Нитрозирующий стресс и апоптоз нейронов СА1-зоны гиппокампа в условиях моделирования хронической алкогольной интоксикации: нейропротективные эффекты тиоцетама

гностическим признаком развития деструктивных осложнений при санации полости рта у больных, которым проводится химиолучевая терапия.

2. Всем больным с местно-распространенным раком слизистой полости рта целесообразно определение прогностического индекса развития осложнений при любых стоматологических манипуляциях.

3. Оценку вероятности развития указанных осложнений с коррекцией профилактических и лечебных мероприятий необходимо осуществлять в зависимости от величины прогностического индекса.

4. Проведение профилактических мероприятий развития осложнений при санации полости рта у онкологических больных после комбинированного и комплексного лечения позволяет снизить количество геморрагических осложнений до 5,0%, а локальных воспалительных процессов - до 2,8%.

Литература

1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2002. М.: ММА, 2004. 254 с.

2.Химиолучевое лечение больных с местно-распространенным раком органов полости рта и ротоглотки / Карасева В.В. [и др.] // «Российская онкология». 2000. №4. С. 21-23.

3. Эпидемиология рака слизистой оболочки полости рта и состояние онкологической помощи населению с данной патологией в Российской Федерации / Подвязников С.О. [и др.] // Материалы научн. конф. «Современные методы диагностики и лечения рака слизистой оболочки полости рта», Самара - М., 2011. С. 42.

4. Late toxicities due to multimodal treatment of head and neck cancer (HNC) / Buentzel J. [et al] // Radiotherapy and oncology. 2004. Vol. 73(1). P. 716.

5. Effects of lapatinibmonotherapy: result of a randomized phase II study in therapy- naive patients with locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck / Del Campo J.M. [et al] // Br. J. Cancer. 2011. Vol.105(5). P.618-627.

6. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher rates / Fan E.I. [et al] // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2010. Vol. 77(4). P.1024-1029.

7. Locoregionally advanced carcinoma of the oropharynx: conventional radiotherapy vs accelerated hyperfractionated radiotherapy vs concomitant radiotherapy and chemotherapy -a multicenter randomized trial. Update at 5 years / Falli C. [et al] // Radiotherapy and oncology. 2004. Vol.73(1). P. 676.

8. Phase II trial of induction chemotherapy followed by surgery for squamous cell carcinoma of the oral tongue in

young adults / Kies M.S. [et al] // Head Neck. 2012. Vol. 34(9). P. 1255-1262.

9. Preoperative concurrent chemoradiotherapy for stages II-IV oral squamous cell carcinoma: a retrospective analysis and future possibility of this treatment strategy / Kirita T. [et al]// Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 2012. Vol. 41(4). P. 241-248.

10. Ord R.A. Surgical management of the N0 neck in early stage Tl-2 oral cancer; a personal perspective of early and impalpable disease // Oral Maxillofac. Surg. 2012. Vol.16(2). P. 181-188.

References

1. Davydov MI, Aksel' EM. Zlokachestvennye novoobra-zovaniya v Rossii i stranakh SNG v 2002. Moscow: MMA; 2004. Russian.

2. Karaseva VV, et al. Khimioluchevoe lechenie bol'nykh s mestno-rasprostranennym rakom organov polosti rta i rotog-lotki. «Rossiyskaya onkologiya». 2000;4:21-3. Russian.

3. Podvyaznikov SO, et al. Epidemiologiya raka slizistoy obolochki polosti rta i sostoyanie onkologicheskoy pomoshchi naseleniyu s dannoy patologiey v Rossiyskoy Federatsii. Mate-rialy nauchn. konf. «Sovremennye metody diagnostiki i leche-niya raka slizistoy obolochki polosti rta»; Samara - Moscow; 2011. Russian.

4. Buentzel J, et al. Late toxicities due to multimodal treatment of head and neck cancer (HNC). Radiotherapy and oncology. 2004;73(1):716.

5. Del Campo JM, et al Effects of lapatinibmonotherapy: result of a randomized phase II study in therapy- naive patients with locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck. Br. J. Cancer. 2011;105(5):618-27.

6. Fan EI, et al. Treatment results of postoperative radiotherapy on squamous cell carcinoma of the oral cavity: coexistence of multiple minor risk factors results in higher rates. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2010;77(4):1024-9.

7. Falli C, et al. Locoregionally advanced carcinoma of the oropharynx: conventional radiotherapy vs accelerated hyper-fractionated radiotherapy vs concomitant radiotherapy and chemotherapy - a multicenter randomized trial. Update at 5 years. Radiotherapy and oncology. 2004;73(1):676.

8. Kies MS, et al. Phase II trial of induction chemotherapy followed by surgery for squamous cell carcinoma of the oral tongue in young adults. Head Neck. 2012;34(9):1255-62.

9. Kirita T, et al. Preoperative concurrent chemoradiothera-py for stages II-IV oral squamous cell carcinoma: a retrospective analysis and future possibility of this treatment strategy. Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 2012;41(4):241-8.

10. Ord RA. Surgical management of the N0 neck in early stage Tl-2 oral cancer; a personal perspective of early and impalpable disease. Oral Maxillofac. Surg. 2012;16(2):181-8.

УДК: 615.214.31:616.89 DOI: 10.12737/5906

НИТРОЗИРУЮЩИЙ СТРЕСС И АПОПТОЗ НЕЙРОНОВ СА1-ЗОНЫ ГИППОКАМПА В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ: НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ ТИОЦЕТАМА

И.Ф. БЕЛЕНИЧЕВ, Т.В. КУЧЕР, Л.И. КУЧЕРЕНКО, С. А. МОРГУНЦОВА

Запорожский государственный медицинский университет, пр. Маяковского, 26, Запорожь, Украина, 69035, e-mail: Ifb1914@mail.ru

Аннотация. В результате проведенных исследований установлено, что моделирование хронической алкогольной интоксикации ежедневным внутрижелудочным введением беспородным белым крысам-самцам этанола по схеме (первые 10 дней 15% раствор этанола в дозе 4 г/кг, затем 10 дней - 15% раствор этанола в дозе 6 г/кг, затем 10 дней - 25% раствор этанола в дозе 4 г/кг) приводит к активации реакций нитрозирующего стресса и инициированию нейроапоптоза. Так, в мозге

животных после хронического введения этанола выявлено значительное повышение по сравнению с группой здоровых животных маркера нитрозирующего стресса- нитротирозина в цитозольной и митохондриальной фракциях гомогената мозга на фоне выявления молекулярных маркеров апоптоза в нейронах СА1-зоны гиппокампа (фрагментация ядер нейронов СА-1 зоны гиппокампа, повышение плотности и процента апоптически и деструктивно измененных клеток), а также депривации антиапоптических механизмов (уменьшение плотности bcl-2-позитивных нейронов в СА-1зоне гиппокампа, и снижение концентрации bcl-2 белка в гиппокампе). Курсовое назначение животным в течение 14 суток после хронической алкоголизации комбинированного нейрометаболического церебропротектора «Тиоцетам» в дозе 100 мг/кг внутрижелудочно оказывало достоверное защитное действие в отношении нейронов СА1-зоны гиппокампа. Так, назначение тиоцетама приводило к снижению уровня нитротирозина как в митохондриях, так и цитозоле мозга животных с хронической алкоголизацией по сравнению с группой нелеченных животных и с группой, которой вводили пирацетам. Введение тиоцетама экспериментальным животным приводило к достоверному снижению плотности апоптических и деструктивно измененных нейронов СА-1 зоны гиппокампа и процента апоптически измененных клеток по сравнению с группой контроля и группой животных, получавших курсом пирацетам. Курсовое назначени тиоцетама достоверно повышало плотность Bcl-2-позитивных нейронов в СА-1 зоне гиппокампа и достоверно повышало концентрацию Bcl-2 в тканях мозга экспериментальных животных по сравнению с контрольной группой и группой, получавшей по такой же схеме пирацетам. Повышение экспрессии белка Bcl-2 в группе животных, получавших тиоцетам, свидетельствует об активации антиапоптотической защиты поврежденных нейронов под действием этого препарата. Мы предполагаем, что один из молекулярных механизмов нейропротективного действия тиоцетама в условиях хронической интоксикации является прерывание NO-зависимых механизмов нейроапоптоза.

Ключевые слова: тиоцетам, пирацетам, хронический алкоголизм, нейроапоптоз, гиппокапм, нитрозирующий стресс.

NITROSORBIDI STRESS AND APOPTOSIS OF NEURONS IN THE CA1 ZONE OF THE HIPPOCAMPUS IN THE CONDITIONS OF MODELING CHRONIC ALCOHOL INTOXICATION: NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF TIETEMA

I.F.BELENICHEV, T.V.KUCHER, L.I.KUCHERENKO, S.A.MORGUNTSOVA

Zaporozhye State Medical University, Mayakovsky av., 35, Zaporozhye, Ukraine, 69035, e-mail: Ifb1914@mail.ru

Abstract. Fulfilled researches showed that modeling of chronic alcohol intoxication by daily intragastric ethanol administration to non-pedigreed male white rats (first 10 days - 15% ethanol solution in dose 4 g/kg, next 10 days - 15% ethanol solution in dose 6 g/kg, then 10 days - 25% ethanol solution in dose 4 g/kg) leads to activation of nitrosorbidi stress reactions and initiation of neuro-apoptosis. Thus, as compared with healthy animals group, in rats' brain after chronic ethanol administration it was revealed significant increase of nitro-tyrosine (nitrosorbidi stress marker) in cytosolic and mitochondrial fractions of brain homogenate against the background of revealing of apoptosis molecular markers in hippocampal CA1 zone neurons (fragmentation of neuron's nuclei of hippocampal CA1 zone, increase of density and ratio of apoptotic- and destructive-changed cells) as well as deprivation of anti-apoptotic mechanisms (decrease of density of Bcl-2-positive neurons in hippocampal CA1 zone and decrease of Bcl-2 protein concentration in hippocampus). Subsequent 14-day intragastric administration of complex neuro-metabolic cerebro-protector Thiocetam in dose 100 mg/kg to the animals after chronic alcoholization showed significant protective effect on hippocampal CA1 zone neurons. Thus, Thiocetam administration resulted in decrease of nitrotyrosine levels in mitochondrion and in cytosol of brain of animals with chronic alcoholization as compared with untreated animals and with animals receiving Piracetam. Thiocetam administration to experimental animals led to significant decrease of density of apoptotic- and destructive-changed neurons of hippocampal CA1 zone and ratio of apoptotic-changed cells as compared with control group and animals receiving Piracetam. Course of treatment with Thiocetam increases significantly the density of Bcl-2-positive neurons in CA1 zone of hippocampus and significantly increases concentration of Bcl-2 in brain tissue of experimental animals as compared with control group and animals which received Piracetam according the same schedule. The increase of Bcl-2 protein expression in animals received Thiocetam testifies to the activation of anti-apoptotic defense of damaged neurons under the influence of this preparation. We suppose that one of the molecular mechanisms of neuro-protective effect of Thiocetam in chronic intoxication is the breaking of NO-depended mechanisms of neuro-apoptosis.

Key words: Thiocetam, Piracetam, chronic alcoholism, neuro-apoptosis, hippocampus, nitrosorbidi stress.

Алкоголизм - одна из актуальнейших социальных и медицинских проблем, стоящих перед современным обществом. В последние десятилетия в большинстве стран мира наблюдается неуклонный рост производства и потребления спиртных напитков, что вызывает глубокую озабоченность и тревогу у многих известных ученых и государственных деятелей. Возросшая доступность алкогольных напитков и снисходительное или пассивное отношение многих государств к проблеме алкоголизма привели к распространению этой болезни среди населения, особенно среди молодых людей и женщин [2,5,14]. Систематическое употребление алкоголя, даже в малых дозах, является предпосылкой возникновения и прогрессирования заболеваний всех внутренних органов, особенно чувствительна к алкоголю нервная система. Установлено, что под действием алкоголя в тканях головного мозга отмечается выраженная гиперемия,

расширение мельчайших капилляров, дистрофические изменения глиозных клеток в коре, аммониевом роге, подкорковых образованиях, гибель клеток мозжечка. Данные обстоятельства определяют особую актуальность дальнейшего исследования биохимических, молекулярных аспектов патогенеза алкоголизма, а также поиск новых высокоэффективных церебропротекторных енение в качестве нейро-метаболического церебропротектора комбинированный препарат Тиоцетам [1,2,5,8,9]. Тиоцетам улучшаетлекарст-венных препаратов для комплексного лечения алкоголизма [1,2,8,12].С 2003 г. в Украине , а позже и в России, нашел прим энергетический метаболизм, тормозит реакции ок-сидативного стресса, улучшает когнитивно-мнестические функции головного мозга после мозговых инсультов, ЧМТ, гипоксической энцефалопатии [1,2,3,14]. Вышеизложенное явилось теоретическим обоснованием для эксперименталь-

ной оценки нейропротективного действия тиоцетама в условиях хронической алкогольной интоксикации.

Материалы и методы исследования. В опытах использовали 40 белых беспородных крыс-самцов с массой тела 180-220 г. и возрастом 4,5 месяцев, которые содержались в виварии при свободном доступе к пище (стандартный гранулированный корм) и воды, при естественной смене дня и ночи; животные получены из питомника ГУ «Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины». Все экспериментальные процедуры осуществляли в соответствии с «Положением об использовании животных в биомедицинских исследованиях» [4].

Хроническую алкогольную интоксикацию (ХАИ) вызывали ежедневным внутрижелудочным введением первые 10 дней 15% раствора этанола в дозе 4 г/кг, следующие 10 дней - 15% раствора этанола в дозе 6 г/кг, и последующие 10 дней крысам вводили 25% раствор этанола в дозе 4 г/кг. С 30 суток прекращали алкоголизацию и проводили экспериментальную терапию изучаемыми препаратами, продолжали наблюдение в течение 14 дней. Все крысы разделены на 4 группы по 10 животных в каждой:

1 группа получала в течение 30 дней этанол и с 31 по 44 сутки - Тиоцетам внутрижелудочно с помощью металлического зонда в дозе100 мг/кг;

2 группа получала в течение 30 дней этанол и с 31 по 44 сутки - пирацетам; внутрижелудочно с помощью металлического зонда в дозе 250 мг/кг 3 группа получала в течение 30 дней этанол (контроль);

4 группа - интакт (вместо этанола получала физиологический раствор).

Биохимические исследования головного мозга проводили на 45 сутки эксперимента, с этой целью животных декапитировали под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг). Выделение митохондриальной и цитоплазматической фракции мозга проводили методом диференциального центрифугирования методом Мак-Ильвейна и Роднайта.

Для иммуноферментных исследований ткань головного мозга гомогенизировалась на холоде в солевой изотонической среде (0,15М КС1) при температуре +4оС с помощью стеклянного гомогенизатора в соотношении ткань - солевой раствор 1:20 [4]. Затем при температуре +4оС методом дифференциального центрифугирования на рефрижераторной центрифуге Sigma 3-30k (Германия) выделяли цитозольную и митохондриальную фракции. В митохондриальной и цитозольной фракциях головного мозга определяли содержание нитротирозина с помощью ELISA-набора NITROTYROSINE фирмы НВТ, который представляет собой твердофазный энзим-связывающий иммуносорбентный набор, работающий по принципу «сендвича». Для морфологических и гистоиммунохимических исследований ткань головного мозга экспериментальных животных помещали на сутки в фиксатор Буэна и после стандартной гистологической проводки ткань заключали в парапласт X-TRA, после чего на ротационном микротоме изготовляли срезы изучаемых отделов головного мозга толщиной 5 микрон (для морфометрических исследований) и 15 микрон (для гистоиммунохимических исследований) [4,7].

Для изучения морфологии нейронов и глиоцитов срезы окрашивали для определения нуклеиновых кислот гал-лоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону.

Определяли следующие показатели:

- плотность апоптотических и деструктивно измененных нейронов как количество клеток на 1мм2 площади среза;

- клеточный состав СА-1 зоны гиппокампа в процен-

тах [10].

Для гистоиммунохимического исследования использовали метод непрямой иммунофлюоресценции. Для определения интенсивности экспрессии антиапоптического белка bcl-2 гистологические срезы выделяли из парапласта и регидрировали, трижды по 5 минут отмывали фосфатным буфером (рН=7,4) и в течение 30 минут инкубировали с 2н соляной кислотой (Т=37оС). Затем в течение 24 часов инкубировали во влажной камере (Т=4-6оС) с первичными поликлональными антителами кроликов IgC (1:500) bcl-2 производства Santa Cruz Biotechnology, Inc. (USA). После инкубации срезы четырежды по 5 минут отмывали фосфатным буфером (рН=7,4), затем в течение 1 часа (Т=37оС) инкубировали с вторичными антителами козы к фрагменту IgG мыши, конъюгированными с флюоресцентным красителем (FITC) фирмы Sigma-Aldrich (кат.№ F2266). После заключительной четырехкратной отмывки фосфатным буфером (рН=7,4) срезы заключали в смесь глицерин-фосфатный буфер (9:1).На флюоресцентном микроскопе Axioskop (Ziess, Germany) определяли интенсивность экс-пресссии bcl-2 по плотности bcl-2-позитивных клеток в срезах с помощью видеокамеры COHU - 4922 (USA) и вводили в систему цифрового анализа изображения VIDAS -386 (Kontron Elektronic, Germany).

Кроме этого, определяли количественное содержание bcl-2 белков методом иммуноблотинга. С этой целью проводилось выделение нейронов коры мозга в два этапа [4]. На первом этапе мозговая ткань дезинтегрировалась с целью получения клеточной суспензии, на втором - осуществлялось дифференциальное ультрацентрифугирование. Для приготовления белковых проб клетки собирали, отделяя их от субстрата смесью растворов трипсина и версена (1:1), трижды промывали в 10 мл холодного PBS, центрифугируя при 200 g в течение 5 мин. К клеточному осадку добавляли 100 мкл лизирующего буфера, состоящего из 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 0.5 % Тритона X-100, 2 мМ EDTA и 1 мМ PMSF (производство Sigma, США). Экстракты центрифугировали при 8000 g в течение 10 мин, отбирали супернатант и измеряли в нем концентрацию общего белка по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Элек-трофоретическое разделение белков проводили по методу Лаэммли (Laemmli, 1970). После перенесения белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану ее инкубировали в течение 1 ч с моноклональными антителами к bcl-2, и с вторичными антителами против иммуноглобулина (IgG) мыши, меченными пероксидазой хрена (Sigma, США).

Результаты представлены в виде выборочного среднего значения±стандартная ошибка среднего значения. Достоверность отличий между экспериментальными группами проводили при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Достоверными считали отличия с уровнем значимости более 95% (p<0,05). Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета лицензионной программы «STATISTICA for Windows 6.1» (StatSoft Inc., № AXX R712D833214SAN5), а также «SPSS 16.0», «Microsoft Excel 2003».

Результаты и их обсуждение. В результате проведенных исследований было установлено, что ХАИ приводит к инициированию нитрозирующего стресса в мозге экспериментальных животных, о чем свидетельствовало повышение нитротирозина в цитозоле и митохондриях на 332% и 361% соответственно в группе контроля по сравнению с группой здоровых животных (интакт) (табл. 1).

Известно, что при повреждении нейронов головного

мозга на фоне хронической алкогольной интоксикации важную роль играет система оксида азота. Цитотоксиче-ские дериваты NO (пероксинит и ион нитрозония) модифицируют (нитрозируют или гидроксилируют) антиапоп-тические белки, в частности bcl-2, снижая их функции, и усиливают синтез проапоптических белков FAS и APO-1 [6,12]. Повышенная концентрация NO, а также пероксинит усиливает экспрессию каспаз, которые относятся к семейству IL-lß-конвертирующих протеаз, причастных к разветвлению цепи апоптоза [1,15,18].

Таблица 1

Влияние тиоцетама на содержание маркера нитрозирующего стресса -нитротирозина в головном мозге животных с ХАИ

Экспериментальные группы Нитротирозин в цитозольной фракции головного мозга, нмоль/г белка Нитротирозин в митохондриальной фракции головного мозга, нмоль/г белка

Интактная 27,110,35 7,2±0,6

Контрольная (ХАИ) 117,2±4,8 33,2±1,7

ХАИ+тиоцетам 50,1±3,2*# 12,8±1,4*#

ХАИ+пирацетам 105,0±10,5 30,4±3,1

Примечание: * - р<0,05 по отношению к контролю; # - р<0,05 по отношению к группе, которая получала пирацетам

Таблица 2

Влияние Тиоцетама на плотность Bcl-2-позитивных нейронов СА-1 зоны гиппокампа животных с ХАИ

Группы животных Плотность Bcl-2-позитивных нейронов в 1 мм2

Интактная 287,8±14,0

Контрольная (ХАИ) 92,2±10,1

ХАИ+тиоцетам 167,1±14,1*#

ХАИ+пирацетам 95,1±11,5

Примечание: *- p<0,05 по отношению к контролю; # - p<0,05 по отношению к группе, которая получала пирацетам

Проводимая экспериментальная терапия в течение 14 суток животных после ХАИ приводила к снижению уровня нитротирозина как в митохондриях, так и цитозоле мозга жи-вотныгх. Как видно из табл. 1, наибольшая депрессия этого маркера нитрозирующего стресса регистрировалась в группах, получавших тиоцетам в дозе 100 мг/кг (57% - цитозольная и 61,5% -митохондриальная фракции) по сравнению с группой нелечен-нытх животнытх и с группой, которой вводили пирацетам. Полученные данные согласуются с нашими предыдущими работами, в который показана высокая антиоксидантная активность тиоцетама [1,5,6]. Подобный эффект Тиоцетама является одним из ключевык механизмов его нейропротективного действия, так как от соотношения внутриклеточный концентраций NO и АФК зависит характер действия этих соединений на процессы, связанные с регуляцией апоптоза в нейрональной клетке. По всей видимости, тиоцетам не благоприятствует условиям накопления пероксинитрита (ONOO-) в цитозоле и, особенно, в митохондриях нейронов, и тем самыш тормозит NO-зависимые механизмы апоптоза, связанные с активацией киназы JNK, факторов р53 и Вах, выквобождением цитохрома С из митохондрий [1,10,13]. Так, гистоиммунохимические исследования показали, что у животнык, перенесших ХАИ, плотность bcl-2-позитивныгх нейронов в СА-1 зоне гиппокампа быыа достоверно ниже, чем у крыс интактной группы (табл. 2).

В цитозольной фракции гомогената головного мозга животнытх после ХАИ методом иммуноблотинга бым вышв-лен дефицит антиапоптотического белка Вс1-2. Известно, что Bcl-2 защищают нейроны от гибели, вызванной активацией п NOS, повыниением NO-ассоциированной нейроток-

сичности (появление избытка токсических дериватов N0) [6,10,11]. Многие клетки защищены сверхэкспрессией Бс1-2 от апоптоза, вызванного активацией iN0S [11,18,19]. Сверхэкспрессия Бс1-2 ведет к защите клеток от большинства апоптоз-индуцирующих агентов. Взаимодействие нитрозирующего стресса с членами суперсемейства Бс1-2 выражается также в том, что при действии избытка N0 на клетку сильно понижается уровень внутриклеточного Бс1-2 белка, возможно, через каспаз-индуцированное расщепление или р53-зависимое подавление его экспрессии [10,13,16,17]. Проапоптотический эффект оксида азота выражается также в индуцируемом им повышении экспрессии проапоп-тического белка Вах [15,18,19]. Морфометрические исследования выявили в СА-1 зоне гиппокампа животных, перенесших ПА, появление апоптически и деструктивно измененных нейронов. Курсовое введение тиоцетама в течение 14 суток животным после ХАИ приводило к достоверному снижению плотности апоптических и деструктивно измененных нейронов СА-1 зоны гиппокампа на 33% и процента апоптически измененных клеток на 42% по сравнению с группой контроля и группой животных, получавших курсом пирацетам (табл. 3).

Таблица 3

Влияние Тиоцетама на плотность апоптически/деструктивно измененных нейронов СА-1 зоны гиппокампа животных с ХАИ

Экспериментальные группы Плотность клеток на 1 мм2 Процент апоптически измененных клеток

Интактная 27,3±14,3 3,07±0,08

Контрольная (ХАИ) 181,6±38,1 27,6±0,45

ХАИ+тиоцетам 121,7±27,1*# 16,1±2,42*#

ХАИ+пирацетам 179,7±42,3 26,8±4,51

Примечание: * - р<0,05 по отношению к контролю; # - р<0,05 по отношению к группе, которая получала пирацетам

Таблица 4

Влияние Тиоцетама на экспрессию белка Вс1-2 в цитозольной фракции гомогената головного мозга животных с ХАИ

Группа животных Общий белок, грамм Площадь, мм2 Оптическая концентрация, усл.ед. Оптическое содержание, усл.ед.

Интактная 4,7±0,02 58,37±1,3 0,17±0,001 7,61±0,32

Контрольная (ХАИ) 4,9±0,01 57,22±1,1 0,03±0,01 0,91±0,07

ХАИ +тиоцетам 4,9±0,01 58,77±1,2 0,12±0,002*# 4,12±0,11*#

ХАИ + пирацетам 4,8±0,01 57,32±1,3 0,03±0,01 0,92±0,08

Примечание: * - р<0,05 по отношению к контролю; # - р<0,05 по отношению к группе, которая получала пирацетам

Курсовое назначение тиоцетама в течение 14-суток животным после ХАИ, достоверно повышало плотность Бс1-2-позитивных нейронов в СА-1 зоне гиппокампа на 81,5% по сравнению с контрольной группой и группой, получавшей по такой же схеме пирацетам. Также нами было установлено, что курсовое введение тиоцетама достоверно повышает концентрацию Бс1-2 в тканях мозга экспериментальных животных. Повышение экспрессии белка Бс1-2 в группе животных, получавших тиоцетам, свидетельствует об активации антиапоптотической защиты поврежденных нейронов под действием этого препарата (табл. 4).

Повышение концентрации белка Вс1-2 в нейронах на фоне введения тиоцетама приводила к торможению N0-зависимыгх механизмов нейроапоптоза под действием хронически вводимого в организм этанола. Так, назначение тиоцетама снижало основные молекулярные маркеры ней-роапотоза (фрагментация ядер нейронов СА-1 зоны гиппо-кампа, уменьшение плотности и процента апоптически

измененных клеток), параллельно увеличивая концентрацию антиапоптического белка Вс1-2 на фоне снижения уровня нитротирозина. По выраженности влияния на эти показатели тиоцетам достоверно превосходил пирацетам.

А

Рис. 1. Картина нейродегенерации после 30-дневной алкогольной интоксикации и последующего 14-дневного лечения (применялась окраска галоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону, увеличение х40). А - СА-1 зона гиппокампа у животных группы интакта; В - СА-1 зона гиппокампа у животных контрольной группы; С - СА-1 зона гиппокампа у животных группы тиоцетама; Э - СА-1 зона гиппокампа у животных группы пирацетама

Рис. 2. Экспрессия белка Вс1-2 в головном мозге крыс (электрофореграмма). 1 - контроль; 2 - пирацетам; 3 - тиоцетам; 4 - интакт

Антиапоптический механизм нейропротективного

действия тиоцетама обусловлен способностью его составляющего компонента (морфолиния 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетата) тормозить реакции нитрозирую-щего стресса. Так, морфолиниий 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат (тиотриазолин) нормализует сдвиги red-oxi-регуляции в условиях нитрозирующего стресса и предупреждает развитие нарушения равновесия тиосульфидной системы при гиперпродукции АФК и NO, обеспечивая такие функции, как передачу клеточного сигнала через ре-цепторно-ионноформный комплекс, сохраняя активность белков, ферментов, факторов транскрипции и антиапопти-ческих белков. [1,5,9,14]. Кроме того, тормозя окислительную инактивацию фактора транскрипции NF-kappa В при избытке NO, тиоцетам усиливает активацию экспрессии редокс-чувствительных генов, которые необходимы для защиты клеток от токсических эффектов нитрозирующего стресса. Среди этих генов есть гены, ответственные за синтез супероксиддисмутазы и bcl-2 [1].

Таким образом, в результате проведенных исследований нами установлено, что классик ноотропной терапии -пирацетам не подавляет нитрозирующий стресс и связанный с ним нейроапоптоз вследствие ХАИ. Назначение ней-рометаболического церебропротектора тиоцетама в дозе 100 мг/кг в течение 14 суток животным после ХАИ приводит к торможению нейроапоптоза в СА1-зоне гиппокампа, возможно, за счет «утилизации» цитотоксических дериватов оксида азота и подавления нитрозирующего стресса. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием для клинического применения тиоцетама в комплексной нейропротекции при алкогольной болезни.

Литература

1. Беленичев И.Ф., Черний В.И., Колесник Ю.М. Рациональная нейропротекция. Донецк: Изд-ль Заславский А.Ю. 2009. 248 с.

2. Беленичев И.Ф., Павлов С.В., Соколик Е.П., Бухтия-рова Н.В. Новые возможности лечения алкогольной болезни. Перспективы применения цереброкурина. Международный неврологический журнал. 2009. №1(29). С. 116-128.

3. Беленичев И.Ф. , Фильянский Е.О., Павлов С.В., Бух-тиярова Н.В. , Кучеренко Л.И., Егоров А.Н. Влияние тиоцетама на показатели энергетического метаболизма и сопряженного с ним ГАМК-шунта в головном мозге потомства, рожденного от алкогользависимых матерей. Запорожский медицинский журнал. 2010. Том 12. №5. С. 127-130.

4. Беленичев И.Ф., Чекман И.С., Губский Ю.И. Доклиническое изучение специфической активности потенциальных нейропротективных препаратов. Методические рекомендации Государственного Фармакологического Центра МЗ Украины. Киев, 2010. 81 с.

5. Беленичев И.Ф., Бухтиярова Н.В., Волков В.П. Фармакология: коллективная научная монография. Новосибирск: Изд. «СибАК», 2013. 194 с.

6. Беленичев И.Ф., Чекман И.С., Бухтиярова Н.В., Горбачева С.В. Тиол-дисульфидное равновесие - определяющий определяющий фактор резистентности нейронов к нитрозирующему стрессу в условиях ишемии мозга. Журнал НАМН Украши. 2013. Т. 19. № 1. С. 3-11.

7. Герштейн Л.М., Корнева И.М., Рахманова В.И. Морфохимические осбенности нейронов гиппокампа у крыс, различающихся по поведению. Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2007. Т. 144. №12. С. 696-698.

8. Егоров А.Н., Беленичев И.Ф., Соколик Е.П. Состояние глутатионовой системы головного мозга пренатально

алкоголизированных крыс на фоне курсового назначения цереброкурина и тиоцетама // Фармакология и врачебная токсикология. 2012. №. 2(27). C. 36-39.

9. Мазур И.А., Волошин Н.А., Беленичев И.Ф. Тиот-риазолин, тиодарон в лечении сердечно-сосудистых патологий. Запорожье: Печатный Мир, 2012. 300 с.

10. Al-Moundhri M., Nirmala V., Al-Mawaly K. Al-Moundhri M. Significance of p53, Bcl-2, and HER-2/neu protein expression in Omani Arab females with breast cancer // Pathol Oncol Res. 2011. Vol. 9. №. 4. P. 226-231.

11. Bassik M.C. Exercise-induced Bcl-2-regulated auto-phagy is required for muscle glucose homeostasis // Nature. 2012 . Vol.18. №.481(7382). P. 511-535.

12. Belenichev I.F., Sokolik E.P. Nitrozine stress and neurological discorders in experimental alcohol intoxication and their pharmacological correction by neuropeptides // Inventi Rapid Molekular Pharmacology. 2011. №4. P. 11-18.

13. Belenichev I.F.,Sokolik E.P., Abramov A.V. Pharmacological modulation of apoptosis signaling in neurons of CA1-zone of hippocampus of rats with chronic alcohol intoxication // Innovative Journal of Medical and Health Science. 2011. Vol.1. №1. P. 12-16.

14. Belenichev I.F., Egorov A., Sokolik A. The impact of neurotrophic cerebroprotection on the expression of hsp70 in the brain of rats with prenatal chronic alcoholism // Conference: XXVIth International Symposium on Cerebral Blood Flow, Metabolism and Function & XIth International Conference on Quantification of Brain Function with PET Shanghai, China, May 20. 23. 2013. Р.591

15. Ben-Neriah S. Concurrent expression of MYC and bcl-2 in diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and predni-sone // J. Clin. Oncol. 2012. Vol 1. №30(28). P. 34-52

16. Boghaert E.R. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets // Nat Med. 2013. Vol.19. №2. P. 220-228.

17. Chertin B., Rolle U., Farkas H. The role of nitric oxide in reflux nephropathy // Pediatr Surg Int. 2009. Vol. 18. P. 630-634.

18. Chen R.M., Tai Y.T., Chen T.G., Lin T.H., Chang H.C., Chen T.L., Wu G.J. Chen R.M. Propofol protects against nitros-ative stress-induced apoptotic insults to cerebrovascular endo-thelial cells via an intrinsic mitochondrial mechanism // Surgery. 2013. Vol.6. №1(154). P. 58-68.

19. Neelam A. Role of oxidative/nitrosative stressmediated Bcl-2 regulation in apoptosis and malignant transformation // Annals of the New York Academy of Sciences. 2010. Vol.8. №1203. P. 1-6.

References

1. Belenichev IF, Cherniy VI, Kolesnik YuM. Ratsion-al'naya neyroprotektsiya. Donetsk: Izd-l' Zaslavskiy A.Yu.; 2009. Russian.

2. Belenichev IF, Pavlov SV, Sokolik EP, Bukhtiyarova NV. Novye vozmozhnosti lecheniya alkogol'noy bolezni. Perspektivy primeneniya tserebrokurina. Mezhdunarodnyy nevrologicheskiy zhurnal. 2009;1(29):116-28.

3. Belenichev IF, Fil'yanskiy EO, Pavlov SV, Bukhtiyarova NV, Kucherenko LI, Egorov AN. Vliyanie tiotsetama na poka-zateli energeticheskogo metabolizma i sopryazhennogo s nim GAMK-shunta v golovnom mozge potomstva, rozhdennogo ot alkogol'zavisimykh materey. Zaporozhskiy meditsinskiy zhurnal. 2010;12(5):127-30. Russain.

4. Belenichev IF, Chekman IS, Gubskiy YuI. Doklini-

cheskoe izuchenie spetsificheskoy aktivnosti potentsial'nykh neyroprotektivnykh preparatov. Metodicheskie rekomendatsii Gosudarstvennogo Farmakologicheskogo Tsentra MZ Ukrainy. Kiev; 2010. Russain.

5. Belenichev IF, Bukhtiyarova NV, Volkov VP. Farmako-logiya: kollektivnaya nauchnaya monografiya. Novosibirsk: Izd. «SibAK»; 2013. Russain.

6. Belenichev IF, Chekman IS, Bukhtiyarova NV, Gorbacheva SV. Tiol-disul'fidnoe ravnovesie - opredelyayushchiy opredelyayushchiy faktor rezistentnosti neyronov k nitrozi-ruyushchemu stressu v usloviyakh ishemii mozga. Zhurnal NAMN Ukrai'ni. 2013;19(1):3-11. Russain.

7. Gershteyn LM, Korneva IM, Rakhmanova VI. Morfok-himicheskie osbennosti neyronov gippokampa u krys, razli-chayushchikhsya po povedeniyu. Byul. eksperim. biologii i meditsiny. 2007;144(12):696-8.

8. Egorov AN, Belenichev IF, Sokolik EP. Sostoyanie glu-tationovoy sistemy golovnogo mozga prenatal'no alkogoliziro-vannykh krys na fone kursovogo naznacheniya tserebrokurina i tiotsetama. Farmakologiya i vrachebnaya toksikologiya. 2012;2(27):36-9.

9. Mazur IA, Voloshin NA, Belenichev IF. Tiotriazolin, ti-odaron v lechenii serdechno-sosudistykh patologiy. Zaporozh'e: Pechatnyy Mir; 2012. Russain.

10. Al-Moundhri M, Nirmala V, Al-Mawaly K. Al-Moundhri M. Significance of p53, Bcl-2, and HER-2/neu protein expression in Omani Arab females with breast cancer. Pathol Oncol Res. 2011;9(4):226-31.

11. Bassik MC. Exercise-induced Bcl-2-regulated auto-phagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 2012.18;481(7382):511-35.

12. Belenichev IF, Sokolik EP. Nitrozine stress and neurological discorders in experimental alcohol intoxication and their pharmacological correction by neuropeptides. Inventi Rapid Molekular Pharmacology. 2011;4:11-8.

13. Belenichev IF, Sokolik EP, Abramov AV. Pharmacological modulation of apoptosis signaling in neurons of CA1-zone of hippocampus of rats with chronic alcohol intoxication. Innovative Journal of Medical and Health Science. 2011;1(1):12-6.

14. Belenichev IF, Egorov A, Sokolik A. The impact of neurotrophic cerebroprotection on the expression of hsp70 in the brain of rats with prenatal chronic alcoholism. Conference: XXVIth International Symposium on Cerebral Blood Flow, Metabolism and Function & XIth International Conference on Quantification of Brain Function with PET Shanghai, China, May 20. 23. 2013. R.591

15. Ben-Neriah S. Concurrent expression of MYC and bcl-2 in diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and predni-sone. J. Clin. Oncol. 2012;1(28):34-52.

16. Boghaert ER. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 2013;19(2):220-8.

17. Chertin B, Rolle U, Farkas H. The role of nitric oxide in reflux nephropathy. Pediatr Surg Int. 2009;18:630-4.

18. Chen RM, Tai YT, Chen TG, Lin TH, Chang HC, Chen TL, Wu GJ, Chen RM. Propofol protects against nitrosative stress-induced apoptotic insults to cerebrovascular endothelial cells via an intrinsic mitochondrial mechanism. Surgery. 2013;6 (154):58-68.

19. Neelam A. Role of oxidative/nitrosative stressmediated Bcl-2 regulation in apoptosis and malignant transformation. Annals of the New York Academy of Sciences. 2010;8(1203):1-6.