СТИМУЛЯТОР ОБРАЗОВАНИЯ НЕЙРИТОВ
EXCITER OF NEURITES FORMATION

Область техники
Настоящее изобретение касается стимулятора образования нейритов. В частности, настоящее изобретение касается средства для улучшения роговичной чувствительности или зрительной функции на основе стимулирования нейритогенеза посредством амидных соединений.
Уровень техники
Поскольку роговичный нерв отделяется хирургическими вмешательствами на роговице, такими как лазерная фоторефракционная кератоэктомия (ФРК), лазерный in situ кератомилез (ЛАЗИК), лазерный эпителиальный кератомилез (ЛАЗЕК) и кератопластика, роговичная чувствительность не восстанавливается, как правило, в течение приблизительно от 3 недель до года. Было выявлено, например, что после ЛАЗИК роговичный нерв явно разъединен (непатентный документ 1), и что чувствительность роговицы уменьшается в корнеальной области, где после ЛАЗИК неврограмма не наблюдается или пучок нервов слишком короткий для создания связи (непатентный документ 2).
Было продемонстрировано, что сниженная роговичная чувствительность после ФРК и ЛАЗИК вызывает снижение ответной реакции слезной железы и уменьшение количества слезной жидкости (непатентный документ 3). В результате функционального уменьшения роговичной чувствительности пациенты после хирургии роговицы мигают меньшее количество раз, демонстрируя проблему, выражающуюся в симптомах синдрома сухого глаза. У пациентов с синдромом сухого глаза пониженная функция слезных желез дает начало патологическим изменениям в роговичном эпителии и сниженной роговичной чувствительности (непатентный документ 4). В особенности проблематичным является то, что сниженная роговичная чувствительность уменьшает слезотечение и делает более серьезными роговичные поверхностные признаки. В других сообщениях утверждается, что лечению роговичной раны препятствует синдром сухого глаза, вызванный ФРК и ЛАЗИК (непатентный документ 3), и что рецидивирующие роговичные эрозии наблюдались после операции ЛАЗИК (непатентный документ 5).
Однако в настоящее время восстановление роговичной чувствительности, которая снизилась после хирургической операции на роговице, оставляют для самостоятельного восстановления и не предоставляют никакой активной обработки для восстановления роговичной чувствительности при лечении синдрома сухого глаза. Кроме того, сниженную роговичную чувствительность вызывают заболевания, сопровождающие роговичную нейродегенерацию, такие как нейропаралитическая кератопатия, язва роговицы и диабетическая кератопатия, но не существует доступных подходящих способов лечения. Относительно роговичных нервов было описано, что нервы, произошедшие из первой ветви (глазная ветвь), которая раздваивается в нервном узле тройничного нерва, в основном распределены в роговичной оболочке и глубоко вовлечены в послеоперационное восстановление роговичной чувствительности, заживление роговичного эпителия и т.п. (непатентный документ 4).
Клетки нервного узла сетчатки глаза представляют собой выходящие из сетчатки клетки; их нейриты, также называемые волокнами зрительного нерва, проходят во внутреннем слое сетчатки и слое нервных волокон (сторона, самая близкая к стекловидному телу) и собираются в оптическом диске, затем выходят из глазного яблока и формируют зрительные нервы, таким образом, участвуя в передаче зрительной информации в кору головного мозга. Известно, что различные относящиеся к сетчатке глаза болезни, повышенное внутриглазное давление (глаукома) и т.п. вызывают атрофию и дегенерацию зрительного нерва, что приводит к зрительным дисфункциям. Лекарственные средства, которые позволяют восстановить функцию пути передачи зрительной информации в сетчатке, особенно лекарственные средства, способные осуществлять неогенез и стимулировать удлинение нейритов нервных клеток сетчатки глаза, вероятно являются пригодными против этих зрительных дисфункций.
N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид представляет собой соединение, демонстрирующее усиливающее действие холинергической активности (непатентный документ 1). Это амидное соединение представляет собой соединение, которое, как ожидают, будет пригодным для лечения расстройств центральной нервной системы млекопитающих, более конкретно амнезии, слабоумия и т.п. Было также продемонстрировано, что это амидное соединение может усиливать высвобождение соматостатина в экспериментах с использованием срезов гиппокампа крыс, ингибировать подавление входящего потока кальция, индуцируемое соматостатином в гиппокампальных нейронах крысы, и вызывать улучшение при когнитивных дисфункциях путем активации системы нейротрансмиссии соматостатина (непатентный документ 6, непатентный документ 2). Также известно, что N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид используют в качестве промотора для продуцирования нейротрофического фактора (патентный документ 3).
in vitro
in vitro
Известно, что соматостатин стимулирует нейритогенез клетки тройничного нерва кролика в экспериментах , и введение соматостатина инстилляцией, как известно, улучшает функцию роговичной чувствительности в тестах  на кроликах (патентный документ 4, особенно тестируемый образец 2 и тестируемый образец 3). Однако, как известно, N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид как не усиливает высвобождение соматостатина в нервных клетках ткани глаза, так и не стимулирует нейритогенез.
Патентный документ 1: WO2000/042011
Патентный документ 2: WO2000/072834
Патентный документ 3: WO2003/084542
Патентный документ 4: WO2004/039403
Непатентный документ 1: Tuuli, U. L. et al., Experimental Eye Research 1998, 66, pp.755-763
Непатентный документ 2: Tuuli, U. L. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science 2000, 41, pp.393-397
Непатентный документ 3: Ang, R. T. et al., Current Opinion in Ophthalmology 2001, 12, pp.318-322
Непатентный документ 4: Xu, K.-T. et al., Cornea 1996, 15, pp.235-239
Непатентный документ 5: Solomon, R. et al., The Ocular Surface 2004, 2, pp.34-42
Непатентный документ 6: Tokita, K. et al., European Journal of Pharmacology 2005, 527, pp.111-120.
Сущность изобретения
Проблемы, которые решаются изобретением
Задачей настоящего изобретения является предоставление средства для стимулирования нейритогенеза ткани глаза. Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтического применения промотора нейритогенеза ткани глаза.
Средства для решения проблем
Ввиду вышеописанных проблем авторы настоящего изобретения, проводя тщательные исследования, обнаружили, что N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид, который, как известно, не проявляет никакой активности в клетках тройничного нерва или в нервных клетках сетчатки, неожиданно стимулировал нейритогенез, и также они обнаружили, что это является полезным против заболеваний, которые сопровождают невропатию ткани глаза, таких как сниженная чувствительность роговицы, и осуществили настоящее изобретение. Соответственно, изобретение в соответствии с данной заявкой является следующим:
[1] Средство для стимулирования нейритогенеза ткани глаза, содержащее N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид или его фармацевтически приемлемую соль.
[2] Средство для стимулирования нейритогенеза роговичной ткани, содержащее N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид или его фармацевтически приемлемую соль.
[3] Средство, описанное выше в [2], которое применяют для улучшения чувствительности роговицы, лечения синдрома сухого глаза или лечения или нарушения роговичного эпителия.
[4] Средство для стимулирования нейритогенеза сетчатки, содержащее N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид или его фармацевтически приемлемую соль.
[5] Средство, описанное выше в [4], которое применяют для улучшения при зрительной дисфункции.
[6] Применение N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления средства, стимулирующего нейритогенез ткани глаза.
[7] Применение N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления средства, стимулирующего нейритогенез роговицы.
[8] Применение описанного выше в [7] средства, стимулирующего нейритогенез роговицы, для улучшения чувствительности роговицы, лечения синдрома сухого глаза и лечения нарушения роговичного эпителия.
[9] Применение N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления средства, стимулирующего нейритогенез сетчатки.
[10] Применение, описанное выше в [9], где средство, стимулирующее нейритогенез сетчатки, используется для улучшения при зрительной дисфункции.
[11] Способ для стимулирования нейритогенеза ткани глаза, включающий введение эффективного количества N-(1-ацетилпиперидин -4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в стимулировании нейритогенеза ткани глаза.
[12] Способ для стимулирования нейритогенеза роговицы, включающий введение эффективного количества N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в стимулировании нейритогенеза роговицы.
[13] Способ, описанный выше в [12], где способ используют для улучшения чувствительности роговицы или лечения синдрома сухого глаза или лечения нарушения роговичного эпителия.
[14] Способ для стимулирования нейритогенеза сетчатки, включающий введение эффективного количества N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в стимулировании нейритогенеза сетчатки.
[15] Способ, описанный выше в [14], где способ используют для улучшения при зрительной дисфункции.
Эффект изобретения
Так как лекарственное средство по настоящему изобретению, содержащее N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид или его фармацевтически приемлемую соль, обладает стимулирующим действием на нейритогенез клеток тройничного нерва, оно применимо для 1) улучшения при сниженной чувствительности роговицы, вызванной повреждением нервов роговицы, и для 2) улучшения при сниженной чувствительности роговицы, связанной с нарушением роговичного эпителия или синдромом сухого глаза. Так как лекарственное средство по настоящему изобретению, содержащее N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид или его фармацевтически приемлемую соль, обладает стимулирующим действием на нейритогенез нервных клеток сетчатки, оно также применимо для улучшения при зрительной дисфункции.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 представлено отношение (%) клеток, в которых протекает нейритогенез, ко всем клеткам. Ось ординат показывает процент клеток, в которых протекает нейритогенез, относительно всех клеток. На этой фигуре * указывает на значимое отличие (р<0,005) от контрольной группы.
На Фиг.2 представлено фотографическое изображение нервных клеток сетчатки глаза, окрашенных антителом против нейрофиламентов.
На Фиг.3 представлен график, на котором показаны изменения с течением времени чувствительности роговицы после создания роговичного лоскута.
Лучший вариант осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к средству для стимулирования нейритогенеза ткани глаза, содержащему N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид или его фармацевтически приемлемую соль. Также настоящее изобретение относится к средству, стимулирующему нейритогенез роговицы и нейритогенез сетчатки, содержащему N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид или его фармацевтически приемлемую соль. Средство для стимулирования нейритогенеза в ткани глаза и нейритогенеза в роговице, средство для улучшения чувствительности роговицы, средство для стимулирования нейритогенеза в сетчатке и средство для улучшения при зрительной дисфункции в совокупности называют лекарственным средством по настоящему изобретению.
В настоящем изобретении «нерв ткани глаза» означает любой нерв, присутствующий в ткани глаза, включая большое разнообразие нервов, таких как нерв роговицы, нерв сетчатки, глазодвигательный нерв и ресничный нервный узел.
В настоящем изобретении «роговичный нерв» означает кольцеобразное сплетение, образованное вокруг роговичной оболочки, под контролем тройничного нерва, который является чувствительным нейроном, стромальное сплетение, распределенное в виде сети в роговичной строме, субэпителиальное сплетение, сформированное непосредственно ниже боуменовой мембраны, и сплетение базальных клеток и нервные волокна, образованные непосредственно проникновения через боуменову мембрану. В настоящем изобретении «нерв сетчатки» означает нервное волокно (зрительный нерв), сформированное клетками нервного узла, и нервное волокно, сформированное клетками глаза, биполярными клетками, горизонтальными клетками и амакринными клетками, которые вовлечены в нейротрансмиссию. В настоящем изобретении «нейрит» означает отросток (дендрит или аксон) от клеточного тела нейрона (нервной клетки); «генез» означает рост и/или удлинение вышеупомянутого нейрита из клеточного тела. В настоящем изобретении «стимулирование…генеза» означает рост и/или удлинение вышеупомянутого нейрита из клеточного тела, вызываемое представленным ниже активным ингредиентом.
N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид ("FK962" CAS No.283167-06-6), который содержится в качестве активного ингредиента в лекарственном средстве по настоящему изобретению, представляет собой амидное соединение, раскрытое в описании заявки WO2000/042011 (особенно в примере 6). Фармацевтически приемлемая соль этого амидного соединения представляет собой обычно используемую нетоксичную соль. Ее примеры включают кислотно-аддитивные соли, к примеру, аддитивные соли неорганических кислот (например, гидрохлориды, гидробромиды, сульфаты, фосфаты и т.п.) и аддитивные соли органических кислот (например, соли муравьиной кислоты, ацетаты, трифторацетаты, малеаты, тартраты, метансульфонаты, бензолсульфонаты, толуолсульфонаты и т.п.), соли аминокислот (например, аспартаты, глутаматы и т.п.), соли металлов, например, соли щелочных металлов (к примеру, соли натрия, калия и т.п.) и соли щелочноземельных металлов (к примеру, соли кальция, магния и т.п.), и т.п.
N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид и его фармацевтически приемлемую соль можно синтезировать, как описано в описании заявки WO2000/042011 (особенно в примере 6).
Лекарственное средство по настоящему изобретению пригодно в качестве промотора нейритогенеза в тканях глаза, таких как роговичный нерв и нерв сетчатки у млекопитающих (например, людей, мышей, крыс, хомяков, кроликов, кошек, собак, коров, овец, обезьян и т.п.).
Лекарственное средство по настоящему изобретению способно улучшить сниженную чувствительность роговичного нерва, вызванную повреждением, разрывом или дефектом роговичного нерва, путем стимулирования нейритогенеза в роговице. Соответственно, лекарственное средство по настоящему изобретению пригодно в качестве средства, улучшающего чувствительность роговицы.
Лекарственное средство по настоящему изобретению пригодно в качестве терапевтического средства, которое улучшает сниженную чувствительность роговицы, связанную с заболеваниями, которые сопровождают повреждение, разрыв или дефект роговичного нерва, например, с нарушением роговичного эпителия, синдромом сухого глаза (сниженная секреция слезной жидкости; тип синдрома сухого глаза с повышенным испарением слезной жидкости; синдром Шегрена; синдром Стивенса-Джонсона; синдром сухого глаза, который сопровождает роговичную эпителиальную эрозию, маргинальный блефарит, глазной пемфигоид, весенний конъюнктивит, аллергический конъюнктивит, дефицит витамина А и т.п.), нейропаралитической кератопатией, язвой роговицы, диабетической кератопатией, кератоконъюнктивитом (эпидемический кератоконъюнктивит, простой герпесный кератит), кератоконусом, дегенерацией роговицы и т.п.). Как указано в настоящем документе, нарушение роговичного эпителия означает, что роговичный эпителий поврежден эндогенным заболеванием, таким как язва роговицы, отслоение роговичного эпителия, сухой кератоконъюнктивит, хронический поверхностный кератит, эрозия роговицы или длительное повреждение роговичного эпителия, экзогенным заболеванием, вызванным лекарственным средством, травмой, ношением контактных линз или сходными с ними, или физическим или химическим повреждением. Лекарственное средство по настоящему изобретению также пригодно в качестве терапевтического средства, которое улучшает сниженную чувствительность роговицы, связанную с хирургическими операциями по поводу катаракты, на стекловидном теле, роговице, такими как ФРК, ЛАЗИК, ЛАЗЕК и хирургическая операция по трансплантации роговицы.
Сниженную чувствительность роговицы и ее улучшение можно определять обычным способом с использованием эстезиометра, такого как эстезиометр Коше-Бонне.
Известно, что у пациентов с синдромом сухого глаза сниженная функция слезных желез вызывает сниженную чувствительность роговицы и что эта сниженная чувствительность роговицы приводит к дальнейшему снижению функции слезных желез. Было описано, что этот порочный круг ухудшает симптомы синдрома сухого глаза и даже вызывает нарушение роговичного эпителия. Например, в статье Mathers (CLAO J. 2000, 26, 159) описана «модель обратной связи в роговичной слезной железе», предполагающая, что слезные железы и роговичная оболочка тесно интегрированы в начале заболевания, и что заболевание слезных желез влияет на глазную поверхность, а заболевание глазной поверхности влияет на слезные железы. Mathers показывает, что сниженная чувствительность роговицы вызывает снижение секреции слезных желез, затем приводит к нарушению роговицы и, в результате, вызывает нарушение слезных желез, и что все это происходит по замкнутому кругу (в частности, на 39-й - 45-й строке, правая колонка, страница 161). В статье Ang et al. (Curr Opin Ophthalmol. 2001, 12, 318.) утверждается, что сниженная чувствительность роговицы является основной причиной нарушений роговичного эпителия, таких как поверхностная точечная кератопатия, вызывающая снижение обратных связей в слезной железе и снижение слезотечения. В статье Xu et al. (Cornea 1996, 15, 235) утверждается, что сниженная секреция слезных желез может привести к морфологическим изменениям в роговичном эпителии и снижению чувствительности роговицы (например, строки 44-47, правая колонка, страница 238). Тем временем, в статье Fudjishima et al. (Cornea 1996, 15, 368) выдвинуто предположение, что в исследовании с использованием ингибитора альдозоредуктазы улучшение динамики продуцирования может быть следствием повышения чувствительности роговицы. Поэтому, так как лекарственное средство по настоящему изобретению улучшает замкнутый круг роговичной гипестезии и сниженной функции слезной жидкости путем улучшения чувствительности роговицы, оно также пригодно как терапевтическое средство от синдрома сухого глаза или нарушения роговичного эпителия. В частности, лекарственное средство по настоящему изобретению пригодно в качестве терапевтического средства от синдрома сухого глаза или нарушения роговичного эпителия, которые сопровождают сниженную чувствительность роговицы.
Лекарственное средство по настоящему изобретению пригодно в качестве терапевтического средства, которое приводит к улучшению при зрительной дисфункции, вызванной повреждением, разрывом, дегенерацией нервов сетчатки глаза или дефектом роста нейритов сетчатки. Соответственно, лекарственное средство по настоящему изобретению пригодно в качестве средства для улучшения при зрительной дисфункции. В соответствии с настоящим изобретением зрительная дисфункция означает уменьшение количества клеток нервного узла сетчатки глаза или волокон зрительного нерва из-за повреждения, дегенерации и т.п. нерва сетчатки или зрительного нерва; потерю зрения, снижение остроты зрения, сужение поля зрения, дефектное цветовое зрение или неясность зрения, которые являются следствием оптической атрофии, потерю аксонов нервных волокон, истончение миелиновой оболочки волокон зрительного нерва, дефект зрительного нерва и т.п., и ухудшение зрения с различными симптомами, такими как отклонения в электроретинограмме и вызванном потенциале зрительного нерва.
Лекарственное средство по настоящему изобретению пригодно в качестве терапевтического средства, которое приводит к улучшению при зрительной дисфункции, связанной с невритом зрительного нерва, капиллярной гемангиомой диска зрительного нерва, ишемической невропатией зрительного нерва, дефектом слоя нервных волокон сетчатки, ретинальной атрофией зрительного нерва, разделением зрительного нерва, травматической невропатией зрительного нерва, отеком зрительного нерва, дефектом оптического диска, гипоплазией зрительного нерва, токсической атрофией зрительного нерва, глаукомой и т.п.
Лекарственное средство по настоящему изобретению пригодно в качестве терапевтического средства, которое приводит к улучшению при зрительной дисфункции, связанной с воспалением сетчатки, такой как заболевания нерва сетчатки, окклюзией сосудов сетчатки, ретинальным перифлебитом, болезнью Илза, ишемическим глазным синдромом, макроаневризмой артериол сетчатки, ретинопатией вследствие гипертонии и заболевания почек и гематологического заболевания, диабетической ретинопатией, дистрофией сетчатки глаза, дистрофией желтого пятна, ретинохориодопатией, дегенерацией желтого пятна, отеком желтого пятна, отслоением пигментного эпителия сетчатки, дегенеративным ретиношизисом, ретинобластомой, ретинальной пигментной эмителиомой. Кроме того, лекарственное средство по настоящему изобретению эффективно для роста и поддержания функционирования клеток глаза, включая клетки нервного узла сетчатки глаза, при трансплантации и при регенерации зрительного нерва при трансплантации зрительного нерва.
Лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить пациентам перорально или парентерально; в качестве способов его введения могут быть упомянуты: пероральное введение, местное глазное введение (введение инстилляцией, введение в стекловидное тело, субконъюнктивальное введение, введение в теноновую капсулу и т.п.), внутривенное введение, трансдермальное введение и т.п., и, когда это требуется, лекарственное средство по настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемой добавкой может быть изготовлено в виде дозированной формы, удобной для введения. В качестве примеров дозированных форм, пригодных для перорального введения, могут быть упомянуты таблетки, капсулы, гранулы, порошки и т.п.; в качестве примеров дозированных форм, пригодных для парентерального введения, могут быть упомянуты глазные капли, глазные мази, инъекции, повязки, лосьоны, кремы и т.п. Их можно изготавливать обычными способами, широко используемыми в медицине. В дополнение к этим препаратам этот состав может быть изготовлен в форме препаратов DDS (системы для доставки лекарственного средства), таких как препараты для внутриглазных имплантатов и микросфер. Хотя лекарственное средство по настоящему изобретению, в частности, не ограничивается способом его введения, при условии что достигают указанного выше терапевтического эффекта, описанного выше, предпочтительным способом введения является местное глазное введение. В качестве примеров дозированных форм для местного глазного введения могут быть упомянуты глазные капли и глазные мази.
В качестве субъектов для введения лекарственного средства по настоящему изобретению могут быть упомянуты млекопитающие (например люди, мыши, крысы, хомяки, кролики, кошки, собаки, коровы, овцы, обезьяны и т.п.).
Например, когда лекарственное средство по настоящему изобретению применяют в виде глазных растворов или глазных мазей, то в качестве добавок можно использовать стабилизаторы (например, гидросульфит натрия, тиосульфат натрия, цитрат натрия, аскорбиновую кислоту, дибутилгидрокситолуол и т.п.), солюбилизаторы (например, глицерин, пропиленгликоль, макрогол, отвержденное полиоксиэтиленом касторовое масло и т.п.), суспендирующие средства (например, поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия и т.п.), эмульгаторы (например, поливинилпирролидон, лецитин соевых бобов, лецитин яичного желтка, отвержденное полиоксиэтиленом касторовое масло, полисорбат 80 и т.п.), буферные растворы (например, фосфатный буферный раствор, ацетатный буферный раствор, боратный буфер, карбонатный буфер, цитратный буфер, Трис-буфер, глутаминовую кислоту, эпсилон-аминокапроновую кислоту), вещества, придающие клейкость (например, растворимые в воде производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза, хондроитинсульфат натрия, гиалуронат натрия, карбоксивиниловый полимер, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, макрогол и т.п.), консерванты (например, бензалконий хлорид, хлорид бензетония, глюконат хлоргексидина, хлорбутанол, бензиловый спирт, дегидроацетат натрия, параоксибензоаты, эдетат натрия, борную кислоту и т.п.), изотонические вещества (например, хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит, сорбит, борную кислоту, глюкоза, пропиленгликоль и т.п.), регуляторы pH (например, соляную кислоту, гидроксид натрия, фосфорную кислоту, уксусную кислоту и т.п.), освежающие вещества (например 1-ментол, d-камфару, d-борнеол, масло перечной мяты и т.п.), основы для мазей (медицинский вазелин, очищенный ланолин, жидкий парафин, растительные масла (оливковое масло, масло камелии, арахисовое масло и т.п.) и т.п. Хотя количество этих добавок, подлежащее применению, варьирует в зависимости от вида, применения и т.п. добавок, подлежащих применению, добавки только должны быть добавлены в концентрациях, способных выполнить назначение добавок.
Когда лекарственное средство по настоящему изобретению изготавливают для применения в виде глазного раствора или глазной мази, препарат можно получать согласно способу, общепринятому в области фармацевтики; например, изготовление можно проводить на основе способов, описанных в разделе "Глазные растворы" и в разделе "Глазные мази", Общих правил для препаратов Японской фармакопеи XV.
Также настоящее изобретение относится к применению N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства по настоящему изобретению.
Дозировка лекарственного средства по настоящему изобретению варьирует в зависимости от конкретного заболевания и она не может быть обобщена; однако она может быть установлена на такое количество, которое позволит достигнуть концентрации препарата в ткани-мишени, где должен проявиться желаемый эффект, составляющей от 0,001 нмоль (0,26 пг/мл на основе N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида; тоже самое применяется ниже) до 1000 нмоль (260 нг/мл), предпочтительно от 0,001 нмоль (0,26 пг/мл) до 10 нмоль (2,6 нг/мл), более предпочтительно от 0,01 нмоль (0,0026 нг/мл) до 1 нмоль (0,26 нг/мл), и еще более предпочтительнее от 0,05 нмоль (0,13 нг/мл) до 0,5 нмоль (0,13 нг/мл).
Когда лекарственное средство по настоящему изобретению применяют местно для глаз взрослых в качестве средства, улучшающего чувствительность роговицы, рекомендуется, чтобы глазной раствор, содержащий от 0,01 нмоль (0,0026 нг/мл) до 100 нмоль (26 нг/мл), более предпочтительно от 0,1 нмоль (0,026 нг/мл) до 10 нмоль (2,6 нг/мл) и более предпочтительнее от 0,5 нмоль (0,13 нг/мл) до 5 нмоль (1,3 нг/мл) активного ингредиента, приблизительно от 20 до 50 мкл на дозу, вводили инстилляцией от 1 до 8 раз, предпочтительно от 1 до 5 раз, в сутки.
Так как лекарственное средство по настоящему изобретению является активным в отношении стимулирования нейритогенеза ткани глаза, стимулирования нейритогенеза роговицы или стимулирования нейритогенеза сетчатки, настоящее изобретение также относится к способу стимулирования нейритогенеза ткани глаза, стимулирования нейритогенеза роговицы или стимулирования нейритогенеза сетчатки, заключающемуся в ведении эффективного количества N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в таком стимулировании.
В качестве субъектов способа стимулирования по настоящему изобретению могут быть упомянуты млекопитающие (например люди, мыши, крысы, хомяки, кролики, кошки, собаки, коровы, овцы, обезьяны и т.п.), причем предпочтительными являются люди.
Способ введения, дозированная форма и дозировка N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамида или его фармацевтически приемлемой соли, являющихся активным ингредиентом в способе стимулирования по настоящему изобретению, могут быть установлены соответствующим образом, как описано выше в отношении лекарственного средства по настоящему изобретению.
Способ по настоящему изобретению для стимулирования нейритогенеза роговицы предпочтительно используют для улучшения чувствительности роговицы, лечения синдрома сухого глаза или лечения нарушения роговичного эпителия.
Способ по настоящему изобретению для стимулирования нейритогенеза сетчатки предпочтительно используют для улучшения при зрительной дисфункции.
Примеры
Настоящее изобретение далее подробно описано с помощью следующих примеров, которыми, однако, изобретение не ограничено.
Тестовый пример 1: Стимулирующий эффект на нейритогенез в культивированных клетках тройничного нерва кролика
1. Использованные животные
Использовали японских белых кроликов (в возрасте 4-х дней, самцы), приобретенных от Oriental Yeast Co., Ltd.
2. Исследуемое вещество
Использовали N-(1-ацетилпиперидин-4-ил)-4-фторбензамид (в дальнейшем называемый соединением А).
3. Процедура испытаний
А) Клеточная культура
Клетки тройничного нерва кролика выделяли согласно сообщению Chan et al. (Kwan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41: 687-699, 1985). Конкретно, кролика подвергали перфузии сердца физиологическим раствором под анестезией инъекцией пентобарбитала натрия (Dainippon Sumitomo Pharma), после которой извлекали узел тройничного нерва. Отделенный узел тройничного нерва промывали сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS, Invitrogen), и после этого обрабатывали 300 мкг/мл коллагеназы (Roche) при температуре 37°C в течение 40 минут; проводили центрифугирование при 120×g в течение 5 минут, и клетки собирали. Ферментативную реакцию останавливали посредством Neurobasal (зарегистрированная торговая марка, Invitrogen), дополненного ЭДТА до конечной концентрации 0,1%, и клетки суспендировали в культурной среде, после чего проводили центрифугирование при 120×g в течение 5 минут, и получали клетки тройничного нерва.
3
Полученные клетки высевали на 8-луночные предметные стекла, покрытые полилизин/ламинином (Falcon), в количестве приблизительно 3×10клеток на лунку; после посева клетки культивировали в течение 24 часов. После культивирования в течение 24 часов в каждую культурную среду добавляли соединение А (конечная концентрация 0,1 нмоль (0,026 нг/мл)) и NGF (конечная концентрация 1 мкг/мл) в качестве положительного контроля или PBS в качестве контроля. После добавления клетки далее культивировали в течение 48 часов.
Используемой культурной средой был Neurobasal, содержащий добавку B27 (Invitrogen) (конечная концентрация 2% (об./об.), L-глутамин (Invitrogen) (конечная концентрация 1 ммоль) и цитозин-1-β-D(+)-арабинофуранозид (конечная концентрация 10 мкмоль). Условия культивирования были установлены при концентрации углекислого газа 5%, концентрации воздуха 95%, влажности 100% и температуре 37°C.
В) Окрашивание
После культивирования в течение 48 часов после добавления клетки тройничного нерва кролика погружали и фиксировали в 10% нейтрально буферизованном растворе формальдегида при комнатной температуре в течение 20 минут. Фиксированные образцы подвергали флуоресцентному окрашиванию с использованием антитела против нейрофиламентов 200 (Sigma-Aldrich), которое специфично распознает нейрофиламенты, составляющие тела нервных клеток и нейриты, и окрашенные клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом (Olympus). Изображение окрашенных клеток передавалось от флуоресцентного микроскопа к компьютеру.
С) Визуальный анализ
Для оценки степени нейритогенеза в культивированных клетках тройничного нерва кролика диаметры тел клеток и длины нейритов измеряли на полученном компьютером изображении окрашенных клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображений (Image-Pro Plus Ver.4.5.1, Media Cybernetics). Клетки, имеющие нейрит с длиной не менее чем два диаметра клеточного тела, считали клетками с нейритогенезом, и вычисляли отношение (%) этих клеток к общему количеству Otori Y, Wei JY, Barnstable CJ. Invest. Ophthalmol Vis Sci (1998) 39, 972-981).
4. Результаты тестов
На Фиг.1 представлен график, на котором показано отношение (%) клеток с нейритогенезом ко всем клеткам. Отношение клеток с нейритогеназом составляло для контрольной группы 29,5±8,7%, для группы с добавлением 0,1 нмоль соединения А - 63,3±5,2%, и для группы с добавлением NGF - 70,0±17,6%. Статистический анализ показал значимый эффект стимулирования нейритогенеза как в группе с добавлением 0,1 нмоль соединения А, так и в группе с добавлением NGF, по сравнению с контрольной группой (N=6, 5, 5 (расположенные в том же порядке), среднее значение±стандартное отклонение, *: p<0,005; критерий множественного сравнения Данетта).
Эти результаты продемонстрировали, что соединение А обладает стимулирующим эффектом на нейритогенез в культивированных клетках тройничного нерва кролика. Более того, соединение А обладает стимулирующим эффектом на нейритогенез клеток тройничного нерва при концентрациях, более низких чем концентрации NGF (1 мкг/мл), который, как правило, используется в качестве положительного контроля.
Тестовый пример 2: Стимулирующий эффект на нейритогенез в ретинальных клетках кролика
1. Использованные животные
Использовали японских белых кроликов (в возрасте 4-х дней, самцы), приобретенных от Oriental Yeast Co., Ltd.
2. Исследуемое вещество
Использовали соединение А.
3. Процедура испытаний
1) Клеточная культура
3
Кролика подвергали перфузии сердца физиологическим раствором под анестезией инъекцией пентобарбитала натрия (Dainippon Sumitomo Pharma), после которой глазные яблоки удаляли и сетчатку отделяли. Отделенные сетчатки помещали в раствор папаина (1 мг/мл, Sigma-Aldrich Japan K.K.), суспендировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS, Invitrogen) и подвергали ферментативному расщеплению при 37°C в течение 30 минут. После этого использовали среду (L-15) Лейбовица (L-15, Invitrogen) для приготовления реагентов. После того как суспензии позволили отстояться, супернатант удаляли, добавляли 3 мл раствора ингибитора трипсина (2 мг/мл ингибитора трипсина, 0,004% ДНКаза и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, растворенного в L-15, рН 7,4) и проводили пипетирование. После того как раствору позволили отстояться, супернатант удаляли, добавляли другие 3 мл раствора ингибитора трипсина, проводили пипетирование, и это действие повторили еще один раз; проводили центрифугирование при 120×g в течение 5 минут и супернатант удаляли. Добавляли 2 мл высококонцентрированного раствора ингибитора трипсина (10 мг/мл ингибитора трипсина, растворенного в L-15, рН 7,4) и проводили пипетирование; проводили центрифугирование при 120×g в течение 5 минут и супернатант удаляли. Клетки суспендировали в 10 мл раствора L-15 (Invitrogen), содержащего 0,05% бычий сывороточный альбумин (БСА), и добавляли антитело против макрофагов (конечная концентрация 1 мкг/мл). После инкубации при комнатной температуре в течение 20 минут проводили центрифугирование при 120×g в течение 5 минут, супернатант удаляли и клетки суспендировали в 20 мл 0,05% раствора БСА/L-15, и высевали в чашки, предварительно покрытые вторым антителом (антителом против иммуноглобулина G мыши, Nippon Chemi-Con). После инкубации при 37°C в течение 40 минут раствор с суспендированными клетками центрифугировали при 120×g в течение 5 минут, посредством чего клетки собирали. Клетки высевали на 8-луночные предметные стекла, покрытые полилизин/ламинином (Falcon), в количестве приблизительно 3×10клеток на лунку; после посева клетки культивировали в течение 24 часов. После культивирования в течение 24 часов в каждую культурную среду добавляли соединение А (конечная концентрация 0,1 нмоль (0,026 нг/мл)) и NGF (конечная концентрация 1 мкг/мл) в качестве положительного контроля или PBS в качестве контроля. После добавления клетки далее культивировали в течение 48 часов. Используемой культурной средой был Neurobasal, содержащий добавку B27 (Invitrogen) (конечная концентрация 2% (об./об.), L-глутамин (Invitrogen) (конечная концентрация 1 ммоль) и цитозин-1-β-D(+)-арабинофуранозид (конечная концентрация 10 мкмоль). Условия культивирования были установлены при концентрации углекислого газа 5%, концентрации воздуха 95%, влажности 100% и температуре 37°C.
2) Окрашивание
Клетки были окрашены таким же способом, что и в тестовом примере 1.
4. Результаты испытаний
Результаты представлены на Фиг.2. На Фиг.2 представлено фотографическое изображение нервных клеток сетчатки, окрашенных антителом против нейрофиламентов. При добавлении Соединения А в клетках наблюдали выраженный нейритогенез.
Подготовка Образца 1 Глазные капли
Соединение А
0,026 мкг
Полисорбат 80
0,1 г
Дигидрофосфат натрия
0,1 г
Хлорид натрия
0,9 г
Хлорид бензалкония
0,005 г
Гидроксид натрия
Достаточное количество
Стерильная дистиллированная вода
Достаточное количество
Общее количество 100 мл (рН 7,0)
Эти ингредиенты смешивали, чтобы получить глазные капли.
Пример получения 1 Глазная мазь
Соединение А
1 мкг
Очищенный ланолин
10 г
Медицинский вазелин
100 г
Эти ингредиенты смешивали, чтобы получить глазную мазь.
Тестовый пример 3: Стимулирующее действие на нейритогенез в культивированных клетках тройничного нерва кролика
1. Использованные животные
Использовали японских белых кроликов (в возрасте 4-х дней, самцы), приобретенных от Oriental Yeast Co., Ltd.
2. Исследуемое вещество
Использовали соединение А.
3. Процедура испытаний
А) Клеточная культура
Клетки тройничного нерва кролика выделяли согласно сообщению Chan et al. (Kwan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41: 687-699, 1985). Конкретно, кролика подвергали перфузии сердца физиологическим раствором под анестезией инъекцией пентобарбитала натрия (Dainippon Sumitomo Pharma), после которой извлекали узел тройничного нерва. Отделенный узел тройничного нерва промывали сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS, Invitrogen), и после этого обрабатывали 300 мкг/мл коллагеназы (Roche) при температуре 37°C в течение 40 минут; проводили центрифугирование при 120×g в течение 5 минут, и клетки собирали. Ферментативную реакцию останавливали посредством Neurobasal (зарегистрированная торговая марка, Invitrogen), дополненного ЭДТА до конечной концентрации 0,1%, и клетки суспендировали в культурной среде, после чего проводили центрифугирование при 120×g в течение 5 минут, и получали клетки тройничного нерва.
3
Полученные клетки высевали на 8-луночные предметные стекла, покрытые полилизин/ламинином (Falcon), в количестве приблизительно 3×10клеток на лунку; после посева клетки культивировали в течение 24 часов. После культивирования в течение 24 часов в каждую культурную среду добавляли соединение А в каждой из концентраций: 0,001 нМ (0,00026 нг/мл), 0,1 нМ (0,026 нг/мл), 10 нМ (2,6 нг/мл), 1000 нМ (260 нг/мл) и NGF (конечная концентрация 1 мкг/мл) в качестве положительного контроля или PBS в качестве контроля. После добавления клетки далее культивировали в течение 48 часов.
Используемой культурной средой был Neurobasal, содержащий добавку B27 (Invitrogen) (конечная концентрация 2% (об./об.), L-глутамин (Invitrogen) (конечная концентрация 1 ммоль) и цитозин-1-β-D(+)-арабинофуранозид (конечная концентрация 10 мкмоль). Условия культивирования были установлены при концентрации углекислого газа 5%, концентрации воздуха 95%, влажности 100% и температуре 37°C.
В) Окрашивание
После культивирования в течение 48 часов клетки тройничного нерва кролика погружали и фиксировали в 10% нейтрально буферизованном растворе формальдегида при комнатной температуре в течение 20 минут. Фиксированные образцы подвергали флуоресцентному окрашиванию с использованием антитела против нейрофиламентов 200 (Sigma-Aldrich), которое специфично распознает нейрофиламенты, составляющие тела нервных клеток и нейриты, и окрашенные клетки исследовали под флуоресцентным микроскопом (Olympus). Изображение окрашенных клеток передавалось от флуоресцентного микроскопа к компьютеру.
С) Визуальный анализ
Для оценки степени нейритогенеза в культивированных клетках тройничного нерва кролика диаметры тел клеток и длины нейритов измеряли на полученном компьютером изображении окрашенных клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображений (Image-Pro Plus Ver.4.5.1, Media Cybernetics). Клетки, имеющие нейрит с длиной не менее чем два диаметра клеточного тела, считали клетками с нейритогенезом, и вычисляли отношение (%) этих клеток к общему количеству Otori Y, Wei JY, Barnstable CJ. Invest. Ophthalmol Vis Sci (1998) 39, 972-981).
4. Результаты испытаний
В таблице 1 представлено отношение (%) клеток с нейритогенезом ко всем клеткам. Во всех группах с добавлением 0,001 нмоль, 0,1 нмоль, 10 нмоль и 1000 нмоль соединения А, отношение (%) клеток с нейрогенезом было выше, чем в контрольной группе. Статистический анализ показал значимый эффект стимулирования нейритогенеза как в группе с добавлением 0,1 нмоль соединения А, так и в группе с добавлением NGF, по сравнению с контрольной группой (N=6, 5, 5 (расположенные в том же порядке), среднее значение±стандартное отклонение, *: p<0,005; критерий множественного сравнения Данетта).
Оценивая результаты, показанные выше, соединение А продемонстрировало стимулирующий эффект на нейритогенез клеток тройничного нерва в концентрациях, меньших чем концентрации NGF (1 мг/мл), который обычно используется в качестве положительного контроля, с оптимальной концентрацией 0,1 нмоль.
Соотношение (%) клеток с нейритогенезом
0,001 нмоль соединения А
33,6±16,3
0,1 нмоль соединения А
45,9±15,1*
10 нмоль соединения А
37,2±16,5
1000 нмоль соединения А
37,0±20,0
NGF (1 мг/мл)
47,3±15,9*
Контроль
30,4±19,5
Тестовый пример 4: Улучшение чувствительности роговицы у кроликов
1. Использованные животные
Использовали японских белых кроликов с массой от 2,5 до 3,0 кг, приобретенных от KITAYAMA LABES. С начала до дня окончания испытания животных содержали в комнате для разведения при комнатной температуре 23±3°C, влажности 55±10% и 12-ти часовом освещении (включение света в 8:00, выключение в 20:00) по одному кролику в клетке. Каждое животное кормили 100-120 г твердой пищи (Labo R Stock, Nosan Corporation) в сутки, и они имели свободный доступ к водопроводной воде.
2. Исследуемое вещество
В качестве исследуемого вещества использовали соединение А. Исследуемое вещество растворяли в основе, показанной ниже, с получением глазного раствора с концентрацией 1 нмоль (0,00000026%). Для контрольной группы капельно вводили следующую основу, не содержащую исследуемого вещества.
Состав основы:
Дигидрат дигидрофосфата натрия
0,1 г
Хлорид натрия
0,9 г
Гидроксид натрия
Достаточное количество
Дистиллированная вода
Достаточное количество
100 мл (pH 7,0)
3. Процедура испытаний
1) Разделение на группы
За сутки до создания кожного лоскута макроскопически исследовали глазную поверхность животных и наличие флуоресцентно окрашиваемых пятен на роговице; отбирали кроликов без наблюдаемых при этом исследовании отклонений, и измеряли начальные значения чувствительности роговицы эстезиометром Коше-Бонне (произведенным Luneau). Для единообразия распределения начальных значений чувствительности роговицы животных распределяли на группы способом одновариантной полной рандомизации, используя пакет программ для доклинических испытаний SAS (версия 5.0, SAS Institute, Япония).
2) Создание роговичного лоскута
Каждое животное подвергали общему наркозу путем внутримышечной инъекции (0,9 мл/кг) смешанного раствора (0,5:1) Celactal (2% ксилазин: Bayer, Япония) и Ketalar (5% кетамин для внутримышечной инъекции: Daiichi Sankyo). После того, как каждое глазное яблоко было тщательно удалено, получали роговичный лоскут толщиной 130 мкм и диаметром 8,5 мм с помощью микрокератома (МК-2000, NIDEK), оборудованного адаптером для глаз кролика (Arbelaez MC. et al. J. Refract Surg. 2002 May-Jun; 18(3 Suppl):S357-60). Лоскут возвращали в первоначальное положение под микроскопом, и животное пробуждали от наркоза под тщательным присмотром, чтобы лоскут не сместился. После пробуждения вводили 0,3% глазной раствор гатифлоксацина (Gatiflo, глазной раствор, Senju Pharmaceutical).
3) Введение
На следующие сутки после создания лоскута особям, у которых отсутствовало отслоение лоскута, вводили инстилляцией исследуемое вещество в виде глазного раствора или основу в течение 6 недель. Введение по каплям проводили на прооперированном глазе с 2-часовыми интервалами четыре раза в сутки по 50 мкл на дозу с использованием микропипетки. В течение 6 дней после хирургической операции вводили 0,3% глазной раствор гатифлоксацина перед инстилляцией глазного раствора исследуемого вещества или носителя.
4) Эстезиометрия роговицы
Через одну, две, четыре или шесть недель после хирургической операции определяли чувствительность роговицы с помощью эстезиометра Коше-Бонне. Исследователь, проводивший измерения, работал в условиях слепого опыта, чтобы он не знал о группе, к которой принадлежит кролик.
5. Результаты испытаний
На Фиг.3 представлены изменения с течением времени чувствительности роговицы после создания роговичного лоскута. В группе с введением носителя через неделю после создания роговичного лоскута все особи теряли свою чувствительность, однако их чувствительность восстановилась в течение 6-недельного периода. Напротив, в группе, в которой проводили инстилляцию лекарственного раствора, через неделю после создания роговичного лоскута все особи потеряли свою чувствительность, однако после 4-х недель группа продемонстрировала ускоренное восстановление по сравнению с группой, где проводили инстилляцию среды. Сравнивая время, когда чувствительность наблюдалось впервые после создания роговичного лоскута (в первый раз, когда было получено измеренное значение 5-мм длины волокна или более для чувствительности к наркозу), время составляло в среднем 5,5 недель для группы с инстилляцией среды и в среднем 4,1 недели для группы с инстилляцией лекарственной жидкости. Исходя из этих результатов, было обнаружено, что группа с введенной лекарственной жидкостью продемонстрировала ускоренное восстановление сниженной чувствительности роговицы после создания лоскута.
Промышленная применимость
Лекарственное средство по настоящему изобретению является пригодным для 1) улучшения при сниженной чувствительности роговицы, вызванной повреждением роговичного нерва, и 2) улучшения при сниженной чувствительности роговицы, которая сопровождает нарушение роговичного эпителия или сухой глаз. Лекарственное средство по настоящему изобретению также пригодно для улучшения при зрительной дисфункции.
Эта заявка основана на патентной заявке № 2007-112248, поданной в Японии (дата подачи: 20 апреля 2007 года), содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.