Изучение биологической активности комплексных соединений металлов с некоторыми антимикробными средствами

УДК 615.281

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТАЛЛОВ С НЕКОТОРЫМИ АНТИМИКРОБНЫМИ СРЕДСТВАМИ

© Басарева О.И., Заикин А.В., Хапчаева Д.А., Костров С.В., Букреева Е.В., Калуцкий П.В.,

Лазурина Л.П.

Кафедра биологической и химической технологии; кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Курского государственного медицинского университета

Проблема лечения гнойно-септических заболеваний далека от разрешения и в современных условиях представляет определенные трудности в связи с появлением резистентных и полирезистентных форм микроорганизмов к имеющимся антибактериальным препаратам. В последние годы повысился интерес к наиболее рациональному использованию уже известных лекарственных средств, а также к возможности их химической модификации. Поэтому целью исследования явилось изучение специфических свойств новых комплексных соединений металлов с некоторыми антимикробными препаратами in vitro и in vivo, также оценка возможности их использования в лекарственных формах для лечения экспериментальной инфицированной раны. Показано, что ряд биокомплексов обладают антимикробной и антигрибковой активностью, являются иммуномодуляторами, не оказывают раздражающего и аллергизирующего действия и относятся к классу малотоксичных веществ и могут использоваться в полимерных лекарственных средствах.

Ключевые слова: инфицированная рана, антимикробные препараты, биокомплексы.

STUDYING BIOLOGICAL ACTIVITY OF COMPLEX COMPOUNDS OF METALS WITH SOME

ANTIMICROBIAL DRUGS Basareva O.I., Zaikin A.V., Khapchayeva D.A., Kostrov S.V., Bukreyeva E.V., Kalutsky P.V., Lazurina L.P.

Biological & Chemical Technology Department; Microbiology, Virology & Immunology Department

of the Kursk State Medical University

The problem of treatment of purulent-septic diseases is far from being solved and at the moment is presenting some difficulties due to the appearance of microorganisms resistant and poly-resistant to the antibacterial drugs available. In recent years the interest to the most rational application of well-known drugs as well as to the possibility of their chemical modification has increased. Therefore, our investigation has aimed to study the specific features of new complex compounds of metals with some antimicrobial drugs in vitro and in vivo, and to estimate the possibility of their application in dosage forms for healing experimental infected wounds. A number of biocomplexes has been shown to possess antimicrobial and antifungal activity, to act as immune modulators, to lack irritating and allergic effects, to belong to the class of low toxic substances, and to be safely used in polymeric drugs.

Key words: infected wound, antimicrobial drugs, bio-complexes.

Проблема лечения гнойно-септических заболеваний далека от разрешения и в современных условиях представляет определенные трудности в связи с появлением резистентных и полирезистентных форм микроорганизмов к имеющимся антибактериальным препаратам [6].

В последние годы повысился интерес к наиболее рациональному использованию уже известных лекарственных средств, а также к возможности их химической модификации, в том числе, к созданию комплексных соединений с биометаллами, так как одним из факторов, осложняющих течение гнойной инфек-

ции, является нарушение баланса микроэлементов [1]. Нередко координационные соединения металлов с лекарственными препаратами обладают не только большей биологической активностью по сравнению с исходными лигандами, но имеют и более широкий спектр действия [2, 4].

Поэтому изучение биологической активности новых координационных соединений с металлами является актуальной задачей в связи с возможным их практическим использованием и может служить теоретической основой для целенаправленного синтеза соединений с заданными свойствами.

В предварительных исследованиях нами было показано, что ряд биокомплексов с производным нитроимидазола обладают антимикробной и антигрибковой активностью, являются иммуномодуляторами, не оказывают раздражающего и аллергизирующего действия и относятся к классу малотоксичных веществ [5].

Поэтому целью исследования явилось изучение специфических свойств новых комплексных соединений металлов с некоторыми антимикробными препаратами in vitro и in vivo, а также оценка возможности их использования в лекарственных формах для лечения экспериментальной инфицированной раны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач применен комплекс микробиологических, иммунологических, физико-химических и гистологических методов.

Исследование антимикробной активности в отношении облигатно-анаэробных микроорганизмов проводили методом двухслойной агаровой культуры. Для исследования антимикробного действия в отношении анаэробных микроорганизмов были использованы как спорообразующие, так и неспорообразующие тест-культуры микроорганизмов из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва): Clostridium perfringens 271,

Bacteroides fragilis 323, Bacteroides melaninogenicus 1011, Fusobacterium necrophorum VPJ 2523, Peptococcus magnus 336, Peptostreptococcus HC.

Антибактериальную активность лигандов, а также их комплексных соединений и лекарственных форм, приготовленных на их основе, в отношении факультативно анаэробных микроорганизмов определяли in vitro методом диффузии в агар (Государственная Фармакопея XI изд-е, 1990). В соответствии с рекомендациями ВОЗ и ГФ для оценки активности новых биокомплексов в качестве тест-культур использовали штаммы факультативно-анаэробных бактерий и грибов из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва): Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus 209-Р, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus ATCC 10702, Escherichia

coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ATCC 4636, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans NCTC 2625.

Биологическую активность биокомплексов in vivo изучали на белых мышах (весом 18-20 г) при моделировании стафилококковой инфекции. Для этого мышей внутрибрюшин-но заражали суточной агаровой культурой Staphylococcus aureus № 554, в дозе, вызывающей гибель 50% мышей в течение 7 суток (1х107 микробных тел/мл), и через сутки после заражения в течение 7 дней ежедневно внутримышечно вводили исследуемые препараты. Терапевтическую эффективность биокомплексов оценивали по выживаемости животных.

Для изучения терапевтической эффективности полимерных лекарственных средств, содержащих новые биокомплексы, на кры-сах-самцах линии Вистар моделировали инфицированную гнойную рану. Под наркозом в асептических условиях наносилась рана на предварительно выбритой спине крысы по паравертебральной линии 2*2 см, которую инфицировали 0,2 мл взвеси суточной агаровой культуры S. aureus № 592, содержащей 1х109 микробных тел/мл. На 3 сутки от момента инфицирования развивалось острое гнойное воспаление, формировался выраженный воспалительный процесс с отеком и гиперемией кожи. Начиная с 3 суток проводилось лечение раны мазями, содержащими изучаемые биокомплексы металлов. Морфологические исследования тканей раны, изучение обсемененности и показателей иммун-нореактивности производили на 3, 5, 7, 9, 14 и 21 сутки. Динамику репаративных процессов в ране оценивали с учетом наличия и характера воспалительной реакции, состояния краев и дна раны, сроков очищения раны от некротических тканей и появления грануляций, сроков эпителизации раны. Скорость заживления раны определяли в динамике заживления путем измерения площади раны [6]. Гистоструктурные изменения в раневых биоптатах изучали при исследовании препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином. Для оценки состояния антиинфекционной защиты организма определяли: фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, завершенность фагоцитоза [7], показатели активности кислородзависимых и кислороднезависимых

бактерицидных систем нейтрофилов [8, 10], уровень сывороточного лизоцима [3], бактерицидную активность сыворотки крови [10], показатели спонтанных Е-РОК [11].

Все полученные данные подвергнуты статистической обработке с определением критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Не возникает сомнения в том, что анти-биотикотерапия была и остается наиболее эффективным методов лечения инфекционновоспалительных процессов различной этиологии. Антибиотики наряду с вакцинацией больше, чем какие-либо другие достижения медицинской науки, повлияли на жизнь человечества. Вместе с тем арсенал антибактериальных средств постоянно расширяется и обновляется в связи с неуклонным ростом резистентности микрофлоры, во многом обусловленным нерациональным их применением. Возможности для открытия новых препаратов практически исчерпаны, и основные усилия, по мнению многих авторов, должны быть направлены на повышение эффективности и усовершенствование имеющихся лекарственных средств.

Особенно привлекательным в этом отношении является химическая модификация лекарственных средств с биометаллами. Применение этих комплексов может восполнить нарушение баланса микроэлементов и тем самым способствовать скорейшему выздоровлению больного. Одними из препаратов, применяемых в терапии анаэробных или смешанных анаэробно-аэробных инфекций различной локализации, являются производные 5-нитроимидазола. В основном они активны против простейших и анаэробных бактерий, но известно их антибактериальное действие и в отношении ряда факультативноанаэробных микроорганизмов. Эти данные явились предпосылками к изучению влияния некоторых металлов на антимикробную активность 5-нитроимидазола.

Проведенные исследования показали, что комплексообразование изучаемых лиганд с металлами позволяет увеличить их антимикробную активность (табл. 1). Изучаемые комплексные соединения цинка с производным

адамантана, производным нитроимидазола, производным нитрофурана в отношении всех изученных тест-микробов проявляли более высокую по сравнению с лигандами антимикробную активность, так как зона задержки роста в отношении исследованных микроорганизмов значимо увеличивалась. Это можно объяснить тем, что в составе биокомплексов биометаллы оказывают существенное синергидное действие, оказывая влияние на специфическую активность лиганда. Очень важной характеристикой антибактериальных препаратов являются их характер действия (бактерицидный или бактериоста-тический) и определение минимальной бактерицидной концентрации. Это связано с тем, что увеличение концентрации нитроимидазо-лов может сопровождаться различными побочными эффектами вследствие способности к кумуляции. Поэтому важно было, чтобы синтезированные биокомплексы по минимальной бактерицидной концентрации, как минимум, не уступали исходному лиганду. Определение минимальных подавляющих концентраций для изучаемых комплексных соединений выявило их изменение в диапазоне от 0,31 мг/мл до 5,00 мг/мл в отношении исследованных штаммов.

Поскольку далеко не всегда антимикробное действие препарата, установленное in vitro, совпадает с его активностью в живом организме, нами было проведено изучение протективной активности биокомплексов цинка в опытах на мышах при внутрибрю-шинном их заражении культурой S. aureus.

Проведенные исследования позволили установить, что при лечении комплексными соединениями цинка с производными ада-мантана выживаемость животных составила 80%. В случае использования для лечения комплексных соединений цинка с производными нитроимидазола и нитрофурана практически все животные были живы (99,6%).

Кроме того, установлено, что новые биокомплексы металлов с 5-нитроимидазолом не обладали раздражающим и аллергизирую-щим действием на кожу морских свинок в

0,1% и 0,5% концентрациях, не оказывали отрицательного воздействия на морфологическую структуру кожи и печени. Препараты не проявляли общетоксического действия на экспериментальных животных: аппетит,

Таблица 1

Антимикробная активность лигандов и их комплексных соединений с цинком в отношении

факультативно анаэробных микроорганизмов

Тест-культура Диаметр зоны задержки роста бактерий препаратами в мм

HAd HAdZn MN MNZn NFS NFSZn

S. aureus ATCC 25923 8,9±0,3 1В,7±0,4 9,2±0,2 19,5±0,4 10,7±0,3 20,5±0,3

S. aureus 209-Р 8,2±0,3 1б,5±0,3 В,2±0,2 17,2±0,3 іі,і±0,3 20,1±0,3

B. subtilis ATCC ббЗЗ 8,9±0,3 1В,4±0,4 9,В±0,2 19,0±0,4 10,2±0,2 21,0±0,4

B. cereus ATCC 10702 7,0±0,2 1б,2±0,3 б,В±0,3 1б,В±0,4 В,7±0,2 19,2±0,4

E.coli ATCC 25922 7,б±0,2 1б,4±0,3 В,2±0,3 17,2±0,3 11,3±0,3 22,5±0,4

P. aeruginosa ATCC 27853 б,4±0,2 15,В±0,2 7,0±0,2 1б,3±0,4 10,5±0,3 23,4±0,3

C. albicans NCTC 2б25 б,0±0,2 15,0±0,2 8,0±0,2 1б,0±0,2 7,7±0,2 17,2±0,2

Примечание. HAd - производное адамантана; НА^п - биокомплекс цинка с производным адамантана; различия данных по отношению к производному адамантану достоверны (р<0,05); ММ - производное нитроимидазола; МЖп -биокомплекс цинка с производным нитроимидазола; различия данных по отношению к производному нитроимидазола достоверны (р<0,05); - производное нитрофурана; ОТ^п - биокомплекс цинка с производным нитрофурана;

различия данных по отношению к производному нитрофурана достоверны (р<0,05).

Таблица 2

Иммунномодулирующие свойства биокомплексов цинка

№ гр. Условия опыта Сроки иммунизации, сут. АОК тыс./орган

1. Введение физиологического раствора и иммунизация ЭБ 5 2,91±0,34

2. Введение производного адамантана и иммунизация ЭБ 5 3,02±0,32

3. Введение биокомплекса цинка с производным адамантана и иммунизация ЭБ 5 4,25±0,411, 2

4. Введение производного нитроимидазола и иммунизация ЭБ 5 2,89±0,34

5. Введение биокомплекса цинка с производным нитроимидазола и иммунизация ЭБ 5 4,39±0,4В1, 4

б. Введение производного нитрофурана и иммунизация ЭБ 5 3,94±1,02

7. Введение биокомплекса цинка с производным нитрофурана и иммунизация ЭБ 5 5,54±0,В41, б

Примечание. 1 - достоверность различий средних относительно 1-й группы (р<0,05); 2 - достоверность различий средних относительно 2-й группы (р<0,05); 4 - достоверность различий средних относительно 4-й группы (р<0,05); 6 -достоверность различий средних относительно 6-й группы (р<0,05); 8 - достоверность различий средних относительно 8-й группы (р<0,05).

привес, реактивность, подвижность, состояние кожи и шерсти не отличались от контроля.

Одним из непременных условий эффективной терапии инфекционных процессов яв-

ляется адекватный иммунологический ответ, поэтому представляло интерес изучение воздействия новых биокомплексов на показатели антиинфекционной защиты организма экспериментальных животных.

В

Введение биокомплексов цинка с производным адамантана, нитроимидазола и нит-рофурана существенно влияло на формирование гуморального иммунного ответа, индуцированного эритроцитами барана, о чем свидетельствовало увеличение количества антителообразующих клеток в 1,5-2 раза (табл. 2).

Одним из важных факторов антиинфек-ционной защиты, определяющим дальнейшее развитие инфекционного процесса, является ее неспецифическое звено. Полученные результаты исследования влияния биокомплексов цинка на фагоцитарную активность лейкоцитов показали (табл. З), что более высокие значения активности фагоцитоза отмечены в группах животных, которым вводили биокомплексы цинка, так как у них фагоцитарный индекс значительно превышал показатели как контрольной группы, которым вводили физиологический раствор, так и групп, которым вводили лиганды.

Показатели НСТ-стимулированного теста, бактерицидной активности сыворотки крови также характеризовались статистически более высокими значениями в группах опытных животных по сравнению с группой контроля.

Учитывая антибактериальную активность биокомплексов и отсутствие раздражающего

эффекта целесообразно было провести испытания биологической активности этих соединений при экспериментальной гнойной ране. Местное применение лекарственных средств при очаговых поражениях, к которым относятся гнойные раны, является наиболее предпочтительным, поскольку позволяет создать максимальные концентрации их в ране и снизить общее отрицательное воздействие на организм больного. Эффективность местной лекарственной терапии определяется суммарным действием целого ряда факторов, среди которых важное значение имеет терапевтическая активность используемых лекарственных средств.

Достижения современной медицинской науки позволили сформулировать основные требования к лекарственным средствам для лечения гнойных ран. Основное из этих требований состоит в том, что применяемый препарат должен способствовать скорейшему заживлению гнойной раны. Однако реализовать это требование на практике оказывается далеко не просто. Успех лечения определяется тем, насколько примененный лекарственный препарат будет соответствовать биологическим процессам, протекающим в ране в этот период.

Таблица З

Влияние биокомплексов цинка на показатели антиинфекционной защиты

Исследованные показатели Физ. р-р HAd HAdZn MN MNZn NFS NFSZn

і 2 3 4 5 б 7

Фагоцитарный индекс, % 39,4±2,8 44,2±2,0 48,2±1,81,2 43,2±2,5 49,4±1,91,2 45,1±1,9 52,4±2,0иб

Фагоцитарное число 1,8±0,3 1,7±0,3 2,0±0,2 1,7±0,2 2,0±0,3 1,9±0,4 2,5±0,5

Завершенность фагоцитоза, % б1,2±2,3 б3,4±2,2 б4,7± 1,5 б5,1± 1,9 б7,3±2,2 бб,2±1,В бВ,4±2,0

НСТ -спонтанный 27,2±3,8 28,0±3,0 30,0± 1,9 2В,4±3,5 30,3±2,9 29,1±2,0 31,5±2,2

НСТ -стимулированный 55,2±3,2 5б,2±3,0 5В,4±2,2 57,4±2,9 б1,1±3,5 5В,9±2,3 б2,2±2,9иб

Функциональный резерв фагоцитов, % 28,0±2,4 29,0±2,1 31,2±2,0 29,0±2,1 30,В±1,9 30,1±1,9 31,5±1,91<5

Уровень ЛКБ 0,10±0,01 0,13±0,01 0,14±0,02 0,11±0,03 0,13±0,02 0,12±0,01 0,14±0,02

Бактерицидная активность сыворотки крови (БАС) бВ,В±5,3 б9,7±4,0 79,1±4,01,2 71,5±4,9 В1,7±4,31,4 73,4±3,0 В4,4±З,21,6

Лизоцим сыворотки крови 14,2±4,8 13,1±3,0 17,В±3,2 15,3±4,5 17,1±3,9 1б,4±З,1 1В,1±3,0

Примечание. Цифрами надстрочного индекса обозначены группы, по отношению к которым различия достоверны.

Наиболее часто для этих целей применяются антимикробные мази. При разработке мази учитывалась природа носителя, так как она имеет большое влияние на терапевтическую активность лекарственных веществ. В связи с этим выбор мазевой основы осуществлялся с учетом требований современной медицины и, особенно, такого показателя, как способность основ к высвобождению действующих веществ.

С учетом этого был разработан состав мази на гидрофильной основе для лечения гнойной инфекции, содержащий в своем составе новые биокомплексы. Введение изучаемых биокомплексов в состав мазей, как было установлено нами ранее, усиливало в 2-3 раза антимикробное действие в отношении изученных тест-штаммов.

Учитывая активность биокомплексов в отношении S. aureus и тот факт, что этот микроорганизм часто выделяется из ран, исследование эффективности применения многокомпонентных мазей для лечения раневой инфекции было произведено на модели полнослойной стафилококковой раны, создаваемой у крыс линии Вистар.

Изучение течения раневого процесса у контрольных животных с экспериментальной кожной раной показало, что к концу срока наблюдения происходит практически полное восстановление поврежденных тканей. Морфологические исследования позволили установить, что заживление кожной раны у животных этой группы происходило под струпом, где с обеих сторон подрастал эпителий.

Результаты динамических наблюдений показали, что гнойные выделения обычно сохранялись в течение 5 -10 суток. Далее рана постепенно очищалась от этих выделений, на 12-13 сутки дно раны покрывалось грануляционной тканью, а по краям начинал интенсивно нарастать эпителий. В итоге к 15 суткам рана уменьшалась в размерах, края и дно ее начинали покрываться грануляционной тканью.

Применение мази, содержащей биокомплекс цинка с производным адамантана, быстро купировало воспалительный процесс, оказывало стимулирующее влияние на процессы восстановления поврежденной ткани, что проявлялось в активизации образования демаркационной линии очага септического

воспаления, более быстрым развитием грануляционной соединительной ткани по сравнению с контролем.

Цитограмма клеток подтверждала ускорение процессов очищения раны и ее регенерации: уменьшение количества нейтрофилов в поле зрения в 1,5-2 раза, увеличение числа макрофагов и фибробластов в 2 раза.

Поскольку биокомплексы металлов с лекарственными препаратами обычно выполняют транспортную и аккумулирующую роль, а также выступают как функционирующие модели активного центра ферментных систем, то усиление активности изучаемых лиганд может быть объяснено именно присутствием цинка в комплексных соединениях, а эффективность мази - высокой антимикробной, ранозаживляющей и регенерирующей активностью и влиянием на иммунный статус организма.

Новый методический прием коррекции нарушенного металлолигандного гомеостаза организма при патологических состояниях, заключающийся в применении новых синтезированных координационных соединений металлов, позволит расширить область их применения в лечебных и лечебнопрофилактических мероприятиях, а также подтверждает необходимость разработки комплекса тонких и аналитически значимых методов.

Таким образом, на основании выполненного исследования можно сделать следующие выводы.

• Разработаны новые комплексные соединения цинка с производным адамантана, нитроимидазола и нитрофурана, обладающие более выраженным антимикробным действием в отношении тест-штаммов микроорганизмов по сравнению с исходными лигандами.

• На модели экспериментальной стафилококковой инфекции установлена высокая терапевтическая эффективность исследованных биокомплексов, заключающаяся в снижении смертности зараженных животных и отсутствии раздражающего эффекта изучаемых биокомплексов.

• Комплексообразование цинка с изучаемыми лигандами приводит к усилению стимулирующего действия на факторы неспецифической резистентности (фагоцитоз, бакте-

рицидная активность сыворотки крови) и гуморального иммунного ответа.

• Гидрофильные мази, содержащие биокомплексы цинка с лигандами, обладают выраженным ранозаживляющим действием.

ЛИТЕРАТУРА

1. Акбаров А.Б., Харитонов Ю.Я. Бионеоргани-ческая химия металлов, аминокислот и биокомплексов. - Ташкент: Фан, 1994. - 324 с.

2. Воронков М.Г., Антоник Л.М., Коган А.С. Антибактериальные и гемостатические свойства серебряных солей полиакриловой кислоты // Хим.-фарм. журн. - 2002. - Т. 36, № 2. -С.27-29.

3. Дорофейчук В.Г. Определение активности ли-зоцима нефелометрическим методом // Лаб. дело. - 1968. - № 1. - С. 28-30.

4. Исмаилова Г.М., Иминова И.М., Тулага-нов А.А. Получение комплексных соединений Мq(II) с никотиновой кислотой и никотином // Хим.-фарм. журн. - 2002. - Т. 36, № 6.- С. 42-43.

5. Краснов А.А., Московцев С.И., Самохва-лова И.В., Лазурина Л.П., Кореневский Н.А. Изучение ранозаживляющего действия многокомпонентных мазей, содержащих биоком-

плексы металлов // Сист. анализ и управл. в биомед. сист. - 2003. - Т. 2, № 3. - С. 225227.

6. Раны и раневая инфекция: Рук-во для врачей / Под. ред. М.И. Кузина, Б.М. Костюченко: 2 изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1990. - 592 с.

7. Матусис З.Е., Пылаева С.И. К методике определения индекса завершенности фагоцитоза // Лаб. дело. - 1972. - № 4. - С. 237-240.

8. Пигаревский В.Е. Лизосомально-катионный тест (Метод. рек.). - М.: НИИЭМ АМН СССР, 1979. - 57 с.

9. Смирнова О.В., Кузьмина Т.А. Определение бактерицидной активности сыворотки крови методом фотонефелометрии // Журн. микро-биол. - 1966. - № 4. - С. 8-12.

10. Теплова С.Н. Оценка факторов неспецифической защиты организма от инфекции в клинической практике (Метод. рек.). - Челябинск, 1978. - 57 с.

11. Gerne N.K., Henry C., Nordin A.A. et al. Plaque techniques for recognising individually antibody-forming cells // Methods in Immunology and Immunochemistry / Ed. C.A. Williams and M.W. Chase. - New York: Academic Press, 1976. - Vol. 5. - P. 335-370.