СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕТРАПЛОИДНЫХ ФОРМ ОСИНЫ
METHOD FOR OBTAINING TETRAPLOID ASPEN FORMS

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйству и может быть использовано для получения новых тетраплоидных форм осины с измененной продуктивностью и морфологией.
Стремительное сокращение площадей лесов и снижение доступности к существующим лесам привело к развитию плантационного лесоводства, основывающегося на производстве лесных культур узкоцелевой направленности с ожидаемой продукцией и законченностью всего цикла производства. Эффективное ведение плантационного лесоводства предполагает наличие высокопродуктивных форм деревьев, обеспечивающих быструю ротацию, и для этих целей подходят тетраплоидные формы осины. В лесном хозяйстве осина (Populus tremula) постепенно начинает занимать приоритетное направление для использования в целлюлозно-бумажной промышленности и получении стройматериалов. Колхицин, более широко применяющийся для полиплоидизации, обладает канцерогенным действием и более дорогой, чем трифлуралин. Трифлуралин характеризуется более высокой аффинностью с микротрубочками растений, чем животных, и используется в сельском хозяйстве в качестве гербицида.
Известен способ получения тетраплоидных форм розы «Trifluralin-mediated polyploidization of Rosa chinensis minima (Sims) Voss seedlings» (Zlesak, D.C., Thill C.A., Anderson N.O. et al. // Euphytica, 2005, 141(3): 281-290.), который является наиболее близким техническим решением. В нем суспензию трифлуралина в концентрации 0,0086 и 0,086% наносили в точку роста между семядолями и укрывали пленкой для поддержания высокого уровня влажности.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности способа получения растений осины с тетраплоидным статусом.
Поставленная задача достигается за счет того, что после высадки растений осины на искусственную питательную среду для мультипликации - WPM (Lloyd, G. and В.Н. McCown. 1980. // Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, (Kalmia latifolia), растения культивируют при стандартном световом режиме (16/8 часов, уровень освещенности - 2,5 тыс.люкс, температура 23-25°C) в течение 7 дней. После этого растения выдерживают в темноте в течение 4 дней. Затем растения вынимают из темноты и срезают этиолированные части побегов. Из побегов вырезают междоузлия и помещают их в раствор трифлуралина с концентрацией 3 мкмоль на 24 часа. Через 24 часа междоузлия промывают стерильной дистиллированной водой и помещают на вышеуказанную питательную среду для мультипликации. Далее производят пересадку на свежую питательную среду для мультипликации через каждые 4 недели.
Предлагаемый способ, заключается в использовании междоузлий этиолированных побегов в качестве эксплантов, что обеспечивает лучшее проникновение трифлуралина в глубокие слои апикальной меристемы.
Анализ известных способов подготовки растений для последующей обработки трифлуралином, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры:
Пример 1. В нестерильных условиях готовится питательная среда, включающая минеральные соли среды WPM, 30 г/л сахарозы и 9 г/л агар-агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 атм (=1 изб. атм) в течение 20 минут. В остывшую до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются 100 мг/л инозитола, 0,1 мг/л пиридоксина, 0,1 мг/л тиамина и 0,5 мг/л никотиновой кислоты. Питательную среду разливают по стерильным культуральным сосудам.
Пример 2. Все манипуляции с растительным материалом производят в стерильных условиях ламинар-бокса. В каждый контейнер помещают по 15-20 черенков, содержащих минимум одну пазушную почку.
Пример 3. Контейнеры с черенками помещают на светокультуральные стеллажи со световым режимом 16/8 часов, 2,5 тыс. люкс. Через неделю контейнеры с активно вегетирующими побегами помещают в темноту при комнатной температуре. Через 4 дня контейнеры вынимают и в асептических условиях срезают этиолированные части побегов, выделяя междоузлия с пазушными почками.
Пример 4. Междоузлия с пазушными почками помещают в жидкую (без добавления агар-агара) питательную среду WPM с трифлуралином с конечной концентрацией 3 мкмоль и оставляют на качалке на 24 часа при постоянном перемешивании.
Пример 5. После этого междоузлия ополаскивают стерильной дистиллированной водой и помещают на питательную среду для мультипликации.
Пример 6. Через каждые 4 недели проводят пересадку на свежую питательную среду для мультипликации.
В таблице 1 представлены результаты исследований по влиянию этиоляции на частоту получения тетраплоидных растений осины.
Трифлуралин является ингибитором микротрубочек, нарушающим процесс расхождения хромосом в делящихся клетках. Поскольку в качестве эксплантов используются междоузлия с меристематическими очагами, представляющими достаточно большую группу клеток, важно обеспечить такие условия, чтобы трифлуралин проник в как можно больше число меристематических клеток. Почки растений имеют естественные защитные слои, затрудняющие проникновение любых веществ. Известно, что при помещении растений в темноту происходит активизация роста побега и, как следствие, увеличение степени ювенильности формирующихся растительных тканей. Чем больше степень ювенильности тканей, тем она более проницаема для любых химических соединений. Исходя из этого, был заложен эксперимент по оценке влияния этиоляции на эффективность получения тетраплоидных форм осины, результаты которого представлены в таблице 1. Было установлено, что предварительная этиоляция побегов снижала выживаемость эксплантов после обработки трифлуралином, по сравнению с контрольными растениями, однако обеспечивала высокий выход тетраплоидных форм осины. Применение более высоких концентраций трифлуралина нецелесообразно из-за снижения общей выживаемости эксплантов.
Статус плоидности подтверждали с помощью цитологического анализа. Для этого производили подсчет числа хромосом в ядрах соматических клеток корешков, сформировавшихся из почек растений осины (фиг. 1).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Метафазные пластинки корневой меристемы микрорастений осины: слева - исходный генотип Ptv 22 (2n=2x=38); справа - тетраплоидная линия (2n=4x=76).