Фенотипические эффекты полиморфизмов генов соматотропинового каскада, ассоциированных с признаками мясной продуктивности относительно общей выборки у коров казахской белоголовой породы

Фенотипические эффекты полиморфизмов генов соматотропинового каскада, ассоциированных с признаками мясной продуктивности относительно общей выборки у коров казахской белоголовой породы

И.С. Бейшова, к.с.-х.н., Костанайский ГУ

Мясное скотоводство является важным источником получения мяса высокого качества [1, 2]. Большой интерес для повышения мясной продуктивности крупного рогатого скота представляют гены соматотропинового каскада, белковые продукты которых являются ключевыми звеньями одной гуморальной цепи, участвующей как в процессе лактации, так и в процессах роста и развития млекопитающих (ЪРИ-1, bGH, bGHR, bIGF-1) [3]. Следовательно, изучение полиморфизмов этих генов является перспективным с точки зрения поиска маркеров, ассоциированных с признаками и молочной, и мясной продуктивности у крупного рогатого скота.

Известно, что гормон роста и целый ряд других белков (прямо или косвенно необходимых для его функционирования) обеспечивают разнообразные молекулярные и клеточные эффекты, приводящие в конечном счёте к развитию и росту организма [4].

Функционирование системы гормона роста представляется в виде целого ряда последовательных молекулярных процессов, в которых принимают участие десятки других белков/пептидов. Компоненты этой системы участвуют в запуске секреции гормона роста, его транспорте в кровотоке, в передаче гормонального сигнала в клетке — мишени (внутриклеточный сигналинг) и, наконец, в целенаправленных изменениях генной экспрессии в клетках-мишенях. Синтез гормона роста обеспечивает ген ЪGH. Регуляция синтеза гормона роста представляет собой многоуровневый каскад взаимодействий белок—рецептор, тесно связанных между собой. Нарушение и тем более выпадение любого звена влечёт за собой изменения в работе соматотропиновой оси, которые могут привести как к различиям в фенотипических проявлениях количественных признаков продуктивности у сельскохозяйственных животных, так и к заболеваниям, развивающимся на разных этапах онтогенеза.

Гипофизарный фактор транскрипции (Р1Т-1) участвует в регуляции экспрессии генов пролак-тина (PRL), соматотропина ^Н) и тиреотропного гормона, а также регулирует дифференциацию и пролиферацию клеток гипофиза в раннем эмбриогенезе и определяет развитие зон, ответственных за синтез соматотропина [5—7].

Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена РИ-1 с признаками мясной продуктивности ведутся на различных породах.

Наиболее исследованным из них является РШ-НтГ I полиморфизм, впервые описанный J Woollard, 1994 [8] и впоследствии идентифицированный как молчащая G ^ А замена в области шестого экзона [9]. Несмотря на то что данная мутация не приводит к аминокислотной замене белка и теоретически не должна влиять на его физиологические свойства, рядом авторов выявлены различные виды ассоциации этого полиморфизма с признаками как мясной, так и молочной продуктивности у представителей разных пород [10].

Ген бычьего гормона роста (ЪGH или bST) картирован на 19-й хромосоме и является участником мультигенного семейства, которое включает также пролактин, и плацентарные лактогены. Его протяжённость составляет примерно 1800 пар оснований и включает пять экзонов (I—V), которые кодируют матричную РНК размером 786 пар оснований, и четыре интрона (А—D). По большей части его последовательность сходна с таковой у мышей и человека.

Учитывая значительную роль в процессе роста и лактации, GH ген является потенциальным объектом для изучения ассоциации его молекулярных вариантов с признаками продуктивности крупного рогатого скота. У представителей различных пород крупного рогатого скота было описано несколько полиморфных вариантов гена соматотропина, их перечень представлен в таблице. Большая часть выявленных полиморфных сайтов расположена в нетранслируемых интронах, некоторые в регу-ляторной последовательности, и лишь один из них расположен в транслируемой области пятого экзона, в положении 2141 и представляет собой трансверсию С ^ G.

Именно она и привлекает наибольшее внимание в исследованиях, связанных с поиском ассоциаций полиморфных вариантов гена гормона роста с признаками мясной и молочной продуктивности у крупного рогатого скота.

Рецептор гормона роста ^Н R) кодируется одиночным геном, который локализован на хромосоме 20 у КРС. Он содержит одиночный трансмембранный домен, содержащий 24 аминокислоты, экстрацеллюлярный (гормон-связывающий) домен и длинный цитоплазматический домен (сигнал-индуцирующий). Состоит из 9 экзонов в транслируемой части (со 2 по 10) и 9 экзонов в 5'-некодирующем регионе, который включает 9 нетранслируемых экзонов. 5'-регуляторная область данного гена содержит составные промоторные элементы, энхансеры, репрессоры, детерминанты

тканеспецефичной экспрессии гена и другие ре-гуляторные элементы. Экзоны нетранслируемой области подвергаются альтернативному сплайсингу, и каждый из них имеет личный сайт начала транскрипции.

Материал и методы исследования. Объектом исследования послужили выборки коров казахской белоголовой породы. Предмет исследования — полиморфные гены соматотропинового каскада (bPit-1, bGH, bGHR).

Материал исследования — образцы ДНК, выделенной из крови коров казахской белоголовой породы. Геномную ДНК выделяли из крови КРС, используя набор «Pure Link Genomic DNA Kits», согласно инструкции изготовителя.

Для определения концентрации полученной ДНК в растворе использовали спектрофотометри-ческий метод. При этом пользовались прибором Dynamica HaloDNAMaster.

Для всех исследуемых локусов при изучении полиморфизма ДНК был применён метод по-лимеразной цепной реакции с последующим ре-стрикционным анализом продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ). Последовательности праймеров и условия ПЦР для анализа каждого полиморфизма приведены в таблице 1.

Полимеразную цепную реакцию генов проводили в амплификаторе ProFlex PCR System, «Applited Biosystems». Результаты амплификации оценивались с помощью метода гель-электрофореза. Электрофорез проводили при силе тока 400 mA в агарозном геле в буфере TAE (40 мМ трисги-дроксиметиламинометан, 20 мМ ледяная уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА), с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Для оценки молекулярного веса фрагментов использовали маркеры молекулярного веса ДНК. Результаты электрофореза визуализировали на трансиллюминаторе системы QUANTUM модель 1100 SUPER.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit-1 в экзоне 6 проводился с помощью рестриктазы Hinfl. Полиморфизм обусловлен

А^G нуклеотидной заменой, не приводящей к изменению аминокислотной последовательности. Сайтом узнавания для рестриктазы НтА является последовательность G ^ ANTC. Разрезаемый в ходе ферментации фрагмент содержит нуклеотид А, соответствующий аллелю ЬРй-1-НтП В. В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как ЬРй-1-НтЯ А.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGH в экзоне 5 проводился с помощью рестриктазы А1и1. Полиморфизм обусловлен транзицией С ^ G. Сайтом узнавания для рестриктазы А1и1 является последовательность АG^СТ. Распознаваемый ферментом аллель содержит нуклеотид С и обозначен как bGH-A1uI Ь. В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGH-A1uI V.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGHR в экзоне 8 проводился с помощью рестриктазы SspI. Рестриктаза SspI распознаёт Т ^ А транзицию в экзоне 8. Сайтом узнавания для рестриктазы является последовательность ААТ ^ АТТ. Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т, соответствующий аллелю bGHR-SspI Е В случае присутствия А-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGHR-SspI У.

Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием стандартного пакета программ «Statistica 6.0». Сравнение выборок по распределению частот аллелей исследуемых генов, а также оценку соответствия фактического распределения генотипов теоретически ожидаемому по закону Харди — Вайнберга проводили с помощью критерия %2. Различия во всех случаях рассматривались как статистически достоверные при уровне значимости Р<0,05 [11].

Результаты исследования. Было установлено, что у коров казахской белоголовой породы полиморфизм ЬРН-1-HinFI ассоциирован с индексом растянутости в возрасте 24 мес. (наибольшее значение признака — генотип ЬРН- 1-HinFIм, а полиморфизм

1. Условия ПЦР и последовательности праймеров

Ген/рестриктаза Условия амплификации Последовательности праймеров

bPit-1-HinfI 94°С - 1 мин. 95°С - 45 сек. 56°С - 60 сек. 72°С - 60 сек. 72°С - 1 мин. х 35 циклов HinFI-F: 5'-aaccatcatctcccttctt-3' HinFI-R: 5'-atgtacaatgtcttctgag-3'

bGH-AluI 95°С - 5 мин. 95°С - 30 сек. 64°С - 30 сек. 72°С - 60 сек. 72°С - 1 мин. х 35 циклов AluI-F: 5'-ccgtgtctatgagaagc-3' AluI-R: 5"-gttcttgagcagcgcgt-3'

bGHR-SspI 95°С - 5 мин. 95°С - 30 сек. 60°С - 30 сек. 72°С - 30 сек. 72°С - 1 мин. х35 циклов SspI-F: 5 '-atatgtagcagtgacaatat-3' SspI-R: 5'-acgtttcactgggttgatga-3'

ЬЮЕ-1- SnaBI ассоциирован с признаком живая масса в возрасте 12, 18, 24 мес. (наибольшее значение генотип ЬЮГ-1^паВ1м и ЫGF-1-SnaBPB, наименьшее — генотип ЬIGF-1-SnaBIAА).

Данные, характеризующие продуктивность групп с генотипами ЬРН- 1-HinFIАА, bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFPВ по индексу растянутости в возрасте 24 мес., приведены в таблице 2.

Из таблицы следует, что наибольшее значение растянутости характерно для группы коров с генотипами ЬРН-1-Ш^1АВ и ЬРи-1-Ш^1ВВ. Для них интервал медианы колеблется в пределах 125—132%. В то время как для группы коров с генотипом ЬРН- 1-HinFIАА этот показатель колеблется в пределах 11-141%.

Результаты интервального анализа относительно общей выборки представлены на рисунке 1.

Из графика, представленного на рисунке 1, очевидно, что, несмотря на достоверное различие групп с генотипами ЬРН- 1-HinFIАА, bPit-1-HinFIАВ и bPit-1-HinFPВ между собой, по отношению к общей выборке все венотипические эффекты находятся в пределах популяционной нормы признака.

Таким образом, полиморфизм bPit-1-HinFI, ассоциированный с растянутостью в возрасте 24 мес., неперспективно рассматривать в качестве генетического маркера.

Данные, характеризующие продуктивность казахских белоголовых коров по признаку живой массы в возрасте 12, 18 и 24 мес., приведены в

таблице 3. лиморфизм ЬРй-1-Ш^1

2. Непараметрические характеристики индекса растянутости в группах коров казахской белоголовой породы с разными генотипами по полиморфизму ЬРН- 1-HinFI

Признак / возраст Генотип Ме Доверительный интервал для медианы Интерквартильный размах, %

ДИ1 ДИ2 25 75

Растянутость 24 мес. ъри-^тш-^ ЪРН-^ШПБ!41» ЪPit-1-HiпFIВВ Общая выборка 124,167 129,364 127,966 127,966 111,864 125,000 125,000 126,891 141,026 132,787 132,787 131,092 113,075 118,817 121,849 120,313 133,958 137,705 138,655 138,333

3. Непараметрические характеристики живой массы в возрасте 12, 18, 24 мес. в группах коров казахской белоголовой породы с разными генотипами по полиморфизму ЬIGF-1-SnaBI

Признак / возраст Генотип Ме Доверительный интервал для медианы Интерквартильный размах, %

ДИ1 ДИ2 25 75

ЪIGF-1-SпaBIAA 307 284 341 284 340

Живая масса ЪIGF-1-SпaBIAB 326 321 332 289 343

12 мес. ЪIGF-1-SпaBIBB 326 321 332 304 345

Общая выборка 325 324 326 293 340

ЪIGF-1-SпaBIAA 346 321 387 326 384

Живая масса ЪIGF-1-SпaBIAB 370 365 376 327 398

18 мес. ЪIGF-1-SпaBIBB 373 365 376 341 401

Общая выборка 370 367 372 329 384

ЪIGF-1-SпaBIAA 381 363 465 369 435

Живая масса ЪIGF-1-SпaBIAB 414 383 425 375 435

24 мес. ЪIGF-1-SпaBIBB 411 383 425 377 447

Общая выборка 411 405 420 374 435

Установлено, что коровы с генотипом ЬЮР-^З^ВР4 во всех возрастах характеризуются пониженной живой массой по отношению к животным с генотипами ЬЮЕ-^З^ВГ3 и ЬЮР-^тВР3.

Так, в возрасте 12 мес. этот показатель для коров с генотипом колебался в пределах 284-341 кг для коров с генотипом ЬЮР-1-З^ВГ44 по сравнению с 321-332 кг у коров с генотипом bIGF-1-SnaBIAB и ЬЮР-1 ^шВ^.

В возрасте 18 и 24 мес. это соотношение составляло 321-387 к 365-376 кг и 363-465 к 383425 кг соответственно.

Рис. 1 - Индекс растянутости (%) у коров казахской белоголовой породы в возрасте 24 мес.; по-

Живая масса (кг) у коров казахской белоголовой породы в возрасте 12 месяцев; полиморфизм d/GP-i-SnaUl

290

?ао

IGF АЛ IGF АВ IGF BR общ яыборкл

Медиана |_j95% доверительный интервал для медианы

хинтерквартипьный размах 25%-75%

2а

Живая масса (кг) у коров казахской белоголовой породы в возрасте 13 месяцев; полиморфизм йЮТ'-/-8паВ1

I " I

KJF -АА Ю1-AI3 IGI -ШЗ оЬщ ныЬорка

с Медиана оУ5% доверительный интервал для медианы хшггерквартнльный размах 25%-75%

26

Живая масса (кг) у коров казахской белоголовой породы в возрасте 24 месяцев; полиморфизм ¿/^-/-БпаВТ

1СГ-АА ЮГ-АВ 1СГ-СВ общ. выборка

в Медиана гц95% доверительный интервал для медианы итп перкварталы или размах 25%-75%

2в

Рис. 2 - Живая масса (кг) у коров казахской белоголовой породы в возрасте 12, 18 и 24 мес.; полиморфизм bIGF-1-SnaBI

Для этих групп пород также было проведено интервальное оценивание относительно общей выборки, результаты которого представлены на рисунке 2.

По приведённым на рисунке 2 данным видно, что группы с генотипами bIGF-1-SnaBIAA, bIGF-1-SnaBP8 и bIGF-1-SnaBIBB действительно значительно различаются между собой. Однако группа с генотипом деконсалидирована и её размах признака находится за пределами и верхнего, и нижнего доверительного интервала медианы общей выборки. Причём данная тенденция прослеживается на всех возрастных категориях.

Вывод. Для коров казахской белоголовой породы генетических маркеров мясной продуктивности среди полиморфных генов соматотропинового каскада не выявлено.

Литература

1. Бозымов К.К. Приоритетное развитие специализированного мясного скотоводства — путь к увеличению производства высококачественной говядины / К. К. Бозымов, Р.К. Абжанов, А.Б. Ахметалиева, В.И. Косилов // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2012. № 3 (35). С. 129-131.

2. Косилов В.И., Губашев Н.М., Насамбаев Е.Г. Повышение мясных качеств казахского белоголового скота путём скрещивания // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2007. № 1 (13). С. 91-93.

3. Михайлова М.Е., Белая Е.В. Влияние полиморфных вариантов генов соматотропинового каскада bGH, bGHR и bIGF-1 на признаки молочной продуктивности у крупного рогатого скота голштинской породы // Доклады Национальной академии наук Беларуси. 2011. Т. 55. № 2. С. 63-69.

4. Phillips J.A. III Inherited defects in growth hormone synthesis and action. In: The metabolic and molecular basis of inherited disease / ed. by C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, D. Valle. 7-th Edition. // McGraw-Hill Health Professions Division. 1995. Vol. 2. P. 3023-3044.

5. Anderson B., Rosenfeld M.G. Pit-1 determines cell types during development of the anterior pituitary gland // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 29335-29338.

6. De Mattos, K.K., Del Lama, S.N., Martinez, M.L., Freitas, A.F., Association of bGH and Pit-1 gene variants with milk production traits in dairy Gyr bulls. Braz // J. Agric. Res. 2004. № 39. Р. 147-150.

7. Ingraham H.A., Chen R., Mangalam H.J., Elsholtz H.P., Flynn S.E., Lin C.R., Simmons D.M., Swanson L., Rosenfeld M.G. A tissue specific transcription factor containing a homeo domain specifies a pituitary phenotype // Cell. 1988. Vol. 55. P. 519-529.

8. Woollard, J., Schmitz C.B., Freeman A.E., Tuggle C.K. Rapid communication: HinfI polymorphism at the bovine Pit1 locus // J. Anim. Sci. 1994. № 72. 3267 р.

9. Kriegesmann B. B. Baumgartner B.G., Brenig B. Dierkes Partial genomic structure of bovine Pit1 gene and characterization of a HinfI transition polymorphism in exon 6 // Anim. Genet. 1998. Vol. 29. P. 398-413.

10. Renaville R., Gengler N., Vrech A., Prandi A., Massart S., Corradini C., Bertozzi, C., Mortiaux, F., Burny, A., Portetelle, D. Pit-1 gene polymorphism, milk yield, and conformation traits for Italian Holstein-Friesian bulls // J. Dairy Sci. 1997. № 80. Р. 3431-3438.

11. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера. 2002. 312 с.