Клиническое значение микроРНК-21 в мониторинге роста церебральных глиом

УДК: 616.831-006.484-07:577.216

клиническое значение микрорнк-21 в мониторинге роста церебральных глиом

Р.Ю. Селиверстов1,3, М.И. Зарайский2, А.А. Сазанов2, Е.Е. Зуева2, С.В. Лобзин3, А.Ф. Гурчин1, Н.В. Стерликова1, К.П. Гайдаенко1, М.Б. Волов1, О.И. Тимонина3, Н.В. Толстых 1 Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой, Санкт-Петербург, Россия 2 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский унивеситет им. И.П. Павлова ,

Санкт-Петербург, Россия 3 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,

Санкт-Петербург, Россия.

Раннее выявление прогрессии церебральных глиом представляет собой актуальную задачу. Установлено, что уровень экспрессии микроРНК-21 в крови высокоспецифичен в эволюции опухолевого процесса. Цель исследования состояла в изучении динамики показателей экспрессии микро РНК в крови и слюне больных церебральными глиомами с прогрессией опухолевого роста или без неё, что было верифицировано при ПЭТ-исследовании с 11С-метионином. Установлено, что в подавляющем числе наблюдений отрицательная динамика опухолевого процесса совпадала с нарастанием метаболических изменений в остатке опухоли и высоко коррелировала с уровнем экспрессии микроРНК. Это позволяет рассматривать определение микроРНК как высокодостоверную скрининговую методику в мониторинге эволюции опухолевого процесса и эффективности проводимого лечения.

Ключевые слова: церебральная глиома, уровень экспрессии микроРНК-21, МРТ, ПЭТ с 11 С - метионином, мониторинг продолженного роста церебральных глиом.

Введение

Важнейшей клинической задачей у больных глиальными церебральными опухолями (ГЦО) является раннее выявление их продолженного роста и последующей малигнизации, так как это непосредственно определяет своевременную коррекцию комплексного лечения и тем самым способствует улучшению прогноза заболевания. Даже тотальное удаление этих опухолей не исключает неопластической инфильтрации мозга [1, 2, 3, 4]. Достоверность нейровизуализацион-ной диагностики продолженного роста опухоли при магнитно-резонансной томографии (МРТ) с контрастным усилением может быть снижена различными послеоперационными изменениями, лучевым некрозом, кровоизлияниями, воспалением и т.д. [5, 6, 7, 8]. При позитронно-эмис-сионной томографии (ПЭТ) высокий уровень фиксации аминокислоты метионина, меченной углеродом-11 в опухолевой ткани, позволяет с большой степенью точности определить наличие неопластической прогрессии или же её регресса [9, 10]. Однако подобный метод контроля не всегда доступен, особенно для регулярного динамического наблюдения больных в ходе их комплексного лечения.

Известно, что мутационные повреждения структурных генов, а равно как и нарушения их регуляции, могут являться причиной развития и прогрессирования многих опухолевых забо-

леваний, включая ГЦО. Нередко эти процессы реализуются через эпигенетические механизмы, одним из которых является экспрессия различных типов РНК. Показано, что уровень экспрессии микроРНК-21 (последние представляют собой класс небольших некодирующих РНК, приблизительно 21-25 нуклеотидов в длину) в плазме крови и слюне пациентов является весьма специфичным критерием оценки динамики церебральных неопластических процессов [11, 12].

Цель исследования: изучение диагностической значимости динамики показателей экспрессии микроРНК-21 у больных церебральными глиомами без признаков прогрессии или с прогрессией опухолевого роста, верифицированного ПЭТ-исследованием с [11С] метиони-ном.

Материалы и методы

Основную группу составили 50 пациентов (20 мужчин и 30 женщин), в возрасте от 24 до 75 лет (средний возраст 49,5 лет) с диагностированными глиальными церебральными опухолями (ГЦО) или с подозрением на прогрессию опухоли в процессе комплексного лечения. Первые анамнестические указания на ГЦО у большинства пациентов отмечались в среднем за 4,3±1,2 мес. до госпитализации. Все испытуемые посту-

пили в клинику в ясном сознании. У 29,9% больных преобладала очаговая, а у 20,1% - общемозговая симптоматика. Индекс функциональной активности по шкале Карновского, составил 85±2,87 баллов, а по шкале оценки когнитивных функций (MMSE) - 24±3,81.

ПЭТ и МРТ-контроль осуществляли как с целью первичной диагностики ГЦО, так и в качестве мониторинга их комплексного лечения. Чаще опухоль была расположена в пределах лобной (36,3% наблюдений) и теменной долей головного мозга (28,4%), несколько реже в височной (24,6% наблюдений) и затылочной долях (4,7%), мультифокальный рост встречался в 2% случаев, а в 4% наблюдений опухоль располагалась в задней черепной ямке. Инвазия опухоли в подкорковые церебральные структуры отмечена в 10 (20%) случаях.

Всем больным основной группы было выполнено хирургическое вмешательство в рамках стандарта комплексного лечения ГЦО. Предоперационная подготовка у 60% больных включала глюкокортикостероидную (протвоотечную, мембраностабилизирующую) терапию. Согласно данным операционных протоколов, у 51,6% выполнено тотальное и субтотальное удаление ткани новообразования (не менее 75% объема опухолевой ткани), а у 34,4% - парциальное (не менее 50% объема опухоли). Стереотаксическая биопсия применена у 10% больных. Стереотак-сическая биопсия и селективная криодеструк-ция - у 4%. В 2-х случаях наблюдали опухоли субтенториальной локализации, а в остальных 48 - супратенториальной. Согласно гистострук-туре (классификация ВОЗ 2007), церебральные опухоли распределились следующим образом: фибриллярная астроцитома (N=12), фибрил-лярно-протоплазматическая астроцитома (N=3), гемистоцитарная астроцитома (N=2), пилоци-тарная астроцитома (N=1), анапластическая оли-гоастроцитома (N=6), анапластическая астроцитома (N=19), анапластическая нейроцитома (N=1), глиобластома (N=4), глиоматоз (N=1), анапластическая эпендимома (N=1). Всем больным в последующем периоде проводилась адъю-вантная (химио- и лучевая) терапия ГЦО.

Клинико-неврологический статус, данные ПЭТ и нейровизуализационных исследований, а также уровень экспрессии микроРНК-21 при ГЦО в процессе лечения заболевания изучены во всей основной группе больных ГЦО различной степени злокачественности на разных стадиях эволюции опухолевого процесса (прогрессия, стабилизация, ремиссия).

Группу контроля составили 50 человек, из них: 45 потенциально здоровых волонтёров и 5 нейрохирургических больных: с кавернозными ангиомой (N=1), коллоидной кистой III желудочка мозга (N=1), базальными менинги-омами (N=2), менингоматозом (N=1). Всем в контрольной группе проведено исследование уровня экспрессии микроРНК-21.

ПЭТ-исследования проведены на пози-тронно-эмиссионном томографе «Scanditronix PC 2048» (Швеция) с использованием радиофармпрепарата (РФП) L-^етил-ИС]-метионин (11С-метионин). Полученные ПЭТ-изображения исследовались на наличие очага/очагов повышенного накопления 11С-метионина соответственно локализации опухоли.

Нейровизуализацию осуществляли с помощью прибора MRT Achieva 3T. В процессе работы использовались следующие основные принципы в оценке данных ПЭТ и МРТ в мониторинге комплексного лечения ГЦО: полный регресс опухоли - отсутствие очага высокого накопления 11С-метионина при исследовании через 6-12 мес. после начала комплексного лечения; частичный регресс опухоли - более, либо равное 25% уменьшение размера опухоли и/ или снижение её метаболической активности в течение от 3 до12 мес. после начала комплексного лечения; прогрессирование опухоли - более, либо 10% увеличение размера опухоли и/ или увеличение ее метаболической активности, уменьшение послеоперационной полости с возможным появлением новых очагов опухолевой пролиферации; стабилизация неопластического процесса - отсутствие изменений на ПЭТ и МРТ в течение от 3 до12 месяцев после начала комплексного лечения.

Методика определения уровня экспрессии микроРНК-21 в нативном биоматериале заключалась в выделении тотальной РНК с помощью фенольного реактива (Trireagent-LS) и последующей её экстракцией хлороформом. Реакция обратной транскрипции для приготовления «ко-пийной» ДНК проводилась по технологии «Stem Loop» раздельно для микроРНК-21 (праймер 5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TCG CACTGGATACGACTCAAC-3) и U6 , которая рассматривалась как ген сравнения (прай-мер 5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTC GCACTGGATACGACAAAAATATG-3).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась в присутствии интеркалирующего красителя SybrGreen для реализации протокола учета резуль-

татов в режиме реального времени. В качестве прай-меров в ПЦР использовались - для микроРНК-21 (прямой 5- GCCCGCTAGCTTATCAGA CTGATG-3 и обратный 5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3) и для U6 (прямой 5- GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3 и обратный 5-GTGCAGGGTCCGAG GT-3). При расчётах использовалась полуколичественная оценка уровня экспрессии микроРНК-21 (в ОЕ) по протоколу 2-AACt при лабораторном референте (0,09) [13].

Полученную в процессе исследования информацию обрабатывали c использованием компьютерной программной системы STATISTICA for Windows (версия 5.5). Массив исходных данных для 50 испытуемых содержал: клинические, генетические, нейровизуализационные характеристики и данные ПЭТ с 11С метионином. Оценку частотных и качественных показателей проводили с помощью непараметрических методов, c2, поправки Йетса (для малых групп) и критерия Фишера. Сравнение количественных параметров в исследуемых группах осуществляли по критериям Манна-Уитни, Вальда, медианного c2 и модуля ANOVA. Доверительные интервалы для частотных показателей рассчитывали с использованием точного метода Фишера. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину р<0,05[14].

результаты и их обсуждение

У представителей контрольной группы экспрессия микроРНК-21 не превышала значения референта 0,09 ОЕ, причём даже в группе больных с опухолевыми церебральными поражениями (не глиального ряда). Так, в плазме волонтёров (45 человек) уровень микроРНК-21 был 0,047±0,021, а в слюне - 0,030 ± 0,003. У пациентов с кавернозной ангиомой, коллоидной кистой III желудочка мозга, менингиомой и даже менингоматозом микроРНК-21 в плазме был 0,055 ± 0,041, а в слюне - 0,05±0,039.

В основной группе уровень экспрессии ми-кроРНК-21 превосходил значения референта. В результате анализа статистической совокупности наблюдений, исходя из принципа максимальных «дискриминационных свойств», были отобраны, сгруппированы и сопоставлены количественные параметры экспрессии микроРНК-21. Статистически «возможный теоретический максимум» (ТМ) экспрессии микроРНК-21, наблюдавшейся в данном исследовании, составил: в плазме крови 3,56±1,141, в слюне 2,45±0,838. В результате, степени выраженности экспрессии микроРНК-21 получили

применяя традиционным «квартальный» подход. Распределение показателей микроРНК-21 по квартилям приведено в таблице 1.

Таблица 1 распределение показателей микрорнК-21 по квартилям

I квартиль: 0 -25% ТМ I степень экспрессии II квартиль: 25 -50% ТМ II степень экспрессии III квартиль: 50 -75% ТМ III степень экспрессии IV квартиль: 75 -100% ТМ IV степень экспрессии

0,057±0,33 - 0,32± 0,2- 1,45±1,18- 1,79±1,67-

0,32± 0,2 1,45±1,18 1,79±1,67 3,56±2,65

в плазме. в плазме. в плазме. в плазме.

0,037±0,53- 0,1±0,14- 0,28±0,77- 1,6±1,4-

0,1±0,14 1,28±0,77 1,6±1,4 2,45±1,73

в слюне. в слюне в слюне в слюне

Распределение значений экспрессии ми-кроРНК-21 по квартилям высоко коррелировало со степенью злокачественности глиом: г=+0,97.

При степенях экспрессии микроРНК-21 от I до II, сопряжение с индексом Карновского и MMSE было невысоким: г=+0,35, в то время как при степени от III до IV достигало значительного уровня: г=+0,89.

Вышеописанные показатели микроРНК-21 также высоко коррелировали с данными ней-ровизуализации и ПЭТ с 11С метионином. Так, при убедительной ремиссии опухоли определялась экспрессия микроРНК-21 I степени; при стабилизации роста глиомы они соответствовали II-III степени (г=+0,77), а при её прогресси-ровании - IV ( г=+0,96).

На рисунке 1 графически представлен уровень экспрессии микроРНК-21 в статистическом массиве.

рис. 1. Распределение статистического массива по экспрессии микроРНК-21 в плазме крови и слюне в сравнении контрольной и основной групп

У 5 больных (10,0%) основной группы при нейровизуализационном МРТ-контроле с контрастным усилением были выявлены признаки перифокального отёка и накопления контраста в области ложа удаленной опухоли, что могло свидетельствовать о прогрессии новообразования. Однако при ПЭТ-исследовании с метио-нином (у этих же больных) продолженный рост глиомы был исключён. Это обстоятельство позволило верифицировать лучевое поражение головного мозга в качестве причины отрицательной динамики при МРТ-нейровизуализации.

Более чем у половины больных (55%) нарастание размеров опухоли сопровождалось увеличением индекса накопления метионина (ИН) при ПЭТ, что отражало рост метаболической активности ГЦО. Средний ИН при продолженном росте ГЦО составил 2,3±0,71 и значимо отличался от ИН в группе больных со стабилизацией или регрессом ГЦО: ИН =1,48±0,46 (р<0,05). Сопряжённость степени экспрессии микроРНК-21 и ИН 11 С метионина при ПЭТ показана в таблице 2.

Таблица 2

сопряжённость степени экспрессии микрорнК-21 и ин 11 с метионина при ПЭт (г=+0,96).

I степень экспрессии II степень экспрессии III степень экспрессии IV степень экспрессии

ИН<1,4 ИН= 1,48±0,46 ИН= 2,3± 0,71 ИН= 2,62± 0,24

заключение

Методика ПЭТ с метионином позволяет определить изменения в биологическом поведении опухоли, что делает возможным оптимизацию серийных исследований. При этом более чем у трети больных повышение метаболического статуса опухоли может опережать появление структурных признаков прогрессирования ГЦО по результатам МРТ. Это обосновывает объективные критерии для своевременной коррекции или инициации лечения до появления клинических появлений заболевания.

Однако ПЭТ остается малодоступной для основной части нейроонкологических больных, поскольку высокая стоимость, определённая лучевая нагрузка, малое количество ПЭТ-центров в нашей стране ограничивают применение этого метода и заставляют тщательно определять показания к его применению. С этих позиций, новые возможности предоставляет исследование экспрессии

микроРНК-21. Проведенное сопоставление результатов МРТ, ПЭТ, а также эпигенетических исследований (микроРНК-21) демонстрирует возможности и перспективы развития последних в мониторинге эволюции ГЦО, эффективности проводимого комплексного лечения и, наконец, позволяет расширить оптимальный алгоритм диспансерного наблюдения больных.

Выводы

1. Динамическое наблюдение за больными с церебральными глиомами при помощи ПЭТ с [11С] метионином представляет собой надежный метод раннего обнаружения опухолевой прогрессии и качественного изменения её ги-стоструктуры (r=+78).

2. Развитие ГЦО сопровождается убедительным ростом экспрессии микроРНК-21, что отражает эпигенетические проявления генетических дисфункций.

3. Методика определения уровня экспрессия микроРНК-21 высокоспецифична для диагностики ГЦО в сравнении с прочими патологическими (включая онкологические) процессами центральной нервной системы (р<0,001).

4. Уровень экспрессии микроРНК-21 у больных ГЦО высоко коррелирует с таким высокоточным методом, как ПЭТ-исследование с 11 С метионином (r=+0,96).

5. Доступность метода определения динамики микроРНК-21 в ходе наблюдения за больными ГЦО позволяет обосновать показания к проведению ПЭТ-исследования.

литература

1. Зозуля, Ю.А. Глиомы головного мозга. — Киев, 2007. — 632 с.

2. Никифоров В.М., Мацко Д.Е. Опухоли головного мозга. — Спб, 2003, — 320 с.

3. Олюшин, В.Е. Глиальные опухоли головного мозга: краткий обзор литературы и протокол лечения больных// Нейрохирургия. — 2005. — №4 — С.41-47.

4. Wen, P. Y. Updated Response Assessment Criteria for High-Grade Gliomas: Response Assessment in Neuro-Oncology Working Group / P. Y. Wen, D. R. Macdonald, D. A. Reardon et al. // J. Clin. Oncol. — 2010. —Vol. 28. — P. 1963 - 1972.

5. Скворцова, Т.Ю., Бродская З.Л., Гурчин А.Ф. Диагностика ранних метаболических признаков прогрессии церебральной глиомы при помощи ПЭТ с 11С-метионином. // Российский нейрохирургический журнал имени профессора А.Л. Поленова, 2012. —Том IV, — № 1— С. 41—47.

6. Brandsma, D. Pseudoprogression and pseudo-response in the treatment of gliomas / D. Brandsma,

M. J. van den Bent // Curr. Opin. Neurol. —2009. —Vol. 22.—P. 633—638.

7. Greenberg, H. S. Brain Tumors / H. S. Green-berg, W. F. Chandler, H. M. Sandler. - New-York.: Oxford University Press, 1999. — 324 p.

8. Blandes, A. A. Disease progression or pseudoprogression after concomitant radiochemotherapy treatment: pitfalls in neurooncology / A. A. Blandes., A. Tosoni, E. Spagnolli et al. // Neuro-Oncol-ogy. —2008. —Vol. 10. — P. 361—367.

9. Skvortsova, T.Yu, Brodskaya Z.L., Savint-seva Zh.I. PET using [11C]methionine for differentiation of pseudoprogression from true glioma progression after combined treatment. // Neu-roradiology.— Vol. 53. —Suppl.1, —September 2011, — P. 76.

10. Nakajima, T. Differential diagnosis between radiation necrosis and glioma progression using sequential proton magnetic resonance spectroscopy and methionine positron emission tomography / T. Nakajima, T. Kumabe, M. Kanamori et al. // Neurol. Med. Chir. (Tokyo). —2009. —Vol. 49. -P. 394—401.

Р.Ю. Селиверстов E-mail: ruseliv@mail.ru

11. Han, L. MicroRNA-21 expression is regulated by beta-catenin/STAT3 pathway and promotes glioma cell invasion by direct targeting RECK/ X.Yue, X. Zhou, FM. Lan, G. You, W. Zhang, KL. Zhang, CZ. Zhang, JQ. Cheng, SZ. Yu, PY. Pu, T. Jiang, CS. Kang // CNS Neurosci Ther. —2012.— Vol. 18. — P. 573-583.

12. Quintavalle, C. Effect of miR-21 and miR-30b/c on TRAIL-induced apoptosis in glioma cells/ E. Donnarumma, M. Iaboni, G. Roscigno, M.Garofalo, G.Romano, D. Fiore, P. De Marinis, CM. Croce, G. Condorelli// Oncogene - 2012. -Vol. 36. — P. 4001-4008.

13. Ling, M. Regulation of miRNA-21 by reactive oxygen speciesactivated ERK/NF-kappaB in arsenite-induced cell transformation/ Y. Li, Y. Xu, Y. Pang, L. Shen, R. Jiang, Y. Zhao, X. Yang, J. Zhang, J. Zhou, X.Wang, Q. Liu// Free Radic Biol Med - 2012 - Vol. 52. —P.1508-1518.

14. Бююль, А. SPSS: искусство обработки информации. Анализ статистических данных и восстановление скрытых закономерностей / А. Бююль, П. Цефель. - СПб.: ДиаСофтЮП, 2002. - 608 с.

Р.Ю. Селиверстов, М.И. Зарайский, А.А. Сазанов, Е.Е. Зуева, С.В. Лобзин, А.Ф. Гурчин, Н.В. Стерликова, К.П. Гайдаенко, М.Б. Волов, О.И. Тймонина, Н.В. Толстых Клиническое значение микроРНК-21 в мониторинге роста церебральных глиом // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. - 2015. - Том 7, № 4. - С. 47-51.

CLINICAL siGNIFICANCE of MICRoRNA-21 expression IN MoNITORING

of tumor progression with cerebral gliomas

R.Yu. Seliverstov 1-3, M.I. Zarayskiy2, A.A. Sazanov2, E.E. Zueva2, S.V. Lobzyn3, A.F. Gurchin 1, N.V. Sterlikova1, K.P. Gaidaenko 1, M.B.Volov 1, O.I. Tymonina3, N.V. Tolstyh 1 1 N.P. Bekhtereva Institute of the Human Brain of the Russian Academy of Sciences 2 First Pavlov State Medical University of St. Peterburg 3 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

The early verifying of cerebral's gliomas progression is an actual problem. It was found that the level of mircroRNA-21 expression is a highly specific in a tumor's evolutional process. That the aim of the study was the assessment with level of mircroRNA-21 expression in blood and saliva of patients with cerebral glioma progression and patients without it which were verified by PET using [11C] methionine. It was found that in majority of cases, the negative dynamics of cerebral neoplastic lesions coincided with an increase in metabolic changes in the residual glioma and highly correlated with the level of mircroRNA-21 expression. This allows us to consider a highly significant the level of mircroRNA-21 expression as a screening technique in monitoring the evolution of the tumor process and the effectiveness of the treatment.

Key words: cerebral glioma, level of microRNA-21 expression MRI, PET with 11C - methionine, monitoring of cerebral's gliomas progression.

Authors

R.Yu. Seliverstov E-mail: ruseliv@mail.ru

R.Yu. Seliverstov, M.I. Zarayskiy, A.A. Sazanov, E.E. Zueva, S.V. Lobzyn, A.F. Gurchin, N.V. Sterlikova, K.P. Gaidaenko, M.B.Volov , O.I. Tymonina , N.V. Tolstyh Clinical significance ofmicroRNA-21 expression in monitoring oftumor progression with cerebral gliomas // Herald of the Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov. — 2015. — Vol. 7, № 4 - P. 47-51.