СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ВИДА ACINETOBACTER BAYLYI ИЗ РЕЧНОЙ ВОДЫ
METHOD FOR ISOLATION OF ACINETOBACTER BAYLYI BACTERIA FROM RIVER WATER

Изобретение относится к области биотехнологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по выделению из внешней среды (рек) бактерий Acinetobacter baylyi для поиска биоремедиаторов загрязнений природной среды, а также при производстве питательных сред для выделения этих бактерий.
Способы селективного выделения бактерий A. baylyi из объектов внешней среды не известны. Бактерии A. baylyi были впервые выделены совместно с шестью другими новыми видами рода Acinetobacter в 2003 году в Австралии из активированного ила, однако методика их выделения в статье не сообщается (Carr E.L., Kampfer P., Patel В.K.С., Gurtler V., Seviour R.J. Seven novel spesies of Acinetobacter isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, Vol. 53, No 4, p. 953-963; DOI 10.1099/ijs.0.02486-0).
Известен способ выделения и идентификации бактерий рода Acinetobacter с использованием синтетической этанол-аммонийной среды ЭАС (Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций. Методические рекомендации. По состоянию на 2014 год. Утверждены зам.Министра здравоохранения СССР К.И. Акуловым 3.06. 1986 года). Отбор проб патологического материала производят в 10 мл стерильной жидкой накопительной среды ЭАС-1, используя для смывов эту же среду. Затем посевы на среде ЭАС-1 выдерживают при 30°С в течение 48 ч. При появлении на поверхности среды бесцветной пленки пересевают материал с пленки на 2-4 сектора плотной среды ЭАС-2 и инкубируют при 30°С 24 ч; при отсутствии роста посевы оставляют еще на 24 ч. На среде ЭАС-2 колонии A. calcoaceticus оранжевые, иногда желтые, средних размеров, выпуклые, с ровными краями; колонии A. lwoffii бледно-зеленые, мелкие, выпуклые. Для идентификации снимают 2-3 колонии и проводят по тестам в соответствии с идентификацией неферментирующих бактерий. Примечание к способу. Питательные среды. Этанол-аммонийная среда жидкая (ЭАС-1). К 100 мл дистиллированной воды добавляют фосфат натрий-аммоний 0,15 г; фосфат калия однозамещенный 0,04 г; сульфат калия 0,02; хлорид магния 0,02 г. После стерилизации при 0,5 атм в течение 15 мин прибавляют 1,2 мл этилового 96-градусного спирта и разливают асептично по 10 мл в пробирки. Этанол-аммонийная среда плотная (ЭАС-2). Основной состав среды тот же, но до стерилизации добавляют 1,5 г агара (порошкового 1,8 г) и 0,5 мл 1,6-процентного щелочного раствора бромтимолового синего. По нашим данным изучения среды ЭАС-2 на ней растут бактерии многих видов ацинетобактеров (A. baumannii, A. pittii, A. nosocomialis, A. baylyi, A. johnsonii и другие), а также бактерии Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, отсутствует рост прочих видов энтеробактерий, неферментирующих и грамположительных бактерий.
Известен способ выделения бактерий рода Acinetobacter из естественных почвенных и водных экосистем с использованием метода обогащения в минимальной минеральной среде с добавлением 0,1% (мас./об.) ацетата натрия, как единственного источника углерода (Krizova L., Maixnerova М., Sedo О., Nemec A. Acinetobacter albensis sp. nov., isolated from natural soil and water ecosystems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015. Vol. 65, No 11. P. 3905-3912; doi 10.1099/ijsem.0.000511).
2
4
2
4
2
4
4
Известен также способ выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii (комплекса ACB) с применением селективной синтетической питательной среды «Ацинетобактер фенилаланин агар» (Сиволодский Е.П., Горелова Г.В., Богословская С.П., Зуева Е.В. Селективная синтетическая питательная среда «Ацинетобактер фенилаланин агар» для выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, №3. С. 591-596. doi: 10.15789/2020-7619-ASS-1177). Селективность этой среды обусловлена трофической селекцией ацинетобактеров L-фенилаланином в качестве единственного источника углерода и азота, а также дополнительной селекцией триметопримом. Состав питательной среды: L-фенилаланин (СAS No 63-91-2) 2,0-3,0 г; триметоприм 0,006-0,01 г; диметилсульфоксид 6-10 мл; NaCl 5,0 г; NaSO 2,0 г; KНРO 1,0 г; KНРO 2,5 г; MgSO 0,1 г; агар 15,0 г; вода дистиллированная 1 л; рН 7,2±0,2. Приготовление: в 1 л дистиллированной воды вносят все ингредиенты, кроме триметоприма, растворяют при нагревании, кипятят 5 мин, добавляют триметоприм (6 мл 0,1% раствора в диметилсульфоксиде), проверяют рН 7,2; разливают в чашки Петри. Для контроля среды используют клинические штаммы A. baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca. Методика применения. Исследуемый материал, например, отделяемое ран засевают бактериологической петлей на поверхность сектора селективной среды (1/4 часть чашки Петри); для количественного изучения используют по 100 мкл соответствующего разведения материала (мочи) и растирают шпателем по всей поверхности среды в чашке. Посевы инкубируют аэробно при 37°С в течение 18-24 ч. Затем определяют принадлежность бактерий к ацинетобактерам комплекса АСВ по наличию характерных колоний диаметром 1-2 мм, круглых, выпуклых, с ровными краями, светло-серых, непрозрачных. Контрольную проверку бактерий из колоний или газона бактерий проводят тестом на цитохромоксидазу (в течение 20 с) и экспрессным (1 ч) определением окисления и ферментации глюкозы (ОФ-тест) пероксидводородным микрообъемным методом. Ацинетобактеры комплекса АСВ оксидазоотрицательные, не ферментируют, но окисляют глюкозу в течение 1 ч. Иногда на селективной среде наблюдается очень подавленный рост синегнойной палочки: мелкоточечные колонии менее 0,1 мм, окруженные прозрачной пленкой, оксидазоположительные. Очень редко наблюдается подавленный рост клебсиелл: мелкие колонии 0,1 мм, выпуклые, оксидазоотрицательные, ферментируют глюкозу в течение 1 ч. Дальнейшую видовую идентификацию проводят по комплексу фенотипических признаков или методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. При изучении 400 проб клинического материала были выделены на селективной среде ацинетобактеры комплекса АСВ в 26 пробах (18 проб в монокультуре, в 8 пробах в ассоцациях с синегнойной палочкой и клебсиеллами); традиционным методом были выделены бактерии комплекса АСВ в 20 пробах (7 проб в монокультуре, в 13 пробах в ассоциациях с другими видами бактерий). Из 26 штаммов ацинетобактеров, выделенных на селективной среде, 25 относились комплексу АСВ (A. baumannii-23, A. pittii-2 штамма), 1 штамм A. baylyi не относился к видам комплекса АСВ.
Прототипом заявляемого способа нами избран способ выделения и идентификации бактерий рода Acinetobacter с использованием синтетической этанол-аммонийной среды ЭАС (Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций. Методические рекомендации. По состоянию на 2014 г. Утверждены зам. Министра здравоохранения СССР К.И. Акуловым 3.06.1986 года), так как он имеет больше совпадающих существенных признаков, чем другие аналоги.
Недостатком прототипного способа с использованием синтетическоо этанол-аммонийной среды является слабая видовая селективность питательной среды для вида Acinetobacter baylyi, вследствие чего на этой среде растут бактерии многих видов ацинетобактеров (A. baumannii, A. nosocomialis, A. pittii, A. lwoffii, A. johnsonii), а также других родов бактерий (Pseudomonas, Klebsiella).
Целью изобретения является повышение селективности способа выделения бактерий вида A. baylyi из объектов внешней среды (речной воды). Повышение селективности исследования состоит в достижении роста на селективной среде заявляемого способа преимущественно бактерий вида А. baylyi.
2
4
4
2
4
2
4
2
4
4
2
4
2
4
В соответствии с изобретением решение указанной технической задачи достигается тем, что исследуемый материал засевают в жидкую питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота L-фенилаланин (СAS No 63-91-2), источника углерода этанол, минеральные соли NaCl, NaSO, MgSO, KНРO, KНРO, дистиллированную воду при следующем содержании ингредиентов: L-фенилаланин 2,0-3,0 г; этанол 96-градусный 4-6 мл; NaCl 5,0 г; NaSO 2,0 г; MgSO 0,1 г; KНРO 1,0 г; KНРO 2,5 г; вода дистиллированная 1 л; рН 7,2±0,2; плотная питательная среда этого же состава имеет дополнительно агар 15,0 г; при этом все ингредиенты, кроме этанола, растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, затем добавляют этанол в расчетном количестве в горячую среду, проверяют рН, разливают в стерильные флаконы и чашки Петри; посевы в жидкой среде инкубируют при 28°С в аэробных условиях в течение 48 ч; пересевают обогащенный материал из флаконов петлей на плотную среду этого же состава и выращивают при 28°С в аэробных условиях в течение 48 ч, затем пересевают изолированные колонии на секторы питательного агара, инкубируют при 28°С в течение 24 ч с последующей идентификацией бактерий A. baylyi по фенотипическим признакам. Примечание: бактериологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при изготовлении среды; суточные бульонные культуры контрольных штаммов A.baylyi (позитивный контроль) и P. aeruginosa АТСС 27853, E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль) засевают по одной петле радиальным штрихом на поверхность плотной среды в чашке Петри, инкубируют аэробно при 28°С в течение 24 ч, учитывают результат - питательная среда пригодна к использованию, если имеется рост бактерий A. baylyi и нет роста P. aeruginosa АТСС 27853, Е. coli АТСС 25922. Срок хранения готовых сред 15 суток при температуре от 4°С до 8°С.
Первый отличительный существенный признак способа - использование в синтетической среде заявляемого способа аминокислоты L-фенилаланина (СAS No 63-91-2) в качестве единственного источника азота. Применение этой аминокислоты в указанном качестве не известно. В прототипе в синтетической этанол-аммонийной среде (ЭАС) используют в качестве единственного источника азота минеральный источник (фосфат натрий-аммония). В аналоге по Krizova L. et al. (Krizova L., Maixnerova M., Sedo O., Nemec A. Acinetobacter albensis sp.nov., isolated from natural soil and water ecosystems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015. Vol. 65, No 11, p. 3905-3912; doi 10.1099/ijsem.0/000511) также используют в качестве единственного источника азота минимальные минеральные среды.
Известно применение L-фенилаланина в качестве единственного источника углерода и азота в аналоге синтетической среде «Ацинетовактер фенилаланин агар» (Сиволодский Е.П., Горелова Г.В., Богословская С.П., Зуева Е.В. Селективная синтетическая питательная среда «Ацинетобактер фенилаланин агар» для выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, №3. С. 591-596. doi: 10.15789/2020-7619-ASS-1177). Однако, известно, что бактерии вида A. baylyi не могут использовать L-фенилаланин как единственный источник углерода (Carr E.L., Kampfer P., Petel В.K.С., Gurtler V., Seviour R.J. Seven novel species of Acinetobacter isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. Vol. 53, No 4, p. 953-963. doi: 10.1099/ijs.0.02486-0). Поэтому бактерии A.baylyi не растут на питательной среде «Ацинетобактер фенилаланин агар». Нами в эксперименте впервые показано, что бактерии A. baylyi интенсивно используют для роста L-фенилаланин в качестве единственного источника только азота при наличии этанола как единственного источника углерода (таблица 1).
Мы впервые использовали для синтетической селективной среды сочетание этанола как единственного источника углерода и L-фенилаланина как единственного для A. baylyi источника только азота. Это сочетание неожиданно выявило необычный узко-селективный эффект обильного выделения A. baylyi из объекта внешней среды - 95% всех изолятов бактерий (19 из 20 изученных колоний), выделенных из пробы воды реки Невы, являлись видом A. baylyi (таблица 2). При этом сравнительное изучение способа прототипа с использованием синтетической этанол-аммонийной среды не выявило выделения бактерий A. baylyi, однако обнаружило бактерии пяти прочих видов ацинетобактеров (A. johnsonii, A. radioresistens, A. haemolyticus, A. towneri, A. tandoii) и изолятов других родов бактерий (таблица 2). При повторных исследованиях трех проб воды были получены результаты одинаковой направленности: заявляемым способом выделялись преимущественно бактерии A. baylyi (90-95% изолятов), прототипным способом -бактерии многих других видов ацинетобактеров.
Механизм выявленного узко-селективного выделения бактерий А. baylyi заявляемым способом состоит в том, что известный источник углерода этанол, имеющий широкий спектр селективного действия для большинства видов ацинетобактеров. при дополнении его L-фенилаланином, который является для A. baylyi источником только азота, создают более специфические селективные условия,чем при универсальном минеральном источнике азота или использовании аминокислот как источника углерода и азота, что обеспечивает преимущественное выделение A. baylyi из объектов внешней среды. При этом отличительный существенный признак (L-фенилаланин как источник только азота) непосредственно определяет решение поставленной технической задачи повышения селективности выделения бактерий А. baylyi из объектов внешней среды. Механизм достижения необычного узкоселективного выделения A. baylyi выявлен впервые и представлен только в материалах данной заявки.
2
4
2
4
4
Второй отличительный существенный признак способа - использование в составе синтетической среды заявляемого способа комплекса минеральных солей, г/л: NaCl 5,0; NaSO 2,0; KНРO 2,5; MgSO 0,1, обеспечивает метаболизм бактерий и направляет его на усвоение этанола и L-фенилаланина как единственных источников углерода и азота.
Существенными признаками способа являются: наличие в питательной среде заявляемого способа этанола как источника углерода; температурный режим 28°С, который обеспечивает рост бактерий всех видов рода
Acinetobacter; аэробные условия культивирования; этап предварительного обогащения речной воды в жидкой питательной среде и время инкубирования посевов в течение 48 ч, которые обусловлены разнообразием и малой концентрацией микроорганизмов в воде.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа
Пример 1. Исследуемый материал - воду реки Невы (температура воды 14°С) засевают в объеме 10 мл в флакон с 40 мл жидкой питательной среды заявляемого способа (состав и приготовление питательной среды указаны в примечании к примеру). Посев инкубируют в аэробных условиях при 28°С в течение 48 ч, затем пересевают бактериологической петлей обогащенный материал из флакона на поверхность плотной питательной среды такого же состава в двух чашках Петри. Инкубируют посевы в аэробных условиях при 28°С в течение 48 ч. Отбирают для последующей видовой идентификации 10 изолированных колоний, характерных для ацинетобактеров, пересевают их на секторы плотной питательной среды, инкубируют при 28°С в течение 24 ч. Контрольная идентификация установила принадлежность девяти из десяти изолятов к виду A.baylyi по комплексу фенотипических признаков (грамотрицательные кокко-бактерии, неподвижные, оксидазоотрицательные, каталазоположительные; не ферментируют, но окисляют глюкозу; не имеют нитратредуктазы; имеют уреазу; утилизируют в качестве единственного источника углерода D-глюкозу; не утилизируют L-арабинозу, путресцин). Видовая идентификация методом MALDI-TOF масс-спектрометрии подтвердила принадлежность 9 изолятов к виду A. baylyi.
2
4
2
4
2
4
4
Примечание к примеру 1. Методика приготовления питательной среды заявляемого способа. Жидкая питательная среда. В 1 л дистиллированной воды вносят: L-фенилаланин (CAS 63-91-2) 2,0 г; NaCl 5,0 г; NaSO 2,0 г; KНРO 1,0 г; KНРO 2,5 г; MgSO 0,1 г; растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, добавляют в теплую среду 4 мл 96-градусного этанола, проверяют рН 7,2±0,2, разливают по 40 мл в стерильные флаконы. Плотная питательная среда содержит на 1 л дистиллированной воды те же компоненты и дополнительно 15 г агара. Все компоненты растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, затем добавляют в теплую среду 4 мл этанола, проверяют рН 7,2±0,2, разливают в стерильные чашки. Бактериологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при изготовлении среды; суточные бульонные культуры контрольных штаммов A. baylyi (позитивный контроль) и P. aeruginosa АТСС 27853, E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль) засевают по одной петле радиальным штрихом на поверхность плотной среды в чашке Петри, инкубируют аэробно при 28°С в течение 24 ч, учитывают результат - питательная среда пригодна к использованию, если имеется рост бактерий A. baylyi и нет роста P. aeruginosa АТСС 27853, Е. coli АТСС 25922. Срок хранения готовых сред 15 суток при температуре от 4°С по 8°С.
Пример 2. Исследуемый материал - воду реки Невы (температура воды 100 С) засевают в объеме 10 мл в флакон с 40 мл жидкой питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды L-фенилаланин (CAS 63-91-2) 3,0 г, этанол 96-градусный 6 мл и остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1. Посев инкубируют в аэробных условиях при 28°С в течение 48 ч, затем пересевают бактериологической петлей обогащенный материал из флакона на поверхность плотной питательной среды такого же состава в двух чашках Петри. Инкубируют посевы аэробно при 28°С течение 48 ч. Отбирают для последующей видовой идентификации 10 изолированных колоний, характерных для ацинетобактеров, пересевают их на секторы плотной питательной среды, инкубируют аэробно при 28°С в течение 24 ч. Контрольная идентификация по фенотипическим признакам установила принадлежность 9 из 10 изолятов к виду A. baylyi.
Таким образом, при всех предельных концентрациях основных ингредиентов питательной среды заявляемого способа (L-фенилаланин 2,0-3,0 г/л, этанол 96-градусный 4-6 мл/л) получены четкие результаты узкой селективности выделения бактерий вида A. baylyi из проб воды реки Невы - 9 из 10 изолятов.