СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СРЕДНЕТЯЖЕЛОГО ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИСТИННОЙ ЭКЗЕМЫ
METHOD FOR PREDICTION OF MODERATE SEVERITY OF CHRONIC TRUE ECZEMA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития среднетяжелого течения хронической истинной экземы.
Истинная экзема - это аллергическое воспалительное заболевание кожи, склонное к хроническому течению и обострениям, вызываемое различными экзогенными и эндогенными факторами и характеризующееся полиморфизмом элементов, среди которых на первое место выступают везикулы [Клиническая дерматовенерология: руководство для врачей: в 2-х т. /под ред. Ю. К. Скрипкина, Ю. С. Бутова. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - Т. 2. - 921 с.]. Экзема составляет 30-40% всех кожных заболеваний. По данным разных авторов, заболеваемость колеблется от 6,0 до 15,0 случаев на 1000 населения. Экзему регистрируют во всех странах и у представителей всех рас с одинаковой частотой у мужчин и женщин. Заболевание может возникнуть как в раннем детском возрасте, так и у лиц пожилого возраста. Пик заболеваемости отмечается в возрасте 40 лет [Оспанова С. А. Совершенствованиее терапии экземы с учетом эндогенной интоксикации: савтореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.11 /С. А. Оспанова; Казах. науч.-исслед. кож.-венерол. ин-т М-ва здравоохранения Респ. Казахстан. - Алматы, 2008. - 21 с.].
Степень тяжести протекания экземы зависит от давности заболевания, частоты рецидивов, условий труда, быта больного (питание, гигиена и т.д.), общего состояния организма (состояния нервной и иммунной системы больного), генетической предрасположенности.
По современным представлениям, в развитии экземы главную роль играют Т-лимфоциты, которые несут на своей поверхности специфические рецепторы к антигену и выделяющие ряд провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-α [Павлова О. В. Экзема: этиология, патогенез, клиника, диагностика и лечение /О. В. Павлова. - Москва: URSS Либроком, 2010. - 61 с.]. При этом в эпидермисе и дерме развивается хроническое рецидивирующее воспаление на фоне циркулирующих микробных антигенов, формируются патологические иммунные комплексы, которые повреждают собственные микроструктуры с образованием аутоантигенов и инициируют формирование аутоантител [Brian Е. C. Pеriphеral rеcеptоr targеts fоr analgеsia: nоvеl apprоachеs tо pain trеatmеnt /Е. C. Brian. - Hоbоkеn, Nеw Jеrsеy: Jоhn Wilеy Sоns, 2009. - 541 р.].
Как свидетельствуют результаты ряда исследований [Chеn G. TNF-R1 signaling: a bеautiful pathway /G. Chеn, D. V. Gоеddеl //Sciеncе. - 2002. - Vоl. 296, №5573. - P. 1634-1635] важную роль в развитии хронической истинной экземы (ХИЭ) играют генетические факторы. Изучение этиопатогенеза экземы с применением современных методов исследования выявило значимую роль таких процессов, как инвазия, пролиферация, апоптоз, воспаление в формировании истинной экземы. Важную роль в развитии, клинике и прогнозе заболевания играют факторы некроза опухолей и их рецепторы.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития среднетяжелого течения хронической истинной экземы истинной на основе данных о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα,+250A/G Ltα и+1663A/G TNFR2 и их сочетаний.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2012 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования повышенного риска развития осложнений хронической истинной экземы. Аналогов патенту нет.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития среднетяжелого течения ХИЭ у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации, по данным о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα,+250A/G Ltα и+1663A/G TNFR2 и их сочетаний.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития среднетяжелого течения хронической истинной экземы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации, по данным о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα,+250A/G Ltα и+1663A/G TNFR2 и их сочетаний.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития среднетяжелого течения ХИЭ, включающий:
- забор венозной крови,
- выделение геномной ДНК из периферической крови методом полимеразной цепной реакции  синтеза ДНК;
- анализ полиморфизмов генов фактора некроза опухоли α (-308G/A TNFα), лимфотоксина α (+250A/G Ltα) и рецептора фактора некроза опухоли 2 типа (+1663A/G TNFR2);
- прогнозируют повышенный риск развития среднетяжелого течения ХИЭ аллель+250G Ltα или сочетание аллеля+250G Ltα с аллелем+1663G TNFR2, или сочетание аллеля -308А TNFα с аллелем+1663G TNFR2, или сочетание аллеля -308G TNFα с аллелем+250G Ltα;
- прогнозирует пониженный риск развития среднетяжелого течения ХИЭ сочетание аллеля -308G TNFα с генотипом+250АА Ltα.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что впервые установлена вовлеченность генетических полиморфизмов фактора некроза опухоли α (-308G/A TNF α), лимфотоксина α (+250A/G Lt α) и рецептoра фактoра некроза опухоли 2-го типа (+1663А/G ТNFR2) и их сочетаний в формирование среднетяжелого течения хронической истинной экземы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации.
Способ осуществляют следующим образом:
2
Выделение геномной ДНК осуществляют стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. 1-ый этап: к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, который содержит 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х -100, 5 мМ МgСl и 10 мМ трис-НCl (pH=7,6) [Мathew С.С. 1984]. Полученную смесь при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут перемешивают и центрифугируют. После центрифугирования сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют 4 мл раствора, с 25 мM ЭДTA (рН=7,8) и 75 мМ NаСl, затем ресуспензируют. После этого прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и в течение 16 часов при 37°С инкубируют образец.
На 2-м этапе в течение 10 минут при 4000 об/мин из полученного лизата последовательно экстрактируют ДНК равными частями фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием. Производят отбор водной фазы после каждого центрифугирования. Из раствора 2-мя объемами охлажденного 96% этанола осаждают ДНК. Полученную ДНК растворяют в деионизованной, бидистиллированной воде и хранили при t=-20°С. Выделенную ДНК используют для полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК.
Анализ -308G/А TNFα,+250G/A Ltα и+1663A/G TNFR2 осуществляют методами ПЦР синтеза ДНК на CFX 96 с системой ПЦР в режиме real time. Используют ДНК-полимеразу Thermus aquaticus (производитель фирма «Силекс-М») и олигонуклеотидные праймеры и зонды (синтезированные фирмой «Синтол»).
2
2
Реакционная смесь (объем 25 мкл) включает: 67 мМ трис-НCl (pН=8,8), 2,5 мМ МgCl, 0,1 мкг геномной ДHK, по 10 пM каждого праймера, по 5 пkмoль каждого зонда, по 200 мkM dАТР, dGТР, dСТР, dТТР и 1 единицу активной Тaq-полимеразы. Для каждой пары праймеров рассчитывают оптимальный температурный и временной режим отжига и подбирают соответствующую концентрацию MgCl.
Генотипирование производят по методу Tag Man зондов на основании данных значений RFU (уровень относительной флуоресценции) для каждого зонда (при проведении ПЦP в амплификаторе IQ5).
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития среднетяжелого течения хронической истинной экземы подтверждает анализ результатов обследования 394 индивидуумов: 72 больных ХИЭ средней степени тяжести и 322 человека контрольной группы.
В исследуемые группы включались лица русской национальности, которые являлись уроженцами Центрального Черноземья Российской Федерации и не имели родства между собой. Клиническое и клинико-лабораторное обследование больных проводили на базе поликлинического отделения ОГБУЗ «Кожно-венерологический диспансер».
Оценка степени тяжести экземы была основана на классификации ХИЭ по индексу EASI (Eczema Area and Severity Index) (1 - легкая, 2 - среднетяжелая, 3 - тяжелая), позволяющая оценить тяжесть течения и распространенность заболевания. Расчет индекса EASI основывался на оценке распространенности кожного процесса. Каждый из четырех признаков (эритема, папулы/везикулы, инфильтрация, лихенизация и экскориации) оценивался по 4-уровневой шкале: 0 - отсутствие, 1 - слабые, 2 - умеренные, 3 - сильные. Процент поражения кожи оценивался по правилу «девятки», за единицу принималась площадь ладонной поверхности кисти. Индекс EASI считался по формуле: ЕАSI=А+В+С+D, где А - общая сумма баллов выраженности и распространенности процесса на коже лица, В - сумма баллов выраженности и распространенности процесса на коже туловища, С - сумма баллов выраженности и распространенности процесса на коже верхних конечностей и D - сумма баллов выраженности и распространенности процесса на коже нижних конечностей.  Интенсивность зуда оценивалась при помощи следующих параметров: 0 баллов - зуд отсутствовал, 1 балл - зуд слабый, 2 балла - зуд незначительный, 3 балла - зуд средней интенсивности, 4 балла - зуд сильный [Cherill R.1998].
Средний возраст больных хронической истинной экземой составил 45,91±2,68 (варьировал от 18 лет до 86 лет), контрольной выборки- 43,62±3,46 (варьировал от 20 до 76 лет) (р>0,05). Следовательно, группа больных не отличалась от группы контроля по возрасту, месту рождения и национальности.
cor
cor
реrm
С целью решения проблемы множественных сравнений, связанной с получением ложноположительных результатов (ошибка 1-го рода), вводят поправку Бонферрони, т.е. производят перерасчет уровня значимости р для множественных парных сравнений по формуле: р=р·n, где р - полученный уровень статистической значимости, n - количество парных сравнений. За статистически значимый уровень принимали р≤0,05. Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ХИЭ проводят с помощью программного обеспечения АРSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующий метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику. Уровень р, полученный после пермутационного теста р≤0,05 (выполнено 100 пермутаций) принимают за статистически значимый.
2
2
Выявлено, что у пациентов с ХИЭ средней тяжести концентрация молекулярно-генетического маркера+250G Ltα составляет 34,56% и является наибольшей по сравнению как с контрольной группой (в 1,42 раза) (24,38%, χ=5,51, р=0,02, OR=1,64, 95% CI 1,08-2,49), так и с больными, имеющими легкое течение ХИЭ (в 1,24 раза) (27,93%, χ=1,63, р=0,02).
perm
perm
perm
В результате проведенного комплексного анализа носительства сочетаний аллелей и генотипов исследуемых локусов факторов некроза опухолей, выявлен целый ряд достоверных различий между больными и контролем. Установлена ассоциация сочетания аллелей+250G Ltα с+1663G TNFR2 с формированием средней степени тяжести ХИЭ. У 52,78% больных ХИЭ средней тяжести имеется данное сочетание генетических маркеров, тогда как в контрольной группе оно выявлено у 32,3% (p=0,0005, p=0,001). Данное сочетание полиморфных вариантов генов является фактором риска развития ХИЭ средней степени тяжести (ОR=2,52, 95%, CI 1,48-4,3). Также факторами риска развития ХИЭ средней степени тяжести являются сочетание аллеля -308А TNFα с аллелем+1663G TNFR2 (27,77%) или сочетание аллеля -308G TNFα с аллелем+250G Ltα (58,33%), в контрольной группе эти сочетания встречаются у 15,22% (p=0,007, p=0,008, ОR=2,26 95%, CI 1,23-4,14) и 43,79% (p=0,004, p=0,007, ОR=2,13, 95%, CI 1,24-3,67), соответственно.
perm
Протективным фактором развития ХИЭ средней тяжести служит сочетание аллеля -308G TNFα с генотипом+250АА Ltα, которое встречается у 34,72% больных и 54,66% индивидуумов контрольной группы (p=0,006, p=0,008, ОR=0,48 95%, CI 0,28-0,84).
Примеры, подтверждающие осуществимость предложенного изобретения.
1. У больного хронической истинной экземой А. выявлен аллель+250G Ltα. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилось среднетяжелое течение данного заболевания.
2. У больного хронической истинной экземой Б. выявлено сочетание аллеля+250G Ltα с+аллелем 1663G TNFR2. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилось среднетяжелое течение данного заболевания.
3. У больного хронической истинной экземой В. выявлено сочетание аллеля -308А TNFα с аллелем+1663G TNFR2. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилось среднетяжелое течение данного заболевания.
4. У больного хронической истинной экземой Г. выявлено сочетание аллеля -308G TNFα с аллелем+250G Ltα. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилось среднетяжелое течение данного заболевания.
5. У больного хронической истинной экземой Д. выявлено сочетание аллеля -308G TNFα с генотипом+250АА Ltα. При дальнейшем наблюдении у данного больного прогрессирование данного заболевания до среднетяжелого течения не развилось.
Таким образом, поставленная задача прогнозирования риска развития ХИЭ средней тяжести у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации в случае наличия аллеля+250G Ltα или сочетания генетических вариантов+250G Ltα с+1663G TNFR2, или сочетания генетических вариантов -308А TNFα с+1663G TNFR2, или сочетания генетических вариантов -308G TNFα с+250G Ltα и прогнозирования пониженного риска развития среднетяжелого течения ХИЭ при сочетании аллеля -308G TNFα с генотипом+250АА Ltα, решена.