Штамм бактерий Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 ВКМ B-3472D для денитрификации с образованием нитрита
BACTERIAL STRAIN VIRGIBACILLUS HALODENITRIFICANS CHEL 4-5 VKM B-3472D FOR DENITRIFICATION WITH NITRITE FORMATION

Изобретение относится к нефтедобывающей промышленности, и может быть использовано в технологиях подавления процесса сульфатредукции в пласте и повышения нефтеизвлечения с использованием бактериальных штаммов.
При интенсивной добыче нефти с целью поддержания пластового давления в продуктивный пласт закачивается вода в объеме, сравнимом с объемом полученной нефти. После сепарации нефти вода вновь закачивается в продуктивный пласт. При этом с течением времени доля воды в извлекаемой жидкости увеличивается и, как правило, растет ее соленость. Постоянная закачка воды приводит к попаданию в пласт микроорганизмов и различных соединений. Наличие в пластовой воде сульфатов приводит к развитию бактериального процесса сульфатредукции, в результате которого в добываемой продукции появляется сероводород, снижающий качество нефти и вызывающий коррозию нефтедобывающего оборудования. Борьба с бактериальной сульфатредукцией и удаление сероводорода из нефти требует больших затрат и удорожает конечную стоимость нефтепродуктов.
Одним из способов борьбы с развитием бактериальной сульфатредукции является использование бактериального процесса денитрификации непосредственно в нефтеносном пласте (Telang et al., 1997). В основу этого подхода положен факт, что при наличии органического субстрата (например, ацетата), процесс денитрификации термодинамически более выгоден по сравнению с процессом сульфатредукции. Пример таких расчетов можно найти в статье (Dolfing, Hubert, 2017). Экспериментально показано, что при наличии денитрифицирующих бактерий и нитратов в культуральной среде бактериальная сульфатредукция не развивается (Xu et al., 2014). Помимо конкурентного преимущества денитрифицирующих бактерий в использовании субстратов, подавление образования сульфида обусловлено еще двумя механизмами: (1) нитрит-ион, образуемый в процессе восстановления нитрата, химически связывает сульфид, который выделяют пластовые сульфидогены; (2) нитрит подавляет восстановление сульфита посредством ингибирования альфа-субъединицы сульфитредуктазы Dsr за счет высокого сродства к этому ферменту (Grigoryan et al., 2008; Bødtker et al., 2009).
С целью подавления сульфатредукции в закачиваемую в пласт воду добавляют нитраты в сравнительно низких концентрациях (Agrawal et al., 2012). Однако при этом переключение пластовой микрофлоры на режим денитрификациии идет медленно, что делает такой подход малоэффективным. Большее распространение получили технологии, при которых в пласт, одновременно с нитратами и дополнительным органическим субстратом (как правило, ацетатом) закачиваются денитрифицирующие бактерии. При этом предполагается, что помимо подавления сульфатредукции активизация анаэробной микрофлоры будет способствовать повышению нефтеизвлечения. Например, в патенте США № 8,753,865 для этих целей предлагается использовать денитрифицирующий бактериальный консорциум на основе штаммов родов Thauera и Azoarcus. В патенте США № 8,528,634 для тех же целей предлагается использование обогащённого микробного анаэробного консорциума. В патентах Канады № 2717852 и 2816202 предлагается в этих целях использование штамма Pseudomonas stutzeri, в том числе, и на месторождениях тяжелой нефти.
Основным недостатком всех этих патентов является то, что в них предполагается использование микроорганизмов или их консорциумов, характеризирующихся низкой степенью галотолерантности. Однако на многих нефтяных месторождениях пластовые воды характеризуются высокой минерализацией – более 100 г/л и интродукция в них микроорганизмов с низкой степенью галотолерантности не даст нужного эффекта.
Штамм Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 обладает свойствами, позволяющими его использование в микробных технологиях подавления сульфатредукции и повышения нефтеизвлечения на месторождениях с пластовыми водами высокой минерализации.
Штамм Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 был выделен из донных отложений ручья Чернушка, впадающего в озеро Эльтон. Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ B-3472D).
Характерные признаки штамма Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 Культурально-морфологические:
На модифицированной плотной среде LB, содержащей (г/л): триптон – 10.0, NaCl – 50.0, дрожжевой экстракт – 5.0, агар-агар – 20.0, культура имеет форму палочек размером 0.6–0.9 × 2.5–4.,5 мкм, часто изогнутых, с закругленными концами, одиночных или в цепочках. Спорообразование терминальное. Споры овальные. Колонии гладкие, полупрозрачные, кремового цвета, около 3–5 мм в диаметре; со временем наблюдается потемнение и увеличение размера колоний.
Физиолого-биохимические:
Грамвариабельная, подвижная, спорообразующая бактерия. Факультативный анаэроб, способный к анаэробному росту в присутствии нитрата или нитрита. Денитрифицирует до нитрита и закиси азота. N2 не образует. Галофил. Диапазон солености для роста составляет от 0,5 до 5 М NaCl с оптимумом в интервале от 1.0 до 3.25 М NaCl. В анаэробных условиях растет на жидких средах, содержащих до 1.5 М NaNO3 и до 0.25 М NaNO2.
Диапазон температуры для роста от 10 до 45°C, с оптимумом 37–38°C. Рост наблюдается при диапазоне рН от 6.0 до 9.5, оптимум pH 7,4. Использует аммиак и глутамин в качестве источников азота, но не нитрат, нитрит, аргинин или мочевину. Использует фруктозу, маннозу, галактозу, глюконат, глюкозу, мальтозу, сахарозу, фумарат, лактат, L-малат, пируват, сукцинат, глицерин, маннит, аланин, аспарагин, аспартат, глутамин, глутамат, серин, треонин и триптофан в качестве источника углерода и энергии. Плохо растет на лактозе, ацетате, гистидине, изолейцине, лейцине, пролине и валине, на н-алканах с длиной углеродной цепи С9÷С13. Не использует ксилозу, D - и L-арабинозу, бутират, цитрат, формиат, пропионат, этанол, метанол, сорбит, аргинин, цистеин, глицин, лизин, метионин и фенилаланин. Производит кислоту (слабо) без газообразования на глюкозе. Каталаза и цитохром оксидаза положительная. Гидролизует желатин и казеин, но не крахмал, эскулин или твин 80. Р-галактозидаза - положительна. Тесты на наличие ферментов уреазы, дезоксирибонуклеазы, лизинкарбоксилазы, орнитин декарбоксилазы, аргининд-дигидролазы, фенилаланин дезаминазы и лецитиназы отрицательные. Индол отрицательный.
Данные молекулярно-генетического анализа:
Последовательность гена 16S рРНК штамма CHEL 4-5 имеет 99.93% сходства с геном Virgibacillus halodenitrificans JCM 12304T, что позволяет отнести штамм CHEL 4-5 к этому виду. Геном штамма CHEL 4-5 депонирован в Генбанк под номером JACWEZ000000000 (биопроект № PRJNA662789). Средняя идентичность нуклеотидов генома штамма CHEL 4-5 с геномом типового штамма JCM 12304T составляет 98.3%, что подтверждает его принадлежность к виду Virgibacillus halodenitrificans.
Рекомендуемые среда и условия культивирования:
Жидкая среда LB бульон модифицированный (г/л): триптон – 10.0, NaCl – 50.0, дрожжевой экстракт – 5.0. Температура 37°C, pH 7.4.
Агаризованная среда LB модифицированная (г/л): триптон – 10.0, NaCl – 50.0, дрожжевой экстракт – 5.0, агар-агар – 20 г/л. Температура 37°C, pH 7.4.
Условия и время инкубации. Аэробные условия. Температура культивирования – 37°C. На средах вырастает в течение 48–72 часов.
Следующие особенности штамма Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 дают основание для его широкого использования на нефтяных месторождениях в микробных технологиях подавления бактериальной сульфатредукции и повышения нефтеизвлечения.
Пример 1. Исследование роста Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 в широком диапазоне солености среды в аэробных и анаэробных условиях.
В аэробных условиях при культивировании на среде LB с добавлением NaCl в течение 5 суток штамм дает хороший рост в диапазоне солености 50–260 г/л (рис. 1). Условия культивирования – при 28°C, на качалке со скоростью 120 об/мин.
Хороший рост штамма в аэробных условиях позволяет получить большой выход биомассы при промышленной ферментации с предварительной адаптацией культуры к конкретной солености пластовой воды.
В анаэробных условиях при культивировании на базовой среде следующего состава (г/л): Na2HPO4 – 1.4; KH2PO4 – 1.2; (NH4)2SO4 – 1.0; дрожжевой экстракт – 1.0; MgCl2·6H2O – 1.0; ацетат натрия·3H2O – 20.0, NaNO3 – 5.0; рН 7.4; с добавлением NaCl в течение 5 суток штамм растет в условиях денитрификации в диапазоне солености 20–200 г NaCl/л (рис. 2).
Пример 2. Исследование способности Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 к восстановлению нитрата в широком диапазоне солености среды с использованием дешевых органических субстратов.
Штамм культивируют в анаэробных условиях на среде следующего состава (г/л): Na2HPO4 – 1.4; KH2PO4 – 1.2; (NH4)2SO4 – 1.0; дрожжевой экстракт – 1.0; MgCl2·6H2O – 1.0; CH3COONa 3H2O – 20.0, NaNO3 – 5.0, NaCl в диапазоне 20–200 г/л; рН 7.4. Среду разливают с соблюдением анаэробных условий во флаконы объемом 50 мл, закрытые пробками из бутиловой резины. Температура культивирования составляет 28°C. В течение 7 суток степень денитрификации (СД) на разных по уровню солености средах составила от 20 до 100% от количества нитрата внесенного в среду (рис. 3). Степень денитрификации рассчитывали согласно формуле:
СД = 100 – (100 × Скон/Снач), %,
где   Снач – начальное содержание нитрата в среде, Скон – конечная концентрация нитрата в среде.
Пример 3. Исследование способности Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 денитрифицировать в присутствии высокой концентрации нитрата.
Штамм культивируют в анаэробных условиях на среде следующего состава (г/л): Na2HPO4 – 1.4; KH2PO4 – 1.2; (NH4)2SO4 – 1.0; дрожжевой экстракт – 1.0; MgCl2·6H2O – 1.0; CH3COONa·3H2O – 75.0; NaCl – 50.0; NaNO3 – в диапазоне 4.25 – 25.50 (50–300 mM); рН 7.4. Среду разливают с соблюдением анаэробных условий во флаконы объемом 50 мл, закрытые пробками из бутиловой резины. Температура культивирования составляет 28°C. Время культивирования – 6 суток.
Экспериментально показано, что процесс денитрификации наблюдается в широком интервале концентрации нитрата натрия, достигающей 300 мМ (25.5 г/л) NaNO3. При этом потребление нитрата было даже выше в вариантах с более высоким его содержанием (таблица 1). В качестве промежуточного продукта денитрификации штамм накапливает нитрит в высокой концентрации.
Таблица 1. Восстановление нитрата и образование нитрита штаммом Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 в средах с высоким содержанием нитратов
NaNO3, мМ
NO3-, mM
NO2-, mM
N2O, mM
Потребление NO3-,% от начального
Потребление NO3-, мг/л
50
0.0
24.9
25.1
100
4250
100
50.2
27.9
21.9
50
4234
200
130.7
18.7
50.6
35
5888
300
221.4
24.9
53.8
26
6683
Пример 4. Исследование способности Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 подавлять рост сульфатвосстанавливающих бактерий.
При проведении исследований использовали флаконы объемом в 50 мл со средой Постгейта, приготовленной согласно https://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_Medium63.pdf с дополнительным внесением 50 г/л NaCl и 200 мМ NaNO3. Среду разливают с соблюдением анаэробных условий во флаконы объемом 50 мл, закрытые пробками из бутиловой резины. Время культивирования – 15 суток. Были поставлены следующие варианты эксперимента. 1. С добавлением в среду культуры Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5. 2. С добавлением в среду накопительной культуры сульфатвосстанавливающих бактерий. 3. С добавлением во флаконы культуры Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 и накопительной культуры сульфатвосстанавливающих бактерий.
В таблице 2 представлены результаты определения содержания сульфида (мг/л) в различных вариантах эксперимента в течение 20 суток. Показано, что при совместном культивировании Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 и накопительной культуры СВБ процесс сульфатредукции подавляется.
Таблица 2. Образование сульфида накопительной культурой СВБ при совместном и раздельном культивировании со штаммом Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5
№ пп
Вариант эксперимента
Время культивирования, сут.
5
10
15
20
1
Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5
0
0
0
0
2
Накопительная культура СВБ
89
137
217
369
3
Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 + накопительная культура СВБ
0
0
0
0
Кроме того важным свойством Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 при использовании в микробных технологиях является способность штамма к спорообразованию. Споровая форма штамма минимизирует потерю жизнеспособности биомассы при транспортировке и хранении. При закачке в нефтяной пласт споры вследствие меньших размеров могут проникать на значительно большее расстояние в толщу нефтеносного пласта, что увеличивает охват биотехнологического воздействия в расчете на одну нагнетательную скважину.
Таким образом, совокупность признаков штамма Virgibacillus halodenitrificans CHEL 4-5 таких как:
1. Галофилия;
2. Способность к росту в аэробных и анаэробных условиях;
3. Спорообразование;
4. Способность к денитрификации на доступных органических субстратах;
5. Подавление бактериальной сульфатредукции вследствие образования нитрита в средеж;
определяет перспективность штамма для использования в микробных технологиях подавления бактериальной сульфатредукции и повышения нефтеизвлечения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Патент США № 8,753,865
2. Патент США № 8,528,634
3. Патент Канады № 2717852
4. Патент Канады № 2816202
5. Agrawal A., Park S., Nathoo S., Gieg L.M., Jack T.R., Miner K., Ertmoed R., Benko A., Voordouw G. Toluene depletion in produced oil contributes to souring control in a field subjected to nitrate injection. Environ. Sci. Technol. 2012. 46, 1285–1292. doi: 10.1021/es203748b
6. Bødtker G., Lysnes K., Torsvik T., Bjornestad E.O., Sunde E. Microbial analysis of back flowed injection water from a nitrate-treated North Sea oil reservoir. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 36, P. 439–450.
7. Dolfing J., Hubert C.R.J. Using thermodynamics to predict the outcomes of nitrate-based oil reservoir souring control interventions. Front. Microbiol. 8, Article 2575. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02575
8. Grigoryan A.A., Cornish S.L., Buziak B., Lin Sh., Cavallaro A., Arensdorf J.J., Voordouw G. Competitive oxidation of volatile fatty acids by sulfate- and nitrate-reducing bacteria from an oil field in Argentina. Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. No. 14. P. 4324–4335.
9. Telang A.J., Ebert S., Foght J.M., Westlake D.W.S., Jenneman G.E., Gevertz D., Voordouw G. Effect of nitrate injection on the microbial community in an oil field as monitored by reverse sample genome probing. Appl. Environ. Microbiol. 1997. 63, 1785–1793.
10. Xu X.-J., Chen C., Wang A.-J., Guo H.-L., Yuan Y., Lee D.-J., Ren N.-Q. Kinetics of nitrate and sulfate removal using a mixed microbial culture with or without limited-oxygen fed. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. 98, 6115–6124.