОМШП 31,25% штаммов деградируют желатин с помощью фермента желатиназы лишь на 2 и 3 сутки. Остальные 68,75% штаммов в этих условиях желатиназу не образуют. 3% ацетоновый экстракт оказывает бактерицидное действие на Pseudomonas aeruginosa и соответственно полностью ингибирует ферментативную активность бактерий. Преобразование гликогена в нормальных условиях характерно лишь для 12,5% штаммов. Под влиянием 1 и 3% раствора экстракта ОМШП разложение гликогена не происходило. Сделан вывод о возможном участии выявленных ферментов патогенности в развитии гнойновоспалительных процессов, хронического течения инфекции и целесообразности изучения природных веществ, влияющих на свойства клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa [3].

Полный системный анализ изменений вирулентных свойств условно-патогенных бактерий при взаимодействии их с природными биоактивными веществами приведен в [9]. Цель работы:

установить изменения вирулентных свойств условно-патогенных бактерий, при взаимодействии их с природными биоактивными веществами, находящимися в составе ШП, изучить влияние веществ, входящих в состав вытяжек, полученных из ШП, на адгезивную способность условно-патогенных бактерий, оценить влияние растворов вытяжек на гемолизирующие свойства бактерий, изучить действие веществ, входящих в состав органического вещества ШП, на биохимические и ферментативные свойства бактерий, определить изменение бактериальных факторов защиты и агрессии под действием биовеществ ШП, используя методы системного анализа установить наличие изменений вирулентных свойств условно-патогенных бактерий при взаимодействии их с биоактивными веществами, входящими в состав ШП.

Выводы. Взаимоотношение между бактериальным патогеном и эукариотической клеткой при формировании межклеточных контактов на ранних этапах инфекционного процесса рассматривается как наиболее важное звено в ходе патогенетических событий и определяет течение заболевания. Именно на этой стадии растворы биоактивных составляющих ШП активно влияют на условно-патогенные бактерии. Изучение механизмов, обеспечивающих адгезию бактерий к клеткам-мишеням, является предпосылкой для создания профилактических антиадгезивных препаратов на основе шунгита, направленных на снижение или предотвращение колонизации тканей хозяина. Достоверно доказано активное влияние вытяжек ШП на гемолизирующие, ферментативные и биохимические свойства бактерий, что позволяет учитывать это при разработке противобактериальных препаратов. Доказано уменьшение синтеза бактериальных факторов защиты и агрессии (секреторных ферментов) под влиянием биоактивных веществ, идентифицированных в растворах вытяжек. С помощью АМКЛ и множественной корреляции достоверно установлено наличие изменений вирулентных свойств условно-патогенных бактерий при воздействии растворов экстрактов ШП [9].

Литература

1. Серегина Н.В. и др. // Сб. статей ХХХХІУ научно-практ. конф. профессорско-преподавательского состава ТулГУ «Общественное здоровье и здравоохранение: профилактическая и клиническая медицина».- Тула: ТулГУ, 2008.- С.76-80.

2. Серегина Н.В. и др. // там же.- С.81-83.

3. Серегина Н.В., Дешко И.В. // там же.- С.84-87.

4. Прокопченков Д.В. и др. // Сб. статей ХХХХІІІ научно-практ. конф. профессорско-преподавательского состава ТулГУ «Общественное здоровье и здравоохранение: профилактическая и клиническая медицина» .- Тула: ТулГУ, 2007.- С.96-103.

5. Серегина Н.В. // там же.- С.103-107.

6. Серегина Н.В. и др. // там же.- С. 107-110.

7. Серегина Н.В., Честнова Т.В. // там же.- С. 110-114.

8. Платонов В.В. и др. // ЖПХ.- 2006.- Е.79, Вып.10.-С.1601-1607.

9. Серегина Н.В. Системный анализ изменений вирулентных свойств условно-патогенных бактерий при взаимодействии их с природными биологически активными веществами: Авто-реф. дис... к.б.н.- Тула: ТулГУ, 2008.- 27 с.

10. Прокопченков Д.В. Системный анализ химического состава шунгитовой породы, как основы ее биологической активности: Автореф. дис. к.б.н.- Тула: ТулГУ, 2008.- 26 с.

11. Платонов В.В. и др. // ВНМТ.- 2006.- Т. ХІІІ, № 4.-С. 132-133.

12. Платонов В.В. и др // ЖПХ.- 2007.- Т. 80, Вып. 1 .-

С. 132-139.

УДК 510.5:510.24:612.821.3

ПРОГРАММА ПОСТРОЕНИЯ АЛГЕБРАИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ КОНСТРУКТИВНОЙ ЛОГИКИ В БИОФИЗИКЕ, БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

В.А. ХРОМУШИН, В.Ф. БУЧЕЛЬ, В.А. ЖЕРЕБЦОВА, Т.В. ЧЕСТНОВА*

Использование алгебраических моделей. Алгебраические модели являются мощным инструментом для выявления причинно-следственных связей. ДМКЬ позволяет строить математические модели, результат которых представлен