ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКА С МЕЛАНОМА-ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ (МИА) В КАЧЕСТВЕ РАННЕГО ИНДИКАТОРА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ОТВЕТА ПРИ МЕЛАНОМЕ
USE OF MELANOMA INHIBITORY ACTIVITY (MIA) PROTEIN AS EARLY INDICATOR FOR THERAPEUTIC RESPONSE IN MELANOMA

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в качестве раннего индикатора ответа на лечение ингибитором клеток опухоли меланомы у пациентов млекопитающих, больных меланомой.
Уровень техники
Общая заболеваемость меланомой среди мужчин и женщин в США повышается (см. например, Edwards B.K. и др., J. Nat. Cancer Inst. 97, 2005, cc.1407-1427). С 1981 года темпы роста заболеваемости меланомой возрастают примерно на 3% в год. По данным Американского общества по борьбе с раком (American Cancer Society) в США в 2005 году было примерно 59580 новых случаев заболевания меланомой и примерно 7700 людей умерло от этого заболевания (Amer. Cancer Soc. 2005, cc.1-62). Управление по пищевым продуктам и лекарствам США (FDA) одобрило лечение метастазирующей меланомы, предусматривающее применение дакарбазина, интерферона-альфа, интерлейкина-2 (ИЛ-2). Однако прогноз у пациентов с диссеминированной формой заболевания остается плохим, и в США доля пациентов с 5-летним выживанием составляет 16% или меньше. Из-за недостаточной эффективности современного лечения особенно остро ощущается потребность в новых способах лечения. Новые лекарственные средства, например анти-ангиогенные агенты, Raf-киназа и вакцины, в настоящее время разрабатываются, и смогут улучшить выживаемость пациентов с данным заболеванием (Mandara M. и др., Expert Rev. Anticancer Ther. 6, 2006, cc.121-130).
Исходя из того, что меланома встречается часто, а современные средства лечения недостаточно эффективны, необходим биомаркер меланомы и исследование биомаркера меланомы, который мог бы выступать в роли раннего индикатора терапевтического ответа у млекопитающих для измерения эффективности исследуемых меланома-ингибирующих агентов.
Краткое описание изобретения
В связи с указанным выше, один из объектов способа настоящего изобретения предусматривает определение ответа пациента млекопитающего с клетками опухоли меланомы на лечение агентом, ингибирующим меланому. Этот способ включает: (а) определение первой концентрации белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в первом биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего до начала лечения агентом, ингибирующим меланому, (б) определение второй концентрации МИА во втором биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего после начала лечения агентом, ингибирующим меланому, и (в) сравнение первой и второй концентраций МИА, причем уменьшение второй концентрации МИА, измеренной во втором биологическом образце, по сравнению с первой концентрацией МИА, измеренной в первом биологическом образце, свидетельствует о положительном ответе на лечение агентом, ингибирующим меланому.
Другой объект настоящего изобретения предусматривает способ оценки эффективности агента, ингибирующего меланому, для лечения меланомы у пациента млекопитающего, больного меланомой. Указанный способ включает: (а) определение первой концентрации белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в первом биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего до начала лечения агентом, ингибирующим меланому, (б) определение второй концентрации МИА во втором биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего после начала лечения агентом, ингибирующим меланому, и (в) сравнение первой и второй концентраций МИА, причем уменьшение второй концентрации МИА, измеренной во втором биологическом образце, по сравнению с первой концентрацией МИА, измеренной в первом биологическом образце, свидетельствует об эффективности ингибирующего агента в лечении меланомы.
Другой объект настоящего изобретения предусматривает способ определения того, следует ли пациенту продолжить лечение агентом, ингибирующим меланому. Указанный способ включает: (а) определение первой концентрации белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в первом биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего до начала лечения агентом, ингибирующим меланому, (б) определение второй концентрации МИА во втором биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего после начала лечения агентом, ингибирующим меланому, (в) сравнение указанных первой и второй концентраций МИА, и (г) определение того, следует ли продолжать лечить пациента агентом, ингибирующим меланому, если вторая концентрация МИА понижена по меньшей мере на 20% по сравнению с первой концентрацией МИА.
Еще один объект настоящего изобретения предусматривает способ идентификации агентов, применимых для лечения меланомы. Указанный способ включает: (а) определение первой концентрации белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в первом биологическом образце, взятом от линии культивируемых клеток меланомы млекопитающего перед введением агента к линии клеток меланомы млекопитающих, (б) определение второй концентрации МИА во втором образце, взятом от линии культивируемых клеток меланомы млекопитающего после введения агента к линии культивируемых клеток меланомы млекопитающего, (в) сравнение первой и второй концентраций МИА, и (г) определение того, что агент применим для лечения меланомы, если вторая концентрация понижена по меньшей мере на 20% по сравнению с первой концентрацией МИА.
Краткое описание фигур
Указанные выше объекты и многие преимущества настоящего изобретения могут стать понятнее благодаря подробному описанию, а также, если их рассматривать вместе с поясняющими фигурами.
Фиг.1А показывает сопоставление аминокислотных последовательностей белков МИА, полученных и от млекопитающих, и не от млекопитающих.
Фиг.1Б показывает сопоставление аминокислотных последовательностей белков МИА, полученных от приматов.
Фиг.2 представляет графически результаты исследования МИА методом ELISA, показывающие, что МИА секретируется в культуральные среды из линий клеток меланомы, но не из линий клеток карциномы толстой кишки, согласно описанному в примере 1.
3
Фиг.3 представляет графически результаты исследования МИА методом ELISA на не подвергнутых какому-либо воздействию мышах (n=4) и на бестимусных голых мышах, имплантированных клетками меланомы человека А375М, у которых объем опухолей составляет примерно 250 мм (n=10), согласно описанному в примере 2.
Фиг.4А представляет графически, что уровни МИА в плазме снижаются в ответ на ингибирование роста опухоли, индуцированное пероральным дозированием соединения CHIR-265 модельных мышей с привитой меланомой человека А375М, согласно описанному в примере 2.
Фиг.4Б представляет графически, что уровни МИА в плазме снижаются в ответ на ингибирование роста опухоли, индуцированное пероральным дозированием соединения CHIR-265 и сорафениба модельных мышей с привитой меланомой человека MEXF 276, согласно описанному в примере 2.
Фиг.4В представляет графически, что уровни МИА в плазме снижаются в ответ на ингибирование роста опухоли, индуцированное пероральным дозированием соединения CHIR-265 и сорафениба модельных мышей с привитой меланомой человека MEXF 1341, согласно описанному в примере 2.
Фиг.5А представляет графически ранние изменения уровней МИА в плазме для лечения соединением CHIR-258 и CHIR-265 модельных мышей с привитой меланомой человека А375М, согласно описанному в примере 3.
Фиг.5Б показывает объемы опухолей у мышей с опухолью меланомы человека А375 перед дозированием (0 сутки) и на 3, 8 и 13 сутки после лечения CHIR-258 или CHIR-265 по сравнению с контролями (растворителем), согласно описанному в примере 3.
Фиг.6А показывает объемы опухолей у мышей с опухолью меланомы человека CHL-1 перед дозированием (0 сутки) и на 8 и 22 сутки после лечения соединением CHIR-258 (в концентрации 30 мг/кг и 80 мг/кг) по сравнению с контролями (растворителем), согласно описанному в примере 4.
Фиг.6Б представляет графически ранние изменения уровней МИА в плазме в ответ на лечение соединением CHIR-258 (в концентрации 30 мг/кг и 80 мг/кг) модельных мышей с привитой меланомой человека CHL-1, согласно описанному в примере 4.
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения
Если не указано иначе, все понятия, используемые в настоящем изобретении, имеют те же значения, которые им придают специалисты в данной области. Ниже приведены пояснения для обеспечения четкости понятий, используемых в настоящем описании и в формуле изобретения, необходимых для описания настоящего изобретения.
В контексте настоящего изобретения понятие «положительный ответ на лечение млекопитающего» относится к уменьшению объема опухоли и/или ингибированию роста опухоли после лечения агентом, подавляющим меланому.
Один из объектов настоящего изобретения предусматривает способ определения ответа пациента млекопитающего, больного меланомой, на лечение агентом, ингибирующим меланому. Указанный способ включает: (а) определение первой концентрации белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в первом биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего до начала лечения агентом, ингибирующим меланому, (б) определение второй концентрации МИА во втором биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего после начала лечения агентом, ингибирующим меланому, и (в) сравнение первой и второй концентраций МИА, причем уменьшение второй концентрации МИА, измеренной во втором биологическом образце, по сравнению с первой концентрацией МИА, измеренной в первом биологическом образце, свидетельствует о положительном ответе на лечение агентом, подавляющим меланому.
В контексте настоящего изобретения понятие «меланома-ингибирующая активность («МИА»)» относится к растворимому белку массой 12 кДа, представленному в общедоступной базе данных GenBank под номером NP_006524 и кодируемому кДНК, представленной в базе данных GenBank под номером NM_006533, а также к гомологам млекопитающих или их фрагментам, включающим по меньшей мере десять последовательно расположенных остатков белка МИА. Установлено, что МИА участвует в отсоединении клеток меланомы от внеклеточного матрикса путем связывания молекул фибронектина и ламинина, тем самым, предупреждая взаимодействие клеток с матриксом (Brockez L. и др., Br. J. Dermatol. 143, 2000, сс. 256-268). Первоначально МИА был выделен из супернатанта клеток меланомы линии HTZ-19 человека (Bogdahn U. и др., Cancer Res. 49, 1989, cc.5358-5363). Из фиг.1А следует, что белок МИА человека состоит из 131 аминокислоты, из которых первые 24 аминокислоты представляют сигнальную последовательность, которая направляет секрецию МИА во внеклеточный компартмент. Зрелый секретированный МИА человека состоит из 107 аминокислот.
На фиг.1А также показано, что гомологи белка МИА были обнаружены у разных млекопитающих и видов, не относящихся к классу млекопитающих, включая, например, крыс (r), мышей (m), шимпанзе (chimp), макаку Резус (rh), собак (d), крупный рогатый скот (bov), хомяков (ham) и иглобрюхих скалозубых рыб-собак (Puffer fish) (pf). Аминокислотную последовательность МИА человека можно получить в базе данных Genbank под номером NP_006524, аминокислотную последовательность белка МИА мыши можно получить в базе данных Genbank под номером NP_062267, аминокислотную последовательность белка МИА крысы можно получить в базе данных Genbank под номером NP_110479, аминокислотную последовательность белка МИА хомяка можно получить в базе данных Genbank под номером AAF76220, аминокислотную последовательность белка МИА крупного рогатого скота можно получить в базе данных Genbank под номером NP_776361, аминокислотную последовательность белка МИА макаки Резус можно получить в базе данных Genbank под номером ХР_001098600, аминокислотную последовательность белка МИА собаки можно получить в базе данных Genbank под номером Number ХР_541610, аминокислотную последовательность белка МИА шимпанзе можно получить в базе данных Genbank под номером ХР_512675 и аминокислотную последовательность белка МИА иглобрюхой скалозубой рыбы-собаки можно получить в базе данных Genbank под номером Genbank Number AAL26991, согласно данным на 20 июля 2006 года.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белки МИА, применимые в практике настоящего изобретения, по меньшей мере на 70% идентичны (например, по меньшей мере на 80% идентичны, или по меньшей мере на 90% идентичны, по меньшей мере на 95% идентичны, по меньшей мере на 99% идентичны) аминокислотной последовательности белка МИА человека, представленного в базе данных Genbank под номером NP_006524, показанного на фиг.1А, или его фрагмента, включающего по меньшей мере десять последовательно расположенных остатков белка МИА.
Понятия «процент идентичности» или «идентичный процент» применительно к белку МИА означают процент аминокислотных остатков в последовательности исследуемого белка, идентичных аминокислотным остаткам белковой последовательности пациента, после сличения исследуемой последовательности с последовательностью пациента для выявления максимального процента идентичности. Например, процент идентичности двух белковых последовательностей может быть определен по парным сравнением двух последовательностей, используя интерфейс bl2seq на сайте Национального центра информации в области биотехнологии (National Center for Biotechnology Information - NCBI) Национальной библиотеки медицины США (US National Library of Medicine), 8600 Rockville Pike, Bethesda, Md. 20894, USA Интерфейс bl2seq позволяет сличать последовательности, используя компьютерную программу BLAST, описанную Tatiana A. и др., FEMS Microbiol Lett. 174, 1999, cc.247-250. Используют следующие параметры сличения: матрица = BLOSUM62, штраф на внесение делеции = 11, штраф на продолжение делеции = 1, величина x_dropff делеции = 50, Expect = 10,0, размер поля (Word size) = 3 и Filter = off.
Фиг.1А показывает сопоставление аминокислотных последовательностей гомологов МИА. Процент идентичности разных гомологов МИА, показанных на фиг.1А, показан ниже в табл.1. Из фиг.1Б и табл.1 следует, что аминокислотная последовательность МИА в высокой степени консервативна и идентична у человека и шимпанзе.
Таблица 1.
Процент идентичности МИА
МИА человека
МИА макаки Резус
МИА шимпанзе
МИА мыши
МИА крысы
МИА собаки
МИА крупного рогатого скота
МИА хомяка
МИА иглобрюхой скалозубой рыбы-собаки
МИА человека
100
96
100
81
83
88
85
73
38
МИА макаки Резус
100
96
82
83
91
87
73
38
МИА шимпанзе
100
81
83
88
85
73
38
МИА мыши
100
92
84
80
66
37
МИА крысы
100
85
81
69
37
МИА собаки
100
86
70
37
МИА крупного рогатого скота
100
67
40
МИА хомяка
100
56
МИА иглобрюхой скалозубой рыбы-собаки
100
МИА является секретируемым белком и, следовательно, его можно обнаружить в доступных тканях, например, в биологических жидкостях, в том числе в крови (включая плазму и сыворотку), в моче и в образцах тканей, например, в биопсийных образцах опухоли меланомы. Следовательно, наличие или концентрация МИА, установленная до и после лечения, могут быть использованы для определения ответа млекопитающего на лечение агентом, ингибирующим меланому, согласно описанию в примерах 1 и 2 и иллюстративному материалу на фиг.2-4. Также было установлено, что снижение концентрации МИА, измеренное после лечения исследуемым агентом, ингибирующим меланому, по сравнению с концентрацией МИА до лечения, выступает в качестве раннего и точного показателя эффективности агента для лечения меланомы у пациента млекопитающего, что описано в примерах 3 и 4 и показано на фиг.4-5Б.
В соответствии со способом настоящего изобретения первый биологический образец взят от пациента млекопитающего перед началом лечения агентом, ингибирующим меланому, и второй биологический образец взят от пациента млекопитающего по меньшей мере один раз после инициации лечения агентом, ингибирующим меланому. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения у пациента, подвергаемого лечению, отбирают большое количество биологических образцов (например, у пациента на стадии доклинического исследования) с периодическими интервалами после начала лечения агентом, ингибирующим меланому.
В контексте настоящего изобретения понятие «лечение» относится к введению одного или нескольких агентов, ингибирующих меланому, для облегчения симптомов, связанных с меланомой, или для остановки дальнейшего прогрессирования, или ухудшения симптомов, или предупреждения или профилактики меланомы. Например, успешное лечение может включать облегчение симптомов или остановку прогрессирования заболевания, измеренных по уменьшению скорости роста опухоли, уменьшению роста опухоли, уменьшению размера опухоли, частичную или полную ремиссию меланомы, или повышенную степень выживаемости, или улучшение клинических показателей. Понятие «инициация лечения» относится ко времени начала введения агента (агентов), ингибирующего меланому.
Например, биологические образцы могут отбираться от подвергаемого лечению пациента ежедневно после начала лечения или на периодической основе после инициации лечения агентом, ингибирующим меланому, на протяжении по меньшей мере 3 суток, и по меньшей мере до 3 месяцев или дольше. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биологические образцы от подвергаемого лечению пациента берут до начала лечения и по меньшей мере один раз на протяжении периода от 3 суток до 3 месяцев (например, на протяжении 1 недели, 2 недель, 1 месяца, 2 месяцев или 3 месяцев) после начала лечения.
Схемы лечения агентами, ингибирующими меланому, описанные в настоящем изобретении, хорошо известны специалистам в данной области. Например, без ограничений, агент, ингибирующий меланому, может вводиться пациенту, нуждающемуся в этом, ежедневно на протяжении 7, 14, 21 или 28 суток, после чего на протяжении 7 или 14 суток соединение не вводят. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения цикл лечения включает введение количества агента, ингибирующего меланому, ежедневно на протяжении 7 суток, после чего на протяжении 7 суток соединение не вводят. Цикл лечения может повторяться один или несколько раз для осуществления курса лечения. Кроме того, агент, ингибирующий меланому, может вводиться один раз, два раза, три раза или четыре раза на протяжении фазы введения цикла лечения. В других вариантах осуществления настоящего изобретения способы также включают введение количества агента, ингибирующего меланому, один раз, два раза, три раза или четыре раза ежедневно или через день на протяжении курса лечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения схемы лечения дополнительно включают введение агента, ингибирующего меланому, в качестве части цикла лечения. Цикл лечения включает фазу введения, во время которой агент, ингибирующий меланому, вводят пациенту на регулярной основе за исключением выходных дней, когда соединение не вводится. Например, цикл лечения может включать ежесуточное введение количества агента, ингибирующего меланому, на 7, 14, 21 или 28 сутки, после которых в течение 7 или 14 суток агент не вводится. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения цикл лечения включает введение количества агента, ингибирующего меланому, ежедневно в течение 7 суток, и в последующие 7 суток агент не вводят. Цикл лечения может быть повторен один или несколько раз для обеспечения курса лечения. Кроме того, агент, ингибирующий меланому, может вводиться ежедневно один, два, три или четыре раза на протяжении фазы введения цикла лечения. В других вариантах осуществления настоящего изобретения способы дополнительно включают введение количества агента, ингибирующего меланому, один, два, три или четыре раза ежедневно или через сутки на протяжении курса лечения. Курсом лечения называется период времени, на протяжении которого пациента лечат от рака указанными способами. Например, курс лечения может распространяться на один или несколько циклов лечения или на период времени, во время которого пациент получает ежедневно или с перерывами дозы агента, ингибирующего меланому.
Биологический образец может быть образцом ткани или образцом жидкости, взятым у пациента из класса млекопитающих, например, образцом крови или мочи, или клиническим образцом, например, биопсийным образцом меланомы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биологическим образцом может быть образец крови. Образец крови может быть каким-либо типом образца крови, применимым для измерения концентрации белка МИА. Например, цельная кровь, плазма (например, отделенная центрифугированием) или сыворотка из плазмы (например, полученная путем коагуляции или в пробирках для отделения сыворотки) может применяться в практике применения способа настоящего изобретения.
Способы настоящего изобретения могут применяться для каких-либо пациентов из класса млекопитающих, обладающих клетками опухоли меланомы, например, для людей, макаки Резус, шимпанзе, мышей, крыс, собак, крупного рогатого скота, кроликов, морских свинок, хомяков, коз, овец или лошадей.
Наличие или концентрация белка МИА в первом биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего, может быть определена, используя какое-либо исследование, позволяющее выявить и/или измерить количество белка МИА. Например, наличие или концентрацию белка МИА можно определить, используя иммунофлуоресцентное окрашивание, жидкостную цитометрию, масс-спектрометрию, иммуноцитохимию, иммуноблоттинг или ELISA. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения концентрацию белка МИА измеряют в биологическом образце млекопитающего, используя антитело, которое специфически связывает МИА, например, метод ELISA или вестерн-блоттинг. Пример метода исследования ELISA для обнаружения уровней МИА в образцах крови описан в примере 1.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения концентрацию белка МИА определяют в биологическом образце, используя вестерн-блоттинг, согласно описанному в примере 1.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения концентрацию белка МИА определяют в биологическом образце, используя методы иммуногистохимии. Например, биологический образец, например, осажденные клетки меланомы человека, погруженные в парафин, трансплантированная меланома, а также меланома и здоровые ткани, выделенные от пациентов, могут быть применены для оценки уровня экспрессии МИА методами иммуногистохимии. Такие иммуногистохимические исследования могут осуществляться с помощью методов, известных специалистам в данной области, например, обнаружение МИА может сопровождаться окрашиванием клеток с помощью прибора Ventana Discovery Autostainer (фирма Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Аризона), используя стандартный протокол обработки клеток 1 для поиска антигена. Срезы тканей инкубируют без нагревания в течение 30-120 мин с антителами к МИА человека и контролями IgG, полученными до иммунизации (фирма Novartis AG, Emeryville, Калифорния), в концентрации 1-20 мкг/мл. Продукт Ventata Universal Secondary (фирма Ventana Medical Systems, Inc.) добавляют к срезам тканей и инкубируют в течение 10-60 мин, затем для выявления вносят продукт Ventana DABMap (фирма Ventana Medical Systems, Inc). Гематоксилин Ventana и реагент Bluing (фирма Ventana Medical Systems, Inc.) могут применяться в качестве красителей для подсчета. Срезы обезвоживают в градиенте растворов спиртов, осветляют в ксилене и накрывают покровным стеклом, используя синтетические поддерживающие среды.
В соответствии со способом настоящего изобретения, снижение второй концентрации МИА, измеренной во втором биологическом образце, взятом от пациента после инициации лечения агентом, ингибирующим меланому, по сравнению с первой концентрацией МИА, измеренной в первом биологическом образце, взятом от пациента до инициации лечения (или в сравнении с предварительно установленным контрольным уровнем), является показателем положительного ответа пациента на лечение ингибирующим агентом. Из примеров 3 и 4 следует, что корреляция присутствует между статистически значимым снижением концентрации МИА в биологическом образце, взятом у пациента из класса млекопитающих, после лечения агентом, ингибирующим меланому, и соответствующим снижением нагрузки опухоли меланомы у млекопитающего по сравнению с млекопитающим, в организме которого имеются клетки опухоли меланомы, и который не подвергался лечению ингибирующим агентом.
В некоторых вариантах осуществления способа настоящего изобретения снижение концентрации МИА в биологическом образце, взятом вскоре после начала лечения агентом, ингибирующим меланому, например, на 3-8 сутки после начала лечения, является ранним индикатором (например, средством прогноза) снижения опухолевой нагрузки у пациента млекопитающего, подвергавшегося лечению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения снижение опухолевой нагрузки связано с уменьшением объема опухоли по сравнению с объемом опухоли при начале лечения, тем самым, показывая, что ингибирующий агент проявляет цитотоксическую активность в отношении клеток меланомы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения снижение опухолевой нагрузки связано с уменьшением объема опухоли по сравнению с контрольным пациентом млекопитающим, который не получал агента, ингибирующего меланому, тем самым показывая, что ингибирующий агент проявляет цитостатическую активность в отношении клеток меланомы.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения снижение уровня МИА по меньшей мере на 20%, измеренное в биологическом образце, взятом у пациента (млекопитающего) в течение 3 месяцев после лечения, по сравнению с биологическим образцом, взятым от пациента, не подвергавшегося лечению, показывает позитивный ответ на агент, ингибирующий меланому. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения снижение уровня МИА по меньшей мере на 20%, измеренное в биологическом образце, взятом от пациента (млекопитающего) в течение 3 суток после лечения, по сравнению с биологическим образцом, взятым у пациента, не подвергавшегося лечению, свидетельствует о положительном ответе на агент, ингибирующий меланому.
Способы настоящего изобретения могут применяться для определения ответа пациента (млекопитающего) на лечение каким-либо агентом, ингибирующим меланому, например, низкомолекулярным соединением, лекарственным белком, антителом, нуклеиновой кислотой. В контексте настоящего изобретения агентом, ингибирующим меланому, является какой-либо агент, который вызывает ингибирование роста клеток меланомы, и культивируемых клеток in vitro, и/или клеток in vivo у млекопитающих. К примерам ингибирующих меланому агентов, которые могут быть применены в практике настоящего изобретения, относятся, но ими не ограничиваются, CHIR-265, сорафениб, CHIR-258, дакарбазин (DTIC, продукт DTIC-Dome), темозоломид (продукт Temodar), кармустин (BCNU, продукт BiCNU), ломустин (CeeNU), ИЛ-2 (продукт Proleukin) и интерферон альфа-2b (продукт IntonA).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способы настоящего изобретения применяют для определения ответа млекопитающего, в организме которого имеются опухолевые клетки меланомы, на лечение агентом, ингибирующим меланому, выбранным из группы, включающей соединения: CHIR-265, сорафениб и CHIR-258, подробное описание которых приведено в примерах 2-4.
Соединение CHIR-265, в настоящее время также обозначаемое «RFB-265», является {1-метил-5-[2-(5-трифторметил-1Н-имидазол-2-ил)-пиридин-4-илокси]-1Н-бензоимидазол-2-ил}-(4-трифторметил-фенил)-амином:
Соединение CHIR-265 является новым ингибитором Raf/VEGFR, описанным в работах Venetsanakos E. и др., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 47, 2006, реферат 4854, Amiri P. и др., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 47, 2006, реферат 4855, Stuart D. и др., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 47, 2006, реферат 4856, которые включены в настоящее изобретение в виде ссылок.
Соединение CHIR-258, в настоящее время обозначаемое «TKI258», имеющее структуру 4-амино-5-фтор-3-[5-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-бензимидазол-2-ил]хинолин-2(1Н)-он, описано в US 6774237. Соединение CHIR-258 является ингибитором многоцелевых рецепторных тирозинкиназ (RTK), описанным в работах Lopes de Menezes D.E. и др., Clin. Cancer Res. 11, 2005, cc.5281-5291, Lee S.H. и др., Clin. Cancer Res. 11, 2005, cc.3633-3641, которые включены в настоящее изобретение в виде ссылок. Сорафениб (также обозначаемый «BAY 43-9006») является ингибитором Raf-киназы и рецепторной тирозинкиназы (Receptor Tyrosine Kinase - RTK), описанным в публикации Wilhelm S.M. и др., Cancer Res. 64, 2004, сс.7099-7109, которая включена в настоящее изобретение в виде ссылки.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способы настоящего изобретения применяют для определения ответа пациента млекопитающего, обладающего клетками опухоли меланомы, на лечение соединением CHIR-265. В соответствии с данным вариантом описания настоящего изобретения было установлено, что уровни МИА быстро понижаются в биологических образцах, полученных от животных с опухолями меланомы, которым перорально вводили соединение CHIR-265 в дозе 100 мг/кг через сутки. Из фиг.5А и примера 3 следует, что уровни МИА (начиная со среднего уровня 27,8 нг/мл) снижаются к третьим суткам у животных, подвергавшихся лечению соединением CHIR-265 (100 мг/кг), до среднего уровня 10,4 нг/мл (снижение 62%), который связан с регрессией опухоли на 29% согласно измерениям на 3 сутки (см. фиг 5Б).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения способы настоящего изобретения используют для определения ответа пациента (млекопитающего), обладающего клетками опухоли меланомы, на лечение соединением CHIR-258. В соответствии с настоящим изобретением установлено, что уровни МИА снизились в биологических образцах, полученных от животных, имеющих опухоль меланомы, которым вводили CHIR-258 в количестве 60 мг/кг в 10 дозах на протяжении периода длительностью 13 суток. Из фиг.4А следует, что статистически значимое снижение МИА, установленное на 3 сутки у животных, которых лечили соединением CHIR-258 (60 мг/кг), связано с ингибированием роста опухоли, согласно измерениям на 8 сутки (см. фиг.5Б).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения снижение концентрации МИА во втором биологическом образце, полученном от пациента человека после лечения, например, в сыворотке крови, по сравнению с концентрацией МИА в первом биологическом образце, полученном от пациента человека перед лечением, используют в качестве ранней точки оценки эффективности для прогноза эффективности агента, ингибирующего меланому, в уменьшении опухолевой нагрузки у пациентов, включенных в клиническое исследование.
Способы настоящего изобретения могут быть использованы для определения ответа пациента млекопитающего на лечение агентом, ингибирующим меланому, введенным каким-либо соответствующим способом введения. Агент, ингибирующий меланому, может быть введен в составе фармацевтической композиции. Обычные способы, известные специалисту в данной области медицины, могут быть применены для введения фармацевтической композиции пациенту млекопитающему обычными путями (например, оральным, подкожным, внутрилегочным, чрезслизистым, внутрибрюшинным, внутриматочным, подъязычным, подоболочечным или внутримышечным путем) стандартными методами. Например, агент, ингибирующий меланому, может быть скомбинирован или введен с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или разбавителем, которые могут иметь самые разные формы, в зависимости от формы препарата, который предназначен для введения. Например, при приготовлении композиций в пероральной дозовой форме какая-либо из обычных фармацевтических сред может быть применена, например, вода, гликоли, масла, спирты и др.
Способы настоящего изобретения могут быть использованы для определения эффективного количества агента, ингибирующего меланому, для введения пациенту млекопитающему. Эффективное количество означает количество или дозу, обычно достаточную вызвать примерно желаемый терапевтический лечебный эффект у пациентов млекопитающих, проходящих лечение. Эффективные количества или дозы агента, ингибирующего меланому, могут быть определены обычными методами, например, моделированием, исследованием повышения дозы или клиническими исследованиями, а также анализом обычных факторов, например, типом или путем введения или высвобождения лекарственного средства, фармакокинетике агента, тяжести и течения меланомы, предшествующей или последующей терапии пациента, состояния здоровья пациента и ответа на лекарственные средства. Примерная доза находится в диапазоне примерно от 0,001 до примерно 200 мг/кг массы тела пациента в сутки, предпочтительно примерно от 0,05 до примерно 100 мг/кг/сутки, или примерно от 1 до 35 мг/кг/сутки. В другом варианте дозы могут вводиться на периодической основе, например, через сутки (например, 0,05-100 мг/кг через сутки).
В другом объекте настоящее изобретение предусматривает способ определения того, следует ли пациента млекопитающего продолжать лечить агентом, ингибирующим меланому. В связи с этим способы настоящего изобретения включают: (а) определение первой концентрации белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в первом биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего перед инициацией лечения агентом, ингибирующим меланому, (б) определение второй концентрации МИА во втором биологическом образце от пациента млекопитающего, взятого после инициации лечения агентом, ингибирующим меланому, (в) сравнение указанных первой и второй концентраций МИА и (г) определение того, следует ли продолжать лечение пациента агентом, ингибирующим меланому, если вторая концентрация МИА снижается по меньшей мере на 20% по сравнению с первой концентрацией МИА. В соответствующих способах настоящего изобретения могут применяться какие-либо агенты, ингибирующие меланому, в том числе агенты, описанные в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй биологический образец берут от пациента до инициации лечения и по меньшей мере один раз в период от 3 суток до 3 месяцев (например, за 1 неделю, за 2 недели, за 1 месяц, за 2 месяца или за 3 месяца) после начала лечения.
В другом объекте настоящее изобретение предусматривает способ оценки эффективности агента, ингибирующего меланому, для лечения меланомы у пациента млекопитающего, больного меланомой. Указанный способ включает: (а) определение первой концентрации белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в первом биологическом образце, взятом от пациента млекопитающего перед инициацией лечения агентом, ингибирующим меланому, (б) определение второй концентрации МИА во втором биологическом образце от пациента млекопитающего, взятого после инициации лечения агентом, ингибирующим меланому, и (в) сравнение указанных первой и второй концентраций МИА, причем снижение второй концентрации МИА, измеренной во втором биологическом образце, по сравнению с первой концентрацией МИА, измеренной в первом биологическом образце, является показателем эффективности ингибирующего агента для лечения меланомы.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ настоящего изобретения дополнительно включает измерение объема по меньшей мере одной опухоли меланомы у пациента млекопитающего перед лечением ингибирующим агентом, и по меньшей мере один раз после введения ингибирующего агента и сравнения измерений объема опухоли, сделанные перед началом лечения и после лечения для того, чтобы определить, не был ли объем опухоли уменьшен. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения снижение в сыворотке концентрации МИА перед выявлением измеряемого снижения объема опухоли положительно коррелирует с эффективностью ингибирующего агента для лечения меланомы. Например, согласно описанному в примере 3 установлено на модельных мышах с привитой меланомой, что лечение агентом CHIR-258 (60 мг/кг), ингибирующим меланому, приводит к статистически значимому снижению концентрации в плазме МИА на 3 сутки, что предполагалось и используется в качестве прогноза для определения статистически значимого снижения нагрузки на организм опухоли, по сравнению с пациентами, которых лечили растворителем, наблюдаемого к 8 суткам (см. фиг.5А и 5Б). Кроме того, степень уменьшения опухоли из-за лечения разными агентами, ингибирующими меланому, коррелировала с уровнями МИА в плазме, например, лечения соединением CHIR-265 (МИА ниже уровня обнаружения при концентрации 3 нг/мл, >97% подавления роста опухоли), лечения сорафенибом (МИА 28,9 нг/мл, 69% подавление роста опухоли).
2
Объем опухоли у пациента (млекопитающего) может быть измерен с помощью какого-либо известного метода. Например, измерения размеров могут быть использованы для оценки объема опухоли по формуле: (a×b)×0,5, в которой «a» означает наибольший диаметр, а «b» означает длину, перпендикулярную диаметру, согласно описанию в примере 2. К другим методам, применимым для выявления уменьшения объема опухолей у пациентов млекопитающих, например, у людей, относят методы визуализации, например, сканирующую компьютерную томографию (КТ), сканирующее магнитно-резонансное исследование (МРИ). Обычно оценивают сокращение опухолей вместе с методами визуализации, используя критерии оценки ответа плотных опухолей (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors - RECIST) согласно описанию в публикации в Jour Natl. Cancer Instit. 92, 2000, cc.205-216, включенной в настоящее изобретение в виде ссылки. К другим методам, которые могут быть применены для оценки метаболической активности опухоли in vivo, включая позитронную эмиссионную томографию (positron emission tomography - PET), фтордезоксиглюкозу (FDG-PET), а синтез ДНК может быть оценен, используя фтордезокситимидин (FLT-PET). Применительно к доклиническим моделям могут быть применены дополнительные методы, которые включают применение клеток опухолей меланомы, генетически модифицированных маркерными генами, например, геном люциферазы.
Способы настоящего изобретения могут применяться для оценки эффективности одного или нескольких исследуемых агентов, ингибирующих меланому, в модельных животных, например, в доклиническом исследовании. Например, практика осуществления способа настоящего изобретения описывается, используя модель привитой опухоли меланомы человека в примере 2 ниже.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается способ выявления агентов, которые могут применяться в лечении меланомы. Способ включает: (а) определение первой концентрации белка с меланома-ингибирующей активностью (МИА) в первом биологическом образце, взятом от культивируемой линии клеток меланомы млекопитающего перед введением агента к линии клеток меланомы млекопитающего, (б) определение второй концентрации МИА во втором образце, взятом от линии клеток меланомы млекопитающего после введения агента к линии клеток меланомы млекопитающего, и (в) сравнение указанных первой и второй концентраций МИА, и (г) подтверждения, что агент может применяться для лечения меланомы, если вторая концентрация МИА снижается по меньшей мере на 20% по сравнению с первой концентрацией МИА.
Способы настоящего изобретения могут применяться, используя какой-либо тип агента, который является исследуемым агентом, ингибирующим меланому, для терапевтического применения пациента млекопитающего, больного меланомой. Например, агент может быть низкомолекулярным соединением, белковым терапевтическим средством, антителом или молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы применяют для идентификации одного или нескольких агентов из множества агентов, например, комбинаторной библиотеки низкомолекулярных соединений. Агент может быть введен к культивируемым клеткам меланомы млекопитающего каким-либо образом, соответствующим типу агента, используя методы, хорошо известные специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы могут применяться с агентом, ингибирующим меланому, в качестве положительного контроля, например, с CHIR-265, сорафенибом или CHIR-258, согласно описанному в настоящем изобретении. Способы могут применяться с какой-либо линией клеток меланомы млекопитающих, например, линии клеток меланомы млекопитающих, выбранной из группы, состоящей из G361, SKMEL-28, А375М и CHL-1, согласно приведенному ниже описанию в примере 1.
Хотя предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения проиллюстрирован и описан, следует учесть, что могут быть произведены разные изменения без отклонения от духа и области охвата настоящего изобретения.
Пример 1
Этот пример показывает, что МИА экспрессируется и секретируется из линии клеток меланомы человека и не экспрессируется в линиях клеток рака прямой кишки человека.
Методы
Линии клеток: Линии клеток меланомы человека G361, SKMEL-28, CHL-1 и линию клеток карциномы толстой кишки НСТ-116 получают из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection - ATCC) (Manassas, Виргиния). Линию клеток меланомы человека А375М и линию клеток карциномы толстой кишки человека НТ-29Р получают из Университета штата Техас, M.D. Anderson Cancer Center (Хьюстон, Техас).
2
Культура клеток: Линии клеток G361, А375М и НТ-29Р культивируют в среде McCoy's 5A, линию клеток SKMEL-28 поддерживают в среде Minimum Essential Medium (MEM), линию клеток CHL-1 выращивают в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbeccos Modification of Eagles Medium - DMEM), a линию клеток НСТ-116 культивируют в среде RPMI 1640. Все среды для культур клеток обогащают 10% фетальной сыворотки теленка, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ натрия пирувата, 1X MEM витаминами, 1X MEM аминокислотами и 1X MEM аминокислот, не являющихся незаменимыми. Все линии клеток поддерживают при 37°C во влажной атмосфере 5% CO.

Анализ вестерн-блоттинг: линии клеток меланомы человека (А375М, G361, SKMEL-28 и CHL-1) и линии клеток карциномы толстой кишки человека (НТ-29Р и НСТ-116) промывают дважды в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, фирма Mediatech, Inc., Herndon, Виргиния) и лизируют в буфере RIPA (50 мМ Tris HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 2 мМ натрий ортованадат, 20 мМ пирофосфат, 1% Triton X-100, 1% натрий дезоксихолат и 0,1% SDS), содержащем свежий 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, таблетки смеси ингибиторов протеазы Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (2 таблетки/25 мл лизирующего буфера) (фирма Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия) и 1X смеси ингибиторов фосфатазы II (Phosphatase Inhibitor Cocktail II, фирма Sigma-Aldrich, Сэнт-Луис, Миссури), в течение 20 мин на льду. Лизаты собирают в центрифужные пробирки, центрифугируют при 4°C в течение 20 мин и фильтруют через пробирки QIAshredder (фирма QIAGEN, Inc., Valencia, Калифорния). Концентрации белков определяют, используя метод ВСА по протоколу производителя (фирма Pierce, Рокфорд, Иллинойс). Образцы подготавливали для проведения вестерн-блоттинга стандартными методами, используя продукт Novex 18% Трис-глициновый гель (фирма Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). МИА обнаруживают с помощью поликлонального антитела козы (фирма R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота), разведенного 1:1000 в солевом Трис-буфере, содержащем 0,1% Tween20 (TBST - Tris buffer saline containing 0,1% Tween20, фирма Fisher Scientific, Гэмптон, Нью-Гэмпшир), с 5% сухого молока, и инкубируют в течение ночи при 4°C. Вторым антителом является связанное с пероксидазой хрена антикозье антитело (фирма Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния), разведенное 1:5000. Полосы белка визуализируют, используя повышенную хемилюминесценцию (фирма Amersham Biosciences, Piscataway, Нью-Джерси). Равную нагрузку и перенос подтверждают обнаружением β-актина (фирма Sigma-Aldrich, Сэнт-Луис, Миссури). Рекомбинантные белки человека МИА (с молекулярной массой 12 кДа), полученные из двух коммерческих источников, используют в качестве положительного контроля (фирма Axxora, LLC, Сан-Диего, Калифорния, и фирма ProSpec-Tany TechnoGene, LTD, Rehovot, Израиль).
Исследование МИА методом ELISA: Равные количества клеток меланомы человека и карциномы прямой кишки (~250000 клеток каждой клеточной линии) высевают в чашки для культуры ткани, и культуральную среду каждой линии клеток собирают через 48 ч. Уровни МИА в культуральных средах или в плазме измеряют с помощью набора для коммерческого одноступенчатого метода ELISA по протоколу производителя (фирма Roche Diagnostics Corporation, Индианополис, Индиана). Концентрации МИА в исследуемых образцах подсчитывают, используя кривую в диапазоне 3-37 нг/мл. Если концентрация МИА превышает наивысшую стандартную концентрацию, образцы разводят 1:5 и исследуют снова для получения результатов, попадающих в линейный диапазон стандартной кривой. Данные оценивают, используя t-критерий Стьюдента (двусторонний критерий), используя Р≤0,05 в качестве уровня значимости.
Результаты: Выявляемые уровни белка МИА наблюдают при анализе методом вестерн-блоттинга для всех исследуемых линий клеток меланомы человека (А375М, G361, SKMEL-28 и CHL-1), но не линий клеток карциномы толстой кишки человека (НТ-29Р и НСТ-116) (данные не представлены). Белок МИА, наблюдаемый в линиях клеток меланомы, мигрирует совместно с рекомбинантным белком МИА положительного контроля (молекулярная масса 12 кДа). Равная нагрузка и перенос методом вестерн-блоттинга подтверждается выявлением β-актина (фирма Sigma-Aldrich, Сэнт-Луис, Миссури).
Фиг.2 показывает результаты измерения методом ELISA секреции МИА в культуральные среды из клеточных линий меланомы и карциномы толстой кишки. На фиг.2 показана секреция МИА линиями клеток меланомы А375М, G361 SKMEL-28 и CHL-1, но не линиями клеток карциномы толстой кишки НТ-29Р и НСТ-116. Пунктирная линия (----) показывает предел чувствительности метода (3 нг/мл).
Полученные результаты показывают, что МИА экспрессируется и секретируется линиями клеток меланомы, но не линиями клеток карциномы толстой кишки.
Пример 2
Этот пример показывает, что МИА может применяться в качестве суррогатного маркера опухолевой нагрузки у мышей с опухолями меланомы человека.
Методы:
Модели животных:
6
3
3
2
Исследование трансплантации меланомы человека А375 проводят на самках бестимусных мышей линии пи/пи (в возрасте 8-12 недель), получаемых от фирмы Charles River Laboratories (Wilmington, Массачусетс). Примерно 2,5×10 клеток имплантируют самкам мышей под кожу в бок. Образцы плазмы собирают при достижении среднего размера опухолей 250 мм (n=10) и хранят при -80°C до анализа МИА. Дозирование обычно начинают при достижении среднего размера опухолей 250 мм. Образцы плазмы исходных мышей (n=4) без опухолей также отбирают для сравнения (фиг.3). Измерения размеров проводят дважды в неделю для определения объема опухолей по формуле: (а×b)×0,5, где «a» обозначает наибольший диаметр, а «b» обозначает длину, перпендикулярную диаметру.
Исследования ксенотрансплантата опухоли меланомы человека MEXF 276 и ксенотрансплантата опухоли меланомы человека MEXF 1341 проводят следующим образом. Клетки опухоли меланомы человека MEXF 276 и клетки эксплантата опухоли меланомы человека MEXF 1341 первоначально получают из образцов, удаленных хирургическим путем у разных пациентов с меланомой (получены от фирмы Oncotest GmbH, Институт экспериментальной онкологии, Фрайбург, Германия), и размножают в качестве ксенотрансплантата в голых мышах. Опухоли после удаления от мышей-доноров режут на фрагменты (1-2 мм в диаметре) и помещают в среду RPMI 1640 перед подкожной имплантацией мышам-реципиентам (самцам линии NMRI пи/пи в возрасте 6-8 недель). Дозирование обычно начинают при достижении опухолями среднего размера 6-8 мм в диаметре. Животных содержат в чистых лабораторных условиях в стерильных вентилируемых клетках и дают стерильный корм для грызунов и воду без ограничений.
Терапевтические агенты: низкомолекулярные соединения CHIR-265, сорафениб и CHIR-258 синтезированы фирмой Chiron Corporation (Emeryville, Калифорния). CHIR-265 и сорафениб перерабатывают в буфере ПЭГ400, CHIR-258 растворяют в воде. Соединение CHIR-265 является новым ингибитором Raf/VEGFR (см. Venetsanakos E. и др., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 47, 2006, реферат 4854, Amiri Р. и др., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 47, 2006, реферат 4855, и Stuart D. и др., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 47, 2006, реферат 4856). Соединение CHIR-258 является многоцелевым ингибитором RTK (см. Lopes de Menezes DE и др., Clin. Cancer Res. 11, 2005, cc.5281-5291, Lee SH и др., Clin. Cancer Res. 11, 2005, cc.3633-3641). Сорафениб является ингибитором Raf-киназы и рецепторной тирозинкиназы (RTK) (см. Wilhelm S.M. и др., Cancer Res. 64, 2004, cc.7099-7109).
Лечение терапевтическими агентами:
лечение лекарственным средством
лечение растворителем
В первом эксперименте мышей с опухолями меланомы человека А375М (n=5) рандомизируют и дозируют перорально соединением CHIR-265 в концентрации 100 мг/кг (n=5) или растворителем (n=5) один раз в сутки через сутки. Животных с опухолями, подвергнутых лечению только буфером ПЭГ400, используют в качестве контроля растворителя. Процент подавления роста опухоли (ПРО) после лечения лекарственным средством подсчитывают следующим образом: 100×[1-(средний объем опухоли/средний объем опухоли)]. Образцы плазмы собирают через 48 ч после введения четвертой дозы (10 сутки) для анализа МИА методом ELISA. Результаты анализа МИА методом ELISA показаны на фиг.4А.
Во втором эксперименте мышей с опухолями меланомы человека MEXF 276 рандомизируют и дозируют перорально соединением CHIR-265 (100 или 10 мг/кг) или сорафенибом (100 мг/кг) n=4/группу. Первые сутки дозирования обозначают «0 сутки». Соответственно, схема дозирования для соединения CHIR-265 составляет 10 мг/кг на 0, 2, 4, 6, 14, 16 и 20 сутки. Для соединения CHIR-265 схема дозирования составляет 100 мг/кг на 0, 2, 14, 16 и 20 сутки. В итоге, схема дозирования для сорафениба и растворителя ПЭГ400 составляет 100 мг/кг ежедневно на протяжении 0-20 суток. Объемы опухолей измеряют дважды в неделю, и процент подавления роста опухолей определяют согласно описанному выше. Измерения объемов опухолей показаны в табл.2. Образцы плазмы собирают через 4 ч после последней дозы на 20 сутки и хранят при -80°C до анализа МИА. Уровни МИА в плазме определяют методом ELISA, который выполняют согласно описанию в примере 1. Результаты исследований МИА методом ELISA показаны на фиг.4Б.
В третьем эксперименте мышей с опухолями меланомы человека MEXF 1341 рандомизируют и дозируют перорально соединением CHIR-265 (100 или 10 мг/кг) или сорафенибом (100 мг/кг) n=4/группу. Первые сутки дозирования обозначают «0 сутки». Соответственно, схема дозирования для соединения CHIR-265 (10 мг/кг) составляет 10 мг/кг на 0, 2, 4, 6, 14, 16 и 20 сутки. Для соединения CHIR-265 (100 мг/кг) схема дозирования составляет 100 мг/кг на 0, 2, 14, 16 и 20 сутки. В итоге схема дозирования сорафениба и растворителя ПЭГ400 составляет 100 мг/кг при ежедневном введении на 0-20 сутки. Объемы опухолей измеряют дважды в неделю, и процент подавления роста опухоли определяют согласно описанному выше. Измерения объемов опухолей показаны в табл.2. Образцы плазмы собирают через 4 ч после введения последней дозы на 20 сутки и хранят при -80°C до анализа МИА. Уровни МИА в плазме определяют методом ELISA, выполняемым согласно описанию в примере 1. Результаты анализа МИА методом ELISA показаны на фиг.4 В.
Результаты
3
Фиг.3 показывает результаты анализа методом ELISA уровня МИА у исходных, не имеющих опухолей мышей (n=4) и у бестимусных голых мышей, имплантированных клетками меланомы человека А375М, с опухолями объемом 250 мм (n=10). На фиг.3 показано, что уровни МИА в плазме, варьирующие от 16 до 48 нг/мл (средняя величина = 31 нг/мл), обнаруживают у мышей с опухолями меланомы. Напротив, величины МИА, получаемые методом ELISA у исходных мышей, ниже предела чувствительности метода (который составляет 3 нг/мл и отмечен на фиг.3 пунктирной линией). Эти результаты показывают, что МИА секретируется in vivo у мышей, несущих клетки меланомы, и может быть обнаружен в плазме методом ELISA.
Таблица 2.
Объем опухолей после лечения ингибиторами опухолей меланомы.
Модель мышей с привитой опухолью:
Объем опухолей (мм<sup>3</sup>)
Растворитель
CHIR-265 (100 мг/кг)
CHIR-265 (10 мг/мл)
Сорафениб
А375М
10 сутки:
10 сутки:
Не выявляется
Не выявляется
Модель мышей с привитой опухолью:
Объем опухолей (мм<sup>3</sup>)
Растворитель
CHIR-265 (100 мг/кг)
CHIR-265 (10 мг/мл)
Сорафениб
436±69,5
133±14,1
MEXF 276
20 сутки: 2902±374
20 сутки: 19±2,9
20 сутки: 58±15,2
20 сутки: 887±196
MEXF 1341
20 сутки: 1895±535
20 сутки: 575±214
20 сутки: 1190±291
20 сутки: 1338±264
3
3
Фиг.4А показывает графически снижение уровней МИА в плазме в ответ на подавление роста опухоли, индуцированное пероральным дозированном соединения CHIR-265 модельным мышам с привитой меланомой А375М. Каждая точка на графике представляет данные, полученные от отдельного животного. Р≤0,05 для уровней МИА в плазме при сравнении лечения растворителем и соединением CHIR-265, согласно t-критерию Стьюдента. Пунктирная линия на графике показывает предел чувствительности метода (3 нг/мл). Выше в табл.2 указано, что средние объемы опухолей на 10 сутки для групп лечения растворителем и соединением CHIR-265 составляют 436±69,5 и 133±14,1 мм, соответственно (±стандартное отклонение оценки) (Р<0,02). Следовательно, соединение CHIR-265, дозируемое перорально в количестве 100 мг/кг через сутки, вызывает существенную регрессию опухоли, почти на 50% после четырех доз, по сравнению с первоначальным объемом опухоли (250 мм). Это соответствует 70% подавлению роста опухоли при сравнении с обработкой растворителем (p<0,02). На фиг.4А показано существенное снижение уровней МИА в плазме, связанное с регрессией опухоли. Уровни МИА у всех подвергавшихся лечению животных близки или ниже предела чувствительности (4 нг/мл) после четырех доз соединения CHIR-265. Напротив, у мышей, обработанных растворителем, средняя концентрация МИА составляет 69,2 нг/мл (варьируя от 21 нг/мл до 119 нг/мл), что в 17 раз выше, чем у мышей, подвергавшихся лечению соединением CHIR-265 (n=5/группу) (Р≤0,05).
3
3
3
3
Фиг.4Б графически показывает, что уровни МИА в плазме снижаются в ответ на подавление роста опухоли, индуцированное пероральным дозированием соединения CHIR-265 и сорафениба у модельных мышей, трансплантированных MEXF 276. Выше в табл.2 показаны средние объемы опухолей, измеренные на 20 сутки для растворителя (2902±374 мм), соединения CHIR-265 в концентрации 100 мг/кг (19±2,9 мм), соединения CHIR-265 в концентрации 10 мг/кг (58±15,2 мм) и сорафениба (887±196 мм) (±стандартное отклонение оценки) (Р<0,007 для всех групп лечения лекарственными средствами по сравнению с группой, в которой применяли растворитель). Следовательно, установлено, что лечение соединением CHIR-265 и сорафенибом, вызвавшее существенное ингибирование роста опухоли на модели меланомы MEXF 276 с >97% подавлением роста опухоли, индуцированным соединением CHIR-265 в обеих дозах и 69% ингибирование роста опухолей при лечении сорафенибом. Из фиг.4Б следует, что указанные ответы по ингибированию опухолей связаны с существенным снижением в плазме уровней МИА у животных, подвергнутых лечению. Средние концентрации в плазме МИА в группе обработки растворителем (113,5 нг/мл) сопоставляют с группой лечения сорафенибом (28,9 нг/мл). Уровни МИА в плазме в группах лечения соединением CHIR-265 ниже предела чувствительности (Р<0,04 для всех случаев лечения лекарственным средством против растворителя). Кроме того, степень уменьшения опухоли в результате лечения коррелирует с уровнями МИА в плазме, например, лечения соединением CHIR-265 (МИА не выявляется, подавление роста опухоли >97%), лечения сорафенибом (МИА 28,9 нг/мл, подавление роста опухоли 69%).
3
3
3
3
Фиг.4В графически показывает, что уровни МИА в плазме снижаются в ответ на подавление роста опухоли при пероральном дозировании CHIR-265 и сорафениба у модельных мышей, привитых меланомой MEXF 1341. В приведенной выше табл.2 показаны средние объемы опухолей, измеренные на 20 сутки для случаев обработки растворителем (1895±535 мм), лечения соединением CHIR-265 в дозе 100 мг/кг (575±214 мм), лечения соединением CHIR-265 в дозе 10 мг/кг (1190±291 мм) и лечения сорафенибом (1338±264 мм) (±стандартное отклонение оценки) (Р>0,08 для всех групп лечения лекарственным средством против группы лечения растворителем). Следовательно, установлено, что лечение соединением CHIR-265 и сорафенибом не вызывает существенного подавления роста опухолей у моделей меланомы MEXF 276 при 37-70% подавлении роста опухолей, индуцированном соединении CHIR-265 в обеих дозах. На фиг.4В показано, что, несмотря на пониженный уровень исходной концентрации МИА в плазме у ксенотрансплантатов MEXF 1341 по сравнению с MEXF276, обнаружено существенное (в 2 раза) снижение МИА в ответ на оба лечения соединением CHIR-265 (Р<0,02). Лечение сорафенибом также снижает в плазме уровни сорафениба (Р>0,17). Согласуясь с результатами, полученными на моделях ксенотрансплантатов А375М и MEXF276, степень уменьшения опухоли у модели ксенотрансплантата MEXF1341, получаемого в результате разных вариантов лечения, коррелирует с уровнями МИА в плазме. Результаты на моделях ксенотрансплантатов MEXF276 и MEXF1341 являются прогнозом для опухолей человека, поскольку опухолевые клетки выделяют от пациента с меланомой человека и серийно пассируют в голых мышах. Поскольку такие опухолевые клетки не растут в культуре, они более полно соответствуют исходной опухоли у пациента человека.
Полученные результаты показывают, что уровни МИА в плазме являются чувствительными суррогатными маркерами опухолевой нагрузки и ответа на лечение агентами, ингибирующими меланому, у животных с опухолями меланомы.
Пример 3
Этот пример показывает, что МИА является ранним и точным индикатором противоопухолевой лекарственной активности у доклинических моделей меланомы.
Способы: Кинетику концентраций МИА в плазме после лечения лекарственным средством исследуют следующим образом. Мышей с опухолью А375М перорально дозируют или соединением CHIR-265 (100 мг/кг), или соединением CHIR-258 (60 мг/кг), или растворителем (n=10/группу). Образцы плазмы собирают перед началом дозирования, а также на 3, 8 и 13 сутки.
Объемы опухолей измеряют в те же временные точки, используя способы, описанные в примере 2.
Результаты: фиг.5А графически показывает ранние и существенные изменения уровней МИА в плазме в ответ на лечение соединениями CHIR-258 и CHIR-265 на модели привитой меланомы человека А375М. *Р<0,05 для всех сопоставлений с обработкой растворителем. Вертикальными отрезками показывают стандартное отклонение оценок (СО). Пунктирная линия показывает предел чувствительности исследования.
ұ
Ф
Фиг.5Б показывает объемы опухолей у мышей с опухолью меланомы человека А375М на 3, 8 и 13 сутки после лечения соединением CHIR-258 или CHIR-265 в сравнении с контролями-растворителями. P<0,01 для соединения CHIR-265 против растворителя, Р<0,005 для CHIR-258 против растворителя. Вертикальными отрезками показывают стандартное отклонение оценок (СО).
Результаты на фиг.5А и 5Б показывают, что и CHIR-258, и CHIR-265 вызывают статистически значимые снижения концентрации МИА в плазме к 3 суткам, причем указанный показатель продолжает снижаться по ходу лечения (Р<0,05). Исходная концентрация МИА, измеренная на 0 сутки, составляет 27,8 нг/кг. Снижение в плазме концентрации МИА - более выраженный показатель при лечении соединением CHIR-265, которое индуцирует регрессию опухоли, но отличается от соединения CHIR-258, подавляющего, но не регрессирующего опухоль. После лечения соединением CHIR-265 концентрации МИА снижаются до 10,4 нг/мл на 3 сутки, 62% уменьшение концентрации МИА связано с регрессией опухоли на 29% (фиг.5А). К 13 суткам концентрации МИА не выявляются в группе лечения соединением CHIR-265. Лечение соединением CHIR-258 приводит к ингибированию роста опухолей, однако регрессий не наблюдают. Тем не менее, уровни МИА снижаются к 3 суткам до статистически значимых более низких уровней по сравнению с растворителем и снижаются до 63% на 13 сутки по сравнению с исходным уровнем.
Указанные данные показывают, что МИА является ранним индикатором действия лекарственного средства и что изменения, обнаруживаемые методом ELISA в уровнях циркулирующего МИА, предшествуют фиксируемым изменениям объемов опухолей. Лечение соединениями CHIR-265 и CHIR-258, приводящее к разным степеням ингибирования роста опухолей и/или регрессии опухолей, что связано с воздействиями на опухолевую нагрузку, является значимым и коррелирующим со снижением уровней МИА в плазме. Например, лечение соединением CHIR-265 индуцирует регрессию опухоли с быстрым и существенным снижением уровней МИА, а лечение CHIR-258 приводит к ингибированию роста опухоли с не столь выраженным снижением уровней МИА.
Другое значимое наблюдение заключается в том, что уровни МИА снижаются раньше и с большей амплитудой, чем объемы опухолей. Примером является существенное снижение уровней МИА на ранние сроки в схемах дозирования. Даже при стабилизации объема опухолей, наблюдаемого при лечении соединением CHIR-258, уровни МИА продолжают снижаться. Без опоры на теоретические обоснования предполагают, что данный эффект может быть связан с наличием некротических и погибающих клеток, что влияет на объем опухоли, но они более не секретируют МИА.
Основываясь на результатах доклинических исследований, клинические исследования у людей могут показать пониженные уровни МИА до момента, когда ответ опухоли может быть измерен, тем самым, являясь ранним индикатором наличия положительного ответа пациента человека на агент, ингибирующий меланому. Кроме того, описанные в настоящем описании данные показывают, что МИА может быть применен в клинических исследованиях агентов, являющихся цитостатическими, а также агентов, являющихся цитотоксическими.
Пример 4
Этот пример показывает, что МИА может применяться в качестве суррогатного маркера опухолевой нагрузки у мышей с привитой опухолью меланомы человека CHL-1.
Методы:
Модели животных:
6
3
2
Исследование привитой меланомы человека CHL-1 проводят на самках бестимусных мышей линии пи/пи (в возрасте 8-12 недель), получаемых от фирмы Charles River Laboratories (Вилмингтон, Массачусетс). Примерно 5×10 опухолевых клеток в продукте Matrigel™ имплантируют подкожно в бок мышам. Дозирование начинают, когда опухоли достигают среднего размера 200 мм. Измерения размеров проводят дважды в неделю для оценки объема опухоли по формуле: (а×b)×0,5, в которой «a» означает наибольший диаметр, а «b» означает длину, перпендикулярную диаметру.
Терапевтические агенты: Низкомолекулярное соединение CHIR-258 получают согласно описанию в примере 2.
Лечение терапевтическими агентами: мышей с опухолью меланомы человека CHL-1 рандомизируют и дозируют перорально соединением CHIR-258 в количестве 30мг/кг и 80 мг/кг (n=10/группу) в сутки через сутки. Первые сутки дозирования обозначают «0 сутки». Образцы плазмы отбирают перед дозированием и на 8 и 22 сутки. В исследовании также используют контрольную группу (n=10).
Результаты: Фиг.6А графически показывает объемы опухолей у мышей с клетками опухолей меланомы человека CHL-1 после лечения соединением CHIR-258 или контролем растворителем. *Р<0,03 для обоих вариантов лечения соединением CHIR-258 относительно контроля. Вертикальными отрезками показывают стандартное отклонение оценок (СО). Из фиг.6А следует, что соединение CHIR-258 в дозах 30 мг/кг или 80 мг/кг при введении один раз в сутки вызывает существенное подавление роста опухоли (Р<0,03) к восьмым суткам по сравнению с обработкой растворителем.
3
Фиг.6Б показывает графически воздействие лечения агентом CHIR-258 на концентрацию в плазме МИА. *Р<0,05 для всех сравнений с растворителем. Вертикальными отрезками показывают стандартное отклонение оценок (СО). Пунктирная линия показывает предел чувствительности метода. На фиг.6Б показано, что соединение CHIR-258 существенно ингибирует секрецию МИА при введении в обеих дозах - и 30 мг/кг, и 80 мг/кг. На фиг.6Б также показано, что уровни МИА в плазме во всех группах мышей до дозирования примерно равны или ниже предела обнаружения данного исследования. Интересно отметить, что уровни МИА у ксенотрансплантатов CHL-1 до дозирования (2,6 нг/мл) ниже, чем уровни МИА у мышей с ксенотрансплантатом меланомы человека А375М (31 нг/мл, согласно описанию в примере 2), несмотря на то, что исходные объемы опухолей до дозирования находились в близком диапазоне (200 против 250 мм, соответственно). Средний уровень МИА в плазме в контрольной группе исследования меланомы CHL-1 составляет примерно 7,7 нг/мл к восьмым суткам, а уровни МИА в плазме из обеих групп, в которых лечили соединением CHIR-258, не обнаруживались к восьмым суткам и в последующие временные точки анализа (см. фиг.6Б).
Эти результаты подтверждают, что хотя лечение соединением CHIR-258 вызывает ингибирование роста опухоли, но не вызывает регрессии, лекарственное средство эффективно при существенно снижающихся уровнях МИА в плазме. Эти результаты согласуются с результатами, полученными на модели привитой меланомы А375М, согласно описанию в примере 2. Хотя теоретическое объяснение отсутствует, данный эффект может быть связан с наличием некротизирующих или гибнущих клеток, которые влияют на объем опухоли, но не секретируют МИА. Результаты также подтверждают применение МИА в качестве раннего индикатора ответа лекарственного средства и эффективности лечения меланомы.
Хотя предпочтительный вариант настоящего изобретения был проиллюстрирован и описан, следует учесть, что различные изменения могут быть сделаны, не отклоняясь от духа и области охвата настоящего изобретения.