Прогнозирование заживления гнойных ран на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии синтеза протеинов при различных способах лечения

Прогнозирование заживления гнойных ран на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии синтеза протеинов при различных способах лечения

О.Б. Нузова, д.м.н., профессор, А А. Стадников, д.б.н., профессор, НИ.Колосова ст. преподаватель, ФГБОУ ВО ОрГМУ, А.В. Студеникин, врач-хирург, ГБУЗ ООКБ

Лечение гнойных ран у больных сахарным диабетом является одной из важнейших проблем медицины, которой посвящены многочисленные исследования [1, 7, 8]. В общепринятом комплексе лечебных мероприятий особую роль играет местное лечение гнойных ран. Несмотря на применяемые в практике разнообразные хирургические и медикаментозные методы лечения гнойно-воспалительных процессов мягких тканей, имеются существенные ограничения клинических

репаративных эффектов в каждом способе ведения ран. Одной из важнейших задач в лечении больных с острой хирургической инфекцией мягких тканей является прогнозирование течения гнойно-воспалительных заболеваний [2, 3]. Актуальной является разработка методик прогнозирования репаративных процессов в гнойных ранах при различных способах лечения на основе иммуноци-тохимической идентификации экспрессии синтеза протеинов. Апоптоз или запрограммированная форма клеточной гибели наряду с делением, ростом, дифференцировкой играет чрезвычайно важную роль в формировании и функционировании многоклеточных организмов [2, 4].

Цель исследования — обоснование прогнозирования заживления гнойных ран на основе экспрессии синтеза проапоптотического белка р53 и белка Ki67 — маркера пролиферации при различных способах лечения гнойных ран на фоне аллоксанового диабета.

Материал и методы исследования. Лечебная эффективность милиацила и КВЧ-терапии изучена в опытах на 128 белых беспородных крысах-самцах, массой 260 — 330 г. Все манипуляции с животными выполнены в соответствии с требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985), Хельсинкской декларации «О гуманном отношении к животным» (2000 г.), приказа Министерства здравоохранения РФ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».

После суточного голодания у подопытных животных был вызван аллоксановый диабет путём введения подкожно 5-процентного раствора аллоксана. Через 30 дн. после получения аллоксанового диабета у крыс моделировали гнойно-воспалительный процесс задних конечностей, в том числе при инфицировании 64 животных Staphylococcus aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) и 64 крыс штаммом стафилококка без антилактоферри-новой активности (АЛфА).

После получения экспериментальной модели гнойно-воспалительного очага производилась его хирургическая обработка в объёме, обеспечивающем удаление нежизнеспособных тканей. Оперативное вмешательство проводилось под общей анестезией. У крыс основной (IV) гр. в местном лечении ран использовали Милиацил и КВЧ-терапию от аппарата «Явь-1». Ранозаживляющий препарат Милиацил разработан профессором Б. Г. Нузовым и профессором Л. Е. Олифсоном в Оренбургском государственном медицинском университете. В лечении гнойных ран в последние годы успешно используют физические методы воздействия, в том числе КВЧ-терапию[2]. У животных I контрольной гр. был исследован характер течения гнойно-воспалительного процесса без лечебной коррекции. Во II контрольной гр. лечение гнойно-воспалительного очага у крыс осуществлялось Милиацилом. В III контрольной гр. применяли КВЧ-терапию от аппарата «Явь-1» с рабочей длиной волны 7,1 мм. Продолжительность проводимых ежедневно воздействий составляла от 5 до 6 мин. В каждой группе было взято по 32 крысы (16 инфицированных S. aureus АЛфА+ и 16 инфицированных S. aureus АЛфА—). Животных выводили из опыта путём ингаляции летальной дозы эфира. Ткани фиксировали в 10-процентном растворе нейтрального формалина и 2,5-процентном растворе глютарового альдегида (рН-7,3). Объекты были исследованы на светооптическом уровне. Гистосрезы толщиной

6 — 8 мкм, изготовленные на ротационном микротоме, после депарафинирования окрашивали гематоксилином Майера и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, метиловым зелёным и пиронином по Браше, перйодатом К и реактивом Шиффа по Мак Манусу. Для идентификации клеток с признаками апоптоза в регенерате гнойных ран применяли иммуноцитохимические реакции. Для определения экспрессии проапоптотического белка р53 и белка Ki-67 — маркера пролиферации серийные гистосрезы (толщиной 5 — 6 мкм) инкубировали с соответствующими моноклональными антителами (фирма «Dako», Дания) в рабочем разведении 1:50.

Полученные данные были обработаны с помощью пакета программы Статистика 6.1.

Результаты исследования. Результаты проведённого обследования 128 крыс с гнойными ранами на фоне аллоксанового диабета свидетельствуют

0 том, что более эффективным оказалось сочетанное использование Милиацила и КВЧ-терапии, чем применение только Милиацила или КВЧ-терапии.

Сроки заживления гнойных ран у крыс на фоне аллоксанового диабета в основной IV гр., лечение которых проводили местно Милиацилом и КВЧ-терапией (11,91±0,28сут.), были короче, чем у животных, при лечении которых использовали только Милиацил (13,88+0,26 сут.), и у крыс, в лечении которых использовали только КВЧ-терапию (не заживали к 28 сут.).

Гистологический анализ исследованных объектов у крыс I контрольной гр. выявил, что в ранах преобладали некротические процессы. У животных на фоне выраженных альтеративных изменений отмечали вполне отчётливо все признаки сосудистой реакции с образованием экссудата. У животных этой группы, инфицированных S. aureus с анти-лактоферриновой активностью, наблюдались более выраженные нарушения кровообращения, некротические процессы, формирование микроабсцессов. Использование Милиацила во II контрольной гр. обусловило более выраженное усиление лейкоцитарной и макрофагальной реакции, быстрее на убыль шёл воспалительный процесс, чем у особей

1 и III контрольных гр.

У крыс на 7-е сут. лечения гнойных ран Милиацилом определялась грануляционная ткань. К 14-м сут. в заживших ранах была выражена типичная рубцовая ткань. У животных III контрольной гр. через 7 сут. лечения ран КВЧ-терапией в области раневого дефекта были выражены репаративные явления грануляционной ткани, сочетающиеся с очагами гнойного воспаления. Выявлялась грануляционная ткань в области раневых дефектов через 14 сут. лечения. Формирующаяся грануляционная ткань определялась через 28 сут. лечения в глубоких отделах дермы.

Сравнительное изучение тканевых структур гнойных ран в различных условиях воздействия

Морфометрические данные по анализу содержания иммунопозитивных клеток

Животные, инфицированные S. aureus с антилактоферриновой активностью Животные, инфицированные S. aureus без антилактоферриновой активности

Количество иммунопозитивных клеток, % I контрольная гр.

Фибробласты Ki-67 - - - - - - - 1,8±0,2

р53 3,5±0,6 - 1,5±0,6 - 2,3±0,1 - - -

Эндотелиоциты Ki-67 - 1±0,4 - 1,8±0,5 - 1,4±0,1 0,6±0,1* 2,0±0,2

p53 3,3±0,5 2,3±0,3 3±0,4 - - - - -

Эпителиоциты Ki-67 - 1,0±0,4* - 3,5±0,6 - 1,8±0,1* - 4,0±0,1

регенерата p53 2,8±0,5 2,0±0,4 2,3±0,5 - 2,3±0,2 - 1,0±0,2 -

Примечание: * — статистическая значимость различий показателей от таковых по сравнению с основной группой

показало большую лечебную эффективность сочетанного использования Милиацила и КВЧ-терапии. Через 7 сут. лечения ран развивалась грануляционная ткань у животных основной IV гр. Регенеративные процессы распространялись и на мышечные волокна. Были идентифицированы плазматические клетки, диффузно распределённые в межкапиллярных пространствах. На 7-е сут. наблюдалась выраженная эпителизация раневого дефекта. Формированием лимфоидно-плазматических инфильтратов завершалось полное очищение раны и образование органотипического регенерата. Благоприятное воздействие Милиа-цила и КВЧ-терапии на заживление гнойных ран подтверждалось и экспрессией синтеза проапоп-тотического белка р53 и белка Ki-67 в регенерате гнойных ран.

Белок р53 является важным маркером биологического потенциала клеток, выполняет три основные функции: регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза (в случаях, когда нарушения ДНК клетки не могут быть репарированы), стабилизацию генома [5]. Ki-67 — белок, являющийся клеточным маркером пролиферации, экспрессиру-ется в пролиферирующих клетках в течение фазы G1, но не обнаруживается в покоящихся клетках [6].

Сравнивая показатели экспрессии синтеза белков р53 и Ki-67, была установлена их разнонаправленная (реципрокная) реализация (табл.). На 7-е сут. лечения р53 положительные фибро-бласты у крыс основной IV и II контрольной гр., инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), обнаружены не были. У животных I и III контрольных гр. определялись р53 положительные фибробласты. Количество р53 положительных фибробластов на 7-е сут. было

больше у крыс I контрольной гр. в 2,3 раза по сравнению с аналогичным показателем у животных III контрольной гр.

У крыс основной IV гр., инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), р53 положительные эндотелиоциты обнаружены не были, но определялись у животных контрольных групп. Количество р53 эндотелиоцитов у крыс I контрольной гр. было больше в сравнении с таким показателем у животных II и III контрольных гр. в 1,4 и 1,1 раза соответственно.

Также р53 положительные эпителиоциты не встречались у животных основной гр., у крыс контрольных гр. они были обнаружены. Количество р53 положительных эпителиоцитов было больше у крыс I контрольной гр. по сравнению с аналогичным показателем у животных II и III контрольных гр. в 1,4 и 1,2 раза. У животных основной IV, II и III контрольных гр., инфицированных S.aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА), на 7-е сут. р53 положительные фибробласты не были обнаружены, только определялись у крыс I контрольной гр. У крыс всех групп р53 положительные эндотелиоциты не определялись.

У крыс основной IV и II контрольной гр. р53 положительные эпителиоциты не определялись, а встречались только у животных I и III контрольных гр. Количество р53 положительных эпителиоцитов у животных I контрольной гр. было больше по сравнению с аналогичным показателем у крыс III контрольной гр. в 2,3 раза.

На 7-е сут. лечения у крыс всех групп, инфицированных S.aureusс антилактоферриновой активностью (АЛфА+), не определялись Ki-67 положительные фибробласты. Ki-67 положительные

эндотелиоциты были обнаружены у животных основной IV и II контрольной гр. Количество Ki-67 положительных эндотелиоцитов на 7-е сут. лечения у крыс основной группы по сравнению с аналогичным показателем у животных II контрольной гр. было больше в 1,8 раза.

У животных основной и II контрольной гр. определялись Ki-67 положительные эпителиоциты, которые не встречались у крыс I и III контрольных гр. На 7-е сут. лечения количество Ki-67 положительных эпителиоцитову крыс основной IV гр. по сравнению с аналогичным показателем у животных II контрольной гр. было больше в 3,5 раза.

У крыс основной группы, инфицированных S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА), определялись Ki-67 положительные фибробласты. У крыс контрольных групп Ki-67 положительные фибробласты обнаружены не были. Ki-67 положительные эндотелиоциты были обнаружены у животных основной, II и III контрольных гр. Количество Ki-67 положительных эндотелиоцитов у крыс основной группы по сравнению с аналогичным показателем у животных II и III контрольных гр. было больше в 1,4 и 3,3 раза. У животных основной и II контрольной гр., инфицированных S.aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА), определялись Ki-67 положительные эпителиоциты. У животных I и III контрольных гр. Ki-67 эпителиоциты не были обнаружены. Количество Ki-67 положительных эпителиоцитов у крыс основной группы по сравнению с аналогичным показателем у животных II контрольной гр. было больше в 2,3 раза.

Выводы. Милиацил, особенно в сочетании с КВЧ-терапией, стимулирует пролиферативную

активность клеток раневой области и приводит к лимитированию апоптотической доминанты (противоапоптотическое действие). При этом у крыс I и III контрольных гр. обнаружено, что пролиферативная активность клеток была существенно снижена на фоне интенсивной экспрессии белка р53 и подавления экспрессии белка Ki-67. Полученные экспериментальные данные подтверждались иммуноцитохимическими исследованиями тканей гнойных ран на фоне аллоксанового диабета. Обоснован способ прогнозирования течения гнойных ран на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии проапоптотического белка р53, а также белка Ki-67 - маркера пролиферации.

Литература

1. Блатун JI.A. БАНЕОЦИН (порошок, мазь) — перспективы использования в комплексном хирургическом лечении гнойно-некротических поражений нижних конечностей у больных с синдромом диабетической стопы // Раны и раневые инфекции. 2015. T. II. №3. С. 36 — 45.

2. Нузов Б.Г., Стадников А.А., Нузова О.Б. Оптимизация репаративной регенерации тканей. М.: Медицина, 2012. 199 с.

3. Фадеев С.Б. Хирургическая инфекция мягких тканей второго уровня, особенности этиотропной терапии: автореф. дисс.... докт. мед. наук. Оренбург, 2010. 38 с.

4. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптоза клеток крови// Лабораторная медицина. 2001. №4. С. 47-54.

5. Некоторые иммуногистохимические особенности мелано-цитарных образований кожи / И.А. Новикова, Н.А. Максимова, В.В. Позднякова, М.И. Максимова, М.Г. Ильченко, Е.П. Ульянова, А.О. Гранкина // Современные проблемы науки и образования. 2016. № 5. С. 22.

6. Лазукин А.В. Фактор пролиферации Ki-67 как показатель прогноза при раке молочной железы // Российский биотерапевтический журнал. 2014. Т. 13. №2. С. 29 — 34.

7. BowlerP.G., DuerdenB.I.,Armstrong D.G.Wound Microbiology and Associatend Approaches to Wound Management // ClinMicrobiol Rev. 2001. Vol. 14. №2. P. 244-269.

8. Cunha B.A. Antibiotic selection for diabetic foot infections a review // J Foot Ankle Surg.2000.Vol. 39, №4.P. 253-257.