НОВЫЙ ПЕПТИД
NEW PEPTIDE

Предпосылки создания изобретения
1. Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому пептиду и, более конкретно, к новому пептиду для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения гиперчувствительности дентина, к полинуклеотиду, кодирующему пептид, к вектору экспрессии, включающему полинуклеотид, к фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающей пептид, к парафармацевтической композиции для профилактики или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающей пептид, и к пищевой функциональной оздоровительной композиции для профилактики или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающей пептид.
2. Описание предшествующего уровня техники
Зубная пульпа представляет собой богато иннервированную и васкуляризированную мягкую соединительную ткань, которая занимает пульповую камеру внутри зуба и распространяется на внешнюю поверхность дентина. Расстройства, возникающие в пульпе зуба, называются заболеваниями пульпы зуба.
Существует множество причин заболеваний зубной пульпы, но в большинстве случаев заболевания зубной пульпы вызваны бактериальной инфекцией в результате зубного кариеса или инфекциями в пульпе зуба, вызванными перфорацией, переломом, трещинами или пародонтальным карманом. Внешняя рана, истирание, зубные трещины или трение или тепло от стоматологического оборудования также могут вызывать заболевания пульпы зуба. Пульпит, вызванный бактериальной инфекцией, может привести к возникновению заболеваний верхушки корня и пародонта. Заболевания пульпы зуба последовательно прогрессируют до гиперемии пульпы, пульпита и некроза пульпы. Некроз пульпы может привести к периапикальным заболеваниям или расстройствам всего зуба, поскольку гибель зубной пульпы препятствует кровоснабжению пульпы зуба и, таким образом, теряется вся ткань пульпы.
Для лечения заболеваний пульпы или периапикальных тканей используются материалы для защитного покрытия пульпы и материалы для пломбирования зубного канала, и обычно используются гидроксиды кальция, MTA (минеральный триоксидный агрегат), гуттаперча и т.д. MTA демонстрирует терапевтические эффекты, поскольку обладает способностью герметизировать просачивание и биосовместимостью. Однако использование MTA затруднено из-за его относительно высокой стоимости в качестве материала для лечения зубов и обесцвечивания, приводящего к эстетической проблеме. Гуттаперча имеет относительно низкую стоимость и обладает хорошими характеристиками текучести. Однако это не является физиологически приемлемым методом, поскольку вызывает потерю жизнеспособности пульпы. Вплоть до настоящего времени существуют такие проблемы, связанные с консервативными методами лечения заболеваний дентина и пульпы, как слабые или ломкие зубы или повторное инфицирование.
Поэтому было активно проведено множество исследований для разработки терапевтических средств, способных эффективно лечить заболевания дентина или пульпы. Например, публикация корейского патента № 2012-0089547 раскрывает композицию для формирования твердых тканей или регенерации тканей дентина или пульпы, включающую амелобласты, апикальные клетки или их культуры в качестве активного ингредиента, а публикация корейского патента № 2009-0033643 раскрывает новые стволовые клетки зубов, происходящие из зубных фолликулов, и способ их культивирования.
Авторы настоящего изобретения предприняли множество попыток для разработки средства, способного более эффективно лечить заболевания дентина или пульпы зуба, и в результате они разработали пептиды, демонстрирующие эффекты промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения гиперчувствительности дентина, создав, таким образом, настоящее изобретение.
Сущность изобретения
Варианты осуществления идей настоящего изобретения могут обеспечить новый пептид для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить полинуклеотид, кодирующий пептид.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить вектор экспрессии, включающий полинуклеотид.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить фармацевтическую композицию для профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающую пептид.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить парафармацевтическую композицию для профилактики или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающую пептид.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить пищевую функциональную оздоровительную композицию для профилактики или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающую пептид.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить способ профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающий введение субъекту композиции, включающей пептид.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить способ промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы, включающий введение субъекту композиции, включающей пептид.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить применение пептида, включающего аминокислотную последовательность следующей формулы 1, или композиции, включающей пептид, для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы, для профилактики или лечения гиперчувствительности дентина и для профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (Формула 1)
где R1 представляет собой аргинин(R), лизин(K) или глутамин(Q);
R2 представляет собой аргинин(R) или глутамин(Q);
R3, R4 и R5 представляют собой аргинин(R) или лизин(K), соответственно;
R6 представляет собой аспарагин(N) или серин(S); и
R7 и R8 представляют собой лизин(K) или тирозин(Y), соответственно.
Варианты осуществления идей настоящего изобретения также могут обеспечить применение пептида, включающего любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-96, или композиции, включающей пептид, для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы, для профилактики или лечения гиперчувствительности дентина и для профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба.
Эффект изобретения
Пептид для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения гиперчувствительности дентина по настоящему изобретению демонстрирует отличные эффекты промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы, и поэтому он может широко применяться для разработки различных средств для профилактики или лечения заболеваний, связанных с дентином или пульпой зуба.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1A представляет график, демонстрирующий результаты сравнения эффектов пептидов соответствующих групп по настоящему изобретению на экспрессию DSPP, который представляет собой маркерный ген дифференциации одонтобластов.
Фиг. 1B представляет график, демонстрирующий результаты сравнения уровней экспрессии маркерного Dspp гена дифференциации одонтобластов в MDPC-23 клетках, обработанных пептидами по настоящему изобретению.
Фиг. 1C представляет график, демонстрирующий результаты сравнения уровней экспрессии маркерных генов дифференциации одонтобластов Dspp, Dmp1 и Nestin в MDPC-23 клетках, обработанных пептидами Группы 11 и Группы 12 по настоящему изобретению.
Фиг. 1D представляет график, демонстрирующий результаты оценки цитотоксичности пептидов по настоящему изобретению на клетки пульпы зуба.
Фиг. 2 показывает полученные под микроскопом изображения дентин/пульпа зуба-подобных тканей, которые были образованы in vivoв течение 6 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения через 6 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 200 мкм, B 100 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11 (масштабная шкала: D 200 мкм, E 100 мкм, F 50 мкм); G - I представляют полученные под микроскопом изображения через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (масштабная шкала: G 200 мкм, H 100 мкм, I 50 мкм); и J - L представляют полученные под микроскопом изображения через 6 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: J 200 мкм, K 100 мкм, L 50 мкм).
Фиг. 3 показывает полученные под микроскопом изображения уровней продукции коллагена в дентин/пульпа зуба-подобных тканях, которые были образованы in vivoв течение 6 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A - C показывают результаты через 6 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 500 мкм, B 200 мкм, C 50 мкм); D - F показывают результаты через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11 (масштабная шкала: D 500 мкм, E 200 мкм, F 50 мкм); G - I показывают результаты через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (масштабная шкала: G 500 мкм, H 200 мкм, I 50 мкм); и J - L показывают результаты через 6 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: J 500 мкм, K 200 мкм, L 50 мкм).
Фиг. 4 показывает картины иммуноокрашивания, демонстрирующие результаты оценки уровней экспрессии DSP, который представляет собой маркерный ген одонтобласт-специфической дифференциации, и BSP, который представляет собой маркерный ген остеобласт-специфической дифференциации, в дентин/пульпа зуба-подобных тканях, которые были образованы in vivoв течение 6 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A и E показывают результаты через 6 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только; B и F показывают результаты через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11; C и G показывают результаты через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12; и D и H показывают результаты через 6 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2. Стрелки A, B, C и D указывают DSP-экспрессирующие области в новообразованных дентин-подобных тканях, а стрелки E, F, G и H указывают BSP-экспрессирующие области в новообразованных костеподобных тканях. Масштабная шкала 50 мкм.
Фиг. 5 показывает полученные под микроскопом изображения дентин/пульпа зуба-подобных тканей, которые были образованы in vivoв течение 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 500 мкм, B 200 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11 (масштабная шкала: D 500 мкм, E 200 мкм, F 50 мкм); G - I представляют полученные под микроскопом изображения через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (масштабная шкала: G 500 мкм, H 200 мкм, I 50 мкм); и J - L представляют полученные под микроскопом изображения через 12 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: J 500 мкм, K 200 мкм, L 50 мкм).
Фиг. 6 показывает полученные под микроскопом изображения уровней продукции коллагена в дентин/пульпа зуба-подобных тканях, которые были образованы in vivoв течение 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A - C показывают результаты через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 500 мкм, B 200 мкм, C 50 мкм); D - F показывают результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11 (масштабная шкала: D 500 мкм, E 200 мкм, F 50 мкм); G - I показывают результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (масштабная шкала: G 500 мкм, H 200 мкм, I 50 мкм); и J - L показывают результаты через 12 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: J 500 мкм, K 200 мкм, L 50 мкм).
Фиг. 7 показывает картину иммуноокрашивания, демонстрирующую результаты оценки уровней экспрессии DSP, который представляет собой маркерный ген одонтобласт-специфической дифференциации, и BSP, который представляет собой маркерный ген остеобласт-специфической дифференциации, в дентин/пульпа зуба-подобных тканях, которые были образованы in vivoв течение 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A и E показывают результаты через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только; B и F показывают результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11; C и G показывают результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12; и D и H показывают результаты через 12 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2. Стрелки A, B, C и D указывают DSP-экспрессирующие области в новообразованных дентин-подобных тканях, а стрелки E, F, G и H указывают BSP-экспрессирующие области в новообразованных костеподобных тканях. Масштабная шкала 50 мкм.
Фиг. 8 показывает изображения, полученные под сканирующим микроскопом, внутренних структур дентин/пульпа зуба-подобных тканей, которые были образованы in vivoчерез 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A и B представляют результаты через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 50 мкм, B 20 мкм); C и D представляют результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (SEQ ID NO: 96) (масштабная шкала: C 50 мкм, D 20 мкм); и E и F представляют результаты через 12 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: E 50 мкм, F 20 мкм).
Фиг. 9 показывает изображения, полученные под микроскопом, и изображения, полученные под сканирующим микроскопом, демонстрирующие результаты анализа одонтобласт/пульпа зуба-подобных тканей, которые были образованы после трансплантации имплантатов, включающих пептиды по настоящему изобретению, в пространство корневых каналов зубов человека, где A и B показывают результаты окрашивания тканей, в которые трансплантировали контрольный имплантат, включающий клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 500 мкм, B 50 мкм); C, D и D’ показывают результаты окрашивания тканей, в которые трансплантировали имплантат, включающий клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (SEQ ID NO: 96) (масштабная шкала: A 500 мкм, B 50 мкм); D представляет увеличенное изображение вставки 1 в C, D’ представляет увеличенное изображение вставки 2 в C (масштабная шкала: C 500 мкм, D 50 мкм, D’ 50 мкм); E и F показывают полученные под сканирующим микроскопом изображения тканей, в которые трансплантировали контрольный имплантат, включающий клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: E 50 мкм, F 10 мкм); G и H показывают полученные под сканирующим микроскопом изображения тканей, в которые трансплантировали имплантат, включающий клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (SEQ ID NO: 96) (масштабная шкала: G 50 мкм, H 10 мкм); P показывает регенерированную пульпу зуба, De показывает существующую дентинную стенку, DT показывает существующие дентинные трубочки, Od показывает одонтобласты, OP показывает дентинные отростки одонтобластов, и стрелки в D указывают регенерированные одонтобласт-подобные клетки с дентинными отростками одонтобластов.
Фиг. 10 показывает полученные под микроскопом картины гистологического анализа эффектов новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в модели неглубокой полости из моделей непрямого покрытия пульпы у собак, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат контрольной группы, в которой никакие материалы не наносили на отверстие дентинной трубочки в незащищенном дентине (масштабная шкала: A 500 мкм, B 100 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат нанесения пептида Группы 11 (1,5 мкг) на отверстие дентинной трубочки в незащищенном дентине (масштабная шкала: D 500 мкм, E 100 мкм, F 50 мкм); и G - I представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат нанесения пептида Группы 12 (1,5 мкг) на отверстие дентинной трубочки в незащищенном дентине (масштабная шкала: G 500 мкм, H 100 мкм, I 50 мкм). P показывает пульпу, D показывает дентин, и TD показывает новообразованный физиологический (третичный) дентин.
Фиг. 11 показывает полученные под микроскопом картины гистологического анализа эффектов новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в модели глубокой полости из моделей непрямого покрытия пульпы у собак, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат контрольной группы, в которой отверстие дентинной трубочки в незащищенном дентине не обрабатывали ни одним из материалов и заполняли пломбировочным материалом для зубов GI цементом (масштабная шкала: A 500 мкм, B 100 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат пломбирования отверстия дентинной трубочки в незащищенном дентине GI цементом после обработки пептидом Группы 11 (1,5 мкг) (масштабная шкала: D 500 мкм, E 100 мкм, F 50 мкм); и G - I представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результаты пломбирования отверстия дентинной трубочки в незащищенном дентине GI цементом после обработки пептидом Группы 12 (1,5 мкг) (масштабная шкала: G 500 мкм, H 100 мкм, I 50 мкм). P показывает пульпу, D показывает дентин, и TD показывает новообразованный физиологический (третичный) дентин.
Фиг. 12 показывает полученные под микроскопом картины гистологического анализа эффектов новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в прямых моделях покрытия пульпы, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат контрольной группы, которую не обрабатывали ни одним из материалов и затем обрабатывали GI цементом (масштабная шкала: A 200 мкм, B 100 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат группы положительного контроля, которую не обрабатывали ни одним из материалов, запломбировывали MTA и затем покрывали GI цементом (масштабная шкала: D 500 мкм, E 200 мкм, F 50 мкм); G - I представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат групп, которые обрабатывали пептидом Группы 11 (1,5 мкг), запломбировывали MTA и затем покрывали GI цементом (масштабная шкала: G 200 мкм, H 100 мкм, I 50 мкм); J - L представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результаты групп, которые обрабатывали пептидом Группы 12 (1,5 мкг), запломбировывали MTA и затем покрывали GI цементом (масштабная шкала: J 500 мкм, K 100 мкм, L 50 мкм). D показывает дентин, OD показывает остеоденин, и TD показывает новообразованный физиологический (третичный) дентин.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Авторы настоящего изобретения осуществили множество исследований для разработки средства, способного более эффективно лечить заболевания дентина или пульпы зуба, и в результате они разработали новый пептид, состоящий из 10 аминокислот.
Новый разработанный пептид был получен путем замены части аминокислотной последовательности пептида, который может оказывать терапевтический эффект на заболевания дентина или пульпы зуба, и было подтверждено, что новый разработанный пептид может повышать уровни экспрессии генов Dspp, Dmp1 и Nestin, которые являются маркерными генами дифференциации одонтобластов, демонстрируя, таким образом, эффект промотирования регенерации дентина без какой-либо цитотоксичности в отношении клеток пульпы зуба.
Кроме того, был получен имплантат, включающий пептид вместе с клетками пульпы зуба, и полученный имплантат трансплантировали в подкожную ткань иммунокомпрометированной мыши и через 6 недель - 12 недель трансплантированную ткань анализировали. В результате было обнаружено, что была образована дентин/пульпа-подобная ткань, имеющая наиболее схожую морфологию с дентином/тканью зубной пульпы in vivo, a уровень продукции коллагена повышался, уровень экспрессии DSP, который представляет собой маркер одонтобласт-специфической дифференциации, повышался, тогда как не было заметного повышения уровня экспрессии BSP, который представляет собой маркер остеобласт-специфической дифференциации.
Кроме того, морфологию трансплантированной ткани исследовали под сканирующим электронным микроскопом, и в результате было обнаружено, что одонтобласт-подобные клетки демонстрировали палисадное расположение на существующей дентинной стенке, и их цитоплазменные отростки, с удлиненными ядрами, вытягивались в направлении существующих дентинных трубочек.
Исследовали эффекты пептида в моделях непрямого и прямого покрытия пульпы у собак, и в результате было обнаружено, что при помощи нового пептида был образован такой же физиологический дентин, какой наблюдается в дентине природного зуба человека.
Поэтому можно видеть, что пептид по настоящему изобретению может демонстрировать эффекты промотирования регенерации дентина или пульпы зуба и лечения гиперчувствительности дентина. Пептид по настоящему изобретению, обладающий такими эффектами, до сих пор нигде не был описан, и он был впервые разработан авторами настоящего изобретения.
В одном аспекте для достижения вышеописанных целей настоящее изобретение обепечивает пептид для промотирования регенерации дентина или пульпы зуба и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, при этом пептид включает аминокислотную последовательность следующей формулы 1:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (Формула 1)
где R1 представляет собой аргинин(R), лизин(K) или глутамин(Q);
R2 представляет собой аргинин(R) или глутамин(Q);
R3, R4 и R5 представляют собой аргинин(R) или лизин(K), соответственно;
R6 представляет собой аспарагин(N) или серин(S); и
R7 и R8 представляют собой лизин(K) или тирозин(Y), соответственно.
В контексте настоящей заявки термин “дентин” также называется дентином и относится к желтовато-белой твердой ткани, которая составляет большую часть зуба. Дентин не выходит на поверхность зуба, потому что он покрыт эмалью в коронке зуба и цементом в корне. Однако незащищенность дентина может возникать на апикальном конце или окклюзионной поверхности коронки зуба, поскольку эмаль изнашивается в процессе старения. Дентин является разновидностью костной ткани, но он отличается от общей костной ткани тем, что клеточные тела дентина остаются в пульпе зуба, в то время как их отростки распространяются в дентинные канальцы.
В контексте настоящей заявки термин “ткань зубной пульпы” также называется “зубной пульпой” и относится к мягкой соединительной ткани, занимающей камеру пульпы внутри зуба. Анатомически, зубная пульпа имеет многочисленные нервы и кровеносные сосуды, распределенные в ней, и она распространяется к наружной поверхности дентина.
Пептид по настоящему изобретению отличается тем, что он может повышать уровни экспрессии генов Dspp, Dmp1 и Nestin, которые являются маркерными генами дифференциации одонтобластов, не вызывая цитотоксичность, и, когда пептид трансплантируют вместе с клетками пульпы зуба, клетки пульпы зуба образуют дентин/зубная пульпа-подобную ткань.
Пептид по настоящему изобретению включает варианты этого пептида, имеющие последовательность, включающую один или несколько аминокислотных остатков, отличающихся от остатков аминокислотной последовательности пептида по настоящему изобретению, при условии, что они могут промотировать регенерацию дентина или пульпы зуба и демонстрировать терапевтический эффект на заболевания дентина или пульпы зуба.
Аминокислотные замены в белках и полипептидах, которые в основном не изменяют молекулярную активность, известны из уровня техники. Наиболее часто встречающиеся замены представляют собой аминокислотные остатки Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, в обоих направлениях. Пептид может включать пептиды, которые имеют улучшенную структурную устойчивость к нагреванию, pH и т.д., или улучшенную способность промотировать регенерацию дентина или пульпы зуба в результате изменения или модификации аминокислотной последовательности.
Например, хотя глутамин, который представляет собой кислую аминокислоту в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению, заменен основной аминокислотой, лизином или аргинином, можно получить эффекты пептида по настоящему изобретению как такового; хотя аргинин, который представляет собой основную аминокислоту в положении 4 или 5 пептида SEQ ID NO: 1, заменен кислой аминокислотой глутамином или основной аминокислотой лизином, можно получить эффекты пептида по настоящему изобретению как такового; хотя лизин, который представляет собой основную аминокислоту в положении 6, 7 или 9 пептида SEQ ID NO: 1, заменен основной аминокислотой аргинином или ароматической аминокислотой тирозином, можно получить эффекты пептида по настоящему изобретению как такового; хотя аспарагин, который представляет собой кислую аминокислоту в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1, заменен нейтральной аминокислотой серином, можно получить эффекты пептида по настоящему изобретению как такового; и хотя тирозин, который представляет собой ароматическую аминокислоту в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1, заменен основной аминокислотой лизином, можно получить эффекты пептида по настоящему изобретению как такового.
Таким образом, хотя кислые аминокислоты, основные аминокислоты или ароматические аминокислоты, образующие пептид по настоящему изобретению, заменены аминокислотами, имеющими такие же свойства, или заменены другими кислыми аминокислотами, основными аминокислотами, нейтральными аминокислотами или ароматическими аминокислотами, соответственно, можно получить эффекты пептида по настоящему изобретению как такового. Поэтому очевидно, что вариант пептида, имеющий последовательность, включающую один или несколько аминокислотных остатков, отличающихся от остатков аминокислотной последовательности, образующей пептид по настоящему изобретению, также включен в объем пептида по настоящему изобретению.
Кроме того, хотя произвольные аминокислоты добавляют на N-конце или C-конце пептида по изобретению, могут быть получены такие же эффекты пептида по настоящему изобретению. Следовательно, пептид, полученный добавлением произвольной аминокислоты на N-конце или C-конце пептида по настоящему изобретению, также входит в объем пептида по настоящему изобретению. Например, в качестве примера может быть приведен пептид, полученный путем добавления от 1 до 300 аминокислот на N-конце или С-конце пептида по настоящему изобретению, в качестве другого примера можно указать пептид, полученный путем добавления от 1 до 100 аминокислот на N-конце или С-концe пептида по настоящему изобретению, и в качестве еще одного примера можно указать пептид, полученный добавлением от 1 до 24 аминокислот на N-конце или С-конце пептида по настоящему изобретению.
2
2
2
2
2
Пептид по настоящему изобретению может быть химически модифицирован или защищен органической группой на N-конце и/или С-конце, или он может быть модифицирован путем добавления аминокислот на конце пептида для защиты пептида от протеазы in vivo и повышения его стабильности. В частности, поскольку химически синтезированные пептиды имеют заряженный N-конец и С-конец, можно осуществить ацетилирование по N-концу, метилирование по N-концу или/и амидирование по С-концу, или можно включить, но не ограничиваясь этим, введение D-аминокислоты, модификацию пептидной связи, такую как CH-NH, CH-S, CH-S=0, CH-CH, модификацию остова или модификацию боковой цепи для удаления заряда. Способы получения пептидомиметических соединений хорошо известны в данной области, например, со ссылкой на описание в Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992).
Термин “модификация остова” в контексте настоящей заявки относится к прямой модификации аминокислот, составляющих пептидный остов, аминокислотными аналогами, где остов (основная цепь) относится к имеющему форму основной цепи или кольцевую форму каркасу из аминокислот, составляющих пептид. Аминокислотный аналог относится к аминокислоте, модифицированной путем замещения атомов водорода при азоте или α-углероде скелета аминокислоты.
4
Термин “модификация боковой цепи” в контексте настоящей заявки относится к модификации боковых цепей аминокислот с использованием химического вещества, где боковые цепи аминокислот относятся к атомным группам, ответвляющимся от имеющего форму основной цепи или кольцевую форму каркаса из аминокислот, составляющих пептид. Примеры модификации боковой цепи пептида могут включать модификацию аминогруппы, такую как восстановительное алкилирование; амидирование метилацетимидатом; алкилирование уксусным ангидридом; карбамилирование аминогрупп цианатом; тринитробензилирование аминокислот 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS); алкилирование аминогрупп янтарным ангидридом; и пиридоксилирование пиридоксаль-5-фосфатом с последующим восстановлением при помощи NaBH.
Кроме того, пептид по настоящему изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с различными носителями, одобренными в качестве лекарственного средства, такими как органический растворитель. Для улучшения стабильности и эффективности пептид по настоящему изобретению также можно использовать путем включения углеводов, таких как глюкоза, сахароза или декстран, антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота или глутатион, хелатирующих агентов, низкомолекулярных белков, других стабилизаторов и т.д.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, были синтезированы 96 видов пептидов, соответствующих формуле 1 настоящего изобретения, и исследованы эффекты синтезированных пептидов на уровень экспрессии гена Dspp, который является маркерным геном дифференциации одонтобластов. В результате было подтверждено, что все уровни мРНК маркерного гена дифференциации одонтобластов Dspp в клетках MDPC-23, которые были обработаны 96 видами пептидов, были в 1,3 раза выше, чем уровень мРНК гена Dspp, который был измерен в MDPC-23 клетках (контрольная группа), которые не обрабатывали ни одним из пептидов по настоящему изобретению (Таблицы 13-24).
Как уже сообщалось, известно, что по мере повышения уровня мРНК DSPP, промотируется дифференциация одонтобластов и регенерация дентина, и, следовательно, можно видеть, что 96 видов пептидов, демонстрирующих эффект повышения уровня мРНК Dspp гена, могут проявлять эффект промотирования дифференциации одонтобластов и регенерации дентина (Taduru Sreenath et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 27, Issue of July 4, pp. 24874-24880, 2003; William T. Butler et al, Connective Tissue Research, 44(Suppl. 1): 171-178, 2003).
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий пептид.
Полинуклеотид может быть модифицирован путем замены, делеции или вставки одного или нескольких оснований, или комбинации таких модификаций. Когда нуклеотидную последовательность получают путем химического синтеза, можно использовать метод синтеза, широко известный в данной области, например, метод, описанный в литературе (Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37: 73-127, 1988), и нуклеотидную последовательность можно синтезировать триэфирным, фосфитным, фосфорамидитным и H-фосфатным методами, ПЦР и другими методами с использованием автопраймера, методом синтеза олигонуклеотидов на твердых носителях и т.д. Например, полинуклеотид, кодирующий пептид по настоящему изобретению, может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.
В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, трансформант, включающий вектор экспрессии, и способ получения пептида с использованием трансформанта.
Термин “вектор экспрессии” в контексте настоящей заявки относится к рекомбинантному вектору, способному экспрессировать целевой пептид в клетке-хозяине, и относится к генетической конструкции, включающей необходимые регуляторные элементы, которые функционально связаны для экспрессии генной вставки. Вектор экспрессии включает регуляторные последовательности экспрессии, такие как кодон инициации, стоп-кодон, промотор, оператор и т.д. Кодон инициации и стоп-кодон обычно рассматриваются как часть нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, и они должны быть функциональными у индивидуума, которому введена генетическая конструкция, и должны быть в рамке с кодирующей последовательностью. Промотор вектора может быть конститутивным или индуцибельным.
Термин “функционально связанный” в контексте настоящей заявки относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты и нуклеотидной последовательностью, кодирующей целевой белок или РНК, таким образом, чтобы обеспечить общие функции. Например, промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок или РНК, чтобы влиять на экспрессию кодирующей последовательности. Функциональная связь с вектором экспрессии может быть получена с использованием метода генетической рекомбинации, хорошо известного в данной области, и сайт-специфическое расщепление и лигирование ДНК можно осуществить с использованием ферментов, хорошо известных в данной области.
Кроме того, вектор экспрессии может включать сигнальные последовательности для выделения пептида, чтобы способствовать выделению пептида из клеточной культуры. Специфические сигналы инициации также могут потребоваться для эффективной трансляции вставленных нуклеотидных последовательностей. Эти сигналы включают кодон инициации ATG и смежные последовательности. В некоторых случаях следует обеспечить экзогенные контрольные сигналы трансляции, включая кодон инициации ATG. Эти экзогенные контрольные сигналы трансляции и кодоны инициации могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии можно повысить путем введения соответствующих энхансерных элементов транскрипции или трансляции.
Кроме того, вектор экспрессии может дополнительно включать белковую метку, которая необязательно может удаляться эндопептидазой, для облегчения детекции пептида.
Термин “метка” в контексте настоящей заявки относится к молекуле, которая проявляет количественно определяемую активность или характеристику. Метка может включать флуоресцентные молекулы, включая химические флуоресцентные вещества, такие как флуоресцеин, и полипептидные флуоресцентные вещества, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или родственные белки; и эпитопные метки, такие как Myc метка, Flag метка, His метка, лейциновая метка, IgG метка, стрептавидиновая метка и т.д. В частности, если используют эпитопную метку, можно использовать пептидную метку, состоящую предпочтительно из 6 или более аминокислотных остатков, и более предпочтительно около 8-50 аминокислотных остатков.
E.coli
Bacillus subtilis
В настоящем изобретении вектор экспрессии может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую вышеописанный пептид, для промотирования регенерации дентина или пульпы зуба и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба по настоящему изобретению. Используемый вектор конкретно не ограничивается, при условии, что он способен продуцировать пептид. Предпочтительно вектор может представлять собой плазмидную ДНК, фаговую ДНК и т.д. Более предпочтительно вектор может представлять собой коммерчески разработанную плазмиду (pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP и т.д.), плазмиду, происходящую из  (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 и т.д.), плазмиду, происходящую из  (pUB110, pTP5 и т.д.), плазмиду, происходящую из дрожжей (YEp13, YEp24, YCp50 и т.д.), фаговую ДНК (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP и т.д.), вектор на основе вируса животного (ретровируса, аденовируса, вируса коровьей оспы и т.д.), вируса насекомого (бакуловируса и т.д.) или т.п. Для вектора экспрессии предпочтительно выбирают и используют клетку-хозяина, наиболее подходящую для предполагаемого использования, поскольку уровень экспрессии и модификации белка варьируются в зависимости от типа клетки-хозяина.
2
2
E.coli
Streptomyces
Salmonella typhimurium
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Pichia pastoris
Трансформант по настоящему изобретению можно получить путем трансформации хозяина при помощи вектора экспрессии по настоящему изобретению, и трансформант может экспрессировать полинуклеотид в векторе экспрессии, таким образом продуцируя пептид. Трансформацию можно осуществить различными способами. Способ трансформации конкретно не ограничивается, при условии, что он может продуцировать пептид. Можно использовать CaCl преципитацию, метод Ханахана, который является усовершенствованным методом CaCl преципитации с использованием DMSO (диметилсульфоксида) в качестве восстановителя, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, слияние протопластов, взбалтывание с использованием волокна из карбида кремния, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, ПЭГ-опосредованную трансформацию, декстрансульфат-, липофектамин- или дессикация/ингибирование-опосредованную трансформацию и т.д. Хозяин, используемый при получении трансформанта, конкретно не ограничивается при условии, что он может продуцировать пептид по настоящему изобретению. Хозяином могут быть бактериальные клетки, такие как , ,  и т.д.; клетки дрожжей, такие как ,  и т.д.; грибковые клетки, такие как  и т.д.; клетки насекомых, такие как клетки дрозофилы, клетки Spodoptera Sf9 и т.д.; клетки животных, такие как CHO, COS, NSO, 293, клетки меланомы Боуеса и т.д.; и растительные клетки.
Трансформант можно использовать в способе получения пептида для промотирования регенерации дентина или пульпы зуба и лечения гиперчувствительности дентина по настоящему изобретению. В частности, способ получения пептида для промотирования регенерации дентина или пульпы зуба и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба по настоящему изобретению может включать (а) культивирование трансформанта для получения культуры; и (b) выделение пептида по настоящему изобретению из культуры.
Термин “культивирование” в контексте настоящей заявки относится к способу выращивания микроорганизма в искусственно контролируемых условиях окружающей среды. В настоящем изобретении культивирование трансформанта можно осуществить способом, широко известным в данной области техники. В частности, культивирование конкретно не ограничивается, при условии, что оно может экспрессировать и продуцировать пептид для промотирования регенерации дентина или пульпы зуба и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба по настоящему изобретению, и культивирование можно осуществить периодическим способом, способом культивирования с подпиткой или способом культивирования с повторной подпиткой.
Среда, используемая для культивирования, включает соответствующие источники углерода, источники азота, аминокислоты, витамины и т.д. и должна подходящим образом удовлетворять требованиям конкретного штамма при регулировании температуры, pH и т.д. в аэробных условиях. Применимые источники углерода могут включать, помимо смешанных сахаров глюкозы и ксилозы в качестве основного источника углерода, сахара и углеводы, такие как сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло и т.д., жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота или линоленовая кислота, спирты, такие как глицерин или этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества можно использовать отдельно или в комбинации. Применимые источники азота могут включать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония или нитрат аммония; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин или глутамин; и органические источники азота, такие как пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыбная мука или продукты ее переработки, обезжиренный соевый жмых или продукты его переработки и т.д. Эти источники азота можно испоьзовать отдельно или в комбинации. Среда может включать в качестве источников фосфора одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия и соответствующие натрий-содержащие соли. Применимые источники фосфора могут включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующие натрий-содержащие соли. Кроме того, неорганические соединения могут включать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца и карбонат кальция. В дополнение к вышеперечисленным материалам можно использовать такие необходимые для роста материалы, как аминокислоты и витамины.
Кроме того, подходящие предшественники можно использовать в культуральной среде. Во время культивирования вышеописанные вещества можно соответствующим образом добавлять в культуру периодическим, с подпиткой или непрерывным способом, но не ограничиваясь этим. рН культуры можно регулировать, используя подходящим образом щелочное соединение, такое как гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак, или кислотное соединение, такое как фосфорная кислота или серная кислота.
Кроме того, образование пузырьков можно подавлять при помощи пеногасителя, такого как сложный эфир полигликоля и жирной кислоты. Чтобы поддерживать аэробное состояние, кислород или кислород-содержащий газ (например, воздух) можно инжектировать в культуру. Температура культуры обычно составляет от 27 до 37°С, предпочтительно от 30 до 35°С. Культивирование продолжают вплоть до достижения желаемого уровня продукции пептида. Это достигается за 10 часов - 100 часов.
Кроме того, выделение пептида из культуры можно осуществить способом, известным в данной области. В частности, способ выделения конкретно не ограничивается при условии, что он может обеспечить выделение образовавшегося пептида. Предпочтительно можно использовать такой способ, как центрифугирование, фильтрация, экстракция, распыление, сушка, испарение, осаждение, кристаллизация, электрофорез, фракционное растворение (например, преципитация сульфатом аммония), хроматография (например, ионообменная, аффинная, гидрофобная и эксклюзионная) и т.д.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение обепечивает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающую пептид.
Как описано выше, когда пептид для промотирования регенерации дентина или пульпы зуба и лечения гиперчувствительности дентина по настоящему изобретению трансплантируют в организм, вместе с клетками пульпы зуба, это может промотировать образование дентин/пульпа зуба-подобной ткани клетками пульпы зуба, и когда пептид наносят на поврежденный участок дентина или пульпы зуба, может образовываться такой же физиологический дентин, который наблюдается в природном дентине зуба человека. Поэтому пептид можно использовать в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции для лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, которые вызваны повреждением дентина или пульпы зуба.
Пептид, включенный в фармацевтическую композицию, можно использовать в одной форме пептида или в полипептидной форме из 2 или более повторов пептида, и пептид также можно использовать в форме комплекса лекарственного средства, обладающего терапевтическим эффектом на заболевания дентина или пульпы зуба, связанного на N-конце или C-конце пептида.
Термин “заболевания дентина или пульпы зуба” в контексте настоящей заявки относится ко всем заболеваниям, вызванным поврежденной тканью зубной пульпы и дентина, связанного с пульпой зуба, из-за повреждения дентина и тканей зубной пульпы.
В настоящем изобретении заболевания дентина или пульпы зуба конкретно не ограничиваются, при условии, что пептид по настоящему изобретению демонстрирует терапевтические эффекты на эти заболевания, и заболевания дентина или пульпы зуба могут включать, например, гиперчувствительность дентина, гиперемию пульпы, пульпит, дегенерацию пульпы, некроз пульпы, гангренозную пульпу и т.д.
Термин “профилактика” в контексте настоящей заявки означает все действия, посредством которых возникновение заболеваний дентина или пульпы зуба сдерживается или замедляется путем введения фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающей пептид по настоящему изобретению.
Термин “лечение” в контексте настоящей заявки, означает все действия, посредством которых заболевания дентина или пульпы зуба лечатся путем промотирования регенерации дентина или пульпы зуба путем введения фармацевтической композиции, включающей пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, субъекту, нуждающемуся в лечении заболеваний дентина или пульпы зуба.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена в форме фармацевтической композиции для лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, дополнительно включающей, помимо пептида, подходящий носитель (природный или неприродный носитель), эксципиент или разбавитель, обычно используемые для получения фармацевтических композиций. Конкретно, фармацевтическую композицию можно сформулировать в соответствии с обычным способом в форме стерильного инъецируемого раствора, который можно вводить на участке заболевания дентина или пульпы зуба. В настоящем изобретении носитель, эксципиент и разбавитель, которые можно включить в фармацевтическую композицию, могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральные масла, коллаген и т.д. Для формулирования композиции обычно используют разбавители или эксципиенты, такие как наполнитель, объемообразующий агент, связующее, смачивающее вещество, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество и т.д. В частности, могут быть включены стерилизованный водный раствор, неводный растворитель, суспензия, эмульсия, лиофилизированный препарат, суппозиторий, мазь (например, прокладка для пульпы и т.д.). В качестве неводных растворителей или суспензий можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат и т.д. В качестве основы для суппозиториев можно использовать Витепсол, Макрогол, Твин 61, масло какао, лауриновый жир, глицерогелатин и т.д.
Содержание пептида в фармацевтической композиции по настоящему изобретению конкретно не ограничивается, но пептид может быть включен в количестве от 0,0001 до 50% масс., более предпочтительно от 0,01 до 20% масс., в расчете на общую массу конечной композиции.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в фармацевтически эффективном количестве. Термин “фармацевтически эффективное количество” в контексте настоящей заявки относится к количеству, достаточному для лечения или профилактики заболеваний, при разумном соотношении польза/риск, применимом к любому медицинскому лечению или профилактике. Эффективный уровень доз может быть определен в зависимости от таких факторов, как тяжесть заболевания, активность препарата, возраст пациента, масса тела, состояние здоровья, пол, чувствительность к препарату, время введения, способ введения и скорость экскреции композиции по настоящему изобретению, продолжительность лечения, лекарственные средства, используемые в смеси или вводимые совместно с композицией по настоящему изобретению, и другие факторы, известные в области медицины. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить индивидуально или в комбинации с известной фармацевтической композицией для лечения заболеваний дентина или пульпы. Важно вводить композицию в минимальном количестве, которое может проявлять максимальный эффект, не вызывая побочных эффектов, в свете всех вышеописанных факторов.
Вводимую дозу фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут определить специалисты в данной области с учетом цели применения, тяжести заболевания, возраста пациента, массы тела, пола и истории болезни, вида вещества, используемого в качестве активного ингредиента, и т.д. Например, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить при дозе от около 0,1 нг/кг до около 100 мг/кг, и предпочтительно от около 1 нг/кг до около 10 мг/кг в расчете на взрослого человека, и частота введения композиции по настоящему изобретению конкретно не ограничивается, но композицию можно вводить один раз в день или несколько раз в день дробными дозами. Вводимая доза не ограничивает объем настоящего изобретения ни в одном аспекте.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающему введение фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции субъекту, страдающему заболеваниями дентина или пульпы зуба, за исключением людей.
Термин “субъект” в контексте настоящей заявки может включать млекопитающих, включая крыс, домашний скот и т.д., нуждающихся в лечении заболеваний дентина или пульпы зуба, без ограничений, и люди исключаются из субъектов, имеющих вышеуказанные заболевания.
Фармацевтическую композицию для лечения заболеваний дентина или пульпы зуба по настоящему изобретению можно вводить любым обычным путем при условии, что фармацевтическая композиция способна достигать ткани-мишени. Фармацевтическую композицию можно вводить, но конкретно не ограничиваясь этим, путем интраорального введения, интраоральной инъекции и т.д., в зависимости от цели.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение обепечивает парафармацевтическую композицию для профилактики или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающую пептид.
Термин “улучшение” в контексте настоящей заявки означает все действия, которые, по меньшей мере, уменьшают параметр, связанный с состояниями, подлежащими лечению, например, степень тяжести симптома.
В настоящем изобретении улучшение следует интерпретировать как все действия, благодаря которым симптомы заболеваний дентина или пульпы зуба изменились в лучшую сторону или были благоприятным образом модифицированы путем промотирования регенерации дентина или пульпы зуба при введении фармацевтической композиции, включающей пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента субъекту, нуждающемуся в лечении заболеваний дентина или пульпы зуба.
Термин “парафармацевтический” в контексте настоящей заявки относится к изделию, обладающему более мягким действием, чем лекарственные средства, среди изделий, используемых для целей диагностики, лечения, улучшения, облегчения, обработки или профилактики заболеваний человека или животных. Например, в соответствии с Pharmaceutical Affairs Law, парафармацевтические средства представляют собой такие, за исключением используемых в качестве лекарств, которые включают изделия из волокна или резины, которые используются для лечения или профилактики заболеваний человека или животных, изделия, не являющихся инструментом или машиной или их аналогом, которые оказывают мягкое воздействие на организм человека или не имеют прямого воздействия на него, и изделия, которые используются для дезинфекции или борьбы с вредителями для предотвращения инфекционных заболеваний.
В настоящем изобретении вид или композиция парафармацевтического средства, включающего пептид, конкретно не ограничены, но парафармацевтическая композиция может представлять собой, например, пероральные антисептические средства для полоскания рта, средства гигиены полости рта, зубные пасты, зубную нить, мази для полости рта и т.п.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение обепечивает пищевую функциональную оздоровительную композицию для профилактики или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающую пептид.
Термин “пищевой продукт” в контексте настоящей заявки включает мясо, колбасы, хлеб, шоколад, конфеты, закуски, кондитерские изделия, пиццу, лапшу быстрого приготовления, другую лапшу, жевательную резинку, молочные продукты, включая мороженое, различные супы, напитки, чай, напитки, алкогольные напитки и витаминные комплексы, функциональные оздоровительные продукты питания, продукты лечебного питания и т.д., и такой пищевой продукт включает все продукты питания в обычном понимании этого термина.
Термин “функциональный пищевой продукт” в контексте настоящей заявки является термином, идентичным пищевому продукту, специально предназначенному для оздоровления (FoSHU), и относится к пищеому продукту, обладающему высокими лечебными, лекарственными эффектами, который обработан таким образом, чтобы эффективно проявлять биологически модулирующую функцию, а также обеспечивать питательными веществами. Здесь термин “функциональный” указывает на полезный эффект для здоровья человека, такой как регулирование питательных веществ для структуры и функции человеческого организма, физиологическое действие и т.д. Пищевой продукт по настоящему изобретению можно получить в соответствии с обычно используемым в данной области техники способом, можно добавлять исходные вещества и ингредиенты, обычно используемые в данной области при получении пищевого продукта. Кроме того, состав пищевого продукта не ограничивается при условии, что этот состав приемлем в качестве пищи. Пищевая композиция по настоящему изобретению может быть получена в виде различных композиций. Поскольку пищевой продукт используют в качестве исходного продукта, в отличие от обычных лекарств, пищевая композиция не имеет побочных эффектов, которые могут возникнуть при длительном приеме лекарства, и может иметь превосходную портативность. Следовательно, пищевой продукт по настоящему изобретению можно принимать в качестве добавки для усиления эффекта предотвращения или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба.
Продукт лечебного питания означает пищевой продукт, имеющий эффекты активного поддержания или улучшения состояния здоровья по сравнению с обычными пищевыми продуктами, а продукт питания с биологически активными пищевыми добавками означает пищевой продукт для укрепления здоровья. При необходимости, функциональный пищевой продукт, продукты лечебного питания и продукт питания с биологически активными пищевыми добавками могут использоваться взаимозаменяемо.
В частности, функциональный пищевой продукт представляет собой пищевой продукт, полученный путем добавления пептида по настоящему изобретению к пищевым продуктам, таким как напитки, чай, специи, жевательные резинки, кондитерские изделия и т.д., или полученный в виде капсулы, порошка, суспензии и т.д. Функциональный пищевой продукт означает, что при употреблении он оказывает определенный эффект на здоровье, но в отличие от обычных лекарств функциональный пищевой продукт имеет то преимущество, что он не имеет побочных эффектов, которые могут возникнуть при длительном приеме лекарственного препарата, поскольку для него в качестве исходного вещества использует пищевые продукты.
Поскольку пищевая композиция по настоящему изобретению регулярно принимается внутрь, ожидается, что пищевая композиция будет демонстрировать высокую эффективность для профилактики или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба, и, таким образом, она может быть очень полезной для применения.
Пищевая композиция может дополнительно включать физиологически приемлемый носитель. Вид носителя конкретно не ограничивается. Можно использовать любой носитель при условии, что это носитель, который обычно используется в данной области.
Кроме того, пищевая композиция может также включать дополнительные ингредиенты, которые обычно используют в пищевых композициях для улучшения запаха, вкуса, внешнего вида и т.д. Например, пищевая композиция может включать витамины A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, ниацин, биотин, фолат, пантотеновую кислоту и т.д. Кроме того, пищевая композиция может также включать минералы, такие как Zn, Fe, Ca, Cr, Mg, Mn, Cu и т.д. Кроме того, пищевая композиция может также включать аминокислоты, такие как лизин, триптофан, цистеин, валин и т.д. Кроме того, пищевая композиция может также включать пищевые добавки, такие как консерванты (сорбат калия, бензоат натрия, салициловая кислота, дегидроацетат натрия и т.д.), дезинфицирующие средства (отбеливающий порошок, интенсивно отбеливающий порошок, гипохлорит натрия и т.д.), антиоксиданты (бутилгидроксианизол (BHA), бутилгидрокситолуол (BHT) и т.д.), красители (анилиновый краситель и т.д.), проявители цвета (нитрит натрия и т.д.), отбеливатели (сульфит натрия), вкусовые добавки (мононатрий глутамат (MSG) и т.д.), подсластители (дульцин, цикламат, сахарин, натрий и т.д.), отдушки (ванилин, лактоны и т.д.), агенты, вызывающие набухание (квасцы, D-битартрат калия и т.д.), обогатители, эмульгаторы, загустители (клейкие пасты), пленкообразующие агенты, гуммиосновы, пеногасители, растворители, улучшители и т.д. Добавки можно выбрать и использовать в соответствующем количестве в соответствии с типами пищевых продуктов.
Пептид по настоящему изобретению может быть добавлен в том виде, в каком он есть, или его можно использовать в сочетании с другими пищевыми продуктами или пищевыми ингредиентами в соответствии с общепринятым способом, или его можно подходящим образом использовать в соответствии с общепринятым способом. Смешиваемые количества активного ингредиента можно соответствующим образом определить в зависимости от цели использования (профилактическое, медицинское или терапевтическое лечение). Как правило, при получении пищевого продукта или напитка пищевую композицию по настоящему изобретению можно добавлять в количестве 50 массовых частей или менее, в частности 20 массовых частей или менее, в расчете на общую массу пищевого продукта или напитка. Однако, когда предполагается длительное употребление для здоровья и гигиены, пищевая композиция может быть включена в количестве ниже вышеуказанного диапазона. Кроме того, поскольку нет проблем с безопасностью, активный ингредиент можно использовать в количестве, превышающем вышеуказанный диапазон.
Пищевую композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве, например, композиции оздоровительного напитка, и в этом случае композиция оздоровительного напитка может дополнительно включать различные отдушки или натуральные углеводы, как в обычных напитках. Натуральные углеводы могут включать моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза; дисахариды, такие как мальтоза и сахароза; полисахариды, такие как декстрин и циклодекстрин; и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит и эритрит. Подсластители могут быть натуральными подсластителями, такими как тауматин или экстракт стевии; или синтетическими подсластителями, такими как сахарин или аспартам. Натуральный углевод обычно можно использовать в количестве от около 0,01 г до 0,04 г и, в частности, от около 0,02 г до 0,03 г, в расчете на 100 мл композиции оздоровительного напитка по настоящему изобретению.
Кроме того, композиция оздоровительного напитка может включать различные питательные вещества, витамины, минералы, отдушки, красители, пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, модификаторы рН, стабилизаторы, антисептики, глицерин, спирты, карбонизаторы и т.д. Кроме того, композиция оздоровительного напитка может включать мякоть фруктов, используемую для приготовления натуральных фруктовых соков, напитков из фруктовых соков или напитков из овощей. Эти ингредиенты могут использоваться по отдельности или в комбинации. Пропорция добавок не является критической, но обычно выбирают количество от 0,01 массовых частей до 0,1 массовых частей на 100 массовых частей композиции оздоровительного напитка по настоящему изобретению.
Пищевая композиция по настоящему изобретению может включать пептид по настоящему изобретению в различных массовых процентах при условии, что она может проявлять эффект предотвращения или облегчения заболеваний дентина или пульпы зуба. В частности, пептид по настоящему изобретению может быть включен в количестве, но не ограничиваясь этим, от 0,00001% масс. до 100% масс. или от 0,01% масс. до 80% масс. в расчете на общую массу пищевой композиции.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение обепечивает способ профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба, включающий введение субъекту композиции, включающей пептид.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение обепечивает способ промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы, включающий введение субъекту композиции, включающей пептид.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение обепечивает применение пептида, включающего аминокислотную последовательность следующей формулы 1, или композиции, включающей пептид, для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы, для профилактики или лечения гиперчувствительности дентина и для профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба:
K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (Формула 1)
где R1 представляет собой аргинин(R), лизин(K) или глутамин(Q);
R2 представляет собой аргинин(R) или глутамин(Q);
R3, R4 и R5 представляют собой аргинин(R) или лизин(K), соответственно;
R6 представляет собой аспарагин(N) или серин(S); и
R7 и R8 представляют собой лизин(K) или тирозин(Y), соответственно.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение обепечивает применение пептида, включающего любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-96, или композиции, включающей пептид, для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы, для профилактики или лечения гиперчувствительности дентина и для профилактики или лечения заболеваний дентина или пульпы зуба.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Однако эти Примеры предназначены только для иллюстративных целей, и объем настоящего изобретения не должен ограничиваться этими Примерами.
Пример 1: Синтез пептидов для промотирования образования дентина или тканей зубной пульпы и лечения гиперчувствительности дентина
Авторы настоящего изобретения синтезировали пептид (SEQ ID NO: 1), демонстрирующий эффект промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы, способом с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонила (Fmoc), и они синтезировали пептиды соответствующих групп (Таблицы 1-12) путем замены аминокислот синтезированного пептида.
N-KYQRRKKNKY-C (SEQ ID NO: 1)
Сначала, синтезировали пептиды Группы 1 с использованием пептида SEQ ID NO: 1 или путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида of SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (Таблица 1).
Таблица 1Пептиды Группы 1
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
12345678
KYQRRKKNKYKYQRRKRNKYKYQRRRKNKYKYQRRRRNKYKYQRKKKNKYKYQRKRKNKYKYQRKKRNKYKYQRKRRNKY
Затем синтезировали пептиды Группы 2 путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином или путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином (Таблица 2).
Таблица 2Пептиды Группы 2
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
910111213141516
KYQRRKKSKYKYQRRKRSKYKYQRRRKSKYKYQRRRRSKYKYQRKKKSKYKYQRKRKSKYKYQRKKRSKYKYQRKRRSKY
Затем синтезировали пептиды Группы 3 путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином или путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином (Таблица 3).
Таблица 3Пептиды Группы 3
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
1718192021222324
KYQRRKKNYKKYQRRKRNYKKYQRRRKNYKKYQRRRRNYKKYQRKKKNYKKYQRKRKNYKKYQRKKRNYKKYQRKRRNYK
Затем синтезировали пептиды Группы 4 путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 4).
Таблица 4Пептиды Группы 4
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
2526272829303132
KYQRRKKSYKKYQRRKRSYKKYQRRRKSYKKYQRRRRSYKKYQRKKKSYKKYQRKRKSYKKYQRKKRSYKKYQRKRRSYK
Затем синтезировали пептиды Группы 5 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином или путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (Таблица 5).
Таблица 5Пептиды Группы 5
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
3334353637383940
KYRQRKKNKYKYRQRKRNKYKYRQRRKNKYKYRQRRRNKYKYRQKKKNKYKYRQKRKNKYKYRQKKRNKYKYRQKRRNKY
Затем синтезировали пептиды Группы 6 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином или путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином (Таблица 6).
Таблица 6Пептиды Группы 6
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
4142434445464748
KYRQRKKSKYKYRQRKRSKYKYRQRRKSKYKYRQRRRSKYKYRQKKKSKYKYRQKRKSKYKYRQKKRSKYKYRQKRRSKY
Затем синтезировали пептиды Группы 7 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 7).
Таблица 7Пептиды Группы 7
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
4950515253545556
KYRQRKKNYKKYRQRKRNYKKYRQRRKNYKKYRQRRRNYKKYRQKKKNYKKYRQKRKNYKKYRQKKRNYKKYRQKRRNYK
Затем синтезировали пептиды Группы 8 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 аргинином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 8).
Таблица 8Пептиды Группы 8
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
5758596061626364
KYRQRKKSYKKYRQRKRSYKKYRQRRKSYKKYRQRRRSYKKYRQKKKSYKKYRQKRKSYKKYRQKKRSYKKYRQKRRSYK
Затем синтезировали пептиды Группы 9 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином или путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином (Таблица 9).
Таблица 9Пептиды Группы 9
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
6566676869707172
KYKQRKKNKYKYKQRKRNKYKYKQRRKNKYKYKQRRRNKYKYKQKKKNKYKYKQKRKNKYKYKQKKRNKYKYKQKRRNKY
Затем синтезировали пептиды Группы 10 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином или путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином (Таблица 10).
Таблица 10Пептиды Группы 10
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
7374757677787980
KYKQRKKSKYKYKQRKRSKYKYKQRRKSKYKYKQRRRSKYKYKQKKKSKYKYKQKRKSKYKYKQKKRSKYKYKQKRRSKY
Затем синтезировали пептиды Группы 11 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 11).
Таблица 11Пептиды Группы 11
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
8182838485868788
KYKQRKKNYKKYKQRKRNYKKYKQRRKNYKKYKQRRRNYKKYKQKKKNYKKYKQKRKNYKKYKQKKRNYKKYKQKRRNYK
Наконец, синтезировали пептиды Группы 12 путем замены аминокислоты в положении 3 пептида SEQ ID NO: 1 лизином, путем замены аминокислоты в положении 4 пептида SEQ ID NO: 1 глутамином, путем замены любой аминокислоты в положениях 5-7 пептида SEQ ID NO: 1 лизином или аргинином, путем замены аминокислоты в положении 8 пептида SEQ ID NO: 1 серином, путем замены аминокислоты в положении 9 пептида SEQ ID NO: 1 тирозином или путем замены аминокислоты в положении 10 пептида SEQ ID NO: 1 лизином (Таблица 12).
Таблица 12Пептиды Группы 12
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность(N-C)
8990919293949596
KYKQRKKSYKKYKQRKRSYKKYKQRRKSYKKYKQRRRSYKKYKQKKKSYKKYKQKRKSYKKYKQKKRSYKKYKQKRRSYK
Пример 2: Исследование эффективности пептидов для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения гиперчувствительности дентина с использованием одонтобластов
Пример 2-1: Эффекты пептидов для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения гиперчувствительности дентина на активность DSPP (дентин сиалофосфопротеин) промотора
2
Сначала MDPC-23 клетки, которые представляют собой одонтобласты мыши, культивировали в DMED среде, дополненной 10% FBS, в условиях 5% CO и 37°C.
4
Затем культивированные MDPC-23 клетки высевали в 24-луночный планшет при плотности 5×10 клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем культивированные клетки трансфицировали рекомбинантным вектором, сконструированным путем введения DSPP промотора и гена люциферазы в pGL3 вектор с использованием реагента Lipofectamine Plus™. Трансфицированные MDPC-23 клетки обрабатывали пептидами Групп 1-12, синтезированными в Примере 1, соответственно, и культивировали в течение 48 часов. Люциферазную активность в каждой из трансфицированных MDPC-23 клеток измеряли и рассчитанные средние уровни соответствующих групп сравнивали друг с другом (Фиг. 1A). Для этого трансфицированные MDPC-23 клетки, которые не обрабатывали никаким из пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы.
Фиг. 1A представляет график, демонстрирующий результаты сравнения эффектов пептидов соответствующих групп по настоящему изобретению на экспрессию DSPP, который представляет собой маркерный ген дифференциации одонтобластов. Как показано на Фиг. 1A, общие уровни люциферазной активности соответствующих пептидов по настоящему изобретению были примерно в 1,3 раз выше, чем в контрольной группе, но была разница между группами. Было подтверждено, что пептиды Группы 12 показали наивысший уровень люциферазной активности, и пептиды Группы 11 показали следующий за ними наивысший уровень люциферазной активности.
Поэтому можно видеть, что пептиды по настоящему изобретению демонстрируют эффект активации Dspp промотора.
Пример 2-2: Эффекты пептидов для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба на уровень экспрессии маркерного Dspp гена дифференциации одонтобластов
MDPC-23 клетки, культивированные в Примере 2-1, обрабатывали пептидами соответствующих групп, которые были синтезированы в Примере 1, и культивировали в течение 48 часов. Затем измеряли уровни мРНК маркерного Dspp гена дифференциации одонтобластов, экспрессируемого в MDPC-23 клетках, и рассчитывали отношение измеренного уровня мРНК Dspp относительно измеренного уровня мРНК Dspp в контрольной группе, соответственно (Таблицы 13-24). Кроме того, средние значения уровней мРНК Dspp, измеренных в пептидах соответствующих групп, сравнивали между группами (Фиг. 1B). Для этого MDPC-23 клетки, которые не обрабатывали никаким из пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы.
Уровни экспрессии Dspp гена измеряли методом ОТ-ПЦР и методом ПЦР в режиме реального времени: более подробно, тотальную РНК выделяли из MDPC-23 клеток при помощи TRIzol реагента. 2 мкг тотальной РНК, 1 мкл обратной транскриптазы и 0,5 мкг oligo (dT) использовали для синтеза кДНК. Синтезированную кДНК использовали в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени осуществляли на системе детекции последовательностей ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) с использованием следующих праймеров и SYBR GREEN PCR Master Mix (Takara, Japan). Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени осуществляли в условиях 94°C, 1 мин; 95°C, 15 сек - 60°C, 34 сек для 40 циклов. Результаты анализировали сравнительным методом расчета значений порогового цикла (CT). Для этого Gapdh ген использовали в качестве внутреннего контроля. Эксперименты осуществляли в трех повторах и затем в качестве измеренных значений брали средние значения и их стандартные отклонения.
Dspp_R: 5’-CTGTTGCTAGTGGTGCTGTT-3’(SEQ ID NO: 97)
Dmp1_F: 5’-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3’(SEQ ID NO: 98)
Gapdh_F: 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’(SEQ ID NO: 99)
Gapdh_R: 5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’(SEQ ID NO: 100)
[Таблица 13]
Эффекты пептидов Группы 1 на уровень мРНК гена Dspp
Таблица 13Эффекты пептидов Группы 1 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
12345678
1,7541,6461,4641,8551,6391,7461,8641,639
0,1320,0920,2210,1020,0570,0910,1320,032
Таблица 14
Эффекты пептидов Группы 2 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
910111213141516
1,8541,7461,6391,5481,6851,8461,9641,739
0,0320,0520,2010,0270,0770,1410,2790,092
Таблица 15
Эффекты пептидов Группы 3 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
1718192021222324
2,1172,3191,9312,5531,8932,4122,1712,212
0,2090,0920,1020,0990,1320,0720,2810,111
Таблица 16
Эффекты пептидов Группы 4 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
2526272829303132
2,3712,1931,9932,4531,8832,5122,3712,219
0,0890,0520,2020,1920,1010,2090,1390,302
Таблица 17
Эффекты пептидов Группы 5 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
3334353637383940
1,7121,9311,9832,3191,5972,1161,7122,219
0,0910,1720,1020,2920,3010,2110,1910,212
Таблица 18
Эффекты пептидов Группы 6 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
4142434445464748
1,5461,5861,6691,7931,5321,8871,6971,558
0,0910,1030,0950,2030,3100,0770,0090,201
Таблица 19
Эффекты пептидов Группы 7 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
4950515253545556
1,9231,8871,6012,0191,5921,4371,6631,701
0,1920,0070,0820,1350,2220,3410,0940,109
Таблица 20
Эффекты пептидов Группы 8 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
5758596061626364
2,0391,9981,7922,1072,3011,6721,7691,967
0,0820,1720,0070,2010,0190,3080,0850,039
Таблица 21
Эффекты пептидов Группы 9 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
6566676869707172
1,7231,6271,7771,4322,0111,9271,8792,011
0,0720,2910,0270,4100,0810,1050,0600,009
Таблица 22
Эффекты пептидов Группы 10 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
7374757677787980
2,0352,0111,9972,3511,7292,6352,2311,837
0,0210,0630,0590,1090,1110,0910,0770,201
Таблица 23
Эффекты пептидов Группы 11 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
8182838485868788
3,0923,3613,5723,7023,6703,7053,8884,021
0,1520,0980,2090,3010,0880,1370,0720,301
Таблица 24
Эффекты пептидов Группы 12 на уровень мРНК гена Dspp
SEQ ID NO:
Уровень мРНК гена Dspp
Среднее значение
Стандартное отклонение
8990919293949596
4,2114,8114,3624,2114,5253,8364,6205,211
0,4130,3020,1820,2870,2500,0990,4010,371
Как показано в Таблицах 13-24, когда пептиды по настоящему изобретению были обработаны, общие уровни мРНК Dspp гена, который представляет собой маркер дифференциации одонтобластов, были в 1,3 раза выше, чем уровень мРНК гена Dspp, измеренный в MDPC-23 клетках (контрольная группа), не обработанных никаким из пептидов по настоящему изобретению.
В частности, все пептиды Группы 11 показали уровни мРНК Dspp в 3 раза больше, и все пептиды Группы 12 показали в уровни мРНК Dspp 3,8 раз больше по сравнению с контрольной группой.
Кроме того, Фиг. 1B представляет график, демонстрирующий результаты сравнения уровней экспрессии маркерного Dspp гена дифференциации одонтобластов в MDPC-23 клетках, обработанных пептидами по настоящему изобретению. Как показано на Фиг. 1B, при обработке пептидами по настоящему изобретению, уровни мРНК маркерного Dspp гена дифференциации одонтобластов были повышены, и аналогично тому, как показано на Фиг. 1A, уровни мРНК были примерно в 1,3 раз выше, чем уровни мРНК Dspp, измеренные в контрольной группе.
Пример 2-3: Эффекты пептидов для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба на уровни экспрессиии маркерных генов дифференциации одонтобластов Dspp, Dmp1 и Nestin
Результаты Примера 2-2 показали, что пептиды по настоящему изобретению могут повышать уровни мРНК Dspp и, в частности, пептиды Группы 11 и Группы 12 могут повышать уровни мРНК Dspp по меньшей мере в три раза или больше.
Соответственно, исследовали, могут ли пептиды Группы 11 и Группы 12 повышать уровни мРНК других маркерных генов дифференциации одонтобластов Dmp1 и Nestin.
Вкратце, эксперименты осуществляли таким же способом, как в Примере 2-2, за исключением того, что использовали следующие праймеры и в качестве пептидов использовали пептиды Группы 11 и Групп 12. Измеряли эффекты пептидов по настоящему изобретению на уровни экспрессиии Dmp1 и Nestin генов и рассчитанные средние значения сравнивали между группами (Фиг. 1C). Для этого MDPC-23 клетки, которые не обрабатывали никаким из пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы, и уровень мРНК гена Dspp использовали в качестве сравнительной группы.
Dmp1_F: 5’-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3’(SEQ ID NO: 101)
Dmp1_R: 5’-TGTGGTCACTATTTGCCTGTG-3’(SEQ ID NO: 102)
Nestin_F: 5’-CCCTGAAGTCGAGGAGCTG-3’(SEQ ID NO: 103)
Nestin_R: 5’-CTGCTGCACCTCTAAGCGA-3’(SEQ ID NO: 104)
Фиг. 1C представляет график, демонстрирующий результаты сравнения уровней экспрессии маркерных генов дифференциации одонтобластов, Dspp, Dmp1 и Nestin, в MDPC-23 клетках, обработанных пептидами Группы 11 и Группы 12 по настоящему изобретению. Как показано на Фиг. 1C, при обработке пептидами по настоящему изобретению, все уровни мРНК маркерных генов дифференциации одонтобластов, Dspp, Dmp1 и Nestin, повышались, и были отличия в повышенных уровнях между генами. Уровни экспрессии, повышенные при помощи пептидов Группы 12, были выше, чем уровни экспрессии, повышенные при помощи пептидов Группы 11.
Указанные выше маркерные гены дифференциаци известны как гены, участвующие в дифференциации одонтобластов и минерализации дентина, из чего можно заключить, что пептиды по настоящему изобретению могут проявлять эффект промотирования регенерации дентина.
Пример 2-4: Испытание цитотоксичности пептидов для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба в клетках пульпы зуба
В Школе стоматологии Сеульского Национального Университета стволовые клетки зубной пульпы человека сначала выделяли из зубов мудрости 10 взрослых субъектов (возраст 18-22 года). Более подробно, все эксперименты осуществляли после одобрения Institutional Review Board и получения информированного согласия пациентов. Зубы мудрости разрушали в соответствии с методом Jung HS et al. (J Mol Histol. (2011)), чтобы обнажить зубную пульпу, и ткани зубной пульпы отделяли щипцами. Каждую из отделенных тканей зубной пульпы разрезали на маленькие кусочки бритвенным лезвием, помещали в 60-мм чашку, накрывали покровным стеклом и затем культивировали в среде DMEM для получения культивированных клеток зубной пульпы.
3
Затем полученные клетки пульпы зуба высевали в 96-луночный планшет при плотности 3 × 10 клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали пептидом Группы 11 или 12 при концентрации 10 мкг/мл или 50 мкг/мл и затем культивировали в течение 1 дня, 3 дней или 5 дней. После завершения культивирования культивированные клетки промывали при помощи PBS, добавляли к ним 20 мкл раствора MTT и затем оставляли для взаимодействия при 37°C в течение 4 часов. После завершения взаимодействия MTT раствор удаляли и добавляли 100 мкл DMSO и измеряли поглощение при 540 нм (Фиг. 1D). Для этого анализа клетки пульпы зуба, которые культивировали без обработки пептидами, использовали в качестве контрольной группы.
Фиг. 1D представляет график, демонстрирующий результаты оценки цитотоксичности пептидов по настоящему изобретению на клетки пульпы зуба. Как показано на Фиг. 1D, хотя испоьзовали пептиды по настоящему изобретению, клетки пульпы зуба показали такой же уровень жизнеспособности, как в контрольной группе.
Пример 3: Эффекты пептидов для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения заболеваний дентина или пульпы зуба на образование дентин/пульпа зуба-подобных тканей in vivo
Пример 3-1: Морфологический анализ трансплантированных тканей, выделенных у животных, которых выращивали в течение 6 недель
6
100 мг заменителя дентина добавляли к 2×10 клеток зубной пульпы и смешивали с 0,5% фибриновым гелем для приготовления имплантатата. Для этого в качестве заменителя дентина использовали керамический порошок гидроксиапатита/трикальцийфосфата (HA/TCP) (Zimmer, США), а фибриновый гель получали путем включения 10 мкг пептида группы 11 (SEQ ID NO: 87)), пептида группы 12 (SEQ ID NO: 96) или 2 мкг BMP-2. Подготовленный имплантатат трансплантировали в подкожные ткани иммунокомпрометированных мышей (NIH-bg-nu-xid; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN), и мышей выращивали в течение 6 недель. Затем выделяли дентин/зубная пульпа-подобные ткани, сформированные из имплантататов. Выделенные ткани фиксировали в 4% параформальдегиде, декальцифицировали в 10% EDTA (рН 7,4), погружали в парафин и окрашивали гематоксилин-эозином (HE) (Vector Labs) для оценки уровней дентин/зубная пульпа-подобных тканей (Фиг.2). Для этого имплантатат, не включающий ни один из пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы.
Фиг. 2 показывает полученные под микроскопом изображения дентин/пульпа зуба-подобных тканей, которые были образованы in vivoв течение 6 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения через 6 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 200 мкм, B 100 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11 (масштабная шкала: D 200 мкм, E 100 мкм, F 50 мкм); G - I представляют полученные под микроскопом изображения через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (масштабная шкала: G 200 мкм, H 100 мкм, I 50 мкм); и J - L представляют полученные под микроскопом изображения через 6 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: J 200 мкм, K 100 мкм, L 50 мкм).
Как показано на Фиг. 2, когда трансплантировали имплантат, включающий или не включающий пептид по настоящему изобретению, (A - I), образование дентин/пульпа зуба-подобной ткани наблюдали на периферии HA/TCP частиц. Однако, когда трансплантировали сравнительный имплантат, включающий rhBMP-2 (J - L), образование костеподобной минерализованной ткани и ткани, подобной костному мозгу, наблюдали на периферии HA/TCP частиц.
Кроме того, дентин/пульпа зуба-подобные ткани, которые были наиболее схожими с дентином-тканью зубной пульпы in vivo, образовывались на сравнительно высоком уровне после трансплантации имплантатов, включающих пептиды по настоящему изобретению (D - I), по сравнению с трансплантацией имплантатов, не включающих никаких пептидов по настоящему изобретению (A - C).
Пример 3-2: Анализ с окрашиванием коллагена трансплантированных тканей, выделенных у животных, которых выращивали в течение 6 недель
Известно, что коллаген является наиболее распространенным органическим матриксом в дентине и кости и позволяет минеральным отложениям играть важную роль в регенерации дентина.
Соответственно, для исследования уровня продукции коллагена в каждой из тканей, выделенных в Примере 3-1, указанные ткани подвергали окрашиванию коллагена (трихромное окрашивание по Массону) с использованием набора для трихромного окрашивания по Массону (Cat. 25088-100) от Polysciences (Фиг. 3). Для этого анализа ткань с трансплантированным имплантатом, не включающим никаких пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы.
Фиг. 3 показывает полученные под микроскопом изображения уровней продукции коллагена в дентин/пульпа зуба-подобных тканях, которые были образованы in vivoв течение 6 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A - C показывают результаты через 6 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 500 мкм, B 200 мкм, C 50 мкм); D - F показывают результаты через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11 (масштабная шкала: D 500 мкм, E 200 мкм, F 50 мкм); G - I показывают результаты через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (масштабная шкала: G 500 мкм, H 200 мкм, I 50 мкм); и J - L показывают результаты через 6 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: J 500 мкм, K 200 мкм, L 50 мкм).
Как показано на Фиг. 3, трансплантация имплантатов, включающих пептиды по настоящему изобретению, показала повышенные уровни продукции коллагена по сравнению с трансплантацией контрольного имплантата.
Пример 3-3: Анализ трансплантированных тканей, выделенных у животных, которых выращивали в течение 6 недель, методом иммуноокрашивания
Для оценки уровней экспрессии DSP, который представляет собой маркерный ген одонтобласт-специфической дифференциации, и BSP, который представляет собой маркерный ген остеобласт-специфической дифференциации, в каждой из тканей, выделенных в Примере 3-1, осуществляли анализ с использованием иммуноокрашивания.
Вкратце, выделенные ткани фиксировали в 4% параформальдегиде, декальцифицировали в 10% EDTA (pH 7,4), погружали в парафин и затем иммуноокрашивали анти-DSP и анти-BSP антителами при разведении 1:150 в качестве первичных антител, и подвергали взаимодействию с биотин-меченными козлиными анти-кроличьими IgG (Vector Labs) в качестве вторичных антител для определения уровней DSP и BSP (Фиг. 4). Для этого анализа ткань с трансплантированным имплантатом, не включающим никаких пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы.
Фиг. 4 показывает изображения, полученные в анализе иммуноокрашивания, демонстрирующие результаты оценки уровней экспрессии DSP, который представляет собой маркерный ген одонтобласт-специфической дифференциации, и BSP, который представляет собой маркерный ген остеобласт-специфической дифференциации, в дентин/пульпа зуба-подобных тканях, которые были образованы in vivoв течение 6 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A и E показывают результаты через 6 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только; B и F показывают результаты через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11; C и G показывают результаты через 6 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12; и D и H показывают результаты через 6 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2, стрелки A, B, C и D указывают DSP-экспрессирующие области в новообразованных дентин-подобных тканях, а стрелки E, F, G и H указывают BSP-экспрессирующие области в новообразованных костеподобных тканях. Масштабная шкала 50 мкм.
Как показано на Фиг. 4, трансплантация контрольного имплантата показала низкий уровень экспрессии DSP в новообразованной дентин/пульпа зуба-подобной ткани (A), тогда как трансплантация имплантата, включающего пептид Группы 11 или 12, показала относительно высокий уровень экспрессии DSP в новообразованной минерализованной ткани (B и C). Однако трансплантация имплантата, включающего rhBMP2, показала незначительную экспрессию DSP (D).
Кроме того, трансплантация контрольного имплантата (E), имплантата (F), включающего пептид Группы 11, или имплантата (G), включающего пептид Группы 12, показала низкий уровень экспрессии BSP в образованной минерализованной ткани, тогда как трансплантация имплантата (H), включающего rhBMP2, показала относительно очень высокий уровень экспрессии BSP в образованной минерализованной ткани и остеобласт-подобных клетках, содержащихся в минерализованной ткани.
Пример 3-4: Морфологический анализ трансплантированных тканей, выделенных у животных, которых выращивали в течение 12 недель
Уровни дентин/пульпа зуба-подобных тканей оценивали таким же способом, как в Примере 3-1, за исключением того, что мышей, которым трансплантировали имплантат, выращивали в течение 12 недель (Фиг. 5).
Фиг. 5 показывает полученные под микроскопом изображения дентин/пульпа зуба-подобных тканей, которые были образованы in vivoв течение 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 500 мкм, B 200 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11 (масштабная шкала: D 500 мкм, E 200 мкм, F 50 мкм); G - I представляют полученные под микроскопом изображения через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (масштабная шкала: G 500 мкм, H 200 мкм, I 50 мкм); и J - L представляют полученные под микроскопом изображения через 12 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: J 500 мкм, K 200 мкм, L 50 мкм).
Как показано на Фиг. 5, когда мышей выращивали в течение 12 недель после трансплантации имплантата, включающего пептид по настоящему изобретению или не включающего его (A - I), образование дентин/пульпа зуба-подобной ткани и дентинных отростков одонтобластов наблюдали на периферии HA/TCP частиц, также как у мышей, которых выращивали в течение 6 недель после трансплантации. Однако, когда трансплантировали сравнительный имплантат, включающий rhBMP-2 (J - L), образование костеподобной ткани и ткани, подобной костному мозгу, содержащей клетки, заключенные внутри матрикса, наблюдали на периферии HA/TCP частиц.
Кроме того, одонтобласты и комплексы дентин/пульпа зуба, которые были чрезвычайно схожи с наблюдаемыми in vivo, образовывались после трансплантации имплантатов, включающих пептиды по настоящему изобретению (D - I), по сравнению с трансплантацией имплантатов, не включающих никаких пептидов по настоящему изобретению (A - C).
Пример 3-5: Анализ с окрашиванием коллагена трансплантированных тканей, выделенных у животных, которых выращивали в течение 12 недель
Для исследования уровня продукции коллагена в каждой из тканей, выделенных в Примере 3-4, указанные ткани подвергали окрашиванию коллагена (трихромное окрашивание по Массону) с использованием набора для трихромного окрашивания по Массону (Cat. 25088-100) от Polysciences (Фиг. 6). Для этого анализа ткань с трансплантированным имплантатом, не включающим никаких пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы.
Фиг. 6 показывает полученные под микроскопом изображения уровней продукции коллагена в дентин/пульпа зуба-подобных тканях, которые были образованы in vivoв течение 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A - C показывают результаты через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 500 мкм, B 200 мкм, C 50 мкм); D - F показывают результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11 (масштабная шкала: D 500 мкм, E 200 мкм, F 50 мкм); G - I показывают результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (масштабная шкала: G 500 мкм, H 200 мкм, I 50 мкм); и J - L показывают результаты через 12 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: J 500 мкм, K 200 мкм, L 50 мкм).
Как показано на Фиг. 6, повышенные уровни продукции коллагена наблюдали через 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих пептиды по настоящему изобретению, также как и через 6 недель после их трансплантации, по сравнению с трансплантацией контрольного имплантата.
Пример 3-6: Анализ методом мммуноокрашивания трансплантированных тканей, выделенных у животных, которых выращивали в течение 12 недель
Анализ методом мммуноокрашивания осуществляли таким же способом, как в Примере 3-3, за исключением того, что использовали ткани, выделенные в Примере 3-4, вместо тканей, выделенных в Примере 3-1 (Фиг. 7). Для этого анализа ткань с трансплантированным имплантатом, не включающим никаких пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы.
Фиг. 7 показывает изображения, полученные методом иммуноокрашивания, демонстрирующие результаты оценки уровней экспрессии DSP, который представляет собой маркерный ген одонтобласт-специфической дифференциации, и BSP, который представляет собой маркерный ген остеобласт-специфической дифференциации, в дентин/пульпа зуба-подобных тканях, которые были образованы in vivoв течение 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A и E показывают результаты через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только; B и F показывают результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 11; C и G показывают результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12; и D и H показывают результаты через 12 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2, стрелки A, B, C и D указывают DSP-экспрессирующие области в новообразованных дентин-подобных тканях, а стрелки E, F, G и H указывают BSP-экспрессирующие области в новообразованных костеподобных тканях. Масштабная шкала 50 мкм.
Как показано на Фиг. 7, низкие уровни экспрессии DSP наблюдали в новообразованной дентин/пульпа зуба-подобной ткани через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата (A) или имплантата, включающего rhBMP2 (D), тогда как относительно очень высокие уровни экспрессии DSP наблюдали в новообразованной минерализованной ткани через 12 недель после трансплантации имплантата (B и C), включающего пептид Группы 11 или 12, подобно тем, которые наблюдали через 6 недель после трансплантации.
Кроме того, трансплантация контрольного имплантата (E), имплантата (F), включающего пептид Группы 11, или имплантата (G), включающего пептид Группы 12, показала низкий уровень экспрессии BSP в образованной минерализованной ткани, тогда как трансплантация имплантата (H), включающего rhBMP2, показала относительно очень высокий уровень экспрессии BSP в образованной минерализованной ткани и остеобласт-подобных клетках, содержащихся в минерализованной ткани.
Соответственно, можно видеть, что пептиды по настоящему изобретению демонстрируют эффект промотирования регенерации комплекса дентина/пульпы зуба.
Пример 3-7: Анализ дифференциации трансплантированной ткани в одонтобласты
Сканирующий электронный микроскоп использовали для определения, произошла или нет дифференциация клеток пульпы зуба, включенных в имплантат, в одонтобласты в тканях, выделенных в Примере 3-4 (Фиг. 8). Для этого анализа ткань с трансплантированным имплантатом, не включающим никаких пептидов по настоящему изобретению, использовали в качестве контрольной группы.
Вкратце, каждую ткань погружали и фиксировали в 2,5% глутаральдегиде/0,1 М какодилатном буфере в течение 30 минут, и каждую фиксированную ткань погружали и подвергали взаимодействию в какодилатном буфере, содержащем 1% тетроксид осмия, в течение 1 часа. После дегидратации тканей в этаноле и сушки высушенные ткани покрывали золотом и наблюдали под сканирующим электронным микроскопом (S-4700, HITACHI, Tokyo, Japan).
Фиг. 8 показывает полученные под сканирующим микроскопом изображения внутренних структур дентин/пульпа зуба-подобных тканей, которые были образованы in vivoчерез 12 недель после трансплантации имплантатов, включающих клетки пульпы зуба и различные компоненты, где A и B представляют результаты через 12 недель после трансплантации контрольного имплантата, включающего клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 50 мкм, B 20 мкм); C и D представляют результаты через 12 недель после трансплантации имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (SEQ ID NO: 96) (масштабная шкала: C 50 мкм, D 20 мкм); и E и F представляют результаты через 12 недель после трансплантации сравнительного имплантата, включающего клетки пульпы зуба, HA/TCP и rhBMP-2 (масштабная шкала: E 50 мкм, F 20 мкм).
Как показано на Фиг. 8, когда трансплантировали контрольные имплантаты (A и B), одонтобласт-подобные клетки, имеющие дентинные отростки одонтобластов, частично наблюдались на периферии образованной твердой ткани, а когда трансплантировали имплантаты (C и D), включающие пептиды по настоящему изобретению, множество одонтобласт-подобных клеток наблюдали на периферии образованной твердой ткани, и дентинные отростки одонтобластов также вытягивались в направлении образованной твердой ткани. Однако, когда трансплантировали сравнительные имплантаты (E и F), включающие rhBMP-2, наблюдали кубовидные клетки, приставшие к поверхности образованной твердой ткани, что является типичной характеристикой остеобластов.
Поэтому, можно видеть, что пептиды по настоящему изобретению более эффективно образуют одонтобласты.
Пример 4: Эффекты пептидов для промотирования регенерации дентина или тканей зубной пульпы и лечения гиперчувствительности дентина в зубе человека
Согласно сообщениям, дентинная стенка и пустая полость пульпы естественного зуба обеспечивают специфическое локальное окружение для регенерации дентин/пульпа-подобных тканей клетками зубной пульпы (Huang GT, et al. (2010) Tissue engineering. Part A 16(2):605-615). Поэтому оценивали образование дентин/пульпа-подобных тканей в пространствах корневых каналов.
Более подробно, среди имплантатов, полученных в Примере 3-1, сравнительный имплантат или имплантат, включающий пептид Группы 12 (SEQ ID NO: 96) в концентрации 10 мкг/мл, трансплантировали в пространства корневых каналов зубов человека и через 6 недель дентин/пульпа зуба-подобные ткани, образованные в соответствующих имплантатах, подвергали окрашиванию гематоксилин-эозином (НЕ) в соответствии со способом примера 3-1 и фотографировали с помощью сканирующего электронного микроскопа в соответствии со способом примера 3-7 (Фиг. 9).
Фиг. 9 показывает полученные под микроскопом изображения и полученные под сканирующим микроскопом изображения, демонстрирующие результаты анализа одонтобластов/пульпа зуба-подобных тканей, которые были образованы после трансплантации имплантатов, включающих пептиды по настоящему изобретению, в пространство корневых каналов зубов человека, где A и B показывают результаты окрашивания тканей с трансплантированным контрольным имплантом, включающим клетки пульпы зуба и HA/TCP только (масштабная шкала: A 500 мкм, B 50 мкм); C, D и D’ показывают результаты окрашивания тканей, в которые трансплантировали имплантат, включающий клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (SEQ ID NO: 96) (масштабная шкала: A 500 мкм, B 50 мкм); D представляет увеличенное изображение вставки 1 в C, D’ представляет увеличенное изображение вставки 2 в C (масштабная шкала: C 500 мкм, D 50 мкм, D’ 50 мкм); E и F показывают полученные под сканирующим микроскопом изображения тканей, в которые трансплантировали контрольный имплантат, включающий клетки пульпы зуба, HA/TCP только (масштабная шкала: E 50 мкм, F 10 мкм); G и H показывают полученные под сканирующим микроскопом изображения тканей, в которые трансплантировали имплантат, включающий клетки пульпы зуба, HA/TCP и пептид Группы 12 (SEQ ID NO: 96) (масштабная шкала: G 50 мкм, H 10 мкм); P показывает регенерированную пульпу зуба, De показывает существующую дентинную стенку, DT показывает существующие дентинные трубочки, Od показывает одонтобласты, OP показывает дентинные отростки одонтобластов, и стрелки в D указывают регенерированные одонтобласт-подобные клетки с дентинными отростками одонтобластов.
Как показано на Фиг. 9, васкуляризированные пульпа-подобные ткани были образованы внутри всех корневых каналов, в которые трансплантировали контрольный имплантат и имплантат, включающий пептид Группы 12.
Однако, когда трансплантировали имплантат, включающий пептид Группы 12 по настоящему изобретению, одонтобласт-подобные клетки демонстрировали палисадное расположение на существующей дентинной стенке, и их цитоплазменные отростки, с удлиненными ядрами, вытягивались в направлении существующих дентинных трубочек, и новообразованный дентин наблюдали в существующей дентинной стенке (C, D и D’).
В частности, как показано в полученных под сканирующим микроскопом изображениях (E - H), трансплантация имплантатов (G и H), включающих пептид Группы 12, показала, что одонтобласт-подобные клетки демонстрировали палисадное расположение на существующей дентинной стенке, и их цитоплазменные отростки, с удлиненными ядрами, вытягивались в направлении существующих дентинных трубочек, по сравнению с трансплантацией контрольных имплантатов (E и F).
Пример 5: Эффекты новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в модели непрямого покрытия пульпы у собак
Для исследования эффектов новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в моделях непрямого покрытия пульпы оценивали их способность регенерировать дентин.
Более подробно, для установления моделей поврежденного дентина у собак путем непрямого покрытия пульпы часть эмали в шейной части удаляли из премоляров 12-месячных взрослых собак с помощью зубного бора. Дентин удаляли поверхностно в соответствии со степенью обнажения дентина для образования неглубокой полости, создав таким образом модель мелкой полости. Дентин глубоко удаляли так, чтобы вся зубная пульпа была видна, но не была открыта наружу, создав таким образом модель глубокой полости. Модели обрабатывали контрольной группой, пептидом 11 группы или пептидом 12 группы. Через 3 недели взрослых собак умерщвляли и их удаляли зубы.
Удаленные зубы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24 часов, промывали PBS (pH 7,4) несколько раз и затем декальцифицировали 10% раствором муравьиной кислоты. Декальцифицированные зубы погружали в парафин для получения срезов ткани. Срезы ткани окрашивали гематоксилином/эозином (H&E) и способности к регенерации дентина оценивали при помощи гистологического анализа.
Фиг. 10 показывает полученные под микроскопом изображения, представляющие определенные гистологическим анализом эффекты новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в модели мелкой полости из моделей непрямого покрытия пульпы у собак, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат контрольной группы, в которой никакие материалы не наносили на отверстие дентинной трубочки в незащищенном дентине (масштабная шкала: A 500 мкм, B 100 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат нанесения пептида Группы 11 (1,5 мкг) на отверстие дентинной трубочки в незащищенном дентине (масштабная шкала: D 500 мкм, E 100 мкм, F 50 мкм); и G - I представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат нанесения пептида Группы 12 (1,5 мкг) на отверстие дентинной трубочки в незащищенном дентине (масштабная шкала: G 500 мкм, H 100 мкм, I 50 мкм). P показывает пульпу, D показывает дентин, и TD показывает новообразованный физиологический (третичный) дентин.
В контрольной группе никакого изменения в поврежденном дентине не наблюдали (Фиг. 10A-C). Однако в группах, обработанных пептидами Группы 11 (Фиг. 10D-F) или Группы 12 (Фиг. 10G-I), регенерацию физиологического третичного дентина (TD), который был сплошным с дентинными отростками одонтобластов исходной дентинового структуры, наблюдали под оставшимся дентином в поврежденном дентине.
Фиг. 11 показывает полученные под микроскопом изображения, представляющие определенные гистологическим анализом эффекты новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в модели глубокой полости из моделей непрямого покрытия пульпы, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат контрольной группы, в которой отверстие дентинной трубочки в незащищенном дентине не обрабатывали ни одним из материалов и заполняли пломбировочным материалом для зубов GI цементом (Стеклоиномерный цемент, Fuji II LC, GC America Inc., Alsip, IL, USA) (масштабная шкала: A 500 мкм, B 100 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат пломбирования отверстия дентинной трубочки в незащищенном дентине GI цементом после обработки пептидом Группы 11 (1,5 мкг) (масштабная шкала: D 500 мкм, E 100 мкм, F 50 мкм); и G - I представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результат пломбирования отверстия дентинной трубочки в незащищенном дентине GI цементом после обработки пептидом Группы 12 (1,5 мкг) (масштабная шкала: G 500 мкм, H 100 мкм, I 50 мкм). P показывает пульпу, D показывает дентин, и TD показывает новообразованный физиологический (третичный) дентин.
Модели глубокой полости показали такие же результаты, как модели мелкой полости. В контрольной группе, в которой поврежденный дентин обрабатывали GI цементом, который представляет собой пломбировочный материал для зубов, никакого изменения не наблюдали (Фиг. 11A-C). Однако в группах, обработанных пептидами Группы 11 (Фиг. 11D-F) или Группы 12 (Фиг. 11G-I) вместе с GI цементом, регенерацию физиологического третичного дентина (TD), который был сплошным с дентинными отростками одонтобластов исходной дентиновой структуры, наблюдали под оставшимся дентином в поврежденном дентине.
Пример 6: Эффекты новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в модели прямого покрытия пульпы у собак
Для исследования эффектов новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в моделях прямого покрытия пульпы, оценивали их способность регенерировать дентин.
Более подробно, для установления моделей поврежденного дентина у собак путем прямого покрытия пульпы, эмаль и дентин в шейной части удаляли из премоляров 12-месячных взрослых собак с использованием зубного бора для обнажения зубной пульпы. Модели обрабатывали контрольной группой, пептидом Группы 11 или пептидом Группы 12. Через 3 недели взрослых собак умерщвляли и их зубы удаляли.
Удаленные зубы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24 часов, промывали PBS (pH 7,4) несколько раз и затем декальцифицировали 10% раствором муравьиной кислоты. Декальцифицированные зубы погружали в парафин для получения срезов ткани. Срезы ткани окрашивали гематоксилином/эозином (H&E) и способности к регенерации дентина оценивали при помощи гистологического анализа.
Фиг. 12 показывает полученные под микроскопом изображения, представляющие определенные гистологическим анализом эффекты новых пептидов на образование физиологического дентина (третичного дентина) в моделях прямого покрытия пульпы, где A - C представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результаты контрольной группы, в которой обнаженную пульпу зуба не обрабатывали ни одним из материалов и затем обрабатывали GI цементом (масштабная шкала: A 200 мкм, B 100 мкм, C 50 мкм); D - F представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результаты положительной контрольной группы, в которой обнаженную пульпу зуба не обрабатывали ни одним из материалов, запломбировывали пломбировочным материалом для зубов MTA (минеральный триоксидный агрегат, ProRoot MTA, Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK, USA) и затем покрывали GI цементом (масштабная шкала: D 500 мкм, E 200 мкм, F 50 мкм); G - I представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результаты групп, в которых обнаженную пульпу зуба обрабатывали пептидом Группы 11 (1,5 мкг), запломбировывали при помощи MTA и затем покрывали GI цементом (масштабная шкала: G 200 мкм, H 100 мкм, I 50 мкм); J - L представляют полученные под микроскопом изображения, демонстрирующие результаты групп, в которых обнаженную пульпу зуба обрабатывали пептидом Группы 12 (1,5 мкг), запломбировывали при помощи MTA и затем покрывали GI цементом (масштабная шкала: J 500 мкм, K 100 мкм, L 50 мкм). D показывает дентин, OD показывает остеодентин, и TD показывает новообразованный физиологический (третичный) дентин.
В контрольной группе, обработанной GI цементом, никакого изменения не наблюдали в пульпе зуба с поврежденным дентином (Фиг. 12A-C). MTA представляет собой пломбировочный материал для зубов, широко используемый для образования и регенерации дентина. Однако известно, что твердые ткани, образованные MTA, имеют клетки, заключенные в минерализованных тканях, и демонстрируют остеодентин, который подобен кости, не имеющей дентинных трубочек, которые являются важным компонентом дентина. Полученные результаты также показали, что остеодентин (OD) с клетками, содержащимися в минерализованной ткани, вместе с оставшимся исходным дентином на обнаженной пульпе и под ней наблюдали в группах, обработанных MTA (Фиг. 12D-F). Однако в группах, обработанных MTA и пептидами Группы 11 (Фиг. 12G-I) или Группы 12 (Фиг. 12J-L), был образован новый физиологический дентин (TD), который был сплошным с дентинными отростками одонтобластов исходного дентина, вместе с оставшимся исходным дентином на обнаженной пульпе и под ней.
Результаты примеров, взятые вместе, показывают, что пептиды по настоящему изобретению увеличивают уровни экспрессии генов Dspp, Dmp1 и Nestin, которые являются маркерными генами одонтобласт-специфической дифференциации, и способствуют образованию одонтобластов при трансплантации пептидов вместе с клетками зубной пульпы в организм, и, в частности, клетки зубной пульпы промотируют образование дентин/зубная пульпа-подобной ткани, когда пептиды трансплантируют в пространства корневых каналов. Также можно видеть, что тот же самый физиологический дентин, который наблюдается в естественном дентине зуба человека, образован новыми пептидами.
Соответственно, можно видеть, что пептиды по настоящему изобретению можно использовать для лечения заболеваний дентина или пульпы зуба.
Это исследование было поддержано Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT), финансируемым Министерством торговли, промышленности и энергетики в 2017 году.
--->
Перечень последовательностей
<110>    HysensBio
<120>    Новый пептид
<130>    OPA17136-PCT
<150>    KR 10-2016-0180408
<151>    2016-12-27
<160>    104
<170>    KopatentIn 2.0
<210>    1
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    1
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    2
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    2
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    3
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    3
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    4
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    4
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    5
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    5
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    6
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    6
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    7
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    7
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    8
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    8
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    9
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    9
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    10
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    10
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    11
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    11
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    12
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    12
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    13
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    13
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    14
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    14
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    15
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    15
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    16
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    16
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    17
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    17
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    18
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    18
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    19
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    19
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    20
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    20
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    21
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    21
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    22
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    22
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    23
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    23
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    24
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    24
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    25
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    25
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    26
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    26
Lys Tyr Gln Arg Arg Lys Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    27
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    27
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    28
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    28
Lys Tyr Gln Arg Arg Arg Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    29
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    29
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    30
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    30
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    31
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    31
Lys Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    32
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    32
Lys Tyr Gln Arg Lys Arg Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    33
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    33
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    34
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    34
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    35
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    35
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    36
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    36
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    37
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    37
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    38
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    38
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    39
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    39
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    40
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    40
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    41
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    41
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    42
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    42
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    43
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    43
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    44
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    44
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    45
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    45
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    46
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    46
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    47
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    47
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    48
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    48
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    49
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    49
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    50
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    50
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    51
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    51
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    52
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    52
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    53
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    53
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    54
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    54
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    55
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    55
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    56
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    56
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    57
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    57
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    58
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    58
Lys Tyr Arg Gln Arg Lys Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    59
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    59
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    60
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    60
Lys Tyr Arg Gln Arg Arg Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    61
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    61
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    62
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    62
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    63
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    63
Lys Tyr Arg Gln Lys Lys Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    64
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    64
Lys Tyr Arg Gln Lys Arg Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    65
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    65
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    66
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    66
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    67
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    67
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    68
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    68
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    69
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    69
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    70
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    70
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    71
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    71
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    72
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    72
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Asn Lys Tyr
1               5                  10
<210>    73
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    73
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    74
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    74
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    75
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    75
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    76
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    76
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    77
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    77
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    78
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    78
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    79
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    79
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    80
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    80
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Ser Lys Tyr
1               5                  10
<210>    81
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    81
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    82
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    82
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    83
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    83
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    84
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    84
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    85
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    85
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    86
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    86
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    87
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    87
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    88
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    88
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Asn Tyr Lys
1               5                  10
<210>    89
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    89
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    90
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    90
Lys Tyr Lys Gln Arg Lys Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    91
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    91
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    92
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    92
Lys Tyr Lys Gln Arg Arg Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    93
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    93
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    94
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    94
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Lys Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    95
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    95
Lys Tyr Lys Gln Lys Lys Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    96
<211>    10
<212>    Белок
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Новый пептид
<400>    96
Lys Tyr Lys Gln Lys Arg Arg Ser Tyr Lys
1               5                  10
<210>    97
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    97
ctgttgctag tggtgctgtt                                                     20
<210>    98
<211>    23
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    98
cattctcctt gtgttccttt ggg                                                 23
<210>    99
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    99
aggtcggtgt gaacggattt g                                                   21
<210>    100
<211>    23
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    100
tgtagaccat gtagttgagg tca                                                 23
<210>    101
<211>    23
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    101
cattctcctt gtgttccttt ggg                                                 23
<210>    102
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    102
tgtggtcact atttgcctgt g                                                   21
<210>    103
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    103
ccctgaagtc gaggagctg                                                      19
<210>    104
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    праймер
<400>    104
ctgctgcacc tctaagcga                                                      19
<---