КОЛОНОЧНОЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ

1. Способ получения полипептида из прополипептида, где прополипептид содержит на своем N- или С-конце метку для металл-ионной аффинной хроматографии и сайт протеазного расщепления, расположенный между меткой и полипептидом, с помощью колоночного ферментативного расщепления сайта протеазного расщепления на колонке для аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металла, включающий следующие этапы:
- денатурацию прополипептида, связанного с материалом для металл-ионной аффинной хроматографии,
- ренатурацию прополипептида, связанного с материалом для металл-ионной аффинной хроматографии, и
- инкубацию связанного прополипептида с протеазой и, таким образом, получение полипептида.
2. Способ получения полипептида из прополипептида, где прополипептид содержит на своем N- или С-конце метку для металл-ионной аффинной хроматографии и сайт протеазного расщепления, расположенный между меткой и полипептидом, путем колоночного ферментативного расщепления сайта протеазного расщепления на колонке для аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металла, при этом способ включает следующие этапы:
- контактирование связанного прополипептида с раствором, содержащим денатурирующий агент,
- возможно контактирование связанного прополипептида с раствором, содержащим мочевину или производные мочевины, если раствор, содержащий денатурирующий агент, используемый на предыдущем этапе, не содержал мочевину или производных мочевины, или контактирование связанного прополипептида с раствором, содержащим мочевину или производные мочевины, если раствор, содержащий денатурирующий агент, используемый на предыдущем этапе, содержал смесь мочевины или производного мочевины и денатурирующего агента,
- выделение полипептида из колонки для аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металла путем инкубации связанного прополипептида с протеазой и, таким образом, получение полипептида.
3. Способ по пп. 1-2, который включает непосредственно перед инкубацией с протеазой этап промывания раствором, не содержащим денатурирующих агентов.
4. Способ по п. 1 или 2, где полипептид выделяют в нативной форме.
5. Способ по п. 1 или 2, где полипептид выделяют в денатурированной форме.
6. Способ по п. 1 или 2, где денатурирующий агент выбирают среди хлорида гуанидина, мочевины, тиомочевины и тетраметилмочевины.
7. Способ по п. 1 или 2, где денатурирующий агент имеет концентрацию от 0,5 M до 6 М.
8. Способ по п. 2, где мочевина или производное мочевины имеет концентрацию от 0,5 M до 8 M.
9. Способ по п. 1 или 2, где прополипептид наносят в нативной форме или в денатурированной форме на материал для аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металла.
10. Способ по п. 1 или 2, где материал для аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металла представляет собой материал для аффинной хроматографии с иммобилизованным цинком.
11. Способ по п. 1 или 2, где протеазу выбирают из lgA-протеазы, трипсина или гранзима В.
12. Способ по п. 3, где раствор, не содержащий денатурирующих агентов, содержит от 0,5 до 1,5 M Tris при значении рН примерно 8.
13. Способ по п. 1 или 2, где указанный полипептид представляет собой негликозилированный полипептид.
14. Способ по п. 1 или 2, где полипептид представляет собой аполипопротеин Α-I или гибридный полипептид, содержащий аполипопротеин A-I, либо человеческий инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) или гибридный полипептид, содержащий инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1).
15. Способ получения полипептида, включающий следующий этап:
- очистка полипептида, полученного из культуральной среды культивируемой прокариотической или эукариотической клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, путем аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металла по любому из пп. 1-14 и, таким образом, получение полипептида.