Определение теофиллина в плазме и крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

вопрос о давности каждого из повреждении черепа и внутричерепных структур и, прежде всего, возможности их образования за 70 ч и, что еще существеннее, за 255 ч до смерти потерпевшего.

Гипотетически каждое из перечисленных повреждении могло образоваться как изолированно от других, так и в комплексе с остальными в рамках одного травмирующего воздействия. Поэтому предложенные следствием версии давности ЧМТ анализировались отдельно для каждого ее компонента (перелома черепа, субдуральной гематомы и УГМ).

При первичном и повторном микроскопическом исследовании УГМ установлено отсутствие зернистых шаров и астроцитарного глиоза. Подобные изменения могли иметь место при давности УГМ равной как 70 ч, так и 255 ч. Поэтому основой выводов повторной экспертизы явилась изложенная вероятностная модель.

Примем а = 0,001 ч. Подставляя соответствующие данные в формулу (1), получаем априорные вероятности дифференцируемых версий давности УГМ:

/»(/,) = 1,051 10 5 и />(/,) = 7,687-10 7,

где ^=70 ч и £,=255 ч.

По формуле (5) вычисляем апостериорные вероятности дифференцируемых версий давности УГМ:

/> =0,931846 и Р2 =0,068154.

То есть, по данным гистологического исследования наиболее вероятной является версия образования УГМ в срок за 70 ч (с вероятностью 93,2%) до смерти пострадавшего.

Следует отметить, что изложенная диагностическая методика пригодна не только при двукратной травме головы, но и при любом другом количестве (теоретически - при бесконечном множестве) травмирующих воздействий.

Таким образом, разработанная аналитическая технология обеспечивает возможность оценки различных версий давности УГМ при многократной травме головы с контролируемой погрешностью, что способствует повышению объективности и точности применяемых в указанных целях методов гистологического исследования очагов УГМ. Полученные данные целесообразно использовать в судебно-медицинской экспертной практике для дифференциальной диагностики и объективного обоснования имеющихся версий о давности УГМ при многократной травме головы.

1.

2.

3.

Литература:

Бугаев К.А., Сафрай А.Е. О возможности установления давности возникновения ушиба мозга // Проблемы практики судебной медицины /Подред. Г.И.Заславского, В.Л. Попова. - СПб., 1997. - С. 83-86.

Недугов Г.В. Использование доверительных интервалов стадийности воспалительно-репаративной реакции при диагностике давности ушибов головного мозга // Вопросы судебной медицины и медицинского права: Сборник научных трудов, посвященный 85-летию кафедры судебной медицины Самарского государственного медицинского университета / Под ред. А.П. Ардашкина, В.В. Сергеева. - Самара: Офорт, 2006. - С. 69-73.

Недугов Г.В. Математическое моделирование качественной кинетики пато-морфологических процессов в аспекте определения их давности //Вопросы судебной медицины, медицинского права и биоэтики: Сборник научных трудов /Подред. А.П. Ардашкина, В.В. Сергеева. - Самара: Кредо, 2008. - С. 94-106.

Пашинян Г.А., Касумова С.Ю., Добровольский Г.Ф., Ромодановский П.О. Патоморфология и экспертная оценка повреждений головного мозга при черепно-мозговой травме. - М., Ижевск: Изд-во «Экспертиза», 1994. - 134 с.

ХижняковаК.И. Динамика патоморфологии черепно-мозговой травмы. - М.: Медицина, 1983. - 192 с.

Челноков B.C., Ильина Е.В. Патоморфологические изменения при черепно-мозговой травме // Суд. -мед. эксперт. - 2001. - № 1. - С. 7-9.

© А.В. Лаврентьева, А.Б. Мелентьев, 2008 УДК 340.67:615.9

А.В. Лаврентьева, А.Б. Мелентьев ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕОФИЛЛИНА В ПЛАЗМЕ И КРОВИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Челябинская областная клиническая больница

ОГУЗ “Челябинское областное бюро судебно-медицинской экспертизы” (нач. - к.м.н. Е.Ф. Швед) Описана аналитическая процедура определения теофиллина в крови и плазме с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектором, предназначенная для токсикологических анализов и терапевтического мониторинга. Процедура включает введение внутреннего стандарта (8-хлорте-офиллин), жидкостно-жидкостную экстракцию и хроматографический анализ образцов. Предел обнаружения равен 0,2 мкг/мл. Диапазон количественного определения от 5 до 200 мкг/мл. Относительная среднеквадратичная ошибка не превышают 8 % для концентраций 10 мкг/мл и 100 мкг/мл. Методика применяется для токсикологических анализов и терапевтического мониторинга.

Ключевые слова: теофиллин, токсикологический анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография.

DETERMINATION OF THEOPHYLLINE IN PLASMA AND BLOOD BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY A.V. Lavrentyeva, A.B. Melentyev Analytical procedure of determination of theophylline in blood and plasma by high performance liquid chromatography with DAD, used for toxicological analyses and therapeutic monitoring is described. Procedure includes introduction of the internal standard (8-chlorotheophylline), liquid-liquid extraction, and chromatography analysis of samples. The detection limit was 0.2 mkg / ml. A range of quantitative determination from 5 up to 200 mkg / ml. The intra-day and inter-day coefficient of variation was < 8 % for concentration of 10 mkg / ml and 100 mkg / ml. The technique is applied to toxicological analyses and therapeutic monitoring.

Key words: theophylline, the toxicological analysis, a high performance liquid chromatography.

Теофиллин (1,3-диметилксантин), алкалоид пурино- все большее клиническое применение из-за наличия

вого ряда, содержащийся в листьях чая и кофе, находит широкого спектра фармакологического действия. Тео-

филлин уменьшает сократительную активность гладкой мускулатуры. Он расширяет бронхи, кровеносные сосуды, главным образом, сосуды мозга, кожи и почек. Уменьшает легочное сосудистое сопротивление, понижает давление в малом круге кровообращения. Оказывает спазмолитическое действие в отношении к периферической венозной системе, увеличивает почечный кровоток, обладает умеренно выраженным диуретическим эффектом. Угнетает агрегацию тромбоцитов. Препарат обладает стимулирующим действием на дыхательный центр, повышает частоту и силу сердечных сокращений.

Препарат применяют при бронхиальной астме для предупреждения приступов и для систематического лечения при хронических обструктивных заболеваниях легких, хронических бронхитах, эмфиземе легких, легочных гипертензиях, расстройствах дыхания по типу Чейн-Стокса [3], а также как мочегонное средство при застойных явлениях сердечного и почечного происхождения [2].

Действие на центральную нервную систему прямо зависит от дозы введенного препарата и может проявляться усталостью, беспокойством, тремором и даже конвульсиями при относительно больших дозах [1].

Для определения степени воздействия препарата на организм при терапевтическом мониторинге или токсикологическом анализе необходимо количественное определение теофиллина в крови. Узкий интервал терапевтических концентраций в крови (10 - 15 мкг/мл), а также близость токсической концентрации (от 30 мкг/мл) [4] обуславливают актуальность терапевтического и токсического мониторинга этого препарата в крови.

Целью данной работы явилась разработка методики количественного определения теофиллина в плазме и крови с использованием в качестве внутреннего стандарта 8-хлор-теофиллина методом ВЭЖХ, предназначенной для терапевтического мониторинга и токсикологического анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оборудование. Жидкостной хроматограф с диодно-матричным детектором Agilent Technologies 1200 с колонкой Eclipse XDB-C18, длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,5 мм и размером частиц фазы C18 5мкм и проточной полумикроячейкой объемом 5 мкл для диодноматричного детектора. Встряхиватель АВУ-6, центрифуга СМ-6М, термоблок ПЭ-4030, набор пипеток-дозаторов фирмы Biohit.

Материалы и реактивы. В качестве исходного раствора анализируемого вещества использован ампули-рованный 2% раствор лекарственного препарата теофиллина производства ОАО Новосибирский химфармзавод. Использовали также порошок 8-хлортеофиллина фирмы Alfa-Aesar, н-бутанол, хлороформ, уксусную кислоту ХЧ и деионизированную воду.

Внутренний стандарт. Стандартный раствор 8-хлор-теофиллина с концентрацией 5 мг/мл готовили растворением 50 мг порошка (8-хлортеофиллина) в 5,05 мл этанола с добавлением 4,95 мл 0,1Н раствора гидроксида натрия. Рабочий раствор с концентрацией 8-хлортеофиллина 1 мг/мл готовили добавлением во флакон с 3,2 мл воды 0,8 мл стандартного раствора 8-хлортеофиллина с концентрацией 5 мг/мл.

Стандартные и калибровочные растворы. Рабочий раствор теофиллина в этаноле с концентрацией 5 мг/мл готовили добавлением во флакон 1,25 мл исходного раствора теофиллина и 3,75 мл этанола. Рабочий раствор с концентрацией теофиллина 1 мг/мл готовили добавлением во флакон 1 мл раствора теофиллина с концентрацией 5 мг/мл и 4 мл этанола. Для приготовления калибровочных растворов использовали схему, приведенную в табл. 1.

К 1 мл «холостой» крови добавлялось соответствующее количество одного из рабочих растворов (табл. 1).

Таблица 1

Приготовление образцов для построения калибровочной кривой

№ пп Название пробы Калибровочная концентрация в крови, мкг/мл Концентрация рабочего раствора, мг/мл Объём рабочего раствора на1мл крови, мкл

1 Бланк 0 0 0

2 Точка 1 5 1 5

3 Точка 2 10 1 10

4 Точка 3 30 5 6

5 Точка 4 100 5 20

6 Точка 5 200 5 40

После этого калибровочные пробы проходили все процедуры пробоподготовки и анализа. По результатам анализов калибраторов строилась калибровочная кривая.

Подготовка крови для анализа. Для исследований и отработки методики использовали плазму или трупную кровь, проверенную на отсутствие теофиллина (менее 1 мкг/мл). До анализа образцы холостой и анализируемой крови хранили в морозильной камере при температуре минус 12°С. Подготовку крови проводили по следующей методике: к аликвотной части 1 мл крови добавляли 20 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта (8-хлортеофиллина с концентрацией 1 мкг/мл), 1 мл 1Н раствора дигидрофосфата натрия (pH=4,3) и 5 мл смеси хлороформ : н-бутанол (9:1), смесь перемешивали 10 мин на встряхивателе и центрифугировали 10 мин при 3500 об/мин. Нижний слой органического экстракта отделяли и пропускали через слой безводного сульфата натрия. Растворитель испаряли досуха в потоке воздуха при температуре 40-50°С. Образец перед анализом растворяли в 500 мкл деионизированной воды.

Хроматографический анализ. Условия анализа: температура колонки - 40°С. Поток элюента 0,25 мл/мин. Элюирование градиентное, начальная мобильная фаза состояла из 0,01% уксусной кислоты и метанола (80:20), к 10 минуте объемное соотношение раствора кислоты и метанола в элюенте составляло 50:50. Восстановление колонки после анализа (post time) 5 мин. Аналитическая длина волны 270 нм, ширина щели 8 нм.

Правильность и воспроизводимость методики определяли по результатам анализа трех серий проб по 6 образцов каждая, содержащих по 10 и 100 мкг/мл теофиллина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В качестве внутреннего стандарта для анализа теофиллина (рис.1 а) выбран 8-хлортеофиллин (рис.1 б), так как соединения имеют близкие физико-химические свойства, что обеспечивает их одинаковое поведение при экстракции и хроматографическом анализе, следовательно, хорошую сходимость анализов и низкий предел обнаружения теофиллина.

О

Рис.1. Структурные формулы теофиллина

CI

При выбранных условиях пробоподготовки и анализа предел обнаружения теофиллина составляет 0,2 мкг/мл крови. Предел обнаружения определяли методом добавок к холостой крови как минимальная концентрация анализируемого вещества в крови, дающая отношение сигнал/ шум более 4. Предел количественного определения равен 5 мкг/мл.

Калибровочная кривая для теофиллина линейна в диапазоне 5-200 мкг/мл и имеет вид:

Y = 29,4хХ+4,1 № = 0,999),

где Y - концентрация теофиллина в крови в мкг/мл, Х- отношение площадей пиков анализируемого вещества и внутреннего стандарта, R - коэффициент корреляции.

Таблица 2

Воспроизводимость методики определения теофиллина в крови

Серия определе- ний Найдено, *мкг/мл Sr Найдено, **мкг/мл Sr

1 10,2±0,4 0,051 101,2±3,5 0,043

2 9,8±0,5 0,069 99,2±6,1 0,077

3 10,3±0,6 0,074 100,7±2,3 0,028

Аналитическому определению теофиллина не мешают другие производные ксантина (кофеин и теобромин) имеющие сходные с теофиллином УФ спектры, так как при выбранных условиях анализа их пики хорошо разрешаются (рис.2).

* Введено 10 мкг/мл (нижний контроль).

** Введено 100 мкг/мл (верхний контроль).

В табл. 2 приведены показатели воспроизводимости методики по анализу трех серий образцов.

Рис.2. Хроматограмма смеси теобромина (2,21 мин), теофиллина (3,277 мин), кофеина (4,721 мин), 8-хлортеофиллина (7,677 мин).

Описанная методика охватывает область от терапевтических до летальных концентраций теофиллина в крови. Она применяется в настоящее время для судебнохимических анализов в Челябинском областном бюро судебно-медицинской экспертизы, а также для токсикологических анализов и терапевтического мониторинга в Челябинском областном токсикологическом центре.

Литература:

1. Вартанян Р.С. Синтез основныхлекарственных средств. М: МИА. - 2005. - 845 с.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2-х томах. Т.1.- 9-е изд., М.: Медицина. - 1984. - 624 с.

3. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. М.: АстраФармСервис. - 1995. -

4. Clarke’s analysis ofdrugs andPoisons. /London., Pharmaceutical Press. - Electronic version, 2004.

1168 c.

© П.Ю. Лукьянчиков, Н.Л. Муравьева, М.Г. Мусина, М.Г. Тихомирова, 2008 УДК 340.624

П.Ю. Лукьянчиков, Н.Л. Муравьева, М.Г. Мусина, М.Г. Тихомирова ИДЕНТИФИКАЦИЯ СТЕРОИДНЫХ И НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ

ГУЗ “Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы” МЗ РТ (нач. - Н.Ш. Нигматуллин) Установлена возможность изолирования противовоспалительных средств производных метилпредни-золона, пропионовой, фенилуксусной кислот, сульфонанилида подкисленной водой. Проведена идентификация рассмотренных веществ различными физико-химическими методами: хроматография в тонком слое сорбента, газожидкостная хроматография, спектрофотометрия в ультрафиолетовой области спектра. Исследована возможность их количественного определения методами газожидкостной хроматографии и спектрофотометрии.

Ключевые слова: противовоспалительные средства, идентификация, хроматография в тонком слое сорбента, газожидкостная хроматография, спектрофотометрия.

IDENTIFICATION OF STEROIDAL AND NON-STEROIDAL ANTIINFLAMMATORI FACILITIES P. Yu. Lukiyanchikov, N.L. Muravieva, M.G. Musina, M.G. Tihomirova The possible isolation of antiinflammatori facilities derived methylprednisolone, propionic, phenylacetic acids, sul-fonanilide by acidified water was installed. The identification of considered drugs by different physico-chemical methods: thin-layer chromatography, gas-liquid chromatography, ultraviolet spectrofotometry was conducted. The possibility of their assay by methods of gas-liquid chromatography and spectrofotometry was explored.

Key words: antiinflammatori facilities, identification, thin-layer chromatography, gas-liquid chromatography, spectrofotometry.

Противовоспалительные препараты находят широ- сульфонанилида. Представители этих групп отображены

кое применение в медицинской практике. Они обладают в таблице 1 [2].

противовоспалительной, анальгетической и умеренной Стандартные растворы исследуемых веществ готови-

жаропонижающей активностью. Эти препараты пользу- ли из выпускаемых лекарственных форм (ампульные рас-

ются спросом у населения и находятся в аптеке в свобод- творы дексаметазона, кетопрофена, ортофена, таблетиро-

ной продаже. В литературе описаны методы исследования ванные формы ибупрофена, индометацина, нимесулида)

производных пиразолона, парааминофенола, салициловой экстракцией хлороформом из водного раствора при рН

кислоты. Нами же были исследованы производные ме- 2 после подкисления раствором щавелевой кислоты и рН

тилпреднизолона, пропионовой, фенилуксусной кислот, 9-10 после подщелачивания 25% раствором гидроксида