Способность миокарда крыс к самообновлению в экспериментах in vitro: колонии сокращающихся неонатальных кардиомиоцитов

Способность миокарда крыс к самообновлению в экспериментах in vitro: колонии сокращающихся неонатальных кардиомиоцитов

Т.А. Голованова, Г.Б. Белостоцкая

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова Минздравсоцразвития РФ, Санкт-Петербург

Regeneration of rat cardiac myocytes in vitro: colonies of contracting neonatal cardiomyocytes

T.A. Golovanova, G.B. Belostotskaya

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of RAS, Saint Petersburg V.A. Almazov Federal Heart, Blood and Endocrinology Centre, Saint Petersburg

В первичной культуре клеток миокарда новорожденной крысы на фоне гипертрофии основной популяции зрелых кардиомиоцитов иммуноцитохимически выявлено формирование колоний из мелких (d = 6,2±0,5 мкм) резидентных c-kit+ и Sca+ стволовых клеток (СК) и предшественников кардиомиоцитов (ПК) IsH^-типа. С 8-го дня культивирования были выявлены первые сокращающиеся колонии (—1—2 клона на 100 тыс. клеток). Клетки колоний были способны к спонтанной дифференцировке, демонстрируя созревание сократительного аппарата и Ca2+ ответы на кофеин (5 мМ) и K+ (120 мМ). Формирование электромеханического сопряжения с типичным для сердечной мышцы Са2+-зависимым высвобождением Ca2+ происходило на протяжении 3-х нед. Вначале в колониях регистрировались локальные, слабые, спонтанные, асинхронные и аритмичные сокращения с частотой 2—3 уд/мин, но со временем сокращения становились синхронными и охватывали все клетки колоний, а частота доходила к концу месяца до 58—60 уд/мин. Первые сокращающиеся клоны были образованы Isl1 + ПК, а c-kit^-колонии из-за, возможно, более продолжительного периода пролиферации начинали сокращаться на 9—10 дней позже.

Таким образом, впервые выявлены и изучены сокращающиеся колонии, образованные из СК и ПК при ко-культивировании со зрелыми клетками миокарда. Описанный процесс имитирует регенерационный кардиомиогенез от резидентной клетки-предшественницы до колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов и представляет собой полноценную модель для фундаментальных исследований, тестирования лекарственных препаратов и выявления регенерационного потенциала СК и ПК с целью возможного применения резидентных самообновляющихся клеток в терапии поврежденного миокарда.

Ключевые слова: резидентные стволовые клетки c-kit+ - и Бса+-типа и кардиопредшественники Isl1 +-типа, пролиферация, дифференцировка, сокращающиеся колонии.

Значительные успехи в изучении биологии стволовых клеток (СК) привели к всплеску интереса к ним в плане возможного применения для восстановления поврежденных органов и тканей. В кардиологии из-за ограниченной регенеративной способности сердечной мышцы эти исследования, направленные на поиск источников самообновляющихся кардиомиоцитов, являются особенно актуальными. Если одни исследования нацелены на изучение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [1, 2], мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) [3] или индуцированных плюрипотентных СК [4], то в других —

e-mail: gbelost@mail.ru

In parallel to the hypertrophy of major cardiac myocyte population, we detected immunohistochemically the formation of colonies consisting of small (dm = 6,2±0,5 jum) resident c-kit+ and Sca+ stem cells (SC) and Isl1+-positive cardiac myocyte progenitors (CMP) in the primary culture of neonatal rat cardiac myocytes. First contracting colonies (—1—2 clones per 100000 cells) were registered starting from 8th day of culture. The cells of the colonies were capable of spontaneous differentiation, demonstrating the maturation of contractile machinery and Ca2+ responses caffeine (5 мМ) and K+ (120 мМ). The full-scale development of electromechanical coupling with typical for cardiac muscle Ca2+-induced Ca2+ release was obvious at 3 weeks of culture. At first, the local, weak, spontaneous, asynchronous, and arrhythmic contractions at a rate of 2—3 beats/min were registered. However, with time the contractions became synchronous and involved all cells of the colony with the rate of contractions being 58—60 beats/min at the end of the month. First contracting clones comprised Isl1 + CMP, while c-kit+-colonies started to contract 9—10 days later possibly owing to a more prolonged period of proliferation.

Thus, we first demonstrated and characterized the contracting colonies originating from SC and CMP when those were co-cultivated with mature cardiac myocytes. The process described in this study is akin to regenerative cardiomyogenesis encompassing the pathway from resident progenitor cell to the colony of mature contracting cardiac myocytes. It follows, therefore, that contracting myocyte colony is a suitable model for basic research, testing of drugs, and the investigation of regenerative capacity of SC and CMP aimed at future applications of resident progenitor cells in cell-based treatment of cardiac injury.

Ключевые слова: резидентные стволовые клетки c-kit+- и Бса+-типа и кардиопредшественники Isl1 +-типа, пролиферация, дифференцировка, сокращающиеся колонии.

в качестве материала для обеспечения регенерации миокарда рассматриваются наработанные вне организма резидентные СК миокарда и/или предшественники кардиомиоцитов (ПК) [5—7]. При этом во всех случаях для восстановления поврежденной ткани клетки должны не только пролиферировать, но и дифференцироваться в специализированные, полностью функциональные кардиомиоциты, способные интегрироваться в миокард. Однако, несмотря на интенсивные исследования, успехи в области использования клеточных технологий для восстановления миокарда остаются весьма скромными [8, 9].

Поэтому создание клеточных моделей, позволяющих прослеживать все этапы пролиферации и дифферен-цировки СК и/или ПК, актуально как для фундаментальной науки, так и для клинической практики.

В нашей работе впервые выявлены и описаны колонии сокращающихся кардиомиоцитов, сформированные в первичной культуре клеток миокарда новорожденной крысы. Показано, что в процессе культивирования образуются колонии из резидентных СК c-kit+- и Бса + -типа и ПК Isl1 +-типа. Причем последние демонстрируют полное созревание кар-диомиоцитов, имитируя регенерационный кардио-миогенез от клетки-предшественницы до колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.

Колонии дифференцированных кардиомиоцитов, образованные резидентными СК и ПК в культуре, представляют собой полноценную модель для фундаментальных исследований, а также для поиска и тестирования лекарственных препаратов. Более того, изучение пролиферации и дифференцировки резидентных СК и ПК позволит выявить их регенеративный потенциал с целью возможного применения резидентных самообновляющихся клеток в терапии поврежденного миокарда.

Материал и методы

Получение культуры клеток миокарда описано в предыдущей работе [10]. Кинетику изменений и морфологию клеток прослеживали путем прижизненного микрофотографирования растущей популяции в чашках Петри на инвертированном микроскопе PIM-III (WPI, USA) с использованием цифровой камеры Leica DFC300 FX (Germany) или на фиксированных смесью ледяной уксусной кислоты и спирта (1:3) и окрашенных гематоксилином препаратах на тринокулярном микроскопе H605T (WPI, USA). Микроизображения и видеоролики колоний сокращающихся кардиомиоцитов получали с помощью цифровой камеры и инвертированного микроскопа с объективом х40.

Регистрацию концентрации свободного внутриклеточного кальция ([Са2+]^ осуществляли с помощью компьютерной системы анализа внутриклеточного содержания ионов (Intracellular Imaging & Photometry System, USA). Программа InCytIm2TM рассчитывала концентрацию ионов кальция по методу Гринкевича [11] как соотношение интенсивностей флуоресценции (F340/F380) с учетом калибровочной кривой. В опытах по измерению [Са2+] применяли раствор Рингера, содержащий кальций (2 мМ СаС!2), а также бескальциевый раствор Рингера. В качестве раствора с высоким содержанием ионов К+ использовали раствор Рингера с содержанием KCl 120 мМ и NaCl 26 мМ. Для измерения [Са2+] стекла с клетками инкубировали в растворе Рингера с флуоресцентным красителем Фура-2АМ (Sigma) в концентрации 10 мкМ в течение 1 ч при 26°С. Эксперименты проводили при комнатной температуре.

Уровень дифференцировки кардиомиоцитов в составе формирующихся в первичной культуре колоний определяли по способности рецепторов наружной мембраны и саркоплазматического ретику-лума (СР) отвечать повышением [Са2+] на действие соответствующих агонистов. Были использованы: ацетилхолин (АцХ, Sigma) в концентрации 20 мкМ; кофеин (Кф, Sigma) в концентрации 5 мМ, взаимодействующий с рианодиновыми рецепторами СР,

раствор Рингера с повышенным содержанием K+ (120 мМ), вызывающего деполяризацию мембраны и запускающего электромеханическое сопряжение (ЭМС), а также АТФ (180 мкМ), взаимодействующую с пуринэргическими рецепторами.

Для выявления пролиферирующих резидентных ПК и СК культуры, выращенные на покровных стеклах, фиксировали с помощью параформальдегида (2,5—4%), пермеабилизировали в течение 10 мин в фосфатном буферном растворе с добавлением 0,25% Тритона X-100 и использовали 2 варианта иммуноцитохимического окрашивания.

При 1-м варианте ПК и СК метили с помощью антител к антигенам СК и ПК: мышиных анти-c-kit моноклональных антител (5 мкг/мл, Invitrogen), мышиных анти-ScaH поликлональных антител (1:100, Abcam) и кроличьих моноклональных анти-isle^ антител (1:100, Abcam). В качестве маркера зрелых миоцитов использовали кроличьи анти-GATA4 поликлональные антитела (1:500, Abcam). Вторичными антителами были козьи антимышиные фикоэритрин-конъюгированные антитела (1:100, Invitrogen), козьи антимышиные конъюгированные с FITC антитела (1:100, Abcam) и ослиные анти-кроличьи FITC-конъюгированные антитела (1:100, Abcam). Для подавления аутофлуоресценции клетки окрашивали в течение 5 мин. кристаллическим фиолетовым в концентрации 2 мг/мл. Идентификацию клеток колоний осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа PFM (WPI, USA) при увеличении х100.

В другом варианте иммуноокрашивания применяли первичные мышиные моноклональные антитела к Isl1 (Abcam) и Sca (Abcam) антигенам, конъюгированные с Alexa 405 (Invitrogen), согласно Zenon-технологии (Invitrogen). Для выявления c-kit+ СК применяли коммерческие конъюгированные с FITC антитела (Abcam). Зрелые кардиомиоциты метили Родамин-Фаллоидином (Sigma) в концентрации 10 мкг/мл. Клетки тестировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Germany) при увеличении х40.

Результаты

Как было описано в первом сообщении [10], пролиферация клеток неонатального миокарда крыс линии Wistar прекращается после 5-го дня культивирования и сменяется гипертрофией кардиомиоцитов. Однако изучение монослоя культивируемых клеток после этого срока позволило выявить образование незначительного количества колоний разного размера (рис. 1). При культивировании наблюдалось трехмерное увеличение размеров колоний. Более того, на 8-й день развития были выявлены редкие (~ 1—2 колонии на 100 тыс. клеток), спонтанно пульсирующие колонии с частотой сокращений 2—3 уд/мин (рис. 2А). Клетки, локализованные в центральной части колоний, были значительно мельче окружающих их крупных кардиомиоцитов и, по-видимому, составляли субпопуляцию клеток с объемом до 250 мкм3 [10]. Через сутки после посева они имели dmax = 6,9±0,6 мкм и dmin = 5,4±0,4 мкм (Уср = 141 ±6 мкм3), в отличие от кардиомиоцитов, которые исчерпали свой пролиферативный потенциал в первые дни культивирования и были отнесены к клеткам 2-й и 3-й субпопуляций [10], с d _ =12,3±0,4 мкм

mi ax с р q

и dmin ср = 11,0±0,3 мкм (Уср = 819±68 мкм ).

Рис. 1. Колонии клеток миокарда новорожденной крысы in vitro:

А, Б, В - 7 сут.; Г - 8 сут. культивирования. Окраска: гематоксилин. Ув. х40

A

Б

Время, с

130

Рис. 2. Кардиомиоциты новорожденной крысы in vitro:

А - колония сокращающихся клеток, 8 сут. культивирования;

Б - спонтанные колебания концентрации внутриклеточного кальция ЦСа2+]1) в отдельных клетках колонии

0

Регистрация [Са2+] в отдельных клетках сокращающихся колоний выявила разрозненные асинхронные флуктуации уровня свободного кальция на этом сроке развития (рис. 2Б). Однако по мере культивирования сокращения становились синхронными, а частота доходила до 58—60 уд/мин к концу месячного срока развития культуры (рис. 3).

Основываясь на данных о наличии в миокарде млекопитающих резидентных Бса-1 + и с-к^+ СК [5, 6] и !б!1 + ПК [7], для установления принадлежности

клеток колоний к определенному типу пролиферирующих клеток сердца иммуноцитохимически определяли экспрессию Бса-1, с-к^ и Ы1 антигенов. На 13 сут. развития клеток миокарда новорожденной крысы в культуре были обнаружены колонии разного размера, содержащие все варианты тестируемых клеток. При этом, по данным флуоресцентной микроскопии, самыми крупными, объемными и дифференцированными оказались колонии, образованные клетками !б!1 +-типа (рис. 4А).

Рис. 3. Колония клеток миокарда новорожденной крысы in vitro: А - 18 сут. культивирования

Б

30 мкм

Рис. 4.

Колонии клеток миокарда новорожденной крысы in vitro, 11 сут. культивирования (красный цвет - актин):

А - экспрессия Isl1 + (синий цвет) резидентными предшественниками кардиомиоцитов;

Б - экспрессия c-kit+ (зеленый цвет) стволовыми клетками колоний,

В - экспрессия Sca+ (синий цвет) стволовыми клетками колоний. Конфокальная микроскопия.

A

20 МКМ

20 мкм

Их размеры были сопоставимы с размерами сокращающихся колоний. К 13 сут. культивирования антитела к Бса-1 антигену выявляли небольшие скопления мелких клеток, которые, по всей видимости, представляли колонию кардиомиоцитов на начальной стадии ее формирования. Клоны с клетками с-к^+-типа были крупнее Бса-1 + колоний (рис. 4В) и по размеру были схожи с колониями, содержащими !э!1+-клетки. Видно, что большое количество недифференцированных клеток (с-к^+) располагалось внутри колонии, а зрелые кардиомиоциты (ЭАТА+) — по периферии. По-видимому, из-за незавершив-шейся пролиферации колонии, образованные с-к^+-клетками, были неспособны к сокращению на этом сроке культивирования.

Последовательное сканирование оптических срезов при конфокальной микроскопии позволило установить, что толщина колоний на протяжении 10—17 сут. развития в культуре варьирует от 13 до 97 мкм. При этом на 11—13 сут. размеры Ы1+- и с-к^+-колоний по 7-оси вполне сопоставимы, в то время как Бса-1-позитивные колонии были гораздо меньше. Их толщина в эти сроки не превышала 19—20 мкм, но к 17 сут. достигала 56—60 мкм. Средние срезы объемных колоний (рис. 4Б) показывают расположение резидентных ПК и СК внутри колоний. Видно, что !з!1+-кпетки (12-й срез из 24) локализуются компактно в центре колонии, имеющей толщину 36 мкм (см. рис. 4Б). По периферии располагаются зрелые кардиомиоциты как исходные, так и дифференцированные из резидентных ПК — часть клеток с развитым цитоскелетом (актин) экспрессировали Ы1-антиген. В с-к^-колонии зона, занимаемая СК (12-й срез из 24), значительно больше, а размер колонии по оси 7 составляет 35 мкм. Периферийно расположенные клетки также представлены кардиомиоцитами, частично дифференцированными из СК с-к^+-типа. Плоская колония (19 мкм), сформированная резидентными Бса-1 +-клетками, содержала незначительное количество СК в центре (11-й срез из 20), а также отдельные дифференцированные из СК кар-диомиоциты.

Факт дифференцировки клеток в составе колоний был подтвержден экспериментами по измерению активности рецепторов наружной мембраны и СР. В отличие от пролиферирующих клеток формирующихся колоний, которые не давали Са2+-ответов на аппликацию АцХ, К+ и Кф, отдельные клетки слабо сокращающейся колонии на 10 сут. развития четко реагировали повышением [Са2+] на действие АцХ, К+, АТФ и Кф (рис. 5). Выброс Са2+ из СР в ответ на подачу Кф демонстрировало окончательное формирование ЭМС и кардиодифференцировку клеток в составе колоний, образованных в первичной культуре клеток миокарда новорожденной крысы. Более того, было показано, что в бескальциевой среде клетки не демонстрировали Са2+-ответа на действие Кф (см. рис. 5). Это свидетельствует в пользу того, что в процессе роста и созревания сокращающихся колоний резидентные ПК и СК делятся и дифференцируются в кардиомиоциты с формированием типичного, характерного для сердечной мышцы кальций-зависимого высвобождения кальция из СР (С!СП). Эти процессы происходят несинхронно: часть клеток, прекратив деление, начинают дифференци-ровку, в то время как другие СК и ПК еще продолжают пролиферацию.

АцХ Кф КС1 АТФ Кф КС1 АТФ

Рис. 5. Кривые изменения концентрации

внутриклеточного кальция ([Са2+]1) в кардиомиоцитах

на 10 сут. культивирования в ответ на действие

АцХ

Обсуждение

В первичной культуре клеток миокарда неонатальных крыс линии Wistaг были впервые выявлены и охарактеризованы колонии, образованные резидентными СК и ПК трех типов Бса-1 +, с-к^+ и Ы1 +. Варьирование размеров колоний как по площади, так и по высоте (см. рис. 1), а также разница в сроках появления первых сокращений свидетельствуют о различиях в скоростях пролиферации и дифференцировки рассмотренных типов СК и ПК. Было установлено, что Бса-1-позитивные СК пролиферируют значительно медленнее других резидентных клеток и образуют мелкие плоские колонии, неспособные к сокращениям, по крайней мере, в течение 25 сут. культивирования. Колонии, образованные с-к^+- и Ы1+-клетками, имели сходные морфометрические параметры, но различные темпы пролиферации и дифференцировки. И, если в !э!1+-колониях разрозненные слабые асинхронные сокращения были зафиксированы уже на 8 сут. культивирования, то первые сокращения клеток с-к^+-колоний были отмечены на 9—10 сут. позже. Поскольку на 13 сут. большое скопление незрелых клеток сосредоточено, по данным иммуноцитохимии, в центре колоний (рис. 4В), указанная задержка может быть обусловлена более продолжительным периодом пролиферации СК с-к^+-типа.

Последующая синхронизация сокращений и нарастание их частоты со временем подразумевает созревание дигидропиридиновых и рианодиновых (РиР) рецепторов и становление ЭМС, соответствующего зрелым дифференцированным кардиомиоцитам. Постепенное сближение рецепторов, обусловленное развитием Т-трубочек, способствует формированию С!СП и позволяет дифференцированным клеткам колоний осуществлять типичные для сердечной мышцы сокращения с частотой, доходящей до 58—60 уд/мин. По данным многочисленных исследований С!СП в эмбриональном периоде отсутствует, появляясь только через несколько недель постнатальной жизни [12]. При рождении вклад высвобождения Са2+ из СР через РиР составляет не более 15%, в то время как в трехнедельном возрасте доходит до 88% общего внутриклеточного выброса [13]. При дифференцировке резидентных СК и ПК в культуре от момента инициации слабых спонтанных пульсаций отдельных клеток

до синхронизированных высокоамплитудных сокращений всей колонии проходит около 18—20 дней, что сходно с модификацией механизма ЭМС от сарколеммно-зависимого при рождении до CICR-зависимого в трехнедельном возрасте. Сходная картина наблюдается и в культивируемых ЭСК [2, 14]. Однако, если инкубирование ЭСК воспроизводит эмбриональное развитие клеток сердца [15], то формирование колоний сокращающихся кардиомио-цитов имитирует регенеративный кардиомиогенез.

Таким образом, иммуноцитохимические исследования с использованием антител к антигенам Sca-1, c-kit и Isl1 позволили сопоставить выявленные нами резидентные клетки миокарда с СК и ПК, описанными другими авторами [5—7]. При этом, в отличие от вышеуказанных исследователей, которые стимулировали СК и ПК к дифференцировке, мы регистрировали полную, и, что очень важно, спонтанную дифферен-цировку резидентных ПК в составе колоний в культуре клеток миокарда крысы во время совместного культивирования со зрелыми кардиомиоцитами.

При формировании колоний резидентные СК и ПК последовательно проходят стадии митотического деления и дифференцировки, формируя сообщество

ЛИТЕРАТУРА:

1. Satin J., Itzhaki I., Rapoport S. et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells 2008; 26(8): 1961-72.

2. Liu J., Lieu D.K., Siu C.W. et al. Facilitated maturation of Ca2+ handling properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes by calsequestrin expression. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2009; 297(1): 152-9.

3. Asai Y., Tada M., Otsuji T.G. et al. Combination of functional cardiomyocytes derived from human stem cells and a highly-efficient microelectrode array system: an ideal hybrid model assay for drug development. Curr. Stem Cell Res. Ther. 2010; 5(3): 227-32.

4. Kuzmenkin A., Liang H., Xu G. et al. Functional characterization of cardiomyocytes derived from murine induced pluripotent stem cells in vitro. FASEB 2009; 23(12): 4168-80.

5. Beltrami A.P., Barlucchi L., Torella D. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 2003; 114: 763-76.

6. Oh H., Bradfute S.B., Gallardo T.D. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: Homing, differentiation, and fusion after infarction. PNAS 2003; 100(21): 12313-18.

7. Laugwitz K-L., Moretti A., Lam J. et al. Postnatal isl1 + cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature 2005; 433: 647-53.

8. Behfar A., Crespo-Diaz R., Nelson T.J. et al. Stem cells: clinical

зрелых кардиомиоцитов, способных к сокращению и, возможно, к интеграции в зрелый миокард. Вероятно, что подобные процессы происходят в миокарде (in vivo) при различных ситуациях, запускающих пролиферацию резидентных клеток (инфаркт, ишемия, травмы, повышенная нагрузка). Мы предполагаем, что стадии развития СК и ПК, рассмотренные нами в первичной культуре при образовании сокращающихся колоний в модели естественного окружения, воспроизводят регенерационные процессы в поврежденном миокарде. В связи с этим, формирование колоний в культуре может быть моделью для изучения пролиферации и дифференцировки ПК, а также возможности влияния на эти процессы различных физических факторов или естественных физиологических или биохимических модуляторов. Кроме того, это эффективная модель для изучения природы формирования пейсмекерной активности клеток миокарда, а также для исследования действия фармакологических препаратов на частоту сердечных сокращений.

Авторы выражают благодарность ИНЦ РАН за предоставленную возможность работы на конфокальном микроскопе. Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-00993-а.

trials results the end of the beginning or the beginning of the end? Cardiovasc. Hematol. Disord. Drug Targets. 2010; 10(3): 186-201.

9. Malliaras K., Marban E. Cardiac cell therapy: where we've been, where we are, and where we should be headed. Br. Med. Bull. 2011; 98(1): 161-85.

10. Голованова Т.А., Белостоцкая Г.Б. Способность миокарда крыс к самообновлению в экспериментах in vitro: пролиферативная активность неонатальных кардиомиоцитов. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI (4): 66-70.

11. Grynkiewicz G., Peenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 1985; 260: 3440-50.

12. Bers D.M. Excitation-contraction coupling and cardiac contractile force. 2d. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic; 2001.

13. Escobar A.L., Ribeiro-Costa R., Villalba-Galea C. et al. Developmental changes of intracellular Ca2 + transients in beating rat hearts. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2004; 286: 971-8.

14. Lieu D.K., Liu J., Siu C.W. et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 2009; 18(10): 1493-500.

15. Satin J., Kehat I., Caspi O. et al. Mechanism of spontaneous excitability in human embryonic stem cell derived cardiomyocytes. J. Physiol. 2004; 559(Pt 2): 479-96.

Поступила: 21.10.2011