Способ параллельного выявления драйверных мутаций и транслокаций при раке легкого на единой диагностической платформе

1. Способ обследования пациента для назначения таргетной терапии при немелкоклеточном раке легкого, включающий получение нуклеиновых кислот из образцов опухоли пациента и выявление в них мутаций и транслокаций, отличающийся тем, что материалом для исследования служит  единый пул нуклеиновых кислот, который выделяется однократно, затем нестабильная фракция РНК сразу переводится в  кДНК посредством обратной транскрипции, и полученная смесь ДНК и кДНК подвергается параллельному выявлению как мутаций, так и транслокаций с применением единого метода ПЦР в режиме реального времени.
2. Способ по п.1, где   определяют одновременно следующий комплекс мутаций: а) мутации гена EGFR: L858R, T790M, 11 вариантов делеций в 19 экзоне; б) мутация гена BRAF V600E; в) мутации гена KRAS: G12D, G12V, G12C, G12A, G12S, G12R, G13D, G13C, G13R, Q61H, Q61L, Q61R, Q61K, Q61E; г) транслокации гена ALK в районе 20 экзона, в т.ч. все транслокации с генами-партнерами EML4 и DCTN1; д) транслокации гена ROS1 в районе экзонов 32-34, в т.ч. с генами SLC34A2, CD74, EZR, TMP3 и SDC4; е) транслокации гена RET в районе 11-го и 12-го экзона,  в т.ч. транслокации с генами-партнерами CCDC6, KIF5B, NCOA4 и TRIM33.
3. Способ по п.2, где для предотвращения амплификации ДНК без мутаций применяют блокирующие тугоплавкие LNA-олигонуклеотиды.
4. Способ по п.3, где реакционная смесь    содержит «hot-start» ДНК-полимеразу, буфер ПЦР и нуклеотидтрифосфаты, в концентрациях рекомендованных производителем полимеразы, по 2 олигонуклеотидных праймера,  флуоресцентный зонд для детекции мутации, LNA-олигонуклеотид и исследуемый образец смеси ДНК и кДНК; ПЦР-реакцию проводят с активацией Taq-полимеразы в соответствии с рекомендациями производителя,  для накопления ПЦР-продукта проводят  45 циклов амплификации c денатурацией в течение 15 сек при 95ºC, отжигом блокирующего LNA-олигонуклеотида в течение 15 сек при 85ºC, отжигом олигонуклеотидов и синтезом в течение 15 сек при 60ºC, и проводят анализ пороговых циклов кривых флуоресценции.
5. Способ по п.4,  где для выявления мутаций L858R и T790M гена EGFR в реакционную смесь добавляют общий флуоресцентный зонд для контроля качества ДНК и прохождения реакции, и в том случае, если пороговый цикл кривой флуоресценции общего флуоресцентного зонда и мутантного зонда находятся в диапазоне 25-35 циклов, делают заключение о наличии мутации в анализируемом образце.
6. Способ по п.4, где для выявления делеций 19-го экзона гена EGFR сопоставляют результаты двух реакций: в первой реакции используют смесь специфичных праймеров, общий флуоресцентный зонд и LNA-блокирующий олигонуклеотид; во второй реакции используют смесь специфичных праймеров и общий флуоресцентный зонд; и в том случае, если пороговые циклы кривой флуоресценции общего флуоресцентного зонда в обеих реакциях находятся в диапазоне 25-35 циклов, делают заключение о наличии мутации в анализируемом образце.
7. Способ по п.4, где для выявления мутации V600E гена BRAF используют специфичный олигонуклеотид к мутантному региону, если пороговый цикл кривой флуоресценции зонда для детекции мутации находится в диапазоне 25-35 циклов, делают заключение о наличии мутации в анализируемом образце.
8. Способ по п. 3, где для выявления мутаций в 12-13, 61-м кодонах гена KRAS применяют метод ПЦР с анализом кривых плавления высокого разрешения (HRM), где в реакционную смесь для HRM-анализа, которая содержит «hot-start» ДНК-полимеразу, буфер ПЦР и флуоресцентный краситель в концентрации рекомендованной производителем, добавляют смесь специфичных праймеров, LNA-олигонуклеотид и исследуемый образец смеси ДНК и кДНК; ПЦР-реакцию проводят с 10-минутной активацией Taq-полимеразы при 95ºC, для накопления ПЦР-продукта проводят  35 циклов амплификации c денатурацией в течение 10 сек при 95ºC, отжигом блокирующего олигонуклеотида в течение 15 сек при 85ºC, отжигом олигонуклеотидов и синтезом в течение 20 сек при 60ºC, затем инкубация 30 сек при 95ºC, инкубация 30 сек при 50ºC и последующее плавление в интервале температур 68-90ºC с приращением 0,1ºC / 7 сек. и, если после обработки программой, которая анализирует кривые плавления с высоким разрешением, образец имеет температурный профиль плавления, отличный от нормальных образцов, то делают вывод о наличии мутации в анализируемом образце.
9. Способ по п.2, где для выявления перестроек генов ALK, ROS1 и RET применяют метод несбалансированной концевой экспрессии путем сопоставления экспрессии 5'- и 3'-фрагментов РНК-транскрипта исследуемых генов и референсного гена SDHA.
10. Способ по п. 9, где для определения несбалансированной концевой экспрессии проводят три ПЦР реакции, каждая из которых содержит по 4 олигонуклеотидных праймера и 2 флуоресцентных зонда с разными красителями, специфичные к 5'- и 3'-фрагментам трех исследуемых генов соответственно.
11. Способ по п.9, где качество кДНК и нормализацию результатов 5'- и 3'-фрагментов ПЦР реакций на исследуемые гены оценивают с помощью дополнительной ПЦР реакции на референсный ген SDHA, которая содержит 2 олигонуклеотидных праймера и флуоресцентный зонд, и в том случае если количество 3'-фрагмента гена значительно превосходит количество 5'-фрагмента – делают вывод о наличии транслокации в анализируемом образце.