Obtaining a full-length sequence of gene hcp_G3 encoding protease inhibitor from the sea anemone Heteractis crispa

Вестник ДВО РАН. 2010. № 4

Виктория Евгеньевна Чаусова

В.Е.Чаусова - аспирант лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. В 2007 г. окончила очное отделение Института химии и прикладной экологии Дальневосточного государственного университета. Студенткой 4-го курса пришла в лабораторию химии пептидов, где начала осваивать методы белковой химии. После успешной защиты дипломной работы поступила в очную аспирантуру ТИБОХ (руководители: д.х.н. М.М.Монастырная и к.м.н. М.П.Исаева). В свою очередь под руководством Виктории Евгеньевны выполнена одна из студенческих дипломных работ на кафедре биоорганической химии и биотехнологии ДВГУ

Объектом исследований молодого ученого являются ингибиторы протеиназ Кунитц-типа из тропической актинии Heteractis crispa. В.Е.Чаусова принимает активное участие в научно-исследовательских проектах, поддержанных грантами РФФИ и ДВО РАН, является победителем Всероссийского конкурса «Умник-2009». Результаты ее работы были представлены на международных и региональных научных конференциях: Первом международном симпозиуме по биологическим наукам (1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, September 2008); III Международной конференции «Химия, структура и функции биомолекул», г. Минск, 1-3 октября 2008, XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, г. Владивосток, сентябрь 2009; Международном семинаре по морским живым ресурсам (International workshop on marine living resources of Vietnam, Hanoi, Vietnam, May 29th-31st, 2010).

УДК 577.2 В.Е.ЧАУСОВА

Получение

полноразмерной последовательности гена hcp_G3, кодирующего ингибитор протеиназ из актинии Heteractis crispa

Методами молекулярной биологии установлена полноразмерная последовательность гена, кодирующего полипептид hcp_G3. Показано, что hcp_G3 является новым ингибитором протеиназ семейства Кунитца. На основе данных сравнительного и филогенетического анализа сделано предположение, что hcp_G3 может обладать трипсинингибирующей, но не анальгезирующей активностью.

Ключевые слова: ингибиторы протеиназ Кунитц-типа, Heteractis crispa, клонирование кДНК.

ЧАУСОВА Виктория Евгеньевна - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток). E-mail: v.chausova@gmail.com

Работа поддержана грантом ДВО РАН № 10-III-B-05-085.

Obtaining a full-length sequence of gene hcp_G3 encoding protease inhibitor from the sea anemone Heteractis crispa. V.E.CHAUSOVA

A full-length sequence of gene encoding the protease inhibitor hcp_G3 was determined by the methods of molecular biology. hcp_G3 was shown to be a new protease inhibitor of the Kunitz family Based on the data of comparative and phylogenetic analysis hcp_G3 is supposed to possess trypsin inhibitor activity but not analgesic one.

Key words: Kunitz-type protease inhibitors, Heteractis crispa, cDNA cloning.

Ингибиторы протеиназ - уникальный природный инструмент регуляции активности ферментов, принимающих участие в различных биохимических процессах. Они широко распространены в животных, растениях и микроорганизмах. Актинии служат богатым источником ингибиторов сериновых протеиназ семейства Кунитца, классический представитель которого - бычий панкреатический ингибитор трипсина (БПТИ). Некоторые ингибиторы актиний не только обладают ингибирующей активностью, но и являются уникальными лигандами, которые влияют на функционирование отдельных рецепторов и ионных каналов [7]. В частности, каликлидины AsKCl, 2, 3 из актинии Anemonia sulcata и ингибитор трипсина SHTX III из актинии Stichodactyla haddoni - блокаторы потенциалзависимых калиевых каналов [4, 8]. Ингибиторы протеиназ Кунитц-типа (APHC1, 2, 3), недавно выделенные из актинии H. crispa, эффективно ингибируют в экспериментах in vivo ваниллоидный рецептор типа TRPV1, участвующий в проведении болевых и воспалительных сигналов [2, 3].

Несмотря на значительное количество публикаций, посвященных выделению природных ингибиторов протеиназ из актиний, практически нет данных о структуре их генов и природе разнообразия изоформ. Проявление ингибиторами различного вида активности и специфичности, возможно, обусловлено полиморфизмом генов, изучение которых может объяснить наличие структурно-функциональных особенностей у представителей этого класса соединений.

Цель работы - получение полноразмерной последовательности гена, кодирующего ингибитор протеиназ из актинии H. crispa. Для этого применяли методы молекулярной биологии, основные этапы которых схематически представлены на рис. 1. В качестве матрицы для ПЦР использовали полноразмерную кДНК библиотеку актинии H. crispa [5]. На первом этапе в результате проведения 3'-RACE (техника быстрой амплификации 3’-концов кДНК) получены последовательности, кодирующие С-концевые аминокислотные последовательности зрелых ингибиторов, которые различались точечными и групповыми нуклеотидными заменами. На основе этих замен сконструированы ген-специфичные праймеры для проведения 5-RACE. В результате получено большое разнообразие последовательностей, кодирующих N-концевые аминокислотные последовательности зрелых ингибиторов и включающих сигнальную и 5'-нетранслируемую области. Однако при совмещении 3'- и 5'-последовательностей удалось получить только одну полноразмерную кДНК, кодирующую ингибитор, обозначенный нами как hcp_G3 (рис. 2). Полноразмерная кДНК ингибитора hcp_G3 состоит из 428 нуклеотидных пар (н.п.), включая 5’-/3’-нетранс-лируемые области и поли(А)-последовательность. Открытая рамка считывания содержит 234 н.п. и кодирует предшественник ингибитора, состоящий из 78 аминокислотных остатков (а.о.). Сигнальный пептид содержит 22 а.о., тогда как зрелый - 56.

Для подтверждения существования гена, кодирующего ингибитор hcp_G3, разработаны ген-специфичные праймеры, фланкирующие последовательность зрелого полипептида. Полученные ПЦР-продукты (около 180 н.п.) были клонированы, и затем их нуклеотидные последовательности установили с помощью ДНК анализатора ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). В ходе работы проанализировали 30 ПЦР-фрагментов, которые затем были объединены с имеющимися данными из GenBank и обработаны с помощью пакетов программ: ChromasPro, Vector NTI8, MEGA 4.1. В результате обнаружено существование комбинаторной библиотеки, представленной полипептидами, структурно гомологичными

Рис. 1. Схема установления полноразмерной последовательности гена, кодирующего ингибитор протеиназ из актинии H. dispa. Стрелками указаны положения олигонуклеотидных праймеров

hep G3: MKGTFLICL 9

cDNA: aaccacaacagagagcaaagacaagataacaagatgaagggaacttttcttatttgtctg 60

hcp_G3: ILIAGESFKSTOA GSICLEP 29

cDNA: atcctaattgcaggtttctctttcaaaagcactcaagccggtagcatttgtttagaaccc 120

hcp_G3: KVVGPCTAYFPRFYFDSETB 49

cDNA aaagtagttggcccgtgtaccgcgtattttccaaçjattctacttcçjattcagaçjactgçja 180

hcp_G3: KCTPFIYGGCEGHGHHFETL 69

cDNA; aaatgcacaccgttcatctacggtggatgcgagggaaatggaaataactttgagaccctg 240

hep G3: HACRAICRA* 78

cDNA: catgcatgccgagctatatgcagggcgtaatcttgttagaagagcaatgagaagttagaa 300

cDNA: attgctacaaaaagtcaagtaaagataaaaataaaagatgtaaattcattaacgtggatt 360

cDNA: tagtaattatattaagtgaaaatgggaataaaaggatgccaatccactgöööaäaäaöctö 420

cDNA: aaaaaaaa 428

Рис. 2. Полноразмерная кДНК и выведенная аминокислотная последовательность ингибитора Ьср_ОЭ. Сигнальный пептид подчеркнут, нетранслируемые участки выделены серым, стоп-кодон обозначен звездочкой, поли

ингибиторам протеиназ Кунитц-типа. Для этих полипептидов характерно наличие консервативно расположенных остатков цистеина, образующих три дисульфидные связи, которые формируют пространственную организацию молекулы по Кунитц-типу. Следует отметить, что последовательность hcp_G3 является одной из наиболее представленных среди всех установленных. Можно предположить, что этот полипептид выполняет общую функцию,

PI

******

APHC1 -G5IC LE P KWGP CTAYF RRF YFD SE TGKCTVFIYGGCE GNGNWF ETL RAC RAICRA-

APHC2 -GSlilgKVV|p|TAYFR|F7FDSETfK|TP| _ _ _

APHC3 -GS ICLEPKWgPCTAYFPRF YFMSETGKCTPFI YGGCE GNGNKFETLi

hep G3 -GS IC LE P KWGP CTAYF P RF YFD 5E TGKCTP FI YGGCE GNGNNFETLHACRAICRA-

Jn- IV -GS IC LE P KWGP CTAYF PRFYFDSE TGKCTP FI YGGCE GNS YVD EKLHAC RAI"CRA-

SHP1-1 —sícsépkkvgrckgyfprfyfdsetgkctpfiyggcggngdmfetlhqcraicra-

SHPI-2 — SFCLEPKRVGRCKGYFPPFYFDSKTGKCTPFIYGGCGGNGNHFETLHQCRAICRA-

БПТИ PPDF^LEPPYTgPgKARI I§YFYHAKA§L§QT¡}vjy^RAKRMNFK5 AEDgMRTgGGA

Рис. 3. Множественное выравнивание ингибиторов протеиназ Кунитц-типа из актиний. Представлены последовательности: ингибитора hcp_G3; ингибитора трипсина Jn-IV (swiss prot P16344) и ингибиторов болевого канала APHC1, 2, 3 (swiss prot B2G331) из актинии H. crispa [3]; ингибиторов протеиназ SHPI-1 (swiss prot P31713) и SHPI-2 (swiss prot P81129) из S. helianthus; БПТИ - ингибитор трипсина из поджелудочной железы быка B. taurus (swiss prot P04815). Идентичные аминокислотные остатки показаны на сером фоне, консервативные - на светлосером, вариабельные - на белом. Реактивный сайт обозначен звездочками, центр реактивного сайта - P1

Рис. 4. Филогенетическое дерево ингибиторов протеиназ Кунитц-типа актиний, построенное методом ближайших соседей. БПТИ из В. 1аигш является внешней группой. Шкала отображает число аминокислотных замен на вариабельный сайт. Цифры в узлах дерева показывают величину бутстреп-поддержки в 1000 реплик

характерную для всех представителей семейства Кунитца, - ингибирование активности протеиназ, в то время как менее представленные полипептиды, по-видимому, выполняют более специфические функции. Сравнение аминокислотной последовательности hcp_G3 по алгоритму BLAST показало, что она имеет наибольшую степень гомологии с последовательностями известных ингибиторов протеиназ Кунитц-типа актиний: APHC1 - 94%, Jn-IV - 91 (H. crispa), SHPI-1 - 87 и SHPI-2 - 85 % (Stichodactyla helianthus).

В аминокислотных последовательностях большинства ингибиторов семейства Кунитца, в центре реактивного сайта (положение P1), расположены остатки лизина или аргинина, отвечающие за связывание с трипсином [6] (рис. 3). У ингибиторов актинии H. crispa APHC1, 2, 3 и Jn-IV в положении P1 расположен остаток треонина. Эти полипептиды

являются ингибиторами трипсина [1-3], но их константы ингибирования гораздо ниже (на 5-8 порядков), чем у БПТИ. Можно предположить, что замена аминокислотного остатка в реактивном центре уменьшает специфичность связывания ингибитора с трипсином.

При филогенетическом анализе аминокислотных последовательностей ингибиторов протеиназ Кунитц-типа из актиний показано, что ингибиторы актинии H. crispa образуют две группы (рис. 4). Первая представлена полипептидами, которые наряду с трипсинин-гибирующей обладают анальгезирующей активностью (APHC1, 2, 3). В отличие от этих полипептидов представитель второй группы - Jn-IV- такой активностью не обладает. Полипептид hcp_G3, входящий в состав второй группы, вероятнее всего, также будет проявлять трипсинингибирующую, а не анальгезирующую активность.

Таким образом, в результате исследований получено множество частичных последовательностей генов, кодирующих ингибиторы протеиназ Кунитц-типа из актинии Heteractis crispa. Для одного из них - ингибитора hcp_G3 - установлена полноразмерная последовательность. Показано, что он является новым представителем семейства ингибиторов протеиназ Кунитц-типа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Маркова Л.Ф. и др. Аминокислотная последовательность трипсинового ингибитора IV из Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1985. Т. 11, № 3. С. 293-301.

2. Козлов С.А., Андреев Я.А., Мурашев А.Н. и др. Новые полипептидные компоненты с анальгетической активностью из морской анемоны Heteractis crispa // Биоорган. химия. 2009. Т. 35, № 6. С. 789-798.

3. Andreev Y., Kozlov S., Koshelev S. et al. Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of vanilloid receptor 1 (TRPV1) // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283. P. 23914-23921.

4. Honma T., Kawahata S., Ishida M. et al. Novel peptide toxins from the sea anemone Stichodactyla haddoni // Peptides. 2008. Vol. 29, N 4. P. 536-544.

5. Il’ina A., Lipkin A., Barsova E. et al. Amino acid sequence of RTX-A’s isoform actinoporin from the sea anemone, Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2006. Vol. 47. P. 517-520.

6. Laskowski M., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Annu. Rev. Biochem. 1980. Vol. 49. P. 593-626.

7. Lewis R., Garcia M. Therapeutic potential of venom peptides // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2. P. 790-802.

8. Schweitz H., Bruhn T., Guillemare E. et al. Kalicludines and kaliseptine. Two different classes of sea anemone toxins for voltage sensitive K+ channels // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, N 42. P. 25121-25126.

Новые книги

Бугаев В. Ф., Маслов А.В., Дубинин В.А. Озерновская нерка (биология, численность, промысел).

Bugaev V.F., Maslov A.V., Dubynin V.A. Sockeye Salmon of the Ozernaya River (Life History. Abundance. Utilization).

Петропавловск-Камчатский: Камчатпресс, 2009. - 156 с. - ISBN 978-5-9610-0100-6.

Камчатский филиал Тихоокеанского института географии ДВО РАН

683083, Петропавловск-Камчатский, ул. Партизанская, 6

Fax: (4152) 11-24-64. E-mail: helm@mail.ru

В достаточно популярной форме представлены научные данные о нерке р. Озерная. С учетом изученности приводятся справочные сведения о распределении, особенностях биологии, состоянии запасов и хозяйственном использовании нерки. Книга прекрасно иллюстрирована.

Предназначена для широкого круга читателей: жителей и гостей полуострова Камчатка, школьников, студентов, биологов, ученых, административных работников и руководителей рыбохозяйственных предприятий, сотрудников рыбоохраны и других природоохранных ведомств.