СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ И АНТИФИБРОТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ В ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
AGENT POSSESSING ANTI-INFLAMMATORY AND ANTIFIBROTIC ACTION IN PULMONARY TISSUE, AND CYTOSTATIC ACTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции воспаления и фиброза в легочной ткани, развивающихся при назначении цитостатиков.
Идиопатический фиброз легкого является хроническим активно прогрессирующим заболеванием неизвестной этиологии. Прогноз заболевания в большинстве своем неблагоприятный, состояние пациентов ухудшается быстрыми темпами. Продолжительность жизни с момента постановки диагноза составляет от 2 до 4 лет [1, 2]. Существующий набор лечебных мероприятий для легочного фиброза ограничен и не эффективен. Клиническая практика сосредоточена преимущественно на лечении осложнений и поддерживающей терапии [3].
Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих противовоспалительным и антифибротическим действием в легочной ткани при цитостатическом воздействии.
Поставленная задача достигается применением нейролептика спиперона в качестве средства, способного препятствовать развитию нарушений в легочной ткани, вызванных введением цитостатиков.
Новым в предлагаемом изобретении является использование курсового введения спиперона после введения цитостатика.
Нами впервые выявлена способность спиперона препятствовать развитию нарушений в легочной ткани, развивающихся при использовании цитостатических препаратов.
2+
2+
Спиперон - селективный антагонист D2 дофаминовых рецепторов; α1В-адреноблокатор; антагонист 5-НТ2А/5-HT1 серотониновых рецепторов; антипсихотический препарат. Ранее было обнаружено, что спиперон демонстрирует высокую иммуносупрессивную активность при местном применении. Спиперон и его активные производные используются в качестве средства при лечении контактного дерматита, атопического дерматита, псориаза, синдрома Шегрена, очаговой алопеции, афтозной язвы, конъюнктивита, язвенного колита, астмы, склеродермии, вагинита, проктита [4]. Было обнаружено также, что местное лечение ран с агентами, имеющими серотонин-антагонистические свойства, усиливает и улучшает процесс заживления ран [5]. Спиперон и его производные были признаны полезными в методах стимулирования СаСС (calcium-activated chlorine channels - кальций-активируемых хлорных каналов) и лечении расстройств (или его симптомов), связанных с СаСС, включая муковисцидоз. Спиперон является мощным усилителем внутриклеточного Са и, показано, что он стимулирует внутриклеточный Са, через белок тирозинкиназу связанный фосфолипаза C-зависимый путь [6].
Применение спиперона по новому назначению стало возможным благодаря выявленному авторами новому свойству препятствовать развитию нарушений в легочной ткани и системе крови при введении цитостатиков.
2А.2В
1-4
Воспаление и фиброз легочного интерстиция, воздухоносных пространств, дезорганизация структурно-функциональных единиц паренхимы легких приводит к нарушению газообмена и развитию дыхательной недостаточности. В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании роли серотонина в развитии фибротического процесса в легких. Интенсивность продукции коллагена фибробластами легких и профибротических факторов находится в прямой зависимости от концентрации серотонина и экспрессии 5-НТ рецепторов в легких. Антифибротические эффекты спиперона могут быть связаны с нарушением серотонинового механизма пролиферации фибробластов и синтеза коллагена фибробластами, с одновременным уменьшением уровней TGF-β1, соединительнотканного ростового фактора и ингибитора активатора плазминогена-1 в легких [7, 8]. Вместе с тем легочная ткань богата дофамином и дофаминовыми рецепторами (D тип) [9].
Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не очевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.
Изобретение может быть использовано для повышения устойчивости легочной ткани к воспалению и отложению фибротических масс при химиотерапии в эксперименте и клинике.
Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».
Предлагаемое действие спиперона изучено в экспериментах на 7-8- недельных мышах линии C57BL/6J в количестве 155 штук. Животные первой категории, инбредные мыши, получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется). Использование животных в экспериментах обосновано и согласовано с Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМИ.
Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенного к нему рисунков 1, 2.
На рис.1 изображено легкое мыши с частично обратимым пневмофиброзом, при окрашивании ткани легкого гематоксилином и эозином: а - интактной, б - получавшей блеомицин, в - получавшей спиперон на фоне моделирования частично обратимого фиброза; легкое мыши, при окрашивании ткани легкого по Ван-Гизону на соединительную ткань: г - интактной; д - получавшей блеомицин; е - получавшей спиперон на фоне моделирования частично обратимого фиброза; 21-й день эксперимента, ув.×100.
На рис.2 изображено легкое мыши с необратимым пневмофиброзом, при окрашивании ткани легкого гематоксилином и эозином: а - интактной, б - получавшей блеомицин, в - получавшей спиперон на фоне моделирования необратимого фиброза; легкое мыши, при окрашивании ткани легкого по Ван-Гизону на соединительную ткань: г - интактной; д - получавшей блеомицин; е - получавшей спиперон на фоне моделирования необратимого фиброза; 21-й день эксперимента, ув.×100.
Изобретение осуществляют следующим образом:
Блеомицин относится к группе противоопухолевых антибиотиков. Его механизм действия до конца не выяснен, хотя известно, что он способен подавлять синтез нуклеиновых кислот (преимущественно ДНК) и белка. Препарат активен в отношении клеток, находящихся как в митотическом цикле, так и вне его, но проявляет большую активность в фазе G2. Основное токсическое действие цитостатик оказывает на легкие: вызывает пневмонию, фибротические изменения в паренхиме легких [10].
Модель токсического пневмофиброза, вызванная однократным интратрахеальным введением блеомицина, наиболее широко применяется в экспериментальных исследованиях для изучения патогенеза и поиска возможных способов лечения фиброзных заболеваний легких. Блеомицин вызывает субплевральное рубцевание, аналогичное человеческому заболеванию [11]. Однако несмотря на явные преимущества модели, следует упомянуть о частичной обратимости фиброза в условиях введения блеомицина. Аспект медленного и необратимого прогрессирования болезни у пациентов с идиоматическим фиброзом легких у экспериментальных животных, получавших блеомицин однократно, невоспроизводим [11, 12]. Идиопатический фиброз легких развивается в силу многократно повторяющихся (“циклических”) травм альвеолярного эпителия. В настоящее время разработаны модели необратимого пневмофиброза. В основе животной модели повторяющихся эпизодов повреждения легкого выступает многократное внутритрахеальное введение блеомицина через процедуру интубации. Гистологические показатели легких при введении блеомицина раз в две недели более коррелирует с человеческим ИФЛ, чем однократная инсталляция цитостатика [13].
Поэтому использовано 2 модели экспериментального фиброза.
1-я модель
Частично обратимый фиброз легкого моделировали однократным интратрахеальным введением 80 мкг блеомицина («Блеомицетин», ОАО «Лэнсфарм», Россия) в 30 мкл физиологического раствора.
Спиперон (Spiperone “Sigma”, США) в дозе 1,5 мг/кг вводили внутрибрюшинно через 3 ч и на 1, 3, 6, 7, 13-21-е сутки после однократного введения блеомицина. Непосредственно перед использованием препарат растворяли в стерильном физиологическом растворе. Объем вводимого раствора составил 100 мкл.
2-я модель
Для моделирования необратимого пневмофиброза блеомицин вводили однократно интратрахеально 80 мкг/мышь в 30 мкл физиологического раствора, на 7, 14, 21, 28-й день эксперимента блеомицин вводили интраназально в дозе 80 мкг/мышь в 15 мкл NaCl 0,9%. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора (контроль).
На модели необратимого пневмофиброза спиперон вводили в дозе 1,5 мг/кг в 100 мкл NaCl 0,9% внутрибрюшинно на 10-16, 18-23, 25-30, 36-42-й день эксперимента. В качестве фона использовали интактных животных (интактный контроль).
2
Исследования легких проводили на 3, 7, 14, 21-й день опыта на модели частично обратимого пневмофиброза и на модели необратимого пневмофиброза на 21, 40, 60-й день опыта. Мышей умерщвляли передозировкой CO, изучали морфологическую картину легких. Для гистологического исследования кусочки легких фиксировали в 10%-ном формалине. По стандартной гистологической методике выполняли проводку материала, заливали объекты исследования в парафиновые блоки, с которых делали гистологические срезы толщиной 5 мкм. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону на соединительную ткань [14]. С помощью компьютерного графического анализа на стандартной площади гистологического среза измеряли площадь коллагеновых волокон в ткани легкого. Затем вычисляли долю этих показателей от стандартной площади среза.
Оценивали способность адгезирующей фракции клеток легких, костного мозга и периферической крови формировать фибробластные колонии (КОЕ-Ф) [15, 16].
Математическую обработку результатов производили с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с использованием параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического критерия Манна-Уитни.
Пример 1
На модели частично обратимого пневмофиброза при окрашивании ткани легкого гематоксилином и эозином выявляется развитие отека межальвеолярных перегородок, инфильтрация интерстиция альвеол нейтрофилами, лимфоцитами, макрофагами и плазматическими клетками, что приводит к значительному нарушению гистоархитектоники легочной ткани мышей, получавших блеомицин однократно (рис.1б). В стенках альвеол наблюдается венозное полнокровие и кровоизлияния. В просвете альвеол появляются плазматические клетки, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты, альвеолярные макрофаги, гистиоциты. В центральных отделах органа встречаются участки, где легочный рисунок отсутствует, часть альвеол эмфизематозно расширена.
При окрашивании легкого по Ван-Гизону на соединительную ткань в интерстиции альвеол мышей, получавших блеомицин однократно, отмечается усиление образования коллагеновых волокон и прогрессирующее разрастание соединительной ткани (рис.1д). На 7-й день эксперимента соединительная ткань располагается в основном периваскулярно и перибронхиально, содержание соединительной ткани составляет 3.07±0.07% от площади ткани легкого (табл.1). На 14, 21-й дни опыта наблюдается диффузное распространение фибротических масс, содержание коллагеновых волокон составляет 3.91±0.07 и 4.26±0.14% от площади ткани легкого (таблица 1).
Уже на 3-й день опыта у мышей, получавших спиперон, отмечается уменьшение отека альвеолярного эпителия, экссудации и инфильтрации стенок и просвета альвеол клетками воспаления. В составе воспалительного инфильтрата наблюдается меньшее количество нейтрофильных лейкоцитов, макрофагов и плазматических клеток по сравнению с фиброзными мышами, леченных NaCl. Спиперон уменьшает степень десквамации альвеоцитов в просвет альвеол, вследствие чего не происходит облитерация альвеол, сохраняется функция альвеолярно-капиллярной мембраны и замедляется деструкция легочной ткани, вызванная однократным введением блеомицина (рис. 1 в, е). Противовоспалительное действие спиперона прослеживается и в более поздние сроки - 7, 14, 21-й день. Начиная с 7-го дня опыта, спиперон препятствует отложению коллагена в фиброзных легких (таблица 1). Антифибротическая активность соединения в большей мере проявляется на 21-й день.
Таблица 1
Содержание соединительной ткани (% от площади ткани) в легких мышей линии C57B L/6J в условиях интратрахеального введения блеомицина и курсового назначения спиперона на фоне моделирования частично обратимого пневмофиброза (M±m)
Сроки исследования, день
Мыши, получавшие интратрахеально NaCl 0,9%
Мыши с частично обратимым пневмофиброзом, леченные NaCl 0,9%
Мыши с частично обратимым пневмофиброзом, леченные спипероном
7
1.13±0.07
3.07±0.07*
2.09±0.11
14
1.14±0.03
3.91±0.07*
2.75±0.12#
21
1.15±0.06
4.26±0.14*
2.12±0.13#
Примечание:* - достоверность различия с мышами, получавшими интратрахеально NaCl (Р<0.05); # - достоверность различия с мышами с частично обратимым пневмофиброзом, леченных NaCl (Р<0.05) (критерий Манна-Уитни).
Однократная интратрахеальная инсталляция блеомицина вызывает генерацию фибробластных колоний адгезирующими мононклеарами костного мозга (3, 7, 14, 21-й день), крови (7, 21-й день) и легких (7, 14, 21-й день) (таблица 2). Из представленных данных видно, что на модели частично обратимого фиброза возрастает клональная активность прогениторных фибробластных клеток костного мозга. К концу исследования более значительна клональная активность прогениторных фибробластных клеток легких. В образцах костного мозга и крови мышей интактного контроля отмечается незначительный по сравнению с частично обратимым иневмофиброзом рост КОЕ-Ф, в культуре адгезирующих мононуклеаров образование колоний не наблюдается.
Спиперон оказывает супрессирующее действие на клональную активность костномозговых адгезирующих клеток мышей с пневмофиброзом (3, 21-й день). Уменьшение количества КОЕ-Ф в условиях введения спиперона отмечается и в образцах адгезирующих клеток крови (7, 21-й день). Примечательно, что после снижения выхода колоний в образцах легких мышей с пневмофиброзом (7, 14-й день) к 21-му дню показатель резко возрастает (таблица 2).
Таблица 2
Влияние спиперопа на рост КОЕ-Ф в культурах адгезирующих мононуклеаров костного мозга, циркулирующей крови и легких (×10<sup>5</sup> адгезирующих мононуклеаров) у мышей линии C57B L/6 при частично обратимом пневмофиброзе (M±m)
Сроки исследования
Костный мозг
Периферическая кровь
Легкие
Интактный контроль
4.83±0.75
0
0
3-й день
Блеомицин
30.17±9.01*
0
Блеомицин+Спиперон
19.83±2.05*
0
7-й день
Блеомицин
28.33±3.62*
0.50±0.17*
3.00±0.58*
Блеомицин+Спиперон
37.67±3.48*
0.17±0.15*
1.00±0.28*
14-й день
Блеомицин
3.17±0.60*
0
6.00±0.58*
Блеомицин+Спиперон
2.17±0.28*
0.33±0.25
3.00±0.58*
21-й день
Блеомицин
16.91±0.54*
1.34±0.33 *
4.50±0.87*
Блеомицин+Спиперон
0.50±0.25*#
0#
22.50±0.87*#
Примечание. P<0,05 - отмечена достоверность различия показателя: от интактного контроля - *, от блеомицинового контроля - #.
Пример 2
Такая особенность человеческого ИФЛ как постоянная прогрессия и необратимость природы при однократном интратрахеальном введении блеомицина не наблюдается. По достижении максимального фиброзного ответа на 21-й день опыта фибротическая реакция на цитостатик в дальнейшем (28-60-й день) менее выражена. К 60-му дню падает и интенсивность воспалительной реакции в легких по отношению к 21-му дню, при этом более чем на 50% сокращается содержание коллагена.
Курсовое введение блеомицина более полно имитирует хронический аспект фиброгенеза и в том числе наличие гиперпластических альвеолярных эпителиальных клеток, наблюдаемых у больных ИФЛ. Инфильтрация интерстиции альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками более выражена по отношению к мышам, которым вводили блеомицин однократно. Активная воспалительная реакция поддерживается до конца наблюдения - 60-й день (рис.2б). Разрастание соединительной ткани начинается с 7-го дня и прослеживается вплоть до 60-го дня (рис.2д). На 14-й день опыта активность отложения коллагена в легких мышей, получавших блеомицин курсом, превосходит таковую у мышей в условиях однократного введения цитостатика. Далее на 40, 60-й день отмечается прогрессирование фиброза. Следует отметить, что начиная с 40-го дня опыта, наблюдается гибель животных с неоднократными блеомициновыми травмами легких. К окончанию наблюдения популяция мышей сократилась на 30%.
Специфическая фармакологическая активность спиперона выявляется и в условиях курсового назначения блеомицина. В данной серии эксперимента препарат вводится в фибротическую фазу развития болезни (терапевтический режим введения). Назначение спиперона уменьшает отек альвеолярного эпителия, экссудацию и инфильтрацию стенок и просвета альвеол клетками воспаления (лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы, плазматические клетки) по сравнению с мышами с необратимым пневмофиброзом без лечения (21, 40, 60-й день) (рис.2в, е). В составе воспалительною инфильтрата в фиброзных легких мышей, леченных спипероном, наблюдалось меньшее количество нейтрофильных лейкоцитов. Как и в случае однократной травмы блеомицином, в условиях курсового введения цитостатика и спиперона регистрировалось уменьшение степени десквамации альвеоцитов в просвете альвеол, вследствие чего не происходила облитерация альвеол и замедлялась деструкция легочной ткани (рис.2в, е). Нами не исключается сохранение функции альвеолярно-капиллярной мембраны.
На 21-й и 40-й дни опыта в легких больных мышей, получавших спиперон, площадь соединительной ткани достоверно меньше по сравнению с животными контрольной группы соответственно на 64% и 63% (рис.2е; таблица 3). При отмене лечения (последнее введение спиперона на 42-й день опыта) у животных вновь активизируется формирование фибротических масс в паренхиме легких - 60-й день.
Таким образом, на моделях частично обратимого и необратимого пневмофиброза спиперон препятствует токсическому разрушению альвеолярного эпителия, снижает активность воспаления и фиброгенеза в легочной ткани.
Таблица 3
Влияние спиперона на содержание соединительной ткани (% от общей площади ткани) в легких мышей линии C57BL/6 при необратимом пневмофиброзе (M±m)
Сроки исследования, день
Мыши, получавшие интратрахеально NaCl 0,9%
Мыши с необратимым пневмофиброзом, леченные NaCl 0,9%
Мыши с необратимым пневмофиброзом, леченные спипероном
21
1.15±0.06
5.13±0.75*
1.86±0.18#
40
1.12±0.18
4.12±0.40*
1.52±0.20#
60
1.23±0.16
5.96±0.93*
4.96±1.34*
Примечание:* - достоверность различия с мышами, получавшими интратрахеально NaCl (Р<0.05); # - достоверность различия с мышами с необратимым пневмофиброзом, леченных NaCl (Р<0.05) (критерий Манна-Уитни)
Таким образом, на моделях частично обратимого и необратимого пневмофиброза спиперон препятствует токсическому разрушению альвеолярного эпителия, снижает активность воспаления и фиброгенеза в легочной ткани.
Литература
1. Tzilas V. Prognostic factors in idiopathic pulmonary fibrosis / V. Tzilas, A. Koti, D. Papandrinopoulou, et al. // American Journal of the Medical Sciences. - 2009. - Vol.338, №.6. - P.481-485.
2. Mahendran S. Treatments in idiopathic pulmonary fibrosis: time for a more targeted approach? / S. Mahendran, T. Sethi // Q J Med. - 2012. - Vol.105. - P.929-934.
3. Khalil N. Idiopathic pulmonary fibrosis: current understanding of the pathogenesis and the status of treatment / N. Khalil, R. O'Connor // CMAJ. - 2004 - Vol.171, №2. - P.153-160.
4. Patent № US 5244902 A Topical application of spiperone or derivatives thereof for treatment of pathological conditions associated with immune responses / R.J. Sharpe (Newtonville, MA), K.A. Arndt (Newton Centre, MA), S.J. Galli (Winchester, MA), P.C. Meltzer (Lexington, MA), R.K. Razdan (Belmont, MA), H.P. Sard (Arlington, MA). - USA, 1993.
5. Patent №4,874,766 METHOD OF PROMOTING WOUND-HEALING / Ooms L.A.A. (Wechelderzande), Degryse Anne-Dominique A Y. (Herentals). - USA, 1989.
6. Patent №: 20120029005 SPIPERONE DERIVATIVES AND METHODS OF TREATING DISORDERS / W.B. Guggino (Baltimore, MD, US), E.M. Schwiebert (Birmingham, AL, US), L. Liang (Baltimore, MD, US). - USA, 2012.
7. Fabre A. Modulation of bleomycin-induced lung fibrosis by serotonin receptor antagonists in mice / A. Fabre, J. Marchal-Somme, S. Marchand-Adam et al. // Eur. Respir. J. - 2008. - Vol.32. - P.426-436.
8. Kőnigshoff M. Increased expression of 5-hydroxytryptamine2A/B receptors in idiopathic pulmonary fibrosis: a rationale for therapeutic intervention. / M. Kőnigshoff, R. Dumitrascu, S. Udalov et al. // Thorax. - 2010. - Vol.65. - P.949-955.
9. Amenta F. The peripheral dopaminergic system: morphological analysis, functional and clinical applications. / F. Amenta, A. Ricci, S.K. Tayebati et al. // Ital. J. Anat. Embryol. - 2002. - Vol.107. - P.145-167.
10. Машковский М.Д. Лекарственные средства. / - М.Д. Машковский. - М.: «Новая волна», 2008. - С.453-454, 1003-1004.
11. Chua F. Pulmonary fibrosis: searching for model answers. / F. Chua, J. Gauldie, G.J. Laurent. // Am J Respir Cell Mol Biol. - 2005. - Vol.33, №1. - P.9-13.
12. Izbicki G. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. / G. Izbicki M.J. Segel T.G. Christensen, et al. // Int J Exp Pathol. - 2002. - Vol.83, №3, p.111-119.
13. Degryse A.L. Repetitive intratracheal bleomycin models several features of idiopathic pulmonary fibrosis / A.L. Degryse, H. Tanjore, X.C. Xu, et al. // Am J Physiol Lung Cell Physiol. - 2010. - Vol.299, №4. - P.L442-L452.
14. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. / Г.А. Меркулов - СПб: Медицина, 1969. - 423 с.
15. Скурихин, Е.Г. Дифференцировка мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток легких при пневмофиброзе / E.Г. Скурихин, Е.С. Хмелевская, О.В. Першина и др. // Клеточные технологии в биол. и медицине. - 2012. - №4. - С.192-199.
16. Гольдберг Е.Д. Методы культуры ткани в гематологии. / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.П. Шахов. - Томск, 1992. - 264 с.