Бумажный биосенсор с равномерно нанесенным слоем аптамер-Zn-MOF

Инфаркт миокарда (ИМ) патологически определяется как гибель клеток миокарда вследствие длительной ишемии, что является наиболее тяжелым проявлением ишемической болезни сердца (ИБС) [Sun T. et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application //International journal of molecular sciences. – 2017. – Т. 18. – №. 4. – С. 745]. Развитие ИБС может быть хроническим из-за накопления бляшек и прогрессирующего сужения коронарной артерии. Внезапный разрыв бляшки и образование тромба приводит к острому ИМ, который протекает гораздо серьезнее: при перекрытии подачи кислорода, через 20 минут начинается ИМ, а полный некроз клеток миокарда происходит через несколько часов. Длительная ишемия приводит к потере сократительной способности сердца из-за плохой пролиферационной способности миокардиальных клеток. Ранняя диагностика начала ИМ позволит врачам своевременно оказать помощь и спасти пациента.
В настоящее время, в качестве диагностического маркера ИМ используется сывороточный тропонин, однако его отсроченное время высвобождения часто приводит к низкой чувствительности [Sun T. et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application //International journal of molecular sciences. – 2017. – Т. 18. – №. 4. – С. 745].
В последнее время особый интерес вызывает циркулирующий миРНК-133, как биомаркер ИМ, благодаря стабильности и специфичности в плазме [Wang G. K. et al. Circulating microRNA: a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans //European heart journal. – 2010. – Т. 31. – №. 6. – С. 659–666]. Исследования показывает, что при повреждении миокарда миРНК просачиваются в кровоток, экспрессия увеличивается и его можно обнаружить количественно. Тем не менее, точное обнаружение и количественное определение миРНК остается большой проблемой в области биосенсинга из-за существующих ограничений доступных аналитических инструментов.
Стандартом для количественного определения миРНК является количественная ПЦР с обратной транскриптазой (RT-qPCR) [Gillespie P., Ladame S., O'Hare D. Molecular methods in electrochemical microRNA detection //Analyst. – 2019. – Т. 144. – №. 1. – С. 114-129; Chen Y. X., Huang K. J., Niu K. X. Recent advances in signal amplification strategy based on oligonucleotide and nanomaterials for microRNA detection-a review //Biosensors and Bioelectronics. – 2018. – Т. 99. – С. 612-624; Yuan Y. H. et al. Ratiometric electrochemical assay for sensitive detecting microRNA based on dual-amplification mechanism of duplex-specific nuclease and hybridization chain reaction //Biosensors and Bioelectronics. – 2018. – Т. 102. – С. 211-216]. Анализ миРНК TaqMan на основе обратной транскрипции стволовой петли (RT) является основным методом ПЦР, используемым в исследованиях, с преимуществом высокой чувствительности и специфичности [Chen C. et al. Quantitation of microRNAs by real-time RT-qPCR //PCR protocols. – Humana Press, 2011. – С. 113-134].  Однако оборудование достаточно дорогое и громоздкое.
Другими доступными вариантами являются прямые анализы SYBR miRNA на основе RT и поли(A)-хвостов [Chen C. et al. Quantitation of microRNAs by real-time RT-qPCR //PCR protocols. – Humana Press, 2011. – С. 113-134]. Недостатком этих методов является то, что иногда могут возникать ошибки восприятия используемых образцов, а также на этапах амплификации существует высокий риск загрязнения [Gillespie P., Ladame S., O'Hare D. Molecular methods in electrochemical microRNA detection //Analyst. – 2019. – Т. 144. – №. 1. – С. 114-129].
Нозерн-блот-гибридизация представляет собой еще одну широко используемую альтернативу для количественной оценки миРНК. Этот метод предполагает выделение общего количества РНК на полиакриламидном геле, обладающего свойством денатурации, с последующим ее переносом на нейлоновую мембрану. После этого РНК подвергается процессу УФ-сшивания и, наконец, гибридизуется с использованием радиоактивного вещества [Pacak A. et al. Heat stress affects Pi-related genes expression and inorganic phosphate deposition/accumulation in barley //Frontiers in plant science. – 2016. – Т. 7. – С. 926; Barciszewska-Pacak M. et al. Arabidopsis microRNA expression regulation in a wide range of abiotic stress responses //Frontiers in plant science. – 2015. – Т. 6. – С. 410; Kruszka K. et al. Transcriptionally and post-transcriptionally regulated microRNAs in heat stress response in barley //Journal of Experimental Botany. – 2014. – Т. 65. – №. 20. – С. 6123-6135; Smoczynska A. et al. miRNA detection by stem-loop RT-qPCR in studying microRNA biogenesis and microRNA responsiveness to abiotic stresses //Plant MicroRNAs. – Humana Press, New York, NY, 2019. – С. 131-150]. Однако этот метод, как правило, трудоемок, требует больших количеств РНК, и иногда сообщалось, что он пропускает редкие типы миРНК [Smoczynska A. et al. miRNA detection by stem-loop RT-qPCR in studying microRNA biogenesis and microRNA responsiveness to abiotic stresses //Plant MicroRNAs. – Humana Press, New York, NY, 2019. – С. 131-150].
Таким образом, новизна представленной полезной модели связана с нетривиальным подходом и созданием портативного хемилюминесцентного бумажного биосенсора, с использованием комплекса аптамер-Zn-MOF, для детекции ми-РНК-133 при остром инфаркте миокарда.
Принцип действия биосенсора основан на работе комплекса аптамер-Zn-MOF. При появлении маркера (ми-РНК-133) аптамер специфично с ним связывается, высвобождая при этом Zn-MOF, металлорганический каркас, состоящий из ионов Zn и гемина в качестве лиганда [Mi L. et al. Hemin-bridged MOF interface with double amplification of G-quadruplex payload and DNAzyme catalysis: ultrasensitive lasting chemiluminescence microRNA imaging //ACS Applied Materials & Interfaces. – 2020. – Т. 12. – №. 7. – С. 7879–7887]. Zn-MOF обладает пероксидазоподобной активностью и способен разлагать Н2О2 до молекулярного кислорода, который, взаимодействуя с люминолом, вызывает интенсивное хемилюминесцентное свечение.
В качестве платформы для нанесения комплекса аптамер-Zn-MOF выбрали целлюлозную бумагу из-за ее недорогой стоимости, большой пористости и возможности химической модификации. Цвет бумаги черный, для улучшения чувствительности биосенсора: на черном фоне лучше видно хемилюминесцентное свечение.
Нижеприведенные примеры иллюстрируют использование бумажного биосенсора, предложенного в настоящей работе, и не должны рассматриваться как ограничивающие его полную сферу применения, охватываемую прилагаемой формулой полезной модели.
Пример 1. Получение комплекса аптамер-Zn-MOF.
Одноцепочечный аптамер ми-РНК-133 был синтезирован в ДНК-Технологии и использовался без дополнительной чистки. Композит получали путем прямого смешивания аптамера 2 мкМ, 0,5 мМ гемина, 27 мМ ацетата цинка и 0,1 мкМ CTAB в водном растворе при комнатной температуре, в течение 2 часов.
Полученный порошок белого цвета (рис. 1а) собирали центрифугированием, промывали водой и сушили при 40°C в течение ночи.  Полученный комплекс аптамер-Zn-MOF имеет форму прямоугольника со срезанными краями (рис 1б). Влияние аптамера на структуру Zn-MOF исследовали методом рентгеновской дифракции (XRD) (рис. 2).
Аптамер является аморфным и пиков на рентгенограмме не дает. После иммобилизации аптамера дифракционные пики остаются неизменными, что указывает на структурную целостность Zn-MOF. Аптамер связывается с Zn-MOF за счет координационных взаимодействий Zn-O-P, через фосфатные группы аптамера.
Пример 2. Изготовление бумажной платформы для биосенсора.
В качестве платформы для биосенсора выбрана черная бумага для офисной техники Canon Black Label Extra, формат А4, марка B, плотность 80 г/кв.м. Для удобства дальнейшего масштабирования бумажный биосенсор имеет прямоугольную форму с размерами Ш×В 3×7 см. На бумаге напечатаны 3 круга диаметром 0,5 см (рис. 3): 1 и 2 – для пользователя, куда он будет капать исследуемой образец сыворотки крови, а 3 – контрольный образец, во избежание ложноположительного сигнала.
Пример 3. Получение бумажного биосенсора с комплексом аптамер-Zn-MOF.
2 мг комплекса аптамер-Zn-MOF диспергировали в 250 мкл 1% раствора PVA (поливиниловый спирт) с образованием липкого раствора. PVA был использован здесь по двум причинам: 1) PVA может служить в качестве диспергатора и агглютинанта, что позволяет равномерно закрепить комплекс на целлюлозной бумаге; 2) поверхность бумаги, модифицированной PVA, становится более однородной, что положительно влияет на измерение изменения цвета при дальнейшей работе биосенсора. Далее 5 мкл липкого раствора комплекса с PVA капали на 3 напечатанных круга бумаги и затем сушили при комнатной температуре в течение 8 часов. В результате получили бумажный биосенсор с нанесенным комплексом аптамер-Zn-MOF массой 0,04 мг.
Пример 4. Оценка влияния бумаги и PVA на работу комплекса аптамер-Zn-MOF.
-18
2
2
Для оценки влияния бумаги и/или PVA на работу комплекса аптамер-Zn-MOF сравнивали интенсивности ХЛ свечения чистого аптамер-Zn-MOF и нанесенного на бумагу согласно следующей методике: (1) в 0,04 мг комплекса аптамер-Zn-MOF добавить в 25 мкл сыворотки крови с миРНК-133 концентрацией 1,96×10 (минимальная концентрация, которую можно детектировать). То же самое количество сыворотки крови с миРНК-133 капнуть на кружок бумажного биосенсора; (2) затем и в чистый аптамер-Zn-MOF и на бумажный биосенсор с комплексом добавить щелочной раствор (рН-10) смеси люминол/НО в соотношении 1 к 1 мМ и в течение 1-5 мин наблюдать появление ХЛ свечения, которое длится в течение 24 часов (рис. 4). Из рисунка видно, что никакого отличия в интенсивности и времени ХЛ свечения между комплексом чистым и нанесенным на бумагу с PVA нет.
Пример 5. Исследование интенсивности ХЛ свечения в бумажном биосенсоре с различными концентрациями миРНК-133.
-18
-12
-18
Далее исследовали интенсивность ХЛ свечения в бумажном биосенсоре с различными концентрациями миРНК-133а, остальные условия постоянные, согласно методике, описанной в примере 4. На рис. 5 изображены кинетические кривые ХЛ свечения при различных концентрациях микроРНК-133. По мере увеличения концентрации мишени интенсивность ХЛ свечения также увеличивается в линейном диапазоне от 10×10 М до 10×10 М (рис. 6 а, б) с пределом обнаружения (LOD) 1,96×10М (S/N = 3).
Пример 6. Исследование селективности бумажного биосенсора по отношению к другим циркулирующим миРНК.
Для демонстрации селективности нашего биосенсора по отношению к другим ми-РНК, которые сосуществуют с миРНК-133 в сыворотке крови пациентов с ОИМ, такие как миРНК-208, миРНК-499, миРНК-1, мы исследовали наличие ХЛ свечение для каждого миРНК в сыворотке крови, а также их смесь. На рисунке 7а показаны изображения ХЛ свечения для всех видов миРНК по отдельности и их смесь. Из этого результата мы можем обнаружить, что сигналы ХЛ заметны только в присутствии миРНК-мишени, а некомплементарные миРНК в образце сыворотки крови не приводят к значительным изменениям по сравнению с фоновым сигналом. Это указывает на то, что наш бумажный биосенсор демонстрирует хорошую селективность в отношении миРНК-133 в сыворотке крови человека, что свидетельствует о способности идентификации наличия ИМ в крови пациентов с высокой точностью, достигающей 93% (рис. 7б).
Изображения:
Рис. 1. Изображение комплекса аптамер-Zn-MOF: а - внешний вид полученного комплекса; б - СЭМ-изображение.
Рис. 2. XDR кривая Zn-MOF и аптамер-Zn-MOF.
Рис. 3. Внешний вид бумажного биосенсора.
2
2
-18
Рис. 4. Сравнение интенсивности ХЛ свечения чистого комплекса аптамер-Zn-MOF и комплекса, нанесенного на бумагу в разные периоды времени (рН - 10, соотношение люминол/НО - 1:1 мМ, миРНК-133 - 1,96×10 М).
Рис. 5. Кинетические кривые ХЛ-свечения бумажного биосенсора на основе комплекса аптамер-Zn-MOF при добавлении миРНК-133 различных концентраций (увеличение).
2
Рис. 6. а) Калибровочная кривая интенсивности ХЛ свечения бумажного биосенсора на основе комплекса аптамер-Zn-MOF при различных концентрациях миРНК-133 (R = 0.99865); б) Изображение интенсивности ХЛ свечения бумажного биосенсора на основе комплекса аптамер-Zn-MOF при различных концентрациях миРНК-133.
-18
Рис. 7. а) Изображения ХЛ свечения для всех видов миРНК по отдельности и их смесь; б) Специфичность сенсорной платформы, нацеленной на миРНК-133, в присутствии интерференционных миРНК в сыворотке крови человека, с ИМ. Количество интерференционных миРНК составляет 10 nМ, а концентрация целевой ми-РНК-133 составляет 1,96×10М.