СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО СЛОЯ ЧИПА БИОСЕНСОРА
METHOD OF RESTORING SENSITIVE LAYER OF BIOSENSOR CHIP

Настоящее изобретение относится к области аналитической биотехнологии и касается способа восстановления чувствительного слоя оптических чипов биосенсоров. Чипы биосенсоров являются продуктом высоких технологий, поэтому их изготовление вне промышленного производства невозможно. В то же время они являются принципиально одноразовыми изделиями, повторного использования которых не предусматривается, хотя стоимость чипа достаточно высока и расходы на один анализ могут быть весьма значительными. Во многих случаях это не является препятствием для использования биосенсоров, поскольку при выполнении жизненно важных анализов или при разработке новых лекарств цена анализа не является определяющим фактором. В то же время существуют исследования, для выполнения которых нужно потратить десятки и даже сотни чипов. Во многих случаях это невозможно по экономическим причинам.
В подавляющем большинстве случаев, если иммобилизованным компонентом при изучении взаимодействия является белок или полипептид, то его иммобилизация на чип производится пользователем. С завода чипы выпускаются без иммобилизованной компоненты, а только подготовленными для иммобилизации. Это связано с тем, что белок и полипептиды, иммобилизованные в чувствительном слое чипа, хранятся хуже, чем отдельно чипы и компоненты для иммобилизации, для каждого из которых раздельно можно обеспечить оптимальные условия хранения.
Иммобилизованный компонент должен прочно удерживаться в чувствительном слое чипа. В противном случае, если этот компонент смывается с чипа, наблюдается сильный дрейф, мешающий измерениям. Кроме того, потеря иммобилизованного компонента приводит к непрерывному снижению чувствительности биосенсора. Поэтому, как правило, для иммобилизации используют необратимую пришивку, приводящую к образованию ковалентной связи между подложкой чипа и иммобилизованным компонентом. Чаще всего применяется иммобилизация за аминогруппу на карбоксиметилированную декстрановую подложку, активированную смесью EDC/NHS. Кроме того, возможна фиксация макромолекул за карбоксильную группу, за сульфгидрильную и т.п. [1, 2]. Применение любого из этих способов приводит к необратимой иммобилизации макромолекул, после которой они остаются в чувствительном слое чипа навсегда и не могут быть смыты с нее детергентами, растворителями и прочими агентами. Поэтому, со временем, после деградации иммобилизованного компонента использованный чип уже не пригоден для любого дальнейшего применения. В то же время подложка такого чипа вполне пригодна для иммобилизации других макромолекул, однако использовать ее для повторной иммобилизации в большинстве случаев не удается, поскольку часть мест (обычно карбоксильных групп) иммобилизации деактивирована или занята предыдущим компонентом, а оставшиеся от предыдущей иммобилизации компонента могут дать непредсказуемые артефакты и ошибки измерения.
Чтобы привести использованный чип в состояние, близкое к тому, в котором он поступает с завода-изготовителя, необходимо по возможности более полно устранить с его чувствительного слоя остатки ранее иммобилизованного компонента и, при необходимости, восстановить до исходного значения поверхностную плотность карбоксильных групп. На настоящий момент не существует способа прицельно разорвать ковалентную связь, образовавшуюся в процессе иммобилизации, однако есть возможность удалить все элементы ранее иммобилизованного компонента за исключением того, который непосредственно пришит к подложке.
Для этого можно привести чувствительный слой чипа в контакт с раствором фермента, способного гидролизовать связи между иммобилизованными компонентами. Для протеинов и белков следует использовать протеазы, а для нуклеиновых кислот - нуклеазы - РНКзы и ДНКзы.
Имеется большой выбор протеолитических ферментов, но не все они подходят для проведения восстановления, так как большинство протеаз разрезают пептидную связь только по определенным аминокислотам, которые, кроме того, должны быть доступны для воздействия фермента, то есть находиться снаружи белковой глобулы. Такие протеазы неспособны полностью гидролизовать пришитые белки. Всегда остаются участки, которые не содержат нужных аминокислот и не будут гидролизованы и удалены. Кроме того, даже если белковая молекула будет разрезана в нескольких местах, отрезанные куски не отделяются от глобулы, поскольку белковая цепочка в глобуле сильно переплетена сама с собой и отрезанные куски не могут покинуть глобулу [3].
Существуют ферменты, способные отрезать от белковой цепочки аминокислоту за аминокислотой с С или N конца (это разные ферменты - соответственно С-пептидазы и N-пептидазы), которые в принципе могут гидролизовать весь белок без остатка. Однако такие ферменты все равно не решают проблему по нескольким причинам. Есть белки, в которых С-конец, или N-конец, или оба спрятаны внутри глобулы [3].
Такие белки неуязвимы для соответствующего типа концевых протеаз или для обоих типов сразу. Поскольку в большинстве случаев иммобилизация белковой глобулы происходит не за конец цепи, а за какое-либо внутреннее звено, для полной очистки чувствительной поверхности биосенсора необходимо присутствие в регенерирующем растворе обоих типов концевых протеаз. В то же время сами эти протеазы обычно устойчивы к своему собственному воздействию, но уязвимы для протеаз другого типа. И, наконец, это довольно дорогие белки, не всегда свободно доступные для приобретения. В то же время удельная активность таких ферментов обычно невысока, и для эффективного удаления белков за приемлемое время их нужно применять в большом количестве.
Из предшествующих разработок известен способ восстановления чувствительного слоя чипа биосенсора путем гидролиза иммобилизованного протеина с помощью раствора протеолитического фермента Проназа Е [4]. Раствор этого фермента с концентрацией 1 мг/мл готовили в буферном растворе состава 150 мМ хлорида натрия, 20 мМ фосфата натрия, рН 7,2.
Чип помещали в раствор на 15-17 часов при комнатной температуре. Затем его промывали в дистиллированной воде. Был получен удовлетворительный результат восстановления свойств чипа, однако основными недостатками описанного метода являются большой расход протеолитического фермента, его высокая стоимость [5] и отсутствие в России производства этого препарата. В связи с этим, стоимость восстановления работоспособности оптического чипа по данному методу получается слишком высокой.
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ многостадийной обработки чувствительного слоя чипа раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба [6].
Навеску сухого лиофилизированного препарата растворяли до концентрации 0,1-0,01 мг/мл в буфере состава: 3 мМ хлорида кальция, 100 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-НСl, рН 8,0, при температуре раствора 35-40°С с последующей экспозицией и последовательной многократной промывкой раствором додецилсульфата натрия и водой после каждой стадии. Существенным недостатком данного метода является его продолжительность - описанный процесс занимает около 76 часов. К тому же, приведенный способ восстановления чувствительного слоя чипа подразумевает большой расход реактивов: процесс состоит из трех циклов, где для проведения каждого цикла необходимо готовить новый раствор для восстановления.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа восстановления чувствительного слоя чипов биосенсоров, лишенного указанных надостатков.
В соответствии с изобретением описывается способ восстановления чувствительного слоя чипов биосенсора путем обработки его регенерационным раствором на основе общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере, состоящем из 3 мМ хлорида кальция, 100 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, при температуре в диапазоне 35-40°С с последующей экспозицией и последовательными промывками чувствительного слоя чипа водным раствором додецилсульфата натрия, а затем дистиллированной водой, при этом в качестве регенерационного раствора используют смесь трипсина и общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба при соотношении трипсина и общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба 1,5:1 (60:40%) в буфере, состоящем из 3 мМ хлорида кальция, 100 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0. Конечная концентрация смеси трипсина и общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере составляет 1 мг/мл.
Экспозицию осуществляют в течение 4 часов, процесс проводят в одну стадию и промывку ведут додецилсульфатом натрия, растворенным в воде в концентрации 0,5%.
Способ осуществляют следующим образом.
Пример.
Чувствительный слой чипа биосенсора обрабатывают смесью трипсина и общей фракцией протеаз гепатопанкреаса камчатского краба (соотношение 1,5:1) в буфере, содержащем 3 мМ хлорида кальция, 100 мМ хлорида натрия, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0, (концентрация смеси в буфере 1 мг/мл). Восстановление проводят в одну стадию путем обработки чувствительного слоя чипа смесью трипсина и общей фракцией протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в указанном буфере при температуре в диапазоне 35-40°С с экспозицией в течение 4 ч. Затем чувствительный слой промывают додецилсульфатом натрия, растворенным в воде в концентрации 0,5%, а затем дистиллированной водой.
Вся процедура восстановления чувствительного слоя чипа может производиться непосредственно в биосенсоре, поскольку применяемые растворы не коррозийны и не разрушают пластики, однако предпочтительнее проводить процедуры отдельно, во вспомогательных пробирках или специально приспособленных емкостях. Восстановление чувствительного слоя чипа можно продемонстрировать на конкретных примерах. На оптическом чипе, установленном в оптический биосенсор, иммобилизовали белок цитохром b5. Функциональность иммобилизованного белка оценивали по наличию позитивного связывания с его известным белком-партнером (цитохром Р450 3А4). Чип вынимали из биосенсора и помещали в специальную емкость для восстановления по описываемому способу. Проводили 10 циклов повторной иммобилизации-восстановления данного чипа. Установлено, что уровень иммобилизованного цитохрома b5 при каждой повторной иммобилизации на восстановленном чипе оставался фактически постоянным, что указывает на отсутствие деградации чувствительного слоя регенерационным раствором. Биосенсорный сигнал после каждого цикла востановления чипа регистрировался в пределах ±2% от первоначальной базовой линии (сигнал до первой иммобилизации), что говорит о полном удалении белка из чувствительного слоя, которое составляло 97,5±1,5%. Аналогичные данные получили при восстановлении чувствительного слоя чипа с использованием белковой пары моноклональных антител против альфафетопротеина (были иммобилизованы на чип) и собственно альфафетопроин (позитивно связывался с антителами). Удаление иммобилизованного белка из чувствительного слоя составляло в этом случае 98,5±1,2%.
Восстановительная эффективность чувствительного слоя чипа, достигаемая при осуществлении данного способа, сопоставима по количественным характеристикам со способом, описанным по патенту РФ 2524438. Однако данный способ восстановления чувствительного слоя биосенсора позволяет сократить в 19 раз время, необходимое на проведение данного процесса, и снизить количество расходуемых реактивов. Введение в состав восстанавливающего раствора трипсина позволяет повысить скорость восстановления (удаление ранее иммобилизованного компонента происходит на 96-99,7%) за счет увеличения узнавания дополнительных сайтов рестрикции в белковой молекуле протеазами.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Weinberger S.R., Tina S Morris T.S., Pawlak M. (1998) Recent trends in protein biochip technology Vol. 1, No. 4, Pages 395-416
2. Rich R.L. and Myszka D.G. (2000) Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61
3. W.J.J. Van den Tweel, A.Harder, R.M. Buitelaar (1993) Stability and stebilization of enzymes. Studies in organic chemistry 47. Elsevier science publishers B.V Amsterdam, 519 p.
4. Chatelier R.C., Gengenbach T.R., Griesser H.J., Brighamburke M., O′Shannessyt D.J. (1995) A General Method to Recondition and Reuse BIAcore Sensor Chips Fouled with Covalently Immobilized Protein/Peptide. Analytical Biochemistry. №229. P. 112-118.
5. Электронный каталог Sigma Aldrich [Электронный ресурс]: каталог особо чистых химических веществ, реагентов, расходных материалов и т.д. Режим доступа: ? TablePage=16410626
6. Пат. RU 2524438, 27.07.2014.