ДЕПЛЕЦИЯ РНК НА ОСНОВЕ НУКЛЕАЗЫ

1. Способ удаления молекул РНК, которые не являются мишенью, из образца нуклеиновой кислоты, включающий:
a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего по меньшей мере одну последовательность-мишень в структуре РНК или ДНК и по меньшей мере одну последовательность молекул РНК, не являющихся мишенью, в контакт с набором зондов, содержащим по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, тем самым гибридизируя ДНК-зонды с молекулами РНК, не являющимися мишенями, с образованием гибридов ДНК : РНК, отличающееся тем, что каждый гибрид ДНК : РНК разделен по меньшей мере на 5 оснований или по меньшей мере на 10 оснований вдоль заданной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, из другого гибрида ДНК : РНК; и
b) приведение гибридов ДНК : РНК в контакт с рибонуклеазой, расщепляющей РНК от гибридов ДНК : РНК, тем самым разрушая молекулы РНК, не являющиеся мишенями, в образце нуклеиновой кислоты с образованием расщепленной смеси.
2. Способ по п. 1, включающий: c) дополнительное расщепление оставшихся ДНК-зондов путем контакта расщепленной смеси с ферментом, расщепляющим ДНК, с образованием расщепленной ДНК-смеси, при этом фермент, расщепляющий ДНК, может необязательно представлять собой ДНКазу I; и d) отделение расщепленной РНК от расщепленной смеси или расщепленной ДНК-смеси.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором приведение в контакт с набором зондов включает обработку образца нуклеиновой кислоты дестабилизатором.
4. Способ по п. 3, в котором дестабилизатор представляет собой нагревание или дестабилизирующее нуклеиновую кислоту химическое вещество, при этом дестабилизирующее нуклеиновую кислоту химическое вещество необязательно представляет собой бетаин, ДМСО, формамид, глицерин, их производные или их смесь.
5. Способ по п. 4, в котором дестабилизирующее нуклеиновую кислоту химическое вещество представляет собой формамид, при этом формамид может присутствовать во время контакта с набором зондов в концентрации от приблизительно 10 до 45 об.%.
6. Способ по п. 4, в котором обработка образца нагреванием включает применение нагрева выше температуры плавления по меньшей мере одного гибрида ДНК : РНК.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором рибонуклеаза представляет собой РНКазу H или гибридазу.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором образец нуклеиновой кислоты получен от человека или примата, отличного от человека.
9. Способ по любому из пп. 1-7, в котором образец нуклеиновой кислоты получен от крысы или мыши.
10. Способ по любому из пп. 1-8, в котором образец нуклеиновой кислоты содержит нуклеиновые кислоты нечеловеческого происхождения.
11. Способ по п. 10, в котором нуклеиновые кислоты нечеловеческого происхождения получены из не относящихся к человеку эукариот, бактерий, вирусов, растений, почвы или их смеси.
12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК, мРНК, тРНК или их смесь.
13. Способ по п. 12, в котором РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК и мРНК глобина.
14. Способ по любому из пп. 1-12, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с по меньшей мере одной молекулой РНК, не являющейся мишенью, выбранной из 28S, 23S, 18S, 5.8S, 5S, 16S, 12S, HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBB-B1, HBB-B2, HBG1 и HBG2.
15. Способ по п. 14, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с двумя или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из 28S, 18S, 5.8S, 5S, 16S и 12S человека.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2 гемоглобина и 23S, 16S и 5S грамположительных или грамотрицательных бактерий.
17. Способ по любому из пп. 1-16, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, полученными из видов Archaea.
18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, крысы и (или) мыши, которые при этом могут выбираться из 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций.
19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором зонды для конкретной молекулы РНК, не являющейся мишенью, комплементарны примерно от 80 до 85% последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, причем бреши составляют по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 оснований между каждым местом гибридизации зонда.
20. Способ по любому из пп. 1-11, в котором ДНК-зонды содержат:
(a) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 333 последовательности, выбранные из номеров SEQ ID NO: 1-333; или
(b) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 400 или более, или 428 последовательностей, выбранных из номеров SEQ ID NO: 1-428; или
(c) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 377 последовательностей, выбранные из номеров SEQ ID NO: 1-377; или
(d) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 384 последовательности, выбранные из номеров SEQ ID NO: 1-333 и номеров SEQ ID NO: 378-428; или
(e) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 44 последовательности, выбранные из номеров SEQ ID NO: 334-377; или
(f) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 51 последовательность, выбранные из номеров SEQ ID NO: 378-428;
или их комбинации.
21. Композиция, содержащая набор зондов, содержащий по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных несмежным последовательностям, находящимся на расстоянии по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 оснований друг от друга вдоль всей длины по меньшей мере одной молекулы РНК, не являющейся мишенью, в образце нуклеиновой кислоты, и рибонуклеазу, способную расщеплять РНК в гибриде ДНК : РНК.
22. Композиция по п. 19, в которой рибонуклеаза представляет собой РНКазу H.
23. Композиция по п. 21 или 22, в которой каждый ДНК-зонд гибридизуется на расстоянии по меньшей мере 10 оснований вдоль всей длины по меньшей мере одной молекулы РНК, не являющейся мишенью, от любого другого ДНК-зонда в наборе.
24. Композиция по любому из пп. 21-23, содержащая дестабилизирующее химическое вещество.
25. Композиция по п. 24, в которой дестабилизирующее химическое вещество представляет собой формамид.
26. Композиция по любому из пп. 21-25, в которой РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК, мРНК, тРНК или их смесь.
27. Композиция по п. 26, в которой РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК и мРНК глобина.
28. Композиция по любому из пп. 21-27, в которой набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с по меньшей мере одной молекулой РНК, не являющейся мишенью, выбранной из 28S, 23S, 18S, 5.8S, 5S, 16S, 12S, HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2.
29. Композиция по п. 28, в которой набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с двумя или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из 28S, 18S, 5.8S, 5S, 16S и 12S человека.
30. Композиция по любому из пп. 21-29, в которой набор зондов содержит по меньшей мере два зонда ДНК, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, выбранными из HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2 гемоглобина и 23S, 16S и 5S грамположительных или грамотрицательных бактерий.
31. Композиция по любому из пп. 21-30, в которой набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных одной или более молекулам рРНК видов Archaea.
32. Композиция по пп. 21-31, в которой набор зондов содержит ДНК-зонды, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, крысы и (или) мыши, которые необязательно выбраны из 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций.
33. Композиция по любому из пп. 21-32, в которой ДНК-зонды содержат:
(a) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 333 последовательности, выбранные из номеров SEQ ID NO: 1-333; или
(b) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 400 или более, или 428 последовательностей, выбранных из номеров SEQ ID NO: 1-428; или
(c) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 377 последовательностей, выбранных из номеров SEQ ID NO: 1-377; или
(d) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 384 последовательности, выбранных из номеров SEQ ID NO: 1-333 и номеров SEQ ID NO: 378-428; или
(e) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 44 последовательности, выбранные из номеров SEQ ID NO: 334-377; или
(f) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 51 последовательность, выбранные из номеров SEQ ID NO: 378-428;
или их комбинации.
34. Комплект, содержащий набор зондов с по меньшей мере двумя ДНК-зондами, комплементарными несмежным последовательностям, находящимся на расстоянии по меньшей мере 5 или 10 оснований друг от друга вдоль всей длины по меньшей мере одной молекулы РНК, не являющейся целью, в образце нуклеиновой кислоты, и рибонуклеазу, способную расщеплять РНК в гибриде ДНК : РНК.
35. Комплект по п. 34, содержащий буфер и среду для очистки нуклеиновых кислот и необязательно содержащий дестабилизирующее химическое вещество.
36. Комплект по любому из пп. 34-35, в котором РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК, мРНК, тРНК или их смесь.
37. Комплект по п. 36, в котором РНК, не являющаяся мишенью, представляет собой рРНК и мРНК глобина.
38. Комплект по любому одному из пп. 34-37, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, гибридизующихся с по меньшей мере одной молекулой РНК, не являющейся мишенью, отобранной из 28S, 23S, 18S, 5.8S, 5S, 16S, 12S, HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2.
39. Комплект по п. 38, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с двумя или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, отобранными из 28S, 18S, 5.8S, 5S, 16S и 12S человека.
40. Комплект по любому из пп. 34-39, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два ДНК-зонда, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, отобранными из HBA-A1, HBA-A2, HBB, HBG1 и HBG2 гемоглобина и 23S, 16S и 5S грамположительных или грамотрицательных бактерий.
41. Комплект по пп. 34-40, в котором набор зондов содержит по меньшей мере два зонда ДНК, комплементарных одной или более молекулам рРНК видов Archaea.
42. Комплект по пп. 34-41, в котором набор зондов содержит ДНК-зонды, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, крысы и (или) мыши, которые при этом могут выбираться из 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций.
43. Комплект по пп. 34-42, в котором ДНК-зонды содержат:
(a) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 333 последовательности, выбранные из номеров SEQ ID NO: 1-333; или
(b) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 400 или более, или 428 последовательностей, выбранных из номеров SEQ ID NO: 1-428; или
(c) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 377 последовательностей, выбранных из номеров SEQ ID NO: 1-377; или
(d) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 100 или более, или 150 или более, или 200 или более, или 250 или более, или 300 или более, или 350 или более, или 384 последовательности, выбранных из номеров SEQ ID NO: 1-333 и номеров SEQ ID NO: 378-428; или
(e) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 44 последовательности, выбранные из номеров SEQ ID NO: 334-377; или
(f) две или более, или пять или более, или 10 или более, или 25 или более, или 50 или более, или 51 последовательность, выбранную из номеров SEQ ID NO: 378-428;
или их комбинации.
44. Комплект по п. 34, содержащий:
(1) набор зондов, содержащий номера SEQ ID NO: 1-333;
(2) рибонуклеазу, которая при этом может представлять собой РНКазу H;
(3) ДНКазу; и
(4) гранулы для очистки РНК;
при этом возможно наличие дополнительного буфера деплеции РНК, буфера деплеции зонда и буфера для удаления зонда.
45. Способ добавления набора зондов для использования при удалении молекул нуклеиновых кислот РНК, не являющихся мишенью, из образца нуклеиновой кислоты, включающий:
a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего по меньшей мере одну последовательность-мишень в структуре РНК или ДНК и по меньшей мере одну последовательность молекул РНК, не являющихся мишенью, от первого вида в контакт с набором зондов, содержащим по меньшей мере два ДНК-зонда, комплементарных к несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, от второго вида тем самым гибридизируя ДНК-зонды с молекулами РНК, не являющимися мишенями, с образованием гибридов ДНК : РНК, при этом каждый гибрид ДНК : РНК отделен друг от друга на расстояние по меньшей мере 5 оснований или по меньшей мере 10 оснований вдоль заданной последовательности молекулы РНК, не являющейся мишенью, из другого гибрида ДНК : РНК;
b) приведение гибридов ДНК : РНК в контакт с рибонуклеазой, расщепляющей РНК от гибридов ДНК : РНК, тем самым разрушая молекулы РНК, не являющиеся мишенями, в образце нуклеиновой кислоты с образованием расщепленной смеси;
c) отделение расщепленной РНК от расщепленной смеси;
d) секвенирование оставшейся РНК из образца;
e) оценку оставшихся последовательностей РНК на наличие молекул РНК первого вида, не являющихся мишенью, таким образом определяя области последовательности бреши; и
f) добавление в набор дополнительных ДНК-зондов, комплементарных к несмежным последовательностям в одной или более областях брешей.
46. Способ по п. 45, в котором участки с брешами в последовательности содержат 50 или более пар оснований.
47. Способ по п. 45 или 46, в котором первый вид не относится к человеку, а второй - представляет собой человека.
48. Способ по п. 47, в котором первый вид представляет собой крысу или мышь.
49. Способ по п. 47 или 48, в котором композицию по любому из пп. 21-33 используют для снабжения рибонуклеазой, а набор зондов содержит ДНК-зонды, комплементарные несмежным последовательностям вдоль всей длины по меньшей мере одной молекулы РНК человека, не являющейся мишенью.
50. Способ по п. 48 или 49, в котором используется метод для идентификации ДНК-зондов, которые гибридизуются с одной или более молекулами РНК, не являющимися мишенью, крысы и (или) мыши, которые необязательно выбраны из 16S крысы, 28S крысы, 16S мыши, 28S мыши и их комбинаций.