Показатели тканевой репарации в экспериментальной карциноме Эрлиха после фотодинамической терапии

Значение ТРО — 99,6 % было максимальным в V группе на 7-е сутки после лечения. В данной группе была достигнута полная резорбция остаточной опухоли у всех животных. Неполная регрессия карциномы в III группе, по-видимому, объясняется экранированием глубоких слоев опухоли при ФДТ [3].

Заключение. В результате проведенных экспериментальных исследований на перевиваемой асцитной карциноме Эрлиха установлено, что оптимальная доза лазерного облучения соответствует 400 Дж/см2. Полная регрессия опухоли была достигнута при комбинации резекции опухоли и интраоперационной ФДТ в данной дозе на остаточную опухоль.

Литература

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. — М. : Практика, 1999. — 459 с.

2. КортаваМ. А., ОборотоваН. А., МееровичГ. А. [и др.]. Оценка фотодинамической активности сте-рически стабилизированной лекарственной липо-сомальной формы и раствора Фотосенса на клеточной линии эпидермального рака кожи А-431 in vitro

// Российский биотерапевтический журнал: Отечественные противоопухолевые препараты: материалы Всероссийской научно-практической конференции. — 2007. —№1. — С. 18.

3. Кубасова И. Ю., Вакуловская Е. Г., Ермакова К. В. [и др.]. Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия при лечении злокачественных опухолей головного мозга // Российский биотерапевтический журнал. — 2006. — Т. 5, № 4. — С. 54-63.

4. Спиченкова И. С., Каплан М. А., Сокол Н. И. Комбинированная лучевая и фотодинамическая терапия экспериментальной опухоли саркомы М1 у крыс // Российский биотерапевтический журнал. — 2003. — Т. 2, № 4. — С. 31-64.

5. Ярославцева-Исаева Е. В., Каплан М. А., Ро-манко Ю. С. [и др.]. Разработка методики фотодинамической терапии экспериментальной опухоли (саркома М1) при локальном введении фотосенсибилизатора // Российский биотерапевтический журнал. — 2003. — Т. 2, № 4. — С. 19-22.

УДК 616-006

ПОКАЗАТЕЛИ ТКАНЕВОЙ РЕПАРАЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРЦИНОМЕ ЭРЛИХА ПОСЛЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

Н. М. Ростовцев1, А. Е. Пастернак2, И. И. Спичак3

1 ГБУЗ ЧОДКБ, г. Челябинск, Россия

2 ГБУЗ ЧОПАБ, г. Челябинск, Россия

3 ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России, г. Челябинск, Россия

Ключевые слова: фотодинамическая терапия, апоптоз, репарация, карцинома Эрлиха

INDICATORS OF TISSUE REPAIR IN EXPERIMENTAL EHRLICH CARCINOMA FOLLOWING PHOTODYNAMIC THERAPY

N. M. Rostovtsev1, A. E. Pasternak2, I. I. Spichak3

1 SBHCI CRPCH, Chelyabinsk, Russia

2 GBUZ ChRMB, Chelyabinsk, Russia

3 SUSMU, Chelyabinsk, Russia

Keywords: photodynamic therapy, apoptosis, repair, Ehrlich carcinoma

Актуальность. Эффективность фотодинамической терапии (ФДТ) обусловлена фотохимическими реакциями повреждения клеток опухоли, происходящие путем некроза и апоптоза [1, 3]. При этом механизм гибели клеток детерминирован гистогенезом опухоли, видом фотосенсибилизатора и характеристиками лазерного излучения [2].

Цель настоящей работы состояла в комплексной оценке темпов репарации тканей — пролиферации и апоптоза опухолевых клеток при фотодинамической терапии экспериментальной опухоли Эрлиха в зависимости от дозы лазерного излучения.

Материалы и методы. Исследование проведено на лабораторных мышах-опухоленосителях асцити-ческой карциномы Эрлиха с выделением группы контроля, I группы животных, получивших ФДТ в дозе 100 Дж/см2, II группа — в дозе 200 Дж/см2, III группа в дозе — 400 Дж/см2, в IV группе животным резецировали половину объема опухоли с интраоперационной ФДТ в дозе 400 Дж/см2. Изучение показателей клеточной кинетики проводилось на 7-е, 14-е, 21-е сутки от момента проведенного лечения (14-е, 21-е, 28-е сутки после трансплантации опухоли). Проли-феративную активность оценивали по индексу экс-

Оригинальные исследования

прессии антигена Ki-67 («DAKO», MIB-1, 1:100). Уровень ингибицин апоптоза определяли по степени экспрессии антиапоптозного фактора — bcl-2 oncoprotein («Cell margue», Е17, 1:50). Выраженность апоптоза выявлялась маркером эффекторной фазы каспазы-3 — Caspase 32 («Novo castra», JHM 62, 1:85). После подсчета клеток с положительной реакцией указанных антигенов рассчитывался индекс апоптоза (ИА), ингибиции апоптоза (ИИА), пролиферации (ИП) по формуле:

число скрашенных ядер

¡¡Нашла) ' х ::•

общее число клеток

Иммуногистохимическое исследование стрепта-

Максимальный ИА на 7-е сутки выявлялся в опухоли животных Ш-1У группах (р < 0,05 по сравнению с I группой). Морфологическая картина была представлена массивным апоптозом клеток, остальные клетки опухоли в состоянии дистрофии и некробиоза (рис. 2). На 14-е, 21-е сутки в 1-Ш группах уровень апоптоза снижался, статистически достоверное уменьшение ИА обнаружено в III группе.

Рисунок 2. Выраженная экспрессия срр-32 в клетках опухоли

видин-биотиновым пероксидазным методом на парафиновых срезах по стандартному протоколу.

Статистический анализ полученных данных включал вычисление средних величин, стандартной ошибки. Сравнение результатов между группами проводили по и-критерию Манна — Уитни.

Результаты и обсуждение. Установлено, что интактной опухоли Эрлиха свойственна тенденция к увеличению ИА по мере нарастания массы и объема опухоли (р > 0,05). ИА во всех опытных группах на 7-е сутки превышал показатель в группе контроля, статистически значимые различия не были обнаружены только с I группой (рис. 1).

Индекс экспрессии Ьс1-2 в контрольной группе достигал максимального значения на 21-е сутки (р < 0,05). Это указывает на нарастание пула клеток, содержащих антиапоптотический белок, с увеличением сроков эксперимента. Во II, Ш, IV группах ИИА на 7-е сутки был статистически значимо меньшим, чем в группе контроля. Среди опытных групп ИИА был наименьшим в IV группе: 0,7 ± 0,14 % (р < 0,05 по сравнению с I, III группами). ИИА в III группе на 14-е и21-е сутки достоверно отличался от показателей интактной, I, II групп (рис. 3).

Следовательно, тенденция к увеличению Ьс1-2-по-зитивных клеток в опухоли по мере ее прогрессии сохранялась при повреждении нелетального объема клеток опухоли ФДГ (в дозе 100 и 200 Дж/см2). Увеличение световой дозы до 400 Дж/см2 приводило к выраженной супрессии протеина Ьс1-2 в ткани опухоли.

ИП опухолевых клеток на конечном сроке эксперимента у интактных животных снижался почти вдвое: 6,0 ± 1,33 % (р < 0,05). На 7-е сутки показатели ИП группы контроля, I, II групп были значительно большими, чем в Ш-1У группах (р < 0,05). Наименьшая пролиферативная активность клеток была отмечена в IV группе: 2,3 ± 0,33 % (р < 0,05) (рис. 4).

15 -, ч я m Rio с О с  g 4 т 5 f. * * s г— л -i s f 1 Ф— 1 " ^_

0 14 суток 1 , , . - 1 '   - г 21 сутки 2всуток

контроль  1 группа  II группа Dill группа BV группа

Примечание. Здесь и далее: * — р < 0,05 по сравнению с контрольной, I группой; ** — р < 0,05 с контрольной, I, II группой

Рисунок 1. Индекс апоптоза опухолевых клеток в контрольной и опытных группах

Рисунок 3. Индекс ингибиции апоптоза опухолевых клеток в контрольной и опытных группах

Рисунок 4. Индекс пролиферации опухолевых клеток в контрольной и опытных группах

На последующих сроках тенденция к снижению ИП носила статистически достоверный характер только в III группе (р < 0,05 по сравнению с контролем, I, II группами).

Изучение маркеров клеточной пролиферации в экспериментальной карциноме Эрлиха показало, что нарастание апоптоза происходит в течение первой недели после сеанса фотодинамической терапии в дозе от 200 Дж/см2 или лучевой терапии сопровождается подавлением экспрессии онкобелка Ьс1-2 и пролиферативной активности клеток опухоли. Таким образом, к выраженному подавлению темпа клеточной пролиферации приводили лучевая терапия и ФДТ в дозе 400 Дж/см2.

Заключение. Проведенное исследование подтверждает данные других авторов, что в опухоли под действием фотосенсибилизаторов 2-го поколения активируется каспаза-3-зависимый механизм апоптоза [4, 5]. Изучение экспрессии этого белка в опухоли показало, что достоверное увеличение индекса апоптоза происходит в течение первой недели после сеанса ФДТ (в дозе 200 и 400 Дж/см2). Также нарастание дозы ФДТ приводит к угнетению экспрессии онкобелка Ьс1-2 и пролиферативной активности опухолевых клеток на всех сроках эксперимента.

Литература

1. Залесский В. Н., Фильченков А. А. Апоптоз клеток опухолей желудочно-кишечного тракта при фотодинамической терапии // Вопросы онкологии. — 2004. — Т. 50, № 1. — С. 9-19.

2. Кубасова И. Ю., Вакуловская Е. Г., Ермакова К. В. [и др.]. Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия при лечении злокачественных опухолей головного мозга // Российский биотерапевтический журнал. — 2006. — Т. 5, № 4. — С. 54-63.

3. Matroule J.-Y., Carthy С. М., Granville D. [et al.]. Mechanism of colon cancer cell apoptosis mediated by pyropheophorbide a methylester photosensitization //Oncogene. — 2001. — Vol. 20, № 30. — P. 4070-4084.

4. O'Connor A. E., Mc Gee M. M., Likar Y. [et al.]. Mechanism of cell death mediated by a BF-2 chelated tetraacryl-azadipyrromethene photodynamic therapeutic: dissection of the apoptotic pathway in vitro and in vivo //Int. J. Cancer. — 2012. — Vol. 130,№ 3. —P. 705-715.

5. Zhuang S., Demirs J. Т., Kochevar I. E. P38 mitogene-activated protein kinase mediatedes bid cleavage, mitochondrial dysfunction, and caspase 3 activation during apoptosis induced by singlet oxygen but not by hydrogen peroxide // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275, № 34. — P. 25939-25948.