Биосенсор для индикации биологических частиц

Полезная модель относится к биосенсору для индикации мелкодисперсных частиц (МЧ) нано- и микронного размера в суспензии: белков, вирусов, бактерий и может быть использовано в области медицины, вирусологии, микробиологии, биотехнологии, токсикологии, биологии.
Предшествующий уровень техники
Современные биосенсоры, изготовленные по технологии КНИ (кремний на изоляторе) позволяют выполнять детекцию широкого спектра низко- и высокомолекулярных соединений. Основным их преимуществом является совместимость изготовления со стандартной КМОП-технологией (КМОП-комплементарных металлоксидных полупроводников). Это превращает биосенсоры в универсальную платформу для крупносерийного или даже массового производства высокочувствительных систем детекции и диагностики заболеваний.
В основе конструкции биосенсора КНИ используется полевой транзистор с изолированным затвором. Технология изготовления полупроводниковых приборов КНИ, основанная на использовании трехслойной подложки со структурой кремний-диэлектрик-кремний вместо обычно применяемых монолитных кремниевых пластин. Принцип действия биосенсора основан на регистрации модуляции тока, протекающего в цепи исток-сток в процессе адсорбции на поверхности затвора транзистора искомых молекул аналита (вирусов, бактерий, клеток, белков, токсинов и др.). Адсорбированная молекула на разделе фаз в системе электролит-затвор "открывает" собственные электрические заряды. Появление указанных зарядов и связанных с ними электрических полей на разделе фаз является фундаментальным феноменом. Они объединены с пространственной структурой, химическим составом, количеством вещества, а следовательно, определяют их физико-химические свойства в конкретной системе электролит-затвор (Фейнман Р., Лейтон Р., Сэндс М. Фейнмановские лекции по физике. Электричество и магнетизм. Т. 5. М.: Мир, 1977. 300 с. ) [1]. Из сказанного следует свойства системы электролит-затвор является важным фактором в конструкции и эффективности работы биосенсора.
В настоящее время разработка методов и систем экспресс детекции на основе КНИ биосенсоров ведется в направлении улучшении характеристик эксплуатации, простоты методических процедур, минимизации материальных и временных затрат, использование персонала среднего звена, а также доступности широкого круга пользователей. Разработчики и конструкторы исходя из опыта эксплуатации устраняют недостатки в известных биосенсорах.
Известен высокочувствительный аналитический датчик - полевой транзистор с изолированным затвором, изготовленный по технологии кремний на изоляторе (Naumova O.V., Fomin B.I. Interface-State Density in SOI-FET Sensors // WSEAS Transaction on System and Control. - 2018. - V. 13. - pp. 514-519.) [2]. Датчик используется для качественного и количественного анализа биологических и химических веществ, фиг. 1. В этой статье (стр. 516) приведена схема поперечного сечения системы сенсор/электролит. Из этой схемы следует, что в устройстве используется специальный отдельный Pt-электрод заземления, который подключает потенциал исследуемого электролита (electrolyte) к "земле" конструктивно располагаясь "сверху" над исследуемой суспензией.
Известно применение полевого транзистора для обнаружения белка р53. В этой же статье [2, стр. 515] приводится принципиальная схема биочипа обнаружения. На схеме представлен заземляющий электрод RE, который выполняет абсолютно аналогичную функцию отдельного Pt-электрода. Он контролирует потенциал электролита, как и в предыдущем варианте, располагаясь конструктивно "сверху".
Известен биосенсор, представленный в работе (Jeho Parka, Hoang Hiep Nguyena, Abdela Woubitc, and Moonil Kima Applications of Field-Effect Transistor (FET)-Type Biosensors // Applied Science and Convergence Technology. - 2014. - Vol.23, No. 2. - pp. 61-71. http://dx.doi.org/10.5757/ASCT.2014.23.2.61) [3]. Конструкция детектора предусматривает также заземляющий электрод Pt, который контролирует потенциал электролита в измерительной ячейке и погружается в него по принципу "сверху". Схема детектора включает мешалку, электрод Pt, измерительную ячейку, чип датчика из нанопроволок на основе кремния на изоляторе, держатель чипа, держатель измерительной ячейки, перистальтический насос, контейнер для отходов, десятиканальная система сбора и хранения данных.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является биосенсор для индикации биопатогенов (патент РФ №2774307, МПК G01N 27/14; B82Y 15/00, опубл. 17.06.2022 г. ). Биосенсор для индикации биопатогенов включает кристалл кремния в виде подложки, на котором расположены проводящие электроды, представляющие собой исток и первый сток транзистора, чувствительный элемент, представляющий собой первый нанопровод, выполненный в тонкопленочной структуре кремний-на-изоляторе на кремниевой подложке и размещенный между двумя проводящими электродами истока и стока с образованием канала транзистора, диэлектрические покрытия, обеспечивающие изоляцию проводящих электродов. По обе стороны нанопровода установлены пара латеральных электродов для диэлектрофоретического концентрирования вирусных частиц, расположенных с зазором относительно указанного нанопровода и с осевым смещением относительно друг друга. Электрическая схема КНИ-НП транзистора указанного биосенсора вместе с подложкой из кристалла кремния содержит индуцированный канал проводимости (подзатвор) транзистора, расположенный под нанопроводом (затвором) транзистора и заземляющий референс-электрод конструктивно расположенный "сверху" над исследуемой суспензией.
Однако в выше приведенных, аналогах и прототипе расположение заземляющих электродов RE или Pt в биочипах по принципу их расположения над поверхностью исследуемой суспензии имеет ряд недостатков:
- ручная установка электрода над поверхностью биосенсора является сложной процедурой, требующей определенных навыков и высокой квалификации со стороны оператора. Сложность определятся миллиметровыми размерами кристалла биосенсора, а также небольшим объемом исследуемой суспензии;
3
- последующее ручное введение электрода внутрь объема капли является следующей еще более сложной процедурой, требующей более высоких навыков и квалификации со стороны оператора: например, ручная установка электрода по глубине капли с объемом 2 мкм исследуемой суспензии может приводить к неконтролируемому механическому контакту электрода с поверхностью биосенсора, появлению царапин и, как следствие, полному или частичному выходу биосенсора из строя;
- применение дополнительного автоматизированного устройства для позиционного раскапывания исследуемой суспензии на поверхность биосенсора приведет к значительному удорожанию и усложнению устройства детекции.
Техническим результатом заявляемой полезной модели является повышение надежности работы биосенсора и упрощение его эксплуатации.
Указанный технический результат достигается тем, что биосенсор для индикации биологических частиц, включающий кристалл кремния в виде подложки, на котором расположены проводящие электроды, представляющие собой исток и сток транзистора, чувствительный элемент, представляющий собой нанопровод, выполненный в тонкопленочной структуре кремний-на-изоляторе на кремниевой подложке и размещенный между двумя проводящими электродами истока и стока с образованием канала транзистора, защитные диэлектрические покрытия из SiO, расположенные соответственно на поверхности истока и стока и обеспечивающие изоляцию указанных проводящих электродов. На кремневой подложке между истоком и стоком расположены две площадки электродов заземления, имеющие участки без изоляции для обеспечения возможности электрического контакта снизу с исследуемым образцом суспензии жидкости.
ds
Полезная модель иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлена схема биосенсора в разрезе. На фиг. 2 приведена топология микросхемы, в которой установлен заявляемый биосенсор с двумя отдельными площадками заземления. На фиг. 3 представлен заявляемый биосенсор в корпусе микросхемы с каплей исследуемого электролита, накрывающей контактные площадки заземления. Внутри круга прозрачная капля суспензии электролита. На фиг. 4 представлены амплитудные изменения величины тока I биосенсора в реакции «тропонин I+аптамер».
Биосенсор для индикации биологических частиц 1 включает кристалл кремния в виде подложки 2, на котором расположены проводящие электроды, представляющие собой исток 3 и сток 4 транзистора, чувствительный элемент, представляющий собой нанопровод 5 (затвор), выполненный в тонкопленочной структуре кремний-на-изоляторе на кремниевой подложке 2 и размещенный между двумя проводящими электродами истока 3 и стока 4 с образованием индуцированного канала 6 проводимости (подзатвора) транзистора, расположенного под нанопроводом 5 (затвором) транзистора, защитные диэлектрические покрытия 7 и 8 из SiO, расположенные соответственно на поверхности истока 3 и стока 4 и обеспечивающие изоляцию указанных проводящих электродов. На кремневой подложке 2 между истоком 3 и стоком 4 расположены площадки 9 и 10 электродов заземления, имеющие участки 11 и 12 без изоляции для обеспечения возможности электрического контакта с исследуемым образцом 13 суспензии жидкости. Кроме того, биосенсор содержит:
- регулируемый источник 14 постоянного напряжения в интервале U=0-20 вольт для индуцированного канала 6 проводимости (подзатвора);
- источник 15 постоянного напряжения U=0,15B, подключенный в цепи сток-исток; клемма плюс этого источника подключается через регистрирующее устройство 16 (амперметр) ко всем стокам;
- типовые контактные площадки 17, 18 транзисторов биосенсора, которые необходимы для подключения кристалла 2 (подложки) кремния к контактам корпуса 19 микросхемы (фиг.2, 3);
- контактную площадку 20 канала 6 проводимости (подзатвора);
21 - типовую контактную площадку общего истока для первой и второй группы из 20 транзисторов.
Кристалл 2 биосенсора в корпусе микросхемы и капля 13 электролита, накрывающая контактные площадки 11,12 заземления представлены на Фиг. 3. Нижняя сторона кристалла 2 биосенсора приклеивается к поверхности микросхемы клеем БФ-6.
Микроэлектроды 9, 10 заземления с двумя неизолированными контактными площадками (11 и 12) на поверхности биосенсора, позволяют:
- снизить время приведения биосенсора в рабочее состояние;
- обеспечат надежный электрический контакт объема исследуемой суспензии микрокапли 13;
- отказаться от использования отдельных выносных электродов типа RE, Pt - 2 и операционной процедуры введение их в исследуемую каплю по принципу "сверху" за счет использования двух электродов 9, 10 в топологии кристалла для заземления исследуемой суспензии на поверхности нанопровода 5 по принципу "снизу";
- увеличить срок службы кристалла биосенсора за счет исключения образования царапин на поверхности кристалла биосенсора и выхода его из строя.
Пример.
si
В эксперименте использовался заявляемый биосенсор, изготовленный на производственной базе акционерного общества Новосибирского завода полупроводников, в конструкции которого вводились два заземляющих электрода в виде двух отдельных контактных площадок (9, 10). Рисунок топологии кристалла биосенсора с двумя отдельными проводниками в виде контакных площадок представлены на фиг. 2. Габаритные размеры кристалла 6×6 мм. Конструктивные параметры площадок составляли: толщина t=20-30 нм; длина и ширина L=2,5 мм. Габаритные размеры кристалла 6×6 мм. Массив кристалла состоит из 12 полевых транзисторов, подключен к двум общим разветвленным по поверхности кристалла электродам, выполняющих функцию истока 3 и одновременно площадками 9, 10 заземления с участками 11 и 12 без изоляции. Транзисторы изготавливались методом оптической литографии. Все транзисторы имели структуру n-p-n типа.
В эксперименте использовались:
∧исх
- Аптамер С=1 мкМ; предоставленный институтом биофизики СО РАН, г. Красноярск.
Тисх
Тропонин I, С-8,3 мкМ; предоставленный институтом биофизики СО РАН, г. Красноярск. Линейные размеры молекулы тропонина I составляют: длина L-10 нм, ширина в самом широком месте W-5 нм. Молекулы аптамера L=8,6 нм, W=4,6 нм.
2
- Буфер связывания: 0,1 М PBS, 0,15 М NaCl, 1 мМ MgCl рН=7, предоставленный институтом биофизики СО РАН, г. Красноярск.
- Дистиллированная вода, рН=5,99 и с удельной проводимостью μ=2,1 мкс см, ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, Россия.
- Кондуктометр, солеметр, термометр EC/TDS/TEMP СОМ-100, компания НМ Digital, Inc. USA.
- рН-метр Ohaus Corporation. Starter ST2100-B, USA.
- Дозатор пипеточный одноканальный Лайт ДПОП-1-1-10 мкл, Thermo Fisher Scientific, США.
- Дозатор пипеточный одноканальный ДПА 100-1000 мкл, Thermo Fisher Scientific, США.
- Планшеты культуральные с крышкой, 96 лунок, плоское дно, стерильные, Techno Plastic Products AG, Швейцария.
Непосредственно перед проведением экспериментов готовили рабочие разведения тропонина I и аптамера.
АПТ
-8
Подготовка аптамера заключалась в проведение фолдинга. Для этого суспензию нагревали до 90-95°С в течение 5 минут, а затем охлаждали при комнатной температуре. Исходное количество С=10 М аптамера разводили в 100 раз однократно дистиллированной водой.
Тисх
Один микролитр исходный количество С=8,3 мкМ тропонина I разводили в первой пробирке с фосфатным буфером связывания в отношении 1:100.
11
10
9
8
8
Далее в 96 луночном планшете осуществляли пробоподготовку четырех его рабочих проб. Изначально, во все четыре лунки планшета добавляли по 90 мкл дистиллированной воды. Далее в первую лунку из четырех вносили 10 мкл тропонина I из пробирки. Во вторую лунку вносилось 10 мкл суспензии из первой. В третью вносилось 10 мкл суспензии из второй и т.д. Таким образом в каждой последующих лунках количество тропонина I уменьшали в 10 раз. В итоге для реализации примера использовали следующие конечные концентрации тропонина I: 5⋅10 шт, 5⋅10 шт, 5⋅10 шт, 5⋅10 шт. Пробы вносились последовательно от наименьшего разведения к большему. Из лунки с разведением 5⋅10 шт 5 микролитов суспензии тропонина I наносили на нанопровод 5 биосенсора.
В эксперименте расчетное количество последовательного увеличения молекул тропонина на поверхности нанопровода 5 составляло:
в первой пробе
1,8Е+02 шт.
во второй пробе
1,8Е+03 шт.
третьей пробе
8Е+04 шт.
в четвертой пробе
18Е+04 шт.
Методически процесс индикации строился на использовании силы Ван-дер-Ваальса связывания молекул тропонина I с поверхностью нанопровода 5.
ds
Амплитудные изменения величины тока I биосенсора в ответ на внесение на его поверхность суспензии аптамера и следом суспензии тропонина I представлены на Фиг. 4.
ds
На временной оси (абсцисс) наблюдаются следующие изменения величины тока I транзистора:
-отсчет 0 - включение транзистора и небольшой дрейф начального тока транзистора в диапазоне 2,1-2,2 Е-7 [А]. Режим холостого хода. На затворе (нанопровод 5) отсутствует какая-либо исследуемая суспензия;
- отсчет 1,1 - незначительное уменьшение тока транзистора в ответ на ручную регулировку напряжения на индуцируемом канале 6 (подзатворе) в режиме холостого хода;
- отсчет 2,2 - внесение 5 мкл суспензии аптамера на поверхность кристалла (нанопровод 5). Наблюдается резкое увеличение тока транзистора от 2,2 Е-7 до 3,0 Е-7 [А] в ответ на внесение суспензии аптамера разведенного в 100 раз дистиллированной водой. Реакция возможна если на затвор транзистора и известной структурой n-p-n типа воздействует положительный электрический заряд. Аптамер имеет положительный заряд в условиях эксперимента на разделе фаз: нанопровод 5 - исследуемый электролит.
- отсчет в интервале 2,2-4,5. Наблюдается небольшой дрейф тока стока транзистора;
- отсчет 4,5. Внесение 5 мкл суспензии тропонина I из первой пробы (с минимальным его содержанием) на поверхность кристалла (нанопроволоку). Наблюдается резкое уменьшение тока транзистора. Величина тока упала от 3,0Е-7 до 5,0Е-7 [А] в результате специфической реакции аптамер+тропонин. Реакция возможна если на затвор транзистора с известной структурой n-р-n типа воздействует отрицательный электрический заряд. Комплекс аптамер+тропонин имеет отрицательный заряд.
- в интервале отсчетов 4,6-5,8 наблюдается незначительное изменение амплитуды тока стока транзистора в ответ на внесение суспензии тропонина из второй пробы. Незначительные изменения тока транзистора связаны и с воздействием на нанопровод 5 вновь образованных комплексов аптамер+тропонин. Комплексы имеет отрицательный заряд. Кроме того, транзистор близок к режиму отсечки (режим полного закрытия), чувствительность транзистора низкая.
- в интервале отсчетов 5,8-8,3 наблюдается процесс стабилизации тока стока транзистора в ответ на дополнительное внесение тропонина из третьего разведения (3 лунка на планшете) специфическую реакцию аптамер+тропонин. Транзистор находится в режиме отсечки (закрыт полностью). Реакция транзистора на внешние изменения заряда на поверхности нанопровода 5 (затвора) отсутствует.
ds
Амплитудные изменения величины тока I биосенсора в реакции «тропонин I+аптамер» представлены на Фиг. 4.
Выше описанный эксперимент подтверждает работоспособность конструкции заявляемого биосенсора с двумя заземляющими электродами, расположенными «снизу» и обеспечивает достижение заявляемый технический результат: повышение надежности работы заявляемого биосенсора и упрощение его эксплуатации.