СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ НЕОАДЪЮВАНТНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ПРИ МЕСТНОРАСПРОСТРАНЕННОМ РАКЕ ЯИЧНИКОВ
METHOD OF PREDICTING EFFICIENCY OF NEOADJUVANT CHEMOTHERAPY IN CASE OF LOCALLY ADVANCED OVARIAN CARCINOMA

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для контроля эффективности лечения больных III-IV стадии рака яичников.
Известен способ оценки эффективности лечения больных по уровню экскреции полиаминов с мочой (Берлинских Н.К.. Залеток С.П., Зиневич А.К.. Евтушенко А.В. Определение экскреции полиаминов в диагностике злокачественных опухолей и для оценки эффективности лечения онкологических больных. Методические рекомендации. Киев. 1980. 12 с.).
Метод основан на экстракции полиаминов из мочи н-бутанолом, затем фракционировании их при помощи электрофореза на бумаге и количественном определении колориметрическим методом. Для этого мочу больного собирают в течение 24 ч. Затем 20 мл мочи выдерживают при 4°С в течение 18-24 ч. В ампулы наливают 3-5 мл мочи и равный объем 6 н. НСl, запаивают и помещают на 14-16 ч в термостат с температурой 120°С. После окончания гидролиза проводят экстракцию н-бутанолом. С помощью универсальной индикаторной бумаги доводят pH мочи сперва до 9,0, а затем - до 9,5-10,0. При этом контролируют pH по pH-метру. В течение двух часов н-бутаноловую фракцию встряхивают на шутель-аппарате, после чего выпаривают на кипящей водяной бане. Сухой остаток растворяют в 0,2 мл 0,1 н. НСl и в количестве 20 мкл наносят на полосу хроматографической бумаги, помещенную в прибор для электрофореза, и в течение 40 мин проводят электрофорез. Электрофореграммы высушивают в термостате при 70°С в течение 20 мин, затем обрызгивают из распылителя нингидриновым красителем и снова помещают в термостат при 70°С на 20 мин для проявления окраски. Окрашенные пятна, которые соответствуют индивидуальным полиаминам, вырезают, помещают в химические пробирки, заливают элюирующим раствором и убирают на 25 мин в темное место. После чего проводят измерение величины поглощения растворов на спектрофотометре при длине волны 505 нм. Количество полиаминов определяют по калибровочной кривой, построенной по стандартным полиаминам.
Однако применение этого способа ограничивают и затрудняют такие его недостатки, как длительность проведения исследования, которое затягивается на 4-5 суток. По этой же причине он не может быть использован для коррекции применяемой специфической терапии. Кроме того, применение указанного метода требует большого количества оборудования и реактивов, что влечет за собой большие затраты.
Известен способ определения биологической агрессивности рака для оценки индивидуального прогноза течения заболевания и назначения адекватной терапии (Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А. Уточняющая диагностика рака некоторых локализаций с использованием иммуногистохимических маркеров // Практическое пособие. Москва. - 2006. - 16 с.), выбранный нами в качестве прототипа.
Метод основан на изучении количества и локализации одного из основных составляющих межклеточного матрикса - гликопротеида тенасцина, обладающего антиадгезивными свойствами, матричных металлопротеиназ (ММР) и их ингибиторов.
Для иммуногистохимического исследования материал фиксируют нейтральным формалином в течение 24 часов, заливают в парафин, готовят срезы толщиной 4 мкм, которые наносят на высокоадгезивные свойства и высушивают при температуре 37°С. Используют моноклональные антитела к ММР1, ММР2, ММР9, TIMP1 и 2 (NovoCastra), тенасцину, бета-катенину и Е-кадгерину (Dako). Восстановление антигенной активности проводят в миниавтоклаве «2100 Retrieval» (Pick Cell) при температуре 121°С в течение 20 мин и последующем остывании 60 мин. Восстановление проводят в нитратном буфере pH 6,0 для антител к ММР1, кадтерина и катенина и в ЭДТА-буфере pH 8,0 для остальных антител. В качестве детекционной системы применяли систему «Еn Vision» (Dako), в качестве хромогена использовали диаминобензидин. Интенсивность реакции оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3+.
Авторы проводили исследования на операционном материале протокового рака молочной железы, рака легкого и рака мочевого пузыря. Полученные результаты показали возможность оценки индивидуальной агрессивности опухоли, позволили оценить клинически еще не реализованную биологическую агрессивность опухоли, ее инвазивный и метастатический потенциал. Полученные в результате исследования индивидуальные характеристики опухоли, по мнению авторов, должны учитываться для оценки индивидуального прогноза течения заболевания и назначения адекватной терапии. Проведение уточняющей морфологической диагностики с использованием панели антител позволят определять индивидуальные параметры карциномы разных локализаций и гистологических типов и поможет в определении индивидуального прогноза течения заболевания и выбора адекватной тактики лечения.
Однако применение этого способа ограничивают и затрудняют такие его недостатки, как длительность проведения исследования. Поэтому он не может быть использован для коррекции объема оперативного вмешательства при раке яичников и назначения специфической терапии в ближайшие сутки после операции. Кроме того, применение указанного метода требует большого количества оборудования и реактивов, что влечет за собой большие затраты.
Целью изобретения является ускорение и упрощение контроля эффективности неоадъювантного этапа комбинированного лечения.
Поставленная цель достигается тем, что после проведения больным III-IV стадии рака яичников неоадъювантного этапа комбинированного лечения, а именно курсов химиотерапии, выполнения операции полного или циторедуктивного объема, производят забор кусочка ткани злокачественной опухоли в объеме 100-150 мг, готовят 10% гомогенат, определяют в нем активность плазминогена и плазмина, вычисляют соотношение первого ко второму и при повышении этого показателя прогнозируют наступление клинического эффекта от проводимого лечения, а в случае снижения показателя либо его неизменности прогнозируют отсутствие такового.
Анализ известных способов определения эффективности неоадъювантной противоопухолевой терапии дает основания говорить о новизне предлагаемого способа, который представлен соотношением объективных показателей исследования в ткани удаляемой злокачественной опухоли яичников уровней плазминогена и плазмина после проведения химиотерапии на первом этапе комбинированного лечения больных III-IV стадии рака яичников. Изучение клеточных маркеров, характеризующих биологические свойства опухоли, в данном случае компонентов системы плазминоген - плазмин, позволяет определить адекватность использования применяемого лечения для каждой больной, определить тактику дальнейшего ведения пациенток и индивидуальный прогноз заболевания.
В отличие от прототипа предлагаемый «Способ оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии при местнораспространенном раке яичников» осуществляется в течение 1 рабочего дня и дает возможность проводить коррекцию адъювантной химиотерапии в соответствии с исследуемой объективной реакцией злокачественной опухоли на конкретные химиопрепараты.
Разработанный способ обладает изобретательским уровнем, так как явным образом не следует для специалиста из известного уровня развития медицины и оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии. В известных источниках информации России, стран СНГ и за рубежом подобный способ не обнаружен.
Изобретение является промышленно применимым, так как оно может быть многократно воспроизведено в лечебных учреждениях онкологического профиля, располагающих биохимическими лабораториями.
Способ осуществляется следующим образом:
Во время операции производят забор кусочка ткани злокачественной опухоли в объеме 100-150 мг, готовят 10% гомогенат на физиологическом растворе, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин, отбирают центрифугат и определяют в нем активность плазминогена и плазмина по методу Robbins, Summaria (1963) в модификации Пасхиной Т.С. и соавт. («Сосотояние кининовой системы при ожоговом шоке и ранней токсемии» // Вопр. мед. химии, 1976. - Т.22. - №5. - С.696-707). Определение проводят следующим образом. Опытная проба: 0,4 мл разведенного в 20 раз центрифугата смешивают с 0,1 мл 0,05 М трис-HCl буфера pH 8,0, пробу выдерживают 5 мин при 37°С, после чего добавляют 0,5 мл 2% раствора казеина и инкубируют 1 ч при 37°С. Реакцию останавливают добавлением 2,5 мл 10% ТХУ, через 30 мин осадок белка отделяют центрифугированием. Контрольная проба отличается от опытной пробы тем, что 2,5 мл 10% ТХУ добавляют для фиксации фермента перед добавлением казеина. Измеряют поглощение при 280 нм против буфера. Активность плазмина вычисляют по разности опытной и контрольной проб и выражают числом казеиновых единиц (КЕ) в 1 мл жидкости.
Содержание плазминогена определяют из данных по активности плазмина в центрифугате ткани, предварительно инкубированном со стрептокиназой: 0,4 мл разведенного в 20 раз центрифугата преинкубируют 5 мин при 37°С с 0,1 мл 0,01% раствора стрептокиназы в 0,05 М трис-HCl буфере pH 8,0, далее анализ проводят так, как описано для определения плазмина. Из полученной величины вычитают значение пробы, не обработанной стрептокиназой, и результат выражают в КЕ в 1 мл.
Затем рассчитывают коэффициент соотношения плазминогена (ПГ) и плазмина (П) - ПГ/П
Для доказательства приводим выписку из историй болезни, подтверждающих клинический эффект лечения предлагаемым способом.
Пример клинического применения №1
Больная Ш., 1966 г.р., ист. болезни №10252/ц, поступила в гинекологическое отделение РНИОИ 10.01.2006 г. С диагнозом: рак яичников IV стадии, клиническая группа 2, полисерозитная форма. Объективно при поступлении: в малом тазу - бугристая неподвижная опухоль с метастатическим узлом в дугласовом пространстве, асцит, правосторонний гидроторакс до IV ребра. При цитологическом исследовании в экссудате из плевральной полости обнаружены клетки серозной цистаденокарциномы.
Учитывая распространенность рака яичников, лечение начато с курса полихимиотерапии по схеме САР (суммарно 600,0 мг циклофосфана, 40,0 мг доксорубицина и 125,0 мг цисплатина). Лечение оказалось эффективным: резорбировались асцит и плеврит; первичная опухоль уменьшилась в размерах более, чем на 50%, что позволило предпринять хирургическое лечение. Через 4 недели после проведения курса неоадъювантной полихимиотерапии выполнена операция полного объема (удаление матки с придатками, оментэктомии). Морфологический анализ №№946694-716 - умеренно дифференцированная серозная цистаденокарцинома.
Взят фрагмент удаленной ткани яичника, в котором произведено определение плазминогена и плазмина, вычислен коэффициент их соотношения. Величина коэффициента соотношения К=ПГ/П была равна 1,3, что позволило не менять вариант лекарственного лечения, в послеоперационном периоде больной проведено еще 5 курсов полихимиотерапии по схеме САР.
При динамическом наблюдении в течение 2 лет признаков активации процесса не обнаружено, больная находится в состоянии полной клинической ремиссии.
Пример 2
2
2
2
Больная Е., 1938 года рождения, ист. болезни №11157/ц, поступила в гинекологическое отделение РНИОИ 02.07.07 г. С диагнозом: рак яичников III стадии, клиническая группа 2. При поступлении жалобы на увеличение живота в объеме, слабость, отсутствие аппетита. При бимануальном исследовании в малом тазу определяется бугристая опухоль на месте матки и правых придатков, в эпигастральной области и метастатически измененный большой сальник. Асцит. Цитологический анализ пунктата заднего свода: цистаденокарцинома яичников. В виду тяжести состояния больной, сомнительной возможности проведения адекватного оперативного вмешательства, больной был проведен 1 курс химиотерапии по схеме САР: цисплатин - 75 мг/м в/в в 8-ой день доксорубицин - 40 мг/м в/в в 1 день; циклофосфамид - 400,0 мг/м в/в в 1 день.
Состояние больной улучшилось резорбировался асцит и через 4 недели после курса химиотерапии она была взята на лапаротомию, хотя размеры опухоли в малом тазу изменились незначительно.
Больной была произведено оперативное вмешательство в объеме надвлагалищной ампутации матки с придатками, экстирпации большого сальника. Гистологический анализ удаленного препарата №666531-536: умеренно дифференцированная серозная папиллярная аденокарцинома.
Величина коэффициента соотношения К=ПГ/П была равна 0,2.
В послеоперационном периоде схема полихимиотерапии для больной была изменена за счет назначения таксанов в сочетании с цисплатином.
Таким образом, данные клинического наблюдения коррелируют с показателями коэффициент К, который может служить критерием эффективности проводимой терапии.
Предлагаемым способом было проведено исследование 18 больных раком яичников без проведения химиотерапии, когда первым этапом комбинированного лечения выполнялась операция полного объема или циторедуктивная оперция, и 21 больной после 1 курса неоадъювантной химиотерапии. Все больные находились в III-IV стадии процесса (диагноз был верифицирован при цитологическом, а затем гистологическом исследовании).
Результаты представлены в таблице.
Таблица.
Уровни активности плазмина и плазминогена и их соотношения (К) в ткани злокачественной опухоли яичников.
Группы обследованных больных
Активность плазмина (КЕ)
Активность плазминогена (КЕ)
Соотношение К=ПГ/П
Больные без неоадъювантной химиотерапии, n=18
16,4±1,2
3,5±0,4
0,3±0,1
Больные с клиническим эффектом после неоадъювантной полихимиотерапии, n=11
5,5±0,6<sup>1</sup>
7,8±3,2<sup>1</sup>
1,4±0,2<sup>1</sup>
Больные без клинического эффекта после неоадъювантной полихимиотерапии, n=10
7,1±0,3<sup>1,2</sup>
1,4±0,1<sup>1,2</sup>
0,2±0,09<sup>2</sup>
Примечание: 1 - показатели достоверны по отношению к значениям в группе больных без неоадъювантной химиотерапии (Р<0,05),2 - показатели достоверны по отношению к значениям в группе больных с клиническим эффектом (Р<0,05).
Как видно из представленных данных, показатель К при эффективном лечении увеличивался относительно фоновых величин, тогда как при отсутствии клинического эффекта он либо не изменялся, либо снижался по сравнению с исходными данными, что подтверждено состоянием больных раком яичников.
Техническо-экономическая эффективность "Способа оценки эффективности неоадъювантной химиотерапии при местнораспространенном раке яичников" заключается в том, что:
- позволяет выявить пациенток с эффектом от лечения и хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость агрессивного адъювантного лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива,
- удается выявить больных без эффекта, а значит с плохим прогнозом, которым требуется более агрессивное адъювантное лечение,
- позволяет определить индивидуальную чувствительность или резистентность злокачественной опухоли больных к конкретным схемам химиотерапии,
- увеличивается продолжительность и улучшается качество жизни больных,
- дает возможность объективизировать результаты специфической терапии.