СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЦИСТЕИНА, L-ЦИСТИНА, S-СУЛЬФОЦИСТЕИНА ИЛИ ТИАЗОЛИДИНОВОГО ПРОИЗВОДНОГО L-ЦИСТЕИНА, ИЛИ ИХ СМЕСИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE
METHOD OF PRODUCING L-CYSTEINE, L-CYSTINE, S-SULPHOCYSTEINE OR L-CYSTEINE THIAZOLIDINE DERIVATIVE, OR MIXTURE THEREOF USING BACTERIA OF ENTEROBACTERIACEAE FAMILY

Описание изобретения
Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-цистеина, L-цистина, их производного или предшественника или их смеси с помощью бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов, участвующих в процессе ассимиляции серы.
Предшествующий уровень техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Остальные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой L-аминокислотой по принципу обратной связи (см., например, WO 95/16042 или патенты США 5,661,012 и 6,040,160).
Синтез L-цистеина из неорганической серы является основным механизмом, благодаря которому восстановленная сера включается в органические соединения микроорганизмов. В этом процессе неорганический сульфат, самый распространенный источник утилизируемой серы аэробной биосферы, поступает внутрь клетки и восстанавливается до сульфида, который, в свою очередь, включается в L-цистеин с использованием механизма, аналогичного фиксации аммония в глутамин или глутамат. Известно множество генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы, в том числе гены, участвующие в активации серы (cysD, cysN, cysC) и деградации (cysQ) аденозин-3'-фосфат-5'-фосфосульфата (PAPS).
Неорганический сульфат восстанавливается до сульфида за счет последовательности ферментативных реакций, осуществляемых АТФ-сульфорилазой (ЕС 2.7.7.4), аденилилсульфаткиназой (APS-киназа) (ЕС 2.7.1.25), фосфоаденилилсульфатредуктазой (PAPS-редуктаза) и сульфитредуктазой (ЕС 1.8.1.2. NADPH-зависимая или ЕС 1.8.7.1. ферредоксин-зависимая). O-Ацетил-L-серин(тиол)лиаза (ЕС 4.2.99.8) встраивает сульфид с образованием аминокислоты цистеин (Krone F.A. et al., Mol.Gen.Genet, 225(2): 314-9 (1991)).
ДНК-последовательность сульфат-активируемого локуса Е. coli K-12 установлена. Данная последовательность включает в себя структурные гены, кодирующие АТФ-сульфорилазу (cysD и cysN) и APS-киназу (cysC), которая катализирует синтез аденилилсульфата. На сегодняшний день известны только эти гены, входящие в сульфат-активируемый оперон. Консенсусные элементы промотора оперона идентифицированы, стартовые кодоны и открытые рамки считывания Cys-белков установлены. Активность АТФ-сульфорилазы стимулируется собственной ГТФазой. Сопоставление первичных последовательностей CysN и Ef-Tu показало, что многие из остатков, необходимых для формирования правильной трехмерной структуры и важных для связывания белков Ef-Tu и RAS с остатками гуанина, консервативны в CysN. Гены nodP и nodQ из Rhizobium meliloti важны для образования клубеньков у бобовых растений. Белки Cys и Nod очень похожи между собой. NodP оказался наименьшей субъединицей АТФ-сульфорилазы. NodQ кодирует гомологи и CysN, и CysC; таким образом, данные ферменты могут быть ковалентно связаны в R. meliloti. Тот факт, что ГТФ-связывающие последовательности NodQ и CysN идентичны, дает основания предполагать, что NodQ кодирует регулятор ГТФ-азы (Leyh T.S. et al., J. Biol. Chem., 267(15): 10405-10 (1992)).
Начальные этапы ассимиляции сульфата в течение биосинтеза цистеина приводят к поглощению сульфата и его активации за счет образования аденозин-5'-фосфосульфата, конверсии в 3'-фосфатаденозин-5'-фофосульфат и восстановлению до сульфита. Мутации в гене cysQ из Escherichia coli, приводящие к потребности бактерии в сульфите или цистеине, были получены in vivo путем инсерции транспозонов Tn5tac1 и Tn5supF, и in vitro инсерцией кассет с генами устойчивости. Ген cysQ расположен в позиции 95.7 min (с 4517 по 4518 т.п.н.) и транскрибируется в противоположном по сравнению с близлежащим геном cpdB направлении. Инсерция в 3'-конец гена cysQ транспозона Tn5tac1 с промотором, индуцируемым изопропил-бета-О-тиогалактопиранозидом и ориентированным в противоположном промотору cysQ направлении, приводила к ауксотрофности только когда был добавлен изопропил-бета-О-тиогалактопиранозид, этот условный фенотип обеспечивался противодействием между сходящимися РНК-полимеразами или взаимодействием между комплементарными антисмысловой и смысловой cysQ мРНК. Ауксотрофность, обусловленная полной потерей функции cysQ, была ауксотрофностью типа "leaky" в некоторых, но не во всех штаммах Е. coli, и могла быть компенсирована мутациями в несопряженных генах. Мутанты cysQ были прототрофными при анаэробном выращивании. Мутации в гене cysQ не влияли на скорость поглощения сульфата или активность АТФ-сульфорилазы и ее белковых активаторов, которые вместе катализируют синтез аденозин-5'-фосфосульфата. Некоторые мутации, компенсировавшие ноль-аллели cysQ, приводили к нарушениям транспорта сульфата. Ген cysQ идентичен гену amtA, который, как считалось, необходим для транспорта аммония. Компьютерный анализ выявил существенную гомологию аминокислотных последовательностей между продуктами генов cysQ и suhB из Е. coli и геном инозитолмонофосфатазы млекопитающих. Предыдущие исследования дали основания предполагать, что 3'-фосфоаденозид-5'-фосфосульфат становится токсичным при накоплении и что CysQ помогает контролировать пул 3'-фосфоаденозид-5'-фосфосульфата или использовать его в синтезе сульфита (Neuwald A.F. et al, J. Bacteriol, 174(2): 415-25 (1992)).
Был опубликован способ получения L-треонина путем ферментации микроорганизмов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, в котором экспрессия как минимум одного или более генов пути биосинтеза цистеина, выбранного(ых) из группы, включающей в себя гены cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE и sbp, усилена (WO 03006666A2).
Известен способ получения L-цистеина с использованием бактерии, относящейся к роду Escherichia, в которой продуктивность L-аминокислоты вышеупомянутой бактерией увеличена за счет усиления экспрессии генов кластера cysPTWAM (US 2005124049 A1).
Но в настоящее время нет данных о последовательностях генов, участвующих в процессе ассимиляции серы бактериями семейства Enterobacteriaceae, и генов, усиление экспрессии которых необходимо для продукции L-цистеина бактерией семейства Enterobacteriaceae.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов-продуцентов и предоставление способа получения L-цистеина, L-цистина, их производных или предшественников или их смеси с использованием указанных штаммов.
Данная цель была достигнута за счет обнаружения того факта, что усиление экспрессии генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы, приводит к увеличению продукции L-цистеина.
Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к семейству Enterobacteriaceae, обладающую повышенной способностью к продукции L-цистеина.
Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии семейства Enterobacteriaceae - продуцента L-цистеина, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что в ней усилена экспрессия одного или более генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой гены, вовлеченные в процесс ассимиляции серы, включают в себя гены, участвующие в активации сульфата и деградации аденозин-3'-фосфат-5'-фосфосульфата(РАРS).
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой гены, участвующие в активации сульфата, включают один или несколько генов кластера cysDNC.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой гены, участвующие в деградации аденозин-3'-фосфат-5'-фосфосульфата (PAPS), включают ген cysQ.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая модифицирована таким образом, что в ней усилена экспрессия гена cysQ, одного или нескольких генов кластера cysDNC или обоих.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой экспрессия вышеупомянутого(ых) гена(ов) усилена за счет модификации последовательности, контролирующей экспрессию, таким образом, что экспрессия указанного(ых) гена(ов) усилена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой природный(ые) промотор(ы) указанного(ых) гена(ов) замещен(ы) более сильным(ыми) промотором(ами).
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая принадлежит к роду Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая является бактерией Pantoea ananatis.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая является бактерией Escherichia coli.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения соединения, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, L-цистина, их производных или предшественников, который включает выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, содержащей сульфат, и выделение указанного соединения из культуральной жидкости.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная бактерия имеет усиленную экспрессию генов, вовлеченных в биосинтез L-цистеина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная бактерия имеет усиленную экспрессию генов, вовлеченных в биосинтез L-метионина.
Настоящее изобретение более детально описано ниже
Подробное описание наилучшего способа осуществления изобретения
1. Бактерия
Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae - продуцент L-цистеина, модифицированная таким образом, что экспрессия генов, участвующих в процессе ассимиляции серы, указанной бактерией усилена.
«Бактерия - продуцент L-цистеина» означает бактерию, способную производить и накапливать L-цистеин в среде, когда такая бактерия культивируется, в питательной среде.
Термин «бактерия - продуцент L-цистеина» также означает бактерию, способную производить и накапливать в культуральной среде L-цистеин в количествах, больших, чем штамм дикого типа, немодифицированный или родительский штаммы, например Pantoea ananatis, такие как Pantoea ananatis (Enter obacter agglomerans) штаммы AJ13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6615), AJ13601 (FERM BP-7207), SС17(патент США 7,090,998), или Escherichia coli, такие как Е. coli K-12. Штамм SC17 отобран в качестве штамма с низкой продукцией слизи из штамма AJ13355, изолированного из почвы Ивата-ши, Шицуока-кен, Япония (Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japan) как штамм, который может расти в среде с низким рН, содержащей L-глутаминовую кислоту и источник углерода (Патент США No.6,596,517). Штамм SC17 был депонирован в Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Тсукуба Централ 6, 1-1, Хигаси 1-Чоме, Тсукуба-щи, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 4 февраля 2009 и получил инвентарный номер FERM ВР-11091. Термин «бактерия - продуцент L-цистеина» также означает, что микроорганизм способен производить и накапливать в среде L-цистеин в концентрациях не меньше чем 0,5 г/л и более предпочтительно не меньше чем 1,0 г/л.
L-цистеин, произведенный указанной бактерией, может превращаться в среде в L-цистин за счет формирования дисульфидных связей. Главным образом, как описано далее, считается, что если L-цистеин образуется в большом количестве за счет увеличения активности DsbA, то запускается формирование L-цистина из L-цистеина с участием окислительной системы DsbA-DsbB-UQ. Кроме того, S-сульфоцистеин может быть получен в реакции L-цистеина и тиосерной кислотой в среде (Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)). Кроме того, L-цистеин, произведенный в бактериальных клетках, может быть сконденсирован с кетоном, альдегидом или, например, пировиноградной кислотой, которая присутствует в клетках, с целью продукции тиазолидинового производного через полутиокетальный интермедиат (см. патент Японии No.2992010). Такое тиазолидиновое производное и полутиокеталь могут присутствовать в виде равновесной смеси. Вследствие этого способность продуцировать L-цистеин не ограничивается способностью накапливать только L-цистеин в среде или клетках, но также включает способность накапливать L-цистин или их производные, или предшественники, или их смесь в среде.
Примеры упомянутого выше производного L-цистеина или L-цистина включают, например, S-сульфоцистеин, тиазолидиновые производные, полутиокеталь, L-метионин, S-аденозилметионин и др. L-цистеин является предшественником L-метионина. L-цистеин участвует в биосинтезе L-метионина в реакции конверсии О-сукцинил-L-гомосерина в L-цистатионин. Таким образом, повышенный уровень L-цистеина может приводить к накоплению L-метионина. В свою очередь, L-метионин является исходным соединением для синтеза S-аденозилметионина и др. Кроме того, если бактерия обладает кроме способности к продукции L-цистеина способностью к продукции L-метионина или аденозилметионина, продукция таких соединений, как L-метионин или аденозилметионин, может быть увеличена за счет усиления экспрессии генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы.
Примеры бактерий-продуцентов L-метионина и родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий-продуцентов L-метионина, включают, но не ограничиваются ими, штаммы бактерии Escherichia, такие как AJ11539 (NRRL В-12399), AJ11540 (NRRL В-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ11542 (NRRL B-12402) (патент Англии GB 2075055); штаммы 218 (VKPM В-8125) (патент Российской Федерации RU 2209248) и 73 (VKPM B-8126) (патент Российской Федерации RU 2215782), устойчивые к аналогу L-метионина норлейцину, или подобные им.
Примеры предшественников L-цистеина или L-цистина включают, например, O-ацетилсерин, который является предшественником L-цистеина. Предшественники L-цистеина или L-цистина также включают, например, N-ацетилсерин, который является предшественником O-ацетилсерина, и др.
O-ацетилсерин (OAS) является предшественником биосинтеза L-цистеина. OAS представляет собой метаболит бактерий и растений и синтезируется за счет ацетилирования L-серина в ферментативной реакции, катализируемой серинацетилтрансферазой (SAT). Далее OAS превращается в L-цистеин в клетках.
Бактерия-продуцент L-цистеина может в своей основе иметь способность к продукции L-цистеина или такая способность может быть ей придана за счет модификации микроорганизма такого, как описано далее, с использованием мутагенеза или технологии рекомбинантных ДНК. Если не оговорено специальным образом, термин L-цистеин относится восстановленному L-цистеину, L-цистину, их производному или предшественнику, как описано выше, или их смеси.
Понятие бактерии не ограничено каким-либо образом при условии, что бактерия согласно настоящему изобретению принадлежит к семейству Enterobacteriaceae и обладает способностью к продукции L-цистеина. Семейство Enterobacteriaceae включает бактерии, относящиеся к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и так далее. В особенности предпочтительны бактерии, отнесенные к семейству Enterobacteriaceae согласно классификации базы данных NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347).
Фраза «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea, соответственно системе классификации, известной специалисту в области микробиологии. Некоторые виды Enterobacter agglomerans недавно были переклассифицированы в Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или другие аналогичные, на основании нуклеотидного анализа последовательности 16S РНК, и других (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).
Фраза «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии, однако перечень бактерий не ограничен каким-либо образом. Среди примеров бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но не ограничивающихся ими, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli).
Примеры бактерий-продуцентов L-цистеина и родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий-продуцентов L-цистеина, включают, но не ограничиваются ими, штаммы бактерии Escherichia, такие как Е. coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующего серинацетилтрансферазы устойчивые к обратной регуляции (патент США No.6,218,168, патентная заявка России 2003121601), Е. coli W3110, который суперэкспрессирует гены, кодирующие белки, регулирующие секрецию токсичных для клетки веществ (патент США No.5,972,663), штаммы Е. coli со сниженной сульфогидразной активностью (патентная заявка Японии 11155571 А2), Е. coli W3110 с увеличенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (WO 01/27307 А1), и др.
Термин "процесс ассимиляции серы" означает процесс, в котором сера из окружающей среды, например сульфат, превращается в органическую серу для использования в клеточном метаболизме. Двумя основными конечными продуктами этого процесса являются важнейшие аминокислоты - L-цистеин и L-метионин. Ключевым в данном процессе является увеличение уровня доступной органической серы для биосинтеза L-цистеина и L-метионина.
Примеры "одного или нескольких генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы и деградации аденозин-3'-фосфат 5'-фософосульфата (PAPS)" включают гены cysG, cysD, cysN, cysC, cysQ и их комбинации. Гены cysG, cysD, cysN, cysC, cysQ участвуют в ассимиляции серы, а ген cysQ участвует в PAPS-деградации. Примеры "одного или нескольких генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы и PAPS-деградации" включают гены cysD, cysN и cysC или cysQ по-отдельности, комбинацию генов cysD и cysN, комбинацию генов cysD, cysN и cysC, комбинацию генов cysD, cysN и cysQ и комбинацию генов cysD, cysN, cysC и cysQ.
Известна система сульфатной активации у Е. coli. Данная система включает в себя структурные гены, кодирующие ферменты АТФ-сульфорилазу (cysD и cysN) и APS-киназу (cysC). Начальные этапы ассимиляции сульфата в течение биосинтеза цистеина приводят к поглощению сульфата и его активации за счет образования аденозин-5'-фосфосульфата, конверсии в 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат и восстановлению до сульфита. Ген cysQ участвует в этом процессе. Ген cysG из Е. coli кодирует белок CysG, являющийся субъединицей уропорфирин-IIIC-метилтрансферазы/прекоррин-2-дегидрогенезы/сирогидрохлоринферрохелатазы. Ген cysD из Е. coli кодирует белок CysD-компонент сульфатаденилилтрансферазы. Ген cysN из Е. coli кодирует белок CysN-компонент сульфатаденилилтрансферазы. Ген cysC из Е. coli кодирует белок CysC-субъединицу аденилилсульфаткиназы. Ген cysQ из Е. coli кодирует белок CysQ, который предположительно помогает контролировать пул 3'-фосфоаденозин-5'-фофосульфата или его использование в синтезе сульфита. В бактерии Escherihica coli гены cysD, cysN и cysC формируют оперон cysDNC.
Известны и клонированы гены Р. ananatis, гомологичные генам системы утилизации серы Е. coli. Нуклеотидная последовательность гена cysG из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:1. Нуклеотидная последовательность гена cysD из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:2. Нуклеотидная последовательность гена cysN из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:3. Нуклеотидная последовательность гена cysC из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:4. Нуклеотидная последовательность гена cysQ из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:5.
В бактерии Pantoea ananatis гены cysG, cysD, cysN и cysC формируют оперон cysGDNC. Усиление экспрессии cysG не является необходимым. Тем не менее, экспрессия cysG может быть усилена.
В связи с тем, что последовательности ДНК могут различаться среди видов и штаммов рода Pantoea, гены cysG, cysD, cysN, cysC и cysQ не ограничиваются последовательностями, представленными в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, соответственно, и могут включать гены, гомологичные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, соответственно.
+
В связи с этим гены cysG, cysD, cysN, cysC и cysQ могут быть вариантами, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, комплементраными нуклеотидным последовательностям, представленным в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, или пробой, которая может быть приготовлена из какой-либо из этих нуклеотидных последовательностей. «Жесткие условия» представляют собой условия, при которых образуются специфические гибриды, например гибриды, имеющие гомологию не менее 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% в различных случаях, и а неспецифические гибриды, имеющие степень гомологии меньшую, чем указано выше, не образуются. Примером жестких условий могут быть однократная или многократная отмывка или, например, двукратная или трехкратная отмывка в растворе с концентрацией соли 1×SSC 0.1% SDS или 0.1×SSC 0.1% SDS при 60°C. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для гибридизации мембраны и, как правило, рекомендуется производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для N нейлоновой мембраны Hybond™ (Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут. Отмывка может быть выполнена 2-3 раза. Длина пробы может варьировать в зависимости от условий гибридизации, но обычно составляет от 100 п.н. до 1 т.п.н.
Фраза "бактерия была модифицирована таким образом, что экспрессия гена усилена" означает, что уровень экспрессии гена в модифицированной бактерии выше, чем в немодифицированном штамме, например штамме дикого типа. Примерами такой модификации могут служить увеличение числа копий экспрессируемого гена(ов) в пересчете на клетку или повышение уровня экспрессии гена(ов) и другие. Количество копий экспрессируемого гена можно измерить, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК и последующей гибридизацией по Саузерну, с использованием зонда, сконструированного на основе нуклеотидной последовательности гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и подобных методов. Уровень экспрессии генов может быть измерен с помощью различных методов, включая гибридизацию по Нозерну, количественную обратную транскрипцию - ПЦР (RT-PCR) и подобные им. В качестве контроля могут служить штаммы дикого типа, например, Pantoea ananatis PERM BP-6614.
Термин «экспрессия» означает образование белкового продукта, кодируемого геном.
Фраза «последовательность, контролирующая экспрессию» относится к нуклеотидным последовательностям, локализованным перед, внутри или после кодирующего участка, контролирующим транскрипцию и/или экспрессию кодирующего участка во взаимодействии с аппаратом белкового биосинтеза клетки. Данная фраза обычно используется для обозначения промоторов, рибосом-связывающих сайтов (RBS), операторов и/или других элементов генома, участвующих в регуляции уровня экспрессии гена.
lac
trp
trc
R
L
Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто помещением фрагмента ДНК согласно настоящему изобретению под контроль более сильного, чем природный, промотора. Термин "природный промотор" означает существующую в природном организме область ДНК, расположенную перед открытой рамкой считывания (ORF - opened reading frame) гена или кластера генов и способствующую экспрессии этого гена или кластера генов. Сила промотора определяется частотой акта инициации синтеза РНК. Например, промоторы P, P, P и промоторы P или P фага лямбда известны как сильные промоторы. Примеры способов оценки силы промотора и сильных промоторов описаны в работе Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) и др. Усиление экспрессии гена может быть достигнуто помещением сильного терминатора после фрагмента ДНК согласно настоящему изобретению.
Кроме того, вдобавок к вышеупомянутым методам экспрессия гена может быть усилена за счет увеличения числа копий гена, например, с помощью техники рекомбинантных генов (молекул). Например, рекомбинантная ДНК может быть получена с помощью лигирования фрагмента гена, содержащего целевой ген с вектором для функционирования в бактерии-хозяине, таким как многокопийный вектор, и далее введена в бактерию с целью трансформации. Примеры упомянутого вектора включают векторы, которые автономно реплицируются в клетках бактерии-хозяина.
Для того чтобы ввести такую рекомбинантную ДНК в бактерию, могут быть использованы любые известные к настоящему времени методы трансформации. Например, подходящими методами являются обработка реципиентных клеток хлоридом кальция, а также увеличение проницаемости клеток для ДНК, описанные для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), и приготовление компетентных клеток из клеток в фазе роста с последующим введением в них ДНК, описанные для Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). К тому же подходящим способом является приготовление из ДНК-реципиентных клеток протоплатов или сферопластов, которые могут с легкостью поглощать рекомбинантную ДНК, с последующим введением рекомбинантной ДНК в указанные клетки, этот метод применим для Bacillus subtilis, актиномицетов и дрожжей (Chang, S. and Choen, S.N., Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). Кроме того, микроорганизмы могут быть трансформированы методом электропорации (выложенная патентная заявка Японии No.2-207791).
Увеличение числа копий гена может быть также достигнуто путем введения множественных копий указанного гена в геномную ДНК бактерии. Для введения множественных копий гена в геномную ДНК бактерии выполняется гомологичная рекомбинация с использованием последовательности, множественные копии которой присутствуют в геномной ДНК в качестве мишеней. В качестве последовательностей, множественные копии которых представлены в геномной ДНК, могут быть использованы повторяющаяся ДНК, инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Другой целевой ген может быть введен на расстоянии от целевого гена, присутствующего в геноме тандемно, или может быть введен вместо ненужного гена в геноме в нескольких копиях. Перенос такого гена может быть достигнут при помощи температурзависимого или интегративного вектора.
В качестве альтернативы, как описано в выложенной патентной заявке Японии No.2-109985, также возможно включить ген в состав транспозона, перемещение которого приведет к введению множественных копий в геномную ДНК. Перемещение указанного гена в геном может быть подтверждено с помощью гибридизации по Саузерну с использованием части гена в качестве пробы.
Гены, участвующие в биосинтезе L-цистеина, включают в себя различные аллели гена cysE, кодирующего серинацетилтрансферазы, устойчивые к обратной регуляции (патент США No.6,218,168, патентная заявка России 2003121601); гены, кодирующие белки, регулирующие секрецию токсичных для клетки веществ (патент США No.5,972,663), ген cysB, кодирующий позитивный транскрипционный регулятор цистеинового регулона (WO 01/27307 A1). Другой пример продукции L-цистеина - снижение активности цистеиндесульфогидразы (патентная заявка Японии 11155571 А2).
Гены, участвующие в биосинтезе L-метионина, могут включать гены метионинового регулона. Метиониновый регулон может содержать мутантные гены, кодирующие белки со сниженной активностью репрессии биосинтеза аминокислот. Примером таких генов может служить измененный тип гена metJ, кодирующий белок репрессии биосинтеза L-метионина из Е. coli, активность которого при репрессии биосинтеза метионина снижена (патентная заявка Японии JP 2000157267 A2).
Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и другие подобные методы являются обычными методами, хорошо известными для специалиста в указанной области техники. Перечисленные методы описаны в Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
2. Способ согласно настоящему изобретению
Способом согласно настоящему изобретению является способ продукции соединений, выбранных из группы, состоящей из L-цистеина, L-цистина, их производных или предшественников или их смеси, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления указанного соединения в питательной среде и выделения указанного соединения из культуральной жидкости. Примеры производного или предшественника L-цистеина включают S-сульфоцистеин, тиазолидиновое производное, полутиокеталь, соответствующий упомянутому выше тиазолидиновому производному, O-ацетилсерин, N-ацетилсерин и др.
Выращивание бактерии, выделение из культуральной жидкости и очистка указанного соединения могут быть осуществлены традиционными способами ферментации, используемыми для аминокислот, продуцируемых бактерией.
Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что она содержит источники углерода, азота, минеральные соединения и, если необходимо, питательные добавки в количестве, необходимом для роста бактерии. Источники углерода включают в себя различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от способа ассимиляции используемых бактерий, могут быть использованы спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источников азота используются аммиак, различные соли аммония, такие как сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и микробный ферментолизат. В качестве источников серы согласно настоящему изобретению используются сульфат аммония, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца и подобные им. В качестве минеральных соединений используются однозамещенный фосфат калия, хлорид натрия, хлорид кальция, соли магния, соли железа, соли марганца и подобные им. В качестве витаминов используются тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им.
Выращивание проводят предпочтительно в аэробных условиях, таких как взбалтывание и аэрация с перемешиванием, при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 30 до 38°С. Значение рН обычно находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно в пределах от 6.5 до 7.2. рН среды может быть скорректировано аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевого соединения в культуральной жидкости.
После выращивания нерастворимые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из питательной среды методом центрифугирования или фильтрации на мембране, после чего целевое соединение может быть выделено и очищено методами ионного обмена, концентрации или кристаллизации.
L-цистеин, полученный как описано выше, может быть использован для продукции производных L-цистеина. Производные цистеина включают метилцистеин, этилцистеин, карбоцистеин, сульфоцистеин, ацетилцистеин и др.
Кроме того, когда тиазолидиновое производное L-цистеина продуцируется в среде, L-цистеин может продуцироваться за счет отбора указанного тиазолидинового производного из среды с целью нарушения равновесной реакции между указанным тиазолидиновым производными и L-цистеином, что приводит к избыточной продукции L-цистеина. Кроме того, когда S-сульфоцистеин продуцируется в среде, он может превращаться в L-цистеин за счет восстановления с восстанавливающим агентом, таким как дитиотриетол.
Краткое описание рисунков
nlpD
nlp8
На Фигуре 1 изображены последовательности природного промотора P (SEQ ID NO:65) и модифицированного промотора P (SEQ ID NO:66).
На Фигуре 2 изображено конструирование плазмиды рМ12.
На Фигуре 3 изображено конструирование плазмиды pM12-ter(thr).
На Фигуре 4 изображено конструирование интегративной кассеты intJS.
На Фигуре 5 изображено конструирование плазмиды pMIV-5JS.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Конструирование штаммов с усиленной экспрессией генов кластера cysGDNC.
1. Конструирование штамма Р. ananatis EYPSG8
ДНК-фрагмент, несущий промотор гена nlpD бактерии Е. coli, был получен с помощью ПЦР. Хромосомная ДНК штамма Е. coli MG1655 была использована в качестве матрицы, а праймерами служили олигонуклеотиды P1 (SEQ ID No:6) и Р2 (SEQ ID No:7). Штамм MG1655 (АТСС 47076) доступен из Американской Коллекции Типовых Культур (American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 55°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 0,2 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенный фрагмент обрабатывался эндонуклеазами PaeI и SalI. Полученный ДНК-фрагмент лигировался с плазмидой pMIV-5JS (конструирование плазмиды pMIV-5JS описано в Справочном примере 1), предварительно обработанной эндонуклеазами PaeI и SalI. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма Е. coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Полученные плазмиды содержали промотор гена nlpD E.coli и были названы pMIV-Pnlp0.
ДНК-фрагмент, содержащий терминатор гена rrnB бактерии E.coli, был получен с помощью ПЦР. Хромосомная ДНК штамма E.coli MG1655 была использована в качестве матрицы, в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды Р3 (SEQ ID No:8) и Р4 (SEQ ID No:9). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 59°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 0,3 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенный фрагмент обрабатывался эндонуклеазами BamHI и XbaI. Полученный ДНК-фрагмент лигировался с плазмидой pMIV-Pnlp0, предварительно обработанной эндонуклеазами BamHI и XbaI. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма E.coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий ампициллин (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Полученная плазмида содержала терминатор гена rrnB E. coli и была названа pMIV-Pnlp0-ter.
ДНК-фрагмент, содержащий ген yeaS бактерии E. coli, был получен с помощью ПЦР. Хромосомная ДНК штамма E. coli MG1655 была использована в качестве матрицы, а праймерами служили олигонуклеотиды Р5 (SEQ ID No:10) и Р6 (SEQ ID No:11). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 55°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 0,7 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенный фрагмент обрабатывался эндонуклеазами SalI и XbaI. Полученный ДНК-фрагмент лигировался с плазмидой pMIV-Pnlp0-ter, предварительно обработанной эндонуклеазами SalI и XbaI. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма E. coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий ампициллин (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Полученные плазмиды содержали ген yeaS E. coli и были названы pMIV-Pnlp0-yeaS3.
nlpD
nlp8
nlpD
nlpD
Затем была выполнена рандомизация района -10 промотора P и селекция промотора P. 3'-конец промотора P был получен с помощью ПЦР-амплификации. Плазмида pMIV-Pnlp0 использовалась в качестве матрицы, а праймерами служили олигонуклеотиды P1 (SEQ ID No:6) и Р7 (SEQ ID No:12). Праймер Р7 содержит случайные нуклеотиды, указанные в последовательности SEQ ID No:12 обозначением "n" (для А или G, или С, или Т). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 60°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. 5'-конец промотора P был получен с помощью ПЦР-амплификации. Плазмида pMIV-Pnlp0 использовалась в качестве матрицы, а в качестве праймеров использовались олигонуклеотиды Р2 (SEQ ID No:7) и Р8 (SEQ ID No:13). Праймер Р8 содержит случайные нуклеотиды, указанные в последовательности SEQ ID No:13, обозначение "n" (для А или G, или С, или Т). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 60°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Оба амплифицированных ДНК-фрагмента очищались с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенные фрагменты обрабатывались эндонуклеазой BglII с последующим лигированием фрагментов в эквимолярном соотношении. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали в качестве матрицы для следующей реакции ПЦР, в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды P1 (SEQ ID No:6) и Р2 (SEQ ID No:7). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 12 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 60°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С.
nlp8
Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 0,2 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенный фрагмент обрабатывался эндонуклеазами PaeI и SalI. Затем полученный ДНК-фрагмент лигировался с плазмидой pMIV-Pnlp0-yeaS3, предварительно обработанной эндонуклеазами PaeI и SalI. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма E. coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий ампициллин (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Полученные плазмиды содержали промотор P (Фиг.1) и были названы pMIV-Pnlp8-yeaS7.
Затем плазмида pMIV-Pnlp8-yeaS7 обрабатывалась эндонуклеазой HindIII с последующей очисткой и добавлением большого фрагмента ДНК-полимеразы I (фрагмент Кленова). Полученный ДНК-фрагмент очищался и обрабатывался эндонуклеазой NcoI. Далее полученный ДНК-фрагмент очищался и лигировался в эквимолярном соотношении с плазмидой pMW-Pomp-cysE5 (WO 2005007841), предварительно обработанной эндонуклеазами SmaI и NcoI. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма Е. coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий ампициллин (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Полученные плазмиды содержали ген cysE5 и были названы pMIV-EY2. Для подтверждения исправности cysE5 аллеля в полученных трансформантах была измерена ферментативная активность серинацетилтрансферазы.
Следующим этапом была интеграция генов the cysE5 и yeaS в хромосому штамма SC17 Р. ananatis (патент США 6,596,517). Плазмида рМН10 (Зименков Д. и др., Биотехнология, 6, 1-22 (2004)) была использована для трансформации штамма SC17 Р. ananatis методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 30°С до образования различимых индивидуальных колоний и дважды пересевались. Затем с помощью метода электропорации проводилась трансформация бактерий Р. ananatis полученного штамма SC17/pMH10 (этот штамм растет при 30°С) плазмидой pMIV-EY2. Далее трансформанты подвергались тепловому шоку при высокой температуре (42°С, 20 минут) и высевались на LB-агар, содержащий хлорамфеникол (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 39°С до образования различимых индивидуальных колоний. Около 50 клонов пересевались при 39°С, и каждый из них засевался в 1 мл LB-среды и инкубировался 48 часов при 39°С. После инкубации все 50 вариантов тестировались на утрату плазмид рМН10 и pMIV-EY2, и отбирались варианты устойчивые к хлорамфениколу (20 мг/л), но чувствительные к канамицину (20 мг/л) и ампициллину (50 мг/л). Желаемые интегранты были идентифицированы с помощью ПЦР анализа с использованием праймеров Р1 и Р6. Полученные линии штаммов были названы EY01-EY50, все из них были проверены на способность продуцировать цистеин в пробирках для ферментации. Для дальнейших экспериментов был отобран наилучший продуцент - штамм EY19.
Чтобы избавиться от устойчивости штамма Р. ananatis EY19 к хлорамфениколу, этот штамм был трансформирован плазмидой pMT-Int-Xis2 (WO 2005010175) методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар с тетрациклином (10 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 30°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы среди отобранных вариантов, чувствительных к хлорамфениколу (20 мг/л). Такой «вылеченный» штамм был назван EY19 (s).
nlp8
nlp8
r
Следующим этапом была замена у штамма EY19 (s) промоторного района cysPTWA-генов промоторным районом P ПЦР была выполнена с использованием плазмиды pMIV-Pnlp8-yeaS7 в качестве матрицы и праймеров P1 (SEQ ID No:6) и Р2 (SEQ ID No:7). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 20 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 59°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 0,2 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенный ДНК-фрагмент обрабатывался фрагментом Кленова. Полученный ДНК-фрагмент лигировался в эквимолярном соотношении с плазмидой pMW118-(λattL-Km-λattR) (см. Справочный пример 2), предварительно обработанной эндонуклеазой XbaI и фрагментом Кленова. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма Е. coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Плазмиды, содержащие промотор P, были названы pMW-Km-Pnlp8. Затем проводилась ПЦР с использованием плазмиды в качестве матрицы и праймерами (SEQ ID No:14) и P10 (SEQ ID No:15). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 30 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 54°С, 90 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С.Полученный ДНК-фрагмент имел длину около 1,6 т.п.н., очищался с помощью агарозного гель-электрофореза и использовался для трансформации штамма SC17 Р. ananatis методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы с помощью ПЦР с праймерами P11 (SEQ ID No:16) и P12 (SEQ ID No:17). Полученный штамм был назван SC17-Pnlp8-PTWA. Из бактерий штамма SC17-Pnlp8-PTWA выделялась хромосомная ДНК, 10 мкг которой использовалась для трансформации методом электропорации штамма Р. ananatis EY19 (s). Полученные трансформанты высевались LB-агар, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы с помощью ПЦР с праймерами Р11 и Р12. Полученный штамм был назван EYP197. Чтобы избавиться от устойчивости штамма Р. ananatis EY19 к канамицину, этот штамм был трансформирован плазмидой pMT-Int-Xis2 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар с тетрациклином (10 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 30°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы отбором вариантов, чувствительных к канамицину (20 мг/л). Такой «вылеченный» штамм был назван EY197 (s).
Мутация N348A была введена с помощью сайт-специфического мутагенеза. Для этого 3'-конец гена serA (с мутацией), который кодирует фосфоглицератдегидрогеназу, был получен с помощью ПЦР-амплификации хромосомной ДНК штамма SC17 с праймерами Р13 (SEQ ID No:18) и Р14 (SEQ ID No:19), а 5'-конец гена serA был получен ПЦР-амплификацией хромосомной ДНК штамма SC17 с праймерами Р15 (SEQ ID No:20) и Р16 (SEQ ID No:21). Условия для первой ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 60°С, 60 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Условия для второй ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 20 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 60°С, 20 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Оба амплифицированных ДНК-фрагмента очищались с помощью агарозного гель-электрофореза и обрабатывались экзонуклеазой SmaI. Далее полученные ДНК-фрагменты лигировались в эквимолярном соотношении. Смесь для лигирования инкубировалась в течение ночи при 4°С и использовалась в качестве матрицы для последующей ПЦР (с праймерами Р13 и Р15 (SEQ ID No:20)). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 15 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 60°С, 75 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 1,3 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Очищенный фрагмент обрабатывался эндонуклеазами SalI и XbaI. После рестрикции ДНК-фрагмент лигировался в эквимолярном соотношении с плазмидой pMIV-Pnlp8-ter, предварительно обработанной теми же эндонуклеазами. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма Е. coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар с ампициллином (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью секвенирования. Полученные плазмиды, содержащие ген serA с мутацией N348A, были названы pMIV-Pnlp8-serA348.
Следующим этапом была интеграция аллеля serA348 в хромосому штамма Р. ananatis SC17. ДНК плазмиды pMIV-Pnlp8-serA348 была использована для трансформации штамма Р. ananatis SC17/pMH10 (этот штамм растет при 30°С) методом электропорации. Полученные трансформанты подвергались тепловому шоку (20 минут при 42°С) и высевались на LB-агар с хлорамфениколом (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 39°С до образования различимых индивидуальных колоний. Около 50 клонов пересевались при 39°С, и каждый из них засевался в 1 мл LB-среды и инкубировался 48 часов при 39°С. После инкубации все 50 вариантов тестировались на отсутствие плазмид рМН10 и pMIV-Pnlp8-serA348, отбором вариантов, устойчивых к хлорамфениколу (20 мг/л), но чувствительных к канамицину (20 мг/л) и ампициллину (50 мг/л). Желаемые интегранты были идентифицированы с помощью ПЦР анализа с использованием праймеров Р1 и Р15. Во всех полученных вариантах была измерена активность фосфоглицератдегидрогеназы (PGD), и вариант SC17int-serA348 с наибольшей активностью был отобран для последующих экспериментов.
Следующим этапом был перенос интегрированной копии serA348 в штамм EYP197 (s).
Из штамма SC17int-serA348 была выделена хромосомная ДНК, 10 мкг которой были использованы для трансформации штамма Р. ananatis EYP197(s) методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар с хлорамфениколом (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы ПЦР-анализом с праймерами Р1 и Р15. Полученные штаммы были названы EYPS1976.
Следующей стадией было введение делеции gcd в штамм EYPS1976. Чтобы избавиться от устойчивости штамма Р. ananatis EYPS1976 к хлорамфениколу, штамм EYPS1976 был трансформирован плазмидой pMT-Int-Xis2 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар с тетрациклином (10 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 30°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы отбором вариантов, чувствительных к хлорамфениколу (20 мг/л). Такой излеченный штамм был назван EY1976(s).
R
+
araB
Штамм Р. ananatis SC17(0), в котором ген gcd делегирован, был сконструирован с помощью метода, впервые разработанного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12), 6640-6645) и называемого "Red-зависимая интеграция". ДНК-фрагмент, содержащий кассету устойчивости к канамицину Km был получен методом ПЦР с использованием праймеров Р17 (SEQ ID No:28) и P18 (SEQ ID NO:29) и плазмиды pMW118-attL-Km-attR-ter_rrnB (Дополнительный пример 2) в качестве матрицы. Полученный ПЦР-фрагмент очищался с помощью агарозного гель-электрофореза и использовался для электропорации в штамм Р. ananatis SC17 (0), содержащий плазмиду pKD46 с температурзависимой репликацией. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) несет ДНК-фрагмент фага λ размером 2154 нуклеотида (хромосомная позиция: 31088-33241, инвентарный номер в GenBank: J02459) и содержит гены Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага (гены γ, β и ехо-гены), находящиеся под контролем индуцируемого арабинозой промотора P. Плазмида pKD46 необходима для интеграции ПЦР-продукта в хромосому штамма SC17(0). Мутанты с делегированным геном gcd и маркированные геном Km-устойчивости были проверены с помощью ПЦР с локус-специфическими праймерами Р37 (SEQ ID No:54) и Р38 (SEQ ID No:28). ПЦР-продукт, полученный в реакции с клетками родительского штамма SC17(0) gcdв качестве матрицы, имел длину 2560 п.н. ПЦР-продукт, полученный в реакции с клетками мутантного штамма в качестве матрицы, имел длину 1541 п.н. Мутантный штамм был назван SC17(0) Δgcd::Km.
Из штамма SC17Δgcd::Km была выделена хромосомная ДНК, 10 мкг выделенной ДНК использовались для трансформации штамма Р. ananatis EYPS1976(s) методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар с канамицином (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы ПЦР-анализом с праймерами Р17 (SEQ ID No:28) и P18 (SEQ ID No:29). Полученный штамм был назван EYPSG8.
Чтобы избавиться от устойчивости штамма Р. ananatis EYPSG8 к канамицину, штамм EYPSG8 был трансформирован плазмидой pMT-Int-Xis2 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар с тетрациклином (10 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 30°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы отбором вариантов, чувствительных к канамицину (20 мг/л). Такой излеченный штамм был назван EYPSG8(s).
2. Конструирование штамма EYPSG-Pnlp8-cysGDNC
nlp8
nlp8
Промоторный район генов cysGDNC штамма EYPSG8(s) был замещен промотором P. ПЦР проводилась с использованием ДНК плазмиды pMW-Km-Pnlp8 в качестве матрицы и праймеров Р19 (SEQ ID No:24) и Р20 (SEQ ID No:25). Условия для ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 30 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 54°С, 90 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Полученный ДНК-фрагмент имел длину около 1,6 т.п.н. и очищался с помощью агарозного гель-электрофореза. Очищенный фрагмент использовался для трансформации штамма A ananatis SC17 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы с помощью ПЦР с праймерами Р21 (SEQ ID No:26) и Р22 (SEQ ID No:27). Полученный штамм назван SC17-Pnlp8-cysGDNC. Для того чтобы перенести cysGDNC под контроль промотора P в штамме EYPSG8(s), была выделена хромосомная ДНК штамма SC17-Pnlp8-cysGDNC, 10 мкг которой использовались для трансформации Р. ananatis EYPSG8(s) методом электропорации. Полученные трансформанты высевались LB-агар, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы с помощью ПЦР с праймерами Р21 и Р22, полученный штамм был назван EYPSG-Pnlp8-cysGDNC.
Чтобы избавиться от устойчивости штамма Р. ananatis EYPSG-Pnlp8-cysGDNC к канамицину, штамм EYPSG-Pnlp8-cysGDNC был трансформирован плазмидой pMT-Int-Xis2 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-arap с тетрациклином (10 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 30°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы отбором вариантов, чувствительных к канамицину (20 мг/л). Такой излеченный штамм был назван EYPSG-Pnlp8-cysGDNC(s).
Пример 2. Конструирование штамма с усиленной экспрессией генов cysGDNC-кластера и гена cysQ
cysK
Во-первых, промоторный район гена cysQ у штамма EYPSG-Pnlp8-cysGDNC(s) был замещен промоторным районом P. ПЦР проводилась с использованием ДНК плазмиды pMW-Km-PcysK в качестве матрицы и праймеров Р10 (SEQ ID No:15) и Р24 (SEQ ID No:29). Плазмида pMW-Km-PcysK была получена за счет вставки ДНК-фрагмента, содержащего промоторный район гена cysK из Р. ananatis, полученный методом ПЦР с использованием хромосомной ДНК штамма SC17 в качестве матрицы и праймеров (SEQ ID No:30) и Р26 (SEQ ID No:31), в плазмиду pMW118-attK-Km-attR-ter_rrnB, предварительно лигированную и последовательно обработанную рестриктазой XbaI и фрагментом Кленова. Условия для ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 30 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 54°С, 90 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 1,6 т.п.н. и очищался с помощью агарозного гель-электрофореза. Очищенный фрагмент использовался для трансформации штамма SC17 Р. ananatis методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-arap, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы с помощью ПЦР с праймерами Р25 и Р26. Полученный штамм был назван SC17-PcysK-cysQ.
cysK
Далее ген cysQ под контролем промотора P был перенесен в штамм EYPSG-Pnlp8-cysGDNC(s). 10 мкг хромосомной ДНК, выделенной из штамма SC17-PcysK-cysQ, использовалось для трансформации Р. ananatis EYPSG-Pnlp8-cysGDNC(s) методом электропорации. Полученные трансформанты высевались LB-arap, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы с помощью ПЦР с праймерами Р21 и Р22, полученный штамм был назван EYPSG-Pnlp8-cysGDNC-PcysK-cysQ.
Пример 3. Конструирование штамма с усиленной экспрессией гена cysQ
cysK
Ген cysQ под контролем промотора P был перенесен в штамм EYPSG8(s). Из штамма SC17-PcysK-cysQ выделялась хромосомная ДНК. 10 мкг выделенной ДНК использовалось для трансформации методом электропорации Р. ananatis EYPSG8(s). Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий канамицин (20 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 34°С до образования различимых индивидуальных колоний. Желаемые трансформанты были идентифицированы с помощью ПЦР-анализа с праймерами Р25 и Р26. Полученный штамм был назван EYPSG-PcysK-cysQ.
Пример 4. Продукция L-цистеина штаммами Р. ananatis
Для проверки эффекта усиления экспрессии генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы при производстве L-цистеина, сравнивалась продуктивность штаммов Р. ananatis EYPSG8, EYPSG8-Pnlp-cysGDNC, EYPSG8-Pnlp-cysGDNC-PcysK-cysQ и EYPSG8-PcysK-cysQ.
2
Штаммы Р. ananatis EYPSG8, EYPSG8-Pnlp-cysGDNC, EYPSG8-Pnlp-cysGDNC-PcysK-cysQ и EYPSG8-PcysK-cysQ выращивались на чашках с L-агаром в течение 17 часов при 34°С. Затем клетки, собранные примерно с 30 смповерхности чашки, инкубировались в колбе объемом 500 мл с L-средой (50 мл) и выращивались с аэрацией в течение 5 часов при 32°С. После этого культуры переносились в 450 мл ферментационной среды в Jar-ферментеры (Marubishi).
2
4
2
2
560
560
После культивирования количество накопленного в среде L-цистеина определяли с помощью метода, описанного Gaitonde M.K. (Biochem J.; 104(2):627-33 (1967)), с изменениями: 150 мкл образца смешивали со 150 мкл 1М HSO, инкубировали 5 минут при 20°С, затем к смеси добавляли 700 мкл НО, 150 мкл полученной смеси переносили в новую пробирку и добавляли 800 мкл раствора А (1М Tris pH8.0, 5 мкМ DTT). Полученную смесь инкубировали 5 минут при 20°С, центрифугировали 10 минут при 13000 об/мин и затем 100 мкл смеси переносили в пробирки 20×200 мм. Затем добавляли 400 мкл HO, 500 мкл ледяной уксусной кислоты и 500 мкл раствора В (0,63 г нингидрина; 10 мл ледяной уксусной кислоты; 10 мл 36% HCl), смесь инкубировали 10 минут на кипящей водяной бане. Затем добавляли 4,5 мл этанола и измеряли оптическую плотность OD. Концентрация цистеина рассчитывалась по формуле С(цис г/л)=11.3*OD. Результаты трех независимых jar-ферментаций представлены в Таблице 1. Как видно из Таблицы 1, штаммы EYPSG8-Pnlp8-cysGDNC, EYPSG8-Pnlp8-cysQ и EYPSG8-Pnlp8-cysGDNC-PcysK-cysQ имели большее количество накопленного в среде L-цистеина по сравнению со штаммом EYPSG8. Состав среды для ферментации (г/л):
Концентрация
Единица
(А) Глюкоза
50
г/л
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0,3
г/л
(В)Триптон Difco
2
г/л
Дрожжевой экстракт Difco
1
г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
15
г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,5
г/л
NaCl
0,5
г/л
L-гистидин HCl
0-0,1
г/л
L-метионин
0-0,35
г/л
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
2
мг/л
CaCl<sub>2</sub>
15
мг/л
Цитрат натрия 5Н<sub>2</sub>О
1
г/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> H<sub>2</sub>O
0,15
мг/л
CoCl<sub>2</sub> 6H<sub>2</sub>O
0,7
мг/л
MnCl<sub>2</sub> 4H<sub>2</sub>O
1,6
мг/л
ZnSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0,3
мг/л
GD 113
0,03
мг/л
(С) Пиридоксин (натриевая соль)
2
мг/л
Пример 5. Продукция L-цистеина штаммами Е. coli
Чтобы оценить влияние усиления экспрессии гена cysQ из Е. coli на продукцию L-цистеина, был сконструирован штамм Е. coli MT/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ. Для этого штамм Е. coli MT/pACYC-DES (Европейский патент ЕР 1528108 В1) трансформировали плазмидой pMIV-PompC-cysQ. Плазмида pMIV-PompC-cysQ была сконструирована с помощью способа, приведенного ниже.
Во-первых, промоторный район гена ompC Е. coli был амплифицирован из хромосомной ДНК штамма Е. coli MG1655 методом ПЦР с использованием праймеров PrOMPCF (SEQ ID No:55) и PrOMPCR (SEQ ID No:56). Фрагмент 0,3 т.п.н. был выделен, обработан рестриктазами with PaeI и SalI и лигирован с плазмидой pMIV-5JS, предварительно обработанной теми же рестриктазами.
Далее ген cysQ из хромосомы штамма MG1655 был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием праймеров mz017 (SEQ ID No:57) и mz018 (SEQ ID No:58). ПЦР-фрагмент размером 0,76 т.п.н. был выделен, обработан рестриктазами SalI и XbaI и клонирован по SalI/XbaI-сайтам ранее полученной плазмиды. Полученная в результате плазмида была названа pMIV-PompC-cysQ.
Штамм МТ был получен из штамма MG1655 следующим образом. Сначала была индуцирована мутация в гене metC с помощью обработки N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (NTG) с последующей многократной процедурой ампициллинового обогащения. Отбирали мутанты, способные расти на цистатионине, но не на гомосерине. Штаммы, лишенные metC, также могут быть получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК согласно процедуре, описанной в патенте США No.6,946,268.
-
ompA
Далее разрушенный ген tnaA из штамма CGSC7152 (tnaA300::Tn10(TcR), E.coli Genetic Stock Center, USA) переносили в полученный metC-штамм с помощью стандартной процедуры P1-трансдукции (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Плазмида pACYC-DES была сконструирована путем инсерции гена ydeD, мутантного гена cysE и мутантного гена serA5 в вектор pACYC184 под контролем P промотора. Ген ydeD, кодирующий мембранный белок, который не участвует в процессе биосинтеза ни одной из аминоскислот, может усиливать продукцию L-цистеина, когда в клетки соответствующего штамма-продуцента введены дополнительные копии указанного гена (патент США 5,972,663). Ген serA5 кодирует устойчивую к регуляции по типу обратной связи фосфоглицератдегидрогеназу (патент США 6,180,373).
4
2
4
2
4
4
3
Штаммы MT/pACYC-DES и MT/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ выращивались в течение ночи при 34°С в 2 мл питательного бульона, содержащего 100 мг/л ампициллина и 25 мг/л стрептомицина. 0.2 мл полученной культуры засевали в 2 мл среды для ферментации, содержащей тетрациклин (20 мг/л) и ампициллин (100 мг/л), в пробирки 20×200 мм и выращивали при 34°С в течение 42 часов на качалке при 250 об/мин. Использовался следующий состав ферментационной среды: 15.0 г/л (NH)SO, 1.5 г/л KHPO, 1.0 г/л MgSO, 20.0 г/л СаСО, 0.1 мг/л тиамина, 1% LB-среды, 4% глюкозы, 300 мг/л L-метионина.
После культивирования количество накопленного в среде L-цистеина определяли с помощью метода, описанного Gaitonde M.K. (Biochem J.; 104(2):627-33(1967)). Полученные результаты представлены в Таблице 2. Как видно из Таблицы 2, штамм MT/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ имел большее количество накопленного в среде L-цистеина по сравнению со штаммом MT/pACYC-DES.
Для того чтобы оценить эффект усиления экспрессии оперона cysDNC, оперона cysDN или гена cysC, и эффект совместного усиления экспрессии оперона cysDNC и гена cysQ из Е. coli на продукцию L-цистеина, были сконструированы штаммы Е. coli MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES и MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ.
cysK
cysK
Сначала с помощью ПЦР амплифицировали промоторный район гена cysK из Е. coli с хромосомной ДНК штамма Е. coli MG1655 и праймерами N1 (SEQ ID No:59) и N2 (SEQ ID No:60). Полученный фрагмент с P выделяли, обрабатывали рестриктазами PaeI и SalI и лигировали в плазмиду pMIV-5JS, предварительно обработанную теми же рестриктазами. Полученная плазмида была названа pMIV-P.
cysK
cysK
Затем с помощью ПЦР с ДНК штамма MG1655 в качестве матрицы и праймерами (SEQ ID No:61) и N4 (SEQ ID No:62) клонировали оперон cysDNC. Полученный ПЦР-фрагмент с опероном cysDNC выделяли, обрабатывали рестриктазами SalI и XbaI и лигировали в плазмиду pMIV-P, предварительно обработанную теми же рестриктазами. Полученная плазмида была названа pMIV-P-cysDNC.
cysK
cysK
Далее с помощью ПЦР с ДНК штамма MG1655 в качестве матрицы и праймерами N3 (SEQ ID No:61) и N5 (SEQ ID No:63) клонировали оперон cysDN. Полученный ПЦР-фрагмент с опероном cysDN выделяли, обрабатывали рестриктазами SalI и XbaI и лигировали в плазмиду pMIV-P предварительно обработанную теми же рестриктазами. Полученная плазмида была названа pMIV-P-cysDN.
cysK
cysK
Также, с помощью ПЦР с ДНК штамма MG1655 в качестве матрицы и праймерами N6 (SEQ ID NO:64) и N4 (SEQ ID NO:62) клонировали ген cysC. Полученный ПЦР-фрагмент с опероном cysDNC выделяли, обрабатывали рестриктазами SalI and XbaI и лигировали в плазмиду pMIV-P, предварительно обработанную теми же рестриктазами. Полученная плазмида была названа pMIV-P-cysC.
cysK
cysK
cysK
Плазмиды pMIV-P cysDNC, pMIV-P cysDN и pMIV-P cysC использовали для трансформации MT/pACYC-DES методом электропорации с целью получения штаммов MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysDNC, MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysDN и MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysC, соответственно.
cysK
cysK
cysK
cysK
cysK
cysK
cysK
cysK
cysK
cysK
Следующим этапом была интеграция фрагмента P-cysDNC в хромосому штамма Е. coli MT. С этой целью оперон cysDNC под контролем промотора P интегрировали с помощью мини-µu интеграции (с помощью µu-транспозазы, содержащейся в плазмиде рМН10) плазмиду pMIV-P-cysDNC в хромосому штамма MG1655. Полученная конструкция (intP-cysDNC) была перенесена из штамма MG1655-int-P-cysDNC в штамм МТ с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма Е. coli MT-int-P-cysDNC. Плазмиду pACYC-DES использовали для трансформации штамма MT-int-P-cysDNC методом электропорации с целью получения штамма Е. coli MT-int-P-cysDNC/pACYC-DES, и обе плазмиды pACYC-DES и pMIV-PompC-cysQ были использованы для трансформации штамма MT-int-P-cysDNC методом электропорации с целью получения штамма MT-int-P-cysDNC/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ.
4
2
4
2
4
4
3
Штаммы MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES и MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ, содержащие интегрированный в хромосому оперон cysDNC, и штаммы MT/pACYC-DES/C, MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysDN и MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysC, содержащие опероны cysDNC, cysDN и ген cysC в плазмиде pMIV, выращивали по-отдельности при 34°С в 2 мл питательной среды с добавлением 100 мг/л ампициллина и 20 мкг/мл тетрациклина. 0.2 мл полученных культур переносили в 2 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (20 мкг/мл) и ампициллин (100 мг/мл) в 20×200 мм пробирки, и выращивали при 34°С в течение 42 часов с центрифугированием при 250 об/мин. Состав ферментационной среды был следующим: 15.0 г/л (NH)SO, 1.5 г/л KНРО, 1.0 г/л MgSO, 20.0 г/л СаСО, 0.1 мг/л тиамина, 1% LB, 4% глюкозы, 300 мг/л L-метионина.
cysK
ompC
После культивирования количество накопленного в среде L-цистеина было определено с помощью метода, описанного Gaitonde, M.K. (Biochem. J., 104:2, 627-33 (1967)). Полученные результаты представлены в Таблице 2. Как видно из Таблицы 2, штамм MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES имел слабый позитивный эффект на продукцию L-цистеина по сравнению с контрольным штаммом MT/pACYC-DES, штамм MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ демонстрировал значительное увеличение продукции L-цистеина по сравнению с MT/pACYC-DES. Также, штамм MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysC DES имел слабый позитивный эффект на продукцию L-цистеина, штаммы MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysDNC и MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysDN демонстрировали значительное увеличение уровня накопления L-цистеина по сравнению с MT/pACYC-DES. Наибольшее количество накопленного L-цистеина наблюдалось при комбинировании оперона cysDNC под контролем P промотора и гена cysQ под контролем P промотора в штамме MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ.
Пример 6. Продукция L-метионина штаммами Е. coli
ompC
cysK
cysK
cysK
ый
Для того чтобы оценить эффект усиления экспрессии оперона cysDNC, оперона cysDN, гена cysC и гена cysQ из Е. coli или их комбинации на продукцию L-метионина, штамм Е. coli 73 (ВКПМ В-8126), содержащий указанные опероны или гены в различных комбинациях в хромосоме и/или клонированные в плазмидах pMIV-P-cysQ, pMIV-P-cysDNC, pMIV-P-cysDN, pMIV-P-cysC, может быть сконструирован как описано в Примере 5. Штамм Е. coli 73 (VKPM В-8126) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1 Дорожный проезд, 1) 14 мая 2001 с инвентарным номером ВКПМ В-8126, затем 1 февраля 2002 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
4
2
4
2
4
4
Штамм Е. coli 73 и полученные штаммы могут быть по отдельности выращены в 2 мл минимальной среды ((NH)SO - 18 г/л, KHPO - 1.8 г/л, MgSO - 1.2 г/л, тиамин - 0.1 мг/л, дрожжевой экстракт - 10 г/л, глюкоза - 60 г/л, треонин - 400 мг/л, ампициллин - 100 мг/л, если необходимо) в 20-мл пробирках и инкубироваться в течение ночи с аэрацией при 32°С, 0.2 мл каждой ночной культуры могут быть перенесены в 20-мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с добавлением или без IPTG и выращены при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.
Состав ферментационной среды:
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
18.0 г/л,
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
1.8 г/л,
MgSO<sub>4</sub>
1.2 г/л,
СаСО<sub>3</sub>
20.0 г/л,
Тиамин
0.1 мг/л,
Глюкоза
60.0 г/л,
Треонин
400 мг/л,
Дрожжевой экстракт
1.0 г/л,
Ампициллин
100 мг/л, если необходимо.
4
2
После выращивания плазмидная стабильность и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм могут быть определены традиционными методами. Количество накопленного в культуральной жидкости метионина может быть определено методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав жидкой фазы для ТСХ может быть следующим: изопропанол - 80 мл, этилацетат - 80 мл, NHOH (30%) - 15 мл, HO - 45 мл.
Справочный пример 1. Конструирование плазмиды pMIV5JS
Плазмида PMIV-5JS была сконструирована согласно нижеприведенной схеме. Во-первых, плазмида рМ12 была сконструирована с помощью интеграции in vivo Ми-зависимой интеграционной кассеты в плазмиду pMW1, полученную из pMW119 (Фиг.2). Были синтезированы две терминаторные олигонуклеотидные последовательности, комплементарные друг другу (SEQ ID No:32 и SEQ ID No:33). Терминатор thrL был получен с помощью отжига этих синтетических олигонуклеотидов в прямом (SEQ ID No:32) и обратном направлении (SEQ ID No:33). Терминатор thrL был фланкирован сайтами HindIII и PstI. Затем с помощью инсерции синтетической терминаторной последовательности Ter(thr)в рМ12 предварительно обработанную рестриктазами HindIII и Mph 1103I, была сконструирована плазмида pM12-ter(thr) (Фиг.3).
Конструирование интегративной кассеты intJS (Фиг.4):
a) фрагмент LattL длиной 0.12 т.п.н. был получен за счет ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера (SEQ ID No:34) (сайт узнавания рестриктазы BglII выделен), и фосфорилированного обратного праймера (SEQ ID No:35). В качестве матрицы была использована плазмида pMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB (WO 2005/010175);
R
b) Cm-фрагмент длиной 1.03 т.п.н. был получен за счет ПЦР-амплификации с использованием фосфорилированного прямого праймера (SEQ ID No:36) и обратного праймера (SEQ ID No:37) (сайт узнавания рестриктазы PstI выделен). В качестве матрицы была использована плазмида pACYC184;
c) LattR-фрагмент длиной 0.16 т.п.н. был получен за счет ПЦР-амплификации с использованием прямого праймера (SEQ ID No:38) (сайт узнавания рестриктазы PstI выделен) и фосфорилированного обратного праймера (SEQ ID No:39) (сайт узнавания рестриктазы SacI выделен). В качестве матрицы была использована плазмида pMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB;
R
d) фрагменты LattL и Cm были лигированы и полученный фрагмент длиной 1.15 т.п.н. был очищен;
R
R
e) фрагменты LattL-Cm и LattR были обработаны рестриктазой PstI, лигированы, полученный фрагмент LattL-Cm-LattR длиной 1.31 т.п.н. был очищен;
f) двуцепочечный фрагмент ДНК длиной 70 п.н., содержащий множественный сайт клонирования (MCS), был получен путем ренатурации двух синтезированных олигонуклеотидов: олигонуклеотида, последовательность которого указана в SEQ ID No:40, и олигонуклеотида, имеющего комплементарную SEQ ID No:40 последовательность;
R
R
g) фрагменты LattL-Cm-LattR и MCS были обработаны рестриктазой Sacl, лигированы, и полученная кассета LattL-Cm-LattR-MCS, длиной 1.38 т.п.н. была очищена;
R
На последнем этапе фрагмент LattL-Cm-LattR-MCS был обработан рестриктазами BglII и HindIII и клонирован в плазмиду pM12-ter(thr), предварительно обработанную BamHI и HindIII, для получения плазмиды pMIV-5JS (Фиг.5).
r
Справочный пример 2. Конструирование плазмиды pMW118-(λattL-Km-λattR).
r
Плазмида pMW118-(λattL-Km-λattR) была сконструирована на основе плазмиды pMW118-attL-Tc-attR (WO 2005/010175) с замещением маркера устойчивости к тетрациклину на ген устойчивости к канамицину, взятый из плазмиды pUC4K (Vieira, J. and Messing, J., Gene, 19(3): 259-68 (1982)).
С этой целью большой фрагмент EcoRI - HindIII плазмиды pMW118-attL-Tc-attR был лигирован с двумя фрагментами плазмиды pUC4K: HindIII - PstI фрагментом (676 п.н.) и EcoRI - HindIII фрагментом (585 п.н.).
Базовый фрагмент pMW118-attL-Tc-attR был получен лигированием следующих четырех ДНК-фрагментов:
1) фрагмент BglII-EcoRI (114 п.н.), несущий сайт attL (SEQ ID No:41), был получен с помощью ПЦР-амплификации соответствующего района хромосомы (содержащего профаг λ) Е. coli W3350 с использованием праймеров Р27 и Р28 (SEQ ID NoS:42 и 43) (эти праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для эндонуклеаз BglII и EcoRI);
2) фрагмент PstI-HindIII (182 п.н.), несущий сайт attR (SEQ ID No:44) был получен с помощью ПЦР-амплификации соответствующего района хромосомы (содержащего профаг λ) Е. coli W3350 с использованием праймеров Р29 и Р30 (SEQ ID NoS:45 и 46) (эти праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для эндонуклеаз PstI и HindIII);
3) большой фрагмент BglII-HindIII (3916 п.н.) плазмиды pMW118-ter_rrnB. Плазмида pMW118-ter_rrnB была получена лигированием следующих трех фрагментов:
1) большой ДНК-фрагмент (2359 п.н.), несущий фрагмент AatII-EcoRI плазмиды pMW118, был получен следующим образом: pMW118 была обработана рестриктазой EcoRI, обработана фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и затем рестриктазой AatII;
R
2) малый фрагмент AatII-BglII (1194 п.н.) вектора pUC 19, несущий ген устойчивости к ампициллину bla (Ap), был получен с помощью ПЦР-амплификации соответствующего района вектора pUC 19 с использованием праймеров Р31 и Р32 (SEQ ID NoS:47 и 48) (эти праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для эндонуклеаз AatII и BglII);
3) малый фрагмент BglII-PstI (363 п.н.) транскрипционного терминатора ter_rrnB был получен с помощью ПЦР-амплификации соответствующего района хромосомы Е. coli MG1655 с использованием праймеров Р33 и Р34 (SEQ ID NoS:49 и 50) (эти праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для эндонуклеаз BglII и PstI);
4) малый фрагмент EcoRI-PstI (1388 п.н.) (SEQ ID No:51) плазмиды pML-Tc-ter_thrL, несущий ген устойчивости к тетрациклину и терминатор транскрипции ter_thrL; плазмида pML-Tc-ter_thrL была получена в два этапа:
- плазмида pML-ter_thrL была получена за счет обработки плазмиды pML-MCS (Машко С. В. и др., Биотехнология, 2001, no. 5, 3-20) рестриктазами XbaI и BamHI, последующим лигированием большого фрагмента (3342 п.н.) с фрагментом XbaI-BamHI (68 п.н.), несущим терминатор ter_thrL, полученным ПЦР-амплификацией соответствующего района хромосомы Е. coli MG1655 с использованием олигонуклеотидов Р35 и Р36 (SEQ ID NoS:52 и 53) в качестве праймеров (эти праймеры содержали дополнительные сайты узнавания для эндонуклеаз XbaI и BamHI);
- плазмида pML-Tc-ter_thrL была получена за счет обработки плазмиды pML-ter_thrL рестриктазами KpnI и XbaI, фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и лигированием с малым фрагментом EcoRI-Van91I (1317 п.н.) вектора pBR322, несущего ген устойчивости к тетрациклину (pBR322 был обработан рестриктазами EcoRI и Van91I, a затем фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I).
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть внесены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
Таблица 1
Штаммы
Концентрация L-цистеина, г/л
EYPSG8-Pnlp8
0.85±0.07
EYPSG8-Pnlp8-cysGDNC
1.37±0.09
EYPSG8-PcysK-cysQ
1.06±0.08
EYPSG8-Pnlp8-cysGDNC-PcysK-cysQ
1.69±0.11
Таблица 2
Штаммы
Концентрация L-цистеина, г/л
MT/pACYC-DES
1.05±0.13
MT/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ
1.46±0.20
MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES
1.13±0.14
MT-intPcysK-cysDNC/pACYC-DES/pMIV-PompC-cysQ
1.70±0.11
MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysDNC
1.67±0.12
MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysDN
1.51±0.11
MT/pACYC-DES/pMIV-PcysK-cysC
1.10±0.10