Состояние системы липопероксидации крови крыс при длительном воздействии озона

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ КРОВИ КРЫС ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ОЗОНА

А.Г. Соловьева, П.В. Перетягин, С.П. Перетягин, А.К. Мартусевич

ФГБУ «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, Нижний Новгород

В работе представлены результаты исследования влияния различных доз озона на про- и антиоксидантные системы крови интактных крыс при длительном субхроническим его применении. Эксперимент выполнен на крысах линии Wistar. Продолжительность эксперимента составила 30 суток, в течение которых животным ежедневно внутрибрюшинно вводили 1 мл 0,9% раствора NaCl, с дозами озона в нем 0,6 мкг, 2,0 или 8,0 мкг. Контроль представлен здоровыми интактными крысами без манипуляций. В плазме крови и эритроцитах изучали интенсивность перекисного окисления липидов с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции и по уровню малонового диальдегида. В гемолизате эритроцитов определяли активность супероксиддисмутазы. Установлено, что длительное использование озона в высоких дозах (2,0 и 8,0 мкг) оказывает ингибирующее влияние на перекисное окисление липидов и общий антиоксидантный статус крови, повышая активность супероксиддисмутазы. Показано, что менее выраженным токсическим эффектом обладает длительное воздействие озоном в дозе 0,6 мкг.

Ключевые слова: озон, перекисное окисление липидов, малоновый диальдегид, супероксиддисмутаза

THE STATE OF BLOOD LIPID PEROXIDATION IN RATS UNDER PROLONGED COURSE OF OZONE ADMINSTRATION

A.G. Soloveva, P.V. Peretyagin, S.P. Peretyagin, A.K. Martusevich

Privolzhsky Federal Medical Research Centre, Nizhny Novgorod Association of Russian Ozone Therapeutists, Nizhny Novgorod

Abstract

The paper presents the research results of influence of different ozone doses on pro - and antioxidant systems of blood of intact rats during prolonged use. The experiment was performed on Wistar rats. The duration of the experiment was 30 days, during which animals daily intraperitoneally were administered 1 ml of 0.9% NaCl solution, with doses of ozone in it to 0.6 mcg, 2.0 mcg or 8.0 mcg. Control presents healthy intact rats without any manipulation. In plasma and erythrocytes the intensity of lipid peroxidation was studied using the method of induced biochemiluminescence and by the level of malonic dialdehyde. In the hemolysate of erythrocytes the activity of superoxide dismutase was determined. It was shown that use of ozone in high doses (2,0 and 8,0 mcg) has a inhibition effect on lipid peroxidation and total antioxidant

status of blood increasing the activity of superoxide dismutase. It was shown that less pronounced toxic effect has ozone in a dose of 0.6 mcg.

Key words: ozone, lipid peroxidation, malonic dialdehyde, superoxide dismutase

На сегодняшний день озонотерапия представляет собой высокоэффективный метод лечения, в основе которого лежит применение этой активной формы кислорода. В терапевтических дозах озон действует как иммуномодулирующее, противовоспалительное и антистрессовое средство, благодаря чему его давно используют в разных областях медицины [3]. Однако, применение любых активных форм кислорода (АФК) в биологии и медицине с саногенетическими целями неизбежно сталкивается с проблемой интенсификации свободно-радикального окисления (СРО), активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран. Поэтому использование окислительных методов терапии неразрывно связано с необходимостью исследования процессов липопероксидации, так как изменение баланса про- и антиоксидантных систем организма является одним из диагностических критериев в оценке патологического состояния, характеризуя формирование и прогрессирование окислительного стресса [1, 2, 7]. В этой связи актуальна проблема изучения механизмов СРО при использовании АФК в условиях их хронического воздействия на организм млекопитающих.

Целью данной работы явилось изучение влияния разных доз озона (0,6; 2,0 и 8,0 мкг) на про- и антиоксидантные системы крови интактных крыс при длительном его применении.

Материал и методы

Эксперимент выполнен на 40 крысах-самцах линии Wistar, содержащихся в стандартных условиях вивария в клетках при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, согласно нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ». Животных разделили на 4 группы. Продолжительность эксперимента составила 30 суток, в течение которых животным 1-ой группы (n=10) ежедневно внутрибрюшинно вводили 1 мл 0,9% раствора NaCl с насыщающей концентрацией озона в кислород-озоновой смеси от озонатора «Медозонс-Систем - 3000 мкг/л и дозой О3 - 0,6 мкг на одно животное. Для животных 2-ой группы (n=10) насыщающая концентрация озона составила 10000 мкг/л и доза О3 - 2 мкг; 3-ей группы (n=10) - 40 000 мкг/л с вводимой дозой озона 8 мкг. Концентрацию О3 в физиологическом растворе определяли с помощью анализатора озона в жидких средах ИКОЖ-5 (сертификат соответствия RU.Q 31.001.А № 29545-05, г. Киров). Крысы 4-й группы (n=10) представлены здоровыми интактными животными без манипуляций (контроль). Через 30 суток животных выводили из эксперимента путем декапитации под комбинированным наркозом (золетил + ксила).

В плазме крови и эритроцитах изучали активность СРО с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции на БХЛ-06 (Н.Новгород). Оценивали следующие параметры хемилюминограммы: tg 2а -характеризуюет скорость спада СРО в плазме и свидетельствуюет об общей антиоксидантной активности (АОА); S - светосумма хемилюминесценции за 30 сек. - отражает

потенциальную способность биологического объекта к ПОЛ. Определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах методом М.ЦеЫуата, М.МШага [8]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по ингибированию образования продукта аутоокисления адреналина [5].

Результаты исследований обрабатывали с использованием программы 81айвйса 6.0.

Результаты и обсуждение

Полученные результаты показали, что хроническое системное воздействие (в течение 30 суток) на животных озоном при использовании его низкой дозы (0,6 мкг), незначительно стимулируя прооксидантный потенциал плазмы крови до +5% (р=0,098) (рис. 1), снижало светосумму хемилюминисценции эритроцитов, свидетельствуя о повышении их перекисной резистентности на 44% (р=0,022) (рис. 2).

14

контроль 0,6 мкг О3 2,0 мкг О3 8,0 мкг О3

Рис. 1. Динамика изменения светосуммы хемилюминесценции в плазме крови крыс при воздействии различных доз озона в условиях хронического

эксперимента

10

контроль 0,6 мкг О3 2,0 мкг О3 8,0 мкг О3

Рис. 2. Динамика изменения светосуммы хемилюминесценции в эритроцитах крыс при воздействии различных доз озона в условиях хронического эксперимента. Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с

контролем

При использовании озона в дозе 0,6 мкг выявлено возрастание АОА плазмы на 21% (р=0,008) по сравнению с интактными животными (рис. 3).

Рис. 3. Динамика изменения показателя tg2a в плазме крови крыс при воздействии различных доз озона в условиях хронического эксперимента. Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем (р<0,05); ** - различия статистически значимы по сравнению с 0,6 мкг О3

Под влиянием низкой дозы озона (0,6 мкг) активность СОД в эритроцитах увеличилась на 11% (р=0,061) (рис. 4).

Рис. 4. Удельная активность супероксиддисмутазы в эритроцитах крови крыс при воздействии различных доз озона в условиях хронического эксперимента.

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем

Суммарное возрастание антиоксидантных свойств плазмы и эритроцитов при использовании низкой дозы озона (0,6 мкг) препятствовало развитию оксидативного стресса, что сопровождалось снижением промежуточного продукта ПОЛ - МДА на 46% (р=0,004) в плазме крови и на 25% (р=0,025) в

эритроцитах (рис. 5). Известно, что О3 способствует синтезу и активации каталитических свойств ферментов антирадикальной защиты: глутатионпероксидазы, каталазы и СОД [3, 6].

Рис. 5. Концентрация малонового диальдегида в крови крыс при воздействии различных доз озона в условиях хронического эксперимента. Примечание: * -различия статистически значимы по сравнению с контролем (р<0,05); ** -различия статистически значимы по сравнению с 0,6 мкг О3 (р<0,05).

Хроническое воздействие большего количества озона (2,0 и 8,0 мкг) по данным биохемилюминисцентного анализа сопровождалось снижением общего уровня прооксидантной активности. Об этом свидетельствовало уменьшение светосуммы хемилюминисценции в плазме крови на 8% (р=0,064) и 11% (р=0,084) соответственно (рис. 1), а в эритроцитах показатель Б был снижен на 35% (р=0,021) при воздействии О3 в дозе 2,0 мкг и на 32% (р=0,034) при использовании 8,0 мкг О3 по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Высокие дозы озона (2,0 и 8,0 мкг) вызвали снижение общей антиоксидантной активности в плазме крови на 28% (р=0,023) и 24% (р=0,031) соответственно по сравнению с применением низких доз озона (0,6 мкг), что свидетельствовало об истощении, скорее всего, неферментативного звена антиоксидантной защиты (рис. 3), так как при использовании больших доз О3 (2,0 и 8,0 мкг) активность СОД в эритроцитах увеличилась на 18% (р=0,041) и 19% (р=0,035) соответственно (рис. 4). Это создавало условия для обрыва ПОЛ. Концентрация МДА в плазме крови уменьшилась на 26% (р=0,041; доза О3 - 2,0мкг) и 54% (р=0,023; доза О3 - 8,0 мкг) по сравнению с показателями животных контрольной группы, в эритроцитах - на 12% (р=0,040) и 6% соответственно (рис. 5).

Таким образом, длительное применение озонированного физиологического раствора в диапазоне высоких доз озона (2,0 и 8,0 мкг) у крыс, не увеличивая АОА, оказывало стимулирующее действие на активность СОД, что могло

снижать прооксидантные физиологические возможности АФК в организме животных и ограничивать диапазон их физиологических регуляторных возможностей. В условиях моделирования хронического воздействия АФК наиболее оптимальным оказалось применение низких доз озона в физиологическом растворе (0,6 мкг), которые, поддерживая активность процессов ПОЛ несколько выше уровня, чем у интактных животных, оказали модулирующее действие как на СОД, так и в целом на АОА крови. Данные литературы о влиянии О3 на каталитические свойства СОД и содержание МДА также подтверждают дозозависимый характер ответных реакций биологических систем на низкие и высокие дозы озона [4, 9]. Ранее установлено, что длительное использование низких доз озона способствовало умеренной физиологической активации оксидоредуктаз, тогда как дозы О3, превышающие 2,0 мкг, приводили к нарастанию тканевой гипоксии и накоплению в печени токсических продуктов

[4].

Заключение

Результаты проведенного исследования позволяют констатировать, что применение низких доз (0,6 мкг) одной из активных форм кислорода, озона, сопровождается минимально инициирующим влиянием на ПОЛ в крови с преимущественным защитным антиоксидантным действием как на системном уровне (кровь), так и на клеточном (эритроциты). Использование более высоких доз озона (2,0 и 8,0 мкг), также стимулирующих СОД, сопровождается при этом уменьшением влияния О3 на окислительно-восстановительные процессы в организме, о чём свидетельствовали сниженные показатели хемилюминограмм и концентрации МДА в крови.

Список литературы

1. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М: Фирма Слово, 2006. 556 с.

2. Павлюченко И. И., Ременякина Е.И., Панасенкова Ю.С., Ваштак И.В. Целесообразность мониторинга перекисного окисления липидов для оценки эффективности терапевтических программ в условиях санатория // Фундаментальные исследования. 2012. № 7. С. 151-154.

3. Перетягин С. П. О многофакторном механизме лечебного действия озона // Нижегородский медицинский журнал. 2003. С. 6-7.

4. Перетягин С.П., Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Зимин Ю.В., Перетягин П.В. Энзимологическая оценка гепатотропного действия озона в субхроническом эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. Т.154, №12. С. 758-760.

5. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45, № 3. С. 109-116.

6. Elvis A.M., Ekta J.S. Ozone therapy: A clinical review // J Nat Sci Biol Med. 2011. Vol. 2, № 1. P. 66-70.

BHopagHKa^w u AHTHOKCHgaHTbi 2017 TOM 4, №1

37

7. Guanche D., Hernandez F., Zamora Z., Alonso Y. Effect of ozone preconditioning on redox activity in a rat model of septic shock // Toxicol. Mech. Methods. 2010. Vol. 20, № 8. P. 466-471.

8. Uchiyama M., Mihara M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test // Analyticac Biochemistry. 1978. № 86. P. 271.

9. Zhou N.B., Fu Z.J., Sun T. Effects of different concentrations of oxygen-ozone on rats' astrocytes in vitro // Neurosci Lett. 2008. Vol. 441, № 2. P.178-182.