Атомно-силовая микроскопия как метод определения структурно-функциональных особенностей слизистой оболочки сфинктерных зон толстой кишки человека

МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА

Вестн. Ом. ун-та. 2011. № 4. С. 114-117.

УДК 616-093:611.18.3.45

Н.А. Давлеткильдеев, А.В. Козинская, В.Ф. Азаров, А.В. Глотов

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ СФИНКТЕРНЫХ ЗОН ТОЛСТОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА

Определена процедура подготовки биоптатов слизистой оболочки сфинктеров толстой кишки человека для исследования методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Отработана методика получения АСМ-изображений эпителия слизистой оболочки толстой кишки человека. Установлено, что АСМ позволяет определять как клеточные элементы с идентификацией типа клеток, так и ультраструктурные компоненты клеток слизистой оболочки толстой кишки.

Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, слизистая оболочка, сфинктерные зоны толстой кишки.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) - новый метод визуального изучения структурно-функциональных особенностей тканей, клеток и их ультраструктур в медицинских и биологических исследованиях. Принцип работы атомно-силового микроскопа основан на регистрации силового взаимодействия между острым зондом и поверхностью исследуемого образца. Зонд закреплен на свободном конце упругой консоли (кантилевера), отклонение которой происходит за счет сил взаимодействия. Детектор измеряет степень отклонения кантилевера по мере прохождения зонда над образцом или по мере перемещения образца под зондом. На основании полученных значений отклонения кантилевера компьютер составляет карту топографии поверхности. АСМ позволяет получать истинный трехмерный рельеф изучаемой поверхности. Исключительной особенностью АСМ является возможность проводить измерения в различных средах: в вакууме, на воздухе, в атмосфере любого газа и даже в капле жидкости. По сравнению с оптической и просвечивающей электронной микроскопией преимуществами АСМ являются более упрощенная технология приготовления образцов без использования красителей и контрастов с солями тяжелых металлов, а также относительно несложная процедура получения изображений. Указанные возможности открывают широкие перспективы для изучения живых и фиксированных клеток методом АСМ.

В настоящее время большая часть знаний о субклеточной структуре тканей человека получена методом просвечивающей электронной микроскопии ультратонких срезов биологического материала. Однако адаптация методики подготовки срезов позволяет успешно применять метод АСМ для изучения структурно-функциональных особенностей таких образцов. На сегодняшний день в доступной литературе встречаются единичные работы, касающиеся процедур получения и исследования образцов тканей методом АСМ [1-5]. Все исследования выполнены на тканях животных. В данной работе объектом

© Н.А. Давлеткильдеев, А.В. Козинская, В.Ф. Азаров, А.В. Глотов, 2011

исследования являются ультратонкие срезы слизистой оболочки толстой кишки человека. В настоящее время отсутствуют сколь-нибудь универсальные методики подготовки биологического материала для исследования методом АСМ, не отработана процедура получения АСМ-изображе-ний и нет данных по применимости метода АСМ для идентификации клеточных и субклеточные компонентов слизистой оболочки толстой кишки человека.

Целью исследования было определить процедуру подготовки биоптатов слизистой оболочки толстой кишки человека для изучения методом АСМ, отработать методику получения АСМ-изображений и установить возможности метода для исследования клеточных и субклеточных структур данных биологических тканей.

Объектом исследования являлись образцы эпителиальной ткани слизистой оболочки толстой кишки человека - био-птаты слизистой оболочки толстой кишки из области сфинктеров О’Берна-Пирого-ва-Мутье и Балли, полученные при эндоскопическом исследовании. Образцы

представляли собой ультратонкие срезы, изготовленные путем микротомирования тканей, залитых в эпоксидную смолу.

Образцы для исследования готовили по следующей методике. Ткани, зафиксированные в глутаральдегиде, подвергали дополнительной фиксации ацетоном, содержащим 2 % оксид осмия при температуре -90°С, -60°С и -30°С в течение 8 часов при каждой температуре и при 0°С в течение 1 часа. Затем нагретые до комнатной температуры образцы помещали в смольную смесь (42,7 г эпон 812; 5,6 г дуркупан АСМ; 57,6 г дудоцинил сукци-новый ангидрид). Пропитку образцов выполняли последовательно (33%-й раствор смолы - на 4 часа, 66 % раствор смолы на 4 часа и на 12 часов - в 100%-й смоле в эксикаторе). Полимеризация образцов проходила при температуре 60°С в течение 72 часов. Срезы выполняли через 24 часа после завершения полимеризации на ультрамикротоме.

Подготовленные срезы помещались на предметное стекло и изучались в оптическом микроскопе МИКМЕД 2 (ЛОМО, Россия) для выбора участка с продольными срезами крипт. Изображения отобранных участков фиксировали цифровой фотокамерой при увеличениях 200-2000-крат.

Для исследования поверхности среза слизистой оболочки толстой кишки использовали сканирующий зондовый мик-

роскоп Solver Pro (NT-MDT, Россия). Сканирование поверхности проводилось методом полуконтактной АСМ на воздухе. Использовались кремниевые зонды серии NSG01 (NT-MDT) с жесткостью кантиле-вера 10 Н/м, радиусом закругления кончика 10 нм. В процессе сканирования наряду с топографией поверхности регистрировались сигнал рассогласования цепи обратной связи и фазовый образ. Обработка и анализ АСМ-изображений осуществлялись с использованием программного модуля обработки изображений Image Analysis (NT-MDT).

Основой АСМ является взаимодействие зонда и образца силами притяжения или отталкивания. В зависимости от способа измерения и фиксации силового взаимодействия зонда и образца выделяют контактную, бесконтактную и полу-контактную методики работы атомносилового микроскопа [6].

В контактном режиме кантилевер касается зондом непосредственно поверхности образца, возникающая при этом сила отталкивания отражает характер взаимодействия. Этот режим позволяет изучать топографию поверхности методами постоянной силы и постоянной высоты. При поддержании постоянной силы зонд осуществляет сканирование образца в горизонтальной плоскости, изгиб кантилевера при этом поддерживается постоянным с помощью системы обратной связи. Вертикальные перемещения сканера при таком режиме описывают топографию исследуемой поверхности. Контактный режим постоянной высоты предполагает фиксирование положения кантилевера на определенной высоте над образцом, регистрирующим сигналом является сигнал рассогласования фотодетектора. Линейные размеры изучаемого образца получают после математической обработки зависимости изгиба кантилевера от расстояния между зондом и поверхностью.

В бесконтактном режиме работы частота колебаний кантилевера находится на уровне резонансной. Наличие градиента силы дает частотный сдвиг резонансного пика. При этом топографический образ поверхности формируется поверхностью постоянного градиента силы: здесь обратная связь при сканировании меняет положение зонда по нормали к поверхности, поддерживая либо амплитуду, либо фазу колебаний кантилевера.

Главным преимуществом АСМ является полуконтактный режим. Этим методом

116

Н.А. Давлеткильдеев, А.В. Козинская, В.Ф. Азаров, А.В. Глотов

исследуются незакрепленные на подложке, хрупкие, легкоранимые и трудноис-следуемые другими АСМ методиками образцы. Этот метод снимает проблемы, вызванные силой трения, адгезии, электростатическими силами и другими сложностями АСМ исследований. При по-луконтактной АСМ система обратной связи поддерживает на заданном уровне величину амплитуды колебаний. Информация о топографии поверхности при этом методе получается с достаточно высоким пространственным разрешением в силу высокой чувствительности амплитуды колебаний к среднему значению расстояния между зондом и образцом. Взаимодействие кантилевера с поверхностью в полу-контактном режиме складывается из ван-дер-ваальсового взаимодействия, к которому в момент касания добавляется упругая сила, действующая на кантилевер со стороны поверхности. Существенное влияние на изменение амплитуды и фазы колебаний кантилевера в этом режиме оказывает локальная жесткость поверхности образцов, так как в нижней точке колебаний зонд механически взаимодействует с их поверхностью.

АСМ-изображение поверхности образца в полуконтактной АСМ формируется следующим образом. Пьезовибратор возбуждает колебания кантилевера на частоте, близкой к резонансной частоте с соответствующей амплитудой. При сканировании образца система обратной связи АСМ поддерживает постоянной амплитуду колебаний кантилевера, устанавливаемую оператором. Напряжение в петле обратной связи записывается в память компьютера как АСМ-изображение рельефа поверхности.

При различных условиях взаимодействия зонда атомно-силового микроскопа с исследуемой поверхностью, сбоем его колебаний инициируется изменение фазы колебаний кантилевера. Фиксация изменений фазы колебаний кантилевера записывается в виде распределения фазового контраста.

Полуконтактный метод рассогласования отображает уровень сигнала рассогласования на входе системы обратной связи и в процессе реализации полукон-тактного метода, обеспечивает подчеркивание малоразмерных деталей рельефа поверхности.

Результаты исследования эпителия слизистой оболочки толстой кишки человека методом атомно-силовой микроско-

пии в области сфинктеров О’Берна-Пиро-гова-Мутье и Балли представлены на рис. 1-3.

На АСМ-изображениях эпителия слизистой оболочки толстой кишки чётко видны границы крипты и самые многочисленные из клеток крипты - бокаловидные клетки с характерными для них элементами: ядрами и муцинсодержащими гранулами (рис. 1).

На АСМ-изображениях отдельных бокаловидных клеток хорошо различимы мембрана клетки, ядро, ядрышко, эндо-плазматическая сеть и гранулы, содержащие муцин (рис. 2).

На АСМ-изображениях отдельных ядер бокаловидных клеток можно заметить четко очерченные участки мембраны ядра, а также ядрышки и гетерохроматин (рис. 3).

О 10 20 30 ЗД 50

Рис. 1. АСМ-изображение среза крипты слизистой оболочки толстой кишки

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0Л?

Рис. 2. АСМ-изображение бокаловидной клетки толстой кишки:

ГМ - гранулы с муцином, ЭПС - эндоплазматическая сеть, Я - ядро, Яд - ядрышко, стрелками указаны границы мембраны ядра

0 1 2 3 4 5

Рис. 3. АСМ-изображение среза ядра бокаловидной клетки толстой кишки

Субклеточные структуры на АСМ-изо-бражениях определяются по морфологическим параметрам: размеру, форме, а также по местоположению в клетке. Сопоставляя АСМ-изображения с изображениями в оптическом микроскопе и учитывая литературные данные [7], в эпителии слизистой оболочки толстой кишки визуально определяются бокаловидные клетки с субклеточными элементами -плазматической и ядерной мембраной, ядром, ядрышком, эндоплазматической сетью, гранулами муцина.

По мнению ряда авторов [1-5], результаты атомно-силовой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии вполне сопоставимы. Вместе с тем метод АСМ имеет существенные преимущества для визуального определения субклеточной структуры в медико-биологических исследованиях, к которым относят упрощенную методику изготовления образцов, ненужность поддержания вакуума, простоту получения изображений, представление трехмерного рельефа изучаемой поверхности.

Таким образом, методика подготовки биологического материала для АСМ-иссле-дований определяет возможность визуализации клеточных и субклеточных структур, заключенных в эпоксидную смолу. Крайне малая шероховатость поверхности чистой эпоксидной смолы, различия в шероховатости срезов отдельных клеточных элементов и наличие перепада рельефа на их мембранах обусловливают возможность визуально представлять клеточные структуры эпителиальной ткани с идентификацией типа клеток и их ультраструктуры.

Метод атомно-силовой микроскопии может существенно дополнить имеющиеся исследовательские подходы к изучению биологических объектов.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Роскошная А. С., Багров Д. В., Онищенко Г. Е., Шайтан К. В. Применение АСМ для визуализации срезов тканей // Современные достижения бионаноскопии : сборник тезисов. М. : Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова. 2009. С. 47.

[2] Mаtsko N. B., Martin M. АFM of biological material embedded in epоxу resin // Journal of Structural Biology. 2004. V. 146. Р. 334-343.

[3] Mаtsko N. B., Martin M. Epоxу resin as fixative during freeze-substitution // Journal of Structural Biology. 2005. V. 152. Р. 92-103.

[4] Matsko N.В., Grogger W, Stadlober B. Correlative AFM and ТЕМ of soft material // Imaging & Microscopy. 2008. № 10. Р. 33-35.

[5] Efimov A. E., Tonevitsky A. G., Dittrich M., Mаtsko N. B. Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: a novel device for the serial section tomography and AFM/TEM compiementary analisis of biological and polymer samples // Journal of Microscopy. 2007. V. 226. Р. 207-217.

[6] Maganov S. N., Whangbo M.-H. Surface analysis with STM and AFM: experimental and theoretical aspects of image analysis // Wiley-VCH, 1996. 323 p.

[7] Moran D. Т., Rowley D. J. Visual Histology // Lippincott Williams& Wilkins LTD, 1988. 259 p.