Ранозаживляющий гель с липосомами и способ его получения
WOUND HEALING GEL WITH LIPOSOMES AND A METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Группа изобретений относится к области ветеринарной медицины, физиологии, биохимии и фармакологии, в частности, к способам активации процессов ранозаживления и регенерации тканей.
Известно средство для лечения гнойно-воспалительных процессов мягких тканей и слизистых оболочек, содержащее в качестве лечебных компонентов комбинацию антисептиков: 0,01% растворы мирамистина и метронидазола; в качестве основы - натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ); в качестве лечебного компонента -антисептик бензалкония хлорид; в качестве анестетика - лидокаина гидрохлорид; в качестве ускорителя трансдермального переноса действующего вещества - диметилсульфоксид; в качестве стабилизатора -глицерин (Патент 2641095). Однако данное средство представляет собой пленку, что затрудняет его использование на раневых поверхностях и слизистых оболочках половых органов, и оно не ускоряет процессы регенерации тканей.
Известен раствор для стимуляции репарации кожи «Коллагель», включающий сульфатированные гликозаминогликаны и воду, дополнительно содержащий коллагены сельскохозяйственных животных при следующем соотношении компонентов в водном растворе, г/100 мл: коллаген сельскохозяйственных животных 0,2-1,5; сульфатированные гликозаминогликаны 0,002-0,05; водорастворимые производные целлюлозы 0,05-2,5; вода - остальное до 100 мл (Заявка на изобретение №94009113).
Однако данный раствор содержит компонент неживотного происхождения - целлюлозу и не обладает антимикробным действием.
Задачей настоящей группы изобретений является разработка эффективного, дешевого, простого в изготовлении ранозаживляющего геля с противомикробным, противопаразитарным, анестезирующим и улучшающим регенерацию тканей действием для наружного применения.
Для решения задачи предлагается гель следующего состава:
Гелевая основа
1. Метронидазол (содержание к объему геля 0,5%) - антибактериальное и антипаразитарное средство широкого спектра действия, незначительно всасывающееся в кровь.
2. Лидокаин, 0,7% - местное анестезирующее средство.
4. Желатин, 0,3% -донор аминокислот для регенерации тканей.
5. Гиалуроновая кислота, 0,3% - гликозаминогликан, входящий в состав различных тканей; является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса.
6. Карбомер 940 - гелеобразующее средство, широко используется в медицине.
Липосомы
Липосомы (содержание к объему геля 0,5-1,0%) - наноконтейнеры для адресной доставки препарата для усиления регенерации в клетки тканей
1. Лецитин 400 мг - фосфолипид, образующий бислой липосом.
2. α-токоферол (витамин Е) 100 ME - антиоксидантное средство, препятствующее перекисному окислению липидов, входящих в состав липосом.
3. Оротат калия - стимулятор процессов регенерации.
Новизной изобретения является использование наноконтейнеров - липосом для адресной доставки усиливающего регенерацию тканей средства непосредственно в клетки.
Способ получения ранозаживляющего геля с липосомами.
1. Получение гелевой основы.
В 10 мл метрогила (форма метронидазола для внутривенного введения) вносят 2 мл лидокаина; 0,1 г желатина; 0,15 г гиалуроновой кислоты и 0,2 г карбомера-940; смесь перемешивают до получения гомогенного геля.
2. Получение липосом с инкапсулированным оротатом калия.
Для получения липосом используется инжекционный метод с использованием безыгольного инъектора БИ-1. Навеску 3,5 г лецитина растворяют в 50 мл этилового спирта, добавляют к раствору 4 мг α-токоферола. Навеску оротата калия 5 г растворяют в 50 мл стерильной дистиллированной воды. Инжектируют спиртовой раствор лецитина в водный раствор оротата калия 100-200 раз при помощи безыгольного инъектора БИ-1 для получения липосом с инкапсулированным оротатом калия.
В результате получали липосомы размером 4-10 мкм, содержащие оротат калия.
3. Получение геля с липосомами.
В полученную гелевую основу вносят липосомы с инкапсулированным оротатом калия, смесь перемешивают до гомогенного состояния.
Для достижения регенерирующего эффекта гель наносят на очищенную рану 1 раз в сутки.
Для изучения и оценки эффективности геля с липосомами были проведены опыты на лабораторных крысах. Для этого из 15 крыс живой массой 280-300 г были сформированы три группы: две опытные и одна контрольная. Для создания травматической модели крысам всех групп на коже спины в межлопаточной области после депиляции удаляли полнослойный кожный лоскут размерами 1,5×1,5 см. На раневой дефект крысам 1 опытной группы наносили широко применяющийся в клинике и в эксперименте препарат - мазь «Офломелид», согласно инструкции по применению. Крысам 2 опытной группы - гель с липосомами 1 раз в сутки. Крысы 3 группы служили контролем без нанесения лекарственных препаратов.
На всем протяжении эксперимента рана оставалась открытой. Для исключения зализывания раны крысы содержались в индивидуальных клетках. Нанесение препаратов осуществлялось в одно и то же время.
Все участвующие в эксперименте крысы содержались в виварии факультета ветеринарной медицины Курской государственной сельскохозяйственной академии в одинаковых зоогигиенических условиях и получали одинаковое кормление. Исследования были проведены с соблюдением этических принципов экспериментов над животными в соответствии с положением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов, и Приказа МЗ РФ от 19.06.2003 №267.
Для оценки эффективности скорости регенерации регулярно осуществляли планиметрические измерения раны, учитывали сроки завершения эпителизации. В конце опыта под хлоралгидратным наркозом (700 мг/кг внутрибрюшинно) забирался полнослойный участок кожи с рубцом для гистологического анализа.
Полученные результаты были подвергнуты математической обработке с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, ImageJ, Statistica. При стандартном анализе определяли площадь раны, среднее арифметическое, стандартное отклонение среднего арифметического, величину доверительных интервалов. Достоверность различий сравниваемых величин определялась при помощи t-критерия Стьюдента. Достоверными различия считались при р<0,05.
В результате исследования были установлены достоверные различия в эффективности и скорости ранозаживления и качестве образующегося рубца (по данным гистологического исследования образцов).
Результаты проведенных исследований показали, что лабораторные крысы хорошо переносят применение геля на основе метронидазола с липосомами. Гель не оказывал раздражающего действия, не вызывал гиперемии и отека кожных покровов и не влиял на двигательную активность подопытных животных. За период наблюдения не было выявлено ни одного случая нагноения раны и осложненного течения раневого процесса у животных. Разработанный гель легко наносился на раны, сорбировал раневые выделения, не высушивая дно раны, останавливал кровотечение.
Результаты ранозаживления у опытных и контрольной групп животных показаны на диаграмме (фиг. 1) и микрофотографиях рубцовой зоны (фиг. 2-3).
На основании полученных данных были построены диаграммы, отражающие во всех 3-х группах животных площади раны на 3-й и на 21-й дни (фиг. 1).
Анализ изменения площади ран показал, что во всех группах к концу опыта наблюдалось уменьшение площади раны. Во второй группе применение геля с липосомами достоверно уменьшало площадь раны в 3,6 раза по сравнению с контрольной группой и в 2,9 раза по сравнению с первой группой, в которой применяли «Офломелид».
В первой группе мазь «Офломелид» уменьшала площадь раны в 1,2 раза по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, применение геля с липосомами способствовало более эффективному и быстрому заживлению моделей ран по сравнению с мазью «Офломелид» и с контролем.
Различия в динамике площади раневой поверхности представлены на фигуре 1. Эффект геля с липосомами на площадь раны был заметен, начиная с 1-го дня исследования, в то время как достоверный эффект «Офломелида» наблюдался к 14-му дню.
Гистологическим исследованием выявлено, что у крыс группы 1 («Офломелид») (фиг. 2) эпителий регенерирован полностью; подлежащие коллагеновые волокна с умеренно выраженной лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией; визуализируются новообразованные вертикально расположенные сосуды.
У крыс группы 2 (гель с липосомами) эпителий (фиг. 3) регенерирован полностью; подлежащие слои дермы с незначительной лимфоидной инфильтрацией; локальных очагов нет; визуализируются новообразованные вертикально расположенные сосуды.
У крыс группы 3 (контроль) эпителий ровный как по верхнему краю, так и по нижнему (фиг. 4), роговой слой тонкий, большинство кератиноцитов вакуолизированы. Коллагеновые волокна плотно прилегают друг к другу, между ними умеренное количество фибробластов, более выражено аморфное вещество, отличается диффузно-очаговая лейкоцитарно-лимфоцитарная инфильтрация.
Таким образом, при нанесении мази «Офломелид» можно констатировать формирование более полноценного, чем в контроле, кожного регенерата. Это подтверждает правомерность использования «Офломелид» в качестве препарата сравнения.
Качество и скорость ранозаживления влияет на исход оперативных вмешательств, что важно для предотвращения осложнений, снижения расходов на лечение животных и потерь, связанных с недополучением продукции. Усилия ветеринарных специалистов в области хирургии могут быть сведены на нет из-за неполноценного ранозаживления в реабилитационный период. Гель с липосомами - наноконтейнерами для адресной доставки усиливающего регенерацию средства оротата калия непосредственно в клетки тканей - способствует сокращению сроков полного завершения эпителизации раны, предотвращает избыточное разрастание коллагеновых фибрилл на фоне стимулирования роста эластиновых волокон, придающих эластичность рубцу; росту числа фибробластов соединительной ткани и формированию аморфного вещества.