Исследование трипсин-ингибиторной активности томатов, заражённых галловой нематодой

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРИПСИН-ИНГИБИТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ТОМАТОВ, ЗАРАЖЁННЫХ ГАЛЛОВОЙ НЕМАТОДОЙ

*Удалова Ж.В., **Ревина Т.А., ** Герасимова Н. Г.,

**Иевлева Е.В., *Зиновьева С.В.

* Центр паразитологии ИПЭЭ РАН ** Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Введение. Протеиназы - ключевые ферменты метаболизма паразита и паразито-хозяинного взаимодействия. Они могут служить потенциальной мишенью в борьбе с нематодами, паразитирующими на растениях. В пищеварительной системе нематод присутствуют различные классы протеиназ (цистеиновые, сериновые, аспартатные, металлопротеиназы). Ферментный состав специфичен для стадии развития нематоды. Очевидно, что у свободноживущих нематод состав пищеварительных ферментов значительно отличается от нематод, питающихся живой растительной тканью. Полагают, что активность ферментативной пищеварительной системы свободноживущих нематод значительно выше, чем у фитопаразитических. Показано, что более высокой активностью у наиболее патогенных родов нематод цистообразующих и галловых обладают цистеиновые и сериновые протеиназы (1). С другой стороны в растениях присутствуют/или индуцируются белки с небольшим молекулярным весом - ингибиторы протеиназ (ИП). В растениях они являются регуляторами собственных белков, а также запасными белками (в запасающих органах их представлено до 10% от всех белков (2)), но основной их функцией, как полагают, является защитная. ИП могут быть как конституционными, так и индуцируемыми в ответ на стрессовое воздействие. Отмечено, что индуцируемые ингибиторы (отсутствующие в тканях здоровых растений) обладают более высокой ингибиторной активностью по отношению к питающимся на растениях насекомым.

Патоген-индуцируемые ИП вписываются в определение PR-белков, но их рассматривают как отдельные соединения). Экспрессия ИП регулируется через сигнальные пути, активируемые поранением (3). Так показано, что поранения, возникающие на листьях томата и картофеля, приводили к системной экспрессии генов ИП (4). Ингибирование кишечных протеиназ нарушает нормальное расщепление белков в кишечнике, что сказывается на развитии и плодовитости патогена. Экспрессия цистеиновых ИП, цистатинов из риса, действующих на кишечные протеиназы цистообразующих нематод, снижает плодовитость нематод. Похожие исследования проводились в отношении цистеиновых протеиназ галловой нематоды, у которых также наблюдали существенную задержку в развитии и, как следствие, снижение плодовитости (5).

Известно, что ингибиторы трипсина, являются активными противонематодными агентами. В этой связи были проведены исследования

424

по обнаружению антитрипсиновой активности в листьях и корнях здоровых и зараженнных нематодами растений.

Материалы и методы. Растения томатов восприимчивого к Meloidogyne incognita гибрида F1 Гамаюн выращивали и заражали нематодой по стандартной методике (6). Время от заражения до конца эксперимента - 14 дней. Способность полученных экстрактов подавлять активность трипсина оценивали путем определения амидазной активности данного фермента, используя в качестве субстрата бензоил-аргинин-пара-нитроанилид (БАПА) (7). Активность ингибиторов, выражали в ингибиторных единицах (и.ед.), за единицу которой принимали такое количество белка-ингибитора, которое вызывает снижение оптической плотности опытного раствора (определение остаточной активности трипсина) на 0.1 при длине волны 410 нм. Значение удельной ингибиторной активности выражали в расчете на мг содержащегося в экстракте белка. Величину общей ингибиторной активности рассчитывали, умножая удельную активность на количество белка, содержащегося в растворе.

Результаты и их обсуждение. Было показано, что активность трипсина угнеталась при добавлении возрастающих концентраций экстрактов из листьев и корней томатов. Было установлено, что экстракты из корней зараженных растений обладали большей ингибиторной активностью, чем из корней здоровых растений. Такая же зависимость была выявлена при изучении ингибиторной активности в листьях томатов. Полученные предварительные результаты позволяют предположить, что при инфицировании растения галловой нематодой, по всей видимости, происходит накопление ингибиторов, подавляющих активность трипсина как в корнях, так и в листьях томатов, что является естественным иммунным ответом растения на проникновение патогена. При чем активность в корнях и листьях увеличилась практически одинаково, что говорит о системном характере реакции растения.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1

Действие экстрактов из корней и листьев томатов на активность трипсина

Экстракт Количество белка в экстракте

Корни здоровых растений 4 7.7 30.8

Корни растений, зараженных M.incognita 5.6 8.8 49.3

Листья здоровых растений 22.4 1.43 32.0

425

Листья растений,

зараженнх M.incognita 22.1 2.2 48.6

Работа поддержана грантом РФФИ 10-04-00792-а.

Литература: 1. Валуева Т.А., Мосолов В.В. //Успехи биол. Химии., 2002, Т.42, С.193-216. 2. Ryan,C.A. //Annu. Rev. Phytopath., 1990, V.28, P.425-449.

3. Lozano J., Smart G. In “Molecular and physiological basis of nematode survival” Eds. By Perry R.N., Wharton D.A. CABI UK 2011, Р.28-56. 4. Green T.R., Ryan C.A. // Science. 1972. V. 175. P. 776-777. 5. Shingles J. et al.,//Experimental Parasitology, 2007, V.115, P.114-120. 6.Удалова Ж.В.//Тр. Ин-та паразитологии РАН, 2002, Т.43, С.267-277. 7.Erlanger B.F., et al // Arch. Biochem. Biophys. 1961, V.1, N 1, P.271-278

Investigation of tripsin-inhibitory activity of tomatoes infected by root-knot nematode. Udalova Zh.V., Revina T.A., gerasimova N.G., Ievleva E.V., Zinovjeva S.V. Center of Parasitoloby, IPEE RAS; Bach Institute of biochemistry RAS.

Summary. The expression of protease inhibitors is regulated through signaling pathways by tissue injury. The inhibition of intestinal protease disrupts normal uptake of protein fragments in gut that affects development and fertility of pathogen. It is known that inhibitors of trypsin are active antinematode agents. It has been shown that at plant infection by root-knot nematode there is accumulation of inhibitors suppressing activity of trypsin both in roots and leaves of tomatoes what is the natural immune response of a plant to pathogen penetration.

РОЛЬ САНИТАРНО-ГЕЛЬМИНТООГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ПРОФИЛАКТИКЕ ЭНТЕРОБИОЗА НА ЮГЕ РОССИИ

Упырев А.В., Хуторянина И.В. *, Говорина С.В. **,

Ковалев Е.В. ***, Ковтунов А.И. ****

*ФБУН Ростов НИИМП Роспотребнадзора **ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области»

*** Управление Роспотребнадзора по Ростовской области **** Управление Роспотребнадзора по Астраханской области

Введение. Энтеробиоз остаётся наиболее часто встречающимся гельминтозом, особенно среди детей в муниципальных дошкольных образовательных учреждениях (МДОУ). В настоящее время уровень поражённости данной инвазией в МДОУ на территории юга России составляет 4,1-6,7% (Упырев А.В. и др.2011г). Удельный вес выявления яиц остриц в

426