ОТБОР БОЛЬНЫХ РАКОМ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ Wnt НА ОСНОВАНИИ СТАТУСА МУТАЦИИ RNF43
SELECTION OF CANCER PATIENTS FOR INTRODUCTION OF WNT SIGNAL INHIBITORS BASED ON RNF43 MUTATION STATUS

Притязание на приоритет
Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США № 61/604290, поданной 28 февраля 2012 г.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам измерения или исследования с целью обнаружения опухолевой или раковой клетки и специфического выявления больных раком, у которых согласно прогнозу при введении ингибитора Wnt может быть достигнут благоприятный эффект, а также к композициям или индикаторным полоскам, содержащим антиген, связанный с клеточной мембраной, или рецептор, связанный с клеточной мембраной, которые предназначены для осуществления вышеуказанных способов. Настоящее изобретение также относится к ингибитору Wnt или фармацевтической композиции, включающей ингибитор Wnt, которые предназначены для введения специально отобранному субъекту.
Уровень техники
В биологии и медицине канонический сигнальный путь Wnt/β-катенина представляет собой ряд внутриклеточных сигнальных событий, включающих секретируемые лиганды Wnt, рецепторы на поверхности клетки и коактиватор транскрипции β-катенин, а также много других эффекторов и регуляторов указанных основных белковых компонентов. При отсутствии лигандов Wnt β-катенин постоянно находится в фосфорилированном состоянии под воздействием мультибелкового комплекса, который запускает его полиубиквитинацию и протеасомное разрушение. При связывании белка Wnt с его рецепторами цитозальный β-катенин стабилизируется в результате ингибирования деструктивного комплекса и перемещается в ядро для активации транскрипции генов-мишеней Wnt.
Главными рецепторами Wnt является семейство белков Frizzled (FZD), в котором LRP5 или LRP6 (белки 5 и 6, родственные рецептору LDL), являются основными корецепторами сигнального пути Wnt/β-катенина. Nusse R. (2005), Cell Research 15(1): 28-32. Рецепторы Frizzled являются трансмембранными молекулами, состоящими из семи фрагментов и имеющими длинный домен с высоким содержанием цистеина. Корецепторы LRP5/6 являются однопроходными трансмембранными белками. Huang H-C and Klein PS (2004) Genome Biol. 5(7): 234. LRP6 является доминантным рецептором по сравнению с LRP5, который необходим только для костного гомеостаза у взрослых. McDonald BT et al. (2009) Developmental Cell 17(1): 9-26.
Неканонический сигнальный путь Wnt не зависит от β-катенина. Рецепторы Frizzled участвуют в неканоническом сигнальном пути Wnt, но корецептор LRP6 не опосредует активность неканонического сигнального пути. Существует по меньшей мере два неканонических сигнальных пути Wnt, сигнальный путь полярности плоских клеток (РСР) и сигнальный путь высвобождения кальция.
Сигнальный путь Wnt/β-катенина имеет важное значение для регуляции роста и дифференцировки клеток в процессе развития эмбриона. У взрослых сигнальный путь Wnt стимулирует тканевый гомеостаз, и нарушение указанного сигнального пути является причиной разных болезней человека, в частности, рака. Nusse R (2005) Cell Research 15(1): 28-32.
Аберрантная сверхактивация сигнального пути Wnt часто имеет важное значение для онкогенеза колоректальных карцином. Также установлено, что анормальная передача сигналов Wnt ассоциирована с раками других типов. Указанные раки других типов включают рак поджелудочной железы, рак печени, рак молочной железы и рак кожи. Повышенная активность неканонического сигнального пути Wnt/РСР также имеет отношение к онкогенезу.
Были созданы антагонисты сигнального пути Wnt для лечения Wnt-зависимых опухолей. Для лечения рака было создано много ингибиторов Wnt, в частности, ингибиторы поркупина, ингибиторы танкиразы, антитела против белков Frizzled и антитела против LRP6. Однако большинство указанных ингибиторов Wnt направленно воздействуют на белковые компоненты верхней области сигнального пути Wnt. Указанные ингибиторы Wnt не подавляют передачу сигналов Wnt в опухолях с мутациями в генах, расположенных в нижней области сигнального пути Wnt, и поэтому часто не оказывают эффективного воздействия на опухоли с онкогенными мутациями в генах нижней области сигнального пути Wnt, таких как АРС (аденоматозный полипоз кишечника), AXIN1/2 и β-катенин.
Отсутствие методов, позволяющих идентифицировать опухоли с мутациями в генах, расположенных в верхней области сигнального пути Wnt, препятствует клиническому созданию ингибиторов Wnt. Таким образом, в данной области существует потребность в методе, позволяющем идентифицировать ассоциированную с раком мутацию в гене или генном продукте сигнального пути Wnt, локализованном в верхней области сигнального пути Wnt.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к диагностическому применению двух гомологичных трансмембранных убиквитин-лигаз Е3 (RNF453 и ZNRF3), которые снижают уровни белков Frizzled/LRP6 в комплексах рецепторов Wnt в результате убиквитинации белков Frizzled. Одним объектом изобретения является использование инактивирующих мутаций в гене RNF43 или гене ZNRF3 в качестве биомаркеров для отбора опухолевых клеток, рост которых замедляется ингибиторами сигнального пути Wnt. Другим объектом изобретения является отбор больных раком для лечения ингибиторами Wnt на основании инактивирующих мутаций в гене RNF43 или ZNRF3, используемых в качестве биомаркеров, определяющих чувствительность опухоли к лечению ингибитором Wnt. В соответствии с конкретным объектом изобретения инактивирующие мутации RNF43, такие как миссенс-мутации и мутации со сдвигом рамки, присутствуют в первичных опухолях и линиях клеток аденокарцином протоков поджелудочной железы (PDAC). Так как эндогенный ген RNF43 дикого типа регулирует передачу сигналов Wnt а клетках PDAC и ингибирование эндогенного гена RNF43 в PDAC повышает уровень белков Frizzled и увеличивает передачу сигналов Wnt, то настоящее изобретение относится к идентификации мутированного в раке компонента (RNF43) в верхней области сигнального пути Wnt.
Настоящее изобретение также показывает, что раковые клетки с мутациями гена RNF43 более чувствительны к ингибированию сигнального пути Wnt. Ингибирование гена RNF43 в раковых клетках вызывает повышение уровней белков Frizzled на поверхности клетки. Поэтому сигнальный путь Wnt с повышенной активностью и раковые клетки с мутантом RNF43, в частности, раковые клетки поджелудочной железы, более чувствительны к антагонистам Wnt. Таким образом, настоящее изобретение относится к использованию статуса мутации RNF43 в качестве метода отбора больных раком для терапевтического введения ингибиторов сигнального пути Wnt.
Ингибиторы Wnt могут быть использованы в фармацевтических композициях, применяемых для лечения людей или в ветеринарии в случаях, требующих ингибирования сигнального пути Wnt, например, при лечении опухолей или анормального роста клеток. Настоящее изобретение относится к способу лечения больного раком ингибитором Wnt, который включает введение ингибитора Wnt или фармацевтической композиции, включающей ингибитор Wnt, субъекту, у которого обнаружен биомеркер, указывающий на чувствительность к ингибитору Wnt. Например, полученный у субъекта образец может быть исследован методами секвенирования ДНК на наличие мутации RNF43 или мутации ZNRF3, свидетельствующей о чувствительности к ингибитору Wnt. Альтернативно полученный у субъекта образец может быть исследован в отношении уровня экспрессии гена RNF43, белка RNF43, гена ZNRF3, белка ZNRF3 или другого биомаркера, при этом уровень биомаркера у субъекта может быть статистически равен или меньше контрольного уровня биомаркера, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt, или уровень биомаркера в опухолевых клетках субъекта может быть статистически равен уровню биомаркера, коррелированному с чувствительностью к ингибитору Wnt. Контрольный уровень может быть нормальным или базовым уровнем биомаркера, уровнем биомаркера в образце здоровой клетки или ткани либо контрольный уровень биомаркера может быть коррелирован с устойчивостью к ингибитору Wnt.
Ингибитор Wnt или фармацевтическая композиция, включающая ингибитор Wnt, может быть использована при лечении субъекта, у которого уровень биомаркера коррелирован с чувствительностью к ингибитору Wnt. В конкретном варианте осуществления изобретения ингибитор Wnt или композиция, включающая ингибитор Wnt, предназначены для лечения больного раком.
ZNRF3 и RNF43 являются функциональными гомологами, и ZNRF3 также может быть мутирован в опухолях определенного типа. Таким образом, статус мутации ZNRF3 также является информативным для отбора больных раком для терапевтического введения антагонистов Wnt.
Один вариант осуществления изобретения относится к способу отбора больного раком, у которого согласно прогнозу может быть достигнут или не достигнут благоприятный эффект при терапевтическом введении ингибитора Wnt. Указанный способ включает следующие стадии:
(а) определение в образце опухолевых клеток, полученном у субъекта, уровня биомаркера, который может представлять собой (i) число обнаруженных копий ДНК в области хромосомы RNF43 или в области хромосомы ZNRF3, для определения утраты гетерозиготности, (ii) секвенированную геномную ДНК, кДНК или РНК из раковых тканей, используемую для обнаружения инактивирующей мутации в гене RNF43 или гене ZNRF3; (iii) результаты анализа по измерению экспрессии мРНК RNF43 или экспрессии мРНК ZNRF3; (iv) результаты анализа по измерению экспрессии белка RBF43 или экспрессии белка ZNRF3; (v) функциональный эффект утраты гена RNF43 или гена ZNRF3; (vi) комбинацию биомаркеров (i)-(v);
(b) сравнение уровня биомаркера в образце опухолевых клеток с контрольным уровнем биомаркера, выбираемым из группы, состоящей из: (i) контрольного уровня биомаркера, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt; и (ii) контрольного уровня биомаркера, коррелированного с устойчивостью к ингибитору Wnt; и
(с) отбор субъекта, у которого согласно прогнозу может быть достигнут благоприятный эффект от терапевтического введения ингибитора Wnt, если наличие в опухоли субъекта мутации RNF43 или ZNRF3 либо пониженной экспрессии мРНК или белка RNF43 или пониженной экспрессии мРНК или белка ZNRF3 свидетельствует о том, что опухоль субъекта, по-видимому, чувствительна к ингибитору Wnt.
Статус мутации гена RNF43 или гена ZNRF3 в опухолевых клетках может быть исследован любым из нижеследующих методов или при помощи комбинации указанных методов.
(i) Анализ числа копий ДНК в области RNF43 хромосомы 17 в геномном локусе 17q22 для определения утраты одной или обеих копий гена RNF43. Альтернативно может быть выполнен анализ числа копий ДНК в области ZNRF3 хромосомы 22 в геномном локусе 22q12.1 для определения утраты одной или обеих копий гена ZNRF3. Утрата гетерозиготности RNF43 или ZNRF3 является биомаркером опухолей, отбираемых для уменьшения скорости роста таких опухолей при помощи ингибитора Wnt.
(ii) Секвенирование геномной ДНК, кДНК или РНК из раковых тканей для обнаружения инактивирующей мутации в гене RNF43. Инактивирующая мутация RNF43 или ZNRF3 является биомаркером опухолей, отбираемых для уменьшения скорости роста таких опухолей при помощи ингибитора Wnt. Инактивирующая мутация может быть нонсенс-мутацией, мутацией со сдвигом рамки, сплайсирующим вариантом или миссенс-мутацией, вызывающей замену аминокислот в положении консервативных остатков.
(iii) Анализ экспрессии мРНК RNF43 или анализ экспрессии мРНК ZNRF3 методом Taqman или другими подобными методами. Нонсенс-мутации или мутации со сдвигом рамки в мРНК часто вызывают разрушение мРНК, опосредованное нонсенс-мутацией. Поэтому утрата экспрессии мРНК RNF43 в раковых клетках может быть использована в качестве вторичного или альтернативного анализа выявления нонсенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки RNF43. Отсутствие мРНК RNF43 может быть также результатом эпигенетического сайленсинга, но в данном случае отсутствует мутация в геномной ДНК.
(iv) Анализ функционального эффекта утраты гена RNF43 или гена ZNRF3, который определяют по повышенным уровням белка Frizzled, повышенным уровням белка LRP6, повышенному фосфорилированию LRP6 и повышенному фосфорилированию белка Disheveled в образцах опухоли по сравнению с нормальным контрольным образцом.
Преимущество использования статуса мутации гена RNF43 или гена ZNRF3 в качестве биомаркера опухолей, отбираемых для уменьшения скорости роста таких опухолей путем введения ингибитора Wnt, приобретает особенно важное значение при создании лекарственных средств.
Один вариант осуществления изобретения относится к анализу или набору для исследования статуса мутации гена RNF43 или гена ZNRF3. Указанный анализ или набор может быть сопутствующим диагностическим средством, используемым после признания ингибитора Wnt в качестве лекарственного средства.
Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей ингибитор Wnt, которая предназначена для лечения рака у субъекта, у которого уровень (вышеуказанного) биомаркера статистически равен или меньше контрольного уровня биомаркера, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена фотография, на которой показаны анализы колониеобразования при обработке ингибитором LGK974. На фиг. 1(а) показан анализ колониеобразования клеток HPAFII в присутствии LGK974 в двух концентрациях (300 нМ и 1 мкМ). 1300 клеток высевали в среды, подвергнутые соответствующей обработке, которые меняли через каждые 5 дней до окрашивания кристаллическим фиолетовым на 14-й день. LGK974 ингибирует колониеобразование клеток HPAFII, содержащих нонсенс-мутацию в гене RNF43. На фиг. 1(b) показаны анализы колониеобразования клеток РК1 (содержащих функциональный белок RNF43) и клеток HPAFII (содержащих нефункциональных белок RNF43) в присутствии только 1 мкМ LGK974 или в сочетании с ежедневно добавляемой кондиционированной среды (СМ), содержащей 10% Wnt3a. Клетки РК1, содержащие RNF43 дикого типа, не проявили чувствительность к LGK974 в течение 10-дневного анализа. Клетки HPAFII, содержащие мутант RNF43, были ингибированы LGK974, при этом ингибирование было частично прекращено при добавлении экзогенного белка Wnt3a, поэтому ингибирование роста при помощи LGK974 зависело от сигнального пути Wnt.
На фиг. 2 изображена диаграмма, на которой показан сравнительный анализ белка RNF43 и белка ZNRF3 с целью выявления консервативных остатков. Указанная информация может быть использована для прогнозирования миссенс-мутаций, являющихся инактивирующими мутациями. Последовательность белка RNF43 человека представлена в SEQ ID NO:3, и последовательность белка ZNRF3 человека представлена в SEQ ID NO:4.
На фиг. 3 изображено несколько столбчатых диаграмм, показывающих отрицательную регуляцию сигнального пути Wnt при помощи RNF43 в раковых клетках поджелудочной железы YAPC, экспрессирующих RNF43 дикого типа. На фиг. 3(а) показано, что истощение RNF43 повышает активность Super TOPFlash (STF) в линии раковых клеток поджелудочной железы YAPC. Клетки YAPC-STF трансфицировали указанной миРНК в присутствии или отсутствии кондиционированной среды (СМ), содержащей Wnt3a, и измеряли активность репортерной люциферазы, используя STF. миРНК pGL2 является отрицательным контрольным образцом. На фиг. 3(b) показано, что повышение активности STF, индуцированное миРНК RNF43, зависит от эндогенного Wnt. Клетки YAPC-STF трансфицировали указанной миРНК и затем обрабатывали ДМСО или ингибитором поркупина LGK974. Затем измеряли активность репортера STF. На фиг. 3(с) показано, что истощение RNF43 увеличивает экспрессию AXIN2, гена-мишени β-катенина. Клетки YAPC, экспрессирующие пустой вектор (EV) или миРНК-устойчивый ген RNF43, трансфицировали указанной миРНК и определяли относительные уровни мРНК AXIN2 и RNF43 при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией.
На фиг. 4 изображено несколько столбчатых диаграмм, показывающих изменение уровня мРНК для нескольких генов, относящихся к сигнальному пути Wnt/β-катенина. На фиг. 4(а) показано, что истощение β-катенина снижает уровень мРНК AXIN2 и RNF43. Клетки обрабатывали миРНК и анализировали относительные уровни мРНК указанных генов при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией. На фиг. 4(b) показано, что ингибиторы поркупина уменьшают экспрессию мРНК RNF43 и мРНК AXIN2. Клетки YAPC обрабатывали 3 мкМ IWP2 или 1 мкМ LGK974 и исследовали экспрессию генов при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией.
Подробное описание изобретения
Введение
Авторы настоящего изобретения обнаружили два отрицательных регулятора сигнального пути Wnt, цинкосодержащий пальцеобразный белок 3 (ZNRF3, Swiss-Prot Q9ULT6, SEQ ID NO:4) и пальцеобразный белок 43 (RNF43, Swiss-Prot Q68DV7, SEQ ID NO:3). Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200. RNF43, пальцеобразный белок, ассоциированный с раком, является убиквитин-лигазой, которая взаимодействует с ядерным белком НАР95. Sugiura T et al. (2008) Exp. Cell Res. 314(7): 1519-28. ZNRF3 и RNF43 являются гомологичными трансмембранными убиквитин-лигазами Е3 на поверхности клетки для рецептора Frizzled Wnt. Оба белка снижают уровни комплекса рецепторов Wnt на поверхности клетки, состоящего из рецепторов Frizzled и LRP6.
Авторы настоящего изобретения также показали, что транскрипция ZNRF3 индуцируется в результате активации сигнального пути Wnt. Сверхэкспрессия ZNRF3 снижала активность сигнального пути Wnt, в то время как миРНК ZNRF3 или доминантный отрицательный ZNRF3 сильно повышал активность сигнального пути Wnt. Фосфорилирование LRP6 увеличивалось при ингибировании ZNRF3, из чего следует, что ZNRF3 действует в верхней области сигнального пути Wnt. Поэтому ZNRF3 регулирует реакцию клетки на стимуляцию лигандом Wnt. Данное наблюдение было подтверждено в клеточных системах при выполнении экспериментов in vivo с использованием брахиданио-рерио и мышей с отсутствием гена. Также было установлено, что RNF43 является функциональным гомологом ZNRF3 и регулирует передачу сигналов Wnt.
RNF43 и опухоли поджелудочной железы
Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является наиболее распространенной формой рака поджелудочной железы. PDAC является чрезвычайно агрессивной и ассоциирована с неутешительным прогнозом. Matthaei H et al. (2011) Ann. Surg. Oncol. 18(12): 3493-9; Luebke AM et al. (2012) Pancreatology 12(1): 16-22; Hezel AF (2006) Genes Dev. 20(10). Предшественниками PDAC считаются интраэпителиальная эндоплазия поджелудочной железы (PanIN), внутрипроточная папиллярная слизеобразующая неоплазма (IPMN) и слизеобразующая кистозная неоплазия (MCN). Несмотря на взаимосвязь с протоками PDAC не обязательно возникает в протоках.
Сигнальный путь Wnt/β-катенина динамически регулируется в процессе развития поджелудочной железы и необходим для развития поджелудочной железы. Wells JM (2007) BMC Dev. Biol. 7:4. Ингибирование сигнального пути Wnt/β-катенина нарушает развитие ацинарных клеток, но не островка поджелудочной железы. Индуцибельная экспрессия стабилизированного β-катенина в поджелудочной железе взрослых мышей увеличивает пролиферацию зрелых экзокринных клеток при минимальном воздействии на клетки островка. Heiser PW et al. (2006) Development 133(10): 2023-32. Имеющиеся данные показывают, что активация сигнального пути Wnt может способствовать сохранению и/или развитию PDAC. Morris JP et al. (2010) Nat. Rev. Cancer 10(10): 683-95. Накопление β-катенина в ядре или цитоплазме отмечено в ряде PDAC (Pasca di Magliano M et al. (2007) PLoS One 2(11): e1155), что указывает на активацию сигнального пути. Уровень цитозольного и ядерного β-катенина положительно коррелирован со степенью PanIN и развитием PDAC (Wang L et al. (2009) Cancer Sci. 101(3): 700-6), поэтому передача сигналов β-катенином стимулирует развитие PDAC. Истощение β-катенина уменьшает пролиферацию клеток PDAC, что свидетельствует о важном значении β-катенина в сохранении трансформирующего фенотипа.
RNF43 часто мутирует в IMPN и MCN (Furukawa T et al. (2011) Sci. Rep. 1: 161; Wu J et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(52): 21188-93). IPMN и MCN являются предшественниками инвазивной аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC).
В данной области известна последовательность RNF43 человека. Непроцессированную кДНК RNF43 человека (NM_017763.4) можно приобрести в коммерческих источниках (например, Open Biosystems, Glastonbury, CT, USA 06033). Для получения дополнительной информации, относящейся к RNF43, см. патент США № 7425612. Полипептид ТАТ179 идентичен внеклеточной области RNF43, расположенной после сигнального пептида. См. международную заявку на патент WO 2003/024392, на основании которой в Европе был выдан патент ЕР 1487877 В1.
Недавно было предложено использовать RNF43 в качестве супрессора кистозных опухолей поджелудочной железы. Wu J et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108: 2188. В исследовании по секвенированию полного экзона было установлено, что 6 из 8 внутрипроточных папиллярных слизеобразующих неоплазм (IPMN) и 3 из 8 слизеобразующих кистозных неоплазм (MCN) содержат инактивирующие мутации RNF43. Преобладание инактивирующих мутаций в RNF43 и утрата гетерозиготности (LOH) его локуса делает возможным использование RNF43 в качестве супрессора как в IPMN, так и в MCN. В публикации Wu et al. отсутствует функциональное исследование RNF43.
Не так давно было установлено, что специфичная для кишечника делеция Znrf3 и Rnf43 индуцирует сверхпролиферацию кишечных крипт и образование кишечной аденомы у мышей. Koo BK et al. (2012) Nature 488(7413): 665-9. Кроме того, мутации RNF43 были обнаружены в разных опухолях, в том числе в кистозных опухолях поджелудочной железы. Указанные исследования показывают, что RNF43 действует в качестве отрицательного регулятора сигнального пути Wnt/β-катенина подобно ZNRF3.
Однако до сих пор не идентифицирована клеточная система, важным элементом которой является RNF43, поэтому функциональное исследование RNF43 in vitro было невозможно. Таким образом, физиологическая принадлежность мутации RNF43 в раке ранее была неизвестна.
Сигнальный путь Wnt/β-катенина
Сохранившийся в процессе эволюции сигнальный путь Wnt/β-катенина имеет важное значение для развития эмбриона и тканевого гомеостаза у взрослых. Logan CY and Nusse R (2004) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20: 781-810; Clevers H (2006) Cell 127(3): 469-80. Сигнальный путь Wnt регулирует преобразование кофактора транскрипции β-катенина и контролирует основные программы экспрессии генов в процессе развития. MacDonald BT et al. (2009) Dev. Cell. 17(1): 9-26. При отсутствии активации сигнального пути Wnt цитозольный 4-катенин ассоциирован с деструктивным комплексом β-катенина, который содержит много белков, в том числе белок аденоматозного полипоза кишечника (АРС), AXIN и протеинкиназу 3α/β (GSK3α/β). В указанном комплексе β-катенин конститутивно фосфорилирован GSK3, при этом фосфорилированный β-катенин разрушается под воздействием сигнального пути протеасомы убиквитина. Сигнал Wnt, принимаемый двумя рецепторами, белком Frizzled и LRP5/6, вызывает диссоциацию деструктивного комплекса β-катенина. Стабилизированный β-катенин проникает в ядро, связывается с семейством TCF факторов транскрипции и включает транскрипцию.
Аберрантная активация сигнального пути Wnt/β-катенина является причиной онкогенеза, при этом многие компоненты нижней области сигнального пути Wnt мутируют в раки. Процессирующие мутации АРС обнаружены в 80% колоректального рака. В разных раках также обнаружены стабилизирующие мутации β-катенина и утрата функциональных мутаций AXIN1/2. Несмотря на интенсивные исследования направленное воздействие сигналов β-катенина в раках, содержащих мутацию в нижней области сигнального пути, до сих пор не установлено из-за отсутствия прослеживаемых мишеней. С другой стороны, существует несколько прослеживаемых мишеней в верхней области сигнального пути Wnt. Созданы разные агенты, направленно воздействующие на верхнюю область сигнального пути Wnt, в том числе антитело против LRP6 (Ettenberg S et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (35): 15473-8), антитело против белка Frizzled (Gurney A et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(29): 11717-22) и ингибитор поркупина (Chen B et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5(2): 100-7). Однако клиническая разработка указанных агентов ранее была затруднена, так как указанные молекулы не ингибируют передачу сигналов β-катенина в опухолях, имеющих мутацию в нижней области, поэтому было трудно идентифицировать опухоли человека, принимающие индуцируемые лигандами сигналы Wnt/β-катенина.
Определения терминов
“Рак” в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 8093011 и патенте США № 8093011 (которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки), является общим названием целого ряда злокачественных новообразований клеток, характеризующихся нерегулируемым ростом, отсутствием дифференцировки и способностью проникать в ткани и метастазировать. Указанные злокачественные новообразования поражают с разной степенью распространения все ткани и органы тела. Таким образом, термин ”рак” в использованном здесь значении означает наличие клеток, обладающих характеристиками, типичными для вызывающих рак клеток, такими как неконтролируемая пролиферация, иммортализация, метастазирование, быстрый рост и пролиферация, а также определенными типичными морфологическими признаками. Раковые клетки часто имеют форму опухоли, но такие клетки могут существовать отдельно или могут циркулировать в кровеносной системе в виде независимых клеток, таких как лейкозные клетки.
Термин ”анормальный рост клеток” означает рост клеток, не зависящий от нормальных регуляторных механизмов (например, утрата контактного ингибирования). В определение данного термина входит анормальный рост: (1) опухолевых клеток (опухолей), которые пролиферируют в результате сверхактивности сигнального пути Wnt в клетке; (2) доброкачественных и злокачественных клеток других пролиферативных заболеваний, при которых в клетке имеет место аберрантная сверхактивность сигнального пути Wnt; (4) любых опухолей, которые пролиферируют в результате сверхактивности сигнального пути Wnt в клетке; (5) любых опухолей, которые пролиферируют в результате сверхактивности сигнального пути Wnt в клетке; и (6) доброкачественных и злокачественных клеток других пролиферативных заболеваний, в которых имеет место аберрантная сверхактивность сигнального пути Wnt.
“Биомаркер” представляет собой нечто, что может быть использовано в качестве индикатора конкретного заболевания или какого-либо другого физиологического состояния организма, такого как человек. Биомаркером может быть наличие гена, аллеля гена, измерение экспрессии гена, белок, функциональный эффект активности белка, который может быть измерен и коррелирован с физиологическим состоянием. Биомаркеры используют в медицине в качестве лабораторных параметров, которые могут помочь лечащему врачу принять решение о диагнозе и выборе курса лечения.
Термин ”утрата гетерозиготности” (LOH) означает делецию генетического материала (ДНК), который подвержен почти всем разновидностям рака по сравнению с нормальными клетками. См. патент США № 7718364 (который полностью включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки). Утрата генетического материала из раковых клеток может привести к избирательной утрате одного из двух или более аллелей гена в определенном локусе хромосомы, где ген может влиять на рост клеток. Вследствие генетической гетерогенности или полиморфизма ДНК многие спаренные аллели генов отличаются друг от друга. При наличии двух идентичных аллелей субъект считается гомозиготным в отношении данной пары аллелей в данном определенном локусе. Альтернативно при наличии двух разных аллелей субъект является гетерозиготным в данном локусе. Оба аллеля обычно транскрибируются и в конечном счете транслируются или в идентичные белки в случае гомозиготности, или в разные белки в случае гетерозиготности. В случае утраты одной из пар гетерозиготных аллелей вследствие делеции ДНК из одной из спаренных хромосом, будет экспрессирован только оставшийся аллель и указанные клетки становятся функционально гомозиготными. Такая ситуация именуется ”утратой гетерозиготности” (LOH) или переходом к гомозиготности. Благодаря использованию ДНК-зондов ДНК из нормальных клеток субъекта можно сравнить с ДНК, экстрагированной из опухолевых клеток того же субъекта и идентифицировать LOH при помощи экспериментальных методов, хорошо известных в данной области. Альтернативно LOH можно исследовать, демонстрируя две полиморфные формы белка в нормальных гетерозиготных клетках и только одну форму в раковых клетках, где произошла делеция аллеля. См., например, публикацию Lasko et al. (1991) Annu. Rev. Genet. 25: 281-314. Частая утрата гетерозиготности в определенных областях хромосомы была обнаружена во многих типах злокачественных новообразований, что указывает на существование предполагаемых генов-супрессоров опухоли или опухолевых генов в указанных локусах или рядом с ними. Таким образом, анализ LOH является мощным инструментом поиска гена-супрессора опухоли путем сужения и идентификации области, в которой находится предполагаемый ген. См. публикации Vogelstein et al. (1988) New Engl. J. Med. 319(9): 525-532; Fearon et al. (1990) Cell 61: 759-767; и Friend et al., Nature 323: 643-646 (1986). В результате выполнения анализов были идентифицированы многие типы предполагаемых генов-супрессоров опухолей или опухолевых генов. См. публикации Call et al. (1990) Cell 60: 509-520; Kinzler et al. (1991) Science 253: 661-665; и Baker et al. (1989) Science 244: 217-221.
Мутация ”утраты функции” (LOF) является мутацией аллеля или гена, в результате которой функция генного продукта (такого как кодированный белок) становится более слабой по сравнению с нормальной функцией или полностью отсутствует в клетке или организме (включая человеческую клетку или самого человека). Мутация, при которой аллель полностью утрачивает функцию (нулевой аллель), часто именуется аморфной мутацией. Фенотипы, ассоциированные с мутациями утраты функции, часто являются рецессивными.
“Замена” представляет собой мутацию, при которой одно основание заменяется другим основанием (то есть изменение однобуквенного ”химического кода”, например, замена буквы А буквой G). Такая замена может быть (1) заменой кодона другим кодоном, кодирующим другую аминокислоту и вызывающим небольшое изменение продуцируемого белка (например, серповидно-клеточную анемию вызывает замена в гене бета-гемоглобина, в результате которой изменяется одна аминокислота в продуцируемом белке; (2) заменой кодона другим кодоном, кодирующим такую же аминокислоту и не вызывающим изменения продуцируемого белка (“молчащие мутации”); или (3) заменой кодона, кодирующего аминокислоту, одним ”терминирующим” кодоном, в результате чего образуется неполный белок (неполный белок обычно является нефункциональным).
“Инсерция” представляет собой мутацию, при которой в ДНК вводятся дополнительные пары оснований.
”Делеция” представляет собой мутацию, при которой утрачивается или удаляется участок ДНК.
“Сдвиг рамки считывания” представляет собой мутацию, вызванную инсерциями или делециями нуклеотидов, число которых не делится на три в последовательности ДНК. Вследствие экспрессии генов кодонами в виде триплетов инсерция или делеция может изменить рамку считывания (группировку кодонов), в результате чего полностью изменится трансляция по сравнению с исходной последовательностью. Такая мутация часто вызывает образование усеченных белков и утрату функции.
“Секвенирование Сангера” (получившее название по имени изобретателя Фредерика Сангера) является методом секвенирования полинуклеотидов с терминатором цепи. Особенностью метода секвенирования Сангера является использование трифосфатов дидезоксинуклеотидов (ddNTP) в качестве терминаторов цепи ДНК. Метод секвенирования Сангера часто является автоматизированным методом.
Методы ”секвенирования следующего поколения” представляют собой группу недавно разработанных высокопроизводительных методов секвенирования, при выполнении которых производится одновременное сравнение тысяч или миллионов последовательностей. Методика получения большого количества данных в сочетании с низкими затратами на получение указанных данных была признана специалистами в данной области универсальным инструментом.
Термин ”лечение” в использованном здесь значении, за исключением особо оговоренных случаев, означает реверсию, уменьшение, ингибирование развития или частичное или полное предотвращение роста опухолей, опухолевых метастазов или других вызывающих рак или неопластических клеток у субъекта. Термин ”лечение” в использованном здесь значении, за исключением особо оговоренных случаев, означает процесс лечения.
Фраза ”метод лечения” или ее эквивалент применительно к лечению рака означает процедуру или действие, направленное на уменьшение числа или устранение раковых клеток или ослабление симптомов рака. “Метод лечения” рака или другого пролиферативного заболевания необязательно означает, что раковые клетки или другие неупорядоченные клетки действительно будут уничтожены, что число клеток действительно сократится или симптомы рака или другого нарушения будут действительно ослаблены. Метод лечения рака часто применяется даже при низкой вероятности успеха, но с учетом истории болезни и предполагаемой продолжительности жизни тем не менее считается благоприятным действием.
Термин ”терапевтически эффективный агент” означает композицию, которая вызывает биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, ожидаемую исследователем, ветеринаром, лечащим врачом или другим клиницистом.
Термин ”терапевтически эффективное количество” или “эффективное количество” означает количество соединения или комбинации, которое вызывает биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, ожидаемую исследователем, ветеринаром, лечащим врачом или другим клиницистом.
“Ингибитор” является соединением, которое ингибирует (например, оказывает антагонистическое воздействие, уменьшает, снижает, блокирует, реверсирует или изменяет) действие природного или контрольного соединения, описанного выше. Такие ингибиторы могут включать любое соединение, белок, пептид, нуклеиновую кислоту (включая рибозимы и антисмысловые нуклеиновые кислоты) или продукт создания или отбора лекарственного средства/соединения/пептида, который оказывает антагонистическое действие.
“Выделенный” полинуклеотид или молекула выделенной нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновой кислоты, которая была удалена из естественного окружения (то есть была подвергнута манипуляциям человека), при этом естественным окружением такой молекулы является геном или хромосома, где молекула нуклеиновой кислоты находится в природе. В указанном значении термин ”выделенный” необязательно отражает степень очистки молекулы нуклеиновой кислоты, но показывает, что указанная молекула не включает весь геном или всю хромосому, где молекула нуклеиновой кислоты находится в природе. Полинуклеотиды, используемые в способе по настоящему изобретению для обнаружения генов (например, путем гибридизации с геном), обычно представляют собой часть гена-мишени, пригодную для использования в качестве гибридизирующего зонда или затравки для ПЦР с целью идентификации непроцессированного гена (или его части) в данном образце (например, образце клеток). Молекула выделенной нуклеиновой кислоты может включать ген или часть гена (например, регуляторную область или промотор). Молекула выделенной нуклеиновой кислоты, включающая ген, не является фрагментом хромосомы, включающей такой ген, а скорее содержит кодирующую область и регуляторные области, ассоциированные с данным геном, но не дополнительные гены, присутствующие в той же хромосоме в естественных условиях. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты может также включать последовательность нуклеиновой кислоты, фланкированную (то есть в положении 5ʹ-конца, 3ʹ-конца или обоих концов последовательности) дополнительными нуклеиновыми кислотами, которые обычно не фланкируют данную последовательность нуклеиновой кислоты в природе (то есть гетерологичные последовательности). Молекула выделенной нуклеиновой кислоты может включать ДНК, РНК (например, мРНК) или производные ДНК или РНК (например, кДНК). Хотя фраза ”молекула нуклеиновой кислоты” прежде всего означает физическую молекулу нуклеиновой кислоты и фраза “последовательность нуклеиновой кислоты” прежде всего означает последовательность нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, обе фразы могут быть использованы взаимозаменяемо, особенно применительно к молекуле нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты, способной кодировать белок. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты может быть получена методами рекомбинантных ДНК (например, путем амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), клонирования) или химического синтеза.
“Зонд” (олигонуклеотидный зонд) является молекулой нуклеиновой кислоты, длина которой обычно находится в диапазоне от около 50-100 нуклеотидов до нескольких сотен нуклеотидов и даже до нескольких тысяч нуклеотидов. Поэтому зонд может иметь любую приемлемую длину для использования в анализе, рассмотренном в настоящем описании изобретения, включая любую длину от 50 до нескольких тысяч нуклеотидов в виде приращений, определяемых целыми числами. Такую молекулу обычно используют для идентификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени в образце путем гибридизации с такой последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени в строгих условиях гибридизации. Условия гибридизации известны в данной области. См., например, публикацию Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press.
“Затравки” также являются последовательностями нуклеиновых кислот. Затравки для ПЦР обычно являются достаточно короткими олигонуклеотидами (например, 8-30 нуклеотидов), используемыми в полимеразных цепных реакциях. Затравки для ПЦР и гибридизирующие зонды могут быть легко созданы и продуцированы специалистами в данной области с использованием информации последовательности-мишени. См. публикацию Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press.
Термины ”испытуемый образец” или “образец, полученный у субъекта” обычно служат для определения образца любого типа, содержащего клетки или продукты, секретированные из клеток и анализируемые способом по настоящему изобретению, который включает, не ограничиваясь ими, образец выделенных клеток, образец ткани или образец биологической жидкости. Образец выделенных клеток является образцом клеток обычно в виде взвеси или клеток, отделенных от соединительной ткани, соединяющей клетки in vivo, которые были получены из органа, ткани или биологической жидкости любым приемлемым методом, позволяющим собрать приемлемое число клеток для исследования способом по настоящему изобретению. Клетки в образце клеток необязательно относятся к одному типу, но при этом могут быть использованы методы очистки для обогащения клеток определенного типа, подлежащего оценке. Клетки могут быть получены, например, путем соскоба с ткани, обработки образца ткани для высвобождения отдельных клеток или выделения из биологической жидкости.
“Образец ткани”, хотя и аналогичен образцу выделенных клеток, определяется в настоящем описании изобретения как срез органа или ткани, который обычно содержит клетки нескольких типов, необязательно с цитоскелетными структурами, удерживающими клетки вместе. Термин ”образец ткани” в некоторых случаях может быть использован взаимозаменяемо с термином ”образец клеток”, хотя термин ”образец ткани” чаще используется для определения более сложных структур по сравнению с образцом клеток. Образец ткани может быть получен путем биопсии, например, включающей срез, шлиф или пункцию.
“Образец биологической жидкости” подобно образцу ткани содержит исследуемые клетки и представляет собой жидкость, полученную любым методом, пригодным для взятия образца определенной биологической жидкости. Биологические жидкости, пригодные для взятия образцов, включают, не ограничиваясь ими, кровь, слизь, сперму, слюну, мокроту, бронхиальный лаваж, грудное молоко, желчь и мочу.
Термин ”контрольный уровень” означает контрольный уровень гетерозиготности, который может включать уровень, коррелированный с чувствительностью к ингибитору Wnt, или уровень, коррелированный с устойчивостью к ингибитору Wnt. Контрольный уровень может быть определен по сравнению с контрольным или базовым уровнем утраты гетерозиготности, при этом образец, полученный у субъекта, может быть чувствительным или устойчивым к лечению ингибитором Wnt (например, хорошо реагирующий субъект (у которого может быть достигнут благоприятный результат лечения), плохо реагирующий субъект или нереагирующий субъект (у которого не может быть достигнут благоприятный результат или может быть достигнут небольшой благоприятный результат лечения). В частности, термин ”контрольный уровень” может означать контрольный уровень гетерозиготности, контрольный уровень последовательности ДНК, кДНК или РНК, относящейся к дикому типу, нормальному или базовому статусу; контрольный уровень мРНК или активности RNF43; контрольный уровень мРНК или активности ZNRF3, функциональный эффект утраты гена RNF43 или гена ZNRF3, который может включать уровень, последовательность или эффект, коррелированный с чувствительностью к ингибитору Wnt, или уровень, коррелированный с устойчивостью к ингибитору Wnt. Поэтому контрольный уровень может быть определен по сравнению с контрольной гетерозиготностью, последовательностью ДНК, кДНК или РНК дикого типа, нормального или базового статуса; нормальной или базовой мРНК или активностью RNF43; нормальной или базовой мРНК или активностью ZNRF3, нормальным или базовым функциональным эффектом генов RNF43 или ZNRF3, при этом образец, полученный у субъекта, раковая клетка или клетка может быть чувствительной или устойчивой к ингибитору Wnt. Термин ”контрольный уровень” может быть использован применительно к последовательности, параметру или уровню, измеренному по сравнению с нераковой, здоровой тканью или клеткой либо тканью или клеткой дикого типа, или в конкретном варианте осуществления изобретения по сравнению с опухолевой клеткой, обработанной плацебо.
Термин ”совместимые субъекты” означает подбор контрольных субъектов на основании одной или нескольких характеристик, пригодных для оценки типа роста клеток или опухоли. Контрольные субъекты могут быть подобраны для исследуемого субъекта с учетом пола, возраста, расы или любого биологического или социологического фактора, который может влиять на базовый показатель контрольных субъектов и исследуемого субъекта (например, доклиническая стадия болезни, потребление определенных веществ, уровни других биологических или физиологических факторов).
“Фармацевтическая композиция” представляет собой комбинацию активного агента и носителя, например, инертного или активного соединения или композиции (например, детектируемый агент или метка), такого как адъювант, разбавитель, связывающее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант, адъювант и тому подобные. Носители также включают фармацевтические наполнители и добавки, например, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахара, включающие моносахариды и олигосахариды; производные сахара, такие как альдиты, альдоновые кислоты, этерифицированные сахара и тому подобные; полисахариды или полисахара), которые могут присутствовать отдельно или в комбинации, составляя 1-99,99% в расчете на массу или объем. Углеводные наполнители включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и тому подобные; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и тому подобные; полисахариды, такие как раффиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, полисахариды, такие как раффиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и тому подобные; альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит) и миоинозит. Фармацевтическая композиция может быть твердой или жидкой.
Способы
Один вариант осуществления изобретения относится к способу отбора больного раком, у которого согласно прогнозу может быть достигнут или не достигнут благоприятный эффект при терапевтическом введении ингибитора Wnt. Указанный способ включает следующие стадии:
(а) определение в полученном у субъекта образце опухолевых клеток уровня биомаркера, который может представлять собой (i) число обнаруженных копий ДНК в области хромосомы RNF43 или в области хромосомы ZNRF3 для определения утраты гетерозиготности, (ii) секвенированную геномную ДНК, кДНК или РНК из раковых тканей для обнаружения инактивирующей мутации в гене RNF43 или гене ZNRF3; (iii) результаты анализа по измерению экспрессии мРНК RNF43 или мРНК ZNRF3; (iv) результаты анализа по измерению экспрессии мРНК RNF434 или мРНК ZNRF3; (v) функциональный эффект утраты гена RNF43 или гена ZNRF3; или (vi) комбинацию биомаркеров (i)-(v);
(b) сравнение уровня биомаркера в образце опухолевых клеток с контрольным уровнем биомаркера, выбираемого из группы, состоящей из: (i) контрольного уровня биомаркера, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt; и (ii) контрольного уровня биомаркера, коррелированного с устойчивостью к ингибитору Wnt; и
(с) отбор субъекта, у которого согласно прогнозу может быть достигнут благоприятный эффект от терапевтического введения ингибитора Wnt, если опухоль субъекта имеет мутацию RNF43 или ZNRF3, либо опухоль субъекта характеризуется пониженной экспрессией мРНК или белка RNF43 или пониженной экспрессией мРНК или белка ZNRF3, из чего следует, что опухоль субъекта, по-видимому, чувствительна к ингибитору Wnt.
Статус мутации гена RNF43 или гена ZNRF3 в опухолевых клетках можно определить любым из нижеследующих методов или комбинацией указанных методов.
(i) Анализ числа копий ДНК в области RNF43 хромосомы 17 в геномном локусе 17q22 для обнаружения утраты одной или обеих копий гена RNF43. Альтернативно анализ числа копий ДНК в области ZNRF3 хромосомы 22 в геномном локусе 22q12.1 для обнаружения утраты одной или обеих копий гена. Утрата гетерозиготности RNF43 или ZNRF3 является биомаркером опухолей, выбираемых для уменьшения скорости роста таких опухолей путем введения ингибитора Wnt.
(ii) Секвенирование геномной ДНК, кДНК или РНК из раковых тканей для обнаружения инактивирующей мутации в гене RNF43. Инактивирующая мутация RNF43 или ZNRF3 является биомаркером опухолей, выбираемых для уменьшения скорости роста таких опухолей путем введения ингибитора Wnt. Инактивирующая мутация может быть нонсенс-мутацией, мутацией со сдвигом рамки, сплайсирующим вариантом или миссенс-мутацией, вызывающей замену аминокислот в положении консервативных остатков.
(iii) Анализ экспрессии мРНК RNF43 или мРНК ZNRF3 методом Taqman или другими подобными методами. Нонсенс-мутация или мутация со сдвигом рамки в мРНК часто вызывает разрушение мРНК, опосредованное нонсенс-мутацией. Поэтому отсутствие экспрессии мРНК RNF43 в раковых клетках может быть использовано в качестве вторичного или альтернативного анализа нонсенс-мутации или мутации со сдвигом рамки RNF43. Отсутствие мРНК RNF43 также может иметь место вследствие эпигенетического сайленсинга, при котором не происходит мутации геномной ДНК.
(iv) Анализ функционального эффекта утраты гена RNF43 или гена ZNRF3, который определяют по повышенным уровням белка Frizzled, повышенным уровням белка LRP6, повышенному фосфорилированию LRP6 и повышенному фосфорилированию белка Disheveled в образцах опухоли по сравнению с нормальным контрольным образцом (при этом повышенные уровни белка Frizzled, повышенные уровни белка LRP6, повышенное фосфорилирование LRP6 и повышенное фосфорилирование белка Disheveled в образцах опухоли свидетельствует о более низком уровне биомаркера гена RNF43 или биомаркера гена ZNRF3 по сравнению с контрольным уровнем).
Стадия обнаружения может быть выполнена с использованием нуклеотидного зонда, который гибридизирует с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:1 (для RNF43) или SEQ ID NO:2 (для ZNRF3).
Инактивирующая мутация может быть нонсенс-мутацией (см. таблицу 1 и таблицу 2), мутацией со сдвигом рамки (см. таблицу 1 и таблицу 2), мутацией сплайсирующего сайта или миссенс-мутацией, вызывающей замену аминокислот в положении консервативных остатков. На фиг. 2 показан сравнительный анализ белков RNF43 и ZNRF3 человека, который позволяет выявить консервативные аминокислоты в указанных белках.
Мутация сплайсирующего сайта является генетической мутацией, которая вызывает инсерции или делеции ряда нуклеотидов в определенном сайте, в котором происходит сплайсинг интрона во время процессирования предшественника матричной РНК в зрелую матричную РНК. Удаление сплайсирующего сайта вызывает сохранение одного или нескольких интронов в зрелой мРНК и может привести к продуцированию аберрантных белков.
Нонсенс-мутации или мутации со сдвигом рамки в мРНК часто вызывают разрушение мРНК, опосредованное нонсенс-мутацией. Поэтому отсутствие экспрессии мРНК RNF43 в раковых клетках может быть использовано в качестве вторичного или альтернативного анализа нонсенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки в RNF43. Отсутствие мРНК RNF43 может быть также следствием эпигенетического сайленсинга, при котором геномная ДНК не мутирует.
Стадия сравнения может быть выполнена путем сравнения уровня биомаркера в опухолевых клетках с контрольным уровнем биомаркера в одной или нескольких контрольных клетках, устойчивых к ингибитору Wnt, или в одной или нескольких контрольных клетках, чувствительных к ингибитору Wnt, или в контрольных клетках обоих типов. В соответствии с одним объектом изобретения контрольный уровень биомаркера, коррелированного с чувствительностью или устойчивостью к ингибитору Wnt, определяют заранее.
Что касается стадии отбора субъекта, у которого согласно прогнозу может быть достигнут или не достигнут благоприятный эффект от лечения ингибитором Wnt, то следует отметить, что большинство исследованных субъектов имеют опухоли, устойчивые к лечению ингибиторами Wnt. Зависимость опухолей от передачи сигналов Wnt, предположительно, встречается не так часто, как зависимость опухолей от передачи сигналов фактора роста. Кроме того, Wnt-зависимые опухоли, имеющие генетические мутации в нижней области сигнального пути Wnt, не реагируют на большинство современных ингибиторов Wnt. Таким образом, в данной области существует необходимость в отборе больных раком, которые хорошо реагируют на лечение ингибитором Wnt. Возможность прогнозирования хорошо реагирующих субъектов является основной целью определения статуса мутации RNF43 или ZNRF3 в опухолях больных раком.
Любой вариант вышеописанного способа по настоящему изобретению может быть применен к субъекту, имеющему рак любого типа. В одном варианте способа по настоящему изобретению субъект имеет карциному протоков, аденокарциному или меланому (см. таблицу 1). В другом варианте способа по настоящему изобретению субъект имеет рак поджелудочной железы, рак ободочной кишки, рак пищевода или рак кожи (см. таблицу 1, таблицу 2, таблицу 3, таблицу 4 и таблицу 5). В соответствии с еще одним способом по настоящему изобретению субъект имеет опухоль желудка с мутацией RNF43.
В любом из описанных выше вариантов осуществления изобретения можно определить чувствительность к любому ингибитору Wnt. Чувствительность к ингибитору Wnt можно определить in vitro при помощи стандартных анализов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. Воздействие ингибитора Wnt на состояние сигнального пути Wnt в опухолевых клетках можно определить, проверяя уровень β-катенина, экспрессию мРНК гена-мишени β-катенина AXIN2 и фосфорилирование LRP6. В клинических условиях воздействие ингибитора Wnt оценивают на основании уменьшения объема опухоли, определяемого методом визуализации в случае солидной опухоли, или биомаркера статуса опухоли, например, при помощи сканирования методом РЕТ.
В данной области известны методы измерения объема опухоли. См. публикацию Therasse P. et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92(3): 205-216. Один и тот же метод оценки должен быть использован для оценки каждого выявленного поражения как в начале исследования, так и на протяжении всего последующего исследования. Оценка на основании визуализации является предпочтительным методом клинического исследования при использовании обоих методов для определения противоопухолевого эффекта лечения.
Клиническое исследование. Поражения, обнаруженные в клинических условиях, подлежат измерению только в том случае, если являются поверхностными поражениями (например, узелки на коже и пальпируемые лимфатические узлы). В случае кожных поражений рекомендуется документировать измерение цветными фотографиями с использованием линейки для определения размера поражения.
Рентген грудной клетки. Поражения, выявленные при помощи рентгена грудной клетки, могут быть измерены, если такие поражения четко отображены и окружены легким, заполненным воздухом. Однако предпочтительным методом является компьютерная томография. Более подробно указанный метод оценки опухоли у субъекта описан в публикации Therasse P. et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92(3): 205-216.
Компьютерная томография (СТ) и ЯМР-томография. Компьютерная томография (СТ) и магнитно-резонансная томография (MRI) являются самыми современными и наиболее эффективными методами измерения поражений, выбранных для оценки реакции. Стандартные исследования методами компьютерной томографии и ЯМР-томографии должны быть выполнены в отношении смежных срезов толщиной 10 мм или меньше. Спиральная компьютерная томография должна быть выполнена при помощи алгоритма реконструкции смежных 5 мм срезов; данный метод применим к опухолям грудной клетки, живота и таза, в то время как опухоли головы и шеи и опухоли конечностей обычно требуют применения специальных методов. См. публикацию Therasse P. et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92(3): 205-216.
Ультразвук. Когда основной целью исследования является объективная оценка реакции, для измерения труднодоступных опухолей не следует применять ультразвук. Ультразвук может быть использован в качестве возможной альтернативы клиническим измерениям поверхностных пальпируемых лимфатических узлов, подкожных поражений и узлов щитовидной железы. Ультразвук может быть также полезен для подтверждения полного исчезновения поверхностных поражений, обычно определяемого клиническим исследованием. Доводы против использования ультразвука для измерения опухолей с целью объективной оценки реакции приведены в приложении I.
Эндоскопия и лапароскопия. Применение указанных методов для объективной оценки опухоли все еще всесторонне не обосновано. Применение указанных методов в данной связи требует сложного оборудования и большого опыта, что может быть обеспечено лишь в некоторых центрах. Поэтому использование таких методов для объективной оценки опухоли должно быть ограничено специализированными центрами. Однако такие методы могут быть использованы для подтверждения результатов полного гистопатологического исследования при получении биопсийных образцов.
Опухолевые маркеры. Опухолевые маркеры, используемые для корреляции с измерениями объема опухоли (то есть не являющиеся маркерами по настоящему изобретению), не могут быть использованы для оценки реакции. Однако, если показатели маркеров первоначально превышают верхний нормальный предел, их значения должны вернуться к нормальным уровням у субъекта, который считается полностью выздоровевшим после исчезновения всех опухолевых поражений. В настоящее время проводятся исследования по обоснованию специальных дополнительных критериев для стандартизированного использования простата-специфического антигена или ракового антигена (СА) 125 в качестве подтверждения клинических исследований.
Цитология и гистология. Цитологические и гистологические методы могут быть использованы для дифференциации частичной реакции и полной реакции в редких случаях (например, после лечения для дифференциации остаточных доброкачественных поражений и остаточных злокачественных поражений в таких опухолях как опухоли половых клеток). Цитологическое подтверждение неопластического характера любого поражения, которое возникает или ухудшается во время лечения, необходимо в том случае, когда измеряемая опухоль удовлетворяет критерию реакции или стабильного заболевания. В указанных обстоятельствах цитологическое исследование биологической жидкости позволит дифференцировать реакцию или стабильное заболевание (поражение может быть побочным эффектов лечения) и прогрессирующее заболевание (при подтверждении неопластического происхождения биологической жидкости). Новые методы, позволяющие более объективно определить реакцию опухоли, будут интегрированы в указанные критерии после обоснования возможности их применения для оценки реакции опухоли.
Утрата гетерозиготности
В одном варианте осуществления изобретения опухоли, характеризующиеся утратой гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3, с большей долей вероятности являются чувствительными к ингибитору Wnt (то есть их рост может быть замедлен ингибитором Wnt). Таким образом, субъекты, имеющие опухоли с утратой гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3, по-видимому, являются более чувствительными к лечению ингибитором Wnt, у них медленнее прогрессирует заболевание, проходит больше времени до дальнейшего развития заболевания и ниже показатель смертности. В одном варианте осуществления изобретения субъект, у которого образец опухоли содержит одну копию гена RNF43 или гена ZNRF3, согласно прогнозу может хорошо реагировать на лечение ингибитором Wnt.
Метод определения контрольного уровня утраты гетерозиготности выбирают с учетом типа образца, ткани или органа, из которого получен образец, и состояния субъекта, подлежащего оценке. Указанный метод может быть аналогичен методу, используемому для исследования образца, полученного у субъекта. В одном варианте осуществления изобретения контрольный уровень определяют, используя клетку того же типа, что и подлежащая оценке клетка. В другом варианте осуществления изобретения контрольный уровень определяют на основании контрольных образцов, полученных у субъектов или из линий клеток, которые, как известно, являются устойчивыми или чувствительными к ингибиторам Wnt. В соответствии с одним объектом изобретения контрольные образцы были получены в группе совместимых субъектов.
Для определения контрольного уровня образцы, полученные у нескольких совместимых субъектов, оценивают так же, как исследуемые образцы. Число совместимых субъектов, у которых должны быть получены контрольные образцы для определения приемлемого контрольного уровня (например, выборочная группа), может быть определено специалистами в данной области, но должно быть статистически значимым для определения приемлемого исходного уровня для сравнения с подлежащим исследованию субъектом (то есть испытуемым субъектом). Показатели, полученные на основании контрольных образцов, статистически обрабатывают, используя любой приемлемый метод статистического анализа, для определения приемлемого базового уровня при помощи стандартных методов, используемых в данной области для определения таких значений.
Число копий гена RNF43 или гена ZNRF3 в опухолевой клетке можно обнаружить при помощи флуоресцентного анализа гибридизации in situ (FISH). Метод FISH является методом на основе ДНК и может быть успешно выполнен в отношении только что полученных или сохраненных в парафине опухолевых образцов. Указанный метод хорошо разработан, и зонды могут быть легко созданы за короткое время в лабораториях клинической цитогенетики и молекулярной патологии. Зонд FISH для RNF43 мыши можно приобрести коммерческим путем, поэтому специалист в данной области может легко создать соответствующий зонд FISH для RNF43 человека. См. публикацию Rogan P. et al. (2001) Genome Res. 11(6): 1086-1094. Альтернативно существует коммерческая служба индивидуального создания зонда FISH для гена человека, такого как RNF43 или ZNRF3 человека, в частности, служба создания зондов FISH компании Empire Genomics, Buffalo, NY, USA.
Гибридизация
Ген может быть обнаружен при помощи анализов гибридизации. Гибридизация нуклеиновой кислоты просто включает контактирование зонда (то есть олигонуклеотида или более крупного полинуклеотида) и нуклеиновой кислоты-мишени в условиях, при которых зонд и комплементарная мишень могут образовывать устойчивые гибридные дуплексы в результате спаривания комплементарных оснований. В использованном здесь значении условия гибридизации являются стандартными условиями гибридизации, в которых молекулы нуклеиновых кислот используют для идентификации подобных молекул нуклеиновых кислот. Такие стандартные условия описаны, например, в публикации Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press (полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки, в частности, см. страницы 9.31-9.62). Кроме того, в публикации Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284 (полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки) приведены формулы для вычисления соответствующих условий гибридизации и промывки с целью достижения гибридизации, допускающей разные степени ошибочного спаривания нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты, не образующие гибридных дуплексов, вымываются из гибридизированных нуклеиновых кислот, после чего гибридизированные нуклеиновые кислоты могут быть обнаружены обычно при помощи присоединенной детектируемой метки. Нуклеиновые кислоты денатурируют, повышая температуру или уменьшая концентрацию соли в буфере, содержащем указанные нуклеиновые кислоты. В условиях пониженной жесткости (например, при низкой температуре, высокой концентрации соли или при наличии обоих условий) гибридные дуплексы (например, ДНК:ДНК, РНК:РНК или РНК:ДНК) образуются даже тогда, когда гибридизированные последовательности не являются полностью комплементарными. Таким образом, специфичность гибридизации уменьшается в условиях пониженной жесткости. И наоборот в более строгих условиях (например, при более высокой температуре или более низкой концентрации соли) успешная гибридизация требует меньшего числа ошибочных спариваний.
Гибридизация и промывка в строгих условиях в значении, использованном в настоящем описании изобретения, означают условия, позволяющие выделить молекулы нуклеиновых кислот, последовательности которых по меньшей мере примерно на 90% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, используемой для зондирования в реакции гибридизации (то есть условия, допускающие примерно 10% или меньше ошибочных спариваний нуклеотидов). Специалист в данной области может использовать формулы, приведенные в публикации Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284, для вычисления соответствующих условий гибридизации и промывки, обеспечивающих достижение указанных уровней ошибочного спаривания нуклеотидов. Такие условия изменяются в зависимости от образования гибридов ДНК:РНК или ДНК:ДНК. Альтернативно значение Tm можно вычислить эмпирически в соответствии с описанием, приведенным в публикации Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press, страницы 9.31-9.62.
3
125
35
14
32
Гибридизированные нуклеиновые кислоты обнаруживают при помощи одной или нескольких меток, присоединенных к образцу нуклеиновых кислот. Метки могут быть присоединены любыми способами, хорошо известными специалистам в данной области. Детектируемые метки, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают любую композицию, обнаруживаемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Приемлемые метки для настоящего изобретения включают флуоресцирующие красители (например, флуоресцеин, техасский красный, родамин, Alexa fluors, спектральные красители и тому подобные), квантовые точки, радиоизотопные метки (например, Н, I, S, C или Р) и колориметрические метки. Средства обнаружения таких меток хорошо известны специалистам с данной области. Например, радиоизотопные метки могут быть обнаружены при помощи фотографической пленки или сцинтилляционных счетчиков, флуоресцентные метки могут быть обнаружены при помощи фотодетектора, детектирующего излучаемый свет, и флуоресцентных микроскопов. Колориметрические метки обнаруживают путем простой визуализации цветной метки. Гибридизирующие нуклеиновые кислоты предпочтительно обнаруживают при помощи флуоресцентных меток и наиболее предпочтительно при помощи флуоресцентного анализа гибридизации in situ (FISH). Анализы FISH хорошо известны в данной области.
В способе по настоящему изобретению уровень утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3 в образце опухолевых клеток сравнивают с контрольным уровнем утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3, выбираемым из: (i) контрольного уровня, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt; и (ii) контрольного уровня, коррелированного с устойчивостью к ингибитору Wnt. Субъекта отбирают на основании прогноза о благоприятном результате терапевтического введения ингибитора Wnt, его агониста или лекарственного средства, обладающего по существу такой же биологической активностью, что и ингибитор Wnt, если уровень утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3 в опухолевых клетках субъекта статистически равен или выше контрольного уровня утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt, или если уровень утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3 в опухолевых клетках субъекта статистически выше уровня утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3, коррелированного с устойчивостью к ингибитору Wnt. Субъекта отбирают на основании прогноза о благоприятном эффекте терапевтического введения ингибитора Wnt, его агониста или лекарственного средства, обладающего по существу такой же биологической активностью, что и ингибитор Wnt, если уровень утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3 в опухолевых клетках субъекта статистически ниже контрольного уровня утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3, коррелированного с чувствительностью к ингибитору Wnt, или если уровень утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3 в опухолевых клетках субъекта статистически равен или меньше уровня утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3, коррелированного с устойчивостью к ингибитору Wnt.
Инактивирующая мутация
В одном варианте осуществления изобретения опухоли, имеющие инактивирующую мутацию в гене RNF43 или гене ZNRF3, с большей долей вероятности являются чувствительными к ингибитору Wnt (то есть их рост может быть замедлен ингибитором Wnt). Обнаружение одной или нескольких мутаций в гене RNF43 или гене ZNRF3 позволяет предположить, что у субъекта будет достигнут благоприятный эффект при лечении ингибитором Wnt. Указания по обнаружению одной или нескольких мутаций в гене RNF43 приведены в разделе ”Примеры”.
Обнаружение одной или нескольких мутаций в гене RNF43 или гене ZNRF3 позволяет предположить, что субъект с большей долей вероятности будет реагировать на лечение ингибитором Wnt. Отсутствие мутаций позволяет предположить, что субъект с меньшей долей вероятности будет реагировать на лечение ингибитором Wnt. Методы скрининга мутаций генов хорошо известны в данной области, описаны в публикации Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press и включают гибридизацию, полимеразную цепную реакцию, анализ в полиакриламидном геле, хроматографию или спектроскопию. Благодаря последним достижениям в ”секвенировании следующего поколения” следует признать, что прямое секвенирование полинуклеотидов становится наименее дорогостоящим и надежным методом анализа статуса мутаций гена RNF43 или гена ZNRF3.
Методы скрининга мутаций генов могут далее включать скрининг измененного белкового продукта, кодированного данным геном (например, при помощи иммуноблоттинга (в частности, вестерн-блоттинга), твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (RIA), иммунопреципитации, иммуногистохимии, иммунофлуоресценции, клеточного сортинга с возбуждением флуоресценции (FACS) и иммунофлуоресцентной микроскопии).
В случае утраты мРНК RNF43 или утраты мРНК ZNRF3 по меньшей мере 50% уменьшение мРНК можно считать показателем утраты функции, так как опухолевые клетки неравномерно распределены в образцах опухолей.
Образец, полученный у субъекта
Специалисту в данной области хорошо известны приемлемые методы получения образца у субъекта. Образец, полученный у субъекта, может включать любую биологическую жидкость или ткань, взятую у субъекта, которая может содержать опухолевые клетки или белки опухолевых клеток.
Тип образца (то есть, клетку, ткань или биологическую жидкость) выбирают с учетом доступности и структуры органа или ткани, оцениваемой в отношении роста опухолевых клеток, или типа рака, подлежащего оценке. Настоящее изобретение особенно пригодно для оценки такой опухоли как карцинома протоков, аденокарцинома или меланома (см. таблицу 1), или опухолей больных раком поджелудочной железы, раком ободочной кишки, раком пищевода или раком кожи (см. таблицу 1, таблицу 2, таблицу 3, таблицу 4 и таблицу 5). В указанных случаях типичным образцом является срез образца опухоли или образца ткани поджелудочной железы, полученного у субъекта.
Образец, полученный у субъекта, исследуют с целью обнаружения одного или нескольких любых описанных биомаркеров. В некоторых вариантах осуществления изобретения ткань, клетку или их часть (например, срез ткани, компонент клетки, такой как нуклеиновые кислоты и т.д.) вводят в соприкосновение с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами. Такие методы используют для обнаружения экспрессии гена или утраты гетерозиготности. Указанные методы могут включать клеточные или бесклеточные анализы. Ткань или клетку, экспрессирующую ген-мишень, обычно вводят в соприкосновение с детектирующим агентом (таким как, например, зонд, затравка или другой детектируемый маркер) любым приемлемым методом, таким как смешивание, гибридизация или объединение, позволяющим обнаружить ген-мишень соответствующим методом.
Образец, полученный у субъекта, готовят любым приемлемым методом. В одном варианте осуществления изобретения может быть использован только что полученный образец, замороженный образец, фиксированный образец или каким-либо другим способом сохраненный образец. Например, опухолевые клетки субъекта могут быть получены путем иммобилизации ткани субъекта в парафине. Из иммобилизованной ткани могут быть приготовлены срезы, которые затем вводят в соприкосновение с зондом для обнаружения гибридизации зонда с геном-мишенью (например, геном RNF43 или геном ZNRF3).
Контрольные уровни
Контрольный уровень не нужно устанавливать для каждого выполняемого анализа. Базовый или контрольный уровень может быть установлен на основании хранившейся информации, относящейся к ранее определенному контрольному уровню для чувствительных и устойчивых субъектов (реагирующие и нереагирующие субъекты). Контрольный уровень может быть определен для любых описанных выше методов обнаружения. Указанная форма хранившейся информации может включать справочную диаграмму, список или электронный файл с данными о группе субъектов или отдельных субъектах, имеющих чувствительные и устойчивые опухоли, или любой другой источник данных, относящийся к контрольному уровню утраты гетерозиготности гена, пригодный для подлежащего исследованию субъекта.
Контрольный уровень, используемый для сравнения, может быть контрольным уровнем любого типа, включая заранее установленный контрольный уровень, полученный в форме информации. Другие системы оценки могут быть основаны на сравнении с контрольными уровнями, и субъекты, показатели которых близки к предельным значениям, могут быть исследованы с использованием других критериев, биомаркеров или методов для подтверждения диагноза. Кроме того, предельные значения могут быть изменены по желанию клинициста или исследователя в зависимости от групп субъектов.
Контрольный уровень, коррелированный с устойчивостью к ингибиторам Wnt, в том случае, когда биомаркер является инактивирующей мутацией в гене RNF43 или гене ZNRF3, может быть определен на основании последовательности дикого типа гена RNF43 или гена ZNRF3. Такие последовательности хорошо определены и являются общедоступными. В одном варианте осуществления изобретения последовательность гена RNF43 представлена в SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления изобретения последовательность гена ZNRF3 представлена в SEQ ID NO:2.
В случае утраты мРНК RNF43 необходимо обратить внимание по меньшей мере на 50% уменьшение экспрессии мРНК в образцах опухолей.
Другой контрольный уровень для устойчивости к ингибиторам Wnt должен быть определен на основании неопухолевых образцов, полученных у того же субъекта. При отсутствии таких неопухолевых образцов может быть произведено сравнение усредненных значений, определенных для других субъектов или здоровых субъектов, так как большинство субъектов не реагируют на ингибиторы Wnt.
Статистический анализ
Стадии обнаружения биомаркеров по настоящему изобретению могут быть объединены в разные комбинации, описанные выше. Стадии могут быть выполнены в любом порядке или по существу одновременно. Статистический анализ с целью определения различий между контрольными образцами и образцами, полученными у субъектов, может быть выполнен любыми методами, известными в данной области, включая точный тест Фишера с проверкой на соответствие по критерию хи-квадрат Пирсона для качественных переменных и t-критерий Стьюдента или дисперсионный анализ для непрерывных переменных. Статистическая значимость обычно определяется как р<0,05.
Ингибиторы Wnt
Способ по настоящему изобретению предназначен для определения или прогнозирования субъектов, которые с наибольшей долей вероятности реагируют (например, с достижением благоприятного терапевтического эффекта) на лечение ингибитором Wnt или лекарственным средством, обладающим по существу такой же биологической активностью, что и ингибитор Wnt, а также для определения или прогнозирования субъектов, которые с наибольшей долей вероятности не реагируют на лечение ингибитором Wnt. Как показывает настоящее изобретение, раковые клетки с мутациями гена RND43 являются более чувствительными к ингибированию сигнального пути Wnt. Ингибирование гена RNF43 в раковых клетках вызывает повышенные уровни белка Frizzled на поверхности клетки. Таким образом, при наличии активированного сигнального пути Wnt раковые клетки, в частности, раковые клетки поджелудочной железы с мутантом RNF43 являются более чувствительными к антагонисту Wnt. См. фиг. 3 и 4, на которых изображена линия клеток HPAFII с нефункциональным белком RNF43. Авторы настоящего изобретения установили, что линия клеток Panc10.05, которая также содержит нефункциональный белок RNF43, тоже чувствительна к воздействию ингибиторов поркупина.
В одном варианте осуществления изобретения ингибитор Wnt является ингибитором поркупина, пригодным для лечения людей. Ингибитор Wnt может быть ингибитором поркупина, выполняющим такую же функцию, что и известные ингибиторы поркупина, такие как IWP-2, IWP-3 или IWP-4, которые описаны в публикации Chen B et al. (2009) Nature Chem. Biol. 5:100-107 и могут быть приобретены на коммерческой основе в компании Miltenyi Biotech под торговым названием ингибитор Wnt IWP-2 Stemolecule™ (№ 130-095-584), ингибитор Wnt IWP-3 Stemolecule™ (№ 130-095-585) и ингибитор Wnt IWP-4 Stemolecule™. Ингибиторы IWP-2 Stemolecule™, IWP-3 Stemolecule™ и IWP-4 Stemolecule™ предотвращают пальмитилирование белков Wnt поркупином (PORCN), мембраносвязанной О-ацилтрансферазой.
Альтернативно ингибиторы Wnt могут быть продуктами создания лекарственных средств, получаемыми разными методами, известными в данной области. См. международную заявку на патент WO 2010/101849, опубликованную 10 сентября 2010 г. Разные методы создания лекарственных средств, предназначенные для получения миметиков или других соединений, пригодных для использования в настоящем изобретении, рассмотрены в публикации Maulik et al. (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc. (полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки). Ингибитор Wnt может быть получен методами молекулярного разнообразия (комбинация родственных методов, позволяющих быстро создавать большие библиотеки химически разных молекул), из библиотек природных или синтетических соединений, в частности, из химических или комбинаторных библиотек (то есть из библиотек соединений, которые отличаются последовательностью или размером, но содержат одинаковые структурные блоки) или путем рационального, целенаправленного или произвольного создания лекарственных средств. См., например, публикацию Maulik et al. (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc. В соответствии с методом молекулярного разнообразия большие библиотеки соединений синтезируют, например, из пептидов, олигонуклеотидов, природных или синтетических стероидных соединений, углеводов, природных или синтетических органических и нестероидных молекул при помощи биологических, ферментативных или химических методов. Главными параметрами метода молекулярного разнообразия являются разнообразие субъединиц, размер молекул и разнообразие библиотек. Общей целью скрининга таких библиотек является последовательный комбинаторный отбор с целью получения лигандов, обладающих высоким сродством к требуемой мишени, и последующая оптимизация наиболее подходящих молекул при помощи методов произвольного или целенаправленного конструирования. Методы молекулярного разнообразия подробно описаны в публикации Maulik et al. (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения ингибитор Wnt является соединением формулы (1):
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
1
2
3
4
7
Х, Х, Х и Х выбирают из N и CR;
5
6
7
8
один из элементов Х, Х, Х и Х означает N и другие элементы являются СН;
9
Х выбирают из N и СН;
Z выбирают из фенила, пиразинила, пиридинила, пиридазинила и пиперазинила;
6
при этом каждый фенил, пиразинил, пиридинил, пиридазинил или пиперазинил элемента Z необязательно замещен группой R;
1
2
3
R, R и Rозначают водород;
m равен 1;
4
R выбирают из водорода, галогена, дифторметила, трифторметила и метила;
6
10
10
R выбирают из водорода, галогена и -С(О)R, где Rозначает метил; и
7
R выбирают из водорода, галогена, циано, метила и трифторметила.
Ингибитор Wnt может быть соединением, выбираемым из группы, включающей:
N-[5-(3-фторфенил)пиридин-2-ил]-2-[5-метил-6-(пиридазин-4-ил)пиридин-3-ил]ацетамид;
2-[5-метил-6-(2-метилпиридин-4-ил)пиридин-3-ил]-N-[5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил]ацетамид (LGK974);
N-(2,3ʹ-бипиридин-6ʹ-ил)-2-(2ʹ,3-диметил-2,4ʹ-бипиридин-5-ил)ацетамид;
N-(5-(4-ацетилпиперазин-1-ил)пиридин-2-ил)-2-(2ʹ-метил-3-(трифторметил)-2,4ʹ-бипиридин-5-ил)ацетамид;
N-(5-(4-ацетилпиперазин-1-ил)пиридин-2-ил)-2-(2ʹ-фтор-3-метил-2,4ʹ-бипиридин-5-ил)ацетамид; и
2-(2ʹ-фтор-3-метил-2,4ʹ-бипиридин-5-ил)-N-(5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил)ацетамид;
или его фармацевтически приемлемой солью.
Наиболее предпочтительно ингибитор Wnt является 2-[5-метил-6-(2-метилпиридин-4-ил)пиридин-3-ил]-N-[5-(пиразин-2-ил)пиридин-2-ил]ацетамидом (LGK974).
Лекарственное средство, обладающее по существу такой же биологической активностью, что и ингибитор Wnt, является лекарственным средством, выполняющим в основном такие же функции, что и эталонное соединение, которые были измерены или исследованы in vivo или in vitro. Например, лекарственное средство, обладающее по существу такой же биологической активностью, что и ингибитор поркупина, является лекарственным средством, выполняющим в основном такие же функции, что и эталонное соединение, такое как IWP-2, IWP-3 или IWP-4.
В другом варианте осуществления изобретения ингибитор Wnt является ингибитором танкиразы XAV939 (С9289), который может быть приобретен в компании Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA, или в других коммерческих источниках. См. публикацию Huang SM et al. (2009) Nature 461 (7264): 614-20.
Ингибиторы Wnt других типов могут включать, не ограничиваясь ими, аптамеры, РНКи и рибозимы. Аптамеры являются короткими цепями синтетических нуклеиновых кислот (обычно РНК, но также ДНК), выбираемыми из рандомизированных комбинаторных библиотек нуклеиновых кислот на основании их способности связываться с заранее определенной специфической молекулой-мишенью с высоким сродством и специфичностью связывания. Аптамеры приобретают определенную трехмерную структуру и способны различать соединения с очень незначительными различиями структуры. РНК-интерференция (РНКи) является процессом, в соответствии с которым двухцепочечная РНК и, в системах млекопитающих, короткая интерферирующая РНК (киРНК) используется для ингибирования или сайленсинга комплементарных генов. Рибозима является сегментом РНК, способным выполнять биологический катализ (например, путем разрушения или образования ковалентных связей). Рибозимы, в частности, являются антисмысловыми молекулами РНК, которые связываются с РНК-мишенью и инактивируют ее, расщепляя фосфодиэфирный остов на специфическом расщепляющем сайте.
Ингибиторы других типов могут быть подобны природным ингибиторам Wnt. Известные природные антагонисты сигнального пути Wnt включают белки Dickkopf, секретируемые Frizzled-родственные белки (sFRP), Wnt-ингибирующий фактор 1 (WIF-1) и Soggy. Члены семейства белков Dickkopf (Dkk 1-4) являются секретируемыми белками с двумя доменами с высоким содержанием цистеина, разделенными линкерной областью. Семейство Dkk также включает белок Soggy, который является гомологом Dkk-3, но не других членов данного семейства.
Белки sFRP представляют собой семейство из пяти Wnt-связывающих гликопротеинов, подобных мембраносвязанным белкам Frizzled. Самое большое семейство ингибиторов Wnt состоит из двух групп, первая из которых включает sFRP-1, 2 и 5 и вторая включает sFRP-3 и 4.
В одном варианте осуществления изобретения антагонист сигнального пути Wnt может быть растворимым рецептором Wnt, таким как белок Frizzled 8CRD-hFc, который, как указано в научной литературе, ингибирует рост тератокарцином in vivo. DeAlmeida VI et al. (2007) Cancer Res. 67(11): 5371-9.
Другие природные антагонисты сигнального пути Wnt включают WIF-1 (Wnt-ингибирующий фактор 1), секретируемый белок, который связывается с белками Wnt и ингибирует их активность.
2
Ингибитором Wnt другого типа может быть антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, антигенсвязывающий пептид или ”связывающийся партнер”. Отличительным признаком антител является то, что они включают иммуноглобулиновые домены и поэтому являются членами иммуноглобулинового надсемейства белков. Антитела могут включать поликлональные и моноклональные антитела, двухвалентные и моновалентные антитела, би- или мультиспецифические антитела, сыворотку, содержащую такие антитела, антитела, очищенные до разных степеней, и любые функциональные эквиваленты полных антител. Выделенные антитела, пригодные для использования в качестве ингибиторов Wnt, могут включать сыворотку, содержащую такие антитела, или антитела, очищенные в разной степени. Полные антитела по настоящему изобретению могут быть поликлональными или моноклональными антителами. Альтернативно в качестве ингибиторов Wnt также могут быть использованы функциональные эквиваленты полных антител, такие как антигенсвязывающие фрагменты, в которых один или несколько доменов антитела усечены или отсутствуют (например, Fv, Fab, Fabʹ или F(ab) фрагменты), а также генетически созданные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, в том числе одноцепочечные антитела или антитела, способные связываться с несколькими эпитопами (например, биспецифические антитела), или антитела, способные связываться с одним или несколькими разными антигенами (например, би- или мультиспецифические антитела).
В процессе создания находятся разные антитела, направленно воздействующие на верхнюю область сигнального пути Wnt, в том числе антитело LRP6 (Ettenberg S et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(35): 15473-8) и антитело Frizzled (Gurney A et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(29): 11717-22).
Анализы и наборы
Наборы для анализов и способы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации субъекта, клетки или ткани, которые согласно прогнозу чувствительны к определенному ингибитору Wnt. Применение такого диагностического набора аналогично применению других диагностических тестов, утвержденных государственными агентствами по регистрации лекарственных средств для использования с разрешенными лекарственными средствами. См., например, разрешение, выданное в 2011 г. Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов на использование кризотиниба для лечения ALK4-мутированного рака легких и вемурафениба для лечения BRAF-мутированной меланомы.
Наборы для анализов и способы по настоящему изобретению могут быть также использованы для определения методов лечения, которые могут повысить чувствительность раковых клеток, устойчивых к ингибиторам Wnt, и для разработки дополнительных лечебных мероприятий, позволяющих повысить чувствительность к ингибиторам Wnt.
Наборы для анализов и способы по настоящему изобретению предназначены для субъектов, страдающих любым раком, подлежащим лечению ингибиторами Wnt, таким как рак поджелудочной железы (см. таблицу 2), или имеющих любые опухоли, рост которых может быть замедлен ингибиторами Wnt, такие как карциномы протоков, аденокарциномы или меланомы (см. таблицу 1). В результате применения способов по настоящему изобретению такие субъекты могут быть избавлены от побочных эффектов и финансовых затрат на неэффективное лечение в том случае, если у них отсутствует пониженная экспрессия RNF43 или ZNRF3. Наборы для анализов и способы по настоящему изобретению также предназначены для лечащих врачей, которые могут рекомендовать или не рекомендовать лечение ингибиторами Wnt конкретным субъектам на основании информации о молекулярных характеристиках их опухолей. Наборы для анализов и способы по настоящему изобретению также увеличивают потребность в создании эффективного анализа RNF43 человека методом FISH, выполняемого с использованием разрабатываемых в настоящее время нуклеотидных зондов.
Один вариант осуществления изобретения относится к набору для анализа, предназначенному для отбора больного раком, у которого согласно прогнозу может быть достигнут или не достигнут благоприятный эффект от терапевтического введения ингибитора Wnt. Указанный набор для анализа включает:
(а) средство для обнаружения в образце опухолевых клеток уровня биомаркера или комбинации биомаркеров, выбираемого из: (i) уровня амплификации гена RNF43 или гена ZNRF3; или (ii) уровня утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3.
(b) контрольный образец, выбираемый из: (i) контрольного образца, предназначенного для выявления чувствительности к ингибитору Wnt; (ii) контрольного образца, предназначенного для выявления устойчивости к ингибитору Wnt; (iii) информации, содержащей заранее определенный контрольный уровень биомаркера, коррелированный с чувствительностью к ингибитору Wnt; или (iv) информации, содержащей заранее определенный контрольный уровень биомаркера, коррелированный с устойчивостью к ингибитору Wnt.
В одном варианте осуществления изобретения набор может далее включать средство для обнаружения мутации в гене RNF43 или гене ZNRF3.
В одном варианте осуществления изобретения средство для обнаружения мутации является нуклеотидным зондом, который гибридизирует с частью гена RNF43 или гена ZNRF3. В конкретном варианте осуществления изобретения указанное детектирующее средство является зондом для флуоресцентного анализа гибридизации in situ (FISH). Любые из указанных детектирующих средств могут содержать детектируемую метку. Любое из указанных детектирующих средств может быть иммобилизовано на субстрате.
В одном варианте осуществления изобретения средство для обнаружения утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3 может быть реагентом любого типа, пригодным для использования в способе по настоящему изобретению. Такое детектирующее средство включает зонд или затравку, которая гибридизирует в строгих условиях гибридизации с геном RNF43 или геном ZNRF3. Последовательности нуклеиновых кислот для гена RNF43 или гена ZNRF3 известны в данной области и могут быть использованы для получения таких детектирующих реагентов. В набор также могут входить дополнительные реагенты, предназначенные для выполнения анализа с использованием такого средства, в частности, реагенты для выполнения гибридизации in situ, реагенты для обнаружения флуоресцирующих маркеров, реагенты для выполнения полимеразной цепной реакции и т.д.
3
125
35
14
32
Детектирующее средство, входящее в набор для анализа по настоящему изобретению, может быть конъюгировано с детектируемой меткой. Такая метка может быть любой приемлемой меткой, позволяющей обнаружить реагенты, используемые для обнаружения представляющего интерес гена или белка, и включает, не ограничиваясь ими, любую композицию или метку, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, электрическими, оптическими или химическими методами. Приемлемые метки по настоящему изобретению включают: биотин для окрашивания меченым конъюгатом стрептавидина, магнитные шарики (например, Dynabeads™), флуоресцирующие красители (например, флуоресцеин, техасский красный, родамин, зеленый флуоресцирующий белок и тому подобные), радиоизотопные метки (например, Н, I, S, C или Р), ферменты (например, пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза и другие ферменты, обычно используемые при выполнении анализа ELISA) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото, окрашенные стеклянные или пластиковые (например, полистироловые, полипропиленовые, латексные и т.д.) шарики.
Кроме того, детектирующее средство, входящее в набор для анализа по настоящему изобретению, может быть иммобилизовано на субстрате. Такой субстрат может быть любым приемлемым субстратом для иммобилизации детектирующего реагента, который может быть использован в любом из ранее описанных методов обнаружения. Субстрат, пригодный для иммобилизации детектирующего средства, включает любую твердую подложку, такую как любая твердая органическая, биополимерная или неорганическая подложка, которая может связываться с детектирующим средством без существенного воздействия на активность или способность детектирующего средства обнаруживать требуемую молекулу-мишень. Типичные органические твердые подложки включают полимеры, такие как полистирол, найлон, фенолформальдегидные смолы и акриловые сополимеры (например, полиакриламид). Набор может также включать приемлемые реагенты для обнаружения реагента или мечения положительных или отрицательных контрольных образцов, промывающие растворы, разбавляющие буферы и тому подобные. Набор может также включать письменные инструкции по использованию данного набора и интерпретации результатов анализа.
Набор для анализа может также включать один или несколько контрольных образцов. Контрольные образцы могут включать: (i) контрольный образец для обнаружения чувствительности к ингибитору Wnt, оцениваемому в отношении использования для лечения субъекта; (ii) контрольный образец для обнаружения устойчивости к ингибитору Wnt; (iii) информацию, содержащую заранее определенный контрольный уровень конкретного биомаркера, измеряемый с целью определения чувствительности или устойчивости к ингибитору Wnt (например, заранее определенный контрольный уровень утраты гетерозиготности гена RNF43 или гена ZNRF3, коррелированный с чувствительностью к ингибитору Wnt или устойчивостью к ингибитору Wnt).
Набор может также включать средство для обнаружения контрольного маркера, соответствующего типу клеток, получаемых в качестве образца, которое может быть реагентом любого типа, используемым при осуществлении способа обнаружения известного маркера (на уровне нуклеиновой кислоты или белка) в образце, например, при помощи метода обнаружения биомаркера, рассмотренного в настоящем описании изобретения. Отличительным признаком данного средства, в частности, является то, что указанное средство идентифицирует специфический маркер анализируемых клеток, позволяющий положительно определить тип клеток. Например, при выполнении анализа опухоли легкого желательно исследовать эпителиальные клетки легкого с целью определения уровня экспрессии или биологической активности биомаркера. Таким образом, средство для обнаружения контрольного маркера идентифицирует маркер, характерный для эпителиальной клетки и предпочтительно для эпителиальной клетки легкого, благодаря чему указанную клетку можно отличить от клеток других типов, таких как клетка соединительной ткани или воспалительная клетка. Такое средство повышает точность и специфичность анализа по настоящему изобретению. Средство обнаружения контрольного маркера включает, не ограничиваясь ими, зонд, который гибридизирует в строгих условиях гибридизации с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей маркер белка, затравки для ПЦР, амплифицирующие такую молекулу нуклеиновой кислоты; аптамер, который специфически связывается с конформационно отличным сайтом молекулы-мишени; антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий пептид, который избирательно связывается с контрольным маркером в образце. В данной области известны последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности для многих клеточных маркеров, которые могут быть использованы для создания таких детектирующих реагентов.
Нижеследующие примеры предназначены для иллюстрации конкретных вариантов осуществления изобретения и разных применений изобретения. Примеры приведены только в целях дальнейшего разъяснения изобретения и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1
Как показано в таблице 1, ген RNF43 мутировал в первичной аденокарциноме протоков поджелудочной железы и в других опухолях. Нонсенс-мутации и мутации со сдвигом рамки обнаружены в девяти геномных ДНК первичных опухолей поджелудочной железы, толстой кишки, пищевода и кожи. Из указанных опухолей пять опухолей являются опухолями поджелудочной железы, при этом было исследовано 19 опухолей поджелудочной железы (мутации были обнаружены более чем в 25% образцов, исключая потенциально повреждающие миссенс-мутации).
Таблица 1
Мутация
Замена аминокислоты
Идентификатор
Патология
Область первичного поражения
Гистология (подтип)
Возраст
нонсенс
p.R337X
Х-1633
первичная
поджелудочная железа
карцинома (карцинома протоков)
44
со сдвигом рамки
неизвестна
Х-1948
первичная
поджелудочная железа
карцинома (карцинома протоков)
Данных нет
со сдвигом рамки
неизвестна
Х-2406
первичная
поджелудочная железа
карцинома (карцинома протоков)
Данных нет
со сдвигом рамки
неизвестна
Х-3184
первичная
поджелудочная железа
карцинома (карцинома протоков)
55
со сдвигом рамки
неизвестна
Х-3268
первичная
поджелудочная железа
карцинома (карцинома протоков)
78
со сдвигом рамки
неизвестна
Х-2239
первичная
толстая кишка
карцинома (карцинома протоков)
76
со сдвигом рамки
неизвестна
Х-3205
первичная
толстая кишка
карцинома (аденокарцинома)
78
со сдвигом рамки
неизвестна
Х-1433
метастазы
пищевод
карцинома (аденокарцинома)
78
нонсенс
p.W302X
Х-2163
метастазы
кожа
меланома (NS)
54
Пример 2
Как показано в таблице 2, ген RNF43 мутировал в нескольких линиях раковых клеток поджелудочной железы. Изменения в геноме были идентифицированы при помощи секвенирования Сангера в 10 линиях клеток рака поджелудочной железы, содержавших, по-видимому, только одну оставшуюся копию гена RNF43 по результатам анализа числа копий. Были идентифицированы три уникальные линии клеток с инактивирующими мутациями RNF43: HPAFII (нонсенс-мутация), Panc 10.05 (мутация со сдвигом рамки, соответствующая мутации в клетках PL45), PaTu-8988S (вредная мутация, соответствующая мутации в клетках PaTu-8988T).
Таблица 2
Линия клеток
Название гена
Замена кДНК
Экзон
Замена аминокислоты
Сохранение
Замечания
РК-1
RNF43
c.g350a
2
p.R117H
Нет
HPAFII
RNF43
c.g520t
4
p.E174X
Да
Нефункциональная
Panc 10.05
RNF43
c.54insatca
1
p.M18fs
~
Нефункциональная
PL45
RNF43
c.54insatca
1
p.M18fs
~
Нефункциональная
PaTu-8988S
RNF43
c.t206g
1
p.F69C
Да
Нефункциональная
PaTu-8988T
RNF43
c.t206g
1
p.F69C
Да
Нефункциональная
KLM-1
RNF43
c.g350a
2
p.R117H
Нет
Capan-1
RNF43
c.c692t
6
p.P231L
Нет
Неполярная и гидрофобная
KP1N
RNF43
c.c692t
6
p.P231L
Нет
Неполярная и гидрофобная
PANC-1
RNF43
c.c692t
6
p.P231L
Нет
Неполярная и гидрофобная
Дополнительная информация о линиях клеток HPAFII, Panc 10.05, PaTu-8988S, а также о других линиях клеток, содержащих инактивирующие мутации RNF43 (например, Capan-2), приведена ниже в примере 3 и примере 4.
Пример 3
Ингибирование канонического сигнального пути Wnt при помощи LGK974
Чувствительность клеток поджелудочной железы к введению LGK974 исследовали при помощи анализа пролиферации клеток in vitro. Двадцать четыре линии раковых клеток поджелудочной железы культивировали с LGK974 или без LGK974.
4
-5
2
50
Данные о пролиферации клеток были получены при использовании 384-луночного планшета. Клетки собирали и ресуспендировали в соответствующей питательной среде с плотностью 1,5×10 клеток/мл. Затем клетки культивировали на 384-луночных планшетах для культур ткани (Greiner-BioOne 789163) в конечном объеме 50 мкл/лунку до достижения плотности, равной 750 клеткам/лунку, используя диспенсер BioTek μFill (серийный номер 000-3586). Планшеты переносили в термостаты системы АСР-1 (37°С, 5% СО) и оставляли клетки для сцепления в течение ночи. Была построена кривая дозовой зависимости для LGK974 из 12 точек на основании данных 384-луночного ЕСНО-совместимого планшета (Labcyte P-05525) при самой высокой концентрации, равной 2 мМ, и самой низкой концентрации, равной 1,13×10 мМ. Примерно через 18 часов после культивирования клеток вводили 50 мл LGK974, используя планшет Labcyte ECHO555, строили кривые IC для данного планшета и повторяли процедуру для планшетов с каждой линией клеток. После добавления соединения планшеты возвращали в термостат на 120 часов. Аналитические планшеты считывали, добавляя 10 мкл 1х Cell Titer Glo (Promega G7573) в соответствии с инструкциями производителя. Затем планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и считывали в интегрированном устройстве Perkin Elmer Viewlux (экспонирование 2 секунды, двойной приемник, высокая чувствительность). Необработанные данные нормализовали на основании контрольных лунок каждого планшета, содержащих ДМСО, и вычерчивали кривую по точкам для определения IC50.
50
Рост клеток измеряли через пять дней, используя Cell Titer Glo (Promega). Как показано в таблице 3, LGK974 ингибировал рост клеток с достижением IC в нМ концентрации в ряде линий раковых клеток поджелудочной железы, включая Capan-2, PaTu-8988S и HPAFII. Как показано в таблице 4 и в примере 4, все четыре линии клеток имеют мутации утраты функции RNF43 (LOF).
Таблица 3
Линия клеток
IC<sub>50</sub> для LGK974 по результатам анализа пролиферации линии клеток
Кратное изменение ингибирования (однократно обработанные клетки/контрольные клетки)
Capan-2
0,0018
0,40
PA-TU-8988S
0,0116
0,40
HPAFII
0,0336
0,50
TCC-PAN2
>1,7
0,02
BXPC3
>2,0
0,01
HUP-T3
>2,0
0,07
KP-1N
>2,0
0,01
KP-1NL
>2,0
0,00
KP-2
>2,0
0,06
KP-3
>2,0
0,02
Panc 03.27
>2,0
0,06
Panc 05.04
>2,0
0,09
Panc 10.05
>2,0
0,02
Panc1
>2,0
0,00
PA-TU-8902
>2,0
0,02
PA-TU-8988T
>2,0
0,00
PK-1
>2,0
0,00
PK-59
>2,0
0,06
PSN-1
>2,0
0,06
SU8686
>2,0
0,03
SUIT-2
>2,0
0,00
SW1990
>2,0
0,03
YAPC
>2,0
0,20
В таблице 4 приведен список линий клеток поджелудочной железы, мутаций RNF43 в указанных линиях клеток и ингибирование сигнального пути при помощи LGK974.
Таблица 4
Идентификатор образца (линия клеток)
Потенциальная мутация LOF
Значение IC<sub>50</sub> пролиферации
Ингибирование сигнального пути
Capan-2
p.R330fs
0,0018
Да
HPAFII
p.E174X
0,0336
Да
PA-TU-8988S
F69C
0,0116
Да
PA-TU-8988T
F69C
>2,0
Да
Panc 10.05
p.M18fs
>2,0
Да
PL45
p.M18fs
данных нет
Нет
BXPC3
p.S495Y
>2,0
Да
KP1N
нет
>2,0
Да
PK-1
нет
>2,0
Да
PANC-1
нет
>2,0
Да
Panc03.27
нет
>2,0
Да
SUIT-2
нет
>2,0
Да
YAPC
нет
>2,0
Да
PANC-05-04
нет
>2,0
Да
KP-2
нет
>2,0
Да
KP-3
нет
>2,0
Да
PA-TU-8902
нет
>2,0
Да
PK-59
нет
>2,0
Да
SW1990
нет
>2,0
Да
Tcc-Pan2
нет
>2,0
Да
HUP-T3
нет
>2,0
Да
PA-TU-8902
нет
>2,0
Да
SU8686
нет
>2,0
Да
KP-1NL
нет
>2,0
Да
SW1990
нет
>2,0
Да
PK-59
нет
>2,0
Да
PSN-1
нет
>2,0
Да
HUP-T3
нет
>2,0
Да
Capan-1
нет
данных нет
Нет
KLM-1
нет
данных нет
Данных нет
HuCCT1
нет
данных нет
Данных нет
MiaPaca
нет
данных нет
Нет
PK-45H
нет
данных нет
Нет
DANG
нет
данных нет
Нет
Panc-04-03
нет
данных нет
Нет
QGP-1
нет
данных нет
Нет
Пример 4
Инактивирующая мутация RNF43 сообщает Wnt-зависимость раку поджелудочной железы
В данном примере показано, что RNF43 ингибирует сигнальный путь Wnt/β4-катенина и снижает уровень белка Frizzled на мембране раковых клеток поджелудочной железы в соответствии с механизмом отрицательной обратной связи. Ингибирование сигнального пути эндогенного Wnt повышало уровень белка Frizzled на поверхности клетки.
Было исследовано несколько линий раковых клеток поджелудочной железы с целью выявления Wnt-зависимости при использовании LGK974, ингибитора поркупина, блокирующего секрецию Wnt. Раковые клетки поджелудочной железы выращивали в среде, рекомендованной АТСС, содержащей 10% FBS.
Весьма удивительным является то, что все линии клеток, чувствительные к ингибитору поркупина, содержат инактивирующую мутацию RNF43. Ингибирование секреции Wnt или истощение 4-катенина подавляет пролиферацию опухолевых клеток поджелудочной железы, содержащих мутант RNF43, но не RNF43 дикого типа. Повторное введение RNF43 дикого типа в линии клеток, содержащих мутант RNF43, также ингибирует пролиферацию указанных клеток. LGK974 ингибирует рост опухолей поджелудочной железы, содержащих мутант RNF43 in vivo. Полученные данные показывают, что мутация RNF43 в раке поджелудочной железы сообщает Wnt-зависимость, поэтому мутация RNF43 должна быть использована в качестве биомаркера для отбора субъектов с целью создания ингибиторов Wnt.
При использовании ингибитора поркупина LGK974 были обнаружены три Wnt-зависимые линии раковых клеток поджелудочной железы, при этом все указанные линии клеток содержат мутации утраты функции RNF43. Рост указанных линий клеток, содержащих мутант RNF43, может быть ингибирован истощением β-катенина или повторной экспрессией RNF43 и ингибитором LGK974. Полученные данные показывают, что RNF43 является супрессором опухоли в случае рака поджелудочной железы и мутация RNF43 может быть использована в качестве биомаркера для прогнозирования эффективности агентов, направленно воздействующих на сигнальный путь Wnt.
Была исследована панель из 39 линий раковых клеток поджелудочной железы в отношении Wnt-зависимости при использовании ингибитора поркупина LGK974, который в настоящее время проходит клинические испытания. Весьма удивительным является то, что все линии клеток, чувствительные к LGK974, содержат инактивирующие мутации RNF43. Ингибирование секреции Wnt, истощение β-катенина или экспрессия RNF43 дикого типа блокируют пролиферацию опухолевых клеток поджелудочной железы, содержащих мутант RNF43, но не RNF43 дикого типа. LGK974 ингибировал рост опухолей поджелудочной железы, содержащих мутированный RNF43, в мышиных моделях ксенотрансплантатов.
Таблица 5
Ингибирование роста по результатам анализа фокус-формирования
Ингибирование сигнального пути по результатам анализа Axin2 методом кПЦР
BxPC3
Нет
Да
Capan-1
Нет
Нет
Capan-2*
Да
Да
CFPAC-1
Нет
Нет
DanG
Нет
Нет
HPAFII*
Да
Да
Hs766T
Нет
Не определялось
HuPT3
Нет
Да
HuPT4
Нет
Нет
KCI-MOH1
Нет
Не определялось
KLM1
Нет
Не определялось
KP1-N
Нет
Да
KP-1NL
Нет
Да
KP2
Нет
Да
KP3
Нет
Да
KP4
Нет
Нет
L3.3
Нет
Нет
MIA CaPa-2
Нет
Нет
PANC-1
Нет
Да
Pan02.03
Нет
Не определялось
Panc03.27
Нет
Да
Panc04.03
Нет
Нет
Panc05.04
Нет
Да
Panc08.13
Нет
Не определялось
Panc10.05*
Нет
Да
PaTu-8902
Нет
Да
PaTu-8988S*
Да
Да
PaTu-8988T*
Нет
Да
PK45H
Нет
Нет
PK1
Нет
Да
PK59
Нет
Да
PL45*
Нет
Нет
PSN-1
Нет
Да
QGP-1
Нет
Нет
SU86.86
Нет
Да
SUIT-2
Нет
Да
SW1990
Нет
Да
T3M4
Нет
Нет
YAPC
Нет
Да
*Линии клеток с инактивирующей мутацией RNF43
Для анализа фокус-формирования 6000-12000 клеток указанных линий клеток высевали на 6-луночный планшет для культуры ткани в 2 мл питательную среду. Клетки культивировали в течение ночи для сцепления с поверхностью лунок, после чего среду заменяли свежей питательной средой, содержащей 1 мкМ LGK974 в присутствии или отсутствии рекомбинантного Wnt3a. Для исследования shPHK DOX-индуцибельного β-катенина клетки обрабатывали 5 нг/мл доксициклина. Когда колонии клеток достигали требуемого размера, клетки фиксировали 4% формалина в PBS и окрашивали раствором кристаллического фиолетового красителя. После нескольких промывок планшеты сушили и визуализировали.
Для выполнения ПЦР с обратной транскрипцией и количественной ПЦР (кПЦР) из клеток или опухолей экстрагировали полную РНК, используя мининабор RNeasy Plus (Qiagen). 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции при помощи реагентов для обратной транскрипции Taqman (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную ПЦР выполняли в 12 мкл реакционных смесях, содержащих 0,6 мкл 20-кратного зонда Taqman и смесь затравок для ПЦР, 6 мкл 2-кратной усовершенствованной исходной смеси Taqman FAST (Applied Biosystems) и 5,4 мкл разведенной матричной кДНК. Были использованы следующие условия термоциклизации: 20 секунд при 95°С, затем 40 циклов по 1 секунде при 95°С и 20 секунд при 60°С. Все эксперименты были выполнены в четырех копиях. Анализ экспрессии генов выполняли при помощи сравнительного метода ΔΔСТ и результаты нормализовали при помощи обязательного гена GUSB или 18S. Зонды Taqman были приобретены в компании Applied Biosystems.
Отрицательная регуляция сигнального пути Wnt геном RNF43 в раковых клетках поджелудочной железы
Истощение RNF43 повышает Wnt-индуцируемую активность STF. Так как ген RNF43 часто мутирует в кистозных опухолях поджелудочной железы (Furukawa T et al. (2011) Sci. Rep. 1:161; Wu J et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(52): 21188-93), ген RNF43 может быть важным регулятором сигнального пути Wnt/β-катенина в раковых клетках поджелудочной железы. Поэтому была исследована мутация утраты функции в линии раковых клеток поджелудочной железы YAPC. Истощение RNF43 при использовании миРНК значительно повышало репортерную активность Wnt SuperTOPFlash (STF) как при отсутствии, так и в присутствии среды, кондиционированной экзогенным Wnt3a. См. фиг. 3(а).
Для выполнения анализа с использованием репортерной люциферазы клетки YAPC-STF трансфицировали миРНК и обрабатывали средой, кондиционированной Wnt3a, или соединением. Анализы с использованием люциферазы STF выполняли при помощи наборов для анализов с использованием люциферазы BrightGlo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.
Для создания линий клеток поджелудочной железы, экспрессирующих репортер STF, клетки НЕК293 выращивали в среде, рекомендованной АТСС, которая содержала 10% FBS. Ретровирус или лентивирус продуцировали из клеток НЕК203 при помощи стандартной процедуры упаковки вируса, используя трансфицирующий реагент FuGENE 6 (Roche). Линии клеток поджелудочной железы, экспрессирующие репортер STF, конструкции RNF43 или shPHK DOS-индуцибельного β-катенина, были созданы путем инфицирования вирусов и отбора лекарственных средств.
миРНК трансфицировали, используя трансфицирующий реагент Dharmafect 1 (Dharmacon) в соответствии с инструкцией производителя. Ниже приведены следующие последовательности миРНК: pGL2 (Dharmacon D-001100-01), последовательность-мишень, 5ʹ-CGTACGCGGAATACTTCGA-3ʹ; RNF43-1 (Dharmacon J-007004-12), последовательность-мишень 5ʹ-GGUGGAGUCUGAAAGAUCA-3ʹ; RNF43-2 (Dharmacon J-007004-11), последовательность-мишень, 5ʹ-GGAGAAAGCUAUUGCACAG-3ʹ; CTNNB1-1 (Dharmacon J-003482-10), последовательность-мишень, 5ʹ-UAAUGAGGACCUAUACUUA-3ʹ и CTNNB1-2 (Dharmacon J-003482-12), последовательность-мишень, 5ʹ-GGUACGAGCUGCUAUGUUC-3ʹ.
Истощение RNF43 вызывает фосфорилирование Dvl и стабилизацию β-катенина. LGK974 является ингибитором поркупина, в значительной степени ингибирующим секрецию Wnt, который в настоящее время проходит клинические испытания. Активность STF, индуцируемую миРНК RNF43 при отсутствии экзогенного Wnt3a, ингибирует LGK974 и ранее известный ингибитор поркупина IWP-2. Chen B et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5(2): 100-7. См. фиг. 3(b), на которой показано, что указанная активность зависит от экспрессии эндогенных белков Wnt. Полученные результаты показывают, что RNF43 активно подавляет аутокринный сигнальный путь Wnt/β4-катенина в клетках YAPC.
Истощение RNF43 вызывает повышение уровня FZD по результатам анализа FACS. Затем были выполнены биохимические анализы, целью которых было исследование функции RNF43 в клетках YAPC. Истощение RNF43 вызывало повышение уровня цитозольного β-катенина в соответствии с усилением активности репортера STF.
Deshevelled (DVL) является внутриклеточным сигнальным белком, локализованным внизу от белка Frizzled, который стимулирует его фосфорилирование. Истощение RBF43 увеличивает фосфорилирование DVL2 по результатам иммуногистохимического анализа. Антитело против DVL было приобретено в компании Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA.
Действительно истощение RNF43 значительно повышает уровень белка Frizzled на поверхности клетки, о чем свидетельствуют результаты проточной цитометрии с использованием пан-Frizzled антитела 18R5. В таблице 6 показано, что истощение RNF43 повышает уровень белка Frizzled (FZD) на поверхности клетки. Клетки YAPC были трансфицированы указанной миРНК, и уровни белка Frizzled на поверхности мембраны анализировали при помощи проточной цитометрии с использованием пан-Frizzled антитела 18R5.
Таблица 6Отрицательная регуляция сигнального пути Wnt геном RNF43 в раковых клетках поджелудочной железы
миРНК
Средняя интенсивность FZD по результатам анализа FACS
миРНК pGL2
237
миРНК №1 RNF43
1498
миРНК №2 RNF43
1751
Неокрашенная
33
Для выполнения проточного цитометрического анализа клетки собирали, используя не содержащий трипсина буфер для диссоциации клеток (Invitrogen), и ресуспендировали в буфере для анализа FACS (PBS с 1% BSA и 0,02% азида натрия). Клетки блокировали и инкубировали с пан-Frizzled (18R%) антителом в течение 1 часа при 4°С, а затем с вторичным антителом козы против IgG человека, конъюгированным с аллофикоцианином (АРС). Клетки несколько раз промывали буфером для FACS, окрашивали иодидом пропидия (PI) и исследовали при помощи мультиканального анализа в проточном цитометре BD LSR II. Флуоресцентные сигналы PI-отрицательных клеток были отображены в виде гистограмм.
Сверхэкспрессия RNF43 дикого типа снижает уровень мембранного белка FZD. Чтобы исключить вероятность того, что действие миРНК RNF43 опосредовано активностью, не имеющей отношения к мишени, был выполнен эксперимент по ”спасению” кДНК путем экспрессии миРНК-устойчивой кДНК RNF43 в клетках YAPC.
Экспрессия миРНК-устойчивого RNF43 в значительной степени отменяла воздействие миРНК RNF43 на уровни белка Frizzled, поэтому активность миРНК RNF43 является целенаправленной.
Сверхэкспрессия RNF43 ΔRING повышает уровень мембранного белка FZD. Истощение RNF43 также вызывает увеличение экспрессии AXIN2, гена-мишени β-катенина, и данное действие отменяется экспрессией миРНК-устойчивого RNF43. См. фиг. 3(с).
кДНК RNF43, устойчивая к миРНК RNF43, RNF43 ΔRIND (с отсутствием аминокислот 272-312) и мутант F69C были созданы при помощи двухстадийного мутагенеза методом ПЦР и клонированы в разные экспрессирующие векторы млекопитающих. Репортерная плазмида pLenti6-STF и вирусная плазмида shPHK β-катенина ранее были описаны в публикации Hao H-X et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200.
На основании пороговых значений цикла (Ct), которые были получены при выполнении анализа методом количественной ПЦР, в клетках YAPC преимущественно экспрессирован RNF43 по сравнению с ZNRF3. Полученные результаты показывают, что RNF43 отрицательно регулирует сигнальный путь Wnt, уменьшая экспрессию мембранного белка Frizzled в клетках поджелудочной железы.
RNF43 экспрессирован на более высоком уровне, чем ZNRF3 в клетках YAPC рака поджелудочной железы по результатам кПЦР, что соответствует значению указанного гена в регулировании сигнального пути Wnt. Сигнальный путь Wnt/β-катенина стимулирует развитие экзокринной полости поджелудочной железы, эктопическую экспрессию стабилизированного β-катенина и пролиферацию ацинарных клеток. Heiser PW et al. (2006) Development 133(10): 2023-32. Ранее было установлено, что белки R-спондина стимулируют сигнальный путь Wnt в результате ингибирования ZNRF3 и RNF43 и стабилизации белка Frizzled. Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200.
Сигнальный путь Wnt/β-катенина подавляет экспрессию мембранного белка Frizzled
Сигнальный путь Wnt/β-катенина отрицательно регулирует экспрессию мембранного белка FZD. Ингибитор поркупина LGK974 повышает уровень мембранного белка FZD. Установлено, что RNF43 и ZNRF3 являются генами-мишенями β-катенина. Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200; Koo BK et al. (2012) Nature 488(7413): 665-9. Однако воздействие сигнального пути эндогенного Wnt/β-катенина на экспрессию белка Frizzled не было исследовано.
В результате выполнения проточной цитометрии было установлено, что миРНК независимого β-катенина значительно повышают уровень белка Frizzled на поверхности клеток YAPC. Истощение β-катенина также снижает уровни мРНК гена-мишени β-катенина AXIN2 и RNF43. См. фиг. 4(а). В таблице 7 показано, что истощение β-катенина повышает уровень белка Frizzled на поверхности клетки. Клетки YAPC трансфицировали указанной миРНК и анализировали уровни мембранного белка Frizzled при помощи проточной цитометрии.
Таблица 7Сигнальный путь Wnt/катенина подавляет экспрессию мембранного белка Frizzled в раковых клетках поджелудочной железы
миРНК
Средняя интенсивность FZD по результатам анализа FACS
миРНК pGL2
137
миРНК №1 β-катенина
530
миРНК №2 β-катенина
561
Неокрашенная
37
В соответствии с данным наблюдением обработка ингибитором поркупина IWP2 или LGK974 повышала уровень белка Frizzled на поверхности клетки и снижала уровни мРНК AXIN2 и RNF43. См. фиг. 4(b). В таблице 8 показано, что ингибиторы поркупина повышают уровень белка Frizzled на поверхности клетки. Клетки YAPC обрабатывали 3 мкМ IWP-2 или 1 мкМ LGK974 и подвергали проточному цитометрическому анализу с целью определения экспрессии мембранного белка Frizzled.
Таблица 8Сигнальный путь Wnt/β-катенина подавляет экспрессию мембранного белка Frizzled в раковых клетках поджелудочной железы
Соединение
Средняя интенсивность FZD по результатам анализа FACS
ДМСО
721
IWP-2
1754
LGK974
1373
Неокрашенное
64
Полученные результаты показывают, что сигнальный путь Wnt/β-катенина значительно снижает уровень мембранного белка Frizzled.
Исследование мутации RNF43 в опухолях поджелудочной железы
Идентификация линий раковых клеток поджелудочной железы, содержащих инактивирующую мутацию RNF43. Открытие LGK974, сильного и избирательно действующего ингибитора поркупина, предоставило уникальное химическое средство для системного исследования зависимости от Wnt при использовании большой панели линий раковых клеток. Ингибитор LGK974 был испытан в большой панели линий раковых клеток поджелудочной железы при помощи анализа фокус-формирования. Анализ фокус-формирования был использован благодаря более высокой чувствительности по сравнению со стандартными анализами роста, такими как CellTiter-Glo, и на результаты данного анализа в меньшей степени влияют разные скорости роста разных линий клеток. Из 39 исследованных линий клеток поджелудочной железы ингибитор LGK974 продемонстрировал сильную ингибирующую рост активность только в трех линиях клеток PaTu-8988S, HPAFII и Capan-2.
Затем была предпринята попытка определить генетическое поражение, вызывающее зависимость от Wnt. RNF43 является единственным отрицательным регулятором верхней области сигнального пути Wnt, мутированного в случае рака. По указанной причине было произведено секвенирование экзона RNF43 во всех линиях раковых клеток поджелудочной железы. Весьма удивительным было то, что все три линии клеток, чувствительные к LGK974, имеют гомозиготные мутации RNF43 (HPAFII, E174X; PaTu-8988S, F69C; Capan-2, R330fs). Мутации E174X и R330fs отсекают большую часть белка RNF43 и, по-видимому, инактивируют данный белок. Последствие мутации F69C, которая вводит дополнительный цистин во внеклеточный домен RNF43, является менее ясным.
Мутации в линиях клеток были определены с помощью анализа секвенирования генома. Для выполнения секвенирования геномную ДНК экстрагировали, используя мининабор для секвенирования ДНК QIAamp (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Экзоны RNF43 амплифицировали при помощи ПЦР и секвенировали, используя платформу Applied Biosystems.
Для определения функции мутации F69C RNF43 дикого типа, меченный в положении С-концевого эпитопа НА, RNF ΔRING и RNF43 F69C устойчиво экспрессировали в клетках YAPC.
Непроцессированная кДНК RNF43 человека (NM_017763.4) была приобретена в компании Open Biosystems и помечена в положении С-концевого эпитопа НА при помощи ПЦР. кДНК RNF43, устойчивая к миРНК RNF43, RNF43 ΔRING (с отсутствием аминокислот 272-312) и мутант F69C были созданы в результате двухстадийного мутагенеза методом ПЦР и клонированы в разные экспрессирующие векторы млекопитающих. Репортерная плазмида pLenti6-STF и вирусная плазмида shPHK β-катенина были ранее описаны в публикации Hao H-X et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200.
В соответствии с функцией RNF43 в регулировании метаболизма белка Frizzled сверхэкспрессия RNF43 дикого типа снижает уровень мембранного белка Frizzled, в то время как сверхэкспрессия RNF43 ΔRING вызывает доминантную отрицательную активность и повышает уровень мембранного белка Ftizzled. Сверхэкспрессия RNF43 F69C умеренно повышает уровень мембранного белка Frizzled, поэтому F69C является мутантом с утратой функции и обладает неполной доминантной отрицательной активностью при сверхэкспрессии.
В таблице 9 показаны результаты проточного цитометрического анализа мембранного белка Frizzled в клетках YAPC, устойчиво экспрессирующих пустой вектор (EV), RNF43 дикого типа (WT) или мутант RNF43 (ΔRING или F69C).
Таблица 9
Клетки
Повторная экспрессия RNF43
EV
1040
Дикого типа
686
ΔRING
2004
F69C
1501
Неокрашенные
64
Сверхэкспрессия RNF43 ΔRING и в меньшей степени RNF43 F69C увеличивает фосфорилирование DVL2 и стимулирует Wnt3a-индуцированную репортерную активность STF. Полученные данные показывают, что F69C является инактивирующей миссенс-мутацией RNF43.
Истощение RNF43 увеличивает экспрессию мембранного FZD в клетках, содержащих RNF43 дикого типа, но не в клетках, содержащих мутант RNF43. Затем была исследована функция RNF43 в указанных линиях раковых клеток поджелудочной железы. Хотя истощение RNF43 увеличивает фосфорилирование DVL2 в клетках YAPC и РК1, двух линиях раковых клеток поджелудочной железы с RNF43 дикого типа, истощение RNF43 в клетках HPAFII, Pa-Tu-8988S и Capan-2 не увеличивало фосфорилирования DVL2. Истощение RNF43 повышает уровень белка Frizzled на поверхности клетки в линиях раковых клеток поджелудочной железы, содержащих RNF43 дикого типа (YAPC и РК1), но не мутант RNF43 (HPAFII, PaTu-8988S и Capan-2). Вместе взятые, полученные результаты показывают, что RNF43 не снижает уровень белка Frizzled в линиях раковых клеток поджелудочной железы при наличии мутации RNF43.
В таблице 10 приведены результаты проточного цитометрического анализа мембранного белка Frizzled в линиях раковых клеток поджелудочной железы, обработанных миРНК RNF43.
Таблица 10Средняя интенсивность FZD по результатам анализа FACS
Клетки
миРНК pGL2
миРНК RNF43
Неокрашенные
YAPC
353
1224
32
PK1
473
923
32
HPAFII
375
402
23
PaTu-8988S
293
245
34
Capan-2
2437
2643
23
Мутация RNF43 прогнозирует чувствительность к ингибированию Wnt в опухолях поджелудочной железы
Ингибитор LGK974 уменьшает содержание цитозольного β-катенина во всех линиях клеток. Далее была исследована зависимость Wnt в линиях раковых клеток поджелудочной железы. При выполнении анализа фокус-формирования ингибитор LGK974 существенно ингибировал рост клеток PaTu-8988S, HPAFII и Capan-2, не оказывая значительного влияния на клетки РК1 и YAPC (см. таблицу 6). Важно отметить, что ингибирующее рост воздействие LGK974 в клетках с мутантом RNF43 было отменено экзогенным Wnt3a, поэтому действие LGK974 опосредовано блокированием секреции Wnt. (При выполнении анализа фокус-формирования линии раковых клеток поджелудочной железы обрабатывали ДМСО, 1 мкМ LGK974 или LGK974 вместе с рекомбинантным Wnt3a). Анализы методом иммуноблоттинга и кПЦР показали, что LGK974 уменьшает экспрессию MYC, гена-мишени β-катенина, и увеличивает экспрессию циклин-зависимого ингибитора киназы р21 в линиях клеток, содержащих мутант RNF43, но не RNF43 дикого типа. LGK974 снижал уровень цитозольного β-катенина и уменьшал экспрессию гена-мишени β-катенина AXIN2 в линиях клеток, содержащих как мутант RNF43, так и RNF43 дикого типа, поэтому все указанные линии клеток имеют активный аутокринный сигнальный путь Wnt.
Ингибитор LGK974 вызывал экспрессию дифференцирующего маркера MUC2, MUC5A/C в клетках, содержащих мутант RNF43. Ингибитор LGK974 блокировал введение EDU в линии клеток, содержащие мутант RNF43, поэтому ингибирование Wnt в указанных клетках вызывает остановку клеточного цикла. LGK974-индуцированное ингибирование роста и дифференцировка клеток, содержащих мутант RNF43, становятся очевидными при окрашивании Ki67 (антитело против Ki67 (SP6) компании Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA 94010) и альциановым синим. LGK974 сильно ингибировал пролиферацию клеток PaTu-8988D и HPAFII, но не РК1, при выполнении анализа в мягком агаре. Клетки Capan-2 нельзя исследовать, так как указанные клетки не растут в мягком агаре. Полученные результаты показывают, что ингибирование аутокринного сигнального пути Wnt в клетках, содержащих мутант RNF43, вызывает остановку роста и дифференцировку клеток.
2
Для выполнения анализа в мягком агаре клетки суспендировали в 250 мкл 0,3% агарозы с низкой температурой плавления (Lonza) в среде DMEM, содержащей 10% FBS, и культивировали на 250 мкл отвержденной 0,8% агарозы, содержащей среду DMEM, на 48-луночных культуральных планшетах с плотностью 5000-10000 клеток/лунку. Планшет охлаждали при комнатной температуре в течение 30 минут и поверх клеток добавляли 250 мкл питательной среды. Затем планшет инкубировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО. Клетки обрабатывали свежей питательной средой, содержащей ДМСО или 1 мкМ LGK974 через каждые 3-4 дня. Колонии, достигшие требуемого размера, фотографировали и окрашивали аламаровым синим (компании Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY, USA 14072) в соответствии с инструкциями производителя. Указанные эксперименты повторяли три раза, и в каждом эксперименте дублировали по меньшей мере четыре лунки.
Для выполнения анализа пролиферации EdU клетки культивировали в питательной среде на 96-луночном планшете с плотностью 6000-12000 клеток/лунку и обрабатывали ДМСО или 1 мкМ LGK974. Через 3 дня клетки обрабатывали свежей питательной средой, содержащей 20 мкМ EdU, которая входила в комплект набора для анализа Click-iT EdU Alexa Fluor 488 (Invitrogen), и планшет инкубировали в течение 2 часов при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 минут, промывали PBS, делали проницаемыми и окрашивали 0,75% тритона Х-100 и 50 мкг/мл Hoechst в PBS в течение 30 минут. После промывки в клетках обнаруживали EdU в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для анализа EdU Click-iT. В каждом эксперименте использовали по три одинаковые лунки.
3
2
2
Процедура окрашивания альциановым синим представляет собой следующее: линии раковых клеток поджелудочной железы культивировали в 225 см колбах для культур тканей с разной плотностью и обрабатывали ДМСО или LGK974 (100 нМ) в течение 72 часов. Клеточный дебрис собирали, удаляя среду, промывали однократным PBS и добавляли 10 мл 10% формалина с буфером. Затем клетки соскабливали со дна колбы и помещали в 50 мл коническую пробирку, которую заполняли до ~50 мл 10% формалина с буфером и оставляли для фиксации на 1-2 часа. Коническую пробирку, содержащую фиксированные клетки, затем центрифугировали со скоростью 1200 оборотов/минуту в течение 5 минут, осажденные клетки заворачивали в бумагу для линз, помещали в гистологическую кассету, обрабатывали и заливали парафином. Срезы FFPE толщиной 5 мкм помещали на предметные стекла, нагревали при 60°С в течение по меньшей мере 30 минут и удаляли парафин. Предметные стекла затем дважды промывали НО, переносили в 3% водный раствор уксусной кислоты на 3 минуты и помещали в 1% альциановый синий в 3% уксусной кислоте, рН 1, на 30 минут. Затем предметные стекла помещали в проточную воду на 10 минут, после чего промывали в дистиллированной НО и помещали в 0,1% нейтральный быстрый красный (Kernechtrot) на 5 минут. Предметные стекла снова промывали в проточной воде и затем обезвоживали. И наконец предметные стекла покрывали стеклом Permaslip.
Для выполнения иммуноблоттинга были получены полные клеточные лизаты путем лизиса клеток с использованием буфера RIPA (50 мМ трис-буфера с HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 1 мМ EDTA), содержащего ингибиторы протеазы и ингибиторы фосфатазы, которые затем центрифугировали со скоростью 14000 оборотов/минуту в течение 10 минут при 4°С. Для экстракции цитозольного β-катенина клеточный дебрис ресуспендировали в гипотоническом буфере (10 мМ трис-буфера с HCl, рН 7,5, и 10 мМ KCl, содержащего ингибиторы протеазы/фосфатазы) и лизировали, выполняя три цикла замораживания-оттаивания. Равное количество белков разлагали при помощи SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4°С. Вторичные антитела, конъюгированные с HRP или инфракрасными красителями, использовали для визуализации сигналов соответственно при помощи пленки ECL или сканнера LI-COR Odyssey.
LGK974 ингибирует MYC и вызывает экспрессию белка р21 в линиях раковых клеток поджелудочной железы, содержащих мутант RNF43, но не RNF43 дикого типа. Белки Frizzled потенциируют канонический сигнальный путь Wnt/β-катенина и неканонический сигнальный путь Wnt, поэтому инактивация RNF43 вследствие мутации значительно усиливает как канонический, так и неканонический сигнальный путь Wnt. Для определения роли сигнального пути Wnt/β-катенина в росте клеток поджелудочной железы была использована shPHK β-катенина. Индуцибельная экспрессия ранее исследованной shPHK β-катенина (Scholer-Dahirel A et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(41): 17135-40) в значительной степени ингибировала пролиферацию линий раковых клеток поджелудочной железы, содержащих мутант RNF43 (PaTu-8988S, HPAFII и Capan-2), но не RNF43 дикого типа (РК1 и YAPC). Истощение β-катенина также уменьшало экспрессию гена-мишени 4-катенина AXIN2 и MYC (антитело против MYC можно приобрести в компании Abcam, Cambridge, MA, USA 02139) и увеличивало экспрессию р21 (антитело против р21 можно приобрести в компании Millipore, Bedford, MA, USA 01730), MUC2 и MUC5A/Cs в линиях клеток, содержащих мутант RNF43. Полученные результаты показывают, что воздействие LGK974 на рост клеток, по-видимому, опосредовано каноническим сигнальным путем Wnt/β-катенина.
Затем была исследована необходимость мутации RNF43 для роста клеток, содержащих мутант RNF43. Было установлено, что экспрессия RNF43 дикого типа, а не LacZ или RNF43 ΔRING, значительно ингибирует пролиферацию клеток PaTu-8988S и Capan-2, содержащих мутированный ген RNF43, не влияя при этом на клетки YAPC, содержащие RNF43 дикого типа. Сверхэкспрессия RNF43 дикого типа, вероятно, превышает незначительную доминантную активность эндогенно экспрессированной мутации F69C RNF43 в клетках PaTu-8988S. Клетки HPAFII невозможно исследовать при выполнении данного анализа, так как эффективность инфицирования вирусом указанной линии клеток является слишком низкой, поэтому нельзя получить устойчиво инфицированные клетки, используя ретровирус, экспрессирующий LacZ или RNF43 ΔRING.
Полученные результаты показывают, что для пролиферации раковых клеток поджелудочной железы, содержащих мутант RNF43, необходимо усиление сигнального пути Wnt/β-катенина, вызываемое мутацией RNF43, и что подавление сигнального пути Wnt/β-катенина в указанных клетках вызывает остановку клеточного цикла и индукцию дифференцирующих маркеров.
Блокирование секреции Wnt ингибирует рост опухолей поджелудочной железы, содержащих мутант RNF43, in vivo. Для анализа роли активации сигнального пути Wnt в сохранении опухолей поджелудочной железы, содержащих мутант RNF43, in vivo, были использованы две модели ксенотрансплантатов PDAC (HPAFII и Capan-2).
3
2
3
3
3
3
t
t
t
t
0
t
t
t
0
t
t
0
t
0
Для исследования эффективности и выполнения фармакодинамических исследований клетки собирали при плотности слияния, равной 95-110%. 10 миллионов клеток (HPAFII) или 3 миллиона клеток (Capan-2), смешанных в отношении 50:50 с базальной мембраной матрицы из матригеля BD (Matrigel) (BD Biosciences), подкожно имплантировали в верхнюю правую часть надпазушной области мышей nu/nu (Harlan) (HPAFII) или scid.bg (Harlan) (Capan-2). Рост опухолей контролировали два раза в неделю при помощи штангенциркуля и вычисляли объем опухолей (TV) по формуле эллипсоида: TV (мм)=((I×w)×3,14159))/6. Мышей, несущих ксенотрансплантаты опухолей, произвольно распределяли в экспериментальные группы (n=8 мышей в группе) через 14 дней после имплантации опухолей (Capan-2), когда средний объем опухоли достигал 223 мм (в диапазоне 200-250 мм), или через 11 дней после имплантации (HPAFII), когда средний объем опухоли достигал 341 мм (в диапазоне 272-418 мм). Мышам через желудочный зонд (р.о.) дважды в день (BID) вводили в объеме, равном 10 мл/кг, наполнитель (0,5% метилцеллюлозы (МС)/0,5% твина 80) или 0,65 мг/мл фумарата LGK974 в виде суспензии (LGK974-AE-4, коэффициент преобразования молекулярной массы свободного основания 1,293) в 0,5% МС/0,5% твина 80. Как указано в научной литературе, дозы, вводимые in vivo, являются эквивалентами свободных оснований. Лечение продолжали в течение 14 дней (HPAFII) или 35 дней (Capan-2), после чего были определены результаты противоопухолевой активности в виде процентного отношения животных, подвергавшихся лечению/контрольных животных (%Т/C), или % значения регрессии (%REG). Противоопухолевую активность вычисляли по следующей формуле: %Т/C=100 ΔΔT/ΔC, если ΔTΔ0; или %REG=100 ΔΔT/T, если ΔT<0; где Т0=средний объем опухоли (TV) в группе, получавшей лекарственное средство, в день произвольного распределения по группам; T=средний объем опухоли в группе, получавшей лекарственное средство, в конце исследования; ΔT=Т-T; C=средний объем опухоли в контрольной группе в последний день исследования; С=средний объем опухоли в контрольной группе в день произвольного распределения по группам; и ΔC=С-Ct; *значения %Т/С в диапазоне от 100 до 42% интерпретируются как отсутствие противоопухолевой активности; значения %Т/С≤42% и >10% интерпретируются как наличие противоопухолевой активности; значения %Т/С≤10% или %REG≥-10% интерпретируются как стаз опухоли. Значения %REG<-10% интерпретируются как регрессия опухоли. Отдельным, параллельно исследуемым группам животных (n=3 для каждого введения и каждого периода времени) вводили наполнитель или LGK974 с целью получения опухолевой ткани для анализа фармакодинамических маркеров ex vivo.
Введение мышам, несущим ксенотрансплантаты HPAFII, 5 мг/кг LGK974 при помощи желудочного зонда два раза в день в течение 14 дней вызвало значительное ингибирование роста опухоли (Т/С=33%) по сравнению с животными, которым вводили наполнитель. Кроме того, введение мышам, несущим ксенотрансплантаты Capan-2, 5 мг/кг LGK974 при помощи желудочного зонда два раза в день в течение 35 дней вызывало стаз опухоли (Т/С=5%). В соответствии с механизмом действия LGK974 экспрессия гена-мишени β-катенина, AXIN2, была уменьшена в ксенотрансплантатах HPAFII и Capan-2, подвергавшихся лечению. Аналогично результатам, полученным in vitro в клетках PDAC, содержащих мутант RNF43, введение LGK974 вызвало остановку клеточного цикла и дифференцировку в опухолевых ксенотрансплантатах.
Для выполнения иммуногистохимических анализов и анализов методом визуализации образцы опухолевых ксенотрансплантатов фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером в течение 6-24 часов, обрабатывали и заливали парафином. Иммуногистохимическое окрашивание выполняли в устройстве Ventana Discovery System. Изображения были получены в устройстве Aperio Scanscope. Изображения полных срезов поджелудочной железы и опухолевых ксенотрансплантатов мышей анализировали в устройстве Visiopharm. В случае опухолевых ксенотрансплантатов ткань стромы автоматически исключалась из анализа при помощи модуля Section Assembler. Некротические участки были удалены вручную при помощи изобразительных средств программного обеспечения анализа. Ткани сегментировали при помощи модуля TissuemorphDP и производили количественное определение интенсивности DAB в виде процентного значения положительных ядер для ядерных белков или процентного значения положительных элементов для белков, не являющихся ядерными белками.
Рассмотрение результатов
В данном примере было продемонстрировано, что RNF43 является отрицательным регулятором с обратной связью сигнального пути Wnt в клетках поджелудочной железы, подавляющим экспрессию мембранного белка Frizzled. Установлено, что передача сигналов Wnt/β-катенина существенно ингибирует экспрессию мембранного белка Frizzled, вероятно, благодаря индукции RNF43. Данное открытие объясняет, почему раковые клетки поджелудочной железы предпочитают мутировать RNF43, чтобы избежать сильной отрицательной регуляции с обратной связью и обеспечить высокий уровень передачи сигналов Wnt/β-катенина. Полученные данные позволяют представить RNF43 в качестве супрессора опухоли в случае рака поджелудочной железы и показывают, что мутация RNF43 может быть использована в качестве биомаркера для прогнозирования эффективности средств, направленно воздействующих на сигнальный путь Wnt.
Установлено, что LGK974 уменьшает экспрессию AXIN2 в 22 из 29 (76%) линий раковых клеток поджелудочной железы, то есть большой процент линий раковых клеток поджелудочной железы характеризуется наличием аутокринного сигнального пути Wnt. Однако по результатам анализа фокус-формирования LGK974 не влияет на рост большинства указанных линий клеток. Весьма удивительным является то, что все три линии раковых клеток поджелудочной железы, обладающие четко выраженной чувствительностью к LGK974 по результатам анализа роста, имеют мутацию утраты функции RNF43. Полученные результаты показывают, что опухоли, содержащие мутированный ген RNF43, в гораздо большей степени зависят от Wnt по сравнению с опухолями, содержащими RNF43 дикого типа.
Интересно отметить, что не все линии клеток с мутациями RNF43 чувствительны к LGK974. Обнаружены три линии раковых клеток поджелудочной железы, имеющие гомозиготную мутацию RNF43, PaTu-8988T (F69C), Panc10.05 (M18fs) и PL45 (M18fs), которые не чувствительны к воздействию LGK974. Следует отметить, что клетки Patu-8988S и Patu-8988T были выделены у одного субъекта и клетки Panc10.05 и PL45 были выделены у того же субъекта. Полученные результаты показывают, что другие механизмы могут делать опухоли, содержащие мутированный RNF43, независимыми от сигнального пути Wnt.
Выявление субъектов, которые с высокой степенью вероятности будут реагировать на лечение в клинических испытаниях, позволяет успешно создавать противораковые лекарственные средства, направленно воздействующие на молекулярном уровне с учетом токсичности указанных агентов и гетерогенности опухолей на молекулярном уровне поражения. Однако клиническая разработка указанных агентов затруднена из-за отсутствия хороших методов идентификации Wnt-зависимых опухолей. Методика, основанная на сверхэкспрессии белков Wnt или низкой экспрессии ингибиторов Wnt, является недостаточно надежной для отбора субъектов. Действительно рост многих линий клеток PDAC с четко выраженным аутокринным сигнальным путем Wnt/β-катенина не зависит от Wnt in vitro. Кроме того, передача сигналов β-катенина может быть активирована независимо от лигандов, поэтому методика, основанная на накоплении β-катенина в ядре также является ненадежной.
В результате выполненного исследования было установлено, что RNF43 является супрессором опухолей, подавляющим передачу сигналов Wnt в верхней области в случае рака поджелудочной железы. Вывод о том, что все линии раковых клеток поджелудочной железы, чувствительные к ингибитору Wnt in vitro, содержат мутацию RNF43, предполагает, что мутация RNF43 может быть использована в качестве прогностического биомаркера для отбора опухолей поджелудочной железы для клинического испытания с целью проверки эффективности ингибитора Wnt.
Содержание всех патентов и публикаций, приведенных в настоящем изобретении, полностью включено в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Подробное описание предназначено для иллюстрации изобретения и не ограничивает его объем. Специалисту в данной области должны быть очевидны другие варианты осуществления изобретения, которые входят в объем прилагаемой формулы изобретения.