Средство растительного происхождения в виде жидкого экстракта, обладающее противогрибковой активностью
VEGETAL ORIGIN AGENT IN FORM OF LIQUID EXTRACT HAVING ANTIFUNGAL ACTIVITY

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению водного или водно-этанольного экстрактов из сырья надземных частей (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного (Elaeagnus angustifolia) и травы астрагала лисьего (Astragalus vulpinus) (листья, стебли, цветки), эффективных в качестве противогрибкового средства. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, обладающих противогрибковым действием, получаемых из растительного сырья.
По данным Европейского журнала клинической микробиологии и инфекционных заболеваний более 800 млн. человек в мире страдают опасными грибковыми заболеваниями. В настоящее время к группе наиболее распространенных возбудителей поверхностных микозов относятся дерматомицеты, а именно - грибы рода Trichophyton (виды Т. rubrum, Т. mentagrophytes, Т. schonleinii, Т. verrucosum, Т. tonsurans, Т. violaceum), Microsporum (М. canis, М. audouinii, М. ferrugineum) и Epidermophyton (Е. floccosum).
Средний годовой показатель заболеваемости микроспорией по России в настоящее время колеблется на уровне более 50,8 случаев на 100 тыс. населения, причем заболеваемость среди детей в 4,8 раза выше (более 243,4 на 100 тыс.детского населения). Трихофития по частоте встречаемости в России уступает микроспории и в среднем составляет 2,8 случаев трихофитии на 100000 населения. Согласно данным статистических исследований, онихомикозы встречаются у 10% населения. У пациентов, обращающихся к врачу по поводу изменения ногтевых пластинок, онихомикоз диагностируется у 96%, 68% из которых женщины и 32%» мужчины. В зависимости от кератолитических свойств возбудителя определяется и область поражения. Например, частыми возбудителями микоза гладкой кожи лица и тела выступают Т. rubrum, М. canis, М. audouinii. Складки кожи поражаются чаще возбудителями Е. floccosum, Т. rubrum, Т. mentagrophytes. Микоз бороды и усов вызывают такие возбудители как Т. rubrum, Т. mentagrophytes, Т. verrucosum, а волосистой части головы, бровей и ресниц Trichophyton species, Microsporum species. При диагностике микоза стоп и ногтей идентифицируются Т. rubrum, Т. mentagrophytes. Микоз кистей - Т. rubrum, Е. floccosum, Т. mentagrophytes.
Широкое распространение данных видов возбудителей объясняется рядом факторов, провоцирующих возникновение заболеваний: возраст пациентов -распространенность среди различных возрастных групп варьирует; микоз как сопутствующее поражение при основном заболевании. Увеличение частоты встречаемости системных грибковых инфекций в последние годы обусловлено возрастанием иммунокомпрометированной популяции пациентов. Сопутствующими факторами являются: использование антибактериальных и химиотерапевтических препаратов, применение инвазивных устройств и инородных материалов, обширные хирургические вмешательства. Кроме того, повышению заболеваемости дерматомикозами, вызываемыми патогенными и условно-патогенными грибами, способствует снижение иммунитета, неполноценное питание, изменение стресс-реактивности организма человека.
Основная масса противогрибковых средств на фармацевтическом рынке представлена синтетическими препаратами (нистатин, леворин, натамицин, амфотерицин В, клотримазол, миконазол, бифоназол, эконазол, изоконазол, оксиконазол, тербинафин, нафтифин, гризеофульвин), оказывающими на ряду с антимикотическим действием разнообразные серьезные побочные эффекты, а также способствующие развитию резистентности микотической клетки. Применение современных антимикотических средств сопровождается рядом побочных эффектов: например, амфотерицин В и его липидные формы - органотоксическими проявлениями; у каспофунгина отсутствует пероральная форма и не обладает активностью в отношении криптококка; мало данных о безопасности парентерального введения интраконазола; ограничен спектр активности флуконазола, несмотря на его высокую эффективность при лечении дрожжевых форм грибковых инфекций.
Увеличение распространенности тяжелых грибковых поражений и рост их рефрактерности к традиционно применяемым антимикотикам, индивидуальная непереносимость, побочные эффекты, высокая токсичность и стоимость обусловливают необходимость разработки новых лекарственных средств, актуальность которой усиливается дополнительно наличием лишь единичных отечественных препаратов данной группы.
В настоящее время многочисленные научные исследования посвящены поиску растительных источников биологически активных веществ, совершенствуются методы разработки средств и способов их получения. Поиск и изучение региональной сырьевой базы перспективных дикорастущих растений является актуальной задачей современной фармации.
Наибольший интерес представляют биологически активные вещества растений рода Elaeagnus и Astragalus как потенциальная основа для создания средства противогрибкового действия.
Лечебные и профилактические свойства растений рода Elaeagnus издавна известны и используются в народной медицине стран Азии и Закавказья. Плоды растений используются при лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта, в качестве отхаркивающего, жаропонижающего, диуретического, антигельминтного и витаминного средства, обладают вяжущим, противовоспалительным и обволакивающим действием. В иранской народной медицине плоды использовались как обезболивающее и противовоспалительное средство у пациентов с ревматоидным артритом, а также для ускорения процесса заживления ран. Настой плодов растения проявляет гипотензивный, а также легкий анальгезирующий эффект. В составе лекарственного сбора плоды лоха с листьями подорожника большого применяются для лечения геморроя. Клетчатка плодов способствует выведению из организма токсичных веществ, избытка холестерина, тяжелых металлов, стимулирует процессы выделения желчи. Листья растений рода Elaeagnus оказывают противовоспалительное и ранозаживляющее действие, их отвар используют для уменьшения подагрических и ревматических болей, полоскания горла при ангине. На основе цветков растений рода Elaeagnus готовятся спиртовые настойки, которые рекомендуются как эффективное средство лечения различных заболеваний сердечно-сосудистой системы.
Благодаря своим уникальным лечебным свойствам растения рода Astragalus широко используются в медицине Китая, Тибета, Монголии, Индии. Биологически активные вещества этого растения улучшают функциональную активность иммунной системы, повышают общую резистентность организма, в связи с чем его применение рекомендовано лицам, проживающим в экологически неблагоприятных районах. На территории Астраханской области произрастает свыше 17 видов растений рода Астрагал, в том числе и астрагал лисий (Astragalus vulpinus).
В настоящее время известны следующие зарегистрированные средства противогрибкового действия, созданные на основе растительного сырья: водный экстракт надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua (L.) Cass.) (патент RU №2560517 от 22.04.2014); водный экстракт измельченной надземной массы лихниса халкедонского (Lychnis chalcedonlca L.) (патент RU №2435602 от 21.07.2010); сухой экстракт, полученный путем измельчения кроющих листьев початков антоциановой диплоидной формы кукурузы (заявка на патент №2017113810 от 20.04.2017); композиция на основе бисульфатов хелетрина и сангвинарина, получаемого из травы маклейи сердцевидной (Macleaya cordata Will L.) или маклейи мелкоплодной (М. microcarpas), и смеси терпеноидных фенолальдегидов и тритерпеноидов из листьев и побегов эвкалипта прутовидного (Eucalyptus viminalis Labill) (патент RU №2325922 от 25.01.2007); водное и спиртовое извлечение различной концентрации экстрактивных веществ листьев липы Folia Tilia (патент RU №2213570 от 10.10.2003). Несмотря на наличие аналогов растительного происхождения, все они обладают ограниченной противогрибковой активностью и избирательностью действия на одного -двух патогенных возбудителей грибковой инфекции.
Патентно-информационный поиск показал, что полного аналога предлагаемого средства, обладающего противогрибковой активностью - нет. Заявителем не обнаружено в доступной научной литературе сведений о применении в качестве противогрибкового средства надземных частей растений (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного (Elaeagnus angustifolia) и травы астрагала лисьего (Astragalus vulpinus).
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала доступных противогрибковых средств растительного происхождения в виде фитокомпозиции. Впервые установлено, что в качестве средства, обладающего противогрибковым действием, можно использовать водный или водно-этанольный экстракт из надземных частей (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного (Elaeagnus angustifolia) и травы астрагала лисьего (Astragalus vulpinus).
Поставленная задача решается путем разработки средства на основе надземных частей растительного сырья лоха узколистного (Elaeagnus angustifolia) и травы астрагала лисьего (Astragalus vulpinus), проявляющих противогрибковую активность.
Новым в изобретении является то, что в качестве противогрибкового средства предложены водный экстракт, обработанный сверхчастотными волнами частотой 2,45 ГГц, и водно-этанольный (в концентрации 40% или 50% или 60% или 70%) экстракт, обработанный ультразвуковыми волнами с частотой излучателя 22 кГц, приготовленные на основе надземного сырья (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного (Elaeagnus angustifolia) и астрагала лисьего (Astragalus vulpinus) в соотношении 1:1. Таким образом, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения "Новизна".
Техническим решением данного изобретения является не только расширение арсенала противогрибковых средств растительного происхождения, но и создание экономически выгодного средства на основе лоха узколистного (Elaeagnus angustifolia) и астрагала лисьего (Astragalus vulpinus), отличающегося ресурсной доступностью сырья, произрастающего на территории Астраханской области, Саратовской области, Краснодарского края, Крымского полуострова.
В сырье лоха узколистного были выявлены фитохимические составляющие, среди которых β-карболиновые алкалоиды, полисахариды, сложные эфиры, флавоновые гликозиды, фенолы, фенольные кислоты, кетоны, пиримидиновые и фенильные эфиры, стероиды и терпены, а также аминокислоты, витамины и жирные кислоты. В различных частях растения обнаружено большое количество флавоноидов, большинством из которых являются глюкопиранозильными, рамнопиранозильными и галактопиранозильными производными галактопиранозида. Трава астрагала лисьего содержит богатейший витамино-минеральный комплекс биологически активных соединений, включающий алкалоиды, сахара, флавоноиды, сапонины, дубильные вещества, аминокислоты, витамин В, С, РР, микроэлементы, органические кислоты, которые принимают участие в физиологических процессах живых систем, что является обоснованием применения надземных частей (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного и астрагала лисьего в фармацевтических и биотехнологических разработках.
Авторами впервые установлено, что водный и водно-этанольный экстракты надземных частей растений (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного (Elaeagnus angustifolia) и травы астрагала лисьего (Astragalus vulpinus) обладают большей активностью по сравнению с контрольным раствором (вода очищенная). Показано, что противогрибковая активность свойственна флавоноидам, флавоновым гликозидам, полисахаридам и сапонинам предлагаемой фитокомпозиции, состоящей из надземных частей растений (листья, цветки, плоды, стебли, кора).
Таким образом, заявленное решение соответствует критерию изобретения «Изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста уровня техники. Водный и водно-этанольный экстракты надземной части растений (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного и травы астрагала лисьего могут быть использованы в медицинской практике как средство противогрибкового действия, в связи, с чем предлагаемое решение соответствует критерию изобретения «Промышленно применимо».
Химический анализ надземной массы растений лоха узколистного и астрагала лисьего показал, что в составе полисахаридного комплекса идентифицированы глюкоза, галактоза, фруктоза, рамноза, пектины. Флавоноиды представлены рутином, кверцетином, кемпферолом, кофейной кислотой. Также обнаружены сапонины (астрагалозид IV), аминокислоты: аспарагиновая кислота, треонин, глицин, валин, метионин, лейцин, тирозин, гистидин, лизин, аргинин, триптофан, цистеин. Обнаружены витамин С, витамин Е и витамин K и дубильные вещества.
Способ приготовления экстрактов предлагаемой фитокомпозиции основан на водном и водно-этанольном экстрагировании биологически-активных веществ, позволяющий получить вытяжку максимальной концентрации с меньшим количеством балластных веществ.
Ниже приведены примеры осуществления изобретения.
Пример 1.
Навеску сухой измельченной надземной массы сырья (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного и травы астрагала лисьего в соотношении 1:1 помещали в коническую колбу соответствующего объема, заливали дистиллированной водой температурой 25°С в соотношениях 1:10 или 1:20. Настаивали 5 часов в темном месте, защищенном от ультрафиолетового излучения. Далее проводили экстракцию под действием сверхвысокочастотных волн частотой 2,45 ГГц и мощностью 200 Вт по 0,25 минут 3 раза (микроволновая печь модель GE73AR, производитель Samsung, Малайзия, 2016). Извлечение экстрактивных веществ происходило в процессе отстаивания и постепенного охлаждения экстракта в течение 12 часов.
Пример 2.
Навеску сухой измельченной надземной массы (листья, цветки, плоды, стебли, кора) лоха узколистного и травы астрагала лисьего в соотношении 1:1 помещали в колбу, заливали спиртом этиловым в концентрациях 40% или 50% или 60% или 70%, в соотношении сырья и экстрагента 1:10 или 1:20. Настаивали 3 часа на водяной бане. Полученные растворы охлаждали и отфильтровывали. Далее экстракты подвергали действию ультразвуковых волн на аппарате УЗДН-А (частота излучателя 22 кГц) по 1 мин 3 раза (диспегатор ультразвуковой, производитель НПП «Укрросприбор», Украина, 2011). Спирт в полученных экстрактах отгоняли с помощью ротационного испарителя (модель R-213b, диагональный тип SENCO, Китай, 2017).
Пример 3.
Оценку противогрибковой активности водного и водно-этанольного экстрактов в концентрациях 40% или 50% или 60% или 70% на основе сырья из листьев, цветков, плодов, стеблей и коры лоха узколистного и травы астрагала лисьего в соотношении 1:1, приготовленных согласно примерам 1 и 2 соответственно, проводили на возбудителях грибковых заболеваний: Trichophyton verrucosum, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum, Microsporum canis, Epidermophyton rubrum, Aspergillus niger.
Для поддержания, освежения и культивирования тест-культур микроорганизмов использовали агар и бульон Сабуро, сусло-агар, дистиллированную воду и физиологический раствор. Концентрацию культур тест-штаммов грибов определяли с помощью стандарта мутности, которая составляла 100 млн.г.т./мл. Противогрибковую активность водного и водно-этанольных экстрактов на основе фитокомпозиции лоха узколистного и астрагала лисьего в соотношении 1:1 in vitro изучали методом прямой диффузии в агар Сабуро.
Опыты проводили в трехкратной повторности. На застывшую поверхность агара Сабуро наносили взвесь культуры определенного возбудителя и равномерно растирали ее шпателем по поверхности агара. По три чашки Петри с агаром Сабуро и нанесенной на его поверхность культурой гриба были опытными, по три чашки - контрольными. Всего было шесть экспериментальных серий. На поверхность засеянной среды агара Сабуро в опытных чашках накладывали 6 стерильных цилиндров размером 10,0 мм из алюминия на равном расстоянии друг от друга и от края чашки, в которое затем капали испытуемые экстракты, а в контрольных чашках капали воду очищенную. Опытные и контрольные чашки Петри помещали в термостат при 33°С на 14 дней, просматривая чашки каждые 12 часов.
После культивирования оценивали характерный рост тест-культур грибов под воздействием водного или водно-этанольного экстрактов на основе надземного сырья лоха узколистного и астрагала лисьего в соотношении 1:1 (см. таблица 1).
Было установлено, что в чашках Петри водный экстракт (соотношение 1:10), приготовленный согласно примеру 1, диффундировал в агар Сабуро и задерживал рост тест-культур следующих грибов: Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Epidermophyton rubrum, Aspergillus niger. Водный экстракт (соотношение 1:20), приготовленный согласно примеру 1, задерживал рост тест-культур следующих грибов: Epidermophyton rubrum, Aspergillus niger.
Было установлено, что в чашках Петри водно-этанольный экстракт, приготовленный согласно примеру 2, в любой из указанных концентраций экстрагента (40%, 50%, 60%, 70%), диффундировал в агар Сабуро и задерживал рост тест-культур следующих грибов: Trichophyton verrucosum, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum, Microsporum canis, Aspergillus niger.
Ни в одной опытной чашке через 14 дней роста грибов не наблюдалось. В контрольных чашках Петри на агаре Сабуро грибы интенсивно развивались и образовывали воздушный мицелий.
Проведенные исследования позволяют достоверно утверждать, что полученные водный и водно-этанольные экстракты в концентрациях 40% или 50% или 60%) или 70%), приготовленные согласно примерам 1 и 2 соответственно, на основе сырья из надземных частей (листья, цветки, плоды, стебли и кора) лоха узколистного и астрагала лисьего в соотношении 1:1, могут успешно применяться в качестве средства с противогрибковой активностью в отношении возбудителей грибковых заболеваний.
Положительный эффект достигнут благодаря использованию как водного, так и водно-этанольного экстракта надземной части лоха узколистного и травы астрагала лисьего в качестве антигрибкового средства, что позволило расширить арсенал средств растительного происхождения, обладающих противогрибковым эффектом, с повышенным специфическим действием.