КОДИРУЮЩАЯ ДНК (кДНК) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ ВИРУСА ГЕПАТИТА С, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ
CODING DNA (cDNA) FOR MAKING VIRUS-LIKE PARTICLES OF HEPATITIS C VIRUS, METHOD FOR MAKING VIRUS-LIKE PARTICLES AND BASED PHARMACEUTICAL COMPOSITION

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается средств предотвращения и лечения состояний, связанных с вирусом гепатита С (Hepatitis С virus=HCV), а также их диагностики.
Вирус гепатита С (Hepatitis С virus=HCV) относится к семейству Flaviviridae и вызывает у людей инфекционный процесс, наиболее часто встречаемым осложнением которого является гепатит, перерастающий в цирроз печени и гепатокарциному. Это заболевание поразило более чем 170 миллионов человек на Земле и количество инфицированных продолжается увеличиваться. Аналитики здравоохранения оценивают потери, связанные с этим заболеванием только в Соединенных Штатах, в 200 миллионов долларов ежегодно.
Инфицированные HCV в абсолютном большинстве случаев не испытывают проблем со здоровьем или у них очень слабые симптомы, тогда как при длительном развитии инфекции часто возникает гепатит, характеризующийся болями и нарушением функций печени. У людей, которые были инфицированы, появляются анти-HCV антитела, а спустя некоторое время и вирусная РНК в крови. В значительном проценте случаев вирусная РНК в крови не определяется. В настоящее время не существует коммерчески доступных HCV вакцин.
Помимо своих инфекционных характеристик HCV инфицирует лимфоциты, дендритные клетки кожи, миоциты, клетки глии, и поэтому может вызывать внепеченочную патологию: псориаз, миокардит, различные нейропатии, васкулит. HCV был также обнаружен в образцах тканей от умерших до 1987 года (дата описания вируса) людей. Кроме того, по всему миру насчитывается порядка около 1,5 млн случаев гепатокарциномы, вызванной инфекцией HCV генотипа 1b. Методы лечения для HCV были и остаются основанными на одновременном применении препаратов генно-инженерного интерферона и одного или двух ингибиторов размножения вирусов (ингибиторов вирус специфических протеазы - геликазы или (и) РНК-полимеразы). В лечебный коктейль клиницисты пробуют ввести ингибиторы Toll-7 или Toll-9 рецепторов, которые используют вирус для заражения клеток иммунной системы. Известны разработки, направленные на использование других подходов для ингибирования размножения вируса в зараженной клетке. Однако из-за значительного количества разнообразных осложнений, вызываемых введением препаратов генно-инженерных интерферонов, исследователи продолжают поиски препаратов, применение которых снизит процент осложнений от введения таких препаратов.
На этом стратегическом направлении самыми перспективными выглядят поиски различных индукторов системы интерферона. Первым стал антагонист Toll-7 рецептора «Imiquimod», входящий в состав мази Aldara (ЗM Pharmaceuticals), накожное применение которого с 1999 года разрешило FDA. Его индуцирующая интерферон активность позволяет достигать 50-кратного, по сравнению с нормой, увеличения концентрации интерферона в культуре моноцитов периферической крови человека (МПКЧ). Наиболее сильным из известных индукторов интерферона 1-го типа является фосфотиоатный олигонуклеотид ODN2216, который является сильным активатором Toll-9 сигналинга (10000-кратная активация образования интерферона МПКЧ, наступающая после связывания индуктора с рецептором Toll-9). Однако широкомасштабный химический синтез ODN2216 стоит дороже производства генно-инженерных интерферонов.
Природными активаторами синтеза МПКЧ интерферонов 1-го типа являются инактивированные вирионы различных вирусов. Однако широкое использование инактивированных вирионов сдерживается требованиями к биологической безопасности технологии и получаемых препаратов, а также необходимостью использования для целей получения вируса исключительно линии клеток ВНК21, для которой в России разработаны промышленные регламенты культивирования, но которая до настоящего времени не позволяла получать вирионы с нужными свойствами. Преодолеть указанные выше противоречия позволяет технология получения псевдовирионов, рекомбинантно-инактивированных вирусоподобных частиц, которые не содержат внутри себя нуклеиновой кислоты.
В литературе известны рекомбинантно-полученные, частично очищенные препараты неинфекционных HCV-подобных вирионов. В большинстве случаев процесс очистки HCV-вирионов не приводит к желаемым результатам, так как вирионы в сыворотке находятся в составе неспецифических иммунных комплексов и липопротеинов низкой и очень низкой плотности. Процесс выделения вируса после размножения в культурах клеток не свободен от подобных проблем, так как вирус выходит в среду с 10% сывороткой, содержащей иммуноглобулины, а также липопротеины низкой и очень низкой плотности. Из популяции инфекционных вирионов HCV-подобные выделяют при помощи центрифугирования в градиенте CsCl («полоса» с плавучей плотностью <1,36 г/см). РНК в HCV-подобных вирионах находят в сравнительно меньших количествах, что происходит за счет делеционного укорочения геномной РНК. Делеции затрагивают последовательности не только в кодирующей рамке трансляции - ORF, но и в нетранслируемых концевых последовательностях - UTR's. Первые могут приводить к утрате около 50% всей РНК, что составляет почти 4 т.п.о. Укороченная в результате делеций ORF геномная РНК теряет инфекционные свойства. Однако до сих не были сконструированы ДНК последовательности, обеспечивающие эффективную экспрессию структурных белков HCV в клетках культивируемых в бессывороточной среде, что обеспечило сборку чистых вирионов, которые не облают индуцирующей интерферон активностью. Не были также сконструированы рекомбинантные плазмиды, которые бы программировали клетки на образование HCV псевдовирионов в большом количестве. Методический подход, согласно которому для трансляции двухцистонной РНК используют внутренние IRES сайты, не позволяет достичь образования клетками большого количества HCV псевдовирионов. Дополнительная литература включает следующие работы и обзоры:
Заболевание в общем плане описаны в Surveillance. Hepatitis. CDC Report №61. 2006. Внепеченочные проявления HCV инфекции описано у М. Ramos-Casals et al. Sjogren's Syndrome and Hepatitis С Virus. Clin RheumaToll. 1999, v.18, p.93-100.
Описание HCV особенностей открытой рамки трансляции приведено у Satoshi Ogata et al. Comparative Sequence Analysis of the Core Protein and Its Frameshift Product, the F Protein, of Hepatitis С Virus Subtype 1b Strains Obtained from Patients with and without Hepatocellular Carcinomaio J. Clin. Mi-crob. 2002, v. 40, №10, p.3625-3630.
Описание ДНК и аминокислотных последовательностей HCV приведены в статье Nagayama К. et al. Time-related changes in full-length hepatitis С virus and hepatitis activity. Virology 1999, v.263, №1, p.244-253 и в патентной заявке США 20060035335.
Особенности репликации HCV РНК раскрыто у ZHANG G. et al. Conformational changes involved in initiation of minus-strand synthesis of a virus-associated RNA, RNA2006, v.12, p.147-162.
Особенности культивирования вируса ящура на клеточной линии ВНК21 раскрыто у С.Escarmis et al. Rapid Selection in Modified BHK-21 Cells of a Foot-and-Mouth Disease Virus Variant Showing Alterations in Cell Tropism, J Virol, 1998, v. 72, №12, p.10171-10179.
Особенности размножения и репликации вируса ящура раскрыто у М. J. Grubman and В. Baxt. Foot-and-Mouth Disease, Clin. Microb. Reviews 2004, v.17, №2, р. 465-493.
Описание различных геномов и их сравнительная характеристика дана у С.Carrillo et al. Comparative Genomics of Foot-and-Mouth Disease Virus, J Virol, 2005, v. 79, №10, p.6487-6504.
В качестве уровня техники могут быть указаны следующие источники:
Известен способ получения псевдовирионов и Isolation of a cDNA clone derived from a blood-bome non-A, non-B viral hepatitis genome, QL Choo, G Kuo, AJ Weiner, LR Overby, DW Bradley, and M Houghton (это основа, на которой построены большинство методов получения псевдовирусных частиц).
Mizuno M. et al. Virion-like structures in HeLa G cells transfected with the full-length sequence of the hepatitis С virus genome. Gastroenterology 1995, v.109, p.1933-1940.
Kolykhalov A. A. et al. Transmission of hepatitis С by intrahepatic inoculation with transcribed RNA // Science 1997, v.277, p.570-574.
Baumert T.F. et al. The hepatitis С virus structural proteins assemble into viruslike particles in in-sect cells. J Virol. 1998;72:3827- 3836.
Beard M. et al. An infectious clone of a Japanese genotype 1b hepatitis С virus // HepaTollogy 1999, v.30, p.316-324.
Baumert T.F. et al. Hepatitis С Virus-like Particles Synthesized in Insect Cells as a Potential Vac-cine Candidate // GASTROENTEROLOGY 1999; 117:1397-1407.
Owsianka A. et al. Functional analysis of hepatitis С virus E2 glycoproteins and virus-like particles reveals structural dissimilarities between different forms of E2 // J. Gen. Virol. 2001, v. 82, p.1877-1883.
Wellnitz S. et al. Binding of hepatitis С virus-like particles derived from infectious clone H77C to defined human cell lines // J. Virol. 2002, v.76, p.1181-1193.
Xiang J et al. Recombinant hepatitis С virus-like particles expressed by baculovirus: utility in cell-binding and antibody detection assays // J. Med. Virol. 2002, v.68, p.537-543.
Miriam Triyatni et al. Interaction of Hepatitis С Virus-Like Particles and Cells: a Model System for Studying Viral Binding and Entry // JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2002, v. 76, №18, p.9335-9344.
Сивов И.Г. и др. Генетический антивирус против вируса гепатита С // Доклады Академии наук 2003, т.392, №5, стр.1-4.
Zhao Wei et al. Expression and self-assembly of HCV structural proteins into virus-like particles and their immunogenicity // Chin Med J 2004, v.117, №8, p.1217-1222.
Tazio Storni et al. Nonmethylated CG Motifs Packaged into Virus-Like Particles Induce Protective Cytotoxic Т Cell Responses in the Absence of Systemic Side Effects // The Journal of Immunology, 2004, v.172, p.1777-1785.
Heidi Barth et al. Uptake and presentation of hepatitis С virus-like particles by human dendritic cells // Blood, 1 May 2005, v. 105, №9, p.3605-3614.
В качестве ближайшего аналога может быть указан например патент US 6387662, описывающий способ получения и очистки гепатит С вирусоподобных частиц.
Введение в клетки человека, животных и насекомых кДНК вируса гепатита С (ВГС) позволяет программировать образование и выход инфекционных вирусных частиц. Для получения псевдо-HVC (псевдо-ВГС) частиц каждая научная группа использует по-своему модифицированные кДНК. Таких модификаций может быть множество.
Однако только настоящим изобретением была решена задача эффективного получения очищенных неинфекционных вирусоподобных частиц вируса гепатита С в большом количестве и разработаны композиции на их основе, которые индуцируют образование интерферонов и других цитокинов в организме человека.
Задача была решена использованием двух РНК со структурами, которые содержали модификации по сравнению с природными геномными последовательностями.
Предложена система плазмидных ДНК, программирующих клетки линии ВНК21 на образование вирусоподобных частиц вируса гепатита С, которые не содержат нуклеиновой кислоты. Вирусоподобные частицы вируса гепатита С используются в фармацевтической композиции для индукции системы интерферона in vivo. Плазмидные ДНК составлены из векторной части, которая позволяет нарабатывать их в бактериальной клетке-хозяине, а после выделения и трансфекции вызывать образование структурных для вируса гепатита С белков и сборку их в вирусоподобные частицы. ДНК в составе векторов транскрибируются исключительно после трансфекции, в результате которой образуется два вида РНК. Одна из них кодирует неструктурные белки репликативного комплекса вируса ящура, которые способны реплицировать другой вид РНК, кодирующий структурные белки вируса гепатита типа С.
Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложены варианты кДНК последовательности HCV субтипа 1b, кодирующие образование белков вирусоподобных частиц. ДНК последовательности настоящего изобретения могут включать выделенную кДНК последовательность, которая кодирует экспрессию гомогенных белков вирусоподобной частицы.
Кодирующая ДНК (кДНК) для получения вирусоподобных частиц вируса гепатита С, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:1, приведена на фиг.1.
Одна кДНК последовательность, полученная с фрагмента генома HCV, включает 51 некодирующую последовательность (5'-UTR), фланкирующую кодирующую последовательность. Чтобы РНК, транскрибируемая с такой кДНК, могла использоваться репликативным механизмом вируса ящура, в ее состав включены необходимые мотивы. Структура франкирующих ORF некодирующих последовательностей в такой ДНК показана на фиг.1. ДНК последовательности вариантов настоящего изобретения получают за счет введения мутаций и новых мотивов в представленную на фиг.1 ДНК последовательность, кодирующую образование структурных белков вирусоподобных частиц. Это исключает продуцирование дефектного протеина, так что продуцируется только
αpep
«C-E1-E2-p7-β-gal» полипротеин.
Соответственно, другой аспект изобретения включает протеины репликативного комплекса вируса ящура и способы получения HCV протеинов с РНК-репликона, кодируемого второй кДНК последовательностью в клетках эукариот. Мы отмечаем, что протеины, рекомбинантно-полученные в клетках млекопитающих с помощью второй кДНК, полученной с геномной РНК вируса ящура, насколько нам известно, никогда не упоминались в научной литературе в таком контексте.
Предложена бинарная система рекомбинантных ДНК, которые включают векторную часть и последовательности, кодирующие укороченные
αpep
αpep
αpep
«C-E1-E2-p7-β-gal» и «Р2-Р3» полипротеины. РНК молекула, транскрибируемая со второй кДНК, обеспечивает образование «Р2-Р3» полипротеина, способного к посттрансляционной модификации, после которой белковый комплекс способен вызывать в клетках линии ВНК21 репликацию РНК, кодирующей образование «C-E1-E2-p7-β-gal». Модифицированные клетки хозяина, трансформированные бинарной системой рекомбинантных ДНК, экспрессируют «C-E1-E2-p7-P-gal» и «Р2-Р3» полипротеины, также предоставлены в этом изобретении.
ДНК молекулы и трансформированные клетки хозяев в настоящем изобретении используют в другом аспекте изобретения - в новом способе получения рекомбинантных гомогенных вирусоподобных частиц, способных после очистки вызывать индукцию синтеза интерферонов и других цитокинов у МПКЧ in vitro и in vivo. В этом способе клеточную линию, трансформированную бинарной системой рекомбинантных ДНК, культивируют в соответствующих условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантных вирусоподобных частиц. Полученные вирусоподобные частицы собирают из среды культивирования при помощи аффинных магнитных микрочастиц.
В качестве клеток хозяина в этом способе использовали клетки линии ВНК21, которые в настоящее время являются предпочтительным объектом для создания лабораторных и промышленных регламентов в биотехнологии России.
ДНК последовательности и протеины настоящего изобретения можно использовать при получении терапевтических и иммуногенных соединений, содержащих HCV и FMDV антигенные детерминанты. Такие соединения находят применение для профилактики, лечения и диагностики заболеваний, которые связаны с HCV и гепатокарциномой. Соответственно, в еще одном аспекте настоящего изобретения представлены диагностические композиции для проведения диагностики методом ОТ-ПЦР связанных с HCV состояний и заболеваний у человека. Такие диагностические композиции включают вирусоподобные частицы, содержащие РНК, кодирующую гены структурных белков, физиологический раствор или физиологический раствор, приготовленный на фосфатном буфере, так как это известно специалистам. Под "диагностическими композициями" подразумевают количества вирусоподобных частиц, которых достаточно для обнаружения в пробах сыворотки у человека как с антителами к HCV, так и без них. В других вариантах активный ингредиент можно вводить в другие диагностические препараты.
В следующем аспекте изобретения предложен способ индукции комплекса интерферонов (цитокинов), связанных с HCV заболеваниями и иммунодефицитными состояниями путем введения пациенту, в частности человеку, иммуногенно-индуцирующего терапевтически эффективного количества вирусоподобных частиц в подходящей фармацевтической препаративной форме. Еще одним способом изобретения является способ стимуляции неспецифической защитной реакции против некоторых других вирусов за счет введения пациенту иммуногенно-индуцирующего терапевтически эффективного количества вирусоподобных частиц в подходящей фармацевтической препаративной форме.
Фиг.1 иллюстрирует структуру плазмид pHCV и pFMDV, a именно: SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Последовательности, кодирующие образование функционально существенных белков, даны в однобуквенном коде ниже соответствующих нуклеотидных, разделены по указанным в тексте белкам и подчеркнуты.
На фиг.2 изображена схема получения фармацевтической композиции на основе вирусоподобных частиц.
Фиг.3 иллюстрирует результаты определения индуцирующей активности препарата in vitro. А. Бляшки вируса везикулярного стоматита на культуре ВНК21, не обработанной индуктором; Б.Бляшки вируса везикулярного стоматита на культуре ВНК21, обработанной индуктором.
На фиг.4 представлены результаты определения индуцирующей активности препарата in vivo.
кДНК последовательности обеспечивают образование вирусоподобных частиц, полностью лишенных инфекционной нуклеиновой кислоты. Система введения в клетки кДНК позволяет вводить две или три разные по структуре последовательности, что открывает возможность программировать клетки не только на образование вирусоподобных частиц, но также получать вирусоподобные частицы с молекулами РНК различной структуры. Это достигается использованием протокола Tat-трансдукции, описанным Carsten R. et al. Oligomers of the Arginine-rich Motif of the HIV-1 TAT Protein Are Capable of Transferring Plasmid DNA into Cells // J. Biol. Chem. 2003, v.278, №13, p.11411-11418.
Настоящее изобретение включает модификации нескольких или всех сигналов из кДНК, полученных с геномных РНК последовательностей, которые должны выражаться в клетках линии ВНК21. Мутации вводили для предотвращения сдвига рамки «С» белка, когда он экспрессирует в клетках линии ВНК21. В результате получают мРНК транскрипты, кодирующие только белки вирусоподобной частицы. Возможная продукция «F» белка не существенна для продуцирования вирусоподобных частиц, так как «F» белок не содержит потенциально антигенные сайты, находящиеся на вирусоподобной частице.
Поэтому в настоящем изобретении используют бинарную систему рекомбинантных ДНК, кодирующих практически такие же неструктурные белки, как вирус ящура, а также белки вирусоподобных частиц за исключением того, что кодоны для вирус специфических протеолитических сайтов, кодирующие различные аминокислоты, заменены на уникальный сайт PYEGP благодаря модификациям, проведенным за счет замены нуклеотидов. Предпочтительно нативные нуклеотиды заменять ненативными нуклеотидами таким образом, чтобы сохранять «рамку трансляции». Так, например, шестичленный нуклеотид TCAAGA заменяют триплетом нуклеотидов GGG соответственно. В результате такой замены сайт PYEGP и ему подобные изменен на PWTP. В результате указанной модификации в сайте фланкирующие остатки пролина остаются теми же. Замещения, отличающиеся от приведенных, могут быть осуществлены специалистами.
Настоящее изобретение предлагает более простой метод выделения вирусоподобных частиц, так как они могут служить «меткой» плавучей плотности для выделения и очистки фармацевтических композиций. Клеточная экспрессия кДНК конструкций упрощает выделение белков вирусоподобных частиц. Это снижает стоимость их получения. Настоящее изобретение также делает более простым получение исходного материала для выделения вирусоподобных частиц. Благодаря наличию только одного вида частиц анализ содержания белков и анализ их аминокислотной последовательности можно осуществлять без учета присутствия других частиц.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает преимущество усиленного продуцирования вирусоподобных частиц. В клетках линии ВНК21, как было установлено, концентрация вирус специфического белка составляет до 3-10% от общей концентрации.
Белки вирусоподобных частиц, кодируемые единственной рамкой считывания, программируются последовательностью из 3900 оснований, кодирующих 1300 аминокислот и определяющих продукт первичной трансляции около 145 кД. Различие между предсказанным и реальным значениями связано с интенсивным гликозилированием белков Е1 и Е2. Кажущийся молекулярный вес генного продукта может также меняться в зависимости от утилизации сайтов гликозилирования и различных типов клеток линии ВНК21. Термин "полипротеин" относится к транслируемому продукту до модификаций, имеющему молекулярный вес примерно 127 кД. Консенсусные последовательности для гликозилирования, выявленные экпериментально на различных модельных системах и на других белках, имеют вид: ASP-X-(SER)-THR.
Настоящее изобретение описывает композиции, полученные с использованием сайтов конститутивного протеолиза штамма 1b HCV для продукта трансляции геномной РНК с 342 основания от 5'-конца. кДНК последовательность, которая была использована в примерах, имеет укороченную 5'-UTR последовательность. В ней отсутствует 60-членная Cap-последовательность, которую узнает «С» белок при формировании рибонуклеопротеина. В других вариантах кДНК, которые можно использовать для создания вирусоподобных частиц, содержащих РНК, содержится Cap-последовательность в соответствии с имеющимися здесь указаниями, что будет продуцировать вирусоподобные частицы с РНК.
Вирусоподобные частицы имеют низкую антигенность, но обладают значительными иммуногенными свойствами, не специфичными для конкретного штамма HCV, и поэтому пригодны для использования в иммуногенных и/или терапевтических фармацевтических композициях для лечения заболеваний, связанных с HCV. В таблице 1 представлен результат индукции INF-α/β при введении фармацевтической композиции на основе вирусоподобных частиц в переживающую культуру мононуклеаров периферической крови человека (МПКЧ).
Чтобы индуцировать образование цитокинов фармацевтической композицией на основе вирусоподобных частиц, в переживающую культуру МПКЧ вводят до 100 мкг белка/мл композиции и инкубируют смесь в среде RPMI1640 с 5% фетальной бычьей сыворотки. В качестве положительного контроля используют фосфоротиоатный олигонуклеотид ODN2216, описанный Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu. Rev. Immunol. 2002. v.20, p.709-760. В качестве отрицательного контроля используют прогретую композицию на основе вирусоподобных частиц (100 мкг белка/мл). Как было показано ранее, для придания нефункциональности композиции на основе вирусоподобных частиц ее следует прогреть в течение 30 минут при 92°С. Меньшие температуры прогрева не позволяют инактивировать композицию.
Обработки различными ферментами композиции на основе вирусоподобных частиц давали невоспроизводимые результаты.
450
Хотя один из аспектов настоящего изобретения включает неспецифический вариант индукции INF-α/β и INF-γ, может оказаться желательным дополнительное описание использования кодирующих последовательностей. Для получения функционально активных протеинов, а именно: "ER протеинов", ассоциированных с мембраной эндоплазматического ретикулума, чтобы избежать проблем сборки вирусоподобной частицы, возникающих при недостаточной экспрессии мембранного аппарата, клеточный обмен модифицируют предварительной обработкой клеток одним из индукторов цитохрома Р450. Предпочтительно, чтобы, по крайней мере, спектрофотометрически присутствие цитохрома Р450 было зафиксировано на уровне OD>0,15. Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения предложены условия, выполнение которых позволяет достичь, по крайней мере, значительного увеличения массы ER-мембран.
Эти варианты кДНК последовательностей можно сконструировать, используя хорошо известные специалистам способы. Модифицированные кДНК последовательности настоящего изобретения можно экспрессировать рекомбинантно, используя не только известные способы для выделения плазмидной ДНК из бактериальных клеток носителей, но и с использованием препаративной высокоточной ПЦР технологии. Такие рекомбинантные плазмиды можно выделить и включать в фармацевтические композиции для профилактического лечения и предотвращения заболеваний, связанных с вирусом гепатита С.
131
Трансформацию клеток линии ВНК21 осуществляют, используя методику с 11-членным PTD-фрагментом Tat-белка со структурой YGRKKRRQRRR, как указано в статье Jong-Sub Yoon et al. J. Microb. 328, 42(4), (2004). Конструирование плазмид, содержащих последовательности вируса гепатита С и ящура, с дополнительными модификациями или без них, осуществляют используя обычные методики лигирования и рестрикции, хорошо известные специалистам. Сайт-специфическое ДНК расщепление осуществляют, обрабатывая подходящим рестрикционным ферментом или ферментами в стандартных условиях, в частности в тех, которые обычно указываются изготовителями рестрикционных ферментов. Для разделения по размерам расщепленных фрагментов использовали электрофорез на геле, используя стандартные методики, для репарации однонитевых концов фрагментов при помощи фрагмента Кленова ДНК полимеразы I E.coli. Обработка S1 нуклеазой в условиях, известных специалистам, позволяет гидролизовать любые однонитевые ДНК. Синтетические олигонуклеотиды получали диэтилфосфоамидитным способом, известным специалистам. Лигирование осуществляли, используя ДНК-лигазу бактериофага Т4 в стандартных условиях и температурах и правильность лигирования подтверждали трансформируя Е. coli лигирующей смесью. Трансформанты отбирали по устойчивости к ампициллину, тетрациклину или другим антибиотикам, или используя другие известные специалистам маркеры. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ее модификации проводили в условиях, которые рассчитывали способами и с помощью программ, встроенных на Интернет-сайтах, известных специалистам. Определение ферментативных активностей проводили способами, известными специалистам. Определение токсичности вирусоподобных частиц проводили на подсвинках и культурах стволовых клеток человека способами, известными специалистам. Вирусоподобные частицы гепатита С получали методом лактопероксидазного йодирования, определения J в моче, интерферонов-α/β, -γ в пробах, проводили способами, известными специалистам. Группу добровольцев формировали согласно рекомендациям FDA (Контрольной комиссии за производством продуктов питания и лекарственных препаратов США) собранным в Belmont Report 18.04.1979. «Качество жизни» определяли по протоколу QL-36.
Методики полностью раскрыты в соответствующей литературе. См.: Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2D ED, (1989); DNA CLONING, Vol 1 and 11 (DN Glover ed 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (MG Gait ed 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (BD Hames ed 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (BD Hames 1984); ANIMAL CELL CULTURE (Rl Freshney ed 1986); В. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (JH Miller ed 1987 Cold Spring Harbor Laboratory); Scopes PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, 2nd ed, (1987 Springer-Verlag NY) and HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY Vols 1-IV (DM Weired 1986); KRUG A. ET AL. IDENTIFICATION OF CPG OLIGONUCLEOTIDE SEQUENCES WITH HIGH INDUCTION OF IFN-α/β IN PLASMACYTOID DENDRITIC CELLS. EUR. J. IMMUNOL. 2001, V.31, №5: 2154-2163; JOHN E. W. JR. SF-36 HEALTH SURVEY UPDATE // http://www.sf-36.com; JACOBS J. SEROLOGICAL STUDIES ON IODINATED SERA. 1 PRECIPITINES AND PRERCIPITINOGENS // J. IMMUNOL. 1932, V. 23, PP. 361-374; СИВОВ И.Г. И ДР. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНТИВИРУС ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С // ДОКЛАДЫ РАН 2003, Т. 392, №5, СТР. 1-4. Все указанные публикации включены сюда со ссылками.
4
4
Соответственно, в следующем аспекте изобретение включает векторы, содержащие кДНК последовательности, и подготовленные клетки-хозяев. Далее способ включает получения вирусоподобных частиц за счет трансфекции клеток линии ВНК21 плазмидами, выделенными из бактерий или полученных препаративным ПЦР, которые несут кДНК последовательности, оперативно связанные с экспрессией репликативного комплекса вируса ящура и белков вирусоподобных частиц, а также контролирующих репликацию РНК, кодирующую образование последних в условиях культивирования, которые обеспечивают образование массы мембран эндоплазматического ретикулума (ER-мембран). Образованные вирусоподобные частицы выделяются из разрушающихся клеток и выходят в культуральную среду. Используя метод осаждения вирусоподобных частиц на лактоферине, мобилизованном на магнитных микрочастицах, извлекали вирусоподобные частицы из культуральной среды, содержащей разрушенные клетки, что является методом магнитоаффинной сорбции. После KCl-элюирования, диализа и стерилизующей фильтрации получали композицию на основе вирусоподобных частиц. Для крупномасштабного производства коммерчески значимых количеств вирусоподобных частиц при использовании в вакцинных композициях предпочтительны сочетания дифференциального NHSO осаждения и ультрафильтрации или лектиновые колонки. Небольшие количества фармацевтических композиций наиболее легко выделять, используя дифференциальное ПЭГ-6000/NaCl осаждение. Небольшие количества фармацевтических композиций использовали в экспериментах по иммунной реакции и токсичности. Очищенные вирусоподобные частицы, полученные согласно настоящему изобретению, можно использовать в терапевтических и/или иммуногенных фармацевтических композициях для предотвращения и лечения состояний, связанных с гепатитом С и таких заболеваний, как опухоли и гепатокарцинома. Такие фармацевтические композиции включают иммуногенно-индуцирующее количество вирусоподобных частиц, полученных согласно настоящему изобретению, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, представляющим собой систему адьювант/антиген. Система вирусоподобных частиц, представляющая собой адьювант, аналогичный таким препаратам, как MF59 (Chiron Corp), QS-21 (Cambridge Biotech Corp), 3-DMPL (3-Деацил-монофосфорил липид A 3-Deacyl-Monophosphoryl Lipid A) (Ribi-lmmuno-Chem Research, Inc.), клинической степени чистоты адьювант Фреунда (IFA), фузогенные липосомы, водорастворимые полимеры или Iscoms (иммуностимулирующие комплексы). Фармацевтические композиции можно вводить системно, предпочтительно, подкожно или внутримышечно в форме приемлемых растворов для подкожного или внутримышечного введения. Инокуляцию можно также осуществить за счет нанесения царапин на поверхность или за счет инокуляции в полости тела. Приготовление таких растворов, обладающих за счет подбора рН изотоничностью, стабильностью и т.д., известно специалистам. Дозовый режим определяют лечащие врачи с учетом таких факторов, как физическое состояние, вес, пол, питание, серьезность состояния, время введения и других клинических факторов, которые могут повлиять на эффект лекарства. Примеры доз составляют интервал от около 1 мкг до около 100 мг вирусоподобных частиц. В практике способа лечения настоящего изобретения иммунологически-индуцирующее эффективное количество вирусоподобных веществ вводят пациенту, нуждающемуся в терапевтическом или профилактическом лечении. Иммуногенно-индуцирующее эффективное количество фармацевтической композиции по настоящему изобретению составляет величину в интервале от около 1 мкг до около 100 мг на вводную дозу. Количество вводимых доз может варьироваться в зависимости от вышеуказанных факторов. Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами без ограничения их объема.
Пример 1.
Получение кДНК последовательностей и вирусоподобных частиц.
1. Конструирование плазмид с HCV- и FMDV-специфическими последовательностями.
Источниками полноразмерных кДНК (асе. №АВ031663 и асе. №Х74812 GenBank) геномов HCV субтипа 1b (штамм VAT96) и FMDV субтипа «О» (штамм А22550) были плазмиды pHCV и pFMVD, соответственно. Для создания нужных конструкций ПЦР-фрагменты, полученные с нужных участков кДНК, клонировали в две плазмиды: 1) 8.3kb pNSFMDV, содержащая ClaI-EcoRV «fusion» ПЦР-фрагмент, и 2) pHCV, 10,7kb EcoRI-KpnI «fusion» ПЦР-фрагмент. Эти фрагменты клонируют в pUC векторах с тем, чтобы можно было осуществить делеции ряда мотивов и/или протеазочувствительных доменов. Для этого получали синтетические, частично комплементарные, 70-членные олигодезоксирибонуклеотиды. Использовали праймеры, структуру которых рассчитывали с помощью Oligo 5.0 и на сайте Blast. Праймеры и олигодезоксирибонуклеотиды синтезированы в ЗАО "Синтол". Автоматическое контрольное секвенирование проводили на секвенаторе 373А Automatic Sequencer (Applied Biosysthems, USA) с использованием набора реагентов "Dye Deoxy Terminator ABI sequencing Kit with Taq-polymerase FS" ("Perkin-Elmer", USA).
pUC вектора это pUC18 (асе. №VВ0025 GenBank) и pUC19 (асc. №VВ0026 GenBank).
2. Tat трансфекция компетентных клеток линии ВНК21.
Предварительно проводили синтез пептида со структурой PTD-домена Tat белка HIV-1. Пептид получали твердофазным методом на полуавтоматическом синтезаторе NPS-4000 (Neosystem Lc.x.oratoires [Франция]) с использованием протокола с трет-бутилоксикарбонилом/ бензилом на ковалентно меченной 4-метилбензгидрил-аминным (0.55 мМ/г; 0.25 мМ) смоле. Для введения флуоресцентной сетки к N-концу домена Tat белка в N,N'-диметилформамиде присоединяли 4(5)-карбоксифлуоресцеин, с предварительной активацией в системе N,N'-пара-диизопропилкарбоди-имид/1-гидробензотриоазол. Одновременное удаление полученных пептидов с носителя и снятие защитных групп выполняли с трифлуорометансульфокислотой (по стандартному протоколу Applied Biosystems). Полученные пептиды растворяли в 50%-й уксусной кислоте и очищали хроматографией на Sephadex G15 в 50%-й уксусной кислоте, а затем HPLC хроматографией на колонке Delta Рак С 18 (Waters, Milford, МА) с водным 0.01% раствором ацетонитрил-трифторуксусная кислота. Чистота полученного пептида (YGRKKRRQRRR) была не менее 97%. Ампулы с 10 мг (±2 мг) пептида высушивали под азотом, запаивали и хранили при -70°С.
Препаративные количества плазмидных ДНК нарабатывали в ПЦР и после спиртового переосаждения и определения количества (не менее 100 мкг) переводили в фосфатно-солевой буфер (PBS, рН 7.4), к которому по каплям добавляли пептид, растворенный в 1 мл деионизованной воды. Для количественного определения эффективности трансформации дезоксинуклеопротеином [ДНП] линейную ДНК окрашивали бромидом этидия. Смесь перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем к заранее приготовленным компетентным клеткам добавляли ДНП.
7
450
450
450
Компетентные клетки готовили по следующей схеме. Клетки растили на среде RPMI1640 с 10% ФБС (фетальная сыворотка теленка) до 10/мл. Через сутки клетки переносили в среду DMEM с 10% ФБС, 0,1% фенобарбитала натрия, 1 мМ гемина и инкубировали еще 60 часов. Содержание цитохрома измеряли на спетрофотометре "Hitachi-557" по двухволновой схеме в 1 мл 100 мМ натрийфосфатного буфера, рН 7.5, используя коэффициент молярной экстинкции ε=91 мМ/см для OD, либо путем регистрации дифференциального спектра поглощения СО-восстановленного комплекса гемопротеина (OD=0,4). Затем клетки тщательно отмывали от среды и переносили их на 2 часа в 1 л свежей среды DMEM с 0,1% фенобарбитала натрия, 1 мМ гемина и 0,5 М лизофосфатидилхолином. По истечению времени к компетентным клеткам добавляли ДНП.
3. Получение массы вирусоподобных частиц.
4
600
4
2
Компетентные клетки, обработанные ДНП, выдерживали при 37°С в течение 6 часов. Затем в среду добавляли СаНРО до конечной концентрации 85 мМ и через 3 часа ФБС до 10%. Клетки инкубировали в течение 48-72 часов до просветления среды. По истечению срока инкубации к клеткам добавляли тритон X100 до конечной концентрации 0,45% (лизис клеточных цитоплазматических мембран). Контроль эффективности текущего процесса трансфекции проводился после реконструкции β-галактозидазной активности методом α-комплиментации с помощью X-gal [5-бромо-4-хлоро-3-индоил-|3-O-галактопиранозида] (OD>1,5). Лизат с указанными характеристиками и содержащий фрагменты разрушенных клеток осветляли либо центрифугированием при 5000g в течение 20 минут, либо фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. К объему осветленного лизата добавляли 1/2 объема раствора, содержащего 1,5М NaCl с 50% ПЭГ6000. Смесь, содержащую ПЭГ6000, выдерживали 12-18 часов при +4°С. Хлопьевидный преципитат осаждали центрифугированием при 6000g в течение 30 минут. Полученный после центрифугирования осадок растворяли в 100 мл буфера PBS (рН 7.4), содержащего 25 мМ NaCl, 1 мМ MgSO, 0,1 мМ CaCl. Концентрация белка в полученном буфере составляла не менее 60 мг/мл.
Пример 2
Свойства вирусоподобных частиц.
5
8
Предварительно определяли параметры сорбции вирулентного штамма HCV на клетках линий Нu-7 и 293Т, на монослое которых штамм вируса образует видимые негативные колонии. Клетки указанных линий (1-2×10/100 мкл) инкубировали с композицией вирусоподобных частиц (2 мкг) в течение 1 часа при 4°С, а затем заражали вирулентным штаммом HCV (10 БОЕ). Установили, что при указанном соотношении композиция полностью блокирует образование видимых негативных колоний. Подавление титра БОЕ на 50% наблюдали при концентрации препарата 0,4 мкг/мл. Если клетки после обработки препаратом, но перед заражением вирусом выдерживали 18 часов, у клеток восстанавливалась способность поддерживать размножение вирулентного вируса. Анти-HCV сыворотка (Hoffman La Rosch, USA) также защищала клетки от заражения вирулентным штаммом HCV, при этом кривая титрования защитного эффекта сыворотки (кривая «доза-эффект») позволяла рассчитать титр сыворотки, снижающий на 50% активность композиции вирусоподобных частиц.
5
Клетки линий Нu-7 и 293Т (1-2×10/10 мкл), зараженные вирулентным штаммом HCV, включают биотинилированный уридин в HCV-специфическую РНК. В случае предварительной инкубации клеток с композицией вирусоподобных частиц (2 мкг в течение 1 часа при 4°С) включения биотинилированного уридина в HCV-специфическую РНК в течение 18 часов нет.
2. ELISA анализ полученной фармацевтической композиции.
Планшеты с плоскодонными лунками промывали двухкратно 200 мкл дистиллированной воды, а затем двухкратно 200 мкл PBS буфера. Тщательно удаляли жидкость из лунок и высушивали планшеты. Композицию вирусоподобных частиц растворяли в PBS буфере до необходимой концентрации, а затем многоканальной пипеткой разливали 50 мкл суспензии по сухим лункам. Планшеты оставляли при 4°С на ночь, а затем вносили в каждую лунку 2% обезжиренное молоко и инкубировали планшеты при 37°С еще 1,5 часа. Удалив жидкость из лунок, промывали их дважды дистилированной воды по 200 мкл. Планшеты сушили.
2
2
За эталонный образец брали диагностический набор фирмы "Orion" (England), который по данным, полученным диагностическим центром 1-ой Московской городской инфекционной больницы, определяет присутствие анти-HCV IgG в 98% случаях при отсутствии ложноположительных ответов. С помощью этого набора определяли значения предельных разведений контрольных сывороток (здорового и больного гепатитом С, обозначения К- и К+ соответственно) в PBS буфер с 0,5% обезжиренным молоком и сравнивали их со значениями, полученными на выделенной композиции вирусоподобных частиц. Установили, что диагностическим количеством препарата является 250 нг внесенного белка/лунку. Промывали сухой планшет, внеся по 200 мкл PBS буфера с 2% твином-20 в каждую лунку, а затем по 200 мкл дистиллированной воды. Вносили по 50 мкл PBS буфера с 0,5% обезжиренным молоком в каждую лунку и по 10 мкл образцов или контролей. Планшет с разведенными образцами инкубировали в темноте 1 час при 37°С в режиме постоянного встряхивания. После окончания инкубации выливали содержимое лунок, промывали лунки по 2 раза PBS буфером с 2% твином-20 и дистиллированной водой (по 200 мкл в каждую лунку), после чего промокали планшет, опрокинув его на лист фильтровальной бумаги. Во все лунки вносили по 50 мкл раствора конъюгата кроличьих антител к IgG человека и инкубировали планшет 40 мин при 37°С и постоянном встряхивании. За 15-20 мин до окончания времени инкубации готовили рабочий раствор субстрата, смешивая 1 объем субстратного раствора ТМБ с 4 объемами субстратного буфера, содержащего HO.
После окончания второй инкубации из лунок планшета выливали содержимое и промывали, как указано, после первой инкубации. Затем во все лунки вносили по 100 мкл рабочего раствора субстрата и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре в темноте. Останавливали ферментативную реакцию добавлением 0,1 М
2
4
450
HSO по 100 мкл в лунку. Измеряли на автоматическом фотометре Bio-Rad значение оптической плотности при длине волны 450 нм (OD, время между остановкой реакции и измерением не должно превышать 30 мин). Контролями в реакции служили сыворотки человека, нереактивная по HBsAg, анти-ВГС и анти-ВИЧ, а также инактивированная положительная по анти-ВГС в буфере с белковыми стабилизаторами. Весь массив включал 395 образцов сывороток, которые были получены при кратных исследованиях 181-ой "положительной" сыворотки, содержащей анти- HCV IgG, и 114-ти "отрицательных", в которой нет анти-HCV IgG. Не отметили случаев получения ложноположительных результатов ИФА. В 16 "положительных" сыворотках ИФА с полученным препаратом не дал правильного результата
3. Связывание с липопротеинами низкой плотности.
Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы проводили 18 часов при 50000g в градиент сахарозы 50-10% w/v (Spinco L2 65 В, Beckman, Ti-ротор SW55) в 4°С. Комплексы липопротеина с вирусоподобными частицами выявляли после раскапывания градиента.
100 мкл антилипопротеиновыми антисыворотками (козлиными анти-ЛПВП, анти-ЛПНП, безлипидными; Sigma) разбавляли 1:2 с PBS и выдерживали при 4°С ночь. Полученные преципитаты осаждали центрифугированием (10 минут в 5000g) и в них, а так же в супернатанте, HCV-положительными сыворотками выявляли присутствие HCV-антигена.
4. Связывание с лактоферином, иммобилизованном на магнитных частицах.
8
В этом эксперименте с помощью MagneSphere Magnetic Separation Products (протокол Promega) проводили связывание комплекса лактоферин-биотин. Магнитные микрочастицы, меченные авидином, требуют БСА для стабилизации, которая присутствует при хранении в PBS буфере с 1 мг/мл БСА и 0.02% азидом натрия и удаляется, как только частицы промыты. Рабочая концентрация частиц 1 мг/мл. Частицы должны быть промыты три раза с равным объемом 0.5Х SSC и используются в течение 30 минут после отмывки, что требуется для оптимальной работы. Готовые магнитные микрочастицы добавляли к смеси лактоферин-биотина и композиции вирусоподобных частиц (2 мкг). В качестве экспериментального контроля готовые магнитные микрочастицы добавляли к CV.CH лактоферин-биотина и вирулентного штамма HCV (10 БОЕ). После трехкратного промывания осадка, образованного на стенках пробирки при помещении ее к магниту, осадок промывали 0,4 М KCl и ELISA анализом определяли количество HCV-специфического антигена. При сравнении результатов, полученных при разведении композиции вирусоподобных частиц и частиц вируса гепатита С, оценили величину 50% ингибирования препаратом (около 0,3 мкг/мл) связывания между лактоферином и вирусом.
Пример 3
Индукция вирусоподобными частицами вируса гепатита С интерферона и других цитокинов.
1. Индукция вирусоподобными частицами вируса гепатита С интерферона и других цитокинов в периферической крови человека
РВМС были изолированы после центрифугирования свежей гепаринизированной периферической крови в градиенте плотности фикол-гипака. Кровь получали «инкогнито» от здоровых добровольцев на основе полной информации и после получения согласия. Группу добровольцев отбирали и формировали согласно рекомендациям FDA (Контрольной комиссии за производством продуктов питания и лекарственных препаратов США), собранным в Belmont Report 18.04.1979.
РВМС дважды переосаждали в буфере MACS (PBS с BSA на 0,5% и EDTA на 2 мм (Сигма)) или в среде RPMI 1640, содержащей 10%, инактивированной при высокой температуре, эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone), La-амид-аминоглутаровой кислоты на 2 мм, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина и HEPES на 25 мм.
Определение интерферона-α/β проводили с помощью ELISA-набора (Nunc Maxisorp™ USA). Данные типичного эксперимента с применением FITZ-меченных антител представлены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1
в пг/мл
Контроль
Опыт
Контроль (через 3 дня)
Опыт (через 3 дня)
TNF-ά/β
12,76
316057,3
21,45
111566,5
2. Индукция вирусоподобными частицами интерферона и других цитокинов в организме добровольцев.
Эксперимент состоял в определении интерферона-α/β в сыворотке крови пяти добровольцев до и после однократного ректального введения фармацевтической композиции на основе вирусоподобных частиц в количестве 20 мкг каждому добровольцу. После однократного ректального введения фармацевтической композиции на основе вирусоподобных частиц в количестве 20 мкг уровень интерферона α/β в сыворотке крови кратковременно увеличился в среднем в 10000 раз. Субъективных отклонений в показателях «качества жизни» по коэффициенту QL-36 у пяти добровольцев в течение эксперимента и спустя 6 месяцев после него не отмечено.
Совместный анализ результатов, полученных в примерах 2 и 3, неоспоримо указывает на применимость фармацевтической композиции, описываемой в данном изобретении, для лечения гепатита С. Как показывает пример 2, вирусоподобные частицы, описываемые в данном изобретении, схожи с частицами вируса гепатита С настолько, что они конкурируют за одни и те же клеточные рецепторы и связываются одними и теми же антителами и липопротеинами. В то же время, пример 3 демонстрирует, что вирусоподобные частицы вызывают резкую иммуностимуляцию, которая, как известно, является ключевым механизмом излечения от гепатита С. Таким образом, очевидно, что при введении в организм больного вирусоподобные частицы будут взаимодействовать с клетками, зараженными вирусом гепатита С, и вызывать в них иммуностимуляцию, которая приведет к излечению.