МИКРООРГАНИЗМЫ И ИХ ФРАКЦИИ, ИНДУЦИРУЮЩИЕ СПЕЦИФИЧНЫЙ К УГЛЕВОДУ КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ

1. Способ выделения положительного по углеводу микроорганизма, содержащего интересующий углеводный эпитоп, из смеси микроорганизмов, включающий
(a) создание контакта между связывающей углевод молекулой, специфичной к интересующему углеводному эпитопу, и смесью микроорганизмов, и
(b) выделение как минимум одного микроорганизма, связавшегося с указанной связывающей углевод молекулой, из указанной смеси,
(c) необязательную проверку того, что выделенный микроорганизм является положительным по углеводу микроорганизмом, путем тестирования выделенного микроорганизма на специфическое связывание с указанной связывающей углевод молекулой.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий (d) тестирование индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа и/или гуморального иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа указанным микроорганизмом и/или его фракцией и/или лизатом in vivo или in vitro.
3. Способ по п.2, где этап (d) включает тестирование индукции эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа указанным положительным по углеводу микроорганизмом и/или его фракцией и/или лизатом для активации CD4-положительных Т-клеток Th1-типа и/или для активации цитотоксических CD8-положительных Т-клеток, предпочтительно как минимум у одного животного или человека и/или in vitro.
4. Способ по п.2, где тестирование клеточного иммунного ответа, выполняемое на этапе (d), включает
i) нагружение как минимум одной дендритной клетки положительной по углеводу клеткой, идентифицированной на этапах (а)-(с);
ii) создание контакта между соответствующим количеством указанной как минимум одной дендритной клетки, нагруженной указанным положительным по углеводу микроорганизмом, и соответствующим количеством иммунных клеток, которые могут активироваться или ингибироваться дендритной клеткой;
iii) культивирование для осуществления взаимодействия указанных иммунных клеток с указанными нагруженными дендритными клетками;
iv) добавление соответствующего количества антигенпрезентирующих клеток (АРС), нагруженных соответствующим количеством как минимум одного второго соединения, несущего тот же углеводный эпитоп, что и положительный по углеводу микроорганизм, где указанное второе соединение отличается от указанного первого положительнго по углеводу микроорганизма;
v) культивирование для повторной стимуляции указанных иммунных клеток;
vi) определение того, произошла ли повторная стимуляция иммунных клеток.
5. Способ по п.4, где как минимум часть АРС, нагруженных соответствующим количеством указанного второго соединения, находятся в контакте с иммунными клетками в присутствии связывающей углевод молекулы, узнающей указанный интересующий углеводный эпитоп.
6. Способ по п.4, где повторную стимуляцию устанавливают, определяя
продукты секреции иммунных клеток, которые секретируются, если указанные иммунные клетки являются стимулированными или повторно стимулированными, такие как интерферон альфа, интерферон гамма или GM-CSF, и/или
пролиферацию иммунных клеток.
7. Способ по п.4, где тест на клеточный иммунный ответ выбирают из следующей группы:
(i) тест 1 на клеточный иммунный ответ, где на этапе (d (vi)) повторную стимуляцию иммунных клеток определяют, измеряя секрецию GM-CSF;
(ii) тест 2 на клеточный иммунный ответ, где на этапе (d (vi)) количество/долю повторно стимулированных лимфоцитов определяют, измеряя количественно секрецию INFгамма и/или ТNFальфа;
(iii) тест 3 на клеточный иммунный ответ, где на этапе (d (vi)) количество/долю повторно стимулированных лимфоцитов определяют, измеряя пролиферацию и/или индукцию пролиферации.
8. Способ по п.2, где тест на клеточный иммунный ответ выбирают из следующей группы:
(iv) тест 4 на клеточный иммунный ответ против интересующего углеводного эпитопа, включающий
(а) создание контакта между соответствующим количеством дендритной клетки, дендритных клеток или смеси клеток, содержащих как минимум одну дендритную клетку, нагруженных соответствующим количеством
(i) положительного по углеводу микроорганизма, его лизата или фракции,
(ii) препаратов, содержащих их,
(iii) нутрицевтика или фармацевтической композиции по изобретению или
(iv) несущей или содержащей углеводный эпитоп молекулы,
(v) смеси, содержащей несущую углеводный эпитоп молекулу,
(vi) клеток, положительных по, или содержащих углеводный эпитоп, их лизата или фракции,
и соответствующим количеством как минимум одной связывающей углевод молекулы;
(b) тестирование связывания указанной связывающей углевод молекулы с дендритной клеткой, дендритными клетками или смесью клеток;
(v) тест 5 на клеточный иммунный ответ против интересующего углеводного эпитопа, включающий
a) инкубацию соответствующего количества клеток-мишеней из линии клеток, содержащих интересующий углеводный эпитоп, меченных соответствующим количеством маркера, как минимум с одной иммунной клеткой, направленной против углеводного эпитопа, или смесью клеток, содержащей как минимум одну иммунную клетку, направленную против интересующего углеводного эпитопа, и
b) измерение лизиса клеток-мишеней путем определения высвобождения маркера, при этом при положительном клеточном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем отрицательных по углеводному эпитопу клеток, и/или наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, инкубированных с направленными против углеводного эпитопа иммунными клетками, чем лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, инкубированных с соответствующими контрольными иммунными клетками, не направленными против углеводного эпитопа.
9. Способ по п.2, где индукцию эффективного специфичного к углеводу гуморального иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа проверяют в тесте на гуморальный иммунный ответ, выбранном из группы, состоящей из
а. теста 1 на гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа, включающего тестирование методом ELISA связывания антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с соединениями, несущими углеводный эпитоп, при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильное связывание антител с указанным соединением, несущим углеводный эпитоп, чем с указанным соединением, не имеющим углеводного эпитопа, или с указанным соединением (например, белком или пептидом) после ферментативной или химической обработки, которая разрушает углеводный эпитоп;
b. теста 2 на гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа, включающего тестирование методом ELISA связывания антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с углеводными структурами, связанными с полиакриламидом (РАА-конъюгаты), при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильное связывание антитела или антител с РАА-конъюгатом, содержащим углеводный эпитоп, чем с тем же РАА-конъюгатом после ферментативной или химической обработки, разрушающей углеводный эпитоп, и/или более сильное связывание антитела или антител с РАА-конъюгатом, содержащим углеводный эпитоп, по сравнению с РАА-конъюгатом, не содержащим углеводный эпитоп, предпочтительно в обоих случаях;
с. теста 3 на гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа, включающего тестирование методом проточной цитометрии связывания антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с клетками, содержащими углеводный эпитоп, и с клетками, не содержащими углеводный эпитоп, при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильное связывание антител с клетками, содержащими углеводный эпитоп, чем с клетками, отрицательными по углеводному эпитопу;
d. теста на гуморальный иммунный ответ (теста 4 на гуморальный иммунный ответ) против углеводного эпитопа, включающего тестирование методом иммунофлуоресценции связывания антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, с клетками, содержащими углеводный эпитоп, и с клетками, отрицательными по углеводному эпитопу, при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильное связывание антитела или антител с клетками, содержащими углеводный эпитоп, чем с клетками, не содержащими углеводный эпитоп, и/или с клетками, содержащими углеводный эпитоп после ферментативной или химической обработки, разрушающей углеводный эпитоп;
е. теста 5 на гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа, включающего
i. инкубацию соответствующего количества клеток, содержащих углеводный эпитоп, меченных соответствующим количеством маркера, с соответствующим количеством антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, и с соответствующим количеством комплемента;
ii. измерение лизиса клеток путем определения высвобождения указанного маркера после инкубации по (i), при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем клеток, не содержащих углеводный эпитоп, и/или наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем лизис без комплемента и/или чем лизис без антител, и/или чем лизис с антителом или антителами, которые не связываются или которые меньше связываются с клетками, содержащими углеводный эпитоп;
f) теста 6 на гуморальный иммунный ответ против углеводного эпитопа, включающего
i) инкубацию соответствующего количества клеток, содержащих углеводный эпитоп, и/или клеток, не содержащих углеводный эпитоп, меченных соответствующим количеством маркера, с соответствующим количеством антитела, антител в сыворотке или антител, извлеченных из сыворотки, плазмы или фекалий, и с соответствующим количеством как минимум одной иммунной эффекторной клетки или смеси клеток, содержащей иммунные эффекторные клетки или мононуклеары периферической крови, и
ii) измерение лизиса клеток путем определения высвобождения маркера после инкубации по (i), при этом при положительном гуморальном иммунном ответе против углеводного эпитопа наблюдают значительно более сильный лизис клеток, содержащих углеводный эпитоп, чем клеток, отрицательных по углеводному эпитопу, чем лизис без антител, и/или чем лизис с антителом или антителами, которые не связываются или которые меньше связываются с клетками, содержащими углеводный эпитоп.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где
(i) углеводный эпитоп выбирают из группы, включающей TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, GD3L, фукозил GM1, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген СА 19-9, антиген СА 72-4 и антиген СА-50, и
(ii) связывающую углевод молекулу выбирают из группы, включающей лектины, селектины, и/или антитела и/или молекулы, производные от них, которые связывают TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, GD3L, фукозил GM1, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген СА 19-9, антиген СА 72-4 или антиген СА-50, либо углеводную структуру, включающую любой из данных углеводных эпитопов или его части.
11. Тест на клеточный иммунный ответ, включающий
a) нагружение как минимум одной дендритной клетки первым положительным по углеводу соединением, где указанное положительное по углеводу соединение несет интересующий углеводный эпитоп;
b) создание контакта между соответствующим количеством указанной как минимум одной дендритной клетки, нагруженной указанным положительным по углеводу соединением, и соответствующим количеством иммунных клеток, которые могут активироваться или ингибироваться дендритной клеткой;
c) культивирование для осуществления взаимодействия указанных иммунных клеток с указанными нагруженными дендритными клетками;
d) добавление соответствующего количества антигенпрезентирующих клеток (АРС), нагруженных соответствующим количеством как минимум одного второго соединения, несущего тот же углеводный эпитоп, что и указанное первое соединение, где указанное второе соединение отличается от указанного первого положительного по углеводу соединения;
e) культивирование для повторной стимуляции указанных иммунных клеток;
f) определение того, произошла ли повторная стимуляция иммунных клеток.
12. Тест на клеточный иммунный ответ по п.11, где как минимум часть АРС, нагруженных соответствующим количеством указанного второго соединения, находится в контакте с иммунными клетками в присутствии связывающей углевод молекулы, узнающей указанный интересующий углевод.
13. Тест на клеточный иммунный ответ по п.11 или 12, где повторную стимуляцию устанавливают, определяя
продукты секреции иммунных клеток, которые секретируются, если указанные иммунные клетки являются стимулированными или повторно стимулированными, такие как интерферон альфа, интерферон гамма или GM-CSF, и/или
пролиферацию иммунных клеток.
14. Способ получения функциональной дендритной клетки против интересующего углеводного эпитопа, включающий создание контакта между соответствующим количеством дендритной клетки или смеси дендритных клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну дендритную клетку, и соответствующим количеством положительного по углеводу микроорганизма или его фракции или лизата по любому из пунктов, сформулированных в данном документе, и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, в течение соответствующего времени при соответствующих условиях для получения как минимум одной функциональной дендритной клетки против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.
15. Способ по п.14, где указанная дендритная клетка является человеческой.
16. Способ по п.14 или 15, где указанный углеводный эпитоп не является биполярным углеводным эпитопом.
17. Способ получения активированной Т-клетки, Т-клеток, Т-клеточного клона или Т-клеточной линии против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, включающий
(a) создание контакта между соответствующим количеством как минимум одной функциональной дендритной клетки по любому из пп.14-16 и соответствующим количеством как минимум одной Т-клетки или смеси Т-клеток, или смеси клеток, содержащей как минимум одну Т-клетку, культивирование указанной Т-клетки или смеси Т-клеток вместе с указанными нагруженными функциональными дендритными клетками для активации или примирования Т-клетки или Т-клеток против указанного углеводного эпитопа, и
(b) повторную стимуляцию указанных Т-клеток соответствующим количеством антигенпрезентирующих клеток (АРС), предпочтительно как минимум одной функциональной дендритной клеткой, нагруженной клеткой человека или животного, либо молекулой, несущей указанный углеводный эпитоп.
18. Функциональная дендритная клетка, активированная Т-клетка, Т-клетки, Т-клеточный клон или Т-клеточная линия, полученные способом по любому из предшествующих пунктов, где активированная Т-клетка, Т-клетки, Т-клеточный клон или Т-клеточная линия направлены против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.
19. Положительный по углеводу микроорганизм, либо его фракция или лизат, содержащие интересующий углеводный эпитоп, который узнается как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей указанный интересующий углеводный эпитоп, при этом указанный микроорганизм, указанная фракция или указанный лизат индуцируют эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.
20. Положительный по углеводу микроорганизм, получаемый способом по любому из пп.1-10.
21. Препарат, выбираемый из группы, включающей нутрицевтики и фармацевтические композиции, содержащий как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, как определено в п.19 или 20.
22. Препарат по п.21, где
(a) указанный эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ включает активацию CD4-положительных Т-клеток Th1-типа и/или активацию CD8-положительных цитотоксических Т-клеток, направленных против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, и
(b) углеводный эпитоп выбирают из группы, включающей TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, GD3L, фукозил GM1, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген СА 19-9, антиген СА 72-4 и/или антиген СА-50, и
(c) связывающую углевод молекулу выбирают из группы, включающей лектины, селектины, и/или антитела и/или молекулы, производные от них, которые связывают TF, Core-1, Tn, сиалил-Tn, сиалил-TF, Globo-H, Lewis-Y, сиалил-Lewis-A, сиалил-Lewis-X, полисиаловую кислоту, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-ацетил GD3, GD3L, фукозил GM1, фукозил GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, сиалилированную цепь типа 1, антиген СА 19-9, антиген СА 72-4 или антиген СА-50, либо углеводную структуру, включающую любой из данных углеводных эпитопов или его части.
23. Препарат по п.21 или 22, где указанный эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ включает активацию CD4-положительных Т-клеток Th1-типа и активацию CD8-положительных цитотоксических Т-клеток, направленных против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.
24. Способ иммунизации или вакцинации человека или животного против углеводного эпитопа, присутствующего на молекуле из клетки человека или животного, включающий
(i) введение человеку или животному эффективного количества функциональной дендритной клетки, активированной Т-клетки, Т-клеточного клона или Т-клеточной линии, либо смеси клеток по любому из предшествующих пунктов, направленных против интересующего углеводного эпитопа, и индукцию иммунного ответа против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, указанной клеткой у человека или животного (примирование), и
ii) активацию иммунного ответа путем введения эффективного количества препарата, содержащего как минимум один положительный по углеводу микроорганизм, узнаваемый как минимум одной связывающей углевод молекулой, специфически узнающей углеводный эпитоп, присутствующий на молекуле из клетки человека или животного, либо его фракцию или лизат, при этом указанный микроорганизм, указанная фракция или указанный лизат, либо указанный содержащий их препарат индуцируют эффективный специфичный к углеводу клеточный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп.
25. Способ индукции или усиления эффективного специфичного к углеводу клеточного иммунного ответа и/или специфичного гуморального иммунного ответа против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека, включающий введение человеку или животному эффективного количества препарата по любому из предшествующих пунктов.
26. Способ профилактики и/или лечения положительной по углеводному эпитопу опухоли и/или болезни, включающий введение человеку или животному соответствующего количества препарата, положительного по углеводу микроорганизма, либо его лизата или фракции, функциональной дендритной клетки или активированной Т-клетки, Т-клеточной линии или Т-клеточного клона против углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, по любому из предшествующих пунктов.
27. Применение положительного по углеводу микроорганизма, выделенного или идентифицированного способом по любому из предшествующих пунктов, либо его фракции или лизата, для производства лекарственного средства или нутрицевтика для профилактики и/или терапии заболевания, ассоциированного с указанным углеводным эпитопом, при этом указанный микроорганизм и/или его фракция и/или лизат индуцирует эффективный специфичный к углеводу клеточный и/или гуморальный иммунный ответ против указанного углеводного эпитопа и/или углеводной структуры, углеводного конъюгата или клетки млекопитающего, содержащей указанный углеводный эпитоп, как минимум у одного животного или человека.