Экспресс-методика контроля активности ферментного комплекса

УДК 54.08

Д.В. Зубов, А.А. Толченов

ЭКСПРЕСС-МЕТОДИКА КОНТРОЛЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА

Разработан метод экспресс-анализа активности ферментов на основе цифровой фототехники, позволяющий одновременно обрабатывать до 50 проб.

Количественный анализ ферментов, оптическое распознавание, активность ферментов, переработка целлюлозы

D.V. Zubov, A.A. Tolchenov RAPID METHOD FOR CONTROL ACTIVITY OF ENZYME COMPLEX

In this article a developed method for rapid analysis of enzyme activity using digital photo technology, allowing simultaneous processing of up to 50 samples, are presented.

Quantitative analysis of enzymes, optical recognition, enzyme activity, processing of cellulose

Одним из существенных факторов, сдерживающих развитие животноводства и птицеводства в России, является недостаток качественного кормового белка. Источниками углеводного сырья могут служить сельскохозяйственные, бытовые отходы, отходы деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, основным компонентом которых является целлюлоза - высокомолекулярный нерастворимый полимер глюкозы. Деструкция целлюлозосодержащих субстратов позволит утилизировать отходы пищевых и зерноперерабатывающих производств и получить кормовой продукт, обогащенный белком и незаменимыми аминокислотами. В основе биологической деградации целлюлозы находится процесс синтезируемых различными микроорганизмами целлюлолитических ферментов. Процесс получения высокоактивных целлюлолитических штаммов и подбора оптимальных условий их культивирования предусматривает большое количество экспериментов, в которых необходимо определять активность выработанного ферментного комплекса. Метод анализа активности ферментов также требуется для создания системы контроля процесса их промышленного получения.

Методы определения активности компонентов целлюлолитической системы являются комплексными, что объясняется сложностью структуры целлюлозных субстратов, многообразием их форм и наличием многокомпонентных целлюлазных систем. Их можно разделить на три категории [1].

1. Методы определения активности целлюлаз по отношению к конкретному виду целлюлозосодержащего сырья - соломе, древесным опилкам, отходам хлопка и т.д. В этом случае испытывается целлюлазный препарат по отношению субстрату, который является целевым для последующего использования ферментного препарата на практике.

2. Методы определения общей целлюлазной активности: по гидролизу фильтровальной бумаги, хлопкового волокна, окрашенных производных целлюлозы и т.д. Продукты ферментативного гидролиза (обычно редуцирующие сахара), содержание которых находят на основе этих методов, образуются при действии не одного, а нескольких компонентов цел-люлазного комплекса.

3. Методы определения активности индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса - эндоглюканаз, целлобиогидролаз, экзоглюканаз и целлобиаз. Эти методы используются для строгой биохимической характеристики состава целлюлазных комплексов и образующих их целлюлолитических ферментов.

Величину активности определяют по уменьшению массы субстрата; по содержанию образовавшихся редуцирующих сахаров (определяемых далее, например, методом Шомодьи-Нельсона); по снижению вязкости растворов Ма-КМЦ - натрий-карбоксиметилцеллюлозы (вискозиметрические методы); по снижению мутности суспензий аморфной целлюлозы (турбидиметрический метод) и колориметрическими методами.

Существуют большое разнообразие колориметрических методов, основанных на измерении поглощения света анализируемыми окрашенными растворами, различаются они в основном условиями проведения ферментной реакции.

Как и при химическом анализе, при колориметрическом определении имеют место различные ошибки. Источниками ошибок при колориметрировании могут быть как отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера, так и причины, связанные с особенностями возникновения окраски: присутствие в растворе посторонних веществ; интенсивность окраски может меняться с изменением рН раствора; нестабильность окраски; интенсивность окраски зависит от температуры исследуемого раствора; интенсивность окраски испытуемого раствора зависит от условий подготовки реакционных сред к анализу и точности соблюдения условий реакции и ряд других.

Вышеуказанные методы имеют ряд недостатков: чувствительность к температуре, примесям, высокие требования к квалификации лаборанта, трудоёмкость.

Нами предложен экспресс-метод определения активности ферментов, который свободен от этих недостатков и успешно применён для определения целлюлатической активности.

Для проведения скриннинга микроорганизмов-целлюлолитиков и осуществления се-леции по признаку активности целлюлаз разработан метод с использованием субстрата кар-бокситилцеллюлозы (КМЦ) и его окрашиванием красителем конго-красным. Найдена зависимость между активностью целлюлаз и диаметром зоны просветления, создан программнотехнический комплекс, проводящий распознавание зон просветления и расчёт активностей для анализируемых проб.

Модифицированный метод определения целлюлолитической активности бактериальной культуры заключается в том, что в лунки агаризованной среды, содержащей КМЦ, вносят целлюлозосодержащий фугат культуральной жидкости тестируемых культр. По истечении времени инкубирования лотки со средой обрабатывают красителем конго-красный, при этом вокруг лунок на красном фоне образуются неокрашенные полупрозрачные зоны в форме кольца, размер которых зависит от активности синтезируемых культурой ферментов (чем больше диаметр зоны, тем выше целлю-лолитическая активность). Использование пластиковых лотков позволяет увеличить число одновременно анализируе-Рис. 1. Изображение лотка с пробами мых проб до 57. Помимо тестируемых

проб наносят растворы с известными активностями - так называемые стандарты

- что обеспечивает возможность формирования оценки активности исследуемого вещества.

Процесс определения диаметров зон лизиса начинается с поиска положения лунок на исходном изображении. Для этого используется корреляция по нормированным коэффициентам между изображением эталонной лунки и лотка, реализованная на основе стандартной библиотеки. Однако, в большинстве случаев, конфигурации расположения лунок в лотке одинаковая, поэтому имеется возможность сформировать шаблон (сетку), по которому алгоритм поиска сможет определить ориентировочные позиции лунок.

В идеальном случае, зона лизиса представляет окружность, однако на практике из-за неоднородности слоя агара, неровности его поверхности и других факторов, зона лизиса имеет эллиптическую форму и разнообразные дефекты (рис. 2а). Поэтому за диаметр зоны лизиса принимается эквивалентный диаметр.

Для поиска окружностей на изображении обычно использует преобразование Хафа (Hough Transform). Входными данными для алгоритма являются массив точек изображения, диапазон поиска диаметра, а также значения порогов для вспомогательных алгоритмов бинаризации и отсечения кандидатов. Эффективность этого алгоритма в существенно чувствительна к качеству входных данных: изображение должно быть не зашумлено, границы должны быть четко определены, применение преобразования Хафа подразумевает использование определённых пороговых значений. В нашем случае зоны лизиса имеют размытые края, пороговые значения существенно меняются от лотка к лотку, что приводит к неточному определению диаметров, обнаружению ложных объектов или полному отсутствию результатов.

Исходя из этого нами разработан алгоритм адаптивного поиска, учитывающий специфические характеристики изображения [2]. В результате работы алгоритма получаем массив точек, описывающий контур окружности (рис. 2б).

После этого вычисляются координаты предполагаемого центра окружности, производится отсев точек, имеющих максимальное отклонение от среднего радиуса, определяется эквивалентный радиус зоны лизиса.

На основе растворов с известной активностью экспериментально найдена связь между активностью целлю-лазы и диаметра зоны просветления:

ln(C) = aD + b,

где С - активность фермента, единицы активности МЕ, О

- диаметр исследуемой пробы, мм, а и Ь - калибровочные

коэфф

циент

ре, тр

деляе

а

б

Концентрация исследуемой пробы может быть найдена по формуле:

Рис. 2. Фрагмент фотографии лотка с найденной зоной лизиса

d — a

C = e b

Результат работы программы [З] продемонстрирован на рис. З.

Э91

Рис. 3. Скриншот разработанной программы

Полученная методика может быть применена для анализа различных ферментов, при этом на базе одновременной обработки нескольких десятков проб существенно снижаются трудозатраты и вероятность человеческих ошибок. Возможно дальнейшее усовершенствование методики - совмещение процесса культивирования продуцента фермента и анализа. В настоящее время осуществляются исследования по разработке методики переноса полученных таким способом данных на глубинное культивирование в промышленных аппаратах.

Работа выполнена в рамках Аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы».

ЛИТЕРАТУРА

1. Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. М: ДеЛи принт, 2003. 375 с.

2. Зубов Д.В., Сергеева А.В., Толчёнов А. А. Оперативный метод определения активности целлюлаз // Программные системы: теория и приложения : тр. межд. конф. Т.2. Пере-славль-Залесский : Изд-во «Университет города Переславля», 2009. С. 207-216.

3. Зубов Д.В., Толчёнов А. А. Определение активности ферментов БиоАнализ. Свид-во о регистрации программного продукта № 2010613446. 2009.

Зубов Дмитрий Владимирович -

кандидат технических наук, доцент кафедры «Техническая кибернетика и автоматика» Московского государственного университета инженерной экологии

Толченов Алексей Андреевич -

аспирант кафедры «Техническая кибернетика и автоматика» Московского государственного университета инженерной экологии

Статья поступила в редакцию 7.02.12, принята к опубликованию 12.03.12