КОМПОЗИЦИЯ ИНКАПСУЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ
INCAPSULATED HEPATOCYTE COMPOSITION

Настоящее изобретение относится к микрокапсулам, содержащим клетки печени и эритропоэтин, способам получения указанных микрокапсул и способам лечения пациента, включающим применение указанных микрокапсул у пациента.
Хотя печень здорового индивидуума способна самостоятельно регенерировать посредством восстановления или замены поврежденной или больной ткани, к сожалению, после гибели или серьезного повреждения определенного количества клеток печени вследствие заболевания или травм, то отказать может целый орган. Такая недостаточность, будь она острой или хронической недостаточностью, может являться причиной заболевания и смерти. Терапия заболеваний печени включает общепринятые способы, такие как введение лекарственных средств. Однако к существующему уровню техники также относится трансплантация печени или ее частей. Кроме того, широко известна трансплантация популяций клеток печени пациентам, например, как описано в WO 2004/009766 A2. Однако по-прежнему существует большая проблема разработки способов терапии для лечения острых или хронических заболеваний печени с доставкой клеток печени нуждающемуся в этом пациенту, где способы оптимизированы в отношении жизнеспособности, приживления, пролиферации и дифференцировки трансплантированных клеток печени в ткани-мишени.
В Haque et al. (Biotechnology Letters 27 (5) (2005), 317-322)) описано исследование in vitro микрокапсул из альгината-хитозана в качестве альтернативы трансплантации клеток печени для лечения печеночной недостаточности. В Chandrasekaran et al. (Tissue Engineering 12 (7), (2006)) описаны клетки-предшественники клеток печени, помещенных в электростатически генерируемые гранулы.
Несмотря на усилия по разработке терапевтических систем, эффективно доставляющих клетки печени в ткань-мишень пациента, все еще сохраняется необходимость предоставления более надежных терапевтических способов лечения заболеваний печени, в частности, способов, обеспечивающих высокую жизнеспособность и физиологическую активность клеток печени в организме-мишени.
Настоящее руководство решает указанную проблему посредством предоставления микрокапсул, содержащих оболочку капсулы, предпочтительно биологически совместимую оболочку капсулы, инкапсулирующую суспензию терапевтически эффективного количества клеток печени в физическом контакте со стимулирующим клетки печени количеством эритропоэтина. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, содержащим оболочку капсулы и ядро, где оболочка капсулы инкапсулирует в ядре суспензию терапевтически эффективного количества клеток печени и стимулирующее клетки печени количество эритропоэтина, в частности, где эритропоэтин (обозначаемый ниже как EPO) и клетки печени находятся в физическом контакте друг с другом так, чтобы обеспечивать стимулирующее действие EPO на клетки печени.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает предоставление микрокапсул, содержащих оболочку капсулы, предпочтительно полученную из биологически совместимого вещества оболочки капсулы, и ядро, окруженное указанной оболочкой капсулы. В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения ядро содержит суспензию терапевтически эффективного количества клеток печени в физическом контакте со стимулирующим клетки печени количеством эритропоэтина.
В другом предпочтительном варианте осуществления ядро содержит матрикс, предпочтительно полученный из биологически совместимого вещества матрикса, где суспензия терапевтически эффективного количества клеток печени помещена в указанный матрикс в физическом контакте со стимулирующим клетки печени количеством эритропоэтина. Предпочтительно вещество матрикса является таким же как вещество оболочки капсулы. В другом варианте осуществления биологически совместимое вещество матрикса может представлять собой вещество отличное от вещества оболочки капсулы.
Таким образом, настоящее изобретение относится к руководству по инкапсуляции совместно эритропоэтина и клеток печени в биологически совместимой оболочке капсулы так, чтобы эритропоэтин находился в физическом контакте с клетками печени так, чтобы проявлять по меньшей мере один из видов своего биологического действия на клетки печени, в частности, стимуляция клеток печени.
Одним из преимуществ по настоящему изобретению является то, что клетки печени инкапсулированы в оболочку капсулы и, таким образом, не вызывают никакой побочной реакции, в частности аллергической или иммунной реакции, у пациента, которому предпочтительно трансплантируют микрокапсулу. Кроме того, тесный контакт эритропоэтина с клеткой печени стимулирует указанные клетки печени к выполнению их биологической функции так, чтобы обеспечивать пациенту биологические функции печени.
В особенно предпочтительном варианте осуществления клетки печени содержатся в микрокапсуле в такой концентрации, чтобы находиться в физическом контакте друг с другом, обеспечивая даже более выраженный эффект при стимуляции эритропоэтином. Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления изобретение предусматривает, что клетки печени, содержащиеся в микрокапсулах, находятся в физическом контакте друг с другом и находятся в физическом контакте с эритропоэтином.
В контексте настоящего изобретения выражение "клетки печени находятся в физическом контакте с эритропоэтином" означает, что эритропоэтин способен проявлять по меньшей мере одну из своих биологических функций на клетку печени, в частности способен достигать и обратимо или необратимо связываться рецепторами эритропоэтина, находящимися на клетке печени.
В контексте настоящего изобретения выражение "клетки печени, находящиеся в физическом контакте друг с другом" означает, что клетки печени находятся в микрокапсуле по настоящему изобретению в такой тесной близости друг к другу, что клетки касаются друг друга и обеспечивают стабильную среду, очень похожую на естественное физиологическое состояние в печени.
В контексте настоящего изобретения термин "стимуляция клеток печени" означает, что эритропоэтин повышает биологическую функциональность клеток печени, предпочтительно у пациента, которому трансплантируют микрокапсулу, повышает жизнеспособность клеток печени, повышает их стабильность при хранении и/или повышает их потенциал в отношении успешного осуществления их биологической функции после трансплантации индивидууму.
В контексте настоящего изобретения "биологическая совместимость" означает, что вещество, в частности вещество оболочки капсулы и/или вещество матрикса способно сохранять жизнеспособными интегрированные клетки печени и обеспечивает взаимодействие между эритропоэтином и клетками печени. В особенно предпочтительном варианте осуществления термин "биологически совместимый" означает, что вещество позволяет, предпочтительно долговременную, имплантацию пациенту, при сохранении, тем не менее, функции помещенных клеток печени без вызова какого-либо нежелательного местного или системного эффекта у индивидуума, в частности аллергических и иммунных реакций. В особенно предпочтительном варианте осуществления термин "биологически совместимый" означает, что вещество способно оказывать в качестве субстрата поддерживающую активность клеток печени, включая стимуляцию молекулярной и механически подобной системы между клетками печени и EPO, предпочтительно с целью оптимизации регенерации печени без выявления любых нежелательных эффектов в клетках и у индивидуума.
В контексте настоящего изобретения термин "эритропоэтин" обозначает гликопротеиновый гормон, контролирующий эритропоэз или образование клеток крови, предпочтительно вещество, которое в соответствующей дозировке, контролирует рост, дифференцировку и созревание стволовых клеток от эритробластов к эритроцитам.
Эритропоэтин представляет собой гликопротеин, содержащий 166 аминокислот, три участка гликозилирования, и с молекулярной массой приблизительно 34000 Да. Во время EPO-индуцированной дифференцировки клеток-предшественников эритроцитов, индуцируется синтез глобина, повышается синтез комплекса гема, и увеличивается количество рецепторов ферритина. Таким образом, клетка может поглощать больше железа и синтезировать функциональный гемоглобин. В зрелых эритроцитах гемоглобин связывает кислород. Таким образом, эритроциты и содержащийся в них гемоглобин играют ключевую роль в обеспечении организма кислородом. Эти процессы инициированы взаимодействием EPO с соответствующим рецептором на клеточной поверхности клеток-предшественников эритроцитов (Graber and Krantz, Ann. Rev. Med. 29(1978), 51-56).
В контексте настоящего изобретения термин "эритропоэтин" включает эритропоэтин дикого типа, в частности эритропоэтин человека, и его производные. В контексте настоящего изобретения производные эритропоэтина представляют собой рекомбинантные белки эритропоэтина, характеризующиеся по меньшей мере изменением одной аминокислоты, в частности делецией, добавлением или заменой еще одной аминокислоты по сравнению с EPO дикого типа и/или белки эритропоэтина с отличным паттерном гликозилирования по сравнению с эритропоэтином дикого типа. В особенно предпочтительном варианте осуществления производные эритропоэтина также представляют собой слитые белки или усеченные белки эритропоэтина дикого типа или их производные. В особенно предпочтительном варианте осуществления производное эритропоэтина также представляет собой эритропоэтин дикого типа, содержащий отличный паттерн гликозилирования по сравнению с паттерном гликозилирования дикого типа.
Термин "эритропоэтин", применяемый в настоящем документе, включает EPO любого происхождения, в частности EPO человека или животного. Таким образом, применяемый в настоящем документе термин включает не только природный, или другими словами формы EPO дикого типа, но также его производные, также названные модификации, мутеины или мутанты, при условии, что они демонстрируют биологические эффекты эритропоэтина дикого типа.
В отношении настоящего изобретения под "производными" также понимают такие производные эритропоэтина, которые несмотря на сохранение основной структуру эритропоэтина, получают посредством замещения одного или нескольких атомов или молекулярных групп, или остатков, в частности, замещением сахарных цепей, таких как этиленгликоль, и/или аминокислотные последовательности, которых отличаются от природного белка эритропоэтина человека или животного по меньшей мере одним положением, но фактически обладают высокой степенью гомологии на уровне аминокислот и сопоставимой биологической активностью. Производные эритропоэтина, которые можно применять в настоящем изобретении, например, известны из WO 94/25055, EP 0148605 B1 или WO 95/05465.
В частности "гомология" означает идентичность последовательности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% и конкретно предпочтительно по меньшей мере более 90%, 95%, 97% и 99%. Таким образом известный специалисту в данной области термин "гомология" относится к степени родства между двумя или более полипептидными молекулами. Ее определяют по совпадению между последовательностями. Такое совпадение может значить или идентичное совпадение, или же консервативную замену аминокислоты.
В отношении изобретения термин "производное" также включает слитые белки, в которых функциональные домены другого белка находятся на N-концевом участке или на C-концевом участке. В одном из вариантов осуществления изобретения этот другой белок, например, может представлять собой GM-CSF, VEGF, PIGF, статин или другой фактор, обладающий стимулирующим эффектом на эндотелиальные клетки-предшественники. В дополнительном варианте осуществления изобретения другой белок также может представлять собой фактор, обладающий стимулирующим эффектом на клетки печени.
Различия между производным эритропоэтина и природным, или эритропоэтином дикого типа, могут появляться, например, в результате мутаций, таких как делеции, замещения, вставки, добавления, замены оснований и/или рекомбинаций нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности эритропоэтина. Очевидно, такие различия также могут представлять собой вариации природной последовательности, такие как последовательности из другого организма, или последовательности, мутировавшие по природе, или мутации, избирательно введенные в последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих эритропоэтин, известными в данной области общепринятыми способами, такими как химические средства и/или физические средства. Таким образом, в отношении изобретения термин "производное" также включает мутантные молекулы эритропоэтина, или другими словами мутеины эритропоэтина.
По изобретению, также можно использовать аналоги пептидов или белков эритропоэтин. В отношении настоящего изобретения термин "аналоги" включает соединения, не содержащие любой аминокислотной последовательности идентичной аминокислотной последовательности эритропоэтина, но имеющие трехмерную структуру в значительно степени сходную с трехмерной структурой эритропоэтина так, что они обладают сопоставимой биологической активностью. Например, аналоги эритропоэтина могут представлять собой соединения, содержащие аминокислотные остатки с подходящей конформацией, отвечающие за связывание эритропоэтина с его рецепторами, и, таким образом, способные стимулировать основные свойства поверхности связывающей области эритропоэтина. Соединения этого класса описаны, например, у Wrighton et al., Science, 273 (1996), 458.
Применяемый по изобретению EPO можно получать различными способами, например, посредством выделения из мочи человека или из мочи или плазмы (включая сыворотку) пациентов, страдающих апластической анемией (Miyake et al., J.B.C. 252 (1977), 5558). Например, EPO человека можно также получать из тканевых культур клеток рака почки человека (JA Unexamined Application 55790/1979), из клеток лимфобластов человека, обладающих способностью продуцировать EPO человека (JA Unexamined Application 40411/1982), и из культуры гибридомы, полученной слиянием клеток клеточной линии человека. EPO также можно получать способами генной технологии, используя подходящие ДНК или РНК, кодирующие соответствующую аминокислотную последовательность EPO для получения желаемого белка посредством генетической инженерия, например, в бактерии, в дрожжах или в растении, клеточной линии животного или человека. Например, такие способы описаны в EP 0148605 B2 или в EP 0205564 B2 и в EP 0411678 B1.
В контексте настоящего изобретения в предпочтительном варианте осуществления производные эритропоэтина представляют собой функциональные и подтвержденные клиническими испытаниями производные EPO, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из эпоэтина, также называемого прокритом, эпогена, эпрекса или неорекормона, эпоэтина дельта, также называемого динепо, дарбэпоэтина, также называемого аранеспом, PD-поэтина, CERA (постоянного антагониста рецепторов эритропоэтина) и метоксиполиэтиленгликоль-эпоэтина бета, также называемого мирцера.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения микрокапсула представляет собой предпочтительно шарообразную гранулу, полученную из биологически совместимого вещества оболочки капсулы, содержащей помещенное в нее терапевтически эффективное количество клеток печени в физическом контакте со стимулирующим клетки печени количеством эритропоэтина. В контексте настоящего изобретения предпочтительно микрокапсула представляет собой гранулу, предпочтительно диаметром от 10 мкм до 10 мм, предпочтительно от 140 мкм до 10 мм, предпочтительно от 50 мкм до 1 мм, предпочтительно от 60 мкм до 800 мкм, предпочтительно от 100 до 700 мкм. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения микрокапсулы по настоящему изобретению содержат клетки печени, эритропоэтин и биологически совместимое вещество оболочки капсулы. Предпочтительно в дополнение к указанным выше трем элементам предусматривать покрытие микрокапсулы и/или биологически совместимого матрикса в ядре микрокапсулы.
Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, содержащим терапевтически эффективное количество клеток печени, инкапсулированных в биологически совместимом веществе матрикса в физическом контакте со стимулирующим клетки печени количеством эритропоэтина.
В особенно предпочтительном варианте осуществления клетки печени помещены в оболочку капсулы в форме суспензии, предпочтительно в форме суспензии клеточной культуры. Предпочтительно суспензия клеток печени находится в форме клеток печени, содержащихся в среде для культивирования клеток или в физиологически приемлемом водном растворе. Предпочтительно суспензия клеток печени представляет собой суспензию клеток печени в среде для культивирования клеток.
В особенно предпочтительном варианте осуществления клетки печени в форме суспензии помещены в содержащийся в оболочке матрикс, предпочтительно в форме суспензии клеточной культуры, предпочтительно в форме клеток печени, содержащихся в среде для культивирования клеток или в физиологически приемлемом водном растворе.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где клетки печени выбраны из группы, состоящей из клеток-предшественников клеток печени, стволовых клетки печени, гепатобластов, гепатоцитов и эндотелиальных клеток.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где клетки печени получают из печени взрослого, из печени эмбриона, из печени плода, из печени новорожденного или из культур клеток печени. Предпочтительно клетки печени представляют собой живые клетки печени. В предпочтительном варианте осуществления клетки печени можно получать у живого или умершего, в частности недавно скончавшегося, донора.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где клетки печени представляют собой клетки печени человека, клетки печени не являющегося человеком примата, клетки печени свиньи, клетки печени собаки, клетки печени кошки, клетки печени кролика, клетки печени мыши или клетки печени крысы.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где средний диаметр микрокапсул составляет от 100 до 700 мкм, предпочтительно от 200, 300, 400, 500, 600 или 650 до 700 мкм.
4
8
5
7
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где терапевтически эффективное количество клеток печени составляет от 10 до 10, предпочтительно от 10 до 10 клеток печени/мл суспензии.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где средний диаметр клеток печени составляет от 8 до 14 мкм, предпочтительно от 9 до 12 мкм.
-7
-2
-7
-3
-7
-5
-6
-5
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где стимулирующее клетки печени количество эритропоэтина составляет от 10 до 10, предпочтительно от 10 до 10, предпочтительно от 10 до 10 и предпочтительно от 10 до 10 Ед/мл суспензии.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где EPO представляет собой эритропоэтин дикого типа или рекомбинантный эритропоэтин.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где вещество оболочки капсулы выбрано из группы, состоящей из альгината, альгинат-хитозана (AC), альгинат-поли-L-лизина (APA), термогелеобразующего полимера и PEG-гидрогеля.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где вещество матрикса выбрано из группы, состоящей из альгината, альгинат-хитозана (AC), альгинат-поли-L-лизина (APA), термогелеобразующего полимера и PEG-гидрогеля.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где в дополнение к клетками печени в микрокапсуле находится по меньшей мере один дополнительный тип клеток.
В особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный тип клеток, находящийся в микрокапсуле, выбран из группы, состоящей из звездчатых эндотелиоцитов печени, желчных клеток, гематопоэтических клеток, моноцитов, клеток макрофагов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено, что микрокапсула в дополнение к клетками печени и EPO содержит по меньшей мере один дополнительный фактор роста, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из HGH (фактора роста человек), VEGF (фактора роста эндотелия сосудов), CSF (колониестимулирующий фактора), тромбопоэтина, комплекса SCF (Skp, куллина, содержащего F-box комплекса), SDF (фактора-1 стромальных клеток), NGF (фактора роста нервов), PIGF (белка биосинтеза гликозилфосфатидилинозитол-якоря класса Ф), ингибитора HMGCoA-редуктазы, ингибитора ACE (ангиотензинпревращающего фермента), ингибитора AT-1 и донора NO.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к микрокапсулам, где микрокапсулы являются покрытыми.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения покрытие представляет собой полимерное покрытие, сахарное покрытие, покрытие из сахарного спирта и/или жировое или восковое покрытие.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения указанных выше микрокапсул, включающего:
a) получение суспензии терапевтически эффективного количества клеток печени и стимулирующего клетки печени количества эритропоэтина,
b) смешивание суспензии клеток печени и эритропоэтина для приведения их в физический контакт друг с другом и
c) инкапсуляция суспензии клеток печени и эритропоэтина в веществе оболочки капсулы, так чтобы сформировать микрокапсулу.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, где микрокапсулы, получаемые на этапе c), криоконсервируют.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу профилактики или терапевтического лечения заболевания печени у нуждающегося в этом индивидуума, включающему введение микрокапсул по настоящему изобретению нуждающемуся в этом индивидууму.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, где заболевание печени представляет собой гепатит, цирроз, врожденные нарушения обмена веществ, острую печеночную недостаточность, острые инфекции печени, острую химическую токсичность, хроническую печеночную недостаточность, холангит, билиарный цирроз печени, синдром Алажиля, недостаточность альфа-1-антитрипсина, аутоиммунный гепатит, атрезию желчных протоков, рак печени, поликистозное заболевание печени, жировую дистрофию печени, галактоземию, камни желчного пузыря, синдром Жильбера, гемохроматоз, гепатит A, гепатит B, гепатит C и другие вирусные инфекции гепатита, порфирию, первичный склерозирующий холангит, синдром Рейе, саркоидоз, тирозинемию, болезнь накопления гликогена 1 типа или болезнь Вильсона.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, где введение проводят посредством введения микрокапсул под капсулу печени, в селезенку, в печень, в паренхиму печени или в селезеночную артерию, или в воротную вену.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения введение проводят посредством введения нуждающемуся в этом индивидууму, где введение является местным, энтеральным или парентеральным введением. В предпочтительном варианте осуществления местное введение представляет собой накожное, ингаляционное, вагинальное или интраназальное введение. В предпочтительном варианте осуществления энтеральное введение проводят через рот, посредством желудочного питательного зонда или ректально. В предпочтительном варианте осуществления парентеральное введение проводят посредством инъекции или инфузии, предпочтительно внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрисердечным, подкожным, внутрикостным, интрадермальным, интратекальным, интраперитонеальным или интравезикальным введением. Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления парентеральное введение представляет собой трансдермальное, трансмукозальное или ингаляционное введение.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток печени в среде для культивирования, предпочтительно in vitro, включая культивирование микрокапсул по настоящему изобретению в подходящей для культивирования среде и в условиях, подходящих для поддержания или повышения жизнеспособности клеток печени.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу поддержания или повышения энергетического состояния клеток печени в среде для культивирования, предпочтительно in vitro, включающему культивирование микрокапсул по настоящему изобретению в подходящей среде для культивирования и в условиях, подходящих для поддержания или повышения энергетического состояния клеток печени.
Дополнительные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения являются объектом подпунктов формулы изобретения.
На фиг.1 в качестве показателя энергетического состояния клетки проиллюстрировано отношение АТФ/АДФ после культивирования клеток печени, инкапсулированных с EPO или без EPO.
Пример 1
-3
4
8
Клетки печени в присутствии EPO (5×10 единиц/мл), инкапсулированные с альгинатом в концентрации от 10 до 10 клеток/мл в гранулы со средним диаметром от 100 до 700 мкм, более жизнеспособны, чем клетки печени, идентично инкапсулированные без EPO. Отношение АТФ/АДФ применяют в качестве показателя энергетического состояния клеток. Если в течение эксперимента отношение АТФ/АДФ увеличивается с большей скоростью или остается большим, чем у необработанных клеток, тогда эти данные подтверждают гипотезу.
2
2
2
2
2
-3
-6
Инкапсуляция клеток печени из единого исходного материала криоконсервированных клеток печени человек проводили, используя устройство электростатической генерации гранул. Клетки печени суспендировали в соответствующей среде для культивирования и смешивали с 2% раствором альгината натрия в соотношении 1:1. Получившийся 1% раствор альгината, содержащий клетки печени в концентрации от 4 миллионов клеток/мл вводили в 1СС шприц, оснащенный ангиокатетером 24 калибра. Ангиокатетер в основании протыкали иглой 23 калибра для применения в качестве положительного электрода при электростатическом литье. Шприц вводили в шприцевой насос (Braintree Scientific BS-8000, Braintree, MA) и располагали так, чтобы капли, выходящие из ангиокатетера падали перпендикулярно к поверхности 125 мМ раствора хлорид кальция (CaCl) (общепринятого или буфера Cytonet 4 с 1% альбумином человека, с 5×10и 5 × 10 Ед/мл EPO или без EPO) в 250 мл аналитический стакан. Расстояние от наконечника ангиокатетера до поверхности CaCl устанавливали приблизительно на 2,5 см. Производительность насоса устанавливали в диапазоне от 0,75 до 1,5 мл/мин. Заземленный электрод погружали в собирающую CaCl баню. Создавали электростатический потенциал между наконечником ангиокатетера и баней с CaCl, используя высоковольтный источник постоянного тока (Spellman model RHR30PF30, Hauppauge, NY) в диапазоне от 3,8 до 6 кВ. Размер гранул (500 мкм) контролировали регулирование применяемого потенциала. Когда шприцевой насос включали в присутствии высокого электростатического потенциала, выступающий раствор альгината натрия вытягивали в виде маленьких капель, которые при контакте с раствором CaCl полимеризовались в твердый альгинат кальция.
После инкапсуляции клеток печени альгинатные гранулы содержали в среде Уильяма E с добавлением 10% сыворотки, 244 единиц/мл пенициллина, 0,244 мг/мл, 5,5 мМ глутамина, 0,195 единиц/мл инсулина, 0,017 мкг/мл глюкагона, 0,73 мкг/мл преднизолона, 0,54 мкг/мл дексаметазона и культивировали в течение 2 часов.
Извлечение из капсул проводили посредством помещения гранул в 100 мМ цитрат. Когда альгинат растворялся, клетки дважды промывали PBS и осаждали центрифугированием при 200xG в течение одной минута. Метаболиты экстрагировали посредством помещения клеток в 4% хлорную кислоту и гомогенизацией в течение 20 секунд в ручном микрогомогенизаторе. Затем образец центрифугировали при 14000xG в течение трех минут и удаляли супернатант с метаболитами. Хлорную кислоту нейтрализовали KOH и удаляли нерастворимый перхлорат калия посредством центрифугирования. Затем для определения АТФ, АДФ образец анализировали методом ВЭЖХ способом, описанным в "Measurements of ATP in Mammalian Cells" (Manfredi et al. Methods 2002 (4), 317-326). Для определения уровня АТФ/АДФ использовали три параллельных планшета.
Результаты
Отношение АТФ/АДФ является показателем энергии и отражает влияние всех биохимических путей обмена на метаболическое состояние клеток. Поддержание отношения АТФ/АДФ (см. фигуру), наблюдаемое в клетках печени, инкапсулированных с EPO, однозначно демонстрирует, что клетки способны поддерживать пути производства энергии, необходимые для любой функции клеток. В этом эксперименте отношение АТФ/АДФ поддерживалось в группе, обработанной EPO, но не поддерживалось в необработанных контролях. Несмотря на то, что группа, обработанная EPO, была способна поддерживать отношение АТФ/АДФ, отношение АТФ/АДФ в контролях опускалось ниже 0,5. Это демонстрирует, что EPO может передавать сигналы посредством каскада, не управляемого рецептором ЕРО, обеспечивая клеткам трофическую стимуляцию.