Идентификация и дифференциация бактериофагов патогенных для человека вибрионов

ogy of vaginal Candida infection: significance of numbers of vaginal yeasts and their biotypes. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 1987; 25(1): 53-66.

25. Hopwood V., Crowley T., Horrocks C. T., Milne J. D., Taylor P. K., Wamock D. W. Vaginal candidosis: relation between yeast counts and symptoms and clinical signs in non-pregnant women. Genitourin Med. 1988; 64(5): 331-4.

26. Odds F. C., Webster C. E., Mayuranathan P., Simmons P. D. Candida concentrations in the vagina and their association with signs and symptoms of vaginal candidosis. J. Med. Vet. Mycol. 1988; 26(5): 277-83.

27. Mahmoudi Rad M., Zafarghandi ASh., Amel Zabihi M., Tavallaee M., Mirdamadi Y. Identification of Candida species associated with

vulvovaginal candidiasis by multiplex PCR. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 2012; 2012: 872169.

28. Trama J. P., Mordechai E., Adelson M. E. Detection and identification of Candida species associated with Candida vaginitis by real-time PCR and pyrosequencing. Mol. cell. probes. 2005; 19(2): 145-52.

29. Malezka R., Clark-Walker G. D. 1993. Yeasts have a Four-fold Variation in Ribosomal DNACopy Number. Yeast. 1993; 9(1): 53-8.

30. Fredricks D. N., Smith C., Meier A. Comparison of six DNA extraction methods for recovery of fungal DNA as assessed by quantitative PCR. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(10): 5122-8.

Поступила 11.08.14 Received 11.08.14

© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2015 УДК 579.843.1:578.81].083

Гаевская Н. Е., Кудрякова Т. А., Македонова Л. Д., Качкина Г. в.

идентификация и дифференциация бактериофагов патогенных для человека вибрионов

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 344002, г. Ростов-на-Дону, Россия

До настоящего времени остается нерешенной проблема идентификации и дифференциации большой группы бактериофагов патогенных для человека вибрионов. Для исследовательских целей и решения прикладных задач важно учитывать признаки бактериофагов, позволяющие выявить сходство и различия между ними. В настоящем исследовании изучены представители ДНК-содержащих бактериофагов патогенных вибрионов, из которых подавляющее большинство отличались сложным видом симметрии, - это фаги, имеющие двуспиральную ДНК, а также открытые у вибрионов в последние годы фаги с односпиральной структурой ДНК. Впервые разработана общая схема идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов, что повышает возможность определения видовой принадлежности фагов и сравнения с фагами, зарегистрированными в базе данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» (№ 2010620549 от 24.09.2010).

Ключевые слова: Vibrio cholerae; V. parahaemolyticus; V. mimicus; V. alginolyticus; V. metschnikovii. Gaevskaia N.E., Kudriakova T.A., Makedonova L.D., Kachkina G.V

THE IDENTIFICATION AND DIFFERENTIATION OF BACTERIOPHAGES OF HUMAN PATHOGENIC VIBRIO The Rostov-on-Don research institute anti-plague institute, 344002 Rostov-on-Don, Russia

The issue of identification and differentiation of large group of bacteriophages of human pathogenic vibrio is still unresolved. In research and practical applied purposes it is important to consider characteristics of bacteriophages for establishing similarity and differences between them. The actual study was carried out to analyze specimens of DNA-containing bacteriophages of pathogenic vibrio The overwhelming majority of them characterized by complicated type ofsymmetry - phages with double-helical DNA and also phages with mono-helical DNA structure discovered recently in vibrio. For the first time, the general framework of identification and differentiation of bacteriophages ofpathogenic vibrio was developed. This achievement increases possibility to establish species assignment ofphages and to compare with phages registered in the database "The collection of bacteriophages and test-strains of human pathogenic vibrio" (№2010620549 of24.09.210).

Keywords: V. cholerae; V. parahaemolyticus; V.mimicus; V.alginolyticus; V. metschnikovii

Бактериофаги являются постоянным спутником патогенных вибрионов. В настоящее время их широко используют для диагностики и дифференциации патогенных вибрионов.

Среди патогенных вибрионов особое место занимают Vibrio cholerae и V. parahaemolyticus. V. cholerae вызывают холеру, которая является древней болезнью, обусловившей семь пандемий, и продолжает вызывать эпидемии и крупные вспышки на различных континентах, несмотря на непрекращающиеся усилия ограничить ее распространение [9]. V. parahaemolyticus приводят к возникновению острого ки-

Для корреспонденции: Гаевская Наталья Евгеньевна, науч. сотр. Адрес: 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40 E-mail: gaevskaya.nata@mail.ru

шечного заболевания, протекающего по типу пищевой ток-сикоинфекции в виде спорадических случаев или эпидемических вспышек. Опасность заражения парагемолитическими вибрионами существует везде, где население использует для питания продукты моря. В местах, удаленных от побережья, зарегистрированы случаи заболевания, связанные с завозом инфицированных морепродуктов.

Бактериофаги патогенных вибрионов представляют собой группу вирусов, характеризующихся широким морфологическим и генетическим разнообразием, поэтому их идентификация и дифференциация является актуальной проблемой, тесно связывающей между собой такие вопросы, как строение вириона, антигенная структура и литиче-ская специфичность при взаимодействии фага с клеткой-хозяином [2, 4].

Цель работы - характеристика биологических свойств

МИКРОБИОЛОГИЯ

бактериофагов и создание схемы их идентификации и дифференциации.

Материалы и методы. Изучены 84 бактериофага: 16 рас - V. cholerae classical, 32 - V. cholerae El Tor, 8 - V cholerae серогруппы 0139, 19 - V. parahaemolyticus; для сравнения использовали фаги 4 - V. alginolyticus, 3 - V. metschnikovii, 2 - V. mimicus. В работе применяли следующие индикаторные штаммы: V. cholerae classical 145 (ctx+ tcp+), V. cholerae El Tor 75M (ctx+ tcp+), KM-199 (P-13169) (ctx- tcp+), V. cholerae серогруппы 0139 - KM-152 (P-16373) (ctx+ tcp+), V. metschnikovii - KM-185 и C-142 [5]. Для дифференциации фага V. mimicus от холерного фага ФБ использовали штамм V. cholerae серогруппы 037 1322-69 (ctx+ tcp+) [6]. Предложенные нами в качестве индикаторных штаммов V. parahaemolyticus KM-97 и KM-184 применяли для размножения бактериофагов парагемолитических вибрионов. Специфичность бактериофагов испытывали на 133 штаммах бактерий близкородственных родов и семейств (Vibrionaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae).

Обнаружение, выделение и размножение фага из лизоген-ных штаммов патогенных вибрионов проводили общепринятыми методами [1], адаптированными к работе с фагами патогенных вибрионов. Антифаговые сыворотки получали путем внутривенной иммунизации кроликов по методу Ю.

H. Марьиной [7], соответствующими фагами. Серологическую идентификацию осуществляли двумя методами: качественным и количественным [1]. Строение корпускул фагов патогенных вибрионов изучали по методике, изложенной в методических указаниях по применению прямого фаготипи-рования возбудителя холеры [8]. Диапазон литической, активности и специфичности фагов изучали путем постановки пробы с фагами (титр 106-1010 БОЕ/мл) [1]. Результат учитывали через 18 ч культивирования при 37 0С. При изучении одиночного цикла размножения использовали методику Эл-лиса и Дельбрюка [3]. Устойчивость фагов к действию концентрированных растворов мочевины, цитрата натрия исследовали по методике F. Burnet [3]. Термоустойчивость фагов определяли методом Friedman и Cowles [3]. Хлороформ добавляли к фаголизату в количестве 10% объема среды.

Все работы со штаммами V. cholerae проводили в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими правилами СП

I.3.1285-03.

Результаты и обсуждение. Изученные фаги V. cholerae classical, V. cholerae El Tor, V. cholerae, серогруппы o139, V. parahaemolyticus, V. mimicus имели негативные колонии

округлой формы, мутные или прозрачные, диаметром 0,3-2 мм. Данные одиночного цикла развития вышеперечисленных фагов свидетельствовали об отсутствии каких-либо значительных различий: продолжительность латентного периода составляла для фагов V. cholerae 60-72 мин, для V. parahaemolyticus - 60-75 мин; средний урожай на одну микробную клетку фагов V. cholerae - 7,53-17,51 корпускулы; V. parahaemolyticus - 1,55-2,61 корпускулы. Относительно действия на исследуемые фаги раствора 30% мочевины при экспозиции 18-20 ч и 3% цитрата натрия различий обнаружено не было.

Отличие филаментозных фагов от фагов с головками и отростком определяли по чувствительности к ним специально подобранных штаммов. Использование этого приема давало возможность проводить первичную оценку морфологической принадлежности фагов.

Выявлены существенные различия в структуре корпускул бактериофагов при применении метода электронной микроскопии. По классификации А. С. Тихоненко [10] у холерных бактериофагов определено 5 морфогрупп I-V: у V. parahaemolyticus 4 морфогруппы (I, III-V), у V. alginolyticus 3 мор-фогруппы (III-V). Фаги V. cholerae серогруппы 0139 имели 2 морфогруппы вирионов (I и V), V. mimicus - 1 морфогруппу (I), V. metschnikovii - 1 морфогруппу (IV) (см. таблицу).

Для изучения антигенных свойств холерных фагов использовали сыворотки I-XII серотипов. Установили, что сыворотки к фагам XII серотипа нейтрализовали исследуемые фаги I морфогруппы, в то же время фаги V морфогруппы относились ко II серотипу, III морфогруппы - к XI сероти-пу. Сыворотки к холерным фагам XII серотипа нейтрализовали фаги V. mimicus. Бактериофаги V. parahaemolyticus, V alginolyticus, V. metschnikovii не имели перекрестных реакций с антисыворотками к фагам V. cholerae и V. mimicus. У фагов V. metschnikovii и V. mimicus определено по 1 серотипу, у V. parahaemolyticus - 11, у V. alginolyticus - 4.

Другой критерий, которым мы руководствовались при идентификации отдельных фагов, - спектр литического действия. Специфичность фагов в отношении хозяина подтверждена на большом наборе представителей близкородственных микроорганизмов семейств Vibnonaceae, Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, которые не лизировали испытуемые фаги.

Диапазон литической активности фагов Эль-Тор составлял от 57,8 до 76,8% штаммов V. cholerae, парагемолитиче-ских фагов - 0,8-82% штаммов V. pamhaemolyticus и 52,5% V. alginolyticus. Фаги V. metschnikovii лизировали единичные

Идентификация и дифференциация бактериофагов патогенных бактерий

Вид бактериофага Идентификация Дифференциация

индикаторные штаммы

V. cholerae El Tor 75M V. chole-rae El Tor KM-199 V cholerae 0139 KM-152 V. cholerae classical 145 V. chole-rae 037 1322-69 V. parahaemolyticus V. metschnikovii KM-185 морфо-группа серотип чувствительность групп фагов

KM-184 KM-97 к хлороформу к 70 0C

V. cho- + + + + - - - - I XII + _

lerae 01 II-V I-XI

+ + - + - - - - - +

V. cho- + + + + - - - - I XII + _

lerae V II

0139 + + - + - - - - - +

V. paraha- - - - - - + - - I I + -

emolyticus - - - - - + + - III-V III-XI - +

V. algino- - - - - - + + - III-V IV, VI, - +

lyticus VIII, XI

V. metsch- - - - - - - - + IV I - +

nikovii

V. mimi- - + - - + - - - I XII + -

cus

Примечание. + - наличие признака, — отсутствие признака.

штаммы своего вида. Репродукций фага V. mimicus обнаруживали при использовании штамма V. cholerae El Tor KM-199 (Р-13169). Свойство фага другого вида вибрионов V. metschnikovii лизировать индикаторный штамм было утрачено после его размножения на новом свежевыделенном штамме V. metschnikovii и сопровождалась появлением вирулентного мутанта фага с измененным спектром. Нами получены доказательства изменчивости свойств фагов, связанных с направляющим действием штаммов-хозяев.

Выбор таксономических критериев в результате сравнительного анализа свойств различных по происхождению фагов позволил решить вопрос о возможности их внутривидовой дифференциации (см. таблицу). Материалы исследования показали, что бактериофаги патогенных вибрионов представляют собой неоднородную по свойствам группу.

Многолетние наблюдения за серологическими свойствами исследованных бактериофагов патогенных вибрионов подтвердили стабильность их антигенной структуры - наиболее важного признака при типизации. Установлен факт сходства антигенного строения фагов, выделенных из штаммов холерных вибрионов серогрупп O1 и O139 (фаги II серотипа), а также фагов V. mimicus с холерными фагами XII серотипа.

В процессе исследования литической активности фагов подобраны индикаторные штаммы к определенным мор-фотипам фагов. На этой основе реализован способ дифференциации холерных фагов I и V морфогрупп (штаммы V. cholerae El Tor KM-199 и V. cholerae O139 KM-152), фагов V. parahaemolyticus I, III-V морфогрупп (штаммы KM-184 и KM-97). Как правило, различия между фагами I и III-V морфогрупп подтверждались и другими тестами.

Из дополнительных методов дифференциации фагов I морфогруппы холерных и парагемолитических вибрионов от остальных (III-V) применяли метод воздействия на них инактивирующих агентов - хлороформа и повышенной температуры (65-70oC). Фаги V. cholerae El Tor V морфогруппы и V. parahaemolyticus III-V морфогрупп инактивировались при 65-70oC в течение 30 мин, в то время как фаги I морфогруппы теряли активность при 75-80oC. К действию хлороформа фаги V. cholerae El Tor V морфогруппы и V. parahaemolyticus III-V морфогрупп устойчивы, а фаги I морфогруппы инак-тивируются под его воздействием, что использовалось нами для их дифференциации [4].

Благодаря обнаруженному свойству фагов V. mimicus лизировать штамм V. cholerae серогруппы O37, проводили их дифференциацию от холерных фагов и определение их присутствия при мониторинге объектов окружающей среды на наличие холерных вибрионов и их фагов [6].

При идентификации и дифференциации бактериофагов патогенных вибрионов целесообразно учитывать следующие признаки их сходства и различия:

• специфичность литического действия, подтверждаемая на соответствующих видах микроорганизмов, применение тест-штаммов вибрионов;

• характерную морфологию бактериофагов в электронном микроскопе - определение морфогруппы;

• отсутствие антигенного родства с бактериофагами других видов;

• устойчивость либо чувствительность к хлороформу и повышенной температуре.

В результате обобщения и анализа полученных данных о биологических свойствах ранее изученных и свежевыделен-ных бактериофагов патогенных вибрионов нами предложена общая схема идентификации и дифференциации бактериофагов (см. таблицу).

Представленные приемы позволяют характеризовать све-жевыделенные фаги и обеспечат пополнение новыми бактериальными вирусами базы данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» (свидетельство о регистрации в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам базы данных № 2010620549 от 24.09.2010).

Знание биологических особенностей фагов патогенных вибрионов имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение, так как способствует созданию диагностических, лечебных и профилактических препаратов, изучению вопросов генетики возбудителей холеры и пищевых токсикоинфекций.

ЛИТЕРАТУРА

1. Адамс М. Бактериофаги. М.; 1961

2. Гаевская H. E., Кудрякова Т. А., Македонова Jl. Д., Качкина Г. В., Алиева А. А. Выявление и первичная идентификация пара-гемолитических фагов по морфологическому признаку: «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Материалы проблемной комиссии. Ростов н/Д; 2005; 18: 104-7.

3. Кудрякова Т. А. Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и ее практическое значение: Дис. ... Ростов-на-Дону; 1996.

4. Кудрякова Т. А. и др. Способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от фи-ламентозных бактериофагов I морфогруппы. Патент РФ; № 2290445; 2006.

5. Кудрякова Т. А. и др. Штамм бактерий Vibrio metschnikovii, используемый в качестве индикаторной культуры для выявления специфического фага. Патент РФ; № 2332453; 2008.

6. Кудрякова Т. А. и др. Способ выделения и дифференциации фага Vibrio mimicus. Патент РФ; № 2375437; 2009.

7. Марьина Ю. Н. Получение антифаговой сыворотки и изучение антигенной структуры фага. Труды Ростовского противочумного института. 1941; 2: 3-7.

8. Дрожевкина М. С., Арутюнов Ю. И. Методические указания по применению прямого фаготипирования возбудителя холеры Эль Тор. Москва; 1983.

9. Москвитина Э. А., Титова С. В., Адаменко О. Л., Кругликов В. Д. Перспективы дальнейшего совершенствования эпидемиологического надзора за холерой на территории Российской Федерации: «Холера и патогенные для человека вибрионы»: Материалы проблемной комиссии. Ростов н/Д; 2014; 27: 14-8.

10. Тихоненко А. С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.; 1968.

REFERENCES

1. Adams M. Bacteriophages. М.; 1961.

2. Gaevskaya N. E., Kudryakova T. A., Makedonova L. D., Kachkina G. V., Alieva A. A. Detection and identification of the primary para-gemoliticheskih phages are morphologically: "Cholera and human pathogenic vibrio". Materialy problemnoi komissii. Rostov n/D; 2005; 18: 104-7.

3. Kudryakova T. A. Lysogenesis Vibrio cholerae and paragemolit-icheskih and its practical significance: Author, dis. ... Dr. med. Sciences. Rostov-na-Donu; 1996.

4. Kudryakova T. A. et al. The method of differentiation of bacteriophages Vibrio parahaemolyticus III, IV, V morfogrupp of filamentous bacteriophage I morfogruppy. Patent RF; № 2290445; 2006.

5. Kudryakova T. A. et al. Bacterial strain Vibrio metschnikovii, used as indicator for the detection of specific culture phage. Patent RF; № 2332453; 2008.

6. Kudryakova T. A. et al. A method for isolating and differentiating phage Vibrio mimicus. Patent RF; № 2375437; 2009.

7. Mar'ina Yu. N. Getting antiphage serum and study of the antigenic structure of the phage: Proc. Rostov, protivochum. Inst; 1941; 2: 3-7.

8. Drozhevkina M. S., Arutyunov Yu. I. Guidelines on the application of direct phage-typing cholera El Tor. Moscow; 1983.

9. Moskvitina E. A., Titova S. V., Adamenko O. L., Kruglikov V. D. Prospects for further improvement of the epidemiological surveillance of cholera in the Russian Federation: "Cholera and human pathogenic vibrio": Materialy problemnoi komissii. Rostov n/D; 2014; 27: 14-8.

10. Tikhonenko A. S. Ultrastructure of bacterial viruses. Moscow; 1968.

Поступила 01.09.14 Received 01.09.14