Установление таксономического положения бактериоцинобразующих лактококков разного происхождения

МИКРОБИОЛОГИЯ

УДК 577.12.9+579.842.24.013

УСТАНОВЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ БАКТЕРИОЦИНОБРАЗУЮЩИХ ЛАКТОКОККОВ РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Л.Г. Стоянова, Т.Д. Сультимова, А.И. Нетрусов

В настоящее время резко возрос интерес исследователей к мезофильным бакгериоцинобразующим лактококкам, которые вследствие своей безвредности, высокой ферментативной и бактериоцинобра-зующей активности являются объектом фундаментальных исследований по созданию новых активных пробиотиков и биологических консервантов (Riley, Wertz, 2002; Грачева, Бондаренко, 2004). Выделяют чистые культуры этих лактококков в основном из молочных продуктов, а в последнее время появились публикации о выделении их с поверхности растений и даже из речной воды. Активность природных штаммов составляла от 1650 до 1860 МЕ/мл, антимикробный спектр действия распространялся только на грамположительные бактерии (Lasango et al., 2002; Zendo et al., 2003; Yildirim et al., 2004). Сравнительное изучение штаммов лактококков, выделенных из различных эко-лого-географических зон, показало, что наблюдается определенная их адаптация к внешним факторам среды обитания. Необходимо отметить, что в природных субстратах группы облигатных гомо-и гетероферментативных молочнокислых бактерий (МКБ) по численности сравнительно малы, а группа факультативных гомоферментативных МКБ более значительна (Mathara et al., 2004). Определяющим свойством последних является их способность сбраживать углеводный субстрат до молочной кислоты. Но в ряде случаев лактококки могут перейти с гомоферментативного пути брожения на гете-роферментативный с образованием побочных нейтральных продуктов: этанола, диацетила и ацетоина. Изменение характера конечных продуктов брожения молочнокислых бактерий в зависимости от ряда конкретных физико-химических факторов свидетельствует о невозможности резкого разграничения групп гомо- и гетероферментативных МКБ (Серебренников и др., 1998; Duwat et al., 2000). Молочнокислые кокки по морфологии являются типичными стрептококками серологической группы N кроме Streptococcus thermophilus, относящихся к группе D. Ранее к роду Streptococcus были отнесены все грампо-ложительные, каталазоотрицательные кокки, образующие пары и цепочки, в том числе строго ана-

эробные формы (Schleifer, Ludwig, 1989). Однако стрептококки отличаются полиморфностью, они могут вытягиваться и напоминать палочковидные формы, образовывать стрептококкоподобные цепочки разной длины, что связано со снижением активности автолитических ферментов в процессе расхождения образующихся при делении клеток. Поэтому морфология и ферментативная активность не могут служить достоверными признаками при дифференциации выделенных культур. В настоящее время молочнокислые стрептококки по систематическому положению выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего и патогенные формы, и под новым родовым названием Lactococ-cus отнесены к категории GRAS, куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных (Хоулт и др., 1997). К этому роду отнесены следующие виды и подвиды: L. lactis subsp. ¡actis, L. lactis subsp. cremoris, L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis, L. lactis subsp. hordniae, L. garvieae, L. pischlum, L. plantarum, L. raf-finolactis. Результаты исследования термостабильности гибридных ДНК-РНК дуплексов выявили четкие отличия лактококков, стрептококков и энтерококков (Аверина и др., 1998). Это существенное достижение в классификации стрептококков было дополнено сравнительным анализом каталога оли-гонуклеотидов генов 16S pPHK, который подтвердил наличие трех таксонов родового ранга: Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus. Сравнительный анализ последовательностей гена 16S рРНК стал обязательным для исследований по систематике прокариот, выделенных из разных экологических систем или полученных разными способами селекции.

Задачей исследования было установление таксономического положения наиболее перспективных штаммов бактериоцинобразующих лактококков, выделенных из молока и молочных продуктов разных территориальных зон, и штамма, полученного слиянием протопластов.

Объекты и методы исследования

Для поиска активных бактериоцинобразующих лактококков использовали коровье молоко без кон-

сервантов молочных комбинатов г. Москвы, г. Улан-Удэ (Бурятия), простоквашу производства Экспериментального завода ГНУ ВНИМИ (г. Москва) и национальный бурятский напиток курунга — кисломолочный продукт комбинированного брожения, состоящего из наиболее активных рас молочнокислых бактерий и дрожжей (Шаблин, 2001). Выделение проводили поэтапно: вначале отделяли мезо-фильные лактобактерии, затем кислотообразующие кокки, а конечным этапом был отбор наиболее активных бактериоцинобразующих штаммов (Стоянова и др., 2006). Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар. Стандартом служил коммерческий препарат низина "Nisaplin" (фирма "Aplin & Barrett Ltd", Англия). Методом слияния протопластов, низкоактивных по синтезу низина родственных штаммов (кислотообразующего штамма 729 и его мутанта 1605, полученного комбинированным воздействие ультрафиолетовых лучей и этиленимина) получен активный штамм, как описано ранее (Стоянова, Егоров, 1998). В качестве контрольного использовали классический низиноб-разующий штамм L. lactis subsp. lactis МГУ, показавший 100%-е сходство нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК с референтным штаммом L. lactis subsp. lactis АВ118034 и депонированный в базу данных GenBank под номером DQ 255952. Штамм МГУ выделен из молока с последующей селекцией на среде с низином (Баранова и др., 1990).

Морфологию штаммов изучали с помощью микроскопа МБИ-15 с фазово-контрастным конденсором КФ-4 (Стоянова и др., 2006). Культуральные признаки оценивали, руководствуясь перечнем признаков для идентификации бактерий (Хоулт и др., 1997). Для дифференциации лактококков подвида L. lactis subsp. lactis от бактерий L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis определяли способность некоторых выделенных культур образовывать диацетил и ацетоин (Серебренников и др., 1998).

Физиолого-биохимические свойства штаммов оценивали по сбраживанию углеводов, чувствительности к ряду антибиотиков и потребности в факторах роста, как описано ранее (Стоянова, Егоров, 1998; Стоянова и др., 2006). Чувствительность к антибиотикам определяли диффузионным методом с использованием дисков (Стоянова, Аркадьева, 2000).

При изучении антимикробного спектра действия штаммов в качестве тест-культур использовали штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий, микроскопических грибов из коллекции культур кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Для точного установления видовой принадлежности новых выделенных штаммов мезофильных лактококков, гибридного штамма F-119, его родителей и штамма F-116, полученного ранее тем же

способом (Стоянова, Егоров, 1998), в сравнении с типовыми была определена нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК.

Выделение тотальной ДНК проводили с помощью набора для выделения ДНК фирмы-изготовителя "Fermentas" согласно рекомендациям производителя.

Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием реактивов фирмы "Fermentas", прай-меров, специально подобранных нами и синтезированных фирмой "Синтол", с использованием амп-лификатора "Perkin Elmer". Использовали прайме-ры 8f: 5' — aga gtt tga tcc tgg ctc — 3' (Leblond-Bo-urget et al., 1996) и 1492r: 5' ggt tac ctt gtt acg t — 3' (Boyer et al., 2001). Секвенирование проводили с использованием праймера 8f, позволяющего определить нуклеотидную последовательность проксимального участка гена 16S рРНК. Температурно-времен-ной профиль реакции следующий: 94°5' [90°30"; 66°30"; 72°1'] 30 c; 72°4'.

Компьютерный анализ подбора праймеров проводили с использованием компьютерных программ: NSBI Blast2 — определение гомологии при изучении сиквенсов с соответствующих праймеров, Oligo 6.31 — основной расчет характеристик ПЦР, возможности образования праймерами дуплексов и вторичных структур, определение мест неспецифического праймирования на матрице, Oligonucleoti-de Properties Calculator — определение температуры отжига праймеров и процента GC состава.

Секвенирование очищенных фрагментов генов 16S рРНК проводили по методу Сэнгера, используя автоматический секвенатор "Beckman Coulter". Секвенирование проводилось в ЦКП ФГУП ГосНИИ генетика.

Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК. Анализ результатов секвенирования проводили с помощью компьютерных программ Vector NTI: ContigExpress, AlignX. Сравнительный анализ и поиск гомологичных последовательностей проводили по базе NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast). Множественные выравнивания последовательностей проводили, используя программу ClustalX. Построение элайментов между сравниваемыми штаммами проводили в программе Mega2. При построении дендрограмм использовали программы TreeView и Mega2.

При построении филогенетического дерева использовали нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК, близких по физиолого-биохимическим свойствам референтных штаммов: Lactococcus lactis subsp. lactis AB100798, AB118034, AJ419572, L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis AY920468, AY920469, L. lactis subsp. cremoris AB100792, AB100802, полученные из базы данных NCBI. Степень гомологии, выраженная в процентном эквиваленте, была рассчитана, исходя из генетических дистанций, которые отражают различия между штаммами в числе

нуклеотидных замен в расчете на 100 пар нуклео-тидов (п.н.) в участке гена 168 рРНК протяженностью в 500 п.н.

Результаты исследования и их обсуждение

Из проб молока, взятых в г. Москве, быи выделен наиболее активный бактериоцинобразующий штамм 119 х с активностью 3700 МЕ/мл, из простокваши и национального бурятского напитка ку-рунги выделены штаммы 119 и К-205 с активностью 2700 МЕ/мл и 2500 МЕ/мл соответственно. Гибридный штамм Б-119, полученный слиянием протопластов, обладал антибиотической активностью 4650 МЕ/мл, в 11—13 раз превышающей активность родительских штаммов 729 и его мутанта 1605 и на 13,4% — активность ранее полученного тем же способом штамма Б-116 (Стоянова, Егоров, 1998), но последний, как и родительские штаммы 729 и 1605, не быш генотипирован по 168 рРНК. Активность контрольного классического низинобразующего штамма МГУ составляла 2000 МЕ/мл.

Первоначальная идентификация бактерий, включающая комплекс фенотипических признаков, основанных на изучении морфологических, культураль-ныгх и физиолого-биохимических свойств лактокок-ков, показала, что выделенные лактококки близки к бактериям рода Lactococcus (табл. 1). По морфологическим признакам штаммы были неподвижные, грамположительные, бесспоровые, но отличались полиморфизмом от контрольного штамма L. lactis subsp. lactis МГУ, в культуре которого, как и у типового, преобладали диплококки. Штамм 119х образовывал цепочки до 4 кокков, 119 и К-205 — до 7 кокков в цепочке, что характерно для сливочного лактококка L. lactis subsp. cremoris или термофильных стрептококков Streptococcus thermophilus (Стоянова, 2005).

По культуральным свойствам штаммы идентичны бактериям рода Lactococcus. При росте в обрате штаммы образовывали плотный молочный сгусток за 6—10 ч с максимальной кислотностью рН 4,0—4,5, что характерно для L. lactis subsp. lactis. Исключение составляли штаммы 119 из простокваши и К-205 из курунги, которые образовывали за это вре-

Таблица 1

Отличительные феиотипические признаки штаммов лактококков разного происхождения

Признаки Штаммы

МГУ 119 119х К-205 1605 729 F-119

Преимущественное расположение клеток диплококки цепочки до 7 кокков цепочки до 4 кокков цепочки до 4 кокков диплококки диплококки цепочки, единичные кокки

Арабиноза — + — + — — +

Ксилоза — — — — — — —

Манноза + — + + — + +

Сахароза + + + + — + +

Мальтоза — + — + + — +

Рафиноза — — — — — — +

Дульцитол — — + — — — +

Маннитол + — + + — — —

Сорбитол — — + + — — +

Декстрин — + — + + — +

Аланин — — — + — — +

Аспарагин — — — + + — +

Аспарагиновая кислота + — — + + — +

Валин + — — + + + —

Глицин + — — — — + —

Глутамин + — + + — + +

Пролин — + — — + — —

Тимин — — — — + + +

Урацил + + + + + + —

Примечание. Для углеводов знак "+" обозначает способность к сбраживанию, "—" — отсутствие способности к сбраживанию; для ростовыгх компонентов знак "+" обозначает потребность в ростовом компоненте, "—" — отсутствие потребности.

мя сметанообразный сгусток, по консистенции характерный для лактококка Ь. ¡асИз 8иЪ8р. cremoris, образующий экзополисахариды.

Свойство сбраживать различные углеводы, включая сахара, спирты и органические кислоты, лежит в основе дифференцирующих признаков. Но иногда сбраживание углеродсодержащего субстрата можно связать с местообитанием микроорганизмов. Как правило, лактококки, обитающие в молоке и молочных продуктах, сбраживают лактозу и не гидролизируют глицерин и крахмал, что подтверждено результатами наших исследований. Из данных, представленных в табл. 1, видно, что изучаемые штаммы отличались по способности к сбраживанию углеводных субстратов как друг от друга, так и от типового штамма МГУ. Штаммы 119 и К-205, выделенные из кисломолочных продуктов, штамм 1605 и гибрид Б-119 разлагали декстрин в отличие от штаммов 729, 119 х и МГУ. Штамм К-205 из курунги, являющейся продуктом смешанного молочнокислого и спиртового брожения и вследствие этого адаптированной к спиртовому субстрату, мог сбраживать сахароспирты, в том числе и маннит, что характерно для Ь. ¡асШ зиЪвр. сгетопз. Штаммы 729, 1605 и 119х образовывали диацетил, что является характерным признаком для ароматобразующих лактококков. Трисаха-рид рафинозу сбраживал только гибридный штамм Б-119, что не свойственно ни для его родительских штаммов, ни для лактококков Ь. ¡асИз зиЪвр. ¡асИз.

Отличительным признаком молочнокислых бактерий является высокая потребность в сложных питательных веществах, пуринах, пиримидинах, аминокислотах, витаминах, особенно группы В. Результаты эксперимента по определению потребности в ростовых компонентах выделенных штаммов показали (табл. 1), что они одинаково хорошо росли на средах, содержащих смесь аминокислот с витамином В1 или в сочетании с урацилом и биоти-ном. Методом дробного исключения одного или нескольких компонентов в среде культивирования установлены отличительные признаки штаммов по усвоению ростовых компонентов. Значительное место в исследованиях занимают вопросы о потребностях лактококков в отдельных аминокислотах. Гидролиз аргинина является таксономическим признаком для Ь. ¡асИз 8иЪ8р. ¡асИз, что дифференцирует изучаемые лактококки от Ь. ¡асИз зиЪвр. сгетопз. Большинству изучаемых штаммов были необходимы цистеин, глутаминовая кислота, лейцин ("незаменимые" аминокислоты). Но имеются аминокислоты, в отсутствие которых интенсивность роста и развития лактококков сохраняется. Так, штамм 119 отличался весьма ограниченной потребностью в ростовых компонентах, но пролин и урацил стимулировали его рост. Глицин был необходим для роста штаммов МГУ и низкоактивного по антибиотической активности штамма 729. Штамм К-205 и

гибридный штамм Б-119 нуждались в аланине, что не характерно для его родительских штаммов и вообще для Ь. ¡асИз 8иЪ8р. ¡асИз.

Чувствительность штаммов к антибиотикам является фенотипическим признаком, используемом при дифференциации лактококков. По результатам исследования чувствительности изучаемых штаммов к антибиотикам было выявлено, что штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез белка: тетрациклину, доксициклину и левомицети-ну, в меньшей степени к аминогликозидным антибиотикам канамицину, сизомицину и стрептомицину, а штаммы 729, К-205 и гибридный Б-119 устойчивы к последнему; все штаммы устойчивы к неомицину. Эти данные подтверждают принадлежность изучаемых бактерий к группе грамполо-жительных бактерий. Все штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки (табл. 2). Устойчивость штаммов к антибиотикам может быть следствием передачи гена резистентности через молоко при их использовании в ветеринарной практике (Грачева, Бондаренко, 2004).

Важным критерием оценки эффективности синтезируемого бактериоцина является спектр его антимикробного действия, т.е. активность по отношению к разным группам микроорганизмов. В табл. 3 представлены результаты изучения спектров антибиотического действия штаммов разного происхождения. Результаты показали, что выделенный из молока активный бактериоцинобразующий штамм 119х подавлял рост грамположительных бактерий, что характерно для низина А ("МзарИп") и низин-образующих лактококков, например штамма МГУ. Бурятский штамм К-205 и штамм Б-119 обладали широким спектром антибактериального действия, эффективно подавляли рост не только грамполо-жительных, но и грамотрицательных бактерий, обладали фунгицидным действием, что является неизвестным биологическим свойством бактериоци-нов, синтезируемых природными штаммами Ь. ¡ас-8иЪ8р. ¡асШ. Следует отметить, что родительские штаммы гибрида Б-119 имели иной спектр действия: 729 слабо подавлял рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, но не подавлял золотистый стафилококк, а его мутант — штамм 1605 приобрел антибиотическую активность по отношению к нему и в незначительной степени ингиби-ровал рост микроскопических грибов. Очевидно, что вышеуказанные штаммы синтезируют бактери-оцины разного спектра антимикробного действия, отличные от широко известного бактериоцина низина. Известно, что молочнокислые бактерии серологической группы N образуют разные антибактериальные вещества (Егоров, Баранова, 1999). Имеются сообщения об антибиотике диплококкцине, продуцентом которого является Ь. ¡асИз зиЪвр. сге-топз, и антибиотических веществах, синтезируемых ароматообразующими молочнокислыми бакте-

Таблица 2

Чувствительность штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis к антибиотикам

Штаммы

Антибиотик Концентрация в диске, мкг 119 119х 729 К-205 1605 F-119 МГУ

Диаметр зон подавления роста, мм

Тетрациклин 30 36,5 35,0 35,0 30,4 35,0 36,0 35,5

Доксициклин 10 32,0 32,5 32,0 29,8 33,0 35,0 34,0

Левомицетин 30 25,2 26,5 23,0 23,6 25,2 35,8 26,0

Сизомицин 10 19,0 17,0 18,0 14,2 16,0 21,0 17,5

Олеандомицин 15 21,0 23,5 24,5 18,3 23,0 25,0 28,5

Метициллин 10 22,0 10,0 25,0 0 20,0 15,0 16,0

Ампициллин 10 29, 28,0 32,0 23,4 30,0 20,0 26,5

Рифампицин 10 12,0 0 0 12,2 0 0 0

Неомицин 30 0 0 0 0 0 0 0

Стрептомицин 30 12,0 13,0 0 0 11,0 0 14,0

Канамицин 30 14,5 14,0 18,0 11,3 15,0 14,5 15,0

Ристомицин 30 19,5 18,0 16,0 14,4 18,0 15,0 19,5

Бензилпенициллин 10 22,6 26,6 24, 18,5 25,0 19,0 26,5

Карбинициллин 10 32,0 30,6 32,0 21,1 34,0 18,0 30,5

Оксациллин 10 21,0 22,0 19,0 13,6 18,0 16,0 17,5

Цефалотин 30 30,5 29,0 29,0 26,8 20,5 21,0 31,0

Цефалексин 30 18,0 24,0 20,0 15,7 20,0 17,0 28,0

Таблица 3 Антимикробный спектр действия штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis разного происхождения

TecT-KyrnTypa Штаммы

119х 119 К-205 729 1605 F-119 МГУ Nisaplin

Диаметр зон подавления роста, мм

Bacillus mycoides 20,0 16,0 16,0 10,0 11,0 24,0 16,0 17,0

Bacillus subtilis 19,0 14,0 16,0 10,0 10,0 24,0 19,0 19,0

Bacillus coagulans 21,0 19,0 16,0 8,0 10,0 34,0 14,0 21,0

Bacillus cereus 18,5 16,0 19,0 10,0 10,0 24,0 16,0 18,0

Micrococcus luteus 21,5 20,0 16,5 13,0 13,5 29,0 19,0 21,5

Staphylococcus aureus 18,0 12,0 17,0 0 12,0 19,0 12,0 15,0

Alcaligenes faecalis 0 0 12,5 0 12,0 26,0 0 0

Escherichia coli 0 0 12,0 0 12,0 14,0 0 0

Proteus vulgaris 0 0 14,0 0 0 16,0 0 0

Pseudomonas aeruginosa 0 0 13,5 0 10,0 14,0 0 0

Pseudomonas fuorescens 0 0 16,0 0 0 16,0 0 0

Fusarium oxysporum 0 0 10,0 0 11,0 14,0 0 0

Penicillium chryzogenum 0 0 10,5 0 10,0 12,0 0 0

Aspergillus niger 0 0 10,0 0 10,0 14,0 0 0

Rhodotorula aurantiaca 0 0 10,0 0 9,0 14,0 0 0

Candida guellermondii 0 0 12,0 0 9,0 15,0 0 0

риями L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis. Из лак-тококков выделен новый бактериоцин — лактицин NK24, активный против Leuconostoc mesenteroides KCCM 324, как и низин, термоустойчивый при 100° в течение 30 мин, с молекулярной массой 3—3,5 кДа, но стабильный в широком диапазоне рН от 2,0 до 9,0 и отличающийся от него спектром действия. Он подавлял рост не только грампо-ложительных бактерий, но и E. coli, Pseudomonas, однако был неэффективен против грибов, в том числе и дрожжей (Lee, Paik, 2001).

Следовательно, имеет место штаммовая специфичность лактококков по синтезу бактериоцинов. Этим объясняется актуальность данной работы по выделению новых культур — продуцентов бактериоцинов.

Данные анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммов L. lactis subsp. lactis (AJ419572, AB118034, AB100798) и близким им по фенотипическим показателям Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis (AY920469, AY920468), L. lactis subsp. cremoris (AB100792, AB100802) объясняют возможности и разрешающую способность метода для идентификации близкородственных таксонов молочнокислых лактококков на уровне подвида. Последовательности генов 16S рРНК штаммов вида Lactococcus lactis subsp. cremoris на участке гена протяженностью 500 н.п. имеют ряд уникальных для этого подвида нуклеотидных замен, дающих возможность точной дифференциации бактерий этого подвида от близкородственного подвида L. lactis subsp lactis. Последовательности генов 16S рРНК, свойственных бактериям L. lactis subsp. lactis и L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis, идентичны, и дифференциация этих бактерий производится на основании биохимического исследования на способность бактерий L. lactis subsp. lactis образовывать диацетил.

При компьютерной обработке результатов сек-венирования генов 16S рРНК и сравнительном анализе полученных нами последовательностей изучаемых штаммов с последовательностями тех же генов вышеуказанных типовых штаммов между ними отмечалось высокое сходство. Все штаммы обнаруживают высокую степень гомологии ДНК (на уровне 98,9—100%) по отношению к референтным штаммам L. lactis subsp. lactis. Гибридный штамм F-119, как и ранее полученный слиянием протопластов активный штамм F-116 (Стоянова, Егоров, 1998), показали 100% сходство фрагментов генов 16S рРНК с референтным штаммом L. lactis subsp. lactis AJ4I572 и штаммом МГУ, который в свою очередь показал 100% сходство последовательностей генов

168 рРНК с референтным штаммом АВ100798. Показано 100% сходство последовательностей генов 168 рРНК их родительских штаммов 729 и 1605 с референтным штаммом Ь. ¡ас^ subsp. ¡ас^ АВ118034, а также со штаммом 119 и с ароматообразующими мезофильными лактококками Ь. 1ас^ subsp. ¡асШ Ъу. diacety¡actis АУ920469, АУ920468. Результаты анализа на наличие диацетила, образуемого при росте этих штаммов, предполагают подвидовое родство. Уровень гомологии между бурятским штаммом К-205 с лактококками, выделенными из молока, полученного в московском регионе, был ниже (98,9%). Уровень генетического родства всех изучаемых штаммов по отношению к близкородственному штамму Ь. ¡асШ subsp. сгетот составил всего 95,4—96,6%, хотя по ряду физиолого-биохимиче-ских признаков штаммы 119 и К-205 были близки к лактококкам этого вида. Уровень гомологии (в %) между штаммами лактококков по результатам сравнительного анализа последовательностей участка гена 168 рРНК представлен на филогенетическом дереве (рисунок) и подтверждает принадлежность изучаемых бактерий к подвиду Ь. IасШ subsp. ¡асйз.

Проведенные исследования по изучению оли-гонуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК новых штаммов в сравнении с перспективными бак-териоцинобразующими штаммами, полученными с использованием разных методов селекции, а именно адаптивной селекции к низину (штамм МГУ), индуцированного мутагенеза (1605) и слияния протопластов (Б-119 и Б-116), уточнили их таксономическое положение и видовую принадлежность к Ь. ¡ас^ subsp. ¡асйз. Штаммы 729, 1605 и 119, обладающие способностью к синтезу диацетила при сбраживании углеводов, на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК могут быть идентифицированы как Ь. ¡ас^ subsp. ¡ас-Ш Ъу. diacety¡actis. Последовательности 168 рРНК явились хорошим инструментом для выявления внутривидовых различий лактококков. Определенные

Lactococcus lactis subsp. lactis AB 100798

Штамм МГУ

F-116

Lactococcus lactis subsp. lactis AJ419572

F-119

119x

729

Lactococcus lactis subsp. lactis AB 118034 119

Lactococcus lactis subsp. lactis bv diacetylactis AY920469 Lactococcus lactis subsp. lactis bv diacetylactis AY920468 1fi05

K-205

i Lactococcus lactis subsp. cremoris AB 100802 Lactococcus lactis subsp. cremoris AB 100792

0.005

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, характерных для Lactococcus lactis subsp. lactis (AJ419572, AB118034, AB100798), L. lactis subsp. cremoris (AB100792, AB100802) и L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis (AY920469, AY920468), взятых из базы данных NCBI, и изучаемых штаммов лак-

тококков

последовательности новых штаммов L. lactis subsp. lactis депонированы под следующими номерами: К-205 - EF 114305, F-116 - EF 100777, F-119 -EF 100778, 729 - EF 102814, 1605 - EF 102815, 119х - EF 114305, 119 - EF 114306.

Таким образом, установлено таксономическое положение новых перспективных бактериоциноб-разующих штаммов мезофильных лактококков, выделенных из молока и молочнокислых продуктов разных территориальных зон России, антибиотическая активность которых составила от 2500 до 3700 МЕ/мл, что значительно превышает уровень активности выделенных из природы штаммов лактококков. Показана перспективность метода слияния протопластов, обеспечивающего получение активных продуцентов из неактивных родственных штаммов, активность нового штамма F-119 составила 4650 МЕ/мл, что в 11-13 раз превышает активность родительских штаммов. Несмотря на некоторые различия штаммов по морфологии, способности к сбраживанию углеводов, потребности в ростовых компонентах, чувствительности к антибиотикам, штаммы идентифицированы как Lactococcus lactis subsp. lactis. Новые штаммы отличались от известных низинсинтезирующих лактококков более широким спектром антимикробного действия, обладали фунгицидным действием, что является неизвестным биологическим свойством бактериоцинов, синтезируемым Lactococcus lactis subsp. lactis. Строгая дифференциация бактерий родов Lactococcus, Streptococcus и Enterococcus важна, так как среди штаммов энтерококков и стрептококков встречаются патогенные варианты и требуются доказательства их авирулентности. Безвредность лактококков сомнений не вызывает (Хоулт и др., 1997; Riley, Wertz, 2002).

Немаловажной является также проблема лекарственной устойчивости и возможная роль используемых культур в распространении генов антибио-тикорезистентности. Контроль по чувствительности изучаемых штаммов к антибиотикам является необходимым, так как при использовании культур, резистентных к лекарственным препаратам, в пищевой и медицинской практике могут передаваться плазмиды, несущие гены лекарственной устойчивости, а если макроорганизм заражен возбудителями, которые имеют множественную устойчивость к антибиотикам, то заболевание протекает в значительно более тяжелой форме (Тешшгешап, 2003).

Полученные штаммы вследствие своих уникальных свойств могут быть с успехом применены для создания биологических консервантов и пробиоти-ков, поскольку они соответствуют основным требованиям, предъявляемым к микробным культурам для этой цели, а именно: их безвредности, высокой ферментативной и антагонистической активности к термофильным споровым бактериям, патогенным и условно патогенным микроорганизмам. Установление таксономического положения бактериоциноб-разующих лактококков является важным этапом для их практического использования.

Авторы выражают благодарность профессору Ю.Д. Цыганкову (ЦКП "Идентификация и оценка биотехнологического потенциала микроорганизмов" ФГУП ГосНИИ генетика) за техническую поддержку и помощь в работе.

* * *

Работа частично финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 05-04-08032).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Аверина О.В., Лысенко А.М., Ермакова Л.М., Огай Д.К., Суходолец В.В. 1998. Сравнительное изучение гомологии ДНК у штаммов термофильных и мезофильных молочнокислых стрептококков различного происхождения // Микробиология. 67. № 6. 792-798.

Баранова И.П., Клюева Л.М., Егоров Н.С., Исаева Н.С., Ходжаев М.Н., Бартошевич Ю.Э. 1990. Изучение антибиотика низина, образуемого культурой Streptococcus lactis, штамм МГУ // Антибиотики и химиотерапия. 35. № 11. 8-10.

Грачева Н.М., Бондаренко В.М. 2004. Пробиотические препараты в терапии и профилактике дисбактериоза кишечника // Инфекц. болезни. 2. № 2. 53-58.

Егоров Н.С., Баранова И.П. 1999. Бакте-риоцины. Образование, свойства, применение // Антибиотики и химиотерапия. 44. № 6. 33-40.

Серебренников В.М., Кисриев Ю.С., Загустина Н.А. 1998. Образование диацетила и ацетоина производственными штаммами лактококков в

различных условиях выращивания // Прикладная биохимия и микробиология. 34. № 3. 276-280.

Стоянова Л.Г. 2005. Молочнокислые бактерии // Практикум по микробиологии / Под ред. А.И. Не-трусова. М. С. 467-486.

Стоянова Л.Г., Аркадьева З.А. 2000. Сравнение способов хранения молочнокислых бактерий // Микробиология. 69. № 1. 98-104.

Стоянова Л.Г., Егоров Н.С. 1998. Получение низинпродуцирующих бактерий методом слияния протопластов двух родственных штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis, низкоактивных по синтезу низина // Микробиология. 67. № 1. 47-54.

Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Бо-тина С.Г., Нетрусов А.И. 2006. Выделение и идентификация бактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из свежего молока // Прикладная биохимия и микробиология. 42. № 5. 560-568.

Хоулт Дж. , Криг Н., Снит П., Стей-ли Дж., Уильямс С. 1997. Определитель бактерий Берджи. Т. 2. М. С. 538, 544, 549.

ffla6nHH n.E. 2001. neHe6H0-np0$H^aKTHHecKHH HanHTOK "3M-KypyHra" // BnoTexHoaorHH-2001. ny^HHO. C. 223-227.

Boyer S.L, Flechtner V.R., Jeffrey R.J. 2001. Is the 16S—23S rRNA internal transcribed spacer region a good tool for use in molecular systematics and population genetics? A Case study in cyanobacteria // Mol. Biol. Evol. 18. 1057—1069.

Duwat P., Cesselin B., Sourice S., G r u s s A . 2000. Lactococcus lactis, a bacterial model for stress response and survival //J. Food Microbiol. 55. 83—86.

Lasango M., Beoleito V., Sesma F., Raya R., Font D., Eraso A. 2002. Selection of bacteriocin-producer strains of lactic acid bacteria from dairy environment // New Microbiol. 25. N 1. 37—44.

Leblond-Bourget N., Philippe H., Man-gin I., Decaris B. 1996. 16S rRNA and 16S to 23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal inter- and intraspecific bifidobacterium phylogeny // Int. J. Syst. Bacte-riol. 46. 102—111.

Lee N.K., Paik H.D. 2001. Partial characterization of lacticin NK 24 a newly identified bacteriocin of Lactococcus lactis NK 24 isolated from Joot-gal // Food Microbiol. 18. 17—24.

Mathara J.M., Schillinger U., Kuti-ma P.M., Mbugua S.K., Holzapfel W.H. 2004. Isolation, identification and characterisation of the dominant microorganisms of kule naoto: the Maasi traditional fermented milk in Kenya // Int. J. Food Microbiol. 94. N 3. 269-278.

Riley M.A., Wertz J.E. 2002. Bacteriocins: evolution, ecology and application // Ann. Rev. Microbiol. 56. 117-137.

Schleifer K.H., Ludwig W. 1989. Phyloge-netic relationships among bacteria // The hierarchy of life / Eds. B. Fernholm, K. Bremer, H. Jornwall. Amsterdam. P. 103-117.

Temmreman R. 2003. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products // Food Microbiol. 73. 410-414.

Yildirim Z., Yildirim M., Johnson M.G. 2004. Mode of action of lactococcin R produced by Lactococcus lactis R // Nahrung. 48. N 2. 145—148.

Zendo T., Fukao M., Higuchi T., Na-kayama J., Sonomoto K. 2003. Identification of the lantibiotic nisin Q, a new natural nisin variant produced by Lactococcus lactis 61—14 isolated from a river in Japan // Biosci. Biotechnol. Biochem. 67. 1616—1619.

üocTynrna b peaaKöHM 27.06.07

THE ESTABLISHMENT OF TAXONOMIC STATE

OF NEW PERSPECTIVE BACTERIOCIN-SYNTHESIZING STRAINS

OF LACTOCOCCI OF DIFFERENT ORIGIN

L.G. Stoyanova, T.D. Sultimova, A.I. Netrusov

Taxonomic state of new perspective bacteriocin-synthesizing strains of mesophilic lactococci isolated from raw milk and milk products of different regions of Russia and also strain F-119 obtained by protoplasts fusing of two related strains with low bacteriocin-synthesizing activities was established by classical methods of identification. Their antibiotical activity were up to 4650 IU/ml (with test-microorganism Bacillus coagulans). There were higher than among natural strains lac-tococci. In spite of some differences on morphology, abilities to ferment of carbohydrates, requirements in growth components and antibiotic sensivities this strains was identified as Lactococcus lactis subsp. lactis. The new strains differed from classic nisin-producing strain L. lactis subsp. lactis MSU with a broad spectrum of bactericidal and fungicidal activity which are rare biological properties for strains of Lactococcus lactis.

The study of gene sequence of 16S r RNA of new natural strains, fusants F-116 and other F-116 which was obtained early, its parents in comparision with referent strains, confirmed their taxonomic state as Lactococcus lactis subsp. lactis. The sequences of 16S r RNA gene were deposited in Gene Bank as EF 100777—EF 114305.