ШТАММ KBL396 LACTOBACILLUS PLANTARUM И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
LACTOBACILLUS PLANTARUM STRAIN KBL396 AND APPLICATION THEREOF

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ДАННОЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относится к новому штамму KBL396 Lactobacillus plantarum и его применению и более конкретно, относится к новому штамму-пробиотику KBL396 Lactobacillus plantarum, композиции, содержащей его живые клетки, убитые клетки, культуру, лизат или экстракт клеток, и к его пищевому или медицинскому применению для улучшения психического здоровья человека.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пробиотики относятся к микроорганизмам, обладающим антимикробной активностью и ферментативной активностью, способствующей балансу кишечных микроорганизмов и вырабатываемых этими микроорганизмами продуктов. Пробиотики дополнительно определяют как живые клетки в форме отдельных штаммов или их комплексов, предоставляемых человеку или животным в форме высушенных клеток или продуктов ферментации для улучшения кишечной микрофлоры. Характеристики, которыми должны обладать пробиотики, состоят в том, что они должны обитать в кишечнике человека, обладать непатогенными и нетоксичными свойствами и выживать при прохождении в кишечник. Кроме того, они должны сохранять жизнеспособность и активность до их доставки в организм с потребляемой пищей, обладать чувствительностью к антибиотикам, применяемым для профилактики инфекции, и не содержать антибиотикорезистентную плазмиду. Кроме того, они должны обладать устойчивостью к кислотам, ферментам и желчи в кишечной среде.
Эти пробиотики включают в себя виды Bacillus sp., которые обладают превосходной способностью к выработке пищеварительных ферментов (амилазы, протеазы, липазы, целлюлазы, фосфатазы), Lactobacillus sp., вырабатывающие молочную кислоту, и фотосинтетические бактерии, которые предотвращают неприятные запахи, за счет потребления в процессе метаболизма веществ, вызывающих запахи, которые остаются в фекалиях животных (аммиак, гидросульфид, амины и т.д.). С недавнего времени, как только появились данные, что пробиотики улучшают различные полезные для здоровья функции, включая улучшение состояния здоровья кишечника, они стали центром внимания как основной терапевтический агент, который может заменить терапевтические агенты, основанные на традиционных соединениях.
В связи с быстро нарастающим в современном обществе стрессом повысилась частота неврологических расстройств, таких как нарушения психики, включающие в себя тревогу, депрессию, шизофрению, когнитивные расстройства и т.п., и нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся постепенной утратой нейронов центральной нервной системы (ЦНС) и/или периферической нервной системы (ПНС), связанные со старением и часто сопровождаемые дегенеративными изменениями или утратой по меньшей мере одного из: памяти, двигательной способности, когнитивной способности и сенсорной способности наряду с другими неврологическими дефицитами.
Также сообщается, что нарушения психики у пациентов в тяжелых случаях могут привести к суициду, и, в частности, более чем у половины пациентов с депрессией возникают суицидальные мысли, и известно, что от 10 до 15% пациентов фактически совершают суицид. Депрессия представляет собой заболевание, основными симптомами которого являются снижение воли и подавленное состояние, являющиеся причиной различных психических и физических симптомов и снижения повседневной деятельности, и сообщается, что вероятность развития депрессивного расстройства в течение жизни составляет от 15 до 20%. Причина депрессии еще не ясна, но известно, что это заболевание, как и другие нарушения психики, вызвано различными биохимическими, генетическими и экологическими факторами. Вероятность развития депрессии в течение жизни составляет от 10 до 25% у женщин и от 5 до 12% у мужчин, и ее частота в два раза выше у женщин.
Так, в наши дни депрессия оказалась репрезентативным заболеванием, встречающимся с высокой частотой, которое приводит к одновременному ухудшению состояния психики и всего организма и в отсутствие лечения может длиться от нескольких месяцев до нескольких лет и приводит к распаду человеческих отношений или к утрате профессиональной работоспособности, но не может привести к смерти, и поэтому оказывается тяжелым грузом не только для пациентов, но и для их семей и для общества.
Хотя тяжесть депрессии была отмечена выше, причина депрессии и механизм действия антидепрессантов еще не полностью понятны. Тем не менее, в научном мире в целом широко известно, что депрессия вызвана недостатком серотонина (5-HT), представляющего собой моноаминный нейротрансмиттер в синапсах центральной нервной системы (Sodhi MS et al., Int Rev Neurobiol 2004, 59, 111-174).
Большинство применяемых в клинической практике современных антидепрессантов составляют лекарственные препараты, усиливающие действие моноаминных нейротрансмиттеров, и вещества, ингибирующие распад серотонина или дофамина и т.п., например, вещества, ингибирующие реабсорбцию серотонина или норэпинефрина в нейронах (селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (SSRI), селективные ингибиторы обратного захвата норэпинефрина (SNRI), трициклические антидепрессанты (TCA) и т.д.), а также ингибиторы моноаминоксидазы. Тем не менее, в настоящее время в Корее лишь около 10-25% пациентов с депрессией получают лечение антидепрессантами, и известно, что около 40% из них прекращают лечение из-за снижения комплаентности в связи с побочными эффектами и т.д., и, кроме того, сообщается, что количество пациентов, не отвечающих на лечение даже на фоне приема антидепрессантов, составляет 33%, и поэтому существует потребность в разработке нового, более эффективного терапевтического агента.
Кроме того, нейродегенеративные заболевания характерны симптомами, при которых по различным причинам нарушается функция головного мозга и непрерывно ухудшается когнитивная функция в целом по сравнению с предшествующим периодом, что приводит к значимому нарушению повседневной жизни; данное нарушение когнитивной способности характеризуется клиническим компонентом прогрессирующей потери памяти, когнитивной способности, способности к осмыслению, суждению и эмоциональной стабильности, что постепенно ведет к полному разрушению психики и в конечном счете — к смерти.
В качестве примера такого заболевания распространенной причиной прогрессирующего нарушения умственных способностей (деменции) у пожилых людей является болезнь Альцгеймера (БА), которая в Соединенных Штатах Америки считается четвертой по значимости медицинской причиной смерти. В частности, при болезни Альцгеймера в основании переднего мозга происходит дегенерация холинергических нейронов, которые играют фундаментальную роль в когнитивных действиях, включая память (Becker et al., Drug Development Research, 1988, 12, 163-195). Кроме того, когнитивные расстройства и дегенеративные расстройства головного мозга встречаются во всем мире у представителей различных рас и племен и стали основной проблемой общественного здравоохранения. В настоящее время согласно оценкам только в Соединенных Штатах Америки этими заболеваниями поражено примерно от 2 до 3 млн человек, но лечение применяемыми в настоящее время лекарственными препаратами невозможно, и по мере увеличения продолжительности жизни человека во всем мире их частота увеличивается; поэтому важно уделять внимание их профилактике на ранней стадии.
С учетом данного уровня техники существует неотложная потребность в разработке эффективного терапевтического агента для лечения неврологических заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для решения описанных выше проблем авторами настоящего изобретения путем скрининга различных штаммов-пробиотиков с учетом того, что действие пробиотиков, улучшающее состояние здоровья, не является общей характеристикой рода и вида, а специфично для конкретного штамма, был идентифицирован штамм, проявляющий превосходный эффект улучшения состояния при неврологических заболеваниях (Отчет объединенной рабочей группы Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО)/Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) о составлении проекта руководства по оценке пробиотиков в пищевых продуктах, г. Лондон, пров. Онтарио, Канада, 2002 г.), и выполнено настоящее изобретение.
Соответственно, цель данного изобретения состоит в предложении новой молочнокислой бактерии.
В дополнение к этому другая цель данного изобретения состоит в предложении различных видов пищевого и медицинского применения новой молочнокислой бактерии.
Для достижения вышеуказанных целей данное изобретение предлагает Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP).
Данное изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из штамма, культуры штамма, лизата штамма и экстракта этого штамма.
Данное изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из штамма, культуры штамма, лизата штамма и экстракта штамма, для профилактики или лечения неврологических заболеваний.
Данное изобретение также предлагает пищевую композицию для профилактики или улучшения состояния при неврологических заболеваниях, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма.
Данное изобретение также предлагает добавку к корму для животных, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма.
Данное изобретение также предлагает способ профилактики или лечения неврологических заболеваний, содержащий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма.
Данное изобретение также предлагает композицию, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма, для применения в профилактике или лечении неврологических заболеваний.
Данное изобретение также предлагает композицию, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из штамма, культуры штамма, лизата штамма и экстракта штамма, для получения лекарственного препарата для профилактики или лечения неврологических заболеваний.
Данное изобретение также предлагает пищевую композицию для профилактики или улучшения состояния при неврологических заболеваниях, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из штамма, культуры штамма, лизата штамма и экстракта штамма.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На ФИГ. 1 представлен результат сравнения влияния различных штаммов Lactobacillus и Bifidobacterium на экспрессию TPH-1, который является ограничивающим скорость ферментом пути биосинтеза серотонина (A), и результат подтверждения отличающегося влияния на TPH-1 штамма Lactobacillus plantarum KBL396 по сравнению с имеющимися в продаже штаммами (B).
На ФИГ. 2 представлена схема экспериментального прибора для проведения теста Y-ОБРАЗНОГО ЛАБИРИНТА (A) и результат количественного определения изменения способности к действию в соответствии с тестом Y-ОБРАЗНОГО ЛАБИРИНТА после введения Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) (B).
На ФИГ. 3 показан результат, подтверждающий повышение экспрессии гена Tph2 и повышение концентрации серотонина (5-HT) в результате введения Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) в тесте Y-ОБРАЗНОГО ЛАБИРИНТА.
На ФИГ. 4 показана клетка для вызывания в животной модели стресса, связанного с социальным поражением (A), и схема экспериментальной камеры для теста на социальное избегание (B).
На ФИГ. 5 представлен результат, подтверждающий эффект улучшения способности к быстрому восстановлению после стресса, индуцированного социальным поражением, при введении Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) мышам C57BL/6.
На ФИГ. 6 представлена схема, показывающая экспериментальную методику теста подвешивания за хвост (A), и результат теста подвешивания за хвост, подтверждающий способность к быстрому восстановлению после стресса, индуцированного социальным поражением, при введении Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) мышам C57BL/6 (B).
На ФИГ. 7 представлен результат, подтверждающий изменение экспрессии IL-1ß, представляющего собой воспалительный цитокин, после введения Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) в головной мозг животной модели для теста на социальное избегание.
На ФИГ. 8 представлен результат, подтверждающий изменение отношения CD4/CD8 и изменение клеток FOXP3+CD25 в CD3+CD4+ в селезенке в животной модели теста на социальное избегание после введения Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP).
На ФИГ. 9 представлен результат, подтверждающий изменение жизнеспособности в процессе лиофилизации путем обработки Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) криопротектором.
ПОДРОБНОЕ РАСКРЫТИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то значение, под которым они обычно понимаются специалистами в области техники, к которой относится данное изобретение. Как правило, используемая в настоящем документе номенклатура хорошо известна и обычно используется в данной области техники.
В настоящем изобретении сравнивали способность различных штаммов-пробиотиков человеческого происхождения к биосинтезу серотонина и было подтверждено, что среди них, в частности, штамм Lactobacillus plantarum KBL396 проявляет превосходный эффект в отношении биосинтеза серотонина и превосходный эффект в профилактике, улучшении состояния и лечении неврологических заболеваний. В дополнение к этому в результате анализа 16s рибосомальной ДНК (рДНК) этого штамма было подтверждено, что этот штамм является новым штаммом, неизвестным на предшествующем уровне техники.
В соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения данное изобретение предлагает Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP).
Штамм в соответствии с данным изобретением отличается тем, что он включает в себя последовательность 16s рДНК, представленную SEQ ID NO: 1.
<SEQ ID NO: 1>
TATCAGTACGTGCTATAATGCAGTCGACGACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGGAGTACGGCCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGGTTTAATTCAAAGCTACGCGAAGAAACCTTACCCAGGTTTTGACATACTAATGCAAATTCTAAAGAGATTAGAACGTTTCCCTTCCGGGGACATGGGATACCGGGTGGGTGCATGGGTTGGTCGTCAGCTTCGTGGTCGTGAGAATGTTTGGGTTTAAGTTCCCCGAAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTAGAACCAGCCGCCTAATGGCACCACCATGCG
Штамм в соответствии с данным изобретением отличается тем, что проявляет по меньшей мере одно из свойств, выбранных из группы, состоящей из повышения секреции серотонина, ингибирования экспрессии воспалительного цитокина, уменьшения количества вредных бактерий в кишечнике и антиоксидантного действия.
В дополнение к этому штамм в соответствии с данным изобретением может использовать в качестве источника углерода по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из D-рибозы, D-галактозы, D-глюкозы, D-фруктозы, D-маннозы, маннита, сорбита, α-метил-D-маннозида, α-метил-D-глюкозида, N-ацетилглюкозамина, амигдалина, арбутина, эскулина, салицина, целлобиозы, мальтозы, лактозы, мелибиозы, сахарозы, трегалозы, мелезитозы и гентиобиозы.
В дополнение к этому штамм в соответствии с данным изобретением обладает активностью по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из лейцинариламидазы, валинариламидазы, α-глюкозидазы и β-глюкозидазы.
Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) в соответствии с данным изобретением проявляет превосходный эффект улучшения состояния при неврологических заболеваниях в отсутствие риска побочных эффектов, свойственных традиционным терапевтическим агентам, применяемым при неврологических заболеваниях, и в дополнение к этому обладает преимуществами, состоящими в безопасности и отсутствии токсичности в организме человека, а также легко доступен и не вызывает отрицательного отношения к нему как к терапевтическому агенту и поэтому может быть очень полезен для промышленного применения.
В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения данное изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма.
В настоящем документе термин «культура» означает продукт, полученный в результате культивирования молочнокислой бактерии в известной питательной среде, при этом продукт может включать в себя молочнокислую бактерию. Питательная среда может быть выбрана из известной жидкой питательной среды или твердой питательной среды и может, например, представлять собой жидкую среду для культивирования лактобактерий по Ману, Рогозе и Шарпу (MRS), жидкую среду GAM, среду MRS с агаром, среду GAM с агаром и среду BL с агаром, но не ограничена ими. В настоящем документе термин «лизат» означает молочнокислую бактерию, разрушенную путем ферментативной обработки, гомогенизации или обработки ультразвуком молочнокислой бактерии. Кроме того, в настоящем документе термин «экстракт» означает продукт, полученный путем экстракции молочнокислой бактерии известным растворителем экстракции. Кроме того, в настоящем документе термин «живая клетка» означает саму новую молочнокислую бактерию согласно данному изобретению, а «убитая клетка» означает молочнокислую бактерию, стерилизованную нагреванием, воздействием давления или обработкой лекарственным препаратом и т.п.
Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением обладает превосходным эффектом для профилактики или лечения неврологических заболеваний и проявляет превосходный эффект в качестве фармацевтической композиции посредством восстановления кишечной микрофлоры, антиоксидантного эффекта, иммунорегулирующего эффекта и т.п.
Фармацевтическая композиция согласно данному изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент и/или лиофилизирующий агент.
Термин «фармацевтически приемлемый» относится к тому, что является физиологически приемлемым и обычно не вызывает серьезных желудочно-кишечных расстройств, головокружения, аллергических реакций или подобных реакций при введении человеку.
Композиция в соответствии с данным изобретением в дополнение к новой молочнокислой бактерии может дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент. Эксципиент, который может содержаться в композиции согласно данному изобретению, может включать в себя лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло и прочее, но не ограничен ими.
Композицию, согласно данному изобретению, можно включать в препараты для перорального введения или в препарат для парентерального введения обычным способом, и при включении в препарат она может быть получена с использованием обычно используемого наполнителя, загустителя, связующего агента, смачивающего агента, разрыхлителя, поверхностно-активного вещества, криопротектора и т.п.
Если композицию согласно данному изобретению готовят в виде твердого препарата для перорального введения, он включает в себя таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и т.п., и в дополнение к активным ингредиентам такой твердый препарат может содержать по меньшей мере один эксципиент, например крахмал, карбонат кальция, сахарозу, лактозу или желатин и т.п. Кроме того, в дополнение к простым эксципиентам он может содержать смазывающий агент, такой как стеарат магния и тальк и т.п., но не ограничен ими.
Если композицию согласно данному изобретению готовят в виде жидкого препарата для перорального введения, он включает в себя суспензию, растворы для приема внутрь, эмульсии и сироп и т.п., и в дополнение к обычно используемым простым разбавителям, таким как вода и вазелиновое масло, он может включать в себя различные эксципиенты, например смачивающие агенты, подсластители, ароматизаторы, консерванты и т.п., но не ограничен ими.
Если композицию, согласно данному изобретению, готовят в виде препарата для парентерального введения, он может включать в себя стерильный водный раствор, неводный растворитель, суспензию, эмульсии и суппозитории. В качестве неводного растворителя и суспензии он может включать в себя пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, пригодный для инъекций сложный эфир, такой как этилолеат, и т.п., но не ограничен ими. В качестве основного соединения для суппозиториев можно использовать Витепсол, Макрогол, Твин 61, масло какао, лаурин, глицерожелатин и прочее.
Содержание новой молочнокислой бактерии и т.п., то есть активных ингредиентов фармацевтической композиции согласно данному изобретению, можно регулировать в различных диапазонах в зависимости от конкретной формы, цели использования и аспектов композиции. В фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением содержание активных ингредиентов не имеет значительных ограничений и, например, может составлять от 0,01 до 99% масс., в частности от 0,1 до 75% масс., более конкретно от 0,5 до 50% масс. в расчете на общую массу композиции.
Используемый в настоящем изобретении криопротектор применяют для предохранения препарата пробиотика во время лиофилизации и увеличения срока годности. Используемый в настоящем изобретении криопротектор может содержать обычный сахарид. Сахарид может представлять собой моно-, ди-, олиго- или полисахарид или смесь по меньшей мере 2 или более сахаридов.
Например, можно использовать криопротектор, выбранный из группы, состоящей из сахарозы, мальтозы, мальтодекстрина, трегалозы, маннита, сорбита, инулина, глицерина, ДМСО, этиленгликоля, пропиленгликоля, 2-метил-2,4-пентандиола, полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиглицерина, обезжиренного молока, молочного белка, белка молочной сыворотки, бетаина, адонита, лактозы или любой их комбинации.
Предпочтительно криопротектор может включать в себя по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из сахарозы, обезжиренного молока и сорбита. Более предпочтительно могут быть включены сахароза, обезжиренное молоко и сорбит, содержание которых может составлять, в частности, от 2 до 20% масс. сахарозы, от 2 до 20% масс. сорбита и от 5 до 30% масс. обезжиренного молока в расчете на общую массу композиции. За счет добавления криопротектора лиофилизированная молочнокислая бактерия может проявлять значимо повышенную жизнеспособность, стабильность в условиях хранения, устойчивость к кислотам и устойчивость к желчи.
В дополнение к этому добавление антиоксидантов, таких как рибофлавин, рибофлавина фосфат или его физиологически приемлемая соль, глутатион, аскорбат и цистеин, в лиофилизированную композицию в соответствии с данным изобретением может дополнительно повышать жизнеспособность штамма в процессе хранения.
В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения данное изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения неврологических заболеваний, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма.
В настоящем документе термин «профилактика» означает все действия по ингибированию симптомов неврологических заболеваний или замедления их прогрессирования путем введения фармацевтической композиции согласно данному изобретению.
В настоящем документе термин «лечение» означает все действия по улучшению состояния или благоприятного изменения симптомов неврологических заболеваний путем введения фармацевтической композиции согласно данному изобретению.
В настоящем документе «неврологическое заболевание» включает в себя все патологические состояния, обусловленные патологией нервной системы. Соответственно, данное изобретение нацелено на профилактику или лечение острых и/или хронических заболеваний, связанных с нервами, психоневрологией, психиатрией, нейропатией и нейродегенерацией.
Это неврологическое заболевание может представлять собой нарушение психики или нейродегенеративное заболевание.
Не имеющие ограничительного характера примеры могут включать в себя обусловленное стрессом напряжение, тревогу, депрессию, расстройство настроения, бессонницу, бредовое расстройство, обсессивно-компульсивное расстройство, мигрень, нарушение памяти, когнитивное расстройство, нарушение внимания и т.п. В дополнение к этому не имеющие ограничительного характера примеры нейродегенеративного заболевания могут включать в себя болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, спинномозговую атрофию, синдром Туретта, атаксию Фридрайха, болезнь Мачадо-Джозефа, деменцию, дистонию, прогрессирующий надъядерный паралич и т.п.
Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения неврологических заболеваний в соответствии с данным изобретением проявляет превосходный эффект улучшения состояния при неврологических заболеваниях в отсутствие риска побочных эффектов, свойственных традиционным терапевтическим агентам, применяемым при неврологических заболеваниях, и в дополнение к этому обладает преимуществами, состоящими в отсутствии токсичности в организме человека и безопасности, и легко доступна при отсутствии отрицательного отношения к ней как к терапевтическому агенту, и поэтому может быть очень полезна для промышленного применения. В соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения композиция, согласно данному изобретению, обладает эффектом для профилактики, улучшения состояния и лечения неврологических заболеваний посредством индукции биосинтеза серотонина. В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения композиция, согласно данному изобретению, проявляет превосходный эффект, улучшающий когнитивную способность. В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения композиция, согласно данному изобретению, проявляет превосходный эффект, улучшающий симптомы, такие как напряжение, депрессия, тревога и т.п., в стрессовых условиях. В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения композиция, согласно данному изобретению, проявляет превосходный эффект для профилактики, лечения и улучшения состояния при неврологических заболеваниях посредством регулирования воспалительной реакции нервной системы. В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения композиция, согласно данному изобретению, проявляет превосходный эффект для профилактики, улучшения состояния и лечения при неврологических заболеваниях посредством регулирования воспалительной реакции. В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения композиция, согласно данному изобретению, проявляет превосходный эффект для профилактики, улучшения состояния и лечения неврологического заболевания посредством регулирования воспалительной реакции в нервах и головном мозге вследствие иммунного дисбаланса.
Доза фармацевтической композиции в соответствии с данным изобретением должна представлять собой фармацевтически эффективное количество. «Фармацевтически эффективное количество» означает достаточное количество для профилактики или лечения неврологических заболеваний при рациональном отношении «польза/риск» применительно к медикаментозному лечению. Эффективный уровень дозы может быть выбран специалистом в данной области техники по-разному в соответствии с такими факторами, как методика приготовления препарата, состояние и масса тела пациента, пол, возраст, степень тяжести заболевания пациента, лекарственная форма, путь и период введения, скорость выведения, реакции чувствительности и прочее. Эффективная доза может быть изменена в соответствии с путем лечения, использованием эксципиентов и возможности совместного применения с другими лекарственными препаратами, как известно специалистам в данной области техники. Тем не менее для получения предпочтительного эффекта в случае препаратов для перорального введения, как правило, композицию согласно данному изобретению можно вводить взрослому в количестве от 0,001 до 1000 мг/кг, предпочтительно от 0,01 до 100 мг/кг в сутки.
3
11
В случае описанного выше введения препарата Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), согласно данному изобретению, можно вводить в количестве от 1 × 10 КОЕ/кг до 1 × 10КОЕ/кг в сутки. Введение можно выполнять один раз в день или разделять на несколько раз. Доза не предусматривает ограничения объема данного изобретения ни в одном аспекте.
Фармацевтическую композицию в соответствии с данным изобретением можно различными путями вводить млекопитающему, включая мышь, сельскохозяйственных животных, человека и прочих. В частности, фармацевтическую композицию, согласно данному изобретению, можно вводить перорально или парентерально (например, применять или вводить внутривенно, подкожно, интраперитонеально), но предпочтительно пероральное введение. Твердые препараты для перорального введения могут включать в себя порошки, гранулы, таблетки, капсулы, мягкие капсулы, пилюли и им подобные.
2
4
Фармацевтическая композиция, согласно данному изобретению, может быть представлена в виде препарата с энтеросолюбильным покрытием, в частности, в единичной лекарственной форме для приема внутрь. В настоящем документе «энтеросолюбильное покрытие» включает в себя все виды известных фармацевтически приемлемых покрытий, которые не разлагаются и, следовательно, сохраняются под действием желудочной кислоты, но в достаточной степени разлагаются в тонком кишечнике и позволяют активным компонентам высвобождаться в тонком кишечнике. «Энтеросолюбильное покрытие» согласно данному изобретению относится к покрытиям, которые сохраняются в течение 2 часов или более в своем исходном виде при контакте с искусственным желудочным соком, таким как раствор HCl pH 1, при температуре от 36°C до 38°C и предпочтительно впоследствии разлагаются в искусственном кишечном соке, таком как буферный раствор KHPO pH 6,8, в течение 30 минут.
Энтеросолюбильное покрытие, согласно данному изобретению, наносят в количестве приблизительно от 16 до 30, предпочтительно от 16 до 20 или 25 мг на 1 ядро. Удовлетворительный результат показан при толщине энтеросолюбильного покрытия согласно данному изобретению от 5 до 100 мкм, предпочтительно от 20 до 80 мкм. Материалы энтеросолюбильного покрытия соответствующим образом выбраны из известных полимерных веществ. Перечни соответствующих полимерных веществ приведены во многих документах (L. Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3 edition, 1986, pp. 365-373; H. Sucker et al., Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis, 4 edition, Vol. 7, pp. 739-742 и 766-778, (SpringerVerlag, 1971); и Remington's Pharmaceutical Sciences, 13 edition, pp. 1689-1691 (Mack Publ., Co., 1970)) и могут включать в себя сложноэфирные производные целлюлозы, простой эфир целлюлозы, сополимер метилакрилата и акрилового полимера и сополимер производных малеиновой кислоты и фталевой кислоты.
2
2
Энтеросолюбильное покрытие, согласно данному изобретению, можно готовить, используя обычный способ нанесения раствора энтеросолюбильного покрытия на ядро путем распыления. В качестве подходящего растворителя для способа нанесения энтеросолюбильного покрытия можно использовать спирты, такие как этанол, кетоны, такие как ацетон, галогенированные углеводородные растворители, такие как дихлорметан (CHCl), и смешанные растворители из этих растворителей. К раствору покрытия добавляют смягчающий агент, такой как ди-н-бутилфталат или триацетин, в отношении (материал покрытия к смягчающему агенту) от 1 до около 0,05 до около 0,3. Процесс распыления целесообразно проводить непрерывно, и распыляемое количество можно регулировать с учетом состояния покрытия. Давление при распылении можно регулировать различным образом, и, как правило, удовлетворительный результат получают при давлении распыления от 1 до около 1,5 бар.
Жидкие препараты для перорального введения представляют собой суспензию, растворы для приема внутрь, эмульсии, сироп, аэрозоль и им подобные и могут включать в себя в дополнение к обычно используемым простым разбавителям, таким как вода и вазелиновое масло, различные эксципиенты, например смачивающие агенты, подсластители, ароматизаторы, консерванты и прочее. В качестве препаратов для парентерального введения можно использовать препараты, приготовленные в форме раствора для наружного применения и стерильного инъекционного раствора, такого как стерильный водный раствор, жидкости, неводный растворитель, суспензия, эмульсия, глазные капли, глазная мазь, сироп, суппозитории, аэрозоль и прочее, которые стерилизуют общепринятым способом. Препараты для местного введения могут быть безводными или водными в зависимости от клинической рецептуры. В качестве неводного растворителя и суспензии можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, пригодный для инъекций сложный эфир, такой как этилолеат, и т.п.
Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения неврологических заболеваний в соответствии с данным изобретением может дополнительно содержать по меньшей мере один из известных активных ингредиентов, обладающих эффектом в профилактике или лечении неврологических заболеваний.
В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения данное изобретение предлагает пищевую композицию для профилактики или улучшения состояния при неврологических заболеваниях, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма.
Пищевая композиция в соответствии с данным изобретением характеризуется композицией для продуктов питания или пищевых добавок, но не ограничена ими, и ее можно легко использовать в качестве продукта питания, обладающего эффектом в профилактике или улучшении состояния при неврологических заболеваниях, например, в качестве основных ингредиентов продукта питания, дополнительных ингредиентов, пищевых добавок, функциональных продуктов для здорового питания или функциональных напитков.
Продукты питания означают натуральные продукты или обработанные продукты, содержащие один или более видов питательных веществ, и предпочтительно означают, что продукт готов к непосредственному употреблению в пищу после некоторой обработки, и в общем смысле включают в себя все продукты питания, пищевые добавки, функциональные продукты для здорового питания и функциональные напитки.
Продукты питания, в которые добавляют пищевую композицию в соответствии с данным изобретением, включают в себя, например, различные виды пищевых продуктов, напитков, жевательную резинку, чай, витаминные комплексы, функциональные продукты питания и т.п. Дополнительно продукт питания согласно данному изобретению включает в себя специальный продукт питания (например, детские смеси, продукты питания для младенцев и грудных детей и т.д.), обработанные мясные продукты, рыбные продукты, тофу, желированные продукты питания, лентовидные макаронные изделия (например, лапшу быстрого приготовления, лапшу и т.д.), различные виды хлеба, полезные для здоровья пищевые добавки, приправы (например, соевый соус, соевую пасту, пасту из красного перца, смешанный соус и т.д.), соусы, кондитерские изделия (например, снеки), леденцы, шоколад, жевательную резинку, мороженое, молочные продукты (например, кисломолочный продукт, сыр и т.д.), другие обработанные продукты питания, Кимчи, маринованные продукты питания (различные виды Кимчи, маринованные овощи и т.д.), напитки (например, фруктовые напитки, овощные напитки, продукты из соевого молока, сброженные напитки и т.д.) и натуральные приправы (например, суп с лапшой быстрого приготовления), но не ограничен ими. Продукт питания, напиток или пищевая добавка могут быть приготовлены обычным способом.
Продукты для здорового питания означают группу продуктов питания, в которых соответствующий продукт питания действует и выполняет функцию для достижения определенной цели, дополнительную ценность которых обеспечивают с помощью физических, биохимических или биотехнологических способов, или продукт питания, предназначенный и обработанный для достаточного осуществления регулирующих функций организма, связанных с регулированием ритмов биологической защиты, профилактикой заболеваний и выздоровлением, и тому подобные пищевые композиции. Функциональный продукт питания может включать в себя пригодную для употребления в пищу пищевую добавку и может дополнительно содержать соответствующий носитель, эксципиент и разбавитель, обычно используемый в производстве функциональных продуктов питания.
В настоящем документе функциональный напиток относится к общему термину, означающему напиток для утоления жажды или наслаждения вкусом, в котором другие компоненты, помимо существенных компонентов композиции для улучшения состояния или профилактики симптомов неврологических заболеваний в указанном соотношении, конкретно не ограничены и могут содержать различные вкусоароматические агенты или натуральные углеводы и прочие дополнительные компоненты, как и обычные напитки.
Кроме того, в дополнение к упомянутому выше продукт питания, содержащий пищевую композицию для улучшения состояния или профилактики симптомов неврологического заболевания согласно данному изобретению, может содержать различные питательные вещества, витамины, минеральные вещества (электролиты), вкусоароматические добавки, например синтетические и натуральные вкусоароматические добавки, красящие вещества и наполнители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и ее соль, альгинат и его соль, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, агенты, регулирующие pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты, карбонизирующие агенты, используемые для приготовления газированных напитков, и прочие компоненты, которые можно использовать по отдельности или в комбинации.
В продуктах питания, содержащих пищевую композицию согласно данному изобретению, количество композиции в соответствии с данным изобретением может составлять от 0,001% масс. до 100% масс., предпочтительно от 1% масс. до 99% масс. от общей массы продукта питания, а в случае напитков его доля может составлять от 0,001 г до 10 г, предпочтительно от 0,01 г до 1 г в расчете на 100 мл, но для длительного потребления в целях здоровья и гигиены или контроля состояния здоровья этот диапазон может быть меньшим, а в связи с отсутствием проблем в аспекте безопасности активных ингредиентов композицию можно использовать в количестве, превышающем этот диапазон, и, следовательно, оно не ограничено данным диапазоном.
Пищевая композиция, согласно данному изобретению, может дополнительно содержать по меньшей мере один из эксципиентов и/или лиофилизирующих агентов.
Пищевую композицию, согласно данному изобретению, можно готовить в форме композиции, подходящей для добавления штамма Lactobacillus plantarum KBL396 независимо или к приемлемому носителю, или для приема внутрь человеком или животными. Иными словами, ее можно использовать путем добавления к продукту питания, который не содержит других бактерий-пробиотиков, и к продукту питания, уже содержащему различные виды бактерий-пробиотиков. Например, при приготовлении продукта питания согласно данному изобретению другие микроорганизмы, которые можно использовать вместе со штаммом согласно данному изобретению, конкретно не ограничены при условии их пригодности для приема внутрь человеком или животными и наличия пробиотической активности, которая может ингибировать патогенные вредные бактерии или улучшать баланс микроорганизмов в кишечнике млекопитающего при приеме внутрь. Примерами этих микроорганизмов являются дрожжи, включая Saccharomyces, Candida, Pichia и Torulopsis, плесневые грибы, такие как Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium и им подобные, бактерии, относящиеся к родам Lactobacillus, Bifidobacterium, Leuconostoc, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Propionibacterium, Enterococcus, Pediococcus и им подобные. Конкретные примеры подходящих микроорганизмов-пробиотиков включают в себя Saccharomyces cerevisiae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactococcus lactis, Pediococcus acidilactici и прочие. Предпочтительно эффект может быть дополнительно усилен за счет дополнительного содержания в композиции для продукта питания согласно данному изобретению смешанных бактерий, являющихся микроорганизмами-пробиотиками, обладающими превосходной пробиотической активностью и одновременно обладающих превосходным эффектом улучшения состояния при неврологических заболеваниях. Примеры носителя для использования в композиции для продукта питания, согласно данному изобретению, могут включать в себя объемообразующие агенты, добавки с высоким содержанием волокна, инкапсулирующие агенты, липиды и прочее, и примеры носителя достаточно известны в данной области техники. Lactobacillus plantarum KBL396, согласно данному изобретению, может быть представлен в лиофилизированной или капсулированной форме или в форме суспензии или сухого порошка культуры.
В соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения данное изобретение предлагает добавку для корма животных, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма.
Добавка для корма животных, согласно данному изобретению, может дополнительно содержать по меньшей мере один из эксципиентов и/или лиофилизирующих агентов.
Добавка для корма животных, согласно данному изобретению, может быть представлена в форме сухого или жидкого препарата и может содержать другие непатогенные микроорганизмы в дополнение к штамму Lactobacillus plantarum KBL396. В качестве добавляемых микроорганизмов можно использовать, например, сенную бациллу, такую как Bacillus subtilis, способную продуцировать протеазу, липазу и карбонат-превращающий фермент, штаммы Lactobacillus, обладающие физиологической активностью и разлагающей органические вещества активностью в анаэробных условиях, например в желудке коров, нитевидные грибы, такие как Aspergillus oryzae, проявляющие эффекты увеличения массы тела и повышения надоев молока сельскохозяйственных животных и способствующие перевариваемости корма (Slyter, L. L. J. Animal Sci.1976, 43. 910-926), и дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae (Johnson, D. E et al., J. Anim. Sci., 1983, 56, 735-739; Williams, P. E. V. et al., 1990, 211), и прочие.
Добавка для корма животных согласно данному изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один ферментный препарат в дополнение к Lactobacillus plantarum KBL396. Добавляемый ферментный препарат возможно находится в сухом или жидком состоянии, и в качестве ферментного препарата можно использовать липолитический фермент, такой как липаза, фитазу, образующую фосфат и инозитолфосфат за счет разложения фитиновой кислоты, амилазу, представляющую собой фермент, гидролизующий α-1,4-гликозидную связь, содержащуюся в крахмале и гликогене и т.п., фосфатазу, представляющую собой фермент, гидролизующий сложный эфир органических фосфатов, карбоксиметилцеллюлазу, разлагающую целлюлозу, ксилазу, разлагающую ксилозу, мальтазу, гидролизующую мальтозу до глюкозы из двух молекул, и гликогенный фермент, такой как инвертаза, образующий смесь глюкозы и фруктозы за счет гидролиза сахарозы, и прочие.
При применении штамма Lactobacillus plantarum KBL396 согласно данному изобретению в качестве добавки для корма животных, в качестве исходного сырья для приготовления корма, в дополнение к различным видам зерновых и соевых белков, можно без ограничений использовать арахис, горох, сахарную свеклу, целлюлозу, побочные продукты зерновых, порошок из внутренних органов животных и порошок из рыбной муки и прочее в необработанном или обработанном виде. Способ обработки, необязательно ограниченный указанным, может представлять собой, например, процесс прессования с определенным выводом под давлением при подаче кормового исходного сырья, и в случае белка предпочтительно использовать экструзию, которая денатурирует белок и увеличивает его доступность. Преимущества экструзии состоят в денатурации белка и разрушении антиферментных факторов за счет процесса термической обработки и прочем. В дополнение к этому в случае соевого белка за счет экструзии можно усилить перевариваемость белка и инактивировать антипитательные факторы, такие как ингибитор трипсина, представляющий собой один из ингибиторов протеазы, присутствующих в соевом белке, а также усилить переваривающую способность протеазы и повысить питательную ценность соевого белка.
В другом варианте осуществления данного изобретения данное изобретение предлагает способ профилактики или лечения неврологических заболеваний, включающий в себя введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма.
В настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество (или эффективная доза)» означает соответствующее количество, совершенно достаточное для придания предпочтительного эффекта, но адекватное для предотвращения серьезных побочных эффектов в объеме медицинского обоснования. Количество микроорганизмов для введения в организм посредством композиции согласно данному изобретению можно соответствующим образом регулировать с учетом пути введения и субъекта, которому ее вводят.
«Введение» означает предоставление назначенной фармацевтической композиции согласно данному изобретению любым подходящим способом. Таким образом, субъект означает животное и, как правило, может представлять собой млекопитающее, которое может демонстрировать полезный эффект в результате лечения с применением новой молочнокислой бактерии согласно данному изобретению. В качестве предпочтительного примера этого субъекта можно рассматривать приматов, таких как человек. Кроме того, такие субъекты могут включать в себя всех субъектов, имеющих симптомы или подверженных риску аллергических заболеваний.
В другом варианте осуществления данного изобретения данное изобретение предлагает композицию, содержащую по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма, для применения для профилактики или лечения неврологических заболеваний.
В другом варианте осуществления данного изобретения предложено применение композиции, содержащей по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культуры этого штамма, лизата этого штамма и экстракта этого штамма, для приготовления лекарственного препарата для профилактики или лечения неврологических заболеваний.
Далее данное изобретение будет раскрыто более подробно путем примеров. Эти примеры предназначены только для иллюстрации данного изобретения и, что очевидно специалистам в данной области техники, объем данного изобретения не ограничен этими примерами.
Пример 1. Скрининг штаммов-пробиотиков, обладающих способностью к индукции биосинтеза серотонина
Во многих документах предшествующего уровня техники отмечено, что серотонин играет важную роль в неврологических заболеваниях, в частности, в нарушениях психики. С использованием 47 видов штаммов-пробиотиков, выделенных из фекалий младенцев и взрослых (19 видов Lactobacillus spp., 28 видов Bifidobacterium spp.), и 2 видов Lactobacillus plantarum, имеющихся в продаже в виде пробиотических продуктов, проводили оценку их способности к индукции биосинтеза серотонина. Способность к индукции биосинтеза серотонина подтверждали путем наблюдения степени стимуляции экспрессии гена триптофангидроксилазы-1 (TPH-1), которая является ограничивающим скорость ферментом пути биосинтеза серотонина, в линии энтерохромаффинных клеток RIN14B после обработки каждым штаммом.
1-1. Культивирование штаммов и получение супернатанта культуры
Для скрининга нового штамма, проявляющего эффективность при неврологических заболеваниях, использовали 47 видов молочнокислых бактерий-кандидатов, выделенных из фекалий здоровых взрослых или младенцев мужского и женского пола из Кореи. Эти молочнокислые бактерии-кандидаты культивировали в питательной среде MRS с добавлением 0,5% цистеина соответственно и активировали путем двукратного пересева через 24-часовой интервал, а затем в эксперименте использовали супернатант культуры, включающий в себя метаболиты каждого штамма. После получения супернатанта культуры путем центрифугирования (13 000g, 5 минут, 4°C) pH супернатанта калибровали до 7,0, а затем стерилизовали его с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм и хранили при 4°C до использования.
Штаммы молочнокислых бактерий, используемых для скрининга новых штаммов, были названы KBL346, KBL642, KBL342, KBL649, KBL351, KBL633, KBL663, KBL621, KBL647, KBL640, KBL646, KBL639, KBL402, KBL600, KBL591, KBL538, KBL501, KBL652, KBL662, KBL389, KBL613, KBL544, KBL391, KBL395, KBL648, KBL497, KBL384, KBL354, KBL500, KBL362, KBL612, KBL664, KBL397, KBL545, KBL363, KBL374, KBL375, KBL385, KBL665, KBL481, KBL381, KBL605, KBL383, KBL624, KBL585, KBL365 или KBL39 соответственно. Среди этих штаммов для 19 видов штаммов KBL346, KBL342, KBL351, KBL402, KBL389, KBL391, KBL395, KBL384, KBL354, KBL362, KBL397, KBL363, KBL374, KBL375, KBL385, KBL381, KBL383, KBL365 и KBL396 была подтверждена принадлежность к штаммам Lactobacillus spp., а для 28 видов штаммов KBL642, KBL649, KBL633, KBL663, KBL621, KBL647, KBL640, KBL646, KBL639, KBL600, KBL591, KBL538, KBL501, KBL652, KBL662, KBL613, KBL544, KBL648, KBL497, KBL500, KBL612, KBL664, KBL545, KBL665, KBL481, KBL605, KBL624 и KBL585 была подтверждена принадлежность к штаммам Bifidobacterium spp.
В дополнение к этому в качестве имеющихся в продаже продуктов были приобретены Solace (Oryx Biomedical Inc., г. Фремонт, штат Калифорния, США), состоящий из продукта одного штамма Lactobacillus plantarum PS128, и L. plantarum (Quest Vitamins Limited, г. Кингстон, Херефорд, Великобритания), состоящий из продукта одного штамма Lactobacillus plantarum 299v, соответственно, и получали супернатанты культуры каждого штамма посредством процессов культивирования и активации таким же способом, как молочнокислые бактерии-кандидаты для использования в эксперименте.
1-2. Культивирование линии клеток RIN14B
2
5
Клетки RIN14B (ATCC CRL-2059) культивировали в условиях 37°C и 5% COв питательной среде RPMI 1640, в которую добавляли 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), пенициллин (100 мкг/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), и пересевали один раз в 3 дня. Линию клеток RIN14B делили на аликвоты по 4×10 клеток/лунка в 24-луночном планшете, а затем супернатант бактериальной культуры был обработан.
1-3. Обработка супернатантом культуры штамма
2
После удаления питательной среды из разделенной на аликвоты линии клеток RIN14B в 24-луночном планшете, как описано в примере 1-2, клетки однократно промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) (500 мкл/лунка). Затем препарат обрабатывали 500 мкл супернатанта культуры штамма, полученного в примере 1-1, или 500 мкл разведенного дезоксихолата, обладающего способностью к индукции синтеза серотонина, в качестве положительной контрольной группы, калибровали pH до 7,0 и разводили стерилизованной с помощью фильтра питательной средой MRS до конечной концентрации 25 мкМ. После культивирования в течение 1 часа в условиях 37°C и 5% CO клетки и супернатант собирали для количественного определения экспрессии гена фермента триптофангидролазы-1 (TPH1).
1-4. Количественное определение экспрессии Tph1 способом ОТ-кПЦР
Для количественного определения уровня экспрессии Tph1 (триптофангидролазы-1) из клеток, полученных в примере 1-3, выделяли РНК с помощью набора реактивов для экстракции суммарной РНК Easy-spin™ (Intron) в соответствии со способом производителя. После синтеза кДНК из выделенной РНК с помощью набора реактивов High-Capacity RNA-to-cDNA™ в соответствии со способом производителя ОТ-кПЦР (количественную полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени) проводили на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN) с набором реактивов для ПЦР Rotorgene SYBR Green или на приборе Quantstudio 5 (Thermofisher) с основной смесью для ПЦР Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems).
Экспрессируемое количество Tph1 рассчитывали как разность измеренных значений относительной экспрессии с праймерами Tph-1 F и Tph1 R или Tph-1A F и Tph-1A R по сравнению с измеренным значением экспрессии гена β-актина с прямым и обратным праймерами к бета-актину крысы (Rat B-actin F и Rat B-actin R), как раскрыто в таблице 1 (анализ ΔΔCT). Сводные данные о праймерах и температурных условиях, используемых для ОТ-кПЦР, представлены в приведенных ниже таблицах 1 и 2 соответственно.
[Таблица 1]
Праймер
Последовательность
Tph-1 F
ggctttgaggtcctctttcca (SEQ ID NO: 2)
Tph-1 R
ccccctttctgaggaatggtc (SEQ ID NO: 3)
Tph-1A F
accctgggatgtgcttcatg (SEQ ID NO: 4)
Tph-1A R
gcgttctgcaaagcaacaga (SEQ ID NO: 5)
Rat B-actin F
cagccttccttcctgggtatg (SEQ ID NO: 6)
Rat B-actin R
tagagccaccaatccacacag (SEQ ID NO: 7)
[Таблица 2]
Температура
Время
Цикл
95°C
5 минут
1 цикл
94°C
15 секунд
50 циклов
60°C
30 секунд
72°C
30 секунд
Результат эксперимента, проведенного в описанных выше условиях, представлен на ФИГ. 1.
Как показано на ФИГ.1A (анализ с помощью Rotor-Gene Q (QIAGEN) с набором реактивов Rotorgene SYBR Green PCR, праймеры Tph-1 F и Tph1 R), в группе, обработанной штаммом KBL396, показана повышенная в 2-4 раза экспрессия гена Tph1 по сравнению с группами, обработанными другими штаммами, и группой, обработанной 25 мкМ дезоксихолатом.
В дополнение к этому результат сравнения с имеющимися в продаже штаммами Lactobacillus plantarum показан на ФИГ. 1B (анализ с помощью прибора Quantstudio 5 (Thermofisher) с основной смесью для ПЦР Power SYBR Green (Applied Biosystems) с использованием праймеров Tph-1A F и Tph-1A R). Как показано на ФИГ. 1B, можно подтвердить, что штамм KBL396, представляющий собой штамм согласно данному изобретению, обладает превосходной способностью к индукции экспрессии Tph1 (Q1, Lactobacillus plantarum 299v; S1, Lactobacillus plantarum PS128).
На основании описанного выше результата было подтверждено, что штамм KBL396, который представлял собой штамм, выделенный из фекалий здоровых взрослых женщин из Кореи, и был собран после получения информированного согласия донора и утверждения клинического исследования (IRB No. 144-2011-07-11) в медицинском центре Самсунг, г. Сеул (Samsung Seoul Hospital).
Пример 2. Приготовление корма, содержащего штамм KBL396, и применение корма к животной модели
Так как в примере 1 было подтверждено, что штамм KBL396 показывает превосходный эффект для биосинтеза серотонина in vitro, чтобы подтвердить, что штамм KBL396 показывает превосходный эффект против неврологических заболеваний in vivo, эксперимент необходимо было продолжить с использованием животной модели в доклиническом эксперименте, и для этого был приготовлен корм, содержащий штамм KBL396, и применен к животной модели.
2-1. Приготовление корма
Поскольку введение через желудочный зонд вызывает сильный стресс у экспериментального животного, и такой стресс может повлиять на объективность экспериментального результата (ошибку), был запланирован эксперимент с введением в форме корма для животной модели, приготовленного путем смешивания со штаммом.
Корм, используемый для введения штамма, готовили следующим способом. Штамм KBL396 активировали культивированием в питательной среде MRS в течение 24 часов и пересевали через 24 часа путем инокуляции 1% в новую питательную среду MRS. Затем культуру клеток центрифугировали при 6000 об/мин при 4°C в течение 20 минут, после чего супернатант отбрасывали, и осадки ресуспендировали при 4°C в 1-кратном ФСБ. Затем добавляли 1-кратный ФСБ до более 50% объема супернатанта культуры для достаточного разведения. После этого проводили центрифугирование в тех же условиях, как описано выше, и промывку повторяли дважды, а затем осадки ресуспендировали в 1-кратном ФСБ (бактериальный концентрат).
9
Корм, стерилизованный облучением, измельчали до порошкообразной формы, смешивали с бактериальным концентратом, приготовленным, как описано выше, и делили на аликвоты в виде шариков подходящего размера и замораживали при -80°C в течение 24 часов. Затем замороженные смеси корма с бактериями лиофилизировали в течение 48-72 часов и хранили при -80°C до использования. Количество штамма KBL396, содержащееся в лиофилизированном корме (корм с включением KBL396), составляло около 1×10 КОЕ/г, а корм для контрольной группы (корм с включением ФСБ) готовили таким же способом путем смешивания корма с такой же массой ФСБ, как масса бактериального концентрата в корме, приготовленном путем смешивания со штаммом, и хранили при -80°C.
2-2. Введение корма
После приготовления «корм с включением ФСБ» и «корм с включением штамма KBL396» хранили при -80°C, отбирали каждый день и давали мышам линии C57BL/6 в 9 часов утра в количестве 3-5 г корма на одну мышь (количество увеличивали в соответствии с возрастом в неделях). После выдачи корма остаточный корм собирали и рассчитывали количество потребляемого корма и количество потребляемого штамма. За животной моделью наблюдали на фоне введения корма в течение 28 или более дней.
Пример 3. Влияние введения штамма KBL396 на улучшение когнитивной способности (эксперимент с Y-ОБРАЗНЫМ ЛАБИРИНТОМ)
Влияние на улучшение когнитивной способности, вызванное применением штамма KBL396, тестировали путем проведения эксперимента в Y-образном лабиринте после введения штамма в течение 28 дней. Животная модель, используемая в настоящем изобретении, представляла собой мышей линии C57BL/6 в возрасте 7 недель, и для проведения эксперимента использовали соответственно по 8 мышей в контрольной группе, получавшей ФСБ, и в группах, получавших KBL396.
Эксперимент в Y-образном лабиринте представляет собой поведенческий эксперимент, по результатам которого можно судить о когнитивной способности с использованием животной модели. В этом эксперименте три рукава Y-образного лабиринта были соединены друг с другом под углом 120°, и каждый рукав обозначен как A, B и C; экспериментальных животных помещали в один рукав и давали им возможность свободно перемещаться в течение 8 минут, а затем отмечали количество и порядок вхождений в каждый рукав и регистрировали его с помощью камеры, установленной на потолке, и подключенной к ней компьютерной программы. Затем количество и порядок вхождений в каждый рукав регистрировали, когда в него полностью входил хвост, а также регистрировали случаи повторного вхождения в один и тот же рукав. При вхождении в 3 отличающихся друг от друга рукава по порядку (фактическое чередование), то есть при вхождении в порядке ABC, CAB, BAC и т.п., присваивали 1 балл и рассчитывали чередование поведения в% по следующей формуле.
Чередование поведения,% = фактическое чередование/максимальное чередование × 100 (максимальное чередование : общее количество вхождений - 2)
Результат представлен на ФИГ. 2. Как видно на ФИГ. 2, можно было подтвердить, что у животной модели, которой вводили KBL396, был отмечен значимо высокий эффект улучшения когнитивной способности по сравнению с контрольной животной моделью, которой вводили ФСБ.
Пример 4. Влияние введения штамма KBL396 на повышение концентрации серотонина в головном мозге
Было проведено тестирование, может ли введение штамма KBL396 вызывать повышение серотонина в головном мозге.
Прежде всего было подтверждено количество ограничивающего скорость фермента пути биосинтеза серотонина TPH-2 (триптофангидроксилазы-2) в ткани головного мозга на основании количества мРНК этого фермента. кДНК синтезировали путем выделения РНК в соответствии с таким же способом, как описано в примере 1-4, из ткани головного мозга, полученной у животной модели примера 3. В синтезированной кДНК был подтвержден уровень экспрессии Tph2 с использованием прибора Rotor-Gene Q (QIAGEN), набора реактивов для ПЦР Rotorgene SYBR Green и следующих праймеров TPH-2f, TPH-2r. Эксперимент и анализ результатов был проведен в других условиях путем сравнения с экспрессией гена Gapdh так же, как в примере 1-4.
TPH-2f: 5’ CAGTCCACGAAGATTTCGACTT 3’ (SEQ ID NO: 8)
TPH-2r: 5’ GCAAGACAGCGGTAGTGTTCT 3’ (SEQ ID NO: 9)
Результат эксперимента, проведенного в описанных выше условиях, представлен на ФИГ. 3A. В результате тестирования была подтверждена значимо повышенная экспрессия гена Tph2у животной модели, которой вводили KBL396 (KBL396), по сравнению с животной моделью, которой вводили ФСБ (ФСБ), что подтверждает стимуляцию биосинтеза серотонина.
Затем для прямого измерения концентрации серотонина в ткани головного мозга был проведен твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). К ткани головного мозга, полученной у животной модели примера 3, добавляли гранулы из нержавеющей стали диаметром 5 мм (Qiagen) и реагент для экстракции белка из ткани T-PER™ (Tissue Protein Extraction Reagent; Sigma) и проводили лизис ткани, используя раствор для лизиса ткани Tissue lyser II (Qiagen), в условиях 30 Гц в течение 10 минут. Путем проведения центрифугирования лизированной смеси (4°C, 11 000g, 15 минут) был получен промежуточный слой водного слоя, который хранили при -80°C до использования в анализе (водный раствор образца). Образцы для измерения количества серотонина в «водном растворе образца» готовили с помощью набора реактивов для ИФА Serotonin Ultrasensitive ELISA Assay (Eagle biosciences) в соответствии с способом производителя и анализировали с помощью ридера для микропланшетов Spark 10M (Tecan).
Результат анализа по количественному определению серотонина (5-HT) показан на ФИГ. 3B. На основании подтверждения, что концентрация серотонина (5-HT), измеренная у животной модели, в которой вводили KBL396 (KBL396), более чем в два раза выше по сравнению с концентрацией в контрольной группе, которой вводили ФСБ (ФСБ), было подтверждено, что штамм KBL396 действительно вызывает повышение концентрации серотонина в головном мозге.
Пример 5. Влияние введения штамма KBL396 на улучшение способности к восстановлению после стресса (тест на социальное избегание)
Тест на социальное избегание представляет собой поведенческий эксперимент по оценке влияния стресса на животную модель. В настоящем изобретении для подтверждения эффекта усиления устойчивости к стрессовому воздействию штаммом KBL396 проводили эксперимент на социальное избегание после индукции стресса у мышей после введения штамма KBL396.
Сначала в настоящем изобретении использовали животную модель в виде мышей линии C57BL/6 в возрасте 7 недель и проводили эксперимент в 4 группах: контрольной группе, получавшей ФСБ, группе, получавшей ФСБ с индукцией стресса, группе, получавшей штамм KBL396, и группе, получавшей штамм KBL396 с индукцией стресса, по 8 мышей в каждой группе.
«Корм с включением ФСБ» или «корм с включением KBL396» вводили в общей сложности в течение 4 недель (28 дней), и мышей подвергали стрессовому воздействию. Для кормления постоянно предоставляли «корм с включением ФСБ» или «корм с включением KBL396» даже в течение периода стрессового воздействия, составлявшего 7 дней.
На ФИГ. 4 показана клетка для вызывания в животной модели стресса, связанного с социальным поражением (A), и схема экспериментальной камеры для теста на социальное избегание (B). Чтобы индуцировать у мышей стресс, к мышам линии C57BL/6 подсаживали мышь линии CD-1 и содержали в одной клетке с прозрачной пограничной стенкой, выполненной из акриловой пластины, с отверстием в центре. На период, составляющий 7 дней, к мышам линии C57BL/6 один раз в день подсаживали агрессивную мышь линии CD-1, которой давали возможность физически атаковать этих мышей (стресс социального поражения). После атаки в общей сложности в течение 5 минут мышей C57BL/6 оставляли в клетке с прозрачной пограничной стенкой на 24 часа, при этом на противоположной стороне находилась новая мышь CD-1. Поскольку мыши C57BL/6 подвергались угрозе со стороны мыши CD-1 в течение 24 часов и постоянно распознавали присутствие агрессивной мыши CD-1, они подвергались не только физическому, но и психическому стрессу, следующему за периодом социального поражения.
Затем для оценки изменения поведения, вызванного стрессовым воздействием, проводили тест на социальное избегание. Тест на социальное избегание состоял из двух серий экспериментов, проведенных в одной и той же камере для поведенческих экспериментов. В первой серии мышей C57BL/6 помещали в середину камеры, позволяя им свободно перемещаться в течение 3 минут. Во второй серии мышь CD-1 помещали в извлекаемый корпус посередине на одной стороне камеры для поведенческих экспериментов, а затем наблюдали поведение мышей C57BL/6 в течение 3 минут. Затем мышей C57BL/6 подвергали стрессу социального поражения, который показывает поведенческий аспект убегания в угловую зону и состояния неподвижности при подтверждении присутствия мыши CD-1, и для определения степени социального избегания измеряли период времени, в течение которого мыши C57BL/6 оставались в угловой зоне.
Результат представлен на ФИГ. 5. Как видно на ФИГ. 5, можно было подтвердить, что у мышей, которым вводили KBL396 согласно данному изобретению (KBL396+СТР), степень социального избегания после индукции стресса социальной атаки значимо улучшалась.
Пример 6. Влияние введения штамма KBL396 на улучшение состояния депрессии (тест подвешивания за хвост)
Мыши C57BL/6, страдающие стрессом социальной атаки, из примера 5, проявляли депрессивное поведение, что является хорошо известной мышиной моделью в области исследования депрессии. В настоящем изобретении для подтверждения эффекта ослабления депрессии, вызванного введением KBL396, проводили тест подвешивания за хвост у мышей C57BL/6 после стресса социальной атаки.
Введение KBL396 и индукцию депрессии стрессовым воздействием выполняли способом, подобным описанному в примере 5, и также вводили KBL396 в период получения стресса социальной атаки.
Мышей C57BL/6, страдающих стрессом социальной атаки, в отдельной зоне прикрепляли за хвост к потолку липкой лентой, которую приклеивали на расстоянии около 1 см от кончика хвоста, и измеряли время неподвижности в течение последних 4 минут из общего времени эксперимента 6 минут. Состояние неподвижности означает состояние, в котором все движения в подвешенном состоянии полностью прекращаются.
Результат теста подвешивания за хвост показан на ФИГ. 6. Как показано на ФИГ. 6, можно было подтвердить, что в группе, которой вводили KBL396 (KBL396+СТР), по сравнению с контрольной группой, в которой индуцировали депрессию (ФСБ+СТР), депрессивный фенотип восстанавливался до такого же уровня, как и в нормальной контрольной группе, хотя ее подвергали такому же стрессу.
На основании описанного выше результата видно, что введение штамма KBL396 обладает эффектом улучшения когнитивной способности и эффектом профилактики и лечения депрессии, вызванной стрессом.
Пример 7. Эффект регуляции воспалительной реакции головного мозга на фоне введения штамма KBL396
Эффект регуляции воспалительной реакции головного мозга на фоне введения штамма KBL396 подтверждали на основании количества воспалительного цитокина IL-1β путем выделения суммарного белка из ткани головного мозга, полученной у животной модели примера 5 и выполнения ИФА. «Водный раствор образца» из ткани головного мозга, полученной у животной модели примера 5, был получен таким же способом, как описано в примере 4. Измерение концентрации белка в «водном растворе образца» проводили с использованием набора реактивов для количественного определения белка BCA Protein Assay Kit (Pierce, США) в соответствии с способом производителя. Для измерения количества IL-1β образцы готовили с помощью набора реактивов для ИФА на мышиный IL-1β (Mouse IL-1β ELISA kit, Sigma Aldrich) в соответствии с способом производителя и анализировали таким же способом, как в примере 4.
Результат анализа измеренного IL-1β показан на ФИГ. 7. Концентрация одного из воспалительных цитокинов IL-1β повышалась в головном мозге мышей, у которых индуцировали депрессию (ФСБ+СТР), по сравнению с головным мозгом нормальной мыши (ФСБ), но в головном мозге мышей группы, которой вводили KBL396 (KBL396 и KBL396+СТР), концентрация IL-1β сохранялась на таком же уровне, как в нормальной контрольной группе, несмотря на стрессовое воздействие.
Пример 8. Влияние введения штамма KBL396 на регуляцию индуцированного стрессом иммунного дисбаланса
Известно, что CD4+ T-лимфоциты и CD8+ T-лимфоциты вносят вклад в противовоспалительную функцию и стимуляцию воспаления соответственно, и снижение отношения количества CD4/CD8 T-лимфоцитов, представляющего собой их относительное отношение, вызывает снижение сопротивляемости воспалению и иммунный дисбаланс, такой как старение иммунной системы. В дополнение к этому регуляторные T-лимфоциты (Treg) ответственны за регуляцию иммунитета, предотвращающую избыточные реакции иммунной системы. При возникновении дисбаланса регулируемого T-лимфоцитами иммунитета, как описано выше, проявляются воспалительные реакции и, в частности, воспалительная реакция в нервах и головном мозге, которая с высокой вероятностью вызывает дегенеративные заболевания головного мозга, такие как деменция и депрессия, и прочие. Чтобы подтвердить, как влияет применение KBL396 на T-лимфоциты, вовлеченные в регуляцию иммунитета, проводили проточную цитометрию (сортировку активированных флуоресценцией клеток, FACS) на ткани селезенки и клетках мезентериального лимфатического узла мышей примера 5.
7
После умерщвления мышей ткани хранили на льду в питательной среде RPMI1640, содержащей 10% инактивированной ФБС. Для предотвращения потерь клеток образец ткани брали сразу после умерщвления с последующим фильтрованием через клеточное сито с размером пор 70 мкм для получения отдельных клеток, а затем окрашивали трипановым синим и подсчитывали количество живых клеток. Затем около 1×10 клеток переносили в лунку 96-луночного планшета и присоединяли флуоресцентное антитело, нацеленное на каждый из иммунных маркеров. Используемые в настоящем документе иммунные маркеры представляли собой конъюгированное с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) антитело к CD3 мыши, PerCP-Cy5.5-конъюгированное антитело к CD4 мыши, конъюгированное с полиэтиленимином (ПЭ) антитело к CD8 мыши, ПЭ-конъюгированное антитело к FOXP3 мыши, конъюгированное с аллофикоцианином (АФЦ) моноклональное антитело к CD25 (все антитела производства eBioscience) соответственно. Затем проводили проточную цитометрию на приборе BD FACSVerse™ (BD bioscience) и идентифицировали иммуноциты с помощью программного обеспечения Flowjo (BD bioscience).
Результаты проточной цитометрии представлены на ФИГ. 8. Подвергнутые стрессу мыши (ФСБ+СТР) были склонны к воспалению, поскольку отношение CD4/CD8 T-лимфоцитов в тканях селезенки было снижено по сравнению с нормальными мышами (ФСБ), но при введении клеток KBL396 (KBL396+СТР) это отношение значимо восстанавливалось (ФИГ. 8A). В дополнение к этому количества клеток Treg мезентериальных лимфатических узлов на фоне стрессового воздействия (ФСБ+СТР) также уменьшались, но при введении клеток KBL396 (KBL396+СТР) они значимо восстанавливалось до уровня мышей, не подвергнутых стрессу (ФИГ. 8B). Соответственно, было подтверждено, что вызванный стрессовым воздействием иммунный дисбаланс может быть ослаблен путем введения KBL396.
Пример 9. Подтверждение доступности источника углерода и ферментативной активности штамма KBL396
Анализ физиологических свойств доступности источника углерода для штамма Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) проводили с помощью теста ферментации сахара с набором реактивов API Kit (название модели: API 50 CHL; производитель: BioMerieux’s, США), результат которого представлен в таблице 3 ниже. В следующей таблице 3 «+» показывает положительный результат доступности источника углерода в данном случае.
В дополнение к этому проводили анализ одного из физиологических свойств ферментативной активности штамма Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) в эксперименте по определению ферментативной активности с набором реактивов API Kit (название модели: API-ZYM CHL; производитель: BioMerieux’s, США), результат которого представлен в таблице 4 ниже. В следующей таблице 4 «+» показывает наличие ферментативной активности в данном случае.
[Таблица 3]
Стрип №
Сокр.<sup>1)</sup>
Субстрат (полное название)
L. plantarumKBL 396
5
RIB
D-рибоза
+
10
GAL
D-галактоза
+
11
GLU
D-глюкоза
+
12
FRU
D-фруктоза
+
13
MNE
D-манноза
+
18
MAN
Маннит
+
19
SOR
Сорбит
+
20
MDM
α-Метил-D-маннозид
+
21
MDG
α-Метил-D-глюкозид
+
22
NAG
N-Ацетилглюкозамин
+
23
AMY
Амигдалин
+
24
ARB
Арбутин
+
25
ESC
Эскулин
+
26
SAL
Салицин
+
27
CEL
Целлобиоза
+
28
MAL
Мальтоза
+
29
LAC
Лактоза
+
30
MEL
Мелибиоза
+
31
SAC
Сахароза
+
32
TRE
Трегалоза
+
34
MLZ
Мелезитоза
+
39
GEN
Гентиобиоза
+
[Таблица 4]
Номер
Анализируемый фермент для
L. plantarumKBL 396
1
Контроль
-
2
Щелочная фосфатаза
-
3
Эстераза (C4)
-
4
Эстераза липаза (C8)
-
5
Липаза (C14)
-
6
Лейцинариламидаза
+
7
Валинариламидаза
+
3
Цистинариламидаза
-
9
Трипсин
-
10
α-химотрипсин
-
11
Кислая фосфатаза
-
12
Нафтол-AS-BI-фосфогидролаза
-
13
α-галактозидаза
-
14
β-глюкуронидаза
-
15
β-глюкозидаза
-
16
α-глюкозидаза
+
17
β-глюкозидаза
+
13
N-ацетил-β-глюкозаминидаза
-
19
α-маннозидаза
-
20
α-фукозидаза
-
Пример 10. Приготовление препарата штамма KBL396
Штамм KBL396, полученный в результате операции по выращиванию в ферментере, собирали на центрифуге, отбрасывая остаточный супернатант питательной среды, и промывали 1-кратным фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) для удаления остатков среды. Для получения стабильного препарата с криопротективным агентом (CPA) для перехода к лиофилизации его обрабатывали обезжиренным молоком, сахарозой и сорбитом (11% обезжиренного молока, 4,29% сахарозы и 5,69% сорбита в расчете на суммарную массу препарата), а отрицательную контрольную группу обрабатывали 1-кратным ФСБ. Собранный на центрифуге штамм концентрировали до 20-кратного удаленного супернатанта и обрабатывали криопротектором (CPA), и после лиофилизации при -80°C в течение 24 часов на следующий день дважды проводили тонкое измельчение готового штамма и измеряли его жизнеспособность. Жизнеспособность после лиофилизации рассчитывали на основании результата подсчета КОЕ до и после лиофилизации.
В результате, как показано на ФИГ. 9, если после обработки 1-кратным ФСБ была показана жизнеспособность 25,8%, после обработки CPA жизнеспособность составляла 95%, и, таким образом, был подтвержден определенный эффект повышения жизнеспособности на фоне лиофилизации.
Сведения о депонировании Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP)
Авторы данного изобретения депонировали Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP) в уполномоченной депозитарной организации Корейская коллекция типовых культур 29 мая 2017 г. (адрес: Научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологии Кореи (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology), 181 Inspin-gil, Jeongeup-si, Jeollabuk-do, 56212, Корея) и получили номер доступа KCTC13278BP.
Как указано выше, данное изобретение раскрыто с помощью приведенных выше примеров, но настоящее изобретение необязательно ограничено ими, и различные его модификации могут быть выполнены без отступления от объема и сущности данного изобретения. Соответственно, объем данного изобретения следует рассматривать как включающий в себя все варианты осуществления изобретения в рамках объема прилагаемой формулы данного изобретения.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Lactobacillus plantarum KBL396 (KCTC13278BP), культура этого штамма, лизат этого штамма и экстракт этого штамма в соответствии с данным изобретением проявляет превосходный эффект улучшения состояния при неврологических заболеваниях в отсутствие риска побочных эффектов, свойственных традиционным терапевтическим агентам, применяемым при неврологических заболеваниях, и в дополнение к этому обладает преимуществами, состоящими в безопасности и отсутствии токсичности в организме человека, а также легко доступен и не вызывает отрицательного отношения к нему как к терапевтическому агенту, и поэтому может быть очень полезен для промышленного применения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>    КОБИОЛАБС, ИНК.
<120>    Штамм Lactobacillus Plantarum KBL 396 и его применение
<130>    ОPP20202037 KR
<150>    KR 10-2018-0013366
<151>    2018-02-02
<160>    9
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    1492
<212>    DNA
<213>    Lactobacillus plantarum
<400>    1
tatcagtacg tgctataatg cagtcgacga ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga         60
tttacatttg agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg        120
gggataacac ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag        180
cttgaaagat ggcttcggct atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt        240
ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat        300
tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg        360
gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc        420
tgttgttaaa gaagaacata tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag        480
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc        540
ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg        600
gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa        660
ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct        720
gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc        780
ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg        840
ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg ggggagtacg gcccgcaagg ctgaaactca        900
aaggaattga cggggggccc gcacaagcgg tgggagcatg tgggtttaat tcaaagctac        960
gcgaagaaac cttacccagg ttttgacata ctaatgcaaa ttctaaagag attagaacgt       1020
ttcccttccg gggacatggg ataccgggtg ggtgcatggg ttggtcgtca gcttcgtggt       1080
cgtgagaatg tttgggttta agttccccga aacgagcgca acccttatta tcagttgcca       1140
gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga       1200
cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa       1260
cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggattgta       1320
ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg       1380
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc       1440
aaagtcggtg gggtaacctt tagaaccagc cgcctaatgg caccaccatg cg               1492
<210>    2
<211>    21
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Tph-1 F Primer
<400>    2
ggctttgagg tcctctttcc a                                                   21
<210>    3
<211>    21
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Tph-1 R Primer
<400>    3
ccccctttct gaggaatggt c                                                   21
<210>    4
<211>    20
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Tph-1A F Primer
<400>    4
accctgggat gtgcttcatg                                                     20
<210>    5
<211>    20
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Tph-1A R Primer
<400>    5
gcgttctgca aagcaacaga                                                     20
<210>    6
<211>    21
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Rat B-actin F Primer
<400>    6
cagccttcct tcctgggtat g                                                   21
<210>    7
<211>    21
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    Rat B-actin R Primer
<400>    7
tagagccacc aatccacaca g                                                   21
<210>    8
<211>    22
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    TPH-2f Primer
<400>    8
cagtccacga agatttcgac tt                                                  22
<210>    9
<211>    21
<212>    DNA
<213>    Artificial Sequence
<220>
<223>    TPH-2r Primer
<400>    9
gcaagacagc ggtagtgttc t                                                   21
<---