СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МЕТАСТАЗОВ В РЕГИОНАРНЫЕ ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗЛЫ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ HER2/NEU
METHOD FOR DETECTING METASTASIS TO REGIONAL LYMPH NODES IN BREAST CANCER PATIENTS WITH HER2/NEU HYPEREXPRESSION

Изобретение относится к области медицины, онкологии, конкретно к способам выявления метастазов в регионарные лимфатические узлы у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu.
Одной из наиболее изученных молекулярных мишеней является рецептор эпидермального роста 2 типа (HER2/neu), экспрессия которого выявляется на поверхности опухолевых клеток при раке легкого, яичников, желудка, простаты и пр. [Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., et al. Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes. Science. 1987; 235: 177-182]. При этом наиболее часто высокая его экспрессия обнаруживается у больных раком молочной железы (РМЖ), частота встречаемости при котором составляет до 20% и ассоциируется как правило с неблагоприятным прогнозом и агрессивным течением заболевания.
На данный момент методами выявления экспрессии HER2/neu в опухолевой ткани больных РМЖ согласно рекомендациям ASCO/CAP от 2018 года являются иммуногистохимическое исследование (ИГХ) и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Однако они имеют ряд существенных недостатков, к которым относятся невозможность одномоментного определения распространенности опухолевого процесса и определения молекулярных характеристик выявленных очагов без выполнения дополнительных инвазивных вмешательств. В настоящее время все чаще говорится о несоответствии статуса рецептора эпидермального роста HER2/neu между первичной опухолью и метастатическим аксиллярными лимфатическими узлами, при этом выполнение «пистолетной» биопсии лимфатического узла не является рутинной процедурой на этапе диагностики онкологических больных [Schrijver W.A.M. Receptor Conversion in Distant Breast Cancer Metastases: A Systematic Review and Meta-analysis / W.A.M. Schrijver, K.P. Suijkerbuijk, C.H. van Gils [et al.] // JNCI J. Natl. Cancer Inst. - 2018. - Vol.110, No 6. - P. 568-580.] Все это диктует необходимость поиска дополнительных диагностических методик для определения статуса рецептора эпидермального фактора роста 2 типа.
В настоящее время для диагностики злокачественных образований все большее распространение получают таргетные радионуклидные методы, обладающие высокой специфичностью к различным молекулярным мишеням, расположенным на поверхности мембран опухолевых клеток и позволяющим визуализировать очаги различных размеров (основной опухолевый узел и метастатические очаги) [Чернов В.И., Медведева А.А., Синилкин И.Г., и соавторы. Ядерная медицина в диагностике и адресной терапии злокачественных новообразований. Бюллетень сибирской медицины. 2018; 17(1):220-231]. В настоящее время для этих целей в качестве «нацеливающего» модуля изучается новый класс таргетных молекул, получивший название «альтернативные каркасные белки» или «скаффолды», обладающие оптимальными характеристиками для переноса различных радиоизотопов к целевым мишеням [Pluckthun A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins): binding proteins for research, diagnostics, and therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2015; 55: 489-511].
Одними из представителей рекомбинантных адресных молекул являются дарпины (DARPin, Design Ankyrin Repeat Protein), которые являются повторами белка анкирина, состоящего из повторяющихся доменов длиной 33 а.о. и обладающего стабильной структурой из β-поворота и двух  Обычно белки представлены 4-6 модулями с суммарной молекулярной массой от 14 до 21 кДа (молекулярная масса каждого 3,5 кДа) [Hanenberg М., McAfoose J., Kulic L. Amyloid-β peptide-specific DARPins as a novel class of potential therapeutics for Alzheimer disease. J Biol Chem. 2014; 26: 27080-27089]. Основными преимуществами данных молекул являются небольшой размер, стабильная структура, высокая специфичность и аффинность к антигену, а также значительно более низкая стоимость производства, обусловленная их экспрессией в бактериальных средах [Kramer L., Renko М., Završnik J., et al. Non-invasive in vivo imaging of tumour-associated cathepsin В by a highly selective inhibitory DARPin. Theranostics. 2017; 8: 2806-2821].
1/2
99m
Наиболее часто используемым радионуклидом для проведения диагностических исследований как на территории Российской Федерации, так и в мире, остается короткоживущий (T=6,02 ч) технеций-99 м (Тс), препараты которого изготавливаются в виде стандартных наборов реагентов (лиофилизатов) к генератору технеция-99 м [Лыков А.В. Сублимационная сушка // В кн.: Теория сушки. - М., Энергия. -1968. - С. 334 - 362].
99m
Известен способ радионуклидной диагностики рака молочной железы с гиперэкспрессией Her2/neu» Брагиной О.Д. и соавт. (Патент на изобретение 2720801 С1, 13.05.2020. Заявка №2019103792 от 11.02.2019) с использованием молекул DARPinG3, меченных технецием-99m («Tc-DARPinG3»). Область применения способа ограничена, очевидным недостатком является отсутствие информации о возможности использования данного применяемого РФП для диагностики пораженных лимфатических узлов и оценке их молекулярных характеристик.
Новый технический результат - разработка информативного и доступного способа диагностики пораженных лимфатических узлов у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu.
99m
+
99m
4-
3
2
3
Для достижения нового технического результата в способе выявления метастазов в регионарные лимфатические узлы у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu, включающем введения радиофармацевтического препарата и проведение сцинтиграфического исследования, пациенту вводят радиофармацевтический препарат на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 в дозе 3000 мкг, препарат изготавливают непосредственно перед введением: в асептических условиях: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [Тс(СО)(НO)]добавляют 1000 мкл (2-4 ГБк) элюата ТсO и инкубируют в течение 30 минут при температуре 100°С, после инкубации 400 мкл трикарбонильного технеция добавляют к 3000 мкг DARPinG3 и инкубируют при температуре 60°С в течение 60 минут, выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок Sephadex G-25 М (GE Healthcare, Швеция),радиохимические выход и чистоту определяют с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ), анализ хроматограмм проводят с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором, после очищения препарат в дозе 200-500 МБК разбавляют в 10 мл стерильного 0,9% раствора NaCl, забирают через стерилизующий фильтр и медленно внутривенно вводят пациенту, через 4 часа после введения, пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию органов грудной клетки на двухдетекторной гамма-камере и оценивают накопление препарата в проекции молочных желез и регионарных лимфатических узлов и при визуализации участков гиперфиксации - диагностируют опухолевое поражение регионарных лимфатических узлов.
99m
+
99m
4-
3
2
3
Способ осуществляют следующим образом. Радиофармацевтический препарат готовят непосредственно перед введением в асептических условиях: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [Тс(СО)(НO)] добавляют 1000 мкл (2-4 ГБк) элюата ТсO и инкубируют в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 400 мкл трикарбонильного технеция добавляют к 3000 мкг DARPinG3 и инкубируют при температуре 60°С в течение 60 минут. В дальнейшем выполняется очистка полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок Sephadex G-25 М (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяют с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводят с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 200-500 МБК разбавляют в 10 мл стерильного 0,9% раствора NaCl, забирают через стерилизующий фильтр и медленно вводят пациенту. Через 4 часа после введения пациенту выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию органов грудной клетки на двухдетекторной гамма-камере, оценивают полученные результаты и при визуализации участков гиперфиксации - диагностируют опухолевое поражение регионарных лимфатических узлов.
99m
1-4
1-3
0-1
Способ основан на анализе результатов клинических исследований, для подтверждения, эффективности которого в выявлении метастатических лимфатических узлов с гиперэкспрессией HER2/neu была изучена диагностическая эффективность «Тс-DARPinG3» в дозировке 3000 мкг. Исследование включало 10 больных раком молочной железы с (TNM) с различной экспрессией HER2/neu.
Всем пациенткам выполнялось гистологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного материала первичной опухоли с определением статуса HER2/neu по стандартным методикам, а также проводилось гистологическое и иммуногистохимическое исследование биопсийного материала пораженных лимфатических узлов. При значении HER2/neu 2+ проводился FISH анализ.
99m
+
99m
4-
3
2
3
Пациенткам внутривенно вводили радиофармацевтический препарат на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 в дозировке 3000 мкг (200-500 МБк). Радиофармацевтический препарат готовили непосредственно перед введением согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: в набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария) для приготовления трикарбонильного технеция [Тс(СО)(НO)]добавляли 1000 мкл (2-4 ГБк) элюата ТсO и инкубировали в течение 30 минут при температуре 100°С. После инкубации 400 мкл трикарбонильного технеция добавляли к 3000 мкг DARPinG3 и инкубировали при температуре 60°С в течение 60 минут [Bragina О., Chernov V., Schulga A., Konovalova Е., Garbukov Е., Vorobyeva A. et al. Phase I trial of 99mTc-(HE)3-G3, a DARPin-based probe for imaging of HER2 expression in breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 2021 - August 12, 2021, jnumed.l21.262542;DOI: https://doi.org/10.2967/jnumed.121.262542]. В дальнейшем выполнялась очистка полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPinG3 с использованием очистительных колонок Sephadex G-25 М (GE Healthcare, Швеция). Радиохимические выход и чистоту определяли с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ). Анализ хроматограмм проводили с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором. Полученный после очищения препарат в дозе 200-500 МБк разбавляли в 10 мл стерильного 0,9% раствора NaCl, забирали через стерилизующий фильтр и медленно вводили пациенту.
Через 4 часа после введения препарата пациенту выполняли однофотонную эмиссионную компьютерную томографию органов грудной клетки на двухдетекторной гамма-камере Е.САМ фирмы SIEMENS и оценивали полученные результаты. Полученные при исследовании изображения (сцинтиграммы) подвергали постпроцессинговой обработке с использованием фирменного пакета программ E.Soft (SIEMENS, Германия). Патологическими считались участки повышенной аккумуляции препарата в ткани молочной железы и регионарных лимфатических узлах. Кроме того, при постпроцессинговой обработке производился расчет индексов «опухоль/фон» и «лимфатический узел/фон», отражающий соотношение накопления препарата в опухолевой ткани и в здоровой ткани молочной железы, а также в пораженном и невовлеченном в опухолевый процесс лимфатических узлах.
Визуализация пораженных лимфатических узлов наблюдалась во всех случаях, что было сопоставимо с данными стандартных инструментальных, морфологических и иммуногистохимических исследований. Помимо этого, была выявлена четкая дифференцировка между метастатическими лимфатическими узлами и узлами без опухолевого поражения (р<0.005, Mann-Whitney U test) (фиг. 1).
Клинический пример 1
Пациентка Т., 46 лет: Ds.: Рак правой молочной железы IIА стадия (T2N1M0), метастатическое поражение аксиллярных лимфатических узлов. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ+, РП-, HER2/neu 3+.
99m
В плане обследования дополнительно выполнена однофотонная эмиссионная компьютерная томография органов грудной клетки с препаратом «Tc-DARPinG3» в дозировке 3000 мкг. На сцинтиграфической картине отчетливо визуализировались опухолевое поражение в правой молочной железе и аксиллярных лимфатических узлах (метастатическое поражение подтверждено данными гистологического исследования) (фиг. 1 Приложения).
Клинический пример 2
Пациентка Л., 37 лет: Ds.: Рак правой молочной железы IIА стадия (T2N1M0), метастатическое поражение аксиллярных лимфатических узлов. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование: Инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности. РЭ-, РП-, HER2/neu 3+.
99m
В плане обследования дополнительно выполнена однофотонная эмиссионная компьютерная томография органов грудной клетки с препаратом «Tc-DARPinG3» в дозировке 3000 мкг. На сцинтиграфической картине отчетливо визуализировались опухолевое поражение в правой молочной железе и аксиллярных лимфатических узлах (метастатическое поражение подтверждено данными гистологического исследования) (фиг. 2 Приложения).
Таким образом, предлагаемый способ диагностики метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2/neu с применением радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 в дозе 3000 мкг и проведением ОФЭКТ органов грудной клетки позволяет наиболее точно оценивать распространенность опухолевого процесса в проекции молочных желез и регионарных лимфатических узлов на метаболическом уровне, а степень аккумуляции представленного радиофармпрепарата в опухолевой ткани дает возможность получать сцинтиграфические изображения надлежащего качества. Таким образом, применение нового способа с использованием радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPinG3 в дозировке 3000 мкг позволит повысить информативность и доступность радионуклидной диагностики рака молочных желез с поражением регионарных лимфатических узлов с гиперэкспрессией HER2/neu.