СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕТА-КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ КРОЛИКОВ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ВЫРАБОТКИ СОБСТВЕННОГО ИНСУЛИНА У ПАЦИЕНТА
METHOD FOR PRODUCING RABBIT PANCREATIC BETA CELLS AND COMPOSITION FOR STIMULATING NATURAL INSULIN DEVELOPMENT IN PATIENT

Это изобретение имеет отношение к способу клеточной терапии и композиции для трансплантации бета-клеток островков, изолированных из поджелудочных желез животных и выращенных в культуре, для стимуляции образования собственного инсулина у людей с диабетом.
Предшествующий уровень техники
Более одного миллиона американцев страдает диабетом 1-го типа. Диабет 1-го типа представляет собой наиболее тяжелую форму заболевания диабетом, при которой иммунная система организма атакует продуцирующие инсулин клетки, необходимые для поддержания сахара в крови на нормальном уровне. Известно, что очень низкий сахар в крови может приводить к судорожным припадкам, расстройству познавательной способности или бессознательному состоянию. В наиболее тяжелых случаях осложнения недостаточно хорошо поддаются контролю с помощью инсулина.
В идеале, замещение клеток, продуцирующих в поджелудочной железе инсулин, может освободить диабетиков от пожизненных инъекций инсулина и эффективно лечить заболевание. Трансплантация этих “островковых” клеток в настоящее время может быть проведена двумя способами: путем трансплантации целой поджелудочной железы или с помощью менее инвазивного и менее дорогостоящего способа инъекции только клеток островков. Было показано, что успешная трансплантация поджелудочной железы эффективна для значительного улучшения качества жизни людей с диабетом, главным образом, путем устранения необходимости в экзогенном инсулине и в частом ежедневном измерении уровня глюкозы в крови (Pancreas Transplantation for Patients with Type I Diabetes. Diabetes Care. 25 (Supplement I): S111. January, 2002). Однако трансплантаты поджелудочной железы требуют пожизненной иммуносупрессивной терапии для предотвращения отторжения имплантата и возможного рецидива автоиммунного процесса, который может привести к разрушению клеток панкреатических островков.
Показано, что трансплантация бета-клеток островков от донорских поджелудочных желез стимулирует выработку собственного инсулина у пациентов с диабетом 1-го и 2-го типа (смотри Sperling, M.A. Type I Diabetes: Etiology and Treatment. Totowa, NJ: Humans Press Inc. 2003. p.529-552; Insulin Therapy. In: Edelman, S.V. and Henry, R.R. Diagnosis and Management of Type 2 Diabetes. Caddo, OK: Professional Communications, Inc. 2002. p.121-148). Трансплантация островковых клеток может быть проведена в виде чрескожной минимально инвазивной процедуры, при которой клетки островков вводят в печень через воротную вену. Однако, так же как и другие пациенты, прошедшие трансплантацию, реципиенты клеток островков должны принимать иммуносупрессоры, лекарственные средства, предотвращающие отторжение чужеродных клеток.
Было исследовано и показано, что ксеноимплантаты или ксенотрансплантаты островковых клеток, полученные от свиньи или быков, требуют подавления иммунитета.
Способность выращенных в культуре бета-клеток поджелудочных желез новорожденных кроликов выживать и активно функционировать в организме ксеногенного реципиента была показана нами в экспериментах на крысах с экспериментально индуцированным сахарным диабетом. (Skaletsky N.N. и другие. 1994 (4)). Был обнаружен выраженный и долговременный (продолжительность эксперимента - 8 недель) антидиабетический эффект ксенотрансплантации культур клеток островков как в случае введения в брюшную полость и в селезенку, так и в случае введения их в поперечную брюшную мышцу. После экспериментов проводят гистологические тесты, с помощью которых в месте введения ксенотрансплантатов обнаруживают клетки островков с сохраненной структурой и без признаков клеточной иммунной реакции. В то же время обнаруживают ясные признаки регенерации собственных бета-клеток в поджелудочных железах животных-реципиентов. Помимо четко установленного эффекта снижения сахара, четко установленного лечебно-профилактического эффекта, в ходе экспериментов было отмечено влияние ксенотрансплантации культур клеток островков на характерное позднее осложнение диабета - нефропатию (Skaletskaya G.N. и другие (2005 (4)).
В патенте Skaletsky и соавт. RU 2135193 раскрыто получение бета-клеток островков из поджелудочных желез новорожденных кроликов и способы их трансплантации. Бета-клетки получают путем миграции из фрагментов панкреатической железы методом культивирования, при котором необходимо добавление сыворотки в культуральную среду.
Таким образом, несмотря на текущие разработки, необходимы клетки островков из различных источников, которые не требуют иммуносупрессии.
Все ссылки, процитированные в этом документе, включены в настоящий документ путем отсылки во всей своей полноте.
Сущность изобретения
Таким образом, один из аспектов изобретения включает способ получения бета-клеток островков из поджелудочных желез кроликов, способ, включающий: (а) сбор указанных поджелудочных желез новорожденных кроликов и помещение поджелудочных желез в солевой раствор, включающий антибиотик при температуре, равной 4-10°С; (b) получение измельченных микрофрагментов поджелудочной железы из указанных поджелудочных желез; и (с) инкубацию указанных измельченных микрофрагментов поджелудочной железы в свободной от сыворотки среде при первой температуре инкубации от 36,6°С до 37°С в течение первого инкубационного периода и периодическую смену свободной от сыворотки среды и удаление спонтанно разрушенных нежелательных клеток, включающих экзокринные клетки, клетки крови и элементы соединительной ткани до тех пор, пока, по меньшей мере, 80% оставшихся клеток не будут представлять собой бета-клеток островков; (d) и инкубацию указанных измельченных микрофрагментов поджелудочной железы в указанной свободной от сыворотки среде при второй температуре инкубации от 22°С до 29°С в течение второго периода инкубации до тех пор, пока, по меньшей мере, 78-90% оставшихся клеток не будут представлять собой бета-клеток островков, при которой указанную свободную от сыворотки среду необязательно периодически заменяют и, таким образом, получают бета-клетки островков.
Другой аспект изобретения включает композицию, включающую бета-клетки островков, полученные из поджелудочных желез кроликов, в которой бета-клетки островков изолируют, следуя выбранному температурному режиму инкубации измельченных микрофрагментов поджелудочной железы, полученных из указанных поджелудочных желез кролика, и культивируют в свободной от сыворотки среде в соответствии с описанным выше способом изобретения, и в которой изолированные бета-клетки островков получают в количестве, равном 1500000±100000, и эти бета-клетки обладают жизнеспособностью, равной, по меньшей мере, 80%, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель, пригодный для этого изобретения, может включать любое подходящее вещество, такое как жидкости, гели и твердые вещества, которые могут быть объединены с композицией и признаны безопасными для введения млекопитающим.
В некоторых воплощениях композиция включает, по меньшей мере, 50% бета-клеток островков.
В некоторых воплощениях композиция включает, по меньшей мере, 78% бета-клеток островков.
Другой аспект изобретения включает применение композиции, такой как была описана выше, для усиления стимуляции выработки собственного инсулина, способ, включающий: получение композиции по п.6, которая включает бета-клетки островков, изолированные из поджелудочных желез кролика и выращенные в культуре; и введение композиции по п.6 субъекту, нуждающемуся в инсулине, и, таким образом, стимулируя выработку собственного инсулина.
Осуществление изобретения
Способ культивирования изобретения включает применение выбранного температурного режима инкубации для измельченных и культивируемых в свободной от сыворотки среде микрофрагментов поджелудочной железы, полученной от кролика. Следуя способу изобретения, получают чистый препарат жизнеспособных и активных бета-клеток островков, которые можно успешно трансплантировать пациентам-диабетикам без применения какой-либо иммуносупрессии.
Способ культивирования изобретения обеспечивает благоприятные условия для панкреатических бета-клеток и создает неблагоприятные условия для балластных и иммуногенных клеток (так называемых клеток-«пассажиров»), таких как, например, экзокринные, эндотелиальные, дендритные клетки и лимфоциты. Элиминация всех этих клеток-«пассажиров» обеспечивает существенное снижение иммуногенности культивированных клеток островков. Вопреки общераспространенному мнению, согласно которому длительное культивирование клеток требует введения в культуральную жидкость добавки в виде сыворотки, автор изобретения обнаружил, что применение свободной от сыворотки среды в способе изобретения способствует росту желательных бета-клеток островков и не способствует росту нежелательных клеток-«пассажиров» и, следовательно, обеспечивает жизнеспособные и активные бета-клетки островков в количестве, представляющем коммерческий интерес, при котором такая клетка в значительной степени свободна от нежелательных клеток-«пассажиров».
Не будучи связанными определенной теорией, авторы изобретения полагают, что также имеет место нарушение прочности сцепления поверхностных антигенов, поскольку существует поразительное отсутствие иммунной реакции, несмотря на отсутствие какого-либо типа иммуносупрессивной терапии ни перед, ни после клинической ксенотрансплантации островковых клеток. Поскольку высокочистая культура бета-клеток, полученная с помощью способа изобретения, не содержит клетки, имеющие отношение к донорским сосудам, то не происходит отторжения ксенотрансплантированных бета-клеток.
2
2
Авторами изобретения была открыта синергическая комбинация клеток, растворов и условий. Это открытие было усовершенствовано путем изменения окружающих условий, например, помещение культуры в О-инкубатор вместо инкубатора с 5%-ным СО, вариациями температуры и временных интервалов в инкубаторе в период от 10 до 14 дня. Никаких генетических манипуляций не применяли.
2
2
Теперь будут подробно описаны методика культивирования и приемы внутримышечной трансплантации культуры островковых клеток. Кроликов забивают с помощью погружения в 40-96%-ный этанол, предпочтительно в 70%-ный этанол до тех пор, пока не была зарегистрирована смерть, например, в течение до 10 мин, предпочтительно 7-8 мин. Из брюшной полости новорожденного кролика в стерильных условиях извлекают поджелудочную железу (термин “новорожденный”, как он применен в настоящем документе, означает кроликов от момента рождения до кроликов 5 дней жизни, которых не кормили грудным молоком, предпочтительно «новорожденный» означает кроликов до 12 часов от роду) и немедленно помещают в чашку Петри с холодным (например, 4-6°С) солевым раствором Хэнкса или с физиологическим раствором (NaCl) и с антибиотиками (например, пенициллин 1000 Ед./мл и стрептомицин 10000 мг/мл). С помощью глазных пинцетов удаляют оболочку поджелудочной железы, сосуды и выводные протоки. Затем поджелудочные железы нарезают с помощью глазных ножниц на микрофрагменты размером, равным примерно 2-3 мм, и затем переносят на специальное часовое стекло. Описанным выше способом обрабатывают 18-20 поджелудочных желез. Затем микрофрагменты поджелудочных желез измельчают с помощью глазных (для роговицы) ножниц до еще более мелких фрагментов, то есть измельченных микрофрагментов поджелудочной железы. Полученные измельченные микрофрагменты поджелудочной железы промывают холодным раствором Хэнкса и помещают в культуральные флаконы или бутыли (например, объемом в 75 см, «Corning-Costar»), распределяя их по поверхности дна флакона. Через 5-7 минут, за это время происходит прикрепление микрофрагментов к пластику, во флакон заливают свободную от сыворотки среду роста, питательную среда 199 («Sigma Aldrich») без добавления сыворотки (например, 10% от объема флакона). Затем флакон помещают в инкубатор с подачей 0-5%-ного СО, и панкреатическую ткань инкубируют при 36-37,5°С (первая температура инкубации), предпочтительно, 36,6-37°С в течение 6-10 дней, предпочтительно, 7-8 дней (первый период инкубации). Каждые 1-2 дня флаконы с культивируемыми клетками осматривают с помощью инвертированного микроскопа и удаляют спонтанно разрушившиеся экзокринные клетки поджелудочной железы, клетки крови и элементы соединительной ткани; питательную среду 199 заменяют свежей средой роста. В результате первого периода инкубации на дне флакона формируются кластеры островковых клеток и, по меньшей мере, 78% из них (согласно специфическому окрашиванию) представляют собой панкреатические бета-клетки.
Для окончательной очистки от балластных клеточных элементов, инициирующих иммунную реакцию (например, от лейкоцитов-«пассажиров»), культуральные флаконы помещают в инкубатор при температуре, изменяющейся от 22 до 29°С (вторая температура инкубации), в течение 4-5 дней (второй период инкубации). Было обнаружено, что при второй температуре инкубации, равной 24°С, достигают наилучших результатов, и бета-клетки содержат наименьшее количество клеток-«пассажиров». После того как культура будет состоять только из клеток островков, 78-90% бета-клеток могут быть трансплантированы пациентам-диабетикам. В дополнение к клеткам островков в культуре обнаруживают единичные фибробласты, но их доля обычно не превышает 1-5%. Остальные клетки культуры обычно представляют собой клетки эпителиального происхождения и составляют 5-17%, их наличие подтверждают с помощью иммуногистохимического окрашивания (с моноклональными антителами к белку цитокератин 18); но они не являются бета-клетками, поскольку в этих клеточных структурах не обнаруживают присутствия инсулина.
Одна доза культуры островковых клеток, предпочтительно содержащая 1400000-1600000 клеток в стерильной суспензии в солевом растворе Хэнкса (объем 10-15 мл, не черепной, все клетки полученные), может быть помещена в пластиковую пробирку, промаркированную соответствующим образом.
Культура островковых клеток, созданная в соответствии со способом изобретения (также обозначаемая в этом документе как бета-клетки Филадельфийского медицинского научного центра (Philadelphia Medical Scientific Center) или BCPMSC), имеет следующий клеточный состав:
Общее количество клеток:
1500000±100000
Бета-клетки
82±8% (по меньшей мере, 50%)
Другие клеток островков
+30
9+2%
Фибробласты
+30
2+1%
Предшественники клеток островков (стволовые клетки островков)
+30
7+3%
Культивирование проводят в свободной от сыворотки среде роста 199.
Время хранения клеток BCPMSC:
при 4-10°С в течение 72 часов
при 11-24°С в течение 48 часов
при 30-37°С в течение 12 часов.
Дозу культуры островковых клеток получают из 80 поджелудочных желез 1-2-дневных новорожденных кроликов.
Продолжительность культивирования - 14-21 дней.
Предпочтительно, чтобы жизнеспособность клеток была равна 82% или более.
В контрольной инкубации культивируемых клеток островков базальную секрецию инсулина делают равной 8400±1200 мкЕд./мл/час, стимулированную - 16500±2700 мк Ед./мл/час.
Способ культивирования изобретения исключает заражение культуры микроорганизмами (например, бактериями, грибами, микоплазмой и вирусами).
Каждая доза сопровождается описывающим препарат сертификатом, который обладает всей необходимой информацией о BCPMSC. Критерий для изоляции или элиминации заболевших животных; как только устанавливают заболевание, при первом признаке любого заболевания животное помещают в карантин и никогда не возвращают обратно в колонию из карантина.
Полученная культура может быть трансплантирована реципиенту, например, пациенту с сахарным диабетом (DM). Трансплантат (ксеноимплантат) или инъекция могут быть введены различными способами, например, с помощью инъекции в печень (то есть непосредственно в печеночную паренхиму или через воротную вену), в мякоть селезенки, в селезеночную артерию, в специально сформированный карман большого сальника с помощью лапароскопической технологии и внутримышечно. Предпочтительный способ введения культуры представляет собой введение в прямую мышцу живота пациента.
МЕТОДИКА ТРАНСПЛАНТАЦИИ
Суспензию островковых клеток набирают в шприц через иглу для инъекций, предпочтительно, не менее чем 7 см в длину и не менее чем 1 мм в диаметре, и вводят в прямую мышцу живота после местной анестезии. Предпочтительно, место инъекции должно быть закрыто стерильной повязкой.
ПРОВЕРКА СНИЖЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ КУЛЬТУРЫ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК
Данные in vitro: различные гистологические эксперименты, включая световую и электронную микроскопию; иммуногистохимические исследования, описанные выше, показывают, что в чистой культуре отсутствуют так называемые лейкоциты-«пассажиры» (лимфоциты, макрофоги и т.д.), способные инициировать иммунную реакцию после процедуры (9-12 месяцев). Данные in vivo: ксенотрансплантация культуры островковых клеток крысам с экспериментальным диабетом приводит к ремиссии диабетического состояния, по меньшей мере, в течение 30 дней.
Для изучения иммуногенности клеток, которые находятся в культуре, полученной с помощью описанного выше способа из поджелудочной железы новорожденных кроликов, проводят эксперименты для определения фиксации на них иммуноглобулинов сыворотки человеческой крови. Клетки после инкубации с различными сыворотками из человеческой крови окрашивают с помощью моноклональных антител к человеческим имуноглобулинам и анализируют на проточном флуориметре. Было обнаружено, что находящиеся в культуре клетки способны к фиксации на своей поверхности иммуноглобулинов М, но не было обнаружено фиксации иммуноглобулина G.
Для трансплантации культуры островковых клеток рекомендуется надлежащая подготовка пациентов с диабетом. Перед лечением с помощью трансплантата пациент-диабетик должен достичь настолько хорошего гликемического состояния, насколько это возможно с помощью интенсивной терапии инсулином. Перед трансплантацией клеток пациенты не должны иметь ни вакцинаций, ни сывороточной терапии в течение 4 недель. Клинические исследования должны включать консультации офтальмологов, нефрологов, неврологов, сосудистого хирурга, дерматолога, специалиста по диабету и консультации других специалистов, имеющих отношение ко вторичным осложнениям диабета.
Пациент может быть подготовлен для островковой ксенотрансплантации клеток следующим образом:
1. Элиминация кетоацидоза, частой гипогликемии или гиперосмолярности путем госпитализации, для того чтобы клиническое состояние пациента было скомпенсировано, насколько это возможно;
2. Максимальная компенсация диабетического состояния, стабилизация сахара в крови в рамках нормы или близко к нормальному уровню с помощью соответствующей терапии инсулином при постоянном самоконтроле гликемии;
3. Уклонение от вакцинаций или сывороточной терапии в течение 4 недель перед трансплантацией клеток.
У пациентов до и после ксенотрансплантации островковых клеток следует наблюдать за следующими показателями и с такой частотой, как указано далее.
Общие:
1. Уровень HBA-lc (гликозилированный гемоглобин), каждые 3 месяца;
2. Уровень С-пептида (базальный и стимулированный), каждые 3 месяца;
3. Детекция автоиммунных антител; антител к GAD, антител к инсулину, антител к ICA.
4. Сывороточный холестерин и триглицериды, каждые 3 месяца.
5. Домашний самоконтроль уровня глюкозы в крови (с записями результатов в дневнике), несколько раз в день.
6. Коррекция потребности в инсулине (с учетом в дневнике).
Специальные:
Диабетическая ретинопатия:
1. Стандартное исследование сетчатки глазного дна путем фотографирования с помощью стереоофтальмоскопа для глазного дна и флуоресцентной диагностики, каждые 3 месяца.
2. Проверка зрения, каждые 3 месяца. Диабетическая нефропатия:
1. Протеинурия/24 ч, один раз в месяц.
2. Микроальбуминурия, каждые 3 месяца.
3. Креатинин в сыворотке, каждые 3 месяца.
4. Клиренс креатинина, каждые 3 (6) месяцев.
5. Измерение кровяного давления, один раз в неделю.
Диабетическая нейропатия:
1. ЭМГ, каждые 3 месяца;
2. Исследования проводимости нервов, большеберцового нерва; икроножного нерва; срединного нерва - каждые 3 (6) месяца.
3. Шкала аналогов боли, один раз в месяц.
4. Ортостатические изменения - один раз в месяц.
5. Изменения r-r-интервалов на ЭКГ - каждые 3 месяца.
Диабетическая васкулопатия:
1. Доплеровское УЗИ, каждые 3 (6) месяцев.
2. Доплеровское обследование.
3. Доплеровское измерение кровяного давления лодыжка/плечо.
4. Доплеровское сегментарное измерение кровяного давления.
5. Изменение в плетизмограмме.
Как было показано с помощью биохимических и морфологических исследований, культуры панкреатических островковых клеток, полученные с помощью описанных способов, обладают высокой секреторной активностью и резко сниженным иммуногенным (иммунологическим) потенциалом. Сертификат качества предпочтительно прикрепляют к каждой порции клеток, созданных для клеточной терапии.
ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ ДЛЯ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУРЫ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК
Типичные показания: (а) неустойчивое течение инсулинозависимого сахарного диабета (IDDM) с тенденцией к гипогликемическому состоянию и/или кетоацидозу, (b) неспособность достигнуть удовлетворительной компенсации IDDM с помощью обычных способов; инсулинорезистентность, (с) вторичные осложнения сахарного диабета у пациентов с IDDM и NIDDM (нейропатия, нефропатия, ретинопатия, ангиопатия нижних конечностей и т.д.), исключая терминальные стадии заболевания, и (d) IDDM (инсулинозависимый диабет) и NIDDM (инсулиннезависимый диабет) без обнаружения вторичных осложнений - в целях профилактики.
В. Противопоказания: острые инфекционные и воспалительные заболевания или обострение хронических заболеваний; онкологические заболевания.
НАБЛЮДЕНИЕ ЗА ПАЦИЕНТАМИ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУРЫ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК
В течение первого года после трансплантации рекомендуют описанное выше обследование через 3, 6, 9 и 12 месяцев.
У большинства реципиентов на 1-3-м месяце после ксенотрансплантации обнаруживают следующие изменения:
1. Лабильный диабет 1-го типа, текущий или предшествовавший XT, стабилизируется.
2. Исчезает склонность пациентов к кетозу.
3. Улучшаются характеристики обмена углеводов (а именно снижается среднесуточная гликемия - на 1-2-м месяце, снижается содержание гликозилированного гемоглобина - на 3-м месяце).
4. Снижение потребности в экзогенном инсулине (на 20-30%).
5. Улучшаются характеристики метаболизма липидов.
6. Реципиенты, у которых отсутствовала остаточная секреция инсулина собственными бета-клетками (а именно не определялся С-пептид), начинают вырабатывать инсулин (появлялся С-пептид).
7. У пациентов с сенсомоторной нейропатией исчезают боль и парестезия; улучшаются характеристики чувствительности и проводимости волокон периферической нервной системы. У пациентов с вегетативной нейропатией, находящихся под гликемическим контролем, с постуральной артериальной гипотензией, с парезом желудка и энтеропатией (диареей), нормализуются характеристики пульса и кровяного давления, также нормализуются функции желудка и кишечника.
8. При диабете 1-го типа у пациентов, находящихся на стадии выраженной диабетической нефропатии (классификация по С.Morgensen), снижается и исчезает протеинурия, снижается и нормализуется высокое кровяного давления. У пациентов с 3-й стадией диабетической нефропатии снижается или становится нормальной микроальбуминурия (менее чем 30 мг/день).
9. У пациентов, находящихся на стадии непролиферативной диабетической ретинопатии и на стадии, предшествующей пролиферативной стадии диабетической ретинопатии, клиническая картина глазного дна стабилизируется, у значительной части реципиентов происходит ее улучшение: кровоизлияния прекращаются, снижается гипостаз сетчатки.
Стабилизация течения сахарного диабета и снижение потребности в экзогенном инсулине является результатом соответствующего функционирования трансплантированных клеток островков и частичного восстановления или усиления функции клеток островков поджелудочной железы реципиента.
Полагают, что лечебный эффект трансплантированной культуры клеток на поздние диабетические осложнения, по-видимому, объясняется восстановлением или усилением секреции С-пептида как трансплантированными, так и собственными бета-клетками пациента, который вырабатывается вместе с инсулином и обладает заметным ангиопротекторным эффектом.
Согласно гипотезе развития микроангиопатии, которая является основой всех диабетических осложнений, она связана с недостатком С-пептида и некоторых других гормоноподобных веществ, вырабатываемых бета-клетками, которые отсутствуют в подавляющем большинстве случаев у пациентов с диабетом 1-го типа.
Инъекция С-пептида пациентам с осложненным сахарным диабетом 1-го типа приводит к регрессу вторичных диабетических осложнений, таких как нефропатия, ретинопатия и нейропатия.
Трансплантированные бета-клетки кролика вырабатывают нормальный С-пептид, который имеет физиологическое влияние на поздние диабетические осложнения.
Таблица 1 демонстрирует улучшение гликемического контроля и падение потребности в инсулине после ICCXT (убедительно подтверждено документальными доказательствами в 112 случаях).
Таблица 1
Параметр
Перед XT
Через 3 месяца
Через 6 месяцев
Через 9 месяцев
Через 12 месяцев
Среднесуточный уровень гликемии, мг/дл
198+41
158+52
129+23
133+30
142+34
HbAlc, %
10,1+2,1
9,1+1,2
7,7+1,9
6,9+1.1
7,5+1,9
Доза инсулина, IU
56+11
38+15
25+12
32+9
40+8
Таблица 2 демонстрирует уровень потребности в инсулине (IU/день) и уровень микроальбуминурии (мг/день) после повторных ICC XT у пациента Ts.S (возраст - 33 года, продолжительность DM 1-го типа - 18 лет)
Таблица 2
XT
Параметр
Перед XT
Через 3 месяца
Через 6 месяцев
Через 9 месяцев
Через 12 месяцев
1-я
Доза инсулина
64
33
38
40
48
Микроальбуминурия
936
680
348
330
496
2-я
Доза инсулина
52
38
24
26
38
Микроальбуминурия
660
377
189
199
167
3-я
Доза инсулина
42
38
25
32
40
Микроальбуминурия
330
145
99
112
88
4-я
Доза инсулина
40
34
20
16
16
Микроальбуминурия
66
45
34
40
39
Основные преимущества трансплантации клеток островков по сравнению с обычной терапией сахарного диабета 1-го типа заключаются в следующем:
В результате регулярно проводимых трансплантаций все реципиенты демонстрируют снижение в развитии диабетической ангиопатии и обратимость начальных стадий поздних диабетических осложнений (ретинопатии, нефропатии, нейропатии и ангиопатии), эти процессы невозможно достичь с помощью обычной терапии (инъекция инсулина при самоконтроле уровня гликемии и традиционное лечение ангиопатии).
Это происходит, главным образом, потому, что трансплантированные бета-клетки, после того как трансплантат прижился (был принят), начинают вырабатывать в организме реципиента ангиопротекторную субстанцию, С-пептид, по которому пациент был обеднен в результате коллапса его собственных бета-клеток (в результате автоиммунной атаки).
Способность культур панкреатических островковых клеток, полученных с помощью способа изобретения из поджелудочной железы новорожденных кроликов, выживать и функционировать в окружении in vivo была продемонстрирована нами в экспериментах по ксенотрансплантации такой культуры животным с экспериментальным сахарным диабетом.
В качестве экспериментальных животных применяли получавших регулярное кормление крыс-самцов линии Вистар с массой тела, равной 180-220 г.
Экспериментальный сахарный диабет вызывали с помощью подкожного введения аллоксана (доза 200 мл на 1 кг массы тела) или с помощью подкожного введения стрептозотоцина (доза 60 мл/кг).
При проведении экспериментов и для контроля мы применяли только крыс с аллоксаниндуцированным или стрептозотоцининдуцированным диабетом, таких, у которых уровень гипогликемии натощак был равен 20 ммоль/л и выше. Ранее проведенные тесты показали, что у таких животных не происходит спонтанного обращения экспериментального сахарного диабета.
После трансплантации культуры P.I.C. у 88 из 104 крыс со стабильной или тяжелой формой аллоксаниндуцированного сахарного диабета (почти 85%) наблюдали устойчивую ремиссию диабетического состояния вплоть до конца экспериментального периода (20 недель). В крови животных-реципиентов регистрировали устойчивое снижение сахара в крови почти до нормального уровня. В то же время исчезали также характерные клинические симптомы диабета (такие как потеря массы тела, полидипсия, полиурия). Антидиабетический эффект ксенотрансплантации был ясно продемонстрирован как в случае введения культур в печень (через воротную вену или непосредственно в паренхиму печени), а также в селезенку (культуры вводят внутрь пульпы), так и в случае введения через брюшные мышцы. У крыс с ремиссией экспериментального диабета в местах имплантации даже через 8 недель после ксенотрансплантации обнаруживают P.I.C. с сохраненной структурой и с признаками секреторной активности.
В ходе специальных серий экспериментов была показана несомненная роль предварительного культивирования P.I.C. в условиях in vitro в выживании клеток в организмах ксеногенных реципиентов. Для этой цели мы провели сравнительный анализ результатов ксенотрансплантации культур P.I.C. поджелудочной железы эмбриона человека и ксенотрансплантации некультивированной ткани эмбриональных островков крысам с экспериментальным сахарным диабетом. Было обнаружено, что снижающий сахар эффект более выражен и продолжителен в случае трансплантации предварительно культивированных Р.Т.С. по сравнению с трансплантацией некультивированной ткани поджелудочной железы, последняя приводит только к краткосрочной ремиссии диабетического состояния. Таким образом, было экспериментально подтверждено, что иммуномодулирующий эффект культивирования in vitro приводит к значительному росту продолжительности способности к выживанию в организме чужеродного реципиента.
Поджелудочные железы от 18 крыс-реципиентов, которым была проведена успешная ксенотрансплантация культур поджелудочной железы новорожденных кроликов, исследуют гистологическими методами на 8 неделе после трансплантации. Для этой цели фрагмент поджелудочной железы фиксируют в растворе Буэна и погружают в парафин. Тонкие срезы (толщиной 5-7 мкм) окрашивают гематоксилином и эозином, а также альдегид-фуксином для обнаружения β-клеток. В то же время тщательно обследуют поджелудочные железы от 6-ти контрольных животных, которым не проводили лечения аллоксаниндуцированного диабета, а также поджелудочные железы от 6-ти здоровых крыс (аллоксан не вводили).
При исследовании поджелудочных желез здоровых интактных крыс, как ожидалось, примерно 45-76% β-клеток обнаруживают в островках Лангерганса. У крыс, которым не проводили лечения аллоксаниндуцированного диабета, резко снижалось количество β-клеток в островках - в среднем на 8,3±1,1%.
У крыс-реципиентов обнаруживают значительно большее количество β-клеток в островках. У животных, которых подвергали ксенотрансплантации культуры P.I.C., в их собственных поджелудочных железах обнаруживали типичных β-клетки, и их доля среди “островковых” клеток равна от 10 до 55% (примерно от 7 до 21%) (среднее значение 23,5+8,8).
В отношении этих экспериментов мы можем заключить, что антидиабетический эффект ксенотрансплантации культуры ОК на развитие экспериментального диабета у крыс осуществляется двумя основными путями: а) функционирование трансплантированных β-клеток, дополнительно подтвержденное выраженным снижающим сахар эффектом, а также обнаружением групп трансплантированных P.I.C. в пульпе селезенки животных-реципиентов; b) стимулирующий эффект трансплантации P.I.C. культуры на аппарат островков поджелудочной железы крыс-реципиентов, возможность существования которого подтверждена данными гистологических исследований, с помощью которых очень часто выявляют наличие островков с нормальными β-клетками и большей их долей в островках поджелудочной железы крыс-реципиентов по сравнению с крысами с аллоксаниндуцированным диабетом, которых не повергали лечению.
Успешное экспериментальное исследование стало основой для проведения клинической трансплантации культур поджелудочной железы новорожденных кроликов пациентам с диабетом 1-го типа.
КЛИНИЧЕСКАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КУЛЬТУРЫ P.I.C., ПОЛУЧЕННОЙ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛИКОВ
Всего 112 пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (IDDUM) находилось под надежно документально подтвержденным динамическим наблюдением.
Из этих 112 пациентов 58 были мужчинами и 54 женщинами. Возраст пациентов на момент трансплантации варьировал от 16 до 53 лет - в среднем 35 лет.
Известно, что тяжесть проявления вторичных осложнений диабета в значительной степени зависит от длительности заболевания IDDM. По общему мнению, разрушение собственных β-клеток пациента в результате аутоиммунного процесса начинается приблизительно на 5-й год после обнаружения заболевания. Вторичные осложнения диабета обычно обнаруживают у пациентов с длительности заболевания более чем 10 лет. По этой причине всех IDDM-пациентов разделяют на 3 группы по длительности заболевания: а) от 1 года до 5 лет - 16 человек; b) от 6 до 10 лет - 43 человека, с) более чем 10 лет - 53 пациента. Всех пациентов обследовали с целью определить особенности развития IDDM и установить наличие осложнений диабета.
Обычно культуры, полученные с помощью описанного выше способа из 50-60 поджелудочных железы 1-2-дневных новорожденных кроликов, применяют для трансплантации одному пациенту. Суспензию обычно вводят в поперечную мышцу брюшной стенки под местной анестезией. Никакой иммуносупрессии не применяют.
Наиболее важный факт, подтверждающий антидиабетический эффект при трансплантации клеток островков только из-за функционирования трансплантированных бета-клеток, это факт их обнаружения на месте введения трансплантата. Если после внутрибрюшинной трансплантации практически невозможно локализовать в брюшной полости введенные клетки, то после введения в селезенку это возможно, хотя и сложно.
Была получена микрофотография окрашенного гистологического среза через пульпу селезенки, на которой ясно виден трансплантат, представленный группой эпителиальных клеток в центре фотографии. Уверенность в том, что эти клетки действительно представляют собой трансплантат, частично основана на том факте, что эпителиальные структуры отсутствуют в ткани селезенки.
Таким образом, присутствие эпителиальных клеток в линейной пульпе подтверждает тот факт, что это “пришелец извне”, в данном случае - трансплантат.
На основании результатов научных экспериментальных исследований можно сделать несколько основных заключений:
1. Действие стрептозотоцина (Stz), в основном, отражается в разрушении бета-клеток островков поджелудочной железы, но в то же время непосредственно или опосредованно он приводит к потере и других клеток островков.
2. Оказалось, что процесс регенерации в пораженных островках Лангерганса заключается, главным образом, в восстановлении пула бета-клеток.
3. Культуры клеток островков, полученные из поджелудочных желез новорожденных кроликов с помощью способа изобретения, большей частью состоят из бета-клеток, освобожденных от балластных клеточных элементов, и имеют очень высокую инсулинпродуцирующую активность.
4. Как внутрибрюшинная, так и внутриселезеночная ксенотрансплантация культур клеток островков крысам с экспериментальным индуцированным стрептозотоцином сахарным диабетом обеспечивает, в большинстве случаев, стабильную ремиссию диабетического состояния на период, по меньшей мере, в 8 недель.
5. Посттрансплантационный эффект снижения сахара закрепляется как благодаря функционированию трансплантированных бета-клеток, так и благодаря инсулинпродуцирующей активности в восстановленном, до некоторой степени, пуле бета-клеток в островках поджелудочных желез крыс-реципиентов. Это подтверждается обнаружением измеримых концентраций экзогенного (кроличьего) и собственного (крысиного) инсулина в крови экспериментальных животных.
6. Гистологические исследования поджелудочных желез экспериментальных крыс подтверждают выраженную стимуляцию регенеративных процессов в островках крыс с индуцированным стрептозотоцином сахарным диабетом после введения им ксенотрансплантационных культур клеток островков. Существует возможность того, что регенерация бета-клеток происходит не только в границах локализации островков Лангерганса, но также в некоторых структурах, находящихся вне островков панкреатической ткани.
Изобретение будет детально проиллюстрировано с отсылкой к следующим примерам, но следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено этими примерами.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
ПРИМЕР 1
На начальной стадии фактической научно-исследовательской работы мы применяли в качестве лабораторных животных крыс линии Вистар с массой тела 220-250 грамм, полученных из специального питомника лабораторных животных. Для того чтобы исключить влияние гормональных циклов на изменение характеристик метаболизма углеводов, мы решили проводить эксперименты на взрослых достигших половой зрелости самцах.
С целью получения объективных результатов при проведении антидиабетического лечения у лабораторных крыс была разработана модель стабильного сахарного диабета.
Заболевание у животных вызывают с помощью дробного внутрибрюшинного введения раствора стрептозотоцина, получаемого ex-tempore, - суммарная доза равна 80 мг на 1 кг массы тела. Все 90 животных были подвергнуты действию стрептозотоцина. Затем у большинства животных развивались характерные признаки диабетического состояния: жажда, полиурия (избыточная глюкоза в крови), полифагия (избыточное потребление пищи), выпадение волос, вялость с приростом массы тела или ее падением. При этом регистрировали выраженную гипергликемию у 58 крыс, то есть у других 22 оставалась нормальная гликемия или концентрация глюкозы возрастала незначительно. Через 4 недели после индукции диабета отбирают 32 животных с более стабильным уровнем гипергликемии. Стабильность подтверждают тем фактом, что в течение почти месячного периода наблюдений концентрация сахара в крови не опускается ниже чем 16 ммоль/л.
Выбор уровня исходной гликемии в таком диапазоне не случаен, а объясняется следующими причинами. Как показали предыдущие эксперименты, если у крыс не позднее чем на 4-й неделе после введения стрептозотоцина регистрируют гликемию на уровне 16 ммоль и выше, то такие крысы в будущем не демонстрируют спонтанной ремиссии, а также обращения диабетического состояния. В то же время даже очень высокий уровень гликемии (даже 30 ммоль/л) позволяет большинству экспериментальных животных с диабетом выживать в течение длительных периодов (2 и более месяцев), что позволяет проводить достаточно продолжительные эксперименты без каких-либо серьезных оснований ожидать несвоевременную смерть таких животных. Эти предположения были подтверждены наблюдением над контрольной (без обработки) группой диабетических крыс. Ниже представлены наши данные, касающиеся влияния внутрибрюшинной ксенотрансплантации культур клеток островков новорожденных кроликов на течение индуцированного стрептозотоцином диабета у 8 крыс со стойким индуцированным стрептозотоцином сахарным диабетом.
Каждому из животных-реципиентов, получившему наркоз путем внутрибрюшинного введения гексенала, вводят с помощью прокола брюшной стенки иглой большого диаметра 700000-800000 клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов.
Ниже представлены данные, касающиеся изменений в тяжести диабетического состояния у каждого из 8-ми экспериментальных животных этой группы.
Животных разделяют на 3 группы по 8 крыс каждая.
1-я группа: 8 крыс с гипергликемией, которым проводят ксенотрансплантацию культуры клеток островков путем введения в брюшную полость;
2-я группа: 8 крыс с гипергликемией, которым проводят ксенотрансплантацию культуры клеток островков путем введения в пульпу селезенки;
3-я группа: 8 крыс с гипергликемией, которых не подвергают никакой обработке (контроль).
Таблица 3
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутрибрюшинной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 1.
Показатель
До Stz
4 недели после Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,7
20,0
24,1
12,2
12,0
12,4
12,5
12,2
11,9
14,8
14,9
Масса тела, г
220
175
170
180
200
230
250
290
330
340
Таблица 4
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутрибрюшинной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 2.
Показатель
До Stz
4 недели после Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,4
18,7
16,6
13,0
6,8
6,7
7,4
6,4
5,5
7,0
6,0
Масса тела, г
200
180
170
180
210
230
240
250
270
290
320
Таблица 5
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутрибрюшинной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 3.
Показатель
До Stz
4 недели после Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
5,4
26,8
29,0
16,1
22,2
16,5
12,5
14,1
17,7
16,5
15,9
Масса тела, г
200
180
160
160
170
200
210
220
240
250
290
Таблица 6
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутрибрюшинной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 4.
Показатель
До Stz
4 недели после Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,0
19,7
21,2
12,2
13,0
14,1
9,2
7,9
9,0
9,2
8,3
Масса тела, г
240
210
200
190
210
250
260
270
310
320
350
Таблица 7
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутрибрюшинной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 5.
Показатель
До Stz
4 недели после Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
4,9
18,9
17,9
15,5
15,9
14,0
15,9
15,0
15,2
16,8
14,6
Масса тела, г
200
180
170
180
200
220
240
250
270
280
300
Таблица 8
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутрибрюшинной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 6.
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
5,9
22,3
21,9
14,2
11,1
7,8
7,0
8,4
8,1
7,8
7,4
Масса тела, г
240
210
210
200
240
240
260
290
320
350
360
Таблица 9
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутрибрюшинной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 7.
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
5,9
18,0
17,1
11,5
7,9
8,1
6,4
5,4
6.1
5,1
6,4
Масса тела, г
200
180
170
180
200
220
240
250
270
280
300
Таблица 10
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутрибрюшинной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 8.
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,3
24,0
25,6
17,7
18,8
20,0
21,8
18,6
17,8
18,8
20,9
Масса тела, г
250
190
170
190
200
220
250
260
270
290
300
ПРИМЕР 2
Восемь (8) крыс со стабильным индуцированным стрептозотоцином сахарным диабетом подвергают внутриселезеночной ксенотрансплантации культур клеток островков. Введение культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов проводят под наркозом, применяя для этого гексенал. После вскрытия брюшной стенки и вынесения селезенки в операционную рану клеточную суспензию вводят непосредственно в пульпу органа с помощью шприца с иглой диаметром 1,2 мм. Место инъекции прижимают марлевым тампоном, ослабляя таким способом паренхимальное кровотечение, и запечатывают его каплями специального медицинского клея. Рану в брюшной стенке зашивают слой за слоем. Ниже приведены основные результаты таких трансплантаций, точнее динамика показателей гликемии и массы тела животных-реципиентов.
Таблица 11
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутриселезеночной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 17.
Показатель
ДоStz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
5,3
16,7
17,1
16,8
12,2
10,2
10,0
11,2
9,9
8,1
6,6
Масса тела, г
220
200
200
190
200
240
250
280
320
340
360
Таблица 12
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутриселезеночной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе #18.
Показатель
ДоStz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,6
24,0
22,1
19,5
18,0
12,6
7,4
6,5
5,7
7,0
10,2
Масса тела, г
220
180
170
170
180
200
240
290
320
330
360
Таблица 13
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутриселезеночной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе #19.
Показатель
ДоStz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
5,3
21,2
21,2
17,6
14,4
10,5
11,2
11,4
9,1
10,5
7,4
Масса тела, г
250
220
210
190
200
210
250
270
300
310
350
Таблица 14
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутриселезеночной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 20.
Показатель
ДоStz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,7
24,5
26,9
14,2
12,8
130
8,8
8,4
9,0
7,4
9,8
Масса тела, г
210
170
170
180
180
200
220
240
270
290
330
Таблица 15
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутриселезеночной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 21
Показатель
ДоStz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,0
22,0
21,9
15,5
15,9
14,0
13,5
15,1
13,8
17,0
15,5
Масса тела, г
250
180
170
170
180
200
220
230
230
240
270
Таблица 16
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутриселезеночной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 22.
Показатель
ДоStz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
7,1
31,4
28,8
24,2
25,9
22,7
17,0
17,9
18,1
16,7
15,8
Масса тела, г
220
170
170
160
160
180
200
220
230
2SO
270
Таблица 17
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутриселезеночной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 23.
Показатель
ДоStz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
5.6
16,0
15,5
11,5
9,7
6,6
7,5
5,6
6,6
5,9
5,7
Масса тела, г
240
260
270
290
300
320
3SO
370
370
400
410
Таблица 18
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина (Stz) и последующей внутриселезеночной трансплантации (Тх) культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов крысе # 24.
Показатель
ДоStz
4 неделипосле Stz
Перед Тх
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,4
21,0
22,6
17,1
15,8
14,2
21,8
18,6
17,8
19,1
19,7
Масса тела, г
250
230
220
210
200
220
230
240
270
280
360
Эти данные затем были подтверждены наблюдениями над контрольной (диабет без лечения) группой диабетических крыс.
ПРИМЕР 3
26 животных разделяют на 3 группы по 8 крыс каждая. Первую группу - 8 крыс с гипергликемией - подвергают ксенотрансплантации культуры клеток островков посредством внутрибрюшинного введения. Вторую группу - 8 крыс с гипергликемией - подвергают ксенотрансплантации посредством внутриселезеночного введения. Третью группу - 10 крыс с гипергликемией - никак не обрабатывают (контроль). Большее число последних животных объясняется тем, что была предусмотрена их возможная гибель в течение эксперимента.
Ниже приведены данные, касающиеся эффекта внутрибрюшинной ксенотрансплантации культуры клеток островков новорожденных кроликов на течение стрептозотоцининдуцированного диабета у 8 крыс с выраженный стрептозотоциноминдуцированным сахарным диабетом.
Каждому животному-реципиенту, получившему внутрибрюшинный наркоз (гескенал), через прокол в брюшине вводят 700000-800000 островковых клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов и выпускают их в брюшную полость.
Ниже приведены данные, касающиеся изменений в тяжести диабетического состояния у каждой из 8-ми крыс этой группы. В отличие от крыс со стабильным стрептозотоцининдуцированным диабетом, которым проводят или внутрибрюшинную, или внутриселезеночную трансплантацию культур клеток островков новорожденных кроликов, у крыс с диабетическим состоянием такой же тяжести, но не подвергавшихся никакой обработке (контрольных) уровень гликемии остается стабильно высоким на протяжении всего времени этого эксперимента. Кроме того, ни одна из крыс-реципиентов не погибла, а в контрольной группе в результате тяжелого диабетического состояния погибло 2 животных, что составляет 1/5 от всех животных группы.
Ниже приведены данные, касающиеся изменений уровня гликемии и массы тела у крыс с экспериментальным сахарным диабетом, не подвергавшихся обработке.
Таблица 19
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 9, которой не проводили трансплантацию (контроль).
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,4
25,8
23,9
23,4
26,6
24,7
23,3
24,4
22,6
24,3
Масса тела, г
250
230
210
200
200
180
170
170
180
180
Таблица 20
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 10, которой не проводили трансплантацию
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
7,1
28,7
27,9
>33
29,9
28,4
>33
31,2
e.l.*
Масса тела, г
200
180
170
160
160
150
150
130
*e.l. - смертельный исход (exitus lelalis)
Таблица 21
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 11, которой не проводили трансплантацию (контроль)
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,4
26,8
24,9
23,4
26,6
25,7
27,3
24,9
25,5
23,7
Масса тела, г
220
220
210
200
190
180
170
180
180
180
Таблица 22
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 12, которой не проводили трансплантацию (контроль)
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,4
22,8
21,3
23,4
27,6
24,1
25,3
24,7
22,5
23,7
Масса тела, г
220
200
210
210
190
180
190
200
210
210
Таблица 23
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 13, которой не проводили трансплантацию (контроль)
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,4
21,8
23,0
23,7
24,6
23,6
28,3
24,8
25,0
23,8
Масса тела, г
220
240
230
220
210
200
190
180
190
200
Таблица 24
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 14, которой не проводили трансплантацию (контроль)
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
4,9
26,6
24,5
25,6
27,7
23,6
25,9
25,0
27,2
28,8
Масса тела, г
200
200
210
200
180
170
180
170
160
160
Таблица 25
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 15, которой не проводили трансплантацию (контроль)
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,9
19,4
19,5
19,6
20,0
18,7
18,7
19,7
19,7
20,3
Масса тела, г
200
220
210
200
210
210
210
220
220
230
Таблица 26
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 16, которой не проводили трансплантацию (контроль)
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,7
25,1
25,5
27,6
27,6
25,6
22,9
25,0
22,2
24,1
Масса тела, г
230
220
210
200
190
200
190
180
180
180
Таблица 27
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 25, которой не проводили трансплантацию (контроль)
Показатель
До Stz
4 неделипосле Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
6,4
27,3
24,5
22,6
27,7
26,1
27,9
e.i.
Масса тела, г
210
220
200
190
190
180
180
Таблица 28
Изменение уровня гликемии и массы тела после введения стрептозотоцина крысе # 26, которой не проводили трансплантацию (контроль)
Показатель
ДоStz
4 недели после Stz
Недели
1
2
3
4
5
6
7
8
Гликемия, мМ/л
5,8
17,7
17,3
18,3
22,9
21,3
19,9
18,3
19,7
17,7
Масса тела, г
230
250
260
260
250
270
280
280
280
300
ПРИМЕР 4
КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ОСТРОВКОВ
Культуры клеток островков получают в соответствии с разработанной нами методикой из поджелудочных желез 1-2-дневных новорожденных кроликов. Для каждой трансплантации применяли культуру, содержащую приблизительно 200000-300000 бета-клетки. Непосредственно перед трансплантацией культуру отмывают от добавленной ранее в среду роста эмбриональной сыворотки и собирают в стерильные пластиковые пробирки, каждая объемом в 5 мл. Неподвижную фракцию культуры удаляют с помощью специального клеточного скребка (фирмы «Corning-Costar»). Плавающую фракцию отделяют центрифугированием культуральной суспензии, покрывающей дно бутыли, на котором расположена прикрепленная фракция. Конечный объем клеточной суспензии соответствует числу операций по ксенотрансплантации, запланированных на день, и каждый миллилитр суспензии должен содержать приблизительно 100000 клеток островков (большей частью бета-клетки).
ПРИМЕР 5
ИНСУЛИНОТЕРАПИЯ
Для подкожной инъекции мы применяем специфически действующий инсулин Aktrapid HM, который вводят дважды в день: в 9:00 и 19:00 часов. Дозу подбирают индивидуально. Снижение уровня гипергликемии вплоть до 10 ммоль/л и ниже принимают в качестве критерия успешно проведенной инсулинотерапии.
ПРИМЕР 6
ВВЕДЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК ОСТРОВКОВ
Клеточную суспензию вводят с помощью инъекции шприцем через иглу для инъекций большого диаметра, прокалывая брюшную стенку без анестезии. Для того чтобы избежать повреждений внутренних органов и сосудов, крысу переворачивают, убеждаются, таким образом, что органы брюшной полости не смещены, и формируют свободное пространство. После прокола брюшины клеточный трансплантат вводят в это свободное пространство.
Для внутриселезеночного введения необходима полостная операция, следовательно, мы применяли наркоз, который проводили с помощью внутрибрюшинной инъекции раствора гексенала, приготовленного ex-tempore в расчете 50-60 мг на 1 кг массы тела. Трансплантацию в пульпу селезенки проводят следующим образом: через срединный разрез вдоль белой линии живота открывают брюшную полость. Селезенку вытаскивают в операционную рану, окружая ее стерильными салфетками. Клеточную суспензию, собранную за день до операции, набирают в шприц (объемом 2 мл) и с помощью иглы для инъекции (диаметр 0,5 мм) вводят в пульпу селезенки и в субкапсулярную зону. Для предотвращения кровотечения место инъекции закрывают медицинским клеем МК-6.
ПРИМЕР 7
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ-ИССЛЕДОВАНИЕ
У экспериментальных животных 2-3 раза в неделю определяют с помощью глюкометра «Glucometr Smart Scan» уровень глюкозы в капиллярной крови. Сывороточный инсулин обнаруживают с помощью иммуноферментного метода, применяя наборы для кроличьего (человеческого) инсулина и выполненные на заказ наборы для специфического обнаружения крысиного инсулина.
ПРИМЕР 8
ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Для изучения динамики морфологических изменений, происходящих в островках под влиянием различных типов лечения экспериментального сахарного диабета, поджелудочные железы животных, забытых в определенные моменты времени в ходе эксперимента, фиксируют в свежеприготовленной смеси Буэна. После специальных гистологических процедур (промывка фиксирующим раствором, обезвоживание и т.д.) фрагменты панкреатической ткани заливают в парафин. Затем нарезанные с помощью микротома микроскопические срезы (толщиной в 5-7 мкм) депарафинизируют и окрашивают гематоксилином и эозином, а также альдегид-фуксином для выделения бета-клеток.
Для того чтобы проследить судьбу бета-клеток, трансплантированных в пульпу селезенки диабетических крыс, в определенные моменты времени после трансплантации селезенки забитых животных и их фрагменты, которые, судя по замыслу операции и некоторым внешним признакам, могут предположительно содержать трансплантат, отсекают и немедленно фиксируют в смеси Буэна. Затем подготавливают парафиновые срезы и окрашивают особым образом так, как это было описано выше.
ПРИМЕР 9
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ: ХАРАКТЕРИСТИКИ КУЛЬТУРЫ
Культуры клеток островков, полученные для последующей трансплантации, соответствуют принятому функциональному критерию. Исследования с помощью инвертированного микроскопа показывают, что в течение 2-х недель культивации полученная культура не содержит клетки экзокринной ткани поджелудочной железы, следовательно, балластные клеточные элементы отсутствуют, включая лейкоцитов-«пассажиров», которые инициируют отторжение клеток островков после их ксенотрансплантация. Эти данные и предшествующий опыт лечения экспериментального сахарного диабета с помощью трансплантации убедил нас в том, что нет необходимости в иммуносупрессии любого вида. Контрольные анализы содержания инсулина в культуральном бульоне показывают, что существующие бета-клетки обладают высокой инсулинпродуцирующей активностью (таблица 29).
Таблица 29
Показатели базальной и стимулированной (глюкоза 25 ммоль/л) секреции инсулина (концентрация в мк Ед./мл) в культурах клеток островков, полученных из поджелудочных желез новорожденных кроликов
Образец #
Базальная
Стимулированная
1
2360
3330
2
11080
13450
3
7800
8760
4
5580
7650
5
7530
9900
6
8800
12300
7
5090
6850
ПРИМЕР 10
РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕРАПИИ ИНСУЛИНОМ
Как это было постулировано в предыдущих работах, проведение выбора эффективных доз инсулина при лечении крыс с экспериментальным стрептозотоцининдуцированным сахарным диабетом представляет собой затруднительную процедуру, это занимающая много времени (иногда практически бесконечная) и неблагодарная работа. При этом часто обнаруживают инсулинорезистентность. Однако у большинства животных 1-й протестированной группы (5 из 8) нам удалось с помощью высоких доз инсулина снизить гипергликемию вплоть до уровня, равного менее чем 10 ммоль/л, и сохранять такую компенсацию ухудшенного метаболизма углеводов на протяжении 8-недельного периода (таблица 30).
Таблица 30
Изменение уровня гликемии у крыс с экспериментальным индуцированным сахарным диабетом (1-я группа) под влиянием ежедневной терапии инсулином
##
Продолжительность терапии инсулином (дни)
Крыса
0
7
13
21
28
35
41
46
53
60
9
17,7
15,5
12,1
10,8
11,9
10,0
7,9
8,5
6,7
6,4
10
28,7
29,0
26,7
22,4
27,8
23,3
22,8
24,9
15,5
18,4
11
18,6
18,9
15,9
11,0
9,7
12,3
11,5
8,6
10,6
9,7
12
16,1
12,0
11,1
8,7
6,7
5,4
6,6
8,1
6,3
6,3
13
29,7
26,7
22,8
13,4
14,5
16,9
18,5
14,6
20,3
18,8
14
24,4
22,2
18,0
22,1
18,3
19,1
17,7
14,8
18,8
14,3
15
19,0
18,7
14,3
11,2
8,6
9,9
10,8
8,6
9,9
7,7
16
24,2
18,8
13,8
9,9
12,0
10,2
9,7
6,7
8,6
8,9
Средняя доза инсулина (Ед.)
0
4
8
12
16
14,1
12,8
17,6
11,9
13,3
Хотя нам удалось снизить уровень гликемии у крыс # 10, 13 и 14, отсутствие адекватной реакции в ответ на введение очень больших доз инсулина (вплоть до 20-30 Ед. в день) не позволило нам обнаружить тенденцию к нормализации гликемии и допустить присутствие у этих животных высокой индивидуальной инсулинрезистентности; а возможность значительной регенерации собственного аппарата островков представляется маловероятной, тем более что после прекращения введения инсулина у все крыс из 1-й группы происходил быстрый рецидив гипергликемии до уровня, близкого к исходному.
ПРИМЕР 11. РЕЗУЛЬТАТЫ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУР КЛЕТОК ОСТРОВКОВ
Выраженный антидиабетический эффект ксенотрансплантации культур клеток островков отмечают как в случае инъекции трансплантата в брюшину (2-я группа экспериментальных крыс), так и при введении их в пульпу селезенки (3-я группа). Эффект проявляется в снижении клинического проявления диабетического состояния и также в выраженном уменьшении уровня гипергликемии. Как видно из данных, представленных в таблицах, характер снижения гликемии в течение обоих способов введения ксенотрансплантата до некоторой степени отличаются друг от друга. Основанием для включения этих различий служит проявление эффекта снижения сахара, его степень и его неизменность (стабильности).
Таблица 31
Изменения гликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом после внутрибрюшинной ксенотрансплантации культур клеток островков (2-я группа)
Крыса #
Перед трансплантацией
Дней после трансплантации
2
7
10
13
15
17
20
22
1
24,1
18,7
12,2
15,5
12,0
11,9
14,5
12,4
14,8
2
16,6
15.0
13,0
8,8
6,8
9,0
7,7
6,7
9,1
3
29,0
27,9
16,1
17,7
22,2
18,4
15,5
14,1
16,5
4
21,2
18,8
12,2
13,0
13,0
11,0
12,2
10,5
8,9
5
17,9
14,8
15,5
16,8
15,9
16,0
15,9
14,0
13,7
6
21,9
19,1
14,2
12,8
11,1
8,5
9.0
7,8
7,1
7
17,1
16,6
11,4
9,8
7,0
7,9
6,4
8,1
8,6
8
25,6
21,1
17,7
17,1
18,8
20,7
18,6
21,2
20,0
М
21,7
19,0
14,1
13,9
13,3
12,9
12,3
11,9
12,3
Таблица 32
Изменения гликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом после внутрибрюшинной ксенотрансплантации культур клеток островков (2-я группа) - продолжение
Крыса #
Дни после трансплантации
24
26
28
30
32
35
37
40
42
1
13,2
13,9
12,5
14,4
16,8
12,2
15,5
12,0
11,9
2
7,8
7,0
7,4
6,7
5,5
6,4
6,4
5,9
5,5
3
17,2
14,8
12,5
14,7
15,6
14,1
16,5
16,1
17,7
4
10
10,1
9,2
10,5
8,4
7,9
11,1
8,7
9,0
5
13,9
14
15,9
12,4
14,7
15,0
14,3
13,8
15,2
6
8,1
8,0
7,0
6,7
7,1
8,4
9,0
7,8
8,1
7
8,7
7,4
6,4
5,1
6,5
5,6
4,9
5,8
6,1
8
18,8
20,6
21,8
22,2
19,2
18,6
21,2
20,0
17,8
М
11,9
12,0
11,6
11,6
11,7
11,0
12,4
11,3
11.4
Таблица 33
Изменения гликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом после внутрибрюшинной ксенотрансплантации культур клеток островков (2-я группа)
Крыса #
Дни после трансплантации
44
46
49
51
53
55
57
60
1
12,5
14,4
16,8
18,2
17,5
16,7
15,6
14,9
2
6,7
5,5
7,0
7,4
6,7
6,8
6,0
5,7
3
15,5
14,1
16,5
16,8
15.9
17,7
15,9
16,0
4
10,0
11,0
9,2
10,5
8,9
7,9
8,3
9,4
5
14,8
15,5
16,8
15,9
16,0
14,6
15,7
17,0
6
8,5
8,0
7,8
7,1
6,7
7,4
6,4
5,1
7
7,1
6,6
5,1
6,8
7,0
7,9
6,4
5,1
8
17,7
17,1
18,8
21,9
19,1
21,0
20,9
17,8
М
11,6
11,5
12,3
13,1
12,2
12,5
11,9
11,4
После анализа полученных результатов по измерению гликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом, которым провели внутрибрюшинную ксенотрансплантацию культур клеток островков, можно заключить, что был достигнут выраженный антидиабетический эффект у большинства животных-реципиентов.
Видно, что крысы # 2, 4, 6, и 7 имели ремиссию заболевания, проявившуюся в стабилизации сахара в крови на нормальном или практически нормальном уровне.
Крысы # 1 и 3 продемонстрировали не столь интенсивное снижение уровня гликемии, хотя статистические данные очень надежны, в таких случаях мы можем говорить только о частичной ремиссии гипогликемического состояния, к тому же как видно крыса # 1 в течение последних недель наблюдения обнаружила тенденцию к росту предшествующей умеренной гипергликемии.
У других животных (крыса # 5 и 8) снижение гликемии было незначительным и нестабильным, этот факт свидетельствует о неудаче этих двух трансплантаций культур клеток островков.
Таблица 34
Изменения гликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом после внутриселезеночной ксенотрансплантации культур клеток островков (3-я группа)
Крыса #
Перед трансплантацией
Дни после трансплантации
2
7
10
13
15
17
20
22
17
17,1
15,5
16,8
13,5
12,2
9,9
12,4
10,2
9,4
18
22,1
21,0
19,5
17,8
18,0
15,6
17,1
12,6
12,1
19
21,2
21,9
17,6
18,7
16,2
14,4
11,8
12,2
10,5
20
26,9
21,8
14,2
13,0
12,8
11,8
12,2
10,5
13,0
21
21,9
14,8
15,5
14,1
15,9
13,6
15,5
14,0
13,3
22
28,8
29,1
24,2
30,8
25,9
21,8
25,2
27,1
22,7
23
15,5
13,6
11,5
8,8
9,0
9,7
7,4
8,0
6,6
24
22,6
23,1
17,1
14,7
15,8
12,2
15,5
12,0
14,2
М
19,3
20,1
17,1
16,2
15,2
13,6
14,0
13,3
12,5
Таблица 35
Изменения гликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом после внутриселезеночной ксенотрансплантации культур клеток островков (3-я группа) - продолжение
Крыса #
Дни после трансплантации
24
26
28
30
32
35
37
40
42
17
10,2
10,9
10,0
9,4
8,7
11,2
10,5
9,8
9,9
18
11,8
8,7
7,4
6,4
5,1
6,5
6,6
7,9
5,7
19
17,7
16,8
11,2
14,0
10,6
11,4
10,6
11,1
9,1
20
8,4
9,0
8,8
8,7
7,5
8,4
9,0
9,7
9,0
21
15,9
12,4
13,5
12.4
14,0
15,1
13,4
13,8
12,8
22
18,1
18,0
17,0
18,1
18,4
17,9
18,1
17,8
18,1
23
9,7
7,4
7,5
6,5
5,4
5,6
5,4
5,8
6,6
24
18,8
20,6
21,8
22,2
19,2
18,6
21,2
20,0
17,8
М
13,8
12,1
12,2
12,2
11,1
11,8
11,9
12,0
11,1
Таблица 35 (продолжение)
Крыса #
Дни после трансплантации
44
46
49
51
53
55
57
60
17
11,5
10,4
8,1
8,2
8,7
6,7
6,6
4,9
18
6,7
5,5
7,0
7,4
9,2
10,5
8,9
7,9
19
10,5
9,4
10,5
8,8
9,9
7,4
8,9
9,1
20
9,1
6,7
7,4
7,1
11,0
7,8
9,8
7,5
21
14,8
15,7
17,0
15,9
13,6
14,0
15,5
16,8
22
17,5
17,8
16,7
16,8
16,0
15,7
14,9
15,8
23
8,7
6,0
5,9
8,3
7,6
6,7
4.6
5,7
24
21,5
21,1
19,1
21,0
18,8
21,0
18,9
19,7
М
12,5
10,3
11,5
11,7
11,9
11,2
11,0
10,9
После ксенотрансплантации культуры клеток островков в пульпу селезенки наблюдают выраженное отступление гипергликемии у большинства животных (7 из 8). При этом происходим практическая нормализация уровня гликемии у 5 крыс с экспериментальным сахарным диабетом (# 17-20, 23). Также у одного дополнительного реципиента (крыса #21) уровень глюкозы в крови значительно снизился, но этот уровень оставался на среднем гипергликемическом уровне, и во второй половине наблюдения отмечают постепенный рост гликемии, который может быть даже расценен как определенный рецидив тяжелой гипергликемии. У двух животных в группе (№22 и 24) не было достигнуто достаточного антидиабетического эффекта, хотя крыса №22 достигла статистически достоверного снижения гликемии, но это не может быть классифицировано как ремиссия диабета.
Как отмечалось ранее, мы ожидали расхождения в изменениях гликемии по сравнению между внутрибрюшинным и внутриселезеночным способами ксенотрансплантации, но, по-видимому, оно не было очень существенным. Для большей простоты сравнения мы объединили динамику показателей гликемии во 2-й и 3-й группах животных в одну таблицу (№34).
Таблица 36
Динамика изменений в гликемии (средняя, М) у крыс 2-й группы (внутрибрюшинная ксенотрансплантация) и в 3-й группе (внутриселезеночная трансплантация) крыс-реципиентов:
Группа #
Перед трансплантацией
Дней после трансплантации
2
7
10
13
15
17
20
22
2-я
21,7
19,0
14,1
13,9
13,3
129
123
11,9
12,3
3-я
19,3
20,1
17,1
16,2
15,2
13,6
14,0
13,3
12,5
Группа #
Дней после трансплантации
24
26
28
30
32
35
37
40
42
2-я
11,9
12,0
11,6
11,6
11,7
11,0
12,4
11,3
11,4
3-я
13,8
12,1
12,2
12,2
11,1
11,8
11,9
12,0
11,1
Группа #
Дней после трансплантации
44
46
49
51
53
55
57
60
44
2-я
11,6
11,5
12,3
13,1
12,2
12,5
11,9
11,4
11,6
3-я
12,5
10,3
11,5
11,7
11,9
11,2
11,0
10,9
12,5
После завершения физиологической части исследования животных, введенных в этот эксперимент, безболезненно забивали. При этом брали образцы крови от экспериментальных животных и полученную сыворотку анализировали на содержание инсулина (и кроличьего, и крысиного). Ниже приведены результаты иммуноферментного анализа (энзимоиммуноанализа) образцов сыворотки крови крыс-реципиентов, эти анализы проводят, применяя различные специальные наборы (таблица 35).
Таблица 37
Содержание ксеногенного (кроличьего) и собственного инсулина в сыворотке крови крыс, подвергнутых трансплантации культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов
Крыса #
Кроличий инсулин
Крысиный инсулин
Общий инсулин
1
16
7
23
2
16
52
68
3
45
11
56
4
23
50
73
5
-
-
-
6
57
53
110
7
21
48
69
8
9
20
29
17
23
60
83
18*
-
-
-
19
17
134
151
20*
-
-
21
4
24
28
22
6
27
33
23
5
74
79
24
0
7
7
* Непроверяемый результат в результате интенсивного гемолиза (массового лизиса эритроцитов) сыворотки.
Дополнительно мы проанализировали образцы крови, полученные после завершения экспериментов на крысах с индуцированным стрептозотоцином диабетом, с которыми проводили терапию инсулином. В этом случае сыворотку анализировали на содержание человеческого и крысиного инсулина (таблица 36), применяя соответствующие наборы для иммуноферментного анализа.
Таблица 38
Содержание человеческого и крысиного инсулина в сыворотке крови крыс, получавших терапию инсулином (1-я группа)
Крыса #
Человеческий инсулин
Крысиный инсулин
Общий инсулин
9
194
17
211
10*
-
-
-
11
258
24
282
12
79
23
102
13
144
0
144
14
331
4
335
15*
-
-
16
261
0
261
* Проверяемый результат не был получен в результате интенсивного гемолиза
Полученные результаты интерпретировать непросто. Сложность анализа обусловлена, во-первых, тем фактом, что приведенные в таблицах данные отражают, в частности, инсулинпродуцирующую функцию ксенотрансплантированных кроличьих бета-клеток и собственных (крысиных) бета-клеток (таблица 8), или инъецированного человеческий инсулин и собственный крысиный инсулин (таблица 9) только на момент завершения многодневного эксперимента. Безусловно, было бы замечательно иметь данные о динамике содержания различных типов инсулина в различные моменты времени по ходу эксперимента, но чрезвычайно сложно получить от маленьких лабораторных животных такое количество крови, которая не будет подвергаться гемолизу и которой будет достаточно для получения необходимого объема сыворотки без нанесения животным серьезной травмы, что не позволило выполнить эту задачу без риска потерять таких ценных лабораторных животных. Таким образом, нам пришлось действовать на основе тех данных, которые имелись у нас в распоряжении.
Оказалось, что в большинстве случаев (11 из 13) в крови крыс-реципиентов обнаруживают кроличий инсулин, что служит неоспоримым доказательством присутствия в крови животных кроличьих, то есть ксенотрансплантированных бета-клеток, секретирующих в кровь “нового хозяина” инсулин, относящийся к донору. Его концентрации значительно колеблются от 4 до 57 пмоль/л. Доля крыс-реципиентов, у которых обнаруживают свои собственные типы инсулина, еще больше (12 из 13). Колебания в его содержании очень большие - от 7 до 134 пмоль/л. Можно интерпретировать присутствие ксеногенного инсулина у животных, подвергнутых ксенотрансплантации клеток островков, но невозможно дать однозначную оценку тому, что в одной или другой концентраций обнаружен инсулин, секретируемый бета-клетками лабораторных крыс с экспериментальным диабетом. Полученные данные можно оценить более или менее объективно, если предположить сочетание нескольких несвязанных количественных данных, а именно: взаимосвязь между уровнем гликемии и общей инсулинемией, соотношение между крысиным и кроличьим инсулином (у крыс-реципиентов) или человеческим инсулином (у крыс, получивших инъекцию такого препарата), а также попытаться найти корреляцию между динамикой гликемии от начала до конца наблюдения и различными (в отношении вида и в специфичности) инсулинемиями.
Анализ проводят на выборочных, но охарактеризованных по общей совместимости образцах, порядку, рассматривали различные корреляции показателей гликемии и концентрации инсулина в сыворотке крови лабораторных животных. Из каждой группы отбирали 3-х крыс с более характерными результатами лабораторных исследований, и все данные сводили в одну таблицу (таблица 37).
Таблица 39
Показатели гликемии и инсулинемии у некоторых крыс 2-й, 3-й и 1-й группы экспериментальных крыс с экспериментальным сахарным диабетом.
Крыса #
Исходная гликемия, ммоль/л
Конечная гликемия, ммоль/л
Кроличий (человеческий) инсулин, пмоль/л
Крысиный инсулин, пмоль/л
Общий инсулин, пмоль/л
2
16,6
5,7
16
52
68
4
21,2
9,4
23
50
73
8
25,6
17,8
9
20
29
17
17,1
4,9
23
60
83
19
21,2
9,1
17
134
151
24
22,6
19,7
0
7
7
9
17,7
6,4
194
17
211
14
24,4
14,3
331
4
335
16
24,2
8,9
261
0
261
Проводят анализ результатов, полученных от 2-й экспериментальной группы (ксенотрансплантация культур клеток островков в брюшину). В обоих успешных случаях (крыса #2 и #4) ремиссия диабетического состояния сопровождается значительным снижением гликемии от 16,6 и 21,2 ммоль/л до 5,7 и 9,4 ммоль/л соответственно. При этом в самом конце 2-го месяца наблюдают нормализацию уровня инсулинемии (соответственно вплоть до 68 и 73 пмоль/л) главным образом вследствие восстановления инсулинпродуцирующих активностей собственных бета-клетки крыс-реципиентов (52 и 50 пмоль/л соответственно), хотя доля инсулина, секретируемого ксенотрансплантированными бета-клетками новорожденных кроликов, по-видимому, сравнительно достаточная (16 и 23 пмоль/л соответственно). Третье животное из этой группы (крыса №8) с исходно более высоким уровнем гипергликемии (25,6 пмоль/л) продемонстрировало функционирование трансплантированных бета-клетки (кроличьих, концентрация инсулина - 9 пмоль/л) наряду с собственными бета-клетками (концентрация крысиного инсулина - 20 пмоль/л). Общая выработка инсулина (в основном за счет усилий собственных островков поджелудочной железы реципиента) подтверждена статистически значимым падением в гипергликемии (вплоть до 17,8 пмоль/л), однако этого не достаточно для достижения ремиссии диабетического состояния.
В 3-й экспериментальной группе (внутриселезеночная ксенотрансплантация клеток островков) в качестве примеров выбирают крыс №17 и №19, так как они обладают исходной и конечной гликемией, очень похожей на гликемию у крыс №2 и №4 из 2-й группы. Однако если данные по гликемии и инсулинемии у крыс №2 и 17, похоже, очень близки (соответственно: исходная гликемия 16,6 и 17,1 ммоль/л, конечная гликемия - 5,7 и 4,9 ммоль/л, крысиный инсулин - 52 и 60 пмоль/л), то у крыс №4 и №19 при идентичности исходной гликемии (21,2 и 21,2 ммоль/л) и сходстве конечной гликемии (9,4 и 9,1 ммоль/л) общая инсулинемия оказывается очень различной (более чем в 2 раза - 73 и 151 пмоль/л соответственно). При этом это различие, в целом, связано с разницей в концентрации крысиного инсулина (50 и 134 пмоль/л соответственно).
У крыс первой группы в результате сверхинтенсивной инсулинотерапии существует возможность достигнуть нормального или близкого к нормальному содержанию глюкозы в крови. По-видимому, в результате восстановления соответствующего нарушенного метаболизма возникают условия для частичного восстановления пула собственных бета-клеток экспериментальных животных. Однако степень достигнутой регенерации, по-видимому, недостаточна для того, чтобы такое количества регенерированных бета-клеток вырабатывало такое количество инсулина, которого было бы достаточно для того, чтобы оказать значительное влияние на развитие экспериментального сахарного диабета.
У некоторых крыс, которых подвергали ксенотрансплантации культур клеток островков и которые продемонстрировали ремиссию диабетического состояния, отмечают только частичную регенерацию бета-клеток (фигура 6). Однако антидиабетический эффект, вероятно, обеспечивается инсулинпродуцирующей активностью бета-клеток новорожденных кроликов, успешно трансплантированных в крыс-реципиентов. На это указывают данные исследования содержания ксеногенного (кроличьего) и собственного (крысиного) инсулина в крови (таблица 8).
Исследование поджелудочных желез крыс с экспериментальным сахарным диабетом, у которых отмечают значительный антидиабетический эффект после ксенотрансплантации культуры островковых клеток новорожденных кроликов, выявило регенерацию бета-клеток. При этом отмечают определенный способ регенерации, как правило, в точности в островках Лангерганса, строго в местах их локализации.
Специальное окрашивание ткани поджелудочной железы крыс-реципиентов, подвергнутых успешной ксенотрансплантации культур клеток островков, показывает, что происходит регенерация структур островков Лангерганса, большей частью, благодаря бета-клеткам. В то же время было отмечено появление единичных точечных бета-клеток (окрашенных альдегид-фуксином) вне области локализации островков, которое может опосредованно указывать на возможность образования бета-клеток в структурах, находящихся вне островков, вероятно, в эпителии протоков.
Таким образом, на основании результатов проведенных научных экспериментов можно сделать несколько общих заключений:
Стрептозотоцин оказывает общий разрушающий эффект на бета-клетки клеток панкреатических островков, но в то же время, непосредственно или опосредованно, приводит к утрате других клетки.
Оказалось, что регенерация в пораженных островках Лангерганса происходит, главным образом, в результате восстановления пула бета-клеток.
Интенсивная инсулинотерапия не способна обеспечить достаточно выраженный способ реабилитации в панкреатических островках крыс с индуцированным стрептозотоцином сахарным диабетом только в результате нормализации гликемического статуса.
Культуры клеток островков, полученных из поджелудочных желез новорожденных кроликов с применение оригинального способа, в большинстве случаев состоят из бета-клеток, очищенных от балластных клеточных элементов, и обладают очень высокой инсулинпродуцирующей активностью.
Как внутрибрюшинная, так и внутриселезеночная ксенотрансплантация культур клеток островков крысам с экспериментальным индуцированным стрептозотоцином сахарным диабетом, в большинстве случаев, обеспечивает стабильную ремиссию диабетического состояния в течение, по меньшей мере, 8 недель.
Посттрансплантационный эффект снижения сахара обеспечивается как функционированием трансплантированных бета-клеток, так и инсулинпродуцирующей активностью восстановленного до некоторой степени пула бета-клеток в островках поджелудочных желез крыс-реципиентов. Это подтверждено данными по изменению концентраций экзогенного (кроличьего) и собственного (крысиного) инсулина в крови экспериментальных животных.
Гистологические исследования поджелудочных желез экспериментальных крыс подтверждают несущественную роль интенсивной инсулинотерапии и выраженную стимуляцию регенеративных процессов в островках крыс с индуцированным стрептозотоцином сахарным диабетом после ксенотрансплантации культур клеток островков.
Вероятно, регенерация бета-клеток происходит не только в границах локализации островков Лангерганса, но также в некоторых структурах, находящихся вне островков панкреатической ткани.
Трудно дать интерпретацию этим результатам. Только одна рабочая версия может быть выдвинута: снижение чувствительности рецепторов инсулина у крысы №19 к собственному инсулину. Незначительное снижение гипергликемии у крысы №24 можно объяснить недостатком, по-видимому, не прижившихся (или отвергнутых в результате иммунологической несовместимости или снижению их инсулин-продуцирующей активности в результате явления апопотоза) ксенотрансплантированных бета-клеток (кроличий инсулин - 0) и слабой гормональной активностью собственных бета-клеток животного (крысиный инсулин - 7 пмоль/л).
Точнее, постулированную выше сниженную чувствительность инсулиновых рецепторов (а точнее, к привнесенному извне синтезированному человеческому инсулину) можно объяснить очень высоким уровнем инсулинемии (соответственно 194, 331 и 261 пмоль/л) у крыс 1-й группы (№9, 14 и 16), которых подвергали ежедневной терапии инсулином. При этом собственный инсулин у этих животные был в очень низкой концентрации (у крыс №9 и 14) или даже его совсем нельзя было определить (крыса №16).
Существует возможность, что присутствие в крови большого количества экзогенного инсулина предотвращает более значительную активность собственных бета-клеток островков поджелудочной железы крыс 1-й группы.
Высокая концентрация экзогенного инсулин по принципу обратной связи способствует особой атрофии островкового аппарата, “атрофии за ненадобностью”. Нельзя исключить, что на основе сверхинтенсивной терапии инсулином, режим которой не может конкурировать с нормальной секрецией инсулина здоровыми эндокринными поджелудочными железами, крысы продемонстрировали выраженные гипогликемические эпизоды, которые были сокращены в результате избыточного потребления пищи (кормление было неограниченным), что само по себе увеличивает потребность во вводимом инсулине. Мы должны принимать во внимание, конечно, продиабетическое влияние всей группы гормонов, концентрация которых резко возрастает в процессе развития гипогликемического состояния, и влияние различных стрессиндуцирующих ситуаций, таких как отбор крови, оперативные вмешательства и т.д.
В отличие от интенсивной терапии инсулином, а точнее, сверхинтенсивной инсулинотерапии антидиабетический эффект ксенотрансплантации культуры клеток островков возникает в результате секреции в кровь животных-реципиентов такого секретируемого трансплантированными бета-клетками количества инсулина, которое более или менее соответствует уровню гликемии. Кроме того, секреция инсулина происходит в брюшной полости или селезенке, в результате гормон попадает в систему воротной вены, что может рассматриваться как практически физиологический, то есть естественный путь для организма.
Успешные экспериментальные исследования, которые продемонстрировали высокий антидиабетический эффект имплантированных клеток островков, полученных из поджелудочных желез новорожденных кроликов, позволяют применять такие культуры в клинической практике.
ПРИМЕР 12
ВНУТРИМЫШЕЧНАЯ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК ОСТРОВКОВ
Всего 112 пациентов с сахарным диабетом 1-го типа находились под документально подтвержденным динамическим наблюдением. Среди этих 112 пациентов было 58 мужчин и 54 женщины. Возраст пациентов на момент трансплантации - от 16 до 53 лет, в среднем - 33,5 лет.
Известно, что тяжесть проявления вторичных осложнений диабета в значительной степени зависит от длительности заболевания. Предположительно, разрушение собственных бета-клеток пациента в результате аутоиммунного процесса происходит приблизительно на 5-м году после обнаружения заболевания. Вторичные осложнения диабета обычно обнаруживают у пациентов с длительностью заболевания более чем 10 лет. По этой причине всех пациентов разделяют на 3 группы в соответствии с длительностью заболевания: а) от 1 до 5 лет - 16 человек; b) от 6 до 10 лет - 43 человека, с) более чем 10 лет - 53 пациента. Всех пациентов обследовали для того, чтобы установить особенность развития сахарного диабета и наличие осложнений диабета.
Обычно в качестве трансплантационной дозы для 1-го пациента применяют культуры клеток островков, полученные с помощью описанного выше способа из 50-60 поджелудочных желез 1-2-дневных новорожденных кроликов.
Каждая доза культуры содержит 1,5-2,0 миллиона бета-клеток. Собранные непосредственно перед трансплантацией культуры клеток островков вводят с помощью инъекции шприцем в прямую мышцу живота под местной анестезией. Никакой иммуносупрессии не применяют.
Ниже приведено описание методики трансплантации культур клеток островков.
Одну дозу культур клеток островков, представляющую собой стерильную суспензию в солевом растворе Хэнкса (объем 10-15 мл), помещают в пластиковую пробирку, промаркированную соответствующим образом. С помощью иглы для инъекций, длиной не менее 7 см и диаметром более 1 мм в шприц набирают суспензию островковых клеток объемом 20 мл.
С правой стороны от пупка пациента в зоне проекции прямой мышцы живота, применяя отдельный шприц и соответствующую иглу для инъекций, проводят местную инфильтрационную анестезию фронтальной брюшной стенки (с помощью новокаина или других анестетиков).
После анестезии мы применяем иглу для инъекций, чтобы произвести прокол субапоневрозного пространства прямой мышцы живота, а место инъекции суспензии культур клеток островков следует закрыть стерильной повязкой.
В дополнении к традиционному способу введения культур клеток островков в поперечную мышцу брюшной стенки был найден более сложный, но более физиологический способ трансплантации, их введение - трансплантация через воротную вену, доступ к которой осуществляют путем бужирования заросшей пупочной вены. Существуют некоторые основания полагать (практически 20 таких трансплантаций были полностью проанализированы), что в результате этого способа введения достигается более быстрый и более выраженный снижающий сахар эффект трансплантации, а также значительное снижение потребности в экзогенном инсулине. (Shumakov et al., 1993 (16)). Однако степень терапевтического эффекта интрапортальной трансплантации культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов на вторичные осложнения диабета практически неотличима от эффектов внутримышечной трансплантации. От этого способа отказались из-за специфических технических сложностей и возможного хирургического риска и практически все трансплантации проводят, применяя безопасный и простой способ - инъекцию клеточной суспензии под апоневроз поперечной мышцы живота.
В то же время при проведении серии интрапортальных трансплантаций мы исследовали способность бета-клеток, содержавшихся в культурах клеток островков новорожденных кроликов, отвечать на соответствующий стимул секрецией in-viva, то есть в организме пациента с диабетом 1-го типа. В этом исследовании принимали участие пять пациентов-мужчин, их возраст варьировал от 25 до 45 лет, продолжительность болезни - от 12 до 25 лет. Контролирующую рентгенотелевизионную установку, следуя инструкции, вводили в правую печеночную вену через катетер левой подключичной вены. Немедленно проводят забор крови (5 мл) из печеночной и воротной вены (через чреспупочный катетер, который вводят перед трансплантацией культуры клеток островков). После этого для местной стимуляции интрапортально трансплантированных культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов в воротную вену вводят примерно 20 мл раствора 20%-ной глюкозы, по аналогии с крысой, 1 грамм глюкозы на 1 килограмм массы тела пациента, участвующего в тесте с внутривенной нагрузкой. Образец крови из воротной и печеночной вены производили на 1-й, 5-й, 15-й, 30-й и 60-й минутах после введение глюкозы. Как показали результаты определения содержания инсулина, перед стимуляцией уже существовала разница между концентрациями инсулина в воротной вене и в печеночной вене (4,9±0,6 и 6,1±1,0 мк Ед./мл соответственно). Было отмечено, что на 1-й минуте после введения глюкозы концентрация инсулина в печеночной вене выросла в 1,5 раза (с 6,1±1,0 до 9,1±1,3 мк Ед./мл; р<0,05), что в два раза больше, чем его концентрация в воротной вене (4,2±0,5 мк Ед./мл). К 5-й минуте после стимуляции концентрация инсулина в печеночной вене вернулась к исходному уровню, и с 15-й минуты она заметно снижалась, что, по-видимому, указывает на постстимуляционное ослабление инсулинпродуцирующей функции культур клеток островков новорожденных кроликов, имплантированных в воротную систему печени.
Эти результаты демонстрируют значительную инсулинпродуцирующую способность (в ответ на стимуляцию глюкозой) бета-клеток культур клеток островков, ксенотрансплантированных в печень реципиента, и их потенциальную способность функционировать по принципу “обратной связи”.
С помощью этого оригинального (уникального) способа было получено подтверждение функционирования трансплантированных бета-клеток поджелудочных желез новорожденных кроликов, потому что еще не существует возможности определять выработку инсулина трансплантатом, основываясь на секреции С-пептида, из-за отсутствия в мире наборов для иммунорадиологической или иммуноферментной идентификации С-пептида кроликов.
ПРИМЕР 13
ОБЩИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУР ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК КРЫСАМ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ
Способность культур панкреатических островковых клеток, полученных с помощью способа изобретения из поджелудочных желез новорожденных кроликов, выживать и функционировать в экспериментах in vivo была продемонстрирована нами в экспериментах по ксенотрансплантации такой культуры животным с экспериментальным сахарным диабетом.
В качестве экспериментальных животных применяли крыс-самцов линии Вистар с массой тела, равной 180-220 грамм, получавших регулярное кормление. Экспериментальный сахарный диабет вызывали путем подкожного введения аллоксана (доза 200 мл на 1 кг массы тела) или путем подкожного введения стрептозотоцина (доза 60 мл/кг). В ходе экспериментов и в контрольных опытах мы применяли только крыс с аллоксаниндуцированным или стрептозотоцин-индуцированным диабетом, тех, у которых уровень гипогликемии натощак равен 20 ммоль/л и выше. Проведенные ранее тесты показали, что у таких животных не происходит спонтанного обращения экспериментального сахарного диабета.
После трансплантации культур панкреатических островковых клеток 88 из 104 крыс со стабильным или тяжелым аллоксаниндуцированным сахарным диабетом (практически 85%) показали устойчивую ремиссию диабетического состояния вплоть до конца экспериментального периода (20 недель). В крови животных-реципиентов регистрировали устойчивое снижение уровня сахара в крови плоть до практически нормальных уровней. В то же время характерные клинические симптомы диабета также пропадали (такие как потеря массы тела, полидипсия, полиурия). Антидиабетический эффект ксенотрансплантации был очевидно продемонстрирован как в случае введения культур в печень (через воротную вену или непосредственно в паренхиму печени), а также в случае введения в селезенку (культуры вводили интрапульпарно), так и через брюшные мышцы. Даже через 8 недель после ксенотрансплантации панкреатические клетки островков с сохраненной структурой и признаками секреторной активности обнаруживают в местах имплантации у крыс с ремиссией экспериментального диабета.
В ходе специальных серий экспериментов была показана очевидная роль предварительного культивирования in vitro панкреатических клеток островков в выживании клеток в организмах ксеногенных реципиентов. Для этой цели мы провели сравнительный анализ результатов ксенотрансплантации культур панкреатических клеток островков поджелудочной железы эмбрионов человека и ксенотрансплантации некультивированной эмбриональной островковой ткани крысам с экспериментальным сахарным диабетом. Было обнаружено, что снижающий сахар эффект более выражен и длится дольше в случае трансплантации предварительно культивированных панкреатических клеток островков по сравнению с трансплантацией некультивированной ткани поджелудочной железы, которая привела только к кратковременной ремиссии диабетического состояния. Таким образом, иммуномодулирующий результат культивирования in vitro был экспериментально подтвержден значительным увеличением длительности способности к выживанию в организме чужеродного реципиента.
Поджелудочные железы 18-ти крыс-реципиентов, которым была проведена успешная ксенотрансплантация культур поджелудочных желез новорожденных кроликов, подвергают гистологическому исследованию на 8-й неделе после трансплантации. Для этой цели фрагмент поджелудочной железы фиксируют в растворе Буэна и погружают в парафин. Срезы (толщиной в 5-7 мкм) окрашивают гематоксилином и эозином, а также альдегид-фуксином для обнаружения β-клеток. В то же время подробно исследовали поджелудочные железы 6 контрольных животных, которые имели не подвергавшийся лечению аллоксаниндуцированный диабет, а также поджелудочные железы 6 здоровых крыс (аллоксан не вводили).
При исследовании поджелудочных желез здоровых интактных крыс, примерно от 45 до 76% бета-клеток, как ожидалось, обнаруживают в островках Лангерганса. У крыс с не подвергавшимся лечению аллоксаниндуцированным диабетом количество β-клеток в островках было резко снижено - в среднем 8,3±1,1%.
Значительно большее количество бета-клеток в островках обнаруживают у крыс-реципиентов. У животных, которых подвергали ксенотрансплантации культур панкреатических островковых клеток, их собственные поджелудочные железы демонстрировали типичные β-клетки, и их доля среди «островковых» клеток была равна от 10 до 55% (примерно от 7 до 21%) (в среднем 23,5±8,8%).
В отношении этих экспериментов мы можем заключить, что антидиабетический эффект ксенотрансплантации культуры OK на развитие экспериментального диабета у крыс осуществляется двумя основными путями: а) функционирование трансплантированных β-клеток, подтвержденное также в дополнении к выраженному снижающему сахар эффекту, обнаружением групп трансплантированных панкреатический клеток островков в пульпе селезенки животных-реципиентов; b) стимулирующий эффект трансплантации культур панкреатических островковых клеток на островковые аппараты поджелудочной железы крыс-реципиентов, возможность которых подтверждена данными гистологических исследований, выявляющих существование значительно часто встречающихся островков с нормальными β-клетками и большей их долей в островках поджелудочной железы крыс-реципиентов по сравнению с крысами с не подвергавшимся лечению аллоксаниндуцированным диабетом. Успешное экспериментальное исследование стало основой для проведения клинической трансплантации клеток островков поджелудочной железы новорожденных кроликов пациентам с диабетом 1-го типа.
ПРИМЕР 14
КЛИНИЧЕСКАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КУЛЬТУР ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ОСТРОВКОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛИКОВ
Всего 112 пациентов с сахарным диабетом 1-го типа (инсулинозависимый сахарный диабет - IDDM) под документально подтвержденным динамическим наблюдением. Среди этих 112 пациентов было 58 мужчин и 54 женщины. Возраст пациентов на момент трансплантации варьировал от 16 до 53 лет - в среднем 35 лет.
Известно, что тяжесть проявления вторичных осложнений диабета в значительной степени зависит от продолжительности инсулинозависимого сахарного диабета. Предположительно, разрушение собственных β-клеток пациента в результате аутоиммунного процесса приблизительно происходит на 5-м году после обнаружения заболевания. Вторичные осложнения диабета обнаруживаются обычно у пациентов с продолжительностью заболевания более чем 10 лет. По этой причине всех пациентов с инсулинозависимым сахарным диабетом разделяют на 3 группы в соответствии с длительностью заболевания: а) от 1 до 5 лет - 16 человек; b) от 6 до 10 лет - 43 человека, с) более чем 10 лет - 53 пациента. Всех пациентов обследовали с целью установить особенность развития инсулинозависимого сахарного диабета и установить наличие осложнений диабета.
Обычно для трансплантации одному пациенту применяют культуры OK, полученные с помощью описанного выше способа из 50-60 поджелудочных желез 1-2-дневных новорожденных кроликов. Суспензию обычно вводят в поперечную мышцу брюшной стенки под местной анестезией. Никакой иммуносупрессии не применяют.
Ниже приведены результаты влияния ксенотрансплантации культуры панкреатических клеток островков на течение развития инсулинозависимого сахарного диабета, на выраженность его осложнений у пациентов с различной длительностью заболевания.
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КУЛЬТУР ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ОСТРОВКОВ НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛИКОВ ПАЦИЕНТАМ С ИНСУЛИН-ЗАВИСИМЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ОТ 1 ДО 5 ЛЕТ
5 из 16 пациентов этой группы имели инсулинозависимый сахарный диабет с резко неустойчивым характером. Из них 2 пациента часто (несколько раз в неделю) имели спонтанные (без известного провоцирующих причин) гипогликемические условия, которые приводили к многочисленным попыткам провести лечение в условиях стационара, но все попытки стабилизировать течение заболевания или отрегулировать инсулин на определенной дозе не приносили пользы. 3 пациента имели неустойчивый инсулинозависимый сахарный диабет с вероятностью развития тяжело поддающегося лечению кетоза; попытки достичь метаболической компенсации привели только к кратковременному эффекту.
У трех пациентов (2 из них с неустойчивым сахарным диабетом) выявили симптомы сенсомоторной нейропатии - парестезии и дергающей боли в икроножных мышцах. После внутримышечной ксенотрансплантации культур панкреатических островковых клеток у большинства пациентов отмечают снижение обычно повышенного среднесуточного уровня гликемии на протяжении 2-4 недель. Отмечают, что его значение сохраняется в диапазоне, соответствующем хорошей компенсации метаболизма углеводов (в среднем от 7,8 до 9,9 ммоль/кг), дополнительно на протяжении, по меньшей мере, 12 месяцев посттрансплантационного наблюдения. При этом у всех 5 пациентов с неустойчивым IDDM течение заболевания приобретало стабильную природу: предрасположенность к гипогликемическому состоянию и кетозу исчезала. Улучшение гликогенного контроля после трансплантации культур панкреатических клеток островков новорожденных кроликов подтверждается данными по определению гликозилированного гемоглобина в крови реципиентов (снижение от 12,4% (состояния до трансплантации) до 9,6, 8,3 и 10,1% соответственно на 6-й, 9-й и 12-й месяц после трансплантации). Усиление компенсации инсулинозависимого сахарного диабета и очевидная тенденция к снижению среднего суточного уровня гликемии позволили нам к концу 1-го месяца до некоторой степени снизить дозу вводимого инсулина (в среднем на 12%), которая оставалась до некоторой степени сниженной на 3-м, 6-м, 9-м и 12-м месяце после трансплантации - соответственно на 31,5, 36,2, 25,5 и 18,4%. При этом у 3-х пациентов потребность в экзогенном инсулине снизилась между 4-м и <ПРОПУСК???> месяцами после трансплантации на более чем 50% (от 54 до 80%), в то же время для 2-х пациентов доза вводимого инсулина во время 1-3-го месяца посттрансплантационного периода была временно (на период в 2-4 недели) до некоторой степени увеличена на 13% и 12%.
Поскольку у пациентов с историей заболевания инсулинозависимым сахарным диабетом, равной менее 5 годам, вероятно присутствуют собственные β-клетки, мы можем ожидать увеличения остаточной секреции С-пептида перед трансплантацией (анализы проводят автоматически с помощью иммуноферментного метода, для которого обычная величина содержания С-пептида в сыворотке крови равна 0,5-3,5 нг/мл). Оказалось, что перед трансплантацией только у 3-х из 6-ти пациентов (19%) не было ни базальной (натощак), ни стимулированной (после стандартного завтрака) секреции С-пептида. Продолжительность истории их инсулинозависимого сахарного диабета была более 3 лет. В среднем уровень базального и стимулированного С-пептида у пациентов с заболеванием, длительностью от 1 до 5 лет (включая нулевой показатель у 4-х из них), был рассчитан соответственно как 0,12 и 0,36 нг/мл. После трансплантации у 2-х из 3-х «отрицательных по С-пептиду реципиентов» была зарегистрирована секреция С-пептида, сначала стимулированная, затем, на 3-м месяце, базальная секреция С-пептида, которая указывает на восстановление секреции инсулина собственными β-клетками пациента. «Положительные по С-пептиду реципиенты» продемонстрировали значительный рост содержания С-пептида в сыворотке крови, которое у 5-ти пациентов даже достигло нормального значения. Важно отметить, что к концу 1-го года наблюдения в крови реципиентов не было выраженной тенденции к уменьшению С-пептида. Такими были изменения, отмеченные в течение 12 месяцев после первой трансплантации пациентам с инсулинозависимый сахарным диабетом с историей заболевания длительностью от 1 до 5 лет.
Девять пациентов из этой группы со средним интервалом, равным 13,3±1,8 месяцев, подвергли повторным внутримышечным трансплантациям культур панкреатических островковых клеток новорожденных кроликов: 1-го пациента - три раза, 3-х пациентов - дважды и 5-х пациентов - один раз. Ни у кого из этих пациентов не наблюдали ни местных, ни общих признаков отторжения/отделения трансплантата, ни каких-либо аллергических реакции.
У восьми из 9-ти пациентов, которых подвергали повторной трансплантации, обнаружили терапевтический эффект, по величине не меньший, чем при исходной трансплантации. У 3-х из 4-х пациентов, которых подвергали ксенотрансплантации культур панкреатических островковых клеток, отмечали тройное (то есть +2 повтора) прибавление клинического эффекта, такого как прирост мышечной массы, и существенное улучшение жизненного тонуса. При этом сохраняется стабильное течение инсулинозависимого сахарного диабета и исчезают симптомы вторичных осложнений диабета. Только один пациент в этой группе, перенесший 4 трансплантации (к концу этого эксперимента история его заболевания длилась более 9 лет), в течение 5,5 лет наблюдения не продемонстрировал признаков дестабилизации течения заболевания (перед 1-й трансплантацией оно было резко неустойчивым), и по-прежнему не было признаков диабетической ангиопатии. Похоже, что усиливающийся эффект повторных трансплантаций регулируется ростом секреторной активности собственного аппарата островков реципиентов, что подтверждается ростом концентрации как базального, так и стимулированного человеческого С-пептида с каждой трансплантацией.
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КУЛЬТУР ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛИКОВ ПАЦИЕНТАМ С ИСТОРИЕЙ БОЛЕЗНИ ОТ 6 ДО 10 ЛЕТ
Под наблюдением находились всего 43 пациента с инсулинозависимым сахарным диабетом с длительностью заболевания от 6 до 10 лет (в среднем длительность - 7,8 лет); 24 мужчины и 19 женщин. Возраст пациентов на момент первой трансплантации был в диапазоне от 15 до 43 лет (в среднем - 28,3 года). 12 пациентов имели резко выраженный неустойчивым характер заболевания, который не удалось стабилизировать после нескольких попыток в условиях стационарного лечения. У 16 пациентов были вторичные симптомы осложнений инсулинозависимого сахарного диабета; у 9 из них была только сенсомоторная нейропатия и развивающаяся нефропатия (стадия 3 по классификации Могенсена), 2 пациента имели автономную нейропатию (предрасположенность к тахикардии) и 2 реципиента - развитую непролиферирующую ретинопатию.
В течение 1-2 месяцев после ксенотрансплантации у всех 12-ти пациентов с неустойчивым статусом инсулинозависимого сахарного диабета статус изменялся на более контролируемый и управляемый. Обычно происходит также и стабилизация показателей метаболизма углеводов. Так, если перед трансплантацией среднесуточный уровень глюкозы в крови реципиентов колебался между 9,6 и 14,1 ммоль/л, то на 1-м месяце после трансплантации среднесуточная гликемия равнялась от 6,6, до 11,2 (в среднем - 8,6 ммоль/л). Максимальное снижение этого индекса отмечают на протяжении 3-го месяца (7,8 ммоль/л), но к концу 1-го года он все еще остается удовлетворительным - на уровне 8,8 ммоль/л.
Улучшение в компенсации метаболизма углеводов подтверждают изменением количества гликозилированного гемоглобина в крови пациентов от 12% перед трансплантацией (в среднем), его уровень на 3-м месяце был равен уже 10,8%, на 6-м месяце - 9,4%, на 9-м месяце - до некоторой степени возрос (до 10,9%), но к концу года снизился снова до 9,8%.
Также у большинства пациентов в этой группе наблюдали быстрое снижение суточной дозы вводимого инсулина по сравнению с уровнем перед трансплантацией: на 3-м месяце после трансплантации она снижалась в среднем на 15,22%, на 6-м месяце - на 30,1%, на 9-м месяце - 27,0%, на 12-м месяце - 25,1%.
Несмотря на существенную историю инсулинозависимого сахарного диабета в этой группе пациентов (от 6 до 10 лет - в среднем 7,8), только приблизительно 75% (32 пациента) перед трансплантацией не обладали собственной секрецией инсулина (С-пептид полностью отсутствует). В то же время другие пациенты в этой группе имели базальный уровень С-пептида, варьировавший от 0,05 до 0,2 нг/мл, и стимулированный уровень С-пептида - от 0,1 до 0,3 нг/мл, в среднем в группе перед трансплантацией его концентрация натощак была равна 0,07 и после стимуляции - 0,08 нг/мл. После трансплантации происходил устойчивый рост концентрации С-пептида в крови: на 3-м месяце базальный уровень был равен в среднем примерно 0,07 и стимулированный уровень - почти 0,11 нг/мл; на 6-м месяце наблюдали более чем 3-кратный рост - вплоть до 0,38 и 0,43 нг/мл соответственно, но к 9-му месяцу концентрация снижалась вплоть до 0,09 и 0,13 нг/мл.
За время посттрансплантационного периода наблюдали признаки более позитивного протекания вторичных осложнений в этой группе реципиентов. Симптомы нейропатии (сенсомоторной и автономной) начали ослабевать уже концу 1-1,5 месяца после ксенотрансплантации, и практически прекращали беспокоить пациентов к 3-му месяцу. Также у обоих пациентов с диабетической нефропатией белок в моче полностью исчезал к 2-4-му месяцу после трансплантации, и его повторно не обнаруживали практически в течение года после трансплантации. У пациентов с диабетической ретинопатией не регистрировали роста в патологических изменениях в глазном дне.
Повторные трансплантации (на 7-13 месяце после 1-й трансплантации) проводили 14-ти пациентам: по 1 разу 5-ти пациентам, дважды 5-ти пациентам, три раза 4-м пациентам и 4 повторные трансплантации - 1-му пациенту. В большинстве случаев повторные трансплантации островковых клеток поджелудочной железы, как минимум, вносят вклад в сохранение положительных изменений в статусе пациентов, которые уже произошли после 1-й трансплантации. Особенно следует отметить результат успешных 5 трансплантаций (интервал - 7-9 месяцев) у пациента с тяжелой сенсомоторной нейропатией, которая и привела 48-летнего мужчину (с историей инсулинозависимого сахарного диабета, равной 8 годам) к тяжелому ухудшению физического состояния (потеря трудоспособности или полная неспособность к работе) в результате сильной боли в конечностях и выраженной мышечной атрофии, особенно в нижних конечностях. После 1-й трансплантации боль в конечностях уменьшилась и затем после 2-й трансплантации она полностью исчезла, затем мышечный тонус и объем начали восстанавливаться. В результате проведенной трансплантации в течение 4,5 лет наблюдения объем мышц пациента увеличился на 23 кг, нормализовался его мышечный тонус, а также проводимость нервного импульса через двигательные нервы. Также диабет приобрел стабильное течение; доза вводимого инсулина снизилась на 50%. Возможно, что снижение количества экзогенного инсулина было в значительной степени обусловлено значительным восстановлением собственных β-клеток пациента, поскольку содержание человеческого С-пептида в крови реципиента перед трансплантациями - 0,1 нг/мл (натощак) и 0,1 нг/мл (стимулированный) стало равно 0,36 и 0,55 нг/мл соответственно к концу 4-летнего периода посттрансплантационного наблюдения.
ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КУЛЬТУР ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛИКОВ ПАЦИЕНТАМ С ИСТОРИЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЯ БОЛЕЕ ЧЕМ 10 ЛЕТ
Эта группа состояла из 53 человек - 32-х женщин и 21-го мужчины. Возраст пациентов на момент первой трансплантация варьировал от 21 до 53 лет - в среднем 33,4 года. Длительность заболевания варьировала от 11 до 27 лет (в среднем - 14,8 лет).
9 пациентов имели действительно неустойчивое течение диабета: спонтанные гипогликемические условия часто чередовались с эпизодами кетоацидоза.
Вторичные осложнения диабета были обнаружены у 38 пациентов: 11 имели только сенсомоторную нейропатию; 1 пациент имел сенсомоторную нейропатию и диабетическую катаракту, 5 пациентов - сенсомоторную нейропатию, начальную нефропатию (по классификации Могенсена) и непролиферирующую диабетическую ретинопатию; 8 пациентов - нарастающую нефропатию и непролиферирующую ретинопатию; 6 пациентов - выраженную нефропатию и ретинопатию, предшествующую пролиферирующей ретинопатии; 2 пациента - нарастающую нефропатию и пролиферирующую ретинопатию; 2 пациента - выраженную нефропатию и пролиферирующую ретинопатию; 2 пациента - сенсомоторную и автономную нейропатию, выраженную нефропатию и ретинопатию, предшествующую пролиферирующей ретинопатии, и 1 пациент - сенсомоторную и автономную нейропатию, уремическую стадию диабетической нефропатии и пролиферирующую ретинопатию.
Следовательно, диабетическую нейропатию выявили у 23-х пациентов, включая 20 - с сенсомоторной и 3-х - с автономной нейропатией. Диабетическую нефропатию обнаружили у 24-х пациентов, включая нарастающую нефропатию у 15-ти пациентов, выраженную - у 8-ми пациентов и в уремической стадии у 1-го реципиента. Диабетическую ретинопатию обнаружили у 26-ти пациентов, включая непролиферирующую стадию - у 13-ти пациентов; стадию, предшествующую пролиферирующей, - у 8-ми пациентов и пролиферирующую стадию - у 5-ти реципиентов.
С целью снизить опасность развития гипогликемических условий пациентам с выраженными стадиями диабетической ретинопатии и нефропатии трансплантировали такую дозу культуры панкреатических островковых клеток, которая была получена из не более чем 40 поджелудочных желез новорожденных кроликов. Все реципиенты с исходно неустойчивым течением IDDM имели сравнительно быструю (в течение 1-3 месяцев) стабилизацию уровня гликемии, и был выбран более подходящий режим инсулинотерапии.
У пациентов этой группы наблюдали значительное снижение среднесуточного уровня гликемии: от 12,8 ммоль/л перед трансплантацией до 9,8 ммоль/л на 3-м месяце после трансплантации и 10,1 ммоль/л - на 9-м месяце после трансплантации. В соответствии с изменениями гликемии в крови реципиентов также происходило снижение концентрации гликозилированного гемоглобина от 13,1 до 10,0%.
Существенный рост степени компенсации IDDM сопровождается снижением в потребности реципиентов в экзогенном инсулине. К 3-му месяцу после ксенотрансплантации дозу вводимого пациентам этой группы инсулина уменьшают в среднем на 12,5%, на 6-м месяце - на 26,6%, на 9-м месяце - на 25,0%, на 12-м месяце - только на 9,8%, что отражает потребность в экзогенном инсулине по отношению к уровню до трансплантации. Максимальное снижение отмечено у пациента С. (женщина) (26 лет, длительность IDDM - 20 лет; вторичные осложнения - сенсомоторная нейропатия, выраженная нефропатия, ретинопатия на стадии предшествующей пролиферирующей стадии). Уже на 2-й неделе после внутримышечной трансплантации культур панкреатических островковых клеток, полученных из 40 поджелудочных желез новорожденных кроликов, происходило снижение потребности в вводимом инсулине: она упала с 36 до 24 Ед./день, на 6 неделе - до 16 Ед./день, на 10-й неделе - до 4 Ед./день (то есть 90% снижения). В то же время на основе стабильного состояния среднесуточный уровень гликемии не превышал 9 ммоль/л, содержание HbAlc на 4-м месяце после трансплантации снижалось до 8,7% и не превышало 9% в течение, по меньшей мере, 1,5-летнего периода. В то же время происходит также значительное снижение выраженности вторичных осложнений диабета.
У 4-х пациентов, несмотря на длительную историю IDDM (от 10,2 до 13,5 лет, в среднем - 11,1 лет), выявили остаточную секрецию С-пептида (в среднем 0,05 нг/мл натощак, не стимулированный). Однако после трансплантации, к 3-му месяцу, количество С-пептидположительных пациентов удвоилось - и у этих 8-ми пациентов (в среднем длительностью диабета - 12,6 лет) концентрация С-пептида была равна в среднем натощак 0,09 нг/мл и после стимуляции - 0,12 нг/мл.
Эффект/влияние трансплантации на степень обнаруженных осложнений диабета зависел в большинстве случаев от их типа и клинической стадии (прогресса). Таким образом, если все пациенты с сенсомоторной нейропатией имели значительное улучшение течения этих осложнении уже после первой трансплантации культур панкреатических островковых клеток, то у 2-х из 3-х пациентов с автономной нейропатией только вторая трансплантация произвела какой-либо положительный эффект.
У 12 из 15-ти пациентов с начальной стадией диабетической нефропатии обнаружили устойчивое исчезновение микропротеинурии и тенденции к артериальной гипертензии. Положительный посттрансплантационный эффект наблюдали у пациентов с выраженной нефропатией практически в 63% случаев - у 5 из 8 реципиентов. В то же время экстракция белка с мочой была значительно снижена: макропротеинурия сменилась микропротеинурией (менее чем 0,3 г/день) и тенденцией к снижению и нормализации повышенного кровяного давления, что позволило снизить дозы понижающих давление лекарственных средств или даже прекратить их прием. У 2-х из 3-х оставшихся реципиентов на протяжении периода наблюдения (примерно 2 и 2,5 года) не было признаков прогрессирующей диабетической нефропатии.
В то же время у пациента с конечной стадией диабетической нефропатии был отмечен только кратковременный положительный эффект: в течение 4-5 недель после ксенотрансплантации культур панкреатических клеток островков его умеренно повышенный уровень креатинина в крови и моче приблизился к верхней границе нормального показателя, после чего имело место относительно медленное, но устойчивое прогрессирование хронической печеночной недостаточности.
10-ти реципиентам с начальной и выраженной стадиями диабетической нефропатии провели повторные трансплантации культур панкреатических островковых клеток, и 4-м пациентам с выраженной нефропатией трансплантацию проводили 3 раза на протяжении 3-4-летнего периода. У 9 из 10 пациентов, подвергнутых повторной трансплантации, не отмечали, по меньшей мере, дополнительной прогрессии функциональных почечных проблем.
Пациент с диабетической катарактой (возраст - 22 года, IDDM) длительность заболевания - 11 лет) на 5-м месяце после трансплантации был осмотрен окулистами, которые перестали замечать пятнышки помутнения хрусталика, они оценили это изменение в клинической картине как «резорбцию катаракты”.
У 10 из 13 пациентов (то есть с непролиферирующей ретинопатией) отсутствовала прогрессия патологических изменений, отмечаемых в течение всего периода наблюдения (от 1 до 6 лет), с улучшением картины глазного дна; у 5 реципиентов не было отслоения сетчатки, снизилось количество микроаневризм. Однако у 3-х пациентов с непролиферирующей ретинопатий наблюдали рост количества аневризм, и имели место местные кровоизлияния.
Из 8 находившихся под наблюдением пациентов с ретинопатией в стадии, предшествующей пролиферирующей, в 3-х случаях через 2-4 года после только ксенотрансплантации культур панкреатических островковых клеток отмечают процесс пролиферации. В то же время 3 пациента из той же группы (63%), которым перед трансплантацией провели процедуру лазерной коагуляции сетчатки, не нуждались в повторной лазерной обработке на протяжении всего периода посттрансплантационного наблюдения - от 1 до 6 лет. При этом 3 пациента из этой группы имели примерно 1, 2 и 3 повторные трансплантации с интервалом от 9 месяцев до 1,5 лет.
После ксенотрансплантации культуры P.L.C. 2-е из 5-ти пациентов с пролиферирующей стадией диабетической ретинопатии имели относительно продолжительную (длительностью 1 и 1,5 года) стабилизацию клинической картины глазного дна с умеренным ростом зрительных функций (вероятно в результате активной резорбции кровоизлияний), но отмечают и дальнейшую прогрессию пролиферирующего процесса, при этом у 1-го пациента (женщины) было повторное кровоизлияние в стекловидное тело со значительным ухудшением зрительных функций.
Применение трансплантации культур клеток островков, полученных из поджелудочных желез новорожденных кроликов, по-видимому, очень эффективно в практике диабета у детей. Последние результаты ксенотрансплантации культур клеток островков у детей с сахарным диабетом 1-го типа были получены после наблюдения за 20-ю пациентами перед трансплантацией и на протяжении 5-ти лет после первой трансплантации (Volkov, 2005 (1)). Группа сравнения (контрольная, без трансплантации) состояла из 20 детей, отобранных по принципу "проявление-контроль" с ограничениями по возрасту, полу, длительности заболевания, уровню компенсации, потребности в инсулине и развитию осложнений.
Анализ катамнеза показывает, что ксенотрансплантация культур клеток островков имела положительное влияние на снижение потребности в инсулине. Таким образом, уже к 3-му месяцу после трансплантации доза вводимого инсулина была снижена по сравнению с исходным уровнем у половины реципиентов, и к концу 1-го года 43% пациентов имели меньшую потребность в инсулине. В группе сравнения таких изменений не было. Был обнаружен эффект «доза-ответ»: наибольшее снижение в потребности в инсулине отмечают после введения культуры, содержащей приблизительно 5 миллионов бета-клеток. При этом в посттрансплантационном периоде наблюдали более стойкую и выраженную компенсацию метаболизма углеводов, что было подтверждено динамикой среднесуточной гликемии по сравнению с контрольной группой. Уже на 3 месяце после ксенотрансплантации уровень суточной гликемии снизился с 10,78±0,55 ммоль/л до 8,6±0,4 ммоль/л по сравнению с 9,15±0,72 ммоль/л (исходно 10,65±0,79 ммоль/л). За 1-й год после трансплантации эти различия стали более выразительными: в наблюдаемой группе среднесуточная гликемия была равна 8,5±0,39 ммоль/л по сравнению с 10,14±0,6 ммоль/л в контрольной группе. Похожие тенденции сохраняются в случае повторных трансплантаций.
Очень важен тот факт, что был подтвержден терапевтический эффект трансплантации культур клеток островков на течение осложнений диабета. Долговременные клинические наблюдения показывают, что после трансплантации у детей с сахарным диабетом 1-го типа, по сравнению с контрольной группой, реже случается диабетическая нефропатия, ретинопатия и проблемы с ростом (такие как появление синдрома Мориака). Таким образом, снижается проявление ретинопатии с 25 до 11% (в контрольной группе этот показатель вырос - с 23 до 25%). Значительно снижается потеря альбумина с мочой - с 207,4 до 78,7 мг/день у пациентов с диабетической нефропатией после ксенотрансплантации, тогда как в группе сравнения этот показатель по-прежнему растет - с 220,67 до 273,1 мг/день.
Такое осложнение, как синдром Мориака, представляет собой одну из особенностей детской и подростковой диабетологии, нарушения роста включены в его структуру. Применение анаболических препаратов для лечения указанных патологий приводит к кратковременному эффекту, к прогрессу в закрытии растущих зон и к снижению конечной высоты (конечному росту) тела. После проведения ксеногенной трансплантации культур клеток островков обнаруживают ускорение роста, но без изменений в скорости закрытия зон роста. Следовательно, доля пациентов, имеющих высоту ниже чем 5% (достоверный нанизм), снижается с 18 до 14% в течение 1-го года наблюдения. На 5-й год катамнеза среди детей в наблюдаемой группе не было обнаружено ни одного пациента с ростом ниже, чем 5 процентиля. В группе сравнения доля низкорослых детей возрастает с 20% до 22% в течение 1-го года наблюдения. На 5-й год наблюдения доля пациентов с ростом менее 5 процентилей снижается на 10% в результате проведения усиленной инсулинотерапии.
Иммунологическое исследование показывает, что ксеногенная трансплантация культур клеток островков не вызывает значительной и долговременной активации аутоиммунного процесса, что очень важно при проведении этого типа терапии у пациентов с частично сохранившейся инсулинпродуцирующей функцией. Тщательные наблюдения пациентов из группы наблюдения (с ежегодным обследованием в стационарных условиях) ни у одного из пациентов не выявило заражения зоонозными инфекциями.
ЭФФЕКТ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУР КЛЕТОК ОСТРОВКОВ ПОДЖЕЛУДОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛИКОВ НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1-ГО ТИПА
Комплексное иммунологическое исследование 20-ти пациентов с диабетом 1-го типа проводят после завершения первичной внутримышечной трансплантации культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов и 12-ти пациентов с диабетом 1-го типа после повторных ксенотрансплантаций культур клеток островков. В иммунологическом исследовании применяют 17 стандартных тестов на клеточный и гуморальный иммунитет, системы фагоцитов и комплемента, включая титр комплементсвязывающего антитела на клетки островков поджелудочных желез новорожденных кроликов.
Было доказано, что у пациентов с диабетом 1-го типа перед трансплантацией культур клеток островков наблюдали активацию иммунных Т-клеток, а также присутствие диспропорции в иммунорегуляторном соотношении субпопуляции Т-лимфоцитов и активацию неспецифических защитных факторов. У 8-ми реципиентов (т.е. 40%) после первичной трансплантации культуры OK обнаруживают низкий KFA-титр антител к общему антигену OK и инсулину, и у 10 пациентов (50%) обнаруживают умеренный рост количества В-лимфоцитов на 2-3-й месяц с его последующим снижением.
При определении субпопуляции Т-лимфоцитов в динамике после ксенотрансплантаций обнаруживают тенденцию к нормализации содержания Т-лимфоцитов к 7-10-му дню. Количество CD4-клеток продолжает снижаться, количество CD3-клеток продолжает расти. К 14-20-му дню измеренное число Т-клеток-хелперов поднялось до нормы. К 2-3-му месяцу после трансплантации происходящая нормализация показателей клеточного иммунитета стала коррелировать с достижением хорошей компенсации заболевания.
Исследование иммунного статуса у пациентов, подвергнутых повторной трансплантации культур клеток островков новорожденных кроликов, не выявило никаких признаков иммунной реакции в отношении ксенотрансплантата. Количественные и функциональные показатели иммунитета были сравнимы с таковыми при первичных ксенотрансплантациях.
КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК ОСТРОВКОВ ПОДЖЕЛУДОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛИКОВ ПАЦИЕНТАМ С НЕДАВНО ВЫЯВЛЕННЫМ ИНСУЛИНЗАВИСИМЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ
Обычно реципиентами культуры ОК становятся пациенты с историей заболевания сахарным диабетом 1-го типа с продолжительностью более чем 5 лет; они практически утрачивают инсулинпродуцирующую активность собственного аппарата островков поджелудочной железы и в большинстве случаев имеют вторичные осложнения диабета на различных стадиях развития.
Однако были также достигнуты обнадеживающие результаты после внутримышечной трансплантации культур клеток островков поджелудочных желез новорожденных кроликов пациентам с недавно выявленным сахарным диабетом 1-го типа.
10 молодых людей (средний возраст 18±02 лет) со средней историей диагностированного диабета (6±0,2 месяцев). Положительные результаты при контроле гликемии отмечали у всех пациентов в течение 6-8 месяцев после ксеногенной трансплантации (гликемия натощак- 5,2±0,2 ммоль/л, после приема пищи - 7,0±0,15 ммоль/л, суточная глюкозурия - 0,25±0,03 грамм, HbAl - 5,8±0,2 ммоль/л). Суточная доза экзогенного инсулина снижалась с 0,62±0,11 до 0,28±00,2 Ед. на 1 килограмм массы тела. У 7-ми пациентов (т.е. в 70% случаев) в течение посттрансплантационного периода произошла частичная ремиссия и у 2-х реципиентов (т.е. в 20% случаев) - полная ремиссия диабетического состояния (индуцированный трансплантацией "медовый месяц" сахарного диабета 1-го типа), которая продолжалась в течение 4-8 месяцев. При этом увеличенные в период до трансплантации уровни глюкагонов и гормона роста в крови реципиентов нормализуются (концентрация глюкагонов снижается с 112,0±2,1 до 69,7±1,2 нг/мл, р<0,05; гормона роста - с 8,9±0,04 до 5,6±0,02 нг/мл, р<0,05) с последующей нормализацией суточного профиля гормона роста. Концентрация человеческого С-пептида в сыворотке пациентов возрастает с 0,3±0,01 до 1,26±0,02 нг/мл; р<5; что свидетельствует о существенном снижении секреции собственных инсулинов у реципиентов под влиянием проведенной трансплантации ксеногенных клеток островков. При этом пациенты демонстрируют нормализацию показателей клеточного и гуморального иммунитета, который был патологически изменен перед трансплантацией (таблица 40).
Таблица 40
Показатели иммунного статуса у пациентов с недавно обнаруженным IIDDM после ксенотрансплантации культур клеток островков
Месяцы Тх
OKT3%
OKT4%
OKT8%
OKT7%
OK1a%
IgA мг%
IgM мг%
IgG мг%
Rec n=10
0
80±5*
50±3*
30±3
18±2*
14±2*
250±13**
221±l8**
15008±22*
1
803*
51±2*
29±4
16±3
12±2
212±9*
212±10*
1472±14**
3
66±2
36±4
30±4
11±3
8±3
174±12
169±10
937±13
8
76±4*
48±2*
26±3
14±3
12±2*
217±13
224119
1461±12**
Контроль
Здоровые
68±4
38±5
30±4
10±2
7±2
162±16
151±8
910±12
ОКТ3 - Т-клетки; ОКТ4 - Т-хелперы; ОКТ8 - Т-супрессоры; ОКВ7 - В-лимфоциты, ОК1а - анти-HLA-DR; Ig - иммуноглобулины; *p<0,05; **p<0,001 - по сравнению с контролем
Были обнаружены следующие общие изменения после ксенотрансплантации культур клеток островков пациентам с сахарным диабетом 1-го типа:
- стабилизация течения неустойчивых форм заболевания, в результате которой проводили успешный выбор соответствующей инсулинотерапии и был достигнут значительный рост степени компенсации поврежденного метаболизма углеводов;
- снижение потребности в экзогенном инсулине на 20-30% у 2/3 реципиентов;
- замедление в развитии поздних осложнений диабета (нейропатии, нефропатии, ретинопатии); уменьшение от начальной стадии в более чем 80% случаев.
Целесообразно дать объяснение в отношении возможных механизмов антидиабетического эффекта трансплантации культур клеток островков новорожденных кроликов. Несмотря на широкое внедрение в практику обучения пациентов с сахарным диабетом 1-го типа метода самоконтроля гликемии и методикам подбора соответствующей дозы вводимого инсулина, у некоторых пациентов отмечают тяжелое неустойчивое течение заболевания. Приступы частого спонтанного (то есть возникающего без видимых причин) гипогликемического состояния часто сменяется развитием кетоза; и все попытки достичь метаболической компенсации у этих пациентов в условиях стационара приводили только к кратковременному облегчению. Однако на 2-3-м месяце после ксенотрансплантации культур клеток островков практически во всех случаях течение неустойчивого сахарного диабета приобретает более контролируемый и управляемый характер. В то же время обычно происходит стабилизация показателей метаболизма углеводов и подавление предрасположенности к кетозу.
По-видимому, стабилизация неустойчивых форм сахарного диабета и компенсация метаболизма углеводов прежде всего обусловлена секрецией инсулина трансплантированными бета-клетками. В ходе посттрансплантационного периода доза вводимого экзогенного инсулина (обычно сниженная по сравнению с уровнем до трансплантации) отчасти удовлетворяет основной потребности в этом гормоне. В свою очередь, инсулин, секретируемый трансплантированными бета-клетками и поступающий в кровь реципиента, более точно коррелирует с изменениями уровня гликемии, таким образом, способствуя более стабильному течению заболевания. Поскольку у части реципиентов с отсутствием признаков функционирования собственных бета-клеток (С-пептид-отрицательных) на 1-2-м месяце после ксенотрансплантации обнаруживают существенную концентрацию человеческого С-пептида, мы можем заключить, что частично восстановленный аппарат островков пациентов представляет собой одну из стадий в процессе регуляции метаболизма углеводов. Благодаря этому у пациентов с ранее неустойчивым течением диабета гипогликемическое состояние становится менее выраженным и часто полностью исчезает, так как трансплантированные и восстановленные бета-клетки прекращают выделять инсулин в ситуациях, в которых гликемия достигает уровня, близкого к нормальному. Это показывает, что стабилизация уровня гликемии после трансплантации культур клеток островков обусловлена восстановлением, до некоторой степени, механизма обратной связи между уровнем гликемии и секрецией инсулина, этот механизм обратной связи отсутствует у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа из-за гибели клеток, вызванной аутоиммунным процессом в островках поджелудочной железы.
Возможно также, что некоторую роль в стабилизации IDDM и в снижении потребности реципиента в экзогенном инсулине можно объяснить нормализацией рецепторов инсулина в периферических тканях после трансплантации культур клеток островков.
Поскольку у значительной части реципиентов с положительным эффектом трансплантации клеток островков на диабетическую ангиопатию не наблюдают существенного снижения потребности в экзогенном инсулине, то, вероятно, что снижение дозы вводимого инсулина нельзя рассматривать в качестве основного, и в особенности, в качестве единственного признака эффективности лечения с помощью трансплантации. Если мы в качестве конечной цели примем тезис о достижении полной независимости от инсулина, то этот подход может быть обременен риском развития клинических ситуаций, опасных для пациента. Как показывает наш опыт, одностадийное введение существенно увеличенных порций ксеногенных культур клеток островков, состоящих практически только из бета-клеток, может спровоцировать развитие тяжелого гипогликемического статуса; а частые (через каждые 1-1,5 месяца) повторные трансплантации “регулярных” порций в печень (через постоянный катетер в воротную вену) могут в итоге привести к тяжелой предсказуемой передозировке количества трансплантированных бета-клеток.
Отсутствие соответствующей продукции инсулина бета-клетками, которое происходит, вероятно, из-за их неспособности секретировать инсулин строго по принципу обратной связи, может привести к развитию серьезного гипогликемического состояния даже при отмене инъекций инсулина. В результате истощения запаса гликогена и образования глюкозы по пути глюконеогенеза у реципиентов начинается накопление кетоновых тел и кетоацидоз.
Задержку и регресс поздних осложнений диабета следует рассматривать как практически более значительные, имеющие большую прогностическую важность и более достижимые реальные результаты трансплантации культур клеток островков.
Особую важность представляет собой влияние ксенотрансплантации культур клеток островков на специфические для сахарного диабета повреждения сосудов - ангиопатию - поскольку именно они служат главной причиной потери зрения (диабетическая ретинопатия).
ВЛИЯНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК ОСТРОВКОВ НА ПОЗДНИЕ ДИАБЕТИЧЕСКИЕ ОСЛОЖНЕНИЯ
Известно, что образование диабетических ангиопатий - очень вероятное событие даже в случае идеальной компенсации метаболизма углеводов (нормогликемия, глюкозория типа А, нормальная концентрация гликозилированного гемоглобина), достигаемой с помощью интенсифицированной инсулинотерапии. В то же время после трансплантации культур клеток островков, несмотря на повышенную у существенного числа пациентов концентрацию гликозилированного гемоглобина в крови, в большинстве случаев мы видим торможение прогресса и частичный регресс поздних осложнений диабета. Вот почему положительный эффект трансплантации клеток островков не может быть объяснен исключительно улучшением показателей метаболизма углеводов.
У пациентов с инсулинозависимым сахарным диабетом, осложненным ретинопатией, тяжесть изменения глазного дна вырастет в ситуации, когда секреция инсулина собственными поджелудочными железами пациента снижается. Об экскреции эндогенного инсулина судят, конечно, по концентрации С-пептида, секретируемого в кровь пациента в эквимолярном к инсулину количестве. Мы полагаем, что прогрессия ретинопатии определяется не только снижением в секреции инсулина, но также снижением в концентрации С-пептида. После трансплантации аллогенных или ксеногенных культур клеток островков реципиентам с зависимостью от инсулина, вызванной гибелью собственных бета-клеток поджелудочной железы, трансплантированные бета-клетки начинают выделять в кровь пациента С-пептид (естественно, одновременно с инсулином), которого пациент был лишен на протяжении нескольких лет, когда в рамках возможностей так называемой заместительной терапии он получал только инъекции препарата инсулина. К тому же у большинства пациентов в посттрансплантационный период имеет место частичная регенерация пула собственных бета-клеток пациента (Skaletskyy N.N. и другие, 1994 (6)), которые, естественно, начинают секретировать инсулин и С-пептид. В результате длившийся годами дефицит С-пептида в организме был скорректирован, и, возможно, именно этот дефицит был ответствен за развитие поздних специфических повреждений сосудов и нервов.
Предположение о физиологической роли С-пептида не соответствует общепринятому мнению, которое состоит в том, что основная роль С-пептида - это чисто структурная роль, соединительная, которая заключается в облегчении укладки молекул проинсулина таким образом, чтобы происходило образование дисульфидных связей между аминокислотными остатками А- и В-цепи молекул инсулина; и что С-пептид не обладает биологическим потенциалом и, следовательно, в физиологическом смысле представляет собой балластную молекулу.
Наше предположение было подтверждено исследованиями, проведенными в Швеции (Wahren J. et al., 1991 (15)). Они показывают, что С-пептид обладает стимулирующим эффектом на утилизацию глюкозы организмом пациента с инсулинозависимым диабетом, хотя нельзя исключить его ингибирующее влияние на продукцию глюкозы печенью. Длительное (4 недели) введение С-пептида пациентам с сахарным диабетом 1-го типа обеспечивает лучший гликемический контроль (подтвержденный измерениями концентрации глюкозы в крови натощак и содержания гликозилированного гемоглобина) по сравнению с пациентами, которым вводили только инсулин. Очень важны данные, показывающие, что введение человеческого С-пептида имеет положительное влияние на поздние осложнения инсулинозависимого сахарного диабета. Так, у пациентов с диабетической нефропатией улучшается их почечная функция, это улучшение выражено в снижении экскреции альбумина и в снижении клубочковой фильтрации в почках; у пациентов с диабетической ретинопатией проницаемость гематоретинального барьера увеличивается; у пациентов с автономной нейропатией происходит замедление частоты сердечных сокращений на вдохе и выдохе. К тому же под влиянием введения С-пептида улучшается ток крови в работающих скелетных мышцах пациентов с сахарным диабетом. Механизм такого ангио- и нейропротекторного эффекта С-пептида неизвестен. Поскольку физиологический эффект С-пептида реализуется через активацию функций клеточной мембраны, то, по-видимому, он имеет отношение к активации Na+K+-ATF (аденозинтрифосфорная кислота), связанной с мембранами различных клеток.
В заключение, стоит указать на то, что трансплантация клеток островков при сахарном диабете 1-го типа очень важна, но должен быть включен вспомогательный способ терапии сахарного диабета 1-го типа, антидиабетическое лечение. Для успеха необходимо правильное сочетание разумной диеты, постепенные физические нагрузки, соответствующая терапия, снижающая сахар. Введение трансплантируемого органа, поджелудочной железы, или имплантирование островков, отделенных от поджелудочной железы, должны сопровождаться обеспечением медицинской помощи пациентам с диабетической нефропатией в ее конечной стадии, когда существует необходимость в трансплантации аллогенной почки. На ранних стадиях почечных повреждений, а также в случае диабетической нефропатии, ретинопатии (за исключением конечных стадий) применение ксенотрансплантации культур клеток островков, полученных из поджелудочных желез новорожденных кроликов, может быть очень эффективно.
Трансплантация надлежащим образом введенных культивированных клеток островков в комплексе (объединенных) с лечением сахарного диабета 1-го типа может оказать значительное влияние на прогноз заболевания, которое делает человека инвалидом и требует дорогостоящего лечения. Профилактика и замедление вторичных осложнений диабета, которые достигаются с помощью регулярных повторных трансплантаций, могут обеспечить не только медицинский, но существенный социально-экономический эффект путем предупреждения или снятия инвалидности у пациентов с диабетом и путем повышения их средней продолжительности жизни и долголетия.
Для обнаружения бета-клеток применяют классический способ окрашивания клеток по Мэлори и окрашивание альдегид-фуксином. Для более специфического обнаружения инсулинсодержащих клеток (бета-клеток) мы в последнее время применяем иммунофлуоресцентный способ морфологического анализа. Ниже приведено описание основных компонентов и этапов этого способа.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ОКРАШИВАНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК ОСТРОВКОВ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛИКОВ
Для идентификации бета-клеток мы применяем культуры, полученные в ходе инкубации панкреатических микрофрагментов на пластиковой культуральной чашке Петри («Corning-Costar»). Суспензию культивированных клеток и клеточные кластеры отмывают три раза от среды роста с помощью теплого раствора фосфатного буфера (PBS). Затем культуры фиксируют 0,5%-ным раствором формалина в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем культуры перфузируют раствором PBS с добавленной эмбриональной (телячьей) сывороткой до тех пор, пока ее концентрация не достигнет 1%, и инкубируют их в течение 60 минут при комнатной температуре для предотвращения неспецифической сорбции антител. После 3-кратного промывания раствором PBS к культурам вносят мышиные моноклональные антитела к инсулину («Sigma»), разведенные раствором PBS с 5%-ной эмбриональной телячьей сывороткой. После этого чашки Петри с исследуемыми культурами инкубируют в течение 120 минут при комнатной температуре. Затем культуру 3 раза отмывают в PBS и вносят в нее вторые антитела (FITC-меченные мышиные антитела), подвергнутые 45-минутной экспозиции.
После этого культуры трижды промывают в PBS. Затем в культуры вносят 60%-ный раствор глицерина и PBS и помещают их под покровное стекло. Готовые препараты исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа и фотографируют с помощью цифровой камеры.
Проведенные серии иммуногистохимических исследований клеток островков, культивированных из поджелудочных желез новорожденных кроликов, показывают, что доля инсулинсодержащих клеток в культурах равна от 78 до 90% (в среднем - 82,2%). Процент был вычислен путем подсчета клеток при их изучении с помощью метода фазового контраста и затем при сравнительном анализе, проведенном с помощью люминесцентного микроскопа. Помимо клеток островков в культуре обнаруживают единичные фибробласты, но обычно их доля не превышает 1-5%. Остальные клетки в культуре обычно представляют собой клетки эпителиального происхождения и составляют 5-17%, что подтверждают иммуногистохимическим окрашиванием (с моноклональными антителами к белку цитокератин 18); но они не являются бета-клетками, так как в этих клеточных структурах не выявлено присутствия инсулина. Вероятно, они представляют собственно другой тип клеток островков, присутствие которых в культуре должно считаться высоко физиологическим, поскольку они (альфа-клетки, дельта-клетки, РР-клетки) представляют собой естественное окружение бета-клеток, которые в нормальных условиях включают, до некоторой степени, автономную морфофизиологическую структуру - островки Лангерганса.
В дополнение к изучению клеточного состава культуры мы определили в ней общее количество клеток. С помощью систематического подсчета в более чем 20 культурах (подсчет проводят во время анализа с помощью инвертированного микроскопа «Nikon», Япония) нам удалось определить, что культура, полученная из 20 поджелудочных желез 1-2-дневных кроликов, содержит от 451600 до 568900 клеток островков (в среднем - 521500). Одна доза культуры клеток островков представляет собой объединение 4-х культур клеток островков, полученных из 80-ти поджелудочных желез 1-2-дневных кроликов. Количество клеток островков, содержащихся в такой дозе, в среднем, равно не менее чем 2000000, из которых бета-клетки составляют, по меньшей мере, 80%.
Культуры, полученные с помощью описанного выше способа, не представляют собой клеточный препарат со строго определенными количественными характеристиками, такими как точный процент бета-клеток в каждой культуре. Это не препарат, полученный в результате строго регулируемого химического синтеза или с помощью генноинженерных методов. Клеточный препарат, применяемый для трансплантации, представляет собой объединение выращенных параллельно культур клеток островков, которые, естественно, до некоторой степени отличаются друг от друга. Анализ клеточного состава, главным образом в отношении доли бета-клеток в культуре, показывает, что она равна 80-94%, тогда как жизнеспособность этих клеток равна от 77 до 85%. Для биологического препарата эти отклонения в цифрах, по нашему мнению, несущественны. С ростом количества культур, применяемых для одной трансплантации, эти вариации могут быть снижены.
Непосредственно перед запланированной клинической трансплантацией (транспортацией) культуры клеток островков производят отбор культур, обращая внимание на длительность их культивирования, результаты микроскопических наблюдений наблюдения и экспресс-анализа на стерильность и жизнеспособность. Комплектацию культур для трансплантации проводят в условиях ламинарного бокса, обеспеченного для безопасности постоянно циркулирующим стерильным воздухом. Выбранные культуры - по 4 культуры для одной дозы для трансплантации собирают с помощью специального клеточного скребка (Cell scraper, «Corning-Costar»). Скомпонованную клеточную суспензию центрифугируют в специальных (50 мл) пластиковых пробирках (800 оборотов в минуту, 10 минут). Затем осадок клеток переносят в стерильную пластиковую пробирку (15 мл) и суспендируют в солевом растворе Хэнкса. Затем маркированную пробирку с клеточным препаратом помещают в пробирку (50 мл) и плотно закрывают крышкой, дополнительно фиксируя ее с помощью специальной пленки (парафильма, «Parafilm»).
Поскольку изобретение описано подробно и с отсылкой на его специфические примеры, специалисту в этой области техники ясно, что в нем могут быть сделаны различные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема изобретения.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Volkov I.E., Skaletskyy N.N., Schenev S.V. / Preliminary results of xenogeneic transplantation of cultures of islet cells of pancreas of rabbit to children with insulin-dependent diabetes mellitus. // Bulletin of Experimental Biology & Medicine. - 1998. - №3. Volume 126. P.105-108
2. Gavrilova N.A., Skeltskyy N.N. / Effect of xenotransplantation of pancreatic islet cells on pathogenic mechanisms of development and course of diabetic retinopathy. // Reporter of Transplantology & Artificial Organs. - 2004. - №1 - P.30-36.
3. Skaletskaya G.N., Kirsanova L.A., Skaletskyy N.N. and others. / Change of course of experimental diabetic nephropathy under influence of xenotransplantation of islet cells cultures. Materials of the III All-Russian Conference on Transplantology & Artificial Organs. // Reporter on Transplantology & Artificial Organs. - 2005. - №3. - P.47.
4. Skaletskyy N.N., Kirsanova L.A., Blyumkin V.N. / Producing cultures of islet cells of pancreases and its transplantation. // Issues of Transplantology & Artificial Organs. - M., 1994. - P.73-80.
7. Skaletskyy N.N., Shumakov V.I. / Transplantation of islet cells in treatment of diabetes mellitus // Transplantation of fetalissues and cells. / Bulletin of Experimental Biology & Medicine. - 1998. - T.126. - Suppl.1. - P.109-114.
8. Shumakov V.L, Blyumkin V.N., Skaletskyy N.N. and others. Transplantation of pancreatic islet cells. - M. Canon, 1995. - P.384.
9. Shumakov V.L, Skaletskyy N.N. / Regulation of carbohydrate metabolism and correction of impairment of carbohydrate metabolism at diabetes Mellitus. // Essay on physiological problems of transplantology and use of artificial organs / Under edition of Academician V.I.Shumakov. - Tula: Repronix Ltd., 1998. - P.93-118.
10. Shumakov V.l., Skaletskyy N.N. Transplantation of islet and other endocrine cells. // Transplantology (under edition of Academician V.I. Shumakov). - M: Medicine, 1995. - P.317-331.
12. Gill R.G., The Immunology of Pancreatic Islet Transplantation. - in book "Type I Diabetes", Oxford University Press, 1996. - P.118-133.
13. Shapiro A.M.J., Lakey J.R.T., Paty B.W., et al. / Strategic opportunities in clinical islet transplantation // Transplantation. - 2005. - Vol.79. - P.1304-1307.
14. Shapiro A.M. J., Lakey J.R.T., Ryan E.A., et al. / Islet transplantation in seven patients with type I diabetes mellitus using a glucocorticoid-free regimen // New England J. of Medicine. - 2000. V.343. - P.230-238.
15. Wahren J., Johansson B.-L., Wallberg-Henriksson H. / Does C-peptide have a physiological role? // Diabetologia. - 1994. - 37, suppl.2. - P.99-107.
16. Shumakov V.L, Skaletskyy N.N., Evseev Yu.N. et al. / Intraportal xenotransplantation of islet cell cultures in diabetic patients // Biomaterial Living System Interactions. - 1993. Vol.1. - N4. - P.179-184.
17. George S. Eizenbarth, Kevin J. Lafferty. Type I Diabetes - Molecular, Cellular & Clinical Immunology. - Oxford University press.