ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ ИЗ Alchemilla vulgaris L.
ANTIVIRAL AGENT BASED ON TOTAL AMOUNT OF FLAVONOIDS FROM Alchemilla vulgaris L

Изобретение относится к средствам, полученным на основе флавоноидов из корней или надземной части Alchemilla vulgaris L. (манжетки обыкновенной), обладающих противовирусной активностью в отношении РНК-геномного вируса (вируса гриппа А) и ДНК-геномных вирусов (ортопоксвирусов: вирусов осповакцины и оспы мышей - эктромелии; и вируса простого герпеса 2-го типа), и может быть использовано в фармацевтике, вирусологии, медицине и ветеринарии.
В настоящее время по своей социальной значимости грипп находится на первом месте среди всех инфекционных болезней человека. Вирус гриппа вызывает ежегодные эпидемии, быстро распространяющиеся из страны в страну, вовлекая в тяжелых случаях (пандемии) значительную часть человеческой популяции земного шара. Наиболее эффективным противоэпидемическим средством против гриппа в настоящее время остается вакцинация, однако вследствие постоянной смены антигенных свойств возбудителя требуется постоянный мониторинг и разработка новых вакцинных штаммов, соответствующих циркулирующим в человеческой популяции в каждый конкретный эпидемический сезон.
Наряду с вакцинацией для предотвращения и лечения гриппа применяются химиопрофилактика и химиотерапия. В настоящее время для этих целей доступен широкий спектр иммуномодулирующих, патогенетических, общеукрепляющих и симптоматических средств и препаратов наряду со средствами специфической противогриппозной терапии. Последние препараты представлены химическими соединениями двух групп, отличающихся по мишеням и механизму действия в жизненном цикле вируса гриппа. Препараты первой группы - римантадин (альфа-метил-1-адамантилметиламина гидрохлорид) и амантадин (1-аминоадамантан) - блокируют белок М2 вируса гриппа, играющий роль ионного канала в вирусной мембране, препятствуя тем самым процессу расщепления гемагглютинина и слияния мембран вируса и лизосомальной вакуоли [Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. // Antiviral Res. 1998, V. 37, P. 83-95]. Препараты второй группы направлены на ингибирование вирусной нейраминидазы - фермента, необходимого для почкования вирусных частиц. К этой группе соединений относятся озелтамивир ((3R,4R,5S)-этил-4-ацетамидо-5-амино-3-(пентан-3-илокси)циклогекс-1-енкарбоксилат) [Woodhead М., Lavanchy D., Johnston S., Colman P., Fleming D. // Int. J. Clin. Pract. 2000 V. 54(9), P. 604-610], занамивир (5-(ацетиламино)-4-[(аминоиминометил)-амино]-2,6-ангидро-3,4,5-тридезокси-D-глицеро-D-галактонон-2-еноновая кислота) и перамивир ((1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-ацетамидо-2-этил-бутил]-4-(диаминометилиденамино)-2-гидрокси-циклопентан-1-карбоновая кислота) [O′Malley Р. // Clin. Nurse Spec. 2010, V. 24(2), Р. 51-53]. Обе группы соединений имеют свои недостатки. В отношении группы производных адамантана можно отметить узкий спектр действия (препараты активны против гриппа A, но не против гриппа B), сравнительно высокую токсичность и быстрое формирование устойчивости штаммов вируса к препаратам. Для ингибиторов нейраминидазы характерны несколько меньшая клиническая эффективность, формирование резистентных вариантов и высокая стоимость синтеза, что делает эти препараты менее доступными для широкого использования. Поэтому поиск наиболее эффективных средств для профилактики и лечения гриппа является чрезвычайно актуальным.
Несмотря на уничтожение вируса натуральной оспы в 1980 г., потенциальная опасность возрождения этой инфекции сохраняется и в наши дни, так как во многих районах Центральной Африки, Южной Америки и Евразии распространены близкие к вирусу натуральной оспы патогенные для человека зоонозные ортопоксвирусы такие, как вирусы осповакцины, оспы коров, оспы буйволов и оспы обезьян, природным резервуаром которых являются разные виды грызунов. Кроме того, у населения отсутствует поствакцинальный иммунитет к вирусу натуральной оспы после прекращения более 30 лет назад вакцинации и производства вакцин по рекомендации ВОЗ, - все это создает риск обострения эпидемической ситуации [Львов Д.К., Зверев В.В, Гинцбург А.Л., Маренникова С.С., Пальцев М.А. Натуральная оспа - дремлющий вулкан // Вопросы вирусологии. - 2008. - №4. - С. 4-8].
В связи с вышеизложенным, а также с тем, что научное сообщество и органы здравоохранения не располагают эффективными адаптированными для массового применения профилактическими и лечебными препаратами против ортопоксвирусов, необходимы исследования по поиску и разработке таких препаратов.
Среди вирусных заболеваний герпетическая инфекция, вызываемая вирусами 1 и 2 типов, занимает одно из лидирующих мест. Так, согласно статистике ВОЗ, в последние годы заражение вирусами простого герпеса (ВПГ) составляет 75,0-95,0% населения Земли, при этом смертность от диссеминированных форм болезни, вызванной ВПГ, составляет 15,8% от всех вирусных заболеваний и занимает 2-е место после показателя смертности от гриппа (35,8%) [Самгин М.А. Простой герпес. Дерматологические аспекты / М.А. Самгин, А.А. Халдин. М.: МЕДпресс информ, 2002. 160 с.]. Герпесвирусная этиология, обусловленная ВПГ-1 и ВПГ-2, прослеживается у 10,0% всех энцефалитов и 20,0% менингоэнцефалитов на территории нашей страны. Летальность при энцефалитах герпетической этиологии составляет 80,0%. В России число госпитализированных больных с диагнозом ВПГ ежегодно превышает 2,5 млн чел, а трудопотери исчисляются более 40 млрд руб. в год. Больные с хроническими поражениями кожных покровов, вызванных вирусами герпеса, а также больные с генитальным герпесом составляют более 10,0% от всего населения России; в 2008 г. заболеваемость составила 18,1 на 100 тыс. населения [Самгин М.А. Простой герпес. Дерматологические аспекты / М.А. Самгин, А.А. Халдин. М.: МЕДпресс информ, 2002. 160 с.].
Для лечения герпетической инфекции используют: химиопрепараты, действующие непосредственно на вирусы; иммуномодуляторы; симптоматические, а также патогенетические средства [Исаков В.А., Архипова Е.И., Исаков Д.В. Герпесвирусные инфекции человека. СПб., 2006; с. 12-150].  Многие из применяемых в настоящее время противогерпетических препаратов имеют ряд существенных недостатков, среди них такие, как низкая биодоступность, высокая нефротоксичность, быстрое развитие устойчивости штаммов ВПГ к препаратам. Все это обусловливает актуальность проблемы создания более эффективных препаратов против герпеса.
Таким образом, одной из главных проблем профилактики и лечения вирусных инфекций является высокая скорость изменчивости многих вирусов, особенно вируса гриппа, что позволяет им, с одной стороны, ускользать от иммунного ответа хозяина, а с другой, - в течение нескольких вирусных поколений вырабатывать устойчивость к противовирусным препаратам. Все вышесказанное свидетельствует о необходимости поиска и разработки эффективных и дешевых противовирусных препаратов возможно более широкого спектра действия.
Предшествующий уровень техники
Известен способ получения суммы флавонолов с адаптогенными свойствами из надземных частей манжетки обыкновенной путем экстракции 96% этиловым спиртом, упаривания экстракта, добавления дистиллированной воды, очистки водного экстракта хлороформом, экстракции очищенного водного остатка этилацетатом, упаривания экстракта и осаждения продукта хлороформом (Патент РФ №2128516 «Способ получения Р-витаминного средства», МПК А61К 35/78, опубл. 10.04.1999).
Однако для полученного таким способом целевого продукта противовирусная активность в отношении РНК- и ДНК-геномных вирусов не исследована и не описана в литературе.
Известно отечественное противовирусное средство гипорамин (Hiporhaminum), получаемое из листьев облепихи крушиновидной - Hippophae rhamnoides L. семейства Лоховые - Elaeagnaceae, представляющее собой сухой очищенный стандартизованный экстракт на основе полифенольного комплекса галлоэллаготаннинов (Вичканова С.А. Изучение листьев облепихи и создание на их основе отечественного противовирусного средства «Гипорамин» // В книге:
«Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». V Междунар. съезд. Матер, съезда. - СПб. - 2001. - С. 198-204; Вичканова С.А. «Исследование клинической эффективности гипорамина при вирусных инфекциях у взрослых» // В книге: «Человек и лекарство». - III Рос. нац. конгресс. Тез. докл. - М.: - 1999. - С. 281). Гипорамин обладает выраженной противовирусной активностью в отношении различных штаммов вирусов гриппа А и В, аденовирусов, парамиксовирусов, вирусов простого герпеса, опоясывающего лишая, цитомегаловирусов, респираторно-синцитиального вируса, вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция).
Однако для гипорамина не показана ингибирующая активность в отношении ортопоксвирусов: вирусов осповакцины и оспы мышей.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является новая синергетическая композиция для лечения актуальных вирусных инфекций, включающая водный экстракт из С.sinensis, содержащий 8% дубильных веществ; водный экстракт из Alchemilla vulgaris (манжетка обыкновенная), содержащий 6,5% дубильных веществ; стеарат сорбитана 5,4 г; сквален 2,0 г; октил октаноат 2,0 г; карбомер 0,55 г; пропиленгликоль 0,22 г; стабилизатор на основе парабенов 0,02 г, вода дистиллированная 100 г и другие компоненты. Состав представляет собой косметический крем для профилактики и лечения вируса папилломы, вируса гриппа и герпеса (заявка США №20130028995 А1, 31.01.2013).
Однако синергетическая композиция-прототип содержит несколько водных экстрактов источников танинов (в примере 9, как минимум два - С.Sinensis и Alchemilla vulgaris), вклад каждого из которых в противовирусную активность неизвестен (в заявке не раскрыт), а композиция называется синергетической, т.е. противовирусная активность обусловлена совместным действием обоих водных экстрактов. В этой связи неочевидно, что водный экстракт на основе одной Alchemilla vulgaris (манжетки обыкновенной) будет обладать активностью против вирусов гриппа и герпеса.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение сырьевой базы и ассортимента противовирусных средств в отношении РНК-содержащего вируса (вируса гриппа А) и ДНК-содержащих вирусов (ортопоксвирусов и вируса простого герпеса 2-го типа).
Указанный технический результат достигается применением суммы флавоноидов из корней или надземной части Alchemilla vulgaris L. (манжетки обыкновенной), полученных путем экстракции корней 50-кратным объемом этилацетата в три приема при нагревании на водяной бане с обратным холодильником по 20 минут, объединения этилацетатного экстракта, концентрирования его упариванием и осаждения концентрата в хлороформе с получением препарата (суммы флавоноидов) или экстракции надземной части манжетки обыкновенной, собранной в начале цветения, 90-96° этиловым спиртом в соотношении 1:10 при комнатной температуре в течение 24 часов с повторением 3-4 раза с последующим объединением и упариванием экстракта, разведения его дистиллированной водой, очистки водного экстракта хлороформом, экстракции очищенного водного остатка этилацетатом, упаривания полученного экстракта и осаждения продукта (суммы флавоноидов) хлороформом в качестве противовирусного средства в отношении РНК-содержащего вируса гриппа А и ДНК-содержащих ортопоксвирусов и вируса простого герпеса 2-го типа.
Указанная сумма флавоноидов, содержащихся в корнях или надземной части манжетки обыкновенной, хорошо растворима в воде.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение суммы флавонолов из надземной части Alchemilla vulgaris L.
К 300 г сырой массы надземной части манжетки обыкновенной, собранной в фазу бутонизации - начала цветения, добавляют 90-96° этиловый спирт (т.к. в сыром материале более 80% воды) в соотношении 1:10, извлечение суммы флавонолов осуществляют при комнатной температуре. При этих условиях оптимальной продолжительностью процесса максимального извлечения суммы флавонолов был период 24 ч, так как увеличение продолжительности процесса до 48 и 72 ч не приводило к статистически достоверному увеличению суммы флавонолов по сравнению с таковой при проведении процесса извлечения в течение 24 ч, а только удлиняло технологический процесс (табл. 1).
1
1
2
2
Операцию этанольного извлечения повторяют 3-4 раза, объединенный экстракт упаривают в ротационном испарителе под вакуумом до объема, равного массе исходного сырья, после чего добавляют / часть от массы сырья дистиллированной воды и испаряют до полного испарения этилового спирта. Для очистки от сопутствующих растительных пигментов водный экстракт переносят в делительную воронку и взбалтывают 4-5 раз равными объемами хлороформа до обесцвечивания хлороформенного слоя. Сумму флавонолов из очищенного водного экстракта экстрагируют этилацетатом, взбалтывая в делительной воронке равными объемами этилацетата и экстракта. Эту процедуру повторяют 6 раз. Объединенный этилацетатный экстракт упаривают в ротационном испарителе под вакуумом до / исходной массы (начало образования осадка). Сгущенный экстракт вливают тонкой струей в шестикратно большее количество хлороформа. Выпавший желтый осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре №4, промывают чистыми порциями хлороформа и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход целевого продукта 4,5 г, что составляет 1,5%. Содержание флавонолов в осадке 3,2 г, т.е. 71%. Определение качественного состава и количественного содержания проводят методом хроматографии на бумаге, в качестве проявителя используют 10%-ный спиртовый раствор хлористого алюминия. При этом в составе препарата обнаруживается до 4 флавоноловых компонентов.
Пример 2. Получение суммы флаванолов (катехинов и лейкоантоцианов) из корней Alchemilla vulgaris L.
Измельченные и просеянные через сито №1 корни манжетки обыкновенной экстрагируют 50-кратным объемом этилацетата в три приема при нагревании на водяной бане с обратным холодильником по 20 минут. Объединенный этилацетатный экстракт концентрируют на ротационном испарителе в вакууме при температуре не выше 50°C до остатка, превышающего в 3 раза массу сырья. Полученный экстракт вливают тонкой струей при помешивании в 6-кратный объем хлороформа. Выпадает хлопьевидный осадок белого цвета, который отфильтровывают через воронку со стеклянным фильтром №4. Полученный осадок высушивают в вакууме. Выход осадка составляет 5-10% от массы сырья. Количественное содержание определяют спектрофотометрически, при взаимодействии экстракта с 1%-ным раствором ванилина в концентрированной соляной кислоте образуется малиновое окрашивание, плотность раствора определяют на спектрофотометре при длине волны 504 нм. Пересчетный коэффициент рассчитывают по (+)-катехину. Содержание флаванолов в препарате - около 70%.
Пример 3. Характеристика противовирусного средства на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L.
Новое противовирусное средство представляет собой природную смесь хорошо очищенных и высокоактивных флавоноидных веществ, выделяемых из корней (катехины и лейкоантоцианы) (розоватого цвета) или надземной части (флавонолы) манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris L.) в виде желтого порошка горьковато-вяжущего вкуса, хорошо растворимого в воде и спирте.
Пример 4. Изучение токсичности препаратов на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L. на перевиваемых культурах клеток MDCK и Vero
5
2
Токсичность препаратов была предварительно изучена в отношении перевиваемых культур клеток MDCK и Vero, полученных из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Суспензию с известной концентрацией клеток MDCK или Vero разводили подогретой до температуры 37°C средой RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург) или DMEM («Биолот», Санкт-Петербург) соответственно, содержащими 10% сыворотки крови плодов коровы (СКПК) («Gibco», США), до концентрации 1×10 кл./мл и по 100 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат на 2-3 сут до образования монослоя при температуре 37°C, 5% CO и 100% влажности.
2
3
4
5
6
2
При определении токсических доз для клеток MDCK или Vero препараты разводили в 5, 10, 10, 10, 10, 10, 10 раз средой RPMI-1640 или DMEM соответственно, вносили по 100 мкл/лунку разведений препаратов и ставили в термостат на 2 и 4 соответственно суток при температуре 37°C, 5% CO и 100% влажности. Через 2 и 4 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали деструктивные изменения в монослое клеток MDCK или Vero соответственно, инкубированных с разными концентрациями препаратов. В качестве контроля использовали монослои культур клеток MDCK или Vero без препаратов.
50
Определяли минимально токсическую концентрацию (МТК) и максимально переносимую концентрацию (МПК), равную половине концентрации вещества, не оказывающей на клетки токсического действия, а также для каждого препарата определяли 50%-ную токсическую концентрацию (ТС), т.е. концентрацию препарата, вызывающую гибель 50% клеток в культуре.
В исследованиях противовирусной активности препаратов использовали МПК или более низкие концентрации [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Хабриева Р.У. М.: Медицина; 2005; 832].
Как показали исследования токсичности препаратов, полученных из манжетки обыкновенной, препараты №5, №6 и №7 были малотоксичными для перевиваемой культуры клеток MDCK (максимально переносимые концентрации для этих клеток для всех препаратов составили 250 мкг/мл), а для клеток Vero наибольшие токсические свойства из всех препаратов проявил образец №7, полученный из надземной части растения (максимально переносимые концентрации составили 350, 250 и 25 мкг/мл для препаратов №5, №6 и №7 соответственно) (табл. 2).
Пример 5. Определение вирулицидной активности средства на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L. в отношении РНК- и ДНК-геномных вирусов
Вирулицидную активность препаратов на основе суммы флавоноидов манжетки обыкновенной исследовали после экспозиции их с вируссодержащим материалом при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем титровали инфекционную активность вируса гриппа в каждом варианте опыта в культуре клеток MDCK, а инфекционную активность ДНК-геномных вирусов (вируса осповакцины (ВО), вируса оспы мышей (ВОМ) и вируса простого герпеса (ВПГ)) в культуре клеток Vero. Препарат характеризовался вирулицидной активностью в случае снижения инфекционного титра вируса гриппа для клеток MDCK или титра ДНК-геномных вирусов для клеток Vero после экспозиции в 100 раз и более.
Исследование вирулицидного действия препаратов в отношении ДНК-геномных вирусов показало, что препараты из корней манжетки (№5 и №6) проявляли вирулицидную активность в отношении ортопоксвирусов (снижение инфекционной активности ВО под действием этих препаратов происходит на 2,2 и 2,5 lg, a BOM на 2,0 и 2,4 lg соответственно) и не обнаруживали такого действия в отношении ВПГ 2-го типа, в то время как препарат №7 (из надземных органов растения) вирулицидными свойствами не обладает ни в отношении ортопоксвирусов, ни в отношении вируса герпеса (табл. 3).
Пример 6. Изучение противовирусной активности препаратов на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L. в отношении РНК- и ДНК-геномных вирусов на перевиваемых культурах клеток
Изучение противовирусной активности препаратов в отношении РНК-геномных вирусов на перевиваемой культуре клеток MDCK.
2
Культура клеток. Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали перевиваемые культуры клеток MDCK и Vero, полученные из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». По 100 мкл суспензии клеток MDCK в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы, или суспензии клеток Vero в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы, вносили в 96-луночные планшеты. Планшеты с клетками MDCK и Vero помещали в термостат при температуре +37°C, 5% СO и 100% влажности на 2 и 4 сут соответственно до образования клеточного монослоя.
2
Определение токсичности препаратов для перевиваемых клеточных культур MDCK и Vero. Для определения токсических концентраций препараты разводили в несколько раз и оценивали наличие токсического действия в монослоях культур клеток MDCK и Vero с помощью инвертированного микроскопа. Для этого препараты растворяли в среде RPMI-1640 или DMEM, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, делали разведения препаратов в 5 раз, в 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой, вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и Vero и ставили в термостат при температуре +37°C, 5% CO и 100% влажности на 2 и 4 сут соответственно. Через 2 или 4 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослое клеток MDCK или Vero, инкубированных с разными концентрациями препаратов из манжетки обыкновенной. В опытах по определению противовирусной активности препаратов на культуре клеток MDCK или Vero использовали предварительно определенные их максимально переносимые концентрации (МПК) для каждой из этих клеточных культур.
Определение противовирусной активности препаратов в отношении вируса гриппа. В работе использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и штамм вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2), полученные из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Новосибирская обл.).
50
Наработку вируса гриппа производили на 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ), титрование вируса гриппа проводили на культуре клеток MDCK. Концентрация разных субтипов вируса гриппа в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляла от 5,5 до 9,5 lg ТЦД/мл (десятичных логарифмов 50% тканевых цитопатических доз в мл). В опытах по определению противовирусной активности препаратов из манжетки обыкновенной в отношении вируса гриппа готовили разведения ВАЖ каждого вируса от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием поддерживающей среды RPMI-1640 (ООО «Биолот», Россия), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США).
2
2
50
50
50
50
50
50
-1
-8
Для определения противовирусной активности образцов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения препарата на поддерживающей среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, и инкубировали в течение 1 часа при 37°C в атмосфере 5% CO в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Затем в лунки с препаратом добавляли по 50 мкл разведенной поддерживающей средой от 10 до 10 вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ). Клетки инкубировали 2 сут при температуре 37°C в атмосфере 5% CO. Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали цитопатическое действие (ЦПД) в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1%-й суспензией эритроцитов кур. За титр вируса в контроле и опыте принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации в лунке, и выражали в количестве 50% инфекционных доз (ИД). Титры вируса определяли в lg ТЦД/мл в контроле (50%-я инфицирующая доза - ИД in vitro без препарата) и в опыте (ИД in vitro с препаратом). Вирусингибирующее действие исследуемых препаратов оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем, для этого высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вирусов под влиянием экстракта: ИН = ИДконтроль - ИДопыт (lg).
50
50
50
50
На основании полученных данных рассчитывали 50% ингибирующую дозу IC, т.е. концентрацию препарата, снижающую уровень вирусной репликации вдвое (на 0,3 lg ИД), и индекс селективности, или химиотерапевтический индекс (SI), представляющий собой отношение ТС к IC.
В качестве контроля использовали следующее.
1. Контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде RPMI-1640 (ООО «Биолот», С-Петербург), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США).
2. Контроль репродукции штаммов вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) с 1 до 8 разведения с десятикратным шагом без внесения экстрактов.
В процессе исследования ингибирования репродукции вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) препаратами из Alchemilla vulgaris L. и эталонами сравнения (римантадином, тамифлю и рибавирином) по профилактической схеме в монослое клеток MDCK были получены результаты, представленные в таблице 4.
Как видно из таблицы 3, препараты №5 и №6, полученные из корней манжетки обыкновенной, по сравнению с препаратом №7 из надземных органов этого растения в отношении вируса гриппа субтипа H3N2 проявили более выраженный противовирусный эффект (индексы нейтрализации вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) под действием препаратов №5 и №6 составили 2,0 и 1,5 lg соответственно, тогда как под действием препарата №7 - только 1,0 lg). В отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) все исследуемые препараты, полученные из манжетки обыкновенной, обнаружили более выраженную противовирусную активность по сравнению с таковой в отношении вируса гриппа человека субтипа H3N2 (индексы нейтрализации вируса гриппа субтипа H5N1 под действием всех трех препаратов составили 4,0 lg) (табл. 4).
50
50
50
50
50
На основании полученных данных были рассчитаны среднетоксические (ТС) и среднеэффективные вирусингибирующие (IC) концентрации препаратов из Alchemilla vulgaris L. в отношении используемых штаммов вируса гриппа, снижающие уровень вирусной репликации вдвое (на 0,3 lg ИД), и индексы селективности, или химиотерапевтические индексы (SI), представляющие собой отношение ТС к IC (табл. 5).
Представленные в таблице 5 результаты показывают, что препараты №5, №6 и №7, приготовленные из манжетки обыкновенной, подавляют размножение вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) в культуре клеток MDCK, при этом среднеэффективные ингибирующие концентрации составляют 7,0, 14,0 и 20,0 мкг/мл, а индексы селективности - 71,4; 35,7 и 22,5 соответственно.
50
Оценка противовирусной активности этих же препаратов (№5, №6 и №7) по отношению к вирусу гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) показала, что значения среднеэффективных вирусингибирующих концентраций (IC) для них были ниже по сравнению со значениями данного показателя в отношении вируса гриппа человека и составляли 5,0; 10,0 и 15,0 мкг/мл соответственно, при этом индексы селективности были выше и составляли 100,0; 50,0 и 30,0 соответственно, что говорит о низкой токсичности этих препаратов для эукариотических клеток MDCK.
Таким образом, получены препараты на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L., обладающие низкой токсичностью и выраженной противовирусной активностью в культуре клеток MDCK. Данные растительные препараты способны ингибировать репликацию вирусов гриппа A/H3N2 и A/H5N1 в концентрациях от нескольких микрограмм до 1,5-2,0-х десятков микрограмм в миллилитре.
Изучение противовирусной активности препаратов в отношении ДНК-геномных вирусов на перевиваемой культуре клеток Vero
Было проведено определение противовирусной активности препаратов в отношении ортопоксвирусов и вируса простого герпеса. В работе использовали штамм Л-ИВП вируса осповакцины (ВО), штамм К-1 вируса оспы мышей (ВОМ) и штамм MS вируса простого герпеса 2-го типа, полученные из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Новосибирская обл.).
50
Наработку и титрование всех ДНК-геномных вирусов проводили на перевиваемой культуре клеток Vero. Концентрация разных вирусов в культуральной вируссодержащей жидкости (КВЖ) составляла от 5,5 до 7,5 lg ТЦД/мл (десятичных логарифмов 50% тканевых цитопатических доз в мл). В опытах по определению противовирусной активности препаратов из манжетки обыкновенной в отношении ДНК-содержащих вирусов готовили разведения КВЖ каждого вируса от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием поддерживающей среды DMEM (ООО «Биолот», Россия).
2
2
50
50
50
50
50
-1
-8
Для определения противовирусной активности образцов в монослой культуры клеток Vero вносили по 50 мкл выбранного разведения препарата на поддерживающей среде DMEM и инкубировали в течение 1 часа при 37°C в атмосфере 5% СO в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Затем в лунки с препаратом добавляли по 50 мкл разведенной поддерживающей средой от 10 до 10 культуральной вируссодержащей жидкости (КВЖ). Клетки инкубировали 4 сут при температуре 37°C в атмосфере 5% CO. Через 4 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали наличие вируса по цитопатическому действию (ЦПД) на монослой клеток. За титр вируса в контроле и опыте принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного вируса, способного вызвать ЦПД в монослое клеток, и выражали в количестве 50% инфекционных доз (ИД). Титры вируса определяли в lg ТЦД/мл в контроле (50%-я инфицирующая доза - ИД50 in vitro без препарата) и в опыте (ИД in vitro с препаратом). Вирусингибирующее действие исследуемых препаратов оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем, для этого высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вирусов под влиянием экстракта: ИН = ИДконтроль - ИДопыт (lg).
В качестве контроля использовали следующее.
1. Контроль клеток Vero, культивируемых в питательной среде DMEM (ООО «Биолот», С-Петербург).
2. Контроль репродукции вируса простого герпеса 2-го типа, вирусов осповакцины и оспы мышей с 1 до 8 разведения с десятикратным шагом без внесения препаратов.
Результаты исследования ингибирования репродукции ДНК-содержащих вирусов в культуре клеток Vero препаратами из Alchemilla vulgaris L. по профилактической схеме представлены в таблице 6.
Как видно из таблицы 6, все препараты, полученные как из корней, так и из надземных органов манжетки обыкновенной, обнаружили противовирусный эффект в отношении используемых в данных экспериментах ДНК-содержащих вирусов. При этом наибольшей антивирусной активностью в отношении этих вирусов обладал препарат №6, полученный из корней растения, в концентрации 100 мкг/мл (индексы нейтрализации вирусов: ВО, ВОМ и ВПГ под действием этого препарата составляли 3,1; 2,6 и 2,0 lg соответственно) (табл. 6).
В целом показано, что полученные препараты на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L. способны ингибировать репликацию ДНК-геномных вирусов (ортопоксвирусов: вируса осповакцины и вируса оспы мышей, а также вируса простого герпеса 2-го типа) в культуре клеток Vero.
Пример 7. Изучение противовирусной активности препаратов на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L. в отношении вируса гриппа на модели лабораторных животных
50
гибели мышей в контроле
гибели мышей в опыте
В опытах по изучению протективных свойств препаратов на основе манжетки обыкновенной в отношении вируса гриппа A использовали профилактическую схему: препараты вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) за час до заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) или вирусом гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в дозе 10 ЛД (50%-х летальных доз in vivo), далее препараты вводили 1 раз в сутки в течение 5 суток. За животными наблюдали в течение 14 суток. Высчитывали процент выживаемости животных в опыте и контроле и коэффициент защиты (КЗ) мышей. КЗ высчитывали по формуле. %  - % .
Введение мышам препаратов №5, №6 и №7 до заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) и после заражения в течение 5 суток вызывало их значительную защиту (выживаемость животных составила 81, 61,0 и 44,0% соответственно). В инфицированной группе сравнения (введение Тамифлю) и контрольной инфицированной группе (введение дистиллированной воды) выжило 100 и 24,1% животных соответственно. Наибольший коэффициент защиты (КЗ), который составлял 56,9%, проявил препарат №5, полученный из корней Alchemilla vulgaris L. (табл. 7).
При проведении аналогичных исследований в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) установлено, что при введении лабораторным мышам препаратов №5, №6, №7 и препарата сравнения Тамифлю процент выживаемости животных составлял 44,7; 33,4, 16,8% и 50,0% соответственно при 100% гибели животных в контроле (введение дистиллированной воды). Наибольший коэффициент защиты (44,7%) в отношении вируса гриппа птиц так же, как и в отношении вируса гриппа человека, обнаружил препарат №5, полученный из корней Alchemilla vulgaris L. (табл. 7).
Таким образом, препараты на основе суммы флавоноидов из манжетки обыкновенной проявляют выраженную противовирусную активность в отношении вируса гриппа в культуре клеток MDCK и в отношении ортопоксвирусов (вируса осповакцины и вируса оспы мышей) и вируса простого герпеса 2-го типа в культуре клеток Vero, а также обнаруживают протективные свойства в модели на лабораторных мышах в отношении вируса гриппа, в связи с чем они могут быть использованы для создания новых эффективных противовирусных препаратов против инфекций, вызванных данными вирусами.