АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА - БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОГУРЦА ОТ ПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ЗЕЛЕНОЙ КРАПЧАТОЙ МОЗАИКИ ОГУРЦА
ATTENUATED VIRUS STRAIN - BIOLOGICAL PREPARATION FOR CUCUMBER PLANTS PROTECTION AGAINST PATHOGENIC STRAINS OF CUCUMBER GREEN MOTTLE MOSAIC VIRUS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики, вирусологии и представляет собой новый аттенуированный штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), который можно использовать для защиты растений огурца от патогенных штаммов вируса. Защита заключается в том, что растения на ранней стадии вегетации, обрабатывают водным раствором аттенуированного штамма вируса, в результате у растений индуцируется иммунитет к патогенным штаммам ВЗКМО.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В хозяйствах защищенного грунта вирусная инфекция является причиной наиболее распространенных заболеваний. Вирусная инфекция сохраняется в семенах, в почве и на инвентаре. Следует особо отметить, что после проникновения даже одной вирусной частицы в растение-хозяин вирус способен размножаться и сохраняться в клетках в течение всей жизни растения, и уже никакие химические средства защиты не способны его в нем уничтожить.
Самый распространенный способ защиты растений от вирусной инфекции - это создание сортов, содержащих гены устойчивости, однако у растений огурца гены устойчивости к ВЗКМО отсутствуют, и поэтому создать устойчивые сорта невозможно.
Эффективным способом биологической защиты растений от вирусных инфекций является метод вакцинации - обработка растений аттенуированными (не вызывающими видимых симптомов заболевания на восприимчивых растениях) штаммами вируса для предотвращения последующего поражения патогенными штаммами этого же вируса (Nishiguchi М., Kobayashi K. Attenuated plant viruses: preventing virus diseases and understanding the molecular mechanism // Journal of General Plant Pathology 2011. V. 77 (4). P. 221-229). Аттенуированные штаммы, которые также называют вакцинными, способны вызывать устойчивость к родственным патогенным штаммам этого же вируса, используя естественный механизм защиты растений от вирусной инфекции, называемый вирус-индуцированное умолкание генов (Voinnet, О., Pinto Y.M., and Baulcombe D.С. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. V. 96. P. 14147-14152; Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses // Trends Genet. 2001. V. 17. P. 449-459).
Одно из самых распространенных вирусных заболеваний растений огурца вызывает вирус зеленой крапчатой мозаики огурца, который относится к семейству тобамовирусов. Самый большой урон вирусная инфекция наносит на начальной стадии вегетации растений. Болезнь вызывает задержку роста растений, а на листьях наблюдается мозаичное чередование светлых и более темных участков, сопровождаемое деформацией листовой пластинки. В зависимости от степени поражения потери урожая могут составить до 45%, при этом снижается товарный вид и качество плодов, на которых тоже можно наблюдать симптомы мозаики.
2
Описаны несколько аттенуированных штаммов тобамовирусов. Для защиты растений томата от вируса табачной мозаики использовали российский штамм ВТМ V-69 (Сухов К.С., Подъяпольская Т.С., Извекова Л.И. и др. Вакцинный штамм вируса табачной мозаики V-69: получение, свойства и практическое применение // Известия АН СССР. Серия биол. 1982 Т. 1. С. 113-125) и японский штамм L11A (Nishiguchi М., Kikuchi S., Kiho Y. et al. Molecular basis of plant viral virulence; the complete nucleotide sequence of an attenuated strain of tobacco mosaic virus // Nucleic Acids Res. 1985. V. 13(15). P. 5585-5590). Однако после обнаружения у томатов генов Tm-1, Tm-2, Tm-2, детерминирующие устойчивость к вирусу мозаики томатов, необходимость в вакцинации гибридов томатов с генами устойчивости отпала. Обработка ВТМ V-69 актуальна для сортов и гибридов с генами Tm-1 устойчивости, так как данный вирус способен преодолевать эти гены устойчивости. Для защиты растений перца от мягкой крапчатой мозаики перца используют аттенуированные штаммы этого вируса (Ichiki T.U., Nagaoka E.N., Hagiwara K. et al. Integration of mutations responsible for the attenuated phenotype of Pepper mild mottle virus strains results in a symptomless cross-protecting strain // Arch Virol. 2005 V. 150(10). P. 2009-2020). Недавно был описан аттенуированный штамм ВЗКМО для защиты мускусной дыни Cucumis melo var. cantalupensis от патогенных дынных штаммов вируса (Ali Е., Waliullah S., Nishiguchi М. Molecular analysis of an attenuated strain of Cucumber green mottle mosaic virus using in vitro infectious cDNA clone: pathogenicity and suppression of RNA silencing // Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 2016. V. 25 (1). P. 79-86. DOI 10.1007/s13562-015-0312-z). Для защиты растений огурца от ВЗКМО описан штамм ВИРОГ-43М (патент РФ №2320721 от 27.03.2008), установлена его нуклеотидная последовательность.
В результате селекции патогенных штаммов ВЗКМО был обнаружен новый аттенуированный штамм, названый ОГАТ. Была определена нуклеотидная геномная последовательность нового штамма ОГАТ, которая соответствует последовательности SEQ ID NO: 1, кодирующая четыре белка установленной последовательности: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, необходимые для размножения вируса внутри растения-хозяина. Новый штамм ОГАТ использовали для защиты растений огурца от патогенных штаммов вируса зеленой крапчатой мозаики огурца, в ходе производственных испытаний были получены положительные результаты, которые подтверждают защитные свойства этого штамма.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение решает задачу пополнения ассортимента аттенуированных штаммов вирусов для защиты растений от патогенных штаммов.
Эта задача была решена с помощью нового аттенуированного штамма, который был получен в результате селекции патогенных штаммов ВЗКМО. Этот штамм не вызывал видимых симптомов вирусного заболевания на чувствительных к ВЗМО растениях. Отбор зараженных бессимптомных растений осуществляли с помощью серологических тестов Identikit-Y for the detection of CGMMV, («Adgen», Великобритания), а из экстракта этих растений выделяли препарат вирусных частиц, осаждением 17% сульфатом аммония.
Новый штамм ОГАТ имеет геномную нуклеотидную последовательностью SEQ ID №1 (6422 нк). Однонитевая плюс-цепь РНК фланкирована 5'-нетранслируемой областью, за которой следуют последовательности, кодирующие 4 белка, участвующие в воспроизводстве вируса внутри клеток хозяина, за этими последовательностями расположена 3'-нетранслируемая область.
Последовательность 1-59 нк, соответствует 5'-нетранслируемой области, обозначенной как 5'-UTR.
Последовательность 60-3494 нк, при трансляции соответствует SEQ ID №2 - 129К белку репликазы. Последовательность 60-5006 нк, при трансляции соответствует SEQ ID №3 - 186К белку репликазы. 129К и 186К белки репликазы, необходимы для репликации вируса внутри растения.
Последовательность с 4993-5787 нк, при трансляции соответствует SEQ ID №4 - 29 К транспортному белку, который необходим для ближнего транспорта вируса из зараженной клетки в соседнюю клетку.
Последовательность с 5762-6247 нк, при трансляции соответствует SEQ ID №5 - 17.4K белку оболочки, который необходим для упаковки вирусного генома в вирусную частицу и дальнего транспорта вируса по всему растению.
Последовательность 6248-6422 нк, соответствует 3'-нетранслируемой области, обозначенной как (3'-UTR).
Для наработки аттенуированного штамма его сначала накапливают в растениях огурца в течение 14-18 дней после инокуляции растений этим штаммом. Затем проводят выделение и отчистку вирусных частиц аттенуированного штамма из листьев. Для проверки отсутствия патогенных вирусных форм в полученном препарате из аликвоты вирусных частиц выделяется суммарная вирусная РНК и проводится ее диагностика (выделение вирусных частиц, выделение вирусной РНК, синтез кДНК, ПЦР в реальном времени, секвенировние кДНК). Полученный препарат в концентрации 0,5 мкг/мл дозируют по 1,5 мл в 2 мл пластиковые пробирки с завинчивающей крышкой. Описание аттенуированного штамма ОГАТ приведено в примере 1.
Новый аттенуированный штамм ОГАТ был предложен для обработки растений огурца от патогенных штаммов ВЗКМО. В примере 3 приведены результаты производственных испытаний штамма в разных регионах РФ на площади минимум 1 га, проведенных в соответствии с технологией его применения (пример 2).
Полученные положительные результаты свидетельствуют о том, что новый аттенуированный штамм ОГАТ может быть использован для защиты растений огурца от патогенных штаммов ВЗКМО. Защитный эффект от применения аттенуированного штамма на производственных посадках в теплицах с закрытым грунтом заключается в снижении или задержки проявлений симптомов вирусной инфекции, в повышении урожайности за счет уменьшения выбраковки растений с симптомами, в повышении общей устойчивости растений к вирусной инфекции, и в улучшения товарных качеств плодов.
Пример 1. Аттенуированный штамм вируса ОГАТ - биологический препарат для защиты растений огурца от патогенных штаммов вируса зеленой крапчатой мозаики огурца
Состав препарата
Препарат представляет собой концентрированную суспензию вирусных частиц аттенуированного штамма ОГАТ в 17% растворе сульфата аммония с осадком от светло-зеленого до светло-коричневого цвета. Для лучшего проникновения аттенуированного штамма вируса внутрь ткани листа используется стерильный абразивный материал - карбид кремния.
Применение
Препарат аттенуированного штамма ОГАТ - биологический препарат для защиты растений огурца от патогенных штаммов ВЗКМО. Норма расхода - 7,5 мл концентрированного (0,5 мкг/мл) раствора аттенуированного штамма и 45 г стерильного карбида кремния на 1 га рассады (25000 растений).
Время действия
Проникновение аттенуированного штамма вируса в ткани листа достигается в течение нескольких часов. Наибольшая эффективность достигается через 7-10 дней после обработки, и сохраняется на протяжении минимум 2-х месяцев. Аттенуированный штамм вируса способен к системной инфекции в течение всего вегетационного периода растения.
Механизм действия
Растения обладают собственной системой защиты от вирусной инфекции, называемой вирус-индуцированным умолканием генов (ВИУГ). Механизм ВИУГ заключается в способности защитной системы растений распознавать и уничтожать вирусную РНК. Таким образом, в зараженных вирусом растениях запускается цепная реакция для уничтожения всех форм вирусной РНК. Однако у патогенных штаммов вирусов в процессе эволюции выработались системы защиты от ВИУГ - так называемые супрессоры ВИУГ, поэтому патогенные штаммы продолжают размножаться и накапливаться в большом количестве в клетках растения, вызывая симптомы болезни. У аттенуированных штаммов вирусов эти супрессоры ВИМГ в результате точечных мутаций инактивированы, и поэтому аттенуированный вирус, деградируемый ВИМГ, накапливается в незначительных количествах, и не вызывает видимых симптомов вирусного заболевания.
Важно, что при размножении аттенуированных штаммов вируса в растении накапливаются компоненты деградации вирусной РНК, которые способны связываться с гомологичной РНК близкородственного патогенного штамма, и уничтожать патогенную РНК в самом начале развития инфекции. Таким образом, аттенуированный штамм предотвращает развитие тяжелых форм вирусного заболевания.
Безопасность
Препарат аттенуированного штамма вируса не токсичен для человека и млекопитающих, птиц. Он безопасен для пчел, не уничтожает полезную микрофлору растений и почвы. Не вызывает отравлений. Обезвреживания пролитого рабочего раствора не требуется.
На фоне вирусных эпифитотий совместим с большинством пестицидов.
Упаковка и условия хранения
Полученный препарат вирусных частиц в концентрации 0,5 мкг/мл дозируют по 1,5 мл в 2 мл пластиковые пробирки с завинчивающей крышкой. Стерильный карбид кремния расфасован по 3 г в бумажные пакетики.
Препарат аттенуированного штамма вируса необходимо хранить в прохладном, защищенном от солнечных лучей месте при температуре от +2°С до +8°С в течение 1 года, после расфасовки. Карбид кремния хранить в сухом месте.
Пример 2. Технология применения биологического препарата для защиты растений огурца от патогенных штаммов вируса зеленой крапчатой мозаики огурца
Для опрыскивания рассады используются любые серийно выпускаемые электрические опрыскиватели (0,15-0,4 мПа). Рекомендуется использовать опрыскиватели с малыми объемами.
1. Необходимо соблюдать профилактические меры защиты от вирусной инфекции в теплице. Перед посадкой рассады необходимо обработать все поверхности теплицы и весь инвентарь химическими антивирусными реагентами.
2. Рассада растений огурца должна быть выращена в чистой рассадной теплице и не должна подвергаться пикировке, так как во время пикировки происходит скрытый разнос вирусной инфекции.
3. Перед обработкой растения необходимо хорошо полить.
4. Обработка рассады огурца проводится один раз в начале оборота в фазе 1-3 развернутых настоящих листьев в утренние или вечерние часы при температуре воздуха 18-22°С.
5. Рабочий раствор готовят непосредственно перед применением в стерильной емкости, согласно таблице 1. Для приготовления рабочего раствор отмеряют медицинским шприцом требуемое количество препарата на одну заправку опрыскивателя, который заполняют примерно наполовину водопроводной водой, вливают в него необходимое количество препарата и соответствующее количество абразивного вещества, и тщательно перемешивая, доливают водой до требуемого объема раствора.
6. Обработка растений огурца проводится путем опрыскивания рассады рабочим раствором с 25 см расстояния от поверхности листьев. В ходе опрыскивания необходимо периодически перемешивать емкость опрыскивателя с рабочим раствором для предотвращения осаждения абразивного материала, поэтому рекомендуется использовать опрыскиватели с малыми объемами.
7. Через 72 часа после обработки, растения можно переносить в производственные теплицы.
Пример 3. Производственные испытания аттенуированного штамма ОГАТ в разных регионах РФ
В ходе производственных испытаний, результаты которых приведены в таблице 2, с ноября 2013 по декабрь 2015 года в разных регионах РФ на разных гибридах огурца F1 в разные календарные периоды наблюдали, что при применении аттенуированного штамма вируса сдерживалось распространение патогенных форм ВЗКМО, удлинялся срок появления вирусных симптомов. Все это способствовало снижению зараженности ВЗКМО в теплице и на посадках. Стоит отметить, что во многих теплицах не происходила выбраковка растений с симптомами, поскольку растения были здоровыми, что способствовало увеличению урожайности.