ПРОМОТОР
PROMOTER

Настоящее изобретение относится к области экспрессии белка и отбору клеток. В настоящем изобретении предусмотрен промотор с низкой силой и, соответственно, с ограниченной экспрессией функционально связанный с кодирующей нуклеиновой кислоты.
Предпосылки создания изобретения
Экспрессия белков представляет фундаментальный процесс, протекающий в живых клетках. Вся информация, необходимая для экспрессии белка, содержится только в нуклеиновой кислоте. Такая нуклеиновая кислота не только содержит информацию о последовательности аминокислот в белке, но также необходимую информацию о регуляции (например, о сайте связывания с рибосомой, сигналах начала и конца транскрипции, сигналах сплайсинга, элементах энхансеров и др.), включая промотор/промоторную последовательность.
Промотор - нуклеиновая кислота, которая регулирует интенсивность транскрипции нуклеиновой кислоты, например, кодирующей полипептид, с которой он функционально связан, в иРНК-предшественнике. Это элемент контроля транскрипции, который локализован вокруг сайта инициации РНК-полимеразы с 5'-конца, функционально связан с кодирующей последовательностью. Из анализа раннего промотора SV40 известно, что сайты распознавания/связывания для активаторов транскрипции содержатся в промоторах в сегментах, состоящих из 7-20 пар оснований. Один сегмент является сайтом начала синтеза РНК, например, хорошо известный сегмент ТАТА-box. Другие сегменты, расположенные примерно на удалении 30-110 п.о. от 5'-конца, т.е. вверх по цепи, к сайту начала синтеза РНК, определяют частоту инициации транскрипции. Промотор нуждается по меньшей мере в одном сегменте, который инициирует синтез РНК по определенному сайту и в определенном направлении, т.е. в направлении от 5'-конца к 3'-концу.
BAD
PL
Известными промоторами являются lac-lpp, ara-, lac-, tac-, trc-, trp-, phoA-, P-, λ-, lpp- и Т7-промотор. Промотор SV40 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, происходящей от генома вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (Simian Virus 40 - SV40). Для рекомбинантной выработки гетерологичного полипептида в эукариотических или прокариотических клетках обычно внедряют в клетку одну или несколько экспрессирующих плазмид. Экспрессирующая плазмида (плазмиды) включает кассету для экспрессии гетерологичного полипептида, а также кассету для экспрессии селективного маркера, который требуется для отбора трансфецированных клеток, экспрессирующих гетерологичный полипептид. Синтез и гетерологичного полипептида, и селективного маркера, нуждается в части объема клеточного механизма экспрессии.
Поскольку задачей, выдвинутой в настоящем изобретении, является получение преимущественно гетерологичного полипептида, основная доступная часть механизма клеточной экспрессии должна быть предназначена для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид. Всего лишь незначительное количество может применяться для экспрессии селективного маркера. Такое распределение способности к экспрессии осуществляют через силу соответствующих промоторов. Более сильный промотор представляет в большей степени функционально связанную нуклеиновую кислоту, транскрибированную и таким образом транслируемую. Поэтому существует потребность в промоторах с регулируемой или редуцируемой силой промотора.
Taylor W.E. и др., (Endocrinol. 137, 1996, сс.5407-5414) описывают делегированные варианты промотора фактора стволовых клеток человека. В патентной заявке US 2007/0092968 описаны новые hTMC промотор и векторы для экспрессии генов, избирательных в отношении опухоли, и высоко эффективных противоопухолевых лекарственных агентов. Fromm и др. (J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, сс.457-481, и J. Mol. Appl. Gen., 2, 1983, сс.127-135) опубликовали картирование делеций и мутации по типу делеций вируса SV-40 в области раннего промотора. Хитин-связывающие фрагменты хитиназы описаны в US 6399571. В WO 99/62927 описан ростовой фактор-4 соединительной ткани.
Краткое описание изобретения
Одним из объектов настоящего изобретения является промотор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 02, или SEQ ID NO: 03, или SEQ ID NO: 04, или SEQ ID NO: 06. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения промотор включает последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 04.
Вторым объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 04 и обладающая силой промотора, составляющей 20% или менее по сравнению с силой промотора SV40 дикого типа последовательности SEQ ID NO: 05, в случае функциональной связи с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 07, кодирующей зеленый флуоресцирующий белок (green-fluorescent-protein - GFP).
Другим объектом настоящего изобретения является способ отбора клеток, включающий следующие стадии в представленном порядке:
а) трансфекции эукариотических клеток нуклеиновой кислотой, включающей
i) первую кассету экспрессии, включающую нуклеиновую кислоту, которая кодирует гетерологичный полипептид,
ii) вторую кассету экспрессии, включающую нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 04 и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер, при этом первая нуклеиновая кислота функционально связана со второй нуклеиновой кислотой,
б) культивирования указанных трансфецированных клеток в условиях, пригодных для роста нетрансфецированных эукариотических клеток,
в) отбора клеток, размножившихся на стадии б), а также
i) размножающихся в определенных культуральных условиях, или
ii) экспрессирующих селективный маркер.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения объектом настоящего изобретения являются клетки млекопитающих. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетками млекопитающих являются клетки СНО, клетки ВНК, или клетки PER.C6, или клетки НЕК, или клетки Sp2/0. В другом варианте осуществления настоящего изобретения гетерологичным полипептидом является иммуноглобулин, или фрагмент иммуноглобулина, или конъюгат иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения селективным маркером является неомицин-аминогликозидфосфотрансфераза, или гигромицин-фосфотрансфераза, или dLNGFR, или GFP.
Четвертым объектом настоящего изобретения является способ экспрессии гетерологичного полипептида, включающий следующие стадии в представленном порядке:
а) трансфекции клеток млекопитающих нуклеиновой кислотой, включающей кассету экспрессии, содержащую первую нуклеиновую кислоту, SEQ ID NO: 02, или SEQ ID NO: 03, или SEQ ID NO: 04, или SEQ ID NO: 06, функционально связанную со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид,
б) отбора клеток, трансфецированных на стадии а),
в) культивирования отобранных клеток в условиях, пригодных для экспрессии гетерологичного полипептида,
г) восстановления гетерологичного полипептида из клеток или культуральной среды.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетками млекопитающих являются клетки СНО, или клетки ВНК, или клетки PER.C6, или клетки НЕК, или клетки Sp2/0. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первой нуклеиновой кислотой является последовательность SEQ ID NO: 04. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота кодирует иммуноглобулин, или фрагмент иммуноглобулина, или конъюгат иммуноглобулина. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота включает вторую кассету экспрессии, кодирующую селективный маркер.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предусмотрена нуклеиновая кислота нового промотора с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 02, или SEQ ID NO; 03, или SEQ ID NO: 04, или SEQ ID NO: 06.
Способы и методики, применимые для выполнения настоящего изобретения, известны специалистам в данной области и описаны, например, в кн.: «Current Protocols in Molecular Biology», 1997, под ред. Ausubel P.M., тома I-III, и в кн.: «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 1989, под ред. Sambrook и др., 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Специалистам в данной области известно применение методов рекомбинации ДНК для получения многочисленных производных нуклеиновой кислоты и/или полипептида. Такие производные могут быть, например, модифицированы по одному или нескольким положениям замещением, изменением, заменой, делецией или инсерцией. Модификация или получение производных могут быть, например, произведены с помощью сайт-направленного мутагенеза. Такие модификации могут быть легко выполнены специалистами в данной области (см., например, кн.: Sambrook J. и др. «Molecular Cloning: A laboratory manual», 1999, изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Нью-Йорк, США). Применение рекомбинантной технологии позволяет специалистам в данной области трансформировать в разные клетки-хозяева нуклеиновую кислоту (нуклеиновые кислоты).
Понятие «промотор» относится к нуклеиновой кислоте, т.е. полинуклеотидной последовательности, которая контролирует транскрипцию нуклеиновой кислоты, с которой он функционально связан. Промотор может включать сигналы связывания РНК-полимеразы и инициации транскрипции. Используемый промотор (промоторы) может функционировать в таком типе клеток-хозяев, в котором предполагается экспрессия функционально связанной нуклеиновой кислоты. Большое число промоторов, включая конститутивные, индуцибельные и репрессируемые промоторы из разнообразных источников, известны в данной области (и идентифицированы в базах данных, например, в базе данных GenBank). Они доступны в качестве клонированных полинуклеотидов или в составе клонированных полинуклеотидов (например, из коллекции, а также из других коммерческих или индивидуальных источников). «Промотор» включает нуклеотидную последовательность, которая направляет транскрипцию, например, функционально связанного структурного гена. Обычно промотор локализован в 5'-некодирующей или 5'-нетранслируемой области (5'-untranslated region - 5'UTR) гена, проксимально расположенной по отношению к сайту начала транскрипции структурного гена. Элементы последовательности в промоторах, которые задействованы в инициации транскрипции, часто отличаются консенсусными нуклеотидными последовательностями. Такие элементы последовательности включают сайты связывания РНК-полимеразы, последовательности ТАТА, последовательности СААТ, специфичные по дифференциации элементы (differentiation-specific elements - DSE; McGehee R.E. и др., Mol. Endocrinol. 7, 1993, с.551), элементы ответа цАМФ (cyclic AMP response elements - CRE), элементы сывороточного ответа (serum response elements - SRE; Treisman R. Seminars in Cancer Biol. 1, 1990, с.47), элементы глюкокортикоидного ответа (glucocorticoid response elements - GRE) и сайты связывания других факторов транскрипции, например, CRE/ATF (O'Reilly М.А. и др., J. Biol. Chem. 267, 1992, с.19938), АР2 (Ye J. и др., J. Biol. Chem. 269, 1994, с.25728), SP1, белка, связывающего элементы ответа цАМФ (cAMP response element binding protein - CREB; Loeken M.R., Gene Expr. 3, 1993, сс.253-264) и октамерные факторы (основные положения см. кн.: «Molecular Biology of the Gene» под ред. Watson и др., 1987, 4-е изд., изд-во The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Lemaigre F.P., Rousseau G.G., Biochem. J. 303, 1994, сс.1-14). Если промотор является индуцибельным промотором, скорость транскрипции повышается в ответ на индуцирующий агент. Напротив, скорость транскрипции не регулируется индуцирующим агентом, если промотор является конститутивным промотором. Также известны репрессирующие промоторы. Например, промотор c-fos специфически активируется при связывании гормона роста с его рецептором на поверхности клетки. Регулируемая тетрациклином (tet) экспрессия может быть активирована искусственными гибридными промоторами, которые состоят, например, из CMV промотора, сопровождаемого двумя сайтами Tet-оператора. Tet-репрессор связывается с двумя сайтами Tet-оператора и блокирует транскрипцию. При добавлении индуктора тетрациклина Tet-репрессор высвобождается с сайтов Tet-оператора и происходит транскрипция (Gossen M., Bujard H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, сс.5547-5551). О других индуцибельных промоторах, включая промотор металлотионеина и промоторы теплового шока, см., например, Sambrook и др., (выше), и Gossen M. и др., Curr. Opin. Biotech. 5, 1994, сс.516-520, Среди эукариотических промоторов, описанных в качестве сильных промоторов, для высокого уровня экспрессии присутствуют ранний промотор вируса SV40, главный поздний промотор аденовируса, промотор металлотионеина-1 мыши, длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса, фактор элонгации 1 альфа китайского хомячка (Chinese hamster elongation factor 1 alpha - CHEF-1, см., например, US 5888809), EF-1 альфа человека, убиквитин и прямой ранний промотор цитомегаловируса человека (cytomegalovirus immediate early - CMV IE). Энхансер (т.е., а cis-действующий элемент ДНК, который действует на промотор для повышения транскрипции) может быть необходимым для действия в соединении с промотором для повышения уровня экспрессии, достигаемого с одним промотором, и может быть включен в качестве элемента регуляции транскрипции. Часто полинуклеотидный сегмент, содержащий промотор, может также включать энхансерные последовательности (например, CMV или SV40).
Понятие «нуклеиновая кислота» в контексте настоящего изобретения означает полимер, состоящий из отдельных нуклеотидов, т.е. полинуклеотид. Это понятие относится к природным, а также к частично или полностью неприродным нуклеиновым кислотам, которые, например, кодируют полипептид, который может быть получен путем рекомбинации. Нуклеиновая кислота может быть построена из фрагментов ДНК, либо выделенных, либо синтезированных химическими методами. Нуклеиновая кислота может быть интегрирована в другую нуклеиновую кислоту, например, экспрессирующую плазмиду или геном/хромосому клетки-хозяина. Плазмида включает челночные и экспрессирующие векторы. Обычно плазмида также может включать начало репликации (т.е. репликатор, например, репликатор ColE1) и селективный маркер (например, ген устойчивости к ампициллину или тетрациклину) для репликации и отбора, соответственно, вектора у бактерий.
Понятие «сила промотора» и его грамматические эквиваленты, используемые в настоящем изобретении, означают эффективность промотора в транскрипции функционально связанной нуклеиновой кислоты. Степень силы промотора может быть высокой, т.е. от 90% до более чем 100%, или средней, т.е. от 40% до менее чем 90%, или низкой, т.е. до менее чем 40%, по сравнению с силой промотора вируса SV40 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO: 05. Эта величина может быть определена сравнением количества гетерологичного полипептида, функционально связанного с промотором, с количеством экспрессированного гетерологичного полипептида, функционально связанного с промотором вируса SV40 дикого типа в клетках того же типа. Это может быть выполнено, например, путем определения количества экспрессированного полипептида в СНО- или HEK-клетках, трансфецированных кассетой экспрессии, состоящей из исследуемого промотора, функционально связанного с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид методом ELISA. Путем сравнения этого экспрессированного количества того же гетерологичного полипептида в той же линии клеток, трансфецированных кассетой экспрессии, состоящей из промотора вируса SV40 дикого типа, функционально связанного с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид, определенный тем же методом ELISA, т.е. сравнивая количество гетерологичного полипептида в тех же клетках с той же экспрессирующей плазмидой, в которой заменен только промотор, может быть определена относительная сила промотора. Понятие «промотор вируса SV40 дикого типа», используемое в настоящем изобретении, означает нуклеиновую кислоту с последовательностью SEQ ID NO: 05, которая соответствует положениям 72-411 нуклеиновой кислоты с последовательностью SEQ ID NO: 01, представляющей геном SV40.
Понятие «функционально связанный» относится к соприкосновению двух или нескольких компонентов, причем компоненты, описанные таким образом, находятся в связи, допуская их функционирование определенным присущим им образом. Например, промотор и/или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если он действует в cis-положении для контроля или модулирования транскрипции связанной кодирующей последовательности. В большинстве случаев, но не обязательно, последовательности ДНК, которые «функционально связаны», соприкасаются и при необходимости соединяют два белка, кодирующие области, например, секреторную лидерную/сигнальную последовательность и полипептид, прилегающих друг к другу и находящихся в одной рамке считывания. Однако, хотя функционально связанный промотор обычно расположен выше по цепи кодирующей последовательности, не обязательно, чтобы он с ней соприкасался. Энхансеры не должны соприкасаться. Энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если энхансер повышает транскрипцию кодирующей последовательности. Функционально связанные энхансеры могут быть локализованы выше по цепи, внутри цепи или ниже по цепи кодирующих последовательностей и на существенном расстоянии от промотора. Сайт полиаденилирования функционально связан с кодирующей последовательностью, если он локализован с конца, расположенного книзу от кодирующей последовательности таким образом, что транскрипция направляется через кодирующую последовательность на последовательность полиаденилирования. Связывание выполняется методами рекомбинации, известными в данной области, например, используя методологию ПЦР, и/или лигированием по соответствующим сайтам рестрикции. Если соответствующих сайтов рестрикции нет, тогда используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с традиционной практикой.
В рамках охвата настоящего изобретения трансфецированные клетки могут быть получены практически любым известным в данной области методом трансфекции. Например, нуклеиновая кислота может быть интродуцирована в клетки с помощью электропорации или микроинъекции. В другом варианте могут применяться реагенты для липофекции, например, FuGENE 6 (фирма Roche Diagnostics GmbH, Германия), X-tremeGENE (фирма Roche Diagnostics GmbH, Германия) и LipofectAmine (фирма Invitrogen Corp., США). В еще одном варианте нуклеиновая кислота может быть внедрена в клетки с помощью соответствующих систем вирусных векторов, основанных на ретровирусах, лентивирусах, аденовирусах или адено-ассоциированных вирусах (Singer О., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2004, сс.5313-5314).
Понятие «клетка» или «клетка-хозяин» относится к клетке, в которой нуклеиновая кислота, например, кодирующая гетерологичный полипептид или составляющая кшРНК, может быть интродуцирована/трансфецирована, или уже интродуцирована/трансфецирована. К клеткам-хозяевам относятся и прокариотические клетки, которые применяют для размножения векторов/плазмид, и эукариотические клетки, которые применяют для экспрессии нуклеиновых кислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эукариотическими клетками являются клетки млекопитающих. В другом варианте осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева млекопитающих выбраны из клеток млекопитающих СНО (например, СНО К1 или СНО DG44), клеток ВНК, клеток NS0, клеток SP2/0, клеток НЕК 293, клеток НЕК 293 EBNA, клеток PER.C6 и клеток COS. В другом варианте осуществления настоящего изобретения клетки млекопитающих выбраны из группы, включающей гибридомы, миеломы и клетки грызунов. К клеткам миеломы относятся клетки миеломы крысы (например, YB2) и клетки миеломы мыши (например, NS0, SP2/0). Полипептиды для фармацевтического применения в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вырабатываются в клетках млекопитающих, например, клетках СНО, клетках NS0, клетках Sp2/0, клетках COS, клетках НЕК, клетках ВНК, клетках PER.C6 или в других. Для ферментации клеток-хозяев и, следовательно, для экспрессии целевого полипептида, используют культуральную среду. В настоящее время клетки СНО широко применяются для экспрессии фармацевтических полипептидов, или в небольшом лабораторном масштабе, или в большом масштабе при производственных процессах. Из-за широкого распространения и применения отличительные свойства и генетическая среда клеток СНО известна. Следовательно, клетки СНО одобрены контролирующими органами для получения терапевтических белков для их назначения людям. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки являются клетками СНО.
Понятие «кассета экспрессии» относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит элементы, необходимые для экспрессии и секреции по меньшей мере имеющегося структурного гена в клетке-хозяине. Нуклеиновая кислота также отличается последовательностью, состоящей из отдельных нуклеотидов, или аминокислотной последовательностью, кодируемой молекулой нуклеиновой кислоты.
Понятие «ген» означает нуклеиновую кислоту, представляющую сегмент, например, на хромосоме или на плазмиде, который может влиять на экспрессию пептида, полипептида или белка. Рядом с кодирующей областью, т.е. структурным геном, ген включает другие функциональные элементы, например, сигнальную последовательность, промотор (промоторы), интроны и/или терминаторы.
Понятие «структурный ген» означает область гена без сигнальной последовательности, т.е. кодирующую область.
Понятие «экспрессия» в контексте настоящего изобретения относится к процессам транскрипции и/или трансляции, происходящим в клетке. Уровень транскрипции целевого продукта в клетке-хозяине может быть определен по количеству соответствующей иРНК, присутствующей в клетке. Например, иРНК, транскрибированная с выбранной нуклеиновой кислоты, может быть оценена количественно методом ПЦР или норзен-гибридизацией (см. Sambrook и др., «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 1989, изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Белок, кодированный выбранной нуклеиновой кислотой, может быть оценен количественно разными методами, например, методом ELISA, по оценке биологической активности белка, или с помощью исследований, независящих от такой активности, например, методом вестерн-блоттинга или радиоиммуноанализа, используя антитела, которые распознают и связывают белок (см. выше Sambrook и др., 1989),
Понятие «регуляторные элементы» в контексте настоящего изобретения относятся к нуклеотидным последовательностям, находящимся в cis-положении, которые необходимы для транскрипции и/или трансляции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой полипептид. Элементы регуляции транскрипции в норме включают промотор выше по цепи от экспрессируемой нуклеиновой кислоты, сайты инициации и терминации транскрипции, а также сигнальную последовательность полиаденилирования. Понятие «сайт инициации транскрипции» означает нуклеотид в нуклеиновой кислоте, соответствующий первому нуклеотиду, инкорпорированному в первичный транскрипт, т.е. предшественник иРНК; сайт инициации транскрипции может перекрываться с последовательностью промотора. Понятие «сайт терминации транскрипции» означает нуклеотидную последовательность, в норме находящуюся на 3'-конце транскрибируемого целевого гена, которая вызывает окончание транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой. Сигнальная последовательность полиаденилирования, или поли-А дополнительный сигнал, обеспечивает сигнал для расщепления по специфическому сайту с 3'-конца эукариотической иРНК и пост-трансляционное добавление в ядре последовательности примерно из 1 GO-200 адениновых нуклеотидов (поли-А хвост) к отщепляемому 3'-концу. Сигнальная последовательность полиаденилирования может включать консенсусную последовательность ААТААА, локализованную примерно на 10-30 нуклеотидов выше по цепи от сайта расщепления.
Понятие «долипептид» означает полимер из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, получаемый естественным образом или путем синтеза. Полипептиды менее чем примерно из 20 аминокислотных остатков могут называться «пептидами». Полипептиды, включающие две или несколько аминокислотных цепей или включающие аминокислотную цепь длиной 100 аминокислот или более, могут называться «белками». Полипептид или белок также может включать компоненты, не являющиеся пептидами, например, углеводные группы или ионы металлов. Углеводы и другие заместители, не являющиеся пептидами, могут быть добавлены к белку клеткой, в которой вырабатывается белок, и могут варьировать в зависимости от типа клетки. Белки и Полипептиды в настоящем изобретении выражены в терминах аминокислотного каркаса молекул; дополнения, например углеводные группы, обычно не указывают, но тем не менее они могут присутствовать.
Понятия «гетерологичная ДНК» или «гетерологичный полипептид» относится к молекуле ДНК или к полипептиду, или к популяции молекул ДНК или популяции полипептидов, которые естественным образом в данной клетке-хозяине отсутствует. Молекулы ДНК, гетерологичные по отношению к определенной клетке-хозяину, могут содержать ДНК, производную от видов клеток-хозяев (т.е. эндогенную ДНК), таким образом, что ДНК, производную от клеток-хозяев, комбинируют с ДНК, производной от клеток, не являющихся клетками-хозяевами (т.е. экзогенной ДНК). Например, молекулу ДНК, содержащую сегмент ДНК не из клетки-хозяина, который кодирует полипептид, функционально связанную с сегментом ДНК хозяина, кодирующим промотор, расценивают в качестве молекулы гетерологичной ДНК. И напротив, молекула гетерологичной ДНК может включать эндогенный структурный ген, функционально связанный с экзогенным промотором. Пептид или полипептид, кодируемый молекулой ДНК, не являющейся ДНК хозяина, является «гетерологичным» пептидом или полипептидом.
Понятие «селективный маркер» означает нуклеиновую кислоту, которая позволяет произвести отбор клеток, несущих эту нуклеиновую кислоту, по специфическому признаку (за или против) в присутствии соответствующего «селективного агента». Полезным положительным селективным маркером является, например, ген устойчивости к антибиотику. Селективный отбор позволяет отобрать трансформированную клетку в присутствии соответствующего селективного агента; нетрансформированная клетка не может расти или выживать в селективных условиях культивирования, т.е. при наличии селективного агента. Селективные маркеры могут быть положительными, отрицательными или двойного действия. Положительные селективные маркеры позволяют отбирать клетки, несущие маркер, а отрицательные селективные маркеры позволяют избирательно уничтожать клетки, несущие селективный маркер. Обычно селективный маркер может подтвердить устойчивость к лекарственному средству или компенсировать метаболический или катаболический дефект в клетках. Селективные маркеры для эукариотических клеток включают, например, гены аминогликозид-фосфотрансферазы (aminoglycoside phosphotransferase - АРН), например, гигромицин-фосфотрансферазы (hygromycin phosphotransferase - HYG), неомицин- и G418-аминогликозид-фосфотрансферазы, дигидрофолат-редуктазы (dihydrofolate reductase - DHFR), тимидин-киназы (thymidine kinase - TK), глутамин-синтетазы (glutamine synthetase - GS), аспарагин-синтетазы, триптофан-синтетазы (селективный агент - индол), гистидинол-дегидрогеназы (селективный агент - гистидинол D) и гены, обусловливающие устойчивость к пуромицину, блеомицину, флеомицину, хлорамфениколу, зеоцину и микофеноловой кислоты. Дополнительные селективные маркеры описаны в WO 92/08796 и WO 94/28143.
Понятие «механизм экспрессии», используемое в настоящем изобретении, означает сумму ферментов, кофакторов и др. в клетке, которые участвуют в процессе, начинающемся с транскрипции нуклеиновой кислоты или гена (т.е. также может быть применено понятие «механизм генной экспрессии»), и длящемся до посттрансляционной модификации полипептида, кодируемого указанной нуклеиновой кислотой. Понятие «механизм экспрессии», например, включает стадии транскрипции ДНК в предшественника иРНК, сплайсинга предшественника иРНК в зрелую иРНК, трансляции иРНК в полипептид и посттрансляционной модификации полипептида.
7
Понятие «в условиях, пригодных для экспрессии гетерологичного полипептида» означает условия, которые используют для культивирования клеток млекопитающего, экспрессирующих гетерологичный полипептид, и которые известны или могут быть легко определены специалистом в данной области. Специалистам известно, что эти условия могут варьировать в зависимости от типа культивируемых клеток млекопитающего и типа экспрессируемого белка. Обычно клетки млекопитающих культивируют при температуре, например, от 20°С до 40°С, в течение времени, достаточного для эффективной выработки белка, например, в течение 4-28 суток, в объеме от 0,1 до 10 л.
Понятие «в условиях, приемлемых для роста нетрансфецированных клеток» означает условия, которые обычно используют для культивирования нетрансфецированных клеток той же клеточной линии. Эти условия известны и могут быть легко определены специалистом в данной области.
Понятие «выделение гетерологичного полипептида» в контексте настоящего изобретения означает осаждение, высаливание, ультрафильтрацию, диафильтрацию, лиофилизацию, уменьшение объема растворителя для получения концентрированного раствора, или хроматографию. Обычно хроматографирование применяют для разделения и очистки полипептидов. Различные методы разработаны и широко применяются для выделения и очистки белков, например, аффинная хроматография с применением микробных белков (например, аффинная хроматография с белком А или белком G), ион-обменная хроматография, например, катионообменная (с карбоксиметильными смолами), анионообменная хроматография (с аминоэтильными смолами) и смешанного типа обмена), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH лигандами), хроматография гидрофобного взаимодействия или ароматической адсорбции (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами или m-аминофенилборной кислотой), аффинная хроматография с хелатированием металла (например, с Ni(II)- и Cu(II)-аффинным материалом), эксклюзионная хроматография и методы электрофореза (например, методы гель-электрофореза, капиллярного электрофореза) (Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, сс.93-102).
Понятие «иммуноглобулин» относится к белку, состоящему из одного или нескольких полипептидов, преимущественно кодируемых генами иммуноглобулинов. К установленным генам иммуноглобулина относятся разные гены константной области, а также множество генов вариабельной области иммуноглобулина. Иммуноглобулины могут существовать в различных форматах, включая, например, Fv, Fab и F(ab)2, а также отдельные цепи (scFv) или двухвалентные антитела (например, Huston J.S. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, сс.5879-5883, Bird R.E. и др., Science 242, 1988, сс.423-426; общая информация представлена в кн.: Hood и др., Immunology, 1984, Benjamin Нью-Йорк, 2-е изд., и в работе Hunkapiller Т., Hood L., Nature 323, 1986, сс.15-16).
Иммуноглобулин обычно включает два так называемых полипептида легкой цепи (легкие цепи) и два так называемых полипептида тяжелой цепи (тяжелые цепи). Каждый из полипептидов тяжелой и легкой цепи содержит вариабельный домен (вариабельную область) (обычно аминоконцевую часть полипептидной цепи), включающий области связывания, которые могут взаимодействовать с антигеном. Каждый из полипептидов тяжелой и легкой цепи включает константную область (обычно карбоксильную концевую часть). Константная область тяжелой цепи опосредует связывание антитела i) с клетками, несущими Fc гамма рецептор (FcR), например, фагоцитарными клетками, или и) с клетками, несущими неонатальный Fc рецептор (FcRn), также называемый рецептором Brambell. Она также опосредует связывание с некоторыми факторами, включая факторы классической системы комплемента, например, компонент (C1q). Вариабельные домены легкой или тяжелой цепей иммуноглобулина в свою очередь включают разные сегменты, т.е. четыре каркасных участка (framework regions - FR) и три гипервариабельных области (CDR).
H
H
H
H
L
Понятие «фрагмент иммуноглобулина» означает полипептид, включающий по меньшей мере один домен из группы доменов, включающих вариабельный домен, домен C1, шарнирную область, домен C2, домен C3, домен C4 тяжелой цепи иммуноглобулина или вариабельный домен или домен C легкой цепи иммуноглобулина. Это понятие также относится к производным и их вариантам. Дополнительно может присутствовать вариабельный домен, в котором одна или несколько аминокислот или аминокислотных областей делегированы.
Понятие «конъюгат иммуноглобулина» означает полипептид, включающий по меньшей мере один домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, конъюгированной через пептидную связь с другим полипептидом. Другим полипептидом является пептид, не относящийся к иммуноглобулинам, например, гормон, ростовой рецептор, антифузогенный пептид или др.
Настоящее изобретение предусматривает промотор с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 02, или SEQ ID NO: 03, или SEQ ID NO: 04, или SEQ ID NO: 06.
Способ идентификации потенциально высоко продуктивного клона клеток представляет связывание экспрессии гена селективного маркера и структурного гена, кодирующего гетерологичный полипептид, через внутреннюю сторону входа рибосомы (internal ribosome entry site - IRES). С этой целью экспрессия гетерологичного полипептида может коррелировать с экспрессией селективного маркера. Другой способ представляет амплификацию гена. В связи с ней клетки, дефицитные по ферменту дегидрофолат-редуктазе (dihydrofolate reductase - DHFR), трансфецируют вектором/плазмидой, которая содержит первую экспрессирующую кассету для экспрессии белка DHFR и вторую экспрессирующую кассету для экспрессии гетерологичного полипептида. Применяя культуральную среду, не содержащую глицина, гипоксантина и тимидина, устанавливают селективные культуральные условия. Для амплификации добавляют метотрексат (МТХ) - ингибитор DHFR (Kaufman R.J. и др., J Mol. Biol. 159, 1982, cc.601-621; US 4656134). Обычно могут применяться гены какого-либо типа, чьи продукты экспрессии локализованы/могут быть выявлены на поверхности клеток в качестве маркера для обогащения и отбора трансфектантов. Усеченная форма рецептора фактора роста нервов низкого сродства (dLNGFR - low-affinity nerve growth factor receptor) неактивна в плане сигнальной трансдукции, которая экспрессируется на поверхности клеток, и установлено, что она является весьма полезным маркером для биологического анализа клеток (Philipps К. и др., Nat. Med. 2, 1996, сс.1154-1156, Machi A.W. и др., Cytometry 29, 1997, сс.371-374).
Если непременно не требуется понизить выработку целевого гетерологичного пептида, экспрессия селективного маркера, который требуется для отбора клеток, вырабатывающих гетерологичный полипептид, т.е. успешно трансфецированных клеток, должна быть низкой насколько это возможно, но тем не менее она должна оставаться на выявляемом уровне.
Неожиданно было обнаружено, что указанная потребность может быть в полной мере удовлетворена за счет промотора по настоящему изобретению. При использовании промотора по настоящему изобретению могут быть отобраны клетки, экспрессирующие гетерологичный полипептид на высоком уровне по сравнению с клетками, отобранными в тех же условиях и без использования промотора по настоящему изобретению. Неожиданно было установлено, что с промотором по настоящему изобретению клетки, экспрессирующие гетерологичный полипептид, могут быть выделены при сниженных затратах. Дополнительно было обнаружено, что при применении промотора по настоящему изобретению могут быть отобраны клетки, которые экспрессируют гетерологичный полипептид на повышенном уровне по сравнению с клетками, отобранными путем применения промотора SV40 полной длины в тех же условиях и при тех же концентрациях селективного агента.
Понятие «укороченный с 5'-конца промотор SV40» в контексте настоящего изобретения означает промотор SV40 дикого типа, в котором определенное число последовательно расположенных нуклеотидов с 5'-конца последовательности нуклеиновой кислоты было делегировано.
Таким образом, настоящее изобретение описывает промотор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 02. Последовательность SEQ ID NO: 02 включает нуклеотиды с 61 по 348 промотора SV40 дикого типа последовательности SEQ ID NO: 05, т.е. нуклеотиды с 1 по 60 были делегированы. Получение промотора с последовательностью SEQ ID NO: 02 показано в примере 1.
Настоящее изобретение также описывает промотор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 03. Последовательность SEQ ID NO: 03 соответствует нуклеотидам со 130 по 348 промотора SV40 дикого типа последовательности SEQ ID NO: 05, т.е. нуклеотиды с 1 по 129 были делегированы. Получение промотора с последовательностью SEQ ID NO: 03 показано в примере 2.
Окончательно настоящее изобретение описывает промотор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 04. Последовательность SEQ ID NO: 04 представляет нуклеотиды со 177 по 348 промотора SV40 дикого типа последовательности SEQ ID NO: 05, т.е. нуклеотиды с 1 по 176 были делегированы. Получение промотора с последовательностью SEQ ID NO: 04 показано в примере 3.
Окончательно настоящее изобретение описывает промотор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 06. Последовательность SEQ ID NO: 06 состоит из нуклеотидов с 203 по 348 промотора SV40 дикого типа последовательности SEQ ID NO: 05, т.е. нуклеотиды с 1 по 202 были делегированы.
Для определения силы промоторов у промоторов с последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 02-04 и 06 были получены экспрессирующие плазмиды, в которых каждый из промоторов функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent protein - GFP, SEQ ID NO: 07). Из фиг.7а)-в) следует, что делеция с 5'-конца нуклеотидов в нуклеиновой кислоте промотора SV40 дикого типа снижает силу промотора. Промотор последовательности SEQ ID NO: 02 имеет примерно ту же силу, что и промотор полной длины SV40 дикого типа. Промоторы SEQ ID NO: 03 и 04 обладают силой промоторов, составляющей примерно 56% и примерно 19%, соответственно. Таким образом, с применением промоторов по настоящему изобретению экспрессия нуклеиновой кислоты, функционально связанной с этими промоторами, может быть понижена или ограничена по сравнению с промотором SV40 дикого типа.
Промотору обезьяньего вируса SV40 предшествуют два повтора из 72 п.о. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый повтор из 72 п.о. делегирован, а второй повтор из 72 п.о. поддерживается. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота по настоящему изобретению включает нуклеиновую кислоту последовательности SEQ ID NO: 14 перед нуклеиновой кислотой последовательности SEQ ID NO: 04. В другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота по настоящему изобретению включает второй повтор из 72 п.о. последовательности SEQ ID NO: 14 промотора обезьяньего вируса SV40. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в нуклеиновой кислоте по настоящему изобретению первый повтор из 72 п.о. промотора обезьяньего вируса SV40 делегирован, а второй повтор из 72 п.н. промотора SV40 поддерживается. Это полезно для экспрессии гетерологичного полипептида. В этом варианте осуществления настоящего изобретения промотор по настоящему изобретению, который содержит только второй повтор из 72 п.о. промотора SV40 дикого типа, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей селективный маркер. При пониженной силе промотора экспрессия с этого селективного промотора снижается, а экспрессия гетерологичного полипептида поддерживается за счет применения, например, промотора SV40 дикого типа последовательности SEQ ID NO: 05. Таким образом, было обнаружено, что комбинация промотора по настоящему изобретению, функционально связанного с нуклеиновой кислотой, кодирующей селективный маркер промотора дикого типа, например, SV40 или CMV, функционально связанного с нуклеиновой кислотой, кодирующей целевой гетерологичный полипептид, приводит к улучшенной экспрессии гетерологичного полипептида по сравнению с конструкциями, в которых нуклеиновая кислота, кодирующая селективный маркер, а также нуклеиновая кислота, кодирующая целевой гетерологичный полипептид, обе функционально связаны с промотором дикого типа.
В стабильных клеточных клонах нуклеиновая кислота, кодирующая селективный маркер, и нуклеиновая кислота, кодирующая гетерологичный полипептид, а также их соответствующие промоторы, интегрированы совместно в геном указанной клетки. Поскольку расположение места встраивания в геном носит случайный характер, обычно проводят стадию отбора. На стадии отбора выбирают только клетки, у которых включены в геном соединенные нуклеиновые кислоты в тесной близости с локусом, обладающим высокой активностью к транскрипции. Клетки, у которых или внедренная нуклеиновая кислота расположена далеко от такого локуса, или обе нуклеиновые кислоты внедрены в разные локусы, элиминируют на стадии отбора.
Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, включающая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 02, или SEQ ID NO: 03, или SEQ ID NO: 04, или SEQ ID NO: 06, которая имеет силу промотора 90% или более, или от 40% до менее чем 90%, или менее 40% от силы промотора SV40 дикого типа последовательности SEQ ID NO: 05 при функциональной связи с нуклеиновой кислотой последовательности SEQ ID NO: 07.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота имеет последовательность SEQ ID NO: 04, а сила промотора составляет 20% или менее от силы промотора SV40 дикого типа с последовательностью SEQ ID NO: 05, если каждая из них по отдельности функционально связана с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO: 07.
Если нуклеиновая кислота и промотор, соответственно, по настоящему изобретению, причем промотор имеет пониженную силу, т.е. нуклеиновая кислота, функционально связанная с ним, транскрибируется в уменьшенном количестве или с пониженной скоростью при сравнении с промотором SV40 дикого типа, они имеют различные применения.
Например, они могут использоваться для индукции экспрессии функционально связанного селективного маркера, позволяя отбирать клетки, несущие этот селективный маркер, без необходимости использовать значительную часть объема клеточного механизма экспрессии. В результате экспрессия, например, совместно экспрессируемого гетерологичного полипептида, не уменьшается.
Другим объектом настоящего изобретения является способ отбора клеток, экспрессирующих гетерологичный полипептид, включающий следующие стадии;
а) трансфекции эукариотических клеток нуклеиновой кислотой, включающей
i) первую экспрессирующую кассету, включающую нуклеиновую кислоту, которая кодирует гетерологичный полипептид,
ii) вторую экспрессирующую кассету, включающую первую нуклеиновую кислоту SEQ ID NO: 04 и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер, при этом первая нуклеиновая кислота функционально связана со второй нуклеиновой кислотой,
б) культивирования указанных трансфецированных клеток в условиях, пригодных для роста нетрансфецированных эукариотических клеток,
в) отбора клеток, размножившихся на стадии б), а также
i) размножающихся в селективных условиях, или
ii) экспрессирующих селективный маркер.
К клеткам, применимым для данного способа, относятся, например, клетки СНО, клетки ВНК, клетки PER.C6, клетки НЕК, клетки HeLa, клетки SP2/0, клетки NSO, клетки миеломы или клетки гибридомы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки являются клетками млекопитающего, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки выбраны из клеток СНО, клеток ВНК, клеток НЕК, клеток Sp2/0 или клеток PER.C6.
Гетерологичные полипептиды могут быть какими-либо целевыми гетерологичными полипептидами, например, пролекарствами, ферментами, фрагментами ферментов, ингибиторами ферментов, активаторами ферментов, биологически активными полипептидами, эмбриональными сигнальными белками семейства Hh (hedgehog proteins), белками морфогенеза костей, факторами роста, эритропоэтином, тромбопоэтином, G-CSF, интерлейкинами, интерферонами, иммуноглобулинами или антифузогенными пептидами, или его фрагментами, или его конъюгатами. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гетерологичным полипептидом является иммуноглобулин, или фрагмент иммуноглобулина, или конъюгат иммуноглобулина.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стадия в) способа представляет отбор клеток, размножившихся на стадии б) в селективных условиях культивирования, т.е. в присутствии селективного агента. В другом варианте осуществления настоящего изобретения стадия в) способа представляет отбор клеток, размножившихся на стадии б) и экспрессирующих селективный маркер, кодируемый указанной второй нуклеиновой кислотой. В первом варианте осуществления настоящего изобретения представлены трансфецированные клетки, культивированные в присутствии селективного агента, который ингибирует размножение клеток, нетрансфецированных или недостаточно экспрессирующих вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Во втором варианте осуществления настоящего изобретения представлены трансфецированные клетки, выращенные в отсутствии селективного агента, например, сортировкой клеток по флуоресценции (FACS) или визуально.
Отбор клеток может проводиться в одну стадию или на протяжении многих стадий. При одной/многих стадиях процедура первого отбора может быть выполнена, основываясь, например, на пороговом уровне селективного маркера, например, dLNGFR или GFP. Например, для отбора жидкостной цитометрией, например, методом сортировки клеток по флуоресценции (fluorescence activated cell sorting - FACS), устанавливают пороговый уровень флуоресценции и отбирают клетки с флуоресценцией выше порогового уровня. В другом варианте могут быть отобраны клетки с наивысшей интенсивностью флуоресценции, составляющей 1-15% (т.е. 15% клеток с наиболее интенсивным выявляемым уровнем), или 1-10%, или 1-5%, или 5-10%, в той же популяции. Другим способом отбора клеток является иммунологическое связывание, например, с магнитными гранулами, покрытыми белком А или специфическими иммуноглобулинами. Выбранная панель клеток может быть взята в качестве основной популяции для дальнейшей стадии отбора, например, путем высева отдельных клеток, культивированием и ферментсвязанным иммуносорбентным анализом (Enzyme-linked Immunosorbent Assay - ELISA), или клонированием путем серийных разведении, или размножением путем культивирования в течение нескольких суток и последующим отбором методом FACS, или последующим отбором методом FACS с повышенным пороговым уровнем, который может, например, основываться на интенсивностях флуоресценции, выявляемых в предшествующем отборе FACS, или методом иммунопреципитации (см., например, WO 2005/020924). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения отбор клеток может проводиться методом, выбранным из жидкостной цитометрии, ELISA, иммунопреципитации, иммуноаффинной колоночной хроматографии, иммуноаффинной сортировки на магнитных гранулах, методах выделения, основанных на микроскопировании, или иммунологического связывания. В другом варианте осуществления настоящего изобретения отбор клеток по настоящему изобретению может быть выполнен методом, выбранным из жидкостной цитометрии, ELISA, иммунопреципитации, иммуноаффинной колоночной хроматографии, иммуноаффинной сортировки на магнитных гранулах, методами выделения, основанными на микроскопировании или иммунологическом связывании, с последующим методом, выбранным из высева отдельных клеток и культивирования, серийного разведения, или размножением путем культивирования с последующим способом, выбранным из FACS, иммунопреципитации, иммуноаффинной колоночной хроматографии, иммуноаффинной сортировки на магнитных шариках, методах выделения, основанных на микроскопировании, или ELISA.
Последним объектом настоящего изобретения является способ экспрессии гетерологичного полипептида в клетках путем функционального связывания промотор по настоящему изобретению с нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный гетерологичный полипептид. Этот способ пригоден для экспрессии, например, крупных белков с низкой растворимостью или медленной кинетикой сворачивания. Уменьшение количества или скорости экспрессии гетерологичного полипептида, или трансляции нуклеиновой кислоты может применяться, если гетерологичный полипептид или нуклеиновая кислота неблагоприятно воздействует на клетки-хозяева или снижает общую продуктивность способного функционировать, т.е. с корректной укладкой, гетерологичного полипептида. Следовательно, один из объектов настоящего изобретения представляет экспрессию или выработку гетерологичного полипептида с пониженной фракцией нефункционального, т.е. с неправильной укладкой, полипептида. Если гетерологичный полипептид, экспрессированный в клетке-хозяине, например, превышает определенный размер по массе, или числу аминокислот, или числу субъединиц, или числу вторичных модификаций, возможно его получение после культивирования клеток-хозяев в нефункциональной, т.е. неактивной форме или в форме с неправильной укладкой. Одна из возможностей исправить такое положение заключается в уменьшении количества, т.е. степени экспрессии, белка. Поскольку экспрессия регулируется силой функционально связанного промотора, промоторы по настоящему изобретению для этого хорошо применимы.
Таким образом, настоящее изобретение включает способ экспрессии или выработки гетерологичного полипептида с пониженной фракцией нефункционального полипептида, в котором имеются следующие стадии в следующем порядке:
а) трансфекции клеток млекопитающих нуклеиновой кислотой, включающей экспрессирующую кассету, содержащую промотор SEQ ID NO: 02, или SEQ ID NO: 03, или SEQ ID NO: 04, или SEQ ID NO: 06, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей гетерологичный полипептид,
б) отбора клеток, трансфецированных на стадии а),
в) культивирования отобранных клеток в условиях, пригодных для экспрессии гетерологичного полипептида,
г) выделения гетерологичного полипептида из клеток или культуральной среды.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения объектом настоящего изобретения являются клетки млекопитающих СНО, клетки ВНК, клетки НЕК, клетки Sp2/0 или клетки PER.C6. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в способе промотором является последовательность SEQ ID NO: 03, или SEQ ID NO: 04. В другом варианте осуществления настоящего изобретения промотором является последовательность SEQ ID NO: 04. В другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует гетерологичный полипептид, кодирующий иммуноглобулин, или фрагмент иммуноглобулина, или конъюгат иммуноглобулина. В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение включает нуклеиновую кислоту второй экспрессирующей кассеты, кодирующей селективный маркер.
Последующие примеры, перечень последовательностей и фигуры приведены для понимания настоящего изобретения, истинная область охвата которого представлена ниже в формуле изобретения. Очевидно, что модификации могут производиться в приводимых ниже методах без отступления от духа настоящего изобретения.
Описание фигур
Фиг.1. Карта плазмиды 5500.
Фиг.2. Карта плазмиды 5501.
Фиг.3. Карта плазмиды 4703.
Фиг.4. Карта плазмиды 4712.
Фиг.5. Карта плазмиды 4713.
Фиг.6. Анализ FACS dLNGFR-экспрессии НЕК293ЕВНА-клеток, трансфецированных:
а) кассетой экспрессии последовательности SEQ ID NO: 05, функционально связанной с последовательностью SEQ ID NO: 07,
б) кассетой экспрессии последовательности SEQ ID NO; 04, функционально связанной с последовательностью SEQ ID NO: 07,
в) кассетой экспрессии последовательности SEQ ID NO: 06, функционально связанной с последовательностью SEQ ID NO: 07.
Фиг.7. FACS анализ GFP-экспрессии HEK293EBNA-клеток, трансфецированных:
а) кассетой экспрессии последовательности SEQ ID NO: 05, функционально связанной с последовательностью SEQ ID NO: 07,
б) кассетой экспрессии последовательности SEQ ID NO: 03, функционально связанной с последовательностью SEQ ID NO: 07,
в) кассетой экспрессии последовательности SEQ ID NO: Об, функционально связанной с последовательностью SEQ ID NO: 07.
Пример 1. Конструирование нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 02
4
Укороченный с 5'-конца промотор SV40 последовательности SEQ ID NO: 02 получают реакцией ПЦР с промотором SV40 полной длины в качестве матрицы, функционально связанной с нуклеиновой кислотой, кодирующей dLNGFR (плазмида 4788). Смесь для ПЦР содержит: 1 × буфер PWO (фирма Roche Molecular Biochemicals, Маннгейм, Германия), обогащенный 2 мМ MgSO, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) ПЦР нуклеотидной смеси (фирма Roche Molecular Biochemicals, Маннгейм, Германия), 1 мкМ прямого праймера последовательности SEQ ID NO: 08, 1 мкМ обратного праймера последовательности SEQ ID NO: 13, 50 нг ДНК-матрицы плазмиды 4788, 2,5 единицы PWO-ДНК-полимеразы (PWO = Pyrococcus woesei; фирма Roche Molecular Biochemicals, Маннгейм, Германия), добавляют 100 мкл бидистиллированной сверхчистой водой. Условия проведения ПЦР: 1 мин при 94°С, 1 цикл; 0,5 мин при 94°С, 25 циклов; 0,5 мин при 55°С, 25 циклов; 1 мин при 72°С, 25 циклов; 5 мин при 72°С, 1 цикл.
Пример 2. Конструирование нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 03
4
Укороченный с 5'-конца вариант промотора SV40 последовательности SEQ ID NO: 03 получают реакцией ПЦР с промотором SV40 полной длины в качестве матрицы, функционально связанной с нуклеиновой кислотой, кодирующей dLNGFR из плазмиды 4788. Смесь для ПЦР содержит: 1 × буфер PWO, обогащенный 2 мМ MgSO, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) ПЦР нуклеотидной смеси, 1 мкМ прямого праймера последовательности SEQ ID NO: 09. 1 мкМ обратного праймера последовательности SEQ ID NO: 13, 50 нг ДНК-матрицы плазмиды 4788, 2,5 единицы PWO-ДНК-полимеразы, добавляют 100 мкл бидистиллированной сверхчистой водой. Условия проведения ПЦР: 1 мин при 94°С, 1 цикл; 0,5 мин при 94°С, 25 циклов; 0,5 мин при 55°С, 25 циклов; 1 мин при 72°С, 25 циклов; 5 мин при 72°С, 1 цикл.
Пример 3. Конструирование нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 04
4
Укороченный с 5'-конца вариант промотора SV40 последовательности SEQ ID NO: 04 получают реакцией ПЦР с промотором SV40 полной длины в качестве матрицы, функционально связанной с нуклеиновой кислотой, кодирующей dLNGFR (плазмида 4788). Смесь для ПЦР содержит: 1 × буфер PWO, обогащенный 2 мМ MgSO, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) ПЦР нуклеотидной смеси, 1 мкМ прямого праймера последовательности SEQ ID. NO: 10. 1 мкМ обратного праймера последовательности SEQ ID NO: 13, 50 нг ДНК-матрицы плазмиды 4788, 2,5 единицы PWO-ДНК-полимеразы, добавляют 100 мкл бидистиллированной сверхчистой водой. Условия проведения ПЦР: 1 мин при 94°С, 1 цикл; 0,5 мин при 94°С, 25 циклов; 0,5 мин при 55°С, 25 циклов; 1 мин при 72°С, 25 циклов; 5 мин при 72°С, 1 цикл.
Пример 4. Конструирование дополнительных промоторов
4
Дополнительные укороченные с 5'-конца варианты промотора SV40 получают реакцией ПЦР с промотором SV40 полной длины в качестве матрицы, функционально связанной с нуклеиновой кислотой, кодирующей dLNGFR (плазмида 4788). Смесь для ПЦР содержит: 1 × буфер PWO, обогащенный 2 мМ MgSO, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) ПЦР нуклеотидной смеси, 1 мкМ прямого праймера последовательности SEQ ID NO: 11 (получая SEQ ID NO: 06 или SEQ ID NO: 12,) 1 мкМ обратного праймера последовательности SEQ ID NO: 13, 50 нг ДНК-матрицы плазмиды 4788, 2,5 единицы PWO-ДНК-полимеразы, добавляют 100 мкл бидистиллированной сверхчистой водой. Условия проведения ПЦР: 1 мин при 94°С, 1 цикл; 0,5 мин при 94°С, 25 циклов; 0,5 мин при 55°С, 25 циклов; 1 мин при 72°С, 25 циклов; 5 мин при 72°С, 1 цикл.
Пример 5. Экспрессия dLNGFR, функционально связанного с последовательностями SEQ ID NO: 02, 03, 04 и 06
Праймер, с которым были получены нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 02, 03, 04 и 06, содержит сайты рестрикции эндонуклеаз Sail и EcoRI. Используя такие сайты рестрикции/эндонуклеазы рестрикции, указанные нуклеиновые кислоты, функционально связанные с нуклеиновой кислотой, кодирующей dLNGFR, см., например, Philipps K., и др., Nat. Med. 2, 1996, сс.1154-1156; или Machi A.W. и др., Cytometry 29, 1997, сс.371-374), лигируют в плазмиду 4736-pUC-DHFR, которая линеаризирована с использованием сайтов рестрикции Sail и PvuII. Образуются следующие плазмиды:
5500-pUC-DHFR_dLNGFR_дикий тип SV40 (плазмидная карта представлена на фиг.1),
5501-pUC-DHFR_dLNGFR_укороченная_2 (плазмидная карта представлена на фиг.2),
5502-pUC-DHFR_dLNGFR_укороченная_3,
5503-pUC-DHFR_dLNGFR_укороченная_4,
5504-pUC-DHFR_dLNGFR_укороченная_6.
Клетки НЕК. 293 EBNA трансфецируют указанными плазмидами, и закодированный полипептид временно экспрессируется. Через 48 ч экспрессию dLNGFR контролируют методом FACS. Для определения силы промотора (силы экспрессии) разных промоторов экспрессированный поверхностный маркер dLNGFR флуоресцентно маркируют с помощью анти-dLNGFR антитела.
6
6
Для каждого определения примерно от 0,5×10 до 1,0×10 клеток изолируют добавлением 1 мл Accutase на 6 лунок (фирма GIBCO Invitrogen, Карлсруэ, Германия). Изолированные клетки переносят в пузырек и однократно промывают средой RPMI 1640, обогащенной 10 об.% фетальной сыворотки теленка. Затем клетки освобождают центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин) и супернатант выбрасывают. Все последующие стадии проводят при температуре от 0 до 2°С или на ледяной бане. Осадок клеток ресуспендируют в 100 мкл раствора, содержащего анти-dLNGFR антитело при 30 мкг/мл. После периода инкубирования в течение 30 мин образцы разводят добавлением 2 мл ледяной среды RPMI 1640 с последующим осаждением центрифугированием. Осадок ресуспендируют в 100 мкл раствора второго антитела, козьего антитела против мышиного IgG, конъюгированного с фикоэритрином (фирма Caltag Laboratories, Burlingame, Калифорния, США), в концентрации 20 мкг/мл. Образцы инкубируют в темноте в течение 30 мин на льду. После промывания и стадии центрифугирования образец ресуспендируют в 500 мкл среды и хранят в темноте на льду до проведения измерения. Результаты анализа FACS оценивают, используя программное обеспечение FACSCalibur (фирма Cell Quest Pro). Результаты представлены на фиг.6.
Результаты анализа FACS:
Плазмида 5500-pUC-DHFR_dLNGFR_ дикий тип SV40 (фиг.6а)):
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
8067
100,00
80,67
567,61
128,64
M1
1,40
2134
26,45
21,34
21,84
21,29
М2
40,9910
5956
73,83
59,56
761,11
345,99
Плазмида 5501-pUC-DHFR_dLNGFR_Укороченная_2:
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
7377
100,00
73,77
564,33
168,49
M1
1,40
1365
18,50
13,65
24,69
25,48
M2
40,9910
6027
81,70
60,27
685,24
291,64
Плазмида 5502-pUC-DHFR_dLHGFR_Укороченная_3:
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
7643
100,00
76,43
582,85
129,80
M1
1,40
1959
25.63
19,59
22,68
22,88
M2
40,9910
5708
74,68
57,08
772,82
339,82
Плазмида 5503-pUC-DHFR_dLNGFR_Укороченная_4 (фиг.6б)):
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
7440
100,00
74,40
436,61
69,78
M1
1,40
2603
34,99
26,03
20,87
19,99
M2
40,9910
4852
65,22
48,52
658,42
250,29
Плазмида 5504-pUC-DHFR_dLNGFR_Укороченная_6 (фиг.6в)):
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
8404
100,00
84,04
31,67
11,65
M1
1, 40
6685
79,55
66,85
12,05
9,14
M2
40,9910
1732
20,61
17,32
107,45
74,32
Из результатов следует, что средняя интенсивность флуоресценции меченого dLNGFR, экспрессированного с плазмиды 5504, показывает существенное снижение экспрессии примерно на 85%.
Пример 6. Экспрессия GFP. функционально связанного с последовательностями SEQ ID NO: 02, 03, 04 и 06
Праймер, с помощью которого нуклеиновые кислоты SEQ ID NO: 02, 03, 04 и 06 были получены, содержит сайты рестрикции эндонуклеазами Sail и EcoRI. Используя эти сайты рестрикции/ эндонуклеазы рестрикции, эти нуклеиновые кислоты, функционально связанные с нуклеиновой кислотой, кодирующей GFP (SEQ ID NO: 07), лигируют в плазмиду 4703-pUC-OriP (фиг.3), которую линеаризируют, используя сайты рестрикции Sail и PvuII. Образуются следующие плазмиды:
4712-pUC-Hyg_GFP_дикий тип SV40 (плазмидная карта на фиг.4),
4713-pUC-Hyg_GFP_Укороченная_2 (плазмидная карта на фиг.5),
4714-pUC-Hyg_GFP_Укороченная_3,
4715-pUC-Hyg_GFP_Укороченная_4,
4716-pUC-Hyg_GFP_Укороченная_6.
6
6
Для каждого определения примерно от 5×10 до 1×10 клеток было изолировано путем добавления 1 мл Accutase на 6 лунок (фирма GIBCO Invitrogen, Карлсруэ, Германия). Изолированные клетки переносят в сосуд и ресуспендируют в 3 мл среды RPMI 1640, обогащенной 10 об.% фетальной сыворотки теленка. Впоследствии клетки осаждают центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин), а супернатант выбрасывают. Осажденные клетки ресуспендируют в 500 мкл среды. Для разделения живых и мертвых клеток добавляют 1 мкл пропидия иодита. Клетки ресуспендируют незадолго до измерения FACS. Результаты анализа FACS оценивают, используя программное обеспечение FACSCalibur (фирма Cell Quest Pro). Результаты представлены на фиг.7.
Результаты анализа FACS:
Плазмида 4712-pUC-Hyg_GFP_дикий тип SV40 (фиг.7а)):
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
8390
100,00
83,90
385,26
17,15
Ml
1,40
4162
49,61
41,62
5,92
4,91
М2
40,9910
4240
50,54
42,40
756,58
302,32
Плазмида 4713-pUC-Hyg_GFP_Укороченная_2:
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
8576
100,00
85,76
514,24
45,73
M1
1,40
3635
42,39
36,35
5,72
4,61
М2
40,9910
4948
57,70
49,48
887,12
392,42
Плазмида 4714-pUC-Hyg_GFP_Укороченная_3 (фиг.7б)):
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
8538
100,00
85,38
215,22
15,96
M1
1,40
4289
50,23
42,89
5,44
4,26
М2
40,9910
4258
49,87
42,58
426,11
203,51
Плазмида 4715-pUC-Hyg_GFP_Укороченная_4:
Маркер
Левый,
Число
% входа
% общий
Среднее
Срединное
правый
событий
значение
значение
Все
1,9910
8601
100,00
86,01
53,76
7,37
M1
1,40
5606
65,18
56,06
5,59
4,41
М2
40,9910
3012
35,02
30,12
143,20
73,65
Плазмида 4716-pUC-Hyg_GFP_Укороченная_6 (фиг.7в)):
Маркер
Левый, правый
Число событий
% входа
% общий
Среднее значение
Срединное значение
Все
1,9910
7622
100,00
76,22
4,09
3,52
M1
1,40
7614
99,90
76,14
4,07
3,52
М2
40,9910
8
0,10
0,08
22,46
18,85
Таким образом, средняя интенсивность флуоресценции зеленого флуоресцирующего белка (GFP), экспрессированного с плазмиды 4714 или плазмиды 4715, показывает существенное снижение экспрессии с уменьшением примерно на 50% и 75%, соответственно. В случае плазмиды 4716 выявляемой экспрессии GFP не обнаружено.