ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА
DRUG PREPARATION FOR PARKINSON DISEASE

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано для создания лекарственного препарата на основе биодеградирующих полимеров для лечения болезни Паркинсона.
Болезнь Паркинсона (БП) - хроническое прогрессирующее заболевание головного мозга, преимущественно связанное с дегенерацией дофаминергических нейронов черной субстанции и проявляющееся сочетанием гипокинезии с ригидностью, тремором покоя и постуральной неустойчивостью. БП - одно из наиболее частых неврологических заболеваний пожилого возраста: его распространенность среди лиц старше 65 лет достигает 2%. Распространенность БП составляет от 120 до 180 на 100 000 населения, заболеваемость - от 12 до 20 случаев на 100 000 населения в год [1, 2]. Прогноз условно неблагоприятный. Больные, не получающие лечения, в среднем теряют возможность обслуживать себя самостоятельно через 8 лет от начала заболевания, а через 10 лет становятся прикованными к постели [1]. Лица, принимающие адекватную терапию, становятся зависимыми от обслуживающих их лиц в среднем через 15 лет [1]. При относительно раннем развитии болезни Паркинсона быстрее всего прогрессируют симптомы нарушения двигательной активности, а при появлении первых симптомов заболевания у лиц 70 лет и старше на первый план выходят психические расстройства [3]. В последнее время среди больных паркинсонизмом все больше молодых людей. Очевидно, это связано с распространением наркотиков, в которых могут присутствовать токсичные для нейронов черного тела примеси. При болезни Паркинсона в стриатуме, одном из подкорковых отделов мозга, участвующем в координации двигательной активности и формировании эмоциональной реакции, понижено содержание нейромедиатора дофамина. Кроме того, поражаются структуры экстрапирамидной системы - базальные ядра и черное вещество, голубое пятно и другие [3]. Наиболее выраженные изменения отмечают в передних отделах черной субстанции. Характерные для болезни Паркинсона симптомы (клинические проявления) возникают при гибели 60-80% нейронов данного анатомического образования [4, 5].
Этиологическими факторами риска БП считаются старение, генетическая предрасположенность, воздействие факторов окружающей среды [4, 6, 7]. Патоморфологически нормальное старение сопровождается уменьшением числа нейронов черной субстанции и наличием в них телец Леви. Старению также сопутствуют нейрохимические изменения в стриатуме - снижение содержания дофамина и фермента тирозингидроксилазы, а также уменьшение числа дофаминовых рецепторов. С помощью позитронно-эмиссионной томографии доказано, что темпы дегенерации нейронов черной субстанции при болезни Паркинсона намного выше, чем при нормальном старении [6]. Около 15% людей с болезнью Паркинсона имеют семейный анамнез данного заболевания. Однако гены, ответственные за развитие болезни Паркинсона, не идентифицированы [6]. Причинами паркинсоноподобных проявлений также могут быть вирусная инфекция, опухоль, механические повреждения нейронов черного тела (травмы), воздействие факторов окружающей среды (пестициды, гербициды, соли тяжелых металлов) [8], хроническая цереброваскулярная недостаточность или употребление лекарств, вызывающих экстрапирамидные побочные эффекты [9]. Окислительная гипотеза возникновения БП отводит важную роль свободным радикалам, образующимся при окислительном метаболизме дофамина и влияющих на развитие и прогрессирование болезни Паркинсона. Увеличение содержания веществ, которые могут служить донорами электронов, в черном веществе, способствует образованию свободных радикалов [6]. Кроме того, при окислении дофамина под действием МАО образуется перекись водорода. Если перекись водорода не связывается с глутатионом, то происходит накопление весьма реакционно-способных гидроксильных радикалов, которые вступают в реакцию с липидами клеточных мембран, вызывая перекисное окисление липидов и гибель клеток черного вещества.
Болезнь Паркинсона на вторую половину 2013 года является неизлечимой, все существующие методы лечения направлены на облегчение ее симптомов (симптоматическое лечение). К основным препаратам, устраняющим двигательные нарушения, относятся: 3,4-дигидрокси-L-фенилаланин - леводопа (чаще в комбинации с периферическими ингибиторами ДОФА-декарбоксилазы или реже с ингибиторами КОМТ), агонисты дофаминовых рецепторов и ингибиторы МАО-Б [10].
Спустя несколько десятилетий после своего появления препараты леводопы остаются самыми эффективными противопаркинсоническими средствами, в сравнении с которыми оценивается активность всех других средств [1, 11, 12]. Леводопа эффективна в отношении всех трех основных симптомов БП: гипокинезии, тремора, ригидности [1, 12]. Поскольку препараты леводопы остаются наиболее эффективным лечебным средством на всех стадиях БП, их назначают практически всем больным с этим заболеванием.
Леводопа (L-ДОФА) - аминокислота, непосредственный метаболический предшественник дофамина, которая в отличие от него способна с помощью переносчика проникать через гематоэнцефалический барьер и компенсировать дефицит дофамина в мозге, лежащий в основе многих клинических проявлений БП. Леводопа всасывается в проксимальном отделе тонкой кишки и захватывается окончаниями сохранившихся дофаминергических нигростриарных нейронов, подвергаясь в них декарбоксилированию, превращается в дофамин, который выделяется в синаптическую щель, поддерживая адекватное функциональное состояние нейронов полосатого тела и других базальных ганглиев [1, 11, 12]. Эффективность леводопа в отношении выработки дофамина и его биологическая доступность намного выше по сравнению с другими предшественниками дофамина - фенилаланином и тирозином. Большим преимуществом препаратов L-ДОФА является и тот факт, что использование их в терапевтических дозах не нарушает синтез эндогенного дофамина, а наоборот, усиливает его выработку [1].
1/2
В наши дни леводопа - основной, но далеко не идеальный препарат для лечения болезни Паркинсона. К недостаткам следует отнести относительно низкую биодоступность препарата, колебания степени абсорбции препарата в желудочно-кишечном тракте, особенно при нарушении моторных функций кишечника, и короткий период полураспада в плазме крови (T до 3 ч). Он проникает не только в мозг, но и в другие органы проходит не хуже. В результате этих процессов часто больше 50% лекарства теряется, не достигая клеток - мишеней. Поэтому, чтобы создать нужную концентрацию в капиллярах мозга, требуются огромные дозы (начальная доза 0,25 г в день, которую при необходимости увеличивают до 4-5 г, а при хорошей переносимости суточная доза достигает 6 г). При развитии побочных явлений уменьшают дозу или прекращают прием препарата [11].
Важное значение имеют еще две особенности леводопы. Во-первых, препарат обеспечивает наиболее гарантированный эффект при БП: оказывает лечебное действие более чем у 95% пациентов [6]. Соответственно положительная реакция на препараты леводопы - важный критерий диагностики этого заболевания. При БП леводопа дает положительный эффект в течение всего срока ее назначения: от самых ранних до финальных стадий болезни. Более того, величина лечебного эффекта в течение всех лет применения леводопы остается почти неизменной [6].
В результате уменьшения нигростриарных терминалей нейронов в стриатуме утрачивается их "буферная" функция - способность накапливать и плавно высвобождать дофамин, образуемый из экзогенной леводопы. В сохранившихся нейронах ускоряется кругооборот дофамина - клетки быстрее высвобождают, а не накапливают дофамин в везикулах. Леводопа все в большей степени перерабатывается в дофамин в соседних глиальных и недофаминергических (например, серотонинергических) нейронах, в которых содержится ДОФА-декарбоксилаза, но отсутствует механизм, регулирующий выброс и обратный захват дофамина, что приводит к массивному неконтролируемому высвобождению дофамина вскоре после приема очередной дозы. Вновь синтезированный дофамин проникает в межклеточное пространство и диффундирует в синаптические щели. В результате концентрация дофамина в синапсе попадает в зависимость от колебаний уровня леводопы в крови и резко меняется в широких пределах. Вскоре после приема очередной дозы она резко повышается, а затем быстро падает. В результате стимуляция дофаминовых рецепторов из тонической превращается в пульсирующую, нефизиологическую, что в свою очередь изменяет функциональное состояние рецепторного аппарата и стриарных нейронов [13, 14].
Таким образом, можно выделить пресинаптические механизмы развития флюктуаций (критическое снижение количества нигростриарных терминалей) и постсинаптические механизмы, инициируемые пульсирующей стимуляцией дофаминовых рецепторов. Постсинаптические механизмы могут быть связаны с изменением чувствительности дофаминовых рецепторов или опосредованы внутриклеточными сигнальными системами, контролирующими состояние генов и продукцию белков в проекционных нейронах стриатума [13].
Одним из подходов устранения вышеперечисленных недостатков препарата, а также снижения возможных побочных эффектов и увеличения эффективности и оптимизации метаболизма является изменение лекарственной формы препарата леводопа, способной обеспечить снижение дозы, необходимой для достижения заданного эффекта, с помощью контролируемого высвобождения и оптимизации биораспределения.
Ранее В.И. Швецом и др. [15, 16] была показана перспективность использования липосом (фосфолипидных пузырьков) для защиты L-ДОФА от деструктивного действия ферментов. Эти микросферы (размером от 25 нм до 1 мкм) служили своеобразным контейнером для препарата, защищая его от преждевременного декарбоксилирования и не допуская быстрого падения концентрации активного вещества в крови, в результате чего была повышена эффективность действия препарата более чем в 10 раз по сравнению с его раствором. Большая активность липосомального L-ДОФА объяснялась также легкостью проникновения этой лекарственной формы через гематоэнцефалический барьер. Этими опытами была показана принципиальная перспективность использования ДОФА в виде наносомальной лекарственной формы для лечения болезни Паркинсона.
Следует отметить, что использование липосомальных лекарственных форм обеспечивает также пролонгированность действия препаратов и снижение их токсичности. В работе During M.J. и др. было показано, что липосомы с включенным ДОФА, имплантированные в частично денервируемый стриатум крыс, проявляли пролонгированный эффект в течение 40 дней. Малые одноламеллярные везикулы были получены озвучиванием липосомальной дисперсии. Результаты этих исследований свидетельствовали о частичном восстановлении дефицита дофамина у животных с апоморфин-индуцированной моделью БП [17].
К существенным недостаткам липосомальных препаратов следует отнести высокую стоимость используемых фосфолипидов, а также их низкую стабильность при хранении.
Как указывалось выше, альтернативой липосомальным препаратам являются формы лекарственных веществ на основе биосовместимых, биодеградирующих полимеров, например на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот. Данные лекарственные формы представляют полимерные частицы микронных и субмикронных размеров с включенным активным соединением и стабилизированные от агрегации поверхностно-активным веществом (ПАВ). В состав композиции входит также криопротектор, необходимый для сублимационной сушки препарата.
Предпринималась попытка включения ДОФА и дофамина в микросферы сформированные из полиамидного полимера [18]. Однако изучение кинетики высвобождения вещества из полимерных частиц в опытах in vitro показала бесперспективность их дальнейшего использования.
Известен способ [19] получения препарата на основе L-ДОФА в составе полимерных частиц, образованных сополимером молочной и гликолевой кислот. В качестве стабилизатора эмульсии используется поливиниловый спирт. Для получения частиц выбран метод двойных эмульсий, в отличие от использованного модифицированнного метода простых эмульсий.
Известна композиция сухого порошка [RU 2484823, C2, A61K 31/485, A61K 9/14, A61K 9/16, A61K 9/12, A61K 9/72, A61P 25/16, 20.06.2013], содержащая апоморфин, для введения посредством легочной ингаляции, для лечения патологических состояний центральной нервной системы, включая болезнь Паркинсона, содержащая апоморфин и стеарат магния, при этом включает номинальную дозу апоморфина примерно от 3 мг до 10 мг и обеспечивает дозу фракции мелких частиц (FPF), составляющую примерно от 2 до 6 мг при введении.
Недостатком композиции является относительно низкая эффективность лечения.
Наиболее близкой фармацевтической композицией к предложенной является фармацевтическая композиция [RU 2440100, C2, A61K 9/20, A61K 31/198, A61K 47/12, A61P 25/16, 20.01.2012], содержащая пищевую кислоту или комбинацию пищевых кислот, обеспечивающую pH композиции в диапазоне 5,5-6,5, и фармакологически эффективное количество микронизированного L-ДОФА в качестве активного ингредиента, в которой активный ингредиент присутствует в виде частиц на поверхности более крупных частиц носителя.
Эта композиция используется для лечения болезни Паркинсона пациентом, страдающим или склонным к такому заболеванию. Лечение направлено на устранение двигательных флуктуаций у больных, принимающих L-ДОФА для лечения болезни Паркинсона.
Недостатком композиции является относительно низкая эффективность лечения.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является повышение эффективности лечения болезни Паркинсона.
Требуемый технический результат заключается в создании фармацевтической композиции, повышающей эффективность лечения болезни Паркинсона при меньших дозах, и тем самым снижать риск возникновения и степень токсических эффектов, с одновременным достижением эффекта пролонгации действия, снижения кратности приема при лечении.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, предложен лекарственный препарат ДОФА-ПК на основе микронизированного L-ДОФА (3-гидрокси-L-тирозина) в качестве активного ингредиента, согласно изобретению, он представляет собой стабильные частицы, содержащие или сополимер молочной и гликолевой кислот 50/50 (PLGA 50/50), или сополимер молочной и гликолевой кислот 75/25 (PLGA 75/25), или сополимер молочной и гликолевой кислот 50/50 с карбоксильной группой (PLGA-COOH 50/50), или полимер молочной кислоты (PLA), D-маннитол, а также или поливиниловый спирт (ПВС), или Твин-80 при следующем соотношении компонентов, масс.%:
L-ДОФА
9,5÷12,5
PLGA 50/50 (или PLGA 75/25,
или PLGA-COOH 50/50,
или PLA)
75,0÷79,0
D-маннитол
7,5÷8,0
ПВС (или Твин-80)
остальное
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что используют стабильные частицы субмикронного размера от 100 до 400 нм.
В предложенной фармацевтической композиции в качестве активного ингредиента используют L-ДОФА (3-гидрокси-L-тирозина), в качестве биодеградируемого полимера используют сополимер молочной и гликолевой кислот 50/50 (PLGA 50/50), или сополимер молочной и гликолевой кислот 75/25 (PLGA 75/25), или сополимер молочной и гликолевой кислот 50/50 с карбоксильной группой (PLGA-COOH 50/50), или полимер молочной кислоты (PLA), в качестве криопротектора используют D-маннитол, а в качестве поверхностно-активного вещества используют или поливиниловый спирт, или Твин-80.
На чертежах представлены:
на фиг.1 - графики эффективности ДОФА-ПК при хроническом назальном введении в дозе 0,35 мг/кг (по L-ДОФА), в сравнении со стандартным препаратом L-ДОФА в той же дозе;
на фиг.2 - пролонгированный эффект ДОФА-ПК при хроническом ежедневном введении (результаты теста через 0,5 и 24 часа после назального введения препарата в дозе 0,35 мг/кг (по L-ДОФА) крысам Wistar с моделью БП.
на фиг.3 - результаты исследования поведения животных с БП в тесте «открытое поле» после введения ДОФА-ПК в дозе 0.35 мг/кг - исследование количества стоек (фиг.3, А), количества актов груминга (фиг.3, Б);
на фиг.4 - сравнительная эффективность желудочного ведения ДОФА-ПК в дозе 20 мг/кг (фиг.4, А) и назального ведения ДОФА-ПК в дозе 1 мг/кг (фиг.4, Б) здоровым крысам линии Wistar в условиях динамической нагрузки в тесте «плавание с отягощением».
Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Получение полимерных частиц с включенным в них L-ДОФА.

Смесь, состоящую из раствора 500±5.0 мг PLGA 50/50 в 3.0±0.1 мл хлороформа и 100±0,5 мг L-ДОФА, интенсивно перемешивают в течение 30 мин на магнитной мешалке, после чего добавляют по каплям 15±0.5 мл 1% раствора поливинилового спирта, насыщенного L-ДОФА. Полученную эмульсию перемешивают на магнитной мешалке еще 30 минут и гомогенизируют при 24000 об/мин на гомогенизаторе Ultra-Turrax Т-25 (IКА, ФРГ) 3 раза по 60 сек с перерывами в 1 минуту.
Полученную эмульсию помещают в круглодонную колбу, которую соединяют с роторным испарителем. Упаривание хлороформа проводят при небольшом вакууме и температуре воды в бане ≈35°C. Полученный коллоидный раствор помещают в пробирки для центрифугирования. Частицы осаждают при 13 000 об/мин 15 мин при 4°C. Отбирают надосадочную жидкость, осадок суспендируют в 10 мл ± 30 мкл дистиллированной воды и фильтруют через стеклянный фильтр (диаметр пор 40-100 мкм). После фильтрования в круглодонную колбу с фильтратом добавляют 50±0,2 мг D-маннитола и растворяют его. Коллоидный раствор замораживают и высушивают на сублимационной сушке в течение 24 часов. Проводят необходимые анализы препарата.
Оптимальный состав, масс.%
L-ДОФА
9,5÷12,5
PLGA 50/50
75,0÷79,0
D-маннитол
7,5÷8,0
ПВС
остальное
Пример 2. Определение размера частиц - ДОФА-ПК
Определение размеров частиц проводят методом автокорреляционной спектроскопии. Для анализа используют субмикронный лазерный спектрометр Coulter N4MD фирмы Coulter Electronics (США). Алгоритм измерений основан на программе CONTIN. Навеску композиции препарата 5÷5.5 мг смешивают с 5 мл дистиллированной воды и суспендируют несколько минут путем встряхивания. Полученный коллоидный раствор переносят в специальную кювету и проводят измерение. Озвучивание образца не проводят. Размер частиц составляет 300÷400 нм. Таким образом, из вышеизложенного следует, что:
1. Лучшим из исследованных ПАВ является 1.0% водный раствор ПВС;
2. Оптимальный режим эмульгирования: 24 тыс.об/мин, 3 раза по 1 мин, с интервалами по 1 мин;
3. Оптимальное объемное соотношение органической и водной фаз составляет 1:5.
Пример 3. Изучение фармакологической эффективности лекарственного средства ДОФА-ПК на крысах с моделью болезни Паркинсона.
Эффективность терапии исследовали на 40 крысах-самцах линии Wistar (m=335±28r) с фармакологически индуцированной моделью болезни Паркинсона.
а) Получение модельных крыс с БП.
Для разрушения компактной части черной субстанции была выбрана стандартная методика с использованием нейротоксина 6-OHDA (6- гидроксидофамин) [2, 20], который, имея структуру, сходную с дофамином, демонстрирует высокое сродство с мембранным переносчиком дофамина (DAT) и захватывается дофаминергическими нейронами. В клетке 6-OHDA подвергается окислению с образованием токсичных продуктов - хинонов и активных форм кислорода, повреждающих клетку. Токсин вводили в правое полушарие животныхри помощи стереотаксической установки по координатам AP -4.4; L -1,2; H 7,8, трем группам крыс (n=30). Операцию проводили под общим наркозом. Для этого крысам внутрибрюшинно вводили хлоралгидрат в дозе 400 мг/кг, растворенный в физрастворе (100 мг/мл). Наркотизированной крысе сбривали шерсть на верхней части черепа, затем вводили подкожно 0,3-0,5 мл 2% р-ра новокаина в качестве местной анестезии. Кожу черепа разрезали и растягивали так, чтобы были видны черепные швы. Надкостницу не удаляли. Животное помещали в стереотаксическую установку, фиксировали голову. В манипулятор вставляли иглу и отмеряли координаты от брегмы (пересечения сагиттального и коронарного швов черепа). При помощи иглы шприца сверлили отверстие в черепе, затем иглу меняли на канюлю, заполненную раствором 6-OHDA в дегазованном физрастворе (4 мкг/мкл). Иглу канюли погружали в мозг на необходимую глубину, затем при помощи гамильтоновского шприца на 10 мкл, присоединенного к канюле, вводили 2,5 мкл (10 мкг/крысу) раствора токсина со скоростью 1 мкл/мин. После введения иглу оставляли в мозге еще на 5 минут для предотвращения рефлюкса (обратного вытекания препарата). Контрольным животным вместо раствора токсина вводили дегазованный физраствор. После операции разрез на черепе зашивали, рану обеззараживали левомеколем и фукорцином.
б) Подтверждение нейродегенерации
Развитие нейродегенеративного процесса подтверждали через три недели после введения токсина, регистрируя односторонние вращения крыс в ответ на введение апоморфина. Апоморфин вводили внутрибрюшинно, в дозе 1,6 мг/кг (раствор 0,4 мг/мл). Через 10 минут крысу помещали в стеклянный цилиндр радиусом 30 см и высотой 40 см. В течение последующих 10 минут регистрировали количество полных оборотов, совершенных крысой с поврежденной черной субстанции, в противоположную сторону относительно стороны введения токсина, в отличие от нормального контроля [21,2].
в) Исследование эффективности ДОФА-ПК.
В качестве препарата сравнения использовали субстанцию L-ДОФА. Препарат ДОФА-ПК и препарат сравнения L-ДОФА вводили хронически, ежедневно, интраназально в дозе 0.35 мг/кг (по L-ДОФА) (0,12 мг/крысу в 1% растворе аскорбиновой кислоты, в объеме - 20 мкл/ноздрю). Для контрольных введений использовался 1% раствор аскорбиновой кислоты с pH 7,0 в стерильной воде для инъекций. Препараты готовили непосредственно перед введением - L-ДОФА растворяли в 1% растворе аскорбиновой кислоты из расчета 3,2 мг/мл, после чего pH доводили до 7. Частицы, с включением препарата 11±1,5%, суспендировали в растворителе в количестве, необходимом для получения концентрации по L-ДОФА - 3,2 мг/мл. Раствор аскорбиновой кислоты готовили раз в неделю и хранили при температуре +4°C.
Эффективность препарата ДОФА-ПК выявляли по улучшению координации движений у животных с моделью БП при выполнении стандартных тестов для исследования поведения животных. Полученные результаты сравнивали с действием стандартного препарата L-ДОФА в той же дозе, а также со здоровыми животными и контролем с БП, не получавшим терапию.
г) Используемые тесты
Животных тестировали через 30 мин после введения препарата. Для оценки координации движений, моторных функций, поведенческой и исследовательской активности животных, а также уровня тревожности были проведены следующие тесты.
Постановка конечности. Данный тест использовали для еженедельной оценки координации движений животных с односторонне разрушенной черной субстанцией. Животное держали одной рукой под живот, другой, по необходимости, придерживали за хвост. Животное держали параллельно краю лабораторного стола, ниже его поверхности. Затем медленно поднимали таким образом, чтобы вибриссы (усы) касались края стола, а в конечной точке подъема передняя лапа соответствующей стороны тела была выше края столешницы. Критерием правильного выполнения попытки считали постановку передней конечности ближней к столу стороны тела на поверхность стола. Испытание повторяли 10 раз для каждой стороны, занося в протокол количество успешных попыток [20].
Открытое поле. Данный тест использовали для оценки возможных последствий хронического введения препаратов на двигательную и исследовательскую активность экспериментальных животных в условиях свободного поведения. Тест проводили дважды - до начала введения препаратов и через 6 недель введения. Животное помещали в центр поля квадратной, равномерно освещенной красной лампой площадки, размером 80×80 см, огороженной непрозрачными стенками высотой 30 см и горизонтальной поверхностью, расчерченной на квадраты со стороной 20 см.
Экспериментаторы фиксировали поведенческую активность животного в течение 2-х минут. Регистрировали следующие параметры: горизонтальную активность животных (количество пройденных квадратов); количество выходов в центр "открытого поля" (центральный квадрат, 20×20 см); вертикальную активность (количество стоек); количество актов груминга.
Груминг - это активное поведение животных, направленное на поверхность тела, т.е. умывание, лизание, чистка гениталий, почесывание. Усиление груминга наблюдается у грызунов при помещении в стрессогенную ситуацию и возникает у животных при высокой эмоциональной напряженности.
К началу введения препаратов результаты групп животных с БП не различались по эффективности выполнения теста «постановка конечности» и эффективность составляла 81±15% выполнения теста от значений здорового контроля.
Ежедневное назальное введение ДОФА-ПК в дозе 0,35 мг/кг (по L-ДОФА) привело к достоверному улучшению показателей координации движений в тесте «постановка конечности» в группе животных с БП. При этом эффективность действия полимерной композиции ДОФА-ПК увеличивалась со второго дня введения препарата в течение двух недель и сохранялась неизменной на протяжении всего эксперимента - 17 недель введения и через неделю после отмены препарата. К 22-му дню эксперимента, через 30 мин после введения препаратов, показатели координации в тесте «постановка конечности» в группе животных с ДОФА-ПК составили 94±12%, в группе с L-ДОФА - 68±7% и для группы контрольных животных с БП - 58±15%, от значений здорового контроля. К 120 дню введения показатель координации животных в группе с ДОФА-ПК составил 94±10% (p<0,05) по сравнению с L-ДОФА - 62±13% и контролем БП - 51±28%. Стандартный препарат сравнения - L-ДОФА был достоверно эффективен только после однократного введения - 91±8% (p<0,05). Через неделю после отмены препаратов, значения эффективности выполнения теста для исследованных групп с ДОФА-ПК, L-ДОФА и контроля БП составили 77±15% (p<0,05), 60±15% и 47±29%, соответственно.
Комментарий к фиг.1.
Необходимо также отметить, что эффективность действия ДОФА-ПК через 30 мин и через 24 часа после его введения в тесте «постановка конечности» при назальном введении отличалась незначительно. Эти результаты свидетельствуют о пролонгированном эффекте ДОФА-ПК, который сохраняется в течение 24 часов после введения препарата в наноформе.
Комментарий к фиг.2.
Исследование влияния препарата ДОФА-ПК на поведение животных в тесте «открытое поле» проводили дважды. До начала введения (0 день) и на 42 день (6 нед.) введения препарата. Наиболее информативными были следующие регистрируемые параметры: вертикальная активность (количество стоек) и количество актов груминга. В то время как горизонтальная активность и количество выходов в центр "открытого поля" не изменялись в ходе эксперимента и не отличались между группами. Этот факт позволяет утверждать, что процесс развития односторонней нейродегенерации не оказывает существенного влияния на исследуемые показатели, поскольку животные из группы контроля БП ни по одному из исследованных параметров не отличаются от интактного (здорового) контроля.
В то же время введение препарата ДОФА-ПК приводило к достоверному увеличению числа стоек и уменьшению числа актов груминга, что свидетельствует об увеличении исследовательской активности, снижении уровня тревожности и уменьшении времени принятия решений.
Комментарий к фиг.3.
Таким образом, включение L-ДОФА в полимерные частицы достоверно повышает эффективность препарата в сравнении с действием той же дозы стандартного препарата. Доказан пролонгированный эффект в течение 24 часов при ежедневном введении ДОФА-ПК на животных с моделью БП. Кроме того, назальное введение L-ДОФА в составе ПЛГА позволяет значительно снизить эффективную суточную дозу препарата - в 57 раз для животных с БП и, соответственно, кумулятивную дозу препарата.
Комментарий к фиг.4.
Значимым эффектом ДОФА-ПК является быстрое восстановление моторных функций у больных животных (в течение 1-2-х недель) с сохранением эффекта в течение 17 исследованных недель без увеличения суточной дозы препарата и через неделю после отмены введения препарата, что имеет важное практическое значение. Перечисленные преимущества позволяют снизить побочное действие L-ДОФА. Важно отметить, что эффективность препарата ДОФА-ПК достигается в отсутствие ингибиторов дофадекарбокилазы, применяемых при стандартном лечении препаратами L-ДОФА, что также позволяет снизить риск возникновения побочных эффектов и свидетельствует о принципиально новом свойстве препарата ДОФА-ПК, позволяющем доставлять лекарственное средство в орган-мишень наиболее эффективно.
Пример 4. Изучение токсичности лекарственного средства ДОФА-ПК для лечения болезни Паркинсона на крысах при однократном введении.
Оценка степени токсических реакций на введение препарата ДОФА-ПК и препарата сравнения L-ДОФА, осуществлялась при интраназальном способе введения препарата на белых мышах линии Balb\c и крысах-самцах линии Wistar.
Общая продолжительность наблюдений за животными после введения препаратов и контрольных веществ (пустые частицы и растворитель) составляла 14 дней, в первый день животные находились под непрерывным наблюдением.
Препарат сравнения вводили в дозе 1 мг/кг, ДОФА-ПК - в концентрации 10 мг/кг (по L-ДОФА) каждые 5 минут, в каждую ноздрю по 20 мкл, в течение 5 часов. Животным контрольных групп вводили пустые наночастицы в 1% р-ре аскорбиновой кислоты, в стерильной воде для инъекций (pH 7,0) в объеме, соответствующем объему препарата ДОФА-ПК.
Выявлено, что введение препаратов не сопровождалось летальностью. Введение 540 мг/кг ДОФА-ПК мышам линии Balb/c массой 19-21 г не вызывало никаких признаков токсического проявления. Состояние животных не отличалось от состояния животных контрольных групп. Все поведенческие реакции на провоцирующие воздействия: тактильный, звуковой и световой раздражители сохранялись. Нарушений мышечного тонуса, проявлений судорожной активности не наблюдалось.
Введение 168 мг/кг раствора препарата сравнения L-ДОФА привело к появлению признаков токсичности. У животных наблюдалось снижение спонтанной двигательной активности, кратковременное затруднение дыхания (дыхательные движения редкие, спастические), пилоэрекция, развивались кратковременные клонико-тонические судороги. Провоцирующие воздействия: тактильные, звуковой и световой раздражители, а также воздействие воздушной струей вызывали судорожную реакцию, нехарактерную двигательную реакцию (неуверенная походка, заваливание набок). Через 2-3 часа от момента последнего введения уровень спонтанной двигательной активности восстанавливался. И последующее наблюдение за животными в течение последующих 14 дней не обнаружило каких-либо изменений поведения животных.
Введение ДОФА-ПК и препарата сравнения L-ДОФА крысам линии Wistar массой 250 г проводили по той же схеме - в течение 5 часов. Наблюдения за животными выявили признаки интоксикации в группе животных, получавших L-ДОФА, после введения 75 мг/кг. При введении вдвое большего количества ДОФА-ПК (по L-ДОФА) - 150 мг/кг, не приводило к появлению каких-либо видимых признаков токсического действия препарата в течение первого дня и последующих 14 дней после введения препарата.
Таким образом, при изучении острой токсичности установлено, что интраназальное (многократное через короткие промежутки времени) введение композиции ДОФА-ПК, в максимально возможном для вида объеме и дозе не сопровождалось летальными исходами испытуемых животных. Наивысшая суммарная доза ДОФА-ПК, достигнутая при многократном интраназальном введении, составила соответственно: на мышах линии Balb/c - 540 мг/кг (по 10 мкл, в каждую ноздрю, каждые 5 мин); на крысах Wistar - 150 мг/кг (по 20 мкл, в каждую ноздрю, каждые 5 мин). Интраназальное введение по той же схеме L-ДОФА также не сопровождалось летальностью испытуемых животных, но проходящие токсические проявления обнаружились при достоверно меньших дозах и были более выражены, чем при действии «ДОФА-ПК». Наблюдалась хорошая переносимость исследуемого средства. Летальных исходов или выраженных проявлений токсических эффектов в момент введения и на протяжении 14 дней наблюдений не отмечалось. Препарат не оказывал раздражающего действия в месте введения.
В макроскопическом исследовании органов и морфометрическом анализе, при патоморфологических исследованиях не обнаружено достоверных изменений в отобранных органах и тканях животных получавших испытуемую композицию ДОФА-ПК, относительно соответствующих органов и тканей у животных контрольной группы и препарата сравнения L-ДОФА.
Таким образом, препарат - ДОФА-ПК в условиях подострого эксперимента при и/н введении крысам 20 мг/кг и 50 мг/кг (по действующему веществу) не вызывал летальных исходов, не оказывал выраженного токсического действия. Наблюдалась хорошая переносимость исследуемого лекарственного средства. Полученные данные свидетельствуют о безопасности назального применения ДОФА-ПК.
Таким образом, новый технический результат достигается по совокупности всех существующих признаков предложенной фармацевтической композиции на основе L-ДОФА, позволяющей достигать положительного фармакологического действия при меньших дозах и тем самым снижать риск и степень возникновения токсических эффектов, с одновременным достижением эффекта пролонгации действия, снижения кратности приема при лечении и новом способе введения.
Технический результат изобретения достигается путем включения в новую фармацевтическую композицию, построенную на основе L-ДОФА, коммерчески доступных биодеградируемых полимеров, разрешенных к медицинскому применению. В качестве такового используется сополимер гликолевой и молочной кислот (ПЛГА) с молекулярной массой от 10 до 300 кДа и молярным соотношением остатков молочной и гликолевой кислот 50/50%. Для получения стабильной лекарственной формы, применяется также поверхностно-активное вещество - поливиниловый спирт и криопротектор-D-маннитол. Предлагаемую фармацевтическую композицию получают модифицированным методом простого (однократного) эмульгирования (вода/масло).
Список использованных источников.
1. Poewe W. The natural history of Parkinson′s disease // J Neurol. - 2006. - T. 253. - C. 7:VII2-6. - PMID 17131223.
2. Dabbeni-Sala F., Di S., Franceschini… D. Melatonin protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity in rats: a role for mitochondrial complex I activity. //The FASEB Journal. 2001.10.1096/fj.00-0129com.
3. Obeso J.A., Rodriguez-Oroz M.C., Benitez-Temino В., Blesa F.J., Guridi J., Marin C., Rodriguez M. Functional organization of the basal ganglia: therapeutic implications for Parkinson′s disease // Mov. Disord. - 2008. - T. 23. - № Suppl 3. - C. S548-59. - PMID 18781672.
4. Robert A Hauser, MD, MBA; Chief Editor: Selim R Benbadis, MD Parkinson Disease. Etiology (англ.). Medscape (Jun 20, 2011). Архивировано из первоисточника 24 августа 2011. Проверено 5 июля 2011.
5. Davie С.A. A review of Parkinson′s disease // Br Med Bull. - 2008. - T. 86. - C. 109-127. - PMID 18398010.
6. Яхно H.H., Штульман Д.P. Болезни нервной системы. - М.: Медицина, 2001. - Т. 2. - С.76-95. - 744 с.- ISBN 5-225-04540-5
7. Гусев Е.И., Коновалов А.Н. и др. Неврология. Национальное руководство. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 2116 с. - ISBN 978-5-9704-0665-6
8. «Ф.Хоффманн-Ля Рош Лтд.» (Базель, Швейцария). «Morbus Parkinson и ее лечение», Москва, 2000.
9. Tysnes OB, VilmingST.. «Atypical parkinsonism.». PMID 18846125.
10. Symptomatic pharmacological therapy in Parkinson′s disease // Parkinson′s Disease / The National Collaborating Centre for Chronic Conditions. - London: Royal College of Physicians, 2006. - P. 59-100. - ISBN 1-86016-283-5.
11. Машковский M.Д. Противопаркинсонические дофаминергические препараты // Лекарственные средства. - 14-е изд., перераб., испр. и доп.- М.:: ООО "Издательство Новая Волна", 2002. - Т. 1. - С.140-144. - 540 с.- ISBN 5-7864-0128-6.
12. Rowland, Lewis P. Rowland, Timothy A. Pedley. Merritt′s Neurology. - Lippincott Williams & Wilkins, 2009. - 1216 c. - ISBN 9780781791861.
13. Cenci M., Lee C., Björklund A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin and glutamic acid decarboxylase mRNA. // Eur J Neurosci. 1998 Aug;10(8):2694-706, 1998.10.1046/j.1460-9568.1998.00285.x.
14. Hanna S.L., Daniella R., Ohlin К.E., Martin L., Cenci M.A. The "motor complication syndrome" in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with 1-DOPA: Relation to dose and route of administration. // Behavioural Brain Research. 2007. V. 177.
15. Борисова H.B., Каплун А.П., Богомолов O.B., Григорьев В.Б., Юрасов В.В., Никушкин Е.В., Крыжановский Г.Н., Швец В.И. Физико-химические свойства липосомальных форм L-3,4-дигидpoкcифeнилaлaнинa (DOPA) и ДОФАМИНА // Биоорганическая химия 1996. - Т.22. - №10, 11. - С.846-851.
16. Борисова Н.В., Жигальцев И.В., Богомолов О.В., Каплун А.П., Юрасов В.В., Кучеряну В.Т., Никушкин Е.В., Крыжановский Г.Н., Швец В.И. Окисление в липосомах из яичного фосфатидилхолина, нагруженных L-3,4-дигидроксифенилаланином (DOPA) и ДОПАМИНОМ: взаимное влияние компонентов // Биоорганическая химия 1997. - Т.23. - №4. - С.284-289.
17. During M.J., Freese A., Deutch A.Y., Kibat P.G., Sabel B.A., Langer R., Roth R.H. Biochemical and behavioral recovery in a rodent model of Parkinson′s disease following stereotactic implantation of dopamine-contatining liposomes//Exper. Neurol. 1992. V115. P.193-199.
18. McRae-Degueurce A., Hjorth S., Dillon D.L., et. al. Implantable microencapsulated dopamine (DA): A new method for slow-release DA delivery into brain tissue//Neurosci. Lett. 1988. №92. P.303-309.
19. Yong Z.Z., Raid G.A., Victor C., Jingyuan Optimization of PLGA nanoparticles formulation containing L-DOPA by applying the central composite design// Drug Development and Industrial Pharmacy, 2013, 39 (2), P.321-330.
20. Bartus R.T. A Pulmonary Formulation of L-Dopa Enhances Its Effectiveness in a Rat Model of Parkinson′s Disease. // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2004. V. 310.
21. Carman L., Gage F., Shults C. Partial lesion of the substantia nigra: relation between extent of lesion and rotational behavior. // Brain research. 1991.