Выделение и изучение лактобацилл ротовой полости здоровых добровольцев в качестве потенциальных универсальных пробиотических средств для сохранения и восстановления микробиоценозов человека

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЛАКТОБАЦИЛЛ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ЗДОРОВЫХ ДОБРОВОЛЬЦЕВ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ УНИВЕРСАЛЬНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ И ВОССТАНОВЛЕНИЯ МИКРОБИОЦЕНОЗОВ ЧЕЛОВЕКА

12 3

© Абрамов В.М. , Мельников В.Г. , Хлебников B.C. ,

Василенко Р.Н.3, Сакулин В.К.3, Косарев И.В.3, Карпухин Д.М.3, Тохтамышева Н.В.3, Куликова Н.Л.3,

33

Чикилева И.О. , Мещерякова A.A.

Институт инженерной иммунологии, Московская область, пос. Любучаны, Международный научно-технический центр, г. Москва

Создание новых универсальных пробиотических препаратов направленных на восстановление и сохранение различных биотопов человека является весьма актуальным. Многочисленные исследования посвящены изучению пробиотических свойств лакгобацилл ЖКТ. Пробиотиче-ские свойства лакгобацилл ротовой полости остаются мало изученны-ми. Цель работы - выделить, определить таксономическую принадлежность и охарактеризовать некоторые пробиотические свойства лак-тобацилл ротовой полости здоровых добровольцев. Обследовано 14 здоровых добровольцев (7 женщин и 7 мужчин) в возрасте 18-25 лет. Из ротовой полости обследованных выделено 86 штаммов лакгобацилл, принадлежащих к 11 видам. Восемь видов лакгобацилл (L. Gassen, L. crispatus, L. reuterii, L. paracasei, L. acidophilus, L. fermentum, L. plantarum, L. rhamnosus) являются универсальными, поскольку они участвуют в формировании орального, интестинального и генитально-го биотопов. Все штаммы были устойчивы к лизоциму. Большинство штаммов ингибировали рост S. aureus, St. mutants, A. actinomycetemco-mitans P. intermedia, но не C. albicans. Резистентность к желчнымкисло-там обнаружена у 38 штаммов из 86. Полученные резутьтаты свидетельствуют о потенциальной пригодности ряда штаммов лакгобацилл, выделенных из ротовой полости для создания универсальных пробиотических препаратов нового поколения.

Нарушение микробиоценоза ротовой полости, сопровождающееся уменьшением лакгобацилл и повышением условно-патогенной микрофло-

1 Руководитель отдела биохимии иммунитета и биозащиты Института инженерной иммунологии, доктор биологических наук, профессор.

2 Международный научно-технический центр.

3 Институт инженерной иммунологии.

ры представляет опасность для здоровья человека. Многочисленные эпидемиологические исследования последних двух десятков лет убедительно показали наличие прямой корреляции ме^ду инфекциями ротовой полости и системными болезнями [1]. Инфекции ротовой полости повышают риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, диабета, остеопо-роза, системных инфекций, превдевременных родов и др. Streptococcus sanguis - основной патоген ротовой полости индуцирует склеивание тромбоцитов, вызывая тромбоз сосудов, лежащий в основе инфаркта миокарда и инсульта [2, 3]. Большинство патогенов ротовой полости проявляют устойчивость ко многим антибиотикам. Создание новых пробиотических препаратов для восстановления и сохранения микробиоценозов человека является весьма актуальным. Целью данных исследований явилось выделение, типирование и характеристика некоторых пробиотических свойств лактобацилл ротовой полости здоровых добровольцев.

Материалы и методы

Выделение и таксономическая идентификация лактобацилл.

86 штаммов лактобацилл были выделены из ротовой полости 14 здоровых добровольцев (7 женщин и 7 мужчин) в возрасте от18 до 25 лет с использованием MRS агара. Таксономическую идентификацию проводили с помощью PCR и API - тестирования и частичного секвенирования гена 16S RNA.

Определение антимикробной активности.

В качестве мишеней использовали Streptococcus mutants NG8, Aggre-gatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Staphylococcus aureus, Candida albicans.

Тестирование на устойчивость к желчным кислотам выполнено по методу [4].

Результаты

В табл. 1 приведено видовое разнообразие лактобацилл, выделенных из ротовой полости здоровых добровольцев. Идентифицировано 11 видов лактобацилл. Доминантными являются L. fermentum, L. oris, L. gasseri и L. paracasei.

Таблица 1

Видовое разнообразие лактобацилл, выделенных из ротовой полости здоровых добровольцев

Виды лактобацилл Количество штаммов

L. gasseri 12

L. crispatus 3

L. reuterii 6

124

НАУКА И СОВРЕМЕННОСТЬ - 2011

Продолжение табл. 1

Виды лактобацилл Количество штаммов

L. acidophilus 4

L. paracasei 10

L. fermentum 21

L. rhamnosus 4

L. plantarum 9

L. delbrueckii 2

L. oris 13

L. salivaris 2

Восемь видов лакгобацилл (L. gasseri, L. crispatus, L. reuterii, L. paracasei, L. acidophilus, L. fermentum, L. plantarum, L. rhamnosus) мы относим к универсальным, поскольку они могут участвовать в формировании орального, инте-стинального и генитального биотопов [5, 6]. Все штаммы были устойчивы к лизоциму (данные не приведены). Большинство штаммов лакгобацилл инги-бировали рост кариесгенного штамма S. mutants (45 из 86 штаммов), перио-донтальных патогенов A. actinomycetemcomitans (71 из 86 штаммов), P. intermedia (35 из 52 штаммов), St. aureus (34 из 48 штаммов), но не угнетали C. albicans (табл. 2). Тестируемые штаммы лакгобацилл (38 из 86 штаммов) были устойчивы к желчным кислотам 5 % (v / v) в течение 24 ч. (табл. 3).

Таблица 2

Антимикробная активность лактобацилл, выделенных из ротовой полости здоровых добровольцев

Лактобациллы Ингибирование - тест-бактерий: зона лизиса (мм) ± SD

S. mutants A. actinomyc-etemcomitans P. intermedia St. aureus C. albicans

L. gasseri 0,3 ± 0,1 2,1 ± 0,8 7,5 ± 3,4 2,5 ± 0,6 0

L. crispatus 0 1.8 ± 0,9 8,6 ± 3,2 3,4 ± 1,1 0

L. reuterii 1,9 ± 1,0 3,2 ± 1,7 6,7 ± 1,8 2,9 ± 0,8 0

L. acidophilus 0 2,6 ± 1,4 0 1,2 ± 0,3 0

L. paracasei 2,6 ± 1,3 3,5 ± 1,6 11,2 ± 2,5 3,7 ± 1,4 0

L. fermentum 1,7 ± 0,9 3,9 ± 1,4 0 0 0

L. rhamnosus 2,3 ± 1,2 4,1 ± 1,3 12,3 ± 1,5 2,6 ± 0,7 0

L. plantarum 3,1 ± 1,6 5,8 ± 2,0 10,5 ± 2,0 7,8 ± 2,3 0

L. delbrueckii 1,8 ± 1,0 3,8 ± 2,1 0,9 ± 0,4 1,5 ± 0,4 0

L. oris 0,6 ± 0,2 3,0 ± 1,0 0 1,2 ± 0,5 0

L. salivaris 3,0 ± 2,2 4,5 ± 1,2 12,4 ± 3,0 0,9 ± 0,3 0

Таблица 3

Устойчивость к желчным кислотам штаммов лактобацилл, выделенных из ротовой полости здоровых добровольцев

Лактобациллы Количество тестируемых штаммов Рост штаммов

0,08 0,16 0,3 0,6 1,25 2,5 5,0

L. gasseri 12 12 12 12 12 12 8 7

L. crispatus 3 3 3 3 3 3 2 1

L. reuterii 6 6 6 6 6 6 5 4

Продолжение табл. 2

Лактобациллы Количество тестируемых штаммов Рост штаммов

0,08 0,16 0,3 0,6 1,25 2,5 5,0

L. acidophilus 4 4 4 4 4 4 4 3

L. paracasei 10 10 10 10 10 10 7 7

L. fermentum 21 21 21 21 21 21 3 1

L. rhamnosus 4 4 4 4 4 4 4 3

L. plantarum 9 9 9 9 9 9 7 4

L. delbrueckii 2 2 2 2 2 2 1 0

L. oris 13 13 13 13 13 13 10 7

L. salivaris 2 2 2 2 2 2 2 1

* * *

Проведенные исследования показали, что большинство штаммов лак-тобацилл, выделенных из ротовой полости здоровых добровольцев обладают антимикробной активностью против патогенов, вызывающих периодонтит и кариес. Штаммы лактобацилл устойчивые к желчным кислотам (L. gasseri, L. crispatus, L. reuterii, L. acidophilus, L. paracasei, L. rhamnosus, L. plantarum) являются потенциальными универсальными пробиотиками, пригодными для восстановления и сохранения орального, интестинально-го и генитального микробиоценозов человека.

Список литературы:

1. Renvert S. (2003). Destructive periodontal disease in relation to diabetes mellitus, cardiovascular disease, osteoporosis and respiratory disease // Oral Health Prev Dentist l (Suppl l). - P. 341-357.

2. Slavkin H.C., Baum B.J. (2000). Relationship of dental and oral pathology to systemic illness // J. Am. Med. Assoc. - № 284. - P. 1215-1217.

3. Herberg M.C., MacFarlane GD., Gong K., Armstrong N.N., Witt A.R., Erickson P.R., el al. (1992). The platelet interactivity phenotype of Streptococcus sanguis influences the course of experimental endocarditis // Infect Immun. - № 60. - P. 4809-4818.

4. Jacobsen C.N., Rosenfeldt Nielsen V., Hayford A.E. et al. Screening of probiotic activities of forty-seven strains of Lactobacillus spp. by in vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in humans // Appl Environ Microbiol. - 1999. - № 65. - P. 4949-4956.

5. Caglar E., Cilder S., Ergenelli S., et al. Salivary mutants streptococci and lactobacilli levels after ingestion of the probiotic bacterium lactobacillus reuteri ATCC55739 by straws or tablets // Acta Odontol. Scand. - 2006. - Vol. 64. -P. 314-318.

6. Reid G, Charbonneau D., Erb J., Kochanowski B. et al. Oral use of Lactobacillus ramnosus GR-1 and L.fermentum RC-14 significantly alters vaginal flora: randomized, placebo-controlled trial in 64 healthy women // Immunol. Med. Microbiol. - 2003. - № 35. - P. 131-134.