Способ прогнозирования высокого риска аутоиммунного воспаления при посттравматическом увеите на отдаленных сроках течения
METHOD FOR PREDICTING HIGH RISK OF AUTOIMMUNE INFLAMMATION IN POST-TRAUMATIC UVEITIS IN LONG TERM

Изобретение относится к медицине, а именно, к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования высокого риска аутоиммунного воспаления при посттравматическом увейте на отдаленных сроках течения.
Травма глаза, согласно сведениям большинства анализируемых работ, является одной из ведущих причин монокулярной слепоты во всем мире, особенно в развивающихся странах, и в настоящее время продолжает занимать лидирующие позиции в структуре причин первичной инвалидизации по зрению [Астахов Ю.С. Использование политетрафторэтиленовых имплантатов в офтальмохирургии / Ю.С. Астахов, В.П. Николаенко, В.Е. Дьяков. - Санкт-Петербург, 2007. - 256 с., Вериго Е.Н. Показания к энуклеации при посттравматической патологии / Е.Н. Вериго // Глазное протезирование и пластическая хирургия в области орбиты: сб. науч. тр. - Москва, 1987. - С. 41-48., Гаврилова Т.В. Анализ случаев удаления глазного яблока по поводу последствий проникающего ранения глаза / Т.В. Гаврилова, Е.В. Родионова, М.В. Черешнева // Навстречу 100-летию высшего медицинского образования на Урале: науч. сессия Пермского гос. мед. ун-та им. акад. Е.А. Вагнера. - Пермь, 2015. - С. 25-27. Гундорова Р.А. Энуклеация с хрящевым имплантатом / Р.А. Гундорова, М.Г. Катаев // Глазное протезирование и пластическая хирургия в области орбиты: сб. науч. тр. - Москва, 1987. - С. 48-50. (8)).
Также следует отметить, что с ростом популярности новых высокотехнологичных методов хирургического лечения, главным образом витреоретинальной хирургии, которая широко применяется при лечении отслойки сетчатки различного генеза, иногда возникают осложнения, связанные как с отслоенным процессом, так и с характером и качеством хирургических вмешательств, которые обостряются после операции и ведут к необратимым изменениям в сетчатой оболочке и потере зрения [Хорошилова-Маслова И.П., Набиева М.М., Лепарская Н.Л. Морфогенез осложнений после длительного пребывания силиконового масла в полости глаза (клинико-гистопатологическое исследование) // Вестник офтальмологии. - 2012, - №4. - C. 57-61. Sisk RA, Davis JL, Dubovy SR, Smiddy WE. Sympathetic ophthalmia following vitrectomy for endophthalmitis after intravitreal bevacizumab. Ocullmmunollnflamm.2008 Sep-Oct;16(5):236-8. doi: 10.1080/09273940802409951].
Наиболее частым воспалительным осложнением травмы глаза, в том числе и хирургической, является посттравматический увеит (ПТУ), который нередко принимает хроническое течение (ХПТУ) и приводит к вынужденной профилактической энуклеации в связи с угрозой развития симпатической офтальмии (СО) [Марачева Я.М. Иммунопатологические варианты течения посттравматического увеита при проникающем ранении глазного яблока // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - №2 (39). - С. 42-44].
Несмотря на значительное число работ, посвященных проблеме ПТУ, механизмов его развития и поиска пусковых факторов, предшествующих развитию СО, этот вопрос все еще остается недостаточно изученным.
На протяжении последних десятилетий научные интересы многих врачей были сосредоточены на изучении иммунных аспектов при травме глаза. Однако число этих работ невелико, и они совершенно не затрагивают отдаленный период течения посттравматического увеита, представляющего огромный научный интерес ввиду того, что все новые хирургические методы, которые внедряют в повседневную практику офтальмохирурга, в настоящее время позволяют сохранять глаза, раннее считавшиеся бесперспективными. Это ведет к тому, что лишенный зрения глаз пациенты предпочитают не удалять. Однако травмированный слепой глаз неизбежно подвергается постепенной субатрофии, а протекающий внутри воспалительный процесс с периодами обострений, которые могут быть спровоцированы любыми стрессорными факторами (переохлаждение, ОРВИ, гиперинсоляция, длительные физические нагрузки, прием лекарственных средств и др.), может привести к развитию ХПТУ иммунной природы, потенциально опасного из-за угрозы симпатической офтальмии (СО) на парном интактном глазу.
Несмотря на тот факт, что последние годы все усилия направлены на поиск специфических маркеров аутоиммунного воспаления в глазу, которые помогли бы офтальмохирургу принять решение об опасности и целесообразности удаления травмированного глаза, этот вопрос до сих пор остается открытым. На данный момент не существует тестов, позволяющих с уверенностью говорить о начинающейся аутоиммунизации и, следовательно, риске симпатической офтальмии. Наиболее интересными в этом плане маркерами являются те, содержание которых можно было бы отследить как на местном, так и на системном уровне и провести сравнительный анализ между ними.
Известно, что одним из ключевых звеньев, обеспечивающих иммунную привилегию глаза, является феномен «иммунного отклонения, связанный с передней камерой» (ИОПК или ACAID) [Stein-Streilein J., Streilein JW. Иммунное отклонение, связанное с передней камерой камеры (AC AID): регуляция, биологическое значение и значение для терапии // Int. Rev. Immunol. 2002. 21: 123-52; Китаичи Н., Намба К., Тейлор А.В. Индуцируемая иммунная регуляция после аутоиммунного заболевания в иммунопривилегированном глазу // J. Leukoc. Биол. 2005. 77: 496-502; Дарт Д.А., Дана Р., Д'Амор П., Нидеркорн Дж. Я. Иммунология, воспаления и заболевания глаз. Академическая пресса. 2013. С. 50-57, 38-42].
Результаты ряда исследований показали, что ИОПК обеспечивает целый комплекс «пассивных» и «активных» факторов, и одним из важнейших является TGFpi. [Sugita S., Horie S., Nakamura O., Futagami Y., Takase H., Keino H., Aburatani H., Katunuma N., Ishidoh K., Yamamoto Y., Mochizuki M. Пигментный эпителий сетчатки CTLA-2alpha индуцирует TGFbeta-продуцирующие T-регуляторные клетки // J. Immunol. 2008. 181: 7525-36; Хори С., Сугита С., Футагами Ю., Кавагути Т., Камой К., Ширато С., Мочизуки М. Пигментный эпителий радужной оболочки человека подавляет активацию сторонних Т-клеток посредством взаимодействия рецепторов TGFbeta-TGFbeta // Exp Eye Res. 2009. 88: 1033-42; Деннистон А.К., Kottoor SH, Khan I., Oswal K., Williams GP, Abbott J., Wallace GR, Salmon M., Rauz S., Murray PI, Curnow SJ. Эндогенный кортизол и TGF-бета в водянистой влаге человека способствуют иммунным привилегиям глаз, регулирующие функцию дендритных клеток // J Immunol. 2011. 186 (1): 305-11].
Трансформирующий фактор роста [31 может быть как провоспалительным так и противовоспалительным (иммуносупрессивным). Последний эффект, как правило, превалирует, что является важным фактором защиты глаза и, как следствие, представляет интерес для изучения его в аспекте ХПТУ, в особенности на отдаленных сроках течения (Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции развития возбудителей) и иммунитета // Иммунология. 1995. Т.3. С. 30-44).
Однако, если говорить о воспалении травмированного глаза, то наличие изменений показателя TGFβ1 на местном уровне может говорить о риске воспаления травмированного или оперированного глаза. Поскольку симпатическая офтальмия - это переход аутоиммунного воспаления на парный интактный глаз, что связано, во многом, с нарушением гематоофтальмического барьера, т.е. сломом иммунной привилегии глаза, то для оценки влияния воспаленного травмированного глаза на парный орган, необходимо оценить показатели также и в сыворотке крови.
Ввиду этого необходим способ, который мог бы определить наличие угрозы присоединения аутоиммунного компонента воспаления при ХПТУ на системном уровне, чтобы оценить риск перехода воспалительной реакции с локального уровня на системный. Если при оценке течения увеита инфекционной природы речь шла об одном глазу с соответствующей патологией, то при последствиях травмы необходимо оценивать риск развития воспаления аутоиммунной природы не только в самом травмированном глазу, но и вероятность вовлечения парного глаза при наличии соответствующих маркеров воспаления в сыворотке крови.
К тому же важным является сам факт определения трансформирующего фактора роста в кровотоке ввиду того, что в норме он системно выявляется в малых концентрациях, и выраженный дисбаланс в его уровне может свидетельствовать о значительном срыве иммунных механизмов.
Ближайшим аналогом изобретения является способ прогнозирования перехода посттравматического увеита в хроническое течение после проникающих ранений глазного яблока, включающий фенотипический анализ состава лимфоцитов с выделением T-reg клеток и субпопуляций В-лимфоцитов, позволяющий определить течение посттравматического увеита у больных в раннем периоде после проникающей травмы глаза (Марачева Н.М. Посттравматический увеит при проникающих ранениях глазного яблока: клинико-инструментальные, иммунологические критерии оценки и прогнозирования течения // Дисс. докт. мед. наук, 2014 г). Однако в данном способе в исследуемой группе были пациенты со свежей травмой глаза (иммунологический анализ проводился на 10-е сутки после проникающего ранения).
Известен также способ прогнозирования органоспецифической аутоиммунизации при воспалительных заболеваниях глаз, который базируется на определении во влаге передней камеры концентрации трансформирующего ростового фактора бета1 (TGFβ1)(RU 2564929, 10.10.2015).
Однако данный способ не учитывает наличие именно хронического увеита, связанного с травмой глаза, при этом в отдаленном периоде, который часто принимает волнообразное течение с частыми периодами обострений и, что очень важно, является угрозой риска развития СО. Также данный способ предлагает диагностику лишь на местном уровне, что не позволяет оценить, какие механизмы происходят на уровне всего организма, что имеет принципиальное значение для понимания механизмов, задействованных при развитии аутоиммунизации и поражении парного глаза, а следовательно, точности диагностики и лечения.
Задачей предлагаемого способа является разработка критериев риска аутоиммунного воспаления в отдаленные сроки посттравматического увеита. Техническим результатом предлагаемого способа является выбор тактики лечения, обеспечивающей предупреждение развития симпатической офтальмии. Технический результат достигается за счет определения уровня трансформирующего фактора роста TGF- β1 во влаге передней камеры травмированного глаза и в сыворотке крови.
Патогенетическим обоснованием предлагаемого способа послужили данные, полученные нами при изучении связи между концентрацией TGFβ1 во влаге передней камеры (ВПК) и в сыворотке крови (СК) с развитием системного клеточного иммунного ответа на антигены тканей глаза, ассоциированного с иммунным воспалением, подтвержденным морфологическим исследованием.
Исследования проводили с помощью иммунноферментного анализа (ИФА), реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) и морфологического исследования материала удаленных глаз. Обследовано 87 пациентов с ХПТУ. Пациенты разделены на две группы. I - пациенты с положительной РТМЛ хотя бы к одному антигену, ассоциированной с иммунным воспалением, выявленным морфологически. II - пациенты с отрицательной РТМЛ, ассоциированной с отсутствием иммунного воспаления при морфологическом анализе, что имеет принципиальное значение в диагностике аутоиммунного воспаления в глазу, так как именно гистологическое исследование способно точно подтвердить наличие или отсутствие иммунного/аутоиммунного воспаления.
Всем 87 пациентам было проведено хирургическое лечение - удаление слепого бесперспективного глаза. Перед операцией всем пациентам осуществляли забор крови из локтевой вены в стерильные пробирки Vacuette с ЭДТА. Интраоперационно, непосредственно перед началом хирургического вмешательства производили забор влаги передней камеры травмированного глаза (ВПК). После операции материал отправляли на морфологическое исследование. Во ВПК с помощью ИФА определяли содержание трансформирующего фактора роста (TGFβ1). В сыворотке крови содержание TGFβ1 также оценивали методом иммуноферментного анализа.
Системный иммунный ответ на антигены тканей глаза (роговица, хрусталик, увеальная ткань, S-антиген сетчатки) оценивали с помощью РТМЛ в 96-луночных микропланшетах. Количественный учет результатов РТМЛ производили на инвертированном микроскопе и оценивали по соотношению индексу перемещений (ИМ) - площади площадей перемещения лейкоцитов в опыте (реакция с антигеном) и контроле (среда RPMI 1640 «Sigma» без антигена). При оценке результатов за норму принимали интервал ИМ от 0,80 до 1,20. Показатели ниже 0,80 и выше 1,20 считали положительной реакцией, отражавшей системный клеточный иммунный ответ на органоспецифические антигены глаза.
Морфологическое исследование осуществляли посредством световой микроскопии. Для гистологического изучения удаленные глаза фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, разрезали на 3 части: центральную и две боковых колодки. Центральную колодку проводили по спиртам восходящей концентрации с целью обезвоживания и заключали в парафин. С каждой центральной колодки делали серию из 50-100 срезов толщиной 5-7 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали с помощью микросистемы со сквозным оптико-цифровым каналом наблюдения Микровизор проходящего света мVizo-101, а также на световом микроскопе «Micros» производства Австрия, и с помощью микросистемы фирмы «Leica» с цифровой фотокамерой.
Статистическую обработку результатов осуществляли в программе «BIOSTATD» (t-критерий Стьюдента, критерий Фишера). Показатель статистической значимости: р<0,05.
Наиболее важные результаты выявлены при исследовании TGFβ1 в группе I - у пациентов с положительной РТМЛ хотя бы к одному антигену, ассоциированной с иммунным воспалением, выявленным морфологически. Содержание его во ВПК у этих больных оказалось достоверно ниже, чем у пациентов II группы, что указывает на недостаточность одного из главных факторов защиты, обеспечивающего привилегированность глаза. К тому же значительный дисбаланс в сторону повышения трасформирующего фактора роста (медиатора, который работает практически лишь на местном уровне) в системном кровотоке в первой группе свидетельствует о выраженном иммунном дисбалансе и срыве компенсаторных механизмов, что характерно для аутоиммунизации. Все это свидетельствует о том, что данные пациенты находятся в высокой группе риска в связи с угрозой развития симпатической офтальмии.
Таким образом, результаты проведенного клинико-иммуно-морфологического исследования выявили связь с падением TGFβ1 во ВПК и его повышение в СК с риском аутоиммунного воспаления при ХПТУ. Выявленные показатели качества сдвигов в локальном и системном цитокиновом статусе - снижение уровня TGFβ1 во ВПК и повышение в СК могут служить критерием раннего прогнозирования аутоиммунного воспаления, что важно для клинической практики для профилактики развития симпатической офтальмии.
Способ осуществляют следующим образом. У пациента с перенесенной ранее травмой глаза и травматическим увеитом во влаге передней камеры травмированного глаза и в сыворотке крови определяют уровень трансформирующего фактора роста TGF- β1. При его уровне ниже 1000 пкг/мл во влаге передней камеры и выше 30000 пкг/мл в сыворотке крови прогнозируют высокий риск аутоиммунного воспаления.
Клинические примеры.
Пример 1. Больной С., 48 лет поступил в отделение пластической хирургии и глазного протезирования НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца с диагнозом OD: Последствие травмы: амавроз, субатрофия I степени, состояние после неоднократных витреоретинальных хирургических вмешательств, болевой синдром.OS - здоров.
При сборе анамнеза установлено, что у пациента травма правого глаза (проникающее ранение отверткой) была 5 лет назад, было проведено ПХО корнеосклерального ранения, затем в течение года были выполнены 3 витреоретинальных вмешательства. Получал консервативное лечение, но на протяжении последнего года происходят частые рецидивы увеита правого глаза.
Пациент отмечает болезненность в правом глазу, покраснение, слезотечение.
VisOD = ноль; VisOS = 1,0 ВГД OD п/п - 1 OS п/п N
При обследовании: OD: смешанная инъекция конъюнктивы глазного яблока, врастающие сосуды роговицы, корнеосклеральный рубец, в передней камере незначительное количество силиконового масла. Радужка отечная, рубеоз. Помутнение хрусталика в кортикальных слоях и ядре. Глубже лежащие среды не просматриваются.
OS: Глаз спокоен. Конъюнктива бледно-розовая, отделяемого нет. Роговица прозрачная, блестящая, сферичная. Передняя камера средней глубины, равномерная, влага ее прозрачная. Радужка структурная, зрачок круглый, по центру, реакция на свет живая. Хрусталик склерозирован. Стекловидное тело структурное. Глазное дно: без патологии.
Анамнез и клиническая картина свидетельствуют об очередном рецидиве хронического посттравматического увеита. С учетом травмы и витреоретинальных вмешательств в анамнезе высока вероятность развития увеита аутоиммунной природы с угрозой перехода в симпатическую офтальмию.
Были проведены общепринятые иммунологические исследования (РТМЛ): результаты РТМЛ с антигенами роговицы ИМ = 0,86; хрусталика ИМ = 1,0;увеа ИМ = 1,34. Повышение показателя увеа до 1,34 (норма 1,20) свидетельствует о наличии сенсибилизации к увеапигментной ткани, что ухудшает прогноз течения хронического посттравматического увеита.
Для оценки риска аутоиммунного воспаления взяты для определения уровня TGFβ1 влага передней камеры травмированного глаза и сыворотка крови. Получены результаты: во влаге передней камеры травмированного правого глаза выявлен уровень TGFβ1 = 847 пг/мл. При исследовании сыворотки крови выявлен уровень TGFβ1 = 30105 пг/мл. Полученные данные свидетельствуют о высоком риске развития аутоиммунного воспаления на травмированном глазу, т.е. очень высок риск развития симпатической офтальмии на интактном левом глазу. Проведена эвисцерация с резекцией заднего полюса склеры с неврэктомией по ранее разработанному безопасному методу с коагуляцией эмиссариев, резекцией заднего полюса склеры с неврэктомией и частичной резекцией внутренних слоев склеры с удалением остаточных элементов пигментного эпителия. Кроме того, после операции проведен курс профилактического лечения, включающий системный прием нестероидных противовоспалительных препаратов и инстилляции кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных препаратов в оставшийся левый глаз. После проведенной морфологическое исследование подтвердило наличие увеита на иммунной основе.
Данный пример показывает, что снижение уровня TGFβ1 во влаге передней камеры травмированного глаза с одновременным значительным повышением уровня TGFβ1 в сыворотке крови соотносится с высоким риском аутоиммунного воспаления, угрожающего развитием симпатического воспаления и потери зрения на парном глазу. Предпринятые меры: операция по безопасному методу и дополнительный курс противовоспалительной терапии позволили избежать нежелательного исхода. В отдаленном периоде наблюдений данных за симпатическое воспаление на парном глазу не выявлено.
Пример 2. Больная С., 54 года, обратилась на консультативный прием в отделение пластической хирургии и глазного протезирования МНИЦ ГБ им. Гельмгольца с диагнозом OD - последствие травмы: амавроз, субатрофия II степени, отслойка сетчатки. OS - здоров.
Из анамнеза известно, что 3 года назад пациентка травмировала правый глаз спицей, было проведено ПХО раны роговицы и удаление мутного хрусталика. Получала консервативное лечение, в течение 2-х лет глаз не беспокоил, однако в последние 6 месяцев дважды было обострение хронического посттравматического увеита.
Пациентка отмечает болезненность в правом глазу, покраснение, слезотечение.
VisOD = ноль; VisOS = 1,0 ВГД OD п/п -1 OS п/п N
При обследовании в OD: смешанная инъекция конъюнктивы глазного яблока. Рубец роговицы на 14-17 ч., с врастающими новообразованными сосудами. ПК неравномерная. Радужка подтянута к рубцу, зрачок запаян, глубже лежащие среды не просматриваются.
OS: Глаз спокоен. Конъюнктива бледно-розовая, отделяемого нет. Роговица прозрачная, блестящая, сферичная. Передняя камера средней глубины, равномерная, влага ее прозрачная. Радужка структурная, зрачок круглый, по центру, реакция на свет живая. Хрусталик склерозирован. Стекловидное тело структурное. Глазное дно: без патологии.
Анамнез и клиническая картина свидетельствуют об очередном рецидиве хронического посттравматического увеита. С учетом характера травмы есть вероятность развития увеита аутоиммунной природы с угрозой перехода в симпатическую офтальмию.
Были проведены общепринятые иммунологические исследования (РТМЛ): результаты РТМЛ с антигенами роговицы ИМ = 0,86; хрусталика ИМ = 1,0;увеа ИМ = 0,95. Все показатели в пределах референтной нормы, однако, поскольку данный анализ информативен только в 30-50% случаев для оценки риска аутоиммунного воспаления взяты для определения уровня TGFβ1 влага передней камеры травмированного правого глаза и сыворотка крови. Получены результаты: во влаге передней камеры травмированного правого глаза выявлен уровень TGFβ1 = 1953 пг / мл. При исследовании сыворотки крови выявлен уровень TGFβ1 = 14908 пг / мл.
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии риска развития аутоиммунного воспаления на травмированном глазу.
В данной ситуации метод выбора хирургического вмешательства по удалению глаза у хирурга свободный. Если склера позволяет, то целесообразнее выполнить эвисцерацию с резекцией заднего полюса склеры и неврэктомией. Необходимости в проведении профилактического противовоспалительного курса терапии нет. После проведенной операции (эвисцерация с резекцией заднего полюса склеры и неврэктомия) морфологическое исследование выявило признаки атрофии и фиброза оболочек глаза, признаков увеита на иммунной основе выявлено не было.
Данный пример показывает, что уровень TGFβ1 в пределах нормальных значений как во влаге передней камеры, так и в сыворотке крови соотносится с отсутствием иммунного воспаления и спокойной морфологической картиной.
В данной ситуации отсутствует риск развития симпатической офтальмии на парном глазу и лечение будет заключаться только в удалении слепого воспаленного бесперспективного глаза без дополнительных приемов во время операции и последующего курса профилактического лечения. Последующие наблюдения подтвердили отсутствие симпатического воспаления на парном глазу.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет прогнозировать высокий риск аутоиммунного воспаления при ХПТУ длительного течения посредством выявленных изменений в уровне трансформирующего фактора роста (TGF- β1) во влаге передней камеры и в сыворотке крови. Это позволяет оптимизировать диагностический подход, а также определить тактику ведения пациентов с ХПТУ в плане выбора безопасного метода удаления глаза и проведения профилактического курса патогенетически ориентированной терапии.