СПОСОБ, УСТРОЙСТВО И СИСТЕМА ДЛЯ ВОЛЮМЕТРИЧЕСКОГО ПОДСЧЕТА БЕЛЫХ КЛЕТОК КРОВИ
METHOD, DEVICE AND SYSTEM FOR VOLUMETRIC CALCULATION OF WHITE BLOOD CELLS

Область техники
Настоящее изобретение касается пробоотборного устройства, способа и системы для волюметрического подсчета белых клеток крови в образце крови.
Уровень техники изобретения
Определение числа белых клеток крови часто является важным в связи с лечением пациента. Данный анализ может быть необходимым для диагностики, например, лейкемии, или инфекционных или воспалительных заболеваний, или для контроля лечения. Желательно получать результаты анализа как можно быстрее, чтобы минимизировать время ожидания для пациентов и давать возможность врачу принимать решение о лечении и диагнозе непосредственно при проведении первого осмотра пациента. Поэтому было бы предпочтительно обеспечить способ анализа, который может быстро выполняться врачом или медицинской сестрой без необходимости отсылать пробу в лабораторию.
Сегодня число белых клеток крови обычно получают посредством ручной процедуры путем окрашивания образца крови и микроскопического наблюдения данного образца в специальной счетной камере, например камере Бюркера. Счетная камера снабжена решеткой, разделяющей камеру на хорошо определенные небольшие объемы. Белым клеткам крови позволяют осесть у дна счетной камеры, чтобы позволить микроскопу фокусироваться на всех клетках в камере и, таким образом, облегчить подсчет. Таким образом, образец нужно осаждать в течение нескольких минут перед проведением подсчета. Число белых клеток крови можно затем определять путем подсчета числа клеток крови на ячейку решетки. Число белых клеток крови получается вручную аналитиком, который должен иметь опыт выполнения данного анализа, чтобы быть способным проводить надежный анализ.
Данный анализ требует времени. Кроме того, так как он выполняется вручную, результаты анализа могут меняться в зависимости от человека, проводящего анализ.
Есть некоторое число существующих автоматизированных способов анализа для определения числа белых клеток крови. Число белых клеток крови можно определять с помощью принципа Культера, который основан на определении размера клетки и тем самым типа клетки путем измерения импеданса. Способ подсчета белых клеток крови с помощью принципа Культера описан в патенте США 5262302.
Принцип Культера представляет собой доминирующий автоматизированный способ анализа, который используется в настоящее время. Однако есть несколько других способов, которые были описаны. Один такой способ для определения числа белых клеток крови описан в патенте США 5585246. В нем образец крови необходимо готовить путем смешения с флуоресцентным красителем и комплексом лиганда, который помечает белые клетки крови. Образец вводят в капилляр и облучают лазером, который сканирует над образцом в капилляре. Флуоресценцию измеряют, чтобы определить число белых клеток крови. Подобный способ описан в WO 97/02482 с использованием флуоресцентного красителя и лазера, сканирующего над капилляром. Данный способ адаптирован для подсчета белых клеток крови в продуктах афереза, содержащих малое число белых клеток крови. Здесь капилляр является достаточно толстым, и необходимо ждать, пока белые клетки крови осядут у дна капилляра перед тем, как капилляр можно будет сканировать.
В WO 99/45384 показана содержащая образец камера, имеющая изменяемую толщину. Изменяющаяся толщина разделяет разные соединения крови. Образец крови окрашивается красителем, чтобы по-разному окрасить, по меньшей мере, три различных типа белых клеток крови в образце крови. Белые клетки крови могут быть подсчитаны с использованием оптического сканирующего инструмента, наблюдая часть камеры.
Все еще существует необходимость ускорить и упростить существующие автоматизированные способы определения числа белых клеток крови, так чтобы анализ можно было проводить в месте осмотра. Кроме того, так как подсчет белых клеток крови является настолько обыкновенно выполняемым анализом, любое улучшение способа анализа будет иметь большое воздействие на уход за пациентом. Способ анализа, обеспечивающий возможность получать результаты на месте осмотра, будет особенно полезным.
Сущность изобретения
Задачей изобретения является обеспечить простой анализ для определения волюметрического подсчета белых клеток крови. Дополнительной задачей изобретения является обеспечить быстрый анализ без необходимости сложной аппаратуры или приготовления больших образцов.
Эти задачи частично или полностью решаются с помощью пробоотборного устройства, способа и системы согласно независимым пунктам формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления представлены в зависимых пунктах формулы изобретения.
Таким образом, обеспечивается пробоотборное устройство для волюметрического подсчета белых клеток крови в образце крови. Пробоотборное устройство содержит измерительную полость для получения образца крови. Измерительная полость имеет заданную фиксированную толщину. Пробоотборное устройство дополнительно содержит реагент, который присутствует в высушенной форме на поверхности, задающей измерительную полость, причем упомянутый реагент содержит гемолизирующий агент для растворения красных клеток крови в образце крови и окрашивающий агент для избирательного окрашивания белых клеток крови в образце крови.
Пробоотборное устройство обеспечивает возможность непосредственно получать образец цельной крови в измерительной полости и предоставлять его для анализа. Нет необходимости в приготовлении образца. Действительно, образец крови может засасываться в измерительную полость непосредственно из уколотого пальца пациента. Снабжение пробоотборного устройства реагентом делает возможной реакцию внутри пробоотборного устройства, что делает образец готовым для анализа. Реакция инициируется, когда образец крови входит в контакт с реагентом. Таким образом, нет необходимости ручного приготовления образца, что делает анализ особенно подходящим для осуществления непосредственно в кабинете для исследований, пока пациент ожидает.
Так как реагент обеспечивается в высушенной форме, пробоотборное устройство может транспортироваться и храниться в течение длительного времени без влияния на применимость пробоотборного устройства. Таким образом, пробоотборное устройство с реагентом может быть изготовлено и приготовлено задолго до проведения анализа образца крови.
Тогда как многие существующие способы способны подсчитывать различные клетки крови и даже подгруппы клеток крови, пробоотборное устройство согласно изобретению специально приспособлено для проведения волюметрического подсчета белых клеток крови. Реагент содержит гемолизирующий агент, который растворит красные клетки крови в образце крови. Это нарушит возможность подсчитывать красные клетки крови в образце. С другой стороны, растворение красных клеток крови упрощает распознавание и идентификацию белых клеток крови в образце крови.
Окрашивающий агент обеспечивает маркировку отдельных белых клеток крови. Это дает возможность индивидуально наблюдать или детектировать белые клетки крови. Белые клетки крови могут, например, детектироваться путем сканирования измерительной полости или получения изображения измерительной полости. Число белых клеток крови, таким образом, может быть получено путем сложения числа отдельно детектированных белых клеток крови в определенном объеме.
Изобретение также обеспечивает способ волюметрического подсчета белых клеток крови в образце крови. Данный способ содержит отбор образца крови в измерительную полость пробоотборного устройства, причем упомянутая измерительная полость несет реагент, содержащий гемолизирующий агент и окрашивающий агент, чтобы реагировать с образцом так, что белые клетки крови окрашиваются; облучение образца с окрашенными белыми клетками крови; получение цифрового изображения увеличения облученного образца в измерительной полости, где белые клетки крови различимы путем избирательного окрашивания красящим агентом; и численный анализ цифрового изображения для идентификации белых клеток крови и определения числа белых клеток крови в образце.
Изобретение дополнительно обеспечивает систему для волюметрического подсчета белых клеток крови в образце крови. Данная система содержит пробоотборное устройство, описанное выше. Система дополнительно содержит измерительный аппарат, содержащий держатель пробоотборного устройства, приспособленный, чтобы принимать пробоотборное устройство, которое содержит образец крови в измерительной полости, и источник света, приспособленный для облучения образца крови. Измерительный аппарат дополнительно содержит систему формирования изображения, содержащую систему увеличения и средство получения цифрового изображения для получения цифрового изображения увеличения облученного образца в измерительной полости, где белые клетки крови различимы в цифровом изображении благодаря избирательному окрашиванию окрашивающим агентом. Измерительный аппарат также содержит анализатор изображения, приспособленный для анализа полученного цифрового изображения, для идентификации белых клеток крови и определения числа белых клеток крови в образце крови.
Способ и система данного изобретения обеспечивают очень простой анализ образца крови для определения числа белых клеток крови. Этот анализ не требует сложной измерительной аппаратуры или сложных этапов, выполняемых оператором. Следовательно, он может выполняться в непосредственной связи с обследованием пациента без необходимости квалифицированного специалиста. Измерительный аппарат использует свойства пробоотборного устройства для выполнения анализа на образце неразбавленной цельной крови, который был непосредственно захвачен в измерительную полость. Измерительный аппарат приспособлен для получения изображения объема образца для выполнения волюметрического подсчета белых клеток крови из одного изображения.
Образцу крови позволяют смешиваться с реагентом в измерительной полости. Через несколько минут или меньше реакция образца крови с реагентом приведет к растворению красных клеток крови и окрашиванию белых клеток крови, так что образец будет готов к представлению для оптического измерения. Образец крови может смешиваться с реагентом путем, например, диспергирования или диффузии реагента в образец крови, или путем активной вибрации или движения пробоотборного устройства, так что в измерительной полости осуществляется взбалтывание.
Пробоотборное устройство может содержать корпус, имеющий две плоские поверхности, определяющие упомянутую измерительную полость. Плоские поверхности могут располагаться на заданном расстоянии друг от друга, определяя толщину образца для оптического измерения. Это означает, что пробоотборное устройство обеспечивает точно определенную толщину для оптического измерения, которая может быть использована для точного определения числа белых клеток крови на единицу объема образца крови. Объем анализируемого образца будет точно определяться толщиной измерительной полости и площадью образца, наблюдаемой в изображении. Таким образом, точно определенный объем может быть использован для соотнесения числа белых клеток крови с объемом образца крови, так что определяется волюметрическое число белых клеток крови.
Измерительная полость предпочтительно имеет равномерную толщину 50-170 микрометров. Толщина, по меньшей мере, 50 микрометров означает, что измерительная полость не принуждает образец крови размазываться в монослой, позволяя анализировать больший объем крови над небольшой площадью сечения. Таким образом, достаточно большой объем образца крови, чтобы давать надежные величины числа белых клеток крови, может анализироваться с использованием относительного небольшого изображения образца крови. Толщина более предпочтительно составляет, по меньшей мере, 100 микрометров, что позволяет анализировать даже еще меньшую площадь сечения или больший объем образца. Кроме того, толщина, по меньшей мере, 50 микрометров и более предпочтительно 100 микрометров также упрощает изготовление измерительной полости, имеющей точно заданную толщину между двумя плоскими поверхностями.
Для большинства образцов, заключенных в полости, имеющей толщину не больше, чем 170 микрометров, число белых клеток крови настолько мало, что будут только незначительные отклонения вследствие перекрывания белых клеток крови друг с другом. Однако влияние таких отклонений будет связано с числом белых клеток крови и может, таким образом, по меньшей мере в некоторой степени учитываться посредством статистического исправления результатов, по меньшей мере, для больших значений чисел белых клеток крови. Это статистическое исправление может быть основано на калибровках измерительного аппарата. Отклонения будут даже меньше для измерительной полости, имеющей толщину не больше, чем 150 микрометров, посредством чего может использоваться более простая калибровка. Такая толщина может даже не требовать какой-либо калибровки для перекрывания клеток крови.
Кроме того, толщина измерительной полости достаточно мала, чтобы позволять измерительному аппарату получать цифровое изображение, так что вся глубина измерительной полости может анализироваться одновременно. Так как в измерительном аппарате должна применяться система увеличения, не просто получать большую глубину резкости. Поэтому толщина измерительной полости предпочтительно не должна превышать 150 микрометров, чтобы для всей толщины одновременно анализировать цифровое изображение. Глубина резкости может быть приспособлена, чтобы устанавливать толщину измерительной полости 170 микрометров.
Цифровое изображение может быть получено с глубиной резкости, по меньшей мере, соответствующей толщине измерительной полости. Это означает, что достаточный фокус получается по всей толщине образца, так что вся толщина измерительной полости может одновременно анализироваться в цифровом изображении образца. Таким образом, нет необходимости ждать, что белые клетки крови осядут в измерительной полости, посредством чего время выполнения анализа уменьшается. Не выбирая фокус очень резким на отдельной части образца, получается достаточный фокус по всей толщине образца, позволяя идентифицировать число белых клеток крови в образце. Это означает, что белые клетки крови могут быть отчасти расплывчатыми и все еще рассматриваться, как находящиеся в фокусе глубины резкости.
Пробоотборное устройство может обеспечиваться реагентом, который наносят на намеченную поверхность в летучей жидкости, которая испаряется, оставляя реагент в высушенной форме.
Было обнаружено, что реагент преимущественно растворяется в летучей жидкости перед внесением в измерительную полость. Это означает, что жидкость может эффективно испаряться из узкого пространства измерительной полости во время изготовления и подготовки пробоотборного устройства.
Реагент может предпочтительно растворяться в органическом растворителе и более предпочтительно растворяться в метаноле. Такие растворители являются летучими и соответственно могут быть использованы для высушивания реагента на поверхности измерительной полости.
Окрашивающий агент может быть приспособлен для избирательного окрашивания ядра белых клеток крови. Это означает, что белые клетки крови могут быть идентифицированы в виде окрашенных точек и, следовательно, легко подсчитаны в цифровом изображении.
Окрашивающий агент может быть любым агентом в группе из гематоксилина, метиленового синего, метиленового зеленого, метиленового голубого, ацетата крезилового фиолетового, толуидинового синего, генцианового фиолетового, разновидностей судана, галлоцианина и разновидностей фуксина или любой их комбинации. Однако следует принять во внимание, что окрашивающий агент не ограничивается данной группой, но также многие другие вещества могут рассматриваться.
Гемолизирующий агент может представлять собой четвертичную соль аммония, сапонин, желчную кислоту, такую как деоксихолевая кислота, дигитоксин, змеиный яд, глюкопиранозид или неионогенный детергент типа Тритона. Однако следует принять во внимание, что гемолизирующий агент не ограничивается данной группой, но также многие другие вещества могут рассматриваться.
Пробоотборное устройство может дополнительно содержать ввод образца, соединяющий измерительную полость с внешним окружением пробоотборного устройства, причем упомянутый ввод приспособлен для приема образца крови. Ввод образца может быть приспособлен для подъема образца крови с помощью капиллярной силы, и измерительная полость может дополнительно затягивать кровь из ввода в полость. В результате образец крови может легко поступать в измерительную полость посредством простого перемещения ввода образца в контакт с кровью. Затем капиллярные силы ввода образца и измерительной полости затянут точно заданное количество крови в измерительную полость. Альтернативно образец крови может засасываться или затягиваться в измерительную полость посредством приложения внешней качающей силы к пробоотборному устройству. Согласно другой альтернативе образец крови может отбираться в пипетку и затем вводиться в измерительную полость с помощью этой пипетки.
Пробоотборное устройство может быть одноразовым, т.е. приспособленным для использования только один раз. Пробоотборное устройство обеспечивает комплект для выполнения подсчета белых клеток крови, так как пробоотборное устройство способно принимать образец крови и содержать все реагенты, необходимые, чтобы представлять образец к подсчету клеток. Это особенно удобно, так как пробоотборное устройство приспособлено только для однократного использования и может быть изготовлено без рассмотрения возможностей очищать пробоотборное устройство и повторно применять реагент. Также пробоотборное устройство может формоваться в пластическом материале и тем самым изготавливаться с низкими затратами. Таким образом, все еще может быть рентабельно применять одноразовое пробоотборное устройство.
Образец может облучаться светом с длиной волны, соответствующей пику поглощения окрашивающего агента. Затем окрашенные белые клетки крови, которые содержат некоторое количество окрашивающего агента, будут детектированы посредством низкого пропускания света.
Облучение может выполняться посредством лазера. Лазер может обеспечивать свет с точно заданной длиной волны, соответствующей поглощению окрашивающего агента. Кроме того, лазер обеспечивает направленный свет, минимизируя помехи от рассеянного света, так что точка низкого пропускания света будет резко различима.
Облучение может альтернативно выполняться посредством светодиода. Этот источник света может также обеспечивать достаточные условия облучения для правильного различения белых клеток крови от другого вещества в образце.
Цифровое изображение может быть получено с использованием увеличения 3-200х, более предпочтительно 3-10х. В этих диапазонах увеличения белые клетки крови являются достаточно увеличенными, чтобы детектироваться, тогда как глубина резкости может быть приспособлена, чтобы покрывать толщину образца. Низкое увеличение означает, что большая глубина резкости может быть получена. Однако, если используется низкое увеличение, белые клетки крови может быть трудно детектировать. Меньшее увеличение может быть использовано при увеличении числа пикселей в получаемом изображении, то есть при улучшении разрешения цифрового изображения. В этом случае можно использовать увеличение 3-4х, все еще позволяя белым клеткам крови детектироваться.
Анализ содержит идентификацию областей высокого поглощения света в цифровом изображении. Анализ может дополнительно содержать идентификацию черных или темных точек в цифровом изображении. Так как окрашивающие агенты могут накапливаться в ядрах белых клеток крови, поглощение света может иметь пики в отдельных точках. Эти точки будут образовывать черные точки в цифровом изображении.
Анализ может дополнительно содержать электронное увеличение полученного цифрового изображения. Хотя образец увеличивают для получения увеличенного цифрового изображения образца, полученное цифровое изображение само может быть электронно увеличено для упрощения различения между целями, которые изображаются очень близко друг к другу в полученном цифровом изображении.
Краткое описание чертежей
Изобретение будет теперь описано более детально посредством примера со ссылкой на сопровождающие чертежи.
Фиг.1 представляет собой схематичный вид пробоотборного устройства согласно одному варианту осуществления изобретения.
Фиг.2 представляет собой схематичный вид пробоотборного устройства согласно другому варианту осуществления изобретения.
Фиг.3 представляет собой схематичный вид измерительного аппарата согласно одному варианту осуществления изобретения.
Фиг.4 представляет собой блок-схему способа согласно одному варианту осуществления изобретения.
Фиг.5 представляет собой цифровое изображение образца крови, используемое для волюметрического подсчета белых клеток крови.
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления
Пробоотборное устройство 10 согласно одному варианту осуществления изобретения будет описано со ссылкой на фиг.1. Пробоотборное устройство 10 является одноразовым и должно выбрасываться после использования для анализа. Это означает, что пробоотборное устройство 10 не требует сложного обращения. Пробоотборное устройство 10 предпочтительно образовано в пластиковом материале и может быть изготовлено путем инжекционного формования. Это делает изготовление пробоотборного устройства 10 простым и дешевым, посредством чего затраты на пробоотборное устройство 10 могут поддерживаться низкими.
Пробоотборное устройство 10 содержит корпус 12, который имеет основание 14, за которое может браться оператор без какого-либо вреда для результатов анализа. Основание 14 также может иметь выступы 16, которые могут подходить для держателя в аппарате анализа. Выступы 16 могут быть выполнены так, что пробоотборное устройство 10 будет правильно расположено в аппарате анализа.
Пробоотборное устройство 10 дополнительно содержит ввод 18 образца. Ввод 18 образца задается между противоположными стенками внутри пробоотборного устройства 10, причем эти стенки расположены так близко друг к другу, что во вводе 18 образца может создаваться капиллярная сила. Ввод 18 образца сообщается с внешним окружением пробоотборного устройства 10, чтобы позволять крови затягиваться в пробоотборное устройство 10. Пробоотборное устройство 10 дополнительно содержит камеру для подсчета белых клеток крови в виде измерительной полости 20, расположенной между противоположными стенками внутри пробоотборного устройства 10. Измерительная полость 20 находится в сообщении с вводом 18 образца. Стенки, определяющие измерительную полость 20, расположены ближе друг к другу, чем стенки ввода 18 образца, так что капиллярная сила может затягивать кровь из ввода 18 образца в измерительную полость.
Стенки измерительной полости 20 расположены на расстоянии 50-170 микрометров друг от друга. Измерительная полость 20 имеет толщину, более предпочтительно, по меньшей мере, 100 микрометров. Кроме того, измерительная полость 20 имеет толщину, более предпочтительно, не более чем 150 микрометров. Это расстояние равномерно по всей измерительной полости 20. Толщина измерительной полости 20 определяет объем исследуемой крови. Так как результат анализа необходимо относить к объему исследуемой крови, толщина измерительной полости 20 должна быть очень точной, т.е. только очень небольшие изменения толщины допустимы внутри измерительной полости 20 и между измерительными полостями 20 разных пробоотборных устройств 10. Эта толщина делает возможным анализ относительно большого объема образца в небольшой области полости. Данная толщина теоретически позволяет белым клеткам крови располагаться поверх друг друга внутри измерительной полости 20. Однако количество белых клеток крови в крови так мало, что вероятность, чтобы это происходило, очень низкая.
9
9
9
9
Пробоотборное устройство 10 обычно приспособлено для измерения числа белых клеток крови свыше 0,5×10 клеток/литр крови. При меньшем числе белых клеток крови объем образца будет слишком мал, чтобы позволять подсчитать статистически значимые количества белых клеток крови. Кроме того, когда число белых клеток крови превышает 12×10 клеток/литр крови, влияние перекрывающегося расположения клеток крови начнет быть существенным для измеряемого числа белых клеток крови. При таком числе белых клеток крови белые клетки крови будут покрывать приблизительно 8% сечения облучаемого образца, если толщина измерительной полости составляет 140 микрометров. Таким образом, чтобы получать правильные числа белых клеток крови, применяется статистическое исправление значений числа белых клеток крови свыше 12×10 клеток/литр крови. Данное статистическое исправление будет увеличиваться при увеличении чисел белых клеток крови, так как влияние перекрывания клеток крови будет больше для больших чисел белых клеток крови. Статистическое исправление может быть определено посредством калибровки измерительного аппарата. В качестве альтернативы статистическое исправление может быть определено на общем уровне для настройки измерительного аппарата, используемого в соединении с пробоотборным устройством 10. Это статистическое исправление имеет такую же величину, как статистические исправления, которые в настоящее время выполняются в аппарате анализа, который использует принцип Культера. Считается, что пробоотборное устройство 10 может быть использовано, чтобы анализировать числа белых клеток крови такие большие, как 50×10 клеток/литр крови.
Поверхность стенки измерительной полости 20, по меньшей мере, частично покрыта реагентом 22. Реагент 22 может быть высушен сублимацией, высушен нагревом или высушен в вакууме и нанесен на поверхность измерительной полости 20. Когда образец крови попадает в измерительную полость 20, кровь будет контактировать с высушенным реагентом 22 и инициировать реакцию между реагентом 22 и кровью.
Реагент 22 наносят путем введения реагента 22 в измерительную полость 20, используя пипетку или дозатор. Реагент 22 растворен в летучей жидкости, например органическом растворителе, таком как метанол, когда вводится в измерительную полость. Растворитель с реагентом 22 могут заполнять измерительную полость. Затем проводят сушку, так что растворитель будет испаряться, и реагент 22 будет прикреплен к поверхностям измерительной полости 20.
Так как реагент должен быть высушен на поверхности узкого пространства, жидкость будет иметь очень маленькую поверхность в контакте с окружающей атмосферой, вследствие чего испарение жидкости окажется более трудным. Таким образом, выгодно использовать летучую жидкость, такую как метанол, что позволяет жидкости эффективно испаряться из узкого пространства измерительной полости.
Согласно альтернативному способу изготовления пробоотборное устройство 10 может быть образовано путем присоединения двух деталей друг к другу, вследствие чего одна деталь образует донную стенку измерительной полости 20, а другая деталь образует верхнюю стенку измерительной полости 20. Это дает возможность реагенту 22 быть высушенным на открытой поверхности до того, как две детали приставят друг к другу. Таким образом, реагент 22 может быть растворен в воде, так как растворитель не должен быть летучим.
Реагент 22 содержит гемолизирующий агент и окрашивающий агент. Гемолизирующий агент может представлять собой четвертичную соль аммония, сапонин, желчную кислоту, такую как деоксихолевая кислота, дигитоксин, змеиный яд, глюкопиранозид или неионогенный детергент типа Тритона. Окрашивающий агент может представлять собой гематоксилин, метиленовый синий, метиленовый зеленый, метиленовый голубой, ацетат крезилового фиолетового, толуидиновый синий, генциановый фиолетовый, разновидности судана, галлоцианин и разновидности фуксина или любую их комбинацию. Когда образец крови вступает в контакт с реагентом 22, гемолизирующий агент будет действовать, растворяя красные клетки крови, так что растворенные красные клетки крови смешиваются с плазмой крови. Дополнительно окрашивающий агент будет накапливаться в ядрах белых клеток крови. Реагент 22 должен содержать достаточные количества окрашивающего агента, чтобы отчетливо окрасить все ядра белых клеток крови. Таким образом, часто будет присутствовать избыток окрашивающего агента, который будет смешан с плазмой крови. Избыток окрашивающего агента будет давать однородный низкий фоновый уровень окрашивающего агента в плазме крови. Накопленный окрашивающий агент в белых клетках крови будет различим на фоновом уровне окрашивающего агента.
Реагент 22 может также содержать другие компоненты, которые могут быть активными, т.е. принимать участие в химической реакции с образцом крови, или неактивными, т.е. не принимать участия в химической реакции с образцом крови. Активные компоненты могут быть, например, предназначены, чтобы катализировать гемолизирующее или окрашивающее действие. Неактивные компоненты могут быть, например, предназначены, чтобы улучшать присоединение реагента 22 к поверхности стенки измерительной полости 20.
За несколько минут образец крови прореагирует с реагентом 22, так что красные клетки крови растворятся, и окрашивающий агент накопится в ядрах белых клеток крови.
Другой вариант осуществления пробоотборного устройства будет описан со ссылкой на фиг.2. Пробоотборное устройство 110 содержит камеру 120, образующую измерительную полость. Пробоотборное устройство 110 имеет ввод 118 в камеру 120 для переноса крови в камеру 120. Камера 120 соединена с насосом (не показан) через отсасывающую трубу 121. Насос может вызывать засасывающую силу в камере 120 через отсасывающую трубу 121, так что кровь может всасываться в камеру 120 через ввод 118. Пробоотборное устройство 110 может быть отсоединено от насоса перед проведением измерения. Подобно измерительной полости 20 пробоотборного устройства 10 согласно первому варианту осуществления камера 120 имеет точно определенную толщину, задавая толщину изучаемого образца. Кроме того, реагент 122 нанесен на стенки камеры 120 для реакции с образцом крови.
Аппарат 30 для волюметрического подсчета белых клеток крови будет описан со ссылкой на фиг.3. Аппарат 30 содержит держатель 32 образца для приема пробоотборного устройства 10 с образцом крови. Держатель 32 образца приспособлен, чтобы принимать пробоотборное устройство 10 так, что измерительная полость 20 пробоотборного устройства 10 правильно располагается в аппарате 30. Аппарат 30 содержит источник света 34 для освещения образца крови в пробоотборном устройстве 10. Источник света 34 может представлять собой лампу накаливания, которая излучает свет во всем видимом диапазоне. Окрашивающий агент, который аккумулирован в ядрах белых клеток крови, будет поглощать свет с конкретными длинами волн, так что ядра белых клеток крови будут появляться в цифровом изображении образца. Если получают цветное изображение, белые клетки крови будут появляться в виде особо окрашенных пятен. Если получают черно-белое изображение, белые клетки крови будут появляться в виде темных точек на более светлом фоне.
Источник света 34 альтернативно может быть лазером или светодиодом. Это может быть использовано для увеличения контраста изображения, так что белые клетки крови могут быть легче детектированы. В этом случае источник света 34 приспособлен, чтобы испускать электромагнитное излучение с длиной волны, которая соответствует пику поглощения окрашивающего агента. Кроме того, длина волны должна быть выбрана так, чтобы поглощение соединениями крови было относительно низким. Кроме того, стенки пробоотборного устройства 10 должны быть существенно прозрачными для данной длины волны. Например, когда метиленовый синий используется в качестве окрашивающего агента, источник света 34 может быть приспособлен, чтобы излучать свет, имеющий длину волны 667 нм.
Аппарат 30 дополнительно содержит систему 36 формирования изображения, которая расположена на противоположной стороне держателя 32 образца относительно источника света 34. Таким образом, система 36 формирования изображения приспособлена принимать излучение, которое прошло через образец крови. Система 36 формирования изображения содержит систему 38 увеличения и средство 40 получения цифрового изображения. Система 38 увеличения приспособлена, чтобы обеспечивать увеличение 3-200х, более предпочтительно 3-100х и наиболее предпочтительно 3-4х. В этих диапазонах увеличения можно различить белые клетки крови. Изображение может быть получено с улучшенным разрешением, чтобы позволить использовать меньшее увеличение. Кроме того, глубина резкости системы 38 увеличения может быть еще приспособлена, чтобы, по меньшей мере, соответствовать толщине измерительной полости 20.
Система 38 увеличения содержит линзу объектива (объектив) или систему 42 линз, которая располагается близко к держателю 32 образца, и линзу окуляра (окуляр) или систему 44 линз, которая располагается на расстоянии от объектива 42. Объектив 42 обеспечивает первое увеличение образца, которое дополнительно увеличивается окуляром 44. Система 38 увеличения может содержать дополнительные линзы для выполнения соответствующего увеличения и получения изображения образца. Система 38 увеличения организована так, что образец в измерительной полости 20, когда помещен в держатель 32 образца, будет фокусироваться на плоскость изображения средства 40 получения цифрового изображения.
Средство 40 получения цифрового изображения приспособлено для получения цифрового изображения образца. Средство 40 получения цифрового изображения может представлять собой любой тип цифровой камеры, такой как CCD камера. Размер пикселя цифровой камеры устанавливает ограничение на систему 36 формирования изображения, так что пятно рассеяния в плоскости изображения не может превышать размера пикселя в глубине резкости. Однако белые клетки крови все еще могут детектироваться, даже если они отчасти размытые, и, следовательно, можно позволить пятну рассеяния превышать размер пикселя, оставаясь в пределах глубины резкости. Цифровая камера 40 получит цифровое изображение образца в измерительной полости, где вся толщина образца фокусируется в цифровом изображении для подсчета белых клеток крови. Система 36 формирования изображения определит площадь измерительной полости 20, которая будет изображена в цифровом изображении. Изображаемая площадь вместе с толщиной измерительной полости 20 определяет объем изображаемого образца. Система 36 формирования изображения настроена, чтобы соответствовать получению изображения образцов крови в пробоотборном устройстве 10. Нет необходимости изменять настройку системы 36 формирования изображения. Предпочтительно система 36 формирования изображения расположена внутри корпуса, так что настройка не может быть случайно изменена.
Аппарат 30 дополнительно содержит анализатор 46 изображения. Анализатор 46 изображения связан с цифровой камерой 40 для приема цифровых изображений, получаемых цифровой камерой 40. Анализатор 46 изображения приспособлен, чтобы идентифицировать шаблоны в цифровом изображении, которые соответствуют белым клеткам крови, для подсчета числа белых клеток крови, присутствующих в данном цифровом изображении. Таким образом, анализатор 46 изображения может быть приспособлен идентифицировать темные точки на более светлом фоне. Анализатор 46 изображения может быть приспособлен сначала электронным образом увеличивать цифровое изображение перед анализом цифрового изображения. Это означает, что анализатор 46 изображения может быть способен легче различать белые клетки крови, которые изображаются близко друг к другу, даже несмотря на то, что электронное увеличение цифрового изображения сделает цифровое изображение отчасти размытым.
Анализатор 46 изображения может вычислять число белых клеток крови на объем крови путем деления числа белых клеток крови, идентифицированных в цифровом изображении, на объем образца крови, который точно определяется, как описано выше. Волюметрическое число белых клеток крови может отображаться на дисплее аппарата 30.
Анализатор 46 изображения может быть выполнен в виде процессорного блока, который содержит коды для выполнения анализа изображения.
Способ волюметрического подсчета белых клеток крови будет описан со ссылкой на фиг.4. Данный способ содержит отбор образца крови в пробоотборное устройство, этап 102. Неразбавленный образец цельной крови отбирают в пробоотборное устройство. Образец может отбираться из капиллярной крови или венозной крови. Образец капиллярной крови может засасываться в измерительную полость непосредственно из уколотого пальца пациента. Образец крови вступает в контакт с реагентом в пробоотборном устройстве, инициируя реакцию. Красные клетки крови будут растворяться, а окрашивающий агент накапливаться в ядрах белых клеток крови. Через несколько минут после отбора образца крови данный образец готов для анализа. Пробоотборное устройство помещают в аппарат анализа, этап 104. Анализ может быть инициирован путем нажатия кнопки аппарата анализа. Альтернативно анализ автоматически инициируется посредством детектирования аппаратом присутствия пробоотборного устройства.
Образец облучают, этап 106, и получают цифровое изображение увеличения образца, этап 108. Образец облучается электромагнитным излучением с длиной волны, соответствующей пику поглощения окрашивающего агента. Это означает, что цифровое изображение будет содержать черные или темные точки в местах расположения ядер белых клеток крови.
Полученное цифровое изображение переносится в анализатор изображения, который выполняет анализ изображения, этап 110, чтобы подсчитать черные точки в цифровом изображении.
На фиг.5 показан пример цифрового изображения, чтобы обозначить возможность идентифицировать белые клетки крови в образце крови, которая гемолизирована и окрашена. Это цифровое изображение было получено с пробоотборным устройством, имеющим толщину полости 140 мкм, используя 50-кратное увеличение. Источник света излучает белый свет, указывая, что белые клетки крови могут быть идентифицированы, даже хотя излучение не адаптировано специально к пику поглощения окрашивающего агента. Использованным окрашивающим агентом был метиленовый синий. Различимые черные точки появляются на фиг.5, обозначая белые клетки крови. Изображение, показанное на фиг.5, является черно-белой версией цветного изображения. Контраст между белыми клетками крови и фоном выглядит яснее в цветном изображении, чем в приведенном здесь черно-белом изображении. Черные точки могут быть легко подсчитаны анализатором изображения.
9
В ручных способах подсчета белых клеток крови приблизительно 200 клеток обычно подсчитывают для определения числа белых клеток крови в образце крови. Способ и аппарат, представленные здесь, могут, например, быть приспособлены подсчитывать приблизительно 2000 клеток, что дает лучшую статистическую достоверность получаемых результатов. Обычный здоровый взрослый человек имеет число белых клеток крови 4-5×10 клеток/литр крови. Это означает, что 2000 клеток находится в образцах, имеющих объем 0,4-0,5 мкл. Например, если получают изображение области 1,5×1,5 мм в измерительной полости, имеющей толщину 140 мкм, изображаемый объем составляет 0,315 мкл. Часть полученного изображения может быть выбрана для анализа. Таким образом, полученное изображение сначала может быть грубо проанализировано, так чтобы никаких аномалий не допускалось в части, используемой для определения числа белых клеток крови. Часть полученного изображения, выбранная для анализа, может быть выбрана имеющей соответствующий размер, так что достаточный объем образца крови будет проанализирован.
Следует подчеркнуть, что предпочтительные варианты осуществления, описанные здесь, не предназначены для ограничения, и что многие альтернативные варианты осуществления возможны внутри объема защиты, определяемого прилагаемой формулой изобретения.