Трансплантация нейронов, полученных из репрограммированных фибробластов

тттт

I  I

ш

Новости клеточных технологий

НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИИ

КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

Трансплантация нейронов, полученных из репрограммированных фибробластов

В связи с тем, что стационарные клеточные популяции (нейроны, кардиомиоциты) не имеют камбиальных резервов для осуществления процессов репаративной регенерации, исследуется возможность лечения пациентов с патологией ЦНС или миокарда посредством клеточной терапии [1 -4]. При этом основная проблема заключается в получении иммуно-совместимых клеток, способных к дифференцировке в соответствующих направлениях. Перспективным решением является использование репрограммированных аутогенных клеток, сходных с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) [5, 6].

В общем виде одной из методик репрограммирования является трансдукция вирусных транскрипционных факторов в геном клетки-реципиента, активация их и последующая селекция клеток, экспрессирующих основные гены ЭСК, ответственные за самообновление и плюрипотентность - Nanog и Oct4. В методике для индукции репрограммирования одними из первых были предложены и используются многими исследователями четыре фактора: Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 [5, 7]. Однако некоторые авторы применяют ретровирусные векторы с иным набором генов, в частности, заменяя опасный в онкогенном отношении c-Myc [8] на Nanog [9].

Во многих работах, касающихся репрограммирования, авторы в качестве обоснования сходства ЭСК и полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced pluripotent stem cells, iPS cells) применяют методики, позволяющие дифференцироваться клеткам исследуемой культуры в кардиомиоциты и нейроны [6, 9]. Логическим продолжением этого этапа исследования являлось бы применение методик индукции дифференцировки клеток по данным направлениям в интересах лечения животных с моделированными заболеваниями сердца или ЦНС.

Указанное направление нашло отражение в материалах исследования M. Wernig с соавт., опубликованными в журнале PNAS в 2008 году. Первый этап исследования заключался в репрограммировании мышиных эмбриональных фибробластов посредством реактивации трансдуци-рованных ретровирусных векторов, содержащих Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4. Культура iPS клеток характеризовалась способностью формировать шаровидные эмбриоидные тела, а при культивировании в среде без сыворотки с добавлением FGF2 клетки по морфологии соответствовали предшественникам нейронов и экспрессировали транскрипционные факторы, характерные для нейральных стволовых клеток - нестин, Sox2 и Brn2. Через неделю культивирования без FGF2, в культуре определялись рШ-тубулин-позитивные нейроны, GFAP-положительные астроциты и 04-позитивные олигодендроциты. С течением времени инкубирования в культуре определялась все более выраженная иммуногистохи-

мическая реакция на тирозингидроксилазу (tyrosine hydroxylase, TH), участвующую в биосинтезе катехоламинов, и везикулярный транспортер моноаминов (vesicular monoamine transporter 2, VMAT2), ответственный за их перемещение в синаптические пузырьки.

Исследователи трансфецировали клетки-предшественницы нейронов лентивирусными векторами с GFP (green fluorescent protein), чтобы оценить миграцию клеток в ЦНС после внутриутробного введении культуры в боковые желудочки головного мозга 13-14-дневных мышиных эмбрионов. Спустя 1-9 нед. меченые клетки были обнаружены в виде интравентрикулярных кластеров, а также субэпенди-мально. Наибольшее количество GFP-позитивных клеток определялось в прозрачной перегородке, полосатом теле, гипоталамусе и среднем мозге, меньшее - в обонятельных луковицах, коре и таламусе. Исследуемая популяция экспрессировала, как и в опыте in vitro, основные маркеры нейронов (piII-тубулин, NeuN) и глиальных клеток (GFAP). Привитые предшественницы нервных клеток давали начало различным подтипам нейронов: глутаматэргическим, ТН-положитель-ным катехоламинэргическим.

Иммунофлюоресцентный анализ меченых клеток выявил их типичное нейрональное строение, а посредством конфокальной микроскопии авторы показали наличие многочисленных дендритных шипиков на нейролемме исследуемых клеток, а также непосредственный контакт с ними синапто-физин-позитивных GFP-отрицательных клеток реципиента. Электрофизиологическое исследование субвитальных срезов мозга, полученных от животных, перенесших трансплантацию, выявило проведение потенциалов действия между нативными и трансплантированными нейронами. Потенциал покоя дериватов введенных клеток находился в интервале от -55 мВ до -63 мВ, а потенциал действия достигал 70-82 мВ, что несколько выше нормальных значений. Полученные данные свидетельствуют о морфо-функциональной интеграции трансплантированных клеток и нейронов реципиента.

Исследователи экстраполировали успешные результаты начального этапа работы в доклиническое исследование на мышах с дегенеративно-дистрофическим заболеванием ЦНС - болезнью Паркинсона. С целью устранения патологии взрослым животным с указанным заболеванием, смоделированным введением 6-гидроксидофамина в полосатое тело, трансплантировали культуру дифференцированных нервных клеток численностью 1-3х105 в среднего мозга. После 4 нед. эксперимента было показано, что ТН-позитив-ные клетки в группе опыта выявляются во всем объеме среднего мозга, а в контроле - животные с болезнью Паркинсона без трансплантационных мероприятий - положительная реакция на ТН наблюдалась лишь в части черной субстанции и

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008

И I II II

ш

Новости клеточных технологий

в дорсальном отделе полосатого тела. Кроме того, введенные нейроны экспрессировали также Еп1, УМАТ2 и транспортер дофамина.

При стимуляции амфетамином движения мышей контрольной группы характеризовались вращением и уклоном в сторону, соответствующую стороне среднего мозга, в которой была нарушена функция дофаминовых нейронов посредством инъекции 6-гидроксидофамина. У большинства животных, перенесших трансплантацию iPS-полученных нейронов, наблюдалось восстановление нормального характера движений.

Исследователи показали экспрессию Ю-67 - маркера пролиферации - в области введения клеток, связывая этот факт с пролиферационной активностью трансплантированной культуры, а также выявили «тератомы», источником которых, по мнению авторов, являлись немногочисленные недифференцированные 55ЕА1-положительные клетки, содержащиеся в культуре трансплантируемых нейронов.

Наиболее вероятно, что присутствие недифференцированных клеток было связано с недостаточной индукцией диф-ференцировки части iPS клеток по линии нейронов. С целью предупреждения формирования опухолей, исследователи в последующем проводили селекцию SSEA1-позитивных элементов из высокоспециализированной культуры с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортинга, что предотвращало образование «тератом».

Таким образом, исследователи продемонстрировали возможность применения высокоспециализированных аутогенных клеток, полученных с использованием явления репрограммирования, в целях устранения дегенеративнодистрофической патологии ЦНС. В целом, этот подход является перспективным путем решения проблемы поиска клеточного материала, предназначенного для трансплантации, при условии воспроизводимости экспериментальных результатов.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Freed C.R., Greene P.E., Breeze R.E. et al. Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease. N. Engl. J. Med. 2001; 344: 710-19.

2. Lim J., Byeon Y., Ryu H. Transplantation of canine umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced spinal cord injured dogs. J. Vet. Sci. 2007; 8(3): 275-82.

3. Jawad H., Ali N.N., Lyon A.R. et al. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2007; 1(5): 327-42.

4. Wernig M., Zhao J., Pruszak J. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. PNAS 2008; 105(15): 5856-61.

5. Wernig M., Meissner A., Foreman R. et. al. In vitro reprogramming of

fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007; 448(7151): 260-2.

6. Takahashi K., Yamanaka S., Tanabe K. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 2007; 131 (5): 861-72.

7. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663-76.

8. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448(7151): 313-7.

9. Yu J., Vodyanik M.A., Thomson J.A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318(5858): 1917-20.

10. Hanna J., Wernig M., Markoulaki S. et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 2007; 318: 1920-23.

Подготовил И.Я. Бозо

По материалам Wernig M., Zhao J., Pruszak J. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. PNAS 2008; 105(15): 5856-61

Обновление клеточного состава костного мозга Trp53-/-/p16Ink4a-/-/p19Arf-/- гемопоэтическими клeтками-пpeдшecтвeнницами

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - резиденты костного мозга, дающие начало гемопоэтическим мультипо-тентным клеткам-предшественницам [1]. В отличие от ГСК, мультипотентные клетки-предшественницы не обладают способностью к длительному самообновлению популяции, и после определенного числа делений их пролиферация прекращается [2]. Молекулярные механизмы, отвечающие за этот процесс, ясны не до конца [3], однако известна система из четырех генов, которая регулирует самообновление ГСК и ограничивает пролиферацию их производных. Это, прежде всего, ген Вті-1 [4, 5], необходимый для самообновления популяции ГСК. Вті-1 является негативным регулятором двух генов-репрессоров самообновления - Тгр53 и Cdkn2a, последний из которых имеет две альтернативные рамки считывания: р161пк4а, р19АГ: и, соответственно, два белковых продукта со сходными функциями [6]. Эти гены функционируют не только в ГСК и клетках гемопоэтического ряда. Например, для нейрональных клеток-предшественниц с дефицитом экспрессии Вті-1 было показано, что их активная пролиферация

и самообновление частично восстанавливаются при искусственной супрессии р161пк4а-/- и р^АгЬ7- [7].

Исследователи из группы 0.0. Ака1а и соавт. предположили, что разные нарушения экспрессии указанных генов могут быть причиной возникновения онкологических заболеваний, при которых наблюдается неограниченная пролиферация клеток-предшественниц гемопоэтического ряда и их потомков. Для проверки этого предположения были проанализированы эффекты одновременной делеции локусов Тгр53, р161пк4а и р19Аг! а также делеций каждого из ло-кусов по отдельности на способность ГСК и мультипотентных гемопоэтических клеток-предшественниц к обновлению костного мозга реципиентов, подвергшихся радиоактивному излучению в летальных дозах.

В клеточном составе костного мозга, периферической крови, печени и селезенки всех мутантов не было выявлено каких-либо отличий в сравнении с интактными животными. То есть делеции Тгр53, р161пк4а и р19Аг! не влияют на дифференцировку ГСК и не подавляют ни один из ростков

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008