Производные 7-гидроксикумарина, содержащие остатки монотерпеноидов, как ингибиторы репродукции респираторно-синцитиального вируса (РСВ)
DERIVATIVES OF 7-HYDROXYCOUMARIN CONTAINING MONOTERPENOID RESIDUES AS INHIBITORS OF RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (RSV) REPRODUCTION

Изобретение относится к медицине и фармацевтике, а именно к лекарственным средствам, обладающим антивирусным действием против респираторно-синцитиального вируса (РСВ).
Pneumoviridae
РСВ, принадлежащий к семейству , представляет собой оболочечный РНК-вирус, имеющий два основных серотипа A и B [1]. РСВ поражает дыхательные пути, вызывая ежегодные эпидемии в холодное время года. Несмотря на относительно невысокую изменчивость данного вируса, иммунитет к нему формируется нестойкий, вследствие чего возможно многократное инфицирование одного и того же человека в течение жизни. Обычно он вызывает простуду. Принципиально другая картина развития респираторно-синцитиальной инфекции наблюдается у пациентов в возрасте до 2 лет, особенно у недоношенных младенцев или детей с пороком сердца, а также пожилых людей [2-4]. Для этих возрастных категорий характерно поражение не только верхних, но и нижних дыхательных путей с развитием тяжелых бронхиолитов и пневмоний, вплоть до летального исхода. РСВ является наиболее частой причиной бронхита и пневмонии у детей в возрасте до одного года [5]. Предполагается, что количество детей, погибающих от этого заболевания, составляет до 200 тысяч ежегодно [6].
Вакцины от РСВ не существует, терапия респираторно-синцитиальной инфекции, как правило, симптоматическая. Практически единственным вариантом является лечение неспецифическим и малоэффективным противовирусным средством рибавирином [7, 8]. Кроме того, для профилактического применения используется моноклональное антитело Паливизумаб, но оно дорого, демонстрирует лишь умеренную эффективность в снижении частоты госпитализаций и не допущено к использованию в России. Таким образом, поиск низкомолекулярных препаратов против РСВ является важной задачей.
1
2
Поставленная задача решается применением в качестве противовирусных средств производных 7-гидроксикумарина общей формулы  и , включая их пространственные изомеры, в том числе оптически активные формы:
1
3
где R может быть Н или CH, n=1 или 2, m может быть от 1 до 4.
1
2
3
4
Фиг. 1
Целевые соединения общей формулы  и могут быть получены взаимодействием 7-гидроксикумарина и его производных общей формулы или  с соответствующими галогенидами, например, бромидами, синтезированными из монотерпеноидов ().
Фиг. 2
Синтез бромидов, содержащих остатки монотерпеноидов, может быть осуществлен исходя из соответствующих спиртов взаимодействием с бромирующими агентами, например, как показано на .
Для получения других оптических изомеров можно использовать другие энантиомеры стартовых монотерпеноидов.
50
50
50
50
На первой стадии биологических экспериментов определяли 50% цитотоксическую дозу (CC) каждого препарата в культуре клеток HEp2. Далее оценивали противовирусную активность каждого препарата и определяли 50% ингибирующую концентрацию (IC), а также вычисляли химиотерапевтический индекс (SI) – отношение CC к IC. Это соотношение отражает эффективность исследуемого соединения как противовирусного средства. Принято считать, что соединения, SI которых превышает 10, проявляют противовирусную активность. Полученные данные сравнивали с соответствующими показателями рибавирина.
1
2
2в
2д
50
Исследования биологической активности соединений  и показали их высокую эффективность как ингибиторов репродукции РСВ (Таблица). Наиболее активные соединения  и  ингибируют репродукцию обоих серотипов РС вируса с IC в субмикромолярном диапазоне, в десятки раз превосходя по активности препарат сравнения рибавирин. В целом, значения активности против РС-вируса типа В не отличались от данных, полученных при использовании РС-вируса типа А, что свидетельствует об отсутствии типоспецифичности в противовирусной активности этих веществ.
1
2
Таблица. Результаты тестирования соединений общей формулы  и  в отношении РСВ A и B
Соединение
R
CC<sub>50</sub>, µM
РСВ A
РСВ B
IC<sub>50</sub>, µM
SI
IC<sub>50</sub>, µM
SI
<b>1а</b>
<img file="00000002.jpg" he="33" wi="86" img-content="undefined" img-format="jpg" />
307.1±34.6
27.0±1.8
11.4
18.5±0.9
16.8
<b>1б</b>
<img file="00000003.jpg" he="25" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" />
121.1±24.5
2.5±0.87
64.6
-
-
<b>1в</b>
<img file="00000004.jpg" he="30" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" />
483.4±23.6
46.7±8.7
10.3
52.4±3.4
9.2
<b>1г</b>
<img file="00000005.jpg" he="41" wi="86" img-content="undefined" img-format="jpg" />
116±23.6
1.3±0.75
90
4.7±0.9
24.7
<b>1д</b>
<img file="00000006.jpg" he="41" wi="86" img-content="undefined" img-format="jpg" />
795.7±28.9
29.0±3.2
27.4
241±41
3.3
<b>1е</b>
<img file="00000007.jpg" he="32" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" />
658.2±54.6
13.9±1.6
62.1
20.1±3.2
32.7
<b>2а</b>
<img file="00000008.jpg" he="42" wi="86" img-content="undefined" img-format="jpg" />
416.2±32.9
4.1±0.78
100
5.1±1.0
81.6
<b>2б</b>
<img file="00000009.jpg" he="33" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" />
66.7±23.1
4.1±0.7
18.3
24.7±5.3
2.7
<b>2в</b>
<img file="00000010.jpg" he="35" wi="108" img-content="undefined" img-format="jpg" />
51.1±11.3
0.57±0.2
90
0.6±0.1
85.2
<b>2г</b>
<img file="00000011.jpg" he="45" wi="86" img-content="undefined" img-format="jpg" />
379.5±29.4
5.1±1.1
77
4.9±0.6
78.2
<b>2д</b>
<img file="00000012.jpg" he="35" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" />
21.9±11.8
0.6±0.13
40
0.82±0.1
26.7
<b>2е</b>
<img file="00000013.jpg" he="36" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" />
718.4±21.9
15.3±1.8
57.9
8.2±0.83
88.1
Рибавирин
4095
31.1±6.7
131.6
54.5±5.9
75.1
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.
1а, б, е
2б, е
Общая методика синтеза соединений  и
8
9
10
3
4
1а, б, е
2б, е
2
4
2
К 1.0 ммоль бромида , или в 5 мл диметилформамида прибавили 0.75 ммоль соединения  или  и 2.0 ммоль 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) и при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Добавили 15 мл воды и 5 мл этилацетата. Этилацетатный слой отделили, водный – экстрагировали этилацетатом (2×5 мл), объединенный экстракт промыли водой и высушили NaSO, упарили. Продукт или выделили кристаллизацией из этанола или хроматографией на SiO.
Пример 2.
1а
S
R
H
Синтез 7-(((1,5)-6,6-Диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-2-хромен-2-она.
1а
8
3а
1а
2
Соединение  получили взаимодействием бромида  и кумарина по методике, приведенной в примере 1. Продукт  выделили хроматографией на SiO, выход составил 53%.
пл
c
1
13
Т 59°C. =+38.7 (=0.46, EtOH). ЯМР Н и С соответствуют опубликованным [9].
Пример 3.
1б
R
S
H
Синтез 7-(4-((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)бутокси)-2-хромен-2-она .
1б
10
3а
1б
2
Соединениеполучили взаимодействием бромида  и кумарина по методике, приведенной в примере 1. Продукт  выделили хроматографией на SiO, выход составил 80%.
c
3
22
25
3
3
H
3
20sin,17
20sin,19
sin
10,11
3,4
9,7
7,6
7.9
6.7
4,3
3
C
+
+
1
2
2
2
2
13
=-9.0 (=1.78, CHCl). Найдено: m/z=337.1793 ([M-1H] (CHO). Вычислено: 337.1798). ЯМР Н (CDCl, δ): 0.80 (с, 3H, 3H-C(22)); 1.11 (д, 1H, J=8.5, Hanti-C(20)); 1.24 (с, 3H, CH-C(21)); 1.42-1.56 (м, 2H, 2H-C(12)); 1.74-1.81 (м, 2H, 2H-C(11)); 1.95-2.02 (м, 3H, 2H-C(13)), 1H-C(19)); 2.02-2.08 (м, 1H, H-C(17)); 2.15 (дм, 1H, J=17.4, H-C(16)); 2.22  (дм, 1H, J=17.4, H'-C(16)); 2.32 (ддд, 1H, J=8.5, J=J=5.6, H-C(20)); 3.98 (т, 2H, J =6.5, 2H-C(10)); 5.16-5.20 (м, 1H, H-C(15)); 6.20 (д, 1H, J=9.5, H-C(3)); 6.76 (д, 1H, J=2.4, H-C(9)); 6.79 (дд, 1H, J=8.6, J=2.4, H-C(7)); 7.32 (д, 1H, J=8.6, H-C(6)); 7.59 (д, 1H, J=9.5, H-C(4)). ЯМР С (CDCl, δ): 155.77 (с, C(1)); 161.07 (с, C(2)); 112.74 (д, C(3)); 143.26 (д, C(4)); 112.22 (с, C(5)); 128.53 (д, C(6)); 112.79 (д, C(7)); 162.26 (с, C(8)); 101.21 (д, C(9)); 68.38 (т, C(10)); 28.56 (т, C(11)); 23.32 (т, C(12)); 36.31 (т, C(13)); 147.68 (с, C(14)); 116.14 (д, C(15)); 31.12 (т, C(16)); 40.73 (д, C(17)); 37.78 (с, C(18)); 45.60 (д, C(19)); 31.52 (т, C(20)); 26.19 (к, C(21)); 21.05 (к, C(22)).
Пример 4.
1е
R
S
H
Синтез 7-(4-((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)бутокси)-4-метил-2-хромен-2-она.
1е
10
3б
1е
Соединение получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 1. Продукт  выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 24%.
пл
3
23
27
3
3
H
anti
21s,18
21s,20
sin
10,3
11,12
3,10
9,7
7,6
7,9
6,7
3
C
c
+
+
1
2
2
2
2
13
Т 77°C. =-20.3 (=0.60, CHCl). Найдено: m/z=351.1954 ([M-1H] (CHO). Вычислено: 351.1955).ЯМР Н (CDCl, δ): 0.81 (с, 3H-C(23)); 1.11 (д, 1H, J=8.5, H -C(21)); 1,24 (с, 3H-C(22)); 1.43-1.57 (м, 2H, 2H-C(13)); 1.74-1.82 (м, 2H, 2H-C(12)); 1.96-2.02  (м, 3H, 2H-C(14)), 1H-C(20)); 2.03-2.08 (м, 1H, H-C(18));  2.16 (дм, 1H, J=17.5, H-C(17)); 2.23 (дм, 1H, J=17.5, H'-C(17)); 2.33 (ддд, 1H, J=8.5, J=J=5.6, H-C(21)); 2.37 (д, 3H, J=1,2, 3H-C(10)); 3.98 (т, 2H, J=6.5, 2H-C(11));  5.16-5.20 (м, 1H, H-C(16)); 6.10 (к, 1H, J=1.2, H-C(3)); 6.77 (д, 1H, J=2.5, H-C(9)); 6.82 (дд, 1H, J=8.8, J=2.5, H-C(7)); 7.45 (д, 1H, J=8.8, H-C(6)). ЯМР С (CDCl, δ): 155.14 (с, C(1)); 161.25 (с, C(2)); 111.65 (д, C(3)); 152.46 (с, C(4)); 113.24 (с, C(5)); 125.31 (д, C(6)); 112.53 (д, C(7)); 162.06 (с, C(8)); 101.18 (д, C(9)); 18.55 (к, C(10)); 68.33  (т, C(11)); 28.59 (т, C(12)); 23.33 (т, C(13); 36.35 (т, C(14)); 147.70 (с, C(15)); 116.13 (д, C(16)); 31.12 (т, C(17)); 40.70 (д, C(18)); 37.80 (с, C(19)); 45.55 (д, C(20)); 31.54 (т, C(21)); 26.20 (к, C(22)); 21.07 (к, C(23)).
Пример 5.
2б
R
S
c
H
Синтез 7-(3-((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)пропокси)-2,3-дигидроциклопента[]хромен-4(1)-она.
2б
9
4а
2б
Соединение получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 1. Продукт  выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 47%.
пл
3
24
28
3
3
H
21.19
21,22sin
21,17
22s,19
22s,21
sin
13,14
3
C
c
+
+
1
2
2
2
13
Т 68°C. =-18.6 (=0.88, CHCl). Найдено: m/z=364.2038 ([M] (CHO). Вычислено: 364.2033). ЯМР Н(CDCl, δ): 0.81 (с, 3H-C(24)); 1.12 (д, 1H, J=8.5, Hanti-C(22)); 1.25 (с, 3H-C(23)); 1.77-1.90 (м, 2H, 2H-C(14)); 2.01 (ддд, 1 H, J=J5.6, J=1.4, H-C(21)); 2.04-2.12 (м, 3H, 2H-C(15), 1H-C(19)); 2.13-2.19 (м, 3H, 2H-C(11), 1H-C(18)); 2.23 (дм, 1H, J=17.6, H'-C(18)); 2.34 (ддд, 1H, J=8.5, J=J=5.6, H-C(22)); 2.83-2.88 (м, 2H, 2H-C(10)); 2.98-3.03 (м, 2H, 2H-C(12)); 3.96 (т, 2H, J=6.5, 2H-C(13)); 5.19-5.23 (м, 1H, H-C(17)); 6.78-6.82 (м, 2H,H-C(7), H-C(9)); 7.27-7.32 (м, 1H, H-C(6)). ЯМРC (CDCl, δ): 155.64 (с, C(1)); 160.46 (с, C(2)); 124.16 (с, C(3)); 156.28 (с, C(4)); 112.11 (с, C(5)); 125.38 (д, C(6)); 112.45 (д, C(7)); 161.43 (с, C(8)); 101.10 (д, C(9)); 30.20 (т, C(10)); 22.43 (т, C(11)); 31.90 (т, C(12)); 68.04 (т, C(13)); 26.50 (т, C(14)); 32.90 (т, C(15)); 146.99 (с, C(16)); 116.59 (д, C(17)); 31.12 (т, C(18)); 40.68 (д, C(19)); 37.81 (с, C(20)); 45.59 (д, C(21)); 31.56 (т, C(22)); 26.17 (к, C(23)); 21.05 (к, C(24)).
Пример 6.
2е
R
S
H
c
Синтез 3-(4-((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)бутокси)-7,8,9,10-тетрагидро-6-бензо[]хромен-6-она.
2е
10
4б
2е
Соединение получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 1. Продукт  выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 36%.
пл
3
26
31
3
3
H
24sin,21
24sin,23
sin
14,15
9,7
7,6
7,9
6,7
3
C
c
+
+
1
2
2
2
2
13
Т 69°C. =-17.6 (=0.90, CHCl). Найдено: m/z=391.2265 ([M-1H] (CHO). Вычислено: 391.2268). ЯМР Н (CDCl, δ): 0.81 (с, 3H-C(26)); 1.11 (д, 1H, J=8.5, Hanti-C(24)); 1.24 (с, 3H-C(25)); 1.42-1.56 (м, 2H, 2H-C(16)); 1.73-1.86 (м, 6H, 2H-C(11), 2H-C(12), 2H-C(15)); 1.95-2.02 (м, 3H, 2H-C(17),  H-C(23)); 2.02-2.08 (м, 1H, H-C(21));  2.16 (дм, 1H, J=17.4, H-C(20)); 2.22 (дм, 1H, J=17.4, H'-C(20)); 2.33 (ддд, 1H, J=8.5, J=J=5.6, H-C(24)); 2.49-2.55 (м, 2H, 2H-C(10));)); 2.68-2.75 (м, 2H, 2H-C(13)); 3.96 (т, 2H, J=6.5, 2H-C(14)); 5.16-5.20 (м, 1H, H-C(19)); 6.75 (д, 1H, J=2.5, H-C(9)); 6.79 (дд, 1H, J= 8.8, J=2.5, H-C(7)); 7.41 (д, 1H, J=8.8, H-C(6)). ЯМР С (CDCl, δ): 153.36 (с, C(1)); 162.10 (с, C(2)); 120.19 (с, C(3)); 147.19 (с, C(4)); 113.42 (с, C(5)); 123.89 (д, C(6)); 112.19 (д, C(7)); 160.82 (с, C(8)); 100.95 (д, C(9)); 23.68 (т, C(10)); 21.56 (т, C(11)); 21.25 (т, C(12)); 25.08 (т, C(13)); 68.20 (т, C(14)); 28.64 (т, C(15)); 23.35 (т, C(16)); 36.37(т, C(17)); 147.74 (с, C(18)); 116.09 (д, C(19)); 31.12 (т, C(20)); 40.70 (д, C(21)); 37.80 (с, C(22)); 45.55 (д, C(23)); 31.54 (т, C(24)); 26.20 (к, C(25)), 21.07 (к, C(26)).
Пример 7
1в-д
2а,в-д
. Общая методика синтеза соединений  и .
3
4
5
6
8
1в-д
2а, в-д
2
3
2
К 0.50 ммоль соединения  или  в 5 мл этанола прибавили 0.75 ммоль KCO и 0.75 ммоль бромида , , 7 или  при 25°С и перемешивании. Перемешивали при комнатной температуре 15 минут, затем нагревали при 60°С в течение 5 часов. Горячий раствор отфильтровали, фильтрат выдерживали при -10°С в течение 48 часов. Продукт  или  выделили кристаллизацией из этанола или хроматографией на SiO.
Пример 8
1в
E
H
. Синтез ()-7-(3,7-диметилокта-2,6-диенилокси)-4-метил-2-хромен-2-она.
1в
5
3б
1в
2
Соединение  получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 7. Продукт  выделили хроматографией на SiO, выход составил 47%.
пл
1
13
Т=54°C. ЯМР Н и С соответствуют опубликованным [9].
Пример 9
1г
S
R
H
. Синтез 7-(((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-метил-2-хромен-2-она.
1г
8
3б
1г
2
Соединение получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 7. Продукт  выделили хроматографией на SiO, выход составил 30%.
пл
c
1
13
Т=85°C. =+36 (=0.8, EtOH). ЯМР Н и С соответствуют опубликованным [10].
Пример 10
1д
R
S
H
. Синтез 7-(((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-4-метил-2-хромен-2-она.
1д
6
3б
1д
2
Соединениеполучиливзаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 7. Продукт  выделили хроматографией на SiO, выход составил 54%.
пл=
c
1
13
Т70°C. =-36 (=0.8, EtOH). ЯМР Н и С соответствуют опубликованным [10].
Пример 11
2а
S
R
c
H
. Синтез 7-(((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-2,3-дигидроциклопента[]хромен-4(1)-она.
2а
8
4а
2а
Соединение получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 7. Продукт  выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 55%.
пл
c
1
13
Т=140°C, =+27.6 (=0.65, EtOH). ЯМР Н и С соответствуют опубликованным [10].
Пример 12
2в
E
H
c
. Синтез ()-3-(3,7-диметилокта-2,6-диенокси)-7,8,9,10-тетрагидро-6-бензо[]хромен-6-она .
2в
5
4б
2в
2
Соединение  получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 7. Продукт  выделили хроматографией на SiO, выход составил 53%.
пл
1
13
Т=62 °C. ЯМР Н и С соответствуют опубликованным [9].
Пример 13
2г
S
R
H
c
. Синтез 3-(((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)метокси)-7,8,9,10-тетрагидро-6-бензо[]хромен-6-она.
2г
8
4б
2г
Соединение  получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 7. Продукт  выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 38%.
пл
c
1
13
Т=105°C. =+32.6 (=0.65, EtOH). ЯМР Н и С соответствуют опубликованным [10].
Пример 14
2д
R
S
H
c
. Синтез 3-(2-((1,5)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2-ен-2-ил)этокси)-7,8,9,10-тетрагидро-6-бензо[]хромен-6-она.
2д
7
4б
2д
Соединение  получили взаимодействием бромида  и кумарина  по методике, приведенной в примере 7. Продукт  выделили кристаллизацией из этанола, выход составил 32%.
пл
c
1
13
Т=120°C. =-12.7 (=0.55, EtOH). ЯМР Н и С соответствуют опубликованным [10].
Пример 15.
1
2
Изучение цитотоксичности соединений и .
Препараты взвешивали в количестве 2 мг и растворяли в 100 мкл ДМСО. Далее доводили полученный раствор средой до концентрации 1000 мкг/мл, и готовили из него серию 2-кратных разведений.
5
2
Односуточную культуру клеток HEp2, выращенную на 96-луночных планшетах, концентрация клеток 3*10/лунку планшета, проверяли визуально в инвертированном микроскопе на целостность монослоя. В работу отбирали планшеты, где сомкнутость клеток составляла 60-80%. В планшет вносили разведения препаратов в соответствующей концентрации в объеме 100 мкл в каждую лунку в 2 повторах на каждую тестируемую концентрацию. Планшеты инкубировали 24 часа при температуре 37°С в присутствии 5% СО.
2
Оценка жизнеспособности клеток велась при помощи микротетразолиевого теста (МТТ). МТТ-тест основан на восстановлении МТТ (желтый водорастворимый тетразолиевый краситель) под действием дегидрогеназ живых клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется спектрофотометрически. Раствор МТТ готовили на поддерживающей среде в концентрации 0.5 мг/мл. Далее вносили 0.1 мл раствора МТТ в каждую лунку. После 1.5 часа контакта МТТ при 37°С при концентрации СО 5% с клетками лунки сбрасывали МТТ и заливали 0.1 мл этилового спирта 96%, после чего оптическую плотность в лунках измеряли на ридере Victor 2 1440 (Perkin Elmer, США) при длине волны 535 нм.
50
Основываясь на полученных данных, рассчитывали СС, то есть дозу препарата в лунке, при которой погибает 50% клеток.
Полученные результаты приведены в таблице.
Пример 16.
1
2
Изучение противовирусной активности соединений и .
50
2
2
Для определения противовирусной активности в отношении респираторно-синцитиального вируса готовили серию 3-кратных разведений препаратов, начиная от 1/2 СС, после чего наносили на культуру клеток НЕр-2 по 100 мкл на лунку в двойной концентрации и сразу же добавляли по 100 мкл вируса в серии 10-кратных разведений, после чего снова инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С и 5% СО, далее вирус отмывали и снова наносили препараты в одинарной концентрации и инкубировали в течение 6 суток при температуре 37°С и 5% СО.
Для проведения иммуноферментного анализа (cell-ELIZA) клеточную культуру фиксировали холодным 80%-ным ацетоном в течение 15 минут при -20°С, после чего ее промывали с помощью фосфатно-солевого буферного раствора с добавлением Tween 20 до 0.05 %. Далее на культуру наносили раствор первичных мышиных антител к белку F респираторно-синцитиального вируса, после чего инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при непрерывном перемешивании.
Далее клетки снова промывали буфером и наносили вторичные антимышиные антитела, после чего снова инкубировали в течение 2 часов при непрерывном перемешивании. Далее антитела отмывали и наносили субстрат-хромогенную смесь с тетраметилбензидином. Через 5 минут реакцию останавливали с помощью 0.1М серной кислоты и оценивали оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм. Лунки, в которых значение абсорбции превышало таковое в лунках с контролем клеток в два и более раза, считаются зараженными. Титр вируса считали по методу Рида и Менча.
Критерием оценки противовирусной активности является статистически значимое снижение титра вируса при применении препарата по сравнению с контролем.
Полученные результаты приведены в таблице.
Литература
Arch Virol.
161
2016
1. Afonso, C.L.; Amarasinghe, G.K.; Banyai K, et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. , , 2351–2360.
Science
372
2021
2. Karron, R.A. Preventing respiratory syncytial virus (RSV) disease in children. , , , 686-687.
Lancet
380
2012
3. Lozano, R.; Naghavi, M.; Foreman, K.; Lim, S.; Shibuya, K.; Aboyans, V.; et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. , , 2095-2128.
N. Engl. J. Med
352
2005
4. Falsey, A.R.; Hennessey, P.A.; Formica, M.A.; Cox, C.; Walsh, E.E. Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults. . , , 1749-1759.
J Clin Lab Anal
34,
2020
5. Huang, H.; Chen, S.; Zhang, X.; Hong, L.; Zeng, Y.; Wu, B. Detection and clinical characteristics analysis of respiratory viruses in hospitalized children with acute respiratory tract infections by a GeXP-based multiplex-PCR assay. . , e23127.
Lancet
375
2010
6. Nair, H.; Nokes, D.J.; Gessner, B.D.; Dherani, M.; Madhi, S.A.; Singleton, R.J.; O'Brien, K.L.; Roca, A.; Wright, P.F.; Bruce, N.; Chandran, A.; Theodoratou, E.; Sutanto, A.; Sedyaningsih, E.R.; Ngama, M.; Munywoki, P.K.; Kartasasmita, C.; Simoes, E.A.; Rudan, I.; Weber, M.W.; Campbell, H. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. , , 1545–1555.
Paediatr. Respir. Rev
11
2010
7. Wainwright, C. Acute viral bronchiolitis in children - a very common condition with few therapeutic options. . , , 39−45.
Clin. Infect. Dis
50
2010
8. Empey, K.M.; Peebles, R.S., Jr.; Kolls, J.K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. . , , 1258−1267.
Bioorg. Med. Chem. Lett
27
2017
9. Khomenko, T.M.; Zarubaev, V.V.; Orshanskaya, I.R.; Kadyrova, R.A.; Sannikova, V.A.; Korchagina, D.V.; Volcho, K.P.; Salakhutdinov, N.F. Anti-influenza activity of monoterpene-containing substituted coumarins. . , , 2920–2925.
Bioorg. Med. Chem
24
2016
10. Khomenko, T.; Zakharenko, A.; Odarchenko, T.; Arabshahi, H.J.; Sannikova, V.; Zakharova, O.; Korchagina, D.; Reynisson, J.; Volcho, K.; Salakhutdinov, N.; Lavrik, O. New inhibitors of tyrosyl-DNA phosphodiesterase I (Tdp 1) combining 7-hydroxycoumarin and monoterpenoid moieties. . , , 5573.