Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по массе CD4+лимфоцитов селезенки
METHOD FOR PREDICTION OF CLINICAL COURSE OF ATROPHIC ANAEMIA AFTER SPLENECTOMY AFTER SPLENECTOMY BASED ON SPLEEN CD4+LYMPHOCYTES WEIGHT

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и может быть использовано при прогнозировании течения апластической анемии (АА) после спленэктомии путем проведения иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания лимфоцитов в гистологических срезах селезенки, морфометрического подсчета количества CD4+ клеток и вычисления их массы.
АА - тяжелое заболевание системы крови и характеризуется синдромом костномозговой недостаточности. Глубокая трехростковая панцитопения развивается в результате угнетения кроветворения вследствие иммунной агрессии, направленной на клетки-предшественники гемопоэза. Одним из важных звеньев патогенеза заболевания является дизрегуляция Т- и В-клеточной системы иммунитета. Так, в результате исследований было доказано повышение количества зрелых и активированных Т-лимфоцитов с фенотипом супрессоров-киллеров, инверсия хелперно-супрессорного соотношения, увеличение продукции цитокинов, обладающих ингибирующим действием на гемопоэтические клетки костного мозга. Однако оценка популяционного состава лимфоцитов при АА многими авторами проводились преимущественно в периферической крови и костном мозге (Solomou Е.Е., Rezvani S., Mielke S. [et al.] / Deficient CD4 CD25 FOXP3 T regulatory cells in acquired aplastic anemia // Blood. - 2007. - Vol. 110, No 5. - P. 1603-1606; Rizitano A.M. Kook H., Zeng W. [et al.] / Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria measured by V-beta spectratyping and flow cytomenry // Blood. - 2002. - Vol. 100, No. 1. - P. 178-183).
Изучение иммунного механизма при АА в последние годы вызывает все большее внимание ученых в связи с эффективностью проводимой иммуносупрессивной терапии. Спленэктомия входит в программу комбинированного лечения пациентов; при этом одним из механизмов влияния операции на течение болезни считается удаление большой массы активированных лимфоидных клеток, участвующих в патогенезе патологического процесса. Тем не менее, роль CD4+ клеток в патогенезе АА до сих пор изучена недостаточно. Практически отсутствуют сведения о влиянии массы CD4+ лимфоцитов селезенки на течение заболевания.
Целью изобретения является разработка способа прогнозирования течения АА после спленэктомии по массе CD4+лимфоцитов селезенки.
Аналогами являются: 1. Известный способ «Функциональная характеристика CD4+ Т-клеток при апластической анемии» Kordasti S., Marsh J., AL-Khan S. [et al.] / Functional characterization of CD4+ T cells in aplastic anemia // Blood. - 2012. - Vol. 119, No 9. - P. 2033-2043 и 2. Сообщение «Возрастание CD4+ и CD8+ Т-клеток эффекторов памяти у больных апластической анемией». Hu X., Gu Y., Wang Y. [et al.] / Increased CD4+ and CD8+ effector memory T cells in patients with aplastic anemia // Haematologica - Vol. 94. - P. 428-429. В приведенных аналогах определяли содержание CD4+ Т-клеток в крови и костном мозге при оценке характера течения АА, спленэктомия не проводилась.
Отличия заявляемого способа от аналога включают:
1. ИГХ окрашивание и морфометрический метод подсчета количества CD4+ лимфоцитов проводят в гистологических срезах селезенки у больных АА после спленэктомии, а не в крови и костном мозге методом проточной цитометрии.
2. Течение АА после спленэктомии прогнозируют по массе CD4+ лимфоцитов селезенки.
В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.
Способа прогнозирования течения АА после спленэктомии по массе CD4+лимфоцитов селезенки не существует.
Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии крови ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в соответствии с планом НИР.
Способ осуществляется следующим образом
После проведения спленэктомии у больных АА определяют массу удаленной селезенки. Проводку образцов послеоперационного материала выполняют на гистологических срезах, приготовленных из парафиновых блоков селезенок, толщиной 3-5 мкм по общепринятому способу. Для идентификации CD4+ лимфоцитов селезенки используют ИГХ метод. Иммунореактивность первичных антител («Dako») выявляют с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой, входящей в набор реактивов EnVISION+ («Dako»). Постановку ИГХ реакции осуществляют по стандартной методике в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрическую оценку количества CD4+ клеток выполняют на световом микроскопе фирмы «Leica» со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений Image Scope Color, версии М с окуляром ×10, при объективе ×100. Исследования выполняют в 20 полях зрения для каждого образца, начиная от капсулы вглубь лимфоидного органа. Исходя из полученных результатов, вычисляют массу CD4+ Т-лимфоцитов селезенки по формуле:
М=m×D/100%,
где:
m - масса селезенки, г;
D - количество CD4+ Т-лимфоцитов, %;
М - масса CD4+ Т-лимфоцитов, г.
Исследования выполнены на гистологических срезах селезенок от 26 больных АА после спленэктомии в возрасте от 18 до 68 лет (12 - с нетяжелой формой заболевания и 14 - тяжелой). При оценке массы CD4+ лимфоцитов селезенки благоприятное течение заболевания установлено у 13 пациентов (9 - с нетяжелой формой и 4 - тяжелой). У остальных 13 больных определен неблагоприятный прогноз (3 - при нетяжелой форме и 10 - тяжелой).
Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать течение АА после спленэктомии по массе CD4+ лимфоцитов селезенки.
Пример 1.
9
9
Больной М., 24 года, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 02.11.20004 г. Диагноз: АА нетяжелая форма. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 64 г/л, гранулоциты 0,71×10/л, тромбоциты 55×10/л. Через три месяца (08.02.2005 г.) выполнена операция: срединная лапаротомия, спленэктомия без осложнений. Масса селезенки (m) составила 170 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено количество CD4+ Т-лимфоцитов (D) - 3,2%. Вычислена масса (М) CD4+ Т-клеток по ранее приведенной формуле: 5,44 г. Установленная величина массы М получена в ходе следующего расчета: М=170 г × 3,2% / 100%.
Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у больного АА благоприятный прогноз течения заболевания.
9
9
9
9
Состояние клинико-гематологического улучшения наступило через 2 недели после операции (22.02.2005 г.): гемоглобин 107 г/л, гранулоциты 1,71×10/л, тромбоциты 150×10/л. Зависимость от гемотрансфузий компонентов крови уменьшена. Состояние ремиссии было достигнуто через 5 месяцев после спленэктомии (10.07.2005 г.): гемоглобин 109 г/л, гранулоциты 1,83×10/л, тромбоциты 180×10/л. Зависимости от гемотрансфузий нет.
Пример 2.
9
9
Больная Д., 39 лет, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 10.02.2006 г. Диагноз: апластическая анемия, тяжелая форма. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 102 г/л, гранулоциты 0,25×10/л, тромбоциты 15×10/л. Через две недели (22.02.2006 г.) выполнена операция: срединная лапаротомия, спленэктомия без осложнений. Масса селезенки (m) составила 120 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. Морфометрически определено количество CD4+лимфоцитов селезенки (D): 9,0%. По ранее приведенной формуле вычислена их масса (М): 10,80 г. Установленное значение массы М было получено в ходе следующего расчета: М=120 г × 9,0% /100%.
Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у больной АА благоприятный прогноз течения заболевания.
9
9
9
9
Состояние клинико-гематологического улучшения наступило через 2,5 недели после операции (13.03.2006 г.): гемоглобин 82 г/л, гранулоциты 1,08×10/л, тромбоциты 60×10/л. Зависимость от гемотрансфузий снижена. Состояние ремиссии было достигнуто через 7 месяцев после спленэктомии (11.09.2006 г.): гемоглобин 101 г/л, гранулоциты 4,0×10/л, тромбоциты 175×10/л. Зависимости от гемотрансфузий нет.
Пример 3.
9
9
Больной К., 26 лет, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 12.09.1995 г. Диагноз: апластическая анемия, нетяжелая форма. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 82 г/л, гранулоциты 0,68×10/л, тромбоциты 15,0×10/л. Через неделю (19.09.1995 г.) выполнена операция: срединная лапаротомия, спленэктомия без осложнений. Масса селезенки (m) составила 70 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено количество CD4+ Т-лимфоцитов (D) - 3,2%. По ранее приведенной формуле вычислена масса (М) CD4+ Т-клеток: 2,24 г. Установленная величина массы М получена в ходе следующего расчета: М=70 г ×3,2% / 100%.
Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у больного АА неблагоприятный прогноз течения заболевания.
В ходе динамического наблюдения за пациентом выявленные данные были подтверждены проведенной оценкой результатов лечения. Так, состояние клинико-гематологического улучшения не наступило. Спустя 6 месяцев после операции (13.03.1996) больной умер.
Заявляемое изобретение обладает новизной, существенными отличиями, дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки прогнозировать течение АА после спленэктомии. При величинах массы CD4+ Т-лимфоцитов селезенки ≥5,4 г констатируют благоприятное течение АА, а при <5,4 г устанавливают неблагоприятное течение заболевания.
Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических отделениях, морфологических и гистологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения АА после спленэктомии.