Особенности процессов ферментации при технологическом производстве сенажа

160 Теория и практика кормления

УДК 636.086.21

Особенности процессов ферментации при технологическом производстве сенажа

Е.А. Йылдырым ООО «БИОТРОФ»

Аннотация. Большинство исследователей придерживаются мнения, о том, что сохранность консервированной растительной массы с содержанием сухого вещества 45 % и более обеспечивается созданием так называемой «физиологической сухости», приводящей к практически полному угнетению микрофлоры. В связи с этим целью нашего исследования был анализ структуры бактериального сообщества сенажа, подвяленного до содержания сухого вещества 55 %, с помощью современного молекулярно-генетического метода Т-К^ЪР. Впервые было показано, что состав микрофлоры сенажа из люцерны на 30 сутки хранения был представлен широким разнообразием микроорганизмов. Так, в сенаже наблюдалось присутствие представителей нежелательной микрофлоры, вызывающей снижение биохимических показателей качества корма: бактерий порядков ВасШа^ (5,9 %), Pseudomonadales (2,1 %), Selenomonadales (1,5 %), филумов АСлпоЬаСейа (2,8 %), Bacteroidetes (1,6 %), семейства ЕПегоЬаСейасеае (3,4 %). Полученные нами данные об интенсивно протекающих процессах брожения при консервировании сенажа согласуются с исследованиями биохимических показателей качества данного корма, проведёнными ранее рядом авторов. Учёными был сделан вывод о необходимости использования при консервировании сенажа заквасок на основе штаммов молочнокислых бактерий, проявляющих устойчивость к высокому уровню осмотического давления.

Ключевые слова: сенаж, люцерна, микрофлора сенажа, метод T-RFLP, осмотолерантные штаммы.

Введение.

В 1977 году С.Я. Зафреном было сформулировано определение понятия «сенаж» [1]. Согласно мнению исследователя, к данной категории объёмистых кормов относятся консервированные травяные корма, подвяленные до содержания сухого вещества 45 % и более, сохранность которых обеспечивается созданием так называемой «физиологической сухости», приводящей к практически полному угнетению нежелательной микрофлоры и дрожжей. Таким образом, автор отрицает факт развития нежелательных микроорганизмов в процессе сенажирования. Позже Чукановым было высказано мнение, сходное с утверждениями С.Я. Заф-рена по микрофлоре сенажа [2].

Однако в противоположность этому результаты исследования процесса сенажирования горного разнотравья (с содержанием сухого вещества - 49-55 %), проведённые Нугматжановым, показали, что качество полученного корма находилось в прямой зависимости от характера брожения [3]. Так, в сенаже без добавок присутствовало до 0,7 % масляной кислоты, что свидетельствует о возникновении вторичной ферментации. Накопление масляной кислоты при этом происходило на фоне крайне низкого содержания молочной кислоты. Тогда как в сенаже, заготовленном с внесением заквасок на основе молочнокислых бактерий, количество масляной кислоты было значительно ниже.

Цель исследования.

Анализ структуры бактериального сообщества сенажа с помощью метода T-RFLP.

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Сенаж из люцерны, заложенный без добавок.

Схема эксперимента. Модельные эксперименты были проведены в лаборатории ООО «БИОТРОФ» (г. Санкт-Петербург).

Теория и практика кормления 161

Растительную массу (370 г), подвяленную до содержания сухого вещества 55 %, хранили в термостатной комнате в вакуумных полиэтиленовых пакетах при температуре +26±1 °С.

Пробы для анализа были отобраны на 30 сутки хранения и выделяли суммарную ДНК для проведения T-RFLP-анализа.

Этапы проведения T-RFLP-анализа включали:

1. Амплификацию ДНК, которую проводили с использованием праймеров: 63F (CAGGCTTAACACATGCCAGTC) - с меткой на 5'-конце (флуорофор D4 - WellRed) и 1492R (TACCGHTACATTGTTCCGACTT), позволяющих амплифицировать фрагмент гена 16S рРНК.

2. Рестрикцию, которую проводили с использованием 50 нг ампликонов 16S рРНК и частощепящих эндонуклеаз рестриктии Hae-III, Hha-I и Msp-I, («Fermentas», Литва). Продукты рестрикции осаждали этиловым спиртом, смешивали с 0,3 мкл маркера молекулярного веса Size Standart 600 («Beckman Coulter», США) и 15 мкл формамида Sample Loading Solution («Beckman Coulter», США).

Оборудование и технические средства. Суммарную ДНК из образцов для проведения T-RFLP-анализа выделяли с использованием набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas», Литва). Амплификацию ДНК для проведения T-RFLP-анализа проводили с применением прибора Verity («Life Technologies, Inc.», США). T-RFLP-анализ проводили с помощью прибора CEQ 8000 («Beckman Coulter», США). Вычисление размеров пиков и их площади проводили в программе Fragment Analysis («Beckman Coulter», США). Принадлежность бактерий к определённой филогенетической группе определяли с использованием программы «Fragment Sorter» («FRAGSORT», США) (doi: http://www.oardc.ohiostate.edu/ trflpfragsort/index.php).

Статистическая обработка проведена стандартными методами дисперсионного анализа [4] с помощью офисного программного комплекса «Microsoft Office» с применением программы «Excel» («Microsoft», США).

Результаты исследования.

С использованием метода T-RFLP показано (рис. 1), что в сенаже из люцерны на 30 сутки количество филотипов микроорганизмов составляло 58±3,9. Средний индекс Шеннона при этом -3,3±0,22, Симпсона - 0,96±0,05.

ZäQCQ --

isaca --

. - .«i r.-ii-üs:

»«¿»»«-а-чс

lili ^ AK'H-t-k-jJ

III Mil I I I I I I I I I I I

1 MrjM

IY-' V I I I I I I I I . I I III

f

aa

ico

35 С га* он*

А

162

Теория и практика кормления

пор.

Некультивируемые ВасШакэ бактерии

пор.

Р5еис1отопас1а1е5

филум АйтоЬасЛепа

пор.

5е1епотоиас1а1е5

сем.

Е ШегоЬ ааепасеае

Фплум Вас1егсас1е1е5

1

\

пор. ЬасЛоЬасПЫеБ

Б

Рис. 1 — Состав микробиоценоза сенажа из люцерны на 30 сутки хранения:

А — T-RFLP-грамма состава микробиоценоза, Б — доля микроорганизмов в сообществе

Значительную долю (12,5 %) выявленных филотипов не удалось отнести ни к одному известному таксону.

В составе культивируемых микроорганизмов сенажа доминирующее положение занимали типичные представители силосной микрофлоры - бактерии порядка LactobaciUales (70,3 %) [5-7]. Однако на данном фоне в сенаже наблюдалось присутствие представителей нежелательной микрофлоры, вызывающей снижение биохимических показателей качества корма: бактерий порядков BacilЫes (5,9 %), Pseudomonadales (2,1 %), филумов Actinobacteria (2,8 %) семейства Enterobacte-riaceae (3,4 %).

Стоит обратить особое внимание на значительное содержание в составе микрофлоры сенажа бактерий филума Bacteroidetes (1,6 %), способных разлагать крахмал с образованием органических кислот. Интересно также обнаружение в сенаже бактерий порядка Selenomonadales (1,5 %), способных ферментировать молочную кислоту [8], что, вероятно, оказывает противодействие снижению уровня рН.

Обсуждение полученных результатов.

Таким образом, состав микрофлоры сенажа из люцерны на 30 сутки хранения был представлен широким разнообразием микроорганизмов. Значения индексов Шеннона и Симпсона также косвенно подтверждают таксономическое богатство и сложность организации микробных сообществ сенажа.

Доминирование в составе сенажа бактерий порядка LactobaciUales свидетельствует о правильном процессе брожения. Однако присутствие в процессе сенажирования представителей порядков BacilЫes, Pseudomonadales, филумов Actinobacteria, семейства Enterobacteriaceae нежелательно, поскольку данные микроорганизмы ферментируют углеводы, органические кислоты и другие соединения, оказывая противодействие подкислению и снижая питательную ценность корма. В процессе их жизнедеятельности образуются аммиак, спирты, различные органические кислоты, токсичные соединения с неприятным запахом и др. [6, 7].

Стоит обратить особое внимание на то, что использование классических микробиологических методов не позволяло ранее обнаружить в сенаже бактерий филума Bacteroidetes и порядка Selenomonadales [6, 8, 9], традиционно выявляемых ранее только в желудочно-кишечном тракте

Теория и практика кормления 163

млекопитающих, прежде всего в рубце крупного рогатого скота [10]. Вероятно, объёмистые корма являются источником поступления данных микроорганизмов в рубец. Ранее Эйкмейер с соавторами, применяя метагеномные методы исследования, также наблюдали увеличение численности бактерий филума Bacteroidetes в процессе силосования растительного сырья без добавок по сравнению с вариантом с инокуляцией штаммом бактерии Lactobacillus buchneri CD034 [11].

Полученные нами данные об интенсивно протекающих процессах брожения при консервировании сенажа согласуются с исследованиями биохимических показателей качества данного корма, проведёнными ранее рядом авторов. Так, Победновым и Кучиным [12] были проведены лабораторные эксперименты по сенажированию многолетних злаковых трав второго укоса с содержанием сухого вещества 45 % без добавок и с использованием биопрепарата Биотроф (производство ООО «БИОТРОФ») на основе осмотолерантных штаммов лактобактерий. В корме без добавок присутствовало от 0,6 до 1,41 % масляной кислоты, в то время как в вариантах с внесением закваски содержание масляной кислоты составляло от 0 до 0,53 %. Авторами был сделан вывод о необходимости использования заквасок на основе штаммов молочнокислых бактерий, устойчивых к высокому осмотическому давлению.

Кроме того, Победновым [13] были проведены эксперименты по консервированию райграса однолетнего при его предварительном подвяливании до содержания СВ 41,7 и 50,6 %. Вариант с содержанием сухого вещества 41,7 % (силос) был заложен с внесением биопрепарата Биотроф, вариант с содержанием сухого вещества 50,6 % (сенаж) - без добавок. Судя по объёму выделившихся газов, свидетельствующему о распаде питательных веществ до газообразующих продуктов, интенсивность микробиологических процессов в сенаже (11,1 л/кг СВ) не уступала таковым в силосе (10,1 л/кг СВ). Присутствие в сенаже без добавок аммиака в количестве 0,21 % в сухом веществе, а также высокий уровень рН (5,29) также подтверждали факт активного процесса микробиологического брожения в сенаже. Содержание аммиака в силосе, заложенном с закваской Биотроф, было существенно ниже и составляло лишь 0,1% в сухом веществе при уровне рН 3,94.

Приведённые нами данные об интенсивно протекающих микробиологических процессах при консервировании сенажа вступают в противоречие со значительным количеством результатов исследователей, высказывавших мнение о том, что сохранность консервированной растительной массы с содержанием сухого вещества более 45 % обеспечивается созданием так называемой «физиологической сухости», приводящей к угнетению микрофлоры.

Причиной несоответствия результатов, полученных классическими микробиологическими и молекулярно-генетическими методами, является то, что значительная часть микроорганизмов биоэкосистем относится к категории объектов, для которых в настоящее время не подобраны адекватные условия культивирования [14]. Кроме того, рядом исследователей [15-17] было продемонстрировано, что многие бактерии способны к длительному сохранению жизнедеятельности при неблагоприятных условий внешней среды в виде вегетативных клеток со сниженной метаболической активностью и не обнаруживаемых традиционными методами лабораторного культивирования.

Полученные нами результаты согласуются с исследованиями биохимических показателей качества сенажа, проведёнными ранее рядом авторов. Так, Победновым и Кучиным [12] были проведены лабораторные эксперименты по сенажированию многолетних злаковых трав второго укоса с содержанием сухого вещества 45 % без добавок и с использованием закваски Биотроф (производства ООО «БИОТРОФ») на основе осмотолерантных штаммов лактобактерий. В корме без добавок присутствовало от 0,6 до 1,41 % масляной кислоты, в то время как в вариантах с внесением закваски содержание масляной кислоты составляло от 0 до 0,53 %.

Выводы.

Таким образом, впервые с использованием современного молекулярно-генетического метода T-RFLP в составе микробиоценоза сенажа было обнаружено богатое таксономическое разнообразие микроорганизмов. При консервировании сенажа необходимо использование заквасок на основе штаммов молочнокислых бактерий, устойчивых к высокому осмотическому давлению.

164 Теория и практика кормления

Литература

1. Зафрен С.Я. Технология приготовления кормов: справ. пособие. М.: Колос, 1977. 239 с.

2. Чуканов Н.К., Попенко А.К. Микробиология консервирования трудносилосуемых растений. Алма-Ата: Наука, 1986. 198 с.

3. Нугматжанов К.Г. Микробиологические способы повышения качества кормов. Алма-Ата: Кайнар, 1984. 120 с.

4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

5. Мишустин E.H. Микробиологические процессы при силосовании кормов // Силосование и технология кормов: сб. ст. М., 1964. С. 5-19.

6. Мак-Дональд П. Биохимия силоса. М., Агропромиздат, 1985. 271 с.

7. Muck E. Recent advances in silage microbiology // Agricultural and Food Science. 2013. V. 22.

P. 3-15.

8. Langston C.W., Bouma C.A. Study of the microorganisms from grass silage // Journal of Applied Microbiology. 1960. V. 8. № 4. P. 223-234.

9. Epiphytic microflora on alfalfa and whole-plant corn / C. Lin, K.K. Bolsen, B.E. Brent, R.A. Hart, A.M. Dickerson, A.M. Feyerherm, W.R. Aimutis // Journal of Dairy Science. 1992. V. 75. P. 2484-2493.

10. Тараканов Б.В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. М.: Науч. мир, 2006. 188 с.

11. Metagenome analyses reveal the influence of the inoculant Lactobacillus buchneri CD034 on the microbial community involved in grass ensiling / F.G. Eikmeyer, P. Köfinger, A. Poschenel, S. Jüne-mann, M. Zakrzewski, S. Heinl, E. Mayrhuber, R. Grabherr, A. Pühler, H. Schwab, A. Schlüter // Journal of Biotechnology. 2013. V. 167. № 3. P. 334-343.

12. Победнов Ю.А., Кучин И.В. Физиолого-биохимические процессы, происходящие в кормовых травах при выращивании, как фактор, влияющий на их технологические свойства при силосовании и качество объёмистых кормов // Проблемы биологии продуктивных животных. 2015. № 1. С. 70-83.

13. Победнов Ю.А., Кучин И.В., Солдатова В.В. Сравнительная эффективность сенажиро-вания и силосования провяленных злаковых трав с препаратами молочнокислых бактерий // Кормопроизводство, 2016. № 3. С. 36-40.

14. Simu K., Hagstrom A. Oligotrophic bacterioplankton with a novel single-cell life strategy // Applied and Environmental Microbiology. 2004. V. 70. P. 2445-2451.

15. Соколенко А.В. Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Ростов н/Д., 2000. 21 с.

16. Ekweozor C.C., Nwoguh C.E., Barer M.R. Transient increases in colony counts observed in declining populations of Campylobacter jejuni held at low temperature // FEMS Microbiology Letters. 1998. V. 158. № 2. P. 267-272.

17. Alexander E., Pham D., Steck T.R. The viable-but-nonculturable condition is induced by copper in Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium leguminosarum // Applied and Environmental Microbiology. 1999. V. 65. № 8. P. 3754-3756.

Йылдырым Елена Александровна, кандидат биологических наук, биотехнолог ООО «БИОТРОФ», 196650, Санкт-Петербург, г. Колпино, Ижорский Завод, д. 45, литера ДВ, тел.: 8-906268-92-19, e-mail: deniz@biotrof.ru

Поступила в редакцию 16 июня 2017 года

UDC 636.086.21

Yildirim Elena Aleksandrovna

LLC «BIOTROF», e-mail: ilina@biotrof.ru

Peculiarities of fermentation processes in the technological production of haylage

Теория и практика кормления 165

Summary. Most researchers hold to an opinion that the preservation of the preserved vegetation debris with a dry matter content of 45 % or more is provided by the creation of so-called «physiological dryness», leading to an almost complete suppression of microflora. In connection with this, the purpose of our study was to analyze the structure of the bacterial community of haylage, dried up to a dry matter content of 55 %, using the modern molecular genetic method of T-RFLP. For the first time it was shown that microflora composition of hay from alfalfa on the 30th day of storage was represented by a wide variety of microorganisms. Thus, in the haylage there were representatives of undesirable microflora, causing a decrease in biochemical indicators of feed quality: Bacillales (5,9 %), Pseudomonadales (2,1 %), Seleno-monadales (1,5 %), Actinobacteria Phylums (2,8 %), Bacteroidetes (1,6 %), Enterobacteriaceae family (3,4 %). The data obtained by us on intensive fermentation processes during preservation of haylage are consistent with studies of biochemical indicators of the quality of this feed, carried out earlier by a number of authors. Scientists concluded that it is necessary to use ferments based on lactic acid bacteria that exhibit resistance to high levels of osmotic pressure during preservation of haylage. Key words: haylage, alfalfa, haylage microflora, T-RFLP method, osmotolerant strains.