ПРИМЕНЕНИЕ СОЛЕЙ ВОЛЬФРАМА (VI) ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЖЕНСКОГО БЕСПЛОДИЯ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ, НЕ СТРАДАЮЩИХ ДИАБЕТОМ
APPLICATION OF TUNGSTEN (VI) SALTS FOR TREATMENT OF FEMALE INFERTILITY IN MAMMALS WITHOUT DIABETES

Изобретение относится к области репродуктивной способности. В частности, оно относится к применению солей вольфрама(VI) для лечения женского бесплодия.
Предшествующий уровень техники
Бесплодие может быть определено как неспособность к достижению беременности в течение периода 1 года регулярных незащищенных половых сношений. В частности, женское бесплодие может обозначаться как неспособность к зачатию и/или сохранению беременности до срока. Несмотря на трудности в оценке распространенности бесплодия, как правило, принято считать, что каждая четвертая женщина является бесплодной на определенном этапе репродуктивного возраста.
Главными причинами бесплодия у женщин являются расстройства овуляции, патологии репродуктивного тракта, снижение качества яйцеклетки и фолликулярное истощение, связанное со старением. Однако имеется также значительный процент женщин с необъяснимым бесплодием, также называемым идиопатическим бесплодием, одна из возможных причин которого может быть связана с нарушениями процесса имплантации.
В частности, среди многих биологических причин бесплодия у женщин могут быть выделены причины, связанные с расстройствами гормональных стимулов, регулирующих развитие фолликула, овуляцию, миграцию незрелой яйцеклетки (ооцита), а также последующее оплодотворение и имплантацию зиготы в стенку матки. Весь этот процесс регулируется секрецией гормонов особых эндокринных органов, например, таких как гипофиз, гипоталамус и щитовидная железа.
Таким образом, нарушения овуляции, такие как отсутствие овуляции, а также патологии, связанные с анатомическими и функциональными нарушениями репродуктивного тракта и матки, которые могут изменять имплантацию зиготы, можно выделить среди основных причин бесплодия.
Известны различные виды лечения женского бесплодия, включая применение медицинских продуктов для лечения бесплодия, связанного с гормональными проблемами, такими как нарушения овуляции, а также методики оплодотворения in vitro и внутриматочного осеменения.
Однако процент беременностей, достигаемых посредством вышеупомянутых видов лечения, имеет некоторые ограничения. Так, например, отмечалось, что лечение женщины с нерегулярной или отсутствующей овуляцией посредством применения кломифена цитрата, лекарства из семейства стильбенов, позволяет восстановить овуляцию с высоким процентом, но частота беременности остается низкой, почти равной или меньше 50%.
С другой стороны, методики оплодотворения in vitro являются очень эффективными на стадии оплодотворения яйцеклетки. Однако частота переноса (имплантации эмбрионов в стенку матки) является низкой. Это приводит к множественным переносам эмбрионов на каждый цикл оплодотворения in vitro, следствием которого является высокий процент многоплодных беременностей высокого риска.
Наконец известно, что метаболические нарушения, такие как диабет или ожирение, приводят к снижению плодовитости. Известно, что частичное или полное восстановление уровня сахара в крови, уровня инсулина в крови и/или массы тела у самок мышей с ожирением или диабетом с повреждением репродуктивной функции приводит к повышению плодовитости.
Было показано, что различные фармакологические средства, такие как метформин или соли вольфрама (VI), или даже изменения стиля жизни, которые способствуют улучшению при диабете или нарушениях инсулина, например таких, как недостаточность инсулина или инсулиновая резистентность, обеспечивают полное или частичное восстановление репродуктивной функции. В частном случае вольфрамата натрия, известно, что крысы со стрептозотоцин-индуцированной инсулинопенией и диабетом частично восстанавливали уровни циркулирующего инсулина после длительного лечения (10 недель) вольфраматом натрия в результате частичного купирования диабета. Затем, когда вышеупомянутых крыс-самок с частично купированным диабетом спаривали со здоровыми крысами-самцами, отмечалось, что параллельно частичному купированию диабета, у крыс-самок частично восстанавливалась их репродуктивная способность. В частности, наблюдалось, что процент рождений по отношению к числу позитивных кюретажей у крыс-самок с частично купированным диабетом после лечения вольфраматом натрия увеличился до 66%, этот процент был ниже, чем у крыс-самок без диабета, где он составил 100% (см. Ballester et al. «Tungstate administration improves the sexual and reproductive function in female rats with streptozotocin-induced diabetes», Human Reproduction, 2007, vol. 22, pp. 2128-2135 («Применение вольфрамата улучшает сексуальную и репродуктивную функцию у крыс-самок со стрептозотоцин-индуцированным диабетом»)).
В итоге, несмотря на прогресс в лечении женского бесплодия, остаются пациентки, которым не приносят пользу современные виды лечения из-за их неэффективности. Таким образом, остается потребность в новых видах терапии для лечения женского бесплодия с повышенной эффективностью.
Описание изобретения
Авторы изобретения установили, что применение терапевтически эффективного количества соли вольфрама (VI) с фармацевтически или ветеринарно-пригодной катионной группой или сольвата указанной соли можно использовать для приготовления медицинского продукта для лечения бесплодия у самок млекопитающих, не страдающих диабетом.
Хотя известно, что вольфрамат натрия может частично восстанавливать нарушенную репродуктивную функцию у крыс-самок, страдающих диабетом, поскольку он нормализует уровни глюкозы в крови, в области техники, к которой относится изобретение, не раскрывается и не предполагается, что вольфрамат натрия может сам влиять на функцию репродуктивной системы самок для лечения женского бесплодия.
Необходимо указать, что в данной области техники было продемонстрировано, что вольфрамат натрия является эффективным в нормализации уровней глюкозы. В частности, документ ЕР 1400246 раскрывает фармацевтическую композицию из соединения вольфрама (VI) для снижения уровня глюкозы в крови людей, страдающих диабетом 1 типа (ИЗСД) или диабетом 2 типа (ИНСД).
Авторы настоящего изобретения показали, что соли вольфрама (VI) являются эффективным средством восстановления овуляции и/или повышения имплантации ооцита, независимо от изменений метаболизма глюкозы или изменений массы тела, и, соответственно, применение соли вольфрама (VI) является эффективным для лечения бесплодия у самок млекопитающих, не страдающих диабетом.
Этот аспект может также быть сформулирован в виде терапевтически эффективного количества соли вольфрама (VI) с фармацевтически или ветеринарно-пригодной катионной группой или сольвата указанной соли для применения в лечении бесплодия у самок млекопитающих, не страдающих диабетом. Он также относится к способу лечения заболевания или состояния, связанного с бесплодием у самок млекопитающих, не страдающих диабетом, включающему применение терапевтически эффективного количества соли вольфрама (VI) с фармацевтически или ветеринарно-пригодной катионной группой или сольвата указанной соли по настоящему изобретению у млекопитающего, нуждающегося в указанном лечении.
Предпочтительные и частные варианты осуществления, описанные ниже, относящиеся к применению терапевтически эффективного количества соли вольфрама (VI) с фармацевтически или ветеринарно-пригодной катионной группой или сольвата указанной соли для приготовления медицинского продукта для лечения бесплодия у самок млекопитающих, не страдающих диабетом, также являются предпочтительными и частными вариантами осуществления соли вольфрама (VI) с фармацевтически или ветеринарно-пригодной катионной группой или сольвата указанной соли для применения в лечении бесплодия у самок млекопитающих, не страдающих диабетом, а также способа лечения заболевания или состояния, связанного с бесплодием у самок млекопитающих, не страдающих диабетом. Далее, настоящее изобретение охватывает все возможные комбинации предпочтительных и частных вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке.
Как применяется в настоящей заявке, выражение «фармацевтически или ветеринарно-пригодная катионная группа» означает любой нетоксичный неорганический или органический пригодный катион, способный к образованию терапевтически эффективной соли вольфрама (VI) и пригодный для применения в ветеринарии или фармацевтике.
Вольфрамат-анион всегда сопровождается катионной группой, образующей нейтральную соль вольфрамата. В одном варианте осуществления настоящего изобретения соли вольфрама (VI) являются солями, содержащими катионные группы, выбранные из щелочно-земельных или щелочных катионов. Предпочтительными являются соли с катионными группами, выбранными из этой группы, включающей натрий, калий, магний и кальций. Предпочтительно соль вольфрама (VI) является натриевой солью вольфрама (VI).
Сольваты солей вольфрама (VI) и их применение для приготовления медицинского продукта для лечения женского бесплодия у млекопитающих, не страдающих диабетом, также являются частью настоящего изобретения. В одном варианте осуществления изобретения сольватом является сольват дигидрата соли вольфрама (VI), как определено выше. Предпочтительно сольватом соли вольфрама (VI) является натрия вольфрамат дигидрат, который является коммерчески доступным.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения млекопитающее является человеком. В предпочтительном варианте осуществления соль вольфрама (VI) по настоящему изобретению пригодна для приготовления медицинского продукта для лечения женского бесплодия, связанного с изменением в гипоталамо-гипофизарной системе. Заболевания или состояния, связанные с изменением в гипоталамо-гипофизарной системе, включают, среди прочего, синдром поликистозных яичников, метаболический синдром, гиперпролактинемию, эндометриоз, нарушения пищевого поведения, ожирение, гипотиреоз, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, цирроз, глютеновую энтеропатию, хроническую почечную недостаточность и идиопатические причины.
В предпочтительном варианте осуществления соль вольфрама (VI) по настоящему изобретению пригодна для приготовления медицинского продукта для лечения идиопатического женского бесплодия. Термины «идиопатическое бесплодие», или «бесплодие без явной причины», или «необъяснимое бесплодие» имеют одно и то же значение и применяются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к тем случаям бесплодия, для которых не установлена причина неспособности к достижению беременности в стандартных тестах стерильности.
В другом предпочтительном варианте осуществления соль вольфрама (VI) по настоящему изобретению пригодна для приготовления медицинского продукта для лечения женского бесплодия, обусловленного нарушениями пищевого поведения. Нарушения пищевого поведения, связанные с изменением гипоталамо-гипофизарной системы, включают, среди прочего, нервную анорексию и булимию.
Термин «овуляция» подразумевает процесс, при котором у женщины в матку высвобождается яйцеклетка, а термин «восстановление овуляции» означает процесс, при котором менструальный цикл восстанавливается, т.е. восстанавливается процесс регулярного высвобождения яйцеклетки в матку женщины, у которой не было овуляции (ановуляция) или наблюдалась нерегулярная овуляция (олигоовуляция).
Как ясно видно из результатов, приведенных в таблице 1 в примерах, применение соли вольфрама(VI) позволяет быстро восстановить эстральный цикл (спустя всего 7 дней с начала лечения) у леченых 100% мышей-самок, не страдающих диабетом. Овуляция восстанавливалась в течение периода времени, при котором применение соли вольфрама (VI) по настоящему изобретению не изменяло ни массу тела, ни уровень глюкозы в крови леченых мышей-самок (см. таблицы 3 и 4). Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению соли вольфрама (VI), определенной выше, или ее сольвата для приготовления медицинского продукта для лечения женского бесплодия, включая восстановление овуляции.
С другой стороны, как ясно видно из результатов, приведенных в таблице 2 в примерах, применение соли вольфрама (VI) обеспечивало имплантацию в среднем 5 имплантированных эмбрионов или рождение потомства у 80% леченых мышей-самок, не страдающих диабетом, у которых восстанавливался нормальный эстральный цикл. Таким образом, один вариант осуществления изобретения относится к применению соли вольфрама(VI), определенной выше, или ее сольвата для приготовления медицинского продукта для лечения женского бесплодия, включающего повышение имплантации зиготы в стенку матки.
Один вариант осуществления изобретения относится к применению соли вольфрама (VI), определенной выше, или ее сольвата для приготовления медицинского продукта для лечения женского бесплодия, включающего восстановление овуляции и повышение имплантации зиготы в стенку матки.
Таким образом, применение соли вольфрама (VI) пригодно для лечения женского бесплодия путем повышения частоты беременности. Лечение по настоящему изобретению может быть пригодным в качестве альтернативного фармакологического лечения по отношению к уже существующим видам лечения для нормализации овуляции и/или повышения имплантации ооцита в стенку матки, или в качестве лечения, связанного с методиками внутриматочного осеменения и/или оплодотворения in vitro для повышения частоты имплантации эмбриона в фазе переноса.
Один вариант осуществления изобретения относится к применению соли вольфрама (VI) или ее сольвата, где указанная соль вольфрама является частью фармацевтической или ветеринарной композиции, дополнительно содержащей фармацевтически или ветеринарно-пригодные наполнители или носители. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая или ветеринарная композиция является композицией для перорального применения. Твердые пероральные композиции, такие как таблетки и капсулы, и жидкие пероральные композиции, такие как пероральные растворы или суспензии, являются особо предпочтительными.
Выражение «фармацевтически или ветеринарно-пригодный наполнитель или носитель» означает наполнители или носители, пригодные для применения в фармацевтической или ветеринарной технологии для приготовления композиций для медицинского применения. Эти компоненты, наполнители и носители должны быть совместимыми с другими ингредиентами композиции. Они должны также быть пригодными для применения в контакте с тканями или органами человека или животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергического ответа или других иммуногенных проблем или осложнений с разумным отношением риск/польза.
Соли вольфрама (VI) используют в терапии для лечения ожирения или диабета. Как применяется в настоящей заявке, выражение «терапевтически эффективное количество» означает количество соли вольфрама (VI), которое при применении является достаточным для лечения женского бесплодия, определенного в настоящем изобретении. Специфические дозы соли вольфрама (VI) в соответствии с настоящим изобретением определяют для конкретных обстоятельств для определенного случая, включая, например, применяемую соль, способ применения, применяемую фармацевтическую композицию, а также характеристики пациентки, включая, среди прочего, рост, массу тела и возраст, и природу и стадию заболевания. Например, можно применять количество соли вольфрама (VI), определенной выше, от 50 до 500 мг/кг/сутки.
Как правило, у грызунов терапевтически эффективное количество соли вольфрама (VI) для лечения женского бесплодия, как определено выше, может составлять от 100 до 350 мг/кг/сутки. Предпочтительно фармацевтически эффективное количество составляет от 150 до 280 мг/кг/сутки.
Эффект соли вольфрама (VI) для лечения женского бесплодия у млекопитающих, не страдающих диабетом, на животной модели IRS-/- был продемонстрирован в примерах по настоящему изобретению. Эти мыши-самки являются хорошей мышиной моделью бесплодия без диабета. Далее, эта мышиная модель также является хорошей моделью для бесплодных женщин, не страдающих диабетом.
На протяжении описания и формулы изобретения термин «включает» и его варианты не исключают других технических характеристик, добавок, компонентов или этапов. Далее, термин «включает» также подразумевает «состоит из». Для специалиста в данной области техники другие объекты, преимущества и характеристики по настоящему изобретению станут понятными отчасти из описания и отчасти из осуществления изобретения. Следующие примеры обеспечены для иллюстрации, и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
Примеры
-/-
1. Описание животной модели (мыши-самки IRS2)
-/-
Мышиная модель IRS2 является мышиной нокаутной моделью Irs2 гена (Burks et al. «IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis)), Nature, 2000, vol. 407, pp. 377-382 («Путь IRS-2 интегрирует репродукцию у самок и энергетический гомеостаз»)). Делеция гена Irs2 приводит к явному половому диморфизму в отношении плодовитости и метаболизма углеводов.
Мыши-самцы из этой модели имеют резистентность к инсулину и тяжелую гипергликемию с раннего возраста. Напротив, мыши-самки остаются относительно эугликемичными до позднего возраста (4-5 месяцев).
-/-
IRS2 мыши-самки демонстрируют низкое развитие фолликулов и стойкую ановуляцию, сопровождающуюся отсутствием эстрального цикла у большинства мышей.
-/-
wt
+/+
Частота беременности у IRS2 мышей-самок составляет 9% по сравнению с частотой 100% у мышей-самок IRS (IRS-2 дикого типа).
2. Изучение овуляции, имплантации и беременности
A. Животные
-/-
10 IRS2 мышей-самок в возрасте от 6 до 8 недель.
wt
6 мышей-самцов «дикого типа» (IRS2) в возрасте от 6 до 8 недель.
Самок и самцов помещали отдельно в нормальные условия, т.е. 12-часовой цикл света/темноты и контролируемые влажность и температура. Животных кормили без ограничения (это также обозначается ad libitum) стандартным рационом.
B. Способ
Фаза перед лечением
-/-
После периода акклиматизации IRS2 мышей-самок помещали в группы по 4-6 мышей на клетку. У животных применяли питьевую воду, не содержащую вольфрамата, в течение фазы перед лечением (2 недели).
Фаза лечения
Вольфрамат натрия применяли в питьевой воде (ad libitum) в виде раствора 2 мг/мл натрия вольфрамата дигидрата (поставляемого Carlo Erba) в дистиллированной воде после фазы перед лечением (0 день лечения) и до 4 недель перед умерщвлением животных. Суточная доза вольфрамата натрия, потребляемая мышами, составила примерно 180 мг/кг массы тела.
Спаривание
-/-
wt
Спустя первые три недели лечения мышей-самок IRS2 помещали в клетки совместно с мышами-самцами IRS2 для постоянного пребывания.
Мышей наблюдали ежедневно для определения признаков беременности или родов. Спустя 4 недели мышей-самцов меняли между клетками и содержали в указанных клетках в течение еще 4 недель.
Применение вольфрамата продолжали в течение 8 недель, когда самцы и самки содержались вместе. Спустя эти 8 недель лечение прекращали, и самцов и самок содержали вместе в течение еще 4 недель.
Умерщвление
По окончании указанного периода мышей-самок умерщвляли и проводили анализ признаков беременности.
C. Результаты
Результаты исследования овуляции
Во время периода перед лечением и в течение первых 3 недель лечения вагинальные мазки анализировали у 6 произвольно выбранных мышей-самок в дни: -8; -5; -2; -1; 7; 8; 14; 15 и 22 для определения фазы астрального цикла мышей.
От 1 до 2 мл солевого раствора вводили во влагалище мыши пастеровской пипеткой. Вагинальный экссудат собирали той же самой пипеткой и наносили на слайд. После высыхания на воздухе его фиксировали и окрашивали по методике Папаниколау.
Методика Папаниколау включает окрашивание вагинальных мазков, фиксированных на слайде, следующим образом:
- 10 погружений в 50 об. % спирт;
- погружение в раствор гематоксилина Гарриса на 3 минуты;
- промывание проточной водой;
- 10 погружений в кислый спирт (1% соляная кислота);
- промывание проточной водой;
- 10 погружений в 95 об. % спирт;
- погружение в раствор OG-6 на 30 секунд;
- 10 погружений в 96 об. % спирт;
- погружение в раствор эозина на 1 минуту;
- 10 погружений в 96 об. % спирт;
- 10 погружений в 86 об. % спирт; и
- 10 погружений в ксилол.
Препараты анализировал обученный персонал с применением кода двойным слепым образом для устранения необъективности наблюдателя.
Образцы идентифицировали в следующие фазы: диэструс, проэструс, эструс, метэструс, анэструс или неопределенные. Цикличность четырех фаз в период от 4 до 6 дней является показателем нормального эстрального цикла, в то время как отсутствие этой цикличности и стойкое сохранение фаз анэструса, диэструса или проэструса является показателем отсутствия эстрального цикла.
-/-
По 10 исследуемым мышам-самкам в таблице 1 обобщены фазы эстрального цикла по вагинальным мазкам, полученным у 6 из этих IRS2 мышей-самок.
Фазы эстрального цикла: А - анэструс; D - диэструс, Р - проэструс; Е - эструс; и М - метэструс.
-/-
Фазы эстрального цикла, выявленные в вагинальных мазках мышей-самок IRS2, приведенные в таблице 1, показали, что во время периода перед лечением все мыши были в фазе проэструса (Р) или диэструса (D), т.е. с отсутствием эстрального цикла.
-/-
Однако после начала лечения вольфраматом отмечалось, что мыши-самки IRS2 находились в поздних фазах эстрального цикла, эструсе (Е) и метэструсе (М), что является показателем восстановления нормального эстрального цикла.
-/-
Эти результаты показывают, что применение соли вольфрама (VI) позволяет быстро восстановить (на седьмой день лечения) эстральный цикл у бесплодных не страдающих диабетом мышей-самок IRS2 у 100% исследуемых мышей.
Результаты исследования имплантации и беременности
После окончания периода спаривания в способе из раздела В, мышей-самок умерщвляли и получали образцы тканей для анализа признаков беременности.
В таблице 2 обобщен возраст во время лечения, наличие или отсутствие беременности и число эмбрионов на мышь-самку.
-/-
-/-
Результаты, приведенные в таблице 2, показывают, что частота беременности у не леченых мышей-самок IRS2 составляет 9%, а частота беременности у мышей-самок IRS2, леченных вольфраматом, возросла до 80%.
Далее, эти результаты также показывают, что среднее число детенышей/имплантированных эмбрионов при беременности мышей-самок составило примерно 5, это число считается сопоставимым с числом детенышей у мышей-самок.
Таким образом, результаты, приведенные в таблицах 1 и 2, показали, что соль вольфрама (VI) является эффективным средством восстановления овуляции и/или повышения имплантации ооцита. Таким образом, применение соли вольфрама (VI), как определено в настоящем изобретении, эффективно для лечения бесплодия у самок млекопитающих, не страдающих диабетом.
3. Анализ уровня глюкозы в крови и массы тела
A. Животные
-/-
6 IRS2 мышей-самок в возрасте от 6 до 8 недель.
Самок мышей помещали в нормальные условия, т.е. 12-часовой цикл света/темноты и контролируемые влажность и температура. Животных кормили без ограничения (это также обозначается ad libitum) стандартным рационом.
B. Способ
Фаза лечения
После периода акклиматизации применяли вольфрамат натрия в питьевой воде (ad libitum) в виде раствора 2 мг/мл натрия вольфрамата дигидрата (поставляемого Carlo Erba) в дистиллированной воде после фазы перед лечением (0 день лечения) и в течение 12 дней.
C. Результаты
Массу тела контролировали в дни 0, 2, 5, 7, 9 и 12 периода лечения, и спустя 6 часов натощак в каждый из вышеуказанных дней определяли уровень глюкозы в крови, отбирая кровь из хвостовой вены и измеряя датчиком глюкозы (анализатор глюкозы Roche AccuTrend, Маннхейм, Германия).
В таблице 3 обобщены уровни глюкозы в крови, выраженные в мг/дл, а в таблице 4 обобщена масса тела исследуемых мышей, выраженная в граммах.
Результаты, приведенные в таблицах 3 и 4, показывают, что во время применения натрия вольфрамата не наблюдалось изменения массы тела или уровня глюкозы в крови в первые 12 дней лечения, в тот самый период, когда овуляция у тестируемых мышей-самок уже успешно восстанавливалась, начиная с 7 дня лечения (см. таблицу 1).
Таким образом, результаты, приведенные в таблицах 1-4, показывают, что соль вольфрама (VI) является эффективным средством восстановления овуляции и/или повышения имплантации ооцита, независимо от изменений массы тела и углеводного метаболизма. Таким образом, показано, что применение соли вольфрама (VI), как определено в настоящем изобретении, оказывает прямое влияние на репродуктивную систему самок и, следовательно, является эффективным для лечения бесплодия у самок млекопитающих, не страдающих диабетом.