Применение клеток штамма Lactobacillus fermentum U-21 для предотвращения патологических изменений в тканях, вызванных оксидативным стрессом
USE OF LACTOBACILLUS FERMENTUM U-21 STRAIN CELLS FOR PREVENTION OF PATHOLOGIC TISSUE CHANGE CAUSED BY OXIDATIVE STRESS

Область техники
Limosilactobacillus
fermentum
Lactobacillus fermentum
Изобретение относится к фармакологии и медицине и касается применения культуры клеток штамма U21 (номер в ВКПМ (Москва) B-12075 от 08.10.14, номер в GenBank: WGS PNBB00000000.1. (LfU21)) для предотвращения изменений в тканях, вызванных оксидативным стрессом.
Настоящее изобретение может найти применение при разработке профилактических и лечебных препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, предназначенных для предотвращения развития оксидативного стресса и его последствий, развивающихся при инфекционных (в том числе – вирусных), нейродегенеративных, кардиоваскулярных заболеваниях, при развитии синдрома ишемии реперфузии, а также при разработке препаратов для предотвращения и элиминации патологических изменений, вызванных оксидативным стрессом в жизненно важных органах, в том числе печени, легких, мозге и нервных тканях, при воздействии химических агентов - индукторов окислительного стресса.
Сведения о предшествующем уровне техники
В соответствии с современными представлениями, большая часть патологических, воспалительных и дегенеративных процессов в организме и развитие многих «возрастных» системных заболеваний, помимо генетических и экологических факторов, связывают с развитием оксидативного стресса (ОС) в результате воздействия активных форм кислорода (АФК), образующихся в процессе жизнедеятельности клетки и свободнорадикального окисления (СРО) биомолекул – белков, липидов, нуклеиновых кислот. (Oxidants, antioxidants and the current incurability of metastatic cancers. Watson J.// Open Biol 2013, 3 120-144; Neurodegeneration, neurogenesis, and oxidative stress. Santos R, Ruiz de Almodóvar C, Bulteau AL, Gomes CM. Oxid Med Cell Longev. 2013; 2013:730581). Sies H. Oxidative Stress: Concept and Some Practical Aspects. Antioxidants (Basel). 2020;9(9):852.
Смещение окислительно-восстановительного равновесия между образованием активных форм кислорода (АФК) и способностью биологической системы их детоксифицировать, приводит к развитию ОС, что сопровождается накоплением повреждений белков, липидов и нуклеиновых кислот, препятствует нормальным физиологическим процессам и, в конечном счете, приводит к нарушениям метаболизма клетки и ее гибели. Причинами образования АФК, могут являться внешние факторы непосредственно, либо через ряд метаболических превращений и реакций (например негативные экологические факторы, развитие иммунной клеточной реакции на попадание различных антигенов, в том числе микробных агентов, другое), способствующие образованию высокореактивных частиц. ОС может развиваться и в результате естественных процессов жизнедеятельности клетки, в том числе на молекулярном уровне (осуществление клеточного дыхания митохондриями, работа различных ферментов). Наиболее распространенными и активными оксидантами являются АФК, такие как супероксид анион, гидроксильный радикал, перекиси.
ОС и заболевания человека
Antioxidants
2017
ОС является общим патогенетическим механизмом тканевого повреждения и является одним из основных факторов, влияющих на развитие многих хронических и «возрастных» болезней. Хронические заболевания легких, в том числе, спровоцированные инфекционными и токсичными агентами, развиваются под воздействием избыточного количества активных форм кислорода, образующимися в результате избыточной или хронической активации иммунной системы (Domej W., Oettl K., Renner W. Oxidative stress and free radicals in COPD – implications and relevance for treatment. // Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2014; 9: 1207–1224. doi: 10.2147/COPD.S51226). Окислительный стресс и окислительная модификация белков являются объединяющим признаком почти всех кардиоваскулярных патологий (Rana AK, Singh D. Targeting glycogen synthase kinase-3 for oxidative stress and neuroinflammation: Opportunities, challenges and future directions for cerebral stroke management. Review. Neuropharmacology. 2018 Sep 1;139:124-136. doi: 10.1016/j.neuropharm.2018.07.006], развиваются при хирургических вмешательствах и трансплантации органов, в сосудистой хирургии [Bejaoui M, Zaouali MA, Sakly R, Ben Abdennebi H. Olprinone protects the liver from ischemia-reperfusion injury through oxidative stress prevention and protein kinase Akt activation. Can J Physiol Pharmacol. 2018. Mar. 96(3):227-231. doi: 10.1139/cjpp-2017-0153; Ferrari RS, Andrade CF. Oxidative Stress and Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Review. Oxid Med Cell Longev. 2015; 2015:590987. doi: 10.1155/2015/590987). ОС служит триггером нейродегенеративных заболеваний мозга, таких как Болезнь Паркинсона, Болезнь Альцгеймера, Боковой амиотрофический склероз (БАС) и другие (Oxidative Stress, Pro-Inflammatory Cytokines, and  Regulate Expression Levels of MicroRNAs in Parkinson's Disease. Prasad KN. Curr Aging Sci. ;10(3):177-184).
Центральная нервная система человека является одной из наиболее метаболически активных тканей организма,  потребление большого количества кислорода клетками головного мозга неминуемо приводит к образованию большого количества его активных форм. Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), защищающий нервную ткань от проникновения токсинов, ограничивает и диффузию других соединений в нейроны и клетки глии. В контексте окислительного стресса, наличие ГЭБ способствует тому, что в клетки головного мозга не попадают некоторые естественные антиоксиданты. Все эти особенности усиливают подверженность головного мозга действию свободных радикалов.
.
В ответ на окислительный стресс вырабатываются цитокины -  медиаторы воспаления, которые в свою очередь, провоцируют выработку активных форм кислорода. Т.е. воспаление и окислительный стресс могут одновременно и провоцировать и усиливать друг друга (Оксидативный стресс в патогенезе нейродегенеративных заболеваний.Возможности терапии. Васенина E.E., Левин O.С.// Современная терапия в психиатрии и неврологии (СТПН) 2013, 3-4, рр.39-46)Нейровоспаление может быть результатом работы врожденного иммунитета – клеточного иммунного ответа на неправильно свернутые, нитрозилированные, фосфорилированные формы белков или их агрегаты, образовавшиеся в результате сбоев  клеточного метаболизма, либо на проникновения эндотоксинов в проток крови.
Journal of Parkinson’s Disease.
,
Причиной попадания эндотоксинов в кровь может стать нарушенный кишечный барьер (КБ), нормальное функционирование которого, в первую очередь зависит от деятельности кишечной микробиоты (The role of oxidative stress in parkinson’s disease. Dias, V., Junn, E., Mouradian, M. M. // 2013. 3 461–491). Повышенная проницаемость кишечника и нарушенный кишечный барьер способствуют транслокации микроорганизмов и микробных продуктов, которые, через стимуляцию Toll-подобных рецепторов (TLR) инициируют клеточный иммунный ответ, активацию макрофагов и провоцируют воспаление и оксидативный стресс. (Increased intestinal permeability correlates with sigmoid mucosa alpha-synuclein stainingand endotoxin exposure markers in early Parkinson’s disease. Forsyth, C.B.; Shannon, K.M.; Kordower, J.H.; Voigt, R.M.; Shaikh, M.; Jaglin, J.A.; Estes, J.D.; Dodiya, H.B.; Keshavarzian, A.// PLoS ONE 2011, 6). Эти же процессы могут нарушить целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), способствуя нейровоспалению и повреждению центральной нервной системы (ЦНС) (The blood-brain barrier and immune function and dysfunction. Banks, W.A.; Erickson, M.A. // Neurobiol. Dis. 2010, 37, 26–32; Microbiome-Gut-Brain Axis and Toll-Like Receptors in Parkinson's Disease. Caputi V, Giron MC.Int J Mol Sci. 2018 Jun 6;19(6)). Основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий -  липополисахарид (ЛПС), вызывает воспаление и гибель нейронов.
Substantia nigra pars compacta
Болезнь Паркинсона (БП) - хроническое прогрессирующее нейродегенеративное расстройство, характеризующееся рядом моторных (двигательных) и немоторных симптомов (вегетативные и когнитивные нарушения, нарушения сна, обонятельная дисфункция и депрессия) - следствием прогрессирующей потери допаминергических нейронов в отделе головного мозга  (SNpc), играющей важную роль в регуляции моторной и многих вегетативных функций: дыхании, сердечной деятельности, тонусе кровеносных сосудов. Немоторные симптомы возникают на ранней стадии болезни в виде нарушения сна, запоров, дисфагии, вздутия, боли в животе, избыточного бактериального роста в тонкой кишке, воспалительных заболеваний кишечника и других, могут быть обусловлены распространением патологии за пределы базальных ганглиев (Shulman etal.,2011). (Gut dysfunction in Parkinson's disease. Mukherjee A., Biswas A., Das S.K.// World J Gastroenterol. 2016 Jul 7;22(25):5742-52) и при этом явно связанны с кишечной микробиотой (КМ) (Idiopathic Parkinson’s disease: Possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. Braak H., Rüb U., Gai W. P., Del Tredici K.//J. Neural Transm. 2003. 110, 517–536).
Присутствие активных форм кислорода и других оксидантов в цитозоле нейрона приводит к необратимой олигомеризации α-синуклеинов, формированию его нерастворимой формы и образованию, так называемых, телец Леви (Interaction between α-synuclein and tau genotypes and the progression of Parkinson's disease. Huang Y, Rowe DB, Halliday GM. J Parkinsons Dis. 2011;1(3):271-6; Role of cytochrome c in α-synuclein radical formation: implications of α-synuclein in neuronal death in Maneb- and paraquat-induced model of Parkinson's disease. Kumar A, Ganini D, Mason RP.// Mol Neurodegener. 2016 Nov 24;11(1):70), состоящих в основном из нитрозилированных и фосфорилированных олигомеров белка синуклеина.
.
Традиционные методы лечения БП включают различные варианты заместительной терапии,  повышающие уровень доступного допамина в мозге. Более современные методы могут сочетать традиционные препараты с модуляторами активности TLRs, с коррекцией рациона и состава нутриентов, нормализующих состояние кишечной микробиоты. Применение пробиотических бактерий, обладающих определенной антиоксидантной активностью, для приготовления функциональных продуктов питания повышает эффективность применения диетотерапии (Fetissov SO, Averina OV, Danilenko VN. Neuropeptides in the microbiota-brain axis and feeding behavior in autism spectrum disorder. Review // Nutrition. 2018 Oct. 27; 61:43-48). Такое вмешательство уменьшает дисбактериоз, облегчает симптомы дисфункции ЖКТ, положительно влияет на ось микробиота-кишечник-мозг и защищает сложную сеть нейроглии, как в ЭНС, так и в ЦНС [Cryan, J.F.; Dinan, T.G. Mind-altering microorganisms: The impact of the gut microbiota on brain and behaviour. // Nat. Rev. Neurosci. 2012, 13, 701–712; Clemente, J.C.; Ursell, L.K.; Parfrey, L.W.; Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: An integrative view. // Cell 2012, 148, 1258–1270;  Maslowski, K.M.; Mackay, C.R. Diet, gut microbiota and immune responses. // Nat. Immunol. 2011, 12, 5–9; Perez-Pardo, P.; Dodiya, H.B.et.al. Gut-brain and brain-gut axis in Parkinson’s disease models: Effects of a uridine and fish oil diet. // Nutr. Neurosci. 2017, 1–12; Perez-Pardo, et.al. PD The gut-brain axis in Parkinson’s disease: Possibilities for food-based therapies..// Eur. J. Pharmacol. 2017, 817, 86–95).
Паракват-индуцированный ОС
Neurochem. Res.
Паракват (PQ) - гербицид, системный токсикант, является одним из стандартных  препаратов для моделирования внутриклеточного и  системного оксидативного стресса.  В клетках, в присутствие кислорода PQ действует как редокс-циклирующий агент и является мощным индуктором окислительного стресса. На цитозольном уровне, паракват производит массивнейший оксидативный стресс: увеличивает пероксидацию липидов, уменьшает уровни антиоксидантов, например восстановленного глутатиона (GSH), повреждает митохондриальную функцию, увеличивает продукцию и агрегацию α-синуклеина (Kuter K, Nowak P, Golembiowska K, Ossowska K. Increased reactive oxygen species production in the brain after repeated low-dose pesticide paraquat exposure in rats. A comparison with peripheral tissues. // 2010.35:1121–30). Основным действующим метаболитом при индукции ОС паракватом, является супероксид-анион радикал – наиболее активная и нестабильная частица, вызывающая каскад окислительных и радикальных процессов в клетке.
.
Паракват-индуцированный ОС является признанной моделью для изучения различных патологий, спровоцированных, либо сопровождающихся, повышенным образованием АФК и развитием ОС. Легкие являются одной из основных мишеней - в тканях легких паракват активно поглощается и накапливается в эпителиальных клетках альвеолярного типа I и II, благодаря механизму транспорта моноаминов, благодаря чему используется при моделировании легочных болезней сопряженных с воспалением (Chakraborti S. et al. (eds.). Paraquat-Induced Oxidative Stress and Lung Inflammation Oxidative Stress in Lung Diseases. 2020 https://doi.org/10.1007/978-981-32-9366-3_11)
Паракват при остром введении (однократно большими дозами) вызывает легочное и системное воспаление, увеличивает уровни экспрессии генов воспалительного ответа, таких, как интерлейкин IL-1, IL-6, IL-8, фактор некроза опухоли  TNF-α, TNF-β, интерферон-1; рекрутирует воспалительные клетки, такие, как нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты, способствующие развитию ОС и воспалению путем генерации АФК. Происходит активация транскрипционных факторов: трансформирующего фактора роста (TGF)-β NF-kB и активатора белка-1 (ap-1), происходит изменение воспалительного статуса, измеряемого по общему количеству лимфоцитов, уровню  TNF-α и С-реактивного белка) (Tyagi N., Singh R.  Paraquat-Induced Oxidative Stress and Lung Inflammation. //Oxidative Stress in Lung Diseases, pp 245-270, 2019. doi: 10.1007/978-981-32-9366-3_11; Meng Z., Dong Y., Gao H., Yao D., Gong Y., Meng Q., Zheng T., Cui X., Su X., and Tian Y. The effects of ω-3 fish oil emulsion-based parenteral nutrition plus combination treatment for acute paraquat poisoning. //J Int Med Res. 2019 Feb; 47(2): 600–614. doi: 10.1177/0300060518806110). Эти изменения во многом сходны со специфической реакцией иммунной ситемы на активность  вируса SARS-CoV2, так называемым цитокиновым штормом. Цитокиновый шторм (цитокиновый каскад) — это потенциально летальная реакция иммунной системы, развивающаяся в некоторых случаях при инфекции вирусом SARS-CoV-2. При этом повышенные уровни ферритина, интерлейкина IL-6 и С-реактивного белка (СРБ) корреллирует с вирусно-обусловленным гипервоспалением и в клинике служат предиктором летальности. Осуществление паракват-индуцированной модели ОС на культуре клеток легких BEAS-2B, полученных из нормального бронхиального эпителия, было успешно проведено Podder B. (Podder B., Song K.S., Song H.-Y., Kim Y.-S. " Cytoprotective Effect of Kaempferol on Paraquat-Exposed BEAS-2B Cells via Modulating Expression of MUC5AC". J-STAGE, 2014 Volume 37, Issue 9, P. 1486-1494. doi: 10.1248/bpb.b14-00239), что может является также суррогатной моделью развития ОС при COVID-19.
Небольшие регулярные дозы параквата провоцируют окислительное повреждение нервной ткани. Благодаря способности проникать через гематоэнцефалический барьер, паракват,  наряду с другими токсическими веществами (такими, как ротенон, манеб, МРТР и МФТП), способными вызывать соответствующие изменения в мозге, используется в моделях изучения Болезни Паркинсона (БП), так как его введение модельным животным вызывает те же изменения, что наблюдаются при БП. (Dias V., Junn E., Mouradian M.M. The role of oxidative stress in parkinson’s disease. //Journal of Parkinson’s Disease. 2013. 3. 461–491).  У мышей, обработанных паракватом, фиксируется снижение двигательной активности, дозозависимая потеря допаминергических нервных волокон в стриатуме и повышенная экспрессия и агрегация а-синуклеина в черной субстанции компактной области мозга (Substancia Nigra pars compacta, SNpc) (Manning-Bog AB, McCormack AL, Li J, Uversky VN, Fink AL & Di Monte DA. The herbicide paraquat causes up-regulation and aggregation of alphasynuclein in mice: paraquat and alpha-synuclein. // J. Biol. Chem. 2002. 277, 1641–1644). Кроме того, существуют документально подтвержденные факты, что продолжительный контакт с паракватом достоверно повышал заболеваемость людей БП. (Pouchieu C, Piel C, Carles C, Gruber A, Helmer C, Tual S, Marcotullio E, Lebailly P, Baldi I. Pesticide use in agriculture and Parkinson's disease in the AGRICAN cohort study. // Int J Epidemiol. 2018 Feb 1; 47(1). 299-310; Colle D, Farina M, Ceccatelli S, Raciti M. Paraquat and Maneb Exposure Alters Rat Neural Stem Cell Proliferation by Inducing Oxidative Stress: New Insights on Pesticide-Induced Neurodevelopmental Toxicity. // Neurotox Res. 2018 Jun 1)
Предотвращение оксидативного стресса
Current Medicinal Chemistry
Антиоксидантами (АО) являются молекулы, которые взаимодействуют со свободными радикалами, генерируемыми в клетках, и прекращают цепную реакцию, вызванную АФК и приводящую к нарушению функционирования клетки. Вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, играют ключевую роль в поддержании общего здоровья человека продления его жизни и молодости (Firuzi, O.; Miri, R.; Tavakkoli, M.; Saso, L. Antioxidant Therapy: Current Status and Future Prospects. , 2011, 18, 3871-3888 3871 0929-8673/11 Bentham Science Publishers Ltd). Известно огромное количество антиоксидантов различных по происхождению, химической природе и механизму действия (A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Carocho M., Ferreira I.C.F.R. // Food and Chemical Toxicology 51 (2013) 15–25). При этом состав АО, количество и форма поступления в организм, имеют важнейшее значение.
Естественная система антиоксидантной защиты организма представлена белками и ферментами (тиоредоксин, глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионредуктаза, и др.) и низкомолекулярными соединениями (тиоловые соединения, мочевая кислота, некоторые пептиды и аминокислоты, аскорбиновая кислота, токоферол, глутатион и др) а так же полиненасыщенные жирные кислоты (Pre- and postweaning iron deficiency alters myelination in sprague-dawley rats. Beard JL, Wiesinger JA, Connor JR. // Developmental Neuroscience. 2003; 25:308–315). Низкомолекулярные АО, в том числе тиолы, играют в клетке важную роль: участвуют в поддержании клеточного редокс-статуса, в работе системы детоксикации, в синтезе эйкозаноидов, в регуляции многих механизмов клеточного сигналинга, регуляции клеточного цикла, экспрессии генов и апоптоза.
В случае нарушения окислительно-восстановительного равновесия под воздействием неблагоприятных факторов, антиоксидантный статус организма можно повысить введением экзогенных антиоксидантов, либо стимулируя собственную антиоксидантную систему организма, например, подавляя микроглиальную активацию и уменьшая высвобождение воспалительных факторов (IL-6 и TNF) (Beamer, C.A.; Shepherd, D.M. Inhibition of TLR-ligand and interferon gamma-induced murine microglial activation by panax notoginseng. // J. Neuroimmune Pharmacol. 2012, 7, 465–476). Такой метод во многих случаях может быть предпочтительнее, поскольку исключается преждевременная деградация вводимого антиоксиданта и проблемы с прохождением биологического барьера между тканями и органами, например гематоэнцефалического или кишечного барьеров.
Способность отдельных штаммов пробиотических бактерий снижать окислительный стресс доказана различными in vitro и in vivo экспериментами (Amaretti A., di Nunzio M., Pompei A., Raimondi S., Rossi M., Bordoni A. Antioxidant properties of potentially probiotic bacteria: in vitro and in vivo activities. Appl Microbiol Biotechnol. 2013. 97:809–817. doi: 10.1007/s00253-012-4241-7),  в том числе за счет способности к продукции антиоксидантов (Mishra V., Shah C., Mokashe N., Chavan R., Yadav H., and Prajapati J. Probiotics as potential antioxidants: A Systematic Review. J. Agric. Food Chem. 26 Mar 2015: 1-48. doi: 10.1021/jf506326t; Nowak A., Paliwoda A. and Błasiak J. Anti-proliferative, pro-apoptotic and antioxidative activity of Lactobacillus and Bifidobacterium strains: A review of mechanisms and therapeutic perspectives. Crit Rev Food Sci Nutr. 2018 Oct 16:1-12. doi: 10.1080/10408398.2018.1494539; Marsova M.V., Abilev S.K., Poluektova E.U., Danilenko V.N. A bioluminescent test system reveals valuable antioxidant properties of Lactobacillus strains from human microbiota. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2018. 34:27. doi: 10.1007/s11274-018-2410-2). Поскольку системный окисидативный стресс и воспаление (в том числе, спровоцированные инфекционными агентами, хирургическими операциями и нарушением баланса кишечной микрофлоры) играют важную роль в развитии множества возрастных и хронических заболеваний, сегодня активно ведётся поиск и изучение пробиотических агентов, способных предотвращать развитие ОС и его последствий (The role of oxidative stress in Parkinson's disease. Review. Dias V, Junn E, Mouradian MM.// J Parkinsons Dis. 2013; 3(4):461-91; The bowel and beyond: the enteric nervous system in neurological disorders. Review. Rao M., Gershon M.D.// Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2016 September ; 13(9): 517–528; Sun MF, Zhu YL, Zhou ZL, Jia XB, Xu YD, Yang Q, et al. Neuroprotective effects of fecal microbiota transplantation on MPTP-induced Parkinson's disease mice: Gut microbiota, glial reaction and TLR4/TNF-alpha signaling pathway.// Brain Behav Immun. 2018, 70:48–60; Wanchao S., Chen M., Zhiguo S., Futang X., Mengmeng S. Protective effect and mechanism of Lactobacillus on cerebral ischemia reperfusion injury in rats . Braz J Med Biol Res. 2018; 51(7): e7172. doi: 10.1590/1414-431X20187172; Wang N., Song G., Yang Y., Yuan W., Qi M. Inactivated Lactobacillus promotes protection against myocardial ischemia–reperfusion injury through NF-κB pathway. Research Article.// Bioscience Reports (2017) 37. https://doi.org/10.1042/BSR20171025).
Пробиотические микроорганизмы и лактобациллы в частности, благодаря активному синтезу  биологически-активных соединений и двунаправленной связи с организмом хозяина, могут активно влиять на общее состояние и антиоксидантный статус организма. Многие исследования подтвердили антиоксидантную активность некоторых штаммов лактобацилл. Влияние на АО статус организма осуществляется через ряд описанных в литературных источниках механизмов, которые можно условно разделить на три основных типа.
Bacillus amyloliquefaciens
Lactobacillus fermentum
1. Действие непосредственно в ЖКТ и снижение воспаления в кишечнике осуществляется через регуляцию состава микробиоты благодаря антагонистической активности по отношению к патогенным бактериям и снижению количества их производных (Hill, C.; Guarner, F Salminen, S.; et al. Expert consensus document. The international scientific association for probiotics and prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2014, 11, 506–514; Wang Y, Wu Y, Wang Y, Fu A, Gong L, Li W, Li Y.  SC06 alleviates the oxidative stress of IPEC-1 via modulating Nrf2/Keap1 signaling pathway and decreasing ROS production. // Appl Microbiol Biotechnol. 2017 Apr;101(7):3015-3026]; через восстановление кишечного барьера (уменьшение проницаемости КБ, снижение количества токсинов в крови и индуцированного патогенами воспаления) [Shieh M-J, Shang H-F, Liao F-H, Zhu J-S, Chien Y-W.  improved intestinal bacteria flora by reducing Clostridium perfringens. Eur. J. Clin. Nutr. 2011;6:e59–e63; Westfall S., Lomis N., Kahouli I., Dia S.Y., Singh S.P., Prakash S.  Microbiome, probiotics and neurodegenerative diseases: deciphering the gut brain axis. Cell Mol Life Sci. 2017 Oct;74(20):3769-3787. doi: 10.1007/s00018-017-2550-9;  Fung T.C. The microbiota-immune axis as a central mediator of gut-brain communication. // Neurobiol Dis. 2019 Dec 14;136:104714. doi: 10.1016/j.nbd.2019.104714; Benakis C, Martin-Gallausiaux C, Trezzi JP, Melton P, Liesz A, Wilmes P.  The microbiome-gut-brain axis in acute and chronic brain diseases. Review.// Curr Opin Neurobiol. 2019 Dec 5;61:1-9. doi: 10.1016/j.conb.2019.11.009).
2. Непосредственная элиминация АФК, возможная за счет продукции веществ с антиокислительными свойствами (КЦЖК, пептиды, аминокислоты, витамины С, B1 ,B12, Е и др.). Например: синтез белков и ферментов-антиоксидантов (супероксиддисмутаза, глютатион, тиоредоксин, каталаза, др.); хелатирование токсичных ионов, в т.ч. ионов  железа (Fe+2) и меди (Cu+2);  ферментация прооксидантных веществ и токсинов; адгезия прооксидантных веществ и токсинов экзополисахаридами клеточной стенки.  Так же многие низкомолекулярные производные, обладающие антиоксидантной активностью,  способны проникать в кровь через кишечный барьер и непосредственно снижать уровень окислительного стресса в различных отделах организма (Kerksick, C.; Willoughby, D. The Antioxidant Role of Glutathione and N-Acetyl-Cysteine Supplements and Exercise-Induced Oxidative Stress Journal of the International Society of Sports Nutrition 2005, 2:38-44; Pophaly, S.D.; Singh, R.; Kaushik, J.K.; Tomar, S.K. Current status and emerging role of glutathione in food grade lactic acid bacteria. Microbial Cell Factories, 2012, 11:114).
Lactobacillus
Bifidobacterium
Lactobacillus acidophilus
3. Непосредственное воздействие на организм хозяина, через осуществление сигнальной функции через стимулирование кишечных нейронов,  стимуляцию иммунной системы при помощи микроб-ассоциированных паттернов через TLR рецепторы эпителиальных клеток. Такой механизм общения с организмом хозяина описан в том числе для лактобацилл. Эмиссия сигнальных молекул и гормонов стимулирует  регуляцию внутренних систем сигнальной трансдукции эукариотических клеток и активацию транскрипции ферментов, нейтрализующих свободные радикалы (активируя метаболические пути Nrf2-Keap1-ARE, NFκB, MAPK и PKC) (Ткачев В.О., Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Механизм работы сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE . Обзор . // Биохимия, 2011, том 76, вып. 4, с. 502 – 519; Yunes R.A., Poluektova E.U. et.al. GABA production and structure of gadB/gadC genes in  and  strains from human microbiota//Anaerobe, 2016. - № 42. - C. 197-204; Sun MF, Zhu YL, Zhou ZL, Jia XB, Xu YD, Yang Q, et al. Neuroprotective effects of fecal microbiota transplantation on MPTP-induced Parkinson's disease mice: Gut microbiota, glial reaction and TLR4/TNF-alpha signaling pathway. // Brain Behav Immun. 2018, 70:48–60; Laiño J., Villena J., Kanmani P., Kitazawa H. Immunoregulatory Effects Triggered by Lactic Acid Bacteria Exopolysaccharides: New Insights into Molecular Interactions with Host Cells. //Microorganisms. 2016 Sep; 4(3): 27. Published online 2016 Aug 15. doi: 10.3390/microorganisms4030027; Kim D.H., Kim S., Lee J.H., Kim J.H., Che X., Ma H.W., Seo D.H., Kim T.I., Kim W.H., Kim S.W., Cheon J.H.  suppresses intestinal inflammation by inhibiting endoplasmic reticulum stress.// J Gastroenterol Hepatol. 2019. Jan;34(1):178-185. doi: 10.1111/jgh.14362).
Существует ряд патентов на пробиотические организмы, обладающие  антиоксидантной активностью, в том числе и пробиотики для профилактического применения при нейродегенеративных расстройствах включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера (Ho L, Ono K, Tsuji M, Mazzola P, Singh R, Pasinetti GM. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. // Expert Rev Neurother. 2018 Jan;18(1):83-90), боковой амиотрофический склероз и другие (WO 2013190068 A1; US 20160199425 A1; WO 2011083354 A1; CN 102858948 B; US 9056123 B2; WO 2003002131 A1).
in vitro
C.elegans
in vivo
Важно отметить высокую штаммоспецифичность антиоксидантных, и иммуномодулирующих свойств лактобацилл. Описанные в них штаммы демонстрируют антиоксидантные свойства и антимикробные свойства в отношении патогенных микроорганизмов и являются ближайшим аналогом изобретения.  Однако, в отличие от настоящего изобретения, эффективность представленных ранее веществ, микроорганизмов и  их экстрактов показана только  на моделях отдельных белков или культуры клеток, либо на модели продолжительности жизни беспозвоночных, например почвенной нематоды . Остается открытым вопрос, можно ли экстраполировать с уверенностью полученные результаты на модели  млекопитающих. Препаратов пробиотиков-антиоксидантов на рынке нет.
Раскрытие сущности изобретения
Limosilactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
)
Целью данного изобретения является представление культуры клеток штамма микроорганизма  U21 (U21в качестве компонента, обладающего антиоксидантной и протекторной активностью для предотвращения и элиминации патологических изменений под воздействием оксидативного стресса, на модели паракват-индуцированного оксидативного стресса в организме мышей.
in vitro
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus
Lactobacillus fermentum
Limosilactobacillus fermentum
Lactobacillus Beijerinck
Lactobacillaceae
Leuconostocaceae
Limosilactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
L.fermentum
L.fermentum
Источник выделения штамма, его основные характеристики и антиоксидантная активность в опытах  подробно описаны в патенте №2705250 от 06 ноября 2019 «ШтаммU21, продуцирующий комплекс биологически активных веществ, осуществляющих нейтрализацию супероксид-аниона, индуцируемого химическими агентами». Необходимо отметить, что в апреле 2020 года была опубликована статья о реклассификации рода , и текущее название вида –  [Zheng et al., A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus  1901, and union of  and , International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2020]. Таким образом, штамм U21, является описанным нами ранее в патенте №2705250 штаммом  U21. Штамм  U21 был депонирован в  международной коллекции ВКПМ (Москва) под номером B-12075 от 08.10.14., нуклеотидная последовательность генома ( LfU21) депонирована в GenBank под номером WGS PNBB00000000.1.
Технический результат
Limosilactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
L.fermentum
Применение культуры клеток штамма  U21 (U21)способствуетпредотвращению и элиминации патологических изменений в жизненно важных органах мышей, включая нервные ткани, легкие, печень и сердце, вызванных оксидативным стрессом при воздействии параквата. Применение культуры клеток штамма  U21 в разработке препаратов для профилактики и сопроводительной терапии заболеваний, сопровождающихся или индуцированных оксидативным стрессом, представляется перспективной стратегией повышения эффективности указанных препаратов в части снижения и предотвращения повреждения тканей и клеток жизненно важных органов, в том числе мозга, нервной ткани, легких сердца и печени.
Краткое описание чертежей
L.fermentum
Фигура 1. Изменения внутренних органов мышей при воздействии параквата. А –  органы мышей, одновременно получавших паракват и штамм U21 (группа «U21»); В – органы мышей, получавших паракват (группа «Токсин»).
L.fermentum
Фигура 2. Медиана и квартили (25 – 75%) максимальной процентной доли длительности вертикального спуска с шеста (%) в группах мышей: «Токсин» - внутрибрюшинные инъекции параквата;  «U21» - паракват и штамм  U21; «Контроль» - физиологический раствор перорально с помощью зонда и внутрибрюшинных инъекций.
Осуществление изобретения.
L.fermentum
E.coli
Lactobacillus fermentum
Штамм U21 был отобран из коллекции штаммов лактобацилл благодаря наличию уникальных антиоксидантных свойств (Marsova M.V., Abilev S.K., Poluektova E.U., Danilenko V.N. A bioluminescent test system reveals valuable antioxidant properties of Lactobacillus strains from human microbiota // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2018 / DOI 10.1007/s11274-018-2410-2). Культуральная жидкость штамма снижала уровень индуцированной паракватом биолюминесценции в тест-системах на основе трансгенных штаммов MG1655. Живая культура клеток штамма продлевала медианную продолжительность жизни почвенной нематоды в модели паракват-индуцированного оксидативного стресса (RU №2705250 от. 05.02.2018. "Штамм  U21, продуцирующий комплекс биологически активных веществ, осуществляющих нейтрализацию супероксид-аниона, индуцируемого химическими агентами" Даниленко В.Н., Марсова М.В., Полуэктова Е.У., Одорская М.В., Юнес Р.А.).
L. fermentum
in vivo
Для выявления и характеристики антиоксидантных свойств культуры клеток штамма U21 в условиях мы использовали методы и системы паракват-индуцированного ОС у грызунов, успешно применяемые и научно обоснованные в  патентах и статьях (Attia H.N., Maklad Y.A. Neuroprotective effects of coenzyme Q10 on paraquat-induced Parkinson's disease in experimental animals. Behav Pharmacol. 2018;29(1):79-86. doi: 10.1097/FBP.0000000000000342; Bastías-Candia S, Zolezzi JM, Inestrosa NC. Revisiting the Paraquat-Induced Sporadic Parkinson's Disease-Like Model. Mol Neurobiol. 2019; 56(2):1044-1055. doi: 10.1007/s12035-018-1148-z   Brooks A.I., et.al.  (1999) Paraquat elicited neurobehavioral syndrome caused by dopaminergic neuron loss. Brain Res 823:1–10. https://doi.org/10.1016/S0006-8993(98)01192-5; Dinis-Oliveira RJ, et.al. Paraquat poisonings: mechanisms of lung toxicity, clinical features, and treatment. Crit Rev Toxicol. 2008;38(1):13-71;  Matsuura K, Kabuto H, Makino H, Ogawa N. Pole test is a useful method for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal dopamine depletion. // J Neurosci Methods. 1997 Apr 25;73(1):45-8; Smeyne R.J., et.al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 2016;11(10):e0164094. doi: 10.1371/journal.pone.0164094).
Модель окислительного стресса, индуцированного регулярными инъекциями раствора параквата
Исследования были проведены на модели хронического окислительного стресса индуцированного регулярными инъекциями раствора параквата на мышах линии C57/BL6. (Neuroprotective effects of coenzyme Q10 on Paraquat-induced Parkinson's disease in experimental animals. Attia H.N., Maklad Y.A. //Behav. pharmacol. 2018. 29, 79-86;).
Самцы мышей линии C57/BL6 в возрасте 6 недель были адаптированы к виварию в течение 2-х недель. Животные были размещены в стандартные клетки и содержались при 12 часовом световом режиме и температуре  ~21°С. За неделю до начала исследования мышей случайным образом относили к одной из трех экспериментальных групп, по 10 особей  в каждой. Для минимизации влияние суточных вариаций, испытания и процедуры проводились между 08:00 и 13:00 часами.
L. fermentum
8
Для индукции оксидативного стресса использовали водный раствор параквата (1,10-диметил-4,40-бипиридинийдихлорид, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), исследуемый препарат - лиофильно высушенная культура пробиотического штамма  U21 в дозе 10.
L.fermentum
8
Мыши получали на регулярной основе, два раза в неделю в течение 3-х недель (6 инъекций в целом), внутрибрюшинную инъекцию параквата  (10мг/кг) (группы «Токсин» и «Токсин+U21») или физиологического раствора (группа «Контроль») в объеме 100 мкл. Ежедневно (одновременно с инъекциями параквата), в течение 3-х недель, животным вводили парентерально с помощью зонда в объеме 0,5 мл физиологический раствор (группы «Контроль» и «Токсин») или лиофильно высушенную культуру пробиотического штамма  U21 в дозе 10(«Токсин+U21»). Наблюдения за животными проводили в течение 3х недель. Животных ежедневно осматривали, смерти фиксировали.
На 21-й и 23-й дни исследования проводился поведенческий тест «спуск по вертикальному шесту», позволяющий оценить координацию движений мыши (Matsuura K, Kabuto H, Makino H, Ogawa N. Pole test is a useful method for evaluating the mouse movement disorder caused by striatal dopamine depletion. // J Neurosci Methods. 1997 Apr 25;73(1):45-8) в модификации (Sleep-wakefulness cycle and behavior in pannexin1 knockout mice.Kovalzon VM, Moiseenko LS, Ambaryan AV, Kurtenbach S, Shestopalov VI, Panchin YV. Behav Brain Res. 2017 Feb 1;318:24-27).
На 23й день эксперимента животных случайным образом отбирали для исследования сохранности допаминергических нейронов черной субстанции мозга.
Примеры определения свойств штамма
L. fermentum
U21
по настоящему изобретению.
L. fermentum
L. fermentum
L. fermentum
8
(Пример 1).
Пероральный прием лиофильно-высушенной культуры штамма  U21 в дозе 10 КОЕ значительно снизил смертность мышей линии C57/BL6 при хроническом отравлении паракватом. Ежедневное применение штамма  U21 одновременно с инъекциями параквата снизило смертность мышей по сравнению с контрольными группами на 8% и 20%: в группе интактных мышей смертность составила 18%, в группе получавших паракват – 30%, в группе одновременно получавших паракват и штамм  U21 - смертность составила менее 10%.
L. fermentum
L. fermentum
8
(Пример 2).
Пероральный прием лиофильно-высушенной культуры штамма  U21 в дозе 10 КОЕ позволил значительно сократить или полностью предотвратить изменения внутренних органов опытных животных при воздействии гербицида параквата. Вскрытие животных из группы получавших паракват показало изменения в состоянии внутренних органов. Применение культуры штамма  U21 позволило предотвратить большинство патологических изменений органов и сократить проявления таких изменений.
L. fermentum
8
Пероральный прием лиофильно-высушенной культуры штамма  U21 в дозе 10 КОЕ эффективно предотвратил симптомы токсического воздействия параквата у мышей линии C57/BL6 на токсиновой модели болезни Паркинсона (БП), вызванной регулярными инъекциями параквата.
L. fermentum
L. fermentum
(Пример 3).
Ежедневное применение штамма  U21 одновременно с инъекциями параквата позволило предотвратить развитие моторных дисфункций. Координация движений мыши оценивалась по стандартной методике в тесте «спуск по вертикальному шесту». В данном исследовании при анализе использовалась относительная (в сравнении с общей длительностью) длительность «контролируемого» спуска с шеста (вертикально вниз). По результатам исследования выявлено, что различия в медианах максимальной процентной доли длительности вертикального спуска с шеста между мышами из групп «Контроль», «Токсин» и «Токсин+U21», достоверно различались при оценке по Манну-Уитни (р<0,05) и составили 54% и 100% соответственно, что свидетельствует о предотвращении двигательных дисфункций у мышей, получавших препарат штамма  U21
L. fermentum
8
Пероральный прием лиофильно-высушенной культуры штамма  U21 в дозе 10 КОЕ показал высокую протекторную активность относительно допаминовых нейронов на токсиновой модели болезни Паркинсона, вызванной регулярными  инъекциями параквата на мышах линии C57/BL6. Тирозингидроксилаза (ТГ) является ключевым ферментом биосинтеза катехоламинов, в том числе допамина. При развитии паркинсонизма, количество ТГ-позитивных клеток в мозге уменьшается, вызывая ряд характерных дисфункций. Количество ТГ-позитивных клеток в черной субстанции мозга обработанных паракватом мышей определяли подсчетом иммуногистохимически окрашенных антителами фронтальных срезов черной субстанции.
L.
fermentum
(Пример 4).
По результатам исследования выявлено, что количества ТГ-позитивных клеток в мозге мышей из групп «Токсин» и «Токсин+U21» достоверно различались (по Манну-Уитни, р<0,05)) и, в среднем по выборке, составили 15,1 и 21,6 тысяч на образец соответственно (т.е. животные, получавшие пробиотический препарат, сохранили на 30% больше допаминергических нейронов), что свидетельствует о протекторном действии препарата штамма  U21 в отношении допаминергических нейронов черной субстанции.
Примеры осуществления способа применения субстанции по настоящему изобретению.
Пример 1. Влияние штамма
L.fermentum
U21 на смертность мышей при воздействии оксидативного стресса, индуцированного раствором параквата.
L.fermentum
Исследования были проведены на модели окислительного стресса, индуцированного регулярными инъекциями раствора параквата, на мышах линии C57/BL6. Применение лиофильно высушенной культуры штамма  U21 параллельно с инъекциями параквата, позволило значительно снизить смертность мышей. Результаты исследования представлены в таблице 2.
L. fermentum
Таблица 2. Изменения смертности мышей, получавших паракват, при применении пробиотического штамма U21
<b>Группы</b><b>(Условия)</b>
<b>Контроль</b>(NaCl /NaCl)
<b>Токсин </b>(Паракват/NaCl)
<b>Токсин+U21</b>Паракват/
<i>L.fermentum</i>
<b>Смертность, %</b>
<b>18</b>
<b>30</b>
<b><10</b>
Пример 2. Изменения внутренних органов при оксидативном воздействии параквата.
Павшие в течение 15-21 дня эксперимента животные подверглись вскрытию. По истечении 3-х недель для исследования состояния внутренних органов случайным образом были выбраны по три особи из каждой группы. Отобранные особи усыпляли эфиром. Было проведено вскрытие. В результате исследования выявлено, что токсическое действие параквата в первую очередь влияет на состояние легких и печени.
У мышей, получавших только паракват (группа «Токсин»), печень сильно увеличена и неоднородна, окраска неравномерная, поверхность с белесыми пятнами, края долей сглажены, закруглены; легкие неправильной формы, со следами фиброзных изменений, в частности бугристая поверхность, спавшиеся в размере, бурые пятна, следы кровоизлияний; сердце несколько увеличено в размерах, присутствует выпот в брюшной полости (Фигура 1).
L. fermentum
Внутренние органы мышей, получавших паракват одновременно со штаммом  U21 (группа «Токсин+U21») и усыпленных эфиром, в основном соответствовали физиологической норме: печень несколько увеличена в размерах, равномерной окраски, правильной формы, гладкая, края долей острые; легкие нормальной формы и размера, равномерно окрашены по всей поверхности, без видимых вкраплений и признаков патологических изменений. Сердце без признаков патологических изменений, нормального размера, выпота в брюшной полости нет.
Пример 3. Предотвращение моторных дисфункций.
Исследования были проведены на модели окислительного стресса, индуцированного регулярными инъекциями раствора параквата на мышах линии C57/BL6.
Здоровая интактная мышь при помещении на вертикальный шест переориентируется вертикально вниз и спускается, используя все четыре лапы при перемещении. В этом случае спуск осуществляется и контролируется двигательной активностью самой мыши, что требует высокой степени координации. Способ соскальзывания с шеста «боком» характерен для мышей, подвергшихся действию токсина и слабо контролируется собственной двигательной активностью. В данном исследовании при анализе использовалась относительная (в сравнении с общей длительностью) длительность «контролируемого» спуска с шеста (вертикально вниз).
L. fermentum
По результатам исследования выявлено, что различия в медианах максимальной процентной доли длительности вертикального спуска с шеста между мышами из группы «Контроль» (95%) и группы «Токсин» (54%) были близки к достоверным. Что свидетельствует об ограничении способности мышей к вертикальному («контролируемому») спуску с шеста. Медианы максимальной процентной доли длительности вертикального спуска с шеста у мышей, одновременно получавших паракват и препарат штамма  U21 (100%), и у мышей из группы «Контроль» (95%) достоверно не различались, что свидетельствует о том, что введение мышам бактериального штамма предотвращает двигательные дисфункции у мышей (Фигура 2).
Таблица 3. Медианы максимальной процентной доли длительности вертикального спуска с шеста.
<b>Группы</b><b>(Условия)</b>
<b>Контроль</b>(NaCl /NaCl)
<b>Токсин </b>(Паракват/NaCl)
<b>«Токсин+U21»</b> (Паракват/
<i>L.fermentum</i>)
Вертикальный спуск, %
<b>95</b>
<b>54</b>
<b>100</b>
Пример 4. Протекторная активность в отношении допаминовых нейронов
Substantia nigra
Мозг чрезвычайно чувствителен к оксидативному стрессу. Одной из наиболее  уязвимых к такому воздействию областей является черная субстанция среднего мозга()  играющая важную роль в регуляции моторной функции, тонуса мышц, осуществлении статокинетической функции, во многих вегетативных функциях: дыхании, сердечной деятельности, тонусе кровеносных сосудов. Нейроны черной субстанции мозга являются активными продуцентами катехоламинов и наиболее подвержены процессам оксидации за счет особенностей метаболизма. Тирозингидроксилаза (ТГ) - ключевой фермент биосинтеза катехоламинов, в том числе допамина. При снижении количества ТГ-позитивных клеток в мозге, проявляется ряд дисфункций, характерных для ранней стадии паркинсонизма, в том числе, нарушение координации движений и снижение кишечного транзита.
Количество ТГ-позитивных клеток в черной субстанции мозга определяли подсчетом иммуногистохимически окрашенных антителами фронтальных срезов черной субстанции.
L. fermentum
о
о
Для определения протекторной активности культуры клеток штамма  U21, на 23 день эксперимента животных наркотизировали хлоралгидратом и перфузировали через сердце физиологическим раствором на фосфатном буфере (PBS), а затем 4% раствором формальдегида в PBS. Головной мозг извлекали и после дополнительной фиксации в перфузионном растворе в течение 12 часов при 4С пропитывали в 30% растворе сахарозы в PBS 24 часа. Коронарные срезы среднего мозга и стриатума толщиной 40 микрометров получали на замораживающем микротоме и собирали в PBS. Было собрано по 4 серии срезов каждого мозга. Срезы помещали в антифриз и хранили при -20С до процедуры окрашивания.
о
Каждый 4-й срез, содержащий черную субстанцию среднего мозга, иммуногистохимически окрашивали на тирозингидроксилазу (TH), используя  моноклональные антитела против нее, разведенные в соотношении 1:200 в растворе PBS с добавлением 2% нормальной сыворотки лошади, 0.5% детергента TritonX100 и 0.01% азида натрия (все реагенты – Sigma-Aldich, USA). В растворе первичных антител свободно плавающие срезы содержали с перемешиванием при 4С в течение 24 часов. После троекратной промывки в PBS  материал инкубировали в  растворе ослиных антител против иммуноглобулина мыши, конъюгированных с флуоресцентным красителем Су2 (Jackson Immuno Research, США) при комнатной температуре в течение одного часа. Окрашенные срезы помещали на предметные стекла, покрывали 50% глицерином и покровным стеклом.
Количественный анализ TH-иммунопозитивных (TH+) клеток проводили с помощью микроскопа OlympusIX81, снабженного моторизованным предметным столиком и управляемого с компьютера, и цифровой фотокамерой Olympus DP72. Подсчет клеток осуществляли на мониторе компьютера с использованием программы “Cell*” (Olympus Soft Imaging Solution GmbH, ФРГ). При малом увеличении (объектив 10х) получали обзорное изображение участка среза с черной субстанцией (SNC) и вентральной областью покрышки (VTAventral tegmental area). Затем при большом увеличении (объектив 40х) неинформированный оператор подсчитывал  количество TH+ клеток с помощью метода оптического фракционатора. Результаты подсчета представлены в Таблице 4.
Таблица 4. Количество ТГ-позитивных клеток в черной субстанции мозга.
<b>Группы</b><b>(Условия)</b>
<b>Контроль</b>(NaCl /NaCl)
<b>Токсин </b>(Паракват/NaCl)
<b>Токсин+U21</b>(Паракват/
<i>L.fermentum</i>)
<b>Кол-во ТГ+ клеток, среднее </b>
19 520
15 104
21600
<b>Кол-во ТГ+ клеток, %</b>
90
70
100