СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛИЧИНОК СТРОНГИЛЯТ ЛОШАДЕЙ ТАБУННОГО СОДЕРЖАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЯИЦ ПРИ ДЕЙСТВИИ КРИТИЧЕСКИ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР
METHOD OF CULTIVATION OF STRONGYLE LARVAE FROM HERD KEEPING HORSES FOR DETERMINATION OF EGGS VIABILITY AT ACTION OF CRITICALLY LOW TEMPERATURES

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности ветеринарии и может быть использовано для определение интенсивности инвазии лошадей находящихся в круглогодичном пастбищном содержании, для определения развития и выживаемости яиц стронгилят при критически низких температурах -45°С; -50°С; -55°С, для использования культивированных личинок стронгилят в лабораторных опытах.
Стронгиляты пищеварительного тракта лошадей - геогельминты. Цикл развития разных видов в общих чертах одинаков. В яйцах, выделившихся во внешнюю среду, при температуре 20-25°С за 12-17 часов развиваются личинки 1-й стадии (Л-I), которые (в большинстве случаев) покидают яйцо, растут и дозревают, превращаясь после двух линек в инвазионную стадию (Л-III) примерно за 4-5 суток. При пониженной температуре развитие продолжается несколько недель. Личинки Л-I и Л-II живут, как свободноживущие организмы, питаются органическими субстратами, Л-III - не питаются. Личинки способны мигрировать по листьям, стеблям растений и влажной почве. Дальнейшее развитие их в организме лошадей протекает неодинаково.
Известен способ культивирования личинок стронгилят по методу П.А. Величкина (1967), по этому методу свежие пробы фекалий весом 50 г помещают в чашки Петри, слегка увлажняют, закрывают крышкой и ставят в термостат при температуре 30°С на 7-10 дней. Начиная с 7 дня пробы берут по 5 г навески, заворачивают в марлю и помещают в воронки аппарата Бермана, в воронки заливается теплая вода (до +35°С). Аппарат с пробами фекалий оставляют при комнатной температуре на 2-3 часа. За это время личинки нематод выпадают из пробы на дно воронки или до места перекрытия трубки зажимом, осадок разливают на предметные стекла и микроскопируется.
Имеются данные о способе диагностики стронгилятозов желудочно-кишечного тракта жвачных животных, заключающийся в том, что берут пробу фекалий весом 3-5 г, помещают в стакан, заливают небольшим количеством флотационной жидкости, состоящей из насыщенного раствора натрия хлорида и глицерина в соотношении 2:1, процеживают в чистый стакан, дают взвеси отстояться в течение 15-30 мин, петлей снимают поверхностную пленку (через 15 мин определяют яйца кишечных стронгилят, а через 30 мин - личинок при их наличии), переносят ее на предметное стекло и микроскопируют (патент RU 2007138691, 2014 г.). Однако данные методы культивирования личинок нематод показывают только условную интенсивность стронгилятозной инвазий лошадей в теплое время года.
Технической задачей заявляемого изобретения является определение выживаемости яиц стронгилят и интенсивности выделения из них личинок стронгилят при содержании лошадей в экстремальных условиях Якутии, при критически низких температурах: -45°С; -50°С; -55°С и ниже.
В основу способа изобретения положена задача культивирования и интенсивности выделения личинок стронгилят, определение выживаемости яиц стронгилят при низких -45°С; -50°С; -55°С и ниже температурах, выхода личинок определяет вероятность круглогодичной реинвазии лошадей.
Технический результат изобретения - определение выживаемости яиц в зимний период и выхода из них личинок в лабораторных условиях. Технический результат изобретения достигается следующим образом: определяется интенсивность выделения из яиц инвазионных личинок, который определяет выживаемость яиц при низких -45°С; -50°С; -55°С и ниже температурах, интенсивность инвазии лошадей стронгилятами при круглогодичной тебеневке в условиях Якутии.
До постановки проб фекалий в термостат при флотационном методе исследования проб фекалий по методу Фюллеборна, обнаруживаются яйца стронгилят.
Исследование начинают при температурах воздуха -5°С; -10°С; -15°С; -25°С, опытные пробы фекалий (целыми комками) ставят в холодильник с температурой +8°С на 24 часов, затем переносят при комнатной температуре +22°С на 12 часов, переносят в термостат при температуре +28°С. При температуре наружного воздуха -25°С; -30°С; -35°С, замерзшие пробы фекалий ставят в холодильник с температурой +8°С на 24 часа, затем переносят при комнатной температуре +22°С на 12 часов, переносят в термостат при температуре +28°С. При температуре наружного воздуха -35°С; -40°С; -45°С, замерзшие пробы фекалий (комки) переносят в помещение с постоянной температурой -10°С на 24 часа, переносят в холодильник с температурой +8°С, выдерживают в течение 24 часа, затем переносят при комнатной температуре +22°С на 12 часов, после ставят в термостат при температуре +28°С. При температуре наружного воздуха -45°С; -50°С; -55°С замерзшие пробы фекалий (комки) переносят в помещение с постоянной температурой -15°С на 24 часа, переносят в холодильник с температурой +8°С, выдерживают в течение 24 часа, затем переносят при комнатной температуре +22°С на 24 часов, после ставят в термостат при температуре +28°С.
Гельминтоовоскопия по Фюллеборну. Но диагноз в данном случае ставится как групповой - трихостронгилидозы или стронгилятозы. Это обусловлено тем, что яйца стронгилят сходны и невозможно определить к какому виду, роду и семейству нематод они относятся.
Яйца светло-серые с тонкой гладкой оболочкой, величиной 0,0750,120 × 0,040-0,050 мм, внутри зародыш в виде шаров дробления. Лишь яйца нематодир отличаются своей величиной - 0,160-240 × × 0,075-0,130 мм - и сравнительно легко поддаются определению.
Начиная с 5 дня после постановки в термостат, берут из проб фекалий навески по 5 г, закладывают в воронки Бермана для сбора инвазионных личинок в пробирки объемом 5 мл, который содержит 30 капель объема взвеси личинок - 2,1 мл. Одна капля взвеси личинок соответствует 0,07 мл. После образования в пробирках плотного осадка из личинок надосадочную жидкость осторожно удаляют. Исследуя надосадочную жидкость, определяют выживаемость яиц стронгилят. Живые личинки стронгилят находятся в движении или в искривленном, скрученном состоянии, что существенно затрудняет изучение их морфологии и оценку размеров. Поэтому был необходим способ обездвиживания личинок, который фиксирует их в прямом состоянии, не разрушая их морфологию и не осветляя, что позволяет осуществить исследования и возможность использования культивированных личинок для дифференциальной диагностики вида гельминта. Для обездвиживания живых личинок в 2,1 мл взвеси личинок добавляют 0,7 мл раствора Мелисептол рапид (содержащий в 100 грамме раствора - пропанол 50 грамм, дидецилдиметиламмониум хлорид - 0,075 грамм, неионные сурфактанты, отдушки).
Для определения интенсивности инвазии и подсчета личинок пробирки тщательно перемешивают, берут одну каплю - 0,07 мл взвеси, наносят на предметное стекло и под малым и большим увеличением микроскопа подсчитывают количество выделенных личинок. Данные по подсчету личинок используются как показатели условной интенсивности стронгилятозной инвазий табунных лошадей при круглогодичном пастбищном содержании в условиях критически низких температур Якутии. Постановка точного прижизненного диагноза стронгилятозной инвазии лошадей, определения выращенных инвазионных личинокдо вида, применение культивированных личинок для проведения лабораторных опытов.