КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖИ, СОДЕРЖАЩИЕ АКТИВАТОРЫ ЦИРКАДНЫХ ГЕНОВ И СИНЕРГИЧЕСКУЮ КОМБИНАЦИЮ АКТИВАТОРОВ ГЕНА sirt1
SKIN REPAIR COMPOSITIONS CONTAINING CIRCADIAN GENE ACTIVATORS AND SYNERGISTIC COMBINATION OF sirt1 GENE ACTIVATORS

Настоящая заявка является частичным продолжением рассматриваемой заявки на патент США № 11/837658, поданной 13 августа 2007 года, и частичным продолжением рассматриваемой заявки US 12/367705, поданной 9 февраля 2009 года, которые обе полностью включены в настоящее описание путем ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к области лечения кожи. Конкретнее, изобретение относится к композициям и способам усиления репарации поврежденной ДНК в клетках кожи.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В настоящее время хорошо известно, что кожа подвергается повседневному воздействию разнообразных факторов окружающей среды и образа жизни. Краткий перечень указанных факторов включает ультрафиолетовое излучение-A (УФ-A), ультрафиолетовое излучение-B (УФ-B), загрязнение внешней среды, сигаретный дым, неправильное питание, недостаточный отдых и физиологический стресс. Это неблагоприятное воздействие проявляется в виде повреждения ДНК и белков клеток кожи. Складки и морщины в коже относятся к менее серьезным исходам повреждения клеток кожи, тогда как меланома является одним из более серьезных поражений.
Повреждение ДНК
Некоторые факторы окружающей среды и образа жизни непосредственно взаимодействуют с ДНК и/или белками клеток кожи, вызывая их повреждение, некоторые факторы вызывают повреждение косвенно, а некоторые факторы способны оказывать оба вида воздействий. Примером непосредственного повреждения ДНК было бы поглощение фотонов УФ-B части ультрафиолетового спектра ДНК клеток кожи. Поглощение фотонов может вызвать мутации в последовательности ДНК. Например, примерно 8% всех случаев меланомы вызваны прямой мутацией ДНК.
Пример непосредственного повреждения ДНК и белков клеток кожи наблюдается, когда фотоны ультрафиолетового излучения поступают в кожу и абсорбируются хромофорами. В состоянии возбуждения хромофоры вступают в реакции, которые ведут к образованию реактивных видов кислорода. Например, в коже человека воздействие УФ-B связано с продукцией пероксида водорода, тогда как УФ-A связано с продукцией синглетного кислорода. Если кожа неспособна поддерживать гомеостаз нейтрализацией реактивных видов, то реактивные виды вызовут повреждение ДНК и белков клеток кожи посредством окисления. Это повреждение ДНК и белков называется окислительным стрессом и является основной причиной старения кожи. Также, примерно 92% всех случаев меланомы вызваны непрямым окислительным повреждением ДНК.
Повреждение ДНК: предотвращение и сдерживание в сравнении с репарацией
Содержащие ДНК клетки кожи включают стволовые клетки кератиноциты и меланоциты. По оценкам, один солнечный ожог приводит к сотням тысяч мутагенных модификаций оснований ДНК, таких как T-T (тиамин-тиамин) димеры; 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-DG); 06MeG (06-метилгуанин); циклобутан-пиримидиновые димеры (CPD); и 6-4 фотопродукты (6-4PP), в пораженных клетках. Указанные мутации запускают различные реакции внутри клеток кожи, которые могут привести к предотвращению дальнейшего повреждения ДНК или апоптозу клетки. Например, известно, что продукция меланина в меланоцитах стимулируется УФ излучением в качестве защитной меры. Для противодействия угрозе со стороны УФ излучения, меланин продуцируется меланоцитами в нижних отделах эпидермиса и с помощью мигрирующих кнаружи кератиноцитов, распределяется по всему верхнему и нижнему отделам эпидермиса. В первом случае, представляется, что меланин предотвращает дальнейшее повреждение ДНК, вызванное УФ, действием в качестве УФ фильтра, который ограничивает количество УФ, которое проникает в нижний отдел эпидермиса, где локализуются меланоциты и стволовые клетки кератиноциты. Однако, в качестве второй линии защиты, меланин сдерживает повреждение ДНК вследствие УФ излучения, вызывая апоптоз кератиноцитов. Путем содействия апоптозу, сдерживается поврежденная ДНК, которая имеет меньше шансов перехода на дочерние клетки (см., например, Yamaguchi et al., Melanin mediated apoptosis of epidermal cells damaged by ultraviolet radiation: factors influencing the incidence of skin cancer; Arch Dermatol Res. 2008 Apr; 300 Suppl 1: S43-S50).
Кроме предотвращения и сдерживания повреждения ДНК, здоровые кератиноциты и меланоциты имеют естественный внутренний механизм для репарации повреждений ДНК. Эти механизмы отличаются от механизмов предотвращения и сдерживания, которые вовлекают различные (хотя иногда перекрывающиеся) каскады реакций. Композиции и способы по настоящему изобретению в первую очередь касаются репарации повреждения ДНК.
Существуют клеточные механизмы восстановления для репарации повреждений ДНК в результате различных причин, не только повреждения, вызванного УФ, которое обсуждалось. Однако репарация повреждений ДНК требует времени. Например, репарация повреждений в виде ТТ димеров и 6-4PP, образованные воздействием УФ-B, может занимать соответственно до 48 и 8 часов, если она не ускоряется экзогенным влиянием. Репарация повреждений в виде 8-оксо-dG и 06MeG вследствие воздействия УФ-A или УФ-B, озона или дыма и загрязнения, может занимать до 2 часов. В идеале, репарация повреждений ДНК происходит перед клеточным делением. В противном случае, предпочтительным исходом является апоптоз. Но если случается, что повреждение ДНК оказывает неблагоприятное воздействие на стимуляцию апоптоза, или если мутация происходит без выявления, то поврежденная ДНК может переходить на следующее поколение. Композиции и способы по настоящему изобретению в первую очередь относятся к максимальному увеличению репарации повреждения ДНК перед тем, как произойдет клеточное деление.
Защитные и репаративные механизмы клетки регулируются циркадными часами.
В нормальных условиях клеточные функции, включая экспрессию и репарацию ДНК, не происходят в случайное время с равной вероятностью. Скорее, каждая клетка имеет эндогенный цикл (или часы) длительностью примерно 24 часа (т.е. циркадный ритм), и различные виды активности клетки регулируются данным эндогенным циклом. При отсутствии какого-либо внешнего стимула каждая клетка функционировала бы автономно в соответствии со своими эндогенными часами. Однако эндогенные часы клеток по всему организму синхронизированы. Для синхронизации видов активности клеток друг с другом и с окружающей средой, организм способен принять сигналы окружающей среды. Самым значительным сигналом окружающей среды является присутствие или отсутствие дневного света. Таким образом, циркадный цикл состоит из фаз света и темноты, которые грубо совпадают с фазами солнечного дня.
В настоящее время понятно, что циркадные ритмы позволяют клеткам предвидеть изменения в окружающей среде, которые могут воздействовать на клетки, и своевременно адаптироваться к тем изменениям. Пока генетические механизмы клеточных циркадных ритмов функционируют должным образом, клетки выполняют каждую из их многих функций синхронизированным образом, во время, которое является оптимальным для жизнеспособности и/или гомеостаза клеток. Например, по мере приближения дневного света (но даже перед тем, как на кожу воздействует УФ), активируются определенные гены для продукции белков, защищающих клетки против предполагаемого повреждения от УФ излучения. Затем, по мере того, как дневной свет убывает, эти гены выключаются. С другой стороны, сами циркадные гены могут подвергаться атаке факторов окружающей среды. Повреждение одного или более генов, которые регулируют циркадный ритм клетки, может изъять клетку из синхронизации с окружающей средой и с другими клетками.
Сердцевинный циркадный механизм
Факторы транскрипции представляют собой белки, которые связываются со специфическими последовательностями ДНК для регуляции передачи генетической информации от ДНК к РНК. Сердцевинный циркадный механизм, или «клеточные часы», состоит из факторов транскрипции, которые участвуют в петлях внефазной, негативной и позитивной обратной связей, которые ведут к осциллирующемуся характеру транскрипции генов.
В основном петли негативной обратной связи млекопитающих, гетеродимер факторов транскрипции CLOCK и BMAL1 активируют транскрипцию генов period (per) и cryptochrome (cry). У людей, период ген представляет собой в действительности семейство из трех генов per1, per2 и per3, а семейство генов cry включает cry1 и cry2. После их трансляции, PER- и CRY-белки мигрируют в цитоплазму и образуют комплексы PER/CRY.
Посттрансляционная регуляция создает преднамеренную задержку, после которой комплексы PER/CRY перемещаются в ядро клетки. Концентрации PER и CRY в ядре достигают пика в конце циркадного дневного времени, в которое CRY-белки затем действуют для ингибирования транскрипционной активности гетеродимера CLOCK/BMAL1. Таким образом, представляется, что CRY выключает свою собственную транскрипцию.
С другой стороны, представляется, что в одной петле позитивной обратной связи, PER2 после перемещения в ядро стимулирует транскрипцию BMAL1, в конечном счете, приводя к транскрипции генов period и cry. Также представляется, что димер CLOCK/BMAL1 стимулирует гены rev-erba и rora. Rora активирует транскрипцию BMAL1, тогда как rev-erba подавляет CLOCK и BMAL1. Максимальные величины активности так называемых «канонических часовых генов» (clock, bmal1, per1, per2, per3, cry1 и cry2) находятся вне фазы, так что в результате возникает самостоятельно поддерживающаяся петля, имеющая период приблизительно 24 часа.
Клеточный цикл
Клеточный цикл относится к серии явлений, которая происходит в клетке, приводя к делению и репликации клетки. Цикл обычно описывается в виде четырех или пяти последовательных фаз, требующих для завершения примерно 24 часа. В пределах каждой фазы клеточного цикла имеются контрольные точки, которые обеспечивают завершение всех необходимых процессов данной фазы перед началом следующей фазы. В клетках человека «первая» фаза представляет собой фазу синтеза (S), в которую копируется и синтезируется ДНК клетки. Фаза S может обычно длиться от 6 до 8 часов. В фазу G2, длящуюся 3-4 часа, синтезируются белки, и клетка удваивается в размере. В течение митоза (M) ядерная оболочка разрушается для того, чтобы каждая копия генетического материала могла отделиться к противоположным полюсам клетки. После образования новой ядерной оболочки вокруг каждого набора хромосом, клетка расщепляется надвое (цитокинез). Фаза M длится примерно 1 час. Четвертой и самой длинной фазой (6-12 часов) является фаза G1, которая характеризуется синтезом РНК и белка. От фазы G1 клетка может снова вступить в фазу S или она может вступить в фазу G0. В фазе G0 клетка находится в состоянии покоя. Фаза G0 может длиться в течение дней и лет. Стволовые клетки могут возвратиться от фазы G0, вступая в фазу G1. Дифференцированные клетки в целом не возвращаются из фазы G0. Также, клетки с поврежденной ДНК могут вступить в фазу G0, а не подвергнуться апоптозу.
Контрольные точки клеточного цикла ингибируют дальнейшее прохождение поврежденной ДНК.
Во время деления клеток контрольные точки используются для регуляции прохождения клетки по клеточному циклу. Контрольные точки предотвращают переход клетки к следующей фазе до завершения всех необходимых процессов, включая любую репарацию поврежденной ДНК. Таким образом, контрольные точки обеспечивают, чтобы поврежденная или неполная ДНК не перешла на дочерние клетки. Существует несколько контрольных точек. Контрольная точка G1/S (контрольная точка ограничения) прерывает клеточный цикл для того, чтобы могло быть принято «решение» о том, входить ли в фазу покоя или нет. В контрольной точке G2/M клеточный цикл останавливается, если выявляется поврежденная ДНК, что является необычной ситуацией. Пострепликационная контрольная точка относится к поврежденной ДНК, которая была реплицирована в фазу синтеза. Репликация поврежденной ДНК запускает клеточную реакцию, которая предотвращает прогрессирование клеточного цикла до завершения процессов пострепликационной репарации. В человеческих клетках пострепликационная контрольная точка предоставляет время для репарации задержкой начала фазы митоза. Ген chk1 осуществляет контроль над пострепликационной контрольной точкой, тогда как ген p53 играет важную роль в запуске контрольных механизмов и в контрольной точке G1/S, и в контрольной точке G2/M.
Циркадные часы также регулируют пролиферацию клеток.
В последние годы достигнуто понимание значения циркадных часов в регуляции клеточной пролиферации. Например:
«Нарушение циркадного регулирования времени... имеет далеко идущие последствия для нормального регулирования клеточного деления» (Reddy et al., 2005 Circadian clocks: neural and peripheral pacemakers that impact upon the cell division cycle. Mutation Research 574 76-91).
«Детальное понимание сущности механизмов, посредством которых компоненты часов взаимодействуют с регуляторными механизмами клеточного цикла, основано на результатах недавних исследований на мышах. Например,... задержка между удалением печеночной ткани (частичной гепатэктомией) и последующей первой волной митоза зависит от времени дня, когда была выполнена операция» (Vallone et al., 2007 Start the clock! Circadian rhythms and development. Developmental Dynamics 236 142-155).
«От цианобактерий до высших позвоночных имеется много примеров «синхронизации» циркадными часами S-фазы и митоза клеточного цикла для того, чтобы они происходили в течение ночного периода» (Vallone et al.). [Предположительно, синтез ДНК и митоз происходят ночью для защиты ДНК от вредного воздействия УФ излучения или другого ионизирующего излучения от солнца].
Таким образом, циркадные часы оказывают перекрывающее влияние на клеточный цикл синтеза ДНК и белка, митоз и цитокинез, синтез и репарацию РНК. Поэтому, когда факторы окружающей среды вмешиваются в циркадный механизм клетки, клеточная функция нарушается. Заявители утверждают, что когда лечение может задействовать или рассинхронизировать циркадные часы клетки, или когда лечение может восстановить «нормальные уровни» циркадной экспрессии генов, то клеточное функционирование может улучшиться, повреждение клеток может быть восстановлено ускоренным образом, или апоптоз может происходить более своевременным образом.
Окружающая среда может вывести циркадный ритм из синхронизации
Средства, которые воздействуют на один или более генов, которые регулируют циркадный ритм клетки, могут вывести клетку из синхронизации с окружающей средой и с другими клетками. Например, в часы после воздействия УФ излучения, возможно до 20 часов, уровни экспрессии генов clock, bmal1 и per1 в человеческих кератиноцитах значительно подавлены (см. фиг.1). Под термином «значительно подавлены» заявители подразумевают ниже минимальной экспрессии, который указанные гены проявляют при их нормальном циркадном цикле, как описано выше. Кроме того, после воздействия УФ излучения обычный тип генной экспрессии, который может быть описан как грубо синусоидальный, утрачивается.
На фиг.1 горизонтальная линия отмечает обычный средний уровень экспрессии гена clock; начиная примерно через 44 часа после воздействия УФ излучения, он проявляет типичное циркадное изменение около этой линии. Напротив, сразу после воздействия УФ-B, уровни генной экспрессии упали до уровня, значительно ниже нормального, и не возвращались к нормальным уровням в течение примерно 20 часов. В течение этих 20 часов нормальный тип генной экспрессии был утрачен для всех трех генов. И даже когда уровни генной экспрессии возвращались до почти нормальных уровней, требовался период от примерно 20 часов до примерно 44 часов для возврата нормального синусоидального типа экспрессии. Таким образом, воздействие УФ излучения действительно оказывало два эффекта. Один эффект состоит в резком снижении уровня экспрессии циркадных генов, а другой представляет тип, например, регулирование по времени их экспрессии. От 0 до примерно 44 часов после воздействия УФ излучения, все процессы - регулирование по времени синтеза ДНК и белка, митоз и цитокинез, синтез и репарация РНК и программируемая гибель клеток (апоптоз) - нарушены.
Конечно, воздействие УФ излучения происходит в дневное время, в частности, в течение особенно опасного периода с 10 часов утра до 2 часов дня. Как уже отмечено, концентрация белков PER и CRY в ядре достигает максимума в конце циркадного дневного времени, когда белки CRY действуют для ингибирования транскрипции гетеродимера CLOCK/BMAL1. Любая задержка в достижении критической концентрации, которая выключает экспрессию clock и bmal1, удлинит циркадный цикл. Таким образом, воздействие УФ излучения имеет тенденцию удлинять циркадный цикл. Это выбрасывает клеточный цикл из синхронизации с окружающей средой. Репликация ДНК и митоз могут не происходить ночью, что является оптимальным для клеточной репликации. Также может быть нарушено синхронизирующее влияние, которое циркадные гены оказывают на клеточный цикл, так что повреждение ДНК может не быть выявлено или может не быть подвергнуто репарации, и ему может быть предоставлена возможность перейти на дочерние клетки.
Сообщается, что сиртуины задерживают начало митоза.
Сиртуин 1 (также известный как SIRT1 или ортолог 1 молчащего информационного регулятора два) представляет собой фермент, который регулирует метаболизм и выживание клеток в ответ на стресс. Он связан с продолжительностью жизни клеток. Ген sirt1, который кодирует фермент SIRT1, не является циркадным геном. Chua et al. предположили, что SIRT1 стимулирует репликативную последовательность путем остановки клеточного цикла (Chua et al. (2005) Mammalian SIRT1 limits replicative life span in response to chronic genotoxic stress. Cell Metabolism 2, 67-76).
В US 2009-0082278 (полностью включенном в настоящее описание путем ссылки), кроме того, описывается этот ген и топические композиции для кожи, которые могут стимулировать его. В абзацах 8-13 указано:
«Заявители недавно обнаружили участие нового белка в механизмах клеток кожи, которые играют важную роль в процессе старения и клеточной защиты».
«Заявители продемонстрировали, что белок SIRT, а точнее, белок SIRT1, был экспрессирован в клетках кожи, и что его экспрессия была связана с различными стрессами, с которыми сталкиваются кожные клетки. Они, в частности, продемонстрировали, что индукция экспрессии этого белка с использованием различных агентов обеспечила возможность защиты клеток и помогала им лучше бороться против стресса и эндогенного старения».
«Белки SIRT являются частью семейства сиртуинов и представляют собой NAD+ зависимые ядерные белки, которые играют важную роль в деацетилировании гистона. Гены SIR (Молчащих Информационных Регуляторов), которые кодируют белки SIR, были впервые описаны у S. cerevisiae в 1979 г. (Rine J and A L, Genetics 1979). Позднее было продемонстрировано, что избыточная экспрессия белка SIR2P у C. elegans обеспечила возможность увеличения продолжительности жизни организма (Tissenbaum and A L, Nature 2001). Это исследование позволило предположить, что эти белки связаны с продолжительностью жизни».
«Белок SIRT1 представляет собой наилучшим образом охарактеризованный человеческий сиртуин, и он взаимодействует с многочисленными транскрипционными регуляторами. Человеческий белок SIRT1 был описан как участвующий в регуляции p53 (Cheng H L and A 1. Proc Natl Acad Sci USA. 2003), а позднее - как модулятор старения клеток (Langley E and A L, EMBO J. 2002). Были обнаружены другие человеческие белки SIRT (SIRT2, SIRT3, SIRT4-7). Человеческий белок SIRT2 был изучен очень мало; однако некоторые исследования продемонстрировали его роль в регуляции митотической активности (Dryden S C and A 1. Mol Cell Bio. 2003), а также его участие в регуляции белка p53 (Vaziri H and A L, Cell. 2001). До настоящего времени сиртуины деацетилазы считались семейством ферментов, играющих важную роль в регуляции клеточной гибели и ее жизненного цикла (Porcu M. and Chiarugi A, Trends Pharmacol Sci., 2005)».
«Настоящее изобретение [то есть US 2009-0082278] относится к косметической или фармацевтической композиции, содержащей, в косметически или фармацевтически приемлемой среде, по меньшей мере одно соединение, которое вероятно активирует синтез белков SIRT в клетках кожи. Предпочтительно, в соответствии с изобретением, соединения активируют конкретный класс белков SIRT, белки SIRT1».
До настоящего времени не были описаны соединения, которые служат в качестве индукторов синтеза семейства белков SIRT в клетках кожи».
В настоящем описании указано, что до настоящего времени даже в US2009-0082278 не было описано применение композиций, содержащих активаторы sirt1, в согласовании с активаторами циркадных генов. Насколько осведомлен заявитель, местная композиция, действие которой направлено на подавленные уровни белков CLOCK и PER1 в кератиноцитах человеческого эпидермиса, включающая один или более нециркадных агентов, задерживающих митоз, неизвестна.
Топические композиции для репарации ДНК
Топические продукты для нанесения на кожу с целью стимуляции процесса клеточной репарации известны. Например, такие продукты могут включать ферменты репарации ДНК для повышения эффективности естественной репарации клеточной ДНК, смачивающие ингредиенты для поддержания гидратации кератиноцитов, увлажняющие ингредиенты для улучшения барьерной функции кожи и т.д. Хотя указанные ингредиенты могут улучшить способность самостоятельного восстановления кератиноцитов, всегда остается возможность для улучшения. В отличие от предшествующего уровня техники настоящее изобретение относится к средствам восстановления уровней неповрежденных циркадных белков в клетках кожи и средствам восстановления нормального типа экспрессии циркадных генов в комбинации со средством ингибирования передачи поврежденной ДНК на дочерние клетки.
ЦЕЛИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является получение топической композиции, которая при нанесении на кожу восстанавливает нормальные уровни циркадных белков в клетках кожи и восстанавливает нормальный тип экспрессии циркадных генов ускоренным образом.
Целью настоящего изобретения является получение композиции, которая восстанавливает подверженную световому и/или окислительному повреждению кожу, путем положительной регуляции экспрессии генов clock и per1 и задержкой митоза клеток кожи.
Целью настоящего изобретения является получение топической композиции, которая снижает вероятность пролиферации поврежденной ДНК клеток кожи.
Целью настоящего изобретения является получение топической композиции, которая снижает вероятность пролиферации ДНК клеток кожи, которая была повреждена агрессивными факторами окружающей среды.
Еще одной целью изобретения является получение композиции для лечения кожи, содержащей по меньшей мере один активатор генов clock и per1, по меньшей мере один нециркадный агент задержки митоза и, возможно, по меньшей мере один фермент репарации ДНК.
Резюме
Все указанные выше цели достигаются топической композицией, содержащей по меньшей мере одно средство, которое стимулирует экспрессию циркадных генов в клетках кожи и по меньшей мере одно нециркадное средство, которое задерживает митоз в клетках кожи. Было обнаружено, что композиции, содержащие средства, которые стимулируют (или активируют) гены clock и гены per1, в то же время также увеличивая уровни SIRT1, синергически усиливают клеточную жизнеспособность, клеточную долговечность, ингибируют клеточное повреждение, вызванное агрессивными факторами внешней среды, улучшают репарацию повреждения ДНК и синергически снижают вероятность пролиферации ДНК поврежденных клеток кожи. Композиция, возможно, содержит один или более ферментов репарации ДНК.
Предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются топические композиции для нанесения на кожу, которые проявляют описанные выше эффекты. Предпочтительно, такие композиции содержат один или более активаторов генов clock и per1 кератиноцитов, наряду с SIRT1 или одним или более активаторами sirt1. Предпочтительно, такие композиции просты в применении, они эффективны, косметически приемлемы, химически, термодинамически устойчивы и устойчивы к действию света, безопасны для топического применения, имеют немного или лишены побочных эффектов и коммерчески целесообразны на рынке средств для личного ухода.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показаны уровни экспрессии генов clock, bmal1 и per1 в кератиноцитах человека в течение 72 часов после воздействия УФ излучения.
На фиг.2 показано воздействие активаторов sirt1, Орсиртина™ и ресвератрола, на выживание кератиноцитов человека.
На фиг.3 показано воздействие активаторов циркадных генов в комбинации с активаторами sirt1, Орсиртином™ и ресвератролом.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ
Насколько известно заявителю, никогда не было описано применение топической композиции, содержащей активаторы sirt1 для содействия остановке клеточного цикла, в сочетании с топическим нанесением активаторов циркадных генов для восстановления нормального циркадного цикла.
Определения
Пока нет иных указаний, все процентные доли, приведенные в настоящем описании, представляют собой процентные доли по массе. В отношении генов термины «активировать» и «стимулировать» или этимологически связанные термины означают ингредиент, который вызывает экспрессию одного или более белков, кодируемых геном.
Термин «часовой ген» иногда используется в литературе для обозначения любого из так называемых «канонических» циркадных генов, включая гены clock, bmal1, period и cryptochrome. В настоящем описании «clock» (курсивом) всегда относится к гену, который кодирует белки CLOCK. В настоящем описании гены clock, bmal1, period и cryptochrome совместно именуются «циркадными генами».
Термин «фермент репарации ДНК» означает фермент, который способен восстановить мутагенное повреждение основания ДНК. Такие ферменты часто группируются по типу повреждения ДНК, которое они восстанавливают. Например, ферменты BER (эксцизионной репарации оснований), ферменты эксцизионной репарации нуклеотидов (NER); ферменты репарации ошибочного спаривания оснований (MMR); ДНК-геликазы; ДНК-полимеразы и т.д. Например, такие мутации, как 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин, могут восстанавливаться OGG1 (8-оксо-гуанин-гликозилазой). T-T димеры могут восстанавливаться ферментом эксцизионной репарации нуклеотидов, фотолиазой. 6-4 фотопродукты могут восстанавливаться NER. 06-метил-гуанин может восстанавливаться 06-алкил-гуанин-трансферазой (AGT).
«Восстановление» в отношении кожи или клеток кожи означает, что в целом улучшается жизнеспособность, сила и долговечность кератиноцитов. Примеры восстановления включают репарацию поврежденной ДНК кератиноцитов и устранение потери клеточной гидратации вследствие УФ света, дыма или других агрессивных факторов окружающей среды.
Фраза «безопасные для топического применения» означает соответствующие всем региональным и местным нормативам, которые регулируют безопасность косметических продуктов. «Косметически приемлемая» означает, что внешний вид, ощущение и запах композиции находятся в пределах приемлемости для потребителя, как понятно среднему специалисту в данной области. Фразы «химически устойчивая», «термодинамически устойчивая» и «устойчивая к действию света» означают, что от момента изготовления до окончания периода по меньшей мере шести месяцев (предпочтительно, 3 лет) композиция остается косметически приемлемой. Фраза «коммерчески целесообразна на рынке средств для личного ухода» означает, что затраты на изготовление и распространение композиции не должны быть больше, чем те, которые по уже имеющемуся опыту характерны для промышленности, выпускающей средства для личного ухода.
Положительная регуляция CLOCK и PERIOD1
Композиция по изобретению содержит по меньшей мере одно средство, которое стимулирует гены clock и/или per1 кератиноцитов. Предлагаемые концентрации указанных генов в целом находятся в диапазоне от примерно 0,000001 до примерно 40%, предпочтительно, от примерно 0,000005 до 35%, более предпочтительно, от примерно 0,00001 до 25% в отношении общей массы готовой композиции. В целом, указанные диапазоны можно понимать как являющиеся эффективными количествами. Под «эффективным количеством» подразумевается, что концентрация указанных средств в композиции для местного нанесения на кожу человека в условиях воздействия внешней среды достаточна для улучшения выживаемости кератиноцитов по меньшей мере на 5%. Походящие активаторы clock или per1 могут присутствовать в форме растительных экстрактов, полипептидов, пептидов, аминокислот и тому подобных.
Особенно предпочтительный активатор генов clock и/или per1 содержит пептид формулы (I):
1
n
1
2
P
2
R-(AA)-X-S-T-P-X-(AA)-R
n
1
2
P
где (AA)-X-S-T-P-X-(AA) представляет собой (SEQ ID NO: 1) и:
1
X обозначает треонин или серин, или равен нулю,
2
X обозначает изолейцин или лейцин, или пролин, или валин, или аланин, или глицин, или равен нулю,
AA обозначает любую аминокислоту или ее производное, и n и p означают целые числа от 0 до 4 (0 и 4 включительно),
1
R обозначает функциональную группу первичного амина N-концевой аминокислоты, или свободной, или замещенной защитной группой, которая может быть выбрана или из ацетильной группы, бензоильной группы, тозильной группы, или из бензилоксикарбонильной группы,
2
1
20
2
1
4
R обозначает гидроксильную группу карбоксильной функциональной группы C-концевой аминокислоты, замещенной защитной группой, которая может быть выбрана или из C-C алкильной цепи, или из группы NH, NHY или NYY, причем Y обозначает C-C алкильную цепь, и где последовательность общей формулы (I) содержит от примерно 3 до 13 аминокислотных остатков.
1
2
Последовательность общей формулы (I) может содержать замещения аминокислот X и X другими химически эквивалентными аминокислотами, где аминокислоты представляют собой: аланин (A), аргинин (R), аспарагин (N), аспарагиновую кислоту (D), цистеин (C), глутаминовую кислоту (E), глутамин (Q), глицин (G), гистидин (H), изолейцин (I), лейцин (L), лизин (K), метионин (M), фенилаланин (F), пролин (P), серин (S), треонин (T), триптофан (W), тирозин (Y) и валин (V).
Более предпочтительными вариантами формулы I являются следующие пептиды:
(SEQ ID NO: 2) Y-V-S-T-P-Y-N-NH<sub>2</sub>Tyr-Val-Ser-Thr-Pro-Tyr-Asn-NH<sub>2</sub>
(SEQ ID NO: 3) NH<sub>2</sub>-V-S-T-P-E-NH<sub>2</sub>NH<sub>2</sub>-Val-Ser-Thr-Pro-Glu-NH<sub>2</sub>
S-T-P-NH<sub>2</sub>Ser-Thr-Pro-NH<sub>2</sub>
(SEQ ID NO: 4) NH<sub>2</sub>-L-H-S-T-P-P-NH<sub>2</sub>NH<sub>2</sub>-Leu-His-Ser-Thr-Pro-Pro-NH<sub>2</sub>
(SEQ ID NO: 5) CH<sub>3</sub>NH-R-H-S-T-P-E-NH<sub>2</sub>CH<sub>3</sub>-NH-Arg-His-Ser-Thr-Pro-Glu-NH<sub>2</sub>
(SEQ ID NO: 6) CH<sub>3</sub>NH-H-S-T-P-E-CH<sub>3</sub>NHCH<sub>3</sub>-NH-His-Ser-Thr-Pro-Glu-CH<sub>3</sub>-NH<sub>2</sub>
2
Более предпочтителен пептид S-T-P-NH, SEQ ID NO: 4, или его смеси. Наиболее предпочтителен пептид, выпускаемый компанией ISP-Vinscience под торговым знаком Chronolux, имеющий название по номенклатуре INCI трипептид-32.
Фиг.1, 2 и 3 родственной заявки US12/367705 и текст, описывающий указанные чертежи, демонстрируют способность Chronolux для улучшения выживания кератиноцитов, защищая против стресса, вызванного действием УФ излучения, особенно при комбинации по меньшей мере с одним ферментом репарации ДНК.
Нет прямых очевидных свидетельств того, что одновременное применение активаторов генов clock и per1 обеспечило бы получение благоприятного результата. В конце концов, при нормальном циркадном ритме клеточные концентрации белка CLOCK и PERIOD1 находятся вне фазы. Тем не менее, достигается благоприятный результат. Можно предположить, что истощение уровней белков CLOCK и PERIOD1 в клетках кожи под воздействием агрессивной внешней среды настолько велико, что благоприятный эффект достигается как можно более быстрой положительной регуляцией обоих белков.
Положительная регуляция SIRTUIN1
Заявители неожиданно обнаружили, что благоприятные результаты, достигаемые применением активаторов генов clock и per1 кератинов, модифицируются, иногда значительно улучшаются при комбинации с активатором sirt1 кератиноцитов. SIRT1 имеет тенденцию индуцировать остановку клеточного цикла. Учитывая сложность циркадного механизма и его регуляторное взаимодействие с клеточным циклом, в предшествующем уровне техники можно было бы не ожидать, что было бы благоприятным индуцировать остановку клеточного цикла при одновременном восстановлении нормальных уровней циркадных белков.
Без связи с какой-либо теорией следует понимать, что PER1 оказывает непосредственные воздействия на клеточный цикл, кроме воздействия посредством циркадного контроля. Например, PER1, кроме его роли в качестве сердцевинного компонента циркадного цикла, по имеющимся сообщениям способен активировать путь ATM-киназы, ведущий к остановке клеточного цикла. ATM- (мутированная при атаксии-телеангиэктазии) киназа представляет собой ядерную протеин-киназу, которая мобилизуется в ответ на двухнитевые разрывы ДНК. ATM-киназа фосфорилирует CHK1 и CHK2, регуляторы контрольных точек клеточного цикла, которые участвуют в остановке клеточного цикла и отсроченном вхождении в митоз. Когда PER1 недостаточно экспрессирован в результате некоторого стресса со стороны окружающей среды, то остановка клеточного цикла может не произойти или может быть отсрочена. Таким образом, может быть недостаточно времени для осуществления репараций поврежденной ДНК перед митозом или цитокинезом. В то же самое время, сниженная экспрессия PER1 связывалась с уменьшенным апоптозом. Таким образом, поврежденная клетка, которая должна погибнуть, может выжить и делиться. Поэтому, с учетом того, что стрессовое воздействие окружающей среды ведет к аномальному снижению уровней PER1, что приводит к неспособности вызвать остановку клеточного цикла и уменьшенному апоптозу, которые ведут к воспроизводству поврежденной ДНК, можно было ожидать, что активация per1 исправила бы эту проблему. Тем не менее, заявители наблюдали, что жизнеспособность кератиноцитов значительно улучшалась, когда активатор гена sirt1 используется в комбинации с активаторами генов clock и per1. Без связи с какой-либо теорией это наблюдение может подразумевать, что активация самого per1 не в состоянии достаточно быстро восстановить уровни PER1, чтобы воздействовать на реперацию перед тем, как поврежденная ДНК может распространяться на дочерние клетки.
Под «активатором SIRT1» заявители подразумевают любое соединение, которое, вероятно, поддержит эндогенную продукцию белков SIRT1, в частности, молекул, участвующих в положительной регуляции таких предшественников, как ДНК или РНК. Среди указанных соединений, которые с вероятностью активируют синтез белков SIRT1 в клетках кожи, были описаны различные молекулы, такие как полифенолы. Более конкретно, можно указать производные транс-стилбена (такие как ресвератрол, пикеатаннол), производные хальконов (такие как изоликвиритигенин, бутеин) и производные флавонов (такие как фистеин, лютеолин, кверцетин). Эффективность ресвератрола или производного ресвератрола была показана в родственной заявке на патент США № 11/837658. Однако определенные пептиды, ввиду присущих им структурных аналогий с пептидами в коже, являются предпочтительными активаторами sirt1. Еще более предпочтительной является сингергическая комбинация пептидного активатора (активаторов) и ресвератрола (подробнее об этом речь идет ниже).
Пептидные активаторы sirt1
Пептиды, ввиду присущих им структурных аналогий с пептидами в коже, являются предпочтительными активаторами sirt1. Среди соединений пептидной природы можно указать белковые фрагменты, пептидные и полипептидные фрагменты, пептиды, а также все последовательности двух или более аминокислот, связанных вместе пептидными связями. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения размеры пептидных фрагментов находятся в диапазоне от 3 до 50 аминокислот, более предпочтительно, от 3 до 10 аминокислот. Все указанные пептидные фрагменты обладают биологической активностью. Предпочтительным пептидом является:
n
n
(SEQ ID NO: 7) (AA)-G-L-Y-D-N-L-E-(AA)
n
n
(AA)-Gly-Leu-Tyr-Asp-Asn-Leu-Glu-(AA)
где (AA) обозначает любую конкретную аминокислоту или ее производное, и n означает целое число от 0 до 3 (0 и 3 включительно). Особенно предпочтительным пептидом является:
(SEQ ID NO: 8) G-L-Y-D-N-L-E
Gly-Leu-Tyr-Asp-Asn-Leu-Glu
Этот пептид доступен в виде Орситрина™ GL (название по номенклатуре INCI: вода (и) глицерин (и) экстракт Oryza Sativa (риса), выпускаемый компанией ISP Vincience). В композициях по настоящему изобретению, пептидные активаторы SIRT1 присутствуют в количестве примерно от 0,000001% до 20% и, предпочтительно, в количестве примерно от 0,0001 до 5% в отношении общей массы готовой композиции.
Ресвератрол и его производные
Ресвератрол, также именуемый 3,5,4'-тригидроксистильбеном, представляет собой соединение полигидрокси-замещенного стильбена, присутствующего в красном винограде, малине, голубике и чернике и определенных других ягодах или экстрактах, который имеет общую формулу:
Было показано, что ресвератрол представляет собой эффективный антиоксидант, а также проявляет сильные антипролиферативные и противовоспалительные свойства. Недавно сообщалось, что ресвератрол может имитировать калорийное ограничение (CR) у различных организмов, таких как дрожжи, круглые черви, дрозофилы, короткоживущая рыба и мыши, замедлять процесс старения у таких организмов и значительно увеличивать их продолжительность жизни. Без связи с какой-либо определенной теорией заявители считают, что ресвератрол может снижать клеточную пролиферацию и замедлять процесс апоптоза, посредством этого, предоставляя больше времени для репарации повреждения ДНК в клетках. Постулируется, что ресвератрол при комбинации с ферментом репарации ДНК может привести к синергическому эффекту на стимуляцию или иное усиление естественной способности клеток к репарации ДНК.
Однако ресвератрол может потенциально быть неустойчивым в определенных косметических готовых формах. В частности, ресвератрол восприимчив к гидролизу в составах на водной основе и может вызвать обесцвечивание таких составов. Один путь для того, чтобы справиться с неустойчивостью ресвератрола в составах на водной основе состоит в модификации ресвератрола замещением гидроксигрупп в положении 3, 5 и 4' другими функциональными группами для образования производных ресвератрола, которые более устойчивы в косметических смесях. Такие производные предпочтительнее ресвератрола. Было обнаружено, что производные ресвератрола с функциональными группами из неорганических кислот, органических карбоновых кислот, моно-, ди- или полисахаридов или с другими функциональными группами более устойчивы в составах на водной основе. Замещающие группы функционируют для защиты и стабилизации фенольных групп ресвератрола и делают производное ресвератрола более подходящими для применения в косметических составах на водной основе. Замещающие группы могут также легко гидролизованы из соединения после нанесение на кожу, предпочтительно, ферментами и другими ингредиентами на поверхности кожи, для высвобождения активной формы ресвератрола в кожу. Производные ресвератрола по настоящему изобретению имеют общую формулу:
где X, Y и Z обозначают или водород, или защитную группу, при условии, что по меньшей мере одна из групп X, Y и Z обозначает защитную группу. Иллюстративные производные ресвератрола, подходящие для применения в косметических или топических композициях по настоящему изобретению, более детально описаны ниже в настоящей заявке.
A. Сложные эфиры неорганических или органических кислот ресвератрола
Сложные эфиры неорганических кислот ресвератрола, в которых одна или более из групп X, Y и Z обозначают функциональные группы неорганических кислот, такие как фосфаты, нитраты, сульфонаты и карбонаты, могут использоваться в настоящем изобретении. Далее приводится перечень иллюстративных сложных эфиров неорганических кислот, которые особенно подходят для осуществления настоящего изобретения:
3-фосфат-5,4'-дигидроксистилбен
5-фосфат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-фосфат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дифосфат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дифосфат-5-гидроксистилбен
4',5-дифосфат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трифосфат стилбена
3-нитрат-5,4'-дигидроксистилбен
5-нитрат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-нитрат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-динитрат-4'-гидроксистилбен
3,4'-динитрат-5-гидроксистилбен
4',5-динитрат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-тринитрат стилбена
3-сульфонат-5,4'-дигидроксистилбен
5-сульфонат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-сульфонат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дисульфонат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дисульфонат-5-гидроксистилбен
4',5-дисульфонат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трисульфонат стилбена
3-карбонат-5,4'-дигидроксистилбен
5-карбонат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-карбонат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дикарбонат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дикарбонат-5-гидроксистилбен
4',5-дикарбонат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трикарбонат стилбена
4
Фармацевтически приемлемые соли перечисленных выше сложных эфиров ресвератрола могут также использоваться в косметических композициях по настоящему изобретению. Такие соли могут включать один или более одновалентных или двухвалентных катионов, выбранных из группы, состоящей из Na, K, Mg, Ca, Fe и NH. Соли могут быть образованы добавлением соответствующих оснований, таких как гидроксид натрия, гидроксид калия и тому подобные, в раствор, содержащий сложные эфиры ресвератрола.
Сложные эфиры неорганических кислот ресвератрола могут быть легко образованы хорошо известными химическими способами, которые замещают гидроксильные группы фенолов или полифенолов фосфатными, сульфонатными и карбонатными функциональными группами. Например, в патенте США № 4003966 описан одностадийный способ селективного фосфорилирования фенолов для образования их сложных эфиров фосфата, содержание которого во всех целях полностью включено в настоящее описание путем ссылки.
Особенно предпочтительным производным ресвератрола для осуществления настоящего изобретения является 3,4',5-трифосфат стилбена, также именуемый сложным эфиром трифосфата ресвератрола, имеющим формулу:
2
4
Сложные эфиры фосфата ресвератрола, включая ресвератрол трифосфат, описаны в публикации международной патентной заявки № WO 2006/029484 A1, которая полностью включена в настоящее описание путем ссылки. Ресвератрол трифосфат может быть синтезирован способом, изложенным в примере 2 WO 2006/029484 A1. Более конкретно, раствор ресвератрола (3,4,5-тригидроксистилбена) (25 ммоль, 5,7 г) и диметиламинопиридина (7,5 ммоль, 0,93 г) в 100 мл ацетонитрила охлаждают в атмосфере азота до -10°C. Через 10 минут добавляют тетрахлорид углерода (375 ммоль, 36,2 мл) и DIEA (диизопропилэтиламин) (159 ммоль, 27,7 мл), и смесь выдерживают при перемешивании в течение 30 минут. Добавляют дибензилфосфат (113 ммоль, 25,0 мл), и смесь перемешивают в течение еще 12 часов при комнатной температуре. Течение реакции контролируют TLC (тонкослойной хроматографией) (диоксид кремния F254, элюент этилацетат/н-гескан 80/20 об./об.). Добавляют 1 литр 0,5 M KHPO, и смесь затем экстрагируют этилацетатом. Полученный продукт, три(дибензилфосфат) ресвератрола, очищают фильтрованием на силикагеле, промывая сначала смесью этилацетата/н-гесана (80/20 об./б.) для удаления любого не вступившего в реакцию ресвератрола, а затем метанолом для получения масла желтого цвета.
2
К три(дибензилфосфату) ресвератрола (12,5 ммоль) в 200 мл безводного DCM (дихлорметана) при 0°C добавляют бромметилсилан (79 ммоль, 10,4 мл). Через 2 часа добавляют 300 мл HO, и реакционную смесь перемешивают в течение 1 часа. Водную фазу повторно промывают этилацетатом, затем лиофилизируют для получения масла оранжевого цвета.
3
2
К полученному выше продукту, солюбилизированному в 400 мл этанола, добавляют CHONa (37 ммоль, 2,03 г), и реакционную смесь перемешивают в течение 12 часов при комнатной температуре. Этанол выпаривают в роторном испарителе, и остаток солюбилизируют в HO. Водную фазу промывают этилацетатом и лиофилизируют. Масс-спектр полученного твердого вещества белого цвета показывает присутствие ресвератрола трифосфата (PM=468,1), при общем выходе >90% в отношении ресвератрола.
При желании, ресвератрол трифосфат может быть нейтрализован органическими или неорганическими основаниями, такими как гидроксид натрия, гидроксид калия и тому подобными. Особенно предпочтительно, когда ресвератрол трифосфат нейтрализуется гидроксидом натрия для образования тринатрий ресвератрол трифосфата. Ресвератрол трифосфат можно также приобрести у компании Ajinomoto в нейтрализованной форме, имеющей тринатрий ресвератрол трифосфат, используемый CTFA (Ассоциацией Производителей Косметических, Туалетных и Парфюмерных Продуктов).
B. Сложные эфиры карбоновых кислот ресвератрола
1
1
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
6-30
1
40
Другая группа производных ресвератрола, которая может использоваться в настоящем изобретении, представляет собой сложные эфиры ресвератрола и алифатических или ароматических карбоновых кислот, в которых одна или более из групп X, Y и Z представляет собой группу -C(O)-R, где группа R выбрана из группы, состоящей из линейного, разветвленного, насыщенного или ненасыщенного или циклического C-C алкила, замещенного C-C алкила, C-C алкенила, замещенного C-C алкенила, C-C алкинила, замещенного C-C алкинила, арила, C-C арила и замещенного C-C арила. В одном предпочтительном варианте осуществления группа R представляет собой жирную или насыщенную или ненасыщенную C алкильную группу с прямой или разветвленной цепью. Заместители могут быть выбраны из C-C насыщенного или ненасыщенного алкила, галогена (такого как фтор), водорода, алкокси, гидроксила и тому подобных с прямой или разветвленной цепью.
Иллюстративные карбоновые кислоты, которые могут использоваться для образования сложного эфира ресвератрола, включают без ограничения: насыщенные монокарбоновые кислоты, такие как уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота (C4), валерьяновая кислота, гексаноевая кислота, каприловая кислота (C8), лауриновая кислота, теариновая кислота (C18), изостеариновая кислота (разветвленная C18), линолиевая кислота, линоленовая кислота, миристиновая кислота (C14), арахиновая кислота (C20), арахидоновая кислота, эруковая кислота, бегеновая кислота (C22), лауриновая кислота (C12), каприновая кислота (C10), капроновая (C6) и пальмитиновая кислота (C16); ненасыщенные монокарбоновые кислоты, такие как акриловая кислота, этакриловая кислота, сорбиновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота, докозагексаеноевая кислота и эйкозапентаеноевая кислота; аминокислоты, такие как аргинин, глутамин и тирозин; кетокислоты, такие как пировиноградная кислота и ацетоуксусная кислота; ароматические карбоновые кислоты, такие как аскорбиновая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота и феруловая кислота; ди- и трикарбоновые кислоты, такие как щавелевая кислота, малоновая кислота, яблочная кислота, янтарная кислота и глутаровая кислота. Обозначение «C» с последующим числом указывает число атомов углерода в алкильной цепи.
Ниже приведен перечень иллюстративных сложных эфиров карбоновых кислот ресвератрола, которые особенно подходят для осуществления настоящего изобретения:
3-ацетат-5,4'-дигидроксистилбен
5-ацетат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-ацетат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диацетат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диацетат-5-гидроксистилбен
4',5-диацетат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триацетат стилбен
3-пропионат-5,4'-дигидроксистилбен
5-пропионат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-пропионат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дипропионат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дипропионат-5-гидроксистилбен
3,4'-дипропионат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трипропионат стилбен
3-бутират-5,4'-дигидроксистилбен
5-бутират-3,4'-дигидроксистилбен
4'-бутират-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дибутират-4'-гидроксистилбен
3,4'-дибутират-5-гидроксистилбен
4',5-дибутират-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трибутират стилбен
3-валерат-5,4'-дигидроксистилбен
5-валерат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-валерат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дивалерат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дивалерат-5-гидроксистилбен
4',5-дивалерат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-тривалерат стилбен
3-гексаноат-5,4'-дигидроксистилбен
5-гексаноат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-гексаноат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дигексаноат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дигексаноат-5-гидроксистилбен
4',5-дигексаноат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-тригексаноат стилбен
3-каприлат-5,4'-дигидроксистилбен
5-каприлат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-каприлат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дикаприлат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дикаприлат-5-гидроксистилбен
4',5-дикаприлат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трикаприлат стилбен
3-лаурат-5,4'-дигидроксистилбен
5-лаурат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-лаурат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дилаурат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дилаурат-5-гидроксистилбен
4',5-дилаурат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трилаурат стилбен
3-стеарат-5,4'-дигидроксистилбен
5-стеарат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-стеарат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дистеарат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дистеарат-5-гидроксистилбен
4',5-дистеарат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-тристеарат стилбен
3-пальмитат-5,4'-дигидроксистилбен
5-пальмитат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-пальмитат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дипальмитат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дипальмитат-5-гидроксистилбен
4',5-дипальмитат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трипальмитат стилбен
3-акрилат-5,4'-дигидроксистилбен
5-акрилат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-акрилат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диакрилат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диакрилат-5-гидроксистилбен
4',5-диакрилат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триакрилат стилбен
3-метакрилат-5,4'-дигидроксистилбен
5-метакрилат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-метакрилат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диметакрилат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диметакрилат-5-гидроксистилбен
4',5-диметакрилат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триметакрилат стилбен
3-сорбат-5,4'-дигидроксистилбен
5-сорбат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-сорбат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дисорбат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дисорбат-5-гидроксистилбен
4',5-дисорбат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трисорбат стилбен
3-олеат-5,4'-дигидроксистилбен
5-олеат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-олеат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диолеат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диолеат-5-гидроксистилбен
4',5-диолеат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триолеат стилбен
3-линолеат-5,4'-дигидроксистилбен
5-линолеат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-линолеат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дилинолеат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дилинолеат-5-гидроксистилбен
4',5-дилинолеат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трилинолеат стилбен
3-линоленат-5,4'-дигидроксистилбен
5-линоленат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-линоленат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дилиноленат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дилиноленат-5-гидроксистилбен
4',5-дилиноленат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трилиноленат стилбен
3-докозагексаеноат-5,4'-дигидроксистилбен
5-докозагексаеноат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-докозагексаеноат-3,5- дигидроксистилбен
3,5-дидокозагексаеноат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дидокозагексаеноат-5-гидроксистилбен
4',5-дидокозагексаеноат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-тридокозагексаеноат стилбен
3-эйкозапентаеноевый-5,4'-дигидроксистилбен
5-эйкозапентаеноевый-3,4'-дигидроксистилбен
4'-эйкозапентаеноевый-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диэйкозапентаеноевый-4'-гидроксистилбен
3,4'-диэйкозапентаеноевый-5-гидроксистилбен
4',5-диэйкозапентаеноевый-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триэйкозагексаеноевый стилбен
3-аргинат-5,4'-дигидроксистилбен
5-аригинат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-аригинат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диаргинат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диаргинат-5-гидроксистилбен
4',5-диаргинат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триаргинат стилбен
3-глутамат-5,4'-дигидроксистилбен
5-глутамат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-глутамат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диглутамат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диглутамат-5-гидроксистилбен
4',5-диглутамат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триглутамат стилбен
3-тирозат-5,4'-дигидроксистилбен
5-тирозат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-тирозат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дитирозат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дитирозат-5-гидроксистилбен
4',5-дитирозат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-тритирозат стилбен
3-пируват-5,4'-дигидроксистилбен
5-пируват-3,4'-дигидроксистилбен
4'-пируват-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дипируват-4'-гидроксистилбен
3,4'-дипируват-5-гидроксистилбен
4',5-дипируват-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трипируват стилбен
3-ацетоацетат-5,4'-дигидроксистилбен
5-ацетоацетат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-ацетоацетат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диацетоацетат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диацетоацетат-5-гидроксистилбен
4',5-диацетоацетат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триацетоацетат стилбен
3-аскорбат-5,4'-дигидроксистилбен
5-аскорбат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-аскорбат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диаскорбат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диаскорбат-5-гидроксистилбен
4',5-диаскорбат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триаскорбат стилбен
3-бензоат-5,4'-дигидроксистилбен
5-бензоат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-бензоат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дибензоат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дибензоат-5-гидроксистилбен
4',5-дибензоат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трибензоат стилбен
3-салицилат-5,4'-дигидроксистилбен
5-салицилат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-салицилат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дисалицилат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дисалицилат-5-гидроксистилбен
4',5-дисалицилат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трисалицилат стилбен
3-ферулат-5,4'-дигидроксистилбен
5-ферулат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-ферулат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диферулат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диферулат-5-гидроксистилбен
4',5-диферулат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триферулат стилбен
3-оксалат-5,4'-дигидроксистилбен
5-оксалат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-оксалат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диоксалат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диоксалат-5-гидроксистилбен
4',5-диоксалат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триоксалат стилбен
3-малонат-5,4'-дигидроксистилбен
5-малонат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-малонат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дималонат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дималонат-5-гидроксистилбен
4',5-дималонат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трималонат стилбен
3-малат-5,4'-дигидроксистилбен
5-малат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-малат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дималат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дималат-5-гидроксистилбен
4',5-дималат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трималат стилбен
3-сукцинат-5,4'-дигидроксистилбен
5-сукцинат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-сукцинат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дисукцинат-4'-гидроксистилбен
3,4'-дисукцинат-5-гидроксистилбен
4',5-дисукцинат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трисукцинат стилбен
3-глутарат-5,4'-дигидроксистилбен
5-глутарат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-глутарат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диглутарат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диглутарат-5-гидроксистилбен
4',5-диглутарат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триглутарат стилбен
3-глутарат-5,4'-дигидроксистилбен
5-глутарат-3,4'-дигидроксистилбен
4'-глутарат-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диглутарат-4'-гидроксистилбен
3,4'-диглутарат-5-гидроксистилбен
4',5-диглутарат-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триглутарат стилбен
Одна особенно предпочтительная группа сложных эфиров карбоновых кислот ресвератола представляет собой или насыщенные, или ненасыщенные сложные эфиры жирных кислот ресвератола, такие как бутираты ресвератола, валераты ресвератола, гексаноаты ресвератола, сорбаты ресвератола, лаураты ресвератола, стеараты ресвератола, пальмитаты ресвератола, олеаты ресвератола, линолеаты ресвератола, линоленаты ресвератола, эйкозапентаеноаты ресвератола и докозагексаноаты ресвератола.
Такие сложные эфиры жирных кислот ресвератола могут быть легко образованы эстерификацией ресвератола с кислотными производными в соответствии с реакцией Шоттена-Бауманна в щелочной водной среде, как описано в патенте США № 6572882, содержание которого во всех целях полностью включено в настоящее описание путем ссылки.
Другая особенно предпочтительная группа сложных эфиров карбоновых кислот ресвератола представляет собой сложные эфиры карбоновых кислот, такие как ферулаты ресвератола, которые могут быть образованы взаимодействием ресвератола с феруловой кислотой в водной среде.
C. Производные ресвератола в виде простого эфира
2
2
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
1
40
Еще одной группой производных ресвератола, которые могут использоваться в настоящем изобретении, являются простые эфиры ресвератола, в которых одна или более из групп X, Y и Z представляет собой -R, где группа R выбрана из группы, состоящей из линейного, разветвленного или циклического C-C алкила, замещенного C-C алкила, C-C алкенила, замещенного C-C алкенила, C-C алкинила, замещенного C-C алкинила, C-C арила, замещенного C-C арила, и моно-, ди-, олиго- и полисахаридов. Ниже приведен перечень иллюстративных простых эфиров ресвератола, которые особенно подходят для осуществления настоящего изобретения:
3-метокси-5,4'-дигидроксистилбен
5-метокси-3,4'-дигидроксистилбен
4'-метокси-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диметокси-4'-гидроксистилбен
3,4'-диметокси-5-гидроксистилбен
4',5-диметокси-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триметоксистилбен
3-этокси-5,4'-дигидроксистилбен
5-этокси-3,4'-триметоксистилбен
4'-этокси-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диэтокси-4'-гидроксистилбен
3,4'-диэтокси-5-гидроксистилбен
4',5-диэтокси-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триэтоксистилбен
3-пропилокси-5,4'-дигидроксистилбен
5-пропилокси-3,4'-дигидроксистилбен
4'-пропилокси-3,5-дигидроксистилбен
3,5-дипропилокси-4'-гидроксистилбен
3,4'-дипропилокси-5-гидроксистилбен
4',5-дипропилокси-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трипропилоксистилбен
3-фенилокси-5,4'-дигидроксистилбен
5-фенилокси-3,4'-дигидроксистилбен
4'-фенилокси-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диенилокси-4'-гидроксистилбен
3,4'-дифенилокси-5-гидроксистилбен
4',5-дифенилокси-3-гидроксистилбен
3,5,4'-трифенилоксистилбен
3-глюкозид-5,4'-дигидроксистилбен
5-глюкозид-3,4'-дигидроксистилбен
4'-глюкозид-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диглюкозид-4'-гидроксистилбен
3,4'-диглюкозид-5-гидроксистилбен
4,5-диглюкозид-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триглюкозидстилбен
В одном частном варианте осуществления настоящего изобретения используется метокси-замещенное производное ресвератрола. Например, композиция по настоящему изобретению может содержать 3,5-диметокси-4'-гидроксистилбен, который может быть экстрагирован из индийского дерева кино (Pterocarpus marsupium) и коммерчески доступен под торговым наименованием PTEROSTILBENE, выпускаемый компанией Sigma-Aldrich в St. Louis, MO.
В другом частном варианте осуществления настоящего изобретения производное ресвератрола содержит одну или более сахаридсодержащих групп, таких как глюкоза, галактоза, манноза, фруктоза, сахароза, лактоза, мальтоза, трегалоза и тому подобные. Например, глюкозид ресвератрола, который может быть получен экстракцией из растений или растительного материала, такого как ткань polygonum cuspidatum (горца гребенчатого), или культуры in vitro клеток vitis vinifera (винограда культурного), используется в косметических композициях по настоящему изобретению.
D. Азотосодержащие производные ресвератрола
Производные ресвератрола, используемые в композициях по настоящему изобретению, могут также содержать одну или более азотосодержащих функциональных групп, т.е. одна или более из групп A, B и C в указанной выше формуле выбраны из группы, состоящей из амидов, аминов, иминов, амидинов и карбоксамидинов. Ниже приведен перечень иллюстративных простых эфиров ресвератрола, которые особенно подходят для осуществления настоящего изобретения:
3-амид-5,4'-дигидроксистилбен
5-амид-3,4'-дигидроксистилбен
4'-амид-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диамид-4'-гидроксистилбен
3,4'-диамид-5-гидроксистилбен
4',5-диамид-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триамид стилбен
3-амино-5,4'-дигидроксистилбен
5-амино-3,4'-дигидроксистилбен
4'-амино-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диамино-4'-гидроксистилбен
3,4'-диамино-5-гидроксистилбен
4',5-диамино-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триамино стилбен
3-имино-5,4'-дигидроксистилбен
5-имино-3,4'-дигидроксистилбен
4'-имино-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диимино-4'-гидроксистилбен
3,4'-диимино-5-гидроксистилбен
4',5-диимино-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триимино стилбен
3-амидино-5,4'-дигидроксистилбен
5-амидино-3,4'-дигидроксистилбен
4'-амидино-3,5-дигидроксистилбен
3,5-диамидино-4'-гидроксистилбен
3,4'-диамидино-5-гидроксистилбен
4',5-диамидино-3-гидроксистилбен
3,5,4'-триамидино стилбен
Предпочтительно, но не обязательно, производные ресвератрола по настоящему изобретению, если они присутствуют, инкапсулированы в липосомы, или отдельно, или в комбинации с ферментом репарации ДНК и/или одним или более дополнительных активных агентов для ухода за кожей для более эффективной их доставки в дерму кожи. Производные ресвератрола могут присутствовать в косметической композиции по настоящему изобретению в диапазоне от примерно 0,001% до примерно 95%, предпочтительно, от примерно 0,005% до примерно 90%, более предпочтительно, от примерно 0,1% до примерно 20% общей массы всей композиции.
Ферменты репарации ДНК
Композиции по настоящему изобретению, возможно, содержат по меньшей мере один фермент репарации ДНК. Это отличается от заявки на патент США № 11/837658, где требуется по меньшей мере один фермент репарации ДНК, и в которой не предусматривается использование активатора sirt1. Предлагаемые концентрации возможного фермента репарации ДНК составляют от примерно 0,00001 до примерно 35%, предпочтительно, от примерно 0,00005 до примерно 30%, более предпочтительно, от примерно 0,0001 до примерно 25% в отношении общей массы готовой композиции.
Ферменты репарации ДНК, описанные в патентах США №№ 5077211, 5190762, 5272079 и 5296231, которые все полностью включены в настоящее описание путем ссылки, подходят для использования в композициях и способу по изобретению. Один пример такого фермента репарации ДНК может быть приобретен у компании AGI/Dermatics под торговым наименованием Roxisomes, и имеет название по номенклатуре INCI экстракт Arabidopsis Thaliana. Он может присутствовать отдельно или в смеси с лецитином и водой. Известно, что этот фермент репарации ДНК эффективен при репарации мутационного повреждения основания 8-оксо-дигуанина.
Известно, что другой тип фермента репарации ДНК, который может быть использован, эффективен при репарации мутационного повреждения основания 06-метил-гуанина. Он продается компанией AGI/Dermatics под торговым наименованием Adasomes и имеет название по номенклатуре INCI фермент Lactobacillus, который может добавляться к композиции по изобретению отдельно или в смеси с лецитином и водой.
Известно, что другой тип фермента репарации ДНК, который может использоваться, эффективен при репарации T-T димеров. Ферменты присутствуют в смесях биологических или растительных материалов. Примеры таких ингредиентов продаются компанией AGI/Dermatics под торговыми наименованиями Ultrasomes или Photosomes. Ultrasomes содержит смесь лизата Micrococcus (конечного продукта регулируемого лизиса различных видов микрококка), лецитина и воды. Photosomes содержит смесь экстракта планктона (который представляет собой экстракт морской биомассы, которая включает один или более из следующих организмов: талассопланктон, зеленые микроводоросли, диатомы, зеленовато-синие и фиксирующие азот морские водоросли), воды и лецитина.
Другой тип фермента репарации ДНК может представлять собой компонент различных инактивированных бактериальных лизатов, таких как лизат Bifida или ферментный лизат Bifida, последний лизат из бифидобактерий, который содержит метаболические продукты и цитоплазматические фракции, когда бифидобактерии культивируются, инактивируются и затем разрушаются. Этот материал имеет название по номенклатуре INCI ферментный лизат Bifida.
6
6
Другие подходящие ферменты репарации ДНК включают эндонуклеазу V, которая может продуцироваться геном denV бактериофага T4. Также подходят эндонуклеаза T4; метилтрасферазы O-метилгуанин-ДНК; фотолиазы, такие как урацил- и гликозилазы гипоксантин-ДНК; апиримидиновые/апуриновые эндонуклеазы; экзонуклеазы ДНК, гликозилазы поврежденных оснований (например, гликозилаза 3-метиладенин-ДНК); коррендонуклеазы, или отдельно, или в комплексах (например, комплексе эндонуклеазы uvrA/uvrB/uvrC E. coli); нуклеаза APEX, которая представляет собой многофункциональный фермент репарации ДНК, часто именуемый «APE»; дигидрофолат-редуктаза; концевая трансфераза; топоизомераза; O-бензил-гуанин; гликозилазы ДНК.
Другие типы подходящих ферментов репарации ДНК могут группироваться по типу облегчаемой репарации и включают BER (эксцизионную репарацию оснований) или ферменты фактора BER, такие как гликозилаза урацил-ДНК (UNG); гликозилаза однонитевой селективной монофункциональной урацил-ДНК (SMUG1); гликозилаза 3,N(4)-этеноцитозина (MBD4); гликозилаза тимин-ДНК (TDG); A/G-специфическая гликозилаза аденин-ДНК (MUTYH); гликозилаза 8-оксогуанин-ДНК (OGG1); эндонуклеаза, подобная III (NTHL1); гликозидаза 3-метиладенин-ДНК (MPG); гликозилаза ДНК/AP-лиаза (NEIL1 или 2); AP эндонуклеаза (APEX 1 и 2), лигаза ДНК (LIG3), вспомогательный фактор лигазы (XRCC1); 5'-киназа/3'-фосфатаза ДНК (PNKP); АДФ-рибозилтрансфераза (PARP1 или 2).
6
Другая категория ферментов репарации ДНК включает те, которые, как считают, непосредственно устраняют повреждение, такие как О-MeG алкил-трансфераза (MGMT); 1-meA диоксигеназа (ALKBH2 или ALKBH3).
Еще одна категория ферментов, функционирующих для репарации поперечных сшивок ДНК/белок, включает Tyr-ДНК фосфодиэстеразу (TDP1).
Подходят также ферменты репарации ДНК MMR (эксцизионной репарации ошибочных спариваний оснований), такие как гомолог репарации ДНК MutS (MSH2); белок репарации ошибочного спаривания оснований (MSH3); гомолог 4 mutS (MSH4); гомолог 5 MutS (MSH5); или белок ошибочного спаривания оснований-связывания G/T (MSH6); белок репарации ошибочного спаривания оснований ДНК (PMS1, PMS2, MLH1, MLH3); белок, подобный белку 2, усиленный постмейотической сегрегацией (PMS2L3); или псевдоген 4, подобный белку 2, усиленный постмейотической сегрегацией (PMS2L4).
Также подходящими являются те ферменты репарации ДНК, которые известны как ферменты эксцизионной репарации нуклеотидов (NER), и включают такие как белок, комплементирующий группу C Xeroderma pigmentosum (XPC); гомолог RAD23 (S. cerevisiae) (RAD23B); изоформа калтрактина (CETN2); белок RFA 1, 2 или 3 (RPA1, 2 или 3); геликаза от 3' до 5' ДНК (ERCC3); геликаза от 5' до 3' ДНК (ERCC2); основной фактор транскрипции (GTF2H1, GTF2H2, GTF2H3, GTF2H4, GTF2H5); киназа, активирующая CDK (CDK7, CCNH); белок, взаимодействующий с циклином G1 (MNAT1); белок эксцизионной репарации ДНК ERCC-51; кросс-комплементирующий ген 1 эксцизионной репарации (ERCC1); ДНК-лигаза 1 (LIG1); АТФ-зависимая геликаза (ERCC6) и тому подобные.
Также подходящими могут быть ферменты репарации ДНК в категории, которая содействует гомологичной рекомбинации, и они включают без ограничения гомолог белка репарации ДНК RAD51 (RAD51, RAD51L1, RAD51B и т.п.); белок репарации ДНК XRCC2; белок репарации ДНК XRCC3; белок репарации ДНК RAD52; АТФазу (RAD50); 3'-экзонуклеазу (MRE11A) и т.д.
Также подходят ферменты репарации ДНК, которые представляют собой ДНК-полимеразы и включают субъединицу бета ДНК-полимеразы (POLB); ДНК-полимеразу гамма (POLG); субъединицу дельта ДНК-полимеразы (POLD1); субъединицу A ДНК-полимеразы II (POLE); вспомогательный белок ДНК-полимеразы дельта (PCNA); ДНК-полимеразу зета (POLZ); гомолог MAD2 (REV7); ДНК-полимеразу эта (POLH); ДНК-полимеразу каппа (POLK) и тому подобные.
Различные типы ферментов репарации ДНК, которые часто именуются «редактирующими и перерабатывающими нуклеазами», включают 3'-нуклеазу; 3'-экзонуклеазу; 5'-экзонуклеазу; эндонуклеазу и тому подобные. Другие примеры ферментов репарации ДНК включают ДНК-геликазы, такие как АТФ ДНК-геликазы и т.д. Ферменты репарации ДНК могут присутствовать в виде компонентов растительных экстрактов, бактериальных лизатов, биологических материалов и тому подобных. Например, растительные экстракты могут содержать ферменты репарации ДНК.
ПРИМЕР 1: Активаторы Sirt1 (Орсиртин™ и ресвератрол) синергически увеличивают выживание кератиноцитов
Орсиртин™ ((SEQ ID NO: 8) G-L-Y-D-N-L-E) и ресвератрол, средства задержки митоза, тестировали для выявления их способности увеличивать выживание человеческих кератиноцитов, облученных УФ-В.
Методы
Нормальные человеческие кератиноциты культивировали в среде Epilife с добавкой для роста человеческих кератиноцитов. Клетки субкультивировали в 96-луночные планшеты (Costar). Кератиноциты предварительно обрабатывали ресвератролом (25 мкМ) и орсиртином (1%, 3%) отдельно и в комплексе ресвератрола (25 мкМ) и Орсиртином™ (3%). Кератиноциты обрабатывали неразбавленным комплексом и в разведениях 1:2, 1:4 и 1:8 (комплекс:среда Epilife).
2
2
2
2
Кератиноциты инкубировали при указанных видах обработки в течение ночи при 37°C; 5% CO. Через 24 часа обрабатывающие вещества аспирировали, и кератиноциты промывали однократно в D-PBS. Добавляли 100 мкл D-PBS для облучения. Клетки подвергали облучению УФ-В при 0, 45, 90 и 135 мДж/см УФ-В. После облучения, D-PBS удаляли. Кератиноциты подвергали последующей соответствующей обработке и инкубировали в течение ночи при 37°C; 5% CO. На следующий день, клетки анализировали для определения их жизнеспособности с использованием реагента MTS (CellTiter96, Promega). Показания спектральной поглощательной способности считывали на спектрофотометре SpectraMax190 (Molecular Devices) при 490 нм после приблизительно двух часов инкубации при 37єC; 5% CO.
Результаты и заключение
2
На фиг.2 показано, что при низкой интенсивности УФ излучения (45 мДж/см) клетки не проявляют интенсивного повреждения, и поэтому ожидалось, что увеличением способности выживания можно было пренебречь. Однако заявители наблюдали, что клетки, обработанные только ресвератролом, проявляли уменьшение выживаемости на 20%, а клетки, обработанные только Орситином™ 3%, проявляли уменьшение выживаемости на 8%. Тем не менее, клетки, обработанные комплексом в разведении 1:2 (ресвератролом 25 мкМ и Орнитином™ 3%) или тестируемым неразведенным комплексом, показывают то же, что и контроль. Также, по мере того, как комплекс разбавляется до 1:4 и затем до 1:8, выживаемость уменьшается. Таким образом, ресвератрол отдельно, и Орситрин 3% отдельно, уменьшают выживание клеток. Однако комбинация ресвератрола и Орситрина 3% не уменьшает выживание клеток. Но может ли данная комбинация увеличить выживаемость, по сравнению с контролем?
2
При УФ облучении 90 мДж/см, величина выживаемости необработанных клеток составляла 47%. По сравнению с этим, выживаемость клеток, обработанных неразбавленным и разбавленным комплексом (ресвератрол 25 мкМ и Орсиртин™ 3%), следовала следующему зависимому от дозы соотношению:
Разведение комплекса
1:8
1:4
1:2
неразведенный
Увеличение выживания после УФ облучения 90 мДж/см<sup>2</sup>
28%
34%
60%
64%
в то время как выживаемость клеток, обработанных только Орсиртином™ или только ресвератролом, была следующей:
Орсиртин™ 3%
Орсиртин™ 1%
Ресвератрол 25 мкМ
Увеличение выживания после УФ облучения 90 мДж/см<sup>2</sup>
11%
-17%
-15%
2
При УФ облучении 135 мДж/см, величина выживаемости необработанных клеток составляла 19%. По сравнению с этим, выживаемость клеток, обработанных неразбавленным и разбавленным комплексом, следовала следующему квази-зависимому от дозы соотношению:
Разведение комплекса
1:8
1:4
1:2
неразведенный
Увеличение выживания после УФ облучения 135 мДж/см<sup>2</sup>
11%
5%
56%
131%
в то время как выживаемость клеток, обработанных только Орсиртином™ или только ресвератролом, была следующей:
Орсиртин™ 3%
Орсиртин™ 1%
Ресвератрол 25 мкМ
Увеличение выживания после УФ облучения 135 мДж/см<sup>2</sup>
26%
5%
22%
Можно сделать вывод, что комплекс (ресвератрол 25 мкМ и Орсиртин™ 3%) обеспечивал значительную защиту против цитотоксичности, вызванной УФ-В, и увеличивал выживание клеток относительно ресвератрола и Орсиртина™ по отдельности.
2
2
2
2
2
2
2
2
Представляется, что указанные цифры свидетельствуют о том, что воздействие комбинации Орсиртина™ и ресвератрола на выживаемость кератиноцитов является синергическим. Например, сам Орсиртин™ 3% увеличивает жизнеспособность на 11% (для УФ-B 90 мДж/см) и на 26% (для УФ-B 135 мДж/см). Сам ресвератрол в дозе 25 мкМ снижал жизнеспособность на 15% (для УФ-B 90 мДж/см) и снижал ее на 22% (для УФ-B 135 мДж/см). Однако неразбавленная комбинация 3% Орсиртин™ и 25 мкМ ресвератрола увеличивала жизнеспособность кератиноцитов на огромные и неожидаемые 64% (для УФ-B 90 мДж/см) и 131% (для УФ-B 135 мДж/см). Даже при разведении до 1:8, комбинация все же увеличивает жизнеспособность кератиноцитов на 28% (для УФ-B 90 мДж/см) и 11% (для УФ-B 135 мДж/см). Это полностью неожиданно. Поскольку Орсиртин™ представляет собой известный активатор сиртуина, а ресвератрол является подозреваемым активатором сиртуина, средний специалист в данной области не мог бы ожидать такого огромного увеличения выживания креатиноцитов. Как максимум, мог бы ожидаться аддитивный, а не синергический эффект.
n
n
Какие относительные концентрации (SEQ ID NO: 8) G-L-Y-D-N-L-E и ресвератрола обеспечат синергический эффект на выживание кератиноцитов? Теперь, когда был идентифицирован указанный эффект, на этот вопрос можно ответить обычным экспериментированием. Под «синергической комбинацией активатора sirt1 и ресвератрола» заявители подразумевают комбинацию (SEQ ID NO: 7) (AA)-G-L-Y-D-N-L-E-(AA) и ресвератрола или его производных, которая увеличивает выживаемость кератиноцитов (при измерении показателей выживаемости способами, известными в данной области), на величину, которая составляет более, чем сумма эффекта каждого материала отдельно.
ПРИМЕР 2: Активаторы SIRT1 в должных концентрациях улучшают функцию активаторов циркадных генов и ферментов репарации ДНК против воздействия УФ-B
2
В соответствии со способами, описанными в примере 1, тестировали два комплекса в различных разведениях для выявления их воздействия на выживание кератиноцитов после воздействия УФ излучения. Комплекс I состоял из среды Epilife с добавкой для роста кератиноцитов и Chronolux (0,1%), экстракта Bifidus (12,4%), Adasome (0,05%) и Roxisome (0,05%). Комплекс II состоял из комплекса I плюс Орсиртин™ (0,08%) и ресвератрол (25 мкМ). Комплекс I тестировали неразбавленным и при разведениях 1:2 и 1:4 (комплекс:среда Epilife). Комплекс II тестировали в неразбавленном виде и при разведениях 1:2, 1:4 и 1:8. Среду использовали в качестве контроля. Кератиноциты подвергали воздействию УФ-B на уровнях 100, 150 и 200 мДж/см.
Результаты и заключение
На фиг.3 и при сравнении комплекса II с комплексом I в пределах одинакового воздействия УФ-B, получены следующие результаты:
Улучшение: сравнение комплекса II с комплексом I
Разведение обоих комплексов
100 мДж/см<sup>2</sup>
150 мДж/см<sup>2</sup>
200 мДж/см<sup>2</sup>
1:4
10,2%
4,7%
3,8%
1:2
3,2%
7,2%
9,6%
Неразведенный
-5,7%
-3,0%
3,6%
2
2
2
Во всех случаях, кроме двух, Орсиртин™ и ресвератрол улучшают выживание кератиноцитов после воздействия УФ-B, по сравнению с одними активаторами циркадных генов. Однако при продвижении вниз по первым двум колонкам (100 мДж/см) становится очевидным, что представленные данные свидетельствуют о том, что чем меньше активатора sirt1 в комбинации с активатором циркадного гена, тем лучше. Однако указанный тип нарушен в колонках 2 и 3 (150 мДж/см и 200 мДж/см), свидетельствуя о том, что оптимальная комбинация sirt1 и активаторов циркадных генов зависит от количества УФ-B, которое воздействует на кератиноциты. Действительно, при продвижении по ряду 3 (неразведенная композиция) слева направо, данные свидетельствуют о том, что добавление Орсиртина™ и ресвератрола оправдано для бульших количеств воздействующего УФ-B. Данный тип также наблюдается в образцах с разведением 1:2, но устраняется в образцах с разведением 1:4, свидетельствуя о том, что при более низких воздействиях УФ-B, требуется меньшая активация sirt1. Таким образом, взятые в целом результаты указанных экспериментов свидетельствуют о том, что оптимальные относительные концентрации активаторов циркадных генов и активаторов sirt1 зависят от количества воздействия УФ-B. Однако все тестируемые образцы комплекса II (циркадный активатор плюс активатор sirt1) проявляли улучшение жизнеспособности кератиноцитов относительно контролей. Определение оптимальных относительных концентраций активаторов циркадных генов и активаторов sirt1 может потребовать лишь обычного экспериментирования теперь, когда среднему специалисту в данной области известно, что относительная концентрация представляет собой определяющую эффективность результатов переменную величину, которая была до настоящего времени неизвестна.
Композиции
Форма композиции по настоящему изобретению в целом не ограничивается. Например, композиция по изобретению может быть представлена в форме эмульсий, водных растворов или дисперсий, гелей или безводных систем. Если композиция представлена в форме эмульсии, то композиция может содержать примерно от 1 до 99%, предпочтительно, примерно от 5 до 90%, более предпочтительно, примерно от 10 до 85% воды и примерно от 1 до 99%, предпочтительно, примерно от 5 до 90%, более предпочтительно, примерно от 10 до 75% масла. Если композиция представлена в форме водной суспензии или дисперсии, то композиция может в целом содержать примерно от 1 до 99,9%, предпочтительно, примерно от 5 до 95%, более предпочтительно, примерно от 10 до 90% воды, причем остающиеся ингредиенты представляют собой активные ингредиенты или другие ингредиенты состава композиции.
Предпочтительно, композиция содержит другие ингредиенты, которые обеспечат получение косметически или фармацевтически приемлемого продукта. Классы таких ингредиентов могут включать увлажнители, солнцезащитные средства от УФ-A и УФ-B излучений, поверхностно-активные вещества (ПАВ), растительные экстракты, биологические материалы, структурирующие агенты водной фазы (т.е. полисахариды, акрилатные полимеры, PEG или полиглицерины с высокой молекулярной массой), летучие и нелетучие масла (включая силиконы), витамины и антиоксиданты.
Возможно также нахождение активаторов циркадных генов и активаторов sirt1 в отдельных композициях, которые могут наноситься на некоторую область кожи последовательно или которые могут наноситься подачей эффективного количества каждой композиции, смешиванием композиций и затем нанесением смеси на кожу.
Предпочтительные композиции
Предпочтительные композиции представлены в форме водного раствора или эмульсии и содержат по меньшей мере одно неионное органическое поверхностно-активное вещество, по меньшей мере один химический солнцезащитный материал, по меньшей мере один активатор гена clock или per1, по меньшей мере один пептидный активатор sirt1 и по меньшей мере один фермент репарации ДНК. Может также быть предпочтителен по меньшей мере один растительный экстракт и по меньшей мере одно масло.
Более предпочтительна композиция, где неионное органическое поверхностно-активное вещество представляет собой алкоксилированный спирт, химический солнцезащитный материал представляет собой солнцезащитный материал против УФ-B излучения, активатор генов clock или per1 кератиноцитов представляет собой трипептид-32, активатор sirt1 представляет собой комбинацию молекулы, подобной Орсиртину™, и ресвератрола, фермент репарации ДНК представляет собой смесь экстракта Arabidopsis Thaliana, лизата Micrococcus, ферментного лизата Bifida, фермента Lactobacillus и экстракта планктона, и по меньшей мере одно масло представляет собой органический сложный эфир или углеводород.
Способы по изобретению
Способы по изобретению главным образом направлены на восстановление повреждения кератиноцитов, предпочтительно, кератиноцитов кожи лица, причем повреждение возникает в ответ на воздействие агрессивных факторов внешней среды. Один способ состоит в нанесении на поврежденную человеческую кожу композиции или композиций, содержащих по меньшей мере один активатор гена clock или per1 и по меньшей мере один активатор sirt1. Возможно содержание в композиции (композициях) способа по меньшей мере одного фермента репарации ДНК. Путем нанесения композиции после того, как возникло повреждение, быстрее будет восстановлен нормальный циркадный цикл. Однако остановка клеточного цикла перед митозом предоставит больше времени для репарации ДНК. С помощью этого способа может быть устранено существенное клеточное повреждение и/или может контролироваться передача повреждения на дочерние клетки. Способ также может улучшить жизнеспособность и долговечность кератиноцитов.
Изобретение также направлено на способ предотвращения или ингибирования повреждения человеческих кератиноцитов, предпочтительно, кератиноцитов кожи лица, причем повреждение возникает в ответ на воздействие агрессивных факторов окружающей среды. Способ состоит в нанесении на человеческую кожу с риском повреждения в результате воздействия факторов окружающей среды композиции или композиций, содержащих по меньшей мере один активатор гена clock или per1 и по меньшей мере один активатор sirt1. Возможно содержание в композиции (композициях) способа по меньшей мере одного фермента репарации ДНК. Путем нанесения композиции перед тем, как произошло повреждение, можно полнее поддерживать нормальный циркадный цикл и можно полнее поддерживать процесс восстановления нормального клеточного цикла. С помощью указанного способа может быть предотвращено существенное клеточное повреждение и/или может контролироваться передача повреждения на дочерние клетки. Способ также может улучшить жизнеспособность и долговечность кератиноцитов.
В способах по изобретению композиция (композиции) может наноситься на кожу один или более раз в день. Например, композиция (композиции) может наноситься на кожу утром перед началом повседневной деятельности и/или на ночь непосредственно перед отходом ко сну. Указанные точки времени предпочтительны, потому что кожа в целом находится под действием по меньшей мере нескольких факторов воздействия окружающей среды, и это означает, что можно максимально увеличить восстановление клеток кожи. В указанные точки времени, «непосредственно перед отходом ко сну» или «непосредственно перед ночным сном», означают в пределах одного часа перед отходом ко сну, более предпочтительно, в пределах 30 минут перед отходом ко сну. Нанесение композиции утром представляет собой в большей степени профилактический подход, тогда как непосредственно перед отходом ко сну или вечером представляет собой в большей степени восстанавливающий подход. Композиция (композиции) может наноситься в виде части схемы; то есть кожа очищается и обрабатывается тоником, после чего наносится композиция (композиции) по изобретению. Композиция (композиции) может представлять собой часть набора, который включает очищающее средство, тоник и композицию (композиции) по изобретению.
Предпочтительно, композиция (композиции) наносится на кожу лица и/или шеи и декольте непосредственно перед отходом ко сну для репарации поврежденной ДНК в кератиноцитах и обеспечения общего улучшения состояния кожи. Комбинирование активаторов генов clock и per1 с активаторами sirt1 (и предпочтительно, ферментами репарации ДНК) в композиции, применяемой для обработки кожи лица на ночь, непосредственно перед отходом ко сну, максимально увеличивает репарацию повреждения ДНК в кератиноцитах, а также содействует клеточной жизнеспособности, долговечности и здоровью.
Как отмечено выше, возможно также содержание активаторов циркадных генов и активаторов sirt1 в отдельных композициях. В таком случае способы по изобретению включают стадии нанесения каждой композиции на одну и ту же область кожи последовательно или подачу эффективного количества каждой композиции, смешивание композиций и затем нанесение смеси на кожу.
Примеры
Далее изобретение будет описано в связи со следующими примерами, которые представлены только в целях иллюстрации. Композиции для обработки кожи могут быть получены следующим образом.
Пример 1
Ингредиент
% масс./ масс.
% масс./ масс.
Олет-3 фосфат
0,45
0,45
Олет-3
0,35
0,35
Олет-5
0,24
0,24
Бутиленгликоль
0,20
0,20
Сквален
0,50
0,50
BHT (бутилированный гидрокситолуол)
0,10
0,10
Этилгексил метоксициннамат
0,10
0,10
Холет-24/цетет-24
0,10
0,10
Триэтаноламин
0,11
0,11
Ретинил пальмитат/маисовое (кукурузное) масло/BHT/BHA (бутилированный гидроксианизол)
0,10
0,10
Бутиленгликоль
1,10
1,10
Ромашка
0,03
0,03
Бисаболол
0,10
0,10
Метилпарабен
0,46
0,46
PEG-75
4,00
4,00
Простой метиловый эфир бис-PEG-18 диметилсилана
2,00
2,00
Глицерет-26
1,00
1,00
Метилглюкет-20
4,00
4,00
Тринатрий ЭДТА
0,10
0,10
Пантетин
0,14
0,14
Кофеин
0,05
0,05
Ксантановая смола
0,075
0,075
Карбомер
0,26
0,26
Триэтаноламин
0,50
0,50
Феноксиэтанол
0,70
0,70
Бензиловый спирт
0,10
0,10
Ферментный лизат бифидобактерий
9,40
9,40
Вода/Ферментный лизат бифидобактерий/гидрированный лецитин
3,00
3,00
Бутиленголиколь/экстракт Cola Acuminata
3,00
3,00
Натриевая соль рибонуклеиновой кислоты
0,01
0,01
Вода/бутиленгликоль/трипептпид-32
0,10
0,10
Фермент Lactobacillus/лецитин/вода
0,05
0,05
Вода/экстракт Arabidopsis Thaliana/лецитин
0,05
0,05
Орсиртин 10Ч
0,08
0,08
Ресвератрол
---
25 мкМ
Феноксиэтанол
0,02
0,02
Гиалуронат натрия
0,01
0,01
FD&C красный № 4 (1% водный раствор с бутиленгликолем)
0,04
0,04
FD&C желтый № 5 (1% водный раствор с бутиленгликолем)
0,09
0,09
D&C зеленый № 5 (0,1% раствор с бутиленгликолем)
0,001
0,001
Вода
Сколько требуется
Сколько требуется
Примеры 2-4
Первая композиция для обработки кожи, содержащая активатор гена clock (Хронолюкс, трипептид-32), но без активатора (активаторов) sirt1, может быть получена в соответствии с составом A (пример 2). Вторая композиция для обработки кожи, содержащая активатор гена clock (Хронолюкс, трипептид-32) и активаторы sirt1 (Орсиртин™ и ресвератрол), может быть получена в соответствии с составом B (пример 3). Третья композиция для обработки кожи, содержащая активатор sirt1 (Орсиртин), но без активатора циркадного гена, может быть получена в соответствии с составом C (пример 4). Композиции получают объединением ингредиентов и тщательным смешиванием для образования жидкости. Композиции могут храниться в коричневых стеклянных флаконах.
Композиция A содержит активаторы циркадных генов и активаторы sirt1, Орсиртин™ и ресвератрол. Таким образом, композиция A предназначена для самостоятельного применения. Композиция B содержит Хронолюкс (активатор циркадного гена), но не содержит активаторы гена sirt1. Таким образом, композиция B предназначена для применения с отдельной композицией, имеющей способность активировать ген sirt1, такой как композиция C.
Ингредиент
А (% масс./ масс.)
В (% масс./ масс.)
Олет-3 фосфат
0,45
0,45
Олет-3
0,35
0,35
Олет-5
0,24
0,24
Бутиленгликоль
0,20
0,20
Сквален
0,50
0,50
BHT (бутилированный гидрокситолуол)
0,10
0,10
Этилгексил метоксициннамат
0,10
0,10
Холет-24/цетет-24
0,10
0,10
Триэтаноламин
0,11
0,11
Ретинил пальмитат/маисовое (кукурузное) масло/BHT/BHA (бутилированный гидроксианизол)
0,10
0,10
Бутиленгликоль
1,10
1,10
Ромашка
0,03
0,03
Бисаболол
0,10
0,10
Вода
Сколько требуется
Сколько требуется
Метилпарабен
0,46
0,46
PEG-75
4,00
4,00
Простой метиловый эфир бис-PEG-18 диметилсилана
2,00
2,00
Глицерет-26
1,00
1,00
Метилглюкет-20
4,00
4,00
Тринатрий ЭДТА
0,10
0,10
Пантетин
0,14
0,14
Кофеин
0,05
0,05
Ксантановая смола
0,075
0,075
Карбомер
0,26
0,26
Триэтаноламин
0,50
0,50
Феноксиэтанол
0,70
0,70
Бензиловый спирт
0,10
0,10
Ферментный лизат бифидобактерий
9,40
9,40
Вода/ферментный лизат бифидобактерий/гидрированный лецитин
3,00
3,00
Бутиленголиколь/вода/экстракт Cola Acuminata
3,00
3,00
Натриевая соль рибонуклеиновой кислоты
0,01
0,01
Вода/бутиленгликоль/трипептид-32 (Хронолюкс)
0,20
0,20
Вода/бутиленгликоль/гидролизованный рисовый экстракт (Орсиртин<sup>TM</sup>)
0,08
---
Ресвератрол
25 мкМ
---
Фермент Lactobacillus/лецитин/вода
0,05
0,05
Вода/экстракт Arabidopsis Thaliana/лецитин
0,05
0,05
Феноксиэтанол
0,02
0,02
Гиалуронат натрия
0,01
0,01
FD&C красный № 4 (1% водный раствор с бутиленгликолем)
0,04
0,04
FD&C желтый № 5 (1% водный раствор с бутиленгликолем)
0,09
0,09
D&C зеленый № 5 (0,1% раствор с бутиленгликолем)
0,001
0,001
Ингредиент
C (% масс./ масс.)
КРЕАТИН
0,08
ТРЕГАЛОЗА
0,50
АЦЕТИЛГЛЮКОЗАМИН
0,50
КОФЕИН
0,20
КАРБОМЕР
0,15
АКРИЛАТЫ/C10-30 АЛКИЛАКРИЛАТНЫЙ КРОССПОЛИМЕР/ФЕНОКСИЭТАНОЛ
0,108
СОПОЛИМЕР АММОНИЯ АКРИЛОИЛДИМЕТИЛТАУРАТА/ВИНИЛПИРРОЛИДОНА
0,50
БУТИЛЕНГЛИКОЛЬ
1,00
КСАНТАНОВАЯ СМОЛА
0,08
ГИДРОКСИД НАТРИЯ
0,03
ЦЕТИЛОВЫЙ СПИРТ
2,00
СЛОЖНЫЙ ЭФИР С12-20 КИСЛОТЫ PEG-8
3,00
КАПРИЛОВЫЙ/КАПРИНОВЫЙ ТРИГЛИЦЕРИД
5,90
ДИМЕТИКОН
0,50
ЦЕТИЛФОСФАТ КАЛИЯ
0,20
МАСЛО COCOS NUCIFERA (КОКОСОВОГО ОРЕХА)/ЭКСТРАКТ ЛИСТЬЕВ ALOE BARBADENSIS
1,60
ХОЛЕСТЕРИН/СУЛЬФАТ КАЛИЯ
0,05
PEG-100 СТЕАРАТ
0,75
ФИТАНТРИОЛ
0,50
ЭКСТРАКТ TRITICUM VULGARE (ПШЕНИЧНЫХ ОТРУБЕЙ)/ЭКСТРАКТ OLEA EUROPAEA (ОЛИВЫ)
0,20
СТЕРИНЫ PUNICA GRANATUM (ГРАНАТА)
0,50
ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ
1,00
ФЕНОКСИЭТАНОЛ
0,30
ГЛИЦЕРИН ПО ФАРМАКОПЕЕ США 99% (растительный)
2,00
ЭТИЛГЕКСИЛГЛИЦЕРИН
1,00
ДРОЖЖЕВОЙ ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ЭКСТРАКТ (ЭКСТРАКТ КОРНЕЙ ГОРЦА ГРЕБЕНЧАТОГО (ресвератрол)/ЭКСТРАКТ ХМЕЛЯ ОБЫКНОВЕННОГО/ЛИНОЛЕНОВАЯ КИСЛОТА/ЭКСТРАКТ СЕМЯН ВИНОГРАДА/ЭКСТРАКТ РОЗМАРИНА ЛЕКАРСТВЕННОГО/ЭКСТРАКТ ПЛАУНКА ТАМАРИСКОВОГО/ЦИКЛОДЕКСТРИН/ ЭТИЛБИСИМИНОМЕТИЛГУАИАКОЛ ХЛОРИД МАРГАНЦА/ЭКСТРАКТ КОЖУРЫ МАНДАРИНОВ/ЭКСТРАКТ СОКА ГРАНАТА/НОРДИГИДРОГУАЙАРЕТИЧЕСКАЯ КИСЛОТА/СИМЕТИКОН)
0,50
ЭКСТРАКТ ДРЕВЕСИНЫ СИБИРСКОЙ ЛИСТВЕННИЦЫ
0,10
ЭКСТРАКТ ЛАМИНАРИИ САХАРИСТОЙ
0,50
РАСТВОР ДРОЖЖЕВОГО ЭКСТРАКТА (АДЕНОЗИН ФОСФАТ/ФЕНОКСИЭТАНОЛ/СИМЕТИКОН)
0,50
АЦЕТИЛ ГЕКСАПЕПТИД-8
0,50
НАТРИЕВАЯ СОЛЬ ХЛОРНОЙ КИСЛОТЫ
0,50
ЭКСТРАКТ СИГЕЗБЕКИИ ВОСТОЧНОЙ (ЯСМЕННИКА СВ. ПАВЛА)
0,50
ГЛИЦЕРИН/ЭКСТРАКТ ТАЛЛОМА БУРЫХ МАКРОВОДОРОСЛЕЙ
0,10
ЭКСТРАКТ ЛИСТЬЕВ ARGANIA SPINOSA
0,10
ВОДА/БУТИЛЕНГЛИКОЛЬ/ЭКСТРАКТ СЕМЯН ТАМАРИНДА ИНДИЙСКОГО
0,10
ПРОПИЛЕНГЛИКОЛЬ ДИКАПРАТ/БРИКЕТ СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА/ЭКСТРАКТ ЯЧМЕНЯ/ЭКСТРАКТ ОГУРЕЧНЫХ ПЛОДОВ
0,50
БУТИЛЕНГЛИКОЛЬ/ЭКСТРАКТ ЗОЛОТОТЫСЯЧНИКА ОБЫКНОВЕННОГО
0,50
Вода/бутиленгликоль/гидролизованный рисовый экстракт (Орсиртин<sup>TM</sup>)
0,08
ГИАЛУРОНАТ НАТРИЯ
2,50
ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА
0,02
ОТДУШКА (АРОМАТИЗАТОР)
0,125
АКРИЛАТ НАТРИЯ/СОПОЛИМЕР НАТРИЯ АКРИЛОИЛА И ДИМЕТИЛТАРТРАТА/ГИДРИРОВАННЫЙ ПОЛИДЕЦЕН/ЛАУРЕТ-8
0,001
ВОДА
Сколько требуется
Хотя изобретение было описано в связи с предпочтительным вариантом осуществления, он не предназначен для ограничения объема изобретения конкретной изложенной формой. Напротив, это описание предназначено для охвата таких альтернатив, модификаций и эквивалентов, которые могут быть включены в сущность и объем изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.