СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И МИГРАЦИИ Helicobacter pylori
METHOD FOR INHIBITING Helicobacter pylori PROLIFERATION AND MIGRATION

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori, которые считаются причиной язвы желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, рака желудка и т.д.
Более определенно, настоящее изобретение касается способа ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori таким образом, чтобы избежать продуцирования резистентных к лекарственным средствам бактерий или исключить побочные эффекты от лечения этими лекарственными средствами, что присуще штаммам Helicobacter Pylori.
В контексте настоящего изобретения способ ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori относится как к способу ингибирования пролиферации штаммов Helicobacter Pylori, так и к способу ингибирования активной миграции штаммов Helicobacter Pylori.
Откачивание глубинной морской воды началось в Японии в 1989 году недалеко от побережья мыса Мурото в Префектуре острова Сикоху, используя построенные на суше сборники глубинной морской воды. Сегодня глубинная морская вода собирается в различных областях Японии, включая Префектуру Тоямы и Префектуру Окинавы. Известно, что глубинная морская вода обладает различными полезными качествами, такими как высокое содержание питательных веществ, чистота и стабильность при низкой температуре. Соответственно за последние годы разработано много продуктов с использованием глубинной морской воды. Среди других есть тенденция активного использования глубинной морской воды в пищевой промышленности в производстве питьевой воды, переработанных морепродуктов, ферментированных продуктов и т.д., и теперь на рынке имеется множество продуктов, использующих глубинную морскую воду.
Многие из этих продуктов привлекают внимание из-за преимуществ глубинной морской воды, таких как чистота и высокое содержание минералов, и используются как чистый материал при производстве продукта или как источник качественных полезных минералов.
С другой стороны, медицинские и научные исследования постепенно обнаруживают функции и механизмы, происходящие в человеческом организме при потреблении питьевой воды, которая использует глубинную морскую воду и таким образом содержит много полезных минералов. Хотя глубинная морская вода, как ожидают, может предложить многочисленные преимущества, такие как регулирование работы кишечника, положительные воздействия на иммунитет и предотвращение связанных с образом жизни заболеваний, специфическое действие глубинной морской воды, включая упомянутое выше, еще полностью не понятно.
С другой стороны, штаммы Helicobacter Pylori заражают и колонизируют человеческий желудок и, как сообщают, участвуют в развитии болезней верхних отделов желудочно-кишечного тракта, а также аутоиммунных болезней, острых ишемических болезней сердца и других, связанных с образом жизни, болезней. В частности, хорошо известен факт, что штаммы Helicobacter Pylori тесно связаны с причинами язвы желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, рака желудка и т.д.
Поэтому для удаления штаммов Helicobacter Pylori используются различные методы лечения, такие которые используют различные антибактериальные средства, ингибиторы протонного насоса (PPIs), которые ингибируют секрецию кислоты желудочного сока, и антибиотики. Как отдельный пример в патентной литературе 1 раскрыто местное пероральное средство для уничтожения штаммов Helicobacter Pylori в полости рта, содержащее соединение висмута, такое как цитрат висмута (Выложенный патент Японии №Hei 8-20543). Кроме того, в патентной литературе 2 (Выложенный патент Японии №8-48629) и патентной литературе 3 (Выложенный патент Японии №Hei 9-208578) раскрыты агенты анти-пилори, проявляющие превосходное антибактериальное действие против штаммов Helicobacter Pylori, где эффективный компонент представляет собой пиридонкарбоновую кислоту, ее сложный эфир или соль.
В дополнение к вышеупомянутому, в патентной литературе 4 (Выложенный патент Японии №Hei 9-295938) описывается средство для лечения язвы, эффективные компоненты которого включают соединение карбапенема или его фармакологически приемлемую соль, имеющее сильное антибактериальное действие против штаммов Helicobacter Pylori, которые колонизируют и врастают во внутренние мембраны желудка, для использования в качестве медикамента для лечения кишечных язв и хронического поверхностного гастрита, а также предотвращения их рецидивов.
2
Кроме того, в патентной литературе 5 (Выложенный патент Японии №2000-63280) и патентной литературе 6 (Выложенный патент Японии №Hei 10-109942) раскрыты лекарственные средства, которые объединяют в себе корень айвы японской, кору пробкового дерева или другие галеновые препараты в форме порошка или экстракта, обладающие антибактериальным действием против штаммов Helicobacter Pylori, эффективные лекарственные композиции для лечения или предупреждения желудочно-кишечных заболеваний путем эффективного ингибирования пролиферации или миграции и удаления штаммов Helicobacter Pylori, которые считаются причиной так называемых пищеварительных язв, типа гастрита, язвы желудка и язвы двенадцатиперстной кишки, по крайней мере одним компонентом, выбранным из антагонистов гистаминового рецептора Н, ингибиторов протонового насоса, медикаментов, защищающих слизистую оболочку желудка от гастрита и пищеварительных язв, медикаментов, снижающих кислотность желудка и анти-диарейных препаратов.
Кроме того, в патентной литературе 7 (Выложенный патент Японии №Hei 11-180888) раскрыт полифенол, полученный из фруктовых или принадлежащих семейству роз растений, используемый в качестве эффективного компонента лекарственных средств, противоинфекционных агентов или пищевых продуктов, обладающий противобактериальным действием против штаммов Helicobacter Pylori, в то время как в патентной литературе 8 (Выложенный патент Японии №Hei 11-292788) раскрыт связанный с железом лактоферрин для использования в противоинфекционных агентах, медикаментах или напитках/пищевых продуктах. Аналогично в патентной литературе 9 (Выложенный патент Японии №2002-68992) раскрыт напиток/пищевой продукт или пищевая добавка, содержащие полифенолы чая в качестве эффективного компонента наряду с ингибитором протонового насоса, в то время как в патентной литературе 10 (Выложенный патент Японии №2005-68014) раскрыто антибактериальное средство против штаммов Helicobacter Pylori, состоящее из одного или двух или более экстрактов, выбранных из группы, которая включает Apocynum venetum L., Vaccinium myrtillus L. и Acanthopanax senticosus Harms.
Однако типы штаммов Helicobacter Pylori, существующие в человеческом теле, отличаются друг от друга, и соответственно действие основных или общих антибактериальных средств не ясно и вызывают неблагоприятную миграцию Helicobacter Pylori благодаря появлению резистентных бактерий и увеличению побочных эффектов.
13
По вышеупомянутым причинам сообщалось о множестве простых методов обнаружения и идентификации штаммов Helicobacter Pylori, включая: инфекционную диагностическую пробу, полезную при обнаружении и идентификации штаммов Helicobacter Pylori непосредственно, как раскрыто в патентной литературе 11 (Выложенный патент Японии №Hei 10-33179); метод исследования инфекции в реальном времени, основанный на принципах "анализа выдыхаемого газа, используя меченую С мочевину", как описано в патентной литературе 12 (Выложенный патент Японии №Hei 10-87512); праймер на основе генов штаммов Helicobacter Pylori и метод исследования сопротивляемости кларомицину штаммов Helicobacter Pylori, как раскрыто в патентной литературе 13 (Выложенный патент Японии №Hei 10-286099) и в патентной литературе 14 (Выложенный патент Японии №2001-321197); и метод определения с использованием уреазного фермента, полученного из штаммов Helicobacter Pylori, как раскрыто в патентной литературе 15 (Выложенный патент Японии №Hei 11-318490). Однако об использовании глубинной морской воды в ингибировании пролиферации или миграции штаммов Helicobacter Pylori до настоящего времени не сообщалось.
Патентная литература 1:
Выложенный патент Японии №Hei 8-20543
Патентная литература 2:
Выложенный патент Японии №Hei 8-48629
Патентная литература 3:
Выложенный патент Японии №Hei 9-208578
Патентная литература 4:
Выложенный патент Японии №Hei 9-295938
Патентная литература 5:
Выложенный патент Японии №2000-63280
Патентная литература 6:
Выложенный патент Японии №Hei 10-109942
Патентная литература 7:
Выложенный патент Японии №Hei 11-180888
Патентная литература 8:
Выложенный патент Японии №Hei 11-292788
Патентная литература 9:
Выложенный патент Японии №2002-68992
Патентная литература 10:
Выложенный патент Японии №2005-68014
Патентная литература 11:
Выложенный патент Японии №Hei 10-33179
Патентная литература 12:
Выложенный патент Японии №Hei 10-87512
Патентная литература 13:
Выложенный патент Японии №Hei 10-286099
Патентная литература 14:
Выложенный патент Японии №2001-321197
Патентная литература 15:
Выложенный патент Японии №Hei 11-318490
Сущность изобретения
Проблемы, на решение которых направлено настоящее изобретение
Как упомянуто выше, найдены методы лечения или предотвращения желудочно-кишечных заболеваний, которые могут приспособиться к разнообразию штаммов Helicobacter Pylori, близко связанных с причинами язвы желудка, двенадцатиперстной кишки, рака желудка и т.д., и таким образом подавить побочные эффекты антибактериальных средств и появление резистентных бактерий.
В то же время ингибирование пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori само по себе представляет способы предотвращения и лечения болезней, вызванных штаммами Helicobacter Pylori. Для предотвращения заболевания более безопасным для здоровья человеческого тела и также более легким способом введения для непрерывного усваивания является введение в виде компонента пищевых продуктов, оказывающего ингибирующее действие на пролиферацию и миграцию штаммов Helicobacter Pylori, вместо того, чтобы регулярно использовать лекарственные средства.
В свете вышеупомянутого объектом настоящего изобретения является осуществление ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori путем использования недорогих материалов типа питьевой воды и других веществ, которые мы потребляем ежедневно, потому что такой способ представляет собой идеальный путь ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori.
Другим объектом настоящего изобретения является создание технологии ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori, которые колонизируют и заражают человеческий желудок, а также, как сообщают, участвуют в развитии болезней верхних отделов желудочно-кишечного тракта, а также аутоиммунных болезней, острых ишемических болезней сердца и связанных с образом жизни болезней, сосредотачиваясь, среди других, на глубинной морской воде, которая богата питательными веществами и минералами, является недорогой и поэтому широко используется в пищевой промышленности для производства питьевой воды, переработанных морепродуктов, ферментированных продуктов и т.д., потому что глубинная морская вода может легко употребляться в повседневной жизни в качестве питьевой воды.
Способы воплощения изобретения
В свете вышеупомянутого настоящее изобретение касается технологии ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori путем использования питьевой воды и других потребляемых каждый день веществ, основанной на открытии способа ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori через вещества, содержащие минералы.
В особенности, настоящее изобретение представляет вновь обнаруженный способ ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori с использованием жидкости, которая содержит по крайней мере один или больше магний, кальций, натрий и калий, основанный на результатах целенаправленного исследования, в котором особое внимание уделялось магнию, кальцию, натрию и калию, которые присутствуют в глубинной морской воде в особенно высоких количествах среди различных, содержащихся в глубинной морской воде минералов, а также жидкостям, которые могут использоваться как средства легкого усваивания этих минералов в повседневной жизни, и соответственно настоящее изобретение касается технологии ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori с использованием питьевой воды и других потребляемых каждый день веществ. Исследованные в связи с настоящим изобретением минералы получены из глубинной морской воды, подверженной минимальному загрязнению вредными примесями и т.д., и таким образом могут благоприятно использоваться как материалы для напитков и пищевых продуктов. Однако нет необходимости ограничивать источник этих минералов глубинной морской водой.
Ингибирование пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori может быть осуществлено, если содержание минералов составляет 40 мг на килограмм или больше.
Если содержание минералов составляет 5900 мг на килограмм или больше, то может быть осуществлено ингибирование пролиферации и миграции всех штаммов Helicobacter Pylori. С точки зрения эффективности расходов нет никакой необходимости увеличивать содержание минералов сверх 5900 мг на килограмм.
Преимущества изобретения
Самым большим преимуществом настоящего изобретения является то, что, употребляя обогащенную минералами воду, полученную из глубинной морской воды, которая является доступной, можно осуществить быстрое ингибирование пролиферации и миграции присущих хозяину штаммов Helicobacter Pylori для предотвращения и лечения среди других заболеваний верхних отделов желудочно-кишечного тракта, не опасаясь появления резистентных бактерий и побочных эффектов от лечения медикаментами.
Краткое описание чертежей
На чертеже представлено состояние колоний, выращенных в культуральной агаровой среде.
Лучшая модель осуществления изобретения
[Метод проверки ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori]
Используемый в настоящем изобретении способ проверки ингибирования пролиферации и миграции штаммов Helicobacter Pylori объясняется ниже.
600
Каждый тип штаммов Helicobacter Pylori, соответствующих приблизительно 1 платиновой петле, был взят из агаровой культуральной среды (Таблица 1) на второй день культивирования и суспендирован в 1 мл 2,8% культуральном растворе бульона бруцеллы таким образом, чтобы O.D.  было 0,3.
-4
-5
-6
2
Затем готовый раствор разводят до 10, 10 и 10 раз соответственно, используя стерилизованную воду, и каждый раствор суспендированных бактерий прикапывают по 10 мкл каждый в агаровые культуральные среды (Таблица 3), содержащие обогащенные минералами воды А, В, С, D, Е, F и G (тестируемые воды), приготовленные из глубинной морской воды, как показано в Таблице 2. Затем культуральные среды культивировали в течение трех дней при 37°С в 10%-ном СО, после чего измеряли КОЕ (колониеобразующая единица = количеству жизнеспособных бактериальных клеток) каждой культуральной среды.
Для реализации изобретения глубинную морскую воду добывали на глубине 344 метра на расстоянии 2200 метров от береговой линии в Мирото, провинция Коучи-кен, Япония. Японский Департамент Науки и Техологии Моря подтвердил чистоту, низкотемпературную стабильность и насыщенность минералами данного участка. Стандартные насосные технологии были использованы для добычи глубинной морской воды. Очищенная глубинная морская вода была получена (схема из приложения 3) путем сепарации глубинной морской воды с использованием стандартного способа сепарации с помощью реверсируемых осмотических мембран (приложение 2) при указанных ниже параметрах: температура жидкости - 15°С, давление - 56 мегапаскалей. Далее, после удаления соли из полученного концентрата, концентрат добавляли в обессоленную глубинную морскую воду, при следующем соотношении элементов: Mg - от 100 мг/л до 240 мг/л (в коммерческой воде - 1,5 мг/л); Ca - от 70 мг/л до 350 мг/л (в коммерческой воде - 9,1 мг/л); Na - от 36 мг/л до 83 мг/л (в коммерческой воде - 6,5 мг/л); K - от 42 мг/л до 240 мг/л (в коммерческой воде - 1,5 мг/л).
В качестве контрольной воды использовали милли-Q воды.
Таблица 1
Состав культуральной агаровой среды
Композиция
Содержание
Бульон бруцеллы
2,8 г
Милли-Q воды
90 мл
Порошок агара
1,4 г
Лошадиная сыворотка
10 мл
Раствор ванкомицина (100 мг/мл)
10 мкл
Таблица 2
Составы обогащенных минералами вод (мг/кг)
Обогащенная минералами вода/тип иона
Mg
Ca
Na
К
А
100
200
50
50
В
150
150
50
50
С
200
70
65
65
D
400
-
-
-
Е
-
400
-
-
F
-
-
400
-
G
-
-
-
400
Таблица 3
Составы обогащенных минералами вод
Композиция
Содержание
Бульон бруцеллы
2,8 г
Тестируемая вода или контрольная вода
90 мл
Порошок агара
1,4 г
Лошадиная сыворотка
10 мл
Раствор ванкомицина (100 мг/мл)
10 мкл
Используемые штаммы Helicobacter Pylori
В тесте использовались главным образом клинически выделенные штаммы.
Серия КМТ: Клинически выделенный штамм, полученный от медицинской школы Университета Косhi
Серия NY: Устойчивый к антибиотикам (метронидазол и кларитромицин) штамм (сделан в Японии)
26695: Клинически выделенный штамм, детально проанализированный до генного уровня (получен из Европы)
NCTC11637: Клинически выделенный штамм (получен из США)
НРК5: Клинически выделенный штамм (получен из Японии)
НРКТ510: Разрушенный штамм cdrA гена (ген, касающийся деления клетки) НРК5, полученного посредством генной рекомбинации
Способ оценки ингибирования пролиферации
Эффекты ингибирования пролиферации штаммов Helicobacter Pylori в тестируемых водах А, В, С, D, Е, F и G были определены на основе КОЕ (колониеобразующая единица = количеству жизнеспособных бактериальных клеток) контрольной воды, составляющей 100%.
Рассматривая вариации, полученные из осуществленных в тесте операций, тестируемые воды, КОЕ которых была менее чем 80% КОЕ контрольной воды, считали эффективными. Испытание проводили три раза, и, если эффективность была установлена в двух тестируемых пробах, тестируемая вода оценивалась, как эффективная в ингибировании пролиферации Helicobacter Pylori (обозначено как О).
Способ тестирования ингибирования миграции штаммов Helicobacter Pylori
2
Из агаровых культуральных сред, в которых культивировали штаммы Helicobacter Pylori, используя стерильную зубочистку, брали бактерии каждого типа и затем переносили в агаровые культуральные среды бульона бруцеллы (Таблица 4), используя обогащенные минералами воды А, В, С, D, Е, F и G, приготовленные из глубинной морской воды, и используя Милли-Q воды в качестве контроля. Затем культуральные среды культивировали в течение трех дней при 37°С в 10%-ном СО, после чего измеряли диаметр колоний в каждой культуральной среде.
Таблица 4
Состав культуральной агаровой среды
Композиция
Содержание
Бульон бруцеллы
2,8 г
Тестируемая вода или контрольная вода
90 мл
Порошок агара
0,35 г
Лошадиная сыворотка
10 мл
Раствор ванкомицина (100 мг/мл)
10 мкл
Способ оценки ингибирования миграции
При оценке тестируемые воды, в которых колонии имели диаметр меньше, чем диаметры колоний в контрольной воде, считали эффективными. Испытание проводили три раза, и, если эффективность была установлена в двух тестируемых пробах, тестируемая вода оценивалась, как эффективная в ингибировании миграции Helicobacter Pylori (обозначено как ). Контрольные колонии с диаметром меньше чем 2 мм считали не достаточно выращенными и не учитывались.
Настоящее изобретение иллюстрируется ниже с использованием примеров относительно тестируемых вод А, В, С, D, Е, F и G. Однако следует отметить, обогащенные минералами воды, приготовленные из глубинной морской воды, нисколько не ограничиваются этими водами.
Пример 1
Таблица 5 показывает воздействие тестируемых вод на ингибирование пролиферации различных типов штаммов Helicobacter Pylori.
Как показано в Таблице 5, ингибирование пролиферации данного типа бактериального штамма меняется в зависимости от типа тестируемой воды. Кроме того, из Таблицы 5 очевидно, что тестируемая вода D ингибирует пролиферацию многих типов бактериальных штаммов, где эффект ингибирования пролиферации Helicobacter Pylori ясно изменяется в зависимости от типа бактериального штамма.
На основании этих результатов найдено, что, употребляя доступную, обогащенную минералами воду, полученную из глубинной морской воды, обладающую эффектом ингибирования пролиферации различных типов штаммов Helicobacter Pylori, можно предотвратить и лечить среди других заболевания верхних отделов желудочно-кишечного тракта, не опасаясь появления резистентных бактерий и побочных эффектов от лечения медикаментами.
Пример 2
Таблица 6 показывает эффект ингибирования миграции различных типов штаммов Helicobacter Pylori, культивированных в агаровых культуральных средах, используя обогащенные минералами воды, полученные из глубинной морской воды.
Как показано в Таблице 6, тестируемые воды В, С, D и Е эффективны в ингибировании миграции штаммов КМТ44, 45 и 46.
На основании вышеупомянутых результатов найдено, что, выбирая подходящие обогащенные минералами воды, можно ингибировать миграцию штаммов Helicobacter Pylori, заражающих и колонизирующих в хозяине.
Пример 3
Начиная с обогащенных минералами вод, имеющих каждая общее содержание минералов 400 мг/кг, общее содержание минералов в каждой воде изменяли в пределах 20-11800 мг/кг, основываясь на процентном содержании ионов, приведенном в Таблице 7, и исследовали воздействие изменения общей концентрации минералов на игибирование пролиферации штаммов Helicobacter Pylori.
Таблица 7
Процентное содержание ионов в различных минеральных водах (%)
Обогащенная минералами вода /Тип иона
Mg
Ca
Na
K
А
25
50
12,5
12,5
В
37,5
37,5
12,5
12,5
С
50
17,5
16,25
16,25
D
100
0
0
0
Е
0
100
0
0
F
0
0
100
0
G
0
0
0
100
Рассматривая различные результаты проведенных в исследовании операций, тестируемые воды, КОЕ которых была менее чем 80% КОЕ контрольной воды, считали эффективными. Испытание проводили три раза, и, если эффективность была установлена в двух тестируемых пробах, тестируемая вода оценивалась, как эффективная в ингибировании пролиферации Helicobacter Pylori (обозначено как $$O$$).
В тестах используемые штаммы были штаммами Helicobacter Pylori, обозначенными с 1 по 16.
Таблицы 8-15 показывают результаты исследований, где общая концентрация минералов постепенно поднималась от 20 до 11 800 мг/кг.
Таблица 8
Общая концентрация минералов = 20 мг/кг
Номер
Название бактерий
А
В
С
D
E
F
G
1
КМТ27
2
КМТ31
3
КМТ40
4
КМТ44
5
КМТ45
6
КМТ46
7
КМТ47
8
КМТ50
9
NY1
10
NY8
11
NY11
12
NY31
13
26695
14
НРК5
15
НРКТ510
16
11637
Увеличение общей концентрации минералов в обогащенных минералами водах, полученных из глубинной морской воды, значительно увеличило типы бактериальных штаммов, пролиферацию которых можно ингибировать, и, как только полная минеральная концентрация достигла 5900 мг/кг, эти обогащенные минералами воды являются эффективными в ингибировании пролиферации всех типов штаммов Helicobacter Pylori. Кроме того, эффекты ингибирования пролиферации штаммов Helicobacter Pylori являются особенно выдающимися при высокой концентрация магния.