СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ ОСНОВЫ И ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА YERSINIA И VIBRIO
NUTRIENT BASE PRODUCTION METHOD AND NUTRIENT BASE FOR YERSINIA AND VIBRIO MICROORGANISMS FERMENTATION

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно к способу получения белковых гидролизатов и питательной среды, предназначенной для выращивания микроорганизмов.
Предпосылки для создания изобретения.
В настоящее время в конструировании полноценных питательных сред мясные основы в основном уступают место казеину, широкое распространение получили также гидролизаты рыбного сырья и дрожжей. Сырье для изготовления питательных компонентов должно быть доступным, стандартным и дешевым. Изыскиваются и новые способы гидролиза исходного сырья.
Известны питательные среды для культивирования различных микроорганизмов, в том числе и патогенных, приготовленные путем триптического гидролиза мяса по Хоттингеру, из панкреатического гидролизата казеина, соевых бобов и гороха, каспийской кильки, пекарских дрожжей (Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. - М.: Медгиз., 1950, - с.51-111).
Известна питательная среда для выращивания микроорганизмов, содержащая панкреатический гидролизат казеина, экстракт пекарских дрожжей, лактозу, соли марганца и магния, аскорбиновую кислоту (патент RU №2027754, C12N 1/20).
Известна монокомпонентная, по белковой основе, среда культивирования чумного микроба на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей, полученного по способу Хоттингера (Питательная среда культивирования чумного микроба при 37°С на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей: отчет о выполнении НИР: 01.200.2 12994: Ростовский-на-Дону науч. - исслед. противочум. ин-т, Северо-Кавказская противочум. станция; исполн.: Мазрухо А.Б., Криваченко К.Б., Каминский Д.К., [и др.] / Методические документы и отчеты по сан. - эпид. охране территории РФ: Реферат, сб. / Под ред. докт. мед. наук, профессора В.В.Кутырева. - Саратов: ОАО «Приволжское книжное издательство», 2005. - c.39, ISBN 5-7633-1061-6).
Известна питательная среда для глубинного культивирования вакцинного штамма чумного микроба на основе ферментативного гидролизата белков обезжиренного молока с содержанием аминного азота 120 мг% и концентрацией водородных ионов рН 6,8-7,2. В состав этой среды входит питательная основа, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магния сульфат, натрия хлорид (патент RU №2270856, C12N 1/20, C12QN 1/10).
Известна питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба следующего состава: панкреатический гидролизат соевых бобов, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий сернокислый, дистиллированная вода (патент RU, №2245362, C12N 1/20, C12QN 1/04).
Недостатком микробиологических сред, приготовленных на основе панкреатических гидролизатов, является возросшая стоимость поджелудочной железы, ее нестандартность, а также длительность (5 суток и более) процесса ферментативного гидролиза, что также увеличивает конечную стоимость среды. При этом использование сырья животного происхождения может привести к контаминации питательных сред биологическими агентами (микоплазмами, прионами, и др.).
Наиболее близким аналогом является среда для культивирования микроорганизмов, содержащая ферментативный гидролизат сои, автолизат пекарских дрожжей, натрия хлорид, и водопроводную воду (Дьяченко Ю.В., Левицкий А.П. Соевые бактериологические питательные среды и перспективы их использования в клинической бактериологии // Клиническая лабораторная диагностика, 2001, №3. - с.49-50).
Известены способы получения белковых гидролизатов, основанные на ферментативном гидролизе белкового сырья протеолитическими препаратами, выделенными из некоторых бактерий или плесневых грибов.
Известен способ получения гидролизата дрожжевой биомассы. Способ предусматривает гидролиз дрожжевой биомассы комплексным ферментным препаратом, полученным на основе штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-683 или его культуральной жидкости при рН 4,5-6,0, с последующей пастеризацией при 80-90°С в течение 15-20 мин и сушкой (патент RU №2104300, C12N 1/06, A23J 1/18, A23L 1/28).
Проведенный поиск по патентам и научно-техническим источникам информации показал, что в настоящее время среди бактериальных ферментных препаратов отечественного и зарубежного производства наиболее часто используют препарат протосубтилин, обладающий протеазной активностью.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения белковых основ для приготовления бактериологических питательных сред (Дьяченко Ю.В., Левицкий А.П. Соевые бактериологические питательные среды и перспективы их использования в клинической бактериологии // Клиническая лабораторная диагностика, 2001, №3. - с.49-50). Способ предлагает использование в качестве сырья соевого экстракта и проведение ферментативного гидролиза протосубтилином при 47-50°С и рН 7,3 в течение 5-8 ч или проназой при 37°С, рН 7,2 в течение 2 ч.
Однако использование таких препаратов бактериальной природы пока не получило широкого распространения в силу их меньшей доступности и недостаточной изученности.
Изобретение направлено на достижение получения питательной среды, не уступающей по своим ростовым свойствам прототипам и одновременно использующей в технологии приготовления побочный продукт производства холерной вакцины в качестве источника ферментного комплекса для переваривания питательной основы, что решает задачу утилизации отходов производства.
Технический результат изобретения заключается: в замене дорогостоящих нестандартных переваривающих агентов на более дешевые и стандартные; в сокращении времени процесса гидролиза (в 5-7 раз), с сохранением ростовых свойств питательной среды; в существенном уменьшении количества переваривающего агента; в рациональной утилизации отходов производства и расширении набора полноценных сред, в том числе для производственного культивирования бактерий.
Поставленная задача решается использованием в качестве агента для переваривания питательной основы низкомолекулярного ферментного комплекса холерного вибриона, выделенного из отхода производства холерной вакцины - ультрафильтрата культуральной жидкости производственного штамма М 41 и названного протеовибрином. Для приготовления питательной основы в качестве исходного сырья возможно использование белкового сырья различного происхождения: в качестве такового выбраны дрожжи пекарские и казеин.
Предварительно подготовленное белковое сырье подвергают гидролизу ферментным комплексом холерного вибриона - протеовибрином. Соотношение ферментного комплекса к белку составляет 1:400-1:500, гидролиз ведут при температуре 45°С, рН 7,4±0,2 в течение 20-22 ч.
На полученной основе можно готовить полноценную и доступную жидкую или плотную питательную среду для выращивания микроорганизмов. В питательную основу можно добавлять при необходимости другие компоненты для расширения спектра культивируемых микроорганизмов в зависимости от их питательных потребностей.
Ферментативный комплекс протеовибрин получают из ультрафильтрата детоксицированной культуральной жидкости производственного штамма холерного вибриона серовара Огава М 41. При одном выращивании в реакторе, после концентрирования O-антигенсодержащего компонента вакцины на ультрафильтрационном аппарате марки УВА-ПС-20-1040, накапливается ультрафильтрат (более 200 л), являющийся отходом производства. Его концентрируют в 15-17 раз на аналогичном аппарате ПС-17-1040 с меньшей пропускной способностью волокон и осаждают сернокислым аммонием до 80% от насыщения с последующим центрифугированием и диализом против дистилированной воды. Препарат в жидком виде может длительно храниться (до 1 года) в замороженном состоянии без потери активности. Препарат может быть лиофилизирован и сохраняться продолжительное время (более 2 лет), выход сухого продукта составляет 0,25±0,05 г на 1 л. Плановый выпуск холерной вакцины обеспечивает получение требуемого количества ферментного комплекса. Высокоактивный ферментный комплекс протеовибрин, полученный описанным способом из отходов производства холерной химической вакцины, до настоящего времени не имел дальнейшего производственного использования.
Протеовибрин представляет собой темно-коричневую жидкость или сыпучий порошок темно-коричневого цвета, хорошо растворимый в воде. Жидкий протеовибрин содержит 18±2 мг/мл белка, в сухом препарате содержание белка составляет 55±77%. Протеовибрин в своем составе содержит 16000±2000 усл. ед./мг нейтральной протеазы (тест-среда с молоком рН 7,2), 20000±4000 усл. ед./мг белка щелочной протеазы (тест-среда с молоком рН 8,5), 8000±400 усл. ед./мг белка кислой протеазы (тест-среда с молоком рН 5,6), 12500±2000 усл. ед./мг белка фосфолипазы А; (тест-среда с желтком рН 7,5), 770±10 усл. ед./мг белка фосфолипазы С (тест-среда с желтком рН 7,5).
В ферментном комплексе - протеовибрине, полученном из отходов производства холерной химической вакцины, присутствуют протеолитические и липолитические ферменты, необходимые для гидролиза питательной основы в широком диапазоне рН и некоторых липидсодержащих компонентов в ней, что указывает на определенное сходство с препаратами из поджелудочной железы. При этом для эффективного гидролиза белкового сырья требуются малые дозы протеовибрина - соотношение его к белку составляет 1:400-1:500.
Задача решается тем, что питательная среда для культивирования микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio содержит питательную основу, дрожжевой автолизат, натрий хлористый, воду, а в качестве питательной основы гидролизат казеина, полученный путем гидролиза казеина ферментным комплексом холерного вибриона, при следующем соотношении компонентов, г/л:
ферментативный гидролизат казеина
300-330
натрий хлористый
30
дрожжевой автолизат
50
водопроводная вода
остальное
Как вариант питательная среда для культивирования микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio содержит питательную основу, натрий хлористый, воду, а в качестве питательной основы ферментативный гидролизат пекарских дрожжей, полученный путем гидролиза пекарских дрожжей ферментным комплексом холерного вибриона, при следующем соотношении, г/л:
ферментативный гидролизат пекарских дрожжей
350-380
натрий хлористый
30
водопроводная вода
остальное
Питательная среда по второму варианту не требует добавления дрожжевого автолизата - стимулятора роста.
Количество питательной основы на 1 л среды рассчитывают в зависимости от исходного содержания в ней аминного азота, доводя его значение до 100±10 мг%.
Для приготовления плотной питательной среды по первому и второму вариантам дополнительно добавляют агар-агар в количестве 15-20 г/л.
Пример 1. Приготовление ферментативного гидролизата пекарских дрожжей.
200 г прессованных дрожжей суспендируют в 800 мл водопроводной питьевой воды и проводят автолиз в течение 5-6 ч при 48-50°С в присутствии 2% хлороформа - индуцирующего агента с консервирующими свойствами. На этой стадии процесс может быть прекращен, а автолизат использован в качестве стимулирующей добавки к среде по примеру 4 в соотношении 1:20. Для этого его инактивируют при 90°С в течение 30 мин, отстаивают 24 ч на холоде при температуре 4-6°С, декантируют и дважды фильтруют через ткань бельтинг. Разливают в стеклянные флаконы и стерилизуют при 110°С 30 мин. При продолжении гидролиза в дрожжевой автолизат вносят 5 мл жидкого или 150-160 мг сухого протеовибрина (соотношение к дрожжевому белку 1:450-1:500), устанавливают рН 7,4±0,2, инкубируют еще 16-18 ч при периодическом перемешивании. По окончании гидролиза ферментолизат подкисляют 6 н. HCl до рН 4,6±0,2 и кипятят на водяной бане в течение 10 мин. Осадок удаляют после отстаивания в течение 24 ч на холоде декантацией и фильтрованием. В фильтрате доводят значения до рН 8,5±0,1 с помощью 5 н. NaOH и повторно кипятят 10 мин с последующим удалением осадка. В прозрачной питательной основе устанавливают рН 7,4±0,2 с помощью 6 н. HCl. Основа содержит 590±20 мг% общего азота, 280±20 мг% аминного азота, степень расщепления белка 47±2%.
Пример 2. Питательная среда для культивирования микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio, (по варианту 2).
Для приготовления питательной среды дрожжевой гидролизат, приговленный в соответствии с заявляемым способом, разводят по расчету водопроводной водой до содержания аминного азота 100±10 мг%, корректируют рН до требуемой величины, добавляют 0,3% NaCl и воду до 1 л. Для приготовления плотной среды в нее добавляют 15-20 г/л агар-агара. Среду разливают в стеклянные флаконы и стерилизуют автоклавированием при 110°С 30 мин.
Готовая среда содержит следующие компоненты, г/л:
ферментолизат пекарских дрожжей
350 (содержание аминного азота 90 мг%)
NaCl
30
водопроводная вода
остальное
Использование данной питательной среды обеспечивает ростовые потребности микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio с сохранением их морфологических признаков.
Пример 3. Питательная среда для культивирования микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio, (по варианту 2).
Для приготовления питательной среды дрожжевой гидролизат, приговленный в соответствии с заявляемым способом, разводят по расчету водопроводной водой, корректируют рН до требуемой величины, добавляют 0,3% NaCl и воду до 1 л. Для приготовления плотной среды в нее добавляют 15-20 г/л агар-агара. Среду разливают в стеклянные флаконы и стерилизуют автоклавированием при 110°С 30 мин.
Готовая среда содержит следующие компоненты, г/л:
ферментолизат пекарских дрожжей
380 (содержание аминного азота 110 мг%)
NaCl
30
водопроводная вода
остальное
Использование данной питательной среды обеспечивает ростовые потребности микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio с сохранением их морфологических признаков.
Пример 4. Приготовление ферментативного гидролизата казеина.
3
60 г сухого казеина заливают 1 л водопроводной питьевой воды, добавляют 8 г NaHCO, (рН 7,4±0,2) и нагревают в водяной бане до 90-95°С в течение 5 мин. После охлаждения до 40-50°С в расплавленный казеин вносят 5 мл жидкого протеовибрина (соотношение к белку казеина 1:400-1:500) или сухой протеовибрин в количестве 150-160 мг, предварительно растворенный в минимальном количестве воды. Ферментативный гидролиз казеина проводят в течение 20-22 ч при 45°С с периодическим перемешиванием. По окончании процесса гидролизат подкисляют до рН 4,5±0,2 с помощью 6 н. HCl для инактивации фермента и осаждения не прореагировавших белков и выдерживают на водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения и удаления осадка фильтрованием через тканевый или бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4±0,2 с помощью 5 н. NaOH. Полученная питательная основа содержит 640±30 мг% общего азота, 300±20 мг% аминного азота, степень расщепления белка 52±3%.
Пример 5. Питательная среда для культивирования микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio (по варианту 1).
Для приготовления питательной среды казеиновый ферментолизат, приговленный в соответствии с заявляемым способом, разводят по расчету водопроводной водой, корректируют рН до требуемой величины, добавляют 0,3% NaCl, дрожжевой автолизат 0,5% и воду до 1 л. Для приготовления плотной среды в нее добавляют 15-20 г/л агар-агара. Среду разливают в стеклянные флаконы и стерилизуют автоклавированием при 110°С 30 мин.
Готовая среда содержит следующие компоненты, г/л:
ферментолизат казеина
300 (содержание аминного азота 90 мг%)
дрожжевой автолизат
50
NaCl
30
водопроводная вода
остальное
Использование данной питательной среды обеспечивает ростовые потребности микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio с сохранением их морфологических признаков.
Пример 6. Питательная среда для культивирования микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio (по варианту 1).
Для приготовления питательной среды казеиновый ферментолизат, приговленный в соответствии с заявляемым способом, разводят по расчету водопроводной водой, корректируют рН до требуемой величины, добавляют 0,3% NaCl, дрожжевой автолизат 0,5% и воду до 1 л. Для приготовления плотной среды в нее добавляют 15-20 г/л агар-агара. Среду разливают в стеклянные флаконы и стерилизуют автоклавированием при 110°С 30 мин.
Готовая среда содержит следующие компоненты, г/л:
ферментолизат казеина
330 (содержание аминного азота 110 мг%)
дрожжевой автолизат
50
NaCl
30
водопроводная вода
остальное
Использование данной питательной среды обеспечивает ростовые потребности микроорганизмов родов Yersinia и Vibrio с сохранением их морфологических признаков.
Для оценки пригодности предлагаемых питательных сред проведено выращивание возбудителей чумы, псевдотуберкулеза и холерного вибриона на жидких и плотных питательных средах. Контрольной была среда, приготовленная на основе гидролизата по Хоттингеру.
Заявляемые жидкие питательные среды по примеру 2,3 и 5,6 обеспечивают отчетливо видимый типичный рост чумного микроба штаммов EV линии НИИЭГ и 708 (К-1) при посеве 1000 м.кл./мл - не позднее, чем через 24 ч инкубации при 28°С в виде прозрачного бульона с рыхлым осадком на дне, псевдотуберкулезного микроба И-199 - в виде равномерного помутнения среды при тех же условиях, холерного вибриона биовара eitor 103 - в виде равномерного помутнения среды с пленкой на поверхности при посеве 20 м.кл./мл - не позднее, чем через 6 ч инкубации при 37°С.
Эффективность роста на жидких средах определяют по приросту оптической плотности, измеренной на фотоколориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2 при 670 нм.
Чувствительность заявляемых сред определяют по количеству колоний, образованных на агаровых пластинках при посеве 10 и 100 м.кл./мл. На плотной питательной среде по примеру 2 и 4 штамм EV линии НИИЭГ чумного микроба образует через 48 ч инкубации при температуре 28°С сглаженные, со слабой зернистостью, более окрашенные, чем на агаре Хоттингера, колонии. Эти изменения в морфологии колоний не имеют принципиального значения. Штамм И-199 псевдотуберкулезного микроба и штамм 103 холерного вибриона на среде по примеру 2 и 4 дают рост колоний с типичной морфологией. Данные приведены в таблице.
Таким образом, реализация изобретения позволяет впервые использовать для ферментативного гидролиза питательных основ питательных сред низкомолекулярный ферментный комплекс холерного вибриона - протеовибрин, выделенный из отхода производства холерной вакцины - ультрафильтрата культуральной жидкости производственного штамма холерного вибриона М 41. По характеру действия протеовибрин может служить в качестве заменителя дорогостоящего нестандартного компонента - поджелудочной железы. Заявляемые питательные среды, приготовленные предложенным способом из ферментолизата пекарских дрожжей или казеина, отличаются простотой изготовления, доступностью сырья и по ростовым характеристикам близки к среде по Хоттингеру для возбудителей чумы, псевдотуберкулеза и холерного вибриона. Кроме того, существенно сокращается время гидролиза белкового сырья и исключается опасность контаминации питательных основ и сред биологическими агентами (микоплазмами, прионами и т.д.).
Проведенный заявителем анализ уровня техники установил, что аналоги, характеризующиеся совокупностями признаков, тождественных всем признакам заявленных объектов, отсутствуют, следовательно, изобретение соответствует условию "новизна".
Результаты поиска известных технических решений в данной и смежных областях техники с целью выявления признаков, совпадающих с отличительными от прототипов признаками заявленного изобретения, показали, что они не следуют явным образом из уровня техники.
Из определенного заявителем уровня техники не выявлена известность влияния предусматриваемых существенными признаками заявленного изобретения преобразований на достижение указанного технического результата, следовательно, заявленное изобретение соответствует "изобретательскому уровню".
В заявке соблюдено требование единства изобретения, поскольку заявляемые объекты: способ получения питательной основы и питательная среда образуют единый изобретательский замысел.
Таблица
Вид возбудителя и штамм
Т °С выращи-ва-ния
Показатели роста
Питательная среда
по примеру 2, 3
по примеру 5, 6
по Хоттингеру (контроль)
Yersinia pestis EV линии НИИЭГ
28°С
Характер роста в бульоне, 24 ч инкубации
Прозрачный бульон с рыхлым осадком
Посевная доза, при которой есть видимый рост в 5 мл бульона
10<sup>4</sup> м.кл
10<sup>4</sup> м.кл
10<sup>4</sup> м.кл
Оптическая плотность взвесей при 670 нм, 24 ч инкубации
0,51-0,58
0,54-0,57
0,61-0,64
Кол-во колоний при посеве 100 м.кл.
75-80
92-95
96-97
Морфология, диаметр колоний через 48 ч
Сглаженные колонии со слабо выраженной зернистостью, слегка окрашенные, 1,4-1,6 мм
Колонии с кружевной зоной, светлые 1,8-2 мм
Yersinia pseudo-tuberculosis И-199
28°С
Характер роста в бульоне, 24 ч
Равномерно мутный бульон
Посевная доза, при которой есть видимый рост в 5 мл бульона
10<sup>3</sup> м.кл
10<sup>3</sup> м.кл
10<sup>3</sup> м.кл
Оптическая плотность взвесей при 670 нм, 24 ч инкубации
0,66-0,72
0,61-0,69
0,68-0,75
Кол-во колоний при посеве 100 м.кл.
80-82
78-83
83-85
Морфология, диаметр колоний через 48 ч
Круглые колонии с ровным краем, с голубоватым оттенком в проходящем свете, 0,2-0,5 мм
Vibrio cholerae биовар eltor 103
37°С
Характер роста в бульоне, 18 ч инкубации
Равномерно мутный бульон с пленкой на поверхности
Посевная доза, при которой есть видимый рост в 5 мл бульона
50 м.кл
50 м.кл
50 м.кл
Оптическая плотность взвесей при 670 нм, 24 ч инкубации
1,08-1,17
1,14-1,19
1,12-1,22
Кол-во колоний при посеве 100 м.кл.
36-38
34-39
40-42
Морфология, диаметр колоний через 18 ч
Круглые полупрозрачные колонии с ровным краем, 2,0-2,5 мм