СРЕДСТВО ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
AGENT FOR TARGETED THERAPY OF MALIGNANT GROWTHS

Изобретение относится к новым лекарственным средствам, которые обладают комплексным антиангиогенным и гипоксия-ориентированным цитотоксическим действием и могут найти применение в качестве средств таргетной терапии солидных злокачественных новообразований.
Проблема разработки эффективных средств для лечения онкологических заболеваний остается высоко актуальной для всего мирового сообщества. Так, в Российской Федерации в настоящее время на учете с различными онкологическими заболеваниями состоит около 3,3 миллионов больных, нуждающихся в эффективном лечении. Но, несмотря на существенные успехи онкологии последних десятилетий, многие распространенные онкологические заболевания, по-прежнему, с трудом поддаются лечению. Например, рак молочной железы, ежегодно поражающий свыше 65 тысяч женщин в России, становится причиной смерти 35% заболевших, а летальность рака легких, которым ежегодно заболевает около 60 тысяч россиян, достигает 85% (Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова В.Г. Злокачественные новообразования в России в 2015 году (заболеваемость и смертность) - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ НМИРЦ МЗ РФ, 2017).
По мнению многих специалистов, изменение сложившейся картины в лечении онкологических заболеваний возможно лишь с внедрением в клиническую практику эффективных таргетных противоопухолевых средств, в частности, антиангиогенных, мишенью воздействия которых являются биохимические и патофизиологические процессы, специфичные для всех злокачественных новообразований или для их определенных видов (Willett C.G., Duda D.G., di Tomaso E. et al. Complete pathological response to bevacizumab and chemoradiation in advanced rectal cancer. Nat. Clin. Pract. Oncol. 2007. 4(5): 316-21; Lein S., Lowman H.B. Therapeutic anti-VEFG antibodies. Handb. Exp. Pharmacol. 2008. 181: 131-50).
Так, известен регорафениб, ингибитор протеинкиназ, применяющийся в таргетной терапии колоректального рака (Grothey A., Van Cutsem Е., Sobrero A. et al. Regorafenib monotherapy for previously treated metastatic colorectal cancer (CORRECT): an international, multicenter, randomized, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 2013. 381(9863): 303-12).
Недостатком регорафениба, как и других антиангиогенных средств, является прогрессивное ослабевание противоопухолевого эффекта вследствие развития резистентности опухоли к его воздействию. Так, по данным клинических исследований увеличение периода выживания онкологических больных за счет применении антиангиогенных средств не превышает 1 года, а длительное подавление роста опухолей при монотерапии такими препаратами наблюдается крайне редко; Frandsen S., Kopp S., Wehland М. et al. Latest results for anti-angiogenic drugs in cancer treatment. Curr. Pharm. Des. 2016. 22(39): 5927-42).
Известен бевацизумаб, таргетный препарат, содержащий рекомбинантные моноклональные IgG1 антитела, для лечения метастатического колоректального, овариального и других видов рака.
Недостатками бевацизумаба являются значительные ограничения к применению, связанные с побочными явлениями (перфорация ЖКТ, трудности при заживлении ран, кровоизлияние, артериальная тромбоэмболия, гипертензивный криз, обратимый лейкоэнцефалопатический синдром, нейтропения и инфекция, нефротический синдром, застойная сердечная недостаточность), а также его неспособность увеличивать общую выживаемость пациентов (Rossi L., Verrico М., Zaccarelli Е., Papa A., Colonna М., Strudel М., Vici P., Bianco V., Tomao F. Bevacizumab in ovarian cancer: A critical review of phase III studies. Oncotarget. 2017 Feb 14; 8(7): 12389-12405).
Известно «Противоопухолевое средство» по патенту RU 2503450 (10.01.2014). Средство является эффективным ингибитором NOS, вызывает выраженное подавление роста и метастазирования ряда перевиваемых опухолей животных, обусловленное, главным образом, антиангиогенным, гипоксическим действием, на фоне которого снижается пролиферация и усиливается апоптоз опухолевых клеток.
Недостатки: противоопухолевый эффект указанного средства реализуется преимущественно на раннем этапе развития опухоли. Поскольку весь молекулярный аппарат, участвующий в ангиогенезе, остается сохранным при действии этого средства, то его «отмена» сопровождается быстрой реваскуляризацией и возобновлением роста опухоли (Филимонова М.В., Южаков В.В., Шевченко Л.И. и др. Экспериментальное исследование противоопухолевой активности нового ингибитора синтаз оксида азота Т1023. Молек. мед. 2015. (1): 61-64).
Прототипом предлагаемого технического решения является «Вазоконстрикторное средство» по патенту на изобретение RU 2475479 (20.02.2013) с общей структурной формулой -
3
2
где R=(СН)СН;
- гидробромид 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины (далее - соединение Т1023). Т1023 является эффективным ингибитором NOS, вызывает выраженное вазоконстрикторное действие, способное создавать гипоксию в биологических тканях, в том числе в тканях опухоли.
Недостатком прототипа является снижение его противоопухолевой эффективности в отдаленные сроки после его воздействия, что проявляется развитием гипоксической резистентности экспериментальных неоплазий: прогрессивным снижением активности апоптоза опухолевых клеток, ослаблением ингибирования роста опухолей и усилением их рецидивирующего роста.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании нового противоопухолевого средства, обладающего большей продолжительностью и выраженностью противоопухолевого действия, а также способного подавлять (или тормозить) развитие резистентности неоплазий.
Проведенные нами исследования подтверждают мнение ряда авторов, что одним из перспективных путей для преодоления гипоксической резистентности неоплазий является применение дихлорацетата (ДХА), который является ингибитором PDK1 и обладает свойствами гипоксия-ориентированного цитотоксина. В ряде экспериментальных работ показана способность ДХА подавлять развитие гипоксической резистентности опухолей на фоне терапии некоторыми фармакопейными антиангиогенными средствами (Кобляков В.А. Гипоксия и гликолиз как возможные объекты противоопухолевого воздействия. Успехи молек. онкол. 2014, 2: 44-49; Duan Y., Zhao X., Ren W. et al Antitumor activity of dichloroacetate on C6 glioma cell: in vitro and in vivo evaluation. Onco. Targets Ther. 2013. 6: 189-98; Kumar A., Kant S., Singh S. Antitumor and chemosensitizing action of dichloracetate implicates modulation of tumor microenvironment: A role of reorganized glucose metabolism, cell survival regulation and macrophage differentiation. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2013. 273(1): 196-208; Kumar K, Wigfield S, Gee HE, et al. Dichloroacetate reverses the hypoxic adaptation to bevacizumab and enhances its antitumor effects in mouse xenografts. J. Mol. Med. (Berl). 2013. 91(6): 749-58).
Авторами предлагаемого изобретения показана целесообразность и перспективность совмещения ДХА и соединения Т1023 в виде нового средства для лечения онкологических заболеваний.
Сущностью технического решения, включающего гидробромид 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины и применение дихлорацетата, является синтез дихлорацетата 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины (далее в тексте - соединение Т1084) и применение этого соединения в качестве действующего вещества противоопухолевых средств.
Перечень фигур
Фиг. 1. Структурная формула дихлорацетата 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины (соединения Т1084).
Химический синтез соединения Т1084, его токсикологические свойства и противоопухолевая активность, а также достижение заявленного технического результата приведены ниже в примерах.
Синтез соединения Т1084
Пример 1. Получение соединения Т1023
пл
6
Смесь 6 г (40 ммоль) изобутаноилтиомочевины, 9,8 г (80 ммоль) изопропилбромида и 15 мл сухого ацетонитрила в запаянной ампуле нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 часов. Растворитель упаривают, остаток отфильтровывают и перекристаллизовывают из 4-метил-2-пентанона. Выход 3,6 г (33%). Т 129-131°С. Спектр ПМР (DMSO-d) δ 1,1 (д, 6Н); 1,36 (д, 6Н); 2,73 (м, 1H); 4,1 (м, 1Н); 10,9 (ушир.т, 2Н).
8
16
2
Вычислено, %: С 35,69; Н 6,37; N 10,41 CHNOS⋅HBr
Найдено, %: С 35,76; Н 6,51; N 10,45
В результате получен гидробромид 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины.
Пример 2. Получение соединения Т1084
2
4
1,3 г гидробромида 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины растворяют в 10 мл воды, по каплям добавляют концентрированный водный раствор аммиака до рН 8 и экстрагируют дважды диэтиловым эфиром (2×10 мл). Сушат безводным NaSO, а затем упаривают. Выход основания 0,7 г.
Растворяют основание в 5 мл диэтилового эфира и добавляют к нему раствор 0,5 г дихлоруксусной кислоты в 3 мл диэтилового эфира. Охлаждают. Выделившийся осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из гексана. Выход 0,8 г (68%).
пл
Т 67-69°С.
8
16
2
2
2
2
2
Вычислено, %: С 37,86; Н 5,72; N 8,83 CHNOS⋅CHClO
Найдено, %: С 37,91; Н 6,09; N 9,04
В результате получают дихлорацетат 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины (соединение Т1084).
Пример 3. Токсическая характеристика соединения Т1084
Токсичность соединения Т1084 исследована на самцах белых беспородных мышей по тесту «острой» токсичности в возрасте 2-2,5 месяца с массой тела 22-25 г при однократном внутрибрюшинном введении (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова - М.: Гриф и К, 2012). Рабочие растворы Т1084 изготавливали на основе 0,9% асептического раствора хлорида натрия (Дальхимфарм, РФ). Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 суток. Расчет показателей «острой» токсичности проводили путем пробит-анализа по методу Литчфильда-Уилкоксона.
50
Результаты этих исследований показали, что, как и Т1023, соединение Т1084 по ГОСТ 12.1.007-76 относится к третьему классу токсичности и опасности (умеренно токсично). Показатель его средней смертельной дозы (ЛД) составил для мышей 447±9 мг/кг (Табл. 2).
Сопоставление показателей «острой» токсичности соединения Т1084 с соответствующими показателями для Т1023, полученными нами ранее на таких же животных и при таком же способе введения, показывает, что их различие в молярном выражении не превышает 10%. Это свидетельствует, что изменение солеобразующей кислоты с гидробромида на дихлорацетат значимо не изменяет токсичность солей 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины, а отличия, наблюдаемые в показателях «острой» токсичности Т1023 и Т1084 при выражении в мг/кг, практически полностью определяются различиями молекулярного веса этих соединений.
Пример 4. Противоопухолевая активность соединения Т1084 на модели солидной карциномы Эрлиха (КЭ).
Целью эксперимента являлось сравнительное изучение влияния Т1023, Na-ДХА (ДХА в виде натриевой соли) и Т1084 при их хроническом применении на рост солидной КЭ у мышей.
1
57
Исследование выполнено на 81 самке мышей-гибридов F (СВА × CBl/6j) в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации в 4 экспериментальные группы: контрольную и три опытные, по 20-21 особи в каждой. Всем животным трансплантировали КЭ по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012). Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Животным опытных групп с 6-х по 20-е сутки роста КЭ проводили ежедневое в/б введение, соответственно, Т1023, Na-ДХА и Т1084 в эквимолярных дозах: Т1023 - 60 мг/кг; Na-ДХА - 33,6 мг/кг; Т1084 - 70,7 мг/кг. Растворы Т1023 и Т1084 изготавливали на основе 0,9% асептического раствора хлорида натрия (Дальхимфарм, РФ), растворы Na-ДХА изготавливали на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, РФ). Противоопухолевые эффекты изучали по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012).
Результаты этого эксперимента показали, что при использованных схемах введения и дозах Т1023 и Na-ДХА оказывали сходное влияние на развитие КЭ (Табл. 3). Практически в течение всего срока наблюдения действие этих соединений сопровождалось статистически достоверным противоопухолевым эффектом. Максимальный противоопухолевый эффект развивался к концу первой недели применения Т1023 и Na-ДХА, и проявлялся торможением роста КЭ примерно на 40%. Но в последующем противоопухолевая эффективность Т1023 и Na-ДХА прогрессивно снижалась и на поздних сроках индекс ТРО составлял 21-24% (около 50% от максимальной эффективности).
Начальные этапы развития противоопухолевого эффекта соединения Т1084 были подобны действию Т1023. Но нарастание противоопухолевого действия Т1084 было более продолжительным и достигало максимума к 10-м суткам от начала его применения. И в эти сроки противоопухолевый эффект Т1084 на уровне статистической тенденции (р=0,12) на 20-25% превышал эффекты Т1023 и Na-ДХА. А в дальнейшем динамика противоопухолевого действия соединения Т1084 качественно отличалась от действия Т1023 и Na-ДХА. Если на поздних сроках торможение роста КЭ под влиянием Т1023 и Na-ДХА прогрессивно ослабевало, то действие Т1084 подавляло адаптацию опухоли к такому воздействию и поддерживало до конца наблюдения стабильное торможение роста опухоли на уровне 45-50% (90-100% от максимальной эффективности). И при этом на поздних сроках противоопухолевый эффект Т1084 статистически достоверно превосходил эффекты Т1023 и Na-ДХА.
Это отражает способность соединения Т1084 реализовать оба вида фармакологической активности - NOS-ингибирующее, антиангиогенное и гипоксия-ориентированное цитотоксическое действие.
Пример 5. Противоопухолевая активность соединения Т1084 на модели рака шейки матки.
Целью эксперимента являлось сравнительное изучение влияния Т1023, Na-ДХА и Т1084 при их хроническом применении на рост рака шейки матки (РШМ-5) у мышей.
1
57
6
Исследование выполнено на 74 самках мышей-гибридов F (СВА × CBl/6j) в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации в 4 экспериментальные группы: контрольную и три опытные, по 18-20 особей в каждой. Всем животным трансплантировали РШМ-5 в область латеральной поверхности правого бедра путем подкожного введения 2⋅10 опухолевых клеток в 0,1 мл суспензии на основе среды 199 (Пан-Эко, РФ). Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Как и в Примере 4, животным опытных групп с 7-х по 21-е сутки роста РШМ-5 проводили ежедневое в/б введение Т1023, Na-ДХА и Т1084 в эквимолярных дозах - 60, 33,6 и 70,7 мг/кг, соответственно. Противоопухолевые эффекты изучали по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012).
Результаты этого эксперимента показали, что использованная экспериментальная неоплазия была слабо чувствительна к действию Т1023 и Na-ДХА (Табл. 4). Кратковременный статистически достоверный противоопухолевый эффект развивался к 3-м суткам после начала применения соединения Т1023 и Na-ДХА, и проявлялся торможением роста РШМ у мышей этих групп на 30-35%. Но в последующем неоплазия стремительно приобретала практически полную резистентность к действию этих соединений. Уже через 5-7 суток от начала применения Т1023 и Na-ДХА ингибирование роста РШМ-5 резко ослабевало, и до конца наблюдения их противоопухолевые эффекты полностью отсутствовали даже на уровне статистической тенденции.
В то же время, к действию Т1084 использованная экспериментальная опухоль была вполне чувствительной, и противоопухолевые эффекты этого соединения были существенно более выраженными и стабильными в сравнении с эффектами Т1023 и Na-ДХА. К 3-5-м суткам от начала применения Т1084 торможение роста РШМ достигало 45%. И в последующем, до конца курса инъекций Т1084 (по 21-е сутки) значимой адаптации опухоли к действию Т1084 не наблюдалось - ингибирование роста РШМ стабильно сохранялось на уровне 35-40% (80-90% от максимальной эффективности). Причем, противоопухолевое действие соединения Т1084 на РШМ-5 было не только стабильным, но и долгосрочным - как показано в Табл. 4, статистически достоверный эффект сохранялся и в течение последующих 5 суток после окончания применения Т1084.
Доказательство достижения технического результата
Заявленный технический результат предлагаемого изобретения заключается в обеспечении более выраженного и стабильного противоопухолевого эффекта соединения Т1084 в сравнении с прототипами - гидробромидом 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины (соединение Т1023) и натрия дихлорацетатом (Na-ДХА), а также в подавлении (или торможении) развития резистентности неоплазий.
В приведенном эксперименте (см. пример 4) установлено, что сочетанное применение ингибитора NOS Т1023 и Na-ДХА сопровождается более выраженным и стабильным противоопухолевым действием на солидную КЭ мышей и подавляет развитие резистентности карциномы к действию Т1023 и Na-ДХА. Полученный результат свидетельствует, что два однонаправленных (противоопухолевых) вида фармакологической активности - NOS-ингибирующее антиангиогенное действие Т1023 и PDKl-ингибирующее гипоксия-ориентированное цитотоксическое действие ДХА, способны к фармакодинамическому синергическому взаимодействию. И в этой связи, сочетание этих видов фармакологической активности, реализуемых по различным механизмам, является перспективным подходом для разработки эффективных комплексных средств и методов таргетной терапии онкологических заболеваний. Совокупность приведенных данных свидетельствует о целесообразности синтеза соединения Т1084 - дихлорацетата 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины (см. примеры 1,2).
В токсикологических исследованиях установлено (см. пример 3), что замена солеобразующей кислоты с гидробромида (Т1023) на дихлорацетат (Т1084) не изменяет «острую» токсичность солей 1-изобутаноил-2-изоприлизотиомочевины, и, формально, не повышает риски негативных эффектов в случае применения Т1084 в качестве лекарственного средства. При этом в исследованиях на двух опухолевых моделях -солидной карциноме Эрлиха (КЭ; см. пример 4) и раке шейки матки (РШМ-5; см. пример 5) у мышей соединение Т1084 проявляло существенно более выраженную и стабильную противоопухолевую активность в сравнении с Т1023 и Na-ДХА. На обеих опухолевых моделях хроническое воздействие Т1023 и Na-ДХА сопровождалось развитием резистентности опухолей к их действию.
В целом, на обеих использованных опухолевых моделях действие Т1084 качественно воспроизводило эффекты, наблюдавшиеся при сочетанном применении Т1023 и Na-ДХА. Следовательно, Т1084 - дихлорацетат 1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины можно рассматривать как комбинированное средство таргетной терапии злокачественных новообразований, что позволяет создать новые возможности для разработки новых, более эффективных фармакологических противоопухолевых средств.