СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕФАРИНА СУЛЬФАТА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ СТЕФАНИЯ ГЛАДКАЯ
METHOD FOR PREPARING STEPHAGLABRINE SULPHATE IN STEPHANIA GLABRA MIERS CELL CULTURE

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается получения субстанции медицинского препарата - стефаглабрина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая.
Стефарина сульфат - сульфат изохинолинового проапорфинового алкалоида стефарина, выделенного из стефании гладкой [Stephania glabra (Roxb.) Miers, сем. лукосемянниковых (Menispermaceae)] - многолетнего тропического травянистого растения. Это растение произрастает в субтропических и тропических горных районах Южного Китая, Японии, Бирмы, Вьетнама, Индии. В СССР были предприняты попытки интродукции данного растения в субтропиках Закавказья, однако они успеха не имели.
18
19
3
2
2
4
Стефарина сульфат имеет формулу (CHNO)·HSO
Представляет собой белый кристаллический порошок, с температурой плавления (247-252)°С с разложением, растворим в воде и водном спирте. Является субстанцией лекарственного средства, названного стефаглабрина сульфатом (Stephaglabrini sulfas).
Известно использование стефаглабрина сульфата (0,25% водный раствор) в медицинской практике в качестве антихолиноэстеразного средства (авторское свидетельство СССР №315388, 1963 г.).
Известно, что стефаглабрин сульфат обладает специфической ингибирующей активностью на развитие соединительной ткани, предотвращая образование рубца при повреждении нерва, и может быть применен в качестве средства для лечения травматических и послеоперационных повреждений периферической нервной системы (патент СССР №1713151, 1985 г.).
В мире многие лекарственные средства, ароматические вещества, пищевые добавки и другие ценные вещества получают из природного растительного сырья. Около 30% всех применяемых лекарств содержат вещества специализированного обмена растений - вторичные метаболиты.
Их получают обычно экстракцией из растений, большинство которых относятся к экзотическим и исчезающим видам, произрастающим в труднодоступных районах с нерегулируемой климатической, экологической и даже политической обстановкой, не гарантирующей стабильной поставки и качества сырья. Плантационный способ выращивания растений, очевидно, не устраняет некоторых природных неблагоприятных условий и вместе с тем требует больших земельных площадей особого характера с возможным альтернативным использованием. В результате этот способ часто оказывается нерентабельным, а получаемое сырье, как правило, содержит ряд вредных примесей - гербицидов, пестицидов, радионуклеидов и других загрязнителей.
Так, известен способ получения стефаглабрина из растительного сырья, включающий экстракцию корневищ растения стефания гладкая ксилолом в щелочной среде, дальнейшую обработку серной кислотой, растворение осадка в спирте, добавление соляной кислоты, извлечение целевого продукта хлороформом с последующим добавлением серной кислоты и кристаллизацией (авторское свидетельство СССР №315387, 1977 г.). Один из основных недостатков этого способа состоит в дефиците исходного сырья.
Недостатки известных способов получения биологически активных соединений экстракцией из растительного сырья устраняются при получении их из биомассы клеток растений путем выращивания клеток растений в культуре.
В культуру вводят клетки из различных органов растения: корня, листа, черенка, стебля, цветоноса и т.д. Доказана способность культур растительных клеток к синтезу веществ, присущих интактному растению, при этом некоторые растительные клетки продуцируют их в количествах даже больших, чем материнское растение. Поэтому культуры клеток растений представляют интерес как источник получения различных веществ для фармацевтической, парфюмерно-косметической, пищевой и химической промышленностей. Этот альтернативный способ получения ценных веществ растительного происхождения имеет следующие преимущества:
- гарантированное получение растительной биомассы в требуемом количестве с заданными характеристиками независимо от сезона, климатических и погодных условий;
- практически абсолютная экологическая чистота производства биомассы культуры клеток и отсутствие в ней поллютантов;
- более короткие сроки накопления биомассы, которые в культуре составляют несколько недель, а в природе - до 10 лет, при этом содержание целевых веществ в культуре клеток может быть не ниже, чем в растении;
- возможность синтеза в культуре клеток новых веществ, не образуемых в растениях в природных условиях;
- возможность использования для получения биомассы клеток индустриальных биотехнологических приемов и оборудования.
Известен способ получения стефарина сульфата при глубинном культивировании с использованием культивируемых клеток растения стефания гладкая (патент РФ №2089610, 1997 г.).
Согласно указанному способу клетки выращивают на питательной среде в темноте, при температуре 26°С, влажности 70% в конических или плоскодонных колбах Эрленмейера на качалке со следующими техническими данными: эллипсоидная траектория движения платформы, амплитуда колебаний 5-7 мм, число оборотов в минуту 100.
Продолжительность цикла выращивания составляет 14 суток. В этот срок, соответствующий началу стационарной фазы, отделяют выращенную биомассу клеток от культуральной жидкости фильтрацией и высушивают, а затем выделяют стефарин из биомассы клеток.
Однако известный способ не применим в промышленных масштабах. Для того чтобы получать большие количества клеток с наименьшими затратами в условиях крупномасштабного производства, необходимо использовать метод глубинного культивирования растительных клеток с перемешиванием и аэрацией.
Однако особенностью морфологии клеток растений являются их большие размеры. Бактерии имеют размер в среднем 1-5 мкм, клетки животных - 20 мкм, растений - 20-60 мкм. Клетки растений в суспензии образуют агрегаты, состоящие от нескольких до сотен клеток, величина агрегатов может доходить до 1 см. Из-за крупных размеров и особых свойств своих оболочек суспензионные культуры клеток растений подвержены травмированию от сдвигового стресса, что является особенностью культивирования и создает трудности при реализации процесса.
Сдвиговый стресс, часто называемый также турбулентным или гидродинамическим стрессом, вызывает смещение параллельных слоев жидкости относительно друг друга. Сдвиг образуется от движения как лопастей мешалки в биореакторе, так и пузырьков газа. Клетки по-разному реагируют на сдвиг. Многие крайне чувствительны к нему, другие довольно толерантны, что позволяет культивировать последние в биореакторах с мешалкой. Но и в этом случае с увеличением сдвига (например, числа оборотов мешалки и/или ее размера) распадаются агрегаты клеток, снижается биосинтетическая и пролиферативная активность клеток, часто происходит их деформация и/или разрыв мембраны клеток, что в конце концов ведет к их гибели.
Сдвиг в биореакторах вызывается также аэрирующим воздухом, однако, значительно меньше, чем мешалкой.
Мощности, вводимые в биореактор для культивирования других микроорганизмов, создают такой уровень сдвигового стресса, который не выдерживают клетки растений. Для их культивирования уровень стресса в биореакторе должен быть ниже.
Понизить вводимую мощность можно, базируясь на меньшей потребности культур клеток растений в кислороде. Показателем обеспечения культуры кислородом служит так называемый общий объемный коэффициент массопередачи кислорода из газа в жидкость.
Таким образом, чтобы добиться максимального выхода целевого продукта, что составляет суть проблемы оптимизации технологического процесса культивирования клеток как в одном отдельно взятом биореакторе, так и при масштабном переходе от лабораторных до промышленных биореакторов при культивировании клеток растений, необходимо создать в биореакторе такие условия аэрации и перемешивания, при которых клетки будут находиться во взвешенном состоянии, не будут травмироваться и при этом будет обеспечен требуемый коэффициент массопередачи кислорода.
Наиболее близким к предлагаемому является способ культивирования стефании гладкой, описанный в работе: Т.А.Савина и др. «Опыт масштабирования от колб к лабораторным ферментаторам процесса выращивания клеток - продуцентов алкалоида стефарина». Тез. докл. III межд. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология». Алматы, 1983, с.193. Согласно этому способу осуществляли глубинное культивирование клеток на питательной среде в биореакторе при перемешивании и аэрации культуральной суспензии путем подачи воздуха в биореактор через барботер.
Клетки культивировали в стандартном лабораторном биореакторе АНКУМ-2М вместимостью 14 л, оснащенном механической мешалкой и барботером для воздуха.
Однако и в данном способе имеет место наличие механического и гидродинамического стресса на клетки от мешалки, отрицательное влияние которого на ростовую и биосинтетическую активность клеток возрастает с увеличением масштаба биореактора. Даже в аппарате такой малой емкости, как 14 л, выход сухой биомассы клеток по сравнению с колбами снизился на величину до 30%.
Постоянное поддержание оптимального значения коэффициента массопередачи по расчету на конечную максимальную концентрацию клеток в известном способе требует больших расходов воздуха, вызывающих недопустимое пенообразование, с которым трудно или даже невозможно бороться.
Величина коэффициента массопередачи зависит, кроме свойств жидкости, более всего от конфигурации биореактора и гидродинамического режима в нем. В конкретном биореакторе при определенном объеме заполнения эта величина определяется двумя параметрами его работы, которыми можно управлять: числом оборотов мешалки и расходом воздуха.
Технической задачей настоящего изобретения является создание способа получения стефарина сульфата в культуре клеток растения стефания гладкая, при котором наличие механического и гидродинамического стресса на клетки минимально, клетки находятся во взвешенном состоянии и не травмируются, что, в конечном счете, ведет к получению высокого выхода целевого продукта.
Для решения этой задачи в способе получения стефарина сульфата из культуры клеток растения стефания гладкая, включающем глубинное культивирование клеток на питательной среде в биореакторе при перемешивании, аэрацию культуральной суспезии путем барботажа воздуха и накопление целевого продукта, контролируют изменение концентрации клеток в культуральной суспензии и устанавливают расход воздуха в соответствии с этой концентрацией.
При этом концентрацию клеток в культуральной суспензии определяют путем отбора проб. Величину расхода воздуха предпочтительно определять по уравнению обратной функции коэффициента массопередачи от расхода воздуха в данном аппарате. Требуемый коэффициент массопередачи при этом рассчитывают из отношения величины концентрации клеток, умноженной на их удельную дыхательную активность, к разности между равновесной и оптимальной концентрациями кислорода в данной культуре.
Расход воздуха V определяют по формуле:
где X - текущая концентрация клеток,
q - их удельная дыхательная активность,
p
опт
C-С - разность между равновесной и оптимальной концентрациями кислорода в культуральной жидкости,
a, b - эмпирические параметры, которые определяются особенностями конструкции биореактора.
Наиболее оптимально вести процесс, осуществляя перемешивание в биореакторе путем вертикальной циркуляции, одним из известных и применимых в данном случае конструктивных приемов, например, с помощью вертикального цилиндра или диффузора.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
В биореакторе без мешалки, например стандартном биореакторе-ферментаторе бакового типа, осуществляют глубинное культивирование клеток растения стефания гладкая на питательной среде следующего состава, мг/л:
Макросоли:
аммоний азотнокислый
1700
калий азотнокислый
1800
калий фосфорнокислый однозамещенный
234
кальций хлористый
64
магний сернокислый 7-водный
850
Микроэлементы:
калий йодистый
0,83
кобальт двухлористый 6-водный
0,025
кислота борная
6,2
марганец сернокислый 4-водный
22,3
медь сернокислая 5-водная
0,025
натрий молибденовокислый 2-водный
0,25
цинк сернокислый 7-водный
8,5
Хелат железа:
железо сернокислое 7-водное
27,8
этилендиаминтетраацетат натрия
3,?3
Регуляторы роста:
кислота α-нафтилуксусная
0,5
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
0,1
пантотенат кальция
2
тиамина хлорид
2
Источники углерода:
пищевой сахар
50·10<sup>3</sup>
В стерильный аппарат со стерильной средой, выведенный на заданный температурный режим (26±1)°С, вносят инокулят, в качестве которого используют клетки, выращиваемые в конических колбах при встряхивании на шейкере в темноте при (26±1)°С в течение 2-х недель. Объем инокулята - 20% клеточной суспензии (пополам со свежей питательной средой), что соответствует посевной дозе 30 г/л сырой биомассы.
Включают минимально необходимую подачу воздуха и начинают процесс культивирования с периодическим отбором проб для определения текущей концентрации клеток. По мере ее возрастания увеличивают подачу воздуха.
В ходе всего процесса культивирования необходимо постоянно контролировать скорость подачи воздуха в биореактор и увеличивать ее при необходимости до величины, обеспечивающей потребность растущей культуры в кислороде. Эту величину определяют расчетным путем, имея данные по удельной дыхательной активности, по концентрации клеток в контролируемый момент, а также зависимость в численном виде коэффициента массопередачи кислорода в данном биореакторе от интенсивности подачи воздуха.
Следующие примеры иллюстрируют предлагаемый способ, не ограничивая его.
Пример 1
Суспензию клеток растения стефания гладкая культивировали периодическим способом в биореакторе вместимостью 100 л, используя стандартный ферментатор БИОР-01 (производство ОКБ г.Кириши) без мешалки, но с направляющим цилиндром. В стерильный аппарат со стерильной средой (55 л) описанного выше состава, выведенный на заданный температурный режим (26±1)°C, вносили инокулят, в качестве которого использовали клетки, выращиваемые в конических колбах емкостью 750 мл (объем заполнения 200 мл) при встряхивании на шейкере (150 об/мин) в темноте при (26±1)°C в течение 2-х недель. Объем инокулята - 15 л клеточной суспензии (пополам со свежей питательной средой), что соответствует посевной дозе 30 г/л сырой биомассы.
3
Включали минимально необходимую подачу воздуха и начинали процесс культивирования с периодическим отбором проб для определения текущей концентрации клеток. По мере ее возрастания увеличивали подачу воздуха. При общей продолжительности культивирования клеток до 14 суток расход воздуха увеличивали практически линейно от 60 л/ч до 1,3 м/ч в конце цикла.
Требуемый расход воздуха рассчитывали по уравнению:
.
p
опт
где X - текущая концентрация клеток, q - их удельная дыхательная активность, C и С - равновесная и оптимальная концентрации кислорода в культуральной жидкости соответственно, a, b - эмпирические параметры, которые определяются особенностями конструкции аппарата.
В данном аппарате проведено более 10 процессов культивирования с выходом клеток по сырой биомассе до 300 г/л, по сухой биомассе - до 20 г/л при доле живых клеток до 90%. Содержание алкалоида в клетках составляло в среднем 0,25% от сухой биомассы. Эти показатели достоверно не отличаются от тех, которые наблюдаются при культивировании клеток в шейкерных колбах, что доказано методами математической статистики. Чрезмерного пенообразования и травмирования клеток в опыте не наблюдали.
Пример 2
-1
Аналогично описанному в предыдущем примере провели культивирование суспензии клеток стефании гладкой в ферментаторе БИОР 01 (ОКБ г.Кириши), оснащенном штатной турбинной мешалкой с числом оборотов 150 мин. Объем среды, инокулята, температура, профиль подачи воздуха были одинаковы, как в аппарате без мешалки. За 12 суток культивирования в ферментаторе с мешалкой роста клеток не наблюдалось, а доля живых клеток снизилась до 10%. Условия культивирования признаны непригодными.
Опыт повторили в ферментаторе того же типа вместимостью 250 л (БИОР025) с мешалкой 100 об/мин. Уже к концу 5-х суток культивирования биомасса клеток уменьшилась по отношению к исходной в 1,7 раза, а доля живых клеток - в 1,5 раза.
Пример 3
Результаты нескольких опытов по культивированию клеток стефании гладкой в барботажном биореакторе емкостью 20 л без мешалки с переменным расходом аэрирующего воздуха от 1,5 до 15 л/мин при остальных условиях культивирования (культура клеток, питательная среда, температура, освещенность, длительность культивирования) тех же, что и в примере 1, показали, что выход биомассы на единицу объема культуры был в 1,3 раза ниже, а содержание в ней стефарина - в 1,6 раза меньше, чем в шейкерных колбах. Кроме того, в опытах с барботажем культуры клеток стефании гладкой отмечено, что клетки в большой массе оседают у дна биореактора, что, возможно, разрушает их структуру и ухудшает процессы массопередачи кислорода и питательных веществ между клетками и культуральной жидкостью.