СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ-ПРАЙМЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ РВ2, РВ1, РА, NP, MP, NS НИЗКОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ ГРИППА ПТИЦ.
SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES-PRIMERS USED TO OBTAIN NUCLEOTIDE SEQUENCES OF GENES PB2, PB1, PA, NP, MP, NS OF LOW PATHOGENIC AVIAN INFLUENZA VIRUSES

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в диагностических целях идентификации вируса гриппа птиц в вирусологии и ветеринарии, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению данного вируса
Вирусы гриппа птиц (вирус гриппа типа А; ВГП) (Orthomyxoviridae, Influenza virus А) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса. Геном вируса состоит из 8-ми сегментов, представленных одноцепочечными (-)РНК, и кодирующих 10 генов и 13 белков (В. W. Jagger, Н. М. Wise, J. С.Kash, К.-А. Walters, N. М. Wills, Y.-L. Xiao, R. L. Dunfee, L. M. Schwartzman, A. Ozinsky, G. L. Bell, R. M. Dalton, A. Lo, S. Efstathiou, J. F. Atkins, A. E. Firth, J. K. Taubenberger, P. Digard. An Overlapping Protein-Coding Region in Influenza A Virus Segment 3 Modulates the Host Response // SCIENCE. - 337. - 199-204). Вирусы гриппа типа А подразделяются на субтипы на основании антигенных свойств их поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящий момент известно 17 субтипов НА и 10 субтипов NA, все из которых были выделены от диких птиц, кроме субтипа H17N10, выделенного от летучих мышей (Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Mar 13; 109(11):4269-74).
Анализ известных аналогов. За рубежом для получения нуклеотидных последовательностей генов ВГП используется метод ОТ-ПЦР с ген-специфицными праймерами. Впоследствии, полученные в ходе данной реакции продукты используются в сиквенсовой реакции с использованием уже другого набора ген-специфических праймеров (Е. Hoffmann, J. Stech, Y. Guan, R. G. Webster, D. R. Perez. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses // Arch Virol. - 2001. - 146(12). - №2275-2289). Данный метод не только трудоемок, но и в связи с тем, что используемые в данном случае праймеры разработаны с учетом генетическом особенностей ВГП американской линии, не применим для получения нуклеотидных последовательностей вирусов евразийской линии. В связи с этим, для получения первичных последовательностей генов (РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS) ВГП нами были разработаны последовательности олигонуклеотидных праймеров, специфичных для ВГП евразийской линии. Кроме того, на 5'-конце разработанных нами праймеров имеется последовательность фага М13 - M13-F 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3', M13-R 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (Е. Ghedin, N.A. Sengamalay, М. Shumway, J. Zaborsky, Т. Feldblyum, V. Subbu, D. J. Spiro, J. Sitz, H. Koo, P. Bolotov, D. Dernovoy, T. Tatusova, Y. Bao,K. St. George, J. Taylor, D. J. Lipman, С.M. Fraser, J. K. Taubenberger, S. L. Salzberg. Large-scale sequencing of human influenza reveals the dynamic nature of viral genome evolution // Nature. - 2005. - 437. - 1162-1166), что в значительной мере упрощает и ускоряет процесс постановки сиквенсовой реакции, а также исключает недосеквенирования концевых последовательностей генов. Метод с использованием фрагментов генома фага М13 в последовательности праймеров ранее был разработан Е. Ghedin с соавторами и в настоящий момент применяется для получения последовательностей генов высокопатогенных ВГП H5N1 субтипа (http://gsc.jcvi.org/projects/msc/influenza/infl_a_virus/primers.shtml) и вируса гриппа человека рНШ1 (http://www.who.int/influenza/en/).
Задачей заявляемого изобретения является создание специфичного набора праймеров, содержащего пары олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров (F и R соответственно), позволяющих получать первичные последовательности полных генов вируса гриппа птиц для дальнейшего генетического анализа.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является набор праймеров, разработанных для получения первичных последовательностей генов РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS низкопатогенных вирусов гриппа птиц, циркулирующего на территории Евразийского континента. Уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР. Разработанные праймеры позволяют получить полную информацию о генах вирусов гриппа птиц, их принадлежности к той или иной генетической линии вируса, наличии нуклеотидных/аминокислотных замен в геноме патогена.
К моменту разработки нового заявляемого набора праймеров, опубликованных данных по молекулярно-генетическому изучению вирусов гриппа птиц, циркулирующих на территории Евразийского континента и России, в частности, не известно. Таким образом, заявляемый объект изобретения обладает критериями новизна, изобретательский уровень и промышленная применимость.
Методика конструирования заявляемых олигонуклеотидных праймеров
Разработка структуры олигонуклеотидных праймеров осуществлялась путем сравнения нуклеотидных последовательностей различных штаммов ВГП, выделенных на территории Евразии и Африки, и депонированных в международной базе данных GeneBank. Локализация в геноме позиций сконструированных олигонуклеотидных праймеров соответствует наиболее консервативным районам генов.
Апробация праймеров была осуществлена с использованием большого числа изолятов ВГП, выделенных от различных видов диких птиц на территории Западной Сибири и Дальнего Востока России, а также Монголии. Было показано, что применение данных праймеров для получения первичных последовательностей ВГП обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера в условиях ПЦР и секвенирующей реакций. Специфичность продуктов амплификации была подтверждена методом прямого секвенирования.
Характеристика набора праймеров и участков амплифицируемой геномной РНК
Праймеры фланкируют участки генов РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS низкопатогенных ВГП, кДНК каждого из которых не имеет полиндромных повторов нуклеотидов и не образует выраженных вторичных структур, не имеет протяженных G-C участков. Для пар праймеров расчетная температура плавления была близкой и составила Tm=50°С. Специфичность образующегося фрагмента кДНК устанавливали прямым секвенированием полученного фрагмента, что и было выполнено для некоторого количества штаммов и изолятов ВГП, выделенных в Новосибирской, Омской области и Алтайском крае. Изобретение иллюстрируется примерами, структура которых приведена в таблице 1.
Таблица 1
Структура олигонуклеотидных праймеров для получения первичных последовательностей генов РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS ВГП в образцах
№
Структура праймера (5'→3')
Локализация в геноме
Размер ампликона (п.н.)
1
TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCAAAAGCAGGGTAG CAGGAAACAGCTATGACCCTTGCATMAGRGAGCAC
NP-2F NP-551R
549
2
TGTAAAACGACGGCCAGTAAGAARACTGGRGGWCC CAGGAAACAGCTATGACCGGCARGCAKGAYTTATG
NP-313F NP-875R
562
3
TGTAAAACGACGGCCAGTAATTYCAAACAGCAGCAC
NP-730F
CAGGAAACAGCTATGACCCTTTTAGAAACAAGGGTATT
NP-1563R
833
4
TGTAAAACGACGGCCAGTAGCAAAAGCAGGGTGAC CAGGAAACAGCTATGACCTTATCATTCCATTCMAGT С
NS-1F NS-576R
575
5
TGTAAAACGACGGCCAGTTGGTWCATGCTNATGCC CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGGTGTT
NS-327F NS-890R
563
6
TGTAAAACGACGGCCAGTGCAGGTAGATRTGAAAG CAGGAAACAGCTATGACCCCAAAAGCMACTTYCGT
M-8F M-459R
451
7
TGTAAAACGACGGCCAGTAARAGRGARATAACATTC CA CAGGAAACAGCTATGACCGATCACTTGAATCGCTG
M-334F M-785R
451
8
TGTAAAACGACGGCCAGTATGGTGCAGRCRATGAG CAGGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGTAGTAG
M-658F M-1053R
395
9
TGTAAAACGACGGCCAGTAGCRAAAGCAGGTACTG CAGGAAACAGCTATGACCCTCTCYTCATCAAGRGT
PA-IF PA-523R
522
10
TGTAAAACGACGGCCAGTAAGATAAARTCHGARAAGAC CAGGAAACAGCTATGACCTGBTKGGCTCYTTCCA
PA-432F PA-990R
558
11
TGTAAAACGACGGCCAGTARGGRGARGGKATACC CAGGAAACAGCTATGACCTRGCWGCACARGATGC
PA-917F PA-1454R
537
12
TGTAAAACGACGGCCAGTCCDATTGARCAYATTGC CAGGAAACAGCTATGACCTKGAGCYTTCYTCCAC
PA-1339F PA-1922R
583
13
TGTAAAACGACGGCCAGTCARCARATTGARAGCATG CAGGAAACAGCTATGACCTTGGACAGTATGGATAGC
PA-1796F PA-2212R
416
14
TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCAAACCATTTGAATG CAGGAAACAGCTATGACCCCATTGATTCCATYACAT С
PB1-11F PB1-549R
538
15
TGTAAAACGACGGCCAGTCARACYTATGAYTGGAC CAGGAAACAGCTATGACCGTTATCATTGCYARAAACAT
PB1-404F PB1-974R
570
16
TGTAAAACGACGGCCAGTGSAATGARAARAARGCTA А
PB1-848F
CAGGAAACAGCTATGACCCARCTRAARTTGGCTAC
PB1-1547R
699
17
TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAYTTYGCYCTCAT
PB1-1358F
CAGGAAACAGCTATGACCYTGGTACATYTGYTCATC
PB1-2078R
720
18
TGTAAAACGACGGCCAGTCAGATGGRGGRCCAAA
PB1-1798F
CAGGAAACAGCTATGACCATTTTTTCAYGAAGGACA AG
PB1-2328R
530
19
TGTAAAACGACGGCCAGTGTCTCAGGKAGCRAAAG
PB2-4F
CAGGAAACAGCTATGACCTCCCARCAGGTYCCTT
PB2-761R
757
20
TGTAAAACGACGGCCAGTTTRATGGTKGCWTACATG
PB2-628F
CAGGAAACAGCTATGACCCYTATCATRCARTCCTC
PB2-1247R
619
21
TGTAAAACGACGGCCAGTAYGARGARTTYACAATGG
PB2-1106F
CAGGAAACAGCTATGACCTCCCADTTYCTRATGATC
PB2-1678R
572
22
TGTAAAACGACGGCCAGTAGTRGATGARTATTCCAG
PB2-1481F
CAGGAAACAGCTATGACCCRCCTGCRTCYTTTCC
PB2-2048R
576
23
TGTAAAACGACGGCCAGTTACCATTTGCRGCAGC
PB2-1882F
CAGGAAACAGCTATGACCGAAACAAGGTCGTTTTTAAA
PB2-2341R
459
Примеры 1-4 иллюстрируют алгоритм апробации сконструированных олигонуклеотидных праймеров на примере штамма A/teal/Chany/7119/2008(H15N4).
Пример 1. Выделение РНК ВГП из образцов вируссодержащей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов.
Для оценки эффективности использования нашего изобретения было исследовано 20 образцов вируссодержащей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов. О наличии в исследуемом материале ВГП судили на основании результатов метода ПЦР в режиме реального времени с использованием зонда (5'-FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-BHQ,-3') и пар праймеров на М ген (5'-TCGA AACGT ACGTTCTCTCTATC-3'), (5'-TGTCTTCAGCCАТТССATGAG-3'), длина фрагмента составляет 103 н.п. Постановка реакции осуществлялась согласно следующему протоколу:
0.5 pmol dNTPs
0.5 pmol смеси праймеров
0.5 pmol зонда
4
2
4
2
10 мкл 10х буфера (100mM TrisHCl (рН=8.9), 160 тМ (NH)SO, 0.5% Tween20, 25 mM MgCl)
0,5 о.е. Taq-ДНК полимераза (СибЭнзим, Россия)
Суммарный объем реакции доводили до 25 мкл водой (nuclease free).
ПЦР программа (52 цикла) включала следующие стадии:
1.Т=95°С,3 минуты,
2. Т=95°С, 40 секунд,
Т=58°С*, 30 секунд
Т=72°С, 30 секунд
Детектирование флуоресценции производилось на стадии отжига.
Для отслеживания наличия внутрилабораторной контаминации постановка реакции осуществлялась в присутствии отрицательного контроля. ПЦР проводили на амплификаторе IQCycler (BioRad, США).
В качестве положительного контроля был использован вирус A/gadwall/Altai/1202/2007(H5N2) (номера штамма в GenBank CY049753-CY049760).
Выделение РНК ВГП из вируссодержащей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов производили с использованием коммерческого набора Promega SV Total RNA Isolation Kit (Promega, США) согласно инструкции производителя.
Пример 2. Получение кДНК методом обратной транскрипции.
Постановка реакции обратной транскрипции производилась коммерческим набором M-MuLV Reverse Transcriptase (BioLabs Inc., США) согласно инструкции производителя и с использованием Random праймера (Fermentas, Литва).
Пример 3. Проведение полимеразной цепной реакции.
Постановка ПЦР осуществлялась с использованием коммерческого набора PyroStart Fast PCR Master Mix (2x) (Fermentas, Литва) и разработанных праймеров, специфичных на соответствующие гены. Использовали следующие параметры ПЦР: 96°С 30 с, затем 95°С 10 с, 50°С 30 с, 68°С 30 сек 35 циклов. Завершающий синтез проводили 10 мин 68°С. Полученные продукты реакции очищались с помощью гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле и 1х ТАЕ буфере. ДНК визуализировали после окраски бромистым этидием (Sigma, США) при освещении УФ-светом. Длина фрагментов продуктов реакции определялась в сравнении с используемым ДНК- маркером (Gene Ruler 100bp DNA Ladder Plus, Fermentas, Литва). Выделение фрагментов ДНК осуществлялось коммерческим набором QIAquick Gel Extraction Kit (Quagen, Германия) согласно инструкции производителя.
Пример 4. Определение нуклеотидной последовательности:
Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР фрагмента проводили на 3130×1 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, США) по методу Sanger et al., согласно инструкции к BigDye Terminator 3.1v Cycler (Applied Biosystem, США) с использованием универсальных праймеров М13 (M13-F 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3', M13-R 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'). Температура отжига праймеров составляет 50°С. Чистка секвенирующей реакции производилась коммерческим набором BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystem, США) согласно инструкции производителя. Нуклеотидные последовательности были проанализированы с использованием программы ContigExpress (Invitrogene Inc., США) и базы данных Influenza virus Recourse (NCBI, США).
Результат исследований: У полученных ПЦР-продуктов были определены нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности.
Специфичность набора праймеров была подтверждена при исследовании заведомо положительных образцов, прямым секвенированием полученного ПЦР-фрагмента. В таблице 2 приведены данные о происхождении образцов материала, для которых были определены нуклеотидные и выведены аминокослотные последовательности. На рисунке 1 приведена электрофореграмма, на которой изображены продукты ПЦР, полученные с использованием разработанных праймеров и их специфичности.
Таблица 2
Данные об образцах материала, в которых была обнаружена, выделена РНК ВГП и определена нуклеотидная последовательность генов вируса
№ п/п
Название штамма
Номера последова тельностей
Ген
Длина
Вид животного
гена
(GenBank)
(п.н.)
1.
A/teal/Chany/7119/2008(H 15N4)
CY098537
PB2
2280
Чирок свистунок (Anas crecca)
2.
A/teal/Chany/7119/2008(H15N4)
CY098538
PB1
2274
Чирок свистунок (Anas crecca)
3.
A/teal/Chany/7119/2008(H15N4)
CY098539
PA
2151
Чирок свистунок (Anas crecca)
4.
A/teal/Chany/7119/2008(H15N4)
CY098541
NP
1497
Чирок свистунок (Anas crecca)
5.
A/teal/Chany/7119/2008(H15N4)
CY098543
MP
982
Чирок свистунок (Anas crecca)
6.
A/teal/Chany/7119/2008(H15N4)
CY098544
NS
844
Чирок свистунок (Anas crecca)
7.
A/teal/Chany/444/2009(H8N8)
CY098521
PB2
2295
Чирок свистунок (Anas crecca)
8.
A/teal/Chany/444/2009(H8N8)
CY098522
PB1
2274
Чирок свистунок (Anas crecca)
9.
A/teal/Chany/444/2009(H8N8)
CY098523
PA
2151
Чирок свистунок (Anas crecca)
10.
A/teal/Chany/444/2009(H8N8)
CY098525
NP
1497
Чирок свистунок (Anas crecca)
11.
A/teal/Chany/444/2009(H8N8)
CY098527
MP
992
Чирок свистунок (Anas crecca)
12.
A/teal/Chany/444/2009(H8N8)
CY098528
NS
870
Чирок свистунок (Anas crecca)
На рисунке 1 приведена электрофореграмма ПЦР продуктов, полученных при использовании разработанных пар праймеров на гены РВ2, РВ1, PA, NP, MP, NS. Дорожки 1-23 соответствуют ПЦР продуктам, полученным с кДНК вируса A/teal/Chany/7119/2008(H15N4), и соответствуют нумерации фрагментов, указанных в таблице 1. Дорожка L - ДНК маркер (Gene Ruler 100bp DNA Ladder Plus).
При исследовании отрицательных контрольных образцов положительных результатов получено не было.
Разработка заявленного набора праймеров позволила получить данные о некоторых генетических характеристиках ВГП, циркулирующих на территории Западной Сибири, Дальнего Востока России и Монголии среди диких птиц.